ES2908040T3

ES2908040T3 - Ratones con inserción génica para la producción de anticuerpos quiméricos

Info

Publication number: ES2908040T3
Application number: ES09818482T
Authority: ES
Inventors: Larry Green; Hiroaki Shizuya
Original assignee: Ablexis LLC
Current assignee: Ablexis LLC
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2022-04-27
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: US10561123B2; EP2346994B1; US20160222092A1; US20160219850A1; US10575504B2; WO2010039900A3; EP2346994A2; US20160222091A1; LT2346994T; CA2739038A1; NZ592308A; KR102362774B1; KR101826224B1; KR20110089846A; CA3038954A1; DK2346994T3; US20160222093A1; EP2346994A4; AU2009298458A1; US10555506B2

Abstract

Una célula de ratón competente para la recombinación homóloga que tiene un genoma que comprende (1) un segmento génico VH humano y (2) una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica, que comprende (a) una parte de los segmentos génicos de ratón cadena abajo de JH, (b) un dominio CH1 singénico reemplazado por un dominio CH1 humano, (c) un segmento génico de bisagra superior humana, (d) un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón, y en donde dicho segmento génico VH humano y dicho locus de la cadena pesada de Ig singénica reemplazan la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena, dando así como resultado un locus de la cadena pesada de Ig quimérica capaz de sufrir un reordenamiento génico y produciendo así un repertorio diversificado de anticuerpos quiméricos de manera que dicha célula comprende un genoma que codifica una cadena pesada de Ig quimérica.

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones con inserción génica para la producción de anticuerpos quiméricos

Antecedentes

Campo técnico

La presente invención está dirigida en general a la producción de mamíferos y células no humanas y cadenas de inmunoglobulina y anticuerpos quiméricos con inserción génica (knock-in).

Descripción de la técnica relacionada

Las terapias de enfermedades que utilizan anticuerpos monoclonales (AcM) han revolucionado la medicina y los fármacos basados en AcM ahora se utilizan en el tratamiento del cáncer, la autoinmunidad, la inflamación, la degeneración macular, infecciones, etc. Sin embargo, las tecnologías disponibles para la generación y el descubrimiento de AcM para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades y trastornos tienen inconvenientes significativos que incluyen ineficacia, ausencia o pérdida de potencia suficiente, ausencia o pérdida de especificidad y la inducción de una respuesta inmunitaria contra el AcM terapéutico. Los primeros intentos de utilizar AcM como agentes terapéuticos se vieron obstaculizados por la inmunogenia de la composición de aminoácidos murinos de los AcM. Cuando se administra a seres humanos, la secuencia de aminoácidos murinos provocó una respuesta de anticuerpos humanos antimurinos (HAMA, del inglés "human anti-mouse antibody") que redujo de manera drástica la potencia y la farmacocinética del fármaco y provocó reacciones alérgicas intensas y potencialmente mortales.

Los métodos adicionales para generar terapias de AcM incluyen AcM quimerizados (AcMq) creados a través de tecnología de ADN recombinante que combina un dominio variable procedente de ratón junto a una región constante humana. Otros métodos para generar anticuerpos implican la humanización in vitro de AcM para reducir aún más la cantidad de secuencia de aminoácidos murinos en un AcM terapéutico. Las tecnologías de visualización de anticuerpos desarrolladas para generar anticuerpos "totalmente humanos" in vitro todavía tienen que imitar adecuadamente el proceso natural de maduración de anticuerpos que ocurre durante una respuesta inmunitaria in vivo (véanse las pág. 1122-23, Lonberg, Nat. Biotech. (2005) 23:1117-1125). Los AcM desarrollados utilizando estos métodos pueden provocar una respuesta inmunitaria que puede reducir la eficacia y/o ser potencialmente mortal, y normalmente son un proceso costoso y que requiere mucho tiempo. Asimismo, durante los procesos moleculares inherentes a estos métodos, puede ocurrir pérdida de afinidad y desplazamiento del epítopo, reduciendo así la potencia e introduciendo cambios indeseables en la especificidad.

Se han genomanipulado ratones transgénicos para producir anticuerpos completamente humanos mediante la introducción de transgenes de anticuerpos humanos para reemplazar de manera funcional loci de inmunoglobulinas (Ig) de ratones inactivados. Sin embargo, muchos de estos modelos de ratones transgénicos carecen de componentes importantes en el proceso de desarrollo de anticuerpos, tales como suficiente diversidad en los genes a partir de los cuales se generan las regiones variables de anticuerpos, la capacidad de producir IgD (Loset et al., J. Immunol., (2004) 172:2925-2934), importantes elementos reguladores cis importantes para la recombinación de cambio de clase (CSR, del inglés "class switch recombination") o una región de control de locus (LCR, del inglés "locus control region") en 3' totalmente funcional (por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.049.426; y Pan et al., Eur. J. Immunol. (2000) 30:1019-1029). Algunos ratones transgénicos contienen cromosomas artificiales de levadura o miniloci humanos como transgenes integrados. Otros llevan transcromosomas que presentan varias frecuencias de inestabilidad mitótica y meiótica. Además, las regiones constantes completamente humanas de estos ratones transgénicos funcionan de manera subóptima debido a la reducción de la actividad junto con otros componentes endógenos y que actúan en trans del aparato de transducción de señales BCR, por ejemplo, Iga e Igp, y receptores Fc (FcR), en comparación con los ratones normales.

Los ratones también se han genomanipulado para producir anticuerpos quiméricos compuestos por dominios V humanos unidos a dominios C de ratón que permanecen completamente intactos, con las porciones completamente intactas y las modificadas que incluyen todo el ADN genómico cadena abajo del grupo génico J (véanse las patentes de EE. Uu . n.° 5.770.429 y 6.596.541 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2007/0061900). Las regiones V humanas de estos ratones se pueden recuperar y agregar a los genes de la región constante humana mediante métodos de biología molecular y expresar mediante métodos recombinantes para producir anticuerpos completamente humanos. Los anticuerpos de estos ratones pueden presentar reducción o pérdida de actividad, potencia, solubilidad, etc. cuando la región V humana se elimina del contexto de los dominios C de ratón con los que evolucionó y después se une a una región C humana para producir un anticuerpo completamente humano.

El documento WO 2007/117410 A2 describe construcciones transgénicas para expresar anticuerpos quiméricos y animales hospedadores no humanos transgénicos que portan dichas construcciones, en donde los anticuerpos quiméricos comprenden regiones variables humanas y regiones constantes del animal hospedador transgénico no humano.

El documento WO 1990/04036 A1 describe inmunoglobulinas quiméricas o totalmente extrañas obtenidas de células o líquidos corporales de un animal transgénico al que se ha insertado en su línea germinal material genético que codifica al menos parte de una inmunoglobulina de origen extraño o que puede reorganizarse para codificar un repertorio de inmunoglobulinas.

El documento US2007/0092505 A1 describe anticuerpos humanizados y preparaciones de anticuerpos producidos a partir de animales no humanos transgénicos.

El documento WO 2002/066630 A1 describe el uso de vectores de ADN grandes (LTVEC) para dirigir, a través de la recombinación homóloga, y modificar genes endógenos y loci cromosómicos en células eucariotas. En particular, se describe un ratón transgénico que produce anticuerpos híbridos que contienen regiones variables humanas (VDJ/VJ) y regiones constantes de ratón.

El documento US 2007/009957 A1 describe vectores de expresión utilizados para la expresión de bibliotecas Fab de ratón y la expresión de clones individuales para crear regiones constantes híbridas en las que porciones de regiones constantes de ratón se reemplazan con regiones constantes humanas.

El documento WO 2006/117699 A2 describe animales transgénicos y métodos para producir anticuerpos recombinantes humanos, humanizados o quiméricos.

El documento WO 2008/151081 A1 describe animales transgénicos que carecen de Ig endógenas y son capaces de producir anticuerpos transgénicos, así como métodos para producir los mismos.

Torres et al. (2007), Journal of Biological Chemistry 282(18), 13917-13927 describen que la región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina puede afectar a los parámetros cinéticos y termodinámicos de las interacciones de la región variable del anticuerpo con el antígeno. Torres et al. (2007), PLoS One, 2(12), e1310 describen que el intercambio de cadenas constantes de inmunoglobulina murina y humana afectó la cinética y la termodinámica de la unión al antígeno y la autorreactividad del anticuerpo quimérico.

Los métodos actuales para desarrollar un AcM terapéutico pueden alterar las funciones del anticuerpo, tales como la solubilidad, potencia y especificidad antigénica, que se seleccionaron durante las etapas iniciales del desarrollo. Asimismo, los AcM generados por los métodos actuales tienen el potencial de provocar una respuesta inmunitaria peligrosa tras la administración. Los ratones productores de anticuerpos humanos y quiméricos actuales carecen del contenido genético adecuado para funcionar correctamente, por ejemplo, diversidad genética, elementos reguladores cis, elementos reguladores que actúan en trans, dominios de señalización y estabilidad genética. Sería beneficioso desarrollar métodos y composiciones para la generación mejorada y el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos y que conserven la potencia y la especificidad durante el proceso de generación, descubrimiento, desarrollo y producción de anticuerpos sin provocar una respuesta inmunitaria, así como métodos para producir dichos anticuerpos. La presente invención proporciona una solución para generar dichos anticuerpos en animales transgénicos.

Breve sumario

La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere a células y mamíferos no humanos con inserción génica, anticuerpos, métodos, composiciones (incluidas las composiciones farmacéuticas), así como diversas realizaciones divulgadas en el presente documento.

Algunos aspectos de la invención se refieren a una célula de ratón competente para la recombinación homóloga que tiene un genoma que comprende (1) un segmento génico VH humano y (2) una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica que comprende

(a) una parte de los segmentos génicos de ratón cadena abajo de JH,

(b) un dominio CH1 singénico reemplazado por un dominio CH1 humano,

(c) un segmento génico de bisagra superior humana,

(d) un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón,

en donde dicho segmento génico VH humano y dicho locus de la cadena pesada de Ig singénica reemplazan la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena, dando así como resultado un locus de la cadena pesada de Ig quimérica capaz de sufrir un reordenamiento génico y produciendo así un repertorio diversificado de anticuerpos quiméricos de manera que dicha célula comprende un genoma que codifica una cadena pesada de Ig quimérica. En determinadas realizaciones, la porción comprende además una región de control de locus (LCR) en 3' o un fragmento funcional de la misma. En una realización, la célula comprende además un segmento génico DH humano. En otra realización, la célula comprende además un segmento génico DH de un mamífero. En una realización particular, el segmento génico DH se selecciona del grupo que consiste en ser humano, primate no humano, conejo, oveja, rata, hámster y ratón. En realizaciones particulares, el segmento génico DH es humano. En otra realización, el dominio CH1 humano comprende un solo segmento génico CH, por ejemplo, Cy1, Cy2 y Cy4.

La célula comprende un segmento génico de bisagra superior humana. En una realización relacionada, la célula comprende además un segmento génico de bisagra media humana. En realizaciones particulares, el segmento génico de bisagra humana es un segmento génico de bisagra de IgG4. En algunas realizaciones, la serina se sustituye por la prolina en la posición 229. En determinadas realizaciones preferidas, la cadena pesada de Ig quimérica es capaz de unirse a un FcR endógeno.

En determinadas realizaciones, la célula es una célula madre embrionaria de ratón.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir la célula descrita anteriormente que comprende un genoma que codifica una cadena pesada de Ig quimérica que comprende las etapas de producir un primer BAC que comprende un segmento génico VH humano; producir un segundo BAC que comprende una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica que comprende (a) una parte de segmentos génicos de ratón cadena abajo de JH, (b) un dominio CH1 singénico reemplazado por un dominio CH1 humano, (c) un segmento génico de bisagra superior humano, y (d) un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón; introducir el primer BAC en una célula de ratón competente en recombinación homóloga y reemplazar la totalidad o una porción de un segmento génico VH endógeno mediante recombinación homóloga; e introducir el segundo BAC en la célula y reemplazar la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena mediante recombinación homóloga, de modo que la célula comprenda un genoma que codifique una cadena pesada de Ig quimérica. En una realización, el primer o el segundo BAC comprende además un segmento génico JH humano.

En realizaciones particulares, el primer BAC comprende además una primera secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio cerca del extremo 3' del primer BAC, y el segundo BAC comprende además una segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio cerca del extremo 5' del segundo BAC. Una realización relacionada comprende además la etapa de expresar una recombinasa específica de sitio, en donde se elimina una secuencia intermedia entre la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio. En una realización particular, la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio son loxP o variantes de la misma, y la recombinasa específica de sitio es CRE. En otra realización, la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio son frt, y la recombinasa específica de sitio es flp.

En determinadas realizaciones relacionadas con un método para producir la célula de acuerdo con la invención, la etapa de introducción del segundo BAC se produce antes de la etapa de introducción del primer BAC.

Algunos aspectos de la invención se refieren a un anticuerpo quimérico que comprende una cadena ligera de Ig humana. Para este fin, se puede utilizar una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga que tiene un genoma que comprende un locus de la cadena ligera de Ig humana o una porción del mismo, en donde el locus de la cadena ligera de Ig humana reemplaza la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de Ig endógena, de manera que la célula comprende un genoma que codifica una cadena ligera de Ig humana o una porción de la misma. En una realización, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende una región variable de IgK humana. En una realización relacionada, el locus de la cadena ligera de Ig comprende además una región constante de IgK humana.

En otra realización más, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de IgA humana y una 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma. En una realización, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende todo el locus de IgA humana. En otra realización, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende segmentos génicos VA humanos y de 1 a 7 pares de segmentos génicos JA CA, en donde CA humano se reemplaza por CA singénico. En otra realización más, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende segmentos génicos VA humanos, de 1 a 7 segmentos génicos JA humanos y un solo segmento génico CA humano, en donde los segmentos génicos humanos se asemejan a una configuración de locus de IgA humana. En realizaciones particulares, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, es de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en ser humano, primate no humano y rata. En una realización, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, es humana. En realizaciones particulares, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, se une a NFKb. En una realización, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, es de ratón y se ha mutagenizado para restaurar la unión de NFKb. En otras realizaciones, la 3'LCR o un fragmento funcional de la misma, en el locus de IgA humana es una 3'LCR de IgK o un fragmento funcional de la misma.

La célula descrita anteriormente que comprende un genoma que codifica una cadena ligera de Ig humana o una porción de la misma, se puede producir con un método que comprende las etapas de producir un primer BAC que comprende un locus de la cadena ligera de Ig humana o una porción del mismo; introducir el primer bAc en una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga; y reemplazar un locus de la cadena ligera de Ig endógena o una porción del mismo, mediante recombinación homóloga, de manera que la célula comprende un genoma que codifica una cadena ligera de Ig humana o una porción de la misma.

En realizaciones particulares, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende una región variable de IgK humana. Una realización relacionada comprende además las etapas de producir un segundo BAC que comprende una región constante de IgK humana; introducir el segundo BAC en la célula; y reemplazar la totalidad o una porción de una región constante de IgK endógena.

En otra realización más, el primer BAC comprende además una primera secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio cerca del extremo 3' del primer BAC, y el segundo BAC comprende además una segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio cerca del extremo 5' del segundo BAC. En una realización relacionada, el método comprende además la etapa de expresar una recombinasa específica de sitio, en donde se elimina una secuencia intermedia entre la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio. En una realización particular, la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio son loxP o variantes de la misma, y la recombinasa específica de sitio es CRE. En otra realización, la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio son frt, y la recombinasa específica de sitio es flp.

En determinadas realizaciones, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de IgA humana y una 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma. En una realización, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende una región variable de cadena ligera de IgA humana. Una realización relacionada comprende además las etapas de producir un segundo BAC que comprende una región constante de IgA humana; introducir el segundo BAC en la célula; y reemplazar la totalidad o una porción de una región constante de IgA endógena. En algunas realizaciones, el primer BAC comprende además una primera secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio cerca del extremo 3' del primer BAC, y el segundo BAC comprende además una segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio cerca del extremo 5' del segundo BAC. En una realización relacionada, el método comprende además la etapa de expresar una recombinasa específica de sitio, en donde se elimina una secuencia intermedia entre la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio. En una realización particular, la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio son loxP o variantes de la misma, y la recombinasa específica de sitio es CRE. En otra realización, la primera y la segunda secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio son frt, y la recombinasa específica de sitio es flp.

