CN107108742A - 结合ccr6的抗体和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与CCR6结合的抗体或抗体片段。更具体地，本发明涉及与CCR6结合的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含了含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1；和/或含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:255的氨基酸序列的重链CDR2和/或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含了含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246或SEQ ID NO:256的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248或SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链CDR2和/或含有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:193的氨基酸序列的轻链CDR3。

Description

结合CCR6的抗体和它们的用途
技术领域
本发明涉及改善的与CCR6结合的抗体或其片段。更具体地，本发明涉及与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1；和/或含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ IDNO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:255的氨基酸序列的重链CDR2和/或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含了含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246或SEQ ID NO:256的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248或SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链CDR2和/或含有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:193的氨基酸序列的轻链CDR3。本发明还涉及包含所述抗CCR6抗体的药物和相关物质及其治疗疾病的用途。
背景技术
趋化因子是对免疫系统稳态和活化必需的趋化性促炎细胞因子家族。它们指导免疫细胞移行入炎症部位和感染部位。趋化因子与属于G蛋白偶联受体(GPCR)的7次跨膜结构域家族的特定细胞表面受体结合。
CCR6是属于GPCR超家族A类的趋化因子受体并且它表达在人树状细胞、记忆T细胞和B细胞上(Zaballos等人,(1996)Biochem&Biophys Res Com,227:846-853；Greaves等人,(1997)J Exp Med,186:837-844；Power等人,(1997)J Exp Med 186:825-835；Liao等人,(1999)J Immunol 162:186-94)。CCR6的唯一已知配体是趋化因子CCL20，也称作MIP-3α、LARC或Exodus(Rossi等人,(1997)J Immunol 158:1033-1036)。CCR6受体首先作为孤儿受体克隆自人类基因组DNA(Zaballos等人，上文)。RNA印迹分析已经揭示在多种人组织中CCR6主要在脾、淋巴结、胸腺、阑尾和PBMC表达(Baba等人,(1997)J Biol Chem,272:14893-14898)。在各种白细胞亚群当中，CCR6mRNA已经在淋巴细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞及B细胞)中检出，但是未在天然杀伤细胞、单核细胞或粒细胞中检出(Baba等人，上文)。匹配CCL20/CCR6的趋化因子配体/受体是有意义的，因为这些分子显示体内稳态功能和活化功能的特征并且这些双重特征提示了CCR6在免疫应答的引发阶段和效应阶段的作用。
由于CCR6表达在Th17细胞上(Romagnani S等人,(2009)Mol Immunol 47:3-7)，CCR6参与多种自身免疫性疾病和炎性疾病，例如，特应性皮炎、接触性皮炎、蕈样霉菌病、银屑病、慢性肝炎、牙周病、HPV、IBD、类风湿性关节炎、过敏性哮喘、COPD、迟发型超敏反应、B细胞恶性肿瘤、乳腺腺癌、肝细胞癌、胰腺腺癌、甲状腺乳头状癌和胶质母细胞瘤。
研究人员已经使用多种方法例如使用噬菌体展示法生成了针对CCR6的抗体WO2013184218(MSM PROTEIN TECHNOLOGIES)。也已经使用常规免疫方法生成抗CCR6抗体WO2001017558A3(SCHERING CORPORATION)。这类现有抗体均不具有适合作为治疗性抗体必需的特性。即，虽然一些或全部的这些抗体对人CCR6具有结合亲和力，但是它们不具有调节人CCR6受体活性的能力(例如防止CCR6依赖性细胞移行的能力)或尚未展示出具有这种能力。这类现有抗体也尚未显示适合用作诊断性抗体，因为它们没有CCR6特异性。
因此本领域仍需要可以在治疗及诊断多种免疫和炎性疾病和病症中使用的组合物。
发明概述
本公开总体上涉及与CCR6结合的抗体或其片段、其制备及使用方法，包括用于治疗CCR6介导的疾病的方法。与CCR6结合的本发明抗体或其片段显示出多种合乎需要的特性并且可以用于治疗多种疾病，包括但不限于炎性疾病和/或自身免疫性疾病。
在一个方面，本公开提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1；和/或含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241或SEQ ID NO:242的氨基酸序列的重链CDR2和/或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含了含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:246的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248或SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或含有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:193的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据本公开的另一个方面，提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1；和/或含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的重链CDR2和/或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含了含有SEQ ID NO:245的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或含有SEQ ID NO:191的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或含有SEQ ID NO:192的氨基酸序列的轻链CDR3。
在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179、249的氨基酸序列的重链可变区序列。
优选地，与CCR6结合的抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:7、37、75、177、178和179和最优选地SEQ ID NO:7、37或249的氨基酸序列的重链可变区序列。
在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含作为选自以下的人基因的产物或衍生自所述人基因的重链可变构架区：IGHV3-11*04(SEQ ID NO:77)、IGHV3-11*01(SEQ ID NO:78)、IGHV3-48*03(SEQ ID NO:79)、IGHV3-23*04(SEQ ID NO:80)和IGHV3-66*04(SEQ ID NO:81)。最优选地，人基因是IGHV3-23*04(SEQID NO:80)并且其中与相应的鼠或中间抗体序列的重链可变区的相应构架区相比，重链可变构架区包含至少一个氨基酸修饰。
根据本发明，中间抗体意指起始抗体的任何形式，其至少一个残基异于原始抗体并且特别指根据本发明通过人化或改善鼠抗体所生成的一种或多种抗体。
在又一个方面，本发明提供一种包含轻链可变序列的抗体或其片段，所述轻链可变序列包含SEQ ID NO:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253的氨基酸序列。
优选地，与CCR6结合的抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:8、38、181、182、250、251、252或253和最优选地SEQ ID NO:8、38、251或253的氨基酸序列的轻链可变区序列。
在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含作为选自以下的人基因的产物或衍生自所述人基因的轻链可变构架区：种系FW区IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)、IGKV2-30*01(SEQ ID NO:83)IGKV2D-30*01(SEQ ID NO:84)、IGKV2-29*02(SEQ ID NO:85)和IGKV2-29*03(SEQ ID NO:86)。
在又一个方面，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含作为人基因IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)的产物或衍生自所述人基因的轻链可变构架区并且其中轻链可变构架区包含来自相应鼠抗体的或中间抗体序列的轻链可变区的相应构架区中的至少一个氨基酸修饰。
在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO:10、19、20、21、22、23、24、173、175、183、184、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、221、224、227、230、233和235的重链序列。在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、176、186、187、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、222、225、228、231和236的轻链序列。
在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了：
(a)含有SEQ ID NO:19、24、214或216的氨基酸序列的重链序列；和
(b)含有SEQ ID NO:25、30、215或217的氨基酸序列的轻链序列。
在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其中抗体包含人IgG4Fc区，其中抗体没有Fc介导的细胞毒活性。在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其中抗体包含人IGHG1Fc区，其中抗体有能力执行细胞毒性机制如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在一个优选的方面，与CCR6结合的抗体或其片段具有非岩藻糖基化的IGHG1Fc区并且显示增强的Fc介导的细胞毒性机制如ADCC。
在另一个方面，本发明提供与人CCR6结合并且还与食蟹猴CCR6结合的交叉反应性抗体或其片段。“交叉反应性抗体”意指与来自一个物种(例如，人)的抗原结合并且还与不同物种(例如，猕猴(Macaca Mulata)和食蟹猴(Macacca fascicularis))中相应抗原结合的抗体。
在另一个方面，本发明的公开内容还描述了人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段以类似于相应嵌合抗体的亲和力与CCR6结合，例如，保留相应嵌合抗体的至少85％的CCR6结合亲和力(KD)或与相应嵌合抗体相比时具有至少等同或更高的CCR6结合亲和力(KD)。
在另一个方面，本发明还涉及抗CCR6抗体或其片段，所述抗CCR6抗体或其片段可以抑制CCL20介导的表达CCR6的细胞群体移行。发明人已经令人惊讶地发现，本发明的抗体具有意料之外的特性，即抑制CCL20介导的表达CCR6的细胞趋化和在一些情况下完全消除这种趋化。
在另一个方面，本发明还涉及在体内影响CCL20与CCR6结合的抗CCR6抗体或其片段。发明人已经令人惊讶地发现，本发明的抗体在CCR6与其配体CCL20的结合中相互作用，从而减少配体受体结合作用和在一些情况下完全阻止这种结合作用。
在另一个方面，本发明还涉及在体内充当CCR6拮抗剂的抗CCR6抗体或其片段。
在另一个方面，本发明还涉及显示热稳定性增强的抗CCR6抗体或其片段。
本发明的公开内容还提供了编码与CCR6结合的抗体及其片段的分离核酸、包含该核酸的载体和包含该核酸或载体的宿主细胞。还提供了包含抗CCR6抗体或其片段和可药用载体的组合物和包含与治疗剂连接的抗体或其片段的免疫缀合物。
本公开还提供用于治疗CCR6介导的疾病的方法。在一个方面，在CCL20诱导细胞移行的体外模型中，响应于CCL20，抗CCR6抗体或其片段有效抑制表达CCR6的细胞移行。
本公开还提供了包含抗CCR6抗体或其片段和载体如稀释剂或赋形剂的药物组合物。
本公开还提供试剂盒和制造品，其包含用于治疗CCR6介导的疾病的抗体或其片段、组合物或免疫缀合物。
附图简述
图1：候选杂交瘤的流式细胞分析。柱状图显示荧光强度的几何平均值(Y-轴)和克隆ID(X-轴)。在人CCR6转染的BAF细胞(图1A)或表达无关蛋白质的BAF(图1B)上评价候选杂交瘤的结合作用。
图2：CCR6生物测定法中测试嵌合4H11的阻断作用。
(A)在Discoverx生物测定法中测试嵌合4H11的阻断潜力。
本图显示来自使用嵌合4H11的功能性Discoverx CCR6生物测定法的结果。在这个测定法中，在含有PathHunter组分的细胞上在按照五个不同浓度(20、6.7、2、0.7和0.2μg/ml)所用的嵌合4H11存在下测量CCL20诱导的化学发光活性。在使用嵌合IgG1同种型对照作为100％发光活性的条件下，考虑化学发光信号计算相对发光单位百分数(RLU)。
(B)在CCL20诱导的趋化性测定法中测试嵌合4H11的阻断潜力。
本图显示来自使用嵌合4H11的功能性CCR6依赖性移行测定法的结果。使用6.5mmTranswell平板的移行测定法，其中在按照三个不同浓度(10、2和0.4μg/ml)使用的嵌合4H11存在下，评价全长人CCR6转染的BAF细胞响应于重组人CCL20的移行。作为阳性对照，按照10μg/ml使用一种商业抗CCL20抗体。通过使用流式细胞仪计数Transwell的上室和下室中的细胞，评价移行过程。
图3：嵌合4H11抗体的流式细胞分析。
(A)活化的人外周血单个核细胞(PBMC)上的染色。
柱状图显示与(X-轴中)每种受检抗体相对应的荧光强度的几何平均值(Y-轴上的几何平均数)。用抗人IgG-PE检测嵌合4H11与人CCR6的结合。为了检测商业抗体与人CCR6的结合，使用抗小鼠-PE第二抗体。
(B)食蟹猴外周血单个核细胞(PBMC)上的染色。
通过流式细胞术评价嵌合4H11抗体与食蟹猴CCR6的结合。外周血单个核细胞(PBMC)从采集自食蟹猴的全血分离并且将2x 105个细胞与10μg/ml对照抗体或嵌合4H11抗体温育。用抗人IgG-PE检测4H11与食蟹猴CCR6的结合。为了检测商业抗体与食蟹猴CCR6的结合，使用抗小鼠-PE第二抗体。
图4：使用人/小鼠CCR6杂合转染子评价嵌合4H11抗体的结合区。
通过流式细胞术评价嵌合4H11抗体与人/小鼠CCR6杂合构建体的结合。计数人/小鼠CCR6转染子并将2x105个细胞与10μg/ml嵌合4H11抗体温育。用抗人IgG-PE检测4H11的结合活性。为了评价人/小鼠嵌合体在细胞上的良好表达，使用针对人CCR6和小鼠CCR6的两种商业抗体。柱状图显示通过流式细胞术测量的荧光强度的几何平均值(Y-轴)。
图5：评价嵌合4H11抗体在CCR6N端区域内部的表位
通过流式细胞术评价嵌合4H11抗体与CCR6N端区域的人/小鼠杂合分子的结合，如图4中所述。
图6：通过细胞-ELISA测试人源化抗人CCR6候选物。
使用人CCR6转染的CHO细胞评价人源化4H11候选物的结合作用。在这个实验中，96孔板用100μl在PBS中按1μg/ml稀释的Poly-D预包被。次日，将细胞洗涤，以1x106个细胞/孔铺种并且与各种浓度的(范围从10至0.0137μg/ml)人源化4H11候选物温育并在4％PFA中固定。使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人Ig Fc片段特异性HRP作为第二抗体。TMB底物用来揭示抗体结合活性并通过添加H2SO4终止反应，并且在450nM读取光密度(OD 450nM)。
图7：在功能性Ab Hunter CCR6生物测定法中测试人源化4H11抗人CCR6候选物。将含有PathHunter组分的细胞与各种浓度(10、3、1和0.3μg/ml)的具有两种不同人IgG主链的人源化4H11候选物温育。在用CCL20活化细胞并添加PathHunter检测试剂后测量化学发光活性。通过计算最大相对发光单位(RLU)百分数评价人源化4H11候选物的中和活性，其中RLU max是最大刺激时的光发射。
图8：在固定化重组人N端CCR6Fc上的直接结合ELISA。通过直接ELISA测量人源化4H11H5L1抗体在CCR6人N端片段上的结合作用。将各种浓度(范围从10至0.00006μg/ml)的具有IgG1主链和IgG4HS主链的人源化4H11H5L1与96孔板中在4℃包被过夜的2μg/ml重组人N端CCR6-Fc标签的蛋白质(图8A)或重组食蟹猴N端肽Fc(图8B)温育。通过辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人(Fab)’2-特异性抗体检测人源化4H11H5L1抗体与N端CCR6-Fc蛋白的结合。
图9：4H11VH5/VL1IgG4HS抗体的表面等离子体共振测量。本图显示使用人源化4H11(VH5/VL1)Fab抗体作为分析物时，在人(图9A)和食蟹猴(图9B)CCR6N端肽Fc融合物上测量的动力学结合亲和力常数(KD)。数据表示为响应数(缩写RU；Y轴)与时间(X轴)。
图10:使用人-小鼠杂合CCR6转染子在移行测定法中测试4H11VH5/VL1IgG4HS抗体。本图显示了来自使用6.5mm Transwell平板的移行测定法的结果，其中在以10μg/ml使用的4H11VH5/VL1IgG4HS存在下，评价人-小鼠嵌合体CCR6转染的BAF细胞响应于重组人CCL20(图形的左侧部分)或小鼠CCL20(图形的右侧部分)的移行。作为对照抗体，商业抗小鼠CCL20抗体以10μg/ml使用。通过使用流式细胞仪计数Transwell的上室和下室中的细胞，评价移行过程。
图11：使用CCR6转染的细胞，通过流式细胞术测试4H11VH5/VL1IgG4HS抗体的中和潜力。
将CCR6转染的细胞在4℃与含有0.1％叠氮化物的FACS缓冲液中系列稀释(从100至0.00001μg/ml)的人源化4H11-VH5/VL1温育20分钟。将细胞离心并且在4℃与0.5μg/ml重组人CCL20温育20分钟。为了检测与CCR6结合的CCL20，将细胞与生物素酰化的山羊抗人CCL20温育，随后与按1/100在含有0.1％叠氮化物的FACS缓冲液中稀释的别藻蓝蛋白(APC)标记的链霉亲和素温育。为了评价人源化4H11VH5/VL1IgG4HS的阻断潜力，在每种抗体浓度测量CCL20百分数。将CCL20与CCR6的最大结合活性计算为对同种型对照所观察到的结合活性的百分数。
图12：使用人CCR6转染的细胞，通过流式细胞术测试单价样式和双价样式的4H11VH5/VL1抗体。
通过流式细胞术评价单价和双价4H11VH5/VL1抗体与人CCR6转染的BAF细胞的结合活性。计数表达人CCR6的BAF细胞并且将2x 105个细胞与多种浓度(范围从3至0.01μg/ml)的单价或双价4H11VH5/VL1抗体温育。使用抗人IgG-PE检测两种抗体的结合活性。作为对照，无关的人IgG抗体以3μg/ml使用。柱状图显示通过流式细胞术测量的荧光强度的几何平均值(Y-轴)。
图13：使用人CCR6转染的细胞，在移行测定法中测试单价样式和双价样式的4H11VH5/VL1抗体。
在使用6.5mm Transwell平板的移行测定法中评价双价和单价4H11VH5/VL1抗体的阻断潜力。在这个测定法中，计数人CCR6转染的BAF细胞并且在多种浓度(范围从50至0.4μg/ml)的单价或双价4H11VH5/VL1抗体存在下，将1x 105个细胞与重组人CCL20温育。作为对照抗体，无关的人IgG抗体以50μg/ml使用。通过使用流式细胞仪计数Transwell的上室和下室中的细胞，评价移行过程。
图14：来自噬菌体展示文库的VH5/VL1scFv变体的解离速率分析。
图14A：从CDR-H2文库分离的scFv片段。图14B：从CDR-L3文库分离的scFv片段。
图15：位置CDR-L1 28和29处VH5/VL1FAB变体的表面等离子体共振测量。
本图显示使用FAB变体作为分析物时，对人CCR6N端肽Fc融合物测量的SPR数据。数据表示为响应数(缩写RU；Y轴)与时间(X轴)。
图16：使用差示扫描量热法的VH5/VL1L1-G29A FAB热稳定性测量。
数据表示为过量摩尔热容(缩写为Cp[kcal/mol/℃]；Y轴)与温度(℃；X轴)。
图17：用于亲和力和功能性测试的工程化VH5/VL1FAB片段和抗体样式的序列详情。
图18：通过SPR对工程化VH5/VL1FAB测量的结合常数。
图18A：人和食蟹猴CCR6融合蛋白的结合常数总结。图18B：四种不同的工程化VH5/VL1FAB片段之间的解离速率比较。
图19.在CCL20诱导的趋化测定法中测试亲和力成熟的双价和单价4H11-VH5/VL1候选物的阻断潜力。
本图显示了来自移行测定法的结果，所述移行测定法使用以四个不同浓度(20、6.67、2.2和0.75μg/ml)测试的各种亲和力成熟的VH5/VL1变体。在这个测定法中，在双价IgG或单价Fab亲和力成熟的VH5/VL1候选物存在下，评价全长人CCR6转染的BAF细胞响应于添加至下室的CCL20穿过HTS-96可透过性支持物的移行过程。作为对照，非亲和力成熟的4H11VH5/VL1IgG1mAb以20μg/ml使用。在测定法中人IgG1同种型对照以20μg/ml使用。
通过使用流式细胞仪计数Transwell的上室和下室中的细胞，评价移行过程。
发明详述
本公开涉及与CCR6结合的适合用作治疗剂或用作诊断试剂组成部分的新抗体及其片段。
如本文所用的术语“CCR6”包括CCR6的变体、同工型和物种同源物。因此，本公开的抗体可以与人CCR6结合并且可以与来自人之外物种(例如小鼠、大鼠或食蟹猴)的CCR6交叉反应。在某些实施方案中，抗体可以完全对一种或多种人CCR6蛋白特异并且可以不显示出物种型或其他类型的非人类交叉反应性。一种示例性人CCR6的完整氨基酸序列具有Swiss-Prot登录号P51684(CCR6_HUMAN；SEQ ID NO:71)。CCR6又称作C-C CKR-6、CC-CKR-6、CCR-6、LARC受体、GPR-CY4、GPRCY4、趋化因子受体样3、CKR-L3、DRY6或GPCR29。CCR6最近还命名为CD196(分化抗原簇196)。人CCR6由Entrez Gene命名为Gene ID:1235并且由HGNC命名为HGNC:1607。CCR6可以由命名为CCR6基因的基因编码。一种示例性鼠CCR6的完整氨基酸序列具有Swiss-Prot登录号O54689(CCR6_MOUSE；SEQ ID NO:72)。鼠CCR6由Entrez Gene命名为Gene ID:12458。一种示例性大鼠CCR6的完整氨基酸序列具有Swiss-Prot登录号Q5BK58(Q5BK58_RAT；SEQ ID NO:73)。大鼠CCR6由Entrez Gene命名为Gene ID:308163。一种示例性恒河猴CCR6(猕猴)的完整氨基酸序列具有Swiss-Prot登录号Q8HZR7(Q8HZR7_MACMU；SEQID NO:74)。恒河猴CCR6由Entrez Gene命名为Gene ID:574335。Swiss-Prot数据库在http://swissmodel.expasy.org,Arnold K等人,(2006)Bioinformatics,22(2):195-201可获得。
本文中使用“CCR6”时涵盖CCR6、优选地人CCR6的全部已知或尚未发现的等位基因和多态性形式。术语“人CCR6”或“CCR6”在本文中等同地使用并且如果不另外特别指出，则意指“人CCR6”。
术语“CCR6配体”或“CCL20”本文中等同使用并且特别地包括人CCR6的配体。CCL20是属于CC趋化因子家族的小细胞因子并且又称作MIP-3α、LARC或Exodus。CCL20具有Swiss-Prot登录号P78556(CCL20_HUMAN；SEQ ID NO:76)并由Entrez Gene命名为Gene ID:6364。CCL20在几种组织中表达，其中在外周血淋巴细胞、淋巴结、肝、阑尾和胎儿肺中观察到最高表达并且在胸腺、睾丸、前列腺和消化道中观察到较低水平。
