JP2016504012A - トランスジェニック動物におけるヒト抗体産生のための複合染色体工学 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年8月3日出願の米国仮特許出願第61/679,288号の優先権を主張し、同出願の開示が参照により援用される。
(a)抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている1以上のヒト抗体重鎖と、
(b)1以上のヒト抗体軽鎖と、
(c)1以上のヒト抗体代替軽鎖、および/または有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むヒト人工染色体(HAC)ベクターを提供し、1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも1つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
(a)抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている1以上のヒト抗体重鎖と、
(b)1以上のヒト抗体軽鎖と、
(c)1以上のヒト抗体代替軽鎖、および/または有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むトランスジェニック有蹄動物を提供し、1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも1つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
(a)有蹄動物の血清または血漿中に標的抗原に特異的なヒト抗体を産生および蓄積するために、本発明の第2および第3の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのトランスジェニック有蹄動物に標的抗原を投与することと、
(b)有蹄動物の血清または血漿から標的抗原に特異的なヒト抗体を回収することと、
を含む、ヒト抗体を産生する方法を提供する。
(i)トランスジェニック有蹄動物からリンパ球を単離することと、
(ii)このリンパ球からヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することと、
(iii)この標的抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体をこのハイブリドーマから回収することと、
を含む。
(a)抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている1以上のヒト抗体重鎖と、
(b)1以上のヒト抗体軽鎖と、
(c)1以上のヒト抗体代替軽鎖、および/または有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むヒト人工染色体(HAC)ベクターを提供し、1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも1つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
IgM:Iμ−Sμ
IgG1:Iγ1−Sγ1
IgG2:Iγ2−Sγ2
IgG3:Iγ3−Sγ3
IgG4:Iγ4−Sγ4
IgA1:Iα1−Sα1
IgA2:Iα2−Sα2
IgE:Iε−Sε
のクラススイッチ調節エレメントを有する。
(a)抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている1以上のヒト抗体重鎖と、
(b)1以上のヒト抗体軽鎖と、
(c)1以上のヒト抗体代替軽鎖、および/または有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むトランスジェニック有蹄動物を提供し、1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも1つのクラススイッチ調節エレメントは、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている。
方法
全ての動物の処置は、Hematechのガイドラインを遵守して実施され、プロトコルは施設内動物管理使用委員会によって承認された。
ゲノムDNAを、κHACベクター(κC1−1)を含むCHO細胞またはウシ線維芽細胞株6939および3427のいずれかから抽出し、それぞれκHACまたはウシゲノムライブラリーを構築した。各λファージベースのゲノムライブラリーは、カスタムライブラリー構築サービス(Lofstrand Labs株式会社)を介してλFIX IIベクターを用いて構築した。ライブラリースクリーニングおよびλファージDNA抽出/精製を先に報告された5ように行った。ウシのゲノムBACライブラリー(CHORI−240)を、小児病院オークランド研究所から購入し、取扱説明書に従ってスクリーニングを行った。
各ベクターの構築を、以下に記載のいくつかの変更を加えて、先に報告された5、12、20、21ように行った。
相同アームのためのゲノムDNA断片を、10秒間98℃および9分間68℃の40サイクルで、PCRプライマーペアのkD−F9およびkD−R9を用いることによって増幅した。このPCR産物を、プラスミドpTEL’hisDpurolox2272のBam HI部位にサブクローニングし、以下のように構築した。オリゴDNAを含む改変lox2272(オリゴDNAペア1;下記の表1参照)を、アニーリング後、プラスミドpPUR(BD Bioscience Clontech社)のHind IIIにクローニングし、プラスミドpPURlox2272を作製した。一方、別のプラスミドpTEL’hisDPmを、前述のプラスミドpTELpuroを改変することによって構築し、その際、puro遺伝子はhisD遺伝子で置換され、Eco RI部位はSrf Iで置換され、Spe I部位はPme I部位に変換された。次いで、pPURlox2272からのBam HI断片を、平滑化した後、pTEL’hisDPmのPme I部位にクローニングし、pTEL’hisDpurolox2272F9R9を作製した。
