KR20240004467A - Tdp-43 단백질병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Tdp-43 단백질병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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네이선 살레
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Abstract

본 개시내용은 대상체에서 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 단백질병증을 치료하거나, UNC13A의 인트론 20-21에서의 UNC13A 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 대상체를 치료하는 세포에서 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현을 감소시키거나, 세포에서 인산화된 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43)을 감소시키는 방법에 대한 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제의 용도에 관한 것이다. UNC13A 은성 스플라이스 변이체에 대항하여 지향된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 또한 고려된다.

Description

TDP-43 단백질병증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
서열 목록에 관한 성명
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되고, 본원에 의해 본 명세서로 참고로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 630264_403WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 243 KB이고, 2022년 4월 5일에 작성되고, EFS 웹을 통해 전자로 제출된다.
신경퇴행성 질환인 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 전두측두 치매(FTD)의 특질 병리학적 특징은 뇌 및 척수에서의 뉴런의 핵으로부터의 RNA-결합 단백질 TDP-43의 고갈이다. TARDBP에 의해 암호화된 TDP-43은 핵으로 보통 국재화하는 풍부한 편재하여 발현된 RNA-결합 단백질이다. 이것은 RNA 전사, 대안적인 스플라이싱 및 RNA 수송을 포함하는 기본적인 RNA 가공 활성에서 역할을 한다(1). TDP-43은 수천개의 프리-메신저 RNA/mRNA 표적에 결합할 수 있다(2, 3). 달리 정상인 성인 신경계로부터의 TDP-43의 감소는 긴 인트론 함유 전사체를 포함하는 1,500개 초과의 RNA의 스플라이싱 또는 발현 수준을 변경한다(2). TDP-43의 주요 스플라이싱 조절 기능은 스플라이싱 동안 은성 엑손의 봉입을 억제하는 것이다(4-7). 정상 보존된 엑손과 달리, 이 은성 엑손은 인트론에 잠복해 있고, 보통 성숙 mRNA로부터 배제된다. TDP-43이 세포로부터 고갈될 때, 이 은성 엑손은 메신저 RNA로 스플라이싱되어서, mRNA의 프레임 쉬프트 및 조기 종료 또는 심지어 비센스 매개된 감퇴를 도입한다. 그러나, 질환의 핵심인 은성 스플라이싱 사건은 확인되도록 남아 있다. 따라서, TDP-43에 의해 조절되고 또한 치료학적 표적으로서의 TDP-43 단백질병증의 발병에서 역할을 하는 은성 스플라이싱 표적의 발견이 필요하다.
일 양태에서, 본 개시내용은 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 세포에서 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현을 감소시키는 방법을 제공하고, (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고; (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 세포에서 인산화된 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43)을 감소시키는 방법을 제공하고, (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고; (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 단백질병증을 치료하는 방법을 제공하고, (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고; (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
더 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 인트론 20-21에서 UNC13A 유전자 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고; (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태에서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 염기 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8을 포함한다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 (a) 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역; (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역; (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는 (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태에서, UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어지거나; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어지거나; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어지거나; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 15개 내지 40개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는다. 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는다. 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491- 498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는다.
실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나; (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나; (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나; (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나; (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 실시형태에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 개시내용은 또한 15개 내지 40개의 염기를 갖고 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기; (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기; (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기; (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기; 또는 (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 15개 내지 40개의 염기를 갖고 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
더 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 15개 내지 40개의 염기를 갖는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하고, 염기 서열은 (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1a-1j. TDP-43의 핵 고갈은 UNC13A RNA에서 은성 엑손 봉입 및 UNC13A 단백질의 감소된 발현을 야기한다. 도 1a: 7명의 FTD/FTD-ALS 환자의 전두 피질로부터 단리된 TDP-43-양성 및 TDP-43-음성 뉴런 핵으로부터 생성된 RNA 시퀀싱 결과에서 스플라이싱 분석을 수행하였다. FACS, 형광 활성화 세포 분류. 도 1b: MAJIQ(P(ΔΨ>0.1)>0.95)(ΔΨ, 2개의 조건 사이에 국소 스플라이싱 변이의 변경) 및 LeafCutter(P < 0.05) 둘 다에 의해 확인된 65개의 대안적으로 스플라이싱된 유전자. 도 1c: UNC13A(hg38)에서의 엑손 20과 엑손 21 사이의 RNA 시퀀싱 정렬의 가시화. (도 1a)에 기재된 것처럼 라이브러리를 생성하였다. CE, 은성 엑손. 도 1d: TDP-43에 대한 iCLIP는 TDP-43이 인트론 20-21에 결합한다는 것을 나타낸다. TDP-43에 의해 흔히 결합된 인트론 20-21에서의 영역의 예. TDP-43 결합 모티프 (UG)n은 오렌지색으로 강조된다. 도 1e 및 도 1h: RT-qPCR은 SH-SY5Y 세포(각각의 조건에 대해 5개의 독립 세포 배양 실험)(도 1e) 및 3개의 독립 유도 운동 뉴런(iMN)(각각의 iMN에 대해 4개의 독립 세포 배양 실험)(도 1h)에서 TDP-43 고갈 시 UNC13A mRNA에서의 은성 엑손의 봉입을 확인시켜 주었다. 은성 엑손 연관된 영역에 이르는 프라이머의 위치가 도시되어 있다. RPLP0은 qRT-PCR을 정규화하도록 사용되었다. (2측 Welch 2개 샘플 t-시험, *P<0.05, **P<0.01, ***P < 0.001, ****P<0.0001; 평균 ± s.e.m.). 도 1f 및 도 1i: 스크램블 shRNA 또는 TDP-43 shRNA(n=3)로 처리된 SH-SY5Y 세포(도 1f) 및 iMN(도 1i)에서 UNC13A 단백질 및 TDP-43의 면역블로팅. GAPDH는 로딩 대조군으로서 작용하였다. 도 1g: (도 1f)에서의 블롯의 정량화(2측 Welch 2개 샘플 t-시험, *P<0.05, **P<0.01). 도 1j: RT-qPCR(n=5) 분석은 인간 iPS 세포로부터 유래된 뉴런에서 TDP-43 고갈 시 UNC13A 은성 엑손의 봉입을 확인시켜 주었다(3개의 독립 세포 배양 실험). RPLP0 및 GAPDH는 qRT-PCR을 정규화하도록 사용되었다(2측 Welch 2개 샘플 t-시험; ***P < 0.001, ****P<0.0001; 평균 ± s.e.m.).
도 2a-2d. 인간 TDP-43 단백질병증에서의 UNC13A 은성 엑손 봉입. 도 2a: UNC13A 은성 엑손 발현 수준은 FTLD-TDP 환자의 전두 피질에서 유의미하게 증가된다. 은성 엑손 검출에 사용된 qRT-PCR 프라이머 쌍은 상부에 도시되어 있다. GAPDH 및 RPLP0은 qRT-PCR을 정규화하도록 사용되었다(2측 Mann-Whitney 시험, ****P<0.0001; 오차 막대는 95% 신뢰 간격을 나타낸다). 도 2b: UNC13A 은성 엑손은 NYGC ALS Consortium 코호트에서 신경병리학적으로 확인된 FTLD-TDP 환자로부터의 전두 피질 조직 및 측두 피질 조직의 거의 50%에서 검출된다. 은성 엑손은 또한 건강한 대조군, FTLD-FUS, FTLD-TAU 및 ALS-SOD1 환자로부터의 조직에서 특히 부재한다. 도 2c: UNC13A 은성 엑손 신호는 메이요 클리닉(Mayo Clinic) 브레인 뱅크에서 FTLD-TDP 환자의 전두 피질에서 인산화된 TDP-43 수준과 양으로 상관된다(스피어만 rho = 0.572, p-값 <0.0001). 데이터 점은 환자의 보고된 유전 돌연변이에 따라 색상 표시된다. 도 2d: UNC13A 은성 엑손 신호와 인산화된 TDP-43 수준 사이의 스피어만 상관관계. 녹색 색상의 열은 각각의 유전 돌연변이 그룹 내에 상관관계를 나타낸다. 청색 색상의 열은 각각의 질환 그룹 내의 상관관계를 보여준다.
도 3a-3b. UNC13A 은성 스플라이싱은 핵 TDP-43의 손실과 연관된 인간 뇌에서의 병리학적 특징이다. 도 3a: BaseScope™ 인시츄 혼성화 및 면역형광을 내측 전두극으로부터의 절편에서 수행하였다. 대표적인 영상은 핵 TDP-43의 고갈을 보여주는 뉴런에서의 UNC13A 은성 엑손(화살촉)의 존재를 예시한다. 환자 및 대상체에서의 정상 핵 TDP-43을 갖는 뉴런은 은성 엑손을 보여주지 않는다(화살표). 도 3b: 내측 전두극으로부터의 층 2-3 뉴런에서의 UNC13A mRNA의 발현을 보여주는 대표적인 영상. BaseScope™ 인시츄 혼성화는 정규 엑손 20/21 연접부를 표적화하는 프로브를 사용하여 UNC13A mRNA를 가시화하도록 사용되고, TDP-43 및 NeuN에 대해 면역형광과 조합되었다. UNC13A mRNA 발현은 뉴런으로 제한된다(화살표). 영상은 공초점 영상 Z-스택의 최대 강도 투영이다. 기준자는 10 μm이다.
도 4a-4j. ALS/FTD 감수성과 연관된 위험 일배체형은 TDP-43이 기능이상일 때 은성 엑손 봉입을 강화시킨다. 도 4a: UNC13A에서 ALS/FTD와 연관된 SNP를 보여주는 LocusZoom 선도. rs12608932인 가장 상당한 GWAS 히트는 기준이도록 선택된다. 다른 SNP는 EUR 집단에서 rs12608932와 연결 평형의 이의 수준에 기초하여 색상 표시된다. rs12608932 및 rs12973192인 인트론 20-21에서의 2개의 SNP(검정색 삼각형)는 강한 연결 불평형에 있다. 도 4b: UNC13A 스플라이스 변이체에서 rs12973192에서의 위험 대립유전자(G)의 더 높은 봉입이 있다(2측 쌍별 t-시험, **P = 0.0094). 단순 선형 회귀 모델(도 4c) 및 다중 회귀 모델(도 4d) 둘 다는 UNC13A 은성 엑손의 풍부도와 위험 대립유전자의 수 사이의 강한 상관관계를 보여준다. 잔기의 정규성은 Shapiro-Wilk 정규성 시험에 의해 시험된다(p-값 = 0.2604). 도 4d: 예측자 변수로서 rs12973192에서의 위험 대립유전자의 수, TDP-43 인산화 수준, 성별, 보고된 유전 돌연변이를 사용한 다중 회귀 분석의 요약 결과. 동일한 색상으로 색상 표시된 열은 동일한 변수 내의 인자를 나타낸다. 잔기의 정규성은 Shapiro-Wilk 정규성 시험에 의해 시험된다(p-값 = 0.1751). 도 4e: 2개의 알려진 GWAS 히트 및 UNC13A 은성 엑손에 대한 rs56041637의 위치의 다이어그램. 도 4f: UNC13A 은성 엑손 미니유전자 리포터 작제물 및 RT-PCR에 사용된 프라이머 쌍의 위치의 설계. GFP 및 mCherry의 전사는 이방향성 프로모터(청색)에 의해 제어된다. 검정색 삼각형은 (e)에 도시된 것과 같은 유전 변이체의 위치를 나타낸다. 도 4g: 미니유전자의 스플라이싱은 WT 및 TDP-43-/- HEK293T 세포에서 평가되었다. HEK293T 세포는 UNC13A를 내인성으로 발현하지 않는다. 각각의 밴드에 의해 표시된 PCR 산물은 각각의 겔의 왼쪽에 표시된다. 은성 엑손(b)의 봉입 이외에, 일부 스플라이스 변이체는 은성 엑손(c)의 더 긴 버전(도 5) 또는 은성 엑손(d)의 상류에서 완전한 인트론의 봉입을 갖는다. 위험 대립유전자 보유 미니유전자는 정규 스플라이싱 산물(a)의 거의 완전한 손실 및 대안적으로 스플라이싱된 산물의 증가를 보여주었다. 도 4h: 상이한 UNC13A 미니유전자 리포터를 발현하는 HeLa 세포에서, siRNA(및 사이클로헥시미드(CHX) 처리)에 의한 TDP-43의 고갈은 은성 엑손의 봉입을 발생시키고, 이는 RNA 결합 결핍 돌연변이체 TDP-43(GFP-TDP-43-5FL)에 의해서가 아니라 과발현하는 TDP-43 단백질(GFP-TDP-43)에 의해 구제될 수 있다. 도 4i: 이들이 보유하는 위험 일배체형의 수에 기초하여 계층화된 FTLD-TDP 환자의 생존 곡선(0, 1 또는 2). 위험 일배체형에 이형접합성 및 동형접합성인 환자는 질환 발병 후 더 짧은 생존 시간을 가졌다(n = 205, 메이요 클리닉 브레인 뱅크)(점수(로그 랭크) 시험, p-값 = 0.01). 점선은 각각의 유전자형에 대한 중앙치 생존을 표시한다. 위험 일배체형의 효과는 유전 돌연변이, 성별 및 발병 시 연령에 대해 조정된 Cox 다변량 분석을 사용하여 첨가 모델로서 모델링된다. 위험 표는 바닥에 도시되어 있다. 분석의 요약 결과는 도 15a에 있다. 도 4j: UNC13A 단백질 발현 수준이 둘 다 UNC13A 위험 일배체형을 보유하고 TDP-43 병리학을 나타내는 환자에서 어떻게 가장 상당히 감소되는지의 모델.
도 5a-5d. MAJIQ를 사용한 스플라이싱 분석은 UNC13A 의 엑손 20과 엑손 21 사이의 은성 엑손의 봉입을 입증한다. 도 5a 및 5b: TDP-43의 고갈은 인트론 20-21에서 2개의 대안적인 3' 스플라이싱 수용체를 도입한다: 하나는 chr19:17642591(ΔΨ=0.05184)에 있고, 다른 하나는 chr19:17642541(ΔΨ=0.48865)에 있다. 도 5c 및 5d: 대안적인 5' 스플라이싱 공여체는 또한 chr19:17642414(ΔΨ=0.772)에서 도입된다. chr19:17642541 3' 스플라이싱 수용체의 훨씬 더 높은 용법이 관찰되므로(도 5b), 이 3' 스플라이싱 수용체 및 대안적인 5' 스플라이싱 공여체(도 5c)에 의해 한정된 128 bp 은성 엑손이 초점이 된다. 도 5a 및 5c는 UNC13A의 엑손 20과 엑손 21 사이의 은성 엑손(CE)의 봉입을 보여주는 스플라이스 그래프이다. 도 5b 및 5d: 각각 도 5a 및 5c에 상응하는 바이올린 선도이다. (도 5b 및 5d)에서의 각각의 바이올린은 스플라이스 그래프에서 색상 일치 연접부에 대한 예상된 상대 봉입(PSI 또는 Ψ)의 사후 확률 분포를 나타낸다. 각각의 바이올린의 꼬리는 10 백분위 및 90 백분위를 나타낸다. 박스는 중앙치를 나타내는 중간에서의 선으로 4분위수간 범위를 나타낸다. 백색의 원은 예상된 PSI(E[Ψ])를 표시한다. 2개의 조건 사이의 각각의 연접부의 상대 봉입 수준의 변화는 ΔΨ 또는 ΔPSI(12)로 지칭된다.
도 6a-6d. UNC13A 의 인트론 20-21은 대부분의 영장류 중에서 보존된다. UCSC(39) 게놈 브라우저(http://genome.ucsc.edu)에서 Primates Multiz Alignment & Conservation 트랙은 20개의 포유류를 포함하고, 이들 중 17개는 영장류이다. 도 6a: UNC13A의 엑손 20 및 엑손 21은 포유류 중에서 잘 보존된다. 그러나, 인트론 20-21(도 6b), 은성 엑손(도 6c) 및 은성 엑손의 상류에서의 스플라이싱 수용체 부위(도 6c) 및 은성 엑손의 하류에서의 스플라이싱 공여체 부위(도 6d)는 영장류에서 오직 보존된다.
도 7a-7b. 유도된 운동 뉴런(iMN)으로부터의 TDP-43의 고갈은 UNC13A에서의 은성 엑손 봉입으로 이어진다. 도 7a: RT-PCR은 3개의 독립 iMN(각각의 iMN 및 병태에 대한 4개의 독립 세포 배양 실험)에서 TDP-43 고갈 시 은성 엑손 함유 UNC13A mRNA 아이소폼의 발현을 확인시켜 주었다. 은성 엑손을 함유하는 스플라이스 변이체 이외에, 은성 엑손의 더 긴 버전의 봉입(도 5a) 및 은성 엑손의 하류에서 완전한 인트론(도 4g)이 검출되었다. 각각의 밴드에 의해 표시된 PCR 산물은 각각의 겔의 왼쪽에 표시된다. 사용된 PCR 프라이머 쌍의 위치는 각각의 겔 영상의 상부에 도시되어 있다. 도 7b: 은성 엑손 및 엑손 21 연접부에 이르는 PCR 프라이머 쌍은 은성 엑손 봉입이 TDP-43 넉다운 시 오직 발생한다는 것을 확인시켜 준다.
도 8. 총 UNC13A 전사체는 메이요 클리닉 브레인 뱅크에서 대부분의 FTLD-TDP 환자의 전두 피질에서 유의미하게 변하지 않는다. 총 UNC13A 전사체의 감소는 유전 돌연변이가 보고되지 않은 FTD 환자 및 GRN 돌연변이를 갖는 FTD 환자에서 검출되었다. 이것은 현재 명확하지 않은 특정 병리학으로 인할 수 있다. 검출에 사용된 qRT-PCR 프라이머 쌍은 상부에 도시되어 있다. GAPDH 및 RPLP0은 qRT-PCR을 정규화하도록 사용되었다(2측 Mann-Whitney 시험, ns: P>0.05; **P<0.01; ****P<0.0001; 오차 막대는 95% 신뢰 간격을 나타낸다).
도 9. UNC13A 은성 엑손은 또한 ALS/FTLD, ALS-TDP 및 ALS/AD 환자의 질환 관련 조직에서 검출될 수 있다. 이들 환자의 진단은 신경병리학적으로 확인되지 않는다. 따라서, TDP-43 국재화오류가 이들 환자에 존재하는지는 명확하지 않다. ALS 환자는 이들이 SOD1 돌연변이를 보유하는지에 기초하여 분류화되었다(ALS-SOD1 대 ALS-TDP). ALS-AD는 알츠하이머병이 의심되는 ALS 환자를 지칭한다. ALS-FTLD는 동시의 FTD 및 ALS를 갖는 환자를 지칭한다.
도 10a-10h. UNC13A 은성 엑손 신호 및 총 UNC13A 신호는 메이요 클리닉 브레인 뱅크에서 FTLD-TDP 환자의 전두 피질에서 인산화된 TDP-43 수준과 상관된다. 도 10a: UNC13A 은성 엑손 신호는 메이요 클리닉 브레인 뱅크에서 FTLD-TDP 환자의 전두 피질에서 인산화된 TDP-43 수준과 양으로 상관된다(스피어만 rho = 0.572, p-값 <0.0001). 데이터 점은 환자의 질환 유형에 따라 색상 표시된다. 도 10b 및 10c: 총 UNC13A 신호는 동일한 샘플에서 인산화된 TDP-43 수준과 음으로 상관된다. 데이터 점은 각각 환자의 보고된 유전 돌연변이(도 10b) 및 질환 유형(도 10c)에 따라 색상 표시된다. 도 10d: 총 UNC13A 신호와 인산화된 TDP-43 수준 사이의 스피어만 상관관계. 녹색 색상의 열은 각각의 유전 돌연변이 그룹 내에 상관관계를 보여준다. 청색 색상의 열은 각각의 질환 그룹 내의 상관관계를 보여준다. 도 10e-10h: 입력으로서 비변환 데이터를 사용한 산란도. 도 10e-10f: 은성 엑손 신호 대 인산화된 TDP-43 수준. 도 10g-10h: 총 UNC13A 신호 대 인산화된 TDP-42 수준. qRT-PCR 프라이머 쌍은 각각의 패널의 상부에 도시되어 있다.
도 11a-11e. UNC13A 은성 스플라이싱은 인간 뇌에서 핵 TDP-43의 손실과 연관된다. 도 11a: 대안적으로 스플라이싱된 UNC13A 전사체를 표적화하는 UNC13A e20/CE BaseScope™ 프로브의 설계. 도 11b: 정규 UNC13A 전사체를 암호화하는 UNC13A e20/e21 BaseScope™ 프로브의 설계. 각각의 "Z"는 독립적으로 전사체에 결합한다. "Z" 둘 다는 성공적인 신호 증폭에 대해 밀접히 근접해야 하여서 결합 특이성을 보장한다. 도 11c: BaseScope™ 인시츄 혼성화 및 면역형광을 내측 전두극으로부터의 절편에서 수행하였다. 대표적인 영상은 핵 TDP-43의 고갈 및 세포질 응집을 보여주는 뉴런에서의 UNC13A 은성 엑손(화살촉)의 존재를 예시한다. 환자 및 대상체에서의 정상 핵 TDP-43을 갖는 뉴런은 은성 엑손을 보여주지 않는다(화살표). 도 11d: 내측 전두극으로부터의 층 2-3 뉴런에서의 UNC13A mRNA의 발현을 보여주는 대표적인 영상. BaseScope 인시츄 혼성화는 엑손 20-엑손 21 연접부를 표적화하는 프로브를 사용하여 UNC13A mRNA를 가시화하도록 사용되고 TDP-43 및 NeuN에 대해 면역형광과 조합되었다. UNC13A mRNA 발현은 뉴런으로 제한된다(화살표). 영상은 공초점 영상 Z-스택의 최대 강도 투사이다. 기준자는 10 μm이다. 도 11e: 내측 전두극의 층 2-3으로부터 6개의 비중첩 Z-스택 영상은 63X 오일 대물렌즈를 사용하여 대상체마다 포착되고 최대 강도 투사 영상으로 편평화되었다. 영상당 푼타 계수치는 ImageJ에서 "입자 분석" 플러그인을 사용하여 도출되었다. 각각의 데이터 점은 단일 영상에서 UNC13A 은성 엑손 푼타의 수를 나타낸다. 은성 엑손의 풍부도는 환자 사이에서 변하지만, 대조군에서 관찰된 것처럼 검정의 기술적 배경을 항상 초과한다. 데이터는 평균 +/- 표준 편차로서 제시된다.
도 12a-12c. 은성 엑손 봉입의 수준은 rs12973192에서의 유전자형에 의해 영향을 받는다. 도 12a: UNC13A의 엑손 20과 엑손 21 사이의 RNA-seq 정렬의 가시화. RNA-seq 라이브러리는 도 1a에 기재된 것과 같이 TDP-43 음성 뉴런 핵으로부터 생성되었다. 도 12b: rs12973192에서의 이형접합성(C/G) 또는 동형접합성(G/G)인 샘플은 SRR8571945의 은성 엑손을 제외하고 은성 엑손의 더 높은 상대 봉입(Ψ)을 갖는다. 도 12c: TDP-43 고갈된 iMN 및 SRR8571950 뉴런 핵에서 UNC13A 스플라이싱된 변이체에서의 C 및 G 대립유전자의 백분율. 정확한 이항식 시험은 관찰된 백분율 차이가 대립유전자 둘 다가 균등하게 은성 엑손에서 포함되면 예상되는 것과 다른지를 시험하기 위해 각각의 반복실험에 대해 수행되었다.
