CN108486125B - 一种核酸分子及其在制备人源单域抗体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种核酸分子及其在制备单域抗体中的应用，所述核酸分子包括了宿主动物的免疫球蛋白基因或其片段，其特征在于：包括了宿主动物的IgH 5’‑端增强子、IgM的转换元件（Sμ）和IgM序列，所述IgM序列全部为宿主动物IgM序列，其中IgM缺失CH1序列（IgM‑dCH1），IgG的表达控制元件来源于宿主动物，包括Sγ、TM1、TM2和PolyA等序列，IgG的Cγ序列（Hinge、CH2和CH3）来源于人的序列（Igγ‑dCH1）。本发明保证了转基因动物B‑细胞的正常发育，并且转基因动物表达的是人的单域抗体，减少后期的人工改造和提高了抗体的成药性。

Description

一种核酸分子及其在制备人源单域抗体中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要是一种核酸分子及其应用。
背景技术
单域抗体(Heavy-chain-only)又称纳米抗体(Nanobody)，是指只有重链的免疫球蛋白抗体。与完整抗体的的质量(150-160kDa)相比，单域抗体要小得多，只有大约50kDa。
单域抗体在自然界(骆驼科动物和鲨鱼)也存在。第一个单域抗体是从骆驼中分离出来的，它利用特殊的VHH序列。另一种制作单域抗体的方法是利用转基因动物的方法来完成：2003年Nguyen等，2005年Zou等利用Igγ2a的CH1突变-构建转基因载体，转基因小鼠高表达了单域抗体；2007年Zou等证明在没有小鼠轻链(Kappa和Lambda链)的情况小，小鼠也能自然产生单域抗体。
单域抗体的特点是分子量小，能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如一些癌症的治疗和图影诊断；可以口服治疗大肠杆菌引起的腹泻以及消化道疾病如炎症性肠病和大肠癌等；单域抗体可以通过血脑屏障，并且和完整的抗体相比更容易渗透到大型肿瘤当中，因此有可能开发出治疗脑肿瘤的药物和双特异性抗体。容易进行抗体的改造，减少制药成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸分子，可以用于制备全人单域抗体，减少后期的人工改造和提高了抗体的成药性。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种核酸分子，包括了免疫球蛋白基因或其片段，其特征在于：包括IgG基因(Igy)和IgG转换元件(switch regionγ，Sγ)和/或IgM基因(IgHCμ)和IgM转换元件(Sμ)；其中IgM基因/IgG基因缺失CH1功能。
进一步的，所述Sμ、Sγ、IgHCμ为宿主动物序列。
上述IgHCμ包括宿主动物IgM的CH2、CH3、CH4外显子及之间的序列，以及TM1、TM2、polyA信号等。具体的，所述IgHCμ结构如图3-1所示。
上述核酸分子还包括宿主动物的IgH 5’-端的增强子(5’-En)。所述增强子位于转换元件(Sμ或Sγ)的5′-端。具体的，其结构如图1和3所示。IgH 5’-端增强子与IgH的VDJ基因片段的重组和转录有关，并能增强抗体的表达量和抗体亚型的转变。IgM的CH1序列可以是完全缺失或者CH1序列中发生突变。在IgM的表达过程中只用CH2、CH3和CH4以及TM1和TM2等序列。
重链的IgM的CH2、CH3、CH4、TM1和TM2等(其中CH1缺失，IgM-dCH1)序列及其5’-增强子和表达调控等序列都来源于宿主动物序列(如图3绿色所示)。IgH 5’-端的增强子(5’-En)，IgM的转换元件(switch region，Sμ)序列，IgM的CH2、CH3、CH4(去除外显子CH1和之后的内含子序列，IgM-dCH1)以及TM1、TM2和PolyA以及之间的所有序列都来源于宿主动物，保证IgM的在宿主动物中高表达和B-细胞发育。当宿主动物为小鼠时，用小鼠IgH 5’-端的增强子(5’-En)，小鼠IgM的转换元件(switch region，Sμ)序列，小鼠IgM的CH2、CH3、CH4(去除外显子CH1和之后的内含子序列，IgM-dCH1)以及TM1、TM2和PolyA以及之间的所有序列，保证小鼠的B-细胞发育和抗体成熟。
更具体地，所述IgH 5’-端增强子、IgH Cμ的转换元件(Sμ)和IgM-dCH1序列为SEQID No.2所示。
上述Igγ包括人的Hinge、CH2、CH3外显子及之间的序列，缺失CH1序列或CH1序列中有突变的IgG命名为Igγ-dCH1。所述Igy-dCH1表达调控序列都来源于宿主动物序列，包括宿主动物的转换元件(switch region，Sγ)序列和宿主动物的终止信号(PolyA)、TM1和TM2等序列。如来源于小鼠的Igγ3、Igγ1、Igγ2a和Igy2b的表达调控元件等。具体地，所述Igy元件结构如图1-1所示：人的Hinge、CH2和CH3外显子序列在小鼠的Igγ表达调控元件(Sγ、TM1、TM2和PloyA等)的控制下得以表达。进一步提高了IgG的表达量和特异性。更具体的，所述小鼠5’-En，Sγ1和Igγ1-dCH1序列为SEQ ID NO.1。人的Igγ1的Hinge、CH2和CH3替代小鼠的Igγ1的CH1、Hinge、CH2和CH3的序列为SEQ ID NO.3。
上述Igγ序列，可以包括人Igγ的各种亚型，即Igγ3、Igγ1、Igγ2和/或Igγ4等；所述Igγ3，Igy1，Igy2，和(或)Igy4包括Hinge、CH2和CH3外显子以及之间的序列(去除外显子CH1和之后的内含子序列，Igy-dCH1)。外显子序列与宿主动物的表达调控元件的序列匹配以保证Igγ的表达框架。
上述Igγ-dCH1的表达调控元件可以来源于(以小鼠为例)：小鼠的Igγ3、Igγ1、Igγ2a和/或Igγ2b等。
上述核酸分子还包括IgH 3’-位置表达调控序列(Local Control Region)。所述LCR是宿主动物IgH 3’-位置表达调控(LCR)序列。如图2、图5、图6和图7所示。
上述核酸分子包括了人IgH重链V-区序列或片段，人IgH D-区序列或片段，和人IgH J-区序列或片段。重链的V-区、D-区和J-区都来源于人如图6和图7。
例如：具体地，上述核酸分子含有多个(或全部)人的免疫球蛋白基因的(IgH)V-区，D-区和J-区序列，链接小鼠免疫球蛋白(IgH)的5’-增强子(5’-En)，再链接小鼠的Igy的转换元件(switch region，Sγ)序列，其次链接人Igγ的Hinge，CH2和CH3序列，以及小鼠的PolyA，TM1和TM2序列，最后链接小鼠重链IgH的3’-位置表达调控(LCR)序列(如图6)。转基因小鼠表达人的IgG等单域抗体。
或者具体地，上述核酸分子含有多个(或全部)人的免疫球蛋白基因的(IgH)V-区，D-区和J-区序列后，链接小鼠免疫球蛋白(IgH)的5’-增强子(5’-En)，转换元件(switchregion，Sμ)序列和IgM的CH2，CH3，CH4以及PolyA，TM1和TM2等序列，再链接小鼠的Igy的转换元件(switch region，Sγ)序列，其次链接人Igγ的Hinge，CH2和CH3序列，以及小鼠的PolyA，TM1和TM2等序列，最后链接小鼠重链IgH的3’-位置表达调控(LCR)序列(如图7)。转基因小鼠表达鼠的IgM和人的IgG等单域抗体。
上述人免疫球蛋白基因包括部分或全部人的重链(IgH)的V-区，D-区，J-区，还包括人Cμ-区序列和Cγ-区序列的CH1序列有突变或缺失。上述小鼠免疫球蛋白基因包括小鼠的重链的5’-端增强子(5’-Enhancer)序列，转换元件(switch region，Sμ和Sγ)序列，终止信号(PolyA)，TM1和TM2以及小鼠重链IgH的3’-位置表达调控(LCR)等序列。
一种载体，包含上述的核酸分子。
一种含有上述核酸分子或载体的原核生物。一种含有上述核酸分子或载体的细胞，包括任何一种来源于这些核酸分子的转基因动物的细胞，还包括但不限于来源于转基因动物的淋巴细胞、杂交瘤、抗体表达细胞等。
一种人源抗体，由上述任一核酸分子重排、编码制得；包括任何一种来源于上述核酸分子或核酸分子转基因动物的人源抗体，包括但不限于抗体蛋白质、抗体DNA、cDNA序列和经过进一步修饰，改造的抗体等。
一种含有上述核酸分子或载体、细胞或抗体的转基因动物。动物可以是猪、牛、马、鼠、大鼠、兔、鸡和羊等哺乳动物。
上述核酸分子、载体、细胞或动物在编码DNA、cDNA、mRNA，表达氨基酸序列、蛋白质、载体，培养杂交瘤、细胞株、转基因动物中的应用。
尤其是，将上述转基因载体转入动物基因组内获得的转基因动物，或者与宿主动物自身免疫球蛋白基因缺失的动物进行交配的后代，宿主动物本身的重链和轻链被失活，只表达人抗体蛋白的基因工程动物。利用抗原免疫转入经过上述改造后的人免疫球蛋白基因的动物，获得的全人单域抗体。
例如，通过以上的改造，含有上述核酸、载体、细胞或转基因动物能表达宿主动物的单域IgM和人的单域IgG抗体。
采用上述核酸分子或载体制备转基因动物的方法，包括以下一些步骤：
(1)所述核酸分子的获得；
(2)将所述核酸分子构建载体；
(3)向宿主动物细胞(包括干细胞，诱导干细胞和体细胞)或胚胎导入上述载体；
(4)将含有上述载体的细胞植入宿主动物的胚胎内(嵌合体的制备)或体细胞克隆；
(5)繁殖杂合，纯合的转基因动物(包括与宿主动物自身免疫球蛋白基因缺失的动物交配)。
上述宿主动物是指上述核酸分子可以应用的转基因动物，比如猪、牛、马、鼠、大鼠、兔、鸡和羊等哺乳动物；上述载体包括酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)，质粒和DNA片段等，上述载体导入方法包括：电穿孔、病毒感染、脂质体介导和显微注射等。
SEQ ID.NO1、SEQ ID.NO2、SEQ ID.NO3作为某(几)次具体的实施方式，上述核酸分子的序列如所示，但这并不作为对本发明范围的限制，本领域技术人员可以根据其对核苷酸序列作出一些非本质的改进和调整，如对核苷酸的删除、增加、替换等。
本发明所述IgM基因缺失CH1功能，本领域技术人员采用常规方法使CH1功能缺失，例如缺失CH1序列或CH1序列突变等，可以简称为IgM-dCH1。
有益效果
1.本发明将免疫球蛋白基因载体的C-区的CH1序列具有突变或缺失，制备单域抗体转基因动物，生产单域抗体。
2.本发明实现了采用人的免疫球蛋白基因或片段生产人单域抗体，在不同抗原的刺激条件下，可以获得高亲和力的单域抗体。
3.本发明直接获得全人的单域抗体，减少后期的人工改造和提高了抗体的成药性。
4.本发明优点在于：转基因动物的IgH的转基因元件中，采用转基因宿主动物本身的IgH5’-端增强子，转换元件Sμ和IgM-dCH1序列，保证了转基因动物的B-细胞的正常发育；采用转基因宿主动物本身的Igγ的转换元件(switch region，Sγ)序列和转基因宿主动物本身Igγ的终止信号(PolyA)和TM1，TM2序列来控制人的Igγ-dCH1(只有Igγ的Hinge、CH2和CH3等序列)的表达，这样有利于DNA的重组、突变和BCR(B-细胞受体)的信号传递，使得人的Igγ-dCH1在抗原刺激下成熟。转基因动物的IgH转基因元件中是利用人的V-区、D-区、J-区和γ序列，所以，转基因动物表达的是人的单域抗体(IgG)，减少后期的人工改造和提高了抗体的成药性。
5.本发明主要用途有：制备人的治疗性单域抗体，具体的：(1)治疗相关疾病，特别是脑部疾病和实体肿瘤；(2)制备双特异性抗体；(3)制备CAT-T。
附图说明：
图1：Igy结构及构建示意图。具体的，构建鼠的IgH 5’-增强子，鼠/人Igγ1嵌合表达元件(鼠Sγ1、TM1、TM2和PolyA等序列和人的Hinge、CH2和CH3序列)示意图。通过同源重组(Recombineering)技术和反筛重组技术(Counter-selection Recombineering)将载体转入人的IgG C-区5’-增强子、IgM和IgD的BAC中。Puromycin(Puro)筛选基因可以在细菌和细胞中分别进行筛选。Lox是一个34bp的DNA序列。
图2：构建一个核酸分子的IgG C-区示意图：将图1的DNA片段，与鼠IgH的3’-LCR通过同源重组技术(同源臂序列)相链接。Puromycin(Puro)和Zeocin(Zeo)筛选基因可以在细菌和细胞中分别进行筛选。Frt和Lox是一个34bp的DNA序列，可以通Flpo或CRE蛋白质或表达质粒去除筛选基因，在DNA序列中只留下一个Frt和Lox的序列。
图3：构建鼠的IgH 5’-增强子，鼠IgM-dCH1表达元件：鼠IgH 5’-增强子、Sμ、CH2、CH3、CH4以及TM1、TM2和PolyA等序列。通过同源重组技术(同源臂序列)将载体转入人的IgGC-区5’-增强子、IgM和IgD的BAC中。Puromycin(Puro)筛选基因可以在细菌和细胞中分别进行筛选。Lox是一个34bp的DNA序列。
图4：鼠和人Igy1-dCH1嵌合表达调控元件结构示意图：通过反筛重组技术(同源臂序列)将人Igy的Hinge、CH2和CH3序列取代鼠Igy的CH1、Hinge、CH2和CH3序列(绿色为小鼠序列，红色为人序列)。
图5：构建一个核酸分子的IgG-dCH1 C-区示意图：将图3和4的DNA片段，与鼠IgH的3’-LCR通过同源重组技术(同源臂序列)相链接。Puromycin(Puro)和Zeocin(Zeo)筛选基因可以在细菌和细胞中分别进行筛选。Frt和Lox是一个34bp的DNA序列，可以通Flpo或CRE蛋白质或表达质粒去除筛选基因，在DNA序列中只留下一个Frt和Lox的序列。
图6：其中一个IgH转基因核酸分子(转基因小鼠Ha)的组成元件：将人的IgH V-区、D-区、J-区与新的IgH C-区(Igγ1-dCH1)和3’-LCR链接，形成一个人单域抗体表达核酸分子(红色是人的DNA序列，绿色是小鼠DNA序列)。
图7：其中一个IgH转基因核酸分子(转基因小鼠Hb)的组成元件：将人的IgH V-区、D-区、J-区与新的IgH C-区(IgM-dCH1和Igy1-dCH1)和3’-LCR链接在一起，形成一个人单域抗体表达核酸分子(红色是人的DNA序列，绿色是小鼠DNA序列)。
