UA47407C2 - Рнк-компонент теломерази ссавця, олігонуклеотид (варіанти), рекомбінантна експресуюча плазміда (варіанти), еукаріотична клітина-хазяїн, трансформована за допомогою рекомбінантної експресуючої плазміди (варіанти), спосіб продукування рекомбінантного ферменту теломерази (варіанти), спосіб ідентифікації можливих агентів, що модулюють теломеразу, спосіб гальмування активності теломерази в клітинах людини (варіанти), спосіб визначення наявності неопластичного стану у пацієнта, спосіб визначення наявності рнк-компонента теломерази ссавця в клітині або клітинному зразку (варіанти) - Google Patents

Рнк-компонент теломерази ссавця, олігонуклеотид (варіанти), рекомбінантна експресуюча плазміда (варіанти), еукаріотична клітина-хазяїн, трансформована за допомогою рекомбінантної експресуючої плазміди (варіанти), спосіб продукування рекомбінантного ферменту теломерази (варіанти), спосіб ідентифікації можливих агентів, що модулюють теломеразу, спосіб гальмування активності теломерази в клітинах людини (варіанти), спосіб визначення наявності неопластичного стану у пацієнта, спосіб визначення наявності рнк-компонента теломерази ссавця в клітині або клітинному зразку (варіанти) Download PDF

Info

Publication number
UA47407C2
UA47407C2 UA97010079A UA97010079A UA47407C2 UA 47407 C2 UA47407 C2 UA 47407C2 UA 97010079 A UA97010079 A UA 97010079A UA 97010079 A UA97010079 A UA 97010079A UA 47407 C2 UA47407 C2 UA 47407C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
telomerase
rna component
rna
sequence
component
Prior art date
Application number
UA97010079A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Брайен Віллепонті
Джанлі Фенг
Уолтер Функ
Уілльям Ендрюз
Original Assignee
Джерон Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/330,123 external-priority patent/US5583016A/en
Priority claimed from US08/472,802 external-priority patent/US5958680A/en
Priority claimed from US08/482,115 external-priority patent/US5776679A/en
Application filed by Джерон Корпорейшн filed Critical Джерон Корпорейшн
Publication of UA47407C2 publication Critical patent/UA47407C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
    • B29C59/02—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing
    • B29C59/04—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing using rollers or endless belts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Shaping Of Tube Ends By Bending Or Straightening (AREA)
  • Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)

Abstract

Нуклеінові кислоти, що містять РНК-компонент теломерази ссавця, використовуються в якості фармацевтичних, терапевтичних та діагностичних реагентів.