如本文所用的术语“与CCR6结合的抗体或其片段”包括以(KD)850pM或更小、优选地700nM或更小、更优选地300nM或更小、更优选地260nM或更小、甚至更优选地250nM或更小的亲和力与CCR6(例如，分离形式的人CCR6)结合的抗体或其片段。
术语“与CCR6结合的抗体或其片段”包括抗体或其抗原性结合片段。术语“拮抗性抗体”或“拮抗抗体”在本文中同等使用并且包括能够例如通过阻断CCR6与其配体的结合或实质地减少这种结合并且因此抑制或减少CCR6触发的信号作用途径和/或抑制或减少CCR6介导的细胞反应如B谱系成熟、抗原驱动的B细胞分化和/或对炎性反应和免疫应答期间树状细胞和T细胞移行和招募的调节，抑制和/或抵消CCR6的生物学信号传导活性的抗体。
如本文提到的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段或单链。“抗体”指包含由二硫键链间连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定结域包含一个结构域CL。VH区和VL区可以再划分为超变区域，称作“互补决定区”(CDR)，所述超变区域在序列上高变和/或参与抗原识别和/或通常形成在结构上确定的环，间插有更保守的区域，称作“构架区”(FR或FW)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FW，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列共同构成如本文提到的VH或VL的“非CDR区”或“非延长的CDR区”。
如本文中提到的术语“重链可变构架区”可以包含一个或多个(例如，一个、二个、三个和/或四个)重链构架区序列(例如，构架1(FW1)、构架2(FW2)、构架3(FW3)和/或构架4(FW4))。优选地，重链可变区构架包含FW1、FW2和/或FW3、更优选地FW1、FW2和FW3。如本文中提到的术语“轻链可变构架区”可以包含一个或多个(例如，一个、二个、三个和/或四个)轻链构架区序列(例如，构架1(FW1)、构架2(FW2)、构架3(FW3)和/或构架4(FW4))。优选地，轻链可变区构架包含FW1、FW2和/或FW3、更优选地FW1、FW2和FW3。
重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))结合。
抗体划分成类，也称作同种型，这在遗传上由恒定区决定。人恒定轻链分为κ轻链(CK)和λ轻链(Cλ)。重链划分为μ(μ)、δ(δ)、γ(γ)、α(α)或ε(ε)，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。因此，如本文所用的“同种型”意指免疫球蛋白的由其恒定区的化学特征和抗原性特征确定的任何类和/或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IgG1(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgA1(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)和IgE(IGHE)。所谓的人免疫球蛋白假γIGHGP基因表示一种额外的人免疫球蛋白重链恒定区基因，所述基因已经测序，但因开关区改变而不编码蛋白质(BensmanaM等人,(1988)Nucleic Acids Res.16(7):3108)。尽管具有改变的开关区域，人免疫球蛋白假γIGHGP基因具有用于全部重链恒定结构域(CH1-CH3)和铰链区的可读框。其重链恒定结构域的全部可读框均编码与全部人免疫球蛋白恒定结构域良好相符的具有预测结构特征的蛋白质结构域。这种额外的假γ同种型在本文中称作IgGP或IGHGP。已经报道了其他的假免疫球蛋白基因，如人免疫球蛋白重链恒定结构域εP1假基因和P2假基因(IGHEP1和IGHEP2)。IgG类最常出于治疗目的使用。在人类中，这个类别包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，这个类别包括亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。
如本文所用的术语“鼠抗体”包括其中可变区序列和恒定区序列衍生自小鼠的抗体。
如本文所用的术语“嵌合抗体”包括其中可变区序列源自一个物种并且恒定区序列源自另一个物种的抗体，如其中可变区序列源自小鼠抗体并且恒定区序列源自人抗体的抗体。
如本文所用的术语“人源化抗体”或“人源化抗CCR6抗体”包括其中从另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系所衍生的CDR序列已经移植到人构架序列上的抗体。可以在人类构架序列内部以及从另一个哺乳动物物种的种系衍生的CDR序列内部产生额外的构架区修饰。
如本文所用的术语“Fab”或“Fab区域”包括这样的多肽，所述多肽包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域。Fab可以指处于分离状态的这种区域，或在全长抗体或抗体片段背景下的这个区域。
如本文所用，术语“Fc”或“Fc区”包括这样的多肽，所述多肽包含抗体的恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域N端的柔性铰链区。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)和Cγl(Cγl)和Cγ2(Cγ2)之间的铰链区。尽管Fc区的边界可以变动，但通常确定人IgG重链Fc区包含残基C226或P230至其羧基端，其中编号根据EU编号体系进行。对于人IgG1，Fc区在本文中定义为包含残基P232至其羧基端，其中编号根据EU编号体系进行(Edelman GM等人,(1969)Proc Natl Acad Sci USA,63(1):78-85)。Fc可以指处于分离状态的这种区域，或在Fc多肽(例如抗体)背景下的这个区域。
本文中的术语“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”包括这样的柔性多肽，所述柔性多肽包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸。如本文提到的“铰链区”是仅存在于IgA、IgD和IgG中的长度6-62个氨基酸的序列区域，所述序列区域涵盖桥接两条重链的半胱氨酸残基。在结构上，IgG CH1结构域止于EU位置220，并且IgG CH2结构域始于残基EU位置237。因此对于IgG，抗体铰链区在本文中定义为包括位置221(IgG1中的D221)至231(IgG1中的A231)，其中根据EU编号体系进行编号(Edelman GM等人,上文)。
如本文所用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括未修饰的抗体，所述抗体随后经修饰以产生变体。所述亲本抗体可以是天然存在的抗体、或天然存在抗体的变体或工程化形式。亲本抗体可以指抗体本身、包含亲本抗体的组合物或编码它的氨基酸序列。如本文所用的“亲本抗CCR6抗体”意指结合配体CCL20并且经修饰以产生变体的抗体或免疫球蛋白。如本文所用的“相应鼠抗体”意指与CCR6结合并且可以是经修饰以产生变体的鼠抗体或免疫球蛋白，尤其如本文中公开的鼠抗体4H11。如本文所用的“相应嵌合抗体”意指与CCR6结合并且可以经修饰以产生变体的嵌合抗体或免疫球蛋白。
如本文所用的术语“变体抗体”或“抗体变体”包含与亲本相比，因至少一个氨基酸修饰而异于亲本抗体序列的抗体序列。本文中的变体抗体序列将优选地与亲本抗体序列具有至少约80％、最优选地至少约90％、更优选地至少约95％氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体本身、包含抗体变体的组合物或编码它的氨基酸序列。
术语“同一性”或“实质同一性”或“基本上同一的”，当指核酸或其片段时，表示在适当插入或缺失核苷酸的情况下与另一个核酸(或其互补链)最佳比对时，在至少约80％和更优选地至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列同一性，如通过如下文讨论的任何熟知的序列同一性算法(如FASTA、BLAST或GAP)所测量。
当应用于多肽时，术语“实质相似性”或“基本上相似的”意指(如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT)最佳比对时，两个肽序列共有至少80％序列同一性、甚至更优选地至少90％、95％、98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸置换而不同。
本文中的术语“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸置换、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸置换”或“置换”意指将亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸替换为另一种氨基酸。例如，置换R94K指一种变体多肽，在这种情况下是重链可变构架区变体，其中位置94处的精氨酸由赖氨酸替换。对于前述例子，94K表示位置94以赖氨酸置换。出于本文目的，多个置换一般用斜线分隔。例如，R94K/L78V指包含置换R94K和L78V的双变体。如本文所用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中特定位置处添加氨基酸。例如，插入-94指在位置94插入。如本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中特定位置处移除氨基酸。例如，R94-指缺失位置94处的精氨酸。
如本文所用，术语“保守性修饰”或“保守性序列修饰”意指氨基酸修饰不显著地影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征。这类保守性修饰包括氨基酸置换、插入和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体引入修饰。保守性氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明抗体的CDR区内部或其构架区内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以对改变的抗体(变体抗体)测试保留的功能。
术语“表位”指由抗体结合的抗原中的区域。表位可以定义为结构表位或功能表位。功能表位通常是结构表位的子集并且具有直接有助于相互作用的亲和力的那些残基。表位也可以是构象的，即，由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括决定簇，所述决定簇是化学活跃的分子表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。
对于全部人免疫球蛋白重链恒定结构域，编号根据“EU编号体系”进行(EdelmanGM等人,(1969)Proc Natl Acad Sci USA,63(1):78-85)。对于人κ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGKC)，编号根据“EU编号体系”进行(Edelman GM等人,上文)。
对于人λ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7)，编号根据如Dariavach P等人,(1987)Proc Natl Acad Sci USA,84(24):9074-8和Frangione B等人,(1985)Proc Natl Acad Sci USA,82(10):3415-9所描述的“Kabat编号体系”进行(Kabat EA等人,(1991)Sequences of proteins of immunological interest第5版-USDepartment of Health and Human Services,NIH出版号91-3242)。
术语“可变结构域”指介导抗原结合并且定义特定抗体针对特定抗原的特异性的结构域。在天然存在的抗体中，抗原结合位点由两个定义特异性的可变结构域组成：一个位于重链(VH)和另一个位于轻链(VL)。在一些情况下，特异性可以完全位于两个结构域仅之一中，如来自驼类中存在的重链抗体的单结构域抗体中那样。V区通常长约110氨基酸并且由具有极端变动性的称作“高变区”的长9-12个氨基酸的较短区域分隔开的15-30个氨基酸的称作构架区(FR)的相对不变动的氨基酸序列区段组成。天然重链和轻链的可变结构域包括形成环的由三个高变区连接的四个FR，所述FR大体上采取β折叠构型。每条链中的高变区由FR密切接近地固定在一起，并且与来自另一链的高变区对形成抗体的抗原-结合位点作出贡献(参见Kabat EA等人,上文)。如本文所用的术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。对于全部可变结构域，根据Kabat进行编号(Kabat EA等人,上文)。
本文中使用并涵盖多种CDR定义。Kabat定义基于序列变异性并且最常使用(KabatEA等人,上文)。取而代之的是，Chothia转而指结构性环的位置(Chothia C&Lesk AM(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。AbM定义是Kabat定义和Chothia定义之间的折衷并且由OxfordMolecular's AbM抗体建模软件使用(Martin ACR等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA,86:9268–72；Martin ACR等人,(1991)Methods Enzymol.203:121–153；Pedersen JT等人,(1992)Immunomethods,1:126–136；Rees AR等人,(1996)引自Sternberg M.J.E.(编著),Protein Structure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141–172)。最近已经引入触点定义(MacCallum RM等人,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)并且以分析ProteinDatabank中可获得的复合物结构为基础。(( )(http://www.imgt.org)的CDR定义基于全部物种的全部免疫球蛋白和T细胞受体V-REGION的IMGT编号(国际免疫遗传学信息系统；；Lefranc MP等人,(1991)Nucleic AcidsRes.27(1):209-12；Ruiz M等人,(2000)Nucleic Acids Res.28(1):219-21；Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res.29(1):207-9；Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res.31(1):307-10；Lefranc MP等人,(2005)Dev.Comp.Immunol.29(3):185-203；Kaas Q等人,(2007)Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64)。
本发明中讨论的全部互补决定区(CDR)均优选地根据确定。这些CDR中每者的可变结构域残基如下(根据上文Kabat EA等人编号)：LCDR1：27-32，LCDR2：50-52，LCDR3：89-97，HCDR1：26-35，HCDR2：51-57和HCDR3：93-102。如本文所用的VL区的“非CDR区”包含以下氨基酸序列：1-26(FR1)、33-49(FR2)、53-88(FR3)和98-大约107(FR4)。如本文所用的VH区的“非CDR区”包含以下氨基酸序列：1-25(FR1)、36-50(FR2)、58-92(FR3)和103-大约113(FR4)。
本发明的CDR可以包含“延长的CDR”，其基于前述的定义并且具有如下的可变结构域残基：LCDR1：24-36，LCDR2：46-56，LCDR3：89-97，HCDR1：26-36，HCDR2：47-65，HCDR3：93-102。如本文所用的这些延长的CDR也根据上文Kabat等人编号。如本文所用的VL区的“非延长的CDR区”包含以下氨基酸序列：1-23(FR1)、37-45(FR2)、57-88(FR3)和98-大约107(FR4)。如本文所用的VH区的“非延长的CDR区”包含以下氨基酸序列：1-25(FR1)、37-46(FR2)、66-92(FR3)和103-大约113(FR4)。
如本文所用的术语“全长抗体”包含构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大部分哺乳动物(包括人和小鼠)中，全长IgG类抗体是四聚体并且由二对相同的两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，并且每条重链包含免疫球蛋白结构域VH、CH1(Cγ1)、CH2(Cγ2)和CH3(Cγ3)。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼(llamas)中，IgG抗体可以仅由两条重链组成，每条重链包含与Fc区连接的可变结构域。
抗体片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包括Fab'和Fab'-SH；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变结构域组成的dAb片段(Ward ES等人,(1989)Nature,341:544-546)；(v)F(ab')2片段，一种包含两个连接的Fab片段的双价片段；(vi)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由允许这两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird RE等人,(1988)Science 242:423-426；Huston JS等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-83)；(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；(viii)通过基因融合所构建的“双体抗体”或“三体抗体”、多价或多特异性片段(TomlinsonI和Hollinger P(2000)Methods Enzymol.326:461-79；WO94/13804；Holliger P等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-48)和(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scFv(Coloma MJ和Morrison SL(1997)Nature Biotechnology,15(2):159-163)。
如本文所用的术语“效应子功能”包括因抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括FcγR介导的效应子功能如ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)和ADCP(抗体依赖性细胞介导的吞噬)和补体介导的效应子功能如CDC(补体依赖的细胞毒性)。可以通过改变即增强或减少、优选地增强抗体对效应分子如Fc受体或补体组分的亲和力，改变抗体的效应子功能。可以使用一种或多种基于细胞或体内测定法确定效应子功能。此类测定法经常涉及监测细胞对抗体的反应，例如细胞存活、细胞死亡、细胞形态变化或转录激活如细胞表达天然基因或报道基因。例如，此类测定法可以测量抗体激发ADCC、ADCP或CDC的能力。对于一些测定法，可能还需要添加除靶细胞之外的额外细胞或组分，例如血清补体或效应细胞如外周血单个核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等。可以通过以下方式确定增强的效应子功能：将改变的抗体与对照抗体比较效应子功能并且检测例如通过多种前述测定法之一测量的ADCC、ADCP或CDC的增加。结合亲和力通常通过修饰效应分子结合位点予以变动，并且在这种情况下，适宜的是定位目的位点并且以适宜方式修饰该位点的至少部分。还构思了，改变针对效应分子的抗体上的结合位点不需要显著地改变总体结合亲和力，但是可以改变相互作用的几何学，从而使得效应子机制无效，如非生产性结合中那样。进一步构思了，也可以通过修饰不直接参与效应分子结合、但参与效应子功能执行的位点，来改变效应子功能。通过改变抗体的效应子功能，可能控制免疫应答的多个方面，例如，增强或抑制免疫系统的多种反应，在诊断和治疗中可能带来有益作用。
如本文所用，术语“CCR6介导的疾病”包括多种疾病，如癌症和炎性疾病和/或自身免疫性疾病、尤其包括类风湿性关节炎、多发性硬化(MS)、银屑病、移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、慢性阻塞性肺病(COPD)、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、SLE、舍格伦综合征、硬皮病、全身性硬化症、慢性肾脏疾病、肝纤维化、结核病、特发性肺纤维化、结核病诱导的肺纤维化、腹膜后纤维变性、肺纤维化、囊性纤维化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维变性(骨髓)、腹膜后纤维化、进行性大块性纤维化、肾源性系统性纤维化、关节纤维化、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和节段性回肠炎)、动脉粥样硬化、移植排斥、中枢神经系统损伤、银屑癣、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL))、动脉粥样硬化和肺癌及结肠癌。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、奶牛、鸡、两栖类、爬行类等。优选地，该受试者是人。
抗CCR6抗体
在第一方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1；和/或含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:255的氨基酸序列的重链CDR2和/或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含了含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246或SEQ ID NO:256的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或含有SEQ ID NO:35、SEQID NO:247、SEQ ID NO:248或SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或含有SEQ IDNO:36或SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:193的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据这个第一方面，本发明提供了一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1；和含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含了含有SEQID NO:245的氨基酸序列的轻链CDR1，和含有SEQ ID NO:248的氨基酸序列的轻链CDR2，和含有SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:193的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据本发明的这个方面，本发明还涉及包含在本公开的多个方面详述的重链CDR或轻链CDR的抗CCR6抗体。
优选地，抗体或其片段与人CCR6结合并且与鼠或大鼠或食蟹猴CCR6具有交叉反应性。
本领域熟知，CDR3结构域独立于CDR1和/或CDR2结构域，CDR3结构域可以单独决定抗体对相应抗原的结合特异性，并且可以基于共同CDR3序列可预测地产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如，Klimka A等人,(2000)Br.J.Cancer,83(2):252-260(其描述了仅使用鼠抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer SH等人,(2000)J.Mol.Biol.296:833-849(其描述仅使用亲本鼠MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader C等人,(1998)Proc.Natl.Acad.SciUSA,95:8910-8915(其描述使用鼠抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链可变CDR3结构域和轻链可变CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每种成员抗体包含在CDR3结构域外部的独特序列并且能够以高亲和力或高于亲本鼠抗体的亲和力结合与亲本鼠抗体相同的表位)；Barbas等人,(1994)J.Am.Chem.Soc.116:2161-62(其公开了CDR3结构域为抗原结合作出最明显的贡献)。
