KR101292169B1 - 옥돔과 옥두어의 감별 방법 및 그 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 옥돔 및 옥두어의 감별 방법 및 그 키트에 관한 것이다. 본 발명의 옥돔 및 옥두어의 감별 방법 및 그 키트는 옥돔의 Cytochrome b 유전자에 존재하는 XcmI 제한효소 인식 부위와 옥두어의 Cytochrome b 유전자의 대립 서열을 이용하거나 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열에서 차이가 있는 서열을 이용함을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 옥돔과 옥두어의 감별 방법 및 그 키트에 관한 것이다.
옥돔(Branchiostegus japonicus)과 옥두어(Branchiostegus albus)는 모두 농어목 옥돔과의 바닷물고기이다.
옥돔은 제주도 특산물로서 가격이 비싼 고급 어종에 속하나, 옥두어는 대부분 중국으로부터 수입되어 판매되고 있으며 중국산 옥두어의 가격은 옥돔의 보통 1/4 수준이다.
그런데 옥돔과 옥두어는 그 크기나 체색 그리고 생김새가 비슷하여 육안으로는 그들 사이의 판별이 매우 어렵다.
옥돔과 옥두어의 육안 판별이 어려운 이유로 중국산 옥두어가 국산 옥돔으로 둔갑되어 판매되는 사례가 발생하고 있다(세계일보 2010.08.20.자 기사 「"제주 옥돔은 없다?"… 수입 생선 제주산으로 둔갑」 참조).
본 발명은 이러한 배경 하에서 완성된 것으로, 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열에 기초하여 옥돔과 옥두어를 감별할 수 있는 기술을 개시한다.
본 발명의 목적은 옥돔과 옥두어의 감별 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 옥돔과 옥두어의 감별 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 본 발명의 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
일 측면에 있어서, 본 발명은 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법에 관한 것이다.
RFLP는 염기서열의 차이로 제한효소로 절단된 절편들의 길이가 다형성을 보이는 현상으로, 미생물의 동정, 생물종의 판별, 친자 확인, 질병의 진단 등에 이용되고 있다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아의 게놈 DNA를 분리하여 이 게놈 DNA 서열을 결정하였고, 그 결정된 서열에 기초하여 서로 다른 서열 부위를 탐색하였으며, 그 결과 미토콘드리아의 옥돔의 Cytochrome b 유전자에서 XcmI 제한효소 인식 부위(CCACTAACAGGATGG, 서열번호 1, XcmI 제한효소 인식 부위는 CCANNNNNNNNNTGG임, 여기서 N은 임의 뉴클레오티드이다)를 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 나아가 옥돔의 상기 제한효소 인식 부위 및 옥두어의 그것의 대립 서열(CCACTAACAGGATGA, 서열번호 2)을 포함한 서열을 증폭하여 상기 제한 효소로 처리하였을 때 옥돔의 경우는 옥두어와 달리 제한효소로 절단된 절편이 뚜렷이 확인되는 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명의 RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, (a) 옥돔과 옥두어로부터 생물학적 시료를 얻는 단계, (b) 그 생물학적 시료로부터 미토콘드리아의 게놈 DNA를 분리하는 단계, (c) 옥돔의 Cytochrome b 유전자의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하고, 또 옥돔의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열과 대립되는 옥두어의 서열번호 2의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 단계, 및 (d) 증폭 산물에 XcmI 제한효소로 처리하고 XcmI 제한효소 처리로 증폭 산물이 절단되었는지를 확인하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명의 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 얻는 단계에 있어서, 생물학적 시료는 그것이 얻어진 그대로 직접 사용되거나, 다음 단계인 미토콘드리아 게놈 DNA의 분리를 용이하게 하기 위하여 상기 시료를 전처리한 후에 사용할 수 있다. 그러므로 상기 생물학적 시료는 예를 들면, 혈액으로부터 혈장 또는 혈청의 제조, 세포의 파괴, 고형 재료로부터 체액의 제조, 점액의 희석, 체액의 여과, 체액의 증류, 체액의 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등에 의해 사용 전에 전처리될 수 있다. 상기 생물학적 시료란 미토콘드리아 DNA가 얻어질 수 있는 세포를 포함하는 조직 또는 체액을 말한다. 예컨대 옥돔과 옥두어의 임의의 조직, 혈액, 타액 등의 체액일 수 있다.
본 발명의 상기 (b) 단계의 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아의 게놈 DNA를 분리하는 단계는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대 에탄올 분리법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 이들을 혼합한 방법 등을 이용할 수 있으며, 또 예컨대 문헌「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2007], 문헌[Doyle et al, Phytochem Bull 19: 11-15, 1987], 문헌[Want et al, Nucleic Acids Res 21: 4153-4154, 1993], 문헌[Lodhi et al., Plant Mol Biol Rep 12(1):6-13, 1994] 등에 개시된 방법을 이용·응용하여 수행할 수 있다. 통상은 생명공학회사에 제작·유통되는 DNA 추출용 키트를 이용하게 될 것이다. 그러한 DNA 추출용 키트로서는 예컨대 아래의 실시예에서 사용된 High Pure PCR Product Purificatin Kit(Roche, Germany), Epicenter Technology 사(WI), XTRANA 사(CO), Cepheid 사(CA), Qiagen 사(NL) 또는 Beckman Coulter 사(US)가 판매하는 키트 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 (c) 단계의 Cytochrome b 유전자의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열 또는 그것의 대립 서열인 서열번호 2의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 단계의 수행을 위해서는, 먼저 서열번호 1 서열 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 증폭 산물이 생성되도록 프라이머를 설계·제작하는 것이 필요하다.
상기에서 "프라이머 (primer)"란 주형 DNA에 특이적으로 결합하여 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 이러한 프라이머는 DNA 뿐만 아니라 RNA일 수 있으며, 또한 이들 프라이머는 여러 형태의 뉴클레오티드의 유사체가 배합된 것일 수도 있다. 뉴클레오티드의 유사체의 예로는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드, 7-데아자구아닌과 같이 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체, 리보스 유사체를 갖는 뉴클레오티드 유사체 등을 들 수 있다.
상기 프라이머의 길이는 주형 DNA와 특이적으로 결합하여 안정한 상보적인 결합을 형성하고 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 한 특별한 제한이 없다. 프라이머의 길이는 온도, 버퍼의 염 농도 등 증폭 조건을 고려하여 결정될 것이다. 통상은 10 내지 100 뉴클레오티드 범위의 길이를 가지도록 설계·제작될 것이나, 프라이머의 길이가 너무 짧거나 너무 길 경우에 주형 DNA와 비특이적 결합이 형성될 수 있으므로 15 내지 50 뉴클레오티드의 길이를 가지도록 설계되는 것이 바람직하다.
또 상기 프라이머의 서열은 주형 DNA와 완전히 상보적일 필요는 없으나 주형 DNA와 특이적 결합을 형성하여 원하는 증폭 산물을 얻기 위해서는 80% 서열 상보성을 가지도록 설계·제작되는 것이 바람직하며 특히 90% 이상의 서열 상보성을 가지도록 설계·제작되는 것이 바람직하다.
또 상기 프라이머의 설계시, 증폭 산물의 길이는 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 2의 대립 서열을 포함함으로써 XcmI 제한효소가 작용하거나(생물학적 시료를 옥돔 시료를 사용하였을 때임) 작용하지 않을 수 있고(생물학적 시료를 옥두어 시료를 사용하였을 때임), 상기 제한효소로 절단되었는지의 여부를 확인할 수 있는 길이이면 무방하다. 통상은 증폭 산물의 길이는 40 내지 2,000 bp 범위에서 결정될 것이며, 이를 고려하여 프라이머는 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 2의 대립 서열의 주변 서열 중에서 설계·제작될 수 있다. 이러한 프라이머의 설계·제작에 이용될 주형 DNA의 서열의 결정에는 옥돔 미토콘드리아 게놈 DNA 서열을 개시하고 있는 서열번호 31 및 옥두어 미토콘드리아 게놈 DNA 서열을 개시하고 있는 서열번호 32, 그리고 아래의 [표 2]의 Cytochrome b의 유전자의 위치를 고려할 수 있다.
또 본 발명의 상기 (c) 단계의 Cytochrome b 유전자의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 단계에서, 프라이머의 설계·제작이 끝난 후의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 2의 대립 서열을 포함하는 DNA 서열의 증폭을 위해서는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 통상은 생명공학회사에서 제작·유통되는 키트를 이용하게 될 것인데, 이러한 DNA의 증폭용 키트는 일반적인 PCR 방법뿐만 아니라, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법, 중합효소 리가아제 체인 반응법, Gap-LCR(Gap-filling Ligase Chain Reaction)법, 리페어 체인 반응법과, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응법, RCA(rolling circle amplification) 등의 등온증폭(isothermal amplification) 방법 등을 이용한 키트일 수 있다(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560, 1989; Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16, 1991; WO 90/01069; EP 439,182; Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173, 1989; U.S. Pat. No. 5,130,238)
본 발명의 상기 (d) 단계의 증폭 산물에 XcmI 제한효소로 처리하고 XcmI 제한효소 처리로 증폭 산물이 절단되었는지를 확인하는 단계도, 절단된 제한효소 처리 산물을 크기에 따라 분리할 수 있는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 일반적으로는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 방법을 이용하게 될 것이다.
크기별로 분리된 제한효소 처리 산물은 인터칼레이터 예컨대 에티듐 브로마이드, 에티듐 호모다이머-1, 에티듐 호모다이머-2, 에티듐 유도체, 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 유도체, 에티듐-아크리딘 헤테로다이머, 에티듐 모노아지드 등을 첨가하여 검출·확인할 수 있다. 구체적인 검출·확인 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Nucleic Acid Microarray and the Latest PCR Method, published by Shujunsha, Japan]에 기재된 방법 등을 참조할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 키트에 관한 것이다.
본 발명의 RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 키트는 (a) 옥돔과 옥두어로부터의 미토콘드리아 게놈 DNA 분리 수단, (b) 옥돔 게놈 DNA의 조절부위의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1 또는 서열번호 2로 특정된 옥두어의 서열번호 1과의 대립 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하기 위한 수단, 및 (c) XcmI 제한효소를 포함하여 구성된다.
본 발명의 키트에서, 상기 옥돔과 옥두어로부터의 미토콘드리아 게놈 DNA 분리 수단은 앞서 설명한 DNA 추출용 시약·키트일 수 있다.
본 발명의 키트에서, 게놈 DNA의 Cytochrome b 유전자의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하기 위한 수단은 전술한 바의 프라이머의 제작 수단 및/또는 DNA 증폭용 키트일 수 있다.
본 발명의 키트는 옥돔과 옥두어로부터 생물학적 시료를 분리하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 생물학적 시료를 전처리하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
또 본 발명의 키트는 본 발명의 키트의 사용 방법을 교시한 설명서를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 설명서는 종이 형태나 CD, 디스크, DVD 등 컴퓨터 판독 가능한 형태일 수 있다.
또 본 발명의 키트는 XcmI 제한효소 처리에 의한 산물의 크기를 검출·확인하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 검출·확인하기 위한 수단은 앞서 설명한 인터칼레이터 등을 들 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법은 (a) 옥돔과 옥두어로부터 생물학적 시료를 얻는 단계, (b) 그 생물학적 시료로부터, 옥돔의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열에서 서로 간에 다형성을 보이는 부위를 포함하는 미토콘드리아의 핵산 분자를 수득하는 단계, 및 (c) 그 수득한 핵산 분자에서, 그 다형성을 보이는 부위를 확인하는 단계를 포함하여 구성된다.
다형성 부위(polymorphism site)의 확인은 그 부위에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 유무 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 염기 타입을 확인함으로써 이루어진다.
본 발명의 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법에서, 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아의 게놈 서열은 각각 서열번호 31 및 32로 개시되어 있으며, 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아의 게놈 서열에 있어서, 서로 간에 하나 이상의 뉴클레오티드에서 다형성을 보이는 부위는 옥돔의 게놈 DNA 서열과 옥두어의 게놈 DNA 서열을 정렬·비교한 <도 5> 내지 <도 22>에 기호(*)가 표시되지 아니한 서열을 말한다.
따라서 옥돔과 옥두어로부터 옥돔의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드에서 다형성을 보이는 부위를 포함하는 핵산 분자를 수득하고, 그 수득한 핵산 분자에서 다형성을 보이는 부위의 뉴클레오티드의 결실 유무 또는 염기 타입을 결정하여 그 결정된 뉴클레오티드의 결실 유무 또는 염기 타입을 그 서열번호 31과 32 그리고 <도 5> 내지 <도 22>에 개시된 서열과 비교함으로써, 옥돔과 옥두어의 판별이 가능하게 된다.
예컨대 옥돔의 미토콘드리아 게놈 서열의 709번째 뉴클레오티드의 염기 타입은 G인 반면, 이에 상응하는 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열의 뉴클레오티드는 결실되어 있다(즉 옥두어의 708번째 및 709번째의 뉴클레오티드의 염기 타입은 T 및 A이며, 이는 옥두어에서 G가 결실되어 있기 때문에 옥돔의 708번째 및 710번째의 뉴클레오티드의 염기 타입과 일치한다). 따라서 옥돔과 옥두어의 709번째 뉴클레오티드가 포함되는 핵산 분자를 각각 옥돔 또는 옥두어로부터 수득하고 그 709번째 뉴클레오티드의 염기 타입을 결정하여 그 염기 타입이 G이면 옥돔으로 판별하게 되며, A이면, 이는 옥돔의 709번째 뉴클레오티드에 상응하는 옥두어의 뉴클레오티드가 결실된 결과 나타난 뉴클레오티드이므로, 옥두어로 판별하게 된다.
또한 예컨대 옥돔의 미토콘드리아 게놈 서열의 15번째 뉴클레오티드의 염기는 C인 반면, 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열의 15번째 뉴클레오티드의 염기 타입은 T이다. 따라서 옥돔과 옥두어의 15번째 뉴클레오티드가 포함되는 핵산 분자를 각각 옥돔 또는 옥두어로부터 수득하고 그 15번째 염기 타입을 결정하여 그 염기 타입이 C이면 옥돔으로 판별하게 되며, T이면 옥두어로 판별하게 된다.
본 발명의 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 핵산 분자의 수득은 gDNA의 분리, gDNA의 분리 후 증폭, mRNA 분리 후 cDNA 합성 등을 통하여 수행된다. gDNA의 분리, 그것으로부터의 gDNA의 증폭 방법은 이미 전술한 바와 같이 공지되어 있으며, RNA의 분리 및 그 RNA로부터의 cDNA의 합성 방법 등도 당업계에 공지되어 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987); PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).
또 본 발명의 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법에 있어서, 상기 (c) 단계 즉, 수득한 핵산에서 하나 이상의 뉴클레오티드에서 다형성 부위를 확인하는 단계도 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
그러한 공지된 방법의 예로서, 직접적인 서열 결정법, SNP(single nucleotide polymorphism) 유전자형 결정법(SNP genotyping) 등을 이용할 수 있는데, 이중 SNP 유전자형 결정법은 크게 전기영동 젤의 사용 유무에 따라 2가지로 대별된다.
전기영동 젤을 사용하는 방법으로서는 대표적으로 제한효소인식부위를 이용한 RFLP 분석법, SSCP(Single Stranded Conformation Polymorphism) 분석법과, tetra-primer ARMS-PCR 분석법, ddNTP(dideoxynucleotide)를 이용한 primer extension 법(예컨대 ABI 사의 SNaPshot 분석법) 등을 들 수 있으며(Orita et al., PNAS, USA 86:2776, 1989; Syvanen A.C. Nat Rev Genet. 2(12):930-42, 2001), 전기영동 젤을 사용하지 않은 방법으로서는 대립형 특이 혼성화 방법(alle-specific hybridization), 헤어핀(hairpin) 구조를 지닌 molecular beacon를 사용하는 방법, TaqMan probe를 사용하는 방법, 뉴클레오티드 미스매치를 인식하는 효소를 이용하는 방법(예컨대 Invader assay 법), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 법(Oligonucleotide Ligation Assay) 등을 들 수 있다(Howell W. et al., Nat Biotechnol. 17(1):87-8, 1999; Abravaya K. et al., Clin Chem Lab Med. 41:468-474, 2003; Olivier M. Mutat Res. 573(1-2):103-10, 2005; McGuigan F.E. et al., Psychiatr Genet. 12(3):133-6, 2002; Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)).
본 발명의 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법의 상기 (b) 단계 및 (c) 단계의 다형성을 보이는 부위는 XcmI 제한효소의 처리를 위한 옥돔의 증폭 산물의 염기서열 즉 서열번호 35의 1052번째 뉴클레오티드 또는 XcmI 제한효소의 처리를 위한 옥두어의 증폭 산물의 염기서열 즉 서열번호 36의 1052번째의 뉴클레오티드를 말한다. 상기 1052번째 뉴클레오티드가 G로 확인되면 옥돔이며, A로 확인되면 옥두어이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드는 <도 5> 내지 <도 22>에 개시된 옥돔의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열에서 서로 간에 다형성을 보이는 부위를 포함하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
이들 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드는 옥돔 게놈 서열(서열번호 31) 또는 옥두어의 게놈 서열(서열번호 32)로부터 유래하며, 서열번호 31 또는 서열번호 32의 옥돔의 게놈 서열 또는 옥두어의 게놈 서열의 일부 또는 전부로서 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 말한다.
이들 서열은 전술한 바의 RFLP(Restiction Fragment Length Polymorphism) 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법과, SNP(single nucleotide polymorphism) 유전자형 결정법(SNP genotyping) 등을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법에 이용될 수 있다.
본 발명의 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드 중, 상보적 뉴클레오티드에서는 다형성을 보이는 부위도 <도 5> 내지 <도 22>에 개시된 옥돔과 옥두어의 다형성 부위에 상보적인 부위로 이해될 수 있다. 예컨대 옥돔의 미토콘드리아 게놈 서열의 15번째 염기는 C이며, 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열의 15번째 염기는 T로서 염기서열의 차이를 보이는데, 이들 염기는 상보적 뉴클레오티드에서는 각각 G 및 A로 이해된다.
본 발명의 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 35의 1052번째 뉴클레오티드인 G를 포함하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열 또는 서열번호 36의 1052번째의 뉴클레오티드인 A를 포함하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 말한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열에 기초한 옥돔과 옥두어의 감별 방법 및 키트를 제공할 수 있다.
도 1은 옥돔의 제한효소 XcmI의 인식 부위를 포함한 DNA 증폭 산물과 옥두어의 그것의 대립 서열을 포함한 DNA 증폭 산물의 전기영동 사진이다.
도 2는 옥돔의 제한효소 XcmI의 인식 부위를 포함한 DNA 증폭 산물의 서열이다.
도 3은 옥두어의 제한효소 XcmI의 인식 부위 대립 서열을 포함한 DNA 증폭 산물의 서열이다.
도 4는 옥돔과 옥두어의 DNA 증폭의 제한효소 XcmI의 처리 결과이다.
도 5 내지 도 22는 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열을 비교·정렬한 것이다(*: 일치하는 서열임).
도 2는 옥돔의 제한효소 XcmI의 인식 부위를 포함한 DNA 증폭 산물의 서열이다.
도 3은 옥두어의 제한효소 XcmI의 인식 부위 대립 서열을 포함한 DNA 증폭 산물의 서열이다.
도 4는 옥돔과 옥두어의 DNA 증폭의 제한효소 XcmI의 처리 결과이다.
도 5 내지 도 22는 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열을 비교·정렬한 것이다(*: 일치하는 서열임).
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
옥돔 및
옥두어로부터의
게놈
DNA
의 분리
옥돔과 옥두어는 국립수산과학원 미래양식연구센터 및 제주수산시장에서 구입하였다.
게놈 DNA의 분리는 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA)를 사용하여 제조자의 메뉴얼에 따라 혈액 임파구로부터 분리하였다.
<
실시예
2>
게놈
DNA
의
PCR
증폭
돌돔의 미토콘드리아 게놈 서열(GeneBank acession number DQ872160; Oh et al., 2007. Gene 392:174-80)을 기초로 아래 [표 1]과 같이 디자인된 프라이머를 사용하여 상기 <실시예 1>에서 분리한 게놈 DNA를, GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystemss, USA)를 사용하여 돌돔(Oplegnathus fasciatus) 미토콘드리아 게놈 분석을 위한 PCR의 수행 조건(Oh et al., 2007. Gene 392:174-80)과 동일한 조건으로 연속적·중첩적으로 증폭하였다.
PCR 산물은 High Pure PCR Product Purificatin Kit(Roche, Germany)를 사용하여 제조자의 메뉴얼에 따라 수거·농축되었다.
프라이머 서열
상기 프라이머 서열 F-mt1 내지 F-mt14는 각각 상기 [표 1]의 순서대로 서열번호 3 내지 30으로 특정된다.
<
실시예
3>
PCR
산물의
클로닝
및 시퀀싱
상기 PCR 산물은 TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen, USA)를 사용하여 제조자의 메뉴얼에 따라 클로닝하였다.
각 클로닝 된 DNA 단편은 TOPO vector inner primer(Invitrogen, USA)를 사용하여 제조자의 메뉴얼에 따라 시퀀싱하였고, 표지된 DNA 단편을 ABI Prism 3100 DNA sequencer(Applied Biosystems, USA)로 분석하였다.
이렇게 하여 분석된 옥돔과 옥두어의 게놈 DNA는 각각 서열번호 31과 서열번호 32에 개시되어 있으며 GeneBank에 기탁번호 EU861052(옥돔, 전체 서열 길이 16,541) 및 EU861053(옥두어, 전체 서열 길이 16,532)로 기탁되어 있으며, 옥돔과 옥두어의 게놈 DNA 서열을 비교 정렬한 것은 <도 5> 내지 <도 22>에 연속적으로 서열번호 순서에 따라 개시되어 있다.
<
실시예
4>
서열 정렬을 통한 미토콘드리아의 유전자 탐색
상기 시퀀싱한 게놈 DNA를 관련 프로그램을 이용하여 기존 보고된 경골어류의 미톤콘드리아의 게놈 DNA 서열(Miya et al., 2003. Mol Phylogent Evol 26:121-38; Mabuchi et al., 2007. BMC Evol Biol 7:10; Tzeng et al., 1992. Nucleic Acids Res 20:4853-858; Inoue et al., 2000. Fish Sci 66:932; Kawaguchi et al., 2001. Ichthyol Res 48:213-23)과 비교함으로써 유전자를 탐색하였다.
MEGA 4.0 프로그램(Tamura et al., 2007. Mol Biol Evol 24:1596-599)과 BioEdit(biological sequence alignment editor and analysis program BioEdit, Hall TA. 1999. Nucleic Acids Symp Ser 41:95-8)을 사용하여 13개의 단백질 코딩 유전자를 확인하였고, DNASIS (version 2.5; Hitachi Software Engineering, USA)를 사용하여 22개의 tRNA 유전자를 확인하였으며, Gutell 등의 방법(Gutell et al., 1993. Nucleic Acids Res 21:3055-074)을 사용하여 2개의 rRNA 유전자를 확인하였다. 이는 기존에 진핵생물의 미토콘드리아에 대해서 보고된 바와 일치하는 결과이다(Boore JL. 1999. Animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Res. 27:1767-80).
이렇게 확인된 각 유전자의 위치를 아래의 [표 2]에 나타내었다.
옥돔과 옥두어의 미토콘드리아의 게놈 DNA에서 확인된 유전자 및 그 위치
<
실시예
5>
제한 효소 인식 부위의 탐색
상기 <실시예 4>에서 확인된 유전자 중에서 제한효소 인지 부위를 포함하는 유전자를 탐색하였다.
구체적으로 ClustalX 프로그램(Thompson et al., 1997. Nucleic Acids Res 25:4876-882)을 사용하여 기 확보된 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 DNA의 서열을 정렬하고 비교하여 서로 다른 부위를 검색하였고, BioEdit 프로그램(Hall, 1999. Nucleic Acids Symp Ser 41:95-8)을 통해 확인된 서로 다른 염기서열 부위에서 제한효소 인지부위를 탐색하였다. 그 결과 옥돔의 미토콘드리아의 Cytochrome b 유전자에서 XcmI(CCACTAACAGGATGG, 서열번호 1) 효소의 인지부위를 확인하였고, 이 부위는 옥두어에서는 발견되지 않는 제한효소 인지부위임을 확인하였다. 옥두어의 대립 서열은 CCACTAACAGGATGA(서열번호 2)이다.
<
실시예
6>
제한효소 인식 부위의 증폭
상기 부위를 증폭하기 위해 제한효소 인지부위를 포함하는 증폭산물이 1,500~1,700 base pairs가 될 수 있도록 시발체를 제작하였다. 제작된 시발체의 서열은 OD-RFLP-F: 5'-TCCCAACTCCCTCAAACATCTC-3'(서열번호 33)과 OD-RFLP-R: 5'-TAGGAACCAGATGCCAGGAATAG-3'(서열번호 34)이다. 옥돔과 옥두어에서 추출된 DNA를 이용하여 PCR(Ploymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응)을 통해 약 1.6 kb의 증폭산물을 얻었다. PCR을 수행하기 위해 I-MaxII DNA polymerase(iNtRON, Korea)를 사용하였다. 100 ng의 genomic DNA가 주형으로 사용되었고, 반응액의 전체 volume은 20 ㎕로 10×buffer가 2 ㎕, dNTP가 1.5㎕, 시발체 각 1 ㎕, 중합효소는 0.5 ㎕가 사용되었고, 3차 증류수는 최종 volume이 20 ㎕가 되게 넣어 혼합하였다. 증폭조건은 95℃에서 3분간 반응 한 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분간 반응시켰고, 총 40회 반복하였다. 40회의 반응이 끝난 후 72℃에서 10분간 반응한 후, 4℃에서 10분간 안정화시켰고, 증폭의 성공 여부를 확인하기 위해 Loading buffer(0.25% Bromophenol Blue, 30% Sucrose)에 증폭 산물을 혼합하고, 1×TBE buffer에 담긴 1% Agarose gel에 Loading 하였다. 전기영동은 실온에서 약 20분간 수평전기영동장치에서 수행하였다. 전기영동이 끝난 후 gel을 0.5mg/ml 농도의 Etidium Bromide로 염색시킨 후, UV Transilluminator를 이용하여 증폭된 밴드 크기를 관찰하였다.
전기영동 사진을 <도 1>에 나타내었고, 증폭된 산물을 시퀀싱하여 그 옥돔의 서열을 서열번호 35에 옥두어의 서열을 서열번호 36에 나타냄과 함께 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2 및 도 3에서 밑줄친 부분은 옥돔의 제한효소 XcmI 인식 부위와 옥두어의 대립 서열이다.
<
실시예
7>
증폭산물의
제한효소의 처리
증폭산물은 제한효소인 XcmI을 이용하여 처리하였고, 처리 조건은 다음과 같다. 증폭산물을 3 ㎕씩 새로운 튜브에 분주하였고, 제한효소용 10×buffer 1 ㎕와 제한효소인 XcmI 1 ㎕를 처리하였고, 최종 volume이 10 ㎕가 되게 증류수를 첨가하여 혼합하였다. 만들어진 반응액은 37℃에서 8시간 이상 반응시켰고, 앞서 언급한 전기영동 방법을 통해 결과를 확인하였다. 만약 옥돔의 증폭산물의 제한효소 처리 결과가 모두 두 개의 밴드로 나타나고, 옥두어의 제한효소 처리 결과가 모두 한 개의 밴드로 나타난다면, XcmI의 처리를 통한 증폭산물의 밴드양상의 차이로 인해 두 종의 구분이 가능할 것이다.
제한효소의 증폭산물은 제한효소(XcmI) 처리 후, 옥돔의 경우 570 bp와 1,045 bp로 절단되며, 옥두어는 증폭산물이 제한효소 인지부위를 가지고 있지 않아, 절단되지 않았다.
결과를 <도 4>에 나타내었다.
<110> JEJUTECHNOPARK
<120> Method for Discriminating Between Branchiostegus japonicus and
Branchiostegus albus and a Kit Therefor
<130> PP10-000-JejuTechnopart
<160> 36
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> Branchiostegus japonicus
<400> 1
ccactaacag gatgg 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Branchiostegus albus
<400> 2
ccactaacag gatga 15
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
gcataacact gaagatgtta ag 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
catgatgcaa aaggtacgag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ctcgtacctt ttgcatcatg 20
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
tgcaccatta ggatgtcctg atccaacatc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gatgttggat caggacatcc caatggtgca 30
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
actctatcaa agtggccct 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
agggccactt tgatagagt 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gcgcttagct gttaactaag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
cttagttaac agctaagcgc 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ggaagtgttg tgggaagaag g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
gttgcctatt actctggtaa 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
gcttcagtat cattggtggc c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
ggccaccaat gatactgaag c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
gctggggtca actatgtggt a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
taccacatag ttgaccccag c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
ccgggtgatt ggaagtcact 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
agtgacttcc aatcacccgg 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
ttgagcctgc aactggggct t 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
taccacagga accctctcct tac 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
agagcagcgg tatttgcatc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
cgagagcacc tcctcatagc 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
caggcgttta ggtgggatgt g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
cacatcccac ctaaacgcct g 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
caacggtggt ttttcaagcc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
ggcttgaaaa accaccgttg 20
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
agaatcctag ctttgggag 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
ctcccaaagc taggattct 19
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
cttaacatct tcagtgttat gc 22
<210> 31
<211> 16541
<212> DNA
<213> Branchiostegus japonicus
<400> 31
gctagcgtag cttactcaaa gcataacact gaagatgtta agatgggccc tagaaagctc 60
cgcaagcata aaggcttggt cctgacttta ctaacagctt tgtcctaacc tacacatgca 120
agtatccgca ccccggtgag aatgccccca cagtcccccg cccggagaca aggagctggt 180
atcaggcaca ctataactga agcccacgac accttgctca gccgcacctt caagggtaat 240
cagcagtggt aaatattaag ccataagtga aaacttgact taattaaggc caagagggtc 300
ggtaaaactc gtgccagcca ccgcggttat acgagagacc caagttgtta aatcacggcg 360
taaagagtgg ttaaaatgta ttaaaaaata gagccgaaca cttacaaagt tgttataagc 420
acacgaaatt aagaagccca atcacgaaag tggctttata taatttgaac ccacgtaagc 480
taggacacaa actgggatta gataccccat tatgcctagc cgtcaacatc gacagcacct 540
tacacccgct gtccgcccgg gaactacgag caacagctta aaacccaaag gacttggcgg 600
tgcttcagat ccccctagag gagcctgttc tggaaccgat aatccccgtt caacctcacc 660
ctttcttgtt tttcccgcct atataccgcc gtcgcaagct caccctgtga aggataaaca 720
gtgagcccaa ccggtactgc ccaatacgtc aggtcgaggt gtagcgtatg gaaggggaag 780
aaatgggcta cattctctaa tacagagcat acggaaggct acattgaaac atgtacctga 840
aggaggattt agtagtaagc aggaagtaga gtgtccctct gaaactggct ctggagcgcg 900
cacacaccgc ccgtcactct ccccgagcta tagaacccta taactaataa cccatgactg 960
caaaggggag gcaagtcgta acatggtaag tgtaccggaa ggtgtacttg gactaaccaa 1020
ggcatggcta aaaacaggaa agcgtctccc ttacaccgag aagatatccg tgcaaaccgg 1080
gttgccctga tgctaaaaag ctagcccctc ccccaaaaac aacaaaccac tatcaatacc 1140
cccaaataca ccaccagact taataaacca aaccattttc ccctcccagt ataggtgata 1200
gaaaagagac acaaggcgca acagagaaag taccgcaagg gaacgctgaa aaagtaatga 1260
aacaacccag taaagcttta aagagcagag attccaactc gtaccttttg catcatgatt 1320
tagccagtaa accccaagca aagagcactt tagtttgaca ccccgaaact acgtgagcta 1380
ctccaagaca gcctacacaa tagggcgaac ccgtctctgt ggcaatagag tgggaagagc 1440
ttcgagtaga ggtgacaagc ctaccgaacc tagttatagc tggttgcctg agaaatggat 1500
agaagttcag cctcccggct tctcctctca ccccaaatac ttcagacatc aaagaaaccg 1560
agagcgttaa tcaaaggagg gacagcccct ttgatacaag acacaacttt tacagaaggc 1620
taaagatcat attcacattt aaaggtaagc atgttctggt tggcttaaaa gcagccctcc 1680
ctacagaaag cgttaaagct cgggcatact acccgcctcc tccctatatt gataattaaa 1740
tcttaagccc ctactcctat caggccgccc catgccagca tggggacgac catgctaata 1800
tgagtaataa gagaacataa gactctctcc tcgcacacgt gtaagtcgga acggaccccc 1860
caccgaactt taacggcccc aaacaaagag ggaattggac atacaaacta agcaaccaga 1920
aaaacatcca gtaaccaacc gttaacccaa caccggtgtg ccctttttca aaggaaagac 1980
taaaagaaag agaaggaact cggcaaataa agcctcgcct gtttaccaaa aacatcgcct 2040
cttgcaaaat taacaaataa gaggtcccgc ctgccctgtg actctatgtt taacggccgc 2100
ggtatactga ccgtgcgaag gtagcgcaat cacttgtctt ttaaatggag acctgtatga 2160
atggcataac gagggcttaa ctgtctcctc tttcaagtca atgaaattga tctccccgtg 2220
cagaagcggg gataaaacca taagacgaga agaccctatg gagctttaga caccaaggcg 2280
gcccacagtt aataacacca aaacaaagga ccaaacaaca caacactccg ccctaatgtc 2340
tttggttggg gcgaccgcgg ggtagtacaa aactcccgcg tggaacgaga ggacttccct 2400
cttacagcta agagctaccg ctctaagaaa cagaatttct gacctattag atccggctta 2460
cgccgatcaa cggaacgagt taccctaggg ataacagcgc aatccccttt tagagcccat 2520
atcgacaagg gggtttacga cctcgatgtt ggatcaggac atcctaatgg tgcagccgct 2580
attaagggtt cgtttgttca acgattaaag tcctacgtga tctgagttca gaccggagca 2640
atccaggtca gcttctatct atgacatgaa cttttctagt acgaaaggac cgaaaagcgg 2700
gagcccctat tccaaacacg cccccccccc acctaatgaa atcaactaaa acaggtaaaa 2760
gggcataccc cctccgccca agaaaaaggc atattaaggt ggcagagccc ggttactgca 2820
aaagacctaa gccctttcta cagaggttca agtcctctcc ttaataatga tatcaatact 2880
catcacccat attattaatc ctcttatctt tattgtaccc gtcctactag cggtcgcttt 2940
tctaacactc gtagaacgaa aagtgcttgg ctatatgcaa ctacgcaaag gcccgaatgt 3000
agtaggcccc tacggcttac tacaaccaat cgccgatgga gtaaaattat ttattaaaga 3060
gcccgtaaaa ccatccacct cttctcccat cctattcctc ctggccccca tactcgcgct 3120
tactcttgcc ctcaccctac gagcccccat acctcttcca tacccagtca ttgacttaaa 3180
cctaggaatt ctttttgtcc tagccctctc cagcctggca gtttactcaa tcctagggtc 3240
aggatgagca tccaactcaa aatacgccct tatcggagca ctacgagccg tagcccagac 3300
catctcatat gaagtcagcc taggactaat ccttctaaac accattatct tcgcaggagg 3360
cttcacacta caaatcttta acgtcgcgca agaaagcgtc tgattaattc tgcccgcctg 3420
acctctcgcc gcaatatggt atatttcaac actagcagaa accaaccgtg ccccatttga 3480
cctcacagaa ggagagtcag aactagtttc cggcttcaac gtagaatatg caggagggcc 3540
attcgccctc tttttcttag ctgaatacgc caacatctta ctcataaata cactttccgc 3600
catccttttc ctaggggcat tccacctccc aacactacca acactaactg caatcaacct 3660
aataactaaa gcagctctac tatcagtagt tttcttatga gtccgagcct cctacccccg 3720
attccgatat gaccagctca tgcacctcat ctgaaaaaac ttcctccccc taacactggc 3780
cctagtcatc tgacacctag cactcccaat tgctcttgca ggcctccccc ctgtactata 3840
gcccaggatc tgtgcctgaa caaaagggcc actttgatag agtgtatcat gagggttaaa 3900
gcccctccag ctccttagaa agaagggatt tgaacccaac ccggagagat caaaactctc 3960
agtgcctcca ctacaccact tcctagtaaa gtcagctaat tcaagctttt gggcccatac 4020
cccaaacatg ttggttaaaa tccttcctat gctaatgaat ccatatgtct ctgccgtcct 4080
cctctctgga cttggcctag gtaccactct caccttcgca agctcccact gactcctcgc 4140
ttgaataggc ctagaaatca acaccctggc catcattcct cttatagccc aacactccca 4200
cccacgagca gtcgaagcag ccaccaaata tttcctcgcc caagccacag cagctgctat 4260
actccttttt gcgagcacta ccaatgcctg actgacagga caatgagaga ttcaacaaat 4320
atcacacccc cttcccatta caataatttc agccgccctc gcactaaaaa ttggactcgc 4380
ccccttccac tcttgaatgc ccgacgtcct tcaaggccta gacctcacca caggccttat 4440
catgacaacc tgacaaaaac tagccccctt tgctctcctc ctccaaatac agcccgtcaa 4500
ctccaccaca ctactaattc taggactaac ctcaacctta attggcggct gaggaggact 4560
aaaccaaaca cagctacgaa aaatcctcgc ttactcctca atcgcacacc tcggatgaat 4620
agccctaatt ctacaattta taccctccct cacactccta gccctactca cgtacttcat 4680
tatgacatcc tccacattcc ttgcattcaa gttaaccaac tctgctacta tcaacgcaat 4740
cgcctcctcc tccacaaaaa caccggccct cacagcactt atgccccttg tcctcctctc 4800
attaggaggc ctccccccac taaccggatt tatacctaaa tgactcatcc ttcacgaact 4860
aaccaaacaa gacctcgtcc ctattgccac ctttgctgcc cttactgctc tcctcagtct 4920
ttacttctat cttcgccttt cctacgcaat aaccctcact atgtccccaa acaacttaac 4980
aggcgcctct ttctgacggc tgcagacccc ccaacccaca ctacccttgg ctgtaaccac 5040
catatccacc atcatgttac tgcctctaac cccaaccgca gttgctttat tgagccccta 5100
agagacttag gttaatgact tagaccaagg gccttcaaag ccctaagtgg gggtgagagc 5160
ccctcagtct ctgtaagact tgcaggccat tacctcacat ctcctgtatg caaaacagac 5220
actttaatta agctaaagcc tttctagaca ggtgggcctc gatcccacaa actcttagtt 5280
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gcccaaaatg catctattta cattattaaa aattttttta t 16541
<210> 32
<211> 16532
<212> DNA
<213> Branchiostegus albus
<400> 32
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aagccctttc tacagaggtt caagtcctct ccttaataat gatatcagta ctgatcaccc 2880
atattgtcaa cccccttatc tttattgtcc ccgtcctcct tgccgtcgct tttctaacac 2940
tcgtagaacg aaaagtactc ggttatatgc aactgcgaaa aggcccgaac gtagtaggcc 3000
cttacggcct actacaacca atcgccgacg gggtcaaact atttattaaa gagcccgtaa 3060
aaccatccac ctcttctccc atcctattcc tcctagcccc catactcgcg cttactctcg 3120
ccctcaccct atgggccccg atgcccctcc catacccagt cgttgactta aacctaggga 3180
ttctttttgt actagccctc tccagcctgg cagtttattc aatcctaggg tcaggatggg 3240
catccaactc aaaatacgcc ctcattgggg cactacgagc cgtagcccaa accatctcgt 3300
atgaagtcag cctaggacta atccttctaa acactattat cttcacggga ggttttacac 3360
tacaaatctt taacgtagca caagaaagcg tctgactaat tctacctgcc tgacctctcg 3420
ccgcaatatg gtatatttca acactagcag agaccaaccg tgcccccttt gacctcacag 3480
aaggagaatc agaactagtt tccggcttca acgtagaata tgcaggaggg ccttttgccc 3540
tctttttctt agccgaatac gccaacatcc tactcataaa tacactttcc gccatccttt 3600
tcctgggagc atttcacctt ccaaccctac caacactaac tgcaatcaac ctaataacta 3660
aagcagccct actatccgta gttttcttat gggtccgagc ctcatacccc cgattccgat 3720
atgaccaact catgcacctc atctgaaaaa acttcctccc cttaacactg gccctcgtta 3780
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tgttggttaa agtccttcct atgctaatga acccatatgt ctttgccatc ctcctctctg 4080
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tactattaat tttgggacta gcctcaacct taattggtgg ctgaggaggg ctaaaccaaa 4560
cacaactacg aaaaatcctc gcttactcct caatcgcaca cctcggatga atagccctaa 4620
ttctacaatt tataccctcc ctcacactcc tagccctact cacgtacttc attatgacat 4680
cctccacatt ccttgcattc aagttaacca actctgctac tatcaacgca atcgcctcct 4740
cctccacaaa aacaccggcc ctcacagcac ttatgcccct tgtcctcctc tcattaggag 4800
gcctcccccc actaaccgga tttataccta aatgactcat ccttcacgaa ctaaccaaac 4860
aagacctcgt ccctattgcc acctttgctg cccttactgc tctcctcagt ctttacttct 4920
atcttcgcct ttcctacgca ataaccctca ctatgtcccc aaacaactta acaggcgcct 4980
ctttctgacg gctgcagacc ccccaaccca cactaccctt ggctgtaacc accatatcca 5040
ccatcatgtt actgcctcta accccaaccg cagttgcttt attgagcccc taagagactt 5100
aggttaatga cttagaccaa gggccttcaa agccctaagt gggggtgaga gcccctcagt 5160
ctctgtaaga cttgcaggat attaccccac atctcctgta tgcaaaacag acactttaat 5220
taagctaaag cctttctaga caggtgggcc tcgatcccac aaactcttag ttaacagcta 5280
agcgctcaaa ccagcgagca tccgcctacc tttcccccgc ctataaatta taggcggagg 5340
cgggggaaag ccccggcaga cgtcaatctg cttcttaaga tttgcaatct aacatgttat 5400
acaccacaag gcttgatagg aagaggactt gaacctctgt ctatggggct acaacccacc 5460
gcttaaaact cagccatcct acctgtggca accacacgtt gattcttttc cactaaccac 5520
aaagacattg gcacccttta tttagtattt ggtgcttgag ccggcatagt aggcacagct 5580
ttgagcttgc tcattcgagc agaacttagc caaccaggcg ccctcctcgg ggatgaccag 5640
atttataatg ttattgttac agcacatgcc tttgtaataa ttttctttat agtaatacca 5700
attatgattg gtgggtttgg caactgactg atccccctta tgatcggtgc ccccgacata 5760
gcctttcctc gtatgaataa tatgagcttt tgacttctac ccccttcctt cctgctcctt 5820
ctcgcctcct caggcgtaga ggcgggagca ggaaccggct gaacagtata ccccccttta 5880
gctggaaacc tggcccacgc aggaccttcc gttgatctaa caatcttctc cctccatctg 5940
gcaggggtat cttcaatcct cggggccatt aactttatta ctactattgt taatatgaaa 6000
cctcccgcca caacacaata tcaaaccccc ttatttgttt gatctgtgtt aattaccgct 6060
gttcttctcc ttctgtccct cccagttctt gccgccggca tcacaatgct tctcacagac 6120
cgaaacctaa atactacctt ctttgaccct gcaggaggag gagacccaat tctctaccaa 6180
catctcttct gatttttcgg ccacccggaa gtttatattt taattcttcc agggttcgga 6240
ataatttcac acattgtcgc ccattattcc ggcaaaaaag aacctttcgg ctacataggc 6300
atggtctggg ccataatagc aattggcctt ctaggattta ttgtttgagc ccaccacata 6360
tttacagtag gtatagatgt tgacacacgt gcatacttta catccgctac tatgattatt 6420
gcgatcccga caggagtaaa agtatttagc tgactggcaa ccctgcatgg aggggccctt 6480
aagtgagaaa cccctttact atgggcccta ggctttattt tcctctttac agtaggggga 6540
ctgaccggaa tcgtgctagc caactcatcc ctagacattg tacttcacga tacatactat 6600
gtagtagccc acttccacta cgtcctatcc atgggggctg tatttgccat cgtagctggc 6660
tttatgcact gattccctct attctccgga tacactttac attctacttg aacaaaaatc 6720
cacttcacag tcatgtttgt gggagtaaac ttaacattct tcccccaaca cttccttggc 6780
ctggcaggaa tgccccgtcg atactcagat taccccgatg cttataccct gtgaaataca 6840
atctcctctc tgggctcttt aatctcttta acagcggtta ttttattcct atttattatc 6900
tgagaggcat tcgccgctaa acgagaagta aaagcagtag aattaaccac aacaaatgta 6960
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gttcggtcta aaaaacttcg ccgagaaagg gaggaattga acccccgtag gctagtttca 7080
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acccccttgt caagggggag ctgtgggttg aagccccgcg tatcttaaac aactaatggc 7200
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tatcgctata gtatccacta agctagttaa cctatacatt ctagactccc aagagatcga 7380
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ggtagtgcca gtcgaatccc ccgttcgcgt tctagtcact gccgaagacg tattacactc 7680
ctgagcagtc ccagccctcg gcgtaaaaat agacgccgta cctgggcgcc taaaccaaac 7740
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cgcataccac atagttgacc ccagcccctg acctttaaca ggtgcagttg ccgccctgct 8880
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cacaatcctc ctactactga caatgtacca atgatgacga gacatcgttc gagaaggcac 9000
ataccaggga caccacactc ctcctgtcca aaaagggctt cgatacggaa taatcctctt 9060
catcacatca gaagttttct tctttctagg atttttctga gccttttacc actcaagcct 9120
cgcacccacc ccagaactag gaggctgctg accccctacc gggatcaccc ccctagaccc 9180
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aatcctactt ggtttttact tcactttcct ccaaggcttg gaatattacg aagccccttt 9360
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acatgtcatt attggttcca ctttcttagc tgtatgtttt gtacgccacc taaaatacca 9480
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tgttgtatga ctattccttt acatctccat ttattgatga ggatcttaat ctttttagta 9600
ttaaactagt acaagtgact tccaatcacc cggtcttggt taaagtccaa ggaaagataa 9660
tgaacctagt cacgacaatt atcacaatcg ccctcttact ttccatcgct ttacttctca 9720
tctcattttg gctcccccaa ataaaccccg accaggaaaa actttcccca tatgagtgtg 9780
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tcctcttcct tctttttgac ctcgaaattg cccttctgct gcccctcccc tgaggcgacc 9900
aactaccctc ccccctactt accttctttt gagcctccgc cgtcctgatt atcctcaccc 9960
tcggactaat ctatgaatga cttcaaggag gcctagaatg agccgaatgg gtgattagct 10020
taagaaaagc atttgatttc ggctcaaaaa cttgtggtta aactccacaa ttgccctatg 10080
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ctactgccct agcccacagc ctggtaattg cactagccag cctcttctgg ttcaaaaact 10500
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ttgtaaaaat gccactatat ggagcacacc tttgactccc taaagcccac gttgaagccc 11040
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ttcgagtact catgatacta gagcccgtgg ctaaacaact atgctacccc ttcatcattc 11160
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ccgcattaaa ctgatcttga tgaactatta ttctaacagg agcgggcacc ttaatcacag 11580
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tagtcctcct gatccttaaa cccgagctga tctgaggatg gaccgcctaa gtagacatag 11760
tttaaaaaaa atattagatt gtgattctaa agacaggggt taaagccccc ttgtccaccg 11820
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cggacagata attgctagcc aaataatgga tcagacctga ttagaaaaat ccggccccaa 13680
agccgtagcc tccctcaata ccccactaat taccacagca agtaacattc aacaaggaat 13740
gatcaaaacc tacctcaccc tatttcttct aaccttagcc attgccttac ttgtggtcat 13800
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ccaactccct caaacatctc agtttgatga aattttggct cccttctagg tctctgctta 14520
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gccttctcat ctgtaaccca catctgccga gacgtaaact acggatgact aattcgaaac 14640
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ccatactttt catacaaaga cctattaggc ttcatagtcc ttctcaccgc actcacttca 15120
ctatcactct tttccccaaa cctactgggc gaccccgata acttcacccc cgccaaccca 15180
ctagtgacac ctccccatat caagcccgaa tgatacttcc tatttgcata tgccatctta 15240
cgttcaattc ctaataaact gggaggagtt cttgcactcc tggcatccat tctcgtcctc 15300
atactagtcc ccttcctcca cacatcaaaa caacgaagcc tcacctttcg gcccttctct 15360
caacttctat tttgaactct tattgcaaac gtcctaatcc ttacttgaat cgggggaatg 15420
cccgtagaag acccttacat cattatcggc caaattgcat ccttcaccta cttcttccta 15480
ttcctagtcc taataccact aacaggatga gtagaaaata aagttatagg gtgaacctgc 15540
attagtagct cagtatcaga gcgccggtct tgtaaaccgg agtgcagggg ttaaactccc 15600
ctctactgct cagaaaggag ggagtttaac cctcaccact ggcccccaaa accaacattc 15660
tcattgaaac tactttctga tatacagtaa tgtatacatg ccatgttcat tacatatatg 15720
taagtacacc atatatgtat ataaccataa catactagca tcagcatata ctatggtgta 15780
ttaccattaa tatcaagtca ccttccaaga aaacatttaa actaaaatcc cacacaaagc 15840
aagatcttaa gcggtaattt aactgcataa taaatgtaag gaactcatta atcgggccaa 15900
tatattcata agtgaagata caccaagtat caacatctct gaatatttaa gatcactgaa 15960
tgtaataaga accgaccatc agttgattac ttaatgcata ctcttattga aggtgaggga 16020
caagaattgt gagggtcgca cttagtgaac tattcctggc atctggttcc tatttcaggg 16080
ccattcgtct atattattcc tcacactttc atcgacgctg acataagtta atggtggaaa 16140
acacaagcgg gagcaccccc catgccgggc cttctttcta gagggtgggg ggttctccct 16200
tttttttctc ttttcacttg gcatctcaca gtgtatgaaa aaagctccag taaggtagaa 16260
cattcattta ctttggcaca ggcaacgtgt aattcatggt gtaagactgt aacataagaa 16320
ttgcatgttt taatctcacg agcatacact aacgtaaaac tcaacccata aacatataac 16380
tgcccccggg gtttctttca cgataaaccc ccctaccccc ctaagcccca gacatgtcta 16440
acactcctga aaaccccccg aaaacaggta aacctctggt ggtgaattta gcgcccaaaa 16500
tgcatctatc tacattatta aaaacttttt gt 16532
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> primer
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tcccaactcc ctcaaacatc tc 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
taggaaccag atgccaggaa tag 23
<210> 35
<211> 1615
<212> DNA
<213> Branchiostegus japonicus
<400> 35
tcccaactcc ctcaaacatc tcagtttgat gaaactttgg atcccttcta ggtctctgct 60
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cagccttttc atctgttacc cacatctgcc gagacgtaaa ctacgggtga ctaattcgaa 180
acctccatgc taacggcgcc tccttcttct ttatatgcat ttatgcacac atcggacgag 240
gactatacta cggctcatac ctttataaag agacatgaaa cattggagtt atcctcttgc 300
tcctagttat aataaccgct ttcgtaggct atgtcctgcc ctgaggacaa atatcatttt 360
gaggcgccac agtcattact aatcttcttt ccgcagtccc ttatgtgggc aacatgctag 420
ttcaatgaat ctgaggagga ttctcagtag ataacgccac cctaactcga tttttcgcct 480
tccacttctt attcccattt gttattctag ccgcaaccct tgttcacctg cttttcttac 540
acgaaacagg gtctaacaac ccactcggct taaactcaaa cgttgacaaa atctcattcc 600
acccatactt ttcatataaa gacttattag gcttcatggt cctccttacc gcactcacct 660
cactatcact cttttcccca aacttactag gcgaccccga caactttacc cccgctaacc 720
ccctagtcac acctccccat atcaagcccg aatggtactt cttattcgcg tacgctattt 780
tacgctcaat tccaaataaa ctagggggcg ttctcgcact cctagcatcc attctcgtcc 840
tcatactagt tcccttcctc cacacatcaa aacaacgaag cctcaccttt cgacccttct 900
cccagctctt attctgaact cttattgcaa acgtcctaat cctcacttga attggaggaa 960
tacccgtaga agacccttac atcattatcg gccaaattgc atccttcacc tacttcttcc 1020
tattcctagt cctaatacca ctaacaggat gggtagaaaa caagatcata ggatgaactt 1080
gcattagtag ctcagtatca gagcgccggt cttgtaaacc ggagtgcagg ggttaaactc 1140
ccctctactg ctcagaaaga agggagttta accctcacca ctggccccca aaaccaacat 1200
tctcgttgaa actactttct ggtgtatagt aatgtacata ttcatgttta ttacatatat 1260
gtaattacac catacactta tatcaatata aacacaatag gtatcagcac atagtatggt 1320
atatcaccat taaatatcaa gtcaacttcc aggaaagcat taaactaaaa ctttacaaaa 1380
agcaaaactt cagaaagtaa tataactgca tgtaggaatg taaggaactc attgattaaa 1440
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cgatgtagta agaaccgacc atcagttgat tacttaatgc atactcttat tgagggtgag 1560
ggacaagaat tgtgggggtc gcactcagtg aactattcct ggcatctggt tccta 1615
<210> 36
<211> 1614
<212> DNA
<213> Branchiostegus albus
<400> 36
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tccaatgaat ctgaggagga ttctcagtag acaacgccac cctaactcga ttctttgcct 480
tccacttcct actcccattc gtcattctag ccgcaaccct tgttcaccta ctattcttac 540
atgagacagg atccaacaac cccctcggct taaactcaaa cgttgacaaa atttcattcc 600
acccatactt ttcatacaaa gacctattag gcttcatagt ccttctcacc gcactcactt 660
cactatcact cttttcccca aacctactgg gcgaccccga taacttcacc cccgccaacc 720
cactagtgac acctccccat atcaagcccg aatgatactt cctatttgca tatgccatct 780
tacgttcaat tcctaataaa ctgggaggag ttcttgcact cctggcatcc attctcgtcc 840
tcatactagt ccccttcctc cacacatcaa aacaacgaag cctcaccttt cggcccttct 900
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gacaagaatt gtgagggtcg cacttagtga actattcctg gcatctggtt ccta 1614
Claims (9)
- (a) 옥돔과 옥두어로부터 생물학적 시료를 얻는 단계,
(b) 그 생물학적 시료로부터 미토콘드리아의 게놈 DNA를 분리하는 단계,
(c) 옥돔의 Cytochrome b 유전자의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하고, 또 옥두어의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열과 대립되는 서열번호 2의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 단계, 및
(d) 증폭 산물에 XcmI 제한효소로 처리하고 XcmI 제한효소 처리로 증폭 산물이 절단되었는지를 확인하는 단계를 포함하는
RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계의 Cytochrome b 유전자의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열 또는 그것의 대립 서열인 서열번호 2의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 단계는 서열번호 1 서열 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 증폭 산물이 생성되도록 프라이머를 설계·제작하는 단계, 및
상기 프라이머를 이용하여 Cytochrome b 유전자의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1의 서열 또는 그것의 대립 서열인 서열번호 2의 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 33의 정방향 프라미어 및 서열번호 34의 역방향 프라이머로 구성된 것을 특징으로 하는 RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법.
- (a) 옥돔과 옥두어로부터의 미토콘드리아 게놈 DNA 분리 수단,
(b) 옥돔 게놈 DNA의 조절부위의 XcmI 제한효소 인식 부위인 서열번호 1 또는 서열번호 2로 특정된 옥두어의 서열번호 1과의 대립 서열을 포함하는 DNA 서열을 증폭하기 위한 수단, 및
(c) XcmI 제한효소를 포함하는
RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 키트.
- 제4항에 있어서,
상기 키트는 옥돔과 옥두어로부터 생물학적 시료를 분리하기 위한 수단, 그 생물학적 시료를 전처리하기 위한 수단, 상기 RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 키트의 사용 방법을 교시한 설명서 및 XcmI 제한효소 처리에 의한 산물의 크기를 검출·확인하기 위한 수단으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 RFLP 분석법을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 키트.
- (a) 옥돔과 옥두어로부터 생물학적 시료를 얻는 단계, (b) 그 생물학적 시료로부터, 옥돔의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열에서 서로 간에 다형성을 보이는 부위를 포함하는 미토콘드리아의 핵산 분자를 수득하는 단계, 및 (c) 그 수득한 핵산 분자에서, 그 다형성을 보이는 부위를 확인하는 단계를 포함하는
옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 다형성 부위는 옥돔의 서열번호 35의 1052번째 뉴클레오티드, 및 옥두어의 서열번호 36의 1052번째의 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 옥돔과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 서열을 이용한 옥돔과 옥두어의 감별 방법.
- 서열번호 31에 기재된 옥돔의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열과 서열번호 32에 기재된 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열을 비교 정렬하였을 때 나타나는, 옥돔의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열과 옥두어의 미토콘드리아 게놈 DNA 서열 사이에 다형성을 보이는 부위를 포함하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진, 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
- 제8항에 있어서,
상기 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드는 옥돔의 서열번호 35의 1052번째 뉴클레오티드인 G를 포함하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열 또는 옥두어의 서열번호 36의 1052번째의 뉴클레오티드인 A를 포함하는 10개 이상의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열인 것을 특징으로 하는, 옥돔과 옥두어의 감별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보적 폴리뉴클레오티드.
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KR101534271B1 (ko) * | 2012-12-03 | 2015-07-09 | 대한민국 | 옥돔과 품종 판별용 프라이머, 이를 이용한 옥돔 원산지 판별방법 및 옥돔과 품종 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 |
KR20180083989A (ko) | 2017-01-13 | 2018-07-24 | 부경대학교 산학협력단 | 옥돔 또는 옥두어의 판별을 위한 초고속 실시간 pcr용 품종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 품종 판별법 |
KR102252413B1 (ko) | 2019-11-19 | 2021-05-14 | 대한민국(식품의약품안전처장) | 옥돔과 옥두어의 신속 판별용 멀티플렉스 pcr 방법 및 이를 위한 pcr 프라이머 |
-
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Title |
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Ichthyol. Res., 48:213-23 * |
Nucleic Acids Res., 20:4853-858 * |
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