CN109963946B

CN109963946B - 用于失活fut8基因的复合物和方法

Info

Publication number: CN109963946B
Application number: CN201780068144.2A
Authority: CN
Inventors: 吴海祥; 秦民民; 林小花; 苏艳芳; 吕亚楠; 崔笑添; 周桢昊; 宋利平; 龙凯
Original assignee: Shanghai Jmt Bio Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Jmt Bio Technology Co ltd
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: CN109963946A; WO2018113753A1

Abstract

提供了一种利用TALEN技术在真核细胞中产生并测序筛选靶基因的双等位基因敲除的方法，以及包含切割位点为ATCTGGCCACTGATG的TALEN质粒对的双链多核苷酸。

Description

用于失活FUT8基因的复合物和方法

相关申请的交叉引用

本发明要求2016年12月21日递交的标题为“用于失活FUT8基因的复合物和方法”的中国发明专利申请201611185840.5的优先权。

技术领域

本发明涉及基因工程、细胞培养以及蛋白质生产领域，具体涉及用于失活Fut8基因的复合物和方法。

背景技术

抗体激活免疫系统破坏攻击细胞存在两种机制：补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。ADCC是主要由针对抗体包被的靶的天然杀伤(NK)细胞产生的免疫应答。参见，Lewis GD等(1993)，Differential responses of human tumor celllines to anti-p185HER2monoclonal antibodies，Cancer Immunol Immunother，37：255-63。在ADCC中，NK细胞主要经由与NK细胞FcγRIII受体的相互作用识别抗体恒定(Fc)区。然后NK细胞沉积穿孔素和颗粒酶等细胞毒物质于靶细胞表面，进而诱导细胞裂解和凋亡。Fc-FcγRIII相互作用对Fc糖基化极度敏感。非糖基化免疫球蛋白不能结合Fc受体。参见，Leatherbarrow RJ等(1985)，Effector functions of a monoclonal aglyco-sylatedmouse IgG2a:binding and activation of complement component CI and interactionwith human monocyte Fc receptor，Mol Immunol，22：407-15；Walker MR等(1989)，Aglycosylation of human IgG1and IgG3monoclonal antibodies can eliminaterecognition by human cells expressing Fc gamma RI and/or Fc gamma RIIreceptors，Biochem J，259：347-53；Leader KA等(1991)，Functional interactions ofaglycosylated monoclonal anti-D with Fc gamma RI+and Fc gamma RIII+cells，Immunology，72：481-5。另外，附着于Fc区Asn297的碳水化合物链的岩藻糖基化抑制抗体Fc区与FcγRIII的结合，并且在体外降低ADCC活性。参见，Shields RL等(2002)，Lack offucose on human IgG1N-linked oligosaccharide improves binding to humanFcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity，J Biol Chem，277：26733-40；Shinkawa R等(2003)，The absence of fucose but not the presence of galactoseor bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1complex-type oligosaccharidesshows the critical role of enhancing antibody-dependent cellularcytotoxicity，J Biol Chem，278：3466-73；Niwa R(2004)，Defucosylated chimericanti-CC chemokine receptor 4IgG1with enhanced antibody-dependent cellularcytotoxicity shows potent therapeutic activity to T-cell leukemia andlymphoma，Cancer Res，64：2127-33。

大多数哺乳动物免疫球蛋白被岩藻糖基化，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，黑线仓鼠(Cricetulus griseus))产生的免疫球蛋白。Jefferis R等(1990)，A comparativestudy of the N-linked oligosaccharide structures of human IgG subclassproteins，Biochem J，268：529-37；Hamako J等(1993)，Comparative studies ofasparagine-linked sugar chains of immunoglobulin G from eleven mammalianspecies，Comp Biochem Physiol B，106：949-54；Raju TS等(2000)，Species-specificvariation in glycosylation of IgG:evidence for the species-specificsialylation and branch-specific galactosylation and importance forengineering recombinant glycoprotein therapeutics，Glycobiology，10：477-86。去除或降低抗体岩藻糖基化有望成为提高治疗性抗体效能的有效手段。因此，敲除细胞中负责蛋白岩藻糖基化修饰的Fut8基因(fucosyltransferase 8/α-1,6-fucosyltransferase)，并利用这种工程细胞株生产无岩藻糖基化蛋白是迫切需要的。

三大基因编辑技术TALEN、ZFN、CRISPR/Cas，已有文献报道利用ZFN、CRISPR/Cas定点敲除了CHO细胞中的Fut8基因，并利用这种基因敲除的工程细胞株生产出了无岩藻糖基化的单抗。目前还没有利用TALEN技术定点敲除CHO细胞中的Fut8基因的相关报道。

TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)靶向基因操作技术是一种分子生物学工具，可以构建并表达能识别任意DNA序列的重组核酸酶，实现目的基因特异性编辑，如敲除(knock-out)、敲入(knock-in)、碱基突变等。TALEN技术三大核心元件是：核定位信号、负责DNA识别的TALEN臂、以及负责基因组切割的人工改造核酸内切酶的切割域(Fok I)，三者的结合实现对细胞基因组的修饰。

TALEN的DNA识别域由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块由34个氨基酸残基组成，其中第12和13位的氨基酸残基为可变残基，用以识别靶向位点。通过DNA识别域结合到靶位点上，将融合表达形成的Fok I的切割域靶向到待切割位点，待切割位点左右两侧的Fok I的切割域形成二聚体后，可特异性对目标基因DNA实现切断。通过诱导DNA双链断裂(DNA double-strand break)来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行同源定向修复。在此过程中，DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。该技术目前已成功应用于植物细胞、酵母、斑马鱼及大鼠、小鼠等各类模式动物的研究领域(参考：http://www.cyagen.com/cn/zh-cn/service/talen-knockout.html；Gaj T等(2013)，ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-based methods for genomeengineering，Trends in Biotechnology，31(7):397-405)。

不同类型的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度有很大区别。一般来说，天然的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为17-18bp；而人工TALEN元件识别的特异性DNA序列长度则一般为14-20bp。DNA特异性识别域重复氨基酸序列模块中第12和13位的氨基酸残基组成二联氨基酸，二联氨基酸与AGCT这4个核苷酸碱基有一一对应的关系：腺嘌呤(A)由NI(天冬酰胺-异亮氨酸)识别、胸腺嘧啶(T)由NG(天冬酰胺-甘氨酸)识别、鸟嘌呤(G)由NN(天冬酰胺-天冬酰胺)识别，而胞嘧啶(C)则由HD(组氨酸-天冬氨酸)识别(Katsuyama T等(2013)，An efficient strategy for TALEN-mediated genome engineering inDrosophila，Nucl.Acids Res.，41(17):e163；Boch J等(2009)，Breaking the code ofDNA binding specificity of TAL-type III effectors，Science，326(5959):1509-12)。实验中，可以在选定待突变位点及其两侧的靶向结合序列之后，通过靶位点的DNA序列可以反推出能特异性识别这一序列的二联氨基酸序列，从而得到一对TAL靶点识别模块。将TAL靶点识别模块与N端的核定位序列、C端的Fok I酶连接起来，就能分别得到针对左右臂的完整TALEN元件，组成一对元件。一般来说，可以采用专门用于构建TALEN的真核表达载体体系，将一对特异性的TAL靶点识别模块克隆进该载体中，再通过转染等方式导入细胞内，即可实现靶序列的改造。

