NO970041L

NO970041L - Pattedyr-telomerase

Info

Publication number: NO970041L
Application number: NO970041A
Authority: NO
Inventors: Bryant Villeponteau; Junli Feng; Walter Funk; William H Andrews
Original assignee: Geron Corp
Priority date: 1994-07-07
Filing date: 1997-01-06
Publication date: 1997-03-06
Also published as: WO1996001835A1; BG63573B1; UA47407C2; KR100789741B1; NZ289720A; CA2194393A1; PL181019B1; CA2194393C; NO970041D0; CN1231491C; CN1158617A; HUT78054A; DK0778842T3; EP0778842B1; JP4068861B2; EP0778842A4; KR20050058527A; AU2964795A; EP0778842A1; JP2002272489A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører human telomerase, et ribonukleoproteinenzym som er involvert i human telomer DNA-syntese. Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter og blandinger som har relasjon til feltet molekylær biologi, kjemi, farmakologi og medisinsk og diagnostisk teknologi.

Beskrivelse av teknikkens stand

DNA i endene eller telomerene av kromosomer i eukaryoter består vanligvis

av tandem-repeterte enkle sekvenser. Telomerase er et ribonukleoproteinenzym som syntetiserer én kjede av det telomere DNA ved som templat å benytte en sekvens som inngår i enzymets RNA-komponent. Se Blackburn, 1992, Annu. Rev. Biochem. 61:113-129, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

RNA-komponenten av human telomerase har hittil ikke vært rapportert i vitenskapelig litteratur, selv om det er kjent at human telomerase syntetiserer telomere repetisjonsenheter med sekvensen 5'-TTAGGG-3'. Se Morin, 1989, Cell 59:521-529 og Morin, 1991, Nature, 353:454-456, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Denne kunnskap har ikke vært tilstrekkelig til å muliggjøre isolering og identifikasjon av resten av nukleotidsekvensen av RNA-komponenten av human telomerase. RNA-komponenten av telomerase-enzymer av Saccharomyces cerevisiae, visse arter av Tetrahymena, så vel som den for andre ciliater, så som Euploter og Glaucoma, har vært sekvensert og rapportert i den vitenskapelige litteratur. Se Singer & Gottschling, 21. oktober, 1994, Science 266:404-409; Lingner et al. 1994 Genes & Development 8:1984-1988; Greider & Blackburn, 1989, Nature 337:331-337; Romero & Blackburn, 1991, Cell 67:343-353; og Shippen-Lentz & Blackburn, 1990, Science 247:546-552, som alle med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Telomerase-enzymer av disse ciliatene syntetiserer telomere repetisjonsenheter som adskiller seg fra menneskets.

Det foreligger et stort behov for mer informasjon om human telomerase. På tross av den tilsynelatende enkle natur av repetisjonsenhetene av telomer DNA, har forskere lenge visst at telomerer har en viktig biologisk rolle når det gjelder å opprettholde kromosomstruktur og funksjon. Mer nylig har forskere vurdert hvorvidt tapet av telomer DNA kan virke som en utløser av cellulær aldring, og at regulering av telomerase kan ha viktige biologiske implikasjoner. Se Harley, 1991, Mutation Research 256:271-282, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

Fremgangsmåter for å påvise telomeraseaktivitet så vel som for å identifisere forbindelser som regulerer eller påvirker telomeraseaktiviteten, sammen med metoder for terapi og diagnostisering av cellulær aldring og udødeliggjøring ved å kontrollere telomerlengde og telomeraseaktivitet, har også vært beskrevet. Se PCT patentpublikasjon nr. 95/13381, publisert 18. mai, 1995; 95/13382, publisert 18. mai, 1995 og 93/23572, publisert 25. november, 1993 og US-patentsøknad serie nr. ikke tildelt (oppfinnere se C.Harley, N. Kim, S. Weinrich), av 7. juni, 1995; 08/315.214, av 28. september, 1994; 08/315.216, av 28. september, 1994; 08/288.501, av 10. august, 1994; 08/014.838, av 8. februar, 1993; 08/153.051 og 08/151.477 alle av 12. november, 1993; 08/060.952, av 13. mai, 1993; 08/038.766, av 24. mars, 1993 og 07/882.438 av 13. mai, 1992, som alle herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

Betydelige forbedringer og nye muligheter for telomerase-medierte terapier og telomerase-bestemmelses- og screeningmetoder ville kunne realiseres dersom nukleinsyrer som omfatter RNA-komponenten og/eller som koder for proteinkomponentene av telomerase, hadde vært tilgjengelige i ren eller isolerbar form og nukleotidsekvensene for slike nukleinsyrer hadde vært kjent. Foreliggende oppfinnelse imøtekommer disse og andre behov og gir slike forbedringer og muligheter.

Sammenfatning av oppfinnelsen

I henhold til et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse RNA-komponenten, så vel som genet for RNA-komponenten, av human telomerase i tilnærmet ren form, så vel som nukleinsyrer som omfatter hele eller i det minste en anvendelig del av nukleotidsekvensen av RNA-komponenten av human telomerase. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også RNA-komponent-nukleinsyrer fra andre arter, hvor disse nukleinsyrene har tilnærmet felles homologi med RNA-komponenten for human telomerase, inklusivt, men ikke begrenset til, RNA- komponenter av pattedyr, så som primater. Andre anvendelige nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen innbefatter nukleinsyrer med sekvenser som er komplementære til RNA-komponenten; nukleinsyrer med sekvenser som er beslektet med, men klart forskjellige fra, nukleotidsekvenser av RNA-komponenten og som på en anvendelig måte gir interaksjon med RNA-komponenten eller genet for RNA-komponenten eller proteinkomponentene av human telomerase; samt nukleinsyrer som ikke har vesentlig sekvenshomologi eller komplementaritet med RNA-komponenten eller genet for RNA-komponenten, men virker på RNA-komponenten på en ønskelig og anvendelig måte. Som beskrevet mer fullstendig nedenfor, inkluderer nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen både DNA- og RNA-molekyler og modifiserte analoger av begge, og tjener en rekke anvendelige formål.

En type anvendelig nukleinsyre ifølge oppfinnelsen er et antisense oligonukleotid, et trippelheliks-dannende oligonukleotid eller annet oligonukleotid

eller oligonukleotid-mimetikum (f.eks. antisense PNA - peptid-nukleinsyre/polyamid-nukleinsyre) som in vivo eller in vitro kan benyttes til å inhibere virkningen av human telomerase. Slike oligonukleotider kan blokkere telomeraseaktiviteten på flere måter, inklusivt ved å forhindre transkripsjon av telomerase-genet (for eksempel ved trippelheliks-dannelse) eller ved å binde seg til telomerasens RNA-komponent på en måte som forhindrer en funksjonell ribonukleoproteintelomerase i å settes sammen eller forhindrer RNA-komponenten når den først er satt sammen til telomerase-enzymkomplekset, fra å tjene som templat for telomer DNA-syntese. Disse oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter typisk, og avhengig av virkningen, en spesifikk sekvens av fra ca. 10 til ca. 25 opp til 200 eller flere, nukleotider som enten er identiske eller komplementære med en spesifikk sekvens av nukleotider i telomerasens RNA-komponent eller genet for telomerasens RNA-komponent.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen antisense polynukleotider som er komplementære til telomerase-RNA-komponentens polynukleotidsekvenser, i alminnelighet komplementære til polynukleotidsekvenser som i det vesentlige er identiske med en naturlig forekommende telomerase-RNA-komponent-gensekvens i pattedyr. Slike antisense polynukleotider benyttes til å inhibere transkripsjon og/eller stabilitet og/eller funksjonalitet av telomerase-RNA-komponentarter og bevirker derved en reduksjon i mengden av den respektive telomeraseaktivitet i en celle

(f.eks. en neoplastisk celle i en pasient). Slike antisense polynukleotider kan virke som telomerase-modulerende midler ved å inhibere dannelsen av funksjonelt (katalytisk aktivt og høyst pålitelig) telomerase-holoenzym som fordres for korrekt telomer replikasjon og reparasjon i en celle. Antisense polynukleotider kan kombineres med andre antineoplastiske terapeutiske modaliteter, så som ioniserende bestråling eller kjemoterapi (f.eks. med et DNA-ødeleggende middel f.eks. bleomycin, cisplatin, nitrogen-sennepsgass, doksyrubicin, nukleotid-analoger og lignende). Antisense polynukleotider kan fremskynde celledød i følsomme celler (f.eks. replikerende celler som fordrer telomeraseaktivitet for DNA-reparasjon eller replikasjon). Antisense polynukleotidene er i det vesentlige identiske med minst 25 sammenhengende nukleotider av den komplementære sekvens av en pattedyr telomerase-RNA-sekvens som her er beskrevet. Antisense polynukleotidene er typisk ssDNA, ssRNA, metylfosfonat-skjelett polynukleotider, fosforotiolat-skjelett polynukleotider, blandede skjelett-polynukleotider, polyamid-nukleinsyrer og lignende kjente antisense-strukturer. I henhold til et aspekt ved oppfinnelsen, administreres et antisense polynukleotid for å inhibere transkripsjon og/eller aktivitet av telomerase-RNA-komponenten og telomeraseaktivitet i en celle, som f.eks. i en replikerbar humancelle.

Ifølge en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et templat-mistilpasset polynukleotid som har en sekvens som i det vesentlige er identisk med en pattedyr-RNA-komponent av telomerase og som omfatter en telomer repeterende templatsekvens som har minst én mistilpasset base i forhold til, men forøvrig komplementær til, menneskets telomerase-repetisjonssekvens 5'-TTAGGGG-3'. Et typisk templat-mistilpasset polynukleotid omfatter en enkelt nukleotid-mistilpasning i den naturlig forekommende templatsekvens og kan omfatte to nukleotid-mistilpasninger i templatsekvensen enten som nabostillede mistilpassede nukleotider eller mistilpassede nukleotider som er adskilt av én eller flere passende (komplementære) nukleotider. Templat-mistilpassede polynukleotider ifølge oppfinnelsen kan i alminnelighet oppvise telomeraseaktivitet sammen med human telomerase-polypeptidkomponent og derved frembringe feilinkorporering i utvalgte (mistilpassede) nukleotidposisjoner i den humane telomerase-repetisjonssekvens etter telomer-repetisjons-replikasjon, reparasjon og/eller addisjon, og således utvikle telomerer som er basert på det kontinuerlige nærvær av den muterte sense telomerase-RNA-komponent for vesentlig replikasjon og vedlikehold av telomerlengde.

En annne type av nyttig nukleinsyre i henhold til oppfinnelsen, er et ribozym som er i stand til spesifikt å spalte RNA-komponenten av human telomerase og dermed gjøre enzymet inaktivt. Nok en type nyttig nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, er en probe eller primer som spesifikt binder seg til RNA-komponenten av human telomerase og således f.eks. kan benyttes for å påvise nærvær av telomerase i en prøve. Endelig inkluderer nyttige nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen rekombinante ekspresjonsplasmider for fremstilling av nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen. En spesielt anvendelig type av et slikt plasmid er et plasmid som benyttes for human genterapi. Anvendelige plasmider for human genterapi kan ifølge oppfinnelsen være av en rekke forskjellige typer som ikke bare inkluderer slike som koder antisense oligonukleotider eller ribozymer, men også de som driver ekspresjon av RNA-komponenten av human telomerase,. eller en deletert eller på annen måte endret (mutert) versjon av RNA-komponenten av human (eller andre arter med RNA-komponentsekvens som i det vesentlige er homolog med den humane RNA-komponent) telomerase eller genet for denne.

Ifølge en utførelsesform derivatiseres et polynukleotid som har en komplementær del til en pattedyr telomerase-RNA-komponent som er tilstrekkelig til spesifikt å hybridisere under fysiologiske betingelser, ved kovalent tilkobling av en ytterligere kjemisk substituent, enten under eller etter, polynukleotidsyntesen slik at det dannes et derivatisert polynukleotid som er i stand til spesifikt å hybridisere til den nevnte telomerase-RNA-komponent. Det derivatiserte polynukleotid kan søke seg til endogene telomeraser som har nevnte RNA-komponent, hvor det nevnte derivatiserte polynukleotid produserer en endring eller kjemisk modifikasjon av RNA-komponenten og/eller proteinkomponenten av telomerase og derved modifiserer, ofte ved å redusere, telomerase-enzymaktiviteten.

Ifølge en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen nukleotider som er egnet til å diagnostisere sykdommer assosiert med avvikende telomerase-RNA-komponent-overflod og/eller -struktur. Polynukleotidprober omfattede sekvenser som i det vesentlige er identiske med eller tilnærmet komplementære til, nukleotidsekvensen av en telomerase-RNA-komponent fra pattedyr, kan benyttes til diagnostisering av sykdomstilstander (f.eks. neoplasi eller preneoplasi) ved å påvise telomerase-RNA-komponent-overflod og/eller telomerase-RNA-komponent-strukturendringer (f.eks. avkortning, sekvensvariasjoner, delesjoner eller insersjoner og lignende) og/eller omleiringer eller amplifisering av telomerase-RNA-komponent-genet i celler eksplantert fra en pasient, eller påvisning av et patognomonisk pattedyr telomerase-RNA-komponent allel (f.eks. ved RFLP eller allel-spesifikk PCR-analyse). Påvisningen vil ofte skje ved in situ hybridisering ved å benytte et merket (f.eks.32P,3<5>S,1<4>C,<3>H, fluorescerende, biotinylert, digoksygeninylert) antisense polynukleotid som er komplementært til en pattedyr telomerase-RNA-komponent, selv om også northem blotting, dot-blotting eller løsningshybridisering foretatt på samlet RNA eller poly A<+>RNA isolert fra en celleprøve, kan benyttes, i likhet med PCR- eller LCR-amplifikasjon under bruk av telomerase-RNA-komponentspesifikke primere. Celler som inneholder en endret mengde (ofte en betydelig økning) av telomerase-RNA-komponent sammenlignet med ikke-neoplastiske celler av samme celletype, identifiseres som kandidat til syke celler, som f.eks. pre-neoplastiske eller faktisk neoplastiske celler, og kan identifiseres som celler som har metastatisk evne. Tilsvarende vil påvisningen av patognomoniske omleiringer eller amplifikasjon av telomerase-RNA-komponent-genlocuset eller nær forbunde loci i en celleprøve, identifisere forekomsten av en patologisk tilstand eller en predisponering for utvikling av en patologisk tilstand (f.eks. kreft, genetisk sykdom). Telomerase-RNA-komponent-polynukleotidprober benyttes også for rettsmedisinsk identifisering av individer, som ved farskapsbestemmelse eller identifikasjon av kriminelle eller av ukjente forfedre.

I henhold til et andre aspekt tilveiebringer oppfinnelsen metoder for behandling av en tilstand assosiert med telomeraseaktiviteten i en celle eller cellegruppe, ved å kontakte cellene med en terapeutisk effektiv mengde av et middel som endrer telomeraseaktiviteten i vedkommende celle. Slike midler innbefatter telomerase-RNA-komponent-kodende nukleinsyrer, trippelheliks-dannende oligonukleotider, antisense oligonukleotider, ribozymer og plasmider og andre gen-terapivektorer (f.eks. adenovirale vektorer, adeno-assosierte virale vektorer, etc.) for human genterapi, ved ekspresjon av en telomerase-RNA-komponent, antisense RNA til telomerase-RNA-komponent eller mistilpasset telomerase-RNA-komponent som beskrevet ovenfor. I henhold til et aspekt relatert til dette, tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske blandinger om omfatter disse terapeutiske midlene sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller et akseptabelt salt, som kan innbefatte formulering i et lipofeksjonskompleks, liposom eller immun-liposom for målrettet avgivelse av det terapeutiske middel. Oppfinnelsen tilveiebringer også kombinasjoner av slike telomerase-medierte terapeutiske midler med andre farmasøytika, så som anti-neoplastiske midler og andre cytotoksiske eller cytostatiske midler, sopp-hindrende midler (f.eks. for behandling av AIDS-pasienter); nukleotider, nukleosider og analoger derav; samt andre farmasøytiske midler egnet for behandling av slike sykdomstilstander som neoplasi, hyperplasi, HIV-infeksjon, AIDS og assosierte patologiske tilstander og andre sykdommerkarakterisert vedunormal telomer metabolisme. Metodene kan omfatte anvendelsen av et derivatisert polynukleotid som er i stand til spesifikt å hybridisere til en telomerase-RNA-komponent i en pattedyr-telomerase, hvori det derivatiserte polynukleotid avgis til pattedyrceller som har telomeraseaktivitet og inhiberer telomeraseaktivitet ved å søke seg til telomerase-RNA-komponenten og inaktivere eller inhibere telomeraseaktivitet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også terapeutiske midler som inhiberer neoplasi eller apoptose ved å modulere telomerasefunksjonen ved å inhibere eller øke dannelsen av telomerase-RNA-komponent, og slike midler kan benyttes som farmasøytika. Slike farmasøytika vil bli benyttet til behandling av en rekke human- og veterinærmedisinske sykdommer, som f.eks.: neoplasi, hyperplasi, neurodegenerative sykdommer, aldring, AIDS, soppinfeksjon og lignende. Ifølge en utførelsesform består midlet av en genterapivektor som er i stand til transkribering av en telomerase-RNA-komponentsekvens eller dens komplement, eller alternativt en enzymatisk inaktiv telomerase-RNA-komponent som gjennom konkurranse kan inhibere dannelsen av et funksjonelt telomerase-holoenzym.

I henhold til en tredje aspekt tilveiebringer oppfinnelsen diagnostiske metoder for bestemmelse av nivået, mengden eller nærværet av RNA-komponenten av human telomerase, av telomerase eller av telomeraseaktivitet i en celle, en cellepopulasjon eller vevsprøve eller et ekstrakt av en av disse. I henhold til et relatert aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nyttige reagenser for slike metoder (inklusivt de ovenfor angitte primere og prober), eventuelt pakket i form av sett sammen med instruksjoner for hvorledes den diagnostiske metode skal foretas.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en metode for diagnostisering av en sykdom (f.eks neoplasi) i en pasient, hvor en diagnostisk bestemmelse (f.eks. in situ polynukleotid-hybridisering av fikserte celler ved hjelp av en merket telomerase-RNA-komponent-probe som spesifikt binder human telomerase-RNA-komponent-eller gen-sekvenser) benyttes til å bestemme hvorvidt en forutbestemt patognomonisk konsentrasjon av telomerase-RNA-komponent foreligger i en biologisk prøve fra vedkommende pasient. Dersom bestemmelsen indikerer nærvær av telomerase-RNA-komponent utenfor normalområdet (f.eks. utenfor den på forhånd bestemte patognomoniske konsentrasjon) vil diagnosen være at pasienten har en sykdomstilstand eller predisposisjon for denne.

I henhold til en utførelsesform anvendes polynukleotider ifølge oppfinnelsen for diagnostisering av patologiske tilstander eller genetiske sykdommer som involverer neoplasi, hyperplasi, prematur eller unormal cellulær aldring eller andre medisinske tilstander relatert til telomerasefunksjon, nærmere bestemt tilstander og sykdommer som involverer endringer i struktur eller rikelighet av en telomerase-RNA-komponent- eller gensekvens, eller som er bundet til et patognomonisk telomerase-RNA-komponent-allel som kan påvises ved RFLP og/eller allel-spesifikk PCR eller annen egnet påvisningsmetode. I typiske tilfeller benyttes metoden for diagnostisering av en sykdom (f.eks. neoplasi) i en human pasient, hvor en diagnostisk bestemmelse (f.eks. bestemmelse av mengde og/eller struktur av telomerase-RNA-komponenten) benyttes for å bestemme om en på forhånd fastlagt patognomonisk konsentrasjon eller struktur av telomerase-RNA-komponenten forekommer i celler i en biologisk prøve fra vedkommende pasient, idet diagnosen dersom bestemmelsen indikerer nærvær av en patognomonisk mengde av telomerase-RNA-komponenten utenfor normalområdet (f.eks. utenfor den på forhånd fastlagte patognomoniske konsentrasjon), vil være at pasienten har en sykdomstilstand eller er predisponert for sykdommen.

I henhold til et fjerde aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse rekombinante telomerasepreparater og fremgangsmåter for fremstilling av slike preparater. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en rekombinant human telomerase som omfatter proteinkomponentene av human telomerase så vel som proteinkomponentene av telomerase fra en pattedyrart med en RNA-komponent som er tilnærmet homolog med RNA-komponenten av human telomerase sammen med en rekombinant RNA-komponent ifølge oppfinnelsen. Slike rekombinante RNA-komponentmolekyler ifølge oppfinnelsen inkluderer de som adskiller seg fra naturlig forekommende RNA-komponentmolekyler ved én eller flere basesubstitusjoner, delesjoner, terminale addisjoner og/eller insersjoner så vel som RNA-komponentmolekyler som er identiske med et naturlig forekommende RNA-komponentmolekyl som produseres i rekombinante vertsceller. Fremgangsmåten for fremstilling av slike rekombinante telomerasemolekyler omfatter transformering av en eukaryot vertscelle som uttrykker proteinkomponentene av telomerase, med en rekombinant ekspresjonsvektor som koder for et RNA-komponentmolekyl ifølge oppfinnelsen, og dyrkning av den nevnte celle som er transformert med nevnte vektor, under slike betingelser at telomeraseproteinkomponenten og telomerase-RNA-komponenten uttrykkes og settes sammen under dannelse av et aktivt telomerasemolekyl som er i stand til å addere sekvenser (ikke nødvendigvis den samme sekvens som er addert av nativ telomerase) til telomerer av kromosomal

DNA.

I henhold til et femte aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for rensing av proteinkomponenter av human telomerase, så vel som proteinkomponentene av telomerase fra en pattedyrart med en RNA-komponent som er tilnærmet homolog med RNA-komponenten av human telomerase. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for isolering og identifisering av nukleinsyrer som koder for slike proteinkomponenter. I henhold til aspekter relatert til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse renset human telomerase og renset telomerase fra pattedyrarter med en RNA-komponent som er tilnærmet homolog med RNA-komponenten av human telomerase, så vel som rensede nukleinsyrer som koder for én eller flere komponenter av slike telomerasepreparater. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også farmasøytiske blandinger som omfatter proteinkomponentene av telomerase eller en nukleinsyre som koder eller gir interaksjon med en nukleinsyre som koder for en proteinkomponent av telomerase, som virkestoff.

I henhold til et sjette aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for identifisering av midler som modulerer (dvs. inhiberer, øker eller endrer spesifisiteten) av pattedyr-telomeraseaktivitet. Slike telomerase-modulerende midler er ofte små molekyler (f.eks. mindre enn ca. 3000 dalton) og kan benyttes til å modifisere telomeraseaktivitet in vitro og in vivo, ofte for terapeutisk effekt, og som benyttes som laboratoriereagenser og/eller farmasøytika.

I henhold til en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter som ut fra en bank eller bibliotek av midler, identifiserer kandidatmidler som modulerer telomeraseaktivitet ved å modulere den ikke kovalente binding av en pattedyr-telomerase-RNA-komponent til en telomerase-proteinkomponent. Telomerase-RNA-komponenten kan om ønskes produseres ut fra en rekombinant templat i en vertscelle eller syntetiseres kjemisk. En pattedyr-telomerase-proteinkomponent som f.eks. en som kan renses fra telomerase-uttrykkende celler og hvorfra en naturlig forekommende telomerase-RNA-komponent kan være fjernet (f.eks. ved RNAase behandling) bringes i alminnelighet i kontakt med en pattedyr-telomerase-RNA-komponent under egnede vandige bindingsbetingelser som muliggjør ikke-kovalent binding mellom RNA- og proteinkomponenten uten nærvær av et tilsatt middel (dvs. i en kontroll-bindingsreaksjon). Graden av ikke-kovalent interaksjon mellom telomerase-RNA-komponenten og proteinkomponenten i nærvær av én eller flere midler valgt fra et bibliotek eller en bank av midler sammenlignes med graden av ikke-kovalent interaksjon i en kontroll-bindingsreaksjon som omfatter telomerase-RNA- og proteinkomponenter og mangler de nevnte midler; midler som fører til en statistisk signifikant økning i graden av ikke-kovalent binding mellom telomerase-RNA- og proteinkomponent bestemmes derved som kandidat for et telomerase-modulerende middel. Den relative grad av ikke-kovalent binding kan bestemmes ved hjelp av en hvilken som helst passende metode, inklusivt bestemmelse av spesifikk bindingsaffinitet, så som ved kompetitiv bindingsbestemmelse, bestemmelse av telomerase-katalytisk aktivitet på en egnet telomer-repetisjonstemplat, eller annen eget bestemmelse av funksjonell ikke- kovalent interaksjon mellom RNA- og proteinkomponenten av pattedyr-telomerase, så som en gel-forskyvning eller EMSA (electrophoretic mobility shift assay).

I henhold til en utførelsesform av en ikke-kovalent bindingsbestemmelse for å påvise kandidater for telomerase-modulerende midler, merkes den ene eller begge telomerase-RNA-komponenter eller proteinkomponenter med en egnet påvisbar merking, og ikke-kovalent binding bestemmes separat med eller uten nærvær av et middel valgt fra et bibliotek eller bank av midler. Bestemmelsen av ikke-kovalent binding omfatter måling av i hvilken grad en merket telomerase-komponent (RNA-komponent eller proteinkomponent) er bundet til dens beslektede telomerase-komponent (henholdsvis proteinkomponent eller RNA-komponent), hvorvidt nevnte beslektede telomerase-komponent er separat merket eller umerket, som ved innfangning (f.eks. immobilisering) av bundne komplekser som omfatter nevnte merkede telomerase-komponent og nevnte beslektede telomerase-komponent, og separering (f.eks. ved vasking) av ubundet merket telomerase-komponent fra nevnte bundne kompleks slik at det frembringes en fraskilt bundet fraksjon, og påvisning av det bundne kompleks i den fraskilte bundne fraksjon ved å bestemme nærværet av påvisbar merking. Midler som forårsaker en statistisk signifikant reduksjon eller økning av ikke-kovalent binding av telomerase-RNA- og proteinkomponent identifiseres derved som kandidat for telomerase-modulerende midler. Midler som reduserer ikke-kovalent binding er telomerase (inhibitor- eller antagonist-) kandidater, mens midler som øker ikke-kovalent binding av telomerase-komponenter er telomerase-agonistkandidater.

Ifølge en utførelsesform identifiseres kandidater for telomerase-modulerende midler gjennom deres evne til å frembringe en statistisk signifikant økning eller svekkelse av den enzymatiske aktivitet av en pattedyr-telomerase som omfatter en renset telomerase-proteinkomponent og en telomerase-RNA-komponent.

