JP2002501486A - リボヌクレオチドレダクターゼｒ１を利用した悪性腫瘍の抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新生物細胞を、哺乳動物のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能核酸配列の増殖調節量と接触させることによって、ヒトまたは他の哺乳動物における細胞の悪性腫瘍性質を調節するための方法を提供する。本発明はまた、ヒトまたは他の哺乳動物における細胞の悪性腫瘍性質を調節するための、リボヌクレオチドレダクターゼＲ１タンパク質または生物学的活性なペプチドの増殖調節量を提供及び使用する。該方法は、哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼのＲ１構成要素の遺伝学的に上昇した発現を提供する。該発現可能核酸配列は、遺伝子治療のためのベクターの形態で存在することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 リボヌクレオチドレダクターゼＲ１を利用した悪性腫瘍の抑制 発明の背景 １．発明の分野 本発明の分野は、新生物細胞の形成および／または転移を制御する方法に関す る。特にそれは、悪性腫瘍を抑制するための、リボヌクレオチドレダクターゼの Ｒ１遺伝子配列、およびその遺伝子産物の使用に関する。 ２．関連技術の説明 ＤＮＡ合成を導く最初の独特の段階は、ハウスキーピング遺伝子リボヌクレオ チドレダクターゼによって細胞周期特異的な方法で触媒される反応である、リボ ヌクレオチドのその相当するデオキシリボヌクレオチドへの変換である[Lewis等 ,1978;Reichard,1993;Wright,1989a;Wright等,1990a;Stubbe,1989]。該哺乳動物 酵素は、しばしばＲ１およびＲ２と呼ばれる二つの非相同なダイマータンパク質 構成要素より成り、それらは異なる染色体上に位置する二つの異なる遺伝子によ ってコードされる[Bjorklund等,1993;Tonin等,1987]。哺乳動物タンパク質Ｒ１ はホモダイマー構造体であり、酵素活性および基質特異性を制御する、基質部位 およびアロステリックエフェクター部位を有する[Wright,1989b;Thelander等,19 80;Caras等,1985;Wight等,1990a]。タンパク質Ｒ２はホモダイマーであり、触媒 に必要とされるチロシル遊離基を安定化する二つの同等なジヌクレアー(dinucle ar)鉄活性中心を形成する[Wright等,1990a;Thelander等,1985;McClarty等,1990] 。Ｒ１およびＲ２タンパク質は、活性ホロ酵素を形成するそのＣ末端で相互作用 する[Reichard,1993;Wright等,1990a;Davis等，1994]。リボヌクレオチドレダク ターゼは、ＤＮＡ複製のための基質を提供することに加えて、他の生物学的機能 を提供 する。例えば、その活性を、クロラムブシルおよびＵＶ照射のようなＤＮＡ架橋 剤によってＳ期以外で誘導することができ、ＤＮＡ修復過程における該酵素の役 割を示す[HurtaおよびWright,1992]。 Ｒ１およびＲ２は、細胞周期の間別々に調節される。デノボ合成から由来する Ｒ２タンパク質のＳ期の相関的増大が存在する[Lewis等，1978;Mann等,1988]。 リボヌクレオチドレダクターゼの活性、それ故ＤＮＡ合成および細胞増殖は、Ｒ ２構成要素の合成および分解によって細胞周期の間、増殖細胞において制御され る[Eriksson等,1984;Choy等,1988]。律速的なＲ２構成要素は、細胞周期進行の ＣＤＣ２およびＣＤＫ２タンパク質キナーゼメディエーターによってリン酸化可 能なリンタンパク質であり[Chan等,1993]、酵素活性に必要とされる独特のチロ シル遊離基を安定化する非ヘム鉄を含む[Reichard,1993;McClarty等,1990]。 Ｒ１タンパク質のレベルは、増殖細胞の細胞周期の間実質的に変化しないよう であり、細胞周期を通じて検出することができる。Ｒ２ ｍＲＮＡと同様に、Ｒ １ ｍＲＮＡの合成は、Ｓ期の間で主に生ずるようである[Eriksson等,1984;Choy 等,1988;Mann等,1988]。細胞周期の間のＲ１タンパク質のより広い配置は、Ｒ２ タンパク質と比較してそのより長い半減期に寄与している[Choy等,1988;Mann等, 1988]。 リボヌクレオチドレダクターゼ、特にＲ２構成要素の調節は、腫瘍プロモータ ーまたは増殖因子ＴＧＦ−βにさらされた悪性細胞において著しく変化する[Ama ra等,1994;Chen等,1993;Amara等,1995b;HurtaおよびWright,1995;Hurta等,1991] 。Ｒ１の欠失が、あるヒト大腸ガンで検出することができる[Glenney,1986]。酵 素活性のより高いレベルが、非悪性細胞と比較した場合、培養悪性細胞で観察さ れており[Weber，1983;TakcdaおよびWeber,1981;Wright等,1989a]、Ｒ２タンパ ク質およびＲ２ ｍＲＮＡの増大したレベルが、正常対照組織サンプルと比較し た場合、悪性前および悪性組織において見出されている[Saeki等,1995:Jensen等 ,1994]。リボヌクレオチドレダクターゼ、特にＲ２構成要素の調節は、腫瘍プロ モーターまたは腫瘍進行の増殖因子介在性機構におけるトランスフォーミング増 殖因子βにさらされたトランスフォーム細胞において顕著に上昇する[Amara等,1 996;Chen等，1993;Amara等,1995b]。 ヒドロキシウレアのような現在の化学療法化合物は、チロシル遊離基の脱構造 化を引き起こすＲ２タンパク質の鉄活性中心を脱安定化し[McClarty等,1990]、 細胞が細胞周期のＳ期を通過して進行することを妨げること[AshiharaおよびBas erga,1979]によって、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を阻害する。上記薬剤 は、ヒトのガンの治療において制限された有用性しか有さず、それ故リボヌクレ オチドレダクターゼを標的にするさらなるアプローチが必要とされている。 分子生物学の飛躍的な発展、およびヒトゲノムプロジェクトは、哺乳動物遺伝 子発現を使用した標的化介入の以前には予期されなかった可能性を開いた[Blaes e,1997;Felgner，1997]。これらには、新生物細胞に、増殖細胞を殺傷するため の遺伝学的コントロール配列および特異的タンパク質を導入するための遺伝子治 療のようなアプローチが含まれる。新生物細胞のような増殖が制御されなければ ならない細胞中のリボヌクレオチドレダクターゼの発現を改変するためにこのア プローチを利用することは有用であろう。 発明の概要 本発明にしたがって、ヒトまたは他の哺乳動物における細胞の腫瘍形成性及び 転移性を調節するための、リボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能 な核酸配列の増殖調節量の使用が開示されている。本発明はまた、ヒトまたは他 の哺乳動物における細胞の腫瘍形成性及び転移性を調節する方法を提供する。該 方法は、哺乳動物のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能核酸配 列の増殖調節量と、新生物細胞を接触させる工程を含み、ヒトに対する実施態様 として、該核酸配列は、配列番号１またはその特異的なＲ１コード配列とされ得 る。発現可能核酸配列は、遺伝子治療のためのベクターの形態であることが可能 な遺伝子輸送ビークルを介して輸送ずることができる。代わりに一つの実施態様 として、製薬学的組成物の形態であることが可能なＲ１遺伝子産物タンパク質ま たはその生物学的に活性なペプチドを、制御される細胞に輸送することができる 。本発明の方法および使用および組成物は、制御される細胞における哺乳動物リ ボヌクレオチドレダクターゼのＲ１構成要素の一般的に上昇した発現のために提 供 される。 図面の簡単な説明 本発明の他の利点は、添付した図面と共に考慮した場合、以下の詳絹な説明を 参考にしてより的確に理解されるのと同様に容易に予測されるであろう。 図１Ａ−Ｂは、間接的免疫学的蛍光アッセイ（Ａ）によるｐＳＨＤ／ｍＲ１一 過的トランスフェクトＢＨＫ細胞由来の、および放射能免疫沈降（Ｂ）による安 定なレトロウイルスパッケージ細胞系ＰＡ／ｍＲ１由来のＭｙｃエピトープタグ 化Ｒ１発現の分析を示す写真である[Fan等,1996b]。抗Ｍｙｃエピトープ抗体９ Ｅ１０を、両者のアッセイについて使用した。 