NO344608B1 - Farmasøytisk sammensetning omfattende et monoklonalt antistoff og anvendelse av et monoklonalt antistoff for å fremstille en farmasøytisk sammensetning - Google Patents

Farmasøytisk sammensetning omfattende et monoklonalt antistoff og anvendelse av et monoklonalt antistoff for å fremstille en farmasøytisk sammensetning Download PDF

Info

Publication number
NO344608B1
NO344608B1 NO20063197A NO20063197A NO344608B1 NO 344608 B1 NO344608 B1 NO 344608B1 NO 20063197 A NO20063197 A NO 20063197A NO 20063197 A NO20063197 A NO 20063197A NO 344608 B1 NO344608 B1 NO 344608B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
cells
seq
heavy chain
variable region
Prior art date
Application number
NO20063197A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20063197L (no
Inventor
Nobuaki Takahashi
Toru Miura
Yoshinori Kitagawa
Aki Hirano
Original Assignee
Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Kirin Co Ltd
Publication of NO20063197L publication Critical patent/NO20063197L/no
Publication of NO344608B1 publication Critical patent/NO344608B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse angår et anti-CD40 antistoff som gjenkjenner CD40 som er en type cellemembranmolekyler forbundet med immunitet. Videre angår foreliggende oppfinnelse et antistoff med en mutasjon i den konstante regionen av det humane antistoffet eller med en subklasse hvor dens andel er substituert for å redusere en ADCC og/eller CDC-aktivitet, mens en agonistisk eller antagonistisk aktivitet beholdes.
Kjent teknikk
I. CD40
CD40 er et antigen med en molekylvekt på 50 kDa som er til stede på overflaten av cellemembranen og uttrykkes i B-celler, dendrittiske celler (DC’ er), noen typer av kreftceller og thymusepitelceller. CD40 er kjent å ha en viktig funksjon i proliferasjon og differensiering av B-celler og DC’er. CD40 ble identifisert som et antigen uttrykt på overflaten av humane B-celler (E. A. Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; og I. Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989) og har blitt betraktet som et medlem av TNF-reseptorfamilien som omfatter lavaffmitets NGF-reseptorer, TNF-reseptorer, CD27, 0X40 og CD30. Ligander (CD40L’er) for humane og murine CD40’er er nylig klonet og funnet å være membranproteiner type Π og uttrykt i aktiverte CD4+T-celler. CD40L er også funnet å gi sterke signaler for aktivering til humane eller murine B-celler.
I dendrittiske celler har CD40 blitt observert å uttrykkes i større monn enn i B-celler og det har blitt klart at CD40 har en viktig funksjon i dendrittiske celler. Binding av CD40 til CD40L aktiverer antigenpresenterende celler (APC), dvs. uttrykker kostimulator-molekyler slik som CD80 (B7-1) og CD86 (B7-2) eller forbedrer produksjonen av IL-2 (Caux, C., et al.: Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp. Med., 180: 1263, 1994; og Shu, U., et al.: Activated T cells induce interleukin- 12 production by monocyte via CD40 - CD40 ligand interaction. Eur. J. Immunol., 25: 1125, 1995). Dendrittiske celler har en stor antigenpresenterende kapasitet og stor kapasitet med hensyn til å aktivere hjelper T (Th)-celler. Dendrittiske celler er også antatt å kontrollere differensiering av naive Th-celler til Thl eller Th2-celler. Når perifere blod monocytter, som er myeloid dendrittiske celler, dyrkes i nærvær av GM-CSF og IL-4, og modens ved CD40L, kan de resulterende modne dendrittiske cellene (DCl) produsere IL-12 in vitro og stimulere og aktivere allogene naive Th-celler til å indusere IFNy-produserende T-celler (dvs. fremme deres differensiering til Thl). Denne funksjonen hemmes av anti-IL-12 antistoff og kan følgelig bevirkes gjennom IL-12. På den annen side, når plasmacytoide T-celler, som er til stede i lymfoide T regioner og perifert blod, dyrkes i nærvær av IL-3 og CD40-ligand, er de resulterende lymfoide dendrittiske cellene (DC2) vist å være ute av stand til å produsere IL-12 og stimulere og aktivere allogene naive Th-celler til å indusere IL-4-produserende T-celler, hvilket indikerer fremming av deres differensiering til Th2. Det er antatt at Thl -celler er involvert i aktivering av cellulær immunitet, mens Th2-celler er forbundet med forbedring av humoral immunitet så vel som restriksjon av cellulær immunitet. Når cytotoksiske T-celler (CTL) aktiveres ved hjelp av Thl-celler, kan de fjerne patogener (flere typer virus, listeria, tuberkulose bakterier, toksoplasma protozoer, osv.) som vokser i cytoplasma og tumorceller.
Monoklonale anti-CD40-antistoffer, som gjenkjenner CD40 uttrykt på membranoverflaten, er vist å ha forskjellige biologiske aktiviteter i forhold til B-celler. Monoklonale anti-CD40-antistoffer er generelt klassifisert i agonistiske eller antagonistiske antistoffer mot interaksjonen mellom CD40 og CD40L.
2. Agoni sti ske anti stoffer
Agonistiske antistoffer er kjent å aktivere B-celler. For eksempel er anti-CD40-antistoffene angitt å indusere celleadhesjon (Barrett et al., J. Immunol. 146: 1722, 1991; og Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1998), øke cellestørrelse (Gordon et al., J. Immunol.
140: 1425, 1998; og Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989), indusere celledeling av B-celler aktivert kun ved et anti-IgM-anti stoff, anti-CD20-antistoff eller forbolester (Clark og Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; Gordon et al., LEUCOCYTE TYPING II A. J. McMicheal ed. Oxford University Press. Oxford, s. 426; og Paulie et al., J. Immunol. 142: 590, 1989), indusere celledeling av B-celler i nærvær av IL4 (Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; og Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987), indusere ekspresjon av IgE ved dyrkede celler stimulert med IL-4 og deprivert for T-celler (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; og Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991), indusere ekspresjon av IgG og IgM ved de dyrkede cellene (Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991), utskille løselig CD23/FceRII fra celler via IL-4 (Gordon og Guy, Immunol. Today 8: 39, 1987; og Caims et al., Eur. J. Immunol. 18: 349, 1988), forbedre ekspresjon av løselig CD23/FceRII i cellene via IL4 (Challa, A., Allergy, 54: 576, 1999) og fremme IL-6-produksjon (Clark og Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990). Videre er det angitt at tilsetning av IL-4 og et anti-CD40-antistoff til primærkultur av humane B-celler i nærvær av CDw32 adhesive celler førte til etablering av klonede B-celler avledet derfra (Bancherauet et al., Science 241: 70, 1991) og apoptose av kimsenter (” germinal center”)celler ble hemmet gjennom CD40 uavhengig av hvorvidt dens antigenreseptor var aktiv eller inaktiv (Liu et al., Nature 342: 929, 1989). Som beskrevet ovenfor har CD40 blitt identifisert som antigen uttrykt på overflaten av humane B-celler og følgelig, har det meste av de isolerte antistoffene blitt vurdert, som et kjennetegn, hovedsakelig ved anvendelse av deres induksjon potens for proliferasjon og/eller differensiering av humane B-celler eller deres induksjon aktivitet for celledød av kreftceller (Katira, A. et al., LEUCOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. s. 547. Oxford University Press. Oxford; W. C. Flansow et. al., LEUCOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. s.555. Oxford University Press. Oxford; og J. D. Pound et. al., International Immunology, 11: 11, 1999).
Anti-CD40-antistoffet har blitt vist å modne DC (Z. H. Zhou et. al., Hybridoma, 18: 471, 1999). Videre ble CD4 T-cellers rolle ved priming av antigen-spesifikke CD8 T-celler angitt å være ved aktivering av DC via CD40 - CD40L-signalering, og anti-CD40 monoklonalt antistoff (mAb) er funnet å være i stand til å erstatte CD40 hjelper T-celler ved aktivering av dendrittiske celler (DC) (Shoenberger, S. P., et. al.: T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40 - CD40L interactions. Nature, 480, 1998). Likeså har administrering av et anti-CD40-antistoff til mus funnet å kunne beskytte dyret mot CD40-uttrykkende tumorceller så vel som CD40 ikke-uttrykkende tumorceller (French, R. R., et. al.: CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell respons that eradicates lymphoma and bypasses T-cell help. Nature Medicine, 5, 1999).
Agonistiske anti-CD40-antistoffer er forventet å være effektive for behandling av infeksiøse sykdommer, som skyldes bakterier, virus, osv., kreft og andre, basert på deres funksjoner beskrevet ovenfor. Anti-CD40-antistoffer med overlegne agonistiske aktiviteter er beskrevet i WO 02/088186. Representative eksempler på disse agonistiske antistoffene er KM341-1-19 og 2105-antistoffer. Hybridomet KM341-1-19 som produserer KM341-1-19-anti stoffet og hybridomet 2105 som produserer 2105-antistoffet ble innlevert den 27. september, 2001 og 17. april, 2002, henholdsvis, for internasjonal deponering i henhold til Budapestkonvensjonen, til International Patent Organisms Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (central 6, 1-1, Higashi 1, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Deres aksesjonsnumre er FERM BP-7759 (KM341-1-19) og FERM BP-8024 (2105).
3. Antagonistisk antistoffer
Tatt i betraktning, på den annen side, at CD40 har en viktig funksjon i immunologiske responser, som nevnt ovenfor, er det forventet at hemming av binding av CD40 til dens Ugander ville føre til utvikling av terapeutiske midler for immunsuppresjon ved organtransplantasjon og autoimmune sykdommer. Sawada, Hase og andre har angitt at det perifere blodet til pasienter som lider av Crohns sykdom har en høyere prosenantdel av monocytter som uttrykker CD40 i stort monn. Imidlertid har likevel ikke slike antistoffer vært kjent som hemmer binding av CD40 til dens ligander. Disse inhibitoriske antistoffene ville være anvendelige ved funksjonell analyse av CD40 og behandling av sykdommer som krever aktivering av CD40. Inhibitoriske antistoffer mot CD40-ligander er også antydet å være effektive mot sykdommer som omfatter binding av CD40 til CD40-ligandene.
Imidlertid ble CD40L angitt å uttrykkes i aktiverte blodplater (V. Henn et al., Nature 391 : 591, 1998) og dersom et anti-CD40L-antistoff blir anvendt som et terapeutisk middel, kan trombedannelse angivelig forekomme (T. Kawai et al., Nat. Med. 6: 114, 2000). Fra dette synspunkt er antistoffer mot CD40 forventet å være sikrere heller enn anti-CD40L antistoffer som terapeutiske antistoffer for å hemme binding av CD40 til dens ligander. Anti-CD40 antistoffer ville være nødvendige for å hemme binding av CD40L til CD40 og fortsatt ikke aktivere CD40 i seg selv.
Slike antagonistiske anti-CD40-antistoffer kan anvendes for behandling av autoimmune sykdommer og suppresjon av immunologiske avstøtninger ved transplantasjon av organer, benmarg, osv., i betraktning av deres funksjoner beskrevet ovenfor. Anti-CD40-antistoffer med overlegne antagonistiske aktiviteter er beskrevet i WO 02/088186. Et representativt eksempel på de antagonistiske antistoffene er 4D11 -antistoff. Hybridomet 4D11 som produserer 4D11 -antistoff ble innlevert den 27. september, 2001 for internasjonal deponering i henhold til Budapestkonvensjonen, til International Patent Organisms Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (central 6, 1-1, Higashi 1, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Aksesjonsnummeret er FERM BP-7758.
Patentdokument 1 WO 02/088186 omtaler et antistoff med agonisme eller antagonisme mot CD40 eller dets funksjonelle fragment. Patentdokument WO 00/61637 omtaler erythropoietinreseptoragonister og -antagonister og deres anvendelse i å forsterke erythropoiese. Patentdokument WO 00/18804 omtaler Tie2-reseptoragonistantistoffer, deres anvendelse i å forsterke angiogenese og andre anvendelser.
Sammenfatning
Et aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter en farmasøytisk sammensetning for forebygging eller behandling av transplantatavstøtning, autoimmune sykdommer, allergi eller blodkoaguleringsfaktor VIII inhibisjon. Den farmasøytiske sammensetninger omfatter et monoklonalt antistoff som en aktiv ingrediens. Det monoklonale antistoffet består av to tunge kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra Q i posisjon 27 til K i posisjon 474 i SED ID NO: 140 og to lette kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra A i posisjon 23 til C i posisjon 235 i SEQ ID NO: 142.
Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et monoklonalt antistoff for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for forebygging eller behandling av transplantatavstøtning, autoimmune sykdommer, allergi eller blodkoaguleringsfaktor Vin inhibisjon. Det monoklonale antistoffet består av to tunge kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra Q i posisjon 27 til K i posisjon 474 i SED ID NO: 140 og to lette kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra A i posisjon 23 til C i posisjon 235 i SEQ ID NO: 142.
Beskrivelse av oppfinnelsen
Formålet ifølge foreliggende oppfinnelse er å frembringe mutanter fra de potensielt terapeutiske anti-CD40-antistoffene beskrevet i WO 02/088186, hvilke mutanter er utformet optimalt som farmasøytisk middel.
Som et resultat av omfattende og intensiv forskning, har foreliggende oppfinnere med hell frembrakt nye mutanter av de agonistiske eller antagonistiske antistoffene, hvilke mutanter kan ha en høyere terapeutisk effekt mot sykdommer enn kjente anti-CD40 antistoffer, og fullført foreliggende oppfinnelse basert derpå. Den grunnleggende idéen angående modifikasjon av anti-CD40-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse vil bli beskrevet i detalj nedenfor.
Foreliggende dokument skal omfatte beskrivelsen i dokumentet og/eller figurene ifølge JP Patentpublikasjon (Kokai) nr. 2003-431408 som er grunnlaget for prioriteten til foreliggende søknad.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 A-l viser bindingssete-peptider fremstilt basert på CD40-sekvensen, til hvilke de anti-CD40-agonistiske antistoffene binder;
Figur 1 A-2 viser bindingssete-peptider fremstilt basert på CD40-sekvensen, til hvilke de anti-CD40-agonistiske antistoffene binder (fortsettelse av Figur 1 A-l);
Figur 1B-1 viser bindingssete-peptider fremstilt basert på CD40-sekvensen, til hvilke de anti-CD40-antagonistiske antistoffene binder;
Figur 1B-2 viser bindingssete-peptider fremstilt basert på CD40-sekvensen, til hvilke de anti-CD40-antagonistiske antistoffene binder (fortsettelse av Figur 1B-1);
Figur 2A illustrerer binding av anti-CD40-antistoffene til CD40-mutanten;
Figur 2B illustrerer binding av anti-CD40-antistoffene til CD40-mutanten;
Figur 2C illustrerer binding av anti-CD40-antistoffene til CD40-mutanten;
Figur 3A viser diagrammer som indikerer at KM341-1-19-anti stoff et som har en P331S-mutasjon er like aktivt som det opprinnelige KM341-l-19-antistoffet med hensyn til å binde til Ramos-celler;
Figur 3B viser diagrammer som indikerer at KM341-l-19-anti stoff et som har en P331 S-mutasjon er like aktiv som det opprinnelige KM341-l-19-antistoffet med hensyn til forbedring av CD95 -ekspresjon ved Ramos-celler;
Figur 4A viser et diagram som indikerer at KM341-l-19-antistoffet som har en P331 S-mutasjon har en lavere CDC-aktivitet via kanin komplementet;
Figur 4B viser et diagram hvilket indikerer at G2/4-antistoffet har en lavere komplementaktivitet når det humane komplementet anvendes;
Figur 5A-1 viser diagrammer som indikerer at omforming av subklassen av 2105-antistoffet fra IgG2 til ulike subklasser ikke har noen effekt på dets binding til Ramosceller;
Figur 5A-2 viser diagrammer som indikerer at omforming av subklassen av KM341-l-19-antistoffet fra IgG2 til ulike subklasser ikke har noen effekt på dens binding til Ramos-celler;
Figur 5B-1 viser diagrammer som indikerer at omforming av subklassen av 2105-antistoffet fra IgG2 til forskjellige subklasser reduserer en aktivitet med hensyn til å forbedre CD95-ekspresjon ved Ramos-celler;
Figur 5B-2 viser diagrammer som indikerer at omforming av subklassen av KM341-l-19-antistoffet fra IgG2 til forskjellige subklasser reduserer en aktivitet med hensyn til å forbedre CD95-ekspresjon ved Ramos-celler;
Figur 6A-1 viser diagrammer som indikerer at bindingskapasiteten for KM341-1-19-anti stoffene til Ramos-celler er uavhengig av den varierende strukturen av hengselsregionen;
Figur 6A-2 viser diagrammer hvilke indikerer at bindingskapasiteten for 2105-antistoffene til Ramos-celler er uavhengig av den varierende strukturen av
hengselsregionen;
Figur 6B-1 viser diagrammer hvilke indikerer at de øvre og midtre hengslene i hengselsregionen er viktig for aktiviteten av KM341-1-19-antistoffene med hensyn til å forbedre CD95-ekspresjon ved Ramos-celler;
Figur 6B-2 viser diagrammer hvilke indikerer at de øvre og midtre hengslene i hengselsregionen er viktige for aktiviteten av 2105-antistoffer med hensyn til å forbedre CD95-ekspresjon ved Ramos-celler;
Figur 7A viser diagrammer hvilke indikerer at omdanning av subklassen av F72 -antistoffet til IgG2 ikke har noen effekt på dets binding til Ramos-celler;
Figur 7B viser diagrammer hvilke indikerer at omdanning av subklassen av F72-antistoffet til IgG2 stimulerer en aktivitet for å forbedre CD95-ekspresjon ved Ramosceller;
Figur 8 A viser diagrammer som indikerer at omdanning av subklassen av 4D11-antistoffet fra IgGl til IgG4 ikke har noen effekt på dets binding til Ramos-celler;
Figur 8B viser diagrammer hvilke indikerer at omdanning av subklassen av 4D11-antistoffet fra IgGl til IgG4 hemmer økning ved CD40Ligand av CD95-ekspresjon ved Ramos-celler, i samme omfang som på annen måte;
Figur 9 viser et diagram som indikerer at omforming av subklassen av 4D11-antistoffet fra IgGl til IgG4 eller IgG4PE reduserer ADCC-aktiviteten;
Figur 10 viser et diagram som indikerer at omforming av subklassen av 4D11-antistoffet fra IgGl til IgG4P reduserer CDC-aktiviteten;
Figur 11 illustrerer en variasjon i antallet av B-celler i blodet (B220-positive celler blant de perifere blodlymfocyttene) over tid etter at 4D11 Gl, 4D11 G4P eller 4D11 G4PE ble administrert til human CD40-transgene mus;
Figur 12A illustrerer en høyere ekspresjon av CD23 ved milt B-celler (CD23-positive celler blant milt B-cellene) etter administrering av hvert anti-CD40-antistoff til human CD40-transgene mus;
Figur 12B illustrerer en høyere ekspresjon av CD86 ved milt B-celler (CD86-positive celler blant milt B-cellene) etter administrering av hvert anti-CD40-antistoff til human CD40-transgene mus;
Figur 12C illustrerer en høyere ekspresjon av CD95 ved milt B-celler (CD95-positive celler blant milt B-cellene) etter administrering av hvert anti-CD40 antistoff til human CD40-transgene mus;
Figur 13 A illustrerer den suppressive aktiviteten av antigen-spesifikt antistoff (IgGl)-produksjon ved 4D11 og 281-1-10 i human CD40-transgene mus;
Figur 13B illustrerer den suppressive aktiviteten av antigen-spesifikt antistoff (IgM)-produksjon ved 4D11 og 281-1-10 i human CD40-transgene mus;
Figur 14A illustrerer antall B-celler i blodet (B220-positive celler blant de perifere blodlymfocyttene) under analyse av suppresjon av den antigen-spesifikke antistoffproduksjonsaktiviteten;
Figur 14B illustrerer antallet milt B-celler (B220-positive celler blant miltlymfocyttene) under suppresjonsanalysen av den antigen-spesifikke antistoffproduserende aktiviteten;
Figur 15 illustrerer en variasjon i antallet av B-celler i blodet (B220-positive celler blant de perifere blodlymfocyttene) over tid etter administrering av 4D11 G4P eller 4D11 G4PE i en dose på 30 mg/kg til Cynomolgus-aper;
Figur 16 illustrerer IL-12-nivåer i blodet under forsøket vist i Figur 15;
Figur 17 viser den suppressive effekten av 4D11G4PE på simian DTH (forsinket type hypersensitivitet i hann Cynomolgus-aper);
Figur 18 viser titerene av anti-tetanustoksinet IgG under analysen med resultatene vist i Figur 17;
Figur 19 viser titerene av anti-tetanustoksinet IgM under forsøket med resultatene vist i Figur 17;
Figur 20A illustrerer de respektive influeringene av 4D11G4PE og 5C8 (anti-CD40Ligand-anti stoff) på blodplateaggregering;
Figur 20B viser de respektive influeringene av 4D11G4PE og 5C8 (anti-CD40Ligand-anti stoff) på blodplateaggregering;
Figur 21 illustrerer en variasjon i oligomerinnhold av 4D11G4P, 4D11G4PE, 4D1 lG2Ser eller 4D11G4/2/4 over tid etter inkubering ved pH 2,7 og 37°C;
Figur 22 illustrerer suppresjon av avstøtning av hudtransplantater ved det anti-CD40-antagonistiske antistoffet;
Figur 23 illustrerer volumendringen av tumoren over tid fra celleimplantasjon, i et tilfelle hvor 341G2Ser ble administrert til tumorbærende mus med Ramos-celler implantert deri;
Figur 24 illustrerer volumendringen av tumoren over tid fra celleimplantasjon, i et tilfelle hvor 341G2Ser ble administrert til tumorbærende mus med T24-celler implantert deri;
Figur 25 illustrerer volumendringen av tumoren over tid fra celleimplantasjon, i et tilfelle hvor 341G2Ser ble administrert til tumorbærende mus med Hs 766T-celler implantert deri; og
Figur 26 illustrerer volumendringen av tumoren over tid fra celleimplantasjon, i et tilfelle hvor 341G2Ser ble administrert til tumorbærende mus med Capan-2-celler implantert deri.