도 13a-13f. UNC13A 은성 엑손의 풍부도는 위험 대립유전자의 수와 연관된다. 비변환 데이터를 사용한 단순 선형 회귀 모델(도 13a) 및 다중 회귀 모델(도 13b)은 UNC13A 은성 엑손의 풍부도와 위험 대립유전자의 수 사이의 강한 상관관계를 보여준다. 도 13b: 예측자 변수로서 위험 대립유전자의 수, TDP-43 인산화 수준, 성별, 보고된 유전 돌연변이를 사용한 다중 회귀 분석의 요약 결과. 동일한 색상으로 색상 표시된 열은 동일한 변수 내의 인자를 나타낸다. 변환 데이터(도 13a 및 13d) 및 비변환 데이터(e 및 f)를 사용한 도 13c 및 13e: 단순 선형 회귀 모델 및 도 13d 및 13f: 다중 회귀 모델은 총 UNC13A mRNA 전사체의 풍부도가 환자가 보유하는 rs12971392에서의 위험 대립유전자의 수와 유의미하게 상관되지 않는다는 것을 보여준다. 이것은 도 3b 및 도 11d에서 도시된 것과 같은 TDP-43 병리학에 의해 영향을 받지 않는 뉴런으로부터의 UNC13A의 발현의 결과일 수 있었다. 잔기의 정규성은 Shapiro-Wilk 정규성 시험에 의해 시험되고, 결과는 각각의 패널의 하부에 도시되어 있다. 검출에 사용된 qPCR 프라이머 쌍은 각각의 패널의 상부에 도시되어 있다.
도 14. rs56041637 및 rs62121687은 UNC13A 의 인트론 20-21에서 GWAS 히트 둘 다와 강한 연결 불평형에 있다. 유럽 혈통의 297명의 ALS 환자로부터의 전체 게놈 시퀀싱 데이터에서 확인된 유전 변이체를 사용하여 (2020년 7월, Answer ALS), 본 발명자들은 이전의 GWAS에서 나타나지 않은 인트론 20-21에서 다른 유전 변이체를 기대하였다. 열도면의 축을 따라 297명의 환자 중에서 변이를 보여주는 모든 좌위가 있다. 각각의 타일은 카이 제곱 시험으로부터의 본페로니 조정된 p-값을 나타낸다. 0.05 미만의 P-값은 황색으로 도시되어 있고, 다른 것은 청색 또는 회색으로 도시되어 있다. 청색 및 적색 블록은 각각 인트론 20-21에서 다른 유전 변이체와 rs12608932 및 rs12973192의 연관을 강조한다. 둘 다에 흔한 상당한 연관이 검정색으로 원에 있다. rs56041637(rs12608932에 의한 본페로니 조정된 p-값 <0.0001, rs12973192에 의한 본페로니 조정된 p-값 <0.0001) 및 rs62121687(rs12608932에 의한 본페로니 조정된 p-값 <0.0001, rs12973192에 의한 본페로니 조정된 p-값 <0.0001)인 2개의 추가의 SNP는 둘 다에 의해 LD에 있는 것으로 발견되었다. 그러나, rs62121687이 GWAS에 포함되고 0.0186585(36)의 p-값을 가지므로, 이것은 추가 분석으로부터 배제되었다.
도 15a-15e. UNC13A 위험 일배체형은 FTLD-TDP 환자의 생존 시간을 감소시킨다. 도 15a: (유전 돌연변이, 성별 및 발병 시 연령에 대해 조정된) 첨가 모델의 Cox 다변량 분석의 요약 결과. 도 15b 및 15d: 우성 모델(도 15b) 및 열성 모델(도 15c) 및 이의 상응하는 위험 표에 따른 FTLD-TDP 환자(n = 205, 메이요 클리닉 브레인 뱅크)의 생존 곡선. 우성 모델(도 15c) 및 열성 모델(도 15d)의 (유전 돌연변이, 성별 및 발병 시 연령에 대해 조정된) Cox 다변량 분석의 요약 결과. 우성 모델(도 15b 및 15c) 및 열성 모델(도 15d 및 15e) 둘 다는 위험 일배체형의 존재가 FTLD-TDP 환자의 생존을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다. 점선은 각각의 유전자형에 대한 중앙치 생존을 표시한다. 점수 시험을 사용하여 로그 랭크 p-값을 계산하였다. 녹색 색상의 열은 하나의 변수 내의 인자를 나타낸다.
도 16a-16f. 생존에 대한 UNC13A 위험 일배체형의 효과는 C9ORF72 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장 보균자 및 GRN 돌연변이 보균자에서 더 상당하다. 도 16a, 16c 및 16e: 첨가 모델(도 16a), 우성 모델(도 16c) 및 열성 모델(도 16e) 및 이의 상응하는 위험 표에 따른 C9ORF72 또는 GRN 돌연변이(n = 80, 메이요 클리닉 브레인 뱅크)를 보유하는 FTLD-TDP 환자의 생존 곡선. 첨가 모델(도 16b), 우성 모델(도 16d) 및 열성 모델(도 16f)의 (유전 돌연변이, 성별 및 발병 시 연령에 대해 조정된) Cox 다변량 분석의 요약 결과. 본 발명자들이 TDP-43 병리학과 연관된 돌연변이를 갖는 FTLD-ALS 환자를 오직 포함할 때, 첨가 모델(도 16a 및 16b) 및 우성 모델(도 16c 및 16d) 둘 다는 생존 시간에 대한 위험 일배체형의 효과가 더 상당해진다는 것을 나타낸다. 2개의 그룹의 생존 분포가 유의미하게 다르지 않지만(로그 랭크 p-값 = 0.3), 위험 일배체형의 수는 여전히 강한 예후 인자이다(p-값 = 0.03800). 점선은 각각의 유전자형에 대한 중앙치 생존을 표시한다. 점수 시험을 사용하여 로그 랭크 p-값을 계산하였다.
도 17은 엑손 20, 은성 엑손 #1(128 bp) 및 엑손 21을 포함하는 UNC13A 게놈 영역을 보여준다.
도 18은 기준 전사체 및 은성 엑손 2a(상부) 및 엑손 2a 서열(하부)을 함유하는 스플라이스 변이체에 대한 STMN2 엑손 구조를 보여준다.
도 19a-19d는 qPCR에 의해 측정된 것과 같은 UNC13A 특이적 2'MOE 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 처리 후 운동 뉴런에서의 UNC13A mRNA 수준을 보여준다. 도 19a-19b는 UNC13A 은성 엑손 봉입에 특이적인 프라이머/프로브를 사용한 qPCR 결과를 보여준다. 도 19c-19d는 기준 UNC13A에 특이적인 프라이머/프로브를 사용한 qPCR 결과를 보여준다.
본 개시내용을 더 자세히 기술하기 전에, 이는 본원에 사용된 소정의 용어의 정의를 제공하도록 이의 이해에 도움이 될 수 있다. 추가 정의는 본 개시내용에 걸쳐 기재되어 있다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절할 때 이의 분수(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100) 또는 하위범위를 포함한다고 이해되어야 한다.
본원에 사용된 것과 같이, "약"의 용어는 달리 표시되지 않는 한 표시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다.
본원에 사용된 것과 같은 "일" 및 "하나"의 용어가 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들면, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다, 또는 임의의 이들의 조합을 의미하도록 이해되어야 한다.
본원에 사용된 것과 같이, "포함한다", "갖는다" 및 "수반한다"의 용어는 동의어로 사용되고, 상기 용어 및 이의 변형어는 비제한적인 것으로서 해석되도록 의도된다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속하여 기재된 요소, 성분, 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있다는 것, 및 설명이 그 요소, 성분, 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 것과 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 시험관내 번역에 의해 생성된 분자 및 임의의 결찰, 절제, 엔도뉴클레아제 작용, 엑소뉴클레아제 작용 또는 기계적 작용(예를 들면, 전단)에 의해 생성된 분자를 지칭한다. 핵산은 자연 발생 뉴클레오타이드(예컨대, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드), 자연 발생 뉴클레오타이드의 유사체(예를 들면, 자연 발생 뉴클레오타이드의 α-거울상이성질체 형태) 또는 둘 다의 조합인 복수의 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 당 모이어티, 또는 피리미딘 또는 푸린 염기 모이어티(예를 들면, 모르폴리노 뉴클레오타이드)의 변형 또는 대체를 가질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트, 또는 기타를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 본원에 사용된 것과 같이 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 지칭한다. "단백질"의 용어는 "폴리펩타이드"의 용어와 동의어일 수 있거나, 또한 2개 이상의 폴리펩타이드의 복합체를 지칭할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 폴리펩타이드는 단편일 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "단편"은 기준 서열에서 발견된 1개 이상의 아미노산이 결여된 폴리펩타이드를 의미한다. 단편은 기준 서열에서 발견된 결합 도메인, 항원 또는 에피토프를 포함할 수 있다. 기준 5 폴리펩타이드의 단편은 기준 서열의 아미노산 서열의 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 초과의 아미노산을 가질 수 있다.
"단리된"의 용어는 재료, 복합체, 화합물 또는 분자가 이의 원래의 환경(예를 들면, 이것이 자연 발생이면 자연 환경)으로부터 제거된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 살아 있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되지만, 자연 시스템에서 공동존재하는 재료의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 핵산 또는 폴리펩타이드는 조성물(예를 들면, 세포 용해물)의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 핵산 또는 폴리펩타이드에 대한 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다. "유전자"의 용어는 폴리펩타이드 사슬의 제조에 관여된 DNA의 분절을 의미하고; 이것은 암호화 영역 "리더 및 트레일러"의 앞 및 뒤의 영역뿐만 아니라 개별 암호화 분절(엑손) 사이의, 존재하면, 개재 서열(인트론)을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "재조합" 또는 "유전 조작된"의 용어는 인간 중재에 의해 유전 변형된 세포, 미생물, 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 벡터를 지칭한다. 예를 들면, 재조합 폴리뉴클레오타이드는 외인성 또는 이종성 핵산 분자의 인간 또는 기계 도입에 의해 변형되거나, 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 제어되거나 완화되거나 구성적이도록 인간 또는 기계 중재에 의해 변경된 세포 또는 미생물을 지칭한다. 인간 생성된 유전 변경은 예를 들면 하나 이상의 단백질 또는 효소를 암호화하는 핵산 분자(발현 제어 요소, 예컨대 프로모터를 포함할 수 있음)를 도입하는 변형, 또는 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환, 또는 세포의 유전 재료 또는 암호화된 산물의 다른 기능적 파괴 또는 이것에 대한 첨가를 포함할 수 있다. 예시적인 인간 또는 기계 도입된 변형은 기준 또는 모 분자로부터의 이종성 또는 동종성 폴리펩타이드의 암호화 영역 또는 이의 기능적 단편에서의 것을 포함한다.
"야생형" 유전자 또는 유전자 산물은 집단에서 가장 흔히 관찰된 것이고, 따라서 유전자의 "정상" 또는 "기준" 또는 "야생형" 형태로 임의로 설계된다.
본원에 사용된 것과 같이, "돌연변이"는 각각 기준 또는 야생형 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자와 비교하여 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 분자의 서열의 변경을 지칭한다. 돌연변이는 뉴클레오타이드(들) 또는 아미노산(들)의 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열의 몇몇 상이한 변경 유형을 발생시킬 수 있다.
"보존적 치환"은 특정 단백질의 결합 특징에 상당히 영향을 미치지 않거나 이를 변경하는 아미노산 치환을 지칭한다. 일반적으로, 보존적 치환은 치환된 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 보존적 치환은 하기 그룹 중 하나에서 발견된 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌(Ala 또는 A), 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 Z); 그룹 3: 아스파라긴(Asn 또는 N), 글루타민(Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌(Arg 또는 R), 리신(Lys 또는 K), 히스티딘(His 또는 H); 그룹 5: 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 발린(Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 티로신(Tyr 또는 Y), 트립토판(Trp 또는 W). 추가적으로 또는 대안적으로, 아미노산은 유사한 기능, 화학 구조 또는 조성(예를 들면, 산성, 염기성, 지방족, 방향족 또는 황 함유)에 의해 보존적 치환 그룹으로 분류될 수 있다. 예를 들면, 지방족 그룹화는 치환의 목적을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile를 포함할 수 있다. 다른 보존적 치환 기는 황 함유: Met 및 시스테인(Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp를 포함한다. 추가 정보는 Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company에서 발견될 수 있다.
"발현"의 용어는, 본원에 사용된 것과 같이, 폴리펩타이드가 핵산 분자, 예컨대 유전자의 암호화 서열에 기초하여 제조되는 과정을 지칭한다. 그 과정은 전사, 전사후 제어, 전사후 변형, 번역, 번역후 제어, 번역후 변형 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.
"서열 동일성"은, 본원에 사용된 것과 같이, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않으면서 서열을 정렬하고 필요하면 갭을 도입한 후 또 다른 기준 폴리뉴클레오타이드(폴리펩타이드) 서열에서의 뉴클레오타이드(아미노산 잔기)와 동일한 하나의 서열에서의 뉴클레오타이드(아미노산 잔기)의 백분율을 지칭한다. 백분율 서열 동일성 값은 디폴트 값으로 설정된 매개변수로 Altschul 등 (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 의해 정의된 것과 같은 NCBI BLAST2.0 소프트웨어를 사용하여 생성될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "UNC13A"는 신경전달물질, 펩타이드 및 호르몬의 방출을 조절하는 중추 시냅스 및 신경근 시냅스에서 발견된 프리시냅스 단백질을 지칭한다. UNC13A 기준 또는 야생형 mRNA 전사체는 1,703개의 아미노산 단백질을 암호화하는 44개의 엑손을 함유한다. 실시형태에서, NCBI 기준 서열: NP_001073890.2(서열 번호 11)은 야생형 또는 기준 UNC13A 단백질의 예이다. 실시형태에서, NCBI 기준 서열 NM_001080421.3(서열 번호 1)은 야생형 또는 기준 UNC13A mRNA 전사체의 예이다. 실시형태에서, UNC13A는 야생형, 스플라이스 아이소폼, 변이체, 돌연변이체, 자연적 구성, 미스폴딩된 및 전사후 변형된 것을 포함하는 UNC13A의 모든 형태를 포함한다. 실시형태에서, UNC13A는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 것과 같이, "예비가공된 mRNA" 또는 "프리-mRNA" 또는 "전구체 mRNA"의 용어는 DNA 주형의 전사로부터 합성되고, 성숙 mRNA가 되기 위해 가공, 예를 들면 스플라이싱, 5' 캡의 첨가 및 3' 폴리A 꼬리의 첨가를 겪지 않은 주요 전사체를 지칭한다. 성숙 mRNA는 리보솜에 의해 단백질로 번역될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "은성 엑손" 또는 "슈도엑손"의 용어는 야생형 프리-mRNA에서 부재하거나 검출 가능하게 사용되지 않지만 변이체 아이소폼에서 선택된 엑손을 지칭하고, 은성 엑손은 새로운 스플라이스 부위를 생성하거나 스플라이싱 리프레서에 대한 기존의 결합 부위를 제거하는 돌연변이의 결과로서 생길 수 있다. 은성 엑손은 또한 전치 가능한 요소(예를 들면, Alu 요소)로부터 나올 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체"는 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하는 mRNA 또는 상기 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. 은성 엑손은 UNC13A 유전자의 인트론 20-21로부터 얻어진다. 실시형태에서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 8의 단백질 서열을 암호화하는 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 10의 단백질 서열을 암호화하는 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "활성화촉진 반응 요소 DNA 결합 단백질 43" 또는 "TAR-DNA 결합 단백질-43" 또는 "TDP-43"은 TARDBP에 의해 암호화된 통상적으로 414개의 아미노산 잔기의 단백질을 지칭한다. 실시형태에서, 야생형 TDP43 아미노산 서열은 Uniprot 수탁 번호 Q13148(서열 번호 378)에 의해 제공된다. 실시형태에서, TDP43은 야생형, 스플라이스 아이소폼, 변이체, 돌연변이체, 자연적 구성, 미스폴딩된 및 전사후 변형된(예를 들면, 유비퀴틴화된, 인산화된, 아세틸화된, 수모일화된 또는 C-말단 단편으로 절단된) 단백질을 포함하는 TDP-43의 모든 형태를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "TAR-DNA 결합 단백질-43 단백질병증" 또는 "TDP-43 단백질병증"은 대상체의 뇌 및/또는 척수에서의 TDP-43 양성 단백질 봉입의 침착을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환을 지칭한다. TDP-43의 과인산화된, 유비퀴틴화된, 절단된 형태의 세포질 봉입은 비제한적인 예로서 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 퇴행(FTLD), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근 위축증(PMA), 안면 발병 감각 및 운동 뉴런병증(FOSMN), 해마회 경화증(HS), 변연계 우위 연령 관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 경화증을 갖는 대뇌 연령 관련 TDP-43(CARTS), 괌 파킨슨-치매 복합체(G-PDC), 구안 ALS(G-ALS), 다계통 단백질병증(MSP), 페리병, 알츠하이머병(AD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE)을 포함하는 질환의 병리학적 특징이다.
"상보성인" 및 "상보성"의 용어는 염기 쌍 짓기와 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 예를 들면, 서열 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"에 상보성이다. 상보성은 핵산 염기의 오직 일부가 염기 쌍 짓기 규칙에 따라 일치되는 "부분"일 수 있거나, 핵산 사이에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 스트랜드 사이의 상보성의 정도는 핵산 스트랜드 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 대한 상당한 효과를 갖는다. 완벽한 상보성이 대개 원해지지만, 일부 실시형태는 표적 핵산(예를 들면, RNA)과 관련하여 1개 이상, 그러나 바람직하게는 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 미스매치를 포함할 수 있다. 올리고머 내의 임의의 위치에서 변이가 포함될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 올리고머의 말단 근처의 서열의 변이는 일반적으로 내부에서의 변이에 대해 바람직하고, 존재하면 통상적으로 5' 및/또는 3' 말단의 약 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 뉴클레오타이드 내이다.
"안티센스 올리고머" 또는 "안티센스 화합물" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"의 용어는 상호교환 가능하게 사용되고, 표적 서열 내에 핵산:올리고머 헤테로듀플렉스를 형성하기 위해 왓슨-크릭 염기 쌍 짓기에 의해 핵산(통상적으로 RNA)에서 표적 서열에 혼성화하는 DNA, RNA 또는 둘 다로 구성된 짧은, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 10개 내지 50개의 아단위)를 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 변형된 뉴클레오타이드, 비천연 뉴클레오타이드 또는 유사체 뉴클레오타이드, 예컨대 모르폴리노, 포스포로티오에이트, 펩타이드 핵산, LNA, 2'-O-Me RNA, 2'F-RNA, 2'-O-MOE-RNA, 2'F-ANA 또는 임의의 이들의 조합을 함유할 수 있다.
이러한 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단하거나 억제하거나 천연 프리-mRNA 스플라이스 가공을 억제하거나 표적화된 mRNA의 분해를 유도하도록 설계될 수 있고, 이것이 혼성화하는 표적 서열에 "지향되거나" 또는 "표적화"된다고 말해질 수 있다. 실시형태에서, 표적 서열은 mRNA의 AUG 시작 코돈, 프리-가공된 mRNA의 3' 또는 5' 스플라이스 부위 또는 분지점을 둘러싸거나 포함하는 영역이다. 표적 서열은 엑손 내 또는 인트론 내 또는 이들의 조합일 수 있다. 스플라이스 부위에 대한 표적 서열은 예비가공된 mRNA에서의 정상 스플라이스 수용체 연접부의 하류에 1개 내지 약 25개의 염기 쌍에서의 이의 5' 말단을 갖는 mRNA 서열을 포함할 수 있다. 스플라이스 부위에 대한 예시적인 표적 서열은 스플라이스 부위를 포함하거나 엑손 암호화 서열 내에 전부 함유되거나 스플라이스 수용체 또는 공여체 부위에 이르는 예비가공된 mRNA의 임의의 영역이다. 올리고머는 더 일반적으로 이것이 상기 기재된 방식으로 표적의 핵산에 표적화될 때 생물학적으로 관련된 표적, 예컨대, 본 개시내용에서, UNC13A 단백질을 암호화하는 인간 UNC13A 유전자 프리-mRNA에 "표적화"된다고 말해진다. 예시적인 표적화 서열은 표 2 내지 표 5에 열거된 것을 포함한다.
"올리고뉴클레오타이드 유사체"의 용어는 (i) 변형된 골격 구조, 예를 들면 천연 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에서 발견된 표준 포스포디에스테르 연결 이외의 골격 및 (ii) 선택적으로, 변형된 당 모이어티, 예를 들면 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티 외의 모르폴리노 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드 유사체는 표준 폴리뉴클레오타이드 염기에 대한 왓슨-크릭 염기 쌍 짓기에 의해 수소 결합을 할 수 있는 염기를 지지하고, 여기서 유사체 골격은 표준 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 단일 가닥 RNA 또는 단일 가닥 DNA)에서 올리고뉴클레오타이드 유사체 분자와 염기 사이에 서열 특이적 방식으로 이러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제시한다. 예시적인 유사체는 실질적으로 비하전된 인 함유 골격을 갖는 것이다.
올리고뉴클레오타이드의 "아단위"는 푸린 또는 피리미딘 염기 쌍 짓기 모이어티를 포함하는 하나의 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 유사체) 단위를 지칭한다. "하전된 아단위"를 지칭할 때, 전하가 통상적으로 아단위간 연결(예를 들면, 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 연결 또는 양이온성 연결) 내에 있더라도, 상기 용어는 부착된 아단위간 연결을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오타이드 단위를 지칭할 수 있다.
본원에서 단순히 "핵염기", "염기" 또는 "염기들"이라고도 칭하는 푸린 또는 피리미딘 염기 쌍 짓기 모이어티는 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 티민 또는 이노신일 수 있다. 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘(예를 들면, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘(예를 들면, 리보티미딘), 5-할로우리딘(예를 들면, 5-브로모우리딘) 또는 6-아자피리미딘 또는 6-알킬피리미딘(예를 들면 6-메틸우리딘), 프로핀, 쿠에소신, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 위부토신, 위부톡소신, 4-아세틸티딘, 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘, 5'-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우리딘, β-D-갈락토실쿠에오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, β-D-만노실쿠에오신, 우리딘-5-옥시아세트산, 2-티오시티딘, 트레오닌 유도체 및 기타(Burgin 등, 1996, Biochemistry, 35:14090; 상기 Uhlman & Peyman)와 같은 염기가 또한 포함된다. "변형된 염기"에 의해 이 양태에서 상기에 예시된 것과 같은 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U) 이외의 뉴클레오타이드 염기가 의도되고; 이러한 염기는 안티센스 분자에서의 임의의 위치에서 사용될 수 있다. 당업자는 올리고머의 사용에 따라 T 및 U가 상호교환 가능하다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 더 RNA 유사인 다른 안티센스 화학, 예컨대 2'-O-메틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해, T 염기는 U로서 기재될 수 있다.
"표적화 서열"의 용어는 RNA 게놈에서 "표적 서열"에 상보성인(또한 이것에 실질적으로 상보성임을 의미) 올리고머 또는 올리고머 유사체에서의 서열이다. 안티센스 올리고머의 전체 서열 또는 오직 일부는 표적 서열에 상보성일 수 있다. 예를 들면, 20개 내지 30개의 염기를 갖는 올리고머에서, 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개 또는 29개는 표적 영역에 상보성인 표적화 서열일 수 있다. 통상적으로, 표적화 서열은 올리고머에서 인접한 염기로 형성되지만, 대안적으로 함께 위치할 때 예를 들면 올리고머의 반대의 말단으로부터 표적 서열에 이르는 서열을 구성하는 비인접한 서열로 형성될 수 있다.