En determinadas realizaciones, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende segmentos génicos VA humanos y de 1 a 7 pares de segmentos génicos JA-CA, en donde CA humano se reemplaza por CA singénico. En otra realización más, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende segmentos génicos VA humanos, de 1 a 7 segmentos génicos JA humanos y un solo segmento génico CA humano, en donde dichos segmentos génicos humanos se asemejan a una configuración de locus de IgA humana. Un método relacionado comprende además confirmar la incorporación de secuencias de empalme en el BAC e incorporar las secuencias de empalme si aún no están incorporadas en el BAC, antes de la etapa de introducción.

En una realización, los segmentos génicos VA humanos comprenden el grupo A. Una realización relacionada comprende además las etapas de producir un segundo BAC que comprende segmentos génicos VA humanos del grupo B; introducir el segundo BAC en dicha célula; y reemplazar segmentos génicos VA endógenos. En una realización adicional, el segundo BAC comprende además segmentos génicos VA humanos del grupo C.

También se describe en el presente documento una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga que tiene un genoma que comprende (1) un locus de Ig humana o una porción del mismo, y (2) un grupo de genes de FcR humanos, en donde el locus de Ig humana y los genes de FcR reemplazan las regiones endógenas, y en donde el genoma codifica una cadena de Ig humana o una porción de la misma, y un FcR humano. El locus de Ig humana puede comprender una porción de un locus de la cadena pesada de Ig humana que comprende todos o una parte de los segmentos génicos cadena abajo de JH, tal que la porción de una cadena pesada de Ig humana se acopla con un FcR humano.

La célula descrita anteriormente que tiene un genoma que codifica una cadena de Ig humana o una porción de la misma, y un FcR humano se puede producir mediante un método que comprende las etapas de producir un primer BAC que comprende un locus de Ig humana o una porción del mismo; producir un segundo BAC que comprende un grupo de genes de FcR humanos; introducir el primer BAC en una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga y reemplazar la totalidad o una porción de un locus de Ig endógena mediante recombinación homóloga; e introducir el segundo BAC en dicha célula y reemplazar un grupo endógeno de genes de FcR mediante recombinación homóloga, de modo que la célula comprenda un genoma que codifica una cadena de Ig humana o una porción de la misma, y un FcR humano.

Otro aspecto de la invención se refiere a un ratón con inserción génica que tiene un genoma que comprende (1) un segmento génico VH humano y (2) una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica que comprende (a) una parte de los segmentos génicos de ratón cadena abajo de JH, (b) un dominio CH1 singénico reemplazado por un dominio CH1 humano, (c) un segmento génico de bisagra superior humano, y (d) un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón; y en donde el segmento génico VH humano y el locus de la cadena pesada de Ig singénica reemplazan la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena, dando así como resultado un locus de la cadena pesada de Ig quimérica capaz de sufrir un reordenamiento génico y produciendo así un repertorio diversificado de anticuerpos quiméricos, de manera que dicho ratón comprende un genoma que codifica una cadena pesada de Ig quimérica, de modo que el ratón es capaz de producir una cadena pesada de Ig quimérica.

En una realización, el ratón comprende además un segmento génico JH humano. En determinadas realizaciones, la porción comprende además una región de control de locus (LCR) en 3' o un fragmento funcional de la misma. En otra realización, el ratón comprende además un segmento génico DH de un ratón. En una realización particular, el segmento génico DH se selecciona del grupo que consiste en ser humano, primate no humano, conejo, oveja, rata, hámster y ratón. En realizaciones particulares, el segmento génico DH es humano. En otra realización, el dominio CH1 humano comprende un solo segmento génico CH, por ejemplo, Cy1, Cy2 y Cy4.

El ratón comprende un segmento génico de bisagra superior humano. En una realización relacionada, el ratón comprende además un segmento génico de bisagra media humano. En realizaciones particulares, el segmento génico de bisagra humana es un segmento génico de bisagra de IgG4. En algunas realizaciones, la serina se sustituye por la prolina en la posición 229. En determinadas realizaciones preferidas, la cadena pesada de Ig quimérica es capaz de unirse a un FcR endógeno.

Para producir anticuerpos quiméricos que comprenden una cadena ligera de Ig humana, el ratón con inserción génica puede tener un genoma que comprenda un locus de la cadena ligera de Ig humana, o una porción del mismo, en donde dicho locus de la cadena ligera de Ig humana reemplaza la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de Ig endógena, de manera que dicho mamífero sea capaz de producir una cadena ligera de Ig humana.

En una realización, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende una región variable de IgK humana. En una realización relacionada, el locus de la cadena ligera de Ig comprende además una región constante de IgK humana.

En otra realización más, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de IgA humana y una 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma. En una realización, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende todo el locus de IgA humana. En otra realización, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende segmentos génicos VA humanos y de 1 a 7 pares de segmentos génicos JA CA, en donde CA humano se reemplaza por CA singénico. En otra realización más, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende segmentos génicos VA humanos, de 1 a 7 segmentos génicos JA humanos y un solo segmento génico CA humano, en donde los segmentos génicos humanos se asemejan a una configuración de locus de IgA humana. En una realización relacionada, el anticuerpo quimérico se reorganiza y expresa, dando como resultado una representación de IgA en relación con IgK superior a 40:60. En realizaciones particulares, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, es de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en ser humano, primate no humano y rata. En una realización, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, es humana. En realizaciones particulares, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, se une a NFKb. En una realización, la 3'LCR de IgA o un fragmento funcional de la misma, es de ratón y se ha mutagenizado para restaurar la unión de NFKb. En otras realizaciones, la 3'LCR o un fragmento funcional de la misma, en el locus de IgA humana es una 3'LCR de IgK o un fragmento funcional de la misma.

En determinadas realizaciones, el ratón con inserción génica capaz de producir una cadena pesada de Ig quimérica descrita anteriormente comprende además un locus de la cadena ligera de Ig humana, o una porción del mismo, en donde el locus de la cadena ligera de Ig humana reemplaza la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de Ig endógena.

También se describe en el presente documento un mamífero no humano con inserción génica que tiene un genoma que comprende (1) un locus de Ig humana, o una porción del mismo, y (2) un grupo de genes de FcR humanos, en donde el locus de Ig humana y los genes de FcR reemplazan las regiones endógenas ortólogas, y en donde el mamífero es capaz de producir una cadena de Ig humana, o una porción de la misma, y un FcR humano. El locus de Ig humana puede comprender una porción de un locus de la cadena pesada de Ig humana, comprendiendo dicha porción la totalidad o una parte de los segmentos génicos cadena abajo de JH, tal que dicha cadena pesada de Ig se acopla con un FcR humano. El locus de la cadena pesada de Ig humana puede comprender además toda o una parte de una región variable humana. El mamífero puede comprender además un locus de la cadena ligera de Ig humana, o una porción del mismo, en donde dicho locus de la cadena ligera de Ig humana reemplaza un locus de la cadena ligera de Ig endógena, o una porción del mismo, de manera que el mamífero no humano con inserción génica es capaz de producir un anticuerpo humano y un FcR humano.

Otra realización se refiere a un anticuerpo producido por el ratón con inserción génica de acuerdo con la invención, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende un VH humano, un dominio CH1 humano, una región bisagra superior humana, un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón. Una realización proporciona un método para producir un anticuerpo que se une de manera específica a un antígeno diana que comprende inmunizar el ratón con inserción génica de acuerdo con la invención con el antígeno diana y recuperar el anticuerpo reivindicado.

El anticuerpo de la invención se puede utilizar en un método para detectar un antígeno diana que comprende la detección de un anticuerpo de acuerdo con la invención con un agente de detección secundario que reconoce una porción del anticuerpo. La porción puede comprender en particular la región Fc del anticuerpo, un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, el dominio Fab del anticuerpo, el dominio F(ab')2 del anticuerpo, un dominio Ck o un dominio CA del anticuerpo. El método puede comprender además evaluar la distribución tisular de dicho antígeno diana.

Determinadas realizaciones se refieren a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo de la invención también se puede utilizar en un kit que comprende el anticuerpo de acuerdo con la invención y las instrucciones de uso de dicho anticuerpo.

El anticuerpo de la invención puede utilizarse para generar un anticuerpo humanizado codificado por una secuencia polinucleotídica que comprende (1) una secuencia polinucleotídica que codifica los segmentos génicos humanos del anticuerpo de acuerdo con la invención adjunta a (2) una secuencia polinucleotídica que codifica la porción restante de una región constante humana. Los segmentos génicos humanos pueden comprender segmentos génicos de la región V humana. El anticuerpo humanizado se puede utilizar en una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado y un vehículo farmacéuticamente aceptable o se puede incluir en un kit que comprende el anticuerpo humanizado y las instrucciones para el uso de dicho anticuerpo.

El ratón capaz de producir una cadena pesada de Ig quimérica descrita anteriormente se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de producir un primer BAC que comprende un segmento génico VH humano; producir un segundo BAC que comprende una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica que comprende todos o una parte de los segmentos génicos cadena abajo de JH, en donde un dominio CH1 singénico se reemplaza por un dominio CH1 humano; introducir el primer BAC en una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga y reemplazar un segmento génico VH endógeno mediante recombinación homóloga; introducir el segundo BAC en dicha célula y reemplazar la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena mediante recombinación homóloga; y generar a partir de la célula un ratón con inserción génica capaz de producir una cadena pesada de Ig quimérica. En una realización, el primer o el segundo BAC comprende además un segmento génico JH humano. En determinadas realizaciones, la etapa de generación comprende la microinyección de blastocistos, agregación de mórula o transferencia nuclear de células somáticas.

El ratón capaz de producir una cadena ligera de Ig humana descrita anteriormente se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de producir un primer BAC que comprende un locus de la cadena ligera de Ig humana, o una porción del mismo; introducir el primer BAC en una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga y reemplazar la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de Ig endógena ortóloga mediante recombinación homóloga; y generar a partir de la célula un mamífero no humano con inserción génica capaz de producir una cadena ligera de Ig humana, o una porción de la misma.

En determinadas realizaciones, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende una región variable de IgK. Una realización adicional comprende las etapas de producir un segundo BAC que comprende una región constante de IgK humana; introducir el segundo BAC en la célula; y reemplazar la totalidad o una porción de una región constante de IgK endógena.

En determinadas realizaciones relacionadas con un método para producir el ratón de acuerdo con la invención, la etapa de introducción del segundo BAC se produce antes de la etapa de introducción del primer BAC.

En una realización, el locus de la cadena ligera de Ig humana comprende la totalidad o una porción de un locus de la cadena ligera de IgA humana y una 3'LCR de IgA, o un fragmento funcional de la misma, que reemplaza un locus de IgA endógena ortóloga y 3'LCR mediante recombinación homóloga. En una realización relacionada, la IgA se expresa en una relación de aproximadamente 40:60 con respecto a la IgK. En otra realización más, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende todo el locus de IgA humana. En otra realización, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende segmentos génicos VA humanos y de 1 a 7 pares de segmentos génicos JA-CA, en donde CA humano se reemplaza por CA singénico.

En una realización, el locus de la cadena ligera de IgA humana comprende los segmentos génicos VA humanos, de 1 a 7 segmentos génicos JA y un solo segmento génico CA, en donde los segmentos génicos se reconstruyen para parecerse a la configuración de IgA humana. En una realización relacionada, el método relacionado comprende además confirmar la incorporación de secuencias de empalme en el BAC e incorporar las secuencias de empalme si aún no están incorporadas en el BAC, antes de la etapa de introducción.

En otra realización, el locus de IgA se reorganiza de manera eficiente, dando como resultado una mayor representación de IgA en relación con IgK superior a 40:60. En una realización, los segmentos génicos VA humanos comprenden el grupo A. Una realización relacionada comprende además las etapas de producir un segundo BAC que comprende segmentos génicos VA humanos del grupo B; introducir el segundo BAC en la célula; y reemplazar los segmentos génicos VA endógenos. En otra realización relacionada, el segundo BAC comprende además segmentos génicos VA humanos del grupo C.

La reproducción de mamíferos no humanos transgénicos está explícitamente excluida de la presente invención. Se puede obtener un ratón con inserción génica que es capaz de producir una cadena pesada de Ig quimérica y una cadena ligera de Ig humana mediante un método que comprende las etapas de reproducir un mamífero no humano que comprende un locus de la cadena pesada de Ig quimérica, en donde el locus de la cadena pesada de Ig comprende (1) un segmento génico VH humano y (2) una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica que comprende todos o una parte de los segmentos génicos cadena abajo de JH, en donde un dominio CH1 singénico se reemplaza por un dominio CH1 humano, con un mamífero no humano que comprende un locus de la cadena ligera de Ig humana; seleccionar la descendencia que tenga un genoma que comprenda el locus de la cadena pesada de Ig quimérica y el locus de la cadena ligera de Ig humana; seguir reproduciendo la descendencia; y producir descendencia que tenga un genoma homocigoto para los loci de la cadena pesada quimérica y de la cadena ligera humana.

De manera similar, un mamífero capaz de producir una cadena de Ig humana, o una porción de la misma, y un FcR humano como se describió anteriormente se puede producir mediante un método que comprende las etapas de producir un primer BAC que comprende un locus de Ig humana, o una porción del mismo; producir un segundo BAC que comprende un grupo de genes de FcR humanos; introducir el primer BAC en una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga y reemplazar la totalidad o una porción de un locus de Ig endógena mediante recombinación homóloga; introducir el segundo BAC en dicha célula y reemplazar la totalidad o una porción de un grupo endógeno de genes de FcR mediante recombinación homóloga; y generar a partir de la célula un mamífero no humano con inserción génica que comprenda un genoma que codifica una cadena de Ig humana, o una porción de la misma, y un FcR humano. El locus de Ig humana puede comprender una porción de un locus de la cadena pesada de Ig, comprendiendo dicha porción la totalidad o una parte de los segmentos génicos cadena abajo de JH, tal que dicha cadena pesada de Ig se acopla con un FcR humano.

También se describe en el presente documento un método para producir un mamífero no humano con inserción génica capaz de producir un anticuerpo humano, en donde el anticuerpo se acopla a un FcR humano, que comprende las etapas de producir un primer BAC que comprende un locus de la cadena pesada de Ig humana, un segundo BAC que comprende un locus de la cadena ligera de Ig humana y un tercer BAC que comprende un grupo de segmentos génicos FcR humanos; introducir el primer, segundo y tercer bAc de manera secuencial en una célula de mamífero no humano competente para la recombinación homóloga y reemplazar una cadena pesada de Ig, una cadena ligera de Ig y un grupo de segmentos génicos FcR endógenos, respectivamente, mediante recombinación homóloga; y generar a partir de la célula un mamífero no humano con inserción génica capaz de producir un anticuerpo humano.

El mamífero no humano con inserción génica que es capaz de producir un anticuerpo humano y un FcR humano descritos en el presente documento también se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de reproducir un mamífero no humano que comprende un locus de la cadena pesada de Ig humana, en donde dicho locus de la cadena pesada de Ig comprende todos o una parte de los segmentos génicos humanos cadena abajo de JH, con un mamífero no humano que comprende un locus de la cadena ligera de Ig humana; seleccionar descendientes que tengan un genoma que comprenda el locus de la cadena pesada de Ig humana y el locus de la cadena ligera de Ig humana; seguir reproduciendo la descendencia; y producir descendencia que tenga un genoma homocigoto para los loci de la cadena pesada y cadena ligera humanas.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

La figura 1 representa la introducción de una cadena pesada de Ig quimérica a través de etapas de recombinación homóloga secuencial. La figura 1A, la figura 1B y la figura 1C son diagramas que muestran la fase 1, la fase 2 y la fase 3, respectivamente, de las etapas de selección y cribado durante el proceso de recombinación homóloga de un locus de IgH.

