KR20000048820A - 텔로머라제 역전사 효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규의 텔로머라제 핵산 및 아미노산에 대한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다양한 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 모티프, 예컨대, 유플로테스 에디큘라투스(Euplotes aediculatus)의 123 kDa 및 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)에서 유래한 관련 서열, 사카로마이세스(Saccharomyces) 서열 및 인간 텔로머라제를 암호화하는 핵산 및 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 텔로머라제 단백질 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 상기 서브유닛을 포함하는 기능적 폴리펩티드 및 리보뉴클레오단백질에 관한 것이다.

Description

텔로머라제 역전사 효소{TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE}
텔로미어는 진핵 생물의 말단부에 물리적으로 위치하는 단백질-DNA 구조물로서, 염색체의 안정성에 필요하며, 핵내 염색체 조직화에 관여한다(예컨대, 문헌[Zakian, Science 270:1601(1995); Blackburn and Gall, J. Mol. Biol., 120:33(1978); Oka 등, Gene 10:301(1980); and Klobutcher 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3015(1981)] 참조). 텔로미어는 효모 및 아마도 대부분의 기타 진핵세포와 같은 생물에 필수적인 것으로 생각되는데, 왜냐하면, 이들은 세포가 천연의 염색체와 파괴된 염색체를 구별할 수 있게 하고, 염색체의 분해를 방지하며, 신규의 복제 메카니즘에 대한 기질로서 작용하기 때문이다. 텔로미어는 일반적으로 복잡한 세포 주기로, 그리고 텔로미어 특이적인 DNA 폴리머라제인 "텔로머라제"에 의해 발생을 조절하는 방식으로 복제된다. 그러나, 텔로미어 유지를 위한 텔로머라제와 무관한 수단이 알려져 왔다. 근년에는, 텔로미어 결손이 암 및 노화에서 일어나는 것과 같은 염색체 변화와 관련이 있었기 때문에 텔로미어에 주의가 집중되어 왔다.
텔로미어 DNA
대부분의 생물에서, 텔로미어 DNA는 매우 간단한 서열의 직렬 구조로, 대부분의 경우에 짧고 정확한 배열로 보고되었다. 통상, 텔로미어는 염색체 말단을 향해 5'으로부터 3'으로 진행하는 가닥에서 G 잔기가 풍부한 간단한 반복 서열로 구성되어 있다. 예를 들면, 테트라히메나의 텔로미어 DNA는 서열 T2G4로 이루어지는 반면에, 옥시트리차(Oxytricha)에서는 그 서열이 T4G4이고, 인간에서 그 서열은 T2AG3이다(예컨대, 문헌[Zakian, Science 270:1601(1995); and Linger 등, Genes Develop., 8:1984(1994)] 참조). 그러나, 이질적인 텔로미어 서열이 일부 생물에서 보고되었다(예컨대, 사카로마이세스에서는 서열 TG1-3). 또한, 일부 생물에서 반복된 텔로미어 서열은 예컨대, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 25 염기쌍 서열과 같이 훨씬 더 길다. 더욱이, 일부 생물의 텔로미어 구조는 완전히 상이하다. 예를 들면, 초파리의 텔로미어는 전위 가능한 요소로 이루어져 있다(문헌[Biessman 등, Cell 61:663(1990); and F.-m Sheen and Levis, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:12510(1994)] 참조).
다수의 생물의 텔로미어 DNA 서열은 결정되어 있다(예컨대, 문헌[Zakian, Science 270:1601(1995)] 참조). 그러나, 보다 많은 텔로미어 서열이 알려짐에 따라, 그 서열을 설명하기에는 부정확한 일치 서열을 동정하기란 점점 더 어려워지고 있다(상기 Zakian의 문헌 참조). 또한, 텔로미어 DNA의 평균량은 생물들 사이에서 상이한 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 마우스는 텔로미어당 150 kb(킬로베이스)만큼 다량의 텔로미어 DNA를 가질 수 있는 반면에, 옥시트리차 거대핵 DNA 분자의 텔로미어는 단지 20 bp의 길이이다(문헌[Kipling and Cooke, Nature 347:400(1990); Starling 등, Nucleic Acids Res., 18:6881(1990); and Klobutcher 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3015(1981)] 참조). 더욱이, 대부분의 생물에서는, 텔로미어 DNA의 양이 변화한다. 예를 들면, 야생형 균주에서 개개의 효모 텔로미어의 텔로미어 DNA의 양은 대략 200 내지 400 bp인데, DNA의 이러한 양은 확률적으로 증가하기도 하고 감소하기도 한다(문헌[Shampay and Blackburn, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:534(1988)] 참조). 텔로미어 길이의 이질성 및 자발적인 변화는 텔로미어 길이의 감소 및 증가에 관여하는 과정들 사이에서 복잡한 균형을 반영할 수 있다. 또한, 유전적, 영양적 및 기타 인자들이 텔로미어 길이의 증가 또는 감소를 일으킬 수 있다(문헌[Lustig and Petes, Natl. Acad. Sci., 83:1398(1986); and Sandell 등, Cell 91:12061(1994)] 참조). 실제로 모든 텔로미어 DNA의 고유한 이질성은 텔로미어가 통상적 복제 과정을 통해 유지되는 것이 아님을 시사하는 것이다.
텔로미어 자체 외에도, 텔로미어에 인접한 영역들이 연구되어 있다. 예를 들면, 대부분의 생물에서, 간단한 반복 서열의 바로 내부의 텔로미어 하부 영역은 텔로미어 관련("TA": telomere-associated) DNA로 명명된 중앙의 반복 서열로 구성된다. 이들 영역은 초파리의 트랜스포존 텔로미어와 약간의 유사성을 보유한다. 사카로마이세스에서는, "X" 및 "Y"로 명명된 두 가지 종류의 TA 요소가 알려졌다(문헌[Chan and Tye, Cell 33:563(1983)] 참조). 이들 요소는 대부분의 또는 모든 텔로미어상에 단독으로 또는 함께 발견될 수 있다.
텔로미어 구조 단백질
텔로미어 DNA와 상호작용하는 다양한 구조 단백질이 텔로머라제 효소의 단백질 성분과 구별되는 것으로 알려져 왔다. 그러한 구조 단백질은 사카로마이세스 염색체의 "텔로좀"(Wright 등, Genes Develop., 6:197(1992)) 및 섬모충류의 거대핵 DNA 분자의 텔로좀(Gottschling and Cech, Cell 38:501(1984); and Blackburn and Chiou, Proc. Natl. Acad. Sci., 78:2263(1981))을 포함한다. 텔로좀은 뉴클레오좀 구조가 아니라 별개의 크로마틴 구조인데, 이 구조는 텔로미어 반복 서열의 전체 말단 배열을 포함한다. 사카로마이세스에서는, 텔로좀에 인접한 DNA가 뉴클레오좀내로 포장된다. 그러나, 이들 뉴클레오좀은 이들이 전사 불활성인 크로마틴의 특성인 모양을 가지기 때문에 효모 게놈의 대부분의 기타 영역의 것과는 상이한 것으로 보고되어 있다(Wright 등, Genes Develop, 6:197[1992]; and Braunstein 등, Genes Develop., 7:592[1993]). 포유류에서, 대부분의 간단한 반복 텔로미어 DNA는 매우 가까이 위치한 뉴클레오좀에 포장된다(Makarov 등, Cell 73:775[1993]; and Tommerup 등, Mol. Cell. Biol., 14:57771994]). 그러나, 인간의 염색체의 바로 말단에 위치한 텔로미어 반복 서열은 텔로좀 유사 구조에서 발견된다.
텔로미어 복제
선형 진핵세포 염색체의 말단의 완전 복제는 DNA 복제의 통상의 방법에 대한 특별한 문제점을 제시한다. 예를 들면, 통상의 DNA 폴리머라제는 DNA 합성을 새로이 개시할 수 있는 것이 아니라, 이들은 복제중에 추후에 제거되는 RNA 프라이머를 필요로 한다. 텔로미어의 경우에, 지체 가닥(lagging strand) 말단으로부터 RNA 프라이머의 제거는 반드시 5'-말단 갭을 남김으로써 모 텔로미어가 평활 말단인 경우 서열의 손실을 초래할 것이다(Watson, Nature New Biol., 239:197[1972]; Olovnikov, J. Theor. Biol., 41:181[1973]. 그러나, 알려진 텔로미어는 3' 여분 서열(overhangs)을 가진다(Klobutcher 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 58:3015[1981]; Henderson and Blackburn, Mol. Cell. Biol., 9:345[1989]; and Wellinger 등, Cell 72:51[1993]). 이들 분자의 경우, 지체 가닥 5'-말단 RNA 프라이머의 제거는 이쪽 분자상의 서열의 손실 없이 3' 여분 서열을 재생할 수 있다. 그러나, 주도 가닥(leading strand) 말단상의 서열 정보의 손실은 3' 여분서열의 합성에서 주형으로서 작용하는 상보 가닥의 부족으로 인해 발생한다(Zahler and Prescott, Nucleic Acids Res., 16:6953[1988]; Linger 등, Science 269:1533[1995]).
그럼에도 불구하고, 염색체는 완전히 복제되어야 한다. 통상의 DNA 폴리머라제가 염색체 DNA 말단을 정확히 재생할 수 없는 반면에, 그 완전한 복제를 보장하기 위한 특별한 인자가 존재한다. 텔로머라제가 이 과정의 중요 성분이다. 텔로머라제는 리보뉴클레오단백질(RNP) 입자 및 텔로미어 반복 DNA 합성용 주형으로서 그 내부의 RNA 부분의 일부를 사용하는 폴리머라제이다(미국 특허 제5,583,016호; Yu 등, Nature 344:126[1990]; Singer and Gottschling, Science 266:404[1994]; Autexier and Greider, Genes Develop., 8:563[1994]; Gilley 등, Genes Develop., 9:2214[1995]; McEachern and Blackburn, Nature 367:403[1995]; Blackburn, Ann. Rev. Biochem., 61:113[1992]; Greider, Ann. Rev. Biochem., 65:337[1996]). 상기 효소의 활성은 텔로미어 DNA의 합성의 주형으로서 RNA(즉, DNA에 반대되는)를 사용한 말단 복제에 의해 제시되는 문제점을 피하기 위해 그 RNA 및 단백질 성분에 의해 좌우된다. 텔로머라제는 텔로미어 DNA의 G 가닥을 연장시킨다. 텔로머라제 처리능, 개개 텔로미어에서의 작용 빈도수 및 텔로미어 DNA의 분해 속도를 포함하는 인자의 조합이 텔로미어의 크기(즉, 텔로미어가 길어지거나, 짧아지거나 또는 특정 크기로 유지되는 지 여부)에 기여한다. 시험관내에서, 텔로머라제는 처리능이 매우 높을 수 있는데; 테트라히메나 텔로머라제는 효소가 해리되기 전에 평균 대략 500개 염기를 G 가닥 프라이머에 첨가한다(Grieder, Mol. Cell. Biol., 114572[1991]).
텔로미어 복제는 발생 및 세포 주기 인자의 양자에 의해 조절된다는 것이 중요하다. 텔로미어 복제의 양상은 세포 주기에서 신호로서 작용할 수 있는 것으로 가정되어 왔다. 예를 들면, 특정 DNA 구조 또는 DNA-단백질 복합체 형성은 염색체 복제가 완료되었음을 나타내는 검사점으로서 작용할 수 있다(예컨대, 문헌[Wellinger 등, Mol. Cell. Biol., 13:4057[1993] 참조). 또한, 인간에게서, 텔로머라제 활성은 대부분의 체세포 조직에서는 검출할 수 없지만, 다수의 종양에서는 검출되는 것으로 관찰되었다(상기 미국 특허 제5,583,016호 참조). 따라서, 텔로미어 길이는 생체내 및/또는 시험관내 세포의 복제능을 제한하는 유사분열의 시계로서 작용하는 것으로 생각된다. 당해 분야에서는 정상 세포 뿐만 아니라 비정상 세포(즉, 암세포)에서 텔로미어의 역할 및 그 복제를 연구하기 위한 추가의 방법에 대한 필요성이 존재한다. 텔로머라제 및 그 기능에 대한 이해는 암 치료 또는 노화 방지 과정의 표적으로서의 텔로머라제의 용도에 대한 보다 양호한 수단을 개발하기 위해 필요하다.
본 발명은 신규의 텔로머라제 유전자 및 단백질을 제공하며, 텔로머라제 역전사 효소("TRT": telomerase reverse transcriptase)로 지칭되는 텔로머라제의 촉매성 단백질 성분의 클로닝 방법 및 특성 분석에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 유플로테스 에디큘라투스(Euplotes aediculatus)에서 분리한 텔로머라제, 이 텔로머라제의 두 개의 폴리펩티드 서브유닛(123 kDa 및 43 kDa), 뿐만 아니라, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 기타 효모, 테트라히메나(Tetrahymena), 기타 진균류, 마우스 및 기타 포유류의, 이. 에디큘라투스 텔로머라제 유사체의 폴리펩티드, 핵산 및 그 서열에 관한 것이다.
도 1은 결합 및 치환 용출 단계를 나타내는 텔로머라제의 친화도 정제의 개략도이다.
도 2는 유플로테스 텔로머라제의 정제중에 얻어진 텔로머라제 제제의 노던 블롯의 사진이다.
도 3은 유플로테스 텔로머라제 정제 프로토콜을 통한 텔로머라제 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 유플로테스 텔로머라제의 SDS-PAGE 겔의 사진으로서, 대략 123 kDa 폴리펩티드 및 대략 43 kDa의 이중체의 존재를 나타내는 것이다.
도 5는 유플로테스 텔로머라제의 침강계수를 나타내는 그래프이다.
도 6은 유플로테스 텔로머라제를 포함하는 36% 포름아미드를 사용한 폴리아크릴아미드/우레아 겔의 사진이다.
도 7은 패널 A의 서열번호 43 및 44와 패널 B의 서열번호 45 및 46으로 텔로머라제 RNA 주형의 추정적 배열을 도시한 것이다.
도 8은 보다 약한 노출 레벨에서 나타나는 도6에 도시한 겔의 레인 25-30의 사진이다.
도 9는 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 유플로테스 텔로머라제 유전자의 DNA 서열(서열번호 1)을 도시한 것이다.
도 10은 유플로테스 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 아미노산 서열(서열번호 2)을 도시한 것이다.
도 11은 유플로테스 43 kDa의 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 유전자의 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 12는 유플로테스 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 3개 모두의 개방형 해독틀의 DNA 서열 및 아미노산 서열(서열번호 4-6)을 도시한 것이다.
도 13은 이. 에디큘라투스의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(서열번호 2의 위치 2 내지 1008)과 티. 써모필라의 80 kDa 폴리펩티드(서열번호 52) 사이의 서열 비교 결과를 도시한 것이다.
도 14는 이. 에디큘라투스의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(서열번호 2의 위치 132 내지 1028)과 티. 써모필라의 95 kDa 폴리펩티드(서열번호 54) 사이의 서열 비교 결과를 도시한 것이다.
도 15는 이. 에디큘라투스의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(서열번호 9)의 "La-도메인"의 일부와 티. 써모필라의 95 kDa 폴리펩티드(서열번호 12)의 일부 사이의 서열 비교 결과를 도시한 것이다.
도 16은 이. 에디큘라투스의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(서열번호 11)의 "La-도메인"의 일부와 티. 써모필라의 80 kDa 폴리펩티드(서열번호 12)의 일부 사이의 서열 비교 결과를 도시한 것이다.
도 17은 이. 에디큘라투스의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(서열번호 13및 18)의 폴리머라제 도메인 및 다양한 역전사 효소(RT)(서열번호 14-17 및 19-22)의 폴리머라제 도메인의 배열 및 모티프를 도시한 것이다.
도 18은 다양한 La 단백질(서열번호 24-27)을 가진 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛(서열번호 23)의 도메인의 배열을 도시한 것이다.
도 19는 티. 써모필라 80 kDa 폴리펩티드(서열번호 51)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 20은 티. 써모필라 80 kDa 폴리펩티드(서열번호 52)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 21은 티. 써모필라 95 kDa 폴리펩티드(서열번호 53)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 22는 티. 써모필라 95 kDa 폴리펩티드(서열번호 54)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 23은 L8543.12("Est2p")(사카로마이세스 세레비제)의 아미노산 서열(서열번호 55)을 도시한 것이다.
도 24는 유플로테스 TRT 서열(서열번호 59)을 가진 옥시트리차 PCR 생성물(서열번호 58)에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 배열을 도시한 것이다.
도 25는 tez1 스키조사카로마이세스 폼베(에스. 폼베) 서열(서열번호 63), 에스. 세레비제 Est2p(서열번호 64) 및 유플로테스 p123(서열번호 65) 아미노산 서열의 부분을 가진 hTRT 아미노산 모티프(서열번호 61)의 배열을 도시한 것이다.
도 26은 에스. 세레비제 Est2의 DNA 서열(서열번호 66)을 도시한 것이다.
도 27은 도 28의 핵산 서열(서열번호 62)이 암호화하는 아미노산 서열(서열번호 67)을 도시한 것이다.
도 28은 도 25에 나타낸 서열(서열번호 61)과 같은 도 27의 서열번호 67의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열(서열번호 62)를 도시한 것이다.
도 29는 스키조사카로마이세스 tez1의 아미노산 서열(서열번호 68)을 도시한 것이다.
도 30은 스키조사카로마이세스 tez1("Sp_Trt1p")의 DNA 서열(서열번호 69)을 도시한 것이다.
도 31은 에스. 세레비제 EST2p(서열번호 83), 유플로테스(서열번호 84) 및 테트라히메나(서열번호 85) 아미노산 서열 뿐만 아니라 일치 서열의 배열을 도시한 것이다.
도 32는 항-TRT 항체의 생산에 유용한 펩티드의 서열을 도시한 것이다.
도 33은 에스. 폼베 tez1+서열 결정 실험을 개략적으로 요약한 것이다.
도 34는 이. 에디큘라투스 p123 서열의 에스. 폼베 유사체를 동정하는데 사용된 두 개의 축퇴성 PCR 프라이머를 도시한 것이다.
도 35는 도 34에 도시한 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR로 생산한 4개의 주요 밴드를 도시한 것이다.
도 36은 이. 에디큘라투스 p123, 에스. 세레비제 및 옥시트리차(서열번호 58 TRT 단백질 서열을 가진 M2 PCR 생성물이 암호화하는 아미노산 서열의 배열을 도시한 것이다.
도 37은 에스. 폼베 TRT 서열을 얻기 위한 3' RT PCR 방법을 도시하는 개략도이다.
도 38은 에스. 폼베 텔로머라제 단백질 서열에 대한 라이브러리를 검색한 결과 및 그 라이브러리를 도시한 것이다.
도 39는 에스. 폼베 텔로머라제 서열을 포함하는 HindIII 처리한 양성 게놈 클론으로 얻은 결과를 도시한 것이다.
도 40은 에스. 폼베 TRT 서열을 얻기 위한 5' RT PCR 방법을 도시하는 개략도이다.
도 41은 텔로머라제 촉매성 서브유닛에서 유래한 RT 도메인의 배열을 도시한 것이다.
도 42는 3개의 텔로머라제 서열의 배열을 도시한 것이다.
도 43은 에스. 폼베에서 텔로머라제 유전자를 분리하는데 사용된 분리 (disruption) 방법을 도시한 것이다.
도 44는 스키조사카로마이세스 폼베 tez1의 분리를 확인하는 실험 결과를 도시한 것이다.
도 45는 tez1 분리로 인한 에스. 폼베의 텔로머라제의 점진적인 단축 과정을 도시한 것이다.
도 46은 나타낸 암호 영역과 함께 tez1의 DNA(서열번호 69) 및 아미노산(서열번호 68) 서열을 도시한 것이다.
도 47은 젠뱅크 #AA281296 EST(서열번호 121)을 포함하는 클론 712562(서열번호 122)의 EcoRI-NotI 삽입체로부터 유래한, 대략 63 kDa 텔로머라제 단백질 또는 그 단편에 대한 개방형 해독틀(ORF)의 DNA(서열번호 100) 및 암호화된 아미노산(서열번호 101)을 도시한 것이다.
도 48은 다양한 출처에서 유래한 역전사 효소 모티프의 배열을 도시한 것이다.
도 49는 플라스미드 pGRN121(ATCC 수탁번호 #209016)의 제한 지도 및 기능 지도를 제시한 것이다.
도 50은 hTRT(서열번호 113)의 예비 핵산 서열 분석의 결과를 제시한 것이다.
도 51은 hTRT의 예비 핵산(서열번호 113) 및 추론된 ORF 서열(서열번호 114-116)을 제시한 것이다.
도 52는 플라스미드 pGRN121의 정리된 제한 지도 및 기능 지도를 제시한 것이다.
도 53은 hTRT의 핵산(서열번호 117) 및 추론된 ORF 서열(서열번호 118)을 제시한 것이다.
도 54는 람다 클론 25-1.1(ATCC 수탁번호 #209024)의 제한 지도를 제시한 것이다.
도 55는 TRT 종류의 여러 종에서 유래한 TRT 서열을 가진 TRT 일치 서열, 즉 모티프("TRT con")의 다중 서열 배열을 도시한 것인데, 여기서, TRT 종류의 예로는 에스. 폼베 Trt1("Sp_Trt1p"), 인간 TRT("hTRT"), 유플로테스 p123("EA_p123) 및 사카로마이세스 세레비제 Eat2p("Sc_Estp")가 있다. 도 55는 또한 역전사 효소 일치 서열, 즉 RT 모티프("RT con") 및 기타 RT 모티프를 포함하는 단백질에서 유래한 일치 서열의 다중 서열 배열을 도시한 것인데, 이 때, 상기 기타 RT 모티프를 포함하는 단백질의 예로는 에스. 세레비제 미토콘드리아에서 유래한 시토크롬 옥시다제 II군 인트론 1이 암호화하는 단백질인 "Sc_al", 봄빅스 모리(Bombyx mori) R1 비-LTR 역전위 가능한 요소에서 유래한 역전사 효소인 "Bm_R1" 및 HIV-1에서 유래한 역전사 효소가 있다.
도 56은 hTRT와 함께 마우스의 텔로머라제 역전사 효소 단백질(mTRT)의 배열을 도시한 것이다.
도 57은 hTRT, 에스. 폼베 Trt1("spTRT"), 유플로테스 p123("eaTRT") 및 에스. 세레비제 EST2p TRT 서열("sc_Est2")의 배열 및 비교를 도시한 것이다. 도 57은 또한 TRT 일치 서열, 즉 보존된 TRT 모티프 서열("TRT con")들을 상기 서열과 비교한 결과를 도시한 것으로서, 도 57A에서는 "텔로머라제 특이 모티프"로 명명된 모티프, 도 57B에서는 "텔로머라제 RT 모티프(손가락)" 및 도 57C에서는 "텔로머라제 RT 모티프(손바닥, 프라이머 그립)"을 비교한 것이다.
도 58은 hTRT의 예비 핵산 및 아미노산 서열 분석(각각 서열번호 119 및 120으로 지정)을 도시한 것이다.
도 59는 클론 #712562의 TRT cDNA(서열번호 122) 및 추론된 해독 생성물(서열번호 123)의 완전 서열 분석 결과를 도시한 것이다.
도 60은 mTRT cDNA의 핵산 서열을 도시한 것이다.
<발명의 개요>
본 발명은 TRT 효소 및 텔로머라제 효소 복합체 종류의 클로닝, 특성 분석, 합성, 정제 및 재조합 발현 방법을 최초로 제공하는 것이며, 또한 최초로 중요한 인간 텔로머라제 역전사 효소 단백질(hTRT) 뿐만 아니라 그러한 상당한 성과를 이행하는 신규의 방법 및 시약을 제공한다.
본 발명은 텔로머라제의 조성물 및 정제 방법과 텔로머라제의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 텔로머라제 및 유플로테스 에디큘라투스 뿐만 아니라 기타 유기체(예컨대, 스키조사카로마이세스, 기타 효모, 테트라히메나, 기타 진균류, 마우스 및 기타 포유류)에서 얻은 동시 정제성 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기타 종 및 속의 생물에서 텔로머라제 상동체의 검출 및 동정에 유용한 방법을 제공한다.
본 발명은 텔로머라제 역전사 효소("TRT")로 지칭되는 텔로머라제의 촉매성 단백질 성분의 클로닝 및 특성 분석에 관한 것이다. 한 가지 관점에서, 본 발명은 섬모충류, 진균류 및 척추동물, 특히 포유류에서 유래한 TRT 유전자 및 단백질을 제공한다. 한 가지 중요한 관점에서, 본 발명은 인간의 텔로머라제("hTRT")의 촉매성 단백질 성분의 클로닝 및 특성 분석에 관한 것이다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 TRT 유전자 및 cDNA를 클로닝하기 위한 TRT 폴리뉴클레오티드로부터 생성되거나 또는 유래한 핵산 프로브 및 프라이머; 및 모티프 및 기타 TRT 에피토프를 포함하여 TRT를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하여 신규의 TRT를 동정하고 클로닝하는 시약 및 방법을 제공하며, 여기서, 상기 항체는 TRT 유전자의 발현 클로닝, TRT 폴리펩티드 종류의 동정 및 정제, 및 본원에 개시한 기타 용도로 유용한 것이다.
본 발명은 SDS-PAGE 상에서 측정하여 대략 123 kDa(서열번호 2) 및 43 kDa(서열번호 4-6)의 이.에디큘라투스의 지금까지 미지의 텔로머라제 TRT 서브유닛 단백질을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 실질적으로 정제된 이.에디큘라투스의 123 kDa 및 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 제공한다.
본 발명의 한 가지 관점은 텔로머라제 서브유닛(즉, 이.에디큘라투스 123 kDa 및 43 kDa 단백질 서브유닛)을 암호화하는 분리되고 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 구체적인 관점에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 이.에디큘라투스의 뉴클레오티드 서열(123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 이.에디큘라투스 텔로머라제 유전자의 DNA 서열) 또는 그 변형체이다. 또 다른 양태로, 본 발명은 길이 10개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 이.에디큘라투스 텔로머라제 123 kDa 서브유닛을 암호화하는 분리된(즉, 실질적으로 정제된) 폴리뉴클레오티드의 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 길이가 뉴클레오티드 6개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 100개 이상, 250개 이상 및 500개 이상인 상기 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 서열번호 1)의 단편을 포함한다. 또한, 본 발명은 엄중 조건하에 서열번호 1의 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 단편을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 서열번호 1의 핵산의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체를 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 3의 서열(이. 에디큘라투스의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 유전자의 DNA 서열)을 가진 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체를 제공한다. 한 가지 양태로, 본 발명은 아미노산 길이가 10개 이상인 이. 에디큘라투스 텔로머라제 43 kDa 서브유닛을 암호화하는 분리된(즉, 실질적으로 정제된) 폴리뉴클레오티드의 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 4-6의 이. 에디큘라투스 폴리펩티드(이. 에디큘라투스 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 3개 모두의 개방형 해독틀의 아미노산 서열)를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체를 제공한다. 본 발명은 또한 길이가 뉴클레오티드 5개 이상, 20개 이상, 100개 이상, 250개 이상 및 500개 이상인 상기 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 서열번호 3)의 단편을 포함한다. 또한, 본 발명은 엄중 조건하에 서열번호 3의 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 단편을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 서열번호 3의 핵산의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체를 포함한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열(123 kDa의 이. 에디큘라투스 텔로머라제 TRT 서브유닛)의 적어도 일부를 포함하는 실질적으로 정제된 이. 에디큘라투스 폴리펩티드 또는 그 변형체를 제공한다. 한 가지 양태로, 폴리펩티드 서열의 일부는 길이가 아미노산 10개를 넘는 서열번호 2의 단편을 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 다양한 길이의 폴리펩티드 서열로, 아미노산 5 내지 500개 범위의 서열번호 2의 서열내에 포함되는 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 서열번호 2의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체를 제공한다.
본 발명은 서열번호 4-6(이. 에디큘라투스 43 kDa의 텔로머라제 단백질 서브유닛의 개방형 해독틀)로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 적어도 일부 또는 그 변형체를 포함하는 실질적으로 정제된 이. 에디큘라투스 폴리펩티드를 제공한다. 한 가지 양태로, 폴리펩티드 서열의 일부는 길이가 아미노산 10개를 넘는 서열번호 4의 단편을 포함한다. 또 하나의 양태로, 폴리펩티드 서열의 일부는 길이가 아미노산 10개를 넘는 서열번호 5의 단편을 포함한다. 한 가지 또 다른 양태로, 폴리펩티드 서열의 일부는 길이가 아미노산 10개를 넘는 서열번호 6의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 다양한 길이의 폴리펩티드 서열로, 아미노산 5 내지 500개 범위의 서열번호 4, 5 및/또는 6의 서열(서열번호 4-6에 나타낸 유플로테스 에디큘라투스 43 kDa 폴리펩티드 개방형 해독틀)내에 포함되는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 정제된 재조합 이. 에디큘라투스 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛, 하나 이상의 정제된 재조합 이. 에디큘라투스 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 정제된 재조합 RNA로 이루어진 텔로머라제 복합체를 제공한다. 바람직한 양태로, 텔로머라제 복합체는 하나의 정제된 재조합 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛, 하나의 정제된 재조합 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 정제된 재조합 텔로머라제 RNA를 포함한다. 한 가지 바람직한 양태로, 텔로머라제 복합체는 유플로테스 에디큘라투스로부터 얻은 123 kDa 및/또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 포함한다. 이. 에디큘라투스 텔로머라제 복합체의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛은 서열번호 1에 의해 암호화될 수 있다. 또한 텔로머라제 복합체의 123 kDa 이. 에디큘라투스 텔로머라제 단백질 서브유닛은 서열번호 2에 나타낸 아미노산으로 이루어진다. 텔로머라제 복합체의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛은 이. 에디큘라투스로부터 정제하여 얻을 수 있다. 또한 텔로머라제 복합체의 43 kDa 텔로머라제 서브유닛은 서열번호 3에 의해 암호화될 수 있다. 텔로머라제 복합체의 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛은 서열번호 4-6으로 구성된 군에서 선택되는 서열의 아미노산으로 구성된다. 텔로머라제 복합체의 정제된 RNA는 Linger 등의 문헌[Linger 등, Genes Develop., 8:1985(1994)]에 개시된 것들과 같은 서열에 의해 암호화되는 RNA로 이루어진다. 바람직한 양태로, 텔로머라제 복합체는 텔로미어 DNA를 복제할 수 있다.
본 발명은 또한 이. 에디큘라투스 이외의 진핵 생물에서 TRT의 종류 및 텔로머라제 단백질 서브유닛을 동정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 다단계로 이루어져 있다. 제1 단계는 서열번호 2, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열에 대한 암호 서열의 일부와 같이 공지의 TRT 암호 서열의 적어도 일부를 암호화하는(그와 동일하거나 상보적인) 하나 이상의 프로브 또는 프라이머의 합성이다. 또 다른 경우로, 합성된 프로브 또는 프라이머 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열에 대한 이. 에디큘라투스 암호 서열의 적어도 일부와 상보적이다. 다음 단계는 핵산 하이브리드의 형성에 적합한 조건하에 게놈에서 유래한 핵산 또는 다른 경우에는 기타 생물(즉, 비 이. 에디큘라투스 생물)의 게놈의 발현된 부분에 하나 이상의 프로브 또는 프라이머 올리고뉴클레오티드(들)를 노출시키는 단계이다. 다음, 하이브리드는 예컨대, 프로브 표지화에 의해 또는 DNA 폴리머라제(예컨대, Taq 또는 당해 분야에 공지된 임의의 기타 적합한 폴리머라제)를 사용하여 증폭시키거나 또는 증폭시키지 않고 동정된다. 마지막으로, 하이브리드의 서열은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 측정하고, 유래된 아미노산 서열중의 서열은 서열번호 2, 4, 5 또는 6에 대한 그 유사성으로 분석한다.
본 발명은 또한 진핵 생물에서 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열의 종류중 임의의 멤버를 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 진핵 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 핵산을 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 제공하는 단계; 그 샘플을 공지된 TRT의 적어도 하나의 영역, 예컨대, 유플로테스 에디큘라투스 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 폴리머라제를 암호화하는 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 진핵 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열이 프라이머 연장 과정에 의해 증폭되도록 하는 조건하에 항온 처리하는 단계; 진핵 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열을 결정하는 단계; 및 진핵 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 유플로테스 에디큘라투스 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열을 비교하는 단계를 포함한다. 한 가지 바람직한 양태로, 유플로테스 에디큘라투스 텔로머라제 서브유닛은 서열번호 1의 적어도 일부를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태로, 유플로테스 에디큘라투스 텔로머라제 서브유닛은 서열번호 3의 적어도 일부를 포함한다.
따라서, 본 발명은 이. 에디큘라투스 이외의 진핵 생물에서 텔로머라제 단백질 서브유닛의 동정 방법을 제공한다. 본 발명은 서열번호 2, 4, 5 또는 6의 유플로테스 에디큘라투스 아미노산 서열 및 기타 생물의 유전자 서열에서 유래하거나 또는 단백질의 직접 아미노산 분석에 의해 얻어진 아미노산 서열을 비교할 수 있게 한다. 서열번호 2, 4, 5 또는 6에 대해 최대의 동일성(즉, 상동성)을 가진 것으로 나타난 아미노산 서열을 추가의 시험에 선택할 수 있다. 특히 중요한 서열은 역전사 효소(RT) 또는 유플로테스 서열의 기타 모티프와 동일성을 공유하는 서열들이다. 일단 동정되면, 최대의 동일성을 나타내는 서열을 가진 단백질은 하기 실시예들에서 제시된 방법을 포함하여 유전적 또는 생화학적 방법으로 텔로머라제 활성에서의 그 역할에 대해 시험할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 TRT 종류의 정제 방법을 제공하는데, 이 방법은 친화도 올리고뉴클레오티드가 텔로머라제에 결합하여 텔로머라제-올리고뉴클레오티드 복합체를 형성하는 조건하에 친화도 올리고뉴클레오티드에 샘플을 노출시키는 단계; 및 텔로머라제가 주형으로부터 방출되도록 하는 조건하에 치환 올리고뉴클레오티드에 올리고뉴클레오티드-텔로머라제 복합체를 노출시키는 단계를 포함한다. 바람직한 양태로, 본 방법은 텔로머라제를 용출시키는 추가의 단계를 포함한다. 또 하나의 바람직한 양태에서는, 친화도 올리고뉴클레오티드는 안티센스 부분 및 비오틴 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서는, 노출 단계 중에 친화도 올리고뉴클레오티드상의 비오틴 잔기가 아비딘 비드에 결합하고 안티센스 부분은 텔로머라제에 결합한다. 노출 단계중에, 치환 올리고뉴클레오티드가 친화도 올리고뉴클레오티드에 결합하기도 한다.
본 발명은 또한 서열번호 58(옥시트리차), 61(인간의 텔로머라제 모티프), 63(스키조사카로마이세스 폼베), 64(에스. 세레비제), 65(유플로테스 에디큘라투스), 67(인간의 텔로머라제 모티프) 및 68(스키조사카로마이세스)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 또 하나의 양태로, 본 발명은 또한 서열번호 58, 61, 63, 64, 65, 67 및 68의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 정제되고 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드가 서열번호 58, 61, 63, 64, 65, 67 및 68의 다양한 길이의 부분 또는 단편을 암호화하는 서열의 임의의 부분을 암호화(또는 그 부분과 동일하거나 상보적임)할 수 있다는 것을 고려한 것이다. 한 가지 양태로, 폴리펩티드의 부분은 아미노산 약 5개, 10개를 넘는 길이의 단편을 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 다양한 길이의 서열로 암호화되는 폴리펩티드, 즉 그 서열이 아미노산 5개 내지 500개 범위(적절하게는 서열번호 58, 61, 63, 64, 65, 67 및 68의 길이를 기준)의 서열번호 58, 61, 63, 64, 65, 67 및 68의 서열에 포함되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 55(에스. 세레비제), 62(인간의 텔로머라제 모티프), 66(에스. 세레비제) 및 69(스키조사카로마이세스)의 서열과 동일하거나 상보적인 또는 그 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 그 변형체를 포함한다. 본 발명은 또한 길이가 뉴클레오티드 6개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 250개 이상 및 500개 이상(적절하게는 서열번호 55, 62, 66 및 69의 서열 또는 그 변형체의 길이 및 의도된 용도의 길이)인 분리된 폴리뉴클레오티드 서열의 단편을 제공한다.
특히 바람직한 양태로, 폴리뉴클레오티드는 TRT 텔로머라제 서열의 종류의 개개의 종에 특이적으로 하이브리드화하는데, 여기서, 텔로머라제 서열은 포유류(즉, 인간, 마우스), 유플로테스 에디큘라투스, 옥시트리차, 스키조사카로마이세스 및 사카로마이세스 텔로머라제 서열로 구성되는 군에서 선택된다. 기타 바람직한 양태로, 본 발명은 서열번호 55, 62, 66 및 69로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열을 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체를 제공한다. 또 다른 바람직한 양태로, 본 발명은 서열번호 55, 62, 66 및 69로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산 서열에 엄중 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 또 다른 양태로, 폴리뉴클레오티드 서열은 길이가 뉴클레오티드 약 10개 내지 30개인 정제된 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 양태로, 본 발명은 서열번호 113 및 117(인간)과 그 상보 서열을 포함하는 인간 텔로머라제인 hTRT에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 길이가 뉴클레오티드 5개 이상, 20개 이상, 100개 이상, 250개 이상 및 500개 이상인 상기 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 서열번호 113 및 117)의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 길이가 뉴클레오티드 5개 이상, 20개 이상, 100개 이상, 250개 이상 및 500개 이상인 상기 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 서열번호 113 및 117)의 상보 가닥의 단편을 포함한다. 또한, 본 발명은 엄중 조건하에 서열번호 113 및 117의 서열 및/또는 그 단편 및/또는 그 상보 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 본 발명은 서열번호 113 및 117의 핵산의 상보 가닥을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체를 포함한다. 또 다른 양태로, 폴리뉴클레오티드 서열은 길이가 뉴클레오티드 약 10개 내지 30개인 서열번호 113 및/또는 117의 단편에 상응하는 정제된 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 플라스미드 pGRN121(ATCC 수탁번호 #209016) 및 람다 클론 25-1.1(ATCC 수탁번호 #209024) 및 GM5(ATCC 수탁번호 #98505)를 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 114-116 및 118(인간)의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 hTRT 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태로, 본 발명은 또한 서열번호 114-116 및 118의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 정제되고 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 다양한 길이의 서열번호 114-116 및 18의 부분 또는 단편을 포함한다. 하나의 양태로, 폴리펩티드의 부분은 길이가 아미노산 10개를 넘는 단편을 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 다양한 길이의 폴리펩티드 서열을 포함하는데, 이 서열은 아미노산 5개 내지 1100개 범위(적절하게는 서열번호 114-116 및 118의 길이를 기준)의 서열번호 114-116 및 118의 서열에 포함된다.
본 발명은 생물학적 샘플에서 TRT의 적어도 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 TRT의 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 서열번호 1(유플로테스), 3(유플로테스), 53(테트라히메나), 62(인간), 66(에스. 세레비제), 69(스키조사카로마이세스), 117(인간)에 제시된 서열에 상응하는 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 핵산과 뉴클레오티드 사이에 하이브리드 복합체가 형성되도록 하는 조건하에 생물학적 샘플을 뉴클레오티드와 배합하는 단계; 및 하이브리드화 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 한 가지 양태에서, TRT의 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 서열번호 1, 3, 53, 62, 66, 69, 117에 제시된 서열에 상응하는 핵산은 리보핵산인 반면에, 또 다른 양태에서는 뉴클레오티드 서열이 데옥시리보핵산이다. 상기 방법의 또 다른 양태에서는, 검출된 하이브리드 복합체가 생물학적 샘플에서 TRT의 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 서열번호 1, 3, 53, 62, 66, 69, 117에 제시된 서열의 발현과 상관 관계가 있다. 상기 방법의 또 하나의 양태에서는, 하이브리드 복합체의 검출은 생물학적 샘플에서 TRT 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열번호 1, 3, 53, 62, 66, 69, 117에 제시된 서열과 비교하여, 변이를 가진 핵산을 검출할 수 있는 조건을 포함한다.
본 발명은 또한 TRT 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 서열번호 1, 3, 55, 62, 66, 69, 117에 제시된 서열의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 분자를 제공한다. 또 다른 바람직한 양태로, 본 발명은 서열번호 1, 3, 55, 62, 66, 69, 117의 안티센스 분자 및 약학적 허용 부형제 및/또는 기타 화합물(예컨대, 보조제)를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로, 본 발명은 재조합 발현 벡터에 포함된 TRT 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 하나의 양태로, TRT 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 숙주 세포내에 포함된다.
본 발명은 또한 서열번호 2(유플로테스), 4-6(유플로테스), 52(테트라히메나), 58(옥시트리차), 61(인간), 63(스키조사카로마이세스), 64(에스. 세레비제), 65(유플로테스), 67(인간), 68(스키조사카로마이세스) 또는 118(인간)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 TRT 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 TRT 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 숙주 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수 또는 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 TRT 종류의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67, 68 및/또는 118에 나타낸 바와 같은 서열의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 제공한다. 한 가지 양태로, 본 발명은 1종 이상의 항체 및 약학적 허용 부형제를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서 TRT를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 인간 텔로머라제 단백질 및 TRT의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 2, 4-6, 52, 55, 61, 63, 64, 65, 67, 68 및/또는 118에 나타낸 바와 같은 서열의 적어도 일부에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체를 발현시키는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 항체:단백질 복합체가 형성되도록 하는 조건하에 생물학적 샘플과 항체(들)을 배합하는 단계; 및 상기 복합체의 존재가 생물학적 샘플에서의 단백질의 발현과 상관 관계가 있는 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 TRT 종류의 실질적으로 정제된 펩티드, 예컨대, 서열번호 71, 73, 75, 77, 79, 82(모든 테트라히메나), 83(에스. 세레비제), 84(유플로테스), 85(테트라히메나), 86 및 101(인간)로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 모든 또는 부분을 포함하는 펩티드를 제공한다. 또 따른 양태로, 본 발명은 상기 서열들에 상응하는 폴리펩티드를 암호화하는 정제되고 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 TRT 서열에 특이적으로 하이브리드화하는데, 여기서, TRT 서열은 포유류(예컨대, 인간, 마우스), 유플로테스 에디큘라투스, 옥시트리차, 스키조사카로마이세스, 사카로마이세스 및 테트라히메나 서열로 구성된 군에서 선택되는 서열이다. 또 다른 양태로, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 70, 72, 74, 76, 78, 80, 81(모두 테트라히메나), 100(hTRT), 113(hTRT), 117(hTRT)로 구성되는 군에서 선택되는 핵산 서열의 상보 가닥 또는 그 변형체를 포함한다. 또 다른 양태로, 폴리뉴클레오티드 서열은 엄중 조건하에 서열번호 66(에스. 세레비제), 69(스키조사카로마이세스), 80(테트라히메나) 및 81(테트라히메나)로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 하이브리드화하는 서열을 포함한다. 또 하나의 양태로, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 70, 72, 74, 76, 78(모두 테트라히메나); 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99(모두 hTRT); 102, 103, 104, 105, 106(모두 에스. 폼베); 107(Adapt SfiI), 108(Adapt SfiII), 109(에스. 폼베), 110(에스. 폼베), 111(테트라히메나), 113(hTRT) 및 117(hTRT)로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 양태로, 뉴클레오티드 서열은 길이가 뉴클레오티드 10개 내지 50개인 정제된 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서 TRT의 적어도 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 TRT의 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 서열번호 100 및/또는 서열번호 113 및/또는 서열번호 117에 나타낸 서열에 상응하는 핵산; 서열번호 100 및/또는 서열번호 113 및/또는 서열번호 117의 뉴클레오티드 또는 그 단편을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 핵산과 뉴클레오티드 사이에 하이브리드 복합체가 형성되도록 하는 조건하에 생물학적 샘플을 뉴클레오티드와 배합하는 단계; 및 하이브리드 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일 양태에서, 서열번호 100 및/또는 서열번호 113 및/또는 서열번호 117의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 TRT 핵산은 리보핵산인 반면에, 또 다른 양태에서는 뉴클레오티드 서열이 데옥시리보핵산이다. 상기 방법의 또 다른 양태에서는, 검출된 하이브리드 복합체가 생물학적 샘플에서 서열번호 100 및/또는 서열번호 113 및/또는 서열번호 117의 폴리뉴클레오티드의 발현과 상관 관계가 있다. 상기 방법의 또 하나의 양태에서는, 하이브리드 복합체의 검출은 생물학적 샘플에서 서열번호 100 및/또는 서열번호 113 및/또는 서열번호 117에 제시된 서열과 비교하여, 핵산내 변이의 검출을 허용하는 조건하에 항온 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 TRT의 뉴클레오티드, 예컨대, 서열번호 82(테트라히메나), 100, 113 및 117(모두 hTRT)에 제시된 서열의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 분자를 제공한다. 또 다른 바람직한 양태로, 본 발명은 서열번호 82, 100, 113, 117의 안티센스 분자 및 약학적 허용 부형제 및/또는 기타 화합물(예컨대, 보조제)를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로, 본 발명은 재조합 발현 벡터에 포함된 TRT 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 하나의 양태로, TRT 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 숙주 세포내에 포함된다.
본 발명은 또한 서열번호 82, 83, 84, 85, 86, 101, 114, 115, 116 및/또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 TRT 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 숙주 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수 또는 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 예컨대, 서열번호 2, 2-4, 71, 73, 75, 77, 79, 82, 83, 84, 85, 86, 101, 114, 115, 116 및/또는 118의 TRT 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 TRT 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 제공한다. 한 가지 양태로, 본 발명은 1종 이상의 항체 및 약학적 허용 부형제를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서 TRT를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 TRT 단백질 및 TRT의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 71, 73, 75, 77, 79, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 101, 114, 115, 116 및/또는 118의 서열의 적어도 일부에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체를 발현시키는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 항체:단백질 복합체가 형성되도록 하는 조건하에 생물학적 샘플과 항체(들)을 배합하는 단계; 및 상기 복합체의 존재가 생물학적 샘플에서의 단백질의 발현과 상관 관계가 있는 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 TRT, 텔로미어 반복 DNA 합성용 주형으로서 사용되는 텔로머라제 관련 핵산 부분 및 선택적으로 기타 텔로머라제 효소 복합체 관련 단백질, 예컨대, 효소 활성을 조절하는 동시 정제 단백질 및 기타 단백질로 이루어진 정제된 텔로머라제 복합체를 제공한다. 하나의 양태에서, 텔로머라제 효소 복합체는 인간에서 유래한 성분, 예컨대, 인간 텔로머라제 효소(서열번호 117의 cDNA에 의해 암호화된 hTRT를 포함), 인간 텔로머라제 RNA(hTR) 부분 및 텔로머라제 관련 단백질로 구성된다. 하나의 양태에서, 복합체는 서열번호 117의 cDNA가 암호화하는 서열번호 118의 서열을 가진 약 127 kd의 hTRT 단백질을 포함한다.
본 발명은 또한 한 가지 이상의 관점에서 시약 및 방법으로서 이용될 수 있는 텔로머라제 및 텔로머라제 관련 화합물을 발현시키고 분리하는 다수의 상이한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법 및 시약은 세포내 상동성 유전자를 무력화하는데 사용될 수 있는 TRT 유전자 및 서열을 제공한다. 따라서, 본 발명의 신규의 시약 및 방법은 TRT 무력화(knockout) 세포 및 동물과 그러한 세포 및 돌연변이 포유류의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 한 가지 측면은 길이가 뉴클레오티드 10개 이상 내지 약 10kb 또는 그 이상이고, 자연 발생적 TRT 유전자 또는 TRT mRNA내 인접 서열과 동일하거나 정확히 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드의 인접 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를, TRT 유전자 서열 또는 TRT mRNA에 대한 분석 또는 검색에 또는 재조합 숙주 세포의 제조에 사용하는 용도이다.
본 발명의 추가의 측면은 TRT의 발현을 증가시키는 작용제를, 척추동물 세포의 증식능을 증가시키는 것을 목표로 하는 상태의 치료용 약제의 제조에, 선택적으로는 노화 효과의 저해에 사용하는 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 텔로머라제 활성의 저해제를, 인간 세포내 텔로머라제 활성의 증가된 레벨과 관련된 상태의 치료용 약제의 제조에 사용하는 용도이다.
본 발명의 단백질, 변형체 및 단편과 암호 폴리뉴클레오티드 또는 단편 역시 각각 본 발명의 추가의 측면에서 약제로서의 용도로 제공된다.
본 발명은 또한 본원에서 정의한 각각의 경우에 단백질, 변형체 또는 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 단편을 약제의 제조에, 예컨대, 노화 또는 암의 효과를 저해하는 약제의 제조에 사용하는 용도를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, TRT 폴리펩티드는 AA281296(서열번호 121)의 389개 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 및/또는 클론 712562 이외의 것인데, 여기서, 클론 712562는 삽입체를 포함하는 플라스미드로서 그 삽입체가 도 58의 서열번호 122에 나타낸 서열을 가진 것이다.
본 발명은 또한 본원에서 정의한 각각의 경우에 단백질, 변형체 또는 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 단편을 약제의 제조에, 예컨대, 노화 또는 암의 효과를 저해하는 약제의 제조에 사용하는 용도를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 (a) 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67, 68 또는 117에 제시한 서열을 가진 DNA; (b) hTRT 단백질 또는 변형체를 암호화하는 상기 DNA에 하이브리드화하거나 또는 그러한 변형체에 대한 암호 서열에 하이브리드화하는 10개 이상의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 상기 (a) 및 (b)에 정의한 DNA 서열에 대한 유전자 암호의 결과로서 축퇴성이고, hTRT 폴리펩티드 또는 변형체를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드이다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명은 유력한 뉴클레아제 활성을 비롯하여 텔로머라제의 활성의 조사에 유용한 정제된 텔로머라제 제제 및 텔로머라제 단백질 서브유닛을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 유플로테스 에디큘라투스에서 얻은 텔로머라제 및 동시 정제되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 하모성 섬모충류가 본 발명에 사용하기 위해 선택되었는데, 그 이유는 매우 다수의 유전자 크기의 DNA 분자가 그 다배체 거대핵에 존재함으로 인해 상기 섬모충류가 매우 다수의 염색체 말단(Prescott, Microbiol. Rev., 58:233[1994])을 포함하기 때문이다. 테트라히메나는 텔로머라제 및 텔로미어에 관한 종래의 연구에서 통상 사용된 전모성 섬모충류로서, 식물이 포유류와 거리가 멀듯이 유플로테스와는 진화론적으로 거리가 멀다(Greenwood 등, J. Mol. Evol., 3:163[1991]).
123 kDa 이. 에디큘라투스 텔로머라제 서브유닛과 L8543.12 서열(서열번호 55)(즉, 사카로마이세스 세레비제의 Est2; 문헌[Lendvay 등, Genetics 144:1399-1412(1996)] 참조) 사이 및 스키조사카로마이세스와 인간의 모티프 사이에서 발견된 상동성은 전체 인간 텔로머라제 분자가 그러한 역전사 효소 모티프를 포함하는 염기성의 큰 단백질을 포함할 것이라는 예측에 대한 강력한 근거를 제시하였다. 다라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다양한 종으로부터 기타 텔로머라제를 동정하는데 유용하다. 본 발명은 유플로테스와 친연 관계가 먼 생물(예컨대, 옥시트리차) 뿐만 아니라, 유플로테스와 친연 관계가 없는 생물(예컨대, 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 마우스, 인간 등)에서 유사한 모티프를 동정하기 위한 방법에 사용하는 123 kDa 역전사 효소 모티프의 용도를 개시한다.
본 발명은 또한 텔로머라제의 특징적 형태의 구조 및 기능의 연구를 위한 추가의 방법을 제공한다. 본 발명의 텔로머라제 단백질은 진단 용도로, 진화적(예컨대, 계통 발생적) 조사용으로 뿐만 아니라, 암 치료 또는 노화 방지를 위한 조성물 및 방법의 개발에 유용할 것으로 생각된다. 본 발명의 텔로머라제 단백질 서브유닛은 자체로도 용도를 갖지만, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 텔로머라제 효소의 RNA 부분과 함께(즉, 완전한 텔로머라제) 사용하면 유용할 것으로 생각된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 추가의 특이적 텔로머라제 구조 및/또는 기능의 발견을 이끌 것으로도 생각된다. 또한, 본 발명은 기능적 텔로머라제 뿐만 아니라 텔로머라제 단백질의 정제를 위한 신규의 방법을 제공한다. 실시예 3에 기재하는 이러한 친화도에 기초한 방법은 두 개의 항-TRT 항체가 본 발명에 의해 제공되기 때문에 기능적으로 활성이 있는 텔로머라제의 정제에 있어서 중요한 측면이다. 이 과정의 주요한 장점은 칼럼 매트릭스에 비특이적으로 결합하는 단백질이 용출되지 않는 부드러운 용출 조건을 사용할 수 있다는 점이다.
텔로머라제는 RNA 성분 및 촉매성 단백질 성분을 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)이다. 본 발명은 "TRT"(텔로머라제 역전사 효소)로 지칭되는 텔로머라제의 촉매성 단백질 성분의 클로닝 및 특성 분석에 관한 것이다. TRT는 텔로미어 DNA 반복 서열을 직접 합성하기 위해 텔로머라제 RNA 성분을 사용하는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(역전사 효소)로서 작용하기 때문에 붙여진 명칭이다. 더욱이, TRT는 기타 역전사 효소와 진화론적으로 친연 관계가 있다.
한 가지 측면에서, 본 발명은 섬모충류, 진균류 및 척추동물, 특히 포유류(예컨대, 인간, "hTRT"로 지칭되는 인간의 텔로머라제 역전사 효소)에서 유래한 TRT 유전자 및 단백질을 제공한다. TRT는 인간(및 기타 포유류 세포)에서의 텔로머라제 활성이 세포 증식능, 세포 불멸성 및 신생물 표현형의 발현과 상관 관계가 있기 때문에 비상한 관심과 가치를 지닌다. 예를 들면, 인간 TRT 유전자 생성물의 텔로머라제 활성 및 레벨은 사멸성 세포(예컨대, 대부분의 인간 체세포)와 비교하여 불멸성 인간 세포(예컨대, 악성 종양 세포 및 불멸성 세포주)에서 증가된다.
본 발명은 한 가지 측면에서는 이. 에디큘라투스 텔로머라제의 단백질 서브유닛의 핵산 및 아미노산 서열 뿐만 아니라, 인간을 비롯한 기타 생물의 텔로머라제의 핵산 및 아미노산 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기능적 텔로머라제의 정제에 관한 것이다. 후술하는 바와 같이, 본 발명은 또한 다양한 생물에서 얻은 재조합 텔로머라제 및 텔로머라제 단백질 서브유닛을 포함하여 다양한 형태의 텔로머라제를 포함한다.
TRT는 섬모충류인 유플로테스 에디큘라투스로부터 텔로머라제를 정제한 후 먼저 특성을 분석하였다. RNA 친화도 크로마토그래피 및 기타 방법을 사용한 이. 에디큘라투스 텔로머라제의 집중적인 정제로부터 단백질 "p123"을 얻었다. 놀랍게도, p123은 텔로머라제 완전효소(holoenzyme)의 단백질 서브유닛(즉, 테트라히메나 써모필라의 p80 및 p95 단백질)을 구성하는 것으로 종래 생각되어 온 단백질과는 무관하다. p123 DNA 및 단백질 서열(젠뱅크 승인 번호 U95964; 도 9 및 10)(서열번호 1 및 서열번호 2)의 분석에 의해 역전사 효소(RT) 모티프는 텔로머라제의 촉매성 서브유닛(예컨대, 도 17, 25, 55, 57 참조)으로서의 p123의 역할과 일치하는 것으로 나타났다. 더욱이, p123은 에스. 세레비제(효모) 단백질인 Est2p와 친연 관계가 있는데, 이 단백질은 에스. 세레비제의 텔로미어(젠뱅크 승인번호 S5396)의 유지에서 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 텔로머라제 촉매성 서브유닛 단백질을 암호화하는 것으로 인식되지는 않고 있다(예컨대, 문헌[Lendvay 등, 1996, Genetics, 144:1399] 참조).
한 가지 측면에서, 본 발명은 본원에 개시한 TRT 폴리뉴클레오티드로부터 생성되거나 유래한 핵산 프로브 및 프라이머(예컨대, TRT 유전자 및 cDNA의 클로닝용); 모티프 또는 모티프 서열이나 기타 TRT 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체(예컨대, TRT 유전자의 발현 클로닝 및 TRT 단백질의 정제용)를 사용하여 검퓨터 데이타베이스를 검색하거나 또는 기타 수단으로 신규의 TRT를 동정하고 클로닝하는 시약 및 방법을 제공한다. 예를 들면, 실시예 16에서 설명하는 바와 같이, 에스. 폼베 DNA의 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 증폭은 유플로테스 p123 RT 모티프 B' 및 C로부터 조작된 축퇴성 서열 프라이머를 사용하여 수행하였다. 생성된 4개의 주요 생성물 중에서, 하나는 유플로테스 p123 및 에스. 세레비제 Est2p와 상동성인 펩티드 서열을 암호화하였다. 이러한 PCR 생성물을 프로브로 사용하여 에스. 폼베 cDNA 및 게놈 라이브러리의 검색 및 역전사 반응 및 PCR(RT-PCR)에 의한 에스. 폼베 RNA의 증폭 반응에 의해 에스. 폼베 TRT 상동체의 완전 서열을 얻었다. 에스. 폼베 유전자("tez1" 또는 "Sp_Trt1p" 또는 "trt1"; 젠뱅크 승인번호 AF015783; 도 69, 도 46)의 완전 서열은 p123과 Est2p의 상동성이 역전사 효소 모티프에서 특히 높다는 것을 나타냈다(도 56, 58 참조).
텔로머라제 RT 모티프에서 유래한 축퇴성 프라이머를 사용한 증폭 반응을 사용하여 각각 실시예 13 및 15에서 설명하는 바와 같이 옥시트리차 트리팔락스(Oxytricha trifallax) 및 테트라히메나 써모필라에서 TRT 유전자 서열을 얻었다.
본 발명의 유플로테스 p123, 에스. 폼베 trt1 및 에스. 세레비제 Est2p 서열은 프로그램 블라스트(BLAST)(Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215:403)를 사용하여 인간에게서 발현되는 서열 표지(EST)의 컴퓨터에 의해 처리된 데이타베이스의 검색에 사용하였다. Est2p 서열을 사용한 상기 데이타베이스의 검색은 일치하는 결과를 나타내지 않았으나, p123 및 trt1 서열을 사용한 검색은 실시예 17에서 설명하는 바와 같이 상동성 단백질을 암호화하는 인간의 EST(젠뱅크 승인번호 AA281296)(서열번호 121)를 동정하였다. EST를 포함하는 cDNA 클론(이하, "클론 712562"라 지칭함; 도 47, 서열번호 122 참조)의 완전한 서열을 분석한 결과, 7개의 RT 모티프가 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, 이 클론은 인접하는 인간의 TRT를 암호화할 수는 없었는데, 왜냐하면, 모티프 B', C, D 및 E는 더 많은 NH2-말단 모티프보다는 상이한 ORF에 포함되었다. 또한, 모티프 A와 B' 사이의 거리는 이미 특성 분석된 3개의 TRT의 거리보다 상당히 더 짧았다.
기능적 hTRT(서열번호 1)를 암호화하는 cDNA 클론 pGRN121(ATCC 승인번호 #209016)은 실시예 17에서 설명하는 바와 같이 인간의 293 세포주로부터 유래한 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 클론 712562를 pGRN121을 비교한 결과, 클론 712562가 모티프 A와 B 사이에 182개의 염기쌍 결실을 가지는 것으로 나타났다. pGRN121에 존재하는 추가의 182개 염기쌍은 단일의 개방 해독틀에 TRT 모티프를 모두 위치시키고, 기타 공지된 TRT와 일치하는 거리로 모티프 A와 모티프 B' 영역 사이의 간격을 증가시킨다. 서열번호 117은 서열번호 118의 서열을 가진 촉매적으로 활성이 있는 텔로머라제 단백질을 암호화한다. 서열번호 118의 폴리펩티드는 1132개 잔기 및 약 127 킬로달톤(kD)의 계산된 분자량을 가진다.
