JPS62502514A - 活性化１１０因子の高収率産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 活性化Ｘ因子の高収率産生 本発明は、概括的にはＸ因子（Ｆ　ａｃｔｏｒ　ｒＸ　）のクローニングおよび 高収率での発現に関するものであり、より詳しくは、■因子ｃＤＮＡが染色体中 に組込まれた哺乳類動物細胞をビタミンＫを含む培地中で培養することによる、 生物学的に活性なＸ因子の産生に関するものである。

血漿糖タンパク質である、Ｘ因子は、血液凝固過程に於いて重要な役割を果たす ０通常、Ｘ因子は肝臓で合成され、１２アミノ末端のグルタミン酸残基のγ−カ ルボキシル化には、ビタミンに活性を必要とする。体内に於けるＸ因子の欠乏は 、血友病の１つのタイプ（Ｂ型）として現れる。現在同疾患の治療法は、Ｘ因子 のヒト血漿タンパク質濃縮物の静脈注射に限られる。しかしながら、血液濃縮物 注射は時間と費用の実際的な拶失に加え、ウィルス性肝炎、後天性免疫不全症候 群、あるいは血栓塞栓症（ｔｈｒｏｌ′Ｉｂｏｅｎｂｏｌ　ｉｃ　ｄｉｓｅａｓ ｅｓ）の受容者への感染の危険性を有する。従って、ヒト血漿からの抽出に代わ る、Ｘ因子産生法が強く望まれている。

組み換えＤＮＡ技術の■因子産生への応用により、同タンパク質に関する重要な 情報が明らかになった。ヒトＸ因子をコードするｃＤＮＡが、単離され、解析さ れ、発現ベクターにクローン化されている０例えば、チュー（Ｋ、　Ｈ，Ｃｈｏ ｏ）他著、“ヒト抗肝炎Ｘ因子遺伝子の分子的クローン化”。

Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　２９９：　１７８−１８０　（１９８２年９月）、 および、Ｋ、クラチ（Ｋ、　Ｋｕｒａｃｈｉ）他著８　“ヒトＸ因子をコードす るｃＤＮＡの単離および解析”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ！、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、　Ｖｏｌ、　７９　：　６４６１−６５　（１９８２年１１月） 　参照。

１９８４年２月１６日に公開されたＰＣＴ特許出ｊｌ１４０８４１００３６０号 は、主として診断用プローブとしての使用のためのヒトＸ因子ヌクレオチド配列 あるいはその断片の同定およびクローニングについて述べている。上記特許出願 は、哺乳動物組織培養細胞、好ましくは肝がん（ｈｅｐａｔｏｌａ）細胞株での 増殖によるヒトＸ因子ポリペプチド産生に関して、予言的に述べているにすぎな い、上記発明者らの続報である、Ｄ、　Ｓ、アンソン（Ｄ、　Ｓ、　Ａｎｓｏｎ ）他著、“組み換えＤＮＡクローン由来活性ヒト血液凝固Ｘ因子の哺乳動物細胞 中における発現”。

Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖａｔ、　３１５．６８３−６８５頁（１９８５年６月２０日 ）には、形質転換したラット肝がん（ｈｅｐａｔｏｎａ　）細胞株からの、活性 を持つと称するヒトＸ因子ポリペプチドの非常に低水準での産生が記述されてい る（６８５頁１欄参照）。

１９８５年１１月１１日に刊行された、ヨーロッパ特許出願□第１６２．７８２ 号は、ヒトＸ因子をコードする塩基配列を含む組み換えウィルスベクターの構造 に関するものである。エピソーム的に組込まれた組み換えＸ因子配列を含有する 菌細胞から生物学的に活性を有するヒトＸ因子が低収率で得られると主張されて いる。しかしながら、宿主細胞の増殖および上記タンパク質の糖タンパクに対す るウィルス成分の影響により、不確定的で、バッチ毎に異なるタンパク質が生成 される可能性がある。〔Ｈ，デ・う・サレ（Ｈ，ｄｅ　ｌａ　５ａｌｌｅ）他著 、“組み換えＤＮＡ技術を用いて発現した活性γ−カルボキシル化ヒト■因子” 　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１ｔ３　：　２６８−２７０　（１９８５年７月１８ 日）も参照のこと〕 最近の別の報告、“トランスフェクションした細胞における活性ヒトＸ因子の発 現”、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６　：　２７１−２７３（１９８５年７月１８日 ）も、二二旦還伝子マーカーとともにトランスフェクションしたＢＨＫ細胞での 組み換えＸ因子の低水準での発現について述べている。