Ifølge en utførelsesform identifiseres kandidater for telomerase-modulerende midler gjennom deres evne til å frembringe en statistisk signifikant reduksjon eller økning i transkripsjonen av en rapportør-polynukleotidsekvens (f.eks. (3-galaktosidase-gen, luciferase-gen, HPRT-gen) operativt koblet til en transkripsjonen regulatorsekvens av et pattedyr-telomerase-RNA-komponent-gen, fortrinnsvis et humant telomerase-RNA-komponent-gen, i en metabolsk aktiv pattedyrcelle. I en variant målrettes et endogent telomerase-RNA-komponent-gen i en pattedyrcelle med en homolog målrettende konstruksjon for å anbringe en rapportør-polynukleotidssekvens operativt koblet til den oppstrøms regulerende transkripsjonssekvens (f.eks. promoter) av det endogene telomerase-RNA-komponent-gen i det endogene gen's kromosomale locus. I henhold til en alternativ variant er et eksogent polynukleotid. som omfatter et rapportør-polynukleotid operativt koblet til transkripsjonsregulator-region av et pattedyr-telomerase-RNA-komponent-gen (f.eks.promoter- og oppstrøms transkripsjonsfaktor-bindende seter); det eksogene polynukleotid overføres til en pattedyrcelle hvor det kan integreres ikke-homologt i en kromosom-lokalisering og/eller opprettholdes eller replikeres som et episomalt polynukleotid. Midler som frembringer en statistisk signifikant transkripsjonen modulering av rapportør-polynukleotidet i celler behandlet med midlet, identifiseres derved som kandidat for pattedyr-telomerase-modulerende midler.

Blandinger for identifisering av kandidater for telomerase-modulerende midler omfatter typisk: (1) en pattedyr-telomerase-proteinkomponent som kan renses fra telomerase-uttrykkende pattedyrceller, fortrinnsvis fra primatceller (f.eks. humane) og som befris for eventuelt forekommende assosiert RNA-komponent ved behandling med RNAse eller annen behandling som er forenelig med fjerningen av RNA-komponenten og bibehold av proteinets evne til å gjenopprette telomeraseaktivitet i nærvær av beslektet telomerase-RNA-komponent under egnede bindingsbetingelser, (2) en pattedyr-telomerase-RNA-komponent, fortrinnsvis en human RNA-komponent fremstillet ved transkripsjon av et rekombinant polynukleotid i en celle og (3) vandige bindingsbetingelser (f.eks. fysiologiske betingelser, telomerasebestemmelsesbetingelser) og eventuelt (4) et rapportør-polynukleotid som omfatter minst én replikerbar eller utvidbar pattedyr-telomerase-repetisjonssekvens, som typisk er komplementær til sekvensen av den telomere repeterende komplementære templat-del av nevnte RNA-komponent og eventuelt (5) nukleotider egnet for replikasjon og/eller utvidelse av nevnte telomere repeterende sekvenser av rapportør-polynukleotidet under telomere bestemmelsesbetingelser; idet et middel typisk tilsettes til en slik blanding for evaluering gjennom ikke-kovalent binding og/eller telomeraseaktivitet sammenlignet med en kontrollblanding som mangler det nevnte middel.

I henhold til et syvende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen også null-alleler av slike pattedyr-telomerase-RNA-komponent-gener som produseres ved homolog gen-målretting av et heterologt polynukleotid inn i et pattedyr-telomerase- RNA-komponent-gen for funksjonelt å inaktivere telomerase-RNA-komponent-genet. Oppfinnelsen tilveiebringer også ikke-humane "knockout animals" som omfatter et telomerase-RNA-komponent-null-allel, og tilveiebringer i en variant, ikke-humane "knockout animals" som er homozygote for telomerase-RNA-komponent-null-aller og i det vesentlige mangler endogen telomeraseaktivitet som skriver seg fra manglende endogen telomerase-RNA-komponent. Slike "knockout animals" benyttes som kommersielle reagenser for toksikologisk screening, for salg til farmasøytiske forskningslaboratorier for å identifisere eller undersøke telomerase-modulerende midler, som kjæledyr og som husdyr, m.m.

I henhold til et åttende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for udødeliggjøring av pattedyrceller, så som ønskede fermenteringsceller for en bioreaktor eller en ønskelige cellestamme som har fordelaktige sider som et kommersielt forskningsreagens. Metoden omfatter at det i en pattedyrcelle innføres et polynukleotid som uttrykker en funksjonell telomerase-RNA-komponent som er i stand til å danne funksjonelt telomerase-enzym i nærvær av telomeraseproteinkomponenten.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den følgende beskrivelse av tegningene, foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, eksemplene og kravene.

Definisjoner

Betegnelsen "telomerase-RNA-komponent-polynukleotid" refererer seg i denne sammenheng til et polynukleotid på minst 20 nukleotider, hvor polynukleotidet omfatter et segment på minst 20 nukleotider som er minst 85% identisk med en naturlig forekommende pattedyr-telomerase-RNA-komponentsekvens, typisk en primat telomerase-RNA-komponent så som menneske- eller ape-telomerase-RNA-komponent. Enkelte telomerase-RNA-komponent-polynukleotider som har sekvensvariasjoner i forhold til en naturlig forekommende telomerase-RNA-komponentsekvens, eller dens komplement, kan være egnet som hybridiseringsprober, PCR-primere, LCR-primere, mismatch RNA-komponenter og lignende.

Betegnelsen "tilsvarende" er her benyttet for å angi at en polynukleotidsekvens er homolog (dvs. er identisk, ikke strengt evolusjonært relatert) til hele eller en del av en referanse-polynukleotidsekvens eller at en polypeptidsekvens er identisk med en referanse-polypeptidsekvens. I motsetning til dette betyr betegnelsen "komplementær til", i denne sammenheng at den komplementære sekvens er homolog til hele eller en del av en referanse-polynukleotidsekvens. For å illustrere dette tilsvarer nukleotidsekvensen "TATAC" en referansesekvens TATAC og er komplementær til en referansesekvens "GTATA".

De følgende betegnelser benyttes til å beskrive sekvensslektskapet mellom to eller flere polynukleotider: "referansesekvens", "sammenligningsvindu", "sekvensidentitet", "prosentandel sekvensidentitet", og "substansiell identitet". En "referansesekvens" er en definert sekvens benyttet som basis for en sekvenssammenligning, hvor en referansesekvens kan være et subsett av en større sekvens, for eksempel som et segment av en telomerase-RNA-komponent-gensekvens i full lengde. Generelt har en referansesekvens minst 20 nukleotiders lengde, hyppig minst 25 nukleotiders lengde og ofte minst 50 nukleotiders lengde. Siden to polynukleotider hver kan (1) omfatte en sekvens (dvs. en del av den komplette polynukleotidsekvens) som er like for de to polynukleotidene og (2) ytterligere kan omfatte en sekvens som er divergerende for de to polynukleotidene, foretas sekvenssammenligning mellom to (eller flere) polynukleotider i alminnelighet ved å sammenligne sekvenser av de to polynukleotidene over et "sammenligningsvindu" for å identifisere og sammenligne lokale regioner av sekvenslikhet.

Et "sammenligningsvindu" refererer seg i denne sammenheng til et tenkt segment på minst 25 påfølgende nukleotidposisjoner, hvor en polynukleotidsekvens kan sammenlignes med en referansesekvens på minst 25 påfølgende nukleotider og hvor polynukleotidsekvens-delen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner eller delesjoner (dvs. åpninger) på 20% eller mindre sammenlignet med referansesekvensen (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) for optimal forskyvningstilpasning av de to sekvensene. Optimal forskyvningstilpasning av sekvenser for tilpasning av et sammenligningsvindu kan foretas ved hjelp av den lokale homologi-algoritmen til Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, ved hjelp av homologi-tilpasningsalgoritmen til Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, ved "search for similarity"-metoden til Pearson & Lipman (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 2444, ved databehandling av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), eller ved inspeksjon, idet den beste tilpasning (dvs. som resulterer i den høyeste prosentandel homologi innenfor sammenligningsvinduet) oppnådd ved de ulike metoder, velges.

Betegnelsen "sekvensidentitet" betyr at de to polynukleotidsekvensene er identiske (dvs. på en nukleotid-til-nukleotid-basis) innenfor sammenligningsvinduet. Betegnelsen "prosentandel sekvensidentitet" beregnes ved å sammenligne to optimalt forskyvningstilpassede sekvenser innenfor sammenligningsvinduet, bestemme det antall posisjoner hvor samme nukleinsyrebase (f.eks. A, T, C, G, U eller I) forekommer i begge sekvenser for å finne antallet av overensstemmende posisjoner, dividere antallet av overensstemmende posisjoner med det totale antall posisjoner innenfor sammenligningsvinduet (dvs. vindusbredden) og multiplisere resultatet med 100 for å komme frem til prosentandelen av sekvensidentitet. Betegnelsen "substansiell identitet" angir i denne sammenheng et kjennetegn ved en polynukleotidsekvens, hvor polynukleotidet omfatter en sekvens som har minst 80% sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 85% identitet og ofte 89 til 95% sekvensidentitet og enda vanligere minst 99% sekvensidentitet sammenlignet med en referansesekvens innenfor et sammenligningsvindu på minst 20 nukleotidposisjoner, hyppig innenfor et vindu på minst 30-50 nukleotider, hvor prosentandelen sekvensidentitet beregnes ved å sammenligne referansesekvensen med polynukleotidsekvensen, som kan inkludere delesjoner eller addisjoner som ialt utgjør 20% eller mindre av referansesekvensen innenfor sammenligningsvinduet. Referansesekvensen kan være et subsett av en større sekvens, for eksempel et segment av den her beskrevne telomerase-RNA-komponent-gensekvensens fulle lengde.

Spesifikk hybridisering er her definert som den hybrid-dannelse mellom et probe-polynukleotid (f.eks. et polynukleotid ifølge oppfinnelsen som kan inkludere substitusjoner, delesjoner og/eller addisjoner) og et spesifikt mål-polynukleotid (f.eks. en telomerase-RNA-komponent eller genomisk gensekvens, hvor proben fortrinnsvis hybridiserer til det spesifikke mål slik at det på et northern blott av RNA fremstillet fra en passende cellekilde (f.eks. en somatisk celle som uttrykker telomerase-RNA-komponenten) identifiseres et enkelt bånd som tilsvarer én eller flere av RNA-artene av telomerase-RNA-komponent-genet (eller spesifikt spaltede eller prosesserte telomerase-RNA-komponent-arter). Polynukleotider ifølge oppfinnelsen som spesifikt hybridiserer til pattedyr-telomerase-RNA-komponent-eller humane telomersekvenser, kan fremstilles på basis av de sekvensdata som her er angitt, i henhold til metoder og termodynamiske prinsipper som er kjent på området og beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. (1989), Cold Spring Harbor, N Y. og Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Bd. 152 Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., Dan Diego, CA, som med hele sitt innhold herved inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

I denne sammenheng refererer betegnelsen "egnede bindingsbetingelser" seg til vandige betingelser hvor en pattedyr-telomerase-RNA-komponent forener seg med dens beslektede proteinkomponent og danner et enzymatisk aktivt telomerase-holoenzym som er i stand til katalytisk replikasjon, reparasjon og/eller addisjon av telomere repetisjoner fra en passende templat som omfatter telomere repetisjoner, idet en slik telomer repetisjonstemplat kan forekomme eller mangle. Ofte kan egnede bindingsbetingelser være fysiologiske betingelser. "Fysiologiske betingelser" refererer seg i denne sammenheng til temperatur, pH, ionestyrke, viskositet og lignende biokjemiske parametere som er forenelige med en levende organisme og/eller som typisk eksisterer intracellulært i en levende dyrket pattedyrcelle, særlig betingelser som eksisterer i kjernen av den nevnte pattedyrcelle. Eksempelvis er de intranukleære eller cytoplasmatiske betingelser i en pattedyrcelle dyrket under typiske laboratoriekulturbetingelser, fysiologiske betingelser. Egnede in vitro reaksjonsbetingelser for in vitro transkripsjons-cocktails er i alminnelighet fysiologiske betingelser og kan eksemplifiseres ved hjelp av en rekke kjente

nukleære ekstrakter. Generelt kan fysiologiske in vitro betingelser omfatte 50-

200 mM NaCI eller KCI, pH 6,5-8,5, 20-45°C og 0,001-10 mM divalent kation (f.eks. Mg<++>, Ca<++>); fortrinnsvis ca. 150 mM NaCI eller KCI, pH 7,2-7,6, 5 mM divalent kation og kan ofte inkludere 0,01-1,0% uspesifikt protein (f.eks. BSA). Et ikke-ionisk overflateaktivt middel (Tween, NP-40, Triton X-100) kan ofte forekomme, vanligvis i ca. 0,001 til 2%, typisk 0,05-0,2% (volumdeler). Det kan dessuten velges særlige vandige betingelser i henhold til konvensjonelle metoder. Som generell veiledning kan følgende buffrede vandige betingelser være anvendelige: 10-250 mM NaCI, 5-50 mM Tris-HCI, pH 5-8, eventuelt tilsatt divalente kationer og/eller metallchelatorer og/eller ikke-ioniske overflateaktive midler og/eller membranfraksjoner og/eller antiskum-midler og/eller scintillasjonsmidler.

Betegnelsen "merking" eller "merket" refererer seg i denne sammenheng til inkorporering av en påvisbar markør, f.eks. inkorporering av en radioaktivt merket aminosyre eller at et polypeptid tilkobles biotinyldeler som kan påvises med merket avidin (f.eks. streptavidin inneholdende en fluorescerende markør eller enzymatisk aktivitet som kan påvises ved hjelp av optiske eller kalorimetriske metoder). Forskjellige metoder for merking av polypeptider og glykoproteiner er kjent på området og kan benyttes. Eksempler på merkinger for polypeptider inkluderer, men er ikke begrenset til, følgende: radioisotoper (f.eks.<3>H,14C,3SS,12<5>l,<131>l), fluorescerende merkinger (f.eks. FITC, rhodamin, lanthanid-fosforescerende midler), enzymatiske merkinger (f.eks. pepperrot-peroksydase, Ø-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), biotinylgrupper, på forhånd bestemte polypeptidepitoper som gjenkjennes av en sekundær rapportør (f.eks. leucinglidelås-parsekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, transkripsjonelt aktivator-polypeptid, metall-bindingsdomener, epitop-merker). I enkelte utførelsesformer er merkingene festet med avstandsarmer av forskjellige lengder for å redusere potensiell sterisk hindring.

Betegnelsen "statistisk signifikant" betyr i denne sammenheng et resultat (dvs. en analyse-avlesning) som i alminnelighet er minst to standardavvik ovenfor eller nedenfor gjennomsnittet av minst tre separate bestemmelser av en kontroll-avlesning og/eller statistisk signifikant ut fra bestemmelse ved Studenfs t-test eller et annet akseptert mål for statistisk signifikans.

Betegnelsen "patognomonisk konsentrasjon", "patognomonisk mengde" og "patognomonisk hybridiseringsmønster" refererer seg i denne sammenheng til henholdsvis en konsentrasjon, mengde eller lokaliseringsmønster av en telomerase-RNA-komponent i en prøve, som indikerer forekomst av en patologisk (f.eks. neoplastisk, aldringsbetinget, immuhdeficient, neurodegenerativ, inflammatorisk, etc.) betingelse eller en predisponering for utvikling av en neoplastisk sykdom, så som karsinom, sarkom eller leukemi. En patognomonisk mengde er en mengde av telomerase-RNA-komponent i en celle eller celleprøve, som faller utenfor området for normale kliniske verdier fastslått gjennom prospektive og/eller retrospektive statistiske kliniske undersøkelser. I alminnelighet vil et individ som har en neoplastisk sykdom (f.eks. karsinom, sarkom eller leukemi) oppvise en mengde av telomerase-RNA-komponent i en celle eller vevsprøve, som ligger utenfor det konsentrasjonsområdet som kjennetegner normale, friske individer. En typisk patognomonisk konsentrasjon er minst ca. ett standardavvik utenfor den gjennomsnittlige normalverdi, og gjerne minst ca. to standardavvik eller mer utenfor den gjennomsnittlige normalverdi. Praktisk talt alle kliniske diagnostiske tester fører imidlertid til en viss prosentandel falske positive og falske negative. Følsomheten og selektiviteten av den diagnostiske bestemmelse må være tilstrekkelig til å tilfredsstille det diagnostiske formål og andre relevante regulatoriske krav. Generelt benyttes de diagnostiske metodene ifølge oppfinnelsen til å identifisere enkeltpersoner som sykdomskandidater, ved å gi en ytterligere parameter i en differensialdiagnose foretatt av kompetent fagpersonell.

Betegnelsen "sykdoms-allel" refererer seg i denne sammenheng til et allel av et gen som er i stand til å frembringe en merkbar sykdom. Et sykdoms-allel kan være dominant eller recessivt og kan forårsake sykdom direkte eller når det forekommer i kombinasjon med en bestemt genetisk bakgrunn eller tidligere patologisk tilstand. Et sykdoms-allel kan forekomme i gen-ansamlingen eller ved somatisk mutasjon være frembragt de novo i et individ.

Betegnelsen "anti-neoplastisk middel" benyttes i denne sammenheng for å angi midler som har den funksjonelle egenskap at de inhiberer utvikling eller progresjon av en neoplasme i et menneske, og inkluderer ofte inhibering av metastase eller et metastatisk potensiale.

Betegnelsen "operativt bundet" refererer seg i denne sammenheng til en binding av polynukleotid-elementer i en funksjonell sammenheng. En nukleinsyre er "operativt koblet" når den er anbragt i en funksjonell sammenheng med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er en promoter eller enhancer operativt koblet til en kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjonen av den kodende sekvens. Operativt koblet betyr at de DNA-sekvensene som er koblet i alminnelighet er sammenhengende, og når det er nødvendig å forbinde to protein-kodende regioner, sammenhengende og i leseramme. Siden enhancere i alminnelighet funksjonerer når de er adskilt fra promoteren med flere kilobaser og siden intronsekvenser kan være av variable lengder, kan imidlertid enkelte polynukleotidelementer være operativt koblet, men ikke sammenhengende. Et strukturelt gen (f.eks. et HSV tk gen) som er operativt koblet til en polynukleotidsekvens som tilsvarer en transkripsjonen regulatorsekvens i et endogent gen, uttrykkes i alminnelighet i tilnærmet samme temporale og celletype-spesifikke mønster som det naturlig forekommende gen.

Betegnelsen "transkripsjonen enhet" eller "transkripsjonelt kompleks" refererer seg i denne sammenheng til en polynukleotidsekvens som omfatter et strukturelt gen (eksoner), en cis-virkende koblet promoter og andre cis-virkende sekvenser som er nødvendige for effektiv transkripsjon av de strukturelle sekvensene, distale regulator-elementer som er nødvendige for den passende vevsspesifikke og utviklingsmessige transkripsjon av de strukturelle sekvensene, samt ytterligere cis-sekvenser som er viktige for effektiv transkripsjon og translasjon (f.eks. polyadenyleringssete, mRNA-stabilitetskontrollerende sekvenser).

Betegnelsen "transkripsjonen modulering" refererer seg her til evnen til enten å forsterke transkripsjon eller inhibere transkripsjon av en strukturell sekvens koblet i cis. En slik forsterkning eller inhibering kan være betinget av inntreden av en bestemt begivenhet, så som stimulering med en inducer og/eller bare være manifestert i vise celletyper.

Betegnelsen "transkripsjonsregulator-region" refererer seg i denne sammenheng til en DNA-sekvens som omfatter en funksjonell promoter og eventuelt assosierte transkripsjonselementer (f.eks. enhancer, CCAAT-boks, TATA-boks, SP1- sete, etc.) som er essensielle for transkripsjon av en polynukleotidsekvens som er operativt koblet til transkripsjonsregulator-regionen.

Betegnelsen "null-allel" betyr i denne sammenheng at et genlocus omfatter minst én mutasjon eller strukturell endring, hvor null-allelet er tilnærmet ute av stand til å styre den effektive ekspresjon av et funksjonelt genprodukt. En "knockout celle" er en celle som har minst ett null-allel av et endogent gen, og som typisk er homozygot for null-allelet. For eksempel kan en knockout-celle være homozygot for null-alleler i telomerase-RNA-komponent-locuset slik at knockout-cellen er tilnærmet ute av stand til å uttrykke en funksjonell telomerase-RNA-komponent.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1. Telomeraseaktivitet fra celler som uttrykker templat-muterte

TRC DEAE-sepharose fraksjonerte ekstrakter fra mutante TRC3-uttrykkende stabile transformanter, ble bestemt med henblikk på telomeraseaktivitet ved å benytte konvensjonelle analyser under forskjellige reaksjonsbetingelser. Ekstrakter fra celler som uttrykker MuC+17 TRC3 (bane 1, 4, 7, 10, 13, 16 merket C<*>), MuC TRC-3 (bane 2, 5, 8, 11, 14, 17 merket C) eller MuA TRC3 (bane 3, 6, 9, 12, 15, 18 merket A) ble analysert under normale reaksjonsbetingelser (banene 1-6, normal pluss 0,5 mM ddCTP (banene 7-9), normal minus dTTP pluss 0,5 mM ddTTP (banene 10-12), eller normal minus dATP pluss 0,5 mM ddATP (banene 13-18). Reaksjonsblandingene i banene 1-9 inneholdt 8 \ iM total dGTP, hvorav 1 uM var<32>P-dGTP (800 Ci/mmol). For å forenkle mutant telomerasepåvisning inneholdt reaksjonsblandingene i bane 10-18, 8 uM total dGTP, hvorav 2 uM var<32>P-dGTP (800 Ci/mmol). Ekstrakter ble behandlet med DNase-fri RNAse (25 ng/mL i 10 minutter ved 30°C) før telomerasebestemmelser (banene 1-3, 16-18). Flankerende baner inneholder DNA-markører med størrelser i nukleotider (nt) som angitt.

Fig. 2. Steady state nivået av telomerase-RNA-komponenten (hTR) og GAPDH RNA ble bestemt ved benytte kvantitativ RT-PCR. Kontroller viste at alle PCR-kvantifikasjoner lå i det lineære området opp til 25 runder. RT-PCR ble analysert med henblikk på fem normale telomerase-negative cellelinjer (1-5) og fem tumor-telomerase positive cellelinjer (6-10): 1) primær føtal lunge; 2) primær føtal håndhud; 3) voksen primær prostata; 4) primære synoviale fibroblaster; 5) forhud- fibroblaster; 6) melanom LOX; 7) leukemi U251; 8) NCIH23 lungekarsinom; 9) colontumor SW620; 10) brysttumor MCF7. PCR-produktene ble merket med<32>P, separert på en 6% PAGE og kvantifisert ved å benytte en Phosphorlmager. Den relative transkripsjon er uttrykt i fritt valgte enheter. Fig. 3. Gjennomsnittlig TRF-lengde i telomerase-RNA-komponent antisense-celler og vektor-kontrollceller. HeTe 7-celler som stabilt uttrykker 10-3-hTR antisense eller vektorkontroll, ble selektert i hygromycin- og puromycin-medium og høstet ved 23 PDL etter transfeksjon. Nukleært DNA ble renset, kuttet med Hinfl og Rsal og kjørt på en 0,5% agarosegel. DNA ble probeundersøkt i gelen med et (TTAGGG)3-oligonukleotid for å merke de telomere terminale restriksjonsfragmenter (TRF). Gelen ble scannet med et Molecular Dynamic's Phosphorlmager og det gjennomsnittlige TRF kvantifisert som beskrevet (Allsopp et al., (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 89: 10114). De stiplede linjene indikerer den gjennomsnittlige midlere TRF for antisense og kontrollgruppene.

Fig. 4. Skjematisk fremstilling av in situ PCR-metoden.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter, reagenser, genetisk modifiserte dyr og celler samt farmasøytiske blandinger som har relasjon til ribonukleoproteinet i human telomerase.

Den nomenklatur som er benyttet i det følgende, og laboratoriemetodikk for celledyrkning, molekylær genetikk og nukleinsyrekjemi og hybridisering beskrevet nedenfor, kan involvere prosedyrer som er velkjent og vanlig benyttet på området. Standardteknikker er benyttet for rekombinante nukleinsyremetoder, polynukleotidsyntese og mikrobiologisk kultur og transformasjon (f.eks. elektroporering, lipofeksjon). Disse teknikker og fremgangsmåter er i alminnelighet foretatt i henhold til konvensjonelle metoder på området og forskjellige generelle referanser (generelt, se Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.utg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, N.Y., som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) som er angitt i foreliggende dokument.

Oligonukleotider kan syntetiseres på en Applied Bio Systems oligonukleotid-syntesemaskin etter produsentens anvisninger.

Metoder for PCR-amplifikasjbner er beskrevet (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, red. HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, red. Innis, Gelfland, Snisky & White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, KA & Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications 1: 17; PCR red. McPherson, Quirkes & Taylor, IRL Press, Oxford; og US-patent 4.683.202, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse).

Oversikt

Oppfinnelsen er delvis fremkommet gjennom kloningen og isoleringen av RNA-komponenten av human telomerase og genet for denne RNA-komponent, inklusivt tilhørende transkripsjonene kontrollelementer. Nukleotidsekvensen for RNA-komponenten av human telomerase er vist nedenfor. For lettvinthets skyld er sekvensen vist ved å benytte standardforkortelsene for ribonukleotider (A er riboadenin, G er riboguanin, C er ribocytidin og U er uridin). Fagmannen vil registrere at sekvensene som er vist nedenfor også viser sekvensen for cDNA, hvor ribonukleotidene er erstattet med deoksyribonukleotider (hvor uridin er erstattet av thymidin).

Sekvensen ovenfor er vist i 5'-3'-retningen og er nummerert med henblikk på referanse. Templatsekvensen av RNA-komponenten antas å være lokalisert innen regionen avgrenset av nukleotidene 50-60 (^-CUAACCCUAAC-S'), som er komplementær til en telomer sekvens sammensatt av en og to tredjedels telomere repetisjonsenheter.

Denne sekvens ble utledet fra cDNA-kloner og fra en genomisk klon av RNA-komponenten. Når RNA-komponenten først er transkribert fra det tilsvarende gen, er minst noen av de dannede RNA-transkriptene betydelig lenger enn den~560 nukleotidsekvensen som er vist ovenfor og kan faktisk omfatte mer enn 1000 nukleotider. Et fullstendig funksjonelt telomerase-molekyl kan imidlertid settes sammen fra transkripter bestående av den~560-nukleotidsekvens som er vist ovenfor. 3'-enden av RNA-komponenten i nativ telomerase antas å ligge innen den region som avgrenses av nukleotidene 514-559 i sekvensen ovenfor. En analyse tyder på at 3'-enden kan være U-resten ved nukleotid 538. Rekombinante RNA-komponentmolekyler som omfatter færre enn nukleotidene 1-559 av den ovenfor viste sekvens, kan også benyttes for å fremstille aktiv telomerase.

