JP2001520022A

JP2001520022A - 生物学的相互作用を調節する新規化合物についてのスクリーニング

Info

Publication number: JP2001520022A
Application number: JP2000516069A
Authority: JP
Inventors: ショート，ジェイ，エム．
Original assignee: ディベルサコーポレーション
Priority date: 1997-10-15
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2001-10-30
Also published as: JP2003111596A; EP1029076A1; AU1094699A; CA2315819A1; US6846627B2; US20020028448A1; EP1029076A4; WO1999019518A1

Abstract

(57)【要約】目的の特定の活性を有する化合物の同定方法を開示する。該方法は、(i)検出可能なシグナルを生成または抑制する条件下で相互作用分子を宿主細胞に導入し、(ii)第３の化合物、または第３の化合物をコードする１つまたは複数の遺伝子を(i)で得た宿主細胞に導入し、そして(iii)in vivo系またはin vitro系におけるタンパク質または他の分子の相互作用の阻害または増強の検出方法を利用して該宿主細胞をスクリーニングする、ことを含む。本発明の別の態様は、目的の化合物の同定方法を提供する。該方法は、(i)環境から直接単離した核酸に由来する発現ライブラリーを１つ以上作製し、(ii) in vivo系またはin vitro系におけるタンパク質または他の分子の相互作用の阻害または増強の検出方法を利用して該ライブラリーをスクリーニングする、ことを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (発明の分野) 本発明は、抗生物質、抗ウイルス物質、抗腫瘍剤、および調節タンパク質など
の新規の生物活性(bio-active)分子を発見するための方法に関する。特に、本発
明は、in vivo系またはin vitro系におけるタンパク質または他の分子の相互作用の検出方法を利用して、他のタンパク質の相互作用または他の分子の相互作用
をもたらす能力について上記分子をスクリーニングする方法に関する。本発明は
さらに、本明細書に記載の方法を利用して、原核生物系または真核生物系におい
て目的の新規生化学的経路をコードしている可能性のある遺伝子を捕捉し、目的
の化合物についてこれらの経路をスクリーニングするための系に関する。

【０００２】 (発明の背景) 過去10年間、新規活性を有する生物活性化合物の必要性が劇的に高まってきた
。この需要は、現在利用できる抗生物質に対して耐性の病原性生物の数が明らか
に上昇傾向にあることを示唆する世界的な統計的変化に大部分起因する。例えば
、若年層が人口を占める開発途上国においては抗菌性薬剤の需要が高い一方で、
老齢化の進む国々(米国など)では、癌、糖尿病、関節炎、および他の衰弱性症状
に対する薬剤のレパートリーを増やすことを必要としている。感染性疾患による
死亡率は、1980年〜1992年の間に58%も上昇し(1)、抗生物質に耐性な微生物の出
現によって米国だけでも医療費が年間300億ドルも超過していると概算されている(2)。この動向に応じて、製薬会社は、特有の活性または特異性を有する化合物についてスクリーニングするための微生物の範囲を有意に増やした。

【０００３】リード(lead)化合物(薬剤候補)の共通の由来源がいくつかあり、天然産物群、
合成化学群、および合成組み合わせ化学ライブラリー(ヌクレオチド、ペプチドまたは他の高分子など)が挙げられる。これらの由来源はそれぞれ利点と欠点を有している。上記候補をスクリーニングするためのプログラムが成功するか否か
は、プログラムに入力する化合物の数に大部分依存する。そして製薬会社は現在
まで、何十万もの合成化合物および天然化合物をスクリーニングしてリード化合
物を検索してきた。残念ながら、これまでに発見された化合物に対する新規化合
物の比率は時間と共に減少している。新規のリード化合物の発見率は、製薬会社
の最善の努力にも関わらず、需要に追い付いていない。可能性のある薬物候補の
新規由来源を入手することが強く必要とされている。

【０００４】現在使用されている大多数の生物活性化合物が、土壌微生物に由来している。
土壌および他の複雑な生態界に生息する多くの微生物は、これらが生存しかつ増
殖するための能力を高める様々な化合物を産生する。これらの化合物は、生物の
成長に不必要で、中間代謝に関わる遺伝子の助けによって合成されると通常考え
られており、それゆえ二次代謝物と呼ばれる。他の生物の成長または生存に影響
を及ぼす二次代謝物は、生物活性化合物として知られており、微生物およびマク
ロ生物の両方の化学的防御供給源(chemical defense arsenal)の重要な成分とし
て機能する。ヒトは、これらの化合物を、広範囲の原核生物病原体および真核生
物病原体に対して活性を有する抗生物質、抗感染症薬、ならびに他の生物活性化
合物として活用してきた。微生物を起源とする約6,000の生物活性化合物が特性決定されており、その60%以上がStreptomyces(ストレプトミセス)属のグラム陽性土壌細菌により生成されている(3)。これらのうち少なくとも70が、現在生物医学および農業の用途に使用されている。生物活性化合物の最も大きいクラスは
、ポリケチドであり、広範囲の抗生物質、免疫抑制剤および抗がん剤を含み、年
間で合せて50億ドル以上の売上げに達している。

【０００５】既存の生物活性化合物の数が一見多いにも関わらず、現代生物医学界が直面し
ている最も大きな課題の１つが、抗生物質耐性病原体の増殖であることは明らか
である。病原性微生物は、その短い生成時間および遺伝子情報を容易に交換する
能力のために、事実上全クラスの抗生物質化合物に対して耐性メカニズムを迅速
に進化させ広めてきた。例えば、ヒト病原体であるStaphylococusおよびStrepto
coccusの毒性(virulent)菌株は単一の抗生物質であるバンコマイシンで現在治療
できるが、この化合物に対する耐性をもたらすのに必要となるのは、耐性のEnte
rococcus種から単一の遺伝子vanAを転移することのみである(4)。このような新規の抗菌化合物に対するきわめて重大な需要を、酵素阻害剤、免疫抑制剤、およ
び抗がん剤に対する高まっている需要と合せると、なぜ製薬会社が、新規性質を
持つ生物活性化合物についてスクリーニングするための微生物種を増やしたのか
容易に理解できる。

【０００６】新規生物活性化合物について微生物をスクリーニングするために現在使用され
ているアプローチは、この分野の始まりから大きく変化していない。細菌(特に土壌環境由来のグラム陽性菌株)の新規の単離体を回収し、それらの代謝物を薬理学的活性について検査する。より最近のアプローチでは、組換え技術を使用し
、既に特性決定されている経路で得た遺伝子サブユニットを組み合わせることに
よってハイブリッド抗生物質経路を合成する。組合わせ生合成(combinatorial b
iosynthesis)と称されるこのアプローチは、主にポリケチド抗生物質に焦点を合
わせ、活性を示す構造的に特有の化合物を多くもたらした(5、6)。しかし、新規
抗生物質活性を持つ化合物は未だ報告されていない。これは、経路サブユニット
が、既に特性決定されている化合物をコードする遺伝子に由来するという事実に
起因するものと考えられる。生合成経路を操作して所望の抗生物質の生成量を増
加することにおいて、小分子合成に対する組換えアプローチの使用の劇的な成功
が最近報告されている(7、8)。

【０００７】リード化合物の由来源として未活用なままの生物種は未だ多くある。しかし、
現在利用可能なリード化合物のスクリーニングおよび生成方法は、これらの未調
査の資源に対して効率的に応用できない。例えば、少なくとも99％の海生細菌種
は研究所の培地で生存できないと推測されており、市販の発酵設備はこれらの種
が成長する条件下での使用に最適ではなく、従ってこれらの生物をスクリーニン
グまたは再供給のために培養することは困難または不可能である。薬剤産生生物
の再回収、成長、菌株の改善、培地の改善、および規模を拡大した産生は、しば
しばリード化合物の合成および開発に問題を提起する。さらに、一部の化合物を
合成するために特定の生物の相互作用が必要であるため、これらを発見のために
使用することは非常に困難である。薬剤発見のために使用されるこれら未活用化
合物源の遺伝子資源および化学種を利用するための新規方法は非常に貴重である
。本発明は、組換えDNA技術を利用して、この未活用生物種を入手し、目的の活性について迅速にスクリーニングするための経路を提供する。本発明では、特性
を迅速にスクリーニングする能力に関連する利点を、生物の遺伝子物質を作用さ
せて得ることができる融通性(flexiblity)および再現性と組み合わせる。

【０００８】本発明は、複合環境遺伝子発現ライブラリーから、目的の生物活性をコードす
る遺伝子を同定し、クローニングした経路を操作して特有の活性を有する組換え
小分子を発展させることを可能にする。細菌および多くの真核生物は、関連した
プロセスに関わる産物を生じる遺伝子を調節するための協同メカニズムを有して
いる。遺伝子は「遺伝子クラスター」と称される構造で単一染色体上でクラスター
化され、クラスター全体の転写を開始する単一のプロモーターを含む単一の調節
配列の制御下で共に転写される。遺伝子クラスター、プロモーター、および調節
機能のある付加配列は全体で「オペロン」と称され、20までまたはそれ以上以上の
遺伝子(通常２〜６の遺伝子)を含みうる。つまり、遺伝子クラスターとは、(通常はそれらの機能の点で)同等または関連した隣接遺伝子の群である。遺伝子クラスターは、薬物発見プロセスにおいて関心が高い。なぜなら、遺伝子クラスタ
ーの産物として、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤および調節タンパ
ク質が挙げられるからである。

【０００９】いくつかの遺伝子ファミリーは１つ以上の同等メンバーで構成されている。ク
ラスター化は、遺伝子間の同一性を維持するための前提条件である。ただし、ク
ラスター化遺伝子は必ずしも同一ではない。遺伝子クラスターは、関連する隣接
遺伝子の複製が生成される場合から、何百もの同一遺伝子がタンデム配列されて
いる場合まで多岐にわたる。場合によっては、特定の遺伝子の反復に意味が認め
られない。この主な例は、一部の種において発現される複製インスリン遺伝子で
あり、一方他の哺乳動物種においては単一のインスリン遺伝子が適当である。

【００１０】遺伝子クラスターは連続的に再編成するため、例えば細菌または他の原核生物
由来源から遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製する能力が、新規生物活
性の由来源(例えば、多数の有用活性を有するポリケチドの合成に関与するポリケチド合成酵素などの酵素を含む)を決定するために貴重となる。

【００１１】ポリケチドは、抗生物質(テトラサイクリンおよびエリスロマイシン)、抗がん
剤(ダウノマイシン)、免疫抑制剤(FK506およびラパマイシン)、ならびに獣医学生成物(モネンシン)を含む、生物活性に非常に富んだ由来源である分子である。
(ポリケチド合成酵素で生成された)多くのポリケチドは、治療薬として貴重であ
る。ポリケチド合成酵素(PKS)は、長さならびに官能性および環化のパターンの異なる広範な炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。これらは、見かけ上
の構造が多様であるにも関わらず、共通の経路によって合成される。この経路で
は、アセテートまたはプロピオネートから誘導されたユニットが、脂肪酸生合成
に似たプロセスで成長鎖上で縮合する。中間体は、多数回の鎖伸長およびそれぞ
れの縮合において形成されたケトン基の(可変程度の)還元の間、ポリケチド合成
酵素に結合したままである。天然ポリケチド間の構造的変差は、付加されるユニ
ットの数および型をそれぞれのPKSが制御する手法、ならびに各サイクルにおける還元の程度および立体化学に大きく起因する。位置特異的（regiospecific）グリコシラーゼ、メチルトランスフェラーゼおよび酸化酵素をPKS産物に作用させることによってさらに多様な種が生成される。

【００１２】ポリケチド合成酵素遺伝子は、遺伝子クラスターに分類される。ポリケチド合
成酵素の少なくとも１つの型(Ｉ型と命名)は、大きいサイズの遺伝子を有し、か
つ酵素をコードしており、これらの遺伝子/タンパク質の遺伝子操作およびin vi
tro研究を複雑にしている。このようなＩ型系の酵素学的理解の向上は、これらの多酵素のいずれかによるポリケチド鎖合成を研究するための無細胞系の欠如に
より、これまで失敗に終っている。ただし、特定の経路のいくつかの部分的反応
がin vitroでアッセイされている。30年以上の鋭意努力にも関わらず、複合ポリ
ケチドの無細胞酵素合成は不成功であることがわかった。これはおそらく、天然
生成生物からこれらの大きく発現の乏しい多機能タンパク質を完全活性形態で単
離するのが困難であり、またポリケチド生合成の過程で形成される中間体が相対
的に不安定性であるからであろう。これらの制限のいくつかを克服する試みにお
いて、モジュラー(modular)PKSサブユニットが、大腸菌(Escherichia coli)およ
びStreptomyces coelicolorなどの異種宿主において発現されてきた。大腸菌において発現されたタンパク質は完全に活性ではないが、S.coelicolorにおける特
定のPKSの異種発現は活性タンパク質産生をもたらした。活性部位が実質的に少ないPKS(6-メチルサリチレート合成酵素、カルコン合成酵素、テトラセノマイシ
ン合成酵素、およびシクロスポリンのポリケチド成分に関与するPKS)からのポリ
ケチドの無細胞酵素合成が報告されている。

【００１３】従って、研究によればポリケチドのin vitro合成が可能であることが示されて
いるが、しかし合成は常に精製された酵素で行われている。PKSモジュラーサブユニットをコードする遺伝子の異種発現により、機能性ポリケチドのin vivoでの合成が可能になったが、このアプローチは解決されなければならないいくつか
の課題を提示している。モジュラーPKS遺伝子クラスターは、サイズが大きいため(>30kb)、プラスミド上での操作が難しい。モジュラーPKSはまた、異種宿主で
不在でありうる基質を利用する場合が多い。最後に、非常に大きい外来ポリペプ
チドの適切な折り畳み、アセンブリー、および翻訳後修飾は保証されていない。

【００１４】本発明はさらに、検出可能なシグナルを生成もしくは阻害できる、または検出
可能なシグナルの生成もしくは阻害を生じ得るハイブリッドタンパク質または融
合分子をコードする融合遺伝子を使用することによって、in vivo系またはin v
itro系におけるタンパク質または他の分子の相互作用をもたらす分子を発見する
方法に関する。

【００１５】タンパク質および/または他の分子間の相互作用の分析は、生物学において研究の根底となる領域である。例えば、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Ｇタンパク質)に媒介される、リガンド:受容体相互作用および受容体/エフェクター共役は、疾患の研究において関心をもたれている。多数のＧタンパク質結合受
容体が、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、一次感覚刺激、および他のシグナ
ルなど多様な細胞外シグナルから、Ｇタンパク質のセットを介して、少数の二次
メッセンジャー系に通じる。Ｇタンパク質は、GTPアーゼサイクルによって「オン
」および「オフ」状態を制御される分子スイッチとして作用する。Ｇタンパク質における突然変異は、構成性活性化または発現変異の欠如のいずれかを生じる。Ｇ
タンパク質共役シグナル伝達によって促進される様々な機能を考慮すると、Ｇタ
ンパク質共役経路における異常が、失明、ホルモン耐性、性的早熟、および新形
成など異類の症状が現れる疾患をもたらすことも驚きではない。Ｇタンパク質共
役受容体は、薬剤研究の試みにおいて非常に重要である。今日の処方薬の60％ま
でが、Ｇタンパク質共役受容体と何らかの相互作用をすることによって機能する
と推測されている。しかし、これらの薬剤は、古典的な医薬品化学によって、作
用の分子メカニズムの知識もなく開発された。個々の受容体を標的として遺伝子
配列および生物学的機能に関する情報を使用することで、より効率的な薬剤発見
プログラムが展開でき、有効な治療を開発できるだろう。本発明は、例えば、Ｇ
タンパク質と受容体との相互作用またはリガンドと受容体との相互作用に影響す
る分子を研究することを可能にする。