但是利用哺乳动物细胞基因组进行基因敲除的效率一般都不高，成功进行目标基因的双等位基因同时敲除的效率更低，需要有方便、直接、高效的筛选方法，从候选细胞池中众多的候选细胞中筛选出FUT8功能缺失的细胞。利用TALEN技术敲除CHO细胞Fut8基因同样存在筛选技术难度高、工作量庞大以及试验结果难以预测等技术问题。

细胞筛选最常用的筛选方法是功能筛选，Fut8基因编码的FUT8蛋白是α-1,6岩藻糖基转移酶。据文献报道，FUT8酶活性相关的细胞功能检测有以下2种方法。一种是文献(Malphettes L等(2010)，Highly efficient deletion of FUT8in CHO cell linesusing zinc-finger nucleases yields cells that produce completelynonfucosylated antibodies，Biotechnol Bioeng，106(5)：774-83)描述的基于LCA凝集素(Lensculinaris agglutinin)的表型筛选方法。该方法可在3周内筛选出双敲除Fut8基因的克隆，筛选效率为5％。在具体实验过程中，本发明人使用该文献报道的浓度50μg/mL LCA帮助筛选细胞克隆后，用含有50μg/mL LCA的培养基将细胞克隆进行逐步扩增同时进行表型筛选，经过9天培养后，细胞生长正常，但基因组测序没有发现突变。初步评估后认为，基于LCA凝集素的表型筛选方法存在以下缺陷：一方面LCA成本偏高，约5mg需花费约3000元，且供货周期长、供货慢；另一方面，实验中没有发现其对突变细胞的选择优势，分析可能需要在50μg/mL浓度的基础上进一步提高LCA筛选浓度，这更加突出了该方法的成本劣势。

FUT8酶活性相关的细胞功能检测的另一种方法如文献(Ihara H等(2006)，Reaction mechanism and substrate specificity for nucleotide sugar ofmammalian alpha1,6-fucosyltransferase--a large-scale preparation andcharacterization of recombinant human FUT8，Glycobiology，16(4)：333-42；Uozumi N等(1996)，Purification and cDNA cloning of porcine brain GDP-L-Fuc:N-acetyl-beta-D-glucosaminide alpha1-->6fucosyltransferase，J Biol Chem，271(44)：27810-7；Uozumi N等(1996)，A fluorescent assay method for GDP-L-Fuc:N-acetyl-beta-D-glucosaminide alpha l-6fucosyltransferase activity,involving high performanceliquid chromatography，J Biochem(Tokyo)，120(2):385-392；Inka Brockhausen编辑，Glycosyltransferases:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology，Humana Press，vol.1022，2013)报道，是一种操作较为复杂的FUT8酶活检测方法，使用荧光标记的糖链底物N-[2-(2-吡啶氨基)乙基]-琥珀酸5-降冰片烯-2,3-二羧基酰亚胺酯，以GDP-β-L-岩藻糖为岩藻糖基供体，进行酶催化的转化反应，通过HPLC方法分离检测产物。该方法在实际应用时需要进一步开发和进行方法学稳定性测试，且底物荧光标记效率存在不确定性，同时受到现有设备分析通量的制约，不能满足大规模筛选要求。

另外，非完全配对(Mis-match)酶切检测法也可用于基因敲除检测。IntegratedDNA Technologies公司生产的商业化产品

Mutation Detection Kit forStandard Gel Electrophoresis可进行基因组突变检测，PCR扩增突变区域后，通过变复性步骤，在突变序列区域产生局部非完全配对，然后通过非完全配对酶发现并切断这些区域，在DNA凝胶电泳中分析酶切产物片段大小时会发现靶片段大小的DNA条带，以及被切断的条带，以此来寻找突变克隆。该试剂盒使用成本约为100元/反应，供货周期长，成本和时间不能达到最优；同时非完全配对酶切、电泳分离小片段酶切产物等过程因容易引入人为误差从而影响结果判断。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明利用TALEN技术对Fut8基因进行定点修饰(敲除)，获得α-1,6-岩藻糖基转移酶功能缺失的细胞株；通过基因组DNA测序直接分析Fut8基因序列变化的方法筛选突变细胞株，得到FUT8双敲除的单克隆细胞；同时应用基因组测序直接分析的方法考察连续传代过程中单克隆细胞的传代稳定性，以筛选得到可稳定传代的单克隆细胞。

在一个方面，本发明提供在真核细胞中产生靶基因的双等位基因敲除的方法，其包括：向细胞提供TALEN质粒对，所述TALEN质粒对识别序列用于识别靶基因，靶基因上的切割位点为所述靶基因的序列，所述切割位点优选为atctggccactgatg(SEQID NO.16)；使细胞表达TALEN蛋白，所述TALEN蛋白识别靶基因并切割所述靶基因的序列；测序筛选靶基因发生双等位基因敲除的真核细胞。在一个实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在又一个实施方案中，所述真核细胞是CHO-K1、CHO-S、CHOK1SV、DG44、DXB11、NS0、SP2/0、PER.C6或HEK293细胞。在一个实施方案中，所述靶基因是岩藻糖基转移酶，任选为Fut8基因，优选切割位点位于Fut8基因的Exon7上。

在另一个方面，本发明提供哺乳动物细胞，其被使用上述靶基因的双等位基因敲除的方法进行靶基因的双等位基因敲除。在一个实施方案中，所述靶基因是岩藻糖基转移酶，任选为Fut8基因，优选切割位点位于Fut8基因的Exon7上，所述切割位点优选为atctggccactgatg(SEQ ID NO.16)。

在又一个方面，本发明提供在宿主细胞中制备目标重组蛋白的方法，所述方法包括：向细胞提供TALEN质粒对，其识别序列用于识别靶基因，相应的切割位点为所述靶基因的序列，所述切割位点优选为atctggccactgatg(SEQ ID NO.16)；使细胞表达TALEN蛋白，所述TALEN蛋白识别靶基因并切割所述靶基因的序列；测序筛选靶基因发生双等位基因敲除的真核细胞；使细胞表达目标重组蛋白。在一个实施方案中，所述靶基因是岩藻糖基转移酶，任选为Fut8基因，优选切割位点位于Fut8基因的Exon7上。

在又一个方面，本发明提供包含核酸酶靶位点的双链多核苷酸，其包含：TALEN质粒对，其识别序列用于识别靶基因，相应的切割位点为所述靶基因的序列，所述切割位点优选为atctggccactgatg(SEQ ID NO.16)。在一个实施方案中，所述靶基因是岩藻糖基转移酶，任选为Fut8基因，优选切割位点位于Fut8基因的Exon7上。

在又一个方面，本发明提供TALEN技术用于在真核细胞中产生靶基因的双等位基因敲除的用途，其中测序筛选靶基因发生双等位基因敲除的真核细胞。在一个实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在又一个实施方案中，所述真核细胞是CHO-K1、CHO-S、CHOK1SV、DG44、DXB11、NS0、SP2/0、PER.C6或HEK293细胞。在一个实施方案中，所述靶基因是岩藻糖基转移酶，任选为Fut8基因，优选切割位点位于Fut8基因的Exon7上。