클론 712562의 182개 염기쌍 결실 특성을 보유하는 TRT cDNA는 텔로머라제 양성 세포(예컨대, 고환 및 293 세포)로부터 RNA를 역전사 반응시킨 이후에 검출된다. 상기 182개 염기쌍 서열이 결핍된 hTRT RNA는 "182 변형체"로 일반적으로 지칭되며, 1개, 2개 또는 여러 개의 종을 나타낼 수 있다. pGRN121 cDNA(서열번호 117)에서 발견되는 182개 염기쌍 서열이 결핍된 hTRT 변형체는 완전 활성의 텔로머라제 촉매 효소를 암호화하는 것 같지는 않지만, 이들 변형체는 텔로머라제 조절에서 역할을 할 수 있고/있거나 부분적인 텔로머라제 활성, 예컨대, 텔로미어 결합 또는 hTR 결합 활성을 가질 수 있다.
유플로테스의 123 kDa 및 43 kDa 텔로머라제 서브유닛 단백질 서열
유플로테스 123 및 43 kDa 단백질 서브유닛의 핵산 및 추론된 아미노산 서열은 도 1-6에 도시되어 있다. 본 발명에 따라, 이. 에디큘라투스 텔로머라제 또는 그 서브유닛을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 사용하여 유플로테스 텔로머라제 또는 그 서브유닛을 발현시키는 재조합 분자를 생성시킬 수 있다.
당업자라면, 유전자 암호의 축퇴성의 결과로서, 일부 서열이 임의의 공지된 자연 발생적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 상동성을 보유하는 다수의 텔로머라제 서브유닛 서열이 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 이. 에디큘라투스에서 시스테인을 암호화하는 것으로 코돈 "UGA"를 사용하는 것을 고려하여, 가능한 코돈 선택에 기초한 조합체를 선별함으로써 이루어질 수 있는 뉴클레오티드 서열의 각각의 그리고 모든 가능한 변이를 의도한다. "UGA" 코돈의 예외 이외에, 상기 조합체는 자연 발생적 이. 에디큘라투스 텔로머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적용되는 표준 3염기 유전자 암호에 따라 만들어지며, 그러한 모든 변형은 구체적으로 개시되는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들면, 43 kDa 뉴클레오티드 서열의 3개의 개방형 해독틀의 각각이 암호화하는 아미노산 서열이 특이적으로 포함된다(서열번호 4-6). 단백질이 실시예 또는 본원의 다른 부분에서 설명하는 것과 같은 분석에서 기능을 나타내는 한, 텔로머라제 서브유닛 단백질의 임의의 변형체 형태는 본 발명에 포함된다.
이. 에디큘라투스 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 그 변형체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 적당히 선택된 엄중 조건하에 자연 발생적 서열의 뉴클레오티드 서열에 하이브리드될 수 있지만, 인간 및 기타 계에 의해 이용되는 "표준" 코돈 용례를 비롯하여 실질적으로 상이한 코돈 용례를 보유하는 이. 에디큘라투스 단백질 서브유닛 또는 그 유도체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제조하는 것이 유용할 수 있다. 특정 코돈이 숙주에 의해 이용되는 빈도수에 따라 펩티드의 발현이 특정 원핵 또는 진핵 발현 숙주에서 일어나는 속도를 증가시키도록 코돈을 선별할 수 있다. 암호화된 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 텔로머라제 서브유닛 및 그 유도체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 실질적으로 변화시키는 기타 이유로는 자연 발생적 서열로부터 제조되는 전사체보다 바람직한 성질, 예컨대, 보다 크거나 짧은 반감기를 가진 RNA 전사체의 제조를 들 수 있다.
이제 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 그 유도체를 암호화하는 DNA 서열 또는 그 부분을 완전히 화학 합성법으로 제조하고, 그 후 합성 유전자를 당해 분야에 널리 공지된 시약을 사용하여 다수의 시판되는 임의 DNA 벡터 및 세포계내로 삽입시킬 수 있게 되었다. 더욱이, 화학 합성법을 사용하여 이. 에디큘라투스 단백질 서브유닛 또는 그 일부를 암호화하는 서열 뿐만 아니라, 효모 또는 인간의 텔로머라제 단백질, 서브유닛 또는 그 일부를 암호화하는 서열내로 돌연변이를 도입시킬 수 있다.
다양한 엄중 조건하에 도 9(123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 DNA 서열), 도 11(43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 DNA 서열), 도 12(43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 개방형 해독틀) 및 도 26(에스. 세레비제 Est2의 DNA 서열)의 서열들을 포함하여, 텔로머라제 종류의 임의의 멤버중의 뉴클레오티드 서열에 하이브리드될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열 역시 본 발명의 범위내에 포함된다. 따라서, 일 양태로, TRT를 암호화하는 핵산 및 항-TRT 항체를 포함하는 본 발명의 신규 조성물을 사용하여 임의의 기타 생물로부터 TRT 동종형 및 텔로머라제 또는 텔로머라제 성분을 포함하여 TRT의 종류를 동정 및 정제할 수도 있다.
본 발명의 한 가지 양태는 본 발명에 의해 제시되는 특이 시약 및 본원에 설명하는 방법을 사용하여 동정되고 분리될 수도 있는 인간의 p43 상동체를 비롯하여 유플로테스 43 kDa 텔로머라제의 동종형(isoforms) 및 상동체를 포함한다.
또 다른 양태에서는, TRT 및 텔로머라제 효소 복합체 성분을 사용하여 텔로머라제 관련 성분을 동정한다.
TRT 유전자의 멤버를 동정하고 분리하는 데 사용된 하이브리드화 조건은 본원에 참고로 인용한 Berger 및 Kimmel의 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Meth. Enzymol., vol. 152, Academic Press, 캘리포니아 샌 디에고(1987)]에 개시된 바와 같이 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 융점 온도(Tm)를 기준으로 하며, 지정된 "엄중" 조건에서 사용할 수도 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열을 변이시키는 예로는 동일하거나 또는 기능적으로 동등한 텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 결실, 삽입 또는 상이한 뉴클레오티드의 치환이 있다. 단백질은 또한 침묵성 변화를 일으키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 나타낼 수도 있으며, 이는 기능적으로 동등한 텔로머라제 서브유닛 또는 하나 이상의 TRT 부분 활성이 부족하거나 거기에 융합된 또다른 펩티를 가진 서브유닛을 생성시킨다. 정교한 아미노산 치환은 텔로머라제 서브유닛의 생물학적 활성이 보유되는 한, 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성의 유사도에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산의 예로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있고; 양으로 하전된 아미노산으로는 리신 및 아르기닌이 있으며; 유사한 친수성 값을 가진 하전되지 않은 극성 헤드기를 가진 아미노산으로는 루이신, 이소루이신, 발린; 글리신, 알라닌; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 및 페닐알라닌, 티로신이 있다.
DNA 서열 분석 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편, 시쿼나제(Sequenase: 등록상표)(US 바이오케미컬 코포레이션, 오하이오주 클리블랜드), Taq DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머, 코네티컷주 노르워크), 열안정성 T7 폴리머라제(아머샴, 일리노이주 시카고) 또는 재조합 폴리머라제와 교정성 엑소뉴클레아제(예컨대, Gibco BRL(매릴랜드주 게이더스버그)에서 시판되는 엘롱가제(ELONGASE) 증폭계)의 조합과 같은 효소를 이용한다. 이 공정은 해밀턴 마이크로 랩 2200(네바다주 레노의 해밀턴), 펠티어 써멀 사이클러(PTC200; 매사추세츠주 워터타운 MJ 리서치) 및 ABI 377 DNA 시퀀서(퍼킨 엘머)와 같은 기계를 사용하여 자동화하는 것이 바람직하다.
인간 또는 기타 포유류 또는 기타 진핵 세포의 텔로머라제 단백질 및 서브유닛을 암호화하는 대립유전자 역시 본 발명의 범위내에 포함된다. 본원에 사용된 "대립유전자(allele)" 또는 "대립유전자 서열"이란 용어는 인간의 텔로머라제 단백질 또는 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열의 또 다른 형태이다. 대립유전자는 돌연변이(즉, 핵산 서열의 변화)로부터 생성되며, 일반적으로 그 구조 및/또는 기능은 변화되거나 변화되지 않을 수 있는 변이된 mRNA 또는 폴리펩티드를 생성시킨다. 임의의 유전자는 하나 또는 다수의 대립유전자 형태를 가지지 않을 수도 있다. 대립유전자에 일어나는 통상의 돌연변이에 의한 변화는 일반적으로 아미노산의 자연적 결실, 부가 또는 치환으로 인한 것이다. 이러한 유형의 변화는 각각 단독으로 또는 다른 변화와 함께 주어진 서열내에서 1회 이상 일어날 수 있다.
텔로머라제 역전사 효소 종류 및 모티프의 특성 분석
본 발명은 역전사 효소(RT) 및 텔로머라제 특이적인 아미노산 모티프를 가진 통상 염기성의 큰 단백질인 텔로머라제 촉매성 서브유닛 단백질(즉, 텔로머라제 역전사 효소)의 서열을 가진 분리된 및/또는 재조합 유전자 및 단백질을 제공한다. 상기 모티프들은 다양한 생물들 사이에서 보존되어 있기 때문에, 다수의 생물의 TRT 유전자의 종류가 본 발명에 의해 제공되며, 프라이머, 핵산 프로브 및 본 발명의 항체, 즉 하나 이상의 모티프 서열에 특이적인 항체를 사용하여 동정, 분리 또는 합성할 수 있다.
본 발명은 텔로머라제 서브유닛 단백질의 종류중 텔로머라제종을 제공한다. 텔로머라제 역전사 효소 단백질 서브유닛은 자신도 역전사 효소 단백질 종류의 멤버이다. 본원에 기재된 TRT 종은 구조 모티프의 형태로 TRT 종류의 멤버와 공통된 구조적 특징을 나타낸다. 이들 모티프는 공통의 텔로머라제 기능을 수행할 수 있다. TRT종의 서열 분석 결과, 이들 종은 도 17, 18, 25, 48, 55 및 57에 예시한 바와 같이, 기타 역전사 효소(RT) 단백질에 공통인 아미노산 영역을 포함한다는 것을 알 수 있다. 이 영역은 hTRT mRNA(cDNA, 서열번호 1)의 대략 중앙에서 세 번째에 위치하고; 기타 생물에서 유래한 역전사 효소와 비교하여 hTRT의 구조적으로 가장 보존된 영역이다. 그러한 모티프 영역에 상응하는 본 발명의 신규 시약을 본 발명의 방법에 사용하여 항체 및 핵산 프로브를 생성시키고, 기타 생물에서 유래한 부가의 동종형 및 텔로머라제종을 동정할 수 있다. 본 발명은 공지의 텔로머라제로부터 생성되는 증폭 생성물 및 제한 효소 단편을 포함하여 RT 영역과 같은 이들 모티프 영역에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 모티프에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서 합성할 수도 있다. TRT의 RT 모티프를 증폭시키는 데 유용한 PCR 프라이머쌍은 후술한다. 상기 올리고뉴클레오티드를 PCR 증폭 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서 사용하여 추가의 인간 동종형 및 기타 생물에서 유래한 텔로머라제종을 동정 및 분리할 수도 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 또한 후술하는 바와 같이 RACE와 같은 기술을 사용하여 추가의 TRT종을 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용할 수도 있다.
TRT에서 발견되지만 기타 역전사 효소에서 발견되는 것과 유사한 7개의 RT 모티프는 TRT 종에 특이한 구체적인 증표를 가진다. 예를 들면, 도 55 및 도 57C에 도시한 바와 같이, TRT RT 모티프내에는 다른 RT들 중에서 고도로 보존되는 잔기에 다수의 아미노산 치환부(화살표로 표시함)가 있다. 예를 들면, 모티프 C에는 활성 부위 금속 이온과 배위 결합하는 두 개의 아스파르트산 잔기(DD)(문헌[Kohlstaedt 등,1992, Science 256:1783; Jacobo-Monila 등, 1993, Proc. Natl. Acad Sci. 미국 90:6320; Patel 등, 1995, Biochemistry 34:5351] 참조)가 구조 hxDD(F/Y)에서 나타나고, 보다 구체적으로는 기타 RT에서의 (F/Y)xDDh와 비교하여 텔로머라제 RT에서 (L/V)xDD(F/Y)로서 나타난다(여기서, h는 소수성 아미노산이고, "x"는 임의의 아미노산이다; 문헌[Xiong 등, 1990, EMBO J. 9:3353; Eickbush, in The Evolutionary Biology of Viruses(S. Morse 편집, Raven Press, 뉴욕, p.121, 1994)] 참조).
텔로머라제 아군의 또 다른 체계적인 변화 특성은 모티프 E에서 나타나는데, 여기서는 WxGxSx가 일치 서열이거나 또는 텔로머라제 단백질 사이에서 보존되는 반면에, hLGxxh는 기타 RT의 특성이다(도 55 및 57C; Xiong 의 상기 문헌(1990); Eickbush의 상기 문헌(1994) 참조). 상기 모티프 E는 "프라이머 그립"이라 불리며, 이 영역에서의 돌연변이는 RNA 프라이밍에는 영향을 미치나 DNA 프라이밍에는 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었다(Powell 등, 1997, J. Biol. Chem. 272:13262). 도 55 및 57C는 hTRT를 포함하여 여러 가지 텔로머라제 RT 프라이머 그립 영역(모티프 E)의 서열 배열을 제시하고 있다. 텔로머라제는 DNA 프라이머(예컨대, 염색체의 3' 말단)를 필요로 하기 때문에, TRT는 프라이머 그립 영역에서 다른 RT와는 상이하여야 한다는 것이 예상된다.
또한, 모티프 A와 B' 사이의 거리는 기타 RT에 대표적인 것보다 TRT에서 더 긴데, 이것은 오른손과 유사한 구조의 "손가락" 영역내에 삽입부를 나타낼 수 있다(도 57B 참조; Kohlstaedt 등의 상기 문헌; Jacobo-Molina 등의 상기 문헌; 및 Patel 등의 상기 문헌 참조).
더욱이, 상기한 바와 같이, T 모티프는 TRT 단백질의 추가의 증표이다. 예컨대, 도 55 및 도 57A에 도시한 T 모티프는 다음 식으로 표시할 수 있는 서열을 포함한다:
Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp
상기 식에서, X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 연속 잔기의 수를 의미하며, R1은 루이신 또는 이소루이신이고, R2는 글루타민 또는 아르기닌이며, R3은 페닐알라닌 또는 티로신이고, R4는 리신 또는 히스티딘이다.
T 모티프는 또한 다음 식으로 표시할 수 있다:
Trp-R1-X4-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X-p-X3-p-X2-3-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp
상기 식에서, X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 연속 잔기의 수를 의미하며, R1은 루이신 또는 이소루이신이고, R2는 글루타민 또는 아르기닌이며, R3은 페닐알라닌 또는 티로신이고, R4는 리신 또는 히스티딘이며, h는 Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp 및 Met로부터 선택되는 소수성 아미노산이고, p는 Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn 및 Gln으로부터 선택되는 극성 아미노산이다.
일 양태로, 본 발명은 도 55 및 도 57에 예시한 하나 이상의 모티프를 포함하는 분리된 자연 발생적 및 재조합 TRT 단백질을 제공하며, 여기서, 상기 모티프의 예는 다음과 같다:
모티프 T W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I
모티프 T' E-X2-V-X
모티프 1 X3-R-X2-PK-X3
모티프 2 X-R-X-I-X
모티프 A X4-F-X3-D-X4-YD-X2
모티프 B' Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8
모티프 C X6-DD-X-L-X3
TRT 단백질이 하나 이상의 TRT 모티프를 포함할 때, 순서(NH2→COOH)는 도 55에 도시되어 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 다음과 같은 초모티프를 포함하는 분리된 천연 TRT 단백질을 제공한다.
(NH2)-X300-600-W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I-X5-20-E-X2-V-X-X5-20-X3-R-X2-PK-X4-10-R-X-I-X-X60-80-X4-F-X3-D-X4-YD-X2-X80-130-Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8-X5-35-X6-DD-X-L-X3-X10-20-X12-K
당업자라면 분명히 이해할 수 있는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 시약으로 사용되는 TRT 서열을 비롯한 시약과 본 명세서에 제시된 방법과 지침(예컨대, 이하 제시된 구체적인 방법)을 사용하면 TRT 유전자 및 단백질을 재조합 형태로 제조, 분리 및 생성할 수 있을 것이다. 예컨대, 프라이머(예, 축퇴성 증폭 프라이머)는 TRT의 특징인 RT 모티프와 T 모티프를 암호하는 유전자 서열에 하이브리드하는 것을 제공한다. 예컨대, T 모티프의 FFYXTE 영역이나 기타 다른 TRT 모티프(이하 상세히 설명됨) 또는 모티프나 일치 서열의 조합체를 암호하는 서열에 하이브리드하는 1종 이상의 프라이머 또는 축퇴성 프라이머는 표적 생물의 코돈 용례에 근거하여 제조하고, 이것을 사용하여 표적 생물에서 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 중에서 TRT 유전자 서열을 증폭시킬 수 있다. 축퇴성 프라이머는 그 용도가 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, PCR의 어닐링 단계에서 염기 부정합이 허용되는 적당한 증폭(예컨대 PCR) 조건 하에 표적 생물의 코돈 선호도와 용례를 고려하여 표적 모티프의 아미노산을 충분히 암호화할 수 있는 핵산 서열 군에 하이브리드하는 프라이머 군도 동시에 사용해야 한다. 보통, 2가지 프라이머 군을 사용하는 것이 일반적이지만 단일 프라이머(또는 이 경우에는 단일 축퇴성 프라이머 군) 증폭계도 잘 알려져 있어 TRT 유전자를 생성하는데 사용할 수 있다.
표 1은 신규 TRT 핵산, 구체적으로 척추 동물(예컨대, 인간) 유래의 핵산을 증폭시키는데 사용할 수 있는 본 발명의 프라이머 예를 제공한 것이다. "N"은 모두 4가지 뉴클레오티드의 등몰 혼합물이고, 괄호안의 서열은 특정 뉴클레오티드의 등몰 혼합물이다.
TRT 핵산 증폭용 축퇴성 프라이머의 예
모티프 방향 5'-서열-3'
a FFYVTE 순방향 TT(CT)TT(CT)TA(CT)GTNACNGA
b FFYVTE 역방향 TCNGTNAC(GA)TA(GA)AA(GA)AA
c RFIPKP 순방향 (CA)GNTT(CT)AT(ACT)CCNAA(AG)CC
d RFIPKP 역방향 GG(TC)TTNGG(TGA)AT(GA)AANC
e AYDTI 순방향 GCNTA(CT)GA(CT)ACNAT
f AYDTI 역방향 TANGT(GA)TC(GA)TANGC
g GIPOG 순방향 GGNAT(ACT)CCNCA(AG)GG
h GIPOGS 역방향 (GC)(AT)NCC(TC)TGNGG(TGA)ATNCC
i LVDDFL 순방향 (CT)TNGTNGA(CT)GA(CT)TT(CT)(CT)T
j DDFLLVT 역방향 GTNACNA(GA)NA(GA)(GA)AA(GA)TC(GA)TC
바람직한 프라이머 조합(y=예, n=아니오)
순방향 역방향b d f h i
a-c-e-g-i- n y y y yn n y y yn n n y yn n n n yn n n n n
1가지 양태로서, 증폭된 TRT 핵산은 표적 생물로부터 제조한 라이브러리(예, cDNA 라이브러리)에 대한 콜로니 하이브리드화용 하이브리드화 프로브로서 사용하면 전체 TRT 단백질 암호화 서열을 가진 핵산이나 이것의 실질적인 부분을 동정하고 분리 또는 클로닝할 수 있다. 이러한 방법으로, 본 발명은 TRT 종류의 모든 종을 동정하고, 분리하며 클로닝하기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 예시로서, 전술한 것과 같은 시약 및 방법은 인간, 마우스, 유플로테스 에디큘라투스 123 kDa 및 43 kDa 종, 에스. 세레비제, 스키조사카로마이세스 폼베, 옥시트리키아 트리팔락스 및 테트라히메나 써모필라를 포함하여 유전자 서열의 TRT 종류의 다수 종을 얻기 위해 본 명세서에 기재된 방법에 따라 사용하였다. 종래 특성규명되지 않은 TRT 종의 유전자를 클로닝한 후 그 서열을 통상의 방법으로 결정하고, 이로부터 암호화된 폴리펩티드를 합성한 뒤, 텔로머라제 촉매 활성과 같은 TRT 활성을 분석(본원에 기술하는 것과 같이 및/또는 당해 분야에 공지된 텔로머라제 분석에 의해)하는 것은 당업자에게는 통상적인 것이다.
또한, 모든 TRT 유전자 및 폴리펩티드는 본 발명에 의해 제시되는 특이 시약을 사용하여 클로닝하고, 임의의 다양한 클로닝 방법을 사용하여 동정, 분리 및 클로닝할 수 있으므로, 상기 유전자 및 폴리펩티드는 본 발명의 범위내에 포함된다는 것은 당업자에게는 자명한 것이다. 예컨대, 하기 실시예들에 기재된 바와 같이 공지의 TRT 서열을 기본으로 한 프로브 또는 표적 생물 유래의 DNA 또는 기타 다른 핵산 라이브러리를 사용하는 하이브리드 방법을 사용할 수 있다. 축퇴성 PCR 프라이머 또는 이들의 증폭 생성물은 표지화된 뒤 하이브리드화 프로브로서 사용할 수 있다. 다른 양태로서, 발현 클로닝 방법도 사용된다.
추가의 양태로, 본 발명에 의해 제공되는 펩티드 및 단백질은 합성 또는 재조합 수단에 의해 제조하여, hTRT 동종형 및 인간 p43 동족체를 포함하여 인간의 TRT와 같이 임의의 종에서 유래한 TRT와 특이적으로 반응할 수 있는 항체를 생성시킬 수 있다. 예컨대, FFYXTE 모티프(여기서, X는 20개 표준 아미노산중 임의의 것임)와 같은 TRT 모티프 또는 기타 다른 TRT 에피토프에 걸치는 펩티드에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체를 사용하면 TRT 단백질과 이를 암호화하는 mRNA를 포함하는 리보좀 복합체를 분리할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 항체를 생성시키기 위한 펩티드 면역원은 일반적으로 길이가 6개 내지 30개의 아미노산, 보다 일반적으로 길이가 약 10개 내지 20개의 아미노산인 것이 보통이다. 이 항체는 목적 생물 유래의 cDNA 발현 라이브러리를 프로브 처리하여 TRT 서열을 암호화하는 클론을 동정하는 경우에도 사용할 수 있다. 다른 양태에서는, 공지의 TRT와 함께 보존되는 서열을 포함하는 DNA에 대한 DNA 데이터베이스를 컴퓨터 조사하면 TRT 서열을 포함하는 클론을 동정할 수 있다.
인간 텔로머라제 모티프
본 발명은 또한 인간 텔로머라제 모티프에 대한 핵산 및 아미노산 서열 정보를 제공한다. 이들 서열은 유플로테스 123 kDa 펩티드 및 "tez1"(서열번호 69)로 명명된 스키조사카로마이세스 폼베의 상동성 서열을 사용하여 BLAST 검색에서 최초로 동정되었다.
도 25는 유플로테스("p123")(서열번호 65); 스키조사카로마이세스("tez1")(서열번호 63); 효모 Est2p(서열번호 64)(즉, Est2 핵산 서열(서열번호 55)이 암호화하는 에스. 세레비제 단백질로서, "L8543.12"로도 지칭됨); 및 이 비교 검색에서 동정된 인간 상동체(서열번호 61)의 서열 배열을 도시한 것이다. 이 배열된 부분의 인간의 아미노산 서열은 서열번호 61 및 67(도 25 및 27)의 서열이다(상응하는 cDNA 암호 서열은 도 28의 서열번호 62에 제시되어 있음). 도 25에 도시한 tez1의 일부분은 서열번호 63이고, 도시한 효모 Est2의 일부분은 서열번호 64이며, 도시한 유플로테스 p123의 일부분은 서열번호 65이다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 이들 영역 사이에는 고도로 보존되는 영역이 있다. 예를 들면, 도 25에 도시한 바와 같이, "모티프 0", "모티프 1", "모티프 2" 및 "모티프 3"에서 동일성 영역이 있다. 동일한 아미노산은 별표(*)로 나타낸 반면에, 유사한 아미노산 잔기는 원(M)으로 나타낸다. 이것은 효모로부터 섬모충류 내지는 인간까지의 광범위한 진핵 세포 사이에 보존되는 영역이 텔로머라제 모티프내에 존재한다는 것을 나타낸다. 추가의 생물들도 마찬가지로 그러한 보존된 서열 영역을 포함할 것으로 생각된다.
도 27은 인간 텔로머라제 모티프를 암호화하는 cDNA 클론의 아미노산 서열(서열번호 67, 또한 도 25, 서열번호 61 참조)을 도시한 것이다. 도 28은 도 27(서열번호 62)의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열로서, 인간의 텔로머라제 펩티드 모티프를 포함하는 서열을 도시한 것이다. 기타 TRT 종과 함께 배열된 이 인간의 아미노산 서열은 도 25의 서열번호 61에 제시되어 있다. 도 29는 에스. 폼베 tez1(서열번호 68)의 아미노산 서열을 도시한 반면에, 도 30은 tez1(서열번호 69)의 DNA 서열을 도시한 것이다. 도 30에서, 인트론 및 기타 비암호 영역은 소문자로 나타낸 반면에, 엑손(즉, 암호 영역)은 대문자로 나타냈다.
본 발명은 TRT 단백질 암호화 또는 cDNA 핵산 서열(즉, 서열번호 117)을 가지거나 또는 TRT의 단백질 서열(즉, 서열번호 118)을 암호화하는 핵산에 특이적으로 하이브리드될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 제공하며, 그러한 시약을 사용하여 텔로머라제 단백질 암호화 서열의 종류중 광범위한 종을 동정하고 증폭시킬 수 있다. 인트론 및 게놈(전사되지 않는) 서열은 또한 본 발명의 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켜 새로운 TRT 종을 동정할 수도 있다. 예시 목적으로, PCR 프라이머 및 증폭 방법을 설명한다.
상기 종류, 즉 일치 TRT 서열, 예컨대, TRT 및 RT 모티프의 상이한 멤버 사이에 보존된 TRT 서열의 증폭을 사용하여 기타 생물에서 유래한 추가의 동종형 및 TRT 종을 동정하고 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서 사용하는 용도로 본 발명의 올리고뉴클레오티드 시약을 생성시킬 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 후술하는 바와 같이, RACE와 같은 기술을 사용하여 추가의 TRT 종 또는 서열을 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용할 수 있다.
다양한 하이브리드화 기술 및 조건을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 추가의 텔로머라제 종을 동정 및 검출할 수 있다. 당업자라면, 사용하는 방법이 증폭 방법이든 하이브리드화 방법이든 간에 정량적 결과를 얻고자 하는 경우에는 증폭된 또는 기타 표적 핵산의 상대 빈도수를 유지하거나 제어하는 방법을 사용하는 것에는 주의를 기울여야 한다. 적합한 증폭 방법으로는 폴리머라제 연쇄 반응인 PCR(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis 편집, Academic Press, 뉴욕(1990) 및 PCR STRATEGIES(1995), Innis 편집, Academic Press, Inc. 뉴욕(Innis)), 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu(1989), Genomics 4:560; Landegren(1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); 전사 증폭(Kwoh Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 86:1173 (1989)); 자립성 서열 복제(Guatelli(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 87:1874); Q 베타 레플리카제 증폭 및 기타 RNA 폴리머라제 매개의 기술(예컨대, NASBA, 캔진, 온타리오주 미시소가)을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니며; 문헌[Berger(1987) Methods Enzymol. 152:307-316, Sambrook, and Ausubel, 및 Mullis(1987) 미국 특허 제4,683,195 및 제4,683,202호; Arnheim(1990) C&EN 36-47; Lomell J. Clin. Chem., 35:1826(1989); Van Brunt, Biotechnology, 8:291-294 (1990); Wu(1989) Gene 4:560; Sooknanan(1995) Biotechnology 13:563-564] 참조. 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하는 방법은 Wallace의 미국 특허 제5,426,039호에 기재되어 있다.
본 발명은 TRT 단백질을 암호화하는 DNA를 제조하기 위한 상기 방법들 각각의 생성물의 증폭 및 조작 또는 검출 방법을 제공한다. PCR 기술에서, 증폭시킬 DNA 영역의 두 경계에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 합성하고 사용한다(Innis의 문헌 참조). PCR은 다양한 프로토콜에서 사용하여 인간 텔로머라제를 암호화하는 핵산을 증폭, 동정, 분리 및 조작할 수 있다. 이들 프로토콜에서, 적당한 프라이머 및 프로브를 선별하는 표준 방법은 문헌에 기재되어 있다. 본 발명은 인간 텔로머라제 단백질을 암호화하는 DNA를 동정하고 증폭시키는 프라이머 및 프로브를 제공하며, 이들은 본원에 열거한 핵산 서열의 모든 또는 일부를 포함하는 것으로 생성될 수 있다.
PCR-증폭된 서열은 검출 가능한 올리고뉴클레오티드로서 표지되고 사용될 수 있으나, 그러한 핵산 프로브는 상술한 바와 같이 임의의 합성 기술 또는 당해 분야에 널리 공지된 기타 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 본 발명의 표지되고 증폭된 DNA 또는 기타 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 다양한 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 TRT 단백질 종 또는 동종형을 추가로 동정하고 분리하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다.
본 발명은 임의의 생물로부터 TRT 핵산을 분리하기 위한 RACE에 기초한 방법을 제공한다(RACE는 DNA 증폭을 위한 PCR에 기초한 또 다른 방법임). 간략히 언급하면, 이 기술은 무작위 5' 프라이머 및 지정된 3' 프라이머(5' RACE) 또는 무작위 3' 프라이머 및 지정된 5' 프라이머(3' RACE)를 사용하여 DNA 서열을 증폭시키기 위해 PCR을 사용하는 것을 포함한다. 그 다음, 증폭된 서열은 표준 기술을 사용하여 서열 분석하고 조작할 수 있는 벡터내로 서브클로닝한다. RACE 방법은 당업자에게는 널리 공지되어 있으며, RACE를 실행하기 위한 키트는 시판된다(예컨대, Gibco #18374-058 (5' RACE) 또는 #18373-019(3' RACE)(매릴랜드주 게이더스버그). 문헌[Lankiewicz(1997) Nucleic Acids Res 25:2037-2038; Frohman(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 85:8998] 참조.
5' RACE의 경우, 유전자 특이적 프라이머인 프라이머는 5' 말단을 향해 연장하도록 배향된 알고 있는 서열의 5' 말단 근처에서 선택된다. 프라이머는 역전사 효소 및 mRNA를 사용하는 프라이머 연장 반응에 사용한다. RNA가 선택적으로 제거된 후, 특이적으로 프라이밍된 cDNA는 1) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) 및 디데옥시말단 전이효소로 "미부를 형성(tailed)"한 다음, 특이 PCR 부위를 제공하는 5' 말단을 가진 미부 및 첫 번째 유전자 특이적인 프라이머에 상보적인 프라이머를 사용하여 cDNA를 PCR 증폭시키거나, 또는 2) 특이 PCR 부위를 제공하는 올리고뉴클레오티드를 RNA 리가제를 사용하여 cDNA의 말단에 결찰시킨 다음, 첨가된 부위 및 첫 번째 유전자 특이적인 프라이머에 상보적인 프라이머를 사용하여 cDNA를 PCR 증폭시킨다. 후속 증폭 반응은 통상 제1 프라이머와 관련하여 정착된(nested) 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 수행된다. 증폭된 생성물은 통상 겔 전기영동에 의해 정제한 다음, 서열 분석하고 이들이 목적하는 추가의 cDNA 서열을 포함하는지 여부를 검사하였다.
3' RACE의 경우, 올리고 dT-프라이머를 mRNA의 폴리-A 꼬리에 어닐링시킨 다음, 역전사 효소로 연장시킨다. 통상 올리고 dT 프라이머는 특이 PCR 부위를 제공하는 5' 말단을 가진다. 그 다음, RNA는 제거되거나 선택적으로는 분리되고, cDNA는 기지 서열(3' 말단을 향해 배향된 서열)의 3' 말단 근처의 유전자 특이 프라이머 및 올리고 dT 미부로 프라이머와 함께 증폭된다. 5' RACE에 대해 기술한 바와 같이, 후속 증폭 반응을 수행하고, 증폭된 생성물을 정제한다.
본 발명의 핵산, 예컨대, 대형 게놈 클론을 얻는 또 다른 유용한 수단은 BAC 또는 P1 게놈 라이브러리를 검색하는 것이다. 박테리아 인공 염색체 BAC는 120+ Kb 삽입체를 포함하는 벡터이다. BAC는 이.콜리의 F 인자 플라스미드 계에 기초하며, ㎍ 양으로 조작 및 정제하기가 간단하다. BAC 플라스미드는 세포당 1개 내지 2개 사본으로 유지되기 때문에, 본 발명에 이용될 수도 있는 YAC의 경우 관찰되는 재배열의 문제는 배제된다. BAC 벡터는 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질(GFP)용 마커 유전자를 포함할 수 있다(Baker(1997) Nucleic Acids Res 25:1950-1956). P1은 75 내지 100 Kb의 DNA 삽입체를 포함하는 이.콜리를 감염시키는 박테리오파지이며 (Mejia(1997) Genome Res 7:179-186; Ioannou(1994) Nat Genet6:84-89), 람다 라이브러리와 동일한 방식으로 다량으로 검색할 수 있다.
텔로머라제, 텔로머라제 단백질 서브유닛 또는 그 기능적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지된 다양한 방법 및 부분적 뉴클레오티드 서열을 이용하여 연장시킴으로써 프로모터 및 조절 요소와 같은 상류 서열을 검출할 수 있다. 예를 들면, Gobinda의 문헌[Gobinda(1993) PCR Meth. Applic. 2:318-22]은 기지의 좌에 인접한 미지의 서열을 회복하기 위해 보편적 프라이머를 사용하는 직접 방법으로서 "제한 부위" 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 기재하고 있다. 먼저, 게놈 DNA를 링커 서열에 대한 프라이머 및 기지 영역에 특이적인 프라이머의 존재하에 증폭시킨다. 동일한 링커 프라이머 및 첫 번째 프라이머의 내부에 있는 또 하나의 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 서열에 2차의 PCR을 수행한다. 각 회의 PCR의 생성물은 적당한 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사시키고 역전사 효소를 사용하여 서열 분석한다.
기지 영역에 기초한 분기성(divergent) 프라이머를 사용함으로써, 역 PCR을 사용하여 서열을 증폭 또는 연장시킬 수 있다(Triglia 등, Nucleic Acids Res 16:8186[1988]). OLIGO(등록상표) 4.06 프라이머 분석 소프트웨어(내쇼날 바이오사이언시즈 인코포레이티드, 미네소타주 플리머스[1992]) 또는 또 다른 적당한 프로그램을 사용하여 길이 22 내지 30개 뉴클레오티드이고, GC 함량이 50% 이상이며, 약 68E-72EC의 온도에서 표적 서열에 어닐링되는 프라이머를 조작하였다. 이 방법은 여러 가지 제한 효소를 사용하여 유전자의 기지 영역에 적당한 단편을 생성시킨다. 그 다음, 단편을 분자내 결찰에 의해 환형화하고, PCR 주형으로서 사용한다.
인간 및 효모의 인공 염색체 DNA내 기지의 서열에 인접한 DNA 단편의 PCR 증폭 방법인 캡쳐(Capture) PCR(Lagerstrom 등, PCR Methods Applic 1:111-19[1991])을 사용할 수도 있다. 캡쳐 PCR은 또한 PCR전에 DNA 분자의 미지 부분내로 조작된 2본쇄 서열을 위치시키기 위해 다수의 제한 효소 처리 및 결찰 과정을 필요로 한다.
미지의 서열을 회복하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 표적으로 된 유전자의 워킹(walking) 방법인 워킹 PCR(Parker 등, Nucleic Acids Res 19:3055-60[1991])이다. 한편, PCR, 정착된 프라이머, 프로모터파인더(상표명)(클론테크, 캘리포니아주 팔로 알토) 및 프로모터파인더 라이브러리를 사용하여 게놈 DNA에서 워킹 작용을 수행할 수 있다. 이 과정은 라이브러리를 검색할 필요성을 배제하며, 인트론/엑손 연접부의 발견에 유용하다.
전길이 cDNA를 검색하기 위한 바람직한 라이브러리는 보다 큰 cDNA를 포함하도록 크기에 따라 선별된 라이브러리이다. 또한, 무작위 프라이밍된 라이브러리는 이들이 유전자의 5' 및 상류 영역을 포함하는 보다 많은 서열을 포함한다는 점에서 바람직하다. 올리고 d(T) 라이브러리가 전길이의 cDNA를 생성시키지 않는다면 무작위 프라이밍된 라이브러리가 특히 유용할 수 있다. 게놈 라이브러리는 5' 비해독된 조절 영역내로의 연장에 유용하다.
모세관 전기영동법을 사용하여 서열 분석 또는 PCR 생성물에서 뉴클레오티드 서열을 확인하거나 또는 그 크기를 분석할 수 있다. 신속한 서열 분석용 계는 퍼킨 엘머, 베크먼 인스트루먼츠(캘리포니아 풀러튼) 및 기타 회사로부터 입수 가능하다. 모세관 서열 분석은 전기 영동에 의한 분리, 레이저에 의해 활성화되는 4개의 상이한 형광성 염료(각 뉴클레오티드에 대해 하나씩) 및 전하가 결합된 장치 카메라에 의한 방출된 파장의 검출을 위해 유동성 중합체를 이용할 수 있다. 적당한 소프트웨어(예컨대, 퍼킨 엘머에서 시판되는 제노타이퍼(상표명) 및 시퀀스 네비게이터(상표명))를 사용하여 출력/광도를 전기 신호로 변환하고, 샘플 적재로부터 컴퓨터 분석 및 전자 데이타 디스플레이까지의 전체 공정을 컴퓨터로 제어한다. 모세관 전기영동은 특정 샘플내 제한된 양으로 존재할 수 있는 DNA의 작은 조각들의 서열 분석에 특히 적합하다. 30분 동안에 350 bp 이하의 M13 파지 DNA의 재현 가능한 서열 분석이 보고되어 있다(Ruiz-Martinez 등, Anal Chem 65:2851-8[1993]).
뉴클레오티드 서열의 발현
본 발명에 따라, 텔로머라제, 텔로머라제 단백질 서브유닛 또는 그 기능적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 적당한 숙주 세포에 의해 텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛의 발현을 유도하는 재조합 DNA 분자에 사용할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 여러 가지 이유로 텔로머라제 서브유닛을 어느 하나 또는 둘다 변화시키도록 조작할 수 있는데, 그 이유의 예로는 클로닝, 프로세싱 및/또는 유전자 생성물의 활성을 변화시키는 변이가 있다. 예를 들면, 당해 분야에 널리 알려진 기술(예컨대, 새로운 제한 부위를 삽입시키기 위해, 당부가 패턴을 변화시키기 위해, 코돈 선호도를 변화시키기 위해, 스플라이스 변형체를 제조하기 위해, 활성을 변화시키기 위해 부위 지향적인 돌연변이 유발)을 사용하여 돌연변이를 도입할 수 있다.
발현계
생물학적으로 활성이 있는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 발현시키기 위해, 서브유닛 또는 기능적 등가물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 적당한 발현 벡터(즉, 삽입된 암호 서열의 전사 및 해독을 위해 필수 요소를 포함하는 벡터)내로 삽입시킨다. 생물학적 활성 텔로머라제 효소를 발현시키기 위해, 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 적당한 발현 벡터내로 삽입하고, 텔로머라제 RNA 서브유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 또는 또 다른 벡터내로 삽입하여 RNA를 발현시킨다. 그 다음, 단백질 RNA 서브유닛은 동일 세포에서 발현되거나 별개로 발현되며, 다음에, 혼합되어 재구성된 텔로머라제가 얻어진다.
당업자에게 널리 알려진 방법을 사용하여 텔로머라제 단백질 서브유닛 서열 및 적당한 전사 또는 해독 제어부를 포함하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이러한 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합 또는 유전자 재조합이 있다. 그러한 기술은 Sambrook 등의 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 뉴욕 플레인뷰(1989)] 및 Ausubel 등의 문헌[Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 뉴욕주 뉴욕(1989)]에 기재되어 있다. 이와 동일한 방법을 사용하여 유플로테스에서 시스테인을 암호화하는 UGA 코돈을 숙주 발현계에 의해 인지되는 시스테인에 대한 UGU 또는 UGC 코돈으로 전환시킬 수 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 계를 이용하여 텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 서열을 포함하고 발현시킬 수 있다. 이들 계의 예로는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모; 비루스 발현 벡터로 감염시킨 곤충 세포계(예컨대, 바쿨로비루스); 비루스 발현 벡터(예컨대, 카울리플라워 모자이크 비루스, CaMV: 담배 모자이크 비루스, TMV)로 형질감염시키거나 또는 박테리아 발현 벡터(예컨대, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포계; 또는 동물 세포계와 같은 미생물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 계의 "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 그 강도 및 특이성에 있어 상이하며, 벡터의 비해독 영역, 인핸서, 프로모터 및 3' 비해독 영역인데, 이들은 숙주 세포 단백질과 상호 작용하여 전사 및 해독을 수행한다. 이용된 벡터계 및 숙주에 따라, 구성성 및 유도성 프로모터를 비롯한 임의의 개수의 적당한 전사 및 해독 요소를 사용할 수 있다. 예를 들면, 박테리아계에서 클로닝할 경우에, 블루스크립트(등록상표) 파지미드(스트래터진, 캘리포니아 라 졸라) 또는 pSport1(Gibco BRL) 및 ptrp-lac 하이브리드 등의 하이브리드 lacZ 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 바쿨로비루스 폴리헤드린 프로모터를 곤충 세포에 사용할 수 있다. 식물 세포의 게놈(예컨대, 열 충격, RUBISCO; 및 저장 단백질 유전자)에서 유래하거나 또는 식물 비루스(예컨대, 비루스 프로모터 또는 리더 서열)에서 유래하는 프로모터 또는 인핸서를 벡터내로 클로닝할 수 있다. 포유류 세포계에서, 포유류 유전자 또는 포유류 비루스에서 유래한 프로모터가 가장 적당하다. 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열의 다수 사본을 포함하는 세포주를 생성시킬 필요가 있으면, SV40 또는 EBV에 기초한 벡터를 적당한 선별 마커와 함께 사용할 수 있다.
박테리아계에서는, 텔로머라제 단백질 또는 서브유닛에 대해 의도하는 용도에 따라 다수의 발현 벡터를 선별할 수 있다. 예를 들면, 다량의 텔로머라제 단백질, 서브유닛 또는 펩티드가 항체의 유도에 필요한 경우에, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 고레벨의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터의 예로는 하이브리드 단백질이 생산되도록 베타 갈락토시다제의 아미노 말단 Met 및 후속의 7개 잔기에 대한 서열을 가진 해독틀의 벡터내로 텔로머라제 또는 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열이 결찰될 수 있는 블루스크립트(등록상표)(스트래터진)와 같은 다기능 이.콜리 클로닝 및 발현 벡터(예컨대, 핀 벡터; Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509[1989])가 있으나, 이에 국한되지 않는다. pGEX 벡터(프로메가, 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시킬 수도 있다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질은 가용성이고, 글루타치온-아가로스 비드에 흡착시킨 다음, 유리 글루타치온의 존재하에 용출시켜 용균된 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다. 그러한 계에서 제조된 단백질은 당해 클로닝된 폴리펩티드가 GST 부분으로부터 자유로이 방출될 수 있도록 헤파린, 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 조작된다.
효모인 사카로마이세스 세레비제에서는, 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 벡터를 사용할 수 있다. 검토를 위해서는 문헌[Ausubel 등의 상기 문헌 및 Grant 등, Meth. Enzymol., 153:516-544(1987)] 참조.
식물 발현 벡터를 사용하는 경우에, 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열의 발현은 다수의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 비루스 프로모터(Brisson 등, Nature 310:511-514[1984])를 단독으로 또는 TMV에서 유래한 오메가 리더 서열(Takamatsu 등, EMBO J., 6:307-311[1987])과 함께 사용할 수 있다. 한편, RUBISCO(Coruzzi 등, EMBO J., 3:1671-1680[1984]; Broglie 등, Science 224:838-843[1984])의 소형 서브유닛 또는 열충격 프로모터(Winter and Sinibaldi Results Probl. Cell Differ., 17:85-105[1991])와 같은 식물 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 구성체는 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원체가 매개하는 형질감염에 의해 식물 세포내로 도입시킬 수 있다(그러한 기술의 검토를 위해서는, 문헌[Hobbs or Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology McGraw Hill 뉴욕주 뉴욕, pp.191-196(1992); or Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 뉴욕주 뉴욕, pp.421-463(1988)] 참조).
텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 발현시키는데 사용할 수 있는 또 다른 발현계는 곤충계이다. 한 가지 그러한 계에서, 오토그라파 캘리포니카 핵 다면증 비루스(AcNPV: Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)를 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 또는 트리코플러시아(Trichoplusia) 유충에서 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 사용한다. 당해 텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 서열을 비루스의 비본질적인 영역, 예컨대, 폴리헤드린 유전자내로 클로닝하고, 폴리헤드린 프로모터의 제어하에 배치할 수 있다. 텔로머라제 단백질 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성으로 만들고 외피(coat) 단백질이 결핍된 재조합 비루스를 생산할 것이다. 그 다음, 재조합 비루스를 사용하여 텔로머라제 서브유닛 서열이 발현되는 트리코플러시아 유충 또는 에스. 프루기페르다 세포를 감염시킨다(Smith 등, J. Virol., 46:584[1983]; Engelhard 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-7[1994]).
포유류 숙주 세포에서는, 다수의 비루스계 발현계를 이용할 수 있다. 아데노비루스를 발현 벡터로서 이용하는 경우에, 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열은 후기 프로모터 및 3부분 리더 서열로 구성되는 아데노비루스 전사/해독 복합체내로 결찰시킬 수 있다. 비루스 게놈의 비본질적 E1 또는 E3 영역에서의 삽입은 감염된 숙주 세포에서 발현할 수 있는 생비루스를 산출할 것이다(Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:3655-59[1984]). 또한, 로우스 육종 비루스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서를 사용하여 포유류 숙주 세포에서의 발현을 증가시킬 수 있다.
텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열의 효율적인 해독에는 특이적인 개시 신호가 필요할 수도 있다. 이들 신호로는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 있다. 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열이 숙주 세포에 의해 발현될 경우에, 그 개시 코돈 및 상류 서열은 가장 적당한 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있고, 추가의 해독 제어 신호는 불필요할 수 있다. 그러나, 암호 서열 또는 그 일부만이 삽입되는 경우에, 또는 세포의 조절 환경이 전사를 저해하는 경우에, ATG 개시 코돈을 포함하는 외래의 전사 제어 신호가 제공될 수 있다. 개시 코돈은 정확한 해독틀로 존재하여 전체 삽입체를 전사시킬 수 있어야 한다. 외래의 전사 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원에서 유래한 것, 즉 자연적인 것 및 합성된 것일 수 있다. 발현 효율은 사용시에 세포계에 적합한 인핸서를 포함함으로써 증가될 수 있다(Scharf 등, Results Probl. Dell Differ., 20:125[1994]; and Bittner 등, Meth. Enzymol., 153:516[1987]).
또한, 숙주 세포 균주는 그것이 삽입된 서열의 발현을 조절하는 능력 또는 발현된 단백질을 목적하는 유형으로 프로세싱하는 능력으로 선별할 수 있다. 폴리펩티드의 그러한 변형의 예로는 아세틸화, 카르복실화, 당부가, 인산화, 지질화 및 아실화가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 단백질의 "프리프로"형을 절단하는 해독후 프로세싱은 또한 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능에 중요할 수 있다. CHO(ATCC CCL 61 및 CRL 9618), HeLa(ATCC CCL 2), MDCK(ATCC CCL 34 및 CRL 6253), HEK 293(ATCC CRL 1573), WI-38(ATCC CCL 75)(ATCC: 미국 모식균 배양 수집소, 매릴랜드주 록빌)과 같은 상이한 숙주 세포는 그러한 해독후 활성에 특이한 세포 기구 및 특징적인 메카니즘을 가지며, 도입된 재조합 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 수행하는 것을 선택할 수 있다.
재조합 단백질의 장기간의 고수율 생산을 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛 단백질을 안정하게 발현시키는 세포주는 비루스의 복제 기점 또는 내재성 발현 요소 및 선별 가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터의 도입후, 세포를 선택 배지로 전환하기 전에 농축된 배지에서 1 내지 2일 또는 그 이상 동안 성장시킬 수 있다. 선별용 마커의 목적은 선별 내성을 부여하는 것이며, 그 존재로 인해 도입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포를 증식 및 회수할 수 있게 된다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 집합체는 그 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
임의의 개수의 선별계를 사용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 이들 선별계의 예로는 단순포진 비루스 티미딘 키나제(Wigler 등, Cell 11:223-32[1977]) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy 등, Cell 22:817[1980]) 유전자가 있는데, 이들은 각각 tk-세포 또는 aprt-세포에서 이용될 수 있다. 또한, 항대사물질, 항생물질 또는 제초제 내성을 선별 기준으로 사용할 수 있는데, 예컨대, dhfr은 메트트렉세이트에 대한 내성을 부여하고(Wigler 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 77:3567[1980]; npt는 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하며(Colbere-Garapin 등, J. Mol. Biol., 150:1[1981]), als 또는 pat는 각각 클로르설퓨론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여하는(Murry, In McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, 뉴욕주 뉴욕, pp 191-196, [1992]) 것이다. 추가의 선별용 유전자가 개시되었는데, 예컨대, trpB는 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하게 하며, hisD는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하게 한다(Hartman and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8047[1988]). 최근에는, 가시성 마커를 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 그 기질인 GUS와 루시퍼라제와 그 기질인 루시퍼린과 같은 마커와 함께 일반적으로 사용하게 되었는데, 이들은 형질전환체의 선별에 뿐만 아니라 특이적 벡터계로 인한 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량하는 데에 널리 사용된다(Rhodes 등, Meth. Mol. biol., 55:121[1995]).
핵산 하이브리드화 기술
본원에 개시하는 하이브리드화 기술을 이용하여 본 발명의 TRT 단백질(예컨대, 상이한 종에서 유래한 TRT 및 하나의 종에서의 TRT의 대립유전자 변이)를 암호화하는 유전자 및 유전자 생성물(즉, mRNA)을 동정하고, 분리하며, 특성 분석할 수 있다. 핵산 하이브리드화 기술을 사용하는 특이 DNA 및 RNA 검출 및 측정을 위한 다양한 방법은 당업자에게는 공지된 사항이다(문헌[Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hames, B.D. and Higgins, S.J., IRL Press, 1985; Gall(1989) Proc. Natl. Acad. Sci., 미국 63:378; and Sambrook] 참조). 용도에 따라, DNA 하이브리드화 형식의 선별은 종종 선택적인 사항이다. 예를 들면, 텔로머라제 단백질을 암호화하는 DNA가 샘플내에 존재 또는 부재하는지 여부를 평가하는 한 가지 방법은 서던 전이를 포함한다. 간략히 언급하면, 분해된 DNA 또는 mRNA와 같은 핵산 샘플을 아가로스 슬랩상에 또는 완충액내 폴리아크릴아미드 겔에서 진행시키고 막으로 옮겼다. 핵산 프로브를 사용하여 하이브리드화를 수행하였다. 본 발명의 TRT 핵산의 경우, 핵산 프로브는 TRT 핵산 종류중에 보존된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산 프로브는 길이가 10개 내지 20개 내지 30개 이상의 염기가 바람직하다(핵산 하이브리드화에 사용하기 위한 핵산 프로브 서열을 선별하는 방법에 대해서는 Sambrook의 문헌 참조). TRT 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 존재 또는 부재의 정량적 및 정성적 측정 방법은 본 발명의 방법에 따라 수행할 수 있다.
유사하게, 그리고 다수의 실시예중 한 가지로서, 노던 전이를 텔로머라제 단백질을 암호화하는 mRNA의 검출에 사용할 수 있다. 예를 들면, 산 구아니디늄-페놀 -클로로포름 추출 방법을 사용하여 주어진 세포 샘플로부터 mRNA를 분리한다. 그 다음, mRNA를 전기영동시켜 mRNA 종을 분리하고, mRNA를 겔로부터 니트로셀룰로스 막으로 옮긴다. 서던 전이의 경우와 같이, 표지된 프로브와 같은 프로브 또는 PCR 증폭 생성물을 사용하여 텔로머라제 단백질을 암호화하는 핵산의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다. 본 발명의 hTRT mRNA는 종종 가장 민감한 분석법을 사용하여서도 노던 블로팅에 의해 검출하기가 극히 어려울만큼 낮은 레벨로 세포에서 발현된다. 이것은 불멸성 세포 및 암 세포와 같이 비교적 고레벨의 hTRT mRNA를 발현시키는 세포의 경우에도 그러하다. 통상 매우 낮은 레벨의 텔로머라제 mRNA의 발현으로 인해, 최적화된 노던 블롯 프로토콜을 후술한다.
TRT-양성 세포, 즉 암 세포와 같은 텔로머라제 활성을 발현시키는 세포에서조차 텔로머라제 mRNA의 저레벨은 그러한 세포에서 나타날 수 있는 TRT 단백질의 저레벨에 의해 반영된다. 그러한 단백질은 면역블로팅(웨스턴 블롯)을 포함하여 본 발명의 검출 방법으로 검출할 수 있다. 인간의 암세포주 293의 TRT 단백질은 본 발명의 항-텔로머라제 다클론 항혈청을 이용하는 민감한 웨스턴 블롯계를 사용하여 검출할 수 있지만, 웨스턴 블롯 상의 TRT 신호는 약해서 부분적으로는 hTRT가 불멸성 세포에서조차 낮거나 매우 낮은 레벨로 존재하는 것으로 나타난다.
샌드위치 분석은 단백질 또는 핵산을 검출 또는 분리하기에 상업적으로 유용한 하이브리드화 분석법이다. 그러한 분석법은 종종 고체 지지체에 공유결합에 의해 고정되는 "캡쳐" 핵산 또는 단백질 및 표지된 "신호" 핵산(통상 용액중의)을 이용한다. 임상 샘플 또는 기타 샘플은 표적 핵산 또는 단백질을 제공한다. "캡쳐" 핵산 또는 단백질 및 "신호" 핵산 또는 단백질은 표적 핵산 또는 단백질과 하이브리드되거나 또는 그에 결합하여 "샌드위치" 하이브리드 복합체를 형성한다. 효과적으로는, 신호 핵산 또는 단백질은 캡쳐 핵산 또는 단백질과는 거의 하이브리드되거나 결합할 수 없다.
통상, 올리고뉴클레오티드 프로브는 하이브리드화의 검출에 사용되는 표지된 신호 핵산이다. 상보성 프로브 핵산 또는 신호 핵산은 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 데 통상 사용되는 여러 가지 방법중의 하나에 사용하기 위해 표지할 수 있다. 검출 방법은3H,125I,35S,14C 또는32P-표지된 프로브 등(상기 표지의 정의 참조)과 같이, 자동 방사선 사진 분석 또는 자동 형광 사진 분석을 위해 표지를 사용할 수 있다. 기타 표지로는 표지된 항체, 형광단, 화학발광제, 효소 및 표지된 리간드에 대한 특이 결합쌍 멤버로서 작용할 수 있는 항체에 결합하는 리간드가 있다.
하이브리드 복합체의 검출에는 표적 및 프로브 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 이중체에 신호 생성 복합체를 결합시킬 필요가 있다. 통상, 그러한 결합은 리간드 접합된 프로브 및 신호, 신호와 접합된 항-리간드 사이에서와 같이 리간드 및 항-리간드 상호작용, 즉 항체-항원 또는 상보성 핵산 결합을 통해 일어난다. 표지는 또한 하이브리드화 복합체를 간접 검출할 수 있게 한다. 예를 들면, 표지가 햅텐 또는 항원인 경우에, 샘플은 유용한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 이들 계에서, 신호는 형광성 또는 효소 분자를 항체에 부착시켜, 또는 일부 경우에는 방사성 표지를 부착시켜 생성시킨다. 하이브리드화 분석의 민감도는 검출되는 표적 핵산 또는 신호를 증폭하는 표적 핵산 또는 신호 증폭계의 사용을 통해 증가될 수 있다. 분자 프로브로서 사용하기에 또는 후속 서브클로닝용 핵산 단편을 생성시키기에 적합한 시험관내 증폭 기술은 상기한 바와 같이 공지되어 있다. PCR 또는 LCR 프라이머 또는 기타 시약을 특이 서열이 존재할 때에만 연장 또는 결찰되도록 조작한 경우에 이들 계를 사용하여 대립유전자 변이 또는 돌연변이 서열을 직접 확인할 수 있다. 한편, 특이 서열은 예컨대, 보다 일반적인 PCR 프라이머 및 나중에 프로브처리되거나 서열분석되는 증폭된 표적 영역을 사용하여 일반적으로 증폭시켜 대립유전자 또는 돌연변이의 표시인 특이 서열을 동정할 수 있다.
핵산 하이브리드 분석법은 정렬에 기초한 방식으로 수행할 수도 있다. 정렬은 다수의 상이한 "프로브" 또는 "표적" 핵산(또는 기타 화합물)로서 표적 핵산에 대해 하이브리드된다. 이러한 방식으로 다수의 상이한 하이브리드화 반응을 거의 "병행하여" 수행할 수 있다. 정렬에 기초한 방식으로 하이브리드화 반응을 수행하는 방법은 당업자에게는 널리 알려진 사항이다(예컨대, 문헌[Jackson (1996) Nature Biotechnology 14:1685; Chee, Science 274:610 (1995)] 참조).
단백질을 암호화하는 유전자의 발현 레벨을 측정하는 또 다른 수단은 동일계 하이브리드화이다. 동일계 하이브리드화 분석법은 널리 알려져 있고, 일반적으로 문헌[Angerer(1987) Methods Enzymol 152:649]에 기재되어 있다. 동일계 하이브리드화 분석에서, 세포들은 고체 지지체, 통상 유리 슬라이드에 고정시키거나 또는 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)에 의해 분석된다. DNA에 프로브 처리를 하는 경우, 세포들은 통상 열 또는 알칼리로 변성시킨다. 그 다음, 세포들은 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 특이적인 표지된 프로브의 어닐링을 허용하는 보통의 온도에서 하이브리드화 용액과 접촉시킨다. 프로브는 통상 방사성 동위원소 또는 형광성 수용체로 표지한다. 예컨대, hTR의 동일계 하이브리드화를 기재하는 문헌[미국 특허 제5,583,016호 및 USSN 08/770,564호 및 08/770,565호(둘다 1996.12.20일자에 출원); Soder(1997) Oncogene 14:1013-1021] 참조. 동일계 하이브리드화 기술에서 널리 알려진 또 다른 프로브는 소위 FISH 형광 동일계 하이브리드화이다 (Macechko(1997) J Histochem Cytochem 45:359-363; and Raap(1995) Hum Mol Genet 4(4), 529-534)
폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환체의 동정
마커 유전자 발현의 존재/부재는 당해 유전자 역시 존재한다는 것을 시사하지만, 그 존재 및 발현을 확인할 수 있다. 예를 들면, 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열을 마커 유전자 서열내에 삽입하면, 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 동정할 수 있다. 한편, 마커 유전자는 단일 프로모터의 제어하에 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열과 직렬식으로 위치할 수 있다. 유도 또는 선별에 반응하여 마커 유전자의 발현은 통상 직렬 서열의 발현을 역시 나타낸다.