【００１６】タンパク質は、共有結合したアミノ酸鎖からなる複合巨大分子である。それぞ
れのタンパク質は、それぞれのアミノ酸配列によって主に決定される特有の三次
元形態をとる。多くのタンパク質は、残りのタンパク質から独立して折り畳むこ
とのできる連続したアミノ酸ストレッチであるドメインと称されるより小さなユ
ニットからなる。タンパク質のいくつかの重要な形態として、酵素、ポリペプチ
ドホルモン、栄養輸送体、細胞の構造成分、ヘモグロビン、抗体、核タンパク質
およびウイルスの成分がある。

【００１７】タンパク質-タンパク質相互作用は、２つ以上のタンパク質が会合することを可能にする。２つのタンパク質表面が正確に一致した場合にタンパク質間で多数
の非共有的結合が形成され、これらの結合は認識の特異性を説明する。タンパク
質-タンパク質相互作用は、例えば、酵素サブユニットのアセンブリー、抗原-抗
体反応、リボソーム、フィラメントおよびウイルスの超分子構造の形成、輸送、
そして細胞上の受容体の成長因子およびホルモンとの相互作用に関与する。腫瘍
遺伝子の産物は、タンパク質-タンパク質相互作用を介して悪性形質転換を生じうる。例えば、いくつかの腫瘍遺伝子は、細胞標的タンパク質に対する酵素活性
により癌性症状をもたらすタンパク質キナーゼをコードする。タンパク質-タンパク質相互作用の別の例は、ウイルスが、表面上のポリペプチド受容体を認識す
ることによって細胞を感染する際に生じる。この相互作用は、抗ウイルス剤を設
計するために使用されてきた。

【００１８】タンパク質-タンパク質相互作用は、過去に、架橋、同時免疫沈降、およびクロマトグラフィーによる同時分画などの生化学技術を用いて研究されてきた。こ
れらの技術の欠点は、相互作用するタンパク質の発現量が非常に低い場合が多く
、従って検出するのが困難なことである。別の主要な欠点は、これらの生化学技
術がタンパク質のみに関与し、タンパク質をコードしている遺伝子には関与しな
いことである。生化学的方法を使用して相互作用が検出された場合、新しく同定
されたタンパク質は、それをコードする遺伝子を得るために、しばしば苦労して
単離されてから、配列決定されなければならない。別の欠点は、これらの方法が
、相互作用しているタンパク質のどのドメインが相互作用に関与しているのかと
いう情報をすぐに提供しないことである。別の欠点は、相互作用しているタンパ
ク質の組成における小さな変化が相互作用に与える影響について容易に検査でき
ないことである。

【００１９】タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための生化学技術固有の欠点を回避するために、遺伝子系が最近設計されている。そのような系の１つは、転写活
性化に基づいている。転写とは、DNA鋳型を用いてRNA分子が合成されるプロセス
である。転写は、RNA合成がいつどこで開始されるべきかを示すDNA中の特定の配
列によって調節されている。これらの配列は、転写因子と称されるタンパク質の
結合部位に対応しており、これらは、RNA重合反応に使用される酵素機構と相互作用する。転写は、転写因子の２つの機能性ドメインを用いることによって活性
化できるという証拠がある。すなわち、Keeganら, Science 231, 699-704(1986)
ならびにMaおよびPtashne, Cell, 48, 847-853(1987)に報告されているような、
DNA上の特定の部位を認識しそれと結合するドメイン、および活性化のために必要なドメインである。転写活性化ドメインは、転写に関与する他のタンパク質と
接触することによって機能すると考えられている。DNA結合ドメインは、転写活性化ドメインを、転写される標的遺伝子上に配置するように機能すると思われる
。これまでのところ知られている数少ないケースでは、これらの２つの機能(DNA
結合および活性化)は別々のタンパク質に存在している。McKnightら, Proc. Nat
'l Acad. Sci. USA, 89, 7061-7065(1987)に報告されるように、一方のタンパク
質はDNAに結合し、転写を活性化する他方のタンパク質はDNA結合タンパク質に結
合する。別の例が、Curranら, Cell, 55, 395-397(1988)で論じられている。

【００２０】転写活性化は、酵母Saccharomyces cerevisiaeのGAL4タンパク質を用いて研究
されてきた。GAL4タンパク質は、ガラクトース利用性酵素をコードする遺伝子の
発現に必要とされる転写アクチベーターである(Johnston, Microbiol.Rev., 51,
458-476(1987)を参照)。UASGと命名された(UASは上流活性化部位を意味し、Ｇはガラクトース遺伝子を指す)特異的なDNA配列と結合するＮ-末端ドメインと、転写を活性化するために必要な酸性領域を含むＣ-末端ドメインとからなる(Keeg
anら(1986)前掲、ならびにMaおよびPtashne(1987)前掲を参照)。Keeganらが論じ
たように、Ｎ-末端ドメインは、配列特異的にDNAと結合するが転写を活性化でき
ない。Ｃ-末端ドメインは、UASGを局在化できないため転写を活性化できない(例
えば、BrentおよびPtashne, Cell, 43, 729-736(1985)を参照)。しかし、Maおよ
びPtashneは、GAL4 Ｎ-末端ドメインおよびＣ-末端ドメインの両方が同じタンパ
ク質において共に融合された場合には、転写活性が誘導されると報告している(C
ell, 51, 113-119(1987)；Cell, 55, 443-446(1988))。他のタンパク質も、同様
のメカニズムを経て転写アクチベーターとして機能する。例えば、HopeおよびSt
ruhl, Cell, 46, 885-894 (1986)に報告されるSaccharomyces cerevisiaeのGCN4
タンパク質、Thukralら, Molecular and Cellular Biology, 9, 2360-2369 (198
9)に報告されるSaccharomyces cerevisiaeのADR1タンパク質、ならびにKumarら,
Cell, 51, 941-951(1987)で論じられているヒトエストロゲン受容体はいずれも
、DNA結合および最大転写活性化のための分離可能なドメインを含む。

【００２１】タンパク質のどのドメインが相互作用するかを決定し、新しく同定された相互
作用タンパク質をコードする遺伝子を得て、どのタンパク質が既知のタンパク質
と相互作用するかを迅速に検出できる遺伝子系が、最近Saccharomyces cerevisi
aeで入手できるようになった(Fields, S.およびSong, O. (1989) Nature 340:24
5-247, Mullinax, R.L., およびSorge, J.A.(1995)Strategies 8:3-5)。これらの系は、真核生物宿主におけるin vivoタンパク質-タンパク質相互作用を研究す
るために有用である。このことはこれまで、原核生物系においては生じない、折
り畳み、可溶性および翻訳後修飾(リン酸化など)をもたらし得る真核生物宿主で
の条件のために有利であるとみなされてきた。細菌中で合成された多くの真核生
物タンパク質は、不正確または非効率的に折り畳まれ、結果的に低い特異的活性
を示す。クローニングされたDNAから真の生物学的に活性な真核生物タンパク質を産生するには、しばしば、細菌細胞では行われない、正確なジスルフィド結合
形成、グリコシル化、リン酸化、オリゴマー化または特異的タンパク質分解切断
のプロセスなどの翻訳後修飾を必要とする。この問題は、細胞表面受容体および
細胞外ホルモンまたは酵素などの機能性膜または分泌タンパク質の発現が必要で
ある場合に特に深刻である。従って、これらの系を原核生物スクリーニング宿主
において開発する必要性は認識されておらず、このような系の利点は最近まで明
らかではなかった。

【００２２】試料中の非培養生物を利用し、これらの試料の遺伝子をクローニングベクター
中で遺伝子ライブラリーの形態で保存し、生物活性分子についての最終的なスク
リーニングに用いる能力の出現により、非常に多数のクローンをスクリーニング
できる系を利用する必要性が急速に浮上してきた。これらの遺伝子ライブラリー
の有効なスクリーニングは、これらの試料を提示する何百万ものクローンをスク
リーニングするために利用できるような高い形質転換効率を提供する系を必要と
する。記載されているような真核生物の系は、残念ながら低い形質転換効率が問
題となっている。原核生物宿主で作用する能力が有利である。つまり、細菌など
の原核生物宿主で作用することの主要な利点は、スクリーニングのためのこれら
の宿主の利用によって得られる高い形質転換効率にある。さらに、上記したよう
な真核生物宿主で作用する場合、タンパク質は核を標的とすることが重要である
。なぜなら相互作用は核で生じなければならないからである。

【００２３】最近、大腸菌におけるアッセイとして、転写抑制を用いて、タンパク質-タンパク質相互作用をin vivoで検出する遺伝子系が記載されている。２つの相互作用タンパク質をコードする遺伝子を、野生型および変異型LexA DNA結合ドメイン
に融合する(変異体は自身のオリゴマー化ドメインが欠けた末端平滑化LexAタンパク質であり、LexA 408と称される)。LexAは、二量体として作用した場合にのみ、大腸菌において効率的な転写リプレッサーとなる。この性質を利用して、Le
xA二量体化ドメインを異種相互作用モチーフと交換して抑制を回復する。ハイブ
リッドタンパク質間の非共有的相互作用を、末端平滑化LexAタンパク質(LexA408
)のリプレッサー活性の回復能力によってプローブする。

【００２４】融合タンパク質の相互作用または会合を、リポーター菌株(SU202)中に半分の野生型部位と半分の変異型部位を含むハイブリッドSulAオペレーター(op408/op+
)によって制御されているリポーター遺伝子を用いて特異的に測定する。lacZリポーター遺伝子は、sulAプロモーター(最も厳しく抑制された天然SOSプロモータ
ー)を用いたop408/op+ハイブリッドオペレーターの制御下にある。相互作用して
いる融合タンパク質の同時発現の際に、lacZが抑制される。Lac+表現型はこの系
で赤いコロニーを形成し、Lac-表現型は白いコロニーを形成する。

【００２５】タンパク質融合はまた、ファージリプレッサーを用いて、大腸菌におけるタン
パク質-タンパク質相互作用を検出し特性決定するために使用されてきた(Hu J.C
.ら, Science 250, 1400-1403 (1990))。バクテリオファージリプレッサーのNH 末端DNA結合ドメインは、非効率的に二量体化し、別々のCOOH末端二量体化ドメインがそのオペレーターと強く結合することを必要とする。この性質により、結
合ドメイン及び二量体化ドメインを利用して生成されたハイブリッドタンパク質
間の相互作用を、リプレッサーのリプレッサー活性の回復能力によって評価する
ことができる。

【００２６】タンパク質-タンパク質相互作用に加えて、他の分子の相互作用、およびこの相互作用に影響する能力についての研究は、研究および発見のプロセス、ならび
に新規薬剤の発見において関心が高い。例えば、ステロイドおよびそれらの受容
体、または多糖およびそれらの受容体がある。

【００２７】 (発明の開示) 本発明は、真核生物系および/または原核生物系において目的の新規生化学的経路をコードする可能性のある遺伝子をクローニングし、これらの経路を新規方
法を利用してスクリーニングすることを可能にする。個体生物(「単離体」)、規定
培地で成長した生物群(「富化培養物」)、または最も好ましくは非培養生物(「環境
試料」)などの遺伝子由来源を単離できる。環境試料から新規生物活性コード遺伝
子を直接クローニングする培養非依存性アプローチの使用が、最も好ましい。な
ぜなら、未活用生物種資源を利用できるからである。

【００２８】「環境ライブラリー」は、環境試料から生成され、適切な原核生物宿主中で増殖
できるクローニングベクター中に保存された天然生物の集団的ゲノムを示す。ク
ローニングされたDNAが元々環境試料から直接抽出されたものであるため、ライブラリーは純粋な培養中で成長できる原核生物の小さい画分に限定されない。ま
た、これらの試料中に存在する環境DNAの標準化により、元の試料に存在した全ての種由来のDNAの表示量をより同等にすることができる。これにより、試料中の優勢種と比較して数桁も下回って発現（under-represented）している少数の構成要素から目的の遺伝子を見つける効率が劇的に上昇し得る。

【００２９】複合環境発現ライブラリーの評価においては、生物活性の発見の段階で律速段
階が生じる。本発明は、例えば何千もの異なる生物を含む複合環境発現ライブラ
リーのスクリーニングを可能にする。

【００３０】本発明によれば、例えば、１つ以上の非培養微生物から作成された遺伝子ライ
ブラリーを目的の活性についてスクリーニングする。目的の生物活性分子をコー
ドする可能性のある経路を、まず原核生物細胞の中で遺伝子発現ライブラリーの
形で捕捉し、本発明の方法を用いて、目的の活性についてスクリーニングする。
スクリーニング宿主は、小分子などの生物活性化合物の発現を補助できる代謝的
に富化された細胞系由来のタンパク質または他の分子を含むように改変すること
ができる。

【００３１】従って、本発明はまた、非培養試料由来のクローニングされた経路を宿主に転
移して、本明細書に記載している方法を用いて、目的の生物活性化合物の異種発
現および下流スクリーニングを行うことができる。

【００３２】本発明は、タンパク質-タンパク質または他の相互作用(例えば、受容体とそれ
らのコグネイト標的との相互作用)のエンハンサーおよびインヒビターを検出できる系を用いた、in vivoまたはin vitroでの組換え生物活性および生成化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明はさらに、膜結合分子(Ｇタンパク質など)と相互作用する分子の相互作用に作用できる、組換え生物活性化合物、生成化合物または他の化合物のスクリーニング方法を提供する。

【００３３】本発明の目的は、多様なタンパク質(細胞のゲノム全体にコードされているものなど)を、他のタンパク質-タンパク質相互作用または他の分子の相互作用の阻
害または増強について同時に検査できる方法を提供することである。本発明のさ
らなる目的は、検査が陽性の場合には相互作用するタンパク質及び潜在的インヒ
ビターまたはエンハンサーをコードする核酸断片を直ちに利用できる、タンパク
質-タンパク質相互作用の阻害または増強の検出方法を提供することである。

【００３４】本発明のさらに別の目的は、新規遺伝子および新規遺伝子経路の同定方法を提
供することである。新規の系を用いて、目的の生物活性についてクローニングお
よびスクリーニングすることが望ましい。本発明の方法は、新規かつ有用な生物
活性分子、特に非培養試料由来の新規生物活性分子のクローニングおよび発見を
可能にする。本発明の方法はさらに、周知の遺伝子系を利用してスクリーニング
することも可能にする。

【００３５】従って、一態様において、本発明は、目的の特定の活性をコードするクローン
の同定方法を提供する。該方法は(i)環境から直接単離した核酸から１つ以上の発現ライブラリーを作成し、(ii)in vivo系またはin vitro系におけるタンパク質または他の分子の相互作用の阻害または増強の検出方法を利用して該ライブラ
リーをスクリーニングする、ことを含む。

【００３６】本発明の別の態様は、目的の化合物の同定方法を提供する。該方法は、(i)検出可能なシグナルを生成または抑制する条件下で、相互作用分子を宿主細胞に導
入し、(ii)第３の化合物または第３の化合物をコードする１つもしくは複数の遺
伝子を(i)で得られた宿主細胞に導入し、そして(iii)in vivo系またはin vitro 系においてタンパク質または他の分子の相互作用の阻害または増強を検出する方
法を利用して該宿主細胞をスクリーニングする、ことを含む。