Beste metode for utførelse av oppfinnelsen
1. Modifikasjon av agonistiske antistoffer
Antistoffer er hovedsakelig molekyler som tjener til å beskytte levende kropper mot fremmedlegemer, slik som mikroorganismer og virus og kreft, og følgelig kan de drepe og fjerne slike celler som binder til dem selv. Den letale aktiviteten er sammensatt av to forskjellige aktiviteter, betegnet antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (forkortet som ADCC nedenfor) og komplementavhengig cytotoksisitet (forkortet som CDC nedenfor).
ADCC angir en type cytotoksisitet indusert ved aktivering av makrofager, NK-celler, nøytrofile celler, osv., som gjenkjenner målceller ved å binde til den konstante regionen av antistoffet via Fc-reseptorer uttrykt på deres overflate. I motsetning refererer CDC til en type cytotoksisitet indusert ved aktivering av et komplementsystem som inntreffer gjennom binding av et antistoff til et antigen. Disse aktivitetene er kjent å variere avhengig av en subklasse av antistoffet, hvilket har blitt funnet å skyldes en strukturell forskjell i den konstante regionen av antistoffer (Charles A. Janeway et al., Immunology, 1997, Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc.).
Anti-CD40 agonistiske antistoffer vil være mer foretrukne som terapeutisk middel dersom de ikke har aktivitetene av ADCC og/eller CDC som kan indusere celledød av CD40-uttrykkende celler, i form av mekanisme for immunaktiv virkning. Hvis CD40-uttrykkende celler er skadet ved ADCC og/eller CDC-aktiviteter, kan immunsuppresjon oppstå heller enn ønsket immunaktivering, hvilket resulterer i eksaserbasjon av sykdommen. I tillegg kan pasienter som lider av infeksiøse sykdommer ha høyere ADCC og/eller CDC-aktiviteter. Når slike antistoffer anvendes for infeksiøse sykdommer, er det derfor nødvendig å vurdere dem grundigere med hensyn til sikkerhet, for eksempel ved anvendelse av mer aktive kanin komplementer enn de til stede i friskt humant serum eller perifert blod som ikke kunne være effektivt med hensyn til å detektere de ovennevnte aktivitetene i denne situasjonen. Følgelig ble mutanter og rekombinanter som ikke hadde noen aktivitet av ADCC eller CDC fremstilt og undersøkt for deres aktivitet.
Siden ADCC og/eller CDC-aktiviteter er kjent å variere avhengig av en subklasse av antistoffet av interesse, kan omdanning av subklassen redusere ADCC og/eller CDC-aktiviteter. For de humane IgG-subklassene er for eksempel IgG4 generelt kjent å være en subklasse med lave aktiviteter av både ADCC og CDC og det er angitt at IgG2 er CDC-aktiv men lite aktiv med hensyn til ADCC, mens IgGl er svært aktiv ved både ADCC og CDC (Charles A. Janeway et al., Immunology, 1997, Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc.). Valg av en bestemt subklasse ved å ta fordel av de ovennevnte egenskapene kan frembringe et mindre cytotoksisk antistoff fra det opprinnelige antistoffet. En kombinasjon av en spesifikk subklasse av antistoff med en slik punktmutasjon som beskrevet nedenfor kan frembringe et antistoff med en ønsket aktivitet. Videre er reduksjon av ADCC og/eller CDC-aktivitetene av et antistoff angitt å være oppnådd ved innføring av en mutasjon inn i dets konstante region. For eksempel kan L235, D265, D270, K322, P331 og P329 (hver alfabetiske bokstav betyr en aminosyre ved énbokstavskoder og hvert tall betyr en EU-indeks foreslått av Kabat et al. (Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Femte utgave); slike symboler vil anvendes nedenfor.) spille en viktig rolle i komplementaktivering ved human IgG og substitusjon av ett av disse setene med en annen aminosyre kan redusere CDC-aktiviteten. Esohe E. Idusogie et. al. J. Immunol. 2000, 164:4178-4184, Yuanyuan Xu et. al. J. Biol. Chem. 1994, 269:3469-3474, Brekke, O. H. et. al. Eur. J. Immunol. 1994, 24:2542, Morgan, A., et. al., Immunology 1995, 86:319, Lund, J., et. al:, J. Immunol., 1996, 157:4963, Tao, M. FL, et. al., J. Exp. Med. 1993, 178:661). Spesielt kan substitusjon av D270, K322, P329 eller P331 med A redusere CDC-aktiviteten. Substitusjon av P331 med S eller G kan også indusere det samme.
Det er antatt at Glu233-Ser239, Gly316-Lys338, Lys274-Arg301, Tyr407-Arg416, Asn297, Glu318, Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 og Ala327-fle332 tar del i binding av IgG til FcR (Duncan, A. R., Woof, J. M., Partridge, L. J., Burton, D. R. og Winter, G. (1988) Nature 332, 563-564, Gessner, J. E., Heiken, FL, Tamm, A. og Schmidt, R. E. (1998) Ann. Hematol. 76, 231-248, Gavin, A., Hulett, M og Hogarth, P. M. (1998) i The Immunoglobulin Receptorers and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity (van de Winkel, J. G. J. ,og Hogarth, P. M., eds), s. 11-35, Kluwer Academic Publishers Group, Dordrecht, Nederland, Sautes, C. (1997) i Cell-mediated Effects of Immunoglobulins (Fridman, W. H. og Sautes, C., eds), s. 29-66, R. G. Landes Co., Austin, TX, Da'ron, M. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234, Canfield, S. M. og Morrison, S. L. (1991) J. Exp. Med. 173, 1483-1491, Chappel, M. S., Isenman, D. E., Everett, M., Xu, Y.-Y., Dorrington, Κ. J. og Klein, M. H. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 9036-9040, Woof, J. M., Partridge, L. J., Jefferis, R. og Burton, D. R. (1986) Mol. Immunol. 23, 319-330, Wines, B. D., Powell, M. S., Parren, P. W. H. I, Barnes, N. og Hogarth, P. M. (2000) J. Imunol. 164, 5313-5318) og følgelig kan innføring av en mutasjon inn i én av disse regionene redusere ADCC-aktiviteten. Spesielt kan substitusjon av L235 med E eller G237 med A redusere binding av IgG til FcR.
Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse har minst én mutasjon av aminosyrer for å redusere ADCC og/eller CDC-aktivitetene, foretrukket 1-20, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 eller 1 eller 2 mutasjoner.
Foreliggende oppfinnelse har vist at i noen anti-CD40 antistoffer er hengselsregionen av IgG2 viktig ved ekspresjon av deres sterke agonistiske aktiviteter. Erstatning av den variable regionen eller den konstante regionen med unntak av hengselsregionen med et motstykke av hvilken som helst ulik subklasse eller innføring av en punktmutasjon deri er forventet å ikke bare modulere ADCC og/eller CDC-aktivitetene, men øke produktiviteten av antistoffet, dets stabilitet under rensning og lagring og dets kinetikk i blodet.
For å fremstille et antistoffmedikament er stabiliteten av antistoffet under rensning og lagring svært viktig. Siden antistoffene hittil utviklet hovedsakelig tilhører IgGl subklassen vil omdanning av den variable regionen eller den konstante regionen med unntak av hengselsregionen til en sekvens avledet fra IgGl subklassen også være effektiv for å forbedre de fysiske egenskaper til de anti-CD40 agonistiske antistoffene beskrevet ovenfor.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer mutanter av agonistiske anti-CD40-antistoffer og andre som følger:
[1] En tung kjede av et monoklonalt antistoff som har en agonistisk aktivitet, som binder til CD40, hvor den tunge kjeden omfatter en øvre hengsel og en midtre hengsel avledet fra et humant IgG2 og en konstant region med minst én aminosyre deletert eller substituert eller med minst én aminosyre tilføyd dertil, hvor nevnte delesjon, substitusjon eller tilføyelse er i stand til å øke eller redusere ADCC og/eller CDC.
[2] Tung kjede i henhold til [1], hvor den konstante regionen er avledet fra et humant IgG.
[3] Tung kjede i henhold til [2], hvor det humane IgG er et humant IgGl .
[4] Tung kjede i henhold til [2], hvor det humane IgG er et humant IgG2.
[5] Tung kjede i henhold til [2], hvor det humane IgG er et humant IgG3.
[6] Tung kjede i henhold til [2], hvor det humane IgG er et humant IgG4.
[7] Tung kjede i henhold til hvilken som helst av [3] til [5], hvor nevnte substitusjon av aminosyrer i den konstante regionen er substitusjon av prolin med serin i posisjon 331 som angitt ved EU-indeksen som i Kabat et al.
[8] Et monoklonalt antistoff omfattende den tunge kjeden i henhold til hvilken som helst av [1] til [7],
[9] Tung kjede i henhold til hvilken som helst av [1] til [7], hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region fra en tung kjede av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet KM341-1-19 (Aksesjonsnummer FERM BP-7759).
[10] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [9] og en lett kjede omfattende en variabel region fra en lett kjede av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet KM341-1-19 (Aksesjonsnummer FERM BP-7759).
[11] Tung kjede i henhold til hvilke som helst av [1] til [7], hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region av polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 38.
[12] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [11] og en lett kjede av et monoklonalt antistoff, hvor den lette kjeden omfatter en variabel region av polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 40.
[13] Den tunge kjeden i henhold til [1], hvor den tunge kjeden består av en gjenværende andel tilveiebrakt ved å fjerne signalsekvensen fra polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 132.
[14] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [13] og en lett kjede av et monoklonalt antistoff, hvor den lette kjeden består av en gjenværende andel tilveiebrakt ved å fjerne signalsekvensen fra polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 134.
[15] Den tunge kjeden i henhold til [1], hvor den tunge kjeden er produsert av en vert omfattende en ekspresjonsvektor som har polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 131.
[16] Det monoklonale antistoffet i henhold til [8], hvor det monoklonale antistoffet er produsert av en vert omfattende en ekspresjonsvektor som har polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 131 og polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 133.
[17] Den tunge kjeden i henhold til hvilke som helst av [1] til [7], hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region fra en tung kjede av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet 2105 (Aksesjonsnummer FERM BP-8024).
[18] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [17] og en lett kjede omfattende en variabel region fra en lett kjede av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet 2105 (Aksesjonsnummer FERM BP-8024).
[19] Den tunge kjeden i henhold til hvilke som helst av [1] til [7], hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region av polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 42.
[20] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [19] og en lett kjede av et monoklonalt antistoff, hvor den lette kjeden omfatter en variabel region av polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 44.
[21] Den tunge kjeden i henhold til [1], hvor den tunge kjeden består av en gjenværende andel tilveiebrakt ved å fjerne signalsekvensen fra polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 136.
[22] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [21] og en lett kjede av et monoklonalt antistoff, hvor den lette kjeden består av en gjenværende andel tilveiebrakt ved å fjerne signalsekvensen fra polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 138.
[23] Den tunge kjeden i henhold til [1], hvor den tunge kjeden er produsert av en vert omfattende en ekspresjonsvektor som har polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 135.
[24] Det monoklonale antistoffet i henhold til [8], hvor det monoklonale antistoffet er produsert av en vert omfattende en ekspresjonsvektor som har polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 135 og polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 137.
[25] Et polynukleotid representert ved SEKV ID NR: 131.
[26] Et polynukleotid representert ved SEKV ID NR: 133.
[27] En ekspresjonsvektor som omfatter polynukleotidet i henhold til [25],
[28] En ekspresjonsvektor som omfatter polynukleotidet i henhold til [26],
[29] En ekspresjonsvektor som omfatter polynukleotidene i henhold til [25] og [26], [30] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [27],
[31] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [28],
[32] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [29],
[33] En fremgangsmåte for fremstilling av en tung kjede av et monoklonalt antistoff, omfattende de følgende trinnene: dyrking av verten i henhold til [30] i et dyrkningsmedium; og oppnå en tung kjede av et monoklonalt antistoff fra kulturen og/eller verten.
[34] En fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff, omfattende de følgende trinnene: dyrking av verten i henhold til [32] i et dyrkningsmedium; og oppnå et monoklonalt antistoff fra kulturen og/eller verten.
[35] Et polynukleotid representert ved SEKV ID NR: 135.
[36] Et polynukleotid representert ved SEKV ID NR: 137.
[37] En ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidet i henhold til [35],
[38] En ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidet i henhold til [36],
[39] En ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidene i henhold til [35] og [36], [40] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [37],
[41] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [38],
[42] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [39],
[43] En fremgangsmåte for fremstilling av en tung kjede av et monoklonalt antistoff, omfattende de følgende trinnene: dyrke verten i henhold til [40] i et dyrkningsmedium; og oppnåelse av en tung kjede av et monoklonalt antistoff fra kulturen og/eller verten.
[44] En fremgangsmåte for fremstilling av et et monoklonalt antistoff, omfattende de følgende trinnene: dyrking av verten i henhold til [42] i et dyrkningsmedium; og oppnåelse av et monoklonalt antistoff fra kulturen og/eller verten.
[45] En fremgangsmåte for fremstilling av en tung kjede av et monoklonalt antistoff som har en agonistisk aktivitet i stand til å binde til CD40, omfattende trinnet med å substituere den øvre hengselen og den midtre hengselen av et antistoff, som verken er en øvre hengsel eller en midtre hengsel avledet fra et humant IgG2, med en øvre hengsel og en midtre hengsel avledet fra et humant IgG2, henholdsvis.
[46] En fremgangsmåte for fremstilling av en tung kjede av et monoklonalt antistoff omfattende en variabel region og en øvre hengsel og en midtre hengsel avledet fra et humant IgG2, omfattende trinnet med å identifisere et polypeptid som danner den variable regionen, som er fra en tung kjede av et monoklonalt antistoff i stand til å binde til CD40.
[47] En fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff som har en agonistisk aktivitet i stand til å binde til CD40, omfattende trinnet med å substituere den øvre hengselen og den midtre hengselen av et antistoff, som verken er en øvre hengsel eller en midtre hengsel avledet fra et humant IgG2, med en øvre hengsel og en midtre hengsel avledet fra et humant IgG2, henholdsvis.
[48] En fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff omfattende en variabel region og en øvre hengsel og en midtre hengsel avledet fra et humant IgG2, omfattende trinnet med identifikasjon av et polypeptid som danner den variable regionen, som er fra en tung kjede av et monoklonalt antistoff i stand til å binde til CD40.
[49] En farmasøytisk blanding omfattende det monoklonale antistoffet i henhold til [8], [10], [12], [14], [16], [18], [20], [22] eller [24] som en aktiv bestanddel.
[50] Den farmasøytiske blandingen i henhold til [49] anvendt for forebygging eller behandling av en malign tumor, et patogen eller en autoimmun sykdom.
[51] En fremgangsmåte for forebygging eller behandling av en malign tumor, et patogen eller en autoimmun sykdom, omfattende å administrere den farmasøytiske blandingen i henhold til [49] inn i et pattedyr.
[52] Anvendelse av det monoklonale antistoffet i henhold til [8], [10], [12], [14], [16], [18], [20], [22] eller [24] for fremstilling av en farmasøytisk blanding anvendt for forebygging eller behandling av en malign tumor, et patogen eller en autoimmun sykdom.
[89] Et polynukleotid tilveiebrakt ved å fjerne andelen som koder for signalsekvensen fra polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 131.
[90] Et polynukleotid tilveiebrakt ved å fjerne andelen som koder for signalsekvensen fra polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 133.
[91] Et polynukleotid tilveiebrakt ved å fjerne delen som koder for signalsekvensen fra polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 135.
