JP2000517167A - リボヌクレオチドレダクターゼのｒ１およびｒ２成分に対して指向される抗腫瘍アンチセンス配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞増殖を調節する、好ましくは腫瘍細胞の増殖を阻害するための化合物および方法が開示される。細胞増殖を調節するために使用され得る化合物は、リボヌクレオチドレダクターゼ発現のインヒビター、すなわちリボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子の転写または翻訳のインヒビターを含む。リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特に有用なインヒビターである。

Description

【発明の詳細な説明】 リボヌクレオチドレダクターゼのR1およびR2成分に対して指向される 抗腫瘍アンチセンス配列 本願は、米国暫定出願第60/023,040号（1996年８月２日出願）および米国暫定 出願第60/039,959号（1997年３月７日出願）の、米国特許法第119条（e）の下で の利益を請求する。発明の分野 発明の分野は、新生物細胞の腫瘍形成能および／または転移を調節する方法に 関する。詳細には、リボヌクレオチドレダクターゼのR1およびR2成分に対して指 向されるアンチセンス配列の使用に関する。発明の背景 DNA合成に導く最初の特有の工程は、リボヌクレオチドのそれらの対応するデ オキシリボヌクレオチドへの変換（細胞周期特異的様式においてハウスキーピン グ遺伝子リボヌクレオチドレダクターゼによって触媒される反応）である（Lewi sら、1978；Reichard、1993；Wright、1989a；Wrightら、1990a；Stubbe、1989 ）。哺乳動物酵素は、しばしばR1およびR2と称される２つの異なる二量体タンパ ク質成分から構成される。これらは、異なる染色体に位置する２つの異なる遺 ンパク質R1は、約170kDaの分子量を有するホモダイマー構造であり、そして酵素 活性および基質特異性を制御する基質部位およびアロステリックエフェクター部 位を有する（Wright、1989；Thelanderら、1980；Carasら、1985；Wrightら、19 90a）。タンパク質R2は、88kDaの分子量を有するホモダイマーであり、そして触 媒作用に必要なチロシルフリーラジカルを安定化させる２つの等価複核鉄中心を 形成する（Wrightら、1990a；Thelanderら、1985；McClartyら、1990）。R1およ びR2タンパク質は、それらのC-末端で相互作用し、活性ホロ酵素を形成する（Re ichard、1993；Wrightら、1990a；Davisら、1994）。 R1およびR2は、細胞周期の間に別々に調節される。そのデノボ合成から生じる R2タンパク質における増加に相関するS期が存在する（Lewisら、1978；Mannら、 1988）。リボヌクレオチドレダクターゼの活性、それゆえDNA合成および細胞増 殖は、細胞周期の間の増殖する細胞において、R2成分の合成および分解によって 調節される（Erikssonら、1984）。速度調節R2成分は、細胞周期進行のCDC2およ びCDK2タンパク質キナーゼメディエーターによってリン酸化され得るリンタンパ ク質であり（Chanら、1993）、酵素活性に必要な特有のチロシルフリーラジカル を安定化させる非ヘム鉄を含む（Reichard、1993；McClartyら、1990）。 R1タンパク質のレベルは、増殖する細胞の細胞周期の間に実際に変化するよう ではなく、そして細胞周期を通して検出され得る。R1 mRNAの合成は、R2 mRNAの ように、主にS期の間に生じるようである（Erikssonら、1984；Choyら、1988；M annら、1988）。細胞周期の間のR1タンパク質の幅広い分布は、R2タンパク質と 比べてそのより長い半減期に起因する（Choyら、1988；Mannら、1988）。 リボヌクレオチドレダクターゼ、および特にR2成分の調節は、腫瘍プロモータ ーまたは増殖因子TGF-βに暴露される悪性細胞において改変される（Amaraら、1 994；Chenら、1993；Amaraら、1995b；HurtaおよびWright、1995；Hurtaら、199 1）。高レベルの酵素活性が、非悪性細胞と比較した場合、培養した悪性細胞に おいて観察されており（Weber、1983；TakedaおよびWeber、1981；Wrightら、19 89a）、そして正常なコントロール組織試料と比較した場合、漸増レベルのR2タ ンパク質およびR2 mRNAが、悪性前組織および悪性組織に見いだされている（Sae kiら、1995；Jensenら、1994）。 リボヌクレオチドレダクターゼ、および特にR2成分の調節は、腫瘍プロモータ ー、または腫瘍進行の機構を媒介する増殖因子中の形質転換増殖因子βに暴露さ れる形質転換細胞において上昇される（Amaraら、1996；Chenら、1993；Amaraら 、1995b）。これらの研究は、齧歯類およびヒト組織から得られた腫瘍細胞に関 し（Weber、1983；Wrightら、1989a；Saekiら、1995；Jensonら、1994）、およ びヒドロキシウレアのような抗腫瘍剤への耐性について選択された培養細胞に関 する（Lewisら、1978；Wrightら、1989b）。 ヒドロキシウレアのような化合物は、チロシルフリーラジカルの破壊を引き起 こしてR2タンパク質の鉄中心を不安定にすること、（McClartyら、1990）、およ び細胞周期のS期を通して進行から細胞を防ぐこと（AshiharaおよびBaserga、19 79）によってリボヌクレオチドレダクターゼ活性を阻害する。 分子生物学およびヒトゲノムプロジェクトの進歩は、悪性遺伝子発現との標的 化干渉についての以前には予期されなかった可能性を開いた（Blaese、1997；Fe lgner、1997）。これらは、特定の遺伝子の破壊のようなアプローチを含む。標 的化mRNA内の特定の配列とハイブリダイズするように設計されたアンチセンス（ AS）オリゴヌクレオチド（AS-ON）は、このような標的干渉の一例である。一般 的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜と良好に相互作用する （Akhterら、1991）。細胞血漿膜とのそれらの相互作用に続いて、それらは生細 胞に活性的または受動的に輸送され得（Lokeら、1989）、そしてこれは、特定の レセプターに関与する予想された飽和機構によって生じ得る（Yakubovら、1989 ）。 多くの優良な概説は、アンチセンス技術およびその非常に大きな治療的可能性 の主要な局面を含む。この迅速な開発技術の化学的局面（Crooke、1995）、細胞 的局面（Wagner、1994）、および治療的局面（Hananiaら、1995；Scanlonら、19 95；Gewirtz、1993）についての概説が存在する。比較的短い時間内で、豊富な 情報が、培養一次細胞および細胞株におけるAS-ONのインビトロでの使用につい て、ならびに一過性の様式における特定のプロセスを抑制しそして体の機能を変 化するためのこのようなODNのインビボでの投与について蓄積されている。さら に、現在ヒトへの有効性を予測するための充分な知見が、動物モデルにおいて、 インビトロおよびインビボで得られる。 悪性前細胞または悪性細胞において、腫瘍形成能および／または転移性能を制 御し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを有することは有用である。ここで、 リボヌクレオチドレダクターゼのR1およびR2成分が利用された。発明の要旨 本発明者らは、R2遺伝子の異常な発現が、細胞の悪性特性を決定することを示 した。改変したR2遺伝子発現は、悪性進行の機構においてrasと協同することが 見いだされ、そして組換えR2発現は、Raf-1タンパク質を会合する膜の増加を生 じた。これらの結果は、R2がRaf-1およびRac-1と協同し、それにより、ras経路 、従って細胞増殖および特に悪性進行に影響を及ぼすことを示す。 本発明者らはまた、R2遺伝子発現の抑制が、腫瘍細胞の形質転換特性を減少さ せることを示した。特に、本発明者らは、新規のR2アンチセンスが、形質転換を 減少させることを実証した。R1アンチセンスはまた、腫瘍細胞の形質転換特性を 抑制した。R1およびR2アンチセンスは低濃度で効果的であり、驚くべきことに、 正常な細胞はアンチセンス分子に対して感受性が少なかった。 R2の異常な発現はまた、腫瘍細胞の化学治療薬剤に対する耐性を増加させるこ とが見いだされた。R2アンチセンスは、新生物細胞を単独では殺傷しないアンチ センスの濃度で、化学治療薬剤に対する腫瘍細胞の耐性を減少させた。 幅広く言えば、本発明は、細胞増殖を調節する、好ましくは腫瘍細胞の増殖を 阻害する化合物および方法に関する。細胞増殖を調節するのに使用され得る化合 物は、リボヌクレオチドレダクターゼ発現のインヒビター（すなわち、リボヌク レオチドレダクターゼをコードする遺伝子の転写または翻訳のインヒビター）を 含む。リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の領域に相補的なアンチセンスオリ ゴヌクレオチドは、特に有用なインヒビターである。 １つの実施態様において、本発明は、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子由 来の核酸配列に相補的であり、そして少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌク レオチドアナログを含む配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供す る。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダ クターゼ遺伝子、より好ましくは、リボヌクレオチドレダクターゼR1またはR2遺 伝子由来のmRNA領域に相補的である。 本発明はまた、化合物がリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の転写および翻 訳を阻害し、それにより細胞増殖に影響するかどうかを評価する方法に関し、こ の方法は、細胞を、リボヌクレオチドレダクターゼをコードする核酸配列を含む 組換え分子および核酸の転写または翻訳に必要な要素を含む発現ベクターでトラ ンスフェクトする工程；試験化合物を投与する工程；ならびにリボヌクレオチド レダクターゼの発現レベルと、試験化合物の非存在下におけるコントロールで得 られるレベルとを比較する工程を含む。 方法はまた、R2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用のアゴニストまたは アンタゴニストについてアッセイすることによって、Rasシグナル経路を調節す る化合物の能力について化合物を評価することが意図され、これは、試験化合物 の存在下でR2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用を可能にする条件下でR2 およびRaf-1および／またはRac-1を含む反応混合物を提供する工程；R2およびRa f-1および／またはRac-1の間の複合体の形成またはRasシグナル経路の活性化を 検出する工程；ならびに試験物質の非存在下でコントロール反応と比較する工程 を含む。ここで反応混合物中の低レベルの複合体または活性化は、試験化合物が R2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用を妨害することを示し、そして高レ ベルは、試験化合物がR2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用を増強するこ とを示す。 本発明はまた、細胞増殖、好ましくは腫瘍細胞増殖を調節するための薬学的組 成物を提供する。これは、R1またはR2の発現の少なくとも１つのインヒビター、 好ましくは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明の方法によ って同定された化合物を、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を有する 混合物において含む。 本発明はまた、細胞増殖、好ましくは腫瘍細胞増殖を、細胞をR1もしくはR2の 発現を阻害する少なくとも１つの化合物、好ましくは本発明のアンチセンスオリ ゴヌクレオチド、または本発明の方法で同定された有効量の化合物と接触させる ことによって調節する方法を意図する。 本発明はまた、細胞増殖、好ましくは腫瘍細胞増殖を減少させる方法を提供す る。これは、細胞を、R1またはR2の発現の少なくとも１つのインヒビター、好ま しくは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明の方法によって 同定された有効量の化合物と接触させる工程を含む。 本発明はまた、腫瘍細胞の化学治療薬剤に対する感受性を増大させるための薬 学的組成物を提供する。これは、R1またはR2の発現の少なくとも１つのインヒビ ター、好ましくは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明の方 法によって同定された化合物を、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を 有する混合物において含む。本発明はさらに、化学治療薬剤に対して耐性である 腫瘍細胞の増殖を調節するための薬学的組成物を提供する。これは、R1またはR2 の発現の少なくとも１つのインヒビター、好ましくは本発明のアンチセンスオリ ゴヌクレオチド、または本発明の方法によって同定された化合物を、生理学的に 受容可能なキャリアまたは希釈剤を有する混合物において含む。 本発明はまた、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または細胞増殖を 調節するための医薬を調製するための、本発明の方法で同定された化合物の使用 を意図する。図面の説明 本発明の他の利点は、添付図面と関連して考慮される場合、以下の詳細な説明 を参照することによってよりよく理解されるのと同様に容易に理解される。ここ で： 図1A〜Cは、、モノクローナル抗Mycエピトープ抗体9E10（A）、ポリクローナ ルウサギ抗R2血清（B）を用いるウエスタンブロット分析、ならびに細胞周期の 間は、抗体9E10（C）を用いるフローサイトメトリー[Blosmanisら、1987;Chadee ら、1995]による、安定なインフェクタントからのMycタグ化R2発現の分析を示す ゲル（AおよびB）および２つのスキャン（C）の写真である。 図２A〜Cは、形質転された焦点を測定する実験の写真（AおよびB）およびグラ フ（C）である。ここで、（A）は、BALB/c 3T3（a）およびNIH 3T3（b）細胞のS H/mR2での感染が、病巣形成を導かなかったことを示す。（B）T24 H-rasプラス ミドで形質転換した後の、B3/SH（a）およびN3/SH（c）と比較してB3/mR2（b） およびN3/mR2（d）との病巣形成における増加があった。（C）３つの独立したra sトランスフェクション実験において形成された焦点の数をプロットした。 図３A〜Cは、軟寒天増殖の写真（A）およびグラフ（BおよびC）を示す。ここ で、（A）は、ras形質転換細胞におけるMyc-R2の発現が軟寒天における増殖効率 の増加を生じることを示す。示される例は、r-3/mR2および非感染のr-3細胞であ る（表１を参照のこと）。（B）対数増殖培養物からの３×10⁵細胞が回収され、 そして５匹の同系C3H/HeNマウス／細胞株／実験に皮下注射されるC1/SHコントロ ール細胞と比較した場合、C1/mR2細胞は腫瘍潜在性の減少および増殖速度の増加 を示した。示される結果は、２つの独立した実験由来である。腫瘍増殖速度のt 試験分析のp値が示され、そして２つの細胞株の増殖速度が有意に異なることを 示す。（C）C1/mR2細胞は、上昇した転移潜在性を示す。 図４A〜Cはグラフである。ここで、（A）は、R2過剰発現細胞中の膜に結合す るRaf-1タンパク質の増加量を示す。組換えR2発現細胞株B3/mR2、N3/mR2、C1/mR 2、r-2/mR2、r-3/mR2、およびNR4/mR2(R2)は、それらのそれぞれのコントロール 株B3/SH、N3/SH、C1/SH、r-2/SH、r-3、およびNR4（コントロール）と比較され た。