CN106167525A

CN106167525A - 筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用

Info

Publication number: CN106167525A
Application number: CN201610194325.7A
Authority: CN
Inventors: 朱晓东; 张海涛
Original assignee: Beijing Kang Ming Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Xuanzhu Biopharmaceutical Co Ltd; Beijing Xuanzhu Kangming Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-04-01
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2036-04-01
Also published as: CN106167525B

Abstract

筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用,本发明提供了构建表达抗体和IgG‑Fc融合蛋白岩藻糖缺陷型的宿主细胞方法及抗体和IgG‑Fc融合蛋白岩藻糖活性的检测方法，及此类细胞株的具体应用。本发明通过TALEN(和/或CRISPR)技术高效敲除生产抗体或IgG‑Fc融合蛋白工程细胞中的岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的表达来实现，通过小扁豆凝集素(LCA)加压、基因测序、流式细胞仪筛选方法，获得岩藻糖高效敲除的宿主细胞。并将岩藻糖缺陷的CHOK1宿主细胞株构建成表达抗体蛋白的稳定工程细胞株，获得抗体蛋白后进行糖型分析，结果表明岩藻糖敲除效率达99％以上。

Description

筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用

发明领域

本发明涉及利用现有的TALEN和/或CRISPR/CAS9技术，使CHO细胞的FUT8基因发生缺失或突变，进而使其产生岩藻糖的通路受阻，用此细胞株表达的抗体或IgG-Fc融合蛋白岩藻糖含量明显减少，且ADCC活性功能显著提高。

技术背景

本发明所用TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。

TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂(DSB，Double-Strand Breaks)，从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制(NHEJ,Non-homologous End Joining)修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误(缺失/插入)，从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。在生物医药领域,已经有很多研究将此技术应用到宿主细胞的改造，来提高宿主细胞生产蛋白的质量和活性。

本发明在其某些实施方式中涉及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，产生该细胞系的方法及其应用。

重组的治疗性抗体或IgG-Fc融合蛋白在治疗各种各样疾病中已发挥了重要作用。估计下一个十年中可能约30％新出现的药物基于抗体。已批准了30种重组抗体和Fc融合物进入市场，2008年销售额达到350亿美元。

抗体含有由重链和轻链可变区组成的靶抗原特异性区域。抗体的这个部分可结合和中和可溶性靶抗原或膜结合的靶抗原。

Fc部分通过抗体依赖的细胞毒(ADCC)机制、补体依赖的复合体和新生受体FcRn机制负责效应器功能。通过效应分子与铰链区和Fc的CH2区的相互作用介导了这些效应器功能。CH2区含有一个位于抗体297位N糖基化位点的寡糖，已知其在结合效应细胞中起着重要作用。该寡糖通常由具有相当大异质性的双触角型复合体如核心戊糖与附加的可变外糖残基一起组成。

ADCC是一种重要的抗体结合靶细胞膜配体的杀伤机制。白细胞上表达的Fc_yR能结合抗体的CH2区。一旦结合，与靶细胞上的抗原产生免疫复合体而启动白细胞活化。这种活化可包括吞噬和细胞介质的释放，这些介质导致细胞通透增加和死亡。ADCC活性一方面依赖于IgG同种型，另一方面依赖于特异性的Fc_yR。IgGl和IgG3可诱导这种活性，而IgG4则不能。能结合IgG并对ADCC激活机制重要的Fc_YR称为Fc_YRIIIa，其表达在NK细胞和巨噬细胞上。在许多情况下通过NK细胞与靶细胞的结合所获得的ADCC活性并不足以实施对靶细胞的杀伤。其原因是Fc_YRIIIa对IgGl的亲和力低。

与表达Fc_YRIIIa-158Phe的患者相比，见于10-15％人群的表达高亲和力同种异型Fc_YRIIIa-158Val的患者中，发现ADCC活性增强。也可通过对IgG-Fc操作来获得ADCC增强。利用计算机设计算法对抗体进行工程改造，并用高通量筛选来选择高亲和力抗体。这一工作产生了在体外显示效应器功能增强大于2个数量级的抗体(Lazar，Dang等；2006)，虽然测得突变的IgGl(含S239D、A330L和I332E的IgGl)热稳定性降低。获得ADCC增强的抗体的另一种方法是产生寡糖上297位的岩藻糖水平低的抗体。先前曾发现该寡糖上的岩藻糖残基可干扰Fc与Fc_YRIIIa的结合(Shinkawa，Nakamura等；2003)。获得低岩藻糖水平抗体的一种方法是采用具有这种天然能力的控制细胞，如大鼠杂交瘤YB2/0细胞(Shinkawa，Nakamura等；2003)，然而这些细胞产生的重组蛋白的岩藻糖含量水平是可变的。几种可能采用的其他非哺乳动物细胞包括Vivalis类的禽细胞，Biolex公司工程改造的水生植物浮萍(Cox,Sterling等；2006)和Igeneon公司的变种Physocmirtella苔藓(Nechansky，Schuster等；2007)。此外，GlycoFi制备了具有几种糖基化能力包括增强ADCC的多种毕赤酵母细胞系(Hamilton，Davidson等；2006)。也可采用几种哺乳动物细胞来制备具有各种通用糖基化能力特别是增强ADCC的抗体。Glycotope创造了多种糖基经工程改造的人细胞系以产生糖基优化的生物治疗剂。罗氏公司通过导入一种能催化形成涉及抗体依赖性细胞毒(ADCC)的二等份寡糖的糖基转移酶，0(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶IlKGnTIII)，获得了Glycart，一种能产生岩藻糖水平降低的重组抗体的基因工程细胞系，(Umana，Jean-Mairet等；1999)。Biowa公司制备了岩藻糖转移酶基因(Fut8)被敲除的CHO DG44细胞以降低岩藻糖水平(Yamane-Ohnuki,Kinoshita等；2004)。