以上のように、これらの最近の研究でさえ、生物学的活性を持ち、確実に一定の 型のＸ因子を高収率で産生ずる安定な系を得ることは依然として困難であること を示している。

本発明に従えば、意外にも、染色体中に組入れた■因子ｃＤＮＡを含むＣＨＯ１ ｉｌ胞系を培賛し、ポリペプチドの回収に先立ち、あらかじめ決められた時間に 、培地中に異種のビタミンＫを加えることにより、生物学的活性Ｘ因子タンパク 質が高収率で産生可能であることが発見された。γ−カルボキシル化を行なうこ とが前もって示されていなかった細胞でさえも、本方法によって活性Ｘ因子を産 生ずることが示される。

ビタミンには、Ｋ１あるいはに３の形で培地中に添加する。

Ｋ３をビタミンとして選択した場合には、１０！あたり約０．１ｎｇから１０μ ｇの濃度のビタミンを添加することが可能であり、推奨される濃度は５ｒｚｒか ら１０μｇの間の範囲である。上記の代わりとして、ビタミンに１は、培地１ｍ ｌあなり約１０ｎｇから５０μｇの要求濃度範囲で添加することが可能であり、 培地１ｍｌあたり１１００ｎから１００μｇのビタミンを添加することが望まし い。

活性Ｘ因子の最大量を産生ずるのに要する時間の長さは、簡単な実験、すなわち 、異なる種々の間隔で調質した培地の分割部分を存在する活性Ｘ因子の量につい て、その最大濃度が決定されるまで分析することにより、容易に決定し得る。

本発明の、異なる態様においては、別のガンマ−カルボキシグルタミン酸を含む 、生物学的活性を有する血液凝固タンパク質および血漿タンパク質を、細胞培地 にビタミンＫを添加することにより、染色体的に組入れた上記タンパク質をコー ドするｃＤＮＡで形質転換した細胞から産生ずる０本発明によれば、ｃＤＮＡか ら生物学的に活性を有する形で産生される上記血液凝固タンパク質および血漿タ ンパク質の例には、７’　口１−　ロアビン（ｐｒｏｔｈｒｏｌ′１ｂｉｎ）、 Ｘ因子、■因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓなどが含まれる。

本発明に従ってクローン化したＸ因子遺伝子の真核生物でとながら、活性成分量 は、被治療状態の重度、選択された投与経路、および活性Ｘ因子の比活性に依存 する。

本発明により産生された活性Ｘ因子は、天然血清由来Ｘ因子で典型的に使用され る、あらゆる経路およびあらゆる薬剤処方および投薬量によって投与することが 可能である。経路、処方および投薬療法は、天然Ｘ因子とここで述べるように産 生されたタンパク質の間に活性の差違がもしもあるならば、その差違を考慮に入 れることが望ましい。

以下の実施例は、■因子ＣＤＮＡ因子の最初の単離およびクローニング、その塩 基配列決定、および活性■因子を発現できる発現ベクター系の速製に関するもの である。第１図は発現プラスミドｐ９１０２３−　ＩＸおよびｐＡａＤ２６ＳＶ ｐＡ３　ｔ７＞構遺を示している。

