JP2023534557A - Ｒｎａ結合タンパク質部位を標的とするオリゴヌクレオチド - Google Patents

Ｒｎａ結合タンパク質部位を標的とするオリゴヌクレオチド Download PDF

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Abstract

本発明は、ＴＤＰ－４３枯渇細胞における複数の独立したｍＲＮＡのプロセシングにおいてＲＮＡ結合タンパク質機能を回復することができるプレｍＲＮＡ転写物上の保存されたＴＤＰ－４３結合部位に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

Description

本発明は、複数のＲＮＡ転写物上のＴＤＰ－４３結合部位などの複数のＲＮＡ上のＲＮＡ結合タンパク質標的部位に相補的、例えば完全に相補的であり、ＲＮＡ結合タンパク質が機能的に枯渇している症状及び医学的適応症での使用などのために、複数のＲＮＡ転写物に対してＲＮＡ結合タンパク質機能を回復することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）は、ＲＮＡ関連代謝に関与する汎用性のあるＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＤＰ－４３沈着物の調節不全は、運動ニューロン疾患：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を有する患者の脳及び脊髄における封入体として作用する（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１９）。
ＴＤＰ－４３は主に核に局在するが、その機能の一部のために細胞質にもシャトルする（Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＡＬＳ及びＦＴＬＤなどの疾患では、細胞質封入体形成をもたらす細胞質ＴＤＰ－４３濃度の増加がある（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｗｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ）。細胞質の誤局在化は、核枯渇に関連し得、ＴＤＰ－４３機能の低下又は喪失をもたらし得る。ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡの異常なスプライシングをもたらし、広範なスプライシング異常をもたらすＴＤＰ－４３突然変異が存在する（例えば、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３ １１０ Ｅ７３６－７４５及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，Ｅ１１２１－Ｅ１１２９を参照のこと）。
Ｋｌｉｍらは、ＴＤＰ－４３機能低下時のＳＴＭＮ２喪失がＳＴＭＮ２スプライシングの変化に起因することを報告しており、ＡＬＳのための治療戦略としてＳＴＭＮ２を回復させることを示唆している。
ＴＤＰ－４３枯渇は、ＴＤＰ－４３病理と呼ばれる様々な疾患で示され、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、海馬硬化性認知症、ダウン症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、例えば脊髄小脳失調症３、ミオパシー及び慢性外傷性脳症などの疾患を含む。
Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０，４５２－４５８は、健康な脳組織及びＦＴＬＤ患者由来の脳組織におけるＲＮＡ標的の特徴付け及びＴＤＰ－４３の位置依存的スプライシング調節について報告している。ほとんどのＴＤＰ－４３結合部位は、イントロン、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及び遺伝子間転写物にマッピングされ、ＵＧリッチモチーフが濃縮されていた。ＴＤＰ－４３中の保存されたＲＮＰセグメントは、ＴＡＲ ＤＮＡ配列及びＵＧリピートを有するＲＮＡ配列への結合に関与する（Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５；３４８：５７５－５８８）。ＴＤＰ病理などの細胞におけるＴＤＰ－４３枯渇は、ＴＤＰ－４３ ＲＮＡ標的へのＴＤＰ－４３のＲＮＡ結合の喪失と相関している。
ヒトＲＮＡ中のＴＤＰ－４３結合部位は、ＲＮＡ結合タンパク質及び関連するモチーフのデータベースからオンラインで入手可能である（ｈｔｔｐｓ：／／ａｔｔｒａｃｔ．ｃｎｉｃ．ｅｓ／ｒｅｓｕｌｔｓ／ｅ９ｆ２９３８０－８９２１－４０６ｅ－８４ａ８－２７ｃｅ９ｂ９３９８ｂ４＃を参照）。開示される特定の特徴付けられたヒトＲＮＡ ＴＤＰ－４３結合部位には、以下のＲＮＡ配列が含まれる。ＧＵＧＡＡＵＧＡ、ＧＵＵＧＵＧＣ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号２０）、ＧＡＡＵＧＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＡＡＵＧＡ、ＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＵＧＵＵＣ、及びＧＵＵＵＵＧＣ。
Ｍｅｌａｍｅｄ ｅｔ ａｌは、ＴＤＰ－４３神経変性の特徴としてＳＴＭＮ２の早期ポリアデニル化媒介性喪失について報告している。国際公開第２０１９／２４１６４８号は、ＳＴＭＮ２発現を増加させるための２’Ｏ－メトキシエチルＡＳＯを開示している。
本発明者らは、ＴＤＰ－４３核酸結合部位に相補的、例えば完全に相補的であり、ＴＤＰ－４３ ＲＮＡ転写物標的のプロセシング又は調節、例えば、ＴＤＰ－４３機能喪失を示す細胞において調節不全であるＲＮＡ転写物の発現及びスプライシングを回復させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定し、それにより、ＴＤＰ－４３枯渇細胞（すなわち、ＴＤＰ－４３機能が喪失した細胞）におけるＴＤＰ－４３機能性を回復させるための新規なアプローチ、並びにＴＤＰ－４３病理を処置するための新規な治療アプローチを提供する。
本発明の目的
本発明は、ＴＤＰ－４３枯渇細胞における複数の独立したｍＲＮＡのプロセシングにおいてＲＮＡ結合タンパク質機能を回復することができるプレｍＲＮＡ転写物上の保存されたＴＤＰ－４３結合部位に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本発明は、低下したレベルの機能性ＴＤＰ－４３を有する細胞において、ＲＮＡ結合タンパク質の機能性、例えばＴＤＰ－４３機能性又はＴＤＰ－４３様機能性を回復させるためのオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、ＲＮＡプロセシング又は１つ若しくは複数のＴＤＰ－４３標的ＲＮＡの発現においてＴＤＰ－４３の核機能を回復させ、それによってＴＤＰ－４３標的ＲＮＡの機能的表現型を少なくとも部分的に回復させるか又は増強することができるオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチド化合物は、本明細書では、ＲＮＡ結合タンパク質模倣物、例えばＴＤＰ－４３模倣物と呼ばれる。
本発明は、ＴＤＰ－４３結合部位に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＴＤＰ－４３病理の処置などの治療におけるそれらの使用を提供する。
本発明はさらに、複数のＲＮＡ転写物、すなわち異なる遺伝子座から転写されるＲＮＡ転写物上のＴＤＰ－４３結合部位に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。複数のＲＮＡ転写物は、例えば、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群から独立して選択され得る。
本発明は、８～４０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（５’－３’）（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３７）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号３８）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３５）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号３９）、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４０）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４１）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４２）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４３）、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される配列に相補的、例えば完全に相補的な、少なくとも８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３が枯渇した細胞、例えば異常なＴＤＰ－４３タンパク質を発現している細胞において、１つ又は複数のＴＤＰ－４３標的ＲＮＡの機能的表現型を回復させることができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド；又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。
連続ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の修飾ヌクレオシドを含み得る。
背景技術のセクションで説明したように、機能性ＴＤＰ－４３は、主に核局在化タンパク質であり、細胞質に存在し得る。しかしながら、細胞質封入体と呼ばれる細胞質におけるＴＤＰ－４３の凝集（異常なＴＤＰ－４３とも呼ばれる）は、非機能的なＴＤＰ－４３と関連しており、これは、例えば多数のプレｍＲＮＡのプロセッシングにおける核ＴＤＰ－４３の機能性の喪失と関連している。したがって、細胞質封入体においてＴＤＰ－４３を発現する細胞は、ＴＤＰ－４３が枯渇していると見なされるべきである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又は精製されたオリゴヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、製造された（人工の）アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
機能的表現型は、例えば、機能的ＴＤＰ－４３（すなわち、非異常ＴＤＰ－４３、典型的には核ＴＤＰ－４３）によって調節されるか又はそれに依存するＲＮＡプロセシング事象、及び／又はその忠実度が機能的ＴＤＰ－４３に依存するＲＮＡプロセシング事象であり得る。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によるＴＤＰ－４３の機能性の増強は、例えば本明細書中に例示されるように、ＳＴＭＮ２、ＡＲＨＧＡＰ３２、ＳＬＣ５Ａ７、ＣＥＲＴ１、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＫＡＬＲＮ及びＵＮＣ１３Ａ ＲＮＡプロセシングを参照して、機能性ＴＤＰ－４３によって調節されるか又はそれに依存するＲＮＡプロセシング事象の忠実度を評価することによって評価され得る。
本発明は、医薬における使用のための、８～４０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（５’－３’）（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３７）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号３８）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３５）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号３９）、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４０）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４２）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４３）、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％相補性、例えば少なくとも９０％相補性又は１００％相補性を有する少なくとも８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。
連続ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の修飾ヌクレオシドを含み得る。
本発明は、ＴＤＰ－４３病理を特徴とする疾患の処置における使用のための、８～４０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（５’－３’）（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３７）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号３８）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３５）、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号３９）、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４０）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４２）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４３）、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％相補性、例えば少なくとも９０％相補性又は１００％相補性を有する少なくとも８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。
連続ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の修飾ヌクレオシドを含み得る。
有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３５）、又はＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４２）、又はＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号３９）、又はＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４３）に相補的な、例えば完全に相補的な、少なくとも１２個又は少なくとも１３個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４６）、又はＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４７）に相補的な、例えば完全に相補的な、少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列（ＵＧ）ｎ又は（ＧＵ）ｎ［式中ｎは整数６～２０、例えば７～９である］に相補的である、例えば完全に相補的な、少なくとも１８個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４８）、又はＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４９）に相補的な、例えば完全に相補的な、少なくとも１８個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列ＣＡＣＡＣＡＣＡ又はＡＣＡＣＡＣＡＣを含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ（配列番号１４）又はＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号５）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号１５）又はＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ（配列番号６）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ（配列番号１６）又はＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号７）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２４）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２５）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２６）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２７）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２８）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号２９）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号３０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号３１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号３２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号３３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号３４）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５４）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５５）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５６）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５７）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５８）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号５９）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６４）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６５）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６６）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６７）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６８）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号６９）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７４）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７５）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７６）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７７）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７８）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号７９）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８４）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８５）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８６）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８７）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８８）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号８９）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９４）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９５）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９６）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９７）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９８）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号９９）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号１００）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号１０１）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号１０２）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列（配列番号１０３）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、（ＣＡ）ｎ又は（ＡＣ）ｎを含み、式中ｎは整数６～２０、例えば７～９である。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される配列、又は配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される配列、又は配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列からなる。
