JPH082307B2

JPH082307B2 - 第▲ｉｘ▼因子の製造方法

Info

Publication number: JPH082307B2
Application number: JP60502263A
Authority: JP
Inventors: ラサルアンリド; ロベールドリリエン; ウエルナーアルテンブルガー; ポールトルストシエフ; ジヤン‐ピエールルコツク
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1984-05-22
Filing date: 1985-05-21
Publication date: 1996-01-17
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: JPS61502164A; DE3576360D1; EP0162782B1; WO1985005376A1; EP0162782A1; CA1262877A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒト第IX因子又はその類似構造蛋白の製造
方法に関する。

第IX因子は、血液凝固過程に関与する蛋白である。第
IX因子は、チモーゲンの形で合成され、翻訳後に炭化水
素鎖の付加、アスパラギン酸の水酸化及び12個のグルタ
ミン酸のγ−カルボキシ−グルタミン酸への転換により
修飾される。後者の修飾は、ビタミンＫに依存している
（ベルチナら、1981年）。

肝臓が、第XI因子の合成部位である。

第IX因子は、血友病患者の血中では活性が低いからあ
るいは存在しない。血友病Ｂは、もつと頻度の高い形の
血友病、即ち、血友病Ａと同様に、出血時間が非常に長
いことが特徴である。これは、劣性伴性体質の形で遺伝
する（ヘドナーら、1982年）。

第IX因子欠損の分子特性は、明らかではない。

第IX因子を血友病Ｂ患者に与えると、出血時間は正常
に回復する。

現在のところ、第IX因子の唯一の利用源は、ヒト血漿
であるが、場合によつては相応するウシ蛋白を使用する
ことができる。

第IX因子製剤は、パイロジーニツク（発熱を起こす）
であることがあり、また、病原因子または肝炎ウイルス
のようなウイルスおよびエイズ（A.I.D.S.）のベクター
因子で汚染されている危険性がある。

このため、組換えDNA法による極めて高純度の第IX因
子の製造方法の開発に関心がもたれている。

しかしながら、この方法は、ある種の困難を伴う。

第IX因子は、上記第２パラグラフで述べたように、高
次に修飾された蛋白である。

第IX因子の安定性又は活性に対するこれら修飾の重量
性は、十分には理解されていない。修飾されたグルタミ
ン酸が、第IX因子の活性化に必須であると考えられる。

このため、本出願人は、第IX因子を活性形で、即ち、
前述の特別な構造を考慮して、発現させることができる
ベクターを開発した。

該ベクターは、ヒト第IX因子又は第IX因子類似蛋白を
コードする遺伝子を含むポツクスウイルス科、特にオル
ソポツクスウイルス属ウイルス、例えばワクシニアウイ
ルスから成る発現ベクターであり、この遺伝子は、ポツ
クスウイルス遺伝子プロモーター、例えばワクシニア7.
5K蛋白をコードする遺伝子プロモーターに依存してい
る。

今後、前記科、特に前記属の代表的種であるワクシニ
アウイルスについて主に言及するが、他のオルソポツク
スウイルス、特に牛痘ウイルスを用いることができる。

発現ベクターがワクシニアウイルスから成ると言う場
合には、このウイルスは不完全であることがある、即
ち、ベクター生産中にある部分がウイルスの本質的性質
を変化させない程度に削除されてもよいことは、容易に
理解されるところである。

一般に、本明細書に記載の「第IX因子類似蛋白」が同
種のインビボ生物活性あるいは見かけの活性を有する蛋
白を示すことは理解されよう。それは、特に、ある種の
アミノ酸を除いて第IX因子と同じ構造を有する蛋白を意
味する。グリコシル化、β−ヒドロキシル化およびγ−
カルボキシル化のような翻訳後修飾は、天然分子のこれ
らと必ずしも同一ではなく、重要なことは、その分子が
天然第IX因子のそれに代わり得る凝固活性を有すること
であり、あるいは完全分子の本来の活性を有する第IX因
子の断片であることである。

ワクシニアウイルス（VV）による第IX因子のような外
因性蛋白をコードする配列の発現は、必ず二つの段階を
含んでいる：１）コード配列をVVプロモーターと一列に並べ、適当な
細菌プラスミド中でクローン化されるVVDNAの非必須領
域に挿入しなければならない。

２）両側に位置するVVDNA配列は、同種組換えがプラス
ミドとウイルス性ゲノムの間でインビボで起るのを可能
ならしめなければならない。二重相互組換えによりプラ
スミドDNA挿入片をウイルスゲノムに移入し、その中で
繁殖、発現される（パニカリおよびパオレツチ、1982;
マケツトら、1982;スミスら、1983;パニカリら、198
3）。

このため、プロモーター／前記に定義した第IX因子を
コードする配列全部をワクシニアウイルス遺伝子、例え
ばチミジンキナーゼ（TK）遺伝子中に挿入し、このこと
により、以下に説明するように、同種組換えが起り、選
択が可能になる。

このようにして得られるハイブリツドウイルスは、細
胞培養物を感染するのに使用することが出来、この培養
物から第IX因子または類似蛋白を、細胞粉末または培地
を用いて既知の方法により抽出することができる。

背推動物宿主細胞、特に哺乳動物細胞は、多種多様の
ものを使用し得るが、使用するベクターにあわせる。

特に、これら細胞は、ヒト肝臓細胞であつてもよく、
従つてインビボで第IX因子を生産する器官に由来する。

これら細胞のうち、HepG2系について述べる。このタ
イプの細胞系の調製方法は、特に、特許WO81/03663（出
願人：ウイスター・インステイチユート・オブ・アナト
ミー・アンド・バイオロジー）に記載されている。

これら細胞は、第IX因子を生産しないが、血液凝固過
程の蛋白を生産し、その一部は、第IX因子と同じ化学的
性質を有する（第IX因子、蛋白Ｃ、プロトロンビン）。
従つて、これら細胞は、本発明を実施するのに好適の宿
主である。

さらに、実験により、この過程において他の細胞培養
物、特にVero細胞またはBHK21細胞のような腎細胞を使
用することができることが確認されている。

ワクシニアウイルスは、CHO系での感染サイクルを完
了することができない。従つて、CHO細胞で十分量の第I
X因子を生産するために、ワクシニアベクターを使用す
ることはできない。

ベクターは、牛痘ウイルス、即ち、ワクシニアウイル
ス系に属するのがCHO細胞を感染できるウイルス由来の
ものを用いる。

形質転換されたまたはトランスフエクトされた細胞
を、それらの発育を可能にする適当な培地で培養する。
培養後、細胞または培地を集め、第IX因子蛋白を既知の
蛋白および膠原精製方法により単離することができる。