え旌■−ユ ヒ　ｃＤＮＡ　ローンの　− ■因子ＲＮＡの開始コドンから約４７５ｂｐＴ流と相同である塩基配列５’　− ｐＧＸＴＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ・３’　ＯＨから成る単一のオリゴヌ クレオチドを合成した（クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ他、１９８２、ｎ」；チュー（ ＣｈＯＯ）他、　１９８２゜Ｕ）、上記オリゴヌクレオチドの５′末端をポリヌ クレオチドキナーゼ（二ニー・イングランド・バイオラブズ社）およびγ−３２ Ｐ　−ＡＴＰ　（二ニー・イングランド・ニュークリアー社）を用いて標識を施 した。ヒト肝臓二本鎖ｃＤＮＡを調製しくマニアティス（Ｍａｎｉａ’ｓ）他、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ虹上止射刀互Ｕ」徂凹１ユコールド・スプリ ング・ハーバ−１１９８２）　、チュール（Ｔｏｏｌｅ）他、Ｎａｔｕｒｅ、皿 ：　３４２−３４７゜（１９８４）に記述されているように、ＧＴ１０ベクター に挿入した。ウォー（Ｗｏｏ）他、ハ及ら一ルｌ二１．　Ａｃａｄ、　！江上、 １針エ　■：３６８８−３６９２．　（１９７８）の方法により、約１００，０ ００の組み換えファージプラークを標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて重 量フィルター（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ　ｆｉｔｅｒ）上でスクリーニングを行なっ た。ハイブリッド形成は、５×ｓｓｃ、５×デンハルト溶液（Ｄ　ｅｎｈａｒｄ ｔ’Ｓ）、Ｏ，Ｓ重量％ＳＤＳおよび１０ｍ　ＭＥＤＴＡ中、４２℃で４０時間 行ない、４２℃において２ｘｓｓｃで十分に洗浄した。二本鎖を形成したプラー クは精製し、ＤＮＡをプレート・ストックから調製し〔マニアテイス（Ｍ　ａｎ ｉａｔｉｓ）他、＜１９８２＞　、　ｕ）　、制限酵素分解によって分析した。

１１五−ユ ヒト　ゲノム　ローンの ３種のヒトゲノムライブラリを、ベントン（Ｂ　ｅｎｔｏｎ）他、５ｃｉｅｎｃ ｅ　１９６　：　１８０−１８２　（１９７７）の方法により、ヒト■因子ｃＤ ＮＡのニックトランスレーションを行なった１０−ブを用いてスクリーニングを 行なった。スクリーニングされた第１のライブラリは、シャロン４Ａ　（Ｃｈａ ｒｏｎ　４Ａ）中の増幅Ｈａｅｌ／ＡｌｕＩ部分分解ライブラリである〔ローン （１，ａｗｎ）他、Ｃｅ１ｌ、　１５；　１１５７−１１７４．　（１９７ｇ） ）　、第２のライブラリは、シャロン２８　（ＣｔｌａｒｏＩ’１２８）中にク ローン化された５ａｕ３Ａ部分分解産物を用いて、マニアテイス（Ｍａｎｔａｔ ｉｓ）ら、（１９８２）Ｌｍに示された方法により調製した。第３のライブラリ は、四本のＸ染色体を含むヒトリンパ芽球細胞株（ｈｕｌｌａｎ　Ｉｙｍｐｈｏ ｂｌａｓｔｏｉｄ　ｌｉｎｅ）０Ｍ１２０２Ａ（ＮＩＧＭＳミュータント・セル ・レボジトリ−）から調製した。この場合、５ａｕ３Ａ部分分解ＤＮＡは、Ｌ４ ７．１（レーニン（Ｌ　ｏｅｎｅｎ）ら、Ｇｅｎｅ　１０：　２４９　（１９８ ０））の誘導体であり、２つの小さなＥｃｏＲＩ　−ＢａｎＨＩフラグメントの 代わりにポリリンカーを挿入した、Ｊｌ（Ｊ、ムリンズ（’Ｊ、　Ｍｕｆｆｉｎ ｓ）　ｃｒ）好意により得た）中は、上記のようにクローン化した。ポジティブ （こハイブリッド形成したプラークは精製し、１リツトルの液体分解物（ｌｉｑ ｕｉｄ　１ｙｓａｔｅ）の塩化セシウム密度勾配精製を行うことによりファージ ＤＮＡを調製した〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）、ｎ」 〕。