全ての場合において、組換えR2を発現する細胞は、Raf-1タンパク質と結合 した膜の増加を示し、そして２つの群の細胞株が比較された場合、それらは、t 試験分析によって有意に異なることが見いだされた（p＜0.001）。（B）また、R 2過剰発現細胞においてタンパク質キナーゼ（MAPK-2）を活性化する分裂促進因 子の活性における増加を示す。組換えR2発現株B3/mR2、N3/mR2、10T/mR2、C1/mR 2、r-2/mR2、およびNR4/mR2(R2)は、LXSH（コントロール）で感染されたそれら のそれぞれのコントロール株と比較した。試験した全ての場合において、R2組換 えを発現する細胞が、酵素活性の増加を示し、そして２つの群の間の差異は、高 度に有意であった（p＜0.001）。（C）活性化V12 Rac-1プラスミド（Jelinekら 、1994）での形質転換後のN3/SH細胞と比較して、N3/mR2細胞での焦点形成の増 加を示す。示される焦点の数は、２つの独立した実験からの平均±SEを示す。 図５A〜Bは、CAD（A）およびDHFR（B）DNAのマウスL細胞とのサザンブロット 分析の例を示すゲルの写真である。（A）コントロールとして、薬物に暴露され ていないH-4細胞（a）、50μＭ PALAの存在下（b）、または60μＭ PALAの存在 下（c）で発生したコロニーからのH-4細胞。DNAは、Xba1で完全に切断された。 （B）コントロールとして、薬物で暴露されていないSC2細胞（a）、80nMメトト レキセート（MTX）の存在下で発生したコロニーからのSC2細胞（b）および（c） 。DNAは、Pst1で完全に切断された。 図６A〜Bは、BALB/c 3T3細胞を用いたCAD（A）およびDHFR（B）DNAのサザンブ ロット分析の例を示すゲルの写真である。DNAは、Pst1で完全に切断された。 （A）PALAに暴露されていないB3/mR2細胞（a）、および、40M PALAの存在下（b ）、または50μＭ PALAの存在下（c）で発生したコロニーからのB3/mR2細胞。 （B）MTXに暴露されていないB3/mR2細胞（a）、および、60nM MTXの存在下（b） 、 または80nM MTXの存在下（c）で発生したコロニーからのB3/mR2細胞。 図７は、N/R2-4（a）およびN/R2+ASR2（b）細胞におけるR2タンパク質レベル のウェスタンブロット分析の写真である。ベクターR2タンパク質をトランスフェ クト細胞中の内因性遺伝子と区別するために、10のアミノ酸およびメチオニンを コードするヒトc-mycエピトープが、R2のcDNAの5'末端に配置された。組換え（ 上部バンド）および内因性（下部バンド）R2タンパク質が、レーンaに観察され 、そして細胞を含むR2アンチセンスにおいて顕著に減少される（レーンb）。両 方の細胞株は、約16時間の倍増時間とほぼ同じ時間で増殖した。 図８は、PALA、MTX、またはヒドロキシウレアの存在下で発生したコロニーか らの細胞における、p53-DNA結合活性を示すゲルの写真である。（a）p53-ヌル（ null）であるコントロール1B細胞、（b）20μＭ PALAの存在下で増殖したB3/mR2 細胞、（c）40μＭ PALAの存在下で増殖したB3/R2c2細胞、（d）40nM MTXの存在 下で増殖したB3/mR2細胞、（e）60nM MTXの存在下で増殖したB3/R2c2細胞、（f ）0.20mMヒドロキシウレアの存在下で増殖したB3/mR2細胞、および（g）0.30mM ヒドロキシウレアの存在下で増殖したB3/R2c2細胞。細胞は、抗体421（これは、 p53のDNA結合を活性化する）の存在下で、³²P標識化p53コンセンサス結合配列と ともにインキュベートされた。1Bコントロールp53-ヌル細胞を除く全ての細胞株 における複合体の存在に注意のこと。低分子量の複合体形成はp53-DNA結合から 生じ、そして高分子量の複合体形成は抗体スーパーシフト化（supershifted）p5 3-DNA結合から生じる。 図９は、（a）H-rasガン遺伝子を含むNIH-3T3マウス細胞、（b）H-rasガン遺 伝子およびR2アンチセンス配列を含むNIH-3T3マウス細胞、および（c）H-rasガ ン遺伝子およびR2のコード領域配列を含むNIH-3T3マウス細胞、における形質転 換焦点の数を示すグラフである。結果は３つの実験の平均である。 図10A〜Bは、L60マウス腫瘍細胞におけるリボヌクレオチドレダクターゼR2タ ンパク質レベルの、AS-II-626-20阻害（A）および種々のR2アンチセンスオリゴ ヌクレオチド（B）による阻害のウエスタンブロット分析の写真である。好ましい実施態様の詳細な説明 １．アンチセンスおよびリボザイム 本発明は、リボヌクレオチドレダクターゼタンパク質の発現を阻害し、そして それにより細胞増殖を調節する化合物を提供する。この化合物は、遺伝子の転写 、またはmRNAのタンパク質への翻訳を阻害することによって、リボヌクレオチド レダクターゼの発現を阻害し得る。このような化合物は、アンチセンスオリゴヌ クレオチドおよびリボザイムを含み得る。 本明細書中で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、その標 的に相補的なヌクレオチド配列を意味する。 用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（inte rsugar）（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオチドモノマーのオリ ゴマーまたはポリマーを意味する。用語はまた、天然には生じないモノマーまた はその一部（同様の機能）を含む改変または置換されたオリゴマーを含む。この ような改変または置換されたオリゴマーは、増強された細胞の取り込み、または ヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などの特性により、天然に存在する形 態よりも好適であり得る。この用語はまた、２つ以上の化学的に別の領域を含む キメラオリゴヌクレオチドを含む。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有益 な特性（例えば、増加したヌクレアーゼ耐性、細胞への増加した取り込み）を付 与する改変ヌクレオチドの少なくとも１つ以上の領域を含み得るか、または本発 明の２つ以上のオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドを形成するた めに結合され得る。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸またはデオキシリボ核 酸であり得、そしてアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル を含む天然に存在する塩基を含み得る。オリゴヌクレオチドはまた、以下のよう な改変塩基を含み得る：キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メ チルアデニン、2-プロピルアデニン、および他のアルキルアデニン、5-ハロウラ シル、5-ハロシトシン、6-アザウラシル、6-アザシトシン、および6-アザチミジ ン、シュードウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、 8-チオールアデニン、8-チオールアルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニン、 および他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグ アニン、8-チオールアルキルグアニン、8-ヒドロキシルグアニン、および他の8- 置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン 、またはグアニン、5-トリフルオロメチルウラシル、および5-トリフルオロシト シン。 本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変亜リン酸、リン酸骨格 中の酸素ヘテロ原子、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間（intersuger） 結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環状糖間結合を含み得る。例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル 、メチルホスホネート、およびホスホロジチオエートを含み得る。本発明の実施 態様において、４〜６の3'末端塩基の間に結合するホスホロチオエート結合が存 在する。別の実施態様において、ホスホロチオエート結合は、全てのヌクレオチ ドを結合する。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、治療または実験試薬として より適合し得るヌクレオチドアナログを含み得る。オリゴヌクレオチドアナログ の例は、ペプチド核酸（PNA）である。ここで、DNA（またはRNA）中のデオキシ リボース（またはリボース）リン酸骨格は、ペプチドにおいて見いだされる骨格 （P.E.Nielsenら、Science 1991，254，1497）と類似のポリアミド骨格で置換さ れる。PNAアナログは、酵素による分解に耐性であり、インビボおよびインビト ロで拡張した生存を有することが示されている。PNAはまた、PNA鎖とDNA鎖との 間の荷電相反（repulsion）の欠失のために、相補的DNA配列により強く結合する 。他のオリゴヌクレオチドは、ポリマー骨格、環状骨格、または非環状骨格を含 むヌクレオチドを含み得る。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有 し得る（米国特許第5,034,506号）。オリゴヌクレオチドはまた、レポーター基 （オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基）、またはアンチセン スオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基のような基を含み得る 。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、糖模倣物を有し得る。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ダイマー形成の最小の可能性、自己相補 性相互作用、および標的配列とは異なるリボヌクレオチドレダクターゼmRNAに対 する結合可能性を示すようなものから選択され得る。これらの特性は、コンピュ ーターモデリングプログラムOLIGO Primer Analysis software Version 3.4（Na tional Biosciences）を用いて決定され得る。プログラムは、これらの３つのパ ラメーターの定性評価の決定を可能にし、そして「可能性無し」；「いくらかの 可能性」；または「本質的に完全な可能性」を示す。オリゴヌクレオチドは、表 7および11に記載されるような全ての３つのパラメーターにおいて、好ましくは 「いくつかの可能性」または「可能性無し」、最も好ましくは「可能性無し」の 評価を有するものから選択される。オリゴヌクレオチドはまた、それらの機能が 、任意の改変または置換によって実質的に影響されないものから選択される。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボヌクレオチド レダクターゼ遺伝子からのmRNA領域に相補的である。より好ましくは、アンチセ ンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼR2遺伝子からのmRNA 領域に相補的である。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも７ヌクレオチドま たはヌクレオチドアナログ、より好ましくは、少なくとも20ヌクレオチドまたは ヌクレオチドアナログ、最も好ましくは、30〜35ヌクレオチドまたはヌクレオチ ドアナログを含む。本発明の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は 、表11および７に見いだされ得、そして配列番号１〜102および配列番号103〜16 1である。より好ましいオリゴヌクレオチドは、表12に示される。最も好ましい オリゴヌクレオチドは、表７に示されるように、配列番号１、２、12、16、18、 21、25、29、34、42、44、45、46、52、53、59、60、64、65、66、68、69、70、 72、73、74、76、78、79、80、90、91、92、96、99、100、および102を有する。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、従来の技術および周知の技術に よって調製され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、固相合成を用いて、特に Applied Biosystemsから入手可能な装置のような市販の装置を用いて調製され得 る。それらの活性を妨害する任意の他の要因を含まないように、オリゴヌクレオ チドを実質的に精製することもまた好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドはま た、遺伝的相補性技術を用いて、または本明細書中に記載のプローブを用いて同 定され得る。改変または置換アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製することも また、当業者に良好である。 リボザイム配列もまた、細胞増殖を調節するために使用され得る。リボザイム は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相同または相補的な配列、およ びオリゴヌクレオチドを切断するために必要な触媒中心を有する。本発明に有用 なリボザイムの型は、当該分野で公知の型から選択され得る。いくつかのリボザ イム構造ファミリーが同定されている。これらは、グループIイントロン、Rnase P、D（delta）型肝炎ウイルスリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、およ び本来はタバコリングスポット（ringspot）ウイルスサテライトRNA（sTRSV）(S ullivan，1994，米国特許第5,225,347号、カラム４〜５)のネガティブ鎖由来の ヘアピン型リボザイムを含む。後者の２つのファミリーは、ウイロイドおよびウ イルソイド由来であり、ここでリボザイムは、ローリングサイクル複製の間に作 製されるオリゴマー形熊モノマーを分離すると考えられる（Symons，1989および 1992）。ハンマーヘッド型およびヘアピン型リボザイムモチーフは、遺伝子治療 のためのmRNAのトランス切断に、最も一般的に適用される（Sullivan，1994）。 現在臨床試験であるヘアピン型リボザイムは、本発明において好ましく使用され る。一般的には、リボザイムは、30〜100ヌクレオチド長である。 ２．化合物を評価する方法 本発明は、化合物が、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の転写または翻訳 を阻害し、それにより細胞増殖を調節する（すなわち減少させる）がどうかを評 価する方法を意図する。この方法は、細胞を、リボヌクレオチドレダクターゼを コードする核酸配列および核酸の転写または翻訳に必要な要素を含む発現ベクタ ーでトランスフェクトする工程；試験化合物を投与する工程；および試験化合物 の非存在下で、リボヌクレオチドレダクターゼの発現のレベルとコントロールで 得られるレベルとを比較する工程を含む。 リボヌクレオチドレダクターゼをコードする核酸配列を含む発現ベクターは、 当該分野で公知の手順を用いて、遺伝子の配列を考慮して構築され得る。適切な 転写および翻訳要素は、種々の供給源（細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス遺伝 子、哺乳動物遺伝子、または昆虫遺伝子を含む）に由来し得る。