CN105392885A

CN105392885A - 用于产生双等位基因敲除的方法和组合物

Info

Publication number: CN105392885A
Application number: CN201480034155.5A
Authority: CN
Inventors: 余波; J·W·拉瑞克
Original assignee: LARIX BIOSCIENCE LLC
Current assignee: LARIX BIOSCIENCE LLC
Priority date: 2013-07-19
Filing date: 2014-07-19
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2034-07-19
Also published as: US20150024500A1; CN105392885B; EP3022304A1; JP2016524918A; WO2015010114A1; EP3022304B1; EP3022304A4; JP6482546B2; US9663782B2

Abstract

本发明提供了利用CRISPR系统来破坏真核细胞中的靶基因以产生双等位基因敲除的方法和组合物。所述方法发现用于产生具有增强的ADCC活性的无岩藻糖基化抗体。

Description

用于产生双等位基因敲除的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2013年7月19日的美国临时申请SerialNo.61/856,579的优先权，所述申请的内容在此以其全文形式被援引加入本文。涉及的序列表、表格或计算机程序

序列表的正式文本以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与本说明书同时提交，其文件名为“LRX.0003_ST25.txt”，建立日期为2014年7月19日，大小为42千字节。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并在此以其全文形式被援引加入本文。

背景技术

已经表明基因敲除技术在生物研究中具有巨大的价值。通过同源重组的传统基因阻断技术是费力并且不可预测的过程。近年来开发的靶向基因组编辑更为有效的多，并可通过在染色体中的靶向双链断裂(DSB)来实现。该技术的示例利用了成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、锌指核酸酶(ZFN)或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)(EsveltandWang,Mol.Syst.Biol.,2013,9:641)。其中，CRISPR是最通用的基因组编辑工具，这是因为其借助于与基因组修饰位点互补的特异性RNA序列的靶向机制。CRISPR允许通过利用成簇的靶向RNA序列在多个位点进行基因组编辑。细胞中的DSB通过非同源末端连接(NHEJ)修复，在低频导致可能产生移码和灭活感兴趣基因的小插入或缺失(插入缺失)。

使用大多数方法，基因组编辑率是较低的，通常小于5％。评定基因组编辑、利用核酸酶分析(Transgenomic,Inc.,Omaha,NE)来检测双链体DNA错配或深度测序的最常用的方法不区分单等位基因或双等位基因突变。由于在单个步骤中产生双等位基因突变的可能性是可忽略不计的，一般要求两步骤(2步骤)序列基因组编辑。

治疗性抗体是在过去二十年开发的成功的新药物类别。FDA已批准了超过三十种重组治疗性抗体，用于治疗不同的疾病，包括癌症、病毒感染、器官移植排斥、类风湿性关节炎和其它自身免疫性病症。更多的治疗性抗体处于临床试验中，用于日益扩大的疾病种类。随着分子生物学的出现，在哺乳动物细胞中产生重组抗体已成为可能(N.Yamane-OhnukiandM.Satoh，mAbs，2009,1(3):230-236)。

针对可溶性因子(例如血管内皮生长因子或肿瘤坏死因子)的抗体治疗的目的仅仅在于通过免疫复合物形成来降低游离配体浓度。相比之下，当抗体治疗是针对细胞表面抗原时(如同通常在抗肿瘤免疫治疗中的情况)，目标通常是去除引起疾病的细胞本身。抗体依赖性细胞(介导)的细胞毒作用(ADCC)-一种对抗体靶向细胞的溶解性攻击，在淋巴细胞受体(例如，FcγRs)通过抗体的恒定区(Fc)结合时被触发，所述抗体在大多数情况下为免疫球蛋白亚类1(IgG1)。ADCC被视为是一些治疗性抗体的主要功能，虽然抗体具有多种治疗功能(例如，抗原结合、诱导凋亡、和补体依赖性细胞介导的细胞毒作用)(T.Shinkawa等人，J.Bio.Chem.，2003，278(5):3466-3473)。在ADCC中，自然杀伤(NK)细胞主要经由与NK细胞的FcγRIII受体的相互作用而识别抗体的恒定(Fc)区，然后激活细胞溶解和细胞凋亡。

Fc-FcγRIII相互作用对Fc糖基化极为敏感。非糖基化的(aglycosylated)抗体(例如，由非哺乳动物细胞系产生的那些)不能结合Fc受体(Leatherbarrow等人，Mol.Immun.，1985，22:407-15；Walker等人，Biochem.J.，1989，259:347-53；Leader等人，Immunology，1991，72:481-5)。另一方面，附接至Fc区的Asn297的糖链的岩藻糖基化降低了与FcγRIII的结合并且降低了体外ADCC活性(Shields等人，J.Biol.Chem.，2002，277:26733-40；Shinkawa等人，J.Biol.Chem.，2003，278:3466-73；Niwa等人，CancerRes.，2004，64:2127-33)。

大多数的哺乳动物免疫球蛋白被岩藻糖基化，包括由中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)产生的那些(Jefferis等人，BiochemJ.，1990，268:529-37；Raju等人，Glycobiology，2000，10:477-86)。岩藻糖经由α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)蛋白产生的α-1,6键附接至Fc核心区(Oriol等人，Glycobiology，1999，9:323-34；Costache等人，J.Biol.Chem.，1997，272:29721-8)。CHO细胞中Fut8基因的阻断/破坏可消除抗体的核心岩藻糖基化并可增大ADCC～100倍(Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioengin.，2004，87(5):614-622)。

已使用基因组编辑通过敲低/敲降或敲除Fut8等位基因来降低或消除FUT8活性。Imai-Nishiya等人已经披露了Fut8和GMD的双敲低，利用siRNA串联表达载体靶向这些基因并将其引入IgG1抗体产生CHO/DG4432-05-12细胞(BMCBiotechnology，2007，7:84；doi:10.1186/1472-6750-7-84)。为了产生双等位基因Fut8敲除CHO细胞，Yamane-Ohnuki等人披露了一种两步序列同源重组工艺(Biotech.Bioengin.，2004，87(5):614-622)来克服低频率的同源重组。类似地，Collingwood披露了一种靶向ZFN方法来敲除CHOK细胞中的两个Fut8等位基因，这是通过在致死量的小扁豆凝集素(LCA)存在的情况下连续培养来富集Fut8裸细胞来进行，利用了由LCA与岩藻糖的特异性结合所诱导的细胞毒性(WO2009/009086；L.Malphettes等人，Biotech.Bioengin.，2010，106(5):774-783)。

此外，可能希望产生其中除Fut8基因外的其它基因被部分或全部抑制的细胞系。因为基因组编辑率低，通常小于5％，因此可合理地假定通过单个crRNA位点产生双等位基因突变的可能性是可忽略不计的。可能必须要进行序列基因组编辑，以便获得双等位基因敲除。例如，Cong等人披露了在两个内源基因(EMX1和PVALB)和在同一EMX1基因的两个靶位点中成功的基因组编辑(Science，2013，339:819-823)。不过，当靶向EMX1基因中的2个原型间隔序列时，缺失效率仅为1.6％，并且没有报告双等位基因敲除。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种通过为真核细胞提供CRISPR系统在真核细胞中产生双等位基因敲除的方法，所述CRISPR系统包括核酸酶和与靶基因中的DNA间隔序列互补的至少两个靶向RNA。在一个实施例中，相同的tracrRNA可与多个不同的crRNA一起使用，并且许多crRNA可用单个tracrRNA组织。在一个实施例中，CRISPR系统包括至少三个或四个靶向RNA。在一个实施例中，多个CRISPR靶(crRNA靶)在相同的基因中。在一个实施例中，多个CRISPR靶在基因的相同外显子中。在一个实施例中，多个CRISPR靶在基因的500bp、450bp、400bp、375bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、或50bp内。在一个实施例中，真核细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施例中，哺乳动物细胞是CHO细胞、CHOS细胞、293细胞、NS0细胞、胚胎干细胞、或其衍生物、或抗体产生细胞或其衍生物。在另一实施例中，核酸酶是Cas变体。在另一个实施例中，Cas变体核酸酶是Cas9。在一个实施例中，靶向RNA由tracrRNA和crRNA构成。在另一个实施例中，tracrRNA和crRNA可由发夹RNA连接物连接。在另一个实施例中，靶基因是岩藻糖基转移酶。在另一个实施例中，靶向的岩藻糖基转移酶基因是Fut8，α-(1-6)-岩藻糖基转移酶。在另一个实施例中，靶基因是谷氨酰胺合成酶。在另一个实施例中，靶基因是二氢叶酸还原酶(DHFR)。在另一个实施例中，靶基因是唾液酸酶。

在另一个方面，本发明包括使用本发明的方法使Fut8敲除的哺乳动物细胞。在一个实施例中，哺乳动物细胞包括Fut8敲除细胞，所述Fut8敲除细胞在荧光标记细胞表面岩藻糖之后通过FACS对阴性荧光信号分离出来的。在一个实施例中，荧光标记包括与荧光素标记的小扁豆凝集素(LCA-FITC)的结合。

在另一方面，本发明包括使用本发明的方法使谷氨酰胺合成酶敲除的哺乳动物细胞。

另一方面，本发明包括使用本发明的方法使DHFR敲除的哺乳动物细胞。

另一方面，本发明包括使用本发明的方法使唾液酸酶敲除的哺乳动物细胞。

另一方面，本发明包括使用本发明的方法使其它靶基因敲除的哺乳动物细胞。

另一方面，本发明包括使用本发明的方法由使Fut8敲除的真核细胞产生的无岩藻糖基化蛋白。在一个实施例中，无岩藻糖基化蛋白是抗体。在另一实施例中，抗体是利妥昔单抗。

另一方面，本发明包括质粒，所述质粒包含编码Cas9蛋白的核苷酸，以及crRNA和tracrRNA中之一或两者，其中质粒是哺乳动物细胞表达载体，并且其中当crRNA和tracrRNA均存在时，它们可选地由发夹RNA连接物连接。在一个实施例中，质粒包括crRNA和tracrRNA中之一或两者，其中利用了能够靶向Cas9染色体位点的crRNA或tracrRNA的部分序列。在另一实施例中，crRNA由靶基因的至少两个原型间隔序列组成。在另一个实施例中，Cas9蛋白表达通过启动子进行表达。在另一实施例中，启动子是CMV启动子。在另一个实施例中，tracrRNA通过启动子进行表达。在另一实施例中，crRNA通过启动子进行表达。在另一个实施例中，通过发夹RNA连接物与tracrRNA连接的crRNA通过启动子进行表达。在另外的实施例中，tracrRNA启动子和crRNA启动子是人U6启动子。在另一个实施例中，质粒还包括抗生素抗性基因。在另一实施例中，抗生素是氨苄青霉素。

另一方面，本发明提供了一种方法，其中本发明的细胞被转染有至少一个含有Cas9的质粒。

另一方面，本发明提供了一种方法，其中本发明的细胞被转染有至少一个含有crRNA的质粒。

另一方面，本发明提供了一种方法，其中本发明的细胞被转染有至少一个含有通过发夹RNA连接物与tracrRNA连接的crRNA的质粒。

附图说明

图1A-C示意性地示出了Cas9介导的序列特异性DNA裂解：图1A示出了通常的CRISPR系统，其具有三个组成部分：Cas9蛋白和两个小RNA(crRNA和tracrRNA)；crRNA含有与靶向DNA互补的序列(间隔序列加上NGG)；tracrRNA含有与crRNA互补的序列；野生型Cas9导致双链DNA断裂，而Cas9-D10A导致单链DNA断裂。图1B示出了本发明的经修饰的CRISPR系统，其具有两个组成部分：Cas9蛋白以及结合crRNA和tracrRNA的序列的单个gRNA，其中gRNA含有与靶向DNA互补的序列和发夹结构。图1C示出了含有3个不同的靶向间隔区的crRNA的示意图；DR是指同向重复序列，而T1、T2、和T3是靶向序列。

图2A-B示出了Cas9介导的基因靶向系统的质粒图谱，哺乳动物细胞表达载体LB200和LB221；Cas9通过CMV启动子进行转录；tracrRNA通过人U6启动子进行转录。图2A示出了载体LB200。图2B示出了载体LB221，其中IRES-GFP盒被插在Cas9之后。

图3示出了Cas9介导的基因靶向系统的质粒图谱，哺乳动物细胞表达载体LB202a；DR-T1-DR的crRNA通过人U6启动子进行转录。

图4A-B示出了在引入靶向Fut8的CRISPR系统之前和之后在CHOS细胞上的岩藻糖的LCA-FITC染色。图4A示出了没有LCA-FITC染色的阴性对照CHOS细胞和在野生型CHOS细胞中具有LCA-FITC染色的阳性对照岩藻糖。图4B示出了在引入具有单个靶向RNA或crRNA的CRISPR系统之后在CHOS细胞上的岩藻糖的LCA-FITC染色。

图5A-C示出了在引入具有1-10个靶向RNA或crRNA的靶向Fut8的CRISPR系统之前和之后在CHOS细胞上的岩藻糖的LCA-FITC染色。图5A示出了没有LCA-FITC染色的阴性对照CHOS细胞和在野生型CHOS细胞中具有LCA-FITC染色的阳性对照岩藻糖。图5B示出了在引入具有一(1)到十(10)个靶向RNA或crRNA的CRISPR系统之后在CHOS细胞上的岩藻糖的LCA-FITC染色。图5C示出了在LCA-FITC染色之前和之后的CHOS细胞，以及从标记为2.123.3P的转染#5(三个靶向RNA)和标记为2.123.4P的转染#6(四个靶向RNA)的M2池克隆的细胞的LAC-FITC染色。

图6A-C示出了岩藻糖的LCA-FITC染色(图6A)；序列比对(图6B：Fut8外显子1-SEQIDNO:1；突变体1-SEQIDNO:2；突变体2-SEQIDNO:3；和突变体3-SEQIDNO:4)；以及从转染#5(三个靶向RNA)的M2峰分离出的克隆的转染率(图6C)。突变体1和3来自细胞系2.123-4，而突变体2来自细胞系2.123-6。从转染#5的M2峰分离的其它突变体细胞系是2.123-1、2.123-11、2.123-12、2.123-13、2.123-15、2.123-20、2.123-23、2.123-25、和2.124-6。

图7示出了在野生型CHOS细胞以及具有Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞中进行的利妥昔单抗(美罗华,Rituxan)和曲妥珠单抗(赫赛汀,Herceptin)的聚糖分析。

图8A-B示出了在野生型CHOS细胞以及具有Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞中所得的利妥昔单抗(Rituxan)和曲妥珠单抗(Herceptin)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。图8A示出了在野生型CHOS细胞以及具有Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞中所得的利妥昔单抗(Rituxan)的ADCC活性。图8B示出了在野生型CHOS细胞以及具有Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞中所得的曲妥珠单抗(Herceptin)的ADCC活性。

具体实施方式

本发明通过示例而非通过限制的方式进行阐述。应当指出，本文中提及一个/一种(“an”)或一个/一种(“one”)或“一些(some)”实施例并不必然指同一实施例，所有这样的提及意味着至少一个。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或(or)”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式的使用，例如“包括(includes)”和“包括(included)”，不是限制性的。

除非本文中另行规定，结合本发明所用的科技术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。这些术语的含义和范围应当是清楚的，不过，如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。

一般而言，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学以及杂交结合使用的术语及其技术是本领域公知且常用的。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据传统的方法进行，所述传统的方法是本领域公知的并且如贯穿本说明书所引用和讨论的不同的一般参考文献和更为特定的参考文献中所述。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。为了本发明可以更易于理解，下文定义了选定的术语。

本文所用的术语“抗体”广义地是指由四个多肽链(两个重(H)链和两个轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子、或任何功能性片段、突变体、变体、或其衍生物(保留了Ig分子的基本表位结合特征)，包括例如基本上由免疫球蛋白基因、免疫球蛋白基因的片段、杂合免疫球蛋白基因(通过组合来自不同动物的遗传信息而得)、或合成免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽，或单链抗体、Fab、F(ab)₂、scFv、dAB、VHH、骆驼抗体、或纳米抗体。所述突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施例在下文讨论。

在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个功能区CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个功能区CL组成。VH和VL区可被进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有称为框架区(FR)的更保守的区域。每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

本文所用的“分离抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的分离抗体)。不过，特异性结合CD20抗原的分离抗体对其它抗原例如来自其它种的CD20分子可能具有交叉反应性。此外，分离抗体可基本无其它细胞物质和/或化学物质。

本文所提及的术语“多核苷酸”意指2个或更多核苷酸的聚合形式，或者是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。术语包括单链形式和双链形式的DNA，但具体地是双链DNA。

本文使用的术语“分离的多核苷酸”应表示一种多核苷酸(例如，基因组的、cDNA、或合成来源，或其某一组合)，由于其来源，“分离的多核苷酸”不与在自然界中随之发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或一部分关联；可操作地连接至自然界不存在的多核苷酸；或在自然界中不作为较大序列的部分出现。

本文所用的术语“载体”意指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其指的是另外的DNA片段可连接入其中的环状双链DNA环。某些载体能够引导它们可操作地连接的基因的表达。所述载体在本文被称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体常常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。不过，本发明旨在包括可以发挥等同功能的此类其它形式的表达载体。在细胞内部，载体和/或质粒可在染色体外存在或整合到宿主细胞DNA中。

术语“可操作地连接(operablylinked)”是指其中所述的组成部分处于允许它们以其预期方式起作用的关系的并置。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式接合/连接，使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。“可操作地连接”的序列包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列，和以反式或在远处起作用以控制感兴趣基因的表达控制序列。本文所用的术语“表达控制序列”是指实现它们所连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和在需要时，增强蛋白质分泌的序列。所述控制序列的性质取决于宿主生物体而不同；在真核细胞中，一般所述控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工是必要的组成部分，并且还可以包括其存在是有利的其它组成部分，例如前导序列和融合伴侶序列(fusionpartnersequence)。

术语“将纯化DNA引入真核宿主细胞”或“转染”表示其中具有或没有伴随物质的细胞外DNA进入宿主细胞的任何过程。术语“经转染的细胞(celltransfected)”或“转染的细胞(transfectedcell)”表示细胞外DNA已被引入并因而包含细胞外DNA的细胞。DNA可能被引入细胞，使得核酸可复制作为染色体组成部分(chromosomalintegrant)或作为染色体外元件。本文所用的“启动子(promoter)”是指调节基因表达的核酸序列。

本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。应当理解，所述术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此类细胞的后代。由于突变或环境影响而在后续代中可能发生某些修饰，事实上这样的后代可能不与亲代细胞(母细胞)相同，但仍被包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。尤其是，宿主细胞包括真核细胞。

“真核细胞”是指任何哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞(来自真核生物)。作为非限制性实例，能够在细胞培养条件下维持并且随后被转染的任何真核细胞都将包括在本发明中。特别优选的细胞类型包括，例如，干细胞、胚胎干细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、293细胞、NS0细胞、COS、BHK21、NIH3T3、HeLa、C2C12、癌细胞、植物细胞、真菌细胞、以及原代分化细胞或未分化细胞。其它适合的宿主细胞对于本领域普通技术人员来说是已知的。

“感兴趣基因(geneofinterest)”或“转基因”优选地编码蛋白质(结构或调节蛋白)。本文所用的“蛋白质”一般是指具有多于约十个氨基酸的肽和多肽。蛋白质对于宿主可以是“同源的”(即，对于被利用的宿主细胞而言是内源的)、或“异源的”(即，对于被利用的宿主细胞而言是外来的)，例如由酵母产生的人类蛋白。可产生蛋白质为不溶性聚集物或为可溶性蛋白于细胞的胞质周围间隙或胞质中、或细胞外介质中。

标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以按照制造商的说明书或如本领域通常所完成、或如本文所述来进行。前述技术和程序可大体按照本领域所公知的传统方法和如贯穿本说明书所引证和讨论的不同通用和更具体的文献中所述来进行。说明性的方法披露于CurrentProtocolsinImmunology(编辑：Coligan,J.E.等人，JohnWiley&Sons,NY,NY,2001)，Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePubl.Assoc.Inc.&JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY,2001)，Sambrook等人(MolecularCloning，3^rdEd.,ColdSpringHarborLaboratory,Plainview，NY，2001)以及别处。

本发明的概述

本发明利用CRISPR系统以阻断/破坏真核细胞中的靶基因。更具体地说，系统瞬时表达Cas9、tracrRNA(单个或多个)、和多个crRNA，其靶向真核细胞例如CHO细胞、293细胞、NS0细胞、或任何抗体产生细胞中的感兴趣基因的多个外显子位点。相比于公开的CRISPR方法，本发明的系统的主要优点在于，它通过利用相同系统中的多个crRNA序列在一个步骤中特定敲除两个靶向等位基因。涉及CRISPR的大多数公开文献利用核酸酶分析/测定(TransgenomicInc.,Omaha,NE)或深度测序来评定基因组编辑率，并且不区分单等位基因或双等位基因突变。针对有效双等位基因基因组编辑的本发明方法用多个crRNA靶来靶向同一基因/外显子。不希望受任何特定理论的束缚，我们假定靶向多个crRNA位点将显著提高产生双等位基因敲除的可能性。确实，我们的结果显示，多个crRNA协同作用以产生1-5％的双等位基因敲除细胞。令人惊奇和出乎意料地是，最佳数目的crRNA(靶向RNA)产生4-5％的敲除频率并且进一步增加crRNA并不增加敲除频率。此外，令人惊奇和出乎意料的是，3-4个crRNA对于敲除频率远不止产生加性效应，尤其是当crRNA位点位于彼此接近时，例如，crRNA的靶序列在靶细胞DNA的500、450、400、375、300、250、200、150、100、或50bp内。对双等位基因敲除的频率的这种邻近效应也是令人惊奇和出乎意料的。

当靶向的DNA由Cas9切割(cleave)以产生双链断裂时，可通过用非同源末端连接(NHEJ)引入移码插入或缺失(插入缺失)来破坏/阻断感兴趣基因。当两个单链切割位点由单催化位点变体Cas9-D10A产生时，通过切割位点之间的缺失可破坏/阻断感兴趣基因。以前，Cas9系统已显示在多种哺乳动物细胞类型中产生靶向基因编辑(Mali等人，Science，2013，339:823-826；Cong,L.等人，Science，2013，339:819-823)。不过，由于取决于靶位点和细胞类型非同源末端连接率通常较低，先前的Cas9系统已不能在有效的单个步骤中选择在两个等位基因处无效的敲除细胞系。本发明描述了利用感兴趣基因中的多个靶向RNA位点在单个步骤中产生双等位基因敲除的方法和组合物。在其它实施例中，同时靶向一个以上的基因。

CRISPR系统适用于许多生物体中的基因组修饰。实际上，CRISPR系统被细菌和古细菌利用，以便通过RNA导引/介导的DNA降解来抵御噬菌体和质粒。外源DNA显然通过由一些CRISPR相关的(cas)基因编码的蛋白质而加工成小元件(～30bp长度)，然后所述小元件以某种方式被插入在前导序列附近的CRISPR基因座。称为间隔区的外来DNA的短片段被整合入基因组在CRISPR重复序列之间，并且用作过去暴露的‘记忆’。CRISPR重复序列的大小范围为24到48个碱基对。在II型CRISPR系统中，Cas9蛋白与共享互补序列的2个小的RNA(crRNA和tracrRNA)形成复合体。crRNA含有与DNA间隔序列互补的序列，并且帮助将Cas9-RNA复合体引导至靶向的外来DNA。可通过使crRNA和tracrRNA与发夹RNA连接物连接来利用单个嵌合引导RNA(gRNA)。Cas9使DNA双链体解旋并且在通过crRNA识别靶序列后切割两条链，但是只有在3’端存在正确的前间区序列邻近基序(protospacer-adjacentmotif,PAM)导致双链断裂。通过表达嵌合gRNA，Cas9可被引导切割具有可兼容的PAM的任何序列(Mali,P.等人，Science，2013，339(6121):823-6)，或加工所需的间隔阵列连同tracrRNA(Cong,L.等人，Science，2013，339(6121):819-23)。敲除两个Cas9核酸酶结构域之一将酶转化成切口酶，所述切口酶引起核酸的切口(在一条链断裂)，使其解旋。CRISPR总体上披露于Richter等人的Viruses，2012，4:2291-2311；CongL.，上文；和MaliP.等人，上文。

在一个实施例中，用于靶向的感兴趣基因是岩藻糖基转移酶，例如，Fut8，α-(1-6)-岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶是将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖(鸟苷二磷酸岩藻糖)供体底物转移到受体底物的酶。受体底物可以是另一种糖，例如在N-连接糖基化的情况下将岩藻糖转移至核心GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)糖，或者在由O-岩藻糖基转移酶产生的O-连接糖基化的情况下将岩藻糖转移至蛋白质。在另一个实施例中，靶向基因编码谷氨酰胺合成酶。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)(EC6.3.1.2)是通过催化谷氨酸盐与氨的缩合形成谷氨酰胺而在氮代谢中发挥重要作用的酶。在另一个实施例中，靶向基因是二氢叶酸还原酶(DHFR)。二氢叶酸还原酶或DHFR是利用NADPH作为电子供体将二氢叶酸还原为四氢叶酸的酶，可转化成用在1-碳转移化学中的四氢叶酸辅因子类型。

在另一个实施例中，靶向基因是唾液酸酶(例如，NEU2或NEU3)。NEU2和NEU3属于从糖蛋白和糖脂去除唾液酸残基的糖水解酶家族。破坏抗体产生细胞中的NEU2或NEU3可防止末端唾液酸从糖基化抗体的去除并提高抗体活性和循环半衰期。

在一个实施例中，用于靶向的感兴趣基因是促凋亡基因，例如BAX、BID、BAK、或BAD。破坏抗体产生细胞中的促凋亡基因可中断凋亡过程并增强细胞存活和抗体产生。

CRISPR

基因组编辑核酸酶对于基因工程是有价值的工具。本发明利用被称为CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)的序列特异性核酸酶系统。在体内，该微生物核酸酶系统帮助抵御入侵的噬菌体和质粒。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关基因的组合以及非编码RNA元件，其能够编程CRISPR介导的核酸裂解的特异性。CRISPR使用基因组编码的RNA阵列通过CRISPR相关(Cas)核酸酶来控制外来DNA的切割。利用Cas变体核酸酶的三种类型(I-III)的CRISPR系统已在广泛的细菌宿主中被确认(Makarova等人，Nat.Rev.Microbiol.，2011，9(6):467-77；Karvelis等人，RNABiol.，2013，10(5):841-51)。每一CRISPR基因座含有被短段的非重复序列(间隔区)间隔的重复序列(同向重复序列)阵列。间隔序列对应于靶向基因组中的原型间隔序列，通常为20-30个核苷酸随后NGG前间区序列邻近基序(PAM)。为了将相关Cas核酸酶用于核酸裂解，非编码CRISPR阵列被转录并在同向重复序列内被切割成含有各间隔序列的短crRNA，将Cas核酸酶导向靶位点(原型间隔序列)。