近年研究证明在胞质内异源表达的原核酶，(3)P-6-脱氧-D-来苏糖-4-已酮糖还原酶，能阻断中间体GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖转变成终末产物，这在脊椎动物细胞中通常不会发生。因此，用这种方法修饰的CHO细胞分泌的抗体缺乏核心岩藻糖(von Horsten，Ogorek等)。另一种方法是制备能在毒性岩藻糖特异性凝集素存在下存活的凝集素抗性突变体。Lecl3细胞是基于在毒碗豆岩藻糖特异性凝集素存在下培育CHO细胞所产生的一种CHO细胞系(Ripka和Stanley,1986)。Lecl3细胞缺乏(3)P-甘露糖4，6-脱水酶活性，导致表达的人IgGl缺乏岩藻糖(Shields，Lai等；2002)。

美国专利申请No.2010/0081150报告了用化学方法处理和选择显示变体糖基化模式的细胞(包括用高剂量岩藻糖杀伤细胞以降低岩藻糖基化)所产生的CHO细胞突变体，以产生用于表达抗体的细胞。

美国专利申请No.2010/0304436报告了通过突变Fx蛋白和调控外源岩藻糖的利用度产生岩藻糖基化降低的CHO细胞系，以指导细胞岩藻糖基化多肽的能力。Kanda等(Kanda,Imai-Nishiya等，2007)公开了GMD和FUT8基因被敲除的宿主细胞系。该GMD敲除细胞具有与GMD外显子5，6和7区相应的基因组缺失。

Ripka等(Ripka和Stanley，1986)公开了4种凝集素抗性CHO突变细胞。通过用N-甲基-N-亚硝基胍培育产生这类突变。

Shields等(Shields,Lai等；2002)公开了Lecl3(岩藻糖缺陷的CHO)细胞系产生的IgGl提高了与Fc_YRIIIa的结合高达50倍，其ADCC也增强。

Kanda等(Kanda,Yamane-Ohnuki等，2006)公开了Lecl3细胞可产生50-70％岩藻糖基化的抗体，然而该已知的细胞系不能稳定产生抗体。因此Lecl3细胞系不适合作为生产细胞系。

在如Yamane-Ohnuki 2004和Kyowa Hakko专利所述的FUT8敲除细胞系中，抗体的产生需要将编码期望抗体的基因转染入已建立的敲除细胞系。需要一种有效的方法在期望细胞系中生产抗体，同时控制重组工程抗体的岩藻糖含量，并且无需每次都经历在选定细胞系中创建FUT8基因敲除的繁瑣过程。本发明满足了这种需要并且具有下文详述中显而易见的其它优势。

发明概述

本发明提供了更有效的TALEN和/或CRISPR/CAS9方法，产生抗体或IgG-Fc融合蛋白生产细胞系，同时降低岩藻糖含量，产生的抗体与哺乳动物细胞中以正常岩藻糖化水平合成的抗体或IgG-Fc融合蛋白相比ADCC有所提高。可采取这样的方法来构建较高抗体或IgG-Fc融合蛋白生产力和岩藻糖化水平较低的细胞系。这样的细胞系可用于抗体或IgG-Fc融合蛋白的规模化扩大生产，正如治疗用抗体的商业生产中的那样。因此，本发明提供了用于产生具有改进的ADCC的IgG抗体或IgG-Fc融合蛋白的方法，包括将至少一种编码抗体的核酸和编码靶向FUT8(SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.7)基因序列不同编码区的至少TALEN或CRISPR/CAS9核酸同时引入宿主细胞，其中抗体和在正常CHO细胞中表达产生的抗体相比，岩藻糖化降低的同时ADCC活性水平明显升高的抗体或IgG-Fc融合蛋白。

按照本发明某些实施方式的一个方面，提供选择CHO细胞用作表达重组蛋白的宿主细胞的方法，该方法包括：

使CHO细胞通过TALEN和/或CRISPR/CAS9方法从而在CHO细胞的细胞群中FUT8导入基因突变，

按照本发明某些实施方式的一个方面，提供按本发明上述方法如LCA方法、基因测序、流式细胞仪分选方法分离出岩藻糖高度缺陷的CHO细胞。

按照本发明某些实施方式的一个方面，提供经基因修饰能表达具有如SEQ IDNO.2和/或3所示核苷酸序列的突变FUT8分离的CHO细胞。

按照本发明某些实施方式的一个方面，提供含有本发明分离细胞的CHO细胞系。

按照本发明某些实施方式的一个方面，提供一种产生重组蛋白质的方法，即用含有编码该重组蛋白的核酸序列的聚核甘酸转染本发明分离的CHO细胞，在适合表达该重组蛋白的条件下培养该转染的CHO细胞和分离该蛋白质。