罠１且−ユ ＤＮＡ塩 ＤＮＡ塩基配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ジデオキシチ ェインターミネーション法〔サンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ’ｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　７４．５４６３−５４６７　 （１９７７）　）により、Ｍ１３ファージベクター〔１ラング−（Ｎ　ｏｒｒａ ｎｄｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ　２６　：　１０１７１０６　（１９８３））にサブク ローン化することより解析した。■因子ｃＤＮＡは、以下の方法によってＥｘｏ ｌにより一連の欠損群を作製した後、Ｍ１３ベクターにサブクローン化した。

塩基配列決定を行なう領域を含むプラスミドを、塩基配列決定を行なう領域の一 方の側の固有の箇所で切断する制限酵素で切断した。上記ＤＮＡ（約２０μｇ） をエタノール沈殿を行ない、５０ｍＭ　）リス、ｐ　Ｈ８，０，１ｍ　Ｍ　Ｍ　 Ｑ　ＣＩＩ　２．１ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む溶液（Ｅ　ｘｏｌ［［ 緩衝液）１００μｍに溶解した。チューブを３０℃に暖め、２００ユニツトのＥ ｘｏｌ［（ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ社）を加える１本条件下で予想 される分解速度である約２００塩基対／分／末端に基づき、３０秒間隔て分注液 の反応を停止させ、塩基配列決定を行なう領域全体◆こわたって末端を生成させ る。

分注液は、５００　ｍＭ　Ｎａ　Ｃｊおよび２０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，０と含む溶液（Ｅ　ｘｏ停止液）３００μｍが入っているチューブに加 えることにより反応を停止させる。欠失させたＤＮＡは、エタノール沈殿を行な い、８０μｍのＨ２Ｏに溶解する。６０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ　Ｚｎ　ｓ ｏ　、５００ｍＭ　Ｎａ　ＣＪＩ　、１０重量％グリセロール、ｐＨ４，６およ び５０ユニツトの８１ヌクレアーゼ（シグマ社）を含む溶液８０μｍを添加する ことにより、穏やかな５１分解を開始する。２０℃で１５分間反応後、４０μｍ の５００ｍＭ　）リス−ＨＣＪＩ、ＬＭＮａ　Ｃ磨、ｐＨ８，０により反応を停 止させ、エタノール沈殿を行なった。続いて、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｊｌ　、 １０ｍ　ＭＭＱ　Ｃｊ　２．１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００ｔｚ １００ｔｚ’　ｓ　（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含む）　−９ １１７，５を含有する溶液１００μｇ中に於いて、ＤＮＡボ　！Ｊメラー４０） フレ／−７−１＞グメント（ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａ（ｌｌｌｅｎｔ）（ＢＲＬ社 ）５ユニツトで３７℃１５分間処哩することにより、プラント末端を生成する６ 反応液はフェノール抽出を行ない、同溶液をｌａ＋ｌＧ５０スピンカラム（１０ ｍＭ　）リス、ｐＨ８，０中の１ｍｌシリジン中で調製）を通して遠心し、１０ ０μｍを回収上記ＤＮＡはエタノール沈殿を行ない、塩基配列決定をする領域の 、Ｅｘｏｌ［に先立つ始めの制限酵素切断部位と反対側の末端を切断する制限酵 素（“粘着”端を残すもの）によって切断する。切断に続いて、ＤＮＡ断片をト リス−酢酸アガロースゲルで解析する。要求されるサイズ範囲巾約２００ｂｐの 大きさの部分に対応するゲル切片を切り出す、ＤＮＡ断片の一方の末端は塩基配 列決定を行なう領域内のＥＸＯＩ［［由来プラント末端であり、他方の末端は再 切断部位由来である。

ＤＮＡ断片はＮａＩへ溶解後、ガラスパウダーアフィニティー〔ヴオルゲルスタ イン（Ｖ　ｏｌｇｅｌｓｔｅｉｎ）とギレシュピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）、旦 旦辷」９エユユユヱ互工玉旦工」釘よ　並：６１５−６１９　（１９７９））に より精製する。