"표적화 서열"은 표적 서열에 "가까운" 또는 "실질적인" 상보성을 가질 수 있고, 여전히 "상보성"인 본 개시내용의 목적을 위해 여전히 기능할 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용에서 사용된 올리고머 유사체 화합물은 10개의 뉴클레오타이드 중 표적 서열과 최대 1개의 미스매치 및 바람직하게는 20개의 뉴클레오타이드 중 최대 1개의 미스매치를 갖는다. 대안적으로, 사용된 안티센스 올리고머는 본원에 지정된 것과 같은 예시적인 표적화 서열과 적어도 90%의 서열 동일성 및 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
"아미노산 아단위" 또는 "아미노산 잔기"는 α-아미노산 잔기(-CO-CHR-NH-) 또는 β- 또는 다른 아미노산 잔기(예를 들면, -CO-(CH2)nCHR- NH-)(여기서, R은 측쇄(수소를 포함할 수 있음)이고, n은 1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 4임)를 지칭할 수 있다.
"자연 발생 아미노산"의 용어는 자연에서 발견된 단백질에 존재하는 아미노산, 예컨대 단백질 생합성 동안 사용된 20개의 (L)-아미노산뿐만 아니라 기타, 예컨대 4-하이드록시프롤린, 하이드록시리신, 데스모신, 이소데스모신, 호모시스테인, 시트룰린 및 오르니틴을 지칭한다. "비자연 아미노산"의 용어는 자연에서 발견된 단백질에 존재하지 않는 아미노산을 지칭하고, 예는 베타-아닐린(β-Ala), 6-아미노헥산산(Ahx) 및 6-아미노펜탄산을 포함한다. "비자연 아미노산"의 추가의 예는 제한 없이 (D)-아미노산, 노르류신, 노르발린, p-플루오로페닐알라닌, 에티오닌 및 당업자에게 알려진 기타를 포함한다.
"표적 서열"의 용어는 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 제제가 지향된 표적 RNA의 부분, 즉 올리고뉴클레오타이드가 상보성 서열의 왓슨-크릭 염기 쌍 짓기에 의해 혼성화하는 서열을 지칭한다. 실시형태에서, 표적 서열은 인트론 및 엑손 표적 서열 둘 다를 포함하는 프리-mRNA의 인접한 영역일 수 있다. 실시형태에서, 표적 서열은 배타적으로 인트론 또는 엑손 서열 중 어느 하나로 이루어질 것이다.
표적 및 표적화 서열은 역평형 구성에서 혼성화가 일어날 때 서로 "상보성"으로서 기재된다. "표적화 서열"은 표적 서열에 "가까운" 또는 "실질적인" 상보성을 가질 수 있고, 본 개시내용의 목적을 위해 여전히 기능하고, 즉 이것은 여전히 기능적으로 "상보성"일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 10개의 뉴클레오타이드 중 표적 서열과 최대 1개의 미스매치 및 바람직하게는 20개의 뉴클레오타이드 중 최대 1개의 미스매치를 가질 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 예시적인 안티센스 표적화 서열과 적어도 90%의 서열 동일성 및 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 올리고머가 실질적으로 45℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃ 및 통상적으로 60℃ 내지 80℃ 또는 초과의 Tm으로 물리적 조건 하에 표적에 혼성화하면 표적 폴리뉴클레오타이드에 "특이적으로 혼성화한다". 이러한 혼성화는 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건에 상응한다. 주어진 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열의 50%가 상보성 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 온도이다. 다시, 이러한 혼성화는 표적 서열에 대한 안티센스 올리고머의 "가까운" 또는 "실질적인" 상보성뿐만 아니라 정확한 상보성으로 발생할 수 있다.
"뉴클레아제 저항" 올리고머 분자(올리고머)는 신체에서 일반 세포외 및 세포내 뉴클레아제에 의해 비혼성화된 형태 또는 혼성화된 형태로 골격이 뉴클레아제 절단에 실질적으로 저항인 것을 지칭하고; 즉 올리고머는 올리고머가 노출된 신체에서 정상 뉴클레아제 조건 하에 적은 뉴클레아제 절단을 보여주거나 뉴클레아제 절단을 보여주지 않는다.
"유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 원하는 치료 효과를 생성하기에 효과적인 단일 용량 또는 일련의 용량의 일부로서 포유류 대상체에게 투여되는 치료제, 예컨대 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 억제제의 양을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해, 이 효과는 통상적으로 선택된 표적 서열의 번역 또는 자연적 스플라이스 가공을 억제함으로써 불러와진다. UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 mRNA에 표적화된 "유효량"은 또한 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 단백질의 발현을 조절하기에 효과적인 양을 지칭한다.
"억제한다" 또는 "억제제"의 용어는 직접적으로 또는 간접적으로 (1) 대조군, 내인성 또는 기준 표적 또는 경로 또는 (2) 표적 또는 경로의 부재에 비해 표적 유전자, 표적 단백질 또는 신호전달 경로의 발현, 양 또는 활성에서의 변경, 간섭, 감소, 하향조절, 차단, 억제, 무효화 또는 저하를 지칭하고, 변경, 간섭, 감소, 하향조절, 차단, 억제, 무효화 또는 저하는 통계적으로, 생물학적으로 또는 임상적으로 유의미하다. "억제한다" 또는 "억제제"의 용어는 예컨대 염색체 편집에 의한 유전자 "넉아웃" 및 유전자 "넉다운" 방법을 포함한다.
예를 들면, "UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 억제제"는 비처리된 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체와 비교하여 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 초과만큼 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 활성을 차단하거나 불활성화하거나 감소시키거나 최소화하거나 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현을 감소시키거나 이의 분해를 촉진함으로써 활성을 감소시킬 수 있다.
개체 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포에서의 질환 또는 병리학의 자연 과정을 변경하기 위한 수단으로서 제공된 임의의 중재 유형이다. 치료는 예를 들면 약학 조성물의 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 예방적으로 또는 병리학적 사건의 개시 또는 원인체와의 접촉에 후속하여 수행될 수 있다. 치료는 본원에 기재된 다른 것들 중에서 염증과 연관된 질환 또는 병태의 증상 또는 병리학에 대한 임의의 바람직한 효과를 포함한다.
치료되는 질환 또는 병태의 진행의 속도를 감소시키는 것, 그 질환 또는 병태의 발병을 지연시키는 것 또는 이의 발병의 중증도를 감소시키는 것과 관련될 수 있는 "예방학적" 처리가 또한 포함된다. "치료" 또는 "예방책"은 반드시 질환 또는 병태, 또는 이의 연관된 증상의 완전한 소거, 치유 또는 예방을 나타내지는 않는다.
추가의 정의는 하기 부문에 제공된다.
UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체
일 양태에서, 본 개시내용은 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하는 신규의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체를 제공한다. 이 은성 엑손은 뉴런 핵으로부터 야생형 UNC13A가 부재하고 UNC13A의 임의의 알려진 아이소폼에 존재하지 않는다. 은성 엑손은 UNC13A 유전자의 인트론 20-21(서열 번호 4)로부터 얻어진다. TDP-43의 고갈은 하나는 chr19:17642591(ΔΨ=0.05184)에 있고 다른 하나는 chr19:17642541(ΔΨ=0.48865)에 있는 인트론 20-21에서 2개의 대안적인 3' 스플라이싱 수용체를 도입한다. 대안적인 5' 스플라이싱 공여체는 또한 chr19:17642414(ΔΨ=0.772)에서 도입된다. chr19:17642591 3' 스플라이싱 수용체보다 더 흔히 사용된 chr19:17642541 3' 스플라이싱 수용체 및 대안적인 5' 스플라이싱 공여체는 서열 번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 128 bp 은성 엑손("은성 엑손 #1")을 생성시킨다. UNC13A 은성 엑손 #1 변이체는 서열 번호 8에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 서열 번호 7에 제시된 것과 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. chr19:17642591 3' 스플라이싱 수용체 및 대안적인 5' 스플라이싱 공여체는 서열 번호 6에 제시된 것과 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는 179bp 은성 엑손("은성 엑손 #2")을 생성시킨다. UNC13A 은성 엑손 #2 변이체는 서열 번호 10에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 서열 번호 9에 제시된 것과 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
UNC13A 은성 엑손 #1 스플라이스 변이체 발현 수준은 정상 대조군과 비교하여 TDP-43 봉입을 갖는 전두측두엽 퇴행(FTLD-TDP) 환자의 전두 피질에서 유의미하게 증가된다. UNC13A 은성 엑손 #1 스플라이스 변이체는 또한 ALS 환자의 질환 관련 조직에서 검출되었다. 실시형태에서, UNC13A 은성 스플라이스 변이체 #1 또는 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 #2의 발현은 TDP-43 단백질병증, 예를 들면 FTLD 또는 ALS를 갖는 대상체를 확인하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
TDP-43이 핵으로부터 고갈되고 세포질에 축적되면, 이것은 인산화된다. 과인산화된 TDP43(pTDP-43)은 TDP-43 단백질병증의 병리학의 핵심 특징이다. UNC13A 은성 엑손 #1 스플라이스 변이체는 FTD/ALS 환자에서 인산화된 TDP-43 수준과 강하게 연관된다. 실시형태에서, UNC13A 은성 스플라이스 변이체 #1 또는 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 #2의 발현은 대상체에서 인산화된 TDP-43 수준에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
UNC13A의 인트론 20-21에서의 몇몇 유전 돌연변이는 TDP-43 고갈 시 UNC13A 은성 엑손 봉입을 촉진하는 것으로 확인되었다. 이러한 유전 돌연변이의 예는 rs12608932(hg38 chr19:17.641,880 A→C), rs12973192(hg38 chr19: 17,642,430 C→G), rs56041637(hg38 chr19:17,642,033-17,642,056 CATC 0-2 반복부→3-5 CATC 반복부) 및 rs62121687(hg38 chr19:17,642,351 C→A)을 포함한다. 더욱이, 은성 엑손 봉입을 증가시키는 UNC13A 유전 돌연변이는 FTD-ALS 환자에서 감소된 생존율과 연관된다. 실시형태에서, 대상체에서의 UNC13A의 인트론 20-21에서의 유전 돌연변이의 확인은 UNC13A 은성 엑손 봉입에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 실시형태에서, TDP-43 단백질병증(예를 들면, FTD, ALS)을 갖는 대상체에서의 UNC13A의 인트론 20-21에서의 유전 돌연변이의 확인은 감소된 생존율에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 조사 및 치료 방법에 사용될 수 있는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 제공한다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 전장 UNC13A 또는 이의 다른 변이체(즉, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 같은 인트론 20-21로부터의 은성 엑손을 함유하지 않는 변이체)에 비해 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체에 선택적으로 결합하거나 이의 발현 또는 활성을 감소시키거나 억제한다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 전장 UNC13A 또는 이의 다른 변이체에 비해 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 #1, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 #2 또는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 #1 및 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 #2 둘 다에 선택적으로 결합하거나 이의 활성을 감소시키거나 억제한다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 인트론 20-21로부터의 은성 엑손, 예를 들면 서열 번호 5 또는 서열 번호 6 또는 이로부터 암호화된 펩타이드 영역을 특이적으로 표적화한다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체와 비교하여 인트론 20-21로부터의 은성 엑손을 함유하지 않는 전장 UNC13A 또는 변이체에 대한 활성의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 또는 미만을 나타낸다.
UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산(예를 들면, RNA 간섭 제제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 펩타이드, 항체, 결합 단백질, 소분자, 리보자임 및 압타머를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 소분자를 포함한다. 소분자는 2000 달톤 미만의 질량인 화합물이다. 소분자의 분자량은 바람직하게는 1000 달톤 미만, 더 바람직하게는 600 달톤 미만이고, 예를 들면 화합물은 500 달톤 미만, 400 달톤 미만, 300 달톤 미만, 200 달톤 미만 또는 100 달톤 미만이다.
소분자는 유기 또는 무기일 수 있다. 예시적인 유기 소분자는 지방족 탄화수소, 알코올, 알데하이드, 케톤, 유기 산, 에스테르, 단당류, 다당류, 방향족 탄화수소, 아미노산 및 지질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 무기 소분자는 미량 광물, 이온, 자유 라디칼 및 대사물질을 포함한다. 대안적으로, 소분자는 효소의 결합 포켓을 충전하기 위해 단편 또는 작은 부분 또는 더 긴 아미노산 사슬로 이루어지도록 합성으로 조작될 수 있다. 통상적으로 소분자는 1 킬로달톤 미만이다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. "항체"의 용어는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 온전한 항체뿐만 아니라 scFv, Fab 또는 Fab'2 단편과 같은 온전한 항체에 의해 인식된 항원 표적 분자에 결합하는 능력을 갖거나 보유하는 온전한 항체의 임의의 항원 결합 부분 또는 단편을 지칭한다. 이와 같이, 본원에서 "항체"의 용어는 광의로 사용되고, 온전한 항체를 포함하는 다중클론 및 단일클론 항체, 및 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 단일 사슬 항체 단편, 및 단일 도메인 항체(예를 들면, sdAb, sdFv, 나노바디)를 포함하는 이의 기능적(항원 결합) 항체 단편을 포함한다. 상기 용어는 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화된 항체, 및 이종접합체 항체, 다중특이적, 예를 들면 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 탠덤 디-scFv 및 탠덤 트리-scFv의 유전 조작되고/되거나 달리 변형된 형태를 포함한다. 달리 기술되지 않는 한, "항체"의 용어는 이의 기능적 항체 단편을 포함하도록 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위종류(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 종류 또는 하위종류의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다.
단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 비인간, 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 면역글로불린 구조 및 기능은 예를 들면 Harlow 등, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)에 검토되어 있다.
"VL" 및 "VH"의 용어는 각각 항체 경쇄 및 항체 중쇄로부터의 가변 결합 영역을 지칭한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "프레임워크 영역"(FR)으로 알려진 별개의 잘 한정된 하위영역을 포함한다. "상보성 결정 영역" 및 "CDR"의 용어는 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이고, 일반적으로 항체의 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 함께 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭하고, 연속 CDR(즉, CDR1 및 CDR2, CDR2 및 CDR3)은 프레임워크 영역에 의해 1차 아미노산 서열에서 서로 분리된다. 각각의 가변 영역에서 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3; LCDR1, LCDR2, LCDR3; 각각 CDRH 및 CDRL로도 지칭됨)이 있다. 실시형태에서, 항체 VH는 FR1- HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4와 같이 4개의 FR 및 3개의 CDR을 포함하고; 항체 VL은 FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4와 같이 4개의 FR 및 3개의 CDR을 포함한다. 일반적으로, VH 및 VL은 이의 각각의 CDR을 통해 항원 결합 부위를 함께 형성한다.
CDR 및 프레임워크 영역의 넘버링은 임의의 알려진 방법 또는 체계, 예컨대 Kabat, Chothia, EU, IMGT 및 AHo 넘버링 체계(예를 들면, Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); Lefranc 등, Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003; Honegger and Pluckthun, J. Mol. Bio. 309:657-670 (2001))에 따라 결정될 수 있다. 동등한 잔기 위치는 주석화되고, 상이한 분자에 대해 항원 수용체 넘버링 및 수용체 분류(ANARCI: Antigen receptor Numbering And Receptor Classification) 소프트웨어 도구(2016, Bioinformatics 15:298-300)를 사용하여 비교될 수 있다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 의해 암호화된 펩타이드에 결합한다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산을 포함한다. "억제성 핵산"은 표적 유전자 또는 mRNA 전사체에 상보성인 서열을 갖는 짧은, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자를 지칭하고, 표적 유전자 또는 mRNA 전사체의 발현을 감소시킬 수 있다. 감소된 발현은 전사 또는 번역의 차단(예를 들면, 입체 장애), 표적 mRNA 전사체의 분해, 프리-mRNA 스플라이싱 부위의 차단, mRNA 가공(예를 들면, 캡핑, 폴리아데닐화)의 차단을 포함하는 각종 공정을 통해 달성될 수 있다. 억제성 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 억제성 핵산은 DNA, RNA 또는 둘 다로 이루어질 수 있다. 억제성 핵산은 비변형된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있거나 변형된 뉴클레오타이드, 비천연 뉴클레오타이드 또는 유사체 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 억제성 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 및 엔도리보뉴클레아제 제조된 siRNA(esiRNA)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 것과 같이, "siRNA" 또는 "짧은 간섭 RNA"의 용어는 동물에서 서열 특이적 전사후 유전자 침묵화, 번역 억제, 전사 억제 또는 후성적 RNAi의 공정을 매개하는 짧은, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 17개 내지 30개의 아단위)을 지칭한다(Zamore 등, Cell 101:25- 33, 2000; Fire 등, Nature 391:806, 1998; Hamilton 등, Science 286:950-951, 1999; Lin 등, Nature 402:128-129, 1999; Sharp, Genes Dev. 13:139-141, 1999; 및 Strauss, Science 286:886, 1999).
실시형태에서, siRNA는 동일한 수의 뉴클레오사이드를 갖는 제1 스트랜드 및 제2 스트랜드를 포함하지만; 제1 스트랜드 및 제2 스트랜드는 제1 스트랜드 및 제2 스트랜드에서의 2개의 말단 뉴클레오사이드가 오버행으로 남도록 오프셋이다. 실시형태에서, 2개의 오버행 뉴클레오사이드는 티미딘 잔기이다. siRNA의 안티센스(또는 가이드) 스트랜드는 표적 RNA에 적어도 부분적으로 상보적인 영역을 포함한다. 실시형태에서, siRNA의 안티센스 스트랜드와 표적 RNA 사이에 100% 상보성이 있다. siRNA의 안티센스 스트랜드의 부분 상보성이 있는 실시형태에서, 상보성은 예컨대 표적 RNA의 RNAi 절단에 의해 siRNA 또는 이의 절단 산물이 서열 특이적 침묵화를 지시하는 것을 가능하게 하기에 충분해야 한다. 일부 실시형태에서, siRNA의 안티센스 스트랜드는 표적 RNA와 관련하여 1개 이상, 예컨대 10개, 8개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 이것 미만의 미스매치를 포함한다. 미스매치는 말단 영역에서 가장 관용되고, 존재하면 바람직하게는 말단 영역 또는 5' 또는 3' 말단의 예를 들면 6개, 5개, 4개 또는 3개의 뉴클레오타이드 내의 영역에 있다. siRNA의 센스 (또는 패신저) 스트랜드는 분자 RNA 유도 침묵화 복합체(RISC)의 전체 이중 스트랜드 특성을 유지시키기 위해 안티센스 스트랜드에 오직 충분히 상보성일 필요가 있다.
실시형태에서, siRNA는 변형되거나 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있다. siRNA의 단일 가닥 영역은 변형되거나 뉴클레오사이드 유사체, 예를 들면 고립 영역 또는 헤어핀 구조의 영역 또는 2개의 상보성 영역을 연결하는 영역을 포함할 수 있다. 실시형태에서, siRNA는 siRNA의 3'-말단, 5'-말단 또는 둘 다를 안정화하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 변형은 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대해 또는 RNA 유도 침묵화 복합체(RISC)로 들어가는 안티센스 스트랜드를 조력하도록 siRNA를 안정화할 수 있다. 실시형태에서, siRNA의 각각의 스트랜드는 30개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개 또는 20개 또는 미만의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 각각의 스트랜드는 적어도 19개의 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들면, 각각의 스트랜드는 siRNA가 적어도 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역 및 2개 내지 3개의 뉴클레오타이드의 1개 이상의 오버행, 예컨대 1개 또는 둘 다의 3'-말단의 오버행을 갖도록 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
엔도리보뉴클레아제 제조된 siRNA(esiRNA)는 엔도리보뉴클레아제, 예컨대 RNAse III 또는 다이서에 의한 긴 이중 가닥 RNA의 절단으로부터 생긴 siRNA이다. esiRNA 산물은 동일한 mRNA 서열을 표적화하는 siRNA의 불균질한 혼합물이다.
본원에 사용된 것과 같이, "miRNA" 또는 "microRNA"의 용어는 프리-miRNA로 알려진 더 긴 RNA 헤어핀 루프 전구체 구조로부터 생성된 약 20개 내지 22개의 뉴클레오타이드의 작은 비암호화 RNA를 지칭한다. 프리-miRNA는 RISC로 혼입된 마이크로RNA 듀플렉스로의 2단계 절단 과정을 겪는다. miRNA 가이드 스트랜드와 표적 RNA 사이의 상보성의 수준은 침묵화 기전이 사용되는지를 결정한다. 통상적으로 3'-UTR에서 RNA 표적 서열에 대한 완벽한 또는 광범위한 상보성으로 결합하는 miRNA는 RNA 매개된 간섭(RNAi) 경로를 통해 표적의 절단을 유도한다. 표적 RNA에 대한 제한된 상보성을 갖는 miRNA는 번역 수준에서 표적 유전자 발현을 억제한다.
본원에 사용된 것과 같이, "shRNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA"의 용어는 짧은 루프(4-11 nt)에 의해 연결된 2개의 상보성 (19-22 bp) RNA 서열에 의해 형성된 이중 가닥 구조를 지칭한다. shRNA는 보통 세포로 도입된 벡터에 의해 암호화되고, shRNA는 RISC 복합체로 혼입된 siRNA 듀플렉스로 다이서에 의해 시토졸에서 가공되고, 여기서 가이드 스트랜드와 RNA 표적 사이의 상보성은 RNA 표적 특이적 절단 및 분해를 매개한다.
본원에 사용된 것과 같이, "리보자임"의 용어는 표적 mRNA의 표적 특이적 절단을 할 수 있는 촉매적으로 활성인 RNA 분자를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 리보자임은 바르쿠드(Varkud) 위성 리보자임, 헤어핀 리보자임, 해머헤드 리보자임 또는 간염 델타 리보자임이다.
실시형태에서, 본 개시내용의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인트론 20-21 및/또는 엑손 20 또는 엑손 21에서의 인접한 서열을 표적화한다. 비정상 스플라이싱은 스플라이스 스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수정될 수 있다. 스플라이스 스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 스플라이싱 부위에서 또는 그 근처에서 혼성화함으로써 비정상 스플라이싱 부위를 차단하여서 세포 스플라이싱 기계에 의한 인식을 방지한다. 실시형태에서, 스플라이스 스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 저항하도록 변형되고, 생성된 표적 핵산:올리고뉴클레오타이드 헤테로듀플렉스는 RNAse H에 의해 절단되지 않는다. 스플라이스 스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 연속 DNA 유사 염기의 실행이 피해지도록 RNA 또는 뉴클레오타이드 화학의 혼합물과 쌍을 지을 때 RNAse H 기질을 형성하지 않는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 따라서, 실시형태에서, 스플라이스 스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 UNC13A mRNA 전사체의 풍부도를 변경하지 않으면서 UNC13A 스플라이싱을 변형시킬 수 있다.