プラスミドpTELpuroを、さらにEco RI部位をSrf I、次いで、Pme Iに変換し、puro遺伝子をCAGzeo遺伝子{pTELCAGzeo(Sr)Pm}に置換することによって改変した。一方、相同アームのためのゲノムDNA断片を、PCRプライマーペアのSL−F2およびSL−R2を用いて、10秒間98℃および9分間68℃の40サイクルで増幅した。このPCR産物を、プラスミドpTELCAGzeo(Sr)PmのBam HI部位にサブクローニングし、pTELCAGzeoSLF2R2を作製した。
HCF2遺伝子の相同性アームの配列をAP000553の配列で置換することによって前述のターゲティングベクターpHCF21oxPHygを改変し、これを、PCRプライマーペアの553−F3および553−R3を用いて、10秒間98℃および15分間68℃の40サイクルで増幅し、p5531oxPHyg(F)を作製した。このプラスミドを、Not Iで消化し、自己連結させ、その後、Srf I部位にDT−A断片をクローニングした。一方、pDRIVE−CAG(InvivoGen社)を以下のように改変した。lacZ断片(Bsr GI−Eco RI)を、アニーリング後に、loxP配列を含むオリゴDNA(オリゴDNAペア2、下記表1参照)で置換し、次いで、Sda I−Swa I断片をPst I/Sma Iで消化したpBluescript SK−(Stratagene社)にクローニングし、pCAGloxPを作製した。loxP配列を、さらに、2つのオリゴDNA(オリゴDNAペア3、下記表1参照)をアニーリングした後に生成したlox2272含有配列で置換した。次いで、bsr遺伝子をSpe I部位に付加し、pCAGloxP2272bsrを作製した。最後に、Not I−Kpn I断片(CAG−lox2272−ポリA−bsr)をNot I部位にクローニングし、p553CAGlox2272BsrDTを得た。
相同アームのためのゲノムDNA断片を、PCRプライマーペア、SC355−F3およびSC355−R3を用いて、10秒間98℃および15分間68℃の40サイクルで増幅した。このPCR産物を、Kpn I部位をSrf I部位に変換したプラスミドpBluescriptのSpe I部位にサブクローニングし、pSC355F3R3を作製した。loxP配列を、2つのオリゴDNA(オリゴDNAペア4、下記の表1参照)をアニーリングした後に生成したlox511含有配列とさらに置換することによって、pCAGloxPプラスミドを同様に改変した。次いで、hisD遺伝子をSpe I部位に付加し、pCAGlox511hisDを作製した。Not I−Kpn I断片(CAG−lox511−ポリA−hisD)をpSC355F3R3のEco RV部位にクローニングした。最後に、DT−AカセットをNot Iにサブクローニングし、pSC355CAGlox511hisDDTを得た。
相同アームのためのゲノムDNA断片を、PCRプライマーペアの14CEN−Fおよび14CEN−Rを用いて、10秒間98℃および15分間68℃の40サイクルで増幅した。このPCR産物を、Kpn I部位をPme I部位に変換したプラスミドpBluescriptのBam HI部位にサブクローニングし、p14CEN(FR)を作製した。この改変lox511含有オリゴDNA(オリゴDNAペア5、下記表1参照)を、アニーリング後に、プラスミドpPUR(BD Bioscience Clontech社)のHind III部位にクローニングし、プラスミドpPURlox511を作製した。pPURlox511のBam HI断片を、pBluescript SK−(Stratagene社)のBam HI部位にクローニングし、hyg遺伝子をEcoRVにクローニングした後、pHygPurolox511を作製した。Not I−Kpn I断片を、p14CEN(FR)のHpa I部位にクローニングした。最後に、DT−Aカセットを、Pme Iにサブクローニングし、p14CEN(FR)hygpurolox511DTを得た。
単にDT−Aカセットを付加することによって、前述のベクターpRNR2loxPbsr(Ref.20)を改変し、pRNR2loxPbsrDTを構築した。
ゲノムλファージライブラリーを、カスタムライブラリー構築サービス(Lofstrand社)を介してλFIX IIベクターを用いてκHACを含むCHO細胞から構築した。このゲノムライブラリーを、PCRペアのhCμ−FRを用いて増幅したPCR産物であるプローブを用いてhIGHM定常領域についてスクリーニングし、次いで、クローン#1、#4、および#7を単離した。クローン#4から、1.7kbのPml I断片をpBluescriptのSma I部位にサブクローニングし、pCH1S(F)を作製した。Sal I−ウシIGHMゲノム断片がpBluescriptにクローニングされたプラスミドpBCμAY37−95からの1kbのSac I−Pml I断片を、pCH1S(F)のPst I部位にサブクローニングし、pCH1SSP(F)を作製した。上記クローン#1からの7.4kbのSma I−Eco RI断片を、Eco RV/Eco RIで消化したpCH1SSP(F)にクローニングし、pCH1SLを作製した。一方、プラスミドpBCμAY37−95から、3.5kbのSac I断片をpBluescriptにサブクローニングし、次いで、loxP導入CAGzeo(CAGzeo断片をpBS246(Gibco社)のEco RV部位にサブクローニングした)のXho I断片を、Van91 I部位にクローニングし、pmAYSazeo(F)を作製した。pmAYSazeo(F)からのSac I断片を、さらにpCH1SLの平滑末端のEco RI部位にサブクローニングし、pCH1zeo(F)を作製した。最終ステップとして、DT−Aカセットを、pCH1zeo(F)のNot I部位にサブクローニングし、pCH1CAGzeo(R)DT(F)を得た。