【００３７】好適な実施形態の詳細な説明本発明の方法は、好適な原核生物宿主中で増殖可能なクローニングベクターの
中に保有された天然生物の集合ゲノムを表わす遺伝子ライブラリーの構築で始ま
る。

【００３８】該ライブラリーを調製することができる微生物には、真正細菌および古細菌な
どの原核微生物、ならびに菌類、幾つかの藻類および原生動物などの下等真核微
生物が含まれる。ライブラリーは、環境サンプルから作成することができるが、
その場合、生物を培養することなくDNAを回収してもよいし、また、DNAは１以上
の培養生物から回収してもよい。このような微生物は、超好熱菌、好冷菌、低温
菌（psychrotrophs）、好塩菌、好酸菌などの好極限性細菌であってもよい。

【００３９】ライブラリーを調製することができる微生物は、当分野で知られている種々の
技法を用いて収集することができる。またサンプルは、以下に挙げる実施例に詳
細に記載された方法を用いて収集することができる。簡単に言うと、以下の実施
例は、細菌および古細菌種の選択的なin situ富化を行いつつ同時に該集団の真核生物メンバーの増殖を阻害する方法を提供する。In situ富化(enrichment)により、希少な種およびこれまで培養されたことのない微生物集団のメンバーを回
収できる可能性を増大させることができる。細菌および古細菌種を得たい場合は
、環境サンプル中の真核生物由来の核酸は、DNAライブラリーの構築を非常に複雑化し、喫食（grazing）により所望の細菌種の数を減少させる可能性がある。以下に記載する方法は、抗真菌剤などの選択剤を使用して、真核生物種の成長を
阻害するものである。

【００４０】 In situ富化は、周囲環境マトリックスのメンバーを選択的に誘導する目的で、成長基質および栄養改良物（nutritional amendments）からなるトラップを用
いて行われる。基質（炭素源）および栄養改良物（すなわち窒素、リンなど）の
選択は、その集団のどのメンバーを富化しようとするかに依存する。真核生物メ
ンバーに対する選択剤も、該トラップに加える。この場合も、的確な組成は、該
群のどのメンバーを富化したいか、および該群のどのメンバーを阻害したいかに
依存する。該群の特定のメンバーを引き出す（pull out）のに有用と思われる富
化培地の幾つかは、本明細書に挙げた実施例の中に記載されている。

【００４１】目的のDNAが得られる出発材料ライブラリーとしての微生物DNA起源は、特に、
北極および南極の氷、水または永久凍土層起源から得られる微生物サンプル、火
山起源の物質、熱帯地域の土壌または植物起源由来の物質などの環境サンプルを
含むよう意図されている。従って、例えばゲノムDNAは、培養可能な生物かもしくは培養不可能な生物のいずれかから回収することができ、後に生物学的活性を
測定するための適当な組換え発現ライブラリーを作成するのに使用することがで
きる。

【００４２】DNAの単離サンプルからのDNAの調製は、非培養生物からなる環境サンプルからのDNAライ
ブラリーの作成、または培養生物からのライブラリーの作成における重要なステ
ップである。DNAは、当分野で周知の種々の技法を用いてサンプルから単離することができる（Nucleic Acids in the Environment Methods & Applications, J
.T. Trevors, D.D. van Elsas, Springer Laboratory, 1995）。好ましくは、得
られたDNAはサイズが大きく、酵素インヒビターまたは他の混入物質を含まない。DNAは環境サンプルから直接単離することができる（直接溶解）。または、細胞をサンプルから収穫してからDNAを回収することができる（細胞分離）。直接溶解法は、細胞分離に基づくプロトコールに比して幾つかの利点を有する。直接
溶解技法は、微生物群の一般により高い表示のDNAを提供することが多いが、たまにサイズが小さい場合があり、細胞分離技法を用いて回収されたDNAよりも酵素インヒビターを含みがちである。高分子量且つ高純度のDNAを提供する非常に有用な直接溶解技法が過去に記載されている（Barns, 1994; Holben, 1994）。インヒビターが存在する場合、細胞単離法を用いる幾つかのプロトコールがあり
、使用可能である（Holben, 1994）。さらに、本明細書に記載されるビス-ベンズイミド分離法（塩化セシウム単離法）などの分画技法を用いて、DNAの純度を高めることができる。

【００４３】極限環境サンプルからの全ゲノムDNAの単離は、物質の起源および量によって異なる。汚染されていない、良質の（＞20kbp）DNAが、本発明の代表的なライブ
ラリーの構築に必要である。成功した一般的なDNA単離プロトコールは、標準的なセチル-トリメチル-アンモニウム-ブロミド（CTAB）沈殿技法である。バイオマスペレットを溶解し、タンパク質を非特異的プロテアーゼであるプロテイナー
ゼKにより界面活性剤SDSの存在下にて消化する。高温および高塩濃度では、CTAB
は変性タンパク質、多糖類および細胞破砕屑と不溶性複合体を形成する。CTAB複
合体を含む白い界面が実質的に減少するまでクロロホルム抽出を行う。上清の中
の核酸を、イソプロパノールで沈殿させ、TE緩衝液に再懸濁させる。

【００４４】溶解することが難しい細胞の場合、種々の細胞溶解酵素のカクテルを用いた化
学的方法と機械的方法との組み合わせを用いることができる。つぎに、単離した
核酸を、小さなセシウム勾配を用いてさらに精製しうる。

【００４５】単離方法の他の例について、以下の実施例で詳細に記載する。このタイプの単
離方法は、クローニングのための良質の大きなDNA断片を得るのに最適である。

【００４６】標準化(normalization) 本発明は、微生物、種々の起源（微生物のコンソルチアス（consortias）、一
次富化および環境「非培養」サンプルを含む）から目的の活性を単離するための
方法をさらに最適化することができる。元のサンプル中のゲノム集団の表示にお
いて「標準化」されたライブラリーは、本発明を用いれば可能である。つぎにこ
れらのライブラリーを、本発明の方法を用いて目的の酵素および他の生物活性に
ついてスクリーニングすることができる。

【００４７】自然界集団において豊富さが非常に異なる微生物に由来するゲノムの同等表示
のライブラリーを作成し、スクリーニングする。この「標準化」方法により、膨
大な数の種からのクローンの冗長を減らし、希少な種からのクローンの表示を増
加させる。これらの標準化されたライブラリーにより、スクリーニング効率が増
し、新規な生物学的触媒をコードする細胞が同定される。

【００４８】１つの実施形態において、環境から単離された生存細胞もしくは非生存細胞は
、発現遺伝子ライブラリーの作成のための核酸単離の前に、例えばその細胞のDN
AまたはAT/GC含量に基づいてサンプルから細胞を分離するためにFACS選別される
。種々の色素および染料が当分野で周知であり、例えば"Practical Flow Cytome
try", 1995 Wiley-Liss, Inc., Howard M. Shapiro, M.D.,に記載されたものを使用して、細胞の核酸に挿入したりまたは該核酸に結合させ、細胞中の相対的な
DNA含量またはAT/GC DNA含量に基づいてFACSで細胞を分離する。他の基準を用い
てサンプルから細胞を分離することもできる。つぎに該細胞からDNAを単離し、発現遺伝子ライブラリーの作成に使用することができる。つぎにこのライブラリ
ーを目的の活性についてスクリーニングする。

【００４９】あるいは、該核酸を環境から直接単離し、遺伝子ライブラリーを作成する前に
、DNAまたはAT/GC含量に基づいて選別する。環境から直接単離したDNAを無傷のまま使用するか、無作為にせん断するか、または消化して、一般的な断片化DNA にする。つぎにこのDNAを上記のような挿入剤に結合させ、相対的な塩基含有量に基づいて分析器で分離し、目的のDNAを単離する。つぎに選別したDNAを使用し
て遺伝子ライブラリーを作成し、次いでこのライブラリーを目的の活性について
スクリーニングする。

【００５０】先に示したように、環境サンプルから標準化ライブラリーを作成するための１
つの実施形態は、サンプルからの核酸の単離から始まる。つぎにこの核酸を標準
化する前に分画し、サンプリングした生物のプールから得た少数種からDNAをクローニングする確率を増大させる。密度勾配遠心分離技法（塩化セシウム勾配な
ど）を用いてDNAを分画することができる。ビス-ベンズイミドなどの挿入剤を使
用して、核酸の浮遊密度を変化させる場合、勾配により、相対的な塩基含有量に
基づいてDNAが分画される。複数の生物から得た核酸をこのように分離することができ、この技術を用いてゲノムの複雑な混合物を分画することができる。これ
は、複雑な環境サンプルを用いて作業を行う場合に特に価値がある。あるいは、
該DNAは、標準化する前に分画する必要はない。該分画したDNAからサンプルを回
収し、つぎに核酸の鎖を融解して、固定条件下において選択的に再アニーリング
させる（C₀t駆動ハイブリダイゼーション）。核酸断片の混合物を融解させてストリンジェント条件下で再アニーリングさせる場合、共通配列はそれに相補的な
鎖を、希少配列よりも速く見つける。場合により行う一本鎖核酸の単離ステップ
のあと、ポリメラーゼ連鎖反応（Barnes, 1994）などの当技術で周知の技術を用
いて希少配列の富化を表わす一本鎖核酸を増幅し、この一本鎖核酸を用いて遺伝
子ライブラリーを作成する。この方法により、希少な、つまり豊富でない核酸分
子が増幅され、つぎにこの核酸分子を使用して遺伝子ライブラリーを作成し、こ
のライブラリーを所望の生物活性についてスクリーニングすることができる。DN
Aを回収することはできるが、もともとそのDNAを含んでいた生物の同定は失われ
るかもしれない。この方法は、「クローニング不可能な」起源からDNAを回収する能力を提供する。この方法については、以下の実施例でさらに詳しく記載する
。A. 従って、環境サンプルから標準化ライブラリーを作成するための１つの実施形
態は、（a）環境サンプルから核酸を単離し、（b）該核酸を適宜分画して所望の
画分を回収し、（c）該集団の中のDNAの表示を標準化してその環境サンプルのDN
Aから標準化発現ライブラリーを作成することによる。この標準化プロセスは、1
996年6月18日に出願され、本発明と同じ譲受人に譲渡された、係属中の米国特許
出願第08/665,565号に詳細に記載され、例示されている。

【００５１】遺伝子ライブラリーサンプルから単離したまたは得た、標準化もしくは非標準化DNAをベクターまたはプラスミドに挿入することにより、遺伝子ライブラリーを作成することがで
きる。このようなベクターまたはプラスミドは、好ましくはプロモーターやエン
ハンサーなどの発現調節配列を含むものである。このようなポリヌクレオチドは
、ベクターおよび／または組成物の一部であって、なおかつ単離することができ
る。なぜならこのようなベクターまたは組成物は、その自然環境の一部ではない
からである。特に好適なファージまたはプラスミドおよびその中への導入および
パッケージング方法が、本明細書に記載されている。

【００５２】以下の実施例は、培養生物および非培養生物からのライブラリーの作成方法の
両方について詳しく説明している。

【００５３】また、目的のDNAの無作為な切断により調製したDNA断片のクローニングを用い
て、代表的なライブラリーを作成することもできる。TE緩衝液に溶解したDNAを２５ゲージの二股針を介して勢い良く通過させ、せん断された断片が所望のサイ
ズになるまで続ける。DNAの末端を、マング豆ヌクレアーゼで「なめらかにし（p
olish）」すなわち平滑末端化し、該目的のDNA中のEcoRI制限部位をEcoRIメチラ
ーゼで保護する。目的のDNAに対するリンカーの非常に高いモル比を用いて、Eco
RIリンカー（GGAATTCC）を、平滑末端化／保護されたDNAに連結する。これにより、２つのDNA分子が互いに連結してキメラクローンを生成する可能性を低くする。該リンカーをEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断し、該DNAをサイズ分画す
る。準最適DNA断片および小さなリンカーの除去は非常に重要である。なぜなら、ベクターへの連結により組換え分子がパッケージング不可能なったり、または
リンカーのみを挿入物として含むライブラリーが構築されることとなるからであ
る。スクロース勾配による分画は、非常に簡単且つ迅速で信頼性が高いので、こ
れを使用する。スクロース勾配ではアガロースゲル単離の分解能は得られないが
、阻害性汚染物質を比較的含まないDNAが得られる。この調製された目的のDNAを
λベクターに連結し、in vitroパッケージング抽出物を用いてパッケージングし
、適切な大腸菌で増殖させる。

【００５４】使用し得る発現ベクターの代表的な例としては、記載されたウイルス粒子、バ
キュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド
、細菌人工染色体、ウイルスDNA（たとえばワクシニア、アデノウイルス、鶏ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40誘導体）、P1をベースとした人
工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および対象となる特定の宿主に特
異的な他のベクター（バチルス、アスペルギルス、酵母など）がある。このよう
に、たとえば該DNAを、ポリペプチドを発現させるための種々の発現ベクターのうちのいずれか１つに含ませてもよい。このようなベクターには、染色体、非染
色体および合成DNA配列が含まれる。膨大な数の好適なベクターが当業者に知られており、市販されている。例として、以下のベクターが挙げられる：細菌性の
ものとして、pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、Z
APベクター（ストラタジーン社）;ptrc99a、pKK223-3, pDR540, pRIT2T (ファル
マシア社)；真核生物のものとして、pXT1. pSG5(ストラタジーン社)、pSVK3, pB
PV, pMSG, pSVLSV40 (ファルマシア社)。しかし、宿主のなかで増幅可能かつ生存可能であれば、他のあらゆるプラスミドやベクターを使用してもよい。本発明
では、低コピー数または高コピー数のベクターを使用することができる。

【００５５】本発明に使用するベクターの好適なタイプは、f-因子複製起点を含む。大腸菌
の中のf-因子（すなわち稔性因子）は、コンジュゲーションの間それ自体の高頻
度輸送および細菌染色体自体の低頻度輸送を行うプラスミドである。特に好適な
実施形態は「フォスミド」と呼ばれるクローニングベクター、すなわち細菌人工
染色体（BAC）ベクターを使用することである。これらは、ゲノムDNAの大きなセ
グメントを安定に組み込むことができる大腸菌のf-因子から得られる。混合した
非培養環境サンプルから得たDNAに組み込めば、安定な「環境DNAライブラリー」
形態の大きなゲノム断片を達成することが可能となる。

【００５６】本発明に使用されるベクターの他の好適なタイプは、コスミドベクターである
。コスミドベクターはもともと、ゲノムDNAの大きなセグメントをクローニングし増幅するために設計された。コスミドベクターへのクローニングは、Sambrook
らのMolecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harb
or Laboratory Press, 1989に詳細に記載されている。

【００５７】発現ベクター中の該DNA配列は、RNA合成を指令する適当な発現制御配列（プロ
モーター）に機能し得る形で結合されている。細菌性プロモーターで特に命名さ
れたものとしては、lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λP_R、P_Lおよびtrpが挙げられる
。真核生物のプロモーターとしては、CMV即時型初期、HSVチミジンキナーゼ、初
期および後期SV４０、レトロウイルス由来のLTRおよびマウスメタロチオネインI
が挙げられる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレ
ベルの範囲内である。また、該発現ベクターは翻訳開始のためのリボソーム結合
部位および転写終結因子も含む。また、該ベクターは、発現を増幅するための適
当な配列も含むことができる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用
いて、任意の所望の遺伝子から選択することができる。