按照本发明某些实施方式，所述LCA部分包括FITC-LCA。

按照本发明某些实施方式，所述同类的结合部分附着于一可检测部分。

按照本发明某些实施方式，所述可检测部分包括荧光基团或磁性基团。

按照本发明某些实施方式，通过FACS分析和分选岩藻糖去除情况。

按照本发明某些实施方式，通过基因测序和序列比对方法实施所述筛选。

按照本发明某些实施方式，通过至少三轮流式细胞仪分选和LCA分选实施所述分选。

按照本发明某些实施方式，所述CHO细胞选自CHO-S、CHO-K1、CHO/DG44细胞。

按照本发明某些实施方式，所述分离的CHO细胞可表达野生型岩藻糖基转移酶-8(FUT8)。

按照本发明某些实施方式，所述分离的CHO细胞可表达突变的OTP-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)。

按照某些实施方式，所述重组蛋白是抗体。

按照某些实施方式，所述重组蛋白是IgG-Fc融合蛋白。

按照某些实施方式，所述抗体具有增强的ADCC。

按照某些实施方式，所述CHO细胞经基因修饰能表达突变的FUT8。

按照某些实施方式，FUT8的至少一个等位基因携带了至少一个可导致功能缺失的突变。

按照某些实施方式，FUT8的各个等位基因携带了至少一个可导致功能缺失的突变。

按照某些实施方式，当外部岩藻糖浓度为零时，所述蛋白的岩藻糖基化量为零。

除非另有说明，本说明书所用的所有技术和/或科学术语具有本发明所涉及领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然在实施或测试本发明实施方式时可采用与本说明书所述相似或等价的方法和材料，但是以下描述的是示范性的方法和/或材料。当发生冲突的情况下，本专利说明书，包括定义，将会予以控制。此外，所述材料、方法和实施例只是说明性的，并不意味着是必需的限制。

附图简述

图1：TALEN靶向FUT8基因外显子5和外显子7示意图。

图2-1：TALEN靶向FUT8基因L序列，连接到质粒上形成可复制的靶向质粒，用于同R序列组合进行TALEN方法，对FUT8基因进行有效地敲除。

图2-2：TALEN靶向FUT8基因R序列，连接到质粒上形成可复制的靶向质粒，用于同L序列组合进行TALEN方法，对FUT8基因进行有效地敲除。

图3：CRISPR/CAS9靶向FUT8蛋白分析与靶向序列设计。

图4A和4B：FUT8-TALEN质粒或质粒对和EGFP表达质粒20微克共转染到CHO-K1细胞中。用荧光显微镜检测转染效率。图4A为正常光源下细胞生长状态，图4B为在荧光状态下，观察到细胞周围具有较强的荧光信号，说明转染效率较高。

图5：使用T7E1酶，对TALEN方法处理后的细胞进行FUT8基因突变的鉴定，结果显示经过T7E1酶酶切，获得两条条带，与预期的220bp+280bp一致，表明筛选后的细胞库中有突变株。

图6：CHO-K1细胞经过TALEN敲除FUT8基因和LCA加压后，用FITC-LCA标记进行流式细胞仪分析。图显示没有加FITC-LCA标记，作为阴性对照，从图可以看出所有细胞的荧光强度处于较低水平。

图7：CHO-K1细胞经过TALEN敲除FUT8基因和LCA加压后，用FITC-LCA标记进行流式细胞仪分析。图显示加FITC-LCA标记，作为阳性对照，从图可以看出所有细胞的荧光强度处于较高水平。

图8：CHO-K1细胞经过TALEN敲除FUT8基因和LCA加压后，用FITC-LCA标记进行流式细胞仪分析。图显示加FITC-LCA标记后，从图可以看出D88克隆细胞株分成两部分，其中一部分荧光信号较弱，岩藻糖含量较低，另外一部分荧光强度与阴性对照相当，岩藻糖含量较高。

图9：CHO-K1细胞经过TALEN敲除FUT8基因和LCA加压后，用FITC-LCA标记进行流式细胞仪分析。图显示加FITC-LCA标记后，从图可以看出D58克隆细胞株分成两部分，其中一部分荧光信号较弱，岩藻糖含量较低，另外一部分荧光强度与阴性对照相当，岩藻糖含量较高。

图10：CHO-K1细胞经过TALEN敲除FUT8基因和LCA加压后，用FITC-LCA标记进行流式细胞仪分析。图显示加FITC-LCA标记后，从图可以看出D57克隆细胞株绝大部分荧光信号较弱，趋近于阴性对照水平，表明其岩藻糖含量非常低。

图11：CHO-K1细胞经过TALEN敲除FUT8基因和LCA加压后，用FITC-LCA标记进行流式细胞仪分析。图显示加FITC-LCA标记后，从图可以看出D24克隆细胞株绝大部分荧光信号较强，趋近于阳性对照水平，表明其岩藻糖含量非常高，其中有一小部分荧光之偏低细胞。

图12：使用岩藻糖敲除细胞株D57构建CK-219(KM219-13X)抗体工程细胞株，经过表达和纯化获得一定量高纯度抗体蛋白，N糖链经过PNGase F酶蛋白切割和2AB标记，最后经过HILIC层析柱检测，结果表明抗体中岩藻糖含量接近于零。