En genomisk klon ble identifisert og isolert fra et genomisk bibliotek av human DNA innskutt i en lambda-yektor FIXII. Den genomiske klon, omfattende RNA-komponent-gensekvensene, inneholdt et~15 kb innskudd og ble betegnet klon 28-1. Genet er lokalisert i den distale ende av q-armen på kromosom 3. Sekvensinformasjonen oppnådd fra gjenkjenningssetet av et SaulllAI-restriksjonsenzym i en ende av~15 kb innskuddet til et internt Hindlll restriksjonsenzym-gjenkjenningssete, som omfatter hele den modne RNA-komponentsekvens så vel som transkripsjonskontroll-elementene for RNA-komponent-genet av lambda klon 28-1 er vist nedenfor ved å benytte standard deoksyribonukleotidforkortelsene og er gjengitt i 5'-3'-retningen.

RNA-komponentsekvensen begynner ved base 1459. Det kan fastslås en rekke transkripsjons-kontrollelementer i sekvensen. En A/T boks-konsensussekvens finnes ved nukleotidene 1431-1436; PSE-konsensussekvenser finnes ved nukleotidene 1406-1414 så vel som nukleotidene 1508-1526; en CAAT-boks konsensussekvens finnes ved nukleotidene 1399-1406; en Sp1 konsensussekvens finnes ved nukleotidene 1354-1359; og en fj/y-interferon responselement-konsensussekvens finnes ved nukleotidene 1234-1245. Steady state transkripsjon av humant telomerase-RNA-komponent-gen i humanceller, som f.eks. HT1080

(telomerase-uttrykkende) forblir i det vesentlige uendret når sekvenser oppstrøms for nukleotid 1159 utelates i vektorer som er stabilt transfektert inn i cellene.

DNA fra ekornape som antas å være blant de genetisk mest divergerende ikke-humane primater i forhold til mennesker, omfatter et telomerase-RNA-komponent-gen som lar seg amplifisere med PCR -primere bestående av sekvenser som tilsvarer eller er komplementære med den beskrevne humane telomerase-RNA-komponents polynukleotidsekvens. Andre ikke-humane primater antas å ha telomerase-RNA-komponent-gener som også lar seg amplifisere med PCR-primere avledet fra sekvensen av det humane telomerase-RNA-komponent-gen.

Telomerase RNA-komponent-polynukleotider

Avdekkingen av sekvensen for pattedyrs telomerase-RNA-komponent og dens gen, slik som ovenfor vist for human telomerase og i Fig. 5 for ekornape-telomerase, muliggjør konstruksjon av isolerte polynukleotider som omfatter en sekvens på minst 15 påfølgende nukleotider, typisk minst 20 til 25 påfølgende polynukleotider, som er tilnærmet identiske med en pattedyr telomerase-RNA-komponentsekvens eller pattedyrs RNA-komponent-gensekvens. Pattedyrs telomerase-RNA-komponenten- (og gen) sekvenser muliggjør dessuten konstruksjon av nukleinsyre-hybridiseringsprober og PCR-primere som kan benyttes for å påvise RNA- og DNA-sekvenser av den beslektede telomerase-RNA-komponent og/eller genet i en celle, celleprøve, vevssnitt, reaksjonsbeholder, hybridiseringsmembran eller lignende.

Polynukleotider som omfatter pattedyrs telomerase-RNA-komponentsekvenser kan innbefatte sekvenser som forenkler transkripsjon (ekspresjonssekvenser), RNA-stabiliserende sekvenser og lignende. Generelle prinsipper for konstruksjon av slike polynukleotider med bakgrunn i den her beskrevne sekvensinformasjon og retningslinjer ifølge oppfinnelsen, er velkjent på området og er beskrevet videre i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.utg. (1989), Cold Spring Harbor, N.Y. For eksempel, uten at dette medfører noen begrensning, kan slike polynukleotider inkludere en promoter, og eventuelt en enhancer, for bruk i eukaryote ekspresjonsverter og eventuelt, sekvenser som er nødvendige for en vektors replikasjon. En typisk eukaryot ekspresjonskassett vil inkludere en polynukleotidsekvens som når den er transkribert, fører til et pattedyrs telomerase-RNA-komponent-transkript. En slik polynukleotidsekvens er koblet nedstrøms (dvs. i transkripsjonsorientering 5' til 3' i en passende promoter, så som HSV tk promoteren eller pgk (fosfoglyceratkinase) promoteren, eventuelt koblet til en enhancer.

Når det ikke ønskes ekspresjon av en funksjonell telomerase-RNA-komponent, behøver polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse ikke transkribere et funksjonelt telomerase-RNA-komponent-transkript. Polynukleotider ifølge oppfinnelsen kan tjene som hybridiseringsprober og/eller PCR-primere (amplimerer) og/eller LCR oligomererfor å påvise telomerase-RNA-komponent- RNA eller DNA-sekvenser.

Polynukleotider ifølge denne oppfinnelse kan alternativt tjene som hybridiseringsprober eller primere for påvisning av RNA- eller DNA-sekvenser av beslektede gener eller telomerase-RNA-komponent-gen i beslektede arter, som f.eks. pattedyrarter. For slike hybridiserings- og PCR-anvendelser behøver polynukleotidene ifølge oppfinnelsen ikke transkribere en funksjonell telomerase-RNA-komponent. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan således inneholde betydelige delesjoner, addisjoner, nukleotidsubstitusjoner og/eller transposisjoner så lenge spesifikk hybridisering eller spesifikk amplifisering til en pattedyrs telomerase-RNA-komponentsekvens opprettholdes.

Genomiske eller cDNA kloner av pattedyrs telomerase-RNA-komponent og tilsvarende gensekvenser kan isoleres fra klonbiblioteker (f.eks. tilgjengelig fra Clontech, Palo Alto, CA) ved å benytte hybridiseringsprober konstruert på basis av de her omtalte nukleotidsekvenser og metoder for konvensjonell hybridiseringsscreening (f.eks. Benton WD & Davis RW (1977) Science 196: 180; Goodspeed, et al., (1989) Gene 76 1). Når det ønskes en cDNA-klon, foretrekkes klonbiblioteker som inneholder cDNA som skriver seg fra somatisk celle-RNA eller annen telomerase-RNA-komponent som uttrykker celle-RNA. Som et alternativ kan det konstrueres syntetiske polynukleotidsekvenser som tilsvarer hele eller en del av, de her omtalte sekvenser, ved kjemisk syntese av oligonukleotider. Dessuten kan PCR (polymerase chain reaction) under bruk av primere basert på de her omtalte sekvensdata, benyttes til å amplifisere DNA-fragmenter fra genomisk DNA, RNA- forråd eller fra cDNA-klonbibliotek. US-patent 4.683.195 og 4.683.202 beskriver PCR-metoden.

Slike polynukleotider har en rekke anvendelser, inklusivt som telomerase-RNA-komponent-prober, som templater for fremstilling av en funksjonell eller ikke-funksjonell telomerase-RNA-komponent i celler, som kommersielle diagnostiske reagenser for standardisering av et telomerase-RNA-komponent-påvisningssett, som genterapi-polynukleotider for administrering til et dyr. Slike polynukleotider kan også benyttes som næringsmidler, forbrennbare energikilder, UV-absorberende solfaktormidler og viskositetsøkende oppløste stoffer, m.m.

De her beskrevne plasmidene som ble konstruert under kloningen av RNA-komponenten av human telomerase og genet for RNA-komponenten, utgjør viktige sider ved foreliggede oppfinnelse. Disse plasmidene kan benyttes til å fremstille RNA-komponenten av, så vel som genet for, human telomerase i tilnærmet ren form, hvilket utgjør en annen viktig side ved foreliggende oppfinnelse. Dessuten vil fagmannen innse at en rekke andre plasmider, så vel som ikke-plasmid nukleinsyrer i tilnærmet ren form, som omfatter hele eller i det minste en anvendelig del av, nukleotidsekvensen i RNA-komponenten av human telomerase, er nyttige materialer tilveiebragt gjennom foreliggende oppfinnelse.

Som et generelt punkt med hensyn til nukleinsyrene i henhold til oppfinnelsen og i preparater som inneholder disse, vil fagmannen innse at nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen inkluderer både DNA- og RNA-molekyler, så vel som syntetiske, ikke-naturlig forekommende analoger av disse, samt heteropolymerer av deoksyribonukleotider, ribonukleotider og/eller analoger av begge. Den bestemte sammensetning av en nukleinsyre eller en nukleinsyreanalog ifølge oppfinnelsen vil avhenge av hvilket formål materialet vil bli benyttet for og av hvilket miljø materialet vil bli anbragt i. Modifiserte eller syntetiske, ikke-naturlig forekommende nukleotider er utviklet for å tjene en rekke formål og for å holde seg stabilt i en rekke miljøer, så som de hvor det forekommer nukleaser, hvilket er velkjent på området. Modifiserte eller syntetiske ikke-naturlig forekommende nukleotider kan adskilte seg fra de naturlig forekommende ribo- eller deoksyribonukleotidene med hensyn til nukleotidets karbohydrat- (sukker-), fosfatbindings- eller base-deler, eller kan endog i enkelte tilfeller, inneholde en ikke-nukleotid-base (eller i det hele tatt ingen base). Se f.eks. Arnold et al., PCT patentpublikasjon nr. WO 89/02439 med tittelen "Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. I likhet med nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen som kan omfatte et stort utvalg av nukleotider, kan også de nukleinsyrene ha et stort utvalg av anvendelige funksjoner.

Isolering av beslektede gener

Som angitt i beskrivelsen foran, gir adgangen til rensede nukleinsyrer som omfatter sekvensen av RNA-komponenten av human telomerase, mulighet for verdifulle diagnostiske og terapeutiske metoder og reagenser, så vel som andre viktige fordeler. En viktig fordel ved foreliggende oppfinnelse er at metodene og reagensene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å isolere RNA-komponenten og gener for RNA-komponenten av telomerase fra en hvilken som helst pattedyrart som har en RNA-komponent som i det vesentlige er homolog med den humane RNA-komponent ifølge foreliggende oppfinnelse. Uttrykket "i det vesentlige homolog" refererer seg til den grad av homologi som fordres for spesifikk hybridisering av et oligonukleotid eller nukleinsyresekvens av den humane RNA-komponent, til en nukleinsyresekvens av en RNA-komponentsekvens av en annen pattedyrart. Når en slik i det vesentlige homologi foreligger, kan fagmannen benytte nukleinsyrene og oligonukleotidprimerne og probene ifølge oppfinnelsen til å identifisere og isolere i det vesentlige homologe sekvenser.

Man kan for eksempel med probe undersøke et genomisk eller cDNA-bibliotek for å påvise homologe sekvenser. Man kan også benytte primere som tilsvarer regioner av RNA-komponentsekvensen og PCR-amplifikasjon under lave eller moderate stringensbetingelser for å amplifisere en bestemt homolog nukleinsyresekvens fra preparater av RNA eller DNA fra en pattedyrart. Ved å benytte disse og andre lignende teknikker vil fagmanen lett kunne isolere både variant-RNA-komponent-nukleinsyrer fra humanceller og homologe RNA-komponent-nukleinsyrer fra andre pattedyrceller, så som celler fra primater, fra pattedyr av veterinærbetydning, dvs. storfe, sau, hest, hund og katt samt fra gnagere, dvs. rotter, mus og hamstere. I sin tur kan disse nukleinsyrene benyttes til fremstilling av transgene dyr av stor verdi for screening og testing av farmasøytika som regulerer telomeraseaktivitet. For eksempel kan man ved å benytte et plasmid ifølge oppfinnelsen "slå ut" RNA-komponentgenet eller erstatte det naturlige RNA-komponent-gen med et rekombinant induserbart gen i en mus spretus embryo-stam-celle og deretter frembringe en transgen mus som vil være egnet som modell eller testsystem for studiet av alders- eller alderdomsrelaterte sykdommer. Eksempel 9 nedenfor illustrerer hvorledes slik metodikk har vært benyttet for å identifisere og isolere RNA-komponentsekvenser for primater.

Andre pattedyr-homologer av menneske- og ape-telomerase-RNA-komponentene og/eller de beslektede genene kan identifiseres og isoleres ved screening av et passende ikke-humant pattedyrs genomiske eller cDNA-klonbibliotek, som f.eks. skriver seg fra mus, rotte, kanin, marsvin, hamster, hund, storfe, sau, lupin, svin, eller et annet genomisk eller cDNA-bibliotek i en egnet vektor, så som kunstige gjærkromosomer, cosmider eller bakteriofag X (f.eks. X Charon 35), med en polynukleotidprobe som omfatter en sekvens på minst 20 påfølgende nukleotider (eller deres komplement) av en menneske- eller ape-telomerase-RNA-komponent eller gen-polynukleotidsekvens. Hybridiserings- og vaskebetingelsene utføres i alminneliget ved høy stringens i henhold til konvensjonelle hybridiseringprosedyrer. Positive kloner isoleres og sekvenseres. Som illustrasjon uten at det i dette ligger noen begrensning, kan et polynukleotid av full lengde som tilsvarer 559 nukleotiders sekvensen av den humane telomerase-RNA-komponent, merkes og benyttes som en hybridiseringsprobe for å isolere genomiske kloner fra et ikke-humant genomisk klonbibliotek i XEMBL4 eller XGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); hvor typiske hybridiseringsbetingelser for screening av

"plaque lifts" (Benton & Davis, (1978) Science 196: 180; Dunn et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 13057) kan være 50% formamid, 5 x SSC eller SSPE, 1-5 x Denhardfs løsning, 0,1-1% SDS, 100-200 ug felles heterolog DNA eller tRNA, 0,10% dekstransulfat, 1 x 10<5>til 1 x 10<7>cpm/mL denaturert probe med en spesifikk aktivitet på ca. 1 x 10<8>cpm/ug og inkubering ved 42°C-37°C i ca. 6-36 timer. Prehybridiseringsbetingelsene er i det vesentlige de samme bortsett fra at proben ikke inngår og at inkuberingstiden i alminnelighet er redusert. Vaskebetingelsene er typisk 1-3 x SSC, 0,1-1% SDS, 45-70°C med endring av vaskeløsning etter ca. 5-30 minutter. For å isolere ikke-humane telomerase-RNA-komponent-polynukleotider

med en human telomerase-RNA-komponent-polynukleotid-probe foretrekker man ofte å hybridisere ved lavere stringens, så som ca. 39°C og vaske suksessivt under følgende temperaturopptrapping: romtemperatur, 37°C, 39°C, 42°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C og 70°C, med stopp etter hvert trinn og overvåking av bakgrunns-probesignalet (og eventuelt påvise signal gjennom autoradiografi og/eller fosforiserings-avbildning dersom en radioaktivt merket probe benyttes), og avbryte vasketrinnene når det er oppnådd passende signal/støy-forhold, hvilket bestemmes empirisk.

Polynukleotider som omfatter sekvenser på minst ca. 30:50 nukleotider, fortrinnsvis minst 100 nukleotider, som tilsvarer eller er komplementære med de her viste nukleotidsekvenser for human- og ape-telomerase-RNA-komponnetsekvensene, kan tjene som PCR-primere og/eller hybridiseringsprober for å påvise og isolere kimlinjegener som tilsvarer det beskrevne gen og RNA-komponentsekvenser. Slike kimlinjegener kan isoleres ved hjelp av forskjellige konvensjonelle metoder, inklusivt, men ikke begrenset til, hybridiseringsscreening av genomiske biblioteker i bakteriofag X eller cosmid-bibliotek, eller ved PCR-amplifisering av genomiske sekvenser under bruk av primere som skriver seg fra de her beskrevne sekvenser. Humane genomiske bibliotek er offentlig tilgjengelige eller kan konstrueres de novo fra human DNA.

Det vil være klart for fagmannen at nukleotidsubstitusjoner, delesjoner og addisjoner kan inkorporeres i polynukleotidene ifølge oppfinnelsen. Nukleotid-sekvensvariasjon kan resultere fra sekvenspolymorfismer i forskjellige alleler og lignende. Slike nukleotidsubstitusjoner, delesjoner og addisjoner, må imidlertid ikke i vesentlig grad ødelegge polynukleotidets evne til å hybridisere til en av de i full lengde her viste menneske- eller ape-telomerase-RNA-komponent-polynukleotidsekvenser under hybridiseringsbetingelser som er tilstrekkelig stringente til å resultere i spesifikk hybridisering.

Pattedyrs telomerase-RNA-komponent-polynukleotider kan være korte oligonukleotider (f.eks. 20-100 baselengder), f.eks. til bruk som hybridiseringsprober og PCR- (eller LCR-)-primere. Polynukleotidsekvensene kan også omfatte en del av et større polynukleotid (f.eks. en kloningsvektor som omfatter en telomerase-RNA-komponentklon) og være fusjonert gjennom polynukleotid-binding, med en annen polynukleotidsekvens. Typiske telomerase-RNA-komponent-polynukleotider omfatter minst 25 påfølgende nukleotider som er tilnærmet identiske med en naturlig forekommende telomerase-RNA-komponent eller gensekvens og vanligvis omfatter telomerase-RNA-komponent-polynukleotidene minst 50 til 100 påfølgende nukleotider som er tilnærmet identiske med en naturlig forekommende pattedyrs telomerase-RNA-komponentsekvens. Fagmannen vil imidlertid innse at den minimumslengde av et telomerase-RNA-komponent-polynukleotid som fordres for spesifikk hybridisering til en telomerase-RNA-komponent-målsekvens vil avhenge av flere faktorer: G/C-innholdet, posisjoneringen av mistilpassede baser (om slike finnes), sekvensens grad av unikhet sammenlignet med populasjonen av mål-polynukleotider, og den kjemiske natur av polynukleotidet (f.eks. metylfosfonat-skjelettet, polyamid-nukleinsyre, fosforotiolat, etc.) m.m.

Dersom det er ønskelig kan PCR-amplimerer for amplifisering av cDNA-kopier i tilnærmet full lengde selekteres ut fra fagmannens vurdering. Tilsvarende kan amplimerer for amplifisering av deler av telomerase-RNA-komponent-genet (ape eller menneske) selekteres.

Alle disse sekvensene kan benyttes som hybridiseringsprober eller PCR-amplimerer for å påvise nærvær av telomerase-RNA-komponent, for eksempel for å diagnostisere en neoplastisk sykdom som karakteriseres ved nærværet av et forhøyet eller redusert telomerase-RNA-komponentnivå i celler eller for å foreta vevstyping (dvs. identifisere vev som kjennetegnes ved ekspresjonen av telomerase-RNA-komponent) og lignende. Sekvensene kan også benyttes for å påvise genomisk telomerase-RNA-komponent-gensekvenser i en DNA-prøve som f.eks. ved rettsmedisinsk DNA-analyse (f.eks. ved RFLP-analyse), PCR-produktlengde-fordeling etc.) eller for diagnostisering av sykdommer som karakteriseres ved amplifikasjon og/eller omleiring av telomerase-RNA-komponent-genet.

Som eksempel og uten at det ligger noen begrensningi dette, kan følgende par av oligonukleotidprimere benyttes til å amplifisere telomerase-RNA-komponent-polynukleotidsekvenser (f.eks. cDNA) eller som hybridiseringsprober (f.eks. som biotinylerte eller endrede-merkede oligonukleotid-prober:

Andre egnede PCR-primere, LCR-primere, hybridiseringsprober og primere og lignende vil være kjent for fagmannen ut fra det som fremgår av de her beskrevne telomerase-RNA-komponentsekvenser og som kan oppnås med disse. Humane telomerase-RNA-komponent-polynukleotider og deres komplementer kan tjene som hybridiseringsprober eller primere for påvisning av RNA- eller DNA-sekvenser av pattedyrs telomerase-RNA-komponenter. For slike hybridiseringsanvendelser og PCR kan de inneholde vesentlige delesjoner, addisjoner, nukleotidsubstitusjoner og/eller transposisjoner så lenge spesifikk hybridisering eller spesifikk amplifisering av en human telomerase-RNA-komponentsekvens bibeholdes. Slike nukleotidsubstitusjoner, delesjoner og addisjoner må imidlertid ikke i vesentlig grad ødelegge polynukleotidets mulighet til å hybridisere til en telomerase-RNA-komponent eller gensekvens under hybridiseringsbetingelser som er tilstrekkelig stringente til å resultere i spesifikk hybridisering.

Som eksempel og uten at det i dette ligger noen begrensing, kan et humant telomerase-RNA-komponent-polynukleotid omfatte sekvensen fra nukleotid 48 til nukleotid 209, som antas å være tilstrekkelig for å rekonstituere human telomerase-holoenzym i nærvær av telomerase-proteinkomponent: eller som DNA:

Et humant telomerase-RNA-komponent-polynukleotid kan omfatte eller bestå av nukleotidene 1-559 og kan innbefatte terminale addisjoner eller andre nukleotider eller nukleotidsekvenser. En templat-omkastet variant bestående av nukleotidene 48-209, hvor imidlertid telomer-repetisjonstemplatsekvensen er endret, er i stand til å konkurrere med en rettavkuttet RNA-komponent bestående av villtypesekvensen 48-209 om binding til telomerase-proteinkomponent og rekonstituere telomerase- holoenzym. Strukturanalyse av den humane telomerase-RNA-komponent indikerer regioner som har en tilbøyelighet til å danne sekundærstrukturer, så som hårnålssløyfer. For eksempel har regionen fra ca. nukleotid 200 til nukleotid 350 av den humane telomerase-RNA-komponent en vesentlig hårnålskarakter. Andre deler av telomerase-RNA-komponenten har dessuten betydelig sekundærstrukturkarakter. Ut fra den registrerte sekundærstruktur kan fagmannen skifte ut disse med andre nukleotidsekvenser som ved dataanalyse forutsies å anta lignende sekundærstrukturformasjoner. Selv om en rekke dataprogrammer egner seg for bestemmelse av nukleotidsekvenser som antar tilnærmet ekvivalente sekundærstrukturer, kan UWGCG Sequence Analysis Software package programmene FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES; DOMES: NOUNTAINS og STEMLOOP og lignende benyttes. Tilsvarende kan det konstrueres ikke-nukleotide strukturelle mimetika, så som peptid-nukleinsyrer og lignende, ved hjelp av molekylære modelleringsprogrammer som mimetika av den karakteristiske sekundære struktur av de humane telomerase-RNA-komponent-regioner som ønskes~etterlignet. Slike strukturelle mimetika kan benyttes terapeutisk eller for forskjellige anvendelser (f.eks. konkurrerende antagonist, etc).

Antisense

En spesielt egnet type av nukleinsyre ifølge oppfinnelsen er et antisense oligonukleotid som kan benyttes in vivo eller in vitro til å inhibere aktiviteten av human telomerase. Antisense oligonukleotider omfatter en spesifikk sekvens på fra ca. 10 til ca. 25 til 200 eller flere nukleotider (dvs. stort nok til å danne en stabil dupleks, men tilstrekkelig lite til avhengig av administrasjonsmåte, eventuelt å administreres in vivo) som er komplementære til en bestemt nukleotidsekvens i RNA-komponenten av human telomerase. Virkningsmekanismen for slike oligonukleotider kan involvere binding av RNA-komponenten for å forhindre sammensetningen av den funksjonelle ribonukleoprotein-telomerase, forhindre RNA-komponenten fra å tjene som templat for telomer DNA-syntese, destabilisere telomerase-RNA-komponenten og redusere dens halveringstid og/eller inhibere transkripsjon av telomerase-RNA-komponent-genet.

Illustrative antisense oligonukleotider ifølge oppfinnelsen som tjener til å inhibere telomeraseaktivitet in vivo og/eller in vitro, innbefatter de oligonukleotider som ovenfor er nevnt i forbindelse med tester for å bestemme hvorvidt klon pGRN7 omfattet cDNA for RNA-komponenten av human telomerase. Det ble som nevnt ovenfor benyttet tre slike oligonukleotider for å demonstrere inhibering av telomeraseaktivitet in vitro. Sekvensen av hver av disse oligonukleotidene er vist nedenfor.

Disse oligonukleotidene kan også benyttes til å inhibere telomeraseaktivitet i humane celler. Fagmannen vil innse at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et stort utvalg antisense oligonukleotider som er i stand til å inhibere telomeraseaktivitet. Andre anvendelige antisense oligonukleotider ifølge oppfinnelsen er oligonukleotid Tel-AU, som har sekvensen

5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3' og som i likhet med en hvilken som helst av antisense oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres ved å benytte fosforotioat-nukleotider, chiral-metylfosfonater, naturlig forekommende nukleotider eller blandinger av disse for å gi stabilitet og den ønskede Tm. Fagmannen vil innse at et stort utvalgt av modifiserte nukleotidanaloger, så som O-metyl-ribonukleotider, fosforotioat-nukleotider og metyl-fosfonat-nukleotider, kan benyttes for å fremstille nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen, med mer ønskelige egenskaper (dvs. nuklease-resistente, tettere binding, etc.) enn de som produseres ved å benytte naturlig forekommende nukleotider. Andre teknikker for å gjøre oligonukleotider nuklease-resistente, inkluderer teknikker beskrevet i PCT patentpublikasjon nr. 94/12633.

Ytterligere utførelsesformer rettet mot modulering av telomeraseaktivitet, inkluderer metoder som benytter spesifikke antisense polynukleotider som er komplementære med hele eller en del av de humane telomerase-RNA-komponent-(hTR) sekvensene, så som antisense polynukleotider til det humane telomerase-RNA-komponent-gen eller dets transkriberte RNA, inklusivt rettavkortede former som kan assosiseres med telomerase-holoenzym. Slike komplementære antisense polynukleotider kan inkludere nukleotidsubstitusjoner, addisjoner, delesjoner eller transposisjoner så lenge spesifikk binding til den relevante målsekvens som tilsvarer telomerase-RNA-komponenten, eller dens gen, bibeholdes som en funksjojnell egenskap ved polynukleotidet. Komplementære antisense polynukleotider inkluderer løselige antisense RNA- eller DNA-oligonukleotider som kan hybridisere spesifikt til telomerase-RNA-komponent-arter og forhindre transkripsjon av telomerase-RNA-komponent-genet (Ching, et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 86: 10006; Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113: 604; Loreau et al., (1990) FEBS Letters 274: 53; Holcenberg et al., W091/11535; U.S.S.N. 07/530.165; WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641; og EP 386563, som alle herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Antisense polynukleotidene inhiberer derfor produksjon av funksjonell telomerase-RNA-komponent. Siden telomerase-RNA-komponent-ekspresjon (transkripsjonshastighet og /eller RNA-stabilitet) er assosiert med aktivering og enzymatisk aktivitet av telomerase-holoenzym, kan antisense polynukleotider som forhindrer transkripsjon av RNA som tilsvarer telomerase-RNA-komponent og /eller interaksjon av telomerase-RNA-komponent med proteinkomponenten av human telomerase og/eller interaksjonen av telomerase-RNA-komponenten med telomere sekvenser, inhibere telomeraseaktivitet og/eller reversere en fenotype, så som udødeliggjøring eller neoplastisk transformasjon av celler som uttrykker telomeraseaktivitet uten nærvær av antisense polynukleotider. Blandinger som inneholder en terapeutisk effektiv dose av telomerase-RNA-komponent antisense-polynukleotider, kan administreres for behandling av sykdommer som fordrer telomeraseaktivitet for cellulær patogenese (f.eks. neoplasi) eller for å inhibere gamet-produksjon eller opprettholdelse (dvs. som prevensjonsmiddel). Antisense polynukleotider av forskjellige lengder kan produseres selv om slike antisense polynukleotider i alminnelighet omfatter en sekvens på minst ca. 25 påfølgende nukleotider som i det vesentlige er komplementære til en naturlig forekommende telomerase-RNA-komponent-polynukleotidsekvens og som i alminnelighet er perfekt komplementær til en human telomerase-RNA-komponentsekvens, ofte er komplementær til den sekvens av telomerase-RNA-komponenten som er komplementær til telomer-repetisjonssekvensen, eller komplementær til en del av den telomerase-RNA-komponent som er i kontakt med telomerase-polypeptid-subenheten.