適切な要素の選 択は、選択された宿主に依存し、そして当業者によって容易に達成され得る。 レポーター遺伝子の例は、βガラクトシダーゼ（例えば、lacZ）、クロラムフ ェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、またはイム ノグロブリンもしくはそれらの一部のようなタンパク質をコードする遺伝子であ る。レポーター遺伝子の転写は、βガラクトシダーゼなどのようなレポータータ ンパク質の濃度の変化によってモニターされる。これは、リボヌクレオチドレダ クターゼ遺伝子の発現における物質の効果を決定するために、組換え分子の発現 の可視化およびアッセイを可能にする。 本発明を実施するのに適切な宿主細胞としては、CHO、COS、BHK、293、および HeLaが挙げられる。哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのプロトコルは 、当該分野で周知であり、そしてリン酸カルシウム媒介エレクトロポレーション 、ならびにレトロウイルスおよびプロトプラスト融合媒介性トランスフェクショ ンを含む。 本発明者らは、R2がRaf-1および／またはRac-1と相互作用または協同し、それ によりRasシグナル経路に影響することを見いだした。従って、本発明はまた、R 2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用のアゴニストまたはアンタゴニスト （すなわち刺激因子または阻害因子）についてアッセイすることによって、Ras シグナル経路を調節するその能力について、化合物を評価する方法を意図する。 化合物が、R2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用のアゴニストまたはアン タゴニストであるかどうかを評価する基本的な方法は、試験化合物の存在下で、 R2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用を可能にする条件下で、R2ならびに Raf-1および／またはRac-1を含む反応混合物を調製することである。試験化合物 は、混合物に最初に添加され得るか、またはR2ならびにRaf-1および／またはRac -1の添加に続いて添加され得る。試験化合物を含まないかまたは偽薬を含むコン トロール反応混合物もまた調製される。複合体の形成または経路の活性化が検出 され、そしてコントロール反応物中では複合体が形成されるかまたは経路が活性 化されるが、反応混合物中では複合体が形成されずまたは経路も活性化されるな いということは、試験化合物が、R2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用を 妨害することを示す。反応は液相で行われ得るか、あるいはR2ならびにRaf-1お よび／もしくはRac-1、または試験化合物は固定化され得る。 本発明はまた、R2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用のアゴニストの効 果を阻害するアンタゴニストについてのスクリーニングを可能にする。従って、 本発明を使用して、R2の同じ結合部位と競合する化合物についてのアッセイし得 る。 本発明はまた、R2と相互作用するタンパク質に結合し、それによりR2を阻害す る化合物を同定するための方法を意図する。タンパク質-タンパク質相互作用は 、同時免疫沈降、架橋および勾配またはクロマトグラフィーカラムを介する同時 精製のような従来の方法を用いて同定され得る。R2と相互作用するタンパク質を コードする遺伝子の同時同定を生じる方法もまた使用され得る。これらの方法は 、標識化R2で発現ライブラリーをプローブする工程を包含する。 ツーハイブリッドシステムはまた、インビボでのタンパク質相互作用を検出す るのに使用され得る。一般的には、２つのハイブリッドタンパク質をコードする プラスミドが構築される。第１のハイブリッドタンパク質は、R2に融合した転写 アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインからなり、そして第２のハイブリ ッドタンパク質は、cDNAライブラリーの一部としてプラスミドに組換えられてい るcDNAによってコードされる未知のタンパク質に融合した転写アクチベータータ ンパク質のアクチベータードメインからなる。プラスミドは、その調節領域が転 写アクチベーターの結合部位を含むレポーター遺伝子（例えば、lacZ、ルシフェ ラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含む酵母の 株（例えば、S．cerevislae）に形質転換される。ハイブリッドタンパク質単独 では、レポーター遺伝子の転写を活性化し得ない。しかし、２つのハイブリッド タンパク質の相互作用は機能的アクチベータータンパク質を再構築し、そしてレ ポーター遺伝子の発現を生じる。これは、レポーター遺伝子産物についてのアッ セイによって検出され得る。 融合タンパク質は、上記の方法に使用され得ることが理解される。特に、グル タチオンSトランスフェラーゼに融合したR2がこの方法に使用され得る。 本発明の方法を用いて同定される化合物としては、以下のようなペプチドが挙 げられるがこれらに限定されない：Igテイル融合ペプチドを含む可溶性ペプチド 、ランダムペプチドライブラリーならびにD-および／またはL-立体配置アミノ酸 から作製されるコンビナトリアル化学由来分子ライブラリーのメンバー、ホスホ ペプチド（ランダムまたは部分縮重した定指向ホスホペプチドライブラリーのメ ン バーを含む）、抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イ デオタイプ、キメラ、短鎖抗体）、フラグメント（例えば、Fab、F(ab)₂、およ びFab発現ライブラリーフラグメント、ならびにそれらのエピトープ結合フラグ メント、ならびに小有機または非有機分子。化合物は、内因性生理学的化合物で あり得るか、または天然または合成化合物であり得る。 本発明の方法を適用するのに適切な、R2とRaf-1および／またはRac-1との相互 作用を調節する化合物を評価するための試薬は、適切な容器に封入された必要な 物質を提供する簡便なキットに封入され得る。キットはまた、本発明の方法を実 施するのに有用な適切な支持体を含む。 本明細書中に記載される方法を用いて同定された化合物、および本明細書中に 記載されるR2発現の他のインヒビター（例えば、R2に対するアンチセンス）は、 Ras経路を調節するために使用され得る。特に、化合物は、Raf-1および／または Rac-1のシグナル伝達特性の阻害；細胞増殖の阻害、細胞周期の改変、ならびに 自己免疫疾患を有する患者における免疫応答をダウンレギュレートするために使 用され得る。本発明の実施態様において、化合物は、抗ガン遺伝子活性または腫 瘍抑制活性を有する。 ３．細胞増殖／転移を調節するための方法および組成物 本発明の方法を用いて同定される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザ イム、および化合物は、細胞増殖、特に腫瘍細胞増殖を調節する。従って、細胞 増殖、好ましくは腫瘍細胞増殖を妨害する方法が提供される。これは、組織また は細胞と、本発明の方法を用いて同定された１つ以上のアンチセンスオリゴヌク レオチド、リボザイム、および化合物とを接触させる工程を含む。好ましくは、 表７または11または12に示されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが投与 される。 用語「接触」は、液体キャリア中のアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザ イムなどの、細胞懸濁物または組織サンプルへの添加、あるいはオリゴヌクレオ チドなどを、動物内の細胞または組織に直接的または間接的に投与することをい う。 方法は、以下に挙げられる増殖性疾患を治療するのに使用され得る。種々の形 態のガン（例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、肉腫、黒 色腫、腺腫、固形組織の悪性腫瘍、低酸素性腫瘍、口、咽喉、咽頭、および肺の 扁平上皮細胞悪性腫瘍、尿生殖器ガン（例えば、子宮頚ガンおよび膀胱ガン）、 造血性ガン、大腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、頭部および頸部ガン、ならびに神経 系ガン、良性病変（例えば、乳頭腫、関節硬化症、乾癬症、一次および二次poly themia、肥満細胞症、自己免疫疾患、血管新生、細菌感染、ならびにウイルス感 染（例えば、HIV感染、肝炎、またはヘルペス感染）。 本発明の方法を用いて同定される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザ イム、および化合物はまた、薬剤耐性腫瘍を処置するために使用され得る。薬剤 耐性腫瘍の例は、ヒドロキシウレアに耐性の腫瘍；複数の抗ガン薬（例えば、コ ルヒチン、ビンブラスチン、およびドキソルビチン）への耐性を付与することが 公知である高レベルのP-糖タンパク質を発現する腫瘍；またはR．Deeleyら、Sci ence，258:1650-1654，1992に記載されるような複数薬剤耐性タンパク質を発現 する腫瘍である。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、転移を減少させることが見 いだされている。本発明の実施態様において、被験体における転移を減少させる ための方法が提供される。これは、転移を減少させるのに有効な量の本発明のア ンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む。好ましくは、アンチセン スオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜102または配列番号103〜161に示される 配列を有し、最も好ましくは、表12に示される配列を有する。 選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および化合物は、 細胞増殖および特に腫瘍細胞増殖を調節するそれらの能力、または本明細書中に 記載されるインビトロ系およびインビボ系での転移を減少させるそれらの能力に ついて試験され得る。 治療適用のために、本発明の方法を用いて同定された、アンチセンスオリゴヌ クレオチド、リボザイム、および化合物が、薬学的組成物に処方され得る。薬学 的組成物は、被験体に投与するのに適切な生物学的適合性形態での被験体への投 与のために、本発明の方法を用いて同定された１つ以上のアンチセンスオリゴヌ クレオチド、リボザイム、および化合物を含む。本発明の組成物は、ヒトおよび 種々の他の動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、およびネコ）への 投与のために意図され得る。 本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置が望まれるか否かに依存し て、そして処置される領域に依存して異なる方法で投与され得る。組成物は、経 口、皮下、または非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、および鼻腔内投与 を含む）、ならびにくも膜下内、および処置される悪性肺腫細胞によって要求さ れるような注入技術で投与され得る。CNSくも膜下内送達のために、送達は、例 えばOmmayaリザーバーまたは当該分野で公知の他の方法で使用され得る。薬学的 に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバント、およびビヒクル、ならびに移植 キャリアは、一般的に、不活性な非毒性固体または液体フィルター、希釈剤、ま たは本発明の活性な成分と反応しない包膜化物質をいう。カチオン性脂質（例え ば、Lipofectin，Life Technologies）はまた、オリゴヌクレオチドの取り込み を促進するために、組成物に含まれ得る。化合物の移植はまた有用である。一般 的には、薬学的組成物は滅菌される。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、ウイルスベク ターまたは非ウイルスベクターを用いて送達され得る。配列は、本発明のアンチ センスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムが細胞内で発現されるようなカセッ トまたは構築物に導入され得る。一般的には、構築物は、オリゴヌクレオチドま たはアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞中で転写されるように適切な転写制 御領域を含む。 従って、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイ ムをコードする配列に作動可能に連結する転写制御配列を含むベクターを提供す る。本発明はさらに、適切な真核生物または原核生物細胞から選択され、これら のベクターで形質転換される宿主細胞を提供する。このような形質転換細胞は、 悪性腫瘍の機能および調節の研究、ならびに本発明の処置を可能にする。 ベクターは公知であるか、または当業者によって構築され得、そして配列の所 望の転写を達成するのに必要な全ての発現要素を含むべきである。異なる形態に おける核酸の回収についての機構のような他の有利な特徴がまた、ベクター内に 含まれ得る。ファージミドは、このような有利なベクターの特定の例である。な ぜなら、それらは、プラスミドまたはバクテリオファージベクターのいずれかと して使用され得るからである。他のベクターの例としては、バクテリオファージ 、バキュロウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス、DNAウイルス、 リポソーム、ならびに他の組換えベクターが挙げられる。ベクターはまた、原核 生物または真核生物のいずれかの宿主系における使用のための要素を含み得る。 当業者には、どの宿主系が特定のベクターと適合するかは公知である。 ベクターは、当該分野で公知の種々の方法のいずれか１つによって、細胞また は組織に導入され得る。このような方法は、一般的に、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(19 89，1992)、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)、Changら、Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)、Vegaら、Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbo r，MI(1995)、Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Use s，Butterworths，Boston MA(1988)、およびGilboaら、(1986)の記載に見いださ れ得、そして、例えば、安定性または一過性のトランスフェクション、リポフェ クション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターでの感染を 含む。 感染による核酸の導入は、いくつかの利点を提供する。高い効率がそれらの感 染性質に起因して得られ得る。さらに、ウイルスは非常に特殊化され、そして代 表的には、特定の細胞型において感染および増殖する。従って、これらの性質特 異性は、ベクターを、インビボまたは組織もしくは細胞の混合培養物内の特定の 細胞型に標的化するのに使用され得る。ウイルスベクターはまた、レセプター媒 介事象を介して、標的特異性を改変するための特定のレセプターまたはリガンド で改変され得る。 さらなる特徴は、ベクターに、その安全性を確実にし得、そして／またはその 治療効率を増強し得るように付加され得る。このような特徴は、例えば、組換え ウイルスで感染した細胞に対してネガティブに選択するために使用され得るマー カーを含む。このようなネガティブ選択マーカーの例は、抗ウイルスガンシクロ ビルに対する感受性を付与するTK遺伝子である。ネガティブ選択は、それゆえ、 感染が制御され得る手段である。