한편, 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛에 대한 암호 서열을 포함하고 텔로머라제 또는 단백질 서브유닛을 발현시키는 숙주 세포는 본 발명의 방법 및 시약을 사용하여 당업자에게 공지된 다양한 표준 절차를 사용하여 동정할 수 있다. 이들 절차로는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생분석 또는 면역분석 기술로서 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량 분석을 위해 막, 용액 또는 칩에 기초한 기술을 포함하는 절차들이 있으나, 이에 국한되지 않는다.
텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 존재는 서브유닛을 암호화하는 서열의 프로브, 일부 또는 단편을 사용하여 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 또는 증폭에 의해 검출할 수 있다. 핵산 증폭에 기초한 분석은 텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 형질전환체를 검출하기 위해 핵산 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고머를 사용한다. 본원에서 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 대략 10개 이상의 뉴클레오티드 및 많게는 대략 100개, 바람직하게는 15개 내지 30개, 보다 바람직하게는 20개 내지 25개 뉴클레오티드의 핵산 서열을 의미하며, 프로브 또는 앰플리머로서 사용할 수 있다.
단백질에 특이적인 다클론 항체 또는 단일클론 항체를 사용한 단백질의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 표준 프로토콜은 당해 분야에 알려져 있다. 그 예로는 효소 결합된 면역 흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역 분석법(RIA) 및 형광성 활성화된 세포 분류법(FACS)이 있다. 이들 및 기타 방법은 문헌[Hamton 등, Serological Methods a Laboratory Manual, APS Press, 미네소타주 세인트폴(1990) and Maddox 등, J. Exp. Med., 158:1211(1983)]에 기재되어 있다.
다양한 표지 및 접합 기술이 당업자에게는 알려져 있으며, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용할 수 있다. 관련 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리드화 또는 PCR 프로브를 제조하는 수단으로는 올리고표지법, 닉 해독, 말단 표지법 또는 표지된 뉴클레오티드 또는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭이 있다. 한편, 텔로머라제 단백질 서브유닛 서열, 또는 그 임의의 일부는 mRNA 프로브의 제조용 벡터내로 클로닝할 수 있다. 그러한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 시판되며, T7, T3 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오티드를 첨가하여 RNA 프로브를 시험관내에서 합성하기 위해 상기 벡터를 사용할 수 있다.
파마시아 바이오테크(뉴저지주 피스캐터웨이), 프로메가(위스콘신주 매디슨) 및 US 바이오케미컬 코포레이션(오하이오주 클리블랜드)과 같은 다수의 회사가 상기 절차에 사용되는 시판용 키트 및 프로토콜을 제공한다. 적합한 리포터 분자 또는 표지로는 방사성핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 발색제 뿐만 아니라, 기질 보조인자, 저해제, 자기 입자 등이 있다. 그러한 표지의 사용에 대해 기재하고 있는 특허로는 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 있다. 또한 재조합 면역글로불린은 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제4,816,567호에 제시된 바와 같이, 제조할 수 있다.
텔로머라제 및 텔로머라제 서브유닛 단백질의 정제
하기 실시예 3에 기재한 TRT 종의 예시적인 정제 방법 외에도, 천연에서 또는 재조합에 의해 생산된 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛으로부터 TRT를 정제(회수)하는 추가의 방법은 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 텔로머라제 및 조성물을 정제하는 방법의 예는 후술한다.
용해도에 의한 분류
단백질 혼합물이 복합체이면, 초기의 염 분류는 다수의 당해 재조합 숙주 세포로부터 원하지 않는 숙주 세포 단백질(또는 세포 배양 배지로부터 유래한 단백질)을 분리할 수 있다. 바람직한 염은 황산암모늄이다. 황산암모늄은 단백질 혼합물에서 물의 양을 효과적으로 감소시킴으로써 단백질을 침전시킨다. 그 다음, 단백질은 그 용해도에 근거하여 침전된다. 단백질의 소수성이 클수록 보다 낮은 황산암모늄에 단백질이 침전하는 경향은 더 커진다. 대표적인 프로토콜은 생성되는 황산암모늄 농도가 20 내지 30%가 되도록 포화된 황산암모늄을 단백질 용액에 첨가하는 것이다. 이것은 가장 소수성인 단백질을 침전시킬 것이다. 침전물은 버리고(당해 단백질이 소수성이 아니면), 황산암모늄을 상청액에 첨가하여 당해 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 농도로 만든다. 그 다음, 침전물을 완충액에 용해시키고, 필요에 따라 투석 또는 투석 여과를 통해 과량의 염을 제거한다. 저온 에탄올 침전과 같은 단백질의 용해도에 따른 기타 방법들은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 복합 단백질 혼합물의 분류에 사용할 수 있다.
크기 분별 여과
TRT 단백질의 종류 및 본원에 예시한 종류의 경우와 같이, 단백질의 크기를 알고 있거나 또는 cDNA 서열로부터 추정할 수 있는 경우에는 상이한 소공 크기를 가진 막(예컨대, 아미콘 또는 밀리포어 막)을 통한 한외여과법에 의해 보다 크고 작은 크기의 단백질을 제거할 수 있다. 제1 단계로서, 단백질 혼합물은 당해 단백질의 분자량보다 낮은 분자량 차단 작용을 가지는 소공 크기를 가진 막을 통해 한외 여과한다. 그 다음, 한외 여과의 보유물은 당해 단백질의 분자량보다 큰 분자량 차단 작용을 가진 막에 대해 한외 여과한다. 재조합 단백질은 막을 통해 여과액내로 통과된다. 그 다음, 여과액을 크로마토그래피한다.
칼럼 크로마토그래피
단백질은 그 크기, 순표면전하, 소수성 및 리간드에 대한 친화도에 근거하여 분리할 수 있다. 또한, 단백질에 대해 생성된 항체를 칼럼 매트릭스에 접합시키고 단백질을 면역 정제할 수 있다. 모든 이들 일반적인 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 문헌[Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, 제2판, Springer Verlag(1987)] 참조. 크로마토그래피 기술은 임의의 규모로 다수의 상이한 제조자(예컨대, 파마시아 바이오테크)로부터 입수한 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 단백질 농도는 임의의 기술, 예컨대, 문헌[Braford(1976) Anal. Biochem. 72:248-257]에 기재된 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
TRT의 정제
텔로머라제는 전술한 바와 같이 본 발명에 의해 제공되는 다양한 수단중 하나에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 텔로머라제는 세포질 미정제 세포 제제에 비해 60,000배가 넘는 순도로 정제할 수 있다. 인간의 TRT는 아데노비루스 유형 5 DNA의 단편으로 형질전환시킨 인간의 배의 신장 기원의 세포인 "293" 세포의 미정제 추출물로부터 정제할 수 있다(Graham(1977) J. Gen. Virol. 36:59-77; Stillman (1985) Mol. and Cell. Biol. 5:2051-2060). 293 세포는 미국 모식균 배양 수집소로부터 수탁번호 ATCC CRL 1573으로 입수할 수 있다.
정제 방법에 포함시킬 단계는 목적하는 정제 레벨에 따라 좌우된다. 텔로머라제 양성 세포의 미정제 추출물과 같은 유기 생분자를 포함하는 불순한 조성물로부터 텔로머라제 효소 또는 TRT 단백질을 미정제 추출물(상대순도 약 4%)과 비교하여 60,000배 이상으로 정제하는 방법은 예컨대, (1) 음전하를 보유하는 분자, 예컨대, 포로스(POROS) 50 HQ에 결합하는 제1 매트릭스와 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 접촉시키고, 매트릭스에 결합하지 않는 다른 유기 생분자로부터 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 분리하며, 텔로머라제를 수집하는 방법; (2) 양전하를 보유하는 분자, 예컨대, 포로스 헤파린 20 HE-1에 결합하는 매트릭스와 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 접촉시키고, 매트릭스에 결합하지 않는 다른 유기 생분자로부터 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 분리하며, 텔로머라제를 수집하는 방법; (3) 음전하를 보유하는 분자, 예컨대, 소스(SOURCE) 15Q에 결합하는 제2 매트릭스와 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 접촉시키고, 매트릭스에 결합하지 않는 다른 유기 생분자로부터 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 분리하며, 텔로머라제를 수집하는 방법; (4) 텔로머라제 또는 TRT 단백질 또는 RNA 서브유닛에 대해 특이 친화도를 가진 친화도 작용제, 예컨대, hTR 또는 항-TRT 또는 항-텔로머라제 항체 또는 기타 단백질에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 접촉시키고, 친화도 작용제에 결합하지 않는 다른 유기 생분자로부터 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 분리하며, 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 수집하는 방법; 및 (5) 분자 크기, 모양 또는 부력 밀도에 따라 다른 유기 생분자로부터 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 분리하고, 예컨대, 토소하스(TosoHaas) TSK-겔*G5000PWXL크기 분별 칼럼상에서 크기에 따라 분자를 분리하고, 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 수집하는 방법을 포함한다. 본 발명은 보다 적은 단계 또는 추가의 단계들을 포함하는 프로토콜을 포함한다.
정제 프로토콜은 또한 텔로머라제 또는 TRT 단백질을 중간 선택도의 매트릭스와 접촉시키는 단계, 중간 선택도의 매트릭스에 결합하지 않는 기타 유기 생분자로부터 텔로머라제를 분리하는 단계 및 텔로머라제를 바람직하게는 친화도 단계 전에 수집하는 단계를 포함한다. 텔로머라제는 정제 프로토콜의 단계들중 임의의 단계를 변형시키거나, 그 순서를 변화시키거나 또는 배제함으로써 상이한 레벨의 순도로 분리할 수 있다. 그러나, 임의의 바람직한 프로토콜은 통상 본 발명의 항체와 같은 친화도 작용제와 텔로머라제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 음전하 또는 양전하를 보유하는 분자에 결합하는 1종 이상의 매트릭스와 텔로머라제를 접촉시키는 단계는 포로토콜에 역시 포함시키기에 통상 바람직한 단계(들)이다.
아미노산 서열 결정
본 발명의 텔로머라제, TRT 단백질 및 텔로머라제 관련 단백질의 예시적인 아미노산 서열은 예컨대, 당해 분야에 널리 알려진 기술인 에드먼 분해법으로 결정할 수 있다. 내부 서열 결정법(문헌[Hwang(1996) J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 686:165-175] 참조) 외에도, N-말단 서열 결정법은 당해 분야에 알려진 기술로 실시할 수 있다. C-말단 서열 결정법의 경우, 매트릭스-보조-레이저-탈착 이온화 질량 분광분석법(MALDI-MS)에 의한 분석법 및 펩티드의 분해를 위한 화학 절차를 문헌[Thiede(1997) Eur. J. Biochem. 244:750-754]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다.
분자량/등전점 측정
단백질의 분자량은 당업자에게 모두 공지된 다수의 상이한 방법으로 측정할 수 있다. 일부 측정 방법으로는 SDS 겔 전기영동, 천연 겔 전기영동, 분자 배타 크로마토그래피, 대역 원심분리, 질량 분광분석법 및 서열 결정법으로부터의 계산법이 있다. 상이한 기술의 결과들 사이의 불일치는 기술에 내재하는 인자들로 인한 것일 수 있다. 예를 들면, 천연 겔 전기영동, 분자 배타 크로마토그래피 및 대역 원심분리는 단백질의 크기에 의해 좌우된다. 시스테인이 풍부한 단백질은 다수의 이황화물 결합(분자내 및 분자간)을 형성할 수 있다. SDS 겔 전기영동은 SDS가 단백질에 존재하는 아미노산에 결합하는 정도에 의해 좌우된다. 일부 단백질은 다른 단백질보다 SDS에 보다 강하게 결합되며, 그러므로, 단백질은 그 아미노산 조성에 따라 상이하게 이동할 것이다. 질량 분광분석법 및 그 서열로부터 계산된 분자량은 부분적으로 특정 아미노산이 단백질에 존재하는 빈도 및 특정 아미노산의 분자량에 따라 좌우된다. 단백질에 당이 부가되면, 질량 분광분석 결과는 당부가를 반영할 것이지만 계산된 분자량은 그러하지 않을 수 있다.
hTRT(서열번호 118)의 계산된 분자량은 약 127 kD로 산정될 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위내의 추가의 인간 또는 비인간 TRT 단백질, hTRT, hTRT 동종형 및 기타 TRT 종은 상기 분자량 범위에 한정되지 않는다.
단백질의 등전점은 단백질의 아미노산 함량을 제시하는 계산에 의해 천연 겔(또는 디스크) 전기영동, 등전 집중법에 의해 또는 바람직한 방법으로 측정할 수 있다. hTRT(서열번호 118)의 등전점(pI)은 약 11.3으로 계산되었다. 그러나, 본 발명의 범위내의 TRT 종 또는 동종형은 반드시 이 등전점 범위에 한정되는 것은 아니다.
cDNA 클론 pGRN121은 기능적인 hTRT(cDNA는 서열번호 118에 도시되어 있음)를 암호화하며, 실시예 17에 기재된 인간 293 세포주의 라이브러리로부터 분리되었다. 서열번호 117의 서열은 서열번호 118의 서열을 가진 촉매 활성적인 텔로머라제 단백질을 암호화한다. 서열번호 118의 폴리펩티드는 1132개 잔기 및 약 127 kD의 계산된 분자량을 가진다. 클론 #712562(서열번호 122)을 pGRN121과 비교하면, 클론 #712562가 모티프 A와 B' 사이에 182개 염기쌍의 결실을 가진다는 것을 알 수 있다. pGRN121에 존재하는 추가의 182개 염기쌍은 단일의 개방형 해독틀에서 모든 TRT 모티프를 배치하고, 모티프 A와 모티프 B' 사이의 간격을 다른 공지된 TRT와 일치되는 거리까지 증가시킨다.
TRT는 재조합에 의해 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들면, 텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛 단백질(들)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환시킨 숙주 세포는 세포 배양으로부터 암호화된 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건하에 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 제조된 단백질은 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 세포내에 포함될 수 있다. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 발현 벡터는 원핵 세포막 또는 진핵 세포막을 통해 텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛 단백질의 분비를 유도하는 신호 서열을 가진 것으로 조작할 수 있다. 다른 재조합체 구성 방법은 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질을 암호화하는 서열을 폴리펩티드 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합시킬 수 있다.
텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛 단백질(들)은 단백질 정제를 촉진하기 위해 또는 기타 목적 또는 의도하는 용도로 첨가되는 하나 이상의 추가 폴리펩티드 도메인을 가진 재조합 단백질로서 발현시킬 수도 있다. 그러한 정제 촉진 도메인으로는 고정화된 금속에 대한 정제를 허용하는 폴리히스티딘 부분 및 히스티딘-트립토판 모듈, 고정화된 면역글로불린에 대한 정제를 허용하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화도 정제계(임뮤넥스 코포레이션, 워싱턴주 시애틀)에 이용되는 도메인과 같은 금속 킬레이트화 펩티드들이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 정제 도메인과 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛 사이에 인자 Xa 또는 엔테로키나제(인비트로겐, 캘리포니아주 샌 디에고)와 같은 절단 가능한 링커 서열을 포함시키는 것은 정제의 촉진에 유용하다. 한 가지 그러한 발현 벡터는 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열 및 6개 히스티딘 잔기와 그에 이은 티오레독신 및 엔테로키나제 절단 부위를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 정제를 촉진하는 반면에, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 포함하는 벡터에 속하는 문헌은 당해 분야에서 입수할 수 있다(예컨대, 문헌[Kroll 등, DNA Cell. Biol., 12:441-53(1993)] 참조).
TRT 서열의 화학 합성
본 발명의 또 다른 양태에서는, 재조합체 제조 외에도, 당해 분야에 널리 공지된 화학적 방법(예컨대, 문헌[Caruthers 등, Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 225-232(1980); Horn 등, Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 225-232(1980)] 참조)을 사용하여 텔로머라제 서브유닛(들)을 암호화하는 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 한편, 단백질 자체는 텔로머라제 서브유닛 아미노산 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 합성하기 위한 화학적 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 다양한 고체상 기술(Roberge 등, Science 269:202[1995]; Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149[1963])을 사용하여 펩티드 합성을 수행할 수 있고, 자동 합성은 예컨대 ABI 431A 펩티드 합성기(퍼킨 엘머)를 사용하여 제조자에 의해 제시된 지시에 따라 수행할 수 있다. 텔로머라제 단백질 서브유닛의 다양한 단편은 별도로 화학적으로 합성하고, 화학적 방법을 사용하여 결합시켜 전길이 또는 보다 큰 분자를 제조할 수 있다.
새로이 합성된 펩티드는 전술한 바와 같이(예컨대, 문헌[Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co, 뉴욕주 뉴욕(1983) 참조), 제조용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 실질적으로 정제할 수 있다. 합성 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열 결정법(예컨대, 에드먼 분해 방법, 상기 Creighton의 문헌 참조)으로 확인할 수 있다. 또한 텔로머라제 서브유닛 단백질, 또는 그 일부분의 아미노산 서열은 직접 합성중에 변화시키고/변화시키거나 다른 단백질 또는 그 일부에서 유래한 서열과 화학적 방법을 사용하여 결합시켜 변형 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
핵산은 또한 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머, TRT 암호 서열, 안티센스, 리보좀 등을 포함하는 핵산으로서 다양한 용액 또는 고체상 방법으로 합성법으로 제조할 수 있다. 포스파이트-트리에스테르, 포스포트리에스테르 및 H-포스포네이트 화학의 고체상 합성 방법에 관한 상세한 설명은 광범위하게 입수할 수 있다. 예를 들면, 자동 합성기를 사용하는 뷰케이지 및 카루터스(Beaucage and Carruthers)의 고체상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법은 문헌[Itakura, 미국 특허 제4,401,796호; Carruthers, 미국 특허 제4,458,006호 및 제4,500,707호; Carruthers(1982) Genetic Engineering 4:1-17; Needham-VanDevanter(1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168; Beigelman(1995) Nucleic Acids Res 23:3989-3994; Jones, chapt2, Atkinson, chapt3, and Sproat, chapt4, in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait(편집), IRL Press, 워싱턴 D.C.(1984); Froehler(1986) Tetrahedron Lett. 27:469-472; Froehler, Nucleic Acids Res. 14:5399-5407(1986); Sinha, Tetrahedron Lett. 24:5843-5846(1983); and Sinha, Nucl. Acids Res. 12:4539-4557 (1984)]에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드를 정제하는 방법으로는 문헌[Pearson(1983) J. Chrom. 255:137-149]에 기재된 바와 같이, 천연 아크릴아미드 겔 전기영동, 음이온 교환 HPLC가 있다. 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 임의의 화학적 분해 방법을 사용하여 입증할 수 있다(예컨대, 문헌[Maxam(1980) Methods in Enzymology 65:499-560, Xiao(1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:247-258] 또는 고체상 화학적 분해 방법의 경우에는 문헌[Rosenthal(1987) Nucleic Acids Symp Ser 18:249-252] 참조).
텔로머라제 및 텔로머라제 서브유닛 단백질과 관련한 방법
본원에 개시한 뉴클레오티드 및 펩티드 서열은 부분적으로는 이. 에디큘라투스 텔로머라제 123 kDa 단백질 서브유닛, 효모 단백질 L8543.12(Est2), 스키조사카로마이세스 및 본 발명의 개발 및 실행중에 관찰되고 본 발명에 의해 생성된 인간의 모티프 사이의 상동성에 기초한 것이다. 구체적으로, 효모 및 123 kDa 단백질은 그 C-말단 영역에 역전사 효소를 포함하고, 이들은 역전사 효소 모티프 외부 영역에 유사도를 공유하며, 이들은 유사하게 염기성이고(123 kDa 단백질의 경우 pI가 10.1이고, 효모의 경우 10.0), 이들은 둘다 대형이다(123 kDa 및 103 kDa). 또한, 역전사 효소 모티프를 고려하면, 이들 서브유닛은 그 관련 텔로머라제의 촉매 중심을 포함하는 것으로 생각된다. 실제로, 123 kDa의 이. 에디큘라투스 텔로머라제 단백질 서브유닛의 역전사 효소 모티프는 본 발명에서 다른 생물에서 유사한 서열의 동정에 유용한 것으로 나타났다.
이. 에디큘라투스 및 에스. 세레비제는 계통 발생학적으로 거리가 멀기 때문에, 이러한 상동성은 인간 및 기타 텔로머라제가 대형이고 염기성이며 그러한 역전사 효소 모티프를 포함하는 단백질을 포함할 것으로 예측하는 강력한 근거를 제시하는 것으로 생각되었다. 실제로, 모티프는 TRT 단백질의 인간의 상동체를 암호화하는 클론내에서 동정되었다. 이러한 관찰은 PCR 및 기타 방법에 의한 인간의 텔로머라제 유전자의 증폭에 중요한 것임이 입증되었다. 본 발명의 방법 및 시약은 인간 및 기타 동물에서 텔로머라제 서열을 검색하는 용도 뿐만 아니라, 유전적, 생화학적 또는 핵산 하이브리드화 방법에 의해 확인되는 후보 텔로머라제 단백질 또는 유전자를 우선적으로 결정하는 용도를 가진다. 본 발명의 텔로머라제 단백질은 시험관내에서 "미부 형성(tailing)"에 또는 염색체 또는 기타 DNA 3' 말단을 연장시키는 데에 있어 용도를 발견할 수 있다.
세포주내 텔로머라제 및/또는 텔로머라제 서브유닛 단백질의 발현은 종양 및 노화 인자의 진단시약의 개발에 있어서의 용도를 찾을 수 있는 것으로 생각된다. 뉴클레오티드 서열은 질병 과정의 초기에 메신저 RNA 서열의 유도된 발현을 진단하기 위한 하이브리드화 또는 PCR 기술에 사용할 수 있다. 마찬가지로 단백질을 사용하여 ELISA 분석에 유용한 항체 또는 유도체 또는 기타 진단 형태를 제조할 수 있다. 그러한 진단 시험은 인간의 종양 또는 기타 세포 증식성 질병의 상이한 부류를 구별할 수 있게 하고, 따라서, 적당한 치료 체계의 선택을 용이하게 한다.
본 발명의 텔로머라제 단백질에서의 역전사 효소 모티프의 발견은 공지되고 아직 설명되지 않은 역전사 효소 저해제, 예컨대, 항-텔로머라제 활성에 대한 뉴클레오시드 및 비뉴클레오시드를 시험하는 방법의 개발에 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
본원에 개시하는 아미노산 서열 모티프는 인간 및/또는 기타 동물에서 유용한 약제(예컨대, 텔로머라제 저해제)의 개발을 유도할 것이고, 세포의 증식을 특징으로 하는 암 또는 기타 질환에서 세포 분열을 차단할 것으로 생각된다. 또한 텔로머라제 단백질은 RNA 또는 RNA에 구속된 약제를 핵 또는 핵하부 소기관으로 또는 텔로미어로 지향시키는 방법에서 용도를 찾을 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 진단 방법중 한 가지 양태에서, 텔로머라제 mRNA 발현에 대한 정상치 또는 표준치가 기준으로서 확립된다. 이것은 당해 분야에 널리 공지된 기술(예컨대, 서던 블롯, 노던 블롯, 도트 또는 슬롯 블롯)을 사용하여 본원에 제시하는 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛 서열(DNA 또는 RNA 형태)에서 유래한 핵산 프로브를 사용하여 동물 또는 인간인 정상 피검체로부로부터 취한 조직내 텔로머라제 mRNA의 양을 정량 분석하는 것과 같은 다수의 분석법으로 수행할 수 있다. 정상 샘플로부터 얻은 표준치는 질병(예컨대, 종양 또는 노화와 관련된 질환)에 의해 잠재적으로 영향을 받은 피검체의 샘플로부터 얻은 값과 비교할 수 있다. 표준치외 피검치 사이의 편차는 질병 상태의 존재를 설정할 수 있다. 또한, 편차는 질병 상태내에서 구체적인 임상적 결과(예컨대, 전이성 또는 비전이성)를 나타낼 수 있다.
텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 치료용으로 단백질의 양을 제조하는 발현 벡터에 위치시킬 경우에 유용하다. 텔로머라제 유전자의 안티센스 뉴클레오티드 서열은 전이를 포함하는 종양에 지향된 유전자 치료를 위해 조작된 벡터에 매우 유용하다. 또한, 텔로머라제 발현의 저해는 노화 과정 또는 화학요법중에 일어나는 문제에서 방해의 진행을 검출하는 데 유용할 수 있다. 한편, 텔로머라제 활성의 양을 증가시키는 것이 바람직한 상황에서는 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 사용하여 텔로머라제 또는 서브유닛의 발현을 유도할 수 있다.
텔로머라제 서브유닛 단백질 활성
본 발명은 또한 다양한 방법으로 유플로테스 p43(43 kDa) 단백질 및 그 인간의 상동체와 같은 텔로머라제 및/또는 기타 텔로머라제 서브유닛 단백질을 검출하고 정량분석하기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 예를 들면, 텔로머라제는 본 발명의 기능적 활성 분석법을 결부시킴에 의해, 본 발명에 의해 제공되는 다양한 항-텔로머라제 항체를 이용하는 면역학적 분석에 의해, 그리고 아래에서 그 예를 상세히 설명하는 핵산을 기초로 하는 방법에 의해 검출하고 정량분석할 수 있다.
일 양태로, 본 발명은 특이적으로 hTRT에 또는 일반적으로 TRT에 결합하는 항체를 제공하며, 이들 항체를 사용하여 본 발명에 제시되는 TRT 종류의 임의의 멤버를 동정하고 분리하거나 또는 텔로머라제 또는 hTRT의 단일 종을 동정할 수 있다. 상기 종류의 임의의 멤버를 동정할 수 있는 항체는 상기 종류의 모든 멤버 또는 기타 TRT-특이적 에피토프에 공통인 구조적인 특징을 포함하는 항원 펩티드로서 사용함으로써 생성시킬 수 있다. 텔로머라제의 이들 공통의 구조적 특징은 전술한 바와 같다. 일반적으로 본 발명의 항체를 사용하여 텔로머라제 효소 및 TRT 단백질의 임의의 또는 모든 활성을 동정하거나, 정제하거나 또는 저해할 수 있다. 항체는 다양한 방법으로, 예컨대, 텔로머라제 복합체 또는 뉴클레오티드가 그 DNA 기질에 결합하지 못하게 함으로써, 텔로머라제 성분이 활성 복합체를 형성하지 못하게 함으로써, 기능적(텔로머라제 복합체) 4차 구조를 유지함으로써 또는 효소의 활성 부위 또는 활성에 관한 알로스테릭 효과를 가지는 기타 부위중 하나에 결합함으로써 텔로머라제 활성의 길항물질로서 작용할 수 있다(텔로머라제의 상이한 부분적 활성은 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 설명함). 본 발명의 항체를 제조하는 일반 방법은 후술한다.
또한 TRT 모티프에 대한 것들을 포함하여 텔로머라제 서브유닛 단백질에 대해 형성된 항체들은 텔로머라제의 발현(과다 발현 및 발현 부재 포함)과 관련된 상태 및 질병의 진단 및 치료에서 용도를 가질 수 있는 것으로 생각된다.
상기 항체의 예로는 다클론, 단일클론, 단쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편이 있으나, 이에 국한되지 않는다.
유플로테스 텔로머라제의 123 kDa 서브유닛에서 역전사 효소의 계통 발생학적 보존이 제공되면, 상기 서브유닛에 대해 유도된 항체는 인간을 포함하는 다른 생물에서 상동성 서브유닛, 예컨대, hTRT 및 유플로테스 43 kDa(p43) TRT 폴리펩티드의 인간의 상동체의 동정에 유용할 것으로 생각된다. 또한 본 발명에 제공된 모티프에 대해 유도된 항체는 치료 및/또는 진단적 이용 분야에서 용도를 가질 수 있는 것으로 생각된다.
항체 유도에 사용된 텔로머라제 서브유닛 단백질은 생물학적 활성을 보유할 필요가 없으나, 단백질 단편, 즉 올리고펩티드는 면역원성, 바람직하게는 항원성이어야 한다. 특이 항체의 유도에 사용된 펩티드는 5개 이상의 아미노산, 바람직하게는 10개 이상의 아미노산으로 구성되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이 펩티드는 천연 단백질의 아미노산 서열의 일부와 유사해야 하며, 작은 천연 존재형 분자의 전체 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 텔로머라제 서브유닛 단백질 아미노산의 짧은 연장부는 키홀 림펫 헤모시아닌 및 키메라 분자에 대해 생성된 항체와 같은 또 다른 단백질의 그 부분과 융합될 수 있다. 항체 유도에 사용된 완전 텔로머라제는 세포에서 단백질 및 RNA 성분의 동시 발현에 의해 또는 별개로 발현되거나 또는 합성된 성분으로부터 시험관내에서의 재구성에 의해 제조할 수 있다.
다클론 및 단일클론 항체의 제조 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 과학 및 특허 문헌, 예컨대, 문헌[Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, 뉴욕(1991); Stites(편집) Basic and Clinical Immunology(7판) Lange Medical Publications, 캘리포니아주 로스 알토스 및 여기에 인용된 참조 문헌(Stites); Goding, Monolonal Antibodies: Principles and Practice(2판) Academic Press, 뉴욕주 뉴욕(1986); Kohler(1975) Nature 256:495; Harlow and Lane, 상기 참조]에 기재되어 있다. 그러한 기술의 예로는 파지에서 발현되거나 또는 세포 상에서 유사한 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체를 선별하는 기술이 있다(문헌[Huse(1989) Science 246:1275 and Ward(1989) Nature 341:544] 참조). 재조합 항체는 문헌[Norderhaug(1997) J. Immunol. Methods 204:77-87]에 기재된 바와 같이, 포유류 세포에서 일시적 또는 안정한 발현 벡터에 의해 발현시킬 수 있다.
예컨대, 면역 친화도 정제 또는 진단에 사용하는 용도로 다량의 항체를 제조하기 위해서는, 본 발명에 의해 제공되는 다수의 면역원을 사용할 수 있다. 천연의 출처 또는 보다 바람직하게는 본 발명에 의해 제공되는 형질전환된 세포로부터 분리된 재조합 단백질로부터 정제된 텔로머라제를 단일클론 또는 다클론 항체 생산에 면역원으로서 사용할 수 있다. 임의의 생물 또는 재조합 텔로머라제 또는 TRT 단백질로부터 자연 발생적인 텔로머라제 또는 TRT 단백질은 순수한 형태 또는 불순한 형태로 사용할 수 있다. 면역원으로서 사용하기 위해 TRT 아미노산 서열의 임의의 부분을 사용하여 합성 펩티드를 제조한다. 펩티드는 단독으로 또는 면역원으로서 또 다른 조성물에 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 텔로미어 구조는 텔로머라제 특이 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 특정 조건하에서 텔로미어는 면역원으로서 사용될 수 있는 보다 고차원의 슈퍼 구조(G-4중체로 부름)(Sen(1992) Biochemistry 31:65-70; Fang(1993) Biochemistry 32:11646-11657)를 형성할 수 있다. 잠재적으로 면역원성을 가질 수 있는 기타 신규의 3차 구조로는 텔로머라제 생성물에 의한 안정한 머리핀 구조 또는 G-4중체 구조가 있다. 이들 신규한 구조는 예컨대, 텔로머라제 생성물의 형성을 모니터하고, 샘플내 텔로머라제 활성을 저해하거나 또는 텔로머라제를 동정할 수 있는 항체의 형성을 위한 면역원으로서 작용할 수 있다. 이들 신규 구조는 또한 뉴클레오티드에 대한 하이브리드화 표적이 될 수 있으며, 이들은 또한 텔로머라제 생성물의 형성을 측정하고, 활성을 저해하는 등의 용도로 사용할 수 있다.
다클론 및 단일클론 항체의 제조 방법은 당업자에게 알려져 있다. 간략히 언급하면, 면역원은 전술한 바와 같이 보조제와 혼합하며, 동물을 면역화한다. 면역원 제제에 대한 동물의 면역 반응은 시험 혈액을 채취하고, 면역원에 대한 반응성의 역가를 측정함으로써 모니터한다. 면역원에 대한 항체의 적당히 높은 역가가 얻어지는 경우에, 동물로부터 혈액을 모으고 항혈청을 제조한다. 단백질에 대해 반응성인 항체를 농축하기 위한 항혈청의 추가의 분류를 수행할 수 있다(Harlow and Lane의 상기 문헌 참조). 그러한 다클론 항체를 생성시키는 데 본 발명의 다양한 예시용 펩티드, 단백질 및 융합 단백질을 사용하여 왔다.
텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛에 대한 단일클론 항체는 배양물내 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 제조된다. 상기 기술의 예로는 Koehler 및 Milstein의 문헌[Koehler 및 Milstein, Nature 256:495-497(1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 기술, 인간의 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor 등, Immunol. today 4:72[1983]; Cote 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030[1983]) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc., 뉴욕주 뉴욕, pp77-96[1985])이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 면역 친화도 정제 또는 면역 분석에 사용하기 위한 다량의 단일클론 항체는 당업자에게 친숙한 다양한 기술에 의해 얻을 수 있다. 간략히 언급하면, 목적하는 텔로머라제 단백질로 면역화한 동물에서 유래한 비장 세포를 통상 골수종 세포와 융합시킴으로써 불멸화한다. 불멸화의 또 다른 방법으로는 당해 분야에서 널리 공지된 엡스타인 바 비루스를 사용한 형질전환, 종양유전자 또는 레트로비루스 또는 기타 방법이 있다. 단일의 불멸화된 세포로부터 생긴 콜로니는 텔로머라제 및 TRT에 대해 목적하는 특이성 및 친화도의 항체의 생산에 대해 검색한다. 상기 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 수율은 척추 동물 숙주의 복강내로의 주사를 비롯한 다양한 기술에 의해 증가시킬 수 있다. 한편, 적당한 인간 B 세포, 즉 문헌[Huse(1989) Science, 상기 참조]에 요약된 일반 프로토콜에 따라 면역화된 세포로부터 DNA 라이브러리를 검색함으로써 단일클론 항체 또는 그 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 분리할 수 있다.
항체의 제조를 위해서는, 염소, 토끼, 래트, 마우스 등을 포함하는 다양한 숙주는 면역원성을 보유하는 텔로머라제, 단백질 서브유닛 또는 임의의 부분, 단편 또는 올리고펩티드를 주사하여 면역화할 수 있다. 숙주 종에 따라, 다양한 보조제를 사용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다. 그러한 보조제는 시판되며, 그 예로는 프로인트, 광물성 겔(예컨대, 수산화알루미늄) 및 표면 활성 물질, 예컨대, 리소레시틴, 플루론산 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 유탁액, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. BCG(바실러스 칼멧-구에린) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)은 잠재적으로 유용한 보조제이다.
동물(예컨대, 마우스 또는 토끼의 근친계)을 TRT 또는 그 단편, 예컨대, 폴리펩티드 또는 서열번호 118을 포함하는 펩티드로, 또는 동종형 또는 그 면역원성 단편으로, 단독으로 또는 표준 보조제(예컨대, 프로인트 보조제) 및 표준 면역화 프로토콜을 사용하여 면역화할 수 있다. 한편, 본원에 개시된 서열에서 유래하고 캐리어 단백질에 접합된 합성 펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다. 다클론 형청을 모으고, 면역분석, 예컨대, 고체 지지체상에 고정된 텔로머라제를 사용한 고체상 면역분석에서 텔로머라제에 대해 역가를 측정하였다. 역가가 예컨대, 104이상인 다클론 항혈청을 선별하고, 예컨대, 경쟁적 결합 면역 분석법을 사용하여 다른 생물에서 유래한 상동성 단백질 및/또는 비텔로머라제 단백질에 대한 그 교차 반응성에 대해 시험하였다. 특이적 단일클론 및 다클론 항체 및 항혈청은 보통 약 1 μM 이상, 바람직하게는 약 0.1 μM 이상 및 가장 바람직하게는 0.01 μM 이상의 KD로 결합할 것이다.
항체들은 또한 임파구 군집에서의 생체내 생산을 유도하거나 또는 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 매우 특이적인 결합 시약의 패널을 검색함으로써 제조할 수도 있다(Orlandi 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 86:3833[1989]; and Winter and Milstein, Nature 349:293[1991]).
텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛에 대해 특이적인 결합 부위를 포함하는 항체 단편도 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 그러한 단편의 예로는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2단편 및 F(ab')2단편의 이황화물 브리지를 환원시켜 생성시킬 수 있는 Fab 단편이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 한편, Fab 발현 라이브러리는 목적하는 특이성을 가진 단일클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있도록 구성할 수 있다(Huse 등, Science 256:1275[1989]).
정립된 특이성을 가진 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 경쟁적 결합 분석 또는 면역 방사성 측정 분석법에 대한 다양한 프로토콜은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 그러한 면역 분석법은 통상 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛과 그 특이 항체 사이의 복합체의 형성 및 복합체 형성의 측정을 요한다. 특이적 텔로머라제 단백질 서브유닛상의 두 개의 비간섭성 에피토프에 대해 반응성이 있는 단일클론 항체를 이용하는 2 부위 단일클론계 면역 분석법이 일부 상황에서는 바람직하지만, 경쟁적 결합 분석법도 이용할 수 있다(예컨대, 문헌[Maddox 등, J. Exp. Med., 158:1211(1983)] 참조).
도 32에 도시한 서열을 포함하는 군에서 선택되는 펩티드를 사용하여 인간 및 기타 텔로머라제 단백질에 대해 특이적으로 유도된 다클론 및 단일클론 항체를 생성시킬 수 있다. 이 펩티드는 텔로머라제 복합체내의 단백질-RNA, 단백질-단백질 상호 작용 및 텔로미어에서의 단백질-DNA 상호작용의 저해에 유용하다. 이들 펩티드에 대해 생성된 항체는 다양한 분야, 예컨대, 텔로머라제 활성을 저해할 수 있는 항암 치료제로, 치료용의 천연의 텔로머라제의 정제에, 인간 텔로머라제의 다른 성분 및 인간 텔로머라제와 관련된 기타 단백질의 정제 및 클로닝 및 진단 시약에 사용된다.
텔로머라제 또는 TRT 단백질의 농도는 본 발명의 다양한 면역 분석법에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 면역 분석법은 상기 Stites의 문헌에 기재되어 있다. 본 발명의 면역 분석법은 여러 가지 입체 형태중 임의의 것으로 실시할 수 있으며, 기초 정보는 문헌[Enzyme Immunoassay, E.T. Maggio 편집, CRC Press, 플로리다주 보카 라톤(1980); Tijssen, and Harlow and Lane, 상기 참조]을 참조할 수 있다.
면역학적 결합 분석
면역학적 결합 분석법(예컨대, 미국 특허 제4,366,241호, 제4,376,110호, 제4,517,288호 및 제4,837,168호)은 당해 분야에 공지되어 있다. 검토를 위해서는, 문헌[Methods in Cell Biology Vol.37: Antibodies in Cell Biology, Asai 편집, Academic Press, Inc. 뉴욕주 뉴욕, 상기 참조]을 참조할 수 있다. 면역학적 결합 분석법(또는 면역 분석법)은 통상 피분석물에 특이적으로 결합하고 피분석물을 종종 고정화하는 포집제(capture agent)를 이용한다. 포집제는 피분석물에 특이적으로 결합하는 부분이다. 본 발명의 일 양태에서 포집제는 텔로머라제 또는 TRT에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대, 본 발명의 방법에 의해 제조된 항체(항-텔로머라제 또는 항-TRT)이다.
면역 분석법은 또한 전술한 바와 같이 포집제 및 피분석물에 의해 형성된 결합 복합체에 특이적으로 결합하고 그것을 표지하는 표지제(labeling agent)를 종종 이용한다. 표지제는 자체적으로 예컨대, 항체/피분석물 복합체를 포함하는 부분중 하나일 수 있으며, 표지제는 표지된 텔로머라제 또는 표지된 항-텔로머라제 항체일 수 있다. 한편, 표지제는 제3의 부분, 예컨대, 항체-텔로머라제 복합체에 특이적으로 결합하는 또 다른 항체일 수 있다. 표지제는 예컨대, 표지를 보유하는 제2 항-텔로머라제 항체일 수 있다. 제2 항체는 표지를 가지지 않을 수 있으나, 그것은 다시 제2 항체가 유래한 종의 항체에 특이적인 표지된 제3의 항체와 결합할 수 있다. 제2 항체는 검출 가능한 부분, 예컨대, 제3의 표지된 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴(예컨대, 효소 표지된 스트렙트아비딘)에 의해 변형시킬 수 있다. 면역글로불린 불변 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 기타 단백질, 예컨대, 단백질 A 또는 단백질 G를 표지제로서 사용할 수도 있다. 이들 단백질은 스트렙토코커스 박테리아의 세포벽의 정상적인 구성성분이며 다양한 종에서 유래한 면역글로불린 불변 영역과 강한 비면역원적 반응성을 나타낸다(일반적으로 문헌[Akerstrom(1985) J. Immunol.135:2589-2542; Chaubert(1997) Mod Pathol10:585-591(1997)] 참조).
분석을 통틀어, 시약의 각각의 조합후에 항온처리 및/또는 세척 단계가 필요할 수 있다. 항온처리 단계는 약 5초 내지 수 시간, 바람직하게는 약 5분 내지 약 24 시간으로 변화될 수 있다. 그러나, 항온처리 시간은 분석 형식, 피분석물, 용액의 부피, 농도 등에 따라 달라질 것이다. 통상, 분석은 주위 온도에서 수행할 것이지만, 일정 온도 범위를 넘어, 예컨대 10EC 내지 40EC에서 수행할 수도 있다.
(1) 비경쟁적 분석 형식
텔로머라제 및 TRT 단백질을 검출하기 위한 면역 분석법은 예컨대 경쟁적 또는 비경쟁적일 수 있다. 비경쟁적 면역 분석법은 포집된 피분석물(텔로머라제, TRT 또는 hTRT)의 양을 직접 측정하는 분석법이다. 한 가지 바람직한 "샌드위치" 분석법에서, 포집제(항-텔로머라제 항체)는 이들이 고정화회어 있는 고체 지지체에 직접 결합할 수 있다. 이들 고정화된 항체는 시험 샘플에 존재하는 단백질을 포집한다. 이렇게 고정화된 텔로머라제 또는 TRT 단백질은 표지제, 예컨대, 표지를 보유하는 제2 항-텔로머라제 항체와 결합된다. 한편, 제2 항-텔로머라제 또는 항-TRT 항체는 표지가 없을 수도 있지만, 그것은 다시 제2 항체가 유래한 종의 항체에 특이적인 표지된 제3의 항체와 결합할 수 있다. 제2 항체는 검출 가능한 부분, 예컨대, 제3의 표지된 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴(예컨대, 효소 표지된 스트렙트아비딘)에 의해 변형시킬 수 있다.
(2) 경쟁적 분석 형식
경쟁적 분석에서는, 샘플에 존재하는 피분석물에 의해 포집제(항-텔로머라제 또는 항-TRT 항체)로부터 치환된(즉, 경쟁적으로 소멸되는) 첨가된(외래성) 피분석물(텔로머라제 또는 TRT)의 양을 측정함으로써, 샘플에 존재하는 피분석물(텔로머라제)의 양을 간접적으로 측정한다. 한 가지 경쟁적 분석에서는, 통상 표지된 기지량의 텔로머라제 또는 TRT를 샘플에 첨가한 다음, 샘플을 포집제와, 이 경우에는 텔로머라제 또는 TRT에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시킨다. 항체에 결합된 표지된 텔로머라제 또는 TRT의 양은 샘플에 존재하는 텔로머라제 또는 TRT의 농도에 반비례한다.
또 다른 양태에서, 항체는 고체 지지체에 고정화된다. 텔로머라제/항체 또는 TRT/항체 복합체에 존재하는 텔로머라제 또는 TRT의 양을 측정하거나 또는 복합체를 형성하지 않은 텔로머라제 또는 TRT의 잔류량을 측정함으로써, 항체에 결합되는 텔로머라제 또는 TRT의 양을 측정할 수 있다. 텔로머라제 또는 TRT의 양은 표지된 텔로머라제 또는 TRT 분자를 제공함으로써 검출할 수 있다.
햅텐 저해 분석이 또 다른 경쟁적 분석법이다. 이 분석법에서는, 기지의 피분석물, 본 발명에서는 텔로머라제 또는 TRT를 고체 지지체상에 고정화한다. 항-텔로머라제 또는 항-TRT 항체의 기지량을 샘플에 첨가한 다음, 고정화된 텔로머라제 또는 TRT와 접촉시킨다. 이 경우에, 고정환된 텔로머라제 또는 TRT에 결합된 항-텔로머라제 또는 항-TRT 항체의 양은 샘플에 존재하는 텔로머라제 또는 TRT의 양에 반비례한다. 또한 항체의 고정화된 분획이나 용액에 잔존하는 항체의 분획을 검출함으로써 고정화된 항체의 양을 검출할 수 있다. 검출은 항체가 표지된 경우에는 직접적으로 수행하거나, 또는 전술한 바와 같이 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 부분의 후속적인 첨가에 의해 간접적으로 수행할 수 있다.
경쟁적 결합 형식의 면역 분석법은 단백질 또는 효소 복합체가 본 발명의 TRT 또는 텔로머라제 효소인 지 여부를 측정하기 위한 교차 반응성 측정에 사용할 수 있다. 예를 들면, TRT는 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 단백질은 항혈청이 고정화된 항원에 결합하는 것과 경쟁하는 분석에 첨가한다. 단백질이 고정화된 TRT에의 항혈청의 결합과 경쟁하는 능력은 고체 지지체를 피복하는 데 사용된 것과 같은 TRT에 의한 결합과 비교한다.
(3) 기타 분석 형식
본 발명은 또한 샘플내 텔로머라제 단백질의 존재를 검출 및/또는 정량 분석하기 위한 웨스턴 블롯(면역블롯) 분석 방법을 제공한다. 이 기술은 일반적으로 분자량에 기초한 전기영동에 의해 샘플 단백질을 분리하는 단계, 분리된 단백질을 적당한 고체 지지체(예컨대, 니트로셀룰로스 필터, 나일론 필터 또는 유도된 나일론 필터)로 옮기는 단계, 샘플을 텔로머라제에 특이적으로 결합하는 항체와 항온 처리하는 단계를 포함한다. 항-텔로머라제 단백질 항체는 고체 지지체상의 텔로머라제에 특이적으로 결합한다. 이들 항체는 직접적으로 표지하거나 아니면, 항-텔로머라제 단백질에 특이적으로 결합하는 표지된 항체(예컨대, 표지된 양의 항-마우스 항체)를 사용하여 후속적으로 검출할 수 있다.
항체를 사용하여 발현 라이브러리를 프로브 처리할 수 있다(문헌[Young (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 80:1194] 참조). 일반적으로, cDNA 발현 라이브러리는 시판 키트로부터 또는 용이하게 입수 가능한 성분들을 사용하여 제조할 수 있다. 파지(Hurst(1997) Methods Mol Biol 69:155-159), 박테리아(데이비스 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 94:2128-2132), 곤충(Granziero(1997) J. Immunol. Methods 203:131-139), 효모 및 동물 세포 라이브러리(제노푸스 난모세포)를 사용할 수 있다. 표적 mRNA로 선택적으로 농축되거나, 또는 단백질이 풍부하고, 벡터내로 결찰되는 cDNA를 생성시키는 공급원으로부터 mRNA를 선별하며, 벡터를 면역 검색용 라이브러리 숙주 세포내로 형질전환시킨다. 검색은 니트로셀룰로스 또는 나일론 막과 같은 고체 지지체상의 고정되거나 세포상의 특이 단백질에 결합된 항체의 결합 및 동정을 수반한다. 균질 상태로 정제하기 위해 양성 클론을 선별하고, 목적하는 숙주 세포에서 발현시키기 위해 분리된 cDNA를 제조한다(문헌[Methods of Cell Biology, Vol.37, Antibodies in Cell Biology, Assai(편집), 1993] 참조).
본 발명의 방법은 또한 리포좀 면역 분석법(LIA)(Rongen(1997) J. Immunol. Methods 204:105-133)을 포함하는 기타 분석 형식에 적합한데, 상기 리포좀 면역 분석법에서는 리포좀이 특이 분자(예컨대, 항체)에 결합하도록 조작하고, 해리 캡귤화된 시약 또는 마커를 이용한다. 해리된 케미컬을 표준 기술을 사용하여 검출할 수 있다(예컨대, 문헌[Monroe(1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34] 참조).
텔로머라제 특이 항체를 사용하는 진단 분석법
특정 텔로머라제 및 텔로머라제 단백질 서브유닛 항체가 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛의 발현을 특징으로 하는 상태 또는 질병의 진단에, 또는 텔로머라제, 그 단편, 작동물질 또는 저해제(텔로머라제의 발현을 감소시킬 수 있는 안티센스 전사체 포함)로 치료한 환자를 모니터하는 분석에 유용하다. 텔로머라제에 대한 진단 분석법으로는 인간 체액 또는 세포 또는 조직 추출물에서 텔로머라제를 검출하기 위해 항체 및 표지를 이용하는 방법이 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체는 변형 여부에 상관 없이 사용할 수 있다. 흔히, 폴리펩티드 및 항체는 이들을 리포터 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 연결함으로써 표지할 수 있다. 광범위한 리포터 분자가 알려져 있으며, 이 중 몇 개는 전술하였다. 구체적으로, 본 발명은 인간의 질병의 진단에 유용하지만, 본 발명은 수의학 분야에도 사용할 수 있다.
각각의 단백질에 특이적인 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하여 텔로머라제 단백질(들)을 측정하는 다양한 프로토콜은 당해 분야에 공지되어 있다. 그 예로는 효소 결합된 면역 흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역 분석법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)이 있다. 텔로머라제 단백질 또는 서브유닛상의 두 개의 비간섭성 에피토프에 대해 반응성이 있는 단일클론 항체를 이용하는 2 부위 단일클론계 면역 분석법이 바람직하지만, 경쟁적 결합 분석법도 이용할 수 있다. 이들 분석법은 예컨대, 문헌[Maddox 등, J. Exp. Med., 158:1211(1983)]에 기재되어 있다.
진단 방법의 기초를 제공하기 위해, 통상 인간 텔로머라제 발현에 대한 정상치 또는 표준치가 설정된다. 이것은 동물이나 인간인 정상 개체로부터 취한 세포 추출물 또는 체액을 당해 분야에 널리 공지된 복합체 형성에 적합한 조건하에 텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛(들)과 배합함으로써 수행한다. 표준 복합체의 형성량은 기지량의 텔로머라제 단백질을 함유하는 다양한 인공 막을 생검 조직에서 취한 대조군 및 질병 샘플과 비교하여 정량 분석한다. 그 다음, 정상 샘플로부터 얻은 표준치는 질병(예컨대, 전이)에 의해 잠재적으로 영향을 받은 개체로부터 취한 샘플로부터 얻은 값과 비교한다. 표준치와 대검치 사이의 편차는 질병 상태의 존재를 설정한다.
약제 검색
텔로머라제의 DNA 복제능 또는 텔로머라제 또는 TRT의 부분 활성을 변화시킬 수 있는 조성물을 임의의 수단으로 검색하는 방법에 관한 것이다. 다양한 양태로, 본 발명은 TRT 단백질의 활성 부위에 결합하거나 또는 그 RNA 부분의 역전사를 방해하는 길항물질의 검색; 핵산 및/또는 텔로머라제 관련 조성물과 TRT의 연합성, 예컨대, TR과 TRT의 연합 또는 TRT와 텔로머라제 관련 단백질의 연합 또는 TRT와 텔로미어 또는 뉴클레오티드와의 연합을 저해하는 조성물의 검색; 효소 복합체, 예컨대, TR 또는 TRT에 대해 유도된 항체의 해리를 촉진하거나 연합을 촉진하는 조성물의 검색; 효소의 처리능에 영향을 미치는 작용제의 검색; 및 TRT에 결합하는 핵산(예컨대, TR과 동일하거나 상보적인 핵산) 및 기타 조성물의 검색을 포함한다. 본 발명은 또한 TRT 유전자의 전사 및/또는 TRT 유전자 생성물의 해독을 증가 또는 감소시키는 조성물의 검색을 포함한다.
길항물질 활성에 대한 검색은 텔로머라제의 복제능을 감소시켜 암 세포와 같은 다른 불멸성 세포를 사멸시키는 조성을 제공한다. 텔로머라제 활성은 중요한 암 마커로서 동정되었는데, 그 한 가지 레벨은 질병의 결과 또는 심각도를 검출, 진단 및 예단할 수 있는 것으로 미국 특허 제5,489,508호, 제5,648,125호 및 제5,639,613호에 기재되어 있다. 본 발명은 텔로머라제 활성 및 hTRT 유전자 발현을 분석함으로써 암을 진단 및 예단하는 유용한 시약을 제공한다.
작동물질 활성 또는 전사 또는 해독 활성화인자에 대한 검색은 텔로머라제의 텔로미어 복제능 또는 부분적 활성을 증가시키는 조성물을 제공한다. 그러한 작동물질 조성물은 유용한 단백질을 발현시킬 수 있는 세포를 포함하여 정상의 비형질전환된 세포를 불멸화하는 방법을 제공한다. 그러한 작동물질은 또한 세포 노화를 제어하는 방법을 제공한다.
텔로머라제 또는 텔로머라제 서브유닛 단백질 또는 그 촉매적 또는 면역원성 단편 또는 그 올리고펩티드는 다양한 약제 검색 기술중 임의의 기술로 치료용 화합물을 검색하는 데 사용할 수 있다. 그러한 시험에 이용된 단편은 용액중에 유리될 수 있고, 고체 지지체에 부가되고, 세포 표면상에 보유되거나 또는 세포내에 위치할 수 있다. 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질과 시험한 작용제 사이의 결합 복합체의 형성을 측정할 수 있다.
텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛에 대한 적당한 결합 친화도를 가진 화합물의 고처리량 검색에 대해 사용할 수 있는 약제 검색을 위한 또 다른 기술은 문헌["Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity"(Geysen, WO 출원 제84/03564호, 1984.9.13 공개, 본원에 참고로 인용함]에 기재되어 있다. 요약하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물은 플라스틱 핀 또는 일부 기타 표면과 같은 고체 지지체상에 합성된다. 펩티드 시험 화합물은 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛의 단편과 반응시키고, 세척한다. 결합된 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛은 당해 분야에 널리 공지된 기타 용도에 대해 개발된 표준 방법으로 검출한다. 실질적으로 정제된 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛은 전술한 약제 검색 기술에 사용하기 위해 평판상에 직접 코팅할 수도 있다. 한편, 비중화성 항체를 사용하여 펩티드를 포집하고, 그것을 고체 지지체상에 고정화할 수 있다.
본 발명은 또한 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질(들)에 결합할 수 있는 중화성 항체가 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질에 결합하는 것에 대해 시험 화합물과 특이적으로 경쟁한다. 이러한 방법으로, 항체들을 사용하여 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질을 가진 하나 이상의 항원성 결정인지에 결합하는 능력을 항체와 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출할 수 있다.
텔로머라제 서브유닛 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 그 용도
텔로머라제 서브유닛 단백질 또는 그 임의의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 진단 및/또는 치료용 목적으로 사용할 수 있다. 진단 목적으로, 본 발명의 텔로머라제 서브유닛 단백질을 암호화하는 서열을 사용하여 텔로머라제 또는 서브유닛 단백질의 유전자 발현을 검출하고 정량 분석할 수 있다. 진단 분석은 텔로머라제의 부재, 존재 및 과다 발현을 구별하는 데, 그리고 치료 방해중의 텔로머라제 레벨의 조절을 모니터하는 데 유용하다. 올리고뉴클레오티드 서열, 안티센스 RNA 및 DNA 분자 및 합성 및 그 비자연 발생적 유사체, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)과 같은 비이온성 주쇄는 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 관점은 텔로머라제 서브유닛 단백질 또는 친연 관계가 가까운 분자를 암호화하는 게놈 서열을 포함하여 폴리뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있는 하이브리드화 또는 PCR 프로브 또는 프라이머를 제공하는 것이다. 프로브의 특이성(프로브가 특이성이 높은 영역(예컨대, 5' 조절 영역에서 10개의 특이 뉴클레오티드)으로부터 제조되거나 또는 특이성이 보다 낮은 영역(예컨대, 특히 3' 영역에서)으로부터 제조되는 지 상관 없이) 및 하이브리드화 또는 증폭의 엄중성(최대, 고, 중간 또는 저)은 프로브가 단지 자연 발생적 텔로머라제, 텔로머라제 서브유닛 단백질 또는 특정 텔로머라제 또는 TRT종의 관련 서열 또는 TRT 폴리뉴클레오티드 멤버중 전부 또는 일부를 동정하는 지 여부를 결정할 것이다.
프로브는 또한 관련 서열의 검출에 사용할 수 있고, 이들 텔로머라제 서브유닛 단백질 암호화 서열중 임의의 것에서 유래한 뉴클레오티드를 50% 이상(동일한 또는 상보적인) 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 하이브리드화 프로브는 본 발명에 의해 제공된 뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열번호 1, 3, 62, 66, 69 또는 117)로부터 또는 텔로머라제 서브유닛 단백질을 암호화하는 자연 발생적 서열의 프로모터, 인핸서 요소 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유래할 수 있다. 하이브리드화 프로브는32P 또는35S와 같은 시판되는 방사핵종을 포함하는 다양한 리포터 기 또는 아비딘/비오틴 커플링계를 통해 프로브에 결합된 알칼리 포스파타제와 같은 효소 표지에 의해 표지할 수 있다.
DNA에 대한 특이적 하이브리드화 프로브를 제조하는 기타 수단으로는 텔로머라제 서브유닛 단백질 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 mRNA 프로브 제조용 벡터내로 클로닝하는 방법이 있다. 그러한 벡터는 당해 분야에 알려져 있고 시판되며, 이들을 사용하여 적당한 RNA 폴리머라제를 T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제로서 그리고 적당한 방사성 표지된 뉴클레오티드의 첨가에 의해 시험관내에서 RNA 프로브를 합성할 수 있다.
진단에의 이용
텔로머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 텔로머라제의 비정상적 발현과 관련된 질병 또는 상태의 진단에 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간 텔로머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 텔로머라제 발현을 검출하기 위해 생검에서 얻은 체액 또는 조직의 하이브리드화 또는 PCR 분석에 사용할 수 있다. 그러한 정성적 또는 정량적 방법의 형태로는 서던 또는 노던 분석, 도트 블롯 또는 기타 막에 기초한 기술; PCR 기술; 딥 스틱, 핀, 칩 및 ELISA 기술이 있을 수 있다. 이들 기술은 모두 당해 분야에 널리 알려져 있으며, 다수의 시판 진단용 키트의 기본이다.
본원에 개시된 텔로머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 질병(전이를 포함)과 관련된 활성화 또는 유도를 검출하는 분석법의 근거를 제공하며; 또한, 본원에 개시한 텔로머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 텔로머라제의 발현의 결손을 검출할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지된 방법으로 표지하고, 하이브리드화 복합체 형성에 적합한 조건하에 환자로부터 체액 또는 조직 샘플에 첨가할 수 있다. 항온처리 기간후에, 뉴클레오티드가 효소로 표지된 경우에는 샘플을 선택적으로 염료(또는 현상제를 필요로 하는 기타 표지)를 함유하는 적합한 유체로 세척한다. 적합한 유체를 세정한 후에, 염료를 정량 분석하고 표준과 비교한다. 생검 샘플 또는 추출 샘플내 염료의 양이 유사한 대조군 샘플의 양에 비해 상당히 증가되면, 뉴클레오티드 서열은 샘플내 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하고, 샘플내 텔로머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 증가된 레벨의 존재는 관련 질병의 존재를 나타낸다. 한편, 텔로머라제 서열을 정상적으로 발현시키는 조직에서 인간 텔로머라제 서열의 발현의 상실은 비정상적인, 즉 질병 상태의 존재를 나타낸다.