【００５８】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換した宿主細胞の選択のための
表現型の特徴を提供するための１以上の選択マーカー遺伝子を含み、該選択マー
カーとしては、真核細胞培養の場合は、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマ
イシン耐性などがあり、大腸菌の場合はテトラサイクリンやアンピシリン耐性な
どがある。

【００５９】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点ならびに宿主細胞の形質転換を可能
とする選択マーカー（たとえば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS. cerev
isiae TRP1遺伝子など）および下流の構造配列の転写を指令するための高発現遺
伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、特に３−ホスホグ
リセリン酸キナーゼ（PGK）、-因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタ
ンパク質などの解糖系酵素をコードするオペロンから得ることができる。異種性
構造配列を、翻訳開始配列および終結配列、ならびに好ましくは細胞周辺腔また
は細胞外培地中への翻訳されたタンパク質の分泌を指令することができるリーダ
ー配列を用いて、適当な段階でアセンブルする。

【００６０】このクローニング方法により、駆動されたベクターおよび内因性プロモーター
の両方を介して発現が可能となる。ベクターのプロモーションは、大腸菌の中で
は機能しない内因性プロモーターを有する遺伝子の発現では重要となろう。

【００６１】微生物由来のDNAを、種々の方法によりベクターに挿入することができる。一般に、DNA配列は、当分野で知られている方法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような方法および他の方法は、当業者の技術範囲内
であるとされる。

【００６２】上記のように選択し単離したDNAを適当な宿主に導入してライブラリーを作成し、このライブラリーを所望の活性についてスクリーニングする。選択されたDN
Aは、好ましくはすでに、適当な制御配列を含むベクターの中にあり、これにより生物活性をコードする選択されたDNAを発現させて所望の活性を検出することができる。この宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞である。特に好適な宿主細胞
は、大腸菌である。該構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランス
フェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーション（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecu
lar Biology, (1986)）により行うことができる。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示より、当業者の範囲内であるとされる。

【００６３】宿主細胞を該ベクターで遺伝子操作（形質導入、形質転換またはトランスフェ
クト）する。この遺伝子操作した宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換
体の選択または遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地の中で培
養することができる。温度やpHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主
細胞とともに以前使用されていたものであり、当業者には自明であろう。

【００６４】細菌起源の多くの生物活性化合物が、15〜100kbp（11、12）の範囲の連続的な
多遺伝子経路の中にコードされているようなので、微生物の天然集団からの新し
い経路を発現させるために、本発明では大きなゲノム断片のクローニングが好ま
しい。大腸菌、バチルスまたはストレプトミセスなどの代理宿主の中での40〜10
0kbpのDNA断片の捕捉および複製は、たとえ大きなDNA断片（各断片は一般的な真
正細菌ゲノムの２〜５％に相当する）であっても、実際には非培養微生物の増殖
である。

【００６５】天然に存在する微生物から大きなゲノム断片を首尾良く捕捉するために、およ
び続くクローンから多遺伝子経路を発現するために、克服しなければならない２
つのハードルは、１）環境DNAの低いクローニング効率、および２）大きなクローンに固有の不安定性である。これらのハードルを克服するために、高品質の大
分子量DNAを、土壌および他の環境から直接抽出し、f因子を主体とした細菌人工
染色体（BAC）ベクターなどのベクターを使用して、大きなゲノム断片を効率的にクローニングおよび増幅する。この環境ライブラリーアプローチ（図１）は、
混合した微生物集団中の集合ゲノムを高い忠実度で保有および複製するために、
このようなサンプルを処理する。この方法のベースは、100〜200kbpのゲノム断片を安定に増やすための、改変した細菌人工染色体（BAC）ベクターの適用である。BACベクターおよびその誘導体である（f-因子ベースのコスミドのための）該フォスミドは、f-複製起点を用いて細胞当たりのコピー数を１または２に維持
する（14）。この特徴は、大きなクローン断片の安定性を維持するのに非常に重
要な要因であることが分かった（15）。忠実性の高い複製はストレプトミセスな
どのGC含量の高い生物（このような生物からのクローンは再配置および重複配列
が欠失される傾向がある）からなるライブラリーを増幅するのに特に重要である
。

【００６６】該フォスミドベクターは高効率のλパッケージング系を使用するので、最小量
の出発DNAを用いて包括的なライブラリーをアセンブルすることができる。サンプルから収集した精製DNA100ngから（例えば本明細書中に記載したバッグトラッ
プ（bug trap）からのものを含む）本発明の４×10⁷クローンからなる環境フォスミドライブラリー（各ライブラリーは約40kbpのクローンDNAを含む）を作成す
ることがでる。

【００６７】大腸菌中の生物活性化合物の発現のためのライブラリーを構築する際に起こり
うる問題は、このグラム陰性細菌は、活性な形態で該化合物を発現する適当な遺
伝的背景を持っていない可能性があることである。本発明の１態様により、大腸
菌中での断片の効率的なクローニング、およびその後の、発現およびスクリーニ
ングに適した他の宿主への輸送が可能となる。２つの異なるタイプの宿主中での
増殖を可能とするシャトルベクターを本発明に使用して、大腸菌などの細菌宿主
中でクローン化および増殖し、ならびに活性分子の発現のための他の宿主へ輸送
することができる。このような他の宿主には、例えばストレプトミセスまたはバ
チルス、あるいはラン細菌(Cyanobacteria)や粘液細菌(Myxobacteria)などの他の代謝豊富宿主（metabolically rich host）が含まれるが、これらに限定されない。例えばStreptomyces lividansを、クローニングされた経路のための発現宿主として使用してもよい。この株は、多くのプロモーターを認識し、制限系を
持っていないようなので、異種性抗生物質経路の組換え発現で通常使用される（
Guseck，T.W. & Kinsella, J.E., (1992) Crit. Rev. Microbiol. 18, 247-260 ）。

【００６８】本発明において、以下に挙げる実施例に、使用することができるシャトルベク
ターについて記載する。このベクターは大腸菌-ストレプトミセス・シャトルベクターである。この系により、大きな挿入物（40kbpゲノム断片）を安定にクローニングおよび発現することができる。染色体組込み型組換え体をオリジナルの
フォスミドとして回収し、陽性クローンの配列特徴付けおよびさらなる操作を容
易にすることができる。宿主中でのクローンコピー数の調節を可能とするレプリ
コンを使用することができる。例えば、SPC２レプリコン（Streptomyces coelic
olor中に細胞当たり１コピー存在する32kbの稔性プラスミド）を使用することが
できる。このレプリコンを末端切断（トランケーション）により「調整(tune)」
し、ストレプトミセス宿主中で様々なコピー数で複製させることができる。例え
ば、ストレプトミセス宿主中のクローンコピー数を細胞当たり1〜10コピーに調節する全長および末端切断型SCP２レプリコンを含む、染色体組込み型シャトルベクターの複製版を設計することができる。

【００６９】推定ポリケチドまたは他のクラスター化遺伝子を含むクローンの生物活性が任
意の内在遺伝子クラスターの活性化によるものではないことを確認するために、
遺伝子の置換または欠失により宿主株から該内在遺伝子配列を除去することがで
きる。その例を以下に示す。

【００７０】バイオパニング（Biopanning）発現ライブラリーを作成したあと、第２宿主に移してスクリーニングする前に
このようなライブラリーの「バイオパニング」のステップをさらに含むことがで
きる。「バイオパニング」法とは、（i）特定の生物学的活性を有する生物学的物質をコードするDNA配列の少なくとも１部を含む少なくとも１つのプローブDNA
を使用して、少なくとも１つの微生物に由来するDNAから目的のDNAを選択的に単
離し、および（ii）単離した目的のDNAで宿主を形質転換してクローンのライブラリーを作成し、次にこれらのクローンを特定の生物学的活性についてスクリー
ニングするために処理する、ことにより調製されたクローンのライブラリーの中
の配列相同性についてスクリーニングすることにより、特定の生物学的活性を有
するクローンを同定するためのプロセスをさす。

【００７１】「バイオパニング」の方法は、1996年8月2日に出願された米国特許出願第08/6
92,002号に記載され、例示されている。

【００７２】さらに、上記の実施形態全てを組み合わせて、発現ライブラリーを作成する前
に標準化ステップを行ってから該発現ライブラリーを作成し、次にこの作成した
発現ライブラリーをバイオパニングし、該バイオパニングされた発現ライブラリ
ーを、高スループット細胞選別およびスクリーニング装置を用いてスクリーニン
グすることが可能である。このように、種々のオプションがある。すなわち（i ）ライブラリーを単に作成してからスクリーニングを行うことができる、（ii）
目的のDNAを標準化し、発現ライブラリーを作成し、そしてこれをスクリーニングする、（iii）標準化、ライブラリーの作成、バイオパニングおよびスクリーニングを行う、あるいは（iv）ライブラリーを作成し、バイオパニングし、スク
リーニングする。

【００７３】スクリーニング本発明は、多くのタイプの生物活性、特にタンパク質とタンパク質との相互作
用もしくは他の相互作用（例えば転写因子とそのアクチベーターとの相互作用、
または受容体とその同種標的との相互作用など）のエンハンサーおよびインヒビ
ターである生物活性についてスクリーニングする能力を提供する。

【００７４】上記のバイオパニング法を使用して、所与のプローブ配列に相同な配列を保持
するクローンに富むライブラリーを作成することができる。この方法を用いて、
最大で40kbpもの挿入物を有するクローンを含むライブラリーを、パニング１回毎に約1,000倍に富化させることができる。これにより、バイオパニング富化を１回行った後に3,000を超えるフィルターフォスミドライブラリーを３フィルターに減らすことができる。この方法は、所望の配列を保持するクローンを富化し
たライブラリーを作成するのに適用することができる。

【００７５】高密度フィルターを用いたハイブリダイゼーションすなわちバイオパニングは
、保存された遺伝子を含む経路の相同性を検出するための能率的な方法であるこ
とが分かった。しかし、既知の相対物（counterpart）を持たない新規の生物活性分子を発見するためには、他の方法が必要である。

【００７６】従って、本発明の１つの態様は、第１タンパク質と第２タンパク質との間、ま
たは２以上の分子間の相互作用をもたらす分子を検出するための方法を提供する
。評価すべき分子は、１以上の遺伝子によりコードされていてもよいし、核酸に
よりコードされていない他の分子（例えば核酸自体または例えば組合せ化学技術
で作成した他の分子など）を含んでいても良い。このような分子としては、天然
のもしくは合成したペプチド、天然産物および合成産物が挙げられる。

【００７７】原核生物宿主または真核生物宿主を、本発明の方法に使用することができる。
該宿主細胞は、転写アクチベーターのDNA結合ドメインのための結合部位を有する検出可能な遺伝子を含むことができ、これにより該検出可能遺伝子の転写が活
性化されると該検出可能遺伝子が検出可能なタンパク質を発現するようになって
いる。このような活性化は、転写アクチベーターの転写活性化ドメインが該転写
アクチベーターのDNA結合ドメインに十分近づいたときに起こる。あるいは、該宿主細胞は、転写リプレッサーの結合ドメインのための結合部位を有する検出可
能な遺伝子を含み、該リプレッサーが結合しない場合に該検出可能な遺伝子が発
現するようになっている。このような抑制は、該リプレッサーのこれらのドメイ
ンが互いに十分近づいたときに起こる。あるいは、相互作用する分子を、互いに
十分近づけたときに検出可能なシグナルを生成させる他の分子と、融合もしくは
会合させることができる。

【００７８】本発明の１つの態様において、宿主細胞の中で発現することができる第１のキ
メラ遺伝子が提供される。この第１キメラ遺伝子は、第１ハイブリッドタンパク
質をコードするDNA配列を含む。該第１ハイブリッドタンパク質は、宿主細胞中の該検出可能遺伝子の近くの結合部位を認識するDNA結合ドメイン、または第２ハイブリッドタンパク質上の該分子に十分近づけたときに検出可能なシグナルを
生成する分子を含む。また、該第１ハイブリッドタンパク質は、第２タンパク質
またはタンパク質断片と相互作用させようとする第１タンパク質またはタンパク
質断片も含む。該第１キメラ遺伝子は、該宿主細胞の染色体中に存在してもよい
。あるいは、該第１キメラ遺伝子は、該DNA結合ドメインをコードするDNA配列に
融合されたゲノムDNA配列、cDNA配列、または合成DNA配列を含むプラスドまたは
他のベクターのライブラリーにコードされてもよい。

【００７９】該宿主細胞中で発現することができる第２キメラ遺伝子が提供される。１つの
実施形態において、第１および第２キメラ遺伝子の両方をプラスミドもしくは他
のベクターの形で該宿主細胞中に導入する。他の実施形態において、該第１キメ
ラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第２キメラ遺伝子は宿主細胞中にプラ
スミドまたは他のタイプのベクターの一部として導入される。該第２キメラ遺伝
子は、第２ハイブリッドタンパク質をコードするDNA配列を含む。該第２ハイブリッドタンパク質は、該宿主細胞中の該検出可能遺伝子の近くの該結合ドメイン
および該オペレーターまたは他の配列と相互作用させると該検出可能遺伝子の転
写を活性化させる転写活性化ドメインを含む。あるいは、該第２ハイブリッドタ
ンパク質は、該宿主細胞中の該検出可能遺伝子の近くの該結合ドメインおよび該
オペレーターまたは他の配列と相互作用させると該検出可能遺伝子の転写を抑制
する、２量化もしくは他のドメイン（「転写リプレッサー」）を含む。あるいは
、第２ハイブリッドタンパク質は、第１ハイブリッドタンパク質上の該分子に十
分近づけると検出可能なシグナルを生成する分子を含む。また、該第２ハイブリ
ッドタンパク質は、該第１タンパク質またはタンパク質断片との相互作用につい
て検査しようとする第２タンパク質またはタンパク質断片も含む。好ましくは、
第１ハイブリッドタンパク質のDNA結合ドメインおよび該第２ハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインまたは転写リプレッサーは、別々のDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメイン、または上記のような２量化ドメインもしくは他の
ドメインを有する転写アクチベーターまたはリプレッサーから得られる。転写に
関わる多くのタンパク質は分離可能な結合ドメインおよび転写活性化ドメインま
たは「リプレッサー」（上記）ドメインを有しており、これらのドメインはこれ
らのタンパク質を本発明に有用なものとする。他の実施形態において、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインまたは２量化もしくは他のドメイン（上記）
は、異なる転写アクチベーターまたはリプレッサーに由来するものであってもよ
い。該第２ハイブリッドタンパク質は、該転写活性化ドメインまたは転写リプレ
ッサーをコードするDNA配列に融合された、ゲノムDNA配列、cDNA配列または合成
したDNA配列を含むプラスミドまたは他のベクターのライブラリーにコードされてもよい。

【００８０】或いは、本発明の方法において、DNA結合ドメインに結合した第１の検査タンパク質および転写アクチベーターもしくはリプレッサーに結合した第２の検査タ
ンパク質も、上記のように遺伝子としてではなくタンパク質産物として細胞中に
導入することができる。前記結合タンパク質は、in vitroまたはin vivoで生成もしくは合成することができ、タンパク質産物を該宿主細胞の中に導入し、本発
明の方法を用いてスクリーニングすることができる。検出可能な遺伝子の発現を
活性化または抑制するのにアクチベーターまたはリプレッサーを使用しない場合
、第１検査タンパク質および第２検査タンパク質を、互いに十分近づけたときに
検出可能なシグナルを生成する分子と結合させ、本発明の方法を用いて、宿主細
胞の中に導入してスクリーニングすることができる。

【００８１】従って、転写アクチベーターを使用する場合、宿主細胞中における第１タンパ
ク質と第２タンパク質との相互作用により、該転写活性化ドメインが、該検出可
能遺伝子の転写を活性化させる。この方法は、第１キメラ遺伝子および第２キメ
ラ遺伝子を該宿主細胞中に導入することにより行われる。該宿主細胞を、第１ハ
イブリッドタンパク質および第２ハイブリッドタンパク質が、該検出可能遺伝子
を活性化するのに十分な量で発現される条件下に置く。次に該細胞を、第１タン
パク質と第２タンパク質とが相互作用しない場合よりも大きな程度の該検出可能
遺伝子の発現について、検査をする。第３遺伝子または遺伝子クラスターをつぎ
に宿主細胞中に導入し、第１および第２のタンパク質の相互作用の強化または抑
制を、該検出可能遺伝子の発現の増加または減少により評価する。第１および第
２のタンパク質の間の相互作用の強化により、該検出可能遺伝子の発現を増加さ
せることができ、また第１および第２のタンパク質の間の相互作用の抑制により
、該検出可能遺伝子の発現を減少させる。また、該第３遺伝子または遺伝子クラ
スターは、第１および／または第２遺伝子を導入する前に、あるいは第１および
／第２遺伝子と同時に、細胞中に導入することができる。あるいは、最初の２つ
のタンパク質の相互作用に及ぼす影響について評価しようとする分子を、遺伝子
または遺伝子クラスターとしてではなく産物として、宿主細胞に直接導入するこ
とができる。

【００８２】転写リプレッサーを使用する場合、宿主細胞中における第１タンパク質と第２
タンパク質との間の相互作用により、転写抑制ドメインが該検出可能遺伝子の転
写を抑制する。この方法は、第１キメラ遺伝子および第２キメラ遺伝子を該宿主
細胞中に導入することにより行われる。該宿主細胞を、第１ハイブリッドタンパ
ク質および第２ハイブリッドタンパク質が、該検出可能遺伝子を不活化するのに
十分な量で発現される条件下に置く。次に、該細胞を該検出可能遺伝子の発現が
無いことについて検査をする。第３遺伝子または遺伝子クラスターをつぎに宿主
細胞中に導入し、第１および第２タンパク質の相互作用を阻害することにより、
該検出可能遺伝子の発現が増加する。この場合もまた、該第３遺伝子または遺伝
子クラスターは、第１および／または第２遺伝子を導入する前に、あるいは第１
および／または第２遺伝子と同時に細胞中に導入することができ、および、最初
の２つのタンパク質の相互作用に及ぼす影響について評価しようとする分子を、
遺伝子または遺伝子クラスターとしてではなく産物として、宿主細胞に直接導入
することができる。

【００８３】互いに近づけたときに会合して検出可能なシグナルを生成することができる分
子を使用する場合、宿主細胞中における第１タンパク質と第２タンパク質との間
の相互作用により、検出可能シグナルが生成される。この方法は、該第１キメラ
遺伝子および第２キメラ遺伝子を該宿主細胞に導入することにより行われる。該
宿主細胞を、第１ハイブリッドタンパク質および第２ハイブリッドタンパク質が
、該検出可能シグナルを生成するのに十分な量で発現される条件下に置く。次に
、該細胞を該検出可能シグナルの存在について検査をする。第３遺伝子または遺
伝子クラスターをつぎに宿主細胞中に導入し、第１および第２タンパク質の相互
作用の増強または阻害することにより、該検出可能シグナルが増大したり減少し
たりする。この場合もまた、該第３遺伝子または遺伝子クラスターは、第１およ
び／または第２遺伝子を導入する前に、あるいは第１および／または第２遺伝子
と同時に、細胞中に導入することができ、そして最初の２つのタンパク質の相互
作用に及ぼす影響について評価しようとする分子を、遺伝子または遺伝子クラス
ターとしてではなく産物として、宿主細胞に直接導入することができる。

【００８４】このように、第３件sタンパク質または分子のライブラリーによる第１タンパク質と第２タンパク質との間の相互作用の強化または阻害を検査することができ
る。たとえば、第１および第２タンパク質は、細菌やウイルスなどに由来するも
のであってもよく、および／またはオンコジーンによりコードされるタンパク質
、成長因子または酵素であってもよい。この第３タンパク質は、本明細書中に記
載する遺伝子ライブラリーに由来するものであってもよいし、他の分子の相互作
用をもたらす可能性についてスクリーニングしたい任意の分子であってもよい。

【００８５】本発明のスクリーニング態様は、３つのベクターおよび１つの宿主細胞を用い
て実施することができる。第１ベクターはプロモーターを含み、第１キメラ遺伝
子に機能的に結合した転写終結シグナルを含み、これにより第１キメラ遺伝子の
転写を指令し得る。該第１キメラ遺伝子は、DNA結合ドメインをコードするDNA配
列、および第１タンパク質またはタンパク質断片をコードするDNA配列を挿入するためのユニークな切断部位を、該第１タンパク質がDNA結合ドメインとのハイブリッドタンパク質の一部として発現するように、含む。また、該第１ベクター
は宿主細胞中で自律複製するための手段も含む。また、該第１ベクターには第１
マーカー遺伝子も含まれ、宿主細胞中でのその発現により、該第１マーカー遺伝
子を含まない細胞からの該第１マーカーを含む細胞の選択が可能となる。好まし
くは、該第１ベクターは、ファージ、コスミド、プラスミド、ファージミド、ま
たはフォスミドまたは他のBACベクターである。

【００８６】第２ベクターは、第２キメラ遺伝子を含む。該第２キメラ遺伝子もまた、転写
を指令するためにプロモーターおよび転写終結シグナルを含む。また、該第２キ
メラ遺伝子は、転写活性化ドメインをコードするDNA配列、および第２タンパク質またはタンパク質断片をコードするDNA配列を該ベクターに挿入するためのユニークな切断部位を、該第２タンパク質が、転写活性化ドメインとのハイブリッ
ドタンパク質の一部として発現するように含む。好ましくは、該第１ハイブリッ
ドタンパク質のDNA結合ドメインおよび第２ハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインは、別々のDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有する転写アクチベーターから得られる。転写に関与する多くのタンパク質は、分離可能な
結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有し、これらのドメインは該タンパク
質を本発明に有用なものとする。他の実施形態において、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、異なる転写アクチベーターに由来するものであってよ
い。該第２ハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードするDNA配列に融合されたゲノムDNA配列、cDNA配列または合成DNA配列を含むベクターのラ
イブラリーにコードされていてもよい。

【００８７】あるいは、該第２キメラ遺伝子は、転写抑制ドメインをコードするDNA配列の代わりに、第２タンパク質またはタンパク質断片をコードするDNA配列を該ベクターに挿入するためのユニークな制限部位を、該第２タンパク質が該転写抑制ド
メインとのハイブリッドタンパク質の一部として発現されることができるように
、含む。好ましくは、該第１ハイブリッドタンパク質のDNA結合ドメインおよび第２ハイブリッドタンパク質の転写抑制ドメインは、別々のDNA結合ドメインおよび転写抑制ドメインを有する転写リプレッサーから得られる。転写に関与する
多くのタンパク質は、分離可能な結合ドメインおよび転写抑制ドメインを有し、
これらのドメインは該タンパク質を本発明に有用なものとする。他の実施形態に
おいて、DNA結合ドメインおよび転写抑制ドメインは、異なる転写リプレッサーに由来するものであってよい。該第２ハイブリッドタンパク質は、転写抑制ドメ
インをコードするDNA配列に融合されたゲノムDNA配列、cDNA配列または合成DNA 配列を含むベクターのライブラリーにコードされていてもよい。

【００８８】該第２ベクターは、宿主細胞中で自律複製するための手段をさらに含む。また
、該第２ベクターは第２マーカー遺伝子も含み、宿主細胞中でのその発現により
、該第２マーカー遺伝子を含まない細胞から該第２マーカーを含む細胞を選択す
ることが可能となる。

【００８９】第３ベクターはプロモーターを含み、第３遺伝子または遺伝子クラスターに機
能的に結合した転写終結シグナルを含み、これにより第３遺伝子または遺伝子ク
ラスターの転写を指令することができる。該第３ベクターは、第３タンパク質、
タンパク質群（例えば遺伝子クラスターによりコードされるタンパク質など）ま
たはタンパク質断片をコードするDNA配列を挿入するためのユニークな切断部位を含む。また、該第３ベクターは宿主細胞中および細菌中で自律複製するための
手段も含む。また、該第３ベクターは第３マーカー遺伝子も含み、宿主細胞中で
のその発現により、該第３マーカー遺伝子を含まない細胞から該第３マーカー遺
伝子を含む細胞を選択することが可能となる。好ましくは、該第３ベクターは、
ファージ、コスミド、プラスミド、ファージミド、またはフォスミドまたは他の
BACベクターである。

【００９０】あるいは、本発明のスクリーニング態様は、ベクターを用いて行うのではなく
、DNA結合ドメインおよび転写アクチベーターまたはリプレッサーに結合した相互作用ハイブリッド分子、あるいは互いに十分に近づけたときに検出可能なシグ
ナルを生成する他の分子に結合した相互作用ハイブリッド分子、および宿主細胞
を用いて行う。

【００９１】該宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。宿主細胞は、第１ハイブリッ
ドタンパク質のDNA結合ドメインのための結合部位を有する検出可能な遺伝子を含む。該結合部位は、該検出可能な遺伝子が第２ベクターによりコードされる転
写活性化ドメインにより活性化されたときに検出可能タンパク質を発現するよう
に、配置される。該検出可能遺伝子の活性化は、転写活性化ドメインが該検出可
能遺伝子の十分近くにあるときに可能である。あるいは、転写リプレッサーを使
用する場合、該リプレッサー結合部位は、検出可能遺伝子が第２ベクターにより
コードされる転写抑制ドメインにより抑制されるときには検出可能タンパク質を
発現しないように配置される。該検出可能遺伝子の抑制は、転写抑制ドメインが
該検出可能遺伝子の十分近くにあるときに可能である。あるいは、会合して検出
可能シグナルを生成する他の会合分子を使用する場合、宿主細胞中に検出可能遺
伝子は存在しない。宿主細胞はそれ自体では、第１マーカー遺伝子、第２マーカ
ー遺伝子、DNA結合ドメイン、転写活性化ドメイン、または会合して検出可能シグナルを生成することができる分子の機能を有するタンパク質を発現することが
できない。該DNA結合ドメインおよび転写活性化もしくは抑制ドメイン、および後者の場合は会合分子は、第１および第２タンパク質がその相互作用によりこれ
らを引き合わせない限り、互いに相互作用することができない。

【００９２】従って、転写アクチベーターを使用する場合、宿主細胞中における第１タンパ
ク質と第２タンパク質との相互作用により、第１タンパク質と第２タンパク質と
の相互作用の不在下でDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインが存在するときよりも、該検出可能遺伝子の発現がある程度大きくなる。あるいは、転写リプ
レッサーを使用する場合、宿主細胞中における第１タンパク質と第２タンパク質
との相互作用により、該検出可能遺伝子の発現が抑制される。

【００９３】該検出可能遺伝子は、簡単に測定することができる酵素や他の産物をコードし
得る。このような測定可能な活性には、該マーカー遺伝子が転写されたときのみ
増殖する細胞の能力、または該マーカー遺伝子が転写されたときのみ存在する検
出可能酵素活性が含まれる。様々な他のマーカーが、当業者に周知である。

【００９４】会合したときに相互作用して検出可能なシグナルを生成する蛍光指標を、本発
明の方法に使用することができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）変異体を作成することができるが、これは、フランキングするGFPとGFPとの間の蛍光共
鳴エネルギーの伝達を増大した。このように、変異GFP分子が会合すると蛍光共鳴得エネルギーが伝達され、測定することができる。１つのGFP変異体と会合した第１検査タンパク質、および他の検査変異体と会合した第２検査タンパク質が
引き合わされ、該２つのGFP分子の会合によりエネルギー伝達が起こり、測定することができる。ハイブリッド分子は、該変異体と会合した該タンパク質または
分子同士の相互作用が生じたとき以外はGFP変異体が独立して相互作用しないように構成される。次に第３分子を、最初の２つの分子の相互作用に影響を及ぼす
能力について評価することができる。

【００９５】該２つのハイブリッドタンパク質を含む細胞を適当な培地でインキュベートし
、培養物を該測定可能な活性についてモニターする。転写アクチベーターを使用
する場合、該第１タンパク質と該第２タンパク質が相互作用したという陽性の指
標は、検出可能遺伝子の発現を示す。このような相互作用は、それぞれのDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを十分に近づけて該マーカー遺伝子の転写
を引き起こす。転写リプレッサーを使用する場合は、該第１タンパク質と該第２
タンパク質が相互作用したという陽性の指標は、検出可能遺伝子の抑制を示すも
のである。このような相互作用は、それぞれのDNA結合ドメインおよび転写抑制ドメインを十分に近づけて該マーカー遺伝子の転写を抑制する。２つの分子が十
分近づいて検出可能シグナルを生成する場合、該第１分子と該第２分子が相互作
用したという陽性の指標は、該シグナルの検出を表わす。

【００９６】第３タンパク質又はタンパク質のグループをコードする第３遺伝子又は遺伝子
クラスターを含むベクターを、相互に作用している２つのハイブリッドタンパク
質を含む細胞に導入する。あるいは、第３タンパク質又は他の分子を、相互に作
用している２つのハイブリッドタンパク質を含む細胞中に直接導入する。第３タ
ンパク質若しくはタンパク質のグループの発現、又は第１及び第２タンパク質の
相互作用を阻害あるいは増強する第３分子の存在は、検出し得る遺伝子の発現に
おける測定可能な差異を作り出す。そのような差異を、検出可能遺伝子によって
製造される検出可能分子の量の検出によって評価する。転写アクチベーターを利
用する場合、２つのタンパク質の間の相互作用の阻害は、検出可能分子の発現レ
ベルの低下をもたらし、２つのタンパク質の間の相互作用の増強は、検出可能分
子の発現レベルの増加をもたらす。転写リプレッサーを利用する場合、２つのタ
ンパク質の間の相互作用の阻害は、検出可能分子の発現レベルの増加をもたらす
。検出可能シグナルを発生させる関連分子を利用する場合の第１の２つのタンパ
ク質の間の相互作用の増強又は阻害は、それぞれ、検出可能シグナルの低下又は
増加をもたらす。

【００９７】このシステムは、本発明の方法を適切に実行するための条件の数に依存する。
第１相互作用タンパク質Xは、それ自身ではなく、マーカーのための活性化又は抑制ドメインを有していなければならない。さもなければ、活性化ドメインは、
第１相互作用タンパク質Xに融合されたDNA結合ドメインのみをコードするベクタ
ーが導入され次第、マーカー遺伝子の転写を可能にするか、又はその転写を抑制
するだろう。第１タンパク質X及び第２タンパク質Yの間の相互作用が、宿主細胞
内で起こり得るに違いない。第２タンパク質Yを含むハイブリッドの活性化ドメイン部分は、細胞の転写装置（transcription machinery）に接近可能であり、マーカー遺伝子の転写を可能にするに違いない。転写リプレッサーを利用する場
合、検出可能遺伝子は、２つのハイブリッドタンパク質の相互作用の不存在下に
発現されているはずである。これらの条件の幾つかが存在しないならば、システ
ムは、相互作用タンパク質X及びYの部分のみを有し、そしてこのようにこれらの
条件に合致するハイブリッドを構築することによって利用のために改質され得る
。

【００９８】このシステムは、他のタンパク質又は分子の相互作用を阻害又は増強するタン
パク質又はタンパク質のグループを遺伝学的に選択するために使用できる。DNA 結合ドメインを有するハイブリッドとして既知のタンパク質を含む原核生物は、
活性化又は抑制ドメインに融合されたゲノム又はcDNA配列のクローンバンク（cl
one bank）によって形質転換され得る。二重形質転換体は、検出マーカーの発現
をスクリーニングできる。次いで、第３タンパク質又はタンパク質グループが導
入され、発現され得る。次いで、第１及び第２タンパク質の間の相互作用の阻害
又は増強が評価できる。

【００９９】原核生物は、類似の転写機構を使用するので、多様な細胞がタンパク質−タン
パク質相互作用の試験に使用できる。リポーター遺伝子機能は、非常に多様な任
意の遺伝子によって提供され得る。分離可能なDNA結合及び転写活性化又は抑制ドメインを有する任意の転写アクチベーター又はリプレッサーを利用できる。確
かに、任意のタンパク質、転写アクチベーター又はリプレッサーではなく、２つ
の分離可能な機能を有するものでさえ、タンパク質−タンパク質或いは他の相互
作用の増強又は阻害を検出するための同様の遺伝学的システムを確立するのに使
用できる。

【０１００】従って、本発明の方法は、再構成され得るアミノ酸配列の分離可能なドメイン
を必要とする任意の検出機能を利用するので、より一般的に適用できる。本発明
のこの一般的な実施態様は、第１タンパク質及び第２タンパク質の間の相互作用
の阻害又は増強を検出する。この方法は、検出機能を欠く宿主細胞を提供するこ
とを含む。検出機能は、分離可能なドメインを有するアミノ酸配列によって提供
される。このように、アミノ酸配列は、それらが宿主細胞中で互いに十分に近接
しているときに、検出機能を製造し得る第１ドメイン及び第２ドメインを含む。

【０１０１】宿主細胞中で発現し得る第１キメラ遺伝子が提供される。第１キメラ遺伝子は
、第１ハイブリッドタンパク質をコードするDNA配列を含む。第１ハイブリッドタンパク質は、アミノ酸配列の第１ドメインを含む。第１ハイブリッドタンパク
質はまた、第２タンパク質又はタンパク質断片と相互作用するべき第１タンパク
質又はタンパク質断片をも含む。

【０１０２】宿主細胞中で発現され得る第２キメラ遺伝子が提供される。第２キメラ遺伝子
は、第２ハイブリッドタンパク質をコードするDNA配列を含む。第２ハイブリッドタンパク質は、アミノ酸配列の第２ドメインを含む。第２ハイブリッドタンパ
ク質はまた、第１タンパク質又はタンパク質断片と相互作用するべき第２タンパ
ク質又はタンパク質断片をも含む。

【０１０３】宿主細胞中での第１タンパク質及び第２タンパク質の間の相互作用は、再構成
されるアミノ酸の機能を引き出す。このように、この方法は、第１キメラ遺伝子
及び第２キメラ遺伝子を、宿主細胞中に導入することによって行われる。宿主細
胞は、第１ハイブリッドタンパク質及び第２ハイブリッドタンパク質が、再構成
されるアミノ酸配列の機能に十分な量で発現される条件に付される。次いで、細
胞は、それらのアミノ酸配列の機能の発現が、試験タンパク質の相互作用の不存
在下よりも高い程度で再構成されたか否かを決定するために試験される。次いで
、第三タンパク質又はタンパク質グループをコードする第３ベクターを、宿主細
胞中に導入する。次いで、第１及び第２タンパク質の相互作用を増強又は阻害す
るタンパク質又はタンパク質グループは、検出可能遺伝子の発現レベルを評価す
ることによって決定される。

【０１０４】この一般化された方法は、例えば、検出機能が検出可能遺伝子の転写又は検出
可能遺伝子の転写の抑制である、本発明の好ましい方法で記載したように、より
特異的にすることができる。この方法では、アミノ酸配列の第１ドメインは、検
出可能遺伝子上の結合部位を認識するDNA結合ドメインを含み、アミノ酸配列の第２ドメインは、転写活性化又は抑制ドメインを含む。

【０１０５】上記の一般化された方法では、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。こ
の方法の実行においては、第１及び／又は第２タンパク質は、細菌タンパク質、
ウイルスタンパク質、癌遺伝子コード（oncogen-encoded）タンパク質、生長因子又は酵素から誘導され得る。第２ハイブリッドタンパク質はまた、ゲノムDNA 、cDNA、又は第２アミノ酸ドメインをコードするDNA配列に融合された合成的に作り出されたDNA配列から誘導されるDNA挿入物を含むプラスミドのライブラリー
上にコードされ得る。第３タンパク質又はタンパク質グループは、ゲノムDNA、c
DNA、又は第３アミノ酸ドメインをコードするDNA配列に融合された合成的に作り
出されたDNA配列から誘導されるDNA挿入物を含むプラスミドのライブラリー上に
コードされ得る。

【０１０６】本発明の方法はまた、タンパク質以外の分子の相互作用の阻害又は増強を評価
するためにも利用できる。相互作用する分子は、転写アクチベーター又はリプレ
ッサーの別個のドメイン（DNA結合ドメイン及び転写活性化又は転写抑制ドメイン）に融合され得る。あるいは、相互作用する分子は、互いに十分に接近させら
れたときに、検出可能シグナルを発生できる分子に融合され得る。2個以上の分子を一緒に連鎖又は結合させるためのあるリンカー、及び／又は分子をタンパク
質に連鎖させるためのリンカーは、当業界で公知である（実施例）。相互作用す
る分子のこれらのドメイン又は分子への連鎖又は結合は、２つの相互作用する分
子が相互作用するときに、上記のような、検出可能遺伝子の発現を活性化若しく
は抑制できる、又は検出可能シグナルそれ自身を作り出すことができるハイブリ
ッド分子を与える。ハイブリッド分子は、宿主細胞中に導入される。次いで、第
３タンパク質又はタンパク質グループのライブラリーが、タンパク質をコードす
る遺伝子若しくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子の導入、又はタンパク
質それ自身、複合タンパク質の発現を介して生産される分子（例えば、遺伝子ク
ラスター若しくは経路の発現を介して生産される分子）、若しくは、組み合わせ
化学技術を介して生産される分子などの、評価されることが望まれる分子の導入
のいずれかによって同じ宿主細胞中に導入される。次いで、相互作用する分子の
間の相互作用の増強又は阻害は、検出可能分子の遺伝子発現に関する効果、又は
上記のような、検出可能分子の存在によって評価できる。

【０１０７】本発明の方法を使用したクローンのFACSスクリーニングは、1997年6月16日出願の米国特許出願第号に記載されているように行うことができる。本発明
の方法で利用される任意の検出可能分子を検出できる検出器を利用する他の装置
を使用できる。そのような装置は、これらに限定されないが、多様な高性能細胞
仕分け器、ロボット機器、及び経過期間に亘って単一分子からの蛍光を実質的に
測定できる時間−分解（time-resolved）蛍光機器を含む。

【０１０８】好ましい生物活性の回収スクリーニング後、目的の活性を潜在的にコードする組換えDNAが利用される場合に陽性のクローンを回収し、当業界で周知の技術を利用して陽性クローンか
らDNAを単離する。次いで、このDNAは、任意の当業界で公知の種々の増幅技術を
利用してin vivo又はin vitroのいずれかで増幅できる。in vivo増幅は、クロー
ン（類）又はクローンのサブクローン（類）の生存可能な宿主中への形質転換、
次いで宿主の増殖を含むだろう。In vitro増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応などの
技術を使用して行うことができる。

【０１０９】次いで、特定の活性を有すると同定されたクローンは、特定の活性を有する生
物活性をコードするDNA配列を特定するために配列決定できる。このように、本発明に従えば、(i)特定活性を有する生物活性をコードするDNA、(ii)（そのアミ
ノ酸配列を含む）そのような活性を含む生物活性及び(iii)そのような活性を有する組換え分子生産物を単離し同定することが可能である。

【０１１０】進化（evolution）新規な生物活性化合物の発見の組換えアプローチによって与えられる１つの利
点は、経路サブユニットを操作して、改変された特異性を有する変異体を生産及
び選択する能力である。経路サブユニットは置換でき、個々のサブユニットは、
得られた異なる活性を有する生物活性分子の選択のために、下記の方法を利用し
て進化され得る。

【０１１１】スクリーニングが行われた生物活性を有することが見出されたクローンは、指
定突然変異誘発に付され、より好ましい特性を有する新しい生物活性を発達させ
るか、又は熱又は有機溶媒に対する安定性などの、野生型活性には存在しないか
、若しくは殆ど目立たない特に望ましい特性を有する改質された生物活性を発達
させることができる。任意の指定突然変異誘発の公知技術が、本発明に適用でき
る。例えば、本発明に従う使用のための特に好ましい突然変異誘発技術は、下記
に記載のものを含む。

【０１１２】語句「誤りがちのPCR」とは、DNAポリメラーゼの複写忠実性が低く、それ故、
PCR産物の全長に沿って、高い率で点突然変異が得られる条件下でPCRを実行する
方法をいう。Leung, D. W.ら, Technique, 1:11-15 (1989)及びCaldwell, R. C.
及びJoyce, G. F., PCR Methods Applic., 2:28-33 (1992)。

【０１１３】語句「オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発」とは、目的の任意のクローン化
されたDNAセグメント中での位置指定突然変異を起こさせる方法をいう。Reidhaa
r-Olson, J. F.及びSauer, R. T.ら, Science, 241:53-57 (1988)。語句「アッセンブリ（assembly）PCR」とは、小さなDNA断片の混合物からのPC
R産物のアッセンブリを含む方法をいう。１つの反応の産物が、もう１つの反応の産物のプライマーとなって、多数の異なるPCR反応が、同じバイアル中で平行して起こる。

【０１１４】語句「性的PCR突然変異誘発」（「DNAシャッフリング」としても知られている
）とは、配列相同性に基づいてDNA分子の無作為断片化、次いでPCR反応中のプラ
イマー伸長による乗換えの固定によって引き起こされる、異なっているが、in v
itroで高度に関連したDNA配列からなるDNA分子の間の強制的相同組換えをいう。
Stemmer, W. P., PNAS, USA, 91:10747-10751 (1994)。

【０１１５】語句「in vivo突然変異誘発」とは、1個以上のDNA修復経路において突然変異を有する大腸菌株中のDNAのプロポゲーション（propogation）を含む、目的の任
意のクローン化されたDNA中での無作為突然変異を作り出す方法をいう。これらの「ミューテーター」株は、野生型親よりも高い無作為突然変異率を有する。こ
れらの株の１つにおけるDNAのプロポゲーションは、最終的には、そのDNA中で無
作為突然変異を作り出すだろう。

【０１１６】語句「カセット突然変異誘発」とは、２本鎖DNA分子の小さな領域を、天然の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置換する任意の方法をい
う。このオリゴヌクレオチドは、しばしば、無作為化された天然配列を完全に及
び／又は部分的に含む。

【０１１７】語句「帰納的（recursive）アンサンブル突然変異誘発」とは、そのメンバーがアミノ酸配列において異なる表現型的に関連する突然変異体の多様な集団を製
造するために発展したタンパク質工学（タンパク質突然変異誘発）のためのアル
ゴリズムをいう。この方法は、組み合わせカセット突然変異誘発の連続したラウ
ンドを制御するためのフィードバック機構を使用する。Arkin, A. P.及びYouvan
, D. C., PNAS, USA, 89:7811-7815 (1992)。

【０１１８】語句「指数的アンサンブル突然変異誘発」とは、高いパーセンテージで独特で
機能性の突然変異体を有する組み合わせライブラリーを生産する方法であって、
各改変部分で、機能性タンパク質（Delegrave, S.及びYouvan, D. C., Biotechn
ology Research, 11:1548-1522 (1993)）；並びに無作為及び位置指定突然変異誘発（Arnold,F.H.,Current Opinion in Biotechnology,4:450-455(1993)）に導
くアミノ酸を同定するために、残基の小さなグループが平行して無作為化される
方法をいう。

【０１１９】上記の全ての文献は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み入
れられる。これらの技術のそれぞれは、記載された文献中に詳細に記載されてい
る。本発明の方法を利用して同定された好ましい分子をコードするDNAを、任意の1
以上のこれらの技術を利用して突然変異誘発、又は「進化」させることができ、
そしてより好ましいクローンを同定するために本発明の方法を利用して再スクリ
ーニングすることができる。

【０１２０】下記実施例によって本発明を説明するが、それらは本発明を決して制限するも
のではない。〔実施例〕（実施例１）サンプル採集ライブラリー生産のための下流の核酸単離のために利用されるサンプルは、下
記実施例に従って採集できる：下記のものは、同時に集団の真核メンバーの増殖を阻害しつつ、細菌種及び始
原種の選択的in situ濃縮方法を代表する。

【０１２１】 in situ濃縮は、表面上に被覆された、周囲環境マトリックスのメンバーを選択的に引き寄せる意図で、増殖基質及び栄養補充剤（amendment）からなるトラップを使用することによって達成される。基質（炭素供給源）及び栄養補充剤（
すなわち、窒素、リンなど）の選択は、濃縮を望む集団のメンバーに依存する。
真核メンバーに対する選択試薬は、トラップにも添加される。さらに、その正確
な組成は、濃縮が望まれる集団のメンバー及び阻害が望まれる集団のメンバーに
依存するだろう。基質は、モノマー及びポリマーを含む。グルコサミン、セルロ
ース、ペンタン酸又は他の酸、キシラン、キチン等のモノマー基質は、あるタイ
プの細菌の誘引力を利用することができる。ポリマーも、それを分解できる細菌
を誘引するために使用できる。集団から特定メンバーを引き抜くのに有用であり
得る幾つかの濃縮培地を、下記に記載する：

【０１２２】１．菌類及び顕微鏡的真核生物に対する生物活性化合物の添加：集団の真核メンバーの増殖は、ナイスタチン、シクロヘキシミド、及び／又は
ピマリシンなどの1以上の商業的に入手可能な化合物の使用によって阻害できる。これらの化合物は、粉末として振りかけるか、又は細菌学（bug）トラップ培地中に液体として組み込むことができる。

【０１２３】２．他の細菌種に対する生物活性化合物の添加：ある細菌種の増殖を阻害するが、他の種は阻害しない化合物（すなわち、ポリ
ミキシン、ペニシリン、及びリファンピン）は、濃縮培地中に導入できる。この
化合物の使用は、濃縮が望まれる細菌集団のメンバーに依存する。例えば、スト
レプトミセス属の大部分は、ポリミキシン、ペニシリン、及びリファンピンに感
受性であるが、これらは、耐性のファミリーの希少メンバーの濃縮に使用できる
。選択試薬も、集団の始原メンバーの濃縮に使用できる。

【０１２４】３．選択試薬としての炭素供給源の使用：任意の特定炭素供給源は、集団のあるメンバーによっては利用できるが、他の
メンバーには利用できない。このように、炭素供給源の選択は、濃縮が望まれる
集団のメンバーに依存する。例えば、ストレプトミセタレス属（Streptomycetal
es）のメンバーは、セルロース、キチン、及びリグニンなどの複合、重合性基質
を利用する傾向がある。これらの複合基質は、他の属によっても利用されるが、
殆どの細菌には利用できない。これらの複合基質は、真菌によって利用され、上
記のように抗真菌剤の使用を必要とする。

【０１２５】４．窒素供給源の添加：追加的な窒素供給源の使用は、炭素供給源の選択に依存して必要とされ得る。
例えば、キチンは、そのC：N比が釣り合っているが、セルロースは釣り合ってい
ない。セルロース（又は他の炭素が豊富な基質）の利用を強化するためには、硝
酸塩又はアンモニアなどの窒素供給源を添加することが、しばしば有用である。

【０１２６】５．微量元素の添加：一般に、環境マトリックスは、微量元素の良好な供給源になる傾向があるが、
ある環境では、その元素が制限的であり得る。微量元素の添加は、集団のあるメ
ンバーの成長を増強するが、他のメンバーでは阻害する。ガラスビーズ又はシリカエーロゲルなどの、大表面積素材は、本実施例で表面
として利用できる。これは、基質−表面コンジュゲートの複数コレクションを保
持する比較的小さな装置中に採集される高い細菌濃度を可能にする。

【０１２７】ガラスビーズは、下記のように、N−アセチル B−D−グルコサミン−フェニルイソチオシアネートによって誘導できる（derivitized with）：ビーズ調製：ガラスビーズ（Biospec Products社製, Bartlesville, OK）30 mlを、APS／ト
ルエン（10％ APS）（Sigma Chemical Co.社製）50 mlと混合する。一晩還流する。デカントし、トルエンで3回洗浄する。エタノールで3回洗浄し、オーブン中で乾燥する。

【０１２８】下記のようにN−アセチル B−D−グルコサミン−フェニルイソチオシアネートにより誘導する：ファルコンチューブ中で混合する：上記で調製したガラスビーズ25 ml 0.1M NaHCO₃ 15 ml ＋ N−アセチル B−D−グルコサミン−PITC（Sigma Chem
ical Co.社製）25 mg ＋ DMSO 1 ml NaHCO₃ 10 ml ＋ DMSO 1 mlを添加する。ガラスビーズ上に注ぐ。ファルコンチューブ中で一晩振とうする。 0.1M NaHCO₃ 20 mlで洗浄する。 ddH₂O 50 mlで洗浄する。 55℃で1時間乾燥する。

【０１２９】次いで、ビーズは、ビーズを封じ込め、同時に細菌を移動できるように作られ
たメッシュフィルター「バッグ」（Spectrum社製, Houston, Texas）に置くこと
ができ、次いで、バッグを封じ込める固体支持体として使用される任意の装置中
に置かれる。特に好ましい装置は、プレキシガラスなどの、不活性素材からなる
。あるいは、ビーズは、直接、針を使用して穴を開けたファルコンチューブ（VW
R、Fisher Scientific社製）中に置くことができる。次いで、これらの「封じ込
め」装置は、望ましい細菌を誘引及び増殖させる期間、所望のバイオトープ中に
展開（deploy）させる。

【０１３０】下記のプロトコールは、単純な「バッグトラップ」を生産する１つの方法を詳
述する： 15 mlのファルコンチューブ（VWR、Fisher Scientific社製）に、加熱した針又は他の先の尖った装置を使用して穴を開ける。誘導されたビーズ約1〜5 mlを、メッシュ孔70 m、開口面積43％、及び厚さ70
mを有するスペクトラム（Spectrum）社製（ヒューストン、テキサス州）から入手可能なものなどの、スペクトラ（Spectra）／メッシュナイロンフィルター中に置く。ナイロンフィルターをシールし、例えば、グープ（Goop）（Houshold A
dhesive & Sealant社製）を使用して、ビーズを含む「バッグ」を作る。ビーズを含むフィルターを通気したファルコンチューブ中に置き、チューブを
所望のバイオトープ中に一定期間（通常は、数日）展開させる。

【０１３１】（実施例２）培養生物からのDNA単離及びライブラリー構築下記に、単離されたストレプトマイセス・リモサス（Streptomyces rimosus）
から遺伝子ライブラリーを生産するために使用される手順を概説する。

【０１３２】DNAの単離１．250 mlの回り止めされた（baffled）エーレンマイヤーフラスコ中のトリプチカーゼダイズ培養液（Trypticase Soy Broth）（BBL Microbiology Systems社
製）25 mlに、ストレプトマイセス・リモサスの胞子を接種する。30℃、250 rpm
で48時間インキュベートする。２．遠心分離によってマイセリン（mycelin）を採集する。50 mlの円錐チューブ
を使用し、25℃、4000 rpmで10分間遠心分離する。

【０１３３】３．上清をデカントし、10.3％ショ糖10 mlでペレットを2回洗浄する（洗浄の間
に上記のように遠心分離する）。４．将来の使用のために、ペレットを−20℃で貯蔵する。５．リゾチーム（1 mg/ml；Sigma Chemical Co.社製）を含むTE（10mMトリス、1
mM EDTA；pH 7.5）40 ml中にペレットを再懸濁し、37℃で45分間インキュベート
する。

【０１３４】６．サルコシル（N−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Sigma Chemical Co. 社製）を加えて、最終濃度を1％ととし、緩やかに転倒させて、数回混合する。７．調製物20 mlをきれいなチューブに移し、プロテイナーゼK（Stratagene Clo
ning Systems社製）を加え、最終濃度を1 mg/mlとする。50℃で一晩インキュベートする。８．（TEで飽和した）フェノールで2回抽出する。９．フェノール：CH₃Clで1回抽出する。１０．CH₃Cl：イソアミルアルコールで1回抽出する。

【０１３５】１１．2倍容量のエタノールでDNAを沈殿させる。１２．シールされたパスツールピペット上にDNAを巻き付ける。１３．70％エタノールですすぐ。１４．空気中で乾燥する。１５．TE 1 ml中にDNAを再懸濁し、4℃で貯蔵してゆっくりと再水和する。１６．DNA濃度を測定する（A₂₆₀−A₂₈₀）。

【０１３６】 A．製造者用プロトコールに従って、EcoRI制限酵素（Stratagene Cloning Syste
ms社製）でDNA 10リットルを消化し、DNA消化物を0.5％アガロース、20Vで一晩電気泳動し；1g/ml臭化エチルでゲルを染色する。１．DNA濃度を測定する（A₂₆₀−A₂₈₀）。

【０１３７】DNAの制限消化１．下記のものを37℃で3時間インキュベートする： DNA 8リットル（〜10 g） H₂O 35リットル 10ｘ制限酵素バッファー5リットル EcoRI制限酵素（200単位）2リットル２．アガロースミニゲルについての試験

【０１３８】ショ糖勾配１．小さなショ糖勾配（Sambrook, Fritsch及びManiatus, 1989）を調製し、DNA
を25℃、45,000 rpmで4時間にかける（run）。２．0.8％アガロースゲル上の各画分5リットルを試験する。３．適当な画分をプールし、2.5倍容量のエタノールで−70℃で1時間、DNAを沈殿させる。４．13,200 rpm、15分間の遠心分離でDNAを採集する。５．デカントし、70％エタノールで洗浄する。６．乾燥させ、5T1E 15リットルに再懸濁させる。７．4℃で貯蔵する。

【０１３９】DNAの脱ホスホリル化１．製造者用プロトコール（US Biochemicals社製）に従って、小エビアルカリ性ホスファターゼでDNAを脱ホスホリル化する。

【０１４０】アダプター連結反応１．製造者用プロトコールに従って、アダプターを連結する。 EcoRI I−BamHIアダプター（Stratagene Cloning Systems社製）中にDNAを手短に、緩やかに再懸濁し；10倍量の連結反応バッファー、10mM rATP、及びT4 D
NAリガーゼを添加し、室温で4〜6時間インキュベートする。

【０１４１】フォスミドアーム（Fosmid arm）の調製１．フォスミドアームは、（Kimら, Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 1992 ）記載のように調製できる。プラスミドDNAは、製造者用プロトコールに従って、PmeI制限酵素（New England Biolabs社製）で消化し、脱ホスホリル化（Sambr
ook, Fritsch及びManiatus, 1989）し、次いで、製造者用プロトコールに従って
、BamH I制限酵素（New England Biolabs社製）で消化し、それぞれが35〜45 kb
pの間の連結DNAのクローニング及びパッケージングに適した方向でcos部位を含む、２つのアームを生産する、もう１つの脱ホスホリル化工程を行うことができ
る。 A．

【０１４２】フォスミドアームへの連結１．連結反応物を調製する： A．挿入DNA及びベクターDNAそれぞれ〜50 ngを、製造者用指示書により、T4 DNA
リガーゼ（Boehringer Mannheim社製）1単位及び10倍量のリガーゼバッファーを
添加し；必要に応じてH₂Oを添加して、総容量10リットルとする。１．16℃で一晩インキュベートする。

【０１４３】パッケージング（package）及びプレーティング（plate） I．製造者用プロトコールに従い、ギガパック（Gigapack）XLパッケージングシステム（Stratagene Cloning Systems, Inc.社製）を使用して連結反応物をパッ
ケージングする。 II．製造者用プロトコールに従い、大腸菌株DH10B（Bethesda Research Laborat
ories, Inc.社製）を感染させ、LB／クロラムフェニコールプレート（Sambrook,
Fritsch及びManiatus, 1989）上に播く。

【０１４４】（実施例３）非培養原核生物DNAライブラリーの調製図1は、混合ピコプランクトンサンプル由来の環境ライブラリー構築に使用する手順の概要を示す。ゴールは、ピコプランクトンゲノムDNAを代表する安定で、大きな挿入物DNAライブラリーを構築することであった。

【０１４５】細胞採集及びDNA調製オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノルルまでの海洋クルージングで採集
したサンプルから、濃縮ピコプランクトン細胞を含むアガロースプラグ（plugs ）を調製した。海水（30リットル）をニスキン瓶（Niskin bottles）に採取し、
10 mニテックス（Nitex）によって選別し、分子量30,000カットオフのポリスルホンフィルターによる中空繊維濾過器（Amicon DC10）によって濃縮する。濃縮された細菌プランクトン細胞を0.22 m、47 mmのデュラポア（Durapore）フィルター上で採集し、2倍量のSTEバッファー（1M NaCl, 0.1M EDTA, 10 mMトリス, p
H 8.0）1 ml中に再懸濁して、最終濃度約1 X 10¹⁰細胞／mlとした。この細胞懸濁液を、40℃に冷却された1％融解シープラーク（Seaplaque）LMPアガロース（F
MC）1容量と混合し、次いで、直ちに1 mlの注射器中に吸引した。注射器をパラフィルムで封じ、10分間氷の上に置いた。細胞含有アガロースプラグを、リシス
（Lysis）バッファー（10mMトリス、pH 8.0, 50mM NaCl, 0.1M EDTA, 1％サルコ
シル(Sarkosyl), 0.2％デオキシコール酸ナトリウム, a mg/mlリゾチーム）中に
押し出し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、このアガロースプラグを、ESPバッファー（0.5M EDTA中、1％サルコシル, 1 mg/mlプロテイナーゼK）40
mlに移し、55℃で16時間インキュベートした。この溶液をデカントし、新しいES
Pバッファーで置換し、55℃でさらに1時間インキュベートした。次いで、アガロ
ースプラグを、50mM EDTA中に置き、海洋クルージング期間中船上で4℃で貯蔵し
た。

【０１４６】オレゴン沿岸沖で採取したサンプルから調製したアガロースプラグ（72リット
ル）の部分（slice）を、2 mlのミクロ遠心チューブ中で、バッファーA（100mM
NaCl, 10mMビストリスプロパン−塩酸(Bis Tris Propane-HCl), 100 g/mlアセチ
ル化BSA：pH 7.0、25℃で）1 mlに対して4℃で一晩透析した。この溶液を、10 m
M MgCl₂及び1 mM DTTを含む新たなバッファーA250リットルで置換し、ロッキングプラットフォーム（rocking platform）上、室温で1時間インキュベートした。次いで、この溶液を、Sau3A 1（NEB社製）4単位を含む同じバッファー250リッ
トルに交換し、水浴中37℃で平衡にし、次いで、ロッキングプラットフォーム上
37℃のインキュベーター中で45分間インキュベートした。プラグを、1.5 mlのミ
クロ遠心チューブに移し、68℃で30分間インキュベートしてタンパク質、例えば
、酵素、を不活性化し、アガロースを解かした。このアガロースを消化し、製造
者用推奨法に従い、それぞれゲラーゼ（Gelase）及びHK−ホスファターゼ（Epic
entre社製）を使用して、DNAを脱ホスホリル化した。緩和なフェノール／クロロ
ホルム抽出によってタンパク質を除去し、DNAをエタノール沈殿させ、ペレット化し、次いで、70％エタノールで洗浄した。この部分的に消化されたDNAを滅菌H ₂ O中に再懸濁し、pFOS1ベクターへの連結のために、濃度を2.5 ng／リットルとした。

【０１４７】幾つかのアガロースプラグ（データは示していない）からのPCR増幅結果は、著しい量の始原DNAの存在を示した。オレゴン沿岸沖200メートルの深さで採取さ
れた、１つのサンプルから抽出されたrRNAを使用した定量的ハイブリダイゼーシ
ョン実験は、このサンプル（このアッセンブリッジ（assemblage）は、総ピコプ
ランクトンバイオマスの約4.7％を含んでいた）中のプランクトン性始原種が、D
eLongら（high abundance of Archaea in Antarctic marine picoplankton, Nat
ure, 371:695-698, 1994）の表１中の「PACI」−200 mに対応していることを示した。アガロースプラグ溶解物に関して行った始原菌偏向（archaeal-biased）r
DNA PCR増幅から得られた結果は、このサンプル中に比較的多量の始原DNAが存在
することを確認した。このピコプランクトンサンプルから調製したアガロースプ
ラグを、続くフォスミドライブラリー調製のために選択した。この部位からのア
ガロースプラグ各1 mlは、約7.5 x 10⁵個の細胞を含んでおり、従って約5.4 x 1
0⁵個の細胞が、部分消化DNAの調製に使用された72リットルの部分（slice）中に
存在した。

【０１４８】ベクターアームを、（Kimら, Stable propagation of cosmid sized human DN
A inserts in an F factor based vector, Nucl. Acids Res., 20:10832-10835,
1992に）記載されているように調製する。簡単に説明すると、プラスミドを、A
stIIで完全に消化し、HKホスファターゼで脱ホスホリル化し、次いで、BamHIで消化して、それぞれが35〜45 kbpの間の連結DNAをクローニング及びパッケージングするのに適した方向でcos部位を含む、２つのアームを生産する。部分的に消化されたピコプランクトンDNAを、ベクター及び挿入物の各25 ng並びにT4 DNA
リガーゼ（Boehringer-Mannheim社製）1単位を含む連結反応物15リットル中でpF
OS1アームに一晩連結させる。この反応物の4μl中の連結DNAを、ギガパックXLパ
ッケージングシステム（Stratagene社製）、大腸菌株DH10B（BRL社製）にトラン
スフェクションされたフォスミド粒子、及びLB_cm15プレート上に播かれた細胞を
使用してin vitroでパッケージングする。得られたフォスミドクローンを、7％グリセロールによって補完されたLB_cm15を含む96穴マイクロリットル皿上に拾い
上げる。それぞれ約40 kbのピコプランクトンDNA挿入物を含む組換えフォスミド
は、クローン化DNAの約1.4 x 10⁸個の塩基対を含む、3,552個のフォスミドクローンからなるライブラリーを与えた。試験した全てのクローンは、38〜42 kbpの
範囲の挿入物を含んでいた。このライブラリーを後の分析のために−80℃で凍結
貯蔵する。