[92] Et polynukleotid tilveiebrakt ved å fjerne delen som koder for signalsekvensen fra polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 137.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et antistoff fremstilt ved modifikasjon av et agonistisk anti-CD40-antistoff som tilhører det humane IgG2, hvor det modifiserte antistoffet er en mutant som har den konstante regionen, utenom de øvre og midtre hengslene, substituert med en sekvens avledet fra en ulik subklasse. Subklassen er foretrukket IgGl . Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et antistoff fremstilt ved modifikasjon av et agonistisk anti-CD40-antistoff som tilhører det humane IgG2, hvor det modifiserte antistoffet er en mutant som har den konstante regionen, utenom hengselsregionen, substituert med en sekvens avledet fra en ulik subklasse. Subklassen er foretrukket IgGl .
Reduksjon av ADCC og CDC-aktivitetene betyr heri reduksjon av disse aktivitetene sammenlignet med de tilsvarende aktivitetene av et anti-CD40 monoklonalt antistoff forskjellig fra mutantene beskrevet ovenfor, for eksempel sammenlignet med de tilsvarende aktivitetene av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet KM341-1-19 (Aksesjonsnummer FERM BP-7759) eller 2105 (Aksesjonsnummer FERM BP-8024).
ADCC og CDC-aktivitetene kan analyseres ved hvilken som helst kjent metode, for eksempel metoden beskrevet i eksemplene her. Sekvensene av variable regioner i de tunge og lette kjedene av et monoklonalt antistoff vil presenteres nedenfor, hvilke er produsert av hybridomet KM341-1-19 (Aksesjonsnummer FERM BP-7759) eller 2105 (Aksesjonsnummer FERM BP-8024).
DNA som koder for variable regioner i de tunge og lette kjedene av KM341-1-19-antistoffet og aminosyresekvensene av de tunge og lette kjedene vil bli presentert nedenfor.
I nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 37) som koder for den tunge kjeden av KM341-1-19-antistoffet, starter signal sekvensen med adenin (A) i posisjon 50. Grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen er lokalisert mellom "adenin" ([A]) i posisjon 109 og cytosin (C) i posisjon 110 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 493 og guanin (G) i posisjon 494 (gen predikering programvaren (Signal P ver.2) ble anvendt).
I tung kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 38) av KM341-l-19-antistoffet, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom serin (S) i posisjon 20 og glutamin (Q) i posisjon 21 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom serin (S) i posisjon 148 og alanin (A) i posisjon 149.
Følgelig har den variable regionen av den tunge kjeden av KM341-l-19-antistoffet en nukleotidsekvens i området fra cytosin (C) i posisjon 110 til adenin (A) i posisjon 493, som sett i SEKV ID NR: 37. Videre har den variable regionen av den tunge kjeden av KM341-l-19-antistoffet en aminosyresekvens i området fra glutamin (Q) i posisjon 21 til serin (S) i posisjon 148, som sett i SEKV ID NR: 38.
I nukleotidsekvens for lett kjede (SEKV ID NR: 39) av KM341-l-19-antistoffet, starter signal sekvensen med adenin (A) i posisjon 29. Grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen er lokalisert mellom "adenin" ([A]) i posisjon 88 og guanin (G) i posisjon 89 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 400 og "cytosin" ([C]) i posisjon 401 (gen predikering programvaren (Signal P ver.2) ble anvendt).
I aminosyresekvensen av den lette kjeden (SEKV ID NR: 40) av KM341-1-19-antistoffet, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom glysin (G) i posisjon 20 og glutaminsyre (E) i posisjon 21 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom lysin (K) i posisjon 124 og "arginin" ([R]) i posisjon 125.
Følgelig har den variable regionen av den lette kjeden av KM341-1-19-antistofet en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 89 til adenin (A) i posisjon 400, som sett i SEKV ID NR: 39. Videre har den variable regionen i den lette kjeden av KM341-l-19-antistoffet en aminosyresekvens i området fra glutaminsyre (E) i posisjon 21 til ly sin (K) i posisjon 124, som sett i SEKV ID NR: 40.
Nukleotidsekvens (SEKV ID NR: 37) av den tunge kjeden av KM341-l-19-antistoffet:
GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTT CCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGT GAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTG GAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTA TCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCT GCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGA TTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTT CGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCG CAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGA GGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCC
Tung kjede aminosyresekvens (SEKV ID NR: 38) av KM341-l-19-antistoffet: MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGR
TYYRSKWYRDYVGSVKSRIIIDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTV
TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE
KSKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Lett kjede nukleotidsekvens (SEKV ID NR: 39) av KM341-1-19-antistoffet:
ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCT
CCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGC
CACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGC
TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTC
TGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCG
TAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG
Lett kjede aminosyresekvens (SEKV ID NR: 40) av KM341-l-19-antistoffet:
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS
NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTCSSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT
DNA som koder for variable regioner i de tunge og lette kjedene av 2105-antistoffet og aminosyresekvensene av de tunge og lette kjedene vil presenteres nedenfor.
I tung kjede nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 41) av 2105-antistoffet, starter signalsekvensen med adenin (A) i posisjon 70. Grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen er lokalisert mellom "tymin" ([T]) i posisjon 126 og guanin (G) i posisjon 127 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 495 og guanin (G) i posisjon 496 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I tung kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 42) av 2105-antistoffet, er grensen mellom signalsekvensen og den variable regionen lokalisert mellom cystein (C) i posisjon 19 og glutaminsyre (E) i posisjon 20 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom serin (S) i posisjon 142 og alanin (A) i posisjon 143.
Følgelig har den variable regionen i den tunge kjeden av 2105-antistoffet en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 127 til adenin (A) i posisjon 495, som sett i SEKV ID NR: 41. Videre har den variable regionen i den tunge kjeden av 2105-antistoffet en aminosyresekvens i området fra glutaminsyre (E) i posisjon 20 til serin (S) i posisjon 142, som sett i SEKV ID NR: 42.
I lett kjede nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 43) av 2105-antistoffet, starter signal sekvensen med adenin (A) i posisjon 28. Grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen er lokalisert mellom "adenin" ([A]) i posisjon 87 og guanin (G) i posisjon 88 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 405 og "cytosin" ([C]) i posisjon 406 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I lett kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 44) av 2105-antistoffet, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom glysin (G) i posisjon 20 og glutaminsyre (E) i posisjon 21 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom lysin (K) i posisjon 126 og "arginin" ([R]) i posisjon 127.
Følgelig har den variable regionen i den lette kjeden av 2105-antistoffet en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 88 til adenin (A) i posisjon 405, som sett i SEKV ID NR: 43. Videre har den variable regionen i den lette kjeden av 2105-antistoffet en aminosyresekvens i området fra glutaminsyre (E) i posisjon 21 til lysin (K) i posisjon 126, som sett i SEKV ID NR: 44.
Nukleotidsekvensen som koder for den tunge kjeden (SEKV ID NR: 41) av 2105-antistoffet:
CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATG
GAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAG
TCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGAT
GATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAAT
AGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCC
CTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTT
CGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACC
AAGG
Tung kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 42) av 2105-antistoffet:
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISW
NSGSLVHADSVKGRFTSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS
TK
Nukleotidsekvensen av den lette kjeden (SEKV ID NR: 43) av 2105-antistofet:
I nukleotidsekvensen av den tunge kjeden (SEKV ID NR: 131) av 341G2Ser, er grensen mellom signalsekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "adenin" ([A]) i posisjon 60 og cytosin (C) i posisjon 61 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 444 og guanin (G) i posisjon 445 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I tung kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 132) av 341G2Ser, er grensen mellom signalsekvensen og den variable regionen lokalisert mellom serin (S) i posisjon 20 og glutamin (Q) i posisjon 21 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom serin (S) i posisjon 148 og alanin (A) i posisjon 149.
Følgelig har den variable regionen i tung kjede av 341G2Ser en nukleotidsekvens i området fra cytosin (C) i posisjon 61 til adenin (A) i posisjon 444, som sett i SEKV ID NR: 131. Videre har den variable regionen i den tunge kjeden av 341G2Ser en aminosyresekvens i området fra glutamin (Q) i posisjon 21 til serin (S) i posisjon 148, som sett i SEKV ID NR: 132.
Hele tung kjede nukleotidsekvensen av 341G2Ser (SEKV ID NR: 131):
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTG
CAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCAC TCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGT GTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGG ACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGAC ACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACA AGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG AGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTG CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Den fullstendige aminosyresekvensen av den tunge kjeden av 341G2Ser (SEKV ID NR: 132):
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQI.QQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGR
TYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTV
TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VfVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIE
KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
I lett kjede nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 133) av 341G2Ser er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "adenin" ([A]) i posisjon 60 og guanin (G) i posisjon 61 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 372 og "cytosin" ([C]) i posisjon 373 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I aminosyresekvensen av den lette kjeden (SEKV ID NR: 134) av 341G2Ser, er grensen mellom signalsekvensen og den variable regionen lokalisert mellom glysin (G) i posisjon 20 og glutaminsyre (E) i posisjon 21 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom lysin (K) i posisjon 124 og "arginin" ([R]) i posisjon 125. Følgelig har den variable regionen i den lette kjeden av 341G2Ser en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 61 til adenin (A) i posisjon 372, som sett i SEKV ID NR: 133. Videre har den variable regionen i den lette kjeden av 341G2Ser en aminosyresekvens i området fra glutaminsyre (E) i posisjon 21 til lysin (K) i posisjon 124, som sett i SEKV ID NR: 134.
Hele lett kjede nukleotidsekvensen av 341G2Ser (SEKV ID NR: 133):
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTG
ACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGT
GTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCC
AACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC
AGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAA
GTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT
GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAT
AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC
AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG
GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
Hele lett kjede aminosyresekvensen av 341G2Ser (SEKV ID NR: 134):
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS
NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS
GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC
I nukleotidsekvensen som koder for den tunge kjeden (SEKV ID NR: 135) av 2105G2Ser er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "thymin" ([T]) i posisjon 57 og guanin (G) i posisjon 58 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 426 og guanin (G) i posisjon 427 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I tung kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 136) av 2105G2Ser, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom cystein (C) i posisjon 19 og glutaminsyre (E) i posisjon 20 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom serin (S) i posisjon 142 og alanin (A) i posisjon 143.
Følgelig har den variable regionen av den tunge kjeden av 2105G2Ser en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 58 til adenin (A) i posisjon 426, som sett i SEKV ID NR: 135. Videre har den variable regionen i den tunge kjeden av 2105G2Ser en aminosyresekvens i området fra glutaminsyre (E) i posisjon 20 til serin (S) i posisjon 142, som sett i SEKV ID NR: 136.
Hele tung kjede nukleotidsekvensen av 2105G2Ser (SEKV ID NR: 135):
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCmTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTG
GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTT
GATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTIGG
AATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAC
TCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTA
TTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGC
TGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTG
CACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC
AACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC
CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCA
CGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACC
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC
AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG
GAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC
GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC
TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Hele tung kjede aminosyresekvensen av 2105G2Ser (SEKV ID NR: 136):
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISW
NSGSLVHADSVKGRFTCSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS
TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS
NFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS
HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKT
KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
I lett kjede nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 137) av 2105G2Ser, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "adenin" ([A]) i posisjon 60 og guanin (G) i posisjon 61 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 378 og "cytosin" ([C]) i posisjon 379 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I lett kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 138) av 2105G2Ser, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom glysin (G) i posisjon 20 og glutaminsyre (E) i posisjon 21 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom lysin (K) i posisjon 126 og "arginin" ([R]) i posisjon 127. Følgelig har den variable regionen i den lette kjeden av 2105G2Ser en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 61 til adenin (A) i posisjon 378, som sett i SEKV ID NR: 137. Videre har den variable regionen i den lette kjeden av 2105G2Ser en aminosyresekvens i området fra glutaminsyre (E) i posisjon 21 til lysin (K) i posisjon 126, som sett i SEKV ID NR: 138.
Hele lett kjede nukleotidsekvensen av 2105G2Ser (SEKV ID NR: 137):
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTG
ACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGT
GTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCC
AACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC
AGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGG
ACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG
AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG
GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGGGAAGTCACC
CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
Hele lett kjede aminosyresekvensen av 2105G2Ser (SEKV ID NR: 138):
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS
NRATGIPARFSGSGSGTDFTT^ISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL
KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC
2. Modifikasjon av antagonistiske antistoffer
Anti-CD40 antagonistiske antistoffer vil være mer foretrukne som terapeutisk middel så vel som de agonistiske antistoffene, hvis de ikke har aktivitetene av ADCC og/eller CDC, når det gjelder virkningsmekanisme. Videre er det viktig at anti-CD40 antagonistiske antistoffer ikke har noen aktivitet med hensyn til å indusere signaler ved deres in vivo-kryssbinding via Fc-reseptorer, selv om ADCC-aktiviteten ikke kan detekteres. Med andre ord er det nødvendig å bekrefte at de ikke aktiverer immunitet og slike aktive antistoffer kan være ønsket som farmasøytiske midler. Anti-CD40 antagonistiske antistoffer er lovende som terapeutisk middel for behandling av autoimmune sykdommer eller for å undertrykke avstøtning ved organtransplantasjon. Dersom de induserer en agonistisk aktivitet på grunn av en eller annen effekt etter at de er administrert til pasienter, hvor svak den enn måtte være, kan symptomene forverres i kontrast til den ønskede terapeutiske effekten. Følgelig er et antistoff uten noen agonistisk aktivitet mer foretrukket som farmasøytiske middel. I foreliggende oppfinnelse har innføring av en punktmutasjon L235E (betyr substitusjon av L i posisjon 235 med E; lignende symboler vil anvendes nedenfor) inn i IgG4 blitt vist å være effektiv for in vivo reduksjon av den agonistiske aktiviteten, i dyreforsøket ved anvendelse av aper. Selv om IgG4 er en subklasse med lave aktiviteter av ADCC og CDC, er det angitt at når det ble forsøkt å uttrykke IgG4 som rekombinant protein i celler lik CHO, ble dets halvdeler utskilt på grunn av en dårlig S-S-binding mellom de tunge kjedene (Rob C. Aalberse et al., Immunology, 105, 9-19, 2002). For å overvinne dette problemet er innføring av en mutasjon inn i den konstante regionen av antistoffer angitt med hell å fremme danningen av S-S-binding. Derfor ble denne type mutasjon også evaluert for dens anvendelighet. Spesielt ble mutasjonen med substitusjon av S i posisjon 228 med P omfattet (S. Angal et al., Molecular Immunology, vol, 30, nr,l, 105-108, 1993).
For antagonistiske antistoffer så vel som agonistiske antistoffer, er stabiliteten av antistoffet under rensing og lagring svært viktig. Det kan være en eller annen metode for å frembringe slike antistoffer som er fysisk bedre mens den antagonistiske aktiviteten beholdes. Farmasøytiske antistoffer hittil tilbytt kommersielt tilhører for det meste IgGl subklassen og de er ikke angitt å være problematiske ved farmasøytisk formulering. Basert på disse fakta kan det være fordelaktig når det angår fysiske egenskaper å dra fordel av den konstante regionen av antistoffer fra IgGl . Med hensyn til anti-CD40 antistoffer er de imidlertid ønskelig lavere i ADCC og CDC-aktiviteter. Som en konsekvens kan antistoffer som har en IgGl -type konstant region modifisert med noen punktmutasjoner være ønsket. Mutasjonene beskrevet ovenfor er anvendelige for å frembringe slike antistoffer. IgGltype konstant region kan bli lavere i ADCC og CDC-aktiviteter ved å innføre punktmutasjon P331G deri. Det er også observert at innføring av punktmutasjon L235E inn i IgG4 fjerner en svak agonistisk aktivitet in vivo hvilket gjør det farmasøytisk mer aktivt, men gjør det fysisk mindre stabilt ved en lav pH. Følgelig kan en substitusjon av L235 med en aminosyre forskjellig fra E gjøre det fysisk mer funksjonelt. Med hensyn til 4D1 1 -antistoffet er det svært likt 2B11 -antistoffet med hensyn til strukturen av den variable regionen. 2B11 -antistoffet har en lavere antagonistisk aktivitet, men har en høyere stabilitet ved en lav pH, sammenlignet med 4D11 -antistoffet. Hvis noen aminosyrer avledet fra den konstante regionen av 2B11 blir innført i 4D11 -antistoffet, basert på de ovennevnte egenskapene, kan 4D11 bli mer stabil. Spesielt kan punktmutasjon L38V, P58R, G62W, I79M, K81Y, H87Y, S98A, K109R, V120M eller T124A i den tunge kjeden eller N75S i den lette kjeden eller en kombinasjon derav være effektiv for dette formål. Spesielt kan en mutant frembrakt ved å substituere L i posisjon 38 i den variable regionen av den tunge kjeden av 4D11 -antistoffet med V (forkortet som L38V; lignende symboler vil anvendes nedenfor), en P58R-mutant, en G62W -mutant, en I79M-mutant, en K81Y-mutant, en H87Y-mutant, en S98A-mutant, en K109R-mutant, en V120M-mutant eller en T124A-mutant eller en N75S-mutant i den lette kjeden eller en kombinasjon derav tilveiebringes for dette formål.
Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse har minst én mutasjon av aminosyrer for å redusere ADCC og/eller CDC-aktivitetene, fortrinnsvis 1-15, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 eller 1 eller 2 mutasjoner.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer mutanter av antagonistiske anti-CD40 antistoffer og andre som følger:
[53] En tung kjede av et monoklonalt antistoff som har en antagonistisk aktivitet i stand til å binde til CD40, hvor den tunge kjeden omfatter en konstant region med minst én aminosyre deletert eller substituert eller med minst én aminosyre tilføyd dertil, hvor nevnte delesjon, substitusjon eller tilføyelse er i stand til å øke eller redusere ADCC og/eller CDC.
[54] Den tunge kjeden i henhold til [53], hvor den konstante regionen er avledet fra et humant IgG.
[55] Den tunge kjeden i henhold til [54], hvor det humane IgG er et humant IgGl .
[56] Den tunge kjeden i henhold til [54], hvor det humane IgG er et humant IgG2.
[57] Den tunge kjeden i henhold til [54], hvor det humane IgG er et humant IgG3.
[58] Den tunge kjeden i henhold til [54], hvor det humane IgG er et humant IgG4.
[59] Den tunge kjeden i henhold til hvilke som helst av [55], [57] eller [58], hvor nevnte substitusjon av aminosyrer i den konstante regionen er substitusjon av leucin med glutaminsyre i posisjon 235 som er angitt ifølge EU-indeksen som i Kabat et al.
[60] En tung kjede i henhold til hvilken som helst av [53] til [58], hvor den tunge kjeden omfatter en konstant region med minst én aminosyre deletert eller substituert eller med minst én aminosyre tilføyd dertil, hvor nevnte delesjon, substitusjon eller tilføyelse er i stand til å fremme danningen av S-S-bindingen mellom de tunge kjedene.
[61] Antistoff tung kjede i henhold til [60], hvor nevnte substitusjon av aminosyrer i den konstante regionen er substitusjon av serin med prolin i posisjon 228 som er angitt ved EU-indeksen som i Kabat et al.
[62] Et monoklonalt antistoff omfattende den tunge kjeden i henhold til hvilke som helst av [53] til [61],
[63] Den tunge kjeden i henhold til hvilke som helst av [53] til [61], hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region fra en tung kjede av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet 4D11 (Aksesjonsnummer FERM BP-7758).