なぜなら、抗生物質の添加を介する誘導性自殺 を提供するからである。このような保護は、例えば、変異がウイルスベクターま たは配列の改変形態の産生を生じる場合、細胞性形質転換が生じないことを確実 にする。特定の細胞型に対する発現を制限する特徴もまた含まれ得る。このよう な特徴は、例えば、所望の細胞型に特異的であるプロモーターまたは調節要素を 含む。 組換えウイルスベクターは、所望の核酸のインビボでの導入に有用なベクター の別の例である。なぜなら、それらは、側方感染および標的特異性のような利点 を提供するからである。側方感染は、例えば、レトロウイルスのライフサイクル に固有であり、そして１つの感染細胞が出芽しない（bud off）多くの子孫ウイ ルスを産生し、そして付近の細胞に感染するプロセスである。結果は、大きな領 域が迅速に感染され、その多くがもとのウイルス粒子によって最初に感染されて いなかったということである。このことは、感染因子が娘子孫を介してのみ広が る垂直型の感染と対称的である。側方に広がり得ないウイルスベクターがまた、 産生され得る。この特徴は、所望の目的が、特定の遺伝子を限局した数の標的細 胞にのみ導入することの場合に有用であり得る。 本発明の方法において使用されるベクターは、標的される所望の細胞型に依存 して選択され得る。例えば、乳ガンが処置される場合、次いで、このような上皮 細胞に特異的なベクターが使用されるべくである。同様に、造血系の細胞が処置 される場合、次いで、血液細胞およびそれらの前駆体、好ましくは特定の型の造 血細胞に特異的なウイルスベクターが使用されるべきである。 レトロウイルスベクターは、感染性粒子として機能するか、または最初の１回 の感染のみを起こすかのいずれかのように構築され得る。前者の場合、ウイルス のゲノムは、それが新たなウイルスタンパク質およびRNAを合成するための必要 な遺伝子、調節配列、およびパッケージングシグナルを全て維持するように、改 変される。一旦これらの分子が合成されると、宿主細胞は、RNAを、さらなる回 の感染を起こし得る新しいウイルス粒子にパッケジーングする。ベクターのゲノ ムはまた、所望の組換え遺伝子をコードしそして発現するように操作される。非 感染性ウイルスベクターの場合、ベクターゲノムは、通常、RNAをウイルス粒子 に包膜化するのに必要とされるウイルスパッケージングシグナルを破壊するよう に変異される。このようなシグナルを含まなければ、形成される任意の粒子はゲ ノムを含まず、従って後続の回の感染を起こし得ない。特定の型のベクターは、 意図される適用に依存する。実際のベクターもまた公知であり、そして当該分野 で容易に入手可能であるか、または周知の方法論を用いて当業者によって構築さ れ得る。 ウイルスベクターが使用される場合、例えば、手順は、それらの標的特異性を 利用し、そして結果として、所望の部位で局所的に投与されなくても良い。しか し、局所投与は、迅速でより効果的な処置を提供し得、投与はまた、例えば、被 験体への静脈内または皮下注射によって実施され得る。ウイルスベクターの脊髄 液への注射もまた、投与の態様として使用され得る。注射に続いて、ウイルスベ クターは、それらが感染に対する適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識する まで、循環する。 リポソームのようなトランスフェクションビヒクルもまた、上記の非ウイルス ベクターを、接種領域内のレシピエント細胞に導入するのに使用され得る。この ようなトランスフェクションビヒクルは、当業者に公知である。 本発明の薬学的組成物およびベクターは、他の薬剤との組み合わせまたは単独 で投与され得、当業者に公知の良好な医療慣習および処置様式と一致し得る。本 発明の組成物などと組み合わせて投与され得る他の薬物の例は、細胞傷害性剤、 免疫毒素、アルカリ化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、および他の抗ガン剤であ る。 アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および化合物の投薬は、数日 から数ヶ月または疾患の減少が達成されるまで持続する治療単位の処置で処置さ れる状態の重傷度および応答性に依存する。最適な投薬スケジュールは、身体の 薬物蓄積の測定を用いて計算され得る。当業者は、最適投薬量、投薬方法論、お よび反復速度を容易に決定し得る。最適投薬量は個々のオリゴヌクレオチドの相 対的な強度に依存して変化し得、そして一般的には、インビトロおよびインビボ での動物研究におけるED₅₀に基づいて決定され得る。本発明の薬学的組成物また はベクター、および組合せ薬物は、非細胞傷害性用量または細胞傷害性用量で 各々投与され得るか、あるいは一方は細胞傷害性用量で投与され得、そして他方 は非細胞傷害性用量で投与され得る。用量は、相乗効果を提供するために選択さ れ得る。 実施例 本実施例は、遺伝子移入技術によって達成される調節解除されたR2発現を含む 細胞の特徴と関連する悪性腫瘍の分析を提供する。R2の過剰発現は、活性化H-ra sでのトランスフェクションに続いて、マウス線維芽細胞による形質転換焦点形 成の増加した頻度を導く。さらに、ras形質転換細胞における組換えR2の発現は 、軟寒天における増強されたコロニー形成効率を生じ、そしてインビボでの腫瘍 形成能および転移能を著しく上昇させた。さらに、調節解除されたR2発現は、形 質転換機構において、rac-1のような他のガン遺伝子様と協同し得る。 本明細書中の結果は、哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼのR2成分は悪性 能を改変するように活性化ガン遺伝子と相乗作用し得る悪性決定因子であること を始めて実証し、そしてこのことは、これらの効果が調節解除されたR2遺伝子発 現によってもたらされる主要なRas経路における改変を介して媒介されるモデル を支持する。本明細書に示される観察は、R2もまた、他の重要な細胞の機能に関 与し得、そしてガン遺伝子との協同作用を介して悪性能の決定において直接的な 役割を果たし得ることを示す。 本実施例はさらに、リボヌクレオチドレダクターゼR2遺伝子発現が、薬物感受 性特徴の決定に重要な役割を果たし得、そしてこのことが、ゲノムの不安定性に 関与する機構を少なくとも部分的に介して生じるようであることを示す。 異常なR2発現が薬剤感受性を改変する機構は、p53の変異または野生型p53機能 の欠失の直接的な関与を必要としないようであるが、p53調節経路の下流の遺伝 事象が関与することはあり得る。実施例１に示されるように、増大したR2発現お よびRaf-1タンパク質を含むras経路の活性化とマイトジェン活性化タンパク質キ ナーゼ-2（MAPK）活性との間に結び付きが存在する。Balb/c 3T3およびNIH-3T3 細胞における組換えR2遺伝子発現は、Raf-2タンパク質活性化およびマイトジェ ン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性の両方を有意に増加させる。 上記の観察についての仮説が作製され得るが、本発明をこの１つの作用の様式 に限定するように解釈されるべきではない。これらの観察は、R2タンパク質が、 MAPK経路におけるシグナル分子として作用し得ることを意味し、さらにリボヌク レオチド減少の律速成分としてのその役割を意味する。c-myc遺伝子の産物のよ うな転写因子は、MAPK経路の下流の標的であり、そして例えば、細胞周期進行の 間の通過点の調節に重要である、サイクリンA、D、およびEの発現を制御する（H unter，1994;1995）。細胞周期通過点制御を損なうことは、ゲノムの不安定化を 増強し、そしてDNA増幅を促進する（Kohn，1996；Livingstonら、1992）。c-myc 過剰発現はまた、DHFRを含む遺伝子増幅機構に直接関連している（Mai，1994） 。これらの観察は、異常なR2発現を介するMAPK経路における改変は、薬剤感受性 およびゲノムの完全性において観察される変化に少なくとも部分的に担われ得る 。 実施例３は、R1およびR2成分に対して指向される短いアンチセンス配列が抗腫 瘍活性を有し、そして新生物細胞に対して細胞傷害性であることを実証する。さ らに、R2アンチセンス配列はまた、周知の化学治療薬と相乗的に作用し得る。非 常に低濃度（非毒性）の短いアンチセンス配列は、新生物細胞の化学治療薬（例 えば、N-(ホスホンアセチル)-L-アスパレート（PALA）およびメトトレキセート （MTX）ならびにヒドロキシウレア）に対する耐性を減少させた。実施例に示さ れるように、細胞は、アンチセンス配向中にR2配列を含むベクターでトランスフ ェクトされた。これらの細胞は、化学治療薬に対してより感受性であった。また 、薬物耐性であるマウス10T1/2細胞は、アンチセンス配向のR2配列でトランスフ ェクトされた場合、化学治療薬に対して有意に減少した耐性（増大した感受性） を有することが見いだされた。提供されたR2配列に相補的な短い合成アンチセン ス配列もまた、感受性を増大する。 上記の議論は、R2 mRNAに対して指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチド およびリボザイムの使用のための実際の基準を提供する。本発明で用いられる方 法および有用性は、以下の非制限的な実施例および添付の図面によって示され得 る。一般的な方法 ：分子生物学における一般的な方法 ：当業者に公知であり詳細には記載されない標 準的な分子生物学技術は、一般的に、Sambrookら、Molecular Cloning:A Labora tory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989,1992)、Ausube lら、Current Protocols in Molecular Biology，Johon Wiley and Sons，Balti more，Maryland(1989)；およびPerbal，A Practical Guide to Molecular Cloni ng，John Wiley & Sons，New York(1988)に従った。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）は、一般的に、PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications，Acade mic Press，San Diego，CA(1990)のように実施された。 ベクターは、本発明のために、当業者によって構築され得、そして配列の所望 の転写を達成するのに必要な全ての発現要素を含むべきである。発現要素は、標 的される細胞においてのみ発現するように選択され得る。異なる形態における核 酸の回収のための機構のような他の有利な特徴がまた、ベクター内に含まれ得る 。当業者には、どの発現要素が特定の細胞型に適合するかが公知である。ベクタ ーは、本明細書中上記のような当業者に公知の種々の方法のいずれか１つによっ て、細胞または組織に導入され得る。免疫学における一般的な方法 ：当業者に公知であり特に記載されない免疫学にお ける標準的な方法は、一般的に、Stitesら（編）Basic and CliniCal Immunolog y(第８版)、Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)、ならびにMishellおよびShi igi（編）、Selected Methods in Cellular Immnology，W.H．Freeman and Co. ，New York(1980)に従った。腫瘍形成および転移についてのアッセイ ：悪性能を、以前に報告されたように（ Wright，1989a；Eganら、1987a、1987b；Damenら、1989；Taylorら、1992；Stok oeら、1994）決定した。６〜８週齢のC3H/HeN同系マウス（Charles River，Qube c）を使用して、細胞の腫瘍形成能および転移能を評価した。細胞をサブコンフ ルエントから調製し、対数増殖的に培養物を培養し、トリプシン/EDTA溶液で穏 やかに処理することによって回収し、そして平衡化塩溶液中に適切な濃度に調整 した。 腫瘍形成能（腫瘍潜在性）アッセイのために、0.1ml容量中の１×10⁵細胞を、 マウスの背中に皮下注射し、そして触診によって検出可能な腫瘍（２×２mm）を 形成するのに必要な時間を記録した。腫瘍の増殖もまた、腫瘍の直径を測定し、 そして腫瘍の出現後の各日に腫瘍の基本領域測定することによって評価した（Da menら、1989）。腫瘍のサイズを、腫瘍の横断面の大きさを増加させることによ って決定した。21日後に腫瘍をマウスから取り出し、そして腫瘍の重量を記録し た。腫瘍が形成されない場合、マウスを注射後２ヶ月間維持し、そして屠殺した 。 実験的な転移アッセイ（転移能の決定）のために、0.2ml容量中の１×10⁵細胞 を、６〜８週齢のC3H/HeN同系マウスの尾静脈に注射し、そして21日後に肺腫瘍 の数の評価を行った。マウスを屠殺し、そして肺をBouin溶液（ピクリン酸、ホ ルムアルデヒド、酢酸（15:5:1））を気管内に注射することによって染色した（ Eganら、1987b；Damenら、1989）。肺腫瘍を、解剖顕微鏡の補助を用いて計数し た。等しい数の試験細胞およびコントロール細胞が注射されたことを確認するた めに、増殖培地を含む２連の培養プレートを、１プレートあたり100細胞で接種 した。培養の10日後、プレートをメチレンブルーで染色し、そしてコロニーを計 数した。リボヌクレオチドレダクターゼアッセイ ：細胞から調製された粗抽出物における リボヌクレオチドレダクターゼ活性を、以前に記載のように（Lewisら、1978；H urtaおよびWright，1992；Hurtaら、1995）アッセイする。酵素調製物を、３サ イクルの凍結-融解によって、リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.2、1mMジチオスレ イトールおよび1mMプロテアーゼインヒビター（AEBSF，CalbIocheM，San Franci sco，CA）を含む）に溶解させた対数増殖細胞から得る。遠心分離の後に、上清 を、以前に記載されているように（Lewisら、1978；HurtaおよびWright，1992； Fanら、1996；Choyら、1988）、[¹⁴C]-CDPを用いる酵素活性アッセイ（Moravek Biomedical，Brea，CA）のために使用する。ウエスタンブロット分析 ：使用した手順は報告されている（Fanら、1996a；1996 b；Choyら、1988）。簡潔には、細胞抽出物調製後に、全タンパク質含有量を決 定し、そしてアリコートを10％直線勾配SDS-ポリアクリルアミドゲルで分析した 。タンパク質の移行およびブロッキングの後、メンブレンを抗R2ウサギポリクロ ーナル抗体とともにインキュベートする。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウ サギIgG（Sigma）を、タンパク質R2検出のために使用した。 実施例１ R2は活性化ガン遺伝子と協同する リボヌクレオチドレダクターゼの律速R2成分の調節解除された発現の悪性能を 決定するために、R2成分（Fanら、1996b）を有するレトロウイルス発現ベクター （SH/mR2）で安定に感染させた細胞の特性を研究した。さらに、R2と活性化ガン 遺伝子との間の相互作用を調査した。 材料および方法 発現ベクター：ヒトMycエピトープタグ化マウスR2成分についてのレトロウイル ス発現ベクターSH/mR2を構築し、そしてFanら（1996b）に記載のようにパッケー ジングした。ウイルスストックの感染性は、＞１×10⁴コロニー形成単位/mlであ った。T-24 H-rasおよび選択マーカーneoを発現するプラスミドpHO6Tiを、悪性 腫瘍形成のために使用した（Eganら、1987a、1987b；Taylorら、1992）。活性化 Rac-1プラスミド（V12 Rac-1）は、M．Symonsによって親切に提供された（Stoko eら、1994）。 細胞および細胞培養：マウス細胞株（BALB/c 3T3、NIH 3T3、T24 H-ras形質転換 10T1/2細胞の４つの株（Cl、NR4、r-2およびr-3と称される））は、R2レトロウ イルスベクターのレシピエントとして以前に使用されている（Fanら、1996b）。 