그러한 분석법을 사용하여 동물 연구에서, 임상 실험에서 또는 개개 환자의 치료를 모니터하는 데 있어서 특정 치료용 처리 체계의 효능을 평가할 수 있다. 이것은 동물 또는 인간의 정상 개체로부터 취한 체액 또는 세포 추출물을 하이브리드화 또는 증폭에 적합한 조건하에 인간 텔로머라제 또는 그 부분과 배합함으로써 수행된다. 표준 하이브리드화는 정상 개체에 대해 얻은 값을 실질적으로 정제된 기지량의 인간 텔로머라제를 사용하는 동일한 실험에서 수행되는 인간 텔로머라제의 희석 시리즈와 비교하여 정량 분석할 수 있다. 정상 샘플에서 얻은 표준치는 텔로머라제 관련 질병에 의해 감염된 환자의 샘플로부터 얻은 값과 비교할 수 있다. 표준치와 피검치 사이의 편차는 질병의 존재를 설정한다.
일단 질병이 확정되면, 치료제가 투여되고 치료 프로필이 생긴다. 그러한 분석법을 조절적인 기준으로 반복하여 프로필의 값이 정상 또는 표준 패턴으로의 복귀를 향해 진행하는 지 여부를 평가할 수 있다. 성공적인 치료 프로필을 사용하여 며칠 또는 몇달의 기간에 걸쳐 치료 효과를 나타낼 수 있다.
미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호(본원에 참고로 인용함)에 기재된 바와 같이 사용할 수 있는 PCR은 텔로머라제 서브유닛 단백질을 암호화하는 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드에 추가의 용도를 제공한다. 그러한 올리고머는 일반적으로 화학적으로 합성되지만, 효소에 의해 생성되거나 또는 재조합 출처로부터 제조될 수도 있다. 2본쇄 핵산은 뉴클레오티드 서열의 두 개의 별개의 가닥, 즉 하나는 센스 방향(5'→3')이고 다른 하나의 안티센스 방향(3'→5')인 가닥을 포함하며, 이 핵산을 특이 유전자 또는 상태의 동정에 최적화된 조건하에 이용할 수도 있다. 올리고머, 올리고머의 정착된 세트 또는 심지의 올리고머의 축퇴성 집합체를 밀접하게 관련된 DNA 또는 RNA 서열의 검출 및/또는 정량 분석을 위해 덜 엄중한 조건하에 이용할 수 있다.
또한, 특정 분자의 발현을 정량 분석하는 데 사용할 수 있는 방법으로는 방사성 표지법(Melby 등, J. Immunol. Meth., 159:235-44[1993]) 또는 비오티닐화(Duplaa 등, Anal. Biochem., 229-36[1993]) 뉴클레오티드, 대조군 핵산의 동시 증폭, 및 실험 결과가 외삽되는 표준 곡선을 들 수 있다. 다수 샘플의 정량 분석은 당해 올리고머가 다양한 희석률에서 제공되며, 분광 분석 또는 비색 반응은 신속한 정량 분석을 제공하는 ELISA 형식의 분석을 수행함으로써 가속될 수 있다. 이 유형의 명확한 진단은 보건 전문가가 공격적 치료를 개시하고 상태의 추가 악화를 방지하게 할 수 있다. 유사하게, 추가의 분석법을 사용하여 치료중 환자의 차도를 모니터할 수 있다. 또한 새로운 기술이 3문자 유전자 암호, 특정 염기쌍 상호 작용과 같은 현재 알려져 있는 뉴클레오티드 서열의 성질에 의존한다면, 본원에 개시하는 뉴클레오티드 서열은 아직 개발된 적이 없는 분자 생물학 기술에도 사용할 수 있다.
치료적 이용
다른 텔로머라제 서열과의 그 상동성에 기초하여, 본원에 개시하는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전이의 치료에 유용할 수 있으며, 특히 텔로머라제 발현의 저해가 치료 효과를 나타낼 수 있다.
레트로비루스, 아데노비루스, 허피스 또는 백시니아 비루스에서 또는 다양한 박테리아 플라스미드에서 유래한 발현 벡터를 표적이 되는 기관, 조직 또는 세포 군집에 뉴클레오티드 서열(센스 또는 안티센스)의 전달에 사용할 수 있다. 당업자에게는 널리 알려진 방법을 사용하여 텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 서열의 안티센스를 발현시킬 재조합 벡터를 구성할 수 있다. 예컨대, Sambrook 등의 상기 문헌 및 Ausubel 등의 상기 문헌에 기재된 기술을 참조할 수 있다.
전길이의 cDNA 서열 및/또는 그 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 연구자로 하여금 유전자 기능의 센스(Youssoufian and Lodish, Mol. Cell. Biol., 13:98-104[1993]) 또는 안티센스(Eguchi 등, Ann. Rev. Biochem., 60:631-652[1991]) 조절에서 연구용 도구로서 다양한 모티프를 포함하여 텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 서열을 사용하게 할 수 있다. 그러한 기술은 이제 당해 분야에서 널리 알려져 있으며, 센스 또는 안티센스 올리고머나 보다 큰 단편은 암호 영역 또는 제어 영역을 따라 다양한 위치로부터 조작될 수 있다.
텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 유전자는 목적하는 텔로머라제 단편의 고레벨을 발현시키는 발현 벡터로 세포 또는 조직을 형질감염시킴으로써 차단될 수 있다. 그러한 구성체는 해독할 수 없는 센스 또는 안티센스 서열을 가진 세포를 증가시킬 수 있다. DNA내로의 통합이 없는 경우에조차, 상기 벡터는 내재성 뉴클레아제에 의해 모든 사본이 기능을 상실할 때까지 RNA 분자를 계속 전사할 수 있다. 일시적 발현은 비복제성 벡터를 사용하면 1개월 이상 지속될 수 있으며, 적당한 복제 요소가 벡터계의 일부인 경우에는 훨씬 더 오래 지속된다.
전술한 바와 같이, 유전자 발현의 변형은 인간 텔로머라제를 암호화하는 서열(즉, 프로모터, 인핸서 및 인트론)의 대조군 영역에 안티센스 분자, DNA, RNA, PNA 등을 조작함으로써 얻을 수 있다. 전사 개시부(예컨대, 리더 서열의 -10 영역과 +10 영역 사이)에서 유래한 올리고뉴클레오티드가 일부 용도에 바람직하다. 안티센스 분자는 또한 전사체가 리보좀에 결합하는 것을 방지함으로써 mRNA의 해독을 차단하도록 조작할 수 있다. 유사하게, "3중 나선" 염기쌍 방법을 사용하여 저해를 달성할 수 있다. 3중 나선 염기쌍 형성은 이중 나선이 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자의 결합을 위해 충분히 개방하는 능력을 상쇄한다(3중 나선 DNA를 사용한 최근의 치료적 발전의 검토를 위해서는, 문헌[Gee 등, Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco 뉴욕(1994)] 참조).
저해성 올리고뉴클레오티드
본 발명에 의해 제공되는 특히 바람직한 한 가지 세트의 저해제는 기능성 TRT 단백질의 생산을 방해 또는 저해하는 경우에 TRT 단백질을 암호화하는 mRNA에 결합하거나 또는 TRT 유전자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 기타 올리고뉴클레오티드는 hTR과 같은 텔로머라제의 RNA 부분과 상호작용하거나 또는 텔로머라제 또는 TRT가 그 DNA 표적에 또는 하나의 텔로머라제 성분이 다른 성분에 또는 지지체에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 또한 텔로머라제 효소 또는 TRT 단백질에 결합할 수 있고, 전술한 바와 같이 부분적 활성(예컨대, 처리 활성, 그 역전사 효소 활성, 그 핵분해 활성 등)을 저해한다. 연합은 앱타머에서처럼 일반적인 결합에 의해 또는 또 다른 핵산에의 서열 특이적 하이브리드화를 통해 이루어질 수 있다.
또 다른 유용한 부류의 저해제로는 hTRT mRNA 또는 hTR의 불활성화 또는 절단을 일으키는 올리고뉴클레오티드가 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형시키거나 또는 리보자임과 같은 절단을 일으키는 효소 활성을 가진다. 전술한 바와 같이, 목적하는 활성을 가진 것들에 대한 다수의 상이한 상기 올리고뉴클레오티드 집합체를 검색할 수 있다.
또 다른 유용한 부류의 저해제로는 폴리펩티드에 결합하는 올리고뉴클레오티드가 있다. 특이적 폴리펩티드 표적에 결합하는 2본쇄 또는 1본쇄 DNA 또는 1본쇄 RNA 분자는 "앱타머(aptamer)"로 불린다. 특이적 올리고뉴클레오티드-폴리펩티드 연합은 정전기적 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 예컨대, 앱타머는 트롬빈상의 음이온 결합 엑소부위에 특이적으로 결합하는데, 이 때, 트롬빈은 다가 음이온성 헤파린에 생리적으로 결합한다(Bock(1992) Nature 355:564-566). TRT 단백질은 hTR 및 그 DNA 기질에 결합하고, 본 발명은 정제된 형태의 hTRT 및 기타 TRT 단백질을 다량으로 제공하기 때문에, 당업자는 본 발명의 방법을 사용하여 TRT-결합 앱타머를 용이하게 검출할 수 있다.
텔로머라제가 매개하는 DNA 복제의 길항물질은 또한 리보자임을 통해서처럼 상보적 서열 인지 또는 절단을 통해 hTR(Norton(1996) Nature Biotechnology 14:615-619)와 같은 TR의 저해에 기초할 수도 있다. 그러한 작용제는 목적하는 효과를 증가시키기 위해 본 발명의 작용제와 함께 사용할 수 있다.
텔로머라제 활성은 TRT mRNA에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 TRT mRNA를 표적으로 함으로써 저해할 수 있다. 일부 상황에서는, 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용되는 자연 발생적 핵산은 비교적 길고(18개 내지 40개 뉴클레오티드), 고농도로 존재할 필요가 있다. 광범위한 합성된 비자연 발생적 뉴클레오티드 및 핵산 유사체가 상기 잠재적인 문제점을 겨냥한 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 전술한 바와 같이, N-(2-아미노에틸)글리신 단위와 같은 비이온성 주쇄를 포함하는 PNA를 사용할 수 있다. 문헌[WO97/03211호; WO96/39154호; Mata(1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, Sudhir Agrawal 편집(Humana Press, 뉴저지주 토토와, 1996)]에 기재된 바와 같이, 포스포로티오에이트 연결체를 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용할 수도 있다. 본 발명에 의해 제공되는 합성 DNA 주쇄 유사체를 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전술한 바와 같이 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트 및 모폴리노 카르바메이트 핵산을 포함할 수도 있다.
전술한 바와 같이, 조합 화학 방법을 사용하여 본 발명의 TRT 단백질과 같은 임의의 표적을 향한 적당한 결합 친화도 및 특이성을 가지는 특이적 올리고뉴클레오티드에 대해 신속하게 검색할 수 있는 광대한 수의 올리고뉴클레오티드를 생성시킬 수 있다(일반적인 기본 정보를 위해서는 문헌[Gold(1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584).
저해성 리보자임
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임 작용 메카니즘은 상보성 표적 RNA에의 리보자임 분자의 서열 특이적인 하이브리드화와 그에 이은 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 필요로 한다. 본 발명의 범위내에는 인간 텔로머라제를 암호화하는 서열의 엔도뉴클레아제 절단을 특이적으로 그리고 효과적으로 촉매하는 조작된 해머머리형 모티프 리보자임 분자가 포함된다.
임의의 잠재적 RNA 표적내의 특정의 리보자임 절단 부위는 서열 GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대해 표적 분자를 스캐닝함으로써 초기에 동정된다. 일단 동정되면, 절단 부위를 포함하는 표적 유전자의 영역에 해당하는 리보뉴클레오티드 15개 내지 20개의 짧은 RNA 서열은 올리고뉴클레오티드를 작동 불능 상태로 만들 수 있는 2차 구조의 특징에 대해 평가할 수 있다. 후보 표적의 적합성은 리보뉴클레아제 보호 분석법을 사용하여 상보성 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화에 대한 접근성을 시험하여 평가할 수도 있다.
리보자임은 표적 RNA를 절단하는 RNA의 효소 부분에 매우 근접하여 유지되는 리보자임의 표적 RNA 결합 부분을 통해 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 따라서, 리보자임은 상보적 염기쌍 형성을 통해 표적 RNA를 인지하고 결합하며, 일단 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA를 효소에 의해 절단하고 불활성화시키는 작용을 한다. 그러한 방법으로 표적 RNA의 절단은 절단이 암호 서열에서 일어나는 경우 그 RNA가 암호화된 단백질을 직접 합성하는 능력을 파괴할 것이다. 리보자임이 그 RNA 표적에 결합하고 절단한 후에, 리보자임은 통상 그 RNA로부터 해리되고, 따라서 반복해서 새로운 표적에 결합하고 절단할 수 있다.
일부 상황에서는, 리보자임의 효소적 성질은 치료를 수행하는 데 필요한 리보자임의 효과적인 농도가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도보다 낮을 수 있으므로, 안티센스 기술(이 기술에서는 핵산 분자가 핵산 표적에 간단히 결합하여 그 전사, 해독 또는 또 다른 분자와의 연합을 차단함)과 같은 기타 기술에 비해 유리할 수 있다. 이러한 유력한 장점은 리보자임이 효소적으로 작용하는 능력을 반영한다. 따라서, 단일의 리보자임 분자는 표적 RNA의 다수 분자를 절단할 수 있다. 또한, 리보자임은 통상 특이성이 높은 저해제인데, 저해의 특이성은 결합의 염기쌍 메카니즘에 좌우될 뿐만 아니라, 분자가 그것이 결합하는 RNA의 발현을 저해하는 메카니즘에 의해서도 좌우된다. 즉, 저해는 RNA 표적의 절단에 의해 야기되고, 따라서, 특이성은 비표적 RNA의 절단 속도에 대한 표적 RNA의 절단 속도의 비로 정의한다. 이러한 절단 메카니즘은 염기쌍 형성에 관여하는 인자들에 부가적인 인자에 의해 좌우된다. 따라서, 리보자임의 작용의 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 특이성보다 더 높을 수 있다.
효소적 리보자임 RNA 분자는 TRT를 암호화하는 mRNA와 같은 표적에 대해 상보성을 가진다. 효소적 리보자임 RNA 분자는 RNA를 절단하여 표적 RNA 분자를 불활성화할 수 있다. 상보성은 절단이 일어나도록 효소적 리보자임 RNA 분자의 표적 RNA에 대힌 충분한 하이브리드화를 일으키는 기능을 한다. 100%의 상보성이 바람직하지만, 50 내지 70% 처럼 낮은 상보성을 이용할 수도 있다. 본 발명은 TRT 유전자 mRNA를 mRNA의 해독을 저해하고 따라서 텔로머라제 활성을 감소시키는 방식으로 절단하는 TRT 유전자의 암호 영역의 임의의 일부를 지향하는 리보자임을 제공한다. 또한, 본 발명은 텔로머라제 활성을 감소시키도록 TRT 유전자의 본래의 RNA 전사체를 지향하는 리보자임을 제공한다.
효소적 리보자임 RNA 분자는 해머머리형 모티프에서 형성될 수 있으나, 머리핀형의 모티프, 간염 델타 비루스, I군 인트론 또는 RNaseP형 RNA(RNA 가이드 서열과 연합 상태의)의 모티프에서도 형성될 수 있다. 그러한 해머머리형 모티프는 문헌[Rossi(1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183]에, 머리핀형 모티프는 문헌[Mhampel(1989) Biochemistry 28:4929, and Hampel(1990) Nuc. Acids Res. 18:299]에, 간염 델타 비루스 모티프는 문헌[Perrotta(1992) Biochemistry 31:16]에, RNaseP 모티프는 문헌[Guerrier-Takada(1983) Cell 35:849]에, 그리고 I군 인트론은 미국 특허 제4,987,071호(Cech)에 기재되어 있다. 이들 특이 모티프에 관한 인용은 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니며; 당업자는 본 발명의 효소적 RNA 분자가 하나 이상의 표적 RNA 영역에 상보적인 특이 기질 결합 부위를 가지며, 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 기질 결합 부위 내부 또는 그 주위의 뉴클레오티드 서열을 가진다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 안티센스 분자 및 리보자임은 RNA 분자의 합성에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 이들 방법으로는 고체상 포스포르아미다이트 화학 합성법과 같은 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 기술이 있다. 한편, RNA 분자는 인간의 텔로머라제 및/또는 텔로머라제 단백질 서브유닛을 암호화하는 DNA 서열의 시험관내 및 생체내 전사에 의해 생성시킬 수 있다. 그러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 폴리머라제 프로모터를 사용하여 다양한 벡터내로 도입시킬 수 있다. 한편, 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도성으로 합성하는 안티센스 cDNA 구성체는 세포주, 세포 또는 조직내로 도입시킬 수 있다.
RNA 분자는 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키도록 변형할 수 있다. 가능한 변형으로는 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 인접 서열의 첨가 또는 분자의 주쇄내에 포스포디에스테라제 연결체보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용을 들 수 있다. 이러한 개념은 PNA의 제조에 내재하는 것이며, 이노신, 퀘오신 및 위부토신 뿐만 아니라, 내재성 엔도뉴클레아제에 의해 용이하게 인지되지 않는 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 유사하게 변형된 형태와 같이 비전통적 염기를 포함하여 이들 분자 전부에 확장될 수 있다.
벡터를 세포 또는 조직내로 도입하는 방법으로는 후술하는 방법들이 있는데,이들은 생체내, 시험관내 및 생체외 요법에 동등하게 적합하다. 생체외 요법의 경우, 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제5,399,493호 및 제5,437,994호에 상이한 내용으로 제시되어 있는 바와 같이, 벡터를 환자로부터 취하고 동일한 환자에게 자가 유래성 이식편을 다시 이식하기 위해 클론 증식된 간세포(stem cell)와 같은 세포내로 도입시킬 수 있다. 형질감염 및 리포좀에 의한 전달은 당해 분야에 널리 알려져 있고, 본 발명에 적용 가능하다.
기타 게놈에서의 관련 폴리뉴클레오티드 서열의 검출 및 지도 작성
이. 에디큘라투스, 에스. 세레비제, 에스. 폼베 및 인간 텔로머라제 서브유닛 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 그 변형체를 사용하여 인간 및 기타 게놈에서 자연 발생적 상동성 게놈 서열의 지도를 작성하기 위한 하이브리드화 프로브를 생성시킬 수도 있다. 널리 공지된 기술을 사용하여 특정 염색체 또는 염색체의 특정 영역에 대한 서열 지도를 작성할 수 있다. 이들 기술의 예로는 염색체 확산체에 대한 동일계 하이브리드화, 유동 분류된 염색체 제제 또는 인공 염색체 구성체, 예컨대, 효모 인공 염색체, 박테리아 인공 염색체, 박테리아 P1 구성체 또는 단일 염색체 cDNA 라이브러리를 들 수 있는데. 이들은 Price의 문헌[Price, Blood Rev., 7:127(1993)] 및 Trask의 문헌[Trask, Trends Genet 7:149(1991)]에 검토되어 있다.
염색체 확산체(spreads)의 형광성 동일계 하이브리드화(FISH)의 기술은 문헌에 기재되어 있다(Verma 등, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, 뉴욕주 뉴욕[1988]). 염색체 제제의 형광성 동일계 하이브리드화 및 기타 물리적인 염색체 지도 작성 기술은 추가의 유전자 지도 데이터와 상관 관계가 있을 수 있다. 유전자 지도 데이터의 예는 문헌[1994 Genome Issue of Science (265: 1981f)]에서 발견된다. 물리적인 염색체 지도상에서 텔로머라제 단위 단백질을 암호화하는 서열의 위치와 특정 질병(또는 특정 질병에 대한 소인) 사이의 상관 관계는 질병과 관련된 DNA의 영역의 한계를 정하는 데에 도움이 될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 정상, 캐리어 또는 발병된 개체들 사이의 유전자 서열의 차이를 검출할 수 있다.
확립된 염색체 마커를 사용하여 연관 분석과 같은 물리적 지도 작성 기술 및 염색체 제제의 동일계 하이브리드화는 유전자 지도의 확장에 있어 중요하다(예컨대, 문헌[Hudson 등, Science 270:1945(1995)] 참조). 종종 마우스(화이트헤드 인스티튜트/MIT 센터 포 게놈 리서치, 제네틱 맥 오브 더 마우스, 데이터베이스 릴리스 10, 1995.4.28)와 같은 또 다른 포유류 종의 염색체상에 유전자를 위치시킴으로써, 특정 인간 염색체의 수 또는 팔을 모르는 경우에도 관련된 마커를 나타낼 수 있다. 새로운 서열을 물리적 지도 작성에 의해 염색체 팔 또는 그 일부에 할당할 수 있다. 이는 위치에 따른 클로닝 또는 기타 유전자 발견 기술을 사용하여 질병 유전자를 탐색하는 연구자들에게는 귀중한 정보를 제공한다.
텔로머라제 및 TRT의 발현의 최적화
박테리아 및 기타 발현계에서, 코돈 용례는 고레벨의 유전자 발현에 대한 잠재적인 장애를 제공하는 것으로 알려져 있다. mRNA에서의 빈도수 및 구성에 따라 "희귀한" 코돈은 그로부터 해독되는 단백질 레벨에 역효과를 가질 수 있다. 문제가 발생하는 경우에는 관련 코돈의 변형에 의해 또는 동족 tRNA 유전자의 동시 발현에 의해 또는 기타 수단에 의해 완화시킬 수 있다. 프로테아제 결핍 숙주 균주의 사용으로 박테리아 발현계로부터 수율을 증가시킬 수도 있다(Makrides (1996) Microbiol Rev 60:512-538).
외래의 전사 조절 요소를 사용하는 것과 같이, 벡터 조작 변형에 의해 텔로머라제 및 TRT의 발현 레벨을 최적화할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 골수 증식성 육종 비루스(MPSV) LTR 프로모터는 일부 포유류 세포주에서 보다 고레벨의 발현을 유발한다.
일반적으로, 당업자는 특정 서열을 가진 핵산이 하나의 세포에서는 약하게 발현되고, 다른 세포에서는 잘 발현될 수 있다는 것을 이해한다. 사전 조치로서, 목적 암호 서열과 함께 외래 서열, 즉 cDNA에서 유래한 3' 비해독 서열과 같은 비암호 서열을 포함하는 것을 피하여야 한다. 따라서, 한 가지 최적화 방법은 암호 서열 삽입체로부터 모든 외래 서열을 제거할 필요가 있다. 이 방법은 일부 상황에서는 박테리아, 곤충, 효모, 포유류 및 기타 세포 발현계에서 단백질 발현을 5 내지 10배 증가시킨다.
염색체내 유전자의 복제에 의한 것이든 벡터의 보다 고사본수에 의한 것이든 유전자 증폭은 포유류 및 기타 세포에서의 재조합 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다. 포유류 세포에서 이종성 유전자 발현의 한 가지 시험관내 증폭 방법은 선별용 마커를 암호화하는 하나의 말단 단위에 연결된 당해 유전자를 암호화하는 완전 발현 단위의 여러 개지의 사본을 보유하는 긴 선형 DNA 분자로 세포를 안정하게 형질감염시키는 것을 기초로 한다. 또 하나의 예로서, 당해 유전자의 유전자 증폭은 유전자를 디히드로폴레이트 리덕타제(Dhfr) 유전자에 연결시키고, 형질감염된 세포에 메토트렉세이트를 투여함으로써 달성될 수 있으며; 이 방법은 재조합 단백질 생산을 다수배 증가시킬 수 있다(문헌[Monaco (1996) Gene 180:145-150] 참조).
텔로머라제 및 TRT의 생산 및 발현과 검색
한 가지 양태로, 본 발명은 동물 및 식물에서의 텔로머라제 활성의 조절인자를 동정하기 위한 검색 분석법을 제공한다. 검색 분석법은 텔로머라제 활성의 완전 또는 부분적 재구성에 의해 또는 기존 활성의 증대에 의해 유래한 텔로머라제 또는 TRT를 이용할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 분석 또는 검색법을 사용하여 텔로머라제가 텔로미어 DNA를 합성하는 능력을 시험하거나 또는 TRT(들)의 "부분 활성"의 어느 하나 또는 전부를 시험할 수 있다. 분석법은 그 RNA 부분 또는 관련 단백질의 존재 여부에 상관 없이 텔로머라제를 발현시키도록 조작된 세포의 생체외 변형법을 포함하며, 이들 세포를 동물내로 재이식하여 생체내 시험에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 생체내 분석법 및 거기에 유용한 돌연변이 동물을 제공한다. 이들 생체내 분석계는 내재성 텔로머라제 효소 복합체의 하나 또는 여러 개의 단위가 고갈되거나 또는 저해된 "무력화" 세포 뿐만 아니라, 외래 또는 내재성 텔로머라제 활성이 재구성되거나 또는 활성화되는 세포를 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 텔로머라제 활성 또는 항-텔로머라제 활성을 돌연변이 동물과 같은 동물내로 재구성함으로써 동물에서의 텔로머라제 조절인자를 검색하는 방법을 포함한다. 본 발명은 "무력화" 모델을 포함하는 생체내 분석계를 제공하는데, 상기 모델에서는 TRT, 텔로머라제 RNA 부분 및/또는 텔로머라제 관련 단백질과 같은 내재성 텔로머라제의 하나 또는 몇 개의 단위가 결실되거나 저해되어 있다. 내재성 텔로머라제 활성은 전체적이든 또는 부분적이든 잔존할 수 있다. 그러한 유전자의 "무력화"는 돌연변이 동물을 사용하는 것처럼, 세포주, 조직 또는 전체 동물로부터 무력화화는 것을 포함한다.
일 양태로, 전체적이거나 부분적인 외래성 텔로머라제 활성이 재구성된다. 본 발명의 돌연변이 동물은 또한 본 발명의 완전히 또는 부분적으로 활성이 있는 텔로머라제 조성물을 다량으로 발현시키는 방법을 제공한다. 돌연변이된 동물은 또한 당해 조성물을 발현시키는 데 사용할 수 있는 다른 정상 세포의 불멸화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태로, 재조합 텔로머라제는 정상의 이배체 사멸성 세포에서 이들 세포를 불멸화하거나, 또는 세포의 장기간 배양 또는 복제를 촉진한다. 핵산 텔로미어 서열 주형 분자(예컨대, hTR) 또는 기타 관련 단백질과같은 기타 텔로머라제 효소 복합체 성분은 활성의 조절인자로서 작용하거나 발현에 유용한 것으로서 동시에 발현될 수도 있다. 본 발명은 다른 정상 표현형 및 핵형을 가진 이배체 불멸성 세포를 얻는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 관점은 대단한 실제적이고 상업적인 용도를 가지며; 예컨대, FDA 및 공공 기관은 정상 세포로부터의 재조합 단백질의 생산이 그러한 세포에서 만들어진 생성물의 비루스 또는 기타 오염을 고려한 우려를 최소화시키는 지를 평가한다. 본 발명은 인간 B 임파구 및 골수종 세포의 불멸성 하이브리드가 생성되게 하여 인간의 단일클론 항체 생산용의 인간 하이브리도마를 얻을 수 있게 한다. 본 발명의 방법을 사용하여 TRT 단백질 및 텔로머라제 활성을 인간 B 임파구내로 형질감염시키면, 항체 생산용의 불멸성 세포를 생성시킬 수 있다. 또 다른 양태는 본 발명의 재조합 텔로머라제 및/또는 텔로머라제 관련 RNA 및 기타 화합물을 세포내로 도입하여 상업적으로 바람직한 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 성장 호르몬과 같은 호르몬을 생산하는 불멸성이지만 핵형은 정상인 인간의 뇌하수체 세포를 상업적 용도로 생산할 수 있다. 상기 양태의 변형예에서, 정상의 인간 세포를 신체로부터 제거하고, 본 발명의 방법 및 시약을 사용하여 불멸화시키며, 유전자가 적당한 레벨로 발현되도록 당해 유전자로 형질감염시키고, 형질감염된 유전자가 개체의 건강에 충격을 주는 분자를 발현시키도록 개체내로 다시 도입시킨다.
본 발명의 또 하나의 양태는 유사한 방법을 포함하나, 여기서, 세포는 조직적합성 항원을 결실시키도록 변형되거나 또는 면역 거부의 가능성을 방해하거나 감소시키는 어떤 방법으로 변형시킨 "보편적인 공여 세포"인 점이 상이하다. 이들 세포를 개체내로 재도입함으로 인한 합병증은 세포가 성장 제어능을 상실하고 제어되지 않는 세포 성장 상태로 변화시켜 암, 종양 또는 기타 악성 종양이 될 수 있는 가능성이다. 본 발명은 이러한 합병증을 TRT 또는 기타 텔로머라제 성분을 조건적으로 발현시키는 수단을 제공하고/하거나, 텔로머라제(또는 활성에 필요한 텔로머라제 효소 복합체 성분)를 무력화시키는 수단을 제공함으로써 해결한다. 더욱이, 이식에 또는 기타 목적으로 사용된 "불멸성" 세포 조차 본 발명에 의해 사멸될 수 있다. 활성 텔로머라제 없이, 세포는 비가역적으로 사멸성이어서 숙주 생물내로의 이식 또는 기타 재도입후에 암 또는 악성 종양 형질전환의 가능성을 감소시킨다. 텔로머라제는 체세포에서 정상적으로는 활성이 없기 때문에, 이는 세포의 기능에 영향을 끼치지 않을 것이다.
TRT 및 기타 텔로머라제 성분을 조건적으로 제공하는 수단, 즉 숙주 세포, 조직 또는 동물에서의 제어 가능한 발현은 안티센스 구성체를 사용하는 것을 포함하는데, 이 때, 상기 구성체는 적당한 세포 또는 조직에서 안티센스 뉴클레오티드를 발현시키도록 하는 신호를 받을 때 텔로머라제 활성을 저해하고 세포 분열을 정지시킨다. 세포내에서 재조합 항체 결합 성분의 발현을 이러한 목적으로 사용할 수도 있다. 유도성 및/또는 조직 특이적 시스- 및/또는 트란스-작용성 전사 및 해독 조절 요소를 사용하여 TRT 및 기타 텔로머라제 성분의 발현을 제어할 수 있다. 시스 작용성 전사 조절 요소의 예로는 mRNA를 안정화하거나 또는 전사체를 분해로부터 보호하는 요소가 있다. 시스 작용성 및 트란스 작용성 조절제의 동정 및 분리는 텔로머라제의 전사 및 해독을 조절하는 작용제를 동정하기 위한 추가의 방법 및 시약을 제공한다.
본 발명은 또한 동물 뿐만 아니라, 당해 조성물을 발현시키는데 사용될 수 있고 관련 방법에서 사용할 수 있는 정상 세포에서 본 발명의 텔로머라제 및 TRT 조성물을 발현시키는 돌연변이 동물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 단독으로 또는 효소의 RNA 부분 또는 기타 텔로머라제 관련 단백질과 동시 발현되는 내재성 또는 외래성 TRT를 발현시키는 돌연변이 동물을 제공한다. 본 발명은 예컨대, 생물 반응기(Khillan(1997) Methods Mol. Biol. 63:327-342)로서 사용하여 다량의 텔로머라제, TRT 및 기타 단백질을 생산하는 돌연변이 동물 및 재조합 세포를 제공한다. TRT의 조절인자를 검색하기 위한 생분석계를 만들기 위해, 비인간 동물 모델을 사용할 수 있다. 상기 비인간 동물에서, 내재성 텔로머라제는 재조합 TRT, TR 및/또는 기타 텔로머라제 관련 성분을 도입시키기 전에 먼저 쇄약화 또는 "무력화"될 수 있다.
본 발명의 텔로머라제 발현 핵산은 다양한 통상의 기술(Jacenko(1997) Methods Mol Biol 62, 399-424)에 의해 동물 또는 식물 숙주 생물의 게놈내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 돌연변이 및 유전자 표적화 방법의 최근의 진보는 유전자 첨가, 유전자 결실 또는 유전자 변형에 의해 마우스 게놈의 복잡한 조작을 가능하게 하여 이 동물을 본 발명의 방법에 편리하도록 만들 수 있다(Franz (1997) J Mol Med 75:115-129; Peterson (1997) Genet. Eng. (NY) 19:235-255). 돌연변이 유전자 구성을 위한 다수의 클로닝 벡터가 당배 분야에 알려져 있는데, 예컨대, 문헌[Yang (1997) Biotechniques 22:1032-1034]에 기재되어 있다. DNA의 동물 게놈내로의 간단한 도입, 전핵 DNA 주사 및 레트로비루스를 사용한 형질도입에 대해서는 두 가지의 잘 확립된 절차가 있다(Wei(1997) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:119-141). DNA를 동물 및 식물내로 도입시키기 위해 사용하는 미세주입 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌에 기재되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜 침전법을 사용하여 DNA 구성체를 세포내로 도입시키는 기술은 문헌[Paszkowski(1984) EMBO J. 3:2717]에 기재되어 있다. 전기사출 기술은 문헌[Fromm(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82:5824]에 기재되어 있다. 탄도식 형질전환 기술은 문헌[Klein(1987) Nature 327:70]에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 텔로머라제 및 TRT 조성물을 발현시키는 돌연변이 식물 및 방법 및 상기 식물에서 텔로머라제의 조절인자를 동정하는 검색 분석법을 제공한다. 식물에서, DNA 구성체는 식물 세포 원형질체의 전기 사출 및 미세 주입과 같은 기술을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA내로 직접 도입시키거나 또는 DNA 구성체는 DNA 입자 충격과 같은 탄도식 방법을 사용하여 식물 조직으로 직접 도입시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 텔로머라제 서열을 포함하는 담배 모자이크 비루스와 같은 식물 비루스 벡터를 사용하여 식물을 접종시킬 수 있다 (Rouwendal(1997) Plant Mol Biol 33:989-999).
약학 조성물
본 발명은 또한 텔로머라제 및/또는 텔로머라제 서브유닛 뉴클레오티드, 단백질, 항체, 작동물질, 길항물질 또는 억제제를, 단독으로 또는 1종 이상의 기타 작용제, 예컨대, 임의의 멸균된 생체 적합성의 약학적 담체(예컨대, 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물이 있으나, 이들에 국한되지 않음)내에 투여될 수 있는 안정화 화합물과 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 분자중 임의의 분자는 환자에게 단독으로 또는 기타 작용제, 약제 또는 호르몬과 함께, 적합한 부형제(들), 보조제 및/또는 약학적 허용 담체와 혼합된 약학 조성물 형태로 투여할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 불활성이다.
약학적 조성물의 투여
약학 조성물의 투여는 경구적으로 또는 비경구적으로 수행한다. 비경구적 전달 방법으로는 국소, 동맥내(예커내, 종양내로 직접), 근육내, 피하, 수질내, 초내, 심실내, 정맥내, 복막내 또는 비강내 투여를 들 수 있다. 활성 성분 외에도, 상기 약학 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제제내로 활성 화합물의 처리를 촉진하는 부형제 및 기타 화합물을 포함하는 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 제제 및 투여 기술에 대한 추가의 상세한 사항은 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences"(Maack Publishing Co, 펜실베니아주 이스턴), 최근판]에서 찾을 수 있다.
경구 투여용 약학 조성물은 경구 투여에 적합한 투여 단위로 당해 분야에 널리 알려진 약학적 허용 담체를 사용하여 제형화할 수 있다. 그러한 담체는 약학 조성물을 환자가 섭취하기에 적당한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화할 수 있게 한다.
경구용 약학 조성물은 활성 화합물과 고체 부형제의 배합을 통해, 선택적으로 생성된 혼합물을 연마하고, 필요한 경우 적당한 추가 화합물을 첨가한 후에 그래뉼 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 핵을 얻을 수 있다. 적당한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제인데, 그 예로는 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 기타 식물에서 얻은 전분; 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스; 및 아라비아 검 및 트라가칸트를 포함하는 검; 뿐만 아니라 젤라틴 및 콜라젠과 같은 단백질이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 필요하다면, 소독제 또는 용해제, 예컨대, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 그 염(예컨대, 알긴산 나트륨)을 첨가할 수 있다.
당의정 핵은 농축된 당 용액과 같은 적합한 피막을 구비한 것으로 제공되는데, 그러한 피막은 또한 아라비아 검, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 래커 용액 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 피막에 첨가하여 생성물을 동정하거나 또는 활성 화합물의 양(즉, 투여량)을 특성화할 수 있다.
경구적으로 사용할 수 있는 약학적 제제로는 겔라틴으로 이루어진 푸시-핏(push-fit) 캡슐 뿐만 아니라, 젤라틴으로 이루어진 밀봉된 캡슐 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 피막이 있다. 푸시-핏 캡슐은 락토스 또는 전분과 같은 충전제 또는 결합제, 활석 또는 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제 및 선택적으로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 액체에 안정화제와 함께 또는 안정화제 없이 용해 또는 현탁시킬 수 있다.
비경구 투여용 약학 조성물로는 활성 화합물의 수용액이 있다. 주사용으로, 본 발명의 약학 조성물은 수용액내에, 바람직하게는 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer solution) 또는 생리적으로 완충된 염수와 같은 생리적으로 적합한 완충액에 제형화할 수 있다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적당한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 잇다. 적당한 지방 친화성 용매 또는 부형제로는 참기름 같은 지방유 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드 또는 리포좀 같은 합성 지방산 에스테르가 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적당한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액을 제조할 수 있게 화합물의 용해도를 증가시는 작용제를 포함할 수 있다.
국소 또는 비강 투여용으로, 투과될 특정 배리어에 적합한 침투제를 제제에 사용한다. 그러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 알려져 있다.
제조 및 저장
본 발명의 약학 조성물은 실질적으로 당해 분야에 알려진 표준 제조 절차에 따라(예컨대, 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 수파(levigation), 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결 건조 공정에 의해) 제조할 수 있다.
약학 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 다수의 산, 예컨대, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등(이들에 국한되지 않음)과 함께 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 기타 양성자성 용매에서 보다 가용성으로 되는 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 히스티딘 1 mM 내지 50 mM, 슈크로스 0.1% 내지 2%, 만니톨 2% 내지 7%를 함유하는 동결 건조된 분말(pH 4.5 내지 5.5)일 수 있는데, 이것은 사용 전에 완충제와 배합한다.
적당한 담체에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제조한 후에, 이들은 적당한 용기에 넣고 지시된 상태의 치료를 위해 표지화할 수 있다. 그러한 표지법은 통상 투여의 양, 빈도수 및 방법을 고려할 것이다.
치료학적 유효량
본 발명에 사용하기에 적합한 약학 조성물은 활성 성분이 의도하는 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 포함되어 있는 조성물을 포함한다. 유효 투여량의 결정은 당업자의 능력 범위내에서 용이하게 이루어진다.
임의의 화합물의 경우, 치료학적 유효 투여량은 세포 배양 분석에서 또는 적당한 동물 모델에서 초기에 산정될 수 있다. 동물 모델을 사용하여 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 결정할 수 있다. 그러한 정보를 사용하여 인간에의 투여를 위해 유용한 투여량 및 경로를 결정할 수 있다.
치료학적 유효 투여량이란 징후 또는 상태를 개선시키는 단백질 또는 그 항체, 길항물질 또는 저해제의 양을 의미한다. 그러한 화합물의 치료적 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 측정할 수 있다(예컨대, ED50, 군집의 50%에서 치료학적으로 유효한 투여량; 및 LD50, 군집의 50%에 대해 치사적인 투여량). 치료학적 효과와 독성 효과 사이의 투여량 비가 치료 지수이며, 비 LD50/ED50으로 표현할 수 있다. 치료 지수가 큰 약학 조성물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에의 사용을 위한 투여량 범위의 설정에 사용된다. 그러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 이용된 투여 형태, 환자의 심각도 및 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 변화한다.
정확한 투여량은 치료할 환자를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여 방법은 활성 부분의 충분한 레벨을 제공하고 목적하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려할 수 있는 추가 인자로는 질병 상태의 심각도(예컨대, 종양의 크기 및 위치; 환자의 나이, 체중 및 성별; 식사; 투여 시간 및 빈도; 약제 배합물(들); 반응 민감도; 및 치료에 대한 내성/반응이 있다. 장기간 작용하는 약학 조성물은 특정 제제의 반감기 및 제거 속도에 따라, 3일 내지 4일 마다, 매주마다 또는 2주에 1회 투여할 수 있다. 구체적인 투여량 및 전달 방법에 관한 지침은 문헌(본원에 참고로 인용한 미국 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 및 제5,225,212호 참조). 당업자는 단백질 또는 그 저해제에 대한 것보다 뉴클레오티드에 대한 상이한 제제를 이용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 구체적인 세포, 상태, 위치 등에 특이적일 수 있다.
예컨대, 인간의 텔로머라제를 질병(예컨대, 암) 및/또는 노화와 관련된 기타 문제에 저항하는 치료용 분자로서 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 또한 인간 텔로머라제 또는 텔로머라제 단백질 서브유닛의 발현을 감소시킬 수 있는 안티센스 분자를 인간 텔로머라제의 이상 발현과 관련된 종양을 치료하는 치료용 분자로서 사용할 수 있을 것으로도 생각된다. 또한, 인간 텔로머라제에 대해 유도되고 인간 텔로머라제의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 항체를 인간 텔로머라제 및/또는 텔로머라제 단백질 서브유닛의 이상 발현과 관련한 종양을 치료하는 치료용 분자로서 사용할 수 있다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 위해서 아래에서 다수의 용어를 정의한다.
본원에서 사용된 "친화도 정제"란 리보뉴클레오단백질 입자에 결합하는 "친화도 올리고뉴클레오티드"(즉, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 사용을 통해 상기 입자를 정제하는 단계와, 그 다음, 그 입자를 "치환 올리고뉴클레오티드"에 의해 올리고뉴클레오티드로부터 용출시키는 단계를 의미한다. 본 발명에서, 치환 올리고뉴클레오티드는 친화도 올리고뉴클레오티드와의 상보성이 보다 더 높고, 그러므로, 입자 및 친화도 올리고뉴클레오티드보다 더 열역학적으로 안정한 이중체를 생성시킨다. 예를 들면, 텔로머라제는 친화도 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있고, 친화도 올리고뉴클레오티드에 결합하는 치환 올리고뉴클레오티드를 사용하여 용출시킬 수 있다. 본질적으로, 치환 올리고뉴클레오티드는 친화도 올리고뉴클레오티드로부터 텔로머라제를 치환하고, 텔로머라제를 용출시킨다. 충분히 부드러운 조건하에서, 방법은 기능적 리보뉴클레오단백질 입자의 농축을 초래한다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드에서의 변이"란 하이브리드화 분석법을 사용하여 검출할 수 있는 결실, 삽입 및 점 돌연변이를 포함하여, 텔로머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 임의의 변이를 포함한다. 이 정의에는 텔로머라제를 암호화하는 게놈 DNA 서열에 대한 변이를 검출하는 것도 포함된다(예컨대, 서열번호 1 또는 3과 같은 임의의 서열에 하이브리드될 수 있는 제한 효소 단편의 패턴의 변이[예컨대, RFLP 분석], 임의의 서열의 선별된 단편이 게놈 DNA의 샘플에 하이브리드될 수 없는 불능성[예컨대, 대립유전자 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로를 사용하여], 중기 염색체 확산체에 대해 FISH를 사용하는 등의 방법에 의한 텔로미어 또는 텔로머라제 유전자에 대한 정상 염색체좌 이외의 좌에의 하이브리드화와 같이 부적절한 또는 예기치 못한 하이브리드화 등에 의해).
본원에 사용된 "아미노산 서열"이란 펩티드 또는 단백질 서열을 의미한다.
"증폭"이란 핵산 서열의 부가 사본의 생산으로 정의되고, 일반적으로 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 당해 분야에 널리 알려진 기타 기술(예컨대, 문헌[Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 뉴욕주 플레인뷰(1995)] 참조)을 사용하여 수행된다. 본원에 사용된 "폴리머라제 연쇄 반응"("PCR")이란 K.B. Mullis의 방법(본원에 참고로 인용한 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호)을 의미하는데, 여기서는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물에서 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키는 방법을 기재하고 있다. 표적 서열을 증폭시키는 이러한 방법은 매우 과량의 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 목적 표적 서열을 포함하는 DNA 혼합물에 도입시킨 다음, DNA 폴리머라제의 존재하에 정확한 순서의 열 순환을 실시하는 것으로 이루어진다. 두 개의 프라이머는 2본쇄 표적 서열의 각각의 가닥에 상보적이다. 증폭을 수행하기 위하여, 혼합물을 변성시킨 다음, 프라이머를 표적 분자내 그 상보적인 서열에 어닐링시킨다. 어닐링 후, 프라이머를 폴리머라제를 사용하여 연장시켜 새로운 상보 가닥쌍을 형성한다. 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머라제 연장의 단계를 여러 차례 반복하여(즉, 변성, 어닐링 및 연장이 하나의 "주기"를 이루고, 다수의 "주기"가 있을 수 있음) 목적 표적 서열의 고농도의 증폭 분절을 얻을 수 있다. 목적하는 표적 서열의 증폭 분절의 길이는 서로에 대해 프라이머의 상대 위치에 의해 측정되며, 그러므로, 이 길이는 제어 가능한 매개변수이다. 공정의 반복적인 관점에 의해, 방법은 "폴리머라제 연쇄 반응"(이하, "PCR"이라 함)으로 지칭된다. 표적 서열의 목적하는 증폭 분절이 혼합물내 우세 서열(농도의 관점에서)이 되기 때문에, 이들은 "PCR 증폭된"으로 언급된다.
본원에 사용된 "증폭 생성물" 및 "PCR 생성물"이란 변성, 어닐링 및 연장의 PCR 단계의 2회 이상의 주기가 완료된 후 생성되는 화합물들의 혼합물을 의미한다. 이들 용어는 하나 이상의 표적 서열중 하나 이상의 분절의 증폭이 있는 경우를 포함한다. PCR를 사용하여, 게놈 DNA내 특이 표적 서열의 단일 사본을 몇 가지 상이한 방법(예컨대, 표지된 프로브에 의한 하이브리드화; 비오티닐화된 프라이머의 혼입과 그에 이은 아비딘-효소 접합체 검출; dCTP 또는 dATP와 같은32P-표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 혼입)으로 검출할 수 있는 레벨까지 증폭시킬 수 있다. 게놈 DNA 외에도, 임의의 올리고뉴클레오티드 서열은 적당한 세트의 프라이머 분자를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 구체적으로, PCR 공정 자체에 의해 생성된 증폭된 분절은 스스로 후속 PCR 증폭용의 효율적인 주형이다. 증폭된 표적 서열을 사용하여 재조합 벡터내로의 DNA 단편을 얻을 수 있다.
"항체"란 용어는 면역글로불린 유전자(들)에 의해 실질적으로 암호화되고 피분석물 및 항원에 특이적으로 결합하여 그들을 인지하는 폴리펩티드 또는 그 단편 또는 합성 또는 재조합 유사체를 의미한다. 인지된 면역글로불린 유전자로는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라, 다수의 면역글로불린 가변 영역 유전자가 있다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되고, 이들은 각각 면역글로불린 종류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 테트라머로 이루어진다. 각각의 테트라머는 폴리펩티드 쇄의 두 개의 동일한 쌍, 즉 각 쌍이 하나의 "경"(약 25 kD)쇄 및 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kD)를 가진 쌍으로 이루어진다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인지를 주로 담당하는 약 100 내지 110 이상의 아미노산의 가변 영역을 이룬다. 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)라는 용어는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다. 항체는 예컨대, 천연 면역글로불린으로 또는 다양한 펩티다제로 처리하여 생성된 다수의 잘 특성 분석된 단편으로서 존재한다(문헌[Fundamental Immunology, 3판, W.E. Paul 편집, Raven Press, 뉴욕(1993)] 참조). 다양한 항체 단편은 천연 항체의 분해의 관점에서 정의되는 반면에, 당업자는 그러한 단편을 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법, 예컨대, 파지, 비루스 또는 세포의 표면상에 발현되는 재조합 단쇄 Fv 또는 그 항체 또는 단편을 이용하여 새로이 합성할 수 있음을 이해할 것이다. 면역학적으로 반응성인 조건이란 용어는 항체들이 항원, 예컨대, 본 발명의 TRT에 결합할 수 있는 환경을 의미한다. 후술하는 바와 같이, 이것은 면역학적 결합 분석일 수 있다. 단백질 또는 펩티드를 언급할 때 "항체에 특이적으로 결합한다"라는 어구는 단백질 및 기타 생물학적 약제의 이질성 군집의 존재하에 단백질의 존재의 결정인자인 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역 분석 조건하에, 지정된 항체는 특정의 단백질에 결합하고, 샘플에 존재하는 기타 단백질에는 상당량으로 결합하지 않는다. 상기 조건하에서의 항체에의 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 그 특이성에 대해 선택되는 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 텔로머라제 TRT 단백질에 대해 또는 TRT 서열에 의해 지정된 단백질의 임의의 부분에 특이적인 항체는 본 발명의 모든 TRT종 또는 본 발명의 단 하나의 TRT종과 특이적으로 면역 반응하고, 기타 비텔로머라제 단백질과는 특이적으로 면역 반응하지 않도록 선택할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 다양한 면역 분석 형식을 사용하여 특정 단백질과의 특이적 면역 반응성이 있는 항체를 선별할 수 있다. 예를 들면, 고체상 ELISA 면역 분석법을 통상적으로 사용하여 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 단일클론 항체를 선별한다. 특이적 면역 반응성을 측정하는 데 사용될 수 있는 면역 분석 형식 및 조건에 대한 상세한 사항은 문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, 뉴욕(Harlow and Lane)]을 참조할 수 있다. 특이적 또는 선택적인 반응은 예컨대, 배경 신호 또는 "노이즈"의 적어도 2배(2X)의 신호를 생성시키는 반응이다.
본원에 사용된 "항원성 결정인자"란 용어는 특정 항체와 접촉하는 항원의 부분(즉, 에피토프)를 의미한다. 단백질 또는 그 단편을 사용하여 숙주 동물을 면역화하는 경우에, 단백질의 다수 영역이 단백질상의 주어진 영역 또는 3차원 구조에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있고; 이들 영역 또는 구조는 항원성 결정인자로 지칭한다. 항원성 결정인자는 항체에 결합하기 위해 천연 항원(즉, 면역 반응을 유도하는 데 사용된 면역원)과 경쟁할 수 있다.
본원에 사용된 "안티센스"란 용어는 특이적 RNA 서열(예컨대, mRNA)과 상보적인 합성되거나 비자연 발생적인 뉴클레오티드 또는 연결체를 포함하거나 또는 완전히 그것으로 이루어진 것들을 포함하여, RNA 서열 또는 기타 올리고뉴클레오티드 또는 핵산과 관련하여 사용된다. 안티센스 RNA는 암호 가닥의 합성을 허용하는 비루스 프로모터에 대해 역방향으로 당해 유전자(들)를 스플라이싱함에 의한 합성을 포함하여 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일단 세포내로 도입되면, 이 전사된 가닥은 세포에 의해 생성된 천연 mRNA와 결합하여 이중체를 형성한다. 이러한 이중체는 mRNA의 추가의 전사 또는 그 해독을 차단한다. 이러한 방법으로, 돌연변이 또는 변이된 표현형이 발생할 수 있다. "안티센스 가닥"이란 용어는 "센스" 가닥에 상보적인 핵산 가닥과 관련하여 사용한다. (-) 표시(즉, "음의")는 때때로 안티센스 가닥과 관련하여 사용되고, (+) 표시는 때때로 센스(즉, "양의") 가닥과 관련하여 사용된다.
"생물학적으로 활성이 있는"이란 자연 발생적 텔로머라제(또는 기타) 분자 또는 펩티드의 구조적, 조절적 또는 생화학적 기능을 가진 펩티드 또는 텔로머라제(또는 다른) 분자를 의미한다. 마찬가지로, "면역학적으로 활성이 있는"이란 천연, 재조합 또는 합성 텔로머라제 단백질 또는 그 임의의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드가 적당한 동물 또는 세포에서 특이적 면역 반응을 유도하고 특이적 항체와 결합할 수 있는 능력을 표시한다.
본원에 사용된 "텔로미어 DNA를 복제할 수 있는"이란 기능적 텔로머라제 효소가 텔로미어에 위치한 DNA를 복제하는 기능을 수행하는 능력을 의미한다. 이 용어는 텔로미어 뿐만 아니라, 염색체의 텔로미어 영역에 위치하는 것으로 통상 확인되는 구조 및 서열의 복제를 포함하는 것이다. 예를 들면, "텔로미어 DNA"는 대부분의 텔로미어에서 확인되는 반복 서열의 직렬식 배열을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 "섬모충류"란 실리아포라(Ciliaphora) 문에 속하는 원생동물 중의 하나를 의미한다.
본원에 사용된 "상보적인" 또는 "상보성"이란 용어는 염기쌍 형성 규칙에 의해 관련되는 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 서열)과 관련하여 사용한다. 예를 들면, 서열 "5'-A-G-T-3'"의 경우는 서열 "3-T-C-A-5'"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 이 때, 2본쇄 핵산의 뉴클레오티드 염기의 일부만이 염기쌍 형성 규칙에 따라 정합된다. 즉, 핵산들 사이에 "완전" 또는 "전체" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥들 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥들 사이의 하이브리드화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 가진다. 이것은 증폭 반응 뿐만 아니라, 핵산들 사이의 결합에 좌우되는 검출 방법에서 특히 중요하다.
"보존적 치환"이란 용어는 본 발명의 TRT와 같은 단백질의 아미노산 조성을 "보존적 변이체"로 변화시키는데, 이 때, 그 변화(들)는 실질적으로 단백질의 (보존적 변이체) 활성을 변화시키지 않는 것이며, 또한 핵산의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 변화도 의미한다. 이것은 구체적인 아미노산 서열의 보존적으로 변형되는 변이, 즉 단백질의 활성에 중요하지 않는 아미노산들의 아미노산 치환 또는 유사한 성질(예컨대, 산성, 염기성, 양전하 또는 음전하를 띤, 극성 또는 비극성 등)을 가진 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 포함하며, 여기서의 치환은 심지어 중요한 아미노산의 치환도 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 것을 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적인 치환에 관한 표는 당해 분야에 널리 알려져 있다. 다음의 6개 군은 각각 서로에 대해 보존적인 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)(문헌[Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company] 참조). 당업자는 상기 명시한 치환은 유일하게 가능한 보존적 치환인 것은 아님을 이해할 것이다. 예를 들면, 일부 목적의 경우, 모든 하전된 아미노산을 이들이 양전하이건 또는 음전하이건 간에 서로에 대한 보존적 치환으로 간주할 수 있다. 또한, 암호화된 서열에서 아미노산의 작은 비율 또는 단일의 아미노산을 변경, 첨가 또는 첨가하는 개개의 치환, 결실 또는 첨가 역시 "보존적으로 변형된 변이"로 간주될 수도 있다. "보존적 치환"이란 용어는 또한 예컨대, 변화되지 않은 핵산에 의해 암호화된 단백질의 활성을 변화시키지 않는 것으로서, 치환이 (보존적 변형체) 핵산의 의도된 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록 하는 "보존적 변형체"로의 핵산 서열의 변화를 의미한다. 본 발명의 핵산 서열은 무조건적으로 그 보존적(변형된) 변이체(예; 축퇴성 코돈 치환체) 및 상보적 서열 뿐만 아니라, 명확하게 나타낸 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다(Batzer (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Rossolini (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).
본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드의 발현과 상관 관계가 있다"란 하이브리드화 분석에 의해 텔로머라제 서열에 상보적인 리보핵산(RNA)의 존재의 검출이 샘플내 인간 텔로머라제를 포함하여 진핵 세포 텔로머라제를 암호화하는 mRNA의 존재의 표시임을 나타낸다. 그러한 상관 관계는 그 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 텔로머라제 mRNA의 발현을 포함할 수 있다.
"결실"은 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 부재하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화로서 정의된다.
본원에 사용된 "유도체"란 용어는 예컨대, 이. 에디큘라투스 텔로머라제의 123 kDa 또는 43 kDa 단백질 서브유닛 또는 기타 텔로머라제 단백질 또는 펩티드와 같은 텔로머라제 구조를 암호화하는 핵산으로서 분자의 화학적 구조 및 그러한 구조의 변형체를 의미한다. 그러한 변형체의 예로는 알킬, 아실 또는 아미노기에 의해 수소를 대체하는 것이 있다. 핵산 유도체로는 자연 발생적 텔로머라제 또는 그 서브유닛이 본질적인 생물학적 특성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화할 핵산이 있다.
본원에서 사용된 "진핵 세포"란 용어는 "원핵 세포"와 구별되는 생물을 의미한다. 이 용어는 핵막(핵막내에 염색체가 존재함)에 의해 둘러싸인 진정 핵의 존재, 막에 결합된 소기관의 존재 및 진핵 세포 생물에서 통상 관찰되는 기타 특성과 같은 진핵 세포의 통상적인 특성을 나타내는 세포를 가진 모든 생물을 포함하는 용어이다. 따라서, 상기 용어는 진균류, 원생동물 및 동물(예컨대, 인간)과 같은 생물(이들에 국한되지 않음)을 포함한다.
본원에 사용되는 "유플로테스 텔로머라제 폴리펩티드"란 용어는 유플로테스 텔로머라제 구조의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 이 용어는 유플로테스 텔로머라제의 123 kDa 및 43 kDa 폴리펩티드 또는 단백질 서브유닛을 포함한다. 또한 이 용어는 상기 단백질 서브유닛의 변형체를 포함하는 것이다. 또한, 이 용어는 서열번호 1 및 3에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 용어이다. 사용된 기술에 따라, 분자량 측정이 달라질 수 있기 때문에, 본 발명은 SDS-PAGE와 같은 임의의 구체적인 방법으로 측정하였을 때, 서열번호 1 및 3이 암호화하는 폴리펩티드의 분자 질량 123 kDa 및 43 kDa에 정확히 한정되는 것은 아니다.
"발현 벡터" 또는 "벡터"란 원핵 세포, 효모, 진균류, 식물, 곤충 또는 포유류 세포를 포함하여 임의세포에서 구성적으로 또는 유도성으로 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 핵산 서열을 발현시킬 목적의 임의의 재조합 발현계를 의미한다. 발현된 핵산 서열은 벡터에 삽입된다(벡터내로 스플라이싱된다). 이 용어는 에피좀으로 잔존하거나 숙주 세포 게놈내로 통합되는 것과 같은 선형 또는 원형 핵산 발현계를 포함한다. 발현계는 자가 복제능을 가지거나, 갖지 않을 수도 있으며, 즉 세포에서의 일시적인 발현만을 유도할 수 있다. 이 용어는 재조합 핵산의 전사에 필요한 최소 요소만을 포함하는 재조합 발현 "카세트"를 포함한다.