图1-7是转基因的关键基因结构图。
图8：小鼠免疫球蛋白重链基因IgH的J-区基因打靶：小鼠IgH的J-区由J1、J2、J3和J4组成，用基因打靶技术，将整个J-区的序列切除。没有J-区序列的同源小鼠就不能产生鼠源的Ig(包括IgM和IgG等)。
图9：单域小鼠(Ha)人的IgHV2-26PCR结果，433bp PCR产物。
图10：单域抗体转基因小鼠(Ha)血清中人IgG Elisa结果。
图11：单域小鼠(Hb)的人IgHV2-26PCR结果，433bp PCR产物。
图12：单域抗体转基因小鼠(Hb)血清中人IgG Elisa结果。
图13：小鼠IgHJ-区序列的基因打靶(基因打靶后J-区PCR产物大小为732bp，正常J-区PCR产物的大小为2422bp)。
图14：OVA和HEL免疫小鼠后获得的特异性和亲和力高的单域抗体统计表。
具体实施方法：
下面是具体实施例证对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例证只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术是由熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例
将改造的人免疫球蛋白基因重链核酸分子载体转入小鼠体内，再免疫含有这个核酸分子的转基因小鼠获得全人单域抗体，具体步骤如下：
1.免疫球蛋白基因载体的构建
1)免疫球蛋白重链基因的构建(如图6)
首先改造人的Igy1的CH1序列：通过反筛重组和基因合成技术，将人Igγ的CH1序列去除，保证Hinge、CH2和CH3及其所有序列的表达框架；再获得小鼠IgH 5’-端增强子构建鼠5’-增强子和鼠/人Igy1的嵌合表达元件，再将这个表达元件同源重组到人IgH C-区的BAC中如图1。获得鼠3’-位置表达调控序列(LCR)并建立筛选基因和同源臂。同时将两个基因片段同源重组形成一个核酸大分子如图2。最后将人的IgH V-区、与图2的核酸大分子形成一个免疫球蛋白重链基因的基因簇如图6所示(绿色为小鼠序列，红色为人的序列)。包括了依次为免疫球蛋白重链基因人的V区、D区、J区、小鼠的IgH 5’-En、Sγ、人的Igy1-dCH1和小鼠的LCR。采用小鼠IgH 5’-端增强子，Igγ的转换元件(Sγ)序列，人的Hinge、CH2、CH3、和小鼠的TM1和TM2序列以及其之间的序列和PolyA信号序列等形成鼠/人Igγ-dCH1嵌合表达元件。LCR是小鼠IgH 3’-位置表达调控序列。
2)免疫球蛋白重链基因的改造(如图7)
首先改造小鼠IgM的CH1序列：通过反筛重组技术或DNA合成技术，将IgM的CH1序列去除，保证CH2、CH3和CH4及其所有序列的表达框架(如图3)；同时通过反筛重组直接将人的Igy1的Hinge、CH2和CH3等序列取代鼠Igy1的CH1、Hinge、CH2和CH3等序列(如图4)。再获得小鼠IgH 3’-位置表达调控序列(LCR)，同时建立DNA片段两端的同源背，通过同源重组获得一种单域核酸分子的C-区序列和3’-LCR(如图5)。再通过同源重组技术将上面改造好的DNA片段转入含人免疫球蛋白重链基因(Ig)的YAC或BAC载体上，构建免疫球蛋白重链基因的基因簇如图7所示(绿色为小鼠序列，红色为人的序列)。包括了依次为免疫球蛋白重链基因人的V区、D区、J区、小鼠的5’-En、Sμ、mIgM-dCH1和Sγ、人的Igy-dCH1和小鼠的LCR(如图7)，其中，mIgM-dCH1经基因改造(如图3)，鼠源IgH 5’-增强子，转换元件(Sμ)序列，IgM的CH2、CH3、CH4、TM1和TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列等等都是小鼠的序列；人的Igγ-dCH1经基因改造(如图4)，是采用小鼠Igγ的转换元件(Sγ)序列，人Igγ的Hinge、CH2、CH3、和小鼠Igy的TM1和TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列等形成鼠/人Igγ-dCH1嵌合表达元件(如图5)。LCR是小鼠IgH 3’-位置表达调控序列。
2、人单域抗体转基因小鼠的培育
1)转人免疫球蛋白重链基因小鼠的培育
A.转人免疫球蛋白重链基因小鼠(单域小鼠Ha)的培育
利用已有的常规转基因技术将步骤1的1)中构建的人免疫球蛋白重链基因载体(图6)转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白重链转基因小鼠为单域抗体小鼠(Ha)。
使用的PCR鉴定引物为：
人的IgHV2-26PCR：
For：GACACACTTTGCTACACACTCCTG
Rev：GCACAGTAATATGTGGCTGTGTCC
PCR产物大小为：433bp
PCR检测结果如图9所示。说明：人IgHV2-26转基因小鼠DNA PCR结果，阳性小鼠有433bp的PCR带(1％凝胶电泳)
人的IgV3-11PCR：
For：TGTTTGCAGGTGTCCAGTGTCAGG
Rev：GACAGGAAGCCAGCCCTCAGC
PCR产物大小为：686bp
Elisa检测转基因小鼠：使用的ELISA鉴定的抗体为：一抗(包埋)Abcam(ab97221)和二抗Millipore(AP113P)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。
单域抗体转基因小鼠血清中人IgG Elisa结果如图10所示。说明：单域抗体转基因小鼠血清中人IgG Elisa检测，用正常小鼠为阴性对照，人血清为阳性对照。转基因小鼠血清中有明显的IgG表达。
B.转人免疫球蛋白重链基因小鼠(单域小鼠Hb)的培育
利用已有的常规转基因技术将步骤1的2)中构建的人免疫球蛋白重链基因载体(图7)转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白重链转基因小鼠为单域抗体小鼠(Hb)。
使用的PCR鉴定引物为：
人的IgHV2-26PCR：
For：GACACACTTTGCTACACACTCCTG
Rev：GCACAGTAATATGTGGCTGTGTCC
PCR产物大小为：433bp
PCR检测结果如图11所示。说明：人IgHV2-26转基因小鼠DNA PCR结果，阳性小鼠有433bp的PCR带(1％凝胶电泳)
人的IgV3-11PCR：
For：TGTTTGCAGGTGTCCAGTGTCAGG
Rev：GACAGGAAGCCAGCCCTCAGC
PCR产物大小为：686bp
Elisa检测转基因小鼠：使用的ELISA鉴定的抗体为：一抗(包埋)Abcam(ab97221)和二抗Millipore(AP113P)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。
单域抗体转基因小鼠血清中人IgG Elisa结果如图12所示。说明：单域抗体转基因小鼠血清中人IgG Elisa检测，用正常小鼠为阴性对照，人血清为阳性对照。转基因小鼠血清中有明显的IgG表达。
2)免疫球蛋白重链基因敲除小鼠的培育(图8)
利用基因打靶技术，构建免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。选择小鼠免疫球蛋白重链基因的IgH J-区作为基因敲除位点(敲除位点及基因敲除效果见图8)，获得免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。
使用的PCR鉴定引物为：
For：GGGAAAGAATGAGCAAATGCAAGC
Rev：TTCTGTGTTCCTTTGAAAGCTGGAC
PCR结果如图13所示。PCR产物：J-区基因打靶后PCR产物大小为732bp，正常J-区PCR产物的大小为2422bp。
使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(M8644)和sigma(A8786)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。
3)小鼠免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠的培育(参考CN105441455A)
4)杂交组合获得人源化抗体转基因小鼠
将第二步的Ha)或Hb)与2)、3)步获得的小鼠进行杂交繁育，经过PCR和ELISA检测，最终获得高表达人单域IgG抗体小鼠，而不表达(或低表达)鼠免疫球蛋白IgG。
转基因小鼠血清中人IgG含量的Elisa检测：
结果：正常小鼠血清的IgG含量：1-3mg/ml
正常人血清的IgG含量：3.5-15mg/ml
转基因小鼠(Ha)血清中的人IgG含：0.001-0.3mg/ml
转基因小鼠(Hb)血清中的人IgG含：0.01-0.5mg/ml
(说明：转基因小鼠中的人IgG基因是经过改造后的IgG，其中CH1及其相关的内含子缺失(IgG-dCH1)，因此，IgG表示量要比正常人的IgG含量少。并且，转基因小鼠饲养在无菌和清洁环境下，其血清中的IgG也要少一些)
3.人单域抗体的获得
对人单域抗体转基因小鼠进行免疫，获得B-细胞，再结合噬菌体展示技术，获得治疗性人单域抗体或者制备双特异性抗体。
A.OVA免疫获得的人源化抗体转基因小鼠
选择8周龄的小鼠进行免疫。
初免：
①用PBS稀释OVA(Sigma A7641)抗原，终浓度为2mg/ml，加入20ug CpG(ODN1826，tlrl-1826，Invivogen)，加入适量氢氧化铝(vac-alu-50，Invivogen)，使氢氧化铝浓度为1％。
②将①中准备好的抗原0.75mL与CFA佐剂(Sigma F5881)按1∶1混合，用MIXPACTM注射器使之乳化，每只小鼠，注射剂量为200ul(0.2mg)，进行皮下注射免疫。
二免：
①免疫后第21天进行二免，用PBS稀释抗原，终浓度为1.0mg/ml，加入10ug CpG，加入适量氢氧化铝，使氢氧化铝浓度为1％。
②将①中准备好的抗原0.75mL与IFA佐剂按1∶1混合，用MIXPACTM注射器使之乳化，每只小鼠注射剂量为200ul(0.1mg)，进行腹腔注射免疫。
三免：
①免疫后第21天后进行三免，用PBS稀释抗原，终浓度为1.0mg/ml，加入10ug CpG，加入适量氢氧化铝，使氢氧化铝浓度为1％。
②直接注射抗原蛋白，按①中方法配制，每只小鼠注射剂量为200ul(0.1mg)进行腹腔注射免疫。
四免：
①免疫后第21天后进行四免，用PBS稀释抗原，终浓度为1.0mg/ml，加入10ug CpG，加入适量氢氧化铝，使氢氧化铝浓度为1％。
②直接注射抗原蛋白，按①中方法配制，每只小鼠注射剂量为200ul(0.1mg)进行腹腔
注射免疫。
加强免疫：
在第四免疫后21天，对Elisa结果符合要求的小鼠，开展加强免疫，然后获得脾胀的B-细胞进行。杂交瘤培养和筛选
1)小鼠免疫检测
第4次免疫后10天，分别取小鼠血进行ELISA检测，以免疫前小鼠作为对照，分别检测免疫后小鼠血清中鼠IgG的含量和人IgG的含量：
小鼠血清中人IgG的检测：用抗原包埋96孔板，用hlgG-HRP(Millipore，AP113P))检测经过稀释后免疫血清中的特异抗体含量。
将免疫后的人源化特异抗体在小鼠中表达量较高(血清稀释at 1∶8000)，其ElisaOD450>大于1.0的免疫小鼠，用于制备单域抗体。
2)单域抗体的获得
收集小鼠的脾脏B-细胞，进行高表达特异抗体B-细胞的分离(hIgG+CD138+Ag+，FACS分离等)，制备mRNA，cDNA，噬菌体展示，获得特异性和亲和力高的单域抗体(KD在0.03-5.6nM之间，如表14)。
SEQUE0CELlSTlNG
<110>金迈博生物科技有限公司
<120>一种核酸分子及其在人源化抗体中的应用
<160>3
<210>1
<211>15999
<212>DNA
<213>小鼠5’-En、Sγ1、人lgγ1-dCH1和小鼠TM1、TM2、PolyA序列(人、鼠和合成DNA)
<220>
<221>
<222>(1)..(8)
<223>Not1酶切位点(合成序列)
<222>(9)..(370)
<223>同源臂(人的序列)
<222>(433)..(1444)
<223>鼠IgH 5’-增强子(鼠的序列)
<222>(3278)..(8527)
<223>鼠Igγ1转换元件(Sγ1)(鼠的序列)
<222>(8648)..(8692)
<223>人Igγ1 Hinge(人的序列)
<222>(8811)..(9141)
<223>人Igγ1 CH2(人的序列)
<222>(9238)..(9560)
<223>人Igγ1 CH3(人的序列)
<222>(10862)..(10992)
<223>鼠TM1(鼠的序列)
<222>(11810)..(11890)
<223>鼠TM2(鼠的序列)
<222>(12611)..(13477)
<223>鼠PolyA信号序列(鼠的序列)
<222>(13837)..(13870)
<223>Lox(合成序列)
<222>(13871)..(15192)
<223>pGK-Puromycin筛选基因(合成序列)
<222>(15193)..(15226)
<223>Lox(合成序列)
<222>(15227)..(15508)
<223>同源臂(同源重组与鼠3’-LCR链接)(鼠的序列)
<222>(15509)..(15516)
<223>AsiSI(合成序列)
<222>(15517)..(15991)
<223>同源臂(同源重组到人lg C-区序列)(人的序列)
<222>(15992)..(15999)
<223>Not1(合成序列)
GCGGCCGCCG AGATGCCTGA ACAAACCAGG GGTCTTAGTG ATGGCTGAGG AATGTGTCTC 60
AGGAGCGGTG TCTGTAGGAC TGCAAGATCG CTGCACAGCA GCGAATCGTG AAATATTTTC 120
TTTAGAATTA TGAGGTGCGC TGTGTGTCAA CCTGCATCTT AAATTCTTTA TTGGCTGGAA 180
