CN104755493A - 用于在转基因动物中生产人类抗体的复杂的染色体工程 - Google Patents

用于在转基因动物中生产人类抗体的复杂的染色体工程 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过转基因动物大规模生产人类抗体，其中在血清中大量生产全人类IgG高达>10g/L，并且人类IgG1亚类占优势。本发明还支持复杂染色体工程用于在非鼠科哺乳动物物种中进行复杂基因研究的可行性。

Description

用于在转基因动物中生产人类抗体的复杂的染色体工程
相关申请
本申请要求2012年8月3日提交的美国临时专利申请系列No.61/679,288的优先权，该申请的公开内容以引用方式并入本文。
随附提交的序列表以引用方式全文并入本文。
背景技术
人类抗体也称为静脉内免疫球蛋白(IVIG)，得自具有或不具有特异抗原免疫的捐献者人类血浆，已经多年用于治疗用途。但是由于由可不控的人类群捐赠的自发性，所以人类血浆衍生的IVIG还必然承受基本的挑战和限制。具体而言，由于人类的免疫耐受，难以强效地产生针对人类起源的抗原(例如癌细胞)的、人类血浆衍生的IVIG。因此，需要用于获得人类抗体的改善的系统。
发明概述
在第一个方面中，本发明提供了包含基因的人类人工染色体(HAC)的载体，其中所述的基因编码：
(a)一条或多条人类抗体重链，其中编码抗体重链的各基因与类别转换调节元件可操作地连接；
(b)一条或多条人类抗体轻链；以及
(c)一条或多条人类抗体替代轻链和/或有蹄动物衍生的IgM重链恒定区；其中编码一条或多条人类抗体重链的基因的至少一个类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别调节元件所替换。
在一个实施方案中，一条或多条人类抗体重链包含人类IgG抗体重链。在另一个实施方案中，IgG重链包含IgG1抗体重链。在另一个实施方案中，一条或多条人类抗体重链包含人类IgA抗体重链。在另一个实施方案中，一条或多条人类抗体重链包含人类IgM抗体重链。在另一个实施方案中，一条或多条人类抗体重链包含IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE和IgD人类抗体重链。
在一个实施方案中，HAC载体包含编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区的基因，其中所述的有蹄动物衍生的IgM重链恒定区与人类IgM重链可变区表达为嵌合体。在另一个实施方案中，有蹄动物衍生的IgM重链恒定区为牛衍生的IgM重链恒定区。
在另一个实施方案中，一条或多条人类抗体重链包含人类IgG抗体重链，其中人类IgG抗体重链的恒定区的跨膜结构域和胞内结构域被有蹄动物衍生的IgG抗体重链恒定区的跨膜结构域和胞内结构域所替换。在另一个实施方案中，人类IgG抗体重链包含人类IgG1抗体重链。在另一个实施方案中，有蹄动物衍生的IgG抗体重链恒定区包含牛衍生的IgG抗体重链恒定区。
在一个实施方案中，有蹄动物衍生的类别转换调节元件包含Iγ-Sγ类别转化调节元件。在另一个实施方案中，Iγ-Sγ类别转化调节元件包含Iγ1-Sγ1。在另一个实施方案中，编码一条或多条人类抗体重链的基因的各类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别转换调节元件所替换。在另一个实施方案中，有蹄动物衍生的类别转换调节元件为牛衍生的类别转化调节元件。
在一个实施方案中，HAC载体包含编码人类抗体替代轻链的一条或多条基因，其中所述的人类抗体替代轻链选自VpreB1、VpreB3和λ5人类抗体替代轻链。
在另一个实施方案中，HAC进一步包含有蹄动物衍生的增强子，其与编码一条或多条人类抗体重链的一个或多个基因可操作地连接。在一个实施方案中，增强子包含3’Eα增强子。
在第二个方面中，本发明提供了转基因有蹄动物，其包含根据本发明的第一个方面的任何实施方案或实施方案的组合的HAC载体。在一个实施方案中，转基因有蹄动物为转基因牛。
在第三个方面中，本发明提供了转基因有蹄动物，其包含整合至其基因组中的基因，该基因编码：
(a)一条或多条人类抗体重链，其中编码抗体重链的各基因与类别转换调节元件可操作地连接；
(b)一条或多条人类抗体轻链；以及
(c)一条或多条人类抗体替代轻链和/或有蹄动物衍生的IgM重链恒定区；其中编码一条或多条人类抗体重链的基因的至少一个类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别调节元件所替换。
本发明的第三个方面的转基因有蹄动物可以包含如本发明的第一个方面中针对HAC所述的、基因、类别转换调节元件和/或增强子的任何实施方案或实施方案的组合，但是其中所述的基因、类别转换调节元件和/或增强子整合至基因组中。
在第四个方面中，本发明提供了生产人类抗体的方法，其包含：
(a)向本发明的第二和第三个方面的实施方案或实施方案的组合的转基因有蹄动物给予靶向抗原，从而在有蹄动物的血清或血浆中生产和累积对靶向抗原具有特异性的人类抗体；以及
(b)由有蹄动物的血清或血浆中回收对靶向抗原具有特异性的人类抗体。在一个实施方案中，回收步骤包含：
(i)由转基因有蹄动物分离淋巴细胞；
(ii)由淋巴细胞生成生产人类单克隆抗体的杂交瘤；以及
(iii)由杂交瘤回收对靶向抗原具有特异性的人类单克隆抗体。
在另一个实施方案中，由转基因有蹄动物得到的淋巴细胞是由转基因有蹄动物的淋巴结分离得到的。在另一个实施方案中，转基因有蹄动物是被靶向抗原超免疫的。
在第五个方面中，本发明提供了通过本发明的第四个方面的任何实施方案或实施方案的组合所述的方法而生产的人类抗体。
附图简述
图1示出了牛IGLJ-IGLC基因簇的结果以及该基因簇的删除策略。(A)牛IGLJ-IGLC基因簇的基因组织。(B)打靶载体的结构以及删除基因簇的策略。质粒pCλ1CAGzeoPuroloxPDT为第一敲除(KO)载体，置于IGLJ1基因外侧的loxP 5’位点处，其由9.9kb和3.1kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、loxP序列、CAG启动子驱动的博来霉素抗性基因(zeo)、DT-A和不含启动子的嘌呤霉素抗性基因(puro)构成。质粒pCλ5CAGloxPneoDT为第二KO载体，置于IGLC5基因外侧的另一个loxP 3’位点处，其由8.7kb和1.5kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、loxP序列、鸡β-肌动蛋白启动子驱动的新霉素抗性基因(neo)、DT-A、SV40polyA和CAG启动子构成。第二KO载体与表达Cre的质粒共表达，使得所述的基因簇被删除，该基因再构成了CAG启动子驱动的puro基因。
图2显示雄性和雌性牛IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—(三倍敲除，“TKO”)细胞系的生成。(A)饲养纯种血统，以建立TKO细胞系。依次靶向雄性细胞系6939和雌性细胞系3427，从而分别得到IGHM—/+IGHML1—/—和IGHM—/—动物用于第一轮饲养，由此生成雄性和雌性IGHM—/—IGHML1—/+细胞系。这些细胞系经历基因簇的删除，从而生成IGHM—/—IGHML1—/+IGL—/+动物用于第二轮饲养，由此建立雄性和雌性TKO细胞系。(B)在由雄性和雌性IGHM—/—IGHML1—/+细胞系的生成。在由细胞系6939来源的雄性细胞系IGHM—/+IGHML1—/—中，通过打靶载体pBCμΔNKOneo、pBCμΔKOpuro和pbCμAYKObsr分别敲除两个IGHML1等位基因U和u、以及一个IGHM等位基因AY。在由细胞系3427来源的雌性细胞系IGHM—/—中，通过打靶载体pbCμAYKObsr和pbCμ7AYJKOhyg分别敲除两个IGHM等位基因10AY和7AYJ。在雄性IGHM—/+IGHML1—/—和雌性IGHM—/—动物之间饲养后，对胚胎实施基因组PCR(AYKObsr-F2R2、ayKOhyg-F2R2、Neo-F2R2或Puro-F2R2)，以识别基因型IGHM—/—IGHML1—/+，从而分别建立雄性J481和雌性细胞系H412。在使用YKObsr-F2R2对H412实施基因组PCR时，进行序列分析以证明等位基因AY和10AY被破坏。(C)通过打靶载体pCλ1CAGzeoPuroloxPDT将IGLJ1基因外侧的loxP 5’序列整合至细胞系J481中。通过基因组PCR(CL1puro-F2F2)证明同源重组的发生，以作为阳性PCR。此外，实施阴性PCR(R-F2x R-R1)来仔细检查同源重组，因为其可能仅由野生型等位基因扩增而来；J481由等位基因A和D扩增同源重组，显示双峰(等位基因A为T，等位基因D为G)。集落27仅显示“G”，证明等位基因A被特异性地敲除，而集落22仅显示“T”，证明等位基因D被特异性地敲除。由集落27建立胚胎细胞系K655-1，其具有CL1puro-F2F2。(D)通过打靶载体pCλ5CAGloxPneoDT将IGLC5基因外侧的loxP 3’序列整合至细胞系K655-1中。通过基因组PCR(CL5CAG-F2F2)证明同源重组的发生，以作为阳性PCR。此外，还通过基因组PCR(CAGpuro-F3R3)证明删除所述的基因簇所导致的CAG启动子驱动的PURO基因的再构建。使用细胞系G054生成小牛用于饲养。(E)雄性和雌性IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—(TKO)细胞系的生成。使雄性和雌性IGHM—/ —IGHML1—/+IGL—/+动物经历第二轮饲养。通过系列基因组PCR(L001-F1xL002x R2，用于扩增IGLC基因；BCμ-f2r2，用于扩增IGHM或IGHML1恒定区基因；特异性删除所述的基因簇的CAGpuro-F3R3和BCμKO-F14R14，用于扩增靶向的IGHM或IGHML1基因)来检测各胚胎。5个胚胎细胞系E024A-2,A596A-1,A332A,C970和A114A为表中所示的基因型，证明为IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—。
图3显示KcHACΔ和cKSL-HACΔ载体的概念和构造。(A)KcHACΔ和cKSL-HACΔ载体的结构。KcHACΔ载体衍生自原始κHAC，其中hIGHM基因恒定区(CH1至TM结构域)的一部分被牛源化而具有牛起源的序列。由于这种修饰，KcHACΔ载体在前B/B细胞表面上表达牛源化的嵌合IgM{cIgM(CH1)}蛋白质。在整个牛源化的CH1结构域中，cIgM(CH1)与牛替代轻链(bSLC)/轻链(bLC)良好地配对。此外，牛源化的TM1-TM2结构域更高效地与牛Ig-α/β络合物(bIg-α/β)相互作用，从而用于更好的pre-BCR/BCR的信号传递。cKSL-HACΔ载体由3种不同的人类染色体(hChr)片段hChr14(14D)、hChr2和hChr22构成，所述的片段均包含完整的人类IGL和替代轻链(hVPREB1和hIGLL1)基因座。在该载体中，hIGHM基因恒定区(CH2至TM结构域)的一部分被牛源化，从而表达cIgM(CH2)蛋白质。在前B细胞阶段，该cIgM(CH2)可以优选地与人类替代轻链(hSLC,hVPREB1/hIGLL1)配对而模仿了人类前BCR，但并非优选地与牛源化的TM1-TM2结构域配对，所述的TM1-TM2结构域更好地与bIg-α/β相互作用，从而用于前BCR的信号转导。(B)cKSL-HACΔ载体在鸡DT40细胞中的构建。DT40克隆子SLKH18(其包含SLKH片段，其中hChr22片段转座至hChr2片段中)与另一个DT40克隆子CH2D4(其保留有cIgM(CH2)牛源化的14D载体)融合，从而生成DT40杂交克隆子cKSLD22。通过人类COT1DNA荧光原位杂交(FISH)证明2个hChr片段的存在。通过引入Cre表达质粒，在2个hChr片段之间引入染色体转座，从而生成cKSL-HACΔ载体。三色FISH表明在cKSL-HACΔ载体上存在hIGH、hIGK和hIGL基因座。(C)KcHACΔ载体在鸡DT40细胞中的构建。
图4显示κHAC、cKSL-HAC和KcHAC IGHM—/—IGHML1—/—双敲除(DKO)小牛的特征。(A)由一系列新生期的HAC/DKO小牛得到的外周血单核细胞(PBMC)的代表性流式细胞仪分析。对于IgM的检测而言，将抗hIgM抗体用于κHAC和cKSL-HACΔ/DKO小牛，或者将抗bIgM抗体用于KcHAC/DKO小牛。由左至右的面板，针对单独的IgM、IgM/bCD21、IgM/bIgλ、IgM/bIgκ和IgM/hIgκ对PBMC进行染色。每个黑体数字表示细胞在Q1(单独的IgM)或Q2(IgM/bCD21、IgM/bIgλ、IgM/bIgκ和IgM/hIgκ)中的百分率。NA：未应用(因为在当时，抗bIgκ抗体是不可得的)。(B,C)为(B)总的hIgG(μg/ml)和(C)全部hIgG/hIgκ(μg/ml)在一系列5-6个月龄的HAC/DKO小牛中的血清浓度。n：对各种基因型所分析的动物的数量。对各种基因型，计算最小值、第一四分位数、中值、第三四分位数和最大值，并绘制于各图中。在虚线圈中示出小牛468的值。(D,E)在一系列5-6个月龄的HAC/DKO小牛中的血清(D)全部hIgG/hIgκ(％)/总的hIgG和(E)hIgG1/hIgG2的比值。n：对各种基因型所分析的动物的数量。对各种基因型，计算最小值、第一四分位数、中值、第三四分位数和最大值，并绘制于左图中。
图5显示isHAC(isKcHACΔ)和istHAC的构建。在cKSL-HACΔ或KcHACΔ载体上将hIγ1-hSγ1类别转换调节元件牛源化，从而分别建立isHAC或isKcHACΔ载体istHAC载体衍生自其中hIGHG1基因的跨膜/细胞质结构域也都是牛源化的isHAC载体。
图6显示isHAC/TKO、istHAC/TKO和isKcHACΔ/TKO小牛的特征。(A)在HAC/TKO小牛中缺乏bIGL表达。使由新生期的5只KcHACΔ/TKO小牛(小牛1-5)得到的PBMC经历RT-PCR，从而证明bIGL表达的缺乏。引物对bIgL-Ld-F1x bIgL-C-R和L003-F2x L004-R2分别用于扩增VJ重新排布的bIGL和恒定区IGLC(bCλ)基因。引物对bIgκ-FR用于扩增VJ重新排布的bIGK基因。N：阴性对照；P：阳性对照。(B)由一系列新生期HAC/TKO小牛得到的PBMC的代表性流式细胞仪分析。对于IgM检测而言，将抗hIgM抗体用于isHAC、istHAC和cKSL-HACΔ/DKO小牛，或者将抗bIgM抗体用于isKcHACΔ和KcHACΔ/TKO小牛。由左至右的面板，针对单独的IgM、IgM/bCD21、IgM/bIgλ、IgM/bIgκ和IgM/hIgκ对PBMC进行染色。每个黑体数字表示细胞在Q1(单独的IgM)或Q2(IgM/bCD21、IgM/bIgλ、IgM/bIgκ和IgM/hIgκ)中的百分率。(C)在一系列5-6个月龄的HAC/TKO和HAC/DKO小牛中总的hIgG的血清浓度(g/l)的Box-whisker图。A：cKSL-HACΔ/TKO(n＝8)；B：isHAC/TKO(n＝12)；C：istHAC/TKO(n＝8)；D：KcHACΔ/TKO(n＝8)；E：isKcHACΔ/TKO(n＝12)；F：cKSL-HACΔ/DKO(n＝33)；G：KcHAC/DKO(n＝12)；H：κHAC/DKO(n＝8)。圆点表示离群值。小牛468的值用箭头表示。对各种基因型，计算最小值、第一四分位数、中值、第三四分位数和最大值，并绘制于各图中。(D)面板显示在各对比较中家族可信度水平为95％。(E)在一系列5-6个月龄的HAC/TKO和HAC/DKO小牛中全部hIgG/hIgκ的血清浓度(g/l)的Box-whisker图。A：cKSL-HACΔ/TKO(n＝8)；B：isHAC/TKO(n＝12)；C：istHAC/TKO(n＝8)；D：KcHACΔ/TKO(n＝8)；E：isKcHACΔ/TKO(n＝12)；F：cKSL-HACΔ/DKO(n＝33)；G：KcHAC/DKO(n＝12)；H：κHAC/DKO(n＝8)。圆点表示离群值。小牛468的值用箭头表示。对各种基因型，计算最小值、第一四分位数、中值、第三四分位数和最大值，并绘制于各图中。(F)面板显示在各对比较中家族可信度水平为95％。(G)在一系列5-6个月龄的HAC/TKO和HAC/DKO小牛中血清全部hIgG/hIgκ(％)/全部hIgG的Box-whisker图。圆点表示离群值。小牛468的值用箭头表示。对各种基因型，计算最小值、第一四分位数、中值、第三四分位数和最大值，并绘制于各图中。(H)面板显示在各对比较中家族可信度水平为95％。n：对各种基因型所分析的动物的数量。(I)在一系列5-6个月龄的HAC/TKO和HAC/DKO小牛中hIgG1/hIgG2比值的Box-whisker图。圆点表示离群值。A：cKSL-HACΔ/TKO(n＝8)；B：isHAC/TKO(n＝12)；C：istHAC/TKO(n＝8)；D：KcHACΔ/TKO(n＝8)；E：isKcHACΔ/TKO(n＝12)；F：cKSL-HACΔ/DKO(n＝33)；G：KcHAC/DKO(n＝12)；H：κHAC/DKO(n＝8)。对各种基因型，计算最小值、第一四分位数、中值、第三四分位数和最大值，并绘制于各图中。(J)面板显示在各对比较中家族可信度水平为95％，不同之处在于主要的hIgG1的比率。(K)所述的表显示各基因型的实际值。(L)在一系列HAC/TKO和HAC/DKO小牛中，在2次接种(V2)人类口腔鳞状细胞癌后，抗人类癌症的hIgG/hIgκ的应答。黑体方形区的百分率显示在V2后的第9-10天，由各动物的血清衍生得到的双阳性hIgG和hIgκ的人类癌细胞的百分率，其中血清稀释因子为1:1280。标记为“V1D0”的分开的面板为在V1后的第0天(V1D0)，使用istHAC/TKO小牛2血清染色的人类癌细胞的流式细胞仪结果，其中血清稀释因子为1:1280。