"상동성", "서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 상보성 또는 서열 동일성의 정도를 의미한다. 부분적인 상동성 또는 완전한 상동성(즉, 동일성)이 있을 수 있다. 부분적으로 상보성인 서열은 완전히 상보적인 서열이 표적 핵산에 하이브리드되는 것을 적어도 부분적으로 저해하고, 기능적인 용어를 사용하여 완전히 상보적인 서열에 대해 "실질적으로 상동성이 있는"것을 의미할 수 있다. 표적 서열에 대해 완전히 상보적인 서열의 하이브리드화의 저해는 낮은 엄중 조건하에 하이브리드화 분석법(서던 또는 노던 블롯, 용액 하이브리드화 등)을 사용하여 검사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브는 낮은 엄중 조건하에 표적에 대해 완전히 상동성인 결합(즉, 하이브리드화)를 저해한다. 이것은, 낮은 엄중 조건이 비특이적 결합이 허용되도록 하는 조건이며; 낮은 엄중 조건이 두 서열의 서로에 대한 결합이 특이적(즉, 선택적) 상호작용일 것을 필요로 한다는 것을 말하는 것은 아니다. 비특이적 서열의 부재는 부분적인 상보성의 정도(예컨대, 약 30% 미만의 동일성) 조차 부족한 제2 표적의 사용에 의해 시험할 수 있으며; 비특이적 결합의 완전한 부재시에 프로브는 제2의 비상보적인 표적에 하이브리드화되지 않을 것이다. "서열 동일성", "서열 유사성" 및 "상동성"이란 용어는 두 서열, 예컨대, 프로그램 BLAST, GAP, FASTA 또는 BESTFIT의 경우처럼 본 발명의 텔로머라제의 hTRT 단백질의 핵산 및 아미노산 서열이 최적으로 배열될 때 40% 이상 내지 50%의 서열 동일성, 바람직하게는 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. "아미노산 서열 동일성 비율"이란 최적으로 배열될 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 대략 지정된 비율을 가지는 두 TRT 핵산 또는 폴리펩티드의 서열을 비교한 것을 의미한다. 예를 들면, "60%의 서열 동일성" 및 "60%의 상동성"이란 최적으로 배열될 때 60%의 동일성을 가지는 두 핵산 또는 폴리펩티드의 서열을 비교한 것이다. 서열 유사성을 결정하기에 적합한 추가의 알고리즘은 BLAST 알고리즘인데, 이것은 문헌[Altschul(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Shaper (1996) Genomics 38:179-191]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 실시하는 소프트웨어는 내쇼날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./)에서 공개적으로 시판된다. 이러한 알고리즘은 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 배열될 때 일부의 양의 값을 가진 역치 T와 일치하거나 또는 역치 T를 충족시키는 의문 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 동정함으로써 높은 수치의 서열쌍(HSP; high scoring sequence pairs)을 먼저 동정할 것을 필요로 한다. T는 인접 단어 역치로서 언급된다(상기 Altschul 등의 문헌 참조). 이들 초기의 인접 단어 히트는 그들을 포함하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 연구를 개시하기 위한 시발점으로서 작용한다. 단어 히트는 누적 배열 값이 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 두 방향으로 연장된다. 각 방향으로 단어 히트의 연장은 누적 배열 값이 그 최대치로부터 X만큼 떨어질 때; 하나 이상의 음의 수치 잔기 배열의 축적으로 인해 누적치가 0 이하로 될 때; 또는 두 서열중 하나의 서열의 말단에 도달될 때 정지된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 배열의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어길이(W) 11, 블로섬(BLOSUM)62 채점 매트릭스(문헌[Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89:10915-10919] 참조) 배열(B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N=-4와 두 가닥의 비교치를 사용한다. BLAST란 용어는 두 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 실시하는 BLAST 알고리즘을 의미한다(예컨대, 문헌[Karlin (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소 합계 확률(P(N))인데, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 정합이 우연히 일어날 확률의 표시를 제공한다. 예를 들면, 핵산은 TRT 핵산과 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.5 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.01 미만 또는 0.001 미만이면 TRT 핵산과 유사한 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 "하이브리드화"란 용어는 "핵산의 가닥이 염기쌍 형성을 통해 상보 가닥과 결합하는 임의의 과정"을 포함한다(Coombs, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, 뉴욕주 뉴욕[1994]). 본원에 사용되는 "하이브리드화 복합체"란 용어는 상보적인 G와 C 염기 사이에 그리고 상보적인 A와 T 염기 사이의 수소 결합의 형성에 의해 두 핵산 사이에 형성된 복합체를 의미하며; 이들 수소 결합은 염기 적층 상호작용에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 두 개의 상보적인 핵산 서열은 반대 방향으로 평행한 모양으로 수소 결합한다. 하이브리드화 복합체는 용액내에 형성되거나 용액내에 존재하는 핵산 서열과 고체 지지체(예컨대, 서던 및 노던 블로팅, 도트 블로팅에 이용되는 나일론 막 또는 니트로셀룰로스 필터, 또는 FISH[형광성 동일계 하이브리드화]를 포함하는 동일계 하이브리드화에 이용되는 유리 슬라이드)에 고정화된 또 다른 핵산 서열 사이에 형성될 수 있다
"특이적으로 하이브리드된다"란 핵산이 특정 표적 DNA 또는 RNA 서열에 하이브리드되거나, 이중체를 형성하거나 결합하는 것을 의미한다. 표적 서열은 총 세포 DNA 또는 RNA의 제제에 존재할 수 있다. 적당한 어닐링 조건은 예컨대, 프로브의 길이, 염기 조성 및 부정합의 수, 및 프로브와 상응하는 표적상에서의 그 위치와 같은 핵산의 조건에 따라 좌우되며, 입수 가능한 적당한 시약을 제공하면서 경험적으로 쉽게 결정할 수 있다. 핵산 프로브의 조작 및 어닐링 조건에 대한 논의는 예컨대, 문헌[Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2판), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) (Sambrook) and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 편집, Greene Publishing and Wiley Interscience, 뉴욕 (1987) (Ausubel)]을 참조할 수 있다. "엄중 하이브리드화", "엄중 하이브리드화 조건", "엄중 조건(stringent conditions)" 또는 "특이적 하이브리드화 조건"이란 올리고뉴클레오티드(예컨대, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 때)가 그 표적 서열, 예컨대, 생물학적 샘플내 핵산의 TRT 재조합 서열에 하이브리드되나 비텔로머라제 서열에는 하이브리드되지 않는 조건을 의미한다. 엄중 조건은 서열 의존적이다. 따라서, 한 세트의 엄중 조건에서는, 올리고뉴클레오티드 프로브가 본 발명의 TRT 종류의 단 하나의 종에만 하이브리드될 것이다. 또 다른 세트의 엄중 조건에서는, 올리고뉴클레오티드 프로브가 본 발명의 TRT 종류의 모든 종에 하이브리드되나 비텔로머라제 핵산에는 하이브리드되지 않을 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드된다. 엄중 조건은 지정된 이온 강도 및 pH에서 특이 서열에 대한 열 용융점(Tm)보다 약 5EC 더 낮은 온도를 선택한다. Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 평형시의 표적 서열에 하이브리드되는 온도(지정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다(표적 서열이 과량으로 존재하면, Tm에서 프로브의 50%가 평형으로 점유된다). 통상, 엄중 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 나트륨 이온, 즉 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예컨대, 10 내지 50개 뉴클레오티드)에 대해서는 약 30EC 이상이며, 긴 프로브(예컨대, 50개 뉴클레오티드 이상)에 대해서는 약 60EC 이상인 조건이다. 엄중 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 얻을 수도 있다. 종종, 높은 엄중도의 세척 조건은 낮은 엄중도의 세척 조건이 선행하여 배경 프로브 신호를 제거한 조건이다. 이중체, 예컨대, 100개 뉴클레오티드의 이중체에 대한 중간 엄중도의 세척 조건의 예는 45EC에서 15분 동안의 1xSSC이다(상기 Sambrook의 문헌 참조). 이중체, 예컨대, 100개 뉴클레오티드의 이중체에 대한 낮은 엄중도의 세척 조건의 예는 40EC에서 15분 동안의 4-6xSSC이다. 특정 하이브리드화 분석에서 무관한 프로브에 대해 관찰되는 것보다 2x(또는 그 이상)의 신호 대 노이즈 비는 "특이적 하이브리드화"의 검출을 나타낸다. 엄중 조건하에 서로에게 하이브리드되지 않는 핵산은 이들이 암호화하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면 역시 실질적으로 동일할 수 있다. 이것은 예컨대, 보존적 치환을 암호화하는 핵산이 생성될 때 일어날 수 있다. 엄중 하이브리드화 및 엄중 하이브리드화 세척 조건은 서던 및 노던 하이브리드화와 같은 상이한 환경적 매개 변수하에서 상이하다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 지침은 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapt. 2, Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probe Assays, Elsevier, 뉴욕]에서 발견된다.
"삽입" 또는 "첨가"는 자연 발생적 서열과 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 첨가를 초래하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
분자 또는 조성물, 예컨대, TRT 또는 텔로머라제 관련된 핵산을 언급할 때 본원에 사용된 "분리된(isolated)"이란 분자 또는 조성물이 하나 이상의 다른 화합물(예컨대, 단백질), 다른 핵산(예컨대, RNA) 또는 생체내에서 또는 그 자연 발생적인 상태에서 연합되어 있는 다른 오염물로부터 분리되는 것을 의미한다. 따라서, TRT가 세포 추출물에서처럼 자연적으로 연합되어 있는 임의의 기타 성분, 예컨대 세포막으로부터 분리될 때 TRT는 분리된 것으로 간주된다. 그러나, 분리된 조성물은 또한 실질적으로 순수할 수 있다.
"표지(label)"란 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 물리적 또는 화학적 수단에 의하는 것과 같이 검출 가능한 조성물을 의미한다. 예를 들면, 유용한 표지로는32P,35S,3H,14C,125I,131I, 형광성 염료(예컨대, FITC, 로다민, 란타니드 포스포르), 전자 밀집 시약, 효소[예컨대, ELISA에서 통상 사용되는 것(예컨대, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈랄토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제)], 비오틴, 디옥시게닌, 또는 항혈청 또는 단일클론 항체가 이용할 수 있는 햅텐 및 단백질이 있다. 표지는 핵산, 펩티드, 또는 검출할 기타 표적 화합물내로 직접 혼입시키거나 또는 표적에 하이브리드되거나 결합하는 프로브 또는 항체에 부착될 수 있다. 펩티드는 2차 리포터(예컨대, 루이신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 전사 활성화인자 폴리펩티드, 금속 결합 도메인, 에피토프 표지)가 인지하는 예정된 폴리펩티드 에피토프를 혼입시킴으로써 검출 가능하게 될 수 있다. 일부 양태에서, 표지는 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 부착되어 기타 유용하거나 목적하는 성질에 대한 잠재적인 입체적 간섭 또는 충격을 감소시킨다. 예컨대, 문헌[Mansfield (1995) Mol Cell Probes 9:145-156] 참조.
본원에 사용된 "거대핵"이란 섬모충류에서 관찰되는 두 가지 유형의 핵중 큰 것을 의미한다. 이 구조는 또한 때때로 "영양성" 핵으로 지칭된다. 거대핵은 각 유전자의 다수 사본을 포함하며 전사 활성이 있다.
본원에 사용된 "미소핵"이란 섬모충류에서 관찰되는 두 가지 유형의 핵중 작은 것을 의미한다. 이 구조는 그것이 감수 분열 및 자가 수정에 참여하기 때문에 때대로 "생식성" 핵으로 지칭된다. 미소핵은 이배체이고 전사 불활성이다.
본원에 사용된 "핵산 서열" 또는 "올리고뉴클레오티드"란 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 그 단편 또는 부분을 의미하며, 또한 1본쇄 또는 2본쇄이거나 또는 센스 또는 안티센스 가닥을 포함할 수 있는 천연 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이 용어는 핵산, 즉 기준 핵산으로서 의도하는 목적에 대해 유사하거나 또는 개선된 결합 또는 기타 성질을 가지는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 의도하는 목적에 대해 개선된 속도로 또는 자연 발생적 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 핵산을 포함한다. 이 용어는 또한 합성 주쇄를 가진 핵산 유사 구조를 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 DNA 주쇄 유사체로는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 모폴리노 카르바메이트 및 기타 핵산이 있다(문헌[Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein 편집, 옥스포드 대학교 출판부의 IRL Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Baserga and Denhardt 편집(NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) in its entirety and specifically Chapter 15, Sanghvi 편집, 제목: "Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides"] 참조). 본원에 사용된 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 뉴클레오시드가 포스포디에스테르 연결체 보다는 펩티드에 의해 연결된 올리고머 분자를 의미한다. 이들 소형 분자는 항-유전자 작용제로도 명명된 것으로서, 핵산의 그 상보적(주형) 가닥에 결합함으로서 전사체 신장을 정지시키기도 한다(Nielsen 등, Anticacer Drug Des 8:53-63[1993]). PNA는 USSN 08/630,019호(1996. 4. 9일자 출원) US CIP USSN 08/838,545호 및 PCT 출원 PCT/US/97/05931호(둘다 1997. 4. 9일자 출원)에 기재된 바와 같이 N-(2-아미노에틸)글리신 단위와 같은 비이온성 주쇄를 포함한다. 포스포로티오에이트 연결체는 WO97/03211호; WO96/39154호; 문헌[Mata(1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197]에 기재되어 있다. 상기 용어에 포함되는 기타 합성 주쇄로는 메틸포스포네이트 연결체 또는 교대로 메틸포스포네이트 및 포스포디에스테르 연결체(Strauss-Soukup(1997) Biochemistry 36:8692-8698)가 있고, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드 및 메틸포스포네이트와 비교하여 뉴클레아제에 대해 더 안정하고 지방 친화도가 더 높은 벤질포스포네이트 연결체가 있다(Samtag(1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156). 핵산이란 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 프로브 및 증폭 생성물과 호환적으로 사용된다. "외래 핵산"이란 용어는 자연계에서 발견되지 않는 방식으로, 또 다른 핵산과 함께 분리, 합성, 클로닝, 결찰, 절제되고/되거나, 상기 핵산 또는 단백질이 자연에서 발견되는 세포 또는 세포 환경과는 상이한 형태 또는 레벨과는 다른 세포 또는 세포 환경에 도입되고/되거나 그 세포 또는 세포 환경에서 발현되는 핵산을 의미한다. 상기 용어는 그것이 발현되는 세포 유형과는 상이한 세포 유형 또는 생물로부터 최초로 얻은 핵산을 포함하고, 또한 그것이 발현되는 세포주와 동일한 세포주로부터 얻은 핵산을 포함한다.
본원에 사용되는 "폴리머라제"라는 용어는 당해 핵산의 증폭 반응에 사용하기에 적합한 임의의 폴리머라제를 의미한다. 이 용어는 열안정성이고 비내열성인 기타 폴리머라제 역시 이 정의내에 포함되지만, 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus)로부터 얻은 Taq DNA 폴리머라제와 같은 DNA 폴리머라제를 포함한다.
본원에 사용된 "다배체(polyploid)"란 용어는 두 세트 이상의 염색체를 포함하는 세포 또는 생물을 의미한다.
본원에 사용하는 "일부분(portion)"이란 단백질과 관련하여(예컨대, "주어진 단백질의 일부분") 그 단백질의 단편을 의미한다. 단편들은 4개 아미노산 잔기로부터 전체 아미노산 서열에서 하나의 아미노산을 뺀 잔기까지의 크기 범위를 가질 수 있다. 따라서, "서열번호 2의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 포함하는" 단백질은 전길이의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 그 단편을 포함한다.
본원에 사용된 "프로브"란 용어는 또 다른 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 예를 들면, 프로브는 정제된 제한 효소 분해물에서처럼 자연 발생적이거나 또는 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 서열)로서, 당해 또 다른 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드될 수 있는 분자이다. 프로브는 핵산이든 단백질이든 특정 유전자 서열 또는 특정 유전자 생성물의 검출, 동정 및 분리에 유용하다. 본 발명에 사용된 임의의 프로브는 효소계(예컨대, ELISA 뿐만 아니라, 효소계 조직화학적 분석), 형광계, 방사성계 및 발광계(이들에 국한되지 않음)를 포함하는 임의의 검출계에서 검출할 수 있는 임의의 "리포터 분자"로 표지할 수 있다. 당해(즉, 검출하고자 하는) 올리고뉴클레오티드, 항체 또는 기타 단백질 또는 핵산을 리포터 분자로 표지할 수 있다. 또한 당해 올리고뉴클레오티드 및 프로브를 표지할 수도 있다. 본 발명을 임의의 특정 검출계 또는 표지에 한정할 의도는 없다.
본원에 사용된 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"라는 용어는 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 근처에서 2본쇄 또는 1본쇄 DNA를 절단하는 박테리아 효소 또는 기타 효소를 의미한다.
세포 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용할 때 "재조합체"라는 용어는 새로운 부분의 도입 또는 기존 부분의 변경에 의해 변형된 것이거나 또는 합성 물질과 동일하나 그로부터 생산되거나 유래하는 것인 물질의 천연 형태에 상응하는 물질을 의미한다. 예를 들면, 재조합 세포는 세포의 천연(비재조합) 형태내에서 발견되지 않는 유전자를 발현시킬 수 있거나 또는 상이한 레벨로 발현되는, 통상 적게 발현되거나 발현되지 않는 천연 유전자를 발현시킬 수 있다. "재조합 수단"이란 용어는 단백질을 암호화하는 cDNA와 같은 재조합 핵산을 발현 벡터내로 삽입하고, 벡터를 세포내로 도입하며, 세포는 단백질을 발현시키는 기술을 의미한다. "재조합 수단"은 또한 본 발명의 TRT 단백질과 같은 단백질을 포함하여 단백질 융합의 발현을 위해 하나의 벡터내로 상이한 출처에서 얻은 암호 또는 프로모터 서열을 가진 핵산을 구성적으로 또는 유도성으로 결찰시키는 것을 포함한다.
본원에서 "재조합 DNA 분자"란 분자 생물학적 기술 및 재조합 수단에 의해 함께 결합된 DNA의 분절을 포함하는 DNA 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 "리보뉴클레오단백질"이란 RNA 및 단백질을 포함하는 복합체 거대분자를 의미한다.
본원에서 사용된 "샘플"이란 용어는 최광의의 의미로 사용한다. 텔로머라제 서브유닛을 암호화하는 핵산을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은 세포, 세포로부터 분리된 염색체(예컨대, 중기 염색체의 확산체), 게놈 DNA(용액중 또는 서던 블롯 분석용과 같이 고체 지지체에 결합된 것), RNA(용액중 또는 서던 블롯 분석용과 같이 고체 지지체에 결합된 것), cDNA(용액중 또는 고체 지지체에 결합된 것) 등을 포함할 수 있다. 어떤 단백질을 포함하는 것으로 의심되는 샘플은 세포, 조직의 일부분, 하나 이상의 단백질을 포함하는 추출물 등을 포함할 수 있다.
항체 및 단백질 또는 펩티드의 상호작용과 관련하여 "특이 결합" 또는 "특이적으로 결합함"이란 그 상호작용이 단백질상의 특정 구조(즉, 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존되는 것을 의미하며; 달리 말하면, 항체는 일반적으로 단백질이라기보다는 특정 단백질 구조를 인지하고 거기에 결합하는 것을 의미한다. 예를 들면, 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A" 및 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 비표지된 유리 A)를 포함하는 단백질의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
핵산 하이브리드화 또는 결합과 관련하여 "엄중도"란 통상 Tm약 5EC(프로브의 Tm의 5EC 이하)로부터 Tm이하 약 20EC 내지 25EC까지의 범위에서 나타난다. 당업자라면 이해하듯이, 엄중 하이브리드화를 사용하여 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 동정 또는 검출하거나 또는 유사한 또는 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 동정 또는 검출할 수 있다. 당업자라면 낮거나 높은 엄중 조건을 포함하는 다수의 동등한 조건을 이용할 수 있음을 잘 알 수 있다: 당업자라면, 프로브의 길이 및 성질(DNA, RNA, 염기 조성) 및 표적의 성질(용액에 존재하거나 또는 고정화된 DNA, RNA, 염기 조성 등) 및 염 및 기타 성분의 농도(예컨대, 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재)를 고려하고, 하이브리드화 용액을 상기에 열거한 조건과는 상이하지만 동등한, 낮거나 높은 엄중 하이브리드화 조건을 생성시키도록 변화시킬 수 있음을 잘 알 수 있다.
"치환"이란 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 각각 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다.
본원에서 "Tm"은 "용융 온도"와 관련하여 사용한다. 용융 온도는 2본쇄 핵산 분자의 군집의 절반이 1본쇄로 해리되는 온도를 의미한다. 핵산의 Tm을 계산하는 식은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 표준으로 나타나는 바와 같이, Tm값의 간단한 산정치는 핵산이 1 M NaCl의 수용액내에 존재할 때, 식 Tm= 81.5 + 0.41(% G+C)에 의해 계산할 수 있다(예컨대, 문헌[Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridisation, in Nucleic Acid Hybridisation (1985)] 참조). 다른 참고 문헌에는 Tm의 계산을 위해서 구조적인 특성 뿐만 아니라 서열 특성을 고려하는 보다 복잡한 계산이 포함된다.
본원에 사용된 "표적"이란 용어는 검출하고자 하거나 또는 특이적으로 조작되는 분자를 의미한다. 예를 들면, PCR에서 표적은 폴리머라제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산 영역을 의미한다. 따라서, "표적"은 다른 핵산 서열로부터 분류하고자 하는 서열이다. "분절"이란 표적 서열내 핵산 영역으로 정의된다.
본원에 사용된 "텔로머라제" 및 "텔로머라제 복합체"란 용어는 기능적 텔로머라제 효소를 의미한다. 이 용어는 텔로머라제에서 발견되는 단백질 복합체 및 핵산을 포함한다. 예를 들면, 이 용어는 이. 에디큘라투스의 123 kDa 및 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 텔로머라제 RNA를 포함한다. "TRT" 및 "텔로머라제 역전사 효소"란 예컨대, 이. 에디큘라투스의 123 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛과 같은 텔로미어 특이적인 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 단백질을 의미한다. "TRT" 및 "텔로머라제 역전사 효소"란 달리 나타내지 않으면, RNA 성분이 없는 텔로머라제 완전 효소를 의미한다. "텔로머라제" 및 "텔로머라제 효소"란 내부 RNA 성분, 즉 DNA 합성 주형으로 사용되는 RNA 부분("TR")을 가진 TRT를 의미한다. 텔로머라제는 그 내부 RNA 부분을 주형으로 이용하여 염색체 말단에 텔로미어 DNA 반복 서열의 첨가를 구체화할 수 있다 본 발명의 TRT 단백질은 RNA 부분(TR)과 연합될 때 텔로미어의 합성을 촉매할 수 있는 종, 예컨대, hTR, 텔로머라제의 하나 또는 여러 개 또는 모든 부분적 활성을 나타낼 수 있는 종, 및 이들이 본 발명의 종류의 필수적이고 공통된 구조적 특성을 포함하기 때문에 본 발명의 종류의 멤버로 간주되는 TRT 동종형과 같은 종을 포함한다. hTR은 클로닝되고 특성 분석되었고, 다양한 유용한 프라이머, 프로브 및 발현 벡터가 알려졌으며, hTR을 표적으로 하고 암 및 기타 텔로머라제 관련 질병을 진단 및 치료하는 데 유용한 진단 및 치료 방법 역시 알려져 있다(PCT 공개번호 제96/01835호 및 제96/40868호 및 미국 특허 제5,583,016호; USSN 08/478,352호, 제08/472,802호 및 제08/482,115(모두 1995. 6. 7일자로 출원); 제08/521,634호(1995. 8. 31일자로 출원); 제08/714,482호 (1996. 9. 16일자로 출원); 및 제08/770,564호 및 제08/770,565호(둘다 1996. 12. 20일자로 출원); 및 문헌[Feng(1995) ` 269:1236] 참조). 또한, 마우스 텔로머라제 RNA 성분(mTR)은 클로닝되고 특성 분석되어 있다(USSN 08/782,787호(1997. 2. 10일자로 출원; 제08/670,516호(1996. 6. 27일자로 출원); 및 제08/485,778호 (1995. 6. 7일자로 출원됨) 참조). hTR 무력화 마우스가 구성되어 있다(USSN 08/623,166호(1996. 3. 28일자로 출원) 참조).
"텔로머라제 활성" 및 "텔로머라제 역전사 효소 활성"이란 용어는 텔로머라제 역전사 효소 또는 텔로머라제의 "완전한" 또는 임의의 "부분 활성"을 의미할 수 있다. 텔로머라제 역전사 효소 활성은 텔로머라제 RNA와 같은 핵산 주형을 사용하여 텔로미어 또는 텔로미어 DNA와 같은 DNA를 합성하는 능력을 포함한다. 텔로머라제 역전사 효소의 "부분 활성"은 TRT가 기질 DNA에 결합하는 능력; 텔로머라제 RNA 부분(TR), 즉 hTR에 결합하는 능력; 뉴클레오티드를 DNA 기질에 첨가하는 반응을 촉매하는 능력; 데옥시뉴클레오티드 기질에 결합하는 능력; "뉴클레아제 분해 활성"을 나타내는 능력(문헌[Collins(1993) Genes Dev 7:1364-1376] 참조); 텔로머라제 또는 텔로미어 관련 단백질 또는 염색체 구조에 결합하는 능력; 텔로머라제의 "처리" 또는 "비처리" 활성을 나타내는 능력(문헌[Morin (1989) Cell 59:521-529] 참조); 텔로머라제의 "역전사 효소 유사 활성"을 나타내는 능력(문헌[Linger (1997) Science 276(5312):561-567] 참조); 그 효소의 처리 DNA 중합 활성의 일부로서 뉴클레오티드에 결합하는 능력; 생체내에서 염색체에 결합하는 능력; 시험관내에서(문헌 [Harrington(1995) J Biol Chem 270:8893-8901] 참조) 또는 재구성된 계에서 올리고뉴클레오티드 프라이머에 결합하는 능력; 및 히스톤, 핵 매트릭스 단백질, 세포 분열/세포 주기 제어 단백질 등에 결합하는 능력과 같은 기능들이 있으나, 이들에 국한되지 않는다.
아미노산 서열과 관련하여 "변형체"란 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산과 상이한 아미노산 서열, 통상 관련된 아미노산 서열을 나타낸다. 변형체는 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 가지는 "보존적" 변화(예컨대, 루이신을 이소루이신으로 대체하는 것)를 가질 수 있다. 보다 드물게, 변형체는 "비보존적" 변화, 예컨대, 글리신을 트립토판으로 대체하는 변화를 가질 수 있다. 유사한 사소한 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입(즉, 첨가) 또는 그 둘다를 포함할 수도 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 상실하지 않으면서 어느 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지, 그리고 얼마나 많은 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 측정하는 지침은 당해 분야에 널리 알려진 컴퓨터 프로그램, 예컨대, DNA스타 소프트웨어를 사용하여 확인할 수 있다. 따라서, 상기 정의는 텔로머라제 및/또는 텔로머라제 단백질 서브유닛의 변형체를 포함할 것이다. 또 다른 예의 경우, 유플로테스 43 kDa 폴리펩티드 유전자의 3개의 개방형 해독틀(ORF)이 암호화하는 폴리펩티드는 서로의 변형체 뿐만 아니라, 폴리펩티드를 암호화하는 43 kDa 유플로테스 유전자의 인간 상동체의 변형체인 것으로 간주될 수 있다. 그러한 변형체는 텔로머라제 분석과 같은 기능적 분석법으로 시험하여 샘플내 기능적 텔로머라제의 존재를 검출할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 양태 및 관점을 입증하고 추가로 예시하기 위해 제시하는 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
하기 실험적 개시 사항에서는, 다음과 같은 약어를 적용한다:
eq(당량); M(몰 농도); μM(마이크로몰 농도); N(노르말 농도); mol(몰); mmol(밀리몰); μmol(마이크로몰); nmol(나노몰); g(그램); ㎎(밀리그램); ㎍(마이크로그램); ng(나노그램); l 또는 L(리터); ㎖(밀리리터); ㎕(마이크로리터); ㎝(센티미터); ㎜(밀리미터); ㎛(마이크로미터); nm(나노미터); EC(℃); RPN(리보뉴클레오단백질); MeRN (2'-O-메틸리보뉴클레오티드); dNTP(데옥시리보뉴클레오티드); dH2O(증류수); DDT(디티오트레이톨); PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드); TE(10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 약 7.2); KGlu(글루탐산 칼륨); SSC(염 및 시트르산 나트륨 완충제); SDS(나트륨 도데실 설페이트); PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동); 노벡스(Novex, 캘리포니아주 샌디에고 소재의 노벡스사); 바이오래드(BioRad, 캘리포니아주 허큘레스 소재의 바이오-래드 래보러토리즈); 파마시아(뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파마시아 바이오테크사); 베링거-만하임(캘리포니아주 콩코드 소재의 베링거-만하임 코포레이션); 아머샴(일리노이주 시카고 소재의 아머샴 인코포레이티드); 스트라타진(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진 클로닝 시스템스); NEB(매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스); 피어스(Pierce, 일리노이주 락포드 소재의 피어스 케미컬 캄파니); 베크만(Beckman, 캘리포니아주 풀러톤 소재의 베크만 인스트루먼츠); 랩 인더스트리즈(캘리포니아주 버클리 소재의 랩 인더스트리즈); 에펜도르프(위스콘신주 매디슨 소재의 에펜도르프 사이언티픽); 및 몰레큘라 다이나믹스(캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘라 다이나믹스).
실시예 1: 유플로테스 에디큘라투스의 성장
본 실시예에서는, 이. 에디큘라투스의 배양물을 콜로라도 대학교 MCDB의 프레스코트 데이비드 박사로부터 입수하였다. 프레스코트 박사는 본래 이 배양물을 연못의 물로부터 분리하였지만, 이 생물은 또한 ATCC(ATCC #30859)로부터 이용할 수 있다. 음식물 공급원으로 클로로고늄(Chlorogonium)을 포함하는 15 리터들이 유리 용기에서 비멸균 조건하에 문헌[Swanton(1980) Chromosoma 77:203]에 기재된 대로 배양물을 증식시켰다. 밀도가 약 104세포/㎖에 도달했을 때 배양물로부터 생물을 수집하였다.
실시예 2: 핵 추출물의 제조
본 실시예에서, 이. 에디큘라투스의 핵 추출물은 후술하는 바와 같이 당해 분야에 개시되어 있는 사항[Linger (1994) Genes Develop. 8:1984]을 약간 변형시켜 제조하였다. 간략히 언급하면, 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시킨 세포를 15 ㎛의 니텍스 필터를 사용하여 농축시키고, 얼음상에서 냉각시켰다. 세포 펠렛을 최종 부피 100 ㎖의 TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액에 재현탁시켰다. 원액 TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액은 스퍼미딘 포스페이트(USB) 0.075 g 및 PMSF(에탄올에 제조된 100 mM 원액으로부터 얻음) 0.75 ㎖를 TMS 150 ㎖에 첨가하여 제조하였다. TMS는 10 mM 트리스-아세테이트, 10 mM MgCl2, 슈크로스 85.5752 g/리터 및 CaCl20.33297 g/리터를 포함하였고, pH는 7.5였다.
TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액에서 재현탁시킨 후, 10% NP-40 8.8 ㎖ 및 슈크로스 94.1 g을 첨가하고, 그 혼합물을 오버헤드 모터에 부착된 스테인레스강 교반봉을 가진 규소화된 유리 비이커에 넣었다. 세포들이 완전히 용해되도록(대략 20분) 그 혼합물을 교반하였다. 베크만 JS-13 스윙아웃 로터를 사용하여 이 혼합물을 4EC에서 7500 rpm(8950 x g)로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 핵 펠렛을 TMS/PMSF/스퍼미딘 포스페이트 완충액에 재현탁시키고, 베크만 JS-13 스윙아웃 로터를 사용하여 4EC에서 7500 rpm(8950 x g)로 5분 동안 다시 원심분리하였다.
상청액을 제거하고, 핵 펠렛을 50 mM 트리스-아세테이트, 10 mM MgCl2, 10% 글리세롤, 0.1% NP-40, 0.4 M KGlu, 0.5 mM PMSF로 이루어진 완충액(pH 7.5)에서 수집된 세포 10 g당 완충액 0.5 ㎖의 부피로 재현탁시켰다. 그 다음, 재현탁된 핵을 약 50 스트로크를 가진 유리 균질화기에서 분쇄시킨 다음, 에펜도르프 원심분리기에서 4EC에서 14,000 rpm으로 25분 동안 원심분리하였다. 핵 추출물을 함유하는상청액을 수집하고, 액체 질소에서 동결시키고 사용시까지 -80EC에서 보관하였다.
실시예 3: 텔로머라제의 정제
본 실시예에서는, 실시예 2에서 설명한 대로 제조한 핵 추출물을 사용하여 이. 에디큘라투스 텔로머라제를 정제하였다. 이 정제 프로토콜에서, 텔로머라제를 먼저 Affi-Gel-헤파린 칼럼상에서 크로마토그래피하여 농축시킨 다음, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 친화도 정제에 의해 광범위하게 정제하였다. 텔로머라제 RNA의 주형 영역은 텔로머라제 RNP 입자에서 하이브리드되기 쉽기 때문에, 안티센스 올리고뉴클레오티드(즉, "친화도 올리고뉴클레오티드")는 텔로머라제에 대한 친화도 유인판으로서의 상기 주형 영역에 상보적인 것으로 합성되었다. 비오틴 잔기를 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 포함시켜 그 잔기를 아비딘 칼럼에 고정화시켰다.
올리고뉴클레오티드에 텔로머라제를 결합시키고 광범위하게 세척한 다음, 치환 올리고뉴클레오티드를 사용하여 텔로머라제를 용출시켰다. 친화도 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA5'에 상보적이지 않은 DNA 염기를 텔로머라제 특이 서열에 포함하였다. 치환 올리고뉴클레오티드는 그 전길이에 대해 친화도 올리고뉴클레오티드와 상보적이기 때문에, 친화도 올리고뉴클레오티드에 결합된 텔로머라제보다 더 많은 열역학적으로 안정한 이중체를 형성할 수 있었다. 따라서, 치환 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과 칼럼으로부터 텔로머라제가 용출되었다.
45 리터의 배양물로부터 제조된 핵 추출물은 핵 추출물 총 34 ㎖을 수집할 때까지 동결시켰다. 이것은 배양물 630 리터(즉, 대략 4 x 109세포)에 해당하였다. 핵 추출물은 완충액으로 410 ㎖까지 희석하여 pH 7.5에서 최종 농도 20 mM 트리스-아세테이트, 1 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 33 mM KGlu, 10%(v/v) 글리세롤, 1 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.5 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 제공하였다.
희석된 핵 추출물을 동일한 완충액에서 평형을 이룬, 베드 부피 230 ㎖ 및 직경 5 ㎝인 Affi-Gel-헤파린 겔 칼럼(바이오-래드)에 첨가하였다. 그 칼럼은 유속 1 칼럼 부피/시간으로 4EC에서 작동시켰다. 50 ㎖의 분획을 각각 모으고 실시예 4에 기술한 바와 같이 텔로머라제 활성에 대해 분석하였다. 텔로머라제는 약 170 mM KGlu에서 칼럼으로부터 용출되었다. 텔로머라제를 함유하는 분획(약 440 ㎖)을 모으고, 20 mM 트리스-아세테이트, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 300 mM KGlu, 10% 글리세롤, 1 mM DTT 및 1% 노니뎃(Nonidet) P-40이 되게 조정하였다. 이 완충액을 "WB"라 명명하였다.
이 제제에, 푸울 1 ㎖당 두 경쟁인자 DNA 올리고뉴클레오티드 (5'-TAGACCTGT TAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3'(서열번호 28) 및 (5'-TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3'(서열번호 29) 각각 1.5 nmol, 효모 RNA 50 ㎍(시그마) 및 비오틴-표지된 텔로머라제 특이 올리고뉴클레오티드(5'-비오틴-TAGACCTGTTA-(MeRN G)2-(MeRN U)4-(MeRN G)4-(MeRN U)4-MeRN G-3'(서열번호 60) 0.3 nmol을 첨가하였다. 텔로머라제 특이 올리고뉴클레오티드의 2-O-메틸리보뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 주형 영역에 상보적이었고, 데옥시리보뉴클레오티드는 상보적이 아니었다. 경쟁인자 비특이적 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하면, 친화도 올리고뉴클레오티드에 결합하거나 또는 혼합물로부터 텔로머라제를 제거할 혼합물내 핵산 결합 단백질 및 기타 성분의 효과가 최소화함에 따라 정제 효율을 증가시켰다.
그 다음, 이 재료를 울트라링크 고정화된 뉴트라비딘 플러스(피어스) 칼럼 재료에 푸울 1 ㎖당 현탁액 60 ㎕의 부피로 첨가하였다. 칼럼 재료는 0.01% 노니셋 p-40, BSA 0.5 ㎎, 라이소자임 0.5 ㎎/㎖, 글리코겐 0.05 ㎎/㎖ 및 효모 RNA 0.1 ㎎/㎖를 함유하는 WB 제제로 각각의 차단(blocking)마다 15분 동안 2회 사전 차단하였다. 차단은 칼럼 재료를 완전히 차단시키는 회전 바퀴를 사용하여 4EC에서 수행하였다. 첫 번째 차단 단계후에, 그리고 두 번째 차단 단계전에 칼럼 재료를 200 x g에서 2분 동안 원심분리하여 매트릭스를 펠렛화하였다.
푸울-칼럼 혼합물을 결합시키기 위한 회전 바퀴(약 10 rpm; 랩인더스트리즈) 상에서 30EC에서 8분 동안 항온처리한 다음, 4EC에서 추가 2 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 푸울-칼럼 혼합물을 200 xg에서 2분 동안 원심분리하고, 결합되지 않은 재료를 함유하는 상청액을 제거하였다. 그 다음, 푸울-칼럼 혼합물을 세척하였다. 이 세척 공정은 푸울-칼럼 혼합물을 4EC에서 WB로 헹구는 단계, 그 혼합물을 4EC에서 WB로 15분 동안 세척하는 단계, WB로 헹구는 단계, 30EC에서 0.6 M KGlu를 함유하고 노니뎃 P-40을 함유하지 않는 WB로 5분 동안 세척하는 단계, 25EC에서 WB로 5분 동안 세척하는 단계, 및 마지막으로 WB로 다시 헹구는 단계를 포함하였다. 최종 세척후에 잔존하는 부피는 작게 유지하여 완충액 대 칼럼 재료의 비를 대략 1:1로 얻었다.
텔로머라제는 칼럼 재료 1 ㎖당 치환 데옥시올리고뉴클레오티드 (5'-CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3') (서열번호 30) 1 nmol을 첨가하고, 25EC에서 30분 동안 항온처리함으로써 칼럼 재료로부터 용출시켰다. 이 재료는 미세 원심분리기(에펜도르프)에서 14,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하고 용출물을 수집하였다. 매번 새로운 치환 올리고뉴클레오티드를 사용하여 용출 절차를 2회 더 반복하였다. 전술한 바와 같이, 치환 올리고뉴클레오티드는 친화도 올리고뉴클레오티드와 상보적이기 때문에, 그것은 친화도 올리고뉴클레오티드와의 복합체로서 텔로머라제보다 더 열역학적으로 안정한 복합체를 형성하였다. 따라서, 친화도에 의해 결합된 텔로머라제에 치환 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과 천연 조건하에서 텔로머라제가 효율적으로 용출되었다. 텔로머라제는 단백질 겔상에서의 분석으로 판단할 때, 이 단계에서 약 50%의 순도를 가진 것으로 나타났다. 텔로머라제의 친화도 정제 및 치환 올리고뉴클레오티드를 사용한 용출 결과는 도 1(각각 패널 A 및 B)에 도시한다. 도 1에는, 친화도 올리고뉴클레오티드의 2'-O-메틸 당이 굵은 선으로 나타나 있다. 도 1에서 흑색 및 흐린 난형의 모양은 본 발명의 단백질 서브유닛을 그림으로 나타내고자 한 것이다.
AffI-Gel-헤파린 칼럼 크로마토그래피 후에 얻어진 추출물 및 재료의 단백질 농도는 표준으로 BSA를 사용하여 브래드포드의 방법(Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248)을 사용하여 측정하였다. 텔로머라제 제제의 분획만이 글리세롤 구배상에서 추가로 정제되었다.
텔로머라제의 침강계수는 실시예 8에서 설명하는 바와 같이 글리세롤 구배 원심분리에 의해 측정하였다.
표 2는 본 실시예의 방법에 따라 정제된 텔로머라제에 대한 정제표이다. 텔로머라제는 전체 세포 추출물과 비교하여 회수율 80%로 핵 추출물에서 12배로 농축되었고; 텔로머라제의 85%는 추출시 핵으로부터 용해되었다.
텔로머라제의 정제
분획 단백질(㎎) 텔로머라제(RNP pmol) 텔로머라제/단백질/RNP pmol/㎎ 회수율(%) 정제 배수
핵 추출물 2020 1720 0.9 100 1
헤파린 125 1040 8.3 60 10
친화도 0.3** 680 2270 40 2670
글리세롤 구배 NA* NA* NA* 25 NA*
* NA = 입수 불가** 이 값은 순도를 50%(단백질 겔을 기준)로 가정하여 텔로머라제의 측정된 양(680 pmol)으로부터 계산하였다.
실시예 4: 텔로머라제 활성
텔로머라제의 정제에 있어서의 각 단계에서, 제제는 본 실시예에서 설명하는 바와 같이, 3개의 별도의 분석법(이중 한 가지는 활성 분석법임)으로 분석하였다. 일반적으로, 텔로머라제 분석은 핵 추출물 0.003 내지 0.3 ㎕, 50 mM 트리스-Cl(pH 7.5), 50 mM KGlu, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 125 μM dTTP, 125 μM dGTP 및 5'-32P-표지된 올리고뉴클레오티드 기질 약 0.2 pmole(즉, 약 400,000 cpm)을 함유하는 40 ㎕에서 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 반응 혼합물에 첨가하기 전에 열 변성시켰다. 반응물은 얼음상에 모으고, 25EC에서 30분 동안 항온처리하였다. 10 mM 트리스-Cl(pH 7.5) 200 ㎕, 15 mM EDTA, 0.6% SDS 및 프로티나제 K 0.05 ㎎/㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고, 45EC에서 30분 이상 동안 항온처리하였다. 에탄올 침전후에, 당해 분야에 알려진 바와 같이(에컨대, Sambrook 등의 문헌(1989) 참조), 변성 8% PAGE 겔상에서 생성물을 분석하였다.
실시예 5: 텔로머라제 활성의 정량 분석
본 실시예에서는, 정제 절차를 통해 텔로머라제 활성을 정량 분석하는 방법을 설명한다. 정량 분석은 dGTP 및 [감마-32P]dTTP의 존재하에 올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장을 분석함으로써 수행하였다. 간략히 언급하면, 1 μM 5'-(G4T4)2-3' 올리고뉴클레오티드를 문헌[Lingner 등, Genes Develp., 8:1984(1994)]에 기재된 바와 같이 [감마-32P]dTTP(10 mCi/㎖, 400 Ci/mmol; 1 Ci=37 GBq) 2 ㎕ 및 125 μM dGTP의 존재하에 반응 혼합물 20 ㎕에서 연장시키고, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 8% PAGE 서열 분석 겔상에 적재하였다.
본 연구의 결과는 도 3에 나타낸다. 레인 1에는, 존재하는 텔로머라제가 없으며(즉, 음성 대조군); 레인 2, 5, 8 및 11은 0.14 fmol의 텔로머라제를 함유하였고; 레인 3, 6, 9 및 12는 0.42 fmol의 텔로머라제를 함유하였으며; 레인 4, 7, 10 및 13은 1.3 fmol의 텔로머라제를 함유하였다. 제조자의 지시에 따라 포스포르이미져(몰레큘라 다이나믹스)를 사용하여 활성을 정량 분석하였다. 이들 조건하에, 1 fmol의 친화도 정제된 텔로머라제는 21 fmol의 dTTP를 30분내에 혼입한 것으로 측정되었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 텔로머라제의 비활성은 정제 과정을 통해 상당히 변화하였다. 친화도 정제된 텔로머라제는 완전히 활성이 있었다. 그러나, 고농도에서, 저해 활성을 검출하고 미정제 추출물의 활성은 선형이 아닌 것으로 측정되었다. 따라서, 도 3에 도시한 분석법에서, 미정제 추출물은 700 내지 7000배 희석하였다. 정제시에, 이러한 저해 활성을 제거하고, 높은 효소 농도에서조차 정제된 텔로머라제 제제에서는 저해성 효과가 검출되지 않았다.
실시예 6: 겔 전기영동 및 노던 블롯
실시예 4에 나타낸 바와 같이, 텔로머라제의 정제에서의 각 단계에서, 제제는 3개의 별도의 분석에 의해 분석하였다. 본 실시예는 분획내에 존재하는 텔로머라제 RNA을 정량 분석하고, 텔로머라제 리보뉴클레오단백질 입자의 완전성을 분석하는 데 사용된 겔 전기영동 및 블로팅 절차를 설명한다.
변성 겔 및 노던 블롯
본 실시예에서, 기지 농도의 합성 T7-전사된 텔로머라제 RNA를 표준으로 사용하였다. 본 조사를 통틀어, RNA 성분을 텔로머라제의 척도로서 사용하였다.
이. 에디큘라투스 텔로머라제 RNA의 파지 T7 RNA 폴리머라제 전사를 위한 구성체는 PCR을 사용하여 생성시켰다. 텔로머라제 RNA 유전자는 유전자의 어느 하나이 말단에 어닐링되는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 5' 말단에서 어닐링된 프라이머는 또한 전사된 RNA의 절단시에 천연의 5' 말단, T7-프로모터 서열, 및 서브클로닝을 위한 EcoRI 부위를 생성시키기 위해 해머머리형 리보자임을 암호화하였다. 상기 5' 프라이머의 서열은 다음과 같았다:
5'-GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCACG AAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTAG-3'(서열번호 31).
3' 프라이머는 천연의 3' 말단에 전사 종결을 위한 EarI 부위 및 클로닝을 위한 BamHI 부위를 포함하였다. 이 3' 프라이머의 서열은 다음과 같았다:
5'-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3'(서열번호 32).
PCR 증폭 생성물은 EcoRI 및 BamHI로 절단하고, pUC19(NEB)의 각각의 부위내로 서브클로닝하여 "pEaT7"을 얻었다. 이 삽입체의 정확도는 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. T7 전사는 EarI-선형화된 플라스미드를 사용하여 문헌[Zaug Biochemistry(1994) 33:14935]에 기재된 바와 같이 실시하였다. RNA를 겔 정제하고, 농도를 측정하였다(A2601= 40 ㎍/㎖). 이 RNA를 표준으로 사용하여 다양한 텔로머라제 제제에 존재하는 텔로머라제 RNA를 측정하였다.
하이브리드화 신호는 텔로머라제 RNA의 양에 비례하고, 유도된 RNA 농도는 천연 겔 전기영동에 의해 얻은 것과 유사하나, 그보다 약간 더 높았다. 기지의 T7 RNA 전사체 농도의 일련의 희석물과 전체 세포 RNA의 전체 텔로머라제 RNA의 양을 비교한 결과, 각각의 이. 에디큘라투스 세포는 약 300,000 텔로머라제 분자를 함유한 것으로 나타났다.
텔로머라제의 가시화는 문헌[Linger(1994) Genes Develop. 8:1984]에 기재된 방법을 사용하여 그 RNA 성분에 대한 노던 블롯 하이브리드화에 의해 수행하였다. 간략히 언급하면, 당해 분야에 알려진 바와 같이(예컨대, Sambrook 등의 문헌(1989) 참조), RNA(0.5 ㎍/레인 이하)를 8% PAGE상에서 분리하고, 하이본드-N 막(아머샴)상에 전기 블로팅하였다. 블롯을 4x SSC 10 ㎖, 10x 덴하르트 용액, 0.1% SDS 및 변성된 청어 정자 DNA 50 ㎍/㎖에서 하루밤 동안 하이브리드시켰다. 3 시간 동안 사전 하이브리드화한 후, 하이브리드화 용액 2 x 106cpm 프로브/㎖를 첨가하였다. 무작위 표지된 프로브는 전체 텔로머라제 RNA 유전자를 이루는 PCR-생성물이었다. 블롯은 2x SSC, 0.1% SDS에서 몇 가지 완충액을 변화시키면서 세척한 다음, 45EC의 0.1x SSC 및 0.1% SDS에서 1 시간 동안 세척하였다.
천연 겔 및 노던 블롯
본 실험에서는, 정제된 텔로머라제 제제를 당해 분야에 알려져 있고 문헌[Lamond(1994)의 상기 문헌 참조]에 기재된 바와 같이 3.5% 폴리아크릴아미드 및 0.33% 아가로스의 천연(즉, 비변성성) 겔상에서 전개시켰다. 텔로머라제는 크실렌 시아놀 염료와 거의 함께 이동하였다.
천연 겔의 결과는 텔로머라제가 정제 프로토콜을 통틀어서 RNP로 유지되었음을 나타냈다. 도 2는 비변성 겔상의 상이한 분획에서의 텔로머라제 뿐만 아니라, 시험관내 전사된 텔로머라제의 이동성을 나타내는 노던 블롯의 사진이다. 도 2에서, 레인 1은 1.5 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였고, 레인 2는 4.6 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였으며, 레인 3은 14 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였고, 레인 4는 41 fmol 텔로머라제 RNA를 함유하였으며, 레인 5는 핵 추출물(42 fmol 텔로머라제)을 함유하였고, 레인 6은 Affi-Gel-헤파린-정제된 텔로머라제(47 fmol 텔로머라제)를 함유하였으며, 레인 7은 친화도-정제된 텔로머라제(68 fmol)를 함유하였고, 레인 8은 글리세롤 구배 정제된 텔로머라제(35 fmol)를 함유하였다.
도 2에 도시한 바와 같이, 핵 추출물에서, 텔로머라제는 조립되지 않은 텔로머라제 RNA보다 더 느리게 이동한 RNP 입자내로 조립되었다. 이 방법에 의해서는 1% 미만의 유리 RNA가 검출되었다. 그러나, 보다 느리게 이동하는 텔로머라제 RNP 복합체 역시 때때로 추출물에서 검출되었다. Affi-Gel-헤파린 칼럼상에서의 정제시에, 텔로머라제 RNP 입자는 이동성이 변화하지 않았다(도 2, 레인 6). 그러나, 친화도 정제시에 RNA 입자의 이동성은 약간 증가하였는데(도 2, 레인 7), 이것은 아마도 단백질 서브유닛 또는 단편이 상실되었음을 나타내는 것이다. 글리세롤 구배상에서, 친화도 정제된 텔로머라제는 크기가 변화하지 않았으나, 약 2%의 유리 텔로머라제 RNA를 검출할 수 있었는데(도 2, 레인 8), 이것은 RNP 입자 조립체의 소량의 분해가 일어났음을 시사하는 것이다.
실시예 7: 텔로머라제 단백질 조성물
본 실시예에서는, 정제된 텔로머라제 단백질 조성물의 분석 방법을 설명한다. 실시예 8에 기재한 바와 같이 얻어지는 글리세롤 구배 분획은 4 내지 20%의 폴리아크릴아미드 겔(노벡스)상에서 분리하였다. 전기영동후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 도 4는 겔의 사진을 나타낸다. 레인 1 및 2는 도 4에 나타낸 겔의 좌측에 나타낸 바와 같이 분자 질량 마커(파마시아)를 포함하였다. 레인 3-5는 겔의 상부에 나타낸 바와 같은 글리세롤 구배 분획 푸울을 포함하였다(즉, 레인 3은 분획 9 내지 14를, 레인 4는 분획 15 내지 22를, 레인 5는 분획 23 내지 32를 포함하였음). 레인 4는 1 pmol의 텔로머라제 RNA를 가진 푸울을 포함하였다. 레인 6 내지 9에서는 BSA 표준은 도 4의 겔의 상부에 나타낸 농도에서 전개시켰다(즉, 레인 6은 0.5 pmol BSA를 포함하였고, 레인 7은 1.5 pmol BSA를 포함하였으며, 레인 8은 4.5 BSA를 포함하였고, 레인 9는 15 pmol을 포함하였음).
도 4에 도시한 바와 같이, 분자 질량 120 및 43 kDa의 폴리펩티드가 텔로머라제와 함께 정제되었다. 43 kDa의 폴리펩티드가 이중체로서 관찰되었다. 레인 3의 약 43 kDa의 폴리펩티드는 레인 4의 이중체와는 상이하게 이동한 것을 알 수 있다. 120 kDa 및 43 kDa 이중체는 각각 BSA 표준과 비교하여 대략 1 pmol의 레벨로 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 이 분획은 텔로머라제 RNA(모두 RNP 입자로 조립되었음, 도 2, 레인 8 참조) 1 pmol을 함유하였기 때문에, 텔로머라제와 화학량론적으로 부합하는 두 개의 폴리펩티드 서브유닛인 것으로 보인다. 그러나, 43 kDa 부근의 두 개의 단백질은 별개의 효소 서브유닛일 가능성도 있다.
글리세롤 구배상에서의 분별증류에 적용시키기 않은 친화도 정제된 텔로머라제는 외관상 분자 질량이 각각 35 및 37 kDa인 추가의 폴리펩티드를 포함하였다. 이 마지막 분획은 순도가 50% 이상인 것으로 산정되었다. 그러나, 친화도 정제된 물질에 존재하는 35 kDa 및 37 kDa 폴리펩티드는 글리세롤 구배 원심분리에 의해 재현 가능하게 분리되지 않았다. 이들 폴리펩티드는 모든 활성을 함유하는 제제에서 볼 수 없기 때문에 오염물일 수 있다.
실시예 8: 침강계수
텔로머라제에 대한 침강계수는 글리세롤 구배 원심분리에 의해 측정하였다. 본 실시예에서, 핵 추출물 및 친화도 정제된 텔로머라제는 1 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 300 mM KGlu 및 1 mM DTT와 함께 20 mM 트리스-아세테이트를 함유하는(pH 7.5) 15 내지 40% 글리세롤 구배상에서 분별 증류하였다. 글리세롤 구배는 5 ㎖(13 x 51 ㎜)의 튜브에 붓고, 4EC에서 55,000 rpm의 SW55Ti 로터(베크만)를 사용하여 14 시간 동안 원심분리하였다.
마커 단백질은 대등한 구배로 전개시켰으며, 그 침강계수는 알코올 디히드로게나제(ADH)의 경우 7.6 S, 카탈라제의 경우 113 S, 아포페리틴의 경우 17.3 S 및 티로글로불린의 경우 19.3 S였다. 텔로머라제 피크는 구배 분획의 천연 겔 전기영동 및 그에 이어 그 RNA 성분에의 블롯 하이브리드화에 의해 확인하였다.
도 5는 텔로머라제에 대한 침강계수를 나타내는 그래프이다. 도 5에 도시한 바와 같이, 친화도 정제된 텔로머라제는 11.5 S에서 카탈라제와 동시에 침강된 반면에, 핵 추출물의 텔로머라제는 약간 더 빨리 침강하여 12.5 S 부근에서 피크에 이르렀다. 그러므로, 천연 겔에서 효소의 이동성과 일치되게, 정제된 텔로머라제는 단백질 분해 단편 또는 약하게 연합된 서브유닛을 상실하는 것으로 보인다.
텔로머라제에 대해 계산된 분자 질량은 그것이 하나의 120 kDa 단백질 서브유닛, 하나의 43 kDa 서브유닛 및 하나의 66 kDa 서브유닛으로 구성되는 것으로 가정하면 결국 총 229 kDa가 된다. 이것은 카탈라제의 분자 질량 232 kDa와 거의 일치하는 것이다. 그러나, 침강계수는 분자 질량의 함수일 뿐만 아니라, 분자의 부분적 비부피 및 마찰계수(둘다 유플로테스 텔로머라제 RNP에 대해서는 알려지지 않았음)의 함수이다.
실시예 9: 기질 이용
본 실시예에서, 유플로테스 텔로머라제의 기질 요건을 조사하였다. DNA 말단 복제에 대한 한 가지 간단한 모델은 반보존적 DNA 복제후에, 텔로머라제가 2본쇄의 평활 말단 DNA 분자를 연장시키는 것으로 예측한다. 이 모델의 변형예에서는, 1본쇄의 3'말단이 복제후 헬리카제 또는 뉴클레아제에 의해 생성된다. 이 3'말단은 결합 및 연장을 위해 텔로머라제에 의해 사용된다.
텔로머라제가 평활 말단 분자를 신장시킬 수 있는 지를 측정하기 위해, 3'말단에 위치하는 텔로미어 반복 서열을 가진 모델 머리핀 구조가 합성되었다. 이들 프라이머 기질을 겔 정제하고 폴리뉴클레오티드 키나제로 5'말단 표지하고, 0.4 μM에서 80EC까지 5분 동안 가열한 다음, 가열 블록에서 실온으로 서서히 냉각시켜 머리핀 구조를 재생시키고 나선을 형성하였다. 비변성 겔상에서의 기질 이동성은 이량체 형성에 비해 매우 효율적인 머리핀 구조 형성이 존재함을 나타냈다.
분석은 10 mM MgCl2, 50 mM KGlu 및 1 mM DTT와 함께 20 mM 트리스-아세테이트를 함유한 반응 혼합물(pH 7.5) 10 ㎕에 표지되지 않은 125 μM dGTP, 125 μM dTTP 및 0.02 μM 5'-말단 표지된 프라이머(5'-32P-표지된 올리고뉴클레오티드 기질)를 사용하여 실시하였다. 이들 혼합물은 25EC에서 30분 동안 항온 처리하였다. 포름아미드 적재 완충액(즉, TBE, 포름아미드, 브롬티몰 블루 및 시아놀, Sambrook의 상기 문헌(1989) 참조)을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
프라이머는 텔로머라제 없이("-"), 5.9 fmol의 친화도 정제된 텔로머라제 ("+")와 함께, 또는 17.6 fmol의 친화도 정제된 텔로머라제("+++")와 함께 항온처리하였다. 본 분석에 사용된 친화도 정제된 텔로머라제는 100 kDa의 분자 질량 한계를 가진 막을 사용하여 투석하여 치환 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 36% 포름아미드를 함유하는 8% PAGE/우레아 겔상에서 반응 생성물을 분리하여 머리핀 구조를 변성시켰다. 본 연구에 사용된 프라이머 서열 뿐만 아니라 그 레인 할당은 표 3에 나타낸다.
프라이머 서열
레인 프라이머 서열(5'→3') 서열번호
1-3 C4(A4C4)3CACA(G4T4)3G4 서열번호 33
4-6 C2(A4C4)3CACA(G4T4)3G4 서열번호 34
7-9 (A4C4)3CACA(G4T4)3G4 서열번호 35
10-12 A2C4(A4C4)2CACA(G4T4)3G4 서열번호 36
13-15 C4(A4C4)2CACA(G4T4)3 서열번호 37
16-18 (A4C4)3CACA(G4T4)3 서열번호 38
19-21 A2C4(A4C4)2CACA(G4T4)3 서열번호 39
22-24 C4(A4C4)2CACA(G4T4)3 서열번호 40
25-27 C2(A4C4)2CACA(G4T4)3 서열번호 41
28-30 (A4C4)2CACA(G4T4)3 서열번호 42
겔 결과는 도 6에 도시되어 있다. 레인 1-15는 4개의 G 잔기로 종결되는 텔로미어 반복 서열을 가진 기질을 포함하였다. 레인 16-30은 4개의 T 잔기로 끝나는 텔로미어 반복 서열을 가진 기질을 포함하였다. 텔로머라제 RNA 주형에 대한 추정적인 배열은 도 7(각각 서열번호 43 및 44와 45 및 46)에 나타냈다. 프라이머 세트는 도 7(즉, 각각 패널 A 및 패널 B)에 나타낸 주형에서 두 개의 매우 상이한 위치에서 어닐링되는 것으로 추정되었다. 이것은 그 결합 및/또는 신장률에 영향을 끼쳤다.
도 8은 도 6의 레인 25-30의 보다 가벼운 노출을 나타낸 것이다. 도 8의 보다 가벼운 노출은 첨가되는 뉴클레오티드 및 신장된 생성물에서의 정지의 위치를 가시화하기 위해 실시하였다. 각 세트의 세 번째 레인에 대해 신장된 기질의 비율을 도 6의 아래에 나타낸 바와 같이, 포스포르이미져 상에서 정량 분석하였다.
이들 머리핀 구조에 대한 기질 효율은 상이한 길이의 여분 서열을 가진 2본쇄 텔로미어 유사 기질과 비교하였다. 4개의 G 잔기(도 6의 레인 1 내지 15 참조)로 종결되는 모델 기질은 평활 말단일 때는(레인 1-3 참조) 신장되지 않았다. 그러나, 두 개 염기의 여분의 길이로 약간의 연장이 관찰되었고; 신장은 여분 서열이 4개 이상의 염기 길이일 때 효율적으로 되었다. 텔로머라제는 매우 효율적인 신장에 필요한 6-염기 여분 서열과 함께 4개의 T 잔기로 종결된 2본쇄 기질과 유사한 방식으로 작용하였다. 도 6에서는, 텔로머라제와 무관한 레인 10-15의 프라이머 아래의 희미한 밴드는 프라이머 제제에서 보다 짧은 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 8의 레인 25-30의 보다 가벼운 노출은 주형의 추정 5' 경계와 관계 있는 가장 어두운 밴드와 함께 신장된 생성물의 사다리형을 나타낸다(문헌[Lingner 등, Genes Develop., 8:1984(1994)]에 기재된 바와 같이). 주형내 다른 위치에 상응하는 생성물이 풍부하다는 것은 정지 및/또는 해리가 정제된 텔로머라제와 전좌 부위이외의 부위에서 일어난다는 것을 시사한다.