AGAGAACTGT CGGAGTGGGT GAATCCAGCC AGGAGGGACG CGTAGCCCCG GTCTTGATGA 240
GAGCAGGGTT GGGGGCAGGG GTAGCCCAGA AACGGTGGCT GCCGTCCTGA CAGGGGCTTA 300
GGGAGGCTCC AGGACCTCAG TGCCTTGAAG CTGGTTTCCA AGAGAAAAGG ATTGTTTATC 360
TTAGGAGGCA TCTTAGTGAT TGAGTCAAGG GAGAAAGGCA TCTAGCCTCG GTCTCAAAAG 420
GGTAGTTGCT GTCTAGAGAG GTCTGGTGGA GCCTGCAAAA GTCCAGCTTT CAAAGGAACA 480
CAGAAGTATG TGTATGGAAT ATTAGAAGAT GTTGCTTTTA CTCTTAAGTT GGTTCCTAGG 540
AAAAATAGTT AAATACTGTG ACTTTAAAAT GTGAGAGGGT TTTCAAGTAC TCATTTTTTT 600
AAATGTCCAA AATTCTTGTC AATCAGTTTG AGGTCTTGTT TGTGTAGAAC TGATATTACT 660
TAAAGTTTAA CCGAGGAATG GGAGTGAGGC TCTCTCATAA CCTATTCAGA ACTGACTTTT 720
AACAATAATA AATTAAGTTT CAAATATTTT TAAATGAATT GAGCAATGTT GAGTTGGAGT 780
CAAGATGGCC GATCAGAACC AGAACACCTG CAGCAGCTGG CAGGAAGCAG GTCATGTGGC 840
AAGGCTATTT GGGGAAGGGA AAATAAAACC ACTAGGTAAA CTTGTAGCTG TGGTTTGAAG 900
AAGTGGTTTT GAAACACTCT GTCCAGCCCC ACCAAACCGA AAGTCCAGGC TGAGCAAAAC 960
ACCACCTGGG TAATTTGCAT TTCTAAAATA AGTTGAGGAT TCAGCCGAAA CTGGAGAGGT 1020
CCTCTTTTAA CTTATTGAGT TCAACCTTTT AATTTTAGCT TGAGTAGTTC TAGTTTCCCC 1080
AAACTTAAGT TTATCGACTT CTAAAATGTA TTTAGAATTC ATTTTCAAAA TTAGGTTATG 1140
TAAGAAATTG AAGGACTTTA GTGTCTTTAA TTTCTAATAT ATTTAGAAAA CTTCTTAAAA 1200
TTACTCTATT ATTCTTCCCT CTGATTATTG GTCTCCATTC AATTCTTTTC CAATACCCGA 1260
AGCATTTACA GTGACTTTGT TCATGATCTT TTTTAGTTGT TTGTTTTGCC TTACTATTAA 1320
GACTTTGACA TTCTGGTCAA AACGGCTTCA CAAATCTTTT TCAAGACCAC TTTCTGAGTA 1380
TTCATTTTAG GAGAAAGACT TTTTTTTTAA ATGAATGCAA TTATCTAGAC TTATTTCAGT 1440
TGAACATGCT GGTTGGTGGT TGAGAGGACA CTCAGTCAGT CAGTGACGTG AAGGGCTTCT 1500
AAGCCAGTCC ACATGCTCTG TGTGAACTCC CTCTGGCCCT GCTTATTGTT GAATGGGCCA 1560
AAGGTCTGAG ACCAGGCTGC TGCTGGGTAG GCCTGGACTT TGGGTCTCCC ACCCAGACCT 1620
GGGAATGTAT GGTTGTGGCT TCTGCCACCC ATCCACCTGG CTGCTCATGG ACCAGCCAGC 1680
CTCGGTGGCT TTGAAGGAAC AATTCCACAC AAAGACTCTG GACCTCTCCG AAACCAGGCA 1740
CCGCAAATGG TAAGCCAGAG GCAGCCACAG CTGTGGCTGC TGCTCTTAAA GCTTGTAAAC 1800
TGTTTCTGCT TAAGAGGGAC TGAGTCTTCA GTCATTGCTT TAGGGGGAGA AAGAGACATT 1860
TGTGTGTCTT TTGAGTACCG TTGTCTGGGT CACTCACATT TAACTTTCCT TGAAAAACTA 1920
GTAAAAGAAA AATGTTGCCT GTTAACCAAT AATCATAGAG CTCATGGTAC TTTGAGGAAA 1980
TCTTAGAAAG CGTGTATAGA AAGTAGGGAC TCTGGGGTCC CAGGTTCAAT CCCAGCATTG 2040
TTATTACAGT AACTAAGGGA ACAGAAGCAA CTCTGGATTG AAGGAGGGAA AGACAAGTAG 2100
AGGGAAGCCC AAGCTGCTCT GAGGGACTCA GGGTATGTGG GGGATCCAGA GAGCCAGGGG 2160
AACTCGAGAG CTCAGGACAG AAGACTGAGC ACCTGCAAAA GAGCTGAGGC TGGTAAGAGT 2220
AACAAGGTAA CCTGGGTAAC AGGTTCAGCA GCTCCAGGGG AGCCAGGAGA GATGGAAGTG 2280
TGGGGAGCCA GGCAGAGCAG CTCCATGACA GCCAGGACAG GTGGAAGTGT GGTACCCAGG 2340
CAGAGCAGCT CCATGACAGC CAGGACAGGT GGAATTGTGG TGACCCAGGC AGAGCAGCTC 2400
CAGGGCAGCC AGGACAGGTG GAAGTGTGGT GACCCAGGCA GAGCATCTAT AGGGGAGCCA 2460
GGACAGGTGG GAGTGTGGTG ACCCAGGCAG AGCAGCTCCA GGGCATCCAG GACAGGTGGA 2520
ATTGTGGTGA CCCAGGCAGA GCAGCTACAG GGGAGCCAGG AAAGGTGGGA GTGTGGTGAC 2580
CCAGGCAGAG CAGCTACAGG GGAGCCAGGA CAGGTGGGAG TGTGGTGACC CAGGCAGAGC 2640
AGCTATAGGG CAGCCAGGAC AGGTGGAAGT GTGGTGACCC AGGCAGAGCA GCTACAGGGG 2700
AGCCAGGAAA GGTGGGAGTG TGGTGACCCA GGCAGAGCAG CTACAGGGGA GCCAGGAAAG 2760
GTGGGAGTGT GGTGACCCAG GCAGAGCAGC TACAGGGGAG CCAGGAAAGG TGGGAGTGTG 2820
GTGACCCAGG CAGAGCAGCT ACAGGGCAGC CAGGACAGGT GGAAGTGTGG TGACCCAGGC 2880
AGAGCAGCTC CATGGCACCC AGGACAGGTG GAAGTGTGGT GACCCAGGCA GAGTAGCTAC 2940
AGGGCAGCCA GGACAGGTGG AAGTGTGGTG ACCCAGGCAG AGCAGCTTCA GGGCAGCCAG 3000
GACAGGTGGA AGTGTGGTGA CCCAGGCAGA GCAGCTTCAG GGCAGCCAGG ACAGGTGGAA 3060
GTGTGGTGAC CCAGGCAGAG CAGCTTCAGG GCAGCCAGGA CAGGTGGGAG TGTGGTGACC 3120
CAGGCAGAGC AGCTCCAGGG GAGCCAGGAC AGGTGGGAGT GTGGTGACCC AGGCAGAGCA 3180
GCTCCAGGGC AGCCAGGACA GGTGGAAGTG TTGTGACCCA GGCAGAGCAT CTATAGGGTA 3240
GCCAGGACAG GTGGAATTGT GGTGACCCAG GCAGAGCAGC TCCAGGGCAG CCAGGACAGG 3300
TGGGAGTGTG GTGACCCAGG CAGAGCATCT ATAGGGGAGC CAGGACAGGT GGAAGTGTGG 3360
TGACCCAGGC AGAGTAGCTA CAGGGAGCCA GGACAGGTGG AAGTGTGGTG ACCCAGGCAG 3420
AGTAGCTCTT GGGGAGCCTG GACAGGTGGG AGTGTGGTGA CCCAGGCAGA GCAGCTACAG 3480
GGGAGCTAGG ACAGGTGGAA GTGTGGTGAC CCAGGCAGAG TAGCTCTTGG GGAGCCAGGA 3540
CAGGTGGAAG TGTGGTGACC CAGGCAGAGC ATCTATAGGG GAGCCAGGAC AGGTGGGAGT 3600
GTGGGGATCC AGGTAAGGCA GGACTGGGGA GCCAGGACAG GTGGAAGTGT GGTGACCCAG 3660
GCAGAGCAGC TCCAGGGCAG CCAGGACAGG TGGAAGTGTG GTGACCCAGG CAGAGCAGCT 3720
CCATGGCAGC CAGGACAGGT GGAAATGTGG TGACCCAGGC AGAGCAGCTC CAGGGCAGCC 3780
AGGACAGGTG GAAGTGTGGT GACCCAGGCA GAGCATCTAT AGGGGAGCCA GGACAGGTGG 3840
GAGTGTGGTG ACCCAGGCAG AGCAGCTCCA TGGCAGCCAG GACAGGTGGG AGTGTGGTGA 3900
CCCAGGCAGA GCAGCTCATG GCAGCCAGGA CAGGTGGGAG TGTGGTGACC CAGTCAGAGC 3960
AGCTGCAGGG CAGCCAGGAC AGGTGGGAGT GTGGTGACCC AGGCAGAGCA TCTATAGGGG 4020
AACCAGGACA GGTGGAAGTG TGGTGACCCA GGCAGAGCAG CTGCAGGGCA GCCAGGACAG 4080
GTGGGAGTGT GGTGACCCAG GCAGAGCATC TATAGGGGAA CCAGGACAGG TGGAAGTGTG 4140
GTGACCCAGG CAGAGCAGCT ATAGGGAGCC AGGACAGGTG GAAGTGTGTT GATCCAGACA 4200
AAACACCTAC AGGGGAGACA AATCAGCTAG ATTGGGCGGA TCCTGGCAGA TCAGCTTCAG 4260
GGGACCTAGG CAAGTGGAAC TGTGGGGACC CGTGTAGGGC AGCTGTAGGG AAATCAGGAC 4320
AGGTACAAGT GTGTGGATCC ATGCAGTGTA GTGCCTTGGG AGCCTGAACA GATAGAAGGG 4380
TGGGGATACA GGCAGGGTAG CTATAGGGAA TCCAGTTGAG GTGGAAGAAT GGGGATCCAG 4440
GCAGAGTAGC TATAGGGCAG CCAGGAGAAA TGGAAGAATG CAGATCCAAA CAGAAGAGCT 4500
ACAGAGGAGC CAAGACAACT AGAAGTGTGT GAATCCAGGC AGAGCAGTGC CTTAGGAGCA 4560
AGGACAGGGA AGCTATAGGG AAACCAGGAC AGGTGGAAGA ATGGGGATCC AGGTGCTGCA 4620
GCTACAGGTA AGCAGGGACA GGTGGAAGTG TGGAGACCCA GGCAGAGCAG CTATAGGGCA 4680
GCCAGGACAG GTGGGAGTGT GGGGATCCAG GTAAGGCAGG ACTGGGGAGT CAAGGTAGGT 4740
GGAATGTGAA GTTCCAGGCA GAACAGGTCC AGGGTGCCAG GACAGGTACA AGTTTAGTAG 4800
TTATAGAGGA ACAGGGGCAG GTTAGAATGA AGGATGGGCA TCCCGGGTGA GCAAATACAA 4860
GGGAACTGAT GGCAAATGGA AGGGCAGGGA CCCAGACTAA ATGGCTACAG AGAAGCTGAG 4920
GCAGGTAAGA GTGTGGGAAC CCAGTCAAAA ACCACAGAAG AGCAGGAGCT AATTGGCACG 4980
GGCTGGGGTG CATGCTGGCT ACTCATAGGG AAGCTGGGAT AAGTAGTAGT TGGGGATTCT 5040
AAGCAGTCAC AGAGAAGCTG ATCCCGGTGA GAGTACGGGG TACACAGCTG AGCAAATACT 5100
ACATAGCTGG AGCTGATGGC TGTATAAGGT ACCAGGCTGA GCAGCTGAAG GTAACCTGGA 5160
CCTAGTGGGG GTGTGGGAGA CCTGGCTGAG CAGCTACCAA GGATCAGGGA TAGACATGTA 5220
AGCAGTCAAG CTCAGCTACT ACATGAGAGC TGGAGCTAGT ATGAAGGTGG AGGTCCAGTT 5280
GAGTGTCTTT AGAGAAACTG AGGCAAGTGG GAGTGCAGAG ATCCAGGCTG AGCAGCTCCA 5340
GCTTAGCTGG TATAGGTGAC AGGATGGGGG ATAACAAGGC TAAGAACACA CAGAGAGCAG 5400
