RO117328B1 - Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice - Google Patents

Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice Download PDF

Info

Publication number
RO117328B1
RO117328B1 RO97-00016A RO9700016A RO117328B1 RO 117328 B1 RO117328 B1 RO 117328B1 RO 9700016 A RO9700016 A RO 9700016A RO 117328 B1 RO117328 B1 RO 117328B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
telomerase
rna
component
sequence
human
Prior art date
Application number
RO97-00016A
Other languages
English (en)
Inventor
Bryant Villeponteau
Junli Feng
Walter Funk
William H Andrews
Original Assignee
Geron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/330,123 external-priority patent/US5583016A/en
Priority claimed from US08/472,802 external-priority patent/US5958680A/en
Priority claimed from US08/482,115 external-priority patent/US5776679A/en
Application filed by Geron Corp filed Critical Geron Corp
Publication of RO117328B1 publication Critical patent/RO117328B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
    • B29C59/02—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing
    • B29C59/04—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing using rollers or endless belts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Shaping Of Tube Ends By Bending Or Straightening (AREA)
  • Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)

Abstract

Inventia se refera la o componenta RNA a telomerazei de mamifere, o enzima ribonucleazica implicata in sinteza DNA-ului telomer uman, la o plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, depusa sub numarul de acces ATCC 75926, si la o metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice la un pacient prin detectarea valorii componentei RNA-zice a telomerazei umane, dintr-o proba celulara, si compararea acestei valori cu o valoare standard a expresiei componentei RNA a telomerazei umane din celulele nonneoplazice de acelasi tip.