[64] Et monoklonalt antistoff omfattende den tunge kjeden i henhold til [63] og en lett kjede omfattende en variabel region fra en lett kjede av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet 4D11 (Aksesjonsnummer FERM BP-7758).
[65] Den tunge kjeden i henhold til hvilke som helst av [53] til [61], hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region av polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 46.
[66] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [65] og en lett kjede av et monoklonalt antistoff, hvor den lette kjeden omfatter en variabel region av polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 48.
[67] Den tunge kjeden i henhold til [53], hvor den tunge kjeden består av en gjenværende andel tilveiebrakt ved å fjerne signal sekvensen fra polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 140.
[68] Et monoklonalt antistoff bestående av den tunge kjeden i henhold til [67] og en lett kjede av et monoklonalt antistoff, hvor den lette kjeden består av en gjenværende andel tilveiebrakt å fjerne signal sekvensen fra polypeptidet representert ved SEKV ID NR: 142.
[69] Den tunge kjeden i henhold til [53], hvor den tunge kjeden er produsert av en vert omfattende en ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 139.
[70] Det monoklonale antistoffet i henhold til [62], hvor det monoklonale antistoffet er produsert av en vert omfattende en ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 139 og polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 141.
[71] Et polynukleotid representert ved SEKV ID NR: 139.
[72] Et polynukleotid representert ved SEKV ID NR: 141.
[73] En ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidet i henhold til [71],
[74] En ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidet i henhold til [72],
[75] En ekspresjonsvektor som innehar polynukleotidene i henhold til [71] og [72], [76] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [73],
[77] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [74],
[78] En vert omfattende ekspresjonsvektoren i henhold til [75],
[79] En fremgangsmåte for fremstilling av en tung kjede av et monoklonalt antistoff, omfattende de følgende trinnene: dyrke verten ifølge [76] i et dyrkningsmedium; og oppnå en tung kjede av et monoklonalt antistoff fra kulturen og/eller verten.
[80] En fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff, omfattende trinnene: dyrkning av verten i henhold til [78] i et dyrkningsmedium; og oppnåelse av et monoklonalt antistoff fra kulturen og/eller verten.
[81] En farmasøytisk blanding omfattende det monoklonale antistoffet i henhold til [62], [64], [66], [68] eller [70] som en aktiv bestanddel.
[82] Den farmasøytiske blandingen ifølge [81] anvendt for forebygging eller behandling av avstøtning av transplantat, en autoimmun sykdom, allergi eller blodkoagulasjonsfaktor Vni-hemming.
[83] En fremgangsmåte for forebygging eller behandling av avstøtning av transplantat, en autoimmun sykdom, allergi eller blodkoagulasjonsfaktor VII-hemning, som omfatter å administrere den farmasøytiske blandingen ifølge [81] til et pattedyr.
[84] Anvendelse av det monoklonale antistoffet i henhold til [62], [64], [66], [68] eller [70] for fremstilling av en farmasøytisk blanding anvendt for forebygging eller behandling av avstøtning av transplantat, en autoimmun sykdom, allergi eller blodkoagulasjonsfaktor Vni-hemning.
[85] En fremgangsmåte for fremstilling av en tung kjede av et monoklonalt antistoff som har en antagonistisk aktivitet i stand til å binde til CD40, hvor den agonistiske aktiviteten er redusert, omfattende et trinn for å foreta en delesjon eller substitusjon av minst én aminosyre eller tilføyelse av minst én aminosyre i en konstant region av en tung kjede av et humant antistoff.
[86] Fremgangsmåten ifølge [85], hvor den konstante regionen er fra et humant IgG.
[87] Fremgangsmåten i henhold til [86], hvor det humane IgG er et humant IgG4.
[88] Fremgangsmåten i henhold til hvilken som helst av [85] til [87], hvor nevnte substitusjon av aminosyrer i den konstante regionen er substitusjon av leucin med glutaminsyre i posisjon 235 som er angitt ved EU-indeksen som i Kabat et al.
[93] Et polynukleotid tilveiebrakt ved å fjerne den andelen som koder for
signal sekvensen fra polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 139.
[94] Et polynukleotid tilveiebrakt ved å fjerne den andelen som koder for
signal sekvensen fra polynukleotidet representert ved SEKV ID NR: 141.
I tillegg tilveiebringer foreliggende oppfinnelse materialene nedenfor.
En mutant av et antagonistisk anti-CD40 antistoff, omfattende minst én substitusjon valgt fra gruppen bestående av substitusjon av L med V i posisjon 38, substitusjon av P med R i posisjon 58, substitusjon av G med W i posisjon 62, substitusjon av I med M i posisjon 79, substitusjon av K med Y i posisjon 81, substitusjon av H med Y i posisjon 87, substitusjon av S med A i posisjon 98, substitusjon av K med R i posisjon 109, substitusjon av V med M i posisjon 120 og substitusjon av T med A i posisjon 124, hvor alle sub sti tusj onene er utført i en variabel region av en tung kjede av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet 4D11 (Aksesjonsnummer FERM BP-7758) og en mutant av et antagonistisk anti-CD40 antistoff omfattende substitusjon av N med S i posisjon 75 i en variabel region av en lett kjede av et 4D11 -antistoff.
Heri betyr reduksjon av ADCC og CDC-aktiviteter reduksjon av disse aktivitetene som sammenlignet med de tilsvarende aktivitetene av et anti-CD40 monoklonalt antistoff forskjellig fra mutantene beskrevet ovenfor, for eksempel sammenlignet med de tilsvarende aktivitetene av et monoklonalt antistoff produsert av hybridomet 4D11 (Aksesjonsnummer FERM BP-7758). ADCC og CDC-aktivitetene kan analyseres ved hvilken som helst kjent metode, for eksempel metoden beskrevet i eksemplene her.
Sekvensene av variable regioner i de tunge og lette kjedene av et monoklonalt antistoff vil presenteres nedenfor hvilke er produsert av hybridomet 4D11 (Aksesjonsnummer FERM BP-7758).
DNA som koder for variable regioner i de tunge og lette kjedene av 4D11-antistoffet og aminosyresekvensene av de tunge og lette kjedene vil presenteres nedenfor, henholdsvis.
I nukleotidsekvensen for den tunge kjeden (SEKV ID NR: 45) av 4D11 -antistoffet, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "cytosin" ([C]) i posisjon 93 og cytosin (C) i posisjon 94 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 456 og guanin (G) i posisjon 457 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I tung kjede aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 46) av 4D11 -antistoffet, er grensen mellom signalsekvensen og den variable regionen lokalisert mellom serin (S) i posisjon 26 og glutamin (Q) i posisjon 27 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom serin (S) i posisjon 147 og alanin (A) i posisjon 148.
Følgelig har den variable regionen i den tunge kjeden av 4D11 -antistoffet en nukleotidsekvens i området fra cytosin (C) i posisjon 94 til adenin (A) i posisjon 456, som sett i SEKV ID NR: 45. Videre har den variable regionen av den tunge kjeden av 4D11-antistofet en aminosyresekvens i området fra glutamin (Q) i posisjon 27 til serin (S) i posisjon 147, som sett i SEKV ID NR: 46.
I lett kjede nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 47) av 4D11 -antistoffet, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "thymin" ([T]) i posisjon 124 og guanin (G) i posisjon 125 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 442 og "cytosin" ([C]) i posisjon 443 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I lett kjede-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 48) av 4D11 -antistoffet, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom cytosin (C) i posisjon 22 og alanin (A) i posisjon 23 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom lysin (K) i posisjon 128 og "arginin" ([R]) i posisjon 129.
Følgelig har den variable regionen i den lette kjeden av 4D11 -antistoffet en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 125 til adenin (A) i posisjon 442, som sett i SEKV ID NR: 47. Videre har den variable regionen i den lette kjeden av 4D11-antistoffet en aminosyresekvens i området fra alanin (A) i posisjon 23 til lysin (K) i posisjon 128, som sett i SEKV ID NR: 48.
Tung kjede-nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 45) av 4D11 -antistoffet:
ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCG
GCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACC
CTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAG
CCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTC
AAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCC
GCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAG
GGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
Tung kjede-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 46) av 4D11 -antistoffet:
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKG
LEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVT
VSSAS
Lett kjede-nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 47) av 4D11 -antistoffet: AGATCTTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGT
CCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTC
TCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAG
TGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGA
AAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGT
GGAAATCAAACGTACG
Aminosyresekvensen av den lette kjeden (SEKV ID NR: 48) av 4D11 -antistoffet:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYD
ASNLESGWSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT
I nukleotidsekvensen av den tunge kjeden (SEKV ID NR: 139) av 4D11 -anti stoffet G4PE, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "cytosin" ([C]) i posisjon 78 og cytosin (C) i posisjon 79 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 441 og guanin (G) i posisjon 442 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I tung kjede-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 140) av 4D11 -antistoffet, er grensen mellom signal sekvensen og den variable regionen lokalisert mellom serin (S) i posisjon 26 og glutamin (Q) i posisjon 27 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom serin (S) i posisjon 147 og alanin (A) i posisjon 148.
Følgelig har den variable regionen i den tunge kjeden av 4D11 -antistoffet en nukleotidsekvens i området fra cytosin (C) i posisjon 79 til adenin (A) i posisjon 441, som sett i SEKV ID NR: 139. Videre har den variable regionen i den tunge kjeden av 4D11-antistoffet en aminosyresekvens i området fra glutamin (Q) i posisjon 27 til serin (S) i posisjon 147, som sett i SEKV ID NR: 140.
Hele nukleotidsekvensen av den tunge kjeden (SEKV ID NR: 139) av 4D11G4PE: ATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTC CTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGC ACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGG CTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACC ATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTG TATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC GTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCC CTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTG ACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGA CCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
Hele tung kjede-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 140) av 4D1 1G4PE:
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKG LEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVT1SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC WVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
I nukleotidsekvensen for den lette kjeden (SEKV ID NR: 141) av 4D1 1G4PE, er grensen mellom signalsekvensen og den variable regionen lokalisert mellom "thymin" ([T]) i posisjon 66 og guanin (G) i posisjon 67 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom adenin (A) i posisjon 384 og "cytosin" ([C]) i posisjon 385 (gen predikering programvare (Signal P ver.2) ble anvendt).
I aminosyresekvens av den lette kjeden (SEKV ID NR: 142) av 4D1 1G4PE, er grensen mellom signalsekvensen og den variable regionen lokalisert mellom cytosin (C) i posisjon 22 og alanin (A) i posisjon 23 og grensen mellom den variable regionen og den konstante regionen er lokalisert mellom lysin (K) i posisjon 128 og "arginin" ([R]) i posisjon 129.
Følgelig har den variable regionen i den lette kjeden av 4D1 1G4PE en nukleotidsekvens i området fra guanin (G) i posisjon 67 til adenin (A) i posisjon 384, som sett i SEKV ID NR: 141. Videre har den variable regionen i den lette kjeden av 4D1 1-antistoffet en aminosyresekvens i området fra alanin (A) i posisjon 23 til lysin (K) i posisjon 128, som sett i SEKV ID NR: 142.
Hele lett kjede-nukleotidsekvensen (SEKV ID NR: 141) av 4D1 1G4PE:
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATC
CAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGT
CAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGAT
GCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACC
ATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGC
CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG
CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG
TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC
ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGGTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA
GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
Hele lett kjede-aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 142) av 4D1 1G4PE:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYD
ASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSyPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE
QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3. Definisjon
Betegnelsene anvendt her vil defineres nedenfor.
"CD40" beskrevet i foreliggende oppfinnelse refererer til et polypeptid som har aminosyresekvensen som beskrevet i E. A. Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986 eller I. Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989 og spesielt, et antigent polypeptid uttrykt på overflaten av B-celler, DC, makrofager, endotelceller, epitelceller eller tumorceller avledet fra disse.
"Et anti-CD40-antistoff' angir hvilket som helst monoklonalt antistoff mot et CD40 uttrykt i celler, et fullengde CD40 eller en del av CD40.
I tillegg er "et antistoff' ifølge oppfinnelsen avledet fra gener (samlet betegnet antistoffgener) som koder for en tung kjede variabel region og en tung kjede konstant region, så vel som en lett kjede variabel region og en lett kjede konstant region som sammen utgjør et immunglobulin. Humane immunglobuliner er gruppert inn i 5 forskjellig klasser bestående av IgG, IgA, IgM, IgD og IgE. Videre er IgG sammensatt av 4 forskjellige subklasser, IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4, mens IgA er sammensatt av 2 forskjellig subklasser, IgAl og IgA2. IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4 er lokalisert i 14q32, 33 i de humane kromosomene. Den grunnleggende strukturen av immunglobulin er sammensatt av to homologe L-kjeder (lette kjeder) og to homologe H-kjeder (tunge kjeder). Klassen og subklassen av et immunglobulin blir bestemt ved dets H-kjeder. Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte hvilken som helst klasse, hvilken som helst subklasse eller hvilken som helst isotype av immunglobulin. "Et funksjonelt fragment" av antistoffet ifølge oppfinnelsen angir en andel (partielt fragment) av antistoffet definert ovenfor som er aktivt enkeltvis eller mangfoldiggjøres i et antigen mot antistoffet, omfattende for eksempel F(ab')2, Fab', Fab, Fv, disulfidstabilisert FV, enkeltkjede FV (scFV) og en multimer derav (D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998, T. J. International Ltd.).
Opp til nå har det vært kjent at IgGl omfatter J00228, Z17370 og Y14737, IgG2 omfatter J00230, AJ250170, AF449616, AF449617, AF449618, Z49802 og Z49801, IgG3 omfatter M12958, K01313, X16110, X99549, AJ390236, AJ390237, AJ390238, AJ390241, AJ390242, AJ390246, AJ390247, AJ390252, AJ390244, AJ390254, AJ390260, AJ390262, AJ390272, AJ390276 og AJ390279 og IgG4 omfatter K01316, AJ001563 og AJ001564 (symbolene listet opp ovenfor angir aksesjonsnumre for genene).
I foreliggende oppfinnelse angir CH1, hengsel, CH2 og CH3 hver en del av av den tung kjede konstante regionen av hvilket som helst antistoff og er basert på EU-indeksen som i Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Femte utgave). Per definisjon er CHI i området fra 118 til 215 ifølge EU-indeksen, hengsel er i området fra 216 til 230 ifølge EU-indeksen, CH2 er i området fra 231 til 340 ifølge EU-indeksen og CH3 er i området fra 341 til 446 ifølge EU-indeksen.
"Humant antistoff' ifølge foreliggende oppfinnelse betyr et antistoff som er et ekspresjonsprodukt av et humant avledet antistoff-gen.
"Agonistisk" referer til en funksjon for å fremme binding av en ligand til CD40 uttrykt på overflaten av slike celler som B-celler, tumorceller eller dendrittiske celler eller en funksjon for å gi CD40-uttrykkende cellene minst én effekt som CD40 liganden gjør ved de CD40-uttrykkende cellene. "Et agonistisk antistoff' angir et antistoff som har en slik agonistisk virkning. Et eksempel på effektene ga for de CD40-uttrykkende cellene er å fremme ekspresjon av CD95.
"Antagonistisk" angir en funksjon for å hemme binding av liganden til CD40 uttrykt på overflaten av slike celler som B-celler, tumorceller eller dendrittiske celler eller en virkning for å nøytralisere minst én effekt som CD40-liganden oppnår for de CD40-uttrykkende cellene. "En antagonistisk antistoff refererer til et antistoff som har en slik antagonistisk virkning. Et eksempel på effektene tilveiebrakt for de CD40-uttrykkende cellene er å undertrykke proliferasjon av B-celler eller produksjon av antistoffer.
Foreliggende søknad presenterer tydelig antistoffer eller tung kjede eller lett kjede variable regioner derav ved aminosyresekvenser. Foreliggende oppfinnelse omfatter også aminosyresekvensene med minst én aminosyre deletert eller substituert eller tilføyd dertil, fortrinnsvis 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 eller 1 eller 2 aminosyrer.
Foreliggende søknad presenterer tydelig gener som koder for antistoffer eller tung kjede eller lett kjede variable regioner derav ved nukleotidsekvenser. Foreliggende oppfinnelse omfatter også nukleotidsekvensene med minst ett nukleotid deletert eller substituert eller tilføyd dertil, fortrinnsvis 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 eller 1 eller 2 aminosyrer.
Anti-CD40-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringes ved å innføre et gen som koder for et antistoff inn i en ekspresjonsvektor, transfektere vektoren inn i en egnet vertscelle, høste antistoffet fra de dyrkede cellene eller supernatanten og rense dette.
Vektoren kan være en fag eller et plasmid som kan replikere i vertscellen alene eller kan være integrert i kromosomet til vertscellen. Plasmid-DNA kan avledes fra Escherichia coli, Bacillus subtilis eller en gjær, mens fag-DNA kan være fra λ fag.
Vertscellen for transformasjon er ikke spesielt begrenset hvis den kan uttrykke målgenet. Eksempler på vertscellen kan omfatte bakterier ( Escherichia coli, Bacillus subtilis, osv.), gjær, dyreceller (COS-celle, CHO-celle, osv.) og insektceller.
Det er kjent metoder for å overføre genet inn i vertscellene, omfattende hvilken som helst metode, så som mediering ved kalsiumion, elektroporering, sfæroplastfusjon, mediering ved litiumacetat, kalsiumfosfattransfeksjon eller lipofeksjon. For å overføre genet inn i et dyr, som beskrevet senere, omfatter metodene mikroinjeksjon; elektroporering eller lipofeksjon for ES-celler; og nukleær transplantasjon.
I foreliggende oppfinnelse refererer "kultur" til (a) kultursupematant, (b) dyrkede celler, dyrket biomasse eller avbrutt materiale derav eller (c) sekresjon av transformant. For å dyrke transformanten, anvendes et medium egnet for verten og statisk kultur, rollerflaske-kultur eller noe annet kan anvendes.
Etter dyrkingen, dersom det ønskede antistoffproteinet blir produsert innen biomassen eller cellene, blir antistoffet høstet ved å oppløse biomassen eller cellene.
Dersom det ønskede antistoffet blir produsert av biomassen eller cellene, anvendes kulturløsningen som den er eller etter at den er separert fra biomassen eller cellene ved sentrifugering eller andre metoder. Deretter blir en biokjemisk prosess ved anvendelse av hvilken som helst kromatografi, som passer for separering/rensning av proteiner, anvendt alene eller eventuelt i kombinasjon med en annen for å separere/isolere det ønskede antistoffet fra kulturen.
Videre kan teknologien for å frembringe et transgent dyr anvendes for å fremstille et transgent dyr som er et vertsdyr som har genet integrert i et endogent gen, slik som et transgent kveg, en transgen geit, en transgen sau eller en transgen gris (Wright, G., et al., (1991) Bio/Technology 9, 830-834) og en stor mengde av et monoklonalt antistoff avledet fra antistoff-genet kan oppnås fra melken utskilt fra det transgene dyret. Dyrking av et hybridom in vitro kan utføres ved anvendelse av et kjent næringsmedium eller hvilket som helst næringsmedium fremstilt med utgangspunkt i et kjent basismedium som anvendt til dyrke, opprettholde og lagre hybridomet og for å produsere et monoklonalt antistoff i supematanten, avhengig av egenskapene til det dyrkede hybridomet, formålet med undersøkelsen og dyrkingsmetoden.