La figura 2 representa la introducción de un locus de IgK humana a través de las etapas de recombinación homóloga secuencial. La figura 2A y la figura 2B son diagramas que muestran la fase 1 y la fase 2, respectivamente, de las etapas de selección y cribado durante la recombinación homóloga de un locus de IgK.

La figura 3 representa la introducción de un locus de IgA humana a través de las etapas de recombinación homóloga secuencial. La figura 3A y la figura 3B son diagramas que muestran la fase 1 y la fase 2, respectivamente, de las etapas de selección y cribado durante el proceso de recombinación homóloga de un locus de IgA.

La figura 4A es un diagrama que representa la introducción de un primer BAC que contiene una secuencia de reconocimiento para una recombinasa específica de sitio en un locus de IgH de ratón mediante recombinación homóloga. La figura 4B es un diagrama que muestra la introducción de un segundo BAC que contiene una secuencia de reconocimiento para una recombinasa específica de sitio en el locus de IgH de ratón mediante recombinación homóloga. La figura 4C es un diagrama que ilustra la eliminación de las secuencias intermedias entre las secuencias de reconocimiento para una recombinasa específica de sitio mediante la introducción de la recombinasa específica de sitio funcional.

La figura 5A es un diagrama que representa la introducción de un primer BAC que contiene una secuencia de reconocimiento para una recombinasa específica de sitio en un locus de IgK de ratón mediante recombinación homóloga. La figura 5B es un diagrama que muestra la introducción de un segundo BAC que contiene una secuencia de reconocimiento para una recombinasa específica de sitio en el locus de IgK de ratón mediante recombinación homóloga. La figura 5C es un diagrama que ilustra la eliminación de las secuencias intermedias entre las secuencias de reconocimiento para una recombinasa específica de sitio mediante la introducción de la recombinasa específica de sitio funcional.

La figura 6A es un diagrama que representa la introducción de un primer BAC en un locus de IgA de ratón mediante recombinación homóloga. La figura 6B es un diagrama que muestra la introducción de un segundo BAC en el locus de IgA de ratón que se recombina de manera homóloga con una porción del primer BAC y una porción del locus de IgA de ratón endógena.

Descripción detallada

Aspectos generales

La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

De manera específica, las realizaciones de la invención proporcionan ratones y células de ratón productores de anticuerpos quiméricos y métodos para producirlos. En ratones productores de anticuerpos, los genes de V, (D) y J de inmunoglobulina (Ig) endógena se reemplazan por sus ortólogos humanos utilizando recombinación homóloga en células madre embrionarias mediante los métodos descritos en el presente documento, tal como el uso de BAC que contienen grandes porciones de genes V, D y J humanos y que están flanqueados por la homología apropiada dirigida al ADN para facilitar la recombinación homóloga de alta frecuencia en el locus de IgH endógena. Esto se puede hacer en un solo reemplazo en cada locus de Ig, mediante reemplazo secuencial ("avance") o mediante el reemplazamiento de porciones del locus seguido por la eliminación de secuencias intermedias. Un BAC que lleva la totalidad o parte del locus de IgH cadena abajo de JH se puede genomanipular de modo que en cada gen de la región constante, el dominio CH1 endógeno se reemplaza por un dominio CH1 humano utilizando la capacidad de realizar modificaciones muy precisas del ADN transportado en los BAC en E. coli. Como alternativa, un bAc que lleva la totalidad o parte del locus de IgH cadena abajo de JH se puede genomanipular de modo que en cada gen de la región constante, el dominio CH1 endógeno se reemplaza por un dominio CH1 humano, utilizando la capacidad de sintetizar y ensamblar con precisión ADN basado en secuencias genómicas publicadas de seres humanos y otros organismos tales como el ratón. Dicha síntesis y ensamblaje es conocido en la materia y lo practican entidades comerciales (por ejemplo, DNA2.0, Menlo Park, Ca ; Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA).

Un beneficio de la estrategia general para reemplazar los loci de Ig endógena por componentes de los loci de Ig humana para producir dominios V humanos optimizados in vivo durante las respuestas inmunitarias primaria y secundaria es que el número total de loci alterados se reduce en comparación con las estrategias disponibles. La estrategia de la presente invención emplea 2 o 3 loci alterados, simplificando en gran medida el proceso de reproducción y, por lo tanto, proporcionando la oportunidad de introducir otras mutaciones útiles en el acervo genético. Dichas mutaciones útiles pueden incluir aquellas que ayudan a romper la tolerancia inmunitaria para generar de manera más eficaz anticuerpos contra antígenos humanos que están altamente conservados entre especies. Estas incluyen la sobreexpresión transgénica de CD19, desactivación génica del receptor inhibidor FcyRllb, Ipr u otras mutaciones propensas autoinmunitarias, desactivación del gen para el antígeno, o transgenes con dedos de zinc genomanipulados para silenciar la expresión de genes específicos tales como el antígeno.

Otro beneficio de la estrategia general para reemplazar los loci de Ig endógena por componentes de los loci de Ig humana es que evita la recombinación trans y el cambio trans que ocurre entre transgenes de Ig humana insertados en una ubicación cromosómica fuera de los loci endógenos. El producto de la cadena Ig resultante de dicha recombinación trans y los acontecimientos de cambio trans son quiméricos para las secuencias de Ig endógenas humanas, pero se desvían del diseño del producto genomanipulado en el transgén.

Una alternativa que no está cubierta por las presentes reivindicaciones es incorporar loci de Ig completamente humana, incluidas las regiones C humanas, en lugar de los loci Ig endógena completos y también reemplazar el grupo de genes de FcR endógenos con el grupo ortólogo de genes de FcR humanos utilizando una genomanipulación similar basada en BAC en células competentes para la recombinación homóloga, tales como células ES. De esta manera, se pueden producir anticuerpos completamente humanos y, durante una respuesta inmunitaria, estos anticuerpos humanos pueden acoplarse al FcR humano de manera normal. Dichos animales también tendrían el beneficio de ser útiles para probar la actividad de la función efectora de los candidatos de AcM terapéuticos humanos en modelos animales de enfermedades cuando se cruzan con el acervo genético adecuado para el modelo, es decir, ratones SCID, nu/nu, nod e Ipr. Además, la secuencia génica diana humana puede reemplazar el gen endógeno utilizando la tecnología de direccionamiento de BAC en células competentes para la recombinación homóloga, tales como células ES, lo que proporciona modelos para la validación de dianas y pruebas funcionales del anticuerpo.

Otra posibilidad que no está cubierta por las presentes reivindicaciones es incorporar Ig completamente humana, incluidas las regiones C humanas que comprenden CH1-bisagra-CH2-CH3(-CH4) y los dominios de membrana e intracelulares singénicos afines, por ejemplo, de ratón, para proporcionar una transducción de señales intracelulares naturales y permitir la asociación de la IgH en el receptor de linfocitos B a Iga e Igp y permitir así la señalización de tipo murino a partir del receptor de linfocitos B que contiene Iga, Igp e IgG. El dominio de membrana e intracelular de la región constante de cadena pesada pueden ser del mismo isotipo de cadena pesada de ratón o no afines. Dicha genomanipulación de los genes de la región constante se puede realizar de manera fácil con métodos de la invención como se detalla a continuación.

La genomanipulación de los anticuerpos quiméricos de esta manera evita la alteración en la conformación del dominio V resultante del cambio in vitro de una primera región C, en particular un dominio CH1, y opcionalmente una porción de la región bisagra, de una especie, por ejemplo, ratón, con la que se evolucionó durante la respuesta inmunitaria in vivo a una segunda región C, en particular un dominio CH1, y opcionalmente una porción de la región bisagra, de otra especie, por ejemplo, ser humano. Los anticuerpos producidos por los animales con inserción génica de la presente invención no muestran la reducción o pérdida de actividad y potencia que se observa en anticuerpos de otros animales productores de anticuerpos quiméricos cuando la región V humana se une a una región C humana para formar un anticuerpo completamente humano, que puede provocarse mediante una conformación alterada del dominio VH resultante del cambio del dominio CH1 y/o mediante diferencias en la unión a antígeno debido al cambio de longitud o flexibilidad de las regiones bisagra superiores (la secuencia peptídica desde el extremo del CH1 hasta el primer resto de cisteína en la bisagra que forma un enlace disulfuro entre cadenas pesadas, y que son variables en longitud y composición) cuando se cambia de región constante de ratón a humana (Roux et al., J. Immunology (1997) 159:3372-3382 y referencias en el mismo). La región bisagra central está delimitada por los restos de cisteína que forman enlaces disulfuro entre cadenas pesadas.

Definiciones

Antes de describir determinadas realizaciones en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, que puede variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante. Los términos utilizados en esta memoria descriptiva en general tienen sus significados habituales en la materia, dentro del contexto de esta invención y en contexto específico donde se usa cada término. Determinados términos se analizan a continuación, o en otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar directrices adicionales al profesional en la descripción de las composiciones y métodos de la invención y en la manera de prepararlos y utilizarlos. El alcance y el significado de cualquier uso de un término serán evidentes a partir del contexto específico en el que se utilice el término. De este modo, las definiciones establecidas en el presente documento están destinadas a proporcionar una guía ilustrativa para determinar realizaciones particulares de la invención, sin limitación a composiciones o sistemas biológicos particulares. Como se usa en la presente divulgación y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "uno/una", y "el/la" incluyen formas en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

Tal como se usa en el presente documento, "anticuerpo" o "inmunoglobulina" (Ig) se refieren a moléculas de proteína producidas por linfocitos B que reconocen y se unen a antígenos específicos y que pueden estar unidos a la membrana o secretados. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, en el sentido de que son producidos por un solo clon de linfocitos B y, por lo tanto, reconocen el mismo epítopo y tienen la misma secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos, o policlonales, en el sentido de que son producidos por múltiples clones de linfocitos B, reconocen uno o más epítopos del mismo antígeno y, normalmente, tienen diferentes secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos.

Normalmente, las moléculas de anticuerpo, o Ig, se componen de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas unidas entre sí a través de enlaces disulfuro. Tanto las cadenas pesadas (IgH) como las cadenas ligeras (IgL) contienen una región o dominio variable (V) y una región o dominio constante (C). La porción del locus de IgH que codifica la región V comprende múltiples copias de los segmentos génicos variables (V), de diversidad (D) y de unión (J). La porción de los loci de IgL, IgK e IgA que codifican la región V comprende múltiples copias de los segmentos génicos V y J. La porción que codifica la región V de los loci IgH e IgL sufre un reordenamiento génico, por ejemplo, diferentes combinaciones de segmentos génicos se organizan para formar las regiones variables de IgH e IgL, para desarrollar especificidad antigénica diversa en los anticuerpos. La forma secretada de la región C de IgH se compone de tres dominios C, CH1, CH2, CH3, opcionalmente CH4 (C|j) y una región bisagra. La forma unida a la membrana de la región C de IgH también tiene dominios de membrana e intracelulares. La región constante de IgH determina el isotipo del anticuerpo, por ejemplo, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE. Se apreciará que los mamíferos no humanos que codifican múltiples isotipos de Ig podrán sufrir un cambio de clase de isotipo. Existen dos tipos de IgL, IgK e IgA.

Un dominio o fragmento "Fab" comprende la porción aminoterminal de la IgH, que incluye la región V y el dominio CH1 de la IgH, y la IgL completa. Un dominio "F(ab')2 comprende el dominio Fab y una porción de la región bisagra, en donde las 2 IgH están unidas entre sí a través de un enlace disulfuro en la región bisagra media. Tanto Fab como F(ab')2 son "fragmentos de unión a antígeno". La porción carboxiterminal de la IgH, que comprende los dominios CH2 y CH3, es el dominio "Fc". El dominio Fc es la porción de la Ig reconocida por los receptores celulares, tales como el FcR, y al que la proteína activadora del complemento, C1q, se une. La región bisagra inferior, que está codificada en la porción 5' del exón CH2, proporciona flexibilidad dentro del anticuerpo para unirse a los receptores FcR.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo traducido a partir de una secuencia polinucleotídica que contiene secuencias polinucleotídicas tanto de seres humanos como de mamíferos no humanos. Un anticuerpo "humanizado" es aquel que se produce por una célula o un mamífero no humano y comprende secuencias humanas, por ejemplo, un anticuerpo quimérico. Los anticuerpos humanizados son menos inmunogénicos después de la administración a seres humanos en comparación con los anticuerpos no humanizados preparados a partir de otra especie. Asimismo, los anticuerpos humanizados se pueden aislar de un mamífero no humano con inserción génica genomanipulado para producir moléculas de anticuerpos completamente humanas. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede comprender la región variable humana de un anticuerpo quimérico unida a una región constante humana para producir un anticuerpo completamente humano.

Como se usa en el presente documento, "cadena de Ig quimérica" se refiere a una cadena pesada de Ig o una cadena ligera de Ig traducida a partir de una secuencia polinucleotídica que contiene secuencias polinucleotídicas tanto de seres humanos como de animales no humanos. Por ejemplo, una cadena pesada de Ig quimérica puede comprender segmentos génicos VH, DH, JH y CH1 humanos y segmentos génicos CH2 y CH3 de ratón.

"Polipéptido", "péptido" o "proteína" se utilizan indistintamente para describir una cadena de aminoácidos que están unidos entre sí mediante enlaces químicos. Un polipéptido o proteína puede ser una IgH, IgL, un dominio V, un dominio C o un anticuerpo.

"Polinucleótido" se refiere a una cadena de ácidos nucleicos que están unidos entre sí mediante enlaces químicos. Los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, ADN, ADNc, ARN, ARNm y secuencias y segmentos génicos. Los polinucleótidos pueden aislarse de una fuente viva, tal como una célula eucariota, célula procariota o virus, o pueden proceder a través de manipulación in vitro utilizando técnicas convencionales de biología molecular, o mediante síntesis de ADN, o mediante una combinación de varias técnicas.

"Locus" se refiere a una ubicación en un cromosoma que comprende uno o más genes o exones, tales como un locus de IgH o IgK, los elementos reguladores cis y las regiones de unión a las que se unen los factores que actúan en trans. Tal como se usa en el presente documento, "gen" o "segmento génico" se refiere a la secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido específico o una porción del mismo, tal como un dominio VL, un dominio CH1, una región bisagra superior o una porción de la misma. Tal como se usa en el presente documento, "segmento génico" y "exón" pueden utilizarse indistintamente y referirse al polinucleótido que codifica un péptido, o una porción del mismo. Un gen, o segmento de gen, puede comprender además uno o más intrones, elementos de control de la transcripción, por ejemplo, un promotor, potenciadores, o regiones no codificantes, por ejemplo, elementos reguladores cis, por ejemplo, regiones no traducidas en 5' y 3', sitios de poliadenilación.

El término "endógeno" se refiere a una secuencia polinucleotídica que se produce de manera natural dentro de la célula o el animal. "Ortólogo" se refiere a una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido correspondiente en otra especie, es decir, un dominio CH1 humano y un dominio CH1 de ratón. El término "singénico" se refiere a una secuencia polinucleotídica que se encuentra dentro de la misma especie que puede introducirse en un animal de esa misma especie, es decir, un segmento génico Vk de ratón introducido en un locus IgK de ratón.

Tal como se usa en el presente documento, el término "homólogo" o "secuencia homóloga" se refiere a una secuencia polinucleotídica que tiene una secuencia muy similar o un porcentaje de identidad elevado (por ejemplo, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o más), a otra secuencia polinucleotídica o segmento de la misma. Por ejemplo, una construcción de ADN para su uso de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia que es homóloga a una porción de una secuencia de ADN endógena para facilitar la recombinación en esa ubicación específica. La recombinación homóloga puede tener lugar en células procariotas y eucariotas.

Tal como se usa en el presente documento, "secuencia flanqueante" o "secuencia flanqueante de ADN" se refiere a una secuencia de ADN adyacente a la secuencia de ADN no endógena en una construcción de ADN que es homóloga a una secuencia de ADN endógena o una secuencia no endógena previamente recombinada o una porción de la misma. Las construcciones de ADN para su uso de acuerdo con la invención pueden tener una o más secuencias flanqueantes, por ejemplo, una secuencia flanqueante en el extremo 3' y 5' de la secuencia no endógena o una secuencia flanqueante en el extremo 3' o 5' de la secuencia no endógena.

La expresión "célula competente para la recombinación homóloga" se refiere a una célula que es capaz de recombinar de manera homóloga fragmentos de ADN que contienen regiones de homología superpuesta. Los ejemplos de células competentes para la recombinación homóloga incluyen, pero sin limitación, células madre pluripotentes inducidas, células madre hematopoyéticas, bacterias, levaduras, varias estirpes celulares y células madre embrionarias (ES, del inglés "embryonic stem").

"Mamífero no humano" se refiere a un animal distinto de los seres humanos que pertenece a la clase Mammalia. Los ejemplos de mamíferos no humanos incluyen, pero sin limitación, primates no humanos, roedores, bovinos, ovinos, equinos, perros, gatos, cabras, ovejas, delfines, murciélagos, conejos y marsupiales. Los mamíferos no humanos preferidos se basan principalmente en la conversión de genes y/o la hipermutación somática para generar diversidad de anticuerpos, por ejemplo, ratón, conejo, cerdo, oveja, cabra o vaca. Los mamíferos no humanos particularmente preferidos son ratones, a los que se dirigen las reclamaciones.

La expresión "con inserción génica" o "transgénico" se refiere a una célula o animal que comprende una secuencia polinucleotídica, por ejemplo, un transgén, procedente de otra especie incorporada a su genoma. Por ejemplo, un ratón que contiene un segmento génico VH humano integrado en su genoma fuera del locus de IgH endógena de ratón es un ratón transgénico; un ratón que contiene un segmento génico VH humano integrado en su genoma que reemplaza una VH de ratón endógena en el locus de IgH endógena de ratón es un ratón transgénico o con inserción génica. En células y mamíferos no humanos con inserción génica, la secuencia polinucleotídica procedente de otra especie, puede reemplazar la secuencia endógena correspondiente, u ortóloga, encontrada originalmente en la célula o mamífero no humano.

Un animal "humanizado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal no humano, por ejemplo, un ratón que tiene una estructura genética compuesta que conserva secuencias genéticas del ratón u otro animal no humano, además de que uno o más segmentos génicos y/o secuencias reguladoras de genes de la composición genética original se han reemplazado por secuencias humanas análogas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico en la que se puede integrar otro fragmento de ácido nucleico sin pérdida de la capacidad de replicación del vector. Los vectores pueden tener su origen en un virus, un plásmido o la célula de un organismo superior. Los vectores se utilizan para introducir ADN extraño o recombinante en una célula hospedadora, en donde el vector se replica.

Un agente polinucleótido puede estar contenido en un vector, que puede facilitar la manipulación del polinucleótido, incluyendo la introducción del polinucleótido en una célula diana. El vector puede ser un vector de clonación, que es útil para mantener el polinucleótido, o puede ser un vector de expresión, que contiene, además del polinucleótido, elementos reguladores útiles para expresar el polinucleótido y, donde el polinucleótido codifica un ARN, para expresar el ARN codificado en una célula particular, ya sea para la traducción posterior del ARN en un polipéptido o para la posterior actividad reguladora trans del ARN en la célula. Un vector de expresión puede contener los elementos de expresión necesarios para lograr, por ejemplo, la transcripción sostenida del polinucleótido codificante, o los elementos reguladores pueden unirse de manera operativa al polinucleótido antes de clonarlo en el vector.

Un vector de expresión (o el polinucleótido) generalmente contiene o codifica una secuencia promotora, que puede proporcionar una expresión constitutiva o, si se desea, inducible o específica de tejido o específica de etapa de desarrollo del polinucleótido codificante, una secuencia de reconocimiento de poli-A y un sitio de reconocimiento de ribosomas o un sitio de entrada de ribosomas interno u otros elementos reguladores tales como un potenciador, que puede ser específico de tejido. El vector también puede contener elementos necesarios para la replicación en un sistema hospedador procariota o eucariota o ambos, según se desee. Dichos vectores, que incluyen vectores plasmídicos y vectores víricos tales como vectores de bacteriófagos, baculovirus, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus de la variolovacuna, virus alfa y virus adenoasociados, son bien conocidos y pueden adquirirse de una fuente comercial (Promega, Madison Wis.; Stratagene, La Jolla California; GIBCO/BRL, Gaithersburg Md.) o se pueden construir por un experto en la materia (véanse, por ejemplo, Meth. Enzymol., vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990); Jolly, Canc. Gene Ther. 1:51-64, 1994; Flotte, J. Bioenerg. Biomemb 25:37-42, 1993; Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest 92:381-387. 1993).

Un vector de ADN utilizado en los métodos de la invención puede contener marcadores de selección positivos y negativos. Los marcadores positivos y negativos pueden ser genes que, cuando se expresan, confieren resistencia a fármacos a las células que expresan estos genes. Los marcadores de selección adecuados para E. coli pueden incluir, pero sin limitación: Km (gen resistente a la kanamicina), tetA (gen resistente a la tetraciclina) y p-lactamasa (gen resistente a la ampicilina). Los marcadores de selección adecuados para células de mamíferos en cultivo pueden incluir, pero sin limitación: hyg (gen de resistencia a la higromicina), puro (gen de resistencia a la puromicina) y G418 (gen de resistencia a la neomicina). Los marcadores de selección también pueden ser genes metabólicos que pueden convertir una sustancia en una sustancia tóxica. Por ejemplo, el gen de la timidina cinasa, cuando se expresa, convierte el fármaco ganciclovir en un producto tóxico. Por lo tanto, el tratamiento de células con ganciclovir puede seleccionar de manera negativa los genes que no expresan timidina cinasa.

En un aspecto relacionado, los marcadores de selección pueden ser "marcadores detectables", tales como la proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteínas similares a GFP y luciferasa.

Varios tipos de vectores están disponibles en la materia e incluyen, pero sin limitación, vectores bacterianos, víricos y de levaduras. Un vector de ADN puede ser cualquier vector de ADN adecuado, incluido un plásmido, cósmido, bacteriófago, cromosoma artificial procedente del fago P1 (PAC, del inglés "p1-derived artificial chromosome"), cromosoma artificial bacteriano (BAC, del inglés "bacterial artificial chromosomes"), cromosoma artificial de levadura (YAC, del inglés yeast artificial chromosome"") o cromosoma artificial de mamífero (MAC, del inglés "mammalian artificial chromosome"). En determinadas realizaciones, el vector de ADN es un BAC. Los diversos vectores de ADN se seleccionan según sea adecuado para el tamaño del ADN insertado en la construcción. En una realización, las construcciones de ADN son cromosomas artificiales bacterianos o fragmentos de los mismos.

La expresión "cromosoma artificial bacteriano" o "BAC", como se usa en el presente documento, se refiere a un vector de a Dn bacteriano. Los BAC, como los procedentes de E. coli, pueden utilizarse para introducir, eliminar o reemplazar secuencias de ADN de células de mamíferos no humanos o animales mediante recombinación homóloga. E. coli puede mantener ADN genómico complejo de hasta 350 kb en forma de BAC (véase Shizuya y Kouros-Mehr, Keio J Med.

2001, 50(1):26-30), con mayor estabilidad del ADN que los cósmidos o los cromosomas artificiales de levadura. Asimismo, las bibliotecas BAC de ADN genómico de a Dn humano tienen una representación más completa y precisa del genoma humano que las bibliotecas en cósmidos o cromosomas artificiales de levadura. Los BAC se describen con mayor detalle en los documentos US2004/0128703 y WO2009/076464.

Los fragmentos de ADN que comprenden un locus de Ig, o una porción del mismo, que se van a incorporar en el mamífero no humano se aíslan de la misma especie de mamífero no humano antes de la humanización del locus. Se pueden humanizar varios BAC que contienen fragmentos superpuestos de un locus de Ig y los fragmentos superpuestos se recombinan para generar un locus de IgH o IgL continuo. El locus de Ig quimérica resultante comprende los segmentos génicos humanos unidos de manera operativa a los segmentos génicos de Ig de mamífero no humano para producir un locus de Ig funcional, en donde el locus es capaz de sufrir un reordenamiento génico y producir así un repertorio diversificado de anticuerpos quiméricos.

Estos procesos para la recombinación de BAC y/o de genomanipulación de un locus de Ig quimérica o fragmento del mismo requiere que una célula bacteriana, tal como E. coli, se transforme con un BAC que contenga el locus de Ig del hospedador o una porción del mismo. A continuación, el bacilo que contiene el BAC se transforma con un vector de recombinación que comprende el segmento génico de Ig humana deseado unido a la secuencia de homología flanqueante compartida con el BAC que contiene el locus de Ig hospedador o una porción del mismo. La homología de secuencia compartida media la recombinación homóloga y el entrecruzamiento entre el segmento génico de Ig humano en el vector de recombinación y el segmento génico de Ig de mamífero no humano en el BAC. La detección de BAC recombinados de manera homóloga puede utilizar marcadores seleccionables y/o detectables incorporados en el vector. Los BAC humanizados se pueden aislar de manera fácil de las bacterias y utilizar para producir células no humanas con inserción génica. Se documentan métodos de recombinación de BAC e inserciones y deleciones de genomanipulación dentro del ADN en BAC y métodos para producir ratones modificados genéticamente a partir de ellos. Véase, por ejemplo, Valenzuela et al. Nature Biotech. (2003) 21:652-659; Testa et al. Nature Biotech. (2003) 21:443-447; y Yang y Seed. Nature Biotech. (2003) 21:447-451.

La primera etapa de recombinación puede llevarse a cabo en una cepa de E. coli que es deficiente para actividad sbcB, sbcC, recB, recC o recD y tiene una mutación sensible a la temperatura en recA. Después de la etapa de recombinación, se aísla una construcción de ADN recombinado, teniendo la construcción las diversas secuencias y orientaciones descritas.

Las regiones utilizadas para la recombinación de BAC deben tener una longitud que permita la recombinación homóloga. Por ejemplo, las regiones flanqueantes pueden ser de aproximadamente 0,1 a 19 kb, y normalmente de aproximadamente 1 kb a 15 kb, o aproximadamente 2 kb a 10 kb.

El proceso de recombinación de BAC para hacer BAC más grandes y/o adaptados que comprenden porciones de los loci de Ig necesita que una célula bacteriana, tal como E. coli, se transforme con un BAC que lleve un primer locus de Ig, una porción del mismo o alguna otra secuencia diana. El BAC que contiene E. coli se transforma entonces con un vector de recombinación (por ejemplo, plásmido o BAC) que comprende el segmento génico de Ig deseado para introducirlo en el ADN diana, por ejemplo, uno o más segmentos génicos VH, DH y/o JH humanos para unirse a una región del locus de IgH de ratón, cuyos vectores tienen una región de identidad de secuencia. Esta región de identidad compartida en presencia de recA funcional en E. coli media el entrecruzamiento entre el segmento génico de Ig en el vector de recombinación y el segmento génico de Ig de mamífero no humano en el BAC. La selección y resolución de BAC recombinados de manera homóloga puede utilizar marcadores seleccionables y/o detectables incorporados en los vectores. Los BAC humanizados y quiméricos de ser humano y ratón se pueden purificar de manera fácil a partir de E. coli y utilizar para producir células y animales no humanos transgénicos y con inserción génica mediante la introducción del ADN mediante varios métodos conocidos en la materia y la selección y/o detección de acontecimientos de integración tanto aleatorios como dirigidos.

Como alternativa, los fragmentos de ADN que contienen un locus de Ig para ser incorporados en el mamífero no humano proceden del ADN sintetizado in vitro. Los genomas de muchos organismos se han secuenciado completamente (por ejemplo, ser humano, chimpancé, macaco de la India, ratón, rata, perro, gato, pollo, cobaya, conejo, caballo y vaca) y están disponibles públicamente con anotaciones. En particular, pero sin limitación, los loci de inmunoglobulina humana y de ratón se han estudiado y caracterizado en cuanto a la ubicación y actividad de los segmentos génicos codificantes y los elementos reguladores no codificantes. Las secuencias de los loci de Ig pueden manipularse y recombinarse in silico con programas informáticos comúnmente disponibles para el análisis de secuencias de ácidos nucleicos. La recombinación in silico puede estar dentro del mismo locus, entre dos loci de la misma especie o entre dos loci de dos o más especies. Las secuencias de un locus de Ig también pueden recombinarse in silico con las de un locus que no es de inmunoglobulina, ya sea de la misma especie o de otra diferente. Dichas secuencias incluirían, pero sin limitación, genes para marcadores de selección de fármacos positivos y negativos, tales como G418, hyg, puro y tk, y secuencias de reconocimiento de recombinasa específicas de sitio tales como sitios loxP y sus variantes y sitios frt. Después de ensamblar la secuencia deseada in silico, a continuación, se puede sintetizar y ensamblar sin errores (Kodumal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2004) 101:15573-15578). La síntesis, el ensamblaje y la secuenciación de ADN grandes se proporcionan de forma contractual (por ejemplo, DNA 2,0, Menlo Park, CA; Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA; y Eurogentec, San Diego, CA). Estas secuencias de ADN sintético se transportan en vectores como plásmidos y BAC y se pueden transferir a otros vectores tales como YAC.

El término "construcción", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN construida de manera artificial mediante genomanipulación, recombinación o síntesis genética. En una realización, las construcciones de ADN se linealizan antes de la recombinación. En otra realización, las construcciones de ADN no se linealizan antes de la recombinación.

Tal como se usa en el presente documento, "loxP" y "CRE" se refieren a un sistema de recombinación específico de sitio procedente del bacteriófago P1. Los sitios loxP tienen 34 nucleótidos de longitud. Cuando el ADN está flanqueado a ambos lados por un sitio loxP y se expone a la recombinación mediada por CRE, el ADN intermedio se elimina y los dos sitios loxP se resuelven en uno. El uso del sistema CRE/lox, que incluye sitios lox de secuencia variante, para la genomanipulación en muchas especies, incluyendo ratones, está bien documentado. Un sistema similar, que emplea sitios frt y flp recombinasa de S. cerevisiae se puede emplear con un efecto similar. Tal como se usa en el presente documento, cualquier implementación de CRE/loxP para mediar acontecimientos de eliminación en células de mamíferos en cultivo también puede estar mediada por el sistema flp/frt.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunizado", "immunización", o "inmunizar" se refiere a exponer el sistema inmunitario adaptativo de un animal a un antígeno. El antígeno se puede introducir por varias vías de administración, tal como inyección, inhalación o ingestión. Tras una segunda exposición al mismo antígeno, la respuesta inmunoadaptativa, es decir, la respuesta de linfocitos T y linfocitos B, aumenta.

"Antígeno" se refiere a un péptido, lípido o aminoácido que es reconocido por el sistema inmunitario adaptativo. Los ejemplos de antígenos incluyen, pero sin limitación, componentes de la pared celular bacteriana, polen y factor rh. "Antígeno diana" se refiere a un antígeno, péptido, lípido, sacárido o aminoácido, que es reconocido por el sistema inmunitario adaptativo que se elige para producir una respuesta inmunitaria contra un agente infeccioso específico o una célula endógena. Los antígenos diana incluyen, pero sin limitación, componentes bacterianos y víricos, antígenos específicos de tumores, citocinas, moléculas de superficie celular, etc.

La expresión "producto farmacéutico" o "fármaco", como se usa en el presente documento se refiere a cualquier agente farmacológico, terapéutico o biológico activo que pueda administrarse a un sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal, y preferentemente un mamífero, lo más preferentemente un ser humano.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere en general a cualquier material que pueda acompañar al fármaco y que no provoque una reacción adversa en el sistema inmunitario del sujeto.

El término "administrar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modo de transferencia, suministro, introducción o transporte de un fármaco u otro agente, tal como un antígeno diana, a un sujeto. Dichos modos incluyen administración oral, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intranasal o subcutánea.

Ratones y células con inserción génica

Los ratones y células con inserción génica de la presente invención comprenden loci de IgH alterados o de IgH e IgL alterados que comprenden segmentos génicos de Ig humana ortóloga, que reemplazan los segmentos génicos endógenos, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, en realizaciones específicas, un dominio CH1 humano que reemplaza un dominio CH1 en un gen de CH endógeno específico, por ejemplo, C|j, C8, Cy, puede ser una secuencia ortóloga para cada región CH de ratón. Para cada uno de los genes Cy endógenos, el CH1 de reemplazo puede ser un CH1 humano ortólogo o puede ser un solo Cy de genes CH humanos del isotipo IgG humana más frecuentemente utilizado en AcM terapéuticos, normalmente Cy1, Cy2 o Cy4, para facilitar mejor la maduración in vivo del dominio V humano en el contexto de un dominio CH1 humano clínicamente más relevante.

De acuerdo con la invención, el locus de IgH alterado comprende un segmento génico de bisagra superior humano. De manera opcional, las secuencias de bisagra superiores de los genes C endógenos se reemplazan por las secuencias de bisagra C humanas ortólogas, respectivamente. Como alternativa, las secuencias de bisagra superior y media de los genes C endógenos también pueden reemplazarse por las secuencias de bisagra C humanas ortólogas, respectivamente. Si se utilizan regiones de bisagra media humana, la secuencia de bisagra media de Cy4 humana se puede genomanipular para que contenga una prolina en la posición 229 en lugar de una serina para impulsar la dimerización entre cadenas pesadas a través de enlaces disulfuro. Las regiones de bisagra inferiores, parte del dominio CH2, de los genes Cy endógenos se dejaría tal cual para facilitar la unión óptima al FcyR endógeno. Esta genomanipulación producirá el dominio Fab de la cadena pesada humana más la bisagra superior, o F(ab')2 si las regiones de bisagra superior y media también se convierten en humanas, que será más probable que conserve las características óptimas tras la conversión a IgG completamente humana.

Los BAC que comprenden los loci de IgH endógena cadena abajo del grupo de genes J y cada gen de C retenido con los exones endógenos CH1 humanos CH2-CH3 (y CH4 para C j) y de dominio intracelular y de membrana se recombinarán de manera homóloga en el locus de IgH endógena en células competentes para la recombinación homóloga, tales como células ES de ratón, ya sea como una primera etapa de introducción seguido por el reemplazo de los genes V-D-J endógenos por sus ortólogos humanos o en el orden opuesto, introducción de V, D y J humanos seguidos de genes C endógenos genomanipulados como se describe anteriormente. El contenido del locus de Ig en el BAC no está restringido solo a los segmentos génicos C en uno y a los segmentos génicos V, D y J en el otro. El BAC con los segmentos génicos C también puede contener segmentos génicos J e incluso segmentos génicos D e incluso uno o más segmentos génicos V. Como alternativa, el BAC con segmentos génicos V puede contener segmentos génicos D e incluso segmentos génicos J e incluso uno o más segmentos génicos C.

Los BAC que portan los genes de la región constante pueden genomanipularse en E. coli o sintetizarse in vitro antes de la introducción en las células ES para eliminar cualquier segmento génico no deseado, tal como los genes Ce y Ca. Esto obligaría a los animales con inserción génica a producir C|j y C8 para las respuestas inmunitarias primarias e isotipos Cy para las respuestas inmunitarias secundarias maduradas por afinidad, de las que normalmente se recuperarían los candidatos a anticuerpos terapéuticos. La 3'LCR de IgH endógena puede dejarse inalterada.

Se emplearía una estrategia de reemplazo similar para el locus de IgK endógena, excepto que el gen de Ck humano completo también podría incorporarse opcionalmente en el BAC para reemplazar el locus Ck endógeno, produciendo así cadenas de IgK completamente humanas. El locus CA humano también podría incorporarse de manera similar.

Se describe, pero no se reclama en el presente documento, la incorporación de loci de Ig completamente humanos, incluidas las regiones C humanas, en lugar de los loci de Ig endógena completos. En el presente documento, el grupo de genes de FcR endógenos también se reemplaza con el grupo ortólogo de genes de FcR humanos utilizando genomanipulación similar basada en BAC en células competentes para la recombinación homóloga, tales como células ES de ratón. El grupo de genes de FcyR endógenos se puede reemplazar en la misma célula ES en la que el locus de IgH humana o porciones del mismo han reemplazado al locus endógeno o en una célula ES separada. En el último caso, los ratones procederían de dichas células ES y se cruzarían con ratones que portan el locus (loci) de Ig genomanipulado para producir ratones que producirían anticuerpos IgG humanos que se unirían al FcyR humano en lugar de genes de FcyR de ratón. De cualquier manera, se producirían anticuerpos completamente humanos y durante una respuesta inmunitaria podrían ser capaces de acoplarse normalmente a los receptores FcR humanos. Dichos animales con inserción génica también tendrían el beneficio de ser útiles para probar la actividad y la función efectora de los candidatos de AcM terapéuticos humanos en modelos de enfermedad cuando se cruzan con el acervo genético adecuado para el modelo, es decir, ratones SCID, nu/nu, nod e Ipr. Además, la secuencia génica diana humana puede reemplazar el gen endógeno utilizando la tecnología de direccionamiento de BAC en células competentes para la recombinación homóloga, lo que proporciona modelos para la validación de dianas y pruebas funcionales del anticuerpo. En este caso, los genes CH humanos pueden genomanipularse para tener segmentos génicos de dominio citoplásmico y/o de membrana de ratón u otras especies ortólogas para facilitar la transducción de señales natural en el linfocito B.

Un aspecto de la invención se refiere al diseño de la región V humana deseada. En particular, puede incorporarse un repertorio de dominios V humanos completo o una porción del mismo en el genoma de la célula, o puede incorporarse un repertorio de dominios V adaptado. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se prefiere omitir los segmentos génicos del dominio V que faltan en algunos haplotipos humanos y, en su lugar, adaptar el repertorio del dominio V para que esté compuesto solo por los segmentos génicos V funcionales comunes en todos los haplotipos humanos conocidos. Al hacerlo, se proporcionan candidatos a fármacos de anticuerpos con dominios V que tienen una mejor tolerancia inmunitaria en todos los posibles pacientes, evitando así la inducción de una respuesta inmunitaria peligrosa tras la administración del anticuerpo codificado a un sujeto. Pueden incorporarse uno o más segmentos génicos del dominio V.

En realizaciones preferidas de la invención, los BAC que contienen los segmentos génicos de los loci de Ig deseados se utilizan para incorporar esta información genética en la célula diana mediante recombinación homóloga. La naturaleza de la genomanipulación de los BAC en E. coli brinda oportunidades adicionales para adaptar finamente los loci de inmunoglobulina antes de la introducción en células competentes. Por ejemplo, el grupo DH humano se puede reemplazar o complementar con genes D de otras especies, tales como de primates no humanos, conejos, rata, hámster, etc. Las bibliotecas de BAC y la secuencia completa de los loci de Ig están disponibles para muchas especies. Los segmentos génicos D dentro de los loci de IgH se pueden definir a partir de información de secuencia o estructura genética disponible públicamente, o mediante pruebas con sondas o cebadores específicos de D adecuados. Los grupos de genes D ortólogos o porciones de los mismos se pueden recombinar de manera homóloga en los BAC o ensamblarse in silico y después sintetizarse, reemplazando o añadiendo en ellos el grupo de segmentos génicos D humanos. Debido a la importante diversificación que se produce al hacer la región determinante de la complementariedad -3 (CDR3, del inglés "complementarity determining region -3") y debido a que la estructura de la región V es tal que la CDR3 suele ser inaccesible a los disolventes, la inmunogenia de la secuencia CDR3 es menos preocupante. Por lo tanto, los aminoácidos codificados por genes D no humanos incorporados en la CDR3 tienen menos probabilidades de ser inmunogénicos. Los genes D no humanos podrían conferir una ventaja al producir nuevas estructuras CDR3 que expandirían la variedad de especificidades y afinidades de epítopos en un grupo de anticuerpos específicos de antígeno, ampliando así la calidad de las actividades mediadas por un grupo de AcM.

De manera similar, el grupo génico JH, es decir, uno o más segmentos génicos JH, puede ser de una especie distinta a la humana debido a la conservación de la secuencia relativa entre los mamíferos. El segmento génico JH puede proceder de cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, primate no humano, conejo, oveja, rata, hámster y ratón. En realizaciones particulares, el segmento génico JH es humano.

Después de genomanipular los loci de Ig en células de ratón competentes para la recombinación homóloga para reemplazar porciones o la totalidad de los loci de Ig endógena, los ratones genomanipulados se pueden producir mediante métodos ahora convencionales tales como la microinyección de blastocistos seguida de la reproducción de animales quiméricos, metodologías de agregación de mórulas o clonación, tales como la transferencia nuclear de células somáticas. Por ejemplo, los ratones con loci de IgH e IgL modificados pueden criarse para producir IgH e IgL homocigotas (ya sea IgK o IgA). La reproducción en varias etapas produciría animales homocigotos para los loci de IgH, IgK e IgA modificados. Los animales heterocigotos para los loci de IgH e IgL, que producirían anticuerpos tanto de ratón como de ser humano y ratón, también se puede utilizar para generar AcM C murina V humana específicos de antígeno, aunque algo menos eficaces que el uso de animales homocigotos porque también habría producción de anticuerpos a partir de los loci de Ig endógena activos. Los ratones heterocigotos y homocigotos para un solo locus alterado, por ejemplo, IgH, también podrían ser útiles como fuente de dominios VH humanos (VH-CH1) para bibliotecas de presentación de anticuerpos y cuando se mezclan con dominios VL de ratones heterocigotos u homocigotos para un locus de IgL alterado, especialmente si los ratones se inmunizaron (véase a continuación). Por ejemplo, una biblioteca de presentación de anticuerpos de dos ratones separados, uno con VH-CH1 humano CH2-CH3 de ratón y el otro con v K-CK humano, podría utilizarse para recuperar anticuerpos completamente humanos utilizando técnicas bien establecidas en biología molecular. Los ratones heterocigotos y homocigotos para más de un locus alterado, por ejemplo, IgH e IgK, también serían útiles como fuente de dominios VH y VL humanos para bibliotecas de presentación de anticuerpos.

Se describe un método para producir un ratón con inserción génica que tiene un genoma que codifica segmentos génicos VH y CH1 humanos y un locus de la cadena ligera de Ig humana que comprende las etapas de reproducir un ratón que comprende un locus de la cadena pesada de Ig quimérica, en donde el locus de la cadena pesada de Ig comprende los segmentos génicos VH y CH1 humanos, con un ratón que comprende un locus de la cadena ligera de Ig humana; seleccionar la descendencia que tenga un genoma que comprenda el locus de la cadena pesada de Ig quimérica y el locus de la cadena ligera de Ig humana; seguir reproduciendo la descendencia; y producir descendencia que tenga un genoma homocigoto para los loci de la cadena ligera humana y los de la cadena pesada quimérica. En aspectos relacionados, el genoma del ratón también codifica un segmento génico JH humano.

Esta estrategia de ingeniería genética también se puede aplicar a la genomanipulación de animales que no sean ratones para expresar regiones V de secuencia humana acopladas con regiones C xenogénicas o anticuerpos completamente humanos o algún intermedio de los mismos. Para los animales para los que actualmente falta tecnología de células ES para la genomanipulación a través de la microinyección de blastocistos o la agregación de mórulas, los loci endógenos se pueden modificar en células susceptibles de diversas tecnologías de clonación o reprogramación del desarrollo (por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas, IPS (del inglés "induced pluripotent stem")). La mayor frecuencia de recombinación homóloga proporcionada por la tecnología con BAC proporciona la capacidad de encontrar loci doblemente reemplazados en las células, y los animales clonados procedentes de ellos serían homocigotos para la mutación, de ahí el ahorro de tiempo y costes, especialmente cuando se reproducen animales grandes con largos tiempos de generación. Los reemplazos iterativos en las células cultivadas podrían proporcionar toda la genomanipulación necesaria en múltiples loci y después dirigir la producción de animales mediante clonación o tecnología con IPS, sin mestizaje para obtener los genotipos adecuados. La capacidad de adaptar finamente los genes de Ig introducidos y también especificar finamente los sitios en los que se introducen proporciona la capacidad de genomanipular mejoras que proporcionarían una mejor función. Animales genomanipulados tales como cabras, bovinos, ovinos, equinos, conejos, perros, etc. serían una fuente de anticuerpos policlonales completamente humanos.

Además, si los BAC se genomanipularon en E. coli con los componentes de ADN necesarios para la función cromosómica, por ejemplo, telómeros y un centrómero, preferentemente, pero no se requiere, de la especie receptora para un funcionamiento óptimo, por ejemplo, telómeros de ratón y un centrómero de ratón, se pueden introducir en la célula receptora mediante electroporación, microinyección, etc. y funcionarían como cromosomas artificiales. Estos cromosomas artificiales basados en BAC también podrían utilizarse como base para rondas posteriores de recombinación homóloga para construir cromosomas artificiales más grandes.

El locus o loci de Ig genomanipulados descritos en el presente documento en vectores tales como plásmidos, BAC o YAC también se pueden utilizar como transgenes convencionales introducidos mediante microinyección en el pronúcleo de un embrión tal como el de un ratón, conejo, rata o hámster. Varios BAC, YAC, plásmidos o cualquier combinación de los mismos pueden microinyectarse de manera conjunta y se integrarán de manera conjunta para formar un locus funcional. Se pueden utilizar varios métodos conocidos en la materia para inactivar los loci de Ig endógena y los animales con un transgén de Ig genomanipulada se reproducen con aquellos con uno o más loci endógenos inactivados para producir genotipos que expresan anticuerpos a partir del transgén y sin producción de la inmunoglobulina natural completa a partir de los loci endógenos inactivados.

Anticuerpos

Los ratones que portan los loci modificados se pueden inmunizar con antígenos diana utilizando diversas técnicas en la materia. Los antígenos diana pueden seleccionarse para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno en particular, tal como varios tipos de cáncer, enfermedad de injerto contra el hospedador, enfermedad cardiovascular y trastornos asociados, enfermedades y trastornos neurológicos, trastornos autoinmunitarios e inflamatorios e infecciones patógenas. En otras realizaciones, los antígenos diana pueden seleccionarse para desarrollar un anticuerpo que sería útil como agente de diagnóstico para la detección de una de las enfermedades o trastornos anteriores.

Los repertorios específicos de antígenos se pueden recuperar de ratones inmunizados mediante tecnología de hibridomas, RT-PCR de una sola célula para linfocitos B seleccionados, mediante tecnologías de presentación de anticuerpos y otros métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, para recuperar AcM a partir de hibridomas procedentes de ratón, un anticuerpo V-CH1 humana y bisagra+CH2+CH3 de ratón o un anticuerpo V-CH1-bisagra superior o media humana y bisagra inferior+CH2+CH3 de ratón (dependiendo de la genomanipulación del locus de IgH) se secretaría en el sobrenadante del cultivo y se puede purificar por medio de técnicas conocidas en la materia tal como la cromatografía en columna con proteína A, proteína G, etc. Dicho anticuerpo purificado se puede utilizar para realizar más pruebas y caracterizaciones del anticuerpo para determinar la potencia in vitro e in vivo, afinidad, etc.

Asimismo, ya que se pueden detectar con agentes secundarios de región constante antimurinos, el AcM V-CH1 humana (bisagra superior/media) y CH2-CH3 de ratón puede ser útil para ensayos inmunoquímicos de tejidos humanos para evaluar la distribución tisular y la expresión del antígeno diana. Esta característica de los anticuerpos quiméricos de la presente invención permite la confirmación de la especificidad del AcM sobre los AcM completamente humanos debido a las dificultades ocasionales en el uso de agentes de detección secundarios de región constante antihumanos contra tejidos que contienen Ig humana normal y de la unión de regiones Fc humanas a FcR humanos expresados en células en algunos tejidos.