本発明は、化合物ＩＤ番号１～１８からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩を提供する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、化合物ＩＤ番号１～１８からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその薬学的に許容され得る塩であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２又は少なくとも１３ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１３個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１４個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１６個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１７個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１８個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１９個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２１個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２２個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２３個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２４個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２５個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２６個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２７個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２８個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２９個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３０個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３１個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３２個の連続ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約－１０ΔＧ未満、例えば約－１５ΔＧ未満、例えば約－１７ΔＧ未満の、相補的標的ＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのギブス自由エネルギーを有する。有利には、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１２、例えば少なくとも１３ヌクレオチド長である。
好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾ヌクレオシドを含み得る。
好都合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシドを含み得る。連続ヌクレオチド配列内のＬＮＡヌクレオチドがさらに有利である。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシド及び非ＬＮＡヌクレオシド、例えばＤＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド又はその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドから独立して選択される。有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内に存在する連続するＤＮＡヌクレオシドの長さは、標的ＲＮＡ分解をもたらすＲＮａｓｅＨ動員を防ぐように制限される。適切には、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、４つを超える連続するＤＮＡヌクレオシドを含まず、より有利には、３つを超える連続するＤＮＡヌクレオシドを含まない。
使用される場合、有利には、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つ以上のＴＤＰ－４３標的プレｍＲＮＡ（標的ＲＮＡ）のスプライシングを調節することができる。例として、２つ以上のＴＤＰ－４３標的ＲＮＡは、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡ、ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡ、ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡ、ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡ、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡからなる群から独立して選択され得る。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つ以上のＴＤＰ－４３標的プレｍＲＮＡ（標的ＲＮＡ）のスプライシングを調節することができる。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３つ以上のＴＤＰ－４３標的プレｍＲＮＡ（標的ＲＮＡ）のスプライシングを調節することができる。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４つ以上のＴＤＰ－４３標的プレｍＲＮＡ（標的ＲＮＡ）のスプライシングを調節することができる。
いくつかの実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のＴＤＰ－４３標的プレｍＲＮＡ（標的ＲＮＡ）のスプライシングを調節することができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合、ＳＴＭＮ２（野生型）の発現を増強することができ、さらに、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡ、ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡ、ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡ、ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡ、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つ、例えば２つ以上のプレｍＲＮＡのプレｍＲＮＡスプライシングの忠実度を増強することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の選択されたプレｍＲＮＡは、ＳＴＭＮ２及びＡＲＨＧＡＰ３２；ＳＴＭＮ２及びＳＬＣ５Ａ７；ＳＴＭＮ２及びＣＥＲＴ１；ＡＲＨＧＡＰ３２及びＳＬＣ５Ａ７；ＡＲＨＧＡＰ３２及びＣＥＲＴ１；並びにＳＬＣ５Ａ７及びＣＥＲＴ１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡ、ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡ、ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡ、ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡ、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡからなる群から選択される２つ以上のプレｍＲＮＡのプレｍＲＮＡスプライシングの忠実度を増強することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の選択されたプレｍＲＮＡは、ＳＴＭＮ２及びＡＲＨＧＡＰ３２；ＳＴＭＮ２及びＳＬＣ５Ａ７；ＳＴＭＮ２及びＣＥＲＴ１；ＡＲＨＧＡＰ３２及びＳＬＣ５Ａ７；ＡＲＨＧＡＰ３２及びＣＥＲＴ１；並びにＳＬＣ５Ａ７及びＣＥＲＴ１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡ、ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡ、ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡ、ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡ、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡからなる群から選択される３つ以上のプレｍＲＮＡのプレｍＲＮＡスプライシングの忠実度を増強することができる。
いくつかの実施形態では、２つ以上の選択されたプレｍＲＮＡは、ＳＴＭＮ２及びＡＲＨＧＡＰ３２；ＳＴＭＮ２及びＳＬＣ５Ａ７；並びにＳＴＭＮ２及びＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡ．からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡ、ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡ、ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡ、ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡ、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡのプレｍＲＮＡスプライシングの忠実度を増強することができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与された場合、ＳＴＭＮ２の発現を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、隣接するエクソン１／エクソン２接合部を有する野生型ＳＴＭＮ２成熟ｍＲＮＡと比較して、エクソン１とエクソン２との間に潜在性エクソン（ｃｅ１）を含むＳＴＭＮ２成熟ｍＲＮＡの割合を減少させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、異常にスプライシングされたＡＲＨＧＡＰ３２成熟ｍＲＮＡのレベルを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＳＬＣ５Ａ７ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＣＥＲＴ１ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＣＡＭＫ２Ｂ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＫＡＬＲＮ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＵＮＣ１３Ａ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＳＴＭＮ２、ＣＥＲＴ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＡＲＨＧＡＰ３２、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＫＡＬＲＮ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡのうちの２つ以上の異常なスプライシングを修正することができる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３個を超えるか、又は４個を超える連続するＤＮＡヌクレオシドの領域を含まない。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅＨ切断を媒介することができない。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、例えば、及び有利に、より低いギブス自由エネルギー、例えば－１０未満、例えば－１５未満などのギブス自由エネルギーを提供するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的ＲＮＡ分子との間の結合親和性を増強する１つ又は複数の親和性増強ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の修飾ヌクレオシド、例えば１つ又は複数の親和性増強２’糖修飾ヌクレオシド、例えば、２’糖修飾ヌクレオシドを含む：２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；ロックド核酸（ＬＮＡ）、又はそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）ヌクレオシドであり、任意に、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルヌクレオシドであり、任意に、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列内の１つ又は複数の修飾ヌクレオシドは、ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）、例えば、拘束型エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）又はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡからなる群から選択されるＬＮＡヌクレオシドである。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、任意にホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されたヌクレオシドＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ミックスマー又はトータルマーである。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも９個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１３個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中に存在するシトシン塩基は、シトシン及び５－メチルシトシンからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中に存在するシトシン塩基は、５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中に存在するＬＮＡシトシン塩基は、ＬＮＡ ５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中に存在するＬＮＡシトシン塩基は、ＬＮＡ ５－メチルシトシンであり、ＤＮＡシトシン塩基は、シトシンである。
有利には、連続ヌクレオチド配列上のヌクレオシド間に位置するヌクレオシド間結合の１つ又は複数が修飾される。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列上のヌクレオシド間に位置するヌクレオシド間結合の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％が修飾されている。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合の１つ若しくは複数、又は全ては、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列内の結合の１つ若しくは複数、又は全ては、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列に存在する全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド中に存在する全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは８～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは８～２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは１２～１８ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは１３～１８ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは１４～１８ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは１０～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２０～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２１～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２２～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２３～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２４～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２５～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２６～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列の長さは２７～３２ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６，１、８，３、１８，３、１８，４、１６，２、１８，２、７，２、１５，２、１６，３、１５，３、８，１、８，２、７，３、６，４、６，３、１８，１、７，１、１４，２、６，２、１４，４、１５，４、１０，１、及び１５，５．からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれからなる。
本発明は、（化合物ＩＤ番号）１６，１、８，３、１８，３、１８，４、１６，２、１８，２、７，２、１５，２、１６，３、１５，３、８，１、８，２、７，３、６，４、６，３、１８，１、７，１、１４，２、６，２、１４，４、１５，４、１０，１、及び１５，５からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のコンジュゲート基を含んでもよく、すなわち、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートであってもよい。
本発明は、本発明に従ったオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲート、及び、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を提供する。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩などの塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩を提供する。
本発明は、請求項のオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤又は溶媒及びカチオンとを含む、医薬組成物を提供する。カチオンは、例えば、ナトリウムカチオン又はカリウムカチオンであり得る。希釈剤／溶媒は水であり得る。
本発明は、異常又は枯渇したレベルのＴＤＰ－４３を発現している細胞においてＴＤＰ－４３の機能性を増強するためのインビボ又はインビトロ方法などの方法を提供し、該方法は、本発明のオリゴヌクレオチド、又は本発明によるコンジュゲート、又は本発明による塩若しくは組成物を有効量で細胞に投与することを含む。
本発明は、対象におけるＴＤＰ－４３病理を処置又は予防するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の本発明のオリゴヌクレオチド若しくは本発明によるコンジュゲート、又は本発明による塩若しくは組成物を、ＴＤＰ－４３病理に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明は、医薬として使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド若しくは本発明によるコンジュゲート、又は本発明による塩若しくは組成物を提供する。
本発明は、ＴＤＰ－４３病理の処置における使用のための、本発明のオリゴヌクレオチド若しくは本発明によるコンジュゲート、又は本発明による塩若しくは組成物を提供する。
本発明は、ＴＤＰ－４３病理の処置又は予防のための医薬の調製のための、本発明のオリゴヌクレオチド若しくは本発明によるコンジュゲート、又は本発明による塩若しくは組成物の使用を提供する。
本発明は、ＴＤＰ－４３病理が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、海馬硬化性認知症、ダウン症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、例えば脊髄小脳失調症３、ミオパシー及び慢性外傷性脳症からなる群から選択される神経障害である、本発明の使用又は方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３病理は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）からなる群から選択される神経障害である。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩、及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩である。