실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성이다. 실시형태에서, UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 15개 내지 40개의 염기, 예를 들면 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개 또는 40개의 염기 길이를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기, 18개 내지 22개의 염기 또는 20개 내지 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2 내지 표 7에서의 서열(예를 들면, 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640) 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2 내지 표 5에서의 서열(예를 들면, 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640) 중 어느 하나를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개, 19개, 20개 또는 21개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 골격 변형, 핵염기 변형, 2'-리보스 치환 또는 브릿징된 핵산을 포함할 수 있고, 변형된 올리고뉴클레오타이드 화학의 예는 제한 없이 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PMO), 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메틸(2'O-Me) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O,4'C-에틸렌-브릿징된 핵산(ENA), 트리사이클로-DNA, 트리사이클로-DNA 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 브릿징된 핵산, 2'-O-[2-(N-메틸카바모일)에틸] 변형된 올리고뉴클레오타이드, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 펩타이드 접합된 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PPMO)를 포함한다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'O-Me 변형된 뉴클레오타이드 및 포스포로티오에이트 연결을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 조성물은 치료 용도 또는 조사 용도에서의 이의 사용을 수월하게 하도록 약학 또는 조사 키트로 어셈블링될 수 있다. 키트는 (a) 본원에 기재된 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드(들); 및 (b) 사용 설명서를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트 성분 (a)는 투여의 특정한 사용 및 방식에 적합한 약학 제형 및 투여량에 있을 수 있다. 예를 들면, 키트 성분 (a)는 단일 용량 또는 다중 용량 용기, 예컨대 밀봉 앰플 또는 바이알에 제시될 수 있다. 키트의 성분은 사용 전에 하나 이상의 성분을 혼합하는 것을 요할 수 있거나, 예비혼합된 형태로 제조될 수 있다. 키트의 성분은 액체 형태 또는 고체 형태일 수 있고, 용매의 첨가 또는 추가의 희석을 요할 수 있다. 키트의 성분은 멸균일 수 있다. 설명서는 서면 형태 또는 전자 형태일 수 있고, 키트와 연관되거나(예를 들면, 서면 인서트, CD, DVD), 인터넷 또는 웹 기반 통신을 통해 제공될 수 있다. 키트는 냉동 온도 또는 동결 온도에서 운송되고 저장될 수 있다.
약학 조성물
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 것과 같이, "약학적으로 허용 가능한"의 용어는 충분한 의학 판단의 범위 내에 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 세포 및/또는 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비에 맞는 화합물, 재료, 조성물, 및/또는 투여량 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"의 용어는 의도된 기능을 수행할 수 있도록 환자 내에 또는 환자에게 본 발명 내에 유용한 화합물을 운반하거나 수송하는 데 관여된 약학적으로 허용 가능한 재료, 조성물 또는 담체, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 재료를 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고, 접촉되는 세포 또는 조직에게 해롭지 않다는 점에서 "허용 가능"해야 한다. 본 발명의 실행에 사용된 약학 조성물에 사용될 수 있는 추가 성분은 당해 분야에 알려저 있고, 예를 들면 본원에 참고로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)에 기재되어 있다.
의학 분야에 잘 알려진 것처럼, 어느 하나의 환자에 대한 투여량은 환자의 몸집, 체중, 체표면적, 연령, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제의 수준, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제의 안정성, 치료되는 특정 질환, 질환의 병기, 성별, 투여의 시간 및 경로, 일반 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 인자에 따라 달라진다.
약학 조성물은 의학 분야의 숙련자에 의해 결정된 것과 같이 치료되는(또는 예방되는) 질환 또는 병태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량 및 적합한 투여 기간 및 투여 빈도는 환자의 일반 컨디션, 환자의 몸집(즉, 체중, 질량 또는 체면적), 환자의 질환의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 섭생은 (개선된 임상 결과, 예컨대 더 빈번한 완전 또는 부분 관해, 또는 더 긴 무질환 및/또는 전체 생존기간 또는 증상 중증도의 줄어듦을 포함하는 본원에 기재된 것과 같은) 치료 이익 및/또는 예방 이익을 제공하기에 충분한 양으로 조성물(을)을 제공한다. 예방 용도를 위해, 용량은 질환 또는 장애와 연관된 질환을 예방하거나 이의 발병을 지연시키거나 이의 중증도를 감소시키기에 충분해야 한다. 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 조성물의 예방 이익은 전임상 연구(시험관내 및 생체내 동물 연구를 포함) 및 임상 연구를 수행하고, 적절한 통계학적, 생물학적 및 임상 방법 및 기법에 의해 이로부터 얻은 데이터를 분석함으로써 결정될 수 있고, 이들 모두는 당업자에 의해 용이하게 실행될 수 있다.
조성물(예를 들면, 약학 조성물)은 장용(예를 들면, 경구), 비경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 연막하, 뇌실질내, 선조체내, 두개내, 수조내, 대뇌내, 대뇌 뇌실내, 안와내, 심실내, 요추내, 피하, 진피경유, 진피내, 직장, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 크림 및/또는 드랍에 의해), 점막, 비강, 협측, 설하를 포함하는 임의의 경로에 의해; 기관내 설치, 기관지 설치 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 경구 스프레이, 비강 스프레이 및/또는 에어로졸로서 투여될 수 있다. 일반적으로, 대부분의 적합한 투여 경로는 제제의 성질(예를 들면, 위장관의 환경에서의 이의 안정성) 및/또는 대상체의 조건을 포함하는 각종 인자에 따라 달라질 것이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 대상체의 CNS로 직접 주사된다. 일부 실시형태에서, CNS로의 직접 주사는 대뇌내 주사, 뇌실질내 주사, 척추강내 주사, 연막하 주사 또는 임의의 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, CNS로의 직접 주사는 대상체의 뇌척수액(CSF)에 대한 직접 주사이고, 선택적으로 직접 주사는 수조내 주사, 심실내 주사 및/또는 요추내 주사이다.
UNC13A 은성 스플라이스 변이체 억제제를 사용하는 방법
본 개시내용은 다양한 조사 및 치료 용도를 위해 본원에 개시된 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 사용하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 세포에서 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현을 감소시키는 방법을 제공하고, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함한다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 전장 UNC13A(야생형) 또는 이의 다른 변이체(즉, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 같은 인트론 20-21로부터의 은성 엑손을 함유하지 않는 변이체)에 비해 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제한다.
실시형태에서, 은성 엑손은 UNC13A 유전자의 인트론 20-21로부터 얻어진다. 실시형태에서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 9의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산, 펩타이드, 항체, 결합 단백질, 소분자, 리보자임 또는 압타머를 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산을 포함한다. 억제성 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 또는 esiRNA일 수 있다. 실시형태에서, 억제성 핵산은 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 실시형태에서, 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 엑손 21 스플라이스 수용체 부위는 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 15개 내지 40개의 염기 길이, 바람직하게는 약 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기, 18개 내지 22개의 염기 또는 20개 내지 30개의 염기 길이를 갖는다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298), 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 염기 서열을 갖는다. 실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298), 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개, 19개, 20개 또는 21개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 실시형태에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메틸(2'O-Me) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O,4'C-에틸렌-브릿징된 핵산(ENA), 트리사이클로-DNA, 트리사이클로-DNA 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 브릿징된 핵산, 2'-O-[2-(N-메틸카바모일)에틸] 변형된 올리고뉴클레오타이드, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 펩타이드 공액 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PPMO) 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 세포는 대상체 내에 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "환자" 또는 "대상체"는 동물, 예컨대 인간, 소, 말, 양, 새끼양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한다. 동물은 포유류, 예컨대 비영장류 및 영장류(예를 들면, 원숭이 및 인간)일 수 있다. 실시형태에서, 환자는 인간, 예컨대 인간 영아, 아동, 청소년 또는 성인이다.
실시형태에서, 대상체는 인트론 20-21에서의 UNC13A 유전자 돌연변이를 갖는 것으로 확인되었다. 실시형태에서, UNC13 유전자 돌연변이는 rs12608932(hg38 chr19:17.641,880 A→C), rs12973192(hg38 chr19: 17,642,430 C→G), rs56041637(hg38 chr19:17,642,033-17,642,056 0-2 CATC 반복부→3-5 CATC 반복부) 및 rs62121687(hg38 chr19:17,642,351 C→A), 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 세포에서 인산화된 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43)을 감소시키는 방법을 제공하고, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함한다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 전장 UNC13A(야생형) 또는 이의 다른 변이체(즉, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 같은 인트론 20-21로부터의 은성 엑손을 함유하지 않는 변이체)에 비해 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제한다.
실시형태에서, 은성 엑손은 UNC13A 유전자의 인트론 20-21로부터 얻어진다. 실시형태에서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 9의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산, 펩타이드, 항체, 결합 단백질, 소분자, 리보자임 또는 압타머를 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산을 포함한다. 억제성 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 또는 esiRNA일 수 있다. 실시형태에서, 억제성 핵산은 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 실시형태에서, 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 엑손 21 스플라이스 수용체 부위는 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 15개 내지 40개의 염기 길이, 바람직하게는 약 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기, 18개 내지 22개의 염기 또는 20개 내지 30개의 염기 길이를 갖는다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298), 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 염기 서열을 갖는다. 실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298), 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개, 19개, 20개 또는 21개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 실시형태에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메틸(2'O-Me) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O,4'C-에틸렌-브릿징된 핵산(ENA), 트리사이클로-DNA, 트리사이클로-DNA 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 브릿징된 핵산, 2'-O-[2-(N-메틸카바모일)에틸] 변형된 올리고뉴클레오타이드, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 펩타이드 공액 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PPMO) 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 세포는 대상체 내에 있다. 실시형태에서, 대상체는 인트론 20-21에서의 UNC13A 유전자 돌연변이를 갖는 것으로 확인되었다. 실시형태에서, UNC13 유전자 돌연변이는 rs12608932(hg38 chr19:17.641,880 A→C), rs12973192(hg38 chr19: 17,642,430 C→G), rs56041637(hg38 chr19:17,642,033-17,642,056 0-2 CATC 반복부→3-5 CATC 반복부) 및 rs62121687(hg38 chr19:17,642,351 C→A), 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 단백질병증을 치료하는 방법을 제공하고, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함한다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 전장 UNC13A(야생형) 또는 이의 다른 변이체(즉, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 같은 인트론 20-21로부터의 은성 엑손을 함유하지 않는 변이체)에 비해 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제한다.
실시형태에서, 은성 엑손은 UNC13A 유전자의 인트론 20-21로부터 얻어진다. 실시형태에서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 9의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산, 펩타이드, 항체, 결합 단백질, 소분자, 리보자임 또는 압타머를 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산을 포함한다. 억제성 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 또는 esiRNA일 수 있다. 실시형태에서, 억제성 핵산은 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 실시형태에서, 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 엑손 21 스플라이스 수용체 부위는 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 15개 내지 40개의 염기 길이, 바람직하게는 약 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기, 18개 내지 22개의 염기 또는 20개 내지 30개의 염기 길이를 갖는다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298), 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 염기 서열을 갖는다. 실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298) 및 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개, 19개, 20개 또는 21개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 실시형태에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메틸(2'O-Me) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O,4'C-에틸렌-브릿징된 핵산(ENA), 트리사이클로-DNA, 트리사이클로-DNA 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 브릿징된 핵산, 2'-O-[2-(N-메틸카바모일)에틸] 변형된 올리고뉴클레오타이드, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 펩타이드 공액 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PPMO) 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 세포는 대상체 내에 있다. 실시형태에서, 대상체는 인트론 20-21에서의 UNC13A 유전자 돌연변이를 갖는 것으로 확인되었다. 실시형태에서, UNC13 유전자 돌연변이는 rs12608932(hg38 chr19:17.641,880 A→C), rs12973192(hg38 chr19: 17,642,430 C→G), rs56041637(hg38 chr19:17,642,033-17,642,056 0-2 CATC 반복부→3-5 CATC 반복부) 및 rs62121687(hg38 chr19:17,642,351 C→A), 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, TDP-43 단백질병증은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 퇴행(FTLD), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근 위축증(PMA), 안면 발병 감각 및 운동 뉴런병증(FOSMN), 해마회 경화증(HS), 변연계 우위 연령 관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 경화증을 갖는 대뇌 연령 관련 TDP-43(CARTS), 괌 파킨슨-치매 복합체(G-PDC), 구안 ALS(G-ALS), 다계통 단백질병증(MSP), 페리병, 알츠하이머병(AD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE) 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 인트론 20-21에서 UNC13A 유전자 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 유전자 돌연변이는 rs12608932(hg38 chr19:17.641,880 A→C), rs12973192(hg38 chr19: 17,642,430 C→G), rs56041637(hg38 chr19:17,642,033-17,642,056 0-2 CATC 반복부→3-5 CATC 반복부) 및 rs62121687(hg38 chr19:17,642,351 C→A), 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 대상체는 TDP-43의 감소된 발현을 갖는다. 실시형태에서, 대상체는 감소된 핵 TDP-43을 나타낸다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 전장 UNC13A(야생형) 또는 이의 다른 변이체(즉, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 같은 인트론 20-21로부터의 은성 엑손을 함유하지 않는 변이체)에 비해 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제한다.
실시형태에서, 은성 엑손은 UNC13A 유전자의 인트론 20-21로부터 얻어진다. 실시형태에서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 9의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 실시형태에서, UNC13 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산, 펩타이드, 항체, 결합 단백질, 소분자, 리보자임 또는 압타머를 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산을 포함한다. 억제성 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 또는 esiRNA일 수 있다. 실시형태에서, 억제성 핵산은 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역; UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는 UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 실시형태에서, 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 엑손 21 스플라이스 수용체 부위는 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단에 상보성인 서열을 포함한다. 실시형태에서, 억제성 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 서열을 포함한다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 15개 내지 40개의 염기 길이, 바람직하게는 약 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기, 18개 내지 22개의 염기 또는 20개 내지 30개의 염기 길이를 갖는다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298), 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 염기 서열을 갖는다. 실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표 2(예를 들면, 서열 번호 13-90), 표 3(서열 번호 92-219), 표 4(서열 번호 221-298), 표 5(서열 번호 300-377), 표 7B(서열 번호 423-522) 및 표 8B(서열 번호 523-640)에 열거된 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 650과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 651과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 652와 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 653과 상보성인 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는다. 실시형태에서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 654와 상보성인 18개, 19개, 20개 또는 21개의 염기를 갖는다.
실시형태에서, UNC13 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 실시형태에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메틸(2'O-Me) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O,4'C-에틸렌-브릿징된 핵산(ENA), 트리사이클로-DNA, 트리사이클로-DNA 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 브릿징된 핵산, 2'-O-[2-(N-메틸카바모일)에틸] 변형된 올리고뉴클레오타이드, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 펩타이드 공액 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PPMO) 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 대상체는 TDP-43 단백질병증을 갖는다. 실시형태에서, TDP-43 단백질병증은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 퇴행(FTLD), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근 위축증(PMA), 안면 발병 감각 및 운동 뉴런병증(FOSMN), 해마회 경화증(HS), 변연계 우위 연령 관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 경화증을 갖는 대뇌 연령 관련 TDP-43(CARTS), 괌 파킨슨-치매 복합체(G-PDC), 구안 ALS(G-ALS), 다계통 단백질병증(MSP), 페리병, 알츠하이머병(AD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE) 또는 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 치료를 위한 방법은 TDP-43 단백질병증의 특징적인 하나 이상의 증상의 발생 또는 진행을 감소시키거나 예방하거나 느리게 한다. TDP-43 단백질병증의 특징적인 증상의 예는 운동 기능이상, 인지 기능이상, 감정/행동 기능이상, 마비, 떨림, 어지러움, 경직, 수축, 근육 약화, 근육 경련, 근육 강직, 근 위축증, 연하 곤란, 호흡 곤란, 발음 및 언어 곤란(예를 들면, 어눌한 말투), 움직임 느려짐, 보행 곤란, 치매, 우울증, 불안 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 치료를 위한 방법은 단독요법으로서의 또는 TDP-43 단백질병증의 치료를 위한 하나 이상의 추가 치료제와 조합된 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제의 투여를 포함한다. 조합 치료제는 하나 이상의 추가 치료제와 동시의, 이것 전의, 이것에 후속하는 대상체에 대한 본 개시내용의 조성물(예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)의 투여를 의미할 수 있다. 조합 치료제의 동시 투여는 본 개시내용의 조성물(예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드) 및 추가 치료제가 동일한 투여량 형태의 투여를 위해 제형화되거나 별개의 투여량 형태로 투여된다는 것을 의미할 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제와 조합되어 사용될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제는 신경퇴행성 질환 관련된 유전자 또는 전사체(예를 들면, C9ORF72)를 표적화하는 억제성 핵산 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 신경퇴행성 관련된 유전자(예를 들면, C9ORF72)를 표적화하는 유전자 편집 제제(예를 들면, CRISPR, TALEN, ZFN 기반 시스템), 산화 스트레스를 감소시키는 제제, 예컨대 자유 라디칼 소거제(예를 들면, 라디카바(Radicava)(에다라본), 브로모크립틴); 항글루타메이트 제제(예를 들면, 릴루졸, 토피라메이트, 라모트리긴, 덱스트로메토르판, 가바펜틴 및 AMPA 수용체 길항제(예를 들면, 탈람파넬)); 항아폽토시스 제제(예를 들면, 미노사이클린, 나트륨 페닐부티레이트 및 아리모클로몰); 소염제(예를 들면, 강글리오사이드, 셀레콕시브, 사이클로스포린, 니메술라이드, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 플라스마페레시스, 글라티라머 아세테이트 및 탈리도마이드); 베타-락탐 항생제(페니실린 및 이의 유도체, 세프트리악손 및 세팔로스포린); 도파민 작용제(프라미펙솔, 덱스프라미펙솔); 및 신경영양성 인자(예를 들면, IGF-1, GDNF, BDNF, CTNF, VEGF, 콜리벨린, 살리프로덴, 티로트로핀 방출 호르몬 및 ADNF)를 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 C9ORF72를 표적화하는 추가 치료제와 조합되어 투여된다. 일부 실시형태에서, C9ORF72를 표적화하는 추가 치료제는 C9ORF72 전사체를 표적화하는 억제성 핵산, C9ORF72 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 C9ORF72 특이적 유전자 편집 제제를 포함한다. C9ORF72 특이적 치료제의 예는 각각이 그 전문이 참고로 포함된 US 특허 제9,963,699호(안티센스 올리고뉴클레오타이드); PCT 공보 WO2019/032612호(안티센스 올리고뉴클레오타이드); US 특허 제10,221,414호(안티센스 올리고뉴클레오타이드); US 특허 제10,407,678호(안티센스 올리고뉴클레오타이드); US 특허 제9,963,699호(안티센스 올리고뉴클레오타이드); US 특허 공보 US2019/0316126호(억제성 핵산); US 특허 공보 제2019/0167815호(유전자 편집); PCT 공보 WO2017/109757호(유전자 편집)에 기재되어 있다.
실시형태에서, TDP-43 단백질병증 예컨대 ALS 또는 FTD를 치료하는 것을 포함하는 본 개시내용의 치료를 위한 방법은 STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제와 조합되어 사용될 수 있다. 스타트민-2라고 칭하는 미세소관 안정성의 조절자를 암호화하는 STMN2는 TDP-43이 뉴런으로부터 고갈될 때 발현이 가장 유의미하게 감소된 유전자이다. 스타트민-2 유전자는 5개의 구성적 엑손과 엑손 4와 엑손 5 사이의 제안된 대안적인 엑손을 함유하는 것으로 주석화된다(표 10 참조). STMN2는 성숙 STMN2 mRNA로부터 보통 배제된 인트론 1에 함유된 은성 엑손(엑손 2a)을 보유한다(도 18 참조). STMN2의 제1 인트론(표 10)은 TDP-43 결합 부위를 함유한다. TDP-43이 손실되거나 이의 기능이 손상될 때, 엑손 2a는 성숙 mRNA로 혼입된다. 엑손 2a는 시작 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 보유하여서(도 18), 절두된 STMN2 mRNA 및 스타트민-2의 8배 감소를 생성시킨다. 비정상 스플라이싱 및 감소된 스타트민-2 수준은 산발성 및 가족성 ALS 사례(SOD1 돌연변이를 갖는 것을 제외) 및 FTLD-TDP의 주요 특징인 것으로 보인다.
실시형태에서, STMN2 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 전장 STMN2(야생형) 또는 이의 다른 변이체(즉, 변이체 인트론 1에 함유된 은성 엑손 2a를 함유하지 않는 변이체)에 비해 STMN2 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제한다.
실시형태에서, STMN2 은성 엑손은 STMN2 유전자의 인트론 1로부터 얻어진다. 실시형태에서, 은성 엑손 2a는 도 19에 도시된 적색 서열을 포함한다.
실시형태에서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산, 펩타이드, 항체, 결합 단백질, 소분자, 리보자임 또는 압타머를 포함한다.
실시형태에서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 은성 엑손 2a를 표적화한다.
실시형태에서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산을 포함한다. 억제성 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 또는 esiRNA일 수 있다. 실시형태에서, 억제성 핵산은 STMN2를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 1 스플라이스 공여체 부위 영역; STMN2를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 2a 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태에서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 15개 내지 40개의 염기 길이, 바람직하게는 약 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기, 18개 내지 22개의 염기 또는 20개 내지 30개의 염기 길이를 갖는다.
실시형태에서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 실시형태에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메틸(2'O-Me) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 올리고뉴클레오타이드, 2'O,4'C-에틸렌-브릿징된 핵산(ENA), 트리사이클로-DNA, 트리사이클로-DNA 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 브릿징된 핵산, 2'-O-[2-(N-메틸카바모일)에틸] 변형된 올리고뉴클레오타이드, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 펩타이드 공액 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PPMO) 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 장용(예를 들면, 경구), 비경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 연막하, 뇌실질내, 선조체내, 두개내, 수조내, 대뇌내, 대뇌 뇌실내, 안와내, 심실내, 요추내, 피하, 진피경유, 진피내, 직장, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 크림 및/또는 드랍에 의해), 점막, 비강, 협측, 설하를 포함하는 임의의 경로에 의해; 기관내 설치, 기관지 설치 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 경구 스프레이, 비강 스프레이 및/또는 에어로졸로서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제(예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 예를 들면 척추강내, 연막하, 뇌실질내, 선조체내, 두개내, 수조내, 대뇌내, 대뇌 뇌실내, 안와내, 정맥내, 요추내 투여 또는 임의의 이들의 조합에 의해 대상체의 CNS로 직접 투여된다.
실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제와 접촉하지 않은 세포에서 UNC13A 은성 스플라이스 변이체와 비교하여 세포에서 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 초과만큼 세포에서 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 발현 또는 활성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 억제성 핵산과 접촉하지 않은 세포에서 UNC13A 은성 스플라이스 변이체의 발현 수준과 비교하여 10-20%, 10-30%, 10-40%, 10-50%, 10-60%, 10-70%, 10-80%, 10-90%, 10-95%, 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100%만큼 세포에서 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 발현 또는 활성을 감소시킨다.
실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 비처리된 대상체의 CNS에서의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체의 발현 수준과 비교하여 CNS에서의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 초과만큼 대상체의 CNS에서의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 발현 또는 활성을 감소시킨다. 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 비처리된 대상체의 CNS에서의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체의 발현 수준과 비교하여 10-20%, 10-30%, 10-40%, 10-50%, 10-60%, 10-70%, 10-80%, 10-90%, 10-95%, 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100%만큼 대상체의 CNS에서의 UNC13A 은성 스플라이스 변이체 발현 또는 활성을 감소시킨다.
실시예
실시예 1: TDP-43은 FTD/ALS 유전자 UNC13A에서 은성 엑손 봉입을 억제한다.
