JPH1028600A - テロメラーゼ活性の測定法 - Google Patents
テロメラーゼ活性の測定法Info
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- JPH1028600A JPH1028600A JP8187350A JP18735096A JPH1028600A JP H1028600 A JPH1028600 A JP H1028600A JP 8187350 A JP8187350 A JP 8187350A JP 18735096 A JP18735096 A JP 18735096A JP H1028600 A JPH1028600 A JP H1028600A
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- fluorescence
- cell
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 癌の早期発見に役立ち、細胞レベルにおける
テロメラーゼ活性を客観的な定量性を持ち、一般検査室
でも適用可能な簡便なテロメラーゼの測定方法を提供す
る。 【解決手段】 直接細胞内で蛍光ラベルした基質を用い
てテロメラーゼ延長反応を行った後、蛍光ラベルしたプ
ライマーを用いて塩基結合連鎖反応を行い、細胞内テロ
メラーゼ反応により、生じた蛍光をフローサイトメトリ
ーで定量的かつ簡便に確認する細胞内のテロメラーゼ活
性の測定方法およびテロメラーゼ陽性細胞の検出方法。
テロメラーゼ活性を客観的な定量性を持ち、一般検査室
でも適用可能な簡便なテロメラーゼの測定方法を提供す
る。 【解決手段】 直接細胞内で蛍光ラベルした基質を用い
てテロメラーゼ延長反応を行った後、蛍光ラベルしたプ
ライマーを用いて塩基結合連鎖反応を行い、細胞内テロ
メラーゼ反応により、生じた蛍光をフローサイトメトリ
ーで定量的かつ簡便に確認する細胞内のテロメラーゼ活
性の測定方法およびテロメラーゼ陽性細胞の検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌細胞の分裂・増
殖に重要な役割を果たし、臨床検査の測定対象因子とし
て重要なテロメラーゼ活性の定量的および簡易な測定方
法に関する。また、本発明は、テロメラーゼ陽性細胞の
検出方法に関する。本発明は、例えば、癌診断およびそ
の経過観察のための臨床検査技術として重要である。
殖に重要な役割を果たし、臨床検査の測定対象因子とし
て重要なテロメラーゼ活性の定量的および簡易な測定方
法に関する。また、本発明は、テロメラーゼ陽性細胞の
検出方法に関する。本発明は、例えば、癌診断およびそ
の経過観察のための臨床検査技術として重要である。
【０００２】
【従来の技術】テロメラーゼ活性の測定方法として、プ
ライマーにラジオアイソトープをラベルした後、テロメ
ラーゼ反応を行い、生じたテロメラーゼ反応生成物をポ
リメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）反応により増幅した後、該Ｐ
ＣＲ反応生成物を電気泳動に付した後オートラジオグラ
フィーにより活性を測定する方法が知られている（キム
ら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４年：
ＷＯ９５／１３３８１号公報）。
ライマーにラジオアイソトープをラベルした後、テロメ
ラーゼ反応を行い、生じたテロメラーゼ反応生成物をポ
リメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）反応により増幅した後、該Ｐ
ＣＲ反応生成物を電気泳動に付した後オートラジオグラ
フィーにより活性を測定する方法が知られている（キム
ら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４年：
ＷＯ９５／１３３８１号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の方法は、試料に
細胞抽出液等を用いるため、個々の細胞におけるテロメ
ラーゼ活性の検出ができず、テロメラーゼ活性の定量化
は困難であった。また、ラジオアイソトープおよび電気
泳動装置を用いるため、一般検査としての利用は繁雑な
操作が必要であった。このため、癌の早期発見に役立
ち、かつ細胞レベルにおけるテロメラーゼ活性を客観的
な定量性を持ち、一般検査室でも適用可能な簡便なテロ
メラーゼの測定方法が望まれている。
細胞抽出液等を用いるため、個々の細胞におけるテロメ
ラーゼ活性の検出ができず、テロメラーゼ活性の定量化
は困難であった。また、ラジオアイソトープおよび電気
泳動装置を用いるため、一般検査としての利用は繁雑な
操作が必要であった。このため、癌の早期発見に役立
ち、かつ細胞レベルにおけるテロメラーゼ活性を客観的
な定量性を持ち、一般検査室でも適用可能な簡便なテロ
メラーゼの測定方法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記課
題を解決するために、直接細胞内で蛍光ラベルした基質
を用いてテロメラーゼ延長反応を行った後、蛍光ラベル
したプライマーを用いて塩基結合連鎖反応（ＰＣＲ反
応）を行い、細胞内テロメラーゼ反応により生じた蛍光
をフローサイトメトリーで定量的かつ簡便に確認すると
いう画期的な細胞内のテロメラーゼ活性の測定方法がお
よび測定試薬が提供される。また、該測定方法の途中で
得られたフローサイトメトリーのヒストグラムを分析す
ることにより、テロメラーゼ陽性細胞の検出方法および
検出試薬が提供される。
題を解決するために、直接細胞内で蛍光ラベルした基質
を用いてテロメラーゼ延長反応を行った後、蛍光ラベル
したプライマーを用いて塩基結合連鎖反応（ＰＣＲ反
応）を行い、細胞内テロメラーゼ反応により生じた蛍光
をフローサイトメトリーで定量的かつ簡便に確認すると
いう画期的な細胞内のテロメラーゼ活性の測定方法がお
よび測定試薬が提供される。また、該測定方法の途中で
得られたフローサイトメトリーのヒストグラムを分析す
ることにより、テロメラーゼ陽性細胞の検出方法および
検出試薬が提供される。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、（１）細胞内でテロメ
ラーゼによるテロメラーゼ基質の延長反応を行う工程、
（２）得られた延長反応生成物を細胞内で塩基結合連鎖
反応に付す工程、および（３）フローサイトメトリーを
用いて細胞中の反応生成物の蛍光を定量することを特徴
とするテロメラーゼ活性の測定方法に関する。また、本
発明は（１）細胞内でテロメラーゼによるテロメラーゼ
基質の延長反応を行う工程、（２）得られた延長反応生
成物を細胞内で塩基結合連鎖反応に付す工程、および
（３）フローサイトメトリーを用いて細胞中の反応生成
物の蛍光を定量することを特徴とするテロメラーゼ陽性
細胞の検出方法に関する。
ラーゼによるテロメラーゼ基質の延長反応を行う工程、
（２）得られた延長反応生成物を細胞内で塩基結合連鎖
反応に付す工程、および（３）フローサイトメトリーを
