JP6021018B2 - 改良されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
テロメラーゼはRNA成分を含むリボ核タンパク質複合体であり、テロメア配列の鋳型となるRNAと逆転写酵素、その他の制御サブユニットから構成される複合体である。RNA構成要素はTERC(Telomere RNA Component)、逆転写酵素はTERT(Telomere Reverse Transcriptase)と呼ばれる。ヒトのテロメラーゼは、TERT、TERC、ジスケリン、TEP1などのサブユニットによって構成されており、それらは異なる染色体上の遺伝子座にコードされている。TERT翻訳産物は、非翻訳RNAであるTERCと一緒に折りたたまれる。TERTは一本鎖テロメア反復配列を付加できるように染色体の周囲を覆う二股の構造をとる。TERTとテロメアの鋳型を含むTERCは隣接している。ヒトTERCの塩基配列は既知でありNIBC Reference Sequence:NR_001566.1として開示されている(配列番号1)。
テロメラーゼの活性を阻害する方法として、特許文献1にはテロメラーゼを阻害するための改変オリゴヌクレオチドが開示されている。特許文献1に開示された化合物は脂質部分とオリゴヌクレオチド部分を含み、該オリゴヌクレオチド部分はヒトテロメーゼRNA成分の特定の領域内の配列に相補的であるために、該化合物は細胞内でテロメラーゼを阻害することができる。
一般的に天然型ヌクレオチドによって合成されたRNA分子は、ヌクレアーゼであるRNA分解酵素による分解を受けてしまう。そのために、RNA分子を医療へ応用するには、該RNA分子がRNA分解酵素による分解を受けることを回避することが要求される。RNA分解酵素による分解を回避する一般的な方法として、RNA分解酵素による分解を受けない人工核酸を代替利用すること、あるいはRNA分子の末端に化学修飾を施すことが行われている。更には特許文献1に関連して述べたように、RNAの末端にリンカーを介して脂質を結合した化合物が提案されている。
一方、特許文献3に記載されているように、RNA分子を医療へ応用するアプローチの1つとしてリボザイムを用いる試みが行われている。リボザイムとはタンパク質同様に触媒能力を有するRNA分子の総称である。ハンマーヘッド型リボザイムは、その二次構造が金槌型をしていることから命名されたリボザイムの一種である。該ハンマーヘッド型リボザイムは、NUX(N=A、C、G又はUであり、X=A、C、又はUの何れかである。)配列を持つあらゆるRNA配列を認識し、該NUX配列のXの3’側のホスホジエステル結合を切断することが知られている。
下記、一般式1
に示される塩基配列、あるいはこの配列中において1から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするRNA分子。
下記、一般式2
で示されるハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有することを特徴とする態様1に記載のRNA分子。
ヒトテロメラーゼRNAの鋳型領域にハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする態様1または態様2に記載のRNA分子。
下記、一般式3
に示される塩基配列、あるいはこの配列中において1から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様1から3のいずれか1に記載のRNA分子。
下記、一般式4
に示される塩基配列、あるいはこの配列中において1から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様1から4のいずれかの1に記載のRNA分子。
5’側末端の配列がGG、G、AまたはGGGであることを特徴とする態様1から5のいずれか1に記載のRNA分子。
一般式1の塩基配列のうち39以上の塩基を備える直鎖状のRNA分子であることを特徴とする態様1から6のいずれか1に記載のRNA分子。
ヌクレオチドの糖部位の少なくとも一部がハロゲンあるいはアルコキシ基により置換されている、リン酸骨格構造の少なくとも一部が、蛍光物質、ポリエチレングリコール、ビオチン、チオール基のいずれかにて修飾されている、またはいずれかの原子が放射標識されていることを特徴とする態様1から7のいずれか1に記載のRNA分子。
下記、一般式5
に示される塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とする態様1から8のいずれか1に記載のRNA分子。
下記、式6
下記、式7
下記、式8
態様1から11のいずれか1に記載のRNAの塩基配列と同一のまたは相補的な塩基配列を有するDNA配列を含むことを特徴とするDNA分子。
[態様13]
態様2記載のRNA分子を有効成分として含むことを特徴とする癌治療用の医薬組成物。
[態様14]
態様3記載のRNA分子を含むことを特徴とする癌細胞に特異性を有するドラッグデリバリーの補助剤。
[態様15]
態様3記載のRNA分子を含むことを特徴とする癌細胞の検出剤。
既に述べたように本発明は、下記の一般式9(配列番号2)に示される塩基配列、あるいはこの配列中において1から複数個の塩基の変異を有する塩基配列を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするRNA分子である。ヌクレアーゼ耐性能を有する本発明のRNA分子は、該RNAの2分子以上が凝集した構造を有することができるが、本発明のRNA分子はそのような構造を有するものに限定されるものではない。
ハンマーヘッドリボザイムは既に述べたようにハンマーヘッド型のリボザイムであって、そのリボザイム活性により特定のRNA配列を切断する活性を有する。ハンマーヘッドリボザイムは下記の一般式10(配列番号3)で示される共通配列を含むことが知られており、本発明のRNA分子は、その様なハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有することが好ましい。
本発明のRNA分子は、ヒトテロメラーゼのRNA鋳型領域にハイブリダイズする塩基配列を有することが好ましい。ヒトおよびマウスからのテロメラーゼのRNA成分は、単離され、そして配列決定されている(例えば、Fengら、Science 269:1236−41(1995);米国特許第5,583,016号;およびBlascoら、Scince 69:1267−1270(1995)参照)。ヒトテロメラーゼのRNA鋳型領域をコードするヒトゲノムDNAは、クローン化され、配列決定され、そして寄託されている。具体的には「28−1」と称されるλクローンは、ヒトテロメラーゼのRNA鋳型領域の遺伝子配列を含有する約15kbの挿入物を含んでいる。当該クローンは、ブダペスト条約に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、そして受託番号ATCC75925号を与えられている。図1はヒトテロメラーゼの塩基配列を示した図である。図1に示されるようにヒトTERCではヒトテロメラーゼのRNA鋳型領域の配列は3’−UCCCAAUC−5’(配列番号10)であり、これを元にTERTはテロメアの3’側へ塩基を付加する。
本発明は、上記した本発明のRNA分子におけるRNA配列と同一のまたは相補的な塩基配列を有するDNA配列を含むDNA分子も含む。なおここで「相補的」とは、2つのポリヌクレオチドの間の適合性をいい、第1のポリヌクレオチド中の塩基配列が第2のポリヌクレオチド中の塩基配列の結合パートナーである場合には、第1のポリヌクレオチドは第2のポリヌクレオチドに対して相補的である。ここでいう結合パートナーとは具体例には、アデニン(A)とウラシル(U)(あるいはチミン(T))、グアニン(G)とシトシン(C)の組み合わせである。またここで「同一の塩基配列」とは、RNA分子の塩基であるウラシルとDNAの塩基であるチミンの差を包含するものである。
本発明のRNA分子は、置換又は分子修飾されていてもよく、例えば本発明のRNA分子のヌクレオチドの糖部位の少なくとも一部がハロゲンあるいはアルコキシ基により置換されているもの、本発明のRNA分子のリン酸骨格構造の少なくとも一部が、蛍光物質、ポリエチレングリコールのいずれかにて修飾されているもの、または本発明のRNA分子を構成するいずれかの原子が放射標識されているものでもよい。本発明において糖部位が置換されている態様の例として、ヌクレオチドの糖部位(リボース等)の2’位の水酸基(−OH)が、フッ素(この場合2’−deoxy−2−fluoro)や−OCH3等に置換されているものを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。また本発明において該RNA分子の5’末端リン酸基、あるいは3’末端のリボース3’部位を修飾するのに使用可能な蛍光物質の例としてはフルオレセイン、テキサスレッド、FITCなどを挙げることができ、ポリエチレングリコールの例としては5万程度の分子量を有するものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。本発明のRNA分子を放射標識する例として、α位、あるいはγ位のリン酸部分が32PラベルされたATP、UTP、CTPもしくはGTPの何れか、もしくはそれらの複数の組み合わせを用いた試験管内転写合成法あるいはキナーゼを用いた5’末端標識による該RNA分子への放射標識などを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
本発明のRNA分子に癌細胞に特異的に認識する化合物あるいは核酸配列やペプチドを付加することや担持させることにより、標的となる癌細胞に医薬を送達することができる。例えば本発明のRNA分子において、前立腺癌細胞を特異的に認識するRNAアプタマー配列を本発明のRNA分子の5’側あるいは3’側、あるいは2分子の本発明のRNA分子の間に配したものを、そのようなドラッグデリバリー補助剤として利用することができる。ドラッグデリバリー補助剤として利用した場合、ヌクレアーゼに対する耐性を備えているので、例えば、静脈投与や患部への注入によって医薬を安定に生体内に導入できる。ドラッグデリバリーの際には、カチオン性脂質、ポリ乳酸担持金コロイドなどのドラッグデリバリー物質との共役的な使用法も含まれる。さらに、蛍光物質で修飾された本発明のRNA分子または放射標識された本発明のRNA分子を用いれば、他の癌細胞標的試薬との共同的な使用により癌細胞の検出剤として使用もできる。
更に本発明は、上記において述べた本発明のRNA分子において配列番号3に示すハンマーヘッドリボザイムの共通配列を有するものを、有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発明のRNA分子が、ヒトテロメラーゼにハイブリダイズする塩基配列を備えて設計されたものであれば、ハンマーヘッドリボザイム活性によりテロメラーゼを切断分解することが可能である。また、本発明のRNA分子はRNA分解酵素耐性を備えているので、細胞内においても触媒として有効に作用する。このために本発明は天然型のRNA分子を有効成分として含む医薬組成物を提供することができる。従って、そのようなRNA分子を有効成分として含有する本発明の医薬組成物を、ヒトテロメラーゼの活性によって異常増殖が生じている細胞、例えば癌細胞に対し投与すれば、癌細胞の異常増殖を抑制することができる。
<実施例2>
<実施例5>
<比較例1>
Claims (4)
- 下記、式6
下記、式7
常温常圧下25%ヒト血清水溶液中において30分浸漬した場合に分解が10%以下であるヌクレアーゼ耐性能を有することを特徴とするRNA分子。 - ヌクレオチドの糖部位の少なくとも一部がハロゲンあるいはアルコキシ基により置換されている、リン酸骨格構造の少なくとも一部が、蛍光物質、ポリエチレングリコールのいずれかにて修飾されている、またはいずれかの原子が放射標識されていることを特徴とする請求項1に記載のRNA分子。
- 請求項1に記載のRNA分子を含むことを特徴とする癌細胞に特異性を有するドラッグデリバリーの補助剤。
- 請求項1に記載のRNA分子を含むことを特徴とする癌細胞の検出剤。
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