Description

Опис винаходу
Настоящее изобретение относится к теломеразе человека, рибонуклеопротеидовому ферменту, 2 включенному в синтез ДНК теломера человека. Изобретение обеспечиваєт создание способов и составов, относящихся Кк областям молекулярной биологии, химии, фармакологии, а также медицинской и диагностической техники.
ДНК на концах или в теломерах хромосом зукариотов обьічно состоийт из последовательно расположенньх повторньїх простьїх последовательностей. Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидньій фермент, которьій синтезирует одну нить теломерической ДНК, используя в качестве матриць! последовательность, содержащуюся внутри РНК-компонента зтого фермента. См. Віаскригп, 1992, Аппи. Кеу. Віоспет. 61:113-129 в качестве ссьілки к описанию данного изобретения.
До настоящего времени в научной литературе не рассматривался РНК-компонент теломеразь!ї человека, хотя известно, что теломераза человека синтезирует теломерические единиць оповторов с последовательностью 5-ГТТА(С(3(0-3 . См. Могіп, 1989, СеїЇ 59:521-529, и Могіп, 1991, Майте 353:454-456 в качестве ссьілки. Указанньій факт не является достаточньм для того, чтобьії обеспечить вьіделение и идентификацию оставшейся части нуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразь! человека.
РНК-компонент теломеразньїх ферментов Засспаготусез сегемізіде, определенньїх видов Теггапутепа, а также
РНК-компонент других реснитчатьїх, например Еиріоїез и сСіайсота, бьіли секвенировань! и описань! в научной литературе. См. 5іпдег и Сой8спіїпо, 21 Осі. 1994, Зсіепсе 266:404-409; | Ііпрдпег и др., 1994, Сепез 5 Юемеіортепі 8:1984-1988; Сгеідег и ВіаскКригп, 1989, Майшге 337:331-337; Котего и ВіаскКригп, 1991, СеїІ! 67:343-353; и
ЗПірреп-Іепі7 и Віаскригп, 1990, Зсіепсе 247:546-552, приведенньюе здесь в качестве ссьілки. В отличие от ферментов теломеразьь человека ферменть! теломеразь! указанньїх реснитчатьх синтезируют единиць теломерических повторов. с
Существует настоятельная потребность в большем количестве информации, касающейся теломеразь Го) человека. Несмотря на кажущуюся простую природу структурньїх единиц теломерической ДНК ученьім уже давно известно, что теломерьй играют важную биологическую роль в сохранений структурь и функции хромосом. Не так давно ученье предположили, что потеря теломерической ДНК может действовать как пусковой механизм старения клеток и что регуляция теломеразь! может играть важную биологическую роль. См. -
Напеу, 1991, Миїгайоп Кезеагсп 256:271-282, используемьїй здесь в качестве ссьІлки. ав
Бьіли также описань! способьї определения активности теломеразь! и идентификации соединений, которье регулируют или влияют на активность теломеразьї, наряду с другими методами, предназначенньми для в терапийи и диагностики старения и иммортализации клеток путем управления длиной теломера и активностью ї- теломеразь. См. патенть РОСТ, Мо публикации 95/13381, опубликованньй 18 мая 1995; 95/13382, 3о опубликованньй 18 мая 1995; и 93/23572, опубликованньй 25 ноября 1993 г.; и регистрационнье номера заявок З к патентам США: номер не присвоен (изобретатели С.Нагеу, М.Кіт, 5.УУеїпгісп), поданная 7 июня 1995 г.; 08/315214, поданная 28 сентября 1994 г.; 08/288501, поданная 10 августа 1994 г.; 08/014838, поданная 8 февраля 1993 г.; 08/153051 и 08/151477, каждая из которьїх подана 12 ноября 1993 г.; 08/060952, поданная 13 « мая 1993 г.; 08/038766, поданная 24 марта 1993 г.; и 07/882438, поданная 13 мая 1992 г. Указаннье документь! З используются в данном описаний в качестве ссьлок. с Значительнье достижения и новьіе возможности в области теломеразоопосредованньїх методов терапии, з» исследований теломеразьй и методов скрининга можно бьіло бьі осуществить, если бьі нуклеиновая кислота, содержащая РНК-компонент и/или кодирующая белковье компоненть! теломеразьї, имелась в чистом виде или в виде, поддающемся вьіделению, и бьіли бьї известньі! нуклеотидньіе последовательности таких нуклеиновьх кислот. Настоящее изобретение обеспечиваєт удовлетворение зтих и других потребностей и позволяет ть осуществить вьішеуказаннье усовершенствования и возможности. -і Первьіїм аспектом настоящего изобретения является то, что оно обеспечиваєт получение РНК-компонента, а также гена РНК-компонента, теломеразьі человека практически в чистом виде, а также нуклеиновьїх кислот, ть содержащих все или по меньшей мере полезную часть нуклеотидной последовательности РНК-компонента о 20 теломеразьі человека. Настоящее изобретение также обеспечиваєт получение нуклеиновьх кислот, содержащих РНкК-компонент, из других видов, нуклеийновье кислоть! которьїх в основном гомМологичнь
Що РНК-компоненту теломеразь! человека, включая, но не ограничиваясь зтим, РНК-компоненть! млекопитающих, например приматов. В число других нуклеийновьїх кислот, используемь!х в изобретении, входят нуклеийновье кислотьі со последовательностями, комплементарньми РНК-компоненту; нуклеийновье кислоть! с 22 последовательностями, родственньми, но отличающимися от нуклеотидньїх последовательностей
ГФ) РНК-компонента, и которне взаймодействуют с РНК-компонентом или геном РНК-компонента или белковьми компонентами теломеразьі человека необходимьм образом; и нуклеийновье кислотьі, которье не имеют о значительную гомологию последовательностей или комплементарность РНК-компоненту или гену
РНК-компонента, но действуют на РНК-компонент желательньм и необходимьм образом. Как более полно 60 описано ниже, нуклеийновье кислоть! согласно изобретения включают как молекуль! ДНК, так и молекуль РНК, а также модифицированньсе аналоги каждой из них и служат различньім необходимьїм целям.
Одним типом полезной нуклейновой кислоть! согласно изобретения является антисмьісловой олигонуклеотид, олигонуклеотид, формирующий тройную спираль, или другой оолигонуклеотид или миметический олигонуклеотид(например, антисмьісловая РНК-пептидная нуклеийновая кислота/полиамидная бо нуклеиновая кислота), которьій может бьіть использован іп міго или іп мімо с целью подавления активности теломеразь! человека. Такие олигонуклеотидь! могут блокировать активность теломеразьі! различньіми путями, включая такие пути, как предотвращение транскрипции гена теломеразь! (например, путем формирования тройной спирали) или за счет связьівания с РНК-компонентом теломеразь таким образом, что зто препятствует сборке функциональной рибонуклеопротейидовой теломеразь или предотвращаєт использование
РНК-компонента в качестве матриць при о синтезе отеломерической ДНК после его сборки в теломеразо-ферментньій комплекс. Обьічно, в зависимости от способа действия, указаннье олигонуклеотидь! согласно изобретения содержат специфическую последовательность, состоящую из приблизительно 10 до приблизительно 25..200 или более нуклеотидов, которая либо идентична, либо комплементарна 70 специфической последовательности нуклеотидов в РНК-компоненте теломеразьй или в гене РНК-компонента теломеразь.
В примере осуществления изобретения обеспечиваєтся получение антисмьсловьх полинуклеотидов, комплементарньх полинуклеотидньмм последовательностям РНК-компонента теломеразь, обьічно комплементарньїх полинуклеотидньім последовательностям, которне в основном идентичньі! природной генной 7/5 последовательности РНК-компонента теломеразь! млекопитающих. Подобнье антисмьсловье полинуклеотидь используются для ингибирования транскрипции и/или стабильности, и/или функциональности видов
РНК-компонента теломеразьй и таким образом воздействия на уменьшение количества соответствующей активности теломеразьі в клетке (например, в неопластической клетке пациента). Такие антисмьсловье полинуклеотидьі могут функционировать в качестве теломеразомодулирующих агентов путем ингибирования образования функционального (каталитически активного и обладающего вьісокой степенью привязанности) холофермента теломеразь, требуемого для правильной репликации и репарации теломера в клетке.
Антисмьісловьіе полинуклеотидьі могут комбинироваться с другими антинеопластическими терапевтическими модальностями, такими как ионизирующая радиация или хемотерапия (например, с повреждающим ДНК агентом, таким как блеомицин, цисплатин, азотистьій иприт, доксирубицин, нуклеотиднье аналоги и т.д.). с Антисмьісловне полинуклеотидь! могут способствовать гибели клеток в чувствительньїх клетках (например, в реплицирующих клетках, в которьїх для репарации или репликации ДНК необходима активность теломеразьї). і)
Антисмьісловьіе полинуклеотидьі в основном идентичньї по меньшей мере 25 смежньм нуклеотидам комплементарной последовательности описьшваемой здесь последовательности РНК теломеразь млекопитающих. Антисмьісловье полинуклеотидьій обьічно являются смьісловой ДНК, смьісловой РНК, М зо полинуклеотидами с метилфосфонатньм остовом, полинуклеотидами с фосфоромеркаптидньм остовом, полинуклеотидами со смешанньм остовом, полиамидньми нуклеийновьми кислотами и аналогичньми о антисмьсловьми структурами, известньми в данной области. В одном аспекте данного изобретения «Е антисмьсловой полинуклеотид применяєется для ингибирования транскрипции и/или активности
РНК-компонента теломеразь и активности теломеразь! в клетке, например, в поддающейся репликации клетке -
Зз5 человека. «г
В примере осуществления изобретения обеспечиваєтся получение полинуклеотида с ошибочньм спариванием матриц, причем указанньійй полинуклеотид имеет последовательность, в основном идентичную
РНК-компоненту теломеразьї млекопитающего и содержит матричную последовательность с теломерическими повторами, которая имеет по меньшей мере одно ошибочное спаривание оснований относительно, но в « остальном комплементарна, последовательности повторов теломеразь! человека 5-ТТАС(О(О-3. Полинуклеотид Ше) с с ошибочньім спариванием матриц обьічно содержит одно ошибочное спаривание нуклеотидов в природной матричной последовательности и может содержать два ошибочньїх спаривания нуклеотидов в матричной ;» последовательности либо в виде соседних ошибочно спаренньїх нуклеотидов, либо в которой ошибочно спареннье нуклеотидьі разделеньй одним или более спаренньми (комплементарньми) нуклеотидами. Полинуклеотидьі с ошибочньм спариванием матриц согласно изобретения обьчно способнь! проявлять ї5» активность теломеразь! в сочетании с полипептидньім компонентом теломеразьі человека, осуществляя таким образом ошибочное включение на вьібранньїх позициях(ошибочно спаренньїх) нуклеотидов в повторяющейся ш- последовательности теломеразь! человека, являющейся результатом репликации теломерических повторов, ї5» репарации и/или присоединения, генерируя таким образом теломерь на основе постоянного присутствия
РНІкомпонента мутированной смьісловой теломеразь! для существенной репликации и поддержания длинь о теломера.
І Другим типом подходящей нуклеийновой кислоть! согласно изобретения является рибоцим, способньй специфически расщеплять РНК-компонент теломеразь! человека, обеспечивая инактивацию фермента. Еще одним используемь!м согласно изобретения типом нуклеийновой кислоть! является зонд или праймер, которьй вв специфически связьшваєтся с РНК-компонентом теломеразьй человека и таким образом может бьть использован, например, для детектирования наличия теломеразь! в образце. В конечном счете используемье (Ф, согласно изобретения нуклейновье кислотьі включают рекомбинантнье зкспрессирующие плазмидь,, ка предназначеннье для продуцирования нуклеиновьїх кислот согласно изобретения. Одним из особо полезньх типов такой плазмидьії является плазмида, используемая для генотерапиий человека. Существует много бо разновидностей плазмид согласно изобретения для генотерапиий человека, включая не только те плазмидь, которье кодируют антисмьісловье олигонуклеотидьії или рибоцимь), но и плазмидь), которье уравляют зкспрессией РНК-компонента теломеразьі человека или делетированного или измененного другим образом (мутированного) варианта РНК-компонента теломеразьй человека (или других видов, последовательности
РНК-компонента которьїх в основном гомологичньї РНК-компоненту человека) или гена РНК-компонента б5 теломеразь! человека.
В варианте воплощения изобретения полинуклеотид, имеющий участок, комплементарньй РНК-компоненту теломеразьї млекопитающих, достаточньій для специфической гибридизации в физиологических условиях, разрезаєтся по ковалентной связи дополнительного химического заместителя либо в период, либо после синтеза полинуклеотидов, формируя таким образом разрезанньй полинуклеотид, способньй к специфической гибридизации с указанньім РНК-компонентом теломеразьї. Разрезанньйй полинуклеотид может локализоваться в зндогенной теломеразе, имеющей указанньй РНК-компонент, в котором указанньіїй разрезанньій полинуклеотид приводит к изменению или химической модификации РНК-компонента и/или белкового компонента теломеразь, и таким образом модифицирует обьічно путем восстановления ферментативную активность теломеразь.
В примере осуществления изобретения обеспечивается создание полинуклеотидов, которье пригоднь! для 7/0 диагностики болезней, связанньїх с отклоняющимся от нормь! количеством и/или структурой РНК-компонента теломеразьі. Полинуклеотиднье зондьі, содержащие последовательности, которне в основном идентичнь! или комплементарньі нуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразьї млекопитающих, могут бьіть использованьії для диагностики заболеваний (например, неоплазии или преднеоплазии) путем детектирования большого количества РНК-компонента теломеразьі и/или структурньїх изменений РНК-компонента теломеразь /5 (например, усечение, изменения последовательностей, делеции или инсерции и т.д.), и/или реаранжировки или амплификации гена РНК-компонента теломеразьі в клетках, полученньїх от пациента, или детектирования патогномоничного аллеля РНК-компонента теломеразьї млекопитающего (например, посредством анализа полиморфизма длинь! рестрикционньіїх фрагментов или специфического для аллеля ЦПР (цепная полимеразная реакция )-анализа). Детектирование часто может осуществляться путем гибридизации іп зйш, используя 2о меченьй (например, ЗР, 358, ис, ЗН, флуоресцентньй, биотинилированньй, дигоксигенинилированньй) антисмьсловой полинуклеотид, комплементарньій РНК-компоненту теломеразьі млекопитающих, хотя могут бьіть использовань!ї нозерн-блоттинг, дот-блоттинг или гибридизация в растворе на обьеме РНК или поли Ак
РНК, вьіделенной из образца клетки, как может бьть использована и амплификация ЦПР или ЦАР с применением праймеров, специфических к РНК-компоненту теломеразь!. Клетки, которне содержатизмененноє су 285 Количество (обьічно значительно увеличенноє) РНК-компонента теломеразь по сравнению с ненеопластическими клетками того же типа (ов) клеток, идентифицируются как возможно пораженнье клетки, і) например, преднеопластические или явно неопластические, и могут бьіть идентифицировань! как клетки с метастатическим потенциалом. Аналогично, детектирование патогномоничньхх реаранжировок о / или амплификации локуса РНК-компонента теломеразь! или тесно связанньіїх лоций в образце клетки указьивает на /зча наличие патологического состояния или на предрасположение к развитию патологического состояния (например, рака, генетического заболевания). Полинуклеотиднье зондьії РНК-компонента теломеразь! также о используются для судебной идентификации личности, например для анализа на отцовство или для «Її идентификации подозреваемьїх уголовньїх личностей или неизвестньїх трупов.
Во втором аспекте, изобретение предполагает создание способов лечения состояния, связанного с - 3з5 активностью теломеразь внутри клетки или группь! клеток за счет контактирования клетки (ок) с терапевтически /«ф зффективньмм количеством агента, которьій изменяет активность теломеразьі в зтой клетке. Такие агенть включают нуклеийновье кислотьї, кодирующие РНК-компонент теломеразьі, олигонуклеотидьії, формирующие тройную спираль, антисмьсловье олигонуклеотидь), рибозимь, плазмидь и другие генотерапевтические « векторьї (например, аденовируснье векторьї, аденосвязанньюе вируснье векторь и т.д.) для генотерапийи человека путем зкспрессий РНК-компонента теломеразьі, антисмьісловой РНК к РНК-компоненту теломеразь ей) с или РНК-компоненту теломеразьі с ошибочньм спариванием, как зто описано вьіше. В аспекте, й взаймосвязанньм с предшествующим, изобретение обеспечивает получение фармацевтических составов, "» содержащих указаннье терапевтические агенть! вместе с фармацевтически приемлемьм носителем или солью, которье могут включать каплю в липофекционном комплексе, липосоме или иммунолипосоме для целевой 75 вставки терапевтического агента. «» МИзобретениеє также ообеспечивает получение комбинации таких теломеразоопосредованньх терапевтических агентов с другими фармацевтическими препаратами, такими как антинеопластические агенть і или другие цитотоксические или цитостатические агенть!; противогрибковье агенть! (например, для лечения «» больньїх СПИДОМм), нуклеотидь, нуклеозидь и их аналоги, а также другие фармацевтические агентьі, пригодгье для лечения болезненньїх состояний, таких как неолплазия, гиперплазия, ВИЧ- инфекция/СПИД и связанньсе с о ними патологии, а также другие заболевания, характеризуемье анормальньм теломерическим метаболизмом. "І Способьі могут включать использование разрезанного полинуклеотида, способного специфически гибридизироваться с РНК-компонентом теломеразьій в теломеразе млекопитающего, в которой разрезанньй полинуклеотид вводится в клетки млекопитающего, обладающие активностью теломеразь, и подавляет активность теломеразь! за счет локализации в РНК-компоненте теломеразь! и инактивации или ингибирования активности теломеразь. о Изобретение также обеспечивает получение терапевтических агентов, которье ингибируют неоплазию или ко апоптоз за счет модуляции функции теломеразь! посредством ингибирования или усиления образования
РНК-компонента теломеразь!; такие агентьії могут использоваться в качестве фармацевтических препаратов. бо Указаннье фармацевтические препаратьі используются для лечения различньїх заболеваний людей и животньїх, например, неоплазии, гиперплазии, нейродегенеративньїх болезней, старения, СПИДа, грибковой инфекции и т.д. В примере осуществления изобретения агент содержит генотерапевтический вектор, способньй транскрибировать последовательность РНК-компонента теломеразьі или ее комплемент или, в ином случає, ферментативно неактивньй РНК-компонент теломеразь), которьій может с таким же успехом ингибировать 65 образование функционального холознзима теломеразь.
В третьем аспекте изобретение обеспечивает создание диагностических методов определения уровня,
количества или наличия РНК-компонента теломеразьі человека, теломеразьй или активности теломеразь! в клетке, клеточной популяции, образце ткани или зкстракта любого из вьшеуказанного. В аспекте, взаймосвязанном с предшествующим, настоящее изобретение позволяет получить необходимьсе реагенть! для таких способов (включая праймерь и зондьї, упомянутье вьіше), произвольно упакованнье в кит-форму вместе с инструкциями для использования кита, при осуществлений способа диагностики.
Настоящее изобретение обеспечивает создание способа диагностики заболевания (например, неоплазии) у человека, при котором диагностический анализ (например, полинуклеотидная гибридизация іп о зйи фиксированньїх клеток с помощью меченого зонда РНК-компонента теломеразь), которая специфически 7/0 связьшваєет РНК-компонент теломеразьі человека или геннье последовательности) используется для определения наличия в биологической пробе пациента заранее определенной патогномоничной концентрации
РНК-компонента теломеразь; если анализ показьівает, что концентрация РНК-компонента теломеразь! вьіходит из диапазона, соответствующего нормальной концентрации (например, находится за пределами заранее определенной патогномоничной концентрации), ставится диагноз, что пациент имеет болезненное состояние 7/5 мли предрасположенность к нему.
В варианте вьіполнения изобретения полинуклеотидь! согласно изобретения используются для диагностики патологических состояний или генетических заболеваний, включающих неоплазию, гиперплазию, раннее или аномальное физиологическое старение клеток или другие медицинские состояния, связаннье с фукцией теломеразьі, и более специфические состояния и заболевания, которне предполагают изменения в структуре мли избьток РНК-компонента теломеразь! или генной последовательности, или которье связань! с аллелем
РНК-компонента патогномоничной теломеразь, что может бьть обнаружено с помощью полиморфизма рестрикционньїх фрагментов и/или специфической к аллелю ЦПР или другим подходящим для зтой цели способом. Обьчно указанньй способ используется для диагностики заболевания (например, неоплазии) у человека, при зтом диагностический анализ (например, определение количества и/или структурь с РНЕ-компонента теломеразь) используется для определения того, имеется ли заранее обусловленная патагномоничная концентрация или структура РНК-компонента теломеразь в клетках биологической пробьї, і) взятой у пациента; если анализ показьваєет наличие патогномоничного количества РНК-компонента теломеразьі, виіходящего за предель! нормального, диапазона (например, за предель! заранее определенной патогномоничной концентрации), пациент диагностируется как имеющий болезненное состояние или ї- зо предрасположенность к болезни.
В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает получение препаратов рекомбинантной о теломеразн и создание способов для производства таких препаратов. Таким образом, настоящее изобретение «Е обеспечиваєт получение рекомбинантной теломеразьі человека, которая содержит белковье компоненть теломеразьі человека, а также белковье комспонентьі теломеразьі от такого вида млекопитающих, где -
РНК-компонент в значительной степени гомологичен РНК-компоненту теломеразьі человека в связи с «Е рекомбинантньм РНК-компонентом, созданньм согласно изобретения. Молекульі такого рекомбинантного
РНК-компонента согласно изобретения представляют собой молекуль!, которье отличаются от молекул природного РНК-компонента одной или более заменами основания, делециями, терминальньми добавками и/или инсерциями, а также молекульї РНК-компонента, идентичнье молекуле природного РНК-компонента, « Которая продуцируется в рекомбинантньїх клетках-хозяевах. Способ получения таких молекул рекомбинантной в с теломеразьі включаєт трансформирование зукариотной клетки-хозяина, которая зкспрессирует белковье
Й компонентьії теломеразьь с помощью рекомбинантного вектора зкспрессии, кодирующим молекуль! а РНК-компонента согласно изобретения, и культивирование указанньїх клеток-хозяев, трансформированньх указанньм вектором в условиях, при которьїх белковьій компонент теломеразьі и РНК-компонент теломеразь!
Зкспрессируются и собираются в виде активной молекульй теломеразь, способной к присоединению ї5» последовательности (необязательно той же последовательности, которая присоединена природной теломеразой) к теломерам хромосомной ДНК. ш- В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает создание способов очистки белковьїх компонентов ї5» теломеразь! человека, а также белковьїх компонентов теломеразь! из вида млекопитающих от РНК-компонента, Которьій в значительной мере гомологичен РНК-компоненту теломеразь! человека. Настоящее изобретение о также обеспечивает создание способов вьіделения и идентификации нуклеиновьїх кислот, кодирующих такие
І белковье компонентьі. В аспекте, взаимосвязанном с вьішеукаазнньм, настоящее изобретение обеспечивает получение очищенной теломеразьі человека и очищенной теломеразь вида млекопитающего с
РНК-компонентом, в значительной мере гомологичньм РНК-компоненту теломеразьій человека, а также ов очищенньх нуклеиновьх кислот, кодирующих один или более компонентов таких препаратов теломеразь!.
Настоящее изобретение также обеспечивает получение фармацевтических составов, содержащих в качестве (Ф, активного ингредиента белковье компонентьі теломеразьі или нуклеийновую кислоту, кодирующую или ка взаймодействующую с нуклеиновой кислотой, которая кодирует белковьій компонент теломеразь.
В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает создание способов идентификации агентов, бо Которне модулируют (те. ингибируют, усиливают или изменяют специфичность) активность теломеразь млекопитающего. Такие модулирующие теломеразу агентьї часто представляют собой небольшие молекуль! (например, менее, чем приблизительно 3000 Дальтон) и могут использоваться для модификации активности теломеразь іп міїго и іп мімо , чаще всего для получения терапевтического зффекта, и применяются в качестве лабораторньїх реагентов и/или фармацевтических препаратов. 65 В примере осуществления изобретения предусматривается создание способов идентификации возможньх агентов, имеющихся в банке или библиотеке, которне модулируют активность теломеразь! путем модуляции нековалентной связи РНК-компонента теломеразьї млекопитающего с белковьім компонентом теломеразь.
РНК-компонент теломеразь! может бьіть продуцирован из рекомбинантной матриць! в клетке-хозяине или при необходимости химически синтезирован. Обьічно белковьій компонент теломеразь! млекопитающего, например,
Компонент, которьій может бьїть очищен от клеток, зкспрессирующих теломеразу, и у которого может бьть удален природньій РНК-компонент теломеразь (например, посредством обработки РНкКазой), вводят в контакт с
РНК-компонентом теломеразьі! млекопитающего в подходящих условиях водного раствора с целью обеспечения нековалентной связи между РНК - и белковьіми компонентами в отсутствии присоединенного агента(т.е. при управляемой реакции связьвания). Степень нековалентного взаимодействия между РНК-компонентом /о тепомеразь! и белковьім компонентом в присутствий одного или более агентов, вьібранньїх из библиотеки или банка агентов, сравнивают со степенью нековалентного взаймодействия в контролируемой реакции связьшвания, содержащей РНК- и белковьй компоненть! теломеразь! и не имеющей агента(ов); агентьї, которне продуцируют статистически значимое увеличение степени нековалентного связьівания между РНК- и белковь!м компонентами теломеразь, определяются таким образом в качестве возможньїх агентов модулирования /5 тепомеразьі. Относительная величина нековалентного связьівания может бьіть определена любьім подходящим способом, включая определение специфической связьвающей аффинности, например, посредством конкурентного связьівания, определение каталитической активности теломеразьі на подходящей матрице теломерических повторов или с помощью другого подходящего анализа функционального нековалентного взаймодействия между РНК- и белковьім компонентами теломеразьї млекопитающего, например, изменение подвижности в геле, или анализа АЗФП (анализ злектрофоретической подвижности).
В примере осуществления анализа нековалентного связьвания для детектирования возможньх агентов, модулирующих теломеразу, один или оба компонента (РНК-или белковьій) метят подходящей детектируемой меткой и нековалентное связьівание определяют раздельно в присутствий и в отсутствий агента, вьібранного из библиотеки или банка агентов. Определение нековалентного связьивания включаєет измерение степени с г связьвания меченого компонента теломеразьі (РНК-или белкового компонента) со своим родственньм компонентом теломеразь! (белковьім компонентом или РНК-компонентом соответственно) независимо от того, і) метится ли указанньй родственньій компонент теломеразь! отдельно или не метится, например, с помощью отлавливания (например, иммобилизацией) связанньїх комплексов, содержащих указанньій меченьйй компонент теломеразьій и указанньій родственньійй компонент теломеразь, и отделение (например, путем вьімьівания) ї- зо несвязанного меченого компонента теломеразь из указанньїх связанньїх комплексов, генерируя таким образом отделенную связанную фракцию и детектируя связаннье комплексь! в отделенной связанной фракции путем о определения наличия детектируемой метки. Агенть, которне продуцируют статистически значимоєе уменьшение /-«ф или увеличение нековалентного связьівания РНК- и белкового компонентов теломеразьі, идентифицируются таким образом в качестве возможньхх модулирующих теломеразу агентов. Агентьі, которнше уменьшают -
Зз5 Ннековалентное связьівание, являются возможньми ингибиторами (или антагонистами) теломеразь, в то время «г как агентьї, увеличивающие нековалентное связьивание компонентов теломеразьі, являются возможньми агонистами теломеразь.
В примере осуществления изобретения возможнье модулирующие теломеразу агентьї идентифицируются по их способности осуществлять статистически значимое увеличение или уменьшение ферментативной « активности теломеразьі млекопитающего, содержащей очищенньй белковьій компонент теломеразьь и /7- с РНКЕ-компонент теломеразь.
В примере осуществления изобретения возможнье модулирующие теломеразу агентьї идентифицируют по ;» их способоности осуществлять статистически значимое уменьшение или увеличение в транскрипции репортерной полинуклеотидной последовательности (например, в гене бета-галактозидазьі, гене люциферазь, гене НРКТ), операбельно связанной с транскрипциальной регуляторной последовательностью гена ї5» РНК-компонента теломеразьі млекопитающего, преимущественно гена РНК-компонента теломеразь! человека, в метаболически активной клетке млекопитающего. В одном из вариантов зндогенньй ген РНК-компонента ш- теломеразьі в клетке млекопитающего совмещен с гомологичной целевой конструкцией для размещения ї5» репортерной полинуклеотидной последовательности в операбельной связи со стоящей вьіше транскрипционной регуляторной последовательностью (например, промотором) зндогенного гена РНК-компонента теломеразь! в о хромосомном локусе зндогенного гена. В альтернативном варианте зкзогенньій полинуклеотид, содержащий
І репортерньій полинуклеотид, операбельно связан с областью регуляции транскрипции гена РНК-компонента теломеразьі млекопитающего (например, с промотором и со стоящими вьше сайтами связьвания транскрипционного фактора); зкзогенньій полинуклеотид переносят в клетку млекопитающего, в которой он в Может негомологично интегрироваться в область хромосом и/или поддерживают или реплицируют в качестве зписомного полинуклеотида. Агентьії, которне продуцируют статистически значимую модуляцию транскрипции (Ф, репортерного полинуклеотида в клетках, обрабатьваемьх агентом, идентифицируют таким образом как ка возможнье модулирующие теломеразу млекопитающего агенть.
Составь! для идентификации возможньїх модулирующих теломеразу агентов обьічно содержат: (1) белковьй бо Компонент теломеразь! млекопитающего, например, такой компонент, которьій может бьіть очищен от клеток млекопитающего, зкспрессирующих теломеразу, преимущественно клеток приматов (например, человека), и которьій обьічно отделяется от связанного РНК-компонента, если таковой имеется, посредством обработки
РНкКазой или другой обработки, совместимой с удалением РНК-компонента и сохранением способности белка к восстановлению активности теломеразьі в присутствий родственного РНК-компонента теломеразь при 6в5 подходящих условиях связьшвания, (2) РНК-компонент теломеразьї млекопитающего, предпочтительно
РНК-компонент человека, продуцированньій путем транскрипции рекомбинантного полинуклеотида в клетке и
(3) условия водного раствора (например, физиологические условия, условия определения теломеразь, т.е. анализ на присутствие теломеразьї) и необязательно (4) репортерньій полинуклеотид, содержащий по меньшей мере одну способную к репликациий или протяженную повторяющуюся последовательность теломеразь Млекопитающего, обьчно комплементарную последовательности комплементарного матричного участка повторяющейся последовательности теломера указанного РНК- компонента и необязательно (5) нуклеотидь, подходящие для репликации и/или расширения указанной повторяющейся последовательности (ей) репортерного полинуклеотида в условиях анализа теломера; агент обьічно добавляют к указанному составу для оценки нековалентной связи и/или активности теломеразьі по сравнению с контрольньім составом, в котором 70 указанньй агент отсутствует.
В седьмом аспекте изобретение также предусматриваєт получение нулевьїх аллелей генов РНК-компонента теломеразьї млекопитающего, например такого, которьій продуцируют путем нацеливания гомологичного гена гетерологичного полинуклеотида в ген РНК-компонента теломеразьїь млекопитающего для функциональной инактивации гена РНкК-компонента теломеразь. Мзобретение также обеспечиваєт создание модельньх /5 Животньх, кроме человека, содержащих нулевой аллель РНК-компонента теломеразь и, в качестве варианта, создание модельньх животньїх, кроме человека, гомозиготньїх для нулевьх аллелей РНК-компонента теломеразьь и у которьїх практически отсутствует зндогенная активность теломеразьі, что обусловлено отсутствием зндогенного РНК-компонента теломеразь». Такие модельнье животнье используют в качестве коммерческих реагентов для токсилогического скрининга, для продажи в научно-исследовательские фармацевтические лабораторий с целью проведения идентификации или исследования модулирующих теломеразу агентов, в качестве домашних животньїх и домашнего скота, помимо других целей.
В восьмом аспекте изобретение предусматриваєт создание способа иммортализации клеток млекопитающих, например, необходимьїх ферментируемьїх клеток в биореакторе или требуемого клеточного штамма, обладающего прейимуществами в качестве исследовательского коммерческого реагента. Указанньй с способ включает введение в клетку млекопитающего полинуклеотида, которьій зкспрессирует функциональньй
РНК-компонент теломеразьі, способньій формировать функциональньй фермент теломеразьй в присутствий о белкового компонента теломеразь.
Другие особенности и преимущества изобретения будут очевидньі из последующего описания, рисунков, примеров и формуль! изобретения. ї- зо Опредиления
Термин "полинуклеотид РНК-компонента теломеразь", используемьй в данном описаний, обозначает о полинуклеотид, состоящий из по меньшей мере 20 нуклеотидов, при зтом полинуклеотид содержит сегмент из «Е по меньшей мере 20 нуклеотидов, которье: по оменьшей мере на 8595 идентичньї природной последовательности РНК-компонента теломеразьї млекопитающего, обьічно РНК-компоненту теломеразь - з5 Ппримата, например, РНК-компоненту теломеразьі человека или обезьянь». Некоторье полинуклеотидь! «г
РНК-компонента теломеразь, имеющие вариации последовательностей по сравнению с о природной последовательностью РНК-компонента теломеразьії или ее комплементом, могут бьіть пригодньіми в качестве зондов гибридизации, праймеров ЦПР, умноженньїхх копий ЦАР, ошибочно спаренньїх РНК-компонентов и т.д.
Термин "соответствует.." используется в данном описаний для обозначения того, что полинуклеотидная « последовательность гомологична (т.е. идентична, не строго зволюционно связана) всей или части зталонной в с полинуклеотидной последовательности или что полинуклеотидная последовательность идентична зталонной полинуклеотидной последовательности. В отличие от вьшеуказанного, термин "комплементарньй с" з используется в данном описаний для обозначения того, что комплементарная почследовательность гомологична всей или части зталонной полинуклеотидной последовательности. Например, нуклеотидная последовательность "ТАТАС" соответствует зталонной последовательности "ТАТАС" и комплементарна їх зталонной последовательности "СТАТА".
Для описания взаймосвязи между двумя или более полинуклеотидами в последовательности используются - следующие терминь!: "зталонная последовательность", "окно сравнения", "идентичность последовательностей", їх "процент идентичности последовательностей" и "существенная идентичность". Термин "зталонная 5р последовательность" относится к определенной последовательности, используемой в качестве основь! для о сравнения последовательностей; зталонная последовательность может бьть сокращенньм г"вариантом
І большей последовательности, например, сегментом полноразмерной последовательности гена
РНК-компонента теломеразьі. В общем случає, длина зталонной последовательности составляет по меньшей мере 20 нуклеотидов, часто зта длина составляет по меньшей мере 25 нуклеотидов, а часто по меньшей мере дв 920 нуклеотидов. Поскольку каждьй из двух полинуклеотидов может (1) содержать последовательность ( то есть, часть полной полинуклеотидной последовательности), которая подобна последовательности указанньїх двух
Ф) полинуклеотидов, и (2) может кроме того содержать последовательность, которая дивергентна ка последовательности укаазнньхх двух полинуклеотидов, сравнение последовательностей двух или более полинуклеотидов обьічно вьіполняется путем сравнения последовательностей укаазанньїх двух бо полинуклеотидов над "окном сравнения" для идентификации и сравнения локальньїх участков подобия последовательностей.
Используемьй в данном описаний термин "окно сравнения" относится к концептуальному сегменту, состоящему из по меньшей мере 25 смежньїх позиций нуклеотидов, где полинуклеотидную последовательность можно сравнить с зталонной последовательностью, содержащей по меньшей мере 25 смежньх нуклеотидов, и 65 де часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. разрьівьії) порядка 20 или менее процентов по сравнению с зталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеции) для оптимального виіравнивания указанньїх двух последовательностей.
Оптимальное вьіравнивание последовательностей для вьравнивания окна сравнения может бьть осуществлено с помощью алгоритма локальной гомологии по Зтійй и У/агегтап (1981) Аду. Аррі. май. 2:482, с помощью алгоритма вніравнивания гомологии по Мееаіетап и УУипесп (1970) 9. Мої. ВіоїЇ. 48:443, с помощью поиска по методу подобия согласно Реагзоп апа Ііртап (1988) Ргос. Май. Асад. Зсі. (0.5.А.) 85:2444, посредством компьютеризированньїх реализаций зтих алгоритмов (ЗАР, ВЕЗТРІТ, РГАЗТА.ТЕАЗТА в пакете программ математического обеспечения 7,0 генетических исследований, разработанньїх группой компьютеризации, Висконсин, 575 Зсіепсе Ог., Мадізоп, МУ!) или посредством просмотра, и вьібираеєется /о найлучшее вьіравнивание (т.е. получение в результате найвьісшего процента гомологии над окном сравнения), достигаемое различньіми способами.
Термин "идентичность последовательностей" означаєт, чтодве полинуклеотиднье последвательнсти являются идентичньми (те. на основе нуклеотид к нуклеотиду) над окном сравнения. Термин "процент идентичности последовательностей" означает, что указанньй процент рассчитьвшают путем сравнения двух 7/5 оптимально сцентрированньїх над окном сравнения последовательностей, определения количества позиций, в которьїх для обеих последовательностей находится идентичное основание нуклеиновой кислоть (например, А,
Т, С, б, ) или І) с целью вьіявления количества спаренньх позиций, деления количества спаренньїх позиций на общее число позиций в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения полученного результата на 100, получая таким образом искомьій процент идентичности. Термин "существенная идентичность" в данном описаний го означаєт характеристику полинуклеотидной последовательности, в которой полинуклеотид содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80-процентную идентичность последовательностей, преимущественно 85-процентную идентичность, зачастую 89...95-процентную идентичность, более типично - по меньшей мере 99-процентную идентичность последовательностей по сравнению со зталонной последовательностью над окном сравнения, содержащим по меньшей мере 20 нуклеотидньїх позиций, чаще над с г окномМ, содержащим по меньшей мере 30...50 нуклеотидов, где процент идентичности последовательностей о вьічисляется путем сравнения зталонной последовательности с полинуклеотидной последовательностью, которая может включать делеции или вставки, составляющих в целом 2095 или менее от зталонной последовательности над окном сравнения. Зталонная последовательность может бьть сокращенньм вариантом большей последовательности, например, сегментом полноразмерной последовательности гена М.
РНіікомпонента теломеразь, рассматриваемой в данном описаний.
Специфическая гибридизация определяется как образование гибридов между полинуклеотидом зонда о (например, полинуклеотидом согласно изобретения, которьій может включать заменьї, делецию и/или добавки) «Е и специфическим мишень-полинуклеотидом (например, РНЕ-компонентом теломеразь! или последовательностью геномного гена, в котором зонд предпочтительно гибридизируется со специфической - з5 Мишенью, так что, например, единственная полоса, соответствующая одному или более виду РНК-компонента «г теломеразь! (или специфически гидрализованного или процессированного вида РНК-компонента теломеразьї!) может бьть идентифицирована на нозерн-блоте РНК, полученной из подходящей клетки (например, соматической клетки, зкспрессирующей РНК-компонент теломеразьї). Полинуклеотидь! согласно изобретения, которье специфически гибридизируются с о РНК-компонентом теломеразьі млекопитающего или « тепомерическими последовательностями человека, могут бьть получень на основе данньх в с последовательности, полученной здесь в соответствии со способами и термодинамическими принципами, известньїми в данной области и описанньіми в Мапіаїз еї аІ., МоіІесшаг Сіопіпд: А І арогаїюгу Мапиаї, 2па Еа., ;» (1989), Соїй Зргіпд Нагрог, М.У. апа Вегдег апа Кіттеї, Меййодз іп Епгутоіоду, Моїште 152, Сціде ою МоїІесшаг
Сіопіпд Тесппіднез (1987), Асадетіс Ргезв, Іпс., Зап Оіедо, СА, которне используются в данном описаний в качестве ссьлок. ї5» Используемьїй в данном описаний термин "подходящие условия связьівания" относится к условиям водного раствора, при которьіх РНК-компонент теломеразь! связьшваєтся с родственньм белковьм компонентом и ш- образует ферментативно-активньй холофермент теломеразь, способньй Кк каталитической репликации, ї5» репарации и/или добавлению теломерических повторов из подходящей матрицьї, содержащей теломерические повторь; такая матрица с теломерическими повторами может как присутствовать, так и отсутствовать. Часто о подходящими условиями связьввания могут бьіть физиологические условия. Используемьй в данном описаний
І термин "физиологические условия" относится к температуре, рН, ионной силе, вязкости и подобньм им биохимическим параметрам, характеризующим состояние живого организма и/или обьчно присущим внутриклеточному состоянию в живой культивированной клетке млекопитающего, особенно условия, присущие ядру указанной клетки млекопитающего. Например, внутриядернье или цитопластические условия в клетке млекопитающего, вьіращенной в типичньх лабораторньх условиях культивирования, являются (Ф, физиологическими условиями. Подходящими условиями осуществления реакции іп мйго для получения ка транскрипционньїх коктейлей іп мійго являются обьчнье физиологические условия, что может бьть подтверждено на ряде примеров известньїх в данной области ядерньїх зкстрактов. В общем случає, бо физиологические условия іп мйго могут предусматривать наличие 50...200 мМ Мас! или КСІ, рН 6,5...8,5, 20...45"С и 0,001...10 мМ двухвалентного катиона (например, Мод, Санкт); предпочтительно 150 мМ Масі или
Кс, рН 7,2...7,6, 5 мМ двухвалентного катиона, и часто включает 0,01...1,095 неспецифического белка ( например, бьічьего сьівороточного альбумина, БСА). Зачастую может присутствовать нейонньій детергент (Тжшееп, МР-40, Ттйоп Х-100), обьічно приблизительно от 0,001 до 295, в типовом варианте 0,05...0,295 в 65 обьемном отношений. Определеннье воднье условия могут бьіть вьібраньї специалистом в соответствии с обьічньіми методами. В общем случае, могут бьіть вбіполненьі следующие условия водного раствора, имеющего буферньсе свойства: 10...250 мМ Масі, 5...50 мМ трис НС, рН 5...86, с необязательной добавкой двухвалентного катиона(ов) и/или хелатов металлов, и/или неионньїх детергентов, и/или мембранньїх фракций, и/или антивспенивательньх агентов, и/или сцинциллятов.