Description

Invenția se referă la componentă RNA a telomerazei de mamifere, o enzimă ribonucleoproteică implicată în sinteza DNA-ului telomer uman, la o plasmidă recombinantă de exprimare a acesteia și la o metodă pentru detectarea prezenței unei stări neoplazice utilizate în domeniile biologiei moleculare, chimiei, farmacologiei, și al tehnologiei medicale și de diagnostic.
Se cunoaște din articolul publicat de Blackburn în Annu.Rev.Biochem.6\:'\ 13 129 în 1992 că DNA-ul de la capetele sau telomerii cromozomilor de la eucariote, constă, de obicei, din secvențe simple repetate în tandem. Telomeraza este o enzimă ribonucleoproteică care sintetizează o spirală din DNA-ul telomeric, utilizând ca matriță o secvență conținută în componenta RNA a enzimei.
Se cunoaște, de asemenea, din articolul publicat de Morin în Cell 59:521-529 în 1989 și Morin în Nature 353: 454 - 456 în 1991 că, componenta RNA a telomerazei umane nu a fost prezentată în literatura științifică de până acum, deși se cunoaște că telomeraza umană sintetizează unități repetitive telomerice cu secvența 5'-TTAGGG-3'. Aceste cunoștințe nu au fost suficiente pentru a permite izolarea și identificarea restului de secvență nucleotidfcă din componenta RNA a telomerazei umane. Componenta RNA-zică a enzimelor telomerazice de la Saccharomyces cerevisiae, de la anumite specii de Tetrahymena, ca și de la alte ciliate cum ar fi, Euplotes și Glaucoma, a fost secvențializată și prezentată în literatura științifică de Singer și Gottschling, 21 oct. 1994, Science 26B: 404-409; Lingner și colab., 1994, Genes & Development 8: 1984-1988; Greider și Blackburn, 1989, Nature 337: 331337; Romero și Blackburn, 1991, Cell 67: 343-353; și Shippen-Lentz și Blackburn, 1990, Science 247:546-552. Enzimele telomerazice ale acestor ciliate sintetizează unități repetitive telomerice diferite de cele de la oameni.
Există o mare necesitate pentru mai multe informații referitoare la telomeraza umană. în ciuda naturii aparent simple a unităților repetitive ale DNA-ului telomeric, oamenii de știință cunosc de mult că telomerazele au un rol biologic important în menținerea structurii și funcției cromozomului. Mai recent, oamenii de știință au speculat că pierderea DNA-ului telomeric poate acționa ca un declanșator al senescenței celulare și al maturizării, iar reglarea telomerazei poate avea implicații biologice importante, așa cum este prezentat de Harley, 1991, Mutation Research 256: 271-282.
Au mai fost descrise, de asemenea, și metode pentru detectarea activității telomerazei, ca și pentru identificarea compușilor care reglează sau afectează activitatea telomerazei, împreună cu metodele pentru terapia și diagnosticarea senescenței celulare și pentru imortalizarea prin controlul lungimii telomerului și al activității telomerazice, prezentate în 95/13381, publicat în 18 mai 1995; 95/13382, publicat în 18 mai 1995; și 93/23572, publicat în 25 noiembrie 1993; și în US (inventatori C.Harley, N.Kim, S.Weinrich], înregistrat În7 iunie 1995; 08/315214, înregistrat în 28 septembrie 1994; 08/315216, întregistrat în 28 septembrie 1994; 08/288501, înregistrat în 10 august 1994; 08/014838, înregistrat în 8 februarie 1993; 08/153051 și 08/151477, fiecare înregistrat în 12 noiembrie 1993; 08/060952, înregistrat în .13 mai 1993; 08/038766, înregistrat în 24 martie 1993; și 07/882438, înregistrat în 13 mai 1992.
îmbunătățiri semnificative și oportunități noi pentru terapiile mediate de telomerază și determinările telomerazei și metodele de screening ar putea fi realizate dacă acidul nucleic care cuprinde componente RNA și/sau care codifică componentele proteice ale telomerazei ar fi disponibile în formă pură sau izolabilă, iar secvențele de nucleotide ale unor astfel de acizi nucleici ar fi cunoscute.
RO 117328 Bl
Problema, pe care o rezolvă invenția, este obținerea unei componente RNA a teiomerazei de mamifere și unei plasmide de exprimare a acesteia și la o metodă pen- 50 tru detectarea prezenței unei stări neoplazice la un pacient.
Componentă RNA a teiomerazei de mamifere, conform invenției, înlătură dezavantajele menționate prin aceea că are următoarea secvență:
ggguugcggagggagggugggccugggaggggugguggccauuuuuuguc UAACCCUAACUGAGĂAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC
UGUtTOVUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU 3 3
UCeACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC
GCCCCUCCCGGGACCOGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC
UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCOCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC
GAAGAGUUGGGCUCUGOCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU
UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC CCCUCGCCGGCAGQGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACOGGGC r n
CAGUGUGCU.
Plasmidă recombinantă de exprimare, conform invenției, conține componenta
RNA telomerază de mamifere și are următoarea secvență nucleotidică:
· -gatcagttagaaagttactagtccacatataaagtgccaagtcttgt
ACTCĂAG ATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTG 6 5
ACAAGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGAT aatgtgggatgctaagagaatggtggtagtgttgacatataactcaaagc ATTTAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAA aaacaggagtcagattctgtccgtaaaaaactttacaacctggcagatgc tatgaaagaaaaaggggatgggagagagagaaggagggagagagatggag agggagatattttacttttctttcagatcgaggaccgacagcgacaactc CACGGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGT CATTTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCC GGGTGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCG GGTGGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTG AAACCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAG GCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACĂCGAGAATCGCTTGA ACCCGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCAT CCAGCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTAC AATTTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACT 7 5
ACTTTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAQG GAGATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGC CATCCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGG CAGGGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTG TAGTCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGT GATGATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTT CCTGTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGC AGAGGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAA 8 0
AGAAGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGC AACGTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCC AACCAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCT TGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCC GGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGC GATTTTTTGTCTAACCCȚAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGC TCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCG GCCTGCCGCCTTCCACCGȚTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTG 85
CTGGCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCC CGAACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCC ACTGCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGC GAGGGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTC CCGCGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGG CTCACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGC gcatccgtcacccctcgccggcagtgggggcttgtgaacccccaaacctg ACTGACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTC 9 0 caaagtcggccaaaatgaatgggcagtgagccggggttgcctggagccgt TCCTGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTÂTGGTTGT attacaacttagttcctgctctgcagattttgttgaggtttttgcttctc ccaaggtagatctcgaccagtccctcaacggggtgtggggâgaacagtca tttttttttgagagatcatttaăcatttaatgaatatttaattagaagat ctaaatgaacattggaaattgtgttcctttaatggtcatgggtttatgcc AGAGGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTG AGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT-3 ·. ·
RO 117328 Bl conținând suplimentar un promotor poziționat să conducă transcrierea unui RNA complementar sau identic cu secvența respectivei oligonucleotide și care este depusă sub numărul de acces ATCC 75926.
Metoda pentru detectarea prezenței unei stări neoplazice la un pacient cuprinde izolarea unei probe celulare de la respectivul pacient, detectarea componentei RNA-zice a telomerazei umane în proba celulară pentru a determina o valoare de diagnostic, compararea valorii de diagnostic cu o valoare standard a expresiei componentei RNA-zice a telomerazei umane în celule non-neoplazice de același tip ca și proba celulară, diagnosticarea ca indicator al prezenței unei stări neoplazice a unei valori de diagnostic care să fie suficient mai mari decât valoarea standard.
Prin aplicarea invenției se obține următorul avantaj:
- îmbunătățiri semnificative și oportunități noi pentru terapiile mediate de telomerază.
într-un prim aspect, prezenta invenție descrie componenta RNA-zică, ca și gena pentru componenta RNA-zică. a telomerazei umane în formă substanțial pură, ca și acizii nucleici conținând toate sau cel puțin o parte utilă din secvența de nucleotide a componentei RNA-zice a telomerazei umane. Prezenta invenție mai descrie componenta RNA-zică a acizilor nucleici de la alte specii, acizi nucleici care împart omologia substanțială cu componenta RNA-zică a telomerazei umane, incluzând, dar nelimitându-se la componentele RNA-zice de la mamifere, cum ar fi primatele. Alți acizi nucleici utili ai acestei invenții includ acizi nucleici cu complementaritatea secvențelor față de componenta RNA-zică; acizi nucleici cu secvențe legate de, dar diferite de secvențele de nucleotide ale componentei RNA-zice și care interacționează cu componenta RNA-zică, sau gena pentru componenta RNA-zică sau componentele proteice ale telomerazei umane, pe o cale utilă; și acizii nucleici care nu împart omologia sau complementaritatea secvenței semnificative cu componenta RNA sau cu gena pentru componenta RNA-zică, dar acționează asupra componentei RNAîntr-un fel dorit și util. Așa cum s-a descris mai pe larg în continuare, acizii nucleici din invenție includ, atât molecule de DNA și de RNA, cât și analogi modificați ai fiecăruia, și servesc unei varietăți de scopuri utile.
Un tip de acid nucleic util din prezenta invenție este o oligonucleotidă antisens, o oligonucleotidă formatoare a unui triplu helix, sau altă oligonucleotidă sau oligonucleotidă mimetică (ex.DNA antisens - acid nucleic peptidic/acid nucleic poliamidic) care pot fi utilizate “in vivo” sau “in vitro pentru a inhiba activitatea telomerazei umane. Astfel de oligonucleotide pot bloca activitatea telomerazei într-un număr de feluri, inclusiv prin prevenirea transcrierii genei pentru telomerază (spre exemplu, prin formarea de triplu helix) sau prin legarea la componenta RNA-zică a telomerazei într-o manieră care să prevină asamblarea unei telomeraze ribonucleoproteice funcționale, sau care să prevină servirea ca matriță pentru sinteza DNA-ului telomeric a componentei RNA-zice, odată asamblată în complexul enzimatic telomerazic. în mod tipic, și în funcție de modul de acțiune, aceste oligonucleotide cuprind o secvență specifică, de aproximativ 1D până la aproape 25 - 200 sau mai multe nucleotide, secvență care este fie identică, fie complementară cu o secvență specifică de nucleotide din componenta RNA-zică a telomerazei, sau a genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei.
RO 117328 Bl
140 într-o altă realizare, invenția prezintă polinucleotide antisens complementare cu secvențele polinucleotidice ale componentei RNA-zice a telomerazei, în mod tipic complementare cu secvențele de polinucleotide care sunt substanțial identice cu o secvență de genă a componentei RNA-zice a telomerazei de mamifere, de origine naturală. Asemenea polinucleotide antisens sunt utilizate pentru inhibarea transcrierii și/sau stabilității și/sau funcționalității speciilor de componente RNA-zice ale telomerazei, efectuând prin aceasta o reducere cantitativă a activității respectivei telomeraze dintr-o celulă (ex. o celulă neoplazică a unui pacient). Astfel de polinucleotide antisens pot funcționa ca agenți de modulare a telomerazei prin inhibarea formării holoenzimei telomerază funcțională (activă catalitic și de înaltă fidelitate) pentru corecta replicare și reparare a telomerului într-o celulă. Polinucleotidele antisens pot fi combinate cu alte modalități terapeutice antineoplazice, cum ar fi radierea ionizantă sau chimioterapia (ex.cu un agent de deteriorare a DNA-ului, cum ar fi bleomicina, cisplatina, azot-iperita, doxirubicina, analogi ai nucleotidelor, și similari). Polinucleotidele antisens pot determina moartea celulei în cazul celulelor susceptibile (ex. replicarea celulelor care necesită activitatea telomerazică pentru repararea sau replicarea DNA-ului). Polinucleotidele antisens sunt substanțial identice cu cel puțin 25 de nucleotide învecinate din secvența complementară a unei secvențe RNA-zice pentru telomeraza de la mamifere, descrise aici. Polinucleotidele antisens sunt, în mod particular, ssDNA, ssRNA, polinucleotide metilfosfonate axiale, polinucleotide fosforotiolate axiale, polinucleotide amestecate axiale,, acizi nucleici poliamidici, și structurile antisens similare, cunoscute în domeniu. într-un aspect al invenției, o polinucleotidă antisens este administrată pentru inhibarea transcrierii și/sau activității componentei RNA-zice a telomerazei, și a activității telomerazice într-o celulă, cum ar fi, într-o celulă umană replicabilă.
într-o altă realizare, invenția prezintă o polinucleotidă matriță nepotrivit împerecheată, menționata polinucleotidă având o secvență substanțial identică cu o componentă RNA-zică a telomerazei de la mamifere, și cuprinzând o secvență matriță telomerică repetitivă care are cel puțin o bază dereglată în această privință, dar, altfel, complementară cu secvența repetitivă telomerazică umană 5'-TTAGGG-3'. □ polinucleotidă dereglată matriță conține în mod tipic o singură nucleotidă dereglată în secvența matriță existentă în mod natural, și poate conține 2 nucleotide dereglate în secvența matriță, fie ca nucleotide adiacente dereglate sau în care nucleotidele dereglate sunt separate prin una sau mai multe nucleotide împerecheate (în mod complementar). Polinucleotidele matriță nepotrivit împerecheate din prezenta invenție sunt, în general, capabile să dezvolte activitate telomerazică în conjuncție cu componenta polipeptidică telomerazică, și producând prin aceasta încorporarea greșită în pozițiile nucleotidelor selecționate (greșit împerecheate) din secvența repetitivă din telomeraza umană, ulterior replicării, reparării, și/sau adiției telomerului repetitiv, generându-se astfel telomeri care se bazează pe prezența continuată a componentei RNA-zice a telomerazei cu sens modificat pentru replicarea substanțială și menținerea lungimii telomerului.
Un alt tip de acid nucleic util din prezenta invenție este un ribozim capabil să separe în mod specific componenta RNA-zică a telomerazei umane, făcând enzima inactivă. încă un alt tip de acid nucleic util al prezentei invenții este o sondă sau primer care se leagă în mod specific la componenta RNA-zică a telomerazei umane și, astfel, poate fi utilizat, spre exemplu, pentru detectarea prezenței telomerazei într-o probă.
145
150
155
160
165
170
175
180
185
RO 117328 Bl în final, acizii nucleici utili ai invenției includ plasmide de exprimare recombinante, pentru producerea acizilor nucleici ai invenției. Un tip util, în mod special, de astfel de plasmida este o plasrrlidă utilizată pentru terapia genică umană. Plasmide utile din prezenta invenție pentru terapia genică umană vin într-o varietate de tipuri, incluzând nu doar pe cele care.codifică oligonucleotidele antisens sau ribozimele, ci și pe cele care efectuează exprimarea componentei RNA-zice a telomerazei umane sau o versiune ștearsă sau una alterată în alt fel (mutație) a componentei RNA-zice a telomerazei umane (sau alte specii cu secvențe ale componentei RNA-zice substanțial omoloage la componenta RNA-zică umană), sau a genei acesteia.
într-o altă realizare a invenției, un polinucleotid având o porțiune complementară componentei RNA-zice a telomerazei de mamifere, suficient pentru a hibridiza în mod specific în condiții fiziologice, este derivat prin legarea covalentă a unui substituent chimic suplimentar, fie în timpul, fie după sinteza polinucleotidei, prin aceasta formând o polinucleotidă derivatizată capabilă de hibridizare specifică la menționata componentă RNA-zică a telomerazei. Polinucleotidul derivatizat se poate localiza pe enzimă telomerazică endogenă care are menționata componentă RNA-zică în care polinucleotidul derivatizat respectiv produce o alterare sau modificare chimică a componentei RNA-zice și/sau a componentei proteice a telomerazei, modificând astfel, în mod tipic, prin reducere, activitatea enzimatică a telomerazei.
într-o altă realizare, invenția prezintă polinucleotide care sunt adecvate diagnosticării bolilor asociate (determinate) cu abundența și/sau structura aberante ale componentei RNA-zice a telomerazei. Sonde polinucleotidice conținând secvențe care sunt substanțial identice cu sau substanțial complementare cu o secvență nucleotidică a componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere, pot fi utilizate pentru diagnosticarea stărilor de boală (de exemplu, neoplazia sau preneoplazia) prin detectarea unei abundente a componentei RNA-zice a telomerazei și/sau a alterărilor structurale ale componentei RNA-zice a telomerazei (de exemplu, secționare, variații ale secvenței, ștergeri sau inserții, și altele asemănătoare), și/sau a rearanjărilor sau amplificării genei componentei RNA-zice a telomerazei în celule recoltate de la un pacient, sau detectarea unei alele patognomonice a componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere (de exemplu, prin RFLP sau prin analiza PCR specifică pentru alele). Detectarea se face adesea prin hibridizarea, in situ, utilizând o polinucleotidă antisens marcată (de exemplu, 3aP, 35B, 14C, 3H, fluorescent, marcat cu biotină, cu digoxigenină), complementar cu o componentă RNA-zică a telomerazei de la mamifere, deși Northern blotting-ul, blotting punctual, sau hibridizarea în soluție pe structura RNA sau poli A+ RNA izolat dintr-o probă celulară, pot fi utilizate, ca PCR sau LCR - amplificarea care utilizează primeri specifici componentei RNA-zice a telomerazei. Celulele care conțin o cantitate modificată (în mod tipic, o creștere semnificativă) din componenta RNA-zică a telomerazei comparativ cu celulele non-neoplazice din același tip(uri) de celule, sunt identificate ca celule candidate la îmbolnăvire, cum ar fi, celulele preneoplazice sau chiar neoplazice, și pot fi identificate ca celule cu potențial metastatic. în mod similar, detectarea rearanjărilor patognomonice sau amplificarea locusului genei cu componenta RNA-zică a telomerazei, sau a locusurilor strâns legate într-o probă celulară, va identifica prezența.condiției patologice sau a predispoziției pentru dezvoltarea unei condiții patologice (de exemplu, cancer, boli genetice). Sondele polinucleotidice din componenta RNA-zică a telomerazei sunt, de asemenea, utilizate pentru identificarea juridică a indivizilor, cum ar fi, pentru testarea paternității sau identificarea suspecților criminali sau a decedaților necunoscuți.
RO 117328 Bl
235 într-o altă realizare, invenția prezintă metode pentru tratarea unei stări asociate cu activitatea telomerazică dintr-o celulă sau grup de celule, prin punerea în contact a celulei(lor) cu o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic dintr-un agent care modifică activitatea telomerazică din acea celulă. Astfel de agenți includ acizii nucleici care codifică componenta RNA-zică a telomerazei, oligonucleotidele formatoare de triplu helix, oligonucleotide antisens, ribozimi și plasmide și alți vectori pentru terapia genică (de exemplu, vectori adenovirali, vectori virali adeno-asociați, etc.) pentru terapia genică umană prin exprimarea componentei RNA-zică a telomerazei, a RNAului antisens în componenta RNA-zică a telomerazei, sau a componentei greșit împerecheate a telomerazei, așa cum s-a descris mai sus. într-o privință înrudită, invenția prezintă compoziții farmaceutice care cuprind acești agenți terapeutici, împreună cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic, sau cu o sare, care pot include formularea într-un complex lipoid, lipozom, sau imunolipozom pentru eliberarea controlată a agentului terapeutic. Invenția mai prezintă și combinații ale unor astfel de agenți terapeutici mediați de telomerază, cu alte produse farmaceutice, cum ar fi, agenții antineoplazici și alți agenți citotoxici sau citostatici; agenți antifungici (de exemplu, pentru tratarea pacienților SIDA); nucleotide, nucleozide, și analogi ai acestora; și alți agenți farmaceutici potriviți pentru tratarea stărilor de boală cum ar fi neoplazia, hiperplazia, infecția cu HIV/SIDA și patologiile asociate, și alte boli caracterizate prin metabolismul telomer anormal. Metodele pot cuprinde utilizarea unei polinucleotide derivatizată capabilă să hibridizeze în mod specific la o componentă RNA-zică a telomerazei dintr-o telomerază de la mamifere, în care polinucleotida derivatizată este eliberată în celule de mamifere care au activitate telomerazică și inhibă activitatea telomerazei prin localizarea pe componenta RNA-zică a telomerazei și prin inactivarea sau inhibarea activității telomerazei.
Invenția mai prezintă și agenți terapeutici care inhibă neoplazia sau apoptoza prin modularea funcției telomerazei prin inhibarea sau sporirea formării de componentă RNA-zică a telomerazei; astfel de agenți pot fi utilizați ca produse farmaceutice. Asemenea produse farmaceutice vor fi utilizate pentru tratarea unei varietăți de boli umane și animale, cum ar fi: neoplaziile, hiperplaziile, bolile neurodegenerative, îmbătrânirea, SIDA, infecția fungică, și altele asemenea. într-o altă realizare a invenției, agentul constă dintr-un vector de terapie genică capabil să transcrie o secvență din componenta RNA-zică a telomerazei, sau complementul său, sau, alternativ, dintro componentă RNA-zică a telomerazei inactivă enzimatic care poate să inhibe competitiv formarea holoenzimei-telomerază funcțională.
într-o altă realizare, invenția prezintă metode de diagnostic pentru determinarea nivelului, cantității, sau a prezenței componentei RNA-zice a telomerazei umane, a telomerazei, sau a activității telomerazei dintr-o celulă, populație de celule, sau probă de țesut, sau un extract din oricare dintre cele precedente. într-un aspect înrudit, prezenta invenție prezintă reactivi utili pentru astfel de metode (incluzând primerii și sondele notate mai sus), opțional împachetate sub formă de kit împreună cu instrucțiunile de utilizare a kitului pentru aplicarea metodei de diagnostic.
Prezenta invenție prezintă o metodă de diagnosticare a unei boli (de exemplu, neoplazia) la un pacient uman, în care un experiment de diagnostic (de exemplu, hibridizarea in situ a polinucleotidelor din celule fixate printr-o sondă de componentă
RNA-zică marcată a telomerazei, care leagă în mod specific componenta RNA-zică a
240
245
250
255
260
265
270
275
RO 117328 Bl telomerazei umane, sau secvențe de genă) este utilizată pentru determinarea dacă concentrația patognomonică predeterminată a componentei RNA-zice a telomerazei este prezentă într-o probă biologică de la un pacient uman; dacă determinarea indică prezența componentei RNA-zice a telomerazei în afara nivelului normal (de exemplu, dincolo de concentrația patognomonică predeterminată), pacientul este diagnosticat ca având o stare de boală sau predispoziție.
într-o altă prezentare a invenției, polinucleotidele invenției sunt folosite pentru diagnosticarea stărilor patologice sau a bolilor genetice care implică neoplazia, hiperplazia, îmbătrânirea prematură sau anormală a celulelor, sau a altor stări patologice legate de funcția telomerazei, și, mult mai specific, a stărilor și bolilor care implică modificări în structura sau abundența componentei RNA-zice a telomerazei sau a secvenței de genă, sau care sunt legate de o alelă a componentei RNA-zice a telomerazei patognomonice care pot fi detectate prin RFLP și/sau PCR specific pentru alelă, sau prin altă metodă adecvată de detectare. în mod tipic, metoda este pentru diagnosticarea unei boli la un pacient uman (de exemplu,neoplazia), metodă în care se utilizează un test de diagnostic (ex. determinarea cantității și/sau structurii componentei RNAzice a telomerazei) pentru a determina dacă o concentrație patognomonică predeterminată sau structură a componentei RNA-zice a telomerazei este prezentă în celulele dintr-o probă biologică de la un pacient uman; dacă determinarea indică prezența unei cantități patognomonice din componenta RNA-zică a telomerazei în afara ratei normale (de exemplu, dincolo de concentrația patognomonică predeterminată), pacientul este diagnosticat ca având o stare de boală sau predispoziție pentru boală.
într-o altă realizare invenția prezintă preparate de telomerază recombinantă și metode pentru producerea unor astfel de preparate. Astfel, prezenta invenție prezintă o telomerază umană recombinantă care cuprinde componentele proteice ale telomerazei umane, ca și componentele proteice ale telomerazei de la o specie de mamifere cu o componentă RNA-zică substanțial omoloagă cu componenta RNA-zică a telomerazei umane în asociere cu o componentă RNA-zică recombinantă din invenție. Astfel de molecule de componente RNA-zice recombinante (molecule) ale prezentei invenții includ pe cele care diferă de moleculele componentei RNA-zice existente în mod natural,prin una sau mai multe substituții deleții, adiții terminale și/sau inserări de baze, ca și molecule de componentă RNA-zică identice cu o moleculă de componentă RNA-zică existentă în mod natural, care sunt produse în celule gazdă recombinante. Metoda de producere de astfel de molecule de telomerază recombinantă cuprinde transformarea unei celule gazdă eucariotă care exprimă (produce) componentele proteice ale telomerazei cu ajutorul unui vector recombinant de exprimare care codifică o moleculă de componentă RNA-zică din invenție, și cultivarea menționatelor celule gazdă transformate, cu amintitul vector în condiții în care componenta proteică a telomerazei și componenta RNA-zică a telomerazei să se exprime și să se asambleze pentru a forma o moleculă activă de telomerază capabilă să adauge secvențe (nu în mod necesar aceeași secvență adăugată de telomerază nativă) la telomeri de DNA cromozomal.
într-o altă realizare, invenția prezintă metode de purificare a componentelor proteice ale telomerazei umane, ca și a componentelor proteice ale telomerazei de la o specie de mamifer cu o componentă RNA-zică substanțial omoloagă cu componenta RNA-zică a telomerazei umane. Prezenta invenție mai descrie și metode pentru
RO 117328 Bl izolarea și identificarea acizilor nucleici care codifică astfel de componente proteice, în aspectele înrudite, prezenta invenție descrie telomeraza umană purificată și telomeraza purificată de la specii de mamifere cu o componentă RNA-zică substanțial omoloagă cu componenta RNA-zică a telomerazei umane, ca și acizii nucleici purificați care codifică una sau mai multe componente ale acestor preparate telomerazice. Prezenta invenție mai descrie și compoziții farmaceutice care cuprind ca ingredient activ componentele proteice ale telomerazei sau un acid nucleic care codifică sau interacționează cu un acid nucleic care codifică o componentă proteică a telomerazei.
într-o altă realizare, invenția prezintă metode pentru identificarea agenților care modulează (adică inhibă, sporesc, sau modifică specificitatea) activitatea telomerazei de la mamifere. Astfel de agenți de modulare a telomerazei sunt adesea molecule mici (de exemplu, mai puțin de 3OOO Da) și pot fi utilizați pentru modificarea activității telomerazei in vitro și in vivo, în mod frecvent pentru efectul terapeutic, și sunt utilizați ca reactivi de laborator și/sau produse farmaceutice.
într-o altă realizare, invenția prezintă metode pentru identificarea, dintr-o bancă sau bibliotecă de agenți, a agenților candidați care modulează activitatea telomerazei prin modularea legării necovalente a componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere cu o componentă proteică a telomerazei. Componenta RNA-zică a telomerazei poate fi produsă dintr-o matriță recombinantă într-o celulă gazdă, sau sintetizată chimic, dacă se dorește. în mod tipic, o componentă proteică a telomerazei de la mamifere ce poate fi purificată din celulele care exprimă (produc) telomeraza, și care poate avea o componentă RNA-zică a telomerazei existentă în mod natural - îndepărtată (de exemplu, prin tratament cu RNA-ază), este pusă în contact cu o componentă RNA-zică a telomerazei de la mamifere în condiții adecvate, apoase, de legare, pentru a permite legarea necovalentă între componentele RNA-zice și proteice în absența unui agent adăugat (adică, într-o reacție de legare controlată). Magnitudinea interacției noncovalente dintre componenta RNA-zică a telomerazei și componenta proteică, în prezența unuia sau mai multor agenți selecționați dintr-o bibliotecă sau bandă de agenți, este comparată cu magnitudinea interacției noncovalente dintr-o reacție de legare - martor conținând componentele proteice și RNA-zice ale telomerazei și lipsindu-i agentul(ii); agenți care produc o creștere semnificativă din punct de vedere statistic a magnitudinii legării noncovalente dintre componentele proteice și RNA-zice ale telomerazei, este prin aceasta determinată ca un agent candidat de modulare, a telomerazei. Magnitudinea relativă a legării noncovalente poate fi determinată prin orice metodă adecvată, incluzând determinarea afinității de legare specifică, cum ar fi prin testul de legare competitivă, determinarea activității catalitice a telomerazei pe o matriță potrivită de repetare a telomerului, sau alt test adecvat al interacției noncovalente funcționale dintre componentele RNA-zice și proteice ale telomerazei de la mamifere, cum ar fi, o deplasare în gel sau EMSA (“electrophoretic mobility shift assay = testul modificării mobilității electroforetice).
într-o altă realizare a unui test de legare noncovalentă pentru detectarea agenților de modulare a candidatului telomerazic, una sau ambele componente, RNAzică și proteică, ale telomerazei sunt marcate cu un agent de marcare adecvat, detectabil, iar legarea noncovalentă este determinată separat în prezența și absența unui agent selecționat dintr-o bibliotecă sau bancă de agenți. Determinarea legăturii noncovalente constă în măsurarea gradului în care o componentă telomerazică marcată
330
335
340
345
350
355
360
365
370
RO 117328 Bl [componenta RNA.zică sau componenta proteică) este legată de componenta sa telomerazică înrudită (componenta proteică sau, respectiv, componenta RNA-zică), dacă amintitul component teiomerazic înrudit este marcat separat sau este nemarcat, cum ar fi, prin capturarea (de exemplu,imobilizarea) complexelor legate care conțin menționatul component teiomerazic marcat și menționatul component teiomerazic înrudit, și în separarea (de exemplu prin spălare) componentei telomerazice marcate nelegate, de un complex legat menționat, generând astfel o fracțiune legată separat, și detectarea complexelor legate în fracțiunea legată separată, prin determinarea prezenței unui agent de marcare detectabil. Agenți care produc o reducere semnificativă din punct de vedere statistic sau creșterea gradului de legare noncovalente a componentelor RNA-zice și proteice ale telomerazei sunt astfel identificați ca agenți candidați de modulare a telomerazei. Agenții care reduc legarea noncovalentă sunt inhibitori (sau antagoniști) ai candidatului pentru telomerază, în timp ce agenții care măresc gradul de legare noncovalentă a componentelor telomerazei sunt agoniști ai candidatului pentru telomerază.
într-o altă realizare, agenții de modulare a candidatului pentru telomerază sunt identificați prin capacitatea lor de a produce o creștere sau scădere semnificative din punct de vedere statistic, a activității telomerazei de la mamifere, enzima care cuprinde o componentă proteică purificată a telomerazei, și o componentă RNA-zică a telomerazei.
într-o altă realizare, agenții de modulare a candidatului pentru telomerază sunt identificați prin capacitatea lor de a produce o reducere sau o creștere semnificativă din punct de vedere statistic a transcrierii unei secvențe raportoare de polinucleotide (de exemplu, gena pentru /^galactozidază, gena pentru luciferază, gena pentru HPRT), legată operabil la o secvență reglatoare a transcrierii dintr-o genă pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere, preferabil o genă pentru componenta RNAzică a telomerazei umane, într-o celulă de la mamifere, activă din punct de vedere metabolic. într-o variantă, o genă pentru componenta RNA-zică a telomerazei endogene dintr-o celulă de la mamifere este țintită cu o structură de țintire omoloagă pentru a plasa o secvență raportoare de polinucleotide legată operabil în amontele secvenței de reglare a transcrierii (de exemplu, promotor) a genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei endogene din locusul cromozomal al genei endogene. într-o variantă alternativă, un polinucleotid exogen conținând un polinucleotid raportor este operabil legat la o regiune de reglare a transcrierii din gena pentru componenta RNAzică a telomerazei de la mamifere (de exemplu, promotorul și situsurile de legare a factorului de transcriere în amonte); polinucleotidul exogen este transferat într-o celulă de la mamifere în care se poate integra în mod non-omolog într-o localizare cromozomală și/sau este menținut sau replicat ca un polinucleotid episomal. Agenții care produc o modulare transcripțională semnificativă din punct de vedere statistic, a polinucleotidului raportor în celulele tratate cu agentul, sunt identificați astfel drept agenți candidați de modulare a telomerazei de la mamifere.
Compozițiile pentru identificarea agenților candidați de modulare a telomerazei conțin în mod tipic: (1) o componentă proteică a telomerazei de la mamifere, cum ar fi, cea purificată din celulele de mamifere care exprimă telomerază, preferabil de la primate (de exemplu,oameni), și care este în mod tipic desprinsă de componenta
RNA-zică asociată, prin tratament cp RNA-ază sau alt tratament compatibil cu
RO 117328 Bl îndepărtarea componentei RNA-zice și reținerea capacității proteinei de a reconstitui activitatea telomerazei în prezența componentei RNA-zice a telomerazei înrudite, în condiții de legare adecvate, (2) o componentă RNA-zică a telomerazei de la mamifere, preferabil, o componentă RNA-zică umană produsă prin transcrierea unei polinucleotide recombinante într-o celulă, și (3) condiții de legare apoase (ex. condiții fiziologice, condiții de determinare a telomerazei), și opțional. (4) o polinucleotidă raportoare conținând cel puțin o secvență repetitivă, replicabilă sau extensibilă, din telomeraza de la mamifere, complementară în mod tipic cu secvența porțiunii matriță complementară, repetitivă, a telomerului din menționata componentă RNA-zică, și opțional, (5) nucleotide adecvate pentru replicarea și/sau extensia menționâtei(lor) secvențe repetitive a telomerului din polinucleotidul raportor, în condiții de determinare al telomerului; un agent este adăugat în mod tipic la o astfel de compoziție, pentru evaluarea prin legarea noncovalentă și/sau activitatea telomerazei, în comparație cu o compoziție martor lipsită de amintitul agent.
într-o altă realizare, invenția mai prezintă și alelele nule ale genelor pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere, produse prin țintirea genei omoloage a unui polinucleotid heterolog într-o genă pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere, pentru inactivarea funcțională a genei componentei RNA-zice a telomerazei. Invenția mai prezintă și animale fără pereche, non-umane, care conțin o alelă nulă a componentei RNA-zice a telomerazei, și, într-o variație, prezintă animale homozigoți, fără pereche, non-umane, pentru alelele nule ale componentei RNA-zice a telomerazei și lipsite în mod substanțial de activitatea telomerazei endogene, care rezultă dintr-o lipsă a componentei RNA-zice a telomerazei endogene. Asemenea animale fără pereche sunt utilizate ca reactivi comerciali pentru screeningul toxicologic, pentru vânzare către laboratoarele de cercetare farmaceutică, pentru identificarea sau investigarea agenților de modulare a telomerazei, ca animale de casă, și ca șeptel agricol, printre alte alte utilizări.
într-o altă realizare, invenția prezintă o metodă pentru imortalizarea celulelor de mamifere, cum ar fi, fermentarea dorită a celulelor într-un bioreactor, sau o tulpină microbiană dorită care are însușiri avantajoase ca reactiv comercial de cercetare. Metoda constă în introducerea într-o celulă de mamifere a unui polinucleotid care exprimă a componentă RNA-zică a telomerazei funcționale, care este capabilă să formeze enzima funcțională, telomeraza, în prezența componentei proteice a telomerazei.
Alte trăsături și avantaje ale invenției devin evidente din următoarea descriere a desenelor, prezentările preferate ale invenției, a exemplelor și a revendicărilor.
Definiții
Termenul de “polinucleotid ăl componentei RNA-zice a telomerazei”, așa cum este utilizat aici, se referă la un polinucleotid cu cel puțin 20 de nucleotide în care polinucleotidul Cuprinde un segment de cel puțin 20 de nucleotide care au o identitate cel puțin 85% cu o secvență a componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere, existentă în mod natural caracteristic, o componentă RNA-zică a telomerazei de la primate, cum ar fi o componentă RNA-zică a telomerazei umane sau de maimuță. Unele polinucleotide ale componente RNA-zice a telomerazei având variații ale secvenței comparativ cu o secvență a componentei RNA-zice a telomerazei existente în mod natural, sau complementul său, pot fi potrivite ca sonde de hibridizare, primeri PCR, amplimeri LCR, componente RNA-zice greșit împerecheate, și altele.
420
425
430
435
440
445
450
455
460
RO 117328 Bl
Termenul “corespunzător la” este utilizat aici pentru a desemna că o secvență polinucleotidică este omoloagă (adică, este identică, asemănătoare nu în mod strict evolutiv] cu toată sau cu o parte din secvența polinucleotidică de referință, sau cu o secvență polipeptidică este identică cu o secvență polipeptidică de referință. Dimpotrivă, termenul “complementar cu” este utilizat aici în sensul că secvența complementară este omoloagă cu toată sau cu o parte din secvența polinucleotidică de referință. Spre exemplificare, secvența de nucleotide TATAC corespunde unei secvențe de referință “TATAC” și este complementară cu o secvență de referință “GTATA”.
Următorii termeni sunt utilizați pentru descrierea relațiilor din secvență între două sau mai multe polinucleotide; “secvență de referință, “fereastră de comparație”, identitatea secvenței”, procentul de identitate a secvenței”, și “identitate substanțială”. O secvență de referință este o secvență definită utilizată ca bază pentru o comparare secvențială; o secvență de referință poate fi un subset dintr-o secvență mai mare, de exemplu, ca un segment dintr-o secvență de genă pentru componenta RNA-zică a telomerazei cu lungime completă. în general, o secvență de referință are cel puțin 20 de nucleotide în lungime, în mod frecvent, cel puțin 25 de nucleotide în lungime, și adesea, cel puțin 50 de nucleotide în lungime. Deoarece, fiecare din cele două polinucleotide pot: (1) cuprinde o secvență (adică o parte din secvența polinucleotidică completă) care este similară cu cele două polinucleotide, și (2) poate să mai conțină și o secvență care este divergentă între cele două polinucleotide, comparațiile secvențiale între două (sau mai multe) polinucleotide sunt, în mod tipic, efectuate prin compararea secvențelor celor două polinucleotide peste o fereastră de comparare” pentru identificarea și compararea regiunilor locale ale similarității secvenței.
O fereastră de comparare”, așa cum a fost utilizată aici, se referă la un segment conceptual de cel puțin 25 de nucleotide învecinate ca poziție, în care o secvență polinucleotidică poate fi comparată cu o secvență de referință cu cel puțin 25 de nucleotide învecinate, și în care porțiunea din secvența polinucleotidică din fereastra de comparare poate cuprinde adiții sau deleții (adică breșe) de 20 de procente sau mai puțin, comparativ cu secvența de referință (care nu cuprinde adiții sau deleții) pentru alinierea optimă a celor două secvențe. Alinierea optimă a secvențelor pentru alinierea unei ferestre de comparare poate fi condusă (dirijată) prin algoritmul de omologie locală, al lui Smith și Waterman (1981) Adv. Appl.Math.,2: 482, prin algoritmul alinierii omoloage al lui Needleman și Wunsh (1970) J.Mol.Biol.48: 443, prin cercetarea cu metoda de similaritate a lui Pearson și Lipman (1988) Proc.IXIatl.Acad.Soi.(USA) 85: 2444, prin implementările computerizate ale acestor logaritmi (GAP, BESTFIT, FASTA și TFASTA în Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), sau prin inspectare, iar cel mai bun aliniament (adică cel care are ca rezultat cel mai mare procent de omologie cu fereastra de comparare) rezultat din diferitele metode, este selecționat.
Termenul de “identitate de secvență” înseamnă că două secvențe polinucleotidice sunt identice (adică pe baza ideii nucleotidă-după-nucleotidă) peste fereastra de comparație. Termenul “procentul de identitate a secvenței” este calculat prin compararea a două secvențe aliniate în mod optim, peste fereastra de comparare, determinând numărul de poziții în care apar baze identice de acid nucleic (de exemplu, A,
T, C, G, U, sau I) în ambele secvențe pentru a produce numărul de poziții împerecheate, divizân,d numărul de poziții împerecheate prin numărul total de poziții din
RO 117328 Bl fereastra de comparare (adică mărimea ferestrei), și multiplicând rezultatul cu 1OO, pentru a produce procentul de identitate a secvenței. Termenii de “identitate substanțială”, așa cum sunt.utilizați aici, denotă o caracteristică a secvenței de polinucleotide, în care polinucleotidul cuprinde o secvență care are cel puțin 80% identitate de secvență, preferabil cel puțin 85% identitate, și adesea, 89 - 95% identitate a secvenței, mai uzual, cel puțin 99% identitate a secvenței comparativ cu o secvență de referință peste o fereastră de comparare cu cel puțin 20 de poziții de nucleotide, în mod frecvent, peste o fereastră cu cel puțin 3050 de nucleotide, în care procentul de identitate a secvenței este calculat prin compararea secvenței de referință cu secvența polinucleotidică care poate include deleții sau adiții care totalizează 20% sau mai puțin din secvența de referință peste fereastra de comparare. Secvența de referință poate fi un subset dintr-o secvență mai mare, spre ex., ca un segment din secvența de genă pentru întreaga componentă RNA-zică a telomerazei, așa cum s-a descris aici.
