JP2011500032A - 糖タンパク質のシアリル化を改善するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、シアリル化が増大した糖タンパク質を産生するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、破壊されたシアリダーゼ発現を含む細胞株およびシアリル化が増大した糖タンパク質を産生するための該細胞株の使用方法を提供する。

Description

本発明は、概して、シアリダーゼに関する。具体的には、本発明は、糖タンパク質のシアリル化を改善するための組成物および方法に関する。

組み換えＤＮＡ技術を使用した哺乳類の細胞培養により産生される糖タンパク質は、ヒトの健康管理にとって重要な治療医薬品のカテゴリーである。糖タンパク質の生物学的機能は、しばしば、それらの糖鎖構造への依存性が高い。糖タンパク質に見られる非常に多くの糖類のうち、末端シアル酸が、特に重要だと考えられる。シアル酸は、様々な糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、抗原性、および特異活性に影響することが認められている。糖タンパク質中のシアル酸の量は、２つの拮抗するプロセス、つまり、シアリルトランスファーゼ活性によるシアル酸の細胞内付加、およびシアリダーゼ切断によるシアル酸の細胞外除去の結果である。

末端シアル酸が血清糖タンパク質から除去される時、脱シアリル化タンパク質は、シアリル化された対応物と比較すると、著しく低い循環性半減期を有する。他の糖タンパク質からのシアル酸の除去は、生物学的活性の減少および血清クリアランスの増加と相関する。さらに、バッチ培養における細胞による糖タンパク質の産生中、栄養素の摂取および産物の蓄積が、細胞環境を変化し得るため、タンパク質糖鎖付加は、時間が経つにつれて減少する。その上、結果として生じる糖タンパク質は、グリコフォームの不均一性を有する傾向にあり、産生プロセスにおいて、バッチ間の変動が著しい。このよう変動は、タンパク質治療剤の大量生産に使用されるバイオプロセスにおいては容認され得ない。したがって、哺乳類細胞培養システムにおいて有効な医薬品としてその品質および一貫性を保証するために、しばしば、糖タンパク質産物の最終シアル酸含量を最大にすることが望ましい。したがって、強化された糖タンパク質のシアリル化を有する哺乳類細胞培養システムの必要性が存在する。このようなシステムは、適切にシアリル化された組み換え糖タンパク質の産生を改善するだろう。

本発明の様々な態様の内で、染色体に組み込まれた、非細胞質シアリダーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列の発現が破壊された細胞株が提供される。発現が破壊された非細胞質シアリダーゼのアミノ酸配列は、（ａ）配列番号２に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４に少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列から成る群から選択される。

本発明の別の態様は、糖タンパク質の産生方法を包含する。該方法は、染色体に組み込まれた、非細胞質シアリダーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列の発現が破壊された細胞において、糖タンパク質をコードする核酸配列を発現するステップを含み、該糖タンパク質は、好適な対照に対してシアリル化が増大する。該細胞において発現が破壊された非細胞質シアリダーゼのアミノ酸配列は、（ａ）配列番号２に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４に少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列から成る群から選択される。

本発明のさらなる態様は、アミノ酸配列が配列番号２から成るポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。

本発明のまた別の態様は、アミノ酸配列が配列番号４から成るポリペプチドをコードする、単離された核酸を包含する。

本発明の別の代替的態様は、アミノ酸配列が配列番号２から成る精製されたポリペプチドを提供する。

本発明のさらなる態様は、アミノ酸配列が配列番号４から成る精製されたポリペプチドを包含する。

本発明の別の態様を、さらに以下で説明する。

カラー図面の参照
本出願書類は、カラーで作成された少なくとも１枚の写真を含む。カラー写真を伴う本特許出願公開のコピーは、要請に応じ、必要手数料の支払いがなされた際に庁により提供される。

ＣＨＯ Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、およびＮｅｕ３遺伝子によりコードされるタンパク質のシアリダーゼ活性を示す。図示されるように、各遺伝子のコード領域を含む遺伝子発現コンストラクト（または任意の空の遺伝子発現コンストラクト）を形質移入された細胞の溶解物の酵素活性を示す。 シアリダーゼＣＨＯ Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、およびＮｅｕ３遺伝子によりコードされるタンパク質のシアリダーゼ活性の阻害を示す。各遺伝子のコード領域を含む遺伝子発現コンストラクトを形質移入された細胞の溶解物における、２つの濃度における２つの異なるシアリダーゼ抑制物質の非存在下または存在下において測定された酵素活性を示す。 Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、およびＮｅｕ３タンパク質の細胞内部位を示す。共焦点蛍光顕微鏡画像を示し、ＦＬＡＧタグ付きＮｅｕタンパク質が緑で示され、リソソーム（Ｌｙｓ）マーカが赤で示され、細胞膜（ＰＭ）マーカが青で示される。 低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術を使用した、Ｎｅｕ１ ｍＲＮＡ、Ｎｅｕ２ ｍＲＮＡ、およびＮｅｕ３ ｍＲＮＡの発現のノックダウンを示す。遺伝子特異的ｓｉＲＮＡｓ（Ｓ１−Ｓ５）または無関係なＧＦＰ核酸配列（Ｃ）を標的とする対照ｓｉＲＮＡによる各遺伝子のノックダウン後に、遺伝子特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって増幅された産物を示す。対照遺伝子（β−２ミクログロブリン、β２Ｍ）の発現は、ｓｉＲＮＡにより影響されなかった。 低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術を使用した、（Ａ）Ｎｅｕ１ ｍＲＮＡ、（Ｂ）Ｎｅｕ２ ｍＲＮＡ、および（Ｃ）Ｎｅｕ３ ｍＲＮＡのノックダウン発現を示す。各Ｎｅｕ遺伝子に対してｓｉＲＮＡ特異的、または無関係な核酸配列（ＧＦＰ）を標的とする対照ｓｉＲＮＡを使用した時の、各遺伝子の相対的発現を示すＱ−ＲＴ ＰＣＲの結果を示す。 低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術を使用した、（Ａ）Ｎｅｕ１ ｍＲＮＡ、（Ｂ）Ｎｅｕ２ ｍＲＮＡ、および（Ｃ）Ｎｅｕ３ ｍＲＮＡのノックダウン発現を示す。各Ｎｅｕ遺伝子に対してｓｉＲＮＡ特異的、または無関係な核酸配列（ＧＦＰ）を標的とする対照ｓｉＲＮＡを使用した時の、各遺伝子の相対的発現を示すＱ−ＲＴ ＰＣＲの結果を示す。 ｓｉＲＮＡを使用してＮｅｕ遺伝子発現がノックダウンされた、ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞のシアリダーゼ活性を示す。各Ｎｅｕ遺伝子が発現停止した、２つのＮｅｕ遺伝子が発現停止した、または全てのＮｅｕ遺伝子が発現停止したＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞のシアリダーゼ活性を示す。また、ｓｉＲＮＡコンストラクト（ＣＨＯ）を欠損した、または無関係な核酸配列（ＧＦＰ）を標的とする対照ｓｉＲＮＡを含む、ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞のシアリダーゼ活性を示す。 ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）技術を使用した（Ａ）Ｎｅｕ１ ｍＲＮＡ、（Ｂ）Ｎｅｕ２ ｍＲＮＡ、および（Ｃ）Ｎｅｕ３ ｍＲＮＡ発現の安定したノックダウンを示す。対応するノックダウンＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞、または無関係な核酸配列を標的とする対照ｓｈＲＮＡを含む対照ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞（非標的）の各シアリダーゼ遺伝子の相対的発現を示す、Ｑ−ＲＴ ＰＣＲの結果を示す。 ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）技術を使用した（Ａ）Ｎｅｕ１ ｍＲＮＡ、（Ｂ）Ｎｅｕ２ ｍＲＮＡ、および（Ｃ）Ｎｅｕ３ ｍＲＮＡ発現の安定したノックダウンを示す。対応するノックダウンＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞、または無関係な核酸配列を標的とする対照ｓｈＲＮＡを含む対照ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞（非標的）の各シアリダーゼ遺伝子の相対的発現を示す、Ｑ−ＲＴ ＰＣＲの結果を示す。 ｓｈＲＮＡを使用した、ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞のシアリダーゼ活性の安定したノックダウンを示す。各シアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、またはＮｅｕ３）が発現停止されたＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞のシアリダーゼ活性を示す。また、無関係な核酸配列を標的とする対照ｓｈＲＮＡを含む、対照ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞（非標的）のシアリダーゼ活性を示す。^*ｐ＜０．００５、^**ｐ＜０．０００１。 細胞増殖がシアリダーゼ遺伝子発現抑制により影響されなかったことを示す。培養日数の関数としての細胞増殖（つまり、生存細胞密度（ＶＣＤ）および生存率％）を示す。増殖データは、各シアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、またはＮｅｕ３）がノックダウンされたＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞に対して、または対照（非標的）ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞（無関係な核酸配列を標的とする対照ｓｈＲＮＡを含む）に対してプロットされる。 ヒトインターフェロンγ（ｈＩＦＮγ）の産生は、シアリダーゼ遺伝子発現抑制により影響されなかったことを示す。各シアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、またはＮｅｕ３）がノックダウンされたＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞または対照（非標的）ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞により産生された、ｈＩＦＮγタンパク質のレベルをプロットする。 シアリダーゼノックダウン細胞が、シアル酸レベルが増大した糖タンパク質を産生することを示す。各シアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、またはＮｅｕ３）がノックダウンされたＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞または対照（非標的）ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞（無関係な核酸配列を標的とする対照ｓｈＲＮＡを含む）により産生された、ヒトインターフェロンγ（ｈＩＦＮγ）のシアル酸の濃度をプロットする。ＮＳ、有意差なし、^*ｐ＜０．０１、^**ｐ＜０．０５。 シアリダーゼノックダウン細胞が、シアル酸レベルが増大した糖タンパク質を産生することを示す。各シアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、またはＮｅｕ３）がノックダウンされたＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞または対照（非標的）ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞（無関係な核酸配列を標的とする対照ｓｈＲＮＡを含む）により産生された、ヒトインターフェロンγ（ｈＩＦＮγ）のシアル酸の濃度をプロットする。ＮＳ、有意差なし、^*ｐ＜０．０１、^**ｐ＜０．０５。