上記ＤＮＡ断片は、次に、プラント末端がユニバーサルプライマー結合部位に最 も近接するような非対称的な方法でＭ１３クローニングベクターに連結する。決 定する塩基配列を含む領域に特異的に作製されたプローブとハイブリッド形成を 行なうＭ１３組み換えプラークは、次の単Ｓ鋳型ＤＮＡの調製のために選択した 〔サンガー（Ｓ　ａｎｑｅｒ）ら、（１９７７）、前出〕、一般的に、４ｋｂま で塩基配列決定を行う全領域にわたる塩基配列を得るために、各サイズ群から１ 種あるいは２種のみの単ｌｌ！断片をユニバーサルプライマーを用いて塩基配列 決定を行なうことが必要である。第２の鎖の塩基配列は、塩基配列決定を行なう 領域の反対側の末端から欠失させ、上記の方法を繰り返すことにより、得られる 。

夫族旦−Ａ エ　ソン１　ｃＤＮＡの　み　λ ■因子プロモーターおよび５′コード領域を含む４．５ｋｂＨｉｎｄｌｌ［７ラ グメントをシＪｌ’Ｃ７ン２１Ａ　（Ｃｈａｒｏｎ　２１Ａ　）にクローン化し た。シグナル配列の第１１番目のコドンから、ポリＡテイルからｆ３６ｂｐのｘ ｂａＩ切断部位までの全■因子コード配列を含む、■因子ｃＤＮＡの２．５ｋｂ フラグメントをＡＮ７ブラスミド（■Ｘの誘導体）にサブクローン化した。〔マ ニアティス（Ｍ　ａｎｉａｔｉｓ）他、（１９８２）、Ｕ、参照〕。■因子ｃＤ ＮＡ内には５７ｂｐのエクソン１配列が存在する。エクソン１を含むシャロン２ １Ａフアージを組み換えＡＮ７プラスミドを含有する細菌上にブレーティングし 、続いてプレート・ストックとして回収した。５ｕｐＦを含むＡＮ７プラスミド と組み換えたファージは、５ｕｐＦ−細菌系Ｗ３１１０上にブレーティングする ことにより選択することが可能となった〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら 、（１９８２）、■遇’］　−約２　ｘ　１０’フアージあたり１個が５ｔｌｐ Ｆ＋であった。単離した１つのファージを選んで大規模にＤＮＡを調製し、制限 酵素マツピングおよび続いて、塩基配列分析を行なうことにより、上記ファージ がＡＮ７ブラスミドの５７ｐｂ相同領域中に正しく組み換えられ、■因子“ミニ 遺伝子”を得たことを示した。

叉立皿−５ に兆ニー　ｘ　ηの工　・　し　−ゼこ　除２、３ｋｂ　Ｘ　ｂａフラグメント を含む■因子“ミニ遺伝子”をガラスパウダーアフィニティーによりＡＮ７から Ｆ＃製した。

約５μｇの上記フラグメントを４０μｍのＥＸＯＩ［［緩衝液中５０ユニットの ＥＸＯ■で切断した。１分後、８μ夏の分注液を１２０μρのＥｘａ停止液に１ ５秒間隔で移した。ＤＮＡは上述のようにエキソヌクレアーゼＳ１ヌクレアーゼ およびポリメラーゼｌのクレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｎｅｎ ｔ）で処理し、次＋　＋　−、、，９ ％＋：Ｉ−’−ｃ＠ 火１劃１−ゑ ■辺ｊｌＵ１１１認 以下の■因子アッセイに使用する試料を調製するために、約４×１０６の対数増 殖細胞を示されたような添加物を含む無血清培地で４回すすいだ（各５ｍ１）、 ３７℃で２４時間いた後、　ドライアイス／エタノール　バス中で凍アッセイす るまで、−７０℃で保存した。

Ａ、　−Ｅｌｉｓａ マイクロタイタープレートをヒト■因子マウスモノクローナル抗体（ハイブリチ ック社）でコーティングした。プレートを洗浄し、試料あるいは標準■因子調製 液をアルファ培地に希釈後プレートに加えた。■因子標準液は、４．０μｇから １、Ｏｎｇに希釈した、精製■因子を使用した。二次抗体（ウサギ抗区因子、カ ルバイオケム社）を添加し、洗浄し、アルカリホスファターゼと結合したヤギ抗 ウサギＩＣ１Ｇ　（ツィメア社）を作用させた。基質はジェタノールアミンに希 釈したアルカリ性すン酸表（シグマ社＃１０４）のものを用い、結果は４１０閣 で測定した。

