JPH10505488A - 哺乳動物のテロメラーゼ - Google Patents

哺乳動物のテロメラーゼ

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JPH10505488A
JPH10505488A JP8504403A JP50440396A JPH10505488A JP H10505488 A JPH10505488 A JP H10505488A JP 8504403 A JP8504403 A JP 8504403A JP 50440396 A JP50440396 A JP 50440396A JP H10505488 A JPH10505488 A JP H10505488A
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ウォルター ファンク，
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Abstract

(57)【要約】 哺乳動物テロメラーゼのRNA成分を含む核酸は、薬学的試薬、治療的試薬、および診断的試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物のテロメラーゼ 発明の背景 発明の分野 本発明は、ヒトテロメアDNAの合成に関与するリボヌクレオプロテイン酵素で ある、ヒトテロメラーゼに関する。本発明は、分子生物学、化学、薬理学、なら びに医学および診断技術の分野に関連する方法および組成物を提供する。関連する開示の記載 真核生物の染色体の末端またはテロメアにおけるDNAは、普通、タンデムに繰 り返す単純な配列からなっている。テロメラーゼは、リボヌクレオプロテイン酵 素であり、この酵素のRNA成分中に含まれる配列を鋳型として用いて、テロメアD NAの一方の鎖を合成する。Blackburn，1992，Annu. Rev. Biochem. 61:113-129 を参照のこと。これは、本明細書に参考として援用される。 ヒトテロメラーゼのRNA成分は、今日まで科学文献には報告されていないが、 ヒトテロメラーゼは、配列5'-TTAGGG-3'を有するテロメアリピートユニットを合 成することは知られている。Morin，1989，Cell 59:521-529、およびMorin，199 1，Nature 353:454-456を参照のこと。これらは、本明細書に参考として援用さ れる。この知見は、ヒトテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列の残りの部 分の単離および同定を可能にするには十分ではなかった。Saccharomyces cerevi siae、テトラヒメナの特定種、および他の繊毛虫の特定種（例えば、Euplotesお よびGlaucoma）のテロメラーゼ酵素のRNA成分は、配列が決定され、科学文献に 報告されている。SingerおよびGottschling，1994年10月21日，Science 266,:40 4-409; Lingnerら、1994, Genes & Development 8:1984-1988; GreiderおよびBl ackburn，1989，Nature 337:331-337; RomeroおよびBlackburn，1991，Cell 67: 343-353; ならびにShippen-LentzおよびBlackburn，1990，Science 247:546-552 を参照のこと。これらは本明細書に参考として援用 される。これらの繊毛虫のテロメラーゼ酵素はヒトのものとは異なるテロメアリ ピートユニットを合成する。 ヒトテロメラーゼに関するさらなる情報が、大いに必要である。テロメアDNA のリピートユニットは単純な性質と考えられているにもかかわらず、科学者らは 、長い間、テロメアが染色体の構造と機能の維持に重要な生物学的な役割を有し ていることを信じてきた。より最近、科学者らは、テロメアDNAの欠失が細胞の 老化と加齢の引き金として作用し得ること、ならびにテロメラーゼの調節が重要 な生物学的関連性を有し得ると推測している。Harley，1991，Mutation Researc h256 :271-282を参照のこと。これは本明細書に参考として援用される。 テロメラーゼ活性を検出する方法、ならびにテロメラーゼ活性を調節しあるい は活性に影響を与える化合物を同定する方法もまた、テロメアの長さおよびテロ メラーゼ活性の制御による細胞の老化の治療および診断方法ならびに不滅化の方 法とともに、記載されている。PCT特許公開第95/13381号,1995年５月18日公開; PCT特許公開第95/13382号,1995年５月18日公開; PCT特許公開第93/23572号，199 3年11月25日公開;および米国特許出願番号未決定（発明者はC.Harley，N．Kim， S．Weinrichである），1995年６月７日出願; 08/315,214,1994年９月28日出願; 08/315,216，1994年９月28日出願; 08/288,501,1994年８月10日出願; 08/014,83 8，1993年２月８日出願; 08/153,051および08/151,477、それぞれ、1993年11月1 2日出願; 08/060,952，1993年５月13日出願; 08/038,766，1993年３月24日出願; および、07/882,438，1992年５月13日出願を参照のこと。これらは本明細書に参 考として援用される。 テロメラーゼ媒介治療ならびにテロメラーゼのアッセイならびにスクリーニン グ方法についての重要な改良および新たな機会は、テロメラーゼのRNA成分を含 有する核酸および/またはタンパク質成分をコードする核酸が純粋なまたは単離 可能な形態で入手可能であり、このような核酸のヌクレオチド配列が知られてい る場合に、実現され得た。本発明はこれらのおよび他の要求に応え、このような 改良および機会を提供する。 発明の要旨 第１の局面において、本発明は、ヒトテロメラーゼのRNA成分、およびヒトテ ロメラーゼのRNA成分の遺伝子を実質的に純粋な形態で提供し、ならびに、ヒト テロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列の全てまたは少なくとも有用な部分 を有する核酸を提供する。本発明はまた、他の種からのRNA成分の核酸（霊長類 などの哺乳動物のRNA成分を含むがこれに限定されない）を提供し、この核酸は ヒトテロメラーゼのRNA成分と実質的な相同性を共有する。本発明の他の有用な 核酸は、RNA成分に相補的な配列を有する核酸；RNA成分のヌクレオチド配列と関 連するが異なる配列を有し、そのRNA成分と、またはヒトテロメラーゼのRNA成分 もしくはタンパク質成分の遺伝子と、有用な方法で相互作用する核酸；および、 RNA成分またはRNA成分の遺伝子と有意な配列相同性あるいは相補性を有さないが 、所望のおよび有用な方法てRNA成分に作用する核酸、を含む。以下にさらに十 分に記載するように、本発明の核酸は、DNA分子およびRNA分子の両方、ならびに 、いずれかの修飾されたアナログを含み、そして種々の有用な目的にかなうもの である。 本発明の有用な核酸の一つのタイプは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三 重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、または他のオリゴヌクレオチドもしくは オリゴヌクレオチド模倣物（例えば、アンチセンスPNA-ペプチド核酸/ポリアミ ド核酸）であり、インビボまたはインビトロでヒトテロメラーゼ活性を阻害する ために用いられ得る。このようなオリゴヌクレオチドはテロメラーゼ活性を多く のの方法でブロックし得る。これは、テロメラーゼ遺伝子の転写抑制による（例 えば、三重ヘリックスの形成による）か、あるいは機能的なリボヌクレオプロテ インテロメラーゼが会合することを妨げるか、またはいったんテロメラーゼ酵素 複合体が形成されて、RNA成分がテロメアDNA合成の鋳型として作用することを妨 げるようにテロメラーゼのRNA成分に結合することによる方法を含む。典型的に は、作用の様式に依存して、これらの本発明のオリゴヌクレオチドは、約10〜約 25から、200またはそれ以上のヌクレオチドの特定の配列を有しており、この配 列は、テロメラーゼのRNA成分中の特定のヌクレオチド配列またはテロメラーゼ のRNA成分の遺伝子と同一かまたは相補的かのいずれかである。 一つの実施態様においては、本発明は、テロメラーゼのRNA成分のポリヌクレ オチド配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを提供し、これは典型的に は、天然に存在する哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分の遺伝子配列と実質的に 同一であるポリヌクレオチド配列に相補的である。このようなアンチセンスポリ ヌクレオチドは、テロメラーゼのRNA成分種の転写および/または安定性および/ または機能を阻害するために用いられ、それによって、細胞(例えば、患者の新 生物性細胞)中のそれぞれのテロメラーゼ活性の量を減少させる。このようなア ンチセンスポリヌクレオチドは、機能的な（触媒的活性と高い忠実性）テロメラ ーゼホロ酵素の形成を阻害することにより、テロメラーゼ調節剤として機能し得 る。このホロ酵素は、細胞における正確なテロメア複製と修復に必要とされる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、他の抗新生物性の治療法、例えばイオン化放 射線照射あるいは化学療法（例えば、ブレオマイシン、シスプラチン、ナイトロ ジェンマスタード、ドキソルビシン(doxyrubicin)、ヌクレオチドアナログなど のDNA-損傷剤を用いて）と組み合わせられ得る。アンチセンスポリヌクレオチド は感受性の細胞（例えば、DNA修復または複製にテロメラーゼ活性を必要とする 複製中の細胞）での細胞死を促進し得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、本 明細書に開示された哺乳動物テロメラーゼRNA配列の相補的配列の少なくとも25 の連続するヌクレオチドと実質的に同一である。アンチセンスポリヌクレオチド は、典型的には、ssDNA、ssRNA、メチルホスホネートバックボーンポリヌクレオ チド、ホスホロチオレートバックボーンポリヌクレオチド、混合バックボーンポ リヌクレオチド、ポリアミド核酸、およびその他の当業者に知られているアンチ センス構造物である。本発明の一つの局面においては、アンチセンスポリヌクレ オチドは、投与されて、複製し得るヒト細胞のような細胞中のテロメラーゼのRN A成分の転写および/または活性ならびにテロメラーゼ活性を阻害する。 一つの実施態様において、本発明は、鋳型ミスマッチポリヌクレオチドを提供 する。このポリヌクレオチドは哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分と実質的に同 一の配列を有し、そして、ヒトテロメラーゼリピート配列5'-TTAGGG-3'に関して 少なくとも１塩基がミスマッチであるが、他は相補的であるテロメアリピート鋳 型配列を有する。鋳型ミスマッチポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存 在する鋳型配列中に単一のヌクレオチドミスマッチを有し、そして、鋳型配列中 で２つのヌクレオチドミスマッチを有し得、この場合、ミスマッチしたヌクレオ チドが隣接するか、あるいはミスマッチしたヌクレオチドが１またはそれ以上の マッチする（相補的な）ヌクレオチドによって分離されているかのいずれかであ る。本発明の鋳型ミスマッチポリヌクレオチドは、一般的にヒトテロメラーゼポ リペプチド成分と結合してテロメラーゼ活性を発現し得、それにより、ヒトテロ メラーゼリピート配列中の選択された（ミスマッチした）ヌクレオチド部分での ミスの導入を行って、テロメアリピートの複製、修復、および/または付加を結 果として生じ、従って、実質的な複製およびテロメアの長さの維持のために、変 異したセンステロメラーゼのRNA成分の持続的な存在に依存するテロメアを生じ る。 本発明の有用な核酸の別のタイプは、リボザイムであり、これは、ヒトテロメ ラーゼのRNA成分を特異的に切断し、酵素を不活性化し得る。本発明の有用な核 酸のさらに別のタイプは、プローブまたはプライマーであり、これは、ヒトテロ メラーゼのRNA成分に特異的に結合し、そして、例えば、サンプル中のテロメラ ーゼの存在を検出するために用いられ得る。最後に、本発明の有用な核酸は、本 発明の核酸を生産するための組換え発現プラスミドを包含する。このようなプラ スミドの特に有用な一つのタイプは、ヒト遺伝子治療に用いられるプラスミドで ある。本発明のヒト遺伝子治療に有用なプラスミドは、種々のタイプを含み、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムをコードするプラスミドのみな らず、ヒトテロメラーゼのRNA成分、または、欠失したもしくは変化した（変異 した）型のヒト（またはヒトRNA成分に実質的に相同なRNA成分配列を有する他の 種）テロメラーゼのRNA成分、またはその遺伝子を発現させるプラスミドも含む 。 一つの実施態様において、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分に相補的であり 、生理学的条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分な部分を有するポリヌ クレオチドは、ポリヌクレオチド合成の間または合成後のいずれかに、付加的な 化学置換基の共有結合により誘導体化され、それにより、このテロメラーゼのRN A成分に特異的にハイブリダイズし得る誘導体化されたポリヌクレオチドを形成 す る。この誘導体化されたポリヌクレオチドはこのRNA成分を有する内因性テロメ アーゼ酵素に局在し得、そして、この誘導体化されたポリヌクレオチドはテロメ ラーゼのRNA成分および/またはタンパク質成分の変化あるいは化学修飾を生じ、 それによって、テロメラーゼの酵素活性を改変し、典型的には減少させる。 一つの実施態様においては、本発明は、異常なテロメラーゼのRNA成分の量お よび/または構造と関連する病気の診断に適したポリヌクレオチドを提供する。 哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列と実質的に同一か実質的 に相補的である配列を有するポリヌクレオチドプローブは、病気の状態（例えば 、新生物あるいはプレ新生物）の診断に用いられ得る。診断は、テロメラーゼの RNA成分の量および/またはテロメラーゼのRNA成分の構造変化（例えば、短縮型 、配列の変化、欠失または挿入など）の検出、および/または患者からの外植片 の細胞におけるテロメラーゼのRNA成分遺伝子の再配列または増幅の検出、また は疾病特徴的な哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分の対立遺伝子(allele)（例え ば、RFLPあるいは対立遺伝子特異的PCR分析による）の検出により行われる。検 出はしばしば、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分に相補的な、標識された（例 えば、32P、35S、14C、3H、蛍光、ビオチン化、ジゴキシゲニン化(digoxigeniny lated)）アンチセンスポリヌクレオチドを用いてインサイチュハイブリダイゼー ションで行われ得る。ノーザンブロッティング、ドットブロッティングまたは溶 液ハイブリダイゼーションが用いられ得るが、これらは、例えば、テロメラーゼ のRNA成分特異的プライマーを用いるPCR増幅またはLCR増幅により細胞サンプル から単離されたバルクRNAあるいはポリA+RNAに対して用いられ得る。同一細胞タ イプの非新生物性細胞と比較したときにテロメラーゼのRNA成分の量的変化（典 型的には有意な増加）を有する細胞は、新生物となる前の(pre-neoplastic)細胞 または明白な新生物性細胞などのような病気細胞の候補として同定され、そして 、転移可能性を有する細胞として同定され得る。同様に、細胞サンプル中のテロ メラーゼのRNA成分の遺伝子座あるいは密接に関連した遺伝子座における疾病特 徴的な再配列または増幅の検出により、病的状態または病的状態（例えば、ガン 、遺伝子病）を発病する疾病素質の存在が同定される。テロメラーゼのRNA成分 のポリヌクレオチドプローブはまた、個人の（犯罪容疑者 または身元不明の故人の父系調査または確認のような）法医学的同定にもまた使 用される。 第２の局面では、本発明は、細胞内でまたは細胞のグループ内でテロメラーゼ 活性に関連する症状を処置する方法を提供する。この方法は、細胞を、治療的に 有効な量の、その細胞内でテロメラーゼ活性を変化させる薬剤と接触させること による。このような薬剤は、テロメラーゼのRNA成分をコードする核酸、三重ヘ リックスを形成するオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リ ボザイム、およびプラスミドならびにその他の遺伝子治療用ベクターである。こ れらのベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクタ ーなど）はヒト遺伝子治療用であり、上記のテロメラーゼのRNA成分、テロメラ ーゼのRNA成分に対するアンチセンスRNA、またはミスマッチしたテロメラーゼの RNA成分を発現する。関連した局面では、本発明は、これらの治療剤を薬学的に 受容可能なキャリアまたは塩とともに含有する薬学的組成物を提供する。これは 、リポフェクチン複合体、リポソーム、または治療剤を標的に送達するための免 疫リポソーム中への処方を含み得る。本発明はまた、このようなテロメラーゼ媒 介治療剤と他の医薬品との組み合わせを提供する。他の薬剤としては、例えば、 抗新生物剤および他の細胞傷害性または静細胞性剤；抗真菌剤（例えば、AIDS患 者の処置用）；ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびこれらのアナログ；および 病状（例えば、新形成、過形成(hyperplasia)、HIV感染/AIDSおよび関連する病 理学、および異常なテロメア代謝により特徴づけられる他の病気）を処置するた めに適切な薬学的薬剤がある。この方法は、哺乳動物テロメラーゼ中のテロメラ ーゼのRNA成分と特異的にハイブリダイズし得る誘導体化されたポリヌクレオチ ドの使用を包含し得る。誘導体化されたポリヌクレオチドはテロメラーゼ活性を 有する哺乳動物細胞に送達され、そして、テロメラーゼのRNA成分に局在化し、 テロメラーゼ活性を不活性化または阻害することによりテロメラーゼ活性を阻害 する。 本発明はまた、テロメラーゼのRNA成分の形成を阻害または増強してテロメラ ーゼの機能を調整することにより新形成またはアポトーシスを阻害する治療剤を 提供する；このような薬剤は医薬品として用いられ得る。このような医薬品は、 ヒトおよび家畜の種々の病気、例えば、新形成、過形成、神経細胞変性病、加齢 、AIDS、真菌感染などの処置に用いられる。一つの実施態様においては、薬剤は テロメラーゼのRNA成分またはその相補体の配列を転写し得る遺伝子治療ベクタ ー、またはその代わりに機能的なテロメラーゼホロ酵素の形成を競合阻害し得る 酵素的に不活性なテロメラーゼのRNA成分からなる。 第３の局面においては、本発明は、細胞、細胞集団あるいは組織サンプルもし くは前記のいずれかからの抽出物中のヒトテロメラーゼのRNA成分、テロメラー ゼあるいはテロメラーゼ活性のレベル、量または存在を決定するための診断方法 を提供する。関連する局面において、本発明はこのような方法に有用な試薬（上 記のプライマーおよびプローブを含む）を提供し、任意に、キットの形態にその 診断方法を実施するためのキットの使用指示書とともにパッケージされる。 本発明は、ヒト患者の病気（例えば、新形成）を診断する方法を提供する。こ の診断アッセイ（例えば、固定化した細胞を用いる、ヒトテロメラーゼのRNA成 分または遺伝子配列を特異的に結合する、標識されたテロメラーゼのRNA成分の プローブによるインサイチュポリヌクレオチドハイブリダイゼーション）は、ヒ ト患者からの生物学的サンプル中に所定の疾病特徴的な濃度のテロメラーゼのRN A成分が存在するか否かを決定するために使用される；もし、そのアッセイが、 テロメラーゼのRNA成分の存在が正常の範囲をはずれている（例えば、所定の疾 病特徴的な濃度を超えている）ことを示すときは、その患者は、病気の状態であ るか疾病素質があると診断される。 一つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、病気の状態または遺 伝子病の診断に用いられる。これらの病状または遺伝子病は、新形成、過形成、 プレ成熟細胞または異常な細胞の老化、またはテロメラーゼ機能に関連する他の 医学的状態を包含し、そして、より詳細には、病状または病気はテロメラーゼの RNA成分または遺伝子配列の構造的または量的変化を包含し、あるいは、RFLPお よび/または対立遺伝子特異的PCR、または他の適切な検出方法によって検出され 得る疾病特徴的なテロメラーゼのRNA成分の対立遺伝子に関連している。典型的 には、この方法はヒト患者における病気（例えば、新形成）の診断である。この 診断アッセイ（例えば、テロメラーゼのRNA成分の量および/または構造の決 定）は、所定の疾病特徴的な濃度または構造のテロメラーゼのRNA成分が、ヒト 患者からの生物学的サンプル中に存在するか否かを決定するために使用される； そのアッセイがテロメラーゼのRNA成分の疾病特徴的な量の存在が正常の範囲を はずれている（例えば、所定の疾病特徴的な濃度を超えている）ことを示すとき は、その患者は、病気の状態であるか疾病素質があると診断される。 第４の局面において、本発明は組換えテロメラーゼ調製物およびこのような調 製物を生産する方法を提供する。従って、本発明は、組換えヒトテロメラーゼを 提供し、この組換えヒトテロメラーゼは、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分、 ならびに、本発明の組換えRNA成分と関連するヒトテロメラーゼのRNA成分と実質 的に相同なRNA成分を有する哺乳動物種由来のテロメラーゼのタンパク質成分を 含む。このような本発明の組換えRNA成分分子は、天然に存在するRNA成分分子と は１またはそれ以上の置換、欠失、末端付加および/または挿入の点で異なる分 子を含み、ならびに、組換え宿主細胞中で生産される、天然に存在するRNA成分 分子と同一のRNA成分分子を含む。このような組換えテロメラーゼ分子を生産す る方法は、テロメラーゼのタンパク質成分を発現する真核宿主細胞を、本発明の RNA成分分子をコードする組換え発現ベクターで形質転換する工程、および、こ のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含する。この培養は、 テロメラーゼのタンパク質成分とテロメラーゼのRNA成分とが発現され、これら の成分が集合して活性なテロメラーゼ分子を形成し、染色体DNAのテロメアに配 列（天然のテロメラーゼによって付加される配列と必ずしも同じである必要はな い）を付加することができるような条件下で行われる。 第５の局面において、本発明は、ヒトテロメラーゼのRNA成分およびヒトテロ メラーゼのRNA成分に実質的に相同なRNA成分を有する哺乳動物種由来のテロメラ ーゼのタンパク質成分の精製方法を提供する。本発明はまた、このようなタンパ ク質成分をコードする核酸を単離かつ同定する方法を提供する。関連する局面に おいて、本発明は、精製されたヒトテロメラーゼ、および、ヒトテロメラーゼの RNA成分に実質的に相同なRNA成分を有する哺乳動物種の精製されたテロメラーゼ 、ならびに、１またはそれ以上のこのようなテロメラーゼ調製物をコードする精 製された核酸を提供する。本発明はまた、活性成分として、テロメラーゼの タンパク質成分、またはテロメラーゼのタンパク質成分をコードする、もしくは タンパク質をコードする核酸と相互作用する核酸を含有する薬学的組成物を提供 する。 第６の局面において、本発明は哺乳動物テロメラーゼ活性を調整する（すなわ ち、阻害、増強または特異性を変化する）薬剤を同定する方法を提供する。この ようなテロメラーゼ調節剤は、しばしば、小さな分子であり（例えば、約3000ダ ルトンよりも小さい）、そして、治療効果のためにインビトロおよびインビボで しばしばテロメラーゼ活性を改変するのに使用され得、そして実験用試薬および /または医薬品として使用される。 一つの実施態様においては、本発明は、薬剤のバンクまたはライブラリーから 、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分とテロメラーゼのタンパク質成分との非共 有結合を調整することによりテロメラーゼ活性を調整する候補薬剤を同定する方 法を提供する。テロメラーゼのRNA成分は、宿主細胞中で組換え鋳型から生産さ れるか、所望であれば、化学的に合成され得る。典型的には、哺乳動物テロメラ ーゼのタンパク質成分（これらは例えばテロメラーゼ発現細胞から精製され得、 そして天然に存在するテロメラーゼのRNA成分が（例えば、RNAse処理により）取 り除かれ得た）は、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分と接触され、それは、添 加する薬剤の非存在下でのRNA成分とタンパク質成分との間の非共有結合を許容 する適切な水性の条件下（すなわち、コントロールの結合反応）である。薬剤の ライブラリーまたはバンクから選択された１またはそれ以上の薬剤の存在下にお けるテロメラーゼのRNA成分とタンパク質成分との間の非共有相互作用の強度を 、テロメラーゼのRNA成分とテロメラーゼのタンパク質成分を有し、薬剤を含ま ないコントロールの結合反応における非共有相互作用の強度と比較する；テロメ ラーゼのRNA成分とタンパク質成分との間の非共有結合の強度が統計的に有意に 増大する薬剤が、それによって、テロメラーゼ調節剤の候補として決定される。 非共有結合の相対的な強度は任意の適切な方法によって決定され得、これには、 （例えば、競合結合アッセイによる）特異的な結合親和性の決定、適切なテロメ アリピート鋳型におけるテロメラーゼ触媒活性の測定、または、哺乳動物のテロ メラーゼのRNA成分とタンパク質成分との間の機能的な非共有相互作用の他の適 切なアッセイ（例えば、ゲルシフトあるいはEMSA(電気泳動移動度シフトアッセ イ)）が含まれる。 テロメラーゼ調節剤の候補を検出するための非共有結合アッセイの一つの実施 態様においては、テロメラーゼのRNA成分またはタンパク質成分の一つまたは両 方が適切な検出可能な標識で標識されており、そして非共有結合は、薬剤のライ ブラリーまたはバンクから選択された薬剤の存在または非存在下において別々に 測定される。