4. Antistoffegenskaper
(1) Agonistiske antistoffer
Mutanten av det agonistiske antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan aktivere immunsystemet uten å skade immunkompetente celler, siden den har en ADCC og/eller CDC-aktivitet lik eller lavere enn det opprinnelige antistoffet, mens den beholder en agonistisk aktivitet. Der er følgelig forventet at mutanten oppviser den immunaktiverende virkningen som er lik eller høyere enn den for det opprinnelige antistoffet og cytotoksisiteten til CD40-uttrykkende celler som er lik eller lavere enn den for det opprinnelige antistoffet.
(2) Antagonistiske antistoffer
Mutanten av det antagonistiske anti-CD40-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse har redusert ADCC og/eller CDC-aktivitet sammenlignet med umodifisert antistoff, mens den beholder en undertrykkende aktivitet mot immunaktiverende signaler indusert av CD40L. Den er også forventet å redusere aktiviteten av signalinduksjon in vivo som er antatt å oppstå via Fc-reseptorer.
5. Farmasøytiske blandinger
En farmasøytisk blanding inneholdende en formulering av det rensede antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Den farmasøytiske blandingen kan fortrinnsvis inneholde et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer i tillegg til antistoffet og kan være en blanding derav med et ulikt antistoff eller et ulikt medikament slik som en antibiotikum. Den egnede bæreren kan omfatte, men er ikke begrenset til, fysiologisk saltoppløsning, fosfatbufret fysiologisk saltoppløsning, fosfatbufret fysiologisk saltoppløsning glukoseløsning og bufret fysiologisk saltoppløsning. Alternativt kan antistoffet være frysetørket for lagring og ved anvendelse blir det rekonstituert i en vandig buffer som beskrevet ovenfor. Den farmasøytiske blandingen kan administreres via oral rute eller parenteral rute, slik som intravenøs, intramuskulær, sub kutan eller intraperitoneal injeksjon eller dosering.
En enkelt effektiv dose, som er en kombinasjon av antistoffet ifølge foreliggende antistoff med et egnet fortynningsmiddel og en fysiologisk akseptabel bærer, er fra 0,0001 mg til 100 mg pr. kg kroppsvekt og kan tas inn ved et tidsintervall på fra 2 dager til 8 uker.
Når den farmasøytiske blandingen av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er et agonistisk antistoff, blir den anvendt som: immunstimulant (antiviralt eller anti-infektivt middel) for patogener omfattende for eksempel hepatitt A, B, C, D eller E virus, HTV, influensavirus, enkel herpesvirus, cytomegalovirus, EB-virus, papilomavirus, klamydia, mykoplasma, toksoplasma, malaria, trypanosom og tuberkelbasillen; antitumormiddel for maligne tumorer som har kreftceller med CD40 uttrykt, omfattende for eksempel pankreaskreft, blærekreft, lymfom (f. eks. Hodgkins lymfom), leukemi, ondartet melanom, pankreaskreft, lungekreft, eggstokkreft, blærekreft, brystkreft, kolonkreft, prostatakreft og hode- og halskreft; og terapeutisk middel for autoimmune sykdommer slik som revmatisme. Den farmasøytiske blandingen kan anvendes for en kombinasjon av sykdommene ovenfor. Den kan også anvendes i kombinasjon som adjuvans for et kreftspesifikt peptid. Når den farmasøytiske blandingen er et antagonistisk antistoff er den, på den annen side, anvendelig som: immunosuppressivt stoff ved organtransplantasjon (forebyggende eller terapeutisk middel for avstøtning ved transplantasjon av øyvev fra pankreas, nyre eller noe annet eller GVHD), terapeutisk middel for autoimmune sykdommer (f.eks. revmatisme, psoriasis, kronisk colitis ulcerosa, Crohns sykdom, systemisk lupus erythematosus, multippel sklerose, myasthenia, sklerodermi, antifosfolipid antistoff syndrom, autoimmun hepatitt, purpura thrombocytopenica idiopathica, Behcets syndrom, arteriosklerose, nefritt og åndenødssyndrom), terapeutisk middel for allergi (f.eks. astma) og terapeutisk middel for blodkoagulasjonsfaktor Vlll-hemming. Den farmasøytiske blandingen kan anvendes for en kombinasjon av sykdommene ovenfor. 6. Epitoper
De bindende epitopene for CD40 ble bestemt for KM341-1-19 og 2105 -antistoffene som har en overlegen agonistisk aktivitet og for 4D11 -antistoffet som har en overlegen antagonistisk aktivitet, henholdsvis (Eksempel 2). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antistoffer med en agonistisk eller antagonistisk aktivitet hvilke har en forskjellig variabel regionsekvens fra de ovennevnte antistoffene men gjenkjenner samme epitop som én av de ovennevnte antistoffene. Disse antistoffene kan oppnås ved en slik fremgangsmåte som beskrevet nedenfor.
Når det er skal oppnås et agonistisk anti-CD40-antistoff som gjenkjenner samme epitop som KM341-1-19-antistoffet, blir for eksempel mus eller lignende immunisert med CD40 for å tilveiebringe monoklonale antistoffer, fra hvilke noen monoklonale antistoffer som konkurrerer med KM341-l-19-antistoffet om binding til CD40 blir screenet i henhold til standardprosedyren. Fra de screenede antistoffene selekteres et antistoff som har samme mønster for binding til peptidet som KM341-l-19-antistoffet, i henhold til fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 2.
Foreliggende oppfinnelse vil bli beskrevet mer detaljert nedenfor med referanse til eksempler. Imidlertid er ikke foreliggende oppfinnelse begrenset til utførelsesformer beskrevet i eksemplene.
Eksempel 1: Ekspresjon og rensing av antistoff og antigenproteiner
En plasmidvektor inneholdende en variabel region av et antistoff ble transfektert inn i CHO-celler (ATCC) og antistoffuttrykkende celler ble selektert ved G418 for å fremstille en cellelinje med stabil ekspresjon.
Et mutant antigen ble uttrykt ved å transient innføre en vektor inn i HEK-celler (ATCC).
Et anti-CD40-antistoff ble renset fra ovennevnte kultursupernatant ved følgende metode. Kultursupernatanten inneholdende et anti-CD40 antistoff ble affmitetsrenset i en Hyper D Protein A-kolonne (fremstilt av NGK Insulators, Ltd.) eller i tilfelle av mus IgGlrensing, en Protein G-kolonne (Amersham Pharmacia Biotech) i henhold til den vedlagte instruksjonen ved anvendelse av PBS(-) som en adsorpsjonsbuffer og en 0,1 M natriumcitrat-buffer (pH 3) som en elueringsbuffer. Den eluerte fraksjonen ble justert til omtrent pH 7,2 ved tilsetning av en 1 M Tris-HCl (pH 8,0) eller Na2HP04-løsning. Den fremstilte antistofløsning ble substituert med PBS(-) ved anvendelse av en dialysemembran (10,000 cuts, fremstilt av Spectrum Laboratories, Inc.) eller en SP-kolonne (Amersham Pharmacia Biotech) og filtrert og sterilisert ved anvendelse av et membranfilter MILLEX-GV med en porediameter på 0,22 pm (fremstilt ved Millipore Corp.). Konsentrasjonen av det rensede antistoffet ble beregnet ved måling av absorbansen ved 280 nm, ved å ta 1 mg/ml som 1,450D.
Eksempel 2: Bestemmelse av epitoper
Et 13 -mer peptid som dekker aminosyre 175 (SEKV ID NR: 1) i en ekstracellulær region av CD40 ble forskjøvet (’’shiftet”) ved to aminosyrer hver for å syntetisere 82 peptider totalt (SEKV ID NR: 49 til 130) som spots fra C-terminalen på en cellulosemembran og acetyl ert N-terminal derav (Jerini AG, Tyskland). Reaksjonen deretter ble utført basert på en konvensjonell Westem-analyse (se Reineke, U. et al. (2001), "Epitope mapping with synthetic peptides prepared by SPOT synthesis. "Antibody Engineering (Springer Lab Manual) Eds.: Kontermann/Dubel, 433-459, for eksempel). Ved analysen ble fargeintensitet av hver spot kvantifisert ved anvendelse av Lumilmager™ (Boehringer-Mannheim Corp.) (Figurene 1A-1, A-2, B-l og B-2).
Resultatene bekreftet at et 4D11 -antistoff sterkt gjenkjenner de 20. til 24., og 41. peptidene, et 2105-antistoff gjenkjenner sterkt de 12. til 23. og 64. peptidene, etKM341-1-19-antistoff gjenkjenner sterkt de 41. og 42. peptidene, KM643-4-11 gjenkjenner sterkt det 43. peptidet, F72 gjenkjenner sterkt det 75. peptidet, 110 gjenkjenner sterkt det 64. peptidet, F4-465 gjenkjenner sterkt det 34., 35., 54., 55., 65., 66. og 75. peptidene, KM281 1-10 gjenkjenner sterkt de 21., 24., 64. og 75. peptidene, 2B11 (nytt antistoff) gjenkjenner sterkt de 21., 24. og 64. peptidene og F 76 (nytt antistoff) gjenkjenner sterkt de 21., 35., 51. og 52. peptidene.
For å bekrefte bindingssetet for anti-CD40-antistoffet, ble det fremstilt et CD40-FC-fusjonsprotein som har en mutasjon innført deri og bindingsevne dertil ble undersøkt ved ELISA. Siden anti-CD40-anti stoffet ikke kryssreagerer med mus B-celler, ble fem CD40Fc-fusjonsproteiner fremstilt ved delvis omforming av aminosyresekvensen til den for mus CD40. Binding av antistoffet til antigenene ble undersøkt. Fremgangsmåten for fremstilling av mutant CD40-FC-fusjonsproteiner er vist nedenfor. Setet for mutasjon ble fremstilt ved innføring av en mus CD40-sekvens inn i en del til hvilken antistoffet binder sterkt til peptidsekvensen. CD40mutl omdannet EFTE ved et sete svarende til det 15. peptidet til ALEK, CD40mut2 omdannet LDT ved et sete svarende til det 21. peptidet til SAQ, CD40mut3 omdannet TH ved et sete svarende til det 24. peptidet til IR, CD40mut4 omdannet EEGW ved et sete svarende til det 42. peptidet til KEGQ og CD40mut5 omdannet VSSA ved et sete svarende til det 64. peptidet til QSSL. Mutantene ble fremstilt i henhold til en genkonstruksjonsteknikk (Figurene 2A, B og C). Analyseresultatene bekreftet at 2105-antistoffet har ekstremt redusert bindingsevne til CD40mutl.
Resultatene bekreftet også at 4D11 -antistoffet og 2B11 har redusert bindingsevne til CD40mut2.
Eksempel 3: Bindingsaktivitet av anti-CD40 agonistisk antistoff til Ramos-celler
En Ramos-cellelinje ble suspendert i en PBS merkingsbuffer (SB) inneholdende 0,1% NaN3og 2% FCS i en konsentrasjon på 2 x 10<6>/ml. Cellesuspensjonen (100 μ1/brønn) ble utlevert til en 96-brønners rundbunnet plate (fremstilt ved Becton, Dickinson og Company). Hver hybridom kultursupematant (50 μl) ble tilsatt og inkubert ved en istemperatur i 30 minutter. Et humant IgGl antistoff til humant serum albumin som en negativ kontroll ble regulert til en konsentrasjon på 2 μg/ml i et hybridomdyrkningsmedium, tilsatt i en mengde på 50 μl og deretter inkubert ved en istemperatur i 15 minutter. Etter vasking av platen med SB, ble 50 μΐ av et 250 ganger fortynnet R-PE fluorescerende merket anti-humant antistoff (fremstilt ved Southern Biotechnology Associates, Inc.) tilsatt og inkubert ved en istemperatur i 15 minutter. Etter vasking av platen med SB to ganger, ble den suspendert i 300 til 500 μl av en FACS-buffer og fluorescensintensitet av hver celle ble målt ved anvendelse av FACS (FACSort, FACScan, fremstilt ved Becton, Dickinson og Company).
Eksempel 4: Evaluering av agonistisk aktivitet av anti-CD40 agonistisk antistoff til Ramos-celler
5.0 x 10<5>celler/ml av en Ramos-cellesuspensjon ble podet μå en 96-brønners plate ved 100 μl/brønn. En hybridom kultursupernatant eller renset antistoff ble fortynnet til 20 μg/ml i et medium og fortynningen ble tilsatt til den 96-brønners platen i en konsentrasjon på 100 μl/brønn. Etter dyrking av natten over, ble celler høstet og R-PE-merket anti-CD95-antistoff (Pharmingen NJ) ble anvendt for cellene. Analyse ble utført ved anvendelse av FACScan eller FACSsort (Becton, Dickinson og Company).
Eksempel 5: Hemming av CD95-ekspresjon ved anti-CD40 antagonistisk antistoff i Ramos-celler
1.0 x 10<6>celler/ml av en Ramos-cellesuspensjon ble podet på en 96-brønners plate ved 50 μl/brønn. En hybridom kultursupernatant eller renset antistoff ble regulert til 2 μg/ml i et medium og mediet ble tilsatt til den 96-brønnes platen ved 100 μΐ/brønn. 4 μg/ml av en løselig CD40-ligand (Alexis Corμoration) og 4 μg/ml av et anti-FLAG antistoff (M2, Sigma) ble tilsatt til et medium og mediet ble tilsatt til en 96-brønners plate ved 50 μl/brønn. Etter dyrking natten over, ble celler høstet og et R-PE-merket anti-CD95-antistoff (Pharmingen NJ) ble anvendt for cellene. Analyse ble utført ved anvendelse av FACS.
Eksempel 6: Måling av CDC-aktivitet i anti-CD40-antistoff
I CDC-forsøket ble, 2,000 1merkede målceller og et humant serumavledet komplement (fremstilt ved Sigma Co.) eller kanin serum-avledet komplement (Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canada) i en endelig konsentrasjon μå 5% dyrket i en rundbunnet 96-brønners plate i et totalt volum på 200 μ1 sammen med antistoffet ved forskjellige konsentrasjoner ved 37°C i nærvær av 5% C02i to timer.
Etter dyrkning ble platen sentrifugert for å bevirke presipptering av cellene og deretter ble 50 μl av suμematanten overført til en 96-brønners plate omfattende en pulver scintillator (Lumaplate™-96: fremstilt ved Packard Instrument Co., Inc.) og tørket ved 55°C i 1,5 timer. Etter bekreftelse på at platen var tørket, ble den dekket med et spesielt deksel (Topseal™-A: 96-brønners mikroplater: fremstilt ved Packard Instrument Co., Inc.) og γ-stråledosen ble målt med en scintillasjonsteller (TopCount: fremstilt ved Packard Instrument Co., Inc.).
Eksemμel 7: Måling av ADCC-aktivitet av anti-CD40-antistoff
Som antistoffmediert cytotoksisitet, ble cytotoksisitet til målceller i nærvær av celler som har killer-aktivitet slik som NK-celler eller nøytrofiler og et antistoff (antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet, nedenfor ADCC) og cytotoksisitet til målceller i nærvær av et komplement og et antistoff (komμlementavhengig cytotoksisitet, nedenfor CDC) målt. hlgG ble anvendt som en kontroll.
Målingsmetoden er enkelt beskrevet som følger. Radioaktivt krom (Cr<51>) ble innført i cytoplasmaet til målcellene og mengden av Cr<51>frigjort i kulturløsningen ved celledød ble målt som en γ-strålingsdose.
Sμesielt ble 10<5>målceller av en Burkitf s lymfom cellelinje Raji (ATCC CCL-86) susμendert i 15 μl føtalt kalveserum (FCS). 50 μ1 (37 MBq/ml) av Cr<51>-merket natriumkromat (fremstilt ved PerkinElmer, Inc.: nedenfor referert til som Cr<51>) ble tilsatt til suspensjonen og cellene ble dyrket ved 37°C i én time. Deretter ble 10 ml av et medium tilsatt og mediet ble kastet ved sentrifugering. Denne operasjonen ble gjentatt tre ganger for å fjerne Cr<51>som ikke er inkorporert i cellene.
I ADCC-analysen ble 2,000 ^merkede målceller og 200,000 friske humane perifere blodmononukleære leukocytter oppnådd ved fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 6 dyrket i en rundbunnet 96-brønners plate (fremstilt ved Falcon) i et totalt volum på 200 μl sammen med antistoffet ved forskjellige konsentrasjoner ved 37°C i nærvær av 5% C02i fire timer.
Etter dyrking ble platen sentrifugert for å bevirke presipiering av cellene og deretter ble 50 μl av supematanten overført til en 96-brønners plate omfattende en pulver scintillator (Lumaμlate™-96: fremstilt ved Packard Instrument Co., Inc.) og tørket ved 55°C i 1,5 timer. Etter bekreftelse μå at platen var tørket, ble platen dekket mep pt spesielt deksel (TopSeal™-A: 96-brønners mikroplater: fremstilt ved Packard Instrument Co., Inc.) og γ-stråledose ble målt med en scintillasjonsteller (TopCount: fremstilt ved Packard Instrument Co., Inc.).
Eksempel 8: Fremstilling og evaluering av aktivitet av anti-CD40 agonistisk antistoff P331S-mutant
Genkloning av anti-CD40 agonistiske antistoffer KM341-1-19 og 2105 er beskrevet i WO 02/099186. Det er angitt at CDC-aktivitet blir redusert ved omdanning av Pro i posisjon 331 i den IgG2 konstante regionen til Ser. For å redusere CDC-aktivitet av KM341-1-19-antistoffet og 2105-antistoffet, ble en P331S-mutasjon innført i IgG2 konstant region derav.
Den humane IgGl konstante regionen av en antistoffuttrykkende vektor N5KG1-Val Lark (IDEC Pharmaceuticals: nedenfor forkortet til N5KG1) ble substituert med human IgG2 for å fremstille N5KG2 og Pro i posisjon 331 av IgG2 ble omdannet til Ser for å fremstille en mutasjon. cDNA-kloning av IgG2 konstant region ble utført ved høsting av KM341-l-19-hybridom ved sentrifugering, tilsetning av TRIZOL (Gibco BRL) og ekstrahering av totalt RNA i henhold til instruksjonen. Antistoff cDNA variabel region ble klonet ved anvendelse av et SMART RACE cDNA-amμlifiseringkit fra Clontech Laboratories, Inc. i henhold til den vedlagte instruksjonen. Første tråd cDNA ble fremstilt ved anvendelse av 5 μg totalt RNA som en temμlat. PCR ble utført med tnIgG3Nhe: atatGCTAGC ACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC (SEKV ID NR: 2)G og tnIgG2Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC (SEKV ID: 3) som primersekvenser ved anvendelse av et ZtaqPCR kit (Takara) i 30 sykluser hver bestående av reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 55°C i 30 sekunder og ved 72°C i 1 minutt for å amplifisere genet. Etter reaksjonen ble det amplifiserte produktet renset ved et QIAGEN PCR rensningskit, kløyvet med Nhel og BamHI og innført i N5KG1 for å bekrefte sekvensen. Denne vektoren ble definert som N5KG2.
N5KG2Ser (med Pro i posisjon 331 omdannet til Ser) ble fremstilt som følger. Reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primere IgG3Nhe: atatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG (SEKV ID NR: 4) og G2Ser2: GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCC (SEKV ID NR: 5). Samtidig ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og μrimere IgG2Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC (SEKV ID NR: 6) og G2Serl: GGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC (SEKV ID NR: 7). De amμlifiserte DNA-fragmentene ble renset ved anvendelse av et PCR rensnings-kit og samme mengder av de to rensede DNA-fragmentene ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger. Primerene IgG3Nhe og IgG2Bam ble tilsatt til blandingen og den samme reaksjonen ble utført 15 ganger. Det amplifiserte DNA-fragmentet ble kløyvet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektoren (N5KG2Ser). Fragmentet inneholdende sekvensen av antistoff variabel region kløyvet med Bglll og Nhel ble innført i vektoren N5KG2Ser.
Antistoffet uttrykt og renset ved metoden ovenfor ble evaluert med hensyn til bindingsevne til Ramos-celler (Figur 3 A) og agonistisk aktivitet (Figur 3B). Svingning i aktivitet μå grunn av innføring av P331 S-variasjonen ble ikke observert.
Eksemμel 9: Måling av CDC-aktivitet av anti-CD40 agonistisk antistoff 331 ser-mutant CDC-aktivitet ble målt ved metoden ovenfor. Et kanin serumavledet komplement ble anvendt og Ramos-celler ble anvendt som målceller. Resultatene bekreftet at, i et KM341-1-19-antistoff ved en antistoffkonsentrasjon μå 1 μg/ml, fremviste IgG2ser CDC-aktivitet betydelig redusert sammenlignet med IgG2 (Figur 4A). På den annen side, når et humant supplement ble anvendt ble ingen forandring observert (Figur 4B).
Eksemμel 10: Fremstilling og aktivitetsmåling av agonist anti-CD40-antistoff som har omdannet konstant region
Av anti-CD-antistoffene beskrevet i WO 02/088186, tilhører to antistoffer som har sterkest agonistisk aktivitet (KM341-l-19-antistoff og 2105 -antistoff) IgG2 subklasse. For å undersøke hvorvidt eller ikke IgG2 subklassen er viktig for aktivering av CD40, ble rekombinante proteiner som har en antistoff konstant region omdannet til IgGl, IgG3 og IgG4, henholdsvis, fremstilt og målt med hensyn til bindingsevne til et antigen og CD95 ekspresjonsfremmende aktivitet i Ramos-celler i henhold til Eksemμlene 4 og 6. IgGl ble uttrykt ved anvendelse av N5KG1, og IgG2 og IgG3 ble henholdsvis uttrykt ved anvendelse av ekspresjonsvektorene N5KG2 og N5KG3 oppnådd ved å substituere N5KG1 konstant region med IgG2 og IgG3, henholdsvis. cDNA-kloning av IgG3 konstant region ble utført i henhold til IgG2 kloningsmetode delvis modifisert, ved anvendelse av en IgG3 -spesifikk primer. IgG4 ble uttrykt ved anvendelse av N5KG4PE (IDEC Pharmaceuticals).
Antistoffproteinet ble uttrykt i henhold til Eksemμel 1. Bindingsaktivitet til Ramosceller som uttrykker human CD40 av KM341-l-19-antistoffet og 2105-antistoffet ble ikke påvirket ved omdanning av IgG2 til IgGl, IgG3 eller IgG4 (Figurene 5A-1 og 5A-2). Imidlertid ble disse antistoffene funnet å ha CD95-eksμresjonsfremmende aktivitet i Ramos-celler redusert ved 10% eller mer (Figurene 5B-1 og 5B-2). Dette viser at det ikke bare er strukturen av den variable regionen som definerer bindingsregionen av antistoffet men også strukturen av den konstante regionen av antistoffet er viktig for den sterke agonistiske aktiviteten av 2105-antistoffet og KM341-1-19-antistoffet. Følgelig, for å undersøke hvilken region i IgG2 konstant region som er viktig for agonistisk aktivitet, ble en domene swap mutant i hvilken IgG2-strukturen blandes med IgG4-strukturen fremstilt for å måle dens aktivitet. Som beskrevet nedenfor blir en domene swap mutant fremstilt ved substitusjon av en hengselsregion. I dette tilfellet omfatter "hengselsregion" det øvre hengselet (fra Rabat EU kode 216), midtre hensel (fra Rabat EU kode 226) og lavere hengsel (Kabat EU kode 231), som beskrevet av Ole H Brekke et. al., Immunology Today 1995, 16, 85-90. Fire domene swap mutanter IgG2/4 (CH1 og hengselsregion: IgG2, andre regioner: IgG4), IgG4/2/4 (hengselsregion: IgG2, andre regioner: IgG4), IgG2/4/4 (CH1: IgG2, andre regioner: IgG4) og IgG4/2/2 (CH1: IgG4, andre regioner: IgG2) ble fremstilt henholdsvis for KM341-l-19-antistoffet og 2105-antistoffet.
En vektor N5KG2/4 for å uttrykke IgG2/4-antistoff ble fremstilt ved anvendelse av et Ztaq PCR kit (Takara). Reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primerene IgG3Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC (SEKV ID NR: 8) og 24Chi4: AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT (SEKV ID NR: 9). Samtidig ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG4 (IDEC Pharmaceuticals) som et templat og primerene 24Chi3: AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT (SEKV ID NR: 10) og linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 11). De amplifiserte DNA-fragmentene ble renset ved anvendelse av et PCR rensnings-kit og samme mengder av de to rensede DNA-fragmentene ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger. Primerene IgG3Bam og linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 12) ble tilsatt til blandingen og samme reaksjon ble utført 15 ganger. Det amμpifiserte DNA-fragmentet ble kløyvet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektoren.
En vektor N5KG4/2/4 for å uttrykke IgG4/2/4 ble fremstilt som følger. Reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG4 som et templat og primerene linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEKV ID NR: 13), G2Hin3:
TTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG (SEKV ID NR: 14), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 15) og G2Hin4:
ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCG (SEKV ID NR: 16). De amplifiserte DNA-fragmentene ble renset med et PCR rensnings-kit og samme mengder av de to rensede DNA-fragmentene ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger ved anvendelse av blandingen som et templat. Primerene linkH og linkH2 ble tilsatt til blandingen og samme reaksjon ble utført 15 ganger. Det amplifiserte DNA-fragment ble kløyvet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektor.
En vektor N5KG2/4/4 for å uttrykke IgG2/4/4 ble fremstilt som følger. Reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primerene linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEKV ID NR: 17) og G4CH1-2:
GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (SEKV ID NR: 18). Samtidig ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG4 som et templat og primerene G4CH1-1 :
CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC (SEKV ID NR: 19) og linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 20). Det amplifisert DNA-fragmentene ble renset ved anvendelse av et PCR rensnings-kit og samme mengder av de to rensede DNA-fragmentene ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger. Primerene linkH og linkH2 ble tilsatt til blandingen og samme reaksjon ble utført 15 ganger. Det amplifiserte DNA-fragmentet ble kløyvet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektoren.
En vektor N5KG4/2/2 for å uttrykke IgG4/2/2 ble fremstilt som følger. Reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført ved anvendelse av N5KG4 som et templat og primerene linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEKV ID NR: 21) og G4CH1-2: GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG (SEKV ID NR: 22). Samtidig ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primerene G4CH1-1 : CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC (SEKV ID NR: 23) og linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 24). De amplifiserte DNA-fragmentene ble renset ved anvendelse av et PCR rensnings-kit og samme mengder av de to rensede DNA-fragm enter ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger. Primerene linkH og linkH2 ble tilsatt til blandingen og samme reaksjon ble utført 15 ganger. Det amplifiserte DNA-fragmentet ble spaltet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektoren.
Bindingsaktivitet av de respektive fire domene swap mutantene av KM341-1-19-antistoffet og 2105 -antistoffet ble undersøkt. Som et resultat ble ingen forskjell mellom dem og det opprinnelige IgG2 observert med hensyn til bindingsevne (Figurene 6A-1 og 6A-2). Imidlertid fremviste kun IgG2/4/4 av både KM341-1-19-antistoffet og 2105-antistoffet betydelig redusert agonistisk aktivitet (Figurene 6B-1 og 6B-2). Resultatene bekreftet at hengselsregionen av IgG2 er viktig for agonistisk aktivitet.
Videre ble det undersøkt hvilken sekvens som er viktig i hengselsregionen.
Hengselsregionen er delt opp i tre seter, spesifikt, øvre hengsel, midtre hengsel og nedre hengsle (Ole H Brekke et al. Immunology Today 1995, 16, 85-90). IgG2-spesifikke sekvenser i disse regionene ble henholdsvis substituert med IgG4-spesifikke sekvenser. Antistoffer oppnådd ved innføring av en mutasjon inn i den øvre hengselen (fra Rabat EU kode 216), midtre hengsel (fra Rabat EU kode 226) og lavere hengsel (fra Rabat EU kode 231) ble henholdsvis definert som IgG2UH4, IgG2MH4 og IgG2LH4. Deres respektive ekspresjonsvektorer ble definert som N5KG2UH4, N5KG2MH4 og N5KG2LH4.
"Hengsel" er definert som EU-indeksene 216 til 230 i henhold til Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Femte utgave.
N5KG2UH4 ble fremstilt som følger. Reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primerene linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEKV ID NR: 25) og UH4-2: CACAACATTTggaCTCAACTcTCTTGTCCACC (SEKV ID NR: 26). Samtidig ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primerene UH4-1 :
GGT GGAC AAGAg AGTTGAGtcc AAAT GTTGT G (SEKV ID NR: 27) og linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 28). De amμlifiserte DNA-fragmentene ble renset ved anvendelse av et PCR rensnings-kit og samme mengder av de to rensede DNA-fragmentene ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger. Primerene linkH og linkH2 ble tilsatt til blandingen og samme reaksjon ble utført 15 ganger. Det amplifiserte DNAfragmentet ble kløyvet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektoren.
N5KG2MH4 ble fremstilt som følger. Reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primere linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEKV ID NR: 29) og UM4-2: GGCACGGTGGGCAtgggggaccataTTTGCGCTC (SEKV ID NR: 30). Samtidig ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primere UM4-1 :
GAGCGCAAAtatggtcccccaTGCCCACCGTGCC (SEKV ID NR: 31) og linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 32). Det amplifiserte DNA-fragmenter ble renset ved anvendelse av et PCR rensningskit og samme mengder av de to rensede DNA-fragmenter ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger. Primere linkH og linkH2 ble tilsatt til blandingen og samme reaksjon ble utført 15 ganger. Det amplifiserte DNA-fragmentet ble spaltet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektoren.
N5KG2LH4 ble fremstilt som følger. Reaksjon ved 98°C i 4 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder ble utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primerene linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag (SEKV ID NR: 33) og UL4-2: GAAGACTGACGGTCCccccaggaactcTGGTGCTGGGCA (SEKV ID NR: 34). Samtidig ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført 15 ganger ved anvendelse av N5KG2 som et templat og primerene UL4-1 :
TGCCCAGCACCAgagttcctggggGGACCGTCAGTCTTC (SEKV ID NR: 35) og linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc (SEKV ID NR: 36). De amplifiserte DNA-fragmentene ble renset ved anvendelse av et PCR rensings-kit og samme mengder av de to rensede DNA-fragmentene ble blandet. Deretter ble reaksjon ved 98°C i 1 sekund, ved 60°C i 30 sekunder og ved 72°C i 30 sekunder utført fem ganger. Primerene linkH og linkH2 ble tilsatt til blandingen og samme reaksjon ble utført 15 ganger. Det amplifiserte DNA-fragmentet ble spaltet med Nhel og BamHI og substituert med IgGl konstant region fra N5KG1 -vektoren.
De tre respektive domene swap mutantene av KM341-1-19-antistoffet og 2105-antistoffet ble bekreftet å ha samme bindingsaktivitet til et antigen (Figurene 6A-1 og 6A-2). Imidlertid fremviste IgG2UH4 og IgG2MH4 betydelig redusert agonistisk aktivitet for Ramos-celler (Figurene 6B-1 og 6B-2). Det ble funnet fra det ovennevnte at strukturene av øvre hengsel og midtre hengsel i hengselsregionen er viktig for IgG2 subklasse-avhengig agonistisk aktivitet av anti-CD40-anti stoffene KM341-1-19 og 2105.
Siden IgG2 subklasse ble funnet å være viktig for agonistisk aktivitet, ble antistoffer av subklasse forskjellig fra IgG2 omdannet til de for IgG2 subklasse for å undersøke hvorvidt den agonistiske aktiviteten ble forbedret, eller ikke. Ved undersøkelsen av mange kloner, kunne agonistisk aktivitet av F76 forbedres ved omdanning av IgGl subklasse til IgG2 subklasse (Figurene 7A og B).
Eksempel 11: Fremstilling av anti-CD40 antagonist antistoff-mutanter
Et DNA-fragment inneholdende en tung kjede og en lett kjede av et 4D11 antistoffgen beskrevet i WO 02/088186, hvis opprinnelige subklasse er IgGl, ble kløyvet med Bgin og Nhel, renset og deretter integrert i N5KG4PE, N5KG4P og N5KG4-vektorene (IDEC Pharmaceuticals). N5KG4PE inneholder punktmutasjonene S228P og L235E i IgG4 konstant region og N5KG4P inneholder en punktmutasjon S228P i IgG4 konstant region. Antistoffproteinet ble uttrykt og renset i henhold til metoden ovenfor. Antistoffet ble renset i henhold til metoden ovenfor ved anvendelse av binding til Ramos-celler som en indeks. Forandring i bindingsaktivitet av IgGl, IgG4, IgG4P og IgG4PE til Ramosceller ble ikke observert (Figur 8A). Antagonistisk aktivitet av IgGl ble sammenlignet med de av forskjellige IgG4-mutanter i henhold til metoden ovenfor for å finne at antagonistisk aktivitet av IgGl ikke skiller seg fra de fra IgG4-mutantene (Figur 8B).
Eksempel 12: Evaluering av ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet til anti-CD40 antagonist anti stoff-mutanter
ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet av anti-CD40 mutant antistoffer ble evaluert i henhold til metoden ovenfor.
Ved anvendelse av human MNC som effektorceller og CD40-uttrykkende Daudiceller som målceller, ble to mutanter IgG4 og IgG4PE henholdsvis observert å ha ADCC-aktivitet som er betydelig redusert sammenlignet med IgGl som den opprinnelige subklasse av 4D11 -antistoffet (Figur 9).
CDC-aktivitet av IgGl ble sammenlignet med den for IgG4P ved anvendelse av Daudi-celler som målceller. IgG4P ble funnet å ha CDC-aktivitet som er betydelig redusert sammenlignet med IgGl (Figur 10).
Eksempel 13: Effekt av anti-CD40 antagonistisk antistoff på B-celler
100 μg av hver av IgGl, IgG4P og IgG4PE av 4D11 -antistoffet ble administrert til halevenen hos mus som har en genetisk bakgrunn hvorved de ble homozygote for mus endogen avbrutt CD40 og som innehar har et transgen fra et humant CD40-gen (Yasui. et al. Int. Immunol. 2002 Vol 14: 319). 24 timer etter administreringen ble blod oppsamlet fra orbital venous plexus. Etter hemolyse med 0, 16 mol ammoniumklorid, ble et FITC-merket anti-B220 antistoff tilsatt til hemolysatet og det ble analysert ved anvendelse av FACS. Resultatene er vist i Figur 11. 1 figuren indikerer den langsgående aksen ratioen av B-celler i de samlede lymfocyttene. IgGl reduserte ratioen av B-celler mest, IgG4P reduserte ratioen i mindre grad og IgG4PE reduserte ratioen i mye mindre grad. 24 timer etter administreringen, ble milten fjernet og knust med et slide glass for å fremstille en cellesuspensjon. Etter hemolyse av cellesuspensjonen ble et PE-merket anti-B220 antistoff og et FITC-merket anti-CD23, CD86 eller CD95-antistoff anvendt for hemolysatet og det ble analysert ved anvendelse av FACS. Resultatene er vist i Figurene 12A, B og C. I figurene indikerer den langsgående aksen ratioen av B-celler som uttrykker hver overflatemarkør i de totale lymfocyttene. 4D11G1 ble funnet å oppnå samme nivå av økning i ekspresjon for hver markør som i et kommersielt tilgjengelig mus anti -human CD40 agonistisk antistoff 5C3 (Pharmingen). IgG4PE oppnådde en mindre økning i ekspresjon av hver aktivering overflatemarkør sammenlignet med IgGl og IgG4P.
Eksempel 14: Effekt av hemming av produksjon av antigenspesifikt antistoff og endring i antallet B-celler bevirket av anti-CD40 antagonistisk antistoff
100 pg (basert påNP-CGG) av et kompleks av 4-hydroksy-3-nitrofenylacetylkylling γ-globulinkonjugater (NP-CGG: distribuert av Professor Hitoshi KIKUTANI, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University) og alun (aluminiumhydroksid-gel) ble intraperitonealt administrert til mus som har en genetisk bakgrunn hvorved de ble homozygote for mus endogen avbrutt CD40 og bærer et transgen fra et humant CD40-gen (Yasui et al. Int. Immunol. 2002 Vol 14: 319) for å sensibilisere musen. Umiddelbart før antigen-sensibiliseringen, ble 50 eller 100 pg av hvert antistoff administrert til halevenen. 100 pg av et anti -human albumin humant IgG4PE-anti stoff ble administrert som en negativ kontroll. 7 og 14 dager etter sensibiliseringen ble blod oppsamlet fra orbital venous plexus. Mengdene av NP-spesifikke IgGl og IgM-anti stoffer i serum ble målt ved ELISA-metoden. ELISA-metoden ble utført som følger. 50 μ1/brønn av NP -bundet bovint serumalbumin (NP-BSA: 2,5 μg/ml) ble tilsatt til hver brønn av en 96 brønners mikroplate for ELISA (Maxisorp, fremstilt av Nunc A/S) og inkubert ved 4°C for å bevirke at NP-BSA adsorberes dertil. Deretter ble supematanten kastet og en blokkeringsreagens (SuperBlock, fremstilt av Pierce Bioteknologi, Inc.) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur for å gjennomføre blokkering. Deretter ble hver brønn vasket med en fosfatbuffer (PBS-T) inneholdende 0,1% Tween 20 tre ganger. Hvert serum fortynnet med PBS-T inneholdende 10% Block Ace (50 μ1/brønn) ble deretter tilsatt til hver brønn og inkubert og reagert ved 37°C i to timer. Mikroplaten ble vasket med PBS-T tre ganger. Deretter ble en 1,000 ganger fortynning av et geit anti-mus IgGl -antistoff eller IgM-antistoff merket med alkalisk fosfatase (Cosmo Bio, 1070-04 eller 1020-04) med PBS-T inneholdende 10% Block Ace (50 pg/brønn) tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37°C i to timer. Deretter ble mikroplaten vasket med PBS-T og deretter ble en fargesubstratløsning (50 μ1/brønn, Sigma 104, fosfatasesubstrat) tilsatt til hver brønn.