Antisense polynukleotider kan fremstilles ut fra en heterolog ekspresjonskassett i en transfekterende celle eller transgen celle. Den heterologe ekspresjonskassett kan være del av en genterapivektor, så som en adenoviral eller adeno-assosiert viral vektor eller annen genterapivektor. Den heterologe kassett kan være på et polynukleotid som ikke er i stand til uavhengig replikasjon og som innføres i celler ved hjelp av én av en rekke egnede kjente metoder (f.eks. lipofeksjon, "biolistics", liposomer, immun-liposomer, elektroporering, etc). Som et alternativ kan antisense polynukleotidene omfatte løselige oligonukleotider som administreres til det eksterne miljø, enten i kulturmediet in vitro eller i interstitielle rom og kroppsvæsker (f.eks. blod, CSF), for in vivo anvendelse. Løselige antisense polynukleotider som forekommer i det eksterne miljø, har vist seg å få adgang til cytoplasmaet og inhibere spesifikke RNA-arter. I enkelte utførelsesformer omfatter antisense polynukleotidene metylfosfonat-deler, C-5-propenyl-deler, 2'-fluororibosesukkere eller utgjør polyamid-nukleinsyrer (PNA) (Egholm et al., (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1895; Wittung et al., (1994) Nature, 368: 561; Egholm et al.

(1993) Nature 365: 566; Hanvey et al. (1992) Science 258: 1481, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Angående generelle metoder som er relatert til antisense polynukleotider, se Antisense RNA and DNA,

(1988), D. A. Melton, red. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

I tillegg til antisense oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen, kan man konstruere oligonukleotider som vil binde seg til dupleks-nukleinsyre, enten i den foldede RNA-komponent eller i genet for RNA-komponenten, og danne en trippelheliks-holdig eller tripleks-nukleinsyre for å inhibere telomeraseaktivitet. Slike oligonukleotider ifølge oppfinnelsen konstrueres ved å benytte base-parringsreglene for trippelheliks-dannelse og nukleotidsekvensen til RNA-komponenten (Cheng et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 15110; Ferrin & Camerini-Otero (1991) Science 354: 1494; Ramdas et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 17395; Strobel et al., (1991) Science 254: 1639; Hsieh et al. (1990) op.cit.; Rigas et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. (U.S.A.) 83: 9591, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Slike oligonukleotider kan blokkere telomeraseaktiviteten på en rekke måter, inklusivt gjennom forhindring av transkripsjon av telomerasegenet eller ved binding seg til en dupleks-region av RNA-komponenten av telomerase på en måte som forhindrer RNA-komponenten enten i å danne en funksjonell ribonukleoprotein-telomerase eller i å tjene som templat for telomer DNA-syntese. De tripleks-dannende oligonuklotidene ifølge oppfinnelsen omfatter i alminnelighet, og avhengig av virkningsmåte, en spesifikk sekvens på fra ca. 10 til ca. 25 til 200 eller flere (dvs. tilstrekkelig stor til å danne en stabil trippelheliks, men tilstrekkelig liten, avhengig av administrasjonsmåle, til eventuelt å administreres in vivo) nukleotider "komplementære" (i denne sammenheng betyr komplementær i stand til å danne en stabil trippelheliks) til en spesifikk sekvens i telomerasens RNA-komponent eller genet for telomerasens RNA-komponent.

I tillegg til de antisense og trippelheliks-dannende oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen, kan sense-oligonukleotider som er sekvens-identiske i det minste med en del av RNA-komponenten av human telomerase, også benyttes til å inhibere telomeraseaktivitet. Oligonukleotider av denne type karakteriseres i henhold til oppfinnelsen ved at de omfatter enten (1) mindre enn den komplette sekvens av RNA-komponenten som fordres for å danne et funksjonelt telomerase-enzym eller (2) den"komplette sekvens av den RNA-komponent som trengs for å danne et funksjonelt telomerase-enzym, så vel som en substitusjon eller insersjon av én eller flere nukleotider som gjør det resulterende RNA ikke-funksjonelt. I begge tilfeller ses inhibering av telomeraseaktivitet som følge av den "mutante" RNA-komponents binding av proteinkomponenter av human telomerase under dannelse av et aktivt telomerase-molekyl. Virkningsmekanismen av slike oligonukleotider involverer således sammensetningen av en ikke-funksjonell ribonukle.oprotein-telomerase eller forhindringen av sammensetningen av en funksjonell ribonukleoprotein-telomerase. Et eksempel kan være en templat-omkastet variant som består av nukleotidene 48-209, men hvor telomer-repetisjons-templatsekvensen er endret. Slike templat-omkastede varianter kan konkurrere om binding til telomerase-proteinkomponenten. Sense oligonukleotider av denne type omfatter ifølge oppfinnelsen i alminnelighet en spesifikk sekvens med fra ca. 20, 50, 100, 200, 400, 500 eller flere, nukleotider som er identiske med en spesifikk nukleotidsekvens i RNA-komponenten av human telomerase.

Dessuten kan antisense polynukleotider omfatte en derivatisert substituent som i det vesentlige ikke interfererer med hensyn til hybridisering til RNA- komponenten av en pattedyr-telomerase. Antisense polynukleotider som er blitt modifisert med tilknyttede kjemiske substituenter, kan føres inn i en metabolsk aktiv eukaryot celle for å hybridisere med en telomerase-RNA-komponent av cellens telomerase. Slike antisense polynukleotider derivatiseres og det tilkobles ytterligere kjemiske substituenter, enten under eller etter polynukleotidsyntesen, og lokaliseres således til en komplementær sekvens i telomerase-RNA-komponenten hvor de frembringer en endring eller kjemisk modifiksjon av en lokal DNA-sekvens og/eller telomerase-proteinkomponenten. Foretrukne tilkoblede kjemiske substituenter innbefatter: europium(lll)texaphyrin, kryssbindende midler, psoralen, metallchelater (f.eks. jern/EDTA chelat for jernkatalysert spaltning), topoisomeraser, endonukleaser, eksonukleaser, ligaser, fosfodiesteraser, fotodynamiske porfyriner, kjemoterapeutiske medikamenter (f.eks. adriamycin, dioksyrubicin), interkallerende midler, base-modifiserte midler, immunglobulin-kjeder og oligonukleotider. Jern/EDTA-chelater er særlig foretrukne kjemiske substituenter når det er ønskelig med lokal spaltning av en polynukleotidsekvens (Hertzberg et al., (1982) J. Am. Chem. Soc. 104: 313; Hertzberg & Dervan (1984) Biochemistry 23: 3934; Taylor et al. (1984) Tetrahedron 40: 457; Dervan, PB (1986) Science 232: 464). Den foretrukne tilkoblingsteknikk inkluderer: direkte binding, f.eks. via en tilknyttet reaktiv aminogruppe (Corey & Schultz (1988) Science 238: 1401 som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse) og andre direktekoblende kjemiske teknikker, selv om streptavidin/biotin og digoksygenin/anti-digoksygenin-antistoff-koblingsmetoder også kan benyttes. Metoder for tilkobling av kjemiske substituenter er beskrevet i US-patent 5:135.720, 5.093.245 og 5.055.556 som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Andre kjemiske koblingsteknikker kan benyttes i henhold til utøverens vurdering. Polynukleotider som tilsvarer hele eller en vesentlig del, av en pattedyr-telomerase-RNA-komponent (dvs. "sense" polynukleotider) kan også derivatiseres og benyttes for reaksjon med telomer-repeterende sekvenser i genomet for å danne addukter eller andre modifikasjoner av det kjemiske miljø i kromosomenes telomer-regioner.

Mismatch templater

Et annet anvendelig oligonukleotid i henhold til oppfinnelsen omfatter en endret eller mutert sekvens av RNA-komponenten av human telomerase. Yu et al., 1990, Nature, 344: 126, viser at en mutert form av RNA-komponenten av Tetrahymena telomerase kan inkorporeres i telomerasen til Tetrahymena-celler og at inkorporeringen har skadelige virkninger på slike celler. Inkorporering av muterte former av RNA-komponenten av human telomerase kan ha lignende virkninger på humane celler som ellers har telomeraseaktivitet, uten å påvirke normale humane celler som ikke har telomeraseaktivitet. Slike muterte former inkluderer de hvor sekvensen 5'-CTAACCCTA-3' er mutert til 5'-CAAACCCAA-3', 5'-CCAACCCCAA-3' eller 5'-CTCACCCTCA-3'. Hver av disse endrede RNA-komponentsekvensene endrer de telomere repeterende enheter som er inkorporert i det kromosomale DNA og påvirker derved kromosomstruktur og funksjon. Slike oligonukleotider kan konstrueres slik at de inneholder restriksjonsenzym-gjenkjenningsseter som kan benyttes i metoder for diagnostisering av nærværet av den endrede RNA-komponent via restriksjonsenzym-kutting av telomer DNA eller et utvidet telomerase-substrat.

For å illustrere denne side ved oppfinnelsen, ble det foretatt setespesifikk mutagenese ved å benytte et plasmid (betegnet pGRN33, tilgjengelig fra the American Type Culture Collection under tilgangsnummeret ATCC 75926) som omfatter et -2,5 kb Hindlll-Sacl-fragment fra lambda-klone 28-1 (se Eksempel 7, nedenfor) så vel som SV40 replikasjonsorigoet (men ingen promoteraktivitet). De resulterende plasmider betegnet pGRN34 (omfattende 5'-CAAACCCAA-3'), pGRN36 (omfattende 5'-CCAACCCCAA-3') og pGRN37 (omfattende 5'-CTCACCCTCA-3') ble transformert inn i eukaryote vertsceller (en 293-avledet cellelinje som uttrykker SV40 stort T-antigen), og telomerase-bestemmelser foretatt ved å benytte celleekstrakter

fra transformantene.

Analysene viste at telomeraseaktiviteten i cellene resulterte i dannelse av nukleinsyrer som omfatter den endrede sekvens, hvilket indikerer at den genomiske klon omfattet et funksjonelt RNA-komponent-gen og at plasmidene omfattet et endret, men funksjonelt, RNA-komponent-gen. Disse resultatene illustrerer hvorledes foreliggende oppfinnelse fører til rekombinante telomerasepreparater og fremgangsmåter for fremstilling av slike preparater. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en rekombinant human telomerase som omfatter proteinkomponentene av human.telomerase i funksjonell assosiering med en rekombinant RNA-komponent ifølge oppfinnelsen. Slike rekombinante RNA-komponent-molekyler ifølge oppfinnelsen inkluderer slike som avviker fra naturlig forekommende RNA-komponent-molekyler ved én eller flere basesubstitusjoner, delesjoner eller insersjoner, så vel som RNA-komponent-molekyler som er identiske med et naturlig forekommende RNA-komponent-molekyl som produseres i rekombinante vertsceller. Fremgangsmåten for fremstilling av slike rekombinante telomerase-molekyler omfatter transformasjon av en eukaryot vertscelle som uttrykker proteinkomponentene av telomerase, med en rekombinant ekspresjonsvektor som koder for et RNA-komponent-molekyl ifølge oppfinnelsen, og dyrkning av nevnte vertsceller, transformert med nevnte vektor under betingelser slik at proteinkomponentene og RNA-komponentene uttrykkes og settes sammen til et aktivt telomerase-molekyl som er i stand til å addere sekvenser (ikke nødvendigvis den samme sekvens som nativ telomerase adderer) til telomerer av kromosomal DNA. Andre anvendelige utførelsesformer av slike rekombinante DNA-ekspresjonsvektorer (eller plasmider) inkluderer plasmider som omfatter genet for RNA-komponenten av human telomerase med en delesjon, insersjon eller annen modifikasjon som gjør genet ikke-funksjonelt. Slike plasmider er spesielt anvendelige ved human genterapi for å "slå ut" det endogene RNA-komponent-gen, selv om det fordres et høyt effektivt transformasjons- og rekombinasjons-system for å gjøre de behandlede celler irreversibelt dødelige.

Ri bozym-utførelsesf ormer

Andre oligonukleotider ifølge oppfinnelsen, betegnet ribozymer, kan også benyttes for å inhibere telomeraseaktivitet. I motsetning til antisense og andre oligonukleotider beskrevet ovenfor, som binder seg til en RNA, en DNA eller en telomerase-proteinkomponent, binder ikke bare et ribozym seg, men spalter også spesifikt og inaktiverer derved potensielt et mål-RNA, så som RNA-komponenten av human telomerase. Et slikt ribozym kan omfatte 5'- og 3'-terminale sekvenser som er komplementære til telomerase-RNA. Avhengig av spaltningssetet, kan et ribozym gjøre telomerase-enzymet inaktivt. Se PCT paténtpublikasjon nr. 93/23572, supra. Fagmannen vil ved gjennomgang av RNA-sekvensen av den humane telomerase-RNA-komponent registrere at det forekommer flere egnede ribozym-målseter som er tilgjengelige for spaltning, for eksempel med et hammerhodemotiv-ribozym. Illustrerende ribozymer av denne type inkluderer ifølge oppfinnelsen ribozymene nedenfor, som er RNA-molekyler som har de angitte sekvenser:

Andre optimale målseter for ribozym-mediert inhibering av telomeraseaktivitet kan bestemmes som beskrevet av Sullivan et al., PCT patentpublikasjon nr. 94/02595 og Draper et al., PCT patentpublikasjon nr. 93/23569, som begge herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Som beskrevet av Hu et al., PCT patentpublikasjon nr. 94/03596, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse, kan antisense- og ribozym-funksjoner kombineres i et enkelt oligonukleotid. Ribozymer kan dessuten omfatte ett eller flere modifiserte nukleotider eller modifiserte koblinger mellom nukleotider slik som ovenfor beskrevet i sammenheng med beskrivelsen av illustrerende antisense oligonukleotider ifølge oppfinnelsen. I henhold til et aspekt, modifiseres en katalytisk subenhet av RNAse P (human eller E. coli) (se Altman S. (1995) Biotechnology 13: 327) for å utvikle en ledersekvens som tilsvarer den del av pattedyr-telomerase-RNA-komponenten som base-parres med telomer-repetisjonssekvensen. Slike RNAse P varianter kan spalte telomersekvenser. I henhold til et aspekt modifiseres en katalytisk subenhet av RNAse P (human eller E. coli) til å utvikle en ledersekvens som er komplementær til en del av telomerase-RNA-komponenten slik at RNAse P varianten kan spalte telomerase-RNA-komponent. Slike manipulerte ribozymer kan uttrykkes i celler eller kan overføres ved en rekke hjelpemidler (f.eks. liposomer, immunliposomer, "biolistics", direkte opptak i celler, etc). Andre former av ribozymer (gruppe I intron ribozymer (Cech T (1995) Biotechnology 13: 323); hammerhode-ribozymer, (Edgington SM (1992) Biotechnology 10: 256) kan modelleres på grunnlag av informasjonen om den beskrevne telomerase-RNA-komponentsekvens til å katalysere spaltning av human telomerase-RNA-komponent og/eller humane telomer-repetisjonssekvenser.

Oppfinnelsen tilveiebringer således et stort utvalg oligonukleotider som inhiberer telomeraseaktivitet. Slike oligonukleotider kan benyttes i terapeutiske metoder for sykdomsbehandling ifølge oppfinnelsen, hvor metodene omfatter at pasienten administreres en terapeutisk effektiv dose av en telomerase-inhibitor eller -aktivator ifølge oppfinnelsen. Man kan måle telomerase-inhibering eller -aktivering for å bestemme den mengde av middel som bør avgis i en terapeutisk effektiv dose, ved å benytte de bestemmelsesmetoder som er beskrevet i de ovenfor omtalte samtidig verserende US-patentsøknader og PCT patentpublikasjoner nr. 93/23572. Som angitt i nevnte søknader og som diskutert ovenfor, gjør inhibering av telomeraseaktivitet en udødelig celle dødelig, mens aktivering av telomeraseaktivitet kan øke cellens replikerende levetid. Telomerase-inhiberingsterapi er en effektiv behandling mot cancere som involverer ukontrollert vekst av udødelige celler, og telomeraseaktivering er en effektiv behandling for å forhindre cellealdring. Administrering av midler som inhiberer eller blokkerer telomeraseaktivitet, så som et antisense oligonukleotid, et trippelheliks-dannende oligonukleotid, et ribozym eller et plasmid som driver ekspresjon av en mutant RNA-komponent av telomerase, kan forhindre telomerase-virkning og i siste instans føre til celle-aldring og celledød i behandlede celler.

Terapeutiske og profylaktiske aspekter

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten terapeutiske metoder som sikrer at normale celler forblir dødelige, idet for eksempel RNA-komponenten modifseres ved å benytte vanlig genetisk manipulering for å deletere hele eller en del av, et naturlig gen som koder for komponenten (f.eks. ved in vitro mutagenese) ved gentisk rekombinasjon. Slike celler vil da være irreversibelt dødelige. Denne fremgangsmåte er nyttig innen genterapi, hvor normale celler som er modifisert til å inneholde ekspresjonsplasmider, føres inn i en pasient, idet man ønsker å sikre at cancerceller ikke innføres eller dersom slike celler innføres, da er disse cellene gjort irreversibelt dødelige.

Siden telomerase bare er aktiv i tumor-, kimlinje- og visse stam-celler i det hematopoietiske system, påvirkes ikke andre normale celler av telomerase-inhiberingsterapi. Det kan også tas forholdsregler for å unngå kontakt mellom telomerase-inhibitoren og kimlinje- eller stam-celler selv om dette kanskje ikke er vesentlig. Siden kimlinjeceller uttrykker telomeraseaktivitet kan for eksempel inhibering av telomerase gi negativ påvirkning på spermatogenese og spermienes levedyktighet, og således indikerer at telomerase-inhibitorer kan være effektive kontraseptive midler eller steriliseringsmidler. Denne kontraseptive effekt behøver imidlertid ikke å være ønsket av en pasient som får en telomerase-inhibitor ifølge oppfinnelsen for behandling av kreft. I slike tilfeller kan man avgi en telomerase-inhibitor ifølge oppfinnelsen på en måte som sikrer at inhibitoren bare vil bli produsert i løpet av terapien, slik at den negative innvirkning på kimlinjeceller bare er forbigående.

Andre terapeutiske metoder ifølge oppfinnelsen benytter telomerase-RNA-nukleinsyre ifølge oppfinnelsen til å stimulere telomeraseaktivitet og til å utvide levetiden til replikative celler. Disse metodene kan utføres ved at det til cellen avgis et funksjonelt rekombinant telomerase-ribonukleoprotein ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan ribonukleoproteinet avgis til en celle i et liposom eller genet for RNA-komponenten av human telomerase (eller et rekombinant gen med andre regulatorelementer) benyttes i et eukaryot ekspresjonsplasmid (med eller uten sekvenser som koder for ekspresjonen av proteinkomponentene av telomerase) for å aktivere telomeraseaktivitet i forskjellige normale, humane celler som ellers mangler påvisbar telomeraseaktivitet som følge av lave ekspresjonsnivåer av RNA-komponenten eller en proteinkomponent av telomerase. Dersom telomerase-RNA-komponenten ikke er tilstrekkelig til å stimulere telomeraseaktivitet, kan RNA-komponenten transfekteres sammen med gener som uttrykker proteinkomponentene av telomerase for å stimulere telomeraseaktivitet. Oppfinnelsen tilveiebringer således fremgangsmåter for behandling av en tilstand assosiert med telomeraseaktivitet i en celle eller gruppe av celler, ved å kontakte cellene med en terapeutisk effektiv mengde av et middel som endrer telomeraseaktiviteten i cellen.

Celler som inkorporerer ekstrakopier av telomerase-RNA-genet kan oppvise en økning i telomeraseaktivitet og en tilsvarende forlenget replikativ levetid. Slik terapi kan foretas ex vivo på celler for senere innføring i en vert eller utføres in vivo. Fordelene ved å stabilisere eller øke telomerlengden ved ex vivo å addere eksogene telomerasegener til normale diploide celler inkluderer: telomer stabilisasjon kan stanse cellulær aldring og potensielt muliggjøre ubegrenset amplifikasjon av cellene; og normale diploide celler med forlenget levetid kan dyrkes in vitro for testing av medikamenter, virusfremstilling eller andre nyttige formål. Dessuten kan ex vivo amplifiserte stam-celler av forskjellige typer som nevnt ovenfor, benyttes ved celleterapi for bestemte sykdommer.

Telomer-stabilisering kan også undertrykke cancer-incidens i replikerende celler ved å forhindre telomerer fra å bli kritisk korte som celler nær krise. Under krise utvikles en massiv genomisk ustabilitet etterhvert som den beskyttende effekt av den telomere "cap" går tapt. Den "genetiske kortstokk" stokkes om, og nesten alle celler dør. De sjeldne celler som unnslipper fra denne prosess er typisk aneuploide med mange gen-omleiringer og ender opp med å reetablere stabilitet i deres telomerer ved å uttrykke telomerase. Dersom krise kan forhindres ved å holde telomerene lange, kan den genomiske ustabilitet som er assosiert med krise, også forhindres, hvilket begrenser sjansene for at en enkelt celle vil undergå det nødvendige antall genetiske mutasjoner som trengs for å utløse en metastatisk cancer.

Celler som målsøkes for telomerase-genterapi (terapi som innebærer økning av telomeraseaktiviteten i en målcelle) innbefatter, men er ikke begrenset til, hematopoietiske stam-celler (AIDS og post-kjemoterapi), vaskulære endotelceller (kardial og cerebral vaskulær sykdom), hudfibroblaster og basale hudkeratinocytter (sårtilheling og forbrenninger), kondrocytter (artritt), hjerneastrocytter og mikroglia-celler (Alzheimers sykdom), osteoblaster (osteoporose), retinaceller (øyesykdommer) og pankretiske celleøyer (Type I diabetes).

De terapeutiske metodene ifølge oppfinnelsen involverer i alminnelighet administrering av et oligonukleotid som bevirker inhibering eller stimulering av telomeraseaktivitet under fysiologiske betingelser in vivo og vil være stabilt under disse betingelsene. Som nevnt ovenfor, kan modifiserte nukleinsyrer bidra til slik stabilitet så vel som til å sikre avgivelse av oligonukleotidet til ønsket vev, organ eller celle. Metoder egnet for avgivelse av oligonukleotider for terapeutiske formål er beskrevet av Inouye et al. US-patent 5.272.065, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.

Selv om oligonukleotider kan avgis direkte som et medikament i en passende farmasøytisk formulering, kan man også avgi oligonukleotider ved å benytte genterapi og rekombinante DNA-ekspresjonsplasmider ifølge oppfinnelsen. Et plasmid som illustrerer dette er beskrevet i Eksempel 8 nedenfor. Generelt vil slike plasmider omfatte en promoter og, eventuelt, en enhancer (adskilt fra eventuelle slike i promotersekvensene) som tjener til å drive transkripsjon av et oligonribonukleotid, så vel som andre regulatorelementer som sørger for episomalt vedlikehold eller kromosomal integrasjon og for høynivå transkripsjon. For genterapi benyttes ofte adenovirusbaserte vektorer, og disse er egnet for bruk i forbindelse med reagensene og metodene ifølge foreliggende oppfinnelse. Se PCT patentpublikasjon nr. 94/12650; 94/12649 og 94/12629. Anvendelige promotere for slike formål er bl.a. metallotioneinpromoteren, den konstitutive adenovirus sene hovedpromoter, den deksametason-induserbare MMTV-promoteren , SV40-promoteren, MRP pollll-promoteren, den konstitutive MPSV-promoteren, den tetracyklin-induserbare CMV-promoteren (som f.eks. den humane umiddelbart tidlige CMV-promoteren) og den konstitutive CMV-promoter. Et plasmid som er anvendelige for genterapi kan omfatte andre funksjonelle elementer, som f. eks. selekterbare markører, identifikasjonsregioner og andre gener. Rekombinante DNA-ekspresjonsplasmider kan også benyttes til å forberede oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen for avgivelse på annen måte enn ved genterapi, selv om det kan være mer regningssvarende å fremstille korte oligonukleotider ved kjemisk syntese in vitro.

Oppfinnelsen vedrører dessuten farmasøytiske blandinger som inkluderer en terapeutisk effektiv mengde av en telomerase-inhibitor eller telomerase-aktivator ifølge oppfinnelsen. Farmasøytiske blandinger for telomerase-inhibitorer ifølge oppfinnelsen, inkluderer en mutant RNA-komponent av human telomerase, et antisense oligonukleotid eller trippelheliks-dannende oligonukleotid som binder RNA-komponenten eller genet for det samme, av human telomerase eller et ribozym som er i stand å spalte RNA-komponenten av human telomerase, eller kombinasjoner av det samme, eller andre farmasøytika i et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel eller salt. Andre farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen omfatter et telomerase-aktivatorpreparat, så som renset human telomerase eller mRNA for proteinkomponenter av telomerase og RNA-komponenten av telomerase og som benyttes til å behandle aldringsrelatert sykdom. I henhold til ett aspekt administreres en cellepopulasjon en mutert sense pattedyr-telomerase-RNA-komponent, hvor den nevnte muterte sense telomerase-RNA-komponent omfatter minst én base-mistilpasning med hensyn til den humane telomerase-repetisjonssekvens, men er i stand til å oppvise telomeraseaktivitet i sammenheng med human telomerase-polypeptidkomponent, hvilket fører til misinkorporering i bestemte nukleotidposisjoner i den humane telomerase-repetisjon, hvorved det dannes telomerer som er avhengig av det stadige nærvær av den muterte sense telomerase-RNA-komponent for vesentlig replikasjon. Det tilveiebringes en terapeutisk fremgangsmåte hvor en mutert sense telomerase-RNA-komponent administreres til en cellepopulasjon for tilstrekkelig lang tid til å innføre telomer-sekvenser som er tilnærmet ikke-funksjonelle, som templater for naturlig forekommende pattedyr-telomerase-RNA-komponenten, etterfulgt av fjerning av den muterte sense telomerase-RNA-komponent, og som resulterer i hurtig tap av den gjennomsnittlige telomerlengde i cellepopulasjonen og øket aldring eller celledødelighet.