細胞を、10％ウシ血清（Fetalclone III，Hyclone，Logan，UT）を補充したα最 小必須培地（α-MEM）（Gibco，Grand lsland，NY）で日常的に培養した。細胞 のポリブレンの存在下でSH/・R2またはコントロールウイルスLXSHでの感染を行 い（Millerら、1993）、そして安定な感染物（＞１×10⁴クローン）を、ハイグ ロマイシン選択を用いて得、そしてプールした（Fanら、1996b；Millerら、1993 ）。細胞分裂時間、プレーティング効率、相対コロニー形成効率を比較すること によるヒドロキシウレア細胞傷害性に対する相対感受性の決定を、以前に記載（ Lewisら、1978；Eganら、1987a；；HardsおよびWright，1981）のように行った 。 軟寒天における増殖を、15mlの基礎寒天（α-MEM＋10％ウシ血清中に0.5％Bac to-agar）および10mlの増殖寒天（10％ウシ血清を含むα-MEM中0.33％寒天）を 含む10cm組織培養プレートにおいて測定した。細胞をサブコンフルエント培養物 から得、そしてコロニーを10〜15日後に計数した（Eganら、1987a、1987b；Hard sおよびWright，1981）。形質転換もまた、細胞をSH/mR2もしくはLXSHで感染さ せた後、またはリン酸カルシウム沈殿法によってT24 RasまたはV12 Rac-1プラス ミドでトランスフェクトした後に、焦点形成を決定することによって分析した（ Taylorら、1992）。感染またはトランスフェクション後40時間で、細胞を３つの 10cm組織培養プレートに分割し、それらに10〜14日間毎日20mlの新鮮な完全培地 （α-MEM+10％ウシ血清）を提供した。メチレンブルーで染色し、そして焦点を 計数した（Taylorら、1992）。全ての実験のトランスフェクションの頻度を、Es herichia coli由来のβガラクトシダーゼについての哺乳動物発現プラスミドの 、T-24 RasプラスミドまたはV-12 Rac-1プラスミドとの同時感染、続いて、細胞 のX-galでの処理、そして青色細胞の数の計数（Priceら、1987）によって日常的 に決定した。いくつかの場合、T-24 Rasプラスミドトランスフェクトプレートを ゲネチシンで選択し、そして薬物耐性コロニーを、メチレンブルーで染色の約14 日後に計数した。 腫瘍形成能および転移についてのアッセイ：悪性能を本明細書中に上記のように 決定した。 タンパク質R2分析：例えば、抗mycマウスモノクローナル9E10抗体（ATCC，Rockv ille，MD）（Fanら、1996b）または抗R2ウサギポリクローナル抗体（Chanら、19 93）のいずれかを用いる、ウエスタンブロット分析についての手順は以前に記載 されている。細胞周期の間の組換えR2タンパク質発現を決定するために、フロー サイトメトリー分析を、以前に記載のように（Blosmanisら、1987；Chadeeら、1 995）、9E10/フルオレセインイソチオシアネート抗体標識に従って実施した。 膜会合Raf-1タンパク質の決定：膜画分を、Quiら（1995）に記載のように調製し 、そしてタンパク質含有量を標準的なBio-Radアッセイによって決定した後に、R af-1タンパク質に特異的なポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc .,Santa Cruz，CA）を用いるウエスタン分析のために使用した。Raf-1バンドの 密度分析を行い、そして各試料からのRaf-1タンパク質の量を、クマシーブルー で染色した平行ゲル上の良好に分離したバンドの密度分析によって補正した。 リボヌクレオチドレダクターゼアッセイ：アッセイを、本明細書中の上記のよう に行った。いくつかの実験において、酵素アッセイを、精製組換えR1タンパク質 （Salemら、1993）を、9E10抗体沈殿R2タンパク質（Hurtaおよびwright，199 2）と結合させることによって行った。本実施例において、20μｇの9E10抗体お よび50μｌのStaphylococcalプロテインA-アガロース（Sigma Chem．Co.，St．L ouis，MO）を、遠心分離した溶解細胞の上清の１mlに添加し、そして４℃にて２ 時間ロッカー（rocker）においた。StaphylococcalプロテインAアガロース-免疫 複合体を、１mg/mlウシ血清アルブミンを含む１mlの冷リン酸緩衝液で３回洗浄 した。次いで、免疫複合体を、リボヌクレオチドレダクターゼ活性についてアッ セイした（Lewisら、1978；Hurtaおよびwright，1992；Fanら、1996b；Choyら、 1988）。 MAPK活性のアッセイ：＞90％コンフルエントな培養物を、無血清培地中でストレ スをかけ（stress）（Stokoeら、1994；Jelinekら、1994）、そして以前に記載 のように抽出した（Alessiら、1995）。MAPK-2タンパク質を、タンパク質に対す る非中和抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）と結合したアガロースビーズ によって免疫沈降させ、そして免疫複合体のキナーゼ活性を、Upstate Biotechn ology,Inc．（Lake Placid,NY）からのMAPKアッセイキットを用いて、ミエリン 塩基性タンパク質をリン酸化する能力を測定することによってアッセイした。 結果 生物学的に活性なR2タンパク質の発現。リボヌクレオチドレダクターゼの律速R2 成分の調節解除された発現の悪性能を決定するために、R2成分を有するレトロウ イルス発現ベクター（SH/mR2）（Fanら、1996b）で安定に感染させた細胞の特性 を調べた。この発現ベクターの使用は、高い感染効率およびR2タンパク質の安定 な発現を可能にした。ベクター遺伝子産物を内因性R2と区別するために、10アミ ノ酸＋メチオニンをコードするヒトc-Mycエピトープを、R2 cDNAの5'末端に付加 した。図１Aは、Mycエピトープ配列を特異的に認識する9E10抗体を用いるウエス タンブロットが、SH/mR2で安定に感染させたBALB/c3T3細胞およびNIH3T3細胞（ それぞれ、B3/mR2およびN3/mR2と称される）において、約45kDaのR2タンパク質 を検出するが、コントロールベクター（LXSH）で感染させたB3/SHまたはN3/SH細 胞においては検出しないことを示す。R2特異的抗体は、発現ベクター感染細胞に おいて内因性および組換えR2タンパク質を検出し、そして予想されたように、内 因性タンパク質のみが、コントロールベクター感染細胞において観察された （図１B）。 9E10/フルオレセインイソチオシアネート抗体標識後のフローサイトメトリー 分析は、組換えR2タンパク質が細胞周期を通じて構成的に発現されたことを示し た（図１C）。9E10抗体を用いる間接的な顕微鏡分析は、B3/mR2およびN3/mR2の 集団における基本的に全ての細胞が、Myc-タグ化R2タンパク質を発現したことを 示した。 ベクター発現R2が生物学的に活性であることを実証するために、いくつかの実 験を実施した。まず、B3/SHおよびN3/SH細胞（Fanら、1996b）と比較した場合に 、コロニー形成実験においてヒドロキシウレア（R2タンパク質のインヒビター（ Wright，1989；Wrightら、1989））の細胞傷害性効果に対して耐性であることを 、B3/mR2およびN3/mR2細胞について観察した。第２に、リボヌクレオチドレダク ターゼ活性をアッセイし、そして3つの独立した実験において、B3/mR2およびN3/ mR2細胞におけるCDPレダクターゼ活性が、それぞれ、1.96±0.32および1.71±0. 11nmoles/mgタンパク質/時間であることを見出した。これらは、B3/SHおよびN3/ SH細胞で観察されたよりも（それぞれ、0.74±0.14および0.83±0.08nmoles/mg/ 時間）、2.6および2.1倍高かった。最後に、酵素アッセイを、精製組換えR1タン パク質（Salemら、1993）を9E10抗体沈降R2タンパク質と結合させることによっ て行った。有意なレベルの活性（15〜20nmoles/mg/hr）を、B3/mR2およびN3/mR2 細胞をMycタグ化R2についての供給源として用いた場合に検出し、そして予想さ れたように、B3/SHおよびN3/SH細胞を用いた場合には活性は見出されなかった。 異常なR2遺伝子発現によって決定されたRas形質転換能力。上記の結果は、細 胞が生物学的に活性なR2タンパク質の調節において改変され得ることを示す。従 って、改変されたR2発現を試験し、BALB/c 3T3またはNIH 3T3のように細胞をさ らに形質転換し得るかどうか確認した。コントロールB3/SHおよびN3/SH細胞なら びに親非感染株と同様に、B3/mR2およびN3/mR2培養物は、組織培養プレート上で 、平らな非形質転換形態を維持し、そして接触および密度で阻害された増殖を示 した（データは示さず）。形質転換焦点は、レトロウイルスSH/mR2ベクターで感 染させた後のBALB/c 3T3またはNIH 3T3細胞では観察されなかった（図２A、aお よびｂ）。 結果は、R2遺伝子発現の解除は、それ自身がBALB/c3T3またはNIH3T3線維芽細 胞を形質転換するわけではないことを示唆する。解除されたR2発現がガン遺伝子 株H-rasと共同し得るという仮説を試験するために、T24 H-rasを含む発現プラス ミドを、BALB/c 3T3またはNIH 3T3由来の樹立した組換えR2発現細胞集団にトラ ンスフェクトした。N3/SHコントロール細胞と比較した場合に、H-rasトランスフ ェクトN3/mR2細胞で形成された焦点の数における一貫しかつ有意な増加（3.4倍 ）を観察した（図２B、cおよびd、ならびに図２C）。H-rasトランスフェクトB3/ mR2細胞をB3/SH細胞と比較した場合に、約70倍のさらにより顕著な増加を観察し た（図４B、aおよびb、ならびに図２C）。このことは、G418選択コロニーを記録 すること、および／またはH-rasのE.coliガラクトシダーゼについての発現プラ スミドでの同時トランスフェクション後の青色細胞を計数することによって決定 されるように（Priceら、1987）、N3/mR2およびB3/mR2細胞とのトランスフェク ション効率が、実際、N3/SHおよびB3/SH細胞とのトランスフェクション効率より 低い（約50％）場合でさえ、生じた。 異常なR2遺伝子発現によって決定されるRas悪性能力。改変されたR2遺伝子発 現と活性化H-rasとの組み合わせが、rasを改変されたR2発現細胞にトランスフェ クトした腫瘍形成実験において相乗的であったので、この遺伝子の組み合わせを 、以前に特徴づけられている４つの独立したH-ras形質転換10T1/2細胞株、C1、N R4、r-2、およびr-3（Eganら、1987a、1987b；Taylorら、1992；Stokoeら、1994 ）を、レトロウイルスベクタ−SH/mR2で感染させることによってさらに試験した 。安定なインフェクタントをヒグロマイシンで選択し、そしてウエスタンブロッ ト分析および酵素活性アッセイは、これらのインフェクタントが生物学的に活性 なMycタグ化R2タンパク質を発現することを確認した。 軟寒天増殖実験は、組換えR2配列を含むH-ras形質転換細胞が、未感染の親集 団（例えば、r-3）またはコントロールベクター感染細胞（c1、NR4、r-2）より 、半固形増殖寒天においてコロニーを産生するのにより効率的であったことを明 らかにした（表１）。さらに、組換えR2で感染させた細胞によって形成されたコ ロニーの多くは、サイズがより大きかった（図３A）。組換えR2発現細胞集団お よびコントロール細胞集団の各対は、固体表面で増殖させた場合、ほとんど同一 の 増殖速度（C1/SHについては12.9時間およびC1/mR2については12.2時間、r-2/SH については13.5時間およびr-2/mR2については13.9時間、r-3については11.6時間 およびr-3/mR2については11.9時間、NR4/SHについては14.1時間およびNR4/mR2に ついては14.3時間）、プレーティング効率（C1/SHについては58％およびC1/mR2 については55％、r-2/SHについては59％およびr-2/mR2については63％、r-3につ いては91％およびr-3/mR2については88％、NR4/SHについては73％およびNR4/mR2 については75％）、および細胞周期相分布（データは示さず）を有するので、軟 寒天および焦点形成実験において観察された改変は、解除されたR2発現と活性化 H-rasとの組み合わせが、インビボでより大きな悪性能力を導き得ることを示唆 する。 従って、C1/mR2およびC1/SH細胞の腫瘍形成能および転移能力を、同系C3H/HeN マウスにおいて比較した。悪性能力における顕著な差異が観察された。C1/mR2細 胞は、C1/SH細胞と比較した場合に、より短い腫瘍潜在性およびより大きな腫瘍 増殖を示した（図３B）。さらに、転移アッセイは、C1/mR2細胞がC1/SH細胞より 悪性であり、そして有意により多くの肺腫瘍を産生したことを明らかに示した（ 図３C）。 R2遺伝子発現およびガン遺伝子協同性。上記の結果は、改変したR2発現が、イ ンビトロでの形質転換アッセイおよびインビボでの悪性アッセイにおいて、活性 化H-rasと協同し得ることを示す。例えば、細胞周期調節における変化につれて 、この協同を説明し得る、増殖速度における明らかな差異または細胞周期相分布 が見出されなかったので、以下の考えを試験した。解除されたR2発現は、Rasシ グナル経路の活性を上昇させることによってRasと相乗するか？このことは、ras 発現と悪性能力との間の直接的な相関関係を示す研究と一致している（Eganら、 1987a、1987b；Wrightら、1993；Bradleyら、1986）。遺伝子発現を調節するた めの主要なRas経路は、Raf-1タンパク質キナーゼを包含する。活性化Rasは、血 漿膜にRafを補充し、そこでRafおよび下流のシグナリング分子様MAPKが活性化さ れるようになる（Stokoeら、1994；Jelinekら、1994；Leeversら、1994）。 Raf-1特異的抗体を用いて、解除されたR2発現を含む6つのBALB/c3T3、NIH3T3 、および10T1/2由来細胞株における膜会合Raf-1のレベルを、内因性R2タンパク 質 のみを含むコントロール細胞と比較した（図４A）。6つの場合すべてにおいて、 解除されたR2を含む細胞株は、増加した膜会合Raf-1を示し、これは約30％の平 均増加を伴い、非常に有意であった（p<0.001）。上記の観察に一致して、解除 されたR2発現を有する細胞株は、MAPK-2活性において、約70％（p<0.001）の一 致しかつ有意な増加を示した（図４B）。ガン遺伝子Rasはまた、Raf経路と平行 するRac経路を活性化し、それゆえ構成的に活性なRac-1は、悪性形質転換におい て、膜標的化Raf-1と協同する（Qiuら、1995）。 Raf-1転座および活性化によって媒介されるMAPKが、本実施例で本明細書中上 記に記載のようにR2/ras相乗作用において重要である場合、異常なR2発現は、細 胞形質転換において、活性化Rac−１と協同するはずである。なぜなら、活性化R af-1およびRac-1は形質転換の機構において協同することが以前に示されている からである（Qiuら、1995）。図４Cは、この予想が正しいことを示す。なぜなら 、活性化Rac-1とR2との間の形質転換におけるポジティブな協同性が、活性化V12 Rac-1でトランスフェクトされたN3/mR2およびN3/SH細胞との焦点形成によって測 定されるように（Qiuら、1995）、RasおよびR2と類似の様式で観察されたからで ある。これらの観察は、解除されたR2遺伝子発現が、Raf転座およびMAPK経路活 性をアップレギュレートすることによって、rasおよびracのようなガン遺伝子と 協同するという見解と一致するが、活性化Rafに関与する他の形質導入経路もま た関与するという可能性を除外する。なぜなら、Rafは、MAPK依存性経路（単数 または複数）を介して、いくつかの細胞活性を調節し得るという証拠が存在する からである（Lenormandら、1996；Koongら、1994；Agarwalら、1995）。 本実施例は、哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼのR2成分が、悪性能力を 改変するために活性化ガン遺伝子と相乗作用し得る新規な悪性決定因子であるこ とを最初に示す。