図２は、組換えＲ１発現細胞を使用したソフトアガー(soft agar)における減 少した増殖効率を示す棒グラフである。Ｒ１ウイルスベクターを使用して安定に 感染された細胞系を、適切な空のベクターで感染させた対照細胞系と比較した( 表１)。存在するデータは、それそれ細胞系当たり三重のプレートより成る少な くとも三つの独立の実験から得られた。接種量（細胞／プレート）は以下のもの であった：Ｃ１／ＳＨＤおよびＣ１／ｍＲ１細胞について５×１０⁵、Ｃ１／ｍ Ｒ２およびＣ１／ｍＲ２／ｍＲ１細胞について１×１０⁵，Ｃ１／ｍＲ２ａ／Ｓ ＨＤおよびＣ１／ｍＲ２ａ／ｍＲ１細胞、ｒａｓ−３／ＳＨＤおよびｒａｓ−３ ／ｍＲ１細胞について１×１０⁴，並びにＣｏｌｏ／ＳＨＤおよびＣｏｌｏ／ｍ Ｒ１細胞について１×１０³。全ての場合において、組換えＲ１発現細胞および 対照細胞の間の形成されたコロニーにおける差異は、統計学的に有意であった( ｐ＜０．００１)。 図３は、対照Ｎ／ｒａｓ細胞（Ａ）と比較したＮ／ｒａｓ＆ＡＳＲＩ細胞（Ｂ ）に関するソフトアガーにおける増大したコロニー形成効率を示すプレートの写 真である。各プレートは、１×１０⁴細胞を使用して接種した。Ｎ／ｒａｓ＆Ａ ＳＲ１細胞は、少なくとも４倍以上のコロニーを形成し、それはＮ／ｒａｓ細胞 によって形成されたものより一般的に多かった。（Ａ）に示されるコロニーは接 種の３週間後の発育であり、（Ｂ）に示されるものは接種の２週間後の発育であ っ た。それぞれ細胞系当たり４つのプレートより成る６回の実験由来のデータを分 析した場合、二つの細胞系によって示されたコロニー形成効率の差異は、非常に 有意であることが見出された(ｐ＜０．０００１)。 図４は、（Ａ）対照Ｎ／ｒａｓ細胞（ａ）と比較したＮ／ｒａｓ＆ＡＳＲ１（ ｂ）の減少したＲ１タンパク質を示すウエスタンブロット分析、および（Ｂ）（ Ａ）に示されたニトロセルロース膜のインドインク染色[WrightおよびAnazodo,1 996]の結果を示す写真であり、およそ等量の細胞抽出物を乗せたことを示す。 発明の詳細な説明 本発明は、腫瘍の抑制を含む、薬理学的手段および遺伝子治療手段を使用した 、細胞内のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１の増大した発現による、ヒトまた は他の哺乳動物における細胞の悪性性質の調節の方法を提供する。例えば、哺乳 動物リボヌクレオチドレダクターゼのR1構成要素の一般的に上昇した発現を提供 する哺乳動物のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１（ヒトについては配列番号１ 参照）の発現可能核酸配列の増殖調節量と新生物細胞を接触することができる。 代わりの実施態様として、該細胞を、Ｒ１発現を増大するために薬理学的に処理 する。さらなる実施態様として、該細胞を、リボヌクレオチドレダクターゼＲ１ タンパク質あるいは生物学的に活性なその類似体または誘導体と接触させる。発 現可能核酸配列は一般的に、遺伝子治療のためのベクターの形態で存在する遺伝 子輸送ビークルにおいて提供される。 さらに本発明は、哺乳動物のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１またはその類 似体に対する発現可能核酸配列の有効量より成る、ヒトまたは他の哺乳動物にお ける悪性新生物細胞増殖を調節するための製薬学的組成物を提供及び使用し、該 核酸配列はベクターの形態および製薬学的生理学的に許容可能な担体または希釈 液の形態で存在する。一つの実施態様として、本発明はさらに、哺乳動物のリボ ヌクレオチドレダクターゼＲ１タンパク質あるいは生物学的に活性なその類似体 または誘導体の有効量、および製薬学的生理学的に許容可能な担体または希釈液 より成る、ヒトまたは他の哺乳動物における悪性新生物細胞増殖を調節するため の製薬学的組成物を提供及び使用する。 該細胞を、例えば適切な経路を活性化することによって発現を増大する、また はｍＲＮＡの安定性を増大する薬剤のような、本分野で周知のものでＲ１発現を 増大するように薬理学的に処理することができる。例えばホルスコリン(forskol in)またはコレラ毒素のそれぞれを使用して、ｃＡＭＰ合成を刺激することは、 機能的な遺伝子が存在する細胞内のＲ１発現を増大する[HurtaおよびWright,199 4]。使用可能なもう一つの薬剤には、３-イソブチル-１-メチルキサンテン（ｃ ＡＭＰ分解のインヒビター）が含まれる。Ｒ１ ｍＲＮＡの発現は、プロテイン キナーゼＣ経路によって調節されており、それ故この経路におけるメッセンジャ ーの安定性を増大する薬剤は、Ｒ１ ｍＲＮＡの利用可能性を増大するであろう[ Chen等,1994A]。 調節するということによって、固定した独立した増殖、および本分野で周知の 他の性質並びに実施例においてここで例示されるもののような、細胞トランスフ ォーメーション性質の抑制を意味する。調節は、腫瘍抑制活性、並びに腫瘍増殖 の遅延および／または腫瘍形成能力および転移能力の腫瘍抑制および減少を引き 起こす活性を包含する。調節は、いすれかの異常な細胞または組織増殖または繁 殖の阻害を含み、正常表現型に細胞を戻すことを含む。 本発明の遺伝子治療ベクターの形態であるリボヌクレオチドレダクターゼの発 現可能核酸配列、またはそのＲ１遺伝子産物またはその類似体または誘導体、あ るいはＲ１細胞発現を増大する薬剤の増殖調節量は、個々の患者の臨床的な病状 、投与の部位と方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重、および医 師に周知の他の要素を考慮して、適切な医療的実践にしたがって投与される。そ れ故、ここでの目的のための製薬学的な「有効量」は、本分野で周知のように上 記考慮によって決定される。該量は、腫瘍の縮小、改良された生存率またはより 急速な回復、または症状の改良または除去、および当業者によって適切な測定値 として選択される他の指標を制限することなく含む改良を達成するために有効で なければならない。 ここで使用される遺伝子治療とは、遺伝学的または後天的疾患または疾病の表 現型を治療または予防するために、宿主内への興味ある遺伝学的物質（例えばＤ ＮＡまたはＲＮＡ）のトランスファーを指す。興味ある遺伝学的物質は、インビ ボでの生産が望ましい産物（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは 機能的ＲＮＡ）をコードする。例えば、興味ある遺伝学的物質は、治療上の価値 を有するホルモン、レセプター、酵素、ポリペプチドまたはペプチドをコードす る。総説としては、一般的に"Gene Therapy"(Advances in Pharmacology 40,Aca demic Press,1997)の文献を参照。 遺伝子治療に対する二つの基本的なアプローチが開発されている：(１)エクス ビボおよび（２）インビボ遺伝子治療である。エクスビボ遺伝子治療においては 、細胞を患者から取り出し、その一方で培養されている細胞をインビトロで処理 する。一般的に、機能的な置換遺伝子が、適切な遺伝子輸送ビークル／方法（ト ランスフェクション、トランスダクション、相同的組換え等）および必要とされ る発現系を介して細胞内に導入され、次いで該修飾細胞が培養物中で増殖し、宿 主／患者に戻される。これらの遺伝学的に再移植された細胞は、原位置でトラン スフェクトされた遺伝子産物を生産することが示されている。 インビボ遺伝子治療においては、標的細胞は患者から取り出されず、むしろト ランスファーされる遺伝子が原位置で受容者生物の細胞内、つまり受容者内に導 入される。代わりに、もし宿主遺伝子が欠損型であれば、該遺伝子は原位置で修 復される[Culver,1998]。これらの遺伝学的に改変された細胞は、原位置でトラ ンスフェクトされた遺伝子産物を生産することが示されている。 遺伝子発現ビークルは、宿主細胞内への異種核酸の輸送／トランスファーが可 能である。該発現ビークルは、本分野で周知の細胞選択方法における核酸の標的 化、発現および転写を制御するためのエレメントを含む。しばしば該遺伝子の５ ’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが、発現ビークルの５’ＵＴＲおよび／また は３’ＵＴＲによって置換されていることに注意すべきである。それ故ここで使 用されているように、発現ビークルは、必要であれば、配列番号１に示された５ ’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含まず、Ｒ１に対する特異的なコード領域 のみを含み、Ｒ１ペプチドまたはこのコード領域はＲ１類似体を生産するために 修飾されている。 