图7显示由κHAC/IGHM—/—IGHML1—/—(DKO)胚胎和小牛468衍生得到的成纤维细胞的比较基因组杂交(CGH)分析。对生成小牛468的细胞系上存在的κHAC载体进行CGH分析而得到的小牛468的更广泛的分析显示非常明显的结构改变。A254-2为生成小牛468的胚胎成纤维细胞系。A254-2、G827-1、K439-1和K439-2通过由CHO细胞系κC1-1得到的κHAC载体的独立MMCT事件而生成DKO细胞系。由胚胎细胞系K439-1得到的DNA作为参照。仅A254-2和小牛468在hChr14的3’Eα2区附近显示明显的CGH图案(虚线圈)。
图8显示牛IGLJ2-IGLC2和IGLJ3-IGLC3基因的DNA比对。(A)牛IGLJ2-IGLC2和IGLJ3-IGLC3基因的内含子DNA序列比对。“JL2-CL2”(SEQ ID NO:147)和“JL3-CL3”(SEQ ID NO:148)分别相当于IGLJ2-IGLC2和IGLJ3-IGLC3基因的的内含子序列。(B)牛IGLC2和IGLC3基因的3’UTRDNA序列比对。“bCL2”(SEQ ID NO:149)和“bCL3”(SEQ ID NO:150)分别相当于IGLC2和IGLC3基因的3’UTR序列。
图9显示bChr21上推断的牛IGH基因簇的结构。BAC克隆子227-A16似乎包含部分IGH可变区以及IGHML1至Cγ1区。BAC克隆子517-B22看起来覆盖IGHM至Cα区。BAC克隆382-F19可能包含Cγ2至3’Eα2区。估计3个BAC克隆子叠连群的大小为大约380kb的长度。
图10显示IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—(TKO)细胞系的基因分型。为了证明IGHM—/—IGHML1—/—(DKO)基因型，由于存在的KO盒抑制扩增，所以实施阴性PCR(BCμ-f2r2)。执行阳性PCR(BCmKO-F14R14)。对于IGL—/ —基因型，实施阴性PCR(L001-F x L002-R)，以证明IGLC基因缺乏。同时，实施对删除的基因组具有特异性的阳性PCR(CAGpuro-F3R3)。
图11显示在人类、牛和小鼠中，人类牛和小鼠(A)IgM(人类SEQ ID NO:151，牛SEQ ID NO:152和小鼠SEQ ID NO:153)；(B)VpreB1(人类SEQ IDNO:154，牛SEQ ID NO:155和小鼠SEQ ID NO:156)；(C)λ5(人类SEQ IDNO:157，牛SEQ ID NO:158和小鼠SEQ ID NO:159)；(D)Ig-α(人类SEQID NO:160，牛SEQ ID NO:161和小鼠SEQ ID NO:162)；以及(E)Ig-β(人类SEQ ID NO:163，牛SEQ ID NO:164和小鼠SEQ ID NO:165)的氨基酸序列比对。各百分率显示出同源性。h：人类；b：牛；m：小鼠。阴影氨基酸与人类不同的氨基酸。
图12显示cKSL-HACΔ和KcHACΔ载体的基因分型以及cKSL-HACΔ/DKO小牛的特征。(A)用于cKSL-HACΔ载体的基因分型的广泛基因组PCR。与cKSL-HACΔ载体结构相关联来描绘各基因组PCR引物对的位置。(B)用于KcHACΔ载体的基因分型的广泛基因组PCR。与KcHACΔ载体结构相关联来描绘各基因组PCR引物对的位置。(C)对包含cKSL-HACΔ和KcHACΔ载体、或者KcHAC载体中的任一者的CHO克隆子进行的CGH分析。在上方的面板中，将包含CHO克隆子的cKSL-HACΔ(cKSLDC6,15,23)与包含κHAC的κC1-1和包含KcHAC载体的KCF4比较。在所有的HAC中都不具有明显的结构差异，不同之处在于在3’Eα2区(虚线圈，其是SC20基HAC、κHAC和KcHAC所特有的)附近一些潜在的DNA扩增。由cKSLDC15得到的DNA用作参照。下方的面板显示在包含KcHACΔ载体的3种不同的CHO克隆子中的CGH图案，其中得自KCDC1的DNA用作参照。在3种细胞系中，KcHACΔ不具有明显的结构差异。(D)人类IGL、VPREB1和IGLL1基因在cKSL-HACΔ/DKO小牛中的转录。使由3只新生期的cKSL-HACΔ/DKO小牛(小牛1-3)得到的PBMC经历RT-PCR，以证明人类IGL、VPREB1和IGLL1基因的表达。N：阴性对照；P：阳性对照。
图13显示牛与人类之间与IgG1类别转换调节和分泌有关的序列的比对。(A)人类与牛之间Iγ1(人类Iγ1SEQ ID NO:166，牛Iγ1SEQ ID NO:167)、Iγ2(人类Iγ2SEQ ID NO:168，牛Iγ2SEQ ID NO:169)和Iγ3(人类Iγ3SEQ IDNO:170，牛Iγ3SEQ ID NO:171)的ECS(进化保守序列)元件的DNA序列的比对。阴影的核苷酸碱基描绘了与人类Iγ1序列不同的核苷酸碱基。KB3(κB3)、KB4(κB4)、KB5(κB5)、ISRE(干扰素刺激的应答元件)、C-EBP(CCAAT增强子结合蛋白)、BSAP(B细胞系特异性的活化剂蛋白)和GAS(γ干扰素活化位点)的结合位点通过方形线表示。(B)人类和牛Sγ1序列之间的点阵序列比对。(C)人类(SEQ ID NO:172)与牛(SEQ ID NO:173)之间的IgG1跨膜/细胞质结构域的氨基酸序列比对。阴影的氨基酸描绘了与人类不同的氨基酸。
图14显示在一系列5-6个月龄的HAC/TKO小牛中全部hIgG/hIgκ的血清浓度(g/L)。n：各基因型所分析的动物的数量。对于各基因型而言，根据使用的TKO细胞系来绘制单个值。
图15显示在一系列5-6个月龄的HAC/TKO和HAC/DKO小牛中的血清全部hIgG/bIgκ(％)/总的hIgG。n：各基因型所分析的动物的数量。对于各基因型而言，计算最小值、第一四分位数、中值、第三四分位数和最大值，并绘制于左图中。
图16显示在一系列HAC/TKO和HAC/DKO小牛中，在2次接种(V2)人类口腔鳞状细胞癌后，抗人类癌症的hIgG/hIgκ的应答。在V2后的第9-10天，在所示的血清稀释因子下，由各免疫的动物绘制hIgG/hIgκ双阳性人类癌细胞的百分率。
图17显示14D载体的构建。(A)14D载体构建的流程。第一lox51整合在完整hChr14上的AL512355处，从而生成I355-2。然后，第二lox511置于AL391156处，从而生成I156-10。引入Cre使得染色体上大段的DNA被删除，从而生成D8。通过在RNR2基因座处整合loxP来建立14D1。随后，cIgM(CH1)或cIgM(CH2)牛源化而生成CH1D2或CH2D4，其分别用于KcHACΔ或cKSL-HACΔ载体的构建。(B)14D载体构建的详细策略。打靶载体pSC355CAGlox511hisDDT由8.2kb和2.0kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、CAG启动子、lox511、SV40polyA信号、鸡β-肌动蛋白启动子驱动的hisD基因和DT-A基因构成，其用于将lox511序列整合在AL512355处,～300kb，IGHA2基因座的着丝粒。另一种打靶载体p14CEN(FR)hygpurolox511DT由8.2kb和1.8kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、不含启动子的puro基因、lox511、鸡β-肌动蛋白启动子驱动的hyg基因和DT-A基因构成，其用于将lox511序列整合在AL391156处。引入Cre诱导2个lox511位点之间的大段的DNA(～85Mb)被删除，从而生成14D。大段删除的结果是CAG启动子驱动的puro基因被再构成，并可通过嘌呤霉素选择。使嘌呤霉素抗性细胞经历基因组PCR(CAGpure-F3R3)，从而在分子水平证明所述的删除。此外，所述的细胞由于所述的删除而对潮霉素B或组氨醇敏感。(C)针对CH1D和CH2D的IgM牛源化。牛源化载体pCH1CAGzeo(R)DT(F)包含7.4kb和1.7kb人类基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、覆盖CH1至TM2结构域的6kb牛IGHM恒定区基因组DNA、以及DT-A基因，其中所述的敲除的CAG启动子驱动的zeo基因盒整合在CH4和TM1内含子之间。在同源重组后，hIGHM恒定区的一部分(CH1至TM2结构域)上，在CH1D上牛源化。另一种牛源化载体pCH2CAGzeoDT(F)包含7.2kb和1.7kb人类基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、覆盖CH2至TM2结构域的5.4kb牛IGHM恒定区基因组DNA、以及DT-A基因，其中所述的敲除的CAG启动子驱动的zeo基因盒整合在CH4和TM1内含子之间。在同源重组后，hIGHM恒定区的一部分(CH2至TM2结构域)上，在CH2D上牛源化。(D)在各靶向事件中的基因分型。在AL512355处，SC355KO-F2R2作为对同源重组具有特异性的阳性PCR与阴性PCR(355N-FR)一起使用，其中所述的阳性对照被存在的KO盒所抑制。在AL391156处，14CENKO-F3R3作为对同源重组具有特异性的阳性PCR与阴性PCR(14CEN(N)-F2R2)一起使用，其中所述的阳性对照被存在的KO盒所抑制。对于CH1D修饰{例如cIgM(CH1)牛源化}而言，cHAC-F3F3作为对同源重组具有特异性的阳性PCR与CH15’-FR和cHAC 3’-FR一起使用，以检查人类与牛序列之间的连接序列。相似地，对于对于CH2D修饰{例如cIgM(CH2)牛源化}而言，cHAC-F3F3作为对同源重组具有特异性的阳性PCR与CH25’-FR和cHAC 3’-FR一起使用，以检查人类与牛序列之间的连接序列。(E)完整的hChr14和缩短的hChr14片段之间的人类COT-1FISH。
图18显示hChr2片段的修饰。(A)克隆子κZ7的生成。使用打靶载体pTELCAGzeoCD8A转染克隆子κTL1，从而以zeo盒替换puro盒。通过基因组PCR(CD8AKO-F2R2)证明靶向事件。(B)hChr2片段截短，从而生成克隆子K53。使用打靶载体pTEL'hisDpurolox2272F9R9转染克隆子κTL1，从而截短hChr2片段并在AC104134处整合lox2272，其中所述的打靶载体由7.4kb的基因组DNA(作为同源臂)、不含启动子的puro基因、lox2272、鸡β-肌动蛋白启动子驱动的hisD基因和人类端粒重复序列(TEL)构成。
图19显示hChr22片段的修饰。(A)克隆子STL54的生成。通过靶向的截短载体pTELCAGzeoSLFR在AP000350处截短克隆子52-18中所保留的完整hChr22，从而生成ST13。随后，通过打靶载体p553CAGlox2272bsrDT在AP000553处整合lox2272序列，从而生成STL54。(B)在AP000350处hChr22的截短。基因座AP000350位于hVPREB3基因座的～70kb端粒中。截短载体pTELCAGzeoSLFR由7.4kb的基因组DNA(作为同源臂)、CAG启动子驱动的zeo基因和人类端粒重复序列(TEL)构成。在同源重组后，在AP000350处hChr22被截短。(C)lox2272位点在AP000553处的整合。打靶载体p553CAGlox2272bsrDT包含6.9kb和2.8kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、CAG启动子、lox2272、SV40polyA信号、鸡β-肌动蛋白启动子驱动的bsr基因、以及DT-A基因。553KO-F3R3作为对同源重组具有特异性的阳性PCR与阴性PCR(553-F4R4)一起使用，其中所述的阳性PCR被存在的KO盒所抑制。
图20显示SLKH片段的构建。(A)SLKH片段生成的流程。使2种克隆子K53和STL54经历全细胞融合，从而生成DT40杂交克隆子SLK2。然后，引入Cre重组酶，从而诱导2个hChr片段(其建立SLKH片段)之间的染色体转座。染色体转座的结果是CAG启动子驱动的puro基因被再构成，并可通过嘌呤霉素选择。此外，通过基因组PCR(CAGpuro-F3R3)来证明转座的发生。通过MMCT，将由DT40杂交克隆子SLKH6得到的SLKH片段转移至平面DT40细胞中，从而生成SLKD18。(B)在SLK2、SLKH6和SLKD18上的多色FISH。使用人类COT-1探针简单地染色SLK2，证明较长的hChr2片段和较短的hChr22片段的存在。对SLKH6和SLKD18实施双色FISH。在SLKH6中，可见2个互相转座的hChr片段；较长的一条片段为SLKH片段。在SLKD18中，仅存在单一的SLKH片段。
图21显示染色体倒位在CH2D上的形成。RNR2基因座处的loxP与删除的连接位点AP391156/AP512355处的lox511之间的渗漏重组产生倒位，这还会再构建CAG启动子驱动的GFP基因，导致GFP的表达比由cKSL-HACΔ载体得到的PGK启动子驱动的GFP基因更高。通过基因组PCR(STOPpuro-F2R2和GFP2x CAGpuro-F3)来证明所述的倒位。