Hibridizarea specifică este definită aici ca formare de hibrizi între o sondă polinucleotidică (ex. un o polinucleotid al invenției care poate include substituții, deleții, și/sau adiții) și o polinucleotidă țintă specifică (de exemplu, o secvență din componenta RNA-zică a telomerazei, sau o secvență de genă genomică, unde sonda hibridizează, de preferință, cu ținta specifică, astfel, încât spre exemplu, o bandă separată corespunzând uneia sau mai multor specii de RNA din gena componentei RNA-zice a telomerazei (sau specii ale componentei RNA-zice a telomerazei clivate sau prelucrate în mod specific] poate fi identificată pe un Northern Blot de RNA preparat dintr-o sursă celulară adecvată (deexemplu, o celulă somatică care exprimă componenta RNA-zică a telomerazei). Polinucleotidele invenției, care hibridizează în mod specific la componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere, sau secvențele telomerice umane, pot fi preparate pe baza datelor despre secvență prevăzute aici, în conformitate cu metodele și principiile termodinamice cunoscute în domeniu și descrise în Maniatis și col., Molecular Cloning: A.Laboratory Manual, 2-nd Ed., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. și Berger și Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA, care sunt incluse aici ca referințe.
Așa cum este utilizat aici, termenul de “condiții de legare corespunzătoare” se referă la condițiile apoase în care o componentă RNA-zică a telomerazei de mamifere se asociază cu componenta sa proteică înrudită și formează o holoenzimă telomerazică activă enzimatic, capabilă de replicare catalitică, reparare, și/sau adăugare de repetiții telomerice dintr-o matriță corespunzătoare conținând repetiții telomerice; astfel de matriță repetitivă telomeră poate fi prezentă sau absentă. Adesea, condițiile de legare adecvate pot fi condițiile fiziologice. “Condițiile fiziologice”, așa cum se folosesc aici, se referă la temperatură, pH, tărie ionică, viscozitate, și alți parametri biochimici care sunt compatibili cu un organism viabil, și/sau care există în mod tipic intracelular, într-o celulă mamiferă cultivată, viabilă, condiții particulare care există în nucleul menționatei celule de la mamifere. Spre exemplu, condițiile intranucleare sau citoplasmatice dintr-o celulă de mamifere cultivată în condiții de cultură tipice de laborator, sunt condiții fiziologice. Condițiile de reacție in vitro adecvate pentru transcrierea cocteilurilor in vitro sunt, în general, condiții fiziologice, și pot fi exemplificate printr-o varietate de extracte nucleare cunoscute în domeniu. în general, condițiile
515
520
525
530
535
540
545
550
555
RO 117328 Bl fiziologice in vitro pot consta în 50 - 200 mM NaCI sau KCI, pH=6,5-8,5, 2O-45°C, și 0,001 - 10 mM cation bivalent (de exemplu, Mg++, Ca++); preferabil, aproximativ 150 mM NaCI sau KCI,pH= 7,2-7,6, 5 mM cation bivalent, și adesea, includ 0,01-1,0 procente de proteină nonspecifică (de exemplu, albumină serică bovină = BSA). Adesea poate fi prezent un detergent non-ionic (Tween, NP-40, Triton X-100), în mod curent la aproximativ 0,001 - 2%, în mod caracteristic 0,05 - 0,2% (v/v). Condiții apoase particulare pot fi selecționate prin metode convenționale, de către un expert. Pentru ghidarea generală, pot fi aplicate următoarele condiții apoase tamponate: NaCI 10-250 mM, Tris-HCI 5-50 mM, pH= 5-8, cu adăugare opțională de cation(i) bivalenți și/sau metale chelatoare și/sau detergenți non-ionici și/sau fracțiuni membranare și/sau agenți antispumanți și/sau scintilanți.
Așa cum s-au utilizat în prezenta lucrare, termenii “marker” sau “marcat” se referă la încorporarea unui marker detectabil, de exemplu, prin încorporarea unui aminoacid radio-marcat sau prin atașarea la o polipeptidă a unor părți biotinil care pot fi detectate cu avidină marcată (de exemplu, streptavidină conținând un marker fluorescent sau activitate enzimatică care poate fi detectată prin metode optice sau calorimetrice). în domeniu sunt cunoscute și pot fi utilizate diferite metode de marcare a polipeptidelor și a glicoproteinelor. Exemple de markeri pentru polipeptide includ, dar nu se limitează la următoarele: radioizotopi (de exemplu, 3H, 14C, 35S, 125l, 131l), markeri fluorescenți (de exemplu, FITC, rodamină, fosfor lantanide), markeri enzimatici (de exemplu, peroxidaza din hrean, β-galactozidaza, luciferaza, fosfataza alcalină), grupări biotinil, epitopi polipeptidici predeterminați, recunoscuți de un raportor secundar (de exemplu, secvențe de perechi zipper de leucină sub formă de fermoar, situsuri de legare pentru anticorpi secundari, polipeptide activatoare transcripționale, domenii de legare a metalelor, capete ale epitopilor). în unele cazuri, markerii sunt atașați prin brațe distanțatoare de diferite lungimi, pentru reducerea potențialelor obstacole sterice.
Așa cum s-a utilizat aici, termenul “semnificativ din punct de vedere statistic” înseamnă un rezultat (adică, o citire a determinării) care, în general, este cel puțin cu două devieri standard peste sau sub media a cel puțin 3 determinări separate a citirii testului martor și/sau care este semnificativ statistic prin determinarea cu ajutorul testului-t Student, sau prin altă măsurătoare acceptată cu semnificație statistică.
Așa cum a fost utilizat în prezenta lucrare, termenul “concentrație patognomonică”, “cantitate patognomonică”, și “schemă de hibridizare patognomonică” se referă la o concentrație, cantitate, sau schemă de localizare a componentei RNA-zice a telomerazei dintr-o probă, care indică prezența unei stări patologice (de exemplu, neoplazice, de senescență, imunodeficitară, neurodegenerative, inflamatorii, etc.) sau a unei predispoziții pentru dezvoltarea unei boli neoplazice, cum ar fi, carcinoame, sarcoame, sau leucemii. 0 cantitate patognomonică este o cantitate din componenta RNA-zică a telomerazei dintr-o celulă sau dintr-o probă celulară, care cade în afara gamei de valori clinice normale, care se stabilește prin studii clinice statistice prospective și/sau retrospective. în general, un individ care are o boală neoplazică (de exemplu, carcinom, sarcom, sau leucemie] va prezenta o cantitate de componentă RNAzică a telomerazei într-o probă de celulă sau țesut, care este în afara gamei de concentrații care caracterizează indivizii normali, care nu prezintă boală; în mod caracteristic, concentrația patognomonică este· cel puțin o abatere standard în afara mediei
RO 117328 Bl normale, mai frecvent, este la cel puțin două abateri standard sau mai mult peste valoarea normală medie. Totuși, în esență, toate testele de diagnostic clinic produc un oarecare procent de falsuri pozitive și falsuri negative. Sensibilitatea și selectivitatea testului de diagnostic trebuie să fie suficiente pentru a satisface obiectivul de diagnostic și orice cerință reglatoare relevantă. în general, metodele de diagnostic ale invenției sunt utilizate pentru a identifica indivizii candidați la îmbolnăvire, prevăzând un parametru suplimentar într-un diagnostic diferențial al bolii dat de un profesionist competent din domeniul sănătății.
Așa cum s-a utilizat aici, termenul “alelă de boală” se referă la o alelă a unei gene care este capabilă să producă o boală de recunoscut. O alelă de boală poate fi dominantă sau recesivă și poate produce boala direct sau când se află în prezența unei combinații cu un fundament genetic specific, sau preexistând starea patologică. O alelă de boală poate fi prezentă în rezerva genetică sau poate fi generată (sintetizată) de novo într-un individ, prin mutație somatică.
Termenul “agent antineoplazic” este utilizat aici cu referire la agenții care au proprietatea funcțională de inhibare a dezvoltării sau progresării unui neoplasm la om, adesea incluzând inhibarea metastazei sau a potențialului metastatic.
Așa cum a fost utilizat aici, termenul “legat operabil” se referă la o legătură între elemente polinucleotidice într-o relație funcțională. Un acid nucleic este “operabil legat” când este plasat într-o relație funcțională cu altă secvență de acid nucleic. Spre exemplu, un promotor sau intensificator este operabil legat la o secvență de codificare dacă el afectează transcrierea secvenței de codificare. Operabil legat înseamnă că secvențele de DNA fiind legate, sunt în mod caracteristic învecinate și, unde, în mod necesar se îmbină două regiuni de codificare de proteine, învecinate și în cadrul de citire. Totuși, deoarece secvențele de creștere (“enhancer”) funcționează, în general, când sunt separate de promotor prin câteva kilobaze, iar secvențele intronice pot fi de lungimi variabile, unele elemente polinucleotidice pot fi operabil legate, dar nu învecinate. O genă structurală (de exemplu, o genă tk a HSV) care este operabil legată de o secvență polinucleotidică corespunzătoare unei secvențe de reglare transcripțională a unei gene endogene, este, în general, exprimată într-o schemă temporal substanțial aceeași și specific față de tipul de celulă, ca și gena existentă în mod natural.
Așa cum s-a utilizat aici, termenul “unitate transcripțională” sau “complex transcripțional” se referă la o secvență polinucleotidică care cuprinde o genă structurală (exoni), un promotor legat activ în poziția cis, și alte secvențe c/s-active necesare pentru transcrierea eficientă a secvențelor structurale, elemente reglatoare periferice necesare pentru transcrierea evolutivă, adecvată, specifică de țesut a secvențelor structurale, și secvențe cis suplimentare, importante pentru transcrierea și translația eficiente (de exemplu, situsul de poliadenilare, secvențe care controlează stabilitatea mRNA).
Termenul “modulare transcripțională” este utilizat aici cu referire la capacitate, fie de a spori, fie de a inhiba transcrierea unei secvențe structurale legate în cis; asemenea creștere sau inhibare poate fi condiționată de apariția unui eveniment specific, cum ar fi, stimularea cu un inductor și/sau se poate manifesta doar în anumite tipuri de celule.
605
610
615
620
625
630
635
640
645
RO 117328 Bl
Așa cum s-a utilizat aici, termenul “regiune reglatoare a transcrierii” se referă la o secvență DNA care cuprinde un promotor funcțional și orice elemente asociate cu transcrierea (de exemplu, secvență de creștere, cutie CCAAT, cutie TATA, situs
SP1, etc.) care sunt esențiale pentru transcrierea unei secvențe polinucleotidice care este operabil legată de regiunea reglatoare a transcrierii.
Termenul “alelă nulă”, așa cum este utilizat aici înseamnă că un locus din genă cuprinde cel puțin o mutație sau modificare structurală, așa încât alela nulă să fie substanțial incapabilă să direcționeze exprimarea eficientă a unui produs funcțional al genei. O celulă “Knockout” este o celulă care are cel puțin o alelă nulă a unei gene endogene, fiind în mod tipic homozigotă pentru alela nulă. Astfel, spre exemplu, o celulă knockout poate fi homozigot pentru alelele nule în locusul componentei RNA-zice a telomerrazei, așa încât celula knockout să fie substanțial incapabilă să exprime o componentă RNA-zică funcțională a telomerazei.
Invenția prezintă metode, reactivi, animale și celule modificate genetic, și compoziții farmaceutice legate de telomeraza umană ribonucleoproteică.
Nomenclatura utilizată, în continuare, și procedeele de laborator referitoare la cultura de celule, genetică moleculară, și chimia și hibridizarea acizilor nucleici, descrise mai jos, pot implica procedee bine cunoscute și folosite în mod curent în domeniu. Tehnici standard sunt utilizate pentru metode de obținere de acizi nucleici recombinând, sinteza de polinucleotide și cultura și transformarea microbiană (de exemplu, electroporare, lipofecție). Tehnicile și procedeele sunt,în general, efectuate în conformitate cu metodele convenționale din domeniu și cu diverse referințe bibliografice generale (a se vedea, în general, Sambrookm și colab. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-nd ed.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., care este încorporată aici ca referință) care sunt furnizate în întregime de acest document.
□ligonucleotidele pot fi sintetizate pe un sintetizator de oligonucleotide Applied Bio Systems, în conformitate cu specificațiile furnizate de producător.
Metodele pentru amplificare PCR sunt descrise în domeniu [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification ed.HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila și col.(1991) Nucleic Acids Res. 19; 4967; Eckert, K.A. și Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, eds. McPherson, Quirkes, și Taylor, IRL Press, Oxford; și US 4.683.202, care sunt incluse aici ca referințe).
Invenția în parte, rezultă din donarea și izolarea componentei RNA-zice a telomerazei umane și a genei pentru acea componentă RNA-zică, inclusiv elementele asociate de control transcripțional. Secvența nucleotidică a componentei RNA-zice a telomerazei umane este prezentată mai jos. Pentru comoditate, secvența este prezentată cu ajutorul prescurtărilor standard pentru ribonucleotide (A este riboadenină, G este riboguanină, C se ribocitidină, iar U este uridină). Experții în domeniu recunosc că secvența prezentată mai jos mai arată și secvența cDNA, în care ribonucleotidele sunt înlocuite cu deoxiribonucleatide (cu uridina înlocuită de timidină).
RO 117328 Bl ggguugcggagggagggugggccugggaggggugguggccauuuuuuguc ‘ ‘ ‘ ‘ 100
UAACCCUAACUGĂGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC ‘ ‘ ‘ * 150
UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU ‘ ‘ ‘ ‘ * 200 UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC ‘ ‘ ‘ 250
GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC * ‘ * * *300
UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC ‘ ‘ ‘ ‘ ‘350
GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU ‘ ‘ ‘ ‘400
UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC •‘ ,
450 GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC
500 AGUUCGCUUUCCUGULJGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC • * * * a
550 CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC • 559
CAGUGUGCU
690
695
700
705
Secvența de mai sus este arătată în sensul 5-3' și este numerotată pentru referință. Se crede că secvența matriță a componentei RNA-zice este localizată în regiunea definită de nucleotidele 50-60 (5’-CUAACCCUAAC-3'), care este complementară cu o secvență telomerică compusă din aproximativ una și două treimi unități repetitive telomerice.
Această secvență a derivat din clone cDNA și dintr-o clonă genomică a componentei RNA-zice. Când componenta RNA-zică este transcrisă mai întâi din gena corespunzătoare, cel puțin câțiva dintre transcripții RNA produși sunt mult mai lungi decât secvența nucleotidică -560 arătată mai sus și, în fapt, poate cuprinde mai mult de 1000 de nucleotide. Cu toate acestea, o moleculă de telomerază complet funcțională poate fi asamblată din transcripții constând din secvența -560 de nucleotide prezentată mai sus. Capătul 3-terminal al componentei RNA-zice din telomeraza nativă este presupus a se întinde în regiunea definită de nucleotidele 514-559 din secvența de mai sus. Analiza indică faptul că, la capătul 3'-terminal poate fi restul de U la nucleotidul 538. Pentru prepararea telomerazei active mai pot fi, de asemenea, utilizate și molecule ale componentei RNA-zice recombinante, care cuprind mai puțin decât nucleotidele 1-559 din secvența prezentată mai sus.
□ clonă genomică a fost identificată și izolată dintr-o bibliotecă genomică a DNA-ului uman inserată într-un vector lambda FIXII. Clona genomică, conținând secvențele, genei pentru componenta RNA-zică, a conținut o inserție de - 15 kb și a fost denumită clona 28-1. Gena este localizată pe capătul periferic al brațului q al cromozomului 3. Informația secvenței obținută dintr-un situs de recunoaștere al enzimei de restricție SaulIlAI la un capăt al inserției de - 15kb spre un situs de recunoaștere intern al enzimei de restricție HiniM, care cuprinde toată secvența componentei RNAzice mature, ca și elementele de control al transcrierii din gena pentru componenta RNA-zică, din clona 28-1 lambda, etc. prezentată mai jos, cu ajutorul prescurtărilor standard pentru deoxiribonucleotide, și reprezentate în direcția 5'-3'.
710
715
720
725
730
735
RO 117328 Bl
RO 117328 Bl
1000 C CT CTG CT CAAGGAGAGG CTGGAGAAG G CATTCTAAGG AGAAGG GG GCAG ‘ ‘ ‘ ‘ *1050
GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG 1 ‘ ‘ ‘ 1100 TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT 4 ‘ ‘ ‘ ‘1150
GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT 4 ‘ ‘ ‘ ‘1200
GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA ‘ ‘ ‘ 41250
GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA 4 ‘ ‘ ‘ *1300
AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC 4 ‘ ‘ 41350
GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC * ‘ ‘ ‘ 41400
C AGCCCG CCCGAGAGAGTGACTCTCACG AGAGC CG CGAGAGTCAGCTTGG 4 ‘ ‘ ‘ ‘1450
770
775
780
CCAATCCGTGCGGTCGGCGGGCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC ‘ ’ * *1500 agcgcaccgggttgcggagggagggtgggcctgggaggggtggtggccat 4 * ‘ * *1550
TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC ‘ ‘ ‘ ‘ 1600 CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC * * * * *1650
TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG * * * ‘ ‘1700
GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA ‘ * *1750
ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT ‘ ‘ ‘ ‘ 1 1800 GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG * ‘ ‘ ‘ ‘1850
GGCGAGGTTOACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG ‘ ‘ ‘ ‘ 41900
CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC ‘ ‘ ‘ 41950
ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA 4 * 1 < a
2000 TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT ‘ *2050
GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA » ‘ 4<
2100 AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC ‘ ‘ ‘ ‘2150
TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT ‘ ‘ 1 4 2200 ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA ‘ ‘ ‘ 4 1 2250
AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT 1 * ‘ 4 ‘2300
TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA ‘ ‘ 4 ‘2350
AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA ‘ ‘ * 4 *2400
GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC * 4 ‘2425
AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT
785
790
795
800
805
810
RO 117328 Bl
Secvența componentei RNA-zice începe la baza 1459. în secvență sunt identificate o varietate de elemente de control al transcrierii. 0 secvență consens a cutiei A/T este găsită la nucleotidele 1431-1436; secvențele consens PSE sunt găsite la nucleotidele 1406-1414, ca și la nucleotidele 1508-1526; o secvență consens a cutiei CAAT se găsește la nucleotidele 1399-1406; o secvență consens SP1 este găsită la nucleotidele 1354-1359; și o secvență consens a elementului răspuns la ^//-interferon se găsește la nucleotidele 1234-1245: Transcrierea în stare staționară a genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane în celule umane cum ar fi, HT 1080 (care exprimă telomerază) este substanțial nemodificată atunci când secvențele din amonte de nucleotidul 1159 sunt șterse în vectorii care sunt transfectați stabil în celule.
DNA-ul de la maimuța veveriță, care se presupune a fi printre cele mai divergente, din punct de vedere genetic, primate non-umane, comparativ cu oamenii, cuprinde o genă pentru componenta RNA-zică a telomerazei care este amplificabilă cu primeri PCR constând din secvențe care corespund cu sau sunt complementare cu secvența polinucleotidică pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane, descrisă. Alte primate non-umane sunt presupuse a poseda gene pentru componenta RNA-zică a telomerazei, care sunt, de asemenea, amplificabile cu primeri PCR derivați din secvența genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane.
Polinucleotidele componentei RNA-zice a telomerazei
Dezvăluirea secvențelor pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere și ale genei sale, așa cum s-a arătat sus pentru telomerază umană, și în fig.5 pentru telomerază de la maimuța veveriță, face posibilă construirea de polinucleotide izolate care cuprind o secvență de cel puțin 15 nucleotide învecinate, în mod caracteristic cel puțin 20-25 polinucleotide învecinate, care sunt substanțial identice cu o secvență pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere, sau cu secvența genei pentru componenta RNA-zică de la mamifere. Mai mult, secvențele (și gena) pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere fac posibilă construirea de sonde de hibridizare a acizilor nucleici și primeri PCR care pot fi utilizați pentru detectarea de secvențe de RNA și DNA ale componentei și/sau genei pentru componenta RNA-zică vecină din telomerază, dintr-o celulă, probă celulară, secțiune de țesut, vas de reacție, membrană de hibridizare, sau altele de acest tip.
Polinucleotidele conținând secvențe ale componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere, pot include secvențe care facilitează transcrierea (secvențe de exprimare), secvențe de stabilizare a RNA-ului, și similari. Principiile generale pentru construirea unor astfel de polinucleotide în vederea informațiilor despre secvența descrisă în prezenta lucrare, precum și orientarea și direcționarea invenției, sunt bine cunoscute în domeniu și sunt descrise în continuare în Maniatis și colab., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. a 2-a (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. Spre exemplu, dar nu pentru limitare, astfel de polinucleotide pot include un promotor și, opțional, un crescător (“enhancer”) spre utilizare în gazde eucariote de producere (exprimare), și, opțional, secvențe necesare pentru replicarea unui vector. 0 casetă tipică de exprimare, eucariotă va include o secvență polinucleotidică care, când este transcrisă, produce un transcript al componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere; o astfel de secvență polinucleotidică este legată în aval (adică în sensul de transcriere, 5'-3' al unui promotor adecvat, cum ar fi, promotorul tk al HSV sau promotorul pgk (fosfoglicerat kinază), opțional legată de un enhancer.
RO 117328 Bl ΐη plus, acolo unde exprimarea unei componente RNA-zice funcționale a telomerazei nu este dorită, polinucleotidele acestei invenții nu trebuie să transcrie un transcript funcțional al componentei RNA-zice a telomerazei. Polinucleotidele prezentei invenții pot servi ca sonde de hibridizare și/sau primeri pentru PCR (amplimeri) și/sau oligomeri pentru LCR în detectarea secvențelor RNA-zice sau DNA-zice ale componentei RNA-zice a telomerazei.
Alternativ, polinucleotidele prezentei invenții pot servi ca sonde de hibridizare sau primeri pentru detectarea secvențelor RNA-zice sau DNA-zice ale genelor înrudite, sau ca genă pentru componenta RNA-zică a telomerazei la specii înrudite, în mod caracteristic, specii de mamifere. Pentru astfel de hibridizare și aplicații PCR, polinucleotidele prezentei invenții nu trebuie să transcrie o componentă funcțională RNAzică a telomerazei. Astfel, polinucleotidele prezentei invenții pot conține substanțiale deleții, adiții, substituiri și/sau transpoziții de nucleotide, atât de lungi, încât hibridizarea specifică sau amplificarea specifică la o secvență pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere să fie susținute.
Clonele genomice sau de cDNA ale componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere și secvențele genei corespunzătoare, pot fi izolate din biblioteci de clone (de exemplu,disponibile de la Clontech, Palo Alto, CA) prin utilizarea sondelor de hibridizare desemnate pe baza secvențelor de nucleotide descrise aici, și prin utilizarea metodelor convenționale de screening al hibridizării (de exemplu,Benton WD și Davis RW (1977) Science 196; 180; Goodspeed și col. (1989) Gene 76; 1). Când se dorește o clonă cDNA, sunt preferate bibliotecile de clone care conțin cDNA derivat din RNA de celule somatice, sau alt RNA celular care exprimă componenta RNA-zică a telomerazei. Alternativ, secvențe de polinucleotide sintetice corespunzătoare întregii secvențe sau unei părți din secvențele descrise aici, pot fi construite prin sinteza chimică de oligonucleotide. în plus, reacția de amplificare în lanț (PCR) cu utilizare de primeri, bazată pe datele de secvență descrisă aici, poate fi utilizată pentru amplificarea fragmentelor de DNA din DNA-ul genomic, rezerve de RNA, sau din bibliotecile de clone de cDNA. Brevetele US 4683195 și 4683202 descriu metoda PCR.
Astfel de polinucleotide au o varietate de utilizări, incluzând: ca sonde pentru componenta RNA-zică a telomerazei, ca matrițe pentru producerea componentei RNAzice funcționale sau nefuncționale a telomerazei în celule, ca reactivi comerciali de diagnostic pentru standardizarea unei determinări de detecție a componentei RNA-zice a telomerazei, ca polinucleotide în terapia genică spre administrare la un animal; asemenea polinucleotide mai pot fi utilizate ca alimente, surse de combustibil energetic, agenți de absorbție a radiațiilor solare UV, și ca agenți de creștere a viscozității, printre alte întrebuințări.
Plasmidele care au fost descrise aici, și care au fost construite prin donarea componentei RNA-zice a telomerazei umane, și gena pentru componenta RNA-zică sunt aspecte importante ale prezentei invenții. Aceste plasmide pot fi utilizate pentru producerea componentei RNA-zice, ca și a genei pentru telomeraza umană, sub formă substanțial pură, un alt aspect important al prezentei invenții. în plus experții în domeniu recunosc că o varietate de alte plasmide, ca și acizii nucleici non-plasmidiali sub formă substanțial pură, care cuprind toată sau o parte (cel puțin) utilă din secvența de nucleotide pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane, sunt materiale utile prevăzute de prezenta invenție.
865
870
875
880
885
890
895
900
905
RO 117328 Bl
Ca un punct general privind acizii nucleici și preparatele care îi conțin, din invenție, experții în domeniu recunosc că acizii nucleici din invenție includ, atât molecule de DNA, cât și molecule de RNA, ca și analogii sintetici, apăruți în mod nenatural, ai acestora, precum și heteropolimeri ai deoxiribonucleotidelor, ribonucleotide, și/sau analogi ai acestora. Compoziția particulară a unui acid nucleic sau analog al acidului nucleic din invenție, va depinde de scopul pentru care materialul va fi folosit și de mediul(iile) în care va fi plasat materialul. Nucleotide modificate sau sintetice, neexistente în mod natural, au fost proiectate pentru a servi unei varietăți de scopuri și pentru a rămâne stabile într-o varietate de medii, cum ar fi cele în care sunt prezente nucleaze, așa cum se cunoaște în domeniu. Nucleotidele modificate sau sintetice, neexistente în mod natural, comparativ cu ribo- sau deoxiribonucleotidele existente în mod natural, pot diferi din punct de vedere al carbohidratului (zahăr), al legăturii fosfat, sau al părților de baze, ale nucleotidelor, sau pot conține chiar o bază non-nucleotidică (sau nici o bază), în unele cazuri. A se vedea, spre ex. Arnold și colab., PCT/WO 89/02439, intitulat Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes [Reactivi de legare non-nucleotidici pentru sondele de nucleotide), inclusă aici ca referință. întrucât acizii nucleici din invenție pot conține o largă varietate de nucleotide, aceștia (acizii nucleici) pot servi o largă varietate de funcții utile.
Izolarea genelor Înrudite
Așa cum indică descrierea precedentă, accesul la acizi nucleici purificați care cuprind secvența pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane furnizează metode și reactivi de diagnostic și terapeutici, valoroși, ca și alte importante beneficii. Un beneficiu important al prezentei invenții este acela că metodele și reactivii invenției pot fi utilizați pentru izolarea componentei RNA-zice și a genelor pentru componenta RNA-zică a telomerazei de la orice specie de mamifere care are o componentă RNAzică substanțial omoloagă cu componenta RNA-zică umană din prezenta invenție. Fraza “substanțial omolog” se referă la acel grad de omologie cerut pentru hibridizarea specifică a unui oligonucleotid sau a unei secvențe de acid nucleic din componenta RNA-zică umană față de o secvență de acid nucleic sau de o secvență din componenta RNA-zică de la o altă specie de mamifere. Fiind dată o astfel de omologie substanțială, experții în domeniu pot utiliza acizii nucleici și primerii oligonucleotidici, precum și sondele prezentei invenții pentru a identifica și izola secvențe substanțial omoloage.
Spre exemplu, unii pot sonda o bibliotecă genomică sau de cDNA pentru a detecta secvențe omoloage. Unii pot utiliza, de asemenea, primerii corespunzători regiunilor din secvența pentru componenta RNA-zică și amplificarea PCR în condiții de severitate scăzută sau moderată pentru amplificarea unei secvențe omoloage de acid nucleic, specifice, din preparatele de RNA sau DNA de la o specie de mamifer. Prin utilizarea acestor tehnici și a altora similare, experții în domeniu pot izola rapid nu doar acizii nucleici ai diferitelor variante de componentă RNA-zică din celule umane, ci și acizi nucleici omologi pentru componenta RNA-zică de la alte celule de mamifere, cum ar fi, celulele de la primate, de la mamifere de interes veterinar, adică vite, oi, cai, câini, și pisici, și de la rozătoare, adică șobolani, șoareci și hamsteri. Alternativ, acești acizi nucleici pot fi utilizați pentru obținerea de animale transgenice de mare valoare pentru screeningul și testarea produselor farmaceutice care reglează activitatea telomerazică. Spre exemplu, prin utilizarea unei plasmide din această invenție, unii pot “knock out gena pentru componenta RNA-zică sau pot înlocui gena pentru
RO 117328 Bl componenta RNA-zică, naturală, cu o genă recombinantă inductibilă, într-o celulă embrionară de trunchi mus spretus, și apoi pot genetra un șoarece transgenic care va fi util ca model sau ca sistem test pentru studiul bolii legate de vârstă sau îmbătrânire. Exemplul 9, de mai jos, ilustrează cum a fost utilizată o astfel de metodologie pentru identificarea și izolarea secvențelor pentru componenta RNA-zică de la primate.
Alți omologi mamiferi ai componentelor RNA-zice ale telomerazei de la om și maimuță și/sau genele înrudite, pot fi identificați și izolați prin screeningul unei biblioteci adecvate de clone genomice sau de cDNA de la mamifere non-umane, cum ar fi, biblioteca derivată de la șoarece, șobolan, iepure, cobai, hamster, câine, bovine, ovine, lup, porcine, sau altă bibliotecă genomică sau de cDNA, într-un vector corespunzător, cum ar fi cromozomi artificiali de drojdie, cosmide, sau bacteriofag λ (de exemplu, Charon 35 λ), cu o sondă polinucleotidică conținând o secvență, de cel puțin 20 de nucleotide învecinate (sau complementul lor) dintr-o secvență polinucleotidică a componentei RNA-zice sau a genei pentru telomeraza umană sau de maimuță. în mod tipic, condițiile de hibridizare și de spălare sunt îndeplinite cu mare strictețe, în conformitate cu procedeele de hibridizare convenționale. Sunt izolate și secvențializate clonele pozitive. Pentru ilustrare, și nu pentru limitare, un polinucleotid întreg (cu toată lungimea), corespunzător secvenței de 559 de nucleotide a componentei RNA-zice a telomerazei umane, poate fi marcat și utilizat ca o sondă de hibridizare pentru izolarea clonelor genomice dintr-o bibliotecă de clone genomice non-umane, în AEMBL4 sau XGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); condiții de hibridizare tipice pentru screeningul lifturilor de pe placă (Benton și Davis (1978) Science 196: 180; Dunn și col. (1989) J.Biol.Chem.264: 13057) pot fi: 50% formamidă, 5 x SSC sau SSPE, 1-5 x soluție Denhardt, 0,1-1% SDS, 100-200 pg DNA sau tRNA heterologi tăiați, 0-10% dextran sulfat, 1 χ 105 până la 1 χ 107 cpm/ml de sondă denaturată, cu o activitate specifică, de aproximativ 1 x 10a cpm/^g, și incubare, la 42-37°C, timp de aproximativ 6-36 h. Condițiile de prehibridizare sunt, în esență, identice, cu excepția că sonda nu este inclusă și timpul de incubare este redus în mod tipic. Condițiile de spălare sunt în mod caracteristic, 1-3 x SSC, 0,1-1% SDS, 45-70°C cu schimbarea soluției de spălare, la aproximativ 5-30 min. Pentru izolarea polinucleotidelor componentei RNA-zice a telomerazei non-umane cu o sondă polinucleotidică pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane, este adesea preferabilă hibridizarea în condiții mai susțin stricte, cum ar fi, aproximativ 39°C și spălarea în etape, la următoarele temperaturi: temperatura camerei, 37°C, 39°C, 42°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, și 70°C, stopând după fiecare etapă și monitorizând semnalul de fond al sondei (și opțional, detectând semnalul prin autoradiogramă și/sau fosfor imagine, dacă este utilizată sondă radiomarcată) și terminând etapele de spălare atunci când este atins raportul potrivit semnal/zgomot, prin determinare empirică.
Polinucleotide conținând secvențe, de aproximativ, cel puțin 30-50 de nucleotide, preferabil cel puțin 100 de nucleotide, corespunzătoare sau complementare cu secvențele de nucleotide arătate în prezenta lucrare pentru secvențele componentei RNA-zice a telomerazei umane și de maimuță, pot servi ca primeri pentru tehnica PCR și/sau ca sonde de hibridizare pentru identificarea și izolarea genelor “germline” corespunzătoare genei descrise (descoperite) și secvențelor pentru componenta RNAzică. Asemenea gene “germline” pot fi izolate prin diferite metode convenționale în domeniu, incluzând, dar nelimitându-șe la screeningul hibridizării bibliotecilor genomice
955
960
965
970
975
980
985
990
995
RO 117328 Bl în bacteriofagul λ sau a bibliotecilor de cosmide, sau la amplificarea prin tehnica PCR a secvențelor genomice cu utilizarea de primeri derivați din secvențele descoperite în prezenta lucrare. Bibliotecile genomice umane sunt accesibile publicului sau pot fi construite de novo, din DNA uman.
Este evident pentru un expert în domeniu că în polinucleotidele prezentei invenții pot fi încorporate substituiri, deleții și adiții de nucleotide. Variația secvenței de nucleotide poate rezulta din polimorfismele secvenței diferitelor alele, și a analogilor. Cu toate acestea, asemenea substituiri, deleții, și adiții de nucleotide nu trebuie să rupă substanțial capacitatea polinucleotidei de a hibridiza una dintre secvențele de polinucleotide (în întregime] ale componentei RNA-zice a telomerazei umane sau de maimuță, prezentate aici, în condiții de hibridizare care sunt suficient de stricte pentru a produce o hibridizare specifică.
Polinucleotidele componentei RNA-zice a telomerazei de la mamifere pot fi oligonucleotide scurte (de exemplu, cu o lungime de 2O-1OO de baze), cum ar fi, pentru utilizarea ca sonde de hibridizare și primeri pentru tehnica PCR (sau LCR). Secvențele polinucleotidice mai pot cuprinde o parte dintr-un polinucleotid mai mare (de exemplu, un vector de donare care cuprinde o clonă a componentei RNA-zice a telomerazei) și pot fi fuzionate, prin legare polinucleotidică, cu o altă secvență polinucleotidică. în mod caracteristic, polinucleotidele componentei RNA-zice a telomerazei cuprind cel puțin 25 de nucleotide consecutive care sunt substanțial identice cu o componentă RNA-zică a telomerazei existente în mod natural sau cu o secvență de genă, mai uzual, polinucleotidele componentei RNA-zice a telomerazei conțin cel puțin 50-1 □□ nucleotide consecutive care sunt substanțial identice cu o secvență a componentei RNA-zice a telomerazei de mamifere existente în mod natural. Totuși, un expert în domeniu va recunoaște că lungimea minimă a polinucleotidului din componenta RNA-zică a telomerazei, necesară pentru hibridizarea specifică cu o secvență țintă a componentei RNA-zice a telomerazei, va depinde de mai mulți factori: conținutul în G/C, poziționarea bazelor greșit împerecheate (dacă există), gradul de unicitate al secvenței comparativ cu populația de nucleotide țintă, și natura chimică a polinucleotidei (de exemplu, schelet metilfosfonat, acid nucleic poliamidic, fosforotiolat, etc.), printre alții.
Dacă se dorește, amplimerii PCR pentru amplificarea copiilor de cDNA substanțial complete (ca lungime), pot fi selecționați la discreția practicianului. în mod similar pot fi selecționați amplimeri pentru amplificarea porțiunilor din gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei (umane sau de maimuță).
Fiecare dintre aceste secvențe poate fi utilizată ca sonde de hibridizare sau amplimeri PCR pentru detectarea prezenței componentei RNA-zice a telomerazei, spre ex. pentru diagnosticarea unei boli neoplazice ce caracterizate de prezența unui nivel ridicat sau redus de componentă RNA-zică a telomerazei în celule, sau pentru realizarea amprentelor de țesut (adică identificarea țesuturilor caracterizate prin exprimarea componentei RNA-zice'a telomerazei), și altele similare. Secvențele pot fi utilizate și pentru detectarea secvențelor genomice de genă pentru componentă RNA-zică a telomerazei, într-o probă de DNA, cum ar fi pentru analiza judiciară cu ajutorul DNAului (de exemplu, prin analiza RFLP, distribuția lungimii(ilor) produsului tehnicii PCR, etc.) sau pentru diagnosticul bolilor caracterizate prin amplificarea și/sau rearanjărilor din gena pentru componenta RNA-zică.a telomerazei.
RO 117328 Bl
Spre exemplu, și nelimitativ, următoarea pereche de primeri oligonucleotidici poate fi utilizată pentru amplificarea secvențelor polinucleotidice a componentei RNAzice a telomerazei (de exemplu, cDNA) sau ca sonde de hibridizare (de exemplu, ca sonde oligonucleotidice biotinilate sau marcate la capăt):
5'-AGCACACTGGCCCAGTCAGTCAGGTTTG-3'
Și 5'-GGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGA-3'.
Alți primeri pentru tehnice PCR adecvați, primeri LCR, sonde de hibridizare și primeri, și analogi ai acestora sunt evidenți pentru experți din domeniu, în privința secvențelor componentei RNA-zice a telomerazei, dezvăluite prin prezenta lucrare, și care pot fi obținute odată cu aceștia. Polinucleotidele componentei RNA-zice a telomerazei umane și complemenții lor pot servi ca sonde de hibridizare sau ca primeri pentru detectarea secvențelor de RNA sau DNA ale componentei RNA-zice a telomerazei de mamifere. Pentru ca, o asemenea hibridizare și aplicații PCR să poată conține substanțiale deleții, adiții, substituții nucleotidice și/sau transpoziții nucleotidice, atâta, încât hibridizarea specifică sau amplificarea specifică a unei secvențe a componentei RNA-zice a telomerazei umane să fie susținute. Cu toate acestea, asemenea substituții, deleții și adiții de nucleotide nu ar trebui să strice în mod substanțial capacitatea polinucleotidului de a hibridiza cu o componentă RNA-zică a telomerazei sau cu o secvență de genă în condiții de hibridizare care să fie suficient de stricte pentru a avea ca rezultat hibridizarea specifică.
Spre exemplu, și nu limitativ, un polinucleotid al componentei RNA-zice a telomerazei umane poate cuprinde secvența de la nucleotidul 48 până la nucleotidul 209, care este considerată suficientă pentru reconstituirea holoenzimei telomerazice umane în prezența componentei proteice a telomerazei:
5' -UCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCAC CGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCC-3 ' sau ca DNA:
' -TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGC TGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCAC CGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCC-3 » .
De asemenea, un polinucleotid al componentei RNA-zice a telomerazei umane poate cuprinde sau constă din nucleotidele 1-559, și poate include adiții terminale de alte nucleotide sau secvențe nucleotidice. O variantă matriță demodulată constând din nucleotidele 48-209, dar în care secvența matriță repetitivă telomerică este modicată este aptă să concureze cu o componentă RNA-zică scindată constând din secvența 48-209 de tip sălbatic, pentru legarea la componenta proteică a telomerazei și pentru reconstituirea holoenzimei telomerazice.
Analiza structurală a componentei RNA-zice a telomerazei umane indică regiuni având o tendință spre formarea de structuri secundare, cum ar fi, bucle sau formă de agrafe. Spre exemplu, regiunea,de la aproximativ nucleotidul 200 până la nucleotidul 350 din componenta RNA-zică a telomerazei umane are un substanțial caracter de buclă de agrafă. Alte porțiuni ale componentei RNA-zice a telomerazei au la fel de
1050
1055
1060
1065
1070
1075
1080
1085
1090
RO 117328 Bl bine un caracter semnificativ de structură secundară. în ceea ce privește această structură secundară menționată, alte secvențe nucleotidice care sunt presupuse de către analiza pe calculator ca adoptă formațiuni de structură secundară similare, pot fi substituite de către specialiști din domeniu. Deși o varietate de programe pe calculator sunt adecvate determinării secvențelor de nucleotide care adoptă structuri secundare substanțial echivalente, pot fi utilizate și următoarele programe Software pentru analiza de secvență UWGCG: FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES, DOMES, NOUNTAINS, și STEMLODP. în mod asemănător, mimetici de structură non-nucleotidici, cum ar fi acizii peptid nucleici și analogi, pot fi creați prin programe de modelare moleculară, ca mimetici ca structura secundară caracteristică regiunii(ilor) din componenta RNA-zică a telomerazei umane, care se dorește a fi imitată. Asemenea mimetici structurali pot fi utilizați în terapie sau pentru diferite întrebuințări (de exemplu, antagonist competitiv, etc.).
Antisens
Un tip de acid nucleic, util în mod special, din prezenta invenție este un oligonucleotid antisens care poate fi utilizat in vivo sau in vitro pentru inhibarea activității telomerazei umane. Oligonucleotidele antisens cuprind o secvență specifică, cu aproximativ de la 10 până la 25-200 sau mai mult (adică, suficient de mare pentru a forma un duplex stabil, dar suficient de mică, în funcție de modul de eliberare, pentru administrare in vivo, dacă se dorește) de nucleotide complementare cu o secvență specifică de nucleotide din componenta RNA-zică a telomerazei umane. Mecanismul de acțiune al unor asemenea oligonucleotide poate implica legarea componentei RNA-zice fie pentru prevenirea asamblării telomerazei ribonucleoproteice funcționale, fie pentru evitarea folosirii componentei RNA-zice ca matriță pentru sinteza DNA-ului telomeric, fie pentru destabilizarea componentei RNA-zice a telomerazei și reducerea timpului său de înjumătățire, și/sau pentru inhibarea transcrierii genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei.
Oligonucleotide antisens ilustrative, ale prezentei invenții, care servesc pentru inhibarea activității telomerazei in vivo și/sau in vitro, includ oligonucleotidele menționate mai sus în legătură cu testele efectuate pentru a determina dacă clona pGRN7 cuprinde cDNA-ul pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane. Așa cum s-a menționat mai sus, 3 astfel de oligonucleotide au fost utilizate pentru a demonstra inhibarea activității telomerazei in vitro. Secvența fiecăreia dintre aceste 3 oligonucleotide este prezentată mai jos.
T35'-CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3' P35'-CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG-3' TA3 5’-GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT-3'
Aceste oligonucleotide pot fi utilizate și pentru inhibarea activității telomerazei în celulele umane.
Experții în domeniu vor recunoaște că prezenta invenție prevede o bară varietate de oligonucleotide antisens capabile să inhibe activitatea telomerazei. 0 altă oligonucleotidă antisens utilă din prezenta invenție este oligonucleotidă Tel-AU, care are secvența:
5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3' și care, la fel ca oricare oligonucleotid antisens al prezentei invenții, poate fi sintetizat utilizând nucleotide fosforotioate, metil· fosfonați-chirali, nucleotide existente în mod
RO 117328 Bl natural, sau amestecuri ai acestora pentru a atribui stabilitate și Tm-ul dorit. Experții în domeniu recunosc că o largă varietate de analogi nucleotidici modificați, cum ar fi, ribonucleotide O-metilice, nucleotide fosforotioate, și nucleotide metil fosfonate, poate fi utilizată pentru producerea de acizi nucleici din prezenta invenție cu proprietăți dorite mai mult (adică, rezistență la nuclează, legare mai strânsă, etc.) decât cele produse prin utilizarea de nucleotide existente în mod natural. Alte tehnici pentru a face oligonucleotidele rezistente la nuclează, le includ pe cele descrise, în PCT/WO 94/12633.