因此，本发明提供与CCR6结合的抗体及其片段，所述抗体及其片段包含一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，尤其包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3和/或含有SEQ ID NO:36、192或193的氨基酸序列的轻链CDR3，其中抗体能够与CCR6结合。在一些实施方案中，包含来自非人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的这类本发明抗体(a)能够竞争与相应的亲本非人类(例如，鼠)抗体相同的表位结合；(b)保留功能特征；(c)结合与相应的亲本非人类(例如，鼠)抗体相同的表位；和/或(d)具有与相应的亲本非人类(例如，鼠)抗体相似的结合亲和力。
在又一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179或249的氨基酸序列的重链可变区序列。在另一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253的氨基酸序列的轻链可变区序列。在一些实施方案中，与CCR6结合的抗体或其片段包含了含有SEQ ID NO:37或249的氨基酸序列的重链可变区序列和含有SEQ ID NO:38或250、251、252或253的氨基酸序列的轻链可变区序列。优选地，抗体或其片段与人CCR6结合并且与食蟹猴CCR6具有交叉反应性。
在另一个方面，本发明提供与CCR6结合的抗体或其片段的变体。因此，本发明提供这样的抗体或其片段，所述抗体或其片段具有重链可变区序列和/或轻链可变区序列的非CDR区的氨基酸序列，所述非CDR区的氨基酸序列分别与重链或轻链的亲本抗体的重链可变区序列和/或轻链可变区序列(如SEQ ID NO:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179、249或SEQ ID NO:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253中的重链可变区序列和轻链可变区序列)的非CDR区氨基酸序列至少90％同一(具有至少90％氨基酸序列同一性)。另外，本发明提供这样的抗体或其片段，所述抗体或其片段具有重链可变区序列和/或轻链可变区序列的非延长的CDR区的氨基酸序列，所述非延长的CDR区的氨基酸序列与重链或轻链的亲本抗体的重链可变区序列和/或轻链可变区序列非延长的CDR区的氨基酸序至少80％同一。优选地，重链可变区序列和/或轻链可变区序列的非CDR区或非延长的CDR区的氨基酸序列同一性是至少85％、更优选地至少90％、并且最优选地至少95％、尤其96％、更具体地97％、甚至更具体地98％、最具体地99％，例如包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。关于氨基酸序列的同一性或同源性，在本文中定义为对齐序列并且根据需要引入空位以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与结合CCR6的抗体或其片段同一的氨基酸残基的百分数。因此，可以通过常用来比较两条多肽的氨基酸位置中相似性的标准方法，确定序列同一性。使用计算机程序如BLAST或FASTA，将两条多肽对齐以最佳匹配它们的相应氨基酸(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预定部分)。程序提供默认开口罚分和默认空位罚分，并且评分矩阵如PAM250(标准评分矩阵；参见Dayhoff MO等人,(1978)引自Atlas of Protein Sequence and Structure,第5卷,附录3)可以与计算机程序联合使用。例如，同一性百分数可以计算为：相同匹配的总数乘以100并且随后除以匹配的范围内部较长序列的长度和引入较长序列中以对齐两个序列的空位数目的总和。
在一些实施方案中，本公开因此提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其中抗体或其片段包含与SEQ ID NO:77、78、79、80、81的构架区序列至少65％同一的重链可变构架区序列和/或与SEQ ID NO:82、83、84、85、86的构架区序列至少75％同一的轻链可变构架区序列。在一些实施方案中，本公开提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其中抗体或其片段包含与SEQ ID NO:80的构架区序列至少75％同一的重链可变构架区序列和/或与SEQ IDNO:82的构架区序列至少82％同一的轻链可变构架区序列。
在另一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含如上文描述的重链CDR和/或轻链CDR并且还包含作为选自IGHV3-11*04(SEQ ID NO:77)、IGHV3-11*01(SEQ ID NO:78)、IGHV3-48*03(SEQ ID NO:79)、IGHV3-23*04(SEQ IDNO:80)和IGHV3-66*04(SEQ ID NO:81)的人基因的产物或衍生自所述人基因的重链可变构架区，优选地作为人基因IGHV3-23*04(SEQ ID NO:80)的产物或衍生自所述人基因的重链可变构架区。重链可变构架区可以包含在那些人基因的产物中存在或衍生自所述人基因的一个或多个(例如，一个、二个、三个和/或四个)重链构架区序列(例如，构架1(FW1)、构架2(FW2)、构架3(FW3)和/或构架4(FW4))。优选地，重链可变区构架包含在选自IGHV3-11*04(SEQ ID NO:77)、IGHV3-11*01(SEQ ID NO:78)、IGHV3-48*03(SEQ ID NO:79)、IGHV3-23*04(SEQ ID NO:80)和IGHV3-66*04(SEQ ID NO:81)的人基因的产物中存在或衍生自所述人基因的FW1、FW2和/或FW3、更优选地FW1、FW2和FW3。如本文所用的重链构架区序列包括FW1(位置1至位置25)、FW2(位置36至位置49)、FW3(位置66至位置94)和FW4(位置103至位置113)，其中利用Kabat中所述的编号体系指示氨基酸位置。
在一些实施方案中，本公开提供一种包含重链序列的抗体或其片段，所述重链序列包含SEQ ID NO:10、173、175、183、184、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、221、224、227、230、233和235的氨基酸序列并且其中其重链可变构架区包含来自相应鼠抗体的相应重链可变构架区中的至少一个氨基酸修饰。
优选地，氨基酸修饰包含选自氨基酸位置24、49和62处的氨基酸置换，其中每个组成员的氨基酸位置根据Kabat编号法指示。
在另一个方面，本发明提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含轻链可变构架区，所述轻链可变构架区作为选自IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)、IGKV2-30*01(SEQ ID NO:83)、IGKV2D-30*01(SEQ ID NO:84)、IGKV2-29*02(SEQ ID NO:85)、IGKV2-29*03(SEQ ID NO:86)的人基因的产物或衍生自所述人基因，优选地作为人基因IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)的产物或衍生自所述人基因。轻链可变构架区可以包含在那些人基因的产物中存在或衍生自所述人基因中的一个或多个(例如，一个、二个、三个和/或四个)轻链构架区序列(例如，构架1(FW1)、构架2(FW2)、构架3(FW3)和/或构架4(FW4))。优选地，轻链可变区构架包含在选自IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)、IGKV2-30*01(SEQ ID NO:83)、IGKV2D-30*01(SEQ ID NO:84)、IGKV2-29*02(SEQ ID NO:85)、IGKV2-29*03(SEQ IDNO:86)的人基因的产物中存在或衍生自所述人基因中的FW1、FW2和/或FW3、更优选地FW1、FW2和FW3。如本文所用的轻链构架区序列包括FW1(位置1至位置23)、FW2(位置35至位置49)、FW3(位置57至位置88)和FW4(位置98至位置108)，其中利用Kabat中所述的编号体系指示氨基酸位置。
在一些实施方案中，本公开提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含作为人基因IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)的产物或衍生自所述人基因的轻链可变构架区并且其中轻链可变构架区包含来自相应鼠抗体的轻链可变区的相应构架区中的至少一个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本公开提供一种包含轻链序列的抗体或其片段，所述轻链序列包含SEQ ID NO:30、176、186、187、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、222、225、228、231和236的氨基酸序列。备选地，轻链序列的轻链可变构架区包含来自相应鼠抗体的相应轻链可变构架区的至少一个氨基酸修饰。
氨基酸修饰可以包含选自氨基酸位置36和46处的氨基酸置换，其中每个组成员的氨基酸位置根据Kabat编号法指示。
特别优选无任何氨基酸修饰的包含SEQ ID NO:30、211或213的氨基酸序列的轻链序列。
在一些实施方案中，与CCR6结合的抗体或其片段包含作为选自IGHV3-11*04(SEQID NO:77)、IGHV3-11*01(SEQ ID NO:78)、IGHV3-48*03(SEQ ID NO:79)、IGHV3-23*04(SEQID NO:80)和IGHV3-66*04(SEQ ID NO:81)的人基因的产物或衍生自所述人基因的重链可变构架区和作为选自IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)、IGKV2-30*01(SEQ ID NO:83)、IGKV2D-30*01(SEQ ID NO:84)、IGKV2-29*02(SEQ ID NO:85)、IGKV2-29*03(SEQ ID NO:86)的人基因的产物或衍生自所述人基因的轻链可变构架区，优选地作为人基因IGHV3-23*04(SEQ IDNO:80)的产物或衍生自所述人基因的重链可变构架区和作为人基因IGKV2-30*02(SEQ IDNO:82)的产物或衍生自所述人基因的轻链可变构架区。本发明还涵盖在上文提到的不同人基因的产物中存在或衍生自所述不同人基因的重链可变构架区和/或在上文提到的不同人基因的产物中存在或衍生自所述不同人基因的轻链可变构架区的组合。
人重链可变区基因和人轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在互联网上以下网址可获得：www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase)中以及在Kabat EA等人,上文；Tomlinson IM等人,(1992)J.Mol.Biol.227:776-798和Cox JPL等人,(1994)Eur.J.Immunol.24:827-836中找到。作为另一个例子，人重链可变区基因和人轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。
在另一个方面，本公开还提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其中至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR包含至少一个氨基酸修饰。可以进行位点定向诱变或PCR介导的诱变引入修饰，并且可以在体外或体内测定法中评估对抗体结合或其他目的功能特性的影响。优选地引入保守性修饰。修饰可以是氨基酸置换、添加或缺失，但优选地是置换。一般地，在CDR区内部进行不多于五个、优选地不多于四个、更优选地不多于三个、甚至更优选地不多于二个、最优选地不多于一个氨基酸修饰。
在某些实施方案中，构架序列可以用来工程化可变区以产生变体抗体。本发明的变体抗体包括其中已经对例如VH和/或VK内的构架残基进行修饰以改善抗体特性的那些抗体。一般地，进行这类构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方案是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的鼠序列或将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。在本发明的上下文中，术语回复突变可互换地用来意指这些操作的任一者并且更通常地用来指依次修饰抗体的氨基酸序列中的一个或多个残基，从而改变其特性，如免疫原性。
因此在又一个方面，本公开提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其中抗体或其片段的重链可变区的至少一个构架区序列包含来自相应鼠抗体的重链可变区的相应构架区中的至少一个氨基酸修饰。优选地，氨基酸修饰是氨基酸置换。一般地，在构架区内部进行不多于七个、优选地不多于六个、优选地不多于五个、优选地不多于四个、更优选地不多于三个、甚至更优选地不多于二个、最优选地不多于一个氨基酸修饰。
本公开还提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其中抗体或其片段的轻链可变区的至少一个构架区序列可以包含来自相应鼠抗体的轻链可变区的相应构架区中的至少一个氨基酸修饰。优选地，氨基酸修饰是氨基酸置换。一般地，在构架区内部进行不多于两个、更优选地不多于一个氨基酸修饰并且最优选地不进行氨基酸修饰。
鉴于这些重链可变区序列和轻链可变区序列的每者均可以与CCR6结合，可以将重链可变区序列和轻链可变区序列“混合并匹配”以产生本发明的抗CCR6结合分子。可以使用例如在实施例中描述的结合测定法测试这类“混合及匹配”抗体的CCR6结合作用。
在本公开的一个实施方案中，抗体或其片段是人源化抗体。优选地，抗体或其片段是人源化单克隆抗体。
本公开还提供与CCR6结合的单价抗体或其片段，即由单一抗原结合臂组成的抗体。本公开还提供与CCR6结合的抗体的片段，所述片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双体抗体、三体抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。优选的片段是scFv、双特异性单链Fv二聚体和双体抗体。本公开还提供与CCR6结合的全长抗体。
本公开还提供一种与CCR6结合的抗体或其片段，其还包含重链恒定区和/或轻链恒定区、尤其人重链恒定区和/或人轻链恒定区。人重链恒定区可以选自IgG1(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgA1(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)或IgE(IGHE)组成的人免疫球蛋白群组，其中优选人重链恒定区IgG、尤其IgG1(IGHG1)。人轻链恒定区可以选自由κ恒定区或λ恒定区组成的人免疫球蛋白群组，其中优选人κ恒定区。在一个优选实施方案中，与CCR6结合的抗体或其片段包含人IgG1(IGHG1)重链恒定结构域和人轻链κ恒定域。
除了在构架区或CDR区内部作出修饰之外或作为其替代，还可以工程化本发明的抗体以在Fc区内部包含修饰，一般旨在改变抗体的一种或多种功能特征，如血清半寿期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外，可以化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以结合到抗体上)或修饰本发明的抗体以改变其糖基化。下文中进一步详细描述了这些实施方案中的每一个。如下文略述的Fc区内部修饰根据Fc区内残基的EU编号法进行。在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，从而改变(例如增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数目。这种方案在美国专利号5,677,425中由Bodmer等人进一步描述。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如旨在促进轻链和重链的装配或增加或减少抗体的稳定性。在另一个实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以减少抗体的生物学半寿期。更特别地，可以向Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相对于天然的Fc铰链结构域SpA结合作用具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合作用。这种方案在美国专利号6,165,745中由Ward等更详细地描述。在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半寿期。多种方法是可能的。例如，可以引入以下一个或多个突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所述。备选地，为了增加生物学半寿期，可以在CH1或CL区内部改变抗体以含有救援受体(salvage receptor)结合表位，所述救援受体结合表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环，如美国专利号5,869,046和6,121,022中由Presta等人所述。在又一个实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同氨基酸残基，改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的效应子配体亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变了亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方案在美国专利号5,624,821和5,648,260中均由Winter等人进一步详细描述。在另一个例子中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的C1q结合作用和/或减少或消除的补体依赖的细胞毒性(CDC)。这种方案在美国专利号6,194,551中由Idusogie等人进一步详细地描述。在另一个例子中，改变CH2结构域N端区域氨基酸位置231至238内部的一个或多个氨基酸残基，旨在因此改变抗体固定补体的能力。这种方案在PCT公开号WO1994/29351中由Bodmer等人进一步描述。又在另一个例子中，通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力和/或以增加抗体对Fcγ受体的亲和力。这种方案在PCT公开WO 2000/42072中由Presta进一步描述。
本公开还提供一种包含人重链恒定区和/或轻链恒定区的与CCR6结合的抗体或其片段，其中人重链恒定区包含同种型变体，所述同种型变体包含来自人IgG4(IGHG4)的CH1区、铰链区、CH2区和CH3区并且其中铰链区在位置228包含丝氨酸至脯氨酸的置换。优选地，包含同种型变体的抗体是全长抗体。包含同种型变体的与CCR6结合的特别优选的抗体或其片段包含来自人IgG4(IGHG4)的CH1、具有S228P置换的来自人IgG4(IGHG4)的铰链区以及来自人IgG4(IGHG4)的CH2和CH3。已经发现与包含来自人IgG1(IGHG1)(其通常是天然人IgG1)的人重链恒定区的与CCR6结合的抗体或其片段相比，即与仅就修饰的重链恒定区而言不同于同种型变体的与CCR6结合的抗体或其片段相比，同种型变体不显示Fc介导的细胞毒性机制如ADCC。
本公开还提供一种包含人IgG Fc区的与CCR6结合的抗体或其片段，其中与人IgGFc区连接的成熟核心糖结构缺少岩藻糖(本文中备选地称作“非岩藻糖基化”)。如本文所用的术语“成熟核心糖结构”包括与Fc区连接的加工型核心糖结构，所述的加工型核心糖结构通常由下文示意性表示的双天线状低聚糖常见的糖结构GlcNAc(岩藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2组成：
本术语特别地包括G-1形式的缺少β1,2GlcNAc残基的核心成熟糖结构。然而，核心糖结构优选地包括两个β1,2GlcNAc残基。本文中成熟的核心糖结构通常不高甘露糖化。成熟的核心糖结构与糖蛋白的Fc区连接，通常借助N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含人IgG1(IGHG1)Fc区，其中与人IgG1(IGHG1)Fc区连接的成熟的核心糖结构缺少岩藻糖。更优选包含人IgG1(IGHG1)Fc区的全长抗体，其中与人IgG1(IGHG1)Fc区连接的成熟的核心糖结构缺少岩藻糖。从WO03/035835已知，与人IgG Fc区连接的成熟核心糖结构中缺少岩藻糖可以增强ADCC。因此在又一个实施方案中，本公开的抗体或其片段包含人IgG1(IGHG1)Fc区，其中与人IgG1(IGHG1)Fc区连接的成熟的核心糖结构缺少岩藻糖，而与不缺少岩藻糖的亲本抗体或其片段相比，缺少岩藻糖的抗体显示增强的ADCC。产生缺少岩藻糖的抗体的方法例如是(a)使用在岩藻糖代谢方面缺陷的工程化或突变宿主细胞，从而它具有降低的使其中表达的蛋白质岩藻糖基化的能力(或不能使其岩藻糖基化)；(b)在阻止或减少岩藻糖基化的条件下培养细胞；(c)翻译后移除岩藻糖(例如，用岩藻糖苷酶)；(d)翻译后添加所需的糖，例如，在重组表达非糖基化的糖蛋白后添加；或(e)纯化糖蛋白，从而选择未岩藻糖基化的产物。优选地使用WO2010/095031的实施例14中描述的方法，例如，在Longmore等人,(1982)Carbohydr.Res.365-92或在Imai-Nishiya等人,(2007),BMC Biotechnol.7:84中描述的方法。
本发明还提供抗体或其片段，所述抗体或其片段与CCR6结合并且结合至与包含下述重链可变序列和轻链可变序列的抗体相同的表位，所述重链可变序列包含SEQ ID NO:7、37、39、40、41、42、75、177、178、179、249的氨基酸序列，所述轻链可变序列包含SEQ ID NO:8、38、43、44、45、46、181、182、250、251、252或253的氨基酸序列。可以通过本领域已知的任何合适的表位定位方法联合本发明提供的任一种抗体，确定CCR6多肽的这个特定区域或表位。这类方法的例子包括用最小片段针对与本发明抗体结合筛选衍生自CCR6的不同长度的肽，所述最小片段可以特异性结合至含有本发明抗体识别的表位的序列的抗体。CCR6肽可以合成产生或通过蛋白酶解消化CCR6多肽产生。可以通过例如质谱分析鉴定结合抗体的肽。在另一个例子中，NMR光谱法或X光结晶学可以用来鉴定由本发明抗体结合的表位。一旦鉴定，如果需要，可以使用结合本发明抗体的表位片段作为免疫原以获得结合相同表位的额外抗体。
抗CCR6抗体特性
本领域已知用于评价抗体例如针对CCR6的结合能力的标准测定法包括例如ELISA、蛋白质印迹法、RIA和流式细胞分析。在实施例中详述合适的测定法。也可以通过本领域已知的标准测定法，如通过Scatchard或系统分析，评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力如KD)。可以通过本领域已知的标准竞争测定法评估相对结合亲和力Ki。
在又一个方面，本发明提供如通过ELISA法或法可视化的与人、小鼠、大鼠和食蟹猴CCR6结合的抗体或其片段。可以根据实施例3实施和测量结合性ELISA。
在又一个方面，本发明提供与重组或天然产生的人CCR6结合并阻止CD4T淋巴细胞活化及分泌细胞因子的抗体或其片段。
在又一个方面，本发明提供以850pM或更小、优选地700nM或更小、更优选地300nM或更小、更优选地260nM或更小、甚至更优选地250nM或更小的亲和力(KD)与CCR6、尤其分离形式的CCR6结合的抗体或其片段，例如，通过在蛋白A偶联的CM5研究级传感芯片(GEHealthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士；BR-1000-14)上，以作为分析物使用的人可溶性CCR6多肽(由SEQ ID NO:101编码)捕获抗体，在仪(GE Healthcare EuropeGmbH,Glattbrugg,瑞士)上通过表面等离子体共振(SPR)测量，如实施例5中详述。在优选的方面，本发明提供了保留相应嵌合抗体的至少85％的CCR6结合亲和力(KD)的人源化抗体或其片段。优选地，人源化抗体或其片段保留相应嵌合抗体的至少90％的CCR6结合亲和力(KD)、更优选地相应嵌合抗体的至少95％的结合亲和力(KD)。优选地，人源化抗体或其片段以等同于相应嵌合抗体的亲和力结合人CCR6。“等同亲和力”意指处于相应嵌合抗体的CCR6结合亲和力的±10％范围内的亲和力值。更优选地，本发明提供人源化抗体或其片段以高于相应嵌合抗体的亲和力结合人CCR6。优选地，人源化抗体或其片段以高于相应嵌合抗体两倍的亲和力、更优选地以高于相应嵌合抗体三倍的亲和力结合人CCR6。在本发明的优选方面，提供与人CCR6结合的人源化抗体或其片段，所述的人源化抗体或其片段具有500nM或更小、优选地250nM或更小、更优选地100nM或更小、更优选地50nM或更小、甚至更优选地48nM或更小的结合亲和力(KD)，例如，通过在蛋白A偶联的CM5研究级传感芯片(GEHealthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士；BR-1000-14)上，以作为分析物使用的人可溶性CCR6多肽(由SEQ ID NO:101编码)捕获抗体，在仪(GE Healthcare EuropeGmbH,Glattbrugg,瑞士)上通过表面等离子体共振(SPR)测量，如实施例7中详述。
