KR20180083989A

KR20180083989A - 옥돔 또는 옥두어의 판별을 위한 초고속 실시간 pcr용 품종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 품종 판별법

Info

Publication number: KR20180083989A
Application number: KR1020170006043A
Authority: KR
Inventors: 양지영; 김군도; 서용배; 신지영; 권기성; 최장덕; 강태선
Original assignee: 부경대학교 산학협력단; 대한민국 (식품의약품안전처장)
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2018-07-24
Also published as: KR101999815B1

Abstract

본 발명은 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별을 위한 종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 유전자 증폭 분석법에 관한 것이다. 상기 프라이머 세트 또는 이를 이용한 유전자 증폭 분석법을 통해 옥돔이 포함된 요리용 원재료에 옥두어가 혼입되는 것을 방지할 수 있으며, 옥돔의 품종 보증을 용이하게 할 수 있어, 국내산 옥돔의 합당한 가격 책정이 가능하다. 또한 수입산 옥두어가 국내산 옥돔으로 둔갑하는 사례를 적발하여 수입산 옥두어를 감시하여 유통 및 소비시장의 활성화에 도움이 될 수 있다.

Description

옥돔 또는 옥두어의 판별을 위한 초고속 실시간 PCR용 품종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 품종 판별법 {Sets of primers of Ultra-Fast PCR-based assay for discriminating red horsehead from yellow horsehead, or method of discriminating species using thereof}

본 발명은 옥돔 또는 옥두어의 판별을 위한 초고속 실시간 PCR용 품종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 품종 판별법에 관한 것이다.

수산물 가공식품에 대한 시장이 점차 확대되면서, 수산물 가공식품이 EMA (Economically motivated adulteration) 식품으로 제조, 유통되는 사례도 급증하고 있다. 수산물을 이용한 EMA 식품의 경우 일반 소비자들이 형태학적으로 구분하기는 힘들어 수산물 판매자들이 저가의 수입산 또는 유사 생물을 이용한 제품을 만들어 소비자들에게 판매하는 경우가 늘어나고 있다. 특히 최근 들어 우리나라 연안에 서식하는 주꾸미의 경우 무분별한 남획으로 개체 수가 급감하여 동남아 일대 또는 중국에서 수입하여 대체하고 있다.

옥돔(Branchiostegus japonicus)은 농어목, 옥돔과, 옥돔속에 속하는 어류이며, 대한민국, 일본, 중국 근해에서 서식하는 어종이다. 성체의 경우 40 ㎝정도 되며, 다른 돔 종류보다 몸이 길고 머리가 튀어나온게 특징이다. 옥두어(Branchiostegus albus)는 농어목, 옥돔과, 옥돔속에 속하는 어류이며, 중국, 일본 남부 등의 북서태평양의 온대 해역에서 주로 서식하며, 성체는 최대 46㎝까지 성장한다. 이 두 종은 형태학적으로 구분하기 힘들어 중국산 옥두어가 국산 옥돔으로 둔갑되어 판매되는 사례가 빈번하게 일어나고 있다. 이러한 이유는 옥돔과 옥두어의 가격 비교에 있어 중국산 옥두어의 가격이 보통 옥돔에 1/4 수준이기 때문이다.

초고속 실시간 PCR(Ultra-Fast PCR) 시스템은 ㈜진시스템의 UF-150 GENECHECKER™ 모델로 일반적인 튜브를 사용하는 경우보다 특수한 폴리머 칩(RAPI:CHIP™)을 사용함으로써 빠른 시료의 열처리가 가능하다. Rapi:chip™ PCR 칩은 박막 필름이 플라스틱 본체의 하부면에 정밀하게 접착된 구조로 되어 있어 초고속 유전자 증폭 작업을 가능하게 해준다. GENECHECKER™의 유전자 증폭 메커니즘은 8℃/SEC의 초고속 가열, 냉각이 가능하여 초고속 PCR 반응을 가능하다. 형광분석 모듈은 유전자 증폭 과정에서 발현되는 형광을 실시간으로 감지, 기록함으로써 사용자가 GENERECORDER 소프트웨어를 통해 실시간으로 반응 과정을 관찰, 분석할 수 있게 한다. 이러한 형광 분석기법을 통해 모델 UF-150은 광학 스캐닝 방식으로 형광값을 분석하는 시중의 실시간 PCR 장비 대비 정밀한 분석 결과를 제공한다. GENERECORDER 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 시중의 실시간 PCR 장비들과 유사한 형태로 디자인되어 타사 장비 사용자들도 어려움 없이 사용할 수 있다. 모델 UF-150은 본체와 연결하여 사용할 노트북(GENERECORDER 설치, 보정 완료)과 함께 공급되어 별도의 사용자 보정 과정 없이 즉시 활용 가능하다.

본 발명자들은 간단하면서도 신속정확한 품종 판별을 위한 유전자 증폭 기술 기반 하에 이러한 문제점을 극복하기 위해, 옥돔과 옥두어의 품종 판별용 폴리뉴클레오티드 프라이머 및 이를 이용한 Ultra-Fast PCR 방법을 도출함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

대한민국 등록특허 제10-1292169호 (발명의 명칭 : 옥돔과 옥두어의 감별 방법 및 그 키트, 출원인 : 재단법인 제주테크노파크, 등록일 : 2013년07월26일) 대한민국 등록특허 제10-1534271호 (발명의 명칭 : 옥돔과 품종 판별용 프라이머, 이를 이용한 옥돔 원산지 판별방법 및 옥돔과 품종 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2015년06월30일)

본 발명의 목적은 옥돔 또는 옥두어의 판별을 위한 초고속 실시간 PCR용 품종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 품종 판별법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은, 옥돔(Branchiostegus japonicus)의 판별을 위한, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 및,

옥두어(Branchiostegus albus)의 판별을 위한, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트;

중 선택되는 프라이머 세트 중 1종 이상이 포함된 옥돔 또는 옥두어의 품종을 판별하는 프라이머 세트에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는 실시간 PCR용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 Thermus aquaticus에서 유래된 Taq DNA 중합효소를 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 옥돔 또는 옥두어의 품종을 판별하는 진단키트를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 옥돔 또는 옥두어의 판별을 위한 품종 특이 프라이머 세트를 제조하는 제1단계;

상기 프라이머 세트와 Taq DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제2단계;

상기 조성물에 옥돔 또는 옥두어의 검체를 첨가하여 반응액을 제조하는 제3단계; 및,

상기 반응액을 이용하여 유전자 증폭 분석을 수행하는 제4단계;

를 포함하는 옥돔 또는 옥두어의 품종을 판별하는 방법을 제공한다. 상기 검체는 조직 용해액 또는 게놈 DNA일 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 상기 제1 또는 제2 프라이머 세트가 포함된 옥돔 또는 옥두어의 품종을 판별하는 프라이머 세트에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 제1 및 제2 프라이머 세트를 모두 포함하는 옥돔 및 옥두어의 품종을 판별하는 프라이머 세트에 관한 것일 수 있다.

본 발명에서의 용어, "프라이머"란 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(Taq DNA 중합효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 의하면, 상기 프라이머는 15 내지 50개의 염기서열을 가지는 핵산으로 구성됨이 바람직하다.

본 발명의 프라이머 세트가 인식하는 옥돔(Branchiostegus japonicus)의 Cytochrome C oxidase I (COI) 게놈 DNA 염기서열은 하기 표 1의 서열번호 1로 표현된다. *표 1의 밑줄 친 부분은 본 발명 프라이머의 결합부위를 나타낸다.

서열번호 1 : ACCESSION No. EU861052.1의 서열 중 5493~7035번째 서열,

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU861052.1

gtggcaaccacacgttgattcttttccactaaccacaaagacattggcaccctttatttagtatttggtg
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gggggcctaac cggaatcgtgctagccaactcatc cttagatattgtacttcacgatacatactatgtag
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gtaaacttaacattcttcccccaacacttccttggtttagcaggaatgccccgtcgatactcagactacc
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본 발명의 프라이머 세트가 인식하는 옥두어(Branchiostegus albus)의 Cytochrome C oxidase I (COI) 게놈 DNA 염기서열은 하기 표 2의 서열번호 2로 표현된다. *표 2의 밑줄 친 부분은 본 발명 프라이머의 결합부위를 나타낸다.

서열번호 2 : ACCESSION No. EU861053.1의 서열 중 5485~7027번째 서열,

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU861053.1

gtggcaaccacacgttgattcttttccactaaccacaaagacattggcaccctttatttagtatttggtg
cttgagccggcatagtaggcacagctttgagcttgctcattcgagcagaacttagccaaccaggcgccct
cctcggggatgaccagatttataatgttattgttacagcacatgcctttgtaataattttctttatagta
ataccaattatgattggtgggtttggcaactgactgatcccccttatgatcggtgcccccgacatagcct
ttcctcgtatgaataatatgagcttttgacttctacccccttccttcctgctccttctcgcctcctcagg
cgtagaggcgggagcaggaaccggctgaacagtatacccccctttagctggaaacctggcccacgcagga
ccttccgttgatctaacaatcttctccctccatctggcaggggtatcttcaatcctcggggccattaact
ttattactactattgttaatatgaaacctcccgccacaacacaatatcaaacccccttatttgtttgatc
tgtgttaattaccgctgttcttctccttctgtccctcccagttcttgccgccggcatcacaatgcttctc
acagaccgaaacctaaatactaccttctttgaccctg caggaggaggagacccaattctct accaacatc
tcttctgatttttcggccacccggaagtttatattttaattcttccagggttcggaataatttcacacat
tgtcgcccattattccggcaaaaaagaacctttcggc tacataggcatggtctgggccata atagcaatt
ggccttctaggatttattgtttgagcccaccacatatttacagtaggtatagatgttgacacacgtgcat
actttacatccgctactatgattattgcgatcccgacaggagtaaaagtatttagctgactggcaaccct
gcatggaggggcccttaagtgagaaacccctttactatgggccctaggctttattttcctctttacagta
gggggactgaccggaatcgtgctagccaactcatccctagacattgtacttcacgatacatactatgtag
tagcccacttccactacgtcctatccatgggggctgtatttgccatcgtagctggctttatgcactgatt
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gtaaacttaacattcttcccccaacacttccttggcctggcaggaatgccccgtcgatactcagattacc
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또한 서열번호 3~6의 프라이머를 구성하는 DNA 염기서열은 하기와 같다.

서열번호 3 : tggaggggcg cttaaatgag aaac - 옥돔(Branchiostegus japonicus)의 Cytochrome C oxidase I (COI) 유전자 부분 증폭을 위한 Forward 프라이머

서열번호 4 : gatgagttgg ctagcacgat tccg - 옥돔(Branchiostegus japonicus) Cytochrome C oxidase I (COI) 유전자 부분 증폭을 위한 Reverse 프라이머 염기서열

서열번호 5 : caggaggagg agacccaatt ctct - 옥두어(Branchiostegus albus) Cytochrome C oxidase I (COI) 유전자 부분 증폭을 위한 Forward 프라이머 염기서열

서열번호 6 : tatggcccag accatgccta tgta - 옥두어(Branchiostegus albus) Cytochrome C oxidase I (COI) 유전자 부분 증폭을 위한 Reverse 프라이머 염기서열

이 때, 상기 각 프라이머가 결합하는 위치를 하기 표 3에 옥돔과 옥두어를 비교하여 나타내었는데, 각 유전자 서열의 아래에 제시한 *은 옥돔과 옥두어가 Cytochrome C oxidase I 유전자에서 동일 base를 갖는 것을 의미하며, 공란 또는 .으로 표시한 것은 다른 base를 갖는 것을 의미한다.

B.japonicus gtggcaaccacacgttgattcttttccactaaccacaaagacattggcaccctttattta
B. albus gtggcaaccacacgttgattcttttccactaaccacaaagacattggcaccctttattta
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B.albus gtatttggtgcttgagccggcatagtaggcacagctttgagcttgctcattcgagcagaa
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B.albus cttagccaaccaggcgccctcctcggggatgaccagatttataatgttattgttacagca
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B.albus catgcctttgtaataattttctttatagtaataccaattatgattggtgggtttggcaac
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B.albus tctttaacagcggttattttattcctatttattatctgagaggcattcgccgctaaacga
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B.albus gaagtaaaagcagtagaattaaccacaacaaatgtagagtgactgcacggctgccctccc
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B.japonicus ccctaccacacatttgaggagcccgcattcgttcaagtccggt
B.albus ccttaccacacatttgaggaacccgcattcgttcaagttcggt
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또한 본 발명은 상기 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는 실시간 PCR용 조성물에 관한 것으로서, 상기 실시간 PCR은 바람직하게는 초고속 실시간 PCR일 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별용 진단키트를 제공한다. 상기 진단키트는, 각 품종에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트와 DNA를 증폭하기 위한 Taq DNA 중합효소 외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 항온기 또는 항온수조, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 멸균수, 발광염료를 포함할 수 있다. 이 때 발광염료로서 Eva 그린을 사용할 수 있다.

본 발명의 유전자 증폭 분석에서 사용하는 검체는 조직 용해액 또는 게놈 DNA일 수 있는데, 상기 조직 용해액은 옥돔 또는 옥두어의 조직 시료를 통상적으로 사용하는 세포용해완충액(cell lysis buffer)에 녹여 얻은 것일 수 있다.

이 때 상기 유전자 증폭 분석은 바람직하게는 실시간 PCR 방법을 이용할 수 있으며, 더 바람직하게는 초고속 실시간 PCR 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별을 위한 종 특이 프라이머 세트 또는 이를 이용한 유전자 증폭 분석법에 관한 것이다. 상기 프라이머 세트 또는 이를 이용한 유전자 증폭 분석법을 통해 옥돔이 포함된 요리용 원재료에 옥두어가 혼입되는 것을 방지할 수 있으며, 옥돔의 품종 보증을 용이하게 할 수 있어, 국내산 옥돔의 합당한 가격 책정이 가능하다. 또한 수입산 옥두어가 국내산 옥돔으로 둔갑하는 사례를 적발하여 수입산 옥두어를 감시하여 유통 및 소비시장의 활성화에 도움이 될 수 있다. 대한민국 등록특허 제10-1292169호와 대한민국 등록특허 제10-1534271호에 유전자 증폭반응을 이용한 옥돔류의 해양생물 종 판별방법이 개시되어 있기는 하지만, 본 발명에 개시된 프라이머 세트들을 이용하여 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별을 하는 방법들은 전혀 개시된 바 없다.

도 1은 본 발명의 옥돔 또는 옥두어의 게놈 DNA에 대해 품종 판별을 위한 PCR 프라이머를 이용하여 단일 PCR(중합효소연쇄반응)을 수행한 젤 사진을 표시한 것이다.
도 2는 본 발명의 옥돔 및 옥두어의 품종 판별을 위한 PCR 프라이머(1~4 샘플: 옥돔 판별용 프라이머, 5~8 샘플: 옥두어 판별용 프라이머)를 이용하여 옥돔의 게놈 DNA(1, 검은색 선), 옥돔의 조직 용해액(3, 노란색 선), 옥두어의 조직 용해액(4,회색 선), 옥두어의 게놈 DNA(5, 초록색 선), 옥돔의 조직 용해액(7, 하늘색 선), 옥두어의 조직 용해액(8, 분홍색 선)에 대해 초고속 실시간 PCR을 수행한 결과를 표시한 것으로서, 1~4 샘플에서는 옥돔의 게놈 DNA 증폭결과인 검은색 선과 함께 옥돔의 조직 용해액 결과인 노란색 선의 증폭 결과가 확인되며 거의 동일한 온도에서 melting peak가 형성됨을 확인할 수 있고, 5~8 샘플에서는 옥두어의 게놈 DNA 증폭결과인 초록색 선과 함께 옥두어의 조직 용해액 결과인 분홍색 선의 증폭 결과가 확인되며 거의 동일한 온도에서 melting peak가 형성됨을 확인할 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 옥돔 및 옥두어의 시료 준비 및 DNA 분리>

대상 재료로는 수산물 국내 제주 한림 수협에서 구입한 옥돔과 청해수산에서 구입한 옥두어 품종을 사용하였다.

실시간 PCR 분석에 의한 유전자별 프라이머 세트를 규정하기 위해 통제집단으로 사용할 옥돔과 옥두어의 게놈 DNA를 확보하기 위하여 각 품종당 3개체씩의 꼬리부분의 근육조직 샘플을 채취하여 3차 멸균 증류수에 세척한 다음 액체질소로 급냉시키고, 막자사발을 이용하여 파쇄한 다음 Genomic DNA extraction kit(Bioneer, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다.

추출된 DNA는 UV/Via Spectrophotometer(Optigen NANO Q, Mecasys사, Korea)를 이용하여 농도를 측정하였다. 농도 측정이 완료된 각 DNA 샘플은 멸균 3차 증류수를 이용하여 최종 DNA 농도를 10 ng/㎕로 조정하여 PCR 반응 시 사용하였다.

옥돔과 옥두어에서 추출된 게놈 DNA는 표 4의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA에 존재하는 Cytochrome C oxidase I 염기서열 부위를 증폭하여 클로닝하였고, 염기서열 분석을 통해 옥돔(Branchiostegus japonicus)과 옥두어(Branchiostegus albus)로 품종을 확인하였다.

대상 유전자 (프라이머 이름)	프라이머 염기서열 및 조합
대상 유전자 (프라이머 이름)	Forward	Reverse
Cytochrome C oxidase I (COI) (Cephal-16s-U)	5‘-gcctcgcctg tttaccaaaa a-3’	5’-gattactccg gtctgaactc ag-3’

< 실시예 2. PCR 및 전기영동 분석>

PCR 반응은 종 간 변이가 있는 부위를 타겟으로 본 발명자들에 의해 자체 개발된 각 품종에 대한 표 5의 프라이머를 이용하여 옥돔과 옥두어 품종을 대상으로 수행하였다.

대상 종 / 유전자 (프라이머 이름)	프라이머 염기서열 및 조합
대상 종 / 유전자 (프라이머 이름)	Forward	Reverse
옥돔/COI (Bj_COI_2-1)	5'-tggaggggcgcttaaatgagaaac-3’ (서열번호 3)	5'-gatgagttggctagcacgattccg-3’ (서열번호 4)
옥두어/COI (Ba_COI_2-1)	5'-caggaggaggagacccaattctct-3’ (서열번호 5)	5'-tatggcccagaccatgcctatgta-3’ (서열번호 6)

한편, 옥돔과 옥두어 품종의 판별을 위한 PCR 반응 혼합물(20 ㎕)의 조성은 다음과 같다: AccuPower ^®PCR PreMix(reaction volume 20㎕, Bioneer, Korea)에 옥돔과 옥두어의 게놈 DNA 20ng, 각 프라이머 10 pmole 2㎕를 첨가하고 멸균 3차 증류수로 최종 20㎕에 맞추어 사용하였다.

PCR 반응은 SimpliAmp Thermal Cycler(ThermoFisher scientific, USA)를 이용하여 94℃에서 5 분간 초기변성 후, 94℃ 30 초 변성, 62℃ 30초 결합 및 72℃ 30초 신장을 총 35회 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 5 분간 최종 신장 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 EtBr로 염색하여 이미지분석기에서 각 품종의 유전자 증폭산물을 확인하였으며, 옥돔과 옥두어 품종에 대한 PCR 산물들을 유전자 클로닝한 후, 품종 간의 염기서열을 비교 분석하였다. 이러한 결과는 도 1에 나타내었고, 도 1을 참고하면, 옥돔에서는 Bj_COI_2-1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과 102 bp 크기의 DNA 단편이 관찰되며, 옥두어에서는 Ba_COI_2-1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과 164 bp 크기의 DNA 단편이 관찰된다.

<실시예 3. 초고속 실시간 PCR을 위한 시료 준비>

옥돔과 옥두어의 조직 시료 50 mg를 취하여 조직 용해액(Direct Lysis Buffer, DLB, Gene System) 500㎕에 넣고, 조직 시료가 포함된 조직 용해액을 1분 간격으로 섞어주면서 5분 동안 상온에서 반응하게 하였다. 조직 용해의 상층액 10 ㎕를 취하여 멸균 3차 증류수 90 ㎕ 넣고 섞어주고, 다시 같은 방법으로 희석하여 잘 섞어주었다(최초 조직 용해액을 10^-2으로 멸균 3차 증류수에 희석). 이렇게 희석된 조직 용해액에는 실시예 1에서 추출한 각 시료 품종 조직의 게놈 DNA가 포함되어 있다. 이러한 조직 용해액을 이용하여 게놈 DNA를 정제하는 데에 필요한 절차를 번거롭게 수행하지 않고, 바로 초고속 실시간 PCR을 위한 시료로서 사용하였다.

<실시예 4. 초고속 실시간 PCR 및 유전자형 분석>

실시간 고속 유전자증폭 반응은 UF-150 GENECHECKER Ultra-Fast PCR system (Gene System, Korea)을 이용하여 수행하였다. PCR 반응 혼합 조성물(10ul)은 옥돔과 옥두어의 게놈 DNA 또는 조직 용해액(실시예 1 또는 3에서 추출한 것) 1㎕, 2X Rapi Master Mix (Gene System) 5㎕, 표 2에서 합성한 각 프라이머 0.5㎕(10pmole/㎕), 멸균 3차 증류수 3㎕를 사용하였으며, PCR 반응 조건은 95℃ 30초 반응 후 95℃ 5초, 62℃ 5초, 72℃ 5초의 3단계로 PCR을 40 사이클 수행하였다. 이 때 게놈 DNA는 실시예 1에서, 조직 용해액은 실시예 3에서 준비한 것을 사용하였다. 상기 2X Rapi Master Mix에는 Eva-green 형광염료가 포함되어 있다.

옥돔과 옥두어의 유전자 증폭의 판별 분석은 상기의 초고속 실시간 PCR 조건으로 각 품종 판별용 프라이머를 이용하여 분석하였는데, 첫 번째부터 네 번째까지의 시료(숫자 1~4)는 옥돔 판별용 프라이머를 사용하였고, 다섯 번째부터 여덟 번째까지의 시료(숫자 5~8)는 옥두어 판별용 프라이머를 사용하였다.

초고속 실시간 PCR 반응 시 첫 번째의 검은색 선은 양성 대조군으로 실시예 1에서 추출된 옥돔 품종의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 증폭한 결과이고, 두 번째 빨간색 선은 음성 대조군으로 멸균 3차 증류수를 주형 DNA 대신 첨가한 것을 나타낸다. 세 번째의 노란색 선은 실시예 3의 방법을 통해 준비된 옥돔의 조직 용해액, 회색 선은 실시예 3의 방법을 통해 준비된 옥두어의 조직 용해액을 주형으로 사용하여 초고속 실시간 PCR 수행한 결과이다.

이 때, 다섯 번째의 초록색 선은 양성 대조군으로 실시예 1에서 추출된 옥두어 품종의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 증폭한 결과이고, 여섯 번째 파란색 선은 음성 대조군으로 멸균 3차 증류수를 주형 DNA 대신 첨가한 것이다. 일곱 번째의 옥색 선은 실시예 3의 방법을 통해 준비된 옥돔의 조직 용해액, 여덟 번째의 핑크색 선은 실시예 3의 방법을 통해 준비된 옥두어의 조직 용해액을 주형으로 사용하여 초고속 실시간 PCR 수행한 결과이다.

PCR 수행이 끝난 후 결과는 UF-150 GENECHECKER Ultra-Fast PCR system 기기에 연결되는 PC(labtop)의 Gene recoder(Gene System) 프로그램을 통해 실시간으로 확인하였다.

도 2를 참고하면, 옥돔 판별용 프라이머를 이용해 옥돔의 조직 용해액에 대한 실험결과를 수행한 결과를 나타내는 노란색 선(3), 옥두어 판별용 프라이머를 이용해 옥두어의 조직 용해액에 대한 실험결과를 나타내는 핑크선(8)이 각각의 게놈 DNA 증폭결과(1; 옥돔 게놈 DNA 증폭, 5; 옥두어 게놈 DNA 증폭)와 마찬가지로 크게 증폭되어 있음이 확인되며, 옥돔 판별용 프라이머를 이용해 옥두어의 조직 용해액에 대한 실험결과를 수행한 결과를 나타내는 회색 선(4), 옥두어 판별용 프라이머를 이용해 옥돔의 조직 용해액에 대한 실험결과를 나타내는 하늘색 선(7)으로 교차 반응 시 증폭이 정상적으로 진행되지 않는 것을 확인할 수 있다.

결론적으로, 본 발명의 각 품종별 프라이머 세트를 이용하여, 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별이 빠르고 안전하고 정확하게 수행될 수 있음을 알 수 있다.

Claims

옥돔(Branchiostegus japonicus)의 판별을 위한, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제1 프라이머 세트; 및,
옥두어 (Branchiostegus albus)의 판별을 위한, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 제2 프라이머 세트;
중 선택되는 프라이머 세트 중 1종 이상이 포함된 옥돔 또는 옥두어의 품종을 판별하는 프라이머 세트.
제1항의 옥돔 또는 옥두어의 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 Taq DNA 중합효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR용 조성물.
제2항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 옥돔 또는 옥두어의 품종을 판별하는 진단키트.
제1항의 프라이머 세트를 제조하는 제1단계;
상기 프라이머 세트와 Taq DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제2단계;
상기 조성물에 옥돔 또는 옥두어의 검체를 첨가하여 반응액을 제조하는 제3단계; 및,
상기 반응액을 이용하여 유전자 증폭 분석을 수행하는 제4단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥돔 또는 옥두어의 품종을 판별하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 검체는 조직 용해액 또는 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 두족류의 품종을 판별하는 방법.