图13：使用岩藻糖敲除细胞株D57构建KM-211-4X/KM-219-4X(KM219-4X 239/CHO)抗体工程细胞株，经过表达和纯化获得一定量高纯度抗体蛋白，N糖链过PNGase F酶蛋白切割和2AB标记，在经过HILIC层析柱检测，结果表明抗体中岩藻糖含量接近于零。

图14：使用岩藻糖敲除细胞株D57构建KM211-D57-6(KM211-4C2)抗体工程细胞株，经过表达和纯化获得一定量高纯度抗体蛋白，N糖链经过PNGase F酶蛋白切割和2AB标记，在经过HILIC层析柱及UPLC设备检测，结果表明抗体中岩藻糖含量接近于零。

具体实施方式：

优选实施方案的详述

本发明的人源化治疗性抗体或IgG-Fc融合蛋白的生物学活性将至少包括抗体与人FcRn的结合，更优选与人和其它灵长类动物抗原(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩、狒狒)的结合。抗体会以不高于1X10-8的Kd值，优选不高于约1X10-9的Kd值结合靶点，而且在体内能够杀死或消减B细胞，优选与未用此类抗体处理的适宜的阴性对照相比至少达20％。B细胞消减可以是ADCC、CDC或其它机制其中一种或多种的结果。在本文中的疾病治疗的有些实施方案中，可能希望特定效应器功能或机制胜过其它的，而且优选以人源化2只H7的某些变体来实现那些生物学功能，诸如ADCC。

“Fv’是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠结构中散发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，促成结合抗原的氛基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域或是只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体在一级氛基酸序列方面相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。

例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降氐其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler etal.,Nature 256:495(1975)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,ColaSpring Harbor Laboratory Press,2en ed.1988；Hammerling et al.,in:MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas,563-681, Elsevier,N.Y.,1981)

本发明的治疗性抗体的“功能性片段”指那些保留与衍生它们的完整全长分子以基本上相同的亲和力，且根椐体外或体内测定法(诸如那些本文所述的)的测量显示出包括消减B细胞在内的生物学活性的片段。术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体间序列差异广泛的实情。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变域跨越的110个象基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸，称作“高变区”的极度变异的较短区域组成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institute ofHealth,Bethesda,MD(1991)恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氣基酸残基(例如VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中的残基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H)附近；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的残基26-32(H1)、52-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and lesk,J.Mol,Biol.196:901-917(1987))。

在本文中提及时，“共有序列”或共有V结构域序列指生自已知人免疫球蛋白可变区序列氨基酸序列比较的人工序列。基于这些比较，制备编码V结构域氛基酸序列的重组核酸序列，所述V结构域氨基酸序列是衍生自人κ链和人H链亚类III V结构域的共有序列。共有V序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和力。

“嵌合”抗体(免疫球蛋白)中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利US 4,816,567；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FV框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能诸如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的恒定区，尽管FR可包含一处或多处提高结合亲和力的氨基酸替代。FR中这些氨基酸替代的数目通常在重链中不超过6处，在轻链中不超过3处。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体化区(天然序列区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调B细胞活化。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγIII，而单核细胞表达FcγI、FcγII和FcγIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利NO.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利NO.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。

“人效应细胞”指表达一种或多种化II并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合抗体的FcR(γ受体)。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统笫一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所记载的。

具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利NO.6，194,551 B1和WO 99/51642。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184 2000)。

贯穿本说明书和权利要求书，除非另有说明，免疫球蛋白重链恒定域的残基编号方式是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991)中的EU索引的编号方式，在此明确收入作为参考。"如Kabat的21；EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。V区的残基依照Kabat编号方式编号，除非明确指明依序或其它编号系统。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％,最优选重量超过99％。(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

“载体”包括穿梭载体和表达栽体。典型的是，质粒构建物还将包含复制起点(例如ColE1复制起点)和选择标志(例如氨苄青霉素或四环素抗性)，分别用于质粒在细菌中的复制和选择。“表达载体”指包含在细菌或真核细胞中表达抗体包括本发明的抗体片段所必需的控制序列或调控元件的载体。下文公开了合适的载体。

术语“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是通过自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

实施例

实验性实施例

实施例1：TALEN靶向FUT8基因序列的设计与载体构建

1.Fut8基因的靶点信息如下:

Fut8CDS：黄色背景标出的为TALEN剪切DNA，形成移码突变的大致位置

ATGCGGGCATGGACTGGTTCCTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGACCTTATTGTTTTATATAGGTGGTCATTTGGTTCGAGATAATGACCACCCTGACCATTCTAGCAGAGAACTCTCCAAGATTCTTGCAAAGCTGGAGCGCTTAAAACAACAAAATGAAGACTTGAGGAGAATGGCTGAGTCTCTCCGAATACCAGAAGGCCCTATTGATCAGGGGACAGCTACAGGAAGAGTCCGTGTTTTAGAAGAACAGCTTGTTAAGGCCAAAGAACAGATTGAAAATTACAAGAAACAAGCTAGGAATGATCTGGGAAAGGATCATGAAATCTTAAGGAGGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTTCTACAAAGTGAATTGAAGAAATTAAAGAAATTAGAAGGAAACGAACTCCAAAGACATGCAGATGAAATTCTTTTGGATTTAGGACATCATGAAAGGTCTATCATGACAGATCTATACTACCTCAGTCAAACAGATGGAGCAGGTGAGTGGCGGGAAAAAGAAGCCAAAGATCTGACAGAGCTGGTCCAGCGGAGAATAACATATCTGCAGAATCCCAAGGACTGCAGCAAAGCCAGAAAGCTGGTATGTAATATCAACAAAGGCTGTGGCTATGGATGTCAACTCCATCATGTGGTTTACTGCTTCATGATTGCTTATGGCACCCAGCGAACACTCATCTTGGAATCTCAGAATTGGCGCTATGCTACTGGAGGATGGGAGACTGTGTTTAGACCTGTAAGTGAGACATGCACAGACAGGTCTGGCCTCTCCACTGGACACTGGTCAGGTGAAGTGAAGGACAAAAATGTTCAAGTGGTCGAGCTCCCCATTGTAGACAGCCTCCATCCTCGTCCTCCTTACTTACCCTTGGCTGTACCAGAAGACCTTGCAGATCGACTCCTGAGAGTCCATGGTGATCCTGCAGTGTGGTGGGTATCCCAGTTTGTCAAATACTTGATCCGTCCACAACCTTGGCTGGAAAGGGAAATAGAAGAAACCACCAAGAAGCTTGGCTTCAAACATCCAGTTATTGGAGTCCATGTCAGACGCACTGACAAAGTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCATCCCATTGAGGAATACATGGTACACGTTGAAGAACATTTTCAGCTTCTCGAACGCAGAATGAAAGTGGATAAAAAAAGAGTGTATCTGGCCACTGATGACCCTTCTTTGTTAAAGGAGGCAAAGACAAAGTACTCCAATTATGAATTTATTAGTGATAACTCTATTTCTTGGTCAGCTGGACTACACAACCGATACACAGAAAATTCACTTCGGGGCGTGATCCTGGATATACACTTTCTCTCCCAGGCTGACTTCCTTGTGTGTACTTTTTCATCCCAGGTCTGTAGGGTTGCTTATGAAATCATGCAAACACTGCATCCTGATGCCTCTGCAAACTTCCATTCTTTAGATGACATCTACTATTTTGGAGGCCAAAATGCCCACAACCAGATTGCAGTTTATCCTCACCAACCTCGAACTAAAGAGGAAATCCCCATGGAACCTGGAGATATCATTGGTGTGGCTGGAAACCATTGGAATGGTTACTCTAAAGGTGTCAACAGAAAACTAGGAAAAACAGGCCTGTACCCTTCCTACAAAGTCCGAGAGAAGATAGAAACAGTCAAATACCCTACATATCCTGAAGCTGAAAAATAG(SEQ ID NO.1)

2.针对外显子1设计TALEN

基因组序列如下：外显子1

GAACCATTTGTTATCAGGTAGAACCCTAACGTGTGTGGTTGACTTAAAGTGTTTACTTTTTACCTGATACTGGGTAGCTAATTGTCTTTCAGCCTCCTGGCCAAAGATACCATGAAAGTCAACTTACGTTGTATTCTATATCTCAAACAACTCAGGGTGTTTCTTACTCTTTCCACAGCATGTAGAGCCCAGGAAGCACAGGACAAGAAAGCTGCCTCCTTGTATCACCAGGAAG ATCTTTTTGTAAGAGTCATCACAGTATACCAGAGAGACTAATTTTGTCTGAAGCATCATGTGTTGAAACAACAGAAACTTATTTTCCTGTGTGGCTAACTAGAACCAGAGTACAATGTTTCCAATTCTTTGAGCTCCGAGAAGACAGAAGGGAGTTGAAACTCTGAAAATGCGGGCATGGACTGGTTCCTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGACCTTATTGTTTTATATAGGTGGTCATTTGGTTCGAGATAATGACCACCCTGACCATTCTAGCAGAGAACTCTCGCTGGAGCGCTTAAAACAACAAAATGAAGACTTGAGGAGAATGGCTGAGTCTCTCCGGTAGGTTTGAAATACTCAAGGATTTGATGAAATACTGTGCTTGACCTTTAGGTATAGGGTCTCAGTCTGCTGTTGAAAAATATAATTTCTACAAACCGTCTTTGTAAAATTTTAAGTATTGTAGCAGACTTTTTAAAAGTCAGTGATACATCTATATAGTCAATATAGGTTTACATAGTTGCAATCTTATTTTGCATATGAATCAGTATATAGAAGCAGTGGCATTTATATGCTTATGTTGCATTTACAATTATGTTTAGACGAACACAAACTTTATGTGATTTGGATTAGTGCTCATTAAATTTTTTTATTCTATGGACTACAACAGAGACATAAATTTTGAAAGGCTTAGTTACTCTTAAATTCTTATGATGAAAAGCAAAAATTCATTGTTAAATAGAACAGTGCATCTGGAATGTGGGTAATTATTGCCATATTTCTAGTCTACTAAAAATTGTGGCATAACTGTTCAAAGTCATCAGTTGTTTGGAAAGCCAAAGTCTGATTTAAATGGAAAACATAAACAATGATATCTATTTCTAGATACCTTTAACTTGCAGTTACTGAGTTTACAAGTTGTCTGACAACTTTGGATTCTCTTACTTCATATCTAAGAATGATCATGTGTACAGTGCTTACTGTCACTTTAAAAAACTGCAGGGCTAGACATGCAGATATGAAGACTTTGACATTAGATGTGGTAATTGGCACTACCAGCAAGTGGTATTAAGATACAGCTGAATATATTACTTTTTGAGGAACATAATTCATGAATGGAAAGTGGAGCATTAGAGAGGATGCCTTCTGGCTCTCCCACACCACTGTTTGCATCCA(SEQ IDNO.2)

T TCTAGCAGAGAACTCTCGCTGGAGCGCTTAAAAC A(SEQ ID NO.3)其中

TALEN-b-L:TCTAGCAGAGAACTCTC 17bp(SEQ ID NO.4)

对应RVD:NG HD NG NI NN HD NI NN NI NN NI NI HD NG HD NG HD

TALEN-b-R:GTTTTAAGCGCTCCAGC 17bp(SEQ ID NO.5)

对应RVD:NN NG NG NG NG NI NI NN HD NN HD NG HD HD NI NN HD

Spacer b:(SEQ ID NO.6)

突变体检测酶:核酸内切酶T7E1酶

3.针对外显子5和外显子7设计TALEN

Design 2

TALEN-1-L:TATTCTTTGCAGATCTGG(SEQ ID NO.17)

TALEN-1-R:TCAATCCTCCTCCTTAAG(SEQ ID NO.18)

Spacer 1:GAAAGGATCATGAAAT(SEQ ID NO.19)

Design 3

TALEN-2-L:TTTCTCTGGAAGAATCCC(SEQ ID NO.20)

TALEN-2-R:TTACATACCAGCTTTCTG(SEQ ID NO.21)

Spacer 2:AAGGACTGCAGCAAAGC(SEQ ID NO.22)

Talen specific primers

Talen-1-F:GGACAGCTACAGGAAGAGTCCGTG(SEQ ID NO.23)

Talen-1-R:TCATCTGCATGTCTTTGGAGTTCG(SEQ ID NO.24)

Talen-2-F:GCTGAATCAGCTCTGACTTATTGTGTG(SEQ ID NO.25)

Talen-2-R:AGTAGCATAGCGCCAATTCTGAGATT(SEQ ID NO.26)

4.TALEN设计序列载体构建

将TALE识别模块和TALEN骨架载体(含有TAL的其他必须结构域及FokI表达序列)进行连接，左边和右边识别序列分别连接到不同质粒，得到完整的TALEN质粒。

实施例2：CRISPR/CAS9靶向FUT8基因序列的设计与载体构建

1.Cas9/gRNA的构建、靶点的设计与合成：

Fut8序列信息：

绿色背景：剪切DNA，形成移码突变的大致位置

黄色背景：Cas9/gRNA剪切DNA，形成移码突变的大致位置

根据蛋白保守区分析，大约是180aa处(位于外显子4)开始为Fut8超级家族的保守区，因此选择外显子4,外显子5作为设计gRNA靶点的DNA区域。

CHO Fut8基因组序列：外显子4

外显子5:

设计用于基因敲除的gRNA靶点：灰色背景为PAM序列

gRNA靶位点位置1:CCAGCTCTGTCAGATCTT

反向互补：CCAAAGATCTGACAGAGCTGG(SEQ ID NO.8)

gRNA靶位点位置2:TATTACATACCAGCTTTC

反向互补：CCAGAAAGCTGGTATGTAATA(SEQ ID NO.9)

gRNA靶位点位置3:GCTCCATCTGTTTGACTG

反向互补：CCTCAGTCAAACAGATGGAGC(SEQ ID NO.10)

实施例3：TALEN法敲除CHOK1细胞FUT8基因及单克隆分选

一、细胞培养与转染

下列步骤适用于6孔板培养的哺乳动物细胞，至于其他培养材料，请参考转染规模调整，所有数量和体积均是按孔计算。大部分细胞系所使用的DNA(ug)与Lipofectamin2000(ul)的比值为1:2到1:3，转染高密度细胞可获得高转染效率、高表达水平和低细胞毒性。优化转染是必需的(见DNA转染优化表)。

1.悬浮细胞：在配制转染试剂前，每孔2-4×10⁶个细胞接种于1.5ml不含抗生素的培养基中。

2.转染试剂制备，每孔细胞用量如下：

A.用250ul CD OptiCHO低血清培养基(或者其他无血清培养基)稀释质粒DNA(TALEN-2L和TALEN-2R质粒各2ug)，轻轻混匀。

B.使用前轻轻摇匀Lipofectamine 2000，然后取适量Lipofectamine 2000(10ul)在250ul CD OptiCHO培养基中稀释，室温孵育5分钟。注意：请在25分钟内进行下一步操作。

C.将前两步所稀释的DNA和Lipofectamine 2000混合(使总体积为500ul)，轻轻混匀，室温放置20分钟(溶液可出现浑浊)。注意：转染复合物常温下可在6小时内保持稳定。

3.在每孔细胞中加入500ul转染试剂，轻轻摇匀。

4.37℃，5％CO2培养箱培养。在转染24小时后以1:10稀释接种于新鲜培养基中，第3-5天可加入含筛选试剂的培养基。

表1：不同转染体系所需的培养基和DNA比列

二、Hygromycin和LCA筛选

1、使用50、100、200、500、1000ug/ml的Hygromycin培养CHOK1细胞，初步确定细胞杀伤的最佳浓度。利用最佳杀伤浓度培养及进行筛选转染后的细胞株(1x6孔板)，在3-4天后观察细胞生长状态，如果细胞生长状态良好则加大Hygromycin的浓度至200ug/ml，当细胞存活率为10％左右，换新鲜培养基进行下一步功能筛选和单克隆分选。

三、进行LCA加压筛选

转染五天后(2x6孔板)，通过在培养基中添加50ug/ml扁豆凝集素(LCA)来筛选FUT8基因敲除细胞(LCA；Vector Laboratories,Peterborough,UK)，使用的是5mg/ml LCA(10mM HEPES/氢氧化钠，pH 8.5，0.15mm NaCl、CaCl2溶液为0.1mm)溶液。发光视野成像使用celigo 成像流式细胞仪(Brooks Automation)。经过7天的选择(12天)，使用基因组提取试剂盒提取基因组DNA。同时，细胞接种于完全培养基(不含LCA)。

四、岩藻糖缺失单克隆细胞分选

将经过约7天(Day 12)的LCA和Hygromycin筛选获得基因敲除阳性细胞株，通过有限稀释方法分单克隆细胞至96孔板内(10块)。37℃，5％CO2培养箱培养。待细胞扩增至一定数量，进行基因水平和功能水平的验证。另外，此步骤视实际操作情况，可以使用FACS和LCA-FITC进行高通量细胞株分选，获得单克隆细胞株。

实施例4：T7E1酶酶切检定

1、非配对内切酶法-T7E1法原理：

以细胞基因组DNA为模板做PCR,将相应的PCR产物退火杂交。若发生突变，将产生非配对DNA片段，即能被非配对内切酶T7核酸内切酶I剪切；若没有发生突变，将产生配对DNA片段，而无法被非配对内切酶T7核酸内切酶I剪切。

2、引物设计：

针对靶位点位置设计PCR引物如下：

3、实验过程：

1)取Fut8-TALEN质粒对20微克转染到CHO-K1细胞中。转染照片如下图:

2)转染后的细胞培养五天，之后加入LCA进行初步筛选，筛选七天后，除去LCA，加入新鲜培养基培养一天，提取细胞基因组DNA，检测突变率。

3)检测突变率：用引物扩增细胞基因组DNA，分两组：突变型的细胞和野生型细胞，纯化PCR产物，定量。将突变型DNA与野生型DNA的PCR产物按照如下体系进行混合，加热95℃，5分钟，自然冷却，退火杂交。

表2：PCR扩增体系

将处理好的PCR产物混合物，用T7E1(北京唯尚立德，货号：E001S)酶切检测突变率。CHO-FUT8基因的突变率检测酶切结果如图所示：

结果显示：T7E1切出两条条带，与预期的220bp+280bp一致，表明筛选后的细胞库中有突变株。

实施例5：基因测序分选突变克隆细胞株及检定

TALEN突变首先采用基因测序的方法进行验证分析。通过cFUT8特异的PCR引物，对其进行Talen特异性扩增引物扩增。所使用的引物如下:

Talen-1-F:GGACAGCTACAGGAAGAGTCCGTG(SEQ ID NO.13)

Talen-1-R:TCATCTGCATGTCTTTGGAGTTCG(SEQ ID NO.14)

Talen-2-F:GCTGAATCAGCTCTGACTTATTGTGTG(SEQ ID NO.15)

Talen-2-R:AGTAGCATAGCGCCAATTCTGAGATT(SEQ ID NO.16)

使用预先设计的引物进行测序，将不同克隆所获得的测序结果进行比对，寻找发生有效突变的序列。

实施例6：流式细胞仪分析

LCA-FITC功能分析

在细胞经过13天的培养后，在室温将细胞孵育在含20mg/ml荧光素-LCA的完全培养基中45min(Vector Laboratories)，每毫升培养基中加两滴nucblue1活readyprobes(Life Technologies)。细胞用完全培养液洗三次，使用装有LEAP软件的荧光显微镜(Intrexon,Germantown,MD)进行检测，采用双通道成像，使用NucBlue染色作为检测目标1，使用绿色荧光标记的LCA作为检测目标2。

实施例7：抗体细胞株构建

一、细胞培养与电转

1.悬浮细胞培养

细胞活率在98％以上，细胞以5x10⁶—1x10⁷cells/ml密度接种于电转缓冲液。

2.电转

取0.7ml已接种细胞的电转缓冲液于0.4cm电转杯中，加入质粒，质粒浓度一般20-50ug/ml，轻轻混匀。在300V，15ms的条件下电击一次，稀释到6ml培养基中，以每孔3.35ml接种于六孔板中。

3.培养

37℃，5％CO2培养箱培养。在电转4-8小时后离心换液，接种于新鲜培养基(无谷氨酰胺)中，第2天加入筛选试剂。

二.MSX筛选

1.使用起始浓度25um/ml的MSX进行筛选，2-3天后观察细胞生长状态，当细胞碎片比较多时，换新鲜培养基，继续使用25um/ml的MSX进行加压，持续一周。

2.加压约一周后，换新鲜培养基，使用50um/ml的MSX进行加压，持续1-2周。

三.单克隆分选

1.有限稀释法挑选单克隆

将经过约2周的MSX筛选获得混合细胞株，通过有限稀释方法分单克隆细胞至96孔板内(8-10块)。37℃，5％CO2培养箱培养，待细胞扩增至一定数量，进行ELISA验证。