Exemple suplimentare direcționate spre modularea activității telomerazei includ metode care folosesc polinucleotide antisens specifice, complementare cu toate sau cu o parte a secvențelor componentei RNA-zice a telomerazei umane (hTR), cum ar fi, polinucleotidele antisens față de gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane sau față de RNA-ul său transcris, incluzând formele scindate care pot fi asociate cu holoenzima telomerazică. Astfel de polinucleotide antisens complementare pot include substituții, adiții, deleții, sau transpoziții de nucleotide, atât de lungi încât legarea specifică la secvența țintă relevantă corespunzătoare componentei RNA-zice a telomerazei sau genei sale, este susținută ca o proprietate funcțională a polinucleotidei. Polinucleotidele antisens complementare includ oligonucleotide din RNA sau DNA antisens solubile care pot hibridiza în mod specific cu specii ale componentei RNA-zice a telomerazei și pot preveni transcrierea genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei (Ching și col. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 10006; Broder și col. (1990) Ann.lnt.Med.113: 604; Loreau și col.(1990) FEBS Letters 274: 53; Holcenberg și colab. WO 91/11535; US 07/530165, WO 91/09865; WO 91/04753; WO 90/13641 și EP 386563, fiecare dintre acestea fiind include aici ca referințe). în consecință, polinucleotidele antisens inhibă producerea componentei RNA-zice funcționale a telomerazei. Deoarece, exprimarea componentei RNA-zice a telomerazei (rata de transcriere și/sau stabilitate a RNA) este asociată cu activarea și activitatea enzimatică a holoenzimei telomerazice, polinucleotidele antisens care previn transcrierea RNA-ului corespunzător componentei RNA-zice a telomerazei și/sau interacția componentei RNA-zice a telomerazei cu componenta proteică a telomerazei umane și/sau interacția componentei RNA-zice a telomerazei cu secvențele telomere, pot inhiba activitatea telomerazei și/sau pot schimba un fenotip, cum ar fi, imortalizarea sau transformarea neoplazică, a celulelor care exprimă activitatea telomerazei în absența polinucleotidelor antisens. Compozițiile conținând o doză eficientă din punct de vedere terapeutic din polinucleotidele antisens ale componentei RNA-zice a telomerazei, pot fi administrate pentru tratamentul bolilor care necesită activitatea telomerazei pentru patogeneza celulară (de exemplu, neoplazia] sau pentru inhibarea producerii sau menținerii gârneților (adică, drept contraceptiv) dacă se dorește. Pot fi produse polinucleotide antisens de diferite lungimi, deși asemenea polinucleotide antisens conțin în mod caracteristic o secvență de aproximativ cel puțin 25 de nucleotide consecutive care sunt substanțial complementare cu o secvență polinucleotidică a componentei RNA-zice a telomerazei existente în mod natural, și care, în mod tipic, sunt perfect complementare cu o secvență a componenței RNA-zice a telomerazei umane, adesea fiind complementare cu secvența componentei RNA-zice a telomerazei care este complementară cu secvența telomerică repetitivă, sau complementară cu o porțiune din componenta RNA-zică a telomerazei care este în contact cu subunitatea polipeptidică a telomerazei.
1140
1145
1150
1155
1160
1165
1170
1175
1180
RO 117328 Bl
Polinucleotidele antisens pot fi produse dintr-o casetă heteroioagă de exprimare într-o celulă transfectantă sau celulă transgenică. Caseta heteroioagă de exprimare poate fi parte dintr-un vector de terapie genică, cum ar fi, un vector adenoviral sau viral adeno-asociat, sau un alt vector de terapie genică. Caseta heteroioagă poate fi o polinucleotidă care nu este capabilă de replicare independentă și care este transferat în celule prin oricare dintr-o varietate de metode adecvate, cunoscute de experții în domeniu (de exemplu, lipofecția, biolistică, lipozomi, imunolipozomi, electroporare, etc.). Alternativ, polinucleotidele antisens pot cuprinde oligonucleotide solubile care sunt administrate în mediul extern, fie în mediul de cultură in vitro, fie în spațiile interstițiale și în fluidele biologice (de exemplu, sânge, CSF) pentru aplicare in vivo. S-a arătat că polinucleotidele antisens solubile, prezente în mediul extern, intensifică procesul de acces spre citoplasmă și inhibă speciile RNA-specifice. în unele exemple ale invenției, polinucleotidele antisens cuprind grupări metilfosfonat, grupări C-5 propenil, zaharuri 2' fluororiboză, sau sunt acizi nucleici poliamidici (PNA) (Egholm și colab., (1992) J.Am.Chem.Soc. 114: 1895; Wittung și col., (1994) Nature 368: 561; Egholm și col.(1993) Nature 365: 566; Hanvey și col.(1992) Science 258: 1481, incluse aici ca referințe. (Pentru metode generale cu privire la polinucleotidele antisens, a se vedea Antisense FINA and DNA, (1988), D.A.Melton, Ed.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hasrbor, NY).
în plus față de oligonucleotidele antisens ale prezentei invenții, unii pot construi oligonucleotide care se vor lega la duplexul acidului nucleic fie în componenta RNA-zică pliată, fie în gena pentru componenta RNA-zică, formând un acid nucleic conținând un triplu helix, sau un acid nucleic triplex, pentru a inhiba activitatea telomerazei. Astfel de oligonucleotide ale invenției sunt construite utilizând regulile de împerechere a bazelor în formarea triplu helixului, și secvența nucleotidică a componentei RNA-zice (Cheng și colab.,(1988) J.Biol.Chem.283: 15110; Ferrin și Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas și colab.,(1989) J.Biol.Chem.264:17395; Strobel și col.(1991) Science 254: 1639; Hsieh și colab.,(1990). op.cit., Rigasși colab.,[1986) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 83: 9591, incluse aici ca referințe). Asemenea oligonucleotide pot bloca activitatea telomerazei într-un număr de feluri, incluzând prin prevenirea transcrierii genei pentru telomerază, sau prin legarea la o regiune duplex a componentei RNA-zice a telomerazei într-o manieră care împiedică componenta RNA-zică fie de la formarea unei telomeraze ribonucleoproteice funcționale, fie de la servirea drept matriță pentru sinteza DNA-ului telomeric. în mod caracteristic, și în funcție de modul de acțiune, oligonucleotidele formatoare de triplex din invenție cuprind o secvență specifică de la aproximativ 10 până la aproximativ 25-200 sau mai multe (adică suficient de mare pentru a forma un triplu helix stabil, dar suficient de mică, funcție de modul de eliberare, pentru administrare in vivo, dacă se dorește) nucleotide “complementare” (în acest context, complementar înseamnă capabil de a forma un triplu helix stabil) cu o secvență specifică din componenta RNA-zică a telomerazei sau din gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei.
în plus, față de oligonucleotidele antisens și formatoare de triplu helix, din prezenta invenție, mai pot fi utilizate, de asemenea, pentru inhibarea activității telomerazei, și oligonucleotide sens identice în secvență cu cel puțin o porțiune din componenta RNA-zică a telomerazei umane. Oligonucleotidele de acest tip ale invenției sunt caracterizate prin faptul că cuprind .(1) mai puțin decât secvența completă a
RO 117328 Bl componentei RNA-zice necesare pentru formarea unei enzime telomerazice funcționale, fie (2) secvența completă a componentei RNA-zice necesară pentru formarea unei enzime telomerazice funcționale, ca și o substituție sau inserție de una sau mai multe nucleotide care fac RNA-ul rezultant, non-funcțional. în ambele cazuri, inhibarea activității telomerazei este observată datorită faptului că componenta RNA-zică “mutantă” leagă componentele proteice ale telomerazei umane pentru a forma o moleculă de telomerază inactivă. Mecanismul de acțiune al unor asemenea oligonucleotide implică, astfel, asamblarea telomerazei ribonucleoproteice non-funcționale sau prevenirea asamblării telomerazei ribonucleoproteice funcționale. Un exemplu poate fi o variantă matriță demodulată constând din nucleotidele 48-209, dar în care secvența matriță telomeră repetitivă, este modificată. Asemenea variante matrițădemodulate sunt capabile să concureze pentru legarea la componenta proteică a telomerazei. Oligonucleotidele sens de acest tip ale invenției, cuprind în mod caracteristic, o secvență specifică, de aproximativ 20, 50, 100, 200, 400, 500, sau mai multe nucleotide identice cu o secvență specifică de nucleotide din componenta RNA-zică a telomerazei umane.
în plus, polinucleotidele antisens pot cuprinde un substituent derivatizat care nu interfera în mod substanțial în ceea ce privește hibridizarea cu componenta RNAzică a telomerazei de mamifere. Polinucleotidele antisens care au fost modificate cu substituenți chimici atașați, pot fi introduse într-o celulă eucariotă activă din punct de vedere metabolic, pentru a hibridiza cu o componentă RNA-zică a telomerazei în celulă. în mod caracteristic, astfel de polinucleotide antisens sunt derivatizate, și li se atașază substituenți chimici suplimentari, fie în timpul, fie după sinteza polinucleotidei, respectiv, și sunt în acest fel, localizate pe o secvență complementară în componenta RNA-zică a telomerazei unde ele produc o alterare sau modificare chimică la o secvență locală de DNA și/sau la componenta proteică a telomerazei. Substituenți chimici atașați, preferați, includ: europium (III) texafirin, agenți de legare încrucișată, psoralen, chelați metalici (de exemplu, chelat fier/EDTA pentru clivarea catalizată de fier), topoizomeraze, endonucleaze, exonucleaze, ligaze, fosfodiesteraze, porfirine fotodinamice, medicamente chimioterapeutice (de exemplu, adriamicină, doxirubicin), agenți de intercalare, agenți de modificare a bazei, lanțuri imunoglobulinice, și oligonucleotide. Chelații fier/EDTA sunt substituenții chimici preferați acolo unde se dorește clivarea locală a secvenței polinucleotidice (Hertzberg și col. (1982) J.Am.Chem.Soc. 104: 313; Hertzberg și Dervan (1984) Biochemistry 23: 3934; Taylor și colab., (1984) Tetrahedron 40. 457; Dervan, PB (1986) Science 232: 464). Reacții chimice preferate pentru atașarea menționată, includ: legătura directă, de exemplu, printr-o grupare amino reactivă atașată (Corey și Schultz (1988) Science 238: 1401, care este încorporată aici ca referință) și alte reacții chimice de legare directă, deși pot fi utilizate și metodele de legare streptavidină/biotină și digoxigenină/anticorp antidigoxigenină. Metode pentru legarea substituenților chimici sunt prevăzute, în brevetele US 5135720, 5093245 și 5055556, care sunt incluse aici ca referință. Alte legări chimice pot fi utilizate la alegerea specialistului. Polinucleotidele care corespund întregii sau unei părți substanțiale din componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere (adică polinucleotide “sens) pot fi, de asemenea, derivatizate și utilizate pentru reacția cu secvențe telomerice repetitive în genom și pot produce aducți sau altă modificare a mediului chimic la regiunile telomere ale cromozomilor.
1235
1240
1245
1250
1255
1260
1265
1270
1275
RO 117328 Bl
Matrițe greșit Împerecheate □ altă oligonucleotidă utilă a invenției cuprinde o secvență alterată sau mutaționată, din componenta RNA-zică a telomerazei umane. YU și colab., 1990, Nature 344: 126, arată că o formă mutaționată a componentei RNA-zice a telomerazei de Tetrahymena, poate fi încorporată în telomeraza din celule de Tetrahymena, și că încorporarea are efecte dăunătoare asupra acelor celule. încorporarea formelor componentei RNA-zice a telomerazei umane supuse mutației, poate avea efecte similare asupra celulelor umane care, altminteri, au activitate telomerazică fără să afecteze celulele umane normale care nu au activitate telomerazică. Astfel de forme supuse mutației le includ pe cele în care secvența 5'-CTAACCCTA-3' este supusă mutației la 5'-CAAACCCAA-3', 5'-CCAACCCCAA-3', sau 5'-CTCACCCTCA-3'. Fiecare dintre aceste secvențe alterate ale componentei RNA-zice modifică unitățile telomerice repetitive încorporate în DNA-ul cromozomal, afectând astfel structura și funcția cromozomului. Asemenea oligonucleotide pot fi proiectate să conțină situsuri de recunoaștere pentru enzima de restricție, utile în metode de diagnostic a prezenței componentei RNA-zice alterate prin digestia cu enzima de restricție a DNA-ului telomeric sau a unui substrat telomerazic extins.
Pentru a ilustra acest aspect al invenției, a fost efectuată mutageneză situs specifică, utilizând o plasmidă (desemnată pGRN33, disponibilă din American Type Culture Collection, sub numărul de acces ATCC 75926), care cuprinde un fragment de 2,5 b de HinM-Sad din clona lambda 28-1 (a se vedea exemplul 7, de mai jos), ca și originea SV40 a replicării (dar fără activitate de promotor). Plasmidele rezultante, desemnate pGRN34 (conținând 5'-CAAACCCAA-3'), pGRN36 (conținând 5’-CCAACCCCAA-3'), și pGRN37 (conținând 5'-CTCACCCTCA-3'), au fost transformate în celule gazdă eucariote (o linie celulară derivată din 293 care exprimă antigenul mare T pentru SV40), iar determinările de telomeraza au fost conduse cu ajutorul extractelor celulare din transformanți.
Determinările au arătat că activitatea telomerazei în celule a avut ca rezultat formarea de acizi nucleici care cuprind secvențele alterate, indicând că clona genomică cuprinde o genă funcțională pentru componenta RNA-zică, și că plasmidele cuprind o genă alterată, dar funcțională, pentru componenta RNA-zică. Aceste rezultate ilustrează cum prezenta invenție furnizează preparate de telomerază recombinantă și metode pentru producerea acestor preparate. Prezenta invenție descrie o telomerază recombinantă umană care conține componentele proteice ale telomerazei umane, în asociere funcțională cu o componentă RNA-zică recombinantă din invenție. Astfel de molecule de componentă RNA-zică recombinantă, din prezenta invenție, includ pe cele care diferă de moleculele de componentă RNA-zică existente în mod natural, prin substituții, deleții, sau inserții de una sau mai multe baze, ca și pe cele molecule de componentă RNA-zică care sunt identice cu o moleculă de componentă RNA-zică existentă în mod natural, care sunt produse în celule gazdă recombinante. Metoda pentru producerea unor astfel de molecule de telomerază recombinantă cuprinde: transformarea unei celule gazdă eucariotă care exprimă componentele proteice ale telomerazei cu un vector recombinant de exprimare care codifică o moleculă de componentă RNA-zică din invenție, și - cultivarea menționatelor celule gazdă transformate cu menționatul vector,, în condiții în care componentele proteice și componenta RNA-zică să fie exprimate și asamblate pentru a forma o moleculă activă de
RO 117328 Bl telomerază capabilă să adauge secvențe (nu neapărat aceeași secvență adăugată de telomerază nativă) la telomeri de DNA cromozomal. Alte exemple utile de astfel de vectori recombinanți de exprimarea DNA-ului (sau plasmide) includ plasmide care conțin gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane cu o deleție, inserție, sau altă modificare care să facă gena nefuncțională. Astfel de plasmide sunt utile, în mod special, pentru terapia genică umană, în scopul “knockout-ului” genei endogene pentru componenta RNA-zică, deși este necesar un sistem de mare eficiență pentru transformare și recombinare, pentru a face celulele tratate, ireversibil mortale.
Exemple de ribozimă
Alte oligonucleotide ale invenției, denumite ribozime, pot fi, de asemenea, utilizate pentru inhibarea activității telomerazei. Spre deosebire de oligonucleotidele antisens și altele descrise mai sus, care se leagă la un RNA, un DNA, sau la o componentă proteică a telomerazei, o ribozimă nu doar se leagă, ci și clivează în mod specific, putând astfel inactiva un RNA țintă, cum ar fi componenta RNA-zică a telomerazei umane. O astfel de ribozimă poate conține secvențe 5'- și 3'- terminale, complementare cu RNA-ul telomerazic. în funcție de situsul de clivare, o ribozimă poate face enzimă telomerază, inactivă. A se vedea, PCT 93/23572, așa cum s-a arătat în lucrarea prezentată mai sus. Pe baza trecerii în revistă a secvenței RNA-ului din componenta RNA-zică a telomerazei umane, experții în domeniu vor lua în considerare că, mai multe situsuri țintă ribozimice, utile, sunt prezente și susceptibile pentru clivarea cu, spre exemplu, o ribozimă cap de ciocan. Ribozime de acest tip ilustrative pentru prezenta invenție, de acest tip, includ ribozimele de mai jos, care sunt molecule de RNA având secvențele indicate:
1: 5'-UAGGGUUACTUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3’;
2: S’-UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-S';
3: 5’-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3’; și
4: 5'-CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3’.
Alte situsuri țintă optime pentru inhibarea mediată de ribozimă a activității telomerazei, pot fi determinate așa cum descrie Sullivan și colab., PCT 94/02595 și Draper și colab., PCT 93/23569, ambele brevete fiind incluse aici ca referințe. Așa cum a fost descris de Hu și colab., PCT 94/03596, inclus aici ca referință, funcțiile de antisens și ribozimă pot fi combinate într-o singură oligonucleotidă. Mai mult, ribozimele pot cuprind unul sau mai multe nucleotide modificate sau legături modificate între nucleotide, așa cum s-a descris mai sus, în legătură cu descrierea oligonucleotidelor antisens ilustrative ale invenției. Sub un aspect, o subunitate catalitică de RNA-ază P (umană sau de E. coli] este modificată (a se vedea Altman S (1995) Biotechnology 13: 327) pentru a genera o secvență ghid care corespunde porțiunii din componenta RNA-zică a telomerazei de la mamifere care împerechează bazele cu secvența repetitivă telomerică; astfel de variante de RNA-ză P pot ciiva secvențe telomere. Sub un aspect, o subunitate catalitică a RNA-azei P (umane sau de
E.coli] este modificată pentru a genera o secvență ghid care este complementară cu o porțiune din componenta RNA-zică a telomerazei, așa încât, varianta de RNA-ză P să poată cliva componenta RNA-zică a telomerazei. Asemenea ribozime obținute prin inginerie genetică, pot fi exprimate în celule sau pot fi transferate printr-o varietate de căi (de exemplu, lipozomi, imunolipozomi, biolisticuri, preluare directă în celule, etc.).
1325
1330
1335
1340
1345
1350
1355
1360
1365
RO 117328 Bl
Alte forme de ribozime [ribozime intronice din grupul I (Cech T (1995) Biotechnology 13; 323); ribozime cap de ciocan (Edgington SM (1992) Biotechnologyi 10: 256) pot fi prelucrate prin inginerie genetică pe baza informației din secvența componentei RNA-zice a telomerazei, descrisă în prezenta invenție, pentru a cataliza clivarea componentei RNA-zice a telomerazei umane și/sau a secvențelor repetitive telomere umane.
Astfel, invenția prevede o largă varietate de oligonucleotide pentru inhibarea activității telomerazei. Asemenea oligonucleotide pot fi utilizate în metodele terapeutice ale invenției pentru tratarea bolii, metode care cuprind în administrarea unui pacient a unei doze eficiente, din punct de vedere terapeutic, dintr-un inhibitor sau activator telomerazic, din prezenta invenție. Unii pot măsura inhibarea sau activarea telomerazei pentru a determina cantitatea dintr-un agent care trebuie eliberat într-o doză eficientă din punct de vedere terapeutic, utilizând protocoalele de experimentare descrise în brevetele US și PCT 93/23572, amintite mai sus. Așa cum s-a consemnat prin acele brevete, și așa cum s-a discutat mai sus, inhibarea activității telomerazei face transformă o celulă nemuritoare în muritoare, în timp ce activarea activității telomerazei poate crește durata vieții replicative a unei celule. Terapia prin inhibarea telomerazei constituie un tratament eficient împotriva cancerelor care implică creșterea necontrolată a celulelor nemuritoare, iar activarea telomerazei este un tratament eficient în prevenirea îmbătrânirii celulare. Distribuirea de agenți care inhibă sau blochează activitatea telomerazei, cum ar fi, o oligonucleotidă antisens, o oligonucleotidă formatoare de triplu helix, o ribozimă, sau o plasmidă care conduce exprimarea unei componente mutante RNA-zice a telomerazei, poate preveni acțiunea telomerazei și, în final conduce la îmbătrânirea celulară și la moartea celulelor, în cazul celulelor tratate.
Aspecte terapeutice și profilactice în plus, prezenta invenție descrie metode terapeutice care asigură că celulele normale rămân mortale; spre exemplu, componenta RNA-zică poate fi modificată utilizând procedee standard de inginerie genetică pentru ștergerea în întregime sau a unei porțiuni dintr-o genă naturală care codifică componenta (de exemplu, prin mutageneza in vitro] prin recombinare genetică. Aceste celule vor deveni astfel, ireversibil, muritoare. Acest procedeu este util în terapia genică, unde celule normale modificate să conțină plasmide de exprimare, sunt introduse într-un pacient, și, deoarece se dorește siguranța că nu sunt introduse celule canceroase, ori, dacă sunt introduse astfel de celule, atunci acele celule sunt făcute în mod ireversibil, muritoare.
Deoarece, telomeraza este activă doar în tumori, celule germinale, și anumite celule stern din sistemul hematopoietic, alte celule normale nu sunt afectate de terapia prin inhibarea telomerazei. Pot fi prevăzute etape de evitare a contactului inhibitorului telomerazic cu celulele germinale sau celulele stern, deși nu este neapărat necesar. Spre exemplu, deoarece celulele germinale exprimă activitate telomerazică, inhibarea telomerazei poate avea un impact negativ asupra spermatogenezei și a viabilității spermei, ceea ce sugerează că inhibitorii telomerazei pot fi contraceptive sau agenți de sterilizare. Acest efect contraceptiv poate totuși să nu fie dorit, de către un pacient care primește un inhibitor telomerazic conform invenției pentru tratarea cancerului. în asemenea cazuri, unii pot administra un inhibitor telomerazic din prezenta invenție într-o manieră care să asigure că inhibitorul va fi produs doar pe perioada de terapie, astfel, încât impactul negativ asupra celulelor germinale să fie doar trecător.
RO 117328 Bl
1415
Alte metode terapeutice ale invenției folosesc acidul nucleic RNA al telomerazei, din invenție, pentru a stimula activitatea telomerazei și pentru a extinde timpul de viață al celulelor replicative. Aceste metode pot fi realizate prin livrarea către o celulă a unei ribonucleoproteine din telomeraza recombinantă, funcțională, conform prezentei invenții. Spre exemplu, ribonucleoproteina poate fi livrată unei celule într-un lipozom, sau gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane (sau o genă recombinantă cu elemente reglatoare diferite) poate fi utilizată într-o plasmidă eucariotă de exprimare (cu sau fără secvențe care să codifice exprimarea componentelor proteice ale telomerazei) pentru a activa activitatea telomerazei în diferite celule umane normale cărora, altfel, le lipsește o activitate telomerazică detectabilă, datorită unor niveluri scăzute de exprimare a componentei RNA-zice sau a componentei proteice a telomerazei. Dacă componenta RNA-zică a telomerazei nu este suficientă pentru a stimula activitatea telomerazei, atunci componenta RNA-zică poate fi transfectată cu gene care exprimă componentele proteice ale telomerazei, pentru a stimula activitatea telomerazei. Astfel, invenția prevede metode pentru tratarea unei stări asociate cu activitatea telomerazei dintr-o celulă sau grup de celule, prin punerea în contact a celulei (lor) cu o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic dintr-un agent care modifică activitatea telomerazei în acea celulă.
Celule care încorporează extra copii ale genei pentru RNA-ul telomerazic pot dezvolta o creștere a activității telomerazei și, de asemenea, un timp de viață replicativă crescut. □ astfel de terapie poate fi efectuată ex vivo asupra celulelor, pentru introducerea ulterioară într-o gazdă, sau poate fi efectuată in vivo. Avantajele stabilizării sau creșterii lungimii telomerului prin adăugare de gene exogene pentru telomerază ex vivo la celule diploide normale, includ: stabilizarea telomerului poate opri îmbătrânirea celulară și permite posibila amplificare nelimitată a celulelor; și celulele diploide normale, cu un timp de viață extins, pot fi cultivate in vitro pentru testarea medicamentelor, producerea virusurilor, sau în alte scopuri. Mai mult, celulele stern amplificate ex vivo. de diferite tipuri, pot fi utilizate în terapia celulară a anumitor boli, așa cum s-a notat mai sus.
Stabilizarea telomerului poate, de asemenea, micșora incidența cancerului în celulele care se replică, prin prevenirea devenirii telomerilor în mod critic de scurți, ca celulele aproape de criză. în timpul crizei, este generată o masivă instabilitate genomica pentru că se pierde efectul protector al gazului telomeric. “Puntea genetică” este refăcută, și aproape toate celulele mor. Rarele celule care rezultă din acest proces sunt în mod tipic aneuploide cu multe rearanjamente de gene și sfârșesc prin restabilirea stabilității în telomerii lor prin exprimarea telomerazei. Dacă criza poate fi prevenită prin păstrarea telomerilor lungi, atunci instabilitatea genomică asociată cu criza poate fi, de asemenea, prevenită, limitând șansele ca o celulă individuală să sufere numărul de mutații genetice necesar pentru a produce un cancer metastazic.
Celulele care pot fi folosite drept țintă pentru terapia genică cu telomeraza (terapie implicând creșterea activității telomerazei într-o celulă țintă) includ, dar nu se limitează la celulele stern hematopoietice (SIDA și post-chimioterapia), celulele endoteliale vasculare (boala cardiacă și cea vasculară cerebrală), fibroblaste ale pielii și keratinocite bazale ale pielii (vindecarea rănilor și a arsurilor), condrocite (artrită), astrocite ale creierului și celule microgliale (boala lui Alzheimer), osteoblaste (osteoporoză), celule retiniene (boli de ochi), și celule pancreatice insulare (diabet de tip I).
1420
1425
1430
1435
1440
1445
1450
1455
1460
RO 117328 Bl în mod caracteristic, metodele terapeutice ale invenției implică administrarea unei oligonucleotide care funcționează pentru a inhiba sau a stimula activitatea telomerazei în condiții fiziologice in vivo, și care va fi stabilă în acele condiții. Așa cum s-a consemnat mai sus, acizii nucleici modificați pot fi folosiți în conferirea unor asemenea condiții de stabilitate, ca și în asigurarea livrării oligonucleotidei spre țesutul, organul, sau celula dorite. Metode utile pentru distribuirea de oligonucleotide în scopuri terapeutice sunt descrise de Inouye și colab., în US 5272065, inclusă aici ca referință.
în timp ce oligonucleotidele pot fi distribuite direct ca un medicament într-o formulare farmaceutică adecvată, unii pot distribui, de asemenea, oligonucleotidele utilizând terapia genică și plasmidele recombinante de exprimare a DNA-ului, din prezenta invenție. □ astfel de plasmidă ilustrativă este descrisă în exemplul 8, de mai jos. în general, asemenea plasmide vor conține un promotor, și, opțional, un enhancer” “secvență de creștere” (separat de oricare conținut în secvențele promotor) care servesc la conducerea transcrierii unei oligoribonucleotide, ca și alte elemente reglatoare care asigură menținerea epizomală sau integrarea cromozomală și transcrierea la un nivel ridicat, dacă se dorește. Vectori pe bază de adenovirus sunt utilizați adesea pentru terapia genică și sunt adecvați utilizării împreună cu reactivii și cu metodele din prezenta invenție, a se vedea PCT 94/12650; 94/12649 și 94/12629. Promotori utili pentru asemenea scopuri sunt aleși dintre: promotorul metalotioneină, promotorul constitutiv major târziu al adenovirusului, promotorul MMTV care induce dexametazona, promotorul SV4D, promotorul MPR pollll, promotorul constitutiv MPSV, promotorul CMV inductibil prin tetraciclină (cum ar fi promotorul CMV uman timpuriu imediat), și promotorul constitutiv CMV. O plasmidă utilă pentru terapia genetică poate conține alte elemente funcționale, cum ar fi, markeri selecționabili, regiuni de identificare, și alte gene. Plasmidele recombinante de exprimare a DNA-ului pot fi, de asemenea, utilizate pentru prepararea oligonucleotidelor din prezenta invenție, pentru furnizare prin alte căi decât terapia genică, deși poate fi mai economic să se producă oligonucleotide scurte prin sinteza chimică in vitro.
Sub aspecte asemănătoare, invenția descrie compoziții farmaceutice incluzând o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic, dintr-un inhibitor telomerazic sau activator telomerazic din prezenta invenție. Compoziții farmaceutice de inhibitori telomerazici ai prezentei invenții, includ o componentă RNA-zică mutantă a telomerazei umane, o oligonucleotidă antisens sau oligonucleotidă formatoare de triplu helix care leagă componenta RNA-zică sau gena pentru aceeași telomerază umană, sau o ribozimă capabilă să cliveze componenta RNA-zică a telomerazei umane, sau combinații ale aceleiași sau a altor produse farmaceutice într-un purtător acceptabil farmaceutic sau sare. Alte compoziții farmaceutice ale invenției cuprind un preparat activator al telomerazei, cum ar fi, telomeraza umană purificată sau mRNA-ul pentru componentele proteice ale telomerazei și componenta RNA-zică a telomerazei, și sunt utilizate în tratarea bolii legate de îmbătrânire. Sub un alt aspect, o componentă RNA-zică sens a telomerazei de mamifere supusă mutației este administrată unei populații de celule; menționata componentă RNA-zică sens a telomerazei, supusă mutației, conține cel puțin o bază greșit împerecheată cu privire la secvența repetitivă din telomeraza umană, dar este capabilă să dezvolte activitate telomerazică împreună cu componenta polipeptidică a telomerazei umane, cu producerea unei încorporări greșite în pozițiile nucleotidice selecționate din unitatea telomerazică umană repetitivă, generându-se
RO 117328 Bl astfel, telomeri care se bazează pe prezența continuă a componentei RNA-zice sens din telomerază supuse mutației, pentru replicarea substanțială. Este prevăzută o metodă terapeutică, prin care o componentă RNA-zică telomerazică sens, supusă mutației, este administrată unei populații de celule, pentru o perioadă suficientă introducerii secvențelor telomere care sunt substanțial ne-funcționale ca matrițe pentru componenta RNA-zică a telomerazei de mamifere, existente în mod natural, urmată de retragerea componentei RNA-zice sens a telomerazei, supuse mutației, care are ca rezultat pierderea rapidă a lungimii telomerice medii în populația de celule și îmbătrânirea crescută sau mortalitatea celulară.
Agentul terapeutic poate fi furnizat într-o formulare corespunzătoare pentru administrarea parenterală, nazală, orală, sau alt mod de administrare. A se vedea PCT 93/23572, prezentat mai sus.
Metode de diagnostic
Prezenta invenție descrie metode de diagnostic și reactivi, în afara formulărilor farmaceutice și a metodelor terapeutice descrise mai sus. Invenția prevede metode de diagnostic pentru determinarea nivelului, cantității, sau prezenței componentei RNA-zice a telomerazei umane, a telomerazei, sau a activității telomerazei într-o celulă, populație de celule sau probă de țesut. Sub un aspect legat de acesta, prezenta invenție prevede reactivi utili pentru astfel de metode, opțional, ambalați sub formă de kit, împreună cu instrucțiunile de utilizare a kitului, pentru punerea în practică a metodei de diagnostic. Așa cum s-a consemnat mai sus, în legătură cu testele destinate determinării dacă clona pGRN7 conține cDNA-ul pentru componenta RNAzică a telomerazei umane, nivelurile de componentă RNA-zică sunt ridicate în celulele tumorale. Astfel, detectarea componentei RNA-zice constituie un diagnostic util al celulelor tumorale.
în plus, în metodele de diagnostic pentru detectarea prezenței acidului nucleic teiomerazic dintr-o probă, pot fi utilizate sonde sau primeri care se leagă specific la componenta RNA-zică a telomerazei umane (sau la oricare torsadă a genei pentru aceeași). Primerii și sondele sunt oligonucleotide care sunt complementare și, astfel, se vor lega la un acid nucleic țintă. Deși, primerii și sondele pot diferi în ceea ce privește secvența și lungimea, factorul primar de diferențiere este unul de funcție: primerii servesc la inițierea sintezei DNA-ului, ca în amplificarea PCR, în timp ce sondele sunt utilizate în mod caracteristic, doar pentru a se lega la un acid nucleic țintă. Lungimi caracteristice pentru un primer sau o sondă pot fi cuprinse, între 8 - 20 - 30 sau mai multe nucleotide. Un primer sau sondă poate fi, de asemenea, marcat pentru ușurarea detecției (adică, în acest scop sunt folosite, în mod tipic, molecule radioactive sau fluorescente) sau purificarea/separarea (adică, în acest scop se utilizează adesea biotina sau avidina).
O metodă de diagnostic preferată în mod special, în cadrul invenției, implică detectarea secvențelor componentei RNA-zice a telomerazei, în probe de celulă sau țesut luate de la pacienți suspectați de riscul de a avea cancer. Asemenea metode vor implica în mod tipic legarea unei sonde sau primer marcate, de o secvență a componentei RNA-zice, în condiții în care doar secvențele perfect împerecheate (complementare) să se lege (să hibridizeze) de o alta. Detectarea materialului marcat legat de RNA-ul din probă, se va corela cu prezența activității telomerazei și cu prezența celulelor canceroase. Asemenea celule pot exprima componenta RNA-zică a telomerazei,
1510
1515
1520
1525
1530
1535
1540
1545
1550
RO 117328 Bl dar rămân telomeraz-negative datorită lipsei exprimării componentelor proteice ale telomerazei. Dacă se dorește detectarea prezenței activității telomerazice în astfel de celule, atunci, s-ar putea izola mai întâi proteina, și apoi determina dacă fracțiunea proteică conține componenta RNA-zică a telomerazei, care ar semnala prezența activității telomerazice. Metodele de diagnostic ale invenției pot fi, în mod special utile în detectarea prezenței activității telomerazice în biopsii de țesut și secțiuni histologice în care metoda este realizată in situ, în mod tipic, după amplificarea componentei RNA-zice a telomerazei prin utilizarea de primeri specifici PCR, din invenție.
Invenția mai prevede și sonde polinucleotidice din componenta RNA-zică a telomerazei, pentru diagnosticarea stărilor de boală (de exemplu, neoplazia sau preneoplazia) prin detectarea unei componente RNA-zice a telomerazei, sau rearanjări sau amplificarea genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei, în celule prelevate de la un pacient, sau detectarea unei alele patognomonice a componentei RNA-zice a telomerazei (de exemplu, prin analiza RFLP sau analiza PCR specifică pentru alelă). în mod tipic, detectarea se va face prin hibridizarea in situ, utilizând o polinucleotidă a componentei RNA-zice a telomerazei marcate (de exemplu, 32P, 35S, 14C, 3H, fluorescență, biotinilare, digoxigenilare), deși pot fi utilizate și Northern blotting, dot blotting, sau hibridizarea soluției pe izolate de RNA sau poli A+ RNA de la o probă celulară ca și amplificarea PCR cu ajutorul primerilor specifici pentru componenta RNA-zică a telomerazei. Celulele care conțin o cantitate modificată de componentă RNA-zică a telomerazei, comparativ cu celulele non-neoplasmice de același tip celular, pot fi identificate drept celule candidate la îmbolnăvire. în mod similar, detectarea rearanjamentelor patognomonice sau amplificării locusului din gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei, sau a locusurilor strâns legate dintr-o probă celulară, va identifica prezența unei stări patologice sau a unei predispoziții spre dezvoltarea unei stări patologice (de exemplu, cancer, boli genetice). Sondele polinucleotidice sunt, de asemenea, utilizate pentru identificarea judiciară a indivizilor, cum ar fi, în testul de paternitate sau în identificarea suspecților criminali sau a decedaților necunoscuți.
în cadrul populației umane pot exista alterări minore în secvența primară de baze a componentei RNA-zice a telomerazei, incluzând variante alele, polimorfisme ale situsului de restricție, și alele de boală congenitală ale componentei RNA-zice a telomerazei-asociate cu boala genetică.
Dacă se dorește, specialistul în domenii poate selecționa la alegere amplimeri PCR pentru amplificarea copiilor substanțial întregi ca lungime, ale componentei RNAzice a telomerazei. în mod similar, pot fi selecționați și amplimeri pentru amplificarea porțiunilor din gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei sau a RNA-ului.
Exprimarea componentei RNA-zice a telomerazei
Plasmidele de exprimare ale prezentei invenții pot fi utile, în funcție de lungimea și funcția preconizată a primerului, sondei, sau a altui acid nucleic conținând secvențe din componenta RNA-zică a telomerazei umane. Spre exemplu, producerea recombinantă a componentei RNA-zice întregi ca lungime, din prezenta invenție, poate fi realizată prin utilizarea unei plasmide de exprimare a DNA-ului recombinant, din invenție, care conține un acid nucleic conținând secvența nucleotidică a componentei RNA-zice poziționate pentru transcrierea sub control a unui promotor corespunzător. Celule gazdă pentru astfel de plasmide pot fi atât procariote cât și eucariote, iar promotorul, ca și alte elemente reglatoare și markeri selecționabili, aleși pentru încorporare în plasmida de exprimare, va depinde de celula gazdă utilizată pentru producere.
RO 117328 Bl
1600
Gena intactă pentru componenta RNA-zică, adică promotorul, care include orice secvență reglatoare în regiunea 5' a genei, și regiunea de codificare a componentei RNA-zice, pot fi utilizate pentru exprimarea componentei RNA-zice în celule umane, incluzând celule umane care au fost făcute nemuritoare prin transformare virală sau cancer. Promotorul genei pentru componenta RNA-zică poate fi, totuși, reglat, și pentru acest motiv și pentru altele, unii pot dori să exprime componenta RNA-zică sub controlul unui promotor diferit. Pe de altă parte, promotorul genei pentru componenta RNA-zică poate fi utilizat independent de secvența de codificare a componentei RNA-zice, pentru a exprima alte secvențe codificatoare de interes. Spre exemplu, s-ar putea studia reglarea transcripțională a genei pentru componenta RNA-zică prin fuzionarea promotorului din gena pentru componenta RNA-zică, cu o secvență codificatoare a unei secvențe raportor de codificare, cum ar fi, secvența de codificare a /^galactozidazei sau a unei alte enzime sau proteine, ale căror exprimări pot fi rapid monitorizate. Astfel, promotorul și alte elemente reglatoare pentru gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane pot fi utilizate nu doar pentru exprimarea componentei RNA-zice, ci și a componentelor proteice ale telomerazei umane, a oligonucleotidelor antisens și a altora, ca și a altor produse ai genelor, de interes în celulele umane. Plasmidele de exprimare care conțin gena intactă pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane pot fi utile, în mod special, pentru o varietate de scopuri, inclusiv terapia genică. Experții în domeniu recunosc că o largă varietate de plasmide de exprimare pot fi utilizate pentru a produce acizii nucleici utili ai invenției, și că termenul de plasmidă”, așa cum este folosit aici, se referă la orice tip de acid nucleic (dintr-un fag, virus, cromozom, etc.) care poate fi utilizat pentru a purta informația genetică specifică într-o celulă gazdă, și a menține acea informație o perioadă de timp.
Izolarea componentei proteice a telomerazei
Reactivii prezentei invenții permit, de asemenea, donarea și izolarea acizilor nucleici care codifică componentele proteice umane, ca și alte enzime telomerazice de la mamifere, care nu au fost disponibile anterior. Accesul la astfel de acizi nucleici furnizează beneficii complementare celor datorate acizilor nucleici care conțin secvențe de acid nucleic din componenta RNA-zică a telomerazei umane. Spre exemplu, așa cum s-a consemnat mai sus, beneficiile terapeutice ale prezentei invenții pot fi sporite, în unele împrejurări, prin utilizarea de preparate purificate ale componentelor proteice ale telomerazei umane, și prin accesul la acizii nucleici care le codifică. Acizii nucleici din prezenta invenție care codifică componenta RNA-zică a telomerazei umane pot fi utilizați pentru a izola acidul nucleic care codifică componentele proteice ale telomerazei umane, permițând accesul la astfel de beneficii. Astfel, invenția prevede metode pentru izolarea și purificarea componentelor proteice ale telomerazei umane, ca și pentru identificarea și izolarea acizilor nucleici care codifică componentele proteice ale telomerazei umane. Sub aspecte înrudite, prezenta invenție furnizează telomeraza umană purificată, acizii nucleici purificați care codifică componentele proteice ale telomerazei umane, plasmidele recombinante de exprimare a componentelor proteice ale telomerazei umane. Invenția mai furnizează și compoziții farmaceutice conținând ca ingredient activ, fie componentele proteice ale telomerazei umane, fie un acid nucleic care, fie codifică acele componente proteice, fie interacționează cu acizii nucleici care codifică acele componente proteice, cum ar fi, oligonucleotide antisens, oligonucleotide formatoare de triplu helix, ribozime, sau plasmide de exprimare a DNA-ului recombinant pentru oricare dintre precedenți.
1605
1610
1615
1620
1625
1630
1635
1640
1645
RO 117328 Bl
Componenta RNA-zică donată a telomerazei umane poate fi utilizată pentru identificarea și donarea acizilor nucleici care codifică componentele proteice ale enzimei ribonucleoprotdce-telomeraza. Pentru realizarea identificării și donării componentelor proteice pot fi utilizate câteva metode diferite. Spre exemplu, se poate utiliza captura de afinitate a enzimei sau a enzimei parțial denaturate, utilizând ca ligand de afinitate fie: (1) secvențe de nucleotide complementare cu componenta RNAzică care să se lege la componenta RNA-zică a enzimei intacte; sau (2) componenta RNA-zică pentru a lega componentele proteice ale unei enzime parțial sau complet denaturate. Ligandul poate fi atașat la un suport solid, sau chimic modificat [de exemplu, biotinilat) pentru imobilizarea ulterioară pe suport. Expunerea extractelor celulare conținând telomerază umană, urmată de spălarea și eluția enzimei telomerază legată pe suport, furnizează un preparat purificat superior de enzimă telomerază. Apoi, componentele proteice pot fi opțional purificate sau analizate direct prin secvențializarea proteinei. Secvența proteică determinată poate fi utilizată pentru prepararea primerilor și sondelor pentru donarea cDNA-ului sau identificarea unei clone dintr-o bancă genomică care conține acizi nucleici care codifică o componentă proteică a telomerazei.
Captura de afinitate a telomerazei cu utilizarea unei componente RNA-zice supuse ingineriei genetice, poate fi, de asemenea, condusă utilizând RNA telomerazic transcris in vitro și un sistem pentru reconstituirea activității enzimatice a telomerazei. A se vedea Autexier și Greider, 1994, Genes & Development 8: 563-575, inclusă aici ca referință. RNA-ul este supus ingineriei genetice pentru a i se atașa un capăt similar epitopului terminal de la proteine. Acest capăt poate fi o secvență de RNA la care este accesibil un ligand de legare strânsă, exemplu un anticorp specific pentru secvența de RNA, o proteină de legare a acidului nucleic specific de secvență, sau un colorant organic care se leagă strâns la o secvență specifică de RNA. Toleranța telomerazei pentru secvența capăt și poziția pot fi testate prin utilizarea de metode standard. Sinteza componentei RNA-zice alterate și etapa de reconstituire din această metodă pot fi, de asemenea, înfăptuite in vivo. Pentru izolarea enzimei poate fi utilizată apoi cromatografia cu captură de afinitate cu utilizarea ligandului imobilizat pentru capătul RNA-zic.