Absorbansen ved en bølgelengde på 405 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser. Resultatene er vist i Figurene 13A og B. I figurene indikerer den langsgående aksen verdi er oppnådd ved omdanning av en 10,000 ganger fortynning (i tilfellet av IgGl) eller 100 ganger fortynning (i tilfellet av IgM-anti stoffet) av serum oppsamlet fra C57BL/6 mus, til hvilke NP-CGG ble injisert to ganger og samlet til én enhet. 4D11 -antistoffet og IgG4P eller IgG4PE-anti stoffet av 281 hemmet produksjon av NP-spesifikk IgGl og IgM-anti stoffer like sterkt.
Endringen i antall B-celler i det perifere blodet og milten i musen anvendt for undersøkelse av effekten av hemming av antistoffproduksjon ble målt i henhold til samme metode som i Eksempel 1. Resultatene er vist i Figurene 14A og B. 4D11 -antistoffet og IgG4P-anti stoffet av 281 reduserte ratioen av B-celler i perifert blod betydelig sammenlignet med IgG4PE-anti stoffet. Administrering av 100 μg av IgG4PE-anti stoffet endret ikke ratioen av B-celler i milten fjernet 14 dager etter antigensensibiliseringen. Imidlertid, administrering av IgG4P endret eller var tilbøyelig til å endre ratioen.
Eksempel 15: Effekt av anti-CD40 antagonistisk antistoff på Cynomolgus-aper
30 mg/kg av IgG4P eller IgG4PE av et 4D11 -antistoff ble administrert til underarm cephalic vene hos Cynomolgus-aper og blod ble oppsamlet fra lårvenen etter en bestemt tidsperiode. I analysen av perifere blodlymfocytter, ble et FITC-merket anti-CD3-antistoff, PE-merket anti-CD20-antistoff og APC-merket anti-CD45-antistoff anvendt for hver cellesuspensjon og ratioen av positive celler ble målt ved anvendelse av FACS for å beregne ratioen av CD45-positive celler. Resultatene er vist i Figur 15. 1 figuren indikerer den langsgående aksen ratioen av CD20-positive celler ved hvert tidspunkt til CD20-positive celler før antistoffadministrering. 1 til 7 dager etter administrering av antistoff, var CD20-positive celler redusert med ca. 40% hos individer til hvilke IgG4P-anti stoffet ble administrert. Imidlertid var, 4 dager etter administreringen, CD20-positive celler redusert ved bare ca. 20% hos individer til hvilke IgG4PE-anti stoff ble administrert.
IL12-konsentrasjonen i serum ble målt ved ELISA-metoden. Blod oppsamlet fra lårvenen fikk stå ved romtemperatur i 20 til 60 minutter og ble deretter sentrifugert ved 3,000 rpm ved romtemperatur i 15 minutter. IL12-konsentrasjonen i det resulterende serum ble målt ved anvendelse av et ape IL12 ELISA kit (BioSource International Inc.).
Resultatene er vist i Figur 16. Ingen økning i IL12-produksjon ved IgG4PE-anti stoff ble observert ved hvilket som helst blodoppsamlingspunkt. Imidlertid ble maksimal IL1 2 roduksjon ved IgG4P-anti stoffet observert på den fjerde dagen.
Eksempel 16: Effekt av anti-CD40 antagonistisk antistoff på Cynomolgus-ape forsinket hypersensitivitet-modell
Ni hann Cynomolgus-aper ble intradermalt og intramuskulært sensibilisert med Tetanus toksoid (TTx) (10 Lf/ml; Denka Seiken Co., Ltd.) for å indusere forsinket hypersensitivitet til TTx. Samtidig, 10 minutter før starten av sensibiliseringen, ble 0,1 og 10 mg/kg av et 4D1 lG4PE-anti stoff intravenøst administrert til hvert tre dyr tre ganger (én gang pr. uke) for å undersøke effekten av 4D11G4PE på forsinket hypersensitivitet. Under anestesi ved intramuskulær administrering av ketamin, ble sensibilisering utført ved intradermal administrering av TTx til ryggen (50 μ1/sete x 12 seter) og intramuskulær administrering av TTx til lårbenet (0,6 ml/kropp) og provokasjon ble utført ved intradermal administrering av TTx til thorax (10 μΐ/sete, 0 til 10 Lf/ml for hvert av tre seter) 21 dager etter sensibiliseringen. 24 og 48 timer etter fremkallingen, ble hudreaksjon ved setet for administrering observert og evaluert i henhold til Draize skin irritation-score. Resultatene av bestemmelse av TTx-konsentrasjonen i hvert av de tre setene ble henholdsvis en gjennomsnittlig verdi. Resultatene er vist i Figur 17. Administrering av 4D11G4PE-antistoffet hemmet tilsynelatende forsinket hypersensitivitetsreaksjonen observert 24 og 48 timer etter administreringen.
Effekten av TTx på TTx-spesifikke IgG og IgM antistoff-titere ble undersøkt. Blod oppsamlet fra lårvenen over tid fikk stå ved romtemperatur i 20 til 60 minutter og ble deretter sentrifugert ved 3,000 rpm ved romtemperatur i 15 minutter. Antistoff-titeren i det resulterende serum ble målt ved anvendelse av ELISA-metoden. ELISA-metoden ble utført som følger. 100 μΐ/brønn av TTx (0,5 Lf/ml) ble tilsatt til hver brønn av en 96-brønners mikroplate for ELISA (Maxisorp, fremstilt av Nunc A/S) og inkubert ved 4°C for å bevirke at TTx adsorberes dertil. Deretter ble supematanten kastet og en blokkeringsreagens (fosfatbuffer inneholdende 0,5% BSA) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur for å utføre blokkering. Deretter ble hver brønn vasket med en fosfatbuffer (PBS-T) inneholdende 0,05% Tween 20 tre ganger. Deretter ble hvert serum fortynnet med PBS-T inneholdende 0,5% BSA (100 til 819,200 ganger fortynning, fortynning forstørrelse: 2; 100 μ1/brønn) tilsatt til hver brønn og inkubert og reagert ved romtemperatur i to timer. Mikroplaten ble vasket med PBS-T tre ganger. Deretter ble en 3,000 ganger fortynning av et geit anti-ape IgG antistoff eller IgM-antistoff merket med peroksidase (Nordic Immunology) med PBS-T inneholdende 0,5% BSA (100 μg/brønn) tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i én time. Deretter ble mikroplaten vasket med PBS-T og deretter ble en fargesubstratløsning (100 μΐ/brønn, o-fenylendiaminhydroklorid vandig hydrogenperoksid) tilsatt til hver brønn. Absorbansen ved en bølgelengde på 492 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser. Anti-TTx antistofftiteren ble definert som en maksimal fortynningsforstørrelse for å få en absorbans på 0,1 og mer. Antistoff-titeren var 0 når absorbansen ikke nådde 0,1 selv ved 100 ganger fortynning. Resultatene er vist i Figurene 18 og 19. Administrering av 1 mg/kg av 4D1 1G4PE undertrykte de TTx-spesifikke IgG og IgM antistoff-ti terene til ca. 1/10. Når 10 mg/kg av 4D11G4PE ble administrert, var antistoff-ti terene under deteksjonssensitiviteten ved hvilket som helst blodoppsamlingspunkt.
Eksempel 17: Effekt av anti-CD40 antagonistisk antistoff på blodplate trombedannelse Blod oppsamlet fra et friskt menneske ble delt i fire alikvoter (hver 6 ml). Kontroll human IgG4PE, kontroll mus IgG2a, human anti-human CD40 IgG4PE (4D11) og mus anti-human CD 154 IgG2a (5C8) ble henholdsvis tilsatt til fraksjonene slik at hver fraksjon hadde en blodkonsentrasjon på 100 μg/ml. Et flatt perfusjonskammer (GlykoTech Corp.) og en kollagenbelagt Petriskål ble satt sammen i henhold til den tilhørende instruksjonen. Blodet behandlet med forskjellige antistoffer ble bevirket til å strømme inn i kammeret ved en hastighet som kan påføre en ’’shear stress” på 1,500/s til blodet i syv minutter. Deretter ble en 4% paraformaldehydfosfatbuffer bevirket til å strømme inn i kammeret ved en hastighet som kan påføre en ’’shear stress” på 1,500/s til bufferen i 10 minutter.
Blodplateaggregatet dannet i Petriskålen ble fiksert, merket med et blodplatespesifikt PEmerket CD41a antistoff og observert med et fluorescensmikroskop. Resultatene er vist i Figurene 20A og B. Blodet behandlet med human anti-human CD40 IgG4PE (4D11) dannet et blodplateaggregat i den kollagenbelagte Petriskålen, i likhet med blodet behandlet med kontrollantistoffene. Blodet behandlet med mus anti -human CD 154 IgG2a dannet imidlertid ikke et blodplateaggregat.
Eksempel 18: Evaluering av stabilitet av anti-CD40 antagonistisk antistoff
Konstant region-modifiserte antistoffer av 4D11 -anti stoffet ble sammenlignet og undersøkt når det gjelder stabilitet. Ved evalueringsmetoden, ble kultursupematanter oppnådd ved henholdsvis å transient uttrykke G4P, G4PE, G2Ser og G4/2/4 i HEK293-celler fylt i en Protein A-kolonne (Amersham Pharmacia Biotech), eluert med en 0,1 M citratbuffer (pH 2,7) og deretter inkubert ved 37°C i 1 minutt og 10 minutter. Deretter ble de nøytralisert med en 50 nM fosfatbuffer (pH 7,0). Oligomerinnholdet i de resulterende antistoffløsningene ble målt ved anvendelse av en gelfiltreringskolonne (Tosoh Corp.). Som et resultat ble det funnet at oligomerinnholdet øker i proporsjon med inkuberingstiden og G4/2/4 produserer en oligomer lettest, G4PE nest lettest, G2Ser tredje lettest og G4P fjerde lettest (Figur 21).
Eksempel 19: Effekt av hemming av avstøtning av hudtransplantat ved anti-CD40 antagonistisk antistoff
Et transplantat oppsamlet fra halen fra DBA/2 -mus ble transplantert inn i side dorsal thorax hos C57BL/6 bakgrunnsmus som har en genetisk bakgrunn hvorved de ble homozygote for mus endogen avbrutt CD40 og inneholder et transgen av et humant CD40-gen og transplantatet ble fiksert med et plaster i syv dager. 100 pg av en testsubstans 4D1 1G4PE eller en konstituent ble administrert til halevenen 0, 2, 4, 7, 9, 11 og 14 dager etter hudtransplantasjon, henholdsvis. For å hemme avstøtning av transplantatet ved NK-celler, ble 100 pg av et anti-asialo GML-antistoff administrert intraperitonealt til alle mus 3 dager før operasjonen og 1, 4 og 9 dager etter operasjonen. Resultatene er vist i Figur 22. Forsinkelsen i avstøtning av transplantat ble observert å være betydelig i den 4D11G4PE-administrerte gruppen sammenlignet med konstituent-administrert gruppe.
Eksempel 20: Analyse av CD40-ekspresjon i humane tumorcellelinjer
Ekspresjon av CD40 i en Burkitts lymfom-cellelinje Ramos, blærekreftcellelinje T24 (ATCC, HTB-4), pankreatisk kreftcellelinje Hs 766T (ATCC, HTB-134) og Capan-2 (ATCC, HTB-80) ble bekreftet ved FACS-analyse ved anvendelse av 341G2Ser.
T24, Hs 766T og Capan-2 ble kløyvet med trypsin og høstet og Ramos ble høstet som den er. Cellelinjene ble vasket med PBS og deretter resuspendert i en merkingsbuffer inneholdende 1 μg/ml 341G2Ser. Merkingsbufferen ble fremstilt ved tilsetning av 0,05 mM EDTA, 0,05% natriumazid og 5% immobilisert bovint serum til PBS. Etter inkubering ved 4°C i 15 minutter, ble cellene vasket med merkingsbufferen to ganger og resuspendert i en 1 :250 fortynning av PE-bundet geit anti-human IgG (γ) (Southern Biotechnology Associates, Inc) med merkingsbufferen. Etter inkubering ved 4°C i 15 minutter, ble cellene vasket med merkingsbufferen to ganger og analysert med FACSCalibur (fremstilt av BD Biosciences). Samme mengde av et humant anti-2,4-dinitrofenol (DNP)-anti stoff ble anvendt som en negativ kontroll. Analysen ble utført ved anvendelse av Cellquest (fremstilt av BD Biosciences) som dataanalyse programvare for å beregne gjennomsnittlig fluorescensintensitet.
Som et resultat hadde Ramos, T24, Hs766T og Capan-2 en gjennomsnittlig fluorescensintensitet tydelig høyere enn den for den negative kontrollen når merket med 341G2Ser og følgelig ble ekspresjon av CD40 bekreftet.
Eksempel 21 : Effekt av anti-CD40 agonistisk antistoff på humane tumorcellelinjer 2,5 x 10<3>Ramos-celler, 2,5 x 10<2>T24 celler, 5 x 10<3>Hs766T-celler og 5 x 10<3>Capan-2 celler ble henholdsvis suspendert i et medium for å oppnå det totale volumet på 100 μΐ i en flatbunnet 96-brønners plate (fremstilt av Falcon). Ramos og Hs766T, Capan-2 og T24 ble dyrket i 66 timer, 90 timer og 114 timer, henholdsvis, sammen med 341G2Ser i en konsentrasjon på 1 ng/ml til 1,000 ng/ml ved 37°C i nærvær av 5% C02.10 μΐ (3, 7 MBq/ml) av<3>H-merket thymidin (fremstilt av Amersham Biosciences) ble tilsatt og dyrket ved 37°C i nærvær av 5% C02i seks timer. Ramos-celler ble høstet på Printed Filtermat A (fremstilt av PerkinElmer, Inc.) ved anvendelse av en 96 mikro cellehøster (fremstilt av Skatron Instruments, Inc.) og dekket med en prøve bag (fremstilt av PerkinElmer, Inc.). 12 ml Betaplate Seint (fremstilt av PerkinElmer, Inc.) ble tilsatt og 3-stråledosen ble målt med en væskescintillasjonsteller (Pharmacia 1205 Betaplate: fremstilt av Pharmacia Corp.). Hs 766T-celler, T24 celler og Capan-2 celler ble henholdsvis høstet på Unifilter (fremstilt av PerkinElmer, Inc.) ved anvendelse av en innhøster (fremstilt av PerkinElmer, Inc.). En spesiell forsegling ble festet til baksiden av hvert filter og 20 μΐ/brønn av MicroScint 20 (fremstilt av PerkinElmer, Inc.) ble tilsatt dertil, 3-strålingsdosen ble målt med en scintillasjonsteller (TopCount: fremstilt av Packard Instrument Co., Inc.). Data ble uttrykt som celle overlevelsesgrad (%) oppnådd ved å dividere et gjennomsnitt av triplikate målinger oppnådd i tre uavhengig tester med en verdi for ikke-behandlet kontroll.
Som et resultat ble celle-overlevelsesratene redusert i alle cellelinjene avhengig av 341G2Ser-konsentrasjonen (Tabell 1). Ved tilsetning av 100 ng/ml 341G2Ser, var Ramoscelle overlevelsesraten 58%, overlevelsesraten for T24-celler var 22%, overlevelsesraten for Hs 766T-celler var 15% og overlevelsesraten for Capan-2-celler var 77%. 341G2Ser ble funnet å ha aktivitet for å hemme vekst av Ramos-celler, T24-celler, Hs 766T-celler og Capan-2 celler.
Tabell 1
Celle
overlevelsesrate
Eksempel 22: Effekt av anti-CD40 agonistisk antistoff på mus kreftbærende modell (1) Ramos-celler
Seks uker gamle hunn Balb/c nakne mus (anskaffet fra CLEA Japan, Inc.) ble bestrålt med 3 Gy stråling og 2 x 10<7>celler/mus av Ramos-celler ble subkutant transplantert inn i ryggen derav. 16 dager etter transplantasjonen, ble størrelsen av tumorer som tok der målt. Kreftbærende mus som har en tumorstørrelse på 50 til 170 mm<3>ble klassifisert i grupper hver bestående av fem mus. 100 μg/mus av 341G2Ser (en løsning i 200 μΐ av PBS inneholdende 1% naken mus serum) ble intravenøst administrert til de kreftbærende musene én gang på den 16. dagen og tumorsstørrelsen ble målt inntil den 47.
dagen. Et humant anti -humant serumalbumin (HAR)-anti stoff ble anvendt som en negativ kontroll.
(2) T24-celler
En T24-cellemasse som hadde gjennomgått sub kutan passasje i ryggen av nakne mus tre ganger ble fjernet og subkutant transplantert inn i ryggen hos seks uker gamle hunn Balb/c nakne mus (anskaffet fra CLEA Japan, Inc.). Tumorcellemassen for transplantasjon er passende ca. 3 mm kvadrat. 10 dager etter transplantasjonen ble størrelsen av transplanterte tumorer målt. Kreftbærende mus som har en tumorstørrelse på 80 til 200 mm<3>ble klassifisert inn i grupper hver bestående av fem mus. 100 μg/mus av 341G2Ser (en løsning i 200 μΐ PBS inneholdende 1% naken mus serum) ble intravenøst administrert til kreftbærende mus én gang på den 10. dagen og tumorrstørrel sen ble målt inntil den 29. dagen. Samme mengde av et humant anti -DNP-antistoff ble anvendt som en negativ kontroll.
(3) Hs 766T-celler
7 x 10<5>celler/mus av Hs 766T-celler ble subkutant transplantert inn i ryggen til åtte uker gamle hunn Balb/c nakne mus (anskaffet fra CLEA Japan, Inc.). 16 dager etter transplantasjonen ble størrelsen av transplanterte tumorer målt. Kreftbærende mus som har en tumorstørrelse på 50 til 140 mm<3>ble klassifisert inn i grupper hver bestående av fem mus. 100 pg/mus av 341G2Ser (en løsning i 200 μΐ PBS inneholdende 1% naken mus serum) ble intravenøst administrert til de kreftbærende musene én gang på den 16. dagen og turn orstørrel sen ble målt inntil den 32. dagen. Samme mengde av et humant anti-DNP antistoff ble anvendt som en negativ kontroll.