2.Clonepix挑选单克隆

将半固体培养基与荧光检测抗体按照说明书混匀，以每孔2.5ml铺于6孔板，边孔加入1ml无菌水，每孔加入计算好的细胞，每孔约1000-3000个，如有需要可以做一个梯度预实验摸索最佳比例。37℃，5％CO2培养箱培养约2周左右，进行Clonepix2分选。待挑选出的单克隆扩增至一定数量，进行ELISA验证。

四.单克隆放大和后续验证

待96孔板内单克隆扩增至一定数量，挑选阳性克隆依次放大到24孔板、6孔板、125ml摇瓶，然后进行Titer检测确定表达量。

实施例8：单克隆抗体糖型分析

一、样品的去糖基化处理

取100μL 10mM pH8.6的甲酸铵溶液，离心力选择14000g，离心洗超滤管。取500μg样品或对照品置于超滤离心管中，离心弃去穿透液。取400μL 10mM pH8.6的甲酸铵溶液离心洗两次，弃去穿透液。加入100μL 50倍稀释的PNGase F酶蛋白溶液至超滤离心管中，45℃酶切3小时，离心收集穿透液，并冻干，待2-AB荧光标记。2AB标记荧光标记试剂选用SIGNAL2-AB LABELING KIT(Prozyme公司)，每个样品用5μL 2AB标记试剂标记，65℃孵育2小时。

三、UPLC分析样品

3.1色谱条件

色谱系统：Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Glycan

柱温：60℃

流动相A：100％乙腈，流动相B：100mM Ammonium formate,pH4.4

FLR检测器：激发波长330nm，吸收波长420nm

梯度：见下表

表3：UPLC运行参数

	时间(分钟)	流速	流动相A(％)	流动相B(％)
					1	0	0.4	90	10
2	60	0.4	50	50
					3	60.1	0.25	5	95
4	65	0.25	5	95
					5	66	0.25	90	10
6	67	0.4	90	10
					7	75	0.4	90	10

待测样品加入25μL超纯水和70μL纯乙腈混合均匀，层析上样量为40μL。

3.2数据处理

对糖基化分析样品和对照品的色谱峰进行积分和比例计算，得到各色谱峰的峰面积及相对的百分比含量。每次实验均加入已知糖型结构的标准品作对照，样品色谱图与标准品色谱图比较，得出糖基分析样品所要关注峰(G0F、G1F、G2F)的峰面积及相对比例。

四、检测结果:

对照品(黑色)与糖基分析样品(红色或蓝色)色谱图比较展示如下。

通过与标准品的对比，KM-219的糖基化在成分上有明显不同，KM-219抗体中的岩藻糖基化基本缺失。其中，从图中可以判断G0F、G1F、G2F转换成G0、G1、G2。

通过与标准品的对比，KM-219-4X-K1的糖基化在成分与标准品类似，含有常见的G0F、G1F和G2F，而KM-219-4X-D57的糖基化与标准品的有较大差别，G0F、G1F和G2F均变成G0、G1、G2。

通过与标准品的对比，KM211-D57-6的糖基化在成分与KM-219-4X-D57类似，初步判断可能是抗体中岩藻糖基化发生缺失。

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本申请中所引用的参考文献，包括专利、已公布的申请和其它出版物，在此收入作为参考。

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Claims

1.在哺乳动物宿主细胞中产生包含低抗体或IgG-Fc融合蛋白岩藻糖含量抗体的方法，包括将至少一种编码靶向FUT8基因序列SEQ ID NO.1和FUT8基因Exon1区域的不同编码区的至少一种TALEN(和/或CRISPR/CAS9)的载体同时引入宿主细胞，抑制fut8的表达并降低抗体或IgG-Fc融合蛋白的岩藻糖化水平，通过LCA方法分选获得岩藻糖缺陷型的稳定宿主细胞株。

2.权利要求1的方法，其中靶向FUT8基因的TALEN编码TALEN-1和2序列的TALEN-L、TALEN-R和Spacer序列分别选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22进行序列分析所使用的PCR引物选自SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26。

3.权利要求1的方法，其中靶向FUT8基因的CRISPR/CAS9编码序列分别选自SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10。

4.权利要求2的方法，其中编码TALEN-L、TALEN-R和Spacer的核酸在同一载体上。

5.权利要求1的方法，其中TALEN方法可以单独使用也可以和CRISPR/CAS9方法联合使用，用于FUT8基因的缺失或突变。

6.权利要求3的方法，其中TALEN的表达载体在CMV启动子的控制下表达。

7.权利要求1的方法，其中的宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物。

8.权利要求1的方法，其中的抗体岩藻糖化水平降低至少90％以上。

9.权利要求1的方法，其中的岩藻糖敲出细胞株，采用LCA加压、基因测序和流式细胞仪分选等方法。

10.权利要求1的方法，其中所产生的抗体或IgG-Fc融合蛋白是治疗用。

11.权利要求1所述方法生产的具有增强ADCC活性的抗体或IgG-Fc融合蛋白。