图22显示isHAC和isKcHACΔ载体的构建。(A)isHAC和isKcHACΔ载体构建的流程。牛源化载体pCC1BAC-isHAC为BAC基载体(主链为pCC1BAC)，其由10.5kb和2kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、9.7kb牛基因组DNA(其覆盖牛Iγ1-Sγ1及其周围区域从而替换人类相应的6.8kb的Iγ1-Sγ1区)、以FRT序列作为侧翼的鸡β-肌动蛋白启动子驱动的neo基因、以及DT-A基因的构成。在靶向牛源化后，通过引入FLP而除去neo盒。(B)打靶载体pCC1BAC-isHAC的详细信息。用于短臂和长臂的2kbAfeI-BamHI片段和10.5kb Apa I-Hpa I片段分别得自克隆子h18/h20，该克隆子h18/h20衍生自通过使用人类Iγ1-Sγ1区周围的探针进行筛选而由包含κHAC的CHO细胞构建的λ噬菌体基因组文库。9.7kb片段(5’至Bsu36I)得自由λ噬菌体牛基因组文库衍生的克隆子b42。(C)牛源化的Iγ1-Sγ1区的基因分型。基本上，如所示实施5组基因组PCR。iscont1-F1/R1为对同源重组具有特异性的阳性PCR。iscont1-F1x hIgG1-R10为被存在的neo盒所抑制的阴性PCR。isHAC-Sw-dig-F5/R3和isHAC-TM-dig-F3/R2用于它们相应区域的结构整体性检查，分别由Bam HI+Pvu II和Age I,Sma I或Pvu II所消化。bNeo 5’-Rx bIgG1-5’-seq-R6用于证明FRT序列的存在。(D)在删除neo盒的FLP-FRT后的基因分型。(E)用于isHAC载体的基因分析的广泛基因组PCR。与isHAC载体结构相关联来描绘各基因组PCR引物对的位置。(F)在包含isHAC载体的3种不同的CHO克隆子中的CGH分析。由isC1-133得到的DNA用作参照。在这3种细胞系中均不具有明显的结构差异。(G)用于isKcHACΔ载体的基因分型的广泛基因组PCR。与isKcHACΔ载体结构相关联来描绘各基因组PCR引物对的位置。(H)在包含isKcHACΔ载体的3种不同的CHO克隆子中的CGH分析。由isKCDC15-8得到的DNA用作参照。在这3种细胞系中均不具有明显的结构差异。
图23显示istHAC载体的构建。(A)istHAC载体构建的流程。分别通过打靶载体phIγ1FRTCAGattPhisDDT和phγ1TMNeoattPDT将attP序列整合至hIγ1外显子1的5’一侧和hIGHG1TM2的3’一侧。然后，使用φC31重组酶引入替换载体pBAC-istHAC，形成attP/attB重组以替换侧翼区。成功的替换使得CAG启动子驱动的DsRed基因被再构建，从而提供红色荧光用于分类。最后，通过FLP表达来除去DsRed盒。(B)attP序列在hIGHG1TM2的3’一侧的整合。打靶载体phγ1TMNeoattPDT由6.3kb和1.2kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、鸡β-肌动蛋白启动子驱动的neo基因、attP和DT-A基因构成。hg1TMneoattP-F1/R1作为对同源重组具有特异性的阳性PCR与阴性PCR(hIgG1-F25/R23和hg1TMneg-F3/R3)一起使用，其中所述的阳性PCR被存在的KO盒所抑制。使用hIgG1TM-dig-F1/R2(后被Sma I或Age I消化)检查相应区的结构整体性。(C)attP序列在hIγ1外显子1的5’一侧的整合。打靶载体phIγ1FRTCAGattPhisDDT包含9.6kb和1.8kb基因组DNA(分别作为长臂和短臂)、鸡β-肌动蛋白启动子驱动的hisD基因、attP、CAG启动子、FRT和DT-A基因。hg1FRTCAGattPhisD-F1/R1作为对同源重组具有特异性的阳性PCR与阴性PCR(iscont1-F1x hIgG1-R10)一起使用，其中所述的阳性PCR被存在的KO盒所抑制。(D)由attP-attB重组介导的大段DNA替换。替换载体pBACistHAC由18.1kb嵌合基因组DNA(bIγ1-bSγ1+hIGHG1CH1至CH3+bIGHG1TM1-TM2)、不含启动子的DsRed、FRT和2个侧翼attB序列形成。通过DsRed表达和基因组PCR(CAGDsRed-F2/R2和bIgG1-3’-SeqF3x hIgG1-R15分别检查attR和attL的生成)来证明通过φC31表达而形成的DNA替换。(E)在删除DsRed盒的FLP-FRT后的基因分型。(F)用于istHAC载体的基因分型的广泛基因组PCR。与istHAC载体结构相关联来描绘各基因组PCR引物对的位置。(G)在包含istHAC载体的3种不同的CHO克隆子中的CGH分析。由istC1-6得到的DNA用作参照。在这3种细胞系中均不具有明显的结构差异。
图24显示用于CGH的、基于推断的cKSL-HACΔ载体序列的探针设计。对于hChr14、hChr2和hChr22片断序列，分别将AB019437与AL512355、AC113612与AC104134、以及AP000553与AP000350组装，并与人工“NNN…N”连接，从而创建4,932,030bp DNA序列作为推断的cKSL-HACΔ载体序列。
图25显示在Tc牛B细胞中在2种水平下的种间不相容性的模型。一种水平为蛋白质-蛋白质相互作用，例如前BCR/BCR结构(例如人类IgM与牛替代/公认轻链之间配对、人类IgM/IgG1与牛Ig-α/β之间的相互作用)。另一种水平为DNA-蛋白质相互作用，例如人类Iγ1-Sγ1DNA序列与牛细胞因子/活化剂诱导的牛DNA结合蛋白质之间。前者通过KcHAC(Δ)和cKSL-HACΔ(也可以通过isHAC、istHAC和isKcHACΔ)来解决。后者通过isHAC、istHAC和isKcHACΔ来解决。
图26显示牛(SEQ ID NO:182)、马(SEQ ID NO:185)和猪(SEQ ID NO:186)的Iγ1-Sγ1区的分析。(A)牛Iγ1-Sγ1与猪Iγ1-Sγ1之间的比较表明在牛和猪的Iγ1区(椭圆形)之间具有一定的同源性，以及在(B)中圈起来的潜在的ECS。(C)牛Iγ1-Sγ1与马Iγ1-Sγ1之间的比较表明在牛和马的Iγ1区(椭圆形)之间具有一定的同源性。(D)马Iγ1-Sγ1与猪Iγ1-Sγ1之间的比较表明在马和猪的Iγ1区(椭圆形)之间具有一定的同源性。
图27显示Iγ1区的ECS是很保守的。(A)在人类(SEQ ID NO:166)、牛(SEQ ID NO:187)、猪(SEQ ID NO:189)和马(SEQ ID NO:188)中Iγ1的ECS的多序列比对。(B)在有蹄动物中，Iγ1的ECS的多序列比对。
图28显示有蹄动物绵羊(SEQ ID NO:174)、牛(SEQ ID NO:152)、猪(SEQ ID NO:175)和马(SEQ ID NO:176)中，IgM的多序列比对。
图29显示使用牛Ig重链3’增强子使HAC牛源化。(A)在人类、牛和小鼠3’Eα增强子中结构的保守性。(B)表明包含牛3’E的区域，其中所述的牛3’E用于HAC上3’Eα的牛源化。(C)用于使HAC上3’α1牛源化的牛基因组片段。(D)证明mu-HAC的构造。(E)在attP/attB重组后，证明HAC的结构整体性。
图30显示在有蹄动物和人类(牛(SEQ ID NO:196)、马(SEQ ID NO:197)、猪(SEQ ID NO:198)和人类(SEQ ID NO:199))中IgG1氨基酸序列的多序列比对。
图31显示人类-牛嵌合IgM(CH2-TM2牛源化的IgM)-cIgM(CH2)序列(SEQ ID NO:200)。
发明详述
所有引用的参考文献均以引用方式全部并入本文。在本申请中，除非另作说明，否则所用的技术均可以在多个公知的参考文献的任意一个中找到，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook,et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methodsin Enzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,SanDiego,CA),“Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide toMethods andApplications(Innis,et al.1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture ofAnimal Cells:AManual ofBasic Technique,2ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.NewYork,NY),Gene Transfer andExpression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.),and theAmbion 1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。
如本文所用，除非另外明确说明，否则单数形式“a”、“an”和“the”包含复数指示物。如本文所用，除非另外明确陈述，否则“和”与“或”可交换使用。
除非内容中另外明确说明，否则本发明的任一方面的所有实施方案都可以组合使用。
除非内容中另外明确地需要，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”(动词)和“包含”(分词)等都解释为包括在内的含义，其含义与专门的或穷举的含义相反；也就是“包含但不限于”的含义。单数或复数形式的词语还分别包含复数和单数。此外，当词语“本文”、“上文”、“下文”以及相似含义的词语用于本申请中时，是将本申请作为整体来看，而不是指本申请的任何特定的部分。
本发明公开的实施方案的描述并非是穷举的，或者是将本发明公开限定为所公开的精确形式。尽管本文中描述本发明公开的具体实施方案和实施例是为了说明的目的，但是相关领域的那些技术人员将意识到的是，在本公开的范围内多个相当的修改是可行的。
在第一个方面中，本发明提供了包含基因的人类人工染色体(HAC)载体，其中所述的基因包含：
(a)一条或多条人类抗体重链，其中编码抗体重链的各个基因与类别转换调节元件可操作地连接；
(b)一条或多条人类抗体轻链；以及
(c)一条或多条人类抗体替代轻链，和/或有蹄动物衍生的IgM重链恒定区；其中编码一条或多条人类抗体重链的基因的至少一个类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别转换调节元件所替换。
如在本发明的方法中所述，本发明的HAC载体可以用于例如转基因动物大规模地生产全部人类抗体。如下文的实施例中所示，相对于以前的HAC，所述的HAC载体可以用于在有蹄动物中生产出乎意料的高水平的抗原特异性多克隆抗体。
在本发明中，术语“HAC载体”是指这样的载体，其至少包含人类染色体衍生的着丝粒序列、端粒序列和复制起点，并且可以包含给定应用中所需的任何其他的序列。当HAC载体存在于宿主细胞中时，其独立于宿主细胞染色体(细胞核)而存在。任何合适的方法可以用于制备HAC载体，并将所关注的核酸插入到HAC中，包含但不限于以下实施例中所述的那些。HAC载体为双链DNA载体，如本领域的那些技术人员已知的那样。
本发明的HAC载体包含编码人类抗体重链的一个或多个基因。任一人类抗体重链或人类抗体重链的组合都可以由HAC上的一个或多个核酸所编码。在多个实施方案中，人类抗体重链IgM,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE和IgD的1,2,3,4,5,6,7,8或所有9种都可以在HAC上以一个或多个拷贝来编码。在一个实施方案中，HAC包含单独的编码人类IgM抗体重链的基因，或者与编码编码1,2,3,4,5,6,7或其他8种人类抗体链的基因组合的、编码人类IgM抗体重链的基因。在一个优选的实施方案中，HAC包含至少编码人类IgG1抗体重链的基因；在这种实施方案中，进一步优选的是HAC包含编码人类IgM抗体重链的基因或编码人类IgM抗体重链(其是嵌合的，从而编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区，例如牛重链恒定区)的基因。在另一个实施方案中，HAC包含至少编码人类IgA抗体重链的基因；在这种实施方案中，进一步优选的是HAC包含编码人类IgM抗体重链的基因或编码人类IgM抗体重链(其是嵌合的，从而编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区，例如牛重链恒定区)的基因。在另一个优选的实施方案中，HAC包含编码所有9种抗体重链的基因，并且更优选的是其中编码人类IgM抗体重链的基因是嵌合的，从而编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区。在另一个实施方案中，HAC可以包含编码人类抗体重链的人类染色体14的一部分。人类抗体重链的可变区和恒定区形成了簇，并且人类重链基因座位于人类染色体14上的14q32上。在一个实施方案中，插入于HAC中的人类染色体14的区域包含由人类染色体14的14q32区得到的人类抗体重链的可变区和恒定区。
在本发明的HAC载体中，编码人类抗体重链的核酸的至少一个类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别转换调节元件所替换。类别转换调节元件是指抗体重链恒定区的5’端的核酸。每个重链恒定区基因都与其自己的转换区可操作地连接(即，处于转换区的控制之下)，所述的转换区也与其自己的I-外显子有关。类别转换调节元件调节类别转换重组，并确定Ig重链的同种型。各重链同种型的种系转录是由恰好位于I-外显子的5’端的启动子/增强子元件而驱动的，并且这些元件为细胞因子或其他活化剂反应性的。在类别转化的简单模式中，特定的活化剂和/或细胞因子通过其类别转换调节元件(即，活化剂/细胞因子反应性启动子和/或增强子)来诱导各重链同种型的种系转录。类别转换凭借各Ig重链(IGH)基因座相关的转换区通过I-外显子的转录而被推进。这样，各重链恒定区基因与其自己的转换区连接。
可以使用任何合适的有蹄动物衍生的类别转换调节元件。如本文所用，“有蹄动物”可以为任何合适的有蹄定位，包含但不限于牛、猪、马、驴、斑马、鹿、公牛、山羊、绵羊和羚羊。例如以下列举的人类重链基因同种型具有以下类别转换调节元件：
IgM：Iμ-Sμ，
IgG1：Iγ1-Sγ1，
IgG2：Iγ2-Sγ2，
IgG3：Iγ3-Sγ3，
IgG4：Iγ4-Sγ4，
IgA1：Iα1-Sα1，
IgA2：Iα2-Sα2，和
IgE：Iε-Sε。
在多个实施方案中，HAC上的1个、多于1个或所有人类抗体重链都具有被有蹄动物衍生的类别转化调节元件所替换的它们的类别转换调节元件，包含但不限于有蹄动物Iμ-Sμ,Iγ-Sγ,Iα-Sα或Iε-Sε类别转换调节元件。在一个实施方案中，在HAC上用于编码人类IgG1重链的核酸的Iγ1-Sγ1人类类别转换调节元件(例如SEQ ID NO:183)被有蹄动物Iγ1-Sγ1类别转换调节元件所替换。示例性的有蹄动物Iγ1-Sγ1类别调节转换元件包含牛IgG1Iγ1-Sγ1类别转换调节元件(SEQ ID NO:182)、马Iγ1-Sγ1类别转换调节元件(SEQ ID NO:185)、和猪Iγ1-Sγ1类别转换调节元件(SEQ ID:186)。但是不必使用由相应的重链同种型得到的有蹄动物类别转换调节元件来替换人类类别转换调节元件。因此，例如在HAC上，用于编码人类IgG3重链的核酸的Iγ3-Sγ3人类类别转换调节元件可以被有蹄动物的Iγ1-Sγ1类别转换调节元件所替换。根据本文的教导，对于本领域的那些技术人员显而易见的是，任何此类的组合都可以用于本发明的HAC中。
在另一个实施方案中，HAC包含至少一种有蹄动物增强子元件，从而替换HAC上与编码一个或多个人类抗体重链恒定区的核酸有关的增强子元件。其中有2种与人类抗体重链基因有关的3’增强子区(α1和α2)。增强子元件为重链恒定区的3’端，还有助于调节类别转化。可以使用任何合适的有蹄动物增强子，包含但不限于3’Eα增强子。可以使用的3’Eα增强子的非限定性实例包含3’Eα,3’Eα1和3’Eα2。由牛得到的可以用于HAC中并可以替换人类增强子的示例性3’Eα增强子元件包含但不限于牛HS3增强子(SEQ ID NO:190)、牛HS12增强子(SEQ ID NO:191)以及牛增强子HS4。该实施方案在其中HAC包含由人类染色体14的14q32区得到的人类抗体重链的可变区和恒定区的实施方案中是特别优选的。