非共有結合の測定は、標識されたテロメラーゼ成分（RNA成分また はタンパク質成分）が、同種の（cognate）テロメラーゼ成分（それぞれ、タン パク質成分またはRNA成分：この同種のテロメラーゼ成分は別々に標識されてい るかまたは標識されていない）と結合する程度を、例えば、この標識されたテロ メラーゼ成分および同種のテロメラーゼ成分を有する複合体を捕獲（例えば、固 定化）することにより測定する工程、および、結合していない標識されたテロメ ラーゼ成分をこの結合複合体から（例えば、洗浄により）分離し、それによって 、分離された結合画分を生じさせ、そして、この分離された結合画分中の結合し た複合体を検出可能な標識の存在を測定することにより検出する工程、を包含す る。テロメラーゼのRNA成分およびタンパク質成分の非共有結合の統計学的に有 意な減弱または増強を生じる薬剤は、それによって、テロメラーゼ調節剤の候補 であると同定される。非共有結合を減弱させる薬剤は、テロメラーゼインヒビタ ー（またはアンタゴニスト）の候補であるが、テロメラーゼ成分の非共有結合を 増強する薬剤はテロメラーゼアゴニストの候補である。 一つの実施態様においては、候補のテロメラーゼ調節剤は、精製されたテロメ ラーゼのタンパク質成分とテロメラーゼのRNA成分とを有する哺乳動物のテロメ ラーゼの酵素活性を統計的に有意に増加または減少させる能力によって同定され る。 一つの実施態様においては、候補のテロメラーゼ調節剤は、代謝的に活性な哺 乳動物細胞中における、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝子（好ましくは ヒトテロメラーゼのRNA成分遺伝子）の転写調節配列に作動可能に連結したリポ ーターポリヌクレオチド配列（例えば、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェ ラーゼ遺伝子、HPRT遺伝子）の転写を統計的に有意に減少または増加させる能 力によって同定される。バリエーションとして、哺乳動物細胞中の内因性テロメ ラーゼのRNA成分遺伝子は、リポーターポリヌクレオチド配列を、内因性遺伝子 の染色体座の内因性テロメラーゼのRNA成分遺伝子の転写調節配列（例えば、プ ロモーター）の上流に作動可能に連結されている相同な標的構築物で標的化され る。別のバリエーションにおいては、リポーターポリヌクレオチドを有する外因 性ポリヌクレオチドは、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝子の転写調節領 域（例えば、プロモーターおよび上流の転写因子結合部位）に作動可能に連結し ている。この外因性ポリヌクレオチドは哺乳動物細胞に転移され、その細胞では 非相同的に染色体の部位に組み込まれ得、および/または維持されるか、あるい はエピソームのポリヌクレオチドとして複製される。薬剤で処理された細胞にお いて、統計的に有意なリポーターポリヌクレオチドの転写調節を生じる薬剤は、 それによって、哺乳動物のテロメラーゼ調節剤の候補であると同定される。 テロメラーゼ調節剤候補を同定するための組成物は、典型的には以下を含む： (1)哺乳動物テロメラーゼのタンパク質成分、これは、テロメラーゼ発現哺乳動 物細胞（好ましくは霊長類(例えば、ヒト)）から精製され得、典型的には付随す るRNA成分が、もしあれば、RNAse処理またはRNA成分の除去、ならびに、適切な 結合条件での同種のテロメラーゼのRNA成分の存在下でテロメラーゼ活性を再構 築するタンパク質の能力を維持することに適合可能な他の処理で取り除かれる、 (2)哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分、好ましくは細胞中の組換えポリヌクレオ チドの転写により生産されるヒトRNA成分、および(3)水性の結合条件（例えば、 生理学的条件、テロメラーゼアッセイ条件）、および任意に(4)少なくとも一つ の複製可能なまたは伸長可能な哺乳動物のテロメラーゼリピート配列を有するリ ポーターポリヌクレオチド、典型的には、RNA成分のテロメアリピート配列に相 補的な鋳型部分の配列に相補的である、および任意に(5)テロメアアッセイ条件 下で、リポーターポリヌクレオチドのテロメアリピート配列の複製および/また は伸長に適したヌクレオチド；薬剤は典型的にはこのような組成物に添加され、 非共有結合および/またはテロメラーゼ活性を、この薬剤がないコントロール組 成物と比較して評価する。 第７の局面において、本発明はまた、哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝 子のヌル対立遺伝子(null allele)を提供する。これらは、異種ポリヌクレオチ ドの相同遺伝子を哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分遺伝子中に標的化してこの テロメラーゼのRNA成分の遺伝子を機能的に不活性化することにより生産される 。本発明はまた、テロメラーゼのRNA成分のヌル対立遺伝子を有する非ヒトノッ クアウト動物を提供する。バリエーションとして、テロメラーゼのRNA成分のヌ ル対立遺伝子および内因性テロメラーゼのRNA成分の欠如により生じる実質的に 欠如する内因性テロメラーゼ活性に対して同型接合である非ヒトノックアウト動 物を提供する。このようなノックアウト動物は、毒物学的スクリーニングのため 、テロメラーゼ調節剤を同定または研究する医薬品研究所への販売のための商業 的試薬として、ペットとして、および農業用家畜として、数ある用途の中で用い られる。 第８の局面において、本発明は哺乳動物細胞を不死化する方法を提供する。こ のような細胞は、例えば、バイオリアクター中での望ましい発酵作用を有する細 胞、または商業的な研究試薬として有利な特徴を有する望ましい細胞株である。 この方法は、テロメラーゼのタンパク質成分の存在下に機能的なテロメラーゼ酵 素を形成し得る機能的なテロメラーゼのRNA成分を発現するポリヌクレオチドを 哺乳動物細胞に導入する工程を包含する。 本発明の他の特徴および有利性は、以下の図面、発明の好ましい実施態様、実 施例および特許請求の範囲の記載から明らかである。定義 本明細書で使用する用語「テロメラーゼのRNA成分ポリヌクレオチド」は、少 なくとも20ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドは 少なくとも20ヌクレオチドのセグメントを有している：これは、天然に存在する 哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分配列、典型的には霊長類のテロメラーゼのRNA 成分、例えば、ヒトまたはサルのテロメラーゼのRNA成分、に対して少なくとも8 5％同一である。天然に存在するテロメラーゼのRNA成分配列またはその相補物と 比較して、配列変異性を有するいくつかのテロメラーゼのRNA成分ポリヌクレオ チドは、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマー、LCRア ンプリマー、ミスマッチRNA成分などとして適切であり得る。 本明細書で使用する用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリ ヌクレオチド配列の全部または一部に対して相同である（すなわち、同一である が厳密には進化的に関連していない）か、あるいはポリペプチド配列が参照ポリ ペプチド配列と同一であることを意味する。対照的に、本明細書で使用する用語 「に相補的な」は、相補的な配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部 と相同であることを意味する。実例として、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照 配列「TATAC」に対応し、参照配列「GTATA」と相補的である。 以下の用語は、２またはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載す るために用いられる：「参照配列」、「比較窓枠」、「配列の同一性」、「配列 同一性の割合(％)」、および「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列の比較 の基礎として用いられる所定の配列である；参照配列は、例えば、全長のテロメ ラーゼのRNA成分遺伝子配列のセグメントのように、より大きな配列のサブセッ トであり得る。一般的に、参照配列は、少なくとも20ヌクレオチド長であり、し ばしば少なくとも25ヌクレオチド長であり、そして、たびたび少なくとも50ヌク レオチド長である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれが、(1)２つのポリヌ クレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部） を有し得、および(2)２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに有し得る ので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列の比較は、典型的に は、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較窓枠」と比較することにより行われ 、配列が類似する局所領域を同定し比較する。 本明細書で使用する「比較窓枠」は、少なくとも25の連続するヌクレオチドの 位置の概念的なセグメントをいい、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも25の連 続するヌクレオチドの参照配列と比較され得る。そして、２つの配列の最適な整 列のために、比較窓枠中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは付 加または欠失を含まない）と比較して20％またはそれより少ない付加または欠失 （すなわち、ギャップ）を有し得る。比較窓枠を整列させるための配列の最適な 整列は、SmithおよびWaterman（1981）Adv ．Appl．Math. 2:482の局部相同性ア ルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch（1970）J ．Mol．Biol. 48: 443 の相同性整列アルゴリズム、PearsonおよびLipman(1988)Proc ．Natl．Acad. Sci . (U.S.A.) 85:2444の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化 した実施（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Comp uter Group，575 Science Dr.，Madison，WIのGAP，BESTFIT，FASTA，およびTFA STA）または調査によって行われ得、そして、種々の方法で生じた最もよい整列 （すなわち比較窓枠に対して最も高い相同性の割合(%)を得る）が選択される。 用語「配列の同一性」は、比較窓枠に対して、２つのポリヌクレオチド配列が 同一（すなわち、ヌクレオチド-ヌクレオチドベースで）であることを意味する 。用語「配列同一性の割合(%)」は、比較窓枠に対して２つの最適に整列した配 列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、U、またはI）が両方の配列 で生じて適合した位置の数を得、適合位置数を算出し、適合した位置の数を比較 窓枠の位置の総数（すなわち、窓枠サイズ）で除し、そして、この結果に100を 乗じて、配列同一性の割合(%)を得ることにより計算される。本明細書で使用す る用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を意味し、ポリヌク レオチドは、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較窓枠、しばしば少なくとも30 -50ヌクレオチドの窓枠に対して、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少 なくとも85％の同一性およびしばしば89から95％の配列同一性、より普通には、 少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含んでいる。配列同一性の割合(%) は、参照配列とポリヌクレオチド配列（これは比較窓枠に対して、参照配列の合 計20％またはそれより少ない欠失または付加を有し得る）とを比較することによ り算出される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得、例えば、本 明細書に開示されるような全長のテロメラーゼのRNA成分遺伝子配列のセグメン トのようなものである。 本明細書では特異的ハイブリダイゼーションは、プローブポリヌクレオチド（ 例えば、置換、欠失、および/または付加を含み得る本発明のポリヌクレオチド ）と特定の標的ポリヌクレオチド（例えば、テロメラーゼのRNA成分配列または ゲノム遺伝子配列）との間のハイブリッド形成と定義される。このプローブは、 優先的に特定の標的とハイブリダイズして、例えば、１またはそれ以上のテロメ ラーゼのRNA成分遺伝子のRNA種（または特異的に切断またはプロセスされたテロ メラーゼのRNA成分種）に対応する一本のバンドが、適切な細胞源（例えば、テ ロメラーゼのRNA成分を発現する体細胞）から調製したRNAのノーザンブロットで 同定され得る。哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分の配列またはヒトテロメア配 列と特異的にハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で提供 される配列データに基づいて調製され得るが、これは当業者に既知の方法および 熱力学的原理および以下の文献の記載に従っている：Maniatisら、Molecular Cl oning: A Laboratory Manual, 第２版,(1989)，Cold Spring Harbor、N.Y.およ び、BergerおよびKimmel，Methods in Enzymology ，Volume152，Guide to Molec ular Cloning Techniques (1987)，Academic Press，Inc.,San Diego，CA。これ らは本明細書に参考として援用される。 本明細書で使用する用語「適切な結合条件」は、水性条件を意味し、その条件 では哺乳動物のテロメラーゼのRNA成分がその同種タンパク質成分と結合し、酵 素的に活性なテロメラーゼホロ酵素を形成する。このホロ酵素は、テロメアリピ ートを含む適切な鋳型からテロメアリピートを触媒的に複製、修復、および/ま たは付加し得る；このようなテロメアリピート鋳型は存在し得るかまたは存在し 得ない。しばしば、適切な結合条件は生理学的条件であり得る。本明細書で使用 する「生理学的条件」は、温度、pH、イオン強度、粘性などの生化学的パラメー ターであって、生存する生物体に適合性であり、および/または典型的には生存 する培養哺乳動物細胞の細胞内に存在し、特に、この哺乳動物細胞の核に存在す る条件をいう。例えば、典型的な実験室での培養条件下における哺乳動物細胞の 生育中の核内または細胞質内条件は、生理学的条件である。インビトロ転写の反 応混液のための適切なインビトロ反応条件は一般的に生理学的条件であり、当業 者に既知の核抽出物の多様性によって、例示され得る。一般に、インビトロの生 理学的条件は、以下を含み得る：50-200mM NaClまたはKCl，pH6.5-8.5，20-45℃ および0.001-10mMの２価のカチオン（例えば、Mg++、Ca++）；好ましくは、約15 0mM NaClまたはKCl，pH7.2-7.6，5mMの２価のカチオンおよびしばしば、0.01-1. 0%の非特異的タンパク質（例えばBSA）を含む。非イオン性界面活性剤（Tween、 NP-40、Triton X-100）は、しばしば存在し得、通常、約0.001から 2%、典型的には0.05-0.2%(V/V)である。特定の水性条件が、通常の方法に従って 研究者に選択され得る。一般的な指針として、以下の緩衝化水性条件が適用され 得る：10-250mM NaCl，5-50mM Tris HCl，pH5-8，任意に２価のカチオンおよび/ または金属キレーターおよび/または非イオン性界面活性剤および/または膜画分 および/または消泡剤および/またはシンチラントを含み得る。 本明細書で使用する用語「標識」または「標識された」は、検出され得るマー カーの導入を意味し、例えば、放射能標識されたアミノ酸の導入、あるいはポリ ペプチドへのビオチン基の付着による導入を意味する。このビオチン基は標識さ れたアビジン（例えば、蛍光マーカーあるいは光学的または熱量測定方法で検出 され得る酵素活性を有するストレプトアビジン）で検出され得る。ポリペプチド および糖タンパク質の種々の標識化方法は当業者に公知であり、用いられ得る。 ポリペプチドの標識の例は、以下を含むが、これらに限定されない：放射性同位 元素（例えば、3H、14C、35S、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダ ミン、ランタニドホスホール(lanthanide phosphors)）、酵素標識（例えば、西 洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ ホスファターゼ）、ビオチン基、二次リポーターにより認識される所定のポリペ プチドのエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位 、転写アクチベーターポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタッグ）。 いくつかの実施態様においては、標識は立体障害の可能性を減少するために種々 の長さのスペーサーアームによって付着されている。 本明細書で使用する用語「統計的に有意な」は、一般的に、コントロールアッ セイ読み出し(readout)の少なくとも３回の個別の測定の平均の少なくとも２標 準偏差以上または以下の結果（すなわち、アッセイ読み出し）、および/またはS tudentのt-検定または他の統計的有意性の当業者に受け入れられている評価法に より決定されるように統計的に有意であることを意味する。 本明細書で使用する用語「疾病特徴的な濃度」、「疾病特徴的な量」および「 疾病特徴的なハイブリダイゼーションパターン」は、それぞれ、サンプル中のテ ロメラーゼのRNA成分の濃度、量、あるいは局在化パターンを意味し、病的状態 （例えば、新形成、老化、免疫不全、神経細胞変性、炎症など）、または、ガ ン、肉腫、あるいは白血病のような新生物性疾病を発病する疾病素質が存在する ことを示す。疾病特徴的な量は、細胞または細胞性サンプル中のテロメラーゼの RNA成分の量であり、予測的および/または遡及的な統計的臨床研究によって確立 された正常な臨床値の範囲からはずれている。一般的に、新生物性疾病（例えば 、ガン、肉腫、あるいは白血病）を有する個体は、細胞内または組織サンプル内 に多量のテロメラーゼのRNA成分を示し、正常な罹患していない個体を特徴づけ る濃度範囲をはずれている；典型的には、この疾病特徴的な濃度は、少なくとも 平均正常値外の約１標準偏差であり、より普通には、平均正常値の少なくとも約 ２標準偏差またはそれ以上である。しかし、本質的にすべての臨床診断テストは ある割合(%)で擬陽性および擬陰性を生じる。診断アッセイの感度と選択性は診 断対象と任意の関連する調節要求性とを十分満足しなければならない。一般的に 、本発明の診断方法は、資格のある健康の専門家によってなされる病気の鑑別診 断における付加的なパラメーターを提供して、個体が病気の候補であると同定す るために用いられる。 本明細書で使用する用語「疾病の対立遺伝子」は、認識し得る病気を生じ得る 遺伝子の対立遺伝子をいう。疾病の対立遺伝子は、優性または劣性であり得、直 接病気を生じ得るか、特定の遺伝的背景あるいはすでに存在する病的状態と組み 合わせて存在するときに病気を生じ得る。疾病の対立遺伝子は、遺伝子プールに 存在し得るか、または体細胞変異により個体中に新しく生じ得る。 本明細書で使用する用語「抗新生物剤」は、ヒトの新生物の発生または進行を 阻害する機能的な特性を有する薬剤をいい、しばしば、転移または転移可能性の 阻害を含む。 本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、機能的な関係でポリヌク レオチドエレメントが連結することを意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的 関係に置かれたときに「作動可能に連結」している。例えば、プロモーターまた はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与えるときにコード配列に作動可 能に連結している。「作動可能に連結した」は、連結されたDNA配列が典型的に は連続しており、そして２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある時に は、連続的であり読み枠に入っている。しかし、エンハンサーは、一般に、プロ モーターから数キロベース離れたときに機能し、そしてイントロン配列は長さが 変化し得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結し得 るが連続ではない。内因性の遺伝子の転写調節配列に対応するポリヌクレオチド 配列に作動可能に連結している構造遺伝子（例えば、HSVのtk遺伝子）は、天然 に存在する遺伝子で起こるのと同様に、実質的に、一時的にそして細胞型特異的 パターンで一般的に発現される。 本明細書で使用する用語「転写ユニット」または「転写複合体」は、以下を含 むポリヌクレオチド配列をいう：構造遺伝子（エクソン）、シス作用性結合プロ モーターおよび構造遺伝子の効率的転写に必要な他のシス作用性配列、構造遺伝 子の適切な組織特異的ならびに発展的な転写に必要な遠位の調節エレメント、お よび効率的な転写ならびに翻訳に重要な付加的なシス配列（例えば、ポリアデニ ル化部位、mRNAの安定性制御配列）。 本明細書で使用する用語「転写調節」は、シスに連結した構造遺伝子の転写を 増強するか、または転写を阻害するかのいずれか能力をいう；このような増強ま たは阻害は、誘導剤による刺激のような特定の事象の発生に付随し得、および/ または特定の細胞の型でのみ明白であり得る。 本明細書で使用する用語「転写調節領域」は、機能的プロモーターと、任意の 関連する転写エレメント（例えば、エンハンサー、CCAATボックス、TATAボック ス、SP1部位など）を有するDNA配列をいう：これらは転写調節領域に作動可能に 連結しているポリヌクレオチド配列の転写に必須である。 本明細書で使用する用語「ヌル(null)対立遺伝子」は、遺伝子座が、実質的に 機能的遺伝子産物の効率的発現の指揮を不能にするような少なくとも１つの変異 または構造変化を含むことを意味する。「ノックアウト(knockout)細胞」は少な くとも１つの内因性遺伝子のヌル対立遺伝子を有し、典型的にはヌル対立遺伝子 に対して同型接合である細胞をいう。従って、例えば、ノックアウト細胞は、ヌ ル対立遺伝子に対して、テロメラーゼのRNA成分の遺伝子座で同種接合であり得 、それによってノックアウト細胞は実質的に機能的なテロメラーゼのRNA成分を 発現することができない。図面の簡単な説明 図１．鋳型-変異TRC3を発現する細胞からのテロメラーゼ活性。変異TRC3を発 現する安定な形質転換体からのDEAEセファロース分画抽出物を、テロメラーゼ活 性について、種々の反応条件下で、一般的なアッセイを用いてアッセイした。Mu C＋17 TRC3（レーン1,4,7,10,13,16 C*で標識されている）、MuC TRC-3（レー ン2,5,8,11,14,17 Cで標識されている）、またはMuA TRC3（レーン3,6,9,12,15, 18 Aで標識されている）を発現している細胞からの抽出物を、通常の反応条件（ レーン1-6）、通常＋0.5mM ddCTP（レーン7-9）、通常−dTTP＋0.5mM ddTTP（レ ーン10-12）、または、通常−dATP＋0.5mM ddATP（レーン13-18）でアッセイし た。レーン1-9のアッセイ反応液は、８μMの総dGTPを含んでいたが、その１μM は、32P-dGTP(800Ci/mmol)であった。変異体テロメラーゼの検出を容易にするた めに、レーン10-18のアッセイ反応液は、８μMの総dGTPを含んでいたが、その２ μMは、32P-dGTP(800Ci/mmol)であった。抽出物をDNaseを含まないRNaseで処理( 25μg/ml、10分間、30℃)して、テロメアーゼをアッセイした（レーン1-3、16-1 8）。これらの両側のレーンは、図に示すヌクレオチド(nt)の図に示すサイズを 有するDNAマーカーを含んでいる。 図２．テロメラーゼのRNA成分(hTR)およびGAPDH RNAの定常状態レベルを、定 量的RT-PCRを用いて測定した。コントロールは、すべてのPCR定量が25サイクル まで直線の範囲であったことを示す。５つの正常テロメラーゼ陰性細胞株(1〜5) 、および５つの腫瘍テロメラーゼ陽性細胞株(6〜10)について、RT-PCRを分析し た：1)初期胎児肺；2)初期胎児手の皮膚；3)成人一次前立腺；4)原発性sinovial 繊維芽細胞；5)包皮繊維芽細胞；6)メラノーマLOX；7)白血病U251；8)NCIH23肺 ガン；9)結腸腫瘍SW620；10)乳腫瘍MCF7。PCR産物を32Pで標識し、6%PAGEで分離 し、Phosphorlmagerを用いて定量した。相対的な転写を任意の単位で表す。 図３．テロメラーゼのRNA成分のアンチセンス細胞およびベクターコントロ ール細胞の平均TRFの長さ。10-3-hTRアンチセンスまたはベクターコントロール を安定に発現するHeTe7細胞をハイグロマイシンおよびピュロマイシン培地で選 択し、トランスフェクション後、23PDLで回収した。核DNAを精製し、HinfI およびRsaIで切断し、そして0.5%アガロースゲルで泳動した。DNAをゲル中で(TT AGGG)3オリゴヌクレオチドでプローブし、テロメアの末端制限フラグメント(TRF )を標識した。ゲルをMolecular DynamicのPhosphorImagerでスキャンし、平均TR FをAllsoppら、(1992)Proc ．Natl．Acad．Sci．(USA) 89:10114に記載のように 定量した。破線は、アンチセンスおよびコントロール群に対するTRFの平均を示 す。 図４．インサイチュPCR方法の模式図である。好ましい実施態様の説明 本発明は、リボヌクレオタンパク質ヒトテロメラーゼに関連する方法、薬剤、 遺伝的に改変した動物および細胞、および薬学的組成物を提供する。 本明細書中、以下で使用される名称、および以下で記述される細胞培養、分子 遺伝学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は 、当該分野において周知で一般的に用いられる手順を包含し得る。