在本发明的实施方案中，测序为DNA直接测序法。

在本发明的实施方案中，筛选包括基于LCA的表型筛选和/或DNA直接测序筛选。

本发明的有益效果：

靶序列的选择对基因敲除的成功率有影响，不同靶点会产生不同的结果。本发明在已报导的FUT8酶的三段序列(一级结构氨基酸残基序列358-370、403-416、451-477)中选择403-416区域(位于Exon7)作为切割位点，具体为其中的一段编码序列atctggccactgatg，在其上下游设计了左右臂结合位点，目的在于通过在该位置发生的切割和引入的突变彻底终止FUT8酶的翻译表达，使之缺失403-416和451-477两个的功能区域，引起Fut8基因失活。同时，根据靶序列所确定的具体识别位点对基因敲除成功率也有影响，且这种影响具有不确定性。本发明公布的L2R2 TALEN质粒组合打靶CHO-S细胞的最大基因敲除效率可达69.6％。

本发明采用的基因组DNA测序直接分析Fut8基因序列变化的方法筛选突变细胞具有以下方面优势：(1)具有很强的可操作性。试验只需得较少的细胞(比如10⁵个)，即可在常规实验室进行小量DNA抽提、PCR扩增实验；序列分析成本低，PCR产物测序成本约10-20元/反应，比对DNA测序彩图、分析测序彩图中的套峰即可直接选出有靶基因突变的细胞池或细胞克隆。(2)效率高。CHO-S细胞经TALEN质粒对转染以后，经过一段短暂的加压筛选后撤压、恢复细胞活率，即可直接分析转染细胞池中基因组DNA的突变情况，根据测序彩图中靶序列附近套峰的高低，直接确定最优转染条件，以最快速度开展后续克隆和进一步筛选，无需经过漫长的分板、克隆、酶活性检测来优化转染条件。(3)为克隆筛选过程提供明确的筛选标准。哺乳动物细胞基因组进行基因敲除后，绝大多数细胞中的靶基因未发生突变，或者只有一个等位基因发生突变，甚至有些细胞中的突变只对FUT8酶活产生一定程度的影响(靶功能区仅发生个别氨基酸的缺失或替换)，一般只有极少部分细胞发生双等位基因敲除，并导致FUT8酶功能彻底丧失。常规酶活检测在早期细胞克隆筛选过程中的指导作用不强，从检测结果中只能找出存在酶活的下降的克隆，下降程度没有量的标准，目标克隆如果不纯，敲除效果容易被混杂的野生型细胞、单敲除细胞、酶活功能仅受部分影响的细胞所掩盖，很容易造成理想的目标克隆漏检，从而加大后期克隆筛选的难度和工作量。基因组DNA测序为后续细胞克隆的筛选提供了明确的临界值(cut-off值)标准，可以按照筛选流程的进展，不断减少细胞筛选的工作量：A)在转染后的第一步克隆筛选中，首先通过测序彩图比对，直接排除含有野生型基因序列的克隆，可以保证后续的筛选都是在双等位基因敲除的候选细胞间进行；然后，通过TA克隆的方法，从选定克隆的基因组PCR产物中克隆出基因组DNA，逐个测序分析该克隆中混合的基因组模板分布情况，通过序列分析剔除那些仅发生氨基酸残基缺失而没有导致FUT8蛋白翻译终止的克隆，这一步排除的是酶活仅受部分影响而没有彻底丧失的细胞。B)下一步对选定克隆进行亚克隆，以获得单细胞克隆，可以大大减轻工作量。亚克隆筛选过程中基因组序列分析，结合上述母克隆基因组模板序列分析情况，还可以进一步为单细胞筛选提供指导和参考：①检测出现3种或以上不同突变类型基因组DNA的单克隆细胞并非真正单克隆，不满足工业化生产对于宿主细胞的要求，可以根据需要进一步亚克隆；②检测出现2种突变类型基因组DNA的单克隆细胞可能为双敲除杂合子单克隆细胞，也可能为两个双敲除纯合子细胞混合形成的克隆，这时可以根据上一步确定的序列突变情况、同时结合同批其他亚克隆序列检测情况进行甄别；③检测仅出现1种突变类型基因组DNA的单克隆细胞为双敲除、纯合子单克隆细胞，遗传背景单一，工业化生产潜在的利用价值高。

本发明以Fut8基因EXON7中负责编码403-416段的DNA序列作为靶序列，利用基因组编辑技术TALEN成功地完成靶序列双等位基因的敲除，在靶序列下游强行终止FUT8酶蛋白的翻译延伸。

本发明所设计的基因组测序的方法贯穿整个过程，指导对突变克隆的直接筛选：首先，利用基因组测序评估TALEN质粒对转染CHO-S细胞所得到的细胞池，可以最低的成本(一个测序反应费用)、最快的速度(1天的时间完成基因组PCR扩增和PCR产物测序)快速、高效地评估细胞池中基因组是否发生突变，观察测序彩图中靶序列附近套峰的高低还可以初步判断基因敲除的效率高低，为下一步筛选快速提供高突变率的细胞池。

其次，转染细胞池进行克隆筛选得到生长正常的克隆细胞以后，进行基因组测序，排除所有仍然出现野生型序列的克隆，以及非目标克隆。通过两个步骤来实现：①测序彩图显示为明显的野生型基因组序列，或者显示有野生型基因组序列残留的克隆立即排除；②对于上述选中的克隆以及一些不易判断突变情况的克隆，通过TA克隆的方法逐个分析混合的基因组序列群体中所发生的突变情况：其中发现有野生型基因组序列的克隆可以排除；基因组序列突变中如果出现3碱基或其整数倍的序列突变，仅影响到个别氨基酸残基，不能彻底缺失目标功能区及其下游氨基酸序列，也在此步排除。该步测序检测的设计有三个方面的有益效果：一方面保证了后续筛选样本均为双等位基因敲除克隆；另一方面也极大降低了基因组回复突变为野生型序列的几率，为将来细胞株稳定性提供保障；再一方面，直接利用基因组中双等位基因序列、及其翻译成相应氨基酸序列突变和酶功能缺失情况进行筛选，简单直接，可避免酶活性检测实验条件要求高、检测时限长、没有明确的临界值标准、不能清晰区分是单等位基因还是双等位基因突变、不能判断回复突变几率高低等弊端。

再次，将选中的克隆进行亚克隆，分离单细胞并形成生长正常的单克隆细胞。检测单克隆细胞的基因组序列，确认其中所含有的基因组突变在上一步均已检测到，且不再出现野生型序列(上一步漏检的野生型序列，或者单细胞克隆过程回复突变成野生型序列的将会被排除)。这一步的基因组测序还可以帮助我们判断所获得的单细胞的单克隆性(monoclonality)。该步测序检测设计的有益效果为：实现其他检测方法无法实现的甄别功能，即检测出现3种或以上不同突变类型基因组DNA的单克隆细胞并非真正单克隆，不满足工业化生产对于宿主细胞的要求，可以根据需要进一步亚克隆；检测出现2种突变类型基因组DNA的单克隆细胞可能为双敲除杂合子单克隆细胞，也可能为两个双敲除纯合子细胞混合形成的克隆，这时可以根据上一步确定的序列突变情况、同时结合同批其他亚克隆序列检测情况进行甄别；检测仅出现1种突变类型基因组DNA的单克隆细胞为双敲除、纯合子单克隆细胞，遗传背景单一，工业化生产潜在的利用价值高。