アニーリングしたオリゴDNA対のSeSpを、pBluescriptの平滑末端のPst I部位にクローニングした。pBCμAY37−95から、2kbのSph I−Bam HI断片を、Sph I−Bam HI部位にサブクローニングし、pmAYSpBを作製した。同様に、pBCμAY37−95からの2kbのBam HI−Pml I断片を、(元のSpe I部位を変換した)Bam HI−Pme I部位にサブクローニングし、pmAYSpBPmlを作製した。上記のクローン#1からの0.6kbのEco RI−Sex AI断片を、pmAYSpBPmlのEco RI−Sex AI部位にサブクローニングし、pRISeを作製した。次いで、loxP導入CAGzeoを、pRISeのVan91 I部位にサブクローニングし、pRISeCAGzeo(R)を作製し、そのNot I部位をEco RI部位に変換し、pRISeCAGzeoEを作製した。一方、上記のクローン#4からの1.7kbのPml I断片をpBluescriptのSma I部位にサブクローニングし、そのEco RV部位をMlu I部位に変換して、pCH2S(F)を作製した。上記クローン#1からの6.6kbのMlu I−Eco RI断片を、pCH2(F)のMlu I−Eco RIにクローニングし、pCH2LSを作製した。次いで、pRISeCAGzeoEからのEco RI断片をpCH2LSのEco RI部位にサブクローニングし、pCH2CAGzeo(F)を作製した。最終ステップとして、DT−AカセットをpCH2CAGzeo(F)のNot I部位にサブクローニングし、pCH2CAGzeoDTを得た。
κHACを含むCHO細胞から構築されるゲノムλファージライブラリーをスクリーニングし、PCRペアのg1(g2)−FRを用いて増幅したPCR産物であるプローブを用いることによって、ヒトIγ1−SγI領域、続いてhIGHG1定常領域をカバーするゲノムDNA断片を単離し、次いで、クローン#h10および#h18/h20を同定した。クローン#h10から、2kbのAfe I−Bam HI断片を短腕として使用するために回収し、10.5kbのApa I−Hpa I断片を、長腕のためにクローン#h18/h20から得た。一方、ウシゲノムλファージライブラリーをスクリーニングして、PCRペアのbIgG1−FRを用いて増幅したPCR産物であるプローブを用いることによって、ウシIγ1−SγI領域、続いてbIGHG1定常領域をカバーするゲノムDNA断片を単離し、次いで、クローン#b42を同定し、その9.7kb断片(5’末端からBsu36 I)を、6.8kbのヒトIγ1−SγI領域を置換するためにアセンブルした。Bsu36 I−Apa Iリンカーを用いて、ウシIγ1−SγI領域の3’末端およびhIGHG1定常領域の5’末端を結合させた。図22Bに示すように、FRTおよびDT−A遺伝子が隣接するneo遺伝子を挿入した。上記の全てのアセンブルを、BACベースの骨格を有するベクターpCC1BAC(EPICENTRE)上で行った。
クローンh10からの11.4kbのKpn I−Not Iゲノム断片を、クローン#h10から単離し、pBluescript SK(−)ベクターにサブクローニングした。次いで、FRT−CAGプロモーター−attP−ポリA−hisDカセットを、Kpn I部位から1.8kb下流にある5’Bam HI部位に挿入した。最後に、DT−A遺伝子をNot I部位にクローニングした。
クローンh20からの7.5kbのSac IIゲノム断片をpBluescript SK(−)ベクターにサブクローニングした。次に、neo−attPカセットをHind III部位に挿入し、その後、Not I部位にDT−A遺伝子をクローニングした。
ウシTM1−TM2ドメインを含む7.3kbのBmg BI−Sph Iウシゲノム断片をクローン#b66から入手し、その5’部分を、リンカーpNsiI−bG1−hG1−BmgBIによって、isHACからの9.5kbのウシIγ1−SγI断片(#b42由来)および1.6kbのhIGHG1遺伝子(#h10由来)の3’部分と結合させた。attB−DsRed−FRTカセットを9.5kbのウシIγ1−SγI断片(#b42由来)の5’側に挿入し、別のattB配列を、クローン#b66から得られたウシTM1/TM2ドメインを含む7.3kbのBmg BI−Sph Iウシゲノム断片の3’側に入れた。上記の全てのアセンブルをBACベースの骨格を有するベクターpCC1BAC(EPICENTRE)上で行った。
プライマーペアのbCLR−FRによって増幅したプローブを用いて、IGLJ1−IGLC1遺伝子の5’側をカバーするいくつかのλファージクローンを同定した。13kbのNde I−Hin dIIIゲノム断片をpBluescript SK(−)ベクターにサブクローニングし、CAGzeo/loxP/プロモーターレスpuroカセットをゲノム断片に存在するAfe I部位に挿入した。最後に、DT−A遺伝子をNot I部位に挿入した。このベクターをアレルAおよびBから構築した。
プライマーペアのbCLL−FRによって増幅したプローブを用いて、IGLJ5−IGLC5遺伝子の3’側をカバーするいくつかのλファージクローンを同定した。10kbのSac II−Nsi Iゲノム断片をpBluescript SK(−)ベクターにサブクローニングし、CAGプロモーター/loxP/ポリA/neoカセットをゲノム断片に存在するHin dIII部位に挿入した。最後に、DT−A遺伝子をNot I部位に挿入した。このベクターを、アレルAおよびBから構築した。
構造が定義されたhChr14ベクターを使用し、できるだけ多くの無関係のヒト遺伝子を除去するために、インタクトなhChr14を改変し、その後、IgMをウシ化した(図17A)。インタクトなhChr14を保持するニワトリDT40細胞を、ターゲティングベクターpSC355CAGlox511hisDDTを用いてエレクトロポレーションし、hIGH遺伝子座に対して約300kbセントロメア側にある遺伝子座AL512355にlox511およびCAGプロモーターを組み込んだ。コロニーをヒスチジノールで選択し、ゲノムPCRスクリーニングに供し、陽性PCRとしてプライマーSC355KO−F2/R2を用い、陰性PCRとしてプライマー355N−F/Rも用いて、相同組み換えの発生を確認した(図17D)。クローンI355−2を良好な標的化クローンとして同定した。
κTL1は、hIGK遺伝子座をカバーするhChr2断片を含むDT40クローンである。ゼオシン選択は、通常、後の工程でウシ線維芽細胞においてより良好に動作するため、この細胞株を、ベクターpTELCAGzeoCD8Aでトランスフェクションし、PGKpuroカセットをCAGzeoで単純置換した。ゼオシン選択後、相同組み換えに特異的なCD8AKO−F2R2(図18A)を用いてゲノムPCRを行い、クローンκZ7を同定して、そのピューロマイシン感受性を確認し、その後、CH1D2を用いたKcHACΔ構築のために用いた。