도 6에 도시한 바와 같이, 2본쇄의 평활 말단 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제의 기질이 아니었다. 이들 분자가 텔로머라제에 결합할 것인지를 측정하기 위해 경쟁 실험을 실시하였다. 이 실험에서는, 서열 (G4T4)2(서열번호 61)를 가진 2 nM의 5'-말단 표지된 기질 또는 6개 염기의 여분 서열을 가진 머리핀 기질을 0.125 nM 텔로머라제를 사용하여 연장시켰다(도 6, 레인 25-27). 동일한 비표지된 올리고뉴클레오티드 기질은 연장용의 표지된 기질과 효율적으로 경쟁하지만, 2본쇄의 평활 말단 머리핀 구조 올리고뉴클레오티드를 경쟁인자로서 사용할 때는 100배 과량의 머리핀 구조의 존재하에서도 활성의 감소가 관찰되지 않았다.
이러한 결과는 2본쇄의 평활성 말단 올리고뉴클레오티드가 본 실시예에서 시험한 농도 및 조건에서 텔로머라제에 결합할 수 없음을 나타냈다. 대신에, 1본쇄의 3' 말단이 결합에 필요하다. 이 3' 말단이 텔로머라제 RNA 주형과 염기쌍을 형성하는 데 필요한 것 같다.
실시예 10: 123 kDa 폴리펩티드의 클로닝 및 서열 분석
본 실시예에서는, 텔로머라제의 유플로테스 123 kDa 폴리펩티드의 클로닝을 설명한다. 본 연구에서는, 상기 실시예 3에서 얻은 정제된 폴리펩티드로부터 얻은 펩티드 서열에 일치하도록 조작된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 텔로머라제 유전자의 내부 단편을 PCR로 증폭시켰다. 폴리펩티드 서열은 당해 분야에 알려져 있고 문헌[Calvio(1995) RNA 1:724-733]에 기재된 nanoES 직렬식 질량 분광 분석 방법을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같은 서열을 가졌는데, 괄호 안에는 축퇴성인 위치를 나타냈다:
5'-TCT(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCAT-3'(서열번호 47) 및 5-GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(G/A)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-3' (서열번호 48).
50 ㎕의 반응물은 0.2 mM dNTP, 이. 에디큘라투스 염색체 DNA 0.15 ㎍, Taq(베링거-만하임) 0.5 ㎕, 각 프라이머 0.8 ㎍ 및 1X 반응 완충액(베링거-만하임)을 함유하였다. 95EC에서 5분, 그 다음에 94EC에서 1분, 52EC에서 1분 및 72EC에서 2분으로 이루어진 30 주기의 조건을 사용하여 반응물을 열교환기(퍼킨-엘머)에서 항온처리하였다. 반응은 72EC에서 10분 항온처리에 의해 완료되었다.
게놈 DNA 라이브러리는 평활 말단 DNA를 pCR-스크립트 플라스미드 벡터(스트라타진)의 SmaI 부위내로 클로닝하여 염색체 이. 에디큘라투스 DNA로부터 제조하였다. 이 라이브러리는 방사성 표지된 겔 정제된 PCR 생성물을 사용하여 콜로니 하이브리드화에 의해 검색하였다. 양성 클론의 플라스미드 DNA는 자동 서열분석기(ABI)를 사용하여 디데옥시 방법(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463[1977])으로 또는 수작업으로 제조하고 서열 분석하였다. 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 DNA 서열은 도 9(서열번호 1)에 도시한다. DNA 서열로부터 추론된 상기 서열에서의 개시 코돈은 뉴클레오티드 위치 101에 위치하고, 개방형 해독틀은 위치 3193에서 종결된다. 유플로테스의 유전자 암호는 "UGA" 코돈이 시스테인 잔기를 암호화한다는 점에서 다른 생물과 상이하다. DNA 서열로부터 추론된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 10(서열번호 2)에 도시되어 있고, 희귀 아미노산은 해독중에 삽입되지 않으며, 해독후 변형이 일어나지 않는 것으로 가정한다.
실시예 11: 43 kDa 폴리펩티드의 클로닝 및 서열 분석
본 발명은 인간 p43(kDa) 상동체를 포함하여 유플로테스 p43(43 kDa)의 동종형 및 상동체를 제공한다. 텔로머라제 서브유닛 종류의 멤버와 같은 43 kDa 핵산 및 상응하는 단백질도 본 발명에 의해 제공되는 시약 및 본원에 설명하는 방법을 사용하여 동정하고 분리할 수 있다. 후술하는 유플로테스 43 kDa 폴리펩티드의 동정 및 클로닝은 43 kDa 아종의 추가 멤버를 분리하는 수단의 예를 제공한다.
본 실시예에서는, 유플로테스 텔로머라제의 43 kDa 폴리펩티드의 클로닝 방법을 설명한다. 본 연구에서는, 상응하는 텔로머라제 유전자의 내부 단편은 상기 실시예 3에서 얻은 정제된 폴리펩티드로부터 얻은 펩티드 서열에 일치하도록 조작된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, PCR로 증폭시켰다. 폴리펩티드 서열은 당해 분야에 알려져 있고 Calvio의 상기 문헌에 기재된 nanoES 직렬식 질량 분광 분석 방법을 사용하여 측정하였다. 본 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같은 서열을 가졌다:
5'-NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3'(서열번호 49) 및
5-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3'(서열번호 50).
상기 서열에서, "N"은 4개의 뉴클레오티드(즉, A, T, G 또는 C)중 임의의 것을 존재를 나타낸다.
상기 실시예 10에서 기술한 대로 PCR을 실시하였다. 게놈 DNA 라이브러리는 상기 실시예 10에서 기술한 바와 같이 제조하고 서열 분석하였다. 이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 DNA는 도 11(서열번호 3)에 나타낸다. 3개의 잠재적인 해독틀은 도 12에 나타낸 바와 같이 상기 서열에 대해 나타낸다. 명료하게 하기 위해, 아미노산 서열은 모든 3개의 해독틀에서 뉴클레오티드 서열 아래에 나타낸다. 이들 해독틀은 서열번호 4, 5 및 6에 나타낸 바와 같이 각각 "a", "b" 및 "c"로 명명하였다. 가능한 개시 코돈은 해독틀 "c"의 뉴클레오티드 위치 84에서 암호화된다. 이들 암호 영역은 해독틀 "b"의 위치 1501에서 종결될 수 있다. 초기의 정지 코돈은 도 12에서 별표로 나타낸 것으로서, 뉴클레오티드 위치 337 내지 350 사이의 3개 모두의 해독틀에서 나타난다.
"La-도메인"은 굵은 활자체로 나타낸다. 더 하류에서 단백질 서열은 3개 해독틀의 어느 것도 정지 코돈에 의해 차단되지 않기 때문에 상이한 해독틀에 의해 암호되는 것으로 보인다. 또한, 정제된 단백질의 펩티드 서열은 3개의 해독틀 모두에서 암호화된다. 그러므로, 이 유전자는 간섭 서열을 포함하거나 아니면 RNA가 편집되는 것으로 보인다. 기타 가능성으로는 리조좀에 의한 틀변경 또는 서열 착오가 있다. 그러나, La-단백질 서열에 대한 상동성은 상당한 흥미거리로 남아 있다. 마찬가지로, 유플로테스에서는 "UGA" 코돈은 시스테인 잔기를 암호화한다.
실시예 12: 아미노산 및 핵산의 비교
본 실시예에서는, 다양한 보고된 서열과 유플로테스 123 kDa 및 43 kDa 텔로머라제 서브유닛 폴리펩티드 서열을 비교하였다.
123 kDa 이. 에디큘라투스 텔로머라제 서브유닛과의 비교
123 kDa 유플로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 테트라히메나 서모필라(젠뱅크 승인번호 #25641)의 80 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사성을 조사하였다. 상기 단백질을 암호화하는 젠뱅크에서 입수한 뉴클레오티드 서열(서열번호 51)은 도 19에 나타낸다. 젠뱅크에서 얻은 상기 단백질의 아미노산 서열(서열번호 52)은 도 20에 나타낸다. 123 kDa 이. 에디큘라투스와 80 kDa 티. 써모필라 사이의 서열 비교는 도 13에 도시한다. 도 13에서, 이. 에디큘라투스 서열은 상부의 서열(서열번호 2)이고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열(서열번호 52)이다. 도 13 뿐만 아니라, 도 14 내지 16에서는 동일성이 수직의 막대로 나타나 있고, 반면에 서열들 사이의 단일 점들은 다소 유사한 아미노산을, 그리고 서열들 사이의 2중 점들은 보다 유사한 아미노산을 나타낸다. 관찰된 동일성은 약 19%로 측정된 반면에, 유사도는 약 45%인데, 이 값은 임의의 무작위 단백질 서열의 경우 관찰되는 것과 유사한 것이다.
123 kDa 유플로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 또한 테트라히메나 써모필라(젠뱅크 승인번호 #U25642)의 95 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사도를 조사하였다. 상기 단백질을 암호화하는 젠뱅크에서 얻은 뉴클레오티드 서열(서열번호 53)은 도 21에 나타낸다. 젠뱅크에서 얻은 상기 단백질의 아미노산 서열(서열번호 54)은 도 22에 나타낸다. 이 서열 비교는 도 14에 도시한다. 도 14에서, 이. 에디큘라투스 서열은 상부의 서열(서열번호 2)이고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열(서열번호 54)이다. 관찰된 동일성은 약 20%로 측정된 반면에, 유사도는 약 43%인데, 이 값은 임의의 무작위 단백질 서열의 경우 관찰되는 것과 유사한 것이다.
123 kDa 이. 에디큘라투스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 역전사 효소의 특징인 5개의 모티프(서열번호 13 및 18)를 포함한다는 점이 중요하다. 123 kDa 폴리펩티드는 또한 다양한 역전사 효소(서열번호 14-17 및 19-22)의 폴리머라제 도메인과 비교하였다. 도 17은 추정 효소 상동체(L8543.12 또는 EST2p)(서열번호 17 및 22)와 함께 123 kDa 폴리펩티드를 배열한 것이다. 젠뱅크에서 입수한 L8543.12(또는 EST2p)의 아미노산 서열은 도 23(서열번호 55)에 나타낸다.
4개의 모티프(A, B, C 및 D)가 이 비교에 포함되었다. 도 17에서는, 고도로 보존된 잔기가 흑색 배경상에 흰색 문자로 나타나 있다. 다른 서열에서 보존되어 있는 이. 에디큘라투스의 잔기는 굵은 활자체로 나타나 있고; "h"는 소수성 아미노산의 존재를 나타낸다. 모티프의 아미노산 잔기 사이에 위치한 숫자는 서열에서의 갭의 길이를 나타낸다. 예를 들면, 모티프 A와 B 사이에 나타낸 "100"은 모티프들 사이의 서열의 100개 아미노산 갭을 반영한다.
전술한 바와 같이, 젠뱅크 탐색에 의해, 이. 에디큘라투스 123 kDa 텔로머라제 서브유닛에 대한 약간의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 암호화하거나 또는 포함하는 효모 단백질(젠뱅크 승인번호 #U20618) 및 유전자 L8543.12(Est2)를 동정하였다. 두 단백질이 그 C-말단 영역에서 역전사 효소 모티프를 포함하고; 두 단백질은 역전사 효소 모티프의 외부 영역에서 유사도를 공유하며; 단백질은 유사하게 염기성이고(이. 에디큘라투스의 경우 pI=10.1이고, 효모의 경우 pI=10.0임); 두 단백질은 크다(이. 에디큘라투스의 경우 123 kDa이고, 효모의 경우 103 kDa임)는 관찰에 근거하여, 이들 서열은 그 각각의 텔로머라제의 촉매 중심을 포함한다. 이. 에디큘라투스와 효모와 같이 계통 발생학적으로 구별되는 두 생물에서의 상동성의 상기 관찰에 근거하여 인간 텔로머라제는 동일한 특성을 가진(즉, 역전사 효소 모티프가 염기성이고 크기가 큰[>100 kDa] 단백질을 포함하는 것으로 생각되었다.
43 kDa 이. 에디큘라투스 텔로머라제 서브유닛과의 비교
43 kDa 유플로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 "La-도메인"의 아미노산 서열은 테트라히메나 서모필라(상기 참조)의 95 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사성을 조사하였다. 이 서열 비교는 도 15에 도시한다. 도 15에서, 이. 에디큘라투스 서열은 상부의 서열(서열번호 9)이고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열(서열번호 10)이다. 관찰된 동일성은 약 23%로 측정된 반면에, 본 유사도는 약 46%인데, 이 값은 임의의 무작위 단백질 서열의 경우 관찰되는 것과 유사한 것이다.
43 kDa 유플로테스 에디큘라투스 폴리펩티드의 "La-도메인"의 아미노산 서열은 또한 테트라히메나 써모필라(상기 참조)의 80 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛의 서열과 비교하여 그 유사도를 조사하였다. 이 서열 비교는 도 16에 도시한다. 도 16에서, 이. 에디큘라투스 서열은 상부의 서열(서열번호 11)이고, 티. 써모필라 서열은 하부의 서열(서열번호 12)이다. 관찰된 동일성은 약 26%로 측정된 반면에, 유사도는 약 49%인데, 이 값은 임의의 무작위 단백질 서열의 경우 관찰되는 것과 유사한 것이다.
43 kDa 이. 에디큘라투스 폴리펩티드의 도메인의 아미노산 서열(서열번호 23)은 다양한 기타 생물에서 유래한 La 단백질(서열번호 24-27)과 비교하였다. 이들 비교는 도 18에 나타냈다. 도 18에서, 고도로 보존된 잔기는 흑색 배경상에 흰색 문자로 나타냈다. 다른 서열에 보존되어 있는 이. 에디큘라투스 서열의 잔기는 굵은 활자체로 나타냈다.
실시예 13: 옥시트리차 트리팔락스에서의 텔로머라제 단백질 서브유닛의 동정
본 실시예에서는, 전술한 실시예들에서 동정된 서열을 사용하여 이. 에디큘라투스와 친연 관계가 매우 먼 섬모충류인 옥시트리차 트리팔락스의 텔로머라제 단백질 서브유닛을 동정하였다. 역전사 효소 도메인 모티프를 포함한 이. 에디큘라투스 123 kDa 폴리펩티드의 보존된 영역에 근거하여 프라이머를 선택하였다. 옥시트리차에서 얻은 총 DNA를 사용하여 적당한 프라이머를 합성하고 PCR 반응에 사용하였다. 옥시트리차 DNA는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 준비하였다. PCR 생성물은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 클로닝하고 서열 분석하였다. 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같았다:
5'-(T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)(C/T)A(G/A)GG-3' (서열번호 56) 및 5'-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3' (서열번호 57).
축퇴성인 위치는 괄호안에 나타내고, 대안적인 염기는 괄호내에 나타낸다. "N"은 4개 뉴클레오티드중의 하나를 나타낸다.
PCR 반응에서, 50 ㎕ 반응물은 0.2 mM dNTP, 옥시트리차 트리팔락스 염색체 DNA 0.3 ㎍, Taq 폴리머라제(베링거-만하임) 1 ㎕, 각 프라이머 2 마이크로몰 및 1x 반응 완충액(베링거-만하임)을 함유하였다. 95EC에서 5분; 94EC에서 1분, 53EC에서 1분 및 72EC에서 1분으로 이루어진 30 주기; 및 이어서 72EC에서 10분의 조건하에 반응물을 열교환기(퍼킨-엘머)에서 항온처리하였다. PCR 생성물은 겔 정제하고 디데옥시 방법으로 서열 분석하였다(예컨대, 문헌[Sanger(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467] 참조).
PCR 생성물의 추론된 아미노산 서열을 결정하고 이. 에디큘라투스 서열과 비교하였다. 도 24는 이들 서열을 상부열에 나타낸 오. 트리팔락스 서열(서열번호 58) 및 하부열에 나타낸 이. 에디큘라투스 서열(서열번호 59)와 함께 배열한 것이다. 도 24로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 실시예에서 동정된 오. 트리팔락스 폴리펩티드 서열과 이. 에디큘라투스 폴리펩티드 서열 사이에는 상당한 상동성이 있다. 따라서, 본 발명에서 동정된 서열은 다른 진핵 생물에서의 상동성 텔로머라제 단백질 서브유닛의 동정에 유용한 것임이 명백하다. 실제로, 본 발명의 개발에 의해 전술한 바와 같이 다수의 다양한 종에서 상동성 텔로머라제 서열을 동정하였다.
실시예 15: 테트라히메나 텔로머라제 서열의 동정
본 실시예에서는, 유플로테스 서열 및 EST2p와 상동성을 공유하는 테트라히메나 클론이 생산되었다.
본 실험은 테트라히메나, 유플로테스 및 EST2p 서열 사이의 상동성 영역을 동정하기 위한 보존된 모티프에 대해 유도된 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 PCR을 이용하였다. 본 실시예에 사용된 PCR 방법은 복합 혼합물로부터 특이적으로 희귀한 DNA 서열을 증폭시키도록 조작된 신규의 방법이다. 이 방법은 PCR 클로닝 방법에서 통상 나타나는 두 말단에서 동일한 PCR 프라이머를 사용한 DNA 생성물(즉, 단일 프라이머 생성물)의 증폭의 문제를 피한 방법이다. 이들 단일의 프라이머 생성물은 원치 않는 배경 레벨을 산출하고, 종종 목적하는 두 프라이머 생물의 증폭 및 검출을 모호하게 할 수 있다. 본 실험에 사용된 방법은 두 프라이머 생성물을 우선적으로 선별한다. 구체적으로, 하나의 프라이머는 비오티닐화되고 다른 하나는 그렇지 않다. PCR 증폭 반응의 수차례의 실시후에, 생성물는 스트렙트아비딘 자기 비드를 사용하여 정제하고 프라이머 생성물은 열 변성을 사용하여 특이적으로 용출시킨다. 이 방법은 본 실시예에서 설명한 실험 이외의 경우에도 사용할 수 있다. 실제로, 이 방법은 희귀한 DNA 서열을 특이적으로 증폭시키고자 하는 용도로, 예컨대, 5' 및 3과 같은 클로닝 방법; RACE; 및 PCR에서 축퇴성 프라이머를 사용하는 임의의 방법에 사용할 수 있다.
당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 분리된 테트라히메나 주형 거대핵 DNA와, FFYXTE 영역(서열번호 71)에 상응하는 "K231"로 명명된 서열 5' 비오틴-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3' (서열번호 70)을 가진 24량체 순방향 프라이머 및 DDFL(FIL)I 영역(서열번호 73)에 상응하는 "K220"으로 명명된 서열 5'-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3' (서열번호 72)을 가진 23량체 역방향 프라이머를 사용하여 제1의 PCR 반응을 수행하였다. 이 PCR 반응물은 DNA(50 ng) 2.5 ㎕, 각 프라이머(20 μM) 4 ㎕, 10x PCR 완충액 3 ㎕, 10 x dNTP 3 ㎕, Mg 2 ㎕, Taq 0.3 ㎕ 및 dH2O 11.2 ㎕를 함유하였다. 이 혼합물은 94EC에서 45초, 37EC에서 45초, 37EC에서 45초 및 72EC에서 1분의 8 주기 동안 순환시켰다.
상기 PCR 반응물은 200 ㎕ 스트렙트아비딘 자기 비드에 결합시키고, TE 200 ㎕로 세척하고, dH2O 20 ㎕에 재현탁시킨 다음, 100EC에서 2분 동안 비등시켜 열 변성시켰다. 비드를 당기고, 용출물을 제거하였다. 다음, 감마-32P dATP 0.3 ㎕를 포함한 것을 제외하고는 상기 조건을 사용하여, 이 용출물 2.5 ㎕를 재증폭시켰으며, PCR은 33 주기 동안 수행하였다. 이 반응은 5% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 수행하고, 적당한 영역을 겔로부터 절단하였다. 이들 생성물을 상기 조건하에서 42EC 어닐링 온도를 사용한 것을 제외하고는 전술한 조건하에 추가 34 주기 동안 재증폭시켰다.
두 번째 PCR 반응은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 분리된 테트라히메나 거대핵 DNA 주형과, R(LI)(LI)PKK 영역(서열번호 75)에 상응하는 "K228"로 명명된 서열 5'-ACAATG(CA)G(GATC)(TCA)T(GATC)(TCA)T(GATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3' (서열번호 74)을 가진 23량체 순방향 프라이머 및 CYDSIPR 영역(서열번호 77)에 상응하는 "K224"로 명명된 서열 5'-ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC) (TA)(AG)TC (AG)TA(AG)CA3' (서열번호 76)을 가진 역방향 프라이머를 사용하여 수행하였다. 이 PCR 반응물은 DNA(50 ng) 2.5 ㎕, 각 프라이머(20 μM) 4 ㎕, 10x PCR 완충액 3 ㎕, 10 x dNTP 3 ㎕, Mg 2 ㎕, 감마-32P dATP 0.3 ㎕, Taq 0.3 ㎕ 및 dH2O 10.9 ㎕를 함유하였다. 이 반응은 5% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 수행하고, 적당한 영역을 겔로부터 절단하였다. 이들 생성물을 상기 조건하에서 42EC 어닐링 온도를 사용한 것을 제외하고는 전술한 조건하에 추가 34 주기 동안 재증폭시켰다.
반응 수행 1로부터 생성된 반응 생성물 10 ㎕를 TE 200 ㎕에서 스트렙트아비딘 코팅된 자기 비드에 결합시켰다. 비드를 TE 200 ㎕로 세척한 다음, dH2O 20 ㎕에 재현탁시키고, 열 변성시키며, 용출물을 제거하였다. 다음, 상기 조건을 사용하여 이 용출물 2.5 ㎕를 33 주기 동안 재증폭시켰다. 반응 수행 2에서 얻은 반응 생성물을 비드에 첨가하고 0.5x SSC 30 ㎕로 희석시켰다. 이 혼합물을 94EC로부터 50EC까지 가열하였다. 용출물을 제거하고 비드를 55EC에서 0.5x SSC에서 3회 세척하였다. 그 다음, 비드를 dH2O 20 ㎕에 재현탁시키고, 열 변성시키며, 용출물을 제거하여 "반응 수행 1 용출물"이라 명명하고 보관하였다.
테트라히메나 밴드를 분리하기 위해, 반응 수행 1 용출물을 순방향 프라이머 K228(서열번호 74) 및 역방향 프라이머 K227(서열번호 78)을 사용하여 재증폭시켰는데, 여기서, 상기 역방향 프라이머는 DIKSCYD 영역(서열번호 79)에 상응하는 서열 5'-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GA)TC-3'(서열번호 78)을 가진 것이다. PCR 반응은 상기한 바와 같이 수행하였다. 반응 생성물은 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전개시키고; 약 295 뉴클레오티드에 상응하는 밴드를 겔로부터 절단하고 서열 분석하였다.
168-3으로 명명한 클론을 서열 분석하였다. 그 DNA 서열(프라이머 서열 포함)은 다음 서열로 확인되었다:
(서열번호 80)
상기 유전자의 추가 서열은 168-3(서열 5'-GAGTGACATAATATACGTGA-3'(서열번호 111)을 가진 "K297")에서 유래한 서열과 일치하도록 조작된 특이 프라이머 및 K231(FFYXTE) 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 얻었다. 168-3과 함께 이 반응으로부터 얻은 단편의 서열은 다음과 같다(프라이머 서열은 없음):
(서열번호 81)
상기 DNA 단편에 상응하는 아미노산 서열은 다음 서열로 확인되었다:
(서열번호 82)
상기 아미노산 서열은 기타 텔로머라제 유전자(EST2p 및 유플로테스)와 함께 배열하였다. 그 배열은 도 31에 나타냈다. 일치 서열 역시 도 31에 나타냈다.
실시예 16: 스키조사카로마이세스 폼베 텔로머라제 서열의 동정
본 실시예에서는 에스. 폼베의 tez1 서열은 이. 에디큘라투스 p123 및 에스. 세레비제 Est2p의 상동체로서 동정되었다.
도 33은 상기 실험을 전체적으로 요약한 것이다. 도 33에서, 상부(패널 A)는 두 개의 중첩하는 게놈 클론과 서열 분석된 5825 bp의 부분의 관계를 나타낸다. "tez1+"로 명명된 영역은 단백질 암호 영역이며, 인접 서열 역시 나타나 있고, 5825 bp 영역 아래의 상자는 후술하는 바와 같이 tez1 분리 구성체의 제조에 사용된 약 2 kb의 HindIII 단편이다.
도 33의 하부(패널 B)는 DNA의 상기 동일 영역을 "부각시킨" 개략도이다. "본래의 PCR"로 명명된 서열은 기재한 대로 유플로테스 서열 모티프 4(B') 및 모티프 5(C)를 기준으로 명명된 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍과 함께 생성된 본래의 축퇴성 PCR 단편이다.
축퇴성 프라이머를 사용한 PCR
축퇴성 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여 에스. 폼베에서 이. 에디큘라투스 p123의 상동체를 발견하였다. 도 34는 이 반응에 사용된 축퇴성 프라이머("폴리 4" 및 "폴리 1"로 명명함)의 서열을 나타낸다. PCR 반응은 전술한 실시예들(예컨대, 상기 실시예 10)에서 설명한 것과 동일한 완충액을 사용하여, 94EC에서 램프(ramp) 시간 5분으로 수행하고, 이어서 94EC에서 30초, 50EC에서 45초 및 72EC에서 30초로 이루어진 30 주기, 그 후 72EC에서 7분 동안 수행하고, 이어서 4EC에서 보관하였다. 변화된 조건(즉, 에스. 폼베 DNA의 다양한 농도 및 MgCl2농도)을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 생성물은 아가로스 겔상에서 전개하고 전술한 바와 같이 에씨듐 브로마이드로 염색하였다. 여러 가지 PCR 반응 수행으로 3개 밴드("T", "M" 및 "B")를 생성시켰다. 이들 밴드는 전술한 것과 동일한 조건을 사용하여 재증폭시키고 겔상에서 전개하였다. 재증폭 반응후 4개의 밴드("T", "M1", "M2" 및 "B")가 관찰되었고, 도 35에 나타냈다. 이들 4개의 밴드는 전술한 것과 동일한 조건을 사용하여 재증폭시켰다. 도 35의 레인의 위로부터 세 번째의 밴드는 텔로머라제 단백질에 대한 정확한 서열을 포함하는 것으로 확인되었다. M2로 명명한 PCR 생성물은 도 36에 나타낸 바와 같이 다른 텔로머라제 단백질과 합리적인 일치성을 나타내는 것으로 확인되었다. 나타낸 배열 외에도, 도 36은 또한 tez1의 실제 서열을 나타낸다. 도 36에서, 별표는 모두 4개의 서열(옥시트리차 "Ot"; 이. 에디큘라투스 "Ea_p123"; 에스. 세레비제 "Sc_p103"; 및 M2)과 공통되는 잔기를 나타내는 반면에, 원(즉, 점)은 유사한 아미노산 잔기를 나타낸다.
3' RT PCR
추가의 서열 정보를 얻기 위해, 도 36에서 동정된 후보 텔로머라제상에서 3' 및 5' RT PCR을 수행하였다. 도 37은 사용된 3'RT PCR 방법의 개략도이다. 먼저, 올리고뉴클레오티드 프라이머 "QT"(5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3'; 서열번호 102)를 사용하여 mRNA로부터 제조한 다음, "QO"(5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3'; 서열번호 103) 및 본래의 축퇴된 PCR 반응에 기초하여 조작된 프라이머(즉, 서열 5'-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3'(서열번호 109))와의 PCR용 주형으로 상기 cDNA를 사용하였다. "QI"(5'-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3'; 서열번호 104) 및 본래의 축퇴성 PCR 반응으로부터 유래한 서열을 가진 또 다른 PCR 프라이머, 즉 "M2-T2"(5'-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3'; 서열번호 110)과의 두 번째 PCR 반응(즉, 정착된 PCR)을 수행하였다. 이 PCR에 사용된 완충액은 전술한 바와 동일하고, 94EC에서 5분의 램프로 시작하여 94EC에서 30초, 55EC에서 30초 및 72EC에서 3분으로 이루어진 30 주기, 그 후 72EC에서 7분 동안 증폭을 수행하였다. 반응 생성물은 사용시까지 4EC에서 보관하였다.
게놈 라이브러리 및 cDNA 라이브러리의 검색
상기 추가의 서열 정보를 얻은 후에, 몇 가지 게놈 및 cDNA 라이브러리를 검색하여 상기 텔로머라제 후보 유전자를 포함하는 임의의 라이브러리를 동정하였다. 사용된 방법 뿐만 아니라, 라이브러리 및 결과는 도 38에 도시한다. 도 38에서, 패널 A는 상기 실험에서 시험한 라이브러리를 나열한 것이고; 패널 B는 사용된 영역을 나타내며; 패널 C 및 D는 상기 라이브러리로부터 얻은 도트 블롯 하이브리드화 결과를 나타낸다. 그 다음, 양성 라이브러리는 콜로니 하이브리드화에 의해 검색하여 tez1 유전자의 게놈 및 cDNA 라이브러리를 얻었다. 상기 실험에서, HindIII 게놈 라이브러리로부터 얻은 약 3 x 104콜로니를 검색하고 6개의 양성 클론을 동정하였다(약 0.01%). DNA는 두 개의 독립 클론(A5 및 B2)으로부터 제조하였다. 도 39는 HindIII-처리된 A5 및 B2 양성 게놈 클론을 사용하여 얻은 결과를 나타낸다.
또한, cDNA REP 라이브러리를 사용하였다. 약 3 x 105콜로니를 검색하고, 5개의 양성 클론을 동정하였다(0.002%). 3개의 독립 클론(2-3, 4-1 및 5-20)으로부터 DNA를 제조하였다. 추후의 실험에서, 2-3 및 5-20은 동일한 삽입체를 포함하는 것으로 측정되었다.
5' RT PCR
이 지점까지 생성된 유전자의 cDNA는 완전하지 않기 때문에, 전길이의 클론을 얻기 위해 5' RT-PCR을 수행하였다. 그 방법은 도 40에 개략적으로 도시되어 있다. 이 실험에서, cDNA는 이미 동정된 tez1의 공지된 영역으로부터 조작된 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머 "M2-B"(5'-CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3'; 서열번호 105) 및 "M2-B2"(5'-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3'; 서열번호 106)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 포스포릴화된 5' 말단("P")(P-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC-3'; 서열번호 107)를 가진 올리고뉴클레오티드 링커 PCR Adapt SfiI을 이 cDNA의 3' 말단에 결찰시키고, 이 구성체를 정착된 PCR용 주형으로서 사용하였다. 제1회의 PCR에서, PCR Adapt SF1 및 M2-B를 프라이머로서 사용한 반면에; 제2회에서는 PCR Adapt SfiII(5'-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CC-3'; 서열번호 108) 및 M2-B2(서열번호 106)을 프라이머로서 사용하였다. 정착된 PCR을 사용하여 반응의 특이성을 증가시켰다.
서열 배열
tez1의 서열이 일단 동정되면, 그것을 전술한 서열들과 비교하였다. 도 41은 에스. 폼베("S.p. Tez1p"), 에스. 세레비제("S.c. Est2p") 및 이. 에디큘라투스 p123("E.a. p123")의 텔로머라제 촉매성 서브유닛의 RT 도메인의 배열을 나타낸 것이다. 도 41에서, "h"는 소수성 잔기를 나타내는 반면에, "p"는 소형 극성 잔기를 나타내며, "c"는 전하를 띤 잔기를 나타낸다. 전술한 아미노산 잔기는 문헌[Xiong (1990) EMBO J. 9:3353-3362]에 기재된 일치 RT 모티프를 나타낸다. 별표는 모두 3개의 단백질에 대해 보존되는 잔기를 나타낸다. "모티프 O"는 본원에서 도 41에서 상기 텔로머라제 서브유닛에 특이적인 모티프로서 동정되고, 일반적으로 역전사 효소에서는 발견되지 않는다. 그러므로, 텔로머라제 촉매성 서브유닛으로서 다른 아미노산 서열을 동정하는데 있어서 중요하다.
도 42는 유플로테스("Ea_p123"), 에스. 세레비제("Sc_Est2p") 및 에스. 폼베("Sp_Tez1p")에서 유래한 전체 서열의 배열을 도시한 것이다. 패널 A에서, 흐리게 표시된 영역은 두 서열들 사이에 공유된 잔기를 나타낸다. 패널 B에서, 흐리게 표시된 영역은 3개 서열 모두 사이에 공유된 잔기를 나타낸다.
tez1의 유전자 분리
본 실시예에서, tez1의 분리(disruption) 효과를 조사하였다. 텔로머라제는 텔로미어 유지에 관여하기 때문에, tez1이 실제로 텔로머라제 성분이라면, tez1의 분리는 점진적인 텔로미어 단축을 일으킬 것으로 가정되었다.
이들 실험에서, 상동 재조합을 사용하여 에스. 폼베에서 특이적으로 tez1 유전자를 분리시켰다. 이러한 방법은 도 43에 개략적으로 예시하였다. 도 43에 나타낸 바와 같이, 야생형 tez1은 ura4 또는 LEU2 마커를 포함하는 단편으로 대체하였다.
tez1 유전자의 분리는 PCR로 확인하였으며(도 44), 서던 블롯을 실시하여 텔로미어 길이를 검사하였다. 도 45는 이 실험에 대한 서던 블롯 결과를 나타낸다. ApaI 제한 효소 부위는 에스. 폼베에서 텔로미어 서열에 바로 인접하여 존재하기 때문에, 에스. 폼베 게놈 DNA 제제의 ApaI 처리로 텔로미어 길이를 분석할 수 있다. 따라서, 에스. 폼베에서 유래한 DNA는 ApaI로 처리하고, 처리 생성물을 아가로스 겔상에서 전개하고, 분리된 에스. 폼베의 텔로미어가 단축되었는 지를 측정하기 위해 텔로미어 서열 특이적 프로브로 처리하였다. 그 결과는 도 45에 나타냈다. 이들 결과로부터, tez1 유전자의 분리는 텔로미어의 단축을 일으킨 것임이 명백하였다.
실시예 17: 인간 텔로머라제 역전사 효소 단백질 및 cDNA의 클로닝 및 특성 분석
본 실시예에서는, 인간 텔로머라제 역전사 효소에 대한 핵산 및 아미노산 서열 정보를 측정하였다. 부분적인 상동성의 인간 서열은 dbEST(발현된 서열 표지) 젠뱅크 데이타베이스(젠뱅크 AA28196으로 명명됨, 서열번호 121)의 BLAST 탐색에서 먼저 동정되었는데, 상기 데이타베이스는 유플로테스 123 kDa 펩티드 및 핵산 서열 뿐만 아니라, 스키조사카로마이세스 단백질 및 상응하는 cDNA(tez1) 서열을 사용하여 수행하였다. "hTCP1.1"로도 지칭되는 EST 젠뱅크 승인번호 #AA281296은 부분적인 cDNA 클론이다.
AA281296 EST(서열번호 121)는 길이가 389개 뉴클레오티드의 길이이고, hTRT cDNA 클론(서열번호 117)에서의 위치는 잔기 1679 내지 2067이다:
(서열번호 121)
클론 #712562(서열번호 122)로 명명된 AA281296 EST 서열을 포함하는 클론은 I.M.A.G.E. 컨소시엄(휴먼 게놈 센터, DOE, 캘리포니아주 리버모어 소재의 로렌스 리버모어 내쇼날 래보러토리)로부터 입수하였다. 이 클론은 편도선 세포의 유동 분류에 의해 유도된 배의 B 세포의 cDNA 라이브러리로부터 입수하였다. 이 hTRT cDNA 클론 #712562(서열번호 122, 도 59)의 완전한 서열 분석은 추론된 해독 생성물(서열번호 123, 도 59)의 분석은 그 클론이 도 1에 도시한 바와 같이 모두 8개의 텔로머라제 RT(TRT) 모티프를 암호화하는 것을 나타냈다. pGRN121(후술함)에서 cDNA의 hTRT 개방형 해독틀이 암호화하는 폴리펩티드와 대조적으로, 클론 #712562는 pGRN121에서 암호화된 hTRT에 존재하는 클론 712562에서 182개 염기쌍이 부재하기 때문에 TRT의 인접 부분을 암호화하지 않았다. 클론 #712562의 암호 서열은 약 30 kD의 계산된 분자량을 가진 259개 잔기의 단백질(이하, "712562 hTRT"라 함)을 암호화한다. 712562 hTRT 폴리펩티드는 모티프 T, 1, 2 및 A를 포함하나, 모티프 B', C, D 및 E는 포함하지 않는데, 왜냐하면, RT 모티프 B', C, D 및 E가 보다 많은 N-말단 RT 모티프와 상이한 개방형 해독틀에 포함되기 때문이다. 또한, RT 모티프 A와 B 사이의 거리는 종래 공지된(비인간) 3개의 TRT의 거리보다 상당히 더 짧았다.
클론 #712562에서 유래한 아미노산 서열(서열번호 123)은 전술한 실시예에서 기술한 바와 같이 측정한 서열과 함께 배열하였다. 도 25는 유플로테스("p123"), 스키조사카로마이세스("tez1"), Est2p(즉, Est2 핵산 서열이 암호화하는 에스. 세레비제 단백질로, "L8543.12"로도 지칭됨) 및 이 비교 탐색에서 동정되는 인간의 상동체의 서열 배열을 나타낸다. 이 배열된 부분의 아미노산 서열은 서열번호 61에 제시되어 있는(cDNA 서열은 서열번호 62에 제시되어 있음) 반면에, 도 25에 도시한 tez1의 부분은 서열번호 63에 제시되어 있다. 도 25에 도시된 Est2의 부분은 또한 서열번호 64에 제시되어 있는 반면에, 도시한 p123의 부분은 또한 서열번호 65에 제시되어 있다. 도 29는 tez1의 아미노산 서열(서열번호 68)에 나타낸 반면에, 도 30은 tez1의 DNA 서열(서열번호 69)을 나타낸다. 도 30에서, 인트론 및 기타 비암호 영역은 소문자로 나타낸 반면에, 엑손(즉, 암호 서열)은 대문자로 나타낸다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 이들 단백질 사이에서는 고도로 보존된 영역이 있다. 예를 들면, 도 25에 나타낸 바와 같이, "모티프 0", "모티프 1", "모티프 2" 및 "모티프 3"에는 동일성 영역이 있다. 동일한 아미노산은 별표(*)로 나타내고, 유사한 아미노산 잔기는 점(.)으로 나타낸다. 이것은 텔로머라제 모티프내에는 효모에서 섬모충류 내지는 인간까지 다양한 진핵 세포 사이에서 보존되는 영역이 있음을 나타낸다. 추가의 생물의 TRT 유전자는 서열의 그러한 보존된 영역을 포함하는 것으로 생각된다. 도 27은 인간 텔로머라제 모티프를 암호화하는 클론 #712562(서열번호 123)의 부분적 아미노산 서열(서열번호 67, 또한 도 25, 서열번호 61 참조)을 나타내는 반면에, 도 28은 상응하는 DNA 서열(서열번호 62)을 나타낸다.
생거 디데옥시 서열 분석법 및 기타 방법은 당해 분야에 알려진 바와 같이 사용하여 클론 712562의 완전한 서열 정보를 수득하였다. 서열 분석에 사용된 프라이머의 일부는 표 4에 나타낸다. 이들 프라이머는 플라스미드 주쇄 서열 또는 클론내 인간 cDNA 삽입체에 대한 서열 상보성에 근거하여 클론에 하이브리드되도록 조작하였다.
프라이머
프라이머 서열 서열번호
TCP1.1 GTGAAGGCACTGTTCAGCG 서열번호 87
TCP1.2 GTGGATGATTTCTTGTTGG 서열번호 88
TCP1.3 ATGCTCCTGCGTTTGGTGG 서열번호 89
TCP1.4 CTGGACACTCAGCCCTTGG 서열번호 90
TCP1.5 GGCAGGTGTGCTGGACACT 서열번호 91
TCP1.6 TTTGATGATGCTGGCGATG 서열번호 92
TCP1.7 GGGGCTCGTCTTCTACAGG 서열번호 93
TCP1.8 CAGCAGGAGGATCTTGTAG 서열번호 94
TCP1.9 TGACCCCAGGAGTGGCACG 서열번호 95
TCP1.10 TCAAGCTGACTCGACACCG 서열번호 96
TCP1.11 CGGCGTGACAGGGCTGC 서열번호 97
TCP1.12 GCTGAAGGCTGAGTGTCC 서열번호 98
TCP1.13 TAGTCCATGTTCACAATCG 서열번호 99
이들 실험으로부터, 클론 712562의 EcoRI-NotI 삽입체는 인간 텔로머라제 단백질에 대한 부분적 개방형 해독틀만을 포함하지만, 그것은 그 단백질의 활성 단편을 암호화할 수 있는 것으로 측정되었다. AA281296 클론의 개방형 해독틀은 약 63 kD의 단백질을 암호화한다. 동정된 최장의 개방형 해독틀 서열은 도 47(서열번호 100)에 나타낸다. ORF는 도 47에 나타낸 "met"와 함께 ATG 코돈에서 개시된다. 서열의 3' 말단의 폴리 A 미부 역시 나타나 있다.
도 48은 클론 712562(인간 텔로머라제 중심 단백질 1, "Hs TCP1"), 이. 에디큘라투스 p123("Ep p123"), 에스 폼베 tez1("Sp Tez1"), 에스. 세레비제 EST2("Sc Est2") 및 일치 서열에서 유래한 텔로머라제 역전사 효소 단백질 암호 서열의 예비 서열 분석에 근거한 임시적인 배열을 나타낸다. 도 48에는, 다양한 모티프가 나타나 있다.
전길이의 클론을 얻기 위해, cDNA 라이브러리 및 5'-RACE를 프로브 처리하는 방법을 사용하여 종래 클로닝되지 않은 영역의 일부분을 암호화하는 클론을 얻었다. 이들 실험에서, RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends; 예컨대, 문헌[M.A. Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends", in Innis 등(편집), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(1990), pp. 28-38; Frohman 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8998-9002(1988)] 참조)를 사용하여 서열 분석용 재료를 생성시켰다. 그러한 4개 클론이 생성되었고, 이들을 사용하여 추가의 5' 서열 정보(pFWRP5, 6, 19 및 20)를 제공하였다.
또한, 인간 cDNA 라이브러리(람다내로 삽입된)를 클론 712562(AA281296 포함)의 EcoRI-NotI 단편으로 프로브 처리하였다. "람다 25-1.1"(ATCC 수탁번호 #209024)로 명명된 하나의 람다 클론이 상보성 서열을 포함하는 것으로서 동정되었다. 도 54는 이 람다 클론의 제한 지도를 나타낸다. 이 클론에서 얻은 인간의 cDNA 삽입체는 시판되는 파지미드 p블루스크립트IISK+(스트라타진)의 EcoRI 부위내로 EcoRI 제한 단편으로서 서브클로닝하여 플라스미드 "pGRN121"(ATCC 수탁번호 #209016으로 ATCC에 기탁되었음)을 생성시켰다. 예비적인 결과는 플라스미드 pGRN121이 인간의 텔로머라제 단백질을 암호화하는 전체 개방형 해독틀(ORF)를 포함한다는 것을 나타냈다.
플라스미드 pGRN121의 cDNA 삽입체는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 서열 분석하였다. 도 49는 이러한 예비 연구에 기초하여 동정된 플라스미드 pGRN121의 제한 부위 및 기능 지도를 제공한다. 이러한 예비 서열 분석 결과는 도 50에 나타냈다.
이러한 분석으로부터, 도 49에 도시한 바와 같이, 암호 영역에 대한 추정 개시 부위는 EcoRI 부위(위치 707에 위치함)로부터 약 50개 뉴클레오티드에서 동정되었고, 뉴클레오티드 #3571(도 51 참조)에서의 추정 정지 부위 외에도, 텔로머라제 특이 모티프 "FFYVTE"(서열번호 112), "PKP", "AYD", "QG" 및 "DD"의 위치가 동정되었다. 도 51은 서열내 개방형 해독틀("a"(서열번호 114), "b"(서열번호 115) 및 "c"(서열번호 116))에 대한 DNA 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다. 그러나, 초기의 서열 분석 작업의 예비적인 성질로 인해, 다양한 모티프에 대한 해독틀은 배열에 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
pGRN121상에서 수행된 추가의 분석은 플라스미드가 712562 클론에 존재하지 않는 암호 서열의 5'-말단으로부터 상당한 부분을 포함한다는 것을 나타냈다. 또한, pGRN121은 약 182개 뉴클레오티드의 삽입체를 포함하는 변형체 암호 서열을 포함하는 것으로 확인되었다. 이 삽입체는 전술한 바와 같이 클론 712562로부터 부재하는 것으로 확인되었다. 이. 에디큘라투스 서열의 경우와 같이, 그러한 변형체는 텔로머라제 분석과 같이 기능 분석법으로 시험하여 샘플내 기능적 텔로머라제 또는 부분적 TRT 활성의 존재를 검출할 수 있다.
예비 서열 분석은 cDNA 서열 및 개방형 해독틀(도 58에 나타낸 바와 같이, 각각 서열번호 119 및 120)을 나타냈다. 추가의 서열 분석은 도 53(서열번호 117)에 나타낸 바와 같이 pGRN121의 cDNA 서열을 분리하였다. 이 cDNA의 분석은 분자량이 약 127,000 달톤이고 다음과 같은 1132개 아미노산(서열번호 118)으로 이루어진 단백질을 암호화하는 인접 개방형 해독틀을 나타낸다:
(서열번호 118)
치료 활성 및 기타 활성을 가진 변형체 hTRT 폴리펩티드는 클론 712562(서열번호 122)에서 pGRN121 cDNA와 유사하나 182개 염기쌍이 결핍된 핵산으로부터 발현될 수 있다. 이 핵산(이하, "프로90 hTRT"라 함)은 본원에 기술한 통상의 합성 또는 재조합 방법을 사용하여 합성할 수 있는 것으로서, 서열번호 118이 암호화하는 hTRT 단백질과 동일한 아미노 말단 서열을 공유하나, 카르복시 말단 영역에서 분기되는(프로90 hTRT의 첫 번째 763개 잔기는 공통이고, 나머지 44개 잔기는 "전길이"의 hTRT와 상이함) 807개 잔기의 단백질(계산된 분자량이 약 90 kD임)을 암호화한다. 프로90 hTRT 폴리펩티드는 모티프 T, 1, 2 및 A를 포함하나, 모티프 B, C, D, E는 포함하지 않으며, 따라서, 전부가 아닌 약간의 텔로머라제 활성을 가질 것으로예상된다.
본 발명은 또한 자연 발생적 hTRT 종 또는 비자연 발생적 변형체의 분리되거나 또는 정제된 다른 재조합 형태를 제공한다. 종래에는 논의되지 않은 자연 발생적 hTRT종의 일례는 클론 712562(서열번호 122)가 암호화하는 mRNA의 리보좀 틀변경으로부터 기인되거나 또는 hTRT cDNA(서열번호 117) 서열은 모든 TRT 모티프를 포함하는 hTRT 폴리펩티드의 합성을 초래할 수 있다(예컨대, 문헌[Tsuchihashi (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2516; Craigengen(1987) Cell 50:1; Weiss(1990) Cell 62:117] 참조). 리보좀 틀변경은 특이 mRNA 서열 및 2차 구조가 리보좀으로 하여금 서열에서 "정지하고" 앞뒤로 하나의 뉴클레오티드를 점프하게 할 때 일어난다. 따라서, 클론 712562의 hTRT 서열에 상응하는 mRNA상에서의 리보좀 틀변경 현상은 대략 523 잔기 폴리펩티드의 합성을 일으킬 것이다. 프로90 서열상의 리보좀 틀변경 현상은 대략 1071 잔기를 가진 단백질을 생성시킬 것이다. 리보좀 틀변경에서 기인하는 가설적인 단백질도 통상의 합성 또는 재조합 기술에 의해 발현될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 18: 텔로머라제의 클로닝 및 서열 분석
본 발명은 인간 및 비인간 기원의 텔로머라제종을 포함하는 텔로머라제 종류를 제공한다. 본 발명은 상기 종류의 텔로머라제의 대표적인 수의 예 및 텔로머라제 동종형 및 동족체와 진핵 생물의 기타 종 및 속의 텔로머라제의 검출 및 동정에 사용할 종류의 멤버에 공통되는 구조적 특징의 설명을 제공한다. 본 발명의 텔로머라제종의 종류중의 멤버로는 유플로테스 에디큘라투스 p123(서열번호 1), 옥시트리차(서열번호 58을 암호화함), 사카로마이세스 세레비제(서열번호 66), 테트라히메나 및 스키조사카로마이세스 폼베, trt1(서열번호 69)로부터 분리한 텔로머라제가 있다.
본 발명은 TRT 유전자 및 cDNA를 클로닝하기 위한 TRT 폴리뉴클레오티드로부터 생성되거나 또는 유래한 핵산 프로브 및 프라이머; 및 TRT 폴리펩티드 종류의 동정 및 정제 또는 TRT 유전자의 발현 클로닝용의 모티프 또는 다른 TRT 에피토프를 포함하여 TRT를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하여 신규의 TRT를 동정하고 클로닝하는 시약 및 방법을 제공한다.
hTRT 핵산 서열(서열번호 117의 cDNA로부터 얻음) 및 단백질 서열 정보(서열번호 118)는 텔로머라제 유전자(들) 및 cDNA의 동정용 PCR 프라이머 및 올리고뉴클레오티드를 제공한다. TRT 종류의 멤버중에서 보존된 서열을 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머가 기타 생물로부터 신규의 TRT 동종형 및 TRT종을 증폭시키기 위한 본 발명의 바람직한 시약이다.
한편, 올리고뉴클레오티드는 다양한 하이브리드화 기술 및 조건을 사용하여 텔로머라제를 암호화하는 핵산을 검출하기에 유용하다. 이들 올리고뉴클레오티드는 PCR, 분리된 DNA의 제한 효소 처리 또는 유기 합성을 포함하는 임의의 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 핵산은 전술한 바와 같이 검출을 위해 표지하고 임의의 공지된 기술에 의해 DNA에 하이브리드시킨다.
총 RNA를 추출하고, 퀵프렙(QuickPrep) 마이크로 mRNA 정제 키트(뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파마시아)를 사용하여 농축시킨다. 그 다음, mRNA는 예컨대, Sambrook의 문헌에 기재된 조류의 골수아구증 비루스(AMV) 역전사 효소(파마시아)를 사용하여 역전사에 의해 cDNA 주형을 만드는 데 사용한다. PCR은 예컨대, 공지의 hTRT 서열에 기초하는 서열을 가진 임의의 프라이머 세트를 사용하는 테크니(Techne) PHC-3 열교환기(뉴저지주 프린스톤 소재의 테크니)를 사용하여 cDNA상에서 수행한다. PCR을 사용하여 게놈 DNA로부터 텔로머라제 서열을 증폭시킬 수도 있다. 전통적인 PCR의 또 다른 변형, 예컨대, 전술한 바와 같은 RACE를 사용할 수 있다. PCR 증폭은 다양한 어닐링 조건을 사용할 수 있다. 예를 들면, 다음의 순환 프로토콜을 사용하여 hTRT를 증폭시킨다: 94℃에서 45초 동안 변성시키고; 60℃에서 45초 동안 어닐링하며, 72℃에서 90초 동안 연장 반응시킨다. 이 과정을 총 약 30 내지 40 주기 동안 반복하여 DNA 생성물을 생성시키고, 정제한다. PCR 생성물은 임의의 공지된 기술, 예컨대, 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(상표명) 레디 리액션 키드(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스) 및 모델 373A DNA 시퀀서(어플라이드 바이오시스템스)를 사용하는 디데옥시쇄 종결 방법에 의해 서열 분석할 수 있다. 인간 텔로머라제 서열로서 일단 동정되면 PCR 생성물은 추가로 표지되고, 전술한 바와 같이 하이브리드화 프로브로서 사용한다.
본 발명은 전길이의 TRT cDNA(즉 서열번호1, 3, 53, 55, 117) 및 TRT cDNA의 다양한 단편을 포함하여 검색에 특히 유용한 TRT 브로브를 제공한다. 한 가지 그러한 프로브는 cDNA(서열번호 117, 도 53)의 대략 처음 세 번째를 포함하는 TRT의 일부분을 포함한다. 이 영역은 TRT의 나머지보다 더 GC가 많으며, 비인간 텔로머라제 서열의 검출에 특히 유용할 수 있다. 그러므로, 이 영역에 대한 프로브로 검색하여 원하지 않는 클론을 최소화할 수 있다. 이 영역의 유용한 예로는 pGRN121의 1203개 염기쌍의 Eco47 III 단편(서열번호 117의 위치 729 내지 1932) 및 pGRN121의 1530개 염기쌍의 Pml 1/Sph 1 단편(서열번호 117의 위치 748 내지 2278)이 있다.
또 다른 양태는 TRT cDNA(즉, 서열번호 117)의 대략 중앙 세 번째를 포함하는 TRT 부분을 포함하는 프로브를 제공한다. 이 영역은 RT 모티프를 암호화하고, 고도로 보존된 영역인 것으로 생각된다. 텔로머라제 RT 영역의 유용한 예로는 pGRN121의 1143 bp Sph1/Xmm1 단편(서열번호 117의 위치 2278 내지 3421)을 포함한다.
추가의 양태는 TRT cDNA(즉, 서열번호 117)의 대략 마지막 세 번째를 포함하는 TRT 부분을 포함하는 프로브를 제공한다. 이 영역은 TRT 중에서 최소로 보존된 hTRT의 영역을 암호화한다. 이 영역의 유용한 예로는 pGRN121의 760 bp Xmm1/Msc1 단편(서열번호 117의 위치 3421 내지 4594)을 포함한다.
실험은 하나 이상의 클론을 검출할 수 있는 프로브의 혼합물을 사용하여 수행할 수 있다. 일단 클론이 동정되면, 그것이 포함하는 영역을 독립적으로 동정하는 각 프로브를 사용하여 검색할 수 있다. 그 다음, 프로브를 독립적으로 사용하여 기타 관련된 영역을 찾을 수 있다. 클론이 동정될 때, mTRT 클론을 프로브로서 사용하여 마우스(및 기타 포유류)의 게놈 라이브러리의 검색을 수행할 수 있다. TRT 프로브를 사용한 초기 하이브리드화는 감소된 엄중도에서 수행되어야 한다. TRT 유전자의 동종형은 TRT 프로브 서열과 약 60 내지 95% 동일할 것으로 예상되기 때문에, 적당한 하이브리드화 조건이 계산된다(예컨대, Sambrook의 문헌 참조).
컴퓨터 데이타베이스 및 프로그램을 사용하여 전술한 바와 같이 공지의 텔로머라제 서열에 대한 서열 동일성 또는 상동성에 대해 생성되는 DNA 서열을 분석할 수 있다. 예를 들면, PC/유전자 TM 소프트웨어(캘리포니아주 마운틴뷰 소재의 인텔리제네틱스 인코포레이티드)는 서열을 배열하고 개방형 해독틀을 나타낸다. BLAST N 및 BLAST D 검색 알고리즘을 이용하여 유도된 텔로머라제 서열과 공지의 서열 사이의 임의의 일치에 대해 젠뱅크 데이타베이스(매릴랜드주 베데스다 소재의 NIH)를 검색할 수 있다.
마우스의 텔로머라제를 암호화하는 서열의 클로닝
hTRT 및 기타 TRT 폴리뉴클레오티드(예컨대, 유플로테스 123 및 43 kDa를 암호화하는 서열, pGRN121)를 사용하여 다른 종에서 유래한 상동성 TRT를 클로닝할 수 있다. 본 실시예에서는 hTRT 프로브를 사용하여 마우스 TRT를 클로닝하는 방법을 설명한다.
또 다른 생물로부터 텔로머라제의 클론을 얻기 위해서는, 하이브리드화 실험을 통상적으로 수행한다. TRT cDNA 또는 TRT 유전자의 영역의 PCR 단편(들)일 수 있는 TRT에서 유래한 프로브, 또는 TRT 암호 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 pGRN121과 같은 플라스미드의 제한 단편(들)을 표적 생물에서 유래한 DNA에 하이브리드시킨다. 한편, 전술한 바와 같이 항체 프로브를 사용할 수도 있다.
pGRN121의 1203 bp의 Eco47 III 단편(pGRN121의 위치 729 내지 1932) 및 pGRN121의 1143 bp의 Sph1/Xmn1 단편(pGRN121의 위치 2278 내지 3421)을 프로브로 사용하여 마우스의 람다 gt10 cDNA 라이브러리(다능성 배의 간세포의 D3 라인에서 유래한 RNA를 사용하여 형성됨)의 플라크 검색에 의해 마우스 TRT cDNA 클론을 얻었다. 마우스 TRT(mTRT) 클론 서열을 p블루스크립트 II KS(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 스트라타진)의 EcoRI 부위내로 서브클로닝하였다. 서브클론을 서열 분석하여 약 2 kb의 5' 서열을 얻었다(서열번호 124의 뉴클레오티드 1-2009, 도 60).
올리고-dT 프라이밍된 마우스 고환 RNA로부터 생성된 마우스 cDNA의 PCR증폭을 사용하여 추가의 mTRT 유전자 서열을 클로닝하였다. 사용된 프라이머는 mTRT.9(5'-CTTTTACATCACAGAGAGCAC(서열번호 125) 및 hTRT.28(5'-CTCGGACCAGGGTCCTG AGGAA)(서열번호 126)였다. 프로브 mTRT.9는 mTRT의 1682-1702에 위치하도록 조작되었다(도 60). 프로브 hTRT.28은 hTRT의 2702-2723에 위치하도록 조작되었다. 인간 TRT 유전자 서열로부터 조작된 프라이머를 사용한 마우스 TRT 유전자의 증폭은 기타 생물, 특히 포유류, 예컨대, 마우스 및 기타 비인간 동물(예컨대, 영장류)로부터 클론을 얻는 데 있어서 TRT 서열 또는 본 발명을 사용하는 용도의 예이다. 증폭된 DNA를 클로닝하고 서열 분석하였다(도 60에 나타낸 바와 같이, 서열번호 124의 뉴클레오티드 1682-2695).
pGRN121의 760 bp Xmn1/Msc1 단편(pGRN121의 위치 3421 내지 4181)을 사용하여 수집된 BAC 라이브러리의 하이브리드 검색에 의해 BAC 클론으로부터 추가의 mTRT 서열을 얻었다. 760 bp Xmn1/Msc1 단편을 프로브로 사용하여 서던 하이브리드화 실험에 의해 mTRT 암호 서열을 포함하는 것으로서 양성 BAC 클론(BAC 495-M5)에서 유래한 1.3 kb PstI 단편을 동정하였다. PstI 단편을 p블루스크립트 II KS(스트라타진)의 PstI 부위내로 서브클로닝하고, 서열 분석하였다(도 60에 나타낸 바와 같이 서열번호 124의 뉴클레오티드 2890-3025). 클론 495-2A2의 추가 부분은 hTRT에 비상동성인 서열을 포함하고, 인트론 또는 벡터 서열인 것으로 생각된다.
도 60에서, "X"는 mTRT 유전자의 클로닝되지 않은 영역을 나타내고, "Xs"는 클로닝되나 서열 분석되지 않은 영역(hTRT에 대한 유사도에 의해 측정한 길이를 가짐)을 나타낸다. 당해 분야에 공지된 표준 방법으로 mTRT 유전자 서열을 연장시켜 mTRT 단백질의 카르복실 말단 + 3' 비해독 영역을 암호화할 수 있다.