用いて細胞中の反応生成物の蛍光を定量することを特徴
とするテロメラーゼ活性の測定方法に関する。また、本
発明は（１）細胞内でテロメラーゼによるテロメラーゼ
基質の延長反応を行う工程、（２）得られた延長反応生
成物を細胞内で塩基結合連鎖反応に付す工程、および
（３）フローサイトメトリーを用いて細胞中の反応生成
物の蛍光を定量することを特徴とするテロメラーゼ陽性
細胞の検出方法に関する。
【０００６】本発明における細胞内でテロメラーゼによ
るテロメラーゼ基質の延長反応を行う工程とは、試料と
して用いる細胞にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体およ
びデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツを添加する
ことにより、細胞内でテロメラーゼ基質延長反応を行う
ことをいう。
るテロメラーゼ基質の延長反応を行う工程とは、試料と
して用いる細胞にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体およ
びデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツを添加する
ことにより、細胞内でテロメラーゼ基質延長反応を行う
ことをいう。
【０００７】試料として用いる細胞とは、血液細胞、リ
ンパ系細胞、培養細胞、浮遊細胞等フローサイトメトリ
ーで分離できる細胞であればどのようなものでもよい。
生体等から採取した細胞を、細胞培養液またはｐＨ６．
５〜８．５、濃度１〜３００ｍＭのリン酸緩衝液等に浮
遊させるか、またはシラン処理をしたミクロチューブ容
器上に静置した状態で基質延長反応に用いることができ
る。なお、細胞は採取後、１５Ｃ°以下、好ましくは４
Ｃ°で冷却保存し、速やかに基質延長反応に用いること
が好ましい。細胞培養液は、通常、浮遊細胞の培養に用
いるものであればどのようなものでもよいが、ＲＰＭＩ
１６４０、ダルベッコ変法ミネラルエッセンシャル培地
等を用いることが好ましい。
ンパ系細胞、培養細胞、浮遊細胞等フローサイトメトリ
ーで分離できる細胞であればどのようなものでもよい。
生体等から採取した細胞を、細胞培養液またはｐＨ６．
５〜８．５、濃度１〜３００ｍＭのリン酸緩衝液等に浮
遊させるか、またはシラン処理をしたミクロチューブ容
器上に静置した状態で基質延長反応に用いることができ
る。なお、細胞は採取後、１５Ｃ°以下、好ましくは４
Ｃ°で冷却保存し、速やかに基質延長反応に用いること
が好ましい。細胞培養液は、通常、浮遊細胞の培養に用
いるものであればどのようなものでもよいが、ＲＰＭＩ
１６４０、ダルベッコ変法ミネラルエッセンシャル培地
等を用いることが好ましい。
【０００８】本発明においてテロメラーゼ（ＥＣ２．
７．７．３１）とは、自己複製能を持つ線状染色体に必
要な末端構造であるテロメアの繰り返し配列（テロメア
反復配列）の合成に関与する酵素を意味する。テロメア
とは、直鎖状染色体の末端部分を意味し、テロメア反復
配列とは、テロメアに局在化している特定塩基配列の反
復配列を表す。
７．７．３１）とは、自己複製能を持つ線状染色体に必
要な末端構造であるテロメアの繰り返し配列（テロメア
反復配列）の合成に関与する酵素を意味する。テロメア
とは、直鎖状染色体の末端部分を意味し、テロメア反復
配列とは、テロメアに局在化している特定塩基配列の反
復配列を表す。
【０００９】テロメラーゼ基質は、テロメリック配列を
含まないオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、
５’−ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧ−３’、
５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’等
も用いることができるが、とりわけ好ましくは、ＴＳプ
ライマー（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴ
Ｔ−３’）を用いる。
含まないオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、
５’−ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧ−３’、
５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’等
も用いることができるが、とりわけ好ましくは、ＴＳプ
ライマー（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴ
Ｔ−３’）を用いる。
【００１０】テロメラーゼ基質の蛍光標識化体とは、蛍
光標識を結合したテロメラーゼ基質を含むテロメラーゼ
基質を意味する。蛍光標識を結合したテロメラーゼ基質
はテロメラーゼ基質に、蛍光ホスフォアミダイト（クロ
ーンテック社製）等の蛍光試薬を結合させることにより
得ることができる（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９
２年、コールドスプリングハーバーラボラトリー社
刊）。
光標識を結合したテロメラーゼ基質を含むテロメラーゼ
基質を意味する。蛍光標識を結合したテロメラーゼ基質
はテロメラーゼ基質に、蛍光ホスフォアミダイト（クロ
ーンテック社製）等の蛍光試薬を結合させることにより
得ることができる（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９
２年、コールドスプリングハーバーラボラトリー社
刊）。
【００１１】デオキシヌクレオシドトリフォスフェーツ
とは、デオキシヌクレオシドトリフォスフェートの混合
物を意味し、デオキシアデノシントリフォスフェート、
デオキシグアノシントリフォスフェート、デオキシシチ
ジントリフォスフェートおよびデオキシチミジントリフ
ォスフェートからなる。
とは、デオキシヌクレオシドトリフォスフェートの混合
物を意味し、デオキシアデノシントリフォスフェート、
デオキシグアノシントリフォスフェート、デオキシシチ
ジントリフォスフェートおよびデオキシチミジントリフ
ォスフェートからなる。
【００１２】テロメラーゼ基質延長反応とは、細胞中の
テロメラーゼによりテロメラーゼ基質の蛍光体を基点と
するテロメア反復配列を合成する反応をいう。より詳細
には、細胞中のテロメラーゼによりテロメラーゼ基質の
蛍光体にデオキシアデノシントリフォスフェート等の各
デオキシヌクレオシドトリフォスフェートがテロメア反
復配列に従って結合される結果、テロメラーゼ基質の延
長体が合成されることをいう。
テロメラーゼによりテロメラーゼ基質の蛍光体を基点と
するテロメア反復配列を合成する反応をいう。より詳細
には、細胞中のテロメラーゼによりテロメラーゼ基質の
蛍光体にデオキシアデノシントリフォスフェート等の各
デオキシヌクレオシドトリフォスフェートがテロメア反
復配列に従って結合される結果、テロメラーゼ基質の延
長体が合成されることをいう。
【００１３】テロメラーゼ基質延長反応は、ライトの方
