KR20210149107A - Angptl2 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 세포에서 ANGPTL2 mRNA를 표적화하여 ANGPTL2 단백질의 감소된 발현을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. ANGPTL2 단백질 발현의 감소는 특정 의학적 장애, 예컨대 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 것, 예를 들어 심혈관-관련 질환 또는 장애의 치료에 유익하다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 출원은 2019년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/828,864의 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
EFS-WEB을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원에 제출된 전자적으로 제출된 서열 목록 (명칭: 3338.144PC01_Seqlisting_ST25.txt, 크기: 149,978 바이트; 및 생성일: 2020년 4월 2일)의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
개시내용의 기술분야
본 개시내용은 세포에서 안지오포이에틴 유사 2 (ANGPTL2) 전사체를 표적화하여 ANGPTL2 단백질의 감소된 발현을 유도하는 안티센스 올리고머 화합물 (ASO)에 관한 것이다. ANGPTL2 단백질 발현의 감소는 광범위한 의학적 장애, 예컨대 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 장애 (예를 들어, 심혈관-관련 질환 또는 장애)에 유익할 수 있다.
안지오포이에틴-유사 2 (ANGPTL2)는 총 8종의 구성원 (ANGPTL1-8)으로 이루어진 안지오포이에틴-유사 패밀리에 속하는 분비된 단백질이다. ANGPTL2는 심장, 지방 조직, 폐, 신장, 및 골격근에서 우세하게 발현되고, 많은 생물학적 과정 (예를 들어, 조직 복구 및 혈관신생)에서 중요한 역할을 한다. 문헌 [Kim, I., et al., J Biol Chem 274(37):26523-8 (1999)]. ANGPTL2의 유익한 혈관신생 특성이 특정 졸중 환자에서 보고되었다. 문헌 [Buga, A.M., et al., Front Aging Neurosci 6:44 (2014)]. ANGPTL2는 또한 조혈 줄기 및 전구 세포의 생존 및 확장에서, 장 상피 재생의 조절에서, 그리고 유익한 선천성 면역 반응의 촉진에서 주요 역할을 하는 것으로 기재되어 있다. 문헌 [Broxmeyer, H.E., et al., Blood Cells Mol Dis 48(1):25-29 (2012); Horiguchi, H., et al., EMBO J 36(4):409-424 (2017); Yugami, M., et al., J Biol Chem 291(36):18843-52 (2016)].
과학적 진보에도 불구하고, 심장-관련 질환은 전세계적으로 남성 및 여성 둘 다에 대한 주요 사망 원인으로 남아있다. 미국 심장 협회는 2030년까지 미국 인구의 거의 40%가 심혈관 질환의 일부 형태를 가질 것으로 추정하며, 직접 의료 비용은 $8180억에 도달할 것으로 예상된다. 문헌 [Benjamin, E.J., et al., Circulation 135:e146-e603 (2017)]. 따라서, 훨씬 더 강건하고 비용-효과적인 새로운 치료 옵션이 매우 바람직하다.
안지오포이에틴 유사 2 (ANGPTL2) 전사체 내의 핵산 서열에 상보적인 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 전사체 내의 핵산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 상보적이다. 특정 실시양태에서, ANGPTL2 전사체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 196, 서열식별번호: 197, 서열식별번호: 198, 서열식별번호: 199, 및 서열식별번호: 207로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO는 ANGPTL2 단백질을 발현하는 인간 세포 (예를 들어, SK-N-AS 세포)에서 ANGPTL2 단백질 발현을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, ANGPTL2 단백질 발현은 ASO에 노출되지 않은 인간 세포에서의 ANGPTL2 단백질 발현과 비교하여 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 전사체 (예를 들어, mRNA)를 발현하는 인간 세포 (예를 들어, SK-N-AS 세포)에서 ANGPTL2 전사체 발현을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, ANGPTL2 전사체 발현은 ASO에 노출되지 않은 인간 세포에서의 ANGPTL2 전사체 발현과 비교하여 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, ASO는 갭머이다.
일부 실시양태에서, ASO는 1종 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 중 1종 이상은 2'-O-알킬-RNA; 2'-O-메틸 RNA (2'-OMe); 2'-알콕시-RNA; 2'-O-메톡시에틸-RNA (2'-MOE); 2'-아미노-DNA; 2'-플루오로-RNA; 2'-플루오로-DNA; 아라비노 핵산 (ANA); 2'-플루오로-ANA; 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 (LNA); 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 뉴클레오시드 유사체는 친화도 증진 2' 당 변형된 뉴클레오시드이다. 특정 실시양태에서, 친화도 증진 2' 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA이다. 추가 실시양태에서, LNA는 구속성 에틸 뉴클레오시드 (cEt), 2',4'-구속성 2'-O-메톡시에틸 (cMOE), α-L-LNA, β-D-LNA, 2'-O,4'-C-에틸렌-가교된 핵산 (ENA), 아미노-LNA, 옥시-LNA, 티오-LNA, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, ASO는 1개 이상의 5'-메틸-시토신 핵염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, ASO는 (i) SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 mRNA 수준을 감소시킬 수 있거나; (ii) SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 단백질 수준을 감소시킬 수 있거나; (iii) 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 감소, 호전, 또는 치료할 수 있거나; 또는 (iv) 그의 임의의 조합을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애는 심혈관 질환, 비만, 대사 질환, 제2형 당뇨병, 암, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO의 인접 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1 - 211; (ii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 471 - 686; (iii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,069 - 1,376; (iv) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,666 - 8,673; (v) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 8,975 - 12,415; (vi) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,739 - 18,116; (vii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,422 - 29,875; 또는 (viii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,373 - 35,389를 포함하는 핵산 서열에 상보적이다. 특정 실시양태에서, ASO의 인접 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 37 - 161; (ii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 521 - 636; (iii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,119 - 1,326; (iv) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,716 - 8,623; (v) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 9,025 - 12,365; (vi) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,789 - 18,066; (vii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,472 - 29,825; 또는 (viii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,423 - 35,339를 포함하는 핵산 서열에 상보적이다. 추가 실시양태에서, ASO의 인접 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 87 - 111; (ii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 571 - 586; (iii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,169 - 1,276; (iv) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,766 - 8,573; (v) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 9,075 - 12,315; (vi) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,839 - 18,016; (vii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,522 - 29,775; 또는 (viii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,473 - 35,289를 포함하는 핵산 서열에 상보적이다. 특정 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,187 - 20,234를 포함하는 핵산에 상보적이다. 다른 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,202 - 20,219를 포함하는 핵산에 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO의 인접 뉴클레오티드 서열은 도 2의 서열 (서열식별번호: 4 내지 서열식별번호: 193)로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ASO의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 93, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 97, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 또는 서열식별번호: 146을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 88, 또는 서열식별번호: 120을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO는 도 2의 설계로 이루어진 군으로부터 선택된 설계를 가지며, 여기서 대문자는 당 변형된 뉴클레오시드이고 소문자는 DNA이다. 일부 실시양태에서, ASO는 15 내지 20개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO의 인접 뉴클레오티드 서열은 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 뉴클레오시드간 연결이 변형된다. 특정 실시양태에서, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은 ASO를 포함하는 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 ASO는 적어도 1개의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티는 단백질, 지방산 쇄, 당 잔기, 당단백질, 중합체, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은 ASO 또는 접합체 및 제약상 허용되는 희석제, 담체, 염, 또는 아주반트를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 염은 나트륨 염, 칼륨 염, 암모늄 염, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 1종의 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 ANGPTL2 길항제이다. 일부 실시양태에서, ANGPTL2 길항제는 항-ANGPTL2 항체 또는 그의 단편이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 또한 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 진단 키트가 개시된다.
본원에 개시된 바와 같은 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물을 ANGPTL2 단백질을 발현하는 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포에서의 ANGPTL2 단백질 발현은 투여 후에 억제 또는 감소되는 것인, 세포에서 ANGPTL2 단백질 발현을 억제 또는 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물을 ANGPTL2 단백질을 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 세포에서의 ANGPTL2 단백질 발현은 접촉 후에 억제 또는 감소되는 것인, 세포에서 ANGPTL2 단백질 발현을 억제 또는 감소시키는 시험관내 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, ASO는 투여 후 또는 접촉 후 세포에서 ANGPTL2 전사체 (예를 들어, mRNA)의 발현을 억제 또는 감소시킨다. 특정 실시양태에서, ANGPTL2 전사체 (예를 들어, mRNA)의 발현은 ASO에 노출되지 않은 세포와 비교하여 투여 후에 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소된다. 추가 실시양태에서, ANGPTL2 단백질의 발현은 ASO에 노출되지 않은 세포와 비교하여 투여 후에 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 감소된다. 일부 실시양태에서, 세포는 뇌 세포, 예를 들어 신경모세포 (예를 들어, SK-N-AS 세포)이다.
또한, 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상의 감소, 호전, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 감소, 호전, 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용은 또한 의약의 제조를 위한 본원에 개시된 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 의약은 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물은 요법에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물은 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 요법을 필요로 하는 대상체에서 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 요법에 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애는 심혈관 질환, 비만, 대사 질환, 제2형 당뇨병, 암, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 심혈관 질환 또는 장애는 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 졸중, 심부전, 고혈압성 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 심장 판막 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 혈전색전성 질환, 정맥 혈전증, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 심혈관 질환 또는 장애는 심부전이다. 특정 실시양태에서, 심부전은 좌측 심부전, 우측 심부전, 울혈성 심부전, 감소된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFrEF), 보존된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFpEF), 중간-범위 박출 계수를 갖는 심부전 (HFmrEF), 비대성 심근병증 (HCM), 고혈압성 심장 질환 (HHD), 또는 고혈압성 비대성 심근병증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물은 심장내로, 경구로, 비경구로, 척수강내로, 뇌실내로, 경폐로, 국소로, 또는 심실내로 투여된다.
도 1a는 인간 ANGPTL2 게놈 서열 (수탁 번호 NC_000009.12를 갖는 NCBI 참조 서열의 잔기 127,087,349 내지 127,122,765의 역 상보체에 상응함)을 나타낸다. 서열식별번호: 1은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 우라실 "u"로 대체된 것을 제외하고는 ANGPTL2 프리-mRNA 서열과 동일하다. 도 1b는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 "t"가 mRNA에서 우라실 "u"로 대체된 것을 제외한, 인간 ANGPTL2 mRNA 서열 (수탁 번호 NM_012098.2)을 보여준다. 도 1c는 인간 CAMK2D 단백질 서열 (수탁 번호 NP_036230.1) (서열식별번호: 3)을 보여준다. 도 1d는 대안적 스플라이싱에 의해 생성될 수 있는 2종의 이성질체를 보여준다. ANGPTL2 이소형 X1의 서열 (수탁 번호 XP_006717093.1, 서열식별번호: 194)은 하기와 같이 도 1c의 정규 서열과 상이하다: 274-274: P → L; 및 275-493: 누락. ANGPTL2 이소형 2의 서열 (수탁 번호 Q9UKU9-2, 서열식별번호: 195)은 하기와 같이 도 1c의 정규 서열과 상이하다: 1-302: 누락.
도 2는 ANGPTL2 프리-mRNA를 표적화하는 예시적인 ASO를 보여준다. 도 2의 각각의 열은 ASO의 서열에 대해서만 지정된 서열식별번호, ANGPTL2 프리-mRNA 서열 상의 표적 시작 및 종료 위치, 설계 번호 (DES No.), 설계에 의한 ASO 서열, ASO 번호 (ASO No.), 및 화학 구조에 의한 ASO 서열을 보여준다. ASO 설계에 대해, 대문자는 뉴클레오시드 유사체를 나타내고, 소문자는 DNA를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 기재된 바와 같은 다양한 ASO와의 시험관내 배양 후 SK-N-AS 세포에서의 ANGPTL2 mRNA 발현의 퍼센트 감소를 보여준다. 세포를 25 μM 또는 5 μM의 ASO로 처리하였다. ANGPTL2 mRNA 발현의 감소 (액틴에 대해 정규화됨)는 대조군의 퍼센트로서 제시된다.
도 4는 시험관내 SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 mRNA 발현을 감소시키는데 있어서의 다양한 ASO에 대한 효력 (IC50)을 보여준다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, SK-N-AS 세포를 상이한 ASO의 10-포인트 적정으로 시험하면서 시험관내 배양하였고, ASO의 효력 (IC50)을 액틴 발현에 대한 ANGPTL2의 비 (M)로서 제시한다.
도 5는 마우스에서 생체내 ANGPTL2 mRNA 발현을 감소시키는데 있어서 예시적인 ASO의 효능을 보여준다. 효능은 염수-투여된 대조군 마우스에서의 상응하는 발현과 비교하여 ANGPTL2 mRNA 발현 (GAPDH에 대해 정규화됨)의 퍼센트 감소로서 제시된다.
도 2는 ANGPTL2 프리-mRNA를 표적화하는 예시적인 ASO를 보여준다. 도 2의 각각의 열은 ASO의 서열에 대해서만 지정된 서열식별번호, ANGPTL2 프리-mRNA 서열 상의 표적 시작 및 종료 위치, 설계 번호 (DES No.), 설계에 의한 ASO 서열, ASO 번호 (ASO No.), 및 화학 구조에 의한 ASO 서열을 보여준다. ASO 설계에 대해, 대문자는 뉴클레오시드 유사체를 나타내고, 소문자는 DNA를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 기재된 바와 같은 다양한 ASO와의 시험관내 배양 후 SK-N-AS 세포에서의 ANGPTL2 mRNA 발현의 퍼센트 감소를 보여준다. 세포를 25 μM 또는 5 μM의 ASO로 처리하였다. ANGPTL2 mRNA 발현의 감소 (액틴에 대해 정규화됨)는 대조군의 퍼센트로서 제시된다.
도 4는 시험관내 SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 mRNA 발현을 감소시키는데 있어서의 다양한 ASO에 대한 효력 (IC50)을 보여준다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, SK-N-AS 세포를 상이한 ASO의 10-포인트 적정으로 시험하면서 시험관내 배양하였고, ASO의 효력 (IC50)을 액틴 발현에 대한 ANGPTL2의 비 (M)로서 제시한다.
도 5는 마우스에서 생체내 ANGPTL2 mRNA 발현을 감소시키는데 있어서 예시적인 ASO의 효능을 보여준다. 효능은 염수-투여된 대조군 마우스에서의 상응하는 발현과 비교하여 ANGPTL2 mRNA 발현 (GAPDH에 대해 정규화됨)의 퍼센트 감소로서 제시된다.
I. 정의
용어 "단수" 실체는 그 실체 중 하나 이상을 지칭한다는 것에 주목하며; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 단수 용어, "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
또한, 본원에 사용된 "및/또는"은 2개의 명시된 특색 또는 성분 각각을 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 각각 하기 측면을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
측면이 언어 "포함하는"과 함께 본원에 기재된 어떠한 경우든, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적 사전을 제공한다.
단위, 접두어, 및 기호는 시스템 인터내셔날 드 유니테스 (SI) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 규정하는 수를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 기재된다. 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 기재된다. 본원에 제공된 표제는 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니며, 이는 전체로서 본 명세서를 참조할 수 있다. 따라서, 바로 하기에 정의된 용어는 본 명세서를 그 전문으로 참조하여 보다 충분히 정의된다.
용어 "약"은 대략, 대략적, 근사, 또는 영역 내를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우에, 이는 경계를 제시된 수치 값 초과 및 미만으로 확장함으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치 값을 언급된 값 초과 및 미만으로, 예를 들어 10 퍼센트 위 또는 아래의 (더 높거나 또는 더 낮은) 변동치만큼 변경할 수 있다. 예를 들어, "ASO가 ASO의 투여 후 세포에서 ANGPTL2 단백질의 발현을 적어도 약 60% 감소시킨다"고 언급되는 경우, 이는 ANGPTL2 단백질 수준이 50% 내지 70%의 범위만큼 감소된다는 것을 암시한다.
용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 복수의 핵산을 포괄하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 생체내 또는 시험관내 표적 서열, 예를 들어 프리-mRNA, mRNA, 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어가 표적 서열 내의 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭하는 경우에, 핵산 또는 뉴클레오티드는 세포 내의 자연 발생 서열일 수 있다. 다른 실시양태에서, "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 본 개시내용의 ASO의 서열을 지칭한다. 용어가 ASO의 서열을 지칭하는 경우에, 핵산 또는 뉴클레오티드는 자연 발생이 아니고, 즉 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 생산되거나, 재조합적으로 생산되거나, 또는 그의 임의의 조합이다. 한 실시양태에서, ASO의 핵산 또는 뉴클레오티드는 합성적으로 또는 재조합적으로 생산되지만, 자연 발생 서열 또는 그의 단편은 아니다. 또 다른 실시양태에서, ASO의 핵산 또는 뉴클레오티드는 자연에서 자연 발생한 것이 아닌 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하기 때문에 자연 발생이 아니다. 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오시드"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 단일 핵산 절편, 예를 들어 DNA, RNA, 또는 그의 유사체를 지칭한다. "핵산" 또는 "뉴클레오시드"는 자연 발생 핵산 또는 비-자연 발생 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 "뉴클레오티드", "단위" 및 "단량체"는 상호교환가능하게 사용된다. 뉴클레오티드 또는 단량체의 서열을 언급할 때, 염기, 예컨대 A, T, G, C 또는 U, 및 그의 유사체의 서열이 언급된다는 것이 인식될 것이다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 당 모이어티, 염기 모이어티 및 공유 연결된 기 (연결 기), 예컨대 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 기를 포함하는 글리코시드를 지칭하고, 자연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 및 변형된 당 및/또는 염기 모이어티를 포함하는, 본원에서 또한 "뉴클레오티드 유사체"로도 지칭되는 비-자연 발생 뉴클레오티드 둘 다를 포괄한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드 (단위)는 또한 단량체 또는 핵산 단위로 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 당 모이어티 (예를 들어, LNA)를 갖는 뉴클레오티드의 비제한적 예는 본원의 다른 곳에 개시된다. 다른 실시양태에서, 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 변형된 핵염기 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 핵염기 모이어티를 갖는 뉴클레오티드는 5-메틸-시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "핵염기"는 핵산 혼성화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 (예를 들어, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들어, 우라실, 티민, 및 시토신) 모이어티를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "핵염기"는 또한 자연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 기능적인 변형된 핵염기를 포괄한다. 이러한 문맥에서, "핵염기"는 자연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 크산틴 및 하이포크산틴, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변이체 둘 다를 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 문헌 [Hirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1]에 기재되어 있다. 핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 여기서 각각의 문자는 임의로 등가의 기능의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C, 및 5-메틸 시토신으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오시드"는 당 모이어티 및 염기 모이어티를 포함하는 글리코시드를 지칭하는데 사용되고, 따라서 ASO의 뉴클레오티드 사이가 뉴클레오티드간 연결에 의해 공유 연결된 뉴클레오티드 단위를 지칭하는 경우에 사용될 수 있다. 생명공학 분야에서, 용어 "뉴클레오티드"는 종종 핵산 단량체 또는 단위를 지칭하는데 사용된다. ASO의 문맥에서, 용어 "뉴클레오티드"는 염기 단독, 즉 시토신 (DNA 및 RNA), 구아닌 (DNA 및 RNA), 아데닌 (DNA 및 RNA), 티민 (DNA) 및 우라실 (RNA)을 포함하는 핵염기 서열을 지칭할 수 있고, 여기에는 당 백본 및 뉴클레오티드간 연결의 존재가 내포되어 있다. 마찬가지로, 특히 뉴클레오티드간 연결 기 중 1개 이상이 변형된 올리고뉴클레오티드의 경우에, 용어 "뉴클레오티드"는 "뉴클레오시드"를 지칭할 수 있다. 예를 들어 용어 "뉴클레오티드"는 심지어 뉴클레오시드 사이의 연결의 존재 또는 성질을 명시하는 경우에도 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" (ASO)는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조정할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니고, 따라서 siRNA 또는 shRNA가 아니다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 본원에 개시된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는, 자기내 상보성 또는 자기간 상보성의 정도가 올리고뉴클레오티드의 전장에 걸쳐 50% 미만인 한, 헤어핀 또는 분자간 듀플렉스 구조 (동일한 올리고뉴클레오티드의 2개의 분자 사이의 듀플렉스)를 형성할 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전체 서열, 또는 일부 실시양태에서 그의 인접 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "iRNA", "RNAi 작용제", "iRNA 작용제", 및 "RNA 간섭 작용제"는 본원의 RNA 뉴클레오시드를 함유하고 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 경로를 통해 RNA 전사체의 표적화된 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭 (RNAi)으로서의 프로세스를 통해 mRNA의 서열-특이적 분해를 지시한다. iRNA는 세포, 예를 들어 포유동물 대상체와 같은 대상체 내의 세포에서 표적 핵산의 발현을 조정, 예를 들어 억제한다. RNAi 작용제는 단일 가닥 RNAi 작용제 및 이중 가닥 siRNA, 뿐만 아니라 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 포함한다. 개시내용의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열은 RNAi 작용제의 형태일 수 있거나, 또는 RNAi 작용제의 일부, 예컨대 siRNA 또는 shRNA를 형성할 수 있다. 개시내용의 일부 실시양태에서, 개시내용의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열은 RNAi 작용제, 예컨대 siRNA이다.
용어 siRNA는 소형 간섭 리보핵산 RNAi 작용제를 지칭한다. siRNA는 이중-가닥 RNA 분자의 부류이고, 또한 짧은 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로서 관련 기술분야에 공지되어 있다. siRNA는 전형적으로 센스 가닥 (또한 패신저 가닥으로도 지칭됨) 및 안티센스 가닥 (또한 가이드 가닥으로도 지칭됨)을 포함하며, 여기서 각각의 가닥은 17 - 30개 뉴클레오티드 길이, 전형적으로 19 - 25개 뉴클레오시드 길이이고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 핵산 (적합하게는 성숙 mRNA 서열)에 상보적이고, 예컨대 완전히 상보적이고, 센스 가닥은 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 듀플렉스 또는 듀플렉스 영역을 형성하도록 안티센스 가닥에 상보적이다. siRNA 가닥은 평활 말단 듀플렉스를 형성할 수 있거나, 또는 유리하게는 센스 및 안티센스 가닥 3' 단부는 예를 들어 1, 2 또는 3개 뉴클레오시드의 3' 오버행을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다는 2nt 3' 오버행을 갖는다. 따라서, 듀플렉스 영역은 예를 들어 17-25개 뉴클레오티드 길이, 예컨대 21-23개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일단 세포 내부에 들어가면, 안티센스 가닥은 표적 핵산의 표적 분해 또는 표적 억제를 매개할 수 있는 RISC 복합체 내로 혼입된다. siRNA는 전형적으로 RNA 뉴클레오시드에 더하여 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나, 또는 일부 실시양태에서, siRNA 가닥의 모든 뉴클레오티드가 변형될 수 있다. 변형의 비제한적 예는 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA (예를 들어 WO2004083430, WO2007085485 참조), 2'플루오로, 2'-O-메틸, 또는 2'-O-메톡시에틸을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, siRNA의 패신저 가닥은 불연속적일 수 있다 (예를 들어 WO2007107162 참조). siRNA의 안티센스 가닥의 시드 영역에서 발생하는 열적 탈안정화 뉴클레오티드의 혼입은 siRNA의 오프-타겟 활성을 감소시키는데 유용한 것으로 보고되어 있다 (예를 들어 WO18098328 참조).
일부 실시양태에서, dsRNA 작용제, 예컨대 개시내용의 siRNA는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함하거나; 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함하거나, 또는 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함하거나; 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함하거나; 또는 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민 (dT) 뉴클레오티드, 2'-0-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 비잠금 뉴클레오티드, 입체형태적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속성 에틸 뉴클레오티드, 염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-변형된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-변형된 뉴클레오티드, 2'-히드록실-변형된 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비-천연 염기 포함 뉴클레오티드, 비연결 뉴클레오티드, 테트라히드로피란 변형된 뉴클레오티드, 1,5-안히드로헥시톨 변형된 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 변형된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드, 글리콜 변형된 뉴클레오티드, 및 2-0-(N-메틸아세트아미드) 변형된 뉴클레오티드, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 적합한 siRNA는 안티센스 가닥의 5' 단부에 5'-포스페이트 기 또는 5'-포스페이트 모방체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 단부는 RNA 뉴클레오시드이다.
한 실시양태에서, dsRNA 작용제는 적어도 1개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함한다.
포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결은 하나 또는 둘 다의 가닥 (예를 들어, 안티센스 가닥; 또는 센스 가닥)의 3'-말단에 있을 수 있거나; 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결은 하나 또는 둘 다의 가닥 (예를 들어, 안티센스 가닥; 또는 센스 가닥)의 5'-말단에 있을 수 있거나; 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결은 하나 또는 둘 다의 가닥 (예를 들어, 안티센스 가닥; 또는 센스 가닥)의 5'- 및 3'-말단 둘 다에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
dsRNA 작용제는 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 단부에 접합된다.
생물학적 분포를 위해, siRNA는 예를 들어 표적화 리간드에 접합될 수 있고/거나, 지질 나노입자로 제제화될 수 있다.
본 개시내용의 다른 측면은 이들 dsRNA, 예컨대 치료 용도에 적합한 siRNA 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 다양한 질환 상태의 치료를 위해 개시내용의 dsRNA 분자, 예컨대 siRNA를 투여함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.
용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 1개 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재한다. 용어 "키메라 올리고뉴클레오티드"는 당-변형된 뉴클레오시드 및 비 당-변형된 뉴클레오시드 둘 다를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재하는 것으로 문헌에 사용된 용어이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오티드이고, 단리된 형태 또는 정제된 형태일 수 있다.
용어 "인접 뉴클레오티드 서열"은 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 용어는 본원에서 용어 "인접 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대 F-G-F' 갭머 영역을 포함하고, 임의로 추가의 뉴클레오티드(들), 예를 들어 인접 뉴클레오티드 서열에 관능기를 부착시키는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 링커 영역을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커 영역은 표적 핵산에 상보적일 수 있거나 또는 상보적일 수 없다. 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 그 자체보다 더 길 수 없고, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열보다 더 짧을 수 없는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 1개 이상의 변형의 도입에 의해 동등한 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드의 실시양태는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 비변형된 DNA 또는 RNA 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 본원에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 명명된다. DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 염기 영역에서 변형을 갖는 뉴클레오시드는, 왓슨 크릭 염기 쌍형성을 허용한다면, 여전히 일반적으로 DNA 또는 RNA로 명명된다.
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결"은 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유 커플링시키는, 포스포디에스테르 (PO) 연결 이외의 연결로서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 길이"는 주어진 서열, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드인 뉴클레오시드의 서열, 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열에서의 뉴클레오티드 (단량체)의 총 수를 의미한다. 예를 들어, tacatattatattactcctc (서열식별번호: 158)의 서열은 20개의 뉴클레오티드를 갖고; 따라서 서열의 뉴클레오티드 길이는 20이다. 따라서, 용어 "뉴클레오티드 길이"는 본원에서 "뉴클레오티드 수"와 상호교환가능하게 사용된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드는 5' 말단 기를 포함할 수 있지만 5' 뉴클레오티드간 연결 기는 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은, 단독으로 또는 조합하여, 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 특히 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 보다 특히 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 의미한다. 직쇄 및 분지쇄 C1-C8 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이성질체 펜틸, 이성질체 헥실, 이성질체 헵틸 및 이성질체 옥틸, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸이다. 알킬의 특정한 예는 메틸이다. 알킬의 추가의 예는 모노, 디 또는 트리플루오로 메틸, 에틸 또는 프로필, 예컨대 시클로프로필 (cPr), 또는 모노, 디 또는 트리 플루오로 시클로프로필이다.
용어 "알콕시"는, 단독으로 또는 조합하여, 화학식 알킬-O-의 기 (여기서 용어 "알킬"은 이전에 주어진 의미를 가짐), 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec.부톡시 및 tert.부톡시를 의미한다. 특정한 "알콕시"는 메톡시이다.
용어 "보호기"는, 단독으로 또는 조합하여, 다관능성 화합물 내의 반응성 부위를 선택적으로 차단하여 화학 반응이 또 다른 비보호된 반응성 부위에서 선택적으로 수행될 수 있도록 하는 기를 의미한다. 보호기는 제거될 수 있다. 예시적인 보호기는 아미노-보호기, 카르복시-보호기 또는 히드록시-보호기이다.
개시내용의 출발 물질 또는 화합물 중 1종이 안정하지 않거나 또는 1개 이상의 반응 단계의 반응 조건 하에 반응성인 1개 이상의 관능기를 함유하는 경우에, 적절한 보호기 (예를 들어, 문헌 ["Protective Groups in Organic Chemistry" by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New York]에 기재된 바와 같음)가 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 적용하는 결정적 단계 전에 도입될 수 있다. 이러한 보호기는 문헌에 기재된 표준 방법을 사용하여 합성의 후기 단계에서 제거될 수 있다. 보호기의 예는 tert-부톡시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메틸 카르바메이트 (Fmoc), 2-트리메틸실릴에틸 카르바메이트 (Teoc), 카르보벤질옥시 (Cbz) 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐 (Moz)이다.
본원에 기재된 화합물은 여러 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 광학적으로 순수한 거울상이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 예컨대 예를 들어 라세미체, 부분입체이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체 라세미체 또는 부분입체이성질체 라세미체의 혼합물의 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비시클릭 당"은 4 내지 7원 고리의 2개의 원자를 연결하여 제2 고리를 형성하여 비시클릭 구조를 생성하는 가교를 포함하는 4 내지 7원 고리를 포함하는 변형된 당 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가교는 LNA 뉴클레오시드에서 관찰된 바와 같이 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4'를 연결한다 (즉, 2'-4' 가교).
본원에 사용된 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역가능한 코돈으로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 부분이다. "정지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만 코딩 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있지만, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 비번역 영역 ("UTR") 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 코딩 영역의 경계는 전형적으로 생성물 폴리펩티드의 아미노 말단을 코딩하는 5' 말단의 개시 코돈, 및 생성물 폴리펩티드의 카르복실 말단을 코딩하는 3' 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다.
본원에 사용된 용어 "비-코딩 영역"은 코딩 영역이 아닌 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 비-코딩 영역의 예는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 비번역 영역 ("UTR"), 비-코딩 엑손 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 엑손 중 일부는 각 전사체의 5' 비번역 영역 (5' UTR) 또는 3' 비번역 영역 (3' UTR)의 전부 또는 일부일 수 있다. 비번역 영역은 전사체의 효율적인 번역 및 전사체의 번역 속도 및 반감기의 제어에 중요하다.
용어 "영역"은, 뉴클레오티드 서열의 문맥에서 사용되는 경우에, 그러한 서열의 섹션을 지칭한다. 예를 들어, 어구 "뉴클레오티드 서열 내의 영역" 또는 "뉴클레오티드 서열의 상보체 내의 영역"은 뉴클레오티드 서열보다 짧지만, 각각 특정한 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 상보체 내에 위치하는 적어도 10개의 뉴클레오티드보다 긴 서열을 지칭한다. 용어 "하위-서열" 또는 "하위서열"은 또한 뉴클레오티드 서열의 영역을 지칭할 수 있다.
용어 "하류"는 뉴클레오티드 서열을 언급할 경우, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치함을 의미한다. 특정 실시양태에서, 하류 뉴클레오티드 서열은 전사의 출발점을 뒤따르는 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 시작 부위의 하류에 위치한다.
용어 "상류"는 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조절 영역"은 코딩 영역의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 연관된 코딩 영역의 전사, RNA 프로세싱, 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, UTR, 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서의 발현을 위해 의도되는 경우에, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.
본원에 사용된 용어 "전사체"는 DNA의 전사에 의해 합성되고 프로세싱 후에 메신저 RNA (mRNA), 즉 전구체 메신저 RNA (프리-mRNA), 및 프로세싱된 mRNA 자체가 되는 1차 전사체를 지칭할 수 있다. 용어 "전사체"는 "프리-mRNA" 및 "mRNA"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. DNA 가닥이 1차 전사체로 전사된 후에, 새로 합성된 1차 전사체는 상이한 단백질 및 RNA, 예컨대 mRNA, tRNA, rRNA, lncRNA, miRNA 등을 생산하기 위해 그의 성숙한, 기능적 형태로 전환되도록 여러 방식으로 변형된다. 따라서, 용어 "전사체"는 엑손, 인트론, 5' UTR, 및 3' UTR을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 유전자 생성물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이는, 비제한적으로, 폴리뉴클레오티드의 메신저 RNA (mRNA)로의 전사 및 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 생성물"을 생산한다. 본원에 사용된 유전자 생성물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 생성물은 전사후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 또는 단백질분해적 절단을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "동일성"은 인접 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 참조 서열 (예를 들어, 서열 모티프)과 동일한 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 내의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 비율 (퍼센트로 표현됨)을 지칭한다. 따라서, 동일성의 백분율은 2개의 서열 사이에 (개시내용의 화합물의 인접 뉴클레오티드 서열 및 참조 서열 내에) 동일한 (매칭) 정렬된 핵염기의 수를 카운팅하고, 그 수를 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 총수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 따라서, 동일성의 백분율 = (매칭 x 100)/정렬된 영역 (예를 들어 인접 뉴클레오티드 서열)의 길이. 삽입 및 결실은 인접 뉴클레오티드 서열의 동일성의 백분율의 계산에서 허용되지 않는다. 동일성을 결정하는데 있어서, 왓슨 크릭 염기 쌍형성을 형성하는 핵염기의 기능적 능력이 유지되는 한, 핵염기의 화학적 변형은 무시된다는 것이 이해될 것이다 (예를 들어, 5-메틸 시토신은 % 동일성을 계산하기 위한 목적으로 시토신과 동일한 것으로 간주됨).
폴리뉴클레오티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 그 자체의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림됨에 주목한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 반올림되고, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수일 것임에 주목한다.
본원에 사용된 용어 "상동" 및 "상동성"은 용어 "동일성" 및 "동일한"과 상호교환가능하다.
용어 "그의 자연 발생 변이체"는 규정된 분류학상 군, 예컨대 포유동물, 예컨대 마우스, 원숭이, 및 인간 내에 자연적으로 존재하는 ANGPTL2 폴리펩티드 서열 또는 ANGPTL2 핵산 서열 (예를 들어, 전사체)의 변이체를 지칭한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드의 "자연 발생 변이체"를 지칭하는 경우에, 용어는 또한 염색체 전위 또는 중복에 의해 염색체 위치 9q33.3 (즉, 진뱅크 수탁 번호 NC_000009.12의 잔기 127,087,349 내지 127,122,765의 역 상보체)에서 발견되는 ANGPTL2-코딩 게놈 DNA의 임의의 대립유전자 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA, 예컨대 mRNA를 포괄할 수 있다. "자연 발생 변이체"는 또한 ANGPTL2 mRNA의 대안적 스플라이싱으로부터 유래된 변이체를 포함할 수 있다. 특정 폴리펩티드 서열에 대해 언급되는 경우에, 예를 들어 용어는 또한 단백질의 자연 발생 형태를 포함하고, 따라서 이는 예를 들어 번역-동시 또는 번역-후 변형, 예컨대 신호 펩티드 절단, 단백질분해적 절단, 글리코실화 등에 의해 프로세싱될 수 있다.
2개의 별개의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 언급하는 경우 용어 "상응하는" 및 "상응한다"는, 구체적 서열의 뉴클레오티드가 상이하게 넘버링될 수 있지만, 상동성 및/또는 기능성에 기초하여 서로 상응하거나 유사한 서열의 영역을 명확하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 전사체의 상이한 이소형은 그의 넘버링이 대안적 스플라이싱 및/또는 다른 변형에 기초하여 각각의 이소형에서 상이할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 유사하거나 보존된 부분을 가질 수 있다. 또한, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 특징화할 때 (예를 들어, 유전자 전사체 및 번역 개시 코돈으로부터 서열의 넘버링을 시작할지 또는 5'UTR을 포함할지 여부) 상이한 넘버링 시스템이 사용될 수 있는 것으로 인식된다. 추가로, 유전자 또는 유전자 전사체의 상이한 변이체의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 달라질 수 있는 것으로 인식된다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 상동성 및/또는 기능성을 공유하는 변이체의 영역은 서로 "상응하는" 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1 ("참조 서열")의 뉴클레오티드 X 내지 Y에 상응하는 ANGPTL2 전사체의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 X 내지 Y와 동일한 서열 또는 유사한 서열을 갖는 ANGPTL2 전사체 서열 (예를 들어, ANGPTL2 프리-mRNA 또는 mRNA)을 지칭하며, 여기서 X는 시작 부위이고, Y는 종료 부위이다 (도 2에 제시된 바와 같음). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 ANGPTL2 전사체 서열을 서열식별번호: 1과 정렬함으로써 ANGPTL2 전사체 서열에서 상응하는 X 및 Y 잔기를 확인할 수 있다.
용어 "상응하는 뉴클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 유사체 및 자연 발생 뉴클레오티드의 핵염기가 동일한 쌍형성 또는 혼성화 능력을 가짐을 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 2-데옥시리보스 단위가 아데닌에 연결된 경우에, "상응하는 뉴클레오티드 유사체"는 아데닌에 연결된 펜토스 단위 (2-데옥시리보스와 상이함)를 함유한다.
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭 염기-쌍형성에 대한 능력을 기재한다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌 (G)-시토신 (C) 및 아데닌 (A)-티민 (T)/우라실 (U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있으며, 예를 들어 5-메틸 시토신은 종종 시토신 대신 사용되고 (시토신의 상응하는 뉴클레오티드 유사체의 예), 따라서 용어 상보성은 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨 크릭 염기-쌍형성을 포괄하는 것으로 이해될 것이다 (예를 들어 문헌 [Hirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참조). 본원에 사용된 용어 "역 상보체", "역 상보적", 및 "역 상보성"은 용어 "상보체", "상보적" 및 "상보성"과 상호교환가능하다. 일부 실시양태에서, 용어 "상보적"은 ANGPTL2 전사체 내 인접 핵산 서열과의 100% 매칭 또는 상보성 (즉, 완전히 상보적)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "상보적"은 ANGPTL2 전사체 내 인접 핵산 서열과의 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 매칭 또는 상보성을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "% 상보적"은 인접 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 참조 서열 (예를 들어, 표적 서열 또는 서열 모티프)에 상보적인 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 내의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 비율 (퍼센트 단위)을 지칭한다. 따라서, 상보성의 백분율은 2개의 서열 사이에서 (왓슨 크릭 염기 쌍으로부터) 상보적인 정렬된 핵염기의 수를 카운팅하고 (표적 서열 5'-3' 및 올리고뉴클레오티드 서열 3'-5'가 정렬된 경우), 그 수를 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 총수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 정렬되지 않은 (염기 쌍을 형성하지 않은) 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치로 명명된다. 삽입 및 결실은 인접 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 허용되지 않는다. 상보성을 결정하는데 있어서, 왓슨 크릭 염기 쌍형성을 형성하는 핵염기의 기능적 능력이 유지되는 한, 핵염기의 화학적 변형은 무시된다는 것이 이해될 것이다 (예를 들어, 5'-메틸 시토신은 % 동일성을 계산하기 위한 목적으로 시토신과 동일한 것으로 간주됨).
용어 "완전히 상보적"은 100% 상보성을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "혼성화하는" 또는 "혼성화하다"는 2개의 핵산 가닥 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)이 반대 가닥 상의 염기 쌍 사이에서 수소 결합을 형성하여 듀플렉스를 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 2개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화도는 혼성화의 강도이다. 이는 종종 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉스화되는 온도로서 정의되는 용융 온도 (Tm)의 관점에서 기재된다. 생리학적 조건에서, Tm은 친화도에 엄격하게 비례하지 않는다 (Mergny and Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537). 표준 상태 깁스 자유 에너지 ΔG°가 결합 친화도의 보다 정확한 표현이며, ΔG°=-RTln(Kd)에 의해 반응의 해리 상수 (Kd)와 관련되고, 여기서 R은 기체 상수이고, T는 절대 온도이다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 매우 낮은 ΔG°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. ΔG°는 수성 농도가 1M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 연관된 에너지이다. 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적 반응이고, 자발적 반응의 경우 ΔG°는 0 미만이다. ΔG°는, 예를 들어 문헌 [Hansen et al., 1965,Chem. Comm. 36-38 및 Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today]에 기재된 바와 같은 등온 적정 열량측정 (ITC) 방법의 사용에 의해 실험적으로 측정될 수 있다. 통상의 기술자는 ΔG° 측정에 상업적 장비가 이용가능하다는 것을 알 것이다. ΔG°는 또한 문헌 [SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465]에 기재된 바와 같은 최근접 이웃 모델을 사용하여, 문헌 [Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 및 McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405]에 기재된 적절하게 유도된 열역학적 파라미터를 사용하여 수치적으로 추정될 수 있다. 혼성화에 의해 그의 의도된 핵산 표적을 조정할 가능성을 갖기 위해, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 10-30개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드의 경우에 -10 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값으로 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 혼성화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 ΔG°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 8-30개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드의 경우에 -10 kcal 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만 및 예컨대 -25 kcal 미만의 범위의 추정된 ΔG° 값으로 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal 예컨대 -18 내지 -25 kcal의 추정된 ΔG° 값으로 표적 핵산에 혼성화한다.
본원에 사용된 용어 "DES 번호" 또는 "DES No."는 뉴클레오시드 (예를 들어, DNA) 및 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, LNA)의 특정 패턴을 갖는 뉴클레오티드 서열에 주어진 고유 번호를 지칭한다. 본원에 사용된 ASO의 설계는 대문자 및 소문자의 조합에 의해 제시된다. 예를 들어, DES-0190은 LLDDDDDDDDDDDDLL (즉, GAgcctttacatgcCG)의 ASO 설계를 갖는 gagcctttacatgccg (서열식별번호: 5)의 ASO 서열을 지칭하며, 여기서 L (즉, 대문자)은 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, LNA)를 나타내고, D (즉, 소문자)는 뉴클레오시드 (예를 들어, DNA)를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "ASO 번호" 또는 "ASO No."는 성분의 상세한 화학 구조, 예를 들어 뉴클레오시드 (예를 들어, DNA), 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 베타-D-옥시-LNA), 핵염기 (예를 들어, A, T, G, C, U, 또는 MC), 및 백본 구조 (예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디에스테르)를 갖는 뉴클레오티드 서열에 주어진 고유 번호를 지칭한다. 예를 들어, ASO-0190은 (5' - 3') OxyGsOxyAsDNAgsDNAcsDNAcsDNAtsDNAtsDNAtsDNAasDNAcsDNAasDNAtsDNAgsDNAcsOxyMCsOxyG를 지칭할 수 있다.
ASO 화학의 주석은 하기와 같다: 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오티드는 OxyN으로 지정되고, 여기서 N은 뉴클레오티드 염기, 예컨대 티민 (T), 우리딘 (U), 시토신 (C), 5-메틸시토신 (MC), 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)을 지정하고, 따라서 OxyA, OxyT, OxyMC, OxyC 및 OxyG를 포함한다. DNA 뉴클레오티드는 DNAn으로 지정되고, 여기서 소문자 n은 뉴클레오티드 염기, 예컨대 티민 (t), 우리딘 (u), 시토신 (c), 5-메틸시토신 (Mc), 아데닌 (a) 또는 구아닌 (g)을 지정하고, 따라서 DNAa, DNAt, DNAc, DNAMc 및 DNAg를 포함한다. C 또는 c 앞의 문자 M은 5-메틸시토신을 나타낸다. 문자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 나타낸다.
"효력"은 통상적으로 달리 언급되지 않는 한 μM, nM 또는 pM 단위의 IC50 또는 EC50 값으로 표현된다. 효력은 또한 퍼센트 억제의 관점에서 표현될 수 있다. IC50은 치료 분자의 중앙 억제 농도이다. EC50은 비히클 또는 대조군 (예를 들어, 염수) 대비 치료 분자의 중앙 유효 농도이다. 기능적 검정에서, IC50은 생물학적 반응, 예를 들어 mRNA의 전사 또는 단백질 발현을 치료 분자에 의해 달성되는 생물학적 반응의 50%만큼 감소시키는 치료 분자의 농도이다. 기능적 검정에서, EC50은 생물학적 반응, 예를 들어 mRNA의 전사 또는 단백질 발현의 50%를 생성하는 치료 분자의 농도이다. IC50 또는 EC50은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수의 수단에 의해 계산될 수 있다.
본원에 사용된 용어, 예를 들어 ANGPTL2 유전자 전사체 및/또는 ANGPTL2 단백질의 발현을 "억제하는"은 ASO가 세포 또는 조직에서 ANGPTL2 유전자 전사체 및/또는 ANGPTL2 단백질의 발현을 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "억제하는"은 ANGPTL2 유전자 전사체 또는 ANGPTL2 단백질의 완전한 억제 (100% 억제 또는 비-검출가능한 수준)를 지칭한다. 다른 실시양태에서, 용어 "억제하는"은 세포 또는 조직에서 ANGPTL2 유전자 전사체 및/또는 ANGPTL2 단백질 발현의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 억제를 지칭한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 곰 등을 포함한, 인간, 가축, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 동물원 동물을 포함한다.
용어 "제약 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 조성물이 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ASO의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 실험적으로 및 상용 방식으로 결정될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하는 것" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키는 것"과 같은 용어는 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 저속화하고/거나, 그의 증상을 줄이고/거나, 그의 진행을 중단시키는 치료적 조치 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 방지하고/거나 저속화하는 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 것은 이미 장애를 갖는 것; 장애를 갖기 쉬운 것; 및 장애를 예방해야 하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자가, 예를 들어 질환 또는 장애와 연관된 증상의 전체적, 부분적, 또는 일시적 완화 또는 제거를 나타내는 경우에, 대상체는 본원에 제공된 방법에 따라 본원의 다른 곳에 개시된 질환 또는 상태에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다.
II. ANGPTL2를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드
본 개시내용은 포유동물 ANGPTL2를 코딩하는 핵산 분자, 예컨대 ANGPTL2 핵산, 예를 들어 ANGPTL2 프리-mRNA 및 ANGPTL2 mRNA를 포함한 ANGPTL2 전사체, 또는 포유동물 ANGPTL2를 코딩하는 이러한 핵산 분자의 자연 발생 변이체의 기능을 조정하는데 사용하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 사용한다. 본 개시내용의 문맥에서 용어 "ASO"는 2개 이상의 뉴클레오티드의 공유 연결에 의해 형성된 분자 (즉, 올리고뉴클레오티드)를 지칭한다.
ASO는 약 10 내지 약 30개, 예컨대 10-20, 14-20, 16-20, 또는 15-25개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO는 15-20개 뉴클레오티드 길이이다. 본원에 사용된 용어 "안티센스 ASO", "안티센스 올리고뉴클레오티드", 및 "올리고머"는 용어 "ASO"와 상호교환가능하다.
서열식별번호에 대한 언급은 특정한 핵염기 서열을 포함하지만, 임의의 설계 또는 전체 화학 구조는 포함하지 않는다. 또한, 본원의 도면에 개시된 ASO는 대표적인 설계를 보여주지만, 달리 나타내지 않는 한 도면에 제시된 구체적 설계로 제한되지 않는다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드 (단위)는 또한 단량체 또는 단위로 지칭될 수 있다. 본 명세서가 구체적 ASO 번호를 언급하는 경우, 언급은 서열, 구체적 ASO 설계, 및 화학 구조를 포함한다. 본 명세서가 구체적 DES 번호를 언급하는 경우, 언급은 서열 및 구체적 ASO 설계를 포함한다. 예를 들어, 청구항 (또는 본 명세서)이 서열식별번호: 5를 언급하는 경우, 이는 gagcctttacatgccg의 뉴클레오티드 서열만을 포함한다. 청구항 (또는 명세서)이 DES-0190을 언급하는 경우, 이는 GAgcctttacatgcCG의 ASO 설계를 갖는 gagcctttacatgccg의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 대안적으로, ASO-0190의 설계는 또한 서열식별번호: 5로서 기재될 수 있으며, 여기서 5' 단부로부터 각각의 제1 뉴클레오티드, 제2 뉴클레오티드, 제15 뉴클레오티드, 및 제16 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 LNA이고, 각각의 다른 뉴클레오티드는 비-변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)이다. ASO 번호는 서열 및 ASO 설계, 뿐만 아니라 ASO의 구체적 세부사항을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 출원에서 언급된 ASO-0190은 OxyGsOxyAsDNAgsDNAcsDNAcsDNAtsDNAtsDNAtsDNAasDNAcsDNAasDNAtsDNAgsDNAcsOxyMCsOxyG를 나타내고, 여기서 "s"는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
다양한 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 RNA (단위)를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, ASO는 1개 이상의 DNA 단위를 포함한다. 한 실시양태에서, 개시내용에 따른 ASO는 선형 분자이거나 또는 선형 분자로서 합성된다. 일부 실시양태에서, ASO는 단일 가닥 분자이며, 예를 들어 동일한 ASO 내의 동등한 영역에 상보적인 적어도 3, 4 또는 5개의 인접 뉴클레오티드의 짧은 영역 (즉, 듀플렉스)을 포함하지 않고 - 이와 관련하여, ASO는 (본질적으로) 이중 가닥이 아니다. 일부 실시양태에서, ASO는 본질적으로 이중 가닥이 아니다. 일부 실시양태에서, ASO는 siRNA가 아니다. 다양한 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 전적으로 인접 뉴클레오티드 영역으로 이루어질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 ASO는 실질적으로 자기-상보적이지 않다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 ASO의 단편을 포함한다. 예를 들어, 개시내용은 본원에 개시된 ASO의 적어도 1개의 뉴클레오티드, 적어도 2개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 3개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 4개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 5개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 6개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 7개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 8개의 인접 뉴클레오티드, 또는 적어도 9개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 개시된 서열 중 임의의 것의 단편은 개시내용의 일부로서 고려된다.
II.A. 표적
적합하게는, 개시내용의 ASO는 ANGPTL2 mRNA 또는 단백질의 발현을 하향-조절 (예를 들어, 감소 또는 제거)할 수 있다. 이와 관련하여, 개시내용의 ASO는 전형적으로 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포에서 ANGPTL2 mRNA 수준의 감소를 통해 ANGPTL2 단백질의 간접 억제에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 본 개시내용은 ANGPTL2 프리-mRNA의 1개 이상의 영역 (예를 들어, 인트론 영역, 엑손 영역, 및/또는 엑손-인트론 접합부 영역)을 표적화하는 ASO에 관한 것이다.
안지오포이에틴-관련 단백질 2 (ANGPTL2)는 또한 안지오포이에틴-유사 단백질 2, ARP2, HARP, ARAP1, 및 안지오포이에틴-유사 2로도 공지되어 있다. ANGPTL2 유전자에 대한 서열은 공중 이용가능한 진뱅크 수탁 번호 NC_000009.12 하에 찾아볼 수 있다. ANGPTL2 프리-mRNA 전사체에 대한 서열 (서열식별번호: 1)은 NC_000009.12의 잔기 127,087,349 내지 127,122,765의 역 상보체에 상응한다. ANGPTL2 단백질에 대한 서열은 공중 이용가능한 수탁 번호 NP_036230.1 (정규 서열), XP_006717093.1 및 Q9UKU9-2 하에 찾아볼 수 있다.
인간 ANGPTL2 유전자 생성물의 변이체는 공지되어 있다. 예를 들어, ANGPTL2 이소형 X1의 서열 (수탁 번호 XP_006717093.1; 서열식별번호: 194)은 하기와 같이 정규 서열 (서열식별번호: 3)과 상이하다: 274-274: P → L; 및 275-493: 누락. ANGPTL2 이소형 2의 서열 (수탁 번호 Q9UKU9-2; 서열식별번호: 195)은 하기와 같이 정규 서열 (서열식별번호: 3)과 상이하다: 1-302: 누락. 따라서, 본원에 개시된 ASO는 ANGPTL2 단백질의 천연 변이체의 발현을 감소시키거나 억제하도록 설계될 수 있다.
ASO의 표적 핵산 서열의 예는 ANGPTL2 프리-mRNA이다. 서열식별번호: 1은 인간 ANGPTL2 게놈 서열 (즉, 진뱅크 수탁 번호 NC_000009.12의 뉴클레오티드 127,087,349 내지 127,122,765의 역 상보체)을 나타낸다. 서열식별번호: 1은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 "t"가 프리-mRNA에서 "u"로 제시된 것을 제외하고는 ANGPTL2 프리-mRNA 서열과 동일하다. 특정 실시양태에서, "표적 핵산"은 ANGPTL2 단백질-코딩 핵산 또는 그의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 인트론을 포함한다. 다른 실시양태에서, 표적 핵산은 ANGPTL2 단백질-코딩 핵산 또는 그의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표적 핵산은 ANGPTL2 단백질-코딩 핵산 또는 그의 자연 발생 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어 프리-mRNA의 엑손-인트론 접합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용되는 경우에, "표적 핵산"은 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 cDNA 또는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. ANGPTL2 프리-mRNA에 의해 코딩된 ANGPTL2 단백질 서열은 서열식별번호: 3으로 제시된다. 도 1c 및 1d를 참조한다. 다른 실시양태에서, 표적 핵산은 ANGPTL2 단백질-코딩 핵산 또는 그의 자연 발생 변이체의 비번역 영역, 예를 들어, 5' UTR, 3' UTR, 또는 둘 다를 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 ANGPTL2 전사체, 예를 들어 서열식별번호: 1의 인트론 내의 영역에 혼성화한다. 특정 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 ANGPTL2 전사체, 예를 들어 서열식별번호: 1의 엑손 내의 영역에 혼성화한다. 다른 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 ANGPTL2 전사체, 예를 들어 서열식별번호: 1의 엑손-인트론 접합부 내의 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 ANGPTL2 전사체 (예를 들어, 인트론, 엑손, 또는 엑손-인트론 접합부), 예를 들어 서열식별번호: 1 내의 영역에 혼성화하고, 여기서 ASO는 본원의 다른 곳 (예를 들어, 섹션 II.G)에 기재된 바와 같은 형식: 5' A-B-C 3'에 따른 설계를 갖는다.
일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 단백질의 특정한 이소형을 코딩하는 mRNA를 표적화한다. 도 1d의 이소형을 참조한다. 일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 단백질의 모든 이소형을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 전사체, 예를 들어 서열식별번호: 1에 상응하는 영역 내의 핵산 서열에 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이)을 포함한다. 일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 전사체의 핵산 서열 또는 ANGPTL2 전사체의 서열 내의 영역 ("표적 영역")에 혼성화하는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 (i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1 - 211; (ii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 471 - 686; (iii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,069 - 1,376; (iv) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,666 - 8,673; (v) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 8,975 - 12,415; (vi) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,739 - 18,116; (vii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,422 - 29,875; 또는 (viii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,373 - 35,389에 상응하고, 여기서 임의로 ASO는 본원에 기재된 설계 중 하나 또는 본원의 다른 곳에 제시된 화학 구조 (예를 들어, 도 1)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 87 - 111에 상응한다. 다른 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 571 - 586에 상응한다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,169 - 1,276에 상응한다. 추가 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,766 - 8,573에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 9,075 - 12,315에 상응한다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,839 - 18,016에 상응한다. 추가 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,522 - 29,775에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,473 - 35,289에 상응한다.
일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 87 - 111의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 다른 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 571 - 586의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,169 - 1,276의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,766 - 8,573의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 9,075 - 12,315의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 추가 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,839 - 18,016의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,522 - 29,775의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,473 - 35,289의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다.
일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,103 - 20,282에 상응한다. 다른 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,103-20,282의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드에 상응한다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,202-20,221에 상응한다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,202-20,221의 3' 단부 및/또는 5' 단부에서의 ± 1, ± 5, ± 10, ± 15, ± 20, 또는 ± 25개 뉴클레오티드에 상응한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 ANGPTL2 전사체(예를 들어, 프리-mRNA, 서열식별번호: 1) 내의 다중 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 전사체 내의 2개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 ANGPTL2 전사체 내의 3개의 상이한 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, ANGPTL2 전사체 (예를 들어, 프리-mRNA, 서열식별번호: 1) 내의 다중 영역에 혼성화하는 ASO는 ANGPTL2 전사체 (예를 들어, 프리-mRNA, 서열식별번호: 1) 내의 단일 영역에 혼성화하는 ASO와 비교하여 ANGPTL2 발현을 감소시키는데 있어서 보다 강력하다 (예를 들어, 보다 낮은 EC50을 가짐).
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 생리학적 조건, 즉 생체내 조건 하에 표적 핵산 (예를 들어, ANGPTL2 전사체)에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 시험관내에서 표적 핵산 (예를 들어, ANGPTL2 전사체)에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 시험관내에서 엄격한 조건 하에 표적 핵산 (예를 들어, ANGPTL2 전사체)에 혼성화할 수 있다. 시험관내 혼성화에 대한 엄격도 조건은 특히 생산적 세포 흡수, RNA 접근성, 온도, 회합의 자유 에너지, 염 농도, 및 시간에 좌우된다 (예를 들어, 문헌 [Stanley T Crooke, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Edition, CRC Press (2007)] 참조). 일반적으로, 실질적으로 유사한 핵산 사이의 혼성화는 가능하게 하지만 상이한 핵산 사이의 혼성화는 가능하게 하지 않기 위해 높은 내지 중간 정도의 엄격도 조건이 시험관내 혼성화에 사용된다. 엄격한 혼성화 조건의 예는 40℃에서 1시간 동안 5X 염수-시트르산나트륨 (SSC) 완충제 (0.75 M 염화나트륨/0.075 M 시트르산나트륨) 중에서의 혼성화에 이어, 샘플을 40℃에서 1X SSC 중에서 10회 및 실온에서 1X SSC 완충제 중에서 5회 세척하는 것을 포함한다. 생체내 혼성화 조건은 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 서열의 혼성화를 지배하는 세포내 조건 (예를 들어, 생리학적 pH 및 세포내 이온 조건)으로 이루어진다. 생체내 조건은 시험관내에서 비교적 낮은 엄격도 조건에 의해 모방될 수 있다. 예를 들어, 혼성화는 시험관내에서 37℃에서 2X SSC (0.3 M 염화나트륨/0.03 M 시트르산나트륨), 0.1% SDS 중에서 수행될 수 있다. 4X SSC, 0.1% SDS를 함유하는 세척 용액은 37℃에서 사용될 수 있고, 최종 세척은 45℃에서 1X SSC 중에서 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 1종 이상의 종 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 및 곰)으로부터의 ANGPTL2 전사체를 하향조절할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO는 인간 및 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) ANGPTL2 전사체 둘 다를 하향조절할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, ASO는 인간 및 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 둘 다에서 ANGPTL2 mRNA 또는 ANGPTL2 단백질의 발현을 하향조절 (예를 들어, 감소 또는 제거)할 수 있다.
마우스 ANGPTL2 전사체의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 마우스 ANGPTL2 유전자에 대한 서열은 공중 이용가능한 진뱅크 수탁 번호 NC_000068.7 하에 찾아볼 수 있다. 마우스 ANGPTL2 프리-mRNA 전사체에 대한 서열은 NC_000068.7의 잔기 33,215,951-33,247,725에 상응한다. 마우스 ANGPTL2 mRNA 전사체에 대한 서열은 수탁 번호: NM_011923.4 (서열식별번호: 196), XM_006498051.1 (서열식별번호: 197), BC138610.1 (서열식별번호: 198), 및 BC138609.1 (서열식별번호: 199)로 공지되어 있고 이용가능하다. 마우스 ANGPTL2 단백질의 서열은 공중 이용가능한 수탁 번호: NP_036053.2 (서열식별번호: 200), Q9R045.2 (서열식별번호: 201), EDL08598.1 (서열식별번호: 202), EDL08597.1 (서열식별번호: 203), AAI38611.1 (서열식별번호: 204), AAI38610.1 (서열식별번호: 205), 및 XP_006498114.1 (서열식별번호: 206) 하에 찾아볼 수 있다.
래트 ANGPTL2 전사체의 서열도 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 래트 ANGPTL2 유전자는 공중 이용가능한 진뱅크 수탁 번호 NC_005102.4 하에 찾아볼 수 있다. 래트 ANGPTL2 프리-mRNA 전사체에 대한 서열은 NC_005102.4의 잔기 12,262,822-12,292,665에 상응한다. 래트 ANGPTL2 mRNA 전사체에 대한 서열은 수탁 번호: NM_133569.1 (서열식별번호: 207)로 공지되어 있고 이용가능하다. 래트 ANGPTL2 단백질의 서열은 공중 이용가능한 수탁 번호: NP_598253.1 (서열식별번호 208) 및 EDL93193.1 (서열식별번호 209) 하에 찾아볼 수 있다.
II.B. ASO 서열
개시내용의 ASO는 ANGPTL2 전사체, 예를 들어 서열식별번호: 1에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 영역의 상보체에 상응하는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 개시내용은 10-30개, 예컨대 10-15개 뉴클레오티드, 10-20개 뉴클레오티드, 또는 10-25개 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 15-20개 뉴클레오티드 길이)의 ASO를 제공하며, 여기서 인접 뉴클레오티드 서열은 ANGPTL2 전사체, 예컨대 서열식별번호: 1 또는 그의 자연 발생 변이체의 상보체 내의 영역에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 따라서, 예를 들어, ASO는 서열식별번호: 1의 서열 또는 그의 부분을 갖는 단일 가닥 핵산 분자에 혼성화한다.
ASO는 포유동물 ANGPTL2 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 1)을 코딩하는 핵산의 등가 영역에 완전히 상보적인 (완벽하게 상보적인) 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. ASO는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 X-Y에 상응하는 핵산 서열, 또는 서열 내의 영역에 완전히 상보적인 (완벽하게 상보적인) 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 X 및 Y는 각각 도 2에 제시된 바와 같은 시작 부위 및 종료 부위이다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 4 내지 193 (즉, 도 2의 서열)으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 적어도 약 99% 서열 동일성, 예컨대 약 100% 서열 동일성 (상동성)을 갖는다. 일부 실시양태에서, ASO는 본원의 다른 곳에 기재된 설계 또는 본원의 다른 곳에 제시된 화학 구조 (예를 들어, 도 2)를 갖는다.
일부 실시양태에서, ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 서열식별번호: 4 내지 193 또는 그의 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개로부터 선택되거나, 또는 그를 포함하며, 여기서 ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 상응하는 ANGPTL2 전사체와 비교할 경우 임의로 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 서열식별번호: 4 내지 193 또는 그의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개로부터 선택되거나, 또는 그를 포함하며, 여기서 ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 상응하는 ANGPTL2 전사체와 비교할 경우 임의로 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 서열식별번호: 4 내지 193 또는 그의 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개로부터 선택되거나, 또는 그를 포함하며, 여기서 ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 상응하는 ANGPTL2 전사체와 비교할 경우 임의로 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 서열식별번호: 4 내지 193 또는 그의 적어도 15 또는 16개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개로부터 선택되거나, 또는 그를 포함하며, 여기서 ASO (또는 그의 인접 뉴클레오티드 부분)는 상응하는 ANGPTL2 전사체와 비교할 경우 임의로 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO는 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 38, SEQ NO: 46, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 93, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 97, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 146, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ASO는 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 표적 핵산 서열 (예를 들어, ANGPTL2 전사체)에 결합하고, ANGPTL 전사체의 발현을 세포에서의 정상 (즉, 대조군) 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20%, 예를 들어 정상 발현 수준 (예를 들어, ASO에 노출되지 않은 세포에서의 발현 수준)과 비교하여 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%만큼 억제하거나 또는 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 ASO와 접촉하지 않은 (예를 들어, 염수와 접촉한) SK-N-AS 세포와 비교하여, 세포가 25 μM의 ASO와 접촉한 경우 SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 mRNA의 발현을 시험관내에서 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 ASO와 접촉하지 않은 (예를 들어, 염수와 접촉한) SK-N-AS 세포와 비교하여, 세포가 5 μM의 ASO와 접촉한 경우 SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 mRNA의 발현을 시험관내에서 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 (i) SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2를 코딩하는 mRNA 수준을 감소시키는 것; (ii) SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2의 단백질 수준을 감소시키는 것; (iii) 심혈관 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 감소, 호전, 또는 치료하는 것, 및 (iv) 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, ASO 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화하는 경우 1 또는 2개의 미스매치를 견딜 수 있고, 목적하는 효과, 즉 표적 mRNA 및/또는 단백질의 하향-조절을 보여주기에 여전히 충분하게 표적에 결합할 수 있다. 미스매치는 예를 들어 ASO 뉴클레오티드 서열의 증가된 길이 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 증가된 수에 의해 보상될 수 있으며, 이는 본원의 다른 곳에 개시된다.
일부 실시양태에서, ASO 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화하는 경우 1개 이하의 미스매치를 포함한다. 다른 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화하는 경우 1개 이하의 미스매치를 포함하고, 유리하게는 미스매치를 포함하지 않는다.
II.C. ASO 길이
ASO는 총 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 인접 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 범위가 ASO 또는 인접 뉴클레오티드 서열 길이에 대해 주어지는 경우에, 범위는 범위로 제공된 하한 및 상한 길이를 포함하며, 예를 들어 10-30 (또는 그 사이)은 10 및 30 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, ASO는 총 약 15-20, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
II.D. 뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체
개시내용의 한 측면에서, ASO는 1개 이상의 비-자연 발생 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 "뉴클레오시드 유사체"는 당 및/또는 염기 모이어티에서의 변형에 의한 천연 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 변이체이다. 유사체는 원칙적으로 올리고뉴클레오티드의 문맥에서 천연 뉴클레오시드에 대해 단지 "침묵" 또는 "등가"일 수 있고, 즉 올리고뉴클레오티드가 표적 유전자 발현을 억제하도록 작용하는 방식에 대해 어떠한 기능적 효과도 갖지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이러한 "등가" 유사체는, 예를 들어 제조하기가 보다 용이하거나 저렴하거나, 또는 저장 또는 제조 조건에 보다 안정하거나, 또는 태그 또는 표지를 나타내는 경우에 유용할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 유사체는, 예를 들어 표적에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 세포내 뉴클레아제에 대한 증가된 저항성 및/또는 세포 내로의 증가된 수송 용이성을 생성함으로써 ASO가 발현을 억제하도록 작용하는 방식에 대해 기능적 효과를 가질 것이다. 뉴클레오시드 유사체의 구체적 예는 예를 들어 문헌 [Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213] 및 반응식 1에 기재되어 있다.
II.D.1. 핵염기
용어 핵염기는 핵산 혼성화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 (예를 들어, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들어, 우라실, 티민 및 시토신) 모이어티를 포함한다. 본 개시내용의 문맥에서, 용어 핵염기는 또한 자연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 기능적인 변형된 핵염기를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 모이어티는 핵염기를 변형시키거나 또는 대체함으로써 변형된다. 이러한 문맥에서, "핵염기"는 자연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 크산틴 및 하이포크산틴, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변이체 둘 다를 지칭한다. 이러한 변이체는 예를 들어 문헌 [Hirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 핵염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘을 변형된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-메틸-시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-브로모우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'티오-티민, 이노신, 디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로부터 선택된 핵염기로 변화시킴으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C, 또는 U에 의해 나타내어질 수 있으며, 여기서 각각의 문자는 임의로 등가 기능의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C, 및 5-메틸-시토신으로부터 선택된다. 임의로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸-시토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
II.D.2. 당 변형
개시내용의 ASO는 변형된 당 모이어티, 즉 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교하여 당 모이어티의 변형을 갖는 1개 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 주로 올리고뉴클레오티드의 특정 특성, 예컨대 친화도 및/또는 뉴클레아제 저항성을 개선시키기 위한 목적으로, 리보스 당 모이어티의 변형을 갖는 다수의 뉴클레오시드가 제조되었다.
이러한 변형은 리보스 고리 구조가, 예를 들어 헥소스 고리 (HNA), 또는 전형적으로 리보스 고리 (LNA) 상의 C2'와 C4' 탄소 사이에 비라디칼 가교를 갖는 비시클릭 고리, 또는 전형적으로 C2'와 C3' 탄소 사이에 결합이 결여된 비연결된 리보스 고리 (예를 들어, UNA)로의 대체에 의해 변형된 것을 포함한다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 비시클로헥소스 핵산 (WO2011/017521) 또는 트리시클릭 핵산 (WO2013/154798)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한, 예를 들어 펩티드 핵산 (PNA) 또는 모르폴리노 핵산의 경우에, 당 모이어티가 비-당 모이어티로 대체된 뉴클레오시드를 포함한다.
당 변형은 또한 리보스 고리 상의 치환기를 수소 또는 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 기 이외의 기로 변경시키는 것을 통해 이루어진 변형을 포함한다. 치환기는, 예를 들어 2', 3', 4', 또는 5' 위치에 도입될 수 있다. 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 또한 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드를 개발하는데 많은 집중이 이루어져 왔고, 수많은 2' 치환된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되는 경우에 유익한 특성, 예컨대 증진된 뉴클레오시드 저항성 및 증진된 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
II.D.2.a 2' 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖거나 (2' 치환된 뉴클레오시드) 또는 2' 연결된 비라디칼을 포함하는 뉴클레오시드이고, 2' 치환된 뉴클레오시드 및 LNA (2' - 4' 비라디칼 가교된) 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 올리고뉴클레오티드에 대해 증진된 결합 친화도 (예를 들어, 친화도 증진 2' 당 변형된 뉴클레오시드) 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 및 2'-플루오로-ANA 뉴클레오시드이다. 추가의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213; 및 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937]을 참조한다. 하기는 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예시이다.
II.D.2.b 잠금 핵산 뉴클레오시드 (LNA).
"LNA 뉴클레오시드"는 리보스 고리의 입체형태를 제한하거나 잠그는, 상기 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4'를 연결하는 비라디칼 (또한 "2'- 4' 가교"로도 지칭됨)을 포함하는 2'-변형된 뉴클레오시드이다. 이들 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 비시클릭 핵산 (BNA)으로 명명된다. 리보스의 입체형태의 잠금은 LNA가 상보적 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되는 경우에 혼성화의 증진된 친화도 (듀플렉스 안정화)와 연관된다. 이는 올리고뉴클레오티드/상보체 듀플렉스의 용융 온도를 측정함으로써 상용적으로 결정될 수 있다.
비제한적 예시적인 LNA 뉴클레오시드는 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 , WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, 문헌 [Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, and Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238, 및 Wan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667]에 개시되어 있다.
추가의 비제한적, 예시적인 LNA 뉴클레오시드가 반응식 1에 개시된다.
반응식 1:
일부 실시양태에서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA, 예컨대 (S)-6'-메틸-베타-D-옥시-LNA (ScET), 또는) 및 ENA이다. 특정 실시양태에서, LNA는 베타-D-옥시-LNA이다.
II.E. 뉴클레아제 매개된 분해
뉴클레아제 매개된 분해는 상보적 뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성하는 경우 이러한 서열의 분해를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 매개된 분해를 통해 기능할 수 있으며, 여기서 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특히 및 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 엔도리보뉴클레아제 (RNase), 예컨대 RNase H, 예컨대 RNaseH1을 동원할 수 있다. 뉴클레아제 매개된 메카니즘을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드 설계의 예는 전형적으로 적어도 5 또는 6개의 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고, 친화도 증진 뉴클레오시드, 예를 들어 갭머, 헤드머 및 테일머와 한 측면 또는 둘 다의 측면에서 플랭킹된 올리고뉴클레오티드이다.
II.F. RNase H 활성 및 동원
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보적 RNA 분자와 듀플렉스로 존재하는 경우에 RNase H를 동원하고 상보적 RNA 분자의 분해를 유도하는 그의 능력을 지칭한다. WO01/23613은 RNaseH를 동원하는 능력을 결정하는데 사용될 수 있는, RNaseH 활성을 결정하는 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 그것이 상보적 표적 핵산 서열과 함께 제공된 경우, 시험되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖되 오직 DNA 단량체만을 함유하고, 올리고뉴클레오티드의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, WO01/23613의 실시예 91 - 95에 제공된 방법론을 사용하여 결정된 초기 속도의 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 20% 초과의 pmol/l/분으로 측정된 바와 같은 초기 속도를 갖는다면, RNase H를 동원할 수 있는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 재조합 인간 RNaseH1은, 상보적 RNA 분자와 듀플렉스로 존재하는 경우에 RNaseH를 동원하고 상보적 RNA 분자의 분해를 유도하는 올리고뉴클레오티드의 능력을 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 그것이 상보적 표적 핵산 서열과 함께 제공된 경우 pmol/l/분으로 측정된 바와 같은 RNaseH 초기 속도가, 시험되는 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖되 오직 DNA 단량체만을 함유하고, 2' 치환은 갖지 않고, 올리고뉴클레오티드의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, WO01/23613의 실시예 91 - 95에 제공된 방법론을 사용한 경우에 결정된 초기 속도의 20% 미만, 예컨대 10% 미만, 예컨대 5% 미만이라면, 본질적으로 RNaseH를 동원할 수 없는 것으로 간주된다.
II.G. ASO 설계
개시내용의 ASO는 뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체 둘 다를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 갭머, 블록머, 믹스머, 헤드머, 테일머, 또는 토탈머의 형태로 존재할 수 있다. 개시내용의 ASO와 함께 사용될 수 있는 갭머, 블록머, 믹스머, 헤드머, 테일머, 또는 토탈머의 배위의 예는 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0322851에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "갭머"는 1개 이상의 친화도 증진 변형된 뉴클레오시드 (플랭크)에 5' 및 3'에서 플랭킹된 RNase H 동원 올리고뉴클레오티드 (갭)의 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "헤드머" 및 "테일머"는 플랭크 중 1개가 누락된, RNase H를 동원할 수 있는 올리고뉴클레오티드이며, 즉 올리고뉴클레오티드의 단부 중 오직 1개만이 친화도 증진 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 헤드머의 경우에는 3' 플랭크가 누락되고 (즉, 5' 플랭크가 친화도 증진 변형된 뉴클레오시드를 포함함), 테일머의 경우에는 5' 플랭크가 누락된다 (즉, 3' 플랭크가 친화도 증진 변형된 뉴클레오시드를 포함함). 용어 "LNA 갭머"는 친화도 증진 변형된 뉴클레오시드 중 적어도 1개가 LNA 뉴클레오시드인 갭머 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "혼합된 윙 갭머"는 플랭크 영역이 적어도 1개의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 1개의 DNA 뉴클레오시드 또는 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 1개의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 예를 들어, 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 및 2'-플루오로-ANA 뉴클레오시드(들)를 포함하는 LNA 갭머를 지칭한다.
"믹스머"로 불리는 다른 "키메라" ASO는 (i) RNase에 의해 인식가능하고 절단가능한 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체, 및 (ii) 비-RNase 동원 뉴클레오시드 유사체 단량체의 교대 조성물로 이루어진다.
"토탈머"는 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체만을 포함하는 단일 가닥 ASO이다.
일부 실시양태에서, 표적 영역에 대한 ASO의 친화도를 증진시키는 것에 더하여, 일부 뉴클레오시드 유사체는 또한 RNase (예를 들어, RNaseH) 결합 및 절단을 매개한다. α-L-LNA 단량체가 RNaseH 활성을 특정 정도로 동원하기 때문에, 일부 실시양태에서, α-L-LNA 단량체를 함유하는 ASO의 갭 영역 (예를 들어, 본원에 언급된 바와 같은 영역 B)은 RNaseH에 의해 인식가능하고 절단가능한 보다 작은 단량체로 이루어지고, 믹스머 구축에서 보다 큰 가요성이 도입된다.
II.G.1. 갭머 설계
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 갭머이고, 본원에서 영역 B (B)로 지칭되는 RNase, 예컨대 RNaseH를 동원할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치 (예를 들어, 1개 이상의 DNA)를 포함하며, 여기서 영역 B는 영역 B의 뉴클레오티드의 인접 스트레치에 대해 5' 및 3'인 뉴클레오시드 유사체의 영역 - 이들 영역은 각각 영역 A (A) 및 C (C)로 지칭됨 - 과 5' 및 3' 둘 다에서 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체는 당 변형된 뉴클레오시드 (예를 들어, 고친화도 당 변형된 뉴클레오시드)이다. 특정 실시양태에서, 영역 A 및 C의 당 변형된 뉴클레오시드는 표적 핵산에 대한 ASO의 친화도를 증진시킨다 (즉, 친화도 증진 2' 당 변형된 뉴클레오시드). 일부 실시양태에서, 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 고친화도 2' 당 변형, 예컨대 LNA 또는 2'-MOE이다.
갭머에서, 영역 B의 가장 5' 및 3' 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드이고, 이는 각각 영역 A 및 C의 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 고친화도 당 변형된 뉴클레오시드)에 인접하여 위치한다. 일부 실시양태에서, 영역 A 및 C는 영역 B로부터 가장 먼 단부에 (즉, 영역 A의 5' 단부 및 영역 C의 3' 단부에) 뉴클레오시드 유사체를 가지는 것으로 추가로 정의될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 형식 (5'에서 3') A-B-C의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서: (A) (5' 영역 또는 제1 윙 서열)는 적어도 1개의 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 1-5개의 LNA 단위)를 포함하고; (B)는 (상보적 RNA 분자, 예컨대 프리-mRNA 또는 mRNA 표적과 듀플렉스로 형성되는 경우에) RNase를 동원할 수 있는 적어도 4개의 연속 뉴클레오시드 (예를 들어, 4-28개의 DNA 단위)를 포함하고; (C) (3' 영역 또는 제2 윙 서열)는 적어도 1개의 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 1-5개의 LNA 단위)를 포함한다.
II.H. 뉴클레오티드간 연결
본원에 기재된 ASO의 단량체는 연결 기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게는, 각각의 단량체는 연결 기를 통해 3' 인접 단량체에 연결된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본 개시내용의 문맥에서, ASO의 단부의 5' 단량체는 5' 연결 기를 포함하지 않지만, 이는 5' 말단 기를 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 없다는 것을 이해할 것이다.
용어 "연결 기" 또는 "뉴클레오시드간 연결"은 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유 커플링시킬 수 있는 기를 의미하는 것으로 의도된다. 구체적이고 바람직한 예는 포스페이트 기 및 포스포로티오에이트 기를 포함한다.
개시내용의 ASO의 뉴클레오시드 또는 그의 인접 뉴클레오시드 서열은 연결 기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게는 각각의 뉴클레오시드는 연결 기를 통해 3' 인접 뉴클레오시드에 연결된다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드간 연결의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 변형된다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
II.I. 접합체
본원에 사용된 용어 접합체는 비-뉴클레오티드 모이어티 (접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유 연결된 ASO를 지칭한다.
개시내용의 ASO의 1개 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티에 대한 접합은, 예를 들어 ASO의 활성, 세포 분포, 세포 흡수, 또는 안정성에 영향을 미침으로써 ASO의 약리학을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티는 ASO의 세포 분포, 생체이용률, 대사, 배출, 투과성, 및/또는 세포 흡수를 개선시킴으로써 ASO의 약동학적 특성을 변형시키거나 증진시킨다. 특정 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티는 ASO를 특정 기관, 조직, 또는 세포 유형으로 표적화함으로써, 그러한 기관, 조직, 또는 세포 유형에서 ASO의 유효성을 증진시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티는 비-표적 세포 유형, 조직, 또는 기관에서의 ASO의 활성, 예를 들어 오프 타겟 활성 또는 비-표적 세포 유형, 조직, 또는 기관에서의 활성을 감소시킨다. WO 93/07883 및 WO2013/033230은 적합한 접합 모이어티를 제공한다. 추가의 적합한 접합 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPr)에 결합할 수 있는 것이다. 특히, 3가 N-아세틸갈락토사민 접합 모이어티가 ASGPr에의 결합에 적합하며, 예를 들어, WO 2014/076196, WO 2014/207232, 및 WO 2014/179620을 참조한다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티 (접합 모이어티)는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친지성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소 (예를 들어 박테리아 독소), 비타민, 바이러스 단백질 (예를 들어 캡시드), 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
II.J. 활성화된 ASO
본원에 사용된 용어 "활성화된 ASO"는 1개 이상의 접합된 모이어티, 즉 그 자체가 핵산 또는 단량체가 아닌 모이어티에 대한 ASO의 공유 연결을 허용하는 적어도 1개의 관능성 모이어티에 공유 연결되어 (즉, 관능화되어), 본원에 기재된 접합체를 형성하는 ASO를 지칭한다. 전형적으로, 관능성 모이어티는, 예를 들어 아데닌 염기의 3'-히드록실 기 또는 엑소시클릭 NH2 기, 친수성일 수 있는 스페이서 및 접합된 모이어티에 결합할 수 있는 말단 기 (예를 들어, 아미노, 술프히드릴 또는 히드록실 기)를 통해 ASO에 공유 결합할 수 있는 화학적 기를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 말단 기는 보호되지 않고, 예를 들어 NH2 기이다. 다른 실시양태에서, 말단 기는, 예를 들어 임의의 적합한 보호기, 예컨대 문헌 ["Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)]에 기재된 것에 의해 보호된다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 접합된 모이어티가 ASO의 5' 단부에 공유 부착하는 것을 가능하게 하기 위해 5' 단부에서 관능화된다. 다른 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 3' 단부에서 관능화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 백본을 따라 또는 헤테로시클릭 염기 모이어티 상에서 관능화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시내용의 ASO는 5' 단부, 3' 단부, 백본 및 염기로부터 독립적으로 선택된 1개 초과의 위치에서 관능화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 활성화된 ASO는 합성 동안 관능성 모이어티에 공유 부착된 1개 이상의 단량체를 혼입시킴으로써 합성된다. 다른 실시양태에서, 개시내용의 활성화된 ASO는 관능화되지 않은 단량체로 합성되고, ASO는 합성이 완료되면 관능화된다.
III. 제약 조성물 및 투여 경로
개시내용의 ASO는 제약 제제 및 조성물에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은 제약상 허용되는 희석제, 담체, 염, 또는 아주반트를 포함한다. 제약상 허용되는 희석제는 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 포함하고, 제약상 허용되는 염은 나트륨 및 칼륨 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 희석제는 멸균 포스페이트 완충 염수이다. 따라서, 제약 조성물은 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 또는 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 희석제 (대안적으로 제약상 허용되는 용매로 지칭됨), 예컨대 포스페이트 완충 염수를 포함하는 제약 용액의 형태로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO는 염, 예컨대 제약상 허용되는 염, 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염, 또는 암모늄 염의 형태이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO 또는 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염은 고체 형태, 예를 들어 분말 (예를 들어, 동결건조된 분말) 또는 데시케이트의 형태이다.
개시내용의 ASO는 단위 제제 중에, 예컨대 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중에 환자에게 치료 유효량을 전달하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료를 목적으로 하는지 및 치료될 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여, 예컨대 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입이 사용될 수 있고; 일부 실시양태에서, ASO는 볼루스 주사로서 심장내로 또는 심실내로 투여된다. 일부 실시양태에서, ASO는 피하로 투여된다.
단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있는 본 개시내용의 제약 제제는 제약 산업에 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분을 제약 담체(들) 또는 부형제(들)와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하고 친밀하게 회합시킨 다음, 필요한 경우에 생성물을 성형함으로써 제조된다.
제약 제제는 멸균 희석제, 완충제, 장성 조절제 및 항박테리아제를 포함할 수 있다. 활성 ASO는 제어 방출 특성을 갖는 이식물 또는 마이크로캡슐을 비롯한, 신체로부터의 분해 또는 즉각적인 제거에 대해 보호하는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 비경구 또는 비경구, 심장내 또는 심실내로의 투여를 위해, 담체는 생리 염수 또는 포스페이트 완충 염수일 수 있다. 2007년 3월 22일에 공개된 국제 공개 번호 WO2007/031091 (A2)은 적합한 제약상 허용되는 희석제, 담체 및 아주반트를 추가로 제공한다.
IV. 진단
본 개시내용은 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 진단 동안 유용한 진단 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환 또는 장애는 심혈관 질환, 비만, 대사 질환, 제2형 당뇨병, 암, 및 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO에 의해 진단될 수 있는 질환 또는 장애는 심혈관 질환이다. 심혈관 질환의 비제한적 예는 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 졸중, 심부전, 고혈압성 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 심장 판막 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 혈전색전성 질환, 및 정맥 혈전증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 심부전은 좌측 심부전, 우측 심부전, 울혈성 심부전, 감소된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFrEF), 보존된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFpEF), 중간-범위 박출 계수를 갖는 심부전 (HFmrEF), 비대성 심근병증 (HCM), 고혈압성 심장 질환 (HHD), 또는 고혈압성 비대성 심근병증을 포함한다.
개시내용의 ASO는 개체로부터의 조직 또는 체액에서 ANGPTL2 전사체의 발현을 측정하고, 측정된 발현 수준을 정상 조직 또는 체액에서의 표준 ANGPTL2 전사체 발현 수준과 비교하는데 사용될 수 있으며, 표준과 비교하여 발현 수준의 증가는 개시내용의 ASO에 의해 치료가능한 장애를 나타낸다.
개시내용의 ASO는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 ANGPTL2 전사체 수준을 검정하는데 사용될 수 있다. (Touboul et al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe et al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91).
용어 "생물학적 샘플"은 ANGPTL2 전사체를 잠재적으로 발현하는 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 세포의 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 포유동물로부터 이러한 생물학적 샘플을 수득하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
V. ASO를 포함하는 키트
본 개시내용은 본원에 기재된 ASO를 포함하고 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 키트를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 1개 이상의 용기에 적어도 1개의 ASO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 검출 검정을 수행하는데 필요하고/거나 충분한 모든 성분, 예컨대 모든 대조군, 검정의 수행에 대한 지침서, 및 분석 및 결과 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 함유한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 개시된 ASO가 관련 기술분야에 널리 공지된 확립된 키트 포맷 중 1종에 용이하게 혼입될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
VI. 사용 방법
개시내용의 ASO는, 예를 들어 진단, 치료, 및 예방을 위한 연구 시약으로서 이용될 수 있다.
연구에서, 이러한 ASO는 세포 및 실험 동물에서 ANGPTL2 단백질의 합성을 특이적으로 억제하는데 사용될 수 있으며 (전형적으로 mRNA를 분해 또는 억제함으로써 단백질 형성을 방지하는 것에 의함), 그에 의해 표적의 기능적 분석 또는 치료적 개입을 위한 표적으로서의 그의 유용성의 평가를 용이하게 할 수 있다. 추가로, 세포 또는 조직을 시험관내 또는 생체내에서 유효량의 개시내용의 ASO, 접합체 또는 조성물 중 1종 이상과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 또는 조직에서 ANGPTL2 mRNA 및/또는 ANGPTL2 단백질의 발현을 하향-조절하는 방법이 제공된다.
진단에서, ASO는 노던 블롯팅, 계내 혼성화, 또는 유사한 기술에 의해 세포 및 조직에서 ANGPTL2 전사체 발현을 검출하고 정량화하는데 사용될 수 있다.
치료의 경우, ANGPTL2 전사체 및/또는 ANGPTL2 단백질의 발현을 조정함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 동물 또는 인간은 본 개시내용에 따라 ASO를 투여하는 것에 의해 치료된다. 추가로, 치료 또는 예방 유효량의 개시내용의 ASO 또는 조성물 중 1종 이상을 투여함으로써 ANGPTL2 전사체 및/또는 ANGPTL2 단백질의 증가된 발현과 연관된 질환 또는 상태를 갖는 것으로 의심되거나 그에 걸리기 쉬운 것으로 의심되는 포유동물을 치료하는, 예컨대 인간을 치료하는 방법이 제공된다. 개시내용에 따른 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 개시내용의 ASO 또는 접합체는 요법에 사용된다.
개시내용은 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 1종 이상의 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 ASO를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환 또는 장애는 심혈관 질환, 비만, 대사 질환, 제2형 당뇨병, 암, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 심혈관 질환이다. 심혈관 질환의 비제한적 예는 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 졸중, 심부전, 고혈압성 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 심장 판막 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 혈전색전성 질환, 및 정맥 혈전증을 포함한다.
특정 실시양태에서, 질환, 장애, 또는 상태는 ANGPTL2 유전자 전사체 및/또는 ANGPTL2 단백질의 과다발현과 연관된다.
개시내용은 또한 세포 또는 조직을 시험관내 또는 생체내에서 유효량의 개시내용의 1종 이상의 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물과 접촉시켜 ANGPTL2 유전자 전사체의 발현의 분해에 영향을 미침으로써 ANGPTL2 단백질을 감소시키는 것을 포함하는, 세포 또는 조직에서 ANGPTL2 유전자 전사체 및/또는 ANGPTL2 단백질의 발현을 억제하는 (예를 들어, 감소시키는 것에 의함) 방법을 제공한다.
개시내용은 또한 본원에 언급된 바와 같은 장애의 치료를 위한 또는 본원에 언급된 바와 같은 장애의 치료 방법을 위한 의약의 제조를 위한, 기재된 바와 같은 개시내용의 ASO 또는 접합체의 용도를 제공한다.
개시내용은 추가로, 개시내용에 따른 ASO 또는 접합체를 세포에 투여하여 세포에서 ANGPTL2 단백질의 억제 또는 감소에 영향을 미치는 것을 포함하는, ANGPTL2를 발현하고 있는 세포에서 ANGPTL2 단백질을 억제 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
개시내용은 개시내용에 따른 ASO 또는 접합체를 투여하는 것을 포함하는, (예를 들어, 심근세포에서 발견되는 것과 같은) 운동 뉴런의 과다흥분성의 감소, 호전, 예방, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 운동 뉴런의 과다흥분성을 감소, 호전, 예방, 또는 치료하는 방법을 포함한다.
개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 개시내용에 따른 ASO 또는 접합체 및/또는 개시내용에 따른 제약 조성물을 본원에 언급된 바와 같은 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에 언급된 바와 같은 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
개시내용에 따른 ASO 및 다른 조성물은 ANGPTL2 단백질의 과다발현과 연관된 상태의 치료에 사용될 수 있다.
일반적으로 말하면, 개시내용의 한 측면은 ANGPTL2의 비정상적 수준과 연관된 상태를 앓고 있거나 또는 이에 걸리기 쉬운 포유동물에게 1개 이상의 LNA 단위를 포함하는 ANGPTL2 전사체에 대해 표적화된 ASO의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, ANGPTL2의 비정상적 수준과 연관된 상태를 앓고 있거나 또는 이에 걸리기 쉬운 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 개시내용에 따른 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다.
개시내용의 흥미로운 측면은 본원에 언급된 바와 같은 질환, 장애 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 ASO (화합물) 또는 본원에 정의된 바와 같은 접합체의 용도에 관한 것이다.
개시내용의 방법은 ANGPTL2 단백질의 비정상적 수준 및/또는 활성에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, ANGPTL2 단백질의 비정상적 수준 및/또는 활성에 의해 유발되는 질환은 심혈관 질환, 비만, 대사 질환, 제2형 당뇨병, 암, 및 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환은 심혈관 질환이다. 본원에 사용된 심혈관 질환은 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 졸중, 심부전, 고혈압성 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 심장 판막 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 혈전색전성 질환, 및 정맥 혈전증을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 심혈관 질환은 심부전으로, 이는 좌측 심부전, 우측 심부전, 울혈성 심부전, 감소된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFrEF), 보존된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFpEF), 중간-범위 박출 계수를 갖는 심부전 (HFmrEF), 비대성 심근병증 (HCM), 고혈압성 심장 질환 (HHD), 또는 고혈압성 비대성 심근병증을 포함할 수 있다.
대안적으로 말하면, 일부 실시양태에서, 개시내용은 추가로 개시내용의 ASO 또는 개시내용의 접합체 또는 개시내용의 제약 조성물을 ANGPTL2 단백질의 비정상적 수준의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, ANGPTL2 단백질의 비정상적 수준을 치료하는 방법에 관한 것이다.
개시내용은 또한 의약으로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 ASO, 조성물 또는 접합체에 관한 것이다.
개시내용은 추가로 ANGPTL2 단백질의 비정상적 수준 또는 ANGPTL2 단백질의 돌연변이체 형태 (예컨대 대립유전자 변이체, 여기서 대립유전자 변이체는 본원에 언급된 질환 중 1종과 연관됨)의 발현의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화합물, 조성물, 또는 접합체의 용도에 관한 것이다.
치료를 필요로 하는 환자는 질환 또는 장애를 앓고 있거나 앓을 가능성이 있는 환자이다.
본 개시내용의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 미국 특허 번호 4,683,195 (Mullis et al.); 문헌 [Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) 및 Ausubel et al., (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]을 참조한다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예
실시예 1: ASO의 구축
본원에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 ANGPTL2 프리-mRNA (서열식별번호: 1) 내의 다양한 영역을 표적화하도록 설계하였다. 서열식별번호: 1은 진뱅크 수탁 번호 NC_000009.12의 잔기 127,087,349 내지 127,122,765의 역 상보체에 상응하는 게놈 ANGPTL2 서열을 제공한다. 예를 들어, ASO를 도 2에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 1의 시작 및 종료 부위를 사용하여 나타낸 영역을 표적화하도록 구축하였다. 본 개시내용의 ASO의 예시적인 서열이 도 2에 제공된다. 일부 실시양태에서, ASO를 도 2에 제시된 바와 같은 갭머이도록 설계하였다. 개시된 갭머는 잠금 핵산 - LNA (대문자)를 함유하도록 구축하였다. 예를 들어, 갭머는 5' 단부 및 3' 단부에 베타-데옥시 LNA를 가질 수 있고, 포스포로티오에이트 백본을 가질 수 있다. 그러나, LNA는 또한 임의의 다른 뉴클레오시드 유사체로 치환될 수 있고, 백본은 다른 유형의 백본 (예를 들어, 포스포디에스테르 연결, 포스포트리에스테르 연결, 메틸포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결, 또는 그의 임의의 조합)일 수 있다.
ASO를 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 합성하였다. 이러한 ASO를 제조하는 예시적인 방법은 문헌 [Barciszewski et al., Chapter 10 - " Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)]에 기재되어 있다.
실시예 2: SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 mRNA 발현의 감소를 측정하기 위한 qPCR 검정
본 개시내용의 ASO를 SK-N-AS 세포 (ATCC®CRL-2137™)에서 ANGPTL2 mRNA 발현을 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. SK-N-AS 세포를 세포 배양 배지 (DMEM 고 글루코스 (D6546), 비-필수 아미노산 보충제 (0.1 mM, M7145), L-글루타민 (2 mM, G7513), 및 10% FBS) 중에서 성장시켰다. 5일마다, 세포 시딩 전에 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척하고, 이어서 0.25% 트립신-EDTA 용액을 첨가하고, 37℃에서 2-3분 인큐베이션하고, 연화처리하는 것에 의해 세포를 트립신처리하였다. 세포를 최대 15 계대 동안 배양물 중에서 유지시켰다.
실험 용도를 위해, 웰당 10,000개 세포를 96 웰 플레이트에 100 μL 성장 배지 중에 시딩하였다. 750 μM 원액으로부터 ASO를 제조하고, PBS 중에 용해시켰다. 세포를 시딩하고 대략 24시간 후에, ASO를 세포에 첨가하여 목적하는 최종 농도 (즉, 5 μM 또는 25 μM)를 수득하였다. 이어서, 세포를 임의의 배지 교체 없이 3일 동안 인큐베이션하였다. 효력 결정을 위해 (도 3 참조), ASO의 8종의 농도를 16-50,000 nM의 최종 농도 범위로 제조하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거한 다음 125 μL 퓨어링크(PURELINK)®프로 96 용해 완충제 및 125 μL 70% 에탄올을 첨가하여 세포를 수거하였다. 이어서, RNA를 제조업체의 지침에 따라 정제하고, 50 μL 물의 최종 부피로 용리시켜 10-20 ng/μL의 RNA 농도를 생성하였다. 이어서, RNA를 물에서 10배 희석한 후, 1-단계 qPCR 반응시켰다.
1-단계 qPCR 반응을 위해, qPCR-믹스 (퀀타바이오(QauntaBio)로부터의 큐스크립트TMXLE(qScriptTMXLE) 1-단계 RT-qPCR 터프믹스(TOUGHMIX)®로우 ROX(Low ROX))를 2개의 택맨 프로브와 10:1:1 (qPCR 믹스:프로브 1:프로브 2)의 비로 혼합하여 마스터믹스를 생성하였다. 택맨 프로브는 라이프테크놀로지스(LifeTechnologies) 및 IDT로부터 획득하였다: ANGPTL2_Hs00765776_m1; ACTB_Hs_PT.39a. 22214847. 이어서, 마스터믹스 (6 μL) 및 RNA (4μL, 1-2 ng/μL)를 qPCR 플레이트 (마이크로앰프(MICROAMP)®옵티칼 384 웰, 카탈로그 번호 4309849)에서 혼합하였다. 플레이트를 밀봉한 후, 플레이트에 신속 회전 (RT에서 1분 동안 1000g)을 제공하고, ViiaTM 7 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 써모(Thermo))으로 옮겼다. 하기 PCR 조건을 사용하였다: 15분 동안 50℃; 3분 동안 95℃; 5초 동안 95℃, 이어서 1.6℃/초의 온도 감소, 이어서 45초 동안 60℃의 40 사이클. 데이터를 퀀트스튜디오(QuantStudio)™ 실시간 PCR 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. ASO 처리된 샘플에 대한 퍼센트 억제를 대조군 처리된 샘플에 대비하여 계산하였다. 결과를 도 3 및 4에 제시한다.
실시예 3: 생체내 ANGPTL2 mRNA 감소의 분석
생체내 ANGPTL2 mRNA 수준을 감소시키는데 있어서 ASO의 효력을 평가하기 위해, 10-주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 하기 예시적인 ASO 중 1종을 피하로 투여하였다: ASO-0027, ASO-0037, ASO-0094, ASO-0079, ASO-0050, ASO-0150, 및 ASO-0132. ASO (~5 mg/mL의 농도로 멸균 염수 중에 제제화됨)를 연속 3일 동안 (제1일, 제2일, 및 제3일) 30 mg/kg/일의 용량으로 투여하였다. 마우스를 제1 투여 1주 후에 희생시키고, 심장을 수거하고, 정단 부분을 RNA레이터 중에 저장하였다. MagMAX-96 총 RNA 단리 키트 (써모 AM1830)를 사용하여 RNA 정제를 수행하였다. 퀀타 큐스크립트 cDNA 합성 키트 (퀀타 95047)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. Angptl2 (써모 Mm00507897_m1) 및 GAPDH (써모 4352339E)에 대한 듀플렉스 택맨 반응을 사용하는 어플라이드 바이오시스템즈 ViiA7 기기 상에서의 정량적 실시간 PCR을 위해 10 ng의 총 cDNA를 사용하였다. ANGPTL2 mRNA 수준을 GAPDH에 대해 정규화하고, 염수-투여 대조군의 퍼센트 대조군으로서 제시하였다.
도 5에 제시된 바와 같이, 시험된 모든 ASO는 C57BL/6 마우스에 투여되었을 때 ANGPTL2 mRNA 수준을 감소시킬 수 있었다. 집합적으로, 본원에 제공된 결과는 ASO의 시험관내 및 생체내 둘 다에서의 효력을 입증하고, ANGPTL2-특이적 ASO가 다양한 의학적 장애, 예컨대 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 것, 예를 들어 심혈관-관련 질환 또는 장애의 치료를 위한 질환-변형 치료제일 수 있다는 것을 지지한다.
SEQUENCE LISTING
<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY
ROCHE INNOVATION CENTER COPENHAGEN A/S
<120> ANGPTL2 ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES AND USES THEREOF
<130> 3338.144PC01/ELE/C-K/DKC
<150> US 62/828,864
<151> 2019-04-03
<160> 209
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35417
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 1
gcctttctgg ggcctggggg atcctcttgc actggtgggt ggagagaagc gcctgcagcc 60
aaccagggtc aggctgtgct cacagtttcc tctggcggca tgtaaaggct ccacaaagga 120
gttgggagtt caaatgaggc tgctgcggac ggcctgagga tggaccccaa gccctggacc 180
tgccgagcgt ggcactgagg cagcggctga cgctactgtg agggaaagaa ggttgtgagc 240
agccccgcag gacccctggc cagccctggc cccagcctct gccggagccc tctgtggagg 300
cagagccagt ggagcccagt gaggcagggc tgcttggcag ccaccggcct gcaactcagg 360
aacccctcca gaggccatgg acaggctgcc ccgctgacgg ccagggtgaa gcatgtgagg 420
agccgccccg gagccaagca ggagggaaga ggtaaggggc cagctctgcg gccatgagag 480
gcaggggcga gaggcagccg ctggccccgt ggctagggct tccagaaccc tgaccctcca 540
gctgggggtg tgtgctgctg gatctcagag ggtcactccc tgctatcgct tggagccaaa 600
cgaggcatgt ccggggcaga acctgtggac atttggtggt gtttgggggc acatgatcat 660
gggctggcat ctcgaggact tcatgagtaa gcctcactct cctcttttgg acaaagagcc 720
tttggggtgc cggccggcag ctcccggcac ggcagagcag ctgggagtgt gcgtgtgtgt 780
aggtgtgtgc ttagagggca gcgtactgaa gagctgcaga aggcaggggt ggcccaagga 840
cttgggtagt cactttgaag ctttggattc ctatgccccc aggccgggac aatgtgaggc 900
aaaggcaagc gctgtgctga ggcgctggga gcccctgctc ggagagttac aggagctggg 960
ctgcctctgc tcacaccctc cagctggcga ggagagcaga ggcacccagc acgggaacgg 1020
acgcatcacc caggggctgc tgcactggat ggtaccccgg gtctccaact gagtggatgt 1080
ggccaagata cagggaggat gcggcttccc tggtaccccc gcaaggggac agcaggggct 1140
ccacatacca agtcgcctga aagcactcag tattagataa catttccaaa caaattcttc 1200
actgatcctt cccttctcct tctatgatat gtgtgtcatg ggtcagctct tgcctctgct 1260
gtaggattat gagagctccc agaggccagt tcagttactt ggaaaagcat ctcctttcac 1320
cccactctct ggggaaaatt gagaatgcca cttccaaagc cggccaaatg ctccccacat 1380
gtatttttcc aaatggaggc agagtagggc agtcctcatg agctggcttc aaatcccagc 1440
tcttctacct actagccaat ggctctggca gaacacttag cctttctaaa cctcagtttt 1500
cttatctgtg aaatgggata atactgccca ggtggtaaca atggccagag agtaacagct 1560
aacacttata ttgcacttac tctatgccag actcaacttg tagaatcctc atgaccaccc 1620
tatagcacag gcattattat tcatccctgt tttataggtg aggaaactga ggtaaagtaa 1680
tgtgcccatg gctacatggc tagtaagtgc caggaccagg acttgaaccc agtggtgtgg 1740
ctccggagcc actcaaccac accctactgc tttctaggag aaagctaggc gcccatgcct 1800
aggaaggcct tggcttagtg cctggtgcac agcaaaccct gagcaaacct tggtcactga 1860
tgattacaaa ccacaacaat caggactggc acagagggaa gggaagagca gagacacgaa 1920
ttcttttttt ttttttttga gatggagtct cgctctgtca cccaggctgg agtgcagtgg 1980
catgatctcg gctcactgca aactccgcct gctgggttca cgccattctc ctgcctcagc 2040
ctcccgagta gctggggcta caggtgccca ccaccacgcc cagctaattt tgtgtgtgtg 2100
tattttcagt agagacgggt ttcaccacgt tagccaggat ggtctcgatc tcctgacctc 2160
gtgatccgcc cacctcggcc tcccgaagtg ctgggattgc aggcgtgagc cactgcaccc 2220
ggccagagac ccaaattctt tccctgttct ggacatatcc tgctagggtt ttcagaaaat 2280
cccacgagac agagataata ctgtggctac tatcactgcc cacactggag ggctttccag 2340
gagcctgagg agaggggggc tttatgtctg gggtttgggt ttggggccac ctgcagcatg 2400
cctgcatcct agaagtccat actaagaaaa agtgcagaca tattaacaaa aggatctaat 2460
accaacctta caggaggaag ggcatcctgc ttcccacatg ggcactgcct gtctgcctat 2520
tgatctcccc agcagaacca tagtggataa gaaaatgcag ctaccttagt gctgtgggaa 2580
gctcacaaaa tcaggaggat ccatagtcag gtttgccccg gagttgcaga ggaagaggca 2640
aggaatggcc atcaccaagt ctggcactat ggtggccatg tctggtggat cttacaccag 2700
acaacactga tacatcttag cccaggagag gagcttctgt gctgtggccc cctgaggttc 2760
cagtgggctc cctgcacgct tggaagcatt ttgaaaaggt gacatcaagt atttgcttct 2820
ctagcacaag gcctctgggg ctactgaagc cacaggtttc cctgctccag cctggaacca 2880
tggtggctca ctgtcttctc tgggcagctt aggatgagca gaggctctga ctgacttcat 2940
gagcttggca aaaaaaatgg gactacttac tactaatgag gcagtctggg tggaacagac 3000
aaaaatgtgt aacgcacatg gtccagcagg ggactacatg ttattgctga agctcacggg 3060
cagagcaaat aagctgttcc tccatctggc cctccatccc ccagtgattt aggaagtacc 3120
cactgggcta aataaggcat atacattatg tcatttcatc ctcaccacaa ccctagaagg 3180
taggttctag ttttagcatc ccattttaca gatgggaaaa ctaagtctcg agaggttaac 3240
ttgcccaaag tcacacagtt atgtgattat gtgggactgg aacccagctc tgtctggctc 3300
caaagcccct gacttcctct cacttcagtg ccttgtttag acacctcaac ttctcttatc 3360
ctgactgtca ctgggtccct gcccagtgtc gtcagtagcc acatctgctt tggttgctgt 3420
cctatcgaat gctgcaccaa cccctctgaa aaccatggac ttactcaact ttagcgcatc 3480
ccttgctctt catggaagcc tacttctgag gcaaaatagg catgactgtt actcttagag 3540
atgagcctca gcacagttat gagggtacct gttatgtggt aatatggtca gtgacaagag 3600
gaactgagct tcgaaaccag gttggctgac ttgttccacg tgcctgggtg ctctgcgata 3660
ctgtctcacc acatcagcac caggaaactc tgtccccagc tcagtggggg cagagcctca 3720
gggaaacact ggtccatgtg actaagatac tattgatgcg ctttctacat ccgtacttgg 3780
aggctccttt aggactgaag aatcagagct caggtcctca tcacccacac tgggccacac 3840
acgagcaatt tctgagaaaa catcagggag atggcaatgg gtagctacaa tagaacaaac 3900
ataacagaca gcagccctgc caaagcaggt acattcagca actggcctct ctgaatcaca 3960
gcccatttaa tctggaatgg tctcaactga cagcaggcag atgggggagg ggctctgctt 4020
catagagccc acagcccagc aggactgggc agacagtaaa taatcacaca aacacacaac 4080
tgtgtgaaag ctgtaaagag gtggcacaag gagctaagag ggtcctcaag gtgggtggtg 4140
ctgtccccgt cttacagaag tggaaactgg gggtcagggt gcagcacctc tcccacggtc 4200
tctccatgca tgggccaaaa agcaaagatt gaaacccaga cctgtgctgg ttccacccca 4260
gcctgctgcc atcctggaca accacactgt ggaaatctca agaaagaatc aattcattga 4320
atagcatttc ttttttgtga atttatataa aacaccccaa atagaagagt tattcagcca 4380
caggcagctt ggagtttgtg gtgatacact ggtcacgtca gaagcctcat tctgggggta 4440
gtttctatga caaaactgtg ttctttcaca tggactgtga gccatatgac tgagttcata 4500
acagtgttgg gggttacaac gttacgatgg cctgtcacat gtacacatca atcacaagcc 4560
acattttggt cccaggaatg ttaaaatgtt gggtgtggca ggagaatccc ttgaacccgg 4620
gaggcggagg ttgcagtgag ctgagatcgc gccactgcac tccagtctgg tgatagagca 4680
agactccatc tcaaaaataa aaaataaaat gttgggtgtg gggagccagg cctctcacaa 4740
ctgaactatt gtgtcagtcc attctctgct gaaatcagcc tgtctggggc cagcagcccc 4800
agagcctcag caaccccctg ctgcctagtt gtccagacag gcagtaccaa gaccaccaag 4860
gaaaagccca gaatggactc tgttcttatc ttcaagagat gcctgaggac ctgcccagct 4920
ccaagaatcc ttaaagtcct gcctgaggtg gtcccactcc aacctccatg agggaaaggc 4980
tgtgtctgtc tcagttactg ccgaatctct aatacccact cagggccagg tagaaaagat 5040
atctgtggaa tgaatgaatc aatgaagcaa gcctcaggcc caggctctca agcaaacaag 5100
cttctctacc ccagggtgcc acaccattcc tctctctgtt gtccagccaa gggcttttct 5160
gaggctaggt caggtgcccc acagcccccc aagtttccct atctgggcat ggatctcttt 5220
gcattacaaa tgcctagtct ctgtctcacc tactaccgtg gaccccttga gggtaaggac 5280
ctcacccacc ttgttcctgt tctacctcca gccgctggca cagtggctgg aagaggagaa 5340
cttattggga aatacattat acaaatgaag ttcttgaatt cctatttagt aacctaggtg 5400
ccatcctgga tactcagtag tcagaggagg aatctgccct ggccctgctt tttaaagaag 5460
ctgtagtcag gagggagata accagatgac tgcaatctga gtcttgggtg ttgagttgga 5520
agcagccaca gctgcacttg tgagctgaag gagggaggga agacctcact gaatggatgg 5580
cttcatggtg aggtcaactt aggaagacag gcaggcatca gccaggacag tgggggaagg 5640
tactcgaggc aggaagcaca gcacatgcaa aggcagggag gcatgacaac acaaggtctg 5700
tttttaagca ggacgctgac atgatcagat gtgggtgtca gacagacagc cctggagctg 5760
catgcagtgt agactgcagg ggagagagca cccaaaggca gggaggccaa ttaggattgt 5820
gtgggtaaga aacctggccc tgggttagac aaatctgtta ctgggcccag ctccaccact 5880
tggtagcact gtgcccctgg acaagtggct tcatccctta cctttgtttg ctcatctgtg 5940
aaatgaggat agtcatagcc cctgcctcaa agagctaccg ggatcagtga ggcagacaca 6000
aacattggtt gtcccagtgt ttgaggaaca agtccatcca aacagccaag gtggccctgg 6060
tgccaacttc tcagcctggt ccagaaaagc agccccaggc aaggcctgga cttcccaaga 6120
aagtcaccct ggggcagtgc tgtccaccca gcccttgact tctccctctt gtctagggct 6180
ttcccagttg tagggctcca gagcacacta ggcactgccg gaaatgcagc agccaactca 6240
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cccactccct aaccacatcc ccctctaccc tatgatctca tggtgtgacc acaacccgcc 6480
tcctccatga actcttcctg gagccagcaa ttcaccaatg gcaggagcac aagagcccaa 6540
agcatcaggc agattcgaac ccccagtgct actcctccag gcaaatctgt cttaccctgc 6600
ttctctgact catggctccc atcacccatg acaggtagta gcaatgcaca atggctagct 6660
gcatgggaag gctaaatggg tgggtgatgg agggctggat ggatggataa atggttcatt 6720
caatggtctt atgagagctg aactagaagg gtttgggaat tgactccaga ctccccaggt 6780
gccttctggt ggggaatcat tcatagcatc ctcagccagg aggggagggc agctggagat 6840
ctggatatgc cctccctggc ctccgggctg atggtgaatc atccaggaca aacaatgcac 6900
agtcctttca ccaggttctc caaggtgagg gtgtcactgc tcatcccaga tgcccatttt 6960
ggggtcttac cacttgcgtