CN114934053B - 岩藻糖基转移酶8缺陷型cho细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，包括：采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组敲除CHO细胞的FUT8基因，以获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系；其中，外显子区域片段包含如SEQ ID NO.1所示的序列；三种sgRNA的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明创造性地采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组以敲除CHO细胞的FUT8基因，显著提高sgRNA的打靶效率，进而显著提高了FUT8基因的敲除效率，更容易获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系及其制备方法和应用。
背景技术
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种来源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系，是生物制药行业制造治疗性蛋白主要手段之一，也是生产单克隆抗体的主要工具之一。在抗体治疗过程中，抗体通过两种途径破坏靶点来执行其功能：补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。ADCC是由抗体Fc区与淋巴细胞受体结合介导的，氨基-寡糖显现在IgG重链Fc区天门冬酰胺297上，而岩藻糖常存在于寡糖结构中，可阻碍Fc与淋巴细胞受体的结合。与来自野生型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的抗体相比，去岩藻糖抗体体外的ADCC活性高出100倍。因此，抗体去岩藻糖被认为是一种增强ADCC活性的有效方法。
在CHO细胞中，氨基多糖核心结构的共同特征是岩藻糖基转移酶8(FUT8)(α-(1,6)-岩藻糖基转移酶)，用来定向添加岩藻糖到天门冬酰胺连接的氨基-乙酰葡萄糖胺部分。目前，已有多个研究报道了通过不同的方法破坏FUT8基因增强ADCC的效果，如同源重组或锌指核酸酶(ZFNs)等，均提高了ADCC活性。
其中，转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectornuclease,TALEN)技术与锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技术是一大类强有力的基因组编辑工具，这两种嵌合核酸酶由两部分组成：一个可编码的序列特异性DNA结合模块与一个非特异性的DNA切割结构域。TALEN和ZFN通过诱导DNA双链断裂(DNA double-strandbreak)来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复，能够完成FUT8基因的敲除。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat规律间隔成簇短回文重复序列)/Cas9(CRISPR associated protein 9)系统，起源于微生物适应性免疫系统，作为一种高效的基因组编辑工具，应用于植物、动物、细菌和酵母等多种物种。该系统只需要Cas9和单导RNA(sgRNA)即可实现FUT8基因敲除，具有易于定制、更高的靶向效率和促进多基因组编辑的能力等优点。
然而，对于ZFN方法，基因编辑很难对准非G丰富的位置，且需要大量的蛋白质工程构建表达系统；对于TALEN方法，每个TALEN单体的5’靶向碱基必须是T，并且需要复杂的分子克隆方法构建表达系统；对于CRISPR/Cas9方法，基因编辑目标位置必须在PAM序列之前，基因中能够作为打靶区域实现阳性敲除的位置有限。由于各方法均存在一定的约束因素，导致不同方法的基因敲除效率均较低。
因此，如何提高CHO细胞的基因敲除效率是提高抗体ADCC活性的难点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一目的在于提供一种岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，包括：
采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组敲除CHO细胞的FUT8基因，以获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系；
其中，外显子区域片段包含如SEQ ID NO.1所示的序列；
三种sgRNA的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明的一种实现方式中，三种sgRNA分别包含于第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体中；
第一sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，第二sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.3所示，第三sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.4所示；
本发明的一种实现方式中，第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体分别使用CRISPR/Cas9质粒构建，CRISPR/Cas9质粒包括pYsY-CMV-Cas9-U6-sgRNA。
本发明的一种实现方式中，采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组敲除CHO细胞的FUT8基因之后还包括：
筛选敲除阳性的CHO细胞进行单克隆以获取单克隆CHO细胞系，在单克隆CHO细胞系中筛选岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
本发明的一种实现方式中，在单克隆CHO细胞系中筛选岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系具体包括：
获取单克隆CHO细胞系的基因组DNA，通过基因组DNA的测序数据筛选岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
本发明的一种实现方式中，测序数据为巢式PCR测序数据，获取测序数据过程中用到的巢氏PCR引物对包括如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的引物对以及如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对。
本发明的一种实现方式中，筛选敲除阳性的CHO细胞是指采用扁豆凝集素筛选敲除阳性的CHO细胞。
本发明的第二目的在于提供一种采用如上述制备方法制备的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
本发明的一种实现方式中，包含编码目的蛋白的核酸分子。
本发明的一种实现方式中，目的蛋白为抗体。
本发明的一种实现方式中，目的蛋白不具有岩藻糖基修饰。
本发明的一种实现方式中，核酸分子插入于基因组中；和/或
核酸分子包含于表达载体中。
本发明的一种实现方式中，表达载体为质粒。