発現ビークルは、異種物質の転写を制御するためのプロモーターを含み、選択 的な転写を許容するための構成的または誘導的プロモーターのそれぞれを含むこ とができる。必要な転写レベルを得るために必要とされるエンハンサーは、場合 により含むことができる。エンハンサーは一般的に、プロモーターによって向け られた基底の転写レベルを変化するためにコード配列と連続的に（シスで）働く いずれかの非翻訳ＤＮＡ配列である。該発現ビークルはまた、ここで以下に記載 される選択遺伝子を含む。 ベクターは遺伝子輸送ビークルの一つの手段であり、本分野で周知の様々な方 法のいずれか一つによって、細胞または組織内に導入される。土記方法は、Samb rook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laborat ory,New York(1989,1992)、Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biolog y,John WileyおよびSons,Baltimore,Maryland(1989)、Chang等,Somatic Gene Th erapy,CRC Press,Ann Arbor,MI(1995)、Vega等,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor,MI(1995)、Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston MA(1988)、およびGilboa等,(1986)に一般的に記載さ れているものが見出され、例えば安定なまたは一過的なトランスフェクション、 リポフェクション、エレクトロポレーション及び組換えウイルスベクターを使用 した感染が含まれる。さらに、中枢神経系を含むベクターについては米国特許第 ４，８６６，０４２号、陽性−陰性選択法については米国特許第５，４６４，７ ６４および５，４８７，９９２号、同様に米国特許第５，６９８，４４３；５， ６８６，２７８；５，５３８，８８５；５，６９１，１７６；５，５８５，２５ ４；５，６１４，３９６；５，６７０，４８８；５，５９９，７１２；５，６４ ５，８２９；５，６４１，６８０および５，６８８，７７３号を参照。 感染による核酸の導入は、他に挙げた方法を越えるいくつかの利点を提供する 。より高い効率が、その感染性の性質のため得ることかできる。さらにウイルス は、大変特異的であり、典型的に特異的な細胞タイプにおいて感染し増殖する。 それ故、その天然の特異性は、インビボの特異的な細胞タイプに対して、あるい は組織または細胞の混合した培養物内にベクターを標的化するために使用するこ とができる。ウイルスベクターはまた、レセプター介在性現象を通じて標的特異 性を改良するために、特異的なレセプターまたはリガンドを使用して修飾される 。 組換え配列を導入および発現するためのＤＮＡウイルスベクターの特異的な例 は、アデノウイルス由来ベクターＡｄｅｎｏｐ５３ＴＫである。このベクターは 、陽性または陰性選択のそれぞれのためのヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ ＴＫ）遺伝子、および所望の組換え配列に対する発現カセットを発現する。この ベクターは、アデノウイルスレセプターを有する細胞を感染するために使用する ことかでき、該細胞には、ほとんどの上皮起源のガン、同様に他のものが含まれ る。このベクター、同様に類似の所望の機能を示す他のものは、細胞の混合した 集団を処理するために使用することができ、例えば、細胞のインビトロまたはエ クスビボ培養物、組織、またはヒト患者が含まれる(例えば米国特許第５，６９ １，１７６；５，５８５，２５４；５，６７０，４８８；５，６８１，７３１号 参照)。 その安全性を確保し、および／またはその治療上の効力を増強するために、該 ベクターに対してさらなる性質を付加することができる。上記性質には、例えば 組換えウイルスを使用して感染された細胞に対して陰性に選択するために使用す ることができるマーカーが含まれる。上記陰性選択マーカーの例として、抗生物 質ガンシクロビルに対して感受性を示す上記記載のＴＫ遺伝子が挙げられる。そ れ故陰性選択は、抗生物質の添加を通じて誘導可能な死を提供するため、感染を 制御することができる手段である。 さらに、組換えウイルスベクターは、横方向の感染および標的化特異性のよう な利点を提供するため、所望の核酸のインビボでの発現に対して有用である。横 方向の感染は、例えばレトロウイルスのライフサイクルにおいて固有のものであ り、単一の感染細胞が、出芽して近隣の細胞に感染する多くの子孫ビリオンを生 産することによる工程である。その結果、多くの領域が急速に感染されるように なり、そのほとんどがもともとのウイルス粒子によつて最初に感染されたもので はなかった。これは、感染剤がその固有の子孫を通じてのみ広がる感染の縦方向 タイプとは対照的である。横方向に広がることができないウイルスベクターもま た生産することができる。この性質は、もし所望の目的が局在した数の標的化細 胞内に特異的遺伝子を導入することである場合に有用である。 上記記載のように、ウイルスは多くの場合、宿主の防御機構を回避するように 進化した大変特異的な感染剤である。典型的には、ウイルスは特異的な細胞タイ プにおいて感染し増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性は、所定の細胞タ イプを特異的に標的化するその天然の特異性を利用し、それによって感染された 細胞内に組み換え遺伝子を導入する。本発明の方法において使用されるベクター は、標的化される所望の細胞タイプに依存し、当業者に周知であろう。例えば、 もし乳ガンが標的化されるのであれば、上記上皮細胞に特異的なベクターが使用 されるであろう。同様に、もし造血系の疾患または病理学的な状態が治療される のであれば、血液細胞およびその前駆体、好ましくは造血細胞の特異的なタイプ に特異的なウイルスベクターが使用されるであろう。 レトロウイルスベクターは、感染性の粒子として機能するように、または感染 の単一の最初のラウンドのみを経験するように構築することができる。前者の場 合、ウイルスのゲノムは、新たなウイルスタンパク質およびＲＮＡを合成するた めの全ての必要な遺伝子、調節配列及びパッケージングシグナルを維持するよう に修飾される。一度これらの分子が合成されると、宿主細胞は、さらなる感染の ラウンドを経験可能な新たなウイルス粒子内にＲＮＡをパッケージする。ベクタ ーのゲノムはまた、所望の組換え遺伝子をコードおよび発現するように操作され る。非感染性ウイルスベクターの場合、ベクターのゲノムは通常、ウイルス粒子 内にＲＮＡをカプセル化するために必要であるウイルスパッケージングシグナル を破壊するように突然変異される。上記シグナルの不存在下では、形成されたい かなる粒子も、感染の引き続くラウンドを通じて進行しないであろう。ベクター の特異的なタイプは、企図される応用に依存するであろう。実際のベクターもま た周知であり、本分野で容易に入手可能であり、周知の方法体系を使用して当業 者によって構築することができる。 組換えベクターは、いくつかの方法で投与することができる。もしウイルスベ クターを使用したならば、例えば該方法は、その標的特異性を利用することがで き、その結果疾患部位に局所的に投与する必要はない。しかしながら、局所的投 与は、より早くより効果的な治療を提供することができ、投与はまた、例えば患 者における静脈注射または皮下注射によって実施することができる。脊髄液内へ のウイルスベクターの注射はまた、特に神経変性疾患の場合、投与の形態として 使用することができる。注射に引き続き、ウイルスベクターは、感染に対して適 切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環するであろう。 投与の代わりの形態は、疾患または病理学上の状態の部位での局所的な直接的 イノキュレーションによって、あるいは該部位を栄養素を使用して補給する血管 系内に、または脊髄液内に接種することによってなすことができる。局所的投与 は、希釈効果が存在せず、それ故より少ない投与量のみが標的化細胞の大多数に おいて発現を達成するために必要であるため有利である。さらに、局所的イノキ ュレーションは、接種された領域の全ての細胞を感染するベクターを使用するこ とができるため、他の形態の投与を必要とする標的化の必要性を軽減することが できる。