재료 및 방법
RNA-Seq 정렬 및 스플라이싱 분석
RNA-Seq 정렬 및 스플라이싱 분석을 위한 상세한 파이프라인 v2.0.1은 https://github.com/emc2cube/Bioinformatics/sh_RNAseq.sh에서 이용 가능하다. FASTQ 파일을 GSE126543으로서 Gene Expression Omnibus(GEO) 데이터베이스로부터 다운로드하였다. FASTQ 파일에서의 어답터를 트림모만틱(trimmomatic)(0.39)(ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36)을 사용하여 제거하였다. 이후, 생성된 파일의 품질을 FastQC(v0.11.9)를 사용하여 평가하였다. 이후, RNA-Seq 판독을 STAR v2.7.3a를 사용하여 인간 (hg38)로 맵핑하였다.
스플라이싱 분석
MAJIQ: 대안적인 스플라이싱 사건을 MAJIQ(2.2) 및 VOILA(12)를 사용하여 분석하였다. 간단히, 특별히 맵핑된, 연접부 스패닝 판독을 신생 검출된 연접부가 보충된 UCSC 트랜스크립토머 주석(82 출간)을 사용하여 전사체에 대해 스플라이스 그래프를 구축하기 위해 하기 매개변수 "majiq build -c config --min-intronic-cov 1 --simplify"에 의해 MAJIQ에 의해 사용하였다. 여기서, 신생은 UCSC 트랜스크립토머 주석에 없지만, RNA-Seq 데이터(--min-intronic-cov 1)에서 충분한 증거를 갖는 연접부를 지칭한다. 구별되는 국소 스플라이스 변이(LSV)는 유전자 스플라이스 그래프에서 확인되고, MAJIQ 정량자(majiq psi)는 각각의 RNA-Seq 샘플에서 (PSI 또는 Ψ)에서 스플라이싱된 퍼센트로서 표시된 각각의 LSV에서의 각각의 연접부의 분획을 추정하였다. 2개의 조건의 변화(TDP-43-양성 뉴런 핵 대 TDP-43-음성 뉴런 핵) 사이의 각각의 연접부의 PSI(ΔPSI 또는 ΔΨ)는 명령어 "majiq deltapsi"를 사용함으로써 계산되었다. PSI 및 ΔPSI의 후방 분포인 유전자 스플라이스 그래프는 VOILA를 사용하여 가시화되었다.
LeafCutter(https://github.com/davidaknowles/leafcutter에서 commit 249fc26): 이전에 기재된 것과 같은 이미 정렬된 RNA-Seq 판독을 사용하여, 각각의 엑손으로 엑손-엑손 연접부 및 최소 6 np를 갖는 맵에 이르는 판독은 디폴트 설정으로 filter_cs.py를 사용하여 정렬(bam) 파일로부터 추출되었다. 인트론 클러스터링은 leafcutter_cluster.py에서 디폴트 설정을 사용하여 수행되었다. 2개의 조건TDP-43-양성 뉴런 핵 대 TDP-43-음성 뉴런 핵)의 차등적 절제는 leafcutter_ds.R을 사용하여 계산되었다.
세포 배양
SH-SY5Y(ATCC) 세포를 37℃, 5% CO2에서 Glutamax(Thermo Scientific), 10% 소 태아 혈청 및 10% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12에서 성장시켰다. shRNA 처리를 위해, 세포를 제0일에 플레이팅하고, 제2일에 shRNA로 형질도입한 후, 제3일에 배지를 새롭게 하고, 제6일에 리드아웃(RT-qPCR, 면역블로팅)을 위해 수확하였다. HEK293T TDP-43 넉아웃 세포 및 모 HEK-293T 세포를 (37)에 기재된 것처럼 생성시켰다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청(Invitrogen 16000-044), 1% 페니실린 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민(Gemini Biosciences), 1x MEM 비필수 아미노산 용액(Gibco)이 보충된 DMEM 매질(Gibco 10564011)에서 배양하였다.
면역블로팅
SH-SY5Y 세포 및 iPSC 유래 운동 뉴런(iPSC-MN)을 용해 전에 상기처럼 형질주입하고 처리하였다. 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher 78429) 및 포스파타제 억제제(Thermo Fisher 78426)가 보충된 아주 차가운 RIPA 완충액(Sigma- Aldrich R0278)에서 용해시켰다. 단백질 농도를 결정하기 위해 4℃에서 15분 동안 테이블 탑 원심분리기에서 최대 속도에서 용해물을 펠릿화한 후, 비신코닌산(Invitrogen 23225) 검정을 수행하였다. 각각의 샘플의 60 μg(SH-SY5Y) 및 30 μg(iPSC-MN)의 단백질을 2.5% 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich)을 함유하는 LDS 샘플 완충액(Invitrogen NP0008)에서 70℃에서 10분 동안 변성시켰다. 이 샘플을 겔 전기영동을 위해 4-12% Bis-Tris 겔(Thermo FisherNP0335BOX)에 로딩한 후, 습식 이송 방법(Bio-Rad Mini Trans-Blot Electrophoretic Cell 170-3930)을 사용하여 2시간 동안 100 V에서 0.45-μm 니트로셀룰로스 막(Bio-Rad 162-0115)으로 옮겼다. 막을 1시간 동안 Odyssey Blocking Buffer (LiCOr 927-40010)에서 차단한 후, UNC13A(1:500, Proteintech 55053-1-AP), TDP-43(1:1,000, Abnova H00023435-M01) 또는 GAPDH(Cell Signaling Technologies 5174S)에 대해 항체를 함유하는 차단 완충액에서 실온에서 밤새 항온처리하였다. 막을 후속하여 1시간 동안 HRP 접합된 항마우스 IgG(H+L)(1:2000, Fisher 62-6520) 또는 HRP 접합된 항토끼 IgG(H+L)(1:2000, Life Technologies 31462)를 함유하는 차단 완충액에서 배향하였다. ECL Prime 키트(Invitrogen)를 블롯의 발생을 위해 사용하였고, 이것을 ChemiDox XRS+ 시스템(BIO-RAD)을 사용하여 영상화하였다. 밴드의 강도를 Fiji를 사용하여 정량화하고, 이후 상응하는 대조군으로 정규화하였다.
RNA 추출, cDNA 합성 및 UNC13A 스플라이스 변이체를 검출하기 위한 RT-qPCR/RT-PCR
총 RNA를 제조사의 지시에 따라 RNeasy Micro 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하고, 용해물을 수율을 최대화하기 위해 QIAshredder 칼럼(Qiagen)을 통해 통과시켰다. RNA를 Nanodrop(Thermo Scientific)에 의해 정량화하고, 75 ng을 cDNA 합성을 위해 SuperScript IV VILO Master Mix(Thermo Scientific)와 사용하였다. qPCR을 표준 사이클링 매개변수(2분 동안 95℃, 15초 동안 95℃/60초 동안 60℃의 40회 사이클), 이후 표준 해리(1.6℃/초에서의 15초 동안 95℃, 1.6℃/초에서의 60초 동안 60℃, 0.075℃/초에서의 15초 동안 95℃)를 사용하여 QuantStudio 6 Flex에서 리드아웃으로 PowerTrack SYBR Green Master Mix(Thermo Scientific)를 사용하여 20 ul 반응에서 6 ng의 cDNA 유입으로 실행하였다. ΔΔCt를 하우스키퍼로서 RPLP0 및 기준으로서 관련 sh스크램블로 계산하고; 40 초과의 측정된 Ct 값은 가시화를 위해 40으로 설정되었다. 하기 프라이머 쌍을 사용하였다:
RT-PCR을 NEBNext Ultra II Q5 Master Mix(New England Biolabs)을 사용하여 100 ul 반응물에서 15 ng의 cDNA 유입으로 수행하고, 생성된 산물을 1.5% TAE 겔에서 가시화하였다. 하기 프라이머 쌍을 사용하였다:
shRNA 클로닝, 렌티바이러스 패키징 및 세포 형질도입
shRNA 서열은 Broad GPP Portal(TDP-43: AGATCTTAAGACTGGTCATTC(서열 번호 391), 스크램블: GATATCGCTTCTACTAGTAAG(서열 번호 392))로부터 기원하였다. 클로닝하기 위해, 상보성 올리고머체를 4 nt 오버행을 생성하도록 합성하고, 어닐링하고, pRSITCH(Tet 유도성 U6) 또는 pRSI16(구성적 U6)(Cellecta)으로 결찰하였다. 결찰을 Stbl3 합성으로 유능한 세포(Thermo Scientific)로 형질변환하고 30℃에서 성장시켰다. 대규모 플라스미드 생성을 Maxiprep 칼럼(Promega)을 사용하여 수행하고, 정제된 플라스미드를 2세대 패키징 플라스미드 psPAX2 및 pMD2.G(Cellecta)로 렌티바이러스 패키징을 위한 유입으로서 사용하고, Lenti-X 293T 세포(Takara)에서 Lipofectamine 2000(Invitrogen)으로 형질도입하였다. 바이러스 상청액을 형질주입 후 48시간 및 72시간에 수집하고, Lenti-X Concentrator(Takara)를 사용하여 농축하였다. 바이러스 역가를 실험을 위해 선택된 80% BFP+ 세포의 최대를 달성하는 희석으로 유세포분석법에 의해 관련 세포주에서의 연속 희석 및 %BFP+의 리드아웃에 의해 확립하였다.
변이체 검증
iPSC 유래 운동 뉴런 세포에서의 변이체를 UNC13A 엑손 19로부터 엑손 21(UNC13A_19_21 FWD 5'-3' = CAACCTGGACAAGCGAACTG(서열 번호 387), UNC13A_19_21 RVS 5'-3' = GGGCTGTCTCATCGTAGTAAAC(서열 번호 388))로의 PCR 증폭에 의해 확립하였다. 생성된 산물을 Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up 칼럼(Promega)을 사용하여 정제하고, Sanger 및 NGS(Amplicon EZ)(Genewiz)에 대해 처리하였다.
iPSC 유지 및 운동 뉴런(iPSC-MN)으로의 분화
iPSC 계통을 공공 바이오뱅크(GM25256-Corriell Institute; NDS00262, NDS00209-NINDS)로부터 얻고, 마트리겔(Corning)에서 mTeSR1 매질(StemCell Technologies)에서 유지시켰다. iPSC를 제조사의 지시에 따라 ReLeSR(StemCell Technologies)을 사용하여 매일 공급하고 4일 내지 7일마다 분할하였다. 운동 뉴런으로의 iPSC의 분화를 이전에 기재된 (41)로서 수행하였다. 간단히, iPSC를 해리하고 초저 부착 플라스크(Corning)에 배치하여 DMEMF12/Neurobasal(Thermo Fisher), N2 보충제(Thermo Fisher) 및 B-27 보충제-Xeno 프리(Thermo Fisher)를 함유하는 배지에서 3D 회전타원체를 형성하였다. 소분자를 회전타원체(LDN193189, SB-431542, Chir99021)의 뉴런 조상 패터닝을 유도하도록 첨가한 후, 운동 뉴런 유도(RA, SAG, DAPT)하였다. 14일 후, 뉴런 회전타원체를 파파인 및 DNAse(Worthington Biochemical)로 해리하고, 신경영양성 인자(BDNF, GDNF, CNTF; R&D Systems)를 함유하는 Neurobasal 배지(Thermo Fisher)에서 폴리-D-리신/라미닌 코팅된 플레이트에 플레이팅하였다. 바이러스 형질도입을 위해, sh스크램블 또는 shTDP-43에 대한 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지로 18시간 동안 뉴런 배양물을 배양하였다. 90% 초과의 감염 효율을 RFP 발현에 의해 평가하였다. 뉴런 배양물을 형질도입 후 7일에 RNA 및 단백질에 대해 분석하였다.
UNC13A 스플라이스 변이체를 검출하기 위한 인간 iPSC-뉴런
상보성 cDNA를 본 발명자들의 이전의 공보(10)로부터 생성된 CRISPRi-i3Neuron iPSC(i3N)로부터 입수하고, 여기서 TDP-43을 약 50%로 하향조절한다. 정량적 실시간 PCR(RT-qPCR)을 SYBR GreenER qPCR SuperMix(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 샘플을 3중으로 실행하고, RT-qPCR을 QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)에서 실행하였다. 하기 프라이머 쌍을 사용하였다: UNC13A_CE FWD 5'-3' = TGGATGGAGAGATGGAACCT(서열 번호 379), UNC13A_CE RVS 5'-3' = GGGCTGTCTCATCGTAGTAAAC(서열 번호 380). 상대 정량화를 ΔΔCt 방법을 사용하여 결정하고 내인성 대조군 RPLP0 및 GAPDH(GAPDH FWD 5'-3' = GTTCGACAGTCAGCCGCATC(서열 번호 397), GAPDH RVS 5'-3' = GGAATTTGCCATGGGTGGA(서열 번호 398); RPLP0_2 FWD 5'-3' = TCTACAACCCTGAAGTGCTTGAT(서열 번호 399), RPLP0_2 RVS 5'-3' = CAATCTGCAGACAGACACTGG(서열 번호 400))로 정규화하였다. 야생형 UNC13A에 대한 상대 전사체 수준을 건강한 대조군의 것(1로 설정된 평균)으로 정규화하였다.
UNC13A 스플라이스 변이체를 검출하기 위한 사후 뇌 조직
FTLD-TDP를 갖는 환자로부터의 사후 뇌 조직 및 인지상 정상인 대조군 개체를 Mayo Clinic Florida Brain Bank로부터 얻었다. 각각 신경학적 검사 및 병리학적 검사 시 훈련된 신경학자 및 신경병리학자에 의해 진단이 독립적으로 확인되었다. 서면 동의서는 모든 참가자 또는 권한 있는 가족 구성원에 의해 주어지고, 모든 프로토콜은 메이요 클리닉 기관 심사 위원회 및 윤리 위원회(Mayo Clinic Institution Review Board and Ethics Committee)에 의해 허가되었다. 내측 전두 피질로부터의 500 ng의 RNA(7.0 이상의 RIN)로부터 얻은 상보성 DNA(cDNA)를 이전의 연구뿐만 아니라 동일한 샘플로부터의 일치하는 pTDP-43 데이터(42)로부터 입수하였다. 표준 프로토콜에 따라, 정량적 실시간 PCR(RT-qPCR)을 3중으로 모든 샘플에 대해 SYBR GreenER qPCR SuperMix(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 수행하였다. UNC13A 스플라이스 변이체를 검출하기 위해 사용된 프라이머 쌍은 UNC13A_CE FWD 5'-3' = TGGATGGAGAGATGGAACCT(서열 번호 379), UNC13A_CE RVS 5'-3' = GGGCTGTCTCATCGTAGTAAAC(서열 번호 380)이였다. RT-qPCR을 QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)에서 실행하였다. 상대 정량화를 ΔΔCt 방법을 사용하여 결정하고 내인성 대조군 RPLP0 및 GAPDH(GAPDH FWD 5'-3' = GTTCGACAGTCAGCCGCATC(서열 번호 397), GAPDH RVS 5'-3' = GGAATTTGCCATGGGTGGA(서열 번호 398); RPLP0_2 FWD 5'-3' = TCTACAACCCTGAAGTGCTTGAT(서열 번호 399), RPLP0_2 RVS 5'-3' 5' CAATCTGCAGACAGACACTGG(서열 번호 400))로 정규화하였다. 상대 전사체 수준을 건강한 대조군의 것(1로 설정된 평균)으로 정규화하였다.
UNC13A 스플라이스 변이체의 정량화
NYGC ALS Consortium 코호트에 의해 생성된 RNA-Seq 데이터를 NCBI의 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터염기(GSE137810, GSE124439, GSE116622 및 GSE153960)로부터 다운로드하였다. (10)에 기재된 것과 같이 분류된 1658개의 이용 가능하고 품질 제어된 샘플을 사용하였다. 이전에 기재된 것과 같이 판독을 예비가공하고 인간 (hg38)로 정렬한 후, 전장 UNC13A의 발현을 RSEM(v1.3.2)을 사용하여 추정하였다. 모든 개체로부터의 모든 조직 샘플에 걸친 UNC13A의 평균 TPM은 평균 10.5였다. PCR 듀플리케이트를 명령어 "MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES=true CREATE_INDEX=true"를 사용하여 Picard Tools(2.23.0)로부터 MarkDuplicates를 사용하여 제거하였다. "엑손 19-엑손 20" 연접부, "엑손 20-CE" 연접부, "CE- 엑손 21" 연접부 또는 "엑손 20-엑손 21" 연접부에 걸친 판독을 명령어 "bedtools intersect -split"를 사용하여 bedtools(2.27.1)을 사용하여 정량화하였다. 사후 조직에서의 UNC13A의 발현의 비교적 낮은 수준 및 조직의 불균질성 때문에, 모든 조직이 본 발명자들이 스플라이스 변이체를 검출하기 위해 충분히 검출 가능한 UNC13A를 갖지 않는 것이 가능하다. UNC13A가 40개 초과의 엑손을 함유하고 mRNA 전사체의 RNA-Seq 커버리지가 대개 균일하게 분포되지 않으므로(43), 정규 아이소폼 및 스플라이스 변이체 둘 다에 포함된 "엑손 19-엑손 20" 연접부에 이르는 판독은 조사되고, "엑손 19- 엑손 20" 연접부와 "엑손 20-엑손 21" 연접부로 맵핑된 판독의 수 사이에 강한 상관관계(피어슨 r = 0.99)가 있다. "엑손 20-CE" 연접부 또는 "CE-엑손 21" 연접부에 이르는 적어도 2개의 판독을 갖는 샘플은 적어도 UNC13A TPM = 1.55 또는 "엑손 19-엑손 20" 연접부에 이르는 20개의 판독을 갖는 것으로 관찰되었다. 따라서, 1.55 이상의 TPM 또는 "엑손 19-엑손 20" 연접부로 맵핑된 적어도 20개의 판독을 갖는 1151개의 샘플은 UNC13A 스플라이스 변이체 분석에 적합한 샘플로서 선택되었다.
인간 사후 뇌에서의 rs12608932 및 rs12973192 SNP 유전자형의 결정
게놈 DNA(gDNA)를 제조사의 지시에 따라 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega)를 사용하여 인간 전두 피질로부터 추출하였다. TaqMan SNP 유전자형분석 검정을 프라이머 쌍 및 각각의 SNP(Cat#4351379, rs12608932에 대해 검정 ID "43881386_10" 및 rs12973192에 대해 "11514504_10", Thermo Fisher Scientific)에 특이적인 VIC/FAM 표지된 프로브로 이루어진 상업용 예비 혼합물을 사용하여 검정마다 20 ng의 gDNA에서 수행하고, 제조사의 지시에 따라 QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 실행하였다. PCR-프로그램은 30초 동안 60℃, 10분 동안 95℃, 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃(rs12973192) 또는 62.5℃의 40회 사이클(rs12608932) 및 30초 동안 60℃였다.
스플라이싱 리포터 검정
미니유전자 작제물을 인 실리코로 설계하고, GeneScript에 의해 합성하고, GFP 스플라이싱 대조군에 의해 벡터로 서브클로닝하였다. HEK293T TDP-43 넉아웃 세포 및 모 HEK-293T 세포를 표준 P12 조직 배양 플레이트(1.6 × 105개의 세포/웰에서)로 시딩하고, 밤새 부착되게 하고, Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(Invitrogen)를 사용하여 표시된 스플라이싱 리포터 작제물(400 ng/웰)로 형질주입하였다. 각각의 리포터는 이방향성 프로모터로부터 발현된 (도 4e에 도시된) 스플라이싱 모듈 중 하나를 포함하였다. 형질주입 후 24시간에, RNA를 온칼럼 PureLink DNAse 처리로 제조사의 프로토콜에 따라 PureLink RNA Mini Kit(Life Technologies)를 사용하여 이들 세포로부터 추출하였다. RNA를 제조사의 지시에 따라 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. PCR을 Mastercycler Pro (Eppendorf) 유전자증폭기 PCR 기계에서 하기 프라이머를 사용하여 Standard Buffer(NEB)로 OneTaq 2X Master Mix를 사용하여 수행하였다: mCherry FWD 5'-3' = GTTCATGCGCTTCAAGGTG(서열 번호 407), mCherry RVS 5'-3' = TTGGTCACCTTCAGCTTGG(서열 번호 408); EGFP FWD 5'-3' = ACAGGTACTGTGCCTATCAAAG(서열 번호 409); EGFP RVS 5'-3' = TGTGGCGGATCTTGAAGTTAG(서열 번호 410). PCR 산물을 1.5% TAE 겔에서 전기영동에 의해 분리하고, ChemiDox XRS+ System(BIO-RAD)에서 영상화하였다.
pTB UNC13A 미니유전자 작제물의 생성
인간 UNC13A 은성 엑손 서열 및 은성 엑손의 상류(인트론 19의 말단에서의 50 bp, 전체 엑손 20, 은성 엑손의 상류에서 전체 인트론 20 서열) 및 하류(약 300 bp 인트론 20)에서의 뉴클레오타이드 플랭킹 서열을 함유하는 pTB UNC13A 미니유전자 작제물을 하기 프라이머를 사용하여 인간 게놈 DNA로부터 증폭시키고: FWD 5'- 3' = AGGTCATATGCACTGCTATAGTGGGAAGTTC(서열 번호 411) 및 RVS5'-3' = CTTACATATGTAATAACTCAACCACACTTCCATC 서열 번호 412); pTB 벡터의 NdeI 부위로 서브클로닝하였다. 다른 TDP-43 표적의 TDP-43 스플라이싱 조절을 연구하기 위한 유사한 접근법이 이전에 사용되었다(44)는 것에 주목한다.
pTB 미니유전자 및 TDP-43 과발현 작제물을 사용한 UNC13A 스플라이싱의 구제
HeLa 세포를 Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement(Gibco)와 10% 소 태아 혈청(Sigma) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)에서 성장시켰다. 이중 형질주입 및 넉다운 실험을 위해, 세포를 처음에 제조사(Invitrogen)의 지시에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 무혈청 배지 중에 1.0 μg의 pTB UNC13A 미니유전자 작제물 및 1.0 μg의 하기 플라스미드 중 하나로 형질주입하였다: GFP, GFP-TDP-43 또는 GFP-TDP-43 5FL(GFP-태그화된 TDP-43 단백질을 발현하기 위한 작제물은 이전에 기재되어 있음(40, 44)). 형질주입 후 4시간에, 배지를 하기 제조사의 프로토콜에 따라 siLentfect(Bio-Rad) 및 siRNA 복합체(AllStars 음성 대조군 siRNA 또는 TARDBP 3' UTR에 대한 siRNA, TDP-43 과발현 작제물에 포함되지 않은 영역)(Qiagen)를 함유하는 완전한 배지로 대체하였다. 사이클로헥시미드(Sigma)를 세포를 수확하기 전 6시간에 100 μg/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이후, 제조사의 지시에 따라 세포를 수확하고, RNA를 TRIzol Reagent(Zymo Research)를 사용하여 추출하였다. 대략 1 μg의 RNA를 RNA 억제제를 갖는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA로 전환하였다. RT-qPCR 검정을 QuantStudio7™ Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 SYBR GreenER qPCR SuperMix(Invitrogen)로 cDNA(1:40 희석됨)에서 수행하였다. 모든 샘플을 3중으로 분석하였다. RT-qPCR 프로그램은 하기와 같았다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃ 및 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40회 사이클. 해리 곡선을 위해, 15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃ 및 15초 동안 95℃의 해리 단계를 프로그램의 마지막에 추가하였다. 상대 정량화를 ΔΔCt 방법을 사용하여 결정하고, 내인성 대조군 RPLP0 및 GAPDH로 정규화하였다. 야생형 UNC13A 및 GFP에 대한 상대 전사체 수준을 대조군 siRNA 조건의 것(1로 설정된 평균)으로 정규화하였다.