最后，将选中的亚克隆进行连续传代10～12代，传代结束后的细胞再次进行基因组DNA序列的检测，了解细胞在连续传代过程中序列突变的稳定性，排除传代结束后检测发现序列突变产生变化的克隆，为后续的生产应用提供参考数据。在后续的生产应用中，有计划地安排检测控制点，进一步监控突变位点序列的稳定性。通过本发明所述的细胞筛选方法可获得FUT8功能缺失的可稳定传代的工程细胞。将所得工程细胞用于生产制备蛋白质，蛋白产量和质量与原始细胞无明显差异。

本发明公开的失活细胞内源Fut8基因方法，可用于，包括但不限于抗体生产用哺乳动物细胞：CHO-K1、CHO-S、CHOK1SV、DG44、DXB11、NS0、SP2/0、PER.C6和HEK293；以及其他用途的哺乳动物细胞遗传特性的改造。

本发明选用基因组测序的方法检测基因敲除突变：获得细胞后使用试剂盒抽提基因组DNA，利用靶序列两端的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，从测序图中查找靶序列附近的套峰来判断基因组序列的突变。与传统的酶活检测、LCA检测、非完全配对酶切检测方法相比，本发明选用的DNA测序的方法更快捷、成本更低廉、可操作性更强。

本发明采用的基因组DNA测序的方法在筛选的不同阶段都能进行选择，通过对测得的序列结合套峰进行分析可以FUT8的敲除结果，最终还能区分纯合子和杂合子。

本领域技术人员应当理解的是，本发明所保护的范围并不会因为本发明的某一项技术方案能够实现某一项本发明明示或暗示的有益效果而不能实现或者完全实现另一项有益效果而被不恰当地限制。本领域技术人员应当理解的是，在本发明的保护范围内，任一项产品、方法或者用途只要获得了任意一项本发明明示或暗示的有益效果或者任选地本发明明示或暗示的有益效果的组合即表示其解决了本发明想要解决的技术问题，实现了相应的技术效果。

附图说明

图1为TALEN质粒对的设计方案。

图2为TALEN质粒对活性评估结果。

图3为0129-A3的测序结果。

图4为A1-A4、B1-B4的测序结果。

图5A为野生型对照克隆65的测序结果，图5B为克隆40的转化子的序列比对结果，图5C为克隆37的转化子的序列比对结果。

图6为亚克隆在连续传代过程中的生长行为实验结果图，图6A分别为克隆40(图6A的上图)和克隆18(图6A的下图)在连续传代过程中的生长行为实验结果图，图6B为克隆37在连续传代过程中的生长行为实验结果图。

图7为亚克隆6-C10在连续传代前后序列比较。

图8A为亚克隆18-44在连续传代前后序列比较，图8B为亚克隆37-9的测序结果，图8C为亚克隆37-30的测序结果，图8D为亚克隆37-24的测序结果，图8E为亚克隆37-41传代前(图8E的左图)和传代后(图8E的右图)的测序结果，图8F为亚克隆37-4传代前(图8F的左图)和传代后(图8F的右图)的测序结果。

图9为CHO表达的抗体的N-糖分布图。

图10为ADCC活性测定结果。

图11为受试物在人B细胞淋巴瘤Raji SCID小鼠系统移植瘤模型中对动物生存期的影响的结果。

图12为受试物在人B细胞淋巴瘤Raji SCID小鼠系统移植瘤模型中动物体重的影响的结果。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

实施例1

Fut8 TALEN质粒对设计和构建

查找基因组序列数据库，获得CHO细胞基因组中Fut8基因序列。选定Fut8基因Exon7中负责编码403-416段的DNA序列作为基因敲除靶序列，在靶序列上下游设计TALEN质粒对。

TALEN质粒对的设计方案(如图1所示)如下，包括2个左臂质粒(DNA结合区序列，即识别序列，长度15～16碱基)和3个右臂质粒(识别序列长度15～17碱基)，可以组合形成6对TALEN质粒对。

根据G2 FastTALEN^TMTALEN试剂盒(上海斯丹赛生物技术有限公司)的使用说明，以识别序列除最后一位碱基外从5’到3’按照1～2个碱基为单位，从模块文库中选择相应的模块；再根据识别序列最后一位碱基选择相应的骨架载体，混合孵育、连接、后处理，转化，和转化子筛选及测序确认，就能分别得到表达所需TALEN蛋白的真核表达质粒，具体如下所示：

注：第一行为具体识别序列，最后的碱基决定使用的载体类型(根据G2FastTALEN^TMTALEN试剂盒产品说明书对应编号选择)，第二行为根据识别序列依次选择的TALEN蛋白组装模块。比如L1的识别序列为ggataaaaaaagagtgt，最后的碱基t决定使用的载体为L57，对应的TALEN蛋白组装模块为G1 ga2t3 aa4 aa5 aa6 ag7 ag8 tg9。

使用质粒是L1-2，L2-1，R1-4，R2-3，R3-3，TALEN质粒的识别序列的蛋白序列和相应编码基因如下：

6对质粒TALEN活性评估

质粒对可能的组合为：L1R1、L1R2、L1R3、L2R1、L2R2、L2R3。

活性测定方法：将TALEN质粒组合转染细胞池，基因组测序，比较测序峰图，套峰高的细胞池初步判定为基因敲除效率高，可用于下一步转染CHO细胞。

在CHO-K1贴壁细胞中按照标准程序进行了上述6对质粒TALEN活性评估，评估结果如图2所示。图2显示了6对TALEN质粒组合转染细胞池基因组测序峰图对比结果。

根据套峰情况，选定套峰高的L2R2组合进行TA克隆，进行基因敲除效率的评估。在基因组测序峰图中，套峰越高则表示敲除效率越高。

TA克隆结果：L2R2共挑取了23个单克隆，有8个克隆是突变的，故TALEN打靶细胞的最大基因敲除效率为(8/23)*2＝69.6％(注：*2的原因是每个细胞都是二倍体，23个单克隆来自于23/2个细胞，敲除细胞的效率为8*2/23)。

优选L2-1和R2-3质粒对转染CHO-S。

实施例2

Fut8 TALEN质粒对转染CHO细胞

脂质体转染条件初步筛选

以L2-1和R2-3质粒对为例，进行脂质体转染，利用质粒中携带的eGFP和嘌呤霉素(puromycin，PM)进行筛选和检测，如上所述，所使用的CHO细胞为CHO-S悬浮细胞。

实验所用试剂：

脂质体转染方案如下(试验批次：0129)：

转染24小时后，加入嘌呤霉素进行加压，4天后，取出细胞进行基因组PCR和测序。测序结果显示(见图3)，A3方案(0129-A3)得到了明显套峰。

将A3方案得到转染细胞0129-A3进行扩增并冻存。

抽提转染细胞池0129-A3基因组DNA，按照常规方法进行目标区域片段PCR扩增，得到的PCR产物进行TA克隆，计算基因敲除效率。

TA克隆结果：共克隆到约23个转化子，其中有5个转化子发现有突变，初步计算细胞最大基因敲除率约为43.5％。

PCR：细胞培养物离心去除上清，使用基因组DNA抽提试剂盒抽提出基因组DNA，在靶序列上下游设计一对引物，按常规方法进行目标区域片段的PCR扩增。

选择转染细胞池0129-A3筛选Fut8双敲除突变细胞。

脂质体转染条件进一步优化

目的：在前期CHO-S基因组改造的基础上，改变部分转染和筛选的条件，以获得突变效率提高的转染细胞池。

实验材料及试剂同上。

脂质体转染方案如下：

加压筛选条件：

转染24小时后加嘌呤霉素进行筛选。

加压方案：

接种条件优化A：

A1：0.25×10<sup>6</sup>，8P，3D	A2：0.25×10<sup>6</sup>，8P，4D
		A3：0.25×10<sup>6</sup>，12.5P，3D	A4：0.25×10<sup>6</sup>，12.5P，4D

接种条件优化B：

B1：0.5×10<sup>6</sup>，8P，3D	B2：0.5×10<sup>6</sup>，8P，4D
		B3：0.5×10<sup>6</sup>，12.5P，3D	B4：0.5×10<sup>6</sup>，12.5P，4D

3～4天之后，取样进行基因组PCR扩增和测序。

测序结果见图4。

根据测序结果中的套峰情况，选择套峰高的A3、A4、B3、B4进行基因敲除效率评估：

150611-A4条件下所得的基因敲除效率为70％，基因敲除效率较高，满足实验需要。

选择此条件下获得的转染细胞池150611-A4筛选Fut8双敲除突变细胞。

实施例3

Fut8双敲除突变细胞筛选

转染细胞池0129-A3、150611-A4筛选Fut8双敲除突变细胞。

复苏0129-A3冻存的细胞，利用MD公司半固体培养基铺6孔板，2ml/孔，培养基：克隆培养基+8mM谷氨酰胺+1％HT+50μg/ml LCA(共设置0311、0512两批次半固体培养基筛选单细胞克隆实验)。每批铺板实验后约1周后，待半固体培养基中形成一定体积的球状克隆(达到可培养状态)，在显微镜下挑选这些克隆至96孔板，培养后根据各孔细胞的生长状态，分批将克隆扩增到24孔板中，得到一定数量的细胞(10⁵个)后进行基因组测序分析。

基因组测序分析结果：0311批半固体培养基筛选单细胞克隆获得出现套峰的克隆2个(克隆40、49)，0512批半固体培养基筛选单细胞克隆获得出现套峰的克隆4个(克隆28、45、94、103)。进一步TA克隆分析上述6个克隆的模板分布情况。克隆65作为野生型对照，其基因组PCR扩增产物测序图谱作为正常对照图谱用于对比参考(图5A)。

将克隆40基因组PCR产物进行TA克隆，成功获得并测序分析了17个转化子，在靶序列区所测序列对比情况如图5B所示。

与野生型序列(即克隆65的TALEN PCR测定结果)相比，发现17种模板仅存在2种突变序列：13bp缺失(11个)以及32bp缺失(6个)，符合筛选标准。初步判断该克隆为双敲除突变细胞，测序区域中已不存在野生型序列，后续进行亚克隆，进一步保证该克隆的单细胞性。

克隆49同样进行了基因组PCR产物TA克隆并测序分析，但发现了野生型序列，同时所发现的突变序列为6bp缺失，不符合筛选标准，直接排除。

采用上述类似的方法，克隆28、45、94、103基因组PCR产物进行TA，获得转化子后测序分析克隆中模板分布情况后发现，上述4个克隆分别出现野生型序列、同框缺失、同框插入、氨基酸残基替换等，均不符合筛选标准，予以排除。

将150611-A4转染细胞池采用有限稀释法铺板，3个细胞/200μl/孔*96孔*3块板(共设置0619、0629两批有限稀释法筛选单克隆细胞试验)。在96孔板中培养10天后，在显微镜下观察，挑选克隆入24孔板培养，1ml/孔，得到一定数量的细胞(10⁵个)后，抽提扩增细胞基因组DNA，按常规方法进行目标区域片段PCR扩增，得到的PCR产物进行基因组测序分析。按照0129-A3批次相同的方法，分析各克隆基因组PCR产物的测序结果。

基因组测序分析结果：0619批有限稀释法筛选单细胞克隆获得出现套峰的克隆6个(克隆18、24、37、51、57、58)，0629批有限稀释法筛选单细胞克隆获得出现套峰的克隆6个(克隆36、54、56、58、75、77)。将上述12个克隆的基因组PCR产物进一步进行TA克隆，分析其模板分布情况。

其中克隆37基因组PCR产物经TA克隆后获得转化子，测序分析结果如图5C所示。经分析，发现克隆37存在2种模板，均为较大片段的序列插入：

克隆	突变
		37-9、37-10、37-12、37-16、37-18	184bp插入，未成熟终止
37-1、37-2、37-8、37-14	202bp插入，未成熟终止

TA克隆分析结果：初步判断克隆18、37、51、56、77为双敲除突变细胞，野生型序列已不存在，可后续进行亚克隆，进一步保证该克隆的单细胞性。

将下列克隆进行亚克隆，确认其单细胞特性。

取冻存的克隆40细胞复苏至正常活率，按照0.5个细胞/孔铺5块96孔板、1个细胞/孔铺5块96孔板，培养11天后，排除生长非常缓慢的孔，选择生长正常的72个孔转入3块24孔板，培养4～8天，获得一定数量细胞后(10⁵个)取样进行基因组DNA PCR扩增和测序分析。排除8个培养失败的亚克隆，共分析了64个亚克隆的基因组测序序列。根据测序分析结果，选择15个亚克隆细胞逐渐扩大到6孔板和摇瓶培养，最终保存选中的亚克隆细胞。

将有限稀释法筛选得到的克隆56和77分别采用有限稀释法铺板，1.5个细胞/200μl/孔，各2块96孔板，培养10天后选择生长正常的克隆转入24孔板培养，1ml/孔，得到一定数量的细胞(10⁵)后，抽提扩增细胞基因组DNA，按常规方法进行目标区域片段PCR扩增，得到的PCR产物进行基因组测序分析。培养后从克隆56的亚克隆中选择48个样品进行基基因组序列分析，从克隆77的亚克隆中选择24个样品进行基基因组序列测序分析。

将有限稀释法筛选得到的克隆18、37、51分别采用有限稀释法铺板，以1个细胞/孔和1.5个细胞/孔各分2块96板进行亚克隆培养。11天后，根据生长情况，从1个细胞/孔的96板中分别挑取亚克隆，转至24孔板中培养，获得一定数量的细胞(10⁵个)以后，进行基因组DNA序列分析。根据前述原则分析克隆基因组测序结果，排除相关亚克隆后，将符合筛选标准的亚克隆扩大培养然后进行保存。培养后从克隆18的亚克隆中选择48个样品进行基基因组序列分析，从克隆37的亚克隆中选择37个样品进行基基因组序列测序分析，从克隆51的亚克隆中选择13个样品进行基基因组序列测序分析。

测序结果分析方法：亚克隆序列的分析均以母克隆已分析到的模板序列以及模板种类为基础，亚克隆序列应被包含于母克隆序列中，比如亚克隆序列分析结果显示出现套峰的位置均为双峰，且符合母克隆基因组序列分析所得2种模板叠加后的序列情况，证明没有出现新的突变序列、没有产生回复突变；同时，结合其他多个亚克隆均出现相同套峰情况，可以判断这些亚克隆已经是单细胞繁殖而成。排除一些测序图谱基线偏高、PCR产物扩增条带偏淡、测序信号杂乱、测序失败的亚克隆。

克隆37的测序结果分析如下：

根据上述原则：

克隆40选中并保存的亚克隆细胞：2，4-E3，6-C10，9-F10，10-H1，8-D1，7-E5，5-C5，5-H10，3-D11，2-E10，1-D9，2-H6，1-E7，2-B5。

克隆56选中并保存的亚克隆细胞：56-5，56-6，56-9，56-10，56-13，56-15，56-17，56-28，56-30，56-46，56-2，56-3，56-4，56-8，56-11，56-14，56-16，56-26，56-45，56-48。

克隆77选中并保存的亚克隆细胞：77-2，77-7，77-3，77-6，77-13。

克隆18选中并保存的亚克隆细胞：18-15，18-25，18-30，18-33，18-45，18-44。测序结果显示，克隆18以上亚克隆细胞为双敲除纯合子。

克隆37选中并保存的亚克隆细胞：37-1，37-4，37-19，37-39，37-40，37-41，37-9，37-11，37-24，37-30，37-33，37-46。测序结果显示，克隆37亚克隆细胞37-9，37-11，37-24，37-30，37-33，37-46为双敲除纯合子。

克隆51选中并保存的亚克隆细胞：51-4，51-5，51-6，51-9，51-10，51-30。

实施例4

Fut8双敲除突变细胞的亚克隆传代稳定性分析

为了确认上述选定的亚克隆在生长和遗传方面具有稳定性，将这些亚克隆分批进行了传代稳定性研究，连续传代10～12代，分析传代过程中亚克隆的生长数据，传代结束后再次进行基因组DNA序列的测序分析和确认，从中选出生长特性稳定、基因组突变可稳定遗传的亚克隆，用于后续的项目研究。

结合细胞生长情况的比较，从上述保存的亚克隆中分别选择具有代表性的数个亚克隆进行传代稳定性研究。

以野生型CHO-S细胞平行对照，进行连续传代，分析各代次倍增时间(doublingtime，DT)的变化规律，以初步了解这些亚克隆在连续传代过程中的生长行为是否具有差异，结果见图6A。图6A的结果显示，克隆40的亚克隆大部分生长过程的DT与CHO-S细胞接近(图6A的上图)；克隆18中的纯合子亚克隆进行了连续传代研究，各亚克隆生长特性稳定，与野生型细胞CHO-S生长行为一致(图6A的下图)；克隆37的选定的亚克隆进行了连续传代，从生长特性来看，各亚克隆与野生型CHO-S细胞相比，细胞倍增时间具有一致性和稳定性(图6B)。

选择生长特性与野生型细胞CHO-S最接近的亚克隆，进行了基因组序列的分析，结果显示(图7和图8A)，经过连续传代，突变序列稳定。亚克隆6-C10的结果见图7：左图显示传代前亚克隆的基因组序列，右图显示传代后基因组序列，结果显示，突变序列能够稳定传代。亚克隆18-44的结果见图8A，与野生型基因组DNA序列相比，亚克隆18-44在传代前和传代后的测序结果相同。

从克隆37传代的亚克隆中选择亚克隆进行基因组序列确认时，却发现了明显的不稳定现象：

(1)纯合子亚克隆出现回复突变

分析了上述6个纯合子亚克隆的基因组序列，发现全部存在回复突变，连续传代后出现了野生型基因组序列的套峰：

37-9亚克隆的测序结果见图8B，37-30亚克隆的测序结果见图8C，37-24亚克隆的测序结果见图8D。各亚克隆测序彩图中野生型序列出现的套峰高低不一致，提示各亚克隆中发生回复突变的起始时间也许不一致，回复突变的进程也有可能有快有慢。

(2)杂合子亚克隆基因组测序彩图中套峰比例失调

选择37-4和37-41亚克隆进行了基因组测序分析，结果发现传代前后基因组序列中套峰发生了改变，同一位置上的两种峰型比例发生变化。如图8E所示，左图显示传代前亚克隆37-41的基因组序列，右图显示传代后37-41亚克隆基因组序列。在37-4亚克隆中同样出现了套峰比例失调的现象(见图8F)。

(3)克隆37亚克隆突变序列不稳定现象的分析

结合上述进行的克隆40、18的各亚克隆传代稳定性分析结果，不难发现这些克隆中的基因组DNA序列突变均为小片段的序列缺失，序列的缺失长度从7bp～32bp之间不等，符合一般的推测，细胞在出现基因组断裂后启动的非同源末端连接(Non-homologous EndJoining,NHEJ)过程中，很容易出现末端序列的丢失。这种情况也出现在我们的Fut8基因敲除实验中，检测基因组DNA序列的突变绝大部分都是这种情况，个别会出现几个碱基的插入突变。

克隆37的突变模板分析显示，其中携带了大片段的DNA序列的插入，插入序列的长度在分别为184bp和202bp，这类似于通过特定手段进行基因敲入所获得的结果，与本实验进行的基因敲除通常会发生的突变情况不同，而且在分析的众多克隆中，仅发现1例，说明该克隆中发生的突变可能为个别现象，有可能产生于TALEN质粒中混有的杂质、个别细胞所发生的特殊突变，其亚克隆的不稳定现象相信也与此有关。

从本实施例的结果可以看出，采用本发明的测序筛选方法可以出人意料地快速有效鉴别不同克隆突变序列的稳定性。

实施例5

使用本发明的Fut8双敲除突变细胞表达纯化抗CD20抗体

选择亚克隆6-C10、18-44进行抗CD20抗体的瞬时转染。复苏野生型CHO-S细胞、6-C10Fut8双敲除杂合子细胞、18-44Fut8双敲除纯合子细胞，进行抗CD20抗体的瞬时转染，通过蛋白A一步纯化的方法制备抗CD20抗体。

当宿主细胞密度增至3×10⁶个/ml且宿主细胞到活力>95％时，进行抗CD20抗体瞬时转染。转染条件如下：

(1)转染过程中，质粒的用量为每3×10⁶个细胞加入3μg(轻链1.5μg+重链1.5μg)质粒，即质粒加入细胞悬液后的浓度应为1μg/ml(注：抽提得到的质粒浓度尽量控制在1mg/ml左右)。另外，转染试剂PEI的用量为每3×10⁶个细胞加入6μg PEI(1mg/ml)，即质粒与PEI的用量比为1:2。

(2)采用Opti-MEM分别稀释质粒和PEI至相同体积，稀释后的体积总和为转染体积的1/10，即稀释后的质粒和PEI体积均为转染体积的1/20。

(3)将上述稀释后的PEI逐滴加入到稀释的质粒中，充分混合均匀后室温静置15min(不要超过20min)后，缓慢加入到宿主细胞中，加入后摇匀，于含5％CO₂、36.5℃的细胞培养箱中培养。

(4)培养2-3h，加入7％的补料培养基(483in FeedC)，降温至33℃进行培养，4天后收获。

将收获的样品通过10000rpm、4℃离心30min，取上清液，蛋白A亲和层析柱纯化抗CD20抗体。

纯化条件如下：

实验器材：AKTA纯化仪(1DS-003)，蛋白A亲和层析柱(自装，MabSelect Sure)

缓冲液：

缓冲液1：50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.2

缓冲液2：50mM HAc-NaAc，pH3.5

缓冲液3：0.1M NaOH-1M NaCl

缓冲液4：1M Tris

缓冲液5：20％EtOH

层析操作步骤：缓冲液3冲柱，30min；缓冲液1冲柱，5CV；取上清上样；缓冲液1冲柱，至UV280基线平稳；缓冲液2冲柱，UV280示数50-max-50mAU收集洗脱峰，洗脱样品加入缓冲液4调pH至中性(即得分离纯化后的抗CD20抗体)；缓冲液3冲柱，不少于3CV；缓冲液5冲柱，3CV。以上步骤中的CV：column volume，柱体积。