もし発現が、接種された領域内の細胞の特異的な部分でのみ望まれるの であれば、所望の部分に特異的であるプロモーター及び調節エレメントを、この 目的を達成するために使用することができる。上記非標的化ベクターは、例えば ウイルスベクター、ウイルスゲノム、プラスミド、ファージミド等が挙げられる 。リポソームのようなトランスフェクションビークルもまた、接種された領域内 の受容者細胞内に上記記載の非ウイルスベクターを導入するために使用すること ができる。上記トランスフェクションビークルは、当業者に周知である。 ここで使用される類似体なる語によって、リボヌクレオチドレダクターゼＲ１ の天然のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中にいくつかの差異を有す る変異体を意味する(代わりに改変、アミノ酸配列改変、アミノ酸配列変異体な る語が使用される)。もともと該類似体は、機能的に関連するいずれの部分につ いても一般的に少なくとも７０％の同一性を有するであろう。より好ましい実施 態様として、該同一性は該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％であり、９５ ％の同一性に近づくことができる。類似体のアミノ酸またはヌクレオチド配列は 、少なくとも一つの残基が欠失、挿入または置換されている点で、リボヌクレオ チドレダクターゼＲ１タンパク質のものとは異なるが、該タンパク質は機能性を 維持しており、生物学的に活性である。グリコシル化における差異は類似体を提 供する。 ここで使用される誘導体なる語によって、ここでの実施例に示される同じまた は同様な生物学的活性を提供するリボヌクレオチドレダクターゼＲ１タンパク質 のペプチド断片を意味することができる。該ペプチド断片は、完全なタンパク質 分子ほど有効ではないが、ここで実施例に測定されるように未だ生物学的活性を 提供することができることが理解される。しかしながら該ペプチド断片は、様々 な輸送系に対して完全なタンパク質よりも優れた薬物速度論的パラメーターを提 供し、それ故代わりの役割を提供する。Ｒ１に対する特異的アミノ酸コード領域 は、ここで上記記載のような遺伝子治療においての使用のため生物学的に活性な Ｒ１タンパク質誘導体を提供するように修飾される。さらに誘導体は、顕著に生 物学的活性を変化することなく、流動性および溶解性を改良するために、本分野 で周知のタンパク質またはペプチドの製薬学的に許容可能な修飾体を指すことが できる。 生物学的に活性なる語は、該分子、類似体または誘導体の生物学的な性質を示 し、この文脈においては、特に実施例で測定され定義されるような、天然で生じ る（天然の）リボヌクレオチドレダクターゼＲ１によって直接または間接に実施 されるインビボでのエフェクターまたは活性を意味する。エフェクター機能には 、レセプター結合、いずれかの酵素的活性または酵素調節活性、いずれかの担体 結合活性、いずれかのホルモン活性、細胞外マトリックスまたは細胞表面分子に 対する細胞の接着を促進または阻害するいずれかの活性、またはいずれかの構造 的役割を制限することなく含む。類似体または誘導体の生物学的活性は、当業者 に周知なように実施例において開示されているように測定することができる。 リボヌクレオチドレダクターゼＲ１タンパク質または生物学的に活性なその類 似体または誘導体は、該配列に基づいてタンパク質またはペプチドを合成するこ とによって調製され、またはクローニング法によって組換え的に調製され、ある いは天然の遺伝子産物および／またはその部分は、当業者に周知なように単離し 使用される。 リボヌクレオチドレダクターゼＲ１およびその生物学的に活性な類似体または 誘導体を投与する際、投与は、数日から数ヶ月、または疾患の減少が達成される までの期間の単一の投与または複数の投与である。治療は一般的に、疾患の過程 の長さおよび薬剤有効性および治療される患者の種類に比例した長さを有する。 最適な投与スケジュールは、体内での薬剤の蓄積の測定を使用して計算される。 当業者は、最適な投与量、投与体系、および反復速度を容易に測定することがで きる。最適な投与量は、リボヌクレオチドレダクターゼＲ１，生物学的に活性な 類似体および誘導体の相対的な能力に依存して変化し、一般的にインビトロおよ びインビボでの動物実験および臨床試験におけるＥＤ₅₀値に基づいて決定するこ とができる。 リボヌクレオチドレダクターゼＲ１およびその生物学的に活性な類似体または 誘導体は、製薬学的組成物において製薬学的に許容可能な担体、希釈液、アジュ バントおよびビークルと組み合わせた活性成分である。該組成物は、経口、皮下 、局所的、または静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、および鼻腔内の投与、同様 に鞘内および点滴法を含む非経口的に投与することができる。該化合物の座薬お よび移植もまた有用である。治療される患者は温血動物であり、特にヒトを含む 哺乳動物である。製薬学的に許容可能な担体、希釈液、アジュバントおよびビー クル、同様に移植担体は一般的に、本発明の活性成分と反応しない不活性で非毒 性な固体または液体フィラー、希釈液またはカプセル化物質を指す。 非経口的に投与される場合、本発明の製薬学的組成物は一般的に、単位投与量 注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルション）で処方される。注射に適した製薬 学的処方には、滅菌水溶液または分散物、および滅菌注射可能溶液または分散物 に再構成するための滅菌パウダーが含まれる。該担体は、例えば水、エタノール 、ポリオール(例えばグリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレング リコール等)、それらの適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒 体であることができる。 正確な流動性は、例えばレシチンのような被膜を使用することによって、分散 物の場合必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によ って維持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、ダイズ油、コーン油 、ヒマワリ油、またはピーナッツ油、およびミリスチン酸イソプロピルのような エステルといった非水性ビークルもまた、構成組成物に対する溶媒系として使用 される。さらに、抗微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、およびバッファーを 含む、該組成物の安定性、滅菌性及び等張性を増大する様々な添加剤を添加する ことができる。微生物の機能の妨害は、例えばパラベン、クロロブタノール、フ ェ ノール、ソルビン酸等といった様々な抗細菌剤および抗真菌剤によって確保する ことができる。多くの場合、例えば糖、塩化ナトリウム等といった等張剤を含む ことが望ましいであろう。注射可能な製薬学的形態の長期化した吸収は、例えば モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった吸収を遅延する剤の使用 によってもたらすことができる。しかしながら本発明にしたがって、使用される いずれのビークル、希釈液、または添加剤も該化合物と適合可能でなければなら ないであろう。 滅菌注射可能溶液は、必要とされる様々な他の成分と適切な溶媒の必要量中に 、本発明を実施するために利用される化合物を取り込ませることによって調製す ることができる。 局所的投与は、本分野で周知のいずれの方法によっても達成することができ、 クリーム、軟膏または経皮的パッチ内への製薬学的組成物の取り込みを含むこと ができる。 薬理学的処方は、様々なビークル、アジュバント、添加剤、および希釈液のよ うないずれかの適合可能な担体を含む注射可能処方において患者に対して投与す ることができる；または本発明において利用される化合物は、遅延放出皮下移植 、またはモノクローナル抗体、ベクター化輸送体、イオン導入剤、ポリマー物質 、リポソーム、およびミクロスフェアのような標的化輸送系の形態で患者に対し て非経口的に投与することができる。本発明において有用な輸送系の例としては 以下のものが含まれる：米国特許第５，２２５，１８２；５，１６９，３８３； ５，１６７，６１６；４，９５９，２１７；４，９２５，６７８；４，４８７， ６０３；４，４８６，１９４；４，４４７，２３３；４，４４７，２２４；４， ４３９，１９６；および４，４７５，１９６号。上記移植、輸送系、およびモジ ュール以外の多くのものが当業者に周知である。 