하기 프라이머 쌍을 사용하였다:
사후 뇌 샘플 환자에서의 인시츄 혼성화 UNC13A 은성 엑손 분석 및 진단학적 신경병리학적 평가
이 연구에 사용된 사후 뇌 조직 샘플을 캘리포니아 샌프란시스코 대학교(UCSF) 신경퇴행성 질환 브레인 뱅크로부터 얻었다. 표 6은 인구학적, 임상학적 및 신경병리학적 정보를 제공한다. 뇌 공여에 대한 동의를 헬싱키 선언서 및 UCSF 인간 조사 위원회에 의해 허가된 하기 절차에 따라 대상체 또는 이의 대리 결정인으로부터 얻었다. 뇌를 1 cm 두께 관상면 슬래브로 새로 절단하고, 교대 슬라이스를 72시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에서 고정하였다. 이전에 기재된 것처럼(45) 내측 전두극으로부터의 블록을 고정된 관상면 슬래브로부터 절제하고, 등급화된 수크로스 용액에서 저온보호하고, 동결하고, 50 μm 두께 절편으로 절단하였다. 이전에 기재된 것처럼(44) 임상 및 신경병리학적 진단을 수행하였다. 대상체를 임상 평가 및 신경병리학적 평가에 기초하여 선택하였다. 선택된 환자는 근위축성 측삭 경화증(ALS)/운동 뉴런 질환(MND)을 갖거나 갖지 않은 행동 변형 전두측두 치매(bvFTD)의 1차 임상 진단 및 2) 전두측두엽 퇴행(FTLD)-TDP, B형의 신경병리학적 진단을 가졌다. 본 발명자들은 대상체가 알려진 질환 야기 돌연변이, 24시간 이상의 사후 간격, 알츠하이머병 신경병리학적 변경>저, Thal 아밀로이드 상>2, Braak 신경섬유 매듭 단계>4, CERAD 신경반 밀도>희박 및 루이소체 질환>뇌간 우세(45)를 가지면 이들을 배제하였다.
인시츄 혼성화(ISH) 및 면역형광
단일 RNA 분자를 검출하기 위해, BaseScope Red Assay 키트(ACDBIO, 미국)를 사용하였다. 각각의 대상체로부터의 1개의 50 μm 두께의 고정된 동결된 조직 절편을 염색에 사용하였다. 적절한 대로 RNAse 무 조건 하에 실험을 수행하였다. mRNA(엑손 20/21 연접부) 또는 스플라이싱된 표적을 함유하는 은성 엑손(엑손 20/은성 엑손 연접부)에 특이적인 UNC13A인 관심 있는 전사체를 표적화하는 프로브를 사용하였다. 양성(호모 사피엔스 PPIB) 및 음성(에스체리치아 콜라이 DapB) 대조군 프로브가 또한 포함되었다. 인시츄 혼성화를 BaseScope Red Assay 키트에 대해 판매자 사양에 기초하여 수행하였다. 간단히, 동결된 조직 절편을 조직 자가형광을 켄칭하기 위해 PBS에서 세척하고, 4℃에서 48시간 동안 LED 성장 광(HTG Supply, LED-6B240) 챔버 하에 두었다. 절편을 빨리 PBS에서 세정하고, 내인성 퍼옥시다제 활성을 위해 차단하였다. 절편을 슬라이드로 옮기고 밤새 건조시켰다. 슬라이드를 표적 검색 및 프로테아제 처리로 처리하고 ISH로 진행시켰다. 프로브를 TSA Plus-Cy3(Akoya Biosciences)로 검출하고, 항체에 의해 TDP-43(토끼 다중클론, Proteintech, RRID: AB_615042) 및 NeuN(기니아 피그 다중클론, Synaptic 시스템)로 면역형광 염색으로 처리하고, 핵에 대해 DAPI(Life Technologies)로 대조염색하였다.
영상 획득 및 분석
Z-스택 영상을 63x 오일 액침 대물렌즈(1.4 NA)로 Leica SP8 공초점 현미경을 사용하여 포착하였다. RNA 프로브에 대해, 영상 포착 설정을 PPIB 및 DAPB 신호에 기초하여 초기 획득 동안 확립하고, UNC13A 프로브 및 대상체에 걸쳐 일정하게 있었다. TDP-43 및 NeuN 영상 포착 설정을 사례 사이의 염색 강도 차이에 기초하여 변형시켰다. 각각의 사례에 대해, 6개의 비중첩하는 Z-스택 영상을 피질 층 2-3에 걸쳐 포획하였다. UNC13A 은성 엑손에 대한 RNA 푼타를 ImageJ에서 "입자 분석" 플러그인을 사용하여 정량화하였다. 간단히, 모든 영상을 유사한 매개변수를 사용하여 휘도에 대해 조정하고, 최대 강도 Z 투영으로 변환하고, 영상을 오토-스레스홀드(인터모드)에 대해 조정하고, 푼타를 계수하였다(크기: 6-무한, 순환성 - 0-1).
연결 불평형 분석
GATK HaplotypeCallers에 의해 생성된 재보정된 VCF 파일을 2020년 7월에 Answer ALS로부터 다운로드하였다. VCFtools(0.1.16)를 인트론 20-21에 있는 부위에 대해 여과하도록 사용하였다. 여과된 VCF 파일을 BCFtools(1.8)을 사용하여 병합하였다. 2개 초과의 대립유전자를 함유하는 부위가 있으므로, 본 발명자들은 명령어 "vcftools --geno-chisq --min-alleles 2 -- max-alleles 8"(4.0.0)을 사용하여 카이 제곱 통계학을 사용하여 유전자형 독립성에 대해 시험하였다.
통계 방법
성별, 보고된 유전 돌연변이 및 발병 시 연령을 함유하는 다변량 Cox 비례 위험 모델에 맞는 생존 (3.1.12) R 패키지에서의 coxph 함수를 사용하여 생존 곡선을 비교하고 점수(로그-랭크) 시험을 수행한다. 효과 크기는 위험 비로서 보고된다. 비례 위험 추정을 cox.zph() 함수를 사용하여 시험하였다. 생존 곡선을 suvminer(v.0.4.8) R 패키지에서 ggsurvplot()를 사용하여 작도하였다.
은성 엑손 신호와 TDP-43의 인산화 수준 또는 위험 일배체형의 수 사이의 상관관계를 은성 엑손 신호를 갖지 않는 모든 샘플(n = 4)을 여과한 후 수행하였다. 선형 혼합 효과 모델을 lmerTest R 패키지(3.1.3)를 사용하여 분석하였다.
통계 분석을 R(버전 4.0.0) 또는 Prism 8(GraphPad)을 사용하여 수행하고, 이들은 또한 그래프를 생성하도록 사용되었다.
결과
질환 발병에서 또한 역할을 할 수 있는 TDP-43에 의해 조절된 은성 스플라이싱 표적을 발견하기 위해, 최근에 생성된 RNA 스플라이싱(RNA-seq) 데이터세트를 이용하였다(11). 핵으로부터의 TDP-43의 손실과 연관된 변경을 확인하기 위해, Liu 외는 그들이 TDP-43을 함유하거나 함유하지 않는 뉴런 핵을 농후화하기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용할 수 있고 이후 FTD/ALS 환자로부터의 사후 내의 7개의 동결된 신생피질로부터의 TDP-43-양성 및 TDP-43-음성 뉴런 핵 사이의 전사체를 비교하기 위해 RNA-seq를 수행할 수 있다는 것을 영리하게 인식하였다. 이들은 많은 관심 있는 차등적으로 발현된 유전자를 확인하였다(11). 본 연구는 Liu 외가 했던 것과 같은 차등적으로 발현된 유전자를 기대하지 않지만 대신에 TDP-43의 손실에 의해 영향을 받는 신규의 대안적인 스플라이싱 사건에 대해 조사하면서 상이한 방식으로 데이터를 재분석하였다. 신규의 스플라이싱 사건에 설계된, MAJIQ(12) 및 LeafCutter(13)인 2개의 파이프라인을 사용한 스플라이싱 분석을 수행하였다(도 1a). 각각의 RNA-seq 라이브러리는 125 bp의 길이, 더 큰 판독 길이 및 TDP-43의 손실에 의해 야기된 스플라이싱 변경의 발견을 수월하게 하는 커버리지로 대략 50M 쌍 지은 말단 판독을 함유한다. 197개의 대안적인 스플라이싱 사건(P(ΔΨ>0.1)>0.95)(ΔΨ, 2개의 조건 사이의 국소 스플라이싱 변이의 변경; P: 확률)을 MAJIQ에 의해 확인하고, 152개를 LeafCutter에 의해 확인하였다(P < 0.05). 아마도 각각의 도구가 전사체 변이에 대해 상이한 정의를 사용하고 거짓 긍정에 대한 대조군에 상이한 기준을 사용하므로 분석 둘 다 사이에 공통인 65개의 대안적으로 스플라이싱된 유전자가 있다(도 1b). 특히, 도구 둘 다에 의해 확인된 대안적으로 스플라이싱된 유전자 중에서 STMN2 및 POLDIP3이 있고, 이들 둘 다는 진짜의 TDP-43 스플라이싱 표적으로서 광범위하게 검증되었다(8-10, 14).
예상치 못하게, UNC13A는 TDP-43이 핵으로부터 고갈된 뉴런에서의 가장 상당히 대안적으로 스플라이싱된 유전자 중 하나인 것으로 발견되었다(도 1b 및 도 5a-5d). TDP-43의 고갈은 정규 엑손 20과 엑손 21 사이의 128 bp 은성 엑손 #1(hg38; chr19: 17642414-17642541)(도 1c 및 1d) 또는 엑손 20과 엑손 21 사이의 ### bp 은성 엑손 #2(hg38; chr19: 17642414-17642591)의 봉입을 생성시켰다. chr19:17642541 3' 스플라이싱 수용체의 더 높은 용법이 관찰되므로, 연구의 초점은 128 bp 은성 엑손 #1에 있다. 이하, 이 실시예에서, 기술되지 않으면, 은성 엑손의 언급은 128 bp 은성 엑손 #1을 지칭한다. CE #1(은성 엑손에 대해)이라 칭하는 이 새로운 엑손은 야생형 뉴런 핵(도 1c)에 부재하고, UNC13A의 임의의 알려진 인간 아이소폼에 존재하지 않는다(15). 더욱이, SH-SY5Y 세포에서 TDP-43에 대한 울트라바이올렛 가교연결 및 면역침강(iCLIP) 데이터의 분석(3)은 TDP-43이 이 은성 엑손을 보유하는 인트론에 직접 결합한다는 증거를 제공한다(도 1d). 성숙 전사체로의 128 bp 은성 엑손 서열은 직접적인 시퀀싱에 의해 확인되었다. STMN2 및 TDP-43의 다른 은성 스플라이싱 표적과 유사한, UNC13A의 인트론 20-21 및 CE 서열의 삽입은 대부분의 영장류에서 보존되지만(도 6a 및 도 6b), 마우스에서 보존되지 않는다(4, 8, 9). 종합하면, 이 결과는 TDP-43이 UNC13A mRNA 전사체에서 은성 엑손의 봉입을 억제하도록 기능한다는 것을 제시한다.
TDP-43이 이 UNC13A 은성 스플라이싱 사건을 직접적으로 조절한다는 것을 시험하기 위해, 독시사이클린 유도성 shRNA는 SH-SY5Y 세포에서 TDP-43 수준을 감소시키도록 사용되었다. 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)은 은성 엑손 봉입을 검출하도록 사용되었고, 이것은 (shTARDBP에 의한 처리에 의해) TDP-43이 고갈된 세포에 존재하지만 대조군 shRNA 처리된 세포에 존재하지 않는다(도 1e). 은성 엑손 수준의 증가에 따라, TDP-43 고갈 시 정규 UNC13A 전사체의 수준의 상응하는 감소가 있었다(도 1e). 면역블로팅에 의해, TDP-43 고갈된 세포에서 UNC13A 단백질의 현저한 감소가 또한 관찰되었다(도 1f, 도 1g). TDP-43 수준은 유도된 운동 뉴런(iMN)(도 1h, 도 1i; 도 7a 및 도 7b) 및 인간 iPS 세포로부터 유래된 흥분성 뉴런(i3N)에서 감소되었다(도 1j). TDP-43 고갈은 UNC13A에서의 은성 엑손 봉입 및 UNC13A mRNA 및 단백질의 감소를 생성시켰다. 따라서, 인간 세포 및 뉴런에서의 TDP-43의 수준 저하는 UNC13A 전사체에서의 은성 엑손의 봉입을 야기하여서, 감소된 UNC13A 단백질을 생성시켰다.
UNC13A는 신경전달물질 방출의 결핍으로 인해 이들 유전자에서의 돌연변이를 갖는 동물(16)에 의해 나타난 비조정된(unc) 이동에 기초하여 씨. 엘레간스(C. elegans)에서 원래 발견된 유전자의 패밀리에 속한다. UNC13A는 신경계에서 발현된 큰 멀티도메인 단백질을 암호화하고, 여기서 이것은 신경근 연접부로 국재화하고 시냅스 소포 융합 전에 소포 프라이밍 단계에서 필수 역할을 한다(17-20). 시험관내 연구는 TDP-43 고갈 시 은성 엑손 스플라이싱 사건이 UNC13A 발현의 현저한 감소를 야기한다는 것을 입증한다(도 1f). Unc13a(Munc13-1이라고도 칭함)가 결여된 마우스는 척수 운동 뉴런에서 형태학적 결함 및 신경근 연접부에서 기능적 결핍을 보여준다. 이 데이터는 TDP-43의 고갈이 UNC13A 기능의 소실로 이어진다는 것을 제시한다(21).
환자 샘플의 더 큰 수집으로 UNC13A 은성 엑손 봉입의 이 분석을 확장하기 위해, 메이요 클리닉 브레인 뱅크로부터의 일련의 115개의 전두 피질 뇌 샘플을 분석하고, UNC13A 은성 엑손(CE) 수준의 유의미한 증가는 건강한 대조군과 비교하여 FTLD-TDP 환자에서 발견되었다(도 2a). FTD 환자의 일부 하위유형의 전두 피질에서의 총 UNC13A 전사체의 감소가 또한 관찰되었다(도 8). 다음에, New York Genome Center(NYGC)로부터의 뇌 샘플을 분석하였다. 비교적 고품질인 데이터(방법)에 대해 여과한 후, 이 데이터세트는 413명의 개체로부터의 1151개의 샘플(개체당 1개 초과의 조직)로부터의 RNA-seq 데이터를 포함하고, 이들 중 330명은 ALS 또는 FTD 환자이다. Liu 외(11)에 의한 FACS 분석이 TDP-43의 손실을 갖는 병리학적 뉴런 핵이 모든 뉴런 핵의 불과 약 7% 및 모든 피질 세포의 2% 미만을 나타낸다(11)를 나타내므로, 스플라이싱 분석 알고리즘은 벌크 RNA 시퀀싱으로부터 생성된 RNA-seq 데이터에서 차등적으로 스플라이싱된 유전자를 검출하도록 고분분투할 것이라고 예상되었다. 이 문제를 극복하기 위해, 엑손 20-CE 및 CE-엑손 21 연접부에 이르는 판독이 구체적으로 기대되었다. 벌크 시퀀싱으로부터 생성된 노이즈로 인해, UNC13A 스플라이스 변이체는 엑손-엑손 연접부의 적어도 하나에 이르는 2개 초과의 판독이 있으면 존재하는 것으로 점수 매겨졌다. 상기 기준을 충족시킨 49명의 환자로부터의 63개의 샘플이 확인되었다. 특히, UNC13A 스플라이스 변이체는 신경병리학적으로 확인된 FTLD-TDP 환자에 의해 공여된 전두 피질 및 측두 피질 조직의 50%에 가깝게 검출되었다. 스플라이스 변이체는 또한 병리학이 확인되지 않은 ALS 환자의 일부에서 검출되었다(도 9). 특히, UNC13A CE는 FTLD-FUS(n=9), FTLD-TAU(n=18) 및 ALS-SOD1(n=22) 환자로부터의 임의의 샘플에서도 검출되지 않고, 임의의 대조군 샘플(n=197)에서도 검출되지 않았다. 따라서, UNC13A 은성 엑손 봉입은 TDP-43 단백질병증에서의 병리학의 강력하고 특정한 양상이다(도 2b).
TDP-43이 핵으로부터 고갈되고 세포질에 축적되면, 이것은 인산화된다. 과인산화된 TDP-43(pTDP-43)은 병리학의 핵심 특징이다(22). pTDP-43 수준과 UNC13A 은성 엑손 봉입 사이의 관계를 결정하기 위해, 전두 피질로부터의 RNA-seq 및 pTDP-43 수준이 얻어진 메이요 클리닉 브레인 뱅크로부터의 86명의 FTD 환자의 세트를 분석하였다. 더 높은 pTDP-43 수준과 UNC13A 은성 엑손 봉입의 더 높은 수준 사이의 놀라운 연관은 모든 질환 하위유형으로부터의 환자에서 발견되었다(스피어만 rho = 0.564, P < 0.0001)(도 3c 및 도 3d 및 도 10a; 비변환 데이터를 사용한 도면: 도 10e 및 도 10f). 총 UNC13A 전사체의 수준은 또한 pTDP-43 수준과 음으로 상관되었다(도 10b, 도 10c, 도 10g 및 도 10h). 따라서, UNC13A 은성 엑손 봉입 및 감소된 전장 전사체 수준은 다수의 TDP-43 단백질병증의 흔한 특징이고 TDP-43 병리학의 부담과 강하게 상관되는 것으로 보인다.
공간 해상에 의해 단일 세포 민감도로 UNC13A CE를 가시화하기 위해, 엑손 20-엑손 21(도 11a) 또는 엑손 21-CE 연접부(도 11b)에 특이적으로 결합하는 커스텀 BaseScope™ 인시츄 혼성화 프로브가 설계되었다. 프로브는 프리-mRNA에 대한 결합의 가능성을 최소화하기 위해 엑손-엑손 연접부에 이르도록 설계되었다. 이 프로브는 NeuN(뉴런을 검출하기 위해) 및 TDP-43(핵 또는 세포질 TDP-43을 검출하기 위해)에 대한 면역형광과 함께 인시츄 혼성화에 사용되었다. 4명의 FTLD-TDP 환자 및 3명의 대조군의 내측 전두극으로부터의 절편을 염색하였다. 엑손 21-CE 프로브를 사용하여 강력한 UNC13A CE 봉입은 핵 TDP-43을 갖는 뉴런에서가 아니라 TDP-43이 핵으로부터 고갈된 거의 모든 뉴런에서 검출되었다(도 3a, 도 11c 및 도 11e). UNC13A mRNA는 사례 둘 다 및 대조군의 뉴런에서 엑손 20/21 프로브를 사용하여 검출되었다(도 3b, 도 11d). UNC13A 은성 엑손 봉입은 이제 FTLD-TDP 병리학의 강력한 양상인 것으로 보인다.
UNC13A는 다수의 연구에 걸쳐 ALS 및 FTD-ALS에 대해 상위 GWAS 히트 중 하나이다(23-28). UNC13A에서의 SNP는 TDP-43 병리학을 갖는 산발성 ALS(24) 및 산발성 FTD의 증가된 위험과 연관된다(23). ALS에 대한 증가하는 감수성 이외에, UNC13A에서의 SNP는 또한 ALS 환자에서 더 짧은 생존과 연관된다(29-32). 그러나 UNC13A에서의 유전 변이가 ALS 및 FTD에 대한 위험을 증가시키는 기전은 알려져 있지 않다. 놀랍게, 2개의 가장 상당히 연관된 SNP인, rs12608932(A>C) 및 rs12973192(C>G)는 둘 다 본 발명자들이 은성 엑손을 보유한다고 발견한 동일한 인트론에 위치하고, rs12973192는 은성 엑손 자체에 오른쪽에 위치한다(도 4a). 이는 이 SNP(또는 이 SNP에 의해 태그화된 근처의 다른 유전 변이)가 TDP-43 고갈 시 UNC13A가 은성 엑손 봉입에 더 취약하게 만든다는 가설을 즉시 제시하였다. 이 가설을 시험하기 위해, 은성 엑손의 봉입을 지지하는 인트론 20-21에 이르는 RNA-seq 판독(도 12a 및 도 12b)의 백분율을 분석하였다. 초기 스플라이싱 분석에 포함된 TDP-43 고갈된 뉴런 핵으로부터의 7개의 RNA-Seq 라이브러리 중에서 rs12973192에서의 위험 대립유전자에 동형접합성(G/G)인 3명 중 2명의 환자 및 이형접합성(C/G)인 1명의 환자는 인트론 20-21로 맵핑된 거의 모든 UNC13A mRNA에서의 은성 엑손의 봉입을 보여주었다. 반대로, 기준 대립유전자에 동형접합성(C/C)인 환자는 은성 엑손의 훨씬 더 적은 봉입을 보여주었다. 은성 엑손 봉입에 대한 UNC13A 위험 대립유전자의 영향을 직접적으로 평가하는 또 다른 방식은 위험 대립유전자에 이형접합성인 것으로 나타난 개체로부터의 RNA에서의 가능한 대립유전자 불균형을 측정하는 것이다. 바꾸어 말하면, 보호성 대립유전자로서의 위험 대립유전자로부터 생성된 은성 엑손 봉입을 갖는 RNA의 동일한 숫자가 있는가? 또는 위험 대립유전자로부터 더 많이 있는가? TDP-43 넉다운 시 은성 엑손 봉입을 검출하기 위해 사용된 iMN의 2개(도 1g, iMN1 및 iMN2)는 rs12973192에서 이형접합성(C/G)이다. 은성 엑손에 이르는 RT-PCR 산물은 서열분석되고, 이들 2개의 샘플로부터의 대립유전자 분포뿐만 아니라 rs12973192에서 이형접합성(C/G)인 원래의 RNA-seq 데이터세트(도 1a)로부터의 1개의 환자 샘플이 분석되었다(도 12b). C 및 G 대립유전자의 백분율 사이의 상당한 차이는 위험 대립유전자의 더 높은 봉입으로 스플라이싱된 변이체에서 발견되었다(p-값 = 0.01, 2측 쌍별 t-시험; 도 4b 및 도 12c). 은성 엑손 봉입에 대한 위험 대립유전자의 효과에 대한 이 증거를 고려하여, rs12973192 및 rs12608932에서의 UNC13A 위험 대립유전자에 대한 메이요 클리닉 브레인 뱅크 데이터세트에서 FTD-TDP 환자(n = 86)를 유전자형분석함으로써 분석이 확장되었다. rs12973192에서 기준 대립유전자에 동형접합성(C/C)이지만 rs12608932에서 이형접합성(A/C)인 1명의 환자가 배제되었다. 환자의 나머지(n=85)는 좌위 둘 다에서 정확히 위험 대립유전자의 동일한 숫자를 갖는다. (전두 피질의 RNA-seq로부터의) 은성 엑손 봉입의 수준과 rs12973192에서의 위험 대립유전자의 수 사이의 상관관계는 단순 선형 회귀로서 처음에 모델링되었다 - 위험 대립유전자의 수와 UNC13A 은성 엑손 봉입의 풍부도 사이의 강한 상관관계(P=0.0136)가 발견되었다(도 4c). 다중 선형 회귀 모델(조정된 R2=0.3616, 비변환 데이터로부터의 도면 및 통계학 도 13a)에서의 UNC13A 은성 엑손의 풍부도의 예측자로서 TDP-43 인산화 수준, 성별, 유전 돌연변이 및 질환 유형과 같은 다른 알려진 변수를 포함한 후 위험 대립유전자의 수가 전체 UNC13A 발현 수준(도 13c 및 도 13d, 비변환 데이터 도 13e 및 도 13f)이 아니라 은성 엑손 봉입(p-값 = 0.00792, 비변환 데이터로부터의 도면 도 13b)의 가장 강한 예측자 중 하나라는 것이 발견되었다. 종합하면, 이 데이터는 인간에서 ALS 및 FTD에 대한 위험을 증가시키는 UNC13A에서의 유전 변이가 TDP-43 핵 고갈 시 은성 엑손 봉입을 촉진한다는 것을 제시한다.