Det terapeutiske middel kan inngå i en formulering egnet for parenteral, nasal, peroral eller annen administrasjonsmåte. Se PCT patentpublikasjon nr. 93/23572, supra.

Diagnostiske metoder

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer diagnostiske metoder og reagenser i tillegg til de farmasøytiske formuleringene og terapeutiske metodene som er beskrevet ovenfor. Oppfinnelsen tilveiebringer diagnostiske metoder for å bestemme nivået, mengden eller nærværet av RNA-komponenten av human telomerase, telomerase eller telomeraseaktivitet i en celle, cellepopulasjon eller vevsprøve. I henhold til et beslektet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse reagenser egnet for slike metoder, eventuelt pakket i form av et sett sammen med bruksanvisninger for settet for å praktisere den diagnostiske metode. Som nevnt ovenfor i forbindelse med de tester som ble foretatt for å bestemme at klon pGRN7 inneholdt cDNA for RNA-komponenten av human telomerase, er nivåene av RNA-komponenten forhøyet i tumorceller. Påvisning av RNA-komponenten er således et nyttig diagnostikum for tumorceller.

I tillegg kan prober eller primere som binder seg spesifikt til RNA-komponenten av human telomerase (eller en av kjedene av genet for denne) benyttes i diagnostiske metoder for å påvise nærværet av telomerase-nukleinsyre i en prøve. Primere og prober er oligonukleotider som er komplementære og som således vil binde seg til en mål-nukleinsyre. Selv om primere og prober kan variere i sekvens og lengde, er den primære differensierende faktor knyttet til funksjonen; idet primere tjener til å initiere DNA-syntese, som ved PCR-amplifikasjon, mens prober i alminnelighet bare benyttes til å binde en tilsiktet nukleinsyre. Typiske lengder for en primer eller probe kan være fra 8 til 20 og opp til 30 eller flere, nukleotider. En primer eller probe kan også være merket for å forenkle påvisning (dvs. radioaktive eller fluorescerende molekyler er typiske for dette formål) eller rensing/separasjon (dvs. biotin eller avidin) benyttes ofte for formålet.

Én spesielt foretrukket diagnostisk metode i henhold til oppfinnelsen, involverer påvisning av telomerase-RNA-komponentsekvenser i celle- eller vevsprøver tatt fra pasienter innen risikogruppen for cancer. Slike metoder vil i alminnelighet innebære binding av en merket probe eller primer til en RNA-komponentsekvens under slike betingelser at kun perfekt overensstemmende (komplementære) sekvenser binder seg (hybridiserer) til hverandre. Påvisning av merket materialet bundet til RNA i prøven vil korrelere med nærværet av telomeraseaktivitet ogmed nærværet av cancerceller. Enkelte celler kan uttrykke RNA-komponenten av telomerase, men fortsatt være telomerase-negative som følge av mangelen på ekspresjon av proteinkomponentene av telomerase. Ønsker man å påvise tilstedeværelse av telomeraseaktivitet i slike celler, kan man først isolere protein og deretter bestemme hvorvidt proteinfraksjonen inneholder telomerase-RNA-komponenten, hvilket ville indikere nærvær av telomeraseaktivitet. De diagnostiske metodene ifølge oppfinnelsen kan være spesielt anvendelige ved påvisning av nærværet av telomeraseaktivitet i vevsbiopsier og histologiske snitt, hvorunder metoden utføres in situ, i alminnelighet etter amplifisering av telomerase-RNA-komponenten under bruk av spesifikke PCR-primere ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen tilveiebringer også telomerase-RNA-komponent-polynukleotidprober for diagnostisering av sykdomstilstander (f.eks. neoplasi eller pre-neoplasi) ved påvisning av en telomerase-RNA-komponent, eller omleiringer eller amplifikasjon av telomerase-RNA-komponent-genet i celler eksplantert fra en pasient, eller påvisning av et patognomonisk telomerase-RNA-komponent-allel (f.eks. ved RFLP eller allel-spesifikk PCR-analyse). Påvisningen vil i alminnelighet bli foretatt ved in situ hybridisering ved å benytte et merket (f.eks.32P,^S,<14>C,<3>H, fluorescerende, biotinylert, digoksygeninylert) telomerase-RNA-komponent-polynukleotid, selv om northern blotting, dot-blotting eller løsnings-hybridisering på hoved-RNA eller poly A<*>RNA isolert fra en celleprøve kan benyttes, i likhet med PCR-amplifikasjon, ved å benytte telomerase-RNA-komponent-spesifikke primere. Celler som inneholder en endret mengde telomerase-RNA-komponent sammenlignet med ikke-neoplastiske celler av den samme celletype, vil identifiseres som kandidater for syke celler. På lignende måte vil påvisning av patognomoniske omleiringer eller amplifikasjon av telomerase-RNA-komponent-gen-locuset eller nærliggende loci i en celleprøve, identifisere nærværet av en patologisk tilstand eller en predisposisjon for utvikling av en patologisk tilstand (f.eks. kreft, genetisk sykdom). Polynukleotid-probene benyttes også for rettsmedisinsk identifisering av individer, så som ved farskapstesting eller identifisering av kriminelle eller av ukjente døde.

Innen den humane populasjon kan det være mindre endringer i den grunnleggende primærsekvens av telomerase-RNA-komponenten, inklusivt alleliske varianter, restriksjonssete-polymorfismer og kongenitale telomerase-RNA-komponent-sykdomsalleler assosiert med genetisk sykdom.

Dersom det er ønskelig kan PCR-amplimerer for amplifisering av telomerase i tilnærmet full lengde, kan RNA-komponent-kopier velges i henhold til utøverens vurdering. Tilsvarende kan amplimerer til å amplifisere deler av telomerase-RNA-komponent-genet eller RNA, selekteres.

Telomerase-RNA-komponent-ekspresjon

Avhengig av lengden og den tiltenkte funksjon av primer, probe eller andre nukleinsyre-omfattende sekvenser fra RNA-komponenten i human telomerase, kan ekspresjonsplasmider ifølge oppfinnelsen være anvendelige. For eksempel kan rekombinant produksjon av den fulle lengde av RNA-komponenten ifølge oppfinnelsen, foretas ved å benytte et rekombinant DNA-ekspresjonsplasmid som ifølge oppfinnelsen omfatter en nukleinsyre som omfatter nukleotidsekvensen av RNA-komponenten posisjonert for transkripsjon under kontroll av en passende promoter. Vertsceller for slike plasmider kan være prokaryote eller eukaryote, og promoteren vil i likhet med de øvrige regulatorelementer og selekterbare markører som er valgt for inkorporering i ekspresjonsplasmidet, avhenge av den vertscelle som benyttes for produksjonen.

Det intakte RNA-komponentgen, dvs. promoteren, som inkluderer eventuelle regulatorsekvenser i genets 5-region og RNA-komponentens kodende region, kan benyttes til å uttrykke RNA-komponenten i humane celler, inklusivt humane celler som er udødeliggjort gjennom viral transformasjon eller cancer. Promoteren av RNA-komponent-genet kan imidletid reguleres, og av denne og andre grunner kan det være ønskelig å uttrykke RNA-komponenten under kontroll av en annen promoter. Promoteren av RNA-komponent-genet kan på den annen side benyttes uavhengig av den RNA-komponent-kodende sekvens, for å uttrykke andre kodende sekvenser av interesse. For eksempel kan man studere den transkripsjonene regulering av RNA-komponent-genet ved å fusjonere promoteren av RNA-komponent-genet til en kodende sekvens for en rapportør-kodende sekvens, så som den kodende sekvens for B-galaktosidase eller et annet enzym eller protein hvis ekspresjon lett kan overvåkes. Promoteren og andre regulatorelementer av genet for RNA-komponenten av human telomerase, kan benyttes, ikke bare til å uttrykke RNA-komponenten, men også proteinkomponenter av human telomerase, antisense eller andre oligonukleotider så vel som andre interessante genprodukter i humanceller. Ekspresjonsplasmider som omfatter det intakte gen for RNA-komponenten av human telomerase kan være spesielt anvendelig for en rekke formål, inklusivt genterapi. Fagmannen vil innse at det kan benyttes et stort utvalg ekspresjonplasmider for å fremstille nyttige nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen og at betegnelsen "plasmid" i denne sammenheng refererer seg til en hvilken som helst type av nukleinsyre (fra en fag, et virus, kromsom, etc.) som kan benyttes til å befordre spesifikk genetisk informasjon inn i en vertscelle og vedlikeholde informasjonen i en tid.

Isolering av telomerase-proteinkomponent

Reagensene ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør også kloning og isolering av nukleinsyrer som koder for proteinkomponentene av humane, så vel som andre, pattedyr-telomerase-enzymer og som tidligere ikke har vært tilgjengelige. Adgangen til slike nukleinsyrer supplerer de fordeler som oppnås gjennom nukleinsyrer som omfatter nukleinsyresekvenser av RNA-komponenten av human telomerase. Som nevnt ovenfor kan for eksempel de terapeutiske fordeler ved foreliggende oppfinnelse i enkelte tilfeller forbedres ved anvendelse av rensede preparater av proteinkomponentene av human telomerase og ved adgangen til nukleinsyrer som koder for disse. De nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen som koder for RNA-komponenten av human telomerase, kan benyttes til å isolere den nukleinsyre som koder for proteinkomponentene av human telomerase, hvilket gir adgang til slike fordeler. Oppfinnelsen tilveiebringer således fremgangsmåter for isolering og rensing av proteinkomponenter av human telomerase, så vel som for identifisering og isolering av nukleinsyrer som koder for proteinkomponentene av human telomerase. I henhold til lignende aspekter, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse renset human telomerase, rensede nukleinsyrer som koder for proteinkomponentene av human telomerase og rekombinante ekspresjonsplasmider for proteinkomponentene av human telomerase. Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske blandinger hvor enten proteinkomponentene av human telomerase eller en nukleinsyre som koder for disse proteinkomponentene eller reagerer med nukleinsyrer som koder for disse proteinkomponentene, så som antisense oligonukleotider, trippelheliks-dannende oligonukleotider, ribozymer eller rekombinante DNA-ekspresjonsplasmider for noen av disse, inngår som virkestoff.

Den klonede RNA-komponent av human telomerase kan benyttes til å identifisere og klone nukleinsyrer som koder for proteinkomponentene av ribonukleoprotein-telomerase-enzymet. Flere ulike metoder kan benyttes for å oppnå identifikasjon og kloning av proteinkomponentene. For eksempel kan man benytte affinitetsoppfanging av enzymet eller av delvis denaturert enzym ved, som affinitetsligand, å benytte enten (1) nukleotidsekvenser som er komplementære med RNA-komponenten til å binde seg til RNA-komponenten av det intakte enzym, eller (2) RNA-komponenten til å binde proteinkomponenter av et delvis, eller fullstendig, denaturert enzym. Liganden kan være festet til en fast bærer eller kjemisk modifisert (f.eks. biotinylert) for senere immobilisering på bæreren. Eksponering av celleekstrakter som inneholder human telomerase, etterfulgt av vasking og eluering av telomerasenzymet bundet til bæreren, gir et høyrenset preparat av telomerase-enzymet. Proteinkomponentene kan deretter eventuelt renses videre eller analyseres direkte ved proteinsekvensering. Den fastslåtte proteinsekvens kan benyttes til å fremstille primere og prober for kloning av cDNA eller identifisering av en klon i en genomisk bank som omfatter nukleinsyrer som koder for en proteinkomponent av telomerase.

Affinitetsoppfanging av telomerase under bruk av en konstruert RNA-komponent, kan også foretas ved å benytte in vitro transkibert telomerase-RNA og et system for gjenopprettelse av telomerase-enzymaktivitet. Se Autexier & Greider, 1994, Genes & Development 8:563-575, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. RNA konstrueres slik at det inneholder en merking, på lignende måte. som epitop-merking av proteiner. Merkingen kan være en RNA-sekvens, hvortil det står til rådighet en sterkt bindende ligand, f.eks. et RNA-sekvens-spesifikt antistoff, et sekvens-spesifikt nukleinsyre-bindende protein eller et organisk farvestoff som binder seg sterkt til en spesifikk RNA-sekvens. Telomerasens toleranse overfor markør-sekvensen og posisjonen kan testes ved å benytte standardmetoder. Syntese av den endrede RNA-komponent og gjenopprettelsestrinnet for denne metode, kan også foretas in vivo. Affinitets-oppfangning gjennom bruk av den immobiliserte ligand for RNA-merkingen, kan deretter benyttes til å isolere enzymet.

Ekspresjons-screening kan også benyttes for å isolere telomerase-enzymets proteinkomponenter. Ved denne metode kan cDNA-ekspresjonsbibliotek underkastes screening med merket telomerase-RNA, og cDNA-kodende proteiner som binder seg spesifikt til telomerase-RNA kan identifiseres. En molekylær-genetisk tilnærmingsmåte hvor det benyttes translasjonen inhibering, kan også benyttes for å isolere nukleinsyrer som koder for telomerase-enzymets proteinkomponenter. Ved denne metode fusjoneres telomerase-RNA-sekvenser oppstrøms for en selekterbar markør. Når den uttrykkes i et egnet system, vil den selekterbare markør være funksjonell. Når cDNA som koder for et telomerase-RNA-bindende protein, uttrykkes, vil proteinet binde seg til sin gjenkjenningssekvens og derved blokkere translasjon av den selekterbare markør og således muliggjøre identifikasjon av klonen som koder for proteinet. I andre utførelsesformer av denne metode vil den blokkerte translasjon av den selekterbare markør tillate vekst av transformerte celler. Andre systemer som kan benyttes, innbefatter "interaction trap system" beskrevet i PCT patentpublikasjon nr. WO94/10300; "one-hybrid" systemet beskrevet av Li & Herskowitz, 17. desember, 1993, Science, 262: 1870-1874, og Zervos et al., 29. januar, 1933, Cell 72:223-232, og "two-hybrid" systemet som er kommersielt tilgjengelig fra Clontech.

Telomerase-RNA-bindings- eller telomeraseaktivitets-bestemmelser for påvisning av spesifikt bindende proteiner og aktivitet, kan benyttes til å forenkle rensingen av telomerase-enzymet og identifiseringen av nukleinsyrer som koder for enzymets proteinkomponenter. For eksempel kan nukleinsyrer som omfatter RNA-komponentsekvenser benyttes som affinitetsreagenser for å isolere, identifisere og rense peptider, proteiner eller andre forbindelser som spesifikt binder seg til en sekvens som inngår i RNA-komponenten, så som proteinkomponentene av human telomerase. Det finnes flere ulike formater, inklusivt gelforskyvning, filterbinding, "footprinting", Northwestern (RNA-probe av protein-blott) og foto-kryssbinding, for å påvise slik binding og isolere de komponentene som binder seg spesifikt til RNA-komponenten. Disse bestemmelsene kan benyttes til å identifisere bindende proteiner, følge rensingen av bindende proteiner, karakterisere RNA-bindingsseter, bestemme molekylstørrelsen av bindende proteiner, merke proteiner for preparativ isolering og for påfølgende immunisering av dyr for utvikling av antistoff for å oppnå antistoffer for bruk ved isolering av proteinet eller identifisering av en nukleinsyre som koder for proteinet i et koblet transkripsjons/translasjons-system.

Rensing av pattedyrs telomerase-proteinkomponent

Pattedyrs telomerase-proteinkomponent kan renses fra telomerase-uttrykkende celler, så som HT1080-celler, 293-celler og andre passende udødeliggjorte cellelinjer, ved konvensjonelle biokjemiske metoder. Som eksempel, og uten at det ligger noen begrensning i dette, kan human telomerase renses fra celleekstrakter i det vesentlige i henhold til metoden omtalt i US-patentsøknad 08/288.501 av 10. august, 1994, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Pattedyr-telomerase-ekstrakter kan skilles fra telomerase-RNA-komponenten ved behandling med en RNAse-aktivitet eller på annen hensiktsmessig måte for å dissosiere og/eller nedbryte telomerase-RNA-komponenten mens telomerase-proteinkomponenten i det vesentlige forblir intakt og i stand til rekonstituering ved tilsetning av eksogen telomerase-RNA-komponent, som f.eks. kan fremstilles ved rekombinasjon eller på lignende måte. Telomerase-proteinkomponenten som er renset på denne måte og eventuelt befridd for endogen telomerase-RNA-komponent, kan benyttes i de metoder for screening av midler som her er beskrevet, og for andre anvendelser.

Genterapi

Overføring av eksogent genetisk materiale inn i celler (dvs. DNA-mediert transfeksjon) er en essensiell metode for grunnforskning innen cellebiologi og molekylær genetikk og utgjør dessuten grunnlaget for utvikling av effektive metoder for human genterapi. Hittil har majoriteten av de godkjente genoverføringsforsøk i USA vært basert på replikasjonsdefekte retrovirale vektorer som inneholder en terapeutisk polynukleotid som del av det retrovirale genom (Miller et al. 1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239; Kolberg, R. (1992) J. NIH Res. 4: 43; Cometta et al., (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215). Adenovirale vektorer har også vært beskrevet som mulig anvendelige innen human genterapi (Rosenfeld et al., (1992) Cell 68: 143).

Den andre genoverføringsmetode som er godkjent for bruk på mennesker, er fysisk overføring av plasmid-DNA i liposomer direkte inn i tumorceller in situ. Til forskjell fra virale vektorer som må formeres i dyrkede celler, kan plasmid-DNA renses inntil homogenitet, hvorved muligheten for patogen forurensning reduseres. I enkelte situasjoner (f.eks. tumorceller) behøver det ikke være nødvendig at det eksogene DNA integreres stabilt i den transduserte celle, siden en forbigående ekspresjon kan være tilstrekkelig til å drepe tumorcellene. Liposom-mediert DNA-overføring har vært beskrevet av forskjellige forskere (Wang & Huang (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 980; Wang & Huang (1989) Biochemistry 28: 9508; Litzinger & Huang (1992) Biochem. Biophys. Acta 1113: 201; Gao & Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280; Felgner W091/17424; WO91/16024).

Immunliposomer har også vært beskrevet som bærere av eksogene polynukleotider (Wang & Huang (1987) Proe. Natl.Acad. Sei. (US.A.) 84:7851; Trubetskoy et al., (1992) Biochem. Biophys. Acta 1131: 311). Immunliposomer skulle hypotetisk kunne forventes å ha forbedret celletype-spesifisitet sammenlignet med liposomer som følge av inklusjonen av spesifikke antistoffer som forutsetningsvis binder seg til overflate-antigener på spesifikke celletyper. Behr et al., (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. (U.S.A.) 86: 6982 rapporterer bruk av lipopolyamin som et æagens for selv å mediere transfeksjon uten behovet for noe ytterligere fosfolipid for å danne liposomer.

Et polynukleotid som er tilnærmet identisk med minst 25 nukleotider, fortrinnsvis 50 til 100 nukleotider eller mer, av telomerase-RNA-komponentsekvensen eller dens komplement, kobles følgelig operativt til en heterolog promoter for å danne en transkripsjonsenhet som kan uttrykke et telomerase-RNA-komponent-eller antisense telomerase-RNA-komponent-polynukleotid i en human celle. En slik transkripsjonsenhet kan inngå i en transgen, adenoviral vektor, eller annen genterapi-modalitet for innføring i humane celler, som f.eks. ved behandling av en telomerase-relatert sykdom (f.eks. neoplasi). Passende innføringsmetoder for telomerase-RNA-komponent- sense eller antisense-ekspresjonskonstruksjonen vil av fagmannen velges ut fra akseptabel praksis og regulerende bestemmelser.

Utførelsesformer av transgene dyr

Genomiske kloner av pattedyr-telomerase-RNA-komponent-, særlig telomerase-RNA-komponent-gener som er tilnærmet identiske med mus-telomerase-RNA-komponenten, kan benyttes til å konstruere homologe målsøkende konstruksjoner for utvikling av celler og transgene dyr, utenom mennesket, som har minst ett funksjonelt forstyrret telomerase-RNA-komponent-allel. Retningslinjer for konstruksjon av homologe målsøkende konstruksjoner er beskrevet, bl.a. av : Rahemtulla et al., (1991) Nature 353: 180; Jasin et al., (1990) Genes Devel. 4: 157; Koh et al., (1992) Science 256: 1210; Molina et al., (1992) Nature, 357: 161; Grusby et al., (1991) Science 253: 1417; Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10: 534, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse). Homolog målsøking kan benyttes for å frembringe såkalte "knock out" mus som er heterozygote eller homozygote for et inaktivert telomerase-RNA-komponent-allel. Slike mus kan omsettes kommersielt som forskningsdyr for undersøkelse av immunsystem-utvikling, neoplasi, spermatogenese, benyttes som kjæledyr, eller benyttes til dyreprotein (formiddel) pg andre anvendelser.

Kimært merkede mus utvikles i henhold til Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1988) og Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, red. IRL Press, Washington, D.C., (1987) som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Embryoniske stamceller manipuleres i henhold til publiserte fremgangsmåter (Teratocarsinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach: E. J. Robertson. red. IRL Press, Washington, D.C., (1987); Zjilstra et al., (1989) Nature 342 435; og Schwartzberg et al. (1989) Science 246: 799, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse).

I tillegg kan en telomerase-RNA-komponent cDNA eller en genomisk genkopi benyttes til å konstruere transgener for høynivå ekspresjon av telomerase-RNA-komponent og/eller under transkripsjonen kontroll av transkripsjonskontrollsekvenser som ikke naturlig forekommer i nabostilling til telomerase-RNA-komponent-genet. Som eksempel, uten at det i dette ligger noen begrensning, kan en konstitutiv promoter (f.eks. en HSV-tk eller pgk-promoter) eller en cellelinje-spesifikk transkripsjonen regulatorsekvens (f.eks. en CD4- eller CD8-genpromoter/enhancer) kobles operativt til en telomerase-RNA-komponent-polynukleotidsekvens for å danne et transgen (i alminnelighet i kombinasjon med en selekterbar markør, så som en neo-genekspresjonskassett). Slike transgener kan innføres i celler (f.eks. ES-celler, hematopoietiske stam-celler), og transgene celler og transgene dyr, utenom mennesket, kan oppnås i henhold til konvensjonelle metoder. Transgene celler og/eller transgene dyr, utenom mennesket, kan benyttes for screening av anti-neoplastiske midler og/eller screening med henblikk på potensielle karsinogener, siden overekspresjon av telomerase-RNA-komponent eller uriktig ekspresjon av telomerase-RNA-komponent kan resultere i en preneoplastisk eller neoplastisk tilstand.

Virkestoff-screening

Telomerase-RNA-komponent-polynukleotider, telomerase-proteinkomponent-preparater, telomer-repetisjonstemplater og bindingsreaksjoner og lignende praktiseres med referanse til forsøkseksemplene. Generelt oppnås telomerase-proteinkomponenter ved konvensjonell rensing fra telomerase-uttrykkende pattedyrceller og befris for medfølgende RNA-komponent før deres anvendelse i de her beskrevne bestemmelser. Spesielle vandige betingelser kan fagmannen velge i henhold til konvensjonelle metoder. Som generell veiledning kan følgende vandige bufferbetingelser benyttes: 10-250 mM NaCI, 5-50 mM Tris HCI, pH 5-8, med eventuell tilsetning av divalente kationer og/eller metallchelatorer og/eller ikke-ioniske overflateaktive midler og/eller membranfraksjoner. Fagmannen vil innse at det kan foretas tilsetninger, utelatelser, modifikasjoner (så som pH) og erstatninger (som f.eks. KCI til erstatning for NaCI eller buffer-erstatninger) til disse basisbetingelsene. Det kan foretas modifikasjoner i disse grunnleggende bindingsreaksjonsbetingelser så lenge det forekommer spesifikk telomerase-holoenzym-dannelse og/eller telomeraseaktivitet i kontrollreaksjonene. Betingelser som ikke tillater spesifikk binding og spaltning i kontrollreaksjoner (intet middel inkludert) er ikke egnet for bruk i bindingsbestemmelser.

For å bestemme binding av telomerase-RNA-komponent til immobilisert telomerase-proteinkomponent, merkes fortrinnsvis telomerase-RNA-komponent-arten med en påvisbar markør, i alminnelighet en biotinylgruppe, en fluorescerende del eller i et nukleotid inkorporert en radioaktiv merking. Egnede merkinger for telomerase-proteinkomponenter inkluderer, men er ikke begrenset til, radioaktiv merking ved inkorporering av en radioaktivt merket aminosyre (f.eks.<14>C-merket leucin,<3>H-merket glycin,<35>S-merket metionin), radioaktiv merking ved posttranslasjonell radiojodering med<125>l eller<131>1 (f.eks. Bolton-Hunter-reaksjon og kloramin T), merking ved posttranslasjonell fosforylering med<32>P (f.eks. fosforylase og uorganisk radioaktivt merket fosfat), fluorescensmerking ved inkorporering av en fluorescerende merking (f.eks. fluorescein eller rhodamin) eller ved merking ved hjelp av andre konvensjonelle metoder. I utførelsesformer hvor én av polypeptidartene er immobilisert ved kobling til et substrat, merkes i alminnelighet den andre komponenten med en påvisbar markør.

Merket telomerase-RNA- eller proteinkomponent bringes i kontakt med henholdsvis immobilisert telomerase-protein- eller RNA-komponent, og et middels evne til å endre den mengde merket komponent som immobiliseres (dvs. som binder den beslektede telomerase-komponent og innfanges), måles. Inkuberingstid og temperatur for en bindingsreaksjon kan varieres så lenge de valgte betingelser tillater at det kan inntre spesifikk binding i en kontrollreaksjon hvor det aktuelle middel ikke er tilstede. Foretrukne utførelsesformer gjør bruk av en reaksjonstemperatur på minst ca. 15°C, helst 35 til 42°C og en inkuberingstid på minst ca. 15 sekunder, selv om lengre inkuberingsperioder i enkelte utførelsesformer er å foretrekke slik at det innstiller seg likevekt. Bindingskinetiske forhold og den termodynamiske stabilitet av bundne komplekser bestemmer hvilket spillerom som finnes for variering av tid, temperatur, salt, pH og andre reaksjonsbetingelser. For en bestemt utførelsesform kan imidlertid de ønskede bindingsreaksjonsbetingelser av fagmannen lett kalibreres ved å benytte konvensjonelle metoder, og disse kan innbefatte bindingsanalyse ved bruk av Scatchard-analyse, Hill-analyse og andre metoder (Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (red.) W.H. Freeman and Company, New York).