概要を図19Aに示す。インタクトなhChr22を保持するDT40細胞株の52−18を、ターゲティングベクターpTELCAGzeoSLFRでエレクトロポレーションし、hChr22がΔΔHACベクターのために切断されるAP000344遺伝子座に対して約450kbテロメア側であるAP000350遺伝子座においてhChr22を切断した(図19B)。コロニーをゼオシンで選択し、それらのゲノムDNAを、52−18に存在するが標的クローンに存在しないAP000350遺伝子座を増幅するプライマー(下記表1参照)350T−FRを用いるPCRスクリーニングに供した。クローンST13を、切断が成功したクローンとして同定した。
SLKH断片を、染色体クローニングシステムを用いて、DT40ハイブリッド細胞内で構築した(図20A)。hygカセットを有するhChr22断片を保持するクローンK53およびbsrカセットを有するhChr2断片を保持するクローンSTL54を融合(全細胞融合、WCF)して、DT40ハイブリッド細胞を作製した。コロニーをハイグロマイシンBおよびブラストサイジンSで維持し、両方のhChr断片を保持する細胞を選択し、hChr2断片については以下のプライマー(下記表1参照)のIGKC−F/R、IGKV−F/R、RPIA−F/R、EIF2AK3−F/Rおよびcos138KO−F/Rを用い、hChr22断片については別のプライマーセットの553P−F/R、hVpreB1−F/R、hVpreB3−F/R、IgL−F/R、344−F/R、hL5−F/R、350P−F/Rおよび553KO−F/Rを用いてゲノムPCRにより確認した。プローブとしてヒトCOT−1 DNAを用いたFISHにより、2つのヒト染色体断片の存在を確認した(図20B)。クローンSLK2を陽性クローンとして同定した。SLK2を、一方がhChr2断片上の遺伝子座AC104134に存在し、もう一方がhChr22断片上の遺伝子座AP000553に存在する2つlox2272部位間の部位特異的組み換えを媒介するためのCre発現プラスミドでトランスフェクションした。ピューロマイシン耐性が転座部位におけるCAGプロモーター−lox2272−puroカセットの再構成によって付与されるので、組み換え体をピューロマイシンによって選択した。これも、CAGpuro−F3R3を用いるゲノムPCRにより確認し、その後、PCR産物の直接配列決定を行った。SLKH6を、SLKH断片を保持する、転座に成功したクローンとして同定した(図20A、20B)。
図3Bに概説するように、染色体クローニングシステムを用いて、cKSL−HACΔベクターをDT40ハイブリッド細胞内で構築した。hChr22断片と転座させたhChr2断片を含み、hygカセットを有するSLKD18、ならびにbsrカセットを有するhChr14断片(14D)およびcIgM(CH2)−ウシ化hIGH遺伝子座を含むCH2D4を融合させ、DT40ハイブリッドクローンcKSLD22を作製し、ハイグロマイシンBおよびブラストサイジンSで選択した。hChr22については第1のPCRプライマーセット(下記表1参照)の553P−F/R、hVpreB1−F/R、hVpreB3−F/R、IgL−F/R、344−F/R、hL5−F/R、350P−F/R、および553KO−F/Rを用い、hChr2については、第2のプライマーセットのIGKC−F/R、IGKV−F/R、RPIA−F/R、EIF2AK3−F/R、cos138KO−F/R、CAGpuro−F3/R3(hChr2とhChr22間の接合部)を用い、hChr14については第3のプライマーセット(下記表1参照)のRNR2−1×STOP−3、VH3−F/R、g1(g2)−F/R、14CENKO−F3/R3、CH2 5’−F/R、cHAC−F3/R3およびSC355F3R3KO−F/2R2を用いて大規模ゲノムPCRを行った。さらに、ヒトCOT−1 DNAを用いたFISHにより、2つのヒト染色体断片の存在も確認した。
isHAC(isKcHACΔ)構築の概略を図22Aに示す。ターゲティングベクターpCC1BAC−isHACを構築し(図22B)、これを用いて、cKSL−HACΔまたはKcHACΔ上のIγ1−SγI領域をウシ化した。cKSLDH22(2L)からMMCTによって得られたcKSL−HACΔを保持するニワトリDT40細胞株のクローンcKSLDD1を、ターゲティングベクターpCC1BAC−isHACでエレクトロポレーションした。コロニーをG418で選択し、それらのゲノムDNAを、プライマーのiscont1−F1R1を用いてPCRスクリーニングに供し、相同組み換えの発生を確認した。さらに、追加の診断PCRも行い、構造的完全性を確認した(図22C)。1種類のクローンis1−11を、FLP発現プラスミドの導入によって、その後のneoカセット欠失のために選択した。このis1−11を、FLP発現プラスミドおよびDsRed発現プラスミドで同時トランスフェクションした。DsRed陽性細胞を選別し、単コロニー分離に供した。neoカセットがFRT−FLP組み換えによって欠失したG418感受性コロニーを、iscont1−F3/R6(下記表1参照)を含むゲノムPCRについて試験した(図22D)。最後に、isH11−S2およびisH9−3を選択し、次いで、それらをCHO細胞に移して、それぞれマスター細胞バンクisC1−133、isC10−2およびisC10−18を樹立し、大規模ゲノムPCRおよびCGHを行って、構造的完全性を確認した(図22E、22F)。isKcHACΔをDT40細胞で構築し、isHACと同様に、2種類のクローンのisKCDH17、isKCDH30を選択し、次いで、CHO細胞に移して、それぞれマスター細胞バンクのisKCDC8およびisKCDC38を樹立し、大規模ゲノムPCRおよびCGHを行って、構造的完全性を確認した(図22G、22H)。
istHACの構築スキームを図23Aに示す。クローンcKSLDD1を、順次、2つのターゲティングベクターphλ1TMNeoattPDT(図23B)およびphIγ1FRTCAGattPhisDDT(図23C)で標的化し、それぞれhIGHG1 TM2ドメインの3’側およびヒトIγ1領域の5’側にattP配列を組み込み、2種類のクローンist1−5およびist1−21を作製した。大きなDNA置換を引き起こすために、それらをpBAC−istHACおよびφC31−発現ベクターと共に同時エレクトロポレーションした。図23Dに示すように、attPおよびattB間の予想される組み換えは、フローサイトメトリーによって検出することができるCAGプロモーター−DsRed遺伝子発現を再構成させるはずである。したがって、DsRed陽性細胞を選別した。DsRed陽性細胞の純度が95%を上回るまで、この選別プロセスを2〜3回繰り返した。その後、細胞を単コロニー単離に供し、3種類の診断ゲノムPCR(下記表1参照)のCAGDsRed−F2/R2(陽性)、bIgG1−3’−SeqF3×hIgG1−R15(陽性)およびbIgG1−3’−SeqF3×attPPuro−R3(陰性)によって調べた。結果として、ist1−5からistH5−S16およびist1−21からistH21H−S10を選択した。