本发明中所用的II型CRISPR得以很好地表征，并且在四个顺序步骤中实施靶向DNA双链断裂。第一步，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA：前crRNA(CRISPRRNA)阵列和tracrRNA(反式激活crRNA)。第二步，将tracrRNA杂交到前crRNA的重复区并介导前crRNA成为含有单独间隔序列的成熟crRNA的过程。第三步，成熟crRNA:tracrRNA复合体经由在crRNA上的间隔区与紧邻前间区序列邻近基序(PAM)的靶DNA上的原型间隔序列之间的碱基配对将Cas9导向靶DNA，这是对靶识别的额外要求。最后，Cas9介导靶DNA的切割，以在原型间隔序列内形成双链断裂(www.genome-engineering.org/crispr/)。除了PAM之外，间隔序列中完美同源的至少12个碱基对(bp)显得对于CRISPR内切核酸酶活性是必要的(EsveltandWang，Mol.Syst.Biol.，2013，9:641)。

来自酿脓链球菌CRISPR组件(包括核定位的Cas9和加工形式的引导RNA)的哺乳动物表达构建体可被转染到不同的细胞类型中，以破坏细胞群中的靶向等位基因。CRISPR系统还服从多路技术。多个引导序列可被编码到单个CRISPR阵列中，以便能够同时编辑哺乳动物基因组内的若干位点。

除了启动靶向基因破坏之外，使用CRISPR的基因组编辑还可利用细胞同源重组机制，以便用工程化的供体DNA盒替换DNA基因座，所述供体DNA盒含有在单链断裂位点侧翼的同源区域。Cong等人已经披露了两种不同的II型CRISPR系统的工程化，证实了Cas9核酸酶可由短RNA引导以诱导在人和小鼠细胞中的内源基因组位点处的精确切割(Science，2013，339:819-823)。他们还公布了Cas9可被转化成切口酶以促进最小诱变活性的同源定向修复。Mali等人也披露了他们构建了II型细菌CRISPR系统与定制向导RNA(gRNA)一起作用在人类细胞(Science，2013，339:823-826)。

产生双等位基因敲除的方法

在一个实施例中，本发明包括在真核细胞中通过对所述细胞提供CRISPR系统来产生双等位基因敲除的方法，所述CRISPR系统包括核酸酶和至少两个靶向RNA。在一个实施例中，CRISPR系统具有3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、或3-10个靶向RNA。该方法的一个应用实例是产生分泌无岩藻糖基化抗体的细胞。Fut8基因编码α-(1,6)-岩藻糖基转移酶，这是催化岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到N连接型复合物糖肽的酶。由于无岩藻糖基化的抗体具有增强的ADCC活性，在抗体产生细胞中敲除Fut8是希望的。在本发明的一个实施例中，中国仓鼠Fut8含有9个外显子(从起始密码子到终止密码子的121,971个核苷酸)。中国仓鼠Fut8的基因结构在表1中示出。

可选择在表2中示出的前四个外显子中的十个原型间隔序列用于构建表达载体。在表2中，crRNA靶“c”是指互补链，并且粗体序列是指PAM(前间区序列邻近基序)。这些序列均以G开始，以促进U6转录起始，然后～20核苷酸之后为NGG。多个crRNA表达载体可被构建为包含靶向间隔序列或多个间隔序列中的一者。

野生型CHO细胞和抗体表达CHO细胞系可用于表征Fut8基因敲除效率。通常，细胞用Cas9、tracrRNA和crRNA的至少一种哺乳动物表达载体进行转染。培养两天之后，通过带小扁豆凝集素(LCA)-FITC(VectorLaboratories，Burlingame，CA)的荧光标记术和流式细胞术分析针对细胞表面岩藻糖含量连续监测细胞。LCA-FITC的负向结合表示Fut8的两个等位基因都已经被敲除。在一些实施例中，Fut8包含由SEQIDNO:2、3或4表示的经修饰的外显子1(如图6B中所示)。

在另一个实施例中，本发明涉及含有在CMV启动子控制之下的Cas9表达盒以及在人U6启动子控制之下的tracrRNA表达盒的双表达载体LB200(图2)。可以使用单独的表达载体或多个载体来表达crRNA。图3示出了载体LB202a，为人U6启动子表达crRNA的基本结构，其含有侧翼为同向重复序列(DR)的靶序列(间隔区)。间隔序列对应于靶向基因组中的原型间隔序列，通常为20-30个核苷酸随后为前间区序列邻近基序NGG(PAM)。在LB200和LB202a共转染到感兴趣细胞中之后，crRNA和tracrRNA形成RNA双链体并且将Cas9导向染色体中的原型间隔序列。Cas9然后在PAM的-3位置切割DNA。crRNA可含有在U6启动子之后的多个间隔区(间隔序列)，例如3个间隔区被靶向在crRNA序列DR-T1-DR-T2-DR-T3-DR中(图1C)。因此，多个原型间隔序列可同时被Cas9靶向。

在某些实施例中，tracrRNA和crRNA可由发夹RNA连接物连接。RNA碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。RNA分子为通过在一个核苷酸的磷酸与另一个核苷酸的糖之间的共价键彼此接合的核苷酸的聚合物。这些连接物称为磷酸二酯键。虽然单链，RNA并不总是直链的。它具有折叠成复合三维形状并形成发夹环的能力。在这些环内，碱基彼此接合：腺嘌呤与尿嘧啶配对(A-U)，而鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G-C)。发夹环常见于RNA分子，如信使RNA(mRNA)和转运RNA(tRNA)。

本文中的表达载体可包含本领域已知的表达控制序列，并且包括例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等等，提供多核苷酸序列在宿主细胞中的表达。表达控制序列与涉及转录的细胞蛋白特异性地相互作用(Maniatis等人，Science，1987，236:237-1245)。示例性的表达控制序列披露于例如，Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology，1990，Vol.185，AcademicPress，SanDiego,CA。

Cas9的表达可以由任何真核启动子驱动，包括但不限于，CMV启动子、EF1α启动子、SV40启动子、RSV启动子、或PGK启动子。适用于本发明的CMV启动子可以质粒形式获得，其来源包括GSLBiotechLLC(Chicago,IL)、PromegaCorporation(Madison,WI)、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)、和ClontechLaboratories(MountainView，CA)。适合的EF1α启动子可从ClontechLaboratories和OxfordGenetics(Oxfordshire,UK)获得。适合的质粒形式的SV40启动子可从广泛来源获得，包括PromegaCorporation,Invitrogen(Carlsbad,CA)和OxfordGenetics。RSV和PGK启动子可从类似的公司获得。

RNA的表达可由任何RNA聚合酶启动子驱动，包括但不限于人U6启动子、人H1启动子、或人7SK启动子。适合的人U6启动子可以质粒形式从包括Invitrogen和OxfordGenetics的来源获得。

“靶向RNA”是指将Cas9导向靶向DNA序列用于基因组编辑的crRNA。它包含与感兴趣基因中的原型间隔DNA序列互补的RNA序列。靶向RNA可通过发夹RNA连接物与tracrRNA的全部或部分序列连接。