6-C10共转染了2.1L，纯化获得抗体37.3mg(4.78mg/ml,7.8mL)；18-44共转染了2.8L，收获蛋白51.58mg(4.96mg/ml,10.4mL)。

抗CD20抗体的质量分析结果：

实施例6

本发明所表达的抗CD20抗体的岩藻糖基化

用PNG F酶将糖蛋白上的N-糖苷与蛋白分离，分离出的N-糖苷干燥后用荧光试剂2-AB标记，标记后的样品用亲水色谱分离，荧光检测器检测出峰。所用实验设备及耗材：Waters Acquity UPLC-FLR(荧光检测器)，PNG F酶(NEB)，色谱柱Waters Acquity UPLCGlycan Amide column 1.7μm，2.1mm×150mm。实验样品：06、06-6C10’、06(18-44)，在相应的宿主细胞(06为野生型细胞株；6C10为Fut8基因双敲除杂合子细胞株；18-44为Fut8基因双敲除纯合子细胞株)在摇瓶中表达后通过蛋白A柱亲和纯化制备得到。

结果见图9：由06、06-6C10’、06(18-44)的N-糖分布图看，野生型CHO表达的抗体的主要糖型为G0F和G1F，经过宿主改造后，06-6C10’和06(18-44)的主要糖型为G0和G1，基本没有G0F和G1F。

实施例7

本发明所表达的抗CD20抗体的ADCC活性

抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)是指IgG抗体通过Fab段与靶细胞表面抗原决定簇特异性结合后，其Fc段可与NK细胞表面FcγRIII结合，从而使NK细胞对靶细胞产生非特异性杀伤作用，即ADCC作用。针对靶细胞Ramos细胞株，加入系列稀释的待测抗CD20抗体药物和参照品，检测抗体药物对靶细胞的ADCC效应，计算EC₅₀值。

待测样品：

样品名称	浓度(mg/ml)	来源
			利妥昔单抗	10.00	市售抗体
06	5.59	瞬转制备
			06-6C10	1.79	瞬转制备
07	2.10	瞬转制备
			07-6C10	2.42	瞬转制备
06-6C10’	4.78	瞬转制备
			06-18-44	4.96	瞬转制备

注：06未经宿主改造的表达06分子序列的抗CD20抗体，07未经宿主改造的表达07分子序列的抗CD20抗体(06和07为平行实施例数据，氨基酸序列不同)；06-6C10、06-6C10’均为经宿主细胞株6C10改造的表达06分子序列的抗CD20抗体，“’”代表第二批次转染制备，06-18-44经宿主细胞株18-44改造的表达06分子序列的抗CD20抗体，07-6C10、07-6C10’为经宿主细胞株6C10改造的表达07分子序列的抗CD20抗体，“’”代表第二批次转染制备。

试验仪器：

名称	厂商	型号
			Spectra Max M2	MD	M2
倒置光学显微镜	Nikon	TS100
			Eppendorf离心机5810	Eppendorf	5810
细胞计数仪	Beckman	Vi-cell

ADCC活性检测方法：

(1)取处于对数生长期的Ramos细胞，调整细胞密度为3×10⁵个细胞/ml，于96孔黑色底透细胞培养板中每孔加入50μl，培养1小时。

(2)96孔细胞培养板中每孔加入系列稀释的待测抗体药物25μl，终浓度分别为8000、1333.33、222.22、37.04、6.17、1.03、0.17、0.028、0.0048和0.000794ng/ml，37℃，5％CO₂孵育0.5小时。

(3)调整效应细胞NK92/FcγRIII细胞密度为2.4×10⁶个细胞/ml，每孔加入25μl。于37℃，5％CO₂孵育5小时。同时设置空白培养基对照组、单独靶细胞自发释放对照组、单独效应细胞自发释放对照组、单独靶细胞和效应细胞自发释放组，以及单独靶细胞孵育结束后加裂解液为其最大释放对照组。

(4)根据Promega LDH试剂盒检测说明书，将96孔板平衡至22℃约30分钟，加入100μl检测液混合，静置10分钟后，加入终止液50μl。

(5)Spectra Max M2检测激发/发射波长为560nm/590nm荧光信号值。

(6)根据公式所有值先减去空白对照组值；采用2种方式进行4参数拟合曲线计算EC₅₀值：a.抗体药物浓度为横坐标，平均荧光强度为纵坐标拟合曲线；b.计算靶细胞杀伤率(Cell Lysis％)＝[(实验组-靶细细胞和效应细胞自发释放组)/(靶细胞最大释放组-靶细胞自发释放组)]×100％。抗体药物浓度为横坐标，靶细胞杀伤率为纵坐标拟合曲线，用GraphPad Prism 5.0计算EC₅₀值。

试验结果：

06、07与参照品利妥昔单抗的EC₅₀比值均在3倍左右，表明该这两个样品与参照品相比，ADCC作用差异不显著，在同一水平。检测的06-6C10、07-6C10、06-6C10’、06-18-44与参照品利妥昔单抗的EC₅₀比值均在25-40倍之间，ADCC作用差异显著提高。四参数拟合曲线见图10。

实施例8

本发明所表达的抗CD20抗体抑制肿瘤生长

运用人B细胞淋巴癌Raji SCID小鼠移植模型对受试物利妥昔单抗、03(CHO-S)、03(6C10)、06(CHO-S)、06-6C10’、07-6C10’单独用药的体内抗肿瘤活性进行评价。

SCID小鼠，尾静脉接种Raji细胞，接种后5天开始分组给药(分成6组，每组12只，各组分别为PBS、利妥昔单抗、03(CHO-S)、03(6C10)、06(CHO-S)、06-6C10’和07-6C10’，给药剂量除PBS(10ml/kg)外，均为1mg/kg，每两周给药一次、给药2周)；观察指标包括：临床观察、体重、中位生存时间和相对生命延长率(给药组VS阴性对照组中位生存时间的百分比)，试验观察至所有动物死亡或试验停止(给药后三个月)。

试验结果表明：各受试药物均表现出显著的生命延长活性，其中利妥昔单抗、03(CHO-S)、03(6C10)、06(CHO-S)、06-6C10’、07-6C10’的中位生存天数分别为40天(p<0.0001)、35天(p<0.0001)、38天(p<0.0001)、37.5天(p<0.0001)、40.5天(p<0.0001)以及39天(p<0.0001)，空白对照组的中位生存天数为21.5天；相对生命延长率百分比：利妥昔单抗、03(CHO-S)、03(6C10)、06(CHO-S)、06-6C10’、07-6C10’在1mg/kg剂量的相对生命延长率百分比T/C分别为186.05％、162.79％、176.74％、174.42％、188.37％、181.39％；死亡率：除06-6C10’组有2只动物和利妥昔单抗组有1只动物外，其余动物在观察期结束(第95天)前均已死亡；体重和临床观察：实验前期的给药过程中观察到06(CHO-S)有一定的动物体重增长抑制作用(-0.6±0.4％，p＝0.0435vs对照，第4天)。各组濒临死亡前的动物均出现后肢无力、瘫痪、消瘦、体重明显下降；存活动物则状态良好，未观察到其他异常反应。