本发明的HAC载体可以包含编码人类抗体轻链的一个或多个基因。编码人类抗体轻链的任何合适的基因可以用于本发明的HAC载体中。人类抗体轻链包含2重基因，即，kappa/κ链基因和lambda/λ链基因。在一个实施方案中，HAC包含一个或多个拷贝的编码κ和λ的基因。κ链的可变区和恒定区定位于人类染色体2的2p11.2-2p12上，并且λ链形成了位于人类染色体22的22q11.2处的簇。因此，在一个实施方案中，本发明的HAC载体包含人类染色体2片段，其包含2p11.2-2p12区的κ链基因簇。在另一个实施方案中，本发明的HAC载体包含人类染色体22片段，其包含22q11.2区的λ链基因簇。
在另一个实施方案中，HAC载体包含至少一个编码人类抗体替代轻链的基因。编码人类抗体替代轻链的基因是指编码设想的抗体轻链的基因，其中所述的设想的抗体轻链与人类祖B细胞中基因再构建(从而构建前B细胞受体(preBCR))所生产的抗体重链有关。可以使用编码人类抗体替代轻链的任何合适的基因，包含但不限于VpreB1(SEQ ID NO:154)、VpreB3(SEQ ID NO:178)以及λ5(也称为IgLL1,SEQ ID NO:157)人类抗体替代轻链和它们的组合。VpreB基因和λ5基因位于人类染色体22的22q11.2处的人类抗体λ链的基因座中。因此，在一个实施方案中，HAC可以包含含有VpreB基因和λ5基因的人类染色体22的22q11.2区。本发明的人类VpreB基因提供了VpreB1基因(SEQ ID NO:154)和/或VpreB3基因(SEQ ID NO:178)，并且在一个实施方案中提供了VpreB1基因和VpreB3基因。
在另一个实施方案中，HAC载体包含编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区的基因。在该实施方案中，IgM重链恒定区与人类IgM抗体重链可变区作为嵌合体表达。可以使用编码有蹄动物IgM重链抗体恒定区的任何合适的核酸，包含但不限于牛IgM(SEQ ID NO:152)、马IgM(SEQ ID NO:176)、绵羊IgM(SEQ ID NO:174)以及猪IgM(SEQ ID NO:175)。在一个实施方案中，嵌合IgM包含SEQ ID NO:200中的序列。通过IgM重链分子进行信号传递的前BCR/BCR通过与B细胞膜分子Igα/Igβ相互作用使得细胞中的信号转导来促进B细胞的增殖和发育。认为IgM的跨膜区和/或其他恒定区在用于信号转导的与Igα/Igβ相互作用中具有重要作用。IgM重链恒定区的实例包含编码恒定区结构域(例如CH1、CH2、CH3和CH4)以及B细胞跨膜和细胞质结构域(例如TM1和TM2)的核酸。编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区的核酸(其包含在本发明的人类人工染色体载体中)并未特别限定，只要所述的区域在上述IgM重链恒定区中可以足以诱导B细胞受体或B细胞增殖/发育的范围内即可。在一个实施方案中，编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区的核酸提供了由有蹄动物衍生的跨膜和细胞质TM1结构域和TM2结构域，并且在其他的实施方案中，编码有蹄动物衍生的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域，或者有蹄动物衍生的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域。
在一个实施方案中，编码牛的IgM重链恒定区的基因为包含于IGHM区(由IGHM衍生得到)(在该IGHM区中牛的内源IgM重链基因定位于其中)中的编码牛IgM重链恒定区的基因，或包含于IGHML1区(由IGHML1衍生得到)中的编码牛IgM重链恒定区的基因。在另一个实施方案中，编码牛的IgM重链恒定区的基因包含于IGHM区。
在另一个实施方案中，HAC包含编码人类抗体重链的基因，包含编码人重链(例如人IgG重链，例如IgG1重链)的基因，并且其中人类重链基因的恒定区的跨膜结构域和细胞内结构域被有蹄动物衍生的重链(例如有蹄动物IgG重链，例如IgG1重链)恒定区基因的跨膜结构域和细胞内结构域所替换。在一个实施方案中，编码有蹄动物(例如牛)衍生的IgG(例如IgG1)重链恒定区的跨膜结构域和细胞内结构域用于替换人类IgG重链基因的相应区域。在另一个实施方案中，编码有蹄动物(例如牛)衍生的IgG(例如IgG1)重链恒定区TM1和TM2结构域的基因用于替换人类IgG重链基因的相应区域。在另一个实施方案中，编码有蹄动物(例如牛)衍生的IgG(例如IgG1)重链恒定区CH1-CH4结构域和/或TM1和TM2结构域中的一者或多者的基因用于替换人类IgG重链基因的相应区域。
在第二个方面中，本发明提供了转基因有蹄动物，其包含根据本发明的第一个方面的任一实施方案或实施方案的组合的HAC载体。包含本发明的HAC载体的转基因有蹄动物是指其中引入了本发明的人类人工染色体载体的动物。具有本发明的HAC的转基因有蹄动物并未特别限定，只要所述的动物为其中人类人工染色体片段可以引入其细胞中的转基因有蹄动物即可，并且可以使用任何非人类动物，例如诸如牛、马、山羊、绵羊和猪等之类的有蹄动物。在一个方面中，转基因有蹄动物为牛。可以例如通过使用任何合适的技术(例如本发明所述的那些)将本发明的HAC载体引入到宿主动物的卵母细胞中来构建具有本发明的HAC载体的转基因有蹄动物。可以例如通过微细胞融合方法将本发明的HAC载体引入到由宿主有蹄动物衍生的体细胞中。因此，可以通过将细胞的细胞核或染色质团块移植到卵母细胞中，并将卵母细胞或待由卵母细胞形成的胚胎移植到宿主动物的子宫中使其分娩，从而构建具有HAC载体的动物。可以通过Kuroiwa et al.(Kuroiwa et al.,Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000andKuroiwa et al.,Nature Biotechnology,20,889-894)的方法来证明上述方法构建的动物是否具有本发明的人类人工染色体载体。
在第三个方面中，本发明提供了转基因有蹄动物，其包含被整合至其基因组中的基因，该基因编码：
(a)一条或多条人类抗体重链，其中编码抗体重链的各基因与类别转换调节元件可操作地连接；
(b)一条或多条人类抗体轻链；以及
(c)一条或多条人类抗体替代轻链和/或有蹄动物衍生的IgM重链恒定区；其中编码一条或多条人类抗体重链的基因的至少一个类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别调节元件所替换。
在该第三个方面中，转基因有蹄动物可以包含针对HAC所述的核酸的任一实施方案或实施方案的组合，其中所述的核酸并非存在于HAC中，它们整合至有蹄动物的染色体中。
在第四个方面中，本发明提供了生产人类抗体的方法，其包含：(a)将靶抗体给予本发明的任一实施方案或实施方案的组合的转基因有蹄动物中，从而在有蹄动物的血清或血浆中生产和累积对靶向抗原具有特异性的人类抗体；以及(b)由有蹄动物的血清或血浆回收对靶向抗原具有特异性的人类抗体。在一个实施方案中，回收抗体包含：(i)由转基因有蹄动物分离离靶细胞；(ii)由淋巴细胞生成生产人类单克隆抗体的杂交瘤；以及(iii)由杂交瘤回收对靶向抗原具有特异性的人类单克隆抗体。在另一个实施方案中，由转基因有蹄动物的淋巴结分离由转基因有蹄动物得到的淋巴细胞。在另一个实施方案中，使用靶向抗原使转基因有蹄动物超免疫。
可以通过使用所需的靶向抗原免疫具有本发明的HAC载体的转基因有蹄动物而在转基因有蹄动物的血清中生产对靶向抗原具有特异性的人类抗体，并由转基因有蹄动物的血清回收对靶向抗原具有特异性的人类抗体，从而生产对靶向抗原具有特异性的人类抗体。对使具有本发明的HAC载体的转基因有蹄动物免疫的靶向抗原并未特别限定，并且其实例包含肿瘤相关抗原、与过敏或炎症有关的抗原、与心血管疾病有关的抗原、与自身免疫疾病有关的抗原、与神经退行性疾病有关的抗原以及与病毒或细菌感染有关的抗原。
肿瘤相关抗原的实例包含CD1a,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD9,CD10,CD13,CD19,CD20,CD21,CD22,CD25,CD28,CD30,CD32,CD33,CD38,CD40,CD40ligand(CD40L),CD44,CD45,CD46,CD47,CD52,CD54,CD55,CD55,CD59,CD63,CD64,CD66b,CD69,CD70,CD74,CD80,CD89,CD95,CD98,CD105,CD134,CD137,CD138,CD147,CD158,CD160,CD162,CD164,CD200,CD227,肾上腺髓质素,血管生成素相关蛋白4(ARP4),极光激酶,B7-H1,B7-DC,integlin,骨髓基质抗原2(BST2),CA125,CA19.9,碳酸酐酶9(CA9),钙粘着蛋白,cc-趋化因子受体(CCR)4,CCR7,癌胚抗原(CEA),富含半胱氨酸的成纤维细胞生长因子受体-1(CFR-1),c-Met,c-Myc,胶原蛋白,CTA,结缔组织生长因子(CTGF),CTLA-4,细胞角蛋白-18,DF3,E-catherin,表皮生长因子受体(EGFR),EGFRvIII,EGFR2(HER2),EGFR3(HER3),EGFR4(HER4),endoglin,上皮细胞粘附分子(EpCAM),内皮细胞蛋白C受体(EPCR),ephrin,ephrin受体(Eph),EphA2,endotheliase-2(ET2),FAM3D,成纤维细胞活化蛋白(FAP),Fc受体同源物1(FcRH1),铁蛋白,成纤维细胞生长因子-8(FGF-8),FGF8受体,碱性FGF(bFGF),bFGF受体,FGF受体(FGFR)3,FGFR4,FLT1,FLT3,叶酸受体,Frizzled同源物10(FZD10),frizzled受体4(FZD-4),G250,G-CSF受体,神经节苷脂(GD2,GD3,GM2,GM3等),球H,gp75,gp88,GPR-9-6,类肝素酶I,肝细胞生长因子(HGF),HGF受体,HLA抗原(HLA-DR等),HM1.24,人乳脂肪球(HMFG),hRS7,热休克蛋白90(hsp90),独特型表位,胰岛素样生长因子(IGF),IGF受体(IGFR),白细胞介素(IL-6,IL-15等),白细胞介素受体(IL-6R,IL-15R等),整联蛋白,免疫受体转座相关的蛋白-4(IRTA-4),激肽释放酶1,KDR,KIR2DL1,KIR2DL2/3,KS1/4,lamp-1,lamp-2,层粘连蛋白-5,Lewis y,多价唾液酸多醣x,淋巴毒素-β受体(LTBR),LUNX,黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP),间皮素,MICA,人缪勒管抑制物质II型受体(MISIIR),粘液素,神经细胞粘附分子(NCAM),Necl-5,Notch1,骨桥蛋白,血小板衍生的生长因子(PDGF),PDGF受体,血小板因子-4(PF-4),磷酯酰丝氨酸,前列腺特异性抗原(PSA),前列腺干细胞抗原(PSCA),前列腺特异性膜抗原(PSMA),甲状旁腺激素相关蛋白/肽(PTHrP),NF-kappaB配体的受体活化剂(RANKL),透明质酸介导的细胞游走受体(RHAMM),ROBO1,SART3,semaphorin4B(SEMA4B),分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI),SM5-1,1-磷酸鞘氨醇,肿瘤相关的糖蛋白-72(TAG-72),铁传递受体(TfR),TGF-beta,Thy-1,Tie-1,Tie2受体,T细胞免疫球蛋白结构域和粘液素结构域1(TIM-1),人类阻止因子(hTF),Tn抗原,肿瘤坏死因子(TNF),Thomsen-Friedenreich抗原(TF抗原),TNF受体,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL),TRAIL受体(DR4,DRS等),系统性ASC氨基酸转运蛋白2(ASCT2),trkC,TROP-2,TWEAK受体Fn14,IV型胶原酶,尿激酶受体,血管内皮生长因子(VEGF),VEGF受体(VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3等),波形蛋白,VLA-4等。
与过敏或突发起病有关的抗原的实例包含IL-6,IL-6R,IL-5,IL-5R,IL-4,IL-4R,TNF,TNF受体,CCR4,趋化因子,趋化因子受体等。与心血管疾病有关的抗原的实例包含GPIIb/IIIa,PDGF,PDGF受体,凝血因子,IgE等。与病毒或细菌感染有关的抗原的实例包含gp120,CD4,CCR5,细菌外毒素,炭疽保护性抗原,抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)抗原,乙型肝炎病毒(HBV)抗原,巨细胞病毒(CMV)抗原,Rabies抗原,水痘-带状疱疹抗原等。它们的其他实例包含T细胞表面膜蛋白混合物,Rh(D)抗原,crotalidvenom,地高辛等。
通过使用例如弗氏完全佐剂或合适的佐剂(例如氢氧化铝凝胶和百日咳菌苗)将靶向抗原以皮下、静脉内或腹膜内的方式给予转基因有蹄动物中来实施免疫。在一个实施方案中，免疫包含超免疫，其是指超出了恰好使动物对抗原产生的保护性效价的免疫。例如如果保护性效价为1:120，我们可以使动物超免疫至1:10240，这样这些效价可以在生产生物治疗剂中稀释，以便在免疫被动转移中给予保护性效价。将靶向抗原给予具有本发明HAC载体的转基因有蹄动物的形式的实例包含肽、蛋白质、细菌、病毒、细胞、生物组织碎片等。当靶向抗原为一部分的肽时，将缀合物与载体蛋白质一起生产，例如牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等，并且可以用作免疫原。在首次给予后，每1至4周给予靶向抗原1至10次。在距各次给予的1至14天后，由动物收集血液，从而测量血清的抗体值。
用于检测和测量血清中所含的靶向抗原特异性人类抗体的实例包含通过酶联免疫吸附测定的结合测定等。可以通过将包含人类抗体的血清与表达抗原的细胞温育，然后使用特异性识别人类抗体的抗体来测量血清中人类抗体的结合量。
此外，除了这些方法以外，可以通过根据本领域已知的方法来识别抗体的靶向抗原，从而选择抗体。用于由血清回收人类抗体的方法的实例包含通过使人类抗体吸附在蛋白质A载体、蛋白质G载体或者其上制成有人类免疫球蛋白特异性抗体的载体而进行纯化的方法。可以将在蛋白质纯化中使用的方法(例如凝胶过滤、离子交换层析和超滤)结合起来。
通过上述方法生产的人类抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体。制备和使用各种抗体的方法是本领域那些技术人员所公知的，并且适用于实施本发明(例如Harlow,et al.antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,1988；Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975))。用于制备杂交瘤的方法的实例包含以下步骤：(1)使用靶向抗原免疫转基因有蹄动物；(2)由转基因有蹄动物(即，由淋巴结)收集生产抗体的细胞；(3)将生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合；(4)由上述步骤获得的融合细胞中选择杂交瘤，该杂交瘤生产与靶向抗原发生相互作用的单克隆抗体；以及(5)由所选的杂交瘤中选择杂交瘤，该杂交瘤生产与靶向抗原相互作用的单克隆抗体。
实施例
方法
按照Hematech的指导原则实施所有的动物程序，并且该方案经过theInstitutional Animal Care and Use Committee批准。