抗体产生

本发明的方法和由此产生的质粒可用于转染真核细胞，使得那些细胞随后产生感兴趣的抗体，优选治疗性抗体。治疗性抗体的产生和纯化是本领域公知的。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码重链和轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。不同形式的术语“转染”意在涵盖常用于将外源DNA引入真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞中表达抗体是优选的，且最优选在哺乳动物宿主细胞中，这是因为所述的真核细胞(且尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠且免疫活性抗体。

用于表达本发明重组抗体的具体哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足够的一段时间以允许在宿主细胞中抗体的表达或者尤其允许将抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。

在一个实施例中，本发明的方法可用于产生生物仿制抗体，例如利妥昔单抗抗体。生物仿制品，也称为生物仿制药，为其活性药物是通过活体生物体制得或借助于重组DNA或受控的基因表达方法源自活体生物体的生物医药产品。生物仿制品或生物仿制药是用于描述原研生物制药产品的官方批准的后续版本的术语，由不同的发起人在原研产品的专利和独占权到期后制得的。

利妥昔单抗(商品名Rituxan^TM)是针对发现于正常和恶性B淋巴细胞的表面上的CD20抗原的基因工程化嵌合鼠/人单克隆抗体。抗体是含有鼠轻链和重链可变区序列以及人恒定区序列的IgG1κ免疫球蛋白。利妥昔单抗由两条重链的451个氨基酸和两条轻链的213个氨基酸组成。利妥昔单抗的Fab区与B淋巴细胞上的CD20抗原结合，而Fc结构域募集抗体和补体来介导细胞溶解。利妥昔单抗用于治疗CD20阳性非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、和类风湿性关节炎。

曲妥珠单抗(商品名Herceptin^TM)是针对发现于某些类型的乳癌细胞的表面上的HER2抗原的基因工程化人源化单克隆抗体。曲妥珠单抗由两条重链的451个氨基酸和两条轻链的213个氨基酸组成。曲妥珠单抗的Fab区与乳癌细胞上的HER2抗原结合，而Fc结构域募集抗体和补体来介导细胞溶解。曲妥珠单抗用于治疗HER2过表达乳癌。

由下文的实验细节将更好地理解本文披露的本发明。下文的实例是以说明性而非限制本发明的方式提供的，正如所附权利要求书中更充分描述的。

实例

实例1：通过靶向单个crRNA位点破坏CHO细胞中的Fut8基因

酿脓性链球菌tracrRNA(SEQIDNO:15)在人U6启动子(SEQIDNO:16)控制下克隆到哺乳动物表达载体中。

酿脓性链球菌tracrRNA

ATCTTGTTGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGCTTT(SEQIDNO.15)

人U6启动子

AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC(SEQIDNO：16)

tracrRNA表达盒被合成和克隆到载体pcDNA3(Invitrogen)在限制性位点DraIII与Bst1107I之间以给出载体LB-tracrRNA。编码Cas9蛋白(SEQIDNO:18)的酿脓性链球菌Cas9cDNA经哺乳动物密码子优化(SEQIDNO:17)并与核定位信号(NLS，SEQIDNO:19和SEQIDNO:20)融合。

编码Cas9的酿脓性链球菌密码子优化的DNA(SEQIDNO.17)

核定位信号

CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG(SEQIDNO：19)

PKKKRKV(SEQIDNO：20)

Cas9cDNA被合成和克隆到载体LB-tracrRNA位于限制性位点XbaI与PmeI之间以给出载体LB200。Cas9的表达由CMV启动子驱动。LB200的质粒图谱在图2中示出。通过LB200中的位点特异性诱变引入Cas9的单突变D10A以给出载体LB201。构建载体LB202a、LB202b、和LB202c(表3)来表达由人U6启动子分别靶向仓鼠Fut8基因中的单个原型间隔序列T1、T2、或T3驱动的crRNA。靶向的原型间隔序列的侧翼为CRISPR同向重复序列(DR；SEQIDNO:21)。

酿脓性链球菌CRISPR同向重复序列

GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC(SEQIDNO:21)

表达盒被合成和克隆到载体pIDT-Smart(IntegratedDNATechnologies)中。LB202a的质粒图谱在图3中示出。所有质粒携带用于细菌增殖的氨苄青霉素抗性基因。

通过用5μg/ml的荧光小扁豆凝集素(LCA-FITC，VectorLaboratories)染色并随后接受流式细胞术分析可易于检测在CHOS细胞表面上的岩藻糖(Invitrogen,Carlsbad,CA)(图4a)。具有Fut8敲除的细胞缺乏表面岩藻糖并因此展现出LCA-FITC的负染色。为了测试Fut8基因组编辑CRISPR载体，用两种质粒(一种来自LB200和LB201，另一种来自LB202a、LB202b、和LB202c)共转染1×10⁶CHOS细胞，总计六种情况(#1-3，#11-13，表4)。使用Neon电穿孔系统(Invitrogen)实施转染。转染一周后，用LCA-FITC将细胞染色，并然后接受流式细胞术分析。转染细胞没有一个显示可检出的岩藻糖阴性群，表明通过靶向一个CRISPR序列的双等位基因Fut8敲除的效率是可忽略不计的(图4b)。

实例2：通过靶向多个crRNA位点破坏CHO细胞中的Fut8基因

构建哺乳动物表达载体LB203-207(表3)来表达crRNA靶向仓鼠Fut8基因中的多个靶序列T1-T10。所有的载体利用人U6启动子来表达类似于图1C中的crRNA阵列。

用表4中所示的2-4种质粒共转染1×10⁶CHOS细胞(条件#4-10，#14-20)。转染一周后，用LCA-FITC将细胞染色，并然后接受流式细胞术分析来确定LCA与细胞表面岩藻糖的结合。

野生型CHO-S细胞展现出在细胞表面上的强LCA染色(图5a)。大多数的细胞驻留在具有强荧光信号强度的M3峰。转染#1(一种CRISPR靶向序列)显示出与没有转染的对照细胞相似的结果。表示LCA-FICT的背景染色的M2峰为0.14％，类似于阴性对照细胞的染色。转染#4(两种CRISPR靶向序列)显示出增强的M2峰(0.73％)，表明小百分比的细胞缺乏表面岩藻糖。在转染#5-8中(3,4,3或3种CRISPR靶向序列)，～5％的细胞失去细胞表面岩藻糖，表明大大增强的双等位基因的基因组编辑。在转染#9-10中，通过3或4种质粒的共转染利用了7或10个CRISPR靶向序列。2-4％的细胞失去了细胞表面岩藻糖。基因组编辑效率的轻度降低与降低的共转染效率一致。转染#5和#6的M2峰中的10³个细胞分别被分类到2.123.3P和2.123.4P池中。在用1μg/ml的LCA-FITC染色之后，它们缺乏LCA染色得以确认(图5c)。这些转染的结果在表5中示出。