Las regiones variables humanas de los AcM pueden recuperarse y secuenciarse mediante métodos covencionales. Ya sea antes o después de identificar los AcM candidatos principales, los genes, ya sea ADN genómico o ADNc, para los dominios VH y VL humanos se pueden recuperar mediante varios métodos de biología molecular, tal como RT-PCR, y después unirse al ADN que codifica la porción restante de la región constante humana, produciendo allí un AcM completamente humano. Los ADN que codifican la VH-CH ahora completamente humana y la VL-CL humana se clonarían en vectores de expresión adecuados conocidos en la materia o que se pueden construir a medida y transfectar en células de mamífero, células de levadura tales como Pichia, otros hongos, etc. para secretar anticuerpos en el sobrenadante de cultivo. Otros métodos de producción tales como la ascitis utilizando células de hibridoma en ratones, animales transgénicos que secretan el anticuerpo en la leche o los huevos, y plantas transgénicas que producen el anticuerpo en la fruta, raíces u hojas también se pueden utilizar para la expresión. El anticuerpo recombinante completamente humano se puede purificar mediante varios métodos tales como la cromatografía en columna con proteína A, proteína G, etc.

El anticuerpo purificado se puede liofilizar para su almacenamiento o formularse en diversas soluciones conocidas en la materia por su solubilidad y estabilidad y coherentes con la administración segura a los animales, incluidos los seres humanos. El anticuerpo recombinante purificado se puede utilizar para una caracterización adicional utilizando ensayos in vitro de eficacia, afinidad, especificidad, etc., modelos animales para la eficacia, toxicología y farmacocinética, etc. Además, el anticuerpo purificado se puede administrar a seres humanos con fines clínicos tales como terapias y diagnósticos de enfermedades.

Se pueden aislar varios fragmentos de los AcM V-CH1-(bisagra superior/media) human y CH2-CH3 endógenas mediante métodos que incluyen escisión enzimática, tecnologías recombinantes, etc. para diversos fines incluidos reactivos, diagnósticos y terapéuticos. El ADNc para los dominios variables humanos CH1 o solo los dominios variables humanos se pueden aislar de los mamíferos no humanos genomanipulados descritos anteriormente, específicamente a partir del ARN de órganos linfoides secundarios tales como el bazo y los ganglios linfáticos, y los ADNc de VH y VL implementados en varios sistemas de presentación de anticuerpos tales como fagos, ribosoma, E. coli, levaduras, mamífero, etc. Los mamíferos con inserción génica pueden ser inmunológicamente indiferenciados o pueden inmunizarse de manera óptima contra un antígeno de elección. Mediante el uso de cebadores de PCR adecuados, tales como 5' en la región líder o marco 1 del dominio variable y 3' en CH1 humano de los genes Cy, se pueden recuperar las regiones V maduradas de manera somática para presentar únicamente el repertorio madurado por afinidad. Los anticuerpos presentados se pueden seleccionar contra el antígeno diana para recuperar de manera eficaz Fv o Fabs completamente humanos específicos de antígeno de alta afinidad, y deshacerse de los dominios CH2-CH3 de ratón con inserción génica que estarían presentes si los AcM se recuperaran directamente de los anticuerpos de los ratones con inserción génica.

Métodos de uso

Los anticuerpos quiméricos purificados de la presente invención pueden ser útiles para la administración a un sujeto para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno particular, tal como varios tipos de cáncer, enfermedad de injerto contra el hospedador, enfermedad cardiovascular y trastornos asociados, enfermedades y trastornos neurológicos, trastornos autoinmunitarios e inflamatorios, alergias e infecciones patógenas. En realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano.

Las composiciones de anticuerpos se administran a sujetos en concentraciones de aproximadamente 0,1 a 100 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 1 a 10 mg/ml. Una composición de anticuerpos puede administrarse por vía tópica, por vía intranasal o mediante inyección, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraocular o subcutánea. Un modo preferido de administración es la inyección. La administración puede ocurrir en una sola inyección o una infusión a lo largo del tiempo, es decir, aproximadamente de 10 minutos a 24 horas, preferentemente de 30 minutos a aproximadamente 6 horas. Se puede administrar una dosis eficaz una vez o mediante una serie de inyecciones. Las dosis repetidas pueden administrarse dos veces al día, una vez al día, una vez a la semana, quincenal, tri-semanalmente, una vez al mes o una vez cada tres meses, dependiendo de la farmacocinética, farmacodinámica e indicaciones clínicas. La terapia puede continuarse durante largos períodos de tiempo, incluso en ausencia de cualquier síntoma.

Una composición de anticuerpos purificados puede comprender anticuerpos policlonales o monoclonales. Una composición de anticuerpos puede contener anticuerpos de múltiples isotipos o anticuerpos de un solo isotipo. Una composición de anticuerpos puede contener anticuerpos quiméricos no modificados o los anticuerpos se pueden haber modificado de alguna manera, por ejemplo, de manera química o enzimática. Una composición de anticuerpos puede contener anticuerpos humanos no modificados o los anticuerpos humanos se pueden haber modificado de alguna manera, por ejemplo, de manera química o enzimática. Por lo tanto, una composición de anticuerpos puede contener moléculas de Ig intactas o fragmentos de las mismas, es decir, Fab, F(ab')2 o dominios Fc.

La administración de una composición de anticuerpos contra un agente infeccioso, sola o en combinación con otro agente terapéutico, puede dar como resultado la eliminación del agente infeccioso del sujeto. La administración de una composición de anticuerpos puede reducir el número de organismos infecciosos presentes en el sujeto de 10 a 100 veces y preferentemente 1.000 veces y más de 1.000 veces.

De manera similar, la administración de una composición de anticuerpos contra células cancerosas, sola o en combinación con otro agente quimioterápico, puede dar como resultado la eliminación de células cancerosas del sujeto. La administración de una composición de anticuerpos puede reducir el número de células cancerosas presentes en el sujeto de 10 a 100 veces y preferentemente 1.000 veces y más de 1.000 veces.

El anticuerpo quimérico de la invención también puede utilizarse en métodos que lo utilizan para unir y neutralizar moléculas antigénicas, ya sean solubles o unidas a la superficie celular. Dicha neutralización puede mejorar la eliminación de la molécula antigénica de la circulación. Las moléculas antigénicas diana para la neutralización incluyen, pero sin limitación, toxinas, moléculas endocrinas, citocinas, quimiocinas, proteínas del complemento, bacterias, virus, hongos y parásitos. Dicho anticuerpo puede administrarse solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, incluidos otros anticuerpos, otros fármacos biológicos o agentes químicos.

También se contempla que un anticuerpo quimérico de la presente invención puede utilizarse en métodos para potenciar o inhibir la señalización de receptores de la superficie celular. Un anticuerpo específico para un receptor de la superficie celular puede ser útil como agente terapéutico o herramienta de investigación. Los ejemplos de receptores de la superficie celular incluyen, pero sin limitación, receptores de células inmunitarias, receptores de adenosina, receptores adrenérgicos, receptores de angiotensina, receptores de dopamina y serotonina, receptores de quimiocina, receptores de citocina, receptores de histamina, etc. Dicho anticuerpo puede administrarse solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, incluidos otros anticuerpos, otros fármacos biológicos o agentes químicos.

También se contempla que un anticuerpo quimérico de la presente invención pueda modificarse adicionalmente para mejorar el potencial terapéutico. Las modificaciones pueden incluir la conjugación directa y/o indirecta con productos químicos tales como agentes quimioterápicos, radioisótopos, ARNip, ARN bicatenarios, etc. Otras modificaciones pueden incluir regiones Fc genomanipuladas para aumentar o disminuir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, aumentar o disminuir la citotoxicidad dependiente del complemento, o aumentar o disminuir la semivida circulante.

Asimismo, se puede utilizar un anticuerpo como agente de diagnóstico para la detección de una de las enfermedades o trastornos anteriores. Un anticuerpo quimérico puede detectarse utilizando un agente de detección secundario que reconoce una porción del anticuerpo, tal como un dominio Fc o Fab. En el caso de la región constante, la porción reconocida puede ser un dominio CH1, CH2 o CH3. El dominio Ck y CA también puede reconocerse para detección. Los ensayos inmunohistoquímicos, tales como la evaluación de la distribución tisular del antígeno diana, pueden aprovechar la naturaleza quimérica de un anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, cuando se evalúa una muestra de tejido humano, el reactivo del agente de detección secundario reconoce la porción no humana de la molécula de Ig, reduciendo así la unión de fondo o no específica a las moléculas de Ig humana que pueden estar presentes en la muestra de tejido.

Composiciones farmacéuticas y kits

La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas y al anticuerpo quimérico de la invención para uso en terapia. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen un anticuerpo quimérico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse in vivo para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno. Además, las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo quimérico de la presente invención pueden incluir uno o más agentes para su uso en combinación, o pueden administrarse junto con uno o más agentes.

El anticuerpo quimérico de la presente invención también puede formar parte de kits relacionados con cualquiera de los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, y/o métodos descritos en el presente documento. Dichos kits pueden incluir métodos de diagnóstico o tratamiento. Además, pueden proporcionar instrucciones para el uso de una composición o anticuerpo y un envase.

El kit pueden incluir dispositivos, reactivos, recipientes u otros componentes, y también puede necesitar el uso de un aparato, instrumento o dispositivo, incluyendo u ordenador.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se proporcionan como ilustraciones adicionales de la presente invención.

EJEMPLO 1

DISEÑO DE BAC EN E. COLI

Como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2004/0128703, la manipulación de BAC en E. coli proporciona una poderosa herramienta para la adaptación fina del ADN genómico transportado en los BAC. Por ejemplo, para reemplazar CH1 de ratón por CH1 humano en uno o más de los genes de la región constante de ratón, por ejemplo, Cy1 o todos los genes Cy de ratón o C|j de ratón, C8 y todos los genes Cy de ratón, se produce un BAC de ratón modificado en E. coli y después se utiliza para la recombinación homóloga en células ES. Por ejemplo, en el BAC de direccionamiento, los exones CH1 de ratón de al menos uno y hasta todos los genes Cy se reemplazan por los exones CH1 humanos. Este reemplazo se realiza de manera similar en E. coli utilizando un método de recombinación homóloga. El BAC modificado resultante tiene un segmento configurado en la línea germinal que lleva la región D humana, la región J humana y la región C j de ratón cadena abajo, la región CS, la región Cy3 (CH1 de ratón de y3 se reemplaza por CH1 humano), la región Cy1 modificada (CH1 de ratón de y1 se reemplaza por CH1 humano), la región Cy2B modificada (CH1 de ratón de y2B se reemplaza por CH1 humano) y Cy2C modificada (CH1 de ratón de y2C se reemplaza por CH1 humano). Esta estrategia también se puede utilizar para modificar los exones CH1 de los genes C j y CS. También se pueden realizar otros reemplazos precisos tales como la secuencia de codificación de la región bisagra superior y media por humana para ratón. Más cambios finamente adaptados, incluidos cambios tan pequeños como de un solo codón y de un solo nucleótido, se pueden realizar en el ADN de reemplazo.

EJEMPLO 2

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DE BAC EN E. COLI

Un vector BAC se basa en el factor F que se encuentra en E. coli. El factor F y el vector BAC procedente de él se mantienen como plásmidos de bajo número de copias, que en general se encuentran como una o dos copias por célula dependiendo de su ciclo vital. Tanto el factor F como el vector BAC muestran el fenotipo fi+, lo que excluye una copia adicional del plásmido en la célula. Mediante este mecanismo, cuando E. coli ya lleva y mantiene un BAC, y después se introduce un BAC adicional en el E. coli, la célula mantiene solo un BAC, ya sea el BAC previamente existente en la célula o el BAC externo recién introducido. Esta característica es extremadamente útil para aislar de manera selectiva BAC recombinados de manera homóloga como se describe a continuación.

La recombinación homóloga en E. coli requiere el producto génico funcional RecA. En este ejemplo, el gen RecA tiene una mutación sensible a la temperatura, por lo que la proteína RecA solo es funcional cuando la temperatura de incubación es inferior a 37 °C. Cuando la temperatura de incubación es superior a 37 °C, la proteína RecA no es funcional o tiene una actividad de recombinación muy reducida. Esta recombinación sensible a la temperatura permite la manipulación de la función RecA en E. coli para activar la recombinación homóloga condicional solo cuando se desea. También es posible obtener, seleccionar o genomanipular mutaciones sensibles al frío de la proteína RecA de modo que la proteína solo sea funcional por encima de determinada temperatura, por ejemplo, 37 °C. En esa condición, E. coli se cultivaría a una temperatura inferior, aunque con un tiempo de generación más lento, y la recombinación se desencadenaría mediante la incubación a más de 37 °C durante un breve período de tiempo para permitir solo un breve intervalo de recombinación.

La recombinación homóloga en E. coli se lleva a cabo proporcionando sustratos de ADN superpuestos que se encuentran en dos BAC circulares. El primer BAC (BAC1) lleva los segmentos contiguos de A a E, y el segundo BAC (BAC2) lleva los segmentos contiguos de E a I. El segmento E que llevan ambos BAC es el segmento superpuesto donde se produce el cruce de ADN, y como resultado, produce un recombinante que lleva los segmentos contiguos desde A hasta I.

El BAC1 descrito anteriormente es el que ya está presente en la célula, y cuando se introduce BAC2 en la célula, solo puede existir BAC1 o BAC2 en la célula, no ambos BAC. Tras la electroporación de BAC2 en la célula, la temperatura se reduciría por debajo de los 37 °C para permitir la actividad condicional de RecA, mediando así la recombinación homóloga. Si BAC1 y BAC2 tienen un marcador seleccionable cada uno y los marcadores son claramente diferentes, por ejemplo, BAC1 lleva Kan (un gen que confiere resistencia a la kanamicina) y BAC2 lleva Amp (un gen que confiere resistencia a la ampicilina), solo el BAC recombinante crece en presencia de ambos antibióticos Kan y Amp.

Dado que hay dos segmentos génicos E en la región separada del BAC recombinante, el segmento E flanqueado por dos vectores debe eliminarse de una de dos maneras, una es mediante recombinación homóloga en los vectores o en la región E, y la otra se lleva a cabo por recombinación específica de sitio loxP mediante la recombinasa CRE. El BAC resuelto ahora tiene el tramo contiguo de A a I con una sola copia de E.

EJEMPLO 3

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA EN E. COLI

De acuerdo con el procedimiento detallado anteriormente, BAC1 y BAC2 se recombinan en E. coli. BAC1 y BAC2 tienen 156.427 pb y 122.500 pb, respectivamente, y se superponen en 42.363 pb. El tamaño del BAC resultante después de la recombinación y resolución es de 236.564 pb. bAC2 que contiene un gen Amp en el vector BAC o en el área adecuada del BAC se introduce en un bacilo de E. coli que lleva BAC1 que tiene un gen Kan en el vector BAC o en el área adecuada del BAC.

La introducción de un BAC a una célula de E. coli se hace normalmente mediante electroporación. Antes de la electroporación, las células se mantienen a 40 °C, una temperatura no permisiva para la recombinación, y después de la electroporación, las células se incuban a 30 °C, una temperatura permisiva para la recombinación. Durante la incubación, se produce una recombinación homóloga y las células expresan las enzimas necesarias para volverse resistentes a ambos antibióticos. El período de incubación es de aproximadamente 45 a 90 minutos. A continuación, las células se distribuyen en las placas de medios que contienen ambos antibióticos y las placas se incuban a 40 °C para evitar una mayor recombinación homóloga. La mayoría de las colonias aisladas que crecen en las placas de medios tienen el BAC recombinado que tiene el tamaño previsto. Esto se puede confirmar mediante análisis de electroforesis en gel de campo pulsado. La integridad del ADN recombinado se confirma con digestiones de restricción utilizando enzimas de restricción de corte raro y de corte infrecuente analizadas mediante electroforesis en gel de campo pulsado.

EJEMPLO 4

GENOMANIPULACIÓN DE UN BAC PARA REEMPLAZAR CH1 ENDÓGENO POR CH1 HUMANO

En este ejemplo, dos BAC (de 173.869 pb y 102.413 pb) se superponen en 6116 pb y se recombinan para producir un BAC de 270.165 pb. Para reemplazar el c H1 de ratón en el BAC del ratón por CH1 humano, se hace una construcción de ADN adecuada. La construcción se hace mediante síntesis química, PCR, técnicas de clonación convencionales o una combinación de estos métodos. La construcción tiene una secuencia CH1 humana flanqueada por brazos de secuencia de ratón que, en el genoma del ratón, flanquean también la región CH1 de ratón.