GWAS SNP는 통상적으로 특질을 야기하지 않고 오히려 다른 이웃하는 유전 변이를 "태그화"한다(33). 따라서, 인간 유전학에서의 주요 도전은 GWAS 히트로부터 질환에 대한 위험을 증가시키는 원인적 유전 변이를 확인하는 것으로 가는 것이다(34). ALS GWAS 결과(36)의 선형 혼합 모델 분석을 사용하여 생성된 LocusZoom(35) 선도(도 4a)는 UNC13A에 대한 가장 강한 연관 신호가 실제로 2개의 주요 SNP(rs12973192 및 rs12608932)를 둘러싸는 영역에 있다는 것을 제시한다. 은성 엑손 봉입에 영향을 미침으로써 질환에 대한 위험을 또한 야기하지만 원래의 GWAS에 포함되지 않은 인트론 20-21에서의 다른 유전 변이를 찾기 위해, ALS 환자의 전체 게놈 시퀀싱 데이터(Answer ALS)에서 확인된 유전 변이체를 분석하였다. 이 데이터세트는 유럽 혈통의 297명의 ALS 환자를 포함한다. 2개의 SNP에 의해 태그화된 신규의 유전 변이체는 rs12608932 및 rs12973192 둘 다와 연결 불평형에 있는 인트론 20-21에서의 다른 좌위를 찾음으로써 조사되었다. 이 기준 - rs56041637(rs12608932를 갖는 FDR-보정된 P-값 <0.0001, rs12973192를 갖는 P-값 <0.0001)에 맞는 하나가 발견되었다(도 14). rs56041637은 CATC-반복부 삽입이다. 환자 데이터세트에서, rs12608932 및 rs12973192 둘 다에서 위험 대립유전자에 동형접합성인 환자가 rs56041637에서 3개 내지 5개의 CATC-반복부를 갖는 경향이 있고; rs12608932 및 rs12973192 둘 다에서 기준 대립유전자에 동형접합성인 환자는 rs56041637에서 더 짧은(0개 내지 2개) 반복부를 갖는 경향이 있다는 것이 관찰되었다. 따라서, 2개의 주요 GWAS SNP(rs12608932 및 rs12973192) 이외에, 이제 또 다른 하나인 rs56041637은 TDP-43이 핵으로부터 고갈될 때 UNC13A가 은성 엑손 봉입에 더 취약하게 만들어서 질환에 대한 위험에 잠재적으로 기여하는 것으로 명명된다.
FTD/ALS 위험 일배체형의 일부인 UNC13A에서의 이들 3개의 변이체가 TDP-43 고갈 시 은성 엑손 봉입을 증가시키는지를 직접적으로 시험하기 위해, 본 발명자들은 위험 일배체형 또는 보호성 일배체형 중 어느 하나를 함유하는 미니유전자 리포터를 합성하였다(도 4f). 리포터는 기준 서열(대조군) 또는 rs12608932(C), rs56041637((CATC)4) 및 rs12973192(G)에서의 ALS/FTD 위험 대립유전자 중 어느 하나와 UNC13A 인트론 20-21에 의해 중단된 전장 EGFP 및 mCherry 작제물을 공동발현하는 이방향성 리포터를 사용한다. 내인성으로 UNC13A를 발현하지 않는 WT 및 TDP-43-결핍 HEK-293T 세포(37)를 각각의 미니유전자 리포터 작제물로 형질주입하였다. RT-PCR을 사용하여, 인트론 20-21의 버전 둘 다는 WT 세포에서 효과적으로 스플라이싱되는 것으로 발견되었다(도 4g, 레인 1-4). 그러나, TDP43-/- 세포에서 인트론 20-21을 완전히 절제하는 스플라이싱 산물의 감소가 있었다. 대신에, 은성 엑손, 은성 엑손의 더 긴 변이체(은성 엑손 #2)(도 5a) 또는 CE 및 인트론 20-CE 둘 다(도 4g, 레인 5-6)를 함유하는 스플라이싱 산물. 현저히, 인트론에서 위험 일배체형을 보유하는 미니유전자 작제물로 형질주입된 TDP-43-/- 세포에서, 완전한 인트론 20-21 스플라이싱의 훨씬 더 큰 감소 및 은성 스플라이싱 산물의 동시 증가가 있었다(도 4g, 레인 7-8). TDP-43과 독립적인 스플라이싱 리포터의 발현 및 스플라이싱 기계의 효율은 TDP-43 의존적이 아닌 EGFP의 발현 수준에 의해 나타난다. 하나가 CFTR 유전자의 맥락에서 임베딩된 UNC13A 인트론을 갖는 상이한 미니유전자 리포터를 또한 시험하였다. 이 작제물에 의해 형질주입된 HeLa 세포에서의 TDP-43의 넉다운은 미스-스플라이싱 결함을 생성시켰다. 이 스플라이싱 사건을 조절하는 것에서 TDP-43의 직접적인 역할을 입증하여, WT TDP-43(그러나 류신으로 돌연변이된 5개의 페닐알라닌 잔기(5FL)에 의한 RNA 결합 결핍 돌연변이체가 아님)의 발현은 미스-스플라이싱을 구제하였다(도 4h). 종합하면, 이 2개의 검정은 1) TDP-43이 UNC13A 인트론 20-21의 스플라이싱을 조절하고, 2) TDP-43이 기능이상일 때 ALS 및 FTD 감수성과 연관된 유전 변이체가 은성 엑손 봉입을 강화한다는 직접적인 기능적 증거를 제공한다.
이 SNP가 메이요 클리닉 브레인 뱅크에서 FTD-ALS 환자(n=205)의 생존에 영향을 미치는지를 정의하기 위해, 위험 일배체형과 질환 발병 후 생존 시간의 연관을 평가하였다. 생존에 영향을 미치는 것으로 알려진 다른 인자(유전 돌연변이, 성별, 발병 시 연령)을 조정하는 Cox 다변량 분석을 사용하여, 위험 일배체형은 첨가 모델(로그-랭크 p-값 = 0.01) 하에 생존 시간과 연관되었다((도 4i). 개체가 보유하는 위험 일배체형의 수는 강한 예후 인자(위험 비(HR) = 1.733, p-값 = 0.00717)였다(도 15a). 그 연관은 우성 모델(로그-랭크 p-값 = 0.05, 도 15b 및 도 15c) 및 열성 모델(로그-랭크 p-값 = 0.02 도 15d 및 도 15e) 하에 유의미하게 머물러서, 위험 일배체형을 보유하는 것이 질환 발병 후 환자 생존 시간을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 그 효과는 C9ORF72 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장 또는 GRN 돌연변이를 보유하는 환자를 오직 포함할 때 더 유의미하였다(도 16a-도 16f). 따라서, 은성 엑손 봉입을 증가시키는 UNC13A에서의 유전 변이체는 환자에서의 감소된 생존과 연관된다.
여기서, TDP-43이 FTD/ALS 유전자 UNC13A에서의 은성 스플라이싱 사건을 조절한다는 것이 발견되었다. 본 발명자들이 여기서 언급한 새로운 것을 포함하여 질환 위험과 연관된 가장 유의미한 유전 변이체는 은성 엑손 자체를 보유하는 인트론에서 오른쪽에 위치한다. 이 SNP를 보유하는 FTLD-TDP 환자로부터의 뇌 샘플은 위험 대립유전자를 함유하지 않은 FTLD-TDP 환자로부터의 샘플보다 더 많은 UNC13A 은성 엑손 봉입을 나타냈다. 본 발명자들이 건강한 대조군 샘플(예를 들면, GTEx)로부터의 RNA-seq 데이터에서 이 위험 대립유전자를 검출하지 않으므로, 이들이 은성 엑손 봉입을 야기하기에 충분한 것으로 보이지 않는다. 대신에, UNC13A에서의 위험 대립유전자는 진짜의 유전 위험 인자 또는 변형자이고, 은성 스플라이싱 사건은 TDP-43 손실 의존적이다. 이러한 방식으로, UNC13A 위험 대립유전자는 TDP-43이 기능이상이 되기 시작하기까지 문제를 야기하지 않으면서 Achilles의 힐-루킹(heel - lurking)의 종류로서 작용하는 것으로 제안된다(도 4j). UNC13A 암호화 영역에서의 일부 기능 소실 돌연변이는 마우스에서와 같이 초기 치사량을 야기하므로 관찰되는 것으로 예상되지 않는다. 은성 엑손 봉입을 촉진하는 SNP는 그 자체가 위험하지 않고 TDP-43 기능이 (예를 들면, 돌연변이 또는 핵 고갈에 의해) 손상될 때 오직 해로운 것으로 보인다. 진짜의 FTD-ALS 위험 유전자에서의 신규의 TDP-43 의존적 은성 스플라이싱 사건의 발견은 ALS 및 FTD에서 바이오마커 및 치료학적 표적으로서 UNC13A를 검증하기 위한 많은 새로운 방향을 연다. TDP-43 병리학이 ALS 또는 FTD 또는 FTD/ALS 또는 심지어 다른 연령 관련 신경병리학적 변화와 왜 연관되는지는 여전히 미스테리로 있다(38). TDP-43 기능이상 관련된 은성 스플라이싱은 인간 뇌의 다양한 구역 및 뉴런 랜드마크에 걸쳐 발생한다. STMN2 및 이제 UNC13A 이외에, TDP-43 기능이상의 임상 표출에서의 이종성에 기여하는 다른 중요한 은성 엑손 스플라이싱 사건(및 이들 사건의 일부에 대한 민감성을 증가시키거나 감소시키는 유전 변이)의 질환 하위유형 특정 포트폴리오가 있을 수 있다는 것을 가정하는 것이 흥미있다.
실시예 2: 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용한 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 억제
UNC13A 전사체를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)는 지질 형질주입 또는 김노틱 (프리) 유입에 의해 합성되고(표 2-5) 배양된 iPSC 유래 운동 뉴런(MN)으로 전달된다. iMN은 2일 내지 3일 동안 ASO의 존재 하에 배양된 후, 스크램블드 또는 TDP-43 표적화 shRNA를 전달하는 렌티바이러스가 도입되었다. 세포를 렌티바이러스 감염 후 추가 4일 내지 5일 동안 배양한 후, mRNA 및 단백질 단리하였다. mRNA를 cDNA로 역전사하고, 적절하게 스플라이싱된 (WT) UNC13A 및 하우스키핑 유전자를 표적화하는 프라이머/프로브 이외에 UNC13A 은성 엑손 봉입에 특이적인 프라이머/프로브에 의해 qPCR로 처리하였다. 단백질 용해물을 웨스턴 블롯에 의해 UNC13A 검출에 대해 가공하였다.
실시예 3: 안티센스 올리고뉴클레오타이드 스크리닝
안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)는 UNC13A 전사체의 은성 엑손을 표적화하도록 설계되었다(표 7a). 표 7B의 ASO 1-45(서열 번호 423-467)는 3개의 뉴클레오타이드 간격으로 스플라이스 수용체 영역(서열 번호 641)을 함유하는 은성 엑손의 5' 말단을 타일링하는 18합체이다. 표 7B의 ASO 121-142(서열 번호 468-489)는 1개의 뉴클레오타이드 간격으로 은성 엑손의 5' 말단을 타일링하는 18합체이다. 표 7B의 ASO 248-280(서열 번호 490-522)은 3개의 뉴클레오타이드 간격으로 스플라이스 공여체 영역(서열 번호 642)을 함유하는 은성 엑손의 3' 말단을 타일링하는 18합체이다. ASO의 게놈 편성은 하기와 같이 기재된다: 은성 엑손의 5' 말단: chr19:17,642,491-17,642,641; 은성 엑손의 3' 말단: chr19:17,642,363- 17,642,470. UNC13A 전사체의 은성 엑손을 표적화하는 2'MOE 변형을 갖는 ASO를 합성하고(표 7B), 자유 유입에 의해 3 mM의 농도로 배양된 iPSC 유래 운동 뉴런(MN)으로 전달하였다. 운동 뉴런을 2일 동안 UNC13A-특이적 ASO뿐만 아니라 3개의 비표적화 ASO의 존재 하에 배양한 후, 스크램블드 또는 TDP-43 표적화 shRNA를 전달하는 렌티바이러스가 도입되었다. 세포를 렌티바이러스 감염 후 추가 7일 동안 배양한 후, mRNA 단리하였다. mRNA를 cDNA로 역전사하고, 적절하게 스플라이싱된 UNC13A를 표적화하는 프라이머/프로브(도 19c-19d) 이외에 UNC13A 은성 엑손 봉입에 특이적인 프라이머/프로브(도 19a-19b)에 의해 qPCR로 처리하였다. 총 UNC13A RNA 수준을 증가시키면서 활성 ASO가 은성 엑손 봉입을 감소시키는 영역(각각 5' 스플라이스 수용체 영역에서의 ASO: 서열 번호 423-432 및 439-443에 상응하는 ASO 1-10 및 17-21; 3' 스플라이스 공여체 영역에서의 ASO: 서열 번호 491-498, 502-507 및 513-514에 상응하는 ASO 249-256, 260-265 및 271-272)이 확인되었다. 21합체 ASO는 이들 영역을 추가로 타일링하도록 설계되었다(표 8B). 표 8B의 ASO 306-354(서열 번호 523-571)는 1개의 뉴클레오타이드 간격으로 은성 엑손의 5' 말단(서열 번호 643)을 타일링하는 21합체이다. 표 8B의 ASO 355-423(서열 번호 572-640)은 1개의 뉴클레오타이드 간격으로 은성 엑손의 3' 말단(서열 번호 644)을 타일링하는 21합체이다.
참고번호
상기 및 부록 A에 기재된 다양한 실시형태는 추가의 실시형태를 제공하도록 조합될 수 있다. 비제한적인 예로서 2021년 4월 6일에 출원된 미국 가출원 제63/171,522호 및 2022년 2월 22일에 출원된 미국 가출원 제63/312,808호를 포함하는 본 명세서에서 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공보의 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 실시형태의 양태는 더 추가의 실시형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 이용하도록 필요하면 변형될 수 있다.
상기에 자세히 기재된 설명의 견지에서 실시형태에 이들 변화 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 본 명세서 및 청구항에 개시된 특정 실시형태에 청구항을 제한하도록 해석되지 않아야 하지만, 이러한 청구항이 권한 부여한 등가물의 완전한 범위에 따라 모든 가능한 실시형태를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 청구항은 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Maze Therapeutics, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING TDP-43 PROTEINOPATHY <130> 630264.403WO <150> US 63/171,522 <151> 2021-04-06 <150> US 63/312,808 <151> 2022-02-22 <160> 654 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9985 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9985) <223> UNC13A reference mRNA NM_001080421.3 <400> 1 gcccccggtg ctgaaccaag atggccggtg gcggccgggc cccggcgtga gccaagcgcg 60 ggctgcagcc gggagatgcc ccagcccagc ggccgctgag cccgacccga cagagccggc 120 ccggccgcct ccggcccacc tgcgagctcg gagacatgtc tctgctttgc gttggagtca 180 aaaaagccaa gtttgatggt gcccaagaga aattcaacac gtacgtgacc ctgaaagtgc 240 agaatgtcaa gagcacgacc atcgcggtgc ggggcagcca gcccagctgg gagcaggatt 300 tcatgttcga gattaaccgt ctggatttgg gactgacggt ggaggtgtgg aataagggtc 360 tcatctggga cacaatggtg ggcactgtgt ggatcccact gaggaccatc cgccagtcca 420 atgaggaggg ccctggagag tggctgacgc tggactccca ggtcatcatg gcagacagtg 480 agatctgtgg caccaaggac cccaccttcc accgcatcct cctggacacg cgctttgagc 540 tacccttaga cattcctgaa gaggaggctc gctactgggc caagaagctg gagcagctca 600 atgctatgcg ggaccaggat gaatattcgt tccaagatga gcaagacaag cctctgcctg 660 tccccagcaa ccagtgctgc aactggaatt attttggctg gggtgagcag cacaacgatg 720 accccgacag tgcagtggat gatcgtgaca gtgactaccg cagtgaaacg agcaacagca 780 tcccgccgcc ctattatact acgtcacaac ccaacgcctc agtccaccaa tattctgttc 840 gcccaccacc cctgggctcc cgggagtcct acagtgactc catgcacagt tacgaggagt 900 tctctgagcc acaagccctc agccccacgg gtagcagccg ctatgcctct tccggggagc 960 tgagccaggg aagctctcag ctgagcgagg acttcgaccc tgacgagcac agcctgcagg 1020 gctccgacat ggaggatgag cgggaccggg actcctacca ctcctgccac agctcggtca 1080 gctaccacaa agactcgcct cgctgggacc aggatgagga agagctggag gaggacctgg 1140 aggacttcct ggaggaggag gagctgcctg aagatgagga ggagctggag gaggaggagg 1200 aggaggtgcc tgacgatttg ggcagctatg cccagcgtga agacgtagct gtggctgagc 1260 ccaaagactt caaacgcatc agcctcccgc cagctgcccc agggaaggag gacaaggccc 1320 cagtggcacc caccgaggcc cccgacatgg ccaaggtggc ccccaagcca gccacgcccg 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atggatggtt gtgagtggct ggtggacaga cgaaaaatgg 960 atggttggat aaattgatgg gtggatggat ggttggttgt atgaaagaat gaatgattgg 1020 gtaggtggat taagttgcgg atcaatgtat gggatggatg aatggatgga tggatggatg 1080 tgtggttgaa ttactgaaag gttggaagag tggatgggtg aaatttgggg tagttagatg 1140 ggtgggtgtg tggatggata aaagagtaga tgaatgaatt aatgaataaa caggcagatg 1200 gatgatgtaa gctgccccag accctgggac ctctgacccc cggcgacccc ttgcactctc 1260 catgacactt tctctcccat ggtggcag 1288 <210> 5 <211> 128 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(128) <223> Cryptic Exon 1 <400> 5 ctgcctgggt ttcctggaaa gaactcttat ccccaggaac tagtttgttg aataaatgct 60 ggtgaatgaa tgaatgattg aacagatgaa tgagtgatga gtagataaaa ggatggatgg 120 agagatgg 128 <210> 6 <211> 179 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(179) <223> Cryptic Exon 2 <400> 6 ccctaaccac tcaggattgg gccgtttgtg tctgggtatg tctcttccag ctgcctgggt 60 ttcctggaaa gaactcttat ccccaggaac tagtttgttg aataaatgct ggtgaatgaa 120 tgaatgattg aacagatgaa tgagtgatga 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cacaacgatg 720 accccgacag tgcagtggat gatcgtgaca gtgactaccg cagtgaaacg agcaacagca 780 tcccgccgcc ctattatact acgtcacaac ccaacgcctc agtccaccaa tattctgttc 840 gcccaccacc cctgggctcc cgggagtcct acagtgactc catgcacagt tacgaggagt 900 tctctgagcc acaagccctc agccccacgg gtagcagccg ctatgcctct tccggggagc 960 tgagccaggg aagctctcag ctgagcgagg acttcgaccc tgacgagcac agcctgcagg 1020 gctccgacat ggaggatgag cgggaccggg actcctacca ctcctgccac agctcggtca 1080 gctaccacaa agactcgcct cgctgggacc aggatgagga agagctggag gaggacctgg 1140 aggacttcct ggaggaggag gagctgcctg aagatgagga ggagctggag gaggaggagg 1200 aggaggtgcc tgacgatttg ggcagctatg cccagcgtga agacgtagct gtggctgagc 1260 ccaaagactt caaacgcatc agcctcccgc cagctgcccc agggaaggag gacaaggccc 1320 cagtggcacc caccgaggcc cccgacatgg ccaaggtggc ccccaagcca gccacgcccg 1380 acaaggtgcc tgcagctgag cagatccctg aggctgagcc acccaaggac gaggagagtt 1440 tcaggccgag agaggatgag gaaggccagg aggggcagga ctccatgtcc agggccaagg 1500 ccaactggct gcgtgccttc aacaaggtgc ggatgcagct gcaggaggcc cggggagaag 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ggagagagac agagatggag agagacatag aggtggaaat atacagagaa agataaatgc 9180 agagaccaag gcagggagtg tcgggggaag taaagagggt gtcctgaaga aagaaggatc 9240 tgttcactct taccagtctg tcctcgaatg atttgcataa aatgaggagg tgcctgtcca 9300 cacccccaat tcctctctca ggccccagag cctgagacct caccatgccc ccatcagaga 9360 tgcaaaaaac taaacaccca actagaaatc cttgggacct ctctcggctg ggatctcaga 9420 gcctttctgt cccctacccc taccccatgt gctgtcgatt ttgcagatgg ggacaacctg 9480 gggcctcccg gaactctgcc accctgggga agttggggga gggccttagt cccggatcac 9540 aaccccgtct gctccccaga atcctttcct aagaatcgtt gaggaccaaa gttgtctttg 9600 ctgacacgtg ttgcttttct ctttgccttt tattgtttca gagaaaaatc aagttgactg 9660 tgtcaagtaa caccccaccc cttacccccg tccagccata gtggctctct ggagacacag 9720 gtcacaggcg gagggtcccc tgatcatccc caaccacaca gccaggggga cttgacccct 9780 gtccacccct gtctcgtgct ccctcagacc cccacaaacc ggccaagcag tccggggagg 9840 cttcccctcc acacaactct tagcatgtga ttgcagatgt gaaatcaaaa cgttgtttgt 9900 tttttgtttt gttttgattc taccccgtcg gtccagtgtc tgcacagacg ccttcatttc 9960 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25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0311 <400> 330 cggtcacgaa gtggaacagg ttctg 25 <210> 331 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0312 <400> 331 ggtcacgaag tggaacaggt tctgc 25 <210> 332 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0313 <400> 332 gtcacgaagt ggaacaggtt ctgcc 25 <210> 333 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0314 <400> 333 tcacgaagtg gaacaggttc tgcca 25 <210> 334 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0315 <400> 334 cacgaagtgg aacaggttct gccac 25 <210> 335 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0316 <400> 335 acgaagtgga acaggttctg ccacc 25 <210> 336 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0317 <400> 336 cgaagtggaa 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MTx_ASO_0324 <400> 343 gaacaggttc tgccaccatg ggaga 25 <210> 344 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0325 <400> 344 aacaggttct gccaccatgg gagag 25 <210> 345 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0326 <400> 345 acaggttctg ccaccatggg agaga 25 <210> 346 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0327 <400> 346 caggttctgc caccatggga gagaa 25 <210> 347 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0328 <400> 347 aggttctgcc accatgggag agaaa 25 <210> 348 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0329 <400> 348 ggttctgcca ccatgggaga gaaag 25 <210> 349 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0330 <400> 349 gttctgccac catgggagag aaagt 25 <210> 350 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0338 <400> 357 accatgggag agaaagtgtc atgga 25 <210> 358 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0339 <400> 358 ccatgggaga gaaagtgtca tggag 25 <210> 359 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0340 <400> 359 catgggagag aaagtgtcat ggaga 25 <210> 360 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0341 <400> 360 atgggagaga aagtgtcatg gagag 25 <210> 361 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0342 <400> 361 tgggagagaa agtgtcatgg agagt 25 <210> 362 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0343 <400> 362 gggagagaaa gtgtcatgga gagtg 25 <210> 363 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide MTx_ASO_0344 <400> 363 ggagagaaag tgtcatggag agtgc 25 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ttctgagtga taattattca 240 tgggctcctg cctcttgctc tttctctagc acggtcccac tctgcagact cagtgcctta 300 ttcagtcttc tctctcgctc tctccgctgc tgtagccgga ccctttgcct tcgccactgc 360 tcagcgtctg cacatcccta caatggctaa aacagcaatg gcctacaagg aaaaaatgaa 420 ggagctgtcc atgctgtcac tgatctgctc ttgcttttac ccggaacctc gcaacatcaa 480 catctatact tacgatgata tggaagtgaa gcaaatcaac aaacgtgcct ctggccaggc 540 ttttgagctg atcttgaagc caccatctcc tatctcagaa gccccacgaa ctttagcttc 600 tccaaagaag aaagacctgt ccctggagga gatccagaag aaactggagg ctgcagagga 660 aagaagaaag tctcaggagg cccaggtgct gaaacaattg gcagagaaga gggaacacga 720 gcgagaagtc cttcagaagg ctttggagga gaacaacaac ttcagcaaga tggcggagga 780 aaagctgatc ctgaaaatgg aacaaattaa ggaaaaccgt gaggctaatc tagctgctat 840 tattgaacgt ctgcaggaaa agctggtcaa gtttatttct tctgaactaa aagaatctat 900 agagtctcaa tttctggagc ttcagaggga aggagagaag caatgagagg catgctgcgg 960 aggtgcgcag gaacaaggaa ctccaggttg aactgtctgg ctgaagcaag ggagggtctg 1020 gcacgcccca ccaatagtaa atccccctgc ctatattata atggatcatg cgatatcagg 1080 atggggaatg tatgacatgg tttaaaaaga actcattata aaaaaaaaaa aacaaaaaaa 1140 atcaaaaatt aaaaaaaatc aatgcggtct ctttgcagaa tgttttgctt gatgtttaaa 1200 aaataccttg gatcttattt tgtaaatact tacatttttg ttaaaaaata caagtattgc 1260 attatgcaag ttatttcata atcttacatg tcctgtaaca ggcttttgat gttgtgtctt 1320 tccactcaaa tgaatttgct aggtctgttc tttttgaagc tccccatgtc taactccatt 1380 ccaaaagaaa aatgaggtca gtagacagtc tatggtgcta gaaacccacc attgcctaat 1440 gacctagaag gctttgttgt ctctgagctt gactaagacc atacctagat cacaggtatt 1500 atgactccac atgaaccttc acatttgttc gctcataatc tacttactgc ctaaaaacta 1560 caaaaccagg ctaagaaata ccaccagtca tagcatttac ttctgcttct cctggattat 1620 gtgctacaaa tgtgctttgg ctttagaaag ggatggatga gaagacagac ctgagaccaa 1680 tctgggtaga agcaaaaagt tgaacctttt aaagtgctga acacaaatcc aaattcgaat 1740 ggttcaagca gccgtgaaat cgctcttcat aaagtgggct taattctcta gtttaagttc 1800 ttttgatgga atgaattaat taatgtgtca ggtggcttat ttgtggatgc catgattgat 1860 gatgttcatt ttaagctctt acctatagta caagtacatg atgctactga atatttttcc 1920 acttggaaac tgtgagctgg ttgttgcatt aaaacacaca tacaaacaaa atcaaaaaca 1980 ctgcggactt tcactcaagc tggtctttct tccccagtgt aaggcaatcc tgcctactaa 2040 caacaccaac aacaaaacac tccatctgtg aagctgacgc agttaagggg gctaggcagg 2100 gcatttgtgc caactaagaa tcaccagata cccaccataa gtacctatcg cagttttgaa 2160 gtcgtttctc cccaactccc aactcctgaa ggttgctgcc tgcatattta ctcttcatta 2220 gtgctatttt cctgtatgtc attgtgagca agctgtgatt aataaagaat tggagttctg 2280 tgaactaata aaggtttggt ctgttaaaaa aaaa 2314 <210> 391 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA TDP-43 <400> 391 agatcttaag actggtcatt c 21 <210> 392 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA scramble <400> 392 gatatcgctt ctactagtaa g 21 <210> 393 <211> 25587 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25587) <223> STMN2 Intron 1 Sequence <400> 393 gtaaggcact gcgcctcgtt ctccgtcggc tctacctgga gcccacctct cacctcctct 60 cttgagctct agaagcattc agagatattt tataaagaaa aagatgttaa tggtaacaca 120 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gaaaatgggg taaatataaa gcatgcaata caacatggcc 24360 ataagaaaaa atgaaatcat gtcctttgct gcaacatgga tgcagttggg acccataatc 24420 ctaagtgaat taacacagga acagaaaacc aaatacagca tgttctcact tataagtggg 24480 agctaaacac tgagcacaca tggacataaa tatgagaaca ataaacactg tggactacta 24540 gaggggggaa ggagagaggt ttgtaaaact acctatcagg tgctatgctc aatacctggg 24600 tgatgggatt tacaccccaa acatcagcat catttaatat tcccatgtaa aaagactgca 24660 catatacccc ttgtatctaa aataaaactt gaaattaaaa aaaaaagaaa gaaagaaaga 24720 ggctggaaat agaggctcac acctgtaatc ccagcacttt gggtggccaa ggtgggtgga 24780 ttgcttgagc ccgggaattc aagaccagcc tgagaaacct ggtgaaactc tgtctgtaca 24840 aaaaatacaa aaattatcca ggcatggtgg agcgcacctg tagtcccagc taatggggag 24900 gctgaggggg gaacatcact tgagcccagg aggtggaggt tgcagtgagc tgggatcaca 24960 ccactgcact acagcctggg taacagagca actctgtctc aaagagagag aggaaagaaa 25020 aaagaaaaga tggacagata agaaaatgca cttggagatt aagagaaagc agcaacatag 25080 gaccctggat aatgtgtttg cttaataact atcctgatga gttatctgac tattcccaaa 25140 tgagtacgtg gcaattcagg ctgaaccatc agagtagccc tccggaatct tacttatgta 25200 caatagacct gcatgcacat ttactagaat gagcctctct ctctggtaat catgtctgct 25260 tccactaatt ccatctgttt cctctctctc cctcctatcc tgctagatct taattccttc 25320 gaccttcctt tgtttttcta actccctttc tttctcttgt tatttaacct gctatactat 25380 gcaattgatc tcctctgcac taaggaacat gcacttcaga attctgttga catcttgcat 25440 tcctttatat ttagtgaaag aatgcaaagg agtctacctg gcaatattca ctctgcagga 25500 ggcaataatt attattcaaa ttaaaggaag cagtaaagag aaattcagaa aaaatgaaat 25560 atactaatct tcagcttttc atttcag 25587 <210> 394 <400> 394 000 <210> 395 <400> 395 000 <210> 396 <400> 396 000 <210> 397 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAPDH FWD 5'-3' <400> 397 gttcgacagt cagccgcatc 20 <210> 398 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAPDH RVS 5'-3' <400> 398 ggaatttgcc atgggtgga 19 <210> 399 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RPLP0_2 FWD 5'-3' <400> 399 tctacaaccc tgaagtgctt gat 23 <210> 400 <211> 21 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cttacatatg taataactca accacacttc catc 34 <210> 413 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer UNC13A_CE_minigene FWD 5'-3' <400> 413 gattgaacag atgaatgagt gatga 25 <210> 414 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer UNC13A_CE_minigene RVS 5'-3' <400> 414 tgtctggacc aatgttggtg 20 <210> 415 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GFP_OE FWD 5'-3' <400> 415 gaagcgcgat cacatggt 18 <210> 416 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GFP_OE RVS 5'-3' <400> 416 ccatgccgag agtgatcc 18 <210> 417 <400> 417 000 <210> 418 <400> 418 000 <210> 419 <400> 419 000 <210> 420 <400> 420 000 <210> 421 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TARDBP_2 FWD 5'-3' <400> 421 tggacgatgg tgtgactgca a 21 <210> 422 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TARDBP_2 RVS 5'-3' <400> 422 agagaagaac tcccgcagct ca 22 <210> 423 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_1 <400> 423 tcaacaaact agttcctg 18 <210> 424 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_2 <400> 424 acaaactagt tcctgggg 18 <210> 425 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_3 <400> 425 aactagttcc tggggata 18 <210> 426 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_4 <400> 426 tagttcctgg ggataaga 18 <210> 427 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_5 <400> 427 ttcctgggga taagagtt 18 <210> 428 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_6 <400> 428 ctggggataa gagttctt 18 <210> 429 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_7 <400> 429 gggataagag ttctttcc 18 <210> 430 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_8 <400> 430 ataagagttc tttccagg 18 <210> 431 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_9 <400> 431 agagttcttt ccaggaaa 18 <210> 432 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_10 <400> 432 gttctttcca ggaaaccc 18 <210> 433 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_11 <400> 433 ctttccagga aacccagg 18 <210> 434 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_12 <400> 434 tccaggaaac ccaggcag 18 <210> 435 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_13 <400> 435 aggaaaccca ggcagctg 18 <210> 436 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_14 <400> 436 aaacccaggc agctggaa 18 <210> 437 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_15 <400> 437 cccaggcagc tggaagag 18 <210> 438 <211> 18 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Antisense oligonucleotide MTx_ASO_127 <400> 474 tggaagagac atacccag 18 <210> 475 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_128 <400> 475 ggaagagaca tacccaga 18 <210> 476 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_129 <400> 476 gaagagacat acccagac 18 <210> 477 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_130 <400> 477 aagagacata cccagaca 18 <210> 478 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_131 <400> 478 agagacatac ccagacac 18 <210> 479 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_132 <400> 479 ggcagctgga agagacat 18 <210> 480 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_133 <400> 480 gcagctggaa gagacata 18 <210> 481 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide 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Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_364 <400> 581 atccatgtac tcacccatct c 21 <210> 582 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_365 <400> 582 tccatgtact cacccatctc t 21 <210> 583 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_366 <400> 583 ccatgtactc acccatctct c 21 <210> 584 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_367 <400> 584 catgtactca cccatctctc c 21 <210> 585 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_368 <400> 585 atgtactcac ccatctctcc a 21 <210> 586 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_369 <400> 586 tgtactcacc catctctcca t 21 <210> 587 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_370 <400> 587 gtactcaccc atctctccat c 21 <210> 588 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_371 <400> 588 tactcaccca tctctccatc c 21 <210> 589 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_372 <400> 589 actcacccat ctctccatcc a 21 <210> 590 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_373 <400> 590 ctcacccatc tctccatcca t 21 <210> 591 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_374 <400> 591 tcacccatct ctccatccat c 21 <210> 592 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_375 <400> 592 cacccatctc tccatccatc c 21 <210> 593 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_376 <400> 593 acccatctct ccatccatcc t 21 <210> 594 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_377 <400> 594 cccatctctc catccatcct t 21 <210> 595 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_378 <400> 595 ccatctctcc atccatcctt t 21 <210> 596 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_379 <400> 596 catctctcca tccatccttt t 21 <210> 597 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_380 <400> 597 atctctccat ccatcctttt a 21 <210> 598 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_381 <400> 598 tctctccatc catcctttta t 21 <210> 599 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_382 <400> 599 ctctccatcc atccttttat c 21 <210> 600 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_383 <400> 600 tctccatcca tccttttatc t 21 <210> 601 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_384 <400> 601 ctccatccat ccttttatct a 21 <210> 602 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_385 <400> 602 tccatccatc cttttatcta c 21 <210> 603 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_386 <400> 603 ccatccatcc ttttatctac t 21 <210> 604 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_387 <400> 604 catccatcct tttatctact c 21 <210> 605 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_388 <400> 605 atccatcctt ttatctactc a 21 <210> 606 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_389 <400> 606 tccatccttt tatctactca t 21 <210> 607 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_390 <400> 607 ccatcctttt atctactcat c 21 <210> 608 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_391 <400> 608 catcctttta tctactcatc a 21 <210> 609 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_392 <400> 609 atccttttat ctactcatca c 21 <210> 610 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_393 <400> 610 tccttttatc tactcatcac t 21 <210> 611 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_394 <400> 611 ccttttatct actcatcact c 21 <210> 612 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_395 <400> 612 cttttatcta ctcatcactc a 21 <210> 613 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_396 <400> 613 ttttatctac tcatcactca t 21 <210> 614 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_397 <400> 614 tttatctact catcactcat t 21 <210> 615 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_398 <400> 615 ttatctactc atcactcatt c 21 <210> 616 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_399 <400> 616 tatctactca tcactcattc a 21 <210> 617 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_400 <400> 617 atctactcat cactcattca t 21 <210> 618 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_401 <400> 618 tctactcatc actcattcat c 21 <210> 619 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_402 <400> 619 ctactcatca ctcattcatc t 21 <210> 620 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_403 <400> 620 tactcatcac tcattcatct g 21 <210> 621 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_404 <400> 621 actcatcact cattcatctg t 21 <210> 622 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_405 <400> 622 ctcatcactc attcatctgt t 21 <210> 623 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_406 <400> 623 tcatcactca ttcatctgtt c 21 <210> 624 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_407 <400> 624 catcactcat tcatctgttc a 21 <210> 625 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_408 <400> 625 atcactcatt catctgttca a 21 <210> 626 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_409 <400> 626 tcactcattc atctgttcaa t 21 <210> 627 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_410 <400> 627 cactcattca tctgttcaat c 21 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_411 <400> 628 actcattcat ctgttcaatc a 21 <210> 629 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_412 <400> 629 ctcattcatc tgttcaatca t 21 <210> 630 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_413 <400> 630 tcattcatct gttcaatcat t 21 <210> 631 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_414 <400> 631 cattcatctg ttcaatcatt c 21 <210> 632 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_415 <400> 632 attcatctgt tcaatcattc a 21 <210> 633 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_416 <400> 633 ttcatctgtt caatcattca t 21 <210> 634 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_417 <400> 634 tcatctgttc aatcattcat t 21 <210> 635 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_418 <400> 635 catctgttca atcattcatt c 21 <210> 636 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_419 <400> 636 atctgttcaa tcattcattc a 21 <210> 637 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_420 <400> 637 tctgttcaat cattcattca t 21 <210> 638 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_421 <400> 638 ctgttcaatc attcattcat t 21 <210> 639 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_422 <400> 639 tgttcaatca ttcattcatt c 21 <210> 640 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide MTx_ASO_423 <400> 640 gttcaatcat tcattcattc a 21 <210> 641 <211> 150 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(150) <223> Cryptic Exon Splice Acceptor hg38 chr19:17,642,640-17,642,491 <400> 641 tccaggttga ctctcactac tcatcatcag gttcttcctt ctattccagc cctaaccact 60 caggattggg ccgtttgtgt ctgggtatgt ctcttccagc tgcctgggtt tcctggaaag 120 aactcttatc cccaggaact agtttgttga 150 <210> 642 <211> 114 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(114) <223> Cryptic Exon Splice Donor hg38 chr19 17,642,504-17,642,391 <400> 642 aactagtttg ttgaataaat gctggtgaat gaatgaatga ttgaacagat gaatgagtga 60 tgagtagata aaaggatgga tggagagatg ggtgagtaca tggatggata gatg 114 <210> 643 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(69) <223> Cryptic Exon Splice Acceptor hg38 chr19 17,642,562-17,642,494 <400> 643 gtctgggtat gtctcttcca gctgcctggg tttcctggaa agaactctta tccccaggaa 60 ctagtttgt 69 <210> 644 <211> 89 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(89) <223> Cryptic Exon Splice Donor hg38 chr19 17,642,479-17,642,391 <400> 644 tgaatgaatg aatgattgaa cagatgaatg agtgatgagt agataaaagg atggatggag 60 agatgggtga gtacatggat ggatagatg 89 <210> 645 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASOs 1-10 compiled sequence <400> 645 tcaacaaact agttcctggg gataagagtt ctttccagga aaccc 45 <210> 646 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASOs 17-21 compiled sequence <400> 646 cagctggaag agacataccc agacacaaac 30 <210> 647 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASOs 249-256 compiled sequence <400> 647 ctatccatcc atgtactcac ccatctctcc atccatcct 39 <210> 648 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASOs 260-265 compiled sequence <400> 648 catcctttta tctactcatc actcattcat ctg 33 <210> 649 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASOs 271-272 compiled sequence <400> 649 ttcaatcatt cattcattca c 21 <210> 650 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> ASOs 1-10 compiled sequence reverse complement <400> 650 gggtttcctg gaaagaactc ttatccccag gaactagttt gttga 45 <210> 651 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> ASOs 17-21 compiled sequence reverse complement <400> 651 gtttgtgtct gggtatgtct cttccagctg 30 <210> 652 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> ASOs 249-256 compiled sequence reverse complement <400> 652 aggatggatg gagagatggg tgagtacatg gatggatag 39 <210> 653 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> ASOs 260-265 compiled sequence reverse complement <400> 653 cagatgaatg agtgatgagt agataaaagg atg 33 <210> 654 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> ASOs 271-272 compiled sequence reverse complement <400> 654 gtgaatgaat gaatgattga a 21

Claims (111)

  1. UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 세포에서 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체의 발현을 감소시키는 방법으로서,
    (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고;
    (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 염기 서열을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어지는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 15개 내지 40개의 염기를 갖는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체 내에 있는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인트론 20-21에서의 UNC13A 유전자 돌연변이를 갖는 것으로서 확인되고, 선택적으로 UNC13A 유전자 돌연변이는 rs12608932(hg38 chr19:17.641,880 A→C), rs12973192(hg38 chr19: 17,642,430 C→G), rs56041637(hg38 chr19:17,642,033-17,642,056 0-2 CATC 반복부→3-5 CATC 반복부) 및 rs62121687(hg38 chr19:17,642,351 C→A), 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  20. UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 세포에서 인산화된 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43)을 감소시키는 방법으로서,
    (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고;
    (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 염기 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8을 포함하는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  25. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어지는, 방법.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 15개 내지 40개의 염기를 갖는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는, 방법.
  30. 제27항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는, 방법.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491- 498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  34. 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는, 방법.
  35. 제16항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  37. 제16항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체 내에 있는, 방법.
  38. 대상체에게 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 TAR-DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 단백질병증을 치료하는 방법으로서,
    (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고;
    (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6을 포함하는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8을 포함하는, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어지는, 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 15개 내지 40개의 염기를 갖는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는, 방법.
  48. 제45항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는, 방법.
  49. 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  52. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는, 방법.
  53. 제38항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  55. 제38항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, TDP-43 단백질병증은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두 치매(FTD), 알츠하이머병, 해마회 경화증, 파키슨병, 페리 증후군, 헌팅턴병, 만성 외상성 뇌병증 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  56. 대상체에게 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 인트론 20-21에서 UNC13A 유전자 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 성숙 mRNA 전사체의 엑손 20과 엑손 21 사이에 은성 엑손을 포함하고;
    (b) UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  57. 제55항에 있어서, UNC13A 유전자 돌연변이는 rs12608932(hg38 chr19:17.641,880 A→C), rs12973192(hg38 chr19: 17,642,430 C→G), rs56041637(hg38 chr19:17,642,033-17,642,056 0-2 CATC 반복부→3-5 CATC 반복부) 및 rs62121687(hg38 chr19:17,642,351 C→A), 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 대상체는 TDP-43의 감소된 발현을 갖는, 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 은성 엑손은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 염기 서열을 포함하는, 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8을 포함하는, 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역; 또는
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    (a) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 20 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 12를 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (b) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 91을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (c) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 스플라이스 공여체 부위 영역은 서열 번호 220을 포함하거나 이것으로 이루어지거나;
    (d) UNC13A를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 21 스플라이스 수용체 부위 영역은 서열 번호 299를 포함하거나 이것으로 이루어지는, 방법.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 15개 내지 40개의 염기를 갖는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는, 방법.
  67. 제65항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는, 방법.
  68. 제65항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는, 방법.
  69. 제56항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 방법.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는, 방법.
  73. 제56항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  75. 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 TDP-43 단백질병증을 갖고, 선택적으로 TDP-43 단백질병증은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 퇴행(FTLD), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근 위축증(PMA), 안면 발병 감각 및 운동 뉴런병증(FOSMN), 해마회 경화증(HS), 변연계 우위 연령 관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 경화증을 갖는 대뇌 연령 관련 TDP-43(CARTS), 괌 파킨슨-치매 복합체(G-PDC), 구안 ALS(G-ALS), 다계통 단백질병증(MSP), 페리병, 알츠하이머병(AD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  76. 제38항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, STMN2 은성 스플라이스 변이체는 은성 엑손 2a를 포함하는, 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 억제성 핵산, 펩타이드, 항체, 결합 단백질, 소분자, 리보자임 또는 압타머를 포함하는, 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 은성 엑손 2a를 표적화하는, 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, STMN2 은성 스플라이스 변이체 특이적 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 선택적으로 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 STMN2를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 엑손 1 스플라이스 공여체 부위 영역 또는 STMN2를 암호화하는 예비가공된 mRNA에서의 은성 엑손 2a 스플라이스 수용체 부위 영역에 상보성인, 방법.
  82. 약학 조성물로서, 15개 내지 40개의 염기를 갖고 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 약학 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 약학 조성물.
  85. 약학 조성물로서,
    (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기;
    (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기;
    (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기;
    (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기; 또는
    (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드;
    및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는, 약학 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는, 약학 조성물.
  88. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는, 약학 조성물.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 약학 조성물.
  90. 제89항에 있어서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 약학 조성물.
  91. 제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인, 약학 조성물.
  92. 제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 억제제는
    (a) 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 약학 조성물.
  93. 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서, 15개 내지 40개의 염기를 갖고 서열 번호 13-90, 92-219, 221- 298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  94. 제93항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  95. 제94항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O- 메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  97. 15개 내지 40개의 염기를 갖는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서, 염기 서열은
    (a) 서열 번호 641에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 5' 말단; 또는 (b) 서열 번호 642에 제시된 서열을 갖는 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  98. 제97항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    (a) 서열 번호 643에 제시된 서열을 갖는 UNC13A 은성 엑손의 5' 말단; 또는
    (b) 서열 번호 644에 제시된 서열을 갖는 UNC13A 은성 엑손의 3' 말단에 상보성인, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    (a) 서열 번호 650과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (b) 서열 번호 651과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (c) 서열 번호 652와 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (d) 서열 번호 653과 상보성인 18개 내지 30개의 염기, 18개 내지 25개의 염기 또는 18개 내지 22개의 염기를 갖거나;
    (e) 서열 번호 654와 상보성인 18개 내지 21개의 염기를 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  102. 제101항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  103. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  104. 키트로서, 15개 내지 40개의 염기를 갖고 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 UNC13A 은성 엑손 스플라이스 변이체 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
  105. 제104항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 13-90, 92-219, 221-298, 300-377 및 423-640 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 키트.
  106. 제105항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 423-432, 439-443, 491-498, 502-507 및 513-514 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는 염기 서열을 갖는, 키트.
  107. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 25개의 염기를 갖는, 키트.
  108. 제107항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개 내지 22개의 염기를 갖는, 키트.
  109. 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20개 내지 30개의 염기를 갖는, 키트.
  110. 제104항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 키트.
  111. 제104항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'OMe 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 2'O-메톡시에틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
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