Pentru izolarea componentelor proteice ale enzimei telomerază poate fi utilizat, de asemenea, screeningul exprimării. în această metodă, bibliotecile de exprimare a cDNA pot fi supuse screeningului cu RNA telomerazic marcat, iar cDNA-urile care codifică proteinele care se leagă specific la RNA-ul telomerazic, pot fi identificate. Pentru izolarea acizilor nucleici care codifică componentele proteice ale telomerazei, poate fi, de asemenea, utilizat un test de genetică moleculară care utilizează inhibarea translației. în această metodă, secvențele RNA-zice ale telomerazei vor fi fuzionate în amontele unui marker selecționabil. Când este exprimat într-un sistem adecvat, markerul selecționabil va fi funcțional. Când cDNA-ul care codifică o proteină de legare a RNA-ului telomerazic, este exprimat, atunci proteina se va lega la secvența sa de recunoaștere prin care blochează translația unui marker selecționabil, ceea ce permite identificarea clonei care codifică proteina. Sub alte reprezentări ale acestei metode, translația [traducerea] blocată a markerului selectabil va permite celulelor transformate să crească. Alte sisteme care pot fi folosite includ “sistemul de blocare a interacției”, descris în PCT 94/10300; sistemul “un hibrid” descris de Li și
RO 117328 Bl
1695
Herskowitz, la 17 dec. 1993, în Science 262: 1870- 1874, și Zervos și colab., 29 ian. 1993, Cell 72: 223 - 232; și sistemul “hibrid dublu”, disponibil comercial de la Clontech. Pentru facilitarea purificării enzimei telomerază și identificarea acizilor nucleici care codifică componentele proteice ale enzimei, pot fi utilizate testele de legare a RNA-ului telomerazic sau de activitate telomerazică, pentru detectarea proteinelor specifice de legare și a activității. Spre exemplu, acizii nucleici care conțin secvențe din componenta RNA-zică pot fi utilizați ca reactivi de afinitate pentru izolarea, identificarea, și purificarea peptidelor, a proteinelor sau a altor compuși care se leagă specific la o secvență conținută în componenta RNA-zică, cum ar fi, componentele proteice ale telomerazei umane. Sunt disponibile câteva formate diferite, incluzând migrarea în gel, filtrarea de legare, amprentarea, Northwestern (sondă RNA a petei proteice), și legarea foto încrucișată, pentru detectarea unei astfel de legări și pentru izolarea componentelor care se leagă specific la componenta RNA-zică. Aceste teste pot fi utilizate pentru identificarea proteinelor de legare, pentru purificarea proteinelor de legare, pentru caracterizarea situsurilor de legare pentru RNA, pentru determinarea mărimii moleculare a proteinelor de legare, pentru marcarea proteinelor în scopul izolării preparative, și pentru imunizarea ulterioară a animalelor pentru generarea de anticorpi în scopul obținerii de anticorpi pentru utilizarea în izolarea proteinelor sau identificarea unui acid nucleic care codifică proteina, într-un sistem cuplat transcriere/transalație.
Purificarea componentei proteice a telomerazei de mamifere
Componenta proteică a telomerazei de mamifere poate fi purificată prin metode biochimice convenționale, din celule care exprimă telomerază, cum ar fi, celulele HT1080, celulele 293, și alte linii celulare imortalizate în mod corespunzător. Spre exemplu, și nu ca imitare, telomerază umană poate fi purificată din extracte celulare, în conformitate cu metoda descrisă în US 08/288501, înregistrat la 10 august 1994, care este inclus aici ca referință. Extractele telomerazice de mamifere pot fi desprinse de componenta RNA-zică a telomerazei prin tratament cu o activitate RNAzică sau prin alte modalități de disociere și/sau degradare a componentei RNA-zice a telomerazei, cu lăsarea componentei proteice a telomerazei substanțial intacte și capabile de reconstituire cu adăugarea de componentă RNA-zică telomerazică exogenă, cum s-ar putea produce în mod recombinant, sau similar. Componenta proteică a telomerazei, astfel purificată și, opțional desprinsă de componenta RNA-zică a telomerazei endogene, poate fi utilizată în testele de screening de agent descrise în prezenta invenție, precum și pentru alte scopuri.
Terapia genetică
Transferarea materialului genetic exogen în celule (adică transfecția mediată de DNA) este o metodă esențială pentru cercetarea de bază în biologia celulară și genetica moleculară, ca și baza de elaborare de metode eficiente pentru terapia genetică umană. Până acum, în SUA majoritatea experiențelor acceptate, de transfer de gene, se bazează pe vectori retrovirali deficienți în replicare, care găzduiesc o secvență polinucleotidică terapeutică ca parte din genomul retroviral [Miller și colab., (1990) Mol. Cell. Biol.10. 4239; Kolberg R, (1992) J.NIH Res.4:43; Cornetta și colab., (1991) Hum. Gene Ther.2: 215). Au fost, de asemenea, descriși vectori adenovirali pentru utilizare potențială în terapia geniă umană (Rosenfeld și colab., (1992) Ce//68: 143).
1700
1705
1710
1715
1720
1725
1730
1735
RO 117328 Bl
Cealaltă metodă de transfer de gene, care a fost aprobată pentru utilizare în cazul oamenilor, este transferul fizic al DNA-ului plasmidial din lipozomi direct în celule tumorale, in situ. Spre deosebire de vectorii virali care trebuie să fie propagați în celule cultivate, DNA-ul plasmidial poate fi purificat la omogenitate, și astfel se reduce potențialul de contaminare patogenă. în unele situații (de exemplu, celule tumorale) poate să nu fie neapărat necesar ca DNA-ul exogen să se integreze stabil în celula transdusa, deoarece, exprimarea trecătoare poate fi suficientă pentru uciderea celulelor tumorale. Transferul DNA-ului mediat de lipozomi a fost descris de diverși cercetători (Wang și Huang (1987) Biochem. biophys. Res. Commun.147; 980; Wang și Huang (1989) Biochemistry 28; 9508; Litzinger și Huang (1992) Biochem. Biophys. Acta 1113; 201; Gao și Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280, Felgner WO 91/17424, WO 91/16024)
Imunolipozomii au fost, de asemenea, descriși ca purtători de polinucleotide exogene (Wang și Huang (1987) Proc. Nati. Acad.Sci. [USA] 84; 7851; Trubetskoy și colab., (1992) Biochem.Biophys.Acta 1131:311]. în mod ipotetic, se presupune că imunolipozomii ar avea o specificitate de tip celular îmbunătățită, comparativ cu lipozomii, datorită incluziunii de anticorpi specifici care se leagă, posibil, la antigeni de suprafață de pe tipuri specifice de celule. Behr și colab., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.(SUA) 86: 6982 raportează utilizarea lipopoliaminei drept reactiv de mediere a transfecției înseși, fără necesitatea vreunei fosfolipide suplimentare pentru formarea lipozomilor.
în consecință, o polinucleotidă substanțial identică cu cel puțin 25 de nucleotide, preferabil 50-100 nucleotide sau mai mult, din secvența componentei RNA-zice a telomerazei sau din complementul său, este operabil legat de un promotor heterolog, pentru a forma o unitate de transcriere capabilă să exprime o componentă RNAzică a telomerazei sau o polinucleotidă antisens din componenta RNA-zică a telomerazei, într-o celulă umană. □ astfel de unitate de transcriere poate fi cuprinsă întrun vector adenoviral, transgenic, sau altă modalitate de terapie genică pentru eliberare în celulele umane, cum ar fi în terapia unei boli determinate de telomerază (exemplu neoplazia). Metode de eliberare, adecvate, a produsului de construcție, de exprimare, sens sau antisens, a componentei RNA-zice a telomerazei, vor fi selecționate de către specialiști, în funcție de practicile acceptabile și de cerințele reglatoare.
Forme de animale transgenice
Clone genomice ale componentei RNA-zice a telomerazei de mamifere, în particular ale genelor pentru componenta RNA-zică a telomerazei, care sunt substanțial identice cu componenta RNA-zică a telomerazei de șoarece, pot fi utilizate pentru construirea de produși omologi de țintire pentru a genera celule și animale non-umane transgenice având cel puțin o alelă funcțională scindată, a componentei RNA-zice a telomerazei. Ghidarea spre construirea de produse de construcție omologi, țintă, poate fi găsită în domeniu, incluzând: Rahemtulla și colab.,(1991) Nature 353; 180; Jasin și colab.,(1990) Genes Devei.4; 157; Koh și colab., (1992) Science 25D. 1210; Molina și colab,, (1992) Nature 357; 161; Grusby și colab., (1991) Science 252; 1417; Bradley și colab., (1992) Bio/Technology 10; 534, incluse aici ca referințe).
Țintirea omoloagă poate fi utilizată pentru generarea așa-numiților “șoareci kockout”, care sunt heterozigoți sau homozigoți din punct de vedere al unei alele inactivate a componentei RNA-zice a telomerazei. Astfel de șoareci pot fi vânduți comercial
RO 117328 Bl ca animale de cercetare pentru investigarea dezvoltării sistemului imun, a neoplaziei, a spermatogenezei, pot fi utilizați ca animale de casă, ca proteină animală (aliment), și alte utilizări.
Șoareci himerici țintă sunt derivați conform lui Hogan și colab., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988] și Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practicai Approach, E. J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987) care sunt incluse aici ca referințe. Celulele stern embrionare sunt manipulate conform procedeelor publicate (Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practicai Approach, E. J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C.(1987); Zjilstra și colab., (1989) Nature 342: 435; și Schwartzberg și colab., (1989) Science 246: 799, fiecare dintre acestea fiind inclusă aici ca referință).
în plus, un cDNA pentru componenta RNA-zică a telomerazei sau o copie genomică de genă pot fi utilizate pentru construirea de transgene pentru exprimarea componentei RNA-zice a telomerazei la nivele înalte și/sau sub controlul transcripțional al secvențelor de control al transcrierii care nu se află în mod natural, învecinate cu gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei. Spre exemplu, dar nu ca limitare, un promotor constitutiv (de exemplu, un promotor HSV-tk sau pgk) sau o secvență reglatoare transcripțională specific de natura celulei (de exemplu, un promotor/”enhancer” (crescător) de gene CD4 sau CD8) pot fi operabil legați la o secvență polinucleotidică pentru componenta RNA-zică a telomerazei, cu formarea unei transgene (în mod caracteristic, în combinație cu un marker selecționabil cum ar fi, caseta de exprimare genică neo). Asemenea transgene pot fi introduse în celule (de exemplu, celule ES, celule stern hematopoietice), iar celule transgenice și animale nonumane transgenice pot fi obținute conform metodelor convenționale. Celulele transgenice și/sau animalele non-umane transgenice pot fi utilizate pentru screeningul agenților antineoplasmici și/sau al potențialilor carcinogeni, după cum supraexprimarea componentei RNA-zice a telomerazei sau exprimarea neadecvată a componentei RNA-zice a telomerazei pot avea ca rezultat o stare preneoplasmică sau neoplasmică.
Determinările de screening a agentului
Polinucleotidele componentei RNA-zice a telomerazei, preparatele din componenta proteică a telomerazei, matrițele repetitive ale telomerului, și reacțiile de legare și analogii acestora sunt lucrate practic, cu referire la exemplele experimentale, în general, componentele proteice ale telomerazei sunt obținute prin purificarea obișnuită din celule de mamifere care exprimă telomeraza, și sunt îndepărtate de componenta RNA-zică asociată anterior utilizării lor în determinările descrise aici. Condiții apoase particulare pot fi selecționate de către specialist, în conformitate cu metodele convenționale. Pentru orientarea generală, pot fi utilizate următoarele condiții de tamponare, apoase: NaCI 10 - 250 mM, Tris HCI 5-50 mM, pH=5-8, cu adăugare opțională de cation(i) bivalent(i) și/sau de chelatori metalici și/sau detergenți non-ionici și/sau fracțiuni membranare. Este apreciat de către specialiștii din domeniu că adițiile, delețiile, modificările (cum ar fi pH) și substituțiile [cum ar fi, substituirea KCI cu NaCI sau substituția de tampon) pot fi făcute la aceste condiții de bază. La condițiile de bază ale reacției de legare pot fi făcute modificări, atâta timp cât formarea holoenzimei telomeraza specifică și/sau activitatea telomerazei au loc în reacție(ii) martor. Condițiile care nu permit legarea și clivarea specifice în reacțiile martor (fără agent inclus) nu sunt potrivite pentru utilizarea în determinările de legare.
1790
1795
1800
1805
1810
1815
1820
1825
1830
RO 117328 Bl
De preferat, pentru determinarea legării componentei RNA-zice a telomerazei la componenta proteică imobilizată a telomerazei, speciile de componentă RNA-zică a telomerazei sunt marcate cu un marker detectabil, în mod caracteristic, o grupare biotinil, o parte fluorescentă, sau un nucleotid radiomarcat încorporat. Marcarea potrivită pentru componenta proteică a telomerazei include, dar nu se limitează la radiomarcarea prin încorporare a unui aminoacid radiomarcat (de exemplu, leucină marcată cu 14C, glicină marcată cu 3H, metionină marcată cu 35S), radiomarcarea prin radioiodurare post-translațională cu 125l sau 1311 (de exemplu, reacție Bolton-Hunter și cloramină T), marcare prin fosforilare post-translațională cu 32P (de exemplu, fosforilază și fosfat anorganic radiomarcat), marcare fluorescentă prin încorporarea unui marker fluorescent (de exemplu, fluoresceină sau rodamină), sau marcare prin alte metode convenționale cunoscute în domeniu. în formele în care una dintre speciile de polipeptidă este imobilizată prin legare la un substrat, cealaltă componentă este, în general, marcată cu un marker detectabil.
Componenta RNA-zică sau cea proteică a telomerazei, marcate, sunt puse în contact cu componenta proteică, sau, respectiv, cu componenta RNA-zică a telomerazei, imobilizate, iar capacitatea unui agent de a altera cantitatea de componentă marcată devine imobilizată (adică care leagă componenta telomerazică înrudită, este capturată). Durata și temperatura de incubare ale unei reacții de legare pot fi variate, atâta timp, cât condițiile selecționate permit ca legarea specifică să aibă loc într-o reacție martor, unde nu este prezent nici un agent. Forme preferabile utilizează o temperatură de reacție, de aproximativ cel puțin 15°C, mai preferabil, 35 - 42°C și, un timp de incubare, de aproximativ 15 s, cel puțin, deși sunt preferabile durate mai lungi de incubare, astfel, încât în unele reprezentări, este atins un echilibru de legare. Cineticile de legare și stabilitatea termodinamică a complexelor legate determină latitudinea disponibilă pentru varierea duratei, a temperaturii, a sării, pH-u)ui, și a altor condiții de reacție. Totuși, pentru oricare reprezentare particulară, condițiile reacției de legare dorite pot fi calibrate rapid de către specialist, prin utilizarea de metode convenționale în domeniu, care pot include analiza legării Satchard, analiza Hill și alte metode [Proteins, Structure and Molecular Principles, [1984) Creighton (ed.) W. H. Freeman and Company, New York).
Legarea specifică a componentei proteice marcate a telomerazei la componenta imobilizată RNA-zică a telomerazei, este determinată prin includerea proteinei competitoare nemarcate (de exemplu, albumina) și/sau a RNA-ului nemarcat. După definitivarea unei reacții de legare, se detectează cantitatea din speciile marcate care este/sunt specific legate de speciile imobilizate. Spre exemplu, dar nu exclusiv, după o perioadă corespunzătoare de incubare pentru legare, faza apoasă conținând componenta proteică a telomerazei, marcată, neimobilizată, este îndepărtată, iar substratul conținând speciile de holoenzimă telomerază imobilizată, marcată, și orice componentă proteică a telomerazei, marcată, legată de aceasta, este spălată cu un tampon corespunzător, conținând opțional agentul de blocare nemarcat(ți), iar tamponul de spălare, îndepărtat. După spălare, este determinată cantitatea de marker detectabil rămas specific legat de componenta marcată, imobilizată, [de exemplu, prin metode optice, enzimatice, autoradiografice sau alte metode radiochimice).
în unele reprezentări, este inclusă și adăugarea de agenți de blocare nemarcați care inhibă legarea nespecifică. Exemple de astfel de agenți de blocare includ, dar nu
RO 117328 Bl
1880 se limitează la următorii: DNA de timus de vițel, DNA din spermă de somon, RNA de drojdie, secvențe de oligonucleotide amestecate (secvență randomizată sau pseudorandomizată) de diferite lungimi, albumină serică bovină, detergenți neionici (NP-4O, Tween, Triton X-1OO, etc.), proteine de lapte praf degresat, reactiv Denhardt, polivinilpirolidona, Ficoll, și alți agenți de blocare. Specialiștii pot selecționa, în mod discret, agenți de blocare în concentrații adecvate a fi incluse în testele de legare.
în reprezentările în care o componentă RNA-zică a telomerazei sau o componentă proteică a telomerazei, este imobilizată, poate fi utilizată legarea covalentă sau necovalentă la un substrat. Legăturile chimice covalente includ, dar nu se limitează la metodele bine caracterizate în domeniu (Kadonaga și Tijan (1986) Proc. Nat/. Acad. Sci.(USA) 83: 5889). Un ex., nu spre limitare, este legarea covalentă la un substrat derivatizat cu bromură cianogenă (cum ar fi, Sepharose 4B derivatizată cu CNBr). Poate fi de dorit utilizarea unui spațiator pentru reducerea potențialului obstacol steric din substrat. Legarea necovalentă a proteinelor la un substrat include, dar nu se limitează la, legarea proteinei la o suprafață încărcată, și legarea cu anticorpi specifici.
într-o altă reprezentare, agenții terapeutici candidați sunt identificați prin capacitatea lor de a bloca legarea unei componente proteice a telomerazei la o componentă RNA-zică a telomerazei.
în mod caracteristic, o componentă RNA-zică a telomerazei utilizată în aceste metode conține o secvență a componentei RNA-zice a telomerazei de mamifere, existente în mod natural, (de exemplu, o componentă RNA-zică umană), deși, uneori sunt utilizate secvențe ale componentei RNA-zice mutante, a telomerazei, dacă componenta RNA-zică mutantă a telomerazei se leagă la componenta proteică a telomerazei, în condițiile determinării martor (de exemplu, condiții fiziologice).
într-o altă reprezentare, agenții candidați la modularea telomerazei sunt identificați prin capacitatea lor de a produce o reducere sau o creștere semnificativă din punct de vedere statistic, în transcrierea unei secvențe polinucleotidice raportoare (de exemplu, gena pentru y^galactodază, gena pentru luciferază, gena pentru HPRT) legată operabil de o secvență de reglare a transcrierii dintr-o genă pentru componenta RNA-zică a telomerazei de mamifere, preferabil dintr-o genă pentru componenta RNAzică a telomerazei umane, într-o celulă de mamifere,, activă din punct de vedere metabolic. □ genă raportoare (exemplu HPRT) poate fi inserată într-un situs de restricție sau într-un situs cu capete tocite dintr-un cDNA ds al unei componente RNAzice a telomerazei de mamifere pentru a genera un construct omolog de țintire, sau transgenă, în care, într-o celulă viabilă de mamifer, gena raportoare este plasată sub controlul transcripțional al promotorului genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei endogene și al elementelor de control transcripțional, înrudite. Agenții care produc o modulare transcripțională dependentă de doză a genei raportor, sunt astfel identificați ca agenți candidați la modularea telomerazei.
într-o variantă, o genă endogenă pentru componenta RNA-zică a telomerazei, dintr-o celulă de mamifere, este proiectată cu un construct omolog de proiectare, pentru plasarea unei secvențe polinucleotidice raportoare în legătură operabilă cu secvența de reglare a transcrierii în amonte (de exemplu, promotor), din gena endogenă pentru componenta RNA-zică a telomerazei, din locusul cromozomal al genei endogene. într-o variantă alternativă, o polinucleotidă exogenă conținând o polinucleotidă raportoare, este operabil legată la o regiune reglatoare a transcrierii genei pentru
1885
1890
1895
1900
1905
1910
1915
1920
1925
RO 117328 Bl componenta RNA-zică a telomerazei de mamifere (de exemplu, promotor și situsuri de legare a factorului de transcriere în amonte]; polinucleotida exogenă este transferată într-o celulă de mamifer în care se poate integra non-omolog, într-o localizare cromozomală și/sau este păstrată sau replicată ca o polinucleotidă epizomală. Agenți care produc o modulare transcripțională semnificativă din punct de vedere statistic a polinucleotidei raportoare în celule tratate cu agentul, sunt în felul acesta identificate ca agenți candidați de modulare a telomerazei de mamifere.
Agenții de modulare a telomerazei, care reduc capacitatea celulei de a repara deteriorarea telomerului sau de a inhiba replicarea telomerului (de exemplu, prin inhibarea competitivă a telomerazei existente în mod natural], sunt agenți candidați antineoplasmici sau agenți de sensibilizare care sensibilizează celulele (de exemplu, celulele neoplazice) la agenții de depreciere a telomerului (de exemplu, agenți de alchilare și radiația ionizantă).
Agenții candidați antineoplazici sunt testați apoi, suplimentar, în ceea ce privește activitatea antineoplazică în determinări utilizate în mod curent pentru prevederea potrivirii pentru folosirea ca medicamente antineoplazice umane. Exemple de astfel de teste includ, dar nu se limitează la; (1) abilitatea agentului candidat de a inhiba capacitatea celulelor transformate prin îmbinare independentă, de a crește pe agar moale, (1) abilitatea de a reduce tumorigenicitatea celulelor transformate transplantate în șoareci nu/nu, (2) abilitatea de a inversa transformarea morfologică a celulelor transformate, (4) abilitatea de a reduce creșterea tumorilor transplantate în șoareci nu/nu, (5) abilitatea de a inhiba formarea de tumori sau de celule preneoplazice în modele animale de carcinogeneză spontană sau indusă chimic, și (6) abilitatea de a induce un fenotip mai diferențiat în celulele transformate la care s-a aplicat agentul.
Testele pentru detectarea capacității agenților de a inhiba sau spori componenta proteică a telomerazei: legarea componentei RNA-zice a telomerazei și/sau activitatea enzimatică a telomerazei asigură screeningul ușor de înaltă legătură, al băncilor de agenți (de exemplu, bibliotecă de compuși, biblioteca.în peptide, și analogi) pentru identificarea antagoniștilor sau agoniștilor telomerazei. Astfel de antagoniști și agoniști pot modula activitatea telomerazei, modulând astfel competența reparatorie a telomerului și potențialul replicativ.
Administrarea unei doze, eficiente dintr-un agent capabil să inhibe în mod specific activitatea telomerazei la un pacient, poate fi utilizată ca metodă terapeutică sau profilactică pentru tratarea stărilor patologice [de exemplu, cancer, inflamări, boli limfoproliferative, boli autoimune, boli neurodegenerative) și altele asemănătoare, care sunt tratate în mod eficient prin modularea activității telomerazei și repararea și replicarea DNA-ului.
Prin citirea acestei prezentări va fi evident celor care lucrează în domeniu că prezenta invenție prezintă reactivi valoroși în legătură cu telomeraza umană, ca și o varietate de metode utile de terapie și diagnostic. Descrierea de mai sus a necesității furnizează o probă limitată din aceste metode, care nu trebuie luate ca o limitare a scopului prezentei invenții. Alte trăsături și avantaje ale invenției vor fi evidente din următoarele exemple și revendicări.
Următoarele exemple descriu aspectele specifice ale invenției pentru ilustrarea acesteia și prezintă o descriere a metodelor utilizate pentru izolarea și identificarea componentei RNA-zice a telomerazei umane de către experții în domeniu. Exemplele nu trebuie interpretate ca o limitare a invenției, ci, pur și simplu, ele furnizează metodologia specifică, utilă în înțelegerea și practica invenției.
RO 117328 Bl
Exemple experimentale
Vedere de ansamblu
Clonarea componentei RNA-zice a telomerazei umane a necesitat o metodă nouă care implică selecția negativă și cicluri de selecție pozitivă, descrise mai jos. Inițial, s-a făcut totuși, o încercare de donare a componentei RNA-zice, utilizând transcrierea inversă și o metodă pentru clonarea capetelor de cDNA, numită amplificare PCR ‘5-RACE. Reacția de transcriere inversă a fost inițiată cu un primer identic cu unitatea repetitivă din porțiunea monocatenară a DNA-ului telomeric uman și complementară, astfel, cu o secvență presupusă a fi prezentă în componenta RNA-zică a telomerazei umane. în acest fel, primerul conține la capătul său 5'- o secvență corespunzătoare unui situs de recunoaștere al enzimei de restricție. Cu toate acestea, atunci când cDNA-ul produs prin reacția de transcriere inversă și amplificare PCR, a fost examinat prin electroforeză în gel și analiza secvenței nucleotidice a benzilor de acid nucleic prezente în gel, au fost detectate doar secvențe de RNA ribozomal. Probleme similare au fost întâmpinate atunci când au fost încercate variații ale abordării 5'-RACE, utilizând primeri grupați.
Efortul de succes al donării a început cu prepararea cDNA din preparate purificate de telomerază umană, ca și din linii celulare care au activitate telomerazică umană, și din linii celulare care nu au activitate detectabilă a telomerazei umane. Metoda utilizată pentru prepararea cDNA-ului este descrisă în detaliu, în exemplul 1, de mai jos. Două etape de selecție negativă și cicluri succesive de selecție pozitivă au fost utilizate împreună cu preparate de cDNA din cele două linii celulare umane pentru scăderea concentrației de secvențe nedorite și pentru sporirea concentrației de secvențe dorite ale componentei RNA-zice.
Etapele selecției negative au implicat prepararea produsului PCR biotinilat din cDNA preparat dintr-o linie celulară umană care nu are activitate telomerazică detectabilă. Produsul PCR biotinilat a fost denaturat și apoi rehibridizat într-o soluție conținând o concentrație mult mai scăzută din produsul PCR ne-biotinilat (100 produs biotinilat: 1 produs ne-biotinilat) din cDNA preparat dintr-o linie celulară umană care are activitate telomerazică. în condițiile posibilității ca linia celulară telomerază-negativă să poată conține o oarecare cantitate mică de componentă RNA-zică, etapa de hibridizare a fost condusă spre discriminarea sau selecția doar aRNA-ului exprimat în mod abundent în ambele linii celulare. După hibridizarea la un Cot selecționat pentru a permite hibridizarea RNA-ului cel mai abundent exprimat, materialul nedorit a fost îndepărtat prin legarea la particule magnetice streptavidinilate; supernatantul rămas după colectarea particulei a conținut cDNA-ul dorit pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane. Procesul de amplificare prin PCR a cDNA-ului este descris, în exemplul 2, de mai jos.
Acest material a fost în continuare îmbogățit cu cDNA-ul dorit, prin cicluri succesive de selecție pozitivă. în etapa de selecție pozitivă, o sondă biotinilată, complementară cu secvența matriță presupusă din componenta RNA-zică a telomerazei umane a fost hibridizată cu produsul PCR dintr-o probă îmbogățită (prin selecție negativă) a cDNA-ului amplificat prin PCR, dintr-o linie celulară umană care prezintă activitate telomerazică. După hibridizare, complexele sondă/țintă au fost legate la granule magnetice avidinilate, care au fost apoi colectate și utilizate ca sursă de acid nucleic îmbogățit în secvențe de componentă RNA-zică, prin cicluri ulterioare de selecție pozitivă. Procesul de selecție pozitivă este descris mai detaliat, în exemplele 3 și 4 de mai jos.
1975
1980
1985
1990
1995
2000
2005
2010
2015
2020
RO 117328 Bl
După cel de-al treilea ciclu de selecție pozitivă, produșii de amplificare au fost separați prin electroforeză în gel, iar secțiunile de gel corespunzătoare acizilor nucleici de 2DO pb au fost îndepărtate. Acizii nucleici au fost apoi eluați din secțiunile de gel și amplificați prin tehnica PCR. Produsele de amplificare prin PCR au fost digerați cu enzime de restricție Notl, iar apoi inserați prin ligare în situsul Notl al plasmidei pBluescriptllSK+, disponibilă comercial de la Stratagene. Plasmidele rezultante au fost transformate în celule gazdă de E coli, iar coloniile individuale au fost izolate și utilizate ca o sursă de acid nucleic pentru analiza ulterioară și secvențializarea DNA. Un număr de clone pozitive prin acest test au fost apoi analizate prin secvențializarea DNA-ului și printr-o varietate de alte teste.
Aceste alte teste au inclus următoarele (1) determinarea dacă oligonucleotidele antisens complementare presupusă cu componenta RNA-zică ar inhiba activitatea telomerazei în extracte celulare umane, cunoscute a conține telomerază; (2) determinarea dacă primerii PCR specifici pentru o presupusă secvență clonală a componentei RNA-zice, ar putea fi utilizați pentru amplificarea unui acid nucleic prezent într-o probă telomerazică și dacă produsul observat ar putea urmări activitatea telomerazică în timpul purificării telomerazei; și (3) determinarea dacă primerii PCR specifici unei presupusă secvențe clonale a componentei RNA-zice, ar putea fi utilizați pentru amplificarea unui acid nucleic prezent într-o abundență mai mare în extractele celulare de celule în care activitatea telomerazei este cunoscută a fi ridicată (adică celule tumorale), decât în extractele celulare de celule cunoscute a nu produce sau a produce doar cantități mici de activitate telomerazică. □ clonă, denumită plasmida pGRN7 a produs rezultate în aceste teste compatibile cu determinarea dacă plasmida a cuprins cDNA-ul corespunzător componentei RNA-zice a telomerazei umane.
Astfel, oligonucleotidele antisens corespunzătoare secvențelor din prezumtiva secvență a componentei RNA-zice a lui pGRN7, au manifestat inhibarea activității telomerazei in vitro. La fel, atunci când telomeraza a fost purificată din extracte celulare printr-un proces implicând (1) cromatografie pe DEAE; (2) cromatografie pe Sephadex S 3OD; și (3) separare, fie în gradient de glicerol, fie pe SP sepharoză, fie pe fenil sepharoză, iar fracțiunile colectate, primerii specifici PCR pentru prezumtiva secvență a componentei RNA-zice a pGRN7 au amplificat un acid nucleic de mărime corespunzătoare, iar cantitatea de produs de amplificare s-a corelat bine cu cantitatea de activitate telomerazică observată în fracțiunile colectate. în final, extracte celulare de celule normale (fără activitate telomerazică detectabilă) și celule canceroase (cu activitate telomerazică prezentă), ca și din testicule (cu activitate telomerazică prezentă), au prezentat cantități corespunzătoare de produs PCR prin revers transcriere și amplificare PCR (RT-PCR) cu primeri specifici pentru componenta RNA-zică, prezumtivă, conținută în pGRN7. Protocolul pentru RT-PCR este descris, în exemplele 5 și 6, de mai jos.
Rezultatele de mai sus furnizează dovada convingătoare că, componenta RNAzică a telomerazei umane a fost donată, încât plasmida pGRN7 a fost apoi utilizată pentru izolarea unei clone genomice pentru componenta RNA-zică dintr-o linie celulară umană, așa cum s-a descris,în exemplul 7, de mai jos. Clona genomică a fost identificată în, și izolată dintr-o bibliotecă genomică a DNA-ului uman inserat într-un vector lambda FIXII achiziționat de la Stratagene. Clona dorită conținând secvențele de genă pentru componenta RNA-zică a conținut un insert de 15 kb și a fost denumită clona
RO 117328 Bl
28-1. Această clonă a fost depozitată în America Type Culture Collection și este accesibilă sub numărul de acces 75925. Diferite fragmente de restricție au fost subclonate din acest fag, și au fost secvențializate. Gena a fost, de asemenea, localizată la capătul periferic al brațului q al cromozomului 3. Informația secvenței a fost obținută dintr-un situs de recunoaștere al enzimei de restricție Sad HA 1 la un capăt al insertului de 15 kb la un situs de recunoaștere intern al enzimei de restricție HindWl, care conține toată secvența componentei RNA-zice mature, ca și elementele de control al transcrierii din gena pentru componenta RNA-zică, a clonei lambda 28-1, și a fost prezentată în lucrarea de mai sus.
în continuare, se prezintă 14 exemple de realizare ale invenției, în legătură cu fig. 1-4, care reprezintă:
- fig. 1, activitatea telomerazei din celulele care exprimă (produc) extractele de TRC3 mutaționate pe matriță, fracționate pe DEAE-sefaroză, din transformanții stabili care exprimă mutantul TRC3, a fost determinată cu ajutorul testelor convenționale, în condiții de reacție diferite. Extractele din celulele care exprimă MuC+17 (benzile 1, 4, 7, 10, 13, 16 marcate cu C*), MuC TRC-3 (benzile 2, 5, 8, 11, 14, 17, însemnate C), sau MuA TRC3 (benzile 3, 6, 9, 12, 15, 18, însemnate A) au fost testate în condițiile normale de reacție (benzile 1-6), normal plus 0,5 mM ddCTP (benzile 7-9), normal minus dTTP plus 0,5 mM ddTTP (benzile 10-12), sau normal minus dATP plus 0,5 mM ddATP (benzile 13-18). Reacțiile test din benzile 1-9 au conținut 8 μΜ dGTP total, 1 μΜ din care au fost 32P-dGTP (800 Ci/mmol). Pentru facilitarea detectării telomerazei mutante, reacțiile de determinare din benzile 10-18 au conținut 8 μΜ dGTP total, 2 μΜ din aceștia fiind 32P-dGTP (800 Ci/mmol). Extractele au fost tratate cu RN-ază liberă de DN-ază (25 μg/ml,timp de 10 min, la 30°C), anterior determinărilor pentru tolomerază (benzile 1-3, 16-18). Benzile de flancare conțin markeri DNA cu mărimea în nucleotide (nt) așa cum se indică.
-fig.2, nivelul stării staționare a componentei RNA-zice a telomerazei (hTR) și GAPDH RNA a fost determinat prin tehnica RT-PCR cantitativă. Martorii arată că toate cantitativările PCR au fost în domeniul linear până la 25 de cicluri. RT-PCR a fost analizat pentru 5 linii celulare normale telomerază-negative (1-5) și 5 linii celulare tumorale telomerază-pozitive (6-10): 1] plămân fetal primordial: 2) piele de mână de feotus primordial; 3) prostată primordială de adult; 4) fibroblaste sinoviale primordiale; 5) fibroblaste de prepuț: 6) melanom LOX; 7) leucemie U251; 8) carcinom de plămân NCIH23; 9) tumoră de colon SW620; 10) tumoră de sân MCF7. Produsele obținute prin tehnica PCR au fost marcați cu 32P, redescompuși pe PAGE (electroforeză în gel de poliacrilamidă) 6%, și cantitativați cu un Phosphorlmager. Transcrierea relativă este exprimată în unități arbitrare.
-fig.3, lungimea medie TRF din componenta antisens RNA-zică a telomerazei, și celulele vectoare martor. Celulele HeTe7 care exprimă stabil 10-3-hTR antisens sau vectorul martor, au fost selecționate pe medii cu higromicină și puromicină și au fost cultivate și recoltate la 23 PDL post transfecție. DNA-ul nuclear a fost sondat în gel cu o oligonucleotidă (TTAGGG)3 pentru a marca fragmentele de restricție telomerice terminale (TRF=terminal restriction fragmentă). Gelul a fost scanat cu un Molecular Dynamic’s Phosphorlmager, iar TRF medii au fost cantitative așa cum s-a descris (Allsopp și col. (1992) Proc.Natl.Acad-Sci.[USA)89: 10114). Liniile punctate indică media TRF pentru grupele antisens și martor.
- fig.4, reprezentarea schematică a metodei PCR in situ.
2070
2075
2080
2085
2090
2095
2100
2105
2110
RO 117328 Bl
Exemplul 1. Prepararea cDNA-ului amplificabil prin PCR
RNA a fost obținut din celule 293 și IMR-90 prin extracție cu guanidinătiocianat sau din fracțiuni purificate de telomeraza, prin extracții cu fenol/cloroform. RNA-ul total din celulele 293 este fracționat în funcție de mărime pe un gel de agaroză 2%, iar RNA-ul numărând mai puțin de 500 pb, a fost izolat.
Sinteza primei catene de cDNA este realizată cu revers transcriptază Superscript™ll obținută din Bethesda Research Laboratories (BRL). Aproximativ 0,5 1,0 Mg RNA sunt amestecate cu aproape 40 ng primer întâmplător (6 mer; pdN6) în apă la un volum total de 11 μ\. Soluția este încălzită, timp de 10 min, la 95°C și apoi, răcită pe gheață, timp de 5 - 10 min. Acidul nucleic denaturat este colectat prin centrifugare. RNA-ul denaturat și amestecul primer au fost, apoi resuspendate prin adăugarea, în ordinea arătată: 4 μ\ tampon pentru sinteza a 5x prima catenă; 2 μ\ ditiotreitol 0,1M (DTT); 1 μ\ RNAsin (Pharmacia); și 1 μ\ dNTP (2,5 mM din fiecare soluție stoc). Amestecul de reacție este incubat, la 42°C, timp de 1 min, apoi, 1 μ\ (200 unități) din Superscript™ll RTază (BRL) este adăugat și amestecat în reacție, fiind incubat apoi,timp de 60 de min, la 42°C. Amestecul de reacție rezultat, conținând cDNA recent sintetizat este plasat pe gheață până la desăvârșirea sintezei celei de-a doua catene.
Sinteza celei de-a doua catene de cDNA este realizată după cum urmează. Aproximativ 20 μ\ din amestecul de reacție din sinteza primei catene de cDNA (de mai sus) sunt amestecați cu, în ordinea arătată, următoarele componente: 111,1 μ\ apă; 16 μΙ tampon pentru DNA ligază de E.coli 10x; 3 μΙ de dNTP (2,5 mM din fiecare stoc); 1,5 μΙ de DNA ligază de E.coli(15 unități din BRL); 7,7 μΙ DNA polimerază de
E.coli(40 unități de la Pharmacia); și 0,7 μΙ RNA-ză H de E.coli(BRL). Soluția rezultată este amestecată ușor și incubată, timp de 2 h, la 16°C, moment în care, la fiecare tub de reacție se adaugă 1 μΙ (10 unități) de DNA polimerază T4, iar incubarea continuă, timp de 5 min, la aceeași temperatură (16°C). Reacția este stopată, iar acidul nucleic este colectat prin extracție cu fenol/cloroform de două ori, urmat de precipitarea acidului nucleic cu etanol, și centrifugarea amestecului de reacție pentru sedimentarea acidului nucleic.
Sedimentul de cDNA colectat prin centrifugare este resuspendat în 20 μΙ de tampon TE și legat la o oligonucleotidă dublu catenar numită “NotAB” alcătuită din două oligonucleotide (NH2 este o grupare de blocare amino):
NotA: 5'-pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH2 NotB: 5'-TGAATTCTTCTTGCGGCCGCTAT-3'
Oligonucleotidă dublu catenară este produsă prin amestecarea a 50 μΙ de oligonucleotidă NotA (100 pmol) cu 50 μΙ de oligonucleotidă NotB (100 pmol) în 46,25 μΙ apă, prin încălzirea soluției rezultate, timp de 5 min, la 95°C, și adăugare de 3,75 μΙ de tampon 20x SSC în soluția încă fierbinte. Tubul conținând amestecul este plasat apoi într-o mensură conținând apă fierbinte (la o temperatură, de aproximativ 70-75°C), temperatură la care s-a permis picurarea înceată sub 15°C, așa încât cele două oligonucleotide ar putea hibridiza pentru a forma oligonucleotidă dublu catenară NotAB. Acidul nucleic rezultat este colectat prin precipitare și centrifugare.
Oligonucleotidă dublu catenară NotAB este resuspendată în aproximativ 30 μΙ tampon TE și apoi, legată la cDNA într-un amestec de reacție conținând 10 μΙ din preparatul cDNA descris mai sus, aproximativ 50 pmol (calculați prin OD260) de
RO 117328 Bl
NotAB; 2 μΙ de tampon pentru DNA ligază T4 1Ox; 1,2 μΙ de DNA ligază T4; 0,2 μΙ de ATP 10 mM; și apă, într-un volum total de 20 μΙ prin incubarea amestecului de reacție, la 16°C, peste noapte. Reacția este apoi inactivată termic prin încălzirea amestecului de reacție, timp de 10 min. la 65°C. Aproximativ 1 - 2 μΙ din amestecul rezultat este utilizat în mod caracteristic pentru amplificarea prin PCR; unii pot amplifica amestecul de legare 10-15 cicluri (94°C, 45 s, 60°C, 45 s și 72°C, 1,5 min) și păstrat ca stoc, așa cum se descrie, în exemplul 2.
Exemplul 2. Amplificarea prin PCR a cDNA cDNA-ul este amplificat în mod obișnuit prin prepararea unui amestec de reacție de amplificare alcătuit din 5 μΙ de tampon PCR 10x (500 mM KCI; 100 mM Tris, pH = 8,3; și 20 mM MgCI2; 5-8 μΙ de dNTP (2,5 mM fiecare); 1 μΙ de Taq polimerază (Boehringer-Mannheim); 0,1 μΙ din gena proteinei 32 (Boehringer-Mannheim); 6 μΙ din primerul NotB (20 μΜ stoc); 2 μΙ cDNA (preparat așa cum s-a descris, în exemplul 1), și apă până la 50 μΙ. Acest amestec este separat apoi cu 50 - 100 μΙ ulei mineral, iar amplificarea PCR este desăvârșită în 10-15 cicluri, de 94°C, 45 s, 60°C, 45 s și 72°C, 1,5 min. După amplificare, amestecul de reacție este extras cu fenol/cloroform, iar acidul nucleic amplificat este precipitat cu etanol și colectat prin centrifugare. Precipitatul este apoi, dizolvat în 100 μΙ de tampon TE pentru prepararea unei soluții stoc.
Exemplul 3. Amplificarea PCR pentru hibridizarea negativă și selecția ciclică
Pentru obținerea produsului PCR pentru hibridizarea negativă și selecția ciclică, aproximativ 1 μΙ dintr-o soluție stoc preparată așa cum este descris, în exemplul 2, este amplificat în 50 μΙ de amestec de reacție PCR preparat așa cum este descris, în exemplul 2, cu excepția că 21-24 de cicluri de ciclizare a primerului, extensie și denaturare a produsului, sunt efectuate. După amplificare, amestecurile de reacție sunt extrase cu fenol/cloroform, precipitate cu etanol, și colectate prin centrifugare. Randamentul în produs este estimat prin colorare cu bromură de etiliu după electroforeză în gel de agaroză a unui mic alicot din amestecul de reacție. Pentru hibridizarea negativă, o bibliotecă de cDNA din celule negativ-telomerazice (IMR-90) este amplificată în prezența dUTP biotinilat. Un raport de aproximativ 100:1 de cDNA din celule telomerază-negative (IMR-90): cDNA din celule telomerază-pozitive (293) este utilizat pentru realizarea hibridizării negative. Condițiile standard sunt utilizate, la 65°C, pentru 48-72 h. în mod caracteristic, aproximativ 2 μg din produsul de acid nucleic din cDNA-ul parțial purificat și materialul selecționat negativ, este utilizat pentru cel puțin 2 runde de selecție ciclică.
După selecția ciclică, descrisă, în exemplul 4, aproximativ 1 - 2 μΙ din produsele selecționate “coborâți” (dintr-un volum total de 20 μΙ) sunt amplificate prin PCR, așa cum este descris în exemplul 2, în 22 de cicluri, precipitate cu etanol, și colectate prin centrifugare sub forma preparatului pentru următoarea selecție ciclică.
Exemplul 4. Selecția pozitivă a cDNA-ului amplificat prin PCR
Pentru etapa de selecție pozitivă a procesului de selecție ciclică utilizat pentru donarea componentei RNA-zice a telomerazei umane, aproximativ 2 gg din cDNA-ul amplificat prin PCR sunt diluați în 25 μΙ de tampon TE și apoi, amestecați cu 1,25 μΙ de 20x SSC, iar soluția rezultată este încălzită, la 95°C, timp de 3 min. Temperatura este redusă la 60°C, timp de 5 min și se adaugă 1 μΙ (0,1 Mg/μΙ) din sonda biotinilată
2165
2170
2175
2180
2185
2190
2195
2200
2205
RO 117328 Bl
R2 sau R4. Secvențele acestor sonde sunt prezentate mai jos. Sondele sunt sonde
O-metil-RNA, astfel, U este O-metil-uridină, A este O-metil-riboadenină, G este 0-metilriboguanină, iar I este înozină:
R2: 5'-UUAGGGUUAGII-biotină
R4: 5'-AUUGGGUUAUII-biotină
Sonda R2 este specifică pentru repetarea telomerului, iar sonda R4 este specifică pentru RNaza P, care este utilizată pentru a urmări validitatea și eficiența procesului ciclic de selecție. Prin executarea unei selecții ciclice în mod simultan, dar separat pentru RNA cu RNaza P, o moleculă din secvența cunoscută, se poate avea o mare încredere că procesul de selecție ciclică este complet funcțional în ceea ce privește molecular de interes, care în acest caz este componenta RNA-zică a telomerazei umane.
După adăugarea, fie a sondei R2, fie a sondei R4 în amestec, la 65°C, temperatura amestecului de reacție de hibridizare este redusă, la 3O°C prin incubarea amestecului la acea temperatură, timp de 5 min, iar apoi, amestecurile de reacție sunt răcite, în continuare încă, la o temperatură de 14°C, prin incubare la acea temperatură timp de 60 min. în final, amestecul este incubat, la 4°C, timp de 2 - 12 h.