마우스의 텔로머라제를 암호화하는 서열의 이용
본 발명에 의해 텔로머라제의 마우스 cDNA 및 게놈 클론이 제공되고, 이들을 사용하여 mTRT의 동형 접합성 결실을 구성하고; mTRT 생화학적 및 생물학적 특성을 규명하며; mTRT 및 hTR(mTR)의 마우스 등가물의 무력화 구조를 구성하고; mTRT 및 mTRT/mTR의 마우스 돌연변이 무력화 구조에서 hTRT 및 hTR을 발현시킬 수 있다. 마우스의 DNA는 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, RNA, cDNA, cDNA 라이브러리 또는 기타의 것이 있다. 일 양태로, 마우스 cDNA 라이브러리를 검색하여 mTRT cDNA의 단편을 얻는다. 이 서열은 다시 게놈 클론 또는 추가의 cDNA 클론을 찾는 데 사용할 수 있다. 이 방법은 hTRT 프로브가 게놈 DNA 라이브러리내의 인트론으로 인해 마우스 게놈 DNA 보다 마우스 cDNA에 하이브리드되는 현상에서 바람직할 수 있다. cDNA 라이브러리의 공급원이 중요하다: 그것은 텔로머라제 활성을 보유하는 것으로 공지된 조직으로부터 유래하는 것이 바람직하다. 마우스 배의 간세포 cDNA 라이브러리가 특히 양호한 선택인데, 왜냐하면, 간세포에서의 텔로머라제의 발현이 정상의 이배체 세포와 비교하여 상대적으로 높기 때문이다.
마우스의 게놈 클론은 무력화 절차와 관련하여 상기한 사항에 따라 mTRT 유전자를 지향하여 무력화하는 데 유용한 구성체를 제공한다. mTRT와 같은 전체 텔로머라제 유전자를 클로닝하기 위해, 전체 게놈 서열의 범위를 포함하도록 다수의 대형 게놈 람다 클론을 사용할 수 있다. 마우스 클론의 분리에 사용되는 마우스 ES 라이브러리는 클론테크에서 입수한 마우스 배의 간세포 5'-스트레치 cDNA 라이브러리인 cat # ML1049a였으며, 평균 삽입체 크기는 1.6 kb(0.8 내지 4.5 kb 범위)이고, 벡터= lgt10, 올리고 dT이며, 무작위 헥사머는 EcoRI 링커로 프라이밍되었고, RNA 공급원= D3 세포주(다능성 ES 세포)였다(Doetschman, T.C. 등 (1985) j. Embryol. Exp. Morphol. 87:27-45).
실시예 18: 43 kDa 텔로머라제의 인간 상동체의 동정
43 kDa 폴리펩티드(서열번호 4-6 및 서열번호 9)를 암호화하는 유플로테스 에디큘라투스 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 사용하여 다른 종에서 유래한 상동성 TRT를 클로닝하였다. 또한, 43 kDa TRT를 포함하여 TRT를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하여 다른 생물에서 유래한 추가의 동종형 및 종을 동정할 수 있다. 과학 문헌 및 특허 문헌은 다양한 기술을 사용하여 밀접하게 관련된 교차 반응성 종을 동정하는 데 사용하는 항체의 용도를 기재하고 있다. 예를 들면, TRT 유전자의 발현 클로닝 또는 43 kDa TRT 폴리펩티드의 동정 및 정제 방법을 사용하여 유플로테스 p43(43 kDa) 텔로머라제 서브유닛 유전자의 인간의 상동체를 분리할 수 있다.
본 실시예에서는, 이. 에디큘라투스 43 kDa TRT와 반응성인 이. 에디큘라투스 올리고뉴클레오티드 프로브 및 항체를 사용하여 이. 에디큘라투스 43 kDa(p43) TRT의 인간의 상동체를 암호화하는 유전자의 클로닝 방법을 설명한다.
43 kDa 특이 항체의 생산
43 kDa 폴리펩티드와 반응성인 항체의 생성을 위해, 면역원으로서 다음과 같은 펩티드를 조작하였다: CGGQKQLEFYFSDANLYNDSFL(서열번호 127). 이 펩티드는 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 및 BSA(소 혈청 알부민)에 접합시켰다. 펩티드 면역원을 사용하여 쥐 및 토끼의 다클론 항혈청을 생성시켰다. 단 두번의 출혈 후에, 최고의 역가를 가진 항혈청은 4.1 x 104이었다. 동일한 프로토콜을 사용하여 동물에게 재투여하였다. 최대 출혈 역가는 8 x 105이었다. 면역원 펩티드 친화도 칼럼과 같은 통상의 기술을 사용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하였다. 43 kDa 폴리펩티드에 반응성인 단일클론 항체는 전술한 바와 같이 파지에서 나타나거나 또는 세포상에서 유사한 재조합 항체 라이브러리로부터 항체를 선별하는 기술을 포함하여 표준 기술을 사용하여 생성시켰다.
실시예 19: 효모 TRT 특이 펩티드의 조작 및 생산
효모 TRT 폴리펩티드(서열번호 64)를 암호화하는 에스. 세레비제 TRT 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 66)을 사용하여 다른 종에서 유래한 상동성 TRT를 클로닝할 수 있다. 효모 TRT를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하여 다른 생물로부터 추가의 TRT 동종형 및 종을 동정할 수 있다. 본 실시예에서는, 효모 TRT 폴리펩티드에 특이적인 항체가 생성되었다.
에스. 세레비제 TRT 폴리뉴클레오티드와 반응성인 항체의 생성을 위해서는, 면역원으로서 사용하기 위해 다음 펩티드를 조작하였다:
NFNHSKMRIIPKKSNNEFRII("yIPKK"로 명명함)(서열번호 128)
및 CLPELYFMKFDVKSCYDSIPRMECMRILK("yCYDS"로 명명함)(서열번호 129).
이들 펩티드는 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 및 BSA(소 혈청 알부민)에 접합시켰다. 펩티드 면역원을 사용하여 쥐 및 토끼의 다클론 항혈청을 생성시켰다. 동물을 면역화하고, 유플로테스 항-p43(43 kDa) 항체의 생성에 대해 기술한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 재투여하였다. 최대 출혈 역가는 8 x 105또는 그 이상이었다. 면역원 펩티드 친화도 칼럼과 같은 통상의 기술을 사용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하였다. 에스. 세레비제 TRT 폴리뉴클레오티드에 반응성인 단일클론 항체는 전술한 표준 기술을 사용하여 생성시켰다.
실시예 20: TRT 펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 발현용 벡터의 조작 및 구성
본 실시예는 전길이의 생물학적 활성 TRT를 다량으로 생산하는 TRT-발현성 박테리아 및 진핵세포 발현 벡터의 조작에 대해 상세히 설명한다. 이러한 방법으로 생물학적으로 활성인 TRT 단백질을 생성시키는 방법은 몇 가지 예로서, 텔로머라제 재구성 분석법에, 텔로머라제 활성 조절인자의 분석에, TRT의 새로이 분리된 종의 활성 분석에, TRT와 특이적으로 연합되는 화합물의 동정 및 분리에, 부위 특이적으로 돌연변이된 TRT 변형체 단백질의 활성 분석에 그리고 면역원으로서 유용하다.
박테리아에서의 TRT의 발현
pThioHis A/hTRT 박테리아 발현 벡터
전길이의 TRT를 다량으로 생산하기 위해, 박테리아 발현 벡터인 pThioHis A(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐사)를 발현계로 선택하였다. hTRT-암호 삽입체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 707 내지 4776을 포함한다. 이 뉴클레오티드 서열은 hTRT 단백질에 대한 완전한 암호 서열을 포함한다.
본 발명의 이 발현 벡터는 박테리아에서 유도성 발현을 위해 조작된 것이다. 이 벡터는 이.콜리에서 절단 가능한 HIS 표지된 티오레독신 부분 및 전길이의 hTRT 단백질로 이루어진 고레벨의 융합 단백질을 발현시키도록 유도할 수 있다. 발현계의 사용은 실질적으로 제조자의 지시에 따라 이루어졌다. 본 발명의 생성 벡터가 암호화하는 융합 단백질의 아미노산 서열(서열번호 130)은 아래에 나타내는데, 별표(*)는 엔테로키나제 절단 부위를 나타낸다:
pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 3272 내지 4177을 가진 pGEX-2TK
본 발명의 이러한 구성체를 사용하여 예컨대, TRT 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체를 형성할 목적으로 융합 단백질을 제조한다. TRT의 단편은 기타 목적, 예컨대, 우성-음성 돌연변이체로서의 텔로머라제 활성의 조절에, 또는 다른 단백질 또는 핵산과 텔로머라제 성분의 연합을 방지하는 데에도 사용할 수 있다.
TRT 단백질 단편을 다량으로 생산하기 위해서는, 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK(뉴저지주 피스캐터웨이 소재의 파마시아 바이오테크)를 선별하고, 본질적으로 제조자의 지시에 따라 사용하여 본 발명의 발현 벡터를 제조하였다. 생성되는 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 3272 내지 4177에서 유래한 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열(서열번호 131)에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고레벨의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
이 융합 단백질을 발현시킬 때, 그것은 불용성 응집체를 형성하였다. 이것을 봉입체에서 유래한 단백질의 정제라는 제목의 단락에서 설명한 바와 같이 일반적으로 처리하였다. 구체적으로, 유도된 세포는 PBS(20 mM 인산나트륨, pH7.4, 150 mM NaCl)에서 현탁시키고 초음파 처리에 의해 붕괴시켰다. NP-40을 0.1%까지 첨가하고, 그 혼합물을 부드럽게 혼합하면서 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 불용성 물질을 PBS중의 4M 우레아에서 1회 세척하고, 원심분리하여 수집한 다음, PBS에서 다시 세척하였다. 수집된 펠렛은 75% 이상의 융합 단백질을 함유하는 것으로 평가되었다. 이 물질을 고속 진공에서 건조시킨 다음, 항체의 생성을 위해 마우스 및 토끼에게 주사하기 위한 보조제에 현탁시켰다.
HIS-8 표지를 가진 pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 2426 내지 3274를 보유한 pGEX-2TK
TRT의 단편을 다량으로 생산하기 위해서는, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다. 이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 2426 내지 3274에서 유래한 삽입체 및 8개의 연속 히스티딘 잔기(HIS-8 표지)를 암호화하는 서열을 포함한다. HIS-8 TAG를 삽입하기 위해, pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 2426 내지 3274를 가진 pGEX-2TK 벡터를 BamH1으로 선형화하였다. 이것은 GST-트롬빈-심근 단백질 키나제와 hTRT 암호 서열 사이의 연접부에서 플라스미드를 개방하였다. BamHI 적합성 말단을 가진 2본쇄의 올리고뉴클레오티드를 선형화된 플라스미드에 결찰시켜 hTRT 서열의 상류에 8개의 히스티딘 잔기의 틀내 도입을 초래하였다.
상기 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열(서열번호 132)에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 3개 잔기 세트 및 5개 잔기의 세트 ([GSV] 및 [GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고레벨의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
본 발명의 각각의 pGEX-2TK 벡터를 사용하여 hTRT 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체를 형성할 목적으로 융합 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 이 융합 단백질을 사용하여 융합 단백질내에 포함된 TRT 펩티드에 대해 형성된 항체를 친화도 정제할 수 있다. 글루타치온 S-트랜스퍼라제 부분으로부터 재조합 단백질의분리는 제조자의 지시에 따라 트롬빈을 사용하는 부위 특이적 단백질 분해에 의해 수행할 수 있다.
HIS-8 표지가 없는 pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 2426 내지 3274를 가진 pGEX-2TK
TRT 단편을 다량으로 생산하기 위해, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다.
이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 2426 내지 3274에서 유래한 삽입체를 포함하나, 전술한 구성체의 HIS-8 표지는 없다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열(서열번호 133)에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고레벨의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 1625 내지 2458을 가진 pGEX-2TK
TRT 단백질을 다량으로 생산하기 위해, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다.
이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 1625 내지 2458에서 유래한 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열(서열번호 134)에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고레벨의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
pGRN121의 hTRT 뉴클레오티드 782 내지 1636을 가진 pGEX-2TK
TRT 단백질을 다량으로 생산하기 위해, 또 다른 이.콜리 발현 벡터 pGEX-2TK 구성체를 제조하였다.
이 구성체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 782 내지 1636에서 유래한 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 서열(아래 서열(서열번호 135)에서 밑줄친 부분), 트롬빈 절단 서열(2중으로 밑줄침), 심근 단백질 키나제에 대한 인지 서열(이탤릭체), 클로닝에 의해 도입된 잔기([GSVTK]) 및 hTRT 단백질 단편(굵은 활자체)으로 구성된 융합 단백질의 고레벨의 이.콜리에서의 발현을 유도한다:
5'-비암호 서열이 결핍된 hTRT cDNA를 가진 pT7FLhTRT
전술한 바와 같이, 일 양태로, 본 발명은 어떠한 5' 비해독 TRT 서열도 없이 박테리아, 포유류, 효모 및 곤충 발현 벡터내로의 클로닝을 촉진하기 위한 부위 특이적 방법으로 변형된 TRT를 제공한다. 어떤 상황에서는, 비단백질을 암호화하는 서열의 양을 최소화함으로써 단백질 생산(수율)을 향상시키고, mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에서는, TRT 유전자 5' 비암호 영역은 박테리아 발현 벡터내로 클로닝하기 전에 제거하였다.
이것은 hTRT 암호 서열(도 53, 서열번호 117)의 개시(ATG) 코돈의 바로 상류(5')에 추가의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 공학적으로 조작함으로써 수행하였다. 5'쪽으로 단백질의 암호 영역의 바로 앞에 제한 부위를 생성시킴으로써, 면역 검출 및 정제용으로 표지 및 펩티드 TAG를 포함하는 융합 단백질과 같은 융합 단백질을 암호화하는 다양한 벡터를 효율적으로 제조할 수 있다.
구체적으로, 올리고뉴클레오티드 5'-CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3'(서열번호 136)을 전술한 바와 같이 사용하여 hTRT cDNA 뉴클레오티드 779 내지 781을 GCG로부터 CAT로 변형시켰다. 이들 3개 뉴클레오티드가 ATG 개시 코돈전의 마지막 뉴클레오티드이고, 따라서, 이들은 단백질 서열을 변형시키지 않는다. 서열의 변화는 hTRT cDNA의 특이 NdeI 제한 부위의 생성을 초래한다. 1본쇄 hTRT DNA를 부위 지향성 돌연변이 유발의 DNA 공급원으로서 사용하였다. 생성된 플라스미드를 서열 분석하여 돌연변이 유발의 성공 여부를 확인하였다.
이러한 변형은 pT7FLhTRT로 명명된 본 발명의 다음과 같은 플라스미드를 구성하였다. 부위 특이적으로 변형된 hTRT 서열(NdeI 제한 부위의 첨가)을 NdeI 및 NotI로 처리하고, (클리나우 단편으로 충전하여 평활 말단이 있는 DNA를 생성시켜) hTRT를 암호화하는 핵산 단편을 생성시켰다. 그 다음, 이 단편을 NdeI 및 SmaI(역시 평활 말단을 만드는 절단 효소)으로 이미 제한 효소 처리한 pSL3418 플라스미드내로 클로닝하였다. pSL3418은 FLAG 서열(워싱턴주 시애틀 소재의 임뮤넥스 코포레이션) 및 엔테로키나제 서열이 상기 언급한 NdeI 부위로부터 바로 상류에 삽입된 변형된 pAED4 플라스미드이다. pT7FLhTR로 명명된 이 플라스미드는 T7 RNA 폴리머라제를 발현시키는 이.콜리 균주에서 전길이의 hTRT(5' 말단에서 플랙-표지를 가짐)를 발현시킨다.
3'-비암호 서열이 결핍된 hTRT cDNA를 가진 플라스미드
전술한 바와 같이, 본 발명은 일부 또는 전부의 비암호 서열이 결실된 TRT-암호 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 어떤 상황에서는, 비단백질 암호 서열의 양을 최소화하면, 단백질 생산(수율)이 향상되고, mRNA 안정성이 증가된다. 본 발명의 이러한 양태에서, TRT의 3' 비해독 영역은 박테리아 발현 플라스미드내로 클로닝하기 전에 결실된다.
전술한 바와 같이 전길이의 hTRT cDNA를 포함하는 플라스미드 pGRN121을 먼저 모든 ApaI 부위를 결실시켰다. 그 다음, 3'UTR을 포함하는 MscI-HincII hTRT 제한 효소 처리 단편을 결실시켰다. 그 다음, hTRT의 정지 코돈을 포함하는 NcoI-XbaI 제한 효소 처리 단편을 3'UTR이 결핍된 것을 제외하고는 pGRN124로 명명된 pGRN121의 NcoI-XbaI 부위내로 삽입하였다.
항생물질 선별 마커를 사용하는 박테리아 발현 벡터
본 발명은 또한 형질전환된 세포상에 선별 가능한 표현형을 부여하는 선별 마커, 및 숙주 게놈내로의 통합이 필요 없도록 에피좀 유지 및 복제를 암호화하는 서열을 포함할 수 있는 박테리아 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 상기 마커는 항생물질 내성, 특히 클로람페니콜 내성(문헌[Harrod(1997) Nucleic Acids Res. 25:1720-1726] 참조), 카나마이신 내성, G418 내성, 블레오마이신 내성 및 하이그로마이신 내성을 암호화하여 목적 DNA 서열로 형질전환시킨 세포들의 선별을 가능하게 할 수 있다. 예컨대, 문헌[Blondelet-Rouault(1997) Gene 190:315-317; and Mahan(1995) Proc Natl Acad Sci 미국 92:669-673] 참조.
본 발명의 일 양태에서, 전길이의 hTRT는 클로람페니콜 항생물질 내성 유전자가 삽입되어 있고, pBBS235로 명명된 변형된 블루스크립트 플라스미드 벡터(캘리포니아 샌 디에고 소재의 스트라타진)내로 클로닝하였다. hTRT ORF를 포함하는 pGRN124(상기함)로부터 얻은 NotI 단편의 pBBS235의 NotI 부위내로의 도입은 TRT ORF가 벡터의 Lac 프로모터의 반대 방향으로 배향되도록 수행된다. 이러한 과정은 본 발명의 TRT 핵산과 같은 플라스미드 삽입체의 돌연변이 유발에 적합한 플라스미드를 제조한다. pGRN125로 명명된 이러한 플라스미드 구성체는 텔로머라제 효소 및 TRT 단백질 암호 서열의 돌연변이 유발과 관련된 본 발명의 방법에 그리고 T7 프로모터를 사용하는 hTRT의 시험관내 전사(및 T3 프로모터를 사용하는 안티센스 hTRT의 시험관내 전사)에 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, hTRT ORF를 포함하는 pGRN124로부터 NotI 제한효소 처리 단편을 TRT ORF가 벡터의 Lac 프로모터와 동일한 방향이 되도록 pBBS235(전술함)의 NotI 부위내로 서브클로닝하였다. 이러한 과정은 이.콜리에서 전길이의 hTRT의 발현에 사용될 수 있는 pGRN126으로 명명된 플라스미드를 제조한다. 발현된 생성물은 벡터 pBBS235가 암호화하는 29개 아미노산, 이어서, hTRT의 5'UTR이 암호화하는 18개의 아미노산, 이어서 전길이의 hTRT 단백질을 포함할 것이다.
본 발명의 추가의 양태에서, hTRT 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 발현 벡터내로의 클로닝을 촉진하기 위한 EcoRI 및 BglII 제한 효소 처리 부위를 생성시키기 위해, pGRN125의 시험관내 돌연변이 유발법을 실시하였다. 돌연변이 유발 과정에는 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'(소문자는 변형된 뉴클레오티드)(서열번호 137). 생성되는 발현 벡터는 pGRN127로 명명하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서, TRT "DD 모티프"의 두 번째 Asp을 알라닌으로 전환하여 비기능성 텔로머라제 효소를 생성시키고, 따라서, 우성/음성 돌연변이체로서 사용하기 위한 돌연변이 TRT 단백질을 생성시켰다. hTRT 암호 서열은 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 시험관내에서 돌연변이를 유발하여 잔기 869(Asp869)의 아스파르트산 코돈을 알라닌(Ala) 코돈으로 전환시켰다:
5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3'(서열번호 138). 이 과정은 또한 MluI 제한 효소 부위도 생성시켰다. 생성된 발현 플라스미드는 GRN130으로 명명되었고, 이는 또한 pGRN127에 대해 기재한 바와 같이 코작 일치 서열을 포함한다.
본 발명의 또 하나의 양태에서는, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발 절차에 사용하여 hTRT 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 제한 부위를 생성시켰다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'(서열번호 139).
본 발명은 또한 hTRT의 안티센스 서열 단편을 발현시키도록 조작된 벡터를 제공한다. pGRN126 플라스미드는 MscI 및 SmaI 제한 효소로 완전히 절단하고, 재결찰하여 hTRT ORF의 95% 이상을 결실시켰다. 하나의 SmaI-MscI 단편은 그 과정중에 재삽입되어 CAT 활성을 재생하였다. 이러한 정제되지 않은 플라스미드는 SalI 및 EcoRI으로 재처리하고, hTRT ORF의 개시 코돈을 포함하는 단편을 pBBS212의 SalI-EcoRI 부분내로 삽입하여 hTRT ORF의 73개 염기쌍 잔기 및 5'UTR에 걸치는 안티센스 서열을 발현시키는 안티센스 발현 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드를 pGRN135로 명명하였다.
효모에서의 hTRT 텔로머라제의 발현
본 발명은 또한 전길이의 생물학적 활성이 있는 TRT를 다량으로 생산하기 위한 TRT-발현용 효모 발현 벡터를 제공한다.
피치아 파스토리스 발현 벡터 pPICZ B 및 전길이의 hTRT
전길이의 생물학적 활성이 있는 TRT를 다량으로 생산하기 위해서는, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 벡터 pPICZ B(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 선택하였다. hTRT-암호 서열 삽입체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 659 내지 4801로부터 유래하였다. 이 뉴클레오티드 서열은 hTRT를 암호화하는 전길이의 서열을 포함한다. 이 발현 벡터는 피. 파스토리스에서 전길이의 변형되지 않은 hTRT를 고레벨로 유도 발현시키도록 조작한다. 발현은 효모 프로모터에 의해 유발되나, 발현된 서열은 hTRT 개시 및 종결 코돈을 이용한다. 클로닝에 의해 외래의 코돈은 도입하지 않았다. 생성된 pPICZ B/hTRT 벡터를 사용하여 효모를 형질전환시켰다.
피치아 파스토리스 발현 벡터 hTRT-His6/pPICZ B
pPICZ B에서 유래한 본 발명의 두 번째 피치아 파스토리스 발현 벡터는 또한 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 659 내지 4801에서 유래한 hTRT를 암호화하는 전길이의 서열을 포함한다. 이 hTRT-His6/pPICZ B 발현 벡터는 그 C-말단에서 Myc 에피토프 및 His6 리포터 표지 서열에 융합된 전길이의 hTRT 단백질을 암호화한다. hTRT 정지 코돈은 제거되고, 정지 코돈 뿐만 아니라 Myc 에피토프 및 His6 리포터 표지를 암호화하는 벡터 서열로 대체된다. 이 벡터는 효모에서 다음과 같은 융합 단백질(서열번호 140)의 고레벨의 유도 발현을 유발할 수 있도록 조작한 것으로서, 서열번호 140의 융합 단백질은 hTRT 서열(밑줄침), 벡터 서열([L] 및 [NSAVD]) 및 Myc 에피토프(이중으로 밑줄침) 및 His6 표지(이탤릭체)로 구성된다:
글루타치온 S-트랜스퍼라제 부분으로부터 재조합 단백질의 분리는 트롬빈을 사용한 부위 특이적 단백질 분해에 의해 제조자의 지시에 따라 수행하였다.
곤충 세포에서의 TRT의 발현
본 발명은 또한 전길이의 생물학적 활성 TRT를 다량으로 생산하는 TRT 텔로머라제 발현용 곤충 세포 발현 벡터를 제공한다.
바쿨로비루스 발현 벡터 pVL1393 및 전길이의 TRT
당해 TRT 암호 서열을 바쿨로비루스 발현 벡터 pVL1393(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)내로 클로닝하였다. 이 구성체는 이어서 오토그라파 캘리포니카 핵 다면증 비루스(바쿨로골드-AcMNPV)로부터 얻은 선형화된 DNA와 함께 스포돕테라 프루기페르다(sf-9) 세포내로 동시 형질감염시켰다. 얻어진 재조합 바쿨로비루스는 이어서 플라크 정제하고 다음과 같은 표준 프로토콜을 따라 증가시켰다.
이 발현 벡터는 고레벨의 전길이 TRT 단백질을 곤충 세포에서 발현시킨다. 발현은 바쿨로비루스 폴리헤드린 유전자 프로모터에 의해 유발된다. 클로닝에 의해 외래의 코돈은 도입시키지 않았다.
바쿨로비루스 발현 벡터 pBlueBacHis2 B 및 전길이 hTRT
전길이의 생물학적 활성 TRT를 다량으로 생산하기 위해, 바쿨로비루스 발현 벡터 pBlueBacHis2 B(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 제어 요소 공급원으로서 선택하였다. hTRT-암호 삽입체는 플라스미드 pGRN121에서 hTRT 삽입체(서열번호 117)의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되었다.
His6 및 항-Xpress 표지(인비트로겐)를 가진 전길이 hTRT도 구성하였다. 이 벡터는 또한 플라스미드 pGRN121로부터 유래한 hTRT 삽입체의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되는 삽입체를 포함한다. 이 벡터는 절단 가능한 6-히스티딘 및 항-Xpress 표지에 융합된 고레벨의 전길이 hTRT 단백질의 곤충 세포에서의 발현을 유도하는데, 융합 단백질의 아미노산 서열(서열번호 141)은 아래에 나타내며, 별표(*)는 엔테로키나제 절단 부위를 나타낸다:
바쿨로비루스 발현 벡터 pBlueBac4.5 및 전길이 hTRT 단백질
전길이의 생물학적 활성 TRT를 다량으로 생산하기 위해, 제2 바쿨로비루스 발현 벡터인 pBlueBac4.5(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 구성하였다. hTRT-암호 삽입체는 또한 플라스미드 pGRN121에서 유래한 hTRT(서열번호 117)의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되었다.
바쿨로비루스 발현 벡터 pMelBacB 및 전길이 TRT 단백질
전길이의 생물학적 활성 TRT를 다량으로 생산하기 위해, 제3 바쿨로비루스 발현 벡터인 pMelBacB(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 구성하였다. hTRT-암호 삽입체는 또한 플라스미드 pGRN121에서 유래한 hTRT의 뉴클레오티드 707 내지 4776으로 구성되었다.
pMelBacB는 멜리틴 신호 서열을 사용하여 분비 경로를 통해 세포외 배지로 곤충 세포에서의 전길이 TRT의 발현을 유도한다. 멜리틴 신호 서열은 분비시에 절단되나, 세포내에 잔존하는 단백질 푸울의 일부이다. 이러한 이유로, 그것은 다음 서열에서 괄호 안에 나타낸다. 이 벡터가 암호화하는 융합 단백질의 서열은 아래에 나타낸다(서열번호 142):
포유류 세포에서의 TRT의 발현
본 발명은 전술한 본 발명의 다수의 양태에 유용하고, 다양한 포유류 세포주에서 전길이의 생물학적 활성 단백질로서 다량으로 TRT를 생산하는 벡터를 제공한다.
MPSV-TRT 발현 플라스미드
본 발명은 또한 암호 서열을 실제로 변형시키지 않고(예컨대 코돈 용례를 최적화하여) 텔로머라제와 같은 재조합 단백질의 최대로 가능한 발현을 제공하고, 표유류 세포에 사용하기 위한 발현계를 제공한다. 한 가지 양태로, 본 발명은 본 발명의 TRT를 발현시킬 수 있는 MPSV 포유류 발현 플라스미드(문헌[Lin J-H(1994) Gene 47:287-292]에 기재된 계를 사용함)를 제공한다. MPSV 플라스미드는 안정한 클론 또는 일시적 클론으로서 발현될 수 있다.
상기 발현계에서는, hTRT 암호 서열 자체가 변화하지 않는 반면에, 외래의 전사 제어 요소를 벡터내로 도입시킨다. 골수 증식성 육종 비루스(MPSV) LTR(MPSV-LTR) 프로모터는 시토메칼로비루스(CMV) 인핸서에 의해 증폭되는 것으로 전자 개시를 위해 도입한다. 이 프로모터는 세포주에서 보다 높은 발현을 나타낸다(Lin J-H(1994)의 상기 문헌 참조). 코작 일치 서열은 해독 개시를 위해 도입할 수 있다(문헌[Kozak(1996) Mamm. Genome 7:563-574] 참조). 모든 이상 5' 및 3' 비해독 hTRT 서열을 제거하여 전술한 바와 같이 이들 서열이 발현을 방해하지 않도록 할 수 있다. 완전 hTRT 암호 서열을 포함하나, 모든 이상 서열은 제거된 MPSV 플라스미드는 pGRN133으로 명명되었다. 대조군인 hTRT "안티센스" 플라스미드도 구성하였다. 이 벡터는 TRT 삽입체가 hTRT의 안티센스 서열(벡터로서 사용될 수 있는 대조군 안티센스는 pGRN 134로 명명됨)인 것을 제외하고는 pGRN133과 동일하다
두 개의 선별 마커, 즉 PAC(퓨로마이신-N-아세틸-트랜스퍼라제= 퓨로마이신 내성) 및 HygB(하이그로마이신 B= 하이그로마이신 내성)는 형질감염후 플라스미드의선별을 위해 존재한다(상기에서 선별용 마커와 관련하여 언급함). 벡터 폴리링커의 양쪽에 마커를 사용하는 이중 선별은 hTRT 암호 서열의 안정성을 증가시킨다. 안정한 클론을 만든 후에 발현 카세트를 증폭시키기 위해서는 DHFR(디히드로폴레이트 리덕타제)을 암호화하는 서열이 포함된다. 유전자 증폭의 기타 수단을 사용하여 재조합 단백질 수율을 증가시킬 수도 있다.
본 발명은 또한 TRT 융합 단백질을 포함하는 MPSV 포유류 발현 플라스미드를 제공한다. 일 양태로, 그 5' 비해독 영역을 보유하는 TRT 서열은 IBI FLAG(코네티컷주 뉴 헤이븐 소재의 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(IBI), 코닥)과 같은 에피토프 플랙에 연결시키고, MPSV 발현 플라스미드(pGRN147로 명명됨))내로 삽입하였다. 이 구체적인 구성체는 코작 해독 개시 부위로 구성된다. 발현된 융합 단백질은 M-1 항-플랙 옥타펩티드 단일클론 항체(상기 IBI, 코닥)를 사용하여 정제할 수 있다.
또 다른 양태로, TRT는 부위 특이적으로 변화시킨다. 하나의 아미노산 잔기 코돈을 돌연변이시켜 위치 869의 아스파르트산을 알라닌으로 대체한다. 그 5' 비해독 영역을 보유하고 코작 서열을 포함하는 이러한 Asp869→Ala hTRT 돌연변이체를 MPSV 발현 플라스미드내로 삽입하고, pGRN146으로 명명하였다. Asp869→Ala hTRT 돌연변이체는 전술한 바와 같이 FLAG 서열 및 MPSV 발현 플라스미드내로 클로닝된 삽입체를 포함하도록 추가로 조작하였다. 이 발현 플라스미드는 pGRN154로 명명하였다. 구체적으로, pGRN154의 경우, hTRT의 코작 서열 포함 "전단"(5'분절)을 포함한 pGRN146에서 유래한 Eam1105I 제한 효소 처리 단편을 pGRN147(상기 참조)의 Eam1105I 부위내로 클로닝하여 코작 서열, 상기 D869→A 돌연변이 및 IBI 플랙을 가진 hTRT를 발현시킬 수 있는 MPSV 발현 플라스미드를 제조하였다.
본 발명의 또 다른 양태는 pGRN146에서 유래한 발현 플라스미드이다. pGRN152로 명명된 포유류의 발현 플라스미드는 플라스미드 pGRN146(포유류 세포에서 TRT ORF를 포함)으로부터 EcoRI 단편을 절제하여 생성시키고, pBBS212의 EcoRI 부위내로 클로닝하여 hTRT의 5'UTR을 제거하였다. hTRT는 그 발현이 MPSV 프로모터에 의해 제어되도록 배향된다. 이 과정은 코작 일치 서열 및 D869→A 돌연변이를 가진 hTRT를 발현시키고, MPSV 프로모터를 사용하는 포유류 발현 플라스미드를 제조한다.
본 발명은 TRT 암호 서열이 MPSV 프로모터에 의해 구동되도록 TRT가 배향된 포유류 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, hTRT 개방형 해독틀(ORF)을 포함하는 pGRN137에서 유래한 EcoR1 제한 효소 처리 단편을 pBBS212(하기 참조)의 EcoR1 부위내로 클로닝하여 hTRT의 5' 비해독 영역(5'-UTR)을 제거하였다. pGRN137은 pGRN136의 Sal 1-SSE 8387I 부위내로 hTRT의 코작 돌연변이를 포함하는 후술하는 바와 같은 pGRN130으로부터 SalI-Sse8387I 단편을 절제하여, MPSV 프로모터로부터 코작 일치 서열을 포함하는 hTRT를 발현시키는 포유류 발현 플라스미드를 형성하도록 구성하였다. 플라스미드 pGRN136은 hTRT ORF를 포함하는 pGRN126으로부터 HindIII SalI 단편을 절제하고, 그것을 플라스미드 pBBS242의 HindIII SalI 부위내로 클로닝하여, MPSV 프로모터로부터 hTRT를 발현시키는 포유류 발현 플라스미드를 형성하도록 구성하였다. 이러한 과정은 MPSV 프로모터를 사용하여 코작 일치 서열을 가진 hTRT를 발현시키는 pGRN145로 명명된 포유류 발현 플라스미드를 제조한다. 또한 후술하는 pGRN152 MPSV 프로모터에 의해 유발되는 포유류 발현 벡터를 참조할 수 있다.
에피좀 벡터 pEBVHis를 사용하는 293 세포에서의 TRT 발현
에피좀 벡터 pEBVHis(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)를 조작하여 N-말단 연장 에피토프 표지, Xpress 에피토프(캘리포니아 샌 디에고 소재의 인비트로겐)(pGRN122로 명명됨)에 융합된 hTRT를 포함하는 TRT 융합 단백질을 발현시켰다. hTRT ORF를 포함하는 pGRN121로부터 얻은 NotI hTRT 단편을 hTRT ORF가 벡터의 로우스 육종 비루스(RSV) 프로모터와 동일한 방향으로 존재하도록 pEBVHisA의 NotI 부위내로 클로닝하였다. 이 방향으로 His6 플랙은 hTRT의 N-말단에 상대적으로 더 가까웠다.
삽입체로서 TRT 및 에피토프 표지의 안티센스 서열을 포함하는 벡터(대조군으로 사용할 수 있는 pGRN123으로 명명된 플라스미드)도 구성되었다. 이 벡터를 293 세포내로 형질감염시키고, Xpress 에피토프에 특이적인 항체를 사용하여 동정되고 분리되는 hTRT를 해독하였다. pEBVHis는 N-말단 펩티드에 융합된 당해 단백질을 발현시키는 하이그로마이신 내성 EBV 에피좀 벡터이다. 이 벡터를 보유하는 세포를 선별하고, 세포수를 증가시킨 다음, 핵 및 세포질 추출물을 준비하였다. 이들 추출물 및 대조군 추출물은 Xpress 항체로 면역 침전시키고, 면역 침전된 비드는 통상의 분석법으로 텔로머라제 활성에 대해 시험하였다.
사멸성의 정상 이배체 인간 세포에서의 재조합 TRT의 발현
본 발명의 일 양태로, 재조합 TRT 및 필요한 텔로머라제 효소 복합체 성분은 정상의 이배체의 사멸성 세포에서 발현되어 그 증식능을 증가시키거나 또는 이 세포들을 불멸화하거나 또는 이 세포들의 불멸화를 촉진할 수 있다. 이로써, 다른 정상의 표현형 및 핵형을 가진 이배체 불멸성 세포를 얻을 수 있다. 전술한 바와 같이, 텔로머라제의 이러한 사용은 엄청난 상업적 용도를 가진다.
센스 hTRT(도 16) 및 안티센스 hTRT를 CMV 벡터내로 클로닝하였다. 이들 벡터를 정제하고, 두 개의 정상의 사멸성 이배체 인간 세포 클론내로 일시적으로 형질감염시켰다. 인간 클론은 어린 계대 이배체 인간 BJ 및 IMR90 세포 계통이었다.
트래피즈(상표명) 키트(매릴랜드주 게이더스버그 소재의 온코르 인코포레이티드)를 이용하는 트랩(TRAP) 분석법을 사용하는 텔로머라제 활성의 분석으로부터 센스 hTRT의 형질감염(안티센스 hTRT의 경우는 아님)은 BJ 및 IMR90 세포 계통에서 둘다 텔로머라제 활성을 생성시켰음을 알 수 있다.
불멸화된 IMR90 인간 세포에서의 재조합 TRT의 발현
전술한 이배체 인간 BJ 및 IMR90 세포 계통 연구에 사용된 CMV 벡터내로 클로닝된 동일한 TRT 센스 구성체를 사용하여, 불멸화된 SW13 ALT 경로의 세포주(SV40 항원으로 불멸화된 IMR90 세포)는 일시적으로 전사되었다. 트랩 분석(트래피즈, 매릴랜드주 게이더스버그 소재의 온코르 인코포레이티드)은 텔로머라제 활성이 센스 구성체 형질감염된 세포에서 생성되었음을 입증하였다.
포유류 세포에서의 hTRT의 조절 발현용 벡터: hTRT의 유도성 및 억제성 발현
본 발명은 hTRT와 같은 본 발명의 TRT의 발현을 유도 또는 억제하도록 조작될 수 있는 벡터를 제공한다. 예를 들면, hTRT 암호 서열은 인비트로겐(캘리포니아주 샌 디에고)의 엑디손-유도성 발현계 및 클론테크 래보러토리즈 인코포레이티드(캘리포니아주 팔로 알토)의 테트-온(Tet-On) 및 테트-오프(Tet-Off) 테트라사이클린 조절되는 계내로 클로닝할 수 있다. 그러한 유도성 발현계는 형질감염된 TRT의 전사 레벨 또는 전사 속도를 제어하는 것이 중요한 경우에 본 발명의 방법에 사용하기 위해 제공된다. 예를 들면, 본 발명은 TRT의 발현을 통해 불멸화된 세포주를 제공하는데; 그러한 세포는 테트-오프계에 의해 제공되는 것들과 같은 전사 제어를 통해 벡터에 의한 TRT 발현의 저해에 의해 "사멸성"으로 될 수 있다. 본 발명은 또한 전술한 바와 같이 형질감염된 세포의 원치 않는 "불멸화"를 초래할 수 있는 TRT의 연속 발현을 피하기 위해 일시적으로만 TRT를 발현시키는 방법을 제공한다.
엑디손-유도성 포유류 발현계는 포유류 세포에서 당해 유전자의 조절된 발현을 허용하도록 조작된다. 이 계는 검출 가능한 기본 발현을 거의 허용하지 않으며, 포유류 세포에서보다 200배 이상의 유도능을 허용한다. 발현계는 초파리의 이종이량체 엑디손 수용체에 근거한다. 엑디손-유도성 발현계는 스테로이드 호르몬 엑디손 유사체인 뮤리스테론 A를 사용하여 이종 이량체의 핵 수용체를 통해 TRT의 발현을 활성화한다. 발현 레벨은 포유류 세포 생리학에 영향이 없는 기본 레벨에 비해 200배를 초과하는 것으로 보고되었다("Ecdysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cells and Transgenic Mice"(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351). 수용체가 엑디손 또는 엑디손의 유사체인 뮤리스테론에 일단 결합하면, 수용체는 당해 유전자의 제어된 발현을 얻기 위해 엑디손-반응성 프로모터를 활성화한다. 엑디손-유도성 포유류 발현계에서, 이종 이량체 수용체의 두 단량체는 동일한 벡터인 pVgRXR로부터 연속적으로 발현된다. 엑디손-반응성 프로모터는 당해 유전자의 발현을 궁극적으로 유발하는 것으로서 제2 벡터인 pIND상에 위치하여 당해 유전자의 전사를 유발한다.
TRT 암호 서열은 pIND 벡터(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크 래보러토리즈 인코포레이티드)에서 클로닝하는데, 이 벡터는 최소 열충격 프로모터 및 다수의 클로닝 부위 상류의 5개의 변형된 엑디손 반응 요소(E/GRE)를 포함한다. 구성체는 엑디손 수용체를 안정하게 발현시키도록 사전 조작된 세포주에서 형질감염된다. 형질감염후, 세포를 뮤리스테론 A로 처리하여 pIND로부터 세포내 발현을 유도한다.
테트-온 및 테트-오프 발현계(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크)는 조절되는 고레벨의 유전자 발현계의 수단이 되는데, 참고 문헌으로는 테트-오프 전사 억제계에 대해서는 문헌[Gossen(1992) "Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551]; 및 테트-온 유도성 전사계에 대해서는 문헌[Gossen(1995) "Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells" Science 268:1766-1769]이 있다. "테트-오프" 형질전환 세포주에서, 유전자 발현은 테트라사이클린(Tc) 또는 독시사이클린("Dox"; Tc 유도체)이 배양 배지로부터 제거될 때 개시된다. 대조적으로, 테트-온 세포주에서는 배지에 Tc 또는 Dox를 첨가하면 개시된다, 두 계는 클로닝된 유전자의 발현이 다양한 농도의 Tc 또는 Dox에 반응하여 세밀하게 조절되도록 한다.
이 계는 당해 유전자를 발현시키는 데 사용될 수 있는 반응 플라스미드로서 "pTRE"를 사용한다. 플라스미드 pTRE는 Tet-반응성 PhCMV*-1 프로모터의 바로 하류에 다수의 클로닝 부위(MCS)를 포함한다. MCS의 부위중의 하나에 삽입된 당해 유전자 또는 cDNA는 테트-오프 및 테트-온계에서 각각 tTA 및 rtTA 조절 단백질에 반응할 것이다. PhCMV*-1은 테트-반응성 요소(TRE)를 포함하며, 이 요소는 42 bp의 tet 오퍼레이터 서열(tetO)의 7개 사본으로 구성되어 있다. TRE 요소는 최소 CMV 프로모터(PminCMV)의 바로 상류에 존재하는데, 이것은 pTet 플라스미드에서 완전 CMV 프로모터의 일부인 인핸서가 결핍되어 있다. 결국, PhCMV*-1은 tetO 서열에 조절 단백질의 결합이 부재하는 경우에는 침묵성이다. 클로닝된 삽입체는 개시 코돈을 가져야 한다. 일부 경우에는, 코작 일치 리보좀 결합 부위의 첨가가 발현 레벨을 향상시킬 수 있으나, 다수의 cDNA는 코작 서열을 첨가하지 않고 Tet 계에서 효율적으로 발현되었다. pTRE-유전자 X 플라스미드는 안정한 형질감염체를 선별할 수 있게 하는 pTK-Hyg로 동시 형질감염된다.
테트-오프 또는 테트-온 발현계의 확립에는 일반적으로 TRE의 제어하에 적당한 조절 단백질 및 TRT를 암호화하는 유전자의 통합된 사본을 포함하는 "이중 안정성" 세포주를 생성시키기 위해 두 번의 연속적인 안정한 형질감염이 필요하다. 첫 번째 형질감염에서는 적당한 조절 단백질을 발현시키는 pTet-Off 또는 pTet-On 벡터와 같은 "조절 플라스미드"의 형질감염에 의해 선택되는 세포주내로 적당한 조절 단백질이 도입된다. 그 다음, pTRE "반응 플라스미드"에서 클로닝된 hTRT는 제2 형질감염에서 도입되어 이중 안정성 테트-오프 또는 테트-온 세포주를 생성시킨다. 두 계는 유전자 발현, 조절되는 용량 의존적 유도 및 높은 절대 레벨의 유전자 발현의 매우 세밀한 온/오프 제어를 제공한다.
DHFR 및 아데노비루스 서열을 가진 재조합 TRT의 발현
pGRN155 플라스미드 구성체는 포유류 세포에서 hTRT cDNA를 일시적으로 발현시키도록 조작하였다. 코작 일치 서열은 hTRT 서열의 5' 말단에 삽입한다. hTRT 삽입체는 3' 또는 5' UTR을 포함한다. hTRT cDNA는 p91023(B)(Wong(1985) Science 228:810-815)의 EcoRI 부위내로 삽입한다. hTRT 삽입체는 DHFR ORF와 동일한 방향으로 삽입된다. 이로써, 일시적 발현에 특히 유용한 발현 벡터가 제조된다.
플라스미드 pGRN155는 아데노비루스 프로모터의 바로 상류의 SV40 기원 및 인핸서, 테트라사이클린 내성 유전자, 이.콜리 기원 및 아데노비루스 VAI 및 VAII 유전자 영역을 포함한다. 이 발현 카세트는 다음 순서로 아데노비루스 주요 후기 프로모터; 아데노비루스 3부분 리더; 3부분 리더의 첫 번째 엑손에서 유래한 5' 스플라이스 부위 및 마우스 임뮤노글로불린 유전자에서 유래한 3' 스플라이스 부위로 구성되는 하이브리드 인트론; hTRT cDNA; 마우스 DHFR 암호 서열; 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
아데노비루스 3부분 리더 및 VA RNA는 폴리시스트론 mRNA가 해독되는 효율을 증가시키는 것으로 보고되었다. DHFR 서열은 하이브리드 mRNA의 안정성을 향상시키는 것으로 보고되었다. DHFR 서열은 또한 선별용 마커 및 벡터 서열의 증폭을 제공할 수 있다. 문헌[Logan(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655); Kaufman (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689; and Kaufman (1988) Focus (Life Technologies, Inc.), Vol.10, no. 3)] 참조.
예시 목적으로 기재하는 본 발명의 다른 발현 플라스미드
pGRN121
hTRT 단백질을 암호화하는 전체 cDNA를 포함하는 람다 클론 25-1.1.6으로부터 얻은 EcoRI 단편을 cDNA의 5' 말단이 벡터내 T7 프로모터 근처에 위치하도록 p블루스크립트IISK+의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN122
hTRT ORF를 포함하는 pGRN121로부터 얻은 NotI 단편을 암호 서열이 RSV 프로모터에 작동 가능하게 연결되도록 pEBVHisA의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린 또는 하이그로마이신이다.
pGRN123
hTRT ORF를 포함하는 pGRN121로부터 얻은 NotI 단편을 암호 서열이 RSV 프로모터와 반대 방향으로 위치하여 안티센스 hTRT를 발현시키도록 pEBVHisA의 NotI 부위내로 삽입하였다.
pGRN124
플라스미드 pGRN121에서 모든 ApaI 부위를 결실시킨 다음, 3'UTR을 포함하는 MscI-HincII 단편을 결실시켰다. hTRT 암호 서열의 정지 코돈을 포함하는 Nco-XbaI 단편을 pGRN121의 Nco-XbaI 부위내로 삽입하여 3'UTR이 결핍된 것을 제외하고는 pGRN121과 동등한 플라스미드를 제조하였는데, 이것은 일부 세포에서의 증가된 발현 레벨에 바람직할 수 있다.
pGRN125
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN124로부터 얻은 NotI 단편을 개방형 해독틀이 Lac 프로모터의 반대 방향으로 위치하도록 pBBS235의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 클로람페니콜이다.
pGRN126
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN124로부터 얻은 NotI 단편을 삽입된 hTRT 암호 서열이 Lac 프로모터와 동일한 방향으로 위치하도록 pBBS235의 NotI 부위내로 삽입하였다.
pGRN127
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 pGRN125의 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT 암호 서열의 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3' (서열번호 143). 또한, 올리고뉴클레오티드 COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR(암피실린 내성)로 전환시키고, 올리고뉴클레오티드 COD1941을 사용하여 CatR(클로람페니콜 내성)을 CatS(클로람페니콜 민감성)으로 전환시켰다.
pGRN128
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT의 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3' (서열번호 144).
또한, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 C-말단에 IBI 플랙(코네티컷주 뉴 헤이븐 소재의 인터내쇼날 바이오케크놀로지스 인코포레이티드(IBI), 코닥)을 삽입하고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCG GCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3' (서열번호 145).
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 CatS로 전환시켰다.
pGRN129
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 Asp869를 Ala 코돈으로 전환시켰다(즉, DD 모티프의 두 번째 Asp를 알라닌으로 전환시켜 우성/음성 hTRT 돌연변이체를 생성시켰다):
5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3' (서열번호 146).
이것은 또한 MluI 부위를 생성시켰다.
또한, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 C-말단에 IBI 플랙을 삽입하고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGG
CCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3' (서열번호 147).
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 CatS로 전환시켰다.
pGRN130
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 Asp869 코돈을 Ala 코돈으로 전환시켰다(즉, DD 모티프의 두 번째 Asp를 알라닌으로 전환시켜 우성/음성 변형체 단백질을 생성시켰다):
5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3' (서열번호 148).
이것은 또한 MluI 부위를 생성시켰다.
또한, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT 암호 서열의 개시 ATG 코돈을 코작 일치 서열로 전환시키고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3' (서열번호 149).
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 전환시켰다.
pGRN131
코작 서열 및 IBI 플랙 돌연변이와 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN128로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT ORF가 MPSV 프로모터로부터 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 플라스미드 pBSS212는 MPSV 프로모터, CMV 인핸서 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
pGRN132
코작 서열 및 IBI 플랙 돌연변이와 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN128로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT ORF의 안티센스가 MPSV 프로모터로부터 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다.
pGRN133
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN121로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT 단백질이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다.
pGRN134
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN121로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT 암호 서열의 안티센스가 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN135
플라스미드 pGRN126을 MscI 및 SmaI로 완전히 처리하고, 삽입된 hTRT 암호 서열의 95% 이상이 결실되도록 재결찰하였다. 이 과정중에 하나의 SmaI-MscI 단편을 재삽입하여 선별을 위해 Cat 활성을 재생시켰다. 이 정제되지 않은 플라스미드를 SalI 및 EcoRI로 재처리하고, hTRT 암호 서열의 개시 코돈을 포함하는 단편을 pBBS212의 SalI-EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이로써, 암호 서열의 73개 염기 및 5'UTR의 안티센스를 발현시키는 안티센스 발현 플라스미드를 제조한다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN136
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN126으로부터 얻은 HindIII-SalI 단편을 pBBS242의 HindIII-SalI 부위내로 삽입하였다.
pGRN137
코작 서열을 포함하는 pGRN130으로부터 얻은 SalI-Sse8387I 단편을 pGRN136의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다.
pGRN138
3'UTR이 제외된 hTRT를 포함하는 pGRN124로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT의 방향이 EGFP 도메인과 동일하도록 pEGFP-C2의 EcoRI 부위내로 삽입하였다.
pGRN139
다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pGRN125의 hTRT의 C-말단에 IBI 플랙을 삽입하고, 클로닝을 위해 EcoRI 및 BglII 부위를 생성시켰다:
5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGG
CCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3' (서열번호 150).
또한, COD2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 전환시키고, COD1941을 사용하여 CatR을 CatS로 전환시켰다.
pGRN140
람다G55로부터 얻은 hTRT의 첫 번째 인트론 및 게놈 hTRT의 상류 서열을 포함하는 NcoI 단편을 pBBS167의 NcoI 부위내로 삽입하였다. 단편은 hTRT가 Lac 프로모터와 동일한 방향으로 위치하도록 배향된다.
pGRN141
람다G55로부터 얻은 hTRT의 첫 번째 인트론 및 게놈 hTRT의 상류 서열을 포함하는 NcoI 단편을 pBBS167의 NcoI 부위내로 삽입하였다. 단편은 hTRT가 Lac 프로모터와 반대 방향으로 위치하도록 배향된다.
pGRN142
이 벡터는 이.콜리에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 람다 GN5(lac 배향)로부터 얻은 프로모터 클론을 사용하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다. hTRT 유전자 프로모터 영역을 포함하는 완전한 ~15 kbp의 게놈 삽입체를 보유한 람다Gphi5로부터 얻은 NotI 단편을 플라스미드 pBBS185의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 단편은 hTRT ORF가 Lac 프로모터와 반대 방향으로 위치하도록 배향된다.
pGRN143
이 벡터는 이.콜리에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. hTRT 유전자 프로모터 영역을 포함하는 완전한 ~15 kbp의 게놈 삽입체를 보유한 람다Gphi5로부터 얻은 NotI 단편을 플라스미드 pBBS185의 NotI 부위내로 삽입하였다. 이 단편은 hTRT ORF가 Lac 프로모터와 동일한 방향으로 위치하도록 배향된다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN144
람다 서열을 제거하기 위한 pGRN140의 SAL1 결실
pGRN145
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN137로부터 얻은 EcoRI 단편을 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하여 hTRT mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열의 일부를 제거하였다. hTRT 암호 서열은 이것이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 배향된다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN146
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT의 D869A 돌연변이를 포함하는 pGRN130으로부터 얻은 Sse8387I-NotI 단편을 pGRN137의 Sse8387I-NotI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/HygB/PAC이다.
pGRN147
IBI 플랙을 포함하는 pGRN139로부터 얻은 Sse8387I-NotI 단편을 pGRN137의 Sse8387I-NotI 부위내로 삽입하였다.
pGRN148
hTRT의 프로모터 영역을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 BflII-Eco47III 단편을 pSESP2의 BglII-NruI 부위내로 삽입하여 hTRT 프로모터/리포터 구성체를 제조하였다.
pGRN149
이 벡터는 이.콜리에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 돌연변이된 올리고 5'-cttcaagaccatcctggactttcgaaacgcggccgccaccgcggtggagctc c-3'을 사용하여 pGRN125의 시험관내 돌연변이 유발에서 hTRT의 C-말단의 CSP45I 부위에 첨가하였다. hTRT의 "정지" 코돈을 결실시키고, Csp45I 부위로 대체하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN150
hTRT의 프로모터 영역을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 BglII-FspI 단편을 pSEAP2의 BglII-NruI 부위내로 삽입하여 hTRT 프로모터/리포터 구성체를 제조하였다.
pGRN151
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN147로부터 얻은 EcoRI 단편을 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하여 hTRT mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열의 일부를 제거하였다. hTRT 암호 서열은 이것이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 배향된다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/HygB/PAC이다.
pGRN152
hTRT 암호 서열을 포함하는 pGRN146으로부터 얻은 EcoRI 단편을 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하여 hTRT의 5'UTR에 상응하는 서열의 일부를 제거하였다. hTRT 암호 서열은 이것이 MPSV 프로모터의 제어하에 발현되도록 배향된다.
pGRN153
hTRT의 D869→A 돌연변이(hTRT 변형체 암호 서열)를 포함하는 pGRN130으로부터 얻은 StyI 단편을 pGRN158의 StyI 부위내로 삽입하여 그 5'-말단에 코작 일치 서열, 그 3'-말단(C-말단 암호 영역)에 IBI 플랙 서열, 및 D869→A 돌연변이를 가진 hTRT 암호 서열을 포함하는 플라스미드를 제조하였다.
pGRN154
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. hTRT 유전자를 포함하는 pGRN153의 EcoRI 단편을 hTRT ORF가 MPSV 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 플라스미드 pBBS212의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이로써, 그 아미노 말단에 코작 일치 서열, 그 카르복시 말단에 IBI 플랙 서열, 및 D869→A 돌연변이를 가진 hTRT 단백질을 발현시키는 MPSV-유도된 발현 플라스미드를 제조하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/HygB/PAC이다.
pGRN155
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, 및 코작 서열을 포함하였다. 코작 일치 서열을 보유하고 3' 또는 5' UTR을 보유하지 않는 hTRT cDNA를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 DHFR ORF와 동일한 방향으로 배향되도록 p91023(B)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이로써, hTRT에 대한 일시적 발현 벡터를 제조하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 테트라사이클린이다.
pGRN156
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 코작 일치 서열을 보유하고 3' 또는 5' UTR을 보유하지 않는 hTRT cDNA의 D869A 돌연변이를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 DHFR ORF와 동일한 방향으로 배향되도록 p91023(B)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 테트라사이클린이다.
pGRN157
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. C-말단에 IBI 플랙과 함께 코작 일치 서열을 보유하고 3' 또는 5' UTR을 보유하지 않는 hTRT cDNA를 포함하는 pGRN147로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 DHFR ORF와 동일한 방향으로 배향되도록 p91023(B)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, IBI 플랙 서열 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 테트라사이클린이다.
pGRN158
이 벡터는 이.콜리 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. hTRT ORF를 포함하는 pGRN151로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 Lac 프로모터와 반대 방향으로 배향되도록 pBBS183의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 전길이의 cDNA, IBI 플랙 서열 및 코작 서열을 포함하였다. hTRT 암호 서열은 T7 프로모터에 의해 작동되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN159
이 벡터는 이.콜리 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. hTRT 융합체에 대한 EGFP를 포함하는 pGRN138로부터 얻은 NheI-KpnI 단편을 p블루스크립트IIKS+의 XbaI-KpnI 부위내로 삽입하였다. 이로써, 융합 단백질에 대한 T7 발현 벡터가 제조되었다(암호 서열은 T7 프로모터에 의해 작동된다). 이 삽입체는 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA를 EGFP와의 융합 단백질로서 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN160
이 벡터는 포유류 세포에서 안티센스 hTR 서열의 발현을 위해 구성하였다. 암호 서열은 MPSV 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 전길이의 hTRT ORF를 포함하는 pGRN90으로부터 얻은 XhoI-NsiI 단편을 pBBS295의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다. 이로써, hTR 안티센스 RNA를 발현시키는 일시적/안정한 벡터가 제조되었다. GPT 마커가 벡터내로 도입되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/gpt/PAC이다.
pGRN161
이 벡터는 포유류 세포에서 센스 hTR 서열의 발현을 위해 구성하였다. 전길이의 hTRT ORF를 포함하는 pGRN89로부터 얻은 XhoI-NniI 단편을 pBBS295의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다. 이로써, hTR을 센스 방향으로 발현시키는 일시적/안정한 벡터가 제조되었다. 암호 서열은 MPSV 프로모터에 의해 작동된다. GPT 마커가 벡터내로 도입되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 Chlor/gpt/PAC이다.
pGRN162
전길이의 hTRT ORF를 포함하는 pGRN87로부터 얻은 XhoI-NsiI 단편을 pBBS295의 SalI-Sse8387I 부위내로 삽입하였다. 이로써, 절두된 hTR(위치 +108로부터 +435)을 센스 방향으로 발현시키는 일시적/안정한 벡터가 제조되었다.
pGRN163
이 벡터는 이.콜리 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 암호 서열은 T7 프로모터에 의해 작동된다. 올리고뉴클레오티드 RA45(5'-GCCACCCCCGCGCTGCCTCGAGCTCCCCGCTGC-3') (서열번호 151)를 시험관내 돌연변이 유발에 사용하여 hTRT의 개시 met를 Leu로 변화시키고, Leu 다음의 두 개 코돈에 XhoI 부위를 도입시켰다. 또한 COD 1941을 사용하여 CatR을 CatS로 변화시키고, BSPH1 부위를 도입시키며, COD 2866을 사용하여 AmpS를 AmpR로 변화시켜 FSP1 부위를 도입시켰다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN164
이 벡터는 이.콜리 세포에서 센스 hTR 서열의 발현을 위해 구성하였다. 프라이머 hTR+1 5'-GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3' 및 hTR+45 5'-CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGG-3' (서열번호 152)을 사용하여 5' 말단에 T7 프로모터를 보유한 전길이의 hTR을 포함하는 pGRN33으로부터 얻은 단편을 PCR로 증폭시켰다(hTR+1에서처럼). PCR 생성물의 BamHI-HindIII 처리물을 pUC119의 BamHI-HindIII 부위내로 삽입하였다. 암호 서열은 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN165
이 벡터는 이.콜리에서 hTRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 암호 서열은 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 코작 전단부와 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 T7 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 p블루스크립트IISK+의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN166
이 벡터는 포유류 세포에서 TRT 서열의 발현 및 돌연변이 유발을 위해 구성하였다. 암호 서열은 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 후단부에 코작 전단부 및 IBI 플랙과 함께 hTRT ORF를 포함하는 pGRN151로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT ORF가 T7 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 p블루스크립트IISK+의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA, 플랙 서열(워싱턴주 시애틀 소재의 임뮤넥스 코포레이션) 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN167
hTRT ORF의 5' 말단을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 AvRII-StuI 단편을 pBBS161의 XbaI-StuI 부위내로 삽입하였다.
pGRN168
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 최적화된 hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT 암호 서열이 미니CMV 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 pIND의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/네오마이신/카나마이신이다.
pGRN169
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 최적화된 hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 미니CMV 프로모터와 역방향으로 배향되도록 pIND의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. hTRT는 인비트로겐으로부터 입수한 엑디손-유도성 발현계내로 클로닝하였다. 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/네오마이신/카나마이신이다.
pGRN170
이 벡터는 포유류 세포에서 안티센스 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였다. 최적화된 hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 미니CMV 프로모터와 반대 방향으로 배향되도록 pIND(sp1)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. hTRT는 pIND(sp1) 서열을 사용하여 인비트로겐으로부터 입수한 엑디손-유도성 발현계내로 클로닝하였다. 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 hTRT의 전길이의 cDNA 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/네오마이신/카나마이신이다.
pGRN171
pGRN163로부터 얻은 Eco47III-NarI 단편을 pGRN167의 Eco47III-NarI 부위내로 삽입하여 hTRT 게놈 DNA의 단편내로 M1L 돌연변이를 도입시켰다.
pGRN172
hTRT ORF에 Met→Leu 돌연변이를 포함하는 pGRN171로부터 얻은 BamHI-StuI 단편을 pSEAP2-Basic의 BglII-NruI 부위내로 삽입하였다.
pGRN173
이 벡터는 TRT 서열의 전사 활성을 분석하기 위해 구성하였는데; 구체적으로 이 벡터는 첫 번째 hTRT 인트론이 프로모터 활성을 가지는지 여부를 측정하기 위한 인트론 구성체이다. hTRT 프로모터 영역의 5' 말단을 포함하는 pGRN144로부터 얻은 EcoRV-ECO47III 단편을 pGRN172의 SrfI-Eco47III 부위내로 삽입하였다. 이로써, Met→Leu 돌연변이와 함께, hTRT ORF의 개시부에서 약 2.3 kb 상류로부터 암호 영역의 첫 번째 인트론 바로 다음까지의 hTRT의 프로모터 영역을 포함하는 프로모터 리포터 플라스미드를 제조하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린이다.
pGRN174
이 벡터는 포유류 세포에서 hTRT 서열의 발현을 위해 구성하였고, 유도성 hTRT 발현 벡터이다. "최적화된" hTRT 발현 카세트를 포함하는 pGRN145로부터 얻은 EcoRI 단편을 hTRT가 미니CMV 프로모터와 동일한 방향으로 배향되도록 pIND(sp1)의 EcoRI 부위내로 삽입하였다. 이로써, hTRT ORF의 개시부에서 약 2.3 kb 상류로부터 암호 영역의 첫 번째 인트론 바로 다음까지의 hTRT 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 프로모터 리포터 플라스미드를 제조하였다. 삽입체는 5' 및 3' UTR이 없는 전길이의 cDNA 및 코작 서열을 포함하였다. 이 벡터와 함께 사용되는 선별용 마커는 앰피실린/네오마이신/카나마이신이다.