Используемье в данном описаний терминьі "метка" или "меченьій" относятся к введению детектируемого маркера, например, с помощью введения радиомеченой аминокислотьї или присоединения к полипептиду биотиниловьїх частей, которьіе могут бьіть продетектированьї с помощью маркированного авидина (например, стрептовидина, содержащего флуоресцирующий маркер или ферментативную активность, которье могут бьіть обнаруженьї оптическими или калориметрическими методами. В данной области известньй и могут бьть 7/0 Мспользовань! различньюе способь! введения меток в полипептидьі и гликопротеидь. Примерами меток для полипептидов могут служить, но не ограничиваясь ими, следующие метки: радисизотопь (например, ЗН, С, 358, 125, 191), флуоресцирующие метки (например, ФИТЦ, радомин, лантаниднье фосфать), ферментативнье метки (например, пероксидаза хрена обьікновенного, бета- галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), биотиниловье группьії, заранее определенньіе полипептиднье зпитопь, 75 узнаваемье по вторичному репортеру (например, парь последовательностей "лейциновой застежки", связьивающие сайть! вторичньїх антител, полипептид-активатор транскрипции, домень! связьивания металлов, зпитопнье метки). В некоторьїх вариантах метки прикрепляются с помощью спейсерньїх плеч различной длинь для уменьшения потенциального стерического несоответствия.
Используемьй в данном описаний термин "статистически значимьй" означает результат (т.е. вьіборку данньїх опьта), которьій в общем случаеє по меньшей мере на два стандартньїх отклонения ниже или вьіше среднего значения по меньшей мере трех отдельньїх результатов контрольной вьіборки данньїх и/или которьй является статистически значимьім по определению Ї-теста Стьюдента или другого допускаемого в данной области измерения статистической значимости.
Используемье в данном описаний терминь "патогномоническая концентрация", "патогномоническое с количество" и "патогномонический паттерн гибридизации" относятся к концентрации, количеству или паттерну о локализации, соответственно, РНК-компонента теломеразьі в образце, которье показьвают наличие патологического (например, неопластического, старения, иммунодефицитного, нейродегенеративного, воспалительного и т.д.) состояния или предрасположения к развитию неопластического заболевания, такого как карциома, саркома или лейкоз. Патогномоническое количество - зто количество РНК-компонента теломеразь в /їче клетке или клеточной образце, которое вьіїходит за предельї диапазона нормальньїх клинических значений, которье устанавливаются посредством ожидаемьмх и/или ретроспективньїх статистических клинических о исследований. В общем случає, пациент с неопластическим заболеванием (например, карциомой, саркомой или «Ж лейкозом) имеет количество РНК-компонента в клетке или образце ткани, виіходящее за предель! диапазона концентраций, характерньїх для нормальньїх здоровьїх людей; обьчно патогномоническая концентрация ге отличается по меньшей мере на приблизительно одно стандартное отклонение от средней нормальной «І величинь, более типично - приблизительно на два стандартньїх отклонения или более от средней нормальной величинь Однако практически все клинические диагностические тестьі дают некоторьй процент ложньх положительньх и отрицательньїх результатов. Чувствительность и избирательность диагностического « исследования должнь! бьіть достаточньіми, чтобьї удовлетворить диагностическую цель и любье релевантнье регуляторнье требования. В общем случае, способь! диагностики согласно изобретения используются для - с идентификации лиц, возможно подверженньх заболеванию, обеспечивая получение дополнительного а параметра при различньїх способах диагностики заболевания, вьіполняемьїх компетентньім специалистом. ,» Используемьй здесь термин "аллель болезни" относится к аллелю гена, которьій способен продуцировать поддающееся распознаванию заболевание. Аллель болезни может бьть доминантньм или рецессивньм и может приводить к заболеванию непосредственно или в сочетаниий со специфическим генетическим фоном или т. предшествующим патологическим состоянием. Аллель болезни может присутствовать в генофонде или -1 генерироваться вновь у человека за счет соматической мутации.
Используемьй здесь термин "антинеопластический агент" относится к агентам, которье обладают ї функциональньі!м свойством ингибирования создания млм развития неоплазмь! у человека, зачастую включая о 50 ингибирование метастазов или метастатического потенциала.
МИспользуемьйй в данном описаний термин "операбельно связанньй" относится Кк связьіванию що полинуклеотидньїх злементов в их функциональной взаймосвязи. Нуклеиновая кислота является операбельно связанной, если она расположена в функциональной взаймосвязи с другой последовательностью нуклейновой кислотьі. Например, промотор или знхансер, операбельно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности.
Термин "операбельно связанньїй" означаєт, что последовательности ДНК. будучи связанньіми, являются о обьічно смежньіми, а при необходимости обьединить две кодирующие области белка - смежньми и в врамке іме) считьмвания. Однако, поскольку знхансерьі обьчно функционируют, когда они отделеньй от промотора несколькими тьісячами гетероциклических оснований нуклейновой кислотьї, а интронньіе последовательности 60 могут иметь различную длину, некоторье полинуклеотиднье злементь! могут бьіть операбельно связань, но не являться смежньми. Структурньй ген (например, ІК -ген вируса герпеса человека, ВГЧ), которьій операбельно связан с полинуклеотидной последовательностью, соответствующей транскрипционной регуляторной последовательности зндогенного гена, обьічно зкспрессируется в основном в тот же самьй временной и клеточньій типоспецифический паттерн, как и в природном гене. 65 Используемьїй в данном описаний термин "транскрипционная единица" или "транскрипционньій комплекс" относятся Кк полинуклеотидной последовательности, которая содержит структурньй ген о (зкзоньї)),
цис-действующий связанньй промотор и другие цис- действующие последовательности, требуемье для осуществления зффективной транскрипции структурньїх последовательностей, дистальнье регуляторнье злементьі), необходимье для требуемой тканевоспецифической и зволюционной транскрипции структурньїх последовательностей, и дополнительнье цис-последовательности, имеющие важное значение для зффективной транскрипции и трансляции (например, сайт полиаденилирования, последовательности, управляющие стабильностью мРНК).
Используемьій в данном описаний термин "транскрипционная модуляция относится к способности либо усиления транскрипции, либо ингибирования транскрипции структурной последовательности, связанной в цис; /о такое усиление или ингибирование может зависеть от появления специфического собьтия, например, стимуляции индуктором и/или может обнаруживаться только в определенньх типах клеток.
МИспользуемьй в данном описаний отермин "регуляторньй участок транскрипции" относится к последовательности ДНК, содержащей функциональньйй промотор и любье связаннье злементь! транскрипции (например, знхансер, рамку ССААТ, рамку ТАТА, сайт ЗР и т.д.), которне имеют существенное значение для /5 транскрипции полинуклеотидной последовательности, операбельно связанной с регуляторньм участком транскрипции.
Используемьйй в данном описаний термин "нулевой аллель" означаєт, что генньій локус содержит по меньшей мере одну мутацию или структурное изменение, так что нулевой аллель почти не может направлять зффективную зкспрессию продукта функционального гена. Термин "модельная клетка" означаеєт клетку, 2о имеющую по меньшей мере один нулевой аллель зндогенного гена, обьічно гомозиготного для нулевого аллеля.
Таким образом, например, модельная клетка может бьіть гомозиготной для нулевьїх аллелей в локусе РНК- компонента теломеразь, так что модельная клетка почти не обладает способностью зкспрессировать
РНКЕ-компонент теломеразь.
Фиг.1 Активность теломеразьі из клеток, зкспрессирующих матрично-мутированньй в зкстрактах, с фракционированньїх на дизтиламинозтил-сефарозе из о мутантньх зкспрессирующих /стабильньх трансформантов бьла исследована для определения активности теломеразьі, используя обьічнье способь і) анализа при различньїх условиях реакции. Зкстрактьії из клеток, зкспрессирующих МиС-17 ТКСЗ (линии 1,4,7,10,13,16б, отмеченнье знаком С"), МиС ТКО-3 (линии 2,5,8,11,14,17, отмеченнье знаком С) или МиА
ТКСЗ (линии 3,6,9,12,15,18, отмеченньве знаком А), бьіли исследовань! при нормальньїх условиях реакции (линии М
Зо 1-6), нормальньїх условиях с добавлением 0,5 мМ ддЦтТФ (дидезоксицитидин-5 - трифосфат) (линии 7-9), нормальньїх условиях с удалением дТТФ (дезоксидитиотреитол) и добавлением 0,5 мМ ддтТТФ (линии 10-12) о или нормальньїх условиях с удалением дАТФ (дезоксиаденозинтрифосфат) и добавлением 0,5 мМ ддАТтФ «г (линии 13-18). Реакционная смесь в линиях 1-9 содержала 8 мкМ общего дГТФ, 1 мкМ из которого составлял З2Р-ДГТФ(ВО0 Ки/мм). Для облегчения детектирования мутантной теломеразь! реакционная смесь в -
Зз5 линиях 10-18 содержала 8 мкКМ общего дГТФ, 2 мкМ из которого составлял. З2Р-дГТФ (800 Ки/мМ). Зкстрактьі «Ж обрабатьввали рибонуклеазой, свободной от ДНКазь (20 мкг/мл в течение 10 минут при З0"С перед анализом теломеразь (линии 1-3, 16-18). Фланкирующие линии содержат маркерь! ДНК с размерами в нуклеотидах (п), как зто показано на рисунке (см.Фиг.1). «
Фиг.2. Уровень устойчивого состояния РНК-компонента теломеразьії (РІЧ) и РНК САРОН определяли, используя количественньй анализ ОТ-ЦПР.Результатьь контроля показьвают, что все количественнье - с показатели ЦПР находились в линейном диапазоне до 25 циклов. Анализ ОТ-ЦПР проводили для пяти а нормальньїх теломеразо-негативньїх клеточньїх линий (1-5) и пяти опухолевьх теломеразно- позитивньх "» клеточньїх линий (6-10): 1) первичная линия клеток легкого плода; 2) первичная линия клеток кожи руки плода;
З) первичная линия клеток предстательной железь! взрослого; 4) первичная линия клеток синовиальньх фибробластов; 5) фибробластов крайней плоти; 6) меланомь! Г ОХ; 7) лейкоза 0251; 8) МСІН2З рака легкого; 9) - опухоли ободочной кишки 5ЗМУ620; 10) опухоли груди МСЕ7. Продуктьі ЦПР бьіли маркированьї с помощью 2Р, -І внесеньі в бо ПААГ и подсчитаньі), используя люминесцентньій счечик радисоактивности. Относительная транскрипция вьіражается в произвольньїх единицах. ї- Фиг.3. Средняя длина терминальньїх рестрикционньїх фрагментов (ТРФ) в антисмьсле РНК-компонента о 50 теломеразьй и в векторньїх контрольньїх клетках. Клетки НеТе7, которне стабильно зкспрессируют 10-3-РТч антисмьісловой или векторньй контроль, бьіли вьібрань! в среде гигромицина или пуромицина и отобрань! через "м 23 УУП (уровень удвоения популяции) после транфекции. Бьіла очищена ядерная ДНК, осуществлен разрез с помощью Ніпі'ї и КзаЇ и проведеньі опьітьі на 0,595 геле агарозьі ДНК бьіла определена в геле с помощью олигонуклеотида(«ТТАсОоо) для маркировки теломерических терминальньїх рестрикционньїх фрагментов (ТРФ).
Гель сканировали с помощью молекулярного динамического счетчика радисактивности и среднее значение ТРФ
Ге! подсчитьшвали так, как зто описано в. (Айворр еї а). (1992) Рос. Май. Асай. сі. (О5А) 89: 10114).
Пунктирньсе линии указьівают на среднюю величину ТРФ для антисмьсловьїх и контрольньх групп. де Фиг.4 Схематическое представление способа ЦПР іп ві.
Описание предпочтительньїх вариантов вьіполнения изобретения бо Настоящее изобретение предусматриваеєт создание способов, реагентов, генетически модифицированньх животньїх и клеток, а также фармацевтических составов, относящихся к рибонуклеопротеидовой теломеразе человека.
Используемая в дальнейшем терминология и лабораторнье методики в культуре клеток, молекулярной генетике и химии и гибридизации нуклеиновьїх кислот, описаннье ниже, могут включать хорошо известнье и б5 обьчно используемье в данной области методики. Стандартнье методики используются для осуществления способов получения рекомбинантной нуклейновой кислотьі, синтеза полинуклеотидов, и вьіращивания и трансформации микробов (например, злектропорация, липофекция). Указанньіе методики обьічно применяются известньмм в данной области образом в соответствии с различньми источниками информации (см., главнь!м образом, ЗатбгооК еї аІ. МоіІесшаг Сіопіпуд: А І арогаїогу Мапиаї, 24 ей. (1989) Соїд Зргіпд Нагбог І арогайгу
Ргезв, Соїй Зргіпд Нагрог, М.М., которая используется в данном описаний в качестве ссьІлки), которье используются на протяжений всего описания.
Олигонуклеотидь! могут бьіть синтезированьі на синтезаторе олигонуклеотидов типа Арріїед Віо Зузіетв в соответствий с инструкциями, поставляемь/ми изготовителем.
Способьії амплификации ЦПР описаньі в следующих источниках, относящихся к данной области: (РСК /о Тесппоіоду: Ргіпсіріеєв апа Арріїсайопе ог ОМА Атрійісайоп ей. НА Епісп, Ргеетап Ргезв, Мем Хогк, МУ (1992); РСК РгоїосоЇїв: А Сціде юю Меїпоаз апа Арріїсайопв5, едв. Іппіз, СеШапа, ЗпізКу, апа М/пйе, Асадетіс
Ргезз, Зап Оіедо, СА (1990); Майіа еї аїЇ. (1991) Мисівіс Асіаз Кев. 19: 4967; ЕсКегі, К.А. апа Кипкеї, Т.А. (1991) РСОК Меїййподз апа Арріїсайопе 1: 17; РСК, едв. МесРІегзоп, Оцігкевз, апа Тауїог, ІК Ргевзв, Ожхога; и патент США 4,683,202, используемье в данном описаний в качестве ссьілок). Изобретение частично основано /5 на клокирований и вьіделений РНК-компонента теломеразь человека и гена для зтого РНК-компонента, включая связаннье транскрипционнье контрольнье злементь. Ниже показана нуклеотидная последовательность
РНК-компонента теломеразьі человека. Для удобства последовательность показана с использованием стандартньїх сокращений, принятьїх для рибонуклеотидов (А - рибоаденин, о - рибогуанин, С - рибоцитидин, Ш - уридин). Специалисть! в данной области понимают, что показанная ниже последователтьность также отражаєт 2о последователтьность КДНК, в которой рибонуклеотидь! замещень! дезоксирибонуклеотидами ( причем уридин замещен тимидином). сосІссоБАСссАососОсосссосссАссооОссососоМмлллллІСОС
ППААСССИААСОСАСААсосссОдсососссОсслллІВСОСССсосСсСсосооС
ОСІДЛЛЛЛІСЮСССОСАСІЛЛІСАССССССССААААСссСсОсСоСсСсОсСсосСООЇ
ПССАСССІІСАГОСОАСАССАААСАДААААОСОСАсСсОССсОСоСсоССвООС се оССССусссоосбАСсСсИиСсСсооСсСсоБОССсСОССсссСАСсссссСАдсоссосоос о
ПСпАСоссосоСОСсооссоССосСпІСОСССбАСеСАСССАСОвссАССоС сААСАсСтОсСооссососОосАосососоооосОсОсооооосоАсоосоАооО
ССАСССТЛЛІСАССССОСАССААСАССААСосСАСссАсСОСсСсСсососососс
СССАІЛІСССОСАССПАОСССАССОССАСССАССАСОССССОСАСАСАОСС
АССОСЛІССОСІШССОССССССААсСоСсСоАОсССОСсоСсСАОССсвИСАС ї-
СССусссссссАСИССССССІЛІВОСААСССССАААССОСАСОСАСОССоС
САСОСОбСО. о « ча « « - с Вьішеуказанная последовательность показана в направлений 5 -3 и пронумерована для последующих а ссьілок. Полагают, что матричная последовательность РНК-компонента расположена в пределах области, "» определяемой нуклеотидами 50-60 (5-СОДАСССИОДАС-3), которая комплементарна теломерической последовательности, составленной из приблизительно одной и двух третей единиц теломерических повторов.
Зта последовательность бьіла вьіделена из клонов кКДНК и из геномного клона РНК-компонента. При первом т. транскрибированиий РНК-компонента из соответствующего гена по меньшей мере несколько продуцированньмх -1 РНК-транскриптов намного длиннее, чем последовательность из приблизительно 560 нуклеотидов, показанная вьше, и в действительности могут содержать более тьісячи нуклеотидов. Однако полностью функциональная ї молекула теломеразь! может бьіть собрана из транскриптов, состоящих из вьішеукаазнной последовательности о 50 из приблизительно 560 нуклеотидов. Полагают, что 3' -конец РНК-компонента нативной теломеразьї! находится внутри области, определяемой нуклеотидами 514-559 вьішеуказанной последовательности; анализ показьваєет, що что 3 -конец может бьть І - остатком нуклеотида 538. Молекульй рекомбинантного РНК-компонента, содержащие меньше, чем нуклеотидьї 1-559 вьішепоказанной последовательности, также могут использоваться для получения активной теломеразь.
Геномньїй клон идентифицировали и вьіделяли из геномной библиотеки ДНК человека, введенной в лямбда -вектор РІХІЇ. Геномньій клон, содержащий последовательности гена РНК-компонента, включал вставку из о приблизительно 15 т.п.н. и бьл обозначен как клон 28-1. Ген локализовали на дистальном конце 4 плеча іме) хромосомь!ї 3. Информация о последовательности, полученная из сайта распознавания рестриктазьї ЗашПА|Ї! на одном конце вставки из приблизительно 15 т.п.н. до внутреннего сайта распознавания рестриктазь! Ніпагйі, бо которьій содержит всю последовательность зрелого РНК-компонента, а также контрольнье злементь транскрипции гена РНК-компонента лямбда-клона 28-1 показаньь ниже с использованием стандартньх сокращений дезоксирибонуклеотида и изображень в направлений 5' -3. б5
САСССАСТТТАТСТААСТОААТАССАСТААААСТТТТААСАТСАТССТСТ
САТТТАТАТСТААААСТОСАСТАТАСТССССАТТАТАААААТТСсссссс
СССТОСОСТОСССТСАТАССТОТААТСССАССАСТТТСССАСССССААссо
ССТОСАТСАСТТОАССССТООССТТССАСАССАСССТООССААСАТОСТСо
АААССССССТСТСТАСТАДАААСАСАААААСТАСсСТоСосоТоСсТоосА
СССССТСТААТСССАССТАСТСАССАСОСТСАСАСАССАСААТСОСТТОА
АССССССАССАСАССТТССАСТСАССССАСАТСАСОССАСТАСАСТССАТ
ССАСССТОССССАААСАССААСАСТОССТСТСАААААААААААТССТТАС
ААТТТАТОСТОСАТТАСТОСССТСТІТТТАССТСАТСААСАСАСАбСАСТ
АСТІТАААССАЛАСТСААТСАТТОАААСОоССТТТСТІТССТААТААААСо 70 САСАТТСАСТОСТТААСАТТААТААТСТАСТАСТТАСАСТІСАТТАААСС
САТССТСТОСТСААССАСАСОСТОСАСААСОСАТТСТААССАСАЛоссосС
САСССТАССААСТСССАСССАТСССАСТСАССССАСАСААСАТТСТОоСТо
ТАСТСАСТОСТОССТОССААТСТАТТТТСАСАААСТТІСТОСААААААТСТ
САТСАТСААЛАСТАССААТТАСТСТІСТОТСТСТТАСССССТААААТСТТ
ССТОТСААТТССАТТІТТААССТАСТССАССТСААсСсосстТСстТостТстТоС /5 АСАССАТАСААААААСССССТСТСАТАССТСААСТТАСТІТСАССТТТАА
АСААССТСССААСТАААСАСССАААСССТТТСССОСАССТОСОСААСсоСС
ААССТССТТССТСАТССССОСАААТССААСТТТААтТтТтсссоттТоессссс
ААССАБССССССССАСАСАСТСАСТСТСАССАСАСССОССАСАСТСАССТ
ТОСССААТССоТОоССоТСССССоССоСТоССтТТТАТААСссоАстТесссС
СОСАССССАССоССТТоСоСАСССАсостооосстообАсосстТостоос
САТТІТТІТОТСТААСССТААСТСАСААооосстТАоссоссотТостТтТтТтТоС
ТССССОСОСССТОТІТТТІСТСОСТСАСТТІТСАССОСССОСААААсСсСстТео
СССТОСССССТТССАСССТТСАТТСТАСАССАААСААААААТСТСАССТО стсоссосоттеосссстоссоосАсстособсоостосстТосссАвсссс
ССААССССОССТобАСоССоСОоСтТобоСсСсоСосттТСТоСобАСССАССС
АСТОССАСССССААСАСТТооосТотТотТсАсссососотТстТотТоооооос
САССОСОСАССТТСАСССТТТСАСОССССАССААСАССААСССАССоАСсТС с
ССССОССССОСОСОАТТСССТСАССТАТСССАССТОСАСССАССАСТОСо
СТСАСАСАТССАСТТСССТІТССТОТТОоСТООООоСААСсоссоАТСОТОС о)
ССАТСССТСАССССТООССООСАСТОСОООСТТСТОААСССССАААССТо
АСТОАСТОБОССАСТОТОСТОСАААТТОССАССАСАССТОААСосдСсСстТС
СААДАСТОСССССААДАТОААТООССАСТОАдосСсооостТтосстосАсссстТ
ТестосстТосотТІСсТоСсстТСТТосостТттТтТІСТТОССТІТТАТОоСТТСТ їч-
АТТАСААСТТАСТТССТОСТСТОСАСАТТТТСТТСАСстТтТтТтТтТостТтТСтТе
ССААССТАСАТСТССАССАСТОССТСААСОоСОСТСТоооСАСААСАСТСА о
ТІТТТІТТТСАСАСАТСАТТІТААСАТТТААТСААТАТТТААТТАСААСАТ
СТАААТСААСАТТОСАААТТСТСТТССТТТААТОСТСАТСССТТТАТОСС «г
АСАССТТАСААСТТТСТТІТТТТСАААААТТАСАССТТОСССАТоАСсСстТТо
АССАСТАБСАТАТААСССССАСААССТТ-З, ї- « с . а с» -І с» (ав) "і ко 60 65
ССААТСССтТОоСесТСссСсоссосСтТосстТІТАТААССССАСТСССССоСС : : : : й 1500 вОСОоСАССООСТТОСООАСССАСССТоССССТобСАССостТоСтТосссАТ й " " и " 1550
ТІТТТСТСТААСССТААСТСАСААСсосстТАСсСсосСсостостТтТтТтТостТеС 4 є ч 1 й 5 1600
СссоооссстТсТтТтТТТсСТоосСтТоАСТТТСАССооСсСсСАЛАдСССТоСССоС 1 1 . Я . 1650
ТОСССССТТССАСССТТСАТТСТАСАССАЛАСААААААТСТСЬССТоСТо ' ' " ' . 1700 сссосттовсссстТоесссооАсстТосСобсооСтТСостТесСссАССССССсСА
Г ї . і 4 1750 70 АССССОССТоСАССССССССсТоСоСССоооСстТТСтТСсоСАСССАСССАСТ ч Е й є їх 1800
СССАСССССААСАСТТОСОСТоТоТСАсССссососстТотТотессобоссАС : . : : . 1850
ССССАССТТСАСССТТТСАССССССАССААСАССАДСССАСССАСТСССС є їі к . ї 1300
СОСОСООСОССАТТОССТОАССТАТОССЬССТОСАСССАССАСТооССТе й й « ' ' 1950 15 АСАСАТОСАСТТСОСТТТОСТОТТОСТОССОССААСОСССАТОСТоСоСА
Й ' ' ' й 2000
ТеССТСАССССТоССССССАСТоСССОСТТСТСААСССОСАААССТСАСТ и Й " ' ' 2050
САСТОСОССАСТОСТОСТОСАДАТТОССАССАСАСОТСААСССАССТОССАА
" ' " й ' 2100 уй АСТССОССААААТСВАТССССАСТСАСССОСОоСТТСССтТосСАССССТТСС
СУ . ч ї ч 2150 тесстТоостТТСТоСостТСТТосостТТТТТстТТссстТтТТАТОСТТСТАТТ зо Й Й Й й ' 2200
АСААСТТАСТТОСТОСТСТОСАСАТТТТСТТСАССТТТТТОСТІСТеСсА . . є ' . 2250
АССТАСАТСТССАССАСТСССТСААССОССТСТОСССАСААСАСТСАТТТ с
Б ї ч із г 2300 25 35 ТІТІТТСАСАСАТСАТТТААСАТТТААТСААТАТТТААТТАСААСАТСТА о " Й й " ' 2350
ААТОСААСАТТОСАААТТСТСТТССТТТААТССТСАТСССТТТАТСССАСА
4 . СІ ї (З 2400
ССТТАСААСТТТСТТТТТТОАВАЛАТТАСАССТТССССАТОАССсТТоАоС 40 " . ' 2425 м
АСТАССАТАТААСССССАСААССТТ
Последовательность РНК-компонента начинаєтся у основания 1459. В последовательности о идентифицируются различнье злементь! контроля транскрипции. Консенсусная последовательность А/ї ВОХ находится в последовательности нуклеотидов от 1431 до 1436; консенсуснье последовательности РБОЕ « находятся в последовательности нуклеотидов от 1406 до 1414, а также в последовательности нуклеотидов М 1508-1526; консенсусная последовательность СААТ Вох находится в последовательности нуклеотидов от 1399 32 до 1406; консенсусная последовательность ЗР1 находится в последовательности нуклеотидов 1354-135 й « консенсусная последовательность злемента, отвечающего бета/гамма-интерферону, находится в последовательности нуклеотидов 1234-1245. Устойчивая транскрипция гена РНК-компонента теломеразь человека в клетках человека, таких как НТ1080 (зкспрессирующих теломеразу) почти не изменяется, когда « последовательности, расположеннье вьше нуклеотида 1159, удаляются в векторьі, которье устойчиво З трансфекцируются в клетки. с ДНК от беличьей обезьянь), которая, как полагают, находится среди найболее генетически дивергентньх "» приматов кроме человека по отношению к человеку, содержит ген РНК-компонента теломеразь, которьй " поддаєтся амплификации праймерами ЦПР, содержащими последовательности, которье соответствуют или комплементарньі заявляемой полинуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразь! человека. Полагают, что другие не относящиеся к человеку приматьї обладают генами РНК-компонента теломеразь, ве которье также поддаются амплификации праймерами ЦПР, вьіделенньми из последовательности гена -І РНЕ-компонента теломеразь! человека.
Полинуклиотидьі РНК-компонента теломеразь! ве Заявляемье последовательности РНК-компонента теломеразьї млекопитающего и его гена, как показано о 20 вьіше для теломеразьй человека, а на рис.5 для теломеразьй беличьей обезьяньї, делают возможньм конструирование вьіделенньїх полинуклеотидов, содержащих последовательность из по меньшей мере 15 "М смежньїх нуклеотидов, обьічно по меньшей мере из 20-25 смежньїх нуклеотидов, которая в значительной мере идентична последовательности РНК-компонента теломеразьі млекопитающего или последовательности гена
РНК-компонента млекопитающего. Кроме того, последовательности РНК-компонента теломеразь 29 Ммлекопитающего (и гена) делают возможньм конструирование зондов гибридизации нуклейновой кислоть и
ГФ) праймеров ЦПР, которье могут использоваться для детектирования последовательностей РНК и ДНК родственного РНК-компонента теломеразь и/или гена в клетке, клеточном образце, тканевом срезе, о реакционном сосуде, гибридизационной мембране и т.д.
Полинуклеотидьі, содержащие последовательности Р Н К-компонента теломеразьї млекопитающего, могут 60 включать последовательности, способствующие транскрипции (зкспрессирующие последовательности), последовательности, стабилизирующие РНК и т.п. Основньіми принципами о конструирования таких полинуклеотидов с точки зрения раскрьтой ниже информации о последовательности и направленности изобретения хорошо известньії в данной области и описаньі Мапіаїйїз еї аіІ., МоіІесціаг Сіопіпд: А І арогагу
Мапчиаї, 274 єд. (1989), Соїа Зргіпд Нагрог, М.У. Например, но не ограничиваясь зтим, такие полинуклеотидь бо могут включать промотор и, необязательно, знхансер для использования в зукариотньїх зкспрессирующих хозяевах и необязательно последовательности, необходимье для репликации вектора. Типичная зукариотная зкспрессирующая кассета включает полинуклеотидную последовательность, которая, будучи транскрибированной, продуцирует транскрипт РНК-компонента теломеразьй млекопитающего; такая полинуклеотидная последовательность связана в направлений вниз ( т.е. в транскрипционной ориентации от 5" до З подходящего промотора, например, ВГЧ тк (тимидин-киназа)-промотора или фгк (фосфоглицерат-киназа)- промотора, необязательно связанного с знхансером.
Кроме того, там, где зкспрессия функционального РНК-компонента теломеразьі! нежелательна, полинуклеотидьі согласно настоящего изобретения не нуждаются в транскрибированиий транскрипта 7/0 функционального РНК-компонента теломеразьі. Полинуклеотидь! согласно зтого изобретения могут служить в качестве зондов гибридизации и/или праймеров ЦПР (умноженньїх копий), и/или олигомеров ЦАР для детектирования последовательности РНК или ДНК РНК-компонента теломеразь.
С другой стороньі, полинуклеотидьі согласно настоящего изобретения могут служить в качестве зондов гибридизации или праймеров для детектирования последовательности РНК или ДНК родственньїх генов или у/5 Гена РНК-компонента теломеразьі родственньх видов, обьчно видов млекопитающих. Для подобного применения гибридизаций и ЦПР полинуклеотидь! согласно настоящего изобретения не нуждаются в транскрибированиий функционального РНК-компонента теломеразьі. Таким образом, полинуклеотидь! согласно настоящего изобретения могут содержать значительнье делеции, добавки, заменьі и/или транспозиции нуклеотидов до тех пор, пока сохраняется специфическая гибридизация или специфическая амплификация в 2о последовательности РНК-компонента теломеразь! млекопитающего.
Геномнье или кКДНК клоньї РНК-компонента теломеразьі и соответствующие последовательности генов могут бьїіть вьіделеньї из библиотеки клонов (например, имеющиеся в Сіопіесй, Раїо АЮ, СА), используя зондь! гибридизации, сконструированньсе на основе раскрьїтьїх в данном описаний нуклеотидньїх последовательностей и обьічнье способьі! гибридизационного скрининга (например, Вепіоп М/О апа Оамів КМУ (1977) Зсіепсе 196: 180; сч боодзрееай еї аї. (1989) Сепе 76:1). В случає, если необходим клон кКДНК, он преимущественно вьібирается из библиотек клонов, содержащих кДНК, полученную из РНК соматической клетки или РНК другой клетки, і) зкспрессирующей РНК-компонент теломеразь. С другой стороньї, синтетические полинуклеотиднье последовательности, соответствующие всем или части последовательностей, раскрьітьїх в данном описаний, могут бьїть сконструированьї посредством химического синтеза олигонуклеотидов. Кроме того, цепная ї- зо полимеразная реакция (ЦПР), использующая праймерь! на основе данньїх о последовательности, раскрьтой в данном описаний, может использоваться для амплификации фрагментов ДНК из геномной ДНК, пулов РНК или о библиотек клонов кКДНК. Способ ЦПР описан в патентах США 4,683,195 и 4,683,202. «Е
Такие полинуклеотидьії находят различное применение, например, в качестве зондов РНК-компонента теломеразьї, матриц для продуцирования функционального или нефункционального РНК-компонента - з5 теломеразьі в клетках, в качестве коммерческих диагностических реагентов для стандартизации метода «г детектирования РНК-компонента теломеразь,, в качестве генотерапевтических полинуклеотидов для применения на животньїх; такие полинуклеотидь! могут также использоваться в качестве кормов, источников знергии от горючих веществ, поглощающих ультрафиолетовое излучение солнцезащитньх агентов и растворов с повьішенной вязкостью, а также другие видь! использования. «
Рассмотреннье в настоящем описаний плазмидь), которье бьли сконструированьї при клонирований в с РНК-компонента теломеразьї человека и гена для РНК-компонента, являются важньми аспектами настоящего изобретения. Указаннье плазмидь! могут использоваться для продуцирования РНК-компонента, а также гена ;» РНК-клмпонента, теломеразь! человека в почти чистом виде, что является другим важньїм аспектом настоящего изобретения. Кроме того, специалистьі в данной области понимают, что цельій ряд других плазмид, а также неплазмиднье нуклейновье кислотьі в почти чистом виде, которье содержат всю или по меньшей мере ї5» полезную часть нуклеотидной последовательности РНК-компонента теломеразьі человека, являются полезньіми материалами, получаемьми при воплощений настоящего изобретения. ш- В отношений нуклеийновьїх кислот и препаратов, содержащих указанньюе нуклеийновье кислоть! согласно ї5» изобретения, специалисть! считают главньм то, что нуклеиновье кислоть! согласно изобретения включают как 5ор Молекульй ДНК, так и молекульь РНК, а также их синтетические аналоги неприродного происхождения и о гетерополимерьі дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и/или их аналоги. Определенньй состав
І нуклеийновой кислотьі или ее аналога согласно изобретения зависит от цели использования материала и от окружающей средь (сред), в которую должньі поместить материал. Для достижения целого ряда целей бьіли сконструированьіь модифицированньюе, синтетические неприроднье нуклеотидь, которье остаются вв стабильньіми при использований в различной окружающей среде, например в среде, где присутствуют нуклеазь, как зто известно в данной области. Модифицированнье или синтетические неприроднье нуклеотидь! (Ф, по сравнению с природньмми рибо-или дезоксирибонуклеотидами могут отличаться в отношений углевода ка (сахара), фосфатной связи или участков основания нуклеотида или могут даже содержать ненуклеотидное основание (или вообще не иметь основания) в некоторьїх случаях. См., например, Агоїа еї а!., патент РОСТ, бо номер публикации УУО 89/02439, озаглавленньій "Ненуклеотиднье связующие реагенть! для нуклеотидньх зондов", используемьій в данном описаний в качестве ссьілки. Также как и нуклейновье кислоть! согласно изобретения могут содержать большое разнообразие нуклеотидов, так и зти нуклеийновье кислоть! могут служить вьіполнению самьїх разнообразньх целей.
Вьіделение родственньх генов 65 Как показано в последующем описаний, получение очищенньх нуклеиновьх кислот, содержащих последовательность РНК-компонента теломеразьі человека, обеспечивает создание ценньїх диагностических и терапевтических способов и реагентов, а также другие важнье преимущества. Одним из главньїх преимуществ, обеспечиваемьх настоящим изобретением, является то, что способь! и реагенть! согласно изобретения могут бьіть использовань! для вьіделения РНК-компонента и генов для РНК-компонента теломеразьії из любого вида Ммлекопитающих, которне имеют РНК-компонент, существенно гомологичньй РНК-компоненту человека согласно настоящего изобретения. Вьіражение "по существу гомологичньІй" соответствует такой степени гомологии, которая требуется для специфической гибридизации олигонуклеотида или последовательности нуклеийновой кислотьі РНК-компонента человека с последовательностью онуклеийновой //- кислоть последовательности РНК-компонента других видов млекопитающих. При такой существенной гомологий 7/0 специалистьі в данной области могут использовать нуклейновье кислоть! и олигонуклеотиднье праймерь! и зондьі согласно изобретения для идентификации и вьіделения существенно гомологичньх последовательностей.
Например, можно зондировать геномную или библиотеку фрагментов кКДНК для детектирования гомологичньЬїх последовательностей. Можно также использовать праймерь, соответствующие участкам 7/5 последовательности РНК-компонента и амплификацию ЦПР в условиях малой или умеренной строгости для амплификации специфической гомологичной последовательности нуклеийновой кислоть! из препаратов РНК или
ДНК, полученньхх от вида млекопитающего. За счет использования зтих и других аналогичньїх методик специалистьі в данной области могут легко вьделить не только различнье нуклеийновье кислоть
РНК-компонента из клеток человека, но также гомологичнье нуклеийновье кислотьї РНК-компонента из клеток 2о других млекопитающих, например, из клеток приматов, домашнего скота, т.е. крупного рогатого скота, овец, лошадей, собак, котов, грьізунов, таких как крьіс, мьішей и хомяков. В свою очередь, зти нуклейновье кислоть могут использоваться для вьіведения трансгенньїх животньїх, представляющих большую ценность для скрининга и испьтания фармацевтических преператов, регулирующих активность теломеразьі. Например, используя плазмиду согласно изобретения, можно промоделировать ген РНК-компонента или заменить ген с г природного РНК-компонента на рекомбинантньй индуцируемьй ген в тиз зргейиз змбриональной стволовой о клетке, а затем создать трансгенную мьішь, которую можно использовать в качестве модели или опьітного образца для исследования заболеваний возрастного характера или старения. В приведенном ниже примере 9 показьшвается, каким образом подобная методология использовалась для идентификации и вьіделения последовательностей РНК-компонента приматов. М зо Другие гомологи РНК-компонентов теломеразь! человека и обезьянь! и/или родственньїх генов могут бьїіть идентифицировань и вьіделеньь путем скрининга подходящей библиотеки геномньх и кДНК клонов о млекопитающих кроме человека, например, вьіделенньїх из мьіши, крьісьі, кролика, гвинейской свиньи, хомяка, «Е из псовьїх, бьічьих, овечьих, волчьих, свиньїх или других геномньїх или кКДНК библиотек в подходящем векторе, таком как дрожжевье искусственнье хромосомь!, космидь! или лямбда-бактериофаг (например, лямбда- Спагоп - з5 Зо), полинуклеотидньім зондом, содержащим последовательность из по меньшей мере 20 смежньїх нуклеотидов «г (или их комплемента) РНК-компонента теломеразьй человека или обезьяньь или полинуклеотидную последовательность гена. Обьічно условия гибридизациийи и промьівания вьіполняются с вьісокой степенью строгости на основе обьічньїх способов гибридизации. Позитивнье клонь! вьіделяются и секвенируются. Для иллюстрации, но не для ограничения, полноразмерньій полинуклеотид, соответствующий последовательности «
МиЗ 559 нуклеотидов РНК-компонента теломеразь! человека, может бьіть маркирован и использован в качестве 7) с зонда гибридизации для вьіделения геномньїх клонов из библиотеки геномньїх клонов не человеческого происхождения в лямбда- ЕМВІ 4 или лямбда- СЕМ11 (Рготеда Согрогайоп, Мадізоп, УУізсопвіп); типовьіми ;» условиями гибридизации для скрининга бляшек (Вепіоп апа Оаміз (1978) Зсіепсе 196: 180; Юипп еї аї. (1989) 3.
ВіоІ. Спет. 264: 13057) могут бьіть: 5095 формамид, 5 х З5С (раствор хлорида и цитрата натрия) или ЗОРЕ, 1-55: раствор Денхарта, 0,1-196 ЗОЗ (додецил сульфат натрия), 100...200мкг фрагментированной гетерологичной ДНК ьч или тРНК, 0-10965 декстран сульфата, 1 х 107 до 1 х 109 циклов в минуту/мл денатурированного зонда с удельной активностью, равной приблизительно 1 х 10 циклов в мин./мкг и инкубация при температуре 42"С - 37"С в і течение приблизительно 6-36 часов. Условия предгибридизации в основном идентичнь! вьішеуказанньм, за «» исключением того, что зонд не используется , а время инкубации обьічно сокращается. Условия промьівания обьчно предусматривают 1 -З3х ЗЗС, 0,1-196 5ОЗ (додецил сульфат натрия), 45-70"С с изменением о промьівочного раствора через каждье приблизительно 5- 30 минут. Для вьіделения полинуклеотидов "І РНК-компонента теломеразьі не человеческого происхождения с помощью полинуклеотидного зонда РНК- компонента теломеразьй человека часто предпочитают гибридизацию при меньшей степени строгости, например, температуре приблизительно равной 39 С, и последующей промьівке при следующих температурньїх режимах: комнатная температура, 37"С, 39"С, 42", 4570, 5070, 5570, 6070, 657С и 707С с остановкой после каждого зтапа и контроля за фоном сигнала зонда (и необязательное детектирование сигнала с помощью о авторадиограммь! и/или радисоактивного подсчета фосфора, если используется радиомеченьій зонд) и ко прекращение зтапов промьвки при достижении требуемого соотношения сигнал/шум, определяемого зкспериментальнь!м образом. во Полинуклеотидь, содержащие последовательности из по меньшей мере оприблизительно 30...50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов, соответствующие или комплементарне рассмотренньім в данном описаний нуклеотидньім последовательностям последовательностей РНК-компонента теломеразь! человека или обезьяньі, могут служить в качестве праймеров ЦПР и/или зондов гибридизации для идентификации и вьіделения генов зародьшевой линии, соответствующих заявляемьм последовательностям 65 гена и РНК-компонента. Указанье геньі зародьшевой линии могут вьіделяться различньмми способами, обьічньіми в данной области, включая, но не ограничиваясь гибридизационньїм скринингом геномньїх библиотек в лямбда-бактериофаге или библиотек космид, или амплификацией ЦПР геномньїх последовательностей с использованием праймеров, вьіделенньїх из заявляемьх здесь последовательностей. Геномнье библиотеки человека общеизвестнь или могут бьіть сконструировань вновь из ДНК человека.
Специалисту в данной области понятно, что замещения, делеции и добавления нуклеотидов могут вводиться в полинуклеотидьі согласно изобретения. Разновидность нуклеотидной последовательности может бьіть получена из полиморфизмов последовательности различньїх аллелей и т.п. Однако подобнье замещения, делеции и добавления нуклеотидов не должнь! в значительной степени нарушать способность полинуклеотида гибридизироваться с одной из полноразмерньїх полинуклеотидньїх последовательностей РНК-компонента /о тепомеразь! человека или обезьяньі, представленньїх в данном описаний в условиях гибридизации, которне являются существенно строгими для получения специфической гибридизации.
Полинуклеотидьї РНК-компонента теломеразьь млекопитающего могут представлять собой короткие олигонуклеотидь! (например, с длиной 200...100 оснований), например, для использования в качестве зондов гибридизации и праймеров ЦПР (ЦАР). Полинуклеотиднье последовательности могут также содержать часть 7/5 большего полинуклеотида (например вектор клонирования, содержащий клон РНК-компонента теломеразь!) и могут бьіть слить с помощью полинуклеотидной связи с другой полинуклеотидной последовательностью.
Обьічно полинуклеотидьії РНК-компонента теломеразьі содержат по меньшей мере 25 последовательньх нуклеотидов, которве в основном идентичньії последовательности гена или РНК-компонента природной теломеразьї, чаще полинуклеотидьї РНК-компонента теломеразьій содержат по меньшей мере 50...100 го последовательньх нуклеотидов, которье в основном идентичньі последовательности РНК-компонента теломеразьі млекопитающего. Однако специалистам понятно, что минимальная длина полинуклеотида
РНЕ-компонента теломеразьі, необходимая для специфической гибридизации с целевой последовательностью
РНК-компонента теломеразь), зависит от нескольких факторов: содержание /С, расположение ошибочно спаренньїх оснований (если таковье имеются), степени уникальности последовательности по сравнению с с ов популяцией целевьх полинуклеотидов и химической природь! полинуклеотида, например, метилфосфатного остова, полиамидной нуклеийновой кислоть!ї, фосфоротиолата и т.д.), а также от других факторов. і)
При необходимости умноженнье копий ЦПР для амплификации в основном полноразмерньїх реплик кКДНК могут вньібираться специалистом, исходя из его опьіта, подобньім образом можно вьібрать и умноженнье копий для амплификации участков гена РНК-компонента теломеразь (человека или обезьяньї). М зо Каждую из указанньх последовательностей можно использовать в качестве зондов гибридизации или умноженньїх копий ЦПР для детектирования наличия РНК-компонента теломеразьі с целью, например, о диагностики неопластического заболевания, характеризуемого наличием в клетках повьшенного или «Е пониженного уровня РНК-компонента теломеразьї или для вьшполнения тканевого типирования ( например, идентификации тканей, характеризуемьїх зкспрессией РНК-компонента теломеразьї) и т.п. Последовательности -
Зз5 Можно таюже использовать для детектирования последовательностей геномного гена РНК-компонента «г теломеразьі в пробе ДНК, например, для проведения судебно-медицинского анализа ДНК (например, посредством анализа полиморфизма рестрикционньїх фрагментов (ПМРФ), распределения длинь(длин) продуктов ЦПР и т.д.) или для диагностики заболеваний, характеризуемьїх амплификацией и/или перестройками гена РНК-компонента теломеразиьі. «
Например, но, не ограничиваясь зтим, может бьіть использована следующая пара олигонуклеотидньх в с праймеров для амплификации полинуклеотидньїх последовательностей РНК-компонента теломеразь
Й (например, кДНК) или в качестве зондов гибридизации (например, в качестве биотинилированньїх или меченьх а на конце олигонуклеотидньх зондов):;Йд й ,
ГАССАСАСТОССССАСТСАСТСАССТІТОЯ и я5 ЗК ТТ ОПО САСОСАССОСТОССССТОСОСАУ, їх Специалистам в данной области известньі другие подходящие праймерь! ЦПР, праймерь! ЦАР, зондь гибридизации, праймерь и другие аналогичнье им средства с точки зренгия заявляемьїх последовательностей, ш- которье к тому же могут бьть получень. Полинуклеотидьї РНК-компонента теломеразьй человека и их ї5» комплементь! могут служить в качестве зондов гибридизации или праймеров для детектирования последовательностей РНК или ДНК РНК-компонента теломеразьї млекопитающего. Для такого применения о гибридизации и ЦПР они могут содержать существеннье делеции, добавления, замещения и/или транспозиции
І нуклеотидов, пока сохраняеєется специфическая гибридизация или специфическая амплификация последовательности РНК-компонента теломеразьі! человека. Однако такие замещения, делеции и добавления нуклеотидов не должньі в значительной мере нарушать способность полинуклеотида гибридизироваться с в последовательностью гена или РНК-компонента теломеразьі в условиях гибридизации, которне являются достаточно строгими для осуществления специфической гибридизации. (Ф, Например, но, не ограничиваясь зтим, полинуклеотид РНК-компонента теломеразьй человека может ка содержать последовательность нуклеотидов от 48 до 209, которая, как полагают, достаточна для восстановления холознзима теломеразьї человека в присутствии белкового компонента теломеразь!: 60 б5
ОСОААСССПОААСОБАСААоСОоССОАОоСоСССО ССО СС
ССОСеСОСООСОООпСОСССИСАСИООСАССОСОСОСААААОСС
ОСБОССООССОССООССАСССПОСАООСОАСАССАААСАААДАА
9 ооо вів вові вові вве вові вони нли как ДНК: 5.
ТСТААСССТААСТОАСААоСОСОТАСОСОСССТОоСТ ТТОСТеСссС
ССОСОСТОТТТТТСТСОСТоАСТТ ТСАССООССССААЛААСССТСоО 70 СеСТОССОССсСТТССАСССТТСАТТСТАСАССАЛАСААААААТОТСАС оре оуеевовомів гово ково
Кроме того, полинуклеотид РНК-компонента теломеразьі человека может содержать или состоять из нуклеотидов 011-559 и может включать терминальнье добавки других нуклеотидов или нуклеотидньх последовательностей. Матрично-ползучий вариант, состоящий из нуклеотидов от 48 до 209, но в котором 72 изменена матричная последовательность теломерических повторов, способен конкурировать с укороченньім
РНК-компонентом, содержащим последовательность дикого типа от 48 до 209 для связьівания белкового компонента теломеразьї и восстановления холознзима теломеразь.
Структурньій анализ РНК-компонента теломеразьі! человека указьівает на участки, имеющие склонность к образованию вторичньїх структур, например, петель шпильки. Например, участок в пределах от приблизительно 20 нуклеотида 200 до нуклеотида 350 РНК-компонента теломеразь! человека, имеет в основном характер петли шпильки. Другие участки РНК-компонента теломеразьї также имеют вьіраженньй характер вторичной структури.
С точки зрения указанной вторичной структурь! другие нуклеотиднье последовательности, которье по данньім компьютерного анализа принимают форму аналогичньїх вторичньїх структур, могут бьть заменень специалистами. Хотя цельй ряд компьютерньїх программ пригоден для определения нуклеотидньх с 25 последовательностей, принимающих в основном характер зквивалентньїх вторичньїх структур, могут бьть о использованьі программьі РОГО, 5БОШІОС1ЕБ, СІКС ЕВ, ООМЕ5, МОШМТАЇІМ5, ТЕМІ ООР и др. из пакета программ анализа последовательностей ОМУССО. Подобньм образом ненуклеотиднье структурньюе копии, например, пептиднье нуклеийновье кислоть и т.п. могут бьть сконструированьь с помощью программ молекулярного моделирования в качестве копий характерной вторичной структурь! участка(ов) РНК-компонента - 30 теломеразьі человека, которьій подлежит копированию. Такие структурньюе копиий могут бьіть использовань с о терапевтической или другими целями (например, конкурентньй антагонист и т.д.).
Антисмьсл -
Одним из найболее ценньїх видов нуклетновой кислоть! согласно изобретения является антисмьісловой ї- олигонуклеотид, которьій может использоваться іп мімо или іп міго для ингибирования активности теломеразь!
Зо человека. Антисмьісловне олигонуклеотидь! содержат специфическую последовательность из приблизительно - до приблизительно 25...200 или более (т.е. достаточно больших для формирования стабильного дуплекса, но достаточно малой, в зависимости от способа доставки, для введения іп мімо, если зто необходимо) нуклеотидов, комплементарньїх специфической последовательности нуклеотидов в РНК-компоненте теломеразь! человека. «
Механизм действия таких олигонуклеотидов может включать связьвание РНК-компонента либо для предотвращения сборки функциональной рибонуклеопротеидовой теломеразь, предотвращения З с РНК-компонента от использования в качестве матриць для синтеза теломерической ДНК, дестабилизации "» РНК-компонента теломеразьь и уменьшения времени его периода полураспада и/или для ингибирования " транскрипции гена РНК-компонента теломеразь.