Ｂ、　アッセイ Ｒ，ビックス（Ｒ，Ｂ　１Ｑ（Ｉｓ）　、ヒト血液凝固血流停止および血栓症（ Ｈｕｌｌａｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｏｕｌａｔｉｏｎ　Ｈａｅｌｌｏｓｔａｓｉ ｓ　ａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）　（第１版）、オックスフォード、ブラック ウェル、サイエンティフィック、６１４頁（１９７２）に述べられた一段階活性 化部分的トロンボブラスチン時間的アッセイを、等容の：１）活性化部分的トロ ンボプラスチン試薬（−散的診断法）２）■因子欠損血漿（ジョージＢ、キング バイオメディカル社）および３）標準として正常保存血漿、あるいは試料に対し て行なった。１ユニツトの活性を、１ｍｌの正常保存血漿中の存在量として定義 した。

１９８３年１２月４日出願の米国特許出願第６７７．８１３号に対応する、１９ ８６年１月２０日に刊行された日本国特許公告公報第１２２８８／８６号の実施 例３で述べられているプラスミドｐ９１０２３（Ａ）のＰＳｔ工部位に■因子コ ード配列を挿入した。得られたクローンを、■因子の適当な向きに関して、ｐ９ １０２３−　ＩＸとして選択された適当な向きを有するクローンでスクリーニン グした。■因子発、現ベクターｐ９１０２３−　ＩＸは、ＡｄＭＬＰの上流にＳ Ｖ４０エンハンサ−、アデノウィルス３分節リーダー（ＴＰＬ）のｃＤＮＡコピ ー、アデノウィルスＶＡ遺伝子、〔カウフマン（Ｋａｕｆｒａａｎ）　、　ＰＮ ＡＳ、８２　：　６８９−６９３（１９８５）　）　、およびＤＨＦＲコード領 域の上流に挿入された■因子ｃＤＮＡコード領域を含む、ＥｃｏＲＩ　（Ｒ１＞ 、Ｂ　ａｎＨ１（ｂａｎ）およびＸｈｏＩ　（Ｘ　）　ＩＭＩＩＩ酵素切断部位 が示される。ＤＨＰＲ，発現ベクターｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３）　（ｌｙ　ｔ 　７　？　ン（Ｋ　ａｕｆｎａｎ　）他、Ｈｏｔ、　Ｃｅ１１．　Ｂｔｏ、２　 ：　１３０４−１３０９（１９８２））は、第１番目の後期リーダ一部位および ５′スプライシング部位を含むアデノウィルス主要後期プロモーターを含む。

ＲＮＡ）ランスクリプト由来リーダーエクソンは導入された３′スプライシング 部位と適切にブライシングを行なう。

上記ベクターは、ＣｏｊＥ１複製開始起点、哺乳動物細胞の複製に有害な塩基配 列を欠いたＤＢＲ３２２由来配列、テトラサイクリン耐性、およびＳＶ４０複製 起点を含む、ｐｓＶＯａ〔メロン（Ｍｅｌｌｏｎ）ら、匡旦、　２７：　２７９ −２８８（１９８１）　〕由来２．７ＫＢのＳＶ４０初期ポリアデニル化部位を 含んでいる。

■因子発現ヘク９−　ｐ９１０２３−　■ヲ、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ　３ととも に、リン酸カルシウムを媒介とするＤＮＡ）ランスフェクションにより、ＤＨＰ Ｒ欠損チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞に導入した。（第１図参照、）ＤＨＦ Ｒ陽性表現型で選択した細胞は■因子を低水準で発現した０次に、形質転換体を プールし、以下の連続的にメトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度を増加させた培地 、すなわち、０．０２．０．１　、０．５　、１．０　、５．０および２０μＭ 、での増殖により選択した０本方法によって選択した細胞は、増幅された■因子 遺伝子および導入されたＤＨＰＲ遺伝子の増幅されたコピーを含む。上記増幅さ れた遺伝子は、一般的に、１本あるいは２本の特異的な染色体に局在する〔カウ フマン（Ｋ　ａｕｆｍａｎ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ。