本実施例の前に細胞においてR2に割り当てられた役割が、リボ ヌクレオチドレダクターゼの速度制限成分としてのみであることに留意すること が重要である。本実施例は、R2がまた、他の重要な細胞機能に関与し得、そして ガン遺伝子協同性を介して悪性能力の決定において直接的な役割を果たし得るこ とを実証する。実施例２ R2遺伝子発現ならびに薬物感受性およびゲノム安定性における変化 材料および方法 細胞株および培養条件：ヒドロキシウレア耐性マウス細胞株、H-2、H-4、LHF、 およびSC2は、マウスL細胞由来であり、Choyら（1988）およびMcClartyら（1986 ）に特徴づけられている。BALB/c 3T3細胞を、R2レトロウイルス発現ベクター（ B3/mR2およびB3/R2c2細胞株）またはR2配列を欠失した同じレトロウイルスベク ター（B3/SH細胞）のレシピエントとして使用した（Fanら、1996a；1996b）。NI H-3T3細胞もまた、以前に記載されたように（Fanら、1996a；1996b）、R2レトロ ウイルス発現ベクター（N/R2-4細胞株）またはR2配列を欠失したこのレトロウイ ルスベクター（N/SH細胞）のレシピエントとして使用した。N/R2+ASR2細胞株は 、アンチセンス方向におけるR2コード配列およびR2配列を含むレトロウイルスベ クターのLipofectAmine（Life Technologies，N.Y.）を用いる、同時トランスフ ェクションを介する受容体であった（Damenら、1991）。RP3およびRP6細胞は、T -24 H-rasガン遺伝子およびp53遺伝子の変異ガン遺伝子形態でトランスフェクト されている10T1/2マウス細胞であり（Taylorら、1992）、そしてそれらもまた、 LipofectAmine試薬を用いるトランスフェクションを介する、アンチセンス方向 におけるR2コード領域を含むレトロウイルスベクターのレシピエントとして使用 し（Fanら、1996b）、RP3/ASR2およびRP6/ASR2細胞を得た。1B細胞はp53^-/-であ り、そして胚線維芽細胞に由来した（Loweら、1994）。全ての細胞を、10％ウシ 胎児血清（Intergen，Purchase，NY）および抗生物質（100unit/mlペニシリンお よび100μg/mlストレプトマイシン）を含むα最小必須培地（Gibco，Grand Isla nd，NY）中で、37℃にて５％CO₂を含む湿潤雰囲気下で培養した。 薬物選択：500〜1-2×10⁵の数の範囲の細胞を、10％透析ウシ胎児血清を含む増 殖培地中、および薬物の非存在下または存在下で、100mm組織培養プレートに添 加した（Huangら、1995a；Choyら、1988）。培養培地を、２〜３週間の間毎週、 新鮮な培地と置換した。生存細胞をメチレンブルー染色によって可視化し、そし て約50細胞以上のコロニーを記録した（Huangら、1995a）。相対的コロニー形成 効率を、薬物の存在下におけるコロニー産生能力を薬物の非存在下での能力で割 ったものとして定義した。 遺伝子増幅についてのアッセイ：ゲノムDNAを、フェノールークロロホルム抽出 法（BlinおよびStafford，1976）によって、対数増殖細胞から抽出し、そして潜 在的な遺伝子増幅事象を、記載されるサザンブロット分析（Huangら、1995a；Ch oyら、1988）によって、以下に記載のプローブとしてcDNAフラグメントを用いて 決定した。CAD cDNA（これは、CADタンパク質複合体をコードする（Shigesadaら 、1985））を含むpCAD142プラスミドを使用して、プローブとして6.3KbのHindII Iフラグメントを得た。マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含むpLTRDHFR2 6プラスミド（Changら、1978）は、プローブとして1.3Kb BamH1フラグメントを 提供した。リボヌクレオチドレダクターゼR2についての1487bpのSalI/PstIプロ ーブを、cDNAクローン10から調製した（Huangら、1995a；Choyら、1988）。 電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ（EMSA）：EMSAを使用して、野生型p53の存 在を決定した。アッセイを、以下の改変とともに、記載されたように（Priceお よびCalderwood，1993）実質的に行った。150mmプレート上の細胞を、氷冷リン 酸緩衝化生理食塩水（PBS）で一回洗浄し、そして1mlのPBSにこすり落とした。 細胞を、1300gで４℃にて10分間遠心分離することによってペレット化し、そし て-80℃にて保存した。核を、氷上で20分間300μｌの緩衝液A（20mM HEPES（pH7 .6）、20％グリセロール、10mM NaCl、1.5mM MgCl₂、0.2mM EDTA、および0.1％T ritonX-100）中にペレットを溶解させることによって調製した。緩衝液Aはまた 、１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）および10mMジチオスレイト ール（DTT）を含んだ。核を、1300gで４℃にて10分間遠心分離することによって 単離した。核溶解物を、500mM NaCl、1mM PMSF、および10mM DTTを含む20〜40μ ｌの緩衝液Aを、核ペレットに添加し、そして氷上で20分間インキュベートする ことによって調製した。抽出した核を、16,000gで４℃にて遠心分離することに よってペレット化した；上清を除去し、そしてアリコートを、Bioradタンパク質 アッセイ手順（Biorad）を用いるタンパク質決定に使用した。 核溶解物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer）を用いて[γ-³²P]-A TPで末端標識した過剰の二本鎖p53コンセンサス結合配列（GGACATGCCCGGGCATGTC C）（配列番号162）とともにインキュベートした。DNA結合を、20mM HEPES（pH7 . 6）、20％グリセロール、1.5mM MgCl₂、0.2mM EDTA、１mM PMSF、および10mM DT Tを含む緩衝液中で行った。各結合反応物は、全容量20μｌ中に、５μｇの細胞 溶解物、10μｇの二本鎖ポリ（dI-dC）（Pharmacia）、1.4ngの標識化コンセン サスプローブ、および100ngのモノクローナル抗体421（Santa Cruz）を含んだ。 DNA結合を室温にて30分間進行させ、そして混合物を５%非変性ポリアクリルアミ ドゲル上の電気泳動によって分離した。電気泳動は、室温にて、キシレンシアノ ール追跡用色素がゲルの下部まで進み、そして遊離プローブがゲルから遊離する まで行った。 統計分析：共分散分析を使用して異なる細胞株の群の間の用量応答データを比較 し、有意性レベルはα=0.05と設定した（Huangら、1995a）。 結果 非選択性薬物に対する感受性を減少したヒドロキシウレア耐性細胞株。H-2、H -4、LHF、およびSC2は、抗腫瘍剤ヒドロキシウレアの細胞毒性効果に対する耐性 について選択されたマウスL細胞株である。これらの４つの細胞株は、コロニー 形成効率実験においてヒドロキシウレアに対する耐性を示した。その範囲は、そ れらが由来する野生型マウスL細胞株より約18（H-2）〜30（SC2）倍高かった（C hoyら、1998；McClartyら、1988）。それらはまた、2.2倍（H-2）〜17倍（LHFお よびSC2）の範囲の上昇したレベルのリボヌクレオチドレダクターゼ活性を含ん だ。これは主に、増殖するマウス細胞における酵素活性および細胞分裂について 制限的であるリボヌクレオチドレダクターゼのR2成分の増加に起因する。表２は 、４つのヒドロキシウレア耐性細胞株はまた、コロニー形成実験において、親の 野生型マウスL細胞と比較した場合、N-（ホスホンアセチル）-L-アスパルテート （PALA）およびメトトレキセート（MTX）の細胞毒性効果に対してより感受性で なかったことを示す。薬物感受性におけるこれらの差異は、非常に有意であり、 親の野生型マウスL細胞と比較した場合、各細胞株について＜0.0001のp値を有す る。 薬物耐性に応答可能な多くの機構が記載されているが（Wright，1989；Kohn， 1996）、MTXおよびPALAに対する耐性は、それぞれ、薬物標的化遺伝子産物であ るジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）またはCAD（カルバミルホスフェートシン セターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオラターゼ を含む多官能ポリペプチド）のレベルの増加によって頻繁に達成され、そしてこ のことは、しばしば、遺伝子増幅の機構を介して生じる（Huangら、1995a；Livi ngstonら、1992；Yinら、1992；Mai，1994；Stark，1993）。実際は、主にそし ておそらく、マウス細胞におけるPALA耐性についての機構のみが、CAD遺伝子増 幅を介して生じる（Stark，1993）。従って、これらの２つの薬物の正常な細胞 毒性濃度の存在下で発達するコロニーを、可能な遺伝子増幅事象について試験し た。図５は、PALAまたはMTXの存在下で増殖した細胞が、増加したCADまたはDHFR 遺伝子コピー数を示したことを示す。以前の研究（Stark，1993；Huangら、1995 b；Ottoら、1989；Starkら、1990）と一致して、PALAにおいて発達しそして試験 した全てのコロニー（10/10）は、CAD遺伝子増幅を示した。また、以前に報告さ れたように（Huangら、1995b）、MTXの存在下で発達した全てではないがいくつ かのコロニー(3/6)は、DHFR遺伝子増幅を示した。 R2遺伝子発現と減少した薬物感受性との間の関係についての直接試験。ヒドロ キシウレア耐性マウス細胞は、リボヌクレオチドレダクターゼにおける変化に加 えて他の生化学的な変化を含むので（Wrightら、1989）、薬物感受性と増加した R2レベルとの間の関係を、マウスR2配列をコードするレトロウイルス発現ベクタ ーを含む細胞、および同じレトロウイルスベクターを含むがR2配列を欠失する細 胞で直接試験した。B3/mR2は、R2をコードするレトロウイルス発現ベクターの存 在に起因して上昇したR2タンパク質を含むBALB/c 3T3細胞の集団であり、そして B3/SHは、野生型レベルのR2タンパク質を有しそしてコントロールとしての空ベ クターを含む細胞集団である。B3/R2c2は、B3/mR2集団から選択された上昇したR 2タンパク質を有するクローン化株である。 R2遺伝子発現における上昇がヒドロキシウレアに対する耐性を導くことを示す 以前の報告と一致して、表３は、B3/SH細胞と比較した場合、B3/mR2およびB3/R2 c2細胞が、幅広い濃度でヒドロキシウレアの細胞毒性効果に対してより有意に耐 性であることを示す。これらの結果は、B3/mR2およびB3/R2c2細胞が、増加した レベルのリボヌクレオチドレダクターゼの活性なR2成分を発現することをさらに 実証する。B3/mR2およびB3/R2c2細胞はまた、PALAおよびMTX（これらは、リボヌ クレオチドレダクターゼとは異なる部位で作用する）の細胞毒性効果に対して有 意により感受性ではなかった（表３）。これらの２つの薬物に対する耐性は、10 0nM MTXで約10倍から、試験したPALAのほとんどの濃度で100倍を超えるまでの範 囲であった。 さらに、サザンブロット分析は、PALAまたはMTXの存在下で発達したコロニー は、CADまたはDHFR遺伝子の増幅を含むことを示した（図６）。ところが、マウ スL細胞で観察されたように（図５）、そして他の研究で報告されているように （Hurtaおよびwright，1992；Hurtaら、1991）、MTX含有培地で発達した全ての コロニーがDHFR遺伝子増幅を示したわけではなかった。PALA耐性とは異なり、マ ウス細胞におけるMTX耐性は、種々の機構を介して生じ得る（Ottoら、1989；Sta rkら、1990；Flintoff，1989）。 上昇したレベルのリボヌクレオチドレダクターゼR2成分を含む細胞によって示 された化学治療化合物に対する感受性の変化を、R2発現レトロウイルスベクター を含むNIH-3T3細胞を用いてさらに試験した（表４）。これらの細胞(N/R2-4)は 、R2コード配列を欠失するレトロウイルスベクターを含む細胞（N/SH）と比較し た場合、ヒドロキシウレアに対して耐性であった。N/R2-4細胞もまた、MTXに対 してより有意に耐性であった。N/R2-4細胞は、N/SH細胞と比較した場合、PALAに 対して耐性になる傾向を示したが、この傾向は、統計学的に有意ではなかった。 この後者の観察は、他の要因が、本研究において使用された細胞株の間の遺伝的 差異に固有であり、増加したR2レベルに加えて、薬物感受性応答に影響し得るこ とを示す。 従って、R2レベルが薬物感受性特徴を決定するのに重要であるという仮定を、 N/R2+ASR2集団を産生するN/R2-4細胞に導入されたR2アンチセンス構築物の発現 を介して、R2のレベルの減少後の薬物感受性を調査することによって試験した。 図７は、R2タンパク質のレベルが、N/R2-4細胞と比較した場合、N/R2+ASR2細胞 において顕著に減少することを示す。N/R2+ASR2細胞は、N/R2-4細胞と比較した 場合、ヒドロキシウレア、PALA、およびMTXに対して有意により感受性であった （表４）。さらに、R2アンチセンス発現細胞におけるこれらの３つの薬物に対す る感受性は、空ベクターを含むコントロールN/SH細胞と比較した場合、有意に増 加した（表４）。 活性化rasおよびp53の変異ガン遺伝子形態でトランスフェクトしたマウス10T1 /2細胞は、化学治療剤に対して非常に耐性である（Huangら、1995b）。R2アンチ センス発現が、NIH-3T3細胞のヒドロキシウレア、PALA、および、MTXに対する感 受性を増加させ得るという観察は、本発明者らを、rasおよび変異したp53を含む 細胞もまたR2アンチセンス配列の存在下で減少した薬物耐性特徴を示し得るとい う可能性を試験することに導く。表５は、このことが正しいことを示す。R2アン チセンス配列を含む細胞は、同じベクターを含むがアンチセンス方向のR2を含ま ない細胞と比較した場合、ヒドロキシウレア、PALA、およびMTXに対して有意に より感受性である。これらの観察は、これらの高度に形質転換されかつ悪性の細 胞の薬物感受性に関連する少なくとも１つの決定因子が、リボヌクレオチドレダ クターゼR2レベルであることを示唆する。 p53タンパク質機能の欠失がR2媒介薬物耐性および遺伝子増幅を必要としない ことの証拠。p53の不活化または欠失は、腫瘍の発達、および悪性細胞において 観察される遺伝的安定性（これは、自発的な遺伝子増幅を起こす能力を含む）の 付随的な減少と関連した一般的な事象である（Liningstonら、1992；Yinら、199 2；Takenakaら、1995）。従って、本発明者らは、R2過剰生産B3/mR2およびB3/R2 c2細胞によって示される薬物耐性特性の増大が、野生型p53活性の欠失を生じる 機構を介して生じ得る可能性を試験した。p53が転写因子であり、そして野生型p 53によるがp53の変異バージョンにはよらないトランス活性化が配列特異的であ り、そしてそのコンセンサスDNA配列への結合と相関することが実証されている （Takenakaら、1995；Kernら、1992；Funkら、1992）。PALA、MTX、またはヒド ロキシウレアの存在下で発達する薬物耐性コロニーにおける野生型p53機能の存 在または非存在を決定するために、細胞抽出物を、電気泳動ゲル移動度シフトア ッセイ（EMSA）（PriceおよびCalderwood，1993）に使用し、配列特異的p53結合 活性について試験した。図８は、R2過剰発現細胞由来の薬物耐性コロニーが、野 生型p53結合活性を示したことを示す。これらの観察はまた、本発明者らが、Pab 240モノクローナル抗体（これは変異p53の一般的な形態を特異的に検出する）を 用いる免疫沈降アッセイ（Gannonら、1990）で、薬物耐性コロニーからの細胞 において変異p53タンパク質を検出できなかったことと一致した。 実施例３ リボヌクレオチドレダクターゼを標的化し、かつヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性 であるアンチセンスデオキシリボヌクレオチド配列 本明細書中の上記の実施例に示されるように、R2の完全長アンチセンス構築物 は、腫瘍細胞の腫瘍形成能および／または転移応答能ならびに化学治療剤に対す る感受性に影響する。従って、出願人は、R1およびR2のより短いアンチセンス構 築物のそれらの腫瘍細胞における効果についての能力を調査した。 材料および方法 コロニー形成効率および細胞のアンチセンス構築物での処置：コロニー形成効率 を、以前の報告のように決定した（HuangおよびWright，1994）。細胞を10％ウ シ胎児血清を有する増殖培地中で、37℃にて24時間培養した。細胞を、リポフェ クチン＋／−オリゴヌクレオチド処置の前に、５mlのリン酸緩衝化生理食塩水（ pH7.2）で一回洗浄した。 試験するオリゴヌクレオチドを、2.5μｇのDOTMA/DOPE（Lipofection；Life T echnologies，Inc.）の存在下で４時間、細胞培養物に添加した。オリゴヌクレ オチドを、他に示さない限り、0.2μＭで試験した。コントロールは、リポフェ クチンで処置されているがオリゴヌクレオチドを含まない培養物である。４時間 後、オリゴヌクレオチドを含む培地を取り出し、５mlの増殖培地で洗浄した。次 いで、細胞を、10％ウシ胎児血清を含む増殖培地中で、７〜10日間培養した。生 存細胞を、メチレンブルー染色によって可視化し、そしてコロニーを記録した。 いくつかの実験において、細胞アリコートを培養物から取り出し、そして生存度 を、トリパンブルー排除試験（Phillips，1973）を用いて決定した。結果を、コ ントロール細胞と比較した生存細胞のパーセントとして分析した。 結果 リボヌクレオチドレダクターゼを標的化するアンチセンス分子を同定した。以 下に示すように、それらは、種々のヒト腫瘍細胞について細胞毒性であった。薬 物耐性腫瘍細胞についての薬物-細胞毒性を促進する配列が見出された。すなわ ち、非常に低い非細胞毒性濃度で、リボヌクレオチドレダクターゼを標的化する アンチセンス配列は、腫瘍細胞を、医療的に重要な化学治療化合物の細胞毒性活 性に対して感作し得る。 最初の研究において、R2 mRNAに対して指向される20マーの２つのアンチセン ス配列（AS-II-336-20およびAS-II-2229B-20と称する）を作製し、そして調査し た。初めに、AS-II-336-20は、配列5'-TCC TGG AAG ATC CTC CTC GC-3'（配列番 号１）を有し、そしてヌクレオチド336-355（R2ヌクレオチドのナンバリングに 基づく）でヒトリボヌクレオチドレダクターゼのR2メッセージを標的化する（Pa vloffら、1992）。AS-II-2229B-20配列は、5'-TCC CAC ATA TGA GAA AAC TC-3' （配列番号２）であり、そしてヌクレオチド2229-2248でR2メッセージを標的化 する。AS-II-336-20およびAS-II-2229B-20の両方を、ホスホロチオエート配列と して構築し、ヌクレアーゼ活性に対して保護した（Anazodoら、1995）。 アンチセンス構築物AS-II-336-20を、本明細書中上記に記載のように、相対コ ロニー形成効率実験において、ヒト腫瘍細胞（Hela）の増殖を阻害する能力につ いて試験した。Hela S3細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockv ille，Marylamd，ATCC）、および抗腫瘍薬剤、ヒドロキシウレアに対する耐性に ついて以前に選択されたHela細胞株（Hela１mM）（Wrightら、1987）を試験した （表６）。２つの実験を、Hela S3細胞で着手した。0.2μＭアンチセンス構築物 AS-II-336-20の４時間の処置で、それぞれ、92％および82％の阻害が、２つの実 験においてコロニー形成効率として見い出された。同じ実験を、Hela１mM細胞株 および類似の結果（0.2μＭはコロニー形成を阻害するのに有効な濃度であった ）を伴う種々の濃度のアンチセンス構築物AS-II-336-20で繰り返した（表６）。 これらのデータは、AS-II-336-20は、ヒト腫瘍細胞コロニー形成能力の非常に 効果的なインヒビターであり、そしてヒト腫瘍細胞コロニー形成能力の増殖の阻 害および他の化学治療化合物に対して耐性を示すヒト腫瘍細胞の増殖の阻害の両 方において効果的であることを示す。同様に、表６に示すように、アンチセンス 構築物AS-II-336-20は、マウス腫瘍細胞株SC2（これは、高度なヒドロキシウレ ア耐性マウスL細胞株である）で実施された実験において、効果的な抗腫瘍化合 物である（McClartyら、1988）。 アンチセンス配列AS-II-2229B-20もまた、相対コロニー形成効率実験において ヒトHela腫瘍細胞の増殖を阻害する能力について試験し、これは、表６に示され るようにAS-II-336-20と類似の結果を有した。これらのデータは、AS-II-2229B- 20が、Hela S3細胞および薬物耐性Hela １mM細胞株で試験した場合、強力な抗腫 瘍薬剤であることを示す。アンチセンス構築物AS-II-2229B-20もまた、ヒト乳ガ ン細胞株MDA435の増殖を阻害する能力について試験し、そして非常に効果的であ ることを見出した（表８）。 AS-II-2229B-20と称されるリボヌクレオチドレダクターゼR2アンチセンス構築 物を、ヒド腫瘍および非腫瘍細胞集団で得られた結果を比較することによって、 腫瘍細胞細胞毒性について試験した。Hela S3腫瘍細胞およびWI38正常非腫瘍形 成ヒト細胞を使用した。腫瘍細胞は、AS-II-2229B-20の細胞毒性効果に対して、 正常非腫瘍形成細胞より感受性であることが見出された。例えば、アンチセンス 曝露3日後の細胞の分析は、腫瘍細胞が、AS-II-2229B-20の細胞毒性効果に対し て、４〜８の決定を通して平均した正常非腫瘍形成細胞より、約５倍感受性であ ったことを示した。 これらの結果は、アンチセンス方向の短いオリゴデオキシリボヌクレオチド配 列が優れた抗腫瘍薬剤であることを示し、そしてR2メッセージを標的化する他の アンチセンス構築物が同様の特性を有し得ることを示唆する。最良の抗腫瘍薬剤 は、それらの相補的なテンプレートとのオリゴヌクレオチド二重鎖形成のために 重要である適切なエネルギー関連特徴を示すものであり、そして自己二量体化ま たは自己相補体化について低い能力を示すものである（Anazodoら、1996）。コ ンピュータープログラム（OLIGO，Primer Analysis Software，Version 3.4）を 用いるR2 ｍRNAの分析を行い、アンチセンス配列溶解温度、遊離エネルギー特性 を決定し、R2メッセージを標的化するように設計された一連のさらなるアンチセ ンス配列（表７、配列番号３〜102）の潜在的な自己二量体形成および自己相補 体化特性を推定した（Anazodoら、1996）。表７は、適切な特性を有する、さら なるR2アンチセンスインヒビターの一覧を示す。 これらの配列（例えば、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド）の多 くのアンチセンス効果を試験するために、これらを一連のヒト腫瘍細胞株で実施 した相対コロニー形成実験において試験した。これらのアンチセンス構築物の多 くは、予想したように、ヒト腫瘍細胞増殖の強力なインヒビターである。膀胱、 乳房、肺、大腸、前立腺、肝臓、および頚部由来のガン細胞で得られた結果につ いては、表12を参照のこと。さらに、AS-II-626-20とのインビボでの研究を、表 13に報告されるように、C3H/HeNマウスにおいて着手し、そしてこれは、アンチ センス処置マウスにおいて転移の有意な減少を示す。 実施例２に基づいて、ヒト腫瘍細胞の非常に低濃度の短いアンチセンス配列で の処置を試験し、これらの構築物が腫瘍細胞を他の化学治療薬物の阻害効果に対 して感作し得るかどうか決定した。用いた濃度は、表６に示されるようにそれ自 身において細胞毒性ではなかった。Hela S3およびHela １mM細胞の、0.02μＭの AS-II-2229B-20アンチセンス構築物での処置は、表９に示されるように、これら の細胞のN-（ホスホンアセチル）-L-アスパルテート（PALA）およびメトトレキ セート（MTX）に対する感受性を増大させた。これらの観察は、R2メッセージを 標的化するアンチセンス化合物が、周知の化学治療薬剤で相乗的に作用し得るこ とを示す。 リボヌクレオチドレダクターゼは、２つの別の遺伝子R1およびR2によってコー ドされる２つの異なるタンパク質成分から構成される。従って、本明細書中上記 に示される結果は、R1メッセージもまた、強力な抗腫瘍活性を有する短いアンチ センス分子を設計するための適切な標的であり得ることを示唆する。この可能性 を試験するために、アンチセンス方向の20マーのデオキシリボヌクレオチドホス ホロチオエート配列（AS-I-1395-20と称される）を構築し、そしてその抗腫瘍能 力を試験した。アンチセンス構築物AS-I-1395-20は、配列5'-ACA GGA ATC TTT G TA GAG CA-3'（配列番号103）を有し、そしてヌクレオチド1395-1414でR1メッセ ージを標的する。表10に示されるように、それは、Hela S3細胞およびHela １mM 薬物耐性細胞を用いる腫瘍細胞増殖の効果的なインヒビターである。これらの結 果は、R1メッセージを標的化するアンチセンス配列の設計に有用であることを示 し、そして他の潜在的な部位もまた効果的であり得ることを示唆する。従って、 R1 mRNAを、適切な特徴を示すアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド配 列の探索において分析した（R2 mRNAについて行ったようにそして上記のよう に）。表11は、抗腫瘍薬剤と一致する特徴を有するさらなるアンチセンス配列の 一覧を提供する。 実施例４ R2アンチセンスによる形質転換の阻害 実施例１〜３に示される方法を利用して、R2コード領域のR2アンチセンス配列 での処置（Fanら、1996b）による哺乳動物細胞の形質転換の阻害を着手した。H- rasガン遺伝子を含むNIH-3T3マウス細胞を、R2コード配列のアンチセンス方向ま たはR2コード配列のセンス方向のいずれかでトランスフェクトした。図９に示さ れる結果は、R2アンチセンス構築物の存在下において、コントロール細胞（図９ 、レーンa）と比較して、形質転換焦点および還元軟寒天増殖（図９、レーンb） における減少が存在したことを実証する。実施例１に示されるように（本明細書 中上記）、R2コード領域はH-rasと協同し得、増加した数の形質転換焦点によっ て示されるように悪性を増強する（図９、レーンc）。 さらに、本明細書中に記載の軟寒天において実施したコロニー効率アッセイは 類似の結果を実証した。H-rasガン遺伝子を含むNIH-3T3マウス細胞については15 .6±6.73、H-rasガン遺伝子およびR2アンチセンス配列を含むNIH-3T3マウス細胞 については4.4±2.62、ならびにH-rasガン遺伝子およびR2のコード領域配列を含 むNIH-3T3マウス細胞については51±12.29のコロニー形成効率が見られた。 実施例５L60 マウス腫瘍細胞におけるリボヌクレオチドレダクターゼR2タンパク質レベル のAS-II-626-20阻害のウエスタンブロット分析。 細胞を、リポフェクチンを補充 したがアンチセンスオリゴヌクレオチドを含まない増殖培地（a）または0.2μＭ AS-II-626-20を含むリポフェクチン培地（b）で、4時間処置した。添加したコン トロールのように、腫瘍細胞もまた、リポフェクチンおよび0.2μＭオリゴヌク レオチド混合コントロール（これは、AS-II-626-20に見出される同じ割合である が異なるオーダーのヌクレオチドを含む（ACGCACTCAGCTAGTGACAC、配列番号164 ））（c）または0.2μＭのミスマッチオリゴヌクレオチド（これは、AS-II-626- 20と比較した場合4つのヌクレオチドミスマッチ変異（TCGCからCTGCに変化）を 含む）（d）を補充した増殖培地で、4時間処置した。コントロール（a、c、およ びd）と比較した場合の、AS-II-626-20(b)で処置した腫瘍細胞におけるR2タンパ ク質の有意な減少に注意のこと。 ウエスタンブロット分析によって決定したような、種々のR2アンチセンスオリ ゴヌクレオチドでの処置後のマウスL60腫瘍細胞におけるR2タンパク質レベルの 減少。 細胞を、リポフェクチンの存在下で0.2μＭオリゴヌクレオチド（b〜f） 、またはコントロールとしてオリゴヌクレオチドを含まないリポフェクチン（a ）で、4時間処置した。（b）AS-II-667-20として処置した細胞；（c）AS-II-816 -20で処置した細胞；（d）AS-II-1288-20で処置した細胞；（e）AS-II-1335-20 で処置した細胞、および（f）AS-II-1338-20で処置した細胞。ヒト腫瘍細胞増殖 を阻害する能力と一致している、R2 ｍRNAを標的化するアンチセンスオリゴヌク レオチドで処置した細胞におけるR2タンパク質レベルの減少に注意のこと（表12 ）。 本出願を通して、種々の刊行物（米国特許および公開特許出願を含む）を、著 者および年または番号によって参照する。刊行物についての完全な引用を以下に 記載する。それらの全体におけるこれらの刊行物および特許の開示を、本発明に 付随する当該技術水準をより十分に記載するために、本明細書中で参考として援 用する。 本発明は、例示様式において記載されており、そして使用されている専門用語 は、限定ではなくむしろ説明の単語の性質であることが理解されるべきである。 明らかに、本発明の多くの改変および変型が、上記の教示に照らして可能であ る。従って、添付の請求項の範囲内において、本発明が特定に記載されるよりも 種々に実施され得ることが理解される。 ^a示されるコロニーの数は、3つの独立した実験において得られた結果であり、3 連の皿での1回の実験から得られたr-2/SHおよびr-2/mR2細胞について得られたも のを除く。ND、検出せず。相対コロニー形成効率は、±seで示される。そして示される値は、４〜８決定で ある。統計学的に有意な差異は、H2（p=0.0004）、H4（p≦=0.0001）、LHF（p≦ 0.0001）、およびSC2（p≦0.0001で得られたデータを、親野生型（W.T.）細胞株 で得られたデータと各々比較した場合観察された。相対コロニー形成効率は、±SEで示され、そして示される値は、４〜12決定であ る。統計学的に有意な差異は、B3/mR2またはB3/R2c2で得られたデータを、B3/SH で得られたデータと比較した場合観察された（すべてのp値は、ヒドロキシウレ ア、PALA、またはMTXの存在下で得られたデータについて、≦0.0001であった） 。相対コロニー形成効率は、±SEで示される。そして示される値は、４〜６決定で ある。０が示される場合、１試験あたり１×10⁵細胞を用いる決定の数は、４と して示される（n=４）。PALAの存在下でN/SHで得られたデータを、ヒドロキシウ レアの存在下（両方の場合においてp=0.0001）またはMTXの存在下（それぞれp=0 .0002および0.032）でN/R2-4またはN/R2+ASR2で得られたデータと比較した場合 、統計学的に有意な差異が観察された。統計学的に有意な差異もまた、PALAの存 在下でN/SHで得られたデータを、N/R2+ASR2で得られるが、N/R2-4では得られな いデータと比較した場合に観察された。相対コロニー形成効率は、±SEで示される。そして示される値は、４〜10決定で ある。統計学的に有意な差異は、RP6/SHで得られたデータを、RP6/ASR2で得られ たデータと比較した場合に観察された（ヒドロキシウレア、PALA、およびMTXの 存在下で、それぞれ、p=0.0001、p=0.0001、およびp=0.0001）。統計学的に有意 な差異もまた、RP3/SHで得られたデータを、RP3/ASR2で得られたデータと比較し た場合に観察された（ヒドロキシウレア、PALA、およびMTXの存在下で、それぞ れ、p=0.04、p=0.0001、およびp=0.004）。 表７の脚注 名前は以下を含む。 AS=アンチセンス； II=R2 1番目の数は、R2 mRNA配列における1番目のヌクレオチド位置を示す。 2番目の数は、配列セグメントの長さを示す。 表において示される配列AS-II-2229Aおよびテキストに記載される配列AS-II-222 9Bは、GENBANK（Pavloffによって提示された）におけるR2のバージョンから選択 された2229AおよびPavloffら、J．DNA Sequencing and Mapping,2：227-234，19 9 2によって刊行されたバージョンから選択された2229Bを有する、別の配列である 。配列は、親チオエート化が示されない限りは、完全にチオエート化された。¹ TM℃＝形成されたオリゴヌクレオチド二重鎖の溶解温度。² dG＝オリゴヌクレオチド相補的ダイマー形成についての遊離エネルギー値。 上記の分析に加えて、潜在的なダイマーお形成（D）、潜在的な自己相補性相互 作用（H）、標的配列とは異なるR2メッセージにおける配列に結合する能力（B） が得られた。上記の分析および評価は、コンピューターモデリングプログラムOL IGO Primer Analysis Software、Version 3.4（National Biosciencesによって 配給される）を用いることによって得られた。プログラムは、Tm℃およびdG値の 決定を可能にし、そしてまた「可能性なし」、「いくらかの可能性」、または実 質的に「完全な可能性」を示すD、H、およびBパラメーターの定量的評価を提供 する。オリゴヌクレオチド配列の選択において、本発明者らは、高いTm℃および dG値を示す配列（これらは、アンチセンス分子のそれらの相補鎖への強固な結合 にとって重要である）に高い優先性を与え、そしてD、H、およびBにおいて可能 性なしの推定を有するアンチセンス配列に高い優先性を与えた。3つのカテゴリ ー（D、H、B）のもっとも重要なものは、DおよびHである。なぜなら、B（すなわ ち、正確な標的配列に加えて、R2 mRNAの他の領域に結合する）は、オリゴヌク レオチド活性を損なわずに増強するからである。表７に示されるほとんどの配列 は、DおよびHカテゴリーにおける可能性を有さなかった。いくつかの配列は、D またはHにおいて「いくらかの可能性」を示し、そして腫瘍細胞増殖阻害研究に おいて効果的であることが後に見出され（表12）、従って表７にもまた含まれた 。本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドインヒビターを選択するこの アプローチは、非常に効果的であることを見出した。なぜなら、非常に大多数の 選択された配列は、表12に示されるような、坑腫瘍特性を示したからである。 ^aPALA＝N-（ホスホンアセチル）-L-アスパルテート^a MTX＝メトトレキセート^b −＝処置せず^b ＋＝処置が施された^c 値は2つの実験値の平均である。 表11の脚注 名前は以下を含む： AS=アンチセンス； I＝R1 １番目の数は、R1mRNA配列における１番目のヌクレオチド位置を示す。 2番目の数は、配列セグメントの長さを示す。¹ Tm℃＝形成されたオリゴヌクレオチド二重鎖の溶解温度。² dG＝オリゴヌクレオチド相補的ダイマー形成についての自由エネルギー値。 上記の分析に加えて、潜在的なダイマー形成の評価（D）、潜在的な自己相補性 相互作用（H）、標的配列とは異なるR1メッセージにおける配列に結合する能力 （B）が得られた。分析を、表７の脚注に記載のように実施し、そして表１１に 示される配列の選択に使用された基準は、表７の脚注に示された基準であった。 表12の説明 −アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表７に記載するように（^*）と示されて いない限り、完全にチオエート化された。 −相対コロニー形成効率の値は、２〜８決定から得られる平均値である。 −ND＝検出されず。 −種々の細胞株が、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville,Mary landから得られた。 これらのヒトガン細胞の情報： T24＝膀胱細胞ガン HCT116＝大腸細胞ガン A549＝肺細胞ガン MDA-MB-231＝乳房細胞腺ガン MIA PaCa-2＝膵臓細胞ガン PC-3＝前立腺細胞腺ガン HepG2＝肝細胞ガン HelaS3＝頚部のガンから単離された細胞 T-47D＝乳房管（breast ductal）ガン H596＝肺腺鱗（adenosquamous）ガン細胞 Colo320＝大腸細胞腺ガン ^*オリゴヌクレオチド補充（なし）リポフェクチンまたは0.2μM AS-II-626-20含 有リポフェクチンのいずれかで４時間処置した10⁵細胞を、C3H/HeN同型マウスに 静脈注射（尾血管）し、そして肺腫瘍を以前に記載された（Damen,J.E.,Greenbe rg,A.H.およびWright,J.A.Biochim.Biophys.Acta.,1097:103−110,1991）ように 分析した。r-3細胞株は高度に悪性であり、そして以前に記載されている（Taylo r,W.R.,Egan,S.E.,Mowat,M.,Greenberg,A.H.およびWight,J.A.Oncogene,7:1383- 1390,1992）。AS-II-626-20処置と未処置の間で観察された差異は、統計学的に 有意であった（p値＝0.027）。明らかに、AS-II-626-20処置腫瘍細胞は、悪性潜 在性において顕著な減少を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヤング，エイピン エイチ. カナダ国 アール３イー １ジー１ マニ トバ，ウィニペグ，パシフィック アベニ ュー 717

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．リボヌクレオチドレダクターゼR2遺伝子由来の核酸配列に相補的であり、お よび腫瘍細胞の増殖を阻害するための少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌク レオチドアナログを含む配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用 。 ２．リボヌクレオチドレダクターゼR2遺伝子由来の核酸配列に相補的であり、お よび腫瘍細胞の化学治療薬剤に対する感受性を増加させるための少なくとも７つ のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む配列を有する、アンチセンス オリゴヌクレオチドの使用。 ３．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜102のいずれか１つに示される核 酸配列またはそのアナログを有する、請求項１または２に記載の使用。 ４．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、12、16、18、21、25、29、34 、42、44、45、46、52、53、59、60、64、65、66、68、69、70、72、73、74、76 、78、79、80、90、91、92、96、99、100、または102に示される核酸配列を有す る、請求項１または２に記載の使用。 ５．前記オリゴヌクレオチドが、表11に示される核酸配列を有する、請求項１ま たは２に記載の使用。 ６．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号42に示されるヌクレオチド配列を有す る、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。 ７．リボヌクレオチドレダクターゼR1遺伝子由来の核酸配列に相補的であり、お よび腫瘍細胞の増殖を阻害するための少なくとも７つのヌクレオチドまたはヌク レオチドアナログを含む配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用 。 ８．リボヌクレオチドレダクターゼR1遺伝子由来の核酸配列に相補的であり、お よび腫瘍細胞の化学治療薬剤に対する感受性を増加させるための少なくとも７つ のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む配列を有する、アンチセンス オリゴヌクレオチドの使用。 ９．前記オリゴヌクレオチドが、表11に示されるような配列番号103〜161のいず れか１つに示される核酸配列またはそのアナログを有する、請求項７または８に 記載の使用。 １０．前記オリゴヌクレオチドが、表11に示されるような配列番号103に示され る核酸配列またはそのアナログを有する、請求項７または８に記載の使用。 １１．前記オリゴヌクレオチドが、減少したダイマー形成および減少した自己相 補性作用を示す、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の使用。 １２．哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子由来の核酸配列に相補的で あり、および少なくとも７〜約35ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含 み、および腫瘍細胞の増殖を阻害し得る配列を有する、アンチセンスオリゴヌク レオチド。 １３．哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼR1遺伝子に相補的である、請求項 １２に記載のオリゴヌクレオチド。 １４．哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼR2遺伝子に相補的である、請求項 １２に記載のオリゴヌクレオチド。 １５．前記オリゴヌクレオチドが、表７に示されるような配列番号１〜102のい ずれか１つに示される核酸配列またはそのアナログを有する、請求項１４に記載 のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 １６．前記オリゴヌクレオチドが、表７に示されるような配列番号１、２、12、 16、18、21、25、29、34、42、44、45、46、52、53、59、60、64、65、66、68、 69、70、72、73、74、76、78、79、80、90、91、92、96、99、100、または102に 示される核酸配列を有する、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。 １７．配列番号42に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記載のオ リゴヌクレオチド。 １８．前記オリゴヌクレオチドが、表11に示されるような配列番号103〜161のい ずれか１つに示される核酸配列またはそのアナログを有する、請求項１３に記載 のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 １９．前記オリゴヌクレオチドが、表11に示されるような配列番号103に示され る核酸配列またはそのアナログを有する、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチ ド。 ２０．生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を用いる混和において、請求 項１２〜１９のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌク レオチドを含む、腫瘍細胞増殖を調節するための薬学的組成物。 ２１．生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を用いる混和において、請求 項１２〜１９のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌク レオチドを含む、腫瘍細胞増殖を阻害するための薬学的組成物。 ２２．生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を用いる混和において、請求 項１２〜１９のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌク レオチドを含む、腫瘍細胞の化学治療薬剤に対する感受性を増加させるための薬 学的組成物。 ２３．生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を用いる混和において、請求 項１２〜１９のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌク レオチドを含む、化学治療薬剤に対して耐性である腫瘍細胞の増殖を調節するた めの薬学的組成物。 ２４．腫瘍細胞増殖を調節するための医薬を調製するための、請求項１２〜１９ のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。 ２５．腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬を調製するための、請求項１２〜１９ のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。 ２６．転写開始領域および請求項１２〜１９のいずれか１つに記載のアンチセン スオリゴヌクレオチドをコードする配列を含む、DNA配列。 ２７．請求項２６に記載のDNA配列を含む、ベクター。 ２８．哺乳動物において、腫瘍を、請求項１２〜１９に記載の少なくとも１つの アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび化学治療薬剤と接触させることによって 、新生物細胞の化学治療薬剤に対する感受性を増加させる方法。 ２９．前記化学治療薬剤が、ヒドロキシウレア、MTX、およびPALAから選択され る、請求項２８に記載の方法。 ３０．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび化学治療薬剤が、非細胞毒性 用量で投与される、請求項２８に記載の方法。 ３１．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび化学治療薬剤が、細胞毒性用 量で投与される、請求項２８に記載の方法。 ３２．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが非細胞毒性用量で投与され、そし て前記薬剤が細胞毒性用量で投与される、請求項２８に記載の方法。 ３３．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞毒性用量で投与され、および 前記薬剤が非細胞毒性用量で投与される、請求項２８に記載の方法。 ３４．細胞を、請求項１２〜１９に記載の少なくとも１つのアンチセンスオリゴ ヌクレオチドの有効量と接触させる工程を含む、腫瘍細胞増殖を調節する方法。 ３５．化合物がリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の転写または翻訳を阻害し 、それにより細胞増殖に影響するかどうかを評価する方法であって、細胞を、リ ボヌクレオチドレダクターゼをコードする核酸配列を含む組換え分子および核酸 の転写または翻訳に必要な要素を含む発現ベクターでトランスフェクトする工程 ；試験化合物を投与する工程；および試験化合物の非存在下で、リボヌクレオチ ドレダクターゼの発現レベルとコントロールで得られるレベルとを比較する工程 を含む、方法。 ３６．R2とRaf-1および／またはRac-1との相互作用のアゴニストまたはアンタゴ ニストについてアッセイすることによって、Rasシグナル経路を調節する化合物 の能力について評価する方法であって、試験化合物の存在下でR2とRaf-1および ／またはRac-1との相互作用を可能にする条件下でR2およびRaf-1および／または Rac-1を含む反応混合物を提供する工程；R2およびRaf-1および／またはRac-1の 間の複合体の形成またはRasシグナル経路の活性化を検出する工程；ならびに該 試験物質の非存在下でコントロール反応と比較する工程を含み、ここでより低い レベルの該反応混合物の複合体または活性は、該試験化合物がR2とRaf-1および ／またはRac-1との該相互作用を妨害することを示し、そしてより高レベルは、 該試験化合物がR2とRaf-1および／またはRac-1との該相互作用を増強することを 示す、方法。