GATCTCCTGG GTAGGTTACA GGTCAAGACT GAGTAGAATC AGGGGAGCTG AGGTTGGGAG 5460
TAATGCAGAA TTCCAGACTT AGCAGTCCAG GCAAACTAAA CCAAGTGGGA GTGTGGGAGT 5520
CCTAACTGAA CAAATACCAG GCATATGAAG CTGATAAGTG TGTATAAAGT ACCAAGCTGA 5580
GCAGCTACAG GAGAGCTGGG ATAGCTATGT GGGGAGACCA GGTTAAGCAA ACAGTGGAGA 5640
GCAAGATAAA GTCTTAATGT ATGCATCCAG GCTGAATAGA CACAGGGGAG CTGAGGAAGG 5700
CAGTACTAGA GGATTCTAGG CTTAGAAGTC ACAGGGAAAC TGAGGCCTGG GTGAGGGTGG 5760
GCATCCTAGC TGGAAAAATC ACCAGGGAGC TGGAGCTGAT GGGTATAAAA AGGTACCAGG 5820
TTGAGCAGCT ACAGGAGAGC TAGGACATGT GGGGATGTTT TGTTCCAGGC TGAACAACTG 5880
TAGAGCATCA GGGGGAGGTG GAACTTTAAG AAGTCAGGCT GAGCAGCTAC AGGAGAGCTG 5940
CAGCTATTCG GTATGTGGAG GTCCAGCCAG AGCAGTTACA GGGTAGCTGG GATAAATGGG 6000
GCTGGAGAAC CAGGCTAAGA AGACACAGGG GAGCAGGTTC TAGTCTGCAT AGGAGTGGGG 6060
ATCCAGGTCG AGTACACACA GAAGAGAAAA GGGTAGGTAG TAATGGAGGA TTCTAGACTC 6120
AGCTATAACT GAGTGGTAGT GTGAGTGTTC TAGCTGGAAA AAAAAATACC ATGAAGCTGG 6180
AGCTGATGGG TATAAAAGGA ACGAGCCTGA GAAACTGTAG GGTATCTGGG GTGGATGGGG 6240
ATGTGGGGAG TCATGCTGAG CTGCTACAAG GGCAGTGTGG CCTCTAGGAG TGTAGGGGAC 6300
CAAACTGAGC ATCTACAGGG AAACTGAGGC AAACTGGAGT GTAGGGCTCC AGAATGAGCA 6360
ACTGCAGGTC AGCTGAGGCC GGTAAGAGTG TGGGGAACCA GACTGGACAG TTAGTTGCAA 6420
GTTAGCCAGG GTAGGTGAGA GTTCTATTAG AGAAGCCTCA GCAGAATGGG AAGTGGGAAC 6480
TAGGAAACCA GGATGAGCAC CTAACAACAG AAGTGAGGCA GGTTAGGGTG TAGGGGATGA 6540
GCTGTGCAGC TACTGTGGAG CACGCAGACT GGAATAGAAG AGGTTCTGGC TGAACACTTG 6600
AAGGGAACCA GGTAGGCAGG AGGCAGTGTG TACAGACAGC TGAATGAGAC ATCATGCAGG 6660
GCCAGTTCCC TGCCCTGAGC TACATTAGCT GGGACCAGGG CCAGCGGTTG AGGAACCAGG 6720
CAGAGGTAAA ATGGTGGTGT GATAGGAAGC CAATGGCAGA GGGGAGGGAG AAGTTATGCT 6780
TATGTCATGC TGGAATGTAG GAAGGGGAAA GAGCCAGGAT GTCTAGGCTG GAGCTGATCC 6840
GGCTGTCTGC TCTGATGGCA GCAACAGGCC TGAGCTTCTC TGGACTCAAG AAGCCAGGGC 6900
AACAAAATAA AGGGGGCCTA GCAGAGCAAA GACACTGCTA GCACTGGGAT CAGGAAAACA 6960
GGACAAGACT CCCGATCCAG GAGGTCATGG GAGGGAAGGA GAAGACTACA GGGGACTGTC 7020
CTTGGGAAAG AGTAAGGGCC CACTGGAGGG AGTGCTCAGG AAGCAAGCCC ATTGACAGGG 7080
GAGAACAAGG CTGGTGGACG TCTGGATGGG CAGTAGGCAG CCCCAAGTCC CAGGAGGGAG 7140
AGAAGAGGCA GATAGGAAAA CAGGTCAGGT CTAGCAGAGG CCTACTGAAG TACTCTCCTC 7200
AGGACAGAAC CCTGAATACT GGAAAATGCG GAACTGCTGC AGGCACAAAG AATAGCTGAG 7260
GTCTAAGAGT AAAACAGACT AGGGGATGAG AGGACCTTAG GAAGAGCCTT TGGCTGAGCA 7320
GGAACAAGAA CAGGGGAAAT CCTAGGGCTG ACATTGCCAG TGGAAACATA CAGGCTGGAG 7380
CTCTTTAGTC AGGAGCTCCA GCTGTGATCT AGACATCAGG CAGGAAGATC AAATCTGTCC 7440
CAACAATACA GGGGACAGAG GCTCAACCTA GAGTGTGAGC ATCAGGGGCT GTGCAGGAGA 7500
TTTCAGAGCT CAGGTGCAGC AGAGACTAGC ATGGCCCTGG GGATAAAGGG AAGGATCCAA 7560
GGGACAAGGG GATAATCCTG GGGAGGTAAG GGCCAGCTTC GTGACAGAAG GTGGTGGTGT 7620
CCAACTTCAA GAGCCCTGTG CTACAATTTA AAAAAAAAAA AAAAGGAAAG GGACTTCTCT 7680
GTGTTTGGCA ACACAAGTGC GATGCACAGG CAGGAAGATC AAATCTGTCC CAACAATACA 7740
GGGGACAGAG GGTCAACCTA CAAAAGGAAA GAACCTGGGG CAGTGTGAAG ACAACACTGT 7800
AGAAGCCAAG GCTGAGTTCA CTGAGCTCTC GTTAGTGAGA CTACACAGCA AGGAGGTGGC 7860
GGGCACTGAG CAGTGAGGCC CCGGGAAGTG GGGGTGATGG TGGTGACGGT GGTAACTGTT 7920
AAGAACTGGG GGAAAGAATT GTGGAGAACC AAGCTAAATA GTTATGTCAA ACCACATGTT 7980
TAGGAGCCTG GGTTGACTTC ATAGGGAGTA GGCATGGAGG CTAATCTAGA GGTTTGTGTA 8040
TAGGCAAGAA GTGAATCCTG ACCCAAGAAT AGAGAGTGCT AAACGGACTT AGTTCAAAGA 8100
CAACTGAAAA AGACAATGCC TGCAAAACAA AGCTAAGGCC AGAGCTCTTG GACTATGAAG 8160
AGTTCAGGGA ACCTAAGAAC AGGGACCATC TGTGTACAGG CCAAGGCCGG TAGAAGCAGC 8220
CTAGGAAGTG TCAAGAGCCA ACGTGGCTGG GTGGGCAAAG ACAGGAAGGG ACTGTTAGGC 8280
TGCAGGGATG TGCCGACTTC AATGTGCTTC AGTATTGTCC AGATTGTGTG CAGCCATATG 8340
GCCCAGGTAT AAGAGGTTTA ACAGTGGAAC ACAGATGCCC ACATCAGACA GCTGGGGGGC 8400
GGGGGTGAAC ACAGATACCC ATACTGGAAA GCAGGTGGGG CATTTTCCTA GGAACGGGAC 8460
TGGGCTCAAT GGCCTCAGGT CTCATCTGGT CTGGTGATCC TGACATTGAT AGGCCCAAAT 8520
GTTGGATATC ACCTACTCCA TGTAGAGAGT CGGGGACATG GGAAGGGTGC AAAAGAGCGG 8580
CCTTCTAGAA GGTTTGGTCC TGTCCTGTCC TGTCTGACAG TGTAATCACA TATACTTTTT 8640
CTTGTAGAGC CCAAATCTTG TGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGGTAAGCCA 8700
GCCCAGGCCT CGCCCTCCAG CTCAAGGCGG GACAGGTGCC CTAGAGTAGC CTGCATCCAG 8760
GGACAGGCCC CAGCCGGGTG CTGACACGTC CACCTCCATC TCTTCCTCAG CACCTGAACT 8820
CCTGGGGGGA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC 8880
CCGGACCCCT GAGGTCACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CTGAGGTCAA 8940
GTTCAACTGG TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA 9000
GCAGTACAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC AGGACTGGCT 9060
GAATGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGCC CTCCCAGCCC CCATCGAGAA 9120
AACCATCTCC AAAGCCAAAG GTGGGACCCG TGGGGTGCGA GGGCCACATG GACAGAGGCC 9180
GGCTCGGCCC ACCCTCTGCC CTGAGAGTGA CCGCTGTACC AACCTCTGTC CCTACAGGGC 9240
AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC 9300
AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG 9360
AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG GACTCCGACG 9420
GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG 9480
TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT 9540
CCCTGTCTCC GGGTAAATGA TAATGTCCTG GTGATTTCTG AGATGTAGAG TCTAGCTAGG 9600
TCATGGAATG AGGGGTCTCC ATGGTTTGAG GCCTGAGTTG TGACTAAGGA AAAACCCATA 9660
GGCCTACACT GCCACACCCA GCACTTTTGA ATTTGCCTGA CATGAAAAGA ATTTACCTCT 9720
CCCTGGAAAG TGGAGCCTTA TCCCTAGGCA GTTCCCTTAC CAGACCTTCC TCTAGCTTGC 9780
ACTTTGTTCT GGGCACAGAA TGTGTCTAAC CCCCCAAAGC AAGGAAGACA CAACCTCTAC 9840
CTCCCTCACT CTGTCCTTAC CCCTTTTCCT GGCTAAGCAT CTCACTGAGT GCGCTGAATA 9900
GATGCATGTG GCCACAGTCT TGCAGACAGA CCCTTGCCAT CTCTCCACTC AGCTTTCCAG 9960
AGGCTAAGTC TAGCCCGTAT GGTGATAATG CAGGGAGCTC TATGCTATCT CAGTGCTATC 10020
AGACTCCCAA GTGGAGGATG AACATGGACC CATTAAAACC AACCTGCGCA GCAACACCCT 10080
GCCAATAAGG CCCGTATGTG AAAATGTGCA CACATCTACA CATGCACAGG CACACACACA 10140
CACACATGCA TGGGCACACA CACATACAGA GAGAGAGAAT CACAGAAACT CCCATGAGCA 10200
TCCTATACAG TACTCAAAGA TAAAAAGGTA CCAGGTCTAC CCACATGATC ATCCTCGGCA 10260
TTTACAAGTG GGCCAACTGA TACAGATAAA ACTTTTCTAT GCCAAGGACG CCAACATATA 10320
CACAAGTCCG CTCATGACAA ATCTGTCCCT GAACCTCAGA CTGGCGCCCG TGACTCATAC 10380
AGTGGACACT CCTCCAAAGC TGTATAGCTT CCTTTACTTC CCTGTGTGTA CTTTCTCTGA 10440
AGTACACTCA TCACACAGAA GAGGCCCTGT GATTACTCTG GCCCTCTGTT CTTGGTCATC 10500
AGAGAATAGA CAGAAGATCA GGCAAACTAC ACAGACACTT CCCACAATCA TCACAGGCCC 10560