本発明において利用される薬理学的処方は、患者に対して経口的に投与するこ とができる。錠剤、懸濁液、溶液、エマルション、カプセル、パウダー、シロッ プ等における該化合物の投与のような簡便な方法が利用可能である。 経口、皮下、または静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、および鼻腔内の投与、 同様に鞘内のおよび点滴法を含む非経口的に輸送し、生物学的活性を維持する周 知の方法が好ましい。 中枢神経系鞘内輸送に関する輸送のために、例えばオマヤレザバーを使用する ことができる。米国特許第５，４５５，０４４号は、中枢神経系輸送のための分 散系の使用を提供し、または米国特許第５，５５８，８５２号は、中枢神経系輸 送について議論している。さらに、血液脳関門を横切る薬理学的処方を投与する ことができる[Betz等,1994;Brem等,1993]。上記処方は、本発明品を血液脳関門 を横切る輸送を許容する脳輸送ベクターに結合するキメラペプチドを提供するた めに、現在利用可能な方法を利用することができる[Pardridge等,1992;Pardridg e,1992;Bickel等，1993]。さらに、適切な場合には、血液脳関門破壊を利用する ことができる［Neuwelt等,1980]。 以下のここでの実施例で得られた結果は、哺乳動物リボヌクレオチドレダクタ ーゼのＲ１構成要素の上昇した発現が、固定した独立の増殖のような細胞トラン スフォーメーション性質を抑制することができることを初めて示す。固定した独 立の増殖活性における著しい上昇によって示されるような、アンチセンス配向に おけるＲ１配列の発現が、Ｒ１タンパク質の減少および細胞トランスフォーメー ションの増大を導くという観察は、これらの結果と一致した。本研究で使用され るマウス細胞系と同様に、ヒト腫瘍Ｃｏｌｏ ３２０ＨＳＲ細胞系におけるＲ１ の過剰発現はまた、減少した固定した独立の増殖を引き起こし、Ｒ１がヒト細胞 においても抑制機能を発揮することができることを示す。明らかに、Ｒ１遺伝子 発現のレベルは、悪性腫瘍の可能性を測定することにおいて重要であり、減少し た発現は悪性腫瘍に関連する特徴を増大することができる。 Ｒ１の発現はまた、実施例に示されているように、インビボで腫瘍形成能力お よび悪性腫瘍能力を抑制することができた。試験された四つの細胞系の三つは、 増大したＲ１発現の存在下で動物において、増大した腫瘍の潜在性および減少し た腫瘍増殖性質を示した。 興味深いことに、Ｒ２過剰発現は、細胞のトランスフォーメーション、腫瘍形 成および悪性腫瘍性質に対して反対の効果を有することが以前に示されている。 Ｒ２の過剰発現は、腫瘍進行を促進する活性化ガン遺伝子と協同し、この過程は ＭＡＰＫ経路における変化を通じて少なくとも部分的に介在されるようである [Fan等,1996a]。以前の研究[Fan等，1996a]および本研究は、ＤＮＡ合成のキー となる律速活性を有する[Reichard,1993;Wright,1989a]リボヌクレオチド還元に 必要とされるＲ１およびＲ２という二つの異なるタンパク質が、新生物細胞にお いて過剰発現された場合、反対のそして大変劇的な悪性腫瘍関連効果を有するこ とを示す。細胞におけるＲ１およびＲ２レベルの間には微妙なバランスが存在す ること、およびこのバランスの破壊は新生物細胞の悪性能力を有意に修飾するこ とを示唆することができる。以下のここでの実施例に示されているように、Ｒ１ 発現の調節発現を変化することは、新規な悪性腫瘍サプレッサーとして機能する ことができる。 上記の議論は、悪性腫瘍サプレッサーとしてのＲ１の使用に対する現実の基礎 を提供する。本発明と共に使用される方法および本発明の有用性は、以下の非制 限的な実施例および添付した図面によって示されよう。 実施例 一般的方法： 分子生物学における一般的方法：本分野で周知であり、特異的には記載されない 標準的な分子生物学の方法は、Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Ma nual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992);Ausubel等,Curren t Protocols in Molecular Biology,John WileyおよびSons,Baltimore,Maryland (1989);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley & Sons,N ew York(1988)に一般的に従った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、PCR Pro tocols:A Guide To Methods And Applications,Academic Press,San Diego,CA(1 990)のように一般的に実施した。ベクター：ベクターは、当業者によって本発明 のために構築され、該配列の所望の転写を達成するのに必要とされる全ての発現 エレメントを含むべきである。発現エレメントは、標的化される細胞においての み発現を許容するように選択することができる。他の有益な特徴はまた、異なる 形態での核酸の回収のための機構のように、ベクター内に含ませることかできる 。当業者の一人は、どの発現エレメントが特定の細胞タイプと適合的であるかを 知っているであろう。該ベクター は、ここで記載されているように本分野の様々な周知の方法のいずれか一つによ って細胞または組織内に導入することができる。 発現ベクター：ヒトＭｙｃエピトープタグ化マウスＲ１ ｃＤＮＡ[Fan等,1996b] を、５’プライマー：ACCGCTCGAGCCACCATGGAACAAAAGCTTATTTCTGAAGAAGACTTGATGC ATGTGATCAAGCGAGA(配列番号２：考え得るリボソーム結合シゲナル[Kozam,1987] であるKozakの配列はイタリックで示されている；ヒトＭｙｃエピトープをコー ドする配列は下線が引かれている；そして天然のＡＴＧ開始コドンは太字で示さ れている)、および３’プライマー：CCGCTCGAATCAGGATCCACACATCAG(配列番号３ ；終止コドンは太字で示されている)、およびテンプレートプラスミドｐｃＤ− Ｍ１[ThelanderおよびBerg,1986]を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） によって得た。レトロウイルスベクターｐＳＨＤ／ｍＲ１を生産するために、Ｐ ＣＲ産物をプロテイナーゼＫを使用して処理し、Ｘｈｏｌを使用して切断し、ゲ ルを精製し、そして脱リン酸化ＸｈｏＩ切断ｐＬＸＳＨＤプラスミド[Miller等 ，1993;Fan等，1996c]にライゲートした。レトロウイルスベクターのパッケージ ングおよびウイルスストックの調製は、ＰＡ３１７由来安定パッケージング系を １５日間のヒスチジノールを使用した選択によって得ることを除いて、我々が以 前に記載したように[Fan等,1996a;1996b]、ψ２およびＰＡ３１７細胞系を使用 することによって達成された。アンチセンス配向におけるＲ１に対する発現ベク ターを得るために、マウスＲ１ ｃＤＮＡを、プライマーGCCTCGAGCTGACAGTCGTCT CTGTCCCT(配列番号４)およびTAAAGCTTATCACTTA GAAATGTTTATTTCAAAAT（配列番 号５）を使用したＰＣＲによって調製し、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用 して切断し、そしてプラスミドｐＡＳＲ１を与えるために、哺乳動物発現プラス ミドｐｃＤＮＡ３(Invitrogen Corp.)内に挿入した。ｐＳＨＤ／ｍＲ１およびｐ ＡＳＲ１の両者の構築は、配列分析によって、同様にエンドヌクレアーゼ切断に よる制限によって確認された。 細胞系および細胞培養物：本研究で使用される細胞系および関連情報は、表１に 示されている。細胞は、８％ウシ血清(Fetalclone III,Hyclone)を使用して補っ たα−最小必須培地（ＭＥＭ）において継代培養された。組換えＲ１を発現する 細胞を生産するために、ポリブレンの存在下で安定なパッケージング系ＰＡ／ｍ Ｒ１ から調製されたＳＨＤ／ｍＲ１ウイルスストックを使用して感染した[Fan等，19 96a;Miller等,1993]。安定な感染体（≧５００クローン）を、細胞系に依存した ４−１５ｍＭヒスチジノールを使用した選択によって得、プールして増殖させた 。対照細胞系を、Ｒ１配列を欠いたＬＸＳＨＤウイルスを使用することによって 平行に生産した。