本发明的第五目的在于提供一种制备上述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的试剂盒，包括用于和CHO细胞FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组的如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的三种sgRNA；其中，外显子区域片段的序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明的一种实现方式中，三种sgRNA分别包含于第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体中；
第一sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，第二sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.3所示，第三sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的一种实现方式中，第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体分别使用CRISPR/Cas9质粒构建，CRISPR/Cas9质粒包括pYsY-CMV-Cas9-U6-sgRNA。
本发明的一种实现方式中，上述试剂盒还包括用于巢氏PCR反应的如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的引物对以及如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对。
本发明的第四目的在于提供一种表达目的蛋白的方法，其特征在于，包括：
将编码目的蛋白的核酸分子导入上述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中，以在岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中表达目的蛋白；或者
采用上述包含编码目的蛋白的核酸分子的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系表达目的蛋白。
本发明的一种实现方式中，上述方法表达的目的蛋白不具有岩藻糖基修饰。
本发明公开的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，创造性地采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组以敲除CHO细胞的FUT8基因，显著提高sgRNA的打靶效率，并且打靶准确率高，不易脱靶，因而显著提高了FUT8基因的敲除效率，更容易获得敲除阳性的CHO细胞，进而更容易获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备sgRNA载体的电泳检测结果；
图2为本发明实施例1构建的sgRNA载体的结构示意图；
图3为本发明实施例1经巢氏PCR筛选的2个单克隆细胞系PCR产物的电泳检测结果；
图4为本发明实施例1中C10两条同源染色体的其中一条染色体敲除位点附近的基因序列与Fut8 Exon11基因序列比较结果示意图；
图5为本发明实施例1中C10两条同源染色体的另一条染色体敲除位点附近的基因序列与Fut8 Exon11基因序列比较结果示意图；
图6为本发明实施例1中E10两条同源染色体的其中一条染色体敲除位点附近的基因序列与Fut8 Exon11基因序列比较结果示意图；
图7为本发明实施例1中E10两条同源染色体的另一条染色体敲除位点附近的基因序列与Fut8 Exon11基因序列比较结果示意图；
图8为本发明实施例2中不同代表性糖型质谱检测谱图；
图9为本发明实施例2中对岩藻糖敲除细胞株C10的糖型的质谱检测图谱；
图10～13为本发明实施例3中不同细胞系产生的抗体与FcγRⅢa(F176)受体之间亲和力的检测结果示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
如上文，传统提高抗体ADCC活性的方法均存在一定的弊端，其中，传统CRISPR/Cas9系统使用单一sgRNA使DNA断裂，易被修复，敲除效率较低，仅为5％左右。
为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本发明的第一方面提供了一种岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，包括：
采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组敲除CHO细胞的FUT8基因，以获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系其中；其中，外显子区域片段的序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列；三种sgRNA的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
如本文中所使用的，术语“岩藻糖基转移酶8(FUT8)”亦称为α-(1,6)-岩藻糖基转移酶，其能够催化岩藻糖基以α-(1,6)的连接方式转移至蛋白的糖基化位点。FUT8的国际系统分类编号为EC2.4.1.68。CHO细胞的基因组中，编码岩藻糖基转移酶8(FUT8)的核苷酸序列是已知的，其示例性核苷酸序列可参见例如，NCBI登录号NW_003613860.1；第608848-730818位。
本发明采用基因敲除技术，创造性地采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组，以敲除CHO细胞的FUT8基因，显著提高sgRNA的打靶效率，提高了CHO细胞FUT8基因的敲除效率，更容易获得敲除阳性的CHO细胞，进而更容易获得岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
本发明首次发现CHO细胞中FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域能够作为3种sgRNA的打靶区域，实现CHO细胞中FUT8基因的敲除，并且显著提高CHO细胞的阳性敲除率，从而能够提高制备ADCC活性更高的抗体的效率。
如本文中所使用的，术语“基因敲除”是指，对细胞基因组中的基因进行编辑(例如，对该基因进行插入、替换、和/或删除等改造)，使得该基因丧失其原有功能(例如，不能表达功能性的蛋白)。可使用各种已知的分子生物学技术(例如，使用ZFN、TALEN、CRISPR/cas9、或NgAgo的基因编辑技术)来编辑细胞基因组中的基因。基因敲除并不局限于将整个基因完整缺失或去除，而只要使基因丧失其原有功能即可。例如，可通过在基因中插入外源DNA片段，使得该基因无法表达功能性蛋白，或可通过在基因中插入或缺失一个或数个碱基，使得该基因发生移码突变，来实现对该基因的敲除。
一些实施方案中，三种sgRNA分别包含于第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体中；第一sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，第二sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.3所示，第三sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
如本文所用，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
一些具体实施方案中，第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体采用CRISPR/Cas9质粒构建，CRISPR/Cas9质粒包括pYsY-CMV-Cas9-U6-sgRNA。
更具体地，本发明通过CRISPR/cas9基因敲除技术，创造性地采用三种sgRNA构建sgRNA载体，sgRNA载体可用Pysy-CMV-Cas9-U6-sgRNA表示，得到第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体，三种sgRNA载体的区别仅在于其中包含的sgRNA序列不同，能准确针对CHO细胞中FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域打靶，从而显著提高CHO细胞FUT8基因的敲除效率，进而用于制备ADCC活性更高的抗体。
一些实施方案中，采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组敲除CHO细胞的FUT8基因后之还包括：
筛选敲除阳性的CHO细胞进行单克隆以获取单克隆CHO细胞系，在单克隆CHO细胞系中筛选岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
一些实施方案中，在单克隆CHO细胞系中筛选岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系具体包括：
获取单克隆CHO细胞系的基因组DNA，通过基因组DNA的测序数据筛选岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
一些实施方案中，测序数据为巢式PCR测序数据。
如本文所用，术语“巢式PCR”是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
一些具体实施方案中，获取测序数据过程中用到的巢氏PCR引物对包括如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示序列的引物对以及如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对，其中，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的引物对扩增区域覆盖SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示序列的引物对的扩增区域，以实现准确扩增sgRNA的打靶区域。
如本文所用，术语“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下)，寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前，首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，在一些实施方案中，引物范围为10-100或更多个核苷酸(例如10-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-90、20-80、20-70、20-60、20-50个核苷酸等)。
一些实施方案中，筛选敲除阳性的CHO细胞是指采用扁豆凝集素筛选敲除阳性的CHO细胞。需要说明的是，扁豆凝集素由两个17kDa和两个8kDa的亚基组成，LCA可识别含有α-甘露糖残基的序列，同时也可识别作为受体结构一部分的糖类。本发明中扁豆凝集素可以特异性的识别并结合带有岩藻糖的多糖，粘附在细胞表面的小扁豆凝集素被吞后会导致细胞死亡，因此通过扁豆凝集素筛选活细胞即可获得敲除阳性的CHO细胞。
本发明的第二方面提供了一种采用如上述制备方法制备的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系，本发明的CHO细胞系产生的抗体不带有α-(1,6)-岩藻糖基转移酶，显著提高了单克隆抗体的ADCC活性。
一些实施方案中，上述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系包含编码目的蛋白的核酸分子，用以表达目的蛋白。
一些实施方案中，目的蛋白为抗体，对于单克隆的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系，其表达的蛋白可以为单克隆抗体。
可以理解的是，本发明的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系表达的抗体不具有岩藻糖基修饰，能够显著提高的抗体的ADCC活性。
如本文中所使用的，术语“ADCC”即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibodydependent cell-mediated cytotoxicity)，其是指，具有杀伤活性的细胞(例如NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)，通过其表面表达的Fc受体(FcR)识别特异性结合于靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)表面抗原的抗体的Fc片段，直接杀伤靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)。
一些实施方案中，核酸分子插入于基因组中；和/或
核酸分子包含于表达载体中。
可以理解的是，核酸分子可以通过转染的方式插入基因组中稳定表达，也可以在转染初期游离于细胞中瞬时表达。
一些实施方案中，表达载体为质粒，用于构建目的蛋白表达载体。
本发明的第三方面提供了一种制备上述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的试剂盒，包括用于和CHO细胞FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组的如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的三种sgRNA；其中，外显子区域片段包含如SEQID NO.1所示的序列。
一些实施方案中，三种sgRNA分别包含于第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体中；
第一sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，第二sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.3所示，第三sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
一些具体实施方案中，第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体采用CRISPR/Cas9质粒构建，CRISPR/Cas9质粒包括pYsY-CMV-Cas9-U6-sgRNA。
一些实施方案中，上述试剂盒还包括用于巢氏PCR反应的如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示序列的引物对以及如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对。
因此，本发明的第四方面还提供了一种表达目的蛋白的方法，包括：
将编码目的蛋白的核酸分子导入上述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中，以在岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中表达目的蛋白；或者
采用上述包含编码目的蛋白的核酸分子的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系表达目的蛋白。
具体地，可使用各种方式来将编码目的蛋白的核酸分子导入岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中。例如，可通过使用转染试剂(例如脂质转染试剂)，或者可通过使用电转染的方式，将编码目的蛋白的核酸导入岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中。或者直接采用包含编码目的蛋白的核酸分子的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系表达目的蛋白。
一些实施方案中，上述方法表达的目的蛋白不具有岩藻糖基修饰。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1制备岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系
1.材料和方法：
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞：CHO细胞系选自CHO-K1细胞，系保存于美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为CCL-61；所用Fut8基因序列的基因库编号为gene ID:ENSCGRG00001018667。
2.基因的基本信息
Fut8基因的具体信息可以通过在Enseml数据库中搜索ENSCGRG00001018667.1获取，Fut8基因转录本的信息可以通过在Enseml数据库中搜索ENSCGRT00001023380.1获取。
3、目标基因的外显子和内含子组成
Fut8基因含有11个外显子以及位于11个外显子之间的内含子。
4、蛋白质序列
Fut8基因编码的蛋白质包括575个氨基酸，蛋白质的序列如SEQ ID NO.9所示(不包括终止密码子)：
MRAWTGSWRWIMLILFAWGTLLFYIGGHLVRDNDHPDHSSRELSKILAKLERLKQQNEDLRRMAESLRIPEGPIDQGTATGRVRVLEEQLVKAKEQIENYKKQARNDLGKDHEILRRRIENGAKELWFFLQSELKKLKKLEGNELQRHADEILLDLGHHERSIMTDLYYLSQTDGAGEWREKEAKDLTELVQRRITYLQNPKDCSKARKLVCNINKGCGYGCQLHHVVYCFMIAYGTQRTLILESQNWRYATGGWETVFRPVSETCTDRSGLSTGHWSGEVKDKNVQVVELPIVDSLHPRPPYLPLAVPEDLADRLLRVHGDPAVWWVSQFVKYLIRPQPWLEREIEETTKKLGFKHPVIGVHVRRTDKVGTEAAFHPIEEYMVHVEEHFQLLERRMKVDKKRVYLATDDPSLLKEAKTKYSNYEFISDNSISWSAGLHNRYTENSLRGVILDIHFLSQADFLVCTFSSQVCRVAYEIMQTLHPDASANFHSLDDIYYFGGQNAHNQIAVYPHQPRTKEEIPMEPGDIIGVAGNHWNGYSKGVNRKLGKTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEK。
5、蛋白质的保守结构功能域
Fut8基因编码的SH3结构域的氨基酸位于第509～559个氨基酸。
6、CRISPR设计
Fut8基因沿5’-3’端的方向最后一个外显子区域片段即Exon11区域编码蛋白的片段序列如SEQ ID NO.1所示：
GTCTGTAGGGTTGCTTATGAAATCATGCAAACACTGCATCCTGATGCCTCTGCAAACTTCCATTCTTTAGATGACATCTACTATTTTGGAGGCCAAAATGCCCACAACCAGATTGCAGTTTATCCTCACCAACCTCGAACTAAAGAGGAAATCCCCATGGAACCTGGAGATATCATTGGTGTGGCTGGAAACCATTGGAATGGTTACTCTAAAGGTGTCAACAGAAAACTAGGAAAAACAGGCCTGTACCCTTCCTACAAAGTCCGAGAGAAGATAGAAACAGTCAAATACCCTACATATCCTGAAGCTGAAAAATAG。
本发明创造性地针对编码SH3结构域的外显子区域Exon11设计3个sgRNA，sgRNA的序列包括：
SEQ ID NO.2：TAAAGAATGGAAGTTTGCAGAGG；
SEQ ID NO.3：TCACCAACCTCGAACTAAAGAGG；
SEQ ID NO.4：ATAAACTGCAATCTGGTTGTGGG；
其中，序列如SEQ ID NO.2所示的sgRNA的CRISPRater效率打分为0.80，序列如SEQID NO.3所示的sgRNA的CRISPRater效率打分为0.76，序列如SEQ ID NO.3所示的sgRNA的CRISPRater效率打分为0.63。
7、设计与合成CRISPR模板(互补引物)
根据之前确定的3个CRISPR序列，设计对应的3对互补引物，由引物合成公司合成。
第一对互补引物对为：
F-Fut8-1S如序列SEQ ID NO.10所示；
SEQ ID NO.10：CACCGTAAAGAATGGAAGTTTGCAG；
R-FUT8-1S如序列SEQ ID NO.11所示；
SEQ ID NO.11：AAACCTGCAAACTTCCATTCTTTAC；
第二对互补引物对为：
F-Fut8-2S如序列SEQ ID NO.12所示；
SEQ ID NO.12：CACCGTCACCAACCTCGAACTAAAG；
R-FUT8-2S如序列SEQ ID NO.13所示；
SEQ ID NO.13：AAACCTTTAGTTCGAGGTTGGTGAC；
第三对互补引物对为：
F-FUT8-3S如序列SEQ ID NO.14所示；
SEQ ID NO.14：CACCGATAAACTGCAATCTGGTTGT；
R-FUT8-3S如序列SEQ ID NO.15所示；
SEQ ID NO.15：AAACACAACCAGATTGCAGTTTATC。
以任意一对引物对为例，利用引物对制备Cas9和sgRNA二合一质粒结构过程如下所示：
7.1引物退火
1)向可信赖的商业公司订购上述寡脱氧核苷酸链(即引物，共2条，每个引物2OD，RPC纯化即可)。
2)将正反向两个引物进行退火：
(1)将引物对溶于超纯水中，至100μM；
(2)在2个PCR管中按下述配方分别组成10μL反应体系：
8μL 1X退火缓冲液(Annealing Buffer)；
1μL正向引物；以及
1μL反向引物。
(3)将反应体系混匀，然后快速离心将溶液离心至PCR底部。
(4)将混匀后的体系放入PCR仪进行反应，95℃孵育5min后，以每分钟1.5℃逐渐从95℃降至22℃。
7.2.退火产物重组连接
1)在PCR管中按下述配方组成10μL反应体系：
5.5μL H2O(PCR级)；
1.0μL线性化二合一质粒(pYSY-CMV-Cas9-U6-sgRNA)；
0.5μL退火产物；
2.0μLT4连接缓冲液；以及
1.0μLT4连接酶。
2)混匀，然后将混合液快速离心至PCR管底部。
3)16℃过夜或室温孵育30min。
7.3.转化
1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，立即置于冰上。
2)待感受态细胞解冻后，将50μL感受态细胞轻轻加入10μL的连接体系即可，不需要吸打混匀，冰浴30min。
3)42℃水浴热激90s,后立即置于冰上孵育2min。
4)加入100μLLB培养基(无抗生素，室温)，于37℃恒温摇床培养40min-1h(盖紧管盖)。
5)取所有菌液均匀涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上(高压灭菌处理过的)，按常规方法倒置于恒温培养箱中37℃培养过夜(14-18h)。
7.4.转化子鉴定
1)准备1.5ml的EP管，每管加入20μL含50μg/mL氨苄的LB液。
2)用高压灭面处理过的枪头从LB琼脂板上挑取单克隆直接放入准备好的EP管中。每个板上挑取8个克隆。
3)盖紧管盖后，涡旋振荡EP管。
4)准备8个0.2ml的PCR管，在每一个管中按下列方法分别制备10μL PCR反应体系：
3.5μL H2O(PCR grade)；
5.0μL 2X PCR Master Mix；
0.5μL正向引物1(试剂盒提供)；
0.5μL反向Oligo(5μM)；以及
0.5μL含单克隆细菌的LB液(来自EP管)。
5)PCR反应条件：95℃，2min；35个循环(94℃30sec,50℃30sec,72℃30sec)；72℃，5min；16℃，∞。
6)2％琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆应出现113bp的条带，如图1所示：
Lane1：DNAMarker(从下往上分别表示100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，3000bp，5000bp的条带)；Lane2-5：出现113bp的条带，表示阳性转化子；Lane 6-7：出现小于100bp的条带，表示阴性转化子。
7.5.Sanger测序验证
送2个经PCR验证有阳性条带的菌液去测序，确认CRISPR序列(不含PAM位点)和骨架序列确实在质粒中，即确认CRISPR+sgRNA骨架模板存在。
8.细胞转染
1)实验设备
电转仪：BIORED Genepulse Xcell
电泳仪：Bio-Rad 1645050
2)细胞培养条件
培养基：CD CHO 012+1x HT+1mM Gln；
培养参数：37℃，5％CO2，80％RH，200rpm。
3)引物设计
在编辑位点外围设计巢式PCR引物，巢式PCR引物的序列包括如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示序列的引物对以及如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对：
SEQ ID NO.5：CAATGGACTGTTCTCAGCCCTC；
SEQ ID NO.6：TTGACAGACATGCTCCGCA；
SEQ ID NO.7：CAAGGTCTGTAGGGTTGCT；
SEQ ID NO.8：TCTCAGCCAAGCAGAAGACC。
Cas9和sgRNA二合一质粒结构如图2所示。
按照表1配置转染液，按照表2设置电转仪电转条件。
表1
| 试剂 | 添加量(一次转染) |
| 细胞 | 6.25*106个 |
| 质粒1 | 10μg |
| 质粒2 | 10μg |
| 质粒3 | 10μg |
| 无菌水 | 补充至总体积为50μL |
表2
| 电压(V) | 电容(μF) | 脉冲 | 电转池(mm) |
| 240 | 950 | 指数衰退 | 4 |
9.扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin，LCA)表型筛选
电转后在无血清培养基内加入100μg/mL LCA(扁豆凝集素)培养6天。有限稀释致96孔板，用MD Clone Select Imager拍照核实。
10.获取单克隆细胞
10.1 PCR反应液的配置：在0.25mL的PCR管中，分别加入10×PCR缓冲液2μL、DNA模板1μL(1000个细胞+10μL一步法DNA提取液)、2.5mmol/L的dNTP混合液1μL、Taq DNA聚合酶(5U/pL)0.5μL、10μmol/L巢氏PCR引物，每条引物各1μL，加水至20μL PCR反应体系。
10.2 PCR反应条件按照表3所示设置。
表3
10.3电泳溶液配置：取PCR反应后的溶液10μL加6x loading缓冲液2μL用于跑2％琼脂糖电泳。
10.4具体实验过程如下：
10.4.1细胞转染24小时，离心去死细胞，对活细胞进行细胞计数；
10.4.2将细胞分装到96孔板，1细胞/孔，铺能选出30单克隆的板(6块板)，其余细胞冻存；
10.4.3细胞培养6-7天，用照相系统能分出单克隆细胞；
10.4.4取出5个细胞，离心去上清；
10.4.5一步法试剂(10μL)消化细胞，提取基因组DNA；
10.4.6对基因组DNA进行巢式(nested)PCR，第一个PCR反应总体机20μL,30cycles；
10.4.7取第一个PCR反应结果5μL，做第二个PCR反应总体机40μL，30cycles；
10.4.8取第二个PCR反应结果25μL，送去进行序列测定；
10.4.9每个反应取10μL扩增产物，跑2％琼脂糖电泳；
10.4.10根据PCR和序列分析结果，挑出敲除阳性克隆。
10.4.11分出一半阳性细胞，进行功能测试。
10.5实验结果
巢式PCR对LCA筛选后，筛选单细胞铺板的2个存活细胞进行鉴定，2个细胞的PCR扩增片段的电泳结果如图3所示；根据图3可知，来自两个存活细胞C10、E10的PCR扩增片段分子量小于野生型对照1G4细胞。
用“T载体PCR产物克隆试剂盒”克隆细胞C10和E10的PCR扩增片段，以获取C10的两条同源染色体的敲除位点附近的基因序列以及E10的两条同源染色体的敲除位点附近的基因序列。
C10两条同源染色体的敲除位点附近的基因序列与Fut8 Exon11基因序列比较结果如图4和图5所示所示。
如图4所示，C10-1与Fut8 Exon11比较，缺失53-106bp和140-142bp的基因片段以及存在139A-G突变；如图5所示，C10-2和Fut8 Exon11比较，缺失53-67bp、87-106bp和140-142bp基因片段。
E10两条同源染色体的敲除位点附近的基因序列与Fut8 Exon11基因序列比较结果如图6和图7所示。
如图6所示，E10-1与Fut8 Exon11比较，缺失53-106bp和136-153bp基因片段；如图7所示，E10-2与Fut8 Exon11比较，缺失60-66bp、86-114bp以及123-143bp基因片段。
实施例2细胞系C10 N-糖基化含量测定检测报告
1、目的
根据检测方案，用UPLC-FLD的方法检测糖蛋白中糖基化的含量。
2、设备、试剂、耗材和样品
2.1仪器
本实施例使用的仪器具体如表4所示。
表4
| 仪器名称 | 生产厂家 | 仪器型号 |
| 高效液相色谱仪 | Waters | H-Class |
| 96孔提取板装置 | Waters | 186001831 |
| SPE真空泵 | GAST | DOA-P504-BN |
| 真空导管垫片 | Waters | 186007986 |
| 加热模块/热循环器 | 上海一恒 | TU-100C |
| 电子天平 | Mettler | Me204e |
| 漩涡混合仪 | Corning | LSE 6776 |
| 台式离心机 | Beckman | X-30R |
| 10μL移液器 | Thermo | OH03771 |
| 100μL移液器 | Thermo | OH03852 |
| 200μL移液器 | eppendorf | L21294H |
| 1000μL移液器 | Thermo | OH04686 |
2.2试剂
本发明实施例使用的试剂具体如表5所示。
表5
2.3耗材
本实施例使用的耗材具体信息如表6所示。
表6
2.4溶液配制
2.4.1流动相A：50mM甲酸铵溶液(pH 4.4)
准确称取15.75±0.1g甲酸铵于1L烧杯中，加入约800mL水，涡旋溶解后，调pH至4.4，转移至1000mL容量瓶内，用超纯水定容，混匀，常温保存，有效期1个月。
2.4.2流动相B：100％乙腈
2.4.3 RapiGest缓冲溶液：将1瓶(3mg)RapiGest溶于60μL的5倍GlycoWorksRapid缓冲液中以制备5％(w/v)RapiGest缓冲溶液。涡旋混匀，-80℃下最多保存一个月。
2.4.4标记溶液：将1瓶9mg RapiFluor-MS溶于131μL无水DMF中以制备试剂溶液，抽吸和分散溶液5-10次，确保试剂溶解，或者盖上瓶盖并略微涡旋试剂瓶中的内容物。
2.5样品准备
2.5.1样品信息
本实施例的样品信息具体如表7所示。
表7
| 样品编号 | 样品名称 | 浓度(mg/mL) |
| P19A-C10 | P19A200303U01 | 0.08 |
本实施例使用的糖蛋白：使用10kD超滤浓缩管将样品浓缩至2mg/mL，使用量7.5μL，检测的蛋白总量为15μg。
注意事项：避免样品中有亲核试剂和SDS。使用RapiGestSF表面活性剂有利于实现快速糖基释放，但在存在亲核试剂(Tris、甘氨酸、组氨酸、铵、巯基乙醇、DTT)、SDS的情况下将会受到影响。需将胺和/或硫醇的浓度稀释至＜0.1mM。因此，样品在酶促糖基释放之前可使用50mM HEPES进行缓冲液交换处理。
2.6实验步骤
2.6.1糖基释放
2.6.1.1在1mL试管中依次加入15.3μL的18.2MΩ水、7.5μL 2mg/mL糖蛋白溶液、6μL含5％(w/v)RapiGest SF的缓冲溶液。抽吸和分散，使其混匀。
2.6.1.2变性：使用加热块将该混合物95℃加热3min。
2.6.1.3冷却：将1mL试管从加热块中取出，冷却3min。
2.6.1.4加入1.2μL Rapid PNGase F，使IgG的浓度为0.5mg/mL，抽吸和分散使其混匀。
2.6.1.5孵育该混合物，使溶液温度在50℃下保持5min。
2.6.1.6将1mL试管从加热块中取出，让糖基释放混合物在室温下冷却3min。
2.6.2快速标记糖胺：
2.6.2.1向1mL试管内的糖基释放混合物中加入12μL RapiiFluor-MS试剂溶液。抽吸和分散试剂溶液5次以确保混合均匀。
2.6.2.2在室温下进行标记反应；5min后，用358μL ACN稀释反应混合物以准备用于HILIC SPE。
2.6.3 HILIC SPE纯化
2.6.3.1在配有3个垫片，一个废液盘的真空导管上调整GlycoWorks HILICμElution提取板。(SPE过程中所有步骤的最佳真空设置为2.5～4in Hg。)
2.6.3.2用200μL的18.2MΩ水对将要使用的Elution提取板上的孔进行活化。
2.6.3.3用200μL的15:85水/乙腈对孔进行平衡。
2.6.3.4加载以乙腈稀释的样品，总体积为大约400μL。
2.6.3.5用两份600μL的1:9:90(v/v/v)甲酸/水/乙腈溶液依次对孔进行清洗。
2.6.3.6将废液盘更换为装有600μL锥底内衬管的96孔收集板。
2.6.3.5用三份30μL的GlycoWorks SPE洗脱缓冲液(200mM醋酸铵的5％乙腈溶液)洗脱糖基。
2.6.3.6在进行HILIC色谱分析前，用100μL DMF稀释90μL洗脱物，再加入210μLACN进行稀释。抽吸和分散溶液5次，确保混合均匀。
2.6.3.7分别吸取100μL样品至内插管放入样品瓶中，其余-20℃保存。
2.6.4 HILIC-FLR分析
2.6.4.1系统准备与平衡
平衡Glycan BEH Amide色谱柱：
(1)首次启用，用50倍柱体积的60％乙腈/40％水溶液(或初始条件)冲洗色谱柱。
(2)首次进样之前，用20倍柱体积的初始流动相条件平衡色谱柱。
(3)两次进样之间用8-10倍柱体积的流动相平衡色谱柱。
2.6.4.2高效液相色谱仪参数
本实施例的色谱参数具体如表8所示。
表8
3.试验结果
3.1不同代表性糖型质谱检测谱图如图8所示，对岩藻糖敲除细胞株C10的糖型的具体检测图谱如图9所示，根据图9得到各糖型的峰面积百分比具体如表9所示。
表9
其中，G0、G0F、G1、G1F和G2等采用的是IgG糖型命名系统，和Oxford牛津糖型命名系统的对应关系为：G0(A2)、G0F(FA2)、G1(A2G1)、G1F(FA2G1)、G2(A2G2)和Man(M)。
所有类型的N-糖基化的基础结构均为两个核心N-乙酰葡糖胺β连接一个甘露糖，该甘露糖在α连接两个甘露糖的五糖结构(Man3)。G0：在该五糖结构上甘露糖的alpha1-2位点各连接一个N-乙酰葡糖胺。G0F：在G0的基础上，核心N-乙酰葡糖胺上连接岩藻糖。G1：在G0的基础上，alpha1-3或alpha1-6位点上连接一个半乳糖均为G1。G1F：在G1的基础上，核心N-乙酰葡糖胺上连接岩藻糖。G2：在G0的基础上，alpha1-3和alpha1-6位点上均连接一个半乳糖。Man：ManX，其中X是两个核心N-乙酰葡糖胺之后的甘露糖数目。
实施例3岩藻糖基转移酶8缺陷型细胞系表达M20R单克隆抗体
1.将构建好的M20R质粒电转到2B3、C10和E10三个细胞系：
2B3：从ATCC购买的CHO-K1细胞，经过悬浮驯化培养和单克隆筛选；
C10和E10：本发明实施例1中筛选的岩藻糖转移酶8缺陷型细胞系。
2.收集每个细胞系电转后5，9，12，16天的上清培养液。
3.用Protein A亲和层析柱纯化。
4.糖型的检测结果如表10所示。
表10
注意：表中标粗的数字的成份都有F，即岩藻糖
5.检测抗体的ADCC效应
本实施例采用分子相互作用-生物膜干涉技术(Biolayer-interferometry，BLI)的设备-ForteBio检测。抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)是治疗性单克隆抗体(mAbs)靶向肿瘤细胞的重要作用机制之一。在人类Fcγ受体(FcγRs)中，FcγRIIIa是已知的唯一在自然杀伤细胞(NK)中表达的受体，并通过IgG1-亚类单克隆抗体在ADCC中发挥关键作用，IgG1-Fc与FcγRIIIa的结合动力学可间接反映ADCC的强度。
本实施例的相关仪器与设备信息如表11所示，相关耗材如表12所示。
表11
表12
| 名称 | 品牌 | 货号/规格 |
| SA传感器 | Fortebio | 18-5020 |
| Black 96-well polypropylene plate | Greiner bio-one | 655209 |
| Fc5209(F176) | ACRO | CDA-H82E8 |
| Tween-20 | 生工生物 | TB0560-500ml |
表13
| 样品名称 | 样品批号 | 样品浓度 |
| M20R-fut8-2B3 | M20R2201141C01 | 0.09mg/ml |
| M20R-fut8-C10 | M20R2201141C02 | 0.43mg/ml |
| M20R-fut8-E10 | M20R2201141C03 | 0.06mg/ml |
注：亲合力的测定涉及抗体结合部位和抗原决定簇，因此要求抗体和抗原为液体的纯品。
本实施例的实验过程具体如下所示：
1.缓冲液配制
PBS溶液(pH7.4)：取PBS一包，倒入1000ml纯化水中，溶解混匀，2～8℃保存，有效期30天。
Q Buffer：PBS+0.02％吐温，2～8℃保存，有效期14天。
2.传感器润湿
先将SA传感器在200μL的Q Buffer缓冲液中润湿10分钟。
3.固化FcγRⅢa(F176)受体
将FcγRⅢa(F176)受体用Q Buffer稀释到1.5μg/mL。取200μL加入到后96孔板2通道，并设置300s反应时间(固化高度为0.25nm)。
4.分析抗体
将M20R抗体用Q Buffer分别稀释到200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM和0nM(其中M20R-fut8-2B3样品M20R抗体重复稀释到800nM、400nM、200nM、100nM、50nM和0nM)。取200μL加入到后96孔板4通道，每根SA传感器对应一个分析物的浓度，并设置M20R抗体与FcγRⅢa(F176)结合时间90s，解离时间90s，转速1000rpm。
5.数据分析
检测结果如图10～13所示。图10表示岩藻糖基转移酶8(FUT8)缺陷型CHO细胞系E10表达的M20R抗体与FcγRⅢa(F176)的ForteBio检测结果示意图；图11表示岩藻糖基转移酶8(FUT8)缺陷型CHO细胞系C10表达的M20R抗体与FcγRⅢa(F176)的ForteBio检测结果示意图；图12和图13表示野生型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系表达的M20R抗体与FcγRⅢa(F176)的ForteBio检测结果示意图，图12和图13的区别在于M20R抗体浓度不同。不同细胞系表达的M20R抗体与FcγRⅢa受体亲和力KD值如表14所示。无岩藻糖细胞所表达抗体对ADCC效应的潜在影响如表15所示。
表14
表15
6.结论
通过基于生物膜层干涉原理的Octet测定抗体与FcγRⅢa(F176)受体之间亲和力KD值，岩藻糖基转移酶8(FUT8)缺陷型CHO细胞系E10的检测样品为M20R-fut8-E10，C10的检测样品为M20R-fut8-C10，与来自野生型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系2B3的检测样品M20R-fut8-2B3相比，均增强了所表达抗体的ADCC效应。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 澳斯康生物（南通）股份有限公司
上海健士拜生物科技有限公司
健顺生物科技（南通）有限公司
上海澳斯康生物制药有限公司
甘肃健顺生物科技有限公司
<120> 岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系及其制备方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctgtaggg ttgcttatga aatcatgcaa acactgcatc ctgatgcctc tgcaaacttc 60
cattctttag atgacatcta ctattttgga ggccaaaatg cccacaacca gattgcagtt 120
tatcctcacc aacctcgaac taaagaggaa atccccatgg aacctggaga tatcattggt 180
gtggctggaa accattggaa tggttactct aaaggtgtca acagaaaact aggaaaaaca 240
ggcctgtacc cttcctacaa agtccgagag aagatagaaa cagtcaaata ccctacatat 300
cctgaagctg aaaaatag 318
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaagaatgg aagtttgcag agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaccaacct cgaactaaag agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ataaactgca atctggttgt ggg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caatggactg ttctcagccc tc 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgacagaca tgctccgca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaggtctgt agggttgct 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctcagccaa gcagaagacc 20
<210> 9
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
20 25 30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
50 55 60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
65 70 75 80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
85 90 95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His
100 105 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
115 120 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu
130 135 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145 150 155 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
165 170 175
Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
180 185 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
195 200 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
210 215 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225 230 235 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
245 250 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
260 265 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
275 280 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
290 295 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305 310 315 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
325 330 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Arg Glu Ile Glu Glu Thr Thr Lys Lys
340 345 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
355 360 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
370 375 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Glu Arg Arg Met Lys Val Asp
385 390 395 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
420 425 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
435 440 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
450 455 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465 470 475 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
500 505 510
His Gln Pro Arg Thr Lys Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
515 520 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asn Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
530 535 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545 550 555 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
565 570 575
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caccgtaaag aatggaagtt tgcag 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaacctgcaa acttccattc tttac 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caccgtcacc aacctcgaac taaag 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaacctttag ttcgaggttg gtgac 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccgataaa ctgcaatctg gttgt 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaacacaacc agattgcagt ttatc 25
Claims (16)
1.一种岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，其特征在于，包括：
采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组敲除CHO细胞的FUT8基因，以获得所述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系；
其中，所述外显子区域片段包含如SEQ ID NO.1所示的序列；
所述三种sgRNA的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系为双等位FUT8基因敲除的CHO细胞系。
2.根据权利要求1所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述三种sgRNA分别包含于第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体中；
所述第一sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，第二sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第三sgRNA载体包含的sgRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述第一sgRNA载体、第二sgRNA载体和第三sgRNA载体分别使用CRISPR/Cas9质粒构建，所述CRISPR/Cas9质粒包括pYsY-CMV-Cas9-U6-sgRNA。
4.根据权利要求1～3任一项所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述采用三种sgRNA与FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域重组以敲除CHO细胞的FUT8基因之后还包括：
筛选敲除阳性的CHO细胞进行单克隆以获取单克隆CHO细胞系，在单克隆CHO细胞系中筛选所述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
5.根据权利要求4所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述在单克隆CHO细胞系中筛选所述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系具体包括：
获取单克隆CHO细胞系的基因组DNA，通过基因组DNA的测序数据筛选所述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
6.根据权利要求5所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述测序数据为巢式PCR测序数据，获取所述测序数据过程中用到的巢氏PCR引物对包括如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的引物对以及如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对。
7.根据权利要求4所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述筛选敲除阳性的CHO细胞是指采用扁豆凝集素筛选敲除阳性的CHO细胞。
8.一种采用如权利要求1～7任一项所述的制备方法制备的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系。
9.根据权利要求8所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系，其特征在于，包含编码目的蛋白的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系，其特征在于，所述目的蛋白为抗体。
11.根据权利要求10所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系，其特征在于，所述目的蛋白不具有岩藻糖基修饰。
12.根据权利要求9所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系，其特征在于，所述核酸分子整合在基因组上；和/或
所述核酸分子包含于表达载体中。
13.根据权利要求12所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系，其特征在于，所述表达载体为质粒。
14.一种制备如权利要求8～13任一项所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系的试剂盒，其特征在于，包括用于与CHO细胞FUT8基因编码SH3结构域的外显子区域片段重组的如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的三种sgRNA；
其中，所述外显子区域片段的序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。
15.一种表达目的蛋白的方法，其特征在于，包括：
将编码目的蛋白的核酸分子导入权利要求8所述的岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中，以在所述岩藻糖基转移酶8缺陷型CHO细胞系中表达所述目的蛋白。
16.根据权利要求15所述的表达目的蛋白的方法，其特征在于，所述目的蛋白不具有岩藻糖基修饰。
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