さらに詳しくは、本発明は、また、肝臓によつて生産
された蛋白の調製法に関するものであり、ワクシニアプ
ロモーターの促進下で前記蛋白をコードする遺伝子をそ
のゲノム中に挿入したワクシニアウイルスによつて感染
させた肝細胞系を培養することを特徴とする。

本発明は、また、得られた第IX因子の活性に関して細
胞培養培地におけるビタミンＫの重要性を立証すること
ができる。

従つて、本発明はさらに詳しくは、前記のように、発
現ベクターと表記される組変えウイルスで感染した哺乳
動物細胞系を培養し、感染細胞系をビタミンＫ含有培地
で培養することを特徴とする活性第IX因子の調製法に関
する。

使用するビタミンＫの量は、細胞培養物により変える
ことができるが、培地を飽和させる量、例えば20−80μ
g/ml培地が好ましく、一般には約50μg/ml培地のオーダ
ーである。過剰量のビタミンＫが存在しても、障害は生
じないものと考えられ、このビタミンは発育中に消費さ
れる。

培地自体は既知である。即ち、使用細胞がVero細胞の
ような腎由来細胞である場合、使用する培地はドウルベ
コ培地で良い。BHK21細胞の場合にはガルスグロウ最小
必須培地（MEM）;Changのような肝由来培養物の場合はM
EM培地が使用されよう。これらの培地に、胎孔ウシ血清
10％を加えるのが好ましい。

本発明のその他の特徴および有用性は以下の実施例を
参照すればさらに明らかとなろう。

本発明によるベウターウイルスの調製は、特に以下の
段階を含んでいる：１）第IX因子に相応するcDNAクローンの生産（第１〜３
図に図示）：第１図は、第IX因子cDANに対する第IX因子およびその
ホモローグ用プローグの模式図である。

第２図は、得られたcDNA部分の配列を示す。

第３図はM13tg315の調製法を示す。

２）pBR322からのミニプラスミドpTG1Hの合成（第４
図）。

３）このミニプラスミド中へのVVTK遺伝子保有Hin−Ｊ
断片の挿入。

４）TK遺伝子への7.5K蛋白プロモーターの挿入（第５
図）。

５）p7.5Kの促進下でのM13tg315により保持された第IX
因子をコードする遺伝子の挿入（第５図）。

６）後者のプラスミドの必須要素のワクシニアウイルス
中でのクローニング（第６図）。

以下の実施例に得られた種々の成分の性質を説明す
る。使用した種々の材料は実施例中に示す。

特に明示しない限り、酵素はメーカー指示の条件下で
使用し、用いた方法は当業者には既知のものである。

図に示すアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、冗
長にならないように本明細書の本文には記載しないが、
本願の必須部分を構成するものである。

ヒト第IX因子に相応するcDNAクローンの生産ヒト第IX因子に相応するcDNAクローンの生産は、本出
願人の名で出願されたフランス特許No.84/07125にすで
に記載されている。

ヒト第IX因子に相応するcDNAクローンを得るには、単
一合成オリゴヌクレオチドから成るプローブを用いる。

驚くべきことに、この合成オリゴヌクレオチドを用い
てヒト肝臓cDNAバンクから直接第IX因子クローンを得る
ことができた。従来は、ウシ第IX因子のアシノ酸配列が
知られているだけである。

材料および方法（ヤーエら） I.ポリアデニル化メツセンジヤーRNAの単離およびcDNA
の合成 RNAは、トルストシエフら（1981）が記載のように、8
M塩酸グアニジン抽出法によりヒト肝臓5gから調製す
る。

このようにして得たRNAは、メーカーの仕様書に従つ
てポリＵ−セフアロース（フエルマシア社）カラムクロ
マトグラフイに付し、ポリ−Ａ含有RNA抽出物を得る。

ポリ−Ａ配列は、オリゴ（dT）を「プライマー」とし
て用いる逆転写の指標として利用できる。cDNAは、100m
MTris−HCl（pH8.3）、10mMMgCl₂、50mMKCl、30mMメル
カプトエタノール、10μg/mlオリゴ（dT）、50μg/mlポ
リ−Ａ−RNA、夫々0.5mMのdATP、dGTP、dTTPおよびdCT
P、およびニワトリ筋芽細胞逆転写酵素（ライフ・サイ
エンシズ社）80単位を含有する試薬100μｌを用いて合
成した。

42℃で45分後、反応を終結させ、cDNA/RNA複合体を10
5℃で３分間加熱して変性させ、素早く氷溶に移す。

第二のDNA鎖の合成の場合には、前記反応混合物を５
倍に希釈し、100mMHEPES−KOH（pH6.9）、100mMKCl、20
0μMdATP、dGTP、dTTPおよび³²P−dCTP（比活性0.5ci/m
mol）で最終濃度に調製する。

次いで大腸菌DNAポリメラーゼ（クレノウ断片）（ベ
ーリンガー・マンハイム社）10単位を添加し、25℃で２
時間培養する。

二重鎖cDNA（dscDNA）をフエノール／クロロホルム
（50:50）の等容量で抽出し、10mM Tris−HCl（pH8）、
1mMEPTAで飽和し、エタノールで２度沈澱させる。

ポリ−Ａ−RNA5μｇからdscDNA約970ngが得られる。
末端は、30mM酢酸ナトリウム（pH4.8）、300mMNaClおよ
び3mMZnCl₂含有反応培地0.1ml中でS1ヌクレアーゼ５単
位を用いて消化することによりフリーにする。37℃で１
時間後、EDTAおよびSDSを添加し、最終濃度をそれぞれ1
0mMおよび0.1％にし、反応混合物を65℃で５分間加熱す
る。

続いて、S1で消化されたdscDNAを、100mM Tris−HCl
（pH7.5）、5mMEDTA、100mMNaCl含有の前もつて用意し
た５−20％スクロース勾配に付し、SW60Tiローターを用
いて30,000rpmにて15℃で16時間遠心分離する。

0.5mlの画分を集める。cDNAの大きさを測定するた
め、各画分の１μｌを中性アガロースゲル電気泳動にか
け、各画分の移動度を適当な分子量マーカーと比較す
る。

１キロベース（１千塩基）以上のcDNAを含有する画分
を合せ、支持体として大腸菌tRNA5μｇの存在下に一
晩、２倍量のエタノールで沈澱させる。沈澱物は、0.1
×ssc（5mMNaCl、0.5mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）20
μｌに再懸濁させる。

