CN101896616A

CN101896616A - 提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法

Info

Publication number: CN101896616A
Application number: CN2008801114498A
Authority: CN
Inventors: 张民; J·S·罗斯
Original assignee: Advanced Separation Technologies Inc
Current assignee: Sigma Aldrich test group Co.,Ltd.
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2008-10-13
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2028-10-13
Also published as: DK2930245T3; CA2702120A1; JP2015057059A; WO2009049284A3; EP2195444B1; CN101896616B; DK2195444T3; EP2195444A4; US8273723B2; EP2930245A1; EP2195444B9; AU2008310583A1; JP6068410B2; EP2930245B1; JP2011500032A; EP2195444A2; US20100291624A1; WO2009049284A2; CA2702120C

Abstract

本发明提供了用于生产具有增强的唾液酸化作用的糖蛋白的组合物和方法。特别地，本发明提供了包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞系和使用该细胞系来生产具有增强的唾液酸化作用的糖蛋白的方法。

Description

提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法

发明领域

本发明一般涉及唾液酸酶。特别地，本发明涉及提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法。

发明背景

采用DNA重组技术培养哺乳动物细胞而生产的糖蛋白，代表了人类保健治疗药品中的一个重要的种类。糖蛋白的生物学功能往往高度依赖于其碳水化合物结构。在糖蛋白中发现的众多糖中，末端唾液酸被认为是特别重要的。已发现，唾液酸影响各种糖蛋白的溶解度、热稳定性、抗蛋白酶的攻击、抗原性以及比活性。糖蛋白中唾液酸的量是两个相反过程的结果，即通过唾液酸转移酶活性胞内增加唾液酸以及通过唾液酸酶切割胞外去除唾液酸。

当从血清糖蛋白除去末端唾液酸时，与唾液酸化的对应物(counterpart)相比，去唾液酸化的蛋白具有显著降低的循环半衰期。其他糖蛋白中唾液酸的去除与降低的生物活性和增加的血清清除率有关。此外，在分批培养的细胞生产糖蛋白的过程中，营养物质的消耗和产物的积累可能会改变细胞环境，使得蛋白质糖基化随着时间变化而降低。再者，由此产生的糖蛋白往往有糖形异质性，并且，生产过程中有显著的批次变化。这些变化在用于蛋白质治疗药物大规模生产的生物加工过程中是不可接受的。因此，在哺乳动物细胞培养系统中，我们往往需要使糖蛋白产物中最终唾液酸含量最大化，以确保其作为有效药物的质量和一致性。因此，存在对具有增强的糖蛋白唾液酸化作用的哺乳动物细胞培养系统的需求。这一系统将提高充分唾液酸化的重组糖蛋白的生产。

发明概述

在本发明的各个方面中，提供了一种细胞系，该细胞系包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达。表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ IDNO：2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ ID NO：4至少约80％同一的序列。

本发明的另一个方面包括一种生产糖蛋白的方法。该方法包括在细胞中表达编码糖蛋白的核酸序列，所述细胞包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，其中糖蛋白相对于适当对照，具有增强的唾液酸化作用。在细胞中表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO：2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ ID NO：4至少约80％同一的序列。

本发明的另一个方面提供了一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成的多肽。

本发明的另一个方面还包括一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO：4组成的多肽。

本发明的另一个可选方面提供了一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成。

本发明的另一个方面包括一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQID NO：4组成。

本发明的其他方面和特征在下面更为详细地描述。

彩色附图的引用

本申请文件包含至少一副彩色照片。具有彩色照片的这一专利申请公布文本的拷贝在经过请求和偿付必要的费用后由专利局提供。

附图说明

图1示出由CHO Neu1、Neu2和Neu3基因编码的蛋白质的唾液酸酶活性。所呈现的是，使用含有所示各种基因的编码区的表达构建体(或任何空表达构建体)转染的细胞溶胞产物中的酶活性。

图2示出由CHO Neu1、Neu2和Neu3基因编码的蛋白质的唾液酸酶活性的抑制。所呈现的是，在不存在或存在两种浓度的两种不同的唾液酸酶抑制剂的情况下，在用含有各种基因编码区的表达构建体转染的细胞的溶胞产物中所测量的酶活性。

图3示出Neu1、Neu2和Neu3蛋白质的亚细胞位置。所呈现的是共焦荧光显微图像，其中带FLAG标签的Neu蛋白质以绿色显示，溶酶体(Lys)标志物以红色显示，而质膜(PM)标志物以蓝色显示。

图4示出采用小干扰RNA(siRNA)技术对Neu1、Neu2和Neu3mRNA表达的敲低。所呈现的是，在使用基因特异性siRNA(S1-S5)或者靶向不相关GFP核酸序列的对照siRNA(C)敲低各种基因后，采用基因特异性引物通过RT-PCR扩增的产物。对照基因(β-2微球蛋白(microglubulin)，β2M)的表达不受siRNA影响。

图5示出采用小干扰RNA(siRNA)技术对(A)Neu1、(B)Neu2和(C)Neu3

mRNA的敲低表达。所呈现的是Q-RT PCR结果，其显示当使用对每种Neu基因特异的siRNA或者靶向不相关核酸序列(GFP)的对照siRNA时，各种基因的相对表达。

图6示出CHO-hIFNγ细胞中的唾液酸酶活性，其中在CHO-hIFNγ细胞中Neu基因的表达使用siRNA敲低。所呈现的是CHO-hIFNγ细胞中的唾液酸酶活性，其中在CHO-hIFNγ细胞中每种Neu基因被沉默，两种Neu基因被沉默，或者全部Neu基因被沉默。还显示的是缺乏siRNA构建体(CHO)或者包括靶向不相关核酸序列(GFP)的对照siRNA的CHO-hIFNγ细胞中唾液酸酶的活性。

图7示出采用短发夹RNA(shRNA)技术对(A)Neu1、(B)Neu2和(C)Neu3mRNA表达的稳定的敲低。所呈现的是Q-RT PCR结果，其显示相应敲低的CHO-hIFNγ细胞或者对照CHO-hIFNγ细胞(非靶向)中每种唾液酸酶基因的相对表达，所述对照CHO-hIFNγ细胞包括靶向不相关核酸序列的对照siRNA。

图8示出使用shRNA对CHO-hIFNγ细胞中唾液酸酶活性的稳定的敲低。所呈现的是CHO-hIFNγ细胞中唾液酸酶的活性，其中在CHO-hIFNγ细胞中，唾液酸酶基因(Neu1、Neu2或Neu3)中的每一种被沉默。还显示了对照CHO-hIFNγ细胞(非靶向)中的唾液酸酶活性，所述对照CHO-hIFNγ细胞包括靶向不相关核酸序列的对照shRNA。*p＜0.005，**p＜0.0001。

图9示出细胞生长不受唾液酸酶基因沉默影响。所呈现的是作为培养天数函数的细胞生长(即，活细胞密度(VCD)和生存力百分比)。对CHO-hIFNγ细胞(其中每种唾液酸酶基因(Neu1、Neu2或Neu3)被敲低)或者对照(非靶向)CHO-hIFNγ细胞(其包括靶向不相关核酸序列的对照shRNA)绘制生长数据的图。

图10示出人干扰素γ(hIFNγ)的产生不受唾液酸酶基因沉默影响。所绘制的是由CHO-hIFNγ细胞或者对照(非靶向)CHO-hIFNγ细胞产生的hIFNγ蛋白的水平，在所述CHO-hIFNγ细胞中，每种唾液酸酶基因(Neu1、Neu2或Neu3)被敲低。

图11示出唾液酸酶敲低细胞产生了具有增加的唾液酸水平的糖蛋白。所绘制的是由CHO-hIFNγ细胞(其中每种唾液酸酶基因(Neu1、Neu2或Neu3)被敲低)或者对照(非靶向)CHO-hIFNγ细胞(其包括靶向不相关核酸序列的对照shRNA)产生的人干扰素γ(hIFNγ)中的唾液酸的浓度。NS，不显著，*p＜0.01，**p＜0.05。

发明详述

唾液酸酶是从糖蛋白和糖脂中去除末端唾液酸残基的酶。已知中国仓鼠卵巢(CHO)细胞含有细胞质唾液酸酶。本发明的发明人已经分离并表征了CHO细胞中另外两种唾液酸酶，即：溶酶体唾液酸酶和质膜相关唾液酸酶。因此，本发明提供了包括两种新鉴定的唾液酸酶基因的受破坏的表达的细胞系，其中所述基因单独，相互组合，或者与细胞质唾液酸酶组合。本发明还提供了使用包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞生产感兴趣的糖蛋白的方法。一般而言，相对于具有正常唾液酸酶活性的亲代细胞所生产的糖蛋白，由本发明的方法所生产的糖蛋白具有增加的唾液酸含量。