３　６９９−７１１　（１９８３））　、ＤＵＫＸ　Ｂ１１　ＤＨＦＲ欠損Ｃ） （Ｏ細胞（ウルラウプ（Ｕｒｌａｕｂ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｔ、７７：４２１０−４２２０．１９８０；カウフマン（Ｋａ ｕｒｎａｎ）ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１５９　：　６０１−６２１． 　１９８２）をリン酸カルシウムにより、２５μｇのｐ９１０２３−　ＩＸおよ び２．５μｇのｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ　３　（カウフマン（Ｋ　ａｕｆｌｌａｎ ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、前掲〕の混合物で形質転換を行なった。形質 転換体を、記述されているように（カウフマンおよびシャープ、前掲）ヌクレオ シドを欠損している培地で選択した。同じ結果が得られた同様の形質転換は、２ ．５μｇのｐＳＶ２Ｎｅｏ（サザン（ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ）ら、Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ａ　Ｉ。Ｇｅｎｅｔ、、　１　：３２７−３４１（１９８２）　）の添加を含 む、後者の形質転換では、ＤＨＦＲ″）形質転換体は、ｌ］５Ｖ２ｎｅｏマーカ ーで選択するために、抗生物質０４１ｇ（１■１０１）を添加したヌクレオチド 欠損培地でまず選択した。　０４１８耐性マーカーの添加は、増幅されたＤ）（ ＰＲ遺伝子コピーの直接的選択が不可能な他の細胞に形質転換されたＤＮＡを含 む染色体の転移の促進に有用となる。

最初の形質転換体をプールしく約２５形質転換体／プール）、ＭＴＸ濃度を増大 させて増殖させた。上記プールの■因子発現は、３５Ｓ−メチオニン標識および 、調製した培地および細胞抽出液の、ヒト■因子を認識するモノクローナル抗体 を用いた免疫沈降によって分析した。細胞抽出物中に５５にダルトンのバンドが 見られ、その水準はＭＴＸ耐性の高濃度で選択された細胞はど高くなった。調製 培地を同様に分析した場合、７２にダルトンから５５にダルトンにわたる不均一 なスミア（Ｓｎｅａｒ）が見られた。スミアの不均一性は、分泌された物質のグ ルコシル化の不均一性によるものと思われる。さらに、イライザ（Ｅｌｉｓａ） によって決定された、分泌された■因子抗原の水準は２０μＭ　ＭＴＸまでの選 択で約３０００倍に増加した。（表■参照、）細胞群５α３中の■因子抗原の水 準（すなわち、生物学的活性ではない）は４３．４μｇ／Ｉ！ｌｌと決定された 。

表−一工 ＭＴＸ濃度の増加における増殖で選択した細胞の調製培地中の■因子抗原 〔Ｋ１Ｘ）　ＬＬＬＬ 二ニル　５α３　０　０．０１５ ５α３　０．０２　０．１５ ５α３　０．１　６．９ ５α３　０．５　２９．４ ５α３　５．０　３６．０ ５α３　２０．０　４３．４ 尺族皿−五 ＣＨｏ　：”ゝ！　因　パ、の発 ■因子を産生ずるＣＨＯ細胞由来の調製培地（ＭＴＸの様々な濃度における５α ３）をＩＸ因子活性について分析すると、バックグラウンドを越える活性は検出 されなかった。ビタミンＫを、■因子抗原を産生ずるＣＨＯ細胞を含む培地に加 えた６表３はＣ）（ＯｒＸ因子産生細胞（５α３．２０μＭ　ＭＴＸ＞にビタミ ンに１　（３−フィチルメナジオン、シグマ社）濃度を増加させながら添加し、 ２４時間後の■因子活性を検定した結果を示す、明らかに、ビタミンに１濃度を ５μｇ　／　ｍｌまで増加させるのに従って、調製培地中の■因子活性も増大す る。