상기 설명으로부터, 본 발명은 핵산 및 아미노산 서열 뿐만 아니라, 텔로머라제, 텔로머라제 단백질 서브유닛 및 다양한 생물에서 얻은 모티프와 관련한 기타 정보, 또한 본원에 개시한 사항 외에도 기타 생물에서 상동성 구조의 동정 방법을 제공한다는 것이 명백하다.
상기 명세서에 언급된 모든 공개문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용한 것이다. 당업자라면 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 전술한 방법 및 계의 다양한 개조예 및 변형예를 실시할 수 있을 것이다. 본 발명을 구체적인 바람직한 양태와 관련하여 설명하였지만, 본원에 청구하는 발명은 그러한 구체적인 양태로 부당하게 제한되어서는 아니됨을 이해하여야 한다. 실제로, 본 발명을 실시하는 상기 방법들의 다양한 개조예는 분자 생물학 또는 기타 관련 분야의 당업자에게는 자명한 사항으로서, 하기 특허 청구의 범위내에 포함되는 것이다.

Claims (105)

  1. TRT 단백질 또는 그 변형체 또는 이들의 단편의 분리된 실질적으로 순수한 또는 재조합 단백질 제제.
  2. 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시한 서열을 가진 TRT 단백질과 75% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 실질적으로 순수한 또는 재조합 TRT 단백질 또는 그 변형체 또는 이들의 단편.
  3. (i) 계산된 분자량이 약 50 내지 150 kDa이고, (ii) (a) 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시한 서열을 가진 단백질 또는 그 면역원성 단편에 대해 형성된 항체에 특이적으로 결합하거나, 또는 (b) 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시한 서열을 가진 단백질과 60%의 아미노산 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 TRT 단백질 또는 그 변형체 또는 이들의 단편.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시한 서열을 가진 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 변형체 또는 이들의 단편.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, TRT 단백질이 재조합 수단 또는 합성 수단에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 TRT 단백질.
  6. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, TRT 단백질이 서열번호 1, 3, 19, 53, 62, 66 또는 69에 특이적으로 하이브리드되는 핵산 분자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 TRT 단백질.
  7. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질, 변형체 또는 단편이 텔로머라제 촉매 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 TRT 단백질.
  8. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질, 변형체 또는 단편이 텔로머라제 촉매 활성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 TRT 단백질.
  9. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노산 잔기가 6개 이상인 것을 특징으로 하는 TRT 단백질 단편.
  10. TRT 단백질 또는 그 변형체 또는 이들의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 실질적으로 순수한 합성 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  11. (a) 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시한 서열을 가진 DNA; (b) 이 DNA에 하이브리드되고 TRT 단백질 또는 변형체를 암호화하는 10개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드; (c) 폴리뉴클레오티드 (a) 또는 (b)가 암호화하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 가진 DNA 중에서 선택되는 분리된 실질적으로 순수한 합성 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  12. (i) 계산된 분자량이 약 50 내지 150 kDa이고, (ii) (a) TRT 단백질 또는 그 면역원성 단편에 대해 형성된 항체에 특이적으로 결합하거나, 또는 (b) TRT 단백질과 60% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 보유하는 것으로 정의되는 TRT 단백질을 암호화하는 분리된 핵산.
  13. 제10항 내지 제12항중 어느 하나의 항에 있어서, TRT 단백질이 유플로테스 (Euplotes), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 테트라히메나 (Tetrahymena), 옥시트리키아(Oxitrichia), 마우스 또는 포유류에서 기원한 것인 분리된 핵산.
  14. 제10항 내지 제12항중 어느 하나의 항에 있어서, 암호화된 텔로머라제 역전사 효소 단백질의 계산된 분자량이 약 123 내지 127 kDa인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  15. 제10항 내지 제12항중 어느 하나의 항에 있어서, 암호화된 TRT 단백질이 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68의 서열을 포함하는 TRT 단백질과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  16. 엄중 조건하에 서열번호 1, 3, 19, 53, 62, 66 또는 69의 서열에 특이적으로 하이브리드되는 분리된 핵산.
  17. 단백질 또는 그 면역원성 단편에 대해 유도된 항체에 특이적으로 결합하고 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 단백질을 암호화하는 분리된 핵산.
  18. 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 TRT의 약 5개 이상의 인접 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 또는 그 변형체.
  19. 제10항 내지 제18항중 어느 하나의 항에 따른 핵산 서열을 가지는 발현 벡터.
  20. 제10항 내지 제19항중 어느 하나의 항에 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  21. TRT 단백질 암호화 핵산의 10개 이상의 뉴클레오티드를 암호화하는 이종성 유전자를 보유하는 형질감염된 세포.
  22. 엄중 조건하에 제10항 내지 제18항중 어느 하나의 항에 따른 핵산에 특이적으로 하이브리드되는 외래의 핵산 서열이 도입되어 외래의 핵산을 TRT 단백질로서 발현시키는 형질감염된 세포.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 형질감염된 세포가 사멸성이고 핵형이 정상적인 이배체 세포인 형질감염된 세포.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 세포가 박테리아, 곤충, 식물, 진균류, 효모 또는 포유류로부터 유래한 것인 형질감염된 세포.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, 비인간 동물 또는 그 자손에 포함된 형질감염된 세포.
  26. 엄중 조건하에 제10항 내지 제19항중 어느 하나의 항에 따른 핵산에 특이적으로 하이브리드되는 외래의 핵산 서열이 도입되고, 동물이 외래의 핵산을 TRT 단백질로서 발현시키는 비인간 동물 또는 그 자손.
  27. TRT 단백질 암호화 핵산의 10개 이상의 뉴클레오티드를 암호화하는 이종성 유전자를 보유하는 돌연변이된 비인간 동물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 동물이 마우스인 비인간 동물.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 동물이 자연 발생적 TRT 유전자와 하나 이상의 코돈에서 상이한 재조합 TRT 유전자를 보유하는 것인 비인간 동물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 유전자가 치환, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 삽입 또는 결실을 가짐으로써 자연 발생적 TRT 유전자와 상이한 것인 비인간 동물.
  31. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 동물은 텔로머라제 활성이 결핍된 것인 비인간 동물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 결핍이 야생형 텔로머라제와 비교하여 텔로머라제 활성의 레벨이 감소된 텔로머라제를 암호화하는 유전자의 결과인 비인간 동물.
  33. TRT 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 결합 단편.
  34. 면역학적으로 반응성인 조건하에 서열번호 2, 4-6, 52, 58, 61, 63, 64, 65, 67 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 TRT 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 면역 반응하는 항체.
  35. 면역학적으로 반응성인 조건하에 제10항 내지 제18항중 어느 하나의 항의 핵산이 암호화하는 단백질을 포함하여 TRT 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 면역 반응하는 항체.
  36. 길이가 10개 이상의 뉴클레오티드 내지 10 kb이고, 자연 발생적 TRT 유전자 또는 TRT mRNA에서 인접 서열과 동일하거나 또는 정확히 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드의 인접 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 TRT 유전자 서열 또는 TRT mRNA의 분석 또는 검색에 사용하는 용도.
  37. 길이가 10개 이상의 뉴클레오티드 내지 10 kb이고, 자연 발생적 TRT 유전자 또는 TRT mRNA에서 인접 서열과 동일하거나 또는 정확히 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드의 인접 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포의 제조에 사용하는 용도.
  38. 임의의 화합물 또는 치료제가 TRT 활성 또는 발현의 조절인자인지 여부를 측정하는 방법으로서, 이 화합물 또는 치료제의 투여 이후에 TRT 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 동물 또는 조성물에서의 활성 또는 발현의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 측정 방법.
  39. 시험 화합물이 TRT 활성의 조절인자인지 여부를 측정하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제9항중 어느 하나의 항의 TRT 단백질을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 시험 화합물의 부재하에서의 활성과 비교하여 시험 화합물의 존재하에서 측정된 TRT 활성의 변화가, 시험 화합물이 텔로머라제 역전사 효소의 활성을 조절한다는 결정을 제시하는 것인 TRT 활성을 측정하는 단계를 포함하는 측정 방법.
  40. 제1항 내지 제9항중 어느 하나의 항의 재조합 TRT 단백질을 이 재조합 단백질과 텔로머라제 RNA 성분이 연합하여 텔로머라제 기질에 뉴클레오티드를 첨가하는 반응을 촉매할 수 있는 텔로머라제 효소를 형성하는 단계를 포함하는 재조합 텔로머라제의 제조 방법.
  41. 샘플내 TRT 유전자 생성물의 검출 방법으로서, (a) 샘플을 유전자 생성물에 특이적으로 결합하는 프로브와 접촉시켜 프르브와 유전자 생성물이 복합체를 형성하게 하고 그 복합체를 검출하는 단계; 또는 (b) 생물학적 샘플내에서 핵산인 유전자 생성물을 특이적으로 증폭시키고 증폭 생성물을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서, 복합체 또는 증폭 생성물의 존재는 생물학적 샘플내 TRT 유전자 생성물의 존재와 상관 관계가 있는 것인 TRT 유전자 생성물의 검출 방법.
  42. 인간의 세포를 포함하는 생물학적 샘플내에서 하나 이상의 텔로머라제 양성인 인간 세포의 존재를 검출하는 방법으로서, (a)상기 샘플내 TRT 유전자 생성물의 양을 측정하는 단계; (b) 측정된 양을 텔로머라제 양성 세포가 결핍된 샘플과 상관 관계가 있는 대조군과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 대조군과 비교하여 상기 샘플내 TRT 유전자 생성물의 보다 고레벨의 존재는 생물학적 샘플내 텔로머라제 양성 세포의 존재와 상관 관계가 있는 것인 검출 방법.
  43. 포유류에서 텔로머라제 관련 상태를 진단하는 방법으로서, (a) 포유류로부터 임의의 세포 또는 조직 샘플을 얻는 단계; (b) 세포 또는 조직내 TRT 유전자 생성물의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 세포 또는 조직내 TRT 유전자 생성물의 양을 동일한 유형의 건강한 세포 또는 조직에서의 양과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서, 포유류 및 건강 세포 또는 조직에서 얻은 샘플내 TRT 유전자 생성물의 상이한 양이 텔로머라제 관련 상태의 진단 인자인 검출 방법.
  44. 세포에서 TRT의 발현을 증가시킴으로써 시험관내에서 척추 동물 세포의 증식능을 증가시키는 방법.
  45. 척추 동물 세포의 증식능을 증가시키는 것을 목표로 하는 상태의 치료용 약제의 제조에 TRT의 발현 또는 활성을 증가시키는 작용제를 사용하는 용도.
  46. 제45항에서 있어서, 약제가 노화 효과를 저해하는 것인 용도.
  47. 허용 가능한 담체와, 제1항 내지 제9항의 TRT 단백질, 그 변형체 또는 단편, 제33항 내지 제35항의 TRT 항체 또는 결합 단편, 제10항 내지 제18항에 정의된 TRT 단백질, 그 변형체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 TRT 단백질 또는 이의 부분 서열을 암호화하는 핵산을 함유하는 약학 조성물.
  48. 텔로머라제 발현 또는 활성의 저해제를 포유류 세포내 텔로머라제 활성의 증가된 레벨과 관련된 상태의 치료용 약제의 제조에 사용하는 용도로서, 이 때, 상기 저해제는 제10항 내지 제18항의 폴리뉴클레오티드 또는 제1항 내지 제8항의 폴리펩티드 또는 이들중 어느 하나를 사용하여 발견한 화합물인 용도.
  49. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제9항중 어느 하나의 항의 단백질, 변형체 또는 단편.
  50. 제1항 내지 제9항중 어느 하나의 항의 단백질, 변형체 또는 단편을 약제의 제조에 사용하는 용도.
  51. 제1항 내지 제9항중 어느 하나의 항의 단백질, 변형체 또는 단편을 노화 또는 암의 효과를 저해하는 약제의 제조에 사용하는 용도.
  52. 약제로서 사용하기 위한 제10항 내지 제18항의 폴리뉴클레오티드 또는 단편.
  53. 제10항 내지 제18항의 폴리뉴클레오티드 또는 단편을 약제의 제조에 사용하는 용도.
  54. 제10항 내지 제18항의 폴리뉴클레오티드 또는 단편을 노화 또는 암의 효과를 저해하는 약제의 제조에 사용하는 용도.
  55. 제51항 또는 제54항에 있어서, 노화에 미치는 약제의 저해 효과는 그 약제를 투여하는 세포 또는 동물의 수명을 증가시키는 것인 용도.
  56. 생물학적 샘플에서 TRT의 적어도 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하는 방법으로서, a) i) TRT의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플; ii) 생물학적 샘플로부터 텔로머라제 역전사 효소에 하이브리드될 수 있는 TRT 또는 그 단편의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계; b) 상기 핵산과 상기 프로브 사이에 하이브리드 복합체가 형성되도록 하는 조건하에 상기 핵산 함유 생물학적 샘플을 상기 프로브와 배합하는 단계; 및 (c) 상기 하이브리드화 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 생물학적 샘플내 상기 핵산이 리보핵산인 검출 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 하이브리드화 복합체가 상기 생물학적 샘플내 TRT의 발현과 상관 관계가 있는 것인 검출 방법.
  59. 제56항에 있어서, 상기 생물학적 샘플내 상기 핵산이 데옥시리보핵산인 검출 방법.
  60. 제56항에 있어서, 상기 하이브리드화 복합체의 상기 검출 단계가 상기 생물학적 샘플내 TRT의 뉴클레오티드 서열의 변이의 검출을 포함하는 것인 검출 방법.
  61. 제10항 내지 제18항의 TRT 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 가진 정제된 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 단편을 약제의 제조에 사용하는 용도.
  62. 제61항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 단편이 서열번호 1, 3, 19, 53, 62, 66 또는 69에 제시한 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 가진 것인 용도.
  63. 제61항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 재조합 발현 벡터에 삽입되는 것인 용도.
  64. 제10항 내지 제18항의 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 암호화된 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 제10항 내지 제18항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  65. 제64항에 있어서, 폴리펩티드를 분리 또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드의 제조 방법.
  66. 생물학적 샘플에서 TRT의 발현 또는 존재를 검출하는 방법으로서, a) i) TRT 단백질을 발현시키는 것으로 의심되는 생물학적 샘플; ii) 제33항 내지 제35항의 항체를 제공하는 단계; b) 항체::TRT 단백질 복합체가 형성되도록 하는 조건하에 상기 생물학적 샘플과 상기 항체를 배합하는 단계; 및 (c) 상기 복합체의 존재가 상기 생물학적 샘플내 상기 TRT의 발현 또는 존재와 상관 관계가 있는 것인 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법.
  67. 서열번호 4-6의 서열로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드 또는 그 변형체 또는 이들의 단편.
  68. 제67항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 상기 일부가 6개 아미노산보다 더 긴 서열번호 4-6의 단편을 포함하는 것인 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
  69. 제67항에 있어서, 상기 변형체가 인간의 세포에서 유래한 상동체인 것인 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
  70. 제67항의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체 또는 이들의 단편.
  71. 제70항에 있어서, 서열번호 3의 핵산 서열의 적어도 일부를 포함하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 변형체 또는 이들의 단편.
  72. 제70항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 일부가 10개 뉴클레오티드보다 더 긴 서열번호 3의 단편을 포함하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  73. 제70항에 있어서, 상기 변형체가 인간 세포로부터 유래한 상동체인 것인 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  74. i) 정제된 TRT 단백질 서브유닛 또는 그 변형체; ii) 정제된 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛 또는 그 상동체 또는 이들의 변형체 및 iii) 정제된 텔로머라제 RNA로 이루어진 텔로머라제 복합체.
  75. 제74항에 있어서, 상기 TRT 단백질 서브유닛이 유플로테스 에디큘라투스 (Euplotes aediculatus)로부터 얻어지는 것인 텔로머라제 복합체.
  76. 제74항에 있어서, 상기 TRT 단백질 서브유닛이 서열번호 1에 의해 암호화되는 것인 텔로머라제 복합체.
  77. 제74항에 있어서, 상기 텔로머라제 복합체가 완전한 또는 부분적 텔로머라제 활성을 나타낼 수 있는 것인 텔로머라제 복합체.
  78. 제74항에 있어서, 상기 텔로머라제 복합체가 텔로미어 DNA를 복제할 수 있는 것인 텔로머라제 복합체.
  79. 제74항에 있어서, 상기 43 kDa 텔로머라제 단백질 서브유닛 상동체 또는 변형체가 인간의 세포로부터 유래한 것인 텔로머라제 복합체.
  80. 제1항 내지 제8항의 TRT 단백질 및 RNA를 포함하는 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 RNA가 텔로머라제 RNA(TR)인 것인 조성물.
  82. 제80항에 있어서, TRT 단백질 및 TR이 완전한 또는 부분적인 텔로머라제 활성을 가진 리보뉴클레오단백질을 형성하는 것인 조성물.
  83. TRT 및 TR을 포함하는 실질적으로 순수한 텔로머라제.
  84. 제83항에 있어서, 순도가 약 95% 이상인 텔로머라제.
  85. 제83항에 있어서, 세포로부터 분리된 것인 텔로머라제.
  86. a) AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13; b) AA14-AA15-AA16-AA17-AA18-AA19-AA20-AA21-AA22-AA23-AA24-AA25-AA26; c) AA27-AA28-AA29-AA30-AA31-AA32-AA33-AA34-AA35-AA36; d) AA37-AA38-AA39-AA40-AA41-AA42-AA43-AA44; 및 e) AA45-AA46-AA47-AA48-AA49-AA50-AA51-AA52로 구성되는 군에서 선택되는 인접 아미노산 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 분리된 TRT 폴리펩티드로서, 이 때, AA1은 소수성 아미노산 또는 시스테인; AA2는 임의의 아미노산; AA3은 임의의 아미노산; AA4는 소수성 아미노산 또는 아스파르트산; AA5는 아스파르트산; AA6은 소수성 아미노산 또는 티로신; AA7은 임의의 아미노산; AA8은 임의의 아미노산; AA9는 임의의 아미노산; AA10은 소수성 아미노산 또는 티로신; AA11은 임의의 아미노산; AA12는 임의의 아미노산; AA13은 소수성 아미노산; AA14는 소수성 아미노산, 글루타민, 아르기닌 또는 글리신; AA15는 임의의 아미노산; AA16은 임의의 아미노산; AA17은 임의의 아미노산; AA18은 임의의 아미노산; AA19는 임의의 아미노산; AA20은 글루타민; AA21은 글리신; AA22는 임의의 아미노산; AA23은 임의의 아미노산; AA24는 임의의 아미노산; AA25는 세린; AA26은 임의의 아미노산; AA27은 소수성 아미노산, 히스티딘 또는 티로신; AA28은 임의의 아미노산; AA29는 임의의 아미노산; AA30은 임의의 아미노산; AA31은 소수성 아미노산 또는 트레오닌; AA32는 아스파르트산; AA33은 아스파르트산; AA34는 소수성 아미노산 또는 티로신; AA35는 소수성 아미노산, 티로신 또는 리신; AA36은 소수성 아미노산; AA37은 글리신; AA38은 소수성 아미노산 또는 시스테인; AA39는 임의의 아미노산; AA40은 소수성 아미노산, 리신 또는 트레오닌; AA41은 임의의 아미노산; AA42는 임의의 아미노산; AA43은 임의의 아미노산; AA44는 리신; AA45는 소수성 아미노산, 시스테인, 리신 또는 티로신; AA46은 임의의 아미노산; AA47은 소수성 아미노산, 트립토판, 세린 또는 티로신; AA48은 임의의 아미노산; AA49는 글리신; AA50은 소수성 아미노산 또는 티로신; AA51은 임의의 아미노산이며 AA52는 소수성 아미노산 또는 아르기닌 또는 글루타민인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  87. 제86항에 있어서, AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13으로 구성되는 인접 아미노산 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 보유하는 것인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  88. 제87항에 있어서, AA1은 소수성 아미노산 또는 시스테인; AA2는 임의의 아미노산; AA3은 트레오닌, 리신, 티로신 또는 글루탐산; AA4는 소수성 아미노산 또는 아스파르트산; AA5는 아스파르트산; AA6은 소수성 아미노산 또는 티로신; AA7은 글루탐산, 리신 또는 글리신; AA8은 임의의 아미노산; AA9는 시스테인 또는 알라닌; AA10은 소수성 아미노산, 티로신 또는 페닐알라닌; AA11은 아스파르트산 또는 페닐알라닌; AA12는 세린 또는 트레오닌이며; AA13은 소수성 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  89. 제88항에 있어서, AA1은 페닐알라닌; AA2는 임의의 아미노산; AA3은 트레오닌 또는 리신; AA4는 메티오닌, 페닐알라닌, 발린; AA5는 아스파르트산; AA6은 이소루이신 또는 발린; AA7은 글루탐산 또는 리신; AA8은 임의의 아미노산; AA9는 시스테인 또는 알라닌; AA10은 티로신; AA11은 아스파르트산; AA12는 세린 또는 트레오닌이며; AA13은 이소루이신 또는 발린인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  90. 제86항 내지 제89항중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리펩티드가 재조합 수단으로 제조되는 것인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  91. 제86항 내지 제89항중 어느 하나의 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 또는 그 변형체.
  92. Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp를 포함하는 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 분리된 실질적으로 순수한 또는 재조합 TRT 폴리펩티드로서, 상기 서열에서 X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 연속 잔기의 수를 의미하며, R1은 루이신 또는 이소루이신미고, R2는 글루타민 또는 아르기닌이며, R3은 페닐알라닌 또는 티로신이고, R4는 리신 또는 히스티딘인 분리된 실질적으로 순수한 또는 재조합 TRT 폴리펩티드.
  93. Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp를 포함하는 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 TRT 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 실질적으로 순수한 또는 재조합 핵산으로서, 상기 서열에서 X는 임의의 아미노산이고, 아래 첨자는 연속 잔기의 수를 의미하며, R1은 루이신 또는 이소루이신미고, R2는 글루타민 또는 아르기닌이며, R3은 페닐알라닌 또는 티로신이고, R4는 리신 또는 히스티딘인 분리된 실질적으로 순수한 또는 재조합 핵산.
  94. 도 55의 모티프 T, 도 55의 모티프 1, 도 55의 모티프 2, 도 55의 모티프 A, 도 55의 모티프 B', 도 55의 모티프 C, 도 55의 모티프 D 및 도 55의 모티프 E로 구성되는 군에서 선택되는 인접 아미노산 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 TRT 폴리펩티드.
  95. 서열 W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I를 포함하는 모티프 T, 서열 E-X2-V-X를 포함하는 모티프 T', 서열 X3-R-X2-PK-X3을 포함하는 모티프 1, 서열 X-R-X-I-X를 포함하는 모티프 2, 서열 X4-F-X3-D-X4-YD-X2를 포함하는 모티프 A, 서열 Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8을 포함하는 모티프 B' 및 서열 X6-DD-X-L-X3을 포함하는 모티프 C로 구성되는 군에서 선택되는 인접 아미노산 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 두 개의 아미노산이며, X3은 임의의 3개의 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  96. 서열 W(L/I)XXXXhhXhh(Q/R)XFFYXTEXXXXXXXXXX(F/Y)(F/Y)RXXXWXX(L/I)XXhXIXX XX(K/M)를 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이고, h는 소수성 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  97. 서열 FFYXTE를 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, X는 임의의 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  98. 서열 hRhIPKK를 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, h는 소수성 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  99. 서열 hXXXXhRhIPKK를 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, h는 소수성 아미노산이고 X는 임의의 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  100. 서열 P(K/E)(K/L)(Y/F)FhXhDh를 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, h는 소수성 아미노산이고 X는 임의의 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  101. 서열 KXYXQXXGIPQGSXLSXhLXXhXYXDL을 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, h는 소수성 아미노산이고 X는 임의의 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  102. 서열 (L/I)L(R/K)(L/V)XDD(F/Y)Lh(I/V)(T/S)를 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, h는 소수성 아미노산이고 X는 임의의 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  103. 서열 (NH2)-X300-600-W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I-X5-20-E-X2-V-X-X5-20-X3-R-X2-PK-X4-10-R-X-I-X-X60-80-X4-F-X3-D-X4-YD-X2-X80-130-Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8-X5-35-X6-DD-X-L-X3-X10-20-X12-K를 포함하는 아미노산 서열 모티프를 보유하고, 여기서, h는 소수성 아미노산이고 X는 임의의 아미노산인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  104. 제92항 내지 제103항중 어느 하나의 항에 있어서, 자연 발생적 TRT 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 TRT 폴리펩티드.
  105. 제104항에 있어서, 유플로테스, 테트라히메나, 스키조사카로마이세스, 옥시트리키아, 마우스 및 포유류로 구성되는 생물 군에서 선택되는 것인 TRT 단백질.
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Families Citing this family (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
DE19681033D2 (de) 1995-11-16 1999-03-18 Michael W Dahm Verfahren zur Quantifizierung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US6881571B1 (en) * 1998-03-11 2005-04-19 Exonhit Therapeutics S.A. Qualitative differential screening
US6607898B1 (en) 1996-03-26 2003-08-19 Oncomedx, Inc. Method for detection of hTR and hTERT telomerase-associated RNA in plasma or serum
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
EP1783139B8 (en) 1996-10-01 2009-09-23 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US6444650B1 (en) * 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US7390891B1 (en) 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
JP2001507570A (ja) * 1996-11-26 2001-06-12 バイラー・カレッジ・オブ・メディスン 染色体末端へのテロメラーゼのアクセスを阻害する阻害剤の同定
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
US20050013825A1 (en) * 1997-04-18 2005-01-20 Geron Corporation Vaccine containing the catalytic subunit of telomerase for treating cancer
WO1998059040A2 (de) * 1997-06-20 1998-12-30 Bayer Aktiengesellschaft Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung
CN1270634A (zh) 1997-07-01 2000-10-18 卡姆比亚生物系统有限责任公司 脊椎动物端粒酶基因和蛋白质及其用途
EP1571215A3 (en) * 1997-07-01 2007-10-31 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
WO1999027113A1 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Geron Corporation Mouse telomerase reverse transcriptase
DE19757984A1 (de) * 1997-12-24 1999-07-01 Bayer Ag Regulatorische DNA-Sequenzen aus der 5'-Region vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit udn deren diagnostische und therapeutische Verwendung
DE19804372A1 (de) * 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US6639057B1 (en) * 1998-03-26 2003-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Monoclonal antibody against human telomerase catalytic subunit
US6337200B1 (en) * 1998-03-31 2002-01-08 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit variants
JP2002509716A (ja) 1998-03-31 2002-04-02 ユニバーシティ テクノロジー コーポレイション テロメラーゼ抗原に対する免疫応答を惹起するための方法および組成物
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
US20030105315A1 (en) * 1998-04-09 2003-06-05 Metagen Pharmaceuticals Gmbh Human nucleic acid sequences from ovarian tumor tissue
US7030211B1 (en) * 1998-07-08 2006-04-18 Gemvax As Antigenic peptides derived from telomerase
US6900049B2 (en) 1998-09-10 2005-05-31 Cell Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
AU1331100A (en) 1998-10-29 2000-05-22 Dana-Farber Cancer Institute Cancer immunotheraphy and diagnosis using universal tumor associated antigens, including htert
GB9900298D0 (en) * 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
WO2000043501A2 (de) * 1999-01-22 2000-07-27 Humboldt-Universität Zu Berlin Universitätsklinikum Charite GEGEN DIE KATALYTISCHE UNTEREINHEIT DER HUMANEN TELOMERASE (hTERT) GERICHTETE RIBOZYME
DK1147181T3 (da) * 1999-02-04 2004-09-20 Geron Corp Telomerase revers transkriptase transskriptionelle regulatoriske sekvenser
US7960540B2 (en) 1999-04-08 2011-06-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
CA2370000A1 (en) 1999-04-08 2000-10-19 Uab Research Foundation Antiproliferative activity of g-righ oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US8114850B2 (en) 1999-04-08 2012-02-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
AU781376B2 (en) * 1999-04-09 2005-05-19 Biomira Inc. Telomerase-specific cancer vaccine
US6358739B1 (en) * 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
DE19916929A1 (de) * 1999-04-15 2000-10-19 Bayer Ag Ein automatisierbarer Schnelltest zum Nachweis von Krebserkrankungen auf der Basis von Telomerase(hTC) mRNA mit spezifischen Primern und Sonden
US6995145B1 (en) 1999-06-04 2006-02-07 Au Jessie L-S Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
US20050255596A1 (en) * 1999-09-07 2005-11-17 West Michael D Methods of repairing tandemly repeated DNA sequences and extending cell life-span nuclear transfer
KR100858465B1 (ko) 1999-09-10 2008-09-16 제론 코포레이션 올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도
FR2798673B1 (fr) * 1999-09-16 2004-05-28 Exonhit Therapeutics Sa Methodes et compositions pour la detection d'evenements pathologiques
US6399384B1 (en) 1999-09-17 2002-06-04 Reneuron Limited Conditional immortalization of cells
AU1309101A (en) * 1999-11-16 2001-05-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of searching for substance inhibiting binding between telomerase subunits
GB9927353D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cantab Pharma Res Virus preparation and use
US6664046B1 (en) * 1999-12-16 2003-12-16 Roche Molecular Systems, Inc. Quantitation of hTERT mRNA expression
KR20010096991A (ko) * 2000-04-19 2001-11-08 임정빈 텔로머레이즈의 프로모터에 특정하게 결합하는더블유티이1 절편, 그 유전자, 발현벡터 및 그것을 이용한세포성장 억제 방법
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
IT1318504B1 (it) * 2000-05-08 2003-08-27 Talent Srl Metodo e apparecchiatura per la diagnosi precoce di tumori vescicalisu campioni di urina.
US6331399B1 (en) 2000-05-16 2001-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of tert expression
US6492171B2 (en) * 2000-05-16 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of TERT expression
US7250294B2 (en) 2000-05-17 2007-07-31 Geron Corporation Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells
EP1158055A1 (fr) 2000-05-26 2001-11-28 Xu Qi University of Teaxs Laboratoire de Leucémie Chen Méthode pour le diagnostic de cancers
US7078491B1 (en) 2000-09-21 2006-07-18 Amgen Inc. Selective binding agents of telomerase
US6576464B2 (en) 2000-11-27 2003-06-10 Geron Corporation Methods for providing differentiated stem cells
AU2002235141A1 (en) 2000-11-27 2002-06-03 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
WO2002048319A1 (en) * 2000-12-14 2002-06-20 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Telomerase immortalized human liver cell lines
US6906237B2 (en) * 2001-02-27 2005-06-14 G. Scott Herron Vivo assay for anti angiogenic compounds
US20040063922A1 (en) * 2001-04-17 2004-04-01 Conrad Charles A. Methods and compositions for catalytic DNA exchange in a sequence specific manner
WO2002091999A2 (en) * 2001-05-09 2002-11-21 Geron Corporation Treatment for wounds
GB0112342D0 (en) * 2001-05-21 2001-07-11 Norsk Hydro As Polypeptides
WO2003008577A1 (fr) * 2001-07-16 2003-01-30 Fuyuki Ishikawa Nouvelles cellules transformees, methode de criblage d'agent anti-vieillissement et agents anti-vieillissement
US7150989B2 (en) * 2001-08-10 2006-12-19 Cornell Research Foundation, Inc. Telomerase immortalized neural progenitor cells
AUPR769701A0 (en) * 2001-09-14 2001-10-11 Li, He Telomerase inhibitory peptides and uses thereof
WO2003035884A2 (de) * 2001-10-18 2003-05-01 Heart Biosystems Gmbh Transiente immortalisierung von zellen durch onkogenproteine oder telomerproteine
CA2466732A1 (en) * 2001-10-22 2003-05-01 University Of Rochester Telomerase interference
JPWO2003038076A1 (ja) * 2001-10-31 2005-02-24 株式会社レノメディクス研究所 不死化間葉系細胞及びその利用
CN102008503B (zh) 2001-12-07 2018-10-09 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 人胚胎干细胞衍生的造血细胞
GB2415432B (en) 2001-12-07 2006-09-06 Geron Corp Islet cells from human embryonic stem cells
DE10163130B4 (de) * 2001-12-20 2009-05-14 Cyto Tools Gmbh Apoptotisch wirksame Peptide und diese umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen
WO2003054545A1 (fr) * 2001-12-21 2003-07-03 Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. Procede permettant de detecter un anticorps anti-telomerase
GB0200929D0 (en) * 2002-01-16 2002-03-06 Univ Glasgow Tissue rejection
EP1474522B1 (en) * 2002-01-18 2012-03-07 Morphotek, Inc. A method for generating engineered cells for locus specific gene regulation and analysis
US20030175961A1 (en) * 2002-02-26 2003-09-18 Herron G. Scott Immortal micorvascular endothelial cells and uses thereof
US20050106729A1 (en) * 2002-05-03 2005-05-19 Mark Irvin Rosenblatt Gene transfer methods and compositions
AU2003239901A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-12 Kathy M. Ensrud Crisp polypeptides as contraceptives and inhibitors of sperm capacitation
US7294708B2 (en) * 2002-05-31 2007-11-13 Beijing Institute Of Biotechnology Telomerase reverse transcriptase fragments and uses thereof
US7262025B2 (en) * 2002-06-18 2007-08-28 Zymogenetics, Inc. Hybrid vector having a cytomegalovirus enhancer and myeloproliferative sarcoma virus promoter
US7285415B2 (en) 2002-07-11 2007-10-23 The Regents Of The University Of California Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
AU2003290689A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof
US7166692B2 (en) 2003-03-04 2007-01-23 Canbrex Bio Science Walkersville, Inc. Intracellular delivery of small molecules, proteins, and nucleic acids
US8771982B2 (en) * 2003-04-30 2014-07-08 Duke University Chimeric molecule and nucleic acid encoding same
BRPI0411856A (pt) 2003-06-23 2006-08-29 Geron Corp composições e métodos para o aumento da atividade de telomerase
AU2004272340B2 (en) * 2003-09-12 2008-01-03 Dana Farber Cancer Institute Immortalisation of mammalian cells and therapeutic applications of said cells
EP1522858A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-13 Jean-Christophe Roegel Methods for selecting compounds using antibodies with activity as agonist, antagonist or allosteric modulators
US7473418B2 (en) 2004-03-25 2009-01-06 Cell Genesys, Inc. Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof
US7420099B2 (en) 2004-04-22 2008-09-02 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Transgenic animals and uses thereof
EP1745144B1 (en) 2004-05-11 2010-12-01 Axiogenesis Ag Assay for drug discovery based on in vitro differentiated cells
AU2005285483A1 (en) * 2004-08-05 2006-03-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for cell activation
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
JP2006242618A (ja) * 2005-03-01 2006-09-14 Univ Of Tokyo 組織ｆｉｓｈ法によるテロメア量を指標とした癌の診断
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
RU2007137122A (ru) * 2005-03-09 2009-04-20 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем (Us) НОВЫЙ ПРОМОТОР hTMC И ВЕКТОРЫ ДЛЯ ОПУХОЛЕСЕЛЕКТИВНОЙ И ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРОТИВОРАКОВЫХ ГЕНОВ
US20090305236A1 (en) * 2005-05-11 2009-12-10 Genetic Technologies Limited Methods of enriching fetal cells
EP1748067A1 (en) * 2005-07-29 2007-01-31 Institut Pasteur Polynucleotides encoding MHC class I-restricted hTERT epitopes, analogues thereof or polyepitopes
DK2281875T3 (en) 2005-12-21 2018-06-06 Univ Catholique Louvain Isolated liver stem cells
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
US20080131442A1 (en) * 2006-06-26 2008-06-05 Science Applications International Corporation IgY antibodies to human telomerase reverse transcriptase
WO2008002285A1 (en) * 2006-06-26 2008-01-03 Science Applications International Corporation Igy antibodies to human telomerase reverse transcriptase
AU2013203229C1 (en) * 2006-07-28 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved vaccines and methods for using the same
CN105132439A (zh) 2006-07-28 2015-12-09 宾夕法尼亚大学托管会 改进的疫苗及其使用方法
BRPI0719865A2 (pt) 2006-10-12 2016-03-15 Angeletti P Ist Richerche Bio molécula de ácido nucleico, proteína de fusão purificada, vetor, célula hospedeira, processo para expressar uma proteína de fusão, e, método para tratar um paciente sofrendo de ou predisposto a um câncer
EP3255061B1 (en) 2006-11-03 2021-06-16 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Selective immunodepletion of endogenous stem cell niche for engraftment
EP1994942A1 (en) * 2007-05-25 2008-11-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions comprising telomerase, and uses thereof
ES2751997T3 (es) 2008-01-14 2020-04-02 Conventus Orthopaedics Inc Aparato de reparación de fracturas
US9782565B2 (en) 2008-10-01 2017-10-10 Covidien Lp Endoscopic ultrasound-guided biliary access system
US9186128B2 (en) 2008-10-01 2015-11-17 Covidien Lp Needle biopsy device
US11298113B2 (en) 2008-10-01 2022-04-12 Covidien Lp Device for needle biopsy with integrated needle protection
US8968210B2 (en) 2008-10-01 2015-03-03 Covidien LLP Device for needle biopsy with integrated needle protection
US9332973B2 (en) 2008-10-01 2016-05-10 Covidien Lp Needle biopsy device with exchangeable needle and integrated needle protection
WO2010121294A1 (en) 2009-04-21 2010-10-28 Genetic Technologies Limited Methods for obtaining fetal genetic material
MX338100B (es) * 2009-07-09 2016-04-01 Janssen Biotech Inc Celulas derivadas de tejido cardiaco.
EP2523614A4 (en) 2010-01-15 2017-02-15 Conventus Orthopaedics, Inc. Rotary-rigid orthopaedic rod
WO2011091052A1 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Kyle Taylor Apparatus and methods for bone access and cavity preparation
SI2536830T1 (sl) 2010-02-16 2019-12-31 Ultimovacs As Polipeptidi
US9249452B2 (en) * 2010-02-26 2016-02-02 Zhu Zhen Pirot Method of detecting and assaying telomerase activity of telomerase bound by anti-telomerase antibodies
JP2013521880A (ja) 2010-03-08 2013-06-13 コンベンタス オーソピディックス， インコーポレイテッド 骨インプラントを固定するための装置および方法
AU2011236653B2 (en) 2010-04-08 2016-10-27 The University Court Of The University Of Edinburgh Chondrogenic progenitor cells, protocol for derivation of cells and uses thereof
WO2012026309A1 (ja) * 2010-08-23 2012-03-01 公立大学法人横浜市立大学 抗ｐａｄ４抗体医薬の創成
CN102093980B (zh) * 2010-12-10 2013-04-17 梁伟国 永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法
US8420617B2 (en) * 2011-03-11 2013-04-16 Biocell Laboratories Multiantivirus compound, composition and method for treatment of virus diseases
CN102676518B (zh) * 2012-02-27 2013-09-18 华侨大学 一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用
EP2639299A1 (en) 2012-03-16 2013-09-18 Invectys Universal cancer peptides derived from telomerase
WO2013169077A1 (ko) * 2012-05-11 2013-11-14 주식회사 카엘젬백스 악액질 예방 또는 치료용 조성물
KR102578891B1 (ko) * 2012-05-11 2023-09-15 주식회사 젬백스앤카엘 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
BR112014032677A2 (pt) * 2012-06-27 2019-01-15 Univ Rutgers ensaios rápido para ativação de célula t por medições de rna usando citometria de fluxo
US20150125438A1 (en) * 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
KR102038487B1 (ko) 2012-09-19 2019-10-30 주식회사 젬백스앤카엘 텔로머라제 펩티드를 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물
WO2014046481A1 (ko) * 2012-09-19 2014-03-27 주식회사 카엘젬백스 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
ES2802253T3 (es) * 2012-09-19 2021-01-18 Gemvax & Kael Co Ltd Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado
KR102166542B1 (ko) 2012-09-28 2020-10-16 주식회사 젬백스앤카엘 줄기세포 검출을 위한 텔로머라제 유래 펩티드 및 조영물질의 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 조영제
KR102093093B1 (ko) 2012-12-13 2020-03-25 주식회사 젬백스앤카엘 피부 노화 개선용 조성물
KR102106756B1 (ko) 2012-12-13 2020-05-06 주식회사 젬백스앤카엘 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 치료용 조성물
EP3988112A1 (en) 2013-02-22 2022-04-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods relating to telomere extension
US10138488B2 (en) 2013-03-28 2018-11-27 Invectys Cancer vaccine for dogs
AU2014242915B2 (en) 2013-03-28 2018-08-09 Invectys A cancer vaccine for cats
MX2015017103A (es) 2013-06-11 2016-11-07 Harvard College Celulas beta derivadas de células madre ( sc-beta ) y composiciones y métodos para generarlas.
JP6601915B2 (ja) 2013-10-28 2019-11-06 アンヴェクティ 皮膚細胞への電気的遺伝子導入
PL3062824T3 (pl) 2013-10-28 2020-06-15 Invectys Szczepionka zawierająca dna kodujący telomerazę
EP2871235A1 (en) 2013-11-07 2015-05-13 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) New methods to produce active hTERT
US10022132B2 (en) 2013-12-12 2018-07-17 Conventus Orthopaedics, Inc. Tissue displacement tools and methods
KR102166549B1 (ko) 2014-01-10 2020-10-16 주식회사 젬백스앤카엘 혈뇌장벽 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트
EP3822364B1 (en) 2014-08-26 2023-05-10 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Engraftment of stem cells with a combination of an agent that targets stem cells and modulation of immunoregulatory signaling
EP3370764A4 (en) 2015-11-05 2019-07-17 The Regents of The University of California CELLS MARKED BY LIPID CONJUGATES AND METHODS OF USING THE SAME
JP6820935B2 (ja) 2016-01-19 2021-01-27 ファイザー・インク がんワクチン
IL267912B2 (en) 2017-01-30 2023-09-01 Univ Leland Stanford Junior A genotoxic matching regimen for stem cell transplantation
US10631881B2 (en) 2017-03-09 2020-04-28 Flower Orthopedics Corporation Plating depth gauge and countersink instrument
US11351246B2 (en) 2017-05-09 2022-06-07 Invectys SAS Recombinant measles vaccine expressing hTERT
US10918426B2 (en) 2017-07-04 2021-02-16 Conventus Orthopaedics, Inc. Apparatus and methods for treatment of a bone
WO2019070740A2 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center LUTENING HORMONE RECEPTOR BINDING AGENTS AND LUTINISING HORMONE AGONISTS FOR IDENTIFICATION, MULTIPLICATION, REMOVAL AND MODIFICATION OF PRIMITIVE STEM CELL POPULATIONS
CN108715863B (zh) * 2018-05-30 2020-09-11 吉林大学 一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用
CN110827920B (zh) * 2018-08-14 2022-11-22 武汉华大医学检验所有限公司 测序数据分析方法和设备及高通量测序方法
SG11202102255VA (en) * 2018-09-05 2021-04-29 Readcoor Llc Methods and systems for therapeutic agent analysis
KR20210057024A (ko) * 2018-09-06 2021-05-20 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 텔로머라제 완전효소 복합체 및 이의 사용 방법
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
CN109545039A (zh) * 2019-01-15 2019-03-29 苏州大学 一种核孔复合体结构模型教具及其使用方法
AU2020311877B2 (en) 2019-07-05 2024-01-04 Case Western Reserve University Priming media and methods for stem cell culture and therapy
JP2021151979A (ja) * 2020-03-24 2021-09-30 均 石井 再生医療薬
CN116870195A (zh) * 2020-09-22 2023-10-13 浙江愈方生物科技有限公司 一种灭活性端粒酶、具有其的腺病毒和人造mRNA及应用
JP2022119144A (ja) * 2021-02-03 2022-08-16 均 石井 パーキンソン病治療薬
JP2022151412A (ja) * 2021-03-23 2022-10-07 均 石井 脳卒中治療薬
CN113355303B (zh) * 2021-06-07 2023-06-16 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种m-mlv逆转录酶突变体及其应用
WO2023141534A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Northwestern University Agents that target telomerase reverse transcriptase (tert) for treating cancer and sensitizing cancer cells to genotoxic therapy
CN114920802B (zh) * 2022-05-16 2023-05-23 中国地质大学（武汉） 调节端粒酶限速蛋白运动的多肽探针及其复合物和方法
CN116364195B (zh) * 2023-05-10 2023-10-13 浙大城市学院 一种基于预训练模型的微生物遗传序列表型预测方法

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US912629A (en) 1908-08-29 1909-02-16 Conrad L Stueber Foundation-top for pipe-carriers.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4254082A (en) 1978-06-12 1981-03-03 Miles Laboratories, Inc. Specific binding-adsorbent assay test means
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
JPS57502090A (ko) 1980-07-18 1982-11-25
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4554101A (en) * 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US5055556A (en) 1981-10-06 1991-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Fluorescent conjugates for analysis of molecules and cells
JPS58215453A (ja) 1982-06-09 1983-12-14 Toray Silicone Co Ltd 室温硬化後塗装可能なオルガノポリシロキサン組成物
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
FR2542494B1 (fr) 1983-03-08 1985-08-16 Sevylor International Combinaison protectrice, utilisable notamment en atmosphere irradiee
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
GB8612087D0 (en) 1986-05-19 1986-06-25 Ici Plc Hybridisation probes
US5001225A (en) 1986-12-08 1991-03-19 Georgetown University Monoclonal antibodies to a pan-malarial antigen
US4889806A (en) 1987-04-15 1989-12-26 Washington University Large DNA cloning system based on yeast artificial chromosomes
US5017478A (en) 1987-07-16 1991-05-21 Berlex Laboratories, Inc. Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of using
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5093245A (en) 1988-01-26 1992-03-03 Applied Biosystems Labeling by simultaneous ligation and restriction
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5075227A (en) * 1989-03-07 1991-12-24 Zymogenetics, Inc. Directional cloning
JPH02307059A (ja) 1989-05-23 1990-12-20 Seiko Instr Inc 反応容器
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5399493A (en) 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5437994A (en) 1989-06-15 1995-08-01 Regents Of The University Of Michigan Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
EP0502976B1 (en) 1989-12-01 1996-07-03 Pharming B.V. Production of recombinant polypeptides by bovine species and transgenic methods
AU647741B2 (en) 1989-12-01 1994-03-31 Regents Of The University Of California, The Methods and compositions for chromosome-specific staining
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
ES2151463T5 (es) 1989-12-22 2012-10-29 Merck Serono Sa Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos
EP0466874A1 (fr) 1990-02-09 1992-01-22 Asulab S.A. Micromoteur electrostatique a champ radial realise par microfabrication photolithographique et procede de realisation d'un tel micromoteur
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
SE468913B (sv) 1990-05-16 1993-04-05 Igesto Ab Saekerhetskrok
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
KR100198659B1 (ko) 1996-05-16 1999-06-15 구본준 메모리 셀, 메모리 장치 및 그의 제조 방법
DE69216385T2 (de) 1991-10-11 1997-06-12 Promega Corp Gekoppelte transkription und translation in zellfreien eukaryoten-extrakten
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
AU687736B2 (en) 1992-05-11 1998-03-05 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting viral replication
US5645986A (en) 1992-05-13 1997-07-08 Board Of Reagents, The University Of Texas System Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5639613A (en) 1992-05-13 1997-06-17 Board Of Regents, University Of Texas System Methods for cancer diagnosis and prognosis
US5648215A (en) 1992-05-13 1997-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Telomerase diagnostic methods
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5629154A (en) 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
AU4769893A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6107062A (en) 1992-07-30 2000-08-22 Inpax, Inc. Antisense viruses and antisense-ribozyme viruses
GB2273932A (en) 1992-11-24 1994-07-06 Stiefel Laboratories Stable oligonucleotides
US5674703A (en) 1992-12-02 1997-10-07 Woo; Savio L. C. Episomal vector systems and related methods
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
EP0686200A4 (en) 1993-01-27 1997-07-02 Oncor Inc AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID SEQUENCES
US6120764A (en) 1993-06-24 2000-09-19 Advec, Inc. Adenoviruses for control of gene expression
US6140087A (en) 1993-06-24 2000-10-31 Advec, Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
US5919676A (en) 1993-06-24 1999-07-06 Advec, Inc. Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
US5583016A (en) 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
RO117328B1 (ro) * 1994-07-07 2002-01-30 Geron Corp Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice
US5597697A (en) 1994-09-30 1997-01-28 Diamond; Paul Screening assay for inhibitors and activators of RNA and DNA-dependent nucleic acid polymerases
US5698686A (en) * 1994-10-20 1997-12-16 Arch Development Corporation Yeast telomerase compositions
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
WO1996019580A2 (en) * 1994-12-19 1996-06-27 Cold Spring Harbor Laboratory Telomerase protein component
CA2221602A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cold Spring Harbor Laboratory Essential oligonucleotides of vertebrate telomerase
WO1997015687A1 (en) 1995-06-07 1997-05-01 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5722998A (en) 1995-06-07 1998-03-03 Intermedics, Inc. Apparatus and method for the control of an implantable medical device
US5741677A (en) 1995-06-07 1998-04-21 Geron Corporation Methods for measuring telomere length
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
US5968506A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
WO1997006012A1 (en) 1995-08-04 1997-02-20 International Business Machines Corporation Stamp for a lithographic process
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
JPH09154575A (ja) 1995-10-04 1997-06-17 Soosei:Kk テロメラーゼ
JPH09164575A (ja) 1995-12-13 1997-06-24 Japan Steel Works Ltd:The 流れ模様を有する樹脂板の製造方法およびその装置
US6015710A (en) 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
US5853719A (en) 1996-04-30 1998-12-29 Duke University Methods for treating cancers and pathogen infections using antigen-presenting cells loaded with RNA
US5770422A (en) * 1996-07-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of California Human telomerase
US5747317A (en) 1996-07-08 1998-05-05 Tularik Inc. Human telomerase RNA interacting protein gene
US5724021A (en) 1996-07-09 1998-03-03 Stephen C. Perrone Self-contained, programmable, time interval alarm reminder device for eyedrop medication administration and a means for affixing such to eyedrop/medication container
WO1998007838A1 (fr) 1996-08-21 1998-02-26 Mitsubishi Chemical Corporation Proteine de telomerase d'animaux superieurs et gene codant pour elle
AU4030697A (en) 1996-08-28 1998-03-19 Shonen Yoshida Proteins having telomerase activity
DE19638482A1 (de) 1996-09-20 1998-04-02 Bosch Gmbh Robert Verfahren zur Auswahl einer Sendefrequenz
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
EP1783139B8 (en) 1996-10-01 2009-09-23 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit
US6767719B1 (en) 1997-11-26 2004-07-27 Geron Corporation Mouse telomerase reverse transcriptase
US6444650B1 (en) 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US5890326A (en) 1996-11-06 1999-04-06 Hill-Rom, Inc. Head wall for a hospital room
US5919656A (en) 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
US7390891B1 (en) * 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
JP2001507570A (ja) 1996-11-26 2001-06-12 バイラー・カレッジ・オブ・メディスン 染色体末端へのテロメラーゼのアクセスを阻害する阻害剤の同定
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
US6617119B2 (en) 1997-02-21 2003-09-09 The Regents Of The University Of California Assay for specific strains of multiple disease related conformations of a protein
DE69725018T2 (de) * 1997-04-04 2004-06-09 Geron Corp., Menlo Park Gereinigte telomerase
US6485789B1 (en) 1997-04-14 2002-11-26 3M Innovative Properties Company Fluorochemical composition containing a condensation product of a fluorochemical polyether and a poly-isocyanate to impart stain release properties to a substrate
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US20050013825A1 (en) 1997-04-18 2005-01-20 Geron Corporation Vaccine containing the catalytic subunit of telomerase for treating cancer
US6201830B1 (en) 1997-06-11 2001-03-13 Texas Instruments Incorporated Low computation idle transmission method for DSL modems
WO1998059040A2 (de) * 1997-06-20 1998-12-30 Bayer Aktiengesellschaft Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung
CN1270634A (zh) 1997-07-01 2000-10-18 卡姆比亚生物系统有限责任公司 脊椎动物端粒酶基因和蛋白质及其用途
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
WO1999027113A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Geron Corporation Mouse telomerase reverse transcriptase
DE19757984A1 (de) 1997-12-24 1999-07-01 Bayer Ag Regulatorische DNA-Sequenzen aus der 5'-Region vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit udn deren diagnostische und therapeutische Verwendung
AU1785099A (en) 1998-01-08 1999-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel gene having reverse transcriptase motif
GB9801902D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Cancer Res Campaign Tech A gene promoter
JP2002509716A (ja) 1998-03-31 2002-04-02 ユニバーシティ テクノロジー コーポレイション テロメラーゼ抗原に対する免疫応答を惹起するための方法および組成物
US6337200B1 (en) * 1998-03-31 2002-01-08 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit variants
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
EP1085892A4 (en) 1998-06-12 2002-07-17 Sloan Kettering Inst Cancer VACCINE STRATEGY FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF CANCER
US7030211B1 (en) 1998-07-08 2006-04-18 Gemvax As Antigenic peptides derived from telomerase
DK1147181T3 (da) 1999-02-04 2004-09-20 Geron Corp Telomerase revers transkriptase transskriptionelle regulatoriske sekvenser
AU781376B2 (en) 1999-04-09 2005-05-19 Biomira Inc. Telomerase-specific cancer vaccine
WO2000073420A2 (en) 1999-06-02 2000-12-07 Whitehead Institute For Biomedical Research Creation of human tumorigenic cells and uses therefor
US6354941B2 (en) 1999-11-03 2002-03-12 516 Holdings Electronic system for a game of chance
AU2001241533A1 (en) 2000-02-15 2001-08-27 The Regents Of The University Of California A universal vaccine and method for treating cancer employing telomerase reverse transcriptase
WO2002091999A2 (en) 2001-05-09 2002-11-21 Geron Corporation Treatment for wounds
JP2002348474A (ja) 2001-05-23 2002-12-04 Dow Corning Toray Silicone Co Ltd ポリオルガノシロキサンマイクロエマルジョン組成物および化粧料原料
US20030143228A1 (en) 2001-10-29 2003-07-31 Baylor College Of Medicine Human telomerase reverse transcriptase as a class-II restricted tumor-associated antigen
US7294708B2 (en) 2002-05-31 2007-11-13 Beijing Institute Of Biotechnology Telomerase reverse transcriptase fragments and uses thereof
KR100705868B1 (ko) 2003-05-06 2007-04-10 후지 덴키 디바이스 테크놀로지 가부시키가이샤 반도체 장치 및 그 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
GB9804859D0 (en) 1998-04-29
GB9720890D0 (en) 1997-12-03
EP0932686A2 (en) 1999-08-04
EP0841396B1 (en) 2003-07-16
BRPI9712254B1 (pt) 2019-01-15
KR100530483B1 (ko) 2006-01-09
CN1291231B (zh) 2010-06-02
DE19743497A1 (de) 1998-08-20
JPH10234384A (ja) 1998-09-08
GB2321642B8 (en) 2006-08-22
ES2205132T3 (es) 2004-05-01
CA2267664C (en) 2013-06-11
FI990655A (fi) 1999-03-24
ES2205132T5 (es) 2012-06-18
US20090269739A1 (en) 2009-10-29
NO20053120L (no) 1998-04-02
NO319982B1 (no) 2005-10-10
GB2321642B (en) 2000-02-09
EA199900355A1 (ru) 2000-08-28
EA199900349A1 (ru) 2000-06-26
EP0841396B2 (en) 2012-04-11
WO1998014593A3 (en) 1999-02-18
DE841396T1 (de) 1998-09-24
JP2001523947A (ja) 2001-11-27
AU734089B2 (en) 2001-06-07
AU4807397A (en) 1998-04-24
EP1333094A3 (en) 2005-02-09
DE69739497D1 (de) 2009-08-27
EP1783139A2 (en) 2007-05-09
BR9711844A (pt) 2000-01-18
US7517971B1 (en) 2009-04-14
CN102021153B (zh) 2016-05-25
EP1783139B1 (en) 2009-07-15
SG94355A1 (en) 2003-02-18
WO1998014592A2 (en) 1998-04-09
JP3869092B2 (ja) 2007-01-17
WO1998014593A2 (en) 1998-04-09
NO991588D0 (no) 1999-03-31
NO991588L (no) 1999-05-31
EP1333094B1 (en) 2012-04-04
BR9712254A (pt) 2000-01-18
EP1783139B8 (en) 2009-09-23
CN1254376A (zh) 2000-05-24
HK1156967A1 (zh) 2012-06-22
CN1291231A (zh) 2001-04-11
DE69739675D1 (de) 2010-01-07
EP1783139A3 (en) 2007-05-23
JPH11313689A (ja) 1999-11-16
CA2267664A1 (en) 1998-04-09
DE69723531T2 (de) 2004-05-27
CN102021153A (zh) 2011-04-20
CA2266752A1 (en) 1998-04-09
CA2645721A1 (en) 1998-04-09
NZ334709A (en) 2001-06-29
GB2317891A (en) 1998-04-08
FR2757177A1 (fr) 1998-06-19
JPH11253177A (ja) 1999-09-21
KR20000048839A (ko) 2000-07-25
JP4070331B2 (ja) 2008-04-02
ATE552341T1 (de) 2012-04-15
JP2001081042A (ja) 2001-03-27
FI990655A0 (fi) 1999-03-24
GB2317891B (en) 1998-08-19
IL129222A0 (en) 2000-02-17
JP4852576B2 (ja) 2012-01-11
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