基因组文库。由包含κHAC载体(κC1-1)或牛成纤维细胞细胞系6939和3427的CHO细胞提取基因组DNA，从而分别构建κHAC或牛基因组文库。使用λFIX II载体通过定制文库构建服务(Lofstrand Labs Ltd.)来构建各基于λ噬菌体的基因组文库。按照之前所述5，来进行文库筛选和λ噬菌体DNA提取/纯化。牛基因组BAC文库(CHORI-240)购自Children’s HospitalOakland Research Institute，并根据他们的指导进行筛选。
打靶载体的构建。按照之前所述5,12,20,21，来进行各载体的构建，并按照以下所述进行一些修改。
pTEL’hisDpuro lox2272 F9R9：通过使用PCR引物对kD-F9和kD-R9，在40个循环(98℃，10秒；68℃，9min)下，来扩增用于同源臂的基因组DNA片段。将该PCR产物亚克隆至质粒pTEL’hisDpurolox2272的Bam HI位点中，该质粒按如下所述构建。将包含lox2272的修饰的oligo DNA(Oligo DNA对1，参见下表1)在退火后克隆至质粒pPUR(BD Bioscience Clontech)的Hin dIII位点中，从而生成质粒pPURlox2272。另一方面，通过修饰之前的质粒pTELpuro来构建另一种质粒pTEL'hisDPm，其中puro基因被hisD基因所替换，Eco RI位点被SrfI所替换，并且Spe I位点转换成Pme I位点。然后，将由pPURlox2272得到的Bam HI片段在末端平滑后克隆至pTEL'hisDPm的Pme I位点中，其生成pTEL’hisDpurolox2272F9R9。
pTELCAGzeoSLF2R2：通过将Eco RI位点转换成SrfI、然后转换成Pme I，并通过将puro基因替换成CAGzeo基因来进一步修饰质粒pTELpuro{pTELCAGzeo(Sr)Pm}。另一方面，通过使用PCR引物对SL-F2和SL-R2，在40个循环(98℃，10秒；68℃，9min)下，来扩增用于同源臂的基因组DNA片段。将该PCR产物亚克隆至质粒pTELCAGzeo(Sr)Pm的Bam HI位点中，其生成pTELCAGzeoSLF2R2。
p553CAG lox2272 BsrDT：对之前的打靶载体pHCF2loxPHyg进行修饰，其中HCF2基因的同源臂序列被AP000553的同源臂序列所替换，将其通过使用PCR引物对553-F3和553-R3，在40个循环(98℃，10秒；68℃，15min)下来扩增，从而生成p553loxPHyg(F)。该质粒是Not I消化的并且是自连接的，然后将DT-A片段克隆至SrfI位点中。另一方面，按照下文所述来修饰pDRIVE-CAG(InvivoGen)。lacZ片段(Bsr GI-Eco RI)在退火后被包含loxP的oligo DNA(Oligo DNA对2；参见下表1)所替换，然后将SdaI-Swa I片段克隆至Pst I/Sma I消化的pBluescript SK—(Stratagene)中，从而生成pCAGloxP。LoxP序列进一步被包含lox2272的序列所替换，其中所述的包含lox2272的序列是在将2条oligo DNA退火后生成的(Oligo DNA对3；参见下表1)。然后，将bsr基因加入到Spe I位点中，从而生成pCAGloxP2272bsr。最后，将Not I-Kpn I片段(CAG-lox2272-polyA-bsr)克隆至Not I位点中，从而完成p553CAGlox2272BsrDT。
pSC355CAG lox511 hisDDT：通过使用PCR引物对SC355-F3和SC355-R3，在40个循环(98℃，10秒；68℃，15min)下来扩增用于同源臂的基因组DNA片段。将该PCR产物亚克隆至质粒pBluescript的Spe I位点中，其中Kpn I位点转换成SrfI位点，从而生成pSC355F3R3。将pCAGloxP质粒进行相似的修饰，其中loxP序列进一步被包含lox511的序列所替换，其中所述的包含lox511的序列是在将2条oligo DNA退火后生成的(OligoDNA对4；参见下表1)。然后，将hisD基因加入至Spe I位点中，从而生成pCAGlox511hisD。将Not I-Kpn I片段(CAG-lox511-polyA-hisD)克隆至pSC355F3R3的Eco RV位点中。最后，将DT-A盒亚克隆至Not I中，从而完成pSC355CAGlox511hisDDT。
p14CEN(FR)hygpuro lox511 DT：通过使用PCR引物对14CEN-F和14CEN-R，在40个循环(98℃，10秒；68℃，15min)下来扩增用于同源臂的基因组DNA片段。将该PCR产物亚克隆至质粒pBluescript的Bam HI位点中，其中Kpn I位点转换成Pme I位点，从而生成p14CEN(FR)。将经修饰的包含lox511的oligo DNA(Oligo DNA对5；参见下表1)在退火后克隆至质粒pPUR(BD Bioscience Clontech)的HindIII位点中，从而生成质粒pPURlox511。将由pPURlox511得到的Bam HI片段克隆至pBluescript SK—(Stratagene)的Bam HI位点中，然后将hyg基因克隆至Eco RV中，从而生成pHygPurolox511。将Not I-Kpn I片段(puro-lox511-hyg)克隆至p14CEN(FR)的Hpa I位点中。最后，将DT-A盒亚克隆至Pme I中，从而完成p14CEN(FR)hygpurolox511DT。
pRNR2 loxP bsrDT：通过简单地加入DT-A盒对之前的载体pRNR2loxPbsr(Ref.20)进行修饰，从而构建pRNR2loxPbsrDT。
pCH1CAGzeo(R)DT(F)：使用λFIX II载体通过定制文库构建服务(Lofstrand)由包含κHAC的CHO细胞构建基因组λ噬菌体文库。使用探针(其为PCR对hCμ-FR通过扩增得到的PCR产物)对hIGHM恒定区来筛选基因组文库，然后分离克隆子#1,#4和#7。将由克隆子#4得到的1.7kb的Pml I片段亚克隆至pBluescript的Sma位点中，从而生成pCH1S(F)。将由质粒pBCμAY37-95(其中Sal I-牛IGHM基因组片段克隆至pBluescript中)得到的1kb的Sac I-Pml I片段亚克隆至pCH1S(F)的Pst I位点中，从而生成pCH1SSP(F)。将由上述克隆子#1得到的7.4kb的Sma I-Eco RI片段克隆至Eco RV/Eco RI消化的pCH1SSP(F)中，从而生成pCH1SL。另一方面，将由质粒pBCμAY37-95得到的3.5kb的Sac I片段亚克隆至pBluescript中，然后将敲除的CAGzeo{CAGzeo片段亚克隆至pBS246(Gibco)的Eco RV位点中}的Xho I片段克隆至Van91I位点中，从而生成pmAYSazeo(F)。将由pmAYSazeo(F)得到的Sac I片段进一步亚克隆至pCH1SL的末端平滑的Eco RI位点中，从而生成pCH1zeo(F)。最后的步骤中，将DT-A盒亚克隆至pCH1zeo(F)的Not I位点中，从而完成pCH1CAGzeo(R)DT(F)。
pCH2CAGzeoDT：将退火的oligo DNA对SeSp克隆至pBluescript的末端平滑的Pst I位点中。将由pBCμAY37-95得到的2kb的Sph I-Bam HI片段亚克隆至Sph I-Bam HI位点中，从而生成pmAYSpB。相似地，将由pBCμAY37-95得到的2kb的Bam HI-Pml I片段亚克隆至Bam HI-Pme I位点(转换成原始的Spe I位点)中，从而生成pmAYSpBPml。将由上述克隆子#1得到的0.6kb的Eco RI-SexAI片段亚克隆至pmAYSpBPml的Eco RI-SexAI位点中，从而生成pRISe。然后，将敲除的CAGzeo亚克隆至pRISe的Van91I位点中，从而生成pRISeCAGzeo(R)，其中Not I位点转换成Eco RI位点，从而生成pRISeCAGzeoE。同时，将由上述克隆子#4得到的1.7kb的Pml片段亚克隆至pBluescript的Sma I位点中，其中Eco RV位点转换成Mlu I位点，从而生成pCH2S(F)。将由上述克隆子#1得到的6.6kb的Mlu I-Eco RI片段克隆至pCH2S(F)的Mlu I-Eco RI中，从而生成pCH2LS。然后，将由pRISeCAGzeoE得到的Eco RI片段亚克隆至pCH2LS的Eco RI位点中，从而生成pCH2CAGzeo(F)。在最后的步骤中，将DT-A盒亚克隆至pCH2CAGzeo(F)的Not I位点中，从而完成pCH2CAGzeoDT。
pCC1BAC-isHAC：通过使用探针(其为使用PCR对g1(g2)-FR扩增得到的PCR产物)，对由包含κHAC的CHO细胞构建的基因组λ噬菌体文库进行筛选，以分离基因组DNA片段，该片段覆盖人类Iγ1-Sγ1区，其后为hIGHG1恒定区，然后我们识别克隆子#h10和#h18/h20。募集由克隆子#h10得到的2kb的Afe I-Bam HI片段以用作短臂，而10.5kb的Apa I-Hpa I片段得自克隆子#h10/h20以用作长臂。另一方面，通过使用探针(其为使用PCR对bIgG1-FR扩增得到的PCR产物)，筛选牛基因组λ噬菌体文库，以分离基因组DNA片段，其覆盖牛Iγ1-Sγ1区，其后为bIGHG1恒定区，然后我们识别克隆子#b42，将由该克隆子得到的9.7kb的片段(5’末端至Bsu36I)组装，从而替换6.8kb的人类Iγ1-Sγ1区。将Bsu36I-Apa I连接体用于连接牛Iγ1-Sγ1区的3’末端和hIGHG1恒定区的5’末端。如图22B所示插入以FRT和DT-A基因作为侧翼的neo基因。在基于BAC主链的载体pCC1BAC(EPICENTRE)上实施所有上述的组装。
phI γ1 FRTCAGattPhisDDT：将由克隆子h10得到的11.4kb的Kpn I-NotI基因组片段与克隆子#h10分离，并亚克隆至pBluescript SK(—)载体中。然后，将FRT-CAG启动子-attP-polyA-hisD盒插入到5’Bam HI位点中，其位于Kpn I位点下游的1.8kb处。最后，将DT-A基因克隆至Not I位点中。
ph λ1 TMNeoattPDT：将由克隆子h20得到的7.5kb的Sac II基因组片段亚克隆至pBluescript SK(—)载体中。然后，将neo-attP盒插入至Hin dIII位点中，然后将DT-A基因克隆至Not I位点中。
pBAC-istHAC：由克隆子#b66得到包含牛TM1/TM2结构域的7.3kb的Bmg BI-Sph I牛基因组片段，该片段的5’部分通过连接体pNsiI-bG1-hG1-BmgBI与9.5kb的牛Iγ1-Sγ1片段(得自#b42)和1.6kb的hIGHG1基因(得自#h10)(得自isHAC)的3’部分连接。将attB-DsRed-FRT盒插入到9.5kb的牛Iγ1-Sγ1片段(得自#b42)的5’一侧并将另一个attB序列置于7.3kb的Bmg BI-Sph I牛基因组片段(其包含得自克隆子#b66的TM1/TM2结构域)的3’一侧。在基于BAC主链的载体pCC1BAC(EPICENTRE)上实施所有上述的组装。
pCλ1CAGzeoPuro loxP DT：由引物对bCLR-FR扩增的探针识别覆盖IGLJ1-IGLC1基因的5’一侧的多个λ噬菌体克隆子。将13kb的Nde I-HindIII基因组片段亚克隆至pBluescript SK(—)载体中，并将CAGzeo/loxP/不含启动子的puro盒插入到基因组片段中存在的Afe I位点中。最后，将DT-A基因插入在Not I位点中。由等位基因A和B构建所述的载体。
pCλ5CAG loxP neoDT：由引物对bCLL-FR扩增的探针识别覆盖IGLJ5-IGLC5基因的3’一侧的多个λ噬菌体克隆子。将10kb的Sac II-Nsi I基因组片段亚克隆至pBluescript SK(—)载体中，并将CAG启动子/loxP/polyA/neo盒插入到基因组片段中存在的Hin dIII位点中。最后，将DT-A基因插入在Not I位点中。由等位基因A和B构建所述的载体。
在鸡DT40细胞中人类染色体14片段的修饰。为了使用结构定义的hChr14载体并尽可能地除去许多不相关的人类基因，对完整的hChr14进行修饰，然后进行IgM牛源化(图17A)。使用打靶载体pSC355CAGlox511hisDDT，对保留完整的hChr14的鸡DT40细胞进行电穿孔，从而将lox511和CAG启动子整合在基因座AL512355中，其为hIGH基因座的大约300kb的着丝粒。使用组氨醇选择集落，并使用引物SC355KO-F2/R2作为阳性PCR并使用引物355N-F/R作为阴性PCR，使其经历基因组PCR筛选，从而发生证明同源重组(图17D)。克隆子I355-2识别为成功靶向的克隆子。
使用打靶载体p14CEN(FR)hygpurolox511DT进一步转染I355-2，从而将另一个lox511和不含启动器的puro基因整合在基因座AL391156处，其为AL391156的大约85Mb的着丝粒。使用潮霉素来寻找集落，并使用引物14CENKO-F3/R3(参见下表1)作为阳性PCR并使用引物14CEN(N)-F2/R2(参见下表1)作为阴性PCR，使其经历基因组PCR筛选，从而证明发生同源重组(图17D)。克隆子I156-10识别为成功靶向的克隆子。
使用Cre表达质粒转染I156-10，从而介导2个lox511位点(一个在基因座AL512355上，另一个在AL391156上)之间的位点特异性重组，删除了它们之间的大约85Mb的序列，由此将hChr14由106Mb缩短至大约21Mb。由于嘌呤毒素抗性是由在重组位点处再构建的CAG启动子-lox511-puro盒所赋予的，所以使用嘌呤毒素来选择其中发生大段删除的细胞。按照bIGL簇删除部分中所述，通过使用引物CAGpuro-F3/R3(参见下表1)进行PCR来证明该盒的再构建。此外，由于该85Mb删除的结果是hisD和hyg盒均被除去，所以证明组氨醇和潮霉素B的敏感性(图17B)。最后，使用人类COT-1DNA作为探针而实施的荧光原位杂交(FISH)证明hChr14缩短(图17E)。克隆子D8证明为成功缩短的克隆子。按照之前所述20,21，使用打靶载体pRNR2loxPbsrDT继续对克隆子D8进行修饰，从而将loxP序列和GFP基因整合在RNR2基因座处。选择克隆子14D1用于最后的IgM牛源化步骤(CH1D和CH2D)。
最后，使用打靶载体pCH1CAGzeo(R)DT(F)将克隆子14D1牛源化，从而使用牛的IGHM基因的CH1结构域至TM2结构域替换hIGHM基因的CH1结构域至TM2结构域，从而生成cIgM(CH1)蛋白质。使用博来霉素来选择集落，并使用引物cHAC-F3/R3(参见下表1)作为阳性PCR以及引物CH15’-F/R和cHAC 3’-F/R来确保人类与牛之间的连接序列是精确的，使其经历基因组PCR筛选，从而证明发生同源重组(图17D)。克隆子CH1D2识别为阳性克隆子，其保留了用于KcHACΔ构建的CH1D片段。相似地，使用打靶载体pCH2CAGzeoDT(F)使克隆子14D1牛源化，从而使用牛的IGHM基因的CH2结构域至TM2结构域替换hIGHM的CH2结构域至TM2结构域，从而生成cIgM(CH2)蛋白质，然后针对cKSL-HACΔ构建来选择克隆子CH2D4。
鸡DT40细胞中人类染色体2片段的修饰。κTL1为包含hChr2片段的DT40克隆子，其中所述的片段覆盖hIGK基因座。使用载体pTELCAGzeoCD8A转染上述细胞系，从而使用CAGzeo简单地替换PGKpuro盒，因为在牛成纤维细胞中，在后来的步骤中选择博来霉素通常效果更好。在选择博来霉素后，对同源重组具有特异性的基因组PCR(CD8AKO-F2R2(图18A))识别为克隆子κZ7，已经证明该克隆子对嘌呤霉素的敏感性，然后与CH1D2用于KcHACΔ的构建。