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと、リン酸緩衝生理食塩水などの薬学的に許容され得る溶媒とを含む、本発明のオリゴヌクレオチドの薬学的溶液を提供する。
本発明は、凍結乾燥粉末の形態などの固体粉末形態の本発明のオリゴヌクレオチドを提供する。
典型的には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも８又は少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０～３２、１５～３２、２０～３２、２１～３２、２２～３２、２３～３２、２４～３２、２５～３２、２６～３２、２７～３２又は１０～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３ ＲＮＡ結合配列に対して少なくとも７５％相補的、例えば少なくとも９０％相補的、又は完全に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシドは、連続ヌクレオチド配列を形成する。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのヒトプレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができる。例えば、ヒトＳＴＭＮ２、ＣＥＲＴ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＡＲＨＧＡＰ３２、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＫＡＬＲＮ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡのスプライシングは、実施例に示すように、ＴＤＰ－４３結合に依存する。
さらなる態様では、本発明は、神経変性疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置又は予防するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを、疾患に罹患しているか又は疾患に罹りやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。
さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物は、ＴＤＰ－４３の病理又は核からのＴＤＰ－４３の誤局在化を特徴とする神経変性障害としての神経変性疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置又は予防に使用される。
配列表
本出願と共に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
異常なＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡ発現レベル対ＷＴ ＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡ発現レベルの比によって測定される、ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡプロセシングの補正におけるオリゴヌクレオチド長と有効性との間の相関。注目すべきことに、より効果的な化合物は、少なくとも１２ヌクレオチド長であった。 異常なＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡ発現レベル対ＷＴ ＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡ発現レベルの比によって測定される、ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡプロセシングの補正におけるオリゴヌクレオチドのギブス自由エネルギー（ΔＧ）と有効性との間の相関。注目すべきことに、より効果的な化合物は、少なくとも－１０ΔＧのギブス自由エネルギーを有していた。 異常なＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡ発現レベル対ＷＴ ＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡ発現レベルの比によって測定される、ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡプロセシングの補正におけるオリゴヌクレオチドの融解温度（予測Ｔｍ）と有効性との間の相関の欠如。 化合物Ａで処置した際のグルタニューロンにおけるＴＡＲＤＢＰノックダウン。未処理のグルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンにおけるＴＡＲＤＢＰの相対的発現。 化合物Ａで処置した際のグルタニューロンにおけるＳＴＭＮ２野生株発現。Ａ）未処理グルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンのＳＴＭＮ２遺伝子の５’末端にマッピングされた正規化リードを示すグラフィカル・ユーザ・インターフェース。灰色の長方形は、選択的スプライスアクセプター部位の使用である整列したリードを強調している。 Ｂ）未処理のグルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンにおける野生型ＳＴＭＮ２転写物の相対的発現。 ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡへの潜在性エクソン封入をもたらす異常なスプライシング事象の一例の説明図である。図は、ｍＲＮＡ転写物を含有するＳＴＭＮ２潜在性エクソンのヌクレオチド配列（配列番号１２０）を示し、アミノ酸配列は、得られた切断型スタスミン－２タンパク質（本明細書ではＳＴＭＮ２タンパク質と呼ぶ）である。網掛けの太字のヌクレオチド配列はＳＴＭＮ２エクソン１配列であり、下線のヌクレオチド配列はイントロン１に由来する潜在性エクソン配列であり、潜在性スプライス部位はｖ記号で示されている。ＡＴＧ開始コドン、ＴＡＧ停止コドン及びポリアデニル化シグナルを強調している。 化合物Ａ、Ｂ及びＣで処置した際のグルタニューロンにおけるＡＲＨＧＡＰ３２発現。Ａ）未処理グルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンのｈｇ３８（ＡＲＨＧＡＰ３２に対する部分ズーム）にアライメントされた正規化リードを示すグラフィカル・ユーザ・インターフェース。灰色の長方形は、選択的スプライスアクセプター部位の使用を示す整列したリードを示す。 Ｂ）未処理のグルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンにおける 選択的最終エクソン（ＥＮＳＧ０００００１３４９０９における位置２００１５３）の封入を有するＡＲＨＧＡＰ３２アイソフォームの相対的発現。 ＡＲＨＧＡＰ３２遺伝子（配列番号１２１）の新規の最終エクソンのヌクレオチド配列であり、新規潜在性スプライス部位は＾記号で示され、太字でない文字はＴＤＰ－４３枯渇細胞において濃縮された潜在性エクソンを表す。潜在性エクソンの封入により、潜在性エクソン内に２つのポリアデニル化部位（影付きの文字）が封入され、その結果、ＡＲＨＧＡＰ３２によってコードされるタンパク質であるＲｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３２の切断型の発現がもたらされる。イタリック体の文字は、ＧＴリッチＲＮＡ結合タンパク質結合部位である。 化合物Ａ、Ｂ及びＣで処置した際のグルタニューロンにおけるＳＬＣ５Ａ７発現。Ａ）未処理グルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンのＳＬＣ５Ａ７にアライメントされた正規化リードを示すグラフィカル・ユーザ・インターフェース。灰色の長方形は、選択的エクソンの封入を示す整列したリードを示す。 Ｂ）未処理のグルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンにおける 選択的最終エクソンの封入を有するＳＬＣ５Ａ７アイソフォームの相対的発現。 ＳＬＣ５Ａ７遺伝子（配列番号１２２）から封入される新規エクソンのヌクレオチド配列。新規潜在性スプライス部位は＾記号で示され、太字でない下線付き文字はＴＤＰ－４３枯渇細胞において濃縮された潜在性エクソンを表す。イタリック体の文字は、ＧＴリッチＲＮＡ結合タンパク質結合部位（ＴＤＰ－４３結合部位）である。 化合物Ａ、Ｂ及びＣで処置した際のグルタニューロンにおけるＣＥＲＴ１発現。Ａ）未処理グルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンのＣＥＲＴ１にアライメントされた正規化リードを示すグラフィカル・ユーザ・インターフェース。灰色の長方形は、選択的エクソンの封入を示す整列したリードを示す。 Ｂ）未処理のグルタニューロン、化合物Ａ、化合物Ａ＋Ｂ及び化合物Ａ＋Ｃで処理したグルタニューロンにおける 選択的最終エクソンの封入を有するＣＥＲＴ１アイソフォームの相対的発現。 ＴＤＰ－４３枯渇細胞中のＣＥＲＴ１遺伝子（配列番号１２３）から含まれる新規インフレームエクソンのヌクレオチド配列。ＣＥＲＴ１の新しいエクソンが下線付き文字で示されており、ＴＤＰ－４３結合部位はイタリック体である。 ベン図である。０．０１未満のｐ値を有する選択的スプライシングを示し、対照と比較して２倍を超える変化を示す転写物の数。化合物Ａの対照は未処理のグルタニューロンであるのに対して、化合物Ａ＋Ｂ及びＡ＋Ｃの対照はＴＤＰ－４３ノックダウン（化合物Ａ）である。ＴＤＰ－４３枯渇細胞（化合物Ａのみで処理）では、ＴＤＰ－４３枯渇のために選択的にスプライシングされた合計９２５個の転写物があった。その後、ＴＤＰ－４３枯渇細胞をＳＴＭＮ２標的化オリゴヌクレオチド（化合物Ｂ）で処理した場合、化合物Ａで処理した細胞と比較して、選択的にスプライシングされた１１４個の転写物が存在した。その後、ＴＤＰ－４３枯渇細胞を本発明のＲＮＡタンパク質結合部位標的化オリゴヌクレオチド（化合物Ｃ）で処理した場合、化合物Ａで処理した細胞と比較して、選択的にスプライシングされた３５１個の転写物が存在した。これは、本発明の化合物が、ＳＴＭＮ２標的化オリゴヌクレオチドと比較して、全体的なＲＮＡスプライシングの調節においてより効果的であることを示している。 図１４Ａは、ＣＡＭＫ２Ｂ遺伝子にマッピングされた正規化されたリードのマッピングを示すグラフ図を示す。化合物Ａ又は対照としての未処理細胞（ＰＢＳ）で処理したグルタニューロン、続いてｍＲＮＡ単離及びＮＧＳ。ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時のＣＡＭＫ２Ｂ遺伝子内の新規エクソンの位置を、水平な灰色長方形で示す（ＣＡＭＫ２Ｂの新規エクソンを囲むエクソンのみを示す）。新規スプライスドナー部位は灰色の矢印で示されている。ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡはマイナス鎖から転写される。 図１４Ｂは、ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時に観察される新規ＣＡＮＫ２Ｂエクソンの配列を示す。太字は、グルタニューロンで観察されたカノニカルエクソンである。下線は新規エクソンであり、斜体では多くの終止コドンのうちの最初の終止コドンが示されている。∧はカノニカルスプライス部位を示し、∨は新規スプライスアクセプター部位の位置を示す。 図１５Ａは、ＫＡＬＲＮ遺伝子にマッピングされた正規化されたリードのマッピングを示すグラフ図を示す。化合物Ａ又は対照としての未処理細胞（ＰＢＳ）で処理したグルタニューロン、続いてｍＲＮＡ単離及びＮＧＳ。ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時のＫＡＬＲＮ遺伝子内の新規エクソンの位置を、灰色長方形で示す（ＫＡＬＲＮの新規エクソンを囲むエクソンのみを示す）。 図１５Ｂは、異常にスプライシングされたエクソンを含むＫＡＬＲＮ遺伝子にマッピングされた正規化されたリードのマッピングを拡大したグラフ図を示す。化合物Ａ又は対照としての未処理細胞（ＰＢＳ）で処理したグルタニューロン、続いてｍＲＮＡ単離及びＮＧＳ。ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時のＫＡＬＲＮ遺伝子内の新規エクソンの位置を、水平な灰色長方形で示す。矢印は、ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時に使用されるスプライス部位を示す。 図１５Ｃは、ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時に観察される新規ＫＡＬＲＮエクソンの配列を示す。太字は、グルタニューロンで観察された新規エクソンである。斜体では、コード配列内の多くの終止コドンのうちの最初のものが示されている。∨は、新規スプライス部位の位置を示す。 図１５Ｄは、ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時に観察される新規ＫＡＬＲＮエクソンのｎｇ配列を示す。太字は、グルタニューロンで観察された新規エクソンである。斜体では、コード配列内の多くの終止コドンのうちの最初のものが示されている。∨は、新規スプライス部位の位置を示す。 図１６Ａは、１２８ヌクレオチド（Ａ）又は１７８ヌクレオチド（Ｂ）のいずれかの潜在性エクソンの封入をもたらす異常なスプライシング事象の説明図を示す。太字は、ＵＮＣ１３Ａの２つの潜在性エクソンのヌクレオチド配列である。スプライス部位は∨によって示されており、エクソンに対するイントロン配列５’及び３’は通常の大文字で示されている。ＵＮＣ１３Ａ遺伝子が１９番染色体のマイナス鎖上に位置するので、逆相補配列が示されている。 図１６Ｂは、ＵＮＣ１３Ａ遺伝子にマッピングされた正規化されたリードのマッピングを示すグラフ図を示す。化合物Ａ又は対照としての未処理細胞（ＰＢＳ）で処理したグルタニューロン、続いてｍＲＮＡ単離及びＮＧＳ。ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時のＵＮＣ１３Ａ遺伝子内の新規エクソンの位置を、灰色長方形で示す（ＵＮＣ１３Ａの新規エクソンを囲むエクソンのみを示す）。 図１６Ｃは、ＴＤＰ４３タンパク質の喪失時のＵＮＣ１３Ａ遺伝子内の新規エクソンを示すグラフ図を示す。化合物Ａ又は対照としての未処理細胞（ＰＢＳ）で処理したグルタニューロン、続いてｍＲＮＡ単離及びＮＧＳ。矢印は、新規スプライス部位を示す。
定義
ＲＮＡ結合タンパク質模倣物及びＴＤＰ－４３模倣物
ＴＤＰ－４３は、ヒトにおいてヒト染色体１：１１，０１２，６５３－１１，０２２，８５８の順鎖（遺伝子ＥＮＳＧ０００００１２０９４８，Ｃｈｒ １：１１，０１２，３４４－１１，０２５，７３９、典型的なＴＤＰ－４３転写物の例＝ＥＮＳＴ０００００４３９０８０．６）にコードされているＴＡＲ ＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質であり、ＲＮＡスプライシング、安定性及び代謝に広く関与している。健康な細胞では、ＴＤＰ－４３タンパク質は核内に位置するが、いくつかの神経変性疾患では、機能障害ＴＤＰ－４３凝集体が細胞質内に形成される（しばしば過剰リン酸化及びユビキチン化ＴＤＰ－４３に関連する）。
ＴＤＰ－４３は、多数の独立したＲＮＡ転写物中のＧＵリピートに結合するＲＮＡ結合タンパク質の一例である。ＴＤＰ－４３などのＲＮＡ結合タンパク質と多数のＲＮＡ転写物の集団との相互作用は、プレｍＲＮＡに対するスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ蓄積などのＲＮＡ転写物の生物学に大きな影響を及ぼし、したがって、細胞内の独立したＲＮＡの集団の発現を発揮するための機構を提供する。これは、機能的ＴＤＰ－４３のＲＮＡ結合の喪失が神経変性と密接に関連するＴＤＰ－４３枯渇の場合に特に関連する。
本発明は、プレｍＲＮＡ転写物の集団上の保存されたＴＤＰ－４３結合部位などの複数のＲＮＡ転写産物上のＧＵリッチ領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。実施例において例示されるように、本発明のオリゴヌクレオチドの投与は、ＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＤＰ－４３の枯渇又は非存在下では異常にプロセシングされる複数の独立したＲＮＡ転写物の機能的プロセシングを回復させることができる。したがって、本発明の化合物とも呼ばれる本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、複数のＲＮＡ転写物のＲＮＡ生物学を調節する際に、ＴＤＰ－４３などのＲＮＡ結合タンパク質の機能性を回復させるという点で、ＲＮＡ結合タンパク質模倣物又はＴＤＰ－４３模倣物と呼ばれることがある。
例として、（例えば、ＴＤＰ－４３枯渇細胞において）本発明の化合物の使用によって回復又は増強されるＴＤＰ－４３機能性などのＲＮＡ結合タンパク質機能性は、プレｍＲＮＡ転写物の発現、プロセシング、例えばスプライシング事象であり、そうでなければ低下したレベルの機能性ＴＤＰ－４３を有する細胞（本明細書ではＴＤＰ－４３枯渇細胞と呼ばれる）において調節不全である機能性遺伝子発現の回復をもたらす。これは、遺伝子発現の増強又は遺伝子発現の質の増強をもたらし得る。
有利には、本発明の化合物は、機能的ＴＤＰ－４３を模倣し、１つ又は複数のＴＤＰ－４３標的ＲＮＡの発現においてＴＤＰ－４３の核機能を回復させ、それによってＴＤＰ－４３標的ＲＮＡの機能的表現型を回復させることができる。
他のＲＮＡ結合タンパク質がＴＤＰ－４３結合部位に結合し得、したがって、本明細書で言及されるＴＤＰ－４３模倣物は、複数の核酸標的（すなわち、異なる遺伝子座から記載されるＲＮＡ標的）などの１つ又は複数のＲＮＡ標的のＴＤＰ－４３結合部位に相補的であり、正常な（野生型）の発現を回復させることができるオリゴヌクレオチドであることが理解されよう。
Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３に報告されているように、いくつかのＴＤＰ－４３病理は特定のＴＤＰ－４３変異に関連しており、これらは必ずしもＴＤＰ－４３細胞質枯渇に関連していない可能性がある。本発明の文脈において、ＴＤＰ－４３の正常な機能は遺伝的に破壊され得るので、これはまた、枯渇又は正常なＴＤＰ－４３（本発明のＴＤＰ－４３模倣物を使用して対処することができる表現型）の潜在的な原因であると考えられる。
ＴＤＰ－４３ ＲＮＡ標的の例
図１３に示すように、神経細胞におけるＴＤＰ－４３の枯渇は、細胞内のＲＮＡ転写物の大きな集団のＲＮＡプロセシングの著しい変化をもたらす－この例では、７４９個のＲＮＡ転写物は、ＴＤＰ－４３の枯渇後に、ＲＮＡ配列決定によって決定される代替的なＲＮＡプロセシングを示した。
実施例は、これらのＴＤＰ－４３標的ＲＮＡのうちの７つを例示する：ＳＴＭＮ２、ＡＲＨＧＡＰ３２、ＳＬＣ５Ａ７、ＣＥＲＴ１、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＫＡＬＲＮ及びＵＮＣ１３Ａ。
Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３ １１０ Ｅ７３６－７４５は、ＴＤＰ－４３枯渇細胞（ＴＤＰ－４３ ＡＳＯ枯渇マウス）におけるＴＤＰ－４３結合ＲＮＡのプレｍＲＮＡスプライシングの広範な異常を同定し、マイクロアレイ分析を使用した指標となるＴＤＰ－４３調節スプライシング事象の同定を説明している。スプライシングがＴＤＰ－４３によって調節されるＡｒｎｏｌｄらによって同定されたＲＮＡには、Ｅｉｆ４ｈ、Ｔａｆ１ｂ、Ｋｃｎｉｐ２（ＴＤＰ－４３変異依存性）、Ｓｏｒｔ１、Ｋｃｎｄ３、Ａｈｉ１、Ａｔｘｎ２、Ｃｔｎｎｄ（用量依存性）が含まれる。
ＳＴＭＮ２（Ｋｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ Ｆｅｂ；２２（２）：１６７－１７９）－（例えばＡＬＳにおける）神経細胞におけるＴＤＰ－４３枯渇は、ＳＴＭＮ２転写物のミススプライシングをもたらす。ＳＴＭＮ２は微小管調節因子をコードし、その発現は、ＴＤＰ－４３のノックダウン及びＴＤＰ－４３の誤局在化の後、並びに患者特異的運動ニューロン及び死後の患者脊髄において低下する。
ＳＴＭＮ２の翻訳後安定化は、ＴＤＰ－４３枯渇によって誘導される神経突起伸長及び軸索再生欠損を救済した。ＴＤＰ－４３枯渇は、ＳＴＭＮ２のエクソン１とエクソン２との間の潜在性イントロンの組み込みをもたらす。国際公開第２０１９／２４１６４８号は、ＳＴＭＮ２のミススプライシングを抑制するために使用される完全にＭＯＥ修飾されたホスホロチオエートＡＳＯを開示している。
上記の転写物及び関連するＴＤＰ－４３枯渇スプライシング事象を使用して、本発明の化合物を使用してＴＤＰ－４３機能性の回復についてアッセイすることができる。
ＴＤＰ－４３病理
ＴＤＰ－４３病理は、ＴＤＰ－４３の発現の減少又は異常に関連する疾患であり、しばしば細胞質ＴＤＰ－４３、特に過剰リン酸化及びユビキチン化ＴＤＰ－４３の増加に関連する。
ＴＤＰ－４３枯渇は、ＴＤＰ－４３病理と呼ばれる様々な疾患で示され、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症 アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、海馬硬化性認知症、ダウン症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、例えば脊髄小脳失調症３、ミオパシー及び慢性外傷性脳症などを含む。
ＴＤＰ－４３が枯渇した細胞
ＴＤＰ－４３が枯渇している細胞とは、ＴＤＰ－４３の機能レベルが低下している細胞を指す。ＴＤＰ－４３病理では、異常なＴＤＰ－４３発現は機能不全細胞質ＴＤＰ－４３の蓄積及び機能性核ＴＤＰ－４３レベルの低下をもたらすことが理解されるであろう。したがって、ＴＤＰ－４３が枯渇しているそのような細胞は、ＴＤＰ－４３の機能レベルの低下を特徴とし得、したがって、機能不全ＴＤＰ－４３のレベルの増加に関連し得る。インビトロ評価のために、ＴＤＰ－４３枯渇は、例えば遺伝子工学的アプローチ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９）によって、又は実施例に例示されるように、ＴＤＰ－４３のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤（ヒトＴＤＰ－４３転写物を標的とするギャップマーオリゴヌクレオチドによって例示される）の使用によって操作され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３が枯渇している細胞はニューロン細胞である。
ＴＤＰ－４３結合部位に相補的な配列