本发明的又一个方面提供与CCR6结合并具有良好热稳定性的抗体或其片段。在一个优选的实施方案中，与CCR6结合的抗体或其片段具有大于70℃、优选地大于75℃和甚至更优选地大于80℃的FAB片段热稳定性温度。为了分析FAB片段热稳定性，使用差示扫描量热法测量，同时确定全长IgG背景下FAB片段的中点熔融温度。这些种类的量热测量是技术人员已知的并且可以例如根据Garber E&Demarest SJ(2007)Biochem Biophys ResCommun,355:751-7实施，如实施例5中进一步描述。
核酸、载体和宿主细胞
本公开还提供了编码与CCR6结合的抗体及其片段的分离核酸、包含该核酸的载体和包含该核酸或载体的宿主细胞。所述核酸可以存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或可以是部分纯化的或基本上纯形式的。当通过包括碱/SDS处理、CsCl区带法、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳的标准技术和本领域熟知的其他技术，与其他细胞组分或其他杂质(例如，其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“变得基本上纯的”，参见，例如F.Ausubel等人编著(1987)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley Interscience,New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以含有或可以不含有内含子序列。在一个优选实施方案中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术，获得本发明的核酸，例如，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码抗体轻链和重链或编码VH区段的和VL区段的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从该文库回收编码该抗体的一个或多个核酸。向宿主细胞中引入外源核酸的方法是本领域熟知的并且将随所用的宿主细胞变动。技术包括但不限于葡聚糖介导的转染法、磷酸钙沉淀法、氯化钙处理法、聚乙烯亚胺介导的转染法、聚凝胺(polybrene)介导的转染法、原生质体融合法、电穿孔法、病毒或噬菌体感染法、多核苷酸在脂质体中的囊化法和直接微量注射DNA至胞核中。在哺乳动物细胞的情况下，转染可以是瞬时的或稳定的。
本发明优选的核酸分子是编码选自SEQ ID NO:88、90、92、94、96、98的重链序列和/或选自SEQ ID NO:87、89、91、93、95、97的轻链序列的那些。
本发明优选的核酸分子是编码SEQ ID NO:7、37或249的重链可变区和/或SEQ IDNO:8、38、250、251、252或253的轻链可变区的那些核酸分子。
一旦获得编码VH区段和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以将可变区基因转化成全长抗体链基因、或转化成与上述片段相对应的片段基因如Fab片段基因或转化成scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(如抗体恒定区或柔性接头)的另一个DNA片段有效连接。如这种环境下所用，术语“有效连接”意指两个DNA片段例如如此连接，从而由这两个DNA片段编码的氨基酸序列仍符合可读框。可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子有效连接，将编码VH区的分离DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat EA等人,上文)并且可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1(IGHG1)、IgG2(IGHG2)、IgG3(IGHG3)、IgG4(IGHG4)、IgA1(IGHA1)、IgA2(IGHA2)、IgM(IGHM)、IgD(IGHD)或IgE(IGHE)恒定区，但最优选地是IgG1(IGHG1)恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子有效连接。可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子有效连接，将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat EA等人,上文)并且可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ恒定区或λ恒定区、优选地κ恒定区。为了产生scFv基因，将编码VH的和编码VL的DNA片段与编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段有效连接，从而VH序列和VL序列可以表达为VL区和VH区由柔性接头连接的连续单链蛋白(参见例如Bird RE等人,(1988)Science,242:423-426；Huston JS等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-83；McCafferty J等人,(1990)Nature,348:552-554)。已经开发了多种技术用于产生抗体的抗体片段。通常，通过蛋白酶解消化完整抗体衍生这些片段(参见，例如，Morimoto K等人,(1992)J.Biochem.&Biophysical Methods,24:107-117和Brennan M等人,(1985)Science,229:81-3)。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离。备选地，Fab'-SH片段可以从大肠杆菌直接回收并且化学地偶联以形成F(ab')2片段(Carter P等人,(1992)Bio/Technology,10:163-167)。根据另一种方法，F(ab′)2片段可以从重组宿主细胞培养物直接分离。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员将是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)，参见，例如，WO 1993/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段也可以是“线型抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中描述。
编码本发明抗体的核酸可以并入载体、优选地表达载体以表达蛋白质。多种表达载体可以用于表达蛋白质。表达载体可以包括自我复制型染色体外载体或整合入宿主基因组的载体。构建表达载体以与宿主细胞类型相容。因此，在本发明中使用的载体、优选地表达载体，包括但不限于能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母中和在体外系统中实现蛋白质表达的那些。如本领域已知，多种表达载体是商业可获得的或可以在本发明中找到的用于表达抗体的载体。
表达载体一般包含与控制或调节序列、选择标记、任何融合配偶体/或额外元件有效连接的蛋白质。“有效连接的”在本文中意指令核酸处于与另一个核酸序列的功能性关系。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其他控制抗体链基因转录或翻译的表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调节序列例如在Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中描述。通常，这些表达载体包含与编码抗体的核酸有效连接的转录性和翻译性调节核酸，并且一般适宜于宿主细胞用来表达蛋白质。通常，该转录性和翻译性调节序列可以包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活蛋白序列。还如本领域已知，表达载体一般含有选择基因或标志物以允许选择含有表达载体的转化的宿主细胞。选择基因是本领域熟知的并且将随所用的宿主细胞变动。例如，选择标记基因一般对其中已经导入载体的宿主细胞赋予针对药物(如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的耐药性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中连同甲氨蝶呤选择/扩增一起使用)和neo基因(用于G418选择)。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是原核生物细胞、酵母细胞或高等真核生物细胞。适合此目的的原核生物包括真细菌，包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌(Shigella)、以及芽孢杆菌纲(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。合适的大肠杆菌克隆宿主包括大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的克隆宿主或表达宿主。低等真核宿主微生物当中，常使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母。但是，众多其他属、物种和菌株是通常可获得和有用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，包括乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.WaItH(AJCC 56,500)、K.drosopmarum(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、或K.marxianusyarrowia(EP402226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉属(Trichoderma reesia)(EP244234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺酵母属(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，包括脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、或曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。
表达本发明抗体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括plaril细胞和昆虫细胞。已经鉴定了多个杆状病毒毒株和变体及来自宿主如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的相应容许性昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是可公开获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5毒株，并且可以使用这类病毒，尤其用于转染草地贪夜蛾细胞。也可以利用棉花、谷物、马铃薯、大豆、碧冬茄、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
用于表达本发明重组抗体的宿主细胞优选地是哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin LA(1980)Proc.Natl.Acad.Sci,USA,77:4216-4220中所述的dhfr-CHO细胞，所述细胞例如与如Kaufman RJ和Sharp PA(1982)J.Mol.Biol,159:601-621中所述的DHFR选择标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体而言，对于NSO骨髓瘤细胞的使用，另一个优选的表达系统是在WO 87/04462(授予Wilson)、WO 89/01036(授予Bebbington)和EP338841(授予Bebbington)中公开的GS基因表达系统。将重组抗体基因引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地允许抗体分泌入培养宿主细胞的培养基中的一段时间，产生抗体。可以在多种培养基中培养可用于产生与CCR6结合的抗体的宿主细胞。市售培养基如Ham F10(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)、极限基本培养基(MEM；Sigma-AldrichChemie GmbH)、RPMI-1640((Sigma-Aldrich Chemie GmbH,巴赛尔，瑞士)和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM；Sigma-Aldrich Chemie GmbH)适于培养宿主细胞。可以用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
抗体可以有效连接于融合配偶体以能够实现导引表达的蛋白质、纯化、筛选、展示等。融合配偶体可以经接头序列与抗体序列连接。接头序列将通常包含括小数目的氨基酸，一般小于十个氨基酸，不过也可以使用较长的接头。一般地，选择接头序列为柔性并抵抗降解。如本领域技术人员将领会，可以使用多种类型的序列中任一者作为接头。例如，常见的接头序列包含氨基酸序列G4S。融合配偶体可以是指导抗体和任何结合的融合配偶体至所需细胞位置或胞外介质的导引序列或信号序列。如本领域已知，某些信号传导序列可以导引蛋白质分泌入生长培养基、或分泌入位于细胞内膜和外膜之间的周质间隙。融合配偶体也可以是编码能够实现纯化和/或筛选的肽或蛋白质的序列。这类融合配偶体包括但不限于多组氨酸标签(His标签)(例如，随固定的金属亲和色谱(IMAC)系统(例如，Ni+2亲和柱)一起使用的H6和H10或其他标签)、GST融合物、MBP融合物、Strep标签、细菌酶BirA的BSP生物素酰化靶序列和抗体靶向的表位标签(例如，c-myc标签、flag-标签等)。如本领域技术人员将领会，这类标签可以用于纯化、筛选或这两种情况。
抗体的构建和生产
可以通过免疫接种动物获得，即通过使用熟知和例行方案施用多肽至动物、优选地非人类动物，针对CCR6多肽生成的抗体，参见例如Handbook of ExperimentalImmunology(Weir DM(编著),第4卷,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。许多温血动物，如兔、小鼠、大鼠、绵羊、奶牛、骆驼或猪可以免疫接种。但是，小鼠、兔、猪和大鼠尤其小鼠通常最适合。也可以通过技术人员已知的重组DNA技术产生抗体。此外，可以通过酶剪切或化学剪切天然存在的抗体，产生抗体。可以通过转移一个或多个来自非人类动物(例如，小鼠)VH区和/或VL区CDR或其部分至一个或多个来自人VH区和/或VL区的构架区，产生本发明的人源化抗体。任选地，当需要或想要减少抗体的免疫原性和/或维持结合亲和力时，如此存在于VH区和/或VL区中的人类构架残基可以是由相应的非人类(例如，小鼠)残基替换。任选地，存在于CDR中的非人类氨基酸残基可以替换为人类残基。可以基于上文所述制备的非人类单克隆抗体的序列，制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目的非人类杂交瘤获得并且使用标准分子生物学技术，经工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法，将鼠可变区与人恒定区连接(例如，参见授予Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法，将鼠CDR区插入人构架中(例如，参见授予Winter的美国专利号5,225,539和授予Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
可以构建本发明的人源化抗体，其中基于潜在接纳分子可变区和鼠抗体的重链可变区之间的同源性考虑，选择重链可变区的人接纳分子。优选人类种系候选接纳分子以减少潜在的免疫原性。种系数据库由通读重链FW3区末端及部分地读入CDR3序列的抗体序列组成。为了选择FW4区，可以检索已经从所选择种系分子衍生的成熟抗体序列数据库或可以使用已经从源自人供体的所选择种系分子衍生的抗体序列。人接纳分子优选地选自与鼠供体分子相同的重链类别并具有鼠供体分子可变区的相同的规范结构类别。针对重链可变区选择人接纳分子的次要考虑事项避开了鼠供体分子和人接纳分子之间CDR长度方面的同源性。优选地，通过同源性检索V-BASE数据库选择人类接纳体抗体分子，不过也可以使用其他数据库如Kabat和公用NCBI数据库。
可以构建本发明的人源化抗体，其中基于潜在接纳分子可变区和鼠抗体的轻链可变区之间的同源性考虑，选择轻链可变区的人接纳分子。优选人类种系候选接纳分子以减少潜在的免疫原性。种系数据库由通读重链FW3区末端及部分地读入CDR3序列的抗体序列组成。为了选择FW4区，可以检索已经从所选择种系分子衍生的成熟抗体序列数据库或可以使用已经从源自人供体的所选择种系分子衍生的抗体序列。人接纳分子优选地选自与鼠供体分子相同的轻链类别并具有鼠供体分子可变区的相同的规范结构类别。针对轻链可变区选择人接纳分子的次要考虑事项包括鼠供体分子和人接纳分子之间CDR长度方面的同源性。优选地，通过同源性检索V-BASE数据库选择人类接纳体抗体分子，并且也可以使用其他数据库如Kabat和公用NCBI数据库。本文中(包括下文在实施例6中)描述了用于人源化非人类抗体的方法。
本发明提供一种产生与CCR6结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码与CCR6结合的抗体或其片段的分离核酸或包含编码与CCR6结合的抗体或其片段的分离核酸的载体，从而表达核酸并产生抗体。优选地，分离抗体。对于宿主细胞、核酸和载体，可以使用上文描述的那些。可以通过例如，如本领域熟知(例如，Morrison S(1985)Science 229:1202)和如上文进一步概述的重组DNA技术和基因转染方法组合，获得核酸的表达。例如，为了表达抗体，可以通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆法)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将所述DNA插入载体(如表达载体)。选择与所用表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分立的载体，或者通常将两个基因插入相同的表达载体。将抗体基因通过标准方法插入表达载体(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或如果不存在限制性位点，则平末端连接)。本文所述的抗体轻链可变区和重链可变区可以用来通过以下方式产生具有任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已经编码所需同种型的重链恒定和轻链恒定区的表达载体，从而VH区段与载体内部的CH1区段有效连接并且VK区段与载体内部的CK区段有效连接。
抗CCR6抗体的表征和纯化
可以使用测量与人CCR6结合的测定法和/或测量阻断CCR6与其配体结合的能力的测定法，进行抗体的筛选。结合测定法的一个例子是ELISA，尤其是使用固定在平板上的融合蛋白，为人CCR6和人Fc，和使用缀合的第二抗体，检测与融合蛋白结合的抗CCR6抗体的ELISA。阻断测定法的一个例子是CCL20-介导的移行测定法，所述测定法测量对BAF转染的细胞上配体蛋白与CCR6结合的阻断。这种测定法寻找当上清液中的抗体阻断表达CCR6的细胞响应于CCL20而移行时的信号降低。阻断测定法的又一个例子是其中通过化学发光测量CCR6激活过程阻断的测定法。
本发明的抗体可以按照本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化。标准纯化方法包括色谱技术，包括在大气压或在高压使用系统如FPLC和HPLC实施的离子交换色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、大小或凝胶过滤色谱和反相色谱。纯化方法还包括电泳技术、免疫技术、沉淀技术、透析技术和聚焦色谱技术。与蛋白质浓缩联用的超滤和渗滤技术也是有用的。为了纯化CCR6抗体，可以例如在转瓶中培育选择的宿主细胞供单克隆抗体纯化用。可以过滤和浓缩上清液，之后进行蛋白A-琼脂糖凝胶亲和色谱(Pharmacia,Piscataway,NJ)。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查洗脱的抗体以确保纯度。本发明的优选抗体因此是分离和/或纯化的与CCR6结合的抗体。
免疫缀合物
在另一个方面，本发明表征了与治疗剂如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素连接的与人CCR6结合的CCR6抗体或其片段。这类缀合物在本文中称作“免疫缀合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作“免疫毒素”。术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”包括有害于(例如，杀死)细胞的任何物质。例子包括紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、佐柔比星、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还例如包括抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷基化剂(例如氮芥、硫代苯丁酸氮芥、美法仓、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C、和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环类(例如佐柔比星(以前为柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前为放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂药(例如长春新碱和长春碱)。可与本发明的抗体连接的治疗性细胞毒素的其他例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦辛和澳瑞司他汀及其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的例子是可商业获得的(American HomeProducts)。细胞毒素可以使用本领域可获得的接头技术与本发明的抗体连接。已经用来将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的例子包括但不限于含腙、硫醚、酯、二硫键和肽的接头。可以选择例如对于溶酶体区室内部低pH所致剪切敏感或对于蛋白酶(如肿瘤组织中优先表达的蛋白酶如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))所致剪切敏感的接头。对于细胞毒素类型、接头和用于将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，还参见Saito G等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail PA等人,(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Payne G(2003)Cancer Cell,3:207-212；Allen TM(2002)Nat.Rev.Cancer,2:750-763；Pastan I&Kreitman RJ(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs,3:1089-1091；Senter PD&Springer CJ,(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。本发明的抗体也可以与放射性同位素连接，以产生细胞毒性放射药物，也称作放射免疫缀合物。可以与抗体缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了用于制备放射性免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的例子是可商业获得的包括(EDEC Pharmaceuticals)和(Corixa Pharmaceuticals)，并且相似的方法可以用来利用本发明的抗体制备放射免疫缀合物。本发明的抗体缀合物可以用来调节给定的生物学反应，并且药物部分不得解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括，例如，酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假单胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物如，例如，淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、或其他生长因子。
将这类治疗剂与抗体连接的技术是熟知的，参见，例如Arnon等人,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,引自MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人,(编者),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,引自Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等人,(编者),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,引自Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人,(编者),第475-506页(1985)；“Analysis,Results,and Future Prospective of theTherapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”,引自MonoclonalAntibodies for Cancer Detection and Therapy,Baldwin等人,(编者),第303-16页(Academic Press 1985)和Thorpe PE&Ross WC(1982)Immunol.Rev.62:119-58。
在另一个方面，本发明提供了与治疗剂如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素一起施用的与CCR6结合的CCR6抗体或其片段。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了包含本发明抗体或其片段和可药用载体的组合物，例如，药物组合物。这类组合物可以包括本发明抗体和/或免疫缀合物和/或如上文描述的治疗剂(如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素)的一个或多个(例如，两个或更多个不同)组合。例如，本发明的药物组合物可以包含与靶抗原上不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物)的组合。本发明的药物组合物也可以在联合疗法中施用，即，与其他药剂组合。例如，联合疗法可以包括与至少一种其他抗炎药或免疫抑制剂组合的本发明CCR6抗体。
如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌药和抗真菌药等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物(即，抗体或免疫缀合物)包覆在保护该化合物免遭可能使这种化合物失活的酸和其他天然条件作用的材料中。可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。使用药学活性物质的此类介质和试剂是本领域已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况下之外，构思了在本发明药物组合物中使用所述介质或试剂。补充性活性化合物也可以并入组合物中。
在另一个方面，本发明提供一种包含免疫缀合物和可药用载体的组合物，所述免疫缀合物包含与治疗剂连接的与CCR6结合的抗体或其片段。如上文描述了可以使用的免疫缀合物和治疗剂。
在另一个方面，本发明提供一种包含本发明抗体或其片段的组合物，所述组合物还包含另一个药物活性物质。优选地，另一种药物活性物质是以下一者或多者：a)CCR6的另一种拮抗剂、b)抗炎药、c)免疫阻抑剂(例如TNFα拮抗剂、可的松或类固醇等)和/或d)抗过敏药。
本发明的药物组合物还可以包括可药用的抗氧化物质。可药用的抗氧化物质的例子包括：(1)水溶性抗氧化物质，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化物质，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁化羟基茴香醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属络合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。可以在本发明的药物组合物中使用的合适水质和非水质载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。这些组合物也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的消毒方法和通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止存在微生物。还可能想要将等渗剂如糖、氯化钠等纳入所述组合物。此外，可以通过纳入延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶引起可注射药物形式的延长吸收。
治疗用途和其他用途
本发明的抗体具有涉及诊断和治疗CCR6介导的疾病的多种体外和体内诊断用途和治疗用途。例如，可以将这些分子施用至体外或体内培养的细胞或(例如体内)施用至人类受试者以治疗、预防及诊断CCR6介导的多种病症。优选的受试者是人类并且包括具有CCR6活性介导的疾病(CCR6介导的疾病)的患者。本发明的中和抗体可以有效治疗患者，无关于他们是否具有异常的CCR6状态，如与幼稚T细胞群体相比，活化的T细胞群体中CCR6表达增加或记忆T细胞群体上CCR6表达增加或在Th17T细胞群体上CCR6表达增加。更优选的受试者是人类并且包括表达高水平CCR6的患者。
出于本发明目的，“患者”包括人类和其他动物，优选地包括哺乳动物并且最优选地包括人类。因此，本发明的抗体具有人类治疗应用和兽医应用。在本发明中，术语“治疗”或“治疗着”意在包括治疗性疗法、以及疾病或病症的预防性或阻抑性措施。因此，例如，在疾病发作之前成功施用抗体导致疾病的治疗。作为另一个例子，在疾病的临床表现后成功施用抗体以减轻疾病症状构成治疗疾病。“治疗”和“治疗着”还涵盖在疾病出现后施用抗体以根除疾病。在发作后和在临床症状已经出现后成功施用抗体，同时可能减轻临床症状和或许改善疾病，构成治疗疾病。那些“需要治疗的患者”包括已经患有这种病状或病症的哺乳动物以及易于患有这种病状或病症的那些患者，包括其中待防止该疾病或病症的那些患者。
在一个具体实施方案中，在体内使用抗体以治疗、防止或诊断CCR6介导的多种病症。因此，本发明提供一种用于治疗受试者中CCR6介导的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体或其片段。CCR6介导的示例性病症包括但不限于炎性疾病和/或自身免疫性疾病，例如，炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和节段性回肠炎、类风湿性关节炎、MS、1型和2型糖尿病、银屑癣、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、异位性皮炎；过敏反应或状况，例如包括哮喘和过敏性肺部炎症；癌、动脉粥样硬化、感染、神经变性病、移植排异、移植物抗宿主病(GVHD)和心血管障碍/疾病。优选地，CCR6介导的疾病包括炎性疾病和/或自身免疫性疾病，尤其包括炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和节段性回肠炎)、类风湿性关节炎、MS和动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、SLE、舍格伦综合征、硬皮病、全身性硬化症、慢性肾脏疾病、肝纤维化、结核病、特发性肺纤维化、结核病所致肺纤维化、腹膜后纤维变性、肺纤维化、囊性纤维化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维变性(骨髓)、腹膜后纤维化、进行性大块性纤维化、肾源性系统性纤维化、关节纤维化。
用本发明抗体待治疗的优选的CCR6介导的疾病选自炎性肠病、多发性硬化、类风湿性关节炎和哮喘。用本发明抗体待治疗的特别优选的CCR6介导的疾病是炎性肠病。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以用来检测CCR6的水平，或在其膜表面上含有CCR6的细胞的水平，所述水平可以随后与某些疾病症状关联。备选地，抗体可以用来抑制或阻断CCR6功能，这转而可以与预防或改善某些疾病症状关联，因而提示CCR6作为该疾病的介体。这可以通过使样品和对照样品与抗CCR6抗体在允许抗体和CCR6之间形成复合物的条件下接触来实现。检测抗体和CCR6之间形成的任何复合物并且在样品和对照中比较。鉴于本发明抗体对CCR6的特异性结合，本发明的抗体可以用来特异性检测细胞表面上表达的CCR6，例如，可以用来检测具有低或高CCR6表达水平的患者。本发明的抗体也可以用来借助免疫亲和纯化法纯化CCR6。
在另一个实施方案中，可以对本发明的抗体初步测试与体外治疗用途或诊断用途相关的结合活性。例如，可以使用流式细胞分析法测试本发明的组合物。
本公开进一步提供抗体或其片段作为药物的用途和抗体或其片段在制备用于治疗CCR6介导的疾病的药物中的用途。在又一个实施方案中，本公开提供用作药物的抗体或其片段。本公开还提供在治疗CCR6介导的疾病方法中使用的抗体或其片段。CCR6介导的疾病是如上文描述的病症。本发明的抗体或其片段可以特别用于治疗与患者的共刺激状态无关的CCR6介导的疾病。在一个优选实施方案中，抗体或其片段可以用于治疗CCR6介导的疾病，例如其中患者表达高水平的CCR6。
如先前所述，本发明的抗CCR6抗体可以随一种或其多种他治疗剂例如细胞毒性剂、放射毒性药物或免疫抑制药一起共施用。抗体可以与所述药物连接(如上文描述，作为免疫缀合物)或可以与所述药物独立地施用。在后一种情况下(独立施用)，抗体可以在所述药物之前、之后或与其同时施用或可以与其他已知的疗法(例如抗癌治疗，例如，放疗法)共施用。
对于施用抗体，剂量是约0.0001至100mg/kg和更常见地0.01至10mg/kg宿主体重。示例性治疗方案需要施用每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三个月至六个月一次。通常在多种场合施用抗体。单次剂量之间的间隔期可以是例如每周、每月、每隔三个月或每年。间隔期也可以是不规则的，如通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中实现约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。备选地，抗体可以作为持续释放形式施用，在这种情况下需要较低施用频率。根据抗体在患者中的半寿期变动剂量和频率。施用的剂量和频率可以根据治疗是否为预防性或治疗性而变动。在预防性应用中，相对低的剂量以相对不频繁的间隔期在长的时间范围内施用。一些患者继续接受治疗持续其余生。在治疗性应用中，有时需要在相对短的间隔期用相对高的剂量直至疾病的进展减少或终止。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分(即抗体)的实际剂量水平，以获得活性成份的这种量，所述量就具体患者、组合物和施用方式而言可以有效达到想要的治疗反应，同时对患者无毒。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明具体组合物的活性、施用途径、施用时间、正在使用的具体抗体的排泄速率、治疗的持续期、与所用具体组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域熟知的因素。
本发明的抗CCR6抗体的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加和/或防止因疾病侵袭所致的损伤或致残。可以在预示人类中功效的动物模型系统中评价化合物治疗CCR6介导的疾病的能力。备选地，可以通过检测化合物抑制细胞生长的能力评价组合物的这种特性，这种抑制作用可以通过熟练技术人员已知的测定法体外测量。本领域普通技术人员将能够基于以下这类因素如受试者的体格大小、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或施用途径，确定这类量。
本发明的抗体或组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种方法，通过一种或多种施用途径施用。如熟练技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所想要的结果而变动。优选的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。更优选的施用途径是静脉内或皮下。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨的胸骨内注射和输注。备选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部地施用。
制造品和试剂盒
在本公开的另一个实施方案中，提供了制造品，其包含本发明的抗体或其片段、组合物或免疫缀合物，用于治疗CCR6介导的疾病。该制造品可以包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器例如包括瓶、小瓶或注射器。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了有效治疗所述病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如，该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质可以是本文所述的抗体。标签或包装插页可以显示组合物可以用于治疗所选的病状，如癌症。在一个实施方案中，标签或包装插页可以显示包含抗体的组合物可以用来治疗CCR6介导的疾病。
另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含除抗体之外的治疗剂。本公开的这个实施方案中的制造品还可以包含包装插页，所述包装插页指示第一和第二组合物可以联合使用以治疗CCR6介导的疾病或病症。这种治疗剂可以是在前述部分中描述的任何辅助治疗剂(例如，溶栓剂、抗血小板药、化疗药、抗血管生成药、抗激素化合物、保心药和/或哺乳动物中免疫功能的调节物，包括细胞因子)。备选地或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料、包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
包含本发明的抗体、组合物或免疫缀合物和使用说明书的试剂盒也处于本发明的范围内。该试剂盒可以进一步含有一种或多种额外的试剂，如免疫抑制试剂、细胞毒性剂或放射毒性剂或一种或多种额外的本发明抗体(例如抗体，其具有与CCR6抗原上不同于第一抗体的表位结合的互补活性)。
在不进一步描述的情况下，认为使用前文描述和以下示意性实施例，本领域普通技术人员可以制得并利用本公开的物质并实施要求保护的方法。提供以下工作实施例以促进本公开的实施，并且不得解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。
实施例
实施例1：
建立稳定地表达人CCR6的CHO细胞和BAF/3细胞
构建体的克隆：
人CCR6的基因订购自Imagenes(现称SourceBiosciences LifeSciences,Nottingham,UK)。由Imagenes赋予的构建体名称是IRATp970E0757D。克隆用靶载体是pGLEX33[IRES-REP]，其是具有表达盒受小鼠CMV启动子控制的Glenmark专利载体。多克隆位点(MCS)允许克隆目的基因CCR6。MCS(和因此，在最终构建体中，CCR6的可读框)后接IRES和编码报道蛋白(REP)的第二可读框。
为了在pGLEX33[IRES-REP]中克隆CCR6的可读框(SEQ ID NO:101)，使用向可读框5’和3’添加便利的限制性位点(NheI/ClaI)的特异性引物对(GlnPr863和GlnPr864)，使用构建体IRATp970E0757D作为PCR的模板。使用NheI/ClaI切割扩增子并将其克隆入pGLEX33[IRES-REP]的主链，其中将所述主链使用相同的酶在MCS中切割并用CIP处理以防止重新环化。所得到的构建体命名为pGLEX33[CCR6-IRES-REP]并通过测序证实(Fasteris,日内瓦,瑞士)。
CHO[hsCCR6]
将中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S，Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)在补充有4mM L-谷氨酰胺(Applichem，德国)的PowerCHO-2CD培养基(Lonza,Verviers，比利时)中悬浮培养并在摇床(200转/分钟，具有2.5cm圆形冲程)中于37℃、5％CO2和80％湿度温育。
使用接种密度0.5x 106个活细胞/ml，每3-4日在新鲜培养基中常规实施CHO-S细胞的继代培养。使用10ml培养基，在含有允许气体交换的可透性滤器的50ml生物反应器管(Tubespin Bioreactor 50；TPP，Trasadingen，瑞士)中培育细胞。使用台盼蓝细胞拒染法，用Countess自动化细胞计数器(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)确定细胞生存力和浓度。对于CHO-S细胞使用PCV管(TPP，Trasadingen，瑞士)，通过细胞压积法(PCV)确定细胞浓度。使用聚乙烯亚胺(PEI；JetPEI，Polyplus-transfection，Illkirch，法国)转染CHO-S细胞。PEI是可以与带负电荷的分子如DNA复合的阳离子聚合物。带正电荷的DNA-PEI复合物与带负电荷的细胞表面结合并且由内体内化。它达到溶酶体区室，从这里它通过裂解释放至胞核。DNA-PEI复合物的高转染效率因PEI保护DNA免于溶酶体降解的能力所致。根据制造商提供的手册转染细胞。
同时共转染将两个质粒，即表达目的基因以及报道基因的pGLEX33[CCR6-IRES-REP]和表达针对选择标记嘌呤霉素提供耐药性的PAC基因的第二载体。将两种载体在稳定转染之前线性化并且按照已知允许产生稳定细胞群体的比率转染。
转染后当日，将细胞按不同浓度用选择培养基稀释并且分配入96孔平板，以产生将称作微型汇集物的稳定细胞群体。使用的选择培养基是PowerCHO-2，4mM谷氨酰胺，所述培养基按已知允许选择稳定细胞系的特定浓度补充嘌呤霉素。
在转染后七日，通过添加选择培养基至细胞更新选择严格性。一旦96孔平板中的集落汇合，使用荧光读数仪分析平板的报道基因表达。48个最高的表达者扩充成24孔平板规模。在这个规模，使用FACS和人CCR6特异性抗体，测试细胞的人CCR6表达。5个克隆#12、16、25、37和47显示最均一和最高的CCR6表达。将这些细胞进一步扩充供制备研究用细胞库，每细胞库10个冷冻管。将RCB在-80℃保存在蛋白质表达和细胞系开发小组的细胞库中。
BA/F3[CCR6]
BA/F3是一种很可能衍生自C3H小鼠的IL-3依赖性鼠proB细胞系。该细胞以订单号ACC 300购自DSMZ(布伦瑞克，德国)。将细胞在T型瓶中使用BA/F3生长培养基(80％RPMI(vol./vol.)、10％热灭活FCS(vol./vol.)、10％(vol./vol.)WEHI-3B细胞系条件培养基(DSMZ目录编号ACC 26)常规培养并且在静置培养箱(37℃、5％CO2和80％湿度)中温育。
使用接种密度0.1x 106个活细胞/ml，每3-4日在新鲜培养基中常规实施BA/F3细胞的继代培养。将细胞在T-150培养瓶(TPP,Trasadingen,瑞士)中使用20ml培养基培育。使用台盼蓝细胞拒染法，用Countess自动化细胞计数器(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)确定细胞生存力和浓度。
使用NEON装置(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)使用电穿孔法进行BA/F3细胞的转染。使用NEON装置手册中提供的说明书，优化电穿孔条件(脉冲数、脉冲时长、电压)。
同时共转染两种质粒，即表达目的基因以及报道基因的pGLEX33[CCR6-IRES-REP]和表达针对选择标记嘌呤霉素提供耐药性的PAC基因的第二载体。将两种载体在稳定转染之前线性化并且按照已知允许产生稳定细胞群体的比率转染。
将细胞按不同浓度稀释于生长培养基中并分配入96孔平板中。次日，向细胞添加另一个体积的选择培养基。所用的选择培养基是补充有嘌呤霉素的BA/F3生长培养基。已知按不同浓度稀释的BA/F3细胞及嘌呤霉素处理的组合允许选择稳定的细胞系
一旦96孔平板中的集落汇合，使用荧光读数仪分析平板的报道基因表达。96个最高的表达者扩充成24孔平板规模。在这个规模，使用FACS和人CCR6特异性抗体，测试细胞的人CCR6表达。5个克隆#7、17、21和48显示最均一和最高的CCR6表达。将这些细胞进一步扩充供制备研究用细胞库，每细胞库10个冷冻管。将RCB在-80℃保存在蛋白质表达和细胞系开发小组的细胞库中。
>Glnpr863SEQ ID NO:99
GAGGCTAGCCACCATGAGCGGGGAATCAATGAA
>Glnpr864SEQ ID NO:100
AGGGGCATCGATTCACATAGTGAAGGACGACGC
>hsCCR6SEQ ID NO:101
ATGAGCGGGGAATCAATGAATTTCAGCGATGTTTTCGACTCCAGTGAAGATTATTTTGTGTCAGTCAATACTTCATATTACTCAGTTGATTCTGAGATGTTACTGTGCTCCTTGCAGGAGGTCAGGCAGTTCTCCAGGCTATTTGTACCGATTGCCTACTCCTTGATCTGTGTCTTTGGCCTCCTGGGGAATATTCTGGTGGTGATCACCTTTGCTTTTTATAAGAAGGCCAGGTCTATGACAGACGTCTATCTCTTGAACATGGCCATTGCAGACATCCTCTTTGTTCTTACTCTCCCATTCTGGGCAGTGAGTCATGCCACCGGTGCGTGGGTTTTCAGCAATGCCACGTGCAAGTTGCTAAAAGGCATCTATGCCATCAACTTTAACTGCGGGATGCTGCTCCTGACTTGCATTAGCATGGACCGGTACATCGCCATTGTACAGGCGACTAAGTCATTCCGGCTCCGATCCAGAACACTACCGCGCAGCAAAATCATCTGCCTTGTTGTGTGGGGGCTGTCAGTCATCATCTCCAGCTCAACTTTTGTCTTCAACCAAAAATACAACACCCAAGGCAGCGATGTCTGTGAACCCAAGTACCAGACTGTCTCGGAGCCCATCAGGTGGAAGCTGCTGATGTTGGGGCTTGAGCTACTCTTTGGTTTCTTTATCCCTTTGATGTTCATGATATTTTGTTACACGTTCATTGTCAAAACCTTGGTGCAAGCTCAGAATTCTAAAAGGCACAAAGCCATCCGTGTAATCATAGCTGTGGTGCTTGTGTTTCTGGCTTGTCAGATTCCTCATAACATGGTCCTGCTTGTGACGGCTGCAAATTTGGGTAAAATGAACCGATCCTGCCAGAGCGAAAAGCTAATTGGCTATACGAAAACTGTCACAGAAGTCCTGGCTTTCCTGCACTGCTGCCTGAACCCTGTGCTCTACGCTTTTATTGGGCAGAAGTTCAGAAACTACTTTCTGAAGATCTTGAAGGACCTGTGGTGTGTGAGAAGGAAGTACAAGTCCTCAGGCTTCTCCTGTGCCGGGAGGTACTCAGAAAACATTTCTCGGCAGACCAGTGAGACCGCAGATAACGACAATGCGTCGTCCTTCACTATGTGAA
小鼠抗人CCR6抗体的产生和筛选
将人CCR6转染的CHO细胞和BAF细胞用PBS洗涤并重悬于PBS中。对于首次免疫，将CCR6转染的CHO细胞转移至0.5mL胰岛素注射器(BD Pharmingen,Allschwil,瑞士)并且用10x 106个转染的细胞在后足垫、尾根和颈部皮下免疫BALB/c动物(Harlan,荷兰)。两周后遵循相同的注射途径，用CCR6转染的BAF重复免疫。
使用转染的BAF细胞和作为阴性对照的BAF模拟，通过流式细胞术评价免疫小鼠血清中循环型抗人CCR6抗体的存在。将不同小鼠血清的系列稀释物(从1:100至1:109)添加至细胞，并且使用PE标记的山羊抗小鼠IgG第二抗体(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)检测结合的抗体。在处死前三天，在展示最佳抗人CCR6IgG血清滴度的动物中用1x 106个CCR6转染的BAF细胞进行末次皮下强化免疫。