II.cDNAのクローニングホモポリマー末端要素（約15のdCMP）を、デオキシヌ
クレオチジルターミナルトランスフエラーゼを用いてcD
NAの３′末端に付加する（デングら、1981）。

同様に、ポリ−dGMPホモポリマー末端要素（約10のdG
MP）を、PstI制限酵素であらかじめ消化したpBR322プラ
スミドの３′末端に付加する。

ポリ−ｃ−dCMP末端を有するcDNA60ngおよび前パラグ
ラフの条件下に調製したベクター１μｇを、10mMTris−
HCl（pH7.5）、100mMNaCl中において42℃で２時間加熱
する。組換えプラスミドを用いて、E.coli 8739を形質
転換し（マレーら、1977）、形質転換体をテトラサイク
リン15μg/mlを含有する寒天−LB平板上で選択する。形
質転換体30,000を得、そのうちの約50％は1Kb以上のcDN
A挿入片を含んでいる。全ての形質転換体を最小量のLB
中に平板から取り、等量のグリセロールを加えた後、得
られたバングを−20℃で保存する。

III.第IX因子用オリゴヌクレオチドプローブの選択およ
び合成肝臓により合成されたウシ蛋白をコードする遺伝子配
列の1755個のヌクレオチドを分析し（マツクギリブライ
ら、1980;チユングら、1981）、優先的に使用されるコ
ドンを立証する。52個の塩基の配列を選択した。このオ
リゴヌクレオチドは次のように構築される：オリゴヌクレオチドA:d（CTCACACTGATCACCATCCACATAC
T）、オリゴヌクレオチドB:d（GCTTCCAGAACTCTGTAGTCTT
CTCA）および相補断片C:d（GGAAGCAGTATGT）を、コーリ
ら（1982）により既に記述されているように、無機固形
支持体上でホスホトリエステル法により化学的に合成
し、フリツツ（1978）記載のようにHPLCにより精製す
る。

オリゴヌクレオチドB0.5nmolを60mMTris−HCl（pH7.
8）、6mMMgCl₂、6mMジチオスレイトール、0.1mMATP、6p
mol³²Ｐ−ATP（3000ci/mmol）およびT₄ポリヌクレオチ
ドキナーゼ２単位を含有する反応培地10μｌ中において
37℃で30分間培養する。５′−リン酸化オリゴマーＢを
10mMTris−HCl（pH7.5）、1mM EDTA中でオリゴヌクレオ
チドＡおよびC0.5nmolと混合し、混合物を100℃で加熱
し、緩徐に冷却して４℃にする。オリゴヌクレオチドＡ
およびＢの反応混合物を、66mMTris−HCl（pH7.5）、10
0mMNaCl、7.5mMMgCl₂、2mMジチオスレイトール、0.5mM
スペルミジン、0.2mMEDTAおよびT₄DNAリガーゼ４単位を
含有する反応混合物50μｌ中において４℃で一晩ライゲ
ートする。

得られた52量体を20％ポリアクリルミドゲル電気泳動
によりライゲーシヨン混合物から精製する。

IV.ヒト肝臓cDNAバンクの分析約10,000コロニーをテトラサイクリン10μg/mlを含有
するいくつかの寒天−LB血で発育させる。翌日、細菌コ
ロニーをニトロセルロースフイルターに移し、フイルタ
ーを基本的にはグルンスタインら（1979）が記載してい
るように、コロニーハイブリダイゼーシヨンのため調製
する。最初のテトラサイクリン含有血上の残りの細菌を
37℃で数時間発育させる。

ハイブリダイゼーシヨンプローブは、50量体100ngを
³²P−ATP50μciとカイネーシヨンすることにより調製す
る。ハイブリダイゼーシヨンは、６×sscおよび１×デ
ンハルト溶液、0.1％SDS、大腸菌tRNA50μg/mlの40ml中
において48℃で一晩行う。

翌日、フイルターを42℃において、６×ssc、0.1％SD
Sの溶液で数回洗浄する。フイルターを乾燥し、次いで
一晩オートラジオグラフイにかける。

結果ウシ第IX因子のアミノ酸配列（カタヤマら、1979）を
分析して、若干縮重したコドンにより決定されるアミノ
酸から成る長い配列を見い出す。

プローブはこのように、４つのコドンによりコードさ
れた４つのアミノ酸（thr、val、gly）、２つのコドン
によりコードされた12のアミノ酸（glu、lys、phe、gl
n、tyr、asp、cys）および１つのコドンによりコードさ
れた１つのアミノ酸（trp）に相応する、ウシ第IX因子
の36〜52番目のアミノ酸に相応するように作られた（第
１図）。

続いて、ウシプロトロンビンおよびウシフイブリノー
ゲンの585個のコドンを分析し、バリンコドンGTGは、38
回中21回用いられていることが明らかとなつた。同様
に、TTCおよびTGTは、アミノ酸pheおよびcysの場合の他
のコドンよりそれぞれ２倍の頻度で使用される。

その他の特に顕著な優先的使用は分析からは判明しな
かつたが、ある種のヌクレオチドは、ある種のコドンの
場合第３位、例えばグリシンおよびスレオニンの場合の
Ｇ、でまれに見い出される。

さらに、G:T対は、G:C塩基対より安定性に劣るが、少
なくともコロニーのハイブリデーシヨン中に52量体のハ
イブリデーシヨンの安定化に寄与するであろうが、一
方、A:C対は、寄与しないであろう。

従つて、縮重コドンの第３位でＧもしくはＡが選択さ
れるアミノ酸（glu、lys、gln）のいずれについてもＧ
が選択された；同様に、アミノ酸tyrおよびaspの場合Ａ
に比してＴが選択された。

これらの状況を考慮し、選択はスレオニンおよびグリ
シンの場合第３位におけるヌクレオチドとしてＴまたは
Ｇに限定された；しかしながら、前述のように、Ｇはス
レオニンコドンの第３位にまれに見い出されるだけであ
る。従つて、スレオニンコドンの１つにはＴを選択し、
52量体内の二次構造による問題を回避するため、グリシ
ンの場合第３位にはＴを選択し、第２のスレオニンコド
ンの場合第３位にはＡを選択した。

ヒトcDNAバンクの選択および第IX因子クローンの同定最初の方法は、ウシ肝臓cDNAバンクを選択するためこ
の52量体を用い、次いでこのウシ第IX因子cDNAクローン
をヒト肝臓cDNAバンク用プローブの形で用いることであ
つた。この方法は、ウシおよびヒト蛋白のＮ末端でのア
ミノ酸配列における既知の相同性を一般化できるという
仮説に基づいている（エイ・シピオら、1977、参照）。