シアリダーゼは、糖タンパク質および糖脂質からの末端シアル酸残基を除去する酵素である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、細胞質シアリダーゼを含むことで知られる。本発明の発明者は、ＣＨＯ細胞内の、さらに２つのシアリダーゼ、つまり、リソソームシアリダーゼおよび細胞膜関連シアリダーゼを単離し、特徴付けをした。したがって、本発明は、単独で、またはお互いの組み合わせで、または細胞質シアリダーゼとの組み合わせのいずれかで、２つの新たに同定されたシアリダーゼ遺伝子の発現が破壊された細胞株を提供する。本発明は、また、破壊されたシアリダーゼ発現を含む細胞を使用して、目的の糖タンパク質を産生する方法を提供する。一般的に、本発明の方法により産生される糖タンパク質は、正常なシアリダーゼ活性を有する親細胞で産生されたものと比較してシアル酸含量が増大する。

（Ｉ）非細胞質シアリダーゼ
本発明の一態様は、アミノ酸配列が配列番号２から成るポリペプチドをコードする単離された核酸配列を包含する。一般的に、該単離された核酸配列は、配列番号１に少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態において、単離された核酸配列は、配列番号１に約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一であってもよい。他の実施形態において、単離された核酸配列は、基本的に、配列番号１から成っていてもよい。これらの実施形態において、該単離された核酸配列の５’末端、３’末端、または両末端に隣接する、付加的な外来性ヌクレオチド配列が存在していてもよい。外来性ヌクレオチド配列は、クローン化のための制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むリンカー、増幅および／または他の検知方法のためのプライマーに相補的であるリンカーなどであってもよい。また他の実施形態において、該単離された核酸配列は、配列番号１から成っていてもよい。

本発明の別の態様は、アミノ酸配列が配列番号４から成るポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。一般的に、該単離された核酸配列は、配列番号３に少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態において、単離された核酸配列は、配列番号３に約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９.５％同一であってもよい。他の実施形態において、該単離された核酸配列は、基本的に、配列番号３から成っていてもよい。これらの実施形態において、単離された核酸配列の５’末端、３’末端、または両末端に隣接する、付加的な外来性ヌクレオチド配列が存在していてもよい。外来性ヌクレオチド配列は、クローン化のための制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むリンカー、増幅および／または他の検知方法のプライマーに相補的であるリンカーなどであってもよい。また他の実施形態において、該単離された核酸配列は、配列番号３から成っていてもよい。

本発明のさらなる態様は、アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一であってもよい精製されたポリペプチドを包含し、該精製されたポリペプチドは、シアリダーゼ酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、該精製されたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列に約９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一であってもよい。他の実施形態において、該精製されたポリペプチドのアミノ酸配列は、基本的に、配列番号２から成っていてもよい。これらの実施形態において、アミノ末端、カルボキシル末端、または該精製されたポリペプチドの両末端に隣接する外来性アミノ酸配列が存在していてもよく、該精製されたポリペプチドの生物学的活性は、変化しない。これらの外来性アミノ酸配列は、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、６ｘＨｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、ＨＳＶタグなどの抗体エピトープタグを含み得るが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、該精製されたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２から成りっていてもよい。通常、配列番号２によりコードされるポリペプチド（または関連ポリペプチド）は、真核細胞のリソソームに局在する。

本発明のまた別の態様は、アミノ酸配列が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であってもよい精製されたポリペプチドを提供し、該精製されたポリペプチドは、シアリダーゼ酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、該精製されたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列に約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一であってもよい。他の実施形態において、該精製されたポリペプチドのアミノ酸配列は、基本的に、配列番号４から成っていてもよい。これらの実施形態において、アミノ末端、カルボキシル末端、または精製されたポリペプチドの両末端に隣接する外来性アミノ酸配列が存在していてもよく、該精製されたポリペプチドの生物学的活性は、変化しない。これらの外来性アミノ酸配列は、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、６ｘＨｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、ＨＳＶタグなどの抗体エピトープタグを含み得るが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、該精製されたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４から成り得る。通常、配列番号２によりコードされるポリペプチド（または関連ポリペプチド）は、真核細胞の細胞膜に局在する。

（ＩＩ）破壊されたシアリダーゼ発現を含む細胞株
本発明の別の態様は、減少したシアリダーゼ酵素活性を有するよう、非細胞質シアリダーゼをコードする少なくとも１つの内在性の、染色体に組み込まれた核酸配列の発現が破壊された細胞株を提供する。該細胞株は、さらに、細胞質シアリダーゼをコードする内在性の、染色体に組み込まれた核酸配列の発現が破壊されていてもよい。

いくつかの実施形態において、該細胞株は、染色体に組み込まれた、非細胞質シアリダーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列の発現が破壊されており、該シアリダーゼのアミノ酸配は、（ａ）配列番号２に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４に少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、該発現が破壊された非細胞質シアリダーゼは、配列番号２に約９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一であってもよい。別の実施形態において、該発現が破壊された非細胞質シアリダーゼは、基本的に、配列番号２から成っていてもよい。さらなる実施形態において、該発現が破壊された非細胞質シアリダーゼは、配列番号２から成っていてもよい。他の実施形態において、該発現が破壊された非細胞質シアリダーゼは、配列番号４のアミノ酸配列に約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一であってもよい。代替的実施形態において、発現が破壊された非細胞質シアリダーゼは、基本的に、配列番号４から成っていてもよい。さらなる実施形態において、該発現が破壊された非細胞質シアリダーゼは、配列番号４から成っていてもよい。

いくつかの反復法において、該細胞株は、１つの非細胞質シアリダーゼの発現が破壊されていてもよい。例えば、リソソームシアリダーゼ（つまり、配列番号２に関連する）の発現が破壊されていてもよい。または、細胞膜関連シアリダーゼ（つまり、配列番号４に関連する）の発現が破壊されていてもよい。他の反復法において、該細胞株は、両方の非細胞質シアリダーゼの発現が破壊されていてもよい。つまり、リソソームシアリダーゼ（つまり、配列番号２に関連する）および細胞膜関連シアリダーゼ（つまり、配列番号４に関連する）の発現が、両方とも破壊されていてもよい。

代替的実施形態において、該細胞株は、細胞質シアリダーゼをコードする染色体に組み込まれた核酸配列が破壊されていてもよく、そのアミノ酸配列は、配列番号５に少なくとも約８５％同一であってもよい。いくつかの実施形態において、該発現が破壊された細胞質シアリダーゼは、配列番号５のアミノ酸配列に約８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一であってもよい。さらなる実施形態において、該発現が破壊された細胞質シアリダーゼは、基本的に、配列番号５から成っていてもよい。さらに別の実施形態において、該発現が破壊された細胞質シアリダーゼは、配列番号５から成っていてもよい。

特定の反復法において、該細胞株は、１つの非細胞質シアリダーゼおよび細胞質シアリダーゼの発現が破壊されていてもよい。例えば、リソソームシアリダーゼ（つまり、配列番号２に関連する）および細胞質（つまり、配列番号５に関する）の発現が、破壊されていてもよい。または、細胞膜関連シアリダーゼ（つまり、配列番号４に関連する）および細胞質（つまり、配列番号５に関する）の発現が、破壊されていてもよい。特定の他の反復法において、該細胞株は、非細胞質シアリダーゼおよび細胞質シアリダーゼの両方の発現が破壊されていてもよい。つまり、リソソームシアリダーゼ（つまり、配列番号２に関連する）、細胞膜関連シアリダーゼ（つまり、配列番号４に関連する）および細胞質（つまり、配列番号５に関する）の発現が、全て破壊されていてもよい。

（ａ）細胞型
一般的に、真核細胞が、本発明の実践に使用される。適切な宿主細胞としては、ピキアパストリス（Pichia pastoris）または出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）などの菌類もしくは酵母菌；ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）由来のＳＦ９細胞またはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来のＳ２細胞などの昆虫類細胞；植物細胞；マウス、ラット、ハムスター、ヒト以外の霊長類、もしくはヒト細胞などの動物細胞などが挙げられる。適切な細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＶ４０（ＣＯＳ７）により形質転換されたサルの腎臓ＣＶＩ株、ヒト胚性腎臓株２９３、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４）、サルの腎細胞（ＣＶＩ−７６）、アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒトの頚部癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌの腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファロラットの肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒトの肺細胞（Ｗ１３８）、ヒトの肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳癌細胞（ＭＭＴ）、ラットの肝細胞腫細胞（ＨＴＣ）、ＨＩＨ／３Ｔ３細胞、およびＴＲＩ細胞が含まれる。哺乳類細胞株の多数のリストについて、当業者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ（ＡＴＣＣ（商標登録）Ｍａｍａｓｓａｓ，ＶＡ）を参照してもよい。一般的に、該細胞は、様々な細胞型（例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、ＴまたはＢ細胞、マクロファージ、上皮細胞など）であってもよい。好適な実施形態において、該細胞は、糖タンパク質の産生に広く使用される型である。例示的な実施形態において、該細胞は、ＣＨＯ細胞であってもよい。いくつかのＣＨＯ細胞株が目的の糖タンパク質を産生する多数のＣＨＯ細胞株は、ＡＴＣＣから入手可能である。目的の糖タンパク質を安定して発現するＣＨＯ細胞の例には、細胞内細胞付着分子１を産生するＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞、およびヒトインターフェロンγを産生するＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞が含まれる。

（ｂ）発現破壊
一般的に、本発明の細胞株のシアリダーゼ発現は減少している。該発現は、遺伝子発現中のいくつかの異なるステップで破壊されてもよい。例えば、機能的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（および結果的に機能的ポリペプチド）が作製されないよう、シアリダーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が変化されてもよい。または、ポリペプチドが作製されないか、またはレベルが減少したポリペプチドが作製されるよう、該ｍＲＮＡが変化（また劣化）されてもよい。

（ｉ）ＲＮＡ干渉
シアリダーゼの発現は、標的ｍＲＮＡまたは転写物の発現を阻害するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤を使用して破壊されてもよい。該ＲＮＡｉ剤は、標的転写物を切断してもよい。または、該ＲＮＡｉ剤は、標的転写物のタンパク質への転写を防止または破壊してもよい。

いくつかの実施形態において、該ＲＮＡｉ剤は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってもよい。一般的に、ｓｉＲＮＡは、長さが約１５から約２９ヌクレオチドの範囲の二重鎖ＲＮＡ分子を含む。該ｓｉＲＮＡは、長さが約１６〜１８、１７〜１９、２１〜２３、２４〜２７、または２７〜２９ヌクレオチドであってもよい。好適な実施形態において、該ｓｉＲＮＡは、長さが約２１ヌクレオチドであってもよい。該ｓｉＲＮＡは、任意に、１つまたは２つの一本鎖オーバーハング、例えば、片方の末端または両末端上に３’オーバーハングをさらに含んでいてもよい。該ｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリダイズする２つＲＮＡ分子から形成されるか、または、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（以下を参照）から生成されてもよい。いくつかの実施形態において、該ｓｉＲＮＡの２つの鎖は、２つの配列間に形成される二重鎖にミスマッチまたはバルジが存在しないよう、完全に相補的であってもよい。他の実施形態において、該ｓｉＲＮＡの２つの鎖は、２つの配列間に形成される二重鎖に１つもしくは複数のミスマッチおよび／またはバルジが存在するよう、実質的に相補的であってもよい。ある実施形態において、１つもしくは両方の該ｓｉＲＮＡの５’末端がリン酸基を有していてもよく、他の実施形態において、１つもしくは両方の５’末端がリン酸基を欠損していてもよい。他の実施形態において、１つもしくは両方の該ｓｉＲＮＡの３’末端がヒドロキシル基を有していてもよく、他の実施形態において、１つもしくは両方の５’末端がヒドロキシル基を欠損していてもよい。

該ｓｉＲＮＡの一本鎖は、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」と呼ばれ、標的転写物とハイブリダイズするタンパク質を含む。好適な実施形態において、該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写物の領域と完全に相補的であってもよく、つまり、長さが約１５〜約２９ヌクレオチドの、好ましくは、長さが少なくとも１６ヌクレオチドの、より好ましくは、長さが約１８〜２０ヌクレオチドの標的領域にわたって、単一のミスマッチまたはバルジがない標的転写物にハイブリダイズする。他の実施形態において、該アンチセンス鎖は、実質的に、標的領域に相補的であってもよく、つまり、１つもしくは複数のミスマッチおよび／またはバルジがアンチセンス鎖および標的転写物により形成される二本鎖に存在していてもよい。通常、ｓｉＲＮＡは、標的転写物のエクソン配列を標的にする。当業者は、標的転写物のｓｉＲＮＡを設計するプログラム、アルゴリズムおよび／または商業サービスに精通している。例示的な例は、Ｒｏｓｅｔｔａ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）およびＭＩＳＳＩＯＮ（商標登録）ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。該ｓｉＲＮＡは、当業者によく知られている方法を使用して生体外で酵素的に合成されてもよい。または、該ｓｉＲＮＡは、当該分野に周知であるオリゴヌクレオチド合成技術を使用して、化学的に合成されてもよい。

ある実施形態において、該ＲＮＡｉ剤は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。一般的に、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（上述の通り）を媒介するのに十分な長さの二本鎖構造を形成するようハイブリダイズするか、またはハイブリダイズ可能である、少なくとも２つの相補的部分、および二本鎖を形成するｓｈＲＮＡ領域を連結するループを形成する少なくとも１つの一本鎖部分を含む、ＲＮＡ分子である。その構造はまた、ステムが二本鎖部分である、ステムループ構造と呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態において、該構造の二本鎖部分は、完全に相補的であり、該ｓｈＲＮＡの二本鎖領域にミスマッチまたはバルジが存在しない。他の実施形態において、該構造の二本鎖部分は、構造的に相補的であってもよく、該ｓｈＲＮＡの二本鎖部分に１つもしくは複数のミスマッチおよび／またはバルジが存在し得る。該構造のループは、長さが約１〜約２０ヌクレオチド、好ましくは、長さが約４〜約１０ヌクレオチド、そしてより好ましくは、長さが約６〜約９ヌクレオチドであってもよい。該ループは、標的転写物に相補的である領域の５’末端または３’末端（つまり、該ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）のいずれかに位置していてもよい。

該ｓｈＲＮＡは、５’末端または３’末端にオーバーハングをさらに含んでもよい。任意のオーバーハングは、長さが約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、長さが約２〜約１５ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、該オーバーハングは、例えば、約１〜約５Ｕ残基の１つもしくは複数のＵ残基を含み得る。いくつかの実施形態において、該ｓｈＲＮＡの５’末端は、リン酸基を有していてもよいが、他の実施形態においては、リン酸基を有していなくてもよい。他の実施形態において、該ｓｈＲＮＡの３’末端は、ヒドロキシル基を有していてもよいが、他の実施形態においてはヒドロキシル基を有していなくてもよい。一般的に、ｓｈＲＮＡは、保存細胞ＲＮＡｉ機構によりｓｉＲＮＡにプロセスされる。したがって、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、同様に、ｓｈＲＮＡの相補的部分（つまり、ｓｈＲＮＡアンチセンス部分）である標的転写物の発現を阻害することができる。当業者は、ｓｈＲＮＡの設計および合成のための利用可能な資源（上述の通り）に精通している。例示的な例は、ＭＩＳＳＩＯＮ（商標登録）ｓｈＲＮＡｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。

また他の実施形態において、該ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ発現ベクターであってもよい。通常、ＲＮＡｉ発現ベクターが、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤の細胞内（生体内）合成に使用されてもよい。ある実施形態において、２つの別の相補的ｓｉＲＮＡ鎖は、それぞれが単一ｓｉＲＮＡ鎖の転写させる（つまり、各プロモータが、転写がおこるよう操作可能にｓｉＲＮＡのテンプレートに連結される）、２つのプロモータを含む単一ベクターを使用して転写されてもよい。２つの該プロモータは、同じ配向であってもよく、この場合、それぞれが、操作可能に、該相補的ｓｉＲＮＡ鎖の１つのテンプレートに連結される。または、２つの該プロモータは、反対の配向であってもよく、該プロモータの転写が２つの相補的ｓｉＲＮＡ鎖の合成を生じるように単一テンプレートに隣接する。別の実施形態において、該ＲＮＡｉ発現ベクターは、転写がｓｈＲＮＡを形成するよう、２つの相補的領域を含む単一ＲＮＡ分子を転写させるプロモータを含んでいてもよい

当業者は、２つ以上の転写ユニットの転写によって生体内でｓｉＲＮＡ剤およびｓｈＲＮＡ剤が産生されることが好ましいということを理解するであろう。一般的に、１または複数の該ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ転写ユニットを生体内で発現させるために利用されるプロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモータであってもよい。Ｕ６またはＨ１などの特定のＰｏｌ ＩＩＩプロモータは、転写された領域内のシス作用制御要素を必要とせず、したがって、特定の実施形態において好ましい。他の実施形態において、Ｐｏｌ ＩＩのプロモータは、１または複数の該ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ転写ユニットを発現させるために使用してもよい。いくつかの実施形態において、組織特異、細胞特異、または誘発性Ｐｏｌ ＩＩプロモータを使用してもよい。

ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供する構築物は、標準的な組み換えＤＮＡ法を使用して産生され、真核細胞内の発現に適切な広範な種々の異なる任意のベクターに挿入されてもよい。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３）またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３^rdｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）において、手引を見出すことができる。当業者も、ベクターがさらなる制御配列（例えば、終止配列、翻訳制御配列など）および選択的マーカ配列を含んでいてもよいことを理解するであろう。ｐＢＲ３２２、ＰＵＣなどに基づくものを含む、ＤＮＡプラスミドが当該分野において周知である。多くの発現ベクターは、既に適切な１または複数のプロモータを含んでおり、プロモータに対して適切な位置で、目的のＲＮＡｉ剤をコードする核酸配列を挿入することのみが必要とされることがある。ＲＮＡｉ剤の細胞内発現を提供するためにウイルスベクターを使用してもよい。適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。好適な実施形態において、該ＲＮＡｉ発現ベクターは、ＭＩＳＳＩＯＮ（商標登録）ＴＲＣ ｓｈＲＮＡ製品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において提供されるような、ｓｈＲＮＡレンチウイルスベースのベクターまたはレンチウイルス粒子である。

該ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ発現ベクターは、当業者によく知られる方法を使用して細胞内に導入されてもよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記を参照）、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ（上記を参照）において手引を見出すことができる。いくつかの実施形態において、該ＲＮＡｉ発現ベクター、例えば、ウイルスベクターは、シアリダーゼ発現が後の細胞世代にわたって破壊されるように、細胞のゲノム内に安定して組み込まれてもよい。

（ｉｉ）標的遺伝子組み換え
他の実施形態において、相同組み換え技術が、ゲノムＤＮＡのレベルでシアリダーゼ発現を破壊するために使用されてもよい。したがって、これらの手法を使用して、機能的産物が作製されないように、核酸配列の除去、核酸配列の一部の除去、または核酸配列の点変異を導入することができる。ある実施形態において、該核酸配列は、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（細胞２２：４７７９−４８８、１９８０）およびＳｍｉｔｈｉｅｓ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ９１：３６１２−３６１５，１９９４）の技術を使用した相同組み換えにより標的としてもよい。他の実施形態において、該核酸配列は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組み換えシステム、ＦＩｐ−ＦＲＴ部位特異的組み換えシステム、またはそれらの変形を使用して標的としてもよい。このような組み換えシステムは、商業的に入手可能であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記を参照）にさらなる手引を見出すことができる。また別の実施形態において、遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）介在遺伝子ターゲティング（Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用して標的とされてもよい。つまり、ＺＦＮは、Ｆｏｋｌ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合する、設計されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む合成タンパク質である。ＺＦＮは、特定のＤＮＡ配列で二重鎖切断を誘発することにより、部位特異相同組み換えおよびゲノム配列の標的処理を促進するために使用されることがある。ＺＦＮは、任意の目的のＤＮＡ配列を標的とするために設計されてもよい。

（ｉｉｉ）破壊された発現の測定
上述のＲＮＡｉおよび遺伝子標的方法は、一般に、シアリダーゼ遺伝子の発現の減少を引き起こし、結果としてシアリダーゼ酵素活性を減少させる。つまり、一般に、細胞のシアリダーゼｍＲＮＡおよび／またはシアリダーゼタンパク質のレベルが低下する。ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、または酵素活動を測定するのに当該分野で知られている様々な方法を使用してもよい。非制限的なＲＮＡ検知方法の例には、逆転写ＰＣＲ、逆転写定量ＰＣＲ、核酸マイクロアレイ、ハイブリダイゼーションベースに基づく方法、分枝ＤＮＡ検知技術、ノーザンブロット法、およびヌクレアーゼ保護アッセイが含まれる。非制限的なタンパク質検知方法の例には、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイ、および他の免疫アッセイが含まれる。これらの検知アッセイに使用されるプローブの特異性によって、各種のシアリダーゼは、単独で検知されるか、または全ての３つが同時に検知されることがある。しかし、特異性に関係なく、発現レベルの低下は、シアリダーゼの発現が破壊された細胞の（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）レベルを未処理細胞のそれらと比較することにより決定することができる。好ましくは、シアリダーゼ発現の減少により、細胞（例えば、細胞から得た溶解物）、細胞が培養された培地、または両方におけるシアリダーゼ酵素活性の減少がもたらされる。シアリダーゼ酵素活性は、当該分野に周知の様々なシアリダーゼアッセイを使用して測定することができる。例えば、シアリダーゼ活性は、実施例２で説明されるアッセイを使用して測定することができる。

いくつかの実施形態において、シアリダーゼｍＲＮＡのレベルは、未処理細胞のレベルに対して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍低下することがある。他の実施形態において、シアリダーゼタンパク質の量は、未処理細胞の量に対して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１０，０００倍低下することがある。さらに、シアリダーゼ酵素活性は、未処理細胞の値の２０％〜５０％の間、５０％〜６０％の間、６０％〜７０％の間、７０％〜８０％の間、８０％〜９０％の間、または９０％〜１００％の間で減少することがある。

（ｃ）好適な実施形態
好ましくは、シアリダーゼの発現が破壊された細胞株は、ＣＨＯ細胞株に由来する。ある実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２から成る、発現が破壊されたシアリダーゼを含む。別の実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号４から成る、発現が破壊されたシアリダーゼを含む。また別の実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２および配列番号４から成る、発現が破壊されたシアリダーゼを含む。さらなる実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２および配列番号５から成る、発現が破壊されたシアリダーゼを含む。さらに別の実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号４および配列番号５から成る、発現が破壊されたシアリダーゼを含む。別の代替的な実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２、配列番号４、および配列番号５から成る、発現が破壊されたシアリダーゼを含む。好ましくは、シアリダーゼ発現は、ＲＮＡｉによって破壊される。

（ＩＩＩ）シアリル化が増大した糖タンパク質の産生方法
本発明のまた別の態様は、シアリル化が強化した糖タンパク質の産生方法を提供する。一般的に、該方法は、非細胞質シアリダーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列の発現が破壊された細胞において、目的の糖タンパク質をコードする核酸配列を発現するステップを含み、細胞により産生された該糖タンパク質は、シアリル化が増大する。他の実施形態において、該細胞は、さらに、細胞質シアリダーゼをコードする核酸の発現が破壊されている。本発明の使用に適したシアリダーゼ破壊細胞は、上述のセクション（ＩＩ）に説明される。

シアリダーゼ発現が破壊された細胞により産生された糖タンパク質は、一般に、シアリダーゼの発現が変化しなかった（例えば、シアリダーゼ破壊細胞が由来する親細胞）対照細胞により産生される糖タンパク質より高いシアリル化レベルを有する。シアリダーゼ発現が破壊された細胞により産生される糖タンパク質のシアリル化は、対照細胞により産生される糖タンパク質のシアリル化より、少なくとも約１０％高いことがある。いくつかの実施形態において、シアリダーゼ発現が破壊された細胞により産生される糖タンパク質のシアリル化は、対照細胞により産生される糖タンパク質のシアリル化より、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００％高いことがある。他の実施形態において、シアリダーゼ発現が破壊された細胞により産生される糖タンパク質のシアリル化は、対照細胞により産生される糖タンパク質のシアリル化より、約５００％以上高いことがある。

いくつかの実施形態において、該糖タンパク質を産生するシアリダーゼ破壊細胞は、既に、目的の糖タンパク質を発現していることがある。例えば、該糖タンパク質は、該糖タンパク質をコードする核酸が細胞のゲノムに存在する細胞に内在性であってもよい。または、該糖タンパク質は、細胞に外来性であってもよく、該糖タンパク質をコードする酸配列は、細胞の染色体に安定して組み込まれていてもよい。上述のセクション（ＩＩ）（ａ）で述べた通り、商業的に入手可能な外来性糖タンパク質を発現する細胞株が存在する。例えば、ＣＨＯ細胞株、ＣＨＯ−ｈＩＦＮγは、安定してヒトインターフェロンγを発現する。

他の実施形態において、該糖タンパク質の産生に使用されるシアリダーゼ破壊細胞は、目的の糖タンパク質を発現しない場合がある。このような場合、目的の糖タンパク質をコードする核酸配列を、シアリダーゼ破壊細胞内に導入してもよい。目的の糖タンパク質をコードする核酸配列は、シアリダーゼ破壊細胞のゲノムに安定して組み込まれてもよい。または、目的の糖タンパク質をコードする核酸配列は、一過的に、シアリダーゼ破壊細胞に導入されてもよい。言い換えると、目的の糖タンパク質をコードする核酸配列は、染色体外であってもよい。当業者は、適切なベクターおよび細胞内に核酸を導入する方法に精通している。さらに、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記を参照）、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ（上記を参照）において、手引を見出すことができる。

シアリダーゼ破壊細胞により産生され得る糖タンパク質の例には、成長因子、成長因子受容体、サイトカイン、インターロイキンおよび他の免疫系タンパク質、インターフェロン、エリスロポエチン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、可溶性主要組織適合複合体抗原、酵素（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成または分解性酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、脱メチラーゼ（ｄｅ−ｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ）、脱水素酵素、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクロームなど）、ホルモンまたはペプチド受容体、結合タンパク質、転写因子、翻訳因子、腫瘍性タンパク質、腫瘍原タンパク質、筋タンパク質、骨髄タンパク質、向神経活性タンパク質、腫瘍増殖抑制タンパク質、抗セプシスタンパク質、構造タンパク質、および血液タンパク質（例えば、トロンピン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、タンパク質Ｃ、フォンビルブランド因子など）が含まれる。いくつかの実施形態において、該糖タンパク質は、抗体エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、６×Ｈｉｓタグなど）などのペプチドタグを含んでいてもよい。他の実施形態において、該糖タンパク質は、目的の糖タンパク質由来の第１ドメインと目的の別のタンパク質由来の第２のドメインを含む融合タンパク質であってもよく、該２つのドメインは、共に融合されるか、または１もしくは複数の追加ドメインにより分離されている。例えば、第１のドメインは、免疫グロブリンドメインまたはそのタンパク質を含んでいてもよく、第２のドメインは、非免疫グロブリンポリペプチドを含んできてもよい。該ポリペプチドまたはそのタンパク質は、自然発生ポリペプチドであってもよく、天然ポリペプチドの設計もしくは変化した形態、または疑似または人工ポリペプチドであってもよい。

該方法は、さらに、該糖タンパク質が産生される条件下でシアリダーゼ破壊細胞を培養するステップを含む。当業者は、特定の種類の細胞を培養するための適切な条件下について周知である。いくつかの実施形態において、該細胞は、少量の糖タンパク質（例えば、ミリグラムからグラム）の産生のために、小さな容器で増殖させてもよい。他の実施形態において、該細胞は、大量の糖タンパク質（例えば、キログラム量）の産生のために、大規模なバイオリアクターで維持されてもよい。一般的に、シアリダーゼ破壊細胞により産生される糖タンパク質は、シアリダーゼ発現が破壊されなかった同一種類の細胞により産生される同一の糖タンパク質に対してシアリル化が強化される。目的の糖タンパク質に結合されるシアル酸の量は、当該分野に周知のいくつかのアッセイの１つ、または商業的に入手可能なキットにより測定することができる。

しばらくして、細胞および／または培地は、一般に、収穫され、目的の糖タンパク質は、そこから精製され得る。適切な精製方法は、親和性クロマトグラフィ、免疫親和性クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、沈降、透析、およびそれらの組み合わせを含む。例えば、Ｒｏｅ（ｅｄ），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２^ndｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照のこと。本分野の技術者は、特定の目的の糖タンパク質に適切な方法を選択できる。

（ＩＶ）キット
本発明のまた別の態様は、シアリル化が増大した糖タンパク質を産生するためのキットを包含する。通常、キットは、本発明の細胞株を含み、該細胞株は、少なくとも１つの非細胞質シアリダーゼの発現が破壊されている。いくつかの実施形態において、該細胞株は、さらに細胞質シアリダーゼの発現が破壊されている。本発明のキットに使用される適切なシアリダーゼ破壊細胞は、上述のセクション（ＩＩ）に説明される。該キットは、使用説明書を含んでいてもよい。

ある実施形態において、該キットは、シアリダーゼ破壊細胞を増殖させるための適切な培地をさらに含んでいてもよい。別の実施形態において、該キットは、目的の糖タンパク質をコードする核酸配列をシアリダーゼ破壊細胞に導入するための構築物（例えば、プラスミド、ウイルスなど）をさらに含んでいてもよい。また別の実施形態において、該キットはまた、本発明の細胞により産生される糖タンパク質を検知および／または精製するための試薬をさらに含んでいてもよい。適切な試薬の非制限的な例には、ＰＣＲプライマー、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、親和性クロマトグラフィ培地、免疫親和性クロマトグラフィ培地などが含まれる。

好適な実施形態において、該キットは、破壊されたシアリダーゼ発現を含むＣＨＯ細胞株を含む。ある実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２から成るシアリダーゼの発現が破壊されている。別の実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号４から成るシアリダーゼの発現が破壊されている。また別の実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２および配列番号４から成るシアリダーゼの発現が破壊されている。さらなる実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２および配列番号５から成るシアリダーゼの発現が破壊されている。さらに別の実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号４および配列番号５から成るシアリダーゼの発現が破壊されている。別の代替的実施形態において、該ＣＨＯ細胞株は、配列番号２、配列番号４および配列番号５から成るシアリダーゼの発現が破壊されている。好ましくは、シアリダーゼ発現は、ＲＮＡｉによって破壊される。

定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。

本明細書に使用される、「相補的」という用語は、特定の水素結合を介した塩基対形成による二重鎖核酸の結合（つまり、相補的配列３’−ＴＣＡＧ−５’は５’−ＡＧＴＣ−３’と対になる）を意味する。２つの一本鎖分子は、完全に相補的であってもよい。つまり、全ての塩基対は相補的であり、ミスマッチが存在しない。または、２つの一本鎖分子は、実質的に、相補的であってもよい。つまり、少なくとも１つのミスマッチが２つの鎖間に存在する。

本明細書に使用される、「発現が破壊された」という表現は、ポリペプチドが作製されない（つまり、ノックアウト）か、または低下したレベルでポリペプチドが作製される（つまりノックダウン）ように、ポリペプチドをコードする核酸配列を操作することを意味する。発現は、いくつかのレベルで破壊され得る。例えば、機能メッセンジャーＲＮＡが存在せず、よって、機能タンパク質が作製されないように、ポリペプチドをコードするＤＮＡを変化させてもよい。または、ポリペプチドが作製されないか、または低下したレベルのポリペプチドが作製されるように、該メッセンジャーＲＮＡが影響されてもよい。

本明細書に使用される、「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの相補的一本鎖核酸分子を含む塩基間の水素結合または塩基対形成プロセスにより二本鎖ハイブリッドつまり二本鎖を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」とは、通常、温度およびイオン強度の状態により決定される。核酸ハイブリッドの安定性は、一般に、ハイブリッドが定義された条件下で５０％変性される温度である融点つまりＴｍで表現される。所定のハイブリッドのＴｍを推定するために方程式が導かれ、該方程式は、核酸、ハイブリッドの性質（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡなど）、核酸プローブの長さなどのＧ＋Ｃ含量を考慮する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（上記を参照）を参照のこと）。当業者は、ハイブリダイゼーションに基づく反応中、ハイブリダイゼーションを最適化するためにどのパラメータを操作するかを理解している。しかし、ポリメラーゼ反応、増幅反応などのいくつかのハイブリダイゼーションに基づく反応において、該反応温度は、通常、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。さらに、該温度は、通常、生体内反応中、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーも決定する。

本明細書に使用される、「同一性」または「同一」という用語は、最大一致性（maximum correspondence）に対してアライメントされた場合、２つのヌクレオチド配列または２つのアミノ酸配列が同一である度合いを意味する。ヌクレオチド配列間の最適なアライメントおよび同一性％は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）のＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して決定することができ、２つのアミノ酸配列間の最適なアライメント及び同一性％は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９３）のＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定することができる。これらのアルゴリズムは、ＮＣＢＩ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のＢＬＡＳＴプログラムに援用される。比較目的のためにギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に説明されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、個々のプログラムのデフォルトパラメータが使用される。配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウに対して２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、式中、比較ウインドウの配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列（追加または欠損を含まない）と比較した時に、追加または欠損（つまり、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、同一ヌクレオチドが両方の配列で生じた位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウインドウの位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。

「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子を意味する。該ヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（つまり、アデオノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体は、修飾プリンまたはピリミジン塩基、もしくは修飾リボース部分を有するヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチド（例えば、イノシン）または非天然ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非制限的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の追加（または除去）、ならびに他の原子（例えば、７−デアザプリン）による塩基の炭素原子および窒素原子の置換が含まれる。ヌクレオチド類似体は、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含む。該ヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合、リン酸チオエート結合、ホスホラミダイト結合、またはホスホロジアミデート結合により連結されていてもよい。

「シアリダーゼ」とは、糖タンパク質などの複合糖質の末端シアル酸残基の加水分解を触媒する酵素群である。シアリダーゼは、エキソ−α−シアリダーゼ、ノイラミニダーゼ、またはアセチルノイラミニダーゼとも呼ばれる。

本発明またはその好適な実施形態の要素を導入する時、冠詞「ａ」、［ａｎ］、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、１または複数の要素があることを意味するものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、包含的であることを意図し、リストに挙げる要素以外の付加の要素があり得ることを意味するものとする。

本発明を詳細に説明することにより、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、修正および変形が可能であることが明白となる。

以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実践で良好に機能するように、発明者により発見された技術であることを、当業者は理解すべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされても、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似した、または同様の結果が得られ、よって、記載される全ての手段が例示として理解され、制限する意味ではないことを理解すべきである。

実施例１．ＣＨＯ細胞内の追加のシアリダーゼ遺伝子の単離
４つのシアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、およびＮｅｕ４）が、ヒト、マウスおよびラットにおいて同定され、よく特徴付けされている。これらのシアリダーゼは、異なる酵素活性、基質選択性、および細胞内の部位を表す。しかし、現在までに、１つのシアリダーゼ遺伝子しかＣＨＯ細胞において特徴付けされていなかった。本遺伝子は、細胞質シアリダーゼ（すなわち、Ｎｅｕ２）（Ｇｒａｍｅｒ ＭＪ，Ｇｏｏｃｈｅｅ ＣＦ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，９：３６６）をコードする。本研究の目的は、ＣＨＯ細胞が他のシアリダーゼ遺伝子を含有しているかを決定するものであった。

ＲＴ−ＰＣＲ、５’／３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端迅速増幅法）、および他の標準的な方法を使用して、他の３つのシアリダーゼ遺伝子をＣＨＯ細胞から単離し、クローン化した。ＣＨＯ Ｎｅｕ１は、４１０のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードし、ＣＨＯ Ｎｅｕ３は、４１７のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードした（表１）。逆に、ＣＨＯ Ｎｅｕ４は、ＣＨＯ細胞において偽遺伝子のようであった。Ｎｅｕ１およびＮｅｕ３の両方は、他の種において、それらの対応物と高い類似性を共有していた（表２）。

実施例２．ＣＨＯ Ｎｅｕ１およびＣＨＯ Ｎｅｕ３はシアリダーゼである
これら２つの新規遺伝子によりコードされるタンパク質が、ＣＨＯ細胞において予測される機能を有することを確認するために、酵素シアリダーゼ活性の研究が実施された。つまり、Ｎｅｕ１（配列番号１）およびＮｅｕ３（配列番号３）遺伝子のコード領域、ならびに以前報告されたＮｅｕ２遺伝子（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ４（３）：３６７−３７３）のコード領域を、ｐｃＤＮＡ３．１哺乳類発現ベクターにクローン化した。次に、発現コンストラクトをＣＯＳ７細胞に導入してシアリダーゼタンパク質を過剰発現させた。また、偽トランスフェクションとしてｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをＣＯＳ７細胞に導入した。導入効率を標準化するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む発現コンストラクトを同時にＣＯＳ７細胞に導入した。

導入してから２４時間後、細胞を超音波処理で溶解した。細胞片を４℃で、１０分間、１０００×ｇの遠心分離で除去し、酵素活性用に上清分画を収集した。基質として１ｍＭの４−メチルウンベリフェロン−Ｎｅｕ５Ａｃを使用して、前述（Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ９：３６６−３７３）の通り、シアリダーゼアッセイを実施した。各溶解物に対して、１００μｇのタンパク質をアッセイに使用した。三重実験でアッセイを実施した。ＧＦＰ読み取りで標準化した後、ＣＨＯ Ｎｅｕ１およびＮｅｕ３タンパク質は、ネガティブコントロール（偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクション）およびポジティブコントロール（Ｎｅｕ２）と比較して顕著なシアリダーゼ活性を有した（図１）。実際、Ｎｅｕ３タンパク質は、Ｎｅｕ２よりおよそ６〜１５倍以上の活性を有した。

これらのシアリダーゼタンパク質の活性をさらに調べるために、２通りの濃度で、２つの異なる抑制物質（Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５ＡＣ２ｅｎ）の存在下で、シアリダーゼアッセイを実施した。図２に示す通り、Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎは、全てのシアリダーゼにおいて、Ｎｅｕ５Ａｃよりも高い抑制作用を有した。実施例としてＣＨＯ Ｎｅｕ３を使用した場合、０．１ｍＭのＮｅｕ３Ａｃ２ｅｎは活性を約３０％低下させ、０．５ｍＭのＮｅｕ３Ａｃ２ｅｎは活性を約６０％低下させた。これらのデータは、新規に同定されたＣＨＯ遺伝子（Ｎｅｕ１およびＮｅｕ３）がシアリダーゼをコードすること示す。

実施例３．ＣＨＯシアリダーゼの細胞内局在
２つの新規ＣＨＯシアリダーゼの細胞内の位置を同定するために、共焦点走査顕微鏡技術を用いた免疫細胞化学を実施した。つまり、８つのアミノ酸残基（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をコードするＦｌａｇタグをＮｅｕ発現コンストラクトの３’末端にクローン化して、Ｆｌａｇタグ融合タンパク質を発現させた。ＦｌａｇタグコンストラクトをＣＯＳ７細胞に導入した。導入の２４時間後、標準的な手順を使用して細胞を免疫染色した。

結果を図３に表す。シアリダーゼの細胞内の位置は、ＦＩＴＣ結合抗ＦＬＡＧ抗体により発生する緑色蛍光により示す。導入された該細胞も、図３の赤色蛍光で示されるリソソームマーカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ ＤＮＤ−９９）、および青色シグナルにより示される細胞膜マーカー（コムギ胚芽凝集素６４７）の細胞小器官マーカーを用いて免疫染色した。本研究は、Ｎｅｕ１がリソソームに局在化していること（染色のパターンは、リソソームマーカーの染色とほぼ同一であった）を明らかにした。Ｎｅｕ３は、細胞膜マーカーの局在化と同様の様式で、細胞膜に局在化した。さらに、ポジティブコントロールであるＮｅｕ２は、予測通り、細胞質の染色を示した。

実施例４．ｓｉＲＮＡ技術を使用した遺伝子発現抑制
３つのＣＨＯシアリダーゼ遺伝子のそれぞれの発現は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術を使用してノックダウンされた。ｃＤＮＡ配列に基づき、ＣＨＯシアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、およびＮｅｕ３）に対するいくつかのｓｉＲＮＡを各遺伝子のために設計し、合成した。それらの配列を表３に表す。これらのｓｉＲＮＡを、ヒトインターフェロンγ（ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ）を安定して発現するＣＨＯ細胞株に導入した。導入は二重実験して実施した。導入から４８時間後、該細胞を回収した。ＲＮＡおよびタンパク質は導入した細胞から単離した。遺伝子特異プライマーを使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、および定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を標準的な手順を使用して実施した。

図４に示す通り、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｓｉＲＮＡの各セットの少なくとも２つが、各遺伝子のｍＲＮＡ発現を減少することができることを示した。Ｎｅｕ１−Ｓ２、Ｎｅｕ１−Ｓ３およびＮｅｕ１−Ｓ４は、Ｎｅｕ１ ｍＲＮＡの発現を減少させ、Ｎｅｕ２−Ｓ２およびＮｅｕ２−Ｓ３は、Ｎｅｕ２ ｍＲＮＡの発現を減少させ、Ｎｅｕ３−Ｓ１およびＮｅｕ３−Ｓ２は、Ｎｅｕ３ ｍＲＮＡの発現を減少させた。定量的逆転写（Ｑ−ＲＴ）ＰＣＲ分析は、ＣＨＯシアリダーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、無関係な核酸配列（ＧＦＰ核酸配列）を標的とする対照ｓｉＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡ発現レベルを著しく低下させた（つまり、約７０％から９５％）ことを示す（図５）。Ｎｅｕ１ ｍＲＮＡ発現は約９０％減少し（図５Ａ）、Ｎｅｕ２ ｍＲＮＡ発現は約７０〜８５％減少し（図５Ｂ）、Ｎｕｅ３ ｍＲＮＡ発現は、約９５％減少した（図５Ｃ）。

タンパク質レベルでの遺伝子発現抑制作用をさらに確認するために、シアリダーゼ活性アッセイを実施した。付着ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞を、既知組成の、動物成分を含まない培地に懸濁した。エレクトロポレーション法により、二重実験により、同定されたｓｉＲＮＡ陽性をＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞の懸濁液に導入した。相乗的な遺伝子発現抑制作用の可能性を調査するために、各Ｎｅｕ遺伝子を個別に、および組み合わせで（つまり、２つまたは３つの遺伝子を発現抑制した）発現抑制した。導入から７２時間後、細胞を回収し、予め冷却した１×ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。総ＲＮＡおよびタンパク質は、ｓｉＲＮＡ導入された細胞から個別に単離された。上述の通り、総ＲＮＡを逆転写（およびＱ−ＲＴ ＰＣＲ）に使用した。実施例２に詳細を述べた通り、タンパク質を生体外シアリダーゼアッセイに使用した。個々のｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの組み合わせは、対照（親ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞、およびＧＦＰ ｓｉＲＮＡ導入された細胞）と比較すると、全て、シアリダーゼ活性が著しく減少した（図６）。最も興味深いことに、Ｎｅｕ１およびＮｅｕ３に対するｓｉＲＮＡの組み合わせにより、検知できないレベルまでシアリダーゼ活性を劇的に減少した。

実施例５．ｓｈＲＮＡ技術を使用した安定した遺伝子発現抑制
Ｎｅｕ ｍＲＮＡおよびシアリダーゼ活性がｓｉＲＮＡを使用してノックダウン可能であることを示す実施例４の結果に基づいて、ｓｈＲＮＡ技術プラットフォーム（Ｍｉｓｓｉｏｎ：ＲＮＡｉ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、Ｎｅｕ遺伝子発現をＣＨＯ ｈＩＦＮγ細胞で安定してノックダウンした。

各シアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ１−Ｓ４、Ｎｅｕ２−Ｓ３、Ｎｅｕ３−Ｓ２）に効果的なｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を、ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ ｓｈＲＮＡ発現ベクターにクローン化した。ＤＮＡ配列を確認した後、プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に導入して、ｓｈＲＮＡカセットをパックしたレンチウイルスを産生した。ｓｈＲＮＡカセットを含むレンチウイルスで懸濁ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞を感染させてピューロマイシンで選択後、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２およびＮｅｕ３遺伝子のｓｈＲＮＡカセットを含むＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞を得た。ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現抑制効果を確認するために、Ｑ−ＲＴ ＰＣＲを実施した（図７）。Ｎｅｕ１（Ｎｅｕ１−Ｓ４）のｍＲＮＡ発現ノックダウンは、Ｎｅｕ１−ｓｈＲＮＡ細胞において９５％を超え（図７Ａ）、Ｎｅｕ２−ｓｈＲＮＡ細胞のＮｅｕ２（Ｎｅｕ２−Ｓ３）では、約５０％のノックダウン（図７Ｂ）、Ｎｅｕ３−ｓｈＲＮＡ細胞のＮｅｕ３（Ｎｅｕ３−Ｓ２）では、７０％を超えたノックダウンであった（図７Ｃ）。

遺伝子ノックダウンの効果は、上述の通りシアリダーゼ活性を測定することにより、タンパク質のレベルでも確認された。対照（非標的ｓｈＲＮＡ）と比較して、３つのシアリダーゼ遺伝子全てに対するｓｈＲＮＡは、ＣＨＯ−ｈＩＦＮγ細胞のシアリダーゼ活性を著しく減少させた（図８を参照）。Ｎｅｕ３−Ｓ２ ｓｈＲＮＡを含む細胞は、シアリダーゼ活性が最も劇的に減少した。

ｓｈＲＮＡが細胞増殖および／またはタンパク質産生に影響するかどうかを調べるために、これらＣＨＯ−ｓｈＲＮＡ細胞の増殖およびヒトインターフェロンγタンパク質の産生を分析した。つまり、４ｍＭのグルタミンを補充した培地（既知組成および動物成分を含まない）で、約２００，０００細胞／ｍｌ生存細胞密度で、細胞を接種した。細胞増殖アッセイを二重実験で準備した。３７℃の５Ｌのバイオリアクターで、５％ＣＯ₂を用いて細胞を培養した。適切な時点で、培地のサンプルをタンパク質分析のために収集した。

５Ｌのバイオリアクター細胞増殖は、非標的ｓｈＲＮＡ対照細胞と比較して、何れのｓｈＲＮＡも細胞増殖に悪影響を及ぼさなかったことを示す（図９）。ヒトＩＦＮγの産生は、ヒトＩＦＮγ用のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して測定した。図１０に示す通り、非標的対照細胞と比較して、何れのｓｈＲＮＡもタンパク質の産生に否定的に影響しなかった。実際、高レベルのヒトＩＦＮγタンパク質が、いくつかのシアリダーゼｓｈＲＮＡ標的細胞により産生された。２５０ｍｌ振とうフラスコを使用して、同様の結果が得られた（データ省略）。

実施例６．ＣＨＯ Ｎｅｕ遺伝子の発現抑制は、シアル酸の含量が増大した糖タンパク質を産生する
シアル酸のレベルは、シアリダーゼｓｈＲＮＡ標的細胞および非標的ｓｈＲＮＡ対照細胞により産生されたヒトＩＦＮγタンパク質において、ＨＰＬＣにより分析した。静止期（６日目、約９５％の細胞生存率）および死滅期（１３日目、約２０％の細胞生存率）で、使用済み培地サンプルを５Ｌのバイオリアクター培養から収集した。免疫親和性精製により、ヒトインターフェロンγタンパク質を細胞培養の上清から精製した。つまり、遠心分離および濾過により細胞片を除去した後、３０ｍｌのタンパク質のサンプルをｈＩＦＮγ抗体と結合させた親和性カラムに装填した。カラムを洗浄した後、ｈＩＦＮγタンパク質を緩衝液で溶出した。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００クロマトグラフィシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で精製を実施した。精製されたタンパク質を前述の通りＥＬＩＳＡにより定量化した。

精製されたｈＩＦＮγタンパク質のシアリル化をＨＰＬＣにより分析した。つまり、５０μｇの精製されたｈＩＦＮγタンパク質のサンプルを凍結乾燥し、２Ｎ酢酸を含有する１００μｌの超純水中で再懸濁した。該サンプルを８０℃で３時間、加水分解した。次に、サンプルを濾過して、減圧遠心で乾燥させた。放出されたシアル酸残基は、蛍光発生化合物の１，２−ジアミノ−４，５−（メチレンジオキシ）ベンゼン（ＤＭＢ）で誘導体化した後、Ｃ１８逆相カラムを使用するＨＰＬＣで追跡した。

データを図１１に示す。第６日目、Ｎｅｕ１およびＮｅｕ２ｓｈＲＮＡ ＣＨＯ細胞により産生されたｈＩＦＮγタンパク質中のシアル酸レベルは、非標的ｓｈＲＮＡ対照と著しく異ならなかった（図１１Ａ）。シアル酸のレベルは、Ｎｅｕ２ｓｈＲＮＡ細胞において、僅かに高いようだったが、有意ではなかった（Ｎｅｕ２：１．９４５±０．１１１ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ対非標的：１．６００±０．０９０ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ，ｐ＝０．０５２８，ｎ＝４）。しかし、Ｎｅｕ３ｓｈＲＮＡ ＣＨＯ細胞からのｈＩＦＮγタンパク質のシアル酸含量は、対照細胞からのタンパク質と比較して著しく増加した（Ｎｅｕ３：２．１３３±０．１０１ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ対非標的：１．６００±０．０９０ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ，ｐ＜０．０１，ｎ＝４）。

第１３日目、Ｎｅｕ１ｓｈＲＮＡ ＣＨＯ細胞から産生されたｈＩＦＮγとのシアリル化に明らかな改善はなかった。しかし、シアル酸のレベルは、Ｎｅｕ２細胞（Ｎｅｕ２：４．９４８±０．１５０ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ対非標準：４．１１３±０．１１３ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ，ｐ＜０．０１，ｎ＝４）およびＮｅｕ３細胞（Ｎｅｕ３：５．１７５±０．４１４ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ対非標的：４．１１３±０．１１３ｐｍｏｌ シアル酸／ｐｍｏｌ ｈＩＦＮγ，ｐ＜０．０５，ｎ＝４）により産生されたｈＩＦＮγタンパク質において増大した（図１１Ｂ）。Ｎｅｕ３およびＮｅｕ２ｓｈＲＮＡ ＣＨＯ細胞から産生されたヒトインターフェロンγタンパク質のシアリル化の強化は、シアリダーゼ遺伝子（Ｎｅｕ３およびＮｅｕ２）の下方制御が全体的にシアリダーゼ活性を減少させ、結果的に、ＣＨＯ細胞により産生された組み換えタンパク質のシアル酸のレベルを低下させたことを示す。これらの実施例は、ＲＮＡ干渉プラットフォームを使用した標的遺伝子の発現抑制がタンパク質糖鎖付加を向上するために効果的な手段であることを示す。

Claims (47)

1. 細胞株であって、染色体に組み込まれた、非細胞質シアリダーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列の発現が破壊されており、該シアリダーゼのアミノ酸配列が、（ａ）配列番号２に少なくとも約９５％の同一のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４に少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列から成る群から選択される、細胞株。
2. 前記アミノ酸配列が、（ａ）配列番号２に少なくとも約９７％同一のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項１に記載の細胞株。
3. 前記アミノ酸配列が、基本的に、配列番号２および配列番号４から成る群から選択される配列から成る、請求項１に記載の細胞株。
4. 前記アミノ酸配列が、配列番号２および配列番号４から成る群から選択される配列から成る、請求項１に記載の細胞株。
5. 前記核酸配列の発現が、ＲＮＡ干渉、相同組み換え、および部位特異的組み換えから成る群から選択される手法により破壊される、請求項１に記載の細胞株。
6. ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、短鎖干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、およびＲＮＡｉ発現ベクターから成る群から選択されるＲＮＡｉ剤により実施される、請求項５に記載の細胞株。
7. 前記細胞株が、昆虫細胞株、哺乳類細胞株、齧歯類細胞株、ヒト以外の霊長類細胞株、およびヒト細胞株から成る群から選択される、請求項１に記載の細胞株。
8. 前記細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１に記載の細胞株。
9. 前記シアリダーゼが、配列番号２から成る、請求項８に記載の細胞株。
10. 前記シアリダーゼが、配列番号４から成る、請求項８に記載の細胞株。
11. 前記シアリダーゼが、配列番号２および配列番号４から成る、請求項８に記載の細胞株。
12. 染色体に組み込まれた、細胞質シアリダーゼをコードする核酸配列の発現がさらに破壊されており、アミノ酸配列が、配列番号５に少なくとも約８５％同一である、請求項１に記載の細胞株。
13. アミノ酸配列が、基本的に、配列番号５から成る、請求項１２に記載の細胞株。
14. アミノ酸配列が、配列番号５から成る、請求項１２に記載の細胞株。
15. 前記核酸配列の発現が、ＲＮＡ干渉、相同組み換え、および部位特異的組み換えから成る群から選択される手法により破壊される、請求項１２に記載の細胞株。
16. ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、短鎖干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、およびＲＮＡｉ発現ベクターから成る群から選択されるＲＮＡｉ剤により実施される、請求項１６に記載の細胞株。
17. 前記細胞株が、昆虫細胞株、哺乳類細胞株、齧歯類細胞株、ヒト以外の霊長類細胞株、およびヒト細胞株から成る群から選択される、請求項１２に記載の細胞株。
18. 前記細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１２に記載の細胞株。
19. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号２から成る、請求項１８に記載の細胞株。
20. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号４から成る、請求項１８に記載の細胞株。
21. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号２および配列番号４から成る、請求項１８に記載の細胞株。
22. 糖タンパク質を産生する方法であって、染色体に組み込まれた、非細胞質シアリダーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列の発現が破壊された細胞において、糖タンパク質をコードする核酸配列を発現することを含み、該シアリダーゼのアミノ酸配列が、（ａ）配列番号２に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４に少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列から成る群から選択され、前記糖タンパク質が、好適な対照に対してシアリル化が増大している、方法。
23. 前記シアリダーゼのアミノ酸配列が、（ａ）配列番号２に少なくとも約９７％同一のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号４に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記シアリダーゼの前記アミノ酸配列が、基本的に、配列番号２および配列番号４から成る群から選択される配列から成る、請求項２２に記載の方法。
25. 前記シアリダーゼのアミノ酸配列が、配列番号２および配列番号４から成る群から選択される配列から成る、請求項２２に記載の方法。
26. 前記シアリダーゼをコードする前記核酸配列の発現が、ＲＮＡ干渉、相同組み換え、および部位特異的組み換えから成る群から選択される手法により破壊される、請求項２２に記載の方法。
27. ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、短鎖干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、およびＲＮＡｉ発現ベクターから成る群から選択されるＲＮＡｉ剤により実施される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記糖タンパク質をコードする前記核酸配列が、染色体に組み込まれたもの、および染色体外であるものから成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
29. 前記細胞が、昆虫細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、ヒト以外の霊長類細胞、およびヒト細胞から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
30. 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２２に記載の方法。
31. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号２から成る、請求項３０に記載の方法。
32. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号４から成る、請求項３０に記載の方法。
33. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号２および配列番号４から成る、請求項３０に記載の方法。
34. 前記細胞が、染色体に組み込まれた、細胞質シアリダーゼをコードする核酸配列の発現がさらに破壊されており、その前記アミノ酸配列が、配列番号５に少なくとも約８５％同一である、請求項２２に記載の方法。
35. 前記細胞質シアリダーゼのアミノ酸配列が、基本的に、配列番号５から成る、請求３４に記載の方法。
36. 前記細胞質シアリダーゼのアミノ酸配列が、配列番号５から成る、請求３４に記載の方法。
37. 前記細胞質シアリダーゼをコードする前記核酸配列の前記発現が、ＲＮＡ干渉、相同組み換え、および部位特異的組み換えから成る群から選択される手法により破壊される、請求項３４に記載の方法。
38. ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、短鎖干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、およびＲＮＡｉ発現ベクターから成る群から選択されるＲＮＡｉ剤により実施される、請求項３７に記載の方法。
39. 前記細胞が、昆虫細胞、哺乳類細胞、齧歯類細胞、ヒト以外の霊長類細胞、およびヒト細胞から成る群から選択される、請求項３４に記載の方法。
40. 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３４に記載の方法。
41. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号２から成る、請求項４０に記載の方法。
42. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号４から成る、請求項４０に記載の方法。
43. 前記非細胞質シアリダーゼが、配列番号２および配列番号４から成る、請求項４０に記載の方法。
44. アミノ酸配列が配列番号２から成るポリペプチドをコードする、単離された核酸。
45. アミノ酸配列が配列番号４から成るポリペプチドをコードする、単離された核酸。
46. アミノ酸配列が配列番号２から成る、精製されたポリペプチド。
47. アミノ酸配列が配列番号４から成る、精製されたポリペプチド。

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