Ｒ１アンチセンス発現細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅキ ット(Life Technologies)を使用してＮＩＨ ３Ｔ３細胞のトランスフェクション によって生産し、引き続きＧ４１８を使用して選択した[Egan等,1987a;Taylor等 ，1992]。細胞増殖速度を、１．０Ｎ ＮａＯＨ中に調製した細胞抽出物における ２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって[Kempe等,1976]、および／または 接種の後の異なる時間点での細胞を計測することによって[Egan等,1987a]評価し た。ソフトアガー中での増殖を、１５ｍｌのベースアガー（１０％ウシ血清を含 むＭＥＭ中に０．５％のＢａｃｔｏアガー）および１０ｍｌの増殖アガー（１０ ％ウシ血清を含むＭＥＭ中に０．３３％のアガー）を含む１０ｃｍ組織培養プレ ート上で見積もった。細胞を融合前の培養物から得、コロニーを１４−２１日後 に記録した[Fan等,1996a;1996b;Taylor等,1992]。 腫瘍形成および転移についてのアッセイ：Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ有性生殖マウス(Charl es River Breeding Laboratories,Quebec)を、以前に記載されたように[Fan等， 1996a;Egan等,1987b]これらのアッセイにおいて使用した。細胞を、融合前の対 数増殖期の培養物から調製し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用して穏やかに処 理することによって回収し、適切な濃度に調節した。腫瘍潜伏性を、皮下に細胞 を注射し、触診によって検出可能な腫瘍（２×２ｍｍ）を形成するために必要と される時間を記録することによって測定した。腫瘍をマウスから取り出し、腫瘍 の重量を２１日後に記録した。腫瘍の形成が存在しない場合、マウスを注射の後 ２ヶ月間維持し、それから殺した。転移アッセイのため、細胞を、６−８週齢の Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ有性生殖マウスの尾の静脈内に注射し、肺腫瘍の数の評価を記載 されたように２１日後に実施した[Fan等，1996a;Egan等，198Th]。試験および対 照細胞の等量の数が注射されたことを確認するために、増殖培地を含む二重の培 養プレートに、プレート当たり１００個の細胞を接種した。培養の１０日後、プ レートをメチレンブルーを使用して染色し、コロニーを記録した。 組換えＲ１タンパク質発現の検出：ＢＨＫ細胞における組換えＲ１タンパク質の 一過的発現を検出するために、間接的免疫蛍光アッセイを使用した[Fan等,1996a ,b]。カバースリップ上に増殖している７０％の融合細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ Ａｍｉｎｅ試薬を使用してｐＳＨＤ／ｍＲ１プラスミドを用いてトランスフェク トした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）の リン酸緩衝生理食塩水中に調製した３％ホルムアルデヒドを使用して固定し、０ ．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＰＢＳ中に）を使用して透過性にし、抗Ｍｙ ｃエピトープモノクローナル９Ｅ１０抗体(American Type Cululure Collection )を使用してインキュベートし、洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（完全分子）ＦＩ ＴＣ接合物(Sigma)を使用して反応させ、再び洗浄し、そして最後に蛍光顕微鏡 の下で調べた[Leonhardt等]。[³⁵S]メチオニン／システインラベル化細胞由来の ９Ｅ１０抗体による組換えＲ１の免疫沈降を、以前に記載された方法を使用して 実施した[McClarty等,1990;Goding,1978]。いくつかの実験においては、Ｒ１タ ンパク質レベルを、以前に記載されたように、抗Ｒ１モノクローナル抗体、ＡＤ ２０３を使用したウエスタンブロット分析により測定した[McClarty等,1990;Fan 等,1996a]。 リボヌクレオチドレダクターゼアッセイ：ＳＣ２／ｍＲ１および対照ＳＣ２／Ｓ ＨＤ細胞系から調製された粗抽出物におけるリボヌクレオチドレダクターゼ活性 を、以前に記載されたようにアッセイした[Lewis,1978;HurtaおよびWright,1992 ;Hurta等,1991]。ある実験においては、酵素アッセイを、９Ｅ１０抗体沈降化Ｒ １タンパク質と精製組換えＲ２タンパク質を組み合わせることによって実施した 。表面プロテインＡおよびウサギ抗マウスＩｇＧを有するパンソルビン細胞(ホ ルムアミド固定化スタフィロコッカス、Calbiochem,La Jolla,CA)を、記載され たように調製した[Goding，1978]。さらにこの接合物を、過剰量の９Ｅ１０抗体 を使用してインキュベートし、５回洗浄した。この複合体の１２μｌ（１０％懸 濁液）を、５×１０⁷細胞から調製された１．０ｍｌの抽出物内に加え、４℃で ２時間ロッカー内に置き、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを 使用して３回洗浄し、そして１．０μｇの精製組換えＲ２タンパク質の添加の後 、リボヌクレオチドレダクターゼ活性についてアッセイした[HurtaおよびWright ,1 992;Fan等,1996a;Mann等,1991]。 実施例１ 組換えＲ１の発現：細胞中にＲ１タンパク質を過剰発現するために、哺乳動物発 現ベクターｐＳＨＤ／ｍＲ１を構築した。このベクター中で、ヒトＭｙｃエピト ープ標識化Ｒ１ ｃＤＮＡの発現は、レトロウイルスプロモーター、長い末端繰 り返し配列の制御の下に存在する[Miller等,1993]。組換えＲ１の発現は、一過 性トランスフェクションに引き続きＢＨＫ細胞内で最初に分析された。抗Ｍｙｃ モノクローナル９Ｅ１０抗体を使用した間接的免疫蛍光アッセイにより、ｐＳＨ Ｄ／ｍＲ１トランスフェクト化細胞における組換えＲ１タンパク質の細胞質の発 現が明らかにされた(図１Ａ)。対照として、非トランスフェクト化細胞または空 のベクターｐＬＸＳＨＤでトランスフェクトされた細胞は、いかなる特異的な蛍 光をも示さなかつた。組換えＲ１タンパク質が、哺乳動物内で発現できることを 示した後、我々はレトロウイルスパッケージング細胞を使用することによって、 高い輸送効率を有する、感染性だが複製が欠損したベクターウイルス内に、発現 可能ＤＮＡを変換した。安定なパッケージング系ＰＡ／ｍＲ１における組換えＲ １の発現を再び分析した。９Ｅ１０抗体を使用した免疫沈降により、[35S]メチ オニン／システインを使用して代謝的に標識したＰＡ／ｍＲ１細胞（表１）から 調製された抽出物由来のおよそ８８ｋＤａの単一のタンパク質が検出された(図 １Ｂ)。予期されたように、安定な対照ウイルスパッケージング細胞系ＰＡ／Ｓ ＨＤからは、何のタンパク質も沈降されなかった(図１Ｂ)。これらの結果は、組 換えＲ１タンパク質の安定な発現が達成されたことを示した。 次いで、細胞発現組換えＲ１が生物学的に活性であるかどうかを測定した。こ の研究のために、ヒドロキシウレア耐性マウスＬ細胞系、ＳＣ２を、ＳＨＤ／ｍ Ｒ１またはＬＸＳＨＤウイルスベクターを使用して感染し、安定な感染体を選択 するために使用した(表１)。ＳＣ２細胞は、Ｒ１サブユニットに対してより多く のＲ２を発現するので、この細胞系における生物学的に活性なＲ１タンパク質の 発現は、増大したリボヌクレオチドレダクターゼ活性を引き起こすであろう[Mc Clarty等,1990]。四つの実験において、ＳＣ２／ｍＲ１細胞から調製された粗抽 出物におけるＣＤＰレダクターゼ活性は、１３．２±0．７ｎｍｏｌ／ｍｇタン パク質／時であり、それは対照ＳＣ２／ＳＨＤ細胞から調製された抽出物におけ るものよりおよそ３０％高い(１０．１±０．２ｎｍｏｌ／ｍｇ／時)。さらに、 Ｃ１／ｍＲ１細胞由来の組換えＲ１を、９Ｅ１０抗体を使用して免疫沈降し、精 製組換えＲ２タンパク質と、洗浄免疫沈降物を組み合わせることによって、リボ ヌクレオチドレダクターゼ活性をアッセイするために使用した[HurtaおよびWrig ht,1992;Fan等,1996a;Mann等,1991]。三つの独立の実験において、Ｃ１／ｍＲ１ 細胞（表１）を組換えＲ１のソースとして使用した場合、１５．