アミノ酸配列におけるこの種間の相同性に基いて、ウ
シ肝臓およびヒト肝臓バンクぼ平行選択を行つた。

使用したハイブリダイゼーシヨンおよび洗浄の条件
は、52量体プローブと第IX因子cDNA間の実際の相同性が
明らかでなかつたため、厳密なものではなかつた。

ウシcDNAバンクにおける種々のコロニーは、52量体プ
ローブでの選択により正のシグナルを与えた。ヒト肝臓
cDNAバンクでは、用いられた条件下でシグナルを与える
１つのコロニーが得られた。

この研究は、ヒト第IX因子cDNAを単離する目的で行わ
れたため、さらなる分析はウシクローンでは行わず、あ
らゆる試みはヒトクローンについて行つた。

このクローンがヒト第IX因子に相応することを確立す
るため、組換えプラスミドをPstIで消化し、切断された
cDNA挿入片をM13mp8フアージに移入し（メツシングら、
1982）、ジデオキシヌクレオチドを鎖ターミネーターと
して用いて配列させる（サンガーら、1977）。得られた
配列は、第２図のヌクレオチド１−180に相応し、推測
されたアミノ酸配列は、該クローンがヒト第IX因子cDNA
のクローンであることを確証している。

このクローン（pTG397）のcDNA挿入片のより完全な配
列は、マキサムの方法およびギルバートの方法（1980）
またはサンガーの方法を組合せることにより、M12mp9に
おいてサブクローン化された制限セグメントから決定さ
れる。得られた配列を第２図に示す。

結果の考察単一オリゴヌクレオチドプローブを用いることによ
り、2.1Kbの挿入片を含むヒト第IX因子クローンを単離
することができた。この2.1Kb挿入片を第２のヒト肝臓c
DNAバンク選択用プローブとして用いる場合、2.6Kb挿入
片を含む、第IX因子に特異的な別のクローン（pTG398）
が単離される。

pTG398の５′末端は第２図のヌクレオチド480に位置
する。このことは、pTG398の３′非翻訳末端が不完全で
あり、非翻訳３′完全末端は約1.7Kbの長さであること
を示唆している。

得られたヌクレオチド配列とクラウチおよびデイビー
によつて示された配列との間には差異が認められる。

この差異は、ヌクレオチド581でのトランジシヨン
（Ｇ→Ａ）、それによるアラニンのスレオニンへの転換
を含んでいる。第IX因子連結ペプチドのアミノ酸配列決
定により、この位置にスレオニンが存在することが確認
される。これらのデータは、他の血清蛋白と同様に、第
IX因子が多形性であることを示唆している（クーパー、
1978）。

この仮説は既に仮説されている（マツクグランR.A.
ら，“ブラツド"64,264a、1984）。

G:T置換コドンの使用およびヌクレオチドプローブにお
ける可能な二次構造の排除を考慮することにより、単一
クローンの配列決定用プローブとして十分に使用し得る
ことが明らかにされた単一52量体を得ることができた。
選択した52量体は、43/52のヌクレオチドについてクロ
ーン化された配列と一致し、一方、２つの誤対はG:T対
である。

このことは、先に観察された種間ヌクレオチド配列に
おいて一致率が85％であることを反映している。

第IX因子cDHAの一般構造第IX因子cDNAヌクレオチド配列の知識は、対応する蛋
白におけるアミノ酸のコードされた配列の推測を可能に
する。pTG397のcDNA挿入部は、以下のヒト第IX因子特性
を示す： a.第IX因子は、415個のアミノ酸を含む蛋白である。

第３図において、ヌクレオチド140−1384はヒト第XI
因子をコードする。

b.ヒト第IX因子は、付着シグナル配列および前蛋白配列
を有する前駆体の形で合成される。これは、分泌される
運命にあるすべての蛋白に共通の特性である。第IX因子
の場合、ヌクレオチド２−76によつてコードされた約25
個のアミノ酸の標準的シグナル配列がある。このアミノ
酸の疎水性伸長部は、通常、蛋白が細胞の外側へ分泌さ
れる間に除去される。ヌクレオチド77−139は、おそら
く分泌後素早く、第IX因子の成熟形から除去される前蛋
白配列をコードする（ヌクレオチド140のチロシンで開
始する）。この前蛋白配列の末端でしばしば見られるよ
うに、リジン−アルギニン二塩基アミノ酸構造は、前蛋
白配列と成熟第IX因子の第１アミノ酸の接合部に見い出
される。

c.第IX因子の活性形（IXa）は、第IX因子の不活性また
はチモーゲン形から、活性第IX因子（IXa）による２つ
のペプチド結合の加水分解により産生される。このペプ
チド結合は、アミノ酸arg−ala（ヌクレオチド572−57
7）およびval−val（ヌクレオチド677−682）の間に認
められる。第IX因子の活性化の間に遊離した35個のアミ
ノ酸から成る最も長いペプチドは、活性化ペプチドと称
されている。このように、第IXa因子は、２つのペプチ
オ鎖から成つてい：即ち、145個のアミノ酸から成るＬ
鎖（ヌクレオチド140−574）および235個のアミノ酸か
ら成るＨ鎖（ヌクレオチド680−1384）である。第IXa因
子のＬおよびＨ鎖は、ジスルフイド架橋により維持され
ている。Ｈ鎖は、典型的セリンプロテアーゼの触媒活性
において重要な他の残基と同様に、セリンプロテアーゼ
の典型的活性部位（met−phe−cys−ala−gly、ヌクレ
オチド1181−1195）を含んでいる。Ｌ鎖は、ビタミンＫ
依存性過程により、γ−カルボキシル化されてγ−カル
ボキシグルタミン酸を生じる12のグルタミン酸単位を含
んでいる。

これは、凝固過程において第IXa因子がCa⁺⁺、膜性リ
ン脂質膜および第VIIIa因子に固着するのに重要であ
る。

d.4つの炭水化物固定部位を有するウシ第IX因子とは対
照的に、ヒト第IX因子は、炭水化物が付加し得る部位が
２カ所ある。これらの部位は、ともに活性化ペプチド、
即ちヌクレオチド608−616および638−646に位置し、典
型的配列asn−ｘ−thr/serを含んでいる。対照的に、ウ
シ第IX因子は、４つの付着炭水化物を有しており、その
構造は、最近、ミズオチら（1983）により決定された。