TGACTCTGCT CTCCAGTCTC AAAACTGAAG GCTGGAGCAC ACAGAATAAG CTCCTGCACA 10620
GGCCAGGCCA GTATCGGGTC CAGTGTGTCT GACTGAGCCC AGGGACAAAA TGGCAGCACT 10680
TTGGGGAACT GAGGTTTCTG GTCCAAGAAG GAGAGATGGA GGCCCAGGGA GGGTCTGCTG 10740
ACCCAGCCCA GCCCAGCCCA GCTGCAGCTT TCTCCTGGGC CTCCATACAG CCTCCTGCCA 10800
CACAGGGAAT GGCCCTAGCC CCACCTTATT GGGACAAACA CTGACCGCCC TCTCTGTCCA 10860
GGGCTGCAAC TGGACGAGAC CTGTGCTGAG GCCCAGGACG GGGAGCTGGA CGGGCTCTGG 10920
ACGACCATCA CCATCTTCAT CAGCCTCTTC CTGCTCAGTG TGTGCTACAG CGCTGCTGTC 10980
ACACTCTTCA AGGTCAGCCA TACTGTCCCC ACAGTGTCTA CAATGTCCTC ATACTCTTCC 11040
CCATACTGTC CCTGTGGTGA CCTATACCCC ACACTGTCCC ATGCTAATGA CCACAGTCTT 11100
ACATGCTATG TAATGCTGTC TACCCTTCTG TATGCACAGT CTCACAATGT CCCATGCAGT 11160
CTCCACGATG CTCCATACTG TCCCCATTCC AACCCATGCT GCCCCTTGTT CCCCGCTATG 11220
CTGTCCCATG CTATTGTCTG TATTTTCATG CTCTTTTCAC ACTGTCCCTA GTGTCACATT 11280
CTGCCCATGT TGTCCACCAC ATTGTCCCCA CTCTGTACAC AGCCTCACAC TGTACCCTGC 11340
TACCCGATAA TGTTCCCTGT TGTCCCCAAC TCTCTCCCTG CACCATTTGT CAACTGTCCC 11400
CTGAATTCCC ATGTTGTTCC CACACTGTTA GTGTGTAATG TGCTCTGTCC CAGGTGTACC 11460
TTGTTCCGTG CTGTCTCACT TCATCGCCCA TTCTGTCCTT GTACTAACCC CACTCTATCA 11520
CCACACTGTC CCTATGCACT GCCCACATTG TCCTCATACT GTCCCATTTT GTATCTTCAT 11580
CCTGTCCCCA TAGTGTCCAA TGATCTACCC CACACTATTC CCACTTCATG CCCCTACAAT 11640
TTCCCTATTC CATTCCTCTC TGGTCACCAT GCCATCCTTC CCACTCCTGC ACAGCTGGAG 11700
AGGGACTCCC GGGATGAGTC CTTGCCCAGA TGAGCTACCT ATCTAGAGGA GTCTTCAGGT 11760
GGGAAGGGAA TGCAGTCTTG ATCTTGGTCT TATTCACCCT GTCTCACAGG TAAAGTGGAT 11820
CTTCTCCTCG GTGGTGGAGC TGAAGCAGAC ACTGGTTCCT GAATACAAGA ACATGATTGG 11880
GCAAGCACCC TAGGCCACCT CCTGTAATGG CATTTCCCAG GCCCCGAAGG ACCCTGTCCA 11940
ATATGCCAAG CAGCACAACT GAGATCACAC TGTCTGCTCA TCTCGCTTTC CTCCGACCCC 12000
GAGACTCAGC TACTCTCAAA TTTTCCCTCT CTGAAGGACC ATGTGGACAT TACATTGCTC 12060
CAGGCCACAG CCACCAGGAC CTAAAACACC ATCACAGCAG CACCAAAGAC ACTGGATAGA 12120
CCCACAAGGG CAATAGTTTC CTCAACAGTA TATCCAAACT GTTGGGACAA ACGAGCAATC 12180
ACTGAAGAAG TGACAAGTTC CCACAATGTC AGTGTCCAGC TGAGAAGGGA CAAAAAGTGG 12240
TACCAGCCCT GTCCACACCA CCTTCTAATT CACAGGAATA CGTGATAGAA GAGGCAGGTT 12300
GTAGATCCGA AAGATGAGAC AGATTTTATC AACTCCAGAA AGAGCTGGGT CCAACTGAAT 12360
TATTCTAGCG ACCTTGGCAT TGTCATGACC TGCCATGACC TTCCTCCTTA ACACTTCGAT 12420
AAACCCTGGG ATATGGAAAA TGCCTGTGTT TCTCAGGGTT TGGGAAAGAA CCATCCATGT 12480
TGGGATTCTT GTGTAGATCC TCCTTCTGGT CACAGATGCA ATACACTGGA TTTTCAGGCA 12540
AAGGAGCAAA TTCACAGACA ACTCTGGCCC TACAGCCCTA AGACCTAGAC ACCACCATCT 12600
CCTTGGAATT ATCAAATTTA ACACCCGGCA CACAACAAAG AAGGACTGGG ACTTTGAGGC 12660
CTTTGTGTAG CCCTAGAGGG GGCAGAGGCC ACTGAGCAGG GATTGGGTGA TCACAAGGAC 12720
CTCCTGGAGA GGGACCTGAG GAGCAGGTTC CAATTGGGCC AAAGAAAGAA GAACAACAAT 12780
AGAGATGAAG GATGCTGGAA AGAGCCATGG TACAGCAGTC TTGTCCTTCA GACATGACTC 12840
TTACAGCCCA GGACTCTTAC AGTAGCTAGC TGGAGCAGAA GTCCAAGGGA TTACCATGCC 12900
CTAGGGCCAC AGGCTACTGG AGGGTGGAGT GAGTCTACTA CACAGGTCCA ATGCCTGTTT 12960
CTCCATTGCT TCTCAGCCAA TGAGAAATCA GAGTCTCCAC CTCCAAGAAA AAGGAAGGTG 13020
GAAATGAAAG GTGAGCACCT GCCTTCCCGT GACTGGCAGA AAGATCTCCA CGGACTCAAG 13080
GCTTTGACTT CAAACTTCCC GTAGATCCCT GATGTCTTTA AGGACTCTGT CTGCTTTGTT 13140
GGTTTTGTTT GTTTGTTTTG TACTTTGTCA ATAAAACATT TTTCAAATAT TCTACAATTG 13200
CTGTGCTCTT CCTATGCAAA CTGGCCCTGG CACTTCAAAA CATGGCACAG TTAAGTTGAC 13260
CAGTGGGCCA TGCAGAGCAT ACTACCCCTC CTGGTCCTGT GTCCTACCAG ATATCCTCTA 13320
AGTGTCCCTT CACTGCTGGG CTCCAGTTCT GCTGCCCTGA ACCACACAGG TCCTCAGTCT 13380
GTCCTCCCTA TGGGCAGTTT CATCCCAGCC AGAAGCTGCC CTGTGGCCCC TAGGCTGCCC 13440
AGGCATGGTC TCCCACACCA ACCACACAAA CTAAGAAGCC TGTCCCATAC ATTGACCTCA 13500
GGCTCAGTGA TAACATTTCT ATAGAAAAAG GAAAGGAATA AGAAAAAAAA AACTCCATAT 13560
TACATGGGGG CTGCCTACCT TGCTGATGCT TATTGTCTCA AGCAAGTTTG GAGAAGTTCC 13620
AAATCAGGCA CTGACAGGGT GGGTTCTCAG CCATGCTCTT CTTACCTGGT AGGTGCCTTC 13680
TCCCCCATGG CACCTCACAG GCTCTCCATC TGTGTGTGTC TGGGTCCTGA TCTCTTCTCA 13740
TAAGTACAAA GTCAGGCTGG AAGAGGTACA CCCTAGCCCT CATTATAACT TACCAGTTTA 13800
TGATCCTGTC TGCAAACATC TGAGGTCCCT GTGGCTATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT 13860
ACGAAGTTAT CTACCGGGTA GGGGAGGCGC TTTTCCCAAG GCAGTCTGGA GCATGCGCTT 13920
TAGCAGCCCC GCTGGGCACT TGGCGCTACA CAAGTGGCCT CTGGCTCGCA CACATTCCAC 13980
ATCCACCGGT AGGCGCCAAC CGGCTCCGTT CTTTGGTGGC CCCTTCGCGC CACCTTCTAC 14040
TCCTCCCCTA GTCAGGAAGT TCCCCCCCGC CCCGCAGCTC GCGTCGTGCA GGACGTGACA 14100
AATGGAAGTA GCACGTCTCA CTAGTCTCGT GCAGATGGAC AGCACCGCTG AGCAATGGAA 14160
GCGGGTAGGC CTTTGGGGCA GCGGCCAATA GCAGCTTTGC TCCTTCGCTT TCTGGGCTCA 14220
GAGGCTGGGA AGGGGTGGGT CCGGGGGCGG GCTCAGGGGC GGGCTCAGGG GCGGGGCGGG 14280
CGCCCGAAGG TCCTCCGGAG GCCCGGCATT CTGCACGCTT CAAAAGCGCA CGTCTGCCGC 14340
GCTGTTCTCC TCTTCCTCAT CTCCGGGCCT TTCGACCTGC AGCAGCACGT GTTGACAATT 14400
AATCATCGGC ATAGTATATC GGCATAGTAT AATACGACAA GGTGAGGAAC TAAACCATGA 14460
CCGAGTACAA GCCCACGGTG CGCCTCGCCA CCCGCGACGA CGTCCCCCGG GCCGTACGCA 14520
CCCTCGCCGC CGCGTTCGCC GACTACCCCG CCACGCGCCA CACCGTCGAC CCGGACCGCC 14580
ACATCGAGCG GGTCACCGAG CTGCAAGAAC TCTTCCTCAC GCGCGTCGGG CTCGACATCG 14640
GCAAGGTGTG GGTCGCGGAC GACGGCGCCG CGGTGGCGGT CTGGACCACG CCGGAGAGCG 14700
TCGAAGCGGG GGCGGTGTTC GCCGAGATCG GCCCGCGCAT GGCCGAGTTG AGCGGTTCCC 14760
GGCTGGCCGC GCAGCAACAG ATGGAAGGCC TCCTGGCGCC GCACCGGCCC AAGGAGCCCG 14820
CGTGGTTCCT GGCCACCGTC GGCGTCTCGC CCGACCACCA GGGCAAGGGT CTGGGCAGCG 14880
CCGTCGTGCT CCCCGGAGTG GAGGCGGCCG AGCGCGCCGG GGTGCCCGCC TTCCTGGAGA 14940
CCTCCGCGCC CCGCAACCTC CCCTTCTACG AGCGGCTCGG CTTCACCGTC ACCGCCGACG 15000
TCGAGGTGCC CGAAGGACCG CGCACCTGGT GCATGACCCG CAAGCCCGGT GCCTGAGCGG 15060
GACTCTGGGG TTCGAATAAA GACCGACCAA GCGACGTCTG AGAGCTCCCT GGCGAATTCG 15120
GTACCAATAA AAGAGCTTTA TTTTCATGAT CTGTGTGTTG GTTTTTGTGT GCGGCGCGCC 15180
GTTTAAACGC GGATAACTTC GTATAATGTA TGCTATACGA AGTTATAGAC CGACGTGACA 15240
ACTTCCCAGC CCACTCACAG ACTTTCCTGA GCAATAAATT GATGCAAAAC CACAAATTCC 15300
TACTCTCAAA AACAAACATT AACAAAGGAT TGGGGGAGGG GGTCAGGGGT AGTATGGTGG 15360
CGTTGGGCAG GGTAAACTCA GGGTACCCAT TGTCTAATGT CTGAGACATA ACTTGAACAT 15420
ATGTGTAGCT GCAGCCAAAG ATGAACAAGT GATGGTATTT GTGTCCTCTT CAGACCCGAT 15480
ACCAGGTCAT TAAGCTTGAG ATCTGGACGC GATCGCCAGC CTCCAGAATG GTGGGAAATA 15540
AGTTTCTGTT GTTTCTCAGC CACCACGTCT GTAGTATGTG GAAGTCATCA GAATCAAAAT 15600
TGAGTCACCT GTGGTTTTTT TTTTTTCTAA ATCCCTGACA AATAGAGCCT AGGAAGGCCA 15660
AGAAGAGAAG AGGGTTCTCA TCCATAAACA CTTGATAACA AAAACTATCA CCAAGGACTC 15720