Характернье антисмьісловье олигонуклеотидь! согласно изобретения, которье служат для ингибирования активности теломеразь іп мімо или іп міго, включают вьішеупомянутье олигонуклеотидь! в связи с тестами по о определению того, содержит ли клон рОКМ7 кДНК для РНК-компонента теломеразь! человека. Три таких -І олигонуклеотида, как зто указано вьіше, использовались для демонстрационного ингибирования активности теломеразь іп міго. Последовательность каждого из зтих трех олигонуклеотидов показана ниже. о ТЗ 5-СТСАСТТАСОСТТАСАСАДА-У; о 50 РЗ 3-СОСССТТСТСАСТТАСОСТТАО-3;
ТАЗ 5-БОССОССТАСОСССТТСТСАСТТ-3 "м Зти олигонуклеотидь! могут также использоваться для ингибирования активности теломеразь! в клетках человека.
Специалистьі в данной области понимают, что настоящее изобретение обеспечиваєт создание широкого 295 ряда антисмьісловьх олигонуклеотидов, способньїх подавлять активность теломеразьі. Другим применяемьм
Ф! олигонуклеотидом согласно изобретения является олигонуклеотид ТеІ-А), которьій имеет последовательность 5-САСОСССАСССТОСОСААССОС-3 и которьій подобно любому из антисмьісловьїх олигонуклеотидов согласно о изобретения может бьіть синтезирован, используя фосфоротисоатнье нуклеотидьі, хирал-метилфосфонать, природнье нуклеотидьї или их смеси для придания стабильности и получения желательного Її . Специалисть 60 в данной области понимают, что цельій ряд модифицированньїх нуклеотидньїх аналогов, таких как О-метил рибонуклеотидьі, фосфоротисоатнье нуклеотидьії и метилфосфонатнье нуклеотидь! могут использоваться для получения нуклеиновьїх кислот согласно изобретения, которне обладают требуемьми свойствами в большей степени (например, нуклеазоустойчивость, более прочное связьівние и т.д.), чем нуклеийновье аналоги, в которьїх используются природнье нуклеотидьі. Другие способьї придания олигонуклеотидам устойчивости к бо нуклеазе включают способь, описаннье в патенте РОСТ, номер публикации 94/12633.
Дополнительнье варианть! воплощения изобретения, направленнье на модуляцию активности теломеразь, включают способь, в которьїх используются специфические антисмьсловье полинуклеотидь, комплементарнье всем или части последовательностей РНК-компонента теломеразь! человека (РТч), таким как антисмьсловье полинуклеотидь, комплементарнье гену РНК-компонента теломеразьі человека или его транскрибированной РНК, включая укороченнье формь), которье могут бьть связаньії с холознзимом теломеразьі. Такие комплементарнье антисмьісловне полинуклеотидь! могут включать замещения, добавления, делеции или транспозиции нуклеотидов пока сохраняется специфическое связьувание с релевантной целевой последовательностью, соотвеоствующей РНК-компоненту теломеразь или его гену в качестве функционального 7/0 свойства полинуклеотида. Комплементарнье антисмьсловье полинуклеотидьі включают растворимье антисмьісловье олигонуклеотидьі РНК или ДНК, которье могут гибридизироваться специфически с видом
РНК-компонента теломеразьї и предотвращать транскрипцию гена РНК-компонента теломеразь! (Спіпд еї аї. (1989) Ргос. Май. Асад. сі. О.5Б.А. 86: 10006; Вгодег ейфаІ. (1990) Апп. Іпї Мей. 113: 604; Іогеаи еї аї. (1990) РЕВБ5 І ецеге 274: 53; Ноісепрегд еї а). М/О91/11535; ци.8.8.п. 07/530,165; УУ/О091/09865;. М/091/04753;
МУ/О90/13641; ЕР 386563, каждьй из которьїх используется в данном описаний в качестве ссьілки. Таким образом, антисмьісловье полинуклеотидьї ингибируют продуцирование функционального РНК-компонента теломеразь. Поскольку зкспрессия РНК-компонента теломеразьй (интенсивность транскрипции и/или стабильность РНК) связаньй с активацией и ферментативной активностью холознзима теломеразь, антисмьсловье полинуклеотидь, которье предотвращают транскрипцию РНК, соответствующую РНК-компоненту теломеразь, и/или взаймодействие РНК-компонента теломеразьй с белковьім компонентом теломеразьі человека, и/или взаймодействие РНК-компонента теломеразьі с о теломерическими последовательностями, могут подавлять активность теломеразьї и/или реверсировать фенотип, например, обеспечивать иммортализацию или неопластическую трансформацию клеток, зкспрессирующих активность теломеразьі при оотсутствим антисмьісловьїх полинуклеотидов. Составь, содержащие терапевтически с г Зффективную дозу антисмьсловьїх полинуклеотидов РНК-компонента теломеразь, могут вводиться для лечения заболеваний, которье требуют активности теломеразьі для клеточного патогенеза (например, і) неоплазии) или ингибировать образование гаметьі или сохранение (т.е. служить контрацептивом), если зто необходимо. Можно продуцировать антисмьсловье полинуклеотидьії различной длиньі, хотя подобнье антисмьсловье полинуклеотидь! обьічно содержат последовательность, состоящую из по меньшей мере 25 ї- зо последовательньїх нуклеотидов, которне существенно комплементарньї полинуклеотидной последовательности
РНК-компонента природной теломеразьь и которне полностью комплементарньі последовательности о
РНК-компонента теломеразьі человека, зачастую будучи комплементарньми последовательности «Е
РНК-компонента теломеразь), которая комплементарна последовательности теломерических повторов или комплементарна части РНК-компонента теломеразьі), которая контактирует с полипептидной субьединицей - з5 теломеразь. «г
Антисмьісловне полинуклеотидь! могут бьіть продуцировань! из гетерологичной зкспрессирующей кассеть! в клетке, инфицированной вирусной нуклейновой кислотой, или в трансгенной клетке. Гетерологичная зкспрессирующая кассета может являться частью генотерапевтического вектора, например, аденовирусного или аденосвязанного вирусного вектора, или другого генотерапевтического вектора. Гетерологичная кассета « 470 Может бьіть на полинуклеотиде, которьій не способен к независимой репликации и которьій переносится в в с клетки любьм из ряда подходящих способов, известньм специалистам в данной области (например,
Й липофекцией, липосомами, иммунолипосомами, злектропорацией и т.д.). С другой стороньї, антисмьісловье а полинуклеотидь!ї могут содержать растворимье олигонуклеотидь!, которье вводятся во внешнюю среду либо в культуральную среду іп мійго, либо в интерстициальнье промежутки и жидкие средь! организма (например, в
Кровь, спинномозговую жидкость) для применения іп мімо. Біло показано, что растворимье антисмьсловне ї5» полинуклеотидь, присутствующие во внешней среде, получают доступ в цитоплазму и подавляют специфические видь! РНК. В некоторьїх вариантах антисмьісловьіе полинуклеотидьі содержит метилфосфонат ш- составляющие, С-5 пропенил составляющие, 2" фторорибознье сахара или являются полиамидньми їх нуклеиновьми кислотами (ПНК) (Еодпо!т еї аї. (1992) 3. Ат. Спет. Бос. 114: 1895; УМУ/іНипа еї аї. (1994) Майшге 368: 561; Едноїт еї аї. (1993) Маїшге 365: 566; Напуеу еї а!. (1992) Зсіепсе 258: 1481, приведеннье в данном о описаний в качестве ссьілок. Что касается общих способов, относящихся к антисмьісловь!м полинуклеотидам, "М см. Апіїзепзе КМА апа ОМА, (1988), О.А. Меп, Еа., Сода Зргіпд Нагброг І арогафгу, Соїд 5ргіпд Нагброг, МУ).
Кроме смьісловьїх олигонуклеотидов согласно изобретения можно сконструировать олигонуклеотидь, которье привязьншваются к дуплексной нуклейновой кислоте либо в в РНК-компоненте со шпилькой, либо в гене дв РНЕ-компонента, образуя нуклеиновую кислоту, содержащую тройную спираль, для ингибирования активности теломеразьі. Такие олигонуклеотидь! согласно изобретения конструируются, используя правила спаривания
Ф) оснований для образования тройной спирали и нуклеотидной последовательности РНК-компонента (СНепа еї аї. ка (1988) 9.Віої. Спет. 263: 15110; Регіп апа Сатегіпі-С(его (1991) Зсіепсе 354: 1494; Катаавз еї аї. (1989) 3.
Віої. Спет. 264: 17395; Бігоре! еї а). (1991) Зсіепсе 254: 1639; Нвіей еї а). (1990) |й.сії; Кідаз еї аї. бо (1986) Ргос. Май. Асай. зсі. (0.5.А.) 83: 9591, используемье здесь в качестве ссьілок). Такие олигонуклеотидь! могут блокировать активность теломеразь! различньмм образом, включая предотвращение транскрипции гена теломеразь! или путем связьівания с дуплексньімм участком РНК-компонента теломеразь! таким образом, чтобь не дать возможность РНК-компоненту либо образовать функциональную рибонуклеопротеидовую теломеразу, либо служить в качестве матриць для синтеза теломерической ДНК. Обьічно, в зависимости от способа 65 действия, олигонуклеотидьії, образующие тройную спираль, согласно изобретения содержат специфическую последовательность из приблизительно 10 до приблизительно 25...200 и болеє( т.е. достаточно большие для формирования устойчивой тройной спирали, но достаточно малье, в зависимости от способа доставки, для введения іп мімо, если зто необходимо) нуклеотидов, "комплементарньх" (в зтом контексте "комплементарньй" означаеєт способность образовьшать устойчивую тройную спираль) специфической последовательности в
РНКЕ-компоненте теломеразьї или гене РНК-компонента теломеразь.
Кроме антисмьсловьїх и образующих тройную спираль олигонуклеотидов согласно изобретения для ингибирования активности теломеразь! могут бьть также использовань смьІісловье олигонуклеотидь, идентичнье в последовательности по меньшей мере части РНК-компонента теломеразь человека.
Олигонуклеотидь! зтого типа согласно изобретения характеризуются содержанием либо (1) меньшей, чем 7/0 полная последовательность РНК-компонента, требуемой для формирования функционального фермента теломеразь, либо (2) полной последовательностью РНК-компонента, требуемой для формирования функционального фермента теломеразь,, а также заменой или инсерцией одного или более нуклеотидов, которье воздействуют на РНК, делая ее нефункциональной. В обоих случаях наблюдается ингибирование активности теломеразьі, обусловленное "мутантньм" РНК-компонентом, связьівающим белковье компоненть! /5 тепомеразь! человека для образования неактивной молекуль! теломеразь!. Таким образом, механизм действия таких олигонуклеотидов включает сборку нефункциональной рибонуклеопротеидовой теломеразь! или предотвращение сборки функциональной рибонуклеопротеидовой теломеразь. В качестве примера можно привести матрично-ползучий вариант, состоящий из нуклеотидов от 48 до 209, но в котором изменена матричная последовательность теломерических повторов. Такие матрично-ползучие варианть! способнь 2о Конкурировать за связь с белковьмм компонентом теломеразь. Смьсловье олигонуклеотидь зтого типа согласно изобретения содержат специфическую последовательность из по меньшей мере 20, 50, 100, 200, 400, 500 или более нуклеотидов, идентичную специфической последовательности нуклеотидов в РНК-компоненте теломеразь! человека.
Кроме того, антисмьксловье полинуклеотидьі могут содержать дериватньй заместитель, которьй в с ов основном не участвует в гибридизациий с РНК-компонентом теломеразьї млекопитающего. Антисмьсловне полинуклеотидьі, которье бьіли модифицированьі путем добавления химических заместителей, могут бьть і) введень в метаболически активную зукариотную клетку для гибридизации с РНК-компонентом теломеразь! в клетке. Обьчно такие антисмьсловье полинуклеотидьій разрезаются и дополнительнье химические заместители присоегдиняются либо во время, либо после синтеза полинуклеотидов соответственно и, таким ї- зо образом, локализуются в комплементарной последовательности РНК-компонента теломеразь», где они продуцируют изменение или химическую модификацию в локальной последовательности ДНК или в белковом о компоненте теломеразьі. Предпочтительнье присоединеннье химические заместители включают: европий (1) «Е тексафирин, сшивающие агенть,, псорален, хелатьь металлов (например, железо/ЕДТК-хелат для катализируемого гидролиза железа), топоизомеразьі, зндонуклеазьї, зкзонуклеазьії, лигазьі, фосфодизстеразь, - з5 фото динамические порфириньі, хемотерапевтические препарать! (например, адриамицин, доксирубицин), «г интеркалирующие агентьії, модифицирующие основание агентьії, иммуноглобулиновье цепи и олигонуклеотидь.
Железо/ЕДТК-хелать! являются найболее предпочтительньми химическими заместителями там, где требуется локальньій гидролиз полинуклеотидной последовательности (Негі2бего еї аї. (1982) У. Ат. Спет. ос. 104: 313;
Негпі2грегд апа Оегуап (1984) Оіоспетівігу 23: 3934; Тауог еї аії. (1984) Тейгапедгооп 40: 457; Оегмап, РВ « (1986) Зсіепсе 232: 464). Предпочтительнье химические процессь! прикрепления включают: непосредственное Ше) с связьувание, например, путем добавленной реактивной аминогруппь! (Согеу апа Зсп!цй: (1988) Зсіепсе 238: 1401, которая используется в данном описаний в качестве ссьлки) и другие химические процессь ;» непосредственного связьівания, хотя могут бьіть также использованьі! и другие методь! связьивания антител стрептавидин/биотин и дигоксигенин/антидигоксигенин. Способь! связьівания химических заместителей описань в патентах США 5,135.720, 5,093,245 и 5,055,556, которье используются здесь в качестве ссьілок. Специалист в ї5» данной области на основе своего опьіта может использовать и другие химические процессь! связьівания.
Полинуклеотидь), которье соответствуют всему или значительной части РНК- компонента теломеразь ш- млекопитающего (т.е. "смьісловьіе" полинуклеотидь), могут бьть также разрезаньй и использовань! для ї5» вступления в реакцию с последовательностями теломерических повторов в геноме и продуцирования аддуктов мли другой модификации химической средь! на теломерических участках хромосом. о Матрицьї ошибочного спаривания
І Таким образом, другой полезньй олигонуклеотид согласно изобретения содержит измененную или мутированную последовательность РНК-компонента теломеразь! человека. В работе Уи еї аї., 1990, Маїшге 344: 126 показано, что мутированная форма РНК-компонента теломеразь! Тейгапйутепа может бьїть включена в ов тепомеразу клеток Тенгапутепа и что такое введение оказьвает на зти клетки вредное воздействие. Введение мутированньїх форм РНК-компонента теломеразьі человека может оказьвать аналогичное воздействие на (Ф, клетки человека, которье в противном случае имеют активность теломеразь, не воздействующую на ка нормальньсе клетки человека, которне не имеют активности теломеразьі. Такие мутированнье формь!ї включают формьї, в которьїх последовательность 5-СТААСССТА-3, мутирована до 5-САДАСССАА-3, 3-ССААССССАА-З бо или 5-СТСАСССТСА-3. Каждая из зтих измененньїх последовательностей РНК-компонента изменяет единиць теломерических повторов, введенньїх в хромосомную ДНК, воздействуя таким образом на структуру и функцию хромосомьі. Такие олигонуклеотидь! могут бьіть сконструировань! так, чтобь! содержать участки распознавания рестрикционного фермента, которьій можно использовать в диагностических методах определения присутствия измененного РНК-компонента путем сжигания рестрикционного фермента теломерической ДНК или 65 / протяженного субстрата теломеразь.
Для иллюстрации зтого аспекта изобретения бьл вьіполнен сайт-специфический мутагенез путем использования плазмидь! (обозначенной рОкКМ33, имеющейся в Американской коллекции тканевьїх культур (АКТК) под инвентарньім номером АКТК 75926), которая содержит фрагмент Ніпа-засі с размером 2,5 т.п.н. из лямбда клона 28-1 (см. нижеприведенньій пример 7), а также область начала репликаций 5М40 (но без активности промотора). Полученнье плазмидь), обозначеннье роОкМ34 (содержащую 5 САААСССАА-3),
РОКМЗ3б6 (содержащую 5-ССААССССАА- 3) и роОкМ37 (содержащую 5 -СТСАСССТСА-3), бьли трансформировань! в зукариотнье клетки-хозяева (293-клеточную линию, зкспрессирующую большой Т антиген вируса ЗМ40), после чего проводили анализ теломеразь, используя зкстракть! клеток из трансформантов. исследования показали, что активность теломеразь! в клетках приводит к образованию нуклеиновьх кислот, 7/0 содержащих измененнье последовательности, указьівающие, что геномньій клон содержит функциональньй ген
РНК-компонента и что плазмидьй содержат измененньй, но функциональньй ген РНК-компонента. Зти результатьії показьвшают, каким образом настоящее изобретение обеспечиваєт создание препаратов рекомбинантной теломеразь! и способов получения таких препаратов. Настоящее изобретение обеспечивает получение рекомбинантной теломеразь! человека, содержащей белковьій компонент теломеразьі человека в 7/5 функциональной взаймосвязи с рекомбинантньм РНК-компонентом согласно изобретения. Молекуль! такого рекомбинантного РНК-компонента согласно изобретения включают молекульї, отличающиеся от молекул природного РНК-компонента одной или более заменой оснований, деледиями или инсерциями, а также молекуль! РНК-компонента, которне идентичньі! молекуле-природного РНК-компонента, которая продуцируется в рекомбинантной клетке-хозлине. Способ продуцирования таких молекул рекомбинантной теломеразь го Включает трансформирование зукариотной клетки-хозяина, которая зкспрессирует белковье компоненть теломеразьі с помощью рекомбинантного вектора зкспрессии, которьій кодирует молекулу РНК-компонента согласно изобретения, и культивирует указанную клетку-хозяин, трансформированную с помощью указанного вектора при таких условиях, что белковье компонентьі и РНК-компонент зкспрессируются и собираются для образования активной молекуль! теломеразьі, способной к добавлению последовательностей (необязательно с оре той же последовательности, добавленной с помощью природной теломеразь) к теломерам хромосомной ДНК.
Другие используемье варианть! таких зкспрессирующих векторов рекомбинантной ДНК (или плазмид) включают і) плазмидь), содержащие ген РНК-компонента теломеразьі человека с делецией, инсерцией или другой модификацией, которая делает ген нефункциональньм. Такие плазмидь! особенно полезньі! для генотерапий человека с целью "моделирования" зндогенного гена РНК-компонента, хотя для необратимой гибели М обработанньх клеток необходима вьісокозффективная система трансформации и рекомбинации.
Варианть! рибозимов о
Другие олигонуклеотидь! согласно изобретения, именуемье рибозимами, могут также использоваться для «Е ингибирования активности теломеразьі. В отличие от антисмьісловьїх и других олигонуклеотидов, описанньх вьіше, которьне связань!ї с РНК, ДНК или белковьім компонентом теломеразьі, рибозим не только связьіваєт, но - зв таюке специфически расщепляет и таким образом потенциально инактивирует целевую РНК, например, «г
РНК-компонент теломеразьі человека. Такой рибозим может содержать 5 - и 3 - терминальнье последовательности, комплементарнье РНК теломеразь. В зависимости от сайта расщепления рибозим может приводить к инактивации фермента теломеразь. См. патент РСТ, Мо публикации 93/23572, см. вьіше.
Специалистьі в данной области после рассмотрения последовательности РНК РНК-компонента теломеразь « человека отметят, что существует несколько полезньїх рибозимньїх целевьх сайтов, которье восприймчивь ко) с расщеплению посредством, например, мотива рибозима рьібьі-молота. Рибозимь! зтого типа, иллюстрирующие настоящее изобретение, представляют собой показаннье ниже рибозимь!, которье являются молекулами РНК, ;» имеющими показаннье ниже последовательности:
І 5ОЮАСССАСОСАОСАСИСССОСАССАСОСАААСАААДААО І їч 452. в'ЛЛІАСССОСОСАОСАСОССООСАССАССАААСАСАААА І; 3: У ДОСОСАСОСОСАОСАСИСССОСАССАССАААСОСОО ОА -ЗІ
В. и 4: 59-ССССАСАСИСАОСАСИССООСАССАССАААСССОСО-. о Другие оптимальнье целевье сайтьї для рибозимоопосредствованного ингибирования активности о 20 теломеразь!ї могут бьіть определень, как зто описано Зщціїмап еї аІ. в патенте РСТ, Мо публикации 94/02595 й
Огарег еї а). в патенте РСТ, Мо публикации 93/23569, используемье в данном описаний в качестве ссьілок. Как "м описано Ни еї аЇ., патент РСТ, Мо публикации 94/03596, используемом в данном описаний в качестве ссьілки, антисмьсловье и рибозимнье функции могут бьть обьединеньй в одном олигонуклеотиде. Более того, рибозимь! могут содержать один или более модифицированньїх нуклеотидов или модифицированньїх связей 252 между нуклеотидами, как зто описано вьіше в связи с рассмотрением иллюстративньх антисмьсловьх
Ф! олигонуклеотидов согласно изобретению. В одном из аспектов каталитическая субьединица рибонуклеазь Р ( человека или Е. соїї) модифицируется (см. АМШтап З (1995) ВіоФесппоіоду 13: 327) для генерирования о направляющей последовательности, которая соответствует участку РНК-компонента теломеразь млекопитающнго, спаривающего основания с последовательностью теломерньїх повторов; такие варианть 60 рибонуклеазьі Р могут расщеплять теломерические последовательности. В одном из аспектов каталитическая субьединица рибонуклеазьі Р (человека или Е. соїї) модифицируется с целью генерирования направляющей последовательности, которая комплементарна участку РНК- компонента теломеразь, так что вариант рибонуклеазьі Р может расщеплять РНК-компонент теломеразь. Такие сконструированнье рибозимь! могут бьть зкспрессированьі в клетки или перенесеньь с помощью различньх средств (например, липосом, бо иммунолипосом, непосредственного ввода в клетки и т.д.). Другие типьі рибозимов (группа І интрона рибозимов
(Сесп Т (1995) Віогесппоіоду 13: 323); рибозимь! рьібьі-молота (Еддіпдіоп ЗМ (1992) ВіоїесппоЇоду 10: 256) могут бьїть сконструированьі на основе информации о заявляемой в данном изоберетениий последовательности
РНК-компонента теломеразьі для католического расщепления Р Н К-компонента теломеразь! человека и/или последовательности теломерических повторов человека.
Таким образом, изобретение обеспечивает создание широкого ряда олигонуклеотидов для ингибирования активности теломеразь. Такие олигонуклеотидьій могут использоваться в способах терапиий согласно изобретения для лечения болезней, причем указаннье способьї включают введение пациенту терапевтически зффективной дозьі ингибитора или активатора теломеразь! согласно изобретения. Можно измерить степень 7/0 Мнгибирования или активирования для определения количества агента, кооторьій должен бьїть введен в терапевтически зффективную дозу, используя протокольї анализов, приведеннье в нахожящихся в одновременном рассмотрении завках к патенту США и в патенте РСТ, Мо публикации 93/23572, упомянутом вьіше. Как указано в зтих заявках и обсуждено вьіше, ингибирование активности теломеразь! приводит к гибели иммортализованной клетки, в то время как активирование активности теломеразьь может увеличить /5 репродуктивную продолжительность жизни клеток. Терапия с применением ингибирования теломеразь является зффективньім средством лечения опухолей, включая неконтролируемьїй рост иммортализованньх клеток, а активация теломеразьй является зффективньм средством лечения, направленного на предотвращение физиологического старения клеток. Доставка агентов, ингибирующих или блокирующих активность теломеразьї, например антисмьіслового олигонуклеотида, олигонуклеотида, формирующего тройную спираль, рибозима или плазмидьі, которая управляет зкспрессией мутантного РНК-компонента теломеразь, может предотвратить действие теломеразь и, в конце концов, привести к старению и гибели обработанньх клеток.
Аспекть! терапии и профилактики
Кроме вьішеуказанного настоящее изобретение направлено на создание способов терапии, которье с Ообеспечивают то, что нормальнье клетки остаются мортализованньми; например, РНК-компонент может бьть модифицирован с использованием стандартньїх способов генной инженерии для уничтожениря всего или части і) природного гена, кодирующего компонент (например, путем мутогенеза іп умйго) за счет генетической рекомбинации. После зтого такие клетки становятся необратимо мортальньми. Зтот способ используется в генотерапии, когда нормальньсе клетки, модифицированньсе таким образом, что они содержат зкспрессирующие М. зо плазмидь), вводят пациенту, не желая при зтом ввести канцерогеннье клетки или, если такие клетки все-таки введень, то зти клетки оказьіваются необратимо мортальньми. о
Поскольку теломераза является активной только в опухолевьїх, зародьішевьїх и определенньїх стволовьсх «Е клетках кроветворной системь), на другие клетки не влияєет терапия, предусматривающая подавление теломеразьі. Можно также предпринять шаги для избежания контакта ингибитора теломеразь с зародьшевьми -
З5 МлИ стволовьіми клетками, хотя зто может бьіть и несущественно. Например, поскольку зародьішевье клетки «г зкспрессируют активность теломеразь, инргибирование теломеразьі может отрицательно сказаться на сперматогенезе и жизнеспособности спермьї, допуская , что ингибиторь! теломеразь! могут бьіть зффективньми контрацептивами или агентами стерилизации. Однако такое влияние контрацептивов может оказаться нежелательнь!м для пациента, получающего ингибитор теломеразь! согласно изобретения для лечения рака. В « таких случаях можно вводить ингибитор теломеразь! согласно изобретения так, чтобь! обеспечивалось в с продуцирование ингибитора только в период терапии, с тем чтобь! негативное воздействие на зародьішевье клетки бьіло только временньм. ;» В других терапевтических способах согласно изобретения используется нуклейновая кислота РНК теломеразь! согласно изобретения для стимулирования активности теломеразьі и увеличения репродуктивньх
Кклеточньх циклов. Зти способьі могут осуществляться за счет достаки в клетку рибонуклеопротеида ї5» функциональной рекомбинантной теломеразь! согласно изобретения. Например, рибонуклеопротеид может бьіть доставлен в клетку в липосоме, или ген РНК-комопнента теломеразь! человека (или рекомбинантньй ген с ш- различньіми регуляторньіми злементами) может бьіть использован в зукариотной зкспрессирующей плазмиде (с ї5» или без кодирования последовательности для зкспрессии белковьх компонентов теломеразь!) для активирования активности теломеразьі в различньїх нормальньх клетках человека, в которьїх в противном о случае отсутствует детектируемая активность теломеразь! из-за низких уровней зкспрессиий РНК-компонента
І или белкового компонента теломеразьі. Если РНК- компонент теломеразь! недостаточен для стимулирования активности теломеразь), то он может бьїть трансфецирован наряду с генами, зкспрессирующими белковье компонентьі теломеразь, для стимулирования активности теломеразь. Таким образом, изобретение предусматривает создание способов лечения состояния, связанного с активностью теломеразь! внутри клеток или группьі клеток путем контактирования клетки(ок) с терапевтически зффективньм количеством агента, (Ф, изменяющим активность теломеразь! в зтой клетке. ка Клетки, которне включают лишние реплики гена РНК-компонента теломеразь, могут проявлять повьішенную активность теломеразьй и связанное с зтим увеличение репродуктивньїх клеточньїх циклов. Такая терапия бо может осуществляться ех мімо на клетках для последующего введения в организм-хозяин или может осуществляться іп мімо. Преимущества стабилизации или увеличения длиньі теломера за счет добавления зкзогенньїх генов теломеразьй ех мімо в нормальнье диплоиднье клетки включают: стабилизация теломера может задержать старение клеток и позволить потенциально нелимитированную амплификацию клеток; и нормальнье диплоиднье клетки с увеличенньім репродуктивньім клеточньім циклом могут культивироваться іп 65 Уго при тестирований лекарств, наработке вирусов и для других полезньїх целей. Более того, стволовье клетки различньїх типов, амплифицированньсе ех мімо, могут бьіть использованьі в клеточной терапиий определенньх заболеваний, как зто указано вьіше.
Стабилизация теломера может способствовать также предотвращению распространения рака в репликацирующихся клетках за счет защитьі теломеров от их критического укорачивания на грани гибели Кклеток. Во время кризиса происходит массовая геномная нестабильность из-за потери защитного зффекта теломерической кзп-группировкой. "Генетическая надстройка" повторно перемещаєтся и почти все клетки гибнут. Редкие клетки, которье возникают при зтом процессе, обьічно явялются анеуплоидами с многочисленньіми перестройками гена и прекращают восстанавливать стабильность в своих теломерах за счет зкспрессии теломеразь. Если кризис может бьть предотвращен за счет сохранения длинь! теломеров, то 7/0 геномная нестабильность, связанная с кризисом, может бьіть таюке предотвращена, ограничивая риск того, что отдельная клетка будет подвержена требуемому количеству генетических мутаций, приводящих к зарождению метастатического рака.
Клетки, которье могут бьть предназначеньй для терапиий с помощью гена теломеразь! (терапия, предусматривающая увеличение активности теломеразьі в клетке- мишени, включают, но не ограничиваются /5 Зтим, кроветворнье стволовье клетки (СПИД и постхемотерапия), васкулярнье зндотелиальнье клетки (сердечнье и церебрососудистье болезни), кожнье фибробластьй и базальнье кожнье кератиноцить (заживление ран и ожогов), хондроцить (артритьї), астроцить! головного мозга и глиальнье микрофаги (болезнь
Альцгеймера), остеобластьі (остеопороз), клетки сетчатой оболочки (болезни глаз) и панкриатические островковне клетки (диабеть 1-ого типа).
Обьічно терапевтические способь! согласно изобретения включают введение олигонуклеотида, которьй вьіступает в роли ингибитора или стимулятора активности теломеразь в физиологических условиях іп мімо и будут оставаться стабильньми в зтих условиях. Как отмечено вьіше, модифицированнье нуклеиновье кислоть! могут применяться для придания такой стабильности, также как и для обеспечения доставки олигонуклеотида в нужную ткань, орган или клетку. Способьі), пригоднье для доставки олигонуклеотидов для терапевтических с целей, описань Іпоцуе еї аі!., патент США 5,272,065, используемьїй в качестве ссьІлки.
В то время как олигонуклеотидь! могут вводиться непосредственно в качестве лекарства в подходящем і) фармацевтическом препарате, их также можно вводить, используя генотерапию и зкспрессирующие рекомбинантную ДНК плазмидь! согласно изобретения. Одна из таких плазмид описана ниже в примере 8. В общем случає, такие плазмидьі содержат промотор и, необязательно, знхансер (вьіделенньій из любьх ї- зо содержащихся внутри промотора последовательностей), которье служат для управления транскрипцией олигонуклеотида, а также другие регуляторнье злементь!, которье обеспечивают поддержание зписомного о состояния или хромосомной интеграции и вьісокоуровневую транскрипцию, если зто необходимо. Векторь! на «Е основе аденовируса часто используют для генотерапии и являются подходящими для применения их совместно с реагентами и способами согласно настоящего изобретения. См. патентьі РСТ, МоМо публикации 94/12650, - 94/12649 и 94/12629. Для таких целей используются следующие промоторь!: металлотионеиновьій промотор, «Е постоянньій аденовирусньй основной поздний промотор, индуцируемьй дексаметазоном промотор вируса опухоли молочной железьї мьішей (ВОМЖМ), промотор ЗМ40, промотор ро МЕР, основной промотор вируса паростальной саркомьі мьшей (ВПСМ), индуцируемьй тетрациклином промотор ЦМВ |(цитомегаловирус) ( например, непосредственно ранний промотор ЦМВ человека) и основной промотор ЦМВ. Плазмида, « применяемая для генотерапии, может содержать другие функциональнье злементь!, например, селектируемье /- с маркерьі, идентифицирующие участки и другие геньі. Зкспрессирующие рекомбинантную ДНК плазмидь! могут также использоваться для получения олигонуклеотидов согласно изобретения для доставки средствами, ;» отличньми от генотерапии, хотя более зкономичньм может оказаться создание коротких олигонуклеотидов посредством химического синтеза іп міїго.
В связанньїх с зтим аспектах в изобретений особое внимание уделяется фармацевтическим составам, ї5» включающим терапевтически зффективное количество ингибитора или активатора теломеразь согласно изобретения. Фармацевтические составь! ингибиторов теломеразь! согласно изобретения включают мутантньй ш- РНК-компонент теломеразьі человека, антисмьсловой олигонуклеотид или олигонуклеотид, образующий ї5» тройную спираль, которьій связьшает РНК-компонент или ген РНК-компонента теломеразь! человека или рибозим, способньій расщеплять РНК-компонент теломеразьі человека, или их комбинации или другие о фармацевтические препаратьї в фармацевтически доступном носителе или соли. Другие фармацевтические
І составь! согласно изобретения содержат препарат активатора теломеразьі, например, очищенную теломеразу человека или мРНК белковьїх компонентов теломеразьй и РНК-компонента теломеразьі, и используются для лечения заболеваний, связанньх с физиологическим старением. В зтом аспекте смьісловой мутированньй вв РНЮК-компонент теломеразьі млекопитающего вводят в клеточную популяцию; указанньй смьсловой мутированньій РНК-компонент теломеразь! содержит по меньшей мере одно ошибочное спаривание оснований (Ф, относительно последовательности повторов теломеразьії человека, но способен проявлять активность ка теломеразьі в сочетаний с полипептидньм компонентом теломеразьй человека, продуцируя ошибочное включение в вьібранньюе нуклеотиднье позиции в повторе теломеразь! человека, генерируя таким образом бо теломерьі, которне базируются на постоянном присутствий смьіслового мутированного РНК-компонента для существенной репликации. Предусмотрен терапевтический способ, при котором смьісловой мутированньй
РНК-компонент теломеразь! добавляют в клеточную популяцию в течение значительного периода времени для введения теломерических последовательностей, которье являются в основном нефункциональнь/ми в качестве матриц для РНК-компонента природной теломеразьь млекопитающего, за которой следует удаление 65 смьіслового мутированного РНК-компонента теломеразь, что приводит к биістрому уменьшению средней длинь теломера в популяции клеток и усиленному старению и отмиранию клеток. В технологий приготовления лекарственного средства, пригодного для парантерального, назального, орального или другого способа введения может бьіть предусмотрен терапевтический агент. См. патент РСТ, Мо публикации 93/23572, упомянутьй вьіше.
Способьі диагностики
Настоящее изобретение обеспечиваєт создание способов диагностики и реагентов дополнительно к фармацевтическим составам и терапевтическим способам, описанньм вьше. Изобретение обеспечивает создание способов диагностики для определения уровня, количества или наличия РНК-компонента теломеразь! человека, теломеразьі или активности теломеразьі в клетке, клеточной популяции или образце ткани. Во 7/0 взаймосвязанном аспекте настоящее изобретение обеспечивает создание реагентов, применяемьхх для таких способов, необязательно помещенньх в кит вместе с инструкциями для использования кита при практическом применений способа диагностики. Как отмечено вьіше в связи с рассмотрением тестов, связанньх с определением того, что клон рОКкМ7 содержит кДНК РНкК-компонента теломеразьй человека, уровни
РНК-компонента в опухолевьїх клетках возрастают. Таким образом, детектирование РНК-компонента является /5 полезньм способом диагностики клеток опухоли.
Кроме того, зондь! или праймерь, которне специфически связаньі! с РНК-компонентом теломеразь! человека (или любой нитью гена РНК- компонента), могут бьть использованьй в диагностических способах детектирования наличия в образце нуклеийновой кислотьі теломеразь. Праймерь и зондь! являются олигонуклеотидами, которне комплементарнь, и таким образом связань, с целевой нуклеийновой кислотой. Хотя 2о праймерь и зондь! могут отличаться по последовательности и по длине, основньім отличительньім фактором является фактор функции: праймерь! служат для инициации синтеза ДНК, как при амплификации ЦПР, в то время как зондь! обьічно используются только для связьшвания с целевой нуклейновой кислотой. Типовье длинь! праймера или зонда могут находиться в диапазоне от 8 до 20...30 или более нуклеотидов. Праймер или зонд может бьіть также промаркирован для облегчения детектирования (т.е. обьічно для таких целей используются с ов радиоактивнье или флуоресцентнье молекуль) или очистки/разделения (т.е. часто для зтих целей используется биотин или авидин). і)
Особо предпочтительньій способ диагностики согласно изобретения включаєт детектирование последовательности РНК-компонента теломеразьй в клетке или в образцах тканей, взятьїх у пациентов, подозреваемьїх в риске заболевания раком. Такие способь! оббічно включают связьівание меченого зонда или ї- зо праймера с последовательностью РНК-компонента в таких условиях, когда только полностью спареннье (комплементарнье) последовательности связань! (гибридизированьі) друг с другом. Детектирование меченого о материала, связанного с РНК в образце, соотносится с наличием активности теломеразьі и наличием раковьх «Е клеток. Некоторье клетки могут зкспрессировать РНК-компонент теломеразь,, но оставаться теломеразонегативньми из-за отсутствия зкспрессии белковьїх компонентов теломеразьі. При необходимости - з5 детектирования наличия активности теломеразь! в таких клетках необходимо вначале вьіделить белок, а затем «г определить, содержит ли белковая фракция РНК-компонент теломеразь, что сигнализировало бьі о наличии активности теломеразь. Способьі диагностики согласно изобретения могут бьть особо применимь! при детектировании наличия активности теломеразь! в тканевьїх биопсиях и гистологических сегментах, в которьїх указанньій способ реализуется іп зіш, оббічно после амплификации РНК-компонента теломеразь, используя « бспецифические праймерь! ЦП Р согласно изобретения. з с Изобретение также обеспечивает создание полинуклеотидньїх зондов для диагностики болезненньх состояний (например, неоплазиий или преднеоплазии) путем детектирования РНК-компонента теломеразь! или ;» перестройки, или амплификации гена РНК-компонента теломеразь в клетках, взятьїх у пациента, или детектирования аллеля РНК-компонента патогномоничной теломеразьй (например, посредством анализа
Пполиморфизма рестрикционньїх фрагментов или аллель-специфического ЦПР анализа). Обьічно «» детектирование осуществляют посредством гибридизации іп 85йи с о использованием меченого - (например, ЗР, 3285, 14С, ЗН, флуоресцентного, биотинилированного, дигоксигенинилированного) полинуклеотида РНК-компонента теломеразь, хотя может бьть использовано нозерн-блоттирование, ї- дот-блоттированиє или гибридизация раствора на основной массе РНК или поли А" РНК, вьіделенной из о 50 клеточного образца, а также амплификация ЦПР с использованием праймеров, специфических для
РНК-компонента теломеразь. Клетки, содержащие измененное количество РНК-компонента теломеразь! по "м сравнению с ненеопластическими клетками того же типа(ов) клетки идентифицируются в качестве возможньмх больньїх клеток. Аналогично, детектирование патогномоничньїх перестроек или амплификации локуса гена
РНК-компонента теломеразьі или тесно связанньх локусов в образце клетки указьвает на наличие паталогического состояния или предрасположения к развитию патологического состояния (например, рака, о генетического заболевания). Полинуклеотидньіе зондьі можно также использовать для судебной зкспертизь личности, например, для установления отцовства или идентификации подозреваемьх в криминальньх ко действиях или неизвестньїх трупов.
В пределах человеческой популяции могут бьть незначительнье отклонения в основной первичной 60 последовательности РНК-компонента теломеразьі, включая варианть! аллелей, полиморфизмь!ї рестрикционньх сайтов и аллели РНК-компонента теломеразь, связаннье с генетическим заболеванием.
При необходимости умноженнье копий ЦПР для амплификации в основном полноразмерньїх реплик
РНК-компонента теломеразь! могут бьіть вьібрань! по усмотрению исследователя. Аналогичньім образом могут бьїть вьібраньї умноженнье копиий для амплификации участков гена РНК-компонента теломеразь или РНК. 65 Зкспрессия РНК-компонента теломеразь
В зависимости от длиньії и целевого предназначения праймера, зонда или другой нуклейновой кислоть,
содержащей последовательности РНК-компонента теломеразьій человека, могут бьть использовань зкспрессирующие плазмидь согласно изобретения. Например, может бьть вьіполнено рекомбинантное продуцирование полноразмерного РНК-компонента согласно изобретения с использованием зкспрессирующей Векомбинантную ДНК плазмиду согласно изобретения, содержащую нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность РНК-компонента, находящуюся в положении для транскрипции под контролем подходящего промотора. Клетки-хозянева для таких плазмид могут бьть прокариотньми или зукариотньіми, а промотор, а также другие регуляторнье злементь! и селектируемье маркерь, вьібраннье для введения в зкспрессирующую плазмиду, зависят от клетки-хозяина, используемой для продуцирования. 70 Неповрежденньй ген РНК-компонента, т.е. промотор, содержащий любье регуляторнье последовательности на 5 -участке гена и кодирующий РНК-компонент участок могут бьіть использовань! для зкспрессий РНК-компонента в клетки человека, включая клетки, которше иммортализованьі посредством вирусной трансформации или рака. Промотор гена РНК-компонента может бьіть упорядочен, однако по зтой и другим причинам может возникнуть необходимость в зкспрессий РНК-компонента под контролем отличного от /5 него промотора. С другой стороньії, промотор гена РНК-компонента может использоваться независимо от кодирующей РНК-компонент последовательности для зкспрессии других представляющих интерес кодирующих последовательностей. Например, можно исследовать транскрипционную регуляцию гена РНК-компонента за счет слияния промотора гена РНК-компонента с кодирующей последовательностью для получения последовательности, кодирующей репортер, например, кодирующей последовательности /- для бета-галактозидазьі или другого фермента или белка, зкспрессия которого может легко контролироваться.
Таким образом, промотор или другие регуляторньюе злементь! гена РНК-компонента теломеразьї человека могут использоваться не только для зкспрессий РНК-компонента, но также белковьїх компонентов теломеразь человека, антисмьісловьїх или других олигонуклеотидов, а также представляющих интерес других генньїх продуктов в клетки человека. Зкспрессирующие плазмидьі, содержащие-неповрежденньйй ген РНК-компонента с г теломеразь! человека, могут бьіть особенно полезнь! для ряда целей, включая генотерапию. Специалисть! в данной области понимают, что широкий набор зкспрессирующих плазмид может бьть использован для і) продуцирования требуемьїх нуклеиновьїх кислот согласно изобретения и что термин "плазмида", используемьй в данном описаний, относится к любому типу нуклейновой кислоть (из фага, вируса, хромосомь! и т.д.), которая может использоваться для ввода специфической генетической информации в клетку-хозяин и сохранения зтой ї- зо информации во времени.
Вьіделение белкового компонента теломеразь о
Реагентьї согласно настоящего изобретения также позволяют клонировать и вьіделять нуклеийновье «Е кислотьі, кодирующие белковье компоненть! человека, а также ферменть! теломеразьі других млекопитающих, что ранее не представлялось возможньм. Доступ к таким нуклеийновьім кислотам обеспечивает дополнительнье - з5 преимущества относительно преиймуществ, обеспечиваемьмх нуклейновьіми кислотами, содержащими «г последовательности нуклеийновьїх кислот РНК-компонента теломеразь! человека. Например, как зто показано вьше, терапевтические преимущества согласно настоящего изобретения могут возрасти в некоторьїх случаях за счет использования очищенньїх препаратов белковьїх компонентов теломеразь! человека и за счет доступа к нуклеиновьм кислотам, кодирующим указаннье белковье компоненть. Нуклеиновье кислоть согласно « Мзобретения, которне кодируют РНК-компонент теломеразь! человека, могут использоваться для вьіделения в с нуклеиновой кислотьі, кодирующей белковье компонентьі теломеразьі человека, обеспечивая достижение указанньїх преимуществ. Таким образом, изобретение обеспечивает создание способов вьіделения и очистки ;» белковьїх компонентов теломеразьі человека, а также идентификации и вьіделения нуклеиновьх кислот, кодирующих белковне компоненть! теломеразь! человека. В связанньїх с зтим аспектах настоящее изобретение
Ообеспечиваєт получение очищенной теломеразьі человека, очищенньх нуклеиновьх кислот, кодирующих ї5» белковье компонентьі теломеразьі человека, рекомбинантньх зкспрессирующих плазмид белковьх компонентов теломеразьії человека. Изобретение также обеспечивает создание фармацевтических составов, ш- содержащих в качестве основного ингредиента либо белковье компоненть! теломеразьі человека, либо ї5» нуклеиновую кислоту, которая либо кодирует зти белковне компоненть!, либо взаймодействует с нуклеийновь!ми 5р Киспотами, кодирующими зти белковье компоненть, например, антисмьсловье олигонуклеотидьі, о олигонуклеотидьї, формирующие тройную спираль, рибозимьї или зкспрессирующие рекомбинантную ДНК