Spesifikk binding av henholdsvis merket telomerase-proteinkomponent til immobilisert telomerase-RNA-komponent, bestemmes ved å inkludere umerket konkurrerende protein (f.eks. albumin) og/eller umerket RNA. Etter at en bindingsreaksjon er fullført, påvises den mengde av merkede arter som spesifikt bindes til den immobiliserte art. Som eksempel og uten at det i dette ligger noen begrensning, fjernes den vandige fase som inneholder ikke-immobilisert merket telomerase-proteinkomponent etter en inkuberingstid som egner seg for binding, hvoretter substratet som inneholder det immobiliserte bundne telomerase-holoenzym og eventuelt merket telomerase-proteinkomponent bundet til dette, vaskes med en passende buffer, eventuelt inneholdende umerkede blokkeringsmidler, hvorpå vaskebuffeme fjernes. Etter vasking bestemmes den mengde av påvisbar merking som forblir spesifikt bundet til den immobiliserte merkede komponent (f.eks. ved optisk, enzymatisk, autoradiografisk eller annen radiokjemisk teknikk).

I enkelte utførelsesformer inkluderes tilsetning av umerkede blokkerende midler som inhiberer ikke-spesifikk binding. Eksempler på slike blokkerende midler inkluderer, men er ikke begrenset til, følgende: kalvethymus-DNA, laksesperma-DNA, gjær-RNA, oligonukleotider av blandede sekvenser (vilkårlig eller pseudovilkårlig sekvens) av forskjellige lengder, bovint serumalbumin, ikke-ioniske overflateaktive midler (NP-40, Tween, Triton X-100, etc), fettfrie tørrmelkproteiner, Denhardfs reagens, polyvinylpyrrolidon, Ficoll og andre blokkeringsmidler. Fagmannen kan dessuten ut fra egen vurdering velge å inkludere blokkeringsmidler i passende konsentrasjoner i bindingsbestemmelser.

I utførelsesformer hvor en telomerase-RNA-komponent eller telomerase-proteinkomponent, immobiliseres, kan det benyttes kovalent eller ikke-kovalent bindingTil et substrat. Kovalent kjemisk koblingsteknikk inkluderer, men er ikke begrenset til, vel karakteriserte kjente metoder (Kadonaga & Tijan (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. (U.S.A.) 83: 5889). Et eksempel, uten at det i dette ligger noen begrensning, er kovalent kobling til et substrat derivatisert med cyanogenbromid (så som CNBr-derivatisert Sepharose 4B). Det kan være ønskelig å benytte en spacer for å redusere mulig sterisk hindring fra substratet. Ikke-kovalent binding av proteiner til et substrat inkluderer, men er ikke begrenset til, binding av proteinet til en ladet overflate og binding med spesifikke antistoffer.

Ifølge én utførelsesform identifiseres kandidater for terapeutiske midler ut fra deres evne til å blokkere bindingen av en telomerase-proteinkomponent til en telomerase-RNA-komponent.

En telomerase-RNA-komponent som benyttes for disse metoder omfatter i alminnelighet en naturlig forekommende pattedyr-telomerase-RNA-komponentsekvens (f.eks. en human RNA-komponent), selv om mutante telomerase-RNA-komponentsekvenser noen ganger benyttes dersom den mutante telomerase-RNA-komponent binder seg til telomerase-proteinkomponenten under betingelsene for kontrollbestemmelsen (f.eks. fysiologiske betingelser).

I henhold til en utførelsesform identifiseres kandidater for telomerase-modulerende midler gjennom deres evne til å frembringe en statistisk signifikant reduksjon eller økning i transkripsjon av en rapportør-polynukleotidsekvens (f.eks. B-galaktosidase-gen, luciferace-gen, HPRT-gen) operativt koblet til en transkripsjonen regulatorsekvens av et pattedyrs telomerase-RNA-komponent-gen, fortrinnsvis et humant telomerase-RNA-komponent-gen, i en metabolsk aktiv pattedyrcelle. Et rapportørgen (f.eks. HPRT) kan settes inn i et restriksjonssete eller et rettavkuttet sete av et ds cDNA av en pattedyrs telomerase-RNA-komponent slik at det utvikles en homolog målsøkende konstruksjon eller et transgen hvor rapportør-genet i en levedyktig pattedyrcelle anbringes under transkripsjonen kontroll av promoteren for det endogene telomerase-RNA-komponent-gen og beslektede transkripsjons-kontrollelementer. Som kandidater for telomerase-modulerende midler identifiseres derved midler som fører til en doseavhengig transkripsjonen modulering av rapportør-genet.

I en variant målsøkes et endogent telomerase-RNA-komponent-gen i en pattedyrcelle med en homolog målsøkende konstruksjon for å anbringe en rapportør-polynukleotidsekvens i en virksom kobling til den oppstrøms transkripsjonsregulerende sekvens (f.eks. promoter) av det endogene telomerase-RNA-komponent-gen i det endogene gen's kromosomale locus. I en alternativ variant kobles et eksogent polynukleotid som omfatter et rapportør-polynukleotid operativt til en transkripsjonsregulerende region av et pattedyrs telomerase-RNA-komponent-gen (f.eks. promoter og oppstrøms franskripsjonsfaktor-bindingsseter), det eksogene polynukleotid overføres til en pattedyrcelle hvor det kan integreres ikke-homologt i en kromosomal lokalisering og/eller opprettholdes eller replikeres som et episomalt polynukleotid. Midler som fører til en statistisk signifikant transkripsjonen modulering av rapportør-polynukleotidet i celler behandlet med midlet, identifiseres derved som kandidater for pattedyr-telomerase-modulerende midler.

Telomerase-modulerende midler som reduserer cellens evne til å reparere telomer skade eller inhibere telomer replikasjon (f.eks. ved kompetitivt å inhibere endogen naturlig forekommende telomerase) er kandidater for antineoplastiske midler eller sensibiliserende midler som sensibiliserer celler (f.eks. neoplastiske celler) overfor telomer-skadende midler (f.eks. alkyleringsmidler og ioniserende bestråling).

Kandidater for antineoplastiske midler undersøkes deretter ytterligere med henblikk på anti-neoplastisk aktivitet i bestemmelser som rutinemessig benyttes for å forutsi egnethet som humant antineoplastisk medikament. Eksempler på disse bestemmelsene inkluderer, men er ikke begrenset til: (1) kandidatmidlets evne til å inhibere forankrings-uavhengig transformerte cellers evne til å vokse i mykagar, (2) evne til å redusere tumorigenitet av transformerte celler transplantert inn i nu/nu mus, (3) evne til å reversere morfologisk transformasjon av transformerte celler, (4) evne til å redusere vekst av transplanterte svulster i nu/nu mus, (5) evne til å inhibere dannelse av svulster eller pre-neoplastiske celler i dyremodeller for spontan eller kjemisk indusert karsinogenese og (6) evne til å indusere en mer differensiert fenotype i de transformerte cellene som midlet tilføres.

Bestemmelser for å påvise midlers evne til å inhibere eller øke telomerase-proteinkomponent -: telomerase-RNA-komponent-binding og/eller enzymatisk aktivitet av telomerase, letter muligheten for rask gjennom-screening av middel-banker (f.eks. forbindelsesbibliotek, peptidbibliotek og lignende) for å identifisere telomerase-antagonister eller -agonister. Slike antagonister og agonister kan modulere telomeraseaktivitet og derved modulere evnen til telomer reparasjon samt replikativt potensiale.

Administrering av en effektiv dose av et middel som er i stand til spesifikt å inhibere telomeraseaktivitet, kan benyttes som en terapeutisk eller profylaktisk metode for behandling av patologiske tilstander (f.eks. kreft, inflammasjon, lymfoproliferative sykdommer, autoimmunsykdommer, neurodegenerative sykdommer og lignende) som effektivt behandles ved å modulere telomeraseaktivitet og DNA-reparasjon og replikasjon.

Som fagmannen vil forstå ved lesing av denne beskrivelse, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse verdifulle reagenser vedrørende human telomerase, så vel som en rekke anvendelige terapeutiske og diagnostiske metoder. Den ovenfor gitte beskrivelse gir nødvendigvis et begrenset utvalg av slike metoder, og må ikke ansees som begrensende for oppfinnelsens ramme. Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå klart fra de etterfølgende eksempler og patentkrav.

De etterfølgende eksempler beskriver bestemte aspekter ved oppfinnelsen for å illustrere oppfinnelsen og gi en beskrivelse av de metoder som er benyttet for å isolere og identifisere RNA-komponenten av human telomerase. Eksemplene må ikke ansees som begrensende for oppfinnelsen, idet eksemplene kun bringer spesifikk nyttig metodikk for forståelse og utøvelse av oppfinnelsen.

Forsøkseksempler

Oversikt

Kloningen av RNA-komponenten av human telomerase fordret en ny metode som involverer negativ seleksjon og positive seleksjonsrunder beskrevet nedenfor. Til å begynne med ble det imidlertid gjort et forsøk på å klone RNA-komponenten ved å benytte revers transkripsjon og en metode for å klone endene av cDNA, betegnet '5-RACE PCR-amplifikasjon. Den reverse transkripsjonsreaksjon ble initiert med en primer som var identisk med repetisjonsenheten i den enkeltkjedede del av human telomer DNA og således komplementær til en sekvens som antas å forekomme i RNA-komponenten av human telomerase. I sin 5'-ende omfattet primeren også en sekvens som tilsvarer gjenkjenningssetet til et restriksjonsenzym. Når imidlertid det cDNA som ble produsert ved den reverse transkripsjonsreaksjon og PCR-amplifikasjon ble undersøkt ved gelelektroforese og nukleotid-sekvensanalyse av nukleinsyre-båndene som forekom i gelen, ble det bare påvist ribosomale RNA-sekvenser. Lignende problemer oppsto når variasjoner av denne 5'-RACE-angrepsmåte ble forsøkt ved å benytte "nested" primere.

De vellykkede kloninger startet med fremstillingen av cDNA fra rensede preparater av human telomerase så vel som fra cellelinjer som har human telomeraseaktivitet og fra cellelinjer som ikke har påvisbar human telomeraseaktivitet. Fremgangsmåten benyttet for å fremstille cDNA er beskrevet utførlig i Eksempel 1, nedenfor. To negative seleksjonstrinn og påfølgende runder av positiv seleksjon ble benyttet sammen med cDNA-preparater fra to humane cellelinjer, for å senke konsentrasjonen av uønskede sekvenser og for å øke konsentrasjonen av de ønskede RNA-komponentsekvensene.

Det negative seleksjonstrinn involverte fremstilling av et biotinylert PCR-produkt fra cDNA fremstillet fra en human cellelinje som ikke har påvisbar telomeraseaktivitet. Det biotinylerte PCR-produkt ble denaturert og deretter rehybridisert i en løsning som besto av en meget lavere konsentrasjon av ikke-biotinylert PCR-produkt (100 biotinylert produkt: 1 ikke-biotinylert produkt) fra cDNA fremstillet fra en human cellelinje som har telomeraseaktivitet. Med utgangspunkt i den mulighet at den telomerase-negative cellelinje skulle inneholde en viss liten mengde av RNA-komponenten, ble hybridiseringstrinnet foretatt for å diskriminere eller selektere bare mot RNA som ble uttrykt rikelig i begge cellelinjene. Etter hybridisering til en c„t selektert for å muliggjøre hybridisering av den mest rikelig uttrykte RNA, ble det uønskede materialet fjernet ved binding til streptavidinylerte magnetiske partikler. Supernatanten som ble igjen etter partikkeloppsamling, inneholdt den ønskede cDNA for RNA-komponenten av human telomerase. Fremgangsmåten for PCR-amplifikasjon av cDNA er beskrevet i Eksempel 2, nedenfor.

Dette materialet ble anriket videre med henblikk på den ønskede cDNA ved påfølgende runder med positiv seleksjon. I det positive seleksjonstrinn ble en biotinylert probe som var komplementær til den predikerte templatsekvens i RNA-komponenten av human telomerase, hybridisert til PCR -produkt fra en anriket (ved negativ seleksjon) prøve av den PCR-amplifiserte cDNAfra en human cellelinje som har telomeraseaktivitet. Etter hybridisering ble probe/mål-kompleksene bundet til avidinylerte magnetiske kuler som så ble oppsamlet og benyttet som kilde for nukleinsyrer anriket med henblikk på RNA-komponentsekvenser, i ytterligere positive seleksjonsrunder. Den positive seleksjonsprosess er beskrevet mer detaljert i Eksempel 3 og 4, nedenfor.

Etter den tredje positive seleksjonsrunde ble amplifikasjonsproduktene separert ved gelelektroforese og utsnitt av gelen tilsvarende nukleinsyrene med en størrelse på -200 bp, fjernet. Nukleinsyrene ble deretter eluert fra gelsnittene og amplifisert ved PCR. PCR-amplifikasjonsproduktene ble kuttet med restriksjonsenzym Noti og deretter ligert inn i Notl-setet til plasmidet pBluescriptllSK+ som er kommersielt tilgjengelig fra Stratagene. De resulterende plasmidene ble transformert inn i E. coli-vertsceller og enkeltkolonier isolert og benyttet som nukleinsyrekilde for videre analyse og DNA-sekvensering. En rekke kloner som ifølge denne test var positive, ble deretter analysert ved DNA-sekvensering og et utvalg av andre tester.

Disse andre testene inkluderte de følgende: (1) bestemmelse av hvorvidt antisense oligonukleotider komplementære til den antatte RNA-komponent, ville inhibere telomeraseaktiviteten i humane celleekstrakter som var kjent for å inneholde telomerase; (2) bestemmelse av hvorvidt PCR-primere som var spesifikke for en antatt RNA-komponent-klonsekvens kunne benyttes til å amplifisere en nukleinsyre forekommende i en telomeraseprøve, og hvorvidt det eventuelt observerte produkt ville spore opp telomeraseaktivitet under rensing av telomerase og (3) bestemme hvorvidt PCR-primere som er spesifikke for en antatt RNA-komponent-klonsekvens kunne benyttes til å amplifisere en nukleinsyre som forekommer i større rikelighet i celleekstrakter fra celler hvor det er kjent at telomeraseaktiviteten er høy (dvs. tumorceller) enn i celleekstrakter fra celler som er kjent for ikke å produsere eller kun produsere små mengder telomeraseaktivitet. En klon, betegnet plasmid pGRN7, produserte i disse testene resultater som var i overensstemmelse med den bestemmelse at plasmidet omfattet cDNA tilsvarende RNA-komponenten av human telomerase.

Antisense oligonukleotider som tilsvarer sekvensene av den antatte RNA-komponentsekvens av pGRN7, viste seg å inhibere telomeraseaktivitet in vitro. Når telomerase ble renset fra celleekstrakter ved en prosess som involverte (1) DEAE-kromatografi; (2) Sephadex S300-kromatografi og (3) enten glycerol-gradient-, SP-sepharose- eller fenyl-sepharose-separasjon og fraksjonssamling, amplifiserte PCR-primere som var spesifikke for den antatte RNA-komponentsekvens av pGRN7, en nukleinsyre av passende størrelse, og mengden av amplifikasjonsprodukt korrelerte godt med den grad av telomeraseaktivitet som ble iakttatt i de oppsamlede fraksjoner. Endelig oppviste celleekstrakter fra normale celler (ikke påvisbar telomeraseaktivitet) og kreftceller (forekommende telomeraseaktivitet) så vel som testikkelceller (forekommende telomeraseaktivitet) mengder som tilsvarte mengdene av PCR-produkt etter revers-transkripsjon og PCR-amplifikasjon (RT-PCR) med primere som var spesifikke for den antatte RNA-komponent i pGRN7. Arbeidsforskriften for denne RT-PCR er beskrevet i Eksempel 5 og 6, nedenfor.

Ovennevnte resultater gir overbevisende indikasjoner på at RNA-komponenten av human telomerase var blitt klonet, og plasmid pGRN7 ble deretter benyttet for å isolere en genomisk klon av RNA-komponenten fra en human cellelinje som beskrevet i Eksempel 7, nedenfor. Den genomiske klon ble identifisert i, og isolert fra, et genomisk bibliotek av human DNA innsatt i en lambda-vektor FIXII anskaffet fra Stratagene. Den ønskede klon som omfatter RNA-komponent-gensekvensene, inneholdt et -15 kb innskudd og ble betegnet klon 28-1. Denne klon er deponert ved American Type Culture Collection og er tilgjengelig under tilgangsnummer 75925. Forskjellige restriksjonsfragmenter ble subklonet fra denne fag og sekvensert. Genet er også blitt lokalisert til den distale ende av q-armen av kromosom 3. Sekvensinformasjonen oppnådd fra et SaulllAI restriksjonsenzyms gjenkjenningssete i den ene ende av -15 kb innskuddet til et internt Hindlll restriksjonsenzyms gjenkjenningssete, som omfatter hele den modne RNA-komponensekvens så vel som transkripsjons-kontrollelementer av RNA-komponent-genet av lambda klon 28-1, er vist ovenfor.

Eksempel 1

Fremstilling av PCR-amplifiserbart cDNA

RNA ble tatt fra 293- og IMR-90-celler ved guanidin-tiocyanat-ekstraksjon eller fra rensede telomerasefraksjoner ved fenol/kloroform-ekstraksjoner. Det totale RNA fra 293-celler ble størrelsesfraksjonert på en 2% agarosegel, og RNA med lengder mindre enn 500 bp ble isolert.

Førstekjede cDNA-syntese ble foretatt med Superscript™ li revers transkriptase anskaffet fra Bethesda Research Laboratories (BRL). Ca. 0,5 til 1,0 u.g RNA ble blandet med ca. 40 ng random primer (6 mer; pdN6) i vann i et totalvolum på 11 jiL Løsningen ble oppvarmet i 10 minutter ved 95°C og deretter avkjølt på is i 5-10 minutter. Den denaturerte nukleinsyren ble oppsamlet ved sentrifugering. Den denaturerte RNA- og primer-blanding ble deretter resuspendert ved i følgende rekkefølge å tilsette: 4 \ xl 5x førstekjede-syntesebuffer; 2 nL 0,1 M ditiotreitol (DTT);

1 ul RNAsin (Pharmacia); og 1 ul dNTP (2,5 mM av hver stam-løsning). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 42°C i 1 minutt, hvoretter 1 ul (200 enheter) Superscript™ II RTase (BRL) ble tilsatt og innblandet i reaksjonsblandingen som så ble inkubert i 60 minutter ved 42°C. Den resulterende reaksjonsblanding som inneholdt det nylig syntetiserte cDNA, ble anbragt på is inntil annenkjede-syntesen ble foretatt.

Annenkjede cDNA-syntesen ble foretatt som følger. Ca. 20 \ xL av reaksjonsblandingen fra førstekjede cDNA-syntesen (ovenfor) ble i den angitte rekkefølge blandet med følgende komponenter: 111,1 jxLvann; 16|iL10xE. coli DNA-ligasebuffer; 3 |il_ dNTP (2,5 mM av hver stam-løsning); 1,5 uL E. coli DNA-ligase (15 enheter fra BRL); 7,7 uL E. coli DNA-polymerase (40 enheter fra Pharmacia) og 0,7 \ xl E. coli RNase H (BRL). Den resulterende løsning ble blandet forsiktig og inkubert i 2 timer ved 16°C, hvorpå 1 |iL (10 enheter) av T4 DNA-polymerase ble tilsatt til reagensrørert og inkuberingen fortsatt i 5 minutter ved samme temperatur (16°C). Reaksjonen ble stanset og nukleinsyren oppsamlet ved å ekstrahere reaksjonsblandingen to ganger med fenol/kloroform, utfelle nukleinsyren med etanol og sentrifugere reaksjonsblandingen for å pelletere nukleinsyren.

cDNA-pelleten oppsamlet ved sentrifugeringen, ble resuspendert i 20 \ xL TE-buffer og ligert til dobbelkjedet oligonukleotid betegnet "NotAB" sammensatt av to oligonukleotider (NH2 er en amino-blokkerende gruppe):

Det dobbelkjedede oligonukleotid ble fremstillet ved å blande 50 u.L NotA oligonukleotid (100 pmol) med 50^L NotB oligonukleotid (100 pmol) i 46,25 uL vann, og oppvarme den resulterende løsning i 5 minutter ved 95°C og tilsette 3,75 uL av 20x SSC-buffer mens løsningen fremdeles var varm. Røret som inneholdt blandingen ble deretter anbragt i et beger inneholdende varmt vann (ved en temperatur på ca. 70 til 75°C), hvoretter temperaturen fikk synke langsomt til under 15°C slik at de to oligonukleotidene kunne hybridisere og danne det dobbelkjedede oligonukleotid NotAB. Den resulterende nukleinsyre ble oppsamlet ved utfelling og sentrifugering.

Det dobbelkjedede NotAB oligonukleotid ble resuspendert i ca. 30 \ xL TE-buffer og deretter ligert til cDNA i en reaksjonsblanding inneholdende 10 uL av det ovenfor beskrevne cDNA-preparat, ca. 50 pmol (beregnet med OD260) av NotAB;

2 |iL av 10x T4 DNA ligasebuffer; 1,2 uL av T4 DNA ligase; 0,2 u.L av 10 mM ATP og vann i et totalvolum på 20 ved inkubering av reaksjonsblandingen ved 16°C over natten. Reaksjonsblandingen ble deretter varme-inaktivert ved oppvarming til 65°C i 10 minutter. Ca. 1 til 2 av den resulterende blanding ble i alminnelighet benyttet for PCR-amplifikasjon. Ligeringsblandingen kan amplifiseres i 10 til 15 runder (94°C, 45 sekunder; 60°C, 45 sekunder; og 72°C, 1,5 minutter) og oppbevares som en stam-løsning, som beskrevet i Eksempel 2.

Eksempel 2

PCR-amplifikasjon av cDNA

cDNA ble rutinemessig amplifisert ved fremstililng av en amplifikasjons-reaksjonsblanding bestående av 5 \ il 10x PCR-buffer (500 mM KCI; 100 mM Tris, pH=8,3; og 20 mM MgCI2; 5-8 (iL dNTP (2,5 mM av hver); 1 Taq polymerase (Boehringer-Mannheim); 0,1 ul av gen 32 protein (Boehringer-Mannheim); 6 ul NotB-primer (20 [ xM stam-løsning); 2 \ iL cDNA (fremstillet som beskrevet i Eksempel 1) og vann til 50 \ iL. Denne blandingen ble deretter overskiktet med 50 til 100 p.L mineralolje, og PCR-amplifikasjon foretatt i 10 til 15 runder ved 94°C, 45 sekunder; 60°C, 45 sekunder; og 72°C, 1,5 minutter. Etter amplifisering ble reaksjonsblandingen ekstrahert med fenol/kloroform og den amplifiserte nukleinsyre utfelt med etanol og oppsamlet ved sentrifugering. Presipitatet ble deretter løst i 100 uL TE-buffer for å fremstille en stam-løsning.

Eksempel 3

PCR-amplifikasjon for subtraherende hybridisering og cyklisk seleksjon For å fremstille PCR-produkt for både subtraherende hybridisering og cyklisk seleksjon, ble ca. 1 uL av en stam-løsning fremstillet som beskrevet i Eksempel 2, amplifisert i 50 (iL PCR-reaksjonblanding fremstillet som beskrevet i Eksempel 2, bortsett fra at det ble foretatt 21-24 runder av primer-hybridisering, ekstensjon og denaturering av produktet. Etter amplifisering ble reaksjonsblandingen ekstrahert med fenol/kloroform, utfelt med etanol og oppsamlet ved sentrifugering. Produktutbyttet ble anslått ved farving med etidiumbromid etter agarose-gelelektroforese av en liten alikvot av reaksjonsblandingen. For subtraksjonshybridisering ble et cDNA-bibliotek fra telomerase-negative celler (IMR-90) amplifisert i nærvær av biotinylert dUTP. Et ca. 100 til 1 forhold til mellom cDNA fra telomerase-negative celler (IMR-90) og cDNA fra telomerase-positive celler (293) ble benyttet for å foreta subtraksjonshybridisering. Standardbetingelsene ble benyttet ved 65°C i 48-72 timer. Det ble i alminnelighet benyttet ca. 2 \ xg av nukleinsyreproduktet fra delvis renset cDNA, og negativt selektert materiale ble benyttet i minst to runder av cyklisk seleksjon.

Etter cyklisk seleksjon, beskrevet i Eksempel 4, ble ca. 1 til 2 jiL av de selekterte "pull-down" produktene (ut fra et totalvolum på 20 uL) PCR-amplifisert som beskrevet i Eksempel 2, i 22 runder, utfelt med etanol og oppsamlet ved sentrifugering for å foreta ytterligere cyklisk seleksjon.

Eksempel 4

Positiv seleksjon av PCR-amplifisert cDNA

For det positive seleksjonstrinn av den cykliske seleksjonsprosess benyttet for å klone RNA-komponenten av human telomerase, ble ca. 2 u.g av den PCR-amplifiserte cDNA fortynnet i 25 jiL TE-buffer og deretter blandet med 1,25 uL 20x SSC og den resulterende løsning oppvarmet til 95°C i 3 minutter. Temperaturen ble senket til 60°C i 5 minutter og 1 \ xl (0,1 ng/nL) av den R2- eller R4-biotinylerte probe tilsatt. Sekvensene for disse probene er vist nedenfor. Probene er O-metyl-RNA-prober slik at U er O-metyl-uridin, A er O-metyl-riboadenin, G er O-metyl-riboguanin og I er inosin.

R2-proben er spesifikk for den telomere repetisjon og R4 er spesifikk for RNase P, som ble benyttet til oppsporing av effektiviteten og effekten av den

cykliske seleksjonsprosess. Ved samtidig å foreta en cyklisk seleksjon, men separat for RNase P, et molekyl med kjent sekvens, kan man ha større tillit til at den cykliske seleksjonsprosess funksjonerer riktig med hensyn til det interessante molekyl, i dette tilfelle RNA-komponenten av human telomerase.

Etter at enten R2- eller R4-proben var tilsatt til blandingen ved 65°C, ble temperaturen av hybridiserings-reaksjonsblandingen senket til 30°C ved inkubering av blandingen ved denne temperatur i 5 minutter, hvorpå temperaturen av reaksjonsblandingen ble ytterligere senket til 14°C ved å inkubere ved denne temperatur i 60 minutter. Tilslutt ble blandingen inkubert ved 4°C i 2-12 timer.

