CN108315437B - 一种用于鉴定翡翠贻贝的snp分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于鉴定翡翠贻贝的snp分子标记，位于核苷酸序列为SEQ ID NO:1的基因片段的第76位和第89位，其中第76位核苷酸为A/C，第89位核苷酸为A/G。本发明筛选获得了能够鉴别翡翠贻贝的SNP位点，通过检测该SNP位点，利用高分辨率熔解曲线方法可以对翡翠贻贝进行基因分型。本发明从分子水平对翡翠贻贝品种进行鉴定，摆脱了靠表型进行鉴别的局限性。

Description

一种用于鉴定翡翠贻贝的SNP分子标记
技术领域
本发明属于种群鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定翡翠贻贝的SNP分子标记。
背景技术
贻贝属于软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，异柱目(Anisomyaria)，贻贝科(Mytilidae)，广泛分布于温带和亚北极地区的潮间带。贻贝的世界年产量1985年为40多万吨，近10年来，中国人工培育贻贝苗成功，华北华东沿海地区已进行大规模人工养殖，2015年总产量达到84.5万余吨，位居贝类养殖产量的前列，其中主要以养殖和出口的紫贻贝(Mytilus edulis)、厚壳贻贝(Mytilus coruscus)和翡翠贻贝(Perna viridis)这三种经济贝类为主。
该科生物在我国已发现的有近50个种，分为18个属。而浙江沿海地带有代表性的主要种属有贻贝属(Genus Mytilus Linnaeus)、隔贻贝属(Genus Septifer Recluz)、肌蛤属(Genus Musclus Roding)、股贻贝属(Genus perna Retzius)、毛贻贝属(GenusTrichomya Ihering)、偏顶蛤属(Genus Modiolus Lamarck)、黑荞麦蛤属(GenusVignadula Kuroda&Habe)、石蛏属(Genus Lithophaga Roding)等。
目前对贻贝属分类常采用贝壳形状、铰合齿等外部形态特征，但是贻贝品种间在浮游期、稚贝期外形相似，且自然杂交个体、脱壳贩卖个体、表型受环境塑造后的个体，单凭外形较难区分。而且，随着分子标记辅助遗传育种在水产领域中的广泛应用，也需要开发一套高效实用的贻贝品种鉴定方法，为贻贝的生产育苗、科学研究和市场整顿提供有力的依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定翡翠贻贝的snp分子标记，通过检测该分子标记，可以有效的将翡翠贻贝(Perna viridis)与目前主要养殖的紫贻贝(Mytilus edulis)和厚壳贻贝(Mytilus coruscus)区分开，从而有效的进行翡翠贻贝的杂交和品系提纯的研究。
本发明所提供的SNP标记，位于核苷酸序列为SEQ ID NO:1的基因片段的第76位和第89位，其中第76位核苷酸为A/C，第89位核苷酸为A/G；
其中SEQ ID NO:1的基因片段的序列如下：
GCATTCGTATTACGGTGTTAGAGGTGAAATTCTTGGATCGCCGTAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGT；
本发明再一个方面提供一种鉴定翡翠贻贝的方法，是通过检测上述的SNP位点来实现；
其中一种实施例的具体记载，是采用高分辨率溶解曲线法进行，通过PCR引物对待检测个体的核酸样品进行扩增后，再进行基因分析确定的；
所述的PCR引物是用于扩增包含上述SNP位点的核苷酸片段；
其中一种具体的引物，其上游引物的序列如下：
5′-GCATTCGTATTACGGTGTT-3′(SEQ ID NO:2)、
下游引物的序列如下：
5′-ACGGTATCTGATCGTCTTCG-3′(SEQ ID NO:3)。
本发明筛选获得了能够鉴别翡翠贻贝的SNP位点，通过检测该SNP位点，利用高分辨率熔解曲线(HRM)方法可以对翡翠贻贝进行基因分型。本发明从分子水平对翡翠贻贝品种进行鉴定，摆脱了靠表型进行鉴别的局限性。
附图说明
图1：翡翠贻贝(Pernaviridis)与紫贻贝(Mytilus edulis)和厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)的SNP位点比对图；
图2：引物检测SNP位点的HRM分型结果图。
具体实施方式
单核苷酸多态性简称SNP(single nucleotide polymorphism),是指由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基的替换，插入或缺失。SNP具有如下优点：(1)位点丰富。基因编码区与非编码区都大量分布。(2)遗传稳定性。单核苷酸突变率为10-9,相比SSR具有更高的遗传稳定性，利用这个特点来开发SNP分子标记用于鉴定物种的类别。(3)性状关联性。某些SNP可能直接影响蛋白质的结构与功能，与生物体的抗性和耐受性相关，因此找到这些SNP，可能意味着找到某些疾病的遗传本质。(4)便于自动化操作。相比过去以凝胶电泳为基础的检测技术，如RFLP、RAPD、AFLP等，SNP的检测与分型可以利用更精密高效的技术来实现，如微测序、毛细管电泳和HRM技术等，效率更高，结果更精确。本发明正是在筛选获得了翡翠贻贝特异性SNP位点的基础上完成的。
本发明中使用的DNA的提取方法如下：
使用天隆动物组织DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，具体步骤为：
(1)剪取成贝样本少量闭壳肌肌肉于1.5ml离心管中，样本则带壳单个完整放入，加入20μL蛋白酶K、200μL裂解液和适量陶瓷珠。
(2)离心管放入BioPrep-24生物样品均质仪中以6.0m/s-7.0m/s的线速度震荡2min。
(3)经过破碎后的组织在干式恒温器中55℃恒温1-3小时，期间不时振荡促进组织裂解直到溶液呈现清亮透明的状态后，12000转离心5分钟
(4)吸取200μL样本混合液于DNA提取试剂盒配套的孔板中，加入20ul磁珠和200ul无水乙醇，在天隆NP968型全自动核酸提取仪中进行动物组织DNA的自动化提取。
(5)DNA的浓度和纯度采用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,USA)分光光度计测定，样品经过编号，放于-20℃备用。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1SNP位点的筛选及引物设计筛选
1、物种鉴定依据序列的获得和比对分析
在NCBI数据库中获得上紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的18SrRNA序列，使用AlignX(a component of Vector NTI Suite 7.1)软件进行序列比对，寻找在至少两种贻贝中存在碱基差异的区域。
最终得到的consensus序列总长1829bp，SNP位点位于该序列的901-1031区间(131bp SEQ ID NO:1)。以核苷酸序列为SEQ ID NO:1的基因片段来说，是位于第76位和第89位，其中第76位核苷酸为A/C，第89位核苷酸为A/G。
在SEQ ID NO:1的核苷酸片段上设计引物来检测上述的SNP位点。
2、引物设计与筛选
引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在50-150bp之间；为使熔解温度不同，序列之间存在GC碱基含量的差异；退火温度(Tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体；引物由上海生工工程有限责任公司合成。随机选择5个所对应的贻贝DNA样本作为模板，使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选，选择能扩增出明亮、单一条带的引物组合进行HRM分析。
3、HRM分析
使用
Figure BDA0001606978210000054
480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：
Figure BDA0001606978210000055
Figure BDA0001606978210000056
480HRM Master Mix with
Figure BDA0001606978210000057
dye(RocheDiagnostics)，正反引物各10μmol，30ng DNA模板，1.6μL Mgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在
Figure BDA0001606978210000064
480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：
Figure BDA0001606978210000061
PCR扩增结束后，程序自动运行高分辨率熔解曲线程序，每升高1℃采集荧光25次。使用
Figure BDA0001606978210000065
480上自带的Tm Calling和Gene Scanning Software 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。
4、测序验证
对于能明显分型的SNP位点，随机选择每种基因型5条曲线对应的PCR产物进行测序，对各种基因型的测序结果进行比对分析，观察彼此之间的碱基组成差异。
对每种基因型曲线对应的PCR产物进行测序，对各种基因型的测序结果进行比对分析，观察彼此之间的碱基组成差异。
最终筛选获得的引物的序列信息如下表所示：
表1：引物的序列信息表
Figure BDA0001606978210000071
用于种间鉴定的90个样品分别采自各种贻贝代表地区的沿海潮间带(表2)，经过形态学上的初步辨认，剪取闭壳肌于试管中，加入无水乙醇，于-20℃冰箱中保存备用。
表2：待检测的贻贝个体信息表
Figure BDA0001606978210000072
结果表明，60个样品DNA经普通PCR扩增测序后的结果与HRM分析的结果相一致。表明本发明所提供的SNP位点和检测的引物可以有效的将翡翠贻贝与其它的与其它两种常见养殖贻贝进行区分(图2)。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种用于鉴定翡翠贻贝的SNP分子标记
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcattcgtat tacggtgtta gaggtgaaat tcttggatcg ccgtaagacg aactactgcg 60
aaagcatttg ccaagaatgt tttcattaat caagaacgaa agtcagaggt tcgaagacga 120
tcagataccg t 131
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcattcgtat tacggtgtt 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acggtatctg atcgtcttcg 20

Claims (1)

1.一种鉴定翡翠贻贝的方法，其特征在于，所述的方法是对待检测的翡翠贻贝、厚壳贻贝、紫贻贝属个体采用高分辨率熔解曲线的方法进行基因分型，其中翡翠贻贝对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1，其中高分辨率熔解曲线的方法中所使用的引物对，其中上游引物的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104046683A (zh) * 2013-03-13 2014-09-17 中国科学院海洋研究所 一种用于鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法

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Title
贻贝属的系统发育及群体的形态学和遗传学研究;毛阳丽;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20120415(第4期);第5.1、5.2.2.2、5.3.1、5.4节和表5-1、图5-2 *

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Application publication date: 20180724

Assignee: Ningbo Science and Technology Innovation Association

Assignor: Ningbo University

Contract record no.: X2023980033633

Denomination of invention: A SNP Molecular Marker for Identification of Perna viridis

Granted publication date: 20210727

License type: Common License

Record date: 20230317