先に報告された5,20,21ように、HACベクター構築を行った。簡単に説明すると、各hChr断片を含むDT40細胞を、各ターゲティングベクター約25μgでエレクトロポレーションした(550V、25μF)。コロニーを、2週間、各薬剤;G418(2mg/ml)、ピューロマイシン(0.5μg/ml)、ハイグロマイシンB(1.5mg/ml)、ブラストサイジンS(15μg/ml)、ヒスチジノール(0.5mg/ml)、またはゼオシン(1mg/ml)で選択し、示したように、それらのDNAをPCRスクリーニングに供した。
先に報告された5、12、21ように、ウシ胎仔線維芽細胞を培養し、トランスフェクションした。簡単に説明すると、550Vおよび50μFにて、線維芽細胞を各ターゲティングベクター約30μgでエレクトロポレーションした。48時間後、これらの細胞を適切な薬物;ゼオシン(0.4mg/ml)またはピューロマイシン(1μg/ml)の下で2週間選択し、耐性コロニーをピックアップして、レプリカプレートに移した。一方は、ゲノムDNA抽出のためのものであり、他方は胚クローニングのためのものであった。先に報告された5、20、21ように、各HACベクターを用いてMMCTを行った。
先に報告された5、12、20、21ように、これらの分析を行った。全てのPCR産物を、0.8%アガロースゲルで泳動した。プライマー配列は下記表1から利用可能である。
CGH分析のためのアレイプローブを、cKSL−HACΔベクターの推定配列に基づいて、Roche NimbleGenが設計した(図24を参照)。実験およびデータ分析をRoche NIMBLEGEN(商標)が行った。
先に報告された5、20、21ように、ヒトCOT−1 FISHおよびhChr特異的な多色FISHを行った。hIGH、hIGKおよびhIGL遺伝子座を特異的に染色するために、プローブを、それぞれBACクローンRP11−417P24、RP11−316G9およびRP11−22M5由来のDNAから合成した。
新生児トランスジェニック(Tc)子ウシにおけるB細胞の発生に関するフローサイトメトリー分析を、以下のように変更して、先に報告された5ように行った。TcウシB細胞上の表面hIgGを検出するために、AF488で直接標識したヤギ抗hIgG(Life Technologies社)を用いた。TcウシB細胞上の表面hIgκまたはhIgλを標識するために、PE(Biolegend社)で直接標識したマウス抗hIgκ抗体またはPE(Southern Biotech社)で直接標識したマウス抗hIgλ抗体を使用した。B細胞上の表面bIgλまたはbIgκを標識するために、マウスモノクローナル抗bIgλ(インハウスクローン132D7)またはマウスモノクローナル抗bIgκ(インハウスクローン132B10)、続いて、ゼノンマウスIgG1PE標識(Life Technologies社)を使用した。染色を標準的なプロトコルによって行い、その後、FACSARIA(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences社)によって分析した。
先に報告された5ように、全hIgG ELISAアッセイを行った。完全hIgG/hIgκまたはhIgG/hIgλ検出のために、捕捉抗体としてアフィニティー精製されたヤギ抗hIgκまたはアフィニティー精製されたヤギ抗hIgλ(Bethyl社)および検出抗体としてヤギ抗hIgG Fc−HRP(Bethyl社)を用いた。hIgG/bIgκ検出のために、捕捉抗体としてマウスモノクローナル抗bIgκ(インハウスクローン132B10)および検出抗体としてマウス抗hIgG Fcγ−HRP(Jackson社)を使用した。hIgG1またはhIgG2の検出のために、捕捉抗体としてマウス抗hIgG1 Fcまたはマウス抗hIgG2 Fc(Hybridoma Reagent Laboratory)、および検出抗体としてマウス抗hIgG HRP(Southern Biotech社)を用いた。
油中水型エマルジョンとしてのモンタニド(Montanide)ISA 25アジュバント(Seppic社)+免疫刺激剤としてのQuil A(Accurate Chemical & Scientific Corp)で製剤化された、2×108細胞/用量のX線照射ヒト口腔扁平上皮癌(DSMZ)抗原を、HAC/TKOおよびHAC/DKO子ウシに免疫した。Tc子ウシを3週間の間隔で2回免疫した(初回免疫の3週間後に追加免疫を行った)。ワクチンを、頸部の筋肉内注射により投与した。先に報告された5ように、抗体価の分析のために、各免疫前(V1およびV2)ならびに各免疫後10日および14日の時点で血清試料を採取した。抗ヒト口腔扁平上皮癌の抗体価を、フローサイトメトリー分析により決定した。
ヒト癌細胞で免疫したTcウシから採取した血清を、ヒト癌細胞を染色するための一次抗体として使用した。免疫前のTcウシ血清(V1D0)を陰性対照として使用した。AF488結合ヤギ抗hIgG Fc(Invitrogen社)を1:80希釈し、PE結合マウス抗hIgκ(Biolegend社)を1:8希釈して用い、結合したhIgG/hIgκ抗体を検出した。このアッセイを、4%ウマ血清、0.1%アジ化ナトリウムおよび2mM EDTAを補充したPBS中で行った。FACSARIA(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences社)によって測定し、結果を、染色したヒト癌細胞の割合(%)および平均蛍光強度(MFI)として表した。
先に報告された5,12,20,21ように、クローン化した胎仔および子ウシを、クロマチン転送手順を用いて生成した。
実施例1.ウシIGL遺伝子クラスターの欠失