TACAAAAACT GCAACTGGCA CAAAGACCAT CACAACCTTA CACAGAAAGT ACTTCTGTGA 15780
GGACATCTTC CCAGCAACGG GCTGTCCAAC CTCAGACTGG CATTGCCTTT GTTATTGGTC 15840
CTTGTAGAGA GGGTAATTAT CTCAAAGCAA TCATGTAATC CTCCTCATTT TTCCTTTGAA 15900
AGCCTTGGTC TCCCTTTGCC TCCCTGAATA CGCACATAGC TGATCATGGC AGGTGTATCC 15960
CACTGCAGTG CTCTACCTCC AAATAGATAT CGCGGCCGC 15999
<210>2
<211>11862
<212>DNA
<213>小鼠5’-En、Sμ和IgM-dCH1序列(人、鼠序列和合成的序列)
<220>
<221>
<222>(1)..(8)
<223>Not1酶切位点(合成序列)
<222>(9)..(370)
<223>同源臂(人的序列)
<222>(433)..(1444)
<223>鼠IgH 5’-增强子(鼠的序列)
<222>(2550)..(4451)
<223>鼠IgM转换元件(Sμ)(鼠的序列)
<222>(5674)..(6012)
<223>鼠IgM CH2(鼠的序列)
<222>(6292)..(6609)
<223>鼠IgM CH3(鼠的序列)
<222>(6717)..(7111)
<223>鼠IgM CH4(鼠的序列)
<222>(7112)..(7341)
<223>鼠PolyA信号序列(鼠的序列)
<222>(8910)..(9025)
<223>鼠TM1(鼠的序列)
<222>(9144)..(9149)
<223>鼠TM2(鼠的序列)
<222>(9265)..(9556)
<223>鼠PolyA信号序列(鼠的序列)
<222>(9700)..(9733)
<223>Lox(合成序列)
<222>(9734)..(11055)
<223>pGK-Puromycin筛选基因(合成序列)
<222>(11056)(110g9)
<223>Lox(合成序列)
<222>(11090)..(11371)
<223>同源臂(同源重组与鼠Igγ1的Sγ1链接)(鼠的序列)
<222>(11372)..(11379)
<223>AsiSI(合成序列)
<222>(11380)..(11854)
<223>同源臂(同源重组到人Ig C-区序列)(人的序列)
<222>(11855)..(11862)
<223>Not1(合成序列)
GCGGCCGCCG AGATGCCTGA ACAAACCAGG GGTCTTAGTG ATGGCTGAGG AATGTGTCTC 60
AGGAGCGGTG TCTGTAGGAC TGCAAGATCG CTGCACAGCA GCGAATCGTG AAATATTTTC 120
TTTAGAATTA TGAGGTGCGC TGTGTGTCAA CCTGCATCTT AAATTCTTTA TTGGCTGGAA 180
AGAGAACTGT CGGAGTGGGT GAATCCAGCC AGGAGGGACG CGTAGCCCCG GTCTTGATGA 240
GAGCAGGGTT GGGGGCAGGG GTAGCCCAGA AACGGTGGCT GCCGTCCTGA CAGGGGCTTA 300
GGGAGGCTCC AGGACCTCAG TGCCTTGAAG CTGGTTTCCA AGAGAAAAGG ATTGTTTATC 360
TTAGGAGGCA TCTTAGTGAT TGAGTCAAGG GAGAAAGGCA TCTAGCCTCG GTCTCAAAAG 420
GGTAGTTGCT GTCTAGAGAG GTCTGGTGGA GCCTGCAAAA GTCCAGCTTT CAAAGGAACA 480
CAGAAGTATG TGTATGGAAT ATTAGAAGAT GTTGCTTTTA CTCTTAAGTT GGTTCCTAGG 540
AAAAATAGTT AAATACTGTG ACTTTAAAAT GTGAGAGGGT TTTCAAGTAC TCATTTTTTT 600
AAATGTCCAA AATTCTTGTC AATCAGTTTG AGGTCTTGTT TGTGTAGAAC TGATATTACT 660
TAAAGTTTAA CCGAGGAATG GGAGTGAGGC TCTCTCATAA CCTATTCAGA ACTGACTTTT 720
AACAATAATA AATTAAGTTT CAAATATTTT TAAATGAATT GAGCAATGTT GAGTTGGAGT 780
CAAGATGGCC GATCAGAACC AGAACACCTG CAGCAGCTGG CAGGAAGCAG GTCATGTGGC 840
AAGGCTATTT GGGGAAGGGA AAATAAAACC ACTAGGTAAA CTTGTAGCTG TGGTTTGAAG 900
AAGTGGTTTT GAAACACTCT GTCCAGCCCC ACCAAACCGA AAGTCCAGGC TGAGCAAAAC 960
ACCACCTGGG TAATTTGCAT TTCTAAAATA AGTTGAGGAT TCAGCCGAAA CTGGAGAGGT 1020
CCTCTTTTAA CTTATTGAGT TCAACCTTTT AATTTTAGCT TGAGTAGTTC TAGTTTCCCC 1080
AAACTTAAGT TTATCGACTT CTAAAATGTA TTTAGAATTC ATTTTCAAAA TTAGGTTATG 1140
TAAGAAATTG AAGGACTTTA GTGTCTTTAA TTTCTAATAT ATTTAGAAAA CTTCTTAAAA 1200
TTACTCTATT ATTCTTCCCT CTGATTATTG GTCTCCATTC AATTCTTTTC CAATACCCGA 1260
AGCATTTACA GTGACTTTGT TCATGATCTT TTTTAGTTGT TTGTTTTGCC TTACTATTAA 1320
GACTTTGACA TTCTGGTCAA AACGGCTTCA CAAATCTTTT TCAAGACCAC TTTCTGAGTA 1380
TTCATTTTAG GAGAAAGACT TTTTTTTTAA ATGAATGCAA TTATCTAGAC TTATTTCAGT 1440
TGAACATGCT GGTTGGTGGT TGAGAGGACA CTCAGTCAGT CAGTGACGTG AAGGGCTTCT 1500
AAGCCAGTCC ACATGCTCTG TGTGAACTCC CTCTGGCCCT GCTTATTGTT GAATGGGCCA 1560
AAGGTCTGAG ACCAGGCTGC TGCTGGGTAG GCCTGGACTT TGGGTCTCCC ACCCAGACCT 1620
GGGAATGTAT GGTTGTGGCT TCTGCCACCC ATCCACCTGG CTGCTCATGG ACCAGCCAGC 1680
CTCGGTGGCT TTGAAGGAAC AATTCCACAC AAAGACTCTG GACCTCTCCG AAACCAGGCA 1740
CCGCAAATGG TAAGCCAGAG GCAGCCACAG CTGTGGCTGC TGCTCTTAAA GCTTGTAAAC 1800
TGTTTCTGCT TAAGAGGGAC TGAGTCTTCA GTCATTGCTT TAGGGGGAGA AAGAGACATT 1860
TGTGTGTCTT TTGAGTACCG TTGTCTGGGT CACTCACATT TAACTTTCCT TGAAAAACTA 1920
GTAAAAGAAA AATGTTGCCT GTTAACCAAT AATCATAGAG CTCATGGTAC TTTGAGGAAA 1980
TCTTAGAAAG CGTGTATACA ATTGTCTGGA ATTATTTCAG TTAAGTGTAT TAGTTGAGGT 2040
ACTGATGCTG TCTCTACTTC AGTTATACAT GTGGGTTTGA ATTTTGAATC TATTCTGGCT 2100
CTTCTTAAGC AGAAAATTTA GATAAAATGG ATACCTCAGT GGTTTTTAAT GGTGGGTTTA 2160
ATATAGAAGG AATTTAAATT GGAAGCTAAT TTAGAATCAG TAAGGAGGGA CCCAGGCTAA 2220
GAAGGCAATC CTGGGATTCT GGAAGAAAAG ATGTTTTTAG TTTTTATAGA AAACACTACT 2280
ACATTCTTGA TCTACAACTC AATGTGGTTT AATGAATTTG AAGTTGCCAG TAAATGTACT 2340
TCCTGGTTGT TAAAGAATGG TATCAAAGGA CAGTGCTTAG ATCCGAGGTG AGTGTGAGAG 2400
GACAGGGGCT GGGGTATGGA TACGCAGAAG GAAGGCCACA GCTGTACAGA ATTGAGAAAG 2460
AATAGAGACC TGCAGTTGAG GCCAGCAGGT CGGCTGGACT AACTCTCCAG CCACAGTAAT 2520
GACCCAGACA GAGAAAGCCA GACTCATAAA GCTTGCTGAG CAAAATTAAG GGAACAAGGT 2580
TGAGAGCCCT AGTAAGCGAG GCTCTAAAAA GCACAGCTGA GCTGAGATGG GTGGGCTTCT 2640
CTGAGTGCTT CTAAAATGCG CTAAACTGAG GTGATTACTC TGAGGTAAGC AAAGCTGGGC 2700
TTGAGCCAAA ATGAAGTAGA CTGTAATGAA CTGGAATGAG CTGGGCCGCT AAGCTAAACT 2760
AGGCTGGCTT AACCGAGATG AGCCAAACTG GAATGAACTT CATTAATCTA GGTTGAATAG 2820
AGCTAAACTC TACTGCCTAC ACTGGACTGT TCTGAGCTGA GATGAGCTGG GGTGAGCTCA 2880
GCTATGCTAC GCTGTGTTGG GGTGAGCTGA TCTGAAATGA GATACTCTGG AGTAGCTGAG 2940
ATGGGGTGAG ATGGGGTGAG CTGAGCTGGG CTGAGCTAGA CTGAGCTGAG CTAGGGTGAG 3000
CTGAGCTGGG TGAGCTGAGC TAAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGAGCTTGGC TGAGCTAGGG 3060
TGAGCTGGGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG TAAGCTGGGA TGAGCTGGGG 3120
TGAGCTGAGC TGAGCTGGAG TGAGCTGAGC TGGGCTGAGC TGGGGTGAGC TGGGCTGAGC 3180
TGGGCTGAGC TGGGCTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG 3240
TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGAGC 3300
TGGGGTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC 3360
TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC 3420
TGAGCTGGAG TGAGCTGAGC TGGGCTGAGC TGGGGTGAGC TGGGCTGAGC TGGGGTGAGC 3480
TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGGGG 3540
TGAGCTGGGC TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC 3600
TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGAGCTGGGC 3660
TGAGCTGGGG TGAGCTGGGC TGAGCTGGGC TGAGCTGGGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC 3720
TGGGGTGAGC TGAGCTGAGC TGGGCTGAGC TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGAGC 3780
TGGGGTGAGC TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGGGCTGAGC AGGGCTGAGC 3840
TGGGGTGAGC TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGGGCTGAGC TGGGCTGAGC TGAGCTGAGC 3900
TGGGCTGAGC TGGGCTGAGC TGGGCTGAGC TGGGCTGAGC TGGGCTGAGC TGGGGTGAGC 3960
TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC 4020
TGAGCTGAGC TGGGGTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC 4080
TGAGCTGGGG TGAGCTGAGC TAGGGTGAAC TGGGCTGGGT GAGCTGGAGT GAGCTGAGCT 4140