標準的な技術 が、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物培養および形質転換 (例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)について使用される。こ の技術および手順は、一般的に、当該分野、およびこの書類を通じて提供される 種々の一般的な参考文献(一般的には、Sambrookら、Molecular Cloning: A Labo ratory Manual、第２版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spr ing Harbor、N.Y.を参照。これらは、本明細書中で参考として援用される)にお ける従来の方法に従って実施される。 オリゴヌクレオチドは、Applied Bio Systemsのオリゴヌクレオチド合成機で 、製造業者によって提供される仕様書に従って合成され得る。 PCR増幅の方法は、当該分野で記載されている(PCR Technology: Principles a nd Applications for DNA Amplification 、HA Erlich編、Freeman Press，New Y ork，NY(1992)；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Innis 、Gelfland、Snisky、およびWhite編、Academic Press、San Diego、CA(1990)； Mattilaら(1991)Nucleic Acids Res. 19: 4967；Eckert，K.A.およびKunkel，T. A.(1991)PCR Methods and Applications 1: 17；PCR、McPherson、Quirkes、お よ びTaylor、IRL Press、Oxford；および米国特許第4,683,202、これらは、本明細 書中で参考として援用する)。 概観 本発明は、一部、ヒトテロメラーゼのRNA成分およびそのRNA成分の遺伝子のク ローニングおよび単離から生じ、関連する(結合した)転写制御エレメントを含む 。ヒトテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド配列を以下に示す。簡便のために 、この配列を、リボヌクレオチドのための標準的な略号(Ａはリボアデニンであ り、Ｇはリボグアニンであり、Ｃはリボシチジンであり、そしてＵはウリジンで ある)を使用して示す。当業者は、以下に示される配列はまた、cDNAの配列も示 し、ここで、リボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドで置換される(ウ リジンはチミジンで置換される)ことを理解する。 上記の配列は、5'−3'方向に示され、そして参照のために番号付けされている。 RNA成分のテンプレート配列は、ヌクレオチド50〜60(5'-CUAACCCUAAC-3')で規定 される領域内に位置すると考えられており、これは、テロメア反復ユニットの約 ３分の１および３分の２から構成されるテロメア配列に相補的である。 この配列は、cDNAクローンおよびRNA成分のゲノムクローンに由来した。RNA成 分が、まず、対応する遺伝子から転写される場合、少なくともいくつかの生成さ れたRNA転写物は、上記の約560ヌクレオチド配列よりずっと長く、そして事実、 1000ヌクレオチド以上含み得る。しかし、完全に機能的なテロメラーゼ分子は、 上記の約560ヌクレオチド配列からなる転写物から組み立てられ得る。天然のテ ロメラーゼにおけるRNA成分の3'末端部は、上記配列中のヌクレオチド514〜559 で規定される領域内にあると考えられている；１つの分析は、3'末端部がヌクレ オチド538のＵ残基であり得ること示す。上記配列のヌクレオチド１〜559未満を 含む組換えRNA成分分子もまた、活性テロメラーゼを調製するために使用され得 る。 ゲノムクローンは、λベクターFIXII中に挿入されたヒトDNAの遺伝子ライブラ リーから同定および単離された。RNA成分遺伝子配列を含むゲノムクローンは、 約15kbの挿入物を含み、そしてクローン28-1と名付けられた。この遺伝子は、第 ３染色体のｑアームの遠位末端部に位置付けられる。λクローン28-1の、約15kb の挿入物の一方の末端部のSauIIIA1制限酵素認識部位〜内部HindIII制限酵素認 識部位(これは、成熟RNA成分配列およびRNA成分遺伝子の転写制御エレメントの 全てを含む)から得られた配列情報を、標準的なデオキシリボヌクレオチド略号 を使用して以下に示し、そして5'−3'方向に示す。 RNA成分配列は塩基1459から始まる。種々の転写制御エレメントがこの配列中に 同定されている。A/Tボックス共通配列は、ヌクレオチド1431〜1436に見出され ；PSE共通配列はヌクレオチド1406〜1414およびヌクレオチド1508〜1526に見出 され；CAATボックス共通配列はヌクレオチド1399〜1406に見出され；SP1共通配 列はヌクレオチド1354〜1359に見出され；そしてβ/γ-インターフェロン応答エ レメント共通配列は、ヌクレオチド1234〜1245に見出される。HT1080(テロメ ラーゼ発現)のようなヒト細胞におけるヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子のて定常 状態転写は、ヌクレオチド1159の上流の配列が、この細胞中に安定にトランスフ ェクトされるベクターにおいて欠失している場合には、実質的に不変である。 ヒトに対して最も遺伝的にかけ離れた非ヒト霊長類であると考えられているリ スザル由来のDNAは、開示したヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列に 対応するかまたはこれに相補的な配列からなるPCRプライマーで増幅可能である テロメラーゼRNA成分遺伝子を含む。他の非ヒト霊長類は、ヒトテロメラーゼRNA 成分遺伝子の配列由来のPCRプライマーで、また増幅可能であるテロメラーゼRNA 成分遺伝子を有すると考えられている。 テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド ヒトテロメラーゼについては上記に、そしてリスザルテロメラーゼについては 図５に示されるような、哺乳動物テロメラーゼRNA成分およびその遺伝子の配列 の開示により、少なくとも15個の連続ヌクレオチド、代表的には、少なくとも20 〜25個の連続ヌクレオチドの配列を含む単離ポリヌクレオチドの構築が可能にな る。これら連続配列は、哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列または哺乳動物RNA成 分遺伝子配列と実質的に同一である。さらに、哺乳動物テロメラーゼRNA成分(お よび遺伝子)配列により、細胞、細胞性サンプル、組織切片、反応容器、ハイブ リダイゼーションメンブレンなどにおいて、同種(cognate)のテロメラーゼRNA成 分および/または遺伝子のRNAおよびDNA配列を検出するために使用され得る核酸 ハイブリダイゼーションプローブおよびPCRプライマーの構築が可能になる。 哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列を含むポリヌクレオチドは、転写を促進す る配列(発現配列)、RNA安定化配列などを包含し得る。本発明により開示した配 列情報ならびに本発明のガイダンスおよび誘導を考慮すると、このようなポリヌ クレオチドの構築に関する一般原理は、当該分野において周知であり、そしてMa niatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版(1989)、Cold Spr ing Harbor、N.Y.にさらに記載されている。例えば、このようなポリヌクレオチ ドは、プロモーター、および必要に応じて、真核生物発現宿主における使用のた めのエンハンサー、ならびに必要に応じて、ベクターの複製に必要な配列を含み 得るが、これらに限定されない。代表的な真核生物発現カセットは、転写された 場合、哺乳動物テロメラーゼRNA成分転写物を生成するポリヌクレオチドを含む ；このようなポリヌクレオチド配列は、下流に(すなわち、必要に応じてエンハ ンサーに連結された、適切なプロモーター(例えば、HSV tkプロモーターまたはp gk(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロモーター)の転写方向５'から３'に)連結さ れる。 さらに、機能的なテロメラーゼRNA成分の発現を望まない場合、本発明のポリ ヌクレオチドは、機能的なテロメラーゼRNA成分転写物を転写する必要がない。 本発明のポリヌクレオチドは、テロメラーゼRNA成分RNAまたはDNA配列を検出す るためのハイブリダイゼーションプローブおよび/またはPCRプライマー(アンプ リマー)ならびに/あるいはLCRオリゴマーとして働き得る。 あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、関連する遺伝子、または関連する種 (代表的には、哺乳動物種)のテロメラーゼRNA成分遺伝子のRNAまたはDNA配列を 検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして働き得 る。このようなハイブリダイゼーションおよびPCRアプリケーションのためには 、本発明のポリヌクレオチドは、機能的なテロメラーゼRNA成分を転写する必要 がない。従って、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物テロメラーゼRNA成分 配列に対する特異的ハイブリダイゼーションまたは特異的増幅が維持されるかぎ り、実質的な欠失、付加、ヌクレオチド置換および/または転移を含み得る。 哺乳動物テロメラーゼRNA成分および対応する遺伝子配列のゲノムクローンま たはcDNAクローンは、クローンライブラリー(例えば、Clontech(Palo Alto、CA) から入手可能)から、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列に基づいて設計 されたハイブリダイゼーションプローブを使用し、そして従来のハイブリダイゼ ーションスクリーニング法(例えば、Benton WDおよびDavis RW(1977)Science 19 6 : 180；Goodspeedら(1989)Gene 76: 1)を使用して単離され得る。cDNAクローン を所望する場合、体細胞RNAまたは他のテロメラーゼRNA成分発現細胞RNA由来のc DNAを含むクローンライブラリーが好ましい。あるいは、本明細書中で開示した 配列の全てまたは一部に対応する合成ポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオ チドの化学合成によって構築され得る。さらに、本明細書中で開示した配列デ ータに基づくプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ゲノムDNA、 RNAプール、またはcDNAクローンライブラリーからDNAフラグメントを増幅するた めに使用され得る。米国特許第4,683,195号および第4,683,202号は、PCR法を記 載する。 このようなポリヌクレオチドは、テロメラーゼRNA成分プローブ、細胞におい て機能的または非機能的テロメラーゼRNA成分を生成するためのテンプレート、 テロメラーゼRNA成分検出アッセイを標準化するための市販の診断試薬、動物に 投与するための遺伝子治療ポリヌクレオチドとしての使用を包含する、種々の使 用を有する；このようなポリヌクレオチドはまた、とりわけ、食料品(foodstuff )、可燃性エネルギー源、UV吸収日焼け止め薬剤、および粘性増強溶質として使 用され得る。 ヒトテロメラーゼのRNA成分およびRNA成分の遺伝子のクローンニングの間に構 築された、本明細書中に記載されるプラスミドは、本発明の重要な局面である。 これらのプラスミドは、実質的に純粋な形態のヒトテロメラーゼのRNA成分およ びその遺伝子を作成するために使用され得る。これは、本発明のさらに別の重要 な局面である。さらに、当業者は、ヒトテロメラーゼのRNA成分のヌクレオチド 配列の全てまたはその少なくとも有用な部分を含む、種々の他のプラスミドおよ び実質的に純粋な形態の非プラスミド核酸が、本発明によって提供される有用な 物質であることを認識する。 本発明の核酸および核酸を含有する調製物に関する一般的な見解として、当業 者は、本発明の核酸がDNAおよびRNA分子の両方、ならびに合成の、天然に存在し ない核酸アナログ、およびデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび /またはそのいずれかのアナログのヘテロポリマーを包含することを認識する。 本発明の核酸または核酸アナログの特定の組成は、その物質が使用される目的お よびその物質が配置される環境に依存する。改変、または合成の天然には存在し ないヌクレオチドは、種々の目的に働くよう、または当該分野において周知のよ うに、ヌクレアーゼが存在する環境のような種々の環境で安定な状態を維持する ように設計されている。改変、または合成の天然には存在しないヌクレオチドは 、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドと比較して 、 ヌクレオチドの炭化水素(糖)、リン酸結合、または塩基部分に関して異なり得る か、またはいくつかの場合、非ヌクレオチド塩基さえ含み得る(あるいは、塩基 を全く含み得ない)。例えば、Arnoldら、「ヌクレオチドプローブのための非ヌク レオチド連結試薬」と題するPCT特許公開第WO89/02439号(本明細書中に参考とし て援用)を参照。本発明の核酸は広範囲のヌクレオチドを含み得るというだけで 、これら核酸は、広範囲の有用な機能を働かせ得る。 同種遺伝子の単離 上記の記載によって示されるように、ヒトテロメラーゼのRNA成分の配列を含 む精製核酸は、有用な診断法および診断薬ならびに治療法および治療薬、ならび に他の重要な利点を提供する。本発明の１つの重要な利点は、本発明の方法およ び試薬が任意の哺乳動物種から、本発明のヒトRNA成分と実質的に相同なRNA成分 を有する、テロメラーゼのRNA成分のおよびRNA成分の遺伝子を単離するために使 用し得ることである。句「実質的に相同な」は、ヒトRNA成分のオリゴヌクレオチ ドまたは核酸配列と別の哺乳動物種のRNA成分配列の核酸配列との特異的ハイブ リダイゼーションに必要とされる相同性の程度をいう。このような実質的な相同 性を仮定すれば、当業者は、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドのプライマ ーおよびプローブ使用して、実質的に相同な配列を同定および単離し得る。 例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーをプローブして相同配列を検出し得る 。また、DNA成分配列の領域に対応するプライマーおよびPCR増幅を、低いまたは 中程度のストリンジェンシー条件下で使用して、特定の相同な核酸配列を、哺乳 動物種由来のRNAまたはDNAの調製物から増幅し得る。これらまたは他の同様な技 術を使用することによって、当業者は、ヒト細胞から変異RNA成分核酸を容易に 単離しだけでなく、他の哺乳動物細胞、例えば、霊長類由来の細胞、獣医学的な 目的の哺乳動物(すなわち、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、およびネコ)由来の細胞 、および齧歯類(すなわち、ラット、マウス、およびハムスター)由来の細胞から 相同なRNA成分核酸を容易に単離し得る。次いで、これらの核酸は、テロメラー ゼ活性を調節する薬物のスクリーニングおよび試験に非常に有用なトランスジェ ニック動物を調製するために使用され得る。例えば、本発明のプラスミドを使用 す ることによって、mus spretus胚幹細胞において、RNA成分遺伝子を「ノックアウ ト(knock out)」するかまたは天然RNA成分遺伝子を組換え誘導可能遺伝子で置換 し、次いで年齢関連疾患または老化関連疾患の研究のためのモデルまたは試験系 として有用であるトランスジェニックマウスを作成し得る。下記の実施例９は、 そのような方法が、霊長類のRNA成分配列を同定および単離するために如何に使 用されているかを説明する。 ヒトまたはサルテロメラーゼRNA成分および/または同種遺伝子の他の哺乳動物 相同体は、適切な非ヒト哺乳動物ゲノムまたはcDNAクローンライブラリー(例え ば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、イヌ、ウシ、ヒツジ、 オオカミ(lupine)、ブタに由来)、あるいは適切なベクター(例えば、酵母人工染 色体、コスミド、またはバクテリオファージλ(例えば、λCharon 35))中の他の ゲノムまたはcDNAライブラリーを、ヒトまたはサルテロメラーゼRNA成分あるい は遺伝子ポリヌクレオチド配列のおよそ少なくとも20個の連続するヌクレオチド の配列(またはそれらの相補体)を含むポリヌクレオチドプローブを用いてスクリ ーニングすることによって同定および単離され得る。代表的には、ハイブリダイ ゼーションおよび洗浄条件は、従来のハイブリダイゼーション手順に従って、高 いストリンジェンシーで実行される。陽性クローンは、単離および配列決定され る。説明のためてあって限定のためではなく、ヒトテロメラーゼRNA成分の559ヌ クレオチド配列に対応する完全長のポリヌクレオチドは標識され、そしてλEMBL 4またはλGEM11(Promega Corporation、Madison、Wisconsin)中の非ヒトゲノム クローンライブラリーからゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーシ ョンプローブとして使用され得る；プラークリフト(plaque lift)をスクリーニ ングするための代表的なハイブリダイゼーション条件(BentonおよびDavis(1978)Science 196:180；Dunnら(1989)J.Biol.Chem. 264:13057)は、50％ホルムアミド 、５×SSCまたはSSPE、１〜５×Denhardt溶液、0.1〜１％SDS、100〜200μgの剪 断(sheared)異種DNAまたはtRNA、０〜10％硫酸デキストラン、１×105〜１×107 cpm/ml変性プローブ(このプローブは、約１×108cpm/μgの比活性を有する)、お よび42℃〜37℃にて約６〜36時間のインキュベーションであり得る。プレハイブ リダイゼーション条件は、プローブを含まないことおよびインキュベーション 時間が代表的には減少していることを除いて、本質的に同一である。洗浄条件は 、代表的には、１〜３×SSC、0.1〜１％SDS、45〜70℃であり、約５〜30分で洗 浄溶液を交換する。非ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドを、ヒトテロ メラーゼRNA成分ヌクレオチドプローブで単離するために、より低いストリンジ ェンシー(例えば、約39℃)でハイブリダイズさせ、そして、続いて以下のステッ プ温度：室温、37℃、39℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、および70℃ で洗浄して、各工程の後に停止し、バックグランドのプローブシグナルをモニタ ー(および、放射活性標識プローブを使用する場合、必要に応じて、オートラジ オグラムおよび/またはリン画像化によってシグナルを検出)し、そして経験的に 決定される適切なシグナル/ノイズ比が達成される場合、洗浄工程を終結するこ とが好ましい。 本明細書中に示される、ヒトおよびサルテロメラーゼRNA成分配列のヌクレオ チド配列に対応するかまたはこれに相補的な、およそ少なくとも30〜50ヌクレオ チド、好ましくは、少なくとも100ヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド は、開示した遺伝子およびRNA成分配列に対応する生殖細胞系列の遺伝子を同定 および単離するためのPCRプライマーおよび/またはハイブリダイゼーションプロ ーブとして働き得る。このような生殖細胞系列の遺伝子は、当該分野における従 来の種々の方法(バクテリオファージλ中のゲノムライブラリーまたはコスミド ライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング、または本明細書中で開 示した配列に由来するプライマーを使用するゲノム配列のPCR増幅を包含するが 、これらに限定されない)によって単離され得る。ヒトゲノムライブラリーは、 公に入手可能であるか、またはヒトDNAから新規に構築され得る。 ヌクレオチド置換、欠失、および付加が本発明のポリヌクレオチド中に組み込 まれ得ることは当業者に明らかである。ヌクレオチド配列のバリエーションは、 種々の対立遺伝子などの配列多形性から生じ得る。しかし、このようなヌクレオ チド置換、欠失、および付加は、本明細書中に示される完全長ヒトまたはサルテ ロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列このポリヌクレオチドのうちの１つに 、特異的ハイブリダイゼーションを生じるに十分なストリンジェンシーであるハ イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力を実 質 的に破壊するべきでない。 哺乳動物テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼ ーションプローブおよびPCR(またはLCR)プライマーとしての使用に関しては、短 いオリゴヌクレオチド(例えば、20〜100塩基長)であり得る。ポリヌクレオチド 配列はまた、より長いポリヌクレオチド(例えば、テロメラーゼRNA成分クローン を含むクローニングベクター)の一部分を含み得、そしてポリヌクレオチド結合 によって、別のポリヌクレオチド配列と融合され得る。代表的には、テロメラー ゼRNA成分ポリヌクレオチドは、天然に存在するテロメラーゼRNA成分または遺伝 子配列と実質的に同一な、少なくとも25個の連続ヌクレオチドを含み、より通常 には、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、天然に存在する哺乳動物テロ メラーゼRNA成分配列と実質的に同一な、少なくとも50〜100個の連続ヌクレオチ ドを含む。しかし、テロメラーゼRNA成分標的配列への特異的ハイブリダイゼー ションに必要なテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドの最小の長さは、いくつ かの因子、とりわけ、G/C含有量、不適合塩基の位置(存在する場合)、標的ポリ ヌクレオチドの集団と比較した場合の配列の独自性の程度、およびポリヌクレオ チドの化学的性質(例えば、メチルホスホネート骨格、ポリアミド核酸、ホスホ ロチオレートなど)に依存することが当業者によって認識される。 所望であれば、実質的に完全長のcDNAコピーを増幅するためのPCRアンプリマ ーは、実施者の自由に選択され得る。同様に、テロメラーゼRNA成分遺伝子(サル またはヒト)の一部分を増幅するためのアンプリマーは、選択され得る。 これらの配列のそれぞれは、テロメラーゼRNA成分を検出するため(例えば、細 胞における増加したまたは減少したテロメラーゼRNA成分レベルの存在によって 特徴づけられる新生物疾患を診断するため)、または組織型決定(tissue typing) (すなわち、テロメラーゼRNA成分の発現によって特徴づけられる組織を同定する )などを実行するために、ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRアンプリマ ーとして使用され得る。配列はまた、DNAサンプルにおいてゲノムテロメラーゼR NA成分遺伝子配列を検出するため、例えば、法廷のDNA分析(例えば、RFLP分析、 PCR産物長さ分布などによる)またはテロメラーゼRNA成分遺伝子の増幅および/ま たは再配置によって特徴づけられる疾患の診断のために使用され得る。 例えば（しかし限定はしないが）、以下のペアのオリゴヌクレオチドプライマ ーが、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列(例えば、cDNA)を増幅するた め、またはハイブリダイゼーションプローブ(例えば、ビオチン化または末端標 識オリゴヌクレオチドプローブ)として使用され得る： 他の適切なPCRプライマー、LCRプライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、 およびプライマーなどは、本明細書中で開示されたテロメラーゼRNA成分および これから得られ得るテロメラーゼRNA成分を考慮すると配列当業者に明らかであ る。ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドおよびそれらの相補体は、哺乳 動物テロメラーゼRNA成分のRNAまたはDNA配列を検出するためのハイブリダイゼ ーションプローブまたはプライマーとして働き得る。このようなハイブリダイゼ ーションおよびPCRの適用増幅のためには、ヒトテロメラーゼRNA成分配列の特異 的ハイブリダイゼーションまたは特異的増幅が維持される限り、実質的な欠失、 付加、ヌクレオチド置換および/または転移を含み得る。しかし、このようなヌ クレオチド置換、欠失、および付加は、テロメラーゼRNA成分または遺伝子配列 と、特異的なハイブリダイゼーションを生じるに十分なストリンジェンシーであ るハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの能力 を実質的に破壊すべきでない。 例えば(そして、限定ではない)、ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド は、ヌクレオチド48からヌクレオチド209までの配列を含み得る。この配列は、 テロメラーゼタンパク質成分の存在下でヒトテロメラーゼホロ酵素を再構築する ために十分であると考えられている： またはDNAとして また、ヒトテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド１〜559を含 み得るかまたはこれからなり得、そして他のヌクレオチドまたはヌクレオチド配 列の末端付加を含み得る。ヌクレオチド48〜209からなるテンプレートスクラン ブルド(template-scrambled)変異体(しかし、ここで、テロメア反復テンプレー ト配列は変更される)は、野生型配列48〜209からなる切形のRNA成分と、テロメ ラーゼタンパク質成分への結合およびテロメラーゼホロ酵素の再構築について競 合し得る。 ヒトテロメラーゼRNA成分の構造分析は、二次構造(例えば、ヘアピンループ) を形成する傾向(propensity)を有する領域を示す。例えば、ヒトテロメラーゼRN A成分のおよそヌクレオチド200からヌクレオチド350までの領域は、実質的なヘ アピンループ特性を有する。