ビタミンに１はアッセイの直前に調製培地に加えた場合には、活性に影響を及ぼ さない０以上のように、ビタミンに１の存在下では、ＣＨＯｆｆｌ胞は、０．２ ７５ユニツトの活性■因子／ｌ１１１１７日／１０６細胞まで産生じた。

非常に少量の脂溶性ビタミンに１が実際に細胞に分泌されているという事典の有 効性を決定するために、水溶性誘導体ビタミンＫｓ　（メナジオン、シグマ社） に関して同様の効果を示した。ビタミンＫによる最大活性を得るには、より低い 水準のに３　（０，００５μｇ　／　ａｌｌ　）が必要とされた。■因子活性に 対するビタミンに３依存性の特異性は、ビタミンにの特異的拮抗薬（ａｎｔａｇ ｏｎｉｓｔ）であるフルファリン（ｖａｒｆａｒｉｎ）（１μｇ　／　ｍｌ　） を加えることにより、活性■因子の発現が抑えられることにより示された。

ビタミンに１に対する■因子活性 ｐ３　ｖクミンＫｒｎユニット　ロ１ ５ａ３（２０μＭ＞　１１００ｎ／ｆｆｌ１　４２．５５α３　（２０μＭ）　 ５００ｒｚｒ／ｍ１１０５．０５α３（２０μＭ）　１μｒ／ｍｌ　１９２．０ ５α３（２０μＭ）　５μｇ／口１　２７５．０５α３（２０μＭ）１０μｇ／ 口＋　２６８．０ＣＨＯ５μｇ／ｍｌ　１７．５ 以上のように、ＣＨＯＭＡ胞由来因子の比活性は■因子１６．５ｍ　Ｕ　／μｇ であった。正常血漿中の■因子水準は、■因子タンパク質１ユニット／ｍ１１５ μｇであるから、Ｃ）［０細胞由来■因子タンパク質の比活性（■因子活性のユ ニットＷ！、／■）は正常血漿由来のものの９％である。

本発明を、推奨される実施例を含む細部にわたり述べてきた。しかしながら、以 下の請求の範囲によって定義される本発明の本質および範囲内において、本分野 に熟達した者は変形および改良することが可能であることは認められるであろ国 際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ビタミンＫを含む培地において染色体中に組入れたＩＸ因子ｃＤＮＡで形質 転換したＣＨＯ細胞を培養することから成る、生物学的活性ＩＸ因子を高収率で 産生する方法。 ２）ｃＤＮＡが表ＩのｃＤＮＡ塩基配列から成る、請求の範囲第１項記載の方法 。 ３）ビタミンＫが、ビタミンＫ１およびビタミンＫ３から成る群から選択される 請求の範囲第１項記載の方法。 ４）上記培地が約０．１ｎｇから５０μｇ／ｍｌ培地の濃度のビタミンＫ３から 成る、請求の範囲第３項記載の方法。 ５）上記培地が約５ｎｇから約１０μｇ／ｍｌ培地の濃度のビタミンＫ３から成 る、請求の範囲第４項記載の方法。 ６）上記培地が約１０ｎｇから約５０μｇ／ｍｌ培地の及濃度ビタミンＫ１から 成る、請求の範囲第３項記載の方法。 ７）上記培地が約１００ｎｇから約１００μｇ／ｍｌ培地の濃度のビタミンＫ１ から成る、請求の範囲第６項記載の方法。 ８）ビタミンＫを含む培地中で、生物学的活性を有するγ・カルボキシル化タン パク質をコードする染色体中に組入れられたｃＤＮＡで形質転換した細胞系を培 養することから成る、上記タンパク質を高収率で産生する方法。 ９）上記タンパク質として、ＩＸ因子、Ｘ因子、ＶＩ因子、タンパク質Ｃおよび タンパク質Ｓから成る群から選択したタンパク質を使用することから成る、請求 の範囲第８項による方法。 １０）上記ビタミンＫをビクミンＫ１、ビタミンＫ３、および水溶性ビタミンＫ から成る群から選択することから成る、請求の範囲第８項による方法。