ＴＤＰ－４３結合部位は、例えばポリＧＵモチーフ（ＲＮＡ結合のＡデータベースｈｔｔｐｓ：／／ａｔｔｒａｃｔ．ｃｎｉｃ．ｅｓ／ｒｅｓｕｌｔｓ／ｅ９ｆ２９３８０－８９２１－４０６ｅ－８４ａ８－２７ｃｅ９ｂ９３９８ｂ４＃を参照のこと）を特徴とし、適切にはアンチセンスオリゴヌクレオチド介入のために、（ＧＵ）ｎ又は（ＵＧ）ｎのモチーフを含んでいてもよく、ここでｎは、少なくとも３又は好ましくは少なくとも４である。いくつかの実施形態では、ｎは、４、５、６、７、８、９又は１０である。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３結合部位は、（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号４２）、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３結合部位は、ＧＵＧＡＡＵＧＡ、ＧＵＵＧＵＧＣ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３５）、ＧＡＡＵＧＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＡＡＵＧＡ、ＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＵＧＵＵＣ、及びＧＵＵＵＵＧＣからなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３結合部位は、配列ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号４６）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される１つ又は複数の配列に相補的、例えば完全に相補的な配列を含み得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３結合部位配列、例えば（ＧＵ）ｎ、（ＵＧ）ｎ、ＧＵＧＡＡＵＧＡ、ＧＵＵＧＵＧＣ、ＧＡＡＵＧＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＡＡＵＧＡ、ＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ（配列番号３５）、ＧＵＵＧＵＵＣ、及びＧＵＵＵＵＧＣからなる群から選択される１つ又は複数の配列に相補的、例えば完全に相補的な配列を含み得る。
オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称されうる。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、通常は精製又は単離される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよい。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって約５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。
いくつかの実施形態では、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオシドを含まなくてもよい。
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることが有利であり得る。
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。連続ヌクレオチド配列は、標的核酸又は標的配列に相補的であり、場合によっては完全に相補的である本発明のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列である。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、更なるヌクレオチド、例えば、官能基（例えばコンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を必要に応じて含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、それ自体としてオリゴヌクレオチドより長くなることはできないことと、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列より短くなることはできないことと、が理解される。
ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ぶことができる。
修飾ヌクレオシド
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの１つ以上は、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。本発明の化合物に使用され得る例示的な修飾ヌクレオシドには、ＬＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ及びモルホリノヌクレオシド類似体が含まれる。
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％又はそれよりも多くのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが、ホスホロチオアートである。
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４５巻２０５５頁及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリン、５’ニトロインドールから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示されてもよく、ここで、各文字は、任意に等価機能の改変された核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドであることが有利であり得る。
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
本明細書で使用される「％相補的」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列とＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列との間の相補性のレベルは、少なくとも約７５％であり得る。
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列との間の相補性のレベルは、少なくとも約８０％であり得る。
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列とＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列との間の相補性のレベルは、少なくとも約８５％であり得る。
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列とＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列との間の相補性のレベルは、少なくとも約９０％であり得る。
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列とＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列との間の相補性のレベルは、少なくとも約９５％であり得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に完全に相補的であり得る。「完全に相補的」という用語は、１００％の相補性を指す。
本発明の化合物は、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡ中のＴＤＰ－４３結合部位に相補的である。
実施例において例示されるように、完全な相補性は必要とされない場合があり、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それが効果的に結合するＴＤＰ－４３標的ＲＮＡ ＴＤＰ－４３ ＲＮＡ結合部位に対する１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるミスマッチを含み得る。これに関して、異なるＴＤＰ－４３標的ＲＮＡ中の複数のＴＤＰ－４３結合部位に十分に相補的であるが同一ではないオリゴヌクレオチドを設計することができる。いくつかの実施形態では、複数のＴＤＰ－４３ ＲＮＡ標的中のＴＤＰ－４３結合部位配列の完全な同一性がない場合、イノシンなどのユニバーサル塩基をアンチセンスオリゴヌクレオチド中の相補的位置に使用することができる。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する２つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する３つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する４つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する５つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する６つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する７つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対する８つ以上のミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、又は８つ以上ミスマッチを含有する本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３２ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、又は８つ以上ミスマッチを含有する本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３２ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて、－１２ｋｃａｌ、－１５ｋｃａｌ、－１７ｋｃａｌ、－２０ｋｃａｌ、－３０ｋｃａｌ、－４０ｋｃａｌ、－５０ｋｃａｌ又は－６０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。
ΔＧ°値の計算については後述する。
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
ハイブリダイゼーション
本明細書で用いられる「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ及びＬａｃｒｏｉｘ（２００３年）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」第１３巻第５１５～５３７頁）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８、及びＨｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定し得る。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５に記載の最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いて（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１１２１１－１１２１６、及びＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：５３８８－５４０５に記載された適切に誘導された熱力学的パラメータを使用し）、数値的に推定し得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０から－６０ｋｃａｌ、例えば－１２から－４０、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、又は－１６から－２７ｋｃａｌ、例えば－１８から－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
例示的なＴＤＰ－４３ ＲＮＡ標的
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡは、スタスミン２、又はＳＣＧ１０、ＳＣＧＮ１０として公知の哺乳動物タンパク質、例えば以下の遺伝子として開示されるヒトＳＴＭＮ２である：ＥＮＳＧ０００００１０４４３５（ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇ）、ヒト第８染色体：７９，６１０，８１４－７９，６６６，１７５フォワード鎖（ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６７０．２）にコードされる。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡは、セラミドトランスポーター１（ＣＥＲＴ１）として公知の哺乳動物タンパク質、例えば以下の遺伝子として開示されるヒトＣＥＲＴ１である：ＥＮＳＧ０００００１１３１６３（ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇ）、ヒト第５染色体：７５，３５６，３４５－７５，５１２，１３８リバース鎖（ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６７．２）にコードされる。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡは、溶質担体ファミリー５メンバー７として公知の哺乳動物タンパク質、例えば、以下の遺伝子として開示されるヒトＳＬＣ５Ａ７である：ＥＮＳＧ０００００１１５６６５（ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇ）、ヒト第２染色体：１０７，９８６，５２３－１０８，０１３，９９４フォワード鎖（ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６４．２）にコードされる。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡは、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３２として公知の哺乳動物タンパク質、例えば、以下の遺伝子として開示されるヒトＡＲＨＧＡＰ３２である：ＥＮＳＧ０００００１３４９０９（ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇ）、ヒト染色体１１：１２８，９６５，０６０－１２９，２７９，３２４リバース鎖（ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６７３．２）にコードされる。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡはＣＡＭＫ２Ｂである。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡはＫＡＬＲＮである。
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ－４３標的ＲＮＡはＵＮＣ１３Ａである。
標的細胞
本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、本発明の化合物の投与によって発現が補正される標的化ＴＤＰ－４３ ＲＮＡ標的を発現している細胞を指す。適切には、標的細胞はさらにＴＤＰ－４３が枯渇している。実験的使用のために、ＴＤＰ－４３枯渇は、例えば遺伝子操作（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９）を介して、又はＴＤＰ－４３のＡＳＯ阻害剤の使用を介して、細胞内に操作され得る。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、神経細胞である。
インビトロ評価のために、標的細胞は、グルタミン酸作動性ニューロン（本明細書ではグルタニューロン細胞とも呼ばれる）、例えばヒトグルタミン酸作動性ニューロン、例えばＴＤＰ－４３が枯渇したヒトグルタミン酸作動性ニューロンであり得る。ヒトグルタミン酸作動性ニューロンは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）から入手可能である。インビトロ評価のための標的細胞、例えばグルタニューロンはインビトロである。例えばインビトロ評価のための標的細胞のＴＤＰ－４３枯渇は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ試薬を使用して達成され得るか、又は例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集又はｓｈＲＮＡベクター発現を介して細胞に操作され得る。実施例においてさらに例示されるように、例えば、インビトロ使用のための標的細胞は、ヒト多能性幹細胞由来ニューロンであり得、例えば、これらは、ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ Ｋｉｔ，０１２７９ Ｃａｔ．Ｒ１０３４（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）として得ることができる。
スプライス調節
スプライス調節を使用して、潜在性スプライシングを修正し、選択的スプライシングを調節し、オープンリーディングフレームを回復させ、タンパク質ノックダウンを誘導することができる。
スプライス調節は、プレｍＲＮＡの異なるスプライス産物の定量的評価を可能にするＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）によって、又は一方若しくは他方のスプライス形態に特異的であるように設計されたＰＣＲアッセイを使用するデジタル液滴ＰＣＲによってアッセイすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、例えば、それらは、例えば標的細胞又はＴＤＰ－４３枯渇細胞において、エクソン１とエクソン２との間に位置するＲＮＡ配列を含む成熟ＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡのレベルを低下させる（実施例に示される）。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し、例えば、それらは、例えば標的細胞において、ＷＴ ＳＴＭＮ２転写物と呼ばれる、エクソン１とエクソン２との間に位置するＲＮＡ配列を含まない成熟した正しくスプライシングされたＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡのレベルを増強する。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、実施例に示されるように、成熟ＣＥＲＴ１ ｍＲＮＡにおける異常なエクソンの封入を減少させることによって、標的細胞におけるＣＥＲＴ１のスプライシングを調節する。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、実施例に示されるように、成熟ＳＬＣ５Ａ７ ｍＲＮＡにおける異常なエクソンの封入を減少させることによって、標的細胞におけるＳＬＣ５Ａ７のスプライシングを調節する。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、実施例に示されるように、成熟ＡＲＨＧＡＰ３２ ｍＲＮＡにおける異常なエクソンの封入を減少させることによって、標的細胞におけるＡＲＨＧＡＰ３２のスプライシングを調節する。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、これは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して、糖部分が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）又は二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、又は典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、又はリボース環の２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）ヌクレオシドである。
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、高められた結合親和性及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
Figure 2023534557000001
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定されうる。
非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６、国際公開第００／６６６０４、国際公開第９８／０３９３５２、国際公開第２００４／０４６１６０、国際公開第００／０４７５９９、国際公開第２００７／１３４１８１、国際公開第２０１０／０７７５７８、国際公開第２０１０／０３６６９８、国際公開第２００７／０９００７１、国際公開第２００９／００６４７８、国際公開第２０１１／１５６２０２、国際公開第２００８／１５４４０１、国際公開第２００９／０６７６４７、国際公開第２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。
さらなる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。
スキーム１：
Figure 2023534557000002
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。
特定の有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
モルホリノオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、モルホリノヌクレオシドを含むか、又はモルホリノヌクレオシドからなる（すなわち、モルホリノオリゴマーであり、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）として）。スプライス調節モルホリノオリゴヌクレオチドは、臨床使用が承認されており、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される、ＤＭＤのフレームシフト変異を標的とする３０ｎｔモルホリノオリゴヌクレオチドである、エテプリルセンを参照のこと。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の４つの連続するモルホリノヌクレオチドの説明に示されるように、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環など、リボースではなく６員のモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。
Figure 2023534557000003
いくつかの実施形態では、本発明のモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、２０～４０モルホリノヌクレオチド長、例えば、２５～３５モルホリノヌクレオチド長であり得る。
ＲＮａｓｅ Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮアーゼＨを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＲＨａｓｅ Ｈ活性の決定に使用するために、組換えＲＮａｓｅ Ｈ１が、Ｌｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド、典型的には高親和性２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２－Ｏ－ＭＯＥ及び／又はＬＮＡを含む領域が５’及び３’に隣接するＤＮＡヌクレオシド（典型的には少なくとも５又は６個の連続するＤＮＡヌクレオシド）の領域を含むギャップマーオリゴヌクレオチドと同様に、ＲＮａｓｅＨを効果的に動員することが公知である。スプライシングの効果的な調節のために、プレｍＲＮＡの分解は望ましくなく、したがって、標的のＲＮａｓｅＨ分解を回避することが好ましい。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはギャップマーオリゴヌクレオチドではない。ＲＮａｓｅＨ動員は、オリゴヌクレオチド中の連続するＤＮＡヌクレオチドの数を制限することによって回避され得、したがって、効果的なスプライス調節のために、ミックスマー（ｍｉｍｘｅｒ）及びトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）設計が使用され得る。
ミックスマー（Ｍｉｘｍｅｒ）及びトータルマー（Ｔｏｔａｌｍｅｒ）
スプライス調節のために、ＲＮＡａｓｅＨを動員しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することがしばしば有利である。ＲＮａｓｅＨ活性はＤＮＡヌクレオチドの連続配列を必要とするので、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、３個を超えるか、又は４個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって達成され得る。これは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドと、１、２若しくは３個のＤＮＡヌクレオシドなどのＤＮＡヌクレオシドの短い領域とを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオシド領域をミックスマー設計で使用することによって達成され得る。ミックスマーは、本明細書において、ヌクレオシドが１個のＬＮＡヌクレオシドと１個のＤＮＡヌクレオシドとの間で交互である２個毎の設計（例えば５’及び３’末端がＬＮＡヌクレオシドであるＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＤＬＬ）、並びに、３個毎にヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドであるＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬＤＤＬなどの３個毎の設計によって例示される。
トータルマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列であり、例えば、治療的使用のための効果的なスプライス調節因子であると報告されている完全ＭＯＥホスホロチオエート、例えばＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭ（Ｍ＝２’－Ｏ－ＭＯＥ）などの２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドのみを含んでもよい。あるいは、ミックスマーは、ＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬＭＬ等の修飾ヌクレオシドの混合物を含んでいてもよく、式中、Ｌ＝ＬＮＡ及びＭ＝非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドである。
有利には、ミックスマー及びトータルマー中のヌクレオシド間ヌクレオシドはホスホロチオエートであってもよく、又はミックスマー中のヌクレオシド結合の大部分はホスホロチオエートであってもよい。ミックスマー及びトータルマーは、例として、ホスホジエステル又はホスホロジチオエートなどの他のヌクレオシド間結合を含み得る。
オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続する配列は、典型的には、異なるＴＤＰ－４３ ＲＮＡ標的に存在する複数のＴＤＰ－４３結合部位に相補的である。ＴＤＰ－４３結合部位に相補的、例えば完全に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域は、連続ヌクレオチド配列と呼ばれる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシドは、連続ヌクレオチド配列内にある（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び連続ヌクレオチド配列は、同じ長さのヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列と、任意に、コンジュゲート又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ’’）などの任意の官能基にオリゴヌクレオチドを連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域とを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏａｌｍｅｒ）、並びにさらに５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか、又はそれからなり得る。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。
領域Ｄ’又はＤ’’の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔｏａｌｍｅｒ）をコンジュゲート部分又は別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連結に用いられる場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、若しくは合成又は製造を容易にするために使用されてもよい。
領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、若しくはこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ’又はＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たしうる（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）を構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
いくつかの実施形態において、領域Ｄ’又はＤ’’とミックスマー又はトータルマー領域との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
コンジュゲート
本明細書で用いられるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成は、ＭａｎｏｈａｒａｎによるＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１ ａｎｄ Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３の包括的レビューにも報告されている。
いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）が、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
リンカー
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
本発明の幾つかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含みうる。
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化又は還元条件、若しくは薬剤などの化学条件、並びに哺乳動物の細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも２つの連続するホスホジエステル結合を含むＤＮＡヌクレオシドなどの１～５個のヌクレオシドを含む。ホスホジエステルを含有する生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号パンフレットにより詳細に記載されている。
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、鎖構造、又はエチレングリコール、アミノ酸単位若しくはアミノアルキル基などの繰返し単位のオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
処置
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の処置、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。いくつかの実施形態では、処置は予防的ではなく、例えば、処置は、患者において診断された既存の疾患症状の処置である。
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、複数の独立したプレｍＲＮＡ転写物上のＲＮＡ結合部位、例えば複数のプレｍＲＮＡ転写物上のＴＤＰ－４３ ＲＮＡ結合部位に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばプレｍＲＮＡスプライシングの（独立した）調節、ＲＮＡ安定化の増強、コードされたタンパク質の発現の増強、プレｍＲＮＡによってコードされる切断型タンパク質の発現の減少を介して、複数のプレｍＲＮＡ転写物の発現を調節することができる。したがって、実施例に示されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、正確に発現された機能性タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡへのプレｍＲＮＡプロセシングの忠実度を高めるために使用され得る。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡ成熟の調節不全に関連する疾患の処置における使用に適し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸ＴＤＰ－４３結合領域との間に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又はそれ以上のミスマッチを含み得る。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＴＤＰ－４３ ＲＮＡ標的ＲＮＡの所望の調節を示すのに依然として十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシド、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
いくつかの実施形態では、イノシンなどの１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上のユニバーサルヌクレオシドをミスマッチ位置で使用することができる。
イノシンは、以下の構造を有するヌクレオシドである。
Figure 2023534557000004
ユニバーサルヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドが、非同一のＴＤＰ－４３結合領域を有する異なるＴＤＰ－４３標的ＲＮＡを標的とする場合に特に有用である。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に１つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に２つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に３つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に４つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に５つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に６つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に７つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＴＤＰ－４３結合部位又は標的配列に対するミスマッチを表す位置に８つ以上のユニバーサルヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、又は８つ以上の、ミスマッチを表す位置におけるユニバーサルヌクレオチドを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３２ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、又は８つ以上ミスマッチを含有する本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３２ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて、－１２ｋｃａｌ、－１５ｋｃａｌ、－１７ｋｃａｌ、－２０ｋｃａｌ、－３０ｋｃａｌ、－４０ｋｃａｌ、－５０ｋｃａｌ又は－６０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。
ΔＧ°値の計算については上述されている。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８の配列からなる群から選択される配列、又は配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列を含むか、又はそれからなる。配列番号１～１８に示される配列又は配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列は、塩基対形成において示される核酸塩基として機能する修飾核酸塩基を含んでいてもよく、例えば、メチルシトシンの代わりに５－メチルシトシンが使用され得ることが理解されるであろう。イノシンは、ユニバーサル塩基として使用され得る。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群より選択される配列又は配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列に対して少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９０％又はそれ以上の同一性を有する８～３０又は８～４０ヌクレオチド長を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１～１８からなる群より選択される配列又は配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列に対して１００％の同一性を有する８～３０又は８～４０ヌクレオチド長を含むか、又はそれからなる。
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸に対する結合親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。
修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。高親和性修飾ヌクレオシドを用いることが有利である。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６個の修飾ヌクレオシド、少なくとも１７個の修飾ヌクレオシド、少なくとも１８個の修飾ヌクレオシド、少なくとも１９個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２０個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２１個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２２個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２３個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２４個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２５個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２６個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２７個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２８個の修飾ヌクレオシド、少なくとも２９個の修飾ヌクレオシド、少なくとも３０個の修飾ヌクレオシド、少なくとも３１個の修飾ヌクレオシド、少なくとも３２個の修飾ヌクレオシド又はそれ以上を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾ヌクレオシド、例えば２～９個の修飾ヌクレオシド、例えば３～８個の修飾ヌクレオシド、例えば４～７個の修飾ヌクレオシド、例えば６又は７個の修飾ヌクレオシドを含む。好適な修飾は、「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」、及びロックド核酸（ＬＮＡ）の「定義」セクションに記載されている。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つ又は複数がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。
更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好適なヌクレオシド間修飾は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％、例えば全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート又はボラノホスフェート結合であれば有利である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの連続する配列中の全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
薬学的に許容され得る塩
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩を意図する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩である。
製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１５４巻第２８７～３１３頁を参照のこと）。さらなる実施形態において、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲーティング部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法が提供される。
医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される。
用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防法のための研究試薬として利用され得る。
研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、神経細胞などのインビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＴＤＰ－４３の活性を模倣し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。
本発明は、異常又は枯渇したレベルのＴＤＰ－４３を発現している細胞においてＴＤＰ－４３の機能性を増強するためのインビボ又はインビトロ方法などの方法を提供し、該方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、塩又は組成物を有効量で細胞に投与することを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物又はインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、正常なＴＤＰ－４３活性が枯渇しているニューロン細胞などのニューロン細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＴＤＰ－４３の疾患関連バリアントを発現し、及び／又は機能不全ＴＤＰ－４３を発現し得る。
治療のために、オリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ－４３を模倣することによって処置することができる疾患又は障害を有することが疑われる動物又はヒトに投与することができる。