テロメラーゼRNA成分の他の部分もまた、重要な二 次構造特性を有する。この顕著な二次構造を考慮すると、コンピュータ解析によ って同様な二次構造形態をとる他のヌクレオチド配列は、当業者によって置換さ れ得る。種々のコンピュータプログラムが、実質的に等価な二次構造をとるヌク レオチド配列を決定するために適切であるか、UWGCG配列解析ソフトウェアパッ ケージプログラムFOLD、SQUIGGLES、CIRCLES、DOMES、NOUNTAINS、およびSTEMLO OPなどが使用され得る。同様に、ペプチド核酸などのような非ヌクレオチド構造 模擬体(mimetic)は、分子モデリングプログラムによって、まねることが望まし いヒトテロメラーゼRNA成分領域の特徴的な二次構造の模擬体として、設計され 得る。このような構造的模擬体は、治療上または種々の使用(例えば、競合アン タゴニストなど)のために使用され得る。 アンチセンス 本発明の核酸の１つの特に有用なタイプは、インビボまたはインビトロで使用 されてヒトテロメラーゼの活性を阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドで ある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトテロメラーゼのRNA成分に相補 的な、約10ヌクレオチドから約25〜200ヌクレオチドまたはそれ以上まで(すなわ ち、安定な二重鎖を形成するに十分であるが、(所望であれば、インビボに投与 するために)送達の様式に依存して、十分に小さい)の特定の配列を含む。このよ うなオリゴヌクレオチドの作用機序は、機能的リボヌクレオタンパク質テロメラ ーゼの組立を妨げるため、RNA成分がテロメアDNA合成のテンプレートとして働く ことを妨げるため、テロメラーゼRNA成分を不安定化しそしてその半減期を減少 させるため、および/またはテロメラーゼRNA成分遺伝子の転写を阻害するための いずれかのためのRNA成分の結合を包含し得る。 インビボおよび/またはインビトロでテロメラーゼ活性を阻害するために働く 、本発明の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、クローンpGRN7がヒト テロメラーゼのRNA成分のcDNAを含むかどうかを決定するための試験に関連して 、上記のオリゴヌクレオチドを包含する。上記のような、３つのこのようなオリ ゴヌクレオチドを使用して、インビトロにおけるテロメラーゼ活性の阻害を示し た。これらオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列を以下に示す。 これらのオリゴヌクレオチドはまた、ヒト細胞においてテロメラーゼ活性を阻害 するために使用され得る。 当業者は、本発明が、テロメラーゼ活性を阻害し得る広範囲のアンチセンスオ リゴヌクレオチドを提供することを認識する。本発明の別の有用なアンチセンス オリゴヌクレオチドは、Tel-AUである。これは、配列5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC- 3'を有し、そして本発明の任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、ホ スホロチオエートヌクレオチド、キラル−メチルホスホネート、天然に存在する ヌクレオチド、またはそれらの混合物を使用して合成されて、安定性および所望 のTnを与えられ得る。当業者は、広範囲の改変ヌクレオチドアナログ(例えば、O -メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、およびメチルホ スホネートヌクレオチド)が、天然に存在するヌクレオチドを使用して生成され る核酸より望ましい性質(すなわち、ヌクレアーゼ抵抗性、より強固な結合など) を有する本発明の核酸を生成するために使用され得ることを理解する。オリゴヌ クレオチドをヌクレアーゼ抵抗性にする他の技術は、PCT特許公開第94/12633号 に記載される技術を含む。 テロメラーゼ活性の調節に関するさらなる実施態様は、ヒトテロメラーゼRNA 成分(hTR)配列の全てまたは一部分に相補的な特定のアンチセンスポリヌクレオ チド、例えば、ヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子またはその転写RNA(テロメラー ゼホロ酵素と結合し得る切形形態を含む)アンチセンスポリヌクレオチドを用い る方法を包含する。このような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、テロメ ラーゼRNA成分またはその遺伝子に対応する関連標的配列への特異的結合が、ポ リヌクレオチドの機能的な性質として維持される限り、ヌクレオチド置換、付加 、欠失、または転移を含み得る。相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、テロ メラーゼRNA成分種に特異的にハイブリダイズし、そしてテロメラーゼRNA成分遺 伝子の転写を妨げ得る可溶性アンチセンスRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを含 む(Chingら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86: 10006；Broderら(1990)Ann.I nt.Med. 113: 604；Loreauら(1990)FEBS Letters 274: 53；Holcenbergら、WO91 /11535；米国特許出願第07/530,165；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；お よびEP 386563、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用する)。従っ て、アンチセンスポリヌクレオチドは、機能的テロメラーゼRNA成分の産生を阻 害する。テロメラーゼRNA成分の発現(転写速度および/またはRNA安定性)は、活 性化およびテロメラーゼホロ酵素の酵素活性と関連するので、テロメラーゼRNA 成分に対応するRNAの転写、および/またはテロメラーゼRNA成分とヒトテロメラ ーゼのタンパク質成分との相互作用、および／またはテロメラーゼRNA成分とテ ロメア配列との相互作用を妨げるアンチセンスポリヌクレオチドは、テロメラー ゼ活性を阻害し、そして／またはアンチセンスポリヌクレオチドの非存在下でテ ロメラーゼ活性を発現する細胞の表現型を逆転(例えば、不死化または悪性転換) し得る。治療有効投与量のテロメラーゼRNA成分アンチセンスポリヌクレオチド を含有する組成物は、細胞性病因(例えば、新生物)のためにテロメラーゼ活性を 必要とする疾患の処置のため、あるいは所望の場合、配偶子産生または維持を阻 害するため(すなわち、避妊剤として)に投与され得る。種々の長さのアンチセン スポリヌクレオチドが生成され得るが、このようなポリヌクレオチドは、代表的 には、およそ少なくとも25個の連続するヌクレオチドの配列を含む。この配列は 、天然に存在するテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列に実質的に相補的 で あり、そして代表的には、ヒトテロメラーゼRNA成分配列に完全に相補的である 。これは、しばしば、テロメア反復配列に相補的であるテロメラーゼRNA成分の 配列に相補的であるか、またはテロメラーゼポリペプチドサブユニットと接触す るテロメラーゼRNA成分の部分に相補的である。 アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランス ジェニック細胞において、異種発現カセットから生成され得る。異種発現カセッ トは、遺伝子治療ベクター(例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ関連 ウイルスベクター)または他の遺伝子治療ベクターの一部であり得る。異種カセ ットは、独立して複製し得ず、そして、当業者に公知の種々の適切な任意の方法 (例えば、リポフェクション、バイオリスティック(biolistic)、リポソーム、イ ムノリポソーム、エレクトロポレーションなど)により細胞中に移入されるポリ ヌクレオチド上にあり得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、外部 環境(インビトロの培養培地、またはインビボ適用については間質性空間および 体液(例えば、血液、CSF))に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含み得る。 外部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質に接近し、 そして特定のRNA種を阻害することが示されている。いくつかの実施態様では、 アンチセンスポリヌクレオチドは、メチルホスホネート部分、C-5プロペニル部 分、2'フルオロリボース糖を含むか、またはポリアミド核酸(PNA)である(Egholm ら(1992)J.Am.Chem.Soc. 114: 1895；Wittungら(1994)Nature 368: 561；Egholm ら(1993)Nature 365: 566；Hanveyら(1992)Science 258: 1481、本明細書中に参 考として援用する)。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的な方法につ いては、Antisense RNA and DNA、(1988)、D.A.Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYを参照。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに加え、折り畳まれたRNA成分また はRNA成分の遺伝子のいずれかにおいて、二重鎖核酸と結合して三重らせん含有 または三重鎖核酸を形成しテロメラーゼ活性を阻害するオリゴヌクレオチドを構 築し得る。本発明のこのようなオリゴクレオチドは、三重らせん形成の塩基対合 規則およびRNA成分のヌクレオチド配列を使用して構築される(Chengら(1988)J.B iol.Chem. 263: 15110；FerrinおよびCamerini-Otero(1991)Science 354: 149 4；Ramdasら(1989)J.Biol.Chem. 264: 17395；Strobelら(1991)Science 254: 16 39；Hsiehら(1990)op.cit. ;Rigasら(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 83: 9 591、本明細書中で参考として援用する)。このようなオリゴヌクレオチドは、テ ロメラーゼ遺伝子の転写を妨げること、あるいは、RNA成分が機能的なリボヌク レオタンパク質テロメラーゼを形成することまたはテロメアDNA合成のテンプレ ートとして働くことのいずれかを妨げる様式で、テロメラーゼのRNA成分の二重 鎖領域に結合させることを包含する多くの方法でテロメラーゼ活性をブロックし 得る。代表的には、そして作用の態様に依存して、本発明の三重鎖形成オリゴヌ クレオチドは、テロメラーゼのRNA成分またはテロメラーゼのRNA成分の遺伝子中 の特定の配列に「相補的な」(この文脈において、相補的なは、安定な三重らせん を形成し得ることを意味する)、約10ヌクレオチドから約25〜200ヌクレオチドま たはそれ以上(すなわち、安定な三重らせんを形成するに十分な長さであるが、( 所望であれば、インビボに投与するために)送達の態様に依存して、十分短い)の 特定の配列を含む。 本発明のアンチセンスおよび三重らせん形成オリゴヌクレオチドに加えて、ヒ トテロメラーゼのRNA成分の少なくとも一部分に連続して同一なセンスオリゴヌ クレオチドもまた、テロメラーゼ活性を阻害するために使用され得る。このタイ プの本発明のオリゴヌクレオチドは、(１)機能的なテロメラーゼ酵素を生成する に必要とされるRNA成分の完全配列より少ない、または(２)機能的なテロメラー ゼ酵素を生成するに必要とされるRNA成分の完全配列、および得られるRNAを非機 能的にする１またはそれ以上のヌクレオチドの置換または挿入のいずれかを含む ことで特徴づけられる。両方の場合において、テロメラーゼ活性の阻害は、「変 異」RNA成分がヒトテロメラーゼのタンパク質成分に結合して不活化テロメラーゼ 分子を形成することに起因して観察される。従って、このようなオリゴヌクレオ チドの作用機序は、非機能的リボヌクレオタンパク質テロメラーゼの組立、また は機能的リボヌクレオタンパク質テロメラーゼの組立の妨害を包含する。例は、 ヌクレオチド48〜209からなるテンプレートスクランブルド変異体(しかし、ここ で、テロメア反復テンプレート配列は変更されている)であり得る。このような テンプレートスクランブルド変異体は、テロメラーゼタンパク質成分への結合に ついて競合し得る。このタイプの本発明のセンスオリゴヌクレオチドは、代表的 には、ヒトテロメラーゼのRNA成分中のヌクレオチドの特定の配列と同一な、約2 0、50、100、200、400、500、またはそれ以上のヌクレオチドの特定の配列を含 む。 さらに、アンチセンスポリヌクレオチドは、哺乳動物テロメラーゼのRNA成分 とのハイブリダイゼーションに関して、実質的に妨害しない誘導体化置換基を含 み得る。化学置換基を付加されて改変されているアンチセンスポリヌクレオチド は、代謝的に活性な真核細胞に導入されて、その細胞においてテロメラーゼのテ ロメラーゼRNA成分とハイブリダイズし得る。代表的には、このようなアンチセ ンスポリヌクレオチドは誘導体化され、そしてさらなる化学置換基が、ポリヌク レオチド合成の間または後のいすれかに、それぞれ、付着され、従って局所的な DNA配列および/またはテロメラーゼタンパク質成分に相補的なテロメラーゼRNA 成分の配列(ここで、化学的置換基は、変化または化学的改変を生じる)に位置さ れられる。好ましい付着化学置換基は、ユウロピウム(III)テクサフィリン(texa phyrin)、架橋剤、プソラレン、金属キレート(例えば、鉄触媒切断については鉄 /EDTAキレート)、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ 、リガーゼ、ホスホジエステラーゼ、光力学的ポルフィリン、化学療法薬剤(例 えば、アドリアマイシン、ドキシルビシン(doxirubicin))、挿入剤、塩基改変剤 、免疫グロブリン鎖、およびオリゴヌクレオチドを含む。鉄/EDTAキレートは、 ポリヌクレオチド配列の局所的切断を所望する場合、特に好ましい化学置換基で ある(Hertzbergら(1982)J.Am.Chem.Soc. 104: 313；HertzbergおよびDervan(198 4)Biochemistry 23: 3934；Taylorら(1984)Tetrahedron 40: 457；Dervan,PB(19 86)Science 232: 464)。好ましい付着化学は、例えば、付加された反応性アミノ 基を介する直接結合(CoreyおよびSchultz(1988)Science 238: 1401、本明細書中 に参考として援用する)、および他の直接結合化学を包含するが、ストレプトア ビジン/ビオチンおよびジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン抗体結合法もまた、使 用され得る。化学置換基を結合するための方法は、米国特許第5,135,720号、第5 ,093,245号および第5,055,556号(本明細書中に参考として援用する)に提供され る。他の結合化学は、実施者の自由に使用され得る。哺乳動物テロメラー ゼRNA成分の全てまたは実質的な部分に対応するポリヌクレオチド(すなわち、「 センス」ポリヌクレオチド)もまた誘導化され、そしてゲノムのテロメア反復配列 と反応させ、そして染色体のテロメア領域に付加生成物(adduct)または他の化学 的環境の改変を生じさせるために使用され得る。 不適合テンプレート 従って、本発明の別の有用なオリゴヌクレオチドは、ヒトテロメラーゼのRNA 成分の改変または変異配列を含む。Yuら、1990，Nature 344: 126は、Tetrahyme naテロメラーゼのRNA成分の変異形態が、Tetrahymena細胞のテロメラーゼ中に取 り込まれること、およびこの取り込みがこれらの細胞に対して有害な効果を有す 得ることを示す。ヒトテロメラーゼのRNA成分の変異形態の取り込みは、そうで なければ、テロメラーゼ活性を有さない正常ヒト細胞に影響することなくテロメ ラーゼ活性を有するヒト細胞に対して同様な効果を有し得る。このような変異形 態は、配列5'-CTAACCCTA-3'が、5'-CAAACCCAA-3'、5'-CCAACCCCAA-3'、または5' -CTCACCCTCA-3'に変異している形態を包含する。これらの改変RNA成分配列のそ れぞれは、染色体DNA中に取り込まれたテロメア反復ユニットを改変し、従って 染色体の構造および機能に影響する。このようなオリゴヌクレオチドは、テロメ アDNAまたは伸長テロメラーゼ基質の制限酵素消化を介する、改変RNA成分の存在 に関する診断方法に有用な制限酵素認識部位を含有するよう設計され得る。 本発明のこの局面を例示するために、部位特異的変異誘発を、λクローン28-1 (下記の実施例７を参照)由来の約2.5kbのHindIII〜SacIフラグメントおよびSV40 複製開始点(しかし、プロモーター活性はない)を含むプラスミド(消化されたpGR N33、American Type Culture Collectionから受託番号ATCC75926で入手可能)を 使用して実行した。pGRN34(5'-CAAACCCAA-3'を含む)、pGRN36(5'-CCAACCCCAA-3' を含む)、およびpGRN37(5'-CTCACCCTCA-3'を含む)と名付けられた、得られたプ ラスミドを、真核生物宿主細胞(SV40ラージＴ抗原を発現する293由来細胞株)中 に形質転換し、そしてテロメラーゼアッセイをこの形質転換体由来の細胞抽出物 を使用して行った。 このアッセイは、細胞におけるテロメラーゼ活性が、改変配列を含む核酸の形 成を生じたことを示し、このことは、ゲノムクローンが機能的なRNA成分遺伝子 を含むこと、およびプラスミドが改変されたが機能的なRNA成分遺伝子を含むこ とを示した。これらの結果は、本発明が、如何にして組換えテロメラーゼ調製物 およびこのような調製物を作成する方法を提供するかを例示する。本発明は、本 発明の組換えRNA成分と機能的に結合したヒトテロメラーゼのタンパク質成分を 含む組換えヒトテロメラーゼを提供する。本発明のこのような組換えRNA成分分 子は、天然に存在するRNA成分分子とは、１個またはそれ以上の塩基置換、欠失 、または挿入で異なるRNA成分分子、および組換え宿主細胞において作成される 、天然に存在するRNA成分分子と同一なRNA成分分子を包含する。このような組換 えテロメラーゼ分子を作成するための方法は、テロメラーゼのタンパク質成分を 発現する真核生物宿主細胞を、本発明のRNA成分分子をコードする組換え発現ベ クターで形質転換する工程、および上記ベクターで形質転換されたこの宿主細胞 を、タンパク質成分およびRNA成分が発現されそして組み立てられて、染色体DNA のテロメアに配列(天然のテロメラーゼによって付加される配列と同じ配列であ る必要はない)を付加し得る活性なテロメラーゼ分子を生成する条件下で培養す る工程を包含する。このような組換えDNA発現ベクター(または、プラスミド)の 他の有用な実施態様は、欠失、挿入、または遺伝子を非機能的にする他の改変を 有するヒトテロメラーゼのRNA成分の遺伝子を含むプラスミドを包含する。この ようなプラスミドは、内因性RNA成分遺伝子を「ノックアウト」するためのヒト遺 伝子治療に特に有用であるが、処置した細胞を不可逆的に致死的にするためには 、高度に効率的な形質転換および組換えシステムが要求される。 リボザイム実施態様 本発明の他のオリゴヌクレオチド(リボザイムと呼ばれる)もまた、テロメラー ゼ活性を阻害するために使用され得る。上記のアンチセンスおよび他のオリゴヌ クレオチド(これらは、RNA、DNA、またはテロメラーゼタンパク質成分と結合す る)とは異なり、リボザイムは、標的RNA(例えば、ヒトテロメラーゼRNA成分)に 結合するだけでなく、標的RNAを特異的に切断しそしてこのことよって標的RNAを 不活化する可能性がある。このようなリボザイムは、テロメラーゼRNAに相補的 な５'-および３'-末端配列を含み得る。切断部位に依存して、リボザイムは、テ ロメラーゼ酵素を不活化し得る。PCT特許公開第93/23572号、上記を参照。当業 者は、ヒトテロメラーゼRNA成分のRNA配列を考慮して、いくつかの有用なリボザ イム標的部位が存在し、そしてこれが、例えば、ハンマーヘッド状モチーフリボ ザイムによる切断を受けやすいことに気づく。このタイプの本発明の例示的なリ ボザイムは、下記のリボザイムを包含し、それらは、示される配列を有するRNA 分子である： テロメラーゼ活性のリボザイム仲介阻害のために他の最適な標的部位は、Sulliv anら、PCT特許公開第94/02595号およびDraperら、PCT特許公開第93/23569号(共 に、本明細書中で参考として援用される)によって記載されるように決定され得 る。Huら、PCT特許公開第94/03596号(本明細書中で参考として援用される)によ って記載されるように、アンチセンスおよびリボザイム機能は、一つのオリゴヌ クレオチドにおいて組み合わされ得る。さらに、リボザイムは、本発明の例示的 なアンチセンスオリゴヌクレオチドの記載ととともに上記のように、１またはそ れ以上の改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド間の改変結合を含み得る。１つの 局面では、RNase P(ヒトまたはE.coli)の触媒サブユニットは、テロメア反復配 列と塩基対合する哺乳動物テロメラーゼRNA成分の一部分に対応するガイド配列 を生成するように改変(Altman S（1995）Biotechnology 13: 327)される；この ようなRNase P変異体は、テロメア配列を切断し得る。１つの局面において、RNa se P(ヒトまたはE.coli)の触媒サブユニットはテロメラーゼRNA成分の一部分に 相補的であるガイド配列を生成するように改変され、その結果、RNase P変異体 がテロメラーゼRNA成分を切断し得る。このような操作されたリボザイムは、細 胞において発現させられ得るか、または種々の手段(例えば、リポソーム、イム ノリポソーム、バイオリスティック、細胞中への直接的取り込みなど)によって 移入され得る。他の形態のリボザイム(グループＩイントロンリボザイム(Cech T (1995)Biotechnology 13; 323)；ハンマーヘッドリボザイム(Edgington SM(1992 )Biotechnology 10: 256)は、開示したテロメラーゼ「RNA成分配列情報に基づい て操作されて、ヒトテロメラーゼRNA成分および/またはヒトテロメア反復配列の 切断を触媒し得る。 従って、本発明は、テロメラーゼ活性を阻害するための広範囲のオリゴヌクレ オチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、疾患を処置するために本 発明の治療方法のおいて使用され得る。この方法は、患者に、治療有効用量の、 本発明のテロメラーゼインヒビターまたはアクチベーターを投与する工程を包含 する。テロメラーゼ阻害または活性化を、共に係属中の上記米国特許出願および PCT特許公開第93/23572号に記載されるアッセイプロトコールを使用して測定し 、治療有効用量で送達されるべき薬剤の量を決定し得る。これらの出願に記載さ れるように、そして上記で議論したように、テロメラーゼ活性の阻害は不死細胞 を致死性にするが、一方テロメラーゼ活性の活性化は、細胞の複製寿命を増加さ せる。テロメラーゼ阻害治療は、不死細胞の未制御の増殖を含むガンに対する効 果的な処置であり、そしてテロメラーゼ活性化は、細胞老化を防ぐための効果的 な処置である。テロメラーゼ活性を阻害またはブロックする薬剤(例えば、アン チセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム 、またはテロメラーゼの変異RNA成分の発現を駆動するプラスミド)の送達は、テ ロメラーゼ作用を妨げ得、そして最終的に、処置した細胞の細胞老化および細胞 死を導く。 治療的および予防的局面 さらに、本発明は、正常細胞が確実に致死性を維持する治療方法を提供する； 例えば、RNA成分は、標準的な遺伝子操作手順を使用して改変されて、遺伝子組 換えによって(例えば、インビトロ変異誘発によって)、この成分をコードする全 てまたは一部の天然遺伝子を欠失し得る。次いで、このような細胞は、不可逆的 に致死性になる。この手順は、発現プラスミドを含むように改変された正常細胞 が患者に導入される遺伝子治療、およびガン細胞が確実に導入されないよう、あ るいはそのような細胞が導入されるとき、その細胞は不可逆的に致死性にされて いることが望まれる遺伝子治療において有用である。 テロメラーゼは腫瘍、生殖細胞系列、および造血系の特定の幹細胞においての み活性であるので、他の正常細胞は、テロメラーゼ阻害治療によって影響されな い。テロメラーゼインヒビターと生殖細胞系列または幹細胞との接触を避ける工 程もまた、採用しうるが、これは本質的でないかもしれない。例えば、生殖細胞 系列の細胞は、テロメラーゼ活性を発現するので、テロメラーゼの阻害は、精子 形成および精子生存能活性に負の影響を与え、このことは、テロメラーゼインヒ ビターが、効果的な避妊剤または不妊化剤であり得ることを示唆する。しかし、 この避妊効果は、ガンの処置のために本発明のテロメラーゼインヒビターを投与 される患者は望まないかもしれない。このような場合、本発明のテロメラーゼイ ンヒビターは、このインヒビターが治療期間の間だけ産生され、その結果、生殖 細胞系列の細胞に対するこの負の影響(negative impact)が単に一時的であるこ とを確実にする様式で送達され得る。 本発明の他の治療方法は、本発明のテロメラーゼRNA核酸を用いてテロメラー ゼ活性を刺激し、そして細胞の複製寿命を延長する。これらの方法は、本発明の 機能的な組換えテロメラーゼリボヌクレオタンパク質を細胞に送達することによ って、その細胞に対して実行され得る。例えば、リボヌクレオタンパク質は、細 胞に、リポソームで送達され得、またはヒトテロメラーゼのRNA成分の遺伝子(ま たは、異なる調節エレメントを有する組換え遺伝子)は、真核生物発現プラスミ ド(テロメラーゼのタンパク質成分の発現をコードする配列を有するかまたは有 しない)において使用されて、種々の正常ヒト細胞(そうでなければ、低いレベル の、テロメラーゼのRNA成分の発現またはタンパク質成分のために、検出可能な テロメラーゼ活性を欠く)においてテロメラーゼ活性を活性化し得る。テロメラ ーゼRNA成分が、テロメラーゼ活性を刺激するに十分でない場合、RNA成分は、テ ロメラーゼ活性を刺激するために、テロメラーゼのタンパク質成分を発現する遺 伝子とともにトランスフェクトされ得る。従って、本発明は、細胞を、治療有効 量の、その細胞におけるテロメラーゼ活性を変化させる薬剤と接触させることに よって、細胞内または細胞群内のテロメラーゼ活性に関連する状態を処置するた めの方法を提供する。 テロメラーゼRNA遺伝子の余分(extra)のコピーを取り込む細胞は、テロメラー ゼ活性増大および関連して複製寿命の延長を示し得る。このような治療は、引き 続く宿主への導入のために細胞に対してエクスビボて実施され得るか、またはイ ンビボで実施され得る。正常二倍体細胞に外因性テロメラーゼ遺伝子をエクスビ ボで付加することによって、テロメアの長さを安定化するかまたは増加させるこ との利点は、以下のことを包含する：テロメアの安定化は、細胞の老化を防ぎそ して、潜在的に細胞の無制限の増幅を可能にし得：そして延長された寿命を有す る正常二倍体細胞は、薬物試験、ウイルス製造、または他の有用な目的のために インビトロで培養され得る。さらに、エクスビボで増幅された種々のタイプの幹 細胞は、上記のような、特定の疾患のための細胞治療に使用され得る。 テロメアの安定化はまた、テロメアが、危機（crisis）に近づいた細胞のよう に臨界的に短くなるのを防ぐことによって、複製中の細胞におけるガンの発現率 を抑制し得る。危機の間、大規模なゲノム不安定性が生じる。なぜなら、テロメ アキャップ(telomeric cap)の保護的効果を失うからである。「遺伝的デッキ(gen etic deck)」は、再びシャッフルされ、そしてほとんど全ての細胞が死ぬ。この プロセスから脱する希な細胞は、代表的には、多くの遺伝子再配置を有する異数 体であり、そしてテロメラーゼを発現することによってテロメアにおける安定性 の再確立を終わりにする。危機が、テロメアを長く維持することによって予防さ れ得る場合、危機に関連するゲノム不安定性もまた予防され得、個々の細胞が、 必要な数の、転移性ガンを生じるに必要な遺伝的変異に遭う機会を制限する。 テロメラーゼ遺伝子治療(標的細胞のテロメラーゼ活性を増加させることを包 含する治療)について標的づけられ得る細胞は、造血幹細胞(AIDSおよび化学治療 後)、血管内皮細胞(心臓および脳血管疾患)、皮膚線維芽細胞および基底皮膚ケ ラチノサイト(創傷治癒および火傷)、軟骨細胞(関節炎)、脳星状細胞および小グ リア細胞(アルツハイマー病)、骨細胞(骨粗鬆症)、網膜細胞(眼疾患)、および膵 島細胞(Ｉ型糖尿病)を包含するが、これらに限定されない。 代表的には、本発明の治療方法は、インビボの生理学的条件下でテロメラーゼ 活性を阻害または刺激するために機能し、そしてそのような条件下で安定である オリゴヌクレオチドの投与を包含する。上記のように、改変核酸は、このような 安定性を与えることにおいて、および所望の組織、器官、または細胞へのオリゴ ヌクレオチドの送達を確実にするために有用であり得る。治療目的のオリゴヌク レオチドの送達に有用な方法は、Inouyeら(米国特許第5,272,065号、本明細書中 で参考として援用される)に記載される。、 オリゴヌクレオチドは、適切な薬学的処方物における薬物として、直接送達さ れ得るが、また、遺伝子治療および本発明の組換えDNA発現プラスミドを使用し てもオリゴヌクレオチドを送達し得る。１つのこのような例示的なプラスミドは 、下記の実施例８に記載される。一般に、このようなプラスミドは、プロモータ ー、および必要に応じて、オリゴヌクレオチドの転写を駆動するために働くエン ハンサー(プロモーター配列内に含まれるものとは別に)、ならびに、所望であれ ば、エピソーム維持または染色体統合および高レベルの転写を提供する他の調節 エレメントを含む。アデノウイルスベースのベクターが、しばしば、遺伝子治療 のために使用され、そして本発明の試薬および方法と組み合わせての使用に適切 である。PCT特許公開第94/12650号；第94/12649号；および第94/12629号を参照 。このような目的に有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構 成性アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモー ター、SV40プロモーター、MRP polIIIプロモーター、構成性MPSVプロモーター、 テトラサイクリン誘導性CMVプロモーター(例えば、ヒトCMV即時プロモーター)、 および構成性CMVプロモーターを包含する。遺伝子治療に有用なプラスミドは、 他の機能エレメント(例えば、選択マーカー)、同定領域、および他の遺伝子を含 み得る。組換えDNA発現プラスミドはまた、遺伝子治療以外の手段による送達の ための本発明のオリゴヌクレオチドを調製するために使用され得るが、インビト ロでの化学合成によって短いオリゴヌクレオチドを作成することはより経済的で あり得る。 関連する局面において、本発明は、治療有効量の、本発明のテロメラーゼイン ヒビターまたはテロメラーゼアクチベーターを含む薬学的組成物を特徴とする。 本発明のテロメラーゼインヒビターの薬学的組成物は、ヒトテロメラーゼの変異 RNA成分、ヒトテロメラーゼのRNA成分またはこれの遺伝子に結合するアンチセン スオリゴヌクレオチドまたは三重らせん形成オリゴヌクレオチド、あるいはヒト テロメラーゼのRNA成分を切断し得るリボザイム、もしくはこれらまたは薬学的 に受容可能なキャリアまたは塩中の他の薬物の組み合わせを含む。本発明の他の 薬学的組成物は、テロメラーゼアクチベーター調製物(例えば、精製ヒトテロメ ラーゼまたはテロメラーゼのタンパク質成分およびテロメラーゼのRNA成分のた めのmRNA)を含み、そして老化に関連する疾患を処置するために使用される。あ る局面において、変異センス哺乳動物テロメラーゼRNA成分は、細胞集団に投与 される；この変異センステロメラーゼRNA成分は、ヒトテロメラーゼ反復配列に 関して、少なくとも１つの塩基不適合を含が、しかし、ヒトテロメラーゼポリペ プチド成分とともにテロメラーゼ活性を示し、ヒトテロメラーゼ反復における選 択されたヌクレオチド位置に取り込みミス(misincorporation)を生じ、このこと によって、実質的な複製のために変異センステロメラーゼRNA成分の連続する存 在を頼るテロメアを生じ得る。変異センステロメラーゼRNA成分が、十分な期間 、細胞集団に投与されて、天然に存在する哺乳動物テロメラーゼRNA成分のテン プレートとして実質的に機能しないテロメア配列が導入され、続いて、変異セン ステロメラーゼRNA成分の退薬が細胞集団の平均テロメア長の迅速な喪失および 増強した老化または細胞死亡率を生じる治療方法が提供される。。 治療薬剤は、非経口、経鼻、経口、または他の投与様式に適切な処方物におい て提供され得る。PCT特許公開第93/23572号、上記を参照。 診断方法 本発明は、上記の薬学的処方物および治療方法に加えて、診断方法および試薬 を提供する。本発明は、細胞、細胞集団、または組織サンプル中のヒトテロメラ ーゼのRNA成分、テロメラーゼ、またはテロメラーゼ活性のレベル、量、または 存在を測定するための診断方法を提供する。関連の局面において、本発明は、こ のような方法のための有用な試薬を提供する。試薬は、必要に応じて、キット形 態で、この診断方法を実施するためにキットを用いるための指示書とともにパッ ケージされる。クローンpGRN7がヒトテロメラーゼのRNA成分に対するcDNAを含有 することを決定するために実施された試験と関連して上述したように、このRNA 成分のレベルは、腫瘍細胞において高レベルである。従って、このRNA成分の検 出は、腫瘍細胞にとって有用な診断である。 さらに、ヒトテロメラーゼのRNA成分（またはヒトテロメラーゼに関する遺伝 子の各鎖）に特異的に結合するプローブまたはプライマーは、サンプル中のテロ メラーゼ核酸の存在を検出する診断方法において用いられ得る。プライマーおよ びプローブは、標的核酸に相補的であり、そして結合するオリゴヌクレオチドで ある。プライマーおよびプローブは、配列および長さにおいて相違し得るが、主 に異なる要素は機能の相違である：プライマーは、DNA合成を開始させるものと して作用する（例えば、PCR増幅において）が、プローブは、典型的には、標的 核酸に結合させるためのみに用いられる。プライマーまたはプローブの典型的な 長さは、８〜20、そしてそこから30またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。 プライマーまたはプローブはまた標識され得、検出（すなわち、放射性分子また は蛍光分子が、典型的に、この目的のために用いられる）または精製／分離（す なわち、ビオチンまたはアビジンが、しばしばこの目的のために用いられる）を 容易にする。 本発明の特に好ましい診断方法は、ガンのおそれがあるとの疑いのある患者か ら採取した細胞または組織サンプルにおけるテロメラーゼRNA成分配列を検出す ることを含む。このような方法は、典型的に、標識プローブまたはプライマーを 、完全に適合した（相補的な）配列のみが互いに結合（ハイブリダイズ）するよ うな条件下でRNA成分配列に結合することを含む。サンプルにおけるRNAに結合し た標識物質の検出は、テロメラーゼ活性の存在およびガン細胞の存在と相関する 。いくつかの細胞は、テロメラーゼのRNA成分を発現するが、テロメラーゼのタ ンパク質成分の発現がないためにテロメラーゼネガティブを維持し得る。このよ うな細胞においてテロメラーゼ活性の存在を検出することが所望される場合、ま ずタンパク質を単離し、次いでタンパク質画分がテロメラーゼRNA成分を含有す るか否かを決定し得る。これによりテロメラーゼ活性の存在の指標となる。本発 明の診断方法は、組織バイオプシーおよび組織学的切片において、テロメラーゼ 活性の存在を検出することに特に有用であり得、ここでこの方法はインサイチュ で実施され、典型的には、それに先だって本発明の特異的PCRプライマーを用い てテロメラーゼRNA成分が増幅される。 本発明はまた、患者から体外移植した細胞におけるテロメラーゼRNA成分の検 出またはテロメラーゼRNA成分遺伝子の再配置または増幅、または疾病特徴的な テロメラーゼRNA成分対立遺伝子の検出（例えば、RFLPまたは対立遺伝子特異的P CR分析による）による、疾患状態（例えば、新生物形成または新生物発生前）の 診断のためのテロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドプローブを提供する。典型 的には、検出は、標識（例えば、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、3Ｈ、蛍光、ビオチン化、 ジコキシゲニン化）テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドを用いるインサイチ ュハイブリダイゼーションによる。しかし、細胞サンプルから単離されたバルク RNAまたはポリＡ+RNAにおけるノーザンブロッティング、ドットブロッティング 、または溶液ハイブリダイゼーションもまた用いられ得る。同様に、テロメラー ゼRNA成分特異的プライマーを用いるPCR増幅も用いられ得る。同じ細胞型の非新 生細胞に比較して変化した量のテロメラーゼRNA成分を含有する細胞が、候補疾 患細胞として同定される。同様に、細胞サンプルにおけるテロメラーゼRNA成分 遺伝子座または近くに連結した遺伝子座の疾病特徴的な再配置または増幅の検出 が、病理状態または病理状態を発現する傾向の存在を同定する（例えば、ガン、 遺伝子疾患）。ポリヌクレオチドプローブはまた、個体の法医学的同定（例えば 、父親判定試験、または犯罪容疑者または身元不明の死者の同定）のために用い られる。 ヒト集団内で、テロメラーゼRNA成分の主要一次配列においてわずかな変化が 見られ得、これらは、対立遺伝子変異体、制限部位多型、および遺伝子疾患に関 連した先天的なテロメラーゼRNA成分疾患対立変異体を含む。 所望であれば、実質的に全長のテロメラーゼRNA成分コピーを増幅するためのP CRアンプリマーが、実施者の判断で選択され得る。同様に、テロメラーゼRNA成 分遺伝子またはRNAの、部分を増幅するアンプリマーが選択され得る。 テロメラーゼRNA成分発現 プライマー、プローブ、またはヒトテロメラーゼのRNA成分由来の配列を含む 他の核酸の、長さおよび意図された機能に依存して、本発明の発現プラスミドは 有用であり得る。例えば、本発明の全長RNA成分の組換え生産は、本発明の組換 えDNA発現プラスミドを用いて実施され得る。本発明の発現プラスミドは、適切 なプロモーターの制御下で転写のために配置されたRNA成分のヌクレオチド配列 を含む核酸を含む。このようなプラスミドのための宿主細胞は、原核性または真 核性のいずれかであり得、そしてプロモーター、ならびに発現プラスミドへの取 り込みのために選択される他の調節エレメントおよび選択マーカーは、生産のた めに用いられる宿主細胞に依存する。 インタクトな（intact）完全RNA成分遺伝子（すなわち、プロモーター（これ は、遺伝子の5'領域における任意の調節配列を含む）およびRNA成分コード領域 ）は、ヒト細胞においてRNA成分を発現させるために用いられ得る。このヒト細 胞には、ウイルス形質転換またはガンにより不死化されたヒト細胞が含まれる。 RNA成分遺伝子のプロモーターは調節され得るが、この理由および他の理由から 、異なるプロモーターの制御下でRNA成分を発現させることを所望し得る。他方 で、RNA成分遺伝子のプロモーターは、目的とする他のコード配列を発現させる ために、RNA成分コード配列とは独立して用いられ得る。例えば、レポーターコ ード配列に関するコード配列にRNA成分遺伝子のプロモーターを融合することに より、RNA成分遺伝子の転写調節を研究し得る。このようなコード配列としては 、例えば、βガラクトシダーゼ、またはその発現が容易にモニターされ得る別の 酵素またはタンパク質に関するコード配列が挙げられる。従って、ヒトテロメラ ーゼのRNA成分に関する遺伝子のプロモーターおよび他の調節エレメントは、こ のRNA成分を発現させるためだけでなく、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分、 アンチセンスまたは他のオリゴヌクレオチド、ならびにヒト細胞における目的と する他の遺伝子産物を発現させるためにも用いられ得る。ヒトテロメラーゼのRN A成分に関するインタクトな遺伝子を含む発現プラスミドが特に、種々の目的の ために有用であり得る。この目的には、遺伝子療法が含まれる。当業者は、広範 な発現プラスミドが本発明の有用な核酸を生産するために用いられ得ること、お よび本明細書で用いられる用語「プラスミド」が、宿主細胞に特定の遺伝情報を 移送し、かつある期間にわたってその情報を維持させるために用いられ得る、任 意のタイプの核酸（ファージ、ウイルス、染色体などに由来するもの）を指すこ とを認識する。 テロメラーゼタンパク質成分の単離 本発明の試薬はまた、まだ入手可能でないヒトおよび他の哺乳動物テロメラー ゼ酵素のタンパク質成分をコードする核酸のクローン化および単離を可能にする 。このような核酸へのアクセスは、ヒトテロメラーゼのRNA成分の核酸配列を含 む核酸により提供される利点に対し、これを補う利点を提供する。例えば、そし て上述されたように、本発明の治療上の利点は、ある場合において、ヒトテロメ ラーゼのタンパク質成分の精製調製物の使用およびこれをコードする核酸へのア クセスにより増強される。ヒトテロメラーゼのRNA成分をコードする本発明の核 酸は、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分をコードする核酸を単離するために用 いられ得、このような利点に近づくことができる。従って、本発明は、ヒトテロ メラーゼのタンパク質成分を単離し精製するための方法、ならびにヒトテロメラ ーゼのタンパク質成分をコードする核酸を同定し単離するための方法を提供する 。関連の局面では、本発明は、精製ヒトテロメラーゼ、ヒトテロメラーゼのタン パク質成分をコードする精製核酸、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分のための 組換え発現プラスミドを提供する。本発明はまた、活性成分として、ヒトテロメ ラーゼのタンパク質成分、またはこれらのタンパク質成分をコードするかまたは これらのタンパク質成分をコードする核酸と相互作用する核酸のいずれかを含む 薬学的組成物を提供する。このような核酸の例としては、アンチセンスオリゴヌ クレオチド、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、または上記 のいずれかのための組換えDNA発現プラスミドが挙げられる。 ヒトテロメラーゼのクローン化RNA成分は、リボ核タンパク質テロメラーゼ酵 素のタンパク質成分をコードする核酸を同定しクローン化するために用いられ得 る。いくつかの異なる方法が、タンパク質成分の同定およびクローン化を達成す るために用いられ得る。例えば、アフィニティーリガンドとして（１）インタク トな酵素のRNA成分に結合する、RNA成分に相補的なヌクレオチド配列；または（ ２）部分的にまたは完全に変性した酵素のタンパク質成分に結合するRNA成分の いずれかを用いる、酵素または部分変性した酵素のアフィニティー捕捉を用い得 る。リガンドは、固体支持体に付着され得、またはその支持体に後で固定化する ために化学修飾（例えば、ビオチン化）され得る。ヒトテロメラーゼを含む細 胞抽出液を曝露し、次いで洗浄し、支持体に結合したテロメラーゼ酵素の溶出を 行うことにより、高度に精製されたテロメラーゼ酵素調製物が提供される。次い で、タンパク質成分は、必要に応じてさらに精製されるか、または直接、タンパ ク質配列決定により分析され得る。決定されたタンパク質配列は、cDNAをクロー ン化し、またはテロメラーゼのタンパク質成分をコードする核酸を含むゲノムバ ンクにおいてクローンを同定するための、プライマーおよびプローブを調製する ために用いられ得る。 設計されたRNA成分を用いるテロメラーゼのアフィニティー捕捉はまた、イン ビトロで転写されたテロメラーゼRNA、およびテロメラーゼ酵素活性の再構築の ための系を用いて実施され得る。AutexierおよびGreider，1994，Genes & Devel opment 8:563-575（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。RNAは 、タンパク質のエピトープ標識と同様に、標識(tag)を含むように設計される。 標識は、それに堅く結合するリガンドが利用可能なRNA配列であり得る。このよ うなリガンドとしては、例えば、RNA配列特異的抗体、配列特異的核酸結合タン パク質、または特定のRNA配列に堅く結合する有機染料が挙げられる。標識配列 および位置に関するテロメラーゼの耐性は、標準的な方法を用いて試験され得る 。変化させたRNA成分の合成およびこの方法の再構築工程はまた、インビボにお いても実施され得る。次いで、RNA標識に対する固定化リガンドを用いるアフィ ニティー捕捉が、酵素を単離するために用いられ得る。 発現スクリーニングもまた、テロメラーゼ酵素のタンパク質成分を単離するた めに用いられ得る。この方法において、cDNA発現ライブラリーは、標識テロメラ ーゼRNAを用いてスクリーニングされ得、そしてテロメラーゼRNAに特異的に結合 するタンパク質をコードするcDNAが同定され得る。翻訳阻害を用いる分子遺伝学 アプローチもまた、テロメラーゼ酵素のタンパク質成分をコードする核酸を単離 するために用いられ得る。この方法において、テロメラーゼRNA配列は、選択マ ーカーの上流に融合される。適切な系において発現される場合、選択マーカーは 機能性である。テロメラーゼRNA結合タンパク質をコードするcDNAが発現される 場合、タンパク質は、その認識配列に結合し、それにより選択マーカーの翻訳を ブロックし、従ってタンパク質をコードするクローンの同定が可能にな る。この方法の他の実施態様では、選択マーカーの翻訳ブロックにより、形質転 換細胞の増殖が可能になる。用いられ得る他の系には、PCT公開公報第WO94/1030 0号に記載の「相互作用トラップ系」；LiおよびHerskowitz、1993年12月17日、S cience 262:1870-1874、およびZervosら、1993年１月29日、Cell 72:223-232に 記載の「１ハイブリッド」系；およびClontechから市販により入手可能な「２ハ イブリッド」系が含まれる。 特異的結合タンパク質および活性の検出のためのテロメラーゼRNA結合または テロメラーゼ活性アッセイは、テロメラーゼ酵素の精製、および酵素のタンパク 質成分をコードする核酸の同定を容易にするために用いられ得る。例えば、RNA 成分配列を含む核酸は、RNA成分内に含まれる配列に特異的に結合するペプチド 、タンパク質、または他の化合物（例えば、ヒトテロメラーゼのタンパク質成分 ）を単離、同定、および精製するためのアフィニティー試薬として用いられ得る 。いくつかの異なるフォーマットが、このような結合を検出し、そしてRNA成分 に特異的に結合する成分を単離するために利用可能である。これらのフォーマッ トには、ゲルシフト、フィルター結合、フットプリンティング、ノースウェスタ ン（タンパク質ブロットのRNAプローブ）、および光架橋が含まれる。これらの アッセイは、結合タンパク質を同定するため、結合タンパク質の精製を追跡する ため、RNA結合部位を特徴付けするため、結合タンパク質の分子サイズを決定す るため、分取単離のためにタンパク質を標識するため、および（抗体生成のため の引き続き行う動物免疫に関して）タンパク質を単離するかまたは組合せ転写／ 翻訳系においてそのタンパク質をコードする核酸を同定する際に用いられる抗体 を得るために、用いられ得る。 哺乳動物テロメラーゼタンパク質成分の精製 哺乳動物テロメラーゼタンパク質成分は、従来の生化学的方法により、テロメ ラーゼ発現細胞から精製され得る。このテロメラーゼ発現細胞の例としては、HT 1080細胞、293細胞、および他の適切な不死化細胞株が挙げられる。例えば、し かもこれに限定されないが、ヒトテロメラーゼは、米国特許出願第08/288,501号 （1994年８月10日出願、これは本明細書中に参考として援用され る）に開示された方法に実質的に従って、細胞抽出液から精製され得る。哺乳動 物テロメラーゼ抽出液からは、RNAse活性または他の適切な手段での処理により 、テロメラーゼRNA成分が除去され得る。これによりテロメラーゼRNA成分は解離 および／または分解されるが、テロメラーゼタンパク質成分を実質的にインタク トで、かつ（組換えなどにより産生され得る）外因性テロメラーゼRNA成分の付 加により再構築可能な状態にとどめる。このようにして精製され、そして必要に 応じて内因性テロメラーゼRNA成分が除去されたテロメラーゼタンパク質成分は 、本明細書中に記載の薬剤スクリーニングアッセイにおいて、および他の用途の ために用いられ得る。 遺伝子療法 外因性遺伝物質の細胞への導入（すなわち、DNA仲介トランスフェクション） は、細胞生物学および分子遺伝学における基礎研究のための必須方法であり、そ してヒト遺伝子療法のための有効な方法の開発のための基礎となる。これまで米 国において承認されてきた遺伝子導入の試みの大部分は、レトロウイルスゲノム の一部として治療用ポリヌクレオチド配列を有する複製欠損レトロウイルスベク ターに依存する（Millerら，（1990）Mol ．Cell．Biol. 10:4239；Kolberg R(19 92)J ．NIH Res. 4:43；Cornettaら（1991）Hum ．Gene Ther. 2:215）。アデノウ イルスベクターもまた、ヒト遺伝子療法における使用可能性が記載されている（ Rosenfeldら，（1992）Cell 68:143）。 ヒトにおける使用について承認されている他の遺伝子導入法は、リポソーム中 のプラスミドDNAを直接インサイチュで腫瘍細胞に物理的に導入することである 。培養細胞において増殖されなければならないウイルスベクターとは異なり、プ ラスミドDNAは、均質に精製され得、従って病原性混入の可能性が減少される。 いくつかの状況（例えば、腫瘍細胞）では、外因性DNAが形質導入細胞中に安定 に組み込まれることは必要ではない。なぜなら、一過性の発現が、腫瘍細胞を殺 傷するために十分であり得るからである。リポソーム仲介DNA導入は、種々の研 究者により記載されている（WangおよびHuang（1987）Biochem ．Biophys．Res.C ommun. 147:980；WangおよびHuang（1989）Biochemistry 28:9508；Litzinger およびHuang（1992）Biochem ．Biophys．Acta 1113:201；GaoおよびHuang(1991)Biochem ．Biophys．Res．Commun. 179:280；Felgner WO91/17424；WO91/16024） 。 免疫リポソームもまた、外因性ポリヌクレオチドのキャリアとして記載されて いる（WangおよびHuang（1987）Proc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 84:7851；Tr ubetskoyら，（1992）Biochem ．Biophys．Acta 1131:311）。免疫リポソームは 、おそらく特定の細胞型上の表面抗原に結合する特異的抗体を含有することによ って、リポソームに比較して改良された細胞型特異性を有することが仮定として 予期され得る。Behrら，（1989）Proc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 86:6982は 、リポソームを形成させるための付加的なリン脂質を必要とせずに、リポポリア ミンをそれ自身トランスフェクションを仲介する試薬として用いることを報告し ている。 従って、テロメラーゼRNA成分配列またはその相補体と少なくとも25ヌクレオ チド、好ましくは50〜100ヌクレオチドまたはそれ以上が実質的に同一であるポ リヌクレオチドが、異種プロモーターに作動可能に連結され、ヒト細胞において テロメラーゼRNΛ成分またはアンチセンステロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチ ドを発現させ得る転写単位を形成する。このような転写単位は、ヒト細胞に送達 するためのトランスジーン、アデノウイルスベクター、または他の遺伝子治療様 式において、例えば、テロメラーゼ関連疾患（例えば、新生物形成）の治療用に 、含まれ得る。テロメラーゼRNA成分センスまたはアンチセンス発現構築物の適 切な送達方法は、許容され得る実施行為および法律に規定される要件を考慮して 、実施者により選択される。 トランスジェニック動物実施態様 哺乳動物テロメラーゼRNA成分のゲノムクローン、特にマウステロメラーゼRNA 成分と実質的に同一であるテロメラーゼRNA成分遺伝子のゲノムクローンは、少 なくとも１つの機能破壊テロメラーゼRNA成分対立遺伝子を含有する細胞および トランスジェニック非ヒト動物を生成するための、相同標的構築物を構築するた めに用いられ得る。相同標的構築物の構築のための指針は、以下を含む技術文 献中に見出し得る：Rahemtullaら、（1991）Nature 353:180；Jasinら、（1990 ）Genes Devel. 4:157；Kohら、（1992）Science 256:1210；Molinaら、（1992 ）Nature 357:161；Grusbyら、（1991）Science 253:1417；Bradleyら、（1992 ）Bio/Technology 10:534（これらは、本明細書中に参考として援用される）。 相同標的は、いわゆる「ノックアウト」マウスを作出するために用いられ得る。 このノックアウトマウスは、不活性化されたテロメラーゼRNA成分対立遺伝子に 関して異型接合性または同型接合性である。このようなマウスは、免疫系の発達 、新生物形成、精子形成の研究のための実験用動物として市販され得、ペットと して用いられ得、動物タンパク質（食糧）および他の用途に関して用いられ得る 。 キメラ標的マウスは、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo: ALaborator y Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory（1988）およびTeratocarcinomas an d Embryonic Stem Cells: A Practical Approach ，E.J.Robertson編、IRL Press ，Washington，D.C.，(1987)（これらは本明細書中に参考として援用される）に 従って入手される。胚幹細胞は、公開された手順に従って操作される（Teratoca rcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach ，E.J．Robertson 編、IRL Press，Washington，D.C.，（1987）；Zjilstraら、（1989）Nature 34 2 :435；およびSchwartzbergら、（1989）Science 246:799、これらはそれぞれ本 明細書中に参考として援用される）。 さらに、テロメラーゼRNA成分cDNAまたはゲノム遺伝子コピーは、高レベルで 、かつ／またはテロメラーゼRNA成分遺伝子に天然では近接して存在しない転写 制御配列の転写制御下で、テロメラーゼRNA成分を発現させるためのトランスジ ーンを構築するために用いられ得る。例えば、しかもこれに限定されないが、構 成性プロモーター（例えば、HSV-tkまたはpgkプロモーター）または細胞系統特 異的転写調節配列（例えば、CD4またはCD8遺伝子プロモーター／エンハンサー） は、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、トラン スジーンを形成させ得る（典型的には、neo遺伝子発現カセットのような選択マ ーカーと組み合わせられる）。このようなトランスジーンは細胞（例えば、ES細 胞、造血幹細胞）に導入され得、そしてトランスジェニック細胞およびトランス ジェニック非ヒト動物が従来の方法に従って入手され得る。トランスジェ ニック細胞および／またはトランスジェニック非ヒト動物は、抗新生物剤につい てのスクリーニングおよび／または潜在的な発ガン性物質についてのスクリーニ ングのために用いられ得る。テロメラーゼRNA成分の過剰発現またはテロメラー ゼRNA成分の不適切な発現は、新生物発生前または新生物形成の状態を生じ得る からである。 薬剤スクリーニングアッセイ テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド、テロメラーゼタンパク質成分調製物 、テロメラーゼ反復鋳型、および結合反応物などは、実施例を参照することによ って実施される。一般的には、テロメラーゼタンパク質成分は、従来の精製によ り、テロメラーゼ発現哺乳動物細胞から得られ、そして本明細書中に記載のアッ セイにおいて使用される前に、付随するRNA成分が除去される。特定の水性条件 が、従来の方法に従って、実施者により選択され得る。一般的指針としては、以 下の緩衝水性条件が用いられ得る：10〜250mM NaCl、５〜50mM Tris HCl、pH５ 〜８であり、必要に応じて二価陽イオンおよび／または金属キレート化剤および ／または非イオン性界面活性剤および／または膜画分を添加する。添加、削除、 改変（例えば、pH）、および置換（例えば、NaClの代わりにKClを用いること、 または緩衝液の置換）が、これらの基本条件に対して行われ得ることは、当業者 により理解される。改変は、特定のテロメラーゼホロ酵素形成および／またはテ ロメラーゼ活性がコントロール反応下で生じる限り、基本結合反応条件に対して 行われ得る。コントロール反応（薬剤を含まない）において特異的結合および開 裂を生じさせない条件は、結合アッセイにおける使用に適切ではない。 好ましくは、テロメラーゼRNA成分の固定化テロメラーゼタンパク質成分への 結合を決定するために、テロメラーゼRNA成分種は、検出マーカー（典型的には 、ビオチニル基、蛍光部分、または放射性標識取り込みヌクレオチド）で標識さ れる。テロメラーゼタンパク質成分のための適切な標識化には、放射性標識アミ ノ酸（例えば、14Ｃ-標識ロイシン、3Ｈ−標識グリシン、35Ｓ-標識メチオニン ）の取り込みによる放射性標識化、125Ｉまたは131Ｉ（例えば、Bolton-Hunter 反応およびクロラミンＴ）での翻訳後放射性ヨウ素化による放射性標識化、32 Ｐ（例えば、ホスホリラーゼおよび無機放射性標識リン酸）での翻訳後リン酸化 による標識化、蛍光標識（例えば、フルオレセインまたはローダミン）の取り込 みによる蛍光標識化、または当該分野で知られる他の従来方法による標識化が含 まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド種の１つが基材への結合により 固定化される実施態様では、一般に、他の成分が検出マーカーで標識される。 標識テロメラーゼRNAまたはタンパク質成分は、固定化テロメラーゼタンパク 質またはRNA成分とそれぞれ接触され、そして、固定化されるようになる（すな わち同一起源の(cognate)テロメラーゼ成分に結合し、捕獲される）標識成分の 量を変化させる薬剤の能力が決定される。結合反応のインキュベーションの時間 および温度は、選択された条件が、薬剤が存在しないコントロール反応において 特異的結合を生じさせる限り、変化され得る。好ましい実施態様は、少なくとも 約15℃、より好ましくは35〜42℃の反応温度、および少なくとも約15秒のインキ ュベーションの時間を用いる。しかし、一つの実施態様においては、結合平衡が 達成されるために、より長いインキュベーション期間が好ましいとされることも ある。結合複合体の結合速度論および熱力学安定性が、時間、温度、塩、pH、お よび他の反応条件の変化に利用可能な範囲を決定する。しかし、いかなる特定の 実施態様においても、所望の結合反応条件は、当該分野の従来の方法を用いて実 施者により容易に検量され得る。この従来方法には、スキャッチャード分析、ヒ ル分析、および他の方法を用いる結合分析が含まれ得る（Protein,Structures a nd Molecular Principles ，（1984）Creighton（編）、W.H.Freeman and Compan y，New York）。 標識テロメラーゼタンパク質成分の固定化テロメラーゼRNA成分への特異的結 合は、それぞれ非標識競合タンパク質（例えば、アルブミン）および／または非 標識RNAを含むことにより決定される。結合反応が完了した後、固定化種に特異 的に結合した標識種の量が検出される。例えば、しかもこれに限定されないが、 結合のために適切なインキュベーション期間後に、非固定化標識テロメラーゼタ ンパク質成分を含有する水相が除去され、そして固定化結合テロメラーゼホロ酵 素種およびこれに結合した任意の標識テロメラーゼタンパク質成分を含有する基 材が適切な緩衝液（必要に応じて非標識ブロッキング剤を含有する）で洗浄され 、 そしてこの洗浄緩衝液が除去される。洗浄後、固定化標識成分に特異的に結合し た状態にある検出可能な標識の量が決定される（例えば、光学的方法、酵素的方 法、オートラジオグラフ法、または他の放射化学法による）。 いくつかの実施態様においては、非特異的結合を阻害する非標識ブロッキング 剤の添加が含まれる。このようなブロッキング剤の例は、以下を包含するがこれ らに限定されない：ウシ胸腺DNA、サケ精子DNA、酵母RNA、混合配列（ランダム または擬ランダム配列）、種々の長さのオリゴヌクレオチド、ウシ血清アルブミ ン、非イオン性界面活性剤（NP-40、Tween、Triton X-100など）、脱脂粉乳タン パク質、デンハルト試薬、ポリビニルピロリドン、Ficoll、および他のブロッキ ング剤。実施者は、自身の判断において、結合アッセイにおいて含まれるべき、 適切な濃度でのブロッキング剤を選択し得る。 テロメラーゼRNA成分またはテロメラーゼタンパク質成分が固定化される実施 態様において、基材に対する共有結合または非共有結合が用いられ得る。共有結 合化学には、当該分野で公知の十分に特徴づけられた方法が含まれるが、これら に限定されない（KadonagaおよびTijan（1986）Proc ．Natl．Acad．Sci.(U.S.A. ) 83:5889）。一例は、これに限定されないが、臭化シアンを用いて誘導化され た基材（例えば、CNBr誘導化Sepharose 4B）への共有結合である。スペーサーを 用いて、基材からの潜在的な立体障害を減少させることが所望され得る。タンパ ク質の基材への非共有結合には、タンパク質の荷電表面への結合および特異的抗 体との結合が含まれるが、これらに限定されない。 １つの実施態様では、候補治療剤は、テロメラーゼタンパク質成分のテロメラ ーゼRNA成分への結合をブロックする能力により同定される。 典型的には、これらの方法において用いられるテロメラーゼRNA成分は、天然 に生じる哺乳動物テロメラーゼRNA成分配列（例えば、ヒトRNA成分）を含む。し かし、変異体テロメラーゼRNA成分配列もまた、この変異体テロメラーゼRNA成分 がコントロールアッセイ条件（例えば、生理的条件）下でテロメラーゼタンパク 質成分に結合する場合に、時折用いられる。 １つの実施態様では、候補テロメラーゼ調節剤は、代謝的に活性な哺乳動物細 胞において、哺乳動物テロメラーゼRNA成分遺伝子（好ましくはヒトテロメラー ゼRNA成分遺伝子）の転写調節配列に作動可能に連結されたレポーターポリヌク レオチド配列（例えば、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、H PRT遺伝子）の転写における統計学的に有意な減少または増加を生じる能力によ り同定される。レポーター遺伝子（例えば、HPRT）は、相同標的構築物またはト ランスジーンを生成するように、哺乳動物テロメラーゼRNA成分の二本鎖cDNAの 制限部位または平滑末端部位に挿入され得る。この相同標的構築物またはトラン スジーンでは、生存哺乳動物細胞において、レポーター遺伝子が、内因性テロメ ラーゼRNA成分遺伝子プロモーターおよび関連転写制御エレメントの転写制御下 に配置される。レポーター遺伝子の用量依存性転写調節を生じる薬剤は、そのこ とにより、候補テロメラーゼ調節剤として同定される。 １つの変型では、哺乳動物細胞における内因性テロメラーゼRNA成分遺伝子は 、相同標的構築物で標的されて、内因性遺伝子の染色体座において内因性テロメ ラーゼRNA成分遺伝子の上流転写調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能 に連結してレポーターポリヌクレオチド配列を配置する。別の変型では、レポー ターポリヌクレオチドを含む外因性ポリヌクレオチドは、哺乳動物テロメラーゼ RNA成分遺伝子転写調節領域（例えば、プロモーターおよび上流転写因子結合部 位）に作動可能に連結される。この外因性ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞に 導入され、ここで、染色体位置に非相同に組み込まれ得、かつ／またはエピソー ムポリヌクレオチドとして維持または複製される。その薬剤で処理された細胞に おいてレポーターポリヌクレオチドの統計学的に有意な転写調節を生じる薬剤は 、そのことにより、候補哺乳動物テロメラーゼ調節剤として同定される。 テロメラーゼ損傷を修復する細胞の能力を減少させるかまたはテロメラーゼ複 製を阻害する（例えば、内因性の天然に生じるテロメラーゼを競合阻害すること による）テロメラーゼ調節剤は、候補抗新生物剤または感作剤である。この感作 剤は、細胞（例えば、新生細胞）をテロメラーゼ損傷剤（例えばアルキル化剤お よび電離放射線）に感作する。 候補抗新生物剤は、次いで、ヒト抗新生物形成薬として用いるための適応性を 推定するために慣用的に用いられるアッセイにおいて、抗新生物形成活性につい てさらに試験される。これらのアッセイの例は、以下を包含するが、これらに限 定されない：（１）候補薬剤が、足場非依存性形質転換細胞が軟寒天において増 殖する能力を阻害する能力、（２）nu/nuマウスに移植された形質転換細胞の腫 瘍発生性を低下させる能力、（３）形質転換細胞の形態学的形質転換を逆転させ る能力、（４）nu/nuマウスにおいて移植された腫瘍の増殖を低下させる能力、 （５）自発性または化学誘導性の発ガンの動物モデルにおいて腫瘍または新生物 発生前細胞の形成を阻害する能力、および（６）薬剤が適用される形質転換細胞 においてより分化された表現型を誘導する能力。 薬剤がテロメラーゼタンパク質成分：テロメラーゼRNA成分結合および／また はテロメラーゼの酵素活性を阻害または増加させる能力を検出するためのアッセ イは、テロメラーゼアンタゴニストまたはアゴニストを同定するための、薬剤バ ンク（例えば、化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなど）の簡便な高処 理能スクリーニングを提供する。このようなアンタゴニストおよびアゴニストは 、テロメラーゼ活性を調整し得、そしてそれによりテロメラーゼ修復反応性およ び複製能を調整し得る。 テロメラーゼ活性を特異的に阻害し得る有効用量の薬剤を患者に投与すること は、テロメラーゼ活性およびDNA修復および複製を調整することにより有効に処 置される病理状態（例えば、ガン、炎症、リンパ増殖性疾患、自己免疫疾患、神 経変性疾患など）を処置するための治療方法または予防方法として用いられ得る 。 本開示を読む際に当業者により理解されるように、本発明は、ヒトテロメラー ゼに関する有益な試薬、ならびに種々の有用な治療方法および診断方法を提供す る。上述の説明は、必然的に、このような方法の限られたサンプルを提供するの みであるが、このことが本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。本 発明の他の特徴および利点は、以下の実施例および請求の範囲から明らかである 。 以下の実施例は、本発明の特定の局面を記載して本発明を説明し、そして当業 者に、ヒトテロメラーゼのRNA成分を単離し同定するために用いられる方法の説 明を提供する。実施例は、本発明を限定するものとしてみなされるべきではない 。実施例は、単に本発明の理解および実施において有用な特定の方法を提供する ものだからである。実施例 概観 ヒトテロメラーゼのRNA成分のクローン化は、新規な方法を必要とした。この 方法は、以下に記載のネガティブ選択およびポジティブ選択サイクルを含む。し かし、まず、逆転写、および'5-RACE PCR増幅と呼ばれるcDNAの末端をクローン 化するための方法を用いて、RNA成分をクローン化する試みが行われた。逆転写 反応を、ヒトテロメアDNAの一本鎖部分の繰り返し単位に同一であり、従ってヒ トテロメラーゼのRNA成分に存在すると考えられる配列に相補的なプライマーを 用いて、開始させた。プライマーはまた、その5'末端に、制限酵素認識部位に対 応する配列を含有した。しかし、逆転写反応およびPCR増幅により生成したcDNA をゲル電気泳動およびゲル中に存在する核酸のバンドのヌクレオチド配列分析に より試験した場合、リボソームRNA配列しか検出されなかった。同様の問題は、 この5'-RACEアプローチの変型をネストプライマーを用いて試みた場合にもみら れた。 成功したクローン化の試みは、ヒトテロメラーゼの精製調製物からの、ならび にヒトテロメラーゼ活性を有する細胞株および検出可能なヒトテロメラーゼ活性 を有しない細胞株からのcDNAの調製で開始した。このcDNAを調製するために用い た方法を、以下の実施例１に詳細に記載する。２つのネガティブ選択工程、およ びポジティブ選択の連続サイクルを、２つのヒト細胞株由来のcDNA調製物ととも に用い、望まれない配列の濃度を下げ、そして所望のRNA成分配列の濃度を高め た。 ネガティブ選択工程は、検出可能なテロメラーゼ活性を有しないヒト細胞株か ら調製したcDNAからのビオチン化PCR産物の調製を包含する。ビオチン化PCR産物 を変性し、次いでテロメラーゼ活性を有するヒト細胞株から調製したcDNAからの 大幅に低い濃度の非ビオチン化PCR産物（100ビオチン化産物：１非ビオチン化産 物）を含有する溶液中で再びハイブリダイズさせた。テロメラーゼネガティブ細 胞株が幾分かの低い量のRNA成分を含有する可能性を考慮して、ハイブリダイゼ ーション工程を実施し、両方の細胞株で豊富に発現されているRNAのみに対して 区別または選択した。最も豊富に発現されたRNAのハイブリダイゼーシ ョンを可能にするように選択されたＣ。ｔに対してハイブリダイゼーションを行 った後、望まれない物質を、ストレプトアビジン化磁気粒子に結合させることに より除去した。粒子回収後に残存する上清は、ヒトテロメラーゼのRNA成分に対 する所望のcDNAを含有した。cDNAのPCR増幅のためのプロセスを、以下の実施例 ２に記載する。 この物質をさらに、所望のcDNAについて、ポジティブ選択の連続サイクルによ り富化した。ポジティブ選択工程において、ヒトテロメラーゼのRNA成分中の推 定鋳型配列に相補的なビオチン化プローブを、テロメラーゼ活性を有するヒト細 胞株由来のPCR増幅cDNAの富化（ネガティブ選択による）サンプルからのPCR産物 にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、プローブ／標的複合体を アビジン化磁気ビーズに結合させ、これを次いで回収し、そしてポジティブ選択 のさらなるサイクルにおいて、RNA成分配列が富化された核酸の供給源として用 いた。ポジティブ選択プロセスを、以下の実施例３および４に、より詳細に記載 する。 ポジティブ選択の３回目のサイクルの後、増幅産物をゲル電気泳動により分離 し、そして約200bpの大きさの核酸に対応するゲルの切片を切り出した。次いで 核酸をゲル切片から溶出し、PCRにより増幅した。PCR増幅産物を制限酵素NotIで 消化し、次いでプラスミドpBluescript IISK+（Stratageneから市販されている ）のNotI部位に連結することにより挿入した。得られたプラスミドをE.coli宿主 細胞に形質転換し、そして個々のコロニーを単離し、さらなる分析およびDNA配 列決定のための核酸の供給源として用いた。次いで、この試験によりポジティブ であった多くのコロニーを、DNA配列決定および種々の他の試験により分析した 。 これらの他の試験は、以下を包含した：（１）推定RNA成分に相補的なアンチ センスオリゴヌクレオチドがテロメラーゼを含有することが知られるヒト細胞抽 出物においてテロメラーゼ活性を阻害するか否かの決定；（２）推定RNA成分ク ローン配列に特異的なPCRプライマーがテロメラーゼサンプル中に存在する核酸 を増幅するために用いられ得るか否か、および観察された産物（もしあれば）が テロメラーゼの精製の間にテロメラーゼ活性を追跡するか否かの決定；および （３）推定RNA成分クローン配列に特異的なPCRプライマーが、テロメラーゼ活性 を全く生じないかまたはほんの少量しか生じないことが知られる細胞からの細胞 抽出物よりもテロメラーゼ活性が高いことが知られる細胞（すなわち、腫瘍細胞 ）からの細胞抽出物において、より豊富に存在する核酸を増幅するために用いら れ得るか否かの決定。１つのクローン（プラスミドpGRN7と称される）が、これ らの試験において、このプラスミドがヒトテロメラーゼのRNA成分に対応するcDN Aを含むという決定と一貫する結果を生じた。 従って、pGRN7の推定RNA成分配列の配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレ オチドは、インビトロでテロメラーゼ活性の阻害を示した。同様に、テロメラー ゼを、（１）DEAEクロマトグラフィー；（２）Sephadex S300クロマトグラフィ ー；および（３）グリセロールグラジエント、SPセファロース、またはフェニル セファロースのいずれかの分離、を含むプロセスにより、細胞抽出物から精製し 、そして画分を回収したとき、pGRN7の推定RNA成分配列に特異的なPCRプライマ ーは、適切な大きさの核酸を増幅し、そして増幅産物の量は、回収された画分で 認められたテロメラーゼ活性の量と良く相関した。最後に、正常（テロメラーゼ 活性が全く検出されない）およびガン（テロメラーゼ活性が存在する）ならびに 精巣（テロメラーゼ活性が存在する）からの細胞抽出物において、細胞は、pGRN 7中に含まれる推定RNA成分に対して特異的なプライマーを用いる逆転写およびPC R増幅(RT-PCR)の際に、対応する量のPCR産物を示した。RT-PCRに関するプロトコ ルを、以下の実施例５および６に記載する。 上記の結果は、ヒトテロメラーゼのRNA成分がクローン化されたことの説得力 のある証拠を提供した。そこで、次いでこのプラスミドpGRN7を用いて、以下の 実施例７に記載のように、ヒト細胞株由来のRNA成分についてゲノムクローンを 単離した。ゲノムクローンを、Stratageneから購入したλベクターFIXIIに挿入 したヒトDNAのゲノムライブラリーにおいて同定し、そしてそこから単離した。R NA成分遺伝子配列を含む所望のクローンは約15kbの挿入断片を含有し、このクロ ーンをクローン28-1と称した。このクローンはAmerican Type Culture Collecti onに寄託され、受託番号第75925号として入手可能である。種々の制限フラグメ ントをこのファージからサブクローン化し、そして配列決定した。こ の遺伝子はまた、第３染色体のｑ腕の遠位末端に位置付けられた。λクローン28 -1の、約15kb挿入断片の一端のSauIIIA1制限酵素認識部位から内部HindIII制限 酵素認識部位まで（これは、成熟RNA成分配列の全部ならびにRNA成分遺伝子の転 写制御エレメントを含む）で得られた配列情報は、上記に示される。 実施例１ PCR- 増幅性cDNAの調製 RNAをグアニジンチオシアネート抽出法により293細胞およびIMR-90細胞から得 るか、フェノール／クロロホルム抽出法により精製テロメラーゼ画分から得た。 293細胞由来の全RNAを、2%アガロースゲル上てサイズ分画し、そして500bp未満 のサイズのRNAを単離した。 第１鎖cDNA合成をBethesda Research Laboratories(BRL)から得たSuperscript TMII逆転写酵素を用いて行った。約0.5μg〜1.0μｇのRNAを全容量11μｌで水 中の約40ngのランダムプライマー(6マー;pdN6)と混合した。溶液を10分間95℃に て加熱し、次いで、５分間〜10分間氷上で冷却した。変性核酸を遠心分離により 回収した。次いで、変性RNAとプライマーとの混合物を、以下に示すものを順に 添加することにより再懸濁させた：４μｌの５×第一鎖合成緩衝液；２μｌの0. 1Mジチオスレイトール(DTT)；１μｌのRNAsin(Pharmacia)；および１μｌのdNTP (各々2.5mMのストック溶液)。反応混合物を42℃にて１時間インキュベーション し、次いで１μl(200単位)のSuperscriptTMII RTase(BRL)を反応物中に添加し、 そして混合した。次いで、この反応物を42℃にて60分間インキュベーションした 。得られた反応混合物(新たに合成したcDNAを含有する)を第２鎖合成を行うまで 氷上に配置した。 第２鎖cDNA合成を以下のように行った。第１鎖cDNA合成反応混合物(上記)から の反応混合物(約20μl)を、以下に示す成分とこの順に混合させた：111.1μｌの 水；16μｌの10×E．coli DNAリガーゼ緩衝液；３μｌのdNTP(各々2.5mMのスト ック)；1.5μｌのE．coli DNAリガーゼ(BRL製の15単位)；7.7μｌのE．coli DNA ポリメラーゼ(Pharmacia製の40単位)；および0.7μｌのE．coli RNase H(BRL)。 得られた溶液を緩やかに混合し、そして16℃にて２時間インキ ュベーションした。この時点で、１μl(10単位)のT4 DNAポリメラーゼを反応チ ューブに添加し、そしてインキュベーションを同一温度(16℃)にて５分間続けた 。反応を停止し、そして核酸をフェノール／クロロホルムを用いて反応物を２度 抽出し、エタノールを用いて核酸を沈殿させ、そして反応物混合物を遠心分離し て核酸をペレット化することにより回収した。 遠心分離により回収したcDNAペレットを20μｌのTE緩衝液中に再懸濁させ、そ して以下の２つのオリゴヌクレオチド(NH2はアミノ保護基である)からなる「Not AB」と呼称される、２本鎖オリゴヌクレオチドに連結した： ２本鎖オリゴヌクレオチドを、50μｌのNotAオリゴヌクレオチド(100pmol)を46. 25μｌの水中で50μｌのNotBオリゴヌクレオチド(100pmol)と混合し、得られた 溶液を95℃にて５分間加熱し、溶液がまだ熱いうちに3.75μｌの20×SSC緩衝液 を添加することにより作製した。次いで、混合物を含有するチューブを熱水(約7 0℃〜75℃の温度にて)を含有するビーカー中に配置した。この温度をゆっくりと 15℃未満に下げると、２つのヌクレオチドがハイブリダイズし得て、２本鎖オリ ゴヌクレオチドNotABを形成し得た。得られた核酸を沈殿および遠心分離により 回収した。 ２本鎖NotABオリゴヌクレオチドを約30μｌのTE緩衝液中に再懸濁させ、次い て上記の10μｌのcDNA調製物、約50pmol(OD260により計算)のNotAB；２μｌの10 ×T4 DNAリガーゼ緩衝液、1.2μｌのT4 DNAリガーゼ；0.2μｌの10mM ATP；およ び水を全容量20μｌ中に含有する反応混合物を16℃にて一晩インキュベーション することにより、この反応混合物中のcDNAに連結した。次いで、反応混合物を65 ℃にて10分間加熱することにより、熱不活性化した。代表的には、約１μ1〜２ μｌの得られた混合物を、PCR増幅に用いた。実施例２に記載のように、連結混 合物を10サイクル〜15サイクル増幅し得(94℃、45秒間；60℃、45秒間；および7 2℃、1.5分間)、そしてストックとして貯蔵し得る。 実施例２ cDNA のPCR増幅 cDNAを、５μｌの10×PCR緩衝液(500mM KCl；100mM Tris、pH=8.3；および20m M MgCl2；5μｌ〜8μｌのdNTP(各2.5mM)；１μｌのTaqポリメラーゼ(Boehringer -Mannheim);0.1μｌの遺伝子32タンパク質(Boehringer-Mannheim)；６μｌのNot B プライマー(20μMストック)；２μｌのcDNA(実施例１に記載のように調製)お よび水(50μｌとする)からなる増幅反応混合物を調製することにより、通常通り 増幅した。次いでこの混合物を50μｌ〜100μｌの鉱油を用いて重層し、PCR増幅 を94℃、45秒間；60℃、45秒間；および72℃、1.5分間の10サイクル〜15サイク ル行った。増幅後、反応混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そ して増幅核酸をエタノールを用いて沈殿させ、そして遠心分離により回収した。 次いで沈殿物を100μｌのTE緩衝液中に溶解させ、ストック溶液を調製した。 実施例３ サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサイクル選択のためのPCR増幅 サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサイクル選択(cyclic select ion)の両方のためのPCR産物を作製するために、実施例２に記載のように調製し た約１μｌのストック溶液を、21サイクル〜24サイクルのプライマーアニーリン グ、伸長、および産物の変性を行ったこと以外は実施例２に記載のように調製し た50μｌのPCR反応混合物中で増幅した。増幅後、反応混合物をフェノール/クロ ロホルムを用いて抽出し、エタノールを用いて沈殿させ、そして遠心分離により 回収した。産物収率を少量のアリコートの反応混合物のアガロースゲル電気泳動 後、臭化エチジウムを用いて染色することにより見積もった。サブトラクティブ ハイブリダイゼーションのために、テロメラーゼ陰性細胞(IMR-90)由来のcDNAラ イブラリーをビオチン化dUTPの存在下で増幅した。テロメラーゼ陰性細胞(IMR-9 0)由来のcDNAとテロメラーゼ陽性細胞(293)由来のcDNAとの比(約100対１)を用い て、サブトラクティブハイブリダイゼーションを行った。標準条件を65℃にて48 時間〜72時間使用した。代表的には、部分精製cDNAおよ び陰性に選択された材料由来の核酸産物(２μg)を少なくとも２回のサイクル選 択に使用した。 サイクル選択後（実施例４に記載）、約１μｌ〜２μｌの選択された「プルダ ウン」産物(20μｌの全容量から)を実施例２に記載のように22サイクルPCR増幅 を行い、エタノールを用いて沈殿させ、そして更なるサイクル選択のための調製 物中に遠心分離により回収した。 実施例４ PCR 増幅cDNAの陽性選択 ヒトテロメラーゼのRNA成分をクローン化するために使用するサイクル選択プ ロセスの陽性選択工程のために、約２μｇのPCR増幅cDNAを25μｌのTE緩衝液中 に希釈し、次いで1.25μｌの20×SSCと混合させ、そして得られた溶液を95℃に て３分間加熱した。温度を５分間に60℃まで下げ、そして１μl(0.1μg/μl)のR 2またはR4ビオチン化プローブを添加した。これらのプローブの配列を以下に示 す。このプローブは、O-メチル-RNAプローブであり、Uは、O-メチルウリジンで あり、Aは、O-メチルリボアデニンであり、Gは、O-メチルリボグアニンであり、 そしてＩは、イノシンである。 このR2プローブは、テロメア反復に特異的であり、そしてR4プローブは、RNase P(これは、サイクル選択プロセスの有効性および効率性を追跡するために使用し た)に特異的である。公知の配列の分子であるRNase P RNAのサイクル選択を同時 に、しかし別々に行うことにより、サイクル選択プロセスが目的分子(この場合 、ヒトテロメラーゼのRNA成分)に関して適切に機能していることにより大きな信 頼を有し得る。 R2プローブまたはR4プローブのいずれかを混合物に65℃にて添加した後、30℃ で５分間混合物をインキュベーションすることにより、ハイブリダイゼーション 反応混合物の温度を30℃まで下げ、次いで14℃にて60分間インキュベーションす ることにより反応混合物をさらに14℃の温度まで下げた。最終的に、混 合物を４℃にて２時間〜12時間インキュベーションした。 各サンプル(R2またはR4)についてのハイブリダイゼーション反応混合物全体を 400μｌの0.5×SSCに４℃にて添加し、次いで氷冷磁気ビーズチューブ(Promega から購入し、そして0.5×SSCを用いて使用前に４回予め洗浄した)に添加した。 得られた混合物を４℃にて30分間インキュベーションして磁気ビーズに確実に完 全に結合させた。次いで、各反応チューブを磁気スタンド(Promega)上で室温に て簡単にインキュベーションして、ビーズをプルダウンした。このビーズを冷0. 5×SSC(600μl)中に再懸濁させ、そして氷上に(チューブ中で)配置した。サンプ ルをこの様にして0.5×SSCを用いてさらに３回洗浄した。核酸を100μｌの水中 にビーズを再懸濁させ、そして65℃にて２分間インキュベーションし、次いで回 収のために磁気スタンド上にビーズを再び配置することによりビーズから溶出し た。このプロセスをさらに３回反復した。最後のプロセスにおいて、再懸濁ビー ズを65℃にて５分間インキュベーションし、次いで回収のために磁気スタンド上 にビーズを配置した。全ての100μｌの上清(各サンプルについて)をプールし、 そしてSpeedVacTM遠心分離機中20μｌまで乾燥した。次いで、回収DNAを更なる 回の増幅および選択用にPCR増幅した。各増幅後、PCR産物を２回フェノール-ク ロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、そして20μｌのTE緩衝液中に再懸濁させ た。 代表的には、PCR増幅をアガロースゲル電気泳動法により確認した。さらに、 種々のコントロールを使用してサイクル選択プロセスをモニターした。１つのコ ントロールとして、PCR「アーム(arm)」(プライマーハイブリダイゼーション部 位として作用する規定された配列のオリゴヌクレオチド)を、ネオマイシン耐性 を付与する遺伝子を含有する核酸上に配置した。得られた核酸をPCR増幅cDNAと 混合し、そして定量的なPCRにより各選択においてモニターした。他のコントロ ールとしては、RNase PをRNase P選択およびテロメラーゼRNA成分選択ライブラ リーの両方の後に続けた。 実施例５ RT-PCR プロトコル 第１鎖cDNAを実施例１に記載の手順と実質的に同一の手順で作製した。基本的 には、RNAを各テロメラーゼ画分(0.1μｇ〜１μｇのRNAを含有する)から精製し ；代表的には、300μｌの画分から作製されるRNAの約３分の１〜５分の１を使用 した。RNAを40ng〜80ngのランダムヘキサマーと10μｌ中で混合し、95℃にて10 分間変性(サーマルサイクル機器(thermal-cycling instrument)を用いて)させ、 そして氷上で冷却した。変性RNAおよび６マーを、逆転写酵素(RTase、BRLから購 入)の製造業者により供給される５×第１鎖合成緩衝液(４μl)、２μｌの0.1M D TT、１μｌの10mM dNTP(各)、１μｌのRNaseインヒビター(Pharmacia)、および 水(全容量を９μｌとする)を含有する反応混合物に添加した。合わせた混合物を 42℃の水浴に配置した。１分間〜２分間インキュベーションした後、１μｌのSu perscriptTM II RTase(BRL)を混合物に添加した。インキュベーションを42℃に て60分間続けた。反応をチューブを95℃〜98℃にて10分間加熱することにより停 止させた。第１鎖cDNAを短い遠心分離により回収し、更なるチューブに分割(ali quoted)し、迅速にドライアイス上で凍結させ、そして-80℃にて貯蔵するか、ま たは即座に使用した。 実施例６ 特異的プライマーセットを用いたcDNAのPCR増幅 放射性標識化ヌクレオチドを用いた20μｌのPCR反応のために、実施例５の手 順に従って調製した１μｌのcDNAを、20pmolのプライマー１、20pmolのプライマ ー２、2.5μｌの2.5mM dNTP、５μCiのα-32P-dATP、２単位のTaqポリメラーゼ( Boehringer-Mannheim)、0.2μgのT4遺伝子32タンパク質(Boehringer-Mannheim) 、２μｌの10×緩衝液(500mM KCl、100mM Tris-HCl-pH8.3、および20mM MgCl2) 、ならびに水(全容量を20μｌにする)と混合した。次いで、鉱油を１滴チューブ に添加した。 テロメラーゼRNA成分クローン用のPCR増幅条件は以下の通りである：94℃で45 秒間、60℃で45秒間、72℃で1.5分間。サイクル数は、代表的には18サイ クル〜25サイクルの範囲であるが、RNA調製に使用される精製物質のタイプに応 じて異なった。全ての定量的なRT-PCRに関して、異なるサイクルのいくつかの反 応を各サンプルについて行って、いつPCR増幅が飽和し、そして非線形となった かを決定した。 RNase Pをコントロールとして使用するための、PCR増幅条件は以下の通りであ った：94℃で45秒間、50℃で45秒間、および72℃で1.5分間。さらにサイクル数 は、サンプルの性質に応じて15サイクル〜22サイクルの範囲であった。RNase P 増幅に使用するプライマーの配列を以下に示す： これら２つのプライマーを用いて得たPCR産物は、約110bpのサイズである。 PCR後、産物(５μｌ〜10μｌの反応混合物)を6%ネイティブポリアクリルアミ ドゲル上にロードし、そして電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを乾燥し、そ して分析のためにPhosphorImagerTMカセットまたはオートラジオグラフィー用フ ィルムに曝露した。 実施例７ ヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子のクローニング ヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子をクローン化するために使用する 手順を、概ねManiatisら、Laboratory Molecular Cloning Manual.に記載される ように行った。λファージベクターFIXIIに挿入したヒト肺線維芽細胞株WI-38由 来のDNAのゲノムDNAライブラリーをStratageneから購入した。このファージを１ プレート当たり約25,000プラークの濃度で３セットの15(150mm)プレート上にプ レートした。このプレートをNZYアガーおよびNZYトップアガロースを用いて作製 し；ファージ形質転換に使用した細胞は、XLlBlueMRAP2細胞であり；そして形質 転換体を37℃にて約16時間一晩増殖させた。次いでプレートを４℃にて約１時間 冷却し、次いでプラークをC/Pナイロンサークル(Bio Rad製のフィルターペーパ ー)上に「リフト」した。このプロセスを反復してリフトしたフィルターの２連 のセットを得た。このフィルター(２連)を変性させ、中和し、 6×SSC緩衝液中で平衡化し、UV照射に曝露して核酸をフィルターに架橋し、次い でブロッター紙上で乾燥した。 プレハイブリダイゼーションを50%ホルムアミド緩衝液中、37℃にて１時間行 った。フィルターを、クローンpGRN7由来の約218bpの放射能標識NotIフラグメン トを用いてプローブした。このフラグメントは、電気泳動による分離後5%ポリア クリルアミドゲルから電気溶出法により単離し、次いで製造業者の手引きに従い Boehringer-Mannheim Biochemicals製のニックトランスレーションキットを用い てα-32P-dCTPでニックトランスレーションした。約25ng(約10μCi標識)のプロ ーブを１フィルター当たり使用し、そしてハイブリダイゼーションを50%ホルム アミドハイブリダイゼーション緩衝液中、37℃にて一晩行った。ハイブリダイゼ ーション後、このフィルターを室温で６回洗浄し；最初の３回の洗浄を6×SSC(0 .1%SDS含有)を用いて行い、そして後の３回の洗浄を6×SSC単独で行った。Phosp horImagerTMカセット中でいくつかの２連フィルターをまず曝露して、ハイブリ ダイゼーション効率とシグナル強度をチェックした後、フィルターを0.5×SSC中 で65℃にて洗浄した。次いでこのフィルターを、２つの増感スクリーンを用いて Kodak XAR5フィルム下に配置し、そしてこのフィルムを-70℃にて約100時間曝露 した。 １つの強いシグナルがファージ(後に28-1と命名、これはヒトテロメラーゼのR NA成分に対する遺伝子を含む)を含有するフィルターから発せられた。このフィ ルター上に観測されたシグナルに相当するプラークを２次プレートを作製するた めに使用し、その結果、単離されたプラーク(標識pGRN7核酸を用いてプローブす ることにより確認)をファージDNAの大規模単離用に培養した。ファージ28-1(ア メリカンタイプカルチャーコレクションから受託番号75925号のもと入手可能)は 、約15Kbのインサートを含有し、かつpGRN7上のRNA成分配列とハイブリダイズす る配列を含む以下のいくつかの制限フラグメントを含有する：4.2kbのEcoRI制限 酵素フラグメント；4.2kbのClaI制限酵素フラグメント、および2.5kbのHindIII-Sac I制限酵素フラグメント。後者のフラグメントは、上記に示されるRNA成分の 約560ヌクレオチド配列全体を含有し、そしてRNA成分に対する完全な遺伝子を含 有すると考えられている。pBluescriptベクター中に 2.5kbのHindIII-SacI制限酵素フラグメントを含有するプラスミドをプラスミドp GRN33と命名し、そしてこれはアメリカンタイプカルチャーコレクションから受 託番号ATCC のもと入手可能である)。ヒト遺伝子が2.5kbのフラグメント上 のもの以外の配列を含み得ても、これらの配列は、ファージ28-1から単離され得 るか、または2.5kbのフラグメント(あるいは本発明の他のプローブ)を用いてプ ローブすることにより同定される他のファージクローンから単離され得る。上記 の制限酵素フラグメントを別々の制限酵素消化において調製し；この消化産物を 0.7%アガロースゲル、または約2.5kbフラグメントのみについては3%ポリアクリ ルアミドゲル上の電気泳動により分離し、そして所望のバンドをゲルから切り取 り、そしてGeneCleanTM Kit II(Bio101、Inc.製)を用いるか、または0.1×TBE中 でSpectropor番号２透析チューブ中に100Vにて２時間（約2.5kbのフラグメント のみについて)電気溶出することによるかのいずれかでサブクローニング用に調 製した。 これらの制限酵素フラグメントをpUC-ベースのプラスミドまたはpBluescriptI Iプラスミドから誘導されるSV40の複製開始点をも含有する(しかし、SVプロモー ター活性はない)E．coli発現/変異誘発プラスミド中にサブクローン化した。得 られたプラスミドを、好ましい実施態様の説明において上記のように種々の目的 のためにヒトまたは他の真核生物細胞中に導入するための改変(変異)RNA成分核 酸を調製するために使用し得る。 実施例８ ヒトテロメラーゼのRNA成分に対するアンチセンスプラスミド アンチセンス発現プラスミドを、以下のプライマーセットを用いるRNA成分cDN AのPCR増幅により調製した：(1)NotBおよびG1、これは、プラスミド中のcDNAイ ンサートより小さいアンチセンス核酸を産生する；および(2)NotBおよびR3C、こ れは完全長(プラスミド中のインサートと比較して)のアンチセンス核酸を産生す る。NotBのヌクレオチド配列を上記実施例１に示し、G1およびR3Cプライマーの ヌクレオチド配列を以下に示す。 PCR増幅後、増幅フラグメントを約10kbの発現プラスミド中にPmlI部位にてクロ ーン化した。このプラスミドは、選択マーカーとしてのプロマイシン耐性を付与 するDHFR遺伝子、およびヒグロマイシンB耐性を付与する遺伝子、SV40の複製開 始点；ヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子のアンチセンス鎖の発現のた めに配置した誘導性ヒトメタロチオネイン遺伝子プロモーター(より高い発現レ ベルを得るためにより強力なプロモーターを使用し得る)、およびSV40後期ポリA 添加部位を含有する。 得られたプラスミド(NotB/G1産物に対してpGRN42およびNotB/R3C産物に対して pGRN45と命名)をリン酸カルシウム手順(Maniatisら、上記を参照のこと)により 線維肉腫細胞株HT1080中にトランスフェクトした。HT1080細胞は、通常不死であ る。ヒトテロメラーゼのRNA成分に対するアンチセンスRNAの発現により、ヒトテ ロメラーゼのRNA成分のタンパク質成分との会合が妨害されて、活性テロメラー ゼの形成を阻害し、かつ細胞死をさせる。 実施例９ 非ヒト哺乳動物由来のRNA成分核酸の同定および単離 いかにして本発明の試薬が、他の哺乳動物種由来の実質的に相同な核酸を同定 し、そして単離するために使用され得るのか示すために、ヒトRNA成分配列に対 して相補的なPCRプライマーを、PCRにおいて相同な配列を増幅するために使用し た。本発明のこの局面を示すために使用した例証的なプライマー対は、プライマ ー＋10(配列5'-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3'を有する)、およびプライマーR7(配列5 '-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3'を有する)からなる。ゲノムDNAをチンパンジー、リ スザル、アカゲザル、およびヒヒの組織から調製し、そして約0.5mg/ml〜４mg/m lの濃度にてTE緩衝液中に溶解した。 各組織タイプについて、PCR混合物を調製し、混合物は以下からなった：１μ ＬのゲノムDNA、48μLのMaster Mix(Master Mixは、Stratagene製の１×TaqExte nderTM緩衝液、200μMの各dNTP、および0.5μMの各プライマーから なる)、ならびに0.5μLTaqポリメラーゼ(5単位/μL、Boehringer Mannheim)：Tt hポリメラーゼ(TaqExtenderTMポリメラーゼ、Stratagene製)の1：1混合物。反応 チューブをサーマルサイクラー(最初に、反応混合物を94℃にて５分間加熱し、 次いで94℃で30秒間、63℃で10秒間、および72℃で45秒間にて27サイクルのイン キュベーションを行うようにプログラムした)上にロードした。増幅反応が完結 した後、電気泳動のために約10μLの各反応混合物を2%アガロースゲル上にロー ドした。電気泳動、ゲルの染色、そしてUV照射後、各反応混合物が予測されたサ イズ(約200bp)のバンドを含有したことを観測し得た。これらのバンド由来の核 酸は、クローン化され得、そして配列決定され得、そしてこれらの各哺乳動物種 由来のRNA成分遺伝子の残りはヒトテロメラーゼのRNA成分に対する遺伝子につい て上記したようにクローン化され得る。実施例14(後述)は、リスザルテロメラー ゼRNAゴモネント(gomonent)遺伝子配列決定の具体的な例を記載する。 実施例１０ 変異センスヒトテロメラーゼRNA成分配列 この実施例は、テンプレート領域におけるテロメラーゼRNA成分配列を変化さ せることにより、ヒトテロメラーゼにより合成される配列が変化し、染色体のテ ロメラーゼ反復における変化を導くことを例証する。 TRC3テンプレート領域の再プログラムが、ヒトテロメラーゼ活性において合成 されたテロメア反復中に対応する変化を導くか否かを決定するために、テロメラ ーゼRNA成分(TRC3)遺伝子配列全体を発現する遺伝子フラグメントをクローン化 し、そして変異誘発した。サザンブロット分析は、TRC3がヒトゲノムにおいて単 一コピー遺伝子にハイブリダイズしたことを示した。TRC3のゲノムコピーをλフ ァージライブラリーから単離し、そしてそれがTRC3を用いてプローブしたゲノム サザンブロット上に観測したものと同一の制限マップを有することが示された。 2.6kb HindIII-Saclフラグメントを単離し、そしてpBluescriptの改変型中にサ ブクローン化し、ゲノムTRC3プラスミドpGRN33を生じた。RNAの5'および3'末端 をプライマー伸長、RACE PCR、およびRT-PCRを用いてマップした。 RNA転写物のサイズは約550塩基であり、ノーザンブロット上の移動度と一致した 。TRC3についての転写された領域はゲノムクローンの中心であり、1.4kbの上流 配列を有した。 RNAを精製テロメラーゼ調製物から抽出し、次いで以下の実験において使用し た。5'RACE：第一鎖cDNAを32P-dATPの存在下、アンチセンスTRC3プライマー(R3B ：5'-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT)を用いて作製した。伸長産物をPAGEにより分 離し、そしてオートラジオグラフィーにより同定し、切り出し、そして抽出した 。オリゴヌクレオチド(NotA：5'-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2)をT4 RNAリガー ゼを用いてこれらの第一鎖産物に連結し、次いでPCRをネストプライマー、R3c(5 '-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG)およびNotAオリゴヌクレオチドに相補的なオリ ゴヌクレオチド(NotB：5'-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT)を用いて行った。PCR産物をア ガロースゲル上に分離し、そしてバンドを切り出し、そしてプライマーとしてオ リゴヌクレオチドG1(5'-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA)を用いて直接配列決定 した。3' 末端マッピング：3'RACEを行う試みは成功しなかった。次に、RT-PCRス トラテジーを採用し、ここでゲノムDNA配列に相補的な一連のアンチセンスプラ イマーを用いて、第一鎖cDNA合成をプライムした。この系列におけるプライマー を約150bp間隔とし、転写物の5'末端から始めて、3'末端に進行した。次いで、P CRを第一鎖プライマーおよびその配列が公知のTRC3転写物の内側であるプライマ ー(F3b：5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG)を用いて行った。逆転写酵素-感受性P CRバンドの予期されたサイズは、＋558〜＋950に対して設計されたいずれのプラ イマーを用いても見られず、間隔＋100〜＋450(5'末端に対して番号づけた)に対 して設計された全てのプライマーを用いて作製されたcDNAを用いる場合に見られ た。これは、＋450位と＋558位との間に成熟TRC3転写物の3'末端を位置づけた。 続くプライマー設計およびRT-PCRにより、＋545と＋558との間にこの間隔を狭め た。 TRC3の予期されたテンプレート配列を、ゲノムプラスミドpGRN33のインビトロ 変異誘発(Perezら、(1994)J ．Biol．Chem. 269：22485に実質的に従って行った) によりCUAACCCUAからCCAACCCCA(MuC)またはCAAACCCAA(MuA)に変えた。機能性テ ロメラーゼ中に組み込まれた場合、これらの変異RNAは、野生型反復 TTAGGGではなく、TTGGGG(MuC)またはTTTGGG(MuC)の合成鋳型となるはずである。 これらの変異テロメラーゼ活性は野生型活性から容易に区別され得る。なぜなら これらは、もはや活性のためにdATPを必要とせず、そして野生型活性のみが、dd ATPによる終結に感受性であるはずだからである。２重変異体(MuC＋17)もまた調 製された。ここでは、17bpインサートがMuCテンプレートに加えて＋180bpにて存 在した。この変異体は、17bpインサートに対するプローブ、またはサイズにより 改変RNAの特異的検出を可能とした。 2.6kbのゲノム配列でインビボのTRC3の発現には十分であった。細胞を一過性 にMuC＋17プラスミドを用いてトランスフェクトし、そしてトランスフェクトさ れたDNAから発現したRNAを逆転写工程におけるプライマーとして17bpインサート 配列を用いるRT PCRにより検出した。RNAをモックトランスフェクト細胞におい てではなくMuC＋17トランスフェクト細胞において検出し、このことによりTRC3 発現のためには、2.6kbゲノムクローンで十分であることが示された。次いで、 安定な形質転換体をpCMVneoと共にHT1080をリン酸カルシウムトランスフェクシ ョンすることによりこれらの３つの変異体プラスミドの各々から誘導した。耐性 クローンをG418中で選択し、そしてMuC＋17RNAの発現をRT-PCRにより確認した(I rvingら、(1992)Exp ．Cell Res. 202：161)。 変異体テロメラーゼ活性を試験するために、未トランスフェクト細胞から、お よび組み込まれたMuC★、MuC、またはMuAベクター(図１におけるC★、CまたはA) を有する安定な形質転換体からの抽出物をアッセイした。変異体抽出物は野生型 および変異体テロメラーゼ活性の両方を含むことが予期されたので、種々のアッ セイ条件をこれらを区別するために採用した。通常の反応条件下(dTPP、32P-dGT PおよびdATP)、変異体構築物系列由来の全ての抽出物は、RNaseに感受性の野生 型テロメラーゼ活性を示した(図１、レーン1〜6)。予期されたように、この活性 は、ddCTPが反応物に含まれた場合影響されず(図１、レーン7〜9)、そしてddTTP によりなくさられた(図１、レーン10〜12)。対照的に、ddATPがdATPに置き換わ った場合、C(レーン14)およびA(レーン15)抽出物は依然、RNase-感受性(レーン1 7および18)テロメラーゼ活性を示し、一方C★(レーン13)およびコントロール抽 出物はテロメラーゼ活性を示さなかった。これらの結果は、テロ メラーゼが示すddATP-耐性活性はMuCまたはMuA TRC3 RNAを用いて再プログラム されたことを示す。対照的に、C★における17bpインサートは再構成を阻害し、 このことはテロメラーゼ再構成がTRC3配列に非常に特異的であることを示す。 変異体MuAにより合成された配列が(GGGTTT)nであることを確認するために、本 発明者らは、独持のテロメラーゼプライマーに付加されたテロメラーゼ反復を増 幅するための既存のPCR方法を改変した(Kimら、（1994）Science 266：2011)。 合成プライマーを用いて、本発明者らは、配列d(CCCAAACCCAAACCCAA)を有する3' プライマーが(TTTGGG)n反復のみを増幅し、(TTAGGG)n含有反復を増幅しない反応 条件を同定した。 野生型と変異体テロメラーゼとによって付加されたテロメラーゼ反復を区別す るために、２工程アッセイを、テロメラーゼ反応に対するヌクレオチドの利用可 能性を制限するストラテジーと組み合わせた。MuAおよびMuCが(TTTGGG)nおよび( TTGGGG)nのテロメア反復配列をそれぞれ生じるので、細胞抽出物を始め室温にて 10分間dTTPおよびdGTPのみの存在下、TS基質と共にインキュベーションしてテロ メア反復を付加させた。次いで、残余のテロメラーゼ活性を５分間抽出物を沸騰 させることにより破壊した。次いで、特異的DNA配列を有するテロメラーゼ産物 を、記載(Kimら、(1994)前出)したように適切な逆方向プライマーを用い、そし て４つ全てのdNTPおよび微量の32P-dCTPの存在下でのPCR増幅により検出した。M uA産物を検出するためには、逆方向プライマーは、(ACCCAA)4であり、そしてPCR 条件は94℃、10秒、60℃、30秒および72℃、30秒で20サイクルであった。MuC産 物を検出するためには、以下の３つの逆方向プライマーをそれぞれ使用した：(C CCCAA)3、(CCAACC)3および(CCAACC)3。これらは、テロメラーゼ産物に対するア ニーリングの予期した位置と一致する、対応する移動度を有するPCR産物を与え た。使用したPCR条件は、アニーリング温度が50℃であったこと以外は上記と同 一であった。同一条件下、テロメラーゼ産物は、親細胞または野生型TRC-3遺伝 子を用いてトランスフェクトした細胞の抽出物から全く生じなかった。本発明者 らのPCR増幅条件の特異性の試験において、(TTTGGG)nおよび(TTGGGG)nを含有す る合成オリゴヌクレオチドは、それぞれ(ACCCAA)4または(CCCCAA)3逆方向プライ マーを用いて適切な６ntラダーPCR産物を生じ、一方 (TTAGGG)nオリゴヌクレオチドは、(ACCCAA)4または(CCCCAA)3逆方向プライマー を用いて全くPCR産物を産生しなかった。 これらの条件を用いて、MuCまたは野生型細胞由来ではなくMuA由来の抽出物は 、改変したテロメラーゼアッセイにおいて産物を生じ、このことは、MuA含有細 胞由来のテロメラーゼが、(TTTGGG)n反復を生じたことを示した。同様の方法を 用いてMuC変異体を分析したところ、(TTGGGG)n反復が合成されていた。まとめる と、上記のデータは、TRC3遺伝子がヒトテロメラーゼのRNA成分をコードするこ との強い証拠を構成し、これにより、本発明者らは、TRC3をヒトテロメラーゼRN A(human Telomerase RNA)のためにhTRと再命名した。 実施例１１ 死滅細胞および不死化細胞におけるテロメラーゼRNA成分 大部分のガン細胞は高レベルのテロメラーゼ活性を発現するが、大部分の正常 な体細胞においては、テロメラーゼは検出されない(Kimら、(1994)前出)。テロ メラーゼRNA成分レベルが、不死化ガン細胞株において高くなっているか否かを 決定するために、テロメラーゼRNA成分およびGAPDH転写物レベルを５つの死滅初 代細胞株(これは、検出可能なテロメラーゼ活性を有さない)および高レベルのテ ロメラーゼ活性を有する５つの不死化ガン細胞株においてRT-PCRを用いて分析し た。定常状態のレベルのテロメラーゼRNA成分転写物は、GAPDHのレベルと比較し た場合、初代細胞においてより、腫瘍細胞株において３倍〜12倍高かった(図2A) 。テロメラーゼRNA成分レベルが高レベルのテロメラーゼを発現する不死化ガン 細胞において増加したが、興味深いことに低いが、容易に検出可能なレベルのテ ロメラーゼRNA成分もまた死滅初代細胞(検出可能なテロメラーゼ活性を有さない )中に存在した(レーン１〜５)。 テロメラーゼRNA成分レベルをまた、ノーザンブロット分析により種々の正常 ヒト組織において検討した。精巣および卵巣は、最も高いレベルのテロメラーゼ RNA成分を有していた。これらの組織が高レベルのテロメラーゼ活性を発現する ので、このことは予期されていた。しかし、他の多くの組織もまた、テロメラー ゼRNA成分を発現した(図2Bおよび2C)。これらは、正常腎臓、前立腺および成 人肝臓を包含し、これらの全ては、検出可能なレベルのテロメラーゼ活性を有さ なかった。これらの結果は、細胞株のデータ(図2A)を裏付け、そしてテロメラー ゼRNAが、多くのヒト組織において存在するが、不活性であり得ることを示唆す る。RNA発現における同様の組織特異的な差異がマウス組織において見られた。 しかし、多くの正常なマウス組織は、テロメラーゼ活性について陽性である。ヒ ト細胞におけるテロメラーゼ活性の見かけ上上昇した抑制は、培養中にマウス細 胞が自然に不死化する(ヒト細胞はそうはならない)理由を説明する助けとなり得 る。 実施例１２ HeLa 細胞におけるアンチセンスhTR(ヒトテロメラーゼRNA成分)転写物の発現は 細胞危機(crisis)および細胞死を導く 不死化細胞におけるテロメラーゼの機能を検討するために、アンチセンスhTR 発現構築物をHeLa細胞中に導入した。１bp-193bpのヒトテロメラーゼRNA成分cDN Aクローン、TRC3、を含有する200bp EcoRI DNAフラグメントをp10-3およびpBBS2 12のEcoRI部位中に挿入して、それぞれプラスミドp10-3-hTRおよびpBBBhTRを生 じた。プラスミドp10-3-hTRは、記載されるように(Gossenら、(1992)Proc ．Natl ．Acad．Sci(USA)89 ：5547)、２つの異なる方向の上流の５つのTet-オペレータ ーに対応してテトラサイクリンで調節されるCMV最少プロモーターの転写制御下 で、テロメラーゼRNA成分のアンチセンスを発現する。プラスミドpBBS-hTRは、M PSVプロモーターの制御下、hTRのアンチセンスを発現する(Linら、(1994)Gene 1 47 ：287)。平行して、アンチセンスhTRコード配列を有さないコントロール発現 ベクターもまた、HeLa細胞中にエレクトロポレートした。アンチセンスまたはコ ントロールプラスミドを含有するクローンを、３つの別々の実験において選択し た。最初、アンチセンスhTRを発現する41の培養物はコントロールベクターを有 する細胞と同様に増殖した。しかし、トランスフェクション後23集団倍加レベル 〜26集団倍加レベル(PDL)で41中33のアンチセンスを発現する培養物は危機を経 験した(表１)。これらの培養物における細胞危機は、20PD〜26PDの細胞増殖にお ける著しい阻害、及びそれに続く１週間 にわたる丸まり(rounding up)およびプレートからの細胞の脱離により特徴づけ られた。細胞が危機を経験した33中28のケースにおいて、希な(1%未満)復帰変異 体コロニーが観察されたが、大部分の細胞はその後３週間以内に死滅した。復帰 変異細胞は、アンチセンスhTR構築物の阻害効果を免れる変異体を示したのかも しれない。アンチセンスクローンとは対照的に、ベクターコントロール細胞株は 、50倍加にかけて増殖または死滅における変化を全く有さなかった。 表１ アンチセンスhTRは比較的短い平均TRFおよび細胞危機を導く ３つの独立した実験を行った。ここで、HeTe7細胞(高レベルのテトラサイクリ ンリプレッサーVP16キメラタンパク質を発現するHeLa細胞)をプラスミドp10-3-h TR(テトラサイクリン-VP16誘導性CMV最少プロモーターの制御下でアンチセンスh TRを発現する)、またはpBBS-hTR(MPSVプロモーター(54)の制御下でアンチセンス hTRを発現する)のいずれかを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェ クトした。[これらの実験において、テトラサイクリンによる調節は観測されな かった。p10-3-hTRを用いた実験は、代表的には、テトラサイクリンの非存在下 で行った。なぜならテトラサイクリン-VP16-誘導性CMV最少プロモーターの制御 下での、ルシフェラーゼまたはアンチセンスhTRを用いたコントロール実験は、 テトラサイクリンの存在または非存在がHete7細胞におけるルシフェラーゼまた はアンチセンスhTR発現においてほとんど有効ではないことを実証したからであ る。実際、HeTe7細胞におけるアンチセンスhTR構築物を用いた初期の実験では、 細胞は依然としてテトラサイクリンの存在下で23PDL〜26PDLにて危機を経験した 。]。コントロールとして、HeTe7細胞をまた同じ条件下で親ベクターでトランス フェクトした。11〜18の安定なクローンが各トランスフェクション系列から単離 された。全ての単離物由来のクローンは20PDLまで同一の形態および増殖プロフ ィールを示した。この時点で大部分のアンチセンス発現クローンの増殖は著しく 遅くなった(p10-3-hTRおよびpBBS-hTR)。PDL23〜26までに、これらの細胞は危機 を経験し、これは大きくかつ丸みを帯びた細胞の出現により特長づけられた。し かし、pBBS-hTRトランスフェクトHeTe7細胞から生 じるクローンの全てが危機を経験したわけではない。アンチセンスhTRを発現す る８つのクローンは、コントロール培養物と同様な増殖を継続した。全てのクロ ーン由来の細胞をPDL23にて回収し、そして平均TRF長を決定した。P値を片側t- 検定の方法により計算した。各系列について、危機を経験したクローンの割合を 示す。 テロメア長およびテロメラーゼ阻害が、アンチセンス発現クローンにおける細 胞危機と相関するか否か決定するために、いくつかの前危機(precrisis)のコン トロールおよび実験コロニーにおけるテロメア長およびテロメラーゼ活性を23PD Lにおいてアッセイした。コントロールベクターを含有する全てのコロニーは、 親細胞株(3.15kb)と同様の平均TRF長(3.22および3.27kb)を有し、一方、危機を 経験したアンチセンスベクター構築物を含有するクローンは、2.39kbと2.72kbと の間の平均TRF長、すなわち、親株のものより17%〜26%短かい平均TRF長を有した (図３)。これらのデータは、テロメラーゼ活性の阻害によりアンチセンス含有ク ローンにおいてテロメア反復が損失されたことと一致している。このことを直接 試験するために、テロメラーゼ活性を14のクローンにおいてアッセイした。テロ メラーゼ活性は、多くのアンチセンスクローンにおいて一般に低いが検出可能で あった。しかし短縮されたテロメアは、このレベルがテロメア長を維持するため に十分ではないことを示唆している。なぜなら、平均TRFは3.22kbから2.39kbま で低下したからである(P=0.0008)。危機を経験しなかった アンチセンスベクター(pBBS-hTRb)を含有する８つのクローンにおいて、テロメ ア長は、有意に変化せず(3.03対3.33、P=0.355)、そしてテロメラーゼ活性はコ ントロールのものと同様であった。考えあわせると、これらの結果はテロメアが 臨界長に達すると、テロメア損失が、危機および細胞死を引き起こすことの証拠 となる。 アンチセンステロメラーゼRNA成分を発現するHeLa細胞における細胞危機の誘 導は、テロメラーゼ阻害がヒトガンに対する特異的、かつ効果的な治療法を提供 し得ることの更なる支持を提供する。 実施例１３ インサイチュ増幅および検出 テロメラーゼRNAのインサイチュ検出 A. 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH) 細胞の混合集団または組織におけるテロメラーゼ陽性細胞の同定を、テロメラ ーゼのRNA成分に標的化した標識プローブのインサイチュハイブリダイゼーショ ンにより行い得る。細胞サンプルの組織を顕微鏡用ガラススライドに固定し、そ して十分透過化し、そしてインサイチュハイブリダイゼーションに使用した。ヒ トテロメラーゼRNA(hTR)用のインサイチュハイブリダイゼーションの例は、予め 70℃〜74℃まで２分〜３分加温した70%の脱イオン化ホルムアミド/2×SSC溶液中 にスライドを浸すことにより核酸を変性させる工程をまず包含する。次いで、こ のスライドを氷冷した70%EtOH、次いで95%EtOH、次いで100%EtOH(各溶液中に４ 分)に移す。100ng〜200ng(１スライド当たり)の標識htRNAプローブ(ビオチン、 ジゴキシゲニン、放射性同位体、蛍光タグを用いて標識した約500bpのDNAプロー ブ)を乾燥し、10μｌの100%脱イオン化ホルムアミド中に再懸濁させ、75℃にて ８分間インキュベーションすることにより変性し、そして即座に氷上で冷却する 。10μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液(４×SSC；４×Denhardt's溶液； 20%デキストランスルフェート；100mM Tris、pH7.5)を10μｌの再懸濁プローブ に添加する。プローブ／ハイブリダイゼーション混合物(20μ1)を固定化サンプ ルに添加し、カバーグラスで覆い、そしてゴムセメントまたは マニキュアを用いてカバーグラスをシールした。サンプルを37℃にて８時間〜48 時間インキュベーションする。ハイブリダイゼーション後、カバーグラスを取り 除き、サンプルを37℃にて2×SSC/50%脱イオン化ホルムアミド中で２回洗浄し、 次いで37℃にて２×SSC中で２回洗浄する(１洗浄当たり５分間)。次いで、サン プルを顕微鏡で観察する。 B.プライムインサイチュ標識(Primed in situ labeling)(PRINS) 伝統的なインサイチュハイブリダイゼーション検出法に対する他の改変は、プ ライムインサイチュ標識(PRINS)である。PRINSによるhTRの検出は、逆転写酵素( RT)によるhTRの最初のcDNA合成、及びそれに続くhTR特異的オリゴヌクレオチド プローブおよび標識ヌクレオチドを取り込む鎖伸長を用いるPRINS検出を包含す る。hTRのRT反応は、種々の方法により行い得る。RT反応の１つの例は、GeneAmp Thermostable rTth Reverse Transcriptase RNA PCRキット(Perkin Elmer)を用 いることによるものである。この方法において、10μｌのRT混合物(10mM Tris-H Cl pH8.3；90mM KCl；１mM MnCl2；200μM dNTP；2.5U rTth DNAポリメラーゼ； 0.4μMリターンプライマー(return primer)[例えば、R7G：5'-GGAGGGGCGAACGGGC CAGCAG-3'])を固定化され、そして透過化されたサンプル上に配置し、カバーグ ラスでシールし、マニキュアでアンカーし、鉱油で重層し、そして70℃にて30分 間インキュベーションする。その後、鉱油をキシレン中で５分間、次いで100%Et OH中で５分間洗浄することによって除去する。カバーグラスを取り外し、DepC水 、次いで100%EtOHで手短に洗浄し、そして５分間風乾する。次いで10μｌのPRIN S混合物(5%(v/v)グリセロール；10mM Tris-HCl、pH.3；100mM KCl；0.05%(w/v)T ween20；0.75mM EGTA；2.5mM MgCl2；0.4μM正方向プライマー[例えば、U3b：5' -GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG-3']；200μM dA、dG、dCTP；110μM dTTP；90 μM標識dUTP)をサンプル上に配置する。カバーグラスでシールし、マニキュアで アンカーし、鉱油で重層し、そして70℃にて30分間〜３時間インキュベーション する。次いでサンプルを70℃まで加熱した洗浄緩衝液(４×SSC；0.05%Tween20) 中で２分間３回洗浄する。次いでシグナルを観測する。 C.インサイチュRT-PCR hTRのRT-PCR検出は、逆転写酵素反応(ウイルス逆転写酵素、または熱安定性DN Aポリメラーゼの内因性RT活性による)による標的RNAのcDNA合成、及びそれに続 く標的cDNAのインサイチュPCR増幅を包含する。種々のRT反応は、第11.B節にお いて論じられるRTプロトコルを包含するhTRのcDNA合成において使用され得る。 さらに、PRINS検出法において使用される同一の緩衝液条件およびプライマーは またRT-PCR用に使用され得るが、70℃にて30分間〜３時間最終インキュベーショ ンの代わりに、サンプルをサイマルサイクラー中で30サイクル〜40サイクルの94 ℃/40秒、55℃/90秒(第11.B節を参照のこと)増幅する。PCRの後、サンプルを70 ℃まで加熱した洗浄緩衝液(４×SSC；0.05%Tween20)中で２分間３回洗浄する。 次いでシグナルを観測する。 別の改変は、GeneAmpインサイチュPCRシステム1000およびGeneAmpインサイチ ュPCRコアキット(Perkin Elmer)を用いることにより最初のRT反応から生じたcDN Aを増幅することである。 固定化され、かつ透過化されたサンプル上の１工程インサイチュRT-PCRを、Ge neAmpインサイチュPCRシステム1000(Perkin Elmer)と組み合わせてGeneAmpEZ rT th RNA PCRプロトコルを用いて行い得る。この方法は、40μｌ〜50μｌのEZRNAP CR緩衝液混合物(50mM Bicine；115mM酢酸カリウム；8%(w/v)グリセロール、pH8. 2；300μM dA、dG、dCTP；165μM dTTP；135μM標識dUTP；5U〜10UのrTth DNAポ リメラーゼ；2.5mM Mn(OAc)2；0.45μM〜１μMのhtRNA-特異的プライマー(例え ば、R7およびU3b))を、顕微鏡用スライド上の固定化され、かつ透過化されたサ ンプル上に配置する工程、および製造業者のプロトコル(GeneAmpインサイチュPC Rシステム1000、Perkin Elmer)に従って、シリコーンガスケットおよびクリップ を用いてそれをシールする工程を包含する。次いで、このサンプルをGeneAmpイ ンサイチュPCR機器中に配置し、そして94℃にて120秒間加熱し、次いで30サイク ル〜40サイクルの94℃/45秒、および60℃/45秒で増幅する。増幅後、サンプルを 洗浄し、そして上記で論じたように視覚化する。 PCR増幅時に蛍光タグを直接取り込むことから生じ得るバックグラウンドシグ ナルを減少させるために、間接検出(これは、非タグ化dNTPを用いたPCR増幅、 及びそれに続く増幅産物に特異的なタグ化ハイブリダイゼーションプローブを利 用するインサイチュハイブリダイゼーションを包含する)が使用され得る。この 方法において、シグナルを標識化dNTPまたはプライマーなしで上記任意のRT-PCR 法により増幅し、そして増幅産物を、インサイチュハイブリダイゼーションによ り検出する。 D．インサイチュPCRへの産物伸長プライマーの適用 インサイチュPCRの成功は、細胞外への細胞マトリックス内の増幅産物の漏れ を防ぐことに依存する。従って、500bpより小さいPCR産物は、インサイチュPCR にとって望ましくはないことが一般的には真実である。細胞マトリックスからの 500bpより小さいPCR産物の漏れを防ぐために、「かさ高い(bulky)」dNTP(例えば 、ビオチン、蛍光タグ、ジゴキシゲニン標識dUTP)のPCR産物への取り込みが通常 用いられる。インサイチュPCRにおける小さい産物の漏れを防ぐ他の方法は、イ ンサイチュPCRプロトコル中に産物伸長プライマーを組み込むことである。 この方法は、5'末端にて３〜４の６ｂｐ反復配列(例えば、[5'-TTTCCC-3']3-4 ]、及びそれに続く標的物に特異的な配列を含むプライマー(図４、プライマー１ )を、適切なリターンプライマー(プライマー２)、および反復配列のみからなる 第３のプライマー(プライマー３、例えば[5'-TTTCCC-3']4)と組み合わせて、イ ンサイチュPCRにおいて特異的な標的を増幅する工程を包含する。プライマー３ の存在は、プライマー３の標的PCR産物の3'末端へのぐらついた結合(staggered- binding)に起因してPCR産物を伸長する。PCR産物の伸長は、最初のPCR条件のア ニーリング温度を低下させることにより誘導され得る。 例えば、プライマー１における標的配列のアニーリング温度が60℃であれば、 サンプルは、15サイクル〜20サイクルの94℃/45℃および60℃/45℃でまず増幅さ れ、次いで15サイクル〜20サイクルの94℃/45℃および50℃/45℃で増幅される。 第２のPCR工程におけるアニーリング温度の低下は、プライマー３の反復配列へ のぐらついた結合の機会を増やすことにより伸長したPCR産物の生成を助ける。 得られた伸長PCR産物は、細胞マトリックスからの漏れがより少ない傾向になり 、これによりインサイチュPCR分析におけるシグナル保持がより良好とな る。 実施例１４ 非ヒト霊長類テロメラーゼRNA成分 他の哺乳動物のテロメラーゼRNA成分配列がヒトRNA成分の配列に基づくプライ マーを用いて得られ得ることを示すために、ヒト配列PCRプライマーを使用して 、リスザル（ヒトと比較して最も進化的に分岐した非ヒト霊長類の種の１つと考 えられている種）のゲノムDNAからのテロメラーゼRNA成分配列を増幅した。 記載のように、リスザルゲノムDNAをプライマーF3b(5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGG GCGTAG-3')およびH3＋20(5'-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3')を用いて増幅した。単一 のDNAバンドを観測し、そして次いでベクターpBluescriptII SK(Stratagene、Sa n Diego、CA)中にクローン化した。得られたクローンを逆方向ユニバーサルプラ イマー(5'-AACAGCTATGACCATG-3')、プライマー210-3'(5'-TCACGTCTCCTGCCAATTTG C-3')、またはプライマーH3＋20を用いるPCR法を用いて部分的に配列決定した。 このリスザルテロメラーゼRNA成分の得られた部分配列は以下の通りである： および ヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子配列に並べた場合、以下のアラインメントが得 られた。ここで、ヒトテロメラーゼRNA成分遺伝子の番号付け慣習を使用してい る(ハイフンは、配列アラインメントを最適化するために導入したギャップを示 す)： および 先の実施例は、本発明の種々の局面、および本発明の特定の核酸がどのように 作製されるのかを記載する。実施例は、以下の請求の範囲により包含される本発 明の多くの異なる実施態様の完全な記載を提供することを意図しない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/573 Ａ 33/573 Ｃ１２Ｎ 9/12 // Ｃ１２Ｎ 9/12 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ０８／４７２，８０２ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４８２，１１５ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ファンク， ウォルター アメリカ合衆国 カリフォルニア 94587, ユニオン シティ，メンドタ ストリー ト 4858 (72)発明者 アンドリューズ， ウィリアム エイチ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94805, リッチモンド，パーク アベニュー 6102

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋形態の哺乳動物テロメラーゼのRNA成分。 ２．以下の配列を有する請求項１に記載のRNA成分： ３．請求項２に記載のRNA成分のうちの長さが10〜500ヌクレオチドの連続配列 と同一かまたは正確に相補的な配列を含む、実質的に純粋形態のオリゴヌクレオ チド。 ４．ヒトテロメラーゼのRNA成分に結合する場合、該テロメラーゼの活性を阻 害するかまたはブロックする、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。 ５．請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを含み、そして該オリゴヌクレオチ ドに相補的であるかまたは連続して同一であるRNAの転写を駆動するために位置 するプロモーターをさらに含む、組換え発現プラスミド。 ６．前記オリゴヌクレオチドが、以下のヌクレオチド配列を含む、請求項５に 記載の組換え発現プラスミド： ７．請求項４に記載の組換え発現プラスミドで形質転換された真核生物宿主細 胞であって、哺乳動物テロメラーゼのタンパク質成分と結合して、ヌクレオチド の反復単位の配列をテロメアに付加し得るテロメラーゼ活性を生じ得るRNA分子 をコードする、真核生物宿主細胞。 ８．組換えテロメラーゼ酵素を生成する方法であって、テロメラーゼのタンパ ク質成分を発現する真核生物宿主細胞を、請求項７に記載のRNA成分をコードす る組換え発現ベクターで形質転換する工程、および該ベクターで形質転換した該 宿主細胞を、該タンパク質成分およびRNA成分が発現され、そして組み立てられ て、染色体DNAのテロメアに配列を付加し得る活性なテロメラーゼ分子を形成す る条件下で培養する工程、を包含する、方法。 ９．候補のテロメラーゼ調節剤を同定する方法であって、 (１)ヒトテロメラーゼRNA成分と実質的に同一で、そしてヒトテロメラーゼタ ンパク質に結合し得るポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、(２)実質的に 精製されたヒトテロメラーゼタンパク質、および(３)薬剤を含む、ヘテロダイマ ー化またはテロメラーゼ活性アッセイを実施する工程； 該薬剤が、該ヒトテロメラーゼRNAおよびヒトテロメラーゼタンパク質のヘテ ロダイマー化またはテロメラーゼ活性を阻害するかどうかを決定する工程； 該ヘテロダイマー化またはテロメラーゼ活性を阻害する薬剤を、テロメラーゼ 活性を阻害する候補のテロメラーゼ調節剤として同定する工程、 を包含する、方法。 １０．ヒト細胞においてテロメラーゼ活性を阻害する方法であって、少なくと も25個の連続ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を有する、転写ユニットを含 む外因性ポリヌクレオチドを細胞中に移入する工程、ここで、該ポリヌクレオチ ド配列は、該細胞において作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写を促進す る異種性の転写調節配列に作動可能に連結したヒトテロメラーゼRNA配列に実質 的に同一であるかまたは実質的に相補的である、を包含する、方法。 １１．患者において新生物状態の存在を検出する方法であって、 細胞性サンプルを患者から単離する工程； 細胞性サンプルにおいてヒトテロメラーゼRNA成分を検出して診断値を決定す る工程； 該診断値を、該細胞性サンプルと同じタイプの非新生物状態の細胞におけるヒ トテロメラーゼRNA成分発現の標準値と比較する工程； 該標準値より実質的に大きな診断値を、新生物状態の存在を示していると診断 して新生物状態の存在を示す工程、 を包含する、方法。 １２．細胞または細胞性サンプルにおいて哺乳動物テロメラーゼRNA成分の存 在を決定する方法であって、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチド、テロメラ ーゼRNA成分プライマー、または、テロメラーゼRNA成分ポリヌクレオチドまたは テロメラーゼRNA成分プライマーに相補的な配列を用いて増幅またはハイブリダ イゼーションを実施する工程、を包含する、方法。
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