４±２．０ｐｍ ｏｌ／ｍｇ／時の酵素活性が検出され、予期したように対照Ｃ１／ＳＨＤ（表１ ）細胞を使用した場合には、何の活性も見出されなかった。 実施例２ Ｒ１を過剰発現する細胞による減少した固定した独立性：細胞のトランスフォー メーションは、しばしばインビボでの腫瘍形成の可能性と相関する、インビトロ での固定した独立の増殖によって頻繁に成し遂げられ、増殖の能力によって評価 され、アガー(agar)を含む培地中でコロニーを形成する[Fan等，1996a;Egan等,1 987a]。Ｒ１が細胞トランスフォーメーションにおいて果たす役割を調べるため に、ＰＡ／ｍＲ１ウイルスベクター、または空のウイルス対照ＬＸＳＨＤを使用 して、ＣＩＲＡＳ−１細胞を感染した(表１)。ＣＩＲＡＳ−１細胞は、ガン遺伝 子Ｔ２４ Ｈ−ｒａｓを使用したトランスフェクションによって野生型の非悪性 腫瘍マウス１０Ｔ1/2細胞から由来した[Egan等,1987a]。以前の研究により、そ れは穏やかな悪性新生物細胞系であり、トランスフォーメーションおよび悪性腫 瘍関連性質を分析するための適切なモデルとして機能することができることが示 されている[HurtaおよびWright,1995;Fan等,1996a;Egan等,1987a;Wright等,1993 ]。ヒスチジノール選択の後に得られた安定な感染体を、ソフトアガー増殖能力 について評価した。Ｒ１の上昇したレベルを含むＣ１／ｍＲ１細胞によるソフト アガー中の形成コロニーの効率は、対照Ｃ１／ＳＨＤ細胞と比較した場合有意に 減少したことが見出された(図２)。Ｒ１発現の効果をまた、脱調節化Ｒ２発現を 含む細胞を使用したソフトアガー増殖において試験した。Ｃ１／ｍＲ２は、組換 えＲ２を 発現するＣＩＲＡＳ−１誘導体であり、増大した悪性腫瘍能力を獲得している[F an等,1996a]。再び、上昇したＲ１を有するＣ１／ｍＲ２／ｍＲ１細胞のコロニ ー形成効率が、対照Ｃ１／ｍＲ２細胞と比較した場合、有意に減少したことが観 察された(図２)。 Ｒ１細胞について観察された減少したソフトアガー増殖効率が、相対的に異種 細胞集団由来の固有のより低い増殖効率を有する細胞の選択から由来する可能性 （可能性がないであろうが）を排除するために、Ｃ１／ｍＲ２ａと名付けられた サブクローンを、Ｃ１／ｍＲ２細胞から単離した。二つの細胞系（Ｃ１／ｍＲ２ ／ｍＲ１およひ対照Ｃ１ｍＲ２ａ／ＳＨＤ）は、このサブクローン集団から由来 した(表１)。もともとの系に関する観察と一致して、Ｃ１／ｍＲ２ａ／ｍＲ１細 胞は、対照Ｃ１／ｍＲ２ａ／ＳＨＤ細胞と比較して、ソフトアガーにおける増殖 効率の同様な減少を示した(図２)。これは、減少した固定した独立性が、組換え Ｒ１発現によってもたらされることを示す。 実施例３ 上記試験された細胞系は、マウス起源のものである。ヒト新生物細胞における 組換えＲ１の発現もまた、ソフトアガー増殖能力の変化によって示されるトラン スフォーメーション性質を改変するかどうかを測定するために、ヒト大腸腺ガン Ｃｏｌｏ ３２０ＨＳＲ細胞系[Quinn等,1979]を使用した。これらの細胞を、Ｃ ｏｌｏ／ｍＲ１細胞系を得るために、Ｒ１配列を含むウイルスベクターを使用し て感染した(表１)。興味深いことに、Ｃｏｌｏ／ｍＲ１細胞を使用したソフトア ガー中での増殖効率は、空のベクターを含むＣｏｌｏ／ＳＨＤ細胞と比較した場 合、約５０％まで減少した(図２)。 実施例４ 上昇したＲ１を含む細胞を使用したインビボでの腫瘍形成および／または転移能 力の抑制：さらに、Ｒ１発現の改変が、悪性腫瘍進行において果たす役割を評価 するために、Ｃ１／ｍＲ１細胞の腫瘍形成性及び転移性質をインビボモデルにお いて分析した。Ｃ１／ｍＲ１細胞は、対照Ｃ１／ＳＨＤ細胞と比較した場合、悪 性能力の劇的な減少を示した(表２)。Ｃ１／ＳＨＤ細胞を使用して皮下に注射さ れた全てのマウスが、注射後約１１日目で腫瘍を形成した一方で、Ｃ１／ｍＲ１ 細胞を使用して注射された動物の全てが、注射後２ヶ月以上でさえ検出可能な腫 瘍を形成しなかった。さらに、実験的転移アッセイにより、Ｃ１／ｍＲ１細胞は 、対照Ｃ１／ＳＨＤ細胞と比較して、肺転移の形成でずっと低い効率であること が示された(表２)。同様な実験を、以前に記載されたｒａｓ−３と呼ばれるもう 一つの独立に選択されたＴ２４ Ｈ−ｒａｓトランスフェクト化マウス１０Ｔ１ ／２細胞系を使用して実施した[Taylor等，1992]。ｒａｓ−３細胞における組換 えＲ１の腫瘍抑制活性は、ＣＩＲＡＳ−１由来細胞で観察されたものほど大きく はなかったが、対照ｒａｓ−３／ＳＨＤ細胞と比較して、ｒａｓ−３／ｍＲ１細 胞を使用した腫瘍形成は、増大した腫瘍潜在性およびより小さい腫瘍サイズによ って判断されるように有意に減少した。ＣＩＲＡＳ−１由来細胞と同様に、ｒａ ｓ−３／ｍＲ１細胞は、対照ｒａｓ−３／ＳＨＤ細胞と比較して、著しく減少し た転移能力を示した(表２)。 脱調節化Ｒ２発現を含む細胞を使用した悪性腫瘍能力に対する組換えＲ１発現 の効果を、インビボでも試験した。以前の観察と一致して、Ｃ１／ｍＲ２細胞は 、対照Ｃ１／ＳＨＤ細胞よりもより高い腫瘍形成および転移能力を示し、Ｒ２の 悪性腫瘍促進機能を確認した[Fan等,1996a]。Ｃ１／ｍＲ２／ｍＲ１細胞が、対 照Ｃ１／ｍＲ２細胞よりもずっと少なく悪性的であるというインビトロ実験で得 られたデータとも一致した(表２)。さらに、Ｃ１／ｍＲ２／ｍＲ１細胞の腫瘍形 成および転移能力の両者は、Ｃ１／ＳＨＤ細胞のものよりも有意に低いレベルに 減少した(表２)。 次いで、複数のガン遺伝子改変を含む高い悪性新生物細胞系の悪性腫瘍性質を 改変する、組換えＲ１発現の潜在的能力を試験した。活性化Ｈ−ｒａｓ、ｃ−ｍ ｙｃおよびｐ５３の突然変異されたガン遺伝子形態の組み合わせを使用してトラ ンスフェクトされているＲＭＰ−６マウス１０Ｔ１／２系は、よく特徴付けされ ており[Taylor等,1992;Huang等,1995]、これらの研究で使用された。研究された 上記Ｒ１過剰発現細胞系とは異なり、ＲＭＰ／ｍＲ１細胞（表１）は、対照ＲＭ Ｐ／ＳＨＤ細胞（表２）と比較した場合、腫瘍形成性の変化を示さなかった。こ れらのインビボの結果と一致して、ＲＭＰ／ｍＲ１およびＲＭＰ／ＳＨＤ細胞は 、ソフトアガー増殖実験においてほぼ同様のコロニー形成効率を有することが観 察された。しかしながら興味深いことに、ＲＭＰ／ｍＲ１細胞は、実験的転移ア ッセイにおいて対照ＲＭＰ／ＳＨＤ細胞よりも有性生殖マウスにおける有意によ り少ない肺腫瘍を形成した(表２)。肺腫瘍が、ＲＭＰ／ｍＲ１細胞を使用して注 射されたマウスの肺で形成されたものより、ＲＭＰ／ＳＨＤ細胞を受け取ったマ ウスにおいて一般的により大きいため、表２に示される肺転移の数の差異は、実 際に見積もりより小さいものであった。これらの結果は、高く悪性腫瘍のＲＭＰ −６細胞においてR1の過剰発現が、著しく転移能力を抑制することを示す。 実施例５ アンチセンス配向におけるＲ１を発現するガン遺伝子ｒａｓトランスフェクト細 胞を使用した増大した固定した独立性：アンチセンス配列の発現は、下流調節遺 伝子発現を達成するために一般的に使用されるアプローチである[Speamlan等,19 94;WrightおよびAnazodo,1996]。もしＲ１が、上記指摘のように細胞トランスフ ォーメーションを阻害できるのであれば、Ｒ１アンチセンス配列の発現は、Ｒ１ タンパク質のレベルを減少し、さらにトランスフォーメーション性質を増大する 。これを試験するために、Ｒ１配列がベクタープロモーターに対してアンチセン ス配向で置かれている発現ベクターを構築した。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、アンチ センスベクター、およびＴ２４ Ｈ−ｒａｓガン遺伝子を発現するｐＨ０６Ｔｉ プラスミドを使用して共トランスフェクトした[Egan等,1987a]。Ｈ−ｒａｓ発現 は、増殖培地を含むソフトアガーにおいてコロニーを形成可能であるように、哺 乳動物細胞をトランスフォームした[Fan等,1996a;Egan等,1987a]。Ｇ４１８を使 用した選択の後に得られた安定な共トランスフェクト物を、固定した独立の増殖 について評価した。上記記載の実験で得られた結果と一致して、Ｒ１アンチセン スを含むＮ／ｒａｓ＆ＡＳＲ１細胞は、Ｒ１アンチセンス配列の不存在下のＨ− ｒａｓガン遺伝子を含む対照Ｎ３／ｒａｓ細胞と比較して、ソフトアガーにおけ る劇的に高いコロニー形成効率を示した(図３)。ウエスタンブロット分析（図４ ）およびノーザンブロット分析により、予期されたように、Ｎ／ｒａｓ細胞より も Ｎ／ｒａｓ＆ＡＳＲ１細胞においてＲ１の低い発現が示された。プラスチック培 養プレートの表面上のＮ／ｒａｓ＆ＡＳＲ１およびＮ／ｒａｓ細胞の増殖速度は 、１４から１６時間の倍化速度を有してほぼ同じであった。 この応用を通じて、米国特許を含む様々な文献が、著者および年及び数字によ る特許によって参考にされている。文献の完全な引用は以下に掲載されている。 本発明が関連する分野の状況をより十分に記載するために、これらの文献および 特許の開示は、完全にここで本出願内に参考として取り込まれる。 本発明は説明的な方法で記載されており、使用されている方法体系は制限する ためよりむしろ記載の用語の性質において企図されるものと理解されるべきであ る。 明らかに、本発明の多くの修飾および変異型が、上記教示に照らして考え得る 。従って、添付した特許請求の範囲内で、本発明が特異的な記載以外の他のもの で実施されることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヨン，アイピン エイチ カナダ・オンタリオ・Ｍ２Ｎ・６Ｖ４・ト ロント・グランドヴュー・ウェイ・88・ア パートメント・508

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 哺乳動物における新生物細胞の腫瘍形成を調節するための、哺乳動物のリ ボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能核酸配列の有効量の使用。 ２． 哺乳動物細胞における新生物細胞の腫瘍形成を調節するための、哺乳動物 のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能核酸配列の有効量、およ び製薬学的生理学的に許容可能な担体または希釈液を含む製薬学的組成物の使用 。 ３． 哺乳動物における新生物細胞増殖を阻害するための、哺乳動物のリボヌク レオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能核酸配列の有効量の使用。 ４． 哺乳動物における新生物細胞増殖を阻害するための、哺乳動物のリボヌク レオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能核酸配列の有効量、および製薬学的 生理学的に許容可能な担体または希釈液を含む製薬学的組成物の使用。 ５． 哺乳動物における遺伝子治療のための、哺乳動物のリボヌクレオチドレダ クターゼＲ１に対する発現可能核酸配列の有効量の使用。 ６． 哺乳動物における遺伝子治療のための、哺乳動物のリボヌクレオチドレダ クターゼＲ１に対する発現可能核酸配列の有効量、および製薬学的生理学的に許 容可能な担体および希釈液を含む製薬学的組成物の使用。 ７． 該核酸配列がベクターの形態で存在することを特徴とする請求項１から６ のいずれか一項に記載の使用。 ８． 該核酸配列が配列番号１であることを特徴とする請求項１から７のいずれ か一項に記載の使用。 ９． 該核酸配列が配列番号１由来のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１タンパ ク質に対するコード領域であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項 に記載の使用。 １０． 該コード領域がリボヌクレオチドレダクターゼＲ１の生物学的に活性な ペプチドをコードするように修飾されていることを特徴とする請求項９に記載の 使用。 １１． 該コード領域がリボヌクレオチドレダクターゼＲ１の生物学的に活性な 類似体をコードするように修飾されていることを特徴とする請求項９に記載の使 用。 １２． 哺乳動物における新生物細胞の腫瘍形成を調節するための、哺乳動物の リボヌクレオチドレダクターゼＲ１の有効量の使用。 １３． 哺乳動物における新生物細胞の腫瘍形成を調節するための、哺乳動物の リボヌクレオチドレダクターゼＲ１の有効量、および製薬学的生理学的に許容可 能な担体または希釈液を含む製薬学的組成物の使用。 １４． 哺乳動物における新生物細胞増殖を阻害するための、哺乳動物のリボヌ クレオチドレダクターゼＲ１の有効量の使用。 １５． 哺乳動物における新生物細胞増殖を阻害するための、哺乳動物のリボヌ クレオチドレダクターゼＲ１の有効量、および製薬学的生理学的に許容可能な担 体または希釈液を含む製薬学的組成物の使用。 １６． 該リボヌクレオチドレダクターゼＲ１が生物学的に活性な類似体または 誘導体であることを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一項に記載の使用 。 １７． 該リボヌクレオチドレダクターゼＲ１類似体または誘導体が組換え的に 生産されることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載の使用。 １８． 該哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項１から１７のいずれか 一項に記載の使用。 １９． 遺伝子治療のためのベクターを生産するための、哺乳動物の配列番号１ に示されたリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対するコード配列を有する発現 可能核酸配列の有効量の使用。 ２０． 哺乳動物のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対する発現可能核酸配 列の有効量、および製薬学的生理学的に許容可能な担体または希釈液より成る、 哺乳動物の新生物細胞増殖を阻害するための製薬学的組成物。 ２１． 該発現可能核酸配列が遺伝子治療のためのベクターに含まれることを特 徴とする請求項２０に記載の製薬学的組成物。 ２２． 該核酸配列が配列番号１であることを特徴とする請求項２０に記載の製 薬学的組成物。 ２３． 該核酸配列が配列番号１由来のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１タン パク質に対するコード領域であることを特徴とする請求項２０または２１に記載 の製薬学的組成物。 ２４． リボヌクレオチドレダクターゼＲ１の有効量、および製薬学的生理学的 に許容可能な担体または希釈液より成る、哺乳動物における新生物細胞増殖を阻 害するための製薬学的組成物。 ２５． 該リボヌクレオチドレダクターゼＲ１が組換え的に生産されることを特 徴とする請求項２４に記載の製薬学的組成物。 ２６． 該リボヌクレオチドレダクターゼＲ１が生物学的に活性な類似体または 誘導体であることを特徴とする請求項２４に記載の製薬学的組成物。 ２７． 該生物学的に活性な誘導体がペプチドであることを特徴とする請求項２ ６に記載の製薬学的組成物。 ２８． 新生物細胞をリボヌクレオチドレダクターゼＲ１の増殖調節量と接触さ せることによって、哺乳動物における上記新生物細胞の腫瘍形成を調節する方法 。 ２９． 該哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。 ３０． 該リボヌクレオチドレダクターゼＲ１が組換え的に生産されることを特 徴とする請求項２８に記載の方法。 ３１． 該リボヌクレオチドレダクターゼＲ１が生物学的に活性な類似体または 誘導体であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。 ３２． 新生物細胞を、哺乳動物のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対する 発現可能核酸配列の増殖調節量と接触させることによって、哺乳動物における上 記新生物細胞の腫瘍形成を調節するための方法。 ３３． 該哺乳動物がヒトであることを特微とする請求項３２の方法。 ３４． 該発現可能核酸配列が遺伝子治療のためのベクターに含まれることを特 徴とする請求項３２に記載の方法。 ３５． 該核酸配列が配列番号１であることを特徴とする請求項３２に記載の方 法。 ３６． 該核酸配列が配列番号１由来のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対 するコード領域であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。 ３７． 該コード領域がリボヌクレオチドレダクターゼＲ１の生物学的に活性な ペプチドをコードするように修飾されることを特徴とする請求項３２に記載の方 法。 ３８． 該コード領域がリボヌクレオチドレダクターゼＲ１の生物学的に活性な 類似体をコードするように修飾されることを特徴とする請求項３２に記載の方法 。