本発明は、疾患を処置又は予防するための方法であって、治療的又は予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物を、疾患を患う、又はそれに罹り易い対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、組成物又はコンジュゲートに関する。
本発明に従ったオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
本発明はまた、本明細書で言及される障害の処置のための医薬の製造のため、又は本明細書で言及される障害の処置方法のための、上記本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
本発明はさらに、ＴＤＰ－４３の病理又は核からのＴＤＰ－４３の誤局在化を特徴とする神経変性障害、例えばＡＬＳなどの神経変性障害としての神経障害を処置するための医薬を製造するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物の使用に関する。
本発明はまた、本明細書で言及される障害を処置する方法で使用するための本発明のオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
一実施形態では、本発明は、ＴＤＰ－４３の病理又は核からのＴＤＰ－４３の誤局在化を特徴とする神経変性障害、例えばＡＬＳなどの神経変性障害としての神経障害の処置に使用するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物に関する。
投与
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、例えば、脳内、脳室内又は髄腔内投与によって投与され得る。
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射若しくは注入、髄腔内又は頭蓋内、例えば脳内又は脳室内、硝子体内投与を含む非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
実施例１－ＴＤＰ－４３枯渇神経細胞におけるＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡのスプライシングを補正する能力における一連の「ＴＤＰ－４３」模倣ＡＳＯの評価
使用した化合物：
化合物１，１～１９，１（化合物Ａ）
材料及び方法
細胞培養材料：
９６ウェル、黒色／透明、組織培養処理プレート－蓋付き平底、Ｆａｌｃｏｎ ３５３２１９
ラミニン５２１ Ｂｉｏｌａｍｉｎａ
ＤＰＢＳ（１Ｘ）ＣａＣｌ２＋／ＭｇＣｌ２＋、Ｇｉｂｃｏ １４０４０－０９１
ＤＡＰＴ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄ５９４２
ｉＣｅｌｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓキット、０１２７９ Ｃａｔ．Ｒ１０４９（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）
ＲＮＡ単離材料：
Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ９６キット、Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７４１９２
Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ Ｓｅｔ、Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７９２５４
ライブラリー調製材料：
ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｇｏｌｄ、Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号：２００２０５９９
細胞播種、維持及びＬＮＡオリゴヌクレオチド処理：
ヒトグルタミン酸作動性ニューロンを、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニンで被覆した９６ウェルプレートに２．０×１０５細胞／ｃｍ２でプレーティングした。ＴＤＰ－４３をノックダウンするために、細胞を３日目から５ｕＭで化合物Ａとインキュベートした。１０日目から、細胞をさらに化合物１，１～１８，１で１０ｕＭで７２時間処理し、次いで溶解緩衝液（キットと共に供給される）で溶解した。対照細胞を希釈剤単独（ＰＢＳ）で処理した。ＲＮＡ単離は、ＤＮａｓｅ処理工程を含み、製造業者の説明書に従って実施した。
ＴＤＰ－４３ ＬＮＡオリゴヌクレオチド－化合物Ａ：
配列番号１９，１＝ＴＣｃａｃａｃｔｇａａｃａＡＡＣＣ（大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、小文字はＤＮＡであり、ＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである）。
培地を除去し、１００ｕｌ／ウェル（９６ｍｗｐ）溶解緩衝液（ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｐｒｏ９６Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒキット）を添加した。ＲＮＡ精製は、ＤｎａｓｅＩ処理を含み、製造者の説明書に従って実施した（ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｐｒｏ ９６ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒキット）。
ＲＮＡシーケンシング分析
シーケンシングライブラリーを、ｒＲＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を除去するためにＲｉｂｏＺｅｒｏを有するＴｒｕＳｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリー調製プロトコルを使用して作製した。ライブラリーを、１５０ｂｐのリード長でＮｏｖａＳｅｑ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）においてペアエンドシーケンシングに供した。
試料：ＴＡＲＤＢＰ（ＴＤＰ－４３をコードする）標的化オリゴヌクレオチド１９，１及び一連のＴＤＰ－４３模倣ＡＳＯ、化合物１，１～１８，１を用いて及び用いずに処理したヒト運動ニューロン（ｈＭＮＳ）。Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗ（ｈｇ３８及びＣｕｆｆｌｉｎｋｓを用いたマッピング）を用いてデータ解析を行った。
潜在性エクソンを含有するＳＴＭＮ２の発現レベル及び野生型ＳＴＭＮ２のレベルを未処理対照細胞における発現レベル（１００％）に対して正規化し、結果表Ａに示し、図１～３に図示する。
以下の化合物は、ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＷＴ ＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡの発現増強をもたらした：５，１、１４，１、１，１、１５，５、１４，２、１５，１、６，１、６，４、１３，１、１５，４、９，１、１０，１、６，３、７，１、１８，１、８，１、７，３、１６，３、１４，４、１５，３、６，２、８，２、７，２、１８，３、１６，１、１６，２、１５，２、１８，２、及び８，３
以下の化合物は、対照細胞における発現レベルよりも高い、ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＷＴ ＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡの発現増強をもたらした：１８，１、８，１、７，３、１６，３、１４，４、１５，３、６，２、８，２、７，２、１８，３、１６，１、１６，２、１５，２、１８，２、及び８，３。これらの特に有効な化合物は、長さが１２～１８ｎｔｓの範囲であった。これらの特に有効な化合物は、約－１２～約－２１のｄＧのギブス自由エネルギーの範囲であった。
注目すべきは、最も有効な化合物が１８ｎｔｓの長さ及び約－２０のギブス自由エネルギーを有し、少なくとも約－１２のギブス自由エネルギーを有する少なくとも１２ヌクレオチド長の化合物が有利であることを示すことである。
以下の化合物は、ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＳＴＭＮ２異常スプライシングｍＲＮＡの発現を減少させた：１８，４、１６，１、１４，２、６，４、８，３、１８，３、８，１、１６，３、１４，３、６，３、１６，２、７，１、３，１、１５，５、７，３、１８，１、５，１、１５，３、１８，２、２，１、１５，４、及び１２，１。
以下のＴＤＰ－４３模倣オリゴヌクレオチド化合物は、ＷＴ ＳＴＭＮ２転写物と比較して、ＳＴＭＮ２転写物を含有するＳＴＭＮ２潜在性エクソンの比の顕著な低減をもたらした（１５０未満）：１６，１、８，３、１８，３、１８，４、１６，２、１８，２、７，２、１５，２、１６，３、１５，３、８，１、８，２、７，３、６，４、６，３、１８，１、７，１、１４，２、６，２、１４，４、１５，４、１０，１、１５，５。
図１～図３に示すように、より長い長さ（図１）及び／又はより低いギブス自由エネルギー（ΔＧ）（図２）を有する化合物が、ＴＤＰ－４３媒介性の正しいスプライシングを補正するのにより有効であるという明らかな傾向がある。注目すべきことに、オリゴヌクレオチド／ＲＮＡ二重鎖の融解温度は、ＴＤＰ－４３媒介スプライス補正の補正と相関することが見出されなかった（図３）。
Figure 2023534557000005
Figure 2023534557000006

Figure 2023534557000007

Figure 2023534557000008
実施例２－ヒト多能性幹細胞由来のニューロン培養、オリゴヌクレオチド処理及びＲＮＡ単離－ＴＤＰ－４３枯渇細胞における複数の独立したＲＮＡの異常なスプライシングを修正するためのＴＤＰ－４３模倣ＡＳＯの評価
使用したオリゴヌクレオチド
化合物Ａ：ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを標的とするＴＤＰ－４３、配列番号１９
ＴＣｃａｃａｃｔｇａａｃａＡＡＣＣ（大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、小文字はＤＮＡであり、ＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである）－本明細書では化合物＃１９，１と呼ぶ。
化合物Ｂ－ＳＴＭＮ２
ＳＴＭＮ２の発現を標的として上方調節するＬＮＡ／ＤＮＡミックスマー
化合物ＩＤ番号３６：ｍＣｓａｓｃｓＡｓｃｓＡｓｃｓＧｓｃｓＡｓｃｓＡｓｃｓａｓＴｓＧ（配列番号３６）
式中、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオチドであり、小文字は２’デオキシリボースヌクレオシド（ＤＮＡヌクレオシド）であり、ｍＣは５－メチルシトシンβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
化合物Ｃ－ＴＤＰ４３
ＬＮＡ／ＤＮＡ １８ ｎｔミックスマー（（８，３）の式
Ａｓ ｍＣｓＡｓｃｓａｓｃｓＡｓｃｓＡｓｃｓａｓｃｓＡｓｃｓＡｓｃｓａｍＣ（配列番号８）
式中、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオチドであり、小文字は２’デオキシリボースヌクレオシド（ＤＮＡヌクレオシド）であり、ｍＣは５－メチルシトシンβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
実験を実施するために使用した方法論は実施例１に記載した通りであったが、化合物Ａで前処理した後、細胞を化合物Ｂ若しくは化合物Ｃで処理したか、又は追加の化合物を用いなかった。
シーケンシングライブラリーを、ｒＲＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を除去するためにＲｉｂｏＺｅｒｏを有するＴｒｕＳｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリー調製プロトコルを使用して作製した。ライブラリーを、１５０ｂｐのリード長及び１億のペアエンドリードの平均出力でＮｏｖａＳｅｑ６０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）においてペアエンドシーケンシングに供した。リードのトリミング（短いリードの除去並びに３’末端から最後のヌクレオチドの除去）後にデータ分析を行った。リードをＴｏｐＨａｔ２の使用によってｈｇ３８に対してマッピングし、転写物の定量化をＣｕｆｆｌｉｎｋｓの使用によって行った。選択的スプライシング転写物の同定は、Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗに含まれるパイプラインを使用することによって行った。
ｍＲＮＡのシーケンシングはＦａｓｔｅｒｉｓ（スイス）で行った－シーケンシングは三連で行い、平均出力は１億対のエンドリードであった。リードのトリミング（短いリードの除去並びに３’末端から最後のヌクレオチドの除去）後にデータ分析を行った。リードをＴｏｐＨａｔ２の使用によってｈｇ３８に対してマッピングし、転写物の定量化をＣｕｆｆｌｉｎｋｓの使用によって行った。選択的スプライシング転写物の同定は、Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗに含まれるパイプラインを使用することによって行った。
結果
ＴＤＰ－４３は、いくつかのプレｍＲＮＡのカノニカルスプライシングにおいて重要であることが知られているので（Ｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５及びＨｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１７）、本発明者らは、化合物Ａ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃで処理したグルタネロン及び未処理細胞をシーケンシングすることを選択した。次世代シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を、ペアードエンド（ＰＥ）シーケンシング（２×１５０ｂｐ）として単離されたｍＲＮＡに対して行い、１億を超えるＰＥリードを得た。トランスクリプトーム内の選択的スプライシングを同定するために、サンプルあたり１億４００万個のＰＥリードを有するようにリードの数をサブサンプリングした（処理は三連で実施した）。
ＴＡＲＤＢＰに対するギャップマーでの処理後にＴＡＲＤＢＰが除去されたことを確認するために、ｍＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づいて発現レベルを調べた。ＴＤＰ－４３タンパク質をコードするＴＡＲＤＢＰの約７５倍のノックダウンが観察された（残りのＴＡＲＤＢＰ転写物は２％未満）（図４）。相対発現から分かるように、化合物Ａ＋Ｂ又はＡ＋Ｃによる処理は、ＴＡＲＤＢＰ ＡＳＯ（化合物Ａ）単独による処理と比較して、ＴＡＲＤＢＰの発現レベルを変化させなかった（図４）。
ＳＴＭＮ２
次に、本発明者らは、化合物Ａ（ＴＤＰ－４３ ＫＤ）で処理するとスプライシングパターンを変化させ、本発明者らのＴＤＰ－４３模倣オリゴ（化合物Ｃ）で処理すると回復し得る他の転写物を調査した。ＳＴＭＮ２のＴＤＰ－４３結合部位を標的とするＴＤＰ－４３模倣ＡＳＯを対照として含めた（化合物Ｂ）。最初に、本発明者らは、以前に公開された新しいスプライスアクセプター部位の包含が、本発明者らのＳＴＭＮ２特異的ＡＳＯ（化合物Ｂ）又は一般的なＴＤＰ－４３模倣ＡＳＯ（化合物Ｃ）によって影響されることに注目した。分析は、野生型（ｗｔ）ＳＴＭＮ２の量が化合物Ａ＋Ｂでの処理によって完全に回復し、化合物Ａ＋Ｃで部分的に回復したことを示した（図５Ａ及びＢ）。野生型ＳＴＭＮ２の回復は、ＴＤＰ－４３結合部位への結合を遮断し、それによってイントロン１におけるＳＴＭＮ２スプライスアクセプター部位の使用を妨げることに起因する。２０１９年に公開されたこの新しいスプライスアクセプター部位（Ｋｌｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１９及びＭｅｌａｍｅｄ ｅｔ ａｌ．２０１９）（ｃｈｒ８：７９，６１６，８２２に位置する）は、ＳＴＭＮ２エクソン２に通常使用されるアクセプター部位を置き換える。この新しいスプライスアクセプター部位の使用は、スプライスアクセプター部位に対して２０３ヌクレオチド３’のポリアデニル化部位の使用のために短縮されるスプライスバリアントをもたらす（図６）。
ＳＴＭＮ２は、正常なｈＭＮ伸長及び修復に必要なタンパク質をコードする。重要なことに、本発明者らは、ＳＴＭＮ２の翻訳後安定化が、ＴＤＰ－４３ノックダウンによって誘導される運動神経突起伸長及び軸索再生の欠損を救済し得ることを確立した。
Ｋｌｉｍ，Ｊ．Ｒ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ａ．，Ｌｉｍｏｎｅ，Ｆ．Ｅｔ ａｌ．ＡＬＳに関与するタンパク質ＴＤＰ－４３は、運動ニューロンの成長及び修復のメディエーターであるＳＴＭＮ２のレベルを維持する。Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２，１６７－１７９（２０１９）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９３－０１８－０３００－４
ＡＲＨＧＡＰ３２
代替転写と呼ばれる徹底的な調査により、別の遺伝子名がニューロンの発生及び維持に関与することが以前に示された。この遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ３２は、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３２をコードし、これは主に脳で発現され、適切なニューロンの発達及び維持に関与することが示されている。ＴＤＰ－４３のノックダウンは、ｐｏｓ．Ｃｈｒ１１：１２８９９２０４６における選択的スプライスアクセプター部位の使用をもたらす（図７に示すように実験的に検証され、図８のＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡ配列を参照して例示される遺伝子のＥＮＳＧ０００００１３４９０９位置２００１５３に選択的最終エクソンをもたらす－選択的スプライス部位は∧で示され、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡのフラグメントのみが図８に示され、また、本明細書において配列番号３５としても開示されることに留意されたい）。選択的スプライス部位の使用によって作り出された新しいエクソンはまた、スプライスアクセプター部位のそれぞれ下流２４７１及び２５３２ｎｔｓの、２つの可能なポリアデニル化部位を含む（図８の網掛け部分を参照されたい）。ＴＤＰ－４３がＴＡＲＤＢＰギャップマーで減少したグルタニューロン（すなわち、ＴＤＰ－４３枯渇細胞）の処理は、本発明のオリゴヌクレオチド（化合物Ｃ）の添加が選択的スプライスアクセプター部位の使用を減少させるのに対して、ＳＴＭＮ２標的化ミックスマー（化合物Ｂ）は効果がなかったことを示す（図７）。図８に示す第２のポリアデニル化部位の前には、潜在的なＴＤＰ－４３結合部位であるＧＵリピートＲＮＡ結合タンパク質配列がある（図８）。選択的スプライスアクセプター部位の使用の結果は、Ｃ末端切断型のＡＲＨＧＡＰ３２タンパク質を生成し、オープンリーディングフレームがこのバリアントの新しい最後のエクソン中に終止コドンを含むので、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３２の切断をもたらすことである。新規タンパク質バリアントは、２，０８７アミノ酸長である野生型Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３２と比較して、Ｃ末端に６個の新規アミノ酸を有する３９０アミノ酸長である。Ｒｈｏ－ＧＡＰドメインの大部分は、このバリアントでは欠けている。同じく欠如している野生型Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３２のＣ末端部分は、神経成長を調節する神経成長因子（ＮＧＦ）に対する高親和性受容体であるＴｒｋＡと直接相互作用することが示されている。
ＳＬＣ５Ａ７
選択的スプライスを示す別のプレｍＲＮＡは、高親和性コリントランスポーター１をコードするＳＬＣ５Ａ７転写物である。ＴＤＰ－４３タンパク質の喪失は、スプライスアクセプター部位（ｃｈｒ２：１０８，００７，３０７）及びスプライスドナー部位（ｃｈｒ２：１０８，００７，４００）の使用を増加させ、９４塩基対の長さを有する新規エクソン（ｃｈｒ２：１０８，００７，３０７－１０８，００７，４００）の封入をもたらす（図９）。相対的発現から分かるように、新規アイソフォームは、ＴＤＰ－４３のノックダウン時に６倍超増加する（化合物Ａ）。しかしながら、ＴＤＰ－４３模倣ＡＳＯ（化合物Ｃ）によるその後の処置は、この選択的エクソンの封入を完全になくしたので、この転写バリアントの発現プロファイルは未処置細胞に似ている（図９Ａ及びＢ）。このエクソン封入は、翻訳中のフレームシフト及び新規エクソン内の未熟な終止コドンをもたらし、３２６アミノ酸の潜在的な短縮型バリアントが生成される（野生型タンパク質は５８０アミノ酸長である（ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＱ９ＧＺＶ３）。高親和性コリントランスポーター１（ＳＬＣ５Ａ７）のＣ末端短縮は、運動ニューロン欠損を引き起こし、場合によってはＡＬＳの初期診断を引き起こすことが示されている（Ｓａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｎｅｕｒｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ａｐｒ；４（２）：ｅ２２２）。この観察されたエクソン封入のタンパク質結果は、Ｃ末端短縮を引き起こす突然変異を有する患者に見られるＣ末端短縮に似ている。
ＣＥＲＴ１
選択的スプライシングを示す別の転写物は、セラミド転移タンパク質又は（ＣＥＲＴ１）をコードするＣＥＲＴ１ ｍＲＮＡである。ＴＤＰ－４３の喪失は、新しいスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の使用をもたらし、ｈｇ３８ ｃｈｒ５：７５４１５１９７－７５４１５２３５（ＥＮＳＧ０００００１１３１６３における位置９６３９５～９６４３３）に位置する新規エクソンを封入する（図１１及び１２）。ＴＤＰ－４３（化合物Ａ）の喪失は新規アイソフォームを約１８倍増加させるが、ＳＴＭＮ２ ＡＳＯ（化合物Ａ＋Ｂ）及びＴＤＰ－４３模倣ＡＳＯ（化合物Ａ＋Ｃ）の両方によるその後の処置は、この新規のインフレームエクソンの封入を除去し、野生型細胞に類似した（図１１）。プレｍＲＮＡ内では、潜在性エクソンの後にいくつかの潜在的なＴＤＰ－４３結合部位が続く（図１２）。潜在性エクソンは３９ｂｐ長であり、それによってＯＲＦを変化させないが、セラミド転移タンパク質（ＣＥＲＴ１）内に１３アミノ酸を導入する。この結果は不明である。ＣＥＲＴ１は、小胞体（ＥＲ）からゴルジ体へのセラミドの移動を担う。セラミドはＥＲで合成され、次いで、ＣＥＲＴ１によってゴルジに移され、そこでスフィンゴミエリンに変換される。スフィンゴミエリンは、動物細胞膜、特にいくつかの神経細胞軸索を取り囲む膜状ミエリン鞘に見られるスフィンゴ脂質の一種である。セラミドシグナル伝達経路の調節は、いくつかの神経変性疾患及び神経炎症性疾患に関与している（Ｊａｎａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．２００９ Ｍａｒ １５；２７８（１－２）：５－１５）。