І плазмидь! для любого вьішеуказнньїх белковьіїх компонентов.
Клонированньй РНК-компонент теломеразьі человека может использоваться для идентификации и клонирования нуклеиновьїх кислот, кодирующих белковье компонентьї рибонуклеопротеидового фермента ов тепомеразьі. Для достижения идентификации и клонирования белковьїх компонентов могут бьіть использовань несколько различньїх способов. Например, можно использовать аффинньй захват фермента или частично (Ф, денатурированного фермента, используя в качестве аффинного лиганда (1) нуклеотиднье последовательности, ка комплементарнье РНК-компоненту, для связьівания с РНК-компонентом неповрежденного фермента; или (2)
РНКЕ-компонент для связьівания белковьїх компонентов частично или полностью денатурированного фермента, бор Лиганд может бьть закреплен на твердом носителе или химически модифицирован (например, биотинилирован) для последующей иммобилизации на носителе. Вьідерживание зкстрактов клеткок, содержащих теломеразу человека, за которьім следует промьівание и злюирование фермента теломеразьі, связанного с носителем, обеспечиваєт получение вьісокоочищенного препарата фермента теломеразь. Затем белковье компоненть могут бьїть подвергнутьї необязательной дальнейшей очистке или же непосредстаенно проанализировань 65 посредством секвенирования белка. Определяемая белковая последовательность может использоваться с целью приготовления праймеров и зондов для клонирования кКДНК или идентификации клона в геномном банке,
содержащем нуклеийновье кислоть!, которье кодируют белковьій компонент теломеразь.
Аффинньй захват теломеразьі, использующий сконструированньїй РНК- компонент, можно также проводить, используя транскрибированную РНК теломеразь іп мйго и ситему для восстановления ферментативной активности теломеразь. См. Аціехіег апа Огеїдег, 1994, Сепез апа ЮОемеіортепі 8: 563-575, используемьй в данном описчаний в качестве ссьілки. РНК конструируется так, чтобьі она содержала метку, подобную зпитопному мечению белков. Метка может представлять собой РНК-последовательность, с которой прочно связан лиганд, например, антитело со специфической последовательностью РНК, белок, связьівающий нуклеиновую кислоту, имеющую специфическую последовательность или органический краситель, которьй 7/0 прочно связан осо специфической последовательностью РНК. Толерантность теломеразь для последовательности и расположения метки может бьіть исследована с использованием стандартньїх способов.
Синтез измененного РНК-компонента и зтапь! восстановления согласно зтого метода можно также вьіполнять іп мімо. Аффинньй захват, использующий иммобилизованньй лиганд для метки РНК, далее можно использовать для вьіделения фермента.
Скрининг зкспрессии также можно использовать для вьіделения белковьх компонентов фермента теломеразь. При зтом способе кКДНК зкспрессирующие библиотеки могут бьіть скринированьії с помощью меченой РНК теломеразь, а белки, кодирующие кДНК, которье специфически связань! с РНК теломеразь, могут бьіть идентифицированьї. Молекулярньій генетический подход, использующий трансляционное ингибирование, может также использоваться для вьіделения нуклеиновьїх кислот, коюодирующих белковьіе компоненть! фермента го теломеразь. При зтом способе последовательности РНК теломеразьі сливаются с верхней частью селектируемого маркера. При озкспрессии в подходящей системе селектируемьйй маркер явялется функциональньм. При кодирований кКДНК зкспрессируется связьівающий РНК теломеразьі! белок, при зтом белок связан со своей последовательностью распознавания, блокируя таким образом трансляцию селектируемого маркера и, таким образом, позволяя идентифицировать клон, кодирующий белок. В других с ов вариантах зтого спосба заблокированная трансляция селектируемого маркера позволяет расти трансформированньїм клеткам. Другие системьі, которне можно использовать, включают "ловушечную систему і) взаиймодействия", описанную в патенте РСТ, Мо публикации УУО 94/10300; "одногибридную" систему, описанную
ЇЇ апаНегеКомії», 17 Юес. 1993, Зсіепсе 262: 1870-1874, апа 7егмоз еї аі,, 29 дап. 1993, СеїЇ 72: 223-232; и "двухгибридную" систему, которую можно приобрести в фирме Сіопіесі. М зо Анализьї на связьівание РНК теломеразьї или активности теломеразьі! для детектирования специфических связьвающих белков и активности могут использоваться для облегчения очистки фермента теломеразь и о идентификации нуклеиновьїх кислот, кодирующих белковье компонентьі! фермента. Например, нуклеийновье «Е кислотьі, содержащие последовательности РНК-компонента, могут использоваться в качестве аффинньх реагентов для вьіделения, идентификации и очистки пептидов белков или других составов, которье ї-
Зз5 специфически связань! с последовательностью, содержащейся внутри РНК-компонента, например, белковьх «г компонентах РНК-компонента теломеразьі человека. Имеется несколько форматов, включая сдвиг геля, связьшание на фильтре, футпринтинг, норзвестерн (зонд РНК белкового блота) и фотосшивка, для детектирования такой связи и вьіделения компонентов, которне специфически связаньі с РНК-компонентом. Зти анализьіь можно использовать для идентификации связьвающих белков, для отслеживания очистки « связьшвающих белков, для установления характеристики сайтов связьшания РНК, для определения в с молекулярного размера связьівающих белков, для мечения белков с целью предварительного вьіделения и для последующей иммунизации животньїх с целью генерации антител для получения антител, используемьх для ;» вьіделения белка или идентификации нуклейновой кислоть, кодирующей белок в связанной системе транскрипции/трансляции.
Очистка белкового компонента теломеразь! млекопитающего ї5» Белковьій компонент теломеразьї млекопитающего может бьіть очищен с помощью обьічньїх биохимических способов от теломеразо зкспрессирующих клеток, таких как клетки НТ1080, клетки 293 и другие подходящие ш- линии иммортализованньх клеток. Например, но не ограничиваясь зтим, теломеразу человека можно в ї5» значительной степени очистить от зкстрактов клеток в соответствии со способом, описанньїм в заявке к патенту
США 08/288,501, поданной 10 августа 1994 г., которая используется в данном описаний в качестве ссьлки. о Зкстрактьї теломеразьї млекопитающего могут бьіть очищеньї от РНК-компонента теломеразь! путем обработки
І рибонуклеазой или другим подходящим средством для диссоциации и/или деградации РНК-компонента теломеразь, оставляя в то же время белковьій компонент теломеразьі практически неповрежденньм и способньм к восстановлению путем добавления зкзогенного РНК-компонента теломеразьі, например такого, вв Которьій может бьть продуцирован рекомбинантно или подобньм образом. Очищенньй таким образом белковьій компонент теломеразьй и необязательно очищенньй от зндогенного РНК-компонента теломеразь, (Ф, можно использовать в описанньх здесь скрининг-анализах и для других целей. ка Генотерапия
Перенос зкзогенного генетического материала в клетки (т.е. ДНК-опосредствованная трансфекция) является бор /Ченньім способом базового исследования в клеточной биологии и молекулярной генетике, а также основой для создания зффективньїх способов генотерапии человека. До сих пор большинство опьітов по исследованию переноса генов основьівалось на использований репликационно-дефективньїх вирусньїх векторов, несущих терапевтическую полинуклеотидную последовательность как часть ретровирусного генома (МіШег еї аї. (1990)
Мої. СеїЇ. ВЬЇ. 10: 4239; КоЇрегд К (19920 9. МІН Кез. 4:43; Согпена еї аІ. (1991) Нит. Сепе ТПпег. 2:215). 65 Аденовируснье векторь! для возможного использования в генотерапии человека также описань!ї Козепгіеїа еї аї. (1992) Сеї| 68:143.
Другим способом переноса гена в генотерапий человека является физический перенос плазмидьі! ДНК непосредственно в клетки опухоли іп зі. В отличие от вирусньім векторам, которне должньі! размножаться в культивированньїх клетках, плазмида ДНК может бьїть очищена до однородного состояния, что уменьшает таким образом потенциал ее патогенного загрязнения. В некоторьїх случаях (например, для клеток опухоли) нет необходимости, чтобьі зкзогенная ДНК устойчиво внедрялась в трансдуцированную клетку, поскольку неустойчивая зкспрессия может бьіть достаточной для умерщвления клеток опухоли. Липосомоопосредованньй перенос ДНК описан рядом исследователей (У/апд апа Ниапад (1987) Віоспет. Віорпуз. Кез. Соттип. 147:980;
УУапд апа Ниапао (1989) Віоспетівігу 28:9508; І й(гіпдег апа Ниапо (1992) Віоспет. Віорпуз. Асіа 1113:201; бао /о апа Ниапу (1991)Віоснет. Віорпувз. Кев. Соттип. 179: 280; РГеідпег УУО91/17424; М/О91/ 16024).
Иммунолипосомь! в качестве носителей зкзогенньїх полинуклеотидов также описаньй у М/апд апа Ниапд (1987) Ргос. Май. Асай. Зсі. (О5БА) 84: 7851; ТгиреївКоу еї аїЇ. (1992) Віоспет. Віорпуз. Асіа 1131: 311.
Гипотетически можно ожидать, что иммунолипосомь имеют клетки улучшенного типа по сравнению с липосомами благодаря присоеєдинению специфических антител, предположительно связанньх с 7/5 поверхностньіми антигенами специфических типов клеток. Вепг еї а. (1989) Ргос. Май. Асад. Зсі. (ОА) 86: 6982, сообщают об использований липополиамина в качестве реагента для возможной самотрансфекции без необходимости использования любого дополнительного фосфолипида для образования липосом.
Соответственно, полинуклеотид, в основном идентичньй по оменьшей мере 025 нуклеотидам, предпочтительно от 50 до 100 нуклеотидам или более последовательности РНК-компонента теломеразь или ее Комплимента, операбельно связьвваєется с гетерологичньмм промотором для образования транскрипционной единицьі, способной зкспрессировать РНК-компонент теломеразьі или антисмьсловой полинуклеотид
РНК-компонента теломеразь! в клетку человека. Подобная транскрипционная единица может содержаться в трансгене, аденовирусном векторе или в другой генотерапевтической модальности для доставки в клетки человека, например, для терапии теломеразообусловленньїх заболеваний (например, неоплазии). Подходящие с бспособь! доставки конструкции, зкспрессирующей смьісловой или антисмьсловой РНК-компонент теломеразь, вьібирается исследователем, исходя из установившейся практики и регуляторньїх требований. і)
Варианть! трансгенньїх животньх
Геномнье клоньії РНК-компонента теломеразьь млекопитающих, в частности геньії РНК-компонента теломеразьї, существенно идентичнье РНК-компоненту теломеразьї мьішей можно использовать для создания ї- зо гомологичньїх нацеливающих конструкций для генерирования клеток и трансгенньїх животньйх, отличньх от человека, которне имеют по меньшей мере один функционально разрушенньй аллель РНК-компонента о теломеразь Правила для конструирования гомологичньїх нацеливающих конструкций можно найти в «Е следующих источниках: Капетіцііа еї аі. (1991) Майте 353: 180; давіп еї аі. (1990) Сепез ЮОемеї. 4: 157; Коп еї а). (1992) Зсіепсе 256: 1210; Моїїпа еї аЇ. (1992) Майте 357: 161; ОСгизру еї аї. (1991) Зсіепсе 253: ї- 1417; Вгадіеу еї аї. (1992) Віо/Геспсппоїоду 10:534, используемьїх в данном описаний в качестве ссьлок. «Е
Гомологичное нацеливание можно использовать для генерирования так назьваеємой "модельной" мьіши, которая гетерозиготна или гомозиготна инактивированному аллелю РНК-компонента теломеразь!і. Такие мьіІши могут бьіть продань! в качестве подопьітньїх животньїх для проведения исследований в области создания иммуносистем, неоплазии, сперматогенеза, а также могут бьіть использованьі! в качестве домашних животньх, « для получения животного белка (корма) и для других целей. Химеровье целевье мьши вьіводят согласно в с Нодап еї аїЇ.Мапіршайпуд (те Моизе Етргуо: А І арогаїогу Мапиа!ї, Соїд Зргіпд Нагрог І арогаїогу (1988) апа
Тегаюсагсіпотаз апа Етрбгуопіс З(іет СеїІв: А Ргасіїсаї Арргоасі, Е.). Кобегізоп, ейд., ІК Ргевзв, У/азпіпдіюп, ;» О.с., (1987), используемье в данном описаний в качестве ссьілок. Змбрионньми стволовьмми клетками манипулируют в соответствии с опубликованньми методиками (Тегаї|сагсіпотаз апа Етбргуопіс Зіет СеїІв: А Ртасіїсаї Арргоасп, Е.). Кобрегівоп, ей. ІК. Ргевзв, УУазпіпдіюп, 0/С/ (1987); ївіга еї аї. (1989) Майшге їх 342:435; Зспмагпгрегод еї а). (1989) Зсіепсе 246:799, каждая из которьїх используется в данном описаний в качестве ссьілки). ш- Кроме того, реплика геномного гена или кКДНК РНК-компонента теломеразьі может бьіть использована для ї5» конструирования трансгенов с целью зкспрессирования РНК-компонента теломеразь! на внісоких уровнях и/или под транскрипционньім контролем последовательностей транскрипционного контроля, которье обьчно не о находятся рядом с геном РНК-компонента теломеразьі. Например, но не ограничиваясь зтим, конститутивньй
І промотор, например, ВГЧ-тк или пжк-промотор) или специфическая для данной клеточной линии транскрипционная регуляторная последовательность (например, промотор/знхансер гена СО4 или СОВ)могут бьїть операбельно связаньії с полинуклеотидной последовательностью РНК-компонента теломеразь! с целью образования трансгена (обьічно в сочетаний с селектируемьм маркером, например, с зкспрессирующей нео ген кассетой). Такие трансгень! могут вводиться в клетки (например, Еб-клетки, кроветворньюе стволовье клетки), (Ф, при зтом могут бьть получень! трансгеннье клетки и трансгеннье животнье, отличнье от человека. ка Трансгеннье клетки и/или трансгеннье животнье, отличнье от человека могут использоваться для скрининга антинеопластических агентов и/или потенциальньїх карциногенов, посколоьку сверхзкспрессия РНК- компонента бо теломеразьі или неподхоходящая зкспрессия теломеразьі может привести к преднеопластическому или неопластическому состоянию.
Скрининг агента
Полинуклеотидьії РНК-компонента теломеразь), препаратьї белкового компонента теломеразьі, матриць повтора теломера и реакции связьшвания и т. п. на практике используются в соответствии с 65 Зкспериментальньми примерами. В общем случае белковье компонентьії теломеразьї получают обьічной очисткой от теломеразо зкспрессирующих клеток млекопитающего и удаляют из сопутствующего
РНК-компонента перед их использованием в рассматриваемом анализе. Специфические условия водного раствора вьібираются специалистом в соответствий с обьічньіми способами. Как правило, могут использоваться следующие условия для водного буфера: 10...250 мМ Масі, 5...50 мМ трис НИЇ, рН 5...8, при необязательной добавке двухвалентного катиона(ов), и/или хелатньїх соединений металлов, и/или нейонньїх детергентов и/или мембранньїх фракций. Специалистьї в данной области понимают, что добавления, делеции, модификации (например, рН) и замещения (например, МСІ на КСІ или замена буфера) могут вьіполняться при указанньх основньїх условиях. Модификации основньїх условий реакции связьшания могут осуществляться пока в контрольной реакций(ях) происходит формирование специфического холознзима и/или активности теломеразь. 7/0 Условия, которье не обеспечивают специфическое связьшание и расщепление в контрольньїх реакциях (отсутствие включенного агента), не подходят для использования в анализах связьвания.
Предпочтительно для определения связьивания РНК-компонента теломеразьї с иммобилизованньм белковьім компонентом теломеразьї РНК-компонент теломеразьі метится детектируемьм маркером, обьічно биотиниловой группой, флуоресцентньм участком или введенньмм радиомеченьм нуклеотидом. В качестве 7/5 подходящего маркирования белкового компонента теломеразьі используют, но не ограничиваются зтим, радиомечениє путем введения радиомеченой аминокислоть! (например, С-меченьй люцин, ЗН-меченьй глицин, З55-меченьй метионин), радиомечение посредством посттрансляционной радиойодинации с помощью 125) или 791) (например, с помощью реакции Войоп-Нипієг и хлорамина Т), мечениеє путем посттрансляционного фосфорилирования с помощью РюВ' (например, фосфорилаза и неорганический радиомеченьй фосфат), флюоресцентного мечения путем введения флюоресцентной метки (например, флюоресцина или родамина) или мечение с помощью других обьічньїх методов, известньїх в данной области. В вариантах, в которьіх один из видов полипептида иммобилизуют путем связьівания с субстратом, другой компонент обьічно метят с помощью детектируемого маркера.
Меченье белковьій компонент или РНК-компонент теломеразьій вводят в контакт с иммобилизованньм с 259 белковьм или РНК-компонентом теломеразь! соответственно и определяют способность агента изменять о количество меченого компонента, которьій становится иммобилизованньм (т.е., которьій связьївает смежньй компонент теломеразь! и захватьівается). Можно варьировать время и температуру инкубации при реакции связьшвания до тех пор, пока вьібраннье условия позволяют осуществлять специфическое связьівание в контрольной реакции при отсутствий агента. В предпочтительньїх вариантах температура реакции составляєт (/ї- по меньшей мере приблизительно 15 градусов по Цельсию, более предпочтительно от 35 до 42 градусов по о
Цельсию, а время инкубации составляет приблизительно по меньшей мере 15 секунд, хотя более длительньй срок инкубации предпочтительнее, так что в некоторьїх вариантах достигается равновесное связьівание. «
Кинетика связьшшания и термодинамическая устойчивость связанньїх комплексов определяют диапазон, в чн котором можно варьировать продолжительность, температуру, соль, рН и другие условия реакции. Однако для
Зо любого частного варианта необходимье условии реакции связьвания могут бьть легко определень « специалистом, используя обьічнье в данной области способьі, которне могут включать анализ связьівания с применением анализа по Зсаїспага, анализа по НіїЇ и другие способь! (Ргоїеіпз, Зігисійгез апа Моіесшаг
Ргіпсіріеєз (1984) Стгеідпюп (ед.), М.Н. Егеетап апа Сотрапу, Мем Жогк). «
Специфическое связьшание меченого о белкового компонента теломеразь с иммобилизованньм
РНК-компонентом теломеразь! соответственно определяют путем включения немеченого конкурентного белка о) с (например, альбумина) и/или немеченой РНК. После завершения реакции связьівания детектируют количество "» меченого вида(ов), которьій в данном случаеє связан с иммобилизованньм видом. Например, но не " ограничиваясь зтим, после подходящего для связьивания периода инкубации удалют жидкую фазу, содержащую неиммобилизованньій меченьій белковьій компонент теломеразьі, а субстрат, содержащий иммобилизованньй связанньій вид холознзима теломеразьь и любой меченьй белковьій компонент теломеразьі, связанньй с пи указанньм холознзимом, промьвают в подходящем буфере, необязательно содержащем немеченьй -І блокирующий агент(ь), а промьвочньй буфер удаляют. После промьшвания определяют количество детектируемой метки, остающейся специфически связанной с иммобилизованньм меченьм компонентом пи (например, оптическим, ферментативньм, авторадиографическим или другими радиохимическими способами). о 20 В некоторьіх вариантах предусматривается добавление немеченьх блокирующих агентов, которье ингибируют неспецифическое связьшание. В качестве таких блокирующих агентов можно указать, но не "м ограничиваясь зтим, следующие агенть: ДНК тимуса теленка ДНК спермь лосося, дрожжевую РНК, олигонуклеотидьі различной длиньі смешанной последовательности (случайной или псевдослучайной последовательности), альбумин бьічьей сьіворотки, нейоннье детергенть! (МР-40, Тмееп, Топ Х-100 и др.), 22 белки нежирного сухого молока, реактив Денхардта, поливинилпиролидон, фиколл и другие блокирующие о агентьі. Специалисть! могут по своему усмотрению вьібирать блокирующие агенть! в подходящей концентрации для использования в анализе связьівания. о В вариантах, где РНК-компонент или белковьій компонент теломеразьі является иммобилизованньї!м, может бьіть использована ковалентная или нековалентная связь с субстратом. Химизм ковалентной связи включаєет, 60 но не ограничивается зтим, хорошо исследованнье в данной области способь (Кадопада апа Ті)дап (1986) Ргос.
Май. Асад. Зсі. (0.5.А.) 83: 5889). Одним из примеров такой связи, не носящим ограничительньй характер, является ковалентная связь с субстратом, полученньм с помощью цианогенбромида (например, СМВг- сефароза 48). Может оказаться желательньм использование спейсера для уменьшения потенциальной стерической помехи от субстрата. Нековалентное связьшание белков с субстратом включаєт, но не бо ограничивается зтим, связьивание белка с заряженной поверхностью или связьівание со специфическими антителами. В одном из вариантов возможнье терапевтические агентьї идентифицируют за счет их способности блокировать связьівание белкового компонента теломеразьї с РНК-компонентом теломеразь.
Обьічно РНК-компонент теломеразь, используемьй при зтих способах, содержит последовательность природного РНК-компонента теломеразь! млекопитающего (например, РНК-компонент человека), хотя иногда
Мспользуют последовательности мутантного РНК-компонента теломеразь, если мутантньй РНК-компонент теломеразьі связан с белковьім компонентом теломеразьї в условиях контрольного анализа (например, в физиологических условиях). В одном из вариантов вьіполнения изобретения возможнье модулирующие теломеразу агентьї идентифицируют по их способности обеспечивать статистически значимое уменьшение или увеличение транскрипции репортерной полинуклеотидной последовательности (например, ген 7/0 бета-галактозидазьі, ген люциферазьї, ген НРКТ), операбельно связанной с транскрипционной регуляторной последовательностью гена РНК-компонента теломеразьь млекопитающего, преимущественно гена
РНК-компонента теломеразьі человека в метаболически активной клетке млекопитающего. Репортерньй ген (например, НРКТ) может бьїть вставлен в сайт рестрикции или тупоконечньій сайт дд кКДНК РНК-компонента теломеразьі млекопитающего с тем, чтобьі генерировать гомологичную нацеливающую конструкцию или /5 трансген, где в жизнеспособной клетке млекопитающего репортерньй ген находится под транскрипционньм контролем промотора зндогенного гена РНК-компонента теломеразьй и связанньх транскрипционньмх контрольньїх злементов. Агентьї, осуществляющие дозозависимую транскрипционную модуляцию репортерного гена, идентифицируют таким образом как возможнье теломеразомодулирующие агенть.
В одном из вариантов вьіполнения изобретения зндогенньій ген РНК-компонента теломеразь в клетке го Ммлекопитающего нацеливают с помощью гомологичной нацеливающей конструкций для размещения репортерноий полинуклеотидной последовательности в операбельной связи с верхней частью транскрипционной регуляторной последовательности (например, промотора) зндогенного гена РНК-компонента теломеразь! в хромосомном локусе зндогенного гена. В альтернативном варианте зкзогенньій полинуклеотид, содержащий репортерньій полинуклеотид, операбельно связан с транскрипционньм регуляторньм участком гена с
РНК-компонента теломеразьй млекопитающего (например, промотора и верхними сайтами связьвания транскрипционного фактора); зкзогенньій полинуклеотид переносится в клетку млекопитающего, в которой он і) может негомологично включаться в местоположение хромосом и/или удерживаться или реплицироваться в качестве зписомного полинуклеотида. Агенть), которне осуществляют статистически значимую транскрипционную модуляцию репортерного полинуклеотида в клетках, ообработанньїх агентом, ї- зо идентифицируются таким образом как возможньсе агентьі, модулирующие теломеразу млекопитающего.
Агентьї, модулирующие теломеразу, которне уменьшают способность клетки восстанавливать разрушение о теломера или подавлять репликацию теломера (например, посредством конкурентно ингибирующей зндогенной «ж природной теломеразьї), являются возможньмми антинеопластическими агентами или сенсибилизирующими агентами, которье сенсибилизируют клетки (например, неопластические клетки) к агентам разрушения - з5 теломера (например, к алкалирующим агентам или ионизирующей радиации). Возможнье антинеопластические «г агентьі затем исследуют, кроме того, на антинеопластическую активность путем анализа, которьій обьічно проводят для предсказания их пригодности для использования в качестве антинеопластических лекарственньх средств для человека. Примерами таких анализов, но не ограничиваясь зтим, являются: (1) анализ на способность возможньїх агентов ингибировать способность независимьїх от закрепления трансформированньх « 70 Кклеток к росту в мягком агаре, (2) анализ на способность уменьшать онкогенность трансформированньіх клеток, у с трансплантированньїх гольм мьшам, (3) анализ на способность к реверсированию морфрлогической
Й трансформации трансформированньх клеток, (4) анализ на способность уменьшать рост трансплантированньх а опухолей у гольїх мьішей, (5) анализ на способность подавлять образование опухоли или преднеопластические клетки в моделях животньїх, обладающих спонтанньім или химически индуцированньїм онкогенезом и (6) анализ на способность индуцировать более дифференцированньй фенотип в трансформированньх клетках, в которье ї5» вводят агент.
Анализьі для детектирования способности агентов к ингибированию или усилению белкового компонента ш- теломеразь: связьшвание РНК-компонента теломеразьй и/или ферментативной активности теломеразь ї5» обеспечиваєт легкий вьісокопроизводительньійй скрининг банков агентов (например, библиотек составов, библиотек пептидов и т.п.) для идентификации антагонистов или агонистов теломеразь!. Такие антагонисть! и о агонистьі могут модулировать активность теломеразьй и таким образом модулировать компетентность
І теломерических повторов и репликационного потенциала.
Введение зффективной дозьй агента, способного специфически ингибировать у пациента активность теломеразь, можно использовать в качестве терапевтического или профилактического способов лечения в патологических состояний (например, рака, воспалений, лимфопролиферативньхх заболеваний, автоиммунньх болезней, невродегенеративньїх заболеваний и т. п.), которне зффективно излечиваются за счет модуляции (Ф, активности теломеразь и восстановления и репликации ДНК. ка Как будет понятно специалистам в данной области после прочтения зтого описания, настоящее изобретение обеспечиваєт создание ценньїх реагентов, относящихся к теломеразе человека, а также способов терапии и бор диагностики. Данное описание в силу необходимости включает ограниченньй набор таких способов, которье не должнь! толковаться как ограничивающие обьем изобретения. Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидньі! из последующих примеров и формуль изобретения.
Нижеприведеннье примерь! описьівают специфические аспектьї, иллюстрирующие изобретение, и способь, используемье для вьіделения и идентификации РНК-компонента теломеразьі человека, специалистами в 6б5 данной области. Примерь не следует рассматривать как ограничивающие изобретение, поскольку в них приведена только специфическая методология, необходимая для понимания и практической реализации изобретения.
Зкспериментальнье примерь
Клонирование РНК-компонента теломеразь! человека потребовало создания нового способа, включающего Негативную селекцию и цикль! позитивной селекции, описанньїх ниже. Однако первоначально бьла сделана попьтка клонирования РНК-компонента с использованием обратной транскрипции и способа клонирования концов кКДНК, назьшшаемого амплификацией 5-КАСЕ ЦПР. Реакция обратной транскрипции начиналась с помощью праймера, идентичного единице повтора на однонитевом участке теломерической ДНК человека и лаким образом, комплементарному последовательности, которая, как полагают, присутствует в 7/0 РНЕкомпоненте теломеразь! человека. Праймер также содержал на своем 5 -конце последовательность, соответствующую сайту распознавания рестрикционного фермента. Однако, когда КДНК , продуцированная с помощью реакции обратной транскрипциий и оамплификации ЦПР, бьла исследована посредством злектрофореза в сгеле и анализа нуклеотидной последовательности полосок нуклеийновой кислоть, присутствующей в геле, бьли обнаруженьй только последовательности рибосомной РНК. Аналогичнье /5 проблемь! встретились, когда бьіли сделань! попьітки изменить зтот 5 - КАСЕ подход, используя гнездовне праймернь!.
Попьїтку успешного клонирования начинали с получения кКДНК из очищенньїх препаратов теломеразь человека, а также из линий клеток, обладающих активностью теломеразь! человека, и из линий клеток, не обладающих детектируемой активностью теломеразь! человека. Способ, используемьй для получения кДНК го подробно описан в нижеприведенном Примере 1. Два зтапа негативной селекций и последующие цикль положительной селекции использовали в сочетанийи с приготовлением кДНК из двух клеточньїх линий человека для уменьшения концентрации нежелательньїх последовательностей и увеличения концентрации желательньх последовательностей РНК-компонента.
Зтапьї негативной селекции включали приготовление биотинилированного продукта ЦПР из кДНК, сч ге полученной из клеточной линии человека не имеющей детектируемой активности теломеразь.
Биотинилированньй продукт ЦПР денатурировали, а затем повторно гибридизировали в растворе, содержащем і) значительно меньшую концентрацию небиотинилированного продукта ЦПР (100 частей биотинилированного продукта к 1 части небиотинилированного продукта) из кКДНК, полученной из клеточной линии человека, не имеющей активности теломеразьі. Если бьї существовала возможность того, что негативная клеточная линия ї- зо тепомеразьі содержит небольшое количество РНК-компонента, зтап гибридизации проводили бь с целью различения или селекции только в отношений ярко вьіраженной РНК в обеих клеточньїх линиях. После о гибридизации по отобранному Со ї, чтобь! позволить проведение гибридизации найболее ярко вніраженной РНК, «ж нежелательньїй материал удаляли за счет связьівания со стрептавидинилированньіми магнитньіми частицами; надосадочная жидкость, остающаяся после сбора частиц, содержала требуемую кДНК для РНК-компонента в. зв теломеразь! человека. Процесс амплификации ЦПР кКДНК описан в нижеприведенном Примере 2. «Е
Затем зтот материал обогащали до желательного уровня кКДНК путем последовательньїх циклов позитивной селекции. На зтапе положительной селекции биотинилированньій зонд, комплементарньій предсказанной матричной последовательности РНК-компонента теломеразьі человека, гибридизировали с продуктом ЦПР из обогащенного (за счет негативной селекции) образца амплифицированной с помощью ЦПР кДНК из клеточной « линии человека, обладающей активностью теломеразь. После гибридизации комплексьй зонд/мишень 7-3) с связьшвали с авидинилированньіми магнитньіми гранулами, которье затем собирали и использовали в качестве источника нуклеиновой кислотьї, обогащенной по последовательностям РНК-компонента в последующих циклах ;» позитивной селекции. Процесс позитивной селекции более детально описан в нижеприведенньїх Примерах З и 4.
После третьего цикла позитивной селекции продуктьї амплификации отделяли посредством злектрофореза ї5» на геле, а участки геля, соответствующие нуклеиновьім кислотам с размером, равньім приблизительно 200 п.н., удаляли. Затем нуклейновьіе кислотьії злюировали из участков геля и амплифицировали с помощью ЦПР.
Ш- Продуктьї амплификации ЦПР гидролизировали с помощью рестрикционного фермента Мої, после чего їх вводили путем лигирования в сайт Мої! плазмидь! рВіезсгірніЗКи, которая имеется в фирме 5ігагадепе. Полученнье в результате плазмидьї трансформировали в клетки-хозяева Е. сої, а отдельнье колоний о вьделяли и использовали в качестве источника нуклейновой кислотьі! для последующего анализа и
І секвенирования ДНК. Ряд клонов, позитивньїх согласно зтого теста, затем анализировали с помощью секвенирования ДНК и других тестов.
Указаннье другие тесть включали следующее: (1) определение того, ингибируют ли антисмьісловье олигонуклеотидьі, комплементарнье предполагаемому РНК-компоненту, активность теломеразь! в зкстрактах клеток человека, которье как известно содержат теломеразу; (2) определение того, возможно ли использование
Ф) праймеров ЦПР, специфических для предполагаемой последовательности клона РНК-компонента с целью ка амплификации нуклеиновой кислотьі, присутствующей в образце теломеразьі и обнаруживает ли наблюдаемьй продукт, если таковой имеется, активность теломеразь! во время ее очистки; (3) определение того, можно ли бо использовать праймерь! ЦПР, специфические для предполагаемой последовательности клона РНК-компонента для амплификации нуклейновой кислотьі, присутствующей в большем количестве в клеточньїх зкстрактах из клеток, в которьїх, как известно, активность теломеразь! вьісокая (т.е. в опухолевьїх клетках), чем в клеточньйх зкстрактах из клеток, которье, как известно, не продуцируют или продуцируют малое количество активности теломеразьі. Один из клонов, обозначенньій как плазмида рОокМ?7, показал результать! в зтих тестах, которье 65 согласуются с определением того, что плазмида содержит кКДНК, соответствющую РНК-компоненту теломеразь человека.
Таким образом, антисмьісловне олигонуклеотидьі, соответствующие последовательностям предполагаемой последовательности РНК-компонента плазмидь! рОокМ7, имеют способность подавлять активность теломеразь! іп мійго. Аналогичньїм образом, когда теломеразу очистили от клеточньїх зкстрактов с помощью процесса,
Включающего (1) дизтиламинозтил (ДЗАЗ) хроматографию, (2) Зерпадех 5300 хроматографию; и (3) отделение и градиента глицерина, сефарозьі 5Р или фенилсефарозь! и сбор фракций, праймерьі! ЦПР, специфические для предполагаемой последовательности РНК-компонента плазмидьй рОкМ7, амплифицировали нуклеийновую кислоту соответствующего размера и количество продукта амплификации хорошо согласовьшвалось с количеством активности теломеразь,, наблюдаемой в собранньїх фракциях. В итоге, клеточнье зкстракть! из 7/0 нормальньх (без детектируемой активности теломеразь) и канцерогенньх (при наличии активности теломеразьї)), а также семенниковьїх (при наличии активности теломеразьї) клеток показали соответствующее количество продукта ЦПР после обратной транскрипциий и амплификации ЦПР (ОТ-ЦПР) праймерами, специфическими для предполагаемого РНК-компонента, содержащегося в плазмиде рокМ7.
Протокол ОТ-ЦПР описан ниже в Примерах и 6.
Вьішеуказаннье результатьь дали убедительнье доказательства того, что РНК-компонент теломеразь человека бьіл клонирован, позтому плазмиду рОКМ7 затем использовали для вьіделения геномного клона
РНК-компонента из клеточной линии человека, как зто описано ниже в Примере 7. Геномньй клон идентифицировали и вьіделяли из геномной библиотеки ДНК человека, введенной в лямбда-вектор РІХІЇ, полученньій от фирмь! Зігаїадепе. Требуемьій клон, содержащий последовательности гена РНК-компонента, 2о имел вставку с размером, приблизительно равньім 15 т.п.н., и бьіл обозначен как клон 28-1. Зтот клон бьл депонирован в Американской коллекции тканевьїх культур под инвентарньм номером 75925. Различнье рестрикционнье фрагменть! бьіли субклонированьй из зтого фага и секвенировань». Кроме того, ген бьл локализовіван на дистальном конце д-плеча хромосомь! 3. Информация о последовательности, полученная от сайта распознавания рестрикционного фермента ЗашПНАЇ! на одном конце вставки с размером приблизительно сч ов 15 т.п.н. до внутреннего сайта распознавания рестрикционного фермента НіпаїЇ, которьій содержит всю последовательность зрелого РНК-компонента, а также транскрипционнье контрольнье злементь! гена і)
РНК-компонента лямбда-клона 28-1, показана вьіше.
Пример 1
Получение кДНК. способной к амплификацииЦПР М зо РНК получали из клеток 293 и ІМК-90 путем зкстракции гуанидин-тиоцианата или из фракций очищенной теломеразь! с помощью зкстракций фенол/хлороформа. РНК из клеток 293 фракционировали по размеру на 290 о геле агарозьї и вьіделяли РНК с размером менее 500 п.н. «г
Синтез первой нити кДНК вьіполняли с помощью обратной транскриптазь! Зирегвсгірі тм |Ї, полученной из лаборатории Веїйезда Кезеагсп І арогагіез (ВКІ). Приблизительно 0,5. .1,0мкг РНК смешивали с - приблизительно 4Онг произвольного праймера (6 тег; раМе ) в воде с обцим обьемом, равньм 1Імкл. Раствор -«ф нагревали в течение 10 минут при температуре 957"С, а затем охлаждали на льду в течение 5...10 минут.
Денатурированную нуклеийновую кислоту собирали с помощью центрифугирования. Денатурированную РНК и смесь праймера затем повторно суспендировали путем добавления в следующем порядке: 4мкл 5х буфера синтеза 1-0й нити; 2мкл 0,1М дитиотрейитола (ДТТ); 71 мкл араназина (РПНагтасіа)) и мкл днНтТФ « (дезоксинукеаозидтрифосфат) (2,5мММ каждого исходного раствора). Реакционную смесь инкубировали при с температуре 42"С в течение 1 мин, а затем 1мкл (200 единиц) обратной транскриптазь! Зирегзсгірітм || (ВК) ц добавляли с перемешиванием в реакционную смесь, которую далее инкубировали в течение 60 мин при 4270. "» Полученную реакционную смесь, содержащую вновь синтезированную кКДНК, помещали на лед и держали там до тех пор, пока не вьіполнялся синтез второй нити. Синтез второй нити кКДНК осуществляли следующим образом. Около 20 мкл реакционной смеси из реакционной смеси, полученной при синтезе первой нити кКДНК ьч (см вьіше), смешивали со следующими компонентами в таком порядке: 111,1 мкл водьі; 16 мкл 10х буфера лигазьі ДНК Е.соїї; З мкл ДНТФ (2,5 мМ каждого исходного раствора); 1,5 мкл лигазьі! ДНК Е.соїї ( 15 единиц из
ВКЮ; 7,7 мкл полимеразьї ДНК Е.соїї (40 единиц из РНагтасіа); и 0,7 мкл рибонуклеазь! Н Е.соїї (ВК). ьч Полученньій раствор слегка перемешивали и инкубировали в течение 2 часов при 16"С, в зто же время в реакционную пробирку добавляли один мкл (10 единиц) полимеразьі! ДНК Т4 и продолжали инкубирование в о течение 5 мин при той же температуре (16"С). Реакцию останавливали и нуклеиновую кислоту собирали путем "і двойного зкстрагирования реакции фенол/хлороформом, осаждения нуклейновой кислотьі фенолом и центрифугирования реакционной смеси до получения осадка нуклеийновой кислоть.
Осадок кДНК, собранньй с помощью центрифугирования, ресуспендировали в 12 мкл буфера ТЕ и лигировали с двунитевь!м олигонуклеотидом, назьіваемьм "МоїАВ", составленньім из двух олигонуклеотидов (
МН2 является аминоблокирующей группой): і) МОЇА: 5- рРАТАВСООССОСААСААТТСА-МН2 ко МОВ: 5- ТСААТТСТТОСОСССОСТАТ-3 Двунитевьйй олигонуклеотид получали путем смешивания 50 мкл олигонуклеотида МоїА (100 пмол) с 50 мкл олигонуклеотида МоїВ (100 пмол) в 46,25 мкл водь, нагревания бо полученного раствора в течение 5 мин при 95"С и добавления 3,75 мкл 20х буфера РХЦ (раствор хлорида и цитрата натрия) пока раствор оставался еще горячим. Затем пробирку, содержащую смесь, помещали в химический стакан с горячей водой (при температуре приблизительно 70..757С), температуру которой медленно снижали до 15"С, с тем чтобьії указаннье оба нуклеотида могли гибридизироваться с образованием двунитивого олигонуклеотида МоїАВ. Полученную нуклеийновую кислоту собирали путем осаждения и центрифугирования. 65 Двунитевьй олигонуклеотид МоїАВ ресуспендировали в приблизительно ЗОмкл буфера ТЕ, а затем лигировали с кДНК в реакционной смеси, содержащей 1Омкл препарата кДНК, описанного вьіше,
приблизительно 5О0пмол (рассчитанного с помощью 00260) МоїАВ; 2мкл 10х буфера лигазьі ДНК Т4; 1,2мкл лигазьї ДНК Т4; 0,2мкл 10мММ АТФ; и воду с общим обьемом 20мкл, путем инкубирования реакционной смеси при 167"С в течение ночи. Затем реакционную смесь термоинактивировали за счет нагревания реакционной смеси в течение 10 мин при 657"С. Обьічно для амплификации ЦПР использовали приблизительно 1..2мкл полученной смеси; возможна амплификация лигирующей смеси в течение 10... 15 циклов (947С, 45сек; и 727С, 1,5мин) и сохранение в качестве запасного сьірья, как зто описано в Примере 2.
Пример 2
Амплификация ЦПР кКЛНнК 70 Обьічно кКДНК амплифицировали путем приготовления амплифицирующей реакционной смеси, содержащей бмкл 10х буфера ЦПР (500мММ Кеї; 100 трис, рН 8,3; и 20мМ Мосі»; 5... мкл ДНТФ (2,5ММ каждьй); один мкл полимеразьі Тад (Воепгіпдег-МаппПеїт); О,їмкл белка гена 32 (Воепгіпдег-МаппПпеїіт); бмкл праймера Мої В (20мкМ запасного раствора); 2мкл КкКДНК ( приготовленной, как описано в Примере 1) и до 50 мкл водь. Затем зту смесь покрьівали 50... 100мкл минерального масла и проводили амплификацию ЦПР в течение 10...15 циклов /5 при 947С. 45сек; 607 С, 45сек; и 72"С, 1,5мин. После амплификации реакционную смесь зкстрагировали с помощью фенол/хлороформа и амплифицированную нуклейиновую кислоту осаждали зтанолом и собирали путем центрифугирования. После зтого осадок растворяли в 100 мкл буфера ТЕ для получения исходного раствора.
Пример З
Амплификация ЦП Р для вьічитающей гибридизации и циклической селекции
Для получения продукта ЦПР как для вьчитающей гибридизации, так и для циклической селекции приблизительно 1 мкл исходного раствора, полученного так, как зто описано в Примере 2, амплифицировали в
Б5Омкл реакционной смеси ЦПР, приготовленной по методике, описанной в Примере 2, за исключением того, что осуществляли 21..24 цикла отжига праймеров, расширение и денатурирование продукта. После амплификации с г реакционную смесь зкстрагировали с помощью фенол/хлороформа, осаждали зтанолом и собирали путем центрифугирования. Полученньй продукт оценивали с помощью окрашивания зтилбромидом после і) злектрофореза на геле агарозьь небольшой аликвотной пробь! реакционной смеси. Для вьчитающей гибридизации библиотеку кДНК. из негативньїх клеток теломеразь!і (ІМК-90) амплифицировали в присутствий биотинилированного дУТФ (дезоксиуридин-5'трифосфат). Для вьполнения вьчитающей гибридизации М зр Мспользовали смесь кКДНК из негативньхх клеток теломеразь (ІМК-90) и кКДНК из позитивньхх клеток полимеразь (293) в соотношении приблизительно 100:1. Бьіли использованьь следующие стандартнье условия: о температура, равная 65"С, в течение 48...72 ч. Обьічно примерно 2 мкг продукта нуклейновой кислоть! из «г частично очищенной кКДНК и негативно вьіделенного материала использовали для по меньшей мере двух циклов циклической селекции. После циклической селекции, описанной в Примере 4, примерно 1...2мкл -
Зз5 отселектированньх " риїі-дашп" продуктов (из общего обьема 20 мкл) амплифицировали за счет ЦПР, как зто «Е описано в Примере 2, в течение 22 циклов, осаждали зтанолом и собирали с помощью центрифугирования в препарат для дальнейшей циклической селекции.
Пример 4
Позитивная селекция КЛНК. амплифицированной ЦПР «
Для зтапа позитивной селекции процесса циклической селекции, используемого для клонирования в с РНК-компонента теломеразь!ї человека, около 2мкг амплифицированной ЦПР кДНК разбавляли в 25мкл буфера
ТЕ, а затем смешивали с 1,25мкл 20 х РХЦ и полученньій раствор нагревали в течение З мин до 9570. После ;» зтого температуру снижали до 60"С и добавляли один микролитр (0,1мкг/мкл) биотинилированного зонда К2 или К4. Последовательности зтих зондов показань! ниже. Зти зондьі являются О- метил РНК зондами, где Оу представляєт собой О-метил-уридин, А -зто О-метил-рибоаденин, С - зто О-метил-рибогуанин, І-зто изонин. ї5» К2: 5 -ШЮШАСОСИШАСІІ- биотин
К4: 5 -АШОСОСИОАЦШІІ- биотин.
Ш- Зонд К2 является специфическим для теломерического повтора, а зонд К4 - специфическим для ї5» рибонуклеазь! Р, которая используется для отслеживания зффективности и производительности процесса Чциклической селекции. Вьіполняя циклическую селекцию одновременно, но раздельно для РНК рибонуклеазь Р, о молекуль! известной последовательности, можно иметь большую уверенность в том, что процесс циклической
І селекции функционирует должньмм образом по отношению к молекуле, представляющей интерес, в данном случае, по отношению к РНК-компоненту теломеразьї человека.
После того, как к смеси при температуре 657"С добавляли либо зонд К2, либо зонд К4, температуру реакции
Б Гибридизации снижали до 30"С путем инкубации указанной смеси при зтой температуре в течение 5 мин, а затем температуру реакционной смеси снижали до 147"С посредством инкубации при зтой температуре в