発現に必要なクローン化第IX因子cDNAの調製（第３図参
照） pTG397を制限酵素PstIで消化した。cDNAバンクをpBR3
22のPstI部位でG/C末端を介してクローン化し、さら
に、pTG397の第IX因子は内部PstI認識部位を含んでいな
いので、この処理により、PstI部位でクローン化し得る
末端とともに、第IX因子に相応する無傷の2.1KbcDNAが
遊離する。

第IX因子cDNA断片は、あらかじめPstIで消化しアルカ
リホスフアターゼで処理したM13mp8フアージ中に標準法
により移入される。組換えフアージを用いてE.coli株JM
103をトランスフエクトする。

組換えフアージM13tg397Bは、以下に記載する様に、
第IX因子cDNA源として用いられる。

第IX因子cDNAは、ヌクレオチド７−10に位置するテト
ラヌクレオチド配列CGCGを認識する酵素FnuDIIに対する
１つの認識部位を含んでいる。

M13tg397BをPstIおよびFnuDIIで消化することによ
り、１つの大きな断片と数個の小さな断片が得られ、こ
れ等はM13mp8におけるFnuDIIに対する19カ所の認識部位
に相応する。最も大きな断片は、FnuDII−PstI断片に相
応する。

この断片は、第IX因子cDNAの５′末端から９つのヌク
レオチドとG/C末端を分離する。このG/C末端を５′末端
から分離することは、発現ベクター中での第IX因子cDNA
の発現および安定性を増大するのに重要と考えられた。

これら９つのヌクレオチドを除去することにより、シ
グナル配列のATGを除去する。しかしながら、このATGが
翻訳を開始するATGであることは確かではない。FnuDII
での消化により除去された第IX因子部分は、シグナル配
列の中にあり、従って第IX因子活性にとつては重要では
ない。

もし翻訳が、FnuDIIでの消化の問に除去されるATGで
開始するならば、このシグナル配列は、アミノ酸５個分
だけ短くなつている。この５個の付加アミノ酸が、第IX
因子の分泌および／または使用にとつて重要であるかど
うかを検討するため、FnuDIIでの消化により除去された
ヌクレオチド配列を２つの合成オリゴヌクレオチドを用
いて復元する：Ａ）５′ GATCCATGCAGCG ３′ Ｂ）５′ CGCTGCATG ３′ オリゴヌクレオチドＡにおいて下線を引いた配列は、
FnuDIIによる消化によりフアージM13tg387Bから最初の
ヌクレオチドＴが取れて分離した配列に相応する。

オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチドＡと相補
している。

オリゴヌクレオチドＡとＢをハイブリダイゼーシヨン
すると、粘着性BamHI末端を有する次の二重鎖構造が得
られる：５′ GATCCATGCAGCG ３′ ３′ GTACGTCGC5′ オリゴヌクレオチドＡおよびＢを、M13tg397Bから精
製した第IX因子cDNAのEcoRI−FnuDII消化断片とライゲ
ートする。アルカリホスフアターゼで処理し、BamHIで
の制限に付したフアージM13mp701をさらにインゲーシヨ
ンのために加え、ライゲーシヨンを一晩行う。最終ライ
ゲーシヨン混合物の一部を用い、JM103細胞を形質転換
する。色色領域を生じた組換えフアージM13tg315のヌク
レオチド配列は、その構造が正しいことを確証してい
る。M13tg315をBmaHIで消化すると第IX因子cDNA断片を
遊離し、その５′配列は次の通りである：オリゴヌクレオチドＡに相応する配列は、上記に点線
で示してある。下線を引いた配列は、M13tg311での第IX
因子cDNAのBamHI−BglII消化断片のシグナル配列にはな
い５個のアミノ酸をコードする15個のヌクレオチドに相
応する。。

ハイブリツドプラスミドの構築第IX因子をコードする配列をVVゲノム中に移入し、次
いでそれを発現させるのに必要な種々要素を合わせた大
きさは、数Kbのオーダーである。従つて、構築作業に用
いる大腸菌中での複製プラスミドの大きさをできるだけ
小さくすることが、必要な操作を容易にするのに必要と
判断された。

VVゲノムのHindIII（Hin−Ｊ）断片は、DNAの変換お
よび組換えをVVゲノム中に挿入可能にするため既に使用
されている（マケツトら、1982）チミジンキナーゼ（T
K）の完全遺伝子を含んでいる。TK遺伝子における挿入
部をVVゲノム中に移入すると、単純選択により認識し得
るTK欠陥ウイルスが得られことに留意することが重量で
ある。

まず、VVHin−Ｊ断片の統合に使用し得る単一HindIII
部位を有する小さなプラスミドを生産することが必要で
あつた。さらに、不必要な制限配列をプラスミドから除
去し、以下の操作を行い得るようにすることが重要であ
つた。

３）構築は、ヌクレオチド1089および2491間セグメント
の自然欠失によるプラスミドpBR322由来ベクターである
プラスミドpML2（ルスキーおよびボツチヤン、1981）か
ら開始した（第４図）。

PstI配列は、まず、pUC8のAhaIII−AhaIII断片（ビエ
イラおよびメツシング、1982）をpML2の２つのAhaIII部
位間に挿入することにより除去し、19の塩基対を除去し
た。「リンカーテーリング」法（ラテら、1984）を用
い、ヌクレアーゼS1で処理したHindIIIリンカーをNruＩ
とEcoRI部位間に挿入し、BamHI部位を除去した。これに
より、機能的β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐
性を与える）を有し、さらに大腸菌において活性な複製
開始点および単一HindIII制限部位を含む2049塩基対の
プラスミドが得られる。

この構築物は、pTG1Hと命名された。

４）TK遺伝子を有するVVDNAのHin−Ｊ断片をあらかじめ
pBR327由来ベクター中でクローン化した（ドリリアンお
よびスペーナー、1983）。この4.6Kb断片をpTG1HのHind
III部位で再クローン化した。TK遺伝子がアンピシリン
耐性をコードする遺伝子に比べ末梢に位置するクローン
を選択した。

この構築物pTG1H−TKを以下の実験においてキヤリア
ーとして使用した。

５）続く段階は、挿入第IX因子をコードする配列の発現
を制限するのに使用できるVVプロモーターを単離するこ
とであつた。7,500ダルトン（7.5K）の蛋白をコードす
る初期遺伝子のプロモーターは既に同じ目的に使用して
成功しており（スミスら、1983）、従つてその単離を行
つた。

7.5K遺伝子は、WR型VVゲノムの最も小さなSalＩ断片
（Sal−Ｓ断片）の１つに位置している（ベンカタサ
ン、1981）。小断片は、優先的にクローン化されるた
め、SalＩにより切断されたWR型VVDNAをプラスミドpBR3
22中で直接クローニングすることにより得られるクロー
ンの大部分は、Sal−Ｓ断片を有している。この断片をS
alＩ消化および再ライゲーシヨンによりベクターバクテ
リオフアージM13mp701に移入し（キーニーら、1983）、
このことによりフアージM13tgSal−Ｓを得る。

このクローンにおいて、ScaＩ部位は、7.5K遺伝子の
開始部ATGのすぐ隣に存在する。7.5K遺伝子の下流に、
ベクター由来の単一BamHIおよびEcoRI部位が位置してい
る。BamHIおよびSacＩ部位を、BamHI消化により生じた
末端をポリメラーゼのクレノウ断片で完全にした後、リ
ンカー法によりBglIＩリンカー５′−CAGATCTG−３′を
介して融合する。この過程によりSacＩ部位が除去され
るが、BamHI部位が再形成され、BamHI部位のすぐ下流に
単一EcoRI部位が位置する。同時に、下流のSalＩ（Aco
Ｉ）部位が除去され、従つて上流部位が唯一の部位とな
る。

この構築物をM13tg7.5Kと命名する。

VVDNAのHind−Ｊ断片内にClaＩおよびEcoRI部位が位
置し、これらは約30の塩基対によりへだてられている
（ウエアおよびモス、1983）。M13tg7.5Kに存在する7.5
Kプロモーター断片は、AccＩおよびEcoRIで切除され、p
TG1H−TKのClaＩ部位およびEcoRI部位間でクローン化さ
れてpTG1H−TK−P7.5Kを生じる；その合成を第５図に示
す。

この構築により、M13ベクターの単一BamHI部位が7.5K
プロモーター配列のすぐ下流に移入される。この単一Ba
mHI部位は、以下の構築に使用する。

６）pTG1H−TK−P7.5KをBamHIで消化し、BamHIで消化し
たM13tg115とライゲートする（第５図）。

大腸菌の形質転換後、この方法により単離した組換え
プラスミドの１つのpTG393を、これが7.5Kプロモーター
からの発現のため正しい方向に第IX因子cDNAを保有する
ので、選択する。

ワクシニアウイルス内でのクローニング（第６図）７）スミスらに記載の方法（1983）は、ウイルスにより
保持されたTK遺伝子を不活性化するように、VVTK遺伝子
に挿入部を有するプラスミドと野性型ウイルスゲノム間
でのインビボ交換に基づいている。TK^-ウイルスは、５
−ブロモデオキシウリジン（5BUDR）の存在下にTK−陰
性細胞系に置くことにより選択できる（マケツトら、19
82）。チミジンキナーゼは、5BUDRをリン酸化して５′
−モノフオスフアートに変え、これは次いでトリフオス
フアートに変換される。この化合物は、dTTPアナローグ
であり、そのDNAへの取込みは、ウイルスの正しい発育
を阻害する。しかし、TK^-ウイルスは、そのDNAを正常に
複製することができ、同様にTK^-細胞系中に見られるウ
イルスプラークとなる。

ワクシニアウイルスは、感染細胞の核におけるよりも
むしろそれらの細胞質において繁殖する。このため、宿
主DNAの複製および転写機構を利用することができず、
ビリオンがウイルス遺伝子発現のための成分を有するこ
とが必要である。精製VVDNAは非感染性である。

組換体を生じさせるために、VVでの細胞感染および興
味あるクローン化DNAセグメントでのトランスフエクシ
ヨンを同時に行う必要がある。しかしながら、組換体の
発生は、DNAでのトランスフエクシヨンに適格な細胞の
小部分に限られる。このため、間接「合同」法を用いて
非組換え親ウイルスのバツクグラウンドを減ずることが
必要であつた。これは、非許容温度39.5℃で繁殖できな
いワクシニアの熱感受性（ts）変異体を生感染ウイルス
として用いることにより、行なつた。（ドリリアンおよ
びスペーナー、1983）。細胞を非許容条件下にts変異体
で感染させ、野性型ウイルスのDNAでトランスフエクト
すると、ウイルス増殖は、トランスフエクシヨンに適切
な細胞中で起こるだけであろう；他の細胞では、それら
が感染したという事実にもかかわらず、いかなる結果も
得られないであろう。

若し、pTG393のようなワクシニアDNA断片含有組換え
プラスミドが適当な濃度でトランスフエクシヨン混合物
中に野性型DNAとともに含まれるならば、それを適格細
胞中でのワクシニアDNAとの同種組換えに関与させるこ
ともできる。

VV−FIX組換体のクローニング 11日令胚から確立され一次ニワトリ胚フイブロプラス
ト（CEF）をウシ新生仔血清（NCS）を加えたイーグル基
礎培地（BME/ユーロビオ）中で発育、融合させる（直径
2cmの皿あたり２×10⁶個）（ドリリアンおよびスペーナ
ー、1983）。

細胞を0.01−0.1pfu/細胞の割合で、コペンハーゲン
野生型ウイルス由来ワクシニアウイルスの熱感受性変異
体N7で感染させる（ドリリアンら、1981）。

ウイルス吸収後、細胞をBME/5％NCS中において該ウイ
ルスに許容温度（33℃）で２時間培養する。細胞は次い
で、精製コペンハーゲン野生型（Wt）ウイルスDNA（30n
g/III）と異種遺伝子含有キメラプラスミドDNA（30ng/I
II）との混合物で、リン酸カルシウム共沈法を用いてト
ランスフエクトする。

１時間吸収させた後、細胞をBME/2％NCSの存在下にお
いて39.5℃で２時間培養する。カルシウム沈澱をPBSで
３回洗浄し、細胞を５％NCS添加BME2mlを用いて非許容
温度（39.5℃）で２日間発育させる。

この過程により、野性型（Wt）または組換えゲノムを
有するウイルスを豊富にすることができる。

第２段階において、TK^-（組換体）ウイルスを前記の
ように、5BUdRの存在下で37℃で選択することができ
る。これらの条件下において、tK^-組換体ウイルスは、
複製を行うことができるが、Wtウイルスの発育は、dTTP
アナローグのそれらのDNAへの取込みにより妨げられ
る。

ウイルスを、第１段階において、１％寒天、LMTK^-細
胞および５％NCS含有固形培地を用いてクローン化し
（ドリリアンら、1982）、5BUdRの存在下にTK^-細胞中で
再クローン化する。第IX因子の正しい組換えがVVのtK遺
伝子において起つたことを確認するため、組換えウイル
スで感染したCEF細胞の全DNAを単離し、種々のエンドヌ
クレアーゼで消化する。分別後、DNAをニトロセルロー
スフイルターに移し、大腸菌DNAポリメラーゼとともに
放射活性リンで標識した第IX因子cDNAとハイブリツド化
する。

以下の実験で使用したウイルスVVRTG2をこのようにし
て選択する。

単離したウイルスは、続いてCEF細胞ローンで培養
し、以下の実験のため大量のウイルスを得る。

HepG2系細胞のワクシニアウイルスによる感染 HepG2細胞を、MEM（MEM、ギブコ）および５％ウシ胎
仔血清（FCS）（ギブコ）から成る培地を含みビタミン
Ｋ（50μg/ml）を添加した平底ビン中で培養、融合させ
る。これらの血は約10⁷個の細胞を含む。

これら細胞を組換えワクシニアウイルスあるいは野生
型ウイルスで感染させる。実際には、細胞培養培地をと
り、ワクシニアウイルス含有抽出物500μｌを細胞上に
置く（約5pfu/細胞に等しい）。皿を室温で１時間撹拌
し、次いでFCS（５％）およびビタミンＫ（50μg/ml）
を加えたMEM10mlを加える。皿を97℃でインキユベータ
ー中に種々の期間（４、８、22時間）置く。

感染細胞の培養培地の分析野生型ワクシニアウイルスおよび組換えウイルスで感
染した肝細胞から得た上澄みを検討した。この分析は、
感染後４、８および22時間に培地を検討することにより
行つた。培地を、常法（ミレツトリツチら由来）に従
い、第XI因子をクエン酸バリウムに吸着させることによ
り分別した：第IX因子は、カルボキシル酸が分子内に存
在する場合、この不溶性塩に吸着させることができる。

実際には、感染細胞上澄みの１容量（組換えまたは正
常ワクシニアウイルスで感染した細胞から得た上澄み7m
l）にクエン酸ナトリウム（最終30mM）を加え、この容
量の1/10量の1M塩化バリウム溶液を撹拌しながら滴下す
る。

混合物を１時間撹拌し続ける。

沈澱を8,000gで20分間遠心分離する。

上澄みを集め、30−70％硫酸アンモニウム分画に付
す。70％硫酸アンモニウムで沈澱した画分を、20mM Tri
s、150mMNaCl（pH7.5）200μｌを加えることにより取
り、同じ緩衝液で透析する。その後最終容量を約800μ
ｌにする。バリウム沈澱物を10mMBaCl₂、100mMNaClの0.
3容量に再懸濁し、8,000gで10分間再遠心分離する。こ
のペレツト洗浄操作を更に２回繰返す。ペレツトを20mM
Tris、150mMNaCl（pH7.5）の0.3容量に取り、2M硫酸ア
ンモニウム0.075容量を滴下する。混合物を１時間撹拌
し、8,000gで10分間遠心分離する。上澄み中の蛋白を硫
酸アンモニウム（70％濃度）で１時間にわたり沈澱させ
る。沈澱した蛋白を8,000gで10分間遠心分離する。

ペレツトを20mMTris、150mMNaCl（pH7.5）の200μｌ
に溶解し、同緩衝液で透析する。この一連の操作は、す
べて０℃で行う。

得られた画分を−20℃で保存する。

これらは２つの方法で試験する：ａ）第IX因子抗原量は、ELISA試験（販売元デイアグノ
ステイカースタゴ）で算定する。

ｂ）この因子の活性は、抽出物を加えた血友病血漿の凝
固時間を測定することにより計算する。

これらの測定値を正常ヒト血漿混合物を用いて得た値
と比較する。

結果は％で表わす。実際には、100％は、正常ヒト血
液1ml中に存在する因子の量に相応する。

結果は付表に示す。この表には、第IX因子濃度をサン
プル1mlあたりで示す。

野生型ワクシニアウイルスで感染させた肝細胞の上澄
みでは、クエン酸バリウムに吸着した画分および非吸着
画分におけるのと同様に、第IX因子抗原量は、１％以下
であり、凝固活性は２％以下である。対照的に、組換え
ウイルスで感染した細胞の上澄みでは、クエン酸バリウ
ムに吸着し得る画分中の第IX因子量は、感染時間と共に
増加する。ELISA試験および活性試験により算定された
量は同様である。クエン酸バリウムに吸着しなかつた画
分では、抗原量は低く（５％）、活性は野生型ウイル
スで検出したバツクグラウンドと同等である。

結論として、組換えワクシニアウイルスで感染させた
HepG2細胞は、活性第IX因子を生じる。クエン酸バリウ
ムに吸着しない画分中に第IX因子抗原が存在しないこと
は、これらの条件下では、生じた第IX因子は、実際に完
全にγ−カルボキシル化されていることを示している。

他細胞での発現実験方法は、既述のものと同様である。

即ち、融合細胞ローンを主発明に記載の条件下で野性
型ウイルスまたは組換えウイルス（１〜5pfu/細胞）で
感染させた。細胞感染（即ち、細胞中でのウイルスの増
殖）は、10％ウシ胎仔血清を添加したMEM（Chang）、ド
ウルベコ（Vero）およびMEM−ガルスゴウ（BHK21）培地
中で22時間行つた。さらに、ビタミンＫ（No.V3501、シ
グマ社カタログ）を50μg/mlの割合でこれら培地に加え
る。

感染後、培地を主発明に記載のように分別した。

表Ａは、得られた結果を示す。結果は、HepG2細胞の
場合の％ではなく、単位で示した。１単位は、正常ヒト
血漿1ml中の第IX因子量を示す。

結果は、組換えウイルスで感染させた３種の細胞系
は、活性第IX因子を産生できることを示している。

HepG2細胞の場合 HepG2細胞を１％合成血清代用ウルトロザーＧ（販売
元IBF−カタログNo.50902）を添加したMEM培地に12−15
世代間（４継代培養）培養した。この培地は、ビタミン
Ｋが添加してあるかまたは添加していなかつた。次いで
細胞をウイルスで感染させた。得られた結果は、表Ｂに
まとめられている。

この表Ｂは、ビタミンＫの存在下で培養し、感染させ
た細胞は、γ−カルボキシル化活性第IX因子を生産する
ことを示している。

対照的に、ビタミンＫ添加なしで培養し、感染させた
細胞のγ−カルボキシル化第IX因子産生は、少ない：バ
リウムに吸着しなかつた画分は、かなりの量の第IX因子
抗原を含んでいる。さらに、バリウムに吸着した画分に
おける凝固活性は、抗原量から予測された値より非常に
小さい。