ＴＤＰ－４３標的化ＡＳＯ（化合物Ｂ及び化合物Ｃ）が同様の標的を有するかどうかを比較するために、選択基準をいくつか設定した選択的スプライシング転写物の分析を行った。ｐ値は０．０１未満であるべきであり、対照分析と比較して２倍を超える変化があるべきである。ＴＡＲＤＢＰのノックダウン時に選択的スプライシングを示す転写物の数は７４９であるが（化合物Ａ対未処理細胞）、最初のＴＡＲＤＢＰ ＫＤの後にＳＴＭＮ２標的化ＡＳＯを使用して選択的スプライシングされた転写物の数は６９１転写物であった（化合物Ａ＋Ｂ対化合物Ａ）。これらの６９１個の選択的に発現された転写物のうち、４８３個は、ＴＤＰ－４３ ＫＤから同定された転写物と重複していた。最後に、ＴＡＲＤＢＰノックダウン（ＫＤ、ＴＤＰ－４３枯渇）後のＴＤＰ－４３模倣ＡＳＯの比較を、ＴＡＲＤＢＰ ＫＤと比較した（化合物Ａ＋Ｃ対化合物Ａ）。これにより、未処理細胞に対する最初のＴＤＰ－４３ ＫＤで見られたものと同じ５０２個の選択的スプライシング転写物が明らかになった（図１３）。この分析は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＴＭＮ２に特異的に標的化される化合物と比較して、ＲＮＡスプライシングの調節に対してより包括的な効果を有することを示し、この結果は、ＳＴＭＮ２特異的化合物ＢがＴＤＰ－４３枯渇によって引き起こされる異常なスプライシングを補正することができず、本発明の化合物が有効であったＡＲＨＧＡＰ３２、ＳＬＣ５Ａ７及びＣＥＲＴ１の特異的転写物分析と完全に一致する。
実施例３：ＣＡリピートＡＳＯを使用したＴＤＰ４３の欠如によって引き起こされる誤ったｍＲＮＡスプライシングの救済。
ここで、本発明者らは、ＣＡリピートアンチセンスオリゴヌクレオチドがいくつかのＴＤＰ４３標的上で、適切なスプライシングを誘導する能力を示す（ＳＴＭＮ２、ＫＡＬＲＮ、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＣＥＲＴ１及びＵＮＣ１３Ａ）。
ＣＡＭＫ２Ｂ
選択的スプライシングを示す別のプレｍＲＮＡは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型サブユニットβをコードするＣＡＭＫ２Ｂ転写物であり、樹状突起スパイン及びシナプス形成並びに神経可塑性に関与する。ＣＡＮＫ２Ｂは、７番染色体：４４２１７１５０－４４３３４５７７：－１（ｈｇ３８）（ＥｎｓｅｍｂｌエントリーＥＮＳＧ００００００５８４０４）に位置する。
ＴＤＰ４３タンパク質の喪失は、位置ｃｈｒ７：４４，２３１，００４－４４，２３１，００５におけるカノニカルスプライスドナー部位の使用を減少させ、伸長したエクソンをもたらす。この配列内で、新規スプライスアクセプター部位は、ｃｈｒ７：４４，２２２，１１３－４４，２２２，１１４に位置するＴＤＰ４３タンパク質の喪失時にも使用される。したがって、新規エクソンは、ｃｈｒ７：４４，２２２，１１５－４４，２３１，０５４に位置する。このエクソンは８９３８ヌクレオチド長であり、多数の終止コドンを含み、ＣＡＭＫ２Ｂ ｍＲＮＡのナンセンス媒介性の崩壊をもたらす（図１４ｂ）。
ＫＡＬＲＮ
ＫＡＬＲＮ遺伝子（ＥｎｓｅｍｂｌエントリーＥＮＳＧ０００００１６０１４５）は、第３染色体（第３染色体：１２４，０３３，３６９－１２４，７２６，３２５）（ｈｇ３８）上に位置する。ＫＡＬＲＮは、Ｄｂｌ及びプレクストリン相同ドメインを有するハンチンチン関連タンパク質相互作用タンパク質、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕｏ又はセリン／トレオニン－プロテインキナーゼとしても知られるカリリンＲｈｏ ＧＥＦキナーゼをコードする。
ＴＤＰ４３タンパク質の喪失は、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡ内の２つの新規な選択的スプライスアクセプター部位（ｃｈｒ３：１２４，７００，９７７；ｃｈｒ３：１２４，７００，９７５－１２４，７００，９７６に位置するＡＧ）及びスプライスドナー部位（ｃｈｒ３：１２４，７０１，２５５，ｃｈｒ３：１２４，７０１，２５６－１２４，７０１，２５７に位置するＧＴ）の使用を増加させる（図１５ａ及び図１５ｂ）。これにより、２７９ヌクレオチドの新規エクソンの封入をもたらし（ｃｈｒ３：１２４，７００，９７７－１２４，７０１，２５５）、これは潜在的に９３アミノ酸をコードする。しかしながら、図１５ｃから分かるように、ＯＲＦは、斜体の下線付きＴＧＡで示されるナンセンスコドンに迅速に入る。
ＵＮＣ１３Ａ
ＵＮＣ１３Ａは、プロテインｕｎｃ－１３ホモログＡをコードする。ＵＮＣ１３Ａ遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌエントリー、ＥＮＳＧ０００００１３０４７７）は、第１９染色体：１７６０１３３６－１７６８８３６５：－１（ｈｇ３８）（マイナス鎖）に位置する。タンパク質ｕｎｃ－１３ホモログＡは、小胞融合の前のシナプス小胞プライミングに作用することによって神経伝達物質放出に関与し、容易に放出可能な小胞プール（ＲＲＰ）の活性依存的再充填に関与する。ほとんどの興奮性／グルタミン酸作動性シナプスにおけるシナプス小胞成熟に必須であるが、阻害性／ＧＡＢＡ媒介性シナプスでは必須ではない（ＵｎｉＰｒｏｔ）。ＵＮＣ１３Ａ遺伝子内のバリアントは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）のリスクを増加させることが長い間知られており、最近の２つの論文では、ＴＤＰ ４３喪失時に潜在性エクソンの封入が記載された（Ａｎｎａ－Ｌｅｉｇｈ Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，「Ｃｏｍｍｏｎ ＡＬＳ／ＦＴＤ ｒｉｓｋ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ＵＮＣ１３Ａ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ｉｔｓ ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｓｓ ｕｐｏｎ ＴＤＰ－４３ ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ」ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．０２．４３８１７０；ｄｏｉ：’ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０４．０２．４３８１７０；Ｘ．Ｒｏｓａ Ｍａ ｅｔ ａｌ．，ＴＤＰ－４３ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｃｒｙｐｔｉｃ ｅｘｏｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ＦＴＤ／ＡＬＳ ｇｅｎｅ ＵＮＣ１３Ａ，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．０２．４３８２１３ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０４．０２．４３８２１３）。さらに、２つの既知の多型が、ＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡ内のＴＤＰ－４３結合を変化させ、それにより潜在性エクソンの封入をもたらすＡＬＳ／ＦＴＤリスクと強く関連する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，２０２１）。
本発明者らのデータは、以下に記載されるように、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，２０２１によって記載された潜在性エクソンの封入を同様に示す。ＴＤＰ４３が失われると、ＵＮＣ１３Ａ内の２つのエクソンが、選択的スプライスアクセプター部位及びスプライスドナー部位の使用によって観察される。一方のエクソンは１２８ヌクレオチド長であり、１９番染色体：１７，６４２，４１４－１７，６４２，５４１上に位置し、他方は１７８ヌクレオチド長であり、１９番染色体：１７，６４２，４１４－１７，６４２，５９１上に位置する（図１６ａ）。２つのエクソンは重複しており、同じスプライスアクセプター部位ｃｈｒ１９：１７，６４２，４１４を使用するが、スプライスドナー部位は異なり、それぞれｃｈｒ１９：１７，６４２，５９１及びｃｈｒ１９：１７，６４２，５４１である（図１６ｂ及び図１６ｃ）。両方のエクソンがＵＮＣ１３Ａのオープンリーディングフレームを破壊している（図１６ａ）。
ヒトグルタミン酸作動性ニューロン（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を、０日目に、２００ｕｌ培養培地中、ラミニン及びポリ（エチレンイミン）溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした９６ウェルプレートあたり６００００細胞で播種した。実験全体の間、細胞培養培地の半分を週に３回交換した（１、５、８、１１、１３、１５日目）。ＴＤＰ－４３をノックダウンするために、化合物Ａ（配列番号１９，１）を１日目及び８日目に５ｕＭで培養培地に添加した（２つの対照ウェルを除く）。ＣＡリピートアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養培地に５日目及び１３日目に１０ｕＭで添加した。合計４８個の異なるＣＡリピートアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した。１２ウェルに、ベースライン基準としての役割を果たすために化合物Ａ（配列番号１９，１）のみを入れた。
Ｍａｇｎａｐｕｒｅ溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞を１８日目に回収し、ＤＮａｓｅ処理工程を含み製造業者の指示に従ってＲＮＡをＭａｇＮＡ ｐｕｒｅ ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）で単離した。精製ＲＮＡを９０で３０ｓｅｋ（３０ ｓｅｋ ａｔ ９０）変性させた後、ｃＤＮＡ合成を行った。ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｂｉｏｒａｄ）を製造者の説明書に従って使用してｃＤＮＡを作成した。
標的遺伝子の発現レベルの測定は、ＱＸ１システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した液滴デジタルＰＣＲによって行った。正常にスプライシングされた標的ｍＲＮＡの発現を測定するために使用されるｐｃｒプローブアッセイは、２つのエクソンにまたがるように設計され、その間に新たな「変異」エクソンが生じるであろう。
結果表Ｂに示されるデータを、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化し、最後に、ＴＤＰ４３ノックダウン又はＣＡリピートアンチセンスオリゴヌクレオチドを受けなかった２つの対照ウェル（ＰＢＳ）の平均発現値に対して正規化した。
（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ））で合成した以下のＰＣＲプローブアッセイを使用した：
ＴＡＲＤＢＰ
プライマー１：ＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣ（配列番号４４）
プライマー２：ＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣ（配列番号４５）
プローブ：／５Ｃｙ５／ＣＡＧＣＧＣＣＣＣＡＣＡＡＡＣＡＣＴＴＴＴＣＴ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／配列番号１０４）
ＳＴＭＮ２
プライマー１：ＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＣ（配列番号１０５）
プライマー２：ＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧ（配列番号１０６）
プローブ：／５ＨＥＸ／ＣＴＡＡＡＡＣＡＧ／ＺＥＮ／ＣＡＡＴＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１０７）
ＣＥＲＴ１
プライマー１：ＣＴＡＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＧＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号１０８）
プライマー２：ＡＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧ（配列番号１０９）
プローブ：／５ＨＥＸ／ＣＡＧＡＡＧＡＧＡ／ＺＥＮ／ＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１１０）
ＫＡＬＲＮ
プライマー１：ＣＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＴＧ（配列番号１１１）
プライマー２：ＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣ（配列番号１１２）
プローブ：／５ＨＥＸ／ＣＧＡＣＴＴＣＣＡ／ＺＥＮ／ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１１３）
ＣＡＭＫ２Ｂ
プライマー１：ＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣ（配列番号１１４）
プライマー２：ＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＡＡＴ（配列番号１１５）
プローブ：／５Ｃｙ５／ＡＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＧ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号１１６）
ＵＮＣ１３Ａ
プライマー１：ＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧ（配列番号１１７）
プライマー２：ＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣ（配列番号１１８）
プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＡＣＣＴＧＴＣＴＧ／ＺＥＮ／ＣＡＴＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣＴＴＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１１９）
以下のＣＹ５．５標識ＨＰＲＴ１プローブをＢｉｏＲａｄから購入した：ｄＨｓａＣＰＥ１３１３６１０７。
結果表Ｂ：遺伝子ＴＡＲＤＢＰ、ＳＴＭＮ２、ＣＥＲＴ１、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＫＡＬＲＮ及びＵＮＣ１３Ａ．の発現値を表示する。発現を、未処置グルタニューロン（ＰＢＳ）の平均と比較した発現パーセンテージとして示す。見ることができるように、いくつかのＣＡ反復アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＤＰ４３ノックダウンアンチセンスオリゴヌクレオチドＴＤＰ４３ ＫＤ（配列番号１９，１）のみで処理した細胞と比較して、標的遺伝子の発現を上昇させることができる。
Figure 2023534557000009
Figure 2023534557000010

Figure 2023534557000011

Figure 2023534557000012

Figure 2023534557000013
実施例４－ＣＡリピートに富むＡＳＯを使用したＴＤＰ４３の欠如によって引き起こされる誤ったｍＲＮＡスプライシングの救済。
いくつかの配列変異を含むＣＡリピートＡＳＯが依然としてＴＤＰ４３の欠如によって引き起こされる誤ったｍＲＮＡスプライシングを修正することができることを示すために、本発明者らは最大５ヌクレオチドの変化を有するＣＡリピートＡＳＯを作製し、それらが依然としてｍＲＮＡスプライシングを修正することができることを示す。これらのＣＡリピートに富むＡＳＯを、ＴＤＰ４３の非存在下で３つの既知のＴＤＰ４３標的（ＳＴＭＮ２、ＫＡＬＲＮ、ＣＡＭＫ２Ｂ）に対する適切なスプライシングを誘導する能力について試験する。
ヒトグルタミン酸作動性ニューロン（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を、０日目に、２００ｕｌ培養培地中、ラミニン及びポリ（エチレンイミン）溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした９６ウェルプレートあたり６００００細胞で播種した。実験全体の間、細胞培養培地の半分を週に３回交換した（１、３、６、８、１０、１３、１５日目）。ＴＤＰ－４３をノックダウンするために、化合物Ａ（配列番号１９，１）を１日目及び８日目に５ｕＭで培養培地に添加した（４つの対照ウェルを除く）。ＣＡリピートに富むＡＳＯを培養培地に１０日目及び１３日目に１０ｕＭで添加した。以下の表Ｃに示すように、６０の異なるＣＡリピートに富むＡＳＯを添加した。１０ウェルに、ベースライン基準としての役割を果たすために化合物Ａ（配列番号１９，１）のみを入れた。
Ｍａｇｎａｐｕｒｅ溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞を１６日目に回収し、ＤＮａｓｅ処理工程を含み製造業者の指示に従ってＲＮＡをＭａｇＮＡ ｐｕｒｅ ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）で単離した。精製ＲＮＡを９０Ｃで３０ｓｅｋ（３０ ｓｅｋ ａｔ ９０Ｃ）変性させた後、ｃＤＮＡ合成を行った。ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｂｉｏｒａｄ）を製造者の説明書に従って使用してｃＤＮＡを作成した。
標的遺伝子の発現レベルの測定は、ＱＸ１システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した液滴デジタルＰＣＲによって行った。正常にスプライシングされた標的ｍＲＮＡの発現を測定するために使用されるｐｃｒプローブアッセイは、２つのエクソンにまたがるように設計され、その間に新たな「変異」エクソンが生じるであろう。
表Ｃに示されるデータを、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化し、最後に、ＴＤＰ４３ノックダウン又はＣＡリピートＡＳＯを受けなかった２つの対照ウェル（ＰＢＳ）の平均発現値に対して正規化した。
（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ））で合成した以下のＰＣＲプローブアッセイを使用した（ＴＡＲＤＢＰ）：
プライマー１：ＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣ（配列番号４４）
プライマー２：ＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣ（配列番号４５）
プローブ：／５Ｃｙ５／ＣＡＧＣＧＣＣＣＣＡＣＡＡＡＣＡＣＴＴＴＴＣＴ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／）（配列番号１０４）
ＳＴＭＮ２：
プライマー１：ＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＣ（配列番号１０５）
プライマー２：ＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧ（配列番号１０６）
プローブ：／５ＨＥＸ／ＣＴＡＡＡＡＣＡＧ／ＺＥＮ／ＣＡＡＴＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／）（配列番号１０７）
ＫＡＬＲＮ：
プライマー１：ＣＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＴＴＧ（配列番号１１１）
プライマー２：ＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣ（配列番号１１２）
プローブ：／５ＨＥＸ／ＣＧＡＣＴＴＣＣＡ／ＺＥＮ／ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／）（配列番号１１３）
ＣＡＭＫ２Ｂ：
プライマー１：ＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣ（配列番号１１４）
プライマー２：ＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＡＡＴ（配列番号１１５）
プローブ：／５Ｃｙ５／ＡＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＧ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／）（配列番号１１６）
以下のＣＹ５．５標識ＨＰＲＴ１プローブをＢｉｏＲａｄから購入した：ｄＨｓａＣＰＥ１３１３６１０７。
結果表Ｃ－遺伝子の発現値を示す：ＴＤＰ４３、ＣＡＮＫ２Ｂ、ＳＴＭＮ２及びＫＡＬＲＮ。発現を、未処置グルタニューロン（ＰＢＳ）の平均と比較した発現パーセンテージとして示す。
Figure 2023534557000014
Figure 2023534557000015
特定の参考文献
Ｓａｌｔｅｒ ＣＧ，Ｂｅｉｊｅｒ Ｄ，Ｈａｒｄｙ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ ＳＬＣ５Ａ７ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒｌｉｅ ａ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｎｅｕｒｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１８；４（２）：ｅ２２２．