Ф) течение 60 мин. В завершение смесь инкубировали при 4"С в течение 2...12часов. ка Всю реакционную смесь для гибридизации для каждого зонда (К2 или К4) добавляли к 400 мкл раствора 0,5х РХЦ при 4"С, а затем добавляли в пробирку с охлажденньіми до температурь! льда магнитньіми гранулами, бо Которьне бьіли закупленьі у фирмь! Рготеда, и перед использованием четьре раза предварительно промьвали раствором 0,5х РХЦ. Полученную смесь инкубировали в течение 30 мин при 47"С для обеспечения окончательного связьівания с магнитньіми гранулами. После зтого каждую реакционную пробирку инкубировали в течение короткого периода времени при комнатной температуре на магнитном стенде (Рготеда) для опускания указанньїх гранул. Зти гранульь ресуспендировали в холодном растворе 0,5х РХЦ (600 мкл) и 65 помещали (в пробирке) на лед. Образць! промьівали еще три раза аналогичньм образом с помощью раствора 0, 5х РХЦ. Нуклеиновую кислоту злюировали из гранул посредством их ресуспендирования в 10О0мкл водь и инкубирования в течение 2 мин при 65"С перед возвратом гранул на магнитньй стенд для сбора. Зтот процесс повторяли еще три раза; в последний раз ресуспендированнье грануль! перед помещением их на магнитньй стенд для сбора инкубировали в течение 5 мин при 65" С. Все 100 мкл надосадочной жидкости (для каждого образца) обьединяли и вьісушивали до 20 мкл в центрифуге ЗреедМас . Затем восстановленную. ДНК подвергали амплификации ЦПР для другого цикла амплификации и селекции. После каждой амплификации продуктьї ЦПР дваждьї зкстрагировали фенол/хлороформом, осаждали зтанолом и ресуспендировали в 20 мкл буфера ТЕ.
Обьічно амплификации ЦПР контролировали с помощью злектрофореза на геле агарозьі. Кроме того, для 7/0 процесса циклической селекции использовали различньсе видь! контроля. При одном из видов контроля "ветви"
ЦПР (олигонуклеотидьї определенной последовательности, которье служат в качестве сайтов гибридизации праймеров) помещали в нуклейновую кислоту, которая содержала ген, обеспечивающий устойчивость к неомицину. Полученную нуклеиновую кислоту смешивали с амплифицированной ЦПР кКДНК и осуществляли контроль при каждой селекции посредством количественно протекающей ЦПР. Рибонуклеаза Р служила 7/5 Контролем по отношению к селектируемой рибонуклеазе Р и РНК-компоненту теломеразь), селектируемьхх из библиотек.
Пример 5
Протокол ОТ-ЦПР
Первую нить кДНК получали, в основном, в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1. По существу, РНК очищали от каждой фракции теломеразьї, содержащей от 0,1 до 1 мкг РНК; обьічно использовали от 1/3 до 1/5 РНК, полученной из 300 мкл фракции. РНК смешивали с 40...80 нг произвольного гексамера в 10 мкл, денатурировали в течение 10 мин при 95" С (используя прибор термоциклирования) и охлаждали на льду.
Денатурированную РНК и праймер (6 тег, рама) добавляли к реакционной смеси, содержащей 4мкл 5х буфера для синтеза первой нити кКДНК, поставляемого изготовителем обратной транскриптазь (отазьі, получаемой от с
ВК), 2 мкл 01 М ДТТ, мкл ТММ днтФ (каждьй), мкл ингибитора обратной транскриптазь (РНагтасіа) и воду с общим обьемом, равньїм мкл. Зту комбинированную смесь помещали в водяную баню при температуре 4276. і)
После 1...2-х минутной инкубации к смеси добавляли 1мкл Зирегзсгірі (ВК). Инкубацию продолжали в течение 60 мин при 42"С. Реакцию прекращали путем нагрева пробирки в течение 1Омин при 95...98"С. Первую нить
КДНК собирали с помощью недолгого центрифугирования, аликвотировали в новье пробирки, бьістро ї- зо замораживали на сухом льду, хранили при температуре, равной -807С или использовали сразу же.
Пример 6 о
Амплификация ЦРП кДНК со специфическим праймерньїм набором «г
Для проведения реакций ЦПР ( обьемом 20 мкл) с радисактивно меченьми нуклеотидами 1 мкл кДНК, приготовленной в соответствии с методикой, описанной в Примере 5, смешивали с 20 пмолями праймера 1, - 2Опмолями праймера 2, 2,5мкл 2,5мММ дДНТФ, 5мкКи альфа- 32р -дАТФ, двумя единицами полимеразь! Тад «Її (Военгіпдег-МаппПеїт), О,2мкг белка гена 32 Т4 (Воепгіпдег-Мапппеїйт), 2мкл 10х буфера (500мММ Кесі, 100ммМ трис-НС1- рН 8,3 и 20мММ Мосі» ) и воду с общим обьемом 20мкл. Затем в пробирку добавляли одну каплю минерального масла. «
Условия амплификации ЦПР для клона РНК-компонента теломеразь! били следующими: 947С в течение 45 с, 60"С в течение 45 с, 72"С в течение 1,5мин. Количество циклов отличалось в зависимости от типа 8 с очищаемого материала, использованного для приготовления РНК, но обьічно находилось в диапазоне от 18 до ц 25 циклов. Как и при всех количественно протекающих ОТ-ЦПР, для каждого образца бьли проведень "» несколько реакций с разньім числом циклов для определения момента, когда амплификация ЦПР становилась насьшщенной и нелинейной.
Для рибонуклеазь Р, используемой в качестве контрольной, условиями амплификации ЦПР бьіли: 947 С в «г» течение 45 с, 507С в течение 45 с и 72"С в течение 1,5мин. Как и ранее, количество циклов в диапазоне от 15 - до 22 зависело от природьі! образцов.Последовательности праймеров, используемьїх для амплификации рибонуклеазь Р, показань! ниже: ї РУ У-СбБААСБОТСТОАСАСТАЄ.-У о ШИ я У-АТСТОССТОСССАСТСТО-У
Продукт ЦПР"-полученньїй с помощью зтих двух праймеров, имеет размер, равньй приблизительно 110 п.н. "м После завершения ЦПР продуктьіь (от 5 до 10 мкл реакционной смеси) загружали на бо нативньй полиакриламидньій гель и подвергали злектрофорезу. После злектрофореза гель вьісушивали и помещали в кассету счетчика радисактивности РіозрПогітадег или на авторадиографическую пленку для анализа. 22 Пример 7 Клонирование гена для РНК-компонента теломеразьії человека о МИспользованнье для клонирования гена РНК-компонента теломеразьі человека операции вьіполняли так, как зто описано у Мапіаїз5 еї аї!., І арогаїогу МоіІесціаг Сіопіпд МапиаІЇ. Библиотека геномной ДНК для ДНК из де клеточной линий УУІ-38 легочного фибропласта человека, введенная в лямбда-вектор РІХІЇ! фага, бьіла получена от фирмь! бЗігаїедепе. Фаг помещали на три набора из 15 (150 мм) пластин в концентрации, равной 60 приблизительно 25 тьісяч бляшек на пластину. Пластиньі изготавливали с помощью агара ММ и концентрирующей агарозьі МАМ; клетками, использованньми для трансформации фага, бьли клетки
ХИВвВІісемкаАР2; и трансформанть! вніращивали всю ночь в течение приблизительно 16 час при 37" С. Затем пластиньії охлаждали до температурь 4 С в течение приблизительно 1 часа после чего бляшки "переносили" на химически чистье нейлоновье кружки С/Р (фильтровальная бумага от фирмь! Віо Кад). Зтот процесс повторяли бо для получения набора перенесенньїх фильтров. Фильтрьі (в дупликате) денатурировали, нейтрализовали, уравновешивали в б х РХЦ-буфере, зкспонировали УФ-излучением для сшивания нуклейновой кислоть! с фильтром, а затем вьісушивали на промокательной бумаге.
Предгибридизацию проводили в течение 1 часа при температуре 37"С в 5095 формамидном буфере.
Фильтрьї зондировали с помощью радисоактивно-меченого фрагмента Мої! с размером приблизительно 218 п.н. Миз клона рОКМ7, которьій вьіделяли путем злектрозлюирования из 590-ого полиакриламидного геля после сепарации злектрофорезом, а затем ник-транслировали с помощью альфа-2Р-дЦТФ, используя ник-трансляционньій кит от фирмь! Воепйгіпдег-Мапппейт Віоспетісаіїз в соответствии с инструкциями изготовителя. На один фильтр использовали приблизительно 25нг ( метка на 10 мкКи) зонда, гибридизацию осуществляли в ночное время при 37"С в 5095-ом формамидном гибридизационном буфере. После 70 гибридизации фильтрь! промьівали при комнатной температуре шесть раз; первне три промьівания проводили с использованием бх РХЦ, содержащем 0,195 додецилсульфат натрия, а последние три промьівания - с помощью одного бх РХЦІОПосле начальной зкспозиции нескольких дублетньїх фильтров в кассете РІіозрпогітадег с целью проверки зффективности гибридизации и силь! сигнала, фильтрь! промьівали при температуре 657С в растворе 0,5х РХЦ. Затем фильтрьї помещали под пленку Кодак ХАК5, используя два зкрана усилителя, и 75 зкспонировали пленку в течение приблизительно 100 часов при температуре -70"С. Фильтр с фагом, далее обозначаемьм 28-1, содержащим ген РНК-компонента теломеразь! человека, излучал один сильньй сигнал.
Бляшку, соответствующую сигналу, наблюдаемому от фильтра, использовали для изготовления вторичньх пластин, так что вбіделенную бляшку ( установленную путем зондирования с помощью меченой плазмидой роОКкМ7 нуклеийновой кислотой) можно бьіло культивировать для крупномасштабного вьіделения ДНК-фага. Шаг 28-14, имеющийся в Американской коллекции тканевьїх культур под инвентарньмм номером 75925, содержит вставку с размером - 15 т.п.н. и несколько рестрикционньїх фрагментов, имеющих последовательности, которье гибридизируются с последовательностями РНК-компонента на плазмиде рОоКкМ7: фрагмент Есокі с размером 4,2 т.п.н.; фрагмент рестрикционного фермента Сіаї! с размером 4,2 т.п.н. и фрагмент рестрикционного фермента Ніпаїїї-Засі с размером 2,5 т.п.н. Последний фрагмент содержит показанную вьше полную су последовательность РНК-компонента из -560 нуклеотидов и, как полагают, полньій ген РНК-компонента.
Плазмида, содержащая фрагмент рестрикционного фермента Ніпайй-ЗасіІ с размером 2,5 т.п.н. в векторе і9) рВійезсгірі, бьла обозначена как плазмида рОкМ33 и может бьть получена из Американской коллекции тканевьїх культур под инвентарньм номером АКТК . Ген человека может содержать последовательности, отличающиеся от последовательностей фрагмента с размером 2,5 т.п.н., указаннье последовательности могут /-|ча бьть вьіделеньь из фага 28-1 или из клонов другого фага, идентифицированньїх путем зондирования фрагментом с размером 2,5 т.п.н. (или другим зондом согласно изобретения). о
Упомянутье вьіше фрагментьі рестрикционньїх ферментов оготовили в оотдельньх гидролизатах «Її рестрикционного фермента; продукть! зтих гидролизатов разделяли путем злектрофореза на 0,790 геля агарозь или, только для фрагмента с размером 2,5 т.п.н., на 3906 полиакриламидном геле; необходимье полоски - вьірезали из геля и готовили для субклонирования либо с использованием Сепесіеап КІї ІЇ (из Віо101, Іпс.), «Її либо путем злектрозлюирования в диализной пробирке Зресігорог в 0,1х ТВЕ при 1008 в течение 2 часов (только для фрагмента с размером 2,5 т.п.н.).
Указаннье фрагменть! рестрикционного фермента субклонировали в плазмидь! зкспрессийи/мутагенеза Е.соїїЇ, « вьіделенньїх из плазмид на основе рус или из плазмид рВішевзстірійІ, которье также содержат репликатор 5М40 (но не активность промотора 5М40). Полученнье плазмидь могут использоваться для приготовления - с измененньїх (мутированньїх) нуклеиновьїх кислот РНК-компонента для введения в человеческие или другие й зукариотнье клетки с различньми целями, как зто описано вьіше в Описаний преймущественньїх вариантов "» вьіполнения изобретения.
Пример 8
Антисмьісловне плазмидь! РНК-компонента теломеразь! человека «г» Антисмьісловье зкспрессирующие плазмидьй сготовили с помощью амплификациий ЦпПР КкДНК
РНкК-компонента, используя следующие наборьі праймеров: (1) МоїВ и 1, которье продуцируют 7 антисмьісловую нуклеиновую кислоту, меньшую по размеру, чем вставка кКДНК в плазмиде; и (2) МоїВ и КЗС, «» которье продуцируют полноразмерную (относительно вставки в плазмиду) антисмьсловую нуклейновую Кислоту. Нуклеотидная последовательность МоїВ показана вьіше в Примере 1; нуклеотиднье о последовательности праймеров 1 и КЗС показань! ниже. й. СІ: 5. САСААДАЛАСАССССОССОСОСАССААААССА-У
Ве: У-«СТТТОСТСТАСААТСААСОСТОСААО-У -
После амплификациий ЦПР амплифицированнье фрагменть! клонировали в зкспрессирующей плазмиде с (Ф. размером 10 т.п.н. в сайте Ртії; указанная плазмида содержит геньї, обеспечивающие устойчивость к
ГІ пуромицину, ОНЕК, и гигромицину В в качестве селектируемьїх маркеров, репликатор 5М40; индуцибельньй промотор гена металлотионейина человека, размещенньй для зкспрессий антисмьсловой нити гена во РНК-компонента теломеразьі человека (также можно бьло бьі использовать более сильньій промотор для получение более вьісоких уровней зкспрессии), и поздний поли А добавочньй сайт 5МУ40.
Полученнье плазмидь! (обозначеннье как ркМ42 для продукта МоїВ/ЗІ и как рОокКМ45 для продукта
МоїВ/КЗС) трансфецировали путем введения фосфата кальция (см. вьіше Мапіаїйіз еї а.) в фибросаркомную клеточную линию НТ1080. Клетки НТ1080 обьічно являются иммортальньми; зкспрессия антисмьісловой РНК бе для РНК-компонента теломеразьї человека должна предохранять РНК-компонент теломеразь! человека от связьшвания с белковьіми компонентами, блокирующими образование активной теломеразьі и от отмирания клеток.
Пример 9
Идентификация и вьіделение нуклеиновьїх кислот РНК-компонента из млекопитающих кроме человека
Для иллюстрации того, как реагенть! согласно изобретения можно использовать для идентификации и вьіделения в основном гомологичньїх нуклеийновьїх кислот из других видов млекопитающих, праймерь! ЦПР, комплементарнье последовательностям РНК-компонента человека, использовали для амплификации гомологичньїх последовательностей в ЦПР. Праймерная пара, используемая для демонстрации зтого аспекта изобретения, содержала праймер 410, имеющий последовательность 5 -САССООоОСТТОоСОбАОооСАСО-3, и 70 праймер К7, содержащий последовательность 5-ССдОоООСсОААСОо((ОСсСАССсСА-3. Геномную ДНК готовили из тканей шимпанзе, беличьей обезьянь,, резуса и бабуйина и растворяли в буфере ТЕ при концентрации, равной приблизительно 0,5...4 мг/мл.
Для каждого типа ткани готовили смесь ЦПР, которая содержала: 1 мкл геномной ДНК, 48 мкл Мазвзіег Міх (Мазіег Міх состоит из 1х буфера ТадеЕхіегідегтм М, полученного от фирмь! Зігаїадепе, 200 мкМ каждой дДНТФ и 75 0,5 МКМ каждого праймера)Ї и 0,5 мкл смеси Тад-полимеразьй (5 единиц/мкл, Воеппіпдег-Маппнеїт) и
Т-полимеразь! (полимераза ТадЕхіепаег, полученная от фирмь! Зігаїадепе) в соотношений 1:1. Реакционнье пробирки загружали в датчик термоциклов, которьій программировали таким образом, чтобьі обеспечить первьй нагрев реакционной смеси при 94"С в течение 5мин, а последующие 27циклов инкубации - при 94"С в течение
ЗОс, при 60"С в течение 10с, при 72"С в течение 45с. После завершения реакций амплификации около 1Омкл го каждой реакционной смеси загружали на 295 гель агарозь для проведения злектрофореза. После злектрофореза, окрашивания геля и УФ-облучения можно бьіло наблюдать, что каждая реакционная смесь содержала полоску предсказанного размера (5200 п.н.). Нуклейновье кислотьі из зтих полосок могут бьть клонированьі и секвенированьі, а остаток генов РНК-компонента от каждого из зтих видов млекопитающих можно клонировать, как зто описано вьіше для гена РНК-компонента теломеразь! человека. В нижеприведенном су примере 14 описан специфический пример секвенирования гомонентного гена РНК теломеразьі беличьей обезьянь. о
Пример 10
Мутированнье смьісловье последовательности РНК-компонента теломеразь! человека
Данньй пример показьівает, что изменение последовательности РНК-компонента теломеразь на матричном зо участке изменяєт последовательность, синтезированную теломеразой человека, приводя к изменению в хромосомньїх теломеразньїх повторах. о
Для определения того, может ли перепрограммирование матричного участка ТКСЗ продуцировать « соответствующие изменения в повторе теломеров, синтезированном с помощью активности теломеразь человека, фрагмент гена, которьій зкспрессирует всю последовательность гена (ТКСЗ3) РНК-компонента - з5 теломеразьї, клонировали и мутировали. Саузерн-блот анализ показал, что ТКСЗ гибридизирован со «Кг однокопийньІмМ геном генома человека. Геномную копию ТКСЗ вьіделяли из библиотеки лямбда фага и удостоверялись, что он имеет ту же рестриктазную карту, что и на геномньїх саузерн-блотах, зондированньмх с помощью ТКСЗ. Фрагмент НіпаїїІ-Засі с размером 2,6 т.п.н. вьіделяли и субклонировали в модифицированную версию рВінчезстгірі, генерируя геномную ТКСЗ плазмиду рОКМ33 . 5 - и 3--концьі РНК картировали, используя « 0 растяжение праймера, ЦПР КАСЕ и ОТ-ЦПР. Размер транскрипта РНК составлял приблизительно 550 шщ с оснований, что согласуется с его миграцией на нозерн-блотах. Транскрибированньїйй участок для ТКОЗ занимал й центральное положение относительно геномного клона, имеющего верхнюю последовательность с размером "» 1,4 т.п.н.
РНК зкстрагировали из препаратов очищенной теломеразь, а затем использовали при последующих Зкспериментах. 5 КАСЕ: первую нить кДНК готовили, используя анитисмьісловье праймерь ТКСЗ (КЗВ: г» 5-СААСОААСООССА ОСАССТОАСАТТ) в оприсутствий З2Р-дАТФ. Продуктьі расширения разлагали -І посредством злектрофореза в полиакриламидном геле, а затем идентифицировали с помощью авторадиографии, вьірезали и зкстрагировали. Олигонуклеотид (МоїА: 5- рРАТАОСОоО ССОСТТ ОССТТ СА-МНО г» ) сшивали с зтими продуктами первой нити, используя лигазу РНК Т4, а затем осуществляли ЦПР, используя 5ор гнездовой праймер КЗс ( 5- СТТТОСТСТАСААТОААСОСТОСААС), и олигонуклеотид (МоїВ: У- о ТОААТТСТТОСООССОСсТтАТ), комплеме-нтарньій олигонуклеотиду МоїА. Продуктьі ЦПР разлагали на геле і агарозь, а полоски вьрезали и секвенировали непосредственно, используя олигонуклеотд 1 (-АВААДААДАСАССОоСОо СОБОСАССААДАССсСА) в качестве праймера. Картирование У -конца: попьїтки осуществить 3 КАСЕ бьли безуспешньми. Затем для синтеза первой нити кКДНК использовали стратегию ОТ-ЦПР, при которой применили ряд антисмьісловьїх праймеров, комплиментарньїх последовательности геномной ДНК. Праймерь зтого ряда размещали на интервалах, равньїх приблизительно 150 п.н., начиная от
ІФ) 5-конца в направлений 3'-конца транскрипта. После зтого осуществляли ЦПР, используя первую нить праймера ко и праймер, последовательность которого бьіла внутренней по отношению к известному транскрипту ТКСЗ (ЕЗБ: 5-ТСТААСССТААСТОАСАдОоОсОСОТАС). Полосьї ЦПР, чувствительнье к обратной транскриптазе, бо предсказанного размера наблюдали при использований кДНК, полученной с помощью всех праймеров, пронумерованньх в интервале от 4100 до 1450 (нумерация относительно 5' -конца), но не с помощью любого из праймеров, пронумерованньїх от 558 до 4950. Зто позволило разместить предполагаемьй 3'-конец зрелого транскрипта ТКСЗ между позициями 1450 и 4558. Последующие цикль! конструирования праймера и ОТ-ЦПР ограничили зтот интервал в пределах 545 и 558. 65 Предсказанную матричную последовательность ТКСОЗ изменили с СПОШДАСССИЦА до ССААССССА (тис) или
САДАСССАА (МиА) посредством мутагенеза іп міго (в основном вьіполненньм в соответствии с Реге? еї аї.
(1994) У. Віої. Спет. 269:22485) плазмидьї рОКМ33. В случае введения в функциональную теломеразу указаннье мутантнье рибонуклеазь!ї должнь! біли служить матрицей для синтеза ТТОСОО (Мис) или ТТТОСО (МиА) в большей мере, чем для повтора дикого типа ТТАОСО. Зти активности мутантной теломеразь! можно бьло бь легко отличить от активности дикого типа, поскольку они больше не требуют дАТФ для активности и только активность дикого типа чувствительна к терминации с помощью ддАТФ. Кроме того бьіл приготовлен двойной мутант (МиС-17), в котором в положений 71180 п.н. присутствовала вставка с размером 17 п.н. помимо матриць (Мис). Зтот мутант позволил осуществить специфическое детектирование измененной РНК с помощью зондирования вставки с размером 17 п.н. или по размеру. 70 Для зкспрессии ТКСЗ іп мімо бьло достаточно 2,6 т.п.н. геномной последовательности. Клетки кратковременно трансфецировали с помощью плазмидьь МиСя17 и РНК, озкспрессированная из трансфецированной ДНК, бьла обнаружена с помощью ОТ-ЦПР, используя последовательность вставки с размером 17 п.н. в качестве праймера на зтапе обратной транскрипции. РНК бьла обнаружена в МиСя17 -трансфецированньїх клетках, а не в псевдотрансфецированньїх клетках, что указьшвает на то, что для /5 Зкспрессиий ТКСЗ геномньій клон с размером 2,6 т.п.н. біл достаточньм. Затем из каждой из зтих трех мутантньїх плазмид с помощью трансфекции фосфатом кальция клеток НТ1080 наряду с рЦМВпео бьіли вьіделеньї стабильнье трансформанть. В (5418 бьіли отобраньї устойчивне клонь, и посредством ОТ-ЦПР бьлла проконтролирована зкспрессия МиС--17 РНК. (Ігміпод еї аії. (1992) Ехр.Сеї! Кев. 202: 161).
Для исследования активности мутантной теломеразьй бьли проанализировань! зкстракть! из нетрансфецированньх н клеток и из трех стабилтьньїх трансформантов с обьединенньіми векторами Мис", Мис или МиА (СУ, С или А на Рис.1). Поскольку ожидалось, что мутантнье зкстракть! содержат как активность дикого типа, так и активность мутантной теломеразь, для их различения использовали разнье условия анализа. При нормальньх реакционньх условиях (дТТФ, р дгТтФ и дАТФ) все три зкстракта из серии мутантньх конструкций показали активность теломеразь! дикого типа, чувствительной к рибонуклеазе (Рис.1, линии 1-6). су
Как ожидалось, зта активность не изменилась, когда в реакцию включили ддЦтТФ (Рис.1, линии 7-9) и исчезала с помощью дидезокситимидин-5'-трифосфата (ддТТФ) (линии 10-12). В противоположность зтому, когда ддАТФ і9) заменили на дАТФ, С (линия 14) и А (линия 15) зкстрактьї все еще показьшали активность теломеразь,, чувствительной к рибонуклеазе (линии 17 и 18), тогда как зкстракт С" (линия 13) и контрольньій зкстракт не показьшвали зту активность. Зти результать! показьівают, что активность, устойчивая к ддАТФ, означаеєт, что - теломераза бьіла перепрограммирована с помощью МиС или МиА ТКСЗ РНК. В противоположность зтому, вставка с размером 17 п.н. в С" ингибирует реконструкцию, показьівая зтим, что реконструкция теломеразь о весьма специфична для последовательности ТКСЗ. «І
Для подтверждения того, что последовательность, синтезированная с помощью мутанта МиА, представляла собой (3ЗООТТТ)п, бьіила модифицирована существующая методология ЦПР для амплификации повторов - теломеразьі, добавленньїх в уникальньій праймер теломеразь! (Кіт еї аї!. (1984) Зсіеєпсе 266: 2011). Используя «Її синтетические праймерь, бьли идентифицированьй условия реакции, при которьїх праймер 3 с последовательностью (ф(СССАААСССААДАСССАА) амплифицируеєет только повторїй (ГТТОоссб)ї и не амплифицирует повторьі, содержащие (ТТАОСО)п. «
Для различения теломерических повторов, добавленньїх посредством теломеразьі дикого типа и мутированной теломеразь;, двухстадийньй анализ комбинировали со стратегией, ограничивающей способность й) с нуклеотидов к реакции теломеразь. Поскольку МиА и Мис генерируют последовательности теломерических ц повторов (ТТТООО)п и (ТТосОоо)п, соответственно, клеточнье зкстракть! сначала инкубировали с субстратом "» Т5 в присутствии только ДТТФ и дДГТФ в течение 10 мин при комнатной температуре с тем, чтобьі! допустить добавление теломерических повторов. Затем остаточную активность теломеразьь уничтожали с помощью
Ккипячения зкстрактов в течение бмин. После зтого продуктьь теломеразь со специфической г» последовательностью ДНК детектировали посредством амплификации ЦПР, используя соответствующие -1 обратнье праймерь! в присутствии всех 4 ДНТФ и следовьх количеств ЗР -дЦТФ, как зто описано в ранєе цитируемой работе (Кіт еї аії. (1994)). Для обнаружения продуктов МиА в качестве обратного праймера т. использовали (АСССАА)), а условия проведения ЦПР бьіли следующие: 94 С в течение 10 с, 60 С в течение 30 о 50 си 72 С в течение 30 с при 20 циклах. Для обнаружения продуктов МиС использовали три обратньїх праймера: (ССССАА)»з, (ССААСС)З и (ССААСС)З соответственно, которне придали продуктам ЦПР соответствующие "ч сдвиги мобильности, согласующиеся с ожидаемьм положением гибридизации с продуктами теломеразь.
Используемье условия проведения ЦІПР бьли таким же, как и указаннье вьше, за исключением того, что температура гибридизации составляла 50"С. При тех же условиях из зкстрактов родительских клеток или клеток, трансфецированньїх с помощью гена дикого типа ТКСЗ, продукть! теломеразь! не вьірабатьвались. В о тестах на специфичность условий амплификации ЦпПР синтетические олигонуклеотидьі, содержащие (Тобо)п и (Ттоооо)п, вьірабатьшали соответствующие продуктьії ЦПР с помощью обратного праймера ко (АСССАА); или (ССССАА)з соответственно, тогда как олигонуклеотидь(ТТАсСОос);, не продуцировали какие-либо продуктьї ЦПР с помощью обратного праймера (АСССАА)) или (ССССАА)з. бо Используя зти условия, зкстракть! из Миа, но не из МиС или клеток дикого типа вьірабатьівали продукть! при анализе модифицированной теломеразь), указьивая на то, что теломераза из МиА, содержащая клетки, внірабатьівала повторьі (ТТТО((0)п. Аналогичнье способьї использовали для анализа мутанта Мис, которьй синтезировал повторьі (ТТОс(00б)п. Наряду с зтим, вьшеприведеннье даннье служат серьезньм доказательством того, что ген ТКСЗ кодирует РНК-компонент теломеразьі человека и позтому ген ТКСЗ бьл 65 переименован на на РТч (РНК теломеразь! человека).
Пример 11 РНК-компонент теломеразь в мортальньх и иммортальньх клетках
Большинство раковьїх клеток зкспрессируют вьісокие уровни активности теломеразь, в то время как в большинстве нормальньїх соматических клетках человека теломераза не обнаруживаєется (Кіт еї а/!. (1994). Для определения того, возрастают ли уровни РНК-компонента теломеразьї в иммортальньїх раковьх клеточньїх линиях, уровни РНК-компонента теломеразь и транскрипта САРОН бьіли проанализировань! с использованием
ОТ-ЦПР в пяти мортальньїх первичньїх клеточньїх штаммах, у которьїх отсутствовала детектируемая активность теломеразь, и в пяти иммортальньх раковьїх клеточньїх линиях с вьісокими уровнями активности теломеразь.
Установившиеся уровни транскриптов РНК-компонента теломеразь бьли в 3...12 раз виіше в клеточньїх линиях опухоли, чем в первичньїх клетках по сравнению с уровнями САРОН (Рис. 2А). В то время, как уровни 7/0 РНЕ-компонента теломеразьі увеличивались в иммортальньх раковьх клетках, зкспрессирующих вьсокие уровни теломеразь, представляет интерес то, что низкие, но без труда детектируемье уровни РНК-компонента теломеразь, также присутствовали в мортальньх первичньїх клетках с недетектируемой активностью теломеразь (линии 1-5).
Уровни РНК-компонента теломеразь! бьіли также исследовань! в различньїх нормальньїх тканях человека с 7/5 помощью нозерн-блот анализа. Щитки и яичник имели самьй вьісокий уровень РНК-компонента теломеразь, которьій и ожидался, поскольку зти ткани зкспрессируют вьісокие уровни активности теломеразьі. Однако ряд других тканей также зкспрессировали РНК-компонент теломеразь (Рис. 28 и 22). Сюда входили нормальная почка, простата и взрослая печень, в которьїх отсутствовали детектируемье уровни активности теломеразь.
Зти результать! подтверждают данньсе, полученньсе от клеточньїх линий (Рис. 2А) и дают повод говорить о том, что РНК теломеразьі может присутствовать, но бьть неактивной в ряде тканей человека. Аналогичнье тканево-специфические различия в зкспрессии РНК наблюдались в тканях мьіши; однако многие ткани нормальньїх мьшей показьівают позитивную активность теломеразьі. Явно увеличенная степень подавления активности теломеразь! в клетках человека может помочь обьяснению того, почему клетки мьішей спонтанно иммортализуются в культуре, тогда как клетки человека не подвержень зтому. с
Пример 12
Зкспрессия антисмьісловьїх транскриптов РТч (РНК-компонент теломеразьій человека) в клетках Не а і) приводит к кризису клеток и гибели клеток
Для исследования функции теломеразь! в иммортализованной клетке в клетки Неї а вводили конструкции, зкспрессирующие антисмьсловой РТч. Фрагмент ДНК ЕсокіІ (с размером 200 п.н.), содержащий клон кКДНК М зо РНК-компонента теломеразьі человека, ТКСЗ, с размером от 1 до 193 п.н. вводили в сайт ЕсоКіІ р10-3 и рВввВ5212 для генерирования плазмид р10-3 РТч и рРВВВРТХ соответственно. Плазмида р10-3-РТч зкспрессирует о антисмьсл РНК-компонента теломеразь! в условиях транскрипционного контроля регулируемого тетрациклином «Е минимального промотора ЦМВ относительно пяти верхних Теїоператоров в двух различньїх ориентациях, как зто описано в (Соззеп еї а). (1992) Ргос. Майї). Асай. Зсі (05А) 89: 5547). Плазмида рВВ5-РТч зкспрессирует ї-
Зв антИСМЬІСсЛ РТч под контролем промотора МВСМ (миелопролиферативньій вирус саркомь! мьішей) (іп еї а). «Е (1994) Сепе 147: 287). Параллельно зтому контрольнье зкспрессирующие векторьї,, не имеющие последовательность, кодирующую антисмьсловой РТч, также злектропорировали в клетки Неї а. Клонь,, содержащие антисмьісловье или контрольнье плазмидь, отбирали в трех отдельньїх зкспериментах.
Первоначально, 41 культура, зкспрессирующая антисмьісловой РТч, росла идентично клеткам с контрольнь!м « вектором. Однако при пост-трансфекции уровней удваийвания популяции (УУП) от 23 до 26 в 33 из 41 культур, з с зкспрессирующих антисмьсл, наблюдался кризис (Таблица 1). Кризис клеток в зтих культурах характеризовался заметньм подавлением роста клеток из У п от 20 до 26, за которьім следовали сбор и ;» вьіделение клеток из пластинь! в течение недели. В 28 из 33 случаев, при которьїх клетки претерпевали кризис, наблюдали редкие (менее 195) колонии ревертантов в течение трех недель после гибели большинства клеток. Клетки-ревертанть! могут представлять собой варианть! клеток, которне избегают ингибирующего воздействия ї» конструкций антисмьслового РТч. В противоположность антисмьсловьм клонам ни одна из векторньх контрольньїх клеточньїх линий не показала какое-либо изменение роста или смертности сверх 50 удвоений.
Ше Таблица 1 ї» Антисмьісловой РТчЧ приводит к более короткой длине ФВТ (фактора, вбісвобождающего тиреотропин) и 5р клеточному кризису о Бьіло проведено три независимьх зксперимента, в которьх клетки НеТе (клетки Неїа, которье "З зкспрессируют вьісокие уровни химерического белка тетрациклинового репрессора-МР16) трансфецировали путем злектропорации либо плазмидой р10-3-РТч, зкпрессирующей антисмьсловую РтТч под контролем терациклина-МРіо, индуцированного минимальньм промотором ЦМВ, либо плазмидой рввз-РТЧч, 5Б Зкспрессирующей антисмьсловую РТч под контроем промотора ВМОСМ (54). (В озтих зкспериментах наблюдалось отсутствие регуляциий с помощью тетрациклина. Зксперимента с плазмидой р10-3-РТч обьічно іФ) вьполняли при оотсутствий тетрациклина, позтому контрольнье зкспериментьі с люциферазой или ко антисмьсловой РТчЧ под контролем индуцированного с помощью тетрациклина-МР16 минимального промотора
ЦМВ, показали, что наличие или отсутствие тетрациклина оказьвало небольшое влияние на зкспрессию бо люциферазь или антисмьісловой РТч в клетки НеТе7. Действительно, в ранних зкспериментах с конструкциями антисмьісловой РТчЧ в клетках НеТе/7 клетки находились в кризисном состояниий в 23-26 УУП в присутствий тетрациклина.) В качестве контрольньїх клетки НеТе7 бьіли также трансфецированьі с помощью родительского вектора при тех же условиях. Из каждого трансфеционного ряда бьло вьіделено от 11 до 18 стабильньх клонов.
Клонь из всех изолятов показали идентичную морфологию и профили роста до 20 УУП, во время которого рост 65 большинства клонов, зкспрессирующих антисмьсл, заметно снижался (р10-3-РТч и рВВ5-РТч). При 23...26 УУП зти клетки бьіли подверженьі! кризису, характеризуемому появлением увеличенньїх и округленньїх клеток.
Однако кризису бьіли подверженьі не все клоньії, генерированнье из рВВ5-РТч трансфецированньїх клеток
НетТе7; восемь клонов, зкспрессирующих антисмьсловой РТч, продолжали расти аналогично контрольньім культурам. Клетки из всех клонов собирали при 23 УУП и определяли средние длиньї ФВТ. Величинь! Р
ВЬІЧИСЛЯЛИ способом непарного (-теста. Для каждой серии показана доля клонов, подверженньмх кризису. . плазмида|кризиє клеток Средняя величина овт Величина Р| 0 Кризи Восго бю вк00111жвиму00010000000от то оРюаРТ да ///овнейимо 17777711 вив сн несе ПОВНИЙ НИК вита дя; 0000 озеюло ів
Клетиетел/ неї 000 зИБЮеЮ 0 |Родительокие клетки)
Для определения того, связана ли длина теломера и ингибирование теломеразь с кризисом клеток в клонах, зкспрессирующих антисмьсл, бьіли проанализированьії длина теломера и активность теломеразь! в нескольких ор предкризисньх контрольньїх и зкспериментальньх колониях при 23 УУП. Все колонии, содержащие контрольньій вектор, имели средние длиньі ФВТ (3,22 и 3,27 т.п.н.), аналогичнье линии родительской клетки (3,15 т.п.н.), тогда как клоньії, содержащие конструкции антисмьслового вектора, подверженнье кризису, имели средние длиньі в пределах 2,39...2,72 т.п.н. или на 17...26 /о бьіли короче, чем клоньї родительской линии (рис.3). Зти даннье согласуются с повторами теломеров, потерянньіми в клонах, содержащих антисмьсл, из-за сч ов подавления активности теломеразь!. Для непосредственного исследования зтого проанализировали активность теломеразь в 14 из указанньїх клонов. Обьічно активность теломеразь! бьіла низкой, но детектируемой во (о) многих антисмьісловьїх клонах, хотя укороченнье теломерь! дают основание предположить, что уровень бьл недостаточньім для сохранения длинь! теломера, поскольку средняя длина ФВТ уменьшалась от 3,22 до 2,39 т.п.н. (Р-0,0008). В восьми клонах, содержащих антисмьісловой вектор, (рРВВ5-РТЧЬ), которне не претерпевали чн Кризис, длина теломера изменялась незначительно (с 3,33 до 3,03, Р-0,355) и активность теломеразь! бьіла аналогична зтой активности контрольньїх клонов. Взятьіе вместе, зти результатьі свидетельствуют о том, что (2 потеря теломера приводит к кризису и гибели клеток сразу же после достижения теломером критической длинь. «
МИндуцтрование клеточного кризиса в клетках Неїа, зкспрессирующих антисмьсловой РНК-компонент теломеразьі, дает дальнейшее подтверждение тому, что ингибирование теломеразьі может обеспечить ї- специфическую зффективную терапию рака человека. «
Пример 13 Амплификация и детектирование іп зйш Детектирование РНК теломеразь іп зйи А.
Флуоресцентная гибридизация іп зіш (ФГИС) Идентификация позитивньїх клеток теломеразьі в смешанной популяции клеток или тканей может бьть вьіполнена с помощью гибридизации іп зі меченого зонда, нацеленного на РНК-компонент теломеразь. Ткань клеточньїх образцов закрепляли на предметном стекле « 70 Микроскопа, разрьїхляли и использовали для гибридизации іп зйш. Пример способа гибридизации іп зйй РНК з с теломеразь! человека включаєт первое денатурирование нуклеийновьїх кислот путем погружения предметньх стекол в 70-процентньій дейонизированньій раствор формамида/ 2х РХЦ, предварительно нагретого в течение :з» 2...3 минут до 70...74 С. Затем стекла переносят на охлажденньій до температурь! льда 7095-ьій ЕЮоН|зтанол), затем в 9596-ьій ЕЮН, затем в 10095-ній ЕЮН (по 4 минуть в каждом растворе). 100...20Онг (на стекло) меченого
Зонда РНК теломеразьй человека (зонда ДНК с размером приблизительно 500 п.н., меченого биотином, їз дигоксигенином, радисизотопом, флуоресцентной меткой) вьісушивают, ресуспендируют в 100 мкл 10095 деионизированного формамида, денатурируют посредством инкубации при 75 С в течение 8 минут и сразу же - охлаждают на льду. Добавляют 1Омкл 2х буфера гибридизации (4х РХЦ; 4х раствор Денхардта; 2090 їз декстрансульфата; 700мММ трис, рН 7,5) к ї17Омкл ресуспендированного зонда. Добавляют зондогибридизационную смесь (2Омкл) к закрепленному образцу, закрьвают покровньім остеклом и о герметизируют с помощью резинового клея или схватьвающего лака. Инкубируют образец при 37 С в течение «М 8..48 час. После гибридизации удаляют покровное стекло, дваждьі промьшают в растворе 2х РХЦ/Б5БО90 дейонизированньй формамид при 30 С, а затем дваждь! промьівают в растворе 2х РХЦ при 37 С (5 мин на каждое промьіваниеє). Затем образец рассматривают под микроскопом.
В. Затравочное мечение іп зйш (РКІМ5)
Другим вариантом традиционного способа детектирования гибридизации іп зіш является способ (Ф) Затравочного мечения іп зіш (РКІМ5). Детектирование РТч с помощью РКІМ5 включает начальньйй синтез КДНК
ГІ РТч с помощью обратной транскриптазь! (ОТ) с последующим детектированием РКІМ5З-способом, используя олигонуклеотидньй зонд, специфический для РТчЧ, и злонгацию цепи, включающей меченье нуклеотидь. во ОТ-реакция РТч может бьіть вьіполнена различньми способами. Одним из примеров ОТ-реакции является использование СепеАтр термостабильньій реверстранскрипциазньій РНК ЦПР кит (Регкіп ЕІтег). При зтом способе 10мкл ОТ-смеси (10 мМ трис- Неї, рН 8,3; 90мММ Ксі; їмМ МисіІ» ; 200 мкМ дНтТФ; 2,5 единиц гл полимеразьі ДНК; 0,4 мкМ праймера возврата |например, К7с: 5-ВББдОвООСОААСОООСсСАССАС-31) помещают на закрепленньй и разрьхленньій образец, покрьивают герметизирующим листом, закрепляют д5 схватьнвающим лаком, покрьівают минеральньм маслом ий инкубируют при 70 С в течение 30 мин. После зтого минеральное масло удаляют посредством промьівания в ксилоле в течение 5 мин, а затем в 10095-ом ЕОН в течение 5 мин. Покровное стекло снимают, кратковременно промьвают в дизтилпирокарбонатной воде (ДерС-воде), затем в 100956-ом ЕЮН, после чего вьісушивают на воздухе в течение 5 мин. Далее на образец помещают 1Омкл смеси для РКІМ5 (595 (в обьеемном отношений) глицерина; 10мММ трис-НСЇ, рН 0,3; 100 мМ КС; 0,0595 (в отношений вес/обьем) Тмееп 20; 0,75 мМ зтиленгликольтетрауксусной кислоть(ЗГТК); 2,5 мМ Масі» у 0,4 мМ ведущего праймера Інапример, ОЗр: 5-5бССТоовдосостТоотТоос ТАТТТТТТО-3; 200 мкМ дАТФ, дДГТФ, дЦТФ; 110МмкМ дтТФ; 90мМкМ меченого дУТФ) помещают на образец. Герметизируют с помощью покровного стекла, закрепляют схватьивающим лаком, покрьівают минеральнь!м маслом и ингибируют в течение от 30 мин до З час при температуре 70 С. После зтого образец триждь! промьівают в промьівочном буфере (4х 76 РХЦ; 0,0595 Ту'ееп 20) и нагревают в течение 2 мин до 70 С. После зтого наблюдают сигнал.
С. ОТ-ЦПР іп зіш
ОТ-ЦП Р-детектирование РТчЧ включает синтез кКДНК целевой РНК с помощью реакции обратной транскриптазьі ( вирусной обратной транскриптазьь или посредством внутренней активности ОТ полимераз термоустойчивой ДНК) с последующей амплификацией ЦПР іп зйш целевой кКДНК. Для синтеза кКДНК РтТч могут 7/5 Мспользоваться различнье ОТ-реакции, включая протокол ОТ, рассмотренньй в разделе 11.8. Более того, те же буферньсе условия и праймерь), используемье в РКІМ5З-способах детектировьания, могут также применять для ОТ-ЦПР, но вместо окончательной инкубации при 70 С в течение 30 мин...3 час образец амплифицируют в термодатчике циклов в течение 30...40 циклов, включающих режимь!: 94 С в течение 40 с, 55 С в течение 90 с (см.раздел 118). После ЦПР образец триждь! промьївают в промьівочном буфере (4х РХЦ; 0,0595 Тмееп 20), 2о нагревают до 70 С в течение 2 минут. После зтого наблюдают сигнал.
Другой альтернативой является амплификация кДНК, полученной из начальной ОТ-реакциий с использованием системь! 1000 СепеАтр для ЦПР іп зіш и коровьій кит СепеАтр для ЦПР іп зйш (Регкіп ЕІтег).
Один зтап ОТ-ЦПР іп зйи на закрепленном и разрьїхленном образце можно вьіполнить, используя протокол ЦПР
РНК СепеАтр Е/ гій в сочетаний с системой 1000 СепеАтр для ЦПР іп зйш (РегКкіп ЕІтег). Зтот способ сч ов Включаєт помещение буферной смеси ЦПР РНК Е7 (50 мМ бицина; 115 мм ацетата калия, 895 (в отношений вес/обьем) глицирина, рН 8,2; 300 мкМ дАТФ, АГТФ, дЦТФ; 165мкМ дТТФ; 135 мкМ меченой дУТФ; 5...10 единиц (8) полимеразьі ДНК гій; 2,5 мМ Мп (ОАс)» ; 0,45... 1мкМ праймеров, специфических к РНК теломеразь! человека, например, К7 и ЗБ) на закрепленньій и разрьхленньй образец на предметном стекле микроскопа и герметизацию его с помощью кремниевой прокладки и зажима в соответствии протоколом изготовителя ї- зо (ЗепеАтр система 1000 для ЦПР іп зни, Регкіп ЕІтег). Затем образец помещают в установку СепеАтр для ЦПР іп ві и нагревают в течение 120 с при 94 С, затем амплифицируют в течение 30...40 циклов в режиме 94 С/45 с о и 60 С/45 с. После амплификации образец промьївают и проводят наблюдения, как зто описано вьіше. Для «г уменьшения фоновьїх сигналов, которье могут появляться при непосредственном введений флуоресцентньх меток в процессе амплификации ЦПР, может бьіть использовано косвенное детектирование, которое включает - амплификацию ЦПР с использованием немеченьх ДНТФ с последующей гибридизацией іп зйш, применяя «Е меченьій зонд гибридизации, специфический для амплифицированного продукта. При зтом способе сигнал усиливают посредством любого из описанньїх вьіше методов ОТ-ЦПР без меченьїх ДНТФ или праймеров, а амплифицированньй продукт детектируют посредством гибридизации іп віш.
О. Применение праймера расширения продукта для ЦПР іп зіш Успешность проведения ЦПР іп зйи зависит « от предотвращения утечки амплифицированньх продуктов внутри клеточной матриць из клетки. Позтому, в с обьічно справедливо то, что продуктьї ЦПР, меньшие по размеру, чем 500 п.н., нежелательньі для ЦПР іп зйи.
Для предотвращения утечки продуктов ЦПР с размерами менее 500 п.н. из клеточной матриць! обьічно ;» используют введение "обьемньх" дНтТФ (например, биотина, флуоресцентной метки, ДУТФ, меченого дигоксигенином) в продукть! ЦП Р. Другим путем предотвращения утечки небольшого продукта при ЦП Р іп віш является введение праймера расширения продукта в протокол ЦПР іп зйи. ї5» Способ включает использование праймера, содержащего 3-4 повторяющиеся последовательности с размером б п.н. (например, (5-ТТТССС-3)3, на 5-конце, за которьми следует последовательность,
Ш- являющаяся специфической для мишени (см. Рис.4, праймер 1), в комбинации с соответствующим праймером ї5» возврата (праймер 2) и третьим праймером, содержащим только повторяющуюся последовательность (праймер
З, например, І5-ТТТОСС-3)/)) для амплификации специфической целевой ЦПР іп зйи. Присутствие праймера З о удлиняєет продукт ЦПР из-за неустойчивого связьвания праймера З с 3З-концом продукта целевой ЦПР.
І Удлинение продуктов ЦПР может бьіть вьізвано уменьшением температурь! гибридизации в условиях начальной
ЦПР.
Например, если температура гибридизации целевой последовательности в праймере 1 составляет 60 С, образец сначала амплифицируют в течение 15..20 циклов в режиме 94 С/45 С и 60 С/45 С, затем амплифицируют в течение 15...220 циклов в режиме 94 С/45 С и 50 С/45 С. Пониженная температура
Ф) гибридизации на втором зтапе ЦПР способствует генерированию удлиненньх продуктов ЦПР за счет ка увеличения вероятности неустойчивого связььивания праймера З с повторяющимися последовательностями.
Полученнье в результате удлиненнье продуктьї ЦПР будут менее предрасположень! к утечке через клеточную бо матрицу, что будет проявляться в лучшем сохранений сигнала при анализе ЦПР іп зйи.
Пример 14 РНК-компонент теломеразьі! приматов кроме человека
Для того, чтобьі продемонстрировать, что последовательности РНК-компонента теломеразь: других млекопитающих могут бьіть полученьі, используя праймерьї на основе последовательности РНК-компонента человека, использовали праймерь ЦПР последовательности человека с целью амплификации 65 последовательности РНК-компонента теломеразьі из геномной ДНК беличьей обезьянь), вида, которьй, как полагают, является одним из видов приматов, отличньїх от человека, и которьій является найболее зволюционно отличающимся от людей.
Геномную ДНК беличьей обезьяньь амплифицировали, как зто описано, с помощью праймеров ЕЗр (Б--СТААСССТААСТОАСАДОООСОТАС-3) и НЗя20 (8-СТСААООТСАТСОССААДОСТ-3). Исследовали полоску одноцепочечной ДНК, а затем ее клонировали в вектор рВішезстгірі! ЗК (Зігаїедепе, Зап Оіедо, СА). Полученнье в результате клоньї бьіли частично секвенировань, используя метод ЦПР с помощью обратного универсального праймера (5-ААСАОСТАТОАССАТО-3), праймера-210-3 (Ї-ТСАСОТСТОСТОССААТТТОС-3), или праймера
НЗя20. Бьіли полученьі следующие частичнье последовательности РНК-компонента теломеразь! беличьей обезьянь!: 70 5" СОСОСОСТТСССТСАОСТОТОСАССТОСАССАССАСТОСОСТ
САСАСАТССАСТТСОСТТТОСТОСТОСТОбСОССАСОСССАТССТО
СССАТСССТСАССССТСОССООСАСТОСОООСТТОТОААТСССТАА
АТСТОАСТОА.У и у ЛТТТТоАСАСАТСАТТААСТАТТТААТОААТАТТ ТАССТАСАА
САТСТААЛАССААААТТСААСТТОТОТТССІ ГТАОСТОСТСАТСОСТТ
ТАТССССААССТТАСАААТТТСТТСТТТОСААДААТТАСАССАТТОС
СОСАТСАТССТТІбА-3
При вьравниваний последовательности гена РНК-компонента теломеразьі человека бьла получено следующее вьіравнивание, при использований условия нумерации гена РНК -компонента теломеразь! человека (соединительнье черточки соответствуют разрьвам, введенньм для ооптимизации вніравнивания последовательностей) 1900 человека СССОССОСОСССАТТСССТСАССТАТОССАССТОСАСССАбОАСТОСОСТО с обезьяньї СССССОСТТСССТОСАССТСТ-ССССТОСАССАССАСТОСОСТС 5) 950 человека. АСАСАТОССАСТТССОСТТТОСТОТТОСТООССССААСОСССАТОСТОСОСА обезьяньї. АСАСАТССАСТТСОСТТТОСТОСТОСТ-ССССССАСССССАТССТОСССА ї- 2000 человека ТОСССТСАССССТСОССОССАСТОСОБОСТТСТОСААСССССАДАССТОАСТ (ав) обезьяньї ТОССТСАССССТОССССООСАСТОССООСТТСТОДАТСССТАААТСТОСАСТ «І 2050 - з человека САСТООССССАСТОТОСТОСАААТТООСАССАСАССТСААСССАССТОСАА « обезьянь: СА и « 2300 З человека / ТТТТГТТСАСАСАТСАТТТААСАТТТААТСААТАТТТААТТАСААСАТСТА - обезьянь ТТ ТОАСАСАТСАТТААСТАТТТААТСААТАТТТАССТАБААСАТСТА » " 2350 человека ААТСААСАТТОСАААТТОТОТТССТТТААТОСТСАТСОСТТТАТОССАСА ї5» обезьяньі / ААССААААТТ-СААСТТСТОТТОСТТТАСТОСТСАТСООСТТТАТОСССАА -І 2400 человека ССТТАСААСТТТСТТ ТТ ТОАААААТТАСАСС-ТТООССАТСА-ССТТСАОС щ» 20 обезьяньі. ССТТАСАААТТТСТТСТТТОСАААААТТАСАССАТТОСССАТСАТССТТСА о Вьішеизложеннье примерь описьшают различнье аспектьі изобретения и способь! изготовления
І определенньїх нуклеийновьїх кислот согласно изобретения. Примерь не предполагают исчерпьівающего описания многих различньїх вариантов изобретения, подпадающих под пункть! формуль! изобретения.