使动物安乐死并且采集腹股沟淋巴结、腋淋巴结、肱淋巴结、腘淋巴结和坐骨淋巴结以通过在DNA酶(Roche Diagnostics(Schweiz)AG,Rotkreuz,瑞士)和胶原酶(RocheDiagnostics(Schweiz)AG,Rotkreuz,瑞士)溶液中用二根25G针破坏淋巴结结构，制备单细胞悬液。将单细胞悬液与骨髓瘤细胞系X63AG8.653(小鼠BALB/c骨髓瘤细胞系；ATCC登录号：CRL 1580；Kearney JF等人,(1979)J.Immunol.123(4):1548-1550)按7:1的比率(融合配偶体对收获的淋巴结细胞)用聚乙二醇1500(Roche Diagnostics(Schweiz)AG,Rotkreuz,瑞士)融合。将融合细胞铺种入含有小鼠巨噬细胞的96孔平底平板的DMEM-10培养基(Invitrogen AG,巴赛尔,瑞士)中，所述培养基补充有10％胎牛血清(FBS,PAALaboratories,Pasching,奥地利)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml(Biochrom AG,德国)青霉素、100μg/ml链霉素(Biochrom AG,德国)、10mM HEPES(Invitrogen AG,巴赛尔,瑞士)、50μMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)、HAT(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)和1％生长因子(Hybridokine,Interchim/Uptima,法国)。
针对识别人CCR6的小鼠IgG的存在，通过FACS筛选来自融合物的大约800个孔。将阳性孔扩充并进行两轮亚克隆。收集细胞，并且克隆重链和轻链并测序。
实施例2：
来自杂交瘤细胞的抗CCR6抗体VH链和VL链的克隆和测序
从杂交瘤分离RNA、逆转录成cDNA，并且通过PCR扩增VH基因和VL基因。将这些PCR产物连接入拯救载体，从而允许对各个PCR产物测序并确定杂交瘤的单克隆性或多克隆性。当不存在插入物时，用于此目的pDrive载体(Qiagen,德国)编码LacZα-肽。这允许在含有IPTG和X-gal的LB琼脂平板(无插入物的菌落因为LacZα肽降解X-gal而为蓝色)上进行蓝色/白色选择。扩增白色菌落并进行微量制备以分离质粒，采用在载体上复性的标准引物(M13rev、M13fwd、T7或SP6)对所述质粒测序。使用三种不同的软件：Geneious、CloneManager和BioEdit分析序列。随后将获得的序列亚克隆入表达载体以重组表达目的抗体。
1.RNA分离
使用来自Macherey-Nagel(德国，目录号740955)的NucelosSpin RNA II试剂盒遵循生产商的操作方案(采用600μl RA1缓冲液，除均化柱和60μl洗脱用无RNA酶的H2O(随试剂盒提供)之外，还均化注射器)，从2-10x 106个细胞分离来自杂交瘤的总RNA。
使用NanoDropND-1000分光光度计(Thermo Fischer Scientific,美国)，对RNA制备物的产率定量。
2.一步RT-PCR
将上文描述的总RNA制备物进一步逆转录成cDNA，并且使用简并引物的二种不同混合物(每种混合物允许回收小鼠免疫球蛋白重链可变片段和可变重链交界区域的全部不同亚家族或回收全部小鼠免疫球蛋白轻链κ可变片段和可变轻链κ交界区域)，通过PCR扩增VH和VL片段。使用QiaGen一步RT-PCR试剂盒(Qiagen，德国，目录号210212)，同时进行逆转录和PCR扩增。由于该技术使用特异性引物，所以每份mRNA样品随后一式两份处理，从而允许独立逆转录和扩增VH片段或VL片段。
将溶解于无RNA酶水至终体积30μl的2μg总RNA与10μl 5x母液QiaGen OneStepRT-PCR缓冲液、浓度为10mM的2μl dNTP混合物、浓度为10μM的3μl引物混合物及2μl QiaGenOneStep RT-PCR酶混合物进行混合。将最终溶液置于PCR管中并且使用以下设定在PCR热循环仪(BioRad iCycler版本4.006,BioRad,美国)中循环：
50℃30分钟
95℃15分钟
40个循环：94℃30秒
55℃30秒
72℃1分钟
72℃10分钟
在4℃保持
3.pDrive克隆
将PCR产物加载于2％琼脂糖凝胶上并且从凝胶切下目的产物(约450bp)，并使用Macherey-Nagel NucloSpin凝胶和PCR Clean-up试剂盒(德国，目录号740609)纯化。对于DNA测序，将提取的PCR产物克隆入拯救载体(pDrive载体，Qiagen，德国，目录号231124)并转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞(Invitrogen AG，巴赛尔，瑞士，目录号C404006)。
微量制备提取
将阳性菌落在MN方孔块(Macherey-Nagel，德国，目录号740488)的1.5ml LB+100μg/ml氨苄青霉素中扩增并且使用NucleoSpin 96质粒试剂盒(Macherey-Nagel，德国，目录号740625)进行微量制备提取。
4.测序
将样品送至DNA测序服务公司Fasteris(Plan-les-Ouates，瑞士)，以便用标准引物M13rev、M13fwd、T7或SP6进行DNA测序。
5.序列分析
Geneious、Clone Manager 9专业版和BioEdit序列比对编辑器(Hall,T.A.1999.BioEdit:a user-friendly biological sequence alignment editor andanalysis program for Windows 95/98/NT.Nucl.Acids.Symp.Ser.41:95-98)用于分析序列。
6.表达重组嵌合抗体的表达载体的克隆
为了在哺乳动物细胞中重组表达，使用基于装配的PCR方法，将分离的鼠VH片段和VL片段安排成嵌合免疫球蛋白。这些嵌合抗体由其中鼠重链可变结构域与人IgG1重链恒定域(γ1区、铰链区、γ2区和γ3区)融合的重链和其中鼠轻链可变结构域与人κ恒定域(Cκ)融合的轻链组成。将全部嵌合抗体克隆入内部哺乳动物表达载体pGLEX18载体供在HEK-293(ATCC编号：CRL-1573)中表达和瞬时转染。
通过重叠PCR产生第一批嵌合体(对于HC和LC)。通过PCR扩增可变部分和恒定部分并且随后通过第二PCR反应融合在一起。随后在BspEI限制性位点上游含有前导肽的一个内部载体中，使用BspEI/NotI，符合可读框地克隆它们。使用HindIII/XhoI(对于LC)或HindIII/XbaI(对于HC)，将所产生的编码序列(前导肽、可变部分、恒定部分)亚克隆入pGLEX18表达载体。在重叠PCR期间在抗体的可变部分和恒定部分之间添加限制性位点RsrII(对于LC)和BbvCI(对于HC)。对于下一批嵌合体，通过PCR扩增VL和VH并且使用BspEI/RsrII(对于LC)和BspEI/BbvCI(对于HC)，符合可读框地直接克隆入含有前导肽和相应恒定部分的pGLEX18主链。
用于逆转录和扩增的引物由Microsynth(Balgach，瑞士)合成并经HPLC纯化。可以在表1中找到引物序列。
表1
引物混合物VH反向100uM(来自100uM母液)(SEQ ID NO:102–120)
引物混合物VH正向100uM(来自100uM母液)(SEQ ID NO:121–124)
引物混合物VL反向100uM(来自100uM母液)(SEQ ID NO:125–144)
引物混合物VL反向100uM(来自100uM母液)(SEQ ID NO:145–148)
使用如表2中所示的以下测序引物：
表2：
实施例3：
抗人CCR6抗体的生物学特征
通过流式细胞术检测CCR6特异性抗体
通过流式细胞术确定杂交瘤的抗体滴度、特异性和产量以及确定重组抗体候选物。简而言之，培养人CCR6转染的BAF细胞(这些转染细胞的产生详述于实施例1中)并且将2×105个细胞分配在96孔V底平板(TPP,Trasadingen,瑞士)中，并且以1300转/分钟离心三分钟；弃去上清液，将细胞收集并如下文描述通过流式细胞术分析。将细胞重悬于50μl杂交瘤上清液中或50μl含5μg/mL同种型对照或商业小鼠抗人CCR6抗体(克隆11A9，BDBiosciences,Allschwil,瑞士)的FACS缓冲液(PBS，2％FBS，10％Versene(Invitrogen，美国))中。将细胞在冰上温育30分钟，洗涤两次并重悬于50μl FACS缓冲液中。1/200稀释的抗小鼠IgG-藻红蛋白-PE(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)用来检测CCR6特异性小鼠杂交瘤和同种型对照抗体。将细胞在冰上温育15分钟，洗涤一次并重悬于400μl FACS缓冲液中，并且在FACS仪(Cyan,Beckman Coulter International S.A.,Nyon,瑞士)上分析。图1显示多种克隆的亲本杂交瘤上清液识别在转染的BAF细胞表面上表达的人CCR6蛋白(图1A)，但是不识别在BAF模拟细胞表面上表达的人CCR6蛋白(图1B)。
选择4H11，因为在全部选择的重组候选物(n＝5)当中，就杂交瘤稳定性及更好的功能特性而言，它显示超过其他候选物的优越特性。
在Discoverx生物测定法中4H11嵌合抗体抵消CCR6介导的细胞活化
为了确定当激活CCR6受体时，嵌合4H11是否抵消β-停止蛋白的召集作用，根据生产商的说明书，使用Ab Hunter抗CCR6试剂盒(DiscoveRx公司，Birmingham，UK)评估生物测定法。使用微量平板读数仪(Biotek,美国；分销商：WITTEC AG,Littau,瑞士)，读取化学发光活性。在该测定法中，嵌合4H11以5个不同浓度(20、6.7、2、0.7和0.2μg/ml)使用。分别使用20μg/ml的嵌合IgG1同种型对照和抗CCL20(R&D Systems,Minneapolis,美国)作为阴性对照和阳性对照。在使用嵌合IgG1同种型对照作为100％发光活性的条件下，考虑化学发光信号时计算相对发光单位(RLU)百分数。图2A显示与同种型匹配的对照相比，嵌合4H11以剂量依赖性方式显著地减少CCR6受体信号传导。此外，嵌合4H11在低浓度(0.2μg/ml)仍有活性。
抑制CCL20诱导的表达CCR6的BAF细胞移行
实施例1中详述了产生人CCR6转染的BAF细胞。测试了嵌合4H11抵消人CCR6转染的BAF细胞响应于人CCL20而移行的能力。简而言之，将以1x106个细胞/ml稀释的100μl BAF-CCR6与3个剂量的嵌合4H11(10、2和0.4μg/ml)预温育并添加到含8.0μm孔聚碳酸酯膜插入物[Corning,Chemie Brunschwig AG,瑞士]的6.5mm上室。Transwell的下室含有以10ng/ml稀释于500μl BAF培养基(含有10％FCS(Amimed，由Bioconcept分销,Allschwil,瑞士)的RPMI-1640(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,巴塞尔,瑞士))中的重组人CCL20(R&D Systems)。在温育后，从下室和上室收获细胞并且使用Guava Easycyte HT(Millipore AG,Zug,瑞士)计数。分别使用10μg/ml的嵌合IgG1同种型和抗CCL20(R&DSystems)作为阴性对照和阳性对照。通过下室中的细胞数目除以上室和下室中的细胞总数，计算移行率。抑制移行的百分数计算为对同种型对照所观察到的抑制移行的百分数。图2B表明与同种型对照相比，嵌合4H11减少人CCL20诱导的BAFCCR6细胞移行，甚至在0.4μg/ml也是如此。
实施例4：
依据流式细胞术，4H11候选物在人和其他动物物种外周血单个核细胞(PBMC)上的结合
人细胞
含有人白细胞的滤器采集自瑞士La Chaux-de-Fonds的血液采集中心(Centre deTransfusion Sanguine et Laboratoire de Sérologie,rue Sophie-Mairet29,CH-2300)。通过60mL含有10U/mL肝素(liquemin)(Drossapharm AG,Lucern,瑞士)的PBS反冲洗从滤器取下细胞。随后遵循生产商的说明书，用50mL血液分离滤管(Brunschwig，巴赛尔，瑞士)纯化PBMC。将细胞用含FBS(PAA Laboratories,Pasching,奥地利)的罗斯维尔公园纪念学院(RPMI,PAA Laboratories,Pasching,奥地利)培养基洗涤3次。计数细胞并且将2×105个细胞分配在96孔V底平板(TPP,Trasadingen,瑞士)中，并且以1300转/分钟离心三分钟；将细胞收集并如下文描述通过流式细胞术分析。
将如上述制备的人PBMC细胞重悬于50μl含10μg/mL嵌合4H11抗体、10μg/mL或适宜同种型对照或10μg/mL商业抗人CCR6抗体(克隆R6H9，eBioscience，维也纳，奥地利)的FACS缓冲液(PBS，2％FBS，10％Versene(Invitrogen，美国))中。将细胞在冰上温育30分钟，洗涤一次并重悬于50μl FACS缓冲液中。1/200稀释的抗人IgG-藻红蛋白-PE和抗小鼠IgG-藻红蛋白-PE(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)分别用来检测嵌合4H11抗体和商业抗人CCR6抗体。将细胞在冰上温育15分钟，洗涤一次并重悬于400μl FACS缓冲液中，并且在FACS仪(Cyan,Beckman Coulter International S.A.,Nyon,瑞士)上分析。
食蟹猴原代细胞
在柠檬酸盐管(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)中收集来自食蟹猴(从瑞士弗里堡州弗里堡大学神经生理学实验室Eric Rouiller教授获得)的全血。2mL PBS与3mL血液混合并且将混合物铺在10ml 85:15Ficoll:PBS混合物(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)的顶部上。将样品在室温不停地离心20分钟。收集PBMC层并用PBS洗涤3次。细胞重悬于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM,PAA Laboratories,Pasching,奥地利)、10％FBS(PAA Laboratories,Pasching,奥地利)、非必需氨基酸(PAA Laboratories,Pasching,奥地利)、1mM丙酮酸钠(PAA Laboratories,Pasching,奥地利)，2mMUltraglutamine(Lonza,比利时)、100U/ml青霉素(Biochrom AG,德国)、100μg/ml链霉素(Biochrom AG,德国)中。计数细胞并且将2×105个细胞分配在96孔V底平板(TPP,Trasadingen,瑞士)中，并且以1300转/分钟离心三分钟。将嵌合4H11、同种型对照或商业抗人CCR6非人灵长类交叉反应性抗体(克隆11A9，BD Pharmingen,Allschwil,瑞士)按10μg/mL添加至各孔。洗涤细胞，并且按1/200在FACS缓冲液中稀释的抗人IgG-藻红蛋白-PE和抗小鼠IgG-藻红蛋白-PE(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)分别用来检测嵌合4H11抗体和商业抗人CCR6抗体。将细胞在冰上温育15分钟，洗涤一次并重悬于400μl FACS缓冲液中，并且在FACS仪(Cyan,Beckman Coulter International S.A.,Nyon,瑞士)上分析。图3显示，嵌合4H11能够识别在人淋巴细胞(图3A)和食蟹猴淋巴细胞(图3B)的表面上表达的CCR6受体，因此提供药物开发迫切所需的交叉反应性特性。
实施例5：CCR6表位绘制研究
评估这项研究以鉴定人CCR6序列(hsCCR6)中对嵌合4H11mAb结合作用重要的小区域和各个氨基酸。由于嵌合4H11不识别小鼠CCR6受体(mmCCR6)，使用人-小鼠杂合分子(其中人CCR6受体的N端区域和胞外环被小鼠等同区域替换)的线性方法用来确定这种mAb的表位。
产生小鼠-人杂合CCR6突变体。
称作hsCCR6/mmECL1的第一突变体对应于这样的hsCCR6序列，其中氨基酸105至119(hsCCR6的胞外环1)由mmCCR6序列的氨基酸97至111替换(mmCCR6的胞外环1)。称作hsCCR6/mmECL2的第二突变体对应于这样的hsCCR6序列，其中氨基酸181至211(hsCCR6的胞外环2)由mmCCR6序列的氨基酸173至203替换(mmCCR6的胞外环2)。称作hsCCR6/mmECL3的第三突变体对应于这样的hsCCR6序列，其中氨基酸280至303(hsCCR6的胞外环3)由mmCCR6序列的氨基酸272至295替换(mmCCR6的胞外环3)。
对于第一突变体hsCCR6/mmECL1，通过融合PCR(使用3次PCR)，将hsECL1序列替换为mmECL1序列。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1778(含有NheI限制性位点和hsCCR6序列的起始)和反向引物GlnPr1947(含有hsCCR6在hsECL1之前的24bp和mmECL1的前34bp)，进行第一PCR(PCR1)。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1948(含有mmECL1的最后33bp和hsCCR6在hsECL1之后的25bp)和反向引物GlnPr1779(含有hsCCR6序列的末端和XhoI限制性位点)，与第一PCR平行地进行第二PCR(PCR2)。
使用PCR1和PCR2作为模板(重叠22bp)和GlnPr1778和GlnPr1779作为正向引物和反向引物，进行第三PCR(PCR3)。
对于第二突变体hsCCR6/mmECL2，通过融合PCR(使用3次PCR)，将hsECL2序列替换为mmECL2序列。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1778(含有NheI限制性位点和hsCCR6序列的起始)和反向引物GlnPr1949(含有hsCCR6在hsECL2之前的28bp和mmECL2的前54bp)，进行第一PCR(PCR1)。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1950(含有mmECL2的最后57bp和hsCCR6在hsECL2之后的25bp)和反向引物GlnPr1779(含有hsCCR6序列的末端和XhoI限制性位点)，与第一PCR平行地进行第二PCR(PCR2)。
使用PCR1和PCR2作为模板(重叠18bp)和GlnPr1778和GlnPr1779作为正向引物和反向引物，进行第三PCR(PCR3)。
对于第三突变体hsCCR6/mmECL3，通过融合PCR(使用3次PCR)，将hsECL3序列替换为mmECL3序列。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1778(含有NheI限制性位点和hsCCR6序列的起始)和反向引物GlnPr1951(含有hsCCR6在hsECL3之前的25bp和mmECL3的前46bp)，进行第一PCR(PCR1)。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1952(含有mmECL3的最后44bp和hsCCR6在hsECL3之后的27bp)和反向引物GlnPr1779(含有hsCCR6序列的末端和XhoI限制性位点)，与第一PCR平行地进行第二PCR(PCR2)。
使用PCR1和PCR2作为模板(重叠18bp)和GlnPr1778和GlnPr1779作为正向引物和反向引物，进行第三PCR(PCR3)。
对于全部三种突变体，使用单一限制性位点NheI和XhoI，将PCR产物插入pT1载体(GSD980)。随后将DNA转化入大肠杆菌细菌并铺在氨苄青霉素平板上。次日，每种突变体选择2-4个克隆，提取它们的DNA并送至Fasteris供测序。基于测序结果，每种突变体选择一个克隆，对于突变体pT1-hsCCR6/mmECL1，选择GSB202，对于突变体pT1-hsCCR6/mmECL2，选择GSB208，并且对于突变体pT1-hsCCR6/mmECL3，选择GSB206。
对全部三种突变体进行微量制备以在HEK细胞中进行瞬时转染。
引物序列：
GlnPr1778:GATCGCTAGCCACCATGAGCGGGGAATCAATGAA(SEQ ID NO:153)
GlnPr1779:GATCCTCGAGTCATCACATAGTGAAGGACGACG(SEQ ID NO:154)
GlnPr1947:
CATCGCTGAAAACCCAAGTGTTGGTGGCATGAGTCACTGCCCAGAATGGGAGAGTAAG(SEQ ID NO:155)
GlnPr1948:
AACACTTGGGTTTTCAGCGATGCACTGTGTAAATTGCTAAAAGGCATCTATGCCATCA(SEQ ID NO:156)
GlnPr1949:
CTCACAGACATCACGATCCTGCAGCTCGTATTTCTTGTTGAAGATAAATGTAGGGCTGGAGATGATGACTGACAGCCCCCAC(SEQ ID NO:157)
GlnPr1950:GATCGTGATGTCTGTGAGCCACGGTACAGGTCTGTCTCAGAGCCCATCACGTGGAAGCTGCTGATGTTGGGGCTTGAGCTAC(SEQ ID NO:158)
GlnPr1951:CGAGGACTTTCTCGGTGCTGCAGCTCCGGCCCACTTTGCCCGTGTTTGCAGCCGTCACAAGCAGGACCATG(SEQ ID NO:159)
GlnPr1952:
GCACCGAGAAAGTCCTCGCCTACACCAGGAACGTGGCCGAGGTCCTGGCTTTCCTGCACTGCTGCCTGAAC(SEQ ID NO:160)
生成两种其他的人/小鼠突变体：突变体4由含有小鼠N端区域的人CCR6受体组成，而突变体5对应于含有人N端区域的小鼠CCR6受体。
称作hsCCR6/mmN-term的突变体4对应于这样的hsCCR6序列，其中氨基酸1至47(hsCCR6N端直至第一跨膜结构域)由mmCCR6序列的氨基酸1至39(mmCCR6N端直至第一跨膜结构域)替换。称作mmCCR6/hsN-term的突变体5对应于这样的mmCCR6序列，其中氨基酸1至39(mmCCR6N端直至第一跨膜结构域)由hsCCR6序列的氨基酸1至47(hsCCR6N端直至第一跨膜结构域)替换。
对于突变体hsCCR6/mmN-term，通过融合PCR(使用3次PCR)，将hsN-term序列替换为mmN-term序列。
使用mmCCR6作为模板(GSD363)、正向引物GlnPr866(含有NheI限制性位点和mmCCR6序列的起始)和反向引物GlnPr1983(含有mmN-term序列的末端和hsCCR6第一跨膜结构域的起始)，进行第一PCR(PCR1)。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1984(含有mmN-term序列的末端和hsCCR6第一跨膜结构域的起始)和反向引物GlnPr1779(含有hsCCR6序列的末端和XhoI限制性位点)，与第一PCR平行地进行第二PCR(PCR2)。
使用PCR1和PCR2作为模板(重叠40bp)和GlnPr866和GlnPr1779作为正向引物和反向引物，进行第三PCR(PCR3)。
对于突变体mmCCR6/hsN-term，通过融合PCR(使用3次PCR)，将mmN-term序列替换为hsN-term序列。
使用hsCCR6作为模板(GSD491)、正向引物GlnPr1778(含有NheI限制性位点和hsCCR6序列的起始)和反向引物GlnPr1985(含有hsN-term序列的末端和mmCCR6第一跨膜结构域的起始)，进行第一PCR(PCR1)。
使用mmCCR6作为模板(GSD363)、正向引物GlnPr1986(含有hsN-term序列的末端和mmCCR6第一跨膜结构域的起始)和反向引物GlnPr1987(含有mmCCR6序列的末端和XhoI限制性位点)，与第一PCR平行地进行第二PCR(PCR2)。
使用PCR1和PCR2作为模板(重叠33bp)和GlnPr1778和GlnPr1987作为正向引物和反向引物，进行第三PCR(PCR3)。
对于突变体4和5，使用单一限制性位点NheI和XhoI，将PCR产物插入pT1载体(GSD980)。随后将DNA转化入大肠杆菌细菌并铺在氨苄青霉素平板上。次日，每种突变体选择4个克隆，提取它们的DNA并送至Fasteris供测序。基于测序结果，每种突变体选择一个克隆，对于突变体pT1-hsCCR6/mm N-term，选择GSB210，并且对于突变体pT1-mmCCR6/hsN-term，选择GSB215。
使用BAF细胞，对两种突变体进行大量制备以建立稳定的细胞系。
引物序列：
GlnPr866:AGAGGCTAGCCACCATGAATTCCACAGAGTCCTA(SEQ ID NO:161)
GlnPr1983:CAAGGAGTAGGCAATCGGTACAAATACCTTGGTGAAGTTTCTGAC(SEQ ID NO:162)
GlnPr1984:AAACTTCACCAAGGTATTTGTACCGATTGCCTACTCCTTGATCTG(SEQ ID NO:163)
GlnPr1779:GATCCTCGAGTCATCACATAGTGAAGGACGACG(SEQ ID NO:154)
GlnPr1778:GATCGCTAGCCACCATGAGCGGGGAATCAATGAA(SEQ ID NO:153)
GlnPr1985:CAATTGGCACAAATAGCCTGGAGAACTGCCTGACCTCCTG(SEQ ID NO:164)
GlnPr1986:TCAGGCAGTTCTCCAGGCTATTTGTGCCAATTGCCTACTC(SEQ ID NO:165)
GlnPr1987:CCGCGATCCTCGAGTCATTACATGGTAAAGGACGATGCATTATCA(SEQ ID NO:166)
下表3中显示全部上述5种突变体的总结：
表3：用于表位绘制的人/小鼠CCR6杂合突变体的总结
N端
hsCCR6–SEQ ID NO:71,mmCCR6–SEQ ID NO:72,hsCCR6/mmECL1-SEQ ID NO:13,hsCCR6/mmECL2–SEQ ID NO:15,hsCCR6/mmECL3–SEQ ID NO:17,hsCCR6/mmN-term–SEQ IDNO:168,mmCCR6/hsN-term–SEQ ID NO:170.