1つの仮説は、ウシIg軽鎖の不活性化が、bIgH破壊に加えて、ウシにおける完全ヒトIgGの高い生産性を支持するというものである。ヒトおよびマウスとは異なり、ウシは、主にIgκを上回るIgλ軽鎖を発現するので、bIGL遺伝子が不活性化された。しかし、本発明者らがこの研究を始めた時には、ウシゲノム中のbIGL遺伝子構造について公表された情報はほとんどなかったので、その周辺領域を含むbIGL遺伝子配列を決定した。そのために、ウシBAC(細菌人工染色体)ゲノムライブラリーをスクリーニングし、次いで、ショットガンアプローチによって、1種類のBACクローンの完全な配列決定を行った。5つのIGLJ−IGLC遺伝子(IGLJ1−IGLC1からIGLJ5−IGLC5)で構成される遺伝子クラスターを同定し、そのうちの3つ(IGLJ2−IGLC2からIGLJ4−IGLC4)は、その推定アミノ酸配列から判断すると機能的であると思われた(図1A)。IGLJ1−IGLC1およびIGLJ5−IGLC5遺伝子の両方は、未熟な終止コドン変異を含み、疑遺伝子の可能性を示す。IGLJ5−IGLC5遺伝子の約13kb下流に、潜在的なエンハンサーエレメント3’Eλが見られ、ヒト3’Eλ(HSS−3)エンハンサー配列と約60%のDNA配列相同性を示した。Chenらは、4つのIGLJ−IGLC遺伝子をウシで同定したことを報告した。本発明者らの分析において、IGLJ2−IGLC2およびIGLJ3−IGLC3エクソン配列が同定されたが、イントロンおよび3’非翻訳領域(UTR)などのそれらの周辺配列はわずかではあるが異なっており、IGLJ2−IGLC2およびIGLJ3−IGLC3は異なる遺伝子であると結論付けた(図8A、8B)。
体細胞における複数ラウンドの遺伝子改変、その後のSCNTは、潜在的に蓄積した不可逆的なエピジェネティックエラーのために、動物の発生を損なわせ得る。図2Aにまとめたように、SCNTのラウンド数を減らすために、逐次的遺伝子ターゲティングを動物育種と組み合わせた。
ウシにおける完全hIgGの高生産を阻害し得る、ヒトおよびウシ間のいくつかの種不適合性がある可能性がある。そのような種不適合性の1つとして、IgMベースのpreBCR/BCR機能を対処した。免疫グロブリン重鎖(IgH)クラスの中で、IgM重鎖が発現する最初のものであり、最終的にIgGを分泌させることはB細胞の発生に重要である。Tcウシの状態で、hIgMをウシB細胞表面上で発現させ、その後のB細胞の発生に重要であるpreBCR/BCR媒介性シグナル伝達のために、ウシ代替軽鎖、続いて、正統なウシ軽鎖、およびウシIg−α/Ig−β分子と相互作用させる。ウシ代替軽鎖、正統なウシ軽鎖およびウシIg−α/Ig−β分子と相互作用するhIgMタンパク質に種不適合性がある可能性がある(図11A〜図11D)。この仮説に対処するために、KcHACΔおよびcKSL−HACΔの2種類のHACベクターを構築した(図3A)。KcHACΔにおいて、このようなキメラIgM{cIgM(CH1)}タンパク質が、良好なpreBCR/BCRシグナル伝達のために、ウシ代替軽鎖、正統な軽鎖およびIg−α/Ig−β分子と相互作用することができるように、hIGHM定常領域遺伝子の一部(CH1〜TM2ドメイン)をウシ化した。cKSL−HACΔにおいて、良好なpreBCR/BCRシグナル伝達のために、このようなキメラIgM(「cIgM(CH2)」;配列番号200)タンパク質が、ヒト代替軽鎖とペアを組み、ウシIg−α/Ig−β分子とも相互作用することができるように、hIGHM定常領域遺伝子の一部(CH2からTM2ドメイン)を別にウシ化し、さらに、ヒト代替軽鎖hVPREB1およびhIGLL1(マウスではλ5)遺伝子をhChr22断片と共に導入した。hIgM、cIgM(CH1)およびcIgM(CH2)タンパク質の可変領域および定常領域の種特異的な異なる配列により、各HACベクターにおけるpreBCR/BCR機能/シグナル伝達(例えば、それぞれκHAC、KcHACΔ、cKSL−HACΔ)は、B細胞の発生運命、最終的には、hIgG産生プロファイルに別々に影響を与え得る。
cKSL−HACΔ、KcHACΔおよびKcHACベクターを、MMCTによりチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に移して、それぞれCHOベースのマスター細胞バンクcKSLDC6、15、23、KCDC15およびCKF4を樹立し、大規模ゲノムPCRおよびCGHにより確認した(図12A−12C)。次いで、3種類のHACベクターのcKSL−HACΔ、KcHACおよびκHACを、このCHO細胞株から、育種して得たIGHM−/−IGHML1−/−(DKO)細胞株へ移し、cKSL−HACΔ/DKO、KcHAC/DKOおよびκHAC/DKO子ウシを作製した。cKSL−HACΔおよびKcHACベクターの目的は、B細胞の発生のためのIgM媒介性preBCR/BCR機能におけるヒトおよびウシ間の種不適合性を解決することであり、したがって、B細胞の発生プロファイルを、新生児段階でのこれらの動物の末梢血単核細胞(PBMC)において調べた(図4A)。KcHAC/DKO動物におけるIgM検出のために、そのウシ化CH1ドメインにより抗bIgM抗体を用いたが、抗hIgM抗体は、なおcKSL−HACΔベクターからのcIgM(CH2)タンパク質を認識することができる。κHAC/DKO動物と比較すると、cKSL−HACΔ/DKOおよびKcHAC/DKO子ウシの両方は、より高い割合のIgM単一陽性細胞およびIgM/CD21二重陽性B細胞を示した。驚くべきことに、IgM/bIgλ、IgM/bIgκおよびIgM/hIgκ二重陽性B細胞は、KcHAC/DKO動物でのみ検出された。cKSL−HACΔ/DKO子ウシでは、hIgM/bIgλ、hIgM/bIgκ、hIgM/hIgκまたはhIgM/hIgλ二重陽性B細胞のいずれも、これらの転写物はRT−PCRでは検出されたが、hIgM/CD21二重陽性B細胞の割合が増加したにもかかわらず、フローサイトメトリーでは検出できなかった(図12D)。
次の方法は、cKSL−HACΔおよびKcHACΔベクター上のhIGHG1遺伝子クラススイッチ調節エレメントの直接的なウシ化により、hIgG、特にhIgG1へのクラススイッチの効率を直接変えることであった。hIGHG1遺伝子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインも、ウシの環境下で、潜在的に良好なhIgG1 BCR媒介性シグナル伝達のためにウシ化した。