用3-4个CRISPR靶转染的细胞具有最高频率的Fut8的双等位基因敲除。用2个CRISPR靶转染的细胞也产生了双等位基因敲除，而用单个CRISPR靶转染的细胞没有产生在背景上可检出的双等位基因敲除。细胞中3-4种CRISPR靶一起的组合令人惊奇和出乎意料地产生了协同效应，其中双等位基因敲除的频率大大高于来自组合的CRISPR靶的加性效应的预期率。还令人惊奇的是，用3-4个CRISPR靶转化的细胞比用7或10个CRISPR靶转化的细胞具有更高频率的双等位基因敲除。存在着令人惊奇和出乎意料的距离效应，更近间隔的多个CRISPR靶增加了双等位基因敲除的频率。

转染#14-20展现出与如图4b中所示的转染#11-13相似的LCA-FITC染色概况，表明Cas9-D10A比野生型Cas9具有更低的活性，并且不适于双等位基因的基因组编辑。

实例3：分离Fut8敲除的CHO细胞

转染#5的M2峰中的细胞作为单细胞被分类到96-孔板中。在集落长出2周后，展现出与野生型CHOS细胞相似的生长模式的11个克隆被选出并在摇瓶中扩增并冻存。通过PCR和测序，确定这些克隆在LCA-FITC染色上为负性并在Fut8基因中包含双等位基因移码突变。3个克隆的LCA染色数据在图6A中示出。3个修饰的Fut8等位基因的外显子1的序列比对在图6B中示出(SEQIDNOS:1-4)，表明2bp插入、1bp缺失、和91bp缺失的移码突变。在前2个突变体中的插入缺失发生在原型间隔序列T2的切割位点处。在第3个突变体的缺失发生在原型间隔序列T1和T2之间。

利用GFP表达载体测试了11Fut8-/-CHO克隆的转染效率。利用Neon电穿孔系统以10μg的DNA转染了1×10⁶个细胞，并且在2天后通过流式细胞术分析来表征GFP阳性细胞的百分比。大多数克隆展现出与野生型CHOS细胞相似的转染效率(图6C)。

在瞬时转染之后还测试了11Fut8-/-CHO克隆的抗体产生。利妥昔单抗用作模型抗体。利用Neon电穿孔系统，以利妥昔单抗重链和轻链表达载体各5μg共转染1×10⁶个细胞。在2天之后通过Elisa法确定培养基中的抗体浓度(表6)。克隆2.123-4,-6和-13表现出与野生型CHOS细胞相似的抗体表达水平。

实例4：无岩藻糖基化的抗体的产生和表征

将编码生物仿制抗体利妥昔单抗重链和轻链序列的核苷酸序列在hEF1α启动子下克隆到哺乳动物表达载体中。利妥昔单抗重链蛋白序列和编码核苷酸序列(包含内含子)分别被设置为SEQIDNO:22和SEQIDNO:23。利妥昔单抗轻链蛋白序列和编码核苷酸序列分别被设置为SEQIDNO:24和SEQIDNO:25。

编码生物仿制抗体曲妥珠单抗重链和轻链序列的核苷酸序列被克隆到哺乳动物表达载体中，从而hEF1α启动子控制表达。曲妥珠单抗重链蛋白序列和编码核苷酸序列(包含内含子)分别被设置为SEQIDNO:26和SEQIDNO:27。曲妥珠单抗轻链蛋白序列和编码核苷酸序列分别显示为SEQIDNO:28和SEQIDNO:29。

利妥昔单抗和曲妥珠单抗表达质粒用于转染野生型CHOS细胞，或2个不同的Fut8-/-CHO克隆：2.123-4和2.123-13(表6)。用重链和轻链表达载体各100μg以及200μl的FreestyleMax转染试剂(Invitrogen)转染约200μl(1×10⁶个细胞/ml)量的细胞。在约7天细胞活力达到70％以下之后，收获条件培养基，并且条件培养基经受蛋白A色谱法来纯化抗体。

100μg的野生型(WT)或无岩藻糖基化(AF)抗体用于聚糖分析。纯化的抗体被变性并用胰蛋白酶消化。通过用PNGaseF处理随后使N-聚糖从肽类酶解释放，然后用质谱分析法定量。每个聚糖由5个数字码表示:己糖(Gal、Man、或Glc)的数目、N-乙酰己糖胺(GlcNAc或GalNAc)的数目、脱氧已糖(Fuc)的数目、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的数目、和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的数目。含岩藻糖的聚糖具有中间数字1，而没有岩藻糖的聚糖具有中间数字0。例如，聚糖33100含有3个己糖、3个N-乙酰己糖胺、和1个岩藻糖。从野生型CHOS细胞产生的利妥昔单抗和曲妥珠单抗表现出稳健的岩藻糖存在，而从Fut8-/-CHO细胞产生的那些抗体表现出完全缺乏岩藻糖(图7)。

纯化的抗体还用于表征ADCC活性。人外周血单核细胞(PBMC)用作效应物。人淋巴瘤Raji细胞用作针对利妥昔单抗的靶细胞，而人乳腺细胞系SK-BR3用作针对曲妥珠单抗的靶细胞。效应细胞与靶细胞的比率保持在20:1。通过LDH释放来确定细胞毒性。

靶细胞被洗涤并接种在96-孔板中(50μl中10,000个细胞)。将具有不同浓度的抗体的50μl的培养基添加至细胞并且在细胞培养箱中孵育达30分钟。然后添加效应细胞(100μl中200,000个细胞，E:T＝20:1)来启动ADCC反应。将终浓度为1％的tritonX-100添加至没有效应细胞或抗体的对照靶细胞来溶解靶细胞并用作最大溶解对照。将测定缓冲液添加至没有效应细胞或抗体的对照细胞并用作最小LDH释放对照。在不存在抗体的情况下与效应细胞一起孵育的靶细胞被设置为非特异性LDH释放的背景对照。将96-孔板在37℃/5％CO₂培养箱中孵育达6小时。用LDH细胞毒性测定试剂盒(FisherScientific)测定ADCC活性。无岩藻糖基化的利妥昔单抗(图8a)和曲妥珠单抗(图8b)相比于野生型抗体分别表现出～50和40倍增强的ADCC活性。

实例5：分离Fut8敲除的利妥昔单抗产生细胞

将生物仿制抗体利妥昔单抗重链和轻链序列克隆到在hEF1α启动子下的哺乳动物表达载体中。在CHOS细胞中稳定转染之后，分离出产生利妥昔单抗的克隆2G8。以载体LB200和LB204各5μg共转染1×10⁶个2G8细胞，以敲除Fut8基因。转染一周后，用荧光标记的LCA将细胞染色，然后接受流式细胞术分析。将LCA-FITC染色的阴性细胞分类到96-孔板中的单细胞。在集落在2周长出后，克隆被扩增并被确认缺乏LCA-FITC染色。Fut8基因被测序并且移码突变被确认。