La construcción se recombina en E. coli con el BAC de ratón originario en uno u otro lado de las secuencias homólogas de ADN de ratón flanqueantes, y después de la recombinación y la resolución repetidas mediante la recombinasa Cre, se fabrica un BAC quimérico que tiene CH1 humano en sustitución de CH1 de ratón. Al repetir este proceso, todas las regiones CH1 de ratón de los genes Cy se reemplazan por regiones CH1 humanas, produciendo un BAC modificado que lleva todos los genes Cy con CH1 humano en lugar de CH1 de ratón.

De manera similar, los dominios CH1 de ratón de C|j, C5 se pueden reemplazar por los dominios CH1 humanos correspondientes. Si se desea, Ca y Ce también se pueden modificar de esta manera. También se pueden realizar reemplazos similares con los segmentos de bisagra superior y/o medio del gen(es) C. Si se incorpora una región bisagra media humana, la secuencia de ADN que codifica la bisagra media de Cy4 humana se puede genomanipular, tal como mediante síntesis química, con un codón que codifica la prolina que reemplaza el codón que codifica la serina 229 para efectuar la formación de uniones disulfuro intercatenarias en lugar de intracatenarias para estabilizar el dímero IgG4.

EJEMPLO 5

INTRODUCCIÓN DE BAC EN LAS CÉLULAS

En la preparación para la introducción en las células ES, se pueden recombinar en los BAC los casetes de expresión de mamíferos para marcadores seleccionables y para marcadores detectables. Dichos casetes contienen genes con los elementos reguladores necesarios tales como promotores, potenciadores y sitios de poliadenilación para la expresión de los genes en células de mamíferos, tales como células ES de ratón. Los genes en el casete pueden ser marcadores seleccionables tales como genes de resistencia y sensibilidad a fármacos para medicamentos tales como G418, higromicina, puromicina, ganciclovir (timidina cinasa), hipoxantina fosforribosil transferasa, etc. y marcadores detectables tales como la proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja fluorescente (RFP), luciferasa, etc. Dichos marcadores se utilizan para seleccionar y detectar células en las que se ha introducido el BAC y se han recombinado de manera homóloga.

Para la introducción en las células ES, el ADN del BAC se purifica a partir de E. coli y el ADN genómico de E. coli mediante métodos conocidos en la materia tales como el método de lisis alcalina, kits comerciales de purificación de ADN, gradiente de densidad CsCI, gradiente de sacarosa o electroforesis en gel de agarosa, que puede ir seguido por un tratamiento con agarasa. Para linealizar el ADN purificado, éste se digiere por Notl. Los dos sitios de Notl flanquean el sitio de clonación en el vector BAC y, por lo tanto, la digestión con Notl separa el inserto del vector. El inserto de ADN está libre del vector de ADN, que tiene un sitio loxP, excepto la pequeña región entre el sitio de clonación y el sitio Notl. Por lo tanto, el ADN que se va a transfectar en la célula de mamífero no lleva un sitio loxP a menos que se genomanipule de manera deliberada en el ADN que se va a transfectar en la célula de mamífero. Aunque el sitio Notl es extremadamente raro en el ADN genómico de inmunoglobulina humana y de ratón, si la construcción de ADN del BAC contiene uno o más sitios Notl, los sitios para otras enzimas de restricción raras tales como AscI, Asi-SI, Fsel, Pacl, Pmel, Sbfl y Swal, endonucleasas de asentamiento tales como I-Ceul, I-Scel, PI-Pspl, Pl-Scel o la A terminasa se introducirán en el área de unión entre el inserto y el vector. Esto se puede lograr mediante transposón, recombinación homóloga y otros métodos de clonación. El ADN linealizado, normalmente de 0,1 a 10 |jg de ADN dependiendo del tamaño, se introduce en las células de mamífero, tales como células ES, mediante métodos conocidos en la materia tales como transfección, lipofección, electroporación, precipitación de Ca o microinyección nuclear directa.

EJEMPLO 6

GENOMANIPULACIÓN DE LOCI DE IG A TRAVÉS DE LA INCORPORACIÓN DE BAC GRANDES A TRAVÉS DEL REEMPLAZO SECUENCIAL EN CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

La recombinación homóloga en E. coli para construir BAC más grandes se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2004/0128703. Dichos métodos se pueden utilizar para hacer BAC con inserciones de ADN más grandes que las representadas por el tamaño medio de las inserciones de las bibliotecas de BAC actualmente disponibles. Dichas inserciones más grandes pueden comprender ADN que representa los loci de Ig humana tales como IgH, IgK e IgA. Las inserciones de ADN también pueden comprender ADN que representa los loci de Ig endógena que incluyen parte o la totalidad del ADN que representa los genes de la región constante, que también pueden llevar modificaciones genomanipuladas en el ADN.

A modo de ejemplo, utilizando dichos BAC más largos, la región que contiene los segmentos génicos V, D y J de IgH humana está cubierta por solo 3 o 4 BAC separados, cada uno de los cuales tendría un tamaño aproximado de ~300 kb (Figura 1). La región que contiene los segmentos génicos de la región constante de IgH de ratón desde cadena abajo del grupo de segmentos génicos JH hasta justo cadena arriba de la región de control del locus en 3' de ratón se puede cubrir en un solo BAC de 170 a 180 kb. Estos BAC también llevan segmentos superpuestos para proporcionar homología con el BAC siguiente para la recombinación homóloga en células tales como las células ES. Utilizando estos BAC más largos, los segmentos génicos V, D y J de la IgH de ratón se reemplazan de manera secuencial por las secuencias humanas correspondientes y los segmentos génicos de la región constante de la IgH de ratón se reemplazan por segmentos génicos de la región constante humana-de ratón genomanipulados. Los reemplazos secuenciales están sustancialmente completos hasta la cantidad deseada.

El primer BAC que se introduce en las células ES puede estar compuesto por ADN de Ig humana flanqueado en cada lado por de 1 kb a 10 kb hasta 100 kb o más de ADN de ratón del genoma de ratón endógeno correspondiente en la célula ES. A continuación, el primer BAC reemplaza una porción del genoma endógeno de ratón mediante recombinación homóloga en las células ES, reemplazando el ADN endógeno de ratón entre los dos ADN flanqueantes, los cuáles son los sitios de direccionamiento, por el ADN humano genomanipulado entre los ADN flanqueantes en el BAC. Por ejemplo, mediante la construcción en E. coli de un BAC que contiene un tamaño conocido en kilobases de ADN de IgH humana que contiene regiones variables humanas, el grupo de genes DH y el grupo JH, flanqueados en el extremo 3' por ADN de ratón correspondiente a la región 3' del locus JH de ratón y flanqueados en 5' por ADN de ratón correspondiente a la región, del mismo tamaño conocido en kilobases, 5' del grupo JH de ratón, y la introducción del BAC purificado en las células ES de ratón para permitir la recombinación homóloga, los genes VH, DH y JH de ratón correspondientes serían reemplazados por el ADN humano ortólogo.

Los ADN de ratón que flanquean también podrían estar más alejados, por ejemplo, la homología 5' podría estar cadena arriba del gen de VH endógeno más 5', de modo que tras la recombinación homóloga, toda la región VH-DH-JH de ratón sería reemplazada por la VH-DH-JH humana en el BAC. En otras palabras, la longitud de la región del ADN endógeno a reemplazar está determinada por la distancia entre los dos segmentos de ratón flanqueantes en el BAC.

La distancia no es la longitud real entre los segmentos de ratón que flanquean en el BAC; más bien es la distancia entre los segmentos de ratón flanqueantes en el cromosoma de ratón endógeno. Esta distancia puede calcularse a partir de las bases de datos genómicas disponibles, tales como UCSC Genomic Bioinformatics, NCBi y otras conocidas en la materia.

Un segundo BAC, y cualquiera posterior, tendría dos segmentos que flanquean el ADN que se va a introducir. Para los dos ADN flanqueantes, uno está compuesto por ADN humano que corresponde a la totalidad o una porción del ADN humano introducido en el genoma celular en el primer reemplazo y el otro es ADN de ratón que corresponde al ADN endógeno cadena arriba (o cadena abajo según sea el caso) de la región que se va a reemplazar en la segunda introducción.

Tras la introducción en una célula competente para la recombinación homóloga, tal como una célula ES de ratón en la que un primer ADN del BAC ha reemplazado una porción del locus endógeno, por ejemplo, en el locus de IgH del ratón, se produciría un entrecruzamiento entre la secuencia flanqueante humana del BAC y la secuencia humana en el cromosoma de ratón modificado, y el otro entre la secuencia de ratón del BAC y la correspondiente región de ratón de dicho cromosoma (véase la figura 1B y la figura 1C). Dicho de otra manera, en el segundo BAC, la secuencia flanqueante humana incluye un segmento homólogo a la porción final de la secuencia de ADN humano del primer BAC previamente integrado en el cromosoma.

De esta manera, cuando se unen mediante recombinación homóloga en células ES, los segmentos unidos se convierten en un segmento contiguo. Dicho segmento puede estar configurado en la línea germinal, tal y como se encuentra de manera natural en los seres humanos o debido a inserciones, deleciones o reordenamientos genomanipulados a propósito, o puede tener una configuración diferente a la línea germinal. La secuencia flanqueante de ratón en el segundo BAC corresponde al ADN cromosómico endógeno de ratón que está a una distancia específica y deseada de la secuencia humana recién introducida en el cromosoma del ratón. La distancia entre los dos segmentos de ratón es lo suficientemente larga como para que el reemplazo de la IgH endógena de ratón se complete según lo previsto después de la recombinación homóloga repetida.

Por ejemplo, utilizando BAC con inserciones de ADN humano adecuadas de los loci VH, DH y JH y flanqueados con ADN de direccionamiento adecuadamente ubicados, sería posible reemplazar todos los genes de VH, DH y JH de ratón endógenos por sus homólogos humanos correspondientes con 2 a 3 reemplazos secuenciales con BAC adecuadamente genomanipulados en E. coli, como se describe anteriormente, para facilitar la recombinación homóloga en células de mamífero, que incluyen células ES, y dejando allí los genes V-D-J humanos unidos de manera operativa a los loci de la región constante de ratón cadena abajo. En un tercer, cuarto o quinto reemplazo, utilizando un BAC con una inserción de ADN humano adecuado que lleva los genes de C|j, C8 y Cy humanos y opcionalmente Ca, Ce y la región de control del locus (LCR) en 3' humana, y flanqueado por ADN humano y de ratón correspondiente al ADN introducido y endógeno, respectivamente, las regiones C endógenas de ratón se pueden reemplazar con sus homólogos humanos.

Como alternativa, el ADN genómico que comprende los genes de la región constante puede ser de origen murino y puede genomanipularse con las modificaciones deseadas, tales como el reemplazo del dominio CH1 de todas las regiones constantes de ratón, o seleccionadas, por ADN de CH1 humana, y/o las regiones bisagra superior y la media opcional de algunos o todos los genes C de ratón por las correspondientes secuencias génicas humanas, todas flanqueadas por el ADN de direccionamiento adecuado como se describe anteriormente. Además, algunas de las regiones C de ratón, por ejemplo, Ce y/o Ca y/o uno y hasta todos los segmentos génicos Cy, se pueden eliminar de tal manera que la 3'LCR de ratón endógena estaría más cerca que la proximidad de la línea germinal a la región constante más en 3' en el BAC, y tras la recombinación homóloga en el genoma, se efectuaría la eliminación de los segmentos génicos C endógenos ausentes del BAC de direccionamiento.

El orden de introducción de los BAC y los reemplazos secuenciales pueden ser de distal a proximal o de proximal a distal.

EJEMPLO 7

GENOMANIPULACIÓN DE LOCI DE IG MEDIANTE LA INCORPORACIÓN DE BAC GRANDES Y EL USO DE RECOMBINASAS ESPECÍFICAS DE SITIO EN CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Como alternativa, los sitios para recombinasas específicas de sitio, tales como loxP/CRE o frt/flp, se pueden emplear para facilitar la genomanipulación de los loci de Ig mediante la introducción de secuencias de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio en los ADN que se introducirán en los vectores de recombinación homóloga, y a continuación, cuando la recombinasa específica de sitio se exprese o introduzca, la recombinación ocurrirá entre las secuencias, eliminando allí las secuencias intermedias. De esta forma, se incorporan dos o más BAC no superpuestos en el locus de Ig endógena mediante recombinación homóloga. El BAC en 5' contiene una secuencia de reconocimiento loxP o frt en su región 3', mientras que el BAC en 3' contiene un sitio loxP o frt en su región 5', y la secuencia endógena restante entre las secuencias recién introducidas se elimina mediante recombinación específica de sitio.

Los BAC se pueden genomanipular para introducir sitios loxP o frt que flanquearán las secuencias intermedias. Posteriormente, la expresión de recombinasa CRE o flp, respectivamente, ya sea en las células o en el organismo genomanipulado procedente de las mismas, desencadenará una recombinación específica de sitio entre los sitios loxP y frt, eliminando así las secuencias intermedias (Figuras 4 y 5).

Después de identificar los clones recombinados de manera homóloga que incorporan el segundo vector de direccionamiento del BAC en la ubicación precisa, incluida el rendimiento del ensayo, por ejemplo, hibridación fluorescente in situ con sondas de ADN del primer y segundo BAC, para confirmar la integración cis del segundo BAC en el cromosoma que lleva el primer BAC integrante, el primer y el segundo BAC están separados por una cantidad de ADN endógeno intermedio del locus de ratón. La cantidad y el contenido de este ADN endógeno intermedio está determinado por la ubicación del ADN flanqueante en 3' en el primer BAC y el ADN flanqueante en 5' en el segundo BAC. Esta porción intermedia restante de la secuencia de ratón contenida entre los sitios loxP o frt que se introdujeron mediante recombinación homóloga se elimina mediante la recombinasa CRE o la recombinasa flp. La recombinasa CRE o la recombinasa flp se pueden expresar de manera transitoria en clones que tienen ambos insertos de BAC dirigidos correctamente. La recombinasa CRE o la recombinasa flp actúan de manera eficaz y precisa sobre el sitio loxP o los sitios flp, respectivamente, eliminando así el ADN intermedio entre dichos sitios. La confirmación de la eliminación y la unión precisa de los dos BAC, el 3' del primer BAC unido al 5' del segundo BAC, se puede detectar mediante transferencias Southern como se describe en el presente documento.

En otra alternativa más, se puede utilizar un sitio loxP y la recombinasa Cre para introducir de manera selectiva un sitio lox que porta ADN exógeno en un sitio lox-P ya incorporado en los loci de Ig genomanipulados. De esta manera, se puede introducir contenido de ADN adicional en los loci genomanipulados.

EJEMPLO 8

REEMPLAZO SECUENCIAL DE ADN ENDÓGENO DESDE LA DIRECCIÓN 5'

La dirección del reemplazo en las células competentes para la recombinación homóloga, tales como células ES, se puede realizar desde el extremo 5' o desde el extremo 3' de la dirección transcripcional. Sin embargo, la modificación del BAC debe realizarse de acuerdo con la configuración del requisito de homología para la recombinación homóloga en células competentes.

Por ejemplo, en la dirección del extremo 5', el primer BAC que se utilizará tiene el lado del telómero de los segmentos génicos V de IgH de la secuencia humana flanqueado a ambos lados por ADN de ratón endógeno para dirigirse al locus de IgH de ratón. El BAC final que se utilizará en el proceso de reemplazo iterativo es un BAC modificado como se describe anteriormente que tiene dominios CH1 humanos que reemplazan dominios CH1 de ratón en algunas o todas las regiones constantes endógenas de ratón. El ADN cadena arriba del ADN configurado en la línea germinal de la región C de ratón (con la excepción de los reemplazos del dominio CH1 y opcionalmente los reemplazos de la bisagra superior y opcionalmente también media) sería ADN humano correspondiente a una porción ya integrada en el locus de IgH modificado y el ADN cadena abajo sería la secuencia de ratón en 3' del Cy de ratón más en 3' en el ADN de reemplazo para efectuar la eliminación de Ca y Ce y cualquier segmento génico Cy pero sin afectar el contenido de la 3'LCR de ratón. Como se ha señalado anteriormente, los ADN flanqueantes pueden variar en tamaño de 1 kb a 10 kb hasta 100 kb o más grandes.

EJEMPLO 9

REEMPLAZO SECUENCIAL DE ADN ENDÓGENO DESDE LA DIRECCIÓN 3'

En la dirección 3', el primer BAC es un BAC modificado basado en el último BAC para el reemplazo direccional en 5'. Además, el primer BAC tiene un segmento de ratón adicional de 1 kb a 10 kb hasta 100 kb o más en el otro lado de la secuencia humana. Por ejemplo, el segmento de 1 kb a 10 hasta 100 kb o más comienza alrededor del extremo 5' de la región D hacia el telómero del cromosoma de ratón. El último BAC es un BAC modificado del primer BAC utilizado para el reemplazo desde la dirección 5'. La modificación es una adición de 1 kb a 10 hasta 100 kb o más del segmento de ratón en el extremo de la secuencia humana. La región de 1 kb a 10 hasta 100 kb o más comienza desde el extremo del primer segmento génico V de IgH hacia el exterior de IgH.

EJEMPLO 10

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DEL LOCUS DE IgK

Una estrategia de reemplazo, como se describe anteriormente, también se puede realizar en un locus de IgK endógena en un cromosoma celular, por ejemplo, en una célula ES de ratón. Para reemplazar los genes de Vk de ratón endógenos con el contenido de los genes de Vk humanos correspondientes, se pueden necesitar solo dos reemplazos iterativos. Esto se debe a que el contenido de genes de Vk humanos es redundante, con los genes de Vk humanos representados aproximadamente 2 veces, con un grupo proximal orientado en la misma orientación 5'-3' que el gen de Jk y Ck y este grupo duplicado en una orientación distal e invertida. Este grupo invertido y duplicado representa solo aproximadamente un 10 % del repertorio de Vk expresado en seres humanos. Además, esta duplicación distal e invertida falta en aproximadamente un 10 % de los seres humanos. Por consiguiente, tan solo dos bAc superpuestos podrían comprender el repertorio de Vk humano único más los genes Jk humanos y el gen de Ck humano como se muestra en la figura 2.

Como alternativa, dos BAC que no se superponen se recombinan de manera homóloga en el locus de IgK, y cada BAC introduce una secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio, tal como loxP o frt. El BAC en 5' contiene, por ejemplo, un sitio de reconocimiento de recombinación específica de sitio en su región 3', y el BAC en 3' contiene un sitio de reconocimiento de recombinación específica de sitio en su región 5'. Tras la expresión de la recombinasa específica del sitio, las secuencias de IgK de ratón intermedias entre los dos sitios de reconocimiento de recombinación específica de sitio se eliminan, uniéndose así las secuencias introducidas por los BAC (Figura 5).

EJEMPLO 11

RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA DEL LOCUS DE I^gA

Una estrategia de reemplazo como se describe anteriormente también se puede realizar en el locus de IgA endógena en un cromosoma celular, tal como en una célula ES de ratón. Para reemplazar los genes de VA de ratón endógenos con los genes de VA humanos correspondientes, se pueden necesitar solo dos reemplazos iterativos (Figura 3). Sin embargo, debido a que la organización genómica del locus de IgA es diferente en ratones frente a seres humanos, debe buscarse una estrategia de genomanipulación alternativa para implantar los genes de VA-JA de IgA humana. En ratones, el locus de IgA consiste en dos grupos de genes separados pero vinculados, cada uno compuesto por uno o dos genes de VA cadena arriba de dos conjuntos de genes de JA-CA emparejados. El VA más cadena arriba rara vez se reorganiza en el par JA-CA más cadena abajo. En los seres humanos, hay aproximadamente 30 genes de VA funcionales cadena arriba de 7 grupos JA-CA.

Además, dejando las regiones constantes de ratón, específicamente las 3'LCR de IgA de ratón, EA2-4 y/o EA3-1, intactas y sin modificar probablemente conduciría a un locus genomanipulado que no se expresaría en la proporción 60/40 de k:A de los seres humanos y más bien se expresaría en la proporción 95/5 de k:A de los ratones debido a mutaciones, probablemente provocadas por defectos en la unión de NF-kB, que están presentes en las 3'LCR de IgA de ratón (véase, por ejemplo, Combriato y Klobeck, J. Immunol. 168:1259-1266). Debido a que el locus de IgA humana contribuye con una cantidad sustancial de diversidad al repertorio total de cadenas ligeras humanas, es beneficioso genomanipular de manera adecuada el BAC de IgA humana para recapitular la respuesta inmunitaria humana genuina a fin de aumentar la eficacia y la probabilidad de generar AcM terapéuticamente útiles contra un amplia gama de dianas antigénicas.

Los BAC genomanipulados reemplazan el locus de IgA de ratón endógena con el homólogo humano y restauran una 3'LCR de IgA funcional de manera más completa cadena abajo de las regiones constantes (Figura 6). Se pueden emplear varias estrategias alternativas. Todo el locus de IgA de ratón se puede reemplazar por el locus humano mediante el direccionamiento secuencial de una serie de BAC que se superponen en el locus de IgA humana, incluida la 3'LCR de IgA humana completamente funcional en el locus de IgA de ratón, reemplazando de manera secuencial todo, incluyendo las 3'LCR. Como alternativa, los BAC superpuestos se pueden genomanipular para contener todos, o una porción de, los genes de VA humanos y los 1 a 7 pares de JA-CA pero con genes de CA de ratón reemplazando los genes de CA humanos de manera que el ratón produce cadenas de IgA quiméricas de VA humana y CA de ratón. Como alternativa, el locus de IgA humana se puede reconstruir en BAC superpuestos para parecerse a la configuración del locus de IgK humana, con el conjunto completo, o subconjunto, de genes de VA humanos, un grupo de 1 a 7 genes de JA y un solo gen de CA humano, o de ratón, seguido por la 3'LCR humana. Se confirma la inclusión de secuencias donantes y aceptoras de empalme adecuadas en el grupo JA y en el gen de CA y, si es necesario, se genomanipula en los BAC(s) en E. coli o durante la síntesis química y el ensamblaje, antes de la introducción en las células ES. Este locus reconfigurado se reorganiza y empalma de manera adecuada. Sin embargo, es posible que dicha construcción pueda reorganizarse de manera más eficaz que en el locus de IgA humano configurado en la línea germinal, lo que conduce a una representación proporcionalmente más elevada de IgA en relación con IgK en el repertorio de cadenas ligeras que la que se observa en seres humanos.

Otras configuraciones del locus humano e introducciones en el locus de IgA de ratón para producir regiones V de IgA humana unidas con genes de CA humanos o de ratón se pueden diseñar y genomanipular de manera fácil. Ya sea la región 3'LCR de IgA humana con sitios de unión a NFkB funcionales o el control 3'LCR de IgA de ratón con mutaciones introducidas, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio in vitro, para restaurar la unión a NFkB (véase, por ejemplo, Combriato y Klobeck, J. Immunol. 168:1259-1266), o una subporción funcional de cualquiera de ellos, tal como el sitio hipersensible a la ADNasa I 3 de la 3'LCR de IgA humana, se incluye cadena abajo del gen de CA final en un grupo en todas las construcciones. Como alternativa, una 3'LCR de IgA funcional o una subporción funcional de la misma de otra especie, por ejemplo, rata, primate no humano, podría incluirse. Como alternativa, se podría utilizar una 3'LCR de IgK funcional de ser humano, ratón u otra especie.

A menos que se elimine de manera específica o cuya secuencia no esté incluida en el ADN humano ensamblado y sintetizado químicamente, el proceso de introducción del repertorio de VA humano también introducirá los genes para la cadena ligera sustituta (SLC, del inglés "surrogate light chain") humana, que está dentro de la matriz de genes de VA humanos en el ADN de la línea germinal. Los genes de SLC de ratón están vinculados al locus de IgA, pero separados por cientos de kilobases, y no se verían alterados en esta estrategia, por lo que los ratones transgénicos expresarían de manera conjunta SLC humana y de ratón.

El repertorio humano de VA se puede agrupar en tres grupos: A, B y C. El grupo A, más próximo a los pares J-C, es el más utilizado, seguido por el grupo B y después el C. Se pueden incorporar uno, dos o tres de estos grupos de VA. La estrategia en el presente documento permite genomanipular cualquiera o todos o una porción de los grupos de VA humanos en el genoma del ratón y reemplazar el locus endógeno de ratón.

EJEMPLO 12

SELECCIÓN DE CÉLULAS DE MAMÍFERO NO HUMANO DESPUÉS DE LA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA

Para identificar células de mamífero, tales como células ES, que son el resultado de la recombinación homóloga, se emplean una serie de procedimientos de selección y detección seguidos de análisis moleculares (Figuras 1, 2 y 3). En primer lugar, las células se cultivan en presencia de un fármaco para el que al menos un gen de resistencia al fármaco está representado en el BAC introducido para seleccionar células que llevan de manera estable el BAC. El BAC puede llevar opcionalmente un marcador de selección negativa tal como la timidina cinasa en el extremo exterior de una o ambas regiones de direccionamiento flanqueantes para seleccionar frente a integrantes aleatorios. Como alternativa, los clones positivos para un marcador de resistencia al fármaco podrían seleccionarse y duplicarse las placas, uno para probar la resistencia al fármaco y otro para probar la sensibilidad al fármaco. De manera opcional, el BAC también llevaría un marcador detectable tal como GFP o RFP aproximadamente adyacente al marcador seleccionable. Los clones GFP+ o RFP+ podrían detectarse mediante FACS o microscopía de fluorescencia. Tanto los marcadores detectables como los seleccionables positivos son internos al ADN de direccionamiento flanqueante para integrarse de manera estable en el genoma junto con el ADN de reemplazo.

Para confirmar la recombinación homóloga en clones seleccionados (resistentes a fármacos) y, opcionalmente, detectables (por ejemplo, GFP+), el ADN genómico se recupera de clones aislados y se realiza un análisis de fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP, del inglés "restriction fragment length polymorphism") mediante una técnica tal como transferencia Southern con una sonda de ADN a partir de los loci endógenos, mapeándose dicha sonda fuera de la región reemplazada. El análisis RFLP muestra diferencias alélicas entre los dos alelos, el ADN endógeno y el ADN entrante, cuando la recombinación homóloga ocurre mediante la introducción de un nuevo sitio de restricción en el ADN de reemplazo. Debido a que los brazos de ADN flanqueantes >10 kb de tamaño pueden generar RFLP que son grandes y difíciles de resolver mediante electroforesis en gel de agarosa convencional, se pueden utilizar geles de agarosa de bajo porcentaje o electroforesis en gel CHEF. Los brazos de ADN flanqueantes de aproximadamente 10 kb o menos de tamaño generan RFLP que pueden resolverse mediante electroforesis en gel de agarosa convencional. Como alternativa, un sitio de restricción puede genomanipularse de manera deliberada en el ADN de reemplazo en el BAC durante la construcción del vector de reemplazo para genomanipular un fragmento de tamaño conveniente que abarque la unión del ADN introducido y el ADN endógeno en la digestión de restricción y que abarque la secuencia de sonda designada. Además del análisis de RFLP, la integración cis puede detectarse con hibridación in situ con fluorescencia (FISH, del inglés "fluorescence in situ hybridization") para confirmar la ubicación del ADN introducido de acuerdo con métodos conocidos en la materia.

Para la genomanipulación posterior, los diferentes marcadores seleccionables y/o detectables son solo internos a un brazo flanqueante mientras que el brazo flanqueante opuesto para la recombinación homóloga, que se superpone con el brazo lateral que lleva los marcadores seleccionables y/o detectables utilizados para dirigir el BAC1, no lleva marcadores, de manera que el acontecimiento de recombinación homóloga elimina los marcadores introducidos en el BAC1 de direccionamiento e introduce un nuevo marcador seleccionable y/o detectable en el extremo opuesto (interno del brazo flanqueante opuesto). Por ejemplo, los marcadores fluorescentes alternan entre GFP y RFP después de cada ronda de recombinación homóloga, de modo que la ronda 1 introduce GFP y la ronda 2 elimina GFP e introduce RFP. Si se produce una inserción aleatoria, ambos marcadores fluorescentes existen en las células ES. Se puede utilizar un citómetro de flujo con capacidad de clasificación de células para clasificar y retener células en función de la presencia de señales de una proteína fluorescente y la ausencia de señal de otra. Los marcadores de resistencia a fármacos se pueden utilizar de manera similar, por ejemplo, con un par de marcadores de selección positiva y negativa (Figuras 6A y 6B).

A través de la planificación avanzada convencional, debería ser posible reemplazar el ADN endógeno con ADN humano en loci del tamaño de una megabase a través de rondas iterativas de recombinación homóloga utilizando solo 2 pares diferentes de combinaciones de un marcador seleccionable y un marcador detectable. Sin embargo, también se podrían utilizar tres o más conjuntos de marcadores seleccionables y detectables.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula de ratón competente para la recombinación homóloga que tiene un genoma que comprende (1) un segmento génico VH humano y (2) una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica, que comprende

(a) una parte de los segmentos génicos de ratón cadena abajo de JH,

(b) un dominio CH1 singénico reemplazado por un dominio CH1 humano,

(c) un segmento génico de bisagra superior humana,

(d) un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón,

y

en donde dicho segmento génico VH humano y dicho locus de la cadena pesada de Ig singénica reemplazan la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena, dando así como resultado un locus de la cadena pesada de Ig quimérica capaz de sufrir un reordenamiento génico y produciendo así un repertorio diversificado de anticuerpos quiméricos de manera que dicha célula comprende un genoma que codifica una cadena pesada de Ig quimérica.

2. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la porción de (2) comprende además una región de control de locus (LCR) en 3'.

3. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

- un segmento génico JH humano.

4. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

- un segmento génico DH de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en ser humano, primate no humano, conejo, oveja, rata, hámster y ratón.

5. La célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha célula es una célula madre embrionaria.

6. Un método para producir la célula de ratón competente para la recombinación homóloga de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de:

producir un primer BAC que comprende un segmento génico VH humano;

producir un segundo BAC que comprende una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica, que comprende

(a) una parte de los segmentos génicos de ratón cadena abajo de JH,

(b) un dominio CH1 singénico reemplazado por un dominio CH1 humano,

(c) un segmento génico de bisagra superior humana,

(d) un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón; e

introducir dicho primer BAC en una célula de ratón competente para la recombinación homóloga y reemplazar la totalidad o una porción de un segmento génico VH endógeno mediante recombinación homóloga; e introducir dicho segundo BAC en dicha célula y reemplazar la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena mediante recombinación homóloga, en donde dicha célula comprende un genoma que codifica una cadena pesada de Ig quimérica.

7. Un ratón con inserción génica (knock-in) que tiene un genoma que comprende (1) un segmento génico VH humano y (2) una porción de un locus de la cadena pesada de Ig singénica, que comprende

(a) una parte de los segmentos génicos de ratón cadena abajo de JH,

(b) un dominio CH1 singénico reemplazado por un dominio CH1 humano,

(c) un segmento génico de bisagra superior humana,

(d) un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón,

en donde dicho segmento génico VH humano y dicho locus de la cadena pesada de Ig singénica reemplazan la totalidad o una porción de un locus de la cadena pesada de Ig endógena, dando así como resultado un locus de la cadena pesada de Ig quimérica capaz de sufrir un reordenamiento génico y produciendo así un repertorio diversificado de anticuerpos quiméricos, de manera que dicho ratón comprende un genoma que codifica una cadena pesada de Ig quimérica.

8. El ratón con inserción génica de la reivindicación 7, en donde la porción de (2) comprende además una región de control de locus (LCR) en 3'.

9. Un anticuerpo quimérico que comprende un VH humano, un dominio CH1 humano, una región bisagra superior humana, un dominio CH2 de ratón y un dominio CH3 de ratón.

10. El anticuerpo quimérico de la reivindicación 9 que comprende una cadena ligera de Ig humana.

11. Uso de un ratón de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 para la producción de un anticuerpo quimérico que se une de manera específica a un antígeno diana, en donde el ratón se inmuniza con dicho antígeno diana y se recupera dicho anticuerpo.

12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. El anticuerpo quimérico de las reivindicaciones 9 o 10 para uso en terapia.