流式细胞术
使用流式细胞术评估MAb与CCR6转染的CHO细胞的表面结合。将2×105个细胞分配在96孔V底平板中，并且以1300转/分钟离心三分钟。将细胞收集并且在FACS缓冲液中以50μl体积与终浓度10μg/ml的适宜mAb温育。将细胞在冰上温育30分钟，洗涤两次并重悬于50μl按1/200在FACS缓冲液中稀释的PE标记的第二抗体中。将细胞在冰上温育15分钟，洗涤一次并重悬于400μl FACS缓冲液中，并且在FACS仪(Cyan,Beckman Coulter InternationalS.A.,Nyon,瑞士)上在通道FL-2中分析。图4中的FACS分析显示，CCR6的小鼠-人杂合突变体在细胞表面上正确表达，因为全部转染子均由商业抗小鼠或抗人CCR6抗体识别。如图4中所示，嵌合4H11mAb识别含有人N端区域的全部杂合突变体(图4A、D、E和F)，而它不与含有小鼠N端区域的嵌合构建体结合(图4C)，从而显示人CCR6N端区域是CCR6和嵌合4H11mAb之间相互作用必需的。
为了鉴定CCR6N端区域上对嵌合4H11mAb的结合重要的关键残基，生成N端区域内部的两个其他突变体。
在CCR6N端区域中产生小鼠-人杂合突变体
目标是将小鼠CCR6(mmCCR6)的N端序列内部的两个小区域(“区段”)替换为它们的人类(hsCCR6)对应物，并且通过FACS评价嵌合4H11抗体对这些杂合构建体的结合活性。
鉴定了两个不同位置并命名为区段1(从氨基酸3至11)(mmCCR6)和区段2(从氨基酸8至16)。称作mmCCR6区段1hsCCR6的第一突变体对应于这样的mmCCR6序列，其中氨基酸3至11由hsCCR6序列的氨基酸21至27替换。称作mmCCR6区段2hsCCR6的第二突变体对应于这样的mmCCR6序列，其中氨基酸8至16由hsCCR6序列的氨基酸29至35替换。
对于突变体“区段1”，使用mmCCR6作为模板(GSD363a)和引物GlnPr2188(含有hsCCR6序列和NHeI限制性位点)和引物GlnPr2189(含有终止密码子和XhoI限制性位点)，通过PCR，将mmCCR6序列替换为hsCCR6序列。
对于突变体“区段2”，使用mmCCR6作为模板(GSD363a)，通过融合PCR，将mmCCR6序列替换为hsCCR6序列。引物GlnPr2190(含有起始密码子和NHeI限制性位点)和引物GlnPr2191(含有hsCCR6序列)用来产生第一产物。同时，引物GlnPr2192(含有hsCCR6序列)和引物GlnPr2193(含有终止密码子和XhoI限制性位点)用来产生第二产物。已知两种PCR产物具有27bp重叠，使用它们作为第二轮PCR的模板，两个最外侧引物为GlnPr2190(含有起始密码子和NHeI限制性位点)和GlnPr2193(含有终止密码子和XhoI限制性位点)。
对于两个突变体(“区段1”和“区段2”)，使用单一限制性位点NheI和XhoI，将PCR产物插入pT1载体(GSD980)。随后将DNA转化入大肠杆菌细菌并铺在氨苄青霉素平板上。次日，每种突变体选择4个克隆，提取它们的DNA并送至Fasteris供测序。基于测序结果，每种突变体选择一个克隆，对于突变体pT1-mmCCR6区段1hsCCR6，选择GSA32，并且对于突变体pT1-mmCCR6区段2hsCCR6，选择GSA33。
CHO细胞的瞬时转染
使用PEI试剂，用mmCCR6突变体转染CHO细胞。为此目的，转染前当日，将细胞分瓶以获得1x 106个细胞/mL的细胞密度。在转染当日，将细胞离心并重悬于5mL转染培养基(来自Gibco的Opti-MEM)中，直至细胞密度为2x106个细胞/mL(必需离心10x 106个细胞)。添加12.5μg DNA至250μL 150mM NaCl。平行地，添加25μg PEI至250μL 150mM NaCl。随后，将两种溶液混合并在室温温育10分钟以允许复合物形成。将DNA混合物倾倒于细胞上并且将细胞在37℃在摇床(105转/分钟，5％CO2)上温育4-5小时。向细胞添加5mL生长培养基(含有4mM谷氨酰胺的来自Lonza的Power CHO 2)以达到1x 106个细胞/mL的最终密度。最后将细胞在摇床(37℃，105转/分钟，5％CO2)上温育4天，之后在FACS上分析。
来自图5的结果显示，嵌合4H11与小鼠CCR6受体中含有人区段1的突变体1结合，但不与人CCR6受体中由人区段2序列组成的突变体2结合。因此，4H11的表位位于CCR6受体的N端区域内部，并且更精确地位于包含位置18处Phe和位置16处Glu之间的9个残基的序列中。
下表4中显示N端人/小鼠杂合构建体的总结。
表4：用于表位绘制的人/小鼠杂合N端CCR6序列的总结
hsCCR6N端序列–SEQ ID NO:172、mmCCR6N端序列–SEQ ID NO:174、突变体mmCCR6区段1hsCCR6–SEQ ID NO:180、突变体mmCCR6区段2hsCCR6–SEQ ID NO:185。
实施例6：小鼠单克隆抗体4H11的人源化
此处描述了抗人CCR6小鼠抗体4H11的人源化，所述人源化包括选择人接纳体构架、回复突变和基本上保留和/或改善移植有人CDR的接纳体构架结合特性的突变。
设计再塑造的可变区
同源性匹配用来选择人接纳体构架以移植4H11CDR。数据库，例如，来自人和小鼠免疫球蛋白基因座的种系可变基因数据库(IMGT数据库，上文)或VBASE2(Retter I等人,(2005)Nucleic Acids Res.33,数据库专刊D671-D674)或Kabat数据库(Johnson G等人,(2000)Nucleic Acids Res.28:214-218)或出版物(例如，Kabat EA等人,上文)，可以用来鉴定鼠重链V区和轻链V区(分别是SEQ ID NO:7和8)所属的人类亚家族并且确定最佳配合的人种系构架以用作接纳分子。待用作接纳体的这些亚家族内部的重链可变序列和轻链可变序列(VH和VL)的选择可以基于序列同源性和/或CDR1区和CDR2区的结构的匹配，以帮助保留移植后六个CDR的适宜的相对呈递作用。
例如，使用IMGT数据库显示了4H11重链可变结构域构架和人重链可变结构域亚家族3成员之间的良好同源性。对以下种系序列观察到CDR序列和构架序列的最高同源性和同一性：IGHV3-11*04(SEQ ID NO:77)、IGHV3-11*01(SEQ ID NO:78)、IGHV3-48*03(SEQ IDNO:79)、IGHV3-23*04(SEQ ID NO:80)和IGHV3-66*04(SEQ ID NO:81)，前述序列全部对完整序列直至CDR3具有74％以上的序列同一性。IGHV3-11*04和IGHV3-11*01显示76％序列同一性，而IGHV3-48*03和IGHV3-23*04显示75％的序列同一性。选择IGHV3-23*04作为VH构架，原因在于其稳定性。
使用相同的方法，4H11轻链可变结构域序列显示与人轻链可变结构域κ亚家族2的成员良好同源。对以下种系序列观察到CDR序列和构架序列的最高同源性和同一性：IGKV2-30*02(SEQ ID NO:82)和IGKV2-30*01(SEQ ID NO:83)显示出最高同一性，分别是82％和81％，紧随其后的是IGKV2D-30*01(SEQ ID NO:84)、IGKV2-29*02(SEQ ID NO:85)和IGKV2-29*03(SEQ ID NO:86)组成的另一个群组，前述序列均显示78％以上的序列同一性。
作为人源化过程的起点，选择人IGHV3-23*04(SEQ ID NO:80)和IGKV2-30*02(SEQID NO:82)可变结构域作为4H11CDR的接纳体。制备了人γ1同种型的第一人源化抗体(参见下文)。该抗体包含人-小鼠杂合重链可变结构域和人-小鼠杂合轻链可变结构域。杂合重链可变结构域基于人重链可变结构域IGHV3-23*04，其中将种系CDR1和CDR2分别地替换为4H11重链CDR1和CDR2。从上文提到的IMGT检索中鉴定到与人接纳体构架最佳匹配的JH区段序列。所产生的人-小鼠杂合重链可变序列具有人IGHV3-23*04构架区、4H11小鼠CDR和最佳匹配的JH区段。类似地，人-小鼠杂合轻链可变结构域具有人IGKV2-30*02构架区、4H11小鼠CDR和与人接纳体最佳匹配的JK。为了在人接纳体构架上容纳CDR，通过将人类残基置换成小鼠残基，修饰关键位置。这个过程称作回复突变并且是单克隆抗体人源化中最不可预测的过程。必须从小鼠抗体鉴定并选择关键构架残基，其中所述关键构架残基需要留存以保留亲和力，而与此同时最大限度减少人源化抗体中的潜在免疫原性。
为了鉴定可能影响大部分CDR构象和/或可变结构域间堆积的残基，使用以自动化模式设置的结构同源性-建模服务器SWISS-MODEL(Arnold K等人,(2006)Bioinformatics,22(2):195-201；http://swissmodel.expasy.org)，计算可变结构域的人-小鼠杂合VH-VL对的3D模型。该模型分析允许基于位置对CDR区和/或重链-轻链可变结构域堆积的推定性影响，选择位置的子集。这个位置子集由可变重链位置24和49以及可变轻链位置36和46(Kabat编号)组成。
新设计的可变结构域在本文中称作SEQ ID NO:75的重链可变结构域VH1并称作SEQ ID NO:38的轻链可变结构域VL1。包含VH1和VL1的第一人源化抗体在本文中缩写为VH1/VL1抗体。
第一人源化抗体原型的产生
VH1和VL1的编码性DNA序列(cDNA)以scFv样式由GENEART AG(雷根斯堡，德国)合成，因而允许单一cDNA序列涵盖两个可变结构域(SEQ ID NO:167)。通过PCR从这个scFv构建体回收各个可变结构域cDNA，并且使用PCR装配技术，在其相应的恒定结构域cDNA序列上游进一步装配。最后，在独立的载体中连接完整的重链cDNA和轻链cDNA，所述载体基于携带CMV启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号的改良型pcDNA3.1载体(Invitrogen,CA,美国)。轻链特异性载体通过在κ轻链恒定结构域cDNA之前使用BamHI和BsiWI限制性酶位点连接目的cDNA的轻链可变结构域，允许表达人κ同种型轻链；而重链特异性载体经工程化以允许使用BamHI和SalI限制性酶位点，在编码人IGHG1CH1、IGHG1铰链区、IGHG1CH2和IGHG1CH3恒定结构域的cDNA序列之前连接目的cDNA的重链可变结构域。在重链表达载体和轻链表达载体中，分泌受含有BamHI位点的小鼠VJ2C前导肽驱动。BsiWI限制性酶位点存在于κ恒定结构域中；而SalI限制性酶位点存在于IGHG1CH1结构域中。
通过将等量的重链载体和轻链载体使用聚乙烯亚胺(PEI,Sigma,Buchs,瑞士)共转染入适应悬浮培养的HEK293-EBNA1细胞(目录号：CRL-10852)，瞬时产生VH1/VL1抗体(具有重链SEQ ID NO:173和轻链SEQ ID NO:30)。一般地，用DNA-PEI混合物转染密度为0.8-1.2百万个细胞/ml的100ml悬浮细胞，所述混合物含有50μg编码重链的表达载体和50μg编码轻链的表达载体。将编码抗体基因的重组表达载体引入宿主细胞时，通过进一步培养宿主细胞4至5天时间产生抗体，以允许向培养基中分泌(EX-CELL 293，HEK293无血清培养基；Sigma,Buchs,瑞士，补充有0.1％普兰尼克(Pluronic)酸、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素)。
使用重组蛋白A流线介质(GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)，将VH1/VL1抗体从无细胞上清液纯化并且在分析之前缓冲交换成磷酸盐缓冲盐水。
表达人CCR6的CHO细胞上的细胞ELISA
如实施例1中所述那样生成人CCR6转染的CHO细胞。为了检测人源化候选物与CHO细胞中表达的CCR6的相互作用，开发一种细胞ELISA。简而言之，将96孔微量滴定板(Costar,美国；分销商VWR AG,Nyon,瑞士)用PBS中1μg/ml的100μl聚D赖氨酸(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)包被并在4℃温育过夜。次日，洗涤平板并将表达CCR6的CHO细胞以1300转/分钟离心3分钟并且按1x 106个细胞/孔在补充有10％FBS(PAALaboratories,Pasching,奥地利)、2mM L-谷氨酰胺(Lonza,Leuven，比利时)、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素(Biochrom AG,柏林，德国)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM,PAALaboratories,Pasching,奥地利)中铺种在37℃，5％CO2过夜。次日，将细胞在室温与各种浓度的(范围从10至0.0137μg/ml)人源化4H11候选物温育一小时。在温育细胞后，将样品用含有10％FCS的DMEM洗涤3次并且用含有4％PFA(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)的50μl PBS在室温固定15分钟。将细胞用含有2％BSA(牛血清白蛋白,PAALaboratories,Pasching,奥地利)的PBS洗涤，并用200μl相同的缓冲液在室温封闭1小时。将样品与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人Ig Fc片段特异性HRP(JacksonImmunoResearch Europe Ltd,Newmarket,UK)温育。将细胞用含有2％BSA的PBS洗涤5次，并将平板与TMB底物(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)温育以显示抗体结合作用。用微量平板读数仪(Biotek,美国；分销商：WITTEC AG,Littau,瑞士)读取吸光度。
从小鼠残基回复突变成人类残基
由于VH1/VL1抗体导致与嵌合抗体VH1和VL1可比较的结合作用，所以使用作为进一步诱变的起点。为了减少4H11的潜在免疫原性，通过将VH中位置24和49处和VL中位置36和46处的小鼠构架残基回复突变成人类残基，设计其他人源化候选物。额外的变体包含CDRH2中位置62处的保守突变，其中小鼠残基苏氨酸由人类残基丝氨酸置换。
抗体表达和纯化遵循上文描述的方法。通过如先前所描述的细胞ELISA测定人源化抗体候选物的结合作用。
图6显示人源化变体当中，VH5/VL1抗体在表达人CCR6的CHO上显示了相似或比其他候选物更好的结合作用。类似地，图7显示，VH5/VL1抗体在Ab Hunter抗CCR6生物测定法上展示了相似或比其他候选物更好的抑制性功能。另外，VH5(SEQ ID NO:37)与人类构架IGHV3-23*04(SEQ ID NO:80)具有最高的同一性，序列同一性为89.5％，从而产生较低的免疫原性风险。
依据差示扫描量热法的所选择人源化抗CCR6抗体的热稳定性
使用差示扫描量热法(DSC)测量人源化抗体的热稳定性。单克隆抗体熔化特征是其同种型的特征(Garber E和Demarest SJ(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.355:751-7)，然而可以甚至在全长IgG的背景下容易地鉴定FAB片段的中点熔化温度。FAB部分的这种中点熔化用来监测人源化候选物的单克隆稳定性。
在VP-DSC示差扫描微量量热计(GE Healthcare Europe GmbH)上实施量热测量。细胞体积是0.128ml，加热速率是200℃/小时，并且过压保持在65p.s.i。全部抗体均以PBS(pH 7.4)中1mg/ml的浓度使用。通过与已经从中省略抗体的含有相同缓冲液的一式两份重复样品比较，估计抗体的摩尔热容。使用标准程序分析部分摩尔热容和熔化曲线。在软件Origin v7.0中使用非双态模型进一步分析之前，温度记录图经基线修正和浓度归一化。
人源化变体VH5/VL1FAB片段在79.4℃展示了单一转变，形状和幅度与通常对紧凑折叠的Fab片段观察到的协同性解折叠一致，这表明工程化过程成功保留FAB稳定性。总体上，人源化变体显示良好的热稳定性。
表5：人源化的抗人CCR6抗体
上表中所述的H5/L1抗体设计为IgG1样式并且还设计为铰链区稳定化的人IgG4以产生无细胞毒性的抗CCR6人源化抗体。
实施例7：
在来自人和食蟹猴物种的CCR6可溶性N端区域上测试4H11人源化候选物的结合活性
由于嵌合4H11的表位定位于CCR6N端区域，所以生成与这个N端片段相对应的可溶性肽并用来评价4H11VH5/VL1IgG4HS候选物在人类物种和食蟹猴物种中的亲和力。如下生成可溶性N端肽区域：
表达人和食蟹猴CCR6N端和IgG1同种型的人Fc的可溶性融合构建体。
克隆人CCR6N端的可溶性融合构建体：
在LifeTechnology(Carlsbad，CA)订购了编码人CCR6N端的可溶性融合构建体的DNA。通过首先使信号肽与人CCR6的胞外N端(Swissprot条目P51684中的氨基酸1至47)融合，设计该氨基酸构建体。如SEQ ID[正确的编号，参见人CCR6-Fc]中所示，将这个构建体借助修饰的甘氨酸接头(GGGGT)与人IgG1同种型的Fc部分连接(Swissprot条目P01857中的氨基酸104至330)。GeneArt将这种氨基酸反向翻译成DNA序列，并且在编码融合蛋白的可读框5’连接NheI限制性位点和Kozak序列及3’连接XhoI限制性位点。将这个构建体克隆在质粒13ABRC6P中并发送至Glenmark。
使用NheI/XhoI切割质粒13ABRC6P，并将插入物克隆到pGLEX18(表达盒在人CMV启动子和oriP元件控制下的Glenmark专利载体)的主链，其中将所述主链使用相同的酶在MCS中切割并用CIP处理以防止重新环化。所得到的构建体命名为pGLEX18-hsCCR6-Nter-Fc并通过测序证实(Fasteris,日内瓦,瑞士)。
克隆食蟹猴融合构建体的程序是相似的。在LifeTechnologies订购的融合构建体仅在食蟹猴CCR6的胞外N端(Swissprot条目G7MR72的氨基酸6至52)不同并且克隆在质粒GeneArt序列#31中。最终的构建体命名为pGLEX18-cynoCCR6-Nter-Fc并通过测序证实(Fasteris,日内瓦,瑞士)。
表达：
在使用150ml培养基的1L Schott瓶中使用聚乙烯亚胺(Polyplus-transfection,Illkirch,法国)，用表达载体转染HEK293-EBNA悬浮细胞。为此目的，将指数生长的细胞以密度8E6个细胞/mL接种在75mL OptiMEM培养基(#31985-047,Invitrogen)中。将DNA复合物按重量比3(μg/μg)添加至细胞。细胞悬液中的DNA终浓度是2.5μg/mL。在37℃振摇(200转/分钟)下温育5小时后，添加75mL新鲜培养基至细胞悬液。随后，将细胞在振摇的平台上在37℃，5％CO2和80％湿度温育5天直至收获。使用0.2μm滤器，澄清细胞的上清液，并且使用蛋白A纯化蛋白质。
SEQ ID NO:188[人CCR6-Fc]
METDTLLLWVLLLWVPGSTGMSGESMNFSDVFDSSEDYFVSVNTSYYSVDSEMLLCSLQEVRQFSRLGGGGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:189[食蟹猴CCR6-Fc]
METDTLLLWVLLLWVPGSTGMSGESMNFSDVFDSSEDYFASVNTSYYTVDSEMLLCTLHEVRQFSRLGGGGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ELISA：