Claims (18)

  1. Формула винаходу Ф) ГІ 1. РНК - компонент теломеразьї млекопитающего, отличающийся тем, что он находится по существу в чистом виде и имеет последовательность
    60 б5 сосІИссобАсссАссооссоссОвосАсососОвоОвосСеЛлІЛЛЛЛЛІВОС ППААСССОААСОСАСААссоссоОдоссосссОсслливсиссссососос ОСІЛЛЛЛІСОСОСОСАСІЛЛІСАССССССССААААсосСсосоососовСсСсоссОЇ ПеССАСССТІСАЦОСОАСАССААЛАСААААААОСОСсАССсОвсОсоссСсоООС СССССууССССССАССИССОСССОСОСССОССССАССССССсСАдСсСсСсСсоСсС уссАссссосссссссссссоосОСиссССАСоСсАсссАсОвсосАссос 70 еле етететвівіоівісій о ев вісівіеісіеівіві ві вівіоісісісстето(еу сеісіетв ер сте! ПСАСССІЛЛІСАССССССАССААСАССААСсссАоссосАСОсссосососовс СССАТІСССОСАССИАОСССАССОССАСССАССАСОССССОСАСАСАОСС АСІПСССІЛЛІССОСТІССОССССССААСССССАОССОССССАОСССОСАС 75 СеСусссссссСАСОССССОСПОІСОСААСССССАААССИБАСОвАСсОооосС сАсОбоосО.
  2. 2. Олигонуклеотид по существу в чистом виде, отличающийся тем, что содержит последовательность, идентичную смежной последовательности РНК - компонента по п. 1, длина которой составляет от 10 до 500 нуклеотидов.
  3. З Олигонуклеотид по п. 2, отличающийся тем, что при связьшшваниий с РНК - компонентом теломеразь человека он ингибирует или блокирует активность теломеразь! человека.
  4. 4. Олигонуклеотид по существу в чистом виде, отличающийся тем, что содержит последовательность, полностью комплементарную смежной последовательности РНК-компонента по п. 1, длина которой составляет от 10 до 500 нуклеотидов. с 29
  5. 5. Олигонуклеотид по п. 4, отличающийся тем, что при связьваний с РНК-компонентом теломеразь Ге) человека он ингибирует или блокирует активность теломеразь! человека.
  6. 6. Рекомбинантная зкспрессирующая плазмида, отличающаяся тем, что она содержит олигонуклеотид по п. 2 и, кроме того, содержит промотор, находящийся в положений для управления транскрипцией РНК, идентичной по последовательности указанному олигонуклеотиду. т
  7. 7. Рекомбинантная зкспрессирующая плазмида, отличающаяся тем, что она содержит олигонуклеотидпо п. (с 4 и, кроме того, содержит промотор, находящийся в положений для управления транскрипцией РНК, комплементарной по последовательности указанному олигонуклеотиду. З
  8. 8. Рекомбинантная зкспрессирующая плазмида по п. б, отличающаяся тем, что содержащийся в ней ч- указанньій олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность «І « - с з т» -І т» о 50 і (Ф) ко бо б5
    САСОССАСТТТАТСТААСТОААТАСОАСТААААСТІТТААСАТСАТССТОТ САТТТАТАТСТААДААСТОСАСТАТАСТОСССАТТАТАААААТТСОСОоССС СССТОСССТОССТСАТАССТОТААТСССАССАСТІТОССАСоСССАдосо ССТОБАТСАСТТСАССССТООСОТІССАСАССАСССТОоБОСААСАТОоСТо АДАССССССТСТСТАСТААДАААСАСАААААСТАсСсТооосоТтооТоосАс СССССТОТААТСССАССТАСТСАССАСССТОАСАСАССАСААТСОСТТОА АССССССАССАСАССТТССАСТОДОССОАСАТСАСОССАСТАСАСТССАТ ССАСССТОСССОАДАСАССААСАСТССОТСТСААААААААДААТССТТАС ААТІТАТОСТОСАТТАСТССССТСТІТТТАССТСАТСААСАСАСАСсСАСТ АСТІТАААДССААДАСТСААТСАТТІСАААСОССТІТСТТІТССТААТАЛАдОо САСАТТСАСТОССТТААСАТТААТААТСОТАСТАСТТАСАСТТСАТТААдОосС САТССТСТССТСААССАСАСССТОСАСААСССАТТСТААССАСААсосссо САСОСТАССААСТСССАСССАТСССАСТСАССССАСАСААСАТТСТОоСТо ТАСТСАСТОСТОССТООСААТСТАТТТТСАСАААСТІСТОСАЛААААТСТ САТОАТСАААЛАСТАССААТТАСТОТІСТОТСОТСТТАСОСССТААААтТСтТТ ССТОТСААТТССАТІТТТААССТАСТССАССТоААСсСсоСсстТСсТооТСстТеС АСАСОАТАСААААДАСССССТСТСАТАССТСААСТТАСТТТСАССТТТАА АСААССТСОСААСТАААСАСССАААСССТІТСССОСАССТОСОСАдосссС сч ААССТОССТТССТСАТСОССОСАААТССААСТІТААтТтТтТсСсСсстТТссссссС о ААССАССССОСССОАСАСАСТСАСТСТСАССАСАСССОССАСАСТСАоСстТ ТОСССААДТССОТОоСОСТоСоСССсСсСОосСтТоссСтТТІТАТААссоссАстосссс СССАССССАССОоССТТССбСАСоСсАссстТососстоссАссостТостТосс їм зо САТТІТТТТСТСТААСССТААСТСАСААсоссстТАСссоссотТостТтТтТтТоС о ТОССССОСССССТОТІТТТСТОССТСАСТІТСАССССССССААААССсСстТоо « СССТОСССОССТТССАСССТТСАТТСТАСАССАДАСААААААТСТСАССстТо стоссоссттоосесстоессоосАоестососссосстТосстосссдосссс те ССААССССОССТОСАСОССОСССТОСССССССССтТІСТССоСдсссАссС - АСТоССАСССССААСАСсТтТоСсоСсТоТотТсАсссососотТостТотТсооосос САССОССАССТТСАСССТТТСАССССССАССААСАССААСССАССсСАСсТС « ССССОСОСОССССОАТТСССТОСАССТАТСССАССТОСАСССАССАСТССоС СТСАСАСАТОСАСТТСОоСТІТССТСТТСоСТоСССССААсосссдтсстТос не с ССАТСССТСАССССТОССССОСАСТОСоСССтТІСТСААСССССАААСсСстТо з» АСТОАСТОБОССАСТСОТОСТОСАААТТСССАССАСАССТоААСсСссдсстТС СААДАСТССОССААААТСААТОоСССАСТоАСсссссссттТосстТоСАСсСсССстТ ТеСтТосотТоСотТІСТССССТСТТССсосСТТІТІТСТТІСССТТТТАТОСТТСТ ве АТТАСААСТТАСТТССТОоСТСТОСАСАТТТТСТТоСАСссТТтТТТоСстТтСстТС - ССААДССТАСАТСТОССАССАСТСССТСААСССОССТСТОСССАСААСАСТСА їм ТІТТТТІТТТОСАСАСАТСАТІТААСАТТТААТСААТАТТТААТТАСААСАтТ о» СТААДАТОСАДСАТТОСАААТТСТСТТССТТТААТОСТСАТСсСстТтТтТАТОСС АСАССТТАСААСТТТСТІТІТТОСАААААТТАСАССТТССССАТСАССТТо Що АССАСТАССАТАТААСССССАСААоСтТТ-З и,
  9. 9. Зукариотная клетка-хозялин, отличающаяся тем, что она трансформирована с помощью рекомбинантной зкспрессирующей плазмидь! по п. б, кодирующей молекулу РНК, которая может связьваться с белковьми ГФ) компонентами теломеразьі млекопитающего с целью продуцирования активности теломеразь,, способной добавлять последовательности повторяющихся единиц нуклеотидов к теломерам. ді
  10. 10. Зукариотная клетка-хозяин, отличающаяся тем, что она трансформирована с помощью рекомбинантной зкспрессирующей плазмидь! по п. 7, кодирующей молекулу РНК, которая может связьваться с белковьми 60 компонентами теломеразьі млекопитающего с целью продуцирования активности теломеразь,, способной добавлять последовательности повторяющихся единиц нуклеотидов к теломерам.
  11. 11. Способ продуцирования рекомбинантного фермента теломеразьї, отличающийся тем, что указанньй способ включаєт трансформирование зукариотной клетки-хозяина, которая зкспрессирует белковье компоненть! теломеразьї с помощью рекомбинантного зкспрессирующего вектора, кодирующего РНК-компонент бо по п. 9, и культивирование указанньїх клеток-хозяев, трансформированньїх с помощью указанного вектора.
  12. 12. Способ продуцирования рекомбинантного фермента теломеразьї, отличающийся тем, что указанньй способ включаєт трансформирование зукариотной клетки-хозяина, которая зкспрессирует белковье компоненть! теломеразьї с помощью рекомбинантного зкспрессирующего вектора, кодирующего РНК-компонент
    ПОП. 10, и культивирование указанньїх клеток-хозяев, трансформированньїх с помощью указанного вектора.
  13. 13. Способ идентификации возможньїх агентов, модулирующих теломеразу, отгличающийся тем, что он включаєт проведение гетеродимеризации или анализа активности теломеразь, включающего: (1) полинуклеотид, являющийся полинуклеотидом, по существу идентичньм РНК-компоненту теломеразь человека, и способньій связьіваться с белком теломеразьій человека, (2) по существу очищенньій белок /о тепомеразь! человека й (3) агент; определение того, ингибирует ли указанньій агент гетеродимеризацию или теломеразную активность РНК теломеразьі человека и белка теломеразь! человека; идентификацию агентов, ингибирующих указанную гетеродимеризацию или активность теломеразь, в качестве возможньїх агентов, модулирующих теломеразу, которне ингибируют активность теломеразь.
  14. 14. Способ ингибирования активности теломеразь! в клетках человека, отличающийся тем, что он включает /5 перенос в клетки зкзогенного полинуклеотида, содержащего транскрипционную единицу, имеющую полинуклеотидную последовательность из по меньшей мере 25 последовательно расположенньїх нуклеотидов, которая по существу идентична последовательности РНК теломеразь! человека, оперебельно связанной с гетерологической транскрипционной регуляторной последовательностью, которая способствует транскрипции операбельно связанньїх полинуклеотидов в указанньх клетках.
  15. 15. Способ ингибирования активности теломеразь! в клетках человека, отличающийся тем, что он включает перенос в клетки зкзогенного полинуклеотида, содержащего транскрипционную единицу, имеющую полинуклеотидную последовательность из по меньшей мере 25 последовательно расположенньїх нуклеотидов, которая по существу комплементарна последовательности РНК теломеразь!ї человека, оперебельно связанной с гетерологической транскрипционной регуляторной последовательностью, которая способствует транскрипции с операбельно связанньїх полинуклеотидов в указанньх клетках.
  16. 16. Способ детектирования наличия неопластического состояния у пациента, отличающийся тем, что он о включаєт следующие операции: вьіделение клеточного образца, взятого у пациента; детектирование РНК-компонента теломеразьі человека в клеточном образце для определения диагностического значения; сравнение диагностического значения со стандартньм значением зкспрессиий ДНК-компонента теломеразь ї- зо человека в ненеопластических клетках того же типа, что и в клеточном образце; диагностику наличия неопластического состояния, при котором диагностическое значение значительно превьішает стандартное о значение, указьівая таким образом на наличие неопластического состояния. «Е
  17. 17. Способ определения наличия РНК-компонента теломеразьі млекопитающего в клетке или клеточном образце, отличающийся тем, что он вьібран из группьі: проведениег амплификации с помощью праймера - РНК-компонента теломеразь; проведение сгибридизации с помощью полинуклеотида РНК-компонента «Е теломеразь!.
  18. 18. Способ определения наличия РНК-компонента теломеразьі млекопитающего в клетке или клеточном образце, отличающийся тем, что он вьібран из группьі!: проведение амплификации с помощью комплементарной последовательности к праймеру РНкК-компонента теломеразь; проведение сгибридизации с помощью « полинуклеотида, комплементарного к полинуклеотиду РНК-компонента теломеразь!. в с з т» -І т» о 50 і (Ф) ко бо б5
UA97010079A 1994-07-07 1995-07-06 Рнк-компонент теломерази ссавця, олігонуклеотид (варіанти), рекомбінантна експресуюча плазміда (варіанти), еукаріотична клітина-хазяїн, трансформована за допомогою рекомбінантної експресуючої плазміди (варіанти), спосіб продукування рекомбінантного ферменту теломерази (варіанти), спосіб ідентифікації можливих агентів, що модулюють теломеразу, спосіб гальмування активності теломерази в клітинах людини (варіанти), спосіб визначення наявності неопластичного стану у пацієнта, спосіб визначення наявності рнк-компонента теломерази ссавця в клітині або клітинному зразку (варіанти) UA47407C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27210294A 1994-07-07 1994-07-07
US08/330,123 US5583016A (en) 1994-07-07 1994-10-27 Mammalian telomerase
US08/472,802 US5958680A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Mammalian telomerase
US08/482,115 US5776679A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Assays for the DNA component of human telomerase
PCT/US1995/008530 WO1996001835A1 (en) 1994-07-07 1995-07-06 Mammalian telomerase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA47407C2 true UA47407C2 (uk) 2002-07-15