細胞を通常培地で培養した場合、同様の結果が観察さ
れる：ビタミンＫを感染の間に除けば、バリウムに吸着
しない画分は非常に多量の第IX因子抗原を含む。

Vero細胞に対する作用ウシ胎仔血清（10％）を添加したドウルベコ培地にお
いて培養したVero細胞をVVRTG2または野性型ウイルスで
感染させた。ウイルス増殖は、適宜ビタミンＫを添加し
た同培地で行なつた。得られた結果を表Ｃにまとめた。

表Ｃは、ビタミンＫを培地に添加することが、生じた
第IX因子活性にとつて非常に重要であることを示してい
る。感染時間が長くなるほどこのビタミン添加の重要性
は大きくなるように思われる。

これらの結果を総合すると、感染細胞の培養培地にビ
タミンＫを添加することの重要性が明らかである。

野生型（WT）または組換え（CII）ワクシニアウイル
ス感染細胞により生産された第IX因子の分別種々の動物細胞系を1pfu/細胞で組換えまたは野生型
ウイルスに感染させた。24時間後、培養培地を集め、ク
エン酸バリウムで分別する。第IX因子を２画分におい
て、ELISA試験を用いて測定する。バリウムに吸着した
画分だけを活性試験（血友病血漿の凝固回復の測定）に
より測定する。

結果は第IX因子単位で表わす。

これらの結果は、試験したすべての細胞が第IX因子の
γ−カルボキシル化を引起すことができることを示して
いる；しかし、この翻訳後修飾の効率は、細胞系により
様々である。これらの結果は、試験した培養細胞を、生
物活性を有するγ−カルボキシル化蛋白の産生に使用で
きることを立証している：培地中に回収された第IX因子
は、少なくとも一部は活性である。

初代サル腎細胞新たにトリプシン処理したサル腎細胞を培養した。一
旦融合性となつたこの初代培養物を前記条件下で感染さ
せた。

24時間感染させた後、培地を集め、バリウムで分別し
た。

結果は次の通りである（培地40mlにつき）：これらの結果は、初代サル腎細胞が活性第IX因子の生
産に使用できることを示している。

牛痘ウイルスを用いる第IX因子の発現 VVRTG2単離の際にすでに記述した実験スキーム（第７
図）を用いてベクターを構築する。しかし、実験方法を
少し変更する必要がある。

CHO−KI（ATCC CCL 61）細胞をニワトリ胚細胞の代り
に使用した。感染には牛痘ウイルス（ブライトン株）を
用いた。使用培地は、CHO細胞に推賞されているもので
ある：アルフア2000培地をBMEの代りに用い、NCS血清を
ウシ胎仔血清（FCS）に代えた。

構築は、pTG393構築段階まで同じである。

次に前記のように、牛痘ウイルス感染CHO細胞への共
移入をpTG393および野生型ワクシニアウイルスDNA間で
行う。VVRTG2の構築においては、プラスミドDNA、共移
入されたワクシニアNDAおよびウイルスゲノム間の組換
えは、確立または含まれておらず、一方牛痘組換え体に
使用する方法ではこの３成分が必要であることに注目す
べきである。

組換え後に得られたウイルスは非熱感受性であり、CH
O細胞を感染することができる。

組換え実験に用いた過程は、牛痘ウイルスゲノム（CH
O細胞において熱感受性）とワクシニアウイルスDNA（非
熱感受性）、および、場合によつては第IX因子ベクタ
ー、pTG393の間での組換体であるウイルス中でのウイル
ス産生を盛んにすることができる。

生じたウイルスは、次いでクローン化し、前記のよう
にそれらのTK^-特性いついて選択する。

次に、第IX因子cDNAは、事実、ウイルスゲノムにおい
て統合されることが確認された。選択されたクローン
は、CHO細胞での第IX因子発現を研究するのに用いた。

この目的のために、CHO−KI細胞を1pfu/細胞で感染さ
せ、感染はFCSおよびビタミンＫ添加アルフア2000培地
で行う。培養培地をクエン酸バリウムで分別する。

典型的結果は、次の通りである：培養物30mlの場合、抗原6.4Uが得られる：・非吸着画分では、抗原0.3Uが集められる。

・吸着画分では、抗原0.86Uおよび凝固活性0.64U。

CHO細胞中に生じた第IX因子は活性である。

バリウムに吸着した画分では、測定された活性と抗原
量から予想された活性との間には20％の差がある。この
差は、有意と思われるが、CHO細胞により生じた第IX因
子が完全に活性であるかどうかを検討するには、他のさ
らに正確な試験を行う必要がある。しかしながら、CHO
細胞中に生じた第IX因子は天然ヒト分子の活性に近似の
活性を有しているということができる。

以下の菌株は、パスツール研究所国立微生物培養物寄
託所（28 rue du Docteur−Roux、Paris 15′eme）に19
85年４月30日に寄託した：プラスミドpTG397含有大腸菌：寄託番号Ｉ−446。

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フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 14/745 8318−4Ｈ (31)優先権主張番号８４／１５２９４ (32)優先日 1984年10月５日 (33)優先権主張国フランス（ＦＲ） (72)発明者トルストシエフポールフランス国ムンデルスハイムリユグーノー５ (72)発明者ルコツクジヤン‐ピエールフランス国 67116 ライヒステートリユデユシヤン・デユ・フオ６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第IX因子発現ベクターで感染された細胞を
培養することにより特徴付けられ、該ベクターはヒト第
IX因子をコードする遺伝子が挿入されたポックスウイル
ス科のウイルスゲノムを含み、培養培地がヒタミンＫを
含み、第IX因子を培養後に回収することを特徴とする第
IX因子の製造方法。
【請求項２】前記感染細胞が、肝臓細胞、Vero、BHKお
よびCHO細胞並びにこれら細胞株のサブ−クローンから
選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項３】加えられるビタミンＫの量が、培養培地を
飽和するのに十分な量であることを特徴とする請求の範
囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項４】前記ポックスウイルスが、オルトポックス
ウイルス属であることを特徴とする請求の範囲第１〜３
項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】前記オルトポックスウイルスが、ワクシニ
ア及び牛痘ウイルスから選ばれることを特徴とする請求
の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】前記遺伝子がポックスウイルスプロモータ
ーの制御下にあることを特徴とする請求の範囲第１〜５
項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】前記遺伝子がワクシニアのプロモーターに
より促進されることを特徴とする請求の範囲第６項記載
の方法。
【請求項８】前記ワクシニアプロモーターが7.5K蛋白遺
伝子のプロモーターであることを特徴とする請求の範囲
第７項記載の方法。