Ｙｕｋｉｋｏ Ｎａｓｕ－Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ １，Ｔｏｍｏａｔｓｕ Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔｏｍｏｈｉｒｏ Ｏｈｉｓｈｉ，Ｔｏｓｈｉｏ Ｏｋａｂｅ，Ｓｕｓｕｍｕ Ｏｈｗａｄａ，Ｙｏｓｈｉｍｉ Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔａｋａｏ Ｓｅｎｄａ，Ｃｈｉｋａｓｈｉ Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，Ｔｓｕｔｏｍｕ Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔｅｔｓｕ Ａｋｉｙａｍａ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＣＳ ｉｎ Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００６ Ｊｕｎ；１１（６）：６０７－１４．
Ａｒｕｎｄｈａｔｉ Ｊａｎａ，Ｅｄｗａｒｄ Ｌ．Ｈｏｇａｎ，ａｎｄ Ｋａｌｉｐａｄａ Ｐａｈａｎ．Ｃｅｒａｍｉｄｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｄｅａｔｈ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．２００９ Ｍａｒ １５；２７８（１－２）：５－１５．
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Claims (57)

  1. ８～４０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（５’－３’）（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される配列に相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、ＴＤＰ－４３が枯渇した細胞又は異常なＴＤＰ－４３タンパク質を発現している細胞において、１つ又は複数のＴＤＰ－４３標的ＲＮＡの機能的表現型を回復させることができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 医薬における使用のための、８～４０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（５’－３’）（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％相補性又は１００％相補性を有する少なくとも８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. ＴＤＰ－４３病理を特徴とする疾患の処置における使用のための、８～４０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、（５’－３’）（ＵＧ）ｎ、（ＧＵ）ｎ［式中、ｎは４～２０である］、ＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ、及びＧＵＧＡＡＵＧＡからなる群から選択される配列に対して少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％相補性又は１００％相補性を有する少なくとも８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. 前記連続ヌクレオチド配列が、１つ又は複数の修飾ヌクレオシドを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項２若しくは請求項４に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. 前記連続ヌクレオチド配列が、配列ＣＡＣＡＣＡＣＡ若しくは配列ＡＣＡＣＡＣＡＣ；又は配列番号１～１８からなる群から選択される配列、若しくは配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. 前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  7. 前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２ヌクレオチド長である、請求項１～６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  8. 前記連続ヌクレオチド配列が、標的配列に対して少なくとも７５％相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  9. 前記連続ヌクレオチド配列が、標的配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相補的である、請求項１～８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  10. 前記連続ヌクレオチド配列が、標的配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるミスマッチを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  11. 相補的標的ＲＮＡに対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのギブス自由エネルギーが、約－１０ΔＧ未満、例えば約－１５ΔＧ未満、例えば約－１７ΔＧ未満である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  12. ２つ以上のＴＤＰ－４３標的プレｍＲＮＡのスプライシングを調節することができる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  13. 前記２つ以上のＴＤＰ－４３標的ＲＮＡが、ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡ、ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡ、ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡ、ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡ、ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡ、ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡ、ＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡからなる群から独立して選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  14. ＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＳＴＭＮ２ ｍＲＮＡ、ＡＲＨＧＡＰ３２ ｍＲＮＡ、ＳＬＣ５Ａ７ ｍＲＮＡ、ＣＥＲＴ１ ｍＲＮＡ、ＣＡＭＫ２Ｂ ｍＲＮＡ、ＫＡＬＲＮ ｍＲＮＡ及びＵＮＣ１３Ａ ｍＲＮＡからなる群から選択される２つ以上のｍＲＮＡのプレｍＲＮＡスプライシングの忠実度を高めることができる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  15. ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＳＴＭＮ２の発現を増加させることができる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  16. ＳＴＭＮ２プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、隣接するエクソン１／エクソン２接合部を有する野生型ＳＴＭＮ２成熟ｍＲＮＡと比較して、エクソン１とエクソン２との間に潜在性エクソン（ｃｅ１）を含むＳＴＭＮ２成熟ｍＲＮＡの割合を減少させることができる、請求項１～１５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  17. ＡＲＨＧＡＰ３２プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、異常にスプライシングされたＡＲＨＧＡＰ３２成熟ｍＲＮＡのレベルを減少させることができる、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  18. ＳＬＣ５Ａ７プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＳＬＣ５Ａ７ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる、請求項１～１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  19. ＣＥＲＴ１プレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＣＥＲＴ１ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる、請求項１～１８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  20. ＣＡＭＫ２ＢプレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＣＡＭＫ２Ｂ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる、請求項１～１９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  21. ＫＡＬＲＮプレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＫＡＬＲＮ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる、請求項１～２０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  22. ＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡを発現しているＴＤＰ－４３枯渇細胞に投与した場合に、ＵＮＣ１３Ａ ｍＲＮＡ転写物中の異常なエクソン封入のレベルを減少させることができる、請求項１～２１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  23. ＴＤＰ－４３枯渇細胞におけるＳＴＭＮ２、ＣＥＲＴ１、ＳＬＣ５Ａ７及びＡＲＨＧＡＰ３２、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＫＡＬＲＮ及びＵＮＣ１３ＡプレｍＲＮＡのうちの２つ以上の異常なスプライシングを修正することができる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  24. ３個を超えるか、又は４個を超える連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含まない、請求項１～２３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  25. ＲＮＡｓｅＨ切断を媒介することができない、請求項１～２４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  26. モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４～２５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  27. 前記１つ又は複数の修飾ヌクレオシドが、２’糖修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項４～２６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  28. 前記２’糖修飾ヌクレオシドが、親和性向上２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  29. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記連続ヌクレオチド配列が、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、請求項４～２５、２７又は２８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
  30. 前記連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシドが、任意にホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結された２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）ヌクレオシドである、請求項２９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  31. 前記修飾ヌクレオシドの１つ又は複数が、ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）、例えば、拘束型エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）及びβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡからなる群から選択されるＬＮＡヌクレオシドである、請求項４～２５、２７又は２８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  32. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの前記連続ヌクレオチド配列が、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むか、又はＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドからなる、請求項３１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  33. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、ミックスマー又はトータルマーである、請求項４～２５又は２７～３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  34. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列、配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列、又はそれらの少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  35. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、配列番号１～１８からなる群から選択される核酸塩基の配列又は配列番号１～３４及び配列番号５０～１０３から選択される配列の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７個の連続ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  36. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中に存在するシトシン塩基が、シトシン及び５－メチルシトシンからなる群から独立して選択される、請求項４～３５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  37. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中に存在するシトシン塩基が５－メチルシトシンである、請求項４～３６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  38. 前記連続ヌクレオチド配列上のヌクレオシド間に位置するヌクレオシド間結合の１つ又は複数が修飾されている、請求項４～３７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  39. 前記連続ヌクレオチド配列上のヌクレオシド間に位置するヌクレオシド間結合の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％が修飾されている、請求項４～３８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
  40. 修飾された前記ヌクレオシド間結合の１つ若しくは複数又は全てがホスホロチオエート結合を含む、請求項３８又は３９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  41. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中に存在する全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項４～２５又は２７～４０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用。
  42. 前記連続ヌクレオチド配列の長さが８～２０ヌクレオチドである、請求項１～４１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  43. 前記連続ヌクレオチド配列の長さが１２～１８ヌクレオチドである、請求項１～４１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  44. 前記連続ヌクレオチド配列の長さが、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドである、請求項１～４１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  45. 前記連続ヌクレオチド配列からなる、請求項１～４４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  46. １６，１、８，３、１８，３、１８，４、１６，２、１８，２、７，２、１５，２、１６，３、１５，３、８，１、８，２、７，３、６，４、６，３、１８，１、７，１、１４，２、６，２、１４，４、１５，４、１０，１、及び１５，５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれからなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  47. 請求項１～４６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
  48. 請求項１～４６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項４７に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容され得る塩。
  49. ナトリウム塩又はカリウム塩である、請求項４６に記載の塩。
  50. 請求項１～４６に記載のオリゴヌクレオチド若しくは使用のためのオリゴヌクレオチド、又は請求項４７に記載のコンジュゲート、又は請求項４８若しくは４９に記載の薬学的塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む、医薬組成物。
  51. 異常又は枯渇したレベルのＴＤＰ－４３を発現している細胞においてＴＤＰ－４３の機能性を増強するためのインビボ又はインビトロ方法などの方法であって、請求項１～４６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項４７に記載のコンジュゲート、又は請求項４８若しくは４９に記載の塩、又は請求項５０に記載の組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
  52. 対象におけるＴＤＰ－４３病理を処置又は予防するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の請求項１～４６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項４７に記載のコンジュゲート、又は請求項４８若しくは４９に記載の塩、又は請求項５０に記載の組成物を、前記ＴＤＰ－４３病理に罹患しているか、又は罹患しやすい対象に投与することを含む、方法。
  53. 医薬としての使用のための、請求項１～４６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項４７に記載のコンジュゲート、又は請求項４８若しくは４９に記載の塩、又は請求項５０に記載の組成物。
  54. ＴＤＰ－４３病理の処置における使用のための、請求項１～４６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項４７に記載のコンジュゲート、又は請求項４８若しくは４９に記載の塩、又は請求項５０に記載の組成物。
  55. ＴＤＰ－４３病理の処置又は予防のための医薬の調製のための、請求項１～４６に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項４７に記載のコンジュゲート、又は請求項４８若しくは４９に記載の塩、又は請求項５０に記載の組成物の使用。
  56. 前記ＴＤＰ－４３病理が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、アルツハイマー病、パーキンソン病、自閉症、海馬硬化性認知症、ダウン症候群、ハンチントン病、ポリグルタミン病、例えば脊髄小脳失調症３、ミオパシー及び慢性外傷性脳症からなる群から選択される神経障害である、請求項１～５５のいずれか一項に記載の使用、オリゴヌクレオチド又は方法。
  57. 前記ＴＤＰ－４３病理が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）からなる群から選択される神経障害である、請求項１～５６のいずれか一項に記載の使用、オリゴヌクレオチド又は方法。
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