另一方面，还使用打靶载体pTEL’hisDpurolox2272F9R9对κTL1进行电穿孔，从而截短hChr2片段并将lox2272和不含启动子的puro基因整合在基因座AC104134处，其为hIGK恒定区Cκ基因(IGKC)的大约300kb的端粒。由于成功截短使得puro盒在CD8A基因座处丧失，所以使用组氨醇来选择集落，然后证明对嘌呤毒素的敏感性。由嘌呤毒素敏感性集落提取基因组DNA，并使用引物FABP1-F对其进行PCR筛选，其中所述的引物扩增存在于κTL1中但不存在于靶物克隆子中的FABP1基因座(图18B)。克隆子K53被识别并用于cKSL-HACΔ的构建。
鸡DT40细胞中人类染色体22片段的修饰。概况描绘于图19A的52-18中，使用打靶载体pTELCAGzeoSLFR对保留完整的hChr22的DT40细胞系进行电穿孔，从而截短AP000350基因座处的hChr22，其为AP000344基因座的大约450kb的端粒，在该AP000344基因座处，hChr22被截短以用于ΔΔHAC载体(图19B)。使用博来霉素来选择集落，并使用引物350T-FR对它们的基因组DNA进行PCR筛选(参见下表1)，其中所述的引物扩增存在于52-18中但不存在于靶物克隆子中的AP000350基因座。克隆子ST13识别为成功截短的克隆子。
使用打靶载体p553CAGlox2272bsrDT对ST13进行修饰，从而将lox2272和CAG启动子整合在基因座AP000553处。使用杀稻瘟菌素S来选择集落，并使用引物553KO-FR作为阳性PCR并使用引物553-F4R4作为阴性PCR来进行PCR筛选，以证明发生同源重组(图19C)。克隆子STL54识别为成功的靶物克隆子。
将人类染色体22片段转座至人类染色体2片段上从而在鸡DT40细胞中生成SLKH片段。使用染色体克隆系统，在DT40杂交细胞中构建SLKH片段(图20A)。将保留有hChr2片段(具有hyg盒)的克隆子K53和保留有hChr22片段(具有bsr盒)的克隆子STL54融合(全细胞融合，WCF)，从而生产DT40杂交细胞。将集落保持在潮霉素B和杀稻瘟菌素S中，从而选择保留2种hChr片段的细胞，这可以使用以下引物通过基因组PCR来证明(参见下表1)：用于hChr2片段的引物为IGKC-F/R,IGKV-F/R,RPIA-F/R,EIF2AK3-F/R和cos138KO-F/R；用于hChr22片段的另一组引物为553P-F/R,hVpreB1-F/R,hVpreB3-F/R,IgL-F/R,344-F/R,hL5-F/R,350P-F/R和553KO-F/R。使用人类COT-1DNA作为探针的FISH证明存在2种人类染色体片段(图20B)。克隆子SLK2识别为阳性克隆子。使用Cre表达质粒来转染SLK2，从而在2个lox2272位点之间介导位点特异性重组，1个lox2272位点位于hChr2片段上的基因座AC104134处，另一个lox2272位点位于hChr22片段上的基因座AP000553处。由于嘌呤毒素抗性是由在转座位点处再构建的CAG启动子-lox2272-puro盒所赋予的，所以使用嘌呤毒素来选择重组子。这也可以通过基因组PCR(CAGpuro-F3R3)、然后通过PCR产物的定点测序来证明。SLKH6识别为保留有SLKH片段的成功转座的克隆子(图20A，20B)。
通过MMCT，将SLKH片段由DT40杂交细胞系SLKH6转移至平面DT40细胞中。使用嘌呤毒素进行选择，随后，由于SLKH片段成果转移至DT40细胞中使得bsr盒丧失，所以针对杀稻瘟菌素S的敏感性对集落进行研究(图20A)。提取由杀稻瘟菌素S敏感和嘌呤毒素抗性的集落得到的基因组DNA，并通过以下PCR引物证明SLKH片段的滞留情况：IGKC-F/R,IGKV-F/R,RPIA-F/R,EIF2AK3-F/R,cos138KO-F/R,CAGpuro-F3/R3,553P-F/R,hVpreB1-F/R,hVpreB3-F/R,IgL-F/R,344-F/R,hL5-F/R,350P-F/R和553KO-F/R(参见下表1)。双色FISH(使用若丹明直接标记的hChr2涂抹探针和使用荧光素直接标记的hChr22涂抹探针)证明存在SLKH片段(图20B)。SLKD18识别为阳性克隆子。
在鸡DT40细胞中cKSL-HACΔ和KcHACΔ载体的构建。按照图3B中所概括，使用染色体克隆系统在DT40杂交细胞中构建cKSL-HACΔ载体。将SLKD18(其包含使用hChr22片段转座的hChr2片段，携带hyg盒)和CH2D4(其包含具有bsr盒和cIgM(CH2)牛源化的hIGH基因座的hChr14片段(14D))融合，从而生成可通过潮霉素B和杀稻瘟菌素S选择的DT40杂交克隆子cKSLD22。对hChr22使用第一组PCR引物：553P-F/R,hVpreB1-F/R,hVpreB3-F/R,IgL-F/R,344-F/R,hL5-F/R,350P-F/R和553KO-F/R(参见下表1)；对hChr2使用第二组PCR引物：hChr2,IGKC-F/R,IGKV-F/R,RPIA-F/R,EIF2AK3-F/R,cos138KO-F/R,CAGpuro-F3/R3(hChr2与hChr22之间的连接)；对hChr14使用第三组引物：RNR2-1x STOP-3,VH3-F/R,g1(g2)-F/R,14CENKO-F3/R3,CH25’-F/R,cHAC-F3/R3和SC355F3R3KO-F/2R2(参见下表1)，来实施广泛基因组PCR。此外，使用人类COT-1DNA的FISH也证明存在2种人类染色体片段。
使用Cre表达质粒对cKSLD22实施电穿孔，从而在2个loxP位点之间截短位点特异性重组，1个位点在SLKH片段上的cos138基因座处，另1个在CH2D片段的RNR2基因座处，此外还删除了cIgM(CH2)结构域中的敲除的CAG启动子-zeo盒。由于GFP的表达是由转座位点处PGK启动子-loxP-GFP盒的再构建所赋予的，所以通过分类GFP阳性细胞来富集重组子。进行2次分类，得到具有不同表达水平的2种不同的GFP阳性群体。较低水平的GFP群体包含成功转座的cKSL-HACΔ(通过PCR引物PGK2xGFP2和PCR引物CreCAGzeo-F3/R3来测定(参见下表1))，并证明在cIgM(CH2)位点中删除了CAG启动子-zeo盒。较高水平的GFP群体通过Cre介导的渗漏重组(其可通过PCR引物CAGpuro-F3x GFP2和STOPpuro-F2x STOPpuro-R来证明(参见下表1))、以及随后的定点测序而在RNR2基因座处的loxP与基因座AL512355/AL391156处的lox511之间包含倒位CH2D片段(图21)。Cksldh(2L)最终识别为保留有cKSL-HACΔ的DT40杂交细胞系，并使其经历广泛基因组PCR和三色FISH(图12A)。按照图3C中所概括，在DT40细胞中相似地构建KcHACΔ载体。使克隆子KCDH1经历广泛基因组PCR和双色FISH(图12B)。同样，我们还构建了KcHAC，其中hChr2片段(κTL1)被转座至携带有牛源化cIgM(CH1)的SC20片段中。
在鸡DT40细胞中isHAC和isKcHACΔ载体的构建。isHAC(isKcHACΔ)的构建描绘于图22A中。构建打靶载体pCC1BAC-isHAC(图22B)，并用于使cKSL-HACΔ和KcHACΔ上的Iγ1-Sγ1区牛源化。使用打靶载体pCC1BAC-isHAC对克隆子cKSLDD1进行电穿孔，其中所述的克隆子为保留有cKSL-HACΔ(通过MMCT由cKSLDH22(2L)获得)的鸡DT40细胞系。使用G418来选择集落，并使用引物iscont1-F1R1使它们的基因组DNA经历PCR筛选，从而识别同源重组的存在情况。此外，还实施其他的诊断PCR，以检查结构整体性(图22C)。选择1个克隆子is1-11，随后通过引入表达FLP的质粒来删除neo盒。使用表达FLP的质粒和表达DsRed的质粒共转染is1-11。将DsRed阳性细胞分类，并进行单一集落的分离。针对包含iscont1-F3/R6的基因组PCR，来检测G418敏感性集落，其中neo盒是通过FRT-FLP重组而删除的(参见下表1)(图22D)。最后，我们选择isH11-S2和isH9-3，然后将它们转移至CHO细胞中，从而分别建立肥大细胞库isC1-133,isC10-2和isC10-18，对该细胞库实施广泛基因组PCR和CGH，以检查结构整体性(图22E,22F)。
与isHAC相似，在DT40细胞中构建isKcHACΔ，并选择2种克隆子isKCDH17和isKCDH30，然后将其转移至CHO细胞中，从而分别建立肥大细胞库isKCDC8和isKCDC38，对该细胞库实施广泛基因组PCR和CGH，以检查结构整体性(图22G,22H)。
在鸡DT40细胞中istHAC载体的构建。istHAC的构建计划描绘于图23A中。使用2种打靶载体phγ1TMNeoattPDT(图23B)和phIγ1FRTCAGattPhisDDT(图23C)相继靶向克隆子cKSLDD1，从而将attP序列整合在hIGHG1TM2结构域的3’一侧和人类Iγ1区的5’一侧，由此生成2种克隆子ist1-5和ist1-21。使用pBAC-istHAC和φC31表达载体一起对所述的克隆子共同进行电穿孔，从而形成大段DNA替换。如图23D所示，所预计的attP和attB之间的重组使得CAG启动子-DsRed基因表达得以再构建，这可以通过流式细胞仪来检测。将DsRed阳性细胞相应地分类。将该分类方法重复2-3次，直至DsRed阳性细胞的纯度达到>95％。然后，对细胞进行单一集落的分离，并通过3种诊断基因组PCR(CAGDsRed-F2/R2(阳性),bIgG1-3’-SeqF3x hIgG1-R15(阳性)和bIgG1-3’-SeqF3x attPPuro-R3(阴性))来检测(参见下表1)。结果，选择由ist1-5得到的istH5-S16和由ist1-21得到的istH21H-S10。
最后，使用FLP表达载体转染2种克隆子istH5-S16和istH21H-S10。如图23E所示，FLP的表达使得CAG-DsRed基因的表达被除去，这可以通过流式细胞仪来检测。将DsRed阴性细胞相应地分类，使得DsRed阴性细胞的纯度达到>95％。然后，对细胞进行单一集落的分离，并通过3种诊断基因组PCR(CAGDsRed-F2/R2(阴性),bIgG1-3’-SeqF3x hIgG1-R15(阳性)和hIgG1-F10x bIgG1-5’-Seq-R10(阳性))来检测(参见下表1)。因此，选择由istH5-S16得到的istHD16L和由istH21H-S10得到的istHD10L，然后将它们转移至CHO细胞中，从而分别建立肥大细胞库istC1-49和istC1-6，对该细胞库实施广泛基因组PCR和CGH，以检查结构整体性(图23F,23G)。
用于构建HAC载体的鸡DT40细胞的转染。按照之前所述，来实施HAC载体的构建5,20,21。简言之，使用～25μg的各打靶载体对包含各hChr片段的DT40细胞实施电穿孔(550V,25μF)。在2周内，通过各药品：G418(2mg/ml),嘌呤霉素(0.5μg/ml),潮霉素B(1.5mg/ml),杀稻瘟菌素S(15μg/ml),组氨醇(0.5mg/ml)或博来霉素(1mg/ml)来选择集落，并按所示将它们的DNA进行PCR筛选。
用于删除牛IGLJ-IGLC基因簇和微细胞介导的染色体转移(MMCT)的牛成纤维细胞的转染。培养牛胚胎成纤维细胞，并按照之前所述转染5,12, 21。简言之，使用～30μg的各打靶载体在550V和50μF下对成纤维细胞实施电穿孔。在48小时后，在2周内在合适的药品(博来霉素(0.4mg/ml)或嘌呤霉素(1μg/ml))下选择细胞，挑选抗性集落，并转移至复制平板中；一部分用于基因组DNA提取，其余的用于胚胎克隆。按照之前所述5,20,21，使用各HAC载体来实施MMCT。
基因组PCR和RT-PCR分析。按照之前所述5,20,21，来进行这些分析。所有这些PCR产物都在在0.8％琼脂糖凝胶上进行的。可以使用下表1中的引物序列。
表1.引物序列
CGH分析。由Roche NimbleGen根据所估计的cKSL-HACΔ载体序列来设计用于CGH分析的阵列探针(参见图24)。由Roche NIMBLEGENTM进行试验和数据分析。
FISH分析。按照之前所述5,20,21，实施人类COT-1FISH和hChr特异性多色FISH。为了特异性地染色hIGH,hIGK和hIGL基因座，由分别衍生自BAC克隆子RP11-417P24,RP11-316G9和RP11-22M5的DNA来合成探针。
流式细胞仪分析。按照之前所述5，对新生转基因(Tc)小牛的B细胞发育实施流式细胞仪分析，并具有以下修改。为了检测Tc牛B细胞上的表面hIgG，可以使用AF488直接标记的山羊抗hIgG(Life Technologies)。为了标记Tc牛B细胞上的表面hIgκ或hIgλ，可以使用PE直接标记的小鼠抗hIgκ抗体(Biolegend)或PE直接标记的小鼠抗hIgλ抗体(Southern Biotech)。为了标记B细胞上的表面bIgλ或bIgκ，可以使用小鼠单克隆抗bIgλ(机构内克隆子132D7)或小鼠单克隆抗bIgκ(结构内克隆子132B10)(其之后进行Zenon小鼠IgG1PE标记(Life Technologies))。通过标准的方案进行染色，然后通过FACSARIATM流式细胞仪(BD Biosciences)进行分析。
ELISA。按照之前所述5，实施总hIgGELISA测试。对于全hIgG/hIgκ或hIgG/hIgλ检测，使用山羊抗hIgκ亲和纯化的或山羊抗hIgλ亲和纯化的(Bethyl)作为捕获抗体，以及山羊抗hIgG Fc-HRP(Bethyl)作为检测抗体。对于hIgG/bIgκ检测，使用小鼠单克隆抗bIgκ(机构内克隆子132B10)作为捕获抗体，以及小鼠抗hIgGFcγ-HRP(Jackson)作为检测抗体。对于hIgG1或hIgG2的检测，使用小鼠抗hIgG1Fc或小鼠抗hIgG2Fc(HybridomaReagent Laboratory)作为捕获抗体，以及小鼠抗hIgGHRP(Southern Biotech)作为检测抗体。
对HAC/TKO和HAC/DKO小牛进行人类口腔鳞状细胞癌免疫。使用2x 108细胞/单剂的X射线辐射的人类口腔鳞状细胞癌(DSMZ)抗原免疫HAC/TKO和HAC/DKO小牛，其中所述的抗原是使用Montanide ISA 25佐剂(Seppic)作为油包水乳液加上Quil A(Accurate Chemical&ScientificCorp)作为免疫刺激剂配制而成的。在3周间隔内2次免疫Tc小牛(初次免疫，3周后实施加强免疫)。在颈区通过肌肉注射给予疫苗。在每次免疫(V1和V2)之前以及每次免疫之后的10天和14天，按照之前所述5，收集血清样品用于抗体效价分析。通过流式细胞仪分析来测定抗人类口腔鳞状细胞癌的抗体效价。
通过流式细胞仪测量Tc动物血清中的抗人类癌细胞的hIgG/hIgκ效价。由使用人类癌细胞免疫的Tc小牛收集得到的血清用作一级抗体，来染色人类癌细胞。免疫前Tc小牛血清(V1D0)用作阴性对照。以1:80稀释的AF488缀合的山羊抗hIgG Fc(Invitrogen)和以1:8稀释的PE缀合的小鼠抗hIg(BioLegend)用于检测结合的hIgG/hIgκ抗体。在补充有4％马血清、0.1％叠氮化钠和2mM EDTA的PBS中实施检测。结果表示为通过FACSARIATM流式细胞仪(BD Biosciences)测量的染色的人类癌细胞％以及平均荧光强度(MFI)。
体细胞的细胞核转移。按照之前所述5,12,20,21，使用染色质转移程序来生产克隆的胚胎和小牛。
结果
实施例1.牛IGL基因簇的删除
一种假说认为除了破坏bIgH以外，使牛Ig轻链钝化可支持全人类IgG在牛中的高生产率。由于与人类和小鼠不同，牛主要表达Igλ轻链(多于Igκ)，所以bIGL基因被钝化。然而，当本发明人开始本研究时关于bIGL基因在牛基因组中的结构的公开信息很小，所以测定包含其周围区域的bIGL基因序列。就该目的而言，筛选牛BAC(细菌人工染色体)基因组文库，然后通过鸟枪使一种BAC克隆子经历全测序。识别出由5种IGLJ-IGLC基因(IGLJ1-IGLC1至IGLJ5-IGLC5)组成的基因簇，其中的3种基因(IGLJ2-IGLC2至IGLJ4-IGLC4)，通过它们的推断的氨基酸序列判断，似乎是功能性的(图1A)。IGLJ1-IGLC1和IGLJ5-IGLC5基因包含不成熟的终止密码子突变，包含可能的假基因。在IGLJ5-IGLC5基因下游的大约13kb处，发现潜在的增强子元件3’Eλ，其显示与人类3’Eλ(HSS-3)增强子序列具有～60％DNA序列同源性。Chen,L et al.报告了在牛中识别4种IGLJ-IGLC基因。在本发明人的分析中，IGLJ2-IGLC2和IGLJ3-IGLC3外显子序列是相同的，但是它们附近的序列(例如内含子和3’非翻译区(UTR))稍微不同，这得到这样的结论：IGLJ2-IGLC2和IGLJ3-IGLC3是不同的基因(图8A,8B)。
由于bIGL基因形成了基因簇而非单一的基因结构，所以策略是研发一种新系统，其为在体细胞中，通过使用Cre/loxP介导的位点特异性重组来删除完整的IGLJ-IGLC基因簇(图1b)。凭借同源重组，通过打靶载体pCλ1CAGzeoPuroloxPDT将各loxP序列整合在IGLJ1基因的5’外侧，并通过另一种打靶载体pCλ5CAGloxPneoDT，将该loxP序列整合在IGLC5基因的3’外侧，然后引入Cre。该步骤需要3轮转染和体细胞细胞核转移(SCNT)，仅用于删除半合子簇，这可能由于表性错误累积而损害动物的发育。因此，所述的策略可以通过将Cre表达载体与第二敲除(KO)载体一起共转染来减少转染和SCNT的数量，2轮转染(第一轮，KO；然后第二轮，KO+Cre)可以完成簇的删除。据本发明人所了解，在体细胞中从未取得此类大段DNA的删除(长度为27kb的删除)，并且其可行性不确定。用于删除的有效的阳性选择方式如下：仅在发生簇的删除时，可以再构建嘌呤毒素抗性基因(puro)，这允许在细胞培养物中在嘌呤毒素存在下进行选择。在实际效率中，这种簇的删除可以在2个步骤中完成，5x 106体细胞中，21个集落被转染，所有这些集落显示所预计的删除，意外地表明在牛的成纤维细胞中，Cre/loxP介导的大段DNA删除(在该删除中为27kb)以及同源重组第二事件(第二KO)的高效率。重要的是，在体细胞中实施2步的大段DNA删除支持所述的细胞能够形成可繁殖的健康克隆的动物。据本发明人所了解，这是第一次报告未使用ES细胞，在体细胞中多基因的位点特异性大段DNA删除，因此其支持更动态的基因组工程(而不仅是一对一的单一基因修饰)在非鼠科物种中的可行性，其中所述的非鼠科动物中体成纤维细胞是可利用的。
实施例2.雄性和雌性牛IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—细胞系的建立
在体细胞中进行多轮基因修饰、然后实施SCNT由于潜在累积的不可逆的表性错误，将损害动物的发育。为了减少SCNT的轮数，将连续的基因打靶与动物育种结合，如图2A中所概括。
之前报告IGHML1基因座绘制于bChr11中，此处的数据表明IGHM和IGHML1基因座意外地位于牛Chr21中(图9)。因此，本研究是基于这种新的且出人意料的表明来实施的。以雄性原代Holstein成纤维细胞系6939(就该细胞系而言，IGHM和IGHML1等位基因分别命名为AY/ay和U/u(图2B))开始，通过对等位基因U、u和AY分别使用打靶载体pBCΔNKOneo、pBCΔKOpuro和pbCμAYKObsr以等位基因特异性的方式依次敲除IGHM和IGHML1基因座，从而建立IGHM—/+IGHML1—/—细胞系。通过对等位基因10AY和7AYJ分别使用打靶载体pbCμAYKObsr和pbCμ7AYJKOhyg，使用雌性原代Holstein x Jersey杂种(HoJo)成纤维细胞系3427(就该细胞系而言，IGHM和IGHML1等位基因分别命名为10AY/7AYJ和8U/5u(图2B))来生成细胞系IGHM—/—。由各雄性IGHM— /+IGHML1—/—和雌性IGHM—/—细胞系生成克隆牛，然后在它们大约18-20个月龄使使它们彼此育种。在怀孕大约40天时，收集18个胚胎并进行基因分型。7个胚胎(39％)为IGHM—/—IGHML1—/+基因型。在所有7种胚胎中，U处的neo KO盒总是与AY处的bsr KO基因盒连接，支持了以下数据：IGHM和IGHML1基因座意外地位于牛Chr21上。分别选择一种雄性细胞系和雌性细胞系J481和H412用于bIGL基因簇的删除(图2B)。
使用对等位基因A具有特异性的pCλ1(A)CAGzeoPuroloxPDT载体转染雄性细胞系J481(IGHM—/—IGHML1—/+)(其中本发明人将bIGL等位基因命名为A和D)，在博来霉素下选择，然后使用引物对CL1puro-F2R2通过基因组PCR来筛选同源重组的发生情况，如图2C所示。通过对PCR产物测序来识别阳性集落(18％)，将其中的一些产物进一步使用PCR对R-R1xR-F2实施另一种基因组PCR，然后测序(图2C)。细胞系J481包含用于bIGL基因座的等位基因A和D，并且所述的PCR扩增了2个等位基因之间的一个多态性位点；等位基因A的多态性位点为T，等位基因D的多态性位点为G。例如在集落27中，仅检测到G，证明由于在R-R1和R-F2引物退火位点之间插入CAGzeo/loxP/不含启动子的puro盒，所以等位基因A被破坏。集落27可用于SCNT，从而生成40天的胚胎，由该胚胎建立细胞系K655-1IGHM—/—IGHML1—/+IGL1—/+。
随后，使用对等位基因A具有特异性的pCλ5(A)CAGloxPneoDT载体和Cre表达载体共转染细胞系K655-1，从而完成簇的删除，这可以通过嘌呤霉素来选择。获得21个嘌呤霉素抗性集落，并经历2种基因组PCR(CL5CAG-F2R2和CAGpuro-F3R3)，如图2D所示。前者将识别同源重组在IGLC5基因的3’一侧处的发生情况，后者将检测簇删除的发生情况。通过测序分析证明所有的PCR产物都是正确的。双阳性集落可用于克隆，从而建立细胞系G054IGHM—/—IGHML1—/+IGL—/+，其进一步用于生成小牛。相似地，使雌性细胞系H412(IGHM—/—IGHML1—/+)(其中本发明人将bIGL等位基因命名为B和C)在等位基因B上经历2步簇的删除，从而生成小牛。
最后，将雄性和雌性IGHM—/—IGHML1—/+IGL—/+动物在大约18-20月龄时彼此育种。在怀孕大约40天时，收集58个胚胎，并进行基因分型。5个胚胎(8.62％)为IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—基因型，然后建立5个IGHM—/ —IGHML1—/—IGL—/—三倍敲除(TKO)的细胞系(图2E和图10)。
实施例3.cKSL-HACΔ和KcHACΔ载体的构建
在人类与牛之间存在一些物种不相容性是可能的，这会妨碍全hIgG在牛中的大量生产。这种物种不相容性之一是解决基于IgM的前BCR/BCR的功能。在免疫球蛋白重链(IgH)类别中，IgM的重链被首先表达，并且对于B细胞的发育是重要的，从而最终导致IgG的分泌。在Tc牛条件下，hIgM在牛B细胞表面上表达，从而与牛替代轻链相互作用，然后与公认轻链相互作用，并与牛Igα/Igβ分子相互作用，以用于前BCR/BCR介导的信号传递，这对于随后B细胞的发育是关键性的。由于物种特异性序列的差异，hIgM蛋白质与牛替代轻链、公认轻链和Igα/Igβ分子的相互作用中可能存在物种不相容性(图11A-11D)。为了解决这种假说，构建2种HAC载体KcHACΔ和cKSL-HACΔ(图3A)。在KcHACΔ中，部分hIGHM恒定区基因(CH1至TM2结构域)被牛源化，这样此类嵌合IgM{cIgM(CH1)}蛋白质可以与牛替代轻链、公认轻链和Igα/Igβ分子相互作用以用于更好的前BCR/BCR信号传递。在cKSL-HACΔ中，部分hIGHM恒定区基因(CH2至TM2结构域)被差异牛源化，此外人类替代轻链hVPREB1和hIGLL1(在小鼠中为λ5)被引入hChr22片段，这样此类嵌合IgM(‘cIgM(CH2)’；SEQ IDNO:200)蛋白质可以与人类替代轻链配对，还可以与牛Igα/Igβ分子相互作用以用于更好的前BCR/BCR信号传递。由于hIgM、cIgM(CH1)和cIgM(CH2)蛋白质的可变区和恒定区的序列是物种特异性不同的，所以各HAC载体中前BCR/BCR功能/信号传递(例如分别为κHAC,KcHACΔ和cKSL-HACΔ)可能影响B细胞的发育命运，并最终使hIgG生产图谱不同。
作为其中所定义的人类染色体区域可以通过点特异性染色体转座而克隆(染色体克隆)于其上的起始HAC载体，可以使用hChr14片段SC20。SC20是在微细胞介导的染色体转移(MMCT)过程中天然形成的片段，因此其结构尚未定义。为了使用结构定义的hChr14载体并尽可能除去许多不相关的人类基因，对完整的hChr14进行修饰，然后进行IgM牛源化，这生成了新的基于hChr14的载体CH1D2和CH2D4，其分别用于KcHACΔ和cKSL-HACΔ载体的构建。
cKSL-HACΔ载体是在鸡DT40细胞中构建的，如图3B中所概括的那样(也参见方法部分)。通过将hChr22片段(其覆盖完整的hIGL和替代轻链hVPREB1/hIGLL1基因座)转座至具有hIGK基因座的hChr2片段中来创建包含SLKH片段的克隆子SLKD18，并将包含hChr14片段(14D)的克隆子CH2D4与cIgM(CH2)-牛源化的hIGH基因座融合，从而生成DT40杂交克隆子cKSLD22。引入Cre表达质粒从而在2个loxP位点之间介导位点特异性重组，其中一个loxP位点位于SLKH片段上的cos138基因座，另一个loxP位点位于CH2D片段上的RNR2基因座，此外，还删除cIgM(CH2)结构域内的敲除的CAG启动子-zeo盒。当通过转座位点处PGK启动子-loxP-GFP盒的再构建而赋予GFP的表达时，通过分类GFP阳性细胞来富集重组子。这是第一次报告由结构定义的3个不同染色体片段(例如hChr2、hChr14和hChr22)构成的人工染色体的构建。
相似地，在DT40细胞中构建KcHACΔ载体，如图3C中所概括的那样(也参见方法部分)。通常，构建其中hChr2片段(κTL1)转座至携带有牛源化IgM{cIgM(CH1)}序列的SC20片段中的KcHAC载体。
实施例4.在一系列HAC/IGHM—/—IGHML1—/—(DKO)牛中生产人类IgG
通过MMCT手段将cKSL-HACΔ、KcHACΔ和KcHAC载体转移至中国仓鼠卵(CHO)细胞中，从而分别建立基于CHO的肥大细胞库cKSLDC6,15,23,KCDC15和CKF4，这可通过广泛的基因组PCR和CGH来证明(图12A-12C)。然后将3个HAC载体cKSL-HACΔ、KcHAC和κHAC由CHO细胞系转移至由育种得到的IGHM—/—IGHML1—/—(DKO)细胞系，从而生成cKSL-HACΔ/DKO、KcHAC/DKO和κHAC/DKO小牛。cKSL-HACΔ和KcHAC载体的目的是为了在用于B细胞发育的IgM介导的前BCR/BCR功能中解决人类与牛之间的物种不相容性，因此，在这些新生期动物的外周血单核细胞(PBMC)中研究B细胞的发育图谱(图4A)。为了在KcHAC/DKO动物中监测IgM，由于抗bIgM抗体具有牛源化CH1结构域而可以使用该抗体，同时抗hIgM抗体仍可以识别由cKSL-HACΔ载体得到的cIgM(CH2)蛋白质。与κHAC/DKO动物相比，cKSL-HACΔ/DKO和KcHAC/DKO小牛显示较高百分率的IgM单阳性和IgM/CD21双阳性B细胞。令人惊奇的是，IgM/bIgλ、IgM/bIgκ以及甚至IgM/hIgκ双阳性B细胞仅在KcHAC/DKO动物中可以检测到。在cKSL-HACΔ/DKO小牛中，hIgM/bIgλ,hIgM/bIgκ,hIgM/hIgκ或hIgM/hIgλ双阳性B细胞不可通过流式细胞仪检测，尽管hIgM/CD21双阳性B细胞的百分率升高，但是这些转录物可以通过RT-PCR来检测(图12D)。
测量大约5-6个月龄的与hIgκ/λ或bIgλ/κ配对的血清总的hIgG、和全hIgG/hIgκ的浓度(图4B)。与κHAC/DKO动物(排除小牛468)相比，特别是cKSL-HACΔ载体，血清总的hIgG的浓度急剧升高，并且大部分是hIgG1占优势(hIgG1/hIgG2比值>1)，而KcHAC/DKO动物显示相当高的hIgG2优势(图4C)。尽管与KcHAC/DKO小牛相比，cKSL-HACΔ/DKO小牛产生相当大量的hIgG，但是全hIgG/hIgκ的百分率似乎较低(图4B,4C)，并且全hIgG/hIgλ为全hIgG/hIgκ的5-10％。
这些数据表明在IgM前BCR/BCR功能中潜在的物种不相容性，导致B细胞发育和hIgG生产图谱在不具有或具有人类替代轻链的差异性牛源化cIgM(CH1)和cIgM(CH2)蛋白质之间具有相当大的差异。这是IgM前BCR/BCR功能具有物种不相容性的新证据，这最终会影响全hIgG生产图谱。
实施例5.isHAC、istHAC和isKcHACΔ载体构建
下一个策略是通过使cKSL-HACΔ和KcHACΔ载体上的hIGHG1基因类别转换调节元件发生定向牛源化来定向改变类别转换成hIgG(特别是IgG1)的效率。此外，对hIGHG1基因的跨膜和细胞质结构域进行牛源化，以用于在牛的环境下可能更好地进行hIgG1BCR介导的信号传递。
通过各个与免疫球蛋白重链(IGH)基因座有关的转换区(SH)(称为种系转录物)的转录来推进IgG亚类类别转环重组的确定。各IGH恒定区(CH)基因与其自身的SH区相连，该SH区也与其自身的IH外显子有关。种系转录物IH-SH-CH(最终拼接成成熟的IH-CH)是由恰好位于IH外显子的5’端的启动子/增强子元件来驱动的，并且这些元件为细胞因子或其他活化剂反应性的。在类别转化的简单模式中，特异性的活化剂和/或细胞因子通过其活化剂/细胞因子反应性IH启动子/增强子来诱导种系转录物。3’Eα元件进一步增强了IH-SH-CH序列的转录。这种转录使得转换区松弛，这样其可以被酶(活化诱导的胞核嘧啶核苷脱氨酶(AID))所靶向，这使得与另一个SH区融合，从而导致类别转换。假说认为例如与hIGHG1基因有关的hIγ1-hSγ1调节元件(得自人类IgG1)与此类牛活化剂/细胞因子诱导的蛋白质由于物种特异性序列差异而有点不相容，从而高效地诱导向hIgG1的类别转换(图13A,13B)。这可能是为什么Tc牛显示hIgG2占优势的，而hIgG1是人类的主要亚类的原因。
根据上述假说，使用bIGHG1基因的类别转换调节元件将hIγ1-hSγ1类别转换调节元件牛源化，从而构建在cKSL-HACΔ载体上hCγ1(人类重链IgG1)区的上游具有bIγ1-bSγ1序列的isHACΔ载体(图5，也参见方法部分)。此外，考虑物种特异性序列差异(图13C)，使用bIGHG1基因跨膜和细胞质结构域将isHAC上的bIGHG1基因跨膜和细胞质结构域进一步牛源化，从而生成istHAC(图5，也参见方法部分)。由于cKSL-HACΔ和KcHACΔ载体可能潜在地具有功能差异，如在DKO背景中所见，并且不确定这2个HAC在缺乏bIGL表达的TKO背景中的行为方式，所以还将KcHACΔ载体牛源化，从而建立在KcHACΔ载体上的hCγ1区的上游具有bIγ1-bSγ1序列的isKcHACΔ载体(图5，也参见方法部分)。
实施例6.在一系列HAC/IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—(TKO)牛中生产人类IgG
通过MMCT将isHAC、istHAC、isKcHACΔ、KcHACΔ和cKSL-HACΔ载体由CHL肥大细胞库转移至IGHM—/—IGHML1—/—IGL—/—(TKO)细胞系，从而生成一系列HAC/TKO小牛。怀孕270天的小牛出生率为移植受者的大约7％，其中的60-70％在出生后存活至少多达5-6个月(表2)。首先，通过在新生期实施RT-PCR来证明bIGL表达的缺乏(图6A)。然后，为了解决消除bIGL表达对B细胞发育的影响，对新生期的HAC/TKO小牛的5种基因型实施流式细胞仪(图6B)。与DKO背景相比，在cKSL-HACΔ系列(例如isHAC、istHAC和cKSL-HACΔ本身)中，除了hIgM/hIgκ(或hIgM/bIgκ)双阳性B细胞增多以外，hIgM单阳性和hIgM/CD21双阳性B细胞的百分率似乎较低，并且hIgG/hIgλ双阳性B细胞是不可检测的。相反，在KcHACΔ系列(例如isKcHACΔ和KcHACΔ本身)中，bIgM单阳性和和hIgM/CD21双阳性B细胞的百分率与DKO背景的百分率非常相似，并且bIgM/hIgκ(bIgM/bIgκ)双阳性B细胞的百分率大幅增多。
表2.由基因修饰的成纤维细胞系生产克隆的小牛
a百分率是通过胚胎或小牛的数量除以移植受者的数量来计算的。
表3.用于比较所有基因型中总的hIgG的血清浓度的p值
A,cKSL-HACΔ/TKO(n＝8)；B,isHAC/TKO(n＝12)；C,istHAC/TKO(n＝8)；D,KcHACΔ/TKO(n＝8)；E,isKcHACΔ/TKO(n＝12)；F,cKSL-HACΔ/DKO(n＝33)；G,KcHAC/DKO(n＝12)；H,HAC/DKO(n＝8)；阴影显示显著性差异(p<0.05)。
表4.用于比较所有基因型中全hIgG/hIgκ的血清浓度的p值
A,cKSL-HACΔ/TKO(n＝8)；B,isHAC/TKO(n＝12)；C,istHAC/TKO(n＝8)；D,KcHACΔ/TKO(n＝8)；E,isKcHACΔ/TKO(n＝12)；F,cKSL-HACΔ/DKO(n＝33)；G,KcHAC/DKO(n＝12)；H,κHAC/DKO(n＝8)；阴影显示显著性差异(p<0.05)。
表5.用于比较所有基因型中血清全hIgG/hIgκ(％)/总的hIgG的p值
A,cKSL-HACΔ/TKO(n＝8)；B,isHAC/TKO(n＝12)；C,istHAC/TKO(n＝8)；D,KcHACΔ/TKO(n＝8)；E,isKcHACΔ/TKO(n＝12)；F,cKSL-HACΔ/DKO(n＝33)；G,KcHAC/DKO(n＝12)；阴影显示显著性差异(p<0.05)。
由于isHAC、istHAC和isKcHACΔ载体构建的基本原理是在牛的生理条件下通过将hIGHG1基因类别转换调节元件牛源化来定向改变类别转换成hIgG(特别是转换成hIgG1)的效率，所以在一系列大约5-6个月龄的HAC/TKO小牛中测量全hIgG/hIgκ以及hIgG亚类分布的血清浓度(图6C-6H，图14)。总之，在5种HAC/TKO基因型中，当与HAC/DKO动物(包含之前独特的小牛468)相比较时，全hIgG/hIgκ的浓度和百分率急剧升高，这样证明删除bIGL簇对于全hIgG/hIgκ的高生产率而言是惊人的有效的。全hIgG/hIgλ是hIgG/hIgκ的～5％，其余为嵌合hIgG/bIgκ(图15)。令人惊奇的是，isHAC/TKO小牛(特别是istHAC/TKO小牛)与它们原始的cKSL-HACΔ/DKO和甚至cKSL-HACΔ/TKO动物相比，大幅增加了总的hIgG和全hIgG/hIgκ的生产(图6E和表4)。当然注意hIgG1/hIgG2比值在isHAC/TKO和istHAC/TKO小牛中均急剧升高，而由在cKSL-HACΔ/DKO动物中hIgG1占优势变成在cKSL-HACΔ/TKO动物中hIgG2占优势(图6I)。这种观察现在isKcHACΔ/TKO、KcHACΔ/TKO和KcHAC/DKO小牛之间的比较中也始终可见(图6C-6F)，其中全hIgG/hIgκ的生产大幅增加，并且在isKcHACΔ/TKO动物中hIgG1占优势转换成原始KcHACΔ/TKO和KcHAC/DKO小牛中hIgG2占优势。
这些数据证明Iγ1-Sγ1类别转换调节元件以物质特异性的方式受到控制。牛源化的Iγ1-Sγ1序列的作用特别受到关注。据报告，在人类干细胞中的hChr21所观察到的事实上所有的转录因子结合位点、转录起始的标志以及所得的基因表达都概括于小鼠干细胞细胞核中的整个hChr21中。这意味着人类特异性基因表达谱图即使在非人类物种环境下可以通过人类DNA一级序列而简单地提供。将这种观点应用于Tc牛情况中，非牛源化的HAC在牛的条件下足以用于提供类似于人类的hIgG表达图谱(例如hIgG1占优势)(然而其本身并非如此)。因此，以下发现：hIγ1-hSγ1序列的牛源化令人惊奇地使得hIgG2占优势足以转换成在Tc牛的条件下hIgG1占优势，强烈地表明在2种物种之间的IgG1类别转换调节中的物种不相容性。由于认为免疫球蛋白基因的组织和多样化(包含类别转换)在物种中是明显进化的，所以解决这种物种不相容性通常用于在非人类物种中表达人类抗体。对全hIgG血清浓度的物种特异性作用在差异性牛源化cIgM蛋白质{cIgM(CH1)与cIgM(CH2)}之间似乎是不同的；在cIgM(CH1)背景中Iγ1-Sγ1元件的牛源化会显著改善全hIgG血清浓度(即，isKcHACΔ与KcHACΔ)，而这种情况在cIgM(CH2)背景(即，isHAC与cKSL-HACΔ)中未发送。在cIgM(CH2)背景下，额外需要对IgG1跨膜/细胞质结构域进行牛源化，从而显著改善全hIgG/hIgκ的生产(即，istHAC与cKSL-HACΔ)。在cIgM(CH1)和cIgM(CH2)背景下，牛源化的Iγ1-Sγ1序列急剧改变为hIgG1亚类占优势。
最终，为了显示发生此类复杂的染色体功能的HAC/TKO小牛响应于抗原免疫而在功能上生成了全hIgG/hIgκ多克隆抗体，使用人类口腔鳞状细胞癌将多个HAC/TKO动物超免疫，以便与HAC/DKO基因型(cKSL-HACΔ/DKO)相比较来观看抗原特异性全hIgG/hIgκ免疫应答。所有免疫的HAC/TKO小牛都增加了强力的抗人类癌症的全hIgG/hIgκ应答(对hIgG和hIgκ的阳性率为28.45-80.36％)，而2种cKSL-HACΔ/DKO动物对hIgG和hIgκ的阳性率仅为0.73-1.54％，并且仅显示对hIgG应答(图6L，图16)。数据显示HAC/TKO基因型对于抗原特异性全hIgG/hIgκ多克隆抗体的高产率而言是重要的，其可以被牛源化的HAC载体、istHAC和isKcHACΔ进一步增强。
本发明能够在大型家畜物种的血清中生产大量全hIgG/hIgκ(在新基因型中平均>5g/l/中值，即，isHAC/TKO、istHAC/TKO和isKcHACΔ/TKO)。据本发明所了解，这种全hIgG/hIgκ的血清浓度是生产全hIgG的任何其他转基因小鼠系统中最高的(通常为大约0.5g/l)，并且最接近健康人类的水平。此外，在isHAC/TKO、istHAC/TKO和isKcHACΔ/TKO小牛中生产的hIgG亚类可以被控制为hIgG1占优势，其在健康人类中是主要的亚类，并且也是研发中及市场上治疗性hIgG重组抗体的主要亚类。重要的是，所测试的所有HAC/TKO小牛在功能上生成了针对所免疫的人类起源的抗原的全hIgG/hIgκ多克隆抗体，由于人类的免疫耐受，所以这种抗体难以通过传统的人类血清衍生的IVIG而得到。所述的抗体可以使用在一些重要成分(前BCR/BCR组织和Iγ1-Sγ1调节元件)通过负载的人类染色体工程以及内源牛染色体工程(位点特异性大段DNA删除)来解决潜在的物质不相容性的新策略来实现。如果一些调节元件的DNA序列与人类的序列具有相当大的差异，则还可以考虑物种不相容性的这种新概念来用于在转基因动物高表达复杂相关的人类基因。显然，这种复杂的染色体功能是在体细胞中实施的，从而减少了使用ES细胞的必要。
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Claims (43)

1.一种包含基因的人类人工染色体(HAC)的载体，其中所述的基因编码：
(a)一条或多条人类抗体重链，其中编码抗体重链的各基因与类别转换调节元件可操作地连接；
(b)一条或多条人类抗体轻链；以及
(c)一条或多条人类抗体替代轻链和/或有蹄动物衍生的IgM重链恒定区；
其中编码所述的一条或多条人类抗体重链的基因的至少一个类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别调节元件所替换。
2.权利要求1所述的HAC，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgG抗体重链。
3.权利要求2所述的HAC，其中所述的IgG重链包含IgG1抗体重链。
4.权利要求1-3的任意一项所述的HAC载体，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgA抗体重链。
5.权利要求1-4的任意一项所述的HAC载体，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgM抗体重链。
6.权利要求1-3的任意一项所述的HAC载体，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE和IgD人类抗体重链。
7.权利要求1-6的任意一项所述的HAC载体，其中所述的HAC载体包含编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区的基因，其中所述的有蹄动物衍生的IgM重链恒定区与人类IgM重链可变区以嵌合体的形式表达。
8.权利要求7所述的HAC，其中所述的有蹄动物衍生的IgM重链恒定区为牛衍生的IgM重链恒定区。
9.权利要求1-8的任意一项所述的HAC载体，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgG抗体重链，其中所述的人类IgG抗体重链恒定区的跨膜结构域和细胞内结构域被有蹄动物衍生的IgG抗体重链恒定区的跨膜结构域和细胞内结构域所替换。
10.权利要求9所述的HAC载体，其中所述的人类IgG抗体重链包含人类IgG1抗体重链。
11.权利要求9-10的任意一项所述的HAC载体，其中所述的有蹄动物衍生的IgG抗体重链恒定区包含牛衍生的IgG抗体重链恒定区。
12.权利要求1-11的任意一项所述的HAC载体，其中所述的有蹄动物衍生的类别转换调节元件包含Iγ-Sγ类别转换调节元件。
13.权利要求12所述的HAC载体，其中所述的Iγ-Sγ类别转换调节元件包含Iγ1-Sγ1。
14.权利要求1-13的任意一项所述的HAC载体，其中编码所述的一条或多条人类抗体重链的基因的各类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别转换调节元件所替换。
15.权利要求1-14的任意一项所述的HAC载体，其中所述的有蹄动物衍生的类别转换调节元件为牛衍生的类别转换调节元件。
16.权利要求1-15的任意一项所述的HAC载体，其中所述的HAC载体包含编码人类抗体替代轻链的一条或多条基因，其中所述的人类抗体替代轻链选自VpreB1、VpreB3和λ5人类抗体替代轻链。
17.权利要求1-16的任意一项所述的HAC载体，其进一步包含有蹄动物衍生的增强子，该增强子与编码所述的一条或多条人类抗体重链的一条或多条基因可操作地连接。
18.权利要求17所述的HAC载体，其中所述的增强子包含3’Eα增强子。
19.一种转基因有蹄动物，其包含权利要求1-18的任意一项所述的HAC载体。
20.权利要求19所述的转基因有蹄动物，其中所述的转基因有蹄动物为转基因牛。
21.一种转基因有蹄动物，其包含整合至其基因组中的基因，该基因编码：
(a)一条或多条人类抗体重链，其中编码抗体重链的各基因与类别转换调节元件可操作地连接；
(b)一条或多条人类抗体轻链；以及
(c)一条或多条人类抗体替代轻链和/或有蹄动物衍生的IgM重链恒定区；
其中编码所述的一条或多条人类抗体重链的基因的至少一个类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别调节元件所替换。
22.权利要求21所述的转基因有蹄动物，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgG抗体重链。
23.权利要求22所述的转基因有蹄动物，其中所述的IgG重链包含IgG1抗体重链。
24.权利要求21-23的任意一项所述的转基因有蹄动物载体，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgA抗体重链。
25.权利要求21-24的任意一项所述的转基因有蹄动物载体，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgM抗体重链。
26.权利要求21-24的任意一项所述的转基因有蹄动物载体，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE和IgD人类抗体重链。
27.权利要求21-26的任意一项所述的转基因有蹄动物载体，其中所述的HAC载体包含编码有蹄动物衍生的IgM重链恒定区的基因，其中所述的有蹄动物衍生的IgM重链恒定区与人类IgM重链恒定区以嵌合体的形式表达。
28.权利要求27所述的转基因有蹄动物载体，其中所述的有蹄动物衍生的IgM重链恒定区为牛衍生的IgM重链恒定区。
29.权利要求21-28的任意一项所述的转基因有蹄动物，其中所述的一条或多条人类抗体重链包含人类IgG抗体重链，其中所述的人类IgG抗体重链恒定区的跨膜结构域和细胞内结构域被有蹄动物衍生的IgG抗体重链恒定区的跨膜结构域和细胞内结构域所替换。
30.权利要求29所述的转基因有蹄动物载体，其中所述的人类IgG抗体重链包含人类IgG1抗体重链。
31.权利要求29-30的任意一项所述的转基因有蹄动物，其中所述的有蹄动物衍生的IgG抗体重链恒定区包含牛衍生的IgG抗体重链恒定区。
32.权利要求21-31的任意一项所述的转基因有蹄动物，其中所述的有蹄动物衍生的类别转换调节元件包含Iγ-Sγ类别转换调节元件。
33.权利要求32所述的转基因有蹄动物载体，其中所述的Iγ-Sγ类别转换调节元件包含Iγ1-Sγ1。
34.权利要求21-33的任意一项所述的转基因有蹄动物，其中编码所述的一条或多条人类抗体重链的基因的各类别转换调节元件被有蹄动物衍生的类别转换调节元件所替换。
35.权利要求21-34的任意一项所述的转基因有蹄动物，其中所述的有蹄动物衍生的类别转换调节元件为牛衍生的类别转换调节元件。
36.权利要求21-35的任意一项所述的转基因有蹄动物，其中所述的HAC载体包含编码人类抗体替代轻链的一条或多条基因，其中所述的人类抗体替代轻链选自VpreB1、VpreB3和λ5人类抗体替代轻链。
37.权利要求21-36的任意一项所述的转基因有蹄动物，其进一步包含整合至其基因组中的有蹄动物衍生的增强子，该增强子与编码所述的一条或多条人类抗体重链的一条或多条基因可操作地连接。
38.权利要求37所述的转基因有蹄动物，其中所述的增强子包含3’Eα增强子。
39.一种生产人类抗体的方法，其包含：
(a)向权利要求19-38的任意一项所述的转基因有蹄动物给予靶向抗原，从而在所述的有蹄动物的血清或血浆中生产和累积对所述的靶向抗原具有特异性的人类抗体；以及
(b)由所述的有蹄动物的血清或血浆中回收对所述的靶向抗原具有特异性的人类抗体。
40.权利要求39所述的方法，其中所述的回收包含：
(i)由所述的转基因有蹄动物分离淋巴细胞；
(ii)由所述的淋巴细胞生成生产人类单克隆抗体的杂交瘤；以及
(iii)由所述的杂交瘤回收对所述的靶向抗原具有特异性的人类单克隆抗体。
41.权利要求40所述的方法，其中由所述的转基因有蹄动物的淋巴结分离所述的转基因有蹄动物得到的淋巴细胞。
42.权利要求39-41的任意一项所述的方法，其中所述的转基因有蹄动物是使用所述的靶向抗原超免疫的。
43.一种组合物，其包含通过权利要求39-42的任意一项所述的方法生产的人类抗体。
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