【０１４９】（実施例４）環境サンプル由来のDNAの正規化（normalization）ライブラリー生産の前に、環境サンプル由来の精製されたDNAを正規化できる。DNAは、下記のプロトコールに従って最初に分画される。

【０１５０】ゲノムDNAからなるサンプルを、塩化セシウム勾配で精製する。塩化セシウム（Rf=1.3980）溶液を、0.2 mフィルターで濾過し、その15 mlを、35 mlのオプテ
ィシール（OptiSeal）チューブ（Beckman社製）にかける。DNAを添加し、十分に
混合する。ビス−ベンズイミド（Sigma；Hoechst 33258）10μgを添加し、十分に混合する。次いで、このチューブを濾過された塩化セシウム溶液で満たし、ベ
ックマンL8-70超遠心分離機中のVTi50ローターで、33,000 rpmで72時間回転する
。遠心分離後、注射筒ポンプ及び分画器（Brandel Model 186）を使用して280 n
mに設定されたISCO UA-5 UV吸収検出器によって勾配を駆動する。環境サンプル中に存在する生物由来のDNAを示すピークが得られる。

【０１５１】次いで、下記のように正規化を達成する： I．２本鎖DNAサンプルをハイブリダイゼーションバッファー（0.12 M NaH₂PO₄,
pH 6.8／0.82 M NaCl／1 mM EDTA／0.1％SDS）中に再懸濁する。 II．サンプルを鉱物油でオーバーレイし、10分間煮沸して変性させる。 III．サンプルを68℃で12〜36時間インキュベートする。 IV．２本鎖DNAを標準プロトコール（Sambrook, 1989）に従い、ハイドロキシアパタイト上で60℃で１本鎖DNAから分離する。 V．１本鎖DNA画分を脱塩し、PCRによって増幅する。このプロセスをもう数回（5回以上まで）繰り返す。

【０１５２】（実施例５）原核生物中で生産されたライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング及び代謝的にリッチな宿主中での発現スクリーニング任意のフォスミドベクターでの上記実施例3記載のプロトコールに従って生産されたライブラリー由来のフォスミドクローンに関してハイブリダイゼーション
スクリーニングを行うことができる。例えば、pMF3ベクターは、大腸菌中で能率
的であるが安定なクローニングに使用でき、ストレプトマイセス・ケリコロール
（Streptomyces coelicolor）又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomy
ces lividans）中に組み込むことができ、安定に維持できるフォスミド系ベクタ
ーである。上記プロトコールに従って生産されたpMF3ライブラリーは、最初に大
腸菌DH10B中に形質転換される。tcm又はoxyを含むクロラムフェニコール耐性形質転換体は、以前に公表されたoxy及びtcm遺伝子の配列から設計された配列を使
用したコロニーハイブリダイゼーションによってライブラリーをスクリーニング
することによって同定される。｝(27,｝28)コロニーハイブリダイゼーションスクリーニングは、「Molecular Cloning」、A Laboratory Mannual, Sambrookら,
(1989) 1.90-1.104に詳細に記載されている。ハイブリダイゼーションによって
陽性となるコロニーを精製でき、それらのフォスミドクローンを制限消化及びPC
Rによって分析して、それらが完全な生合成経路を含んでいることを確認することができる。（図6を参照されたい。）

【０１５３】あるいは、上記フォスミドコロニー由来のDNAは、経路全体が陽性のコロニーを同定するために設計された増幅反応で使用できる。例えば、下記の配列は、１
つのフォスミドクローン上に潜在的にコードされた34 kbp DNA上に存在する、抗
生物質グラミシジンをコードする経路（グラミシジンオペロン）を増幅するため
の増幅反応で使用できる。

【０１５４】プライマー：

【０１５５】増幅反応： 1リットルフォスミド／挿入物DNA 5リットル各プライマー（50 ng/l） 1リットルベーリンガー・マンハイム・エクスパンド（Boehringer Mannheim EXPAND）キットのポリメラーゼ 1リットル dNTP 5リットル 10倍量のベーリンガー・マンハイム・エクスパンドキットのバッファー#3 30リットル ddH₂O

【０１５６】PCR反応プログラム 94℃ 60秒次の20サイクル： 94℃ 10秒 65℃ 30秒 68℃ 15分次の1サイクル： 68℃ 7分 4℃で貯蔵

【０１５７】次いで、DNA配列をコードするオキシテトラサイクリン又はテトラセノマイシンポリケタイドを含むことが示されているクローン由来のフォスミドDNAを用いて実施例6からのエス・リビダンス TK24 Dactプロトプラストを形質転換する。再生プレートをハイグロマイシン（pMF5）でオーバーレイすることによって、形
質転換体を選択する。耐性形質転換体は、形質転換プレートを試験生物である大
腸菌又は枯草菌の細胞を含む栄養ソフト寒天2 mlでオーバーレイすることによっ
て生物活性をスクリーニングする。大腸菌は、pMF3クローンのオーバーレイに使
用されるチオストレプトン濃度（50 mg/ml）には耐性であるが、5 mg/ml濃度のオキシテトラサイクリンには感受性である(29)。枯草菌試験株は、pHT315が有す
るチオストレプトンマーカーによる形質転換によってスクリーニングする前に、
チオストレプトンに耐性にする(30)。生物活性は、エス・リビダンスコロニー周
辺の特定試験株の増殖阻害によって証明される。生物活性を確認するために、活
性であると推定されるコロニーを単離し、適度に極性の溶媒、メタノールを使用
して培養物を抽出する。クローン発酵培養液によって1：1の比率でメタノールを
添加して抽出物を調製し、次いで、4℃で一晩振とうする。次いで、水相中の細胞の残骸及び培地固体を遠心分離によって分離する。溶媒相中で組換えによって
発現された化合物を回収し、必要に応じて濃縮又は希釈することができる。クロ
ーンの抽出物を、0.25インチのフィルターディスク上に等分し（aliquoted）、溶媒を蒸発させ、次いでアッセイ生物を含むオーバーレイ表面に置く。適当な温
度でインキュベートした後、透明ゾーンの直径を測定し、記録する。真正なオキ
シテトラサイクリン及びテトラセノマイシンをスタンダードとして使用する、ダ
イオードアレー（array）HPLCを使用して、組換えクローン由来のこれらの抗生物質の発現を確認できる。

【０１５８】染色体組込経路の救出（rescue）スクリーニングによって同定された染色体組込経路の配列分析は、生物活性分
子の確認で行うことができる。試験生物に対して生物活性を示すエス・リビダン
スクローンからのフォスミドDNAの救出のための１つのアプローチは、pMF3などの、IS117を含むプラスミドベクターが、10〜30個の染色体当たり1個の頻度で循
環中間体として存在するという観察に基づくものである(31)。推定上の陽性クロ
ーンは、培養培地25 ml中で増殖でき、プラスミドDNAは、標準アルカリ性分解手
順によって単離できる。次いで、プラスミドDNA調製物（preps）を使用して、大
腸菌を形質転換し、形質転換体は、クロラムフェニコール（15 mg/ml）を含むLB
上へのプレーティングによるCm^rで選択される。大腸菌Cm^r形質転換体由来のフォ
スミドDNAは、制限酵素消化分析、PCR、及びDNAシークエンシングによって単離及び分析する。

【０１５９】（実施例６）原核生物中の他の分子の相互作用に影響を与える化合物の遺伝子ライブラリースクリーニング実施例２及び３に従って生産された大きな挿入物ライブラリーは、下記の方法
を使用して他の分子の相互作用に影響を与える化合物でスクリーニングできる：

【０１６０】２つの相互作用するタンパク質をコードする遺伝子を、野生型及び突然変異体
LexA DNA結合ドメイン（突然変異体は、それ自身のオリゴメリゼーションドメイ
ンを欠く先端が切断された（truncated）LexAタンパク質であり、LexA408と呼ば
れる）に融合する。LexAは、それが二量体として作用する場合にのみ、大腸菌中
で有効な転写リプレッサーである。LexA二量化ドメインを、抑制を回復するため
の異種相互作用モチーフによって交換するために、この特性を使用する。ハイブ
リッドタンパク質の間の非共有結合相互作用は、先端が切断されたexAタンパク質（LexA408）のリプレッサー活性を回復させるそれらの能力によって判明する。

【０１６１】融合タンパク質の相互作用又は会合は、リポーター株（SU202）中の野生型半部位（half-site）及び突然変異半部位（op408/op+）を含むハイブリッドによっ
て制御されるリポーター遺伝子を使用して特異的に測定される。lacZリポーター
遺伝子は、sulAプロモーターをを使用するop408/op+ハイブリッドオペレーターの調節下にあり、その殆どが、天然のSOSプロモーターを厳重に抑制する。

【０１６２】上記由来の相互作用するタンパク質を含むSU202細胞は、上記実施例で生産されたものなどの、小さな分子を発現する遺伝子ライブラリーによって同時形質転
換される。次いで、細胞は、GFP発現でスクリーニングされ；タンパク質−タンパク質相互作用の阻害を示す。

【０１６３】（実施例７）真核生物中の他の分子の相互作用に影響を与える化合物の遺伝子ライブラリースクリーニング商業的に入手可能なツー−ハイブリッドシステムは、クロンテック・ラボラト
リース社（Clontech Laboratories）（パロアルト、カリフォルニア州）又はストラタジーン・クローニング・システムズ社（Stratagene Cloning Systems）（
ラジョラ、カリフォルニア州）から購入できる。相互作用するタンパク質をコー
ドする遺伝子は、提供されるベクター中にクローニングされ、提供される適当な
酵母株中に同時形質転換される。相互作用は、提供される方法を利用して確認で
きる。次いで、相互作用するタンパク質を含む細胞は、当業界で周知の方法を利
用して、上記実施例で生産されたものなどの、小さな分子を発現する遺伝子のラ
イブラリーによって形質転換される。次いで、細胞は、検出可能分子（β−ガラ
クトシダーゼ）の発現レベルの増加又は減少でアッセイされ、タンパク質−タン
パク質相互作用に関する効果が示される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の１つの方法を示しており、タンパク質-タンパク質または他の相互作用を増強または阻害する小分子についてスクリーニングする方法を示し
ている。DNA結合ドメインタンパク質および転写活性化ドメインタンパク質は、第１および第２の相互作用分子と会合している。第１の分子と第２の分子との相
互作用により、検出可能な遺伝子(GFP)の転写活性化が生じる。第３の分子をコードする遺伝子または遺伝子群を宿主細胞に導入し、第１の分子と第２の分子と
の相互作用に作用する能力について第３の分子を評価する。例えば、検出可能な
遺伝子の発現を変えるクローンをFACSによって分類し、経路クローンを単離して
特性決定することができる。

【図２】図２は、本発明の別の方法を示しており、タンパク質-タンパク質または他の相互作用を増強または阻害する小分子についてスクリーニングする方法を示して
いる。DNA結合ドメインタンパク質および転写抑制ドメインタンパク質は、第１および第２の相互作用分子と会合している。第１の分子と第２の分子との相互作
用により、検出可能な遺伝子(GFP)の転写抑制が促進される。第３の分子をコードする遺伝子または遺伝子群を宿主細胞に導入し、第１の分子と第２の分子との
相互作用に作用する能力について第３の分子を評価する。例えば、検出可能な遺
伝子の発現を変えるクローンをFACSによって分類し、経路クローンを単離して特
性決定することができる。

【図３】図３は、本発明の別の方法を示しており、タンパク質-タンパク質または他の相互作用を増強または阻害する分子についてスクリーニングする方法を示してい
る。シグナル分子、すなわち互いと充分に近位に存在する場合に検出可能なシグ
ナルを生成する分子が、第１および第２の相互作用分子と会合している。第１の
分子と第２の分子との相互作用により、検出可能なシグナルが生成する。第３の
分子をコードする遺伝子または遺伝子群を宿主細胞に導入し、第１の分子と第２
の分子との相互作用に作用する能力について第３の分子を評価する。例えば、検
出可能なシグナル分子の存在を変えるクローンをFACSによって分類し、経路クロ
ーンを単離して特性決定することができる。

【図４】図４は、本発明の別の方法を示しており、タンパク質-タンパク質または他の相互作用を増強または阻害する分子についてスクリーニングする方法を示してい
る。シグナル分子、すなわち互いと充分に近位に存在する場合に検出可能なシグ
ナルを生成する分子が、第１および第２の相互作用分子と会合している。第１の
分子と第２の分子との相互作用により、検出可能なシグナルが生成する。第３の
分子を宿主細胞に導入し、第１の分子と第２の分子との相互作用に作用する能力
について第３の分子を評価する。例えば、検出可能なシグナル分子の存在を変え
る分子をFACSによって分類できる。

【図５】図５は、天然環境より得た非培養微生物から大きいゲノム断片を捕捉し、クロ
ーニングし、保存するスキームを示す。この方法においては、40kbp(ホスミド) から100kbp以上(BAC)のものまで保存できるクローニングベクターを使用できる。

【図６】図６は、標識オリゴヌクレオチドプローブでプローブされた環境ホスミドクロ
ーンの高密度フィルターアレイを示す。2400のアレイ化クローンは、天然微生物
界からクローニングしたDNAを約9,600万塩基対含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:01） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｆターム(参考） 2G045 AA28 BB05 BB10 BB14 BB20 BB50 CB21 DA13 DA20 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 BA67 CA01 CA11 EA04 GA11 HA11 HA14 4B063 QA05 QA06 QA18 QQ05 QQ06 QQ15 QQ22 QQ26 QQ33 QQ35 QQ79 QQ98 QR08 QR33 QR62 QR75 QR80 QR83 QS25 QS34 4B064 AH19 CA02 DA02 DA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 DNA結合部と結合した第１の検査タンパク質と、転写活性化部と結合した第２の検査タンパク質との相互作用を調節する能力について化合物
を評価する方法であって、該化合物を、DNA結合部と結合した第１の検査タンパク質または転写活性化部と結合した第２の検査タンパク質と接触させ、DNA結合部と結合した第１の検査タンパク質と転写活性化部と共有結合した第２の検査タ
ンパク質との相互作用を調節する該化合物の能力を決定することを含み、該調節
によって検出可能なタンパク質の発現を増強または阻害することを特徴とする、
上記方法。
【請求項２】前記DNA結合部および前記転写活性化部が単一の転写アクチベーターに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記DNA結合部および前記転写活性化部が異なるタンパク質に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記検出可能なタンパク質が、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロラムフ
ェニカル(chloramphenical)アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記化合物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記タンパク質がポリヌクレオチドによってコードされてい
る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記ポリヌクレオチドが、発現ベクター中に機能しうる形で
連結されて含まれている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記化合物が生物活性分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記生物活性分子がポリケチドである、請求項８に記載の方
法。
【請求項１０】前記ポリケチドが、オペロンまたはその一部にコードされ
た、酵素的プロセスの産物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記オペロンまたはその一部が、発現ベクター中に機能し
うる形で連結されて含まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記オペロンまたはその一部が、非培養微生物に由来する
、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】前記非培養微生物が、陸生微生物の混合物、海生微生物の
混合物、または陸生微生物および海生微生物の混合物を含む、請求項１２に記載
の方法。
【請求項１４】前記非培養微生物が好極限性細菌（extremophile）である
、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】前記好極限性細菌が、好熱菌、超好熱菌、好冷菌、および
低温菌からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。