GAGGTGAACT GGGGTGAGCC GGGATGTTTT GAGTTGAGCT GGGGTAAGAT GAGCTGAACT 4200
GGGGTAAACT GGGATGAGCT GTGGTGAGCG GAGCTGGATT GAACTGAGCT GTGTGAGCTG 4260
AGCTGGGGTC AGCTGAGCAA GAGTGAGTAG AGCTGGCTGG CCAGAACCAG AATCAATTAG 4320
GCTAAGTGAG CCAGATTGTG CTGGGATCAG CTGTACTCAG ATGAGCTGGG ATGAGGTAGG 4380
CTGGGATGAG CTGGGCTAGC TGACATGGAT TATGTGAGGC TGAGCTAGCA TGGGCTGGCC 4440
TAGCTGATGA GCTAAGCTTG AATGAGCGGG GCTGAGCTGG ACTCAGATGT GCTAGACTGA 4500
GCTGTACTGG ATGATCTGGT GTAGGGTGAT CTGGACTCAA CTGGGCTGGC TGATGGGATG 4560
CGCCAGGTTG AACTAGGCTC AGATAAGTTA GGCTGAGTAG GGCCTGGTTG AGATGGTTCG 4620
GGATGAGCTG GGAAAAGATG GACTCGGACC ATGAACTGGG CTGAGCTGGG TTGGGAGACC 4680
ATGAATTGAG CTGAACTGAG TGCAGCTGGG ATAAACTGGG TTGAGCTAAG AATAGACTAC 4740
CTGAATTGTG CCAAACTCGG CTGGGATCAA TTGGAAATTA TCAGGATTTA GATGAGCCGG 4800
ACTAAACTAT GCTGAGCTGG ACTGGTTGGA TGTGTTGAAC TGGCCTGCTG CTGGGCTGGC 4860
ATAGCTGAGT TGAACTTAAA TGAGGAAGGC TGAGCAAGGC TAGCCTGCTT GCATAGAGCT 4920
GAACTTTAGC CTAGCCTGAG CTGGACCAGC CTGAGCTGAG TAGGTCTAAA CTGAGTTAAA 4980
AATCAACAGG GATAATTTAA CAGCTAATTT AACAAGCCTG AGGTCTGAGA TTGAATGAGC 5040
AGAGCTGGGA TGAACTGAAT GAGTTTCACC AGGCCTGGAC CAGTTAGGCT AGGACCTCGT 5100
TCTATAGAGG CAGACTGTGT GCTACAGTGG AGTTTCAAGA TGATTCCATG AGTCCTCCCC 5160
GCCCCCAACA TAACCCACCT TCCTCCTACC CTACACGCCT GTCTGGTGTG TAAATCCCAG 5220
CTTTGTGTGC TGATACAGAA GCCTGAGCCC CTCCCCCACC TCCACCTACC TATTACTTTG 5280
GGATGAGAAT AGTTCTCCCA GCCAGTGTCT CAGAGGGAAG CCAAGCAGGA CAGGCCCAAG 5340
GCTACTTGAG AAGCCAGGAT CTAGGCCTCT CCCTGAGAAC GGGTGTTCAT GCCCCTAGAG 5400
TTGGCTGAAG GGCCAGATCC ACCTACTCTA GAGGCATCTC TCCCTGTCTG TGAAGGCTTC 5460
CAAAGTCACG TTCCTGTGGC TAGAAGGCAG CTCCATAGCC CTGCTGCAGT TTCGTCCTGT 5520
ATACCAGGTT CACCTACTAC CATATCTAGC CCTGCCTGCC TTAAGAGTAG CAACAAGGAA 5580
ATAGCAGGGT GTAGAGGGAT CTCCTGTCTG ACAGGAGGCA AGAAGACAGA TTCTTACCCC 5640
TCCATTTCTC TTTTATCCCT CTCTGGTCCT CAGCTGTCGC AGAGATGAAC CCCAATGTAA 5700
ATGTGTTCGT CCCACCACGG GATGGCTTCT CTGGCCCTGC ACCACGCAAG TCTAAACTCA 5760
TCTGCGAGGC CACGAACTTC ACTCCAAAAC CGATCACAGT ATCCTGGCTA AAGGATGGGA 5820
AGCTCGTGGA ATCTGGCTTC ACCACAGATC CGGTGACCAT CGAGAACAAA GGATCCACAC 5880
CCCAAACCTA CAAGGTCATA AGCACACTTA CCATCTCTGA AATCGACTGG CTGAACCTGA 5940
ATGTGTACAC CTGCCGTGTG GATCACAGGG GTCTCACCTT CTTGAAGAAC GTGTCCTCCA 6000
CATGTGCTGC CAGTGAGTGG CCTGGGCTAA GCCCAATGCC TAGCCCTCCC AGATTAGGGA 6060
AGTCCTCCTA CAATTATGGC CAATGCCACC CAGACATGGT CATTTGCTCC TTGAACTTTG 6120
GCTCCCCAGA GTGGCCAAGG ACAAGAATGA GCAATAGGCA GTAGAGGGGT GAGAATCAGC 6180
TGGAAGGACC AGCATCTTCC CTTAAGTAGG TTTGGGGGAT GGAGACTAAG CTTTTTTCCA 6240
ACTTCACAAC TAGATATGTC ATAACCTGAC ACAGTGTTCT CTTGACTGCA GGTCCCTCCA 6300
CAGACATCCT AACCTTCACC ATCCCCCCCT CCTTTGCCGA CATCTTCCTC AGCAAGTCCG 6360
CTAACCTGAC CTGTCTGGTC TCAAACCTGG CAACCTATGA AACCCTGAAT ATCTCCTGGG 6420
CTTCTCAAAG TGGTGAACCA CTGGAAACCA AAATTAAAAT CATGGAAAGC CATCCCAATG 6480
GCACCTTCAG TGCTAAGGGT GTGGCTAGTG TTTGTGTGGA AGACTGGAAT AACAGGAAGG 6540
AATTTGTGTG TACTGTGACT CACAGGGATC TGCCTTCACC ACAGAAGAAA TTCATCTCAA 6600
AACCCAATGG TAGGTATCCC CCCTTCCCTT CCCCTCCAAT TGCAGGACCC TTCCTGTACC 6660
TCATAGGGAG GGCAGGTCCT CTTCCACCCT ATCCTCACTA CTGTCTTCAT TTACAGAGGT 6720
GCACAAACAT CCACCTGCTG TGTACCTGCT GCCACCAGCT CGTGAGCAAC TGAACCTGAG 6780
GGAGTCAGCC ACAGTCACCT GCCTGGTGAA GGGCTTCTCT CCTGCAGACA TCAGTGTGCA 6840
GTGGCTTCAG AGAGGGCAAC TCTTGCCCCA AGAGAAGTAT GTGACCAGTG CCCCGATGCC 6900
AGAGCCTGGG GCCCCAGGCT TCTACTTTAC CCACAGCATC CTGACTGTGA CAGAGGAGGA 6960
ATGGAACTCC GGAGAGACCT ATACCTGTGT TGTAGGCCAC GAGGCCCTGC CACACCTGGT 7020
GACCGAGAGG ACCGTGGACA AGTCCACTGG TAAACCCACA CTGTACAATG TCTCCCTGAT 7080
CATGTCTGAC ACAGGCGGCA CCTGCTATTG ACCATGCTAG CGCTCAACCA GGCAGGCCCT 7140
GGGTGTCCAG TTGCTCTGTG TATGCAAACT AACCATGTCA GAGTGAGATG TTGCATTTTA 7200
TAAAAATTAG AAATAAAAAA AATCCATTCA AACGTCACTG GTTTTGATTA TACAATGCTC 7260
ATGCCTGCTG AGACAGTTGT GTTTTGCTTG CTCTGCACAC ACCCTGCATA CTTGCCTCCA 7320
CCCTGGCCCT TCCTCTACCT TGCCAGTTTC CTCCTTGTGT GTGAACTCAG TCAGGCTTAC 7380
AACAGACAGA GTATGAACAT GCGATTCCTC CAGCTACTTC TAGATATATG GCTGAAAGCT 7440
TGCCTAACCT GGTGCAGGCA GCATTCAGGC ACATATATAG ACACACATGC ATTTATACAT 7500
AGATATATAG GTACACATGT GTAGACACAT ACATGAATGT GTATTCATGG ACACACAGAC 7560
AAAGGTACAC ATATATACAC ATGAGTTCAT GCGCACACAC ATGCATGGAC ACTTACAAAC 7620
GCCTTCAGAG ACAAATAGGC ATAGACACAC AACCACTCAC AGAAACAGAT ACCAATATGC 7680
ATGGTCCTGT GTACACAGAA ACAGACTATA GGCAAATATA CACAAATAAA CTATATAGAT 7740
ACAAAGATAT GCATATACAC ACATGTACAG AAACATCTTC ACATGTGTAC ACTAACATGT 7800
GAACAGGTAT AGCACACAGA TACACCTGGA CTCTGACCAG GGCTGTAATC TCCAAGGCTC 7860
ACGGCTCAGA GAGCCTACAC TAGGCTGGGT CACTGATACT CCTCAGGAGC CCACTCTATG 7920
ATTGGGAGAG ATAACCCCAG GTACAAAGTA TGCCTATCTG TCTCAACACC ATGGGGCAGA 7980
AGATACTCCA CTAACCACCC ATGACAGAAA GTTAGCCTTG GCTGTGTCTC CATTAATAGA 8040
ACACCTCAGA AGACCAATGT GAAATTGCCT AACCCACTCA CACCCACCCT GATCTCCAGT 8100
TCAAAATGCA GAAAACATAA TGCAGTTGTC CAAAAGATGC CCCAACCACA CACACACACA 8160
CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACCAT CAAGGAGCCT 8220
CTGTAAGGAG TCACCACCCA ATAACACTGC CTCTTTGGGC TCATATCCTG GACATTCTTC 8280
ATATTCATAT CCATTTGGGG CCTAGGCTTT AGATATCCCC AAGGGCTCAT CTTTACAGGG 8340
ATCAGAGATC CCAATAAATG CCCTGGTCCC ACAGCCTCCC TCAGGTATCT GTCTGTTTAT 8400
CTCTTGGTAC CAAGACCCAA CATTGCTGGC AGGGGTAGGA CAAGCAACGC ACGGGAACTC 8460
TGATCAAAGA AAGTCATGAG ATGCCTGAGT CCTTCAGGAA GTAAGGAGGG ACAACCTCTG 8520
GTATCCCTGT TCTTATTGCT AAAGCCCAAG AGACAGGGAG ACCTGCTCTA AATTCTCAGT 8580
CTAAACAGCA CCGATGGCAC CACCTGCTCA GGGAAAGTCC AGAGCACACC AATATCATTT 8640
TGCCACAGTT CCTGAGTCTG CCTTTACCCA GGTCCATACA TTGCATCTGT CTTGCTTGCT 8700
CTGCTGCCCC AGGGCTCCTG GAACAAAGGC TCCAAATTAG TGTGTCCTAC AGCTTGGCCT 8760
GTTCTGTGCC TCCGTCTAGC TTGAGCTATT AGGGGACCAG TCAATACTCG CTAAGATTCT 8820
CCAGAACCAT CAGGGCACCC CAACCCTTAT GCAAATGCTC AGTCACCCCA AGACTTGGCT 8880
TGACCCTCCC TCTCTGTGTC CCTTCATAGA GGGGGAGGTG AATGCTGAGG AGGAAGGCTT 8940
TGAGAACCTG TGGACCACTG CCTCCACCTT CATCGTCCTC TTCCTCCTGA GCCTCTTCTA 9000
CAGCACCACC GTCACCCTGT TCAAGGTAGT GTGGTTGTGG GGCTGAGGAC ACAGGGCTGG 9060
GACAGGGAGT CACCAGTCCT CACTGCCTCT ACCTCTACTC CCTACAAGTG GACAGCAATT 9120
CACACTGTCT CTGTCACCTG CAGGTGAAAT GACTCTCAGC ATGGAAGGAC AGCAGAGACC 9180
AAGAGATCCT CCCACAGGGA CACTACCTCT GGGCCTGGGA TACCTGACTG TATGACTAGT 9240
AAACTTATTC TTACGTCTTT CCTGTGTTGC CCTCCAGCTT TTATCTCTGA GATGGTCTTC 9300