(I)非细胞质唾液酸酶

本发明的一个方面包括一种分离的核酸序列，该核酸序列编码氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成的多肽。一般而言，分离的核酸序列与SEQ ID NO：1至少约80％同一。在一些实施方案中，分离的核酸序列可与SEQ ID NO：1约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％同一。在其他实施方案中，分离的核酸序列可主要由SEQ ID NO：1组成。在这些实施方案中，可能有侧翼于分离的核酸序列的5’端、3’端或者两端的其他外源核苷酸序列。外源核苷酸序列可以是包括用于克隆的限制性内切核酸酶切割位点的连接体，与用于扩增和/或其他检测方法的引物互补的连接体，及类似物。在另外一些实施方案中，分离的核酸序列可由SEQ ID NO：1组成。

本发明的另一个方面提供了一种分离的核酸序列，该核酸序列编码氨基酸序列由SEQ ID NO：4组成的多肽。一般而言，分离的核酸序列与SEQ IDNO：3至少约80％同一。在一些实施方案中，分离的核酸序列可与SEQ IDNO：3约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％同一。在其他的实施方案中，分离的核酸序列可主要由SEQ ID NO：3组成。在这些实施方案中，可能有侧翼于分离的核酸序列的5’端、3’端或者两端的其他外源核苷酸序列。外源核苷酸序列可以是包括用于克隆的限制性内切核酸酶切割位点的连接体，与用于扩增和/或其他检测方法的引物互补的连接体，及类似物。在另外一些实施方案中，分离的核酸序列可由SEQ ID NO：3组成。

本发明的另一个方面包括了一种纯化的多肽，所述纯化的多肽的氨基酸序列可与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少约95％同一，其中纯化的多肽具有唾液酸酶的活性。在一些实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可与SEQ IDNO：2的氨基酸序列约95、96、97、98、99或99.5％同一。在其他的实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可主要由SEQ ID NO：2组成。在这些实施方案中，可能有侧翼于纯化的多肽的氨基末端、羧基末端或者两端的外源氨基酸序列，其中纯化的多肽的生物活性没有改变。这些外源氨基酸序列可包括，但不限于抗体表位标签，如FLAG标签、myc标签、6xHis标签、HA标签、GST标签、HSV标签，及类似物。在进一步的实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可由SEQ ID NO：2组成。通常，由SEQ ID NO：2编码的多肽(或相关多肽)位于真核细胞的溶酶体。

本发明的另一个方面还提供了一种纯化的多肽，所述纯化的多肽的氨基酸序列可与SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少80％同一，其中纯化的多肽具有唾液酸酶的活性。在一些实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可与SEQ IDNO：4的氨基酸序列约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％同一。在其他的实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可主要由SEQ ID NO：4组成。在这些实施方案中，可能有侧翼于纯化的多肽的氨基末端、羧基末端或者两端的外源氨基酸序列，其中纯化的多肽的生物活性没有改变。这些外源氨基酸序列可包括，但不限于抗体表位标签，如FLAG标签、myc标签、6xHis标签、HA标签、GST标签、HSV标签，及类似物。在进一步的实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可由SEQ ID NO：4组成。通常，由SEQ ID NO：2编码的多肽(或相关多肽)位于真核细胞的质膜。

(II)包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞系

本发明的另一个方面提供了细胞系，在该细胞系中至少一种编码非细胞质唾液酸酶的内源性、染色体整合的核酸序列的表达被破坏，使得细胞系具有降低的唾液酸酶活性。该细胞系还可包括编码细胞质唾液酸酶的内源性、染色体整合的核酸序列的受破坏的表达。

在一些实施方案中，该细胞系包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，其中唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO：2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ IDNO：4至少约80％同一的序列。在一些实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可与SEQ ID NO：2约95、96、97、98、99或者99,5％同一。在另一个实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可主要由SEQ IDNO：2组成。在另一个实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可由SEQ ID NO：2组成。在其他的实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可与SEQ ID NO：4的氨基酸序列约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或者99.5％同一。在可选的实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可主要由SEQ ID NO：4组成。在另一个实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可由SEQ ID NO：4组成。

在一些迭代中，细胞系可具有一种非细胞质唾液酸酶的受破坏的表达。例如，溶酶体唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：2)的表达可能被破坏。另外，质膜相关唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：4)的表达可能被破坏。在其他迭代中，细胞系可具有两种非细胞质唾液酸酶的受破坏的表达。也就是说，溶酶体唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：2)和质膜相关唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：4)的表达可能都被破坏。

在可选的实施方案中，细胞系还可包括编码细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列可与SEQID NO：5至少约85％同一。在一些实施方案中，表达受到破坏的细胞质唾液酸酶可与SEQ ID NO：5的氨基酸序列约85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％同一。在另一个实施方案中，表达受到破坏的细胞质唾液酸酶可主要由SEQ ID NO：5组成。在另一个实施方案中，表达受到破坏的细胞质唾液酸酶可由SEQ ID NO：5组成。

在某些迭代中，细胞系可具有一种非细胞质唾液酸酶和细胞质唾液酸酶的受破坏的表达。例如，溶酶体唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：2)和细胞质唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：5)的表达可能被破坏。可选地，质膜相关唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：4)和细胞质唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：5)的表达可能被破坏。在某些其他迭代中，细胞系可具有非细胞质唾液酸酶和细胞质唾液酸酶两者的受破坏的表达。也就是说，溶酶体唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：2)，质膜相关唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：4)，和细胞质唾液酸酶(即关于SEQ ID NO：5)的表达可能都被破坏。

(a)细胞类型

一般而言，真核细胞将会用于本发明的实施中。适当的宿主细胞包括真菌或酵母，如巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)或者酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；昆虫细胞，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的SF9细胞或者黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的S2细胞；植物细胞；和动物细胞，如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物或者人类细胞。适当细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SV40转化的猴肾CVI系(COS7)；人胚胎肾系293；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4)；猴肾细胞(CVI-76)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell，BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT)；大鼠肝细胞瘤细胞(HTC)；HIH/3T3细胞和TRI细胞。对于一份全面的哺乳动物细胞系清单，本领域的普通技术人员可参考美国典型培养物保藏中心目录(

Mamassas，VA)。一般而言，细胞可以是多种细胞类型，如成纤维细胞、成肌细胞、T细胞或B细胞、巨噬细胞、上皮细胞，等等。在优选的实施方案中，细胞是一种广泛用于生产糖蛋白的类型。在一个示例的实施方案中，细胞可以是CHO细胞。其中一些产生感兴趣的糖蛋白的众多CHO细胞系可从ATCC获得。稳定表达感兴趣的糖蛋白的CHO细胞的例子，包括产生细胞内细胞粘附分子-1的CHO-ICAM-1细胞和产生人干扰素γ的CHO-hIFNγ细胞。

(b)受破坏的表达

一般而言，本发明中的细胞系具有降低的唾液酸酶表达。该表达可能会在基因表达过程的几个不同阶段受到破坏。例如，编码唾液酸酶多肽的DNA序列可能会被改变，使得功能信使RNA(mRNA)(和，因此，功能多肽)不能合成。可选地，该mRNA可能会被改变(或降解)，使得多肽不能合成或合成较低水平的多肽。

(i)RNA干扰

使用抑制靶mRNA或者转录产物表达的RNA干扰(RNAi)剂可破坏唾液酸酶的表达。RNAi剂可导致靶转录产物的裂解。可选地，RNAi剂可阻止或者破坏靶转录产物翻译为蛋白质。

在一些实施方案中，RNAi剂可以是短干扰RNA(siRNA)。一般而言，siRNA包括双链RNA分子，长度范围为约15至约29个核苷酸。siRNA的长度可以为约16-18，17-19，21-23，24-27，或者27-29个核苷酸。在优选的实施方案中，siRNA的长度可为约21个核苷酸。siRNA还可任选地包括一个或两个单链突出端，例如，在一端或两端的3’突出端。siRNA可由杂交在一起的两个RNA分子形成，或者可选地，可由短发夹RNA(shRNA)生成(见下文)。在一些实施方案中，siRNA的两条链可能完全互补，使得在两条序列之间形成的双链体中不存在错配或者凸起。在其他的实施方案中，siRNA的两条链可能大体上互补，使得在两条序列之间形成的双链体中可存在一个或多个错配和/或凸起。在某些实施方案中，siRNA的5’端中的一个或两个可能具有磷酸基，而在其他的实施方案中，5’端中的一个或两个可能没有磷酸基。在其他的实施方案中，siRNA的3’端中的一个或两个可能具有羟基，而在其他的实施方案中，5’端中的一个或两个可能没有羟基。

siRNA的一条链被称为“反义链”或“指导链”，包括与靶转录产物杂交的部分。在优选的实施方案中，siRNA的反义链，可能与靶转录产物的区域完全互补，即其在长度为约15和约29个核苷酸，长度优选为至少16个核苷酸，以及长度更优选为约18-20个核苷酸的靶区域内，与靶转录产物杂交而没有一个错配或凸起。在其他的实施方案中，反义链可能与靶区域大体上互补，即由反义链和靶转录产物形成的双链体中可能存在一个或多个错配和/或凸起。通常情况下，siRNA靶向于靶转录产物的外显子序列。本领域的技术人员熟悉设计靶转录产物的siRNA的程序、算法和/或商业服务。示例的例子是Rosetta siRNA设计算法(Rosetta Inpharmatics，North Seattle，WA)和

siRNA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。siRNA可在体外用本领域技术人员熟知的方法酶促合成。可选地，siRNA可以用本领域熟知的寡核苷酸合成技术化学合成。

在其他的实施方案中，RNAi剂可以是短发夹RNA(shRNA)。一般而言，shRNA是一种RNA分子，包括至少两个杂交或者能够杂交形成足够长以介导RNA干扰的双链结构的互补部分(如上所述)，和至少一个与形成双链体的shRNA区连接而形成环的单链部分。该结构也可以称为茎-环结构，以茎作为双链体部分。在一些实施方案中，该结构的双链体部分可能完全互补，使得shRNA的双链体区域中不存在错配或凸起。在其他的实施方案中，该结构的双链体部分可能大体上互补，使得shRNA的双链体部分中可存在一个或多个错配和/或凸起。该结构的环长度可能为约1至约20个核苷酸，优选长度为约4至约10个核苷酸，以及更优选长度为约6至约9个核苷酸。该环可能位于与靶转录产物互补的区域的5’或3’端(即shRNA的反义部分)。

该shRNA在5’或3’端还可包括突出端。任选的突出端长度可能为约1至约20个核苷酸，以及更优选长度为约2至约15个核苷酸。在一些实施方案中，突出端可包括一个或者多个U残基，如约1和约5个U残基之间。在一些实施方案中，shRNA的5’端可具有磷酸基，而在其他的实施方案中可能没有。在其他的实施方案中，shRNA的3’端可具有羟基，而在其他的实施方案中可能没有。一般而言，通过保守的细胞RNAi机制，将shRNA加工成siRNA。因此，shRNA是siRNA的前体并且类似地，能够抑制与shRNA的一部分(即shRNA的反义部分)互补的靶转录产物的表达。本领域的技术人员熟悉设计和合成shRNA的可用的资源(如上面提到的细节)。示例的例子是

shRNA(Sigma-Aldrich)。

在其他的实施方案中，RNAi剂可以是RNAi表达载体。通常地，RNAi表达载体可用于在细胞内(体内)合成RNAi剂，如siRNA或shRNA。在一个实施方案中，两条独立的互补siRNA链可使用包含两个启动子的单一载体转录，两个启动子中的每一个指导单一siRNA链的转录(即每个启动子可操作地与siRNA的模板连接，使得转录可以发生)。两个启动子可以在相同的方向上，在这种情况下，每个启动子可操作地与互补siRNA链之一的模板连接。可选地，两个启动子可以在相反的方向上，其侧翼于单一模板，使得启动子的转录导致两个互补siRNA链的合成。在另一个实施方案中，RNAi表达载体可包括一个启动子，该启动子驱动包括两个互补区域的单一RNA分子的转录，使得转录物形成shRNA。

本领域的技术人员将了解，在体内通过多于一个的转录单元的转录来产生siRNA和shRNA剂是优选的。一般而言，用来指导一个或多个siRNA或者shRNA转录单元在体内表达的启动子可以是RNA聚合酶III(Pol III)启动子。某些Pol III启动子，如U6或者H1启动子，不需要转录区域内的顺式作用调控元件(cis-acting regulatory element)，因此，在某些实施方案中是优选的。在其他的实施方案中，Pol II启动子可用于驱动一个或多个siRNA或shRNA转录单元的表达。在一些实施方案中，可以使用组织特异性的、细胞特异性的或者可诱导的Pol II启动子。

可使用标准重组DNA方法生产提供合成siRNA或shRNA模板的构建体，并插入适于在真核细胞中表达的多种不同载体中的任一种。指导可参阅最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology；Ausubel等，John Wiley & Sons，New York，2003)或分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Sambrook & Russell，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，第3版，2001)。本领域的技术人员还了解，载体可包括附加的调控序列(例如，终止序列、翻译控制序列等)，以及选择性标记序列。本领域已知DNA质粒，包括基于pBR322、PUC的那些，等等。由于许多表达载体已经包含了适当的一个或多个启动子，可能只需要在相对于启动子的适当位置插入编码感兴趣的RNAi剂的核酸序列。病毒载体也可用于提供RNAi剂的细胞内表达。适当的病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体，等等。在优选的实施方案中，RNAi表达载体是shRNA的基于慢病毒的载体或慢病毒粒子，例如，

TRC shRNA产品(Sigma-Aldrich)中所提供的。

RNAi剂或RNAi表达载体可用本领域技术人员熟知的方法引入细胞。指导可参阅，例如Ausubel等，见上或Sambrook & Russell，见上。在一些实施方案中，RNAi表达载体，例如，病毒载体，可稳定地整合到细胞的基因组中，使得后续的细胞后代中的唾液酸酶表达被破坏。

(ii)基因靶向

在其他的实施方案中，可使用同源重组技术来破坏基因组DNA水平上的唾液酸酶表达。因此，这些技术可以用来删除核酸序列，删除核酸序列的一部分，或在核酸序列中引入点突变，使得没有功能产品可以被合成。在一个实施方案中，可通过使用Capecchi(Cell 22：4779-488，1980)和Smithies((Proc Natl Acad Sci USA 91：3612-3615，1994))的技术的同源重组来靶向核酸序列。在其他的实施方案中，可使用Cre-loxP位点特异性重组系统，FIp-FRT位点特异性重组系统，或其变型来靶向核酸序列。这种重组系统是商业可得的，并且更多的指导可参阅Ausubel等，见上。在另一个实施方案中，可使用锌指核酸酶(ZFN)介导的基因靶向(Sangamo Biosciences，Richmond，CA)来靶向基因。简单地说，ZFN是合成的蛋白质，其包括与FokI限制性内切核酸酶的切割结构域融合的设计的锌指DNA结合结构域。ZFN可用于诱导特定DNA序列中的双链断裂，从而促进基因组序列的位点特异性同源重组和靶向操控。ZFN可经过设计以便靶向任何感兴趣的DNA序列。

(iii)测量受破坏的表达

上述RNAi和基因靶向方法，通常将导致唾液酸酶基因的降低的表达，因而导致降低的唾液酸酶活性。因此，所述细胞通常将具有降低水平的唾液酸酶mRNA和/或唾液酸酶蛋白。可使用本领域已知的多种方法来测量mRNA水平、蛋白质水平或酶活性。RNA检测方法的非限制性例子包括逆转录酶PCR、逆转录酶定量PCR、核酸微阵列、基于杂交的方法、支链DNA检测技术、Northern印迹和核酸酶保护测定。蛋白质检测方法的非限制性例子包括蛋白质印迹法、ELISA测定和其他免疫测定。每种唾液酸酶可逐一检测或者全部三个可同时检测，这取决于这些检测测定中所用探针的特异性。然而，与特异性无关，可通过将具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞中的(mRNA和/或蛋白质的)水平与未处理细胞中的水平进行比较而确定表达水平的降低。优选地，唾液酸酶表达的降低导致细胞中(例如，在从细胞获得的溶胞产物中)，培养所述细胞的培养基中或两者中的唾液酸酶活性的降低。唾液酸酶的活性，可使用本领域中各种已知的唾液酸酶测定来测量。例如，唾液酸酶的活性可使用实施例2中所述的测定来测量。

在一些实施方案中，相对于未处理细胞，唾液酸酶mRNA的水平可能降低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10,000倍。在其他的实施方案中，相对于未处理的细胞，唾液酸酶蛋白的量可能降低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10,000倍。此外，唾液酸酶活性可降低未处理细胞值的20％-50％，50％-60％，60％-70％，70％-80％，80％-90％，或90％-100％。

(c)优选的实施方案

优选地，包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞系，来源于CHO细胞系。在一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：2组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：4组成的唾液酸酶的受破坏的表达。还有另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ)ID NO：2和SEQ ID NO：4组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在进一步的实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个可选的实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。优选地，唾液酸酶的表达通过RNAi破坏。

(III)生产具有增强的唾液酸化作用的糖蛋白的方法

本发明的另一个方面提供了一种生产包括增强的唾液酸化作用的糖蛋白的方法。一般而言，该方法包括在细胞中表达编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列，所述细胞包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的核酸序列的受破坏的表达，其中细胞产生的糖蛋白具有增加的唾液酸化作用。在其他的实施方案中，该细胞还包括编码细胞质唾液酸酶的核酸的受破坏的表达。本发明方法中适用的唾液酸酶受到破坏的细胞在上文第(II)部分中描述。

相比于唾液酸酶表达未改变的对照细胞(例如，唾液酸酶被破坏的细胞所源自的亲代细胞)所产生的糖蛋白，具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产生的糖蛋白通常将具有更高水平的唾液酸化作用。具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用，可能比对照细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用高至少约10％。在一些实施方案中，具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用，可能比对照细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用高约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500％。在其他的实施方案中，具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用，可能比对照细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用高约500％以上。

在一些实施方案中，用于生产糖蛋白的唾液酸酶受到破坏的细胞可能已经表达了感兴趣的糖蛋白。例如，糖蛋白对细胞而言可能是内源性的；据此编码糖蛋白的核酸存在细胞的基因组中。可选地，糖蛋白对细胞而言可能是外源性的，并且编码糖蛋白的核酸序列可能已稳定地整合到细胞的染色体上。如上第(II)(a)部分所述，具有商业上可得的表达外源糖蛋白的细胞系。例如，CHO细胞系，即CHO-hIFNγ，稳定地表达了人干扰素γ。

在其他的实施方案中，用于生产糖蛋白的唾液酸酶受到破坏的细胞可能不表达感兴趣的糖蛋白。在这种情况下，唾液酸酶受到破坏的细胞中可引入编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列。编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列，可稳定地整合到唾液酸酶受到破坏的细胞的基因组中。可选地，编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列，可瞬时引入唾液酸酶受到破坏的细胞中。换一种说法，编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列可能是染色体外的。本领域的技术人员熟悉将核酸引入细胞的合适载体和方法。此外，指导可参阅Ausubel等，见上或Sambrook & Russell，见上。

可由唾液酸酶受到破坏的细胞产生的糖蛋白的例子包括：生长因子、生长因子受体、细胞因子、白细胞介素和其他免疫系统蛋白、干扰素、红细胞生成素、整合蛋白、地址素、选择蛋白、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白、单克隆抗体、可溶性主要组织相容性复合体抗原、酶(例如，组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解酶、促类固醇生成酶、激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素等)、激素或肽受体、结合蛋白、转录因子、翻译因子、癌蛋白质或原癌蛋白质、肌蛋白、脊髓蛋白(myeloprotein)、神经活性蛋白、肿瘤生长抑制蛋白、抗败血症蛋白、结构蛋白和血液蛋白(例如，凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、蛋白C、血管假性血友病因子(von Willebrand factor)等)。在一些实施方案中，糖蛋白可包括肽标签，如抗体表位标签(例如，FLAG标签、HA标签、myc标签、6xHis标签等)，在其他实施方案中，糖蛋白可以是包括来自感兴趣的糖蛋白的第一结构域和来自另一种感兴趣的蛋白质的第二结构域的融合蛋白，其中两个结构域或融合在一起，或由一个或多个另外的结构域隔离。例如，第一结构域可包括免疫球蛋白结构域或其一部分，而第二结构域可包括非免疫球蛋白多肽。多肽或其一部分可以是天然存在的多肽，可以是天然存在的多肽的改造或改变的形式，或者可以是人工或人造的多肽。

该方法还包括，在糖蛋白产生条件下培养唾液酸酶受到破坏的细胞。本领域的技术人员将会了解，培养特定类型细胞的适当条件。在一些实施方案中，所述细胞可在生产少量糖蛋白(例如，毫克-克)的小型容器中生长。在其他的实施方案中，所述细胞可在生产大量糖蛋白(如，千克数量)的大型生物反应器中维持。一般而言，相对于唾液酸酶表达未被破坏的相同类型的细胞所产生的相同的糖蛋白，由唾液酸酶受到破坏的细胞所产生的糖蛋白将具有增强的唾液酸化作用。与感兴趣的糖蛋白轭合的唾液酸的量，可通过本领域已知的几个测定之一或使用商用试剂盒测量。

经过一段时间后，通常将收集细胞和/或培养基，并可以从中纯化感兴趣的糖蛋白。适当的纯化方法包括亲和色谱、免疫亲和色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、沉淀、透析，以及它们的组合。参见，例如，Roe(编辑)，Protein Purification Techniques：A Practical Approach(蛋白质纯化技术：一种实用方法)，Oxford University Press，第二版，2001。熟练的技术人员将能够选择适用于感兴趣的特定糖蛋白的方法。

(IV)试剂盒

本发明还有一个方面包括试剂盒，该试剂盒用于产生包括增强的唾液酸化作用的糖蛋白。通常地，试剂盒包括本发明的细胞系，其中细胞系包括至少一种非细胞质唾液酸酶的受破坏的表达。在一些实施方案中，该细胞系还可包括细胞质唾液酸酶的受破坏的表达。适用于本发明试剂盒的唾液酸酶受到破坏的细胞在上文第(II)部分中描述。该试剂盒还可包括使用说明书。

在一个实施方案中，该试剂盒还可包括培养唾液酸酶受到破坏的细胞的适当的培养基。在另一个实施方案中，该试剂盒还可包括将编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列引入唾液酸酶受到破坏的细胞的构建体(例如，质粒、病毒等)。在另一个实施方案中，该试剂盒也还可包括用于检测和/或纯化本发明中细胞所产生的糖蛋白的试剂。合适试剂的非限制性例子包括PCR引物、多克隆抗体、单克隆抗体、亲和色谱介质、免疫亲和色谱介质，及类似试剂。

在优选的实施方案中，该试剂盒包括CHO细胞系，所述细胞系包括受破坏的唾液酸酶表达。在一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：2组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：4组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在进一步的实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个可选的实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。优选地，唾液酸酶的表达通过RNAi破坏。

定义

为方便理解本发明，下面定义了一些术语。

本文中所使用的术语“互补”是指双链核酸通过特定的氢键进行碱基配对(即5’-AGTC-3’与互补序列3’-TCAG-5’配对)的缔合。两个单链分子可能完全互补，即所有的碱基对是互补的，并且没有错配。可选地，两个单链分子可能大体互补，即至少一个错配存在于两条链之间。

本文中所使用的短语“受破坏的表达”，是指编码多肽的核酸序列的操控使得没有合成多肽(即敲除)或以降低的水平合成多肽(即敲低)。表达可能会在几个水平受到破坏。例如，编码多肽的DNA可能会被改变，使得没有功能信使RNA，和因此，没有功能蛋白被合成。可选地，信使RNA可能受到影响，使得不能合成多肽或者以降低的水平合成多肽。

本文中所使用的术语“杂交”，指的是在包括两个互补的单链核酸分子的碱基之间进行氢键合或碱基配对以形成双链杂合体或双链体的过程。“杂交”的严格性通常由温度和离子强度条件确定。核酸杂合体稳定性一般以解链温度或Tm表示，这是杂合体在确定条件下有50％变性的温度。对方程式进行推导以便估算给定杂合体的Tm；该方程式考虑了核酸中的G+C含量、杂合体的性质(如DNA:DNA，DNA:RNA等)、核酸探针的长度等(参见，例如，Sambrook和Russell，见上)。本领域技术人员应了解，在基于杂交的反应过程中操控哪一个参数来优化杂交。然而，在一些基于杂交的反应中，如聚合酶反应、扩增反应等，反应温度通常决定了杂交的严格性。此外，温度通常还决定体内反应过程中的杂交严格性。

本文中所使用的术语“同一性”或“同一的”，是指当比对最大一致性时，两个核苷酸序列或两个氨基酸序列相同的程度。核苷酸序列之间的最优比对和百分比同一性可采用Altschul等人的BLASTN算法(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)确定；而两个氨基酸序列之间的最优比对和百分比同一性可采用Karlin和Altschul的BLASTP算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268，1993)确定。在NCBI网站上，这些算法被纳入BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)描述的使用缺口BLAST。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，使用各自程序的默认参数。序列同一性的百分比通过在比较窗口内比较两个优化比对的序列而确定，其中比较窗口中的序列部分与用于两个序列最优比对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，可包括添加或缺失(即缺口)。所述百分比通过以下来计算：确定两个序列中相同核苷酸出现的位置数以获得匹配位置数，将匹配位置数除以在比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。

术语“核酸”是指包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。该核苷酸可以是标准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(如肌苷)或非天然存在的核苷酸。对核苷酸的糖或碱基部分修饰的非限制性例子包括添加(或去除)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基，以及使用其他原子取代碱基的碳原子和氮原子(例如，7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括二脱氧核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代核苷酸(morpholinos)。核苷酸可通过磷酸二酯键、硫代磷酸酯(phosphothioate)键、亚磷酰胺键或磷酰二胺(phosphorodiamidate)键相连接。

“唾液酸酶”是催化末端唾液酸残基从糖轭合物如糖蛋白水解的一组酶。唾液酸酶也被称为外-α-唾液酸酶(exo-α-sialidase)、神经氨酸酶或乙酰神经氨酸酶。

当引用本发明或其优选实施方案中的元素时，冠词″一(a)″、″一(an)″、″该(the)″和″所述(said)″旨在说明有一种或多种元素。术语″包括(comprising)″、″包括(including)″和″具有(having)″预期为包容性的，说明除了列出的元素还有其他元素。

已详细描述了本发明，明显的是修饰和改变是可能的，而不背离所附权利要求中定义的本发明的范围。

实施例

包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该了解，下面实施例中所公开的技术代表了本发明人所发现的在本发明的实施中良好运作的技术。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应该意识到，所公开的具体实施方案中可以进行很多变化，且仍得到相似或类似结果，而不背离本发明的精神和范围，因此，所有提到的内容将被解释为说明性的，而不是限制性的含义。

实施例1.CHO细胞中另外的唾液酸酶基因的分离。

已在人、小鼠和大鼠中鉴定出四种唾液酸酶基因(Neu1、Neu2、Neu3和Neu4)，并已良好表征。这些唾液酸酶表现出不同的酶活性、底物偏好和亚细胞位置。然而，到目前为止，只有一种唾液酸酶基因已在CHO细胞中表征。这种基因编码细胞质唾液酸酶(即Neu2)(Gramer MJ，Goochee CF.(1993)Biotechnol Prog，9：366)。本研究的目的是确定CHO细胞是否包含其他唾液酸酶基因。

采用RT-PCR、5’/3’RACE(cDNA末端的快速扩增)和其他标准方法，从CHO细胞中分离和克隆了其他三种唾液酸酶基因。CHO Neu1编码具有410个氨基酸残基的蛋白质，而CHO Neu3编码具有417个氨基酸残基的蛋白质(表1)。另一方面，CHO Neu4似乎是CHO细胞中的假基因。Neu1和Neu3两者与其他物种中的其对应物享有高度相似性(表2)。

表1.CHO细胞中新唾液酸酶的特性

	cDNA	SEQ ID NO：	蛋白质	SEQ ID NO：
					Neu1	1463bp	1	410aa	2
Neu3	1833bp	3	417aa	4

表2.唾液酸酶蛋白之间的百分比相似性

CHO唾液酸酶	人唾液酸酶	小鼠唾液酸酶	大鼠唾液酸酶
				Neu1(SEQ ID NO：2)	86.5％	95.4％	95.6％
Neu2	77.1％	86.5％	87.1％
				(SEQ ID NO：5)
Neu3(SEQ ID NO：4)	76.8％	81.1％	83.3％

实施例2.CHO Neu1和CHO Neu3是唾液酸酶

进行酶促唾液酸酶活性研究，以证实由CHO细胞中有预期功能的这两种新基因编码的蛋白质。简言之，Neu1基因(SEQ ID NO：1)的编码区和Neu3基因(SEQ ID NO：3)的编码区，以及以前报道的Neu2基因(Ferrari等.(1994)Glycobiology 4(3)：367-373)的编码区被克隆入pcDNA3.1哺乳动物表达载体。然后，该表达构建体转染入COS7细胞，以过表达唾液酸酶蛋白。单独的pcDNA3.1载体也转染入COS7细胞作为模拟转染。含绿色荧光蛋白(GFP)的表达构建体共转染入COS7细胞，以标准化转染效率。

转染24小时后，通过超声溶解细胞。细胞碎片在4℃，1000×g下离心10min除去，收集上清液部分用于酶活性。如前所述(Gramer等.(1993)Biotechnol Prog 9：366-373)，使用1mM的4-甲基伞形酮-Neu5Ac作为底物，进行唾液酸酶测定。对于每个溶胞产物，100μg蛋白质被用于测定。该测定进行三次。在使用GFP读数标准化后，CHO Neu1和Neu3蛋白质相比于阴性对照(模拟转染)和阳性对照(Neu2)，有显著的唾液酸酶活性(图1)。事实上，Neu3蛋白质具有Neu2活性约6-15倍以上的活性。

为了进一步考察这些唾液酸酶蛋白的活性，在两种浓度的两种不同唾液酸酶抑制剂(Neu5Ac和Neu5AC2en)存在下，进行了唾液酸酶测定。如图2所示，Neu5Ac2en对所有唾液酸酶具有比Neu5Ac强的抑制作用。使用CHONeu3为例，0.1mM Neu3Ac2en降低活性约30％，而0.5mM Neu3Ac2en降低活性约60％。这些数据表明，新鉴定的CHO基因(Neu1和Neu3)编码唾液酸酶。

实施例3.CHO唾液酸酶的亚细胞定位

为鉴定这两个新CHO唾液酸酶的亚细胞位置，进行了使用共聚焦扫描显微镜技术的免疫细胞化学。概括地讲，编码8个氨基酸残基(DYKDDDDK)的Flag标签被克隆到Neu表达构建体的3’-末端，以表达带有Flag标签的融合蛋白。带有Flag标签的构建体转染入COS7细胞。转染24小时后，使用标准程序进行细胞免疫染色。

结果示于图3。唾液酸酶的亚细胞位置由FITC轭合的抗FLAG抗体产生的绿色荧光表示。转染的细胞也用细胞器标志物进行免疫染色：在图3中，溶酶体标志物(Lyso Tracker DND-99)由红色荧光表示，和质膜标志物(麦胚凝集素647)由蓝色信号表示。本研究显示，Neu1位于溶酶体；其染色模式几乎与溶酶体标志物的染色模式一样。Neu3位于质膜，以与质膜标志物染色模式相似的方式。此外，阳性对照Neu2显示了所预期的细胞质染色。

实施例4.采用siRNA技术的基因沉默

采用小干扰RNA(siRNA)技术，敲低三种CHO唾液酸酶基因的每一种的表达。根据cDNA序列，设计并合成了几个针对CHO唾液酸酶基因(Neu1、Neu2和Neu3)的每种基因的siRNA。序列示于表3。这些siRNA转染入稳定表达人干扰素γ的CHO细胞系(CHO-hIFNγ)。该转染重复操作两次。转染48小时后，收获细胞。RNA和蛋白质从转染细胞中分离。使用标准程序，进行了利用基因特异性引物的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和定量RT-PCR(O-RT-PCR)。

*大写字母表示19 nt siRNA序列，小写字母表示3’突出端。

如图4所示，RT-PCR分析表明，每组siRNA中的至少两种能够降低每个基因的mRNA表达。Neu1-S2、Neu1-S3和Neu1-S4降低了Neu1 mRNA的表达，Neu2-S2和Neu2-S3降低了Neu2 mRNA的表达，而Neu3-S1和Neu3-S2降低了Neu3 mRNA的表达。定量逆转录酶(Q-RT)PCR分析表明，与靶向不相关核酸序列(GFP核酸序列)的对照siRNA相比，针对CHO唾液酸酶基因的siRNA显著地降低了mRNA的表达水平(即～70％-95％)(图5)。Neu1 mRNA表达降低了约90％(图5A)；Neu2 mRNA表达降低了约70-85％(图5B)和Nue3 mRNA表达降低了约95％(图5C)。

为了进一步证实蛋白质水平上的基因沉默效应，进行了唾液酸酶活性测定。粘附CHO-hIFNγ细胞悬浮在化学成份确定且不合动物组分的培养基中。上述鉴定的阳性siRNA通过电穿孔转染入CHO-hIFNγ细胞的悬浮液，重复两次。为了研究潜在的协同基因沉默效应，每种Neu基因单独和组合(即两种或三种基因沉默)沉默。转染72小时后，收获细胞，并用预冷的1X PBS缓冲液洗涤。总RNA和蛋白质，从siRNA转染的细胞中分别分离。如上所述，总RNA用于逆转录(和Q-RT PCR)。蛋白质用于体外唾液酸酶活性测定，如实施例2中详述。与对照(亲代CHO-hIFNγ细胞和GFP siRNA转染的细胞)相比，单个siRNA和siRNA组合都显著降低了唾液酸酶的活性(图6)。最有趣的是，针对Neu1和Neu3的siRNA的组合显著降低唾液酸酶活性至不可检测的水平。

实施例5.利用shRNA技术的稳定的基因沉默

根据实施例4显示的Neu mRNA和唾液酸酶的活性可使用siRNA敲低的结果，用shRNA技术平台(Mission：RNAi^TM，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)稳定地敲低CHO hIFNγ细胞中Neu基因的表达。

将编码每种唾液酸酶基因(Neu1-S4、Neu2-S3、Neu3-S2)的有效siRNA的DNA片段克隆到pLKO.1-puro shRNA表达载体。DNA测序确认后，质粒DNA转染入HEK293细胞，以产生包装有shRNA盒的慢病毒。使用含shRNA盒的慢病毒感染CHO-hIFNγ细胞悬浮液和进行嘌呤霉素选择后，获得了携带Neu1、Neu2和Neu3基因shRNA盒的CHO-hIFNγ细胞。进行Q-RTPCR来证实在mRNA水平上的基因沉默效应(图7)。在Neu1-shRNA细胞中，Neu1(Neu1-S4)的mRNA表达敲低超过95％(图7A)，在Neu2-shRNA细胞中，Neu2(Neu2-S3)的敲低为约50％(图7b)，而在Neu3-shRNA细胞中，Neu3(Neu3-S2)的敲低超过70％(图7C)。

如上所详述的，通过测量唾液酸酶活性，还在蛋白质水平证实了基因敲低效应。与对照(非靶向shRNA)相比，针对所有三种唾液酸酶基因的shRNA显著降低了CHO-hIFNγ细胞中唾液酸酶的活性(见图8)。携带Neu3-S2shRNA的细胞具有最显著的唾液酸酶活性的降低。

为了评估shRNA是否影响细胞生长和/或蛋白质的生产，分析了这些CHO-shRNA细胞的生长及其对人干扰素γ蛋白的生产。简言之，以～200,000细胞/毫升活细胞密度将细胞接种于补充有4mM谷氨酰胺的培养基(化学成分确定且不含动物组分)中。细胞生长测定重复进行两次。细胞在37℃，含5％CO₂的5L生物反应器中培养。在适当的时间点，收集培养基样品用于进行蛋白质分析。

5L生物反应器细胞生长数据表明，相比于非靶向shRNA对照细胞，无shRNA负面影响细胞生长(图9)。人IFNγ的生产使用人IFNγELISA试剂盒(eBioscience，San Diego，CA)测量。如图10所示，相比于非靶向对照细胞，无shRNA负面影响蛋白质生产。事实上，通过一些唾液酸酶shRNA靶向细胞生产高水平的人类IFNγ蛋白。采用250毫升摇瓶得到了相似的结果(数据未显示)。

实施例6.CHO Neu基因的沉默产生了具有增加的唾液酸含量的糖蛋白

通过HPLC，分析了唾液酸酶shRNA靶向细胞和非靶向shRNA对照细胞所产生的人IFNγ蛋白中的唾液酸水平。废培养基样品收集自5L生物反应器培养物的稳定期(第6天，细胞生存力约95％)和死亡期(第13天，细胞生存力约20％)。通过免疫亲和纯化从细胞培养上清液纯化人干扰素γ蛋白。简言之，经离心和过滤除去细胞碎片后，将30毫升蛋白质样品负载到与hIFNγ抗体轭合的亲和柱上。洗涤柱后，hIFNγ蛋白用洗脱缓冲液洗脱。在AKTA Explorer 100色谱系统(Amersham Biosciences)上进行纯化。纯化的蛋白通过ELISA定量，如前所述。

通过HPLC对纯化的hIFNγ蛋白的唾液酸化作用进行分析。简言之，将50μg纯化的hIFNγ蛋白样品冷冻干燥，并重新悬浮于含有2N乙酸的100μl超纯水中。该样品在80℃水解3小时。之后，过滤样品，并快速真空干燥(speed-vac dried)。释放的唾液酸残基用荧光化合物1，2-二氨基-4，5-(亚甲二氧基)苯(DMB)衍生化，然后用C18反相柱进行HPLC。

数据示于图11。在第6天，由Neu1和Neu2shRNA CHO细胞产生的hIFNγ蛋白质中的唾液酸水平，与非靶向shRNA对照无显著差异(图11A)。虽然Neu2shRNA细胞中的唾液酸水平似乎略高，但不显著(Neu2：1.945±0.111pmol唾液酸/pmol hIFNγvs.非靶向：1.600±0.090pmol唾液酸/pmol hIFNγ，p＝0.0528，n＝4)。然而，与来自对照细胞的蛋白相比，来自Neu3 shRNA CHO细胞的hIFNγ蛋白的唾液酸含量显著提高(Neu3：2.133±0.101pmol唾液酸/pmol hIFNγvs.非靶向：1.600±0.090pmol唾液酸/pmol hIFNγ，p＜0.01，n＝4)。

在第13天，由Neu1shRNA CHO细胞产生的hIFNγ的唾液酸化作用没有明显改善。然而，Neu2细胞(Neu2：4.948±0.150pmol唾液酸/pmol hIFNγ，vs.非靶向：4.113±0.113pmol唾液酸/pmol hIFNγ，p＜0.01，n＝4)和Neu3细胞(Neu3：5.175±0.414pmol唾液酸/pmol hIFNγ，vs.非靶向：4.113±0.113pmol唾液酸/pmol hIFNγ，p＜0.05，n＝4)产生的hIFNγ蛋白中的唾液酸水平提高了(图11B)。由Neu3和Neu2 shRNA CHO细胞产生的人干扰素γ蛋白的唾液酸化作用的提高表明，唾液酸酶基因(Neu3和Neu2)的下调降低了总唾液酸酶的活性，因而降低了CHO细胞产生的重组蛋白中的唾液酸水平。这些实施例表明，采用RNA干扰平台的靶向基因沉默，是一种提高蛋白质糖基化的有效途径。

序列表

<110>西格玛-奥德里奇公司

张民

詹姆士·罗斯

<120>提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法

<130>47497-129808

<150>US 60/979,483

<151>2007-10-12

<160>19

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>1463

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>1

ggggcgagca atggtggcgg cagcacagcc gagcagaccc cgggggccgc cgagcggctg 60

ggcgagccgt cggggtcagg tgctcgcagc gctcttcctg ctgctggcgt ccgtggcggg 120

atccgaggcc agggtgcaag acgacttcag tctggtgcag ccgctggtga ccatggagca 180

gctgctgtgg gtgagcggga ggcagatcgg ctcggtggac actttccgca tcccgctcat 240

caccgccacc cctcggggca cgctcctcgc cttcgccgag gccaggaaaa cgtctgcctc 300

cgatgagggg gccaagttca tcgccatgag gaggtccacg gaccagggta gtacatggtc 360

ctcgacagcc ttcatcgtag acgatgggga ggcctccgac gggctgaacc tgggggccgt 420

ggtgaacgac gtggacacag gggtggtgtt ccttatctat accctgtgtg ctcacaaggt 480

caactgccag gtggcctcca ccatgttggt gtggagtaaa gacgatggca tttcctggag 540

cccaccccgg aatctctccg tggacattgg cacagaaatg tttgcccctg gaccaggctc 600

tggcattcag aaacagcggg agcctcggaa gggccggctc attgtgtgtg gccatgggac 660

gctggaacga gatggagtct tttgtctcct cagtgatgac cacggtgcct cgtggcacta 720

cgggactgga gtgagcggca ttcccttcgg ccagcccaaa cacgagcacg atttcaaccc 780

cgacgagtgc cagccctacg agcttccaga tggctctgtc atcatcaatg cccggaacca 840

gaacaactac cattgccgct gcaggatcgt cctccgcagc tatgatgcct gcgataccct 900

caggccccgg gatgtaacct tcgaccccga gctggtggac cctgtggtag cagcaggagc 960

attagccacc agctcaggca ttgtcttctt ctccaatcca gcccatcctg agttccgagt 1020

gaacctgacc ctgcgctgga gcttcagcaa cggtacgtcc tggcagaagg agagagtcca 1080

ggtgtggccg ggacccagcg gctactcgtc cctgactgcc ctggaaaaca gcacggaggg 1140

agagcagcag cccccgcagc tgttcgttct gtacgagaag ggcctgaacc agtacaccga 1200

gagcatctcc atggtgaaaa tcagtgtcta cggcacgctc tgagccccac cggcgcccaa 1260

ggacactacg cgtcatctga cctcacggct ctctcgaggg gctgcagaaa gggcctgaag 1320

cacagctctt cctcgggatg ctagcctttt gcagagcagt ttctctttaa cagggaagcc 1380

actccgttag gacctaacag ctgcccagct gcctctccca gacaggaagt tcctccctca 1440

ccaagagcac tttgtagaag gct 1463

<210>2

<211>410

<212>PRT

<213>中国仓鼠

<400>2

Met Val Ala Ala Ala Gln Pro Ser Arg Pro Arg Gly Pro Pro Ser Gly

1 5 10 15

Trp Ala Ser Arg Arg Gly Gln Val Leu Ala Ala Leu Phe Leu Leu Leu

20 25 30

Ala Ser Val Ala Gly Ser Glu Ala Arg Val Gln Asp Asp Phe Ser Leu

35 40 45

Val Gln Pro Leu Val Thr Met Glu Gln Leu Leu Trp Val Ser Gly Arg

50 55 60

Gln Ile Gly Ser Val Asp Thr Phe Arg Ile Pro Leu Ile Thr Ala Thr

65 70 75 80

Pro Arg Gly Thr Leu Leu Ala Phe Ala Glu Ala Arg Lys Thr Ser Ala

85 90 95

Ser Asp Glu Gly Ala Lys Phe Ile Ala Met Arg Arg Ser Thr Asp Gln

100 105 110

Gly Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Phe Ile Val Asp Asp Gly Glu Ala

115 120 125

Ser Asp Gly Leu Asn Leu Gly Ala Val Val Asn Asp Val Asp Thr Gly

130 135 140

Val Val Phe Leu Ile Tyr Thr Leu Cys Ala His Lys Val Asn Cys Gln

145 150 155 160

Val Ala Ser Thr Met Leu Val Trp Ser Lys Asp Asp Gly Ile Ser Trp

165 170 175

Ser Pro Pro Arg Asn Leu Ser Val Asp Ile Gly Thr Glu Met Phe Ala

180 185 190

Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ile Gln Lys Gln Arg Glu Pro Arg Lys Gly

195 200 205

Arg Leu Ile Val Cys Gly His Gly Thr Leu Glu Arg Asp Gly Val Phe

210 215 220

Cys Leu Leu Ser Asp Asp His Gly Ala Ser Trp His Tyr Gly Thr Gly

225 230 235 240

Val Ser Gly Ile Pro Phe Gly Gln Pro Lys His Glu His Asp Phe Asn

245 250 255

Pro Asp Glu Cys Gln Pro Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Ser Val Ile Ile

260 265 270

Asn Ala Arg Asn Gln Asn Asn Tyr His Cys Arg Cys Arg Ile Val Leu

275 280 285

Arg Ser Tyr Asp Ala Cys Asp Thr Leu Arg Pro Arg Asp Val Thr Phe

290 295 300

Asp Pro Glu Leu Val Asp Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Leu Ala Thr

305 310 315 320

Ser Ser Gly Ile Val Phe Phe Ser Asn Pro Ala His Pro Glu Phe Arg

325 330 335

Val Asn Leu Thr Leu Arg Trp Ser Phe Ser Asn Gly Thr Ser Trp Gln

340 345 350

Lys Glu Arg Val Gln Val Trp Pro Gly Pro Ser Gly Tyr Ser Ser Leu

355 360 365

Thr Ala Leu Glu Asn Ser Thr Glu Gly Glu Gln Gln Pro Pro Gln Leu

370 375 380

Phe Val Leu Tyr Glu Lys Gly Leu Asn Gln Tyr Thr Glu Ser Ile Ser

385 390 395 400

Met Val Lys Ile Ser Val Tyr Gly Thr Leu

405 410

<210>3

<211>1833

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>3

gcgcgtgggc gtggcgtcac ttcagcacgg cgcggtctct ctttcctgcc agctcctgct 60

cagagttgtc agggtctgtc tccgcgtcag tggtttccgt ctccgcttcc ctgcctccat 120

cgccccagcc cttctgcagg tcctcctccg agacctcaag gagagctcag aagccagaga 180

cactagagcc gaagtcatgg aagaagtatc agcctgctcc ctcaacagca ctctgttcca 240

gcaggaacac cagaaaggga ccacctaccg gattccagcg ctgctctaca tccctcccag 300

ccacaccttc ctggcctttg cagagaagcg ttcctcaagc aaagacgtag atgctctcca 360

cctggtgctc aggcgagggg tgatgaaggg ccactctgta gagtggggac ccctgcagcc 420

actgatggaa gccacattgc ctgggcatcg gaccatgaac ccctgccctg tatgggagca 480

gagtaccagc cgtgtgttac tgtttttcat ctgtgtgcca gaccgtgtta ctgaacattg 540

gcagattagg tcaggcaaga atgccgcccg tctctgcttc ctgtgcagtc aggatgctgg 600

gtgctcatgg ggtgaagtga aggacttgac tgaggaggtc attggctcag agttgaagca 660

ctgggccaca tttgctgtgg gcccaggcca tggcatccgg ctgcagtcag gaaggctgat 720

cattcccacc tacgcctact atttctcatg caggttcctc tgcttcccgt gttcagtcaa 780

gccccattcc ctgatgatct acagtgatga cttaggagtc acatggcacc atggcaagct 840

cattgggccc caggtgacag gggagtgcca agtggcagaa gtgactggga cgtctggtaa 900

ccttgtgctc tactgcaatg cccggacacc aaacagattc cgagcagaat cttttagtac 960

tgattacggt gactgttttc agaaaccaac cctgaacaca caactctgtg agccccgcta 1020

tggctgccaa ggcagtatag tgagcttcca gcccttgaag atgccattct cacaagaccc 1080

aattggtaaa gctgctccca ctactcagaa gagccctctg ctggacagtt ttctggagcg 1140

ggaggaagga gttggaagac catcaggaac atggctcttg tactcacatc caactagcaa 1200

gaagcggaga attaacctgg gcatctacta caaccggaac cccttggagg tgacctgctg 1260

gtcccgccct tggatcttgc actgtgggcc ctgtggctac tctgatctgg ctgttgtgga 1320

agagcagggc ttatttgcat gtttgtttga atgtgggcag gagcatgagt gtgagcagat 1380

tgccttccgt ctattttcag tccaagaggt tttgagctgt gaagactgca ctggccctag 1440

tagggactaa agccaaatca agcccgatgg gtgaggaccc aactttcctc agaagtgaat 1500

tccaagaggt tttgagctgt gaagactgca ctggccctag tagggactaa agccaaatca 1560

agcccgatgg gtgaggaccc aactttcctc agaagtgaat ccaagagaaa tgtgtgcctt 1620

atcttacaca gcaataaggg tgttgaactg ggagcttgga gacaatggtg tggttttggc 1680

ttgctttagg actgtggata tatcccctga actctgggca tcaggtctcc atttgtaaaa 1740

tgacaagggt ggtttgtgat ttcttgtctt cccattaaaa ggagtgttca cttcttgtcc 1800

cacgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1833

<210>4

<211>417

<212>PRT

<213>中国仓鼠

<400>4

Met Glu Glu Val Ser Ala Cys Ser Leu Asn Ser Thr Leu Phe Gln Gln

1 5 10 15

Glu His Gln Lys Gly Thr Thr Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Tyr Ile

20 25 30

Pro Pro Ser His Thr Phe Leu Ala Phe Ala Glu Lys Arg Ser Ser Ser

35 40 45

Lys Asp Val Asp Ala Leu His Leu Val Leu Arg Arg Gly Val Met Lys

50 55 60

Gly His Ser Val Glu Trp Gly Pro Leu Gln Pro Leu Met Glu Ala Thr

65 70 75 80

Leu Pro Gly His Arg Thr Met Asn Pro Cys Pro Val Trp Glu Gln Ser

85 90 95

Thr Ser Arg Val Leu Leu Phe Phe Ile Cys Val Pro Asp Arg Val Thr

100 105 110

Glu His Trp Gln Ile Arg Ser Gly Lys Asn Ala Ala Arg Leu Cys Phe

115 120 125

Leu Cys Ser Gln Asp Ala Gly Cys Ser Trp Gly Glu Val Lys Asp Leu

130 135 140

Thr Glu Glu Val Ile Gly Ser Glu Leu Lys His Trp Ala Thr Phe Ala

145 150 155 160

Val Gly Pro Gly His Gly Ile Arg Leu Gln Ser Gly Arg Leu Ile Ile

165 170 175

Pro Thr Tyr Ala Tyr Tyr Phe Ser Cys Arg Phe Leu Cys Phe Pro Cys

180 185 190

Ser Val Lys Pro His Ser Leu Met Ile Tyr Ser Asp Asp Leu Gly Val

195 200 205

Thr Trp His His Gly Lys Leu Ile Gly Pro Gln Val Thr Gly Glu Cys

210 215 220

Gln Val Ala Glu Val Thr Gly Thr Ser Gly Asn Leu Val Leu Tyr Cys

225 230 235 240

Asn Ala Arg Thr Pro Asn Arg Phe Arg Ala Glu Ser Phe Ser Thr Asp

245 250 255

Tyr Gly Asp Cys Phe Gln Lys Pro Thr Leu Asn Thr Gln Leu Cys Glu

260 265 270

Pro Arg Tyr Gly Cys Gln Gly Ser Ile Val Ser Phe Gln Pro Leu Lys

275 280 285

Met Pro Phe Ser Gln Asp Pro Ile Gly Lys Ala Ala Pro Thr Thr Gln

290 295 300

Lys Ser Pro Leu Leu Asp Ser Phe Leu Glu Arg Glu Glu Gly Val Gly

305 310 315 320

Arg Pro Ser Gly Thr Trp Leu Leu Tyr Ser His Pro Thr Ser Lys Lys

325 330 335

Arg Arg Ile Asn Leu Gly Ile Tyr Tyr Asn Arg Asn Pro Leu Glu Val

340 345 350

Thr Cys Trp Ser Arg Pro Trp Ile Leu His Cys Gly Pro Cys Gly Tyr

355 360 365

Ser Asp Leu Ala Val Val Glu Glu Gln Gly Leu Phe Ala Cys Leu Phe

370 375 380

Glu Cys Gly Gln Glu His Glu Cys Glu Gln Ile Ala Phe Arg Leu Phe

385 390 395 400

Ser Val Gln Glu Val Leu Ser Cys Glu Asp Cys Thr Gly Pro Ser Arg

405 410 415

Asp

<210>5

<211>379

<212>PRT

<213>中国仓鼠

<400>5

Met Ala Thr Cys Pro Val Leu Gln Lys Glu Thr Leu Phe Gln Thr Gly

1 5 10 15

Asp Tyr Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Ile Tyr Leu Ser Lys Gln Lys

20 25 30

Thr Leu Leu Ala Phe Ala Glu Lys Arg Leu Thr Lys Thr Asp Glu His

35 40 45

Ala Asp Leu Phe Val Leu Arg Arg Gly Ser Tyr Asn Ala Asp Thr His

50 55 60

Gln Val Gln Trp Gln Ala Glu Glu Val Val Thr Gln Ala Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Gly His Arg Ser Met Ser Pro Cys Pro Leu Tyr Asp Lys Gln Thr Arg

85 90 95

Thr Leu Phe Leu Phe Phe Ile Ala Val Arg Gly Gln Ile Ser Glu His

100 105 110

His Gln Leu Gln Thr Gly Val Asn Val Thr Arg Leu Cys His Ile Thr

115 120 125

Ser Thr Asp His Gly Lys Thr Trp Ser Ala Val Gln Asp Leu Thr Asp

130 135 140

Thr Thr Ile Gly Ser Thr His Gln Asp Trp Ala Thr Phe Gly Val Gly

145 150 155 160

Pro Gly His Cys Leu Gln Leu Arg Asn Thr Ala Gly Ser Leu Leu Val

165 170 175

Pro Ala Tyr Ala Tyr Arg Lys Gln Pro Pro Ile His Ala Pro Ala Pro

180 185 190

Ser Ala Phe Cys Phe Leu Ser His Asp His Gly Ser Thr Trp Glu Leu

195 200 205

Gly His Phe Val Ser Gln Asn Ser Leu Glu Cys Gln Val Ala Glu Val

210 215 220

Gly Thr Gly Ala Glu Arg Val Val Tyr Leu Asn Ala Arg Ser Cys Leu

225 230 235 240

Gly Ala Arg Val Gln Ala Gln Ser Pro Asn Ser Gly Leu Asp Phe Gln

245 250 255

Asp Asn Gln Val Val Ser Lys Leu Val Glu Pro Pro Lys Gly Cys His

260 265 270

Gly Ser Val Ile Ala Phe Pro Asn Pro Thr Ser Lys Ala Asp Ala Leu

275 280 285

Asp Val Trp Leu Leu Tyr Thr His Pro Thr Asp Ser Arg Lys Arg Thr

290 295 300

Asn Leu Gly Val Tyr Leu Asn Gln Lys Pro Leu Asp Pro Thr Thr Trp

305 310 315 320

Ser Ala Pro Thr Leu Leu Ala Thr Gly Ile Cys Ala Tyr Ser Asp Leu

325 330 335

Gln Asn Met Gly His Gly Pro Asp Gly Ser Pro Gln Phe Gly Cys Leu

340 345 350

Tyr Glu Ser Asn Asn Tyr Glu Glu Ile Val Phe Leu Met Phe Thr Leu

355 360 365

Lys Gln Ala Phe Pro Ala Val Phe Gly Ala Gln

370 375

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>6

gggugcaaga cgacuucagt t 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>7

cugaagucgu cuugcaccct t 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>8

ugggacgcug gaacgagaut t 21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>9

aucucguucc agcgucccat t 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>10

ggacacuacg cgucaucugt t 21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>11

cagaugacgc guagugucct t 21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>12

ccugggugug uaccucaaut t 21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>13

auugagguac acacccaggt t 21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>14

gacggaugag caugcagaut t 21

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>15

aucugcaugc ucauccguct t 21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>16

gggaccaccu accggauuct t 21

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>17

gaauccggua ggugguccct t 21

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>18

guaccagccg uguguuacut t 21

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>中国仓鼠

<400>19

aguaacacac ggcugguact t 21

Claims

1.一种细胞系，所述细胞系包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，所述唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO：2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ ID NO：4至少约80％同一的序列。

2.如权利要求1所述的细胞系，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO：2至少约97％同一的序列，和(b)与SEQ IDNO：4至少约90％同一的序列。

3.如权利要求1所述的细胞系，其中所述氨基酸序列主要由选自SEQID NO：2和SEQ ID NO：4组成的组的序列组成。

4.如权利要求1所述的细胞系，其中所述氨基酸序列由选自SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4组成的组的序列组成。

5.如权利要求1所述的细胞系，其中所述核酸序列的表达通过选自以下组成的组的技术破坏：RNA干扰、同源重组和位点特异性重组。

6.如权利要求5所述的细胞系，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi剂介导：短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。

7.如权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系选自由昆虫细胞系、哺乳动物细胞系、啮齿动物细胞系、非人灵长类动物细胞系和人类细胞系组成的组。

8.如权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

9.如权利要求8所述的细胞系，其中所述唾液酸酶由SEQ ID NO：2组成。

10.如权利要求8所述的细胞系，其中所述唾液酸酶由SEQ ID NO：4组成。

11.如权利要求8所述的细胞系，其中所述唾液酸酶由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4组成。

12.如权利要求1所述的细胞系，所述细胞系还包括编码细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：5至少约85％同一。

13.如权利要求12所述的细胞系，其中氨基酸序列主要由SEQ IDNO：5组成。

14.如权利要求12所述的细胞系，其中氨基酸序列由SEQ ID NO：5组成。

15.如权利要求12所述的细胞系，其中所述核酸序列的表达通过选自以下组成的组的技术破坏：RNA干扰、同源重组和位点特异性重组。

16.如权利要求16所述的细胞系，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi剂介导：短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。

17.如权利要求12所述的细胞系，其中所述细胞系选自由昆虫细胞系、哺乳动物细胞系、啮齿动物细胞系、非人灵长类动物细胞系和人类细胞系组成的组。

18.如权利要求12所述的细胞系，其中所述细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

19.如权利要求18所述的细胞系，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQID NO：2组成。

20.如权利要求18所述的细胞系，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQID NO：4组成。

21.如权利要求18所述的细胞系，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQID NO：2和SEQ ID NO：4组成。

22.一种生产糖蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达编码所述糖蛋白的核酸序列，所述细胞包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，所述唾液酸酶的氨基酸序列选自以下组成的组：(a)与SEQ ID NO：2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ IDNO：4至少约80％同一的序列，其中所述糖蛋白相对于适当对照，具有增加的唾液酸化作用。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO：2至少约97％同一的序列，和(b)与SEQ ID NO：4至少约90％同一的序列。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述唾液酸酶的氨基酸序列主要由选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4组成的组的序列组成。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述唾液酸酶的氨基酸序列由选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4组成的组的序列组成。

26.如权利要求22所述的方法，其中编码所述唾液酸酶的所述核酸序列的表达通过选自以下组成的组的技术破坏：RNA干扰、同源重组和位点特异性重组。

27.如权利要求26所述的方法，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi剂介导：短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。

28.如权利要求22所述的方法，其中编码所述糖蛋白的所述核酸序列选自由染色体整合的核酸序列和染色体外核酸序列组成的组。

29.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞选自由昆虫细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、非人灵长类动物细胞和人类细胞组成的组。

30.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQ IDNO：2组成。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQ IDNO：4组成。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4组成。

34.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞还包括编码细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：5至少约85％同一。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列主要由SEQ ID NO：5组成。

36.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列由SEQ ID NO：5组成。

37.如权利要求34所述的方法，其中编码所述细胞质唾液酸酶的所述核酸序列的表达通过选自以下组成的组的技术破坏：RNA干扰、同源重组以及位点特异性重组。

38.如权利要求37所述的方法，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi剂介导：短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。

39.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞选自由昆虫细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、非人灵长类动物细胞和人类细胞组成的组。

40.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQ IDNO：2组成。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQ IDNO：4组成。

43.如权利要求40所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4组成。

44.一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成的多肽。

45.一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO：4组成的多肽。

46.一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成。

47.一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：4组成。