isHAC、istHAC、isKcHACΔ、KcHACΔおよびcKSL−HACΔベクターを、MMCTによりCHOマスター細胞バンクからIGHM−/−IGHML1−/−IGL−/−(TKO)細胞株に移し、一連のHAC/TKO子ウシを作製した。妊娠270日目の分娩効率は、移植されたレシピエントのうちの約7%であり、そのうちの60〜70%が誕生後少なくとも5〜6ヶ月まで生き残った(表2)。最初に、bIGLが発現していないことを、新生児の段階でRT−PCRによって確認した(図6A)。その後、B細胞発生におけるbIGL発現の除去の影響に対処するために、新生児の段階でHAC/TKO子ウシの5種類の遺伝子型についてフローサイトメトリーを行った(図6B)。DKO背景と比較して、cKSL−HACΔシリーズ(例えば、isHAC、istHACおよびcKSL−HACΔそれ自体)において、hIgM/hIgκ(またはhIgM/bIgκ)二重陽性B細胞の割合が増加したことを除いて、hIgM単一陽性B細胞およびhIgM/CD21二重陽性B細胞の割合は低いように思われ、hIgG/hIgλ二重陽性B細胞は検出できなかった。逆に、bIgM単一陽性B細胞およびbIgM/CD21二重陽性B細胞の割合は、KcHACΔシリーズ(例えば、isKcHACΔおよびKcHACΔそれ自体)において、DKO背景のものとかなり類似しているように思われ、bIgM/hIgκ(またはbIgM/bIgκ)二重陽性B細胞の割合は実質的に増加した。
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Claims (43)
- (a)抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている1以上のヒト抗体重鎖と、
(b)1以上のヒト抗体軽鎖と、
(c)1以上のヒト抗体代替軽鎖、および/または有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むヒト人工染色体(HAC)ベクターであって、
前記1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも1つのクラススイッチ調節エレメントが、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されているHACベクター。 - 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgG抗体重鎖を含む、請求項1に記載のHAC。
- 前記IgG重鎖がIgG1抗体重鎖を含む、請求項2に記載のHACベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgA抗体重鎖を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgM抗体重鎖を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgEおよびIgDヒト抗体重鎖を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記HACベクターが、有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域をコードする遺伝子を含み、前記有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域が、ヒトIgM重鎖可変領域とのキメラとして発現する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域が、ウシ由来のIgM重鎖定常領域である、請求項7に記載のHACベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgG抗体重鎖を含み、前記ヒトIgG抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが、有蹄動物に由来するIgG抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置換されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載のHAC。
- 前記ヒトIgG抗体重鎖がヒトIgG1抗体重鎖を含む、請求項9に記載のHACベクター。
- 前記有蹄動物に由来するIgG抗体重鎖定常領域が、ウシ由来のIgG抗体重鎖定常領域を含む、請求項9〜10のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントが、Iγ−Sγクラススイッチ調節エレメントを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記Iγ−Sγクラススイッチ調節エレメントがIγ1−Sγ1を含む、請求項12に記載のHACベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の各クラススイッチ調節エレメントが、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントが、ウシ由来のクラススイッチ調節エレメントである、請求項1〜14のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記HACベクターが、VpreB1、VpreB3およびλ5ヒト抗体代替軽鎖からなる群から選択されるヒト抗体代替軽鎖をコードする1以上の遺伝子を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載のHACベクター。
- さらに、前記1以上のヒト抗体重鎖をコードする1以上の遺伝子と作動可能に連結されている有蹄動物に由来するエンハンサーを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載のHACベクター。
- 前記エンハンサーが3’Eαエンハンサーを含む、請求項17に記載のHACベクター。
- 請求項1〜18のいずれかに記載のHACベクターを含むトランスジェニック有蹄動物。
- 前記トランスジェニック有蹄動物がトランスジェニックウシである、請求項19に記載のトランスジェニック有蹄動物。
- ゲノムに組み込まれ、
(a)抗体重鎖をコードする各遺伝子が、クラススイッチ調節エレメントに作動可能に連結されている1以上のヒト抗体重鎖と、