受试物在人B细胞淋巴瘤RajiSCID小鼠系统移植瘤模型中的抗肿瘤作用

受试物在人B细胞淋巴瘤RajiSCID小鼠系统移植瘤模型中对动物体重的影响

受试物在人B细胞淋巴瘤RajiSCID小鼠系统移植瘤模型中对动物生存期的影响的结果见图11。受试物在人B细胞淋巴瘤RajiSCID小鼠系统移植瘤模型中动物体重的影响(Mean±SEM)的结果见图12。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元件对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110> 上海津曼特生物科技有限公司

<120> 用于失活FUT8基因的复合物和方法

<130> IDC190082

<150> 201611185840.5

<151> 2016-12-21

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggataaaaaa agagtgt 17

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggataaaaaa agagtg 16

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctttaacaa agaagggt 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctttaacaa agaaggg 17

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctttaacaa agaagg 16

<210> 6

<211> 544

<212> PRT

<213> TALEN蛋白

<400> 6

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

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Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

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Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

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Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

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Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

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Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

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355 360 365

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Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

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Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

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405 410 415

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130 135 140

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165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

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Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

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Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

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530 535 540

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His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

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Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

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Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

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Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

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Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

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245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

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ctaaccccag agcaggtcgt ggcaatcgcc tccaacattg gcgggaaaca ggcactcgag 1080

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ccagtgctgt gccaagcgca cgggctcacc ccagagcagg tcgtggcaat cgcctccaac 1260

attggcggga aacaggcact cgagactgtc cagcgcctgc ttcccgtgct ttgtcaggca 1320

cacggcctca ctccggaaca agtggtcgca atcgcctcca acattggcgg gaaacaggca 1380

ctcgagactg tccagcgcct gcttcccgtg ctgtgccaag cgcacgggct aaccccagag 1440

caggtcgtgg caatcgcgag caataacggc ggaaaacagg ctttggaaac ggtgcagagg 1500

ctccttccag tgctttgtca ggcacacggc ctcactccgg aacaagtggt cgcaatcgcg 1560

agcaataacg gcggaaaaca ggctttggaa acggtgcaga ggctccttcc agtgctgtgc 1620

caagcgcacg ga 1632

<210> 14

<211> 510

<212> PRT

<213> TALEN蛋白

<400> 14

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

500 505 510

<210> 15

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctgaccccag agcaggtcgt ggcgatcgca agccacgacg gaggaaagca agccttggaa 60

acagtacaga ggctgttgcc tgtgctgtgc caagcgcacg gtttaacccc agagcaggtc 120

gtggcgatcg caagccacga cggaggaaag caagccttgg aaacagtaca gaggctgttg 180

cctgtgcttt gtcaggcaca cggcctcact ccggaacaag tggtcgccat tgcctcgaat 240

ggagggggca aacaggcgtt ggaaaccgta caacgattgc tgccggtgct gtgccaagcg 300

cacggcctca ccccagagca ggtcgtggcc attgcctcga atggaggggg caaacaggcg 360

ttggaaaccg tacaacgatt gctgccggtg ctttgtcagg cacacggcct cactccggaa 420

caagtggtcg ccattgcctc gaatggaggg ggcaaacagg cgttggaaac cgtacaacga 480

ttgctgccgg tgctgtgcca agcgcacgga ttaaccccag agcaggtcgt ggcaatcgcc 540

tccaacattg gcgggaaaca ggcactcgag actgtccagc gcctgcttcc cgtgctttgt 600

caggcacacg gcctcactcc ggaacaagtg gtcgcaatcg cctccaacat tggcgggaaa 660

caggcactcg agactgtcca gcgcctgctt cccgtgctgt gccaagcgca cggacttacc 720

ccagagcagg tcgtggcgat cgcaagccac gacggaggaa agcaagcctt ggaaacagta 780

cagaggctgt tgcctgtgct ttgtcaggca cacgggctca ctccggaaca agtggtcgca 840

atcgcctcca acattggcgg gaaacaggca ctcgagactg tccagcgcct gcttcccgtg 900

ctgtgccaag cgcacggcct taccccagag caggtcgtgg caatcgcctc caacattggc 960

gggaaacagg cactcgagac tgtccagcgc ctgcttcccg tgctgtgcca agcgcacgga 1020

ctaaccccag agcaggtcgt ggcaatcgcc tccaacattg gcgggaaaca ggcactcgag 1080

actgtccagc gcctgcttcc cgtgctgtgc caagcgcacg ggctcacccc agagcaggtc 1140

gtggcaatcg cgagcaataa cggcggaaaa caggctttgg aaacggtgca gaggctcctt 1200

ccagtgcttt gtcaggcaca cggcctcact ccggaacaag tggtcgcaat cgcctccaac 1260

attggcggga aacaggcact cgagactgtc cagcgcctgc ttcccgtgct gtgccaagcg 1320

cacgggctaa ccccagagca ggtcgtggca atcgcctcca acattggcgg gaaacaggca 1380

ctcgagactg tccagcgcct gcttcccgtg ctttgtcagg cacacggcct cactccggaa 1440

caagtggtcg caatcgcgag caataacggc ggaaaacagg ctttggaaac ggtgcagagg 1500

ctccttccag tgctgtgcca agcgcacgga 1530

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atctggccac tgatg 15

Claims

1.在真核细胞中产生靶基因的双等位基因敲除的方法，其包括：

向细胞提供TALEN质粒对，所述TALEN质粒对的识别序列用于识别靶基因；

使细胞表达TALEN蛋白，所述TALEN蛋白识别靶基因并切割靶基因；

测序筛选靶基因发生双等位基因敲除的真核细胞；

其中切割位点位于Fut8基因的Exon7上，相应的切割位点为atctggccactgatg（SEQ IDNO. 16），所述TALEN质粒对的识别序列为L2R2，L2序列为：ggataaaaaaagagtg，并且R2序列为：cctttaacaaagaaggg；

其中真核细胞是CHO细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中CHO细胞是CHO-K1、CHO-S、CHOK1SV、DG44或DXB11细胞。

3.哺乳动物细胞，其被使用如权利要求1-2任一项所述的方法进行靶基因的双等位基因敲除，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。

4.制备目标重组蛋白的方法，所述方法包括：

向真核细胞提供TALEN质粒对，所述TALEN质粒对的识别序列用于识别靶基因；

测序筛选靶基因发生双等位基因敲除的细胞；

使细胞表达目标重组蛋白；

其中真核细胞是CHO细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中真核细胞是CHO-K1、CHO-S、CHOK1SV、DG44或DXB11细胞。

6.双链多核苷酸，其包含：

TALEN质粒对，其识别序列用于识别靶基因，相应的切割位点为atctggccactgatg（SEQID NO. 16），所述TALEN质粒对的识别序列为L2R2，L2序列为：ggataaaaaaagagtg，并且R2序列为：cctttaacaaagaaggg。

7.TALEN技术用于在真核细胞中产生靶基因的双等位基因敲除的用途，其中测序筛选靶基因发生双等位基因敲除的真核细胞；

其中真核细胞是CHO细胞。

8.根据权利要求7所述的用途，其中真核细胞是CHO-K1、CHO-S、CHOK1SV、DG44或DXB11细胞。

9.根据权利要求1-2和4-5任一项所述的方法或权利要求7-8任一项所述的用途，其中测序为DNA直接测序。

10.根据权利要求1-2和4-5任一项所述的方法或权利要求7-8任一项所述的用途，其中筛选包括基于LCA的表型筛选和/或DNA直接测序筛选。