进行结合ELISA以测试4H11VH5/VL1IgG1和4H11VH5/VL1IgG4HS抗体对来自人类物种和食蟹猴物种的CCR6N端区域组成的肽的反应性。简而言之，将96孔微量滴定板(Costar,美国；分销商VWR AG,Nyon,瑞士)用PBS中2μg/ml的100μl重组人和食蟹猴N端肽-Fc包被。将平板在4℃温育过夜并随后用PBS 2％BSA(牛血清白蛋白，PAA Laboratories,Pasching,奥地利)在室温(RT)封闭1小时。移除封闭液并添加多种浓度的4H11VH5/VL1IgG1和4H11VH5/VL1IgG4HS。将平板在室温温育1小时，随后用PBS 0.01％Tween-20(Sigma-Aldrich ChemieGmbH,Buchs,瑞士)洗涤六次，并加入山羊抗人Ig F(ab′)2片段特异性HRP(JacksonImmunoResearch Europe Ltd,Newmarket,UK)。在洗涤后，将平板与TMB底物(Bio-RadLaboratories AG,Reinach,瑞士)温育以显示抗体结合作用。通过添加2M H2SO4终止反应，并且在Synergy HT2分光光度计(Biotek,美国；分销商：WITTEC AG,Littau,瑞士)上在450nM读取光密度(OD 450nM)。图8显示4H11VH5/VL1IgG1和4H11VH5/VL1IgG4HS抗体类似地识别与人类物种(图8A)和食蟹猴物种(图8B)的CCR6N端区域相对应的N端肽。
通过表面等离子体共振(SPR)的动力学结合亲和力常数：
以4H11VH5/VL1IgG4hs抗体作为分析物，对Fc融合的huCCR6N端肽和食蟹猴CCR6N端肽测量动力学结合亲和力常数(KD)。为了比较，使用4H11VH5/VL1IgG1抗体和嵌合4H11抗体进行相同的测量。室温在BIAcore2000(GE Healthcare-BIAcore,GE Healthcare EuropeGmbH,Glattbrugg,瑞士)上实施测量，并使用双价分析物动力学亲和力模型，以BiaEvaluation软件(BIAcore；v4.1，GE Healthcare Europe GmbH)分析。
通过注射35μl 1:1N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(v/v；5μl/分钟流速；在流路1和2上)，活化CM5研究级传感芯片(GEHealthcare Europe GmbH；参考号BR-1000-14)。将Fc融合的人或食蟹猴CCR6N端肽在乙酸盐缓冲液pH 4.5(GE Healthcare Europe GmbH，BR-1003-50；pI以下一个pH单位)中稀释至终浓度25nM并且随后通过在流路1和2上注射20μl(5μl/分钟)，固定在之前活化的CM5传感芯片上；这对应于大约300个响应单位(RU)。随后通过注射35μl乙醇胺溶液(5μl/分钟)，使偶联人或食蟹猴CCR6N端肽的CM5传感芯片失活。最后，注射两次3M MgCl2溶液(GEHealthcare Europe GmbH，参考号BR100839)以释放未交联的Fc-融合肽。
为了测量亲和力，将1x PBS缓冲液中储存的重组4H11抗体稀释于HBS-EP缓冲液(GE Healthcare Europe GmbH，参考号BR-1001-88；0.01M HEPES，0.15M NaCl，EDTA 3mM，0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)中，并且按不同的浓度(3.8nM至1μM)在流路1和2(流路1用作参照)上以30μl/分钟流速注射4分钟，随后是在运行缓冲液中的10分钟解离时间。在每个结合事件后，用3M MgCl2令表面再生10秒(30μl/分钟流速)。
用双价分析物模型最佳拟合量值(传感图：fc2-fc1)。测量包括参比用零浓度样品。这个模型将结合数据对两个序贯反应拟合，导致确定二个平衡解离常数集合并且随后确定两个KD值：KD1和KD2。用来测定动力学数据的模仿IgG与其膜结合型靶之间在体内出现的相互作用的样式允许增加表观亲和力的亲合力。
Chi2值表示在每个点处实验数据和参考数据之间的平方差和；而残差曲线表示拟合中每个点的实验数据和参考数据之间的差异。Chi2和残差值均用来评价实验数据和个体结合模型之间拟合的质量。
图9显示4H11VH5/VL1IgG4hs抗体识别Fc融合的人类N端肽和食蟹猴N端肽，KD值分别为1.56nM和4.67nM。
抑制CCL20诱导的经嵌合人-小鼠CCR6构建体转染的BAF细胞移行：
如图8和图9中所示，4H11VH5/VL1IgG4HS特异性识别CCR6受体的N端部分。为了进一步探索CCR6N端区域的生物学功能，在阻断性抗小鼠CCR6或4H11VH5/VL1IgG4HS存在下使用经含有人N端区域的杂合小鼠CCR6或含有小鼠N端区域的人CCR6转染的BAF细胞。根据实施例3中描述的方案评估一种移行测定法。来自图10的结果显示，4H11VH5/VL1IgG4HS能够抵消人CCL20介导的经含有小鼠N端区域的人CCR6受体转染的BAF细胞移行，但是不抵消鼠CCL20介导的经含有小鼠N端区域的人CCR6受体转染的BAF细胞移行。因此，这种抗体特异性阻断由CCR6N端区域介导的生物学功能。作为对照，阻断性大鼠抗小鼠CCR6抗体(R&DSystems，克隆140706)以终浓度10μg/ml使用。
抑制CCL20-CCR6相互作用：
为了确定4H11VH5/VL1IgG4HS是否通过直接抑制CCL20-CCR6相互作用抵消CCR6介导的生物学功能，建立一种使用流式细胞术方案的测定法。简而言之，将CCR6转染的BAF细胞计数并且在含有0.1％叠氮化物的FACS缓冲液中按1*106个细胞/ml稀释。随后将100μl的这些细胞在4℃与多种浓度的稀释于含0.1％叠氮化物的FACS缓冲液中的4H11VH5/VL1IgG4HS温育20分钟。在温育后，将细胞离心和洗涤2次并且与固定浓度(0.5μg/ml)的稀释于含0.1％叠氮化物的FACS缓冲液中的重组CCL20(R&D Systems)温育20分钟。随后，使用生物素酰化的抗人CCL20(R&D Systems，克隆BAF360)，随后使用分别按1μg/ml和1/100稀释于FACS缓冲液+0.1％叠氮化物中的别藻蓝蛋白(APC)-标记链霉亲和素检测CCL20。将细胞在FACS缓冲液，0.1％叠氮化物中洗涤两次并且通过流式细胞术分析样品。在使用嵌合IgG1同种型对照作为100％荧光活性的条件下，考虑荧光信号时计算CCL20与CCR6结合的相对百分数。图11显示与同种型匹配的对照相比，4H11VH5/VL1IgG4HS以剂量依赖性方式显著地减少CCL20与CCR6受体结合的信号传导。此外，4H11VH5/VL1IgG4HS在低浓度(低于0.5μg/ml)仍有活性。
实施例8：
评价双价和单价4H11VH5/VL1的结合潜力及中和潜力。
在结合测定法中测试双价和单价VH5/VL1mAb
使用人CCR6全长蛋白转染的BAF细胞，遵循实施例3中描述的方案，通过流式细胞术评价双价VH5/VL1IgG1抗体(SEQ ID NO:10和30)和单价VH5/VL1抗体(SEQ IDNO:218、219和220)的结合活性。在该测定法中，将转染的细胞与多种浓度的两种抗体(范围从3至0.01μg/ml)温育。使用按1/200稀释的抗人H+L-藻红蛋白-PE(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)作为第二抗体以检测双价IgG1抗体分子和单价抗体分子。图12显示IgG1抗体和VH5/VL1抗体均以剂量依赖性方式识别细胞表面上的CCR6。但是，双价VH5/VL1抗体与单价片段相比，展示更好的结合特征，前者显示高于后者的最大结合活性。
在CCL20介导的移行生物测定法中测试双价和单价VH5/VL1mAb。
为了评价及比较单价VH5/VL1和双价VH5/VL1IgG1抗体的中和有效性，遵循实施例3中详述的方案，将两种分子在趋化测定法中在不同的浓度(范围从50至0.4μg/ml)测试。如图13中所示，与同种型照对相比，测试的两种抗体均显示细胞移行减少，甚至单价VH5/VL1抗体与双价样式相比也显示减少的活性。
总之，来自图12和图13的结果显示，作为单价抗体，VH5/VL1仍有活性，尽管如与双价分子相比，结合作用和功能效应减少。这些观察结果支持使用VH5/VL1作为能够与多于一种抗原结合的抗体(如双特异性抗体)的组分。
实施例9：
人源化VH5/VL1抗体的工程化
亲和力成熟
通过噬菌体展示法进一步工程化VH5/VL1对人CCR6N端区域的亲和力。使用噬菌体展示使抗体亲和力成熟的技术是已知的(Benhar I(2007)Expert Opin Biol Ther.,7(5):763-79)。VH5/VL1抗体基因序列设计为scFv片段供展示，并且通过位点定向诱变引入多样性。
建立两个不同的噬菌体文库：第一噬菌体文库在CDR-H2中多样化(在Kabat残基：52、53、56和58处使用NNK密码子)，而其他CDR不改变，并且第二噬菌体文库在CDR-L3中多样化(在Kabat残基：92、93和94处使用NNK密码子，而通过混合物五种不同的寡核苷酸，使Kabat残基96对Leu；Phe；Ile；Tyr和Trp多样化)，其他CDR不改变。所得到的亲和力成熟文库具有>2x 10e7的多样性，并且使用生物素酰化的抗原(与人IgG1Fc片段融合的人CCR6N端区域)和链霉亲和素捕获法进行三轮选择。抗原浓度在三个轮次之间降低(轮次1：50nM，轮次2：5nM，和轮次3：0.5nM)，并且增加采用非生物素酰化抗原的竞争步骤以选择高亲和力变体(轮次2和轮次3中1μM)。通过表面等离子体共振(SPR)对亲和力成熟的scFv候选物评价融合蛋白上改善的结合解离速率(图14)。来自CDR-H2文库的变体不显示解离速率改善或仅显示中度的解离速率改善，而来自CDR-L3文库变体显示中度至明显的解离速率改善。
一个优选的CDR-H2变体是携带置换N53T和I56R(Kabat编号)的VH5/VL1-H2-B3scFv克隆(图14A)。与亲本对照相比，这个变体具有中度的解离速率改善，具有下述增加的益处：移除亲本CDR-H2序列中Kabat位置53和54处存在的推定性脱酰胺化位点。
两个优选的CDR-L3变体因其解离速率改善超过亲本对照而鉴定：变体VH5/VL1-L3-C9和VH5/VL1-L3-G8(图14B)。VH5/VL1-L3-C9具有以下CDR-L3置换：S92T、H93Y和V94Y(Kabat编号)，而VH5/VL1-L3-G8序列仅在位置94处不同于VH5/VL1-L3-C9，并且经如下置换：S92T、H93Y和V94L(Kabat编号)。
CDR-H2和CDR-L3中从这些改进的克隆所鉴定的全部优选的氨基酸变化用来形成如下文描述的新FAB片段和抗体。
移除CDR-L1中的推定性脱酰胺化基序
VH5/VL1的CDR-L1在Kabat位置28和29处具有脱酰胺化基序。采用几种置换以废除其共有序列。产生了在CDR-L1中的位置N28T、N28S、N28Q、N28E和G29A处置换的VH5/VL1FAB片段。在CDR-L1位置28处的全部置换均损害结合作用，如通过人或食蟹猴融合蛋白上的SPR所判断(图15)；仅G29A不影响VH5/VL1对人CCR6的亲和力或其FAB稳定性(图16)。
设计
从噬菌体展示筛选中鉴定的CDR-L3置换和CDR-H2置换用来产生工程化的VH5/VL1抗体及其片段，所述抗体及其片段还包含前述的G29A修饰，因而移除位于CDR L1的脱酰胺化位点。样式包括人FAB片段、人IgG1抗体、人单价抗体(PCT公开号WO 2012/131555和WO 2014/049003)和铰链区稳定化的IgG4抗体，如图17中所述。FAB构建体用于人或食蟹猴CCR6融合蛋白偶联到传感芯片时，通过SPR测定KD。
使用添加CDR-L1G29A修饰的优选的CDR-L3文库scFv克隆VH5/VL1-L3-C9和VH5/VL1-L3-G8的可变结构域，产生第一对工程化的FAB。与相同实验集合中作为对照使用的亲本FAB相比，本文中称作VH5/VL1-C9-G29A和VH5/VL1-G8-G29A的两种FAB显示出KD值改善约二十倍(图18)。注意，与先前测量的48nM相反(实施例7)，亲本FAB具有约20nM的KD值，所述差异由这组实验中融合蛋白的质量、所用抗原的质量变异更大而解释。
还产生第二对工程化的FAB，所述FAB涵盖与优选的CDR-H2置换(N53T和I56R)和CDR-L1G29A修饰组合的优选的CDR-L3置换(S92T、H93Y和V94Y或S92T、H93Y和V94L)。本文中称作VH5/VL1-B3C9-G29A和VH5/VL1-B3G8-G29A的FAB仅在CDR-H2中异于第一对FAB构建体并且显示KD值进一步改善两倍。VH5/VL1-B3C9-G29A和VH5/VL1-B3G8-G29A均对人CCR6的N端区域具有约0.5nM的KD值并且对食蟹猴CCR6的N端区域具有约1nM的KD值，这代表与亲本VH5/VL1FAB相比，对人CCR6的亲和力改善约40倍，以及对食蟹猴CCR6的亲和力改善约30倍。
实施例10：
亲和力成熟的VH5/VL1变体的阻断潜力改善。
为了评价VH5/VL1IgG1的亲和力成熟对趋化活性的影响，在使用全长人CCR6转染的BAF细胞的移行测定法中在多种浓度(范围从20至0.75μg/ml)测试处于双价IgG1样式或单价样式的四种工程化变体VH5/VL1。简而言之，将100000个细胞在亲和力成熟的变体存在下添加至HTS-96平板[Corning,Chemie Brunschwig AG,瑞士]的上室。Transwell的下室含有按照10ng/ml稀释于235μl BAF培养基(含有10％FCS(Amimed，由Bioconcept,Allschwil,瑞士分销)的RPMI-1640(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,巴塞尔,瑞士))中的重组人CCL20(R&D Systems)。在37℃，5％CO2温育4小时后，从下室和上室收获细胞并且使用Guava Easycyte HT(Millipore AG,Zug,瑞士)计数。作为阴性对照，无关的人IgG1抗体以20μg/ml使用。使用非亲和力成熟的双价VH5/VL1IgG1和单价VH5/VL1分子作为生物测定法中的参比。对于全部受测分子，通过下室中的细胞数目除以上室和下室中的细胞总数，计算移行率。抑制移行的百分数计算为对同种型对照所观察到的抑制移行的百分数。图19表明，对人CCR6-N端肽显示出增加的亲和力的VH5/VL1变体(如图18中所示的B3G8G29A和B3C9G29A)更有效地抑制表达CCR6的BAF细胞移行。四种工程化的变体显示高阻断潜力，甚至在低浓度(例如0.75μg/ml)时也是如此。有趣地，与亲和力成熟之前的单价VH5/VL1抗体相比，单价形式的亲和力成熟变体还显示增加的中和潜力。特别地，在低浓度时，与20μg/ml未工程化的单价VH5/VL1的抑制特征(为大约20％)相比，B3G8G29A和B3C9G29A突变体展示更高的抑制特征(大约35％)。
总之，来自图19的数据展示了在移行测定法中四个不同工程化的VH5/VL1变体的亲和力增加与其阻断潜力增加之间的直接关系。

Claims (15)

1.一种与CCR6结合的抗体或抗体片段，包含了含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1；和/或含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ IDNO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:254或SEQ ID NO:255的氨基酸序列的重链CDR2和/或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3；和/或包含了含有SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246或SEQ ID NO:256的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248或SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链CDR2和/或含有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:193的氨基酸序列的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含由SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:249组成的氨基酸序列或与任一所述重链可变区序列的非CDR区至少80％同一的序列，和/或其中抗体或抗体片段包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:253的氨基酸序列或与任一所述轻链可变区序列的非CDR区至少80％同一的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗体片段，其中至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR包含至少一个氨基酸修饰。
5.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或片段包含人重链恒定区和/或轻链恒定区并且其中人重链恒定区选自由IGHG1、非岩藻糖基化IGHG1和IGHG4组成的人免疫球蛋白。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗体片段，其中抗体是全长抗体、或抗体片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双体抗体、三体抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。
7.抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段与人CCR6结合并且结合至与权利要求1至6中任一项所述的抗体相同的表位。
8.可溶性人CCR6上的表位，其被权利要求1至7中任一项所述的抗体结合。
9.分离的核酸，其编码权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗体片段。
10.宿主细胞，其包含权利要求9所述的分离的核酸。
11.产生与人CCR6结合的抗体或抗体片段的方法，包括培养权利要求10所述的宿主细胞，从而表达核酸并产生抗体。
12.组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体片段和可药用载体。
13.免疫缀合物，其包含与治疗剂连接的权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体片段。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体片段，用作药物。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体片段，作为药物用于治疗选自以下的疾病：类风湿性关节炎、多发性硬化(MS)、银屑病、移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、COPD、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、SLE、舍格伦综合征、硬皮病、全身性硬化症、慢性肾脏疾病、肝纤维化、结核病、特发性肺纤维化、结核病诱导的肺纤维化、腹膜后纤维变性、肺纤维化、囊性纤维化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维变性(骨髓)、腹膜后纤维化、进行性大块性纤维化、肾源性系统性纤维化、关节纤维化、炎性肠病、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、动脉粥样硬化、移植排斥、中枢神经系统损伤、银屑癣、白血病或淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、动脉粥样硬化、肺癌和结肠癌。
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