(b)1以上のヒト抗体軽鎖と、
(c)1以上のヒト抗体代替軽鎖、および/または有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域と、
をコードする遺伝子を含むトランスジェニック有蹄動物であって、
前記1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の少なくとも1つのクラススイッチ調節エレメントが、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されているトランスジェニック有蹄動物。 - 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgG抗体重鎖を含む、請求項21に記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 前記IgG重鎖がIgG1抗体重鎖を含む、請求項22に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgA抗体重鎖を含む、請求項21〜23のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgM抗体重鎖を含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgEおよびIgDヒト抗体重鎖を含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記HACベクターが、有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域をコードする遺伝子を含み、前記有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域が、ヒトIgM重鎖可変領域とのキメラとして発現する、請求項21〜26のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記有蹄動物に由来するIgM重鎖定常領域が、ウシ由来のIgM重鎖定常領域である、請求項27に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖がヒトIgG抗体重鎖を含み、前記ヒトIgG抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが、有蹄動物に由来するIgG抗体重鎖定常領域の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置換されている、請求項21〜28のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物。
- 前記ヒトIgG抗体重鎖がヒトIgG1抗体重鎖を含む、請求項29に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記有蹄動物に由来するIgG抗体重鎖定常領域が、ウシ由来のIgG抗体重鎖定常領域を含む、請求項29〜30のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントが、Iγ−Sγクラススイッチ調節エレメントを含む、請求項21〜31のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記Iγ−Sγクラススイッチ調節エレメントがIγ1−Sγ1を含む、請求項32に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記1以上のヒト抗体重鎖をコードする遺伝子の各クラススイッチ調節エレメントが、有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントで置換されている、請求項21〜33のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記有蹄動物に由来するクラススイッチ調節エレメントが、ウシ由来のクラススイッチ調節エレメントである、請求項21〜34のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記HACベクターが、VpreB1、VpreB3およびλ5ヒト抗体代替軽鎖からなる群から選択されるヒト抗体代替軽鎖をコードする1以上の遺伝子を含む、請求項21〜35のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- さらに、ゲノムに組み込まれ、前記1以上のヒト抗体重鎖をコードする1以上の遺伝子と作動可能に連結されている有蹄動物に由来するエンハンサーを含む、請求項21〜36のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- 前記エンハンサーが3’Eαエンハンサーを含む、請求項37に記載のトランスジェニック有蹄動物用ベクター。
- (a)前記有蹄動物の血清または血漿中に標的抗原に特異的なヒト抗体を産生および蓄積するために、請求項19〜38のいずれか一項に記載のトランスジェニック有蹄動物に標的抗原を投与することと、
(b)前記有蹄動物の血清または血漿から前記標的抗原に特異的なヒト抗体を回収することと、
を含む、ヒト抗体を産生する方法。 - 前記回収が、
(i)前記トランスジェニック有蹄動物からリンパ球を単離することと、
(ii)前記リンパ球からヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することと、
(iii)前記標的抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体を前記ハイブリドーマから回収することと、
を含む、請求項39に記載の方法。 - 前記トランスジェニック有蹄動物のリンパ球が、前記トランスジェニック有蹄動物のリンパ節から単離される、請求項40に記載の方法。
- 前記トランスジェニック有蹄動物が前記標的抗原で過免疫される、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法によって産生されるヒト抗体を含む組成物。
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