(4) Capan-2-celler
2 x 10<6>celler/mus av Capan-2 celler ble subkutant transplantert inn i ryggen til seks uker gamle hunn Balb/c nakne mus (anskaffet fra CLEA Japan, Inc.). 13 dager etter transplantasjonen ble størrelsen av transplanterte tumorer målt. Kreftbærende mus som har en tumorstørrelse på 30 til 130 mm<3>ble klassifisert inn i grupper hver bestående av fem mus. 10 eller 100 μg/mus av 341G2Ser (en løsning i 200 μl PBS inneholdende 1% naken mus serum) ble intravenøst administrert til de kreftbærende musene to ganger pr. uke fra den 13. dagen og turn orstørrel sen ble målt inntil den 34. dagen. Et humant polyklonalt antistoff (hlgG) (fremstilt av Sigma Co.) ble anvendt som en negativ kontroll.
’Tumor growth inhibition ratio” (TGIR) ble beregnet fra den følgende formelen.
100- [ { (gj g tumorvolum for 341G2Ser-administrert gruppe ved siste
målingsdag - gjennomsnittlig tumorvolum for 341G2Ser-administrert gruppe på dagen for start av antistoffadministrering)/( gjennomsnittlig tumorvolum for negativ kontrolladministrert gruppe på siste målingsdag - gjennomsnittlig tumorvolum for negativ kontrolladministrert gruppe på dagen for start av antistoffadministrering)} x 100]
Som et resultat overgikk TGIR 100% i T24, Hs766T og Capan-2 kreftbærende mus og en reduksjon i tumorvolumet ble observert i musen. På den annen side var TGIR 73,4% i Ramos kreftbærende mus og en økning i tumorvolumet ble betraktelig undertrykket i musen (Tabell 2). Figurene 23 til 26 henholdsvis viser endringen i tumorvolumet for kreftbærende mus til hvilke Ramos-celler, T24-celler, Hs 766T-celler og Capan-2 celler ble henholdsvis transplantert.
Tabell 2
’’Tumor growth
inhibition ratio”
Inhiberingsratioen i hver cellelinje er en verdi på siste målingsdag.
Industriell anvendelighet
Anti-CD40-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse som har en konstant region inn i hvilken en mutasjon innføres og et anti-CD40-antistoff hvor en del av strukturen av subklassen er substituert med den fra en annen subklasse, har som vist i eksemplene, redusert ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet, mens den opprettholder sin aktivitet. Følgelig har antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse den reduserte cytotoksi si teten til CD40-uttrykkende celler når administrert til et subjekt som et terapeutisk antistoff og kan følgelig anvendes med sikkerhet.
Sekvens Liste Fri Tekst
SEKV ID NR: 2 til 36: Syntetiske DNA-er SEKV ID NR: 49 til 130: Syntetiske peptider

Claims (2)

PATENTKRAV
1. Farmasøytisk sammensetning for forebygging eller behandling av transplantatavstøtning, autoimmune sykdommer, allergi eller blodkoaguleringsfaktor VIII inhibisjon, omfattende et monoklonalt antistoff som en aktiv ingrediens, hvor det monoklonale antistoffet består av to tunge kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra Q i posisjon 27 til K i posisjon 474 i SED ID NO: 140 og to lette kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra A i posisjon 23 til C i posisjon 235 i SEQ ID NO:142.
2. Anvendelse av et monoklonalt antistoff for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for forebygging eller behandling av transplantatavstøtning, autoimmune sykdommer, allergi eller blodkoaguleringsfaktor VIII inhibisjon, hvor det monoklonale antistoffet består av to tunge kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra Q i posisjon 27 til K i posisjon 474 i SED ID NO:140 og to lette kjeder, hver representert ved en aminosyresekvens som går fra A i posisjon 23 til C i posisjon 235 i SEQ ID NO: 142.
NO20063197A 2003-12-25 2006-07-10 Farmasøytisk sammensetning omfattende et monoklonalt antistoff og anvendelse av et monoklonalt antistoff for å fremstille en farmasøytisk sammensetning NO344608B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003431408 2003-12-25
PCT/JP2004/019750 WO2005063981A1 (ja) 2003-12-25 2004-12-24 抗cd40抗体の変異体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20063197L NO20063197L (no) 2006-09-21
NO344608B1 true NO344608B1 (no) 2020-02-10

Family

ID=34736433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20063197A NO344608B1 (no) 2003-12-25 2006-07-10 Farmasøytisk sammensetning omfattende et monoklonalt antistoff og anvendelse av et monoklonalt antistoff for å fremstille en farmasøytisk sammensetning

Country Status (25)

Country Link
US (4) US8568725B2 (no)
EP (1) EP1707627B1 (no)
JP (2) JP4242388B2 (no)
KR (2) KR101223373B1 (no)
CN (1) CN1922316B (no)
AU (1) AU2004309275B2 (no)
BR (1) BRPI0417266B8 (no)
CA (1) CA2551008C (no)
CY (1) CY1114019T1 (no)
DK (1) DK1707627T3 (no)
EC (1) ECSP066710A (no)
ES (1) ES2397631T3 (no)
HK (1) HK1102134A1 (no)
HR (1) HRP20130078T1 (no)
IL (1) IL176508A (no)
NO (1) NO344608B1 (no)
NZ (1) NZ548325A (no)
PL (1) PL1707627T3 (no)
PT (1) PT1707627E (no)
RU (1) RU2377254C2 (no)
SI (1) SI1707627T1 (no)
TW (1) TW200540186A (no)
UA (1) UA93027C2 (no)
WO (1) WO2005063981A1 (no)
ZA (1) ZA200605874B (no)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US20080199471A1 (en) * 2002-03-01 2008-08-21 Bernett Matthew J Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
US8277810B2 (en) * 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
NZ548325A (en) 2003-12-25 2009-07-31 Kirin Pharma Kk Mutants of anti-CD40 antibody
JP4986633B2 (ja) * 2005-01-12 2012-07-25 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ３抗体
WO2006105062A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Verenium Corporation Altered antibody fc regions and uses thereof
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
US8048421B2 (en) 2006-03-23 2011-11-01 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Agonist antibody to human thrombopoietin receptor
EP4218801A3 (en) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
GB0620894D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
WO2008091954A2 (en) * 2007-01-23 2008-07-31 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
EP2150277B1 (en) * 2007-04-25 2013-02-27 Immurx, Inc. Adjuvant combinations of nkt activator, cd40 agonist, and optional antigen, the use through inducing synergistic cellular immunity
SI2202245T1 (sl) 2007-09-26 2016-10-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Postopek modificiranja izoelektrične točke protitelesa preko aminokislinske substitucije v CDR
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
WO2009041734A1 (ja) * 2007-09-26 2009-04-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体
PT2238168E (pt) * 2007-12-26 2014-07-18 Biotest Ag Agentes visando cd138 e suas utilizações
PL2242772T3 (pl) 2007-12-26 2015-05-29 Biotest Ag Immunokonjugaty nakierowane na CD138 i ich zastosowanie
EP2245065A1 (en) 2008-01-23 2010-11-03 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
PL2250279T3 (pl) 2008-02-08 2016-11-30 Przeciwciała anty-ifnar1 o zmniejszonym powinowactwie do liganda fc
WO2010064090A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-10 Pierre Fabre Medicament Process for the modulation of the antagonistic activity of a monoclonal antibody
AR074438A1 (es) * 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal
EP2406290B1 (en) 2009-03-10 2017-07-05 Baylor Research Institute Antigen presenting cell targeted cancer vaccines
ES2584956T3 (es) 2009-03-10 2016-09-30 Baylor Research Institute Anticuerpos anti-CD40 y usos de los mismos
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
AU2010240138B9 (en) * 2009-04-20 2016-12-15 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody containing IgG2 having amino acid mutation introduced therein
JP2011041475A (ja) * 2009-08-19 2011-03-03 Asahi Kasei Medical Co Ltd 抗体製造方法
EP2481752B1 (en) * 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
LT3178851T (lt) * 2010-03-31 2020-08-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-cd40 antikūnai
CN103517990A (zh) 2010-10-07 2014-01-15 通用医疗公司 癌症生物标志物
AR083847A1 (es) * 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
EP2676677B1 (en) * 2011-02-17 2019-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Highly concentrated anti-cd40 antibody pharmaceutical preparation
EP2683406B1 (en) 2011-03-11 2019-05-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
US9475879B2 (en) * 2011-04-21 2016-10-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibody polypeptides that antagonize CD40
CN106928362B (zh) 2011-04-29 2021-10-26 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
CN116063522A (zh) * 2011-06-13 2023-05-05 美国全心医药生技股份有限公司 抗psgl-1抗体及其用途
EP2812443B1 (en) 2012-02-06 2019-05-29 Inhibrx, Inc. Cd47 antibodies and methods of use thereof
EP2914627B1 (en) 2012-10-30 2021-04-07 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
MX2016001555A (es) 2013-08-08 2016-08-03 Cytune Pharma Modulocinas basadas en dominio sushi de interleucina-15 (il-15) y receptor alfa de interleucina-15 (il-15ra).
EP3050896B1 (en) 2013-09-27 2021-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
US10286058B2 (en) 2014-01-13 2019-05-14 Baylor Research Institute Vaccines against HPV and HPV-related diseases
WO2015134988A1 (en) * 2014-03-07 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
CA2943167A1 (en) * 2014-03-24 2015-10-01 University Of Southampton Modified antibodies containing modified igg2 domains which elicit agonist or antagonistic properties and use thereof
WO2016011401A1 (en) * 2014-07-18 2016-01-21 Kedl Ross M Immunostimulatory combinations and use thereof
EP3229586A4 (en) 2014-12-10 2018-10-24 Regents of the University of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
SI3303395T1 (sl) 2015-05-29 2020-03-31 Abbvie Inc. Protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
SI3307322T1 (sl) 2015-09-04 2021-08-31 Primatope Therapeutics Inc. Humanizirana protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
AU2016331819B2 (en) * 2015-09-30 2023-08-24 Janssen Biotech, Inc. Agonistic antibodies specifically binding human CD40 and methods of use
MX2018007781A (es) 2015-12-28 2018-09-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para promover la eficiencia de purificacion del polipeptido que contiene la region de fragmento cristalizable (fc).
CN109476750B (zh) 2016-05-27 2022-02-01 艾伯维生物制药股份有限公司 抗cd40抗体及其用途
PE20190562A1 (es) 2016-05-27 2019-04-22 Abbvie Biotherapeutics Inc Proteinas de union biespecificas que se unen a una proteina inmunomoduladora y un antigeno tumoral
KR102531889B1 (ko) 2016-06-20 2023-05-17 키맵 리미티드 항-pd-l1 및 il-2 사이토카인
US11471515B2 (en) 2016-11-09 2022-10-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Restoration of tumor suppression using MRNA-based delivery system
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
KR102696143B1 (ko) 2017-04-07 2024-08-21 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 보체-의존성 세포용해 효과기 기능의 조정을 위한 변형된 인간 IgM 불변 영역
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
MX2020004411A (es) 2017-11-03 2020-08-06 Novartis Ag Anticuerpos anti-cd40 para usarse en el tratamiento del sindrome de sjogren.
CN109971725B (zh) * 2017-12-28 2024-02-02 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN109971721B (zh) * 2017-12-28 2023-10-31 上海细胞治疗研究院 自表达cd47抗体的间皮素特异性car-t细胞及其用途
CA3090652A1 (en) 2018-02-06 2019-08-15 The General Hospital Corporation Repeat rna as biomarkers of tumor immune response
JP6861301B2 (ja) 2018-04-13 2021-04-21 ノバルティス アーゲー 移植片拒絶の予防に使用するための抗ｃｄ４０抗体
US11976123B2 (en) 2018-04-20 2024-05-07 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Anti-CD40 antibodies and uses thereof
CN112638375A (zh) 2018-06-15 2021-04-09 旗舰创业创新五公司 通过后细胞信号传导因子的调节来增加免疫活性
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
EP3856790A4 (en) * 2018-09-28 2022-09-28 Lyvgen Biopharma Holdings Limited ANTI-CD40 BINDING MOLECULES WITH MODIFIED CF DOMAINS AND THEIR THERAPEUTIC USES
WO2020065409A2 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 Lyvgen Biopharma Co., Ltd. Anti-cd40 binding molecules having engineered fc domains and therapeutic uses thereof
EP3883635A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
BR112021009835A2 (pt) * 2018-11-30 2021-08-17 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso farmacêutico dos mesmos
TW202033558A (zh) 2019-01-11 2020-09-16 瑞士商諾華公司 化膿性汗腺炎治療中使用的抗cd40抗體
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
BR112021021923A2 (pt) 2019-05-08 2022-02-22 Novartis Ag Anticorpos anti-cd40 para uso no tratamento de dm1 e insulite
US20220332836A1 (en) 2019-09-11 2022-10-20 Novartis Ag A method for preventing human virus associated disorders in patients
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
AU2021206256A1 (en) 2020-01-10 2022-07-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for delivery of immunotherapy agents across the blood-brain barrier to treat brain cancer
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
CN116963774A (zh) 2021-01-28 2023-10-27 瑞泽恩制药公司 用于治疗细胞因子释放综合征的组合物和方法
AU2022246895A1 (en) 2021-03-31 2023-10-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000018804A1 (en) * 1998-09-28 2000-04-06 Smithkline Beecham Corporation Tie2 agonist antibodies
WO2000061637A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Smithkline Beecham Corporation Erythropoietin receptor antibodies
WO2002088186A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-07 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-cd40 monoclonal antibody
EP1369431A1 (en) * 2001-10-15 2003-12-10 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-hla-dr antibody

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
NZ226694A (en) 1987-10-28 1994-04-27 Oncogen Human immunoglobulin produced by recombinant dna techniques
DE3737506A1 (de) 1987-11-05 1989-05-24 Ibm Deutschland Vorrichtung zur bestueckung insbesondere von leiterplatten
JPH0725784B2 (ja) 1989-09-14 1995-03-22 鐘紡株式会社 アルコール刺激臭暖和剤
NZ282849A (en) * 1994-03-29 1998-05-27 Celltech Therapeutics Ltd Antibodies against e-selectin; whole antibodies of neutral isotype, being variants of natural antibodies altered in the fc region
WO1999055369A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
US6376653B1 (en) * 1998-09-28 2002-04-23 Smithkline Beecham Plc Tie2 antagonist antibodies
US6998124B1 (en) * 1999-04-14 2006-02-14 Smithkline Beecham Corporation Erythropoietin receptor antibodies
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
DK1391464T3 (da) * 2001-04-27 2008-01-14 Kirin Pharma Kk Anti-CD40 monoklonalt antistof
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
NZ548325A (en) * 2003-12-25 2009-07-31 Kirin Pharma Kk Mutants of anti-CD40 antibody
EP2676677B1 (en) * 2011-02-17 2019-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Highly concentrated anti-cd40 antibody pharmaceutical preparation

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000018804A1 (en) * 1998-09-28 2000-04-06 Smithkline Beecham Corporation Tie2 agonist antibodies
WO2000061637A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Smithkline Beecham Corporation Erythropoietin receptor antibodies
WO2002088186A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-07 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-cd40 monoclonal antibody
EP1391464A1 (en) * 2001-04-27 2004-02-25 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-cd40 monoclonal antibody
EP1369431A1 (en) * 2001-10-15 2003-12-10 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-hla-dr antibody

Also Published As

Publication number Publication date
US20150057437A1 (en) 2015-02-26
UA93027C2 (ru) 2011-01-10
US20140248266A1 (en) 2014-09-04
CA2551008C (en) 2013-10-01
US20070148163A1 (en) 2007-06-28
CN1922316A (zh) 2007-02-28
SI1707627T1 (sl) 2013-02-28
AU2004309275A1 (en) 2005-07-14
RU2006126979A (ru) 2008-01-27
WO2005063981A1 (ja) 2005-07-14
KR101200188B1 (ko) 2012-11-13
NZ548325A (en) 2009-07-31
KR20120116018A (ko) 2012-10-19
ZA200605874B (en) 2008-04-25
BRPI0417266B8 (pt) 2021-05-25
ES2397631T3 (es) 2013-03-08
EP1707627B1 (en) 2012-11-14
US9598494B2 (en) 2017-03-21
PT1707627E (pt) 2013-01-24
JP2009022289A (ja) 2009-02-05
US8568725B2 (en) 2013-10-29
JPWO2005063981A1 (ja) 2007-07-19
RU2377254C2 (ru) 2009-12-27
CY1114019T1 (el) 2016-07-27
IL176508A0 (en) 2006-10-05
BRPI0417266B1 (pt) 2020-04-28
KR101223373B1 (ko) 2013-01-16
US9023361B2 (en) 2015-05-05
DK1707627T3 (da) 2012-12-17
BRPI0417266A (pt) 2007-03-13
HK1102134A1 (en) 2007-11-09
JP4242388B2 (ja) 2009-03-25
CN1922316B (zh) 2011-03-23
US9023360B2 (en) 2015-05-05
ECSP066710A (es) 2006-11-24
CA2551008A1 (en) 2005-07-14
EP1707627A4 (en) 2008-08-27
KR20060130615A (ko) 2006-12-19
HRP20130078T1 (hr) 2013-02-28
EP1707627A1 (en) 2006-10-04
US20140105907A1 (en) 2014-04-17
IL176508A (en) 2011-09-27
TWI343389B (no) 2011-06-11
AU2004309275B2 (en) 2010-12-23
TW200540186A (en) 2005-12-16
PL1707627T3 (pl) 2013-04-30
NO20063197L (no) 2006-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9598494B2 (en) Anti-CD40 antibody mutants
CA2580981C (en) Stabilized human igg4 antibodies
JP2019519223A (ja) 免疫調節タンパク質及び腫瘍抗原に結合する二重特異性結合タンパク質
US20230227584A1 (en) Bispecific antibodies comprising a modified c-terminal crossfab fragment
US20220112298A1 (en) Novel anti-cd4o antibodies and use thereof
WO2020065409A2 (en) Anti-cd40 binding molecules having engineered fc domains and therapeutic uses thereof
WO2020069382A1 (en) Anti-cd137 binding molecules having engineered fc domains and therapeutic uses thereof
WO2023093811A1 (zh) 分子开关调控型嵌合抗原受体细胞和抗体的组合及其应用
WO2023056429A1 (en) Anti-nmdar2b antibodies, antibody-drug conjugates, and chimeric antigen receptors, and compositions and methods of use
CA3180321A1 (en) Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CA3159555A1 (en) Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
US11993659B2 (en) BCMA targetting antibodies, chimeric antigen receptors, and uses thereof
EP3856790A2 (en) Anti-cd40 binding molecules having engineered fc domains and therapeutic uses thereof
JP2024526090A (ja) 同種ｃａｒ ｔ細胞の持続性を延長するための宿主ｃｄ７０＋アロ反応性細胞の選択的標的化
CN114933654B (zh) 靶向cd123的抗体、嵌合抗原受体及其用途
JP7278623B2 (ja) 抗ｃｄ２７抗体およびその使用
WO2023019398A1 (en) Bcma targetting antibodies, chimeric antigen receptors, and uses thereof
MXPA06006760A (en) Mutants of anti-cd40 antibody
WO2024148243A1 (en) Anti-il-18bp antibodies
CN115322257A (zh) Bcma靶向抗体、嵌合抗原受体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: KYOWA KIRIN CO., JP

MM1K Lapsed by not paying the annual fees