întregul amestec de reacție de hibridizare pentru fiecare probă (R2 sau R4) a fost adăugat la 400 μ\ de O,5x SSC, la 4°C, și apoi adăugat la un tub de răcire cu gheață, cu perle magnetice, care sunt cumpărate de la Promega, și prespălate de 4 ori cu O,5x SSC înainte de utilizare. Amestecul rezultat este incubat, timp de 30 min, la 4°C pentru asigurarea legării complete la perlele magnetice. Fiecare tub de reacție este incubat apoi puțin, la temperatura camerei, pe un dispozitiv magnetic (Promega) pentru depunerea perlelor. Perlele sunt resuspendate în O,5x SSC rece (600 μΙ) și plasate (într-un tub) pe gheață. Probele sunt spălate de mai mult de trei ori cu 0,5x SSC în această manieră. Acidul nucleic este eluat din perle prin resuspendarea acestora în 100 μΙ apă și incubarea, timp de 2 min, la 65°C înaintea plasării perlelor înapoi pe dispozitivul magnetic, pentru colectare. Acest proces este repetat de mai mult de trei ori; ultima oară, perlele resuspendate sunt incubate, timp de 5 min, la 65°C înaintea plasării perlelor pe dispozitivul magnetic pentru colectare. Toate supernatantele de 100 μΙ (pentru fiecare probă)sunt reunite și uscate până la 20 μΙ într-o centrifugă SpeedVac™. DNA-ul recuperat este amplificat, apoi prin PCR pentru o altă rundă de amplificare și selecție. După fiecare amplificare, produsele PCR sunt extrase de două ori cu fenol/cloroform, precipitate cu etanol, și resuspendate în 20 μΙ de tampon TE.
în mod caracteristic, amplificările PCR au fost verificate prin electroforeză în gel de agaroză. în plus, sunt utilizați o varietate de martori pentru monitorizarea procesului de selecție ciclică. Ca un martor, “brațele” PCR (oligonucleotide cu secvență definită care servesc ca situsuri de hibridizare primară) sunt plasate pe un acid nucleic care conține o genă care conferă rezistența la neomicină. Acidul nucleic rezultat este amestecat cu cDNA-ul amplificat prin PCR și monitorizat la fiecare selecție cu PCR cantitativ. Ca un alt martor, RNaza P a fost urmărită în ambele biblioteci selectate de RNaza P și de componenta RNA-zică a telomerazei.
Exemplul 5. Protocolul RT-PCR
Prima catenă a cDNA-ului este făcută în conformitate cu procedeul descris în exemplul 1. în esență, RNA-ul este .purificat din fiecare fracțiune telomerazică
RO 117328 Bl conținând 0,1-1 gg RNA; în mod caracteristic, aproximativ 1/3 până la 1/5 din RNAul produs dintr-o fracțiune de 300 μ\, este utilizat. RNA-ul este amestecat cu 40 - 80 ng hexamer întâmplător în 10 μΙ, denaturat, timp de 10 min, la 95°C (utilizând un instrument de ciclizare termică), și răcit pe gheață. RNA-ul denaturat și 6-mer sunt adăugați la un amestec de reacție conținând 4 μΙ tampon de sinteză a 5x prima catenă, furnizat de către producătorul revers transcriptazei (RTază, cumpărată de la BRL), 2 μΙ de DTT 0,1 M, 1 μΙ de dNTP 10 mM (fiecare), 1 μΙ inhibitor RN-azic (Pharmacia), și apă până la un volum total de 9 μΙ. Amestecul combinat este plasat într-o baie de apă, la 42°C. După 1 - 2 min de incubare, la acest amestec se adaugă 1 μΙ de Superscript™ II Rtază (BRL). Incubarea este continuată, timp de 60 min, la 42°C. Reacția este stopată prin încălzirea tubului, timp de 10 min, la 95-98°C. Prima catenă de cDNA este colectată prin centrifugare scurtă, împărțită în părți alicote în tuburi noi, înghețată rapid pe gheață uscată și păstrată, la - 80°C, sau utilizată imediat.
Exemplul 6. Amplificarea PCR a cDNA-ului cu un set specific primer
Pentru o reacție PCR de 20 μΙ cu nucleotide marcate radioactiv, 1 μΙ din cDNAul preparat în conformitate cu procedeul, din exemplul 5, este amestecat cu 20 pmol din primerul 1, 20 pmol, din primerul 2, 2,5 μΙ de dNTP 2,5 mM, 5 μθί de alfa-32PdATP, 2 unități de polimeraza Taq (Boehringer-Mannheim), 0,2 μg din gena T4 pentru proteina 32 (Boehringer-Mannheim), 2 μΙ de tampon 10x (500 mM KCI, 100 mM Tris-HCI-pH= 8,3 și MgCI2 20 mM) și apă până la un volum total de 20 μΙ. La conținutul tubului se adaugă apoi o picătură de ulei mineral.
Condițiile pentru amplificarea PCR a clonei de componentă RNA-zică a telomerazei sunt: 94°C, timp de 45 s, 60°C, timp 45 s și 72°C, timp de 1,5 min. Numărul de cicluri diferă în funcție de tipul de materiale purificate utilizate pentru prepararea RNA, dar, în mod caracteristic, este cuprins, între 18 și 25 de cicluri. Ca și pentru toată RT-PCR, câteva reacții cu cicluri diferite sunt efectuate pentru fiecare probă pentru a determina când amplificarea PCR devine saturată și non-lineară.
Pentru ca RNaza P să fie utilizată ca martor, condițiile amplificării PCR sunț: 94°C, timp de 45 s, 50°C, timp de 45 s și 72°C, timp de 1,5 min. Iar, numărul de cicluri este cuprins,între 15 și 22 de cicluri, în funcție de natura probelor. Secvențele primerilor utilizați pentru amplificarea RNazei P sunt prezentate mai jos:
P3: 5'-GGAAGGTCTGAGACTAG-3' P4: 5-ATCTCCTGCCCAGTCTG-3'
Produsul obținut prin amplificare PCR cu acești doi primeri are un număr de aproximativ 110 pb.
După PCR, produsele (5 -10 μΙ din amestecul de reacție) au fost plasate pe un gel de poliacrilamidă nativă 6% și supuse electroforezei. După electroforeză, gelul este uscat și expus unei casete Phosphorlmager™ sau unui film autoradiografic, pentru analiză.
Exemplul 7. donarea genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane Procedeele utilizate pentru donarea genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane sunt efectuate, așa cum este descris, în general, în Maniatis și colab., Laboratory Molecular Cloning Manual. O bibliotecă genomică a DNA-ului din linia celulară WI-38 de fibroblast pulmonar uman, introdusă în vectorul - fag lambda FIXII, este cumpărată de la Stratagene. Fagul este pus pe placă la o concentrație de aproximativ
2255
2260
2265
2270
2275
2280
2285
2290
2295
RO 117328 Bl
25OOO trombocite per placă, în trei seturi de 15 plăci (150 mm). Plăcile sunt pregătite cu agar NZY și agaroză NZY; celulele utilizate pentru transformarea fagului sunt celulele X11 BlueMRAP2; iar transformanții sunt cultivați peste noapte, timp de aproximativ 16 h, la 37°C. Plăcile sunt apoi, răcite la 4°C, timp de aproximativ 1 h, iar apoi, trombocitele sunt “ridicate pe cercuri de nylon C/P (hârtie de filtru de la Bio Rad). Acest proces este repetat pentru a produce un set duplicat de filtre ridicate. Filtrele (în duplicat) sunt denaturate, neutralizate, echilibrate în tampon 6x SSC, expuse la radiație UV pentru a lega încrucișat acidul nucleic la filtru, și apoi, uscate pe hârtie blotter.
Prehibridizarea este condusă, timp de 1 h, la 37°Cîn tampon formamidă 50%. Filtrele sunt probate cu un fragment Λ/otl, de 218 pb, marcat radioactiv, din clona pGRN7, care este izolat prin electroeluție dintr-un gel de poliacrilamidă 5% după separarea prin electroforeză și apoi, nik translatat cu a-32P-dCTP, utilizând un kit de translație“nick” (crestătură) de la Boehringer-Mannheim Biochemicals, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Aproximativ 25 ng (~ 10 pCi marker) din sondă sunt utilizate per filtru, iar hibridizarea este condusă peste noapte, la 37°Cîn tampon de hibridizare - formamidă 50%. După hibridizare, filtrele sunt spălate, la temperatura camerei de 6 ori, primele 3 spălări sunt făcute cu 6 x SSC conținând SDS 0,1%, iar ultimele trei spălări sunt doar cu 6 x SSC. După o expunere inițială a câtorva filtre duplicat într-o casetă Phosphor Imager™ pentru a verifica eficacitatea hibridizării și tăria semnalului, filtrele sunt spălate, la 65°Cîn O,5x SSC. Filtrele sunt plasate apoi pe film Rodak XARS, utilizând două ecrane de intensificare, și permit expunerea filmului,timp de aproximativ 100 h,la - 7O°C.
Un semnal puternic emanat din filtrul conținând un fag, denumit mai târziu 281, conținând gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane. Trombocitul corespunzătoare semnalului observat pe filtru este utilizată pentru producerea plăcilor secundare, așa încât, o plăcuță sangomă izolată (confirmată prin sondare cu acid nucleic marcat pGRN7) ar putea fi cultivată pentru izolarea pe scară largă a fagului DNA. Fagul 28-1, disponibil din American Type Culture Collection sub numărul de acces 75925, conține un insert de ~ 15 kb și cuprinde câteva fragmente de restricție care conțin secvențe care hibridizează cu secvențele componentei RNA-zice pe pGRN7: un fragment de 4,2 kb din enzima de restricție EcoRI; un fragment de 4,2 kb din enzima de restricție C/al, și un fragment de 2,5 kb din enzima de restricție HindlW-Sad. Ultimul fragment conține întreaga secvență de -560 nucleotide a componentei RNA-zice prezentate mai sus și se presupune că ar conține gena completă pentru componenta RNA-zică. Plasmida conținând fragmentul de 2,5 kb din enzima de restricție H/ndlll-Sad din vectorul pBluescript a fost desemnată plasmida pGRN33 și este disponibilă de la American Type Culture Collection sub numărul de acces Nr.ATCC—. într-o măsură, gena umană poate conține secvențe, altele decât cele de pe fragmentul de 2,5 kb, acele secvențe pot fi izolate din fagul 28-1 sau din alte clone de fag identificate prin sondare cu fragmentul de 2,5 kb (sau cu o altă sondă din prezenta invenție). Fragmentele de enzima de restricție notate mai sus sunt preparate în digești separați ai enzimei de restricție; produsele digeștilor sunt separate prin electroforeză pe un gel de agaroză 0,7% sau, doar pentru fragmentul de -2,5 kb, pe un gel de poliacrilamidă 3%, iar benzile dorite sunt decupate din gel și preparate pentru subclonare, fie prin utilizarea Kit-ului II GenaClean™ (de la Biol01, Inc.), fie prin electroeluție într-un dispozitiv de dializă Spectropor * 2 în 0,1 x TBE, la 100 V, timp de 2 h (doar pentru fragmentul de 2,5 kb).
RO 117328 Bl
Aceste fragmente de enzimă de restricție sunt subclonate în plasmide de E.coli de exprimare/mutageneză, derivate din plasmide bazate pe pUC sau din plasmide pBluescriptll care conțin, de asemenea, o origine SV40 a replicării (dar fără activitate de promotor SV40). Plasmidele rezultate pot fi utilizate pentru a prepara acizi nucleici alterați (supuși mutației) ai componentei RNA-zice, pentru introducere în celule umane sau în alte celule de eucariote, pentru o varietate de scopuri, așa cum s-a descris mai sus în descrierea realizărilor preferate.
Exemplul 8. Plasmide antisens pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane
Plasmidele antisens de exprimare sunt preparate prin amplificarea PCR a cDNA-ului pentru componenta RNA-zică, utilizând următoarele seturi de primer: (1) NotB și G1, care produce un acid nucleic antisens care este mai mic decât insertul cDNA din plasmidă; și (2) NotB și R3C, care produce un acid nucleic antisens de lungime întreagă (relativ la insertul din plasmidă). Secvența nucleotidică a lui NotB este arătată, în exemplul 1, de mai sus; secvențele nucleotidice ale primerilor G1 și R3C sunt prezentate mai jos:
G1: 5-GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA-3’ R3C: 5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3'
După amplificarea PCR, fragmentele amplificate sunt donate în plasmida de -10 kb de exprimare, la un situs Pm 7I; plasmida conține genele care conferă rezistență la puromicină, gena DHFR și gena care conferă rezistență la higromicină B, ca markeri de selecție, originea SV40 a replicării; promotorul din gena umană care induce metalotioneina, poziționat pentru exprimarea catenei antisens a genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane (unii pot utiliza, de asemenea, un promotor mai puternic pentru a obține nivele de exprimare mai înalte), și situsul de adiție târzie a lui poli A, de SV40.
Plasmidele rezultate (desemnate ca pGRN42 pentru produsul NotB/GÎ și pGRN45 pentru /\foi8/R3C) sunt transfectate prin procedeul cu fosfat de calciu (a se vedea Maniatis și colab., prezentat mai sus în linia celulară HT1080 de fibrosarcom. în mod normal, celulele HT1080 sunt nemuritoare; exprimarea RNA-ului antisens pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane ar preveni componenta RNA-zică a telomerazei umane să se asocieze cu componentele proteice, blocând formarea telomerazei acive și făcând celulele mortale.
Exemplul 9. Identificarea și izolarea acizilor nucleici pentru componenta RNAzică de la mamifere non-umane
Pentru a ilustra cum pot fi utilizați reactivii acestei invenții pentru a identifica și izola acizi nucleici substanțial omologi de la alte specii de mamifere, sunt utilizați primeri PCR complementari cu secvențele pentru componenta RNA-zică umană, în scopul amplificării secvențelor omoloage într-un PCR. □ pereche primer ilustrativă, utilizată pentru a demonstra acest aspect al invenției este alcătuită din primerul +10, care are secvența 5'-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3' și din primerul R7, care are secvența 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3'. DNA-ul genomic este preparat din țesut de cimpanzeu, maimuță, veveriță, maimuță rhesus și pavian, și dizolvat în tampon TE, la o concentrație, de aproximativ 0,5-4 mg/ml.
Pentru fiecare tip de țesut este preparat un amestec PCR, amestecare este alcătuit din: 1 μΙ de DNA genomic, 48 μΙ de Mașter Mix (Mașter Mix este compus din
2350
2355
2360
2365
2370
2375
2380
2385
2390
RO 117328 Bl tampon 1x TaqEx-tender™ de la firma Stratagene, 2OO μΜ din fiecare dNTP, 0,5 μΜ din fiecare primer) și 0,5 μΙ dintr-un amestec 1:1 de Taq polimerază (5 unități/μΙ, Boehringer Mannheim): Tth polimerază (TaqExtender™ polimerază, de la Stratagene). Tuburile de reacție sunt puse într-un dispozitiv termic, care este programat pentru o primă încălzire a amestecului de reacție, la 94°C pentru 5 min și apoi, pentru realizarea a 27 de cicluri de incubare, la 94°C,timp de 30 s, 63°C, timp de 10 s și 72°C, timp de 45 s. După ce reacția de amplificare este completă, aproximativ 10 μΙ din fiecare amestec de reacție este încărcat într-un gel de agaroză 2% pentru electroforeză. După electroforeză, colorarea gelului, și iradiere UV, s-ar putea observa că fiecare amestec de reacție conține o bandă de mărimea prevăzută (200 pb). Acizii nucleici din aceste benzi pot fi donați și secvențializați, iar restul acestor gene pentru componenta RNA-zică de la fiecare dintre aceste specii de mamifere poate fi donat, așa cum este descris mai sus, pentru gena pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane. Exemplul 14, prezentat aici, descrie un exemplu specific de secvențializare a genei componentei RNA-zice a telomerazei de maimuță veveriță.
Exemplul 10. Secvențele sens supuse mutației, ale componentei RNA-zice a telomerazei umane
Acest exemplu demonstrează că schimbarea secvenței pentru componenta RNA-zică a telomerazei la regiunea matriță, modifică secvența sintetizată de telomeraza umană, conducând la modificări ale repetițiilor telomerazice cromozomale.
Pentru a determina dacă reprogramarea regiunii matriță TRC3 ar produce devansări ale schimbărilor corespunzătoare din telomerul repetitiv sintetizat prin activitatea telomerazei umane, un fragment de genă care exprimă întreaga secvență de genă (TRC3) pentru componenta RNA-zică a telomerazei, donată și supusă mutației. Analiza Southern bloot arată că TRC3 hibridizează cu o genă mono-copie din genomul uman. □ copie genomică a lui TRC3 este izolată dintr-o bibliotecă de fag lambda și s-a dovedit că are aceeași hartă de restricție ca cea observată pe bloturile Southern genomice sondate cu TRC3. Un fragment de 2,6 kb Hindlll-Sac1 este izolat și subclonat într-o versiune modificată a lui pBluescript, generând plasmida pGRN33 genomică TRC3. Capetele 5' și 3' ale RNA-ului sunt cartate utilizând extensia primer, PCR RACE și RT-PCR. Mărimea transcriptului RNA este de aproximativ 550 baze, compatibilă cu migrarea sa pe bloturile Northern. Regiunea transcrisă pentru TRC3 este centrală față de dona genomică cu 1,4 kb a secvenței din amonte.
RNA-ul este extras din preparatele purificate de telomerază și este utilizat apoi în următoarele experiențe. 5'RACE: Prima catenă a cDNA este obținută utilizând primeri antisens TRC3 [R3B: 5'CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT) în prezența 3SPdATP. Produsele de extensie sunt separate prin PAGE (electroforeză în gel de poliacrilamidă) și sunt identificate prin autoradiografie, tăiate și extrase. □ oligonucleotidă este (NotA: 5'-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2) legată la aceste produse prime catenare, utilizând RNA ligaza T4, iar PCR este realizat, apoi, cu ajutorul unui primer îmbinat, R3c (5’-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) și o oligonucleotidă (A/oiB: TGAATTCTTGCGGCCGCTAT) complementar cu oligonucleotidul NotA. Produsele PCR sunt separați pe un gel de agaroză, iar benzile sunt tăiate și secvențializate direct, utilizând ca primer oligonucleotidul G1 (5'-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA).
Cartarea capătului 3': încercările de a realiza 3'RACE sunt lipsite de succes.
Ulterior este folosită o strategie RT-PCR în care sunt utilizați o serie de primeri
RO 117328 Bl antisens, complementari cu secvența de DNA genomic, pentru sinteza primei catene a cDNA. Primerii din această serie sunt spațiați la intervale de aproximativ 150 pb, începând de la capătul 5' al transcriptului, continuând spre capătul 3'. A fost efectuată apoi PCR, utilizând prima catenă primer și un primer a cărui secvență este internă transcriptului cunoscut TRC3 (F3b: 5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG). Benzi PCR sensibile la revers transcriptază, de mărimea prevăzută, sunt văzute când este utilizat cDNA produs cu toți primerii proiectați în intervalul +100 până la + 450 (numărătoare relativă la capătul 5'), dar nu cu vreunul dintre primerii proiectați, de la + 558 la + 950. Aceasta plasează presupusul capăt 3' al transcriptului matur TRC3 între poziția + 450 și + 558. Rundele ulterioare ale proiectării primerului și RT-PCR îngustează acest interval, până la + 545 și + 558.
Secvența matriță prevăzută a lui TRC3 este modificată de la CUAACCCUA, la CCAACCCCA(MuC) sau CAAACCCAA (MuA) prin mutageneză in vitro [efectuată, substanțial, în conformitate cu Perez și colab., (1994) J. Biol. Chem.269: 22485) a plasmidei genomice pGRN233. Dacă se încorporează în telomeraza funcțională, acești RNA mutanți ar putea servi drept matriță pentru sinteza lui TTGGGG (MuC) sau TTTGGG (MuA), mai bine decât unitatea repetitivă TTAGGG de tip sălbatic. Aceste activități de telomerază mutantă ar putea fi ușor deosebite de activitatea de tip sălbatic, deoarece ele nu necesită pentru mult timp dATP pentru activitate, și doar activitatea de tip sălbatic ar putea fi sensibilă la terminarea prin ddATP. Este preparat, de asemenea, un dublu mutant (Muc+17), în care este prezentă o inserție de 17 pb la + 180 pb, pe lângă matrița MuC. Acest mutant a permis detectarea RNA-ului modificat cu o sondă la inserția 17 pb, sau prin mărime.
Secvența genomică de 2,6 kb este suficientă pentru exprimarea lui TRC3 in vivo. Celulele sunt transfectate temporar cu plasmida MuC+17, iar RNA-ul exprimat din DNA-ul transfectat este detectat prin RT PCR, utilizând secvența insert de 17 pb ca primer în etapa de transcriere inversă. RNA-ul este detectat în celulele transfectate MuC+17, dar nu în celulele transfectate false, indicând că clona genomică de 2,6 kb este suficientă pentru exprimarea TRC3. Transformanți stabili sunt atunci când au derivat de la fiecare dintre aceste 3 plasmide mutante prin transfecția cu fosfat de calciu a celulelor HT1080, împreună cu pCMVneo. Clone rezistente sunt selectate în G418, iar exprimarea lui MuC+17 RNA este verificată prin RT-PCR (Irving și colab., (1992) Exp. Cell. Res. 202: 161).
Pentru testarea din punct de vedere al activității telomerazei mutante, extractele sunt testate din celulele netransfectante și din trei transformanți stabili cu vectori integrați MuC*, MuC, sau MuA (C*, C, sau A, în fig.1). Deoarece, se presupune că extractele mutante conțin ambele activități telomerazice (de tip sălbatic și mutant) sunt folosite diferite condiții de testare pentru deosebirea lor. în condiții normale de reacție, (dTTP, 32P-dGTP și dATP), toate cele trei extracte din seriile de construct mutant prezentă activitate telomerazică de tip sălbatic, care este sensibilă la RNază (fig.1, benzile 1-6). Așa cum este de așteptat, această activitate este neafectată la includerea ddCTP în reacții (fig. 1, benzile 7-9) și este abolită de ddTTP (benzile 10-12). Spre deosebire de aceasta, atunci când ddATP este substituit cu dATP, extractele C (banda 14) și A (banda 15) manifestă încă activitate telomerazică sensibilă la RNază (benzile 17 și 18), în timp ce extractul C* (banda 13) și martorul, nu manifestă. Aceste rezultate indică că activitățile rezistente la ddATP ale telomerazei
2440
2445
2450
2455
2460
2465
2470
2475
2480
485
'.490
1495
1500
2505
2510
2515
2520
RO 117328 Bl sunt reprogramate cu MuCsau MuA TRC3 RNA. în contrast, inserția de 17 pb în C* inhibă reconstituirea, ceea ce indică că reconstituirea telomerazei este foarte specifică pentru secvența TRC3.
Pentru a confirma că secvența sintetizată cu mutanta MuA este (GGG II I )n, noi modificăm metodologia PCR existentă pentru amplificarea repetițiilor telomerazice adăugate pe un unic primer telomerazic (Kim și colab., (1994) Science 266:2011). Utilizând primeri sintetici, noi am identificat condițiile de reacție în care un primer 3' cu secvența d(CCCAAACCCAAACCCAA) ar putea doar amplifica unitățile repetitive (TTTGGG)n și nu ar amplifica repetițiile conținând (TTAGGG).
Pentru distincția între repetițiile telomere adăugate de către tipul sălbatic, comparativ cu telomeraza supusă mutației, un test în două etape este combinat cu o strategie de limitare a disponibilității nucleotidelor pentru reacția telomerazei. Deoarece MuA și MuC ar genera secvențe repetitive telomerice de (TTTGGG)n și, respectiv, (TTGGGG)n, extractele celulare sunt mai întâi,incubate cu substratul TSîn prezența doar a dTTP și dGTP, timp de 10 min, la temperatura camerei pentru a permite adiția de repetiții telomere. Activitatea telomerazică reziduală este distrusă apoi prin fierberea extractelor, timp de 5 min. Produsele telomerazei cu secvența specifică de DNA sunt detectate apoi, prin amplificarea PCR, utilizând primeri inverși adecvați, și în prezența tuturor celor 4 dNTP și a unor urme de 32P-dCTP, așa cum este descris (Kim și colab., (1994) op. cit). Pentru a detecta produsele MuA, primerul invers este (ACCCAA)4, iar condițiile amplificării PCR sunt 94°C, 10 s, 6O°C, 30 s și 72°C, 30 s în 20 de cicluri. Pentru a detecta produsele MuC, sunt utilizați 3 revers primeri: (CCCCAA)3, (CCAACC)3 și (CCAACC)3, respectiv, care au dat produși PCR cu pozițiile de mobilitate corespunzătoare, potrivite cu poziția așteptată de revenire spre produsele telomerazei. Condițiile utilizate pentru amplificarea PCR sunt aceleași ca mai sus, cu excepția faptului că temperatura de revenire este, de 5O°C. în aceleași condiții, nu sunt generate produsele telomerazice din extractele celulelor parentale sau ale celulelor transfectate cu gena de tip sălbatic TRC-3. în testele de specificitate în condițiile noastre de amplificare PCR, oligonucleotide sintetice conținând (I I IGGG)n și (TTGGGG)n generează produșii PCR adecvați, de tip scară, 6 nt, cu revers primerul (ACCCAA)4 sau, respectiv, (CCCCAA]3, în timp ce oligonucleotidele (TTAGGG)n nu produc vreun produs PCR cu revers primerul (ACCCAA)4 sau (CCCCAA]3.
Utilizând aceste condiții, extracte de MuA, dar nu de MuC sau de celule de tip sălbatic, au generat produse în testul telomerazei modificate, ceea ce indică faptul că, telomeraza din celule conținând MuA generează repetiții (TTTGGG)n. Metode similare sunt utilizate pentru analizarea mutantei MuC, care sintetizează repetiții (TTGGGG)n. împreună, datele de mai sus constituie dovada puternică că gena TRC3 codifică componenta RNA-zică a telomerazei umane, și astfel, noi am redenumit TRC3 ca hTR pentru RNA-ul Telomerazei umane (human Telomerase RNA).
Exemplul 11. Componenta RNA-zică a telomerazei în celulele muritoare și în cele nemuritoare
Majoritatea celulelor canceroase exprimă nivele înalte de activitate telomerazică, în timp ce în majoritatea celulelor umane somatice, normale, telomeraza nu este detectată (Kim și colab., (1994) op. c/t). Pentru a determina dacă nivelele componentei RNA-zice a telomerazei sunt ridicate în liniile celulare canceroase nemuritoare, componenta RNA-zică a telomerazei și nivelele transcriptului GAPDH sunt analizate cu
2525
I
RO 117328 Bl
2530 ajutorul RT-PCR în 5 tulpini celulare primare, muritoare, lipsite de activitate telomerazică detectabilă, și 5 linii celulare canceroase nemuritoare, cu nivele ridicate de activitate telomerazică. Nivelele stării staționare a transcripțiilor componentei RNA-zice a telomerazei sunt de 3-12 ori mai ridicate în liniile celulare tumorale decât în celulele primare, când comparația este făcută cu nivelele de GAPDH (fig.2A). în timp ce nivelurile componentei RNA-zice a telomerazei sunt, crescute în celulele canceroase nemuritoare care exprimă nivele ridicate de telomerază, este interesant că nivele scăzute, dar rapid detectabile de componentă RNA-zică a telomerazei, sunt, de asemenea, prezente în celulele primare muritoare lipsite de activitate telomerazică detectabilă (benzile 1-5).
Sunt, de asemenea, examinate nivelele componentei RNA-zice a telomerazei, într-o varietate de țesuturi umane normale, prin analiza Northern blot. Testiculele și ovarele au nivelul cel mai ridicat de componentă RNA-zică a telomerazei, ceea ce este de așteptat, deoarece aceste țesuturi exprimă nivele ridicate ale activității telomerazei. Cu toate acestea, un număr de alte țesuturi exprimă, de asemenea, componenta RNA-zică a telomerazei (fig. 2B și 2C). Acestea includ rinichiul normal, prostata, și ficatul adult, tuturor lipsindu-le nivelurile detectabile de activitate telomerzică. Aceste rezultate confirmă datele din liniile celulare (fig.2A) și sugerează că RNA-ul telomerazic poate fi prezent, dar inactiv într-un număr de țesuturi umane. Diferențe similare specifice de țesut în ceea ce privește exprimarea RNA-ului sunt văzute în țesuturile de șoarece; totuși, multe țesuturi normale de șoarece sunt pozitive din punct de vedere al activității telomerazei. Represia aparent crescută a activității telomerazice din celulele umane poate ajuta explicarea cauzei pentru care celulele de șoarece devin nemuritoare spontan în cultură, în timp ce celulele umane, nu.
Exemplul 12. Exprimarea transcripțiilor antisens hTR (componenta RNA-zică a telomerazei umane] În celule HeLa conduce la criza celulară și la moartea celulară
Pentru a examina funcționarea telomerazei într-o celulă nemuritoare, construcții de exprimare ai hTR antisens sunt introduși în celule HeLa. Un fragment de DNA EcoRI de 2OO pb conținând 1 -193 pb dintr-o clonă cDNA a componentei RNAzice a telomerazei umane, TRC3, este inserat în situsul EcoRI al p10-3 și pBBS212 pentru a genera plasmide p1O-3-hTR și, respectiv, pBBBhTR. Plasmida p10-3-hTR exprimă antisensul componentei RNA-zice a telomerazei sub controlul transcripțional al promotorului minimal CMV reglat de tetraciclină, comparativ cu cei 5 operatori Tet din amonte, în două orientări diferite, așa cum este descris (Gossen și colab., (1992) ProcNatl. Acad. Sci.(USA] 89: 5547). Plasmida pBBS-hTR exprimă antisensul hTRului, sub controlul promotorului MPSV (Lin și colab., (1994) Gene 147.287]. în paralel, vectorii de exprimare martor, lipsiți de secvența antisens care codifică hTR, au fost de asemenea, electroporați în celule HeLa. în trei experiențe separate sunt selecționate clone conținând plasmide antisens sau martor. Inițial, cele 41 de culturi exprimând hTR antisens, au crescut în mod identic cu celulele cu vectorul martor. Totuși, nivelele care dublează populația 23 până la 26 (PDL=”population doubling levels”) posttransfecție, culturi exprimând antisensul 33 în afară de 41, au suferit criza (Tabelul I). Criza celulară din aceste culturi este caracterizată printr-o inhibiție marcată a creșterii celulare de la 20 la 26 PD, urmată de rotunjirea și detașarea celulelor de pe placă după o perioadă de o săptămână. în 28 din 33 de cazuri, în care celulele au suferit criza, în cele trei săptămâni după ce majoritatea celulelor au murit,
2535
2540
2545
2550
2555
2560
2565
2570 .2575
RO 117328 Bl sunt observate rare colonii reversibile (<1%). Celulele reversibile pot reprezenta variante care scapă de efectul inhibitor al constructului antisens hTR. în contrast cu clonele antisens, nici una dintre liniile celulare de vectori martor nu manifestă vreo schimbare în creștere sau mortalitate, la peste 50 de dublări.
Tabelul 1 hTR antisens conduce la un TRF mediu mai scăzut și la criza celulară
Sunt efectuate 3 experiențe independente, în care celulele HeTe7 (HeLa = celule care exprimă nivele ridicate de proteină himeră VP16-represor tetraciclinic) sunt transfectate prin electroporare fie cu plasmida p10-3-hTR care exprimă hTR antisens sub controlul promotorului minimal CMV indus de VP16 tetraciclinic, fie cu pBBS-hTR, care exprimă hTR antisens sub controlul promotorului MPSV (54). (în aceste experiențe nu sunt observate reglări prin intermediul tetraciclinei. Experiențele cu p1D-3-hTR sunt efectuate în mod caracteristic în absența tetraciclinei, deoarece experiențele martor cu luciferază sau hTR antisens sub controlul promotorului minimal CMV indus de tetraciclină-VP16, demonstrează că prezența sau absența tetraciclinei are un efect mic asupra exprimării luciferazei sau hTR antisens în celulele HeTe7. întradevăr, în experimentele timpurii cu construcții hTR antisens în celule HeTe7, celulele suferă încă, criza la 23 - 26 PDLîn prezența tetraciclinei). Ca martor, celule HeTe7 sunt, de asemenea, transfectate cu vectorul parental sub aceleași condiții. 11-18 clone stabile sunt izolate din fiecare serie de transfecție. Clone din toate izolatele manifestă morfologii și profite de creștere identice, până la 20 PDL, moment în care creșterea majorității clonelor care exprimă antisensul, încetinesc în mod pronunțat (p1O-3-hTR și pBBS-hTR). Prin PDL 23-26, aceste celule suferă criza, caracterizată prin apariția celulelor lărgite și rotunjite. Totuși, nu toate dintre clonele generate din celulele HeTe7 transfectate cu pBBS-hTR suferă criza; 8 clone exprimând hTR antisens continuă să crească în mod similar cu culturile martor. Celulele din toate clonele sunt recoltate la PDL 23, și sunt determinate lungimile medii TRF. Valorile P se calculează prin metoda testului-t neperechi. Pentru fiecare serie, este indicată proporția de clone care suferă criza.
Nr. ort. Plasmida Criza celulară TRF mediu Valoarea Criză/ Total
1 p1O-3 lipsă ND 0/7
p1O-3-hTR prezentă ND 18/18
2 P1O-3 prezentă 3,27+0,10 0,0003 0/12
p10-3-hTR prezentă 2,72±0,07 11/11
3 pBBS lipsă 3,22±0,11 0/13
pBBS-hTRa . prezentă 2,39±O,1O 0,0008 4/4
pBBS-hTRb lipsă 3,03+0,20 0,3551 0/8
Celule HeTe7 lipsă 3,15±O,O9 Celule parentale
RO 117328 Bl
Pentru a determina dacă lungimea telomerului și inhibarea telomerazei se corelează cu criza celulară în clonele care exprimă antisensul, sunt determinate lungimea telomerului și activitatea telomerazei în câțiva martori precriză și colonii experimentale, la 23 PDL. Toate coloniile conținând vectorul martor au lungimi TRF medii 3,22 și 3,27 kb] similare celor ale liniei celulare parentale (3,15 kb), în timp ce clone conținând construcții vectorului antisens care suferă criza au lungimi medii TRF între 2,39 și 2,72 kb sau cu 17-26% mai scurte decât cele ale liniei parentale (fig.3). Aceste date sunt compatibile cu repetițiile telomere care sunt pierdute în clonele antisens conținând, datorită inhibării activității telomerazei. Pentru a testa în mod direct aceasta, activitatea telomerazei este determinată în 14 dintre clone. Activitatea telomerazei este în general scăzută, dar detectabilă în multe dintre clonele antisens, deși telomerii scurtați sugerează că nivelul nu este suficient pentru menținerea lungimii telomerului, deoarece TRF mediu scade de la 3,22 la 2,39 kb (P=O,OOO8). în cele 8 clone conținând vectorul antisens (pBBS-hTRb) care nu suferă criza, lungimea telomerului nu este modificată semnificativ (3,03 față de 3,33, P=0,355), iar activitatea telomerazei este similară cu cea a martorilor. Luate împreună, aceste rezultate sunt dovada că pierderea telomerului conduce la criză și moartea celulară odată ce telomerii ating o lungime critică.
Inducerea crizei celulare în celule HeLa care exprimă componenta RNA-zică antisens a telomerazei furnizează dovada suplimentară că inhibarea telomerazei poate dovedi un efect terapeutic specific și eficient împotriva cancerului uman.
Exemplul 13. Amplificarea și detectarea in situ. Detectarea in situ a RNA-ului telomerazic
A. Hibridizarea fluorescentă in situ [FISH)=Fluorescent in situ hybridization]
Identificarea celulelor pozitive în ceea ce privește telomeraza, într-o populație amestecată de celule sau țesuturi poate fi realizată prin hibridizarea in situ a sondei marcate țintită la componenta RNA-zică a telomerazei. Un țesut de probe celulare fixat pe o lamelă de sticlă și permeabilizat suficient este utilizat pentru hibridizarea in situ. Un ex. de hibridizare in situ pentru RNA-ul telomerazic uman (hTR) constă din denaturarea, mai întâi a acizilor nucleici prin imersarea lamelelor în formamidă deionizată 70%/soluție 2x SSC preîncălzită, la 7O-74°C, timp de 2 - 3 min. Lamelele sunt apoi transferate în etanol 70% răcit pe gheață și apoi, în etanol 95%, apoi în etanol 100% (4 min. în fiecare soluție). 100 - 200 ng (per lamelă) de sondă htRNA marcată (-500 pb sondă DNA marcată cu biotină, digoxigenină, radioizotopi, fluorescență) este uscată, resuspendată în 10μΙ de formamidă deionizată 100%, denaturată prin incubare, la 75°C,timp de 8 min, și răcită imediat pe gheață. Se adaugă 10 μΙ de 2 x tampon de hibridizare (4x SSC; 4x soluție Denhardt; sulfat de dextran 20%; Tris 100 mM, pH= 7,5) la 10 μΙ de sondă resuspendată. Se adaugă amestecul sondă/hibridizare (20 μΙ] la proba fixată se întinde cu un dispozitiv, și se închide dispozitivul (“coverslip”) cu liant de cauciuc sau lac de unghii. Se incubă proba la 37°C, timp de 8 -48 h. După hibridizare se îndepărtează dispozitivul, se spală proba de două ori în formamidă deionizată 50%/2x SSC/la 37°C, și apoi spălată de 2 ori în 2x SSC la 37°C (5 min per spălare). Proba este apoi supusă vizualizării la microscop.
B. Marcarea in situ amorsată (PRINS=’primed in situ iabeling)
O altă variantă a metodei de detecție tradiționale, de hibridizare in situ, este marcarea amorsată in situ (PRINS). Detectarea lui hTR prin PRINS constă din sinteza inițială a cDNA din hTR prin intermediul revers transcriptazei (RT), urmată de
2620
2625
2630
2635
2640
2645
2650
2655
2660
RO 117328 Bl detectarea PRINS care utilizează sonda oligonucleotidică specifică pentru hTR, și alungirea catenei prin încorporarea de nucleotide marcate. Reacția RT a hTR poate fi realizată printr-o varietate de metode. Un exemplu de reacție RT este prin utilizarea kitului PCR pentru revers transcriptază RNA GeneAmp Thermostable rTth (Perkin Elmer). în această metodă, ΤΟ μΐ de amestec RT [10 mM Tris-HCI pH 8,3; KCL 90 mM; MnCI2 1 mM; 200 μΜ dNTP-uri; 2,5U rTth DNA polimerază; 0,4 μΜ primer de schimb (de exemplu, R7G: 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3')] se plasează pe proba fixată și permeabilizată, închisă ermetic cu o bandă lipită cu lac de unghii, acoperit cu mineral, și incubat, la 7O°C, timp de 30 min. După aceea, uleiul mineral este îndepărtat prin spălare, timp de 5 min. în xilen, și apoi 5 min în EtOH 100%. Banda acoperitoare este îndepărtată, spălată scurt cu apă DepC, apoi cu EtOH 100%, și uscată la aer timp, de 5 min. Apoi, 10 μΙ de amestec PRINS (glicerol 5% (v/v); TrisHCI 10 mM, pH=3; KCI 100 mM; Tween 20 0,05% (masă/volum); EGTA 0,75 mM; MgCla 2,5 mM; primer avansat 0,4 μΜ [de exemplu, U3b: 5'GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG-3'); 200 μΜ dA, dG, dCTP; 110μΜ dTTP; 90 μΜ dUTP marcat) se plasează pe probă. închis ermetic cu bandă adezivă, ancorat cu lac de unghii, acoperit cu ulei mineral, și incubat, la 70°C, timp de 30 min până la 3 h. Proba se spală apoi de trei ori în tamponul de spălare [4x SSC; Tween 20 0,05%), se încălzește la 70°C, timp de 2 min. Se observă, apoi semnalul.
C. RT-PCR in situ
Detectarea RT-PCR a hTR constă din sinteza cDNA din RNA-ul țintă, prin reacția revers transcriptazei, (reverstranscriptază virală sau prin activitatea intrinsecă RT a DNA polimerazelor termostabile, urmate de amplificarea PCR in situ a cDNA-ului țintă. Pot fi utilizate diverse reacții RT pentru sinteza cDNA a hTR, inclusiv protocolul RT discutat în Sec. 11B. Mai mult, aceleași condiții de tamponare și primeri utilizați în metodele de detectare PRINS pot fi utilizați și pentru RT-PCR, dar, în locul incubării finale, la 70°C, timp de 30 min până la 3 h, proba este amplificată într-un termociclu în 30 - 40 de cicluri de 94°C/40 s, 55°C/9O s (a se vedea Sec.11B). După PCR, proba este spălată de 3 ori în tampon de spălare (4x SSC; Tween 20, 0,05%), încălzită, la 70°C, timp de 2 min. Este observat, apoi, semnalul.
O altă alternativă este aceea de a amplifica cDNA-ul generat din reacția inițială RT, prin utilizarea sistemului 1000 Gene Amp in situ PCR și a kitului PCR GeneAmp in situ (Perkin Elmer).
Poate fi efectuată o etapă in situ RT-PCR pe o probă fixată și permeabilizată, utilizând protocolul PCR GeneAmp EZ rTth RNA în combinație cu sistemul 1 □□□ PCR GeneAmp in situ (Perkin Elmer). Această metodă constă în plasarea a 40-50 μΙ de amestec tampon EZ RNA PCR (50 mM Bicină; 115 mM acetat de potasiu; glicerol 8% (masă/volum), pH=8,2; 300 μΜ dA, dG, dCTP; 165 μΜ dTTP; 135 μΜ dUTP marcat; 5-10 U de DNA polimerază rTth; 2,5 mM Mn(0Ac)2; 0,45-1 μΜ de primeri htRNA-specifici.de exemplu, R7 și U3b, pe o probă fixată și permeabilizată pe o lamă microscopică, și fixată cu o gRNAitură de etanșare siliconică și într-o menghină, conform protocolului producătorului (sistemul 1000 de PCR GeneAmp in situ, Perkin Elmer). Proba este plasată apoi în dispozitivul PCR in situ GeneAmp și încălzită, timp de 120 s, la 94°C și apoi, amplificată în 30-40 de cicluri de 94°C/45 s și 60°C/45 s. După amplificare, proba este spălată și vizualizată așa cum s-a discutat.
RO 117328 Bl
2710
Pentru reducerea semnalelor de bază care pot rezulta din încorporarea directă a părților fluorescente în timpul amplificării, poate fi utilizată detectarea indirectă care constă din amplificarea PCR utilizând dNTP-uri neatașate, urmată de hibridizarea in situ utilizând o sondă de hibridizare atașată, specifică pentru produsul amplificat. în această metodă, semnalul este amplificat prin oricare dintre metodele RT-PCR descrise mai sus, fără dNTP-uri sau primeri marcați, iar produsul amplificat este detectat prin hibridizarea in situ.
D. Aplicarea primerului pentru extensia produsului, la PCR in situ
Succesul PCR in situ depinde de prevenirea pierderiiprodușilor amplificați în cadrul matricei celulare externe celulei. Așadar, este, în general, adevărat că produsele PCR mai mici de 500 pb nu sunt dorite pentru PCR in situ. în scopul prevenirii legării produselor PCR mai mici de 500 pb din matricea celulară, se utilizează în mod curent încorporarea dNTP-urilor “voluminoase” (de exemplu, biotina, capul fluorescent, dUTP marcat cu digoxigenină) în produsul PCR. O altă cale de a preveni legarea unui mic produs în PCR in situ ar putea fi încorporarea primerului de extensie a produsului în protocolul PCR in situ.
Metoda constă în utilizarea unui primer care conține 3-4 secvențe repetitive de 6 pb [de exemplu, (5'-l I I CCC-3')M] la capătul 5', urmată de o secvență care este specifică pentru țintă (a se vedea fig.4, primerul 1), în combinație cu primerul de schimb adecvat (primerul 2) și un al 3-lea primer care constă doar din secvența repetitivă [primerul 3,de exemplu, (5'-TTTCCC-3')4] pentru amplificarea țintei specifice în PCR in situ. Prezența primerului 3 va alungi produsul PCR datorită legării alternate a primerului 3 la capătul 3' al produsului PCR țintă. Alungirea produselor PCR poate fi indusă prin descreșterea temperaturii de încălzire a condiției inițiale de PCR.
Spre exemplu, dacă temperatura de colorare a secvenței țintă din primerul 1 este 60°C, proba va fi amplificată inițial, în 15-20 de cicluri, de 94°C/45°C și 60°C/45°C, apoi ea va fi amplificată în 15-20 de cicluri de 94°C/45°C și 50°C/45°C. Temperatura scăzută de colorare din cea de-a doua etapă a PCR, va favoriza generarea de produse PCR alungite prin creșterea șansei de legare alternante a primerului 3 la secvențele repetitive. Produsele PCR alungite rezultate vor fi mai puțin înclinate spre pierdere prin matricea celulară, rezultând astfel un semnal mai bun de retenție în analiza PCR in situ.
Exemplul 14. Componenta RNA-zică a telomerazei de la primatele non-umane în scopul demonstrării că alte secvențe ale componentei RNA-zice a telomerazei de mamifere pot fi obținute utilizând primeri bazați pe secvența componentei RNA-zice umane, sunt utilizați primeri PCR din secvența umană, pentru amplificarea secvențelor componentei RNA-zice a telomerazei din DNA-ul genomic din maimuța veveriță, o specie considerată a fi una dintre speciile de primate non-umane care este cea mai divergentă din punct de vedere evoluționar în comparație cu oamenii.
DNA-ul genomic de maimuță veveriță este amplificat cu primeri F3b (5TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3') și H3+20 (5'-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3') așa cum este descris. O singură bandă DNA este observată și ulterior donată în vectorul pBluescriptll SK (Stratagene, San Diego, CA). Clonele rezultate sunt parțial secvențializate utilizând metoda PCR cu primerul universal invers (5AACAGCTATGACCATG-3’), primerul 210-3’ (5'-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-3'), sau primer H3+20. Sunt obținute următoarele secvențe parțiale ale componentei RNA-zice a telomerazei d.e la maimuța veveriță:
2715
2720
2725
2730
2735
2740
2745
2750
2755
RO 117328 Bl ’ -GGCGCGCTTCCCTGAGCTGTGGACGTGCACCAGGACTCGGCTCACACATGCAGTTCG
CTTTCCTGCTGGTGGGGGGACGCCGATCGTGGCCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGG
GGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACTGA-3 · și ' -TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTAAACGAAAATT CAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAAGGTTACAAATTTCTTCTTTGAA AAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA-3'
Când alinierea s-a făcut la secvența genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane, se obține următoarea aliniere, utilizând convenția de numărătoare a genei pentru componenta RNA-zică a telomerazei umane (liniuțele de unire reprezintă breșele introduse pentru optimizarea alinierii secvenței):
umane maimuță 1900 CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC GGCGCGCTTCCCTGAGCTGT- GGACGTGCACC-AGGACTCGGCTC
umane maimuță 1950 ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGCTGGT-GGGGGGACGCCGATCGTGGCCA
umane maimuță 2000 TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACT
umane maimuță 2050 GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA GA
și umane maimuță 2300 TTTITTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTA
umane maimuță 2350 AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA AACGAAAATT-CAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAA
umane maimuță 2400 GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACC-TTGGCGATGA-CCTTGAGC GGTTACAAATTTCTTCrTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA
Exemplele precedente descriu diferite aspecte ale invenției și modul în care sunt obținuți anumiți acizi nucleici ai invenției. Exemplele nu intenționează să furnizeze o descriere completă a mai multe forme diferite ale invenției cuprinse în următoarele revendicări.

Claims (8)

1. Componentă. RNA a telomerazei de mamifere, caracterizată prin aceea că are următoarea secvență:
GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC CAGUGUGCU.
2. Componentă RNA a telomerazei de mamifere, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se folosește într-o metodă pentru inhibarea activității telomerazei care cuprinde transfectarea în celule a unei secvențe polinucleotidice exogene din cel puțin 25 de nucleotide consecutive care este substanțial identică sau substanțial complementară cu o secvență RNA a telomerazei umane operabil legată la o secvență heterologă, reglatoare a transcrierii, care promovează transcrierea de polinucleotide operabil legate în celulele menționate.
3. Componentă RNA a telomerazei de mamifere, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se folosește într-o metodă pentru determinarea prezenței componentei RNA a telomerazei de mamifere într-o celulă sau probă celulară care cuprinde realizarea unei amplificări sau hibridizări cu un polinucleotid al componentei RNA a telomerazei, cu un primer al componentei RNA a telomerazei sau cu o secvență complementară la un polinucleotid al componentei RNA-zice a telomerazei sau la un primer al componentei RNA-zice a telomerazei.
4. Componentă RNA a telomerazei de mamifere, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se folosește într-o metodă pentru producerea unei enzime telomerazice recombinante care cuprinde transformarea unei celule gazdă eucariote care exprimă componentele proteice ale telomerazei cu un vector recombinant de exprimare, cultivarea respectivelor celule în condiții în care componentele proteice și componenta RNA să fie exprimate și ansamblate pentru a forma o moleculă de telomerază activă, capabilă să adauge secvențe la telomerii DNA-ului cromozomal.
5. Componentă RNA a telomerazei de mamifere, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, secvența ei de nucleotide conține o secvență identică sau exact complementară cu o secvență vecină specifică de nucleotide a componentei RNA a telomerazei având, între 20 și 500 nucleotide.
6. Componentă RNA a telomerazei de mamifere, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că, atunci când oligonucleotidă este legată la o componentă RNA a telomerazei umane, inhibă sau blochează activ telomeraza.
2805
2810
2815
2820
2825
2830
2835
2840
2845
RO 117328 Bl
7. Plasmidă recombinantă de exprimare, caracterizată prin aceea că, conține oligonucleotidă, definită în revendicarea 5, care cuprinde următoarea secvență nucleotidică:
S · -GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGT ACTCAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTG ACAAGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGAT AATGTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGC ATTTAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAA aaacaggagtcagattctgtccgtaaaaAactttacaacctggcagatgc TATGAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAG AGGGAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTC eACGGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCeTaT CATTTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCC gggtgcggtggctcatacctgtaatcccagcactttgggagGccgaagcg ggtggatcacttgagccctggcgttcgagaccagcctgggcaacatggtg aaacccccgtctctactaaaaacacaaaaactagctgggcgtggtggcag gcgcctgtaatcccagctactcaggaggctgagacacgagaatcgcttga acccgggagcagaggttgcagtgagccgagatcacgccactagactccat ccagcctgggcgaaagagcaagactccgtctcaaaaaaaaaaatcgttac aatttatggtggattactccccîctttttacctcatcaagacacagcact actttaaagcaaagtcaatgattgaaacgcctttctttcctaataaaagg gagattcagtccttaagattaataatgtagtagttacacttgattaaagc catcctctgctcaaggagaggctggagaaggcattctaaggagaaggggg cagggtaggaactcggacgcatcccactgagccgagacaagattctgctg tagtcagtgctgcctgggaatctattttcacaaagttctccaaaaaatgt gatgatcaaaactaggaattagtgttctgtgtcttaggccctaaaatctt cctgtgaattccatttttaaggtagtcgaggtgaaccgcgtctggtctgc AGAGGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAA AGAAGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCeTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGC AACGTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCC aaccagcccgcccgagagagtgactctcacgagagccgcgagagtcagct TGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCC GGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGC CATTTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGC TCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAĂAAGCCTCG gcctgccgccttccaccgttcattctagagcaaacaaaaaatgtcagctg CTGGCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCC CGAACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCC actgccaccgcgaagagttgggctctgtcagccgcgggtctctcgggggc gagggcgaggttcaccgtttcaggccgcaggaagaggaacggagcgagtc ccgcgcgcggcgcgattccctgagctatgggacgtgcacccaggactcgg ctcacacatgcagttcgctttcctgttggtggggggaacgccgatcgtgc gcatccgtcacccctcgccggcagtgggggcttgtgaacccccaaacctg actgactgggccagtgtgctgcaaattggcaggagacgtgaaggcacctc caaagtcggccaaaatgaatgggcagtgagccggggttgcctggagccgt tcctgcgtgggttctcccgtcttccgctttttgttgccttttatggttgt attacaacttagttcctgctctgcagattttgttgaggtttttgcttctc ccaaggtagatctcgaccagtccctcaacggggtgtggggagaacagtca tttttttttgagagatcatttaacatttaatgaatatttaattagaagat, ctaaatgaacattggaaattgtgttcctttaatggtcatcggtttatgcc agaggttagaagtttcttttttgaaaaattagaccttggcgatgaccttg AGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT-3 ’ .
care, cuprinde suplimentar un promotor poziționat să conducă transcrierea unui RNA complementar sau identic cu secvența respectivei oligonucleotide și care este depusă sub numărul de acces ATCC 75926.
RO 117328 Bl
8. Metodă pentru detectarea prezenței unei stări neoplazică la un pacient, caracterizată prin aceea că, cuprinde izolarea unei probe celulare de la respectivul pacient, detectarea componentei RNA-zice a telomerazei umane în proba celulară pentru a determina o valoare de diagnostic, compararea valorii de diagnostic cu o valoare standard a expresiei componentei RNA telomerazice umane în celule non-neoplazice de același tip ca și proba celulară, diagnosticarea ca indicator al prezenței unei stări neoplazice a unei valori de diagnostic care să fie suficient mai mari decât valoarea standard, astfel că indică prezența unei stări neoplazice.
RO97-00016A 1994-07-07 1995-07-06 Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice RO117328B1 (ro)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27210294A 1994-07-07 1994-07-07
US08/330,123 US5583016A (en) 1994-07-07 1994-10-27 Mammalian telomerase
US08/472,802 US5958680A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Mammalian telomerase
US08/482,115 US5776679A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Assays for the DNA component of human telomerase
PCT/US1995/008530 WO1996001835A1 (en) 1994-07-07 1995-07-06 Mammalian telomerase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO117328B1 true RO117328B1 (ro) 2002-01-30