TTTCTAGACT GACCAAAGAC TTTTTGTCAA CTTGTACAAT CTGAAGCAAT GTCTGGCCCA 9360
CAGACAGCTG AGCTGTAAAC AAATGTCACA TGGAAATAAA TACTTTATCT TGTGAACTCA 9420
CTTTATTGTG AAGGAATTTG TTTTGTTTTT CAAACCTTTC CTGCGGTGTT GACAGCCCAA 9480
GGATTATCTG AATAGAGCTT AGGAACTGGA AATGGAACAG TGCAGTCTGA TGGTACTTAA 9540
GGGAGAAAGA GGGAAAGGAG GTGTGGAAGA AGAAAAAAGA GAAGCAGAGG GGGAGGGGAG 9600
AAGGGAGAGG GAGAGGGAGA GGGAGAGGGA GAGGGAGAGG GAGAGGGAGA GAGAGAGAGA 9660
GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GCATGCACTA TAACTTCGTA TAATGTATGC 9720
TATACGAAGT TATCTACCGG GTAGGGGAGG CGCTTTTCCC AAGGCAGTCT GGAGCATGCG 9780
CTTTAGCAGC CCCGCTGGGC ACTTGGCGCT ACACAAGTGG CCTCTGGCTC GCACACATTC 9840
CACATCCACC GGTAGGCGCC AACCGGCTCC GTTCTTTGGT GGCCCCTTCG CGCCACCTTC 9900
TACTCCTCCC CTAGTCAGGA AGTTCCCCCC CGCCCCGCAG CTCGCGTCGT GCAGGACGTG 9960
ACAAATGGAA GTAGCACGTC TCACTAGTCT CGTGCAGATG GACAGCACCG CTGAGCAATG 10020
GAAGCGGGTA GGCCTTTGGG GCAGCGGCCA ATAGCAGCTT TGCTCCTTCG CTTTCTGGGC 10080
TCAGAGGCTG GGAAGGGGTG GGTCCGGGGG CGGGCTCAGG GGCGGGCTCA GGGGCGGGGC 10140
GGGCGCCCGA AGGTCCTCCG GAGGCCCGGC ATTCTGCACG CTTCAAAAGC GCACGTCTGC 10200
CGCGCTGTTC TCCTCTTCCT CATCTCCGGG CCTTTCGACC TGCAGCAGCA CGTGTTGACA 10260
ATTAATCATC GGCATAGTAT ATCGGCATAG TATAATACGA CAAGGTGAGG AACTAAACCA 10320
TGACCGAGTA CAAGCCCACG GTGCGCCTCG CCACCCGCGA CGACGTCCCC CGGGCCGTAC 10380
GCACCCTCGC CGCCGCGTTC GCCGACTACC CCGCCACGCG CCACACCGTC GACCCGGACC 10440
GCCACATCGA GCGGGTCACC GAGCTGCAAG AACTCTTCCT CACGCGCGTC GGGCTCGACA 10500
TCGGCAAGGT GTGGGTCGCG GACGACGGCG CCGCGGTGGC GGTCTGGACC ACGCCGGAGA 10560
GCGTCGAAGC GGGGGCGGTG TTCGCCGAGA TCGGCCCGCG CATGGCCGAG TTGAGCGGTT 10620
CCCGGCTGGC CGCGCAGCAA CAGATGGAAG GCCTCCTGGC GCCGCACCGG CCCAAGGAGC 10680
CCGCGTGGTT CCTGGCCACC GTCGGCGTCT CGCCCGACCA CCAGGGCAAG GGTCTGGGCA 10740
GCGCCGTCGT GCTCCCCGGA GTGGAGGCGG CCGAGCGCGC CGGGGTGCCC GCCTTCCTGG 10800
AGACCTCCGC GCCCCGCAAC CTCCCCTTCT ACGAGCGGCT CGGCTTCACC GTCACCGCCG 10860
ACGTCGAGGT GCCCGAAGGA CCGCGCACCT GGTGCATGAC CCGCAAGCCC GGTGCCTGAG 10920
CGGGACTCTG GGGTTCGAAT AAAGACCGAC CAAGCGACGT CTGAGAGCTC CCTGGCGAAT 10980
TCGGTACCAA TAAAAGAGCT TTATTTTCAT GATCTGTGTG TTGGTTTTTG TGTGCGGCGC 11040
GCCGTTTAAA CGCGGATAAC TTCGTATAAT GTATGCTATA CGAAGTTATA TGACATCTTG 11100
TTGTGGAATA GCAAACAGAG AAGACTGTTT GGACATCGAT TTAAGGCAAT AGAAAGTCTT 11160
TACTAGCCAA CCTGTGACTA CACTGGGTGT TCAGGATCTC AGTGTAGCCC TGAACCTTTC 11220
TCAGGGTGAG ATTTTAGGTA AAAATTATGT TCTGGGTTGA CATAGTTCAG TTAACAAGAA 11280
CACTTAGCCA GAAACAGAAC TACAAGACCC AAAAAGCAAA GTTAAAACAT TTACAAACTT 11340
TCCTAGAACT GTATGAACTT TAATGGATTA GGCGATCGCC AGCCTCCAGA ATGGTGGGAA 11400
ATAAGTTTCT GTTGTTTCTC AGCCACCACG TCTGTAGTAT GTGGAAGTCA TCAGAATCAA 11460
AATTGAGTCA CCTGTGGTTT TTTTTTTTTC TAAATCCCTG ACAAATAGAG CCTAGGAAGG 11520
CCAAGAAGAG AAGAGGGTTC TCATCCATAA ACACTTGATA ACAAAAACTA TCACCAAGGA 11580
CTCTACAAAA ACTGCAACTG GCACAAAGAC CATCACAACC TTACACAGAA AGTACTTCTG 11640
TGAGGACATC TTCCCAGCAA CGGGCTGTCC AACCTCAGAC TGGCATTGCC TTTGTTATTG 11700
GTCCTTGTAG AGAGGGTAAT TATCTCAAAG CAATCATGTA ATCCTCCTCA TTTTTCCTTT 11760
GAAAGCCTTG GTCTCCCTTT GCCTCCCTGA ATACGCACAT AGCTGATCAT GGCAGGTGTA 11820
TCCCACTGCA GTGCTCTACC TCCAAATAGA TATCGCGGCC GC 11862
<210>3
<211>1280
<212>DNA
<213>人Igγ1的Hinge、CH2和CH3序列以及小鼠Igγ1的同源臂【人和鼠序列(Swa1酶切片段)】
<220>
<221>
<222>(1)..(131)
<223>同源臂(同源重组与鼠Igγ1的5’-端)(鼠的序列)
<222>(132)..(176)
<223>人Igγ1Hinge(人的序列)
<222>(295)..(625)
<223>人Igγ1CH2(人的序列)
<222>(722)..(1044)
<223>人1gγ1CH3(人的序列)
<222>(1045)..(1280)
<223>同源臂(同源重组与鼠Igγ1的3’-端)(鼠的序列)
AAATGTTGGA TATCACCTAC TCCATGTAGA GAGTCGGGGA CATGGGAAGG GTGCAAAAGA 60
GCGGCCTTCT AGAAGGTTTG GTCCTGTCCT GTCCTGTCTG ACAGTGTAAT CACATATACT 120
TTTTCTTGTA GAGCCCAAAT CTTGTGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGGTAA 180
GCCAGCCCAG GCCTCGCCCT CCAGCTCAAG GCGGGACAGG TGCCCTAGAG TAGCCTGCAT 240
CCAGGGACAG GCCCCAGCCG GGTGCTGACA CGTCCACCTC CATCTCTTCC TCAGCACCTG 300
AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA 360
TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG 420
TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG 480
AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT 540
GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GCCCCCATCG 600
AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGTGGGA CCCGTGGGGT GCGAGGGCCA CATGGACAGA 660
GGCCGGCTCG GCCCACCCTC TGCCCTGAGA GTGACCGCTG TACCAACCTC TGTCCCTACA 720
GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGATGA GCTGACCAAG 780
AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG 840
TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT GCTGGACTCC 900
GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG 960
AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC 1020
CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA ATGATCCCAG TGTCCTTGGA GCCCTCTGGT CCTACAGGAC 1080
TCTGACACCT ACCTCCACCC CTCCCTGTGT AAATAAAGCA CCCAGCACTG CCTTGGGACC 1140
CTGCAATAAT GTCCTGGTGA TTTCTGAGAT GTAGAGTCTA GCTAGGTCAT GGAATGAGGG 1200
GTCTCCATGG TTTGAGGCCT GAGTTGTGAC TAAGGAAAAA CCCATAGGCC TACACTGCCA 1260
CACCCAGCAC TTTTGAATTT 1280

Claims (10)

1.一种核酸分子，包括了免疫球蛋白基因或其片段，其特征在于：包括IgG基因Igγ、IgG转换元件Sγ和IgM基因IgHCμ、IgM转换元件Sμ，其中IgM基因和IgG基因缺失CH1功能；
所述Sμ、Sγ、IgM基因IgHCμ为宿主动物序列；
所述IgG基因Igγ包括人的Hinge、CH2、CH3外显子及之间的序列，以及宿主动物的TM1、TM2、polyA信号；
所述核酸分子还包括位于宿主动物免疫球蛋白重链IgH的5'端增强子，序列如SEQ IDNO.1的(433)..(1444)所示；
所述Sγ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(3278)..(8527)所示；
所述核酸分子还包括了人免疫球蛋白重链IgH的V-区序列或片段，人IgH D-区序列或片段，和人IgH J-区序列或片段；
其中，在所述人IgH的V-区、D-区和J-区序列后，链接所述宿主动物IgH的5’端增强子、所述宿主动物IgM转换元件Sμ序列和IgM基因的CH2、CH3、CH4以及PolyA、TM1和TM2序列，再链接所述宿主动物IgG转换元件Sγ序列，其次链接所述人IgG基因Igγ的Hinge、CH2和CH3序列以及宿主动物PolyA、TM1和TM2序列，最后链接宿主动物IgH的3’位置表达调控序列LCR。
2.如权利要求1所述的核酸分子，所述Sγ为Sγ1、Sγ3、Sγ2a和/或Sγ2b。
3.如权利要求1或2所述的核酸分子，所述Sμ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2(2550)..(4451)所示。
4.如权利要求3所述的核酸分子，所述Igγ序列包括人Igγ的单种或多种亚型，和宿主动物的各种Igγ亚型的位置转换元件Sγ。
5.如权利要求4所述的核酸分子，人Igγ亚型包括Igγ3、Igγ1、Igγ2和/或Igγ4。
6.一种载体，包含如权利要求1-5任一所述的核酸分子。
7.一种细胞，包含如权利要求1-5任一所述核酸分子或权利要求6所述载体。
8.一种人源抗体，来源于权利要求1-5任一所述核酸分子或权利要求6所述载体或权利要求7所述细胞。
9.权利要求1-5任一所述核酸分子或权利要求6所述载体或权利要求7所述细胞在编码DNA、cDNA、mRNA，表达氨基酸序列、蛋白质、载体，培养杂交瘤、细胞株、转基因动物和/或制备人源单域抗体中的应用。
10.采用权利要求1-5任一所述核酸分子或权利要求6所述载体或权利要求7所述细胞制备转基因动物的方法，包括以下步骤：(1)所述核酸分子的获得；(2)将所述核酸分子构建入载体；(3)向宿主动物细胞或胚胎导入所述载体；(4)将含有上述载体的细胞植入宿主动物的胚胎内或体细胞克隆；(5)繁殖杂合、纯合的转基因动物。
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