实例6：通过靶向多个crRNA位点破坏CHO细胞中的唾液酸酶基因

唾液酸化作用影响重组治疗性糖蛋白的药代动力学、免疫原性和功能(Bork等人，JPharmSci.，2009，98:3499-3508)。唾液酸化作用的程度与重组蛋白的血清半衰期相关。唾液酸也是重组蛋白的免疫原性的重要调节剂，其是基于蛋白质的疗法的主要问题。唾液酸对于掩蔽抗原决定簇或表位是重要的。因此，增大的唾液酸化作用一般是优选的。尽管它们对重组蛋白的若干重要特性的影响，唾液酸结合是高度可变的。在CHO细胞中产生的IgG和Fc片段展现出非常低水平的唾液酸化作用(<2％；Raymond，2012，Chapter17，pp.397-418.In:Biochemistry，GeneticsandMolecularBiology，ed.S.Petrescu，InTechOpenAccess.ISBN978-953-51-0771-2)。产生培养快要结束时的细胞内唾液酸酶的释放是低唾液酸化作用水平的主要原因。

中国仓鼠基因组含有3种唾液酸酶基因：溶酶体Neu1、细胞质Neu2、和质膜Neu3。其中，Neu2和Neu3已显示影响产生的糖蛋白的唾液酸化作用水平(ZhangandRoss，2012，Compositionsandmethodsforimprovedglycoproteinsialylation，US8,273,723)。具体而言，在分批培养产生的结尾，在从死细胞释放之后Neu2在从聚糖去除唾液酸中起着最重要的作用。Neu2(GenBank:U06143.1)和Neu3(GenBank:FJ476074.1)都含有2个外显子和1137和1251nt的开放阅读框，分别编码379和417个氨基酸的蛋白质。

在用于CHO细胞中基因组编辑的Neu2和Neu3外显子中，三个CRISPR靶原型间隔序列被选定以使所述的潜在脱靶修饰最小化(Hsu,P.D.等人，NatBiotechnol.，2013，31:827-32)。类似于载体LB204的CRISPR阵列的表达载体被构建为含有3个Neu2原型间隔序列靶或3个Neu3原型间隔序列靶(在人U6启动子下)。

我们先前已经优化了在CMV启动子下表达Cas9和在人U6启动子下表达tracrRNA的哺乳动物细胞表达载体LB200。我们还通过将IRES-EGFP盒插入载体LB200的Cas9cDNA下游作为转染报告子构建了LB221(图2B)。

用LB200或LB221以及表达靶向Neu2和/或Neu3的CRISPR阵列的载体共转染CHO细胞。如果使用LB221，则在转染后两天GFP阳性细胞会以单细胞被分类到96-孔板中。在集落在2-3周长出后，通过以1:10传代细胞将所述板复制成一组新的96-孔板。TritonX-100(0.1％)或Tween20(0.5％)会被添加到原96-孔板以便将细胞膜进行渗透化处理并使胞质唾液酸酶释放入培养基。通过荧光底物甲基伞形酮基Neu5Ac(Neu5Ac-a-4MU，SantaCruzBiotechnology)，澄清的培养基会被用于测定唾液酸酶活性。培养基(100μL)会与4mMNeu5Ac-a-4MU一起在黑色96-孔板中在37℃下孵育达90分钟，之后添加100μL的0.2M甘氨酸缓冲液(pH10.4)，以终止酶促反应。使用读板仪测量荧光，其中激发波长为362nm并且发射波长为448nm。确定测定的线性范围。90分钟孵育的荧光变化与唾液酸酶活性成正比。所有实验将包括野生型CHO作为基线控制。在测定中表现出较少荧光性的克隆可能含有Neu2或Neu3修饰。这些克隆的Neu2和Neu3序列会被PCR扩增并测序以确认移码突变。唾液酸酶阴性克隆将被扩增和冻存。可能按顺序或同时实施Neu2和Neu3敲除。

在本申请中引用的所有公开文献、专利、专利申请、和其它文献在此以其全文形式被援引加入本发明，用于所有目的，在程度上如同每个单独的公开文献、专利、专利申请或其它文献被单独表明被援引加入用于所有目的。

尽管本文已示出并描述了本发明的优选实施例，但对于本领域的普通技术人员显而易见，所述实施例仅是以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多的变化、改动和取代现在会被本领域技术人员想到。应该理解，可以采用本文所述的本发明的实施例的不同替代方案来实施本发明。

Claims

1.一种在真核细胞中产生靶基因的双等位基因敲除的方法，所述方法包括下述步骤：向细胞提供包括核酸酶和位于相同基因中的至少两个靶向RNA的CRISPR系统，其中每个靶向RNA由crRNA和tracrRNA组成，其中每个crRNA具有不同的序列，并且表达CRISPR核酸酶和靶向RNA，借此靶基因在细胞的两个等位基因被敲除。

2.根据权利要求1所述的方法，其中CRISPR系统包括至少三个靶向RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其中每个靶向RNA具有相同的tracrRNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其中靶向RNA利用至少两个不同的tracrRNA之一。

5.根据权利要求1所述的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中细胞是CHO细胞、293细胞、NS0细胞、胚胎干细胞、或其衍生物、或抗体产生细胞或其衍生物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中核酸酶是Cas9。

8.根据权利要求1所述的方法，其中tracrRNA和crRNA通过发夹RNA连接物连接。

9.根据权利要求1所述的方法，其中每个靶向RNA与靶基因中的相应靶序列互补，并且其中靶序列在靶基因的单外显子中。

10.根据权利要求2所述的方法，其中每个靶向RNA与靶基因中的相应靶序列互补，并且其中靶序列位于靶基因中的375bp的连续段中。

11.根据权利要求2所述的方法，其中每个靶向RNA与靶基因中的相应靶序列互补，并且其中靶序列位于靶基因中的200bp的连续段中。

12.根据权利要求2所述的方法，其中每个靶向RNA与靶基因中的相应靶序列互补，并且其中靶序列位于靶基因中的150bp的连续段中。

13.根据权利要求1所述的方法，其中靶基因是岩藻糖基转移酶。

14.根据权利要求1所述的方法，其中靶基因是谷氨酰胺合成酶。

15.根据权利要求1所述的方法，其中靶基因是二氢叶酸还原酶(DHFR)。

16.根据权利要求1所述的方法，其中靶基因是唾液酸酶。

17.一种哺乳动物细胞，包括使用如权利要求2所述的方法进行的靶基因的双等位基因敲除。

18.根据权利要求17所述的哺乳动物细胞，其中靶基因是Fut8。

19.根据权利要求18所述的哺乳动物细胞，其中Fut8包括由SEQIDNO:2、3或4表示的经修饰的外显子1序列。

20.根据权利要求17所述的哺乳动物细胞，其中靶基因是谷氨酰胺合成酶。

21.根据权利要求17所述的哺乳动物细胞，其中靶基因是二氢叶酸还原酶(DHFR)。

22.根据权利要求17所述的哺乳动物细胞，其中靶基因是唾液酸酶。