Hele hybridiserings-reaksjonsblandingen for hver prøve (R2 eller R4) ble tilsatt til 400 uL 0,5x SSC ved 4°C og deretter tilsatt til et rør inneholdende iskalde magnetiske kuler som ble anskaffet fra Promega og på forhånd vasket fire ganger med 0,5x SSC før bruk. Den resulterende blanding ble inkubert i 30 minutter ved 4°C for å sikre fullstendig binding til magnetkulene. Hvert reaksjonsrør ble deretter inkubert en kort stund ved romtemperatur på magnetstativet (Promega) for å trekke ned kulene. Kulene ble resuspendert i kald 0,5x SSC (600 uL) og anbragt (i et rør) på is. Prøvene ble vasket tre ganger til på denne måte med 0,5x SSC. Nukleinsyrer ble eluert fra kulene ved at kulene ble resuspendert i 100jj.L vann og inkubert i 2 minutter ved 65°C før de igjen ble plassert på magnetstativet for oppsamling. Denne prosessen ble gjentatt tre ganger til, idet de resuspenderte kulene siste gang ble inkubert i 5 minutter ved 65°C før de ble anbragt på magnetstativet for oppsamling. Alle 100 [ il supernatantene (for hver prøve) ble slått sammen og tørket ned til 20 u.L i en SpeedVac™ sentrifuge. Det gjenvundne DNA ble deretter PCR-amplifisert i en ny runde amplifikasjon og seleksjon. Etter hver amplifisering ble PCR-produktene ekstrahert to ganger med fenol-kloroform, utfelt med etanol og resuspendert i 20 ul TE-buffer. PCR-amplifikasjonene ble i alminnelighet verifisert ved elektroforese på agarosegel. Dessuten ble en rekke kontrollrutiner benyttet for å følge selekteringsprosessen. Som én kontroll ble PCR-"armer" (oligonukleotider av definert sekvens som tjener som primer-hybridiseringsseter) anbragt på en nukleinsyre som omfattet et gen som medførte neomycin-resistens. Den resulterende nukleinsyre ble blandet med den PCR-amplifiserte cDNA og fulgt ved hver selektering ved kvantitativ PCR. Som en annen kontroll ble RNase P fulgt både i de RNase P selekterte og de telomerase-RNA-komponent-selekterte bibliotek.

Eksempel 5

RT-PCR-protokoll

Førstekjede cDNA ble fremstillet i det vesentlige overensstemmende med fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 1.1 utgangspunktet ble RNA renset fra hver telomerasefraksjon inneholdende 0,1 til 1 jag RNA; i alminnelighet ble ca. en tredjedel til en femtedel av RNA fremstillet fra en 300 |iL fraksjon, benyttet. RNA ble blandet med 40 til 80 ng tilfeldig heksamer i 10 jj.L, denaturert i 10 minutter ved 95°C (ved å benytte en varmecykliserings-maskin) og avkjølt på is. Den denaturerte RNA og 6-mer ble tilsatt til en reaksjonsblanding inneholdende 4 av 5x førstekjede syntesebuffer fra leverandøren av den reverse transkriptase (RTase, anskaffet fra BRL), 2 [ xL 0,1 M DTT, 1^L 10 mM dNTP (hver), 1 uL RNase-inhibitor (Pharmacia) og vann til et totalvolum på 9 uL Blandingen ble anbragt i et 42°C vannbad. Etter inkubering i 1-2 minutter ble 1 [ il Superscript™ II RTase (BRL) tilsatt til blandingen. Inkuberingen ble fortsatt i 60 minutter ved 42°C. Reaksjonen ble stanset ved å varme opp røret til 95-98°C i 10 minutter. Førstekjede cDNA ble oppsamlet ved kort sentrifugering, likt fordelt på to nye rør, hurtig nedfrosset på tørris og oppbevart ved

-80°C eller anvendt umiddelbart.

Eksempel 6

PCR-amplifikasjon av cDNA med et spesifikt primer-sett

For en 20 \ xL PCR-reaksjon med radioaktivt merkede nukleotider, ble 1 \ iL av den cDNA som var fremstillet etter fremgangsmåten i Eksempel 5, blandet med 20 pmol av primer 1, 20 pmol av primer 2, 2,5 \ iL av 2,5 mM dNTP, 5 |iCi av alfa-<32>P-dATP, 2 enheter Taq-polymerase (Boehringer-Mannheim), 0,2 u.g av T4-gen 32 protein (Boehringer-Mannheim), 2 \ il 10x buffer (500 mM KCI, 100 mM Tris-HCI, pH 8,3, og 20 mM MgCI2), og vann til et totalvolum på 20 \ xL. Røret ble deretter tilsatt én dråpe mineralolje.

PCR-amplifikasjonsbetingelsene for telomerase-RNA-komponentklonen var: 94°C i 45 sekunder, 60°C i 45 sekunder, 72°C i 1,5 minutter. Antall runder varierte avhengig av hvilken type renset materiale som var benyttet for RNA-fremstillingen, men utgjorde i alminnelighet fra 18 til 25 runder. Som for all kvantitativ RT-PCR ble det for hver prøve foretatt flere reaksjoner med ulikt antall runder for å bestemme når PCR-amplifikasjonen var mettet og ikke-lineær.

For den RNase P som ble benyttet som kontroll, var PCR-amplifikasjonsbetingelsene: 94°C i 45 sekunder, 50°C i 45 sekunder og 72°C i 1,5 minutter. Rundeantallet varierte fra 15 til 22 runder avhengig av prøvenes natur. Sekvensene for de primerne som ble benyttet for RNase P amplifikasjon er vist nedenfor:

Det PCR-produkt som ble oppnådd med disse to primerne har en lengde på ca. 110 bp.

Etter PCR ble produktene (5 til 10 (iL av reaksjonsblandingen) avsatt på en 6% nativ polyakrylamid-gel. Etter elektroforese ble gelen tørket og eksponert for en Phosphorlmager™-kassett eller for autoradiografisk film, for analyse.

Eksempel 7

Kloning av genet for RNA-komponenten av human telomerase Fremgangsmåtene benyttet for å klone genet for RNA-komponenten av human telomerase ble foretatt som generelt beskrevet i Maniatis et al. Laboratory Molecular Cloning Manual. Et genomisk DNA-bibliotek av DNA fra den humane lungefibroblast-cellelinjen WI-38 innskutt i fag lambda vektor FIXII ble anskaffet fra Stratagene. Fagen ble utplatet i en konsentrasjon på ca. 25.000 plakk per plate på 3 sett av 15 (150 mm) plater. Platene ble fremstillet med NZY-agar og NZY topp agarose; cellene benyttet for fag-transformasjonen var XL1 BlueMRAP2-celler; og transformantene ble dyrket over natten i ca. 16 timer ved 37°C. Platene ble deretter avkjølt til 4°C i ca. 1 time og plakkene deretter "lifted" over på C/P nylonskiver (filterpapir fra Bio Rad). Denne prosessen ble gjentatt for å frembringe et dobbeltsett av "lifted" filtere. Filterne (i parallellforsøk) ble denaturert, nøytralisert, ekvilibrert i 6x SSC-buffer, eksponert for UV-bestråling for å kryssbinde nukleinsyren til filteret og deretter tørket over på blotting-papir.

Pre-hybridiseringen ble foretatt i 1 time ved 37°C i 50% formamid-buffer. Filterne ble probe-undersøkt med et -218 bp, radioaktivt merket Notl-fragment fra klon pGRN7 som var isolert ved elektroeluering fra en 5% polyakrylamid-gel etter separasjon ved elektroforese, og deretter nick-translatert med alfa-<32>P-dCTP ved å benytte et nick-translasjons-sett fra Beohringer-Mannheim Biochemicals i henhold til leverandørens instruksjoner. Ca. 25 ng (~10 ji Ci-merking) av proben ble benyttet per filter, og hybridiseringen ble foretatt over natten ved 37°C i 50% formamid-hybridiserings-buffer. Etter hybridisering ble filterne vasket seks ganger ved romtemperatur, de første tre vaskingene ble foretatt med 6x SSC inneholdende 0,1% SDS og de siste tre vaskingene kun med 6x SSC. Etter en innledende eksponering av flere parallelle filtere i en Phosphorlmager™-kassett for å kontrollere hybridiseringseffektiviteten og signalstyrken, ble filterne vasket ved 65°C i 0,5x SSC. Filterne ble deretter anbragt under Kodak XAR5 film ved å benytte to forsterknings-skjermer og fikk eksponere filmen i ca. 100 timer ved -70°C.

Det utgikk et sterkt signal fra filteret som inneholdt en fag, senere betegnet 28-1, omfattende genet for RNA-komponenten av human telomerase. Plakk tilsvarende signalet observert på filteret, ble benyttet for å fremstille sekundære plater slik at et isolert plakk (bekreftet ved undersøkelse med merket pGRN7 nukleinsyre som probe) kunne dyrkes for isolering i stor skala av fag-DNA. Fag 28-1, som kan skaffes fra American Type Culture Collection under tilgangsnummer 75925, omfatter et~15 kb innskudd og flere restriksjonsfragmenter som inneholder sekvenser som hybridiserer med RNA-komponentsekvenser på pGRN7: et 4,2 kb EcoRI restriksjons-enzymfragment; et 4,2 kb Clal restriksjons-enzymfragment, og et 2,5 kb Hindlll-Sacl restriksjons-enzymfragment. Sistnevnte fragment omfatter hele~560 nukleotidsekvensen av den ovenfor viste RNA-komponent og antas å omfatte RNA-komponentens komplette gen. Plasmidet omfattende det 2,5 kb Hindlll-Sacl restriksjons-enzymfragment i pBluescript vektoren ble betegnet plasmid pGRN33 og er tilgjengelig fra American Type Culture Collection under tilgangsnummer ATCC . I den utstrekning det humane gen måtte omfatte andre sekvenser enn de på 2,5 kb fragmentet, kan disse sekvensene isoleres fra fag 28-1 eller fra andre fag-kloner identifisert ved probeundersøkelse med 2,5 kb fragmentet (eller en annen probe ifølge oppfinnelsen): Ovennevnte restriksjons-enzymfragmenter ble fremstillet i separate restriksjons-enzymoppslutninger, idet produktene av oppslutningene ble separert ved elektroforese på en 0,7% agarosegel eller, kun for~2,5 kb fragmentet, på en 3% polyakrylamid-gel, hvoretter de ønskede bånd ble kuttet ut fra gelen og preparert for subkloning enten ved bruk av GeneClean™ kit II (fra Biol01, Inc.) eller ved elektroeluering inn i Spectropor #2 dialyserør i 0,1x TBE ved 100V i 2 timer (kun for~2,5 kb fragmentet).

Disse restriksjons-enzymfragmentene ble subklonet inn i E. coli ekspresjon/mutagenese-plasmider tatt fra pUC-baserte plasmider eller fra pBluescriptll-plasmider som også omfatter et SV40 replikasjonsorigo (men ingen SV40 promoteraktivitet). De resulterende plasmidene kan benyttes for å fremstille endrede (muterte) RNA-komponent-nukleinsyrer for innføring i humane eller andre eukaryote celler for en rekke formål, som beskrevet ovenfor under Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer.

Eksempel 8

Antisense plasmider for RNA-komponenten av human telomerase Antisense ekspresjonsplasmider ble fremstillet ved PCR-amplifikasjon av RNA-komponent cDNA ved å benytte følgende primersett: (1) NotB og G1, som produserer en antisense nukleinsyre som er mindre enn cDNA-innskuddet i plasmidet; og (2) NotB og R3C, som produserer en antisense nukleinsyre i full lengde (i forhold til innskuddet i plasmidet). Nukleotidsekvensen av NotB er vist i Eksempel 1, ovenfor; nukleotidsekvensen for G1- og R3C-primerne er vist nedenfor.

Etter PCR-amplifikasjon ble de amplifiserte fragmentene klonet inn i et~10 kb ekspresjonsplasmid ved et Pmll-sete. Plasmidet omfattet puromycin-resistens-overførende DHFR og hygromycin B-resistens-overførende gener som selekterbare markører, SV40 replikasjonsorigo; den induserbare humane metallotionein-gen-promoter posisjonert for ekspresjon av antisense-kjeden av genet for RNA-komponenten av human telomerase (man kan også benytte en sterkere promoter for å oppnå høyere ekspresjonsnivåer), og det SV40 sene polyA-addisjonssete.

De resulterende plasmidene (med betegnelsen pGRN42 for NotB/G1-produktet og pGRN45 for NotB/R3C-produktet) ble transfektert ved hjelp av kalsiumfosfat-prosedyren (se Maniatis et al., supra) inn i fibrosarkomcellelinjen HT1080. HT1080-celler er normalt udødelige. Ekspresjon av antisense RNA for RNA-komponenten av human telomerase skulle kunne forhindre RNA-komponenten av human telomerase fra assosiasjon med proteinkomponentene, blokkere dannelsen av aktiv telomerase og gjøre cellene dødelige.

Eksempel 9

Identifikasjon og isolering av RNA-komponent-nukleinsyrer fra pattedyr utenom mennesket

For å illustrere hvorledes reagensene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å identifisere og isolere i det vesentlige homologe nukleinsyrer fra andre pattedyrarter, ble PCR-primere som var komplementære til humane RNA-komponentsekvenser, benyttet til å amplifisere homologe sekvenser i en PCR. Et illustrerende primerpar benyttet for å demonstrere denne side ved oppfinnenlsen er sammensatt av primer +10, som har sekvensen 5'-CACCGGGUGCGGAGGGAGG-3' og primer R7, som har sekvensen 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3'. Genomisk DNA ble fremstillet fra chimpanse-, ekornape-, Rhesusape- og bavian-vev og løst i TE-buffer i en konsentrasjon på ca. 0,5-4 mg/mL.

For hver vevstype ble det fremstillet en PCR-blanding som omfattet.: 1 |iL genomisk DNA, 48 \ iL Master Mix (Master Mix er sammensatt av 1x TaqExtender™-buffer fra Stratagene, 200jaM av hver dNTP og 0,5 \ xM av hver primer), og 0,5 jil_ av en 1:1 blanding av Taq-polymerase (5 enheter/^L, Boehringer-Mannheim): Tth-polymerase (TaqExtender™-polymerase fra Stratagene). Reaksjonsrørene ble satt inn i en "termal cycler" som ble programmert til først å oppvarme reaksjonsblandingen til 94°C i 5 minutter og deretter foreta 27 runder inkuberinger ved 94°C i 30 sekunder, 63°C i 10 sekunder og 72°C i 45 sekunder. Etter at amplifiserings-reaksjonen var fullført, ble ca. 10 |aL av hver reaksjonsblanding avsatt på en 2% agarosegel for elektroforese. Etter elektroforese, farving av gelen og UV-bestråling, kunne man registrere at hver eaksjonsblandingen inneholdt et bånd av den predikerte størrelse (-200 bp). Nukleinsyrer fra disse båndende kan klones og sekvenseres og de øvrige gener av RNA-komponenten fra hver av disse pattedyrartene kan klones som beskrevet ovenfor for genet for RNA-komponenten av human telomerase. Eksempel 14, nedenfor, beskriver et spesifikt eksempel på sekvensering av telomerase-RNA-komponent-genet fra ekornape.

Eksempel 10

Muterte sense humane telomerase-RNA-komponentsekvenser

Dette eksempel demonstrerer at endring av telomerase-RNA-komponentsekvensen i templatregionen endrer den sekvens som er syntetisert av human telomerase, hvilket fører til forandringer i de kromosomale telomerase-repetisjoner.

For å bestemme om re-programmering av TRC3-templat-regionen ville gi hint om tilsvarende endringer i telomer-repetisjon syntetisert i human telomeraseaktivitet, ble det klonet og mutagenisert et genfragment som uttrykker hele gensekvensen av telomerase-RNA-komponenten (TRC3). Southern blott viste at TRC3 hybridiserte til et enkelt kopi-gen i det humane genom. En genomisk kopi av TRC3 ble isolert fra et lamda fag-bibliotek og vist å ha samme restriksjonskart som det som ble observert på genomiske Southern blott prober undersøkt med TRC3. Det ble isolert et 2,6 kb Hindlll-Sacl-fragment som ble subklonet inn i en modifisert versjon av pBluescript, hvilket frembragte det genomiske TRC3-plasmid pGRN33. 5'- og 3'-endene av det tilsvarende RNA ble kartlagt ved å benytte primerekstensjon, RACE PCR og RT-PCR. Størrelsen av RNA-transkriptet var «550 baser, hvilket stemmer overens med dens vandring på northern-blott. Den transkriberte region av TRC3 var sentral for den genomiske klon med 1,4 kb oppstrøms-sekvens.

RNA ble ekstrahert fra rensede telomerasepreparater og ble deretter benyttet

i de følgende eksperimenter. 5' RACE: førstekjede cDNA ble fremstillet ved å benytte antisense TRC3-primere (R3B: 5'-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT) i nærvær av<32>P-dATP. Ekstensjonsproduktene ble separert ved PAGE og identifisert ved autoradiografi, snittet ut og ekstrahert. Et oligonukleotid (NotA: 5'-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2) ble ligert til disse førstekjede-produktene ved å benytte T4 RNA-ligase, hvoretter PCR ble foretatt ved å benytte en "nested" primer, R3C (5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) og et oligonukleotid (NotB: 5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT) komplementært til NotA-oligonukleotidet. PCR-

produktene ble separert på en agarosegel og båndene snittet ut sekvensert direkte ved å benytte oligonukleotid G1 (5'-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA) som primer. 3'-ende kartlegging: Forsøk på å foreta 3' RACE var mislykkede. Deretter ble det benyttet en RT-PCR-strategi hvor en rekke antisense primere som var komplementære til den genomiske DNA-sekvens, ble benyttet til priming av førstekjede cDNA-syntese. Primerne i denne serien var spredt i ca. 150 bp intervaller utgående fra 5'-enden av transkriptet, og mot 3'-enden. Det ble deretter foretatt PCR ved å benytte førstekjede-primeren og en primer hvis sekvens var intern i det kjente TRC-transkriptet

(F3b: 5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG). Revers-transkriptase-følsomme PCR-bånd av den predikerte størrelse, ble registrert når det ble benyttet cDNA fremstillet med alle primerne tilordnet intervallet +100 til +450 (nummerering i forhold til 5'-enden) men ikke med noen av primerne tilordnet +558 til +950. Dette plasserte den antatte 3'-ende av det modne TRC3-transkript mellom posisjon +450 og +558. Påfølgede runder av primer-konstruksjon og RT-PCR innskrenket dette intervall til mellom +545 og +558.

Den predikerte templatsekvens for TRC3 ble endret fra CUAACCCUA til CCAACCCCA (MuC) eller CAAACCCAA (MuA) ved in vitro mutagenese (foretatt i det vesentlige i henhold til Perez et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 22485) av det genomiske plasmid pGRN33. Dersom de inkorporeres i funksjonell telomerase, skulle disse mutate RNA utgjøre templat for syntesen av TTGGGG (MuC) eller TTTGGG (MuA) fremfor villtype-repetisjonen TTAGGG. Disse mutante telomeraseaktivitetene skulle lett kunne skjelnes fra villtypeaktiviteten siden de ikke lenger fordrer dATP for aktivitet, og bare villtypeaktiviteten ville være følsom for terminering ved ddATP. Det ble også fremstillet en dobbeltmutant (MuC+17) hvor en 17 bp insersjon forekom ved +180 bp i tillegg til MuC templaten. Denne mutanten muliggjorde spesifikk deteksjon av den endrede RNA med en probe for 17 bp insersjonen eller ut fra størrelse.

Den 2,6 kb av genomisk sekvens var tilstrekkelig for ekspresjon av TRC3 in vivo. Cellene ble forbigående transfektert med MuC+17-plasmidet, og RNA uttrykt fra den transfekterte DNA ble påvist ved RT PCR ved å benytte 17 bp insersjonssekvensen som primer i det reverse transkripsjonstrinn. RNA ble påvist i MuC+17-transfekterte celler, men ikke i liksom transfekterte celler, hvilket tyder på at den 2,6 kb genomiske klon var tilstrekkelig for TRC3-ekspresjon. Fra hver av disse tre mutante plasmidene ble det frembragt stabile transformanter ved kalsiumfosfat-transfeksjon av HT1080-celler sammen med pCMVneo. Resistente kloner ble selektert i G418, og ekspresjon av MuC+17 RNA ble bekreftet ved RT-PCR (Irving et al., (1992) Exp. Cell Res. 202:161).

For å teste for mutant telomeraseaktivitet ble ekstraktene bestemt fra utransfekterte celler og fra tre stabile transformanter med integrerte MuC<*->, MuC-eller MuA-vektorer (C<*>, C eller A i Fig. 1). Siden mutantekstraktene skulle forventes å inneholde både villtype og mutante telomeraseaktiviteter, ble det benyttet forskjellige bestemmelsesbetingelser for å skjelne mellom dem. Under normale reaksjonsbetingelser (dTTP,<32>P-dGTP og dATP) oppviste alle tre ekstraktene fra den mutante konstruksjonsrekke villtype telomeraseaktivitet som var følsom for RNase (Fig. 1, bane 1-6). Som forventet ble denne aktiviteten ikke påvirket når ddCTP inngikk i reaksjonene (Fig. 1, bane 7-9) og opphevet med ddTTP (bane 10-12). Når derimot ddATP ble benyttet i stedet for dATP, oppviste C- (bane 14) og A-(bane 15) ekstraktene fremdeles RNase-sensitiv telomeraseaktivitet (bane 17 og 18), mens C<*>(bane 13) og kontrollekstrakt ikke oppviste dette. Disse resultatene tyder på at de ddATP-resistente aktivitetene som representerer telomerase, ble reprogrammert med MuC- eller MuA TRC3 RNA. Derimot inhiberer 17 bp innskuddet i C<*>rekonstitusjon, hvilket tyder på at telomerase-rekonstitusjon er meget spesifikk for TRC3-sekvensen.

For å bekrefte at sekvensen syntetisert ved hjelp av mutant MuA var (GGGTTT)n, modifiserte vi den eksisterende PCR-metodikk til å amplifisere telomerase-repetisjoner addert til en unik telomeraseprimer (Kim et al., (1994) Science 266: 2011). Ved å benytte syntetiske primere fant vi frem til reaksjonsbetingelser hvor en 3' primer med sekvensen d(CCCAAACCCAAACCCAA) bare ville amplifisere (TTTGGG)„ repetisjoner og ikke amplifisere (TTAGGG)n-holdige repetisjoner.

For å skjelne mellom telomer-repetisjoner addert ved villtype i forhold til mutert telomerase, ble en totrinns-bestemmelse kombinert med en strategi som gikk ut på å begrense tilgjengeligheten av nukleotider for telomerasereaksjonen. Siden MuA og MuC ville utvikle telomer-repetisjonssekvenser av henholdsvis (TTTGGG)nog (TTGGGG)n, ble celleekstrakter først inkubert med TS-substratet i nærvær av kun dTTP og dGTP i 10 minutter ved romtemperatur for å gi mulighet for addisjon av telomere repetisjoner. Gjenværende telomeraseaktivitet ble deretter ødelagt ved å koke ekstraktene i 5 minutter. Telomeraseprodukter med spesifikk DNA-sekvens ble deretter påvist ved PCR-amplifikasjon under bruk av de passende reverse primerne og i nærvær av alle fire dNTP og spormengder av<32>P-dCTP som beskrevet (Kim et al., (1994) op. eit.). For å påvise MuA-produktene ble det som revers primer benyttet (ACCCAA)4 og PCR-betingelsene var 94°C, 10 sekunder, 60°C, 30 sekunder og 72°C, 30 sekunder i 20 runder. For å påvise MuC-produktene ble henholdsvis følgende tre reverse primere benyttet: (CCCCAA)3, (CCAACC)3 og (CCAACC)3 som ga PCR-produkter med tilsvarende mobilitetsforskyvninger som var i overensstemmelse med den forventede hybridiseringsposisjon til telomeraseproduktene. De anvendte PCR-betingelsene var som ovenfor, bortsett fra at hybridiseringstemperaturen var 50°C. Under de samme betingelsene ble det ikke utviklet noen telomeraseprodukter fra ekstrakter av parentale celler eller celler transfektert med villtype TRC3-genet. I undersøkelser av spesifisiteten av våre PCR-amplifikasjonsbetingelser frembragte syntetiske oligonukleotider som inneholdt (TTTGGG)nog (TTGGGG)n de passende "6 nt ladder PCR products", med henholdsvis (ACCCAA)4 eller (CCCCAA)3reverse primere, mens (TTAGGG)noligonukleotider ikke produserte noen PCR-produkter med den (ACCCAA)4 eller (CCCCAA)3reverse primer.

Ved å benytte disse betingelsene utviklet ekstrakter fra MuA, men ikke fra MuC eller villtype celler, produkter i den modifiserte telomerasebestemmelsen, hvilket tyder på at telomerase fra MuA-holdige celler frembragte (TTTGGG)nrepetisjoner. Lignende metoder ble benyttet for å analysere MuC-mutanten som syntetiserte (TTGGGG)nrepetisjoner. Alt i alt utgjør ovennevnte data sterke indikasjoner på at TRC3-génet koder for RNA-komponenten av human telomerase, og vi har derfor omdøpt TRC3 til hTR for human Telomerase RNA.

Eksempel 11

Telomerase RNA-komponent i dødelige og udødelige celler

De fleste kreftceller uttrykker høye nivåer av telomeraseaktivitet, mens telomerase i de fleste normale somatiske humane celler ikke påvises (Kim et al.

(1994) op. eit.). For å bestemme hvorvidt telomerase-RNA-komponent-nivåene er forhøyet i udødelige kreftcellelinjer, ble telomerase-RNA-komponent og GAPDH-transkriptnivåene analysert ved å benytte RT-PCR i fem dødelige primære cellestammer som manglet påvisbar telomeraseaktivitet og i fem udødelige cancercellelinjer med høye nivåer av telomeraseaktivitet. Steady state nivåene av telomerase-RNA-komponent-transkripter var 3- til 12-ganger høyere i tumorcellelinjene enn i primære celler sammenlignet med nivåene av GAPDH (Fig. 2A). Mens telomerase-RNA-komponentnivåene var forhøyet i de udødelige cancerceller som uttrykte høye telomerasenivåer, er det interessant at det også forekom lave, men lett påvisbare, nivåer av telomerase-RNA-komponent i dødelige primærceller uten påvisbar telomeraseaktivitet (bane 1-5).