Family

ID=27501040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA97010079A UA47407C2 (uk) 1994-07-07 1995-07-06 Рнк-компонент теломерази ссавця, олігонуклеотид (варіанти), рекомбінантна експресуюча плазміда (варіанти), еукаріотична клітина-хазяїн, трансформована за допомогою рекомбінантної експресуючої плазміди (варіанти), спосіб продукування рекомбінантного ферменту теломерази (варіанти), спосіб ідентифікації можливих агентів, що модулюють теломеразу, спосіб гальмування активності теломерази в клітинах людини (варіанти), спосіб визначення наявності неопластичного стану у пацієнта, спосіб визначення наявності рнк-компонента теломерази ссавця в клітині або клітинному зразку (варіанти)

Country Status (23)

Country Link
EP (2) EP1293565A3 (uk)
JP (2) JPH10505488A (uk)
KR (1) KR100789741B1 (uk)
CN (1) CN1231491C (uk)
AT (1) ATE308554T1 (uk)
AU (1) AU696702B2 (uk)
BG (1) BG63573B1 (uk)
BR (1) BR9508254A (uk)
CA (1) CA2194393C (uk)
CZ (1) CZ3497A3 (uk)
DE (1) DE69534568T2 (uk)
DK (1) DK0778842T3 (uk)
ES (1) ES2251720T3 (uk)
FI (1) FI970026A (uk)
HK (1) HK1011691A1 (uk)
HU (1) HUT78054A (uk)
IS (1) IS4408A (uk)
NO (1) NO970041L (uk)
NZ (1) NZ289720A (uk)
PL (1) PL181019B1 (uk)
RO (1) RO117328B1 (uk)
UA (1) UA47407C2 (uk)
WO (1) WO1996001835A1 (uk)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA009442B1 (ru) * 2003-06-23 2007-12-28 Герон Корпорейшн Композиции и способы увеличения активности теломеразы

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067497B2 (en) 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5972605A (en) * 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US5858777A (en) 1995-09-08 1999-01-12 Geron Corporation Methods and reagents for regulating telomere length and telomerase activity
JP2000512126A (ja) * 1995-11-16 2000-09-19 ダーム、ミヒャエル・ヴェー 体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法およびかかる方法に適合した試験キット
AU2593697A (en) * 1996-03-28 1997-10-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Transgenic organisms with altered telomerase activity
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
JPH1052300A (ja) * 1996-06-03 1998-02-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 細胞内テロメラーゼ活性の測定法
JPH1028600A (ja) * 1996-07-17 1998-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd テロメラーゼ活性の測定法
ATE552341T1 (de) 1996-10-01 2012-04-15 Geron Corp Katalytische untereinheit der menschlichen telomerase
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US7390891B1 (en) 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
US5919656A (en) 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
US5846723A (en) * 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
WO1998028442A1 (en) * 1996-12-20 1998-07-02 Geron Corporation Methods for detecting and inhibiting the rna component of telomerase
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
ATE250130T1 (de) * 1997-04-04 2003-10-15 Geron Corp Gereinigte telomerase
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
AU745420B2 (en) * 1997-06-20 2002-03-21 Bayer Aktiengesellschaft Human catalytic telomerase sub-unit and its diagnostic and therapeutic use
EP1571215A3 (en) * 1997-07-01 2007-10-31 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
EP0917579A1 (en) * 1997-07-01 1999-05-26 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
DE19757300A1 (de) * 1997-12-22 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer Urinprobe
GB9801902D0 (en) * 1998-01-29 1998-03-25 Cancer Res Campaign Tech A gene promoter
DE19804372A1 (de) 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
US6358739B1 (en) * 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
US6995145B1 (en) 1999-06-04 2006-02-07 Au Jessie L-S Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
WO2000074667A2 (en) * 1999-06-04 2000-12-14 Au Jessie L S Compositions active in telomere damage comprising a taxane and telomerase inhibitor
DK1210357T3 (da) 1999-09-10 2008-07-21 Geron Corp Oligonukleotid-N3' -P5' -thiophosphoramidater: syntese og anvendelse deraf
WO2001036971A1 (fr) * 1999-11-16 2001-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Methode de recherche de substance d'inhibition de liaison entre des sous-unites de telomerase
DK3342425T3 (da) 2003-09-09 2020-03-16 Geron Corp Modificerede oligonukleotider til inhibering af telomerase
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
WO2008094640A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
US9447467B2 (en) 2009-04-21 2016-09-20 Genetic Technologies Limited Methods for obtaining fetal genetic material
JP6021018B2 (ja) * 2011-05-30 2016-11-02 国立大学法人豊橋技術科学大学 改良されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
US20150125438A1 (en) * 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
SG11201601890UA (en) * 2013-09-13 2016-04-28 Hoffmann La Roche Application of oligo-dt molecules to avoid generation of high molecular pcr products induced by polya-carrier
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
KR101628890B1 (ko) * 2015-09-03 2016-06-09 주식회사 학표벽지 엠보싱 벽지 제조 장치

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4312686A (en) * 1980-02-11 1982-01-26 American Biltrite Inc. Printed and embossed floor covering and method and apparatus for its manufacture
JPH02179729A (ja) * 1988-12-30 1990-07-12 Shinetsu Kogyo Kk ゲートル巻きするラッピングフィルムの製造法
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
EP0666313A3 (en) * 1994-01-27 1996-03-06 Univ Iowa State Res Found Inc Targeting telomerase in gene therapy for cancer.
US5876979A (en) * 1994-07-07 1999-03-02 Cold Spring Harbor Laboratory RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
JPH08294966A (ja) * 1995-04-26 1996-11-12 Nippon Shokubai Co Ltd 樹脂成形品の連続成形方法
JPH10119130A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Steel Works Ltd:The 連続発泡体の製造方法及び装置
KR100815605B1 (ko) * 2002-02-18 2008-03-20 바프렉스 주식회사 공압출 다층필름의 제조방법 및 장치

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA009442B1 (ru) * 2003-06-23 2007-12-28 Герон Корпорейшн Композиции и способы увеличения активности теломеразы

Also Published As

Publication number Publication date
KR100789741B1 (ko) 2008-01-02
DE69534568T2 (de) 2006-07-27
NO970041L (no) 1997-03-06
RO117328B1 (ro) 2002-01-30
IS4408A (is) 1997-01-03
JP2002272489A (ja) 2002-09-24
DK0778842T3 (da) 2006-03-20
EP0778842A4 (en) 1999-08-11
HUT78054A (hu) 1999-07-28
EP1293565A2 (en) 2003-03-19
BR9508254A (pt) 1997-12-23
KR20050058527A (ko) 2005-06-17
PL181019B1 (pl) 2001-05-31
ATE308554T1 (de) 2005-11-15
CZ3497A3 (en) 1997-10-15
EP1293565A3 (en) 2004-05-12
CN1158617A (zh) 1997-09-03
WO1996001835A1 (en) 1996-01-25
BG101103A (en) 1997-10-31
FI970026A (fi) 1997-03-03
NZ289720A (en) 1999-03-29
JP4068861B2 (ja) 2008-03-26
HK1011691A1 (en) 1999-07-16
CN1231491C (zh) 2005-12-14
AU2964795A (en) 1996-02-09
JPH10505488A (ja) 1998-06-02
NO970041D0 (no) 1997-01-06
AU696702B2 (en) 1998-09-17
FI970026A0 (fi) 1997-01-03
CA2194393A1 (en) 1996-01-25
EP0778842B1 (en) 2005-11-02
DE69534568D1 (de) 2005-12-08
BG63573B1 (bg) 2002-05-31
PL318169A1 (en) 1997-05-26
EP0778842A1 (en) 1997-06-18
ES2251720T3 (es) 2006-05-01
CA2194393C (en) 2002-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA47407C2 (uk) Рнк-компонент теломерази ссавця, олігонуклеотид (варіанти), рекомбінантна експресуюча плазміда (варіанти), еукаріотична клітина-хазяїн, трансформована за допомогою рекомбінантної експресуючої плазміди (варіанти), спосіб продукування рекомбінантного ферменту теломерази (варіанти), спосіб ідентифікації можливих агентів, що модулюють теломеразу, спосіб гальмування активності теломерази в клітинах людини (варіанти), спосіб визначення наявності неопластичного стану у пацієнта, спосіб визначення наявності рнк-компонента теломерази ссавця в клітині або клітинному зразку (варіанти)
CN104968784B (zh) 包含向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的组合物及其用途
US7732402B2 (en) Mammalian telomerase
Tran et al. Chromosomal localization, gene structure, and expression pattern of DDAH1: comparison with DDAH2 and implications for evolutionary origins
WO1998011207A2 (en) Assays for regulators of mammalian telomerase expression
Ordway et al. Cysteine 64 of Ref-1 is not essential for redox regulation of AP-1 DNA binding
JPH10507067A (ja) テロメラーゼのｒｎａ成分
CN114206108B (zh) 包括人源化凝血因子12基因座的非人动物
US5776679A (en) Assays for the DNA component of human telomerase
KR20200024772A (ko) B4galt1 변이체 및 이의 용도
US7208583B2 (en) Antibodies immunologically specific for a DNA repair endonuclease and methods of use thereof
EP0909317B1 (en) Compositions for modulating the length of telomeres
KR101842014B1 (ko) Cpf1 유전자가위를 이용한 유전자 결손 동물모델 및 이의 제조방법
Yevtodiyenko et al. A 178-kb BAC transgene imprints the mouse Gtl2 gene and localizes tissue-specific regulatory elements
KR100566766B1 (ko) 포유류텔로머라제
Shore et al. Tutorial: Molecular Biology for the Clinician Part II. Tools of Molecular Biology.
AU714540B2 (en) Mammalian telomerase
JP2024518413A (ja) 修飾ヌクレアーゼ
O'Hare Analysis of telomere length regulation in the chicken
Bradshaw et al. DNA Double-Strand Breaks Relieve