Family

ID=27501040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO97-00016A RO117328B1 (ro) 1994-07-07 1995-07-06 Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice

Country Status (23)

Country Link
EP (2) EP1293565A3 (ro)
JP (2) JPH10505488A (ro)
KR (1) KR100789741B1 (ro)
CN (1) CN1231491C (ro)
AT (1) ATE308554T1 (ro)
AU (1) AU696702B2 (ro)
BG (1) BG63573B1 (ro)
BR (1) BR9508254A (ro)
CA (1) CA2194393C (ro)
CZ (1) CZ3497A3 (ro)
DE (1) DE69534568T2 (ro)
DK (1) DK0778842T3 (ro)
ES (1) ES2251720T3 (ro)
FI (1) FI970026A (ro)
HK (1) HK1011691A1 (ro)
HU (1) HUT78054A (ro)
IS (1) IS4408A (ro)
NO (1) NO970041L (ro)
NZ (1) NZ289720A (ro)
PL (1) PL181019B1 (ro)
RO (1) RO117328B1 (ro)
UA (1) UA47407C2 (ro)
WO (1) WO1996001835A1 (ro)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067497B2 (en) 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US5972605A (en) * 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
US5858777A (en) 1995-09-08 1999-01-12 Geron Corporation Methods and reagents for regulating telomere length and telomerase activity
EP0861334B2 (de) 1995-11-16 2008-04-09 Michael W. Dahm Verfahren zur quantifizierung von tumorzellen in einer körperflüssigkeit und dazu geeignete testkits
AU2593697A (en) * 1996-03-28 1997-10-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Transgenic organisms with altered telomerase activity
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
JPH1052300A (ja) * 1996-06-03 1998-02-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 細胞内テロメラーゼ活性の測定法
JPH1028600A (ja) * 1996-07-17 1998-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd テロメラーゼ活性の測定法
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
CA2267664C (en) * 1996-10-01 2013-06-11 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US5919656A (en) * 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
US7390891B1 (en) 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
US5846723A (en) * 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
AU733610B2 (en) * 1996-12-20 2001-05-17 Geron Corporation Methods for detecting and inhibiting the RNA component of telomerase
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
DE69725018T2 (de) * 1997-04-04 2004-06-09 Geron Corp., Menlo Park Gereinigte telomerase
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
EP0990037A2 (de) * 1997-06-20 2000-04-05 Bayer Ag Humane katalytische telomerase-untereinheit und deren diagnostische und therapeutische verwendung
CA2294782A1 (en) 1997-07-01 1999-01-14 Cambia Biosystems Llc Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
EP1571215A3 (en) * 1997-07-01 2007-10-31 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
DE19757300A1 (de) * 1997-12-22 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer Urinprobe
GB9801902D0 (en) * 1998-01-29 1998-03-25 Cancer Res Campaign Tech A gene promoter
DE19804372A1 (de) * 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US7402307B2 (en) * 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
US6358739B1 (en) * 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
AU5466500A (en) * 1999-06-04 2000-12-28 Jessie L.S. Au Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
US6995145B1 (en) 1999-06-04 2006-02-07 Au Jessie L-S Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
WO2001018015A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Geron Corporation Oligonucleotide n3'→p5' thiophosphoramidates: their synthesis and use
WO2001036971A1 (fr) * 1999-11-16 2001-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Methode de recherche de substance d'inhibition de liaison entre des sous-unites de telomerase
CN1809364B (zh) * 2003-06-23 2010-06-16 杰龙公司 增加端粒酶活性的组合物和方法
PL1667522T3 (pl) 2003-09-09 2018-06-29 Geron Corporation Zmodyfikowane oligonukleotydy do hamowania telomerazy
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
WO2008094640A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
SG175282A1 (en) 2009-04-21 2011-11-28 Genetic Technologies Ltd Methods for obtaining fetal genetic material
JP6021018B2 (ja) * 2011-05-30 2016-11-02 国立大学法人豊橋技術科学大学 改良されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
US20150125438A1 (en) * 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
SG11201601890UA (en) * 2013-09-13 2016-04-28 Hoffmann La Roche Application of oligo-dt molecules to avoid generation of high molecular pcr products induced by polya-carrier
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
KR101628890B1 (ko) * 2015-09-03 2016-06-09 주식회사 학표벽지 엠보싱 벽지 제조 장치

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4312686A (en) * 1980-02-11 1982-01-26 American Biltrite Inc. Printed and embossed floor covering and method and apparatus for its manufacture
JPH02179729A (ja) * 1988-12-30 1990-07-12 Shinetsu Kogyo Kk ゲートル巻きするラッピングフィルムの製造法
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
EP0666313A3 (en) * 1994-01-27 1996-03-06 Univ Iowa State Res Found Inc Targeting telomerase in gene therapy for cancer.
US5876979A (en) * 1994-07-07 1999-03-02 Cold Spring Harbor Laboratory RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
JPH08294966A (ja) * 1995-04-26 1996-11-12 Nippon Shokubai Co Ltd 樹脂成形品の連続成形方法
JPH10119130A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Steel Works Ltd:The 連続発泡体の製造方法及び装置
KR100815605B1 (ko) * 2002-02-18 2008-03-20 바프렉스 주식회사 공압출 다층필름의 제조방법 및 장치

Also Published As

Publication number Publication date
FI970026A0 (fi) 1997-01-03
EP0778842A4 (en) 1999-08-11
NO970041L (no) 1997-03-06
EP0778842B1 (en) 2005-11-02
DE69534568D1 (de) 2005-12-08
JP2002272489A (ja) 2002-09-24
IS4408A (is) 1997-01-03
CN1231491C (zh) 2005-12-14
CA2194393A1 (en) 1996-01-25
UA47407C2 (uk) 2002-07-15
FI970026A (fi) 1997-03-03
CZ3497A3 (en) 1997-10-15
EP1293565A3 (en) 2004-05-12
WO1996001835A1 (en) 1996-01-25
JP4068861B2 (ja) 2008-03-26
HUT78054A (hu) 1999-07-28
BG101103A (en) 1997-10-31
BR9508254A (pt) 1997-12-23
DK0778842T3 (da) 2006-03-20
NZ289720A (en) 1999-03-29
ATE308554T1 (de) 2005-11-15
HK1011691A1 (en) 1999-07-16
AU696702B2 (en) 1998-09-17
DE69534568T2 (de) 2006-07-27
EP1293565A2 (en) 2003-03-19
JPH10505488A (ja) 1998-06-02
EP0778842A1 (en) 1997-06-18
CN1158617A (zh) 1997-09-03
KR20050058527A (ko) 2005-06-17
CA2194393C (en) 2002-06-25
PL181019B1 (pl) 2001-05-31
ES2251720T3 (es) 2006-05-01
KR100789741B1 (ko) 2008-01-02
PL318169A1 (en) 1997-05-26
BG63573B1 (bg) 2002-05-31
NO970041D0 (no) 1997-01-06
AU2964795A (en) 1996-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO117328B1 (ro) Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice
US7732402B2 (en) Mammalian telomerase
US6054575A (en) Mammalian telomerase RNA gene promoter
US5876979A (en) RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
US8778906B2 (en) Modulation of line-1 reverse transcriptase
Liu et al. Telomerase-associated protein TEP1 is not essential for telomerase activity or telomere length maintenance in vivo
WO1998011207A2 (en) Assays for regulators of mammalian telomerase expression
Liu et al. Vault poly (ADP-ribose) polymerase is associated with mammalian telomerase and is dispensable for telomerase function and vault structure in vivo
JP2000517167A (ja) リボヌクレオチドレダクターゼのｒ１およびｒ２成分に対して指向される抗腫瘍アンチセンス配列
EP1049774A2 (en) Promoter regions of the mouse and human telomerase rna component genes
US5776679A (en) Assays for the DNA component of human telomerase
Davis et al. Telomerase: therapeutic potential in cancer
AU714540B2 (en) Mammalian telomerase
KR100566766B1 (ko) 포유류텔로머라제
US6013468A (en) RNA component of telomerase