Telomerase-RNA-komponentnivåene ble også undersøkt i en rekke normale humane vev ved northern blott-analyse. Testikler og ovarier hadde det høyeste nivå av telomerase-RNA-komponent, hvilket var å forvente siden disse vev uttrykker høye nivåer av telomeraseaktivitet. En rekke andre vev uttrykte imidlertid også telomerase-RNA-komponent (Fig. 2B og 2C). Disse innbefattet normal nyre, prostata og lever hos voksne som alle mangler påvisbare nivåer av telomeraseaktivitet. Disse resultatene bekrefter dataene fra cellelinjer (Fig. 2A) og tyder på at telomerase-RNA kan forekomme, men være inaktiv i en rekke humane vev. Lignende vevsspesifikke forskjeller i RNA-ekspresjon ses i musevev; men mange normale musevev er imidlertid telomerase-positive. Den tilsynelatende økede represjon av telomeraseaktivitetet i humane celler, kan bidra til å forklare hvorfor museceller, i motsetning til humane celler, spontant udødeliggjøres ved dyrkning.

Eksempel 12

Ekspresjon av antisense hTR- (human telomerase-RNA-komponent)

transkripter i HeLa-celler fører til cellekrise og celledød

For å undersøke funksjonen av telomerase i en udødeliggjort celle ble antisense hTR-ekspresjonskonstruksjoner innført i HeLa-celler. Et 200 bp EcoRI DNA fragment inneholdende 1 til 193 bp av en human telomerase-RNA-komponent cDNA klon, TRC3, ble skutt inn i EcoRI-setet til p10-3 og pBBS212 for å frembringe henholdsvis plasmid p10-3-hTR og pBBBhTR. Plasmid p10-3-hTR uttrykker antisense av telomerase-RNA-komponenten under transkripsjonen kontroll av den tetracyklin-regulerte CMV minimale promoter i forhold til de fem Tet-operatorer oppstrøms i to forskjellige orienteringer som beskrevet (Gossen et al.

(1992) Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 89:5547). Plasmid pBBS-hTR uttrykker antisense av hTR under kontroll av MPSV-promoteren (Lin et al. (1994) Gene 147:287). Parallelt ble også kontrollekspresjonsvektorer som manglet den antisense hTR-kodende sekvens elektroporert inn i HeLa-celler. Kloner som inneholdt antisense eller kontrollplasmider ble selektert i tre separate eksperimenter. Til å begynne med vokste de 41 kulturene som uttrykte antisense hTR identisk med celler med kontrollvektor. Ved 23 til 26 PDL (population doubling levels) etter transfeksjon, undergikk 33 av i alt 41 antisense-uttrykkende kulturer, krise (Tabell I). Cellekrise ble i disse kulturenekarakterisert veden markant inhibering av cellevekst fra 20 til 26 PD, etterfulgt av "rounding up" og løsning av celler fra platene i løpet av 1 uke. I 28 av 33 tilfeller hvor cellene undergikk krise, ble det observert sjeldne (<1%) revertantkolonier i løpet av 3 uker etter at de fleste cellene var døde. Revertant-cellene kan representere varianter som unnslipper den inhiberende virkning av antisense hTR-konstruksjonen. I motsetning til antisense kloner, hadde ingen av vektorkontrollens cellelinjer noen endring i vekst eller dødelighet i løpet av 50 doblinger.

Tabell I

Antisense hTR fører til kortere gjennomsnittlig TRF og cellekrise

Det ble foretatt tre uavhengige forsøk hvor HeTe7-celler (HeLa-celler som uttrykker høye nivåer av det tetracyklin-repressor-VP16-kimære protein) ble transfektert ved elektroporering enten med plasmid p10-3-hTR som uttrykker antisense hTR under kontroll av den tetracyklin-VP16-induserte CMV minimale promoter, eller pBBS-hTR som uttrykker antisense hTR under kontroll av MPSV-promoteren (54). [I disse forsøkene ble det ikke observert noen regulering av tetracyklin. Forsøkene med p10-3-hTR ble i alminnelighet foretatt uten nærvær av tetracyklin siden kontrollforsøk med luciferase eller antisense hTR under kontroll av den tetracyklin-VP16-induserte CMV minimale promoter, viste at nærvær eller fravær av tetracyklin hadde liten effekt på luciferase- eller antisense-hTR-ekspresjon i HeTe7-celler. I tidlige forsøk med antisense hTR-konstruksjoner i HeTe7-celler gikk fremdeles cellene i krise ved 23 til 26 PDL i nærvær av tetracyklin]. Som kontroll ble HeTe7-celler også transfektert med den parentale vektor under de samme betingelsene. Det ble fra hver transfeksjonsrekke isolert 11 til 18 stabile kloner. Kloner fra alle isolatene oppviste identisk morfologi og vekstprofil inntil 20 PDL, et tidspunkt hvor veksten av de fleste av de antisense-uttrykkende kloner avtok markant (p10-3-hTR og pBBS-hTR). Ved PDL 23-26 undergikk disse cellene krise som ga seg tilkjenne ved tilsynekomst av forstørrede og avrundede celler. Imidlertid undergikk ikke alle de klonene som var utviklet av de pBBS-hTR-transfekterte HeTe7-cellene, krise, idet 8 kloner som uttrykte antisense hTR, fortsatte å vokse i likhet med kontrollkulturene. Celler fra alle klonene ble høstet ved PDL 23, og de gjennomsnittlige TRF-lengder ble bestemt. P-verdiene ble beregnet etter metoden for uparet t-test. For hver rekke er andelen av kloner som undergikk krise angitt.

For å bestemme om telomerlengde og telomeraseinhibering korrelerte med cellekrise i de antisense-uttrykkende kloner, ble telomerlengde og telomeraseaktivitet i flere pre-krise-kontroller og eksperimentelle kolonier bestemt ved 23 PDL. Alle kolonier som inneholdt kontrollvektor hadde gjennomsnittlige TRF-lengder (3,22 og 3,27 kb) tilsvarende den parentale cellelinje (3,15 kb), mens kloner som inneholdt de antisense vektorkonstruksjoner som undergikk krise, hadde gjennomsnittlige TRF-lengder på mellom 2,39 og 2,72 kb, eller 17 til 26% kortere enn for den parentale linje (Fig. 3). Disse data stemmer overens med at telomer-repetisjoner er gått tapt i de antisense-holdige kloner som følge av inhiberingen av telomeraseaktivitet. For å teste dette direkte ble telomeraseaktiviteten bestemt i 14 av klonene. Telomeraseaktiviteten var generelt lav, men påvisbar, i mange av antisense klonene, selv om de forkortede telomerene tyder på at nivået ikke var tilstrekkelig til å opprettholde telomerlengde i og med at gjennomsnittlig TRF falt fra 3,22 til 2,39 kb (P=0,0008). I de 8 klonene som inneholdt antisense vektoren (pBBS-hTRb) som ikke undergikk krise, var telomerlengden ikke endret vesentlig (3,03 i forhold til 3,33, P=0,355) og telomeraseaktiviteten var omtrent som den for kontrollene. Alt i alt er disse resultatene indikasjoner på at telomertap fører til krise og celledød så snart telomerene når en kritisk lengde.

Induksjonen av cellekrise i HeLa-celler som uttrykker antisense telomerase-RNA-komponent, understøtter ytterligere at telomerase-inhibering kan føre til et spesifikt og effektivt terapeutikum mot human cancer.

Eksempel 13

In situ amplifikasjon og påvisning

In situ påvisning av telomerase-RNA

A. Fluorescerende in situ hybridisering (FISH)

Identifikasjon av telomerase-positive celler i en blandet populasjon av celler eller vev kan foretas ved in situ hybridisering av en merket probe målrettet mot RNA-komponenten av telomerase. Vev av celleprøver fiksert på et objektglass permeabiliseres tilstrekkelig og benyttes for in situ hybridisering. Et eksempel på in situ hybridisering for human telomerase-RNA (hTR) består i først å denaturere nukleinsyrene ved å dyppe objektglassende i 70% deionisert formamid/2x SSC-løsning forvarmet til 70-74°C i 2-3 minutter. Objektglassene overføres deretter til iskald 70% EtOH og deretter til 95% EtOH og deretter til 100% EtOH (4 minutter i hver løsning). 100-200 ng (per objektglass) av den merkede htRNA-probe (-500 bp DNA-probe merket med biotin, digoksygenin, radioisotop, fluorescensmerking) tørkes, resuspenderes i 10jj.L 100% deionisert formamid, denatureres ved inkubering ved 75°C i 8 minutter og avkjøles umiddelbart på is. Tilsett 10 u.l 2x hybridiseringsbuffer (4x SSC; 4x Denhardfs løsning; 20% dekstransulfat; 100 mM Tris, pH 7,5) til de 10 (iL av resuspendert probe. Tilsett probe/hybridiserings-blandingen (20 piL) til den fikserte prøve, legg på et dekkglass, og forsegl dekkglasset med gummisement eller neglelakk. Inkuber prøven ved 37°C i 8-48 timer. Fjern dekkglasset etter hybridiseringen, vask prøven to ganger i 2x SSC/50% deionisert formamid ved 37°C og deretter to ganger i 2x SSC ved 37°C (5 minutter per vask). Prøven undersøkes deretter under mikroskop.

B. PRINS-merking (Primed in situ labeling)

En annen variant til den tradisjonelle påvisningsmetode for in situ hybridisering er Primed in situ merking (PRINS). Påvisning av hTR ved hjelp av PRINS består i en initial cDNA-syntese av hTR ved revers transkriptase (RT), etterfulgt av PRINS-påvisning ved bruk av en hTR-spesifikk oligonukleotidprobe og kjedeforlengelse som inkorporerer merkede nukleotider. RT-reaksjonene av hTR kan foretas gjennom et utvalg av metoder. Et eksempel på RT-reaksjonen er bruken av GeneAmp Thermostable rTth revers transkriptase RNA PCR kit (Perkin Eimer). Ved denne metode anbringelse 10 uL RT-blanding (10 mM Tris-HCI, pH 8,3; 90 mM KCI; 1 mM MnCI2; 200 [ iM dNTP; 2.5U rTth DNA-polymerase; 0,4 yiM retur-primer [f.eks. R7G: 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3']) på den fikserte og permeabiliserte prøve, forsegles med dekkglass, forankres med neglelakk, overskiktes med mineralolje og inkubers ved 70°i 30 minutter. Deretter fjernes mineraloljen ved vasking i xylen i 5 minutter og deretter i 100% EtOH i 5 minutter. Dekkglasset tas av, vaskes kort med DepC-vann, deretter med 100% EtOH og lufttørkes i 5 minutter. Deretter anbringes 10 ul Prins-blanding (5% volumdeler glycerol; 10 mM Tris-HCI, pH ,3; 100 mM KCI; 0,05% vekt/vol. Tween 20; 0,75 mM EGTA; 2,5 mM MgCI2;

0,4 uM forward primer [f.eks. U3b:

5'-GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTA I I I I I IG-3']; 200^M dA, dG, dCTP; 110 uM dTTP; 90 jaM merket dUTP) på prøven. Forsegles med dekkglass, forankres med neglelakk, overskiktes med mineralolje og inkuberes ved 70°C i 30 minutter til 3 timer. Prøven vaskes deretter tre ganger i vaskebuffer (4x SSC; 0,05% Tween 20) oppvarmet til 70°C, i 2 minutter. Deretter observeres signalet.

C. In situ RT-PCR

RT-PCR deteksjon av hTR består i cDNA-syntese av mål-RNA ved revers transkriptasereaksjon (vira] revers transkriptase eller ved den naturlige RT-aktivitet av termostabile DNA-polymeraser), etterfulgt av in situ PCR-amplifikasjon av det målsøkte cDNA. Forskjellige RT-reaksjoner kan benyttes i cDNA-syntesen av hTR inklusivt RT-protokollen diskutert i avsnitt 11.B. Dessuten kan de samme bufferbetingelsene og primere som er benyttet i PRINS-deteksjonsmetodene også benyttes for RT-PCR, men i stedet for en avsluttende inkubering ved 70°C i 30 minutter til 3 timer, amplifiseres prøven i en varmecykliseringsmaskin i 30-40 runder ved 94°C/40 sekunder, 55°C/90 sekunder (se avsnitt 11.B). Etter PCR vaskes prøven tre ganger i vaskebuffer (4x SSC; 0,05% Tween 20) oppvarmet til 70°C,

i 2 minutter. Deretter observeres signalet.

Et annet alternativ er å amplifisere den cDNA som er utviklet fra den første RT-reaksjon ved å benytte GeneAmp in situ PCR system 1000 og GeneAmp in situ PCR core kit (Perkin Eimer).

Et-trinns in situ RT-PCR på en fiksert og permeabilisert prøve kan foretas ved å benytte GeneAmp EZ rTth RNA PCR-protokoll i kombinasjon med GeneAmp in situ PCR-system 1000 (Perkin Eimer). Denne metode består i å anbringe 40-50 ul EZ RNA PCR-bufferblanding (50 mM Bicine; 115 mM kaliumacetat; 8% (vekt/vol.) glycerol, pH 8,2; 300 \ xM dA, dG, dCTP; 165^M dTTP; 135^M merket dUTP; 5-10U av rTth DNA-polymerase; 2,5 mM Mn(OAc)2; 0,45-1 u.M htRNA-spesifikke primere, f.eks. R7 og U3b, på en fiksert og permeabilisert prøve på et objektglass og forsegle dette med silikon-stoppskiven og klipset i henhold til produsentens anvisning (GeneAmp in situ PCR system 1000, Perkin Eimer). Prøven anbringes deretter i GeneAmp in situ PCR maskinen og oppvarmes til 94°C i 120 sekunder og amplifiseres deretter i 30-40 runder ved 94°C/45 sekunder og 60°C/45 sekunder. Etter amplifikasjonen vaskes prøven og visualiseres som omtalt ovenfor.

For å redusere de bakgrunnssignaler som kan oppstå fra direkte inkorporering av fluorescerende merkinger under PCR-amplifikasjon, kan det benyttes indirekte påvisning som består i PCR-amplifikasjon ved å benytte ikke-merkede dNTP etterfulgt av in situ hybridisering ved bruk av en merket hybridiseringsprobe som er spesifikk for det amplifiserte produkt. Ved denne fremgangsmåte forsterkes signalet ved hjelp av en hvilken som helst av de RT-PCR metoder som er beskrevet ovenfor uten merkede dNTP eller primere, og det amplifiserte produkt påvises ved in situ hybridisering.

D. Anvendelse av produkt-ekstensjons primer for in situ PCR

Suksessen med in situ PCR er avhengig av at lekkasje av de amplifiserte produktene innenfor cellematriksen ut av cellen, forhindres. Det er derfor i alminnelighet et faktum at PCR-produkter mindre enn 500 bp ikke er ønskelige for in situ PCR. For å forhindre lekkasje av PCR-produkter mindre enn 500 bp fra cellematriksen, er det vanlig å inkorporere "bulky" dNTP (f.eks. biotin, fluorescensmerking, digoksygenin-merket dUTP) i PCR-produktet. En annen måte å forhindre lekkasje av et lite produkt ved in situ PCR, ville være å inkorporere produkt-ekstensjons primere i in situ PCR-protokollen.

Denne fremgangsmåte omfatter anvendelse av en primer som inneholder 3-4 6 bp repetisjonssekvenser (f.eks. [5'-TTTCCC-3']3-4]i 5'-enden, etterfulgt av en sekvens som er spesifikk for målet (se Fig. 4, primer 1) i kombinasjon med en passende returprimer (primer 2) og en tredje primer som utelukkende består av repetisjonssekvensen (primer 3), f.eks. [5,-TTTCCC-3,]4) for å amplifisere det spesifikke mål i in situ PCR. Nærværet av primer 3 vil forlenge PCR-produktet som følge av den siksakk-forskjøvne binding av primer 3 til 3'-enden av PCR-målproduktet. Forlengelsen av PCR-produktene kan induseres ved å senke hybridiseringstemperaturen under de innledende PCR-betingelser.

Dersom hybridiseringstemperaturen av målsekvensen i primer 1 er 60°C, vil for eksempel prøven initialt bli amplifisert i 15-20 runder ved 94°C/45°C og 60°C/45°C, hvoretter den vil bli amplifisert i 15-20 runder ved 94°C/45°C og 50°C/45°C. Senket hybridiseringstemperatur i det andre PCR-trinn vil favorisere dannelsen av de forlengede PCR-produktene ved å øke sjansen for forskjøvet binding av primer 3 til repetisjonssekvensene. De resulterende forlengede PCR-produktene vil være mindre utsatt for lekkasje gjennom den cellulære matriks og derved resultere i en bedre signalretensjon ved in situ PCR-analyse.

Eksempel 14

Ikke-human primat telomerase-RNA-komponent

For å vise at det kan oppnås andre pattedyr-telomerase-RNA-komponentsekvenser ved å benytte primere basert på sekvensen for den humane RNA-komponent, ble humansekvens-PCR-primere benyttet til amplifisering av telomerase-RNA-komponentsekvenser fra genomisk DNA fra ekornape, en art som antas å være en av de arter av primater som evolusjonært er mest forskjellig fra mennesket.

Ekronape-genomisk DNA ble amplifisert med primerne F3b (5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3') og H3+20

(5'-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3') som beskrevet. Et enkelt DNA-bånd ble iakttatt og ble senere klonet inn i vektoren pBluescriptll SK (Stratagene, San Diego, CA). De resulterende kloner ble sekvensert partielt ved å benytte PCR-metoden med den reverse universale primer (5'-AACAGCTATGACCATG-3'), primer 210-3'

(5-TCACGTCTCCTGCCMTTTGC-3') eller primer H3+20. De oppnådde partielle sekvenser av ekornape telomerase-RNA-komponent var:

Ved forskyvningstilpasning til den humane telomerase-RNA-komponent-gensekvens ble følgende tilpasning oppnådd ved å benytte nummereringskonvensjonene for human telomerase-RNA-komponent-genet (bindestreker representerer åpninger innført for å optimalisere sekvenstilpasning):

Eksemplene foran beskriver forskjellige aspekter ved oppfinnelsen og hvorledes visse nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen ble fremstillet. Eksemplene er ikke ment å gi uttømmende beskrivelse av de mange ulike utførelsesformer av oppfinnelsen slik den fremgår av de etterfølgende patentkrav.

Claims

1. RNA-komponent av pattedyr-telomerase i tilnærmet ren form.

2. RNA-komponent av pattedyr-telomerase som omfatter et polynukleotid tilnærmet identisk med sekvensen:

3. RNA-komponent ifølge krav 1 som har sekvensen

4. Oligonukleotid i tilnærmet ren form omfattende en sekvens som er identisk eller nøyaktig komplementær med en sammenhengende sekvens på 10 til 500 nukleotiders lengde av RNA-komponenten ifølge krav 3.

5. Oligonukleotid ifølge krav 4 som er et oligodeoksyribonukleotid.

6. Oligonukleotid ifølge krav 4 som er et oligoribonukleotid.

7. Oligonukleotid ifølge krav 5 som når det er bundet til en RNA-komponent av human telomerase, inhiberer eller blokkerer telomeraseaktiviteten.

8. Oligonukleotid ifølge krav 5 som er plasmid pGRN33.

9. Oligonukleotid ifølge krav 5 som er lambda klon 28-1.

10. Rekombinant ekspresjonsplasmid omfattende oligonukleotidet ifølge krav 5, og som ytterligere omfatter en promoter posisjonert for å styre transkripsjon av en RNA som er komplementær eller sekvensidentisk med nevnte oligonukleotid.

11. Rekombinant ekspresjonsplasmid ifølge krav 10, hvor plasmidet bevirker produksjon av oligonukleotidet i eukaryote vertsceller.

12. Rekombinant ekspresjonsplasmid ifølge krav 11, hvor plasmidet bevirker produksjon av oligonukleotidet i prokaryote vertsceller.

13. Rekombinant ekspresjonsplasmid ifølge krav 11, hvor plasmidet omfatter et humant gen for RNA-komponenten av human telomerase.

14. Rekombinant ekspresjonsplasmid ifølge krav 13, hvor nevnte gen omfatter nukleotidsekvensen:

15. Eukaryot vertscelle transformert med et rekombinant ekspresjonsplasmid ifølge krav 10, som koder for et RNA-molekyl som kan assosiere med proteinkomponenter av pattedyr-telomerase for å frembringe en telomeraseaktivitet som er i stand til å addere sekvenser av repeterende enheter av nukleotider til telomerer.

16. Vertscelle ifølge krav 14, hvor nevnte repeterende enhet er S^TTAGGG-S'.

17. Vertscelle ifølge krav 14, hvor nevnte repeterende enhet ikke er ^-TTAGGG-S'.

18. Vertscelle ifølge krav 15, hvor nevnte RNA-molekyl er:

19. Vertscelle ifølge krav 15, hvor nevnte rekombinante ekspresjonsvektor omfatter en sekvens av nukleotider definert ved:

20. RNA-komponent av en pattedyr-telomerase som omfatter en sekvens som er tilnærmet identisk med en sekvens på minst 20 sammenhengende nukleotider av RNA-komponentsekvensen ifølge krav 3.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant telomerase-enzym, hvor fremgangsmåten omfatter transformasjon av en eukaryot vertscelle som uttrykker proteinkomponenter av telomerase, med en rekombinant ekspresjonsvektor som koder for en RNA-komponent ifølge krav 19, og dyrkning av nevnte vertscelle, transformert med nevnte vektor, under betingelser hvor proteinkomponentene og RNA-komponenten uttrykkes og sammensettes under dannelse av et aktivt telomerase-molekyl som er i stand til å addere sekvenser til telomerer av kromosomalt DNA.

22. Blanding omfattende en i det vesentlige renset human telomerase-RNA-komponent ifølge krav 1 eller krav 2, og et i det vesentlige renset humant telomeraseprotein.

23. Blanding ifølge krav 22, hvor den humane telomerase-RNA-komponent er renset fra en vertscelle som uttrykker et rekombinant polynukleotid som har en sekvens som er komplementær til en human telomerase-RNA-komponentsekvens.

24. Blanding ifølge krav 22, som ytterligere omfatter en kandidat for et telomerase-modulerende middel.

25. Fremgangsmåte for identifisering av mutante pattedyr-telomerase-RNA-komponent-polynukleotider, som omfatter: syntetisering av et mutant telomerase-RNA-komponent-polynukleotid tilnærmet identisk med telomerase-RNA-komponent-polynukleotidsekvensen og som adskiller seg i minst ett nukleotid; bestemmelse av det mutante telomerase-RNA-komponent-polynukleotid med henblikk på binding til et vesentlig renset pattedyr-telomeraseprotein.

26. Fremgangsmåte for identifisering av kandidater for telomerase-modulerende midler som omfatter: foreta en heterodimerisering eller telomeraseaktivitets-bestemmelse som omfatter: (1) et polynukleotid som omfatter et polynukleotid som er tilnærmet identisk med en human telomerase-RNA-komponent og i stand til å binde seg til humant telomeraseprotein, (2) et vesentlig renset humant telomeraseprotein og (3) et middel; bestemme hvorvidt nevnte middel inhiberer heterodimerisering eller telomeraseaktivitet av den humane telomerase-RNA og humant telomeraseprotein; identifisering av midler som inhiberer nevnte heterodimerisering eller telomeraseaktivitet som kandidat for telomerase-modulerende midler som inhiberer telomeraseaktivitet.

27. Fremgangsmåte for inhibering av telomeraseaktivitet i humane celler og som omfatter at det til celler overføres et eksogent polynukleotid omfattende en transkripsjonen enhet som har en polynukleotidsekvens på minst 25 sammenhengende nukleotider som er tilnærmet identisk eller tilnærmet komplementær til en human telomerase-RNA-sekvens, operativt bundet til en heterolog transkripsjonen regulatorsekvens som fremmer transkripsjon av operativt koblede nukleotider i de nevnte celler.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, hvor cellene er neoplastiske celler.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 27, hvor det eksogene polynukleotid omfatter sekvensen:

30. Fremgangsmåte ifølge krav 27, hvor den heterologe transkripsjonene regulatorsekvens omfatter en promoter som er konstitutivt aktiv i humane celler.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 27, hvor det eksogene polynukleotid er et adenoviralt genom som har en human telomerase-RNA-komponent-transkripsjonsenhet.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 27, hvor nevnte transkripsjonsenhet produserer antisense RNA som i det vesentlige er komplementær til human telomerase-RNA-komponent.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 27, hvor det eksogene polynukleotid omfatter sekvensen:

34. Polynukleotid for genterapi ved en human sykdom, omfattende en transkripsjonsenhet som omfatter en polynukleotidsekvens på minst 25 sammenhengende nukleotider som er tilnærmet identiske eller tilnærmet komplementære til en human telomerase-RNA-sekvens, operativt koblet til en heterolog transkripsjonen regulatorsekvens som fremmer transkripsjon av operativt koblede polynukleotider i nevnte celler.

35. Ribozym som spalter human telomerase-RNA-komponent eller humane telomere repetisjonssekvenser.

36. Fremgangsmåte for påvisning av forekomsten av en telomerase-relatert tilstand i en pasient, omfattende følgende trinn: isolering av en celleprøve fra en pasient; påvisning av human telomerase-RNA-komponent RNA i celleprøven for å bestemme en diagnostisk verdi; sammenligning av den diagnostiske verdi med en standardverdi for human telomerase-RNA-komponent-ekspresjon i standardiserte normale celler av samme type som celleprøven; diagnostisering, som indikasjon på forekomsten av en telomerase-relatert tilstand, av en diagnostisk verdi som er tilstrekkelig høyere enn standardverdien til at forekomsten av en patologisk tilstand indikeres.

37. Fremgangsmåte for påvisning av forekomsten av en neoplastisk tilstand i en pasient, omfattende følgende trinn: isolering av en celleprøve fra en pasient; påvisning av human telomerase-RNA-komponent i celleprøven for å bestemme en diagnostisk verdi; sammenligning av den diagnostiske verdi med en standardverdi for human telomerase-RNA-komponent-ekspresjon i ikke-neoplastiske celler av samme type som celleprøven; diagnostisering, som indikasjon på forekomsten av en neoplastisk tilstand, av en diagnostisk verdi som er tilstrekkelig høyere enn standardverdien til at forekomsten av en neoplastisk tilstand indikeres.

38. Fremgangsmåte for bestemmelse av forekomst av pattedyr-telomerase-RNA-komponent i en celle eller celleprøve, omfattende utførelse av en amplifikasjon eller hybridisering med et telomerase-RNA-komponent-polynukleotid, en telomerase-RNA-komponent-primer, eller komplementær sekvens til et telomerase-RNA-komponent-polynukleotid eller telomerase-RNA-komponent-primer.

39. Blanding omfattende et par av pattedyr-telomerase-RNA-komponent-polynukleotid PCR-primere.

40. Blanding ifølge krav 39, hvor primerne består av sekvenser som tilsvarer eller er komplementære til humane telomerase-RNA-komponent-gensekvenser.

41. Blanding omfattende en pattedyr-telomerase-RNA-komponent-polynukleotid hybridiseringsprobe.

42. Blanding ifølge krav 41, hvor proben omfatter minst 25 sammenhengende nukleotider som tilsvarer eller er komplementære til humane telomerase-RNA-komponent-gensekvenser