法（ライトら、ヌクレオシド アシド リサーチ２３
巻、３７９４頁、１９９５年）等に記載されている手法
で行えばよい。細胞にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体
およびデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツを含ん
だ緩衝液を添加した後、インキュベートする。この際細
胞が浮遊液の状態にあるときは、遠心分離の後、ミクロ
チューブの底等に沈降した細胞に該緩衝液を添加して反
応を開始させることが好ましい。この際、緩衝液に塩基
結合酵素連鎖反応に用いる耐熱性（Ｔａｑ）塩基結合酵
素およびプライマーのどちらかを加えておくことが好ま
しい。また、インキュベーションは暗箱中で行うことが
好ましい。
法（ライトら、ヌクレオシド アシド リサーチ２３
巻、３７９４頁、１９９５年）等に記載されている手法
で行えばよい。細胞にテロメラーゼ基質の蛍光標識化体
およびデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツを含ん
だ緩衝液を添加した後、インキュベートする。この際細
胞が浮遊液の状態にあるときは、遠心分離の後、ミクロ
チューブの底等に沈降した細胞に該緩衝液を添加して反
応を開始させることが好ましい。この際、緩衝液に塩基
結合酵素連鎖反応に用いる耐熱性（Ｔａｑ）塩基結合酵
素およびプライマーのどちらかを加えておくことが好ま
しい。また、インキュベーションは暗箱中で行うことが
好ましい。
【００１４】緩衝液とは、濃度１〜１００ｍＭで、ｐＨ
６〜９、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の緩衝液であれ
ばどのようなものでもよいが、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液等を用いることが好ましい。該緩衝液には塩化
カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグ
ネシウム等の金属塩、ポリオキシエチレン ソルビタン
モノラウレート（以下、ツイン２０という）等の界面活
性剤、エチレングリール ビス（２−アミノエチルエチ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラアセテックアシド
（以下、ＥＧＴＡという）等のキレート剤、Ｔ４ジーン
３２プロテイン、牛血清アルブミン等の蛋白質を添加し
てもよい。
６〜９、好ましくはｐＨ７．５〜８．５の緩衝液であれ
ばどのようなものでもよいが、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液等を用いることが好ましい。該緩衝液には塩化
カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグ
ネシウム等の金属塩、ポリオキシエチレン ソルビタン
モノラウレート（以下、ツイン２０という）等の界面活
性剤、エチレングリール ビス（２−アミノエチルエチ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラアセテックアシド
（以下、ＥＧＴＡという）等のキレート剤、Ｔ４ジーン
３２プロテイン、牛血清アルブミン等の蛋白質を添加し
てもよい。
【００１５】プライマーとしては、塩基結合酵素連鎖反
応にＰＣＲ反応を用いる場合は、不完全なテロメリック
反復配列（５’−ＣＣＣＴＴＡ−３’）と完全なテロメ
リック反復配列（５’−ＣＣＣＴＡＡ−３’）から構成
されるものが用いられ、３個の不完全なテロメリック反
復配列と１個の完全なテロメリック反復配列から構成さ
れる蛍光標識化ＣＸリバースプライマー（５’−ＣＣＣ
ＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−３’）
を用いることが好ましい。また、塩基結合酵素連鎖反応
にリガーゼ連鎖（ＬＣＲ）反応を用いる場合は、Ｃリッ
チテロメリック配列（５’−ＣＴＡＡＣＣ−３’）から
構成されるものが用いられ、蛍光標識化ＡＣＴプライマ
ー（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ
ＡＡＣＣ−３’）を用いることが好ましい。
応にＰＣＲ反応を用いる場合は、不完全なテロメリック
反復配列（５’−ＣＣＣＴＴＡ−３’）と完全なテロメ
リック反復配列（５’−ＣＣＣＴＡＡ−３’）から構成
されるものが用いられ、３個の不完全なテロメリック反
復配列と１個の完全なテロメリック反復配列から構成さ
れる蛍光標識化ＣＸリバースプライマー（５’−ＣＣＣ
ＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−３’）
を用いることが好ましい。また、塩基結合酵素連鎖反応
にリガーゼ連鎖（ＬＣＲ）反応を用いる場合は、Ｃリッ
チテロメリック配列（５’−ＣＴＡＡＣＣ−３’）から
構成されるものが用いられ、蛍光標識化ＡＣＴプライマ
ー（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ
ＡＡＣＣ−３’）を用いることが好ましい。
【００１６】該プライマーまたは本明細書に記載された
以下のオリゴヌクレオチド・プライマー等は、ＤＮＡ自
動合成機等を用いる常法により得ることができる。蛍光
標識化ＣＸリバースプライマーまたは蛍光標識化ＡＣＴ
プライマーとは、蛍光標識を結合したＣＸリバースプラ
イマーまたはＡＣＴプライマーを意味する。蛍光標識を
結合したＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマ
ーはＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマー
に、蛍光ホスフォアミダイト（クローンテック社製）等
の蛍光試薬を結合させることにより得ることができる
（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９２年、コールドス
プリングハーバーラボラトリー刊）。
以下のオリゴヌクレオチド・プライマー等は、ＤＮＡ自
動合成機等を用いる常法により得ることができる。蛍光
標識化ＣＸリバースプライマーまたは蛍光標識化ＡＣＴ
プライマーとは、蛍光標識を結合したＣＸリバースプラ
イマーまたはＡＣＴプライマーを意味する。蛍光標識を
結合したＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマ
ーはＣＸリバースプライマーまたはＡＣＴプライマー
に、蛍光ホスフォアミダイト（クローンテック社製）等
の蛍光試薬を結合させることにより得ることができる
（牧野ら、ＰＣＲ方法と応用、１９９２年、コールドス
プリングハーバーラボラトリー刊）。
【００１７】耐熱性（Ｔａｑ）塩基結合酵素は、塩基結
合酵素連鎖反応にＰＣＲ反応を用いる場合はＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．７．７）を表し、
ＬＣＲ反応を用いる場合はＴａｑ ＤＮＡリガーゼ
（Ｅ．Ｃ．６．５．１．１）を表す。塩基結合酵素連鎖
反応としては、ＰＣＲ反応またはＬＣＲ反応が挙げら
れ、該反応のいずれかひとつを選択することにより、耐
熱性塩基結合酵素およびプライマーが上記のように決定
される。
合酵素連鎖反応にＰＣＲ反応を用いる場合はＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．７．７）を表し、
ＬＣＲ反応を用いる場合はＴａｑ ＤＮＡリガーゼ
（Ｅ．Ｃ．６．５．１．１）を表す。塩基結合酵素連鎖
反応としては、ＰＣＲ反応またはＬＣＲ反応が挙げら
れ、該反応のいずれかひとつを選択することにより、耐
熱性塩基結合酵素およびプライマーが上記のように決定
される。
【００１８】より具体的には、テロメラーゼ基質延長反
応生成物とプライマーとを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を用いて増幅させるＰＣＲ反応に付する場合（サイキ
ら、サイエンス、２３９巻、４８７頁、１９８８年；キ
ムら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４
年）、またはテロメラーゼ基質延長反応生成物とプライ
マーとを、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを用いて増幅させる
ＬＣＲ反応に付する場合（バラニーら、プロシーデング
オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンス Ａ
８７巻、１８７４頁、１９８７）が挙げられる。上記の
ように耐熱性塩基結合酵素およびプライマーが適当に組
み合わされることにより塩基連結酵素連鎖反応が開始さ
れるが、該反応を行うには、市販の自動ＰＣＲシステム
（商品名サーマルサイクラー、パーキンエルマー社製）
等を用いることが好ましい。
応生成物とプライマーとを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を用いて増幅させるＰＣＲ反応に付する場合（サイキ
ら、サイエンス、２３９巻、４８７頁、１９８８年；キ
ムら、サイエンス、２６６巻、２０１１頁、１９９４
年）、またはテロメラーゼ基質延長反応生成物とプライ
マーとを、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを用いて増幅させる
ＬＣＲ反応に付する場合（バラニーら、プロシーデング
オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンス Ａ
８７巻、１８７４頁、１９８７）が挙げられる。上記の
ように耐熱性塩基結合酵素およびプライマーが適当に組
み合わされることにより塩基連結酵素連鎖反応が開始さ
れるが、該反応を行うには、市販の自動ＰＣＲシステム
（商品名サーマルサイクラー、パーキンエルマー社製）
等を用いることが好ましい。
【００１９】塩基連結酵素連鎖反応終了後、遠心分離を
行い得られた細胞を上記の緩衝液で洗浄する。得られた
細胞をフローサイトメトリーに用いられるよう、常法に
より再び緩衝液中に浮遊させる（細谷ら、蛋白質、核酸
酵素３９巻、１８８８−１８９８頁、１９９４年）。得
られたサンプルをフルオロサイトメーターに注入するこ
とにより、細胞中の蛍光強度をフルオロサイトメトリー
により検出することができる。この際、得られた試料の
総蛍光強度を求めれば、試料中のテロメラーゼ活性を定
量することができる。また、ソーターを用いて試料中の
細胞を分離した場合は、各細胞群におけるテロメラーゼ
活性を定量することができる。さらに、試料中の細胞の
大きさ、蛍光強度等を事象としてヒストグラムを作成す
ることにより、テロメラーゼ陽性細胞の検出および総細
胞数に対する陽性細胞の比率を確認することができる。
行い得られた細胞を上記の緩衝液で洗浄する。得られた
細胞をフローサイトメトリーに用いられるよう、常法に
より再び緩衝液中に浮遊させる（細谷ら、蛋白質、核酸
酵素３９巻、１８８８−１８９８頁、１９９４年）。得
られたサンプルをフルオロサイトメーターに注入するこ
とにより、細胞中の蛍光強度をフルオロサイトメトリー
により検出することができる。この際、得られた試料の
総蛍光強度を求めれば、試料中のテロメラーゼ活性を定
量することができる。また、ソーターを用いて試料中の
細胞を分離した場合は、各細胞群におけるテロメラーゼ
活性を定量することができる。さらに、試料中の細胞の
大きさ、蛍光強度等を事象としてヒストグラムを作成す
ることにより、テロメラーゼ陽性細胞の検出および総細
胞数に対する陽性細胞の比率を確認することができる。
【００２０】フローサイトメトリーを用いて検出すると
は、例えば、細胞中に存在するＰＣＲ反応により増幅さ
れた蛍光標識した塩基連結酵素連鎖反応の産物に、励起
波長４８８ｎｍのレーザー光を照射し、１度に細胞１個
づつ通過する度に５個の光学検出器を用いて５種類のパ
ラメーターを測定し、蛍光標識された細胞を検出するこ
とを示す。５種類のパラメーターとは、前方散乱光（Ｆ
ＳＣ：フォワードスキャター）、側方散乱光（ＳＳＣ：
サイドスキャター）、そして３種類の蛍光（ＦＬ：フル
オレッセンス）である。該反応により増幅された蛍光標
識プライマーは、レーザー光に対して垂直方向で検出さ
れる（矢田純一、藤原道夫編：リンパ球機能検索法、中
外医学社、１９９４年、１５〜５３頁）。該反応の検出
を行うには、市販のフローサイトメーター等を用いるこ
とが好ましい。〔ＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２２ ９６５−９７４（１９９４）〕。なお、フロー
サイトメトリーにおけるレーザー光の波長等の条件は、
プライマー等にラベルされる蛍光試薬の種類によって変
化させることもできる。
は、例えば、細胞中に存在するＰＣＲ反応により増幅さ
れた蛍光標識した塩基連結酵素連鎖反応の産物に、励起
波長４８８ｎｍのレーザー光を照射し、１度に細胞１個
づつ通過する度に５個の光学検出器を用いて５種類のパ
ラメーターを測定し、蛍光標識された細胞を検出するこ
とを示す。５種類のパラメーターとは、前方散乱光（Ｆ
ＳＣ：フォワードスキャター）、側方散乱光（ＳＳＣ：
サイドスキャター）、そして３種類の蛍光（ＦＬ：フル
オレッセンス）である。該反応により増幅された蛍光標
識プライマーは、レーザー光に対して垂直方向で検出さ
れる（矢田純一、藤原道夫編：リンパ球機能検索法、中
外医学社、１９９４年、１５〜５３頁）。該反応の検出
を行うには、市販のフローサイトメーター等を用いるこ
とが好ましい。〔ＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２２ ９６５−９７４（１９９４）〕。なお、フロー
サイトメトリーにおけるレーザー光の波長等の条件は、
プライマー等にラベルされる蛍光試薬の種類によって変
化させることもできる。
【００２１】以下に、本発明方法の詳細について説明す
る。生体から採取した検体から常法により遠心分離法等
を用いて細胞を採取する。検体は組織から細切後に分離
した細胞でも可能である。得られた細胞を細胞培養液
（ＲＰＭＩ １６４０等）あるいは燐酸緩衝液等で洗浄
した後、ミクロチューブに回収し、遠心により上清を除
く。１〜１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝６〜
９）に１〜１０００ｐｍｏｌ好ましくは５〜２００ｐｍ
ｏｌ、とりわけ好ましくは１０ｐｍｏｌの蛍光標識化Ｔ
Ｓプライマー（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡ
ＧＴＴ−３’）、１〜３００ｍＭのデオキシヌクレオシ
ドトリフォスフェーツおよび０．１〜２０ユニットのＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有させミクロチューブ内
の試料に添加し、細胞を懸濁する。１０〜５０℃、好ま
しくは２０〜４０℃、とりわけ好ましくは２２℃で、１
０分〜１時間、好ましくは３０分、暗箱中でインキュベ
ートする。
る。生体から採取した検体から常法により遠心分離法等
を用いて細胞を採取する。検体は組織から細切後に分離
した細胞でも可能である。得られた細胞を細胞培養液
（ＲＰＭＩ １６４０等）あるいは燐酸緩衝液等で洗浄
した後、ミクロチューブに回収し、遠心により上清を除
く。１〜１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝６〜
９）に１〜１０００ｐｍｏｌ好ましくは５〜２００ｐｍ
ｏｌ、とりわけ好ましくは１０ｐｍｏｌの蛍光標識化Ｔ
Ｓプライマー（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡ
ＧＴＴ−３’）、１〜３００ｍＭのデオキシヌクレオシ
ドトリフォスフェーツおよび０．１〜２０ユニットのＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有させミクロチューブ内
の試料に添加し、細胞を懸濁する。１０〜５０℃、好ま
しくは２０〜４０℃、とりわけ好ましくは２２℃で、１
０分〜１時間、好ましくは３０分、暗箱中でインキュベ
ートする。
【００２２】ＴＳプライマー延長反応が終了した後、１
〜３００ｐｍｏｌ、好ましくは５０〜２００ｐｍｏｌ、
とりわけ好ましくは１０ｐｍｏｌの蛍光標識化ＣＸリバ
ースプライマー（５’−ＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣ
ＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−３’）を添加する。これにより
ＰＣＲ反応が開始されるが、ＰＣＲ反応の熱反応サイク
ルは、例えば９０〜１００℃の温度で１〜１２０秒間、
４０〜６０℃の温度で１〜１２０秒間、６０〜８０℃の
温度で１〜２４０秒間のサイクルを１〜５０回行えばよ
い。ＰＣＲ反応を行うため、上記のサーマルサイクラー
等を用いることが好ましい。
〜３００ｐｍｏｌ、好ましくは５０〜２００ｐｍｏｌ、
とりわけ好ましくは１０ｐｍｏｌの蛍光標識化ＣＸリバ
ースプライマー（５’−ＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣ
ＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−３’）を添加する。これにより
ＰＣＲ反応が開始されるが、ＰＣＲ反応の熱反応サイク
ルは、例えば９０〜１００℃の温度で１〜１２０秒間、
４０〜６０℃の温度で１〜１２０秒間、６０〜８０℃の
温度で１〜２４０秒間のサイクルを１〜５０回行えばよ
い。ＰＣＲ反応を行うため、上記のサーマルサイクラー
等を用いることが好ましい。
【００２３】ＰＣＲ反応終了後、細胞を燐酸緩衝液で洗
浄した後、再度、燐酸緩衝液に懸濁し、フローサイトメ
ーターを用いて、試料中のテロメラーゼ活性の定量、ソ
ーターで分取した細胞群別のテロメラーゼ活性の定量お
よび試料中のテロメラーゼ陽性細胞の比率を確認するこ
とができる。フローサイトメトリーを用いての陽性細胞
の比率の確認とは、例えば、ＰＣＲ反応のみを行わなか
った細胞における蛍光発色を陰性として、ＰＣＲ反応後
の細胞における蛍光発色細胞を陽性として、細胞数の総
和での引き算を行い、蛍光の増加した細胞の比率から陽
性細胞を算出することを示す。
浄した後、再度、燐酸緩衝液に懸濁し、フローサイトメ
ーターを用いて、試料中のテロメラーゼ活性の定量、ソ
ーターで分取した細胞群別のテロメラーゼ活性の定量お
よび試料中のテロメラーゼ陽性細胞の比率を確認するこ
とができる。フローサイトメトリーを用いての陽性細胞
の比率の確認とは、例えば、ＰＣＲ反応のみを行わなか
った細胞における蛍光発色を陰性として、ＰＣＲ反応後
の細胞における蛍光発色細胞を陽性として、細胞数の総
和での引き算を行い、蛍光の増加した細胞の比率から陽
性細胞を算出することを示す。
【００２４】また、本発明で用いられている、テロメラ
ーゼ基質、プライマー、デオキシヌクレシドトリフォス
フェート、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ジーン３２
プロテイン等の化合物、上記の緩衝液、洗浄液またはそ
れに含まれる上記の各種添加剤を、本発明に用いるミク
ロチューブ等の器具のいずれかを組み合わせることによ
り、テロメラーゼ活性の測定試薬およびテロメラーゼ陽
性細胞の検出試薬が提供される。
ーゼ基質、プライマー、デオキシヌクレシドトリフォス
フェート、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ジーン３２
プロテイン等の化合物、上記の緩衝液、洗浄液またはそ
れに含まれる上記の各種添加剤を、本発明に用いるミク
ロチューブ等の器具のいずれかを組み合わせることによ
り、テロメラーゼ活性の測定試薬およびテロメラーゼ陽
性細胞の検出試薬が提供される。
【００２５】
実施例１ 白血病細胞株、Ｋ５６２細胞を採取した。得られた細胞
を４℃のＲＰＭＩ１６４０培養液で洗浄した後、４℃の
状態で遠心機を用いて回収し、ミクロチューブに細胞を
移した。２５μｌの２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
６〜９）［塩化マグネシウム１．５ｍＭ、塩化カリウム
６３ｍＭ、ツイン２０（商品名）０．０５％、ＥＧＴＡ
１μＭ、Ｔ４ジーン３２プロテイン１μｇ／ｍｌ（ベー
リンガーマンハイム社製）、牛血清アルブミン（０．１
ｍｇ／ｍｌ）含有］に、１０ｐｍｏｌの蛍光標識化ＴＳ
プライマー（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧ
ＴＴ−３’）［ファルマバイオテック社製〕、５０ｍＭ
のデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツおよび２ユ
ニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有させ、ミク
ロチューブ内の試料に添加した。ミクロチューブを２２
℃で、３０分間暗箱中でインキュベートした。
を４℃のＲＰＭＩ１６４０培養液で洗浄した後、４℃の
状態で遠心機を用いて回収し、ミクロチューブに細胞を
移した。２５μｌの２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
６〜９）［塩化マグネシウム１．５ｍＭ、塩化カリウム
６３ｍＭ、ツイン２０（商品名）０．０５％、ＥＧＴＡ
１μＭ、Ｔ４ジーン３２プロテイン１μｇ／ｍｌ（ベー
リンガーマンハイム社製）、牛血清アルブミン（０．１
ｍｇ／ｍｌ）含有］に、１０ｐｍｏｌの蛍光標識化ＴＳ
プライマー（５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧ
ＴＴ−３’）［ファルマバイオテック社製〕、５０ｍＭ
のデオキシヌクレオシドトリフォスフェーツおよび２ユ
ニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有させ、ミク
ロチューブ内の試料に添加した。ミクロチューブを２２
℃で、３０分間暗箱中でインキュベートした。
【００２６】ＴＳプライマー延長反応が終了した後、Ｔ
Ｓプライマーの不活性化を目的として、９０℃の温度
で、１．５分間処理した。その後、２５μｌの１０ｐｍ
ｏｌの蛍光標識化ＣＸリバースプライマー（５’−ＣＣ
ＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−
３’）をミクロチューブ内の試料に添加した。これによ
り、ＰＣＲ反応が開始されるが、ＰＣＲは上記のサーマ
ルサイクラー中で行った。熱サイクルは９４℃の温度で
３０秒間、５０℃の温度で３０秒間、７２℃の温度で９
０秒間のサイクルを３０回行った。ＰＣＲ反応終了後、
ミクロチューブ内の試料を燐酸緩衝液（ｐＨ＝６．４）
で２回洗浄した後、１００μｌの燐酸緩衝液に浮遊し
た。蛍光標識した細胞をフローサイトメトリーを用い
て、試料中のテロメラーゼ陽性細胞の比率を確認した。
フローサイトメトリーの検討にはＰＣＲ反応細胞を１
０，０００個を用い、各々の細胞の蛍光強度を横軸に、
細胞の大きさを縦軸に検出できるようにフローサイトメ
トリーを設定した（図１Ａ）。
Ｓプライマーの不活性化を目的として、９０℃の温度
で、１．５分間処理した。その後、２５μｌの１０ｐｍ
ｏｌの蛍光標識化ＣＸリバースプライマー（５’−ＣＣ
ＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ−
３’）をミクロチューブ内の試料に添加した。これによ
り、ＰＣＲ反応が開始されるが、ＰＣＲは上記のサーマ
ルサイクラー中で行った。熱サイクルは９４℃の温度で
３０秒間、５０℃の温度で３０秒間、７２℃の温度で９
０秒間のサイクルを３０回行った。ＰＣＲ反応終了後、
ミクロチューブ内の試料を燐酸緩衝液（ｐＨ＝６．４）
で２回洗浄した後、１００μｌの燐酸緩衝液に浮遊し
た。蛍光標識した細胞をフローサイトメトリーを用い
て、試料中のテロメラーゼ陽性細胞の比率を確認した。
フローサイトメトリーの検討にはＰＣＲ反応細胞を１
０，０００個を用い、各々の細胞の蛍光強度を横軸に、
細胞の大きさを縦軸に検出できるようにフローサイトメ
トリーを設定した（図１Ａ）。
【００２７】フローサイトメトリーで計測した細胞の大
きさおよび蛍光強度をゲートし（図１Ａの枠内）、フロ
ーサイトメトリーに付属するコンピューターを用いて、
個々の細胞の蛍光強度を積算し、横軸に蛍光強度、縦軸
に細胞数を表わすように設定した（図１Ｄ）。同様に、
ＰＣＲ反応のみを行わなかった細胞における蛍光強度と
細胞数を計測し（図２−Ｄ）、テロメラーゼ陽性細胞の
検出は蛍光プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った細胞
と（図１Ｄ）、ＰＣＲ反応のみを行わなかった細胞にお
ける蛍光標識細胞（図２−Ｄ）との差を求め（図３）、
その差を蛍光の増強していた細胞に由来する増強率と
し、これをテロメラーゼ陽性細胞率として算出した。
きさおよび蛍光強度をゲートし（図１Ａの枠内）、フロ
ーサイトメトリーに付属するコンピューターを用いて、
個々の細胞の蛍光強度を積算し、横軸に蛍光強度、縦軸
に細胞数を表わすように設定した（図１Ｄ）。同様に、
ＰＣＲ反応のみを行わなかった細胞における蛍光強度と
細胞数を計測し（図２−Ｄ）、テロメラーゼ陽性細胞の
検出は蛍光プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った細胞
と（図１Ｄ）、ＰＣＲ反応のみを行わなかった細胞にお
ける蛍光標識細胞（図２−Ｄ）との差を求め（図３）、
その差を蛍光の増強していた細胞に由来する増強率と
し、これをテロメラーゼ陽性細胞率として算出した。
【００２８】フローサイトメトリーで確認したＫ５６２
細胞由来の蛍光シグナルがテロメラーゼ活性に依存する
ものであるか否かを確認するため、蛍光標識プライマー
による伸長反応およびＰＣＲ反応後の同検体をスライド
ガラスに固着させ、蛍光顕微鏡で観察した。なお、蛍光
顕微鏡で観察するとは、Ｇ−フィルターを用いて蛍光標
識した細胞が該反応により破壊されていないかどうかを
形態学的に確認することを指す。ＰＣＲ反応のみを施さ
なかったサンプル（図２−Ｄ）、および蛍光標識プライ
マーのみを添加しないサンプルにおいては蛍光の減弱を
認めたことから、蛍光ピークが細胞内のテロメラーゼに
より合成されたＰＣＲ産物に由来することが裏付けられ
た。上記の方法により、テロメラーゼ陽性細胞を、ＰＣ
Ｒ反応のみを行わなかった細胞における蛍光標識細胞と
の差（図３）を求め、蛍光の増強していた細胞を陽性細
胞としてコンピューターにより計算したところ陽性率は
３９．３％であった。
細胞由来の蛍光シグナルがテロメラーゼ活性に依存する
ものであるか否かを確認するため、蛍光標識プライマー
による伸長反応およびＰＣＲ反応後の同検体をスライド
ガラスに固着させ、蛍光顕微鏡で観察した。なお、蛍光
顕微鏡で観察するとは、Ｇ−フィルターを用いて蛍光標
識した細胞が該反応により破壊されていないかどうかを
形態学的に確認することを指す。ＰＣＲ反応のみを施さ
なかったサンプル（図２−Ｄ）、および蛍光標識プライ
マーのみを添加しないサンプルにおいては蛍光の減弱を
認めたことから、蛍光ピークが細胞内のテロメラーゼに
より合成されたＰＣＲ産物に由来することが裏付けられ
た。上記の方法により、テロメラーゼ陽性細胞を、ＰＣ
Ｒ反応のみを行わなかった細胞における蛍光標識細胞と
の差（図３）を求め、蛍光の増強していた細胞を陽性細
胞としてコンピューターにより計算したところ陽性率は
３９．３％であった。
【００２９】実施例２ 同様の方法を用いて、各種の細胞におけるテロメラーゼ
陽性細胞をフローサイトメトリーを用いて算出した。結
果を表１に示す。
陽性細胞をフローサイトメトリーを用いて算出した。結
果を表１に示す。
【表１】 細胞の由来 テロメラーゼ陽性細胞 正常人末梢血単核球細胞 ４．２９％ ＰＨＡ−刺激正常人単核球細胞 ６４．５２％ 白血病細胞株 ＨＥＬ ６７．０２％ ＭＬ−１ ６５．１８％ Ｕ９３７ ５４．７４％ ＨＡＬ−０１ ６５．６３％ ＴＡＬＬ２ ２７．００％ ＨＬ６０ ９７．１９％
【００３０】表１によれば、これらの細胞を用いた従来
のテロメラーゼ活性測定法でも正常人単核球細胞ではテ
ロメラーゼ活性は０．８と低く、一方白血病細胞株では
高いテロメラーゼ活性が見られることを確認した（大屋
敷一馬ほか、インターナショナル ジャーナル オブ
オンコロジー、１９９６年、８巻、４１７頁）。このこ
とより、ＰＣＲ法により増強している蛍光はテロメラー
ゼ活性に由来するものであることが判明した。以上、本
願のフローサイトメトリーを用いた細胞内テロメラーゼ
測定方法により、細胞等のテロメラーゼ活性が定量的に
かつ簡単に測定でき、テロメラーゼ活性陽性細胞の比率
が測定できることが確認された。
のテロメラーゼ活性測定法でも正常人単核球細胞ではテ
ロメラーゼ活性は０．８と低く、一方白血病細胞株では
高いテロメラーゼ活性が見られることを確認した（大屋
敷一馬ほか、インターナショナル ジャーナル オブ
オンコロジー、１９９６年、８巻、４１７頁）。このこ
とより、ＰＣＲ法により増強している蛍光はテロメラー
ゼ活性に由来するものであることが判明した。以上、本
願のフローサイトメトリーを用いた細胞内テロメラーゼ
測定方法により、細胞等のテロメラーゼ活性が定量的に
かつ簡単に測定でき、テロメラーゼ活性陽性細胞の比率
が測定できることが確認された。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、臨床診断上重要なテロメ
ラーゼ陽性細胞の測定に有用な測定方法および試薬が提
供される。本発明は臨床医学上多用される癌の細胞診断
に適用可能であり、フローサイトメトリーを用いること
により簡便にテロメラーゼ陽性細胞の比率を計測する方
法であるため、臨床検査、病理検査等に活用される。
ラーゼ陽性細胞の測定に有用な測定方法および試薬が提
供される。本発明は臨床医学上多用される癌の細胞診断
に適用可能であり、フローサイトメトリーを用いること
により簡便にテロメラーゼ陽性細胞の比率を計測する方
法であるため、臨床検査、病理検査等に活用される。
【００３２】
【００３３】配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡ ＧＧＧＴＴＡＧＧ
【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ ＧＧＴＴＡＧＧＧ
【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡ ＧＣＡＧＡＧＴＴ
【００３６】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴ ＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣ
ＣＴＡＡ
ＣＴＡＡ
【００３７】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＡ ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ
ＡＡＣＣ
ＡＡＣＣ
【図１】 Ｋ５６２細胞におけるＰＣＲ反応後の蛍光強
度を示す図面。Ａは１０，０００細胞当たりの大きさ
（縦軸）と蛍光強度（横軸）の関係を表す図面。ＢはＡ
のゲーティング後の細胞の大きさ（縦軸）と蛍光強度
（横軸）の関係を表す図面。Ｃは蛍光強度（横軸）と細
胞数（縦軸）の関係を表す図面。Ｄは細胞の大きさ（横
軸）と細胞数（縦軸）の関係を表す図面。
度を示す図面。Ａは１０，０００細胞当たりの大きさ
（縦軸）と蛍光強度（横軸）の関係を表す図面。ＢはＡ
のゲーティング後の細胞の大きさ（縦軸）と蛍光強度
（横軸）の関係を表す図面。Ｃは蛍光強度（横軸）と細
胞数（縦軸）の関係を表す図面。Ｄは細胞の大きさ（横
軸）と細胞数（縦軸）の関係を表す図面。
【図２】 Ｋ５６２細胞におけるＰＣＲ反応を行わなか
ったときの蛍光強度を示す図面。Ａは１０，０００細胞
当たりの大きさ（縦軸）と蛍光強度（横軸）の関係を表
す図面。ＢはＡのゲーティング後の細胞の大きさ（縦
軸）と蛍光強度（横軸）の関係を表す図面。Ｃは蛍光強
度（横軸）と細胞数（縦軸）の関係を表す図面。Ｄは細
胞の大きさ（横軸）と細胞数（縦軸）の関係を表す図
面。
ったときの蛍光強度を示す図面。Ａは１０，０００細胞
当たりの大きさ（縦軸）と蛍光強度（横軸）の関係を表
す図面。ＢはＡのゲーティング後の細胞の大きさ（縦
軸）と蛍光強度（横軸）の関係を表す図面。Ｃは蛍光強
度（横軸）と細胞数（縦軸）の関係を表す図面。Ｄは細
胞の大きさ（横軸）と細胞数（縦軸）の関係を表す図
面。
【図３】 Ｋ５６２細胞におけるＰＣＲ反応前後の蛍光
増強の変化を示す図面。
増強の変化を示す図面。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年８月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】フローサイトメトリーで計測した細胞の大
きさおよび蛍光強度をゲートし（図１Ａの枠内）、フロ
ーサイトメトリーに付属するコンピューターを用いて、
個々の細胞の蛍光強度を積算し、横軸に蛍光強度、縦軸
に細胞数を表わすように設定した（図１）。同様に、Ｐ
ＣＲ反応のみを行わなかった細胞における蛍光強度と細
胞数を計測し（図２）、テロメラーゼ陽性細胞の検出は
蛍光プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った細胞と（図
１）、ＰＣＲ反応のみを行わなかった細胞における蛍光
標識細胞（図２）との差を求め（図３）、その差を蛍光
の増強していた細胞に由来する増強率とし、これをテロ
メラーゼ陽性細胞率として算出した。
きさおよび蛍光強度をゲートし（図１Ａの枠内）、フロ
ーサイトメトリーに付属するコンピューターを用いて、
個々の細胞の蛍光強度を積算し、横軸に蛍光強度、縦軸
に細胞数を表わすように設定した（図１）。同様に、Ｐ
ＣＲ反応のみを行わなかった細胞における蛍光強度と細
胞数を計測し（図２）、テロメラーゼ陽性細胞の検出は
蛍光プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った細胞と（図
１）、ＰＣＲ反応のみを行わなかった細胞における蛍光
標識細胞（図２）との差を求め（図３）、その差を蛍光
の増強していた細胞に由来する増強率とし、これをテロ
メラーゼ陽性細胞率として算出した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】フローサイトメトリーで確認したＫ５６２
細胞由来の蛍光シグナルがテロメラーゼ活性に依存する
ものであるか否かを確認するため、蛍光標識プライマー
による伸長反応およびＰＣＲ反応後の同検体をスライド
ガラスに固着させ、蛍光顕微鏡で観察した。なお、蛍光
顕微鏡で観察するとは、Ｇ−フィルターを用いて蛍光標
識した細胞が該反応により破壊されていないかどうかを
形態学的に確認することを指す。ＰＣＲ反応のみを施さ
なかったサンプル（図２）、および蛍光標識プライマー
のみを添加しないサンプルにおいては蛍光の減弱を認め
たことから、蛍光ピークが細胞内のテロメラーゼにより
合成されたＰＣＲ産物に由来することが裏付けられた。
上記の方法により、テロメラーゼ陽性細胞を、ＰＣＲ反
応のみを行わなかった細胞における蛍光標識細胞との差
（図３）を求め、蛍光の増強していた細胞を陽性細胞と
してコンピューターにより計算したところ陽性率は３
９．３％であった。
細胞由来の蛍光シグナルがテロメラーゼ活性に依存する
ものであるか否かを確認するため、蛍光標識プライマー
による伸長反応およびＰＣＲ反応後の同検体をスライド
ガラスに固着させ、蛍光顕微鏡で観察した。なお、蛍光
顕微鏡で観察するとは、Ｇ−フィルターを用いて蛍光標
識した細胞が該反応により破壊されていないかどうかを
形態学的に確認することを指す。ＰＣＲ反応のみを施さ
なかったサンプル（図２）、および蛍光標識プライマー
のみを添加しないサンプルにおいては蛍光の減弱を認め
たことから、蛍光ピークが細胞内のテロメラーゼにより
合成されたＰＣＲ産物に由来することが裏付けられた。
上記の方法により、テロメラーゼ陽性細胞を、ＰＣＲ反
応のみを行わなかった細胞における蛍光標識細胞との差
（図３）を求め、蛍光の増強していた細胞を陽性細胞と
してコンピューターにより計算したところ陽性率は３
９．３％であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】表１に用いた細胞を従来のテロメラーゼ活
性測定法で測定すると正常人単核球細胞ではテロメラー
ゼ活性は０．８と低く、一方白血病細胞株では高いテロ
メラーゼ活性が見られることが確認されている（大屋敷
一馬ほか、インターナショナル ジャーナル オブ オ
ンコロジー、１９９６年、８巻、４１７頁）。表１のテ
ロメラーゼ陽性細胞の結果もほぼこれに準じているの
で、ＰＣＲ法により増強している蛍光はテロメラーゼ活
性に由来するものであることが判明した。以上、本願の
フローサイトメトリーを用いた細胞内テロメラーゼ測定
方法により、細胞等のテロメラーゼ活性が定量的にかつ
簡単に測定でき、テロメラーゼ活性陽性細胞の比率が測
定できることが確認された。
性測定法で測定すると正常人単核球細胞ではテロメラー
ゼ活性は０．８と低く、一方白血病細胞株では高いテロ
メラーゼ活性が見られることが確認されている（大屋敷
一馬ほか、インターナショナル ジャーナル オブ オ
ンコロジー、１９９６年、８巻、４１７頁）。表１のテ
ロメラーゼ陽性細胞の結果もほぼこれに準じているの
で、ＰＣＲ法により増強している蛍光はテロメラーゼ活
性に由来するものであることが判明した。以上、本願の
フローサイトメトリーを用いた細胞内テロメラーゼ測定
方法により、細胞等のテロメラーゼ活性が定量的にかつ
簡単に測定でき、テロメラーゼ活性陽性細胞の比率が測
定できることが確認された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
Claims (2)
- 【請求項１】 （１）細胞内でテロメラーゼによるテロ
メラーゼ基質の延長反応を行う工程、（２）得られた延
長反応生成物を細胞内で塩基結合連鎖反応に付す工程、
および（３）フローサイトメトリーを用いて細胞中の反
応生成物の蛍光を定量することを特徴とするテロメラー
ゼ活性の測定方法。 - 【請求項２】 （１）細胞内でテロメラーゼによるテロ
メラーゼ基質の延長反応を行う工程、（２）得られた延
長反応生成物を細胞内で塩基結合連鎖反応に付す工程、
および（３）フローサイトメトリーを用いて細胞中の反
応生成物の蛍光を定量することを特徴とするテロメラー
ゼ陽性細胞の検出方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8187350A JPH1028600A (ja) | 1996-07-17 | 1996-07-17 | テロメラーゼ活性の測定法 |
| CA 2206007 CA2206007A1 (en) | 1996-07-17 | 1997-07-14 | A method of flow cytometric determination of telomerase activity |
| EP97112232A EP0819769A3 (en) | 1996-07-17 | 1997-07-17 | A method of flow cytometric determination of telomerase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8187350A JPH1028600A (ja) | 1996-07-17 | 1996-07-17 | テロメラーゼ活性の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1028600A true JPH1028600A (ja) | 1998-02-03 |
Family
ID=16204462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8187350A Withdrawn JPH1028600A (ja) | 1996-07-17 | 1996-07-17 | テロメラーゼ活性の測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0819769A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1028600A (ja) |
| CA (1) | CA2206007A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7390891B1 (en) | 1996-11-15 | 2008-06-24 | Amgen Inc. | Polynucleotides encoding a telomerase component TP2 |
| DE19980548D2 (de) * | 1998-04-01 | 2001-07-12 | Juergen Wolfrum | Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung von DNA und RNA |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1996
- 1996-07-17 JP JP8187350A patent/JPH1028600A/ja not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-07-14 CA CA 2206007 patent/CA2206007A1/en not_active Abandoned
- 1997-07-17 EP EP97112232A patent/EP0819769A3/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0819769A2 (en) | 1998-01-21 |
| CA2206007A1 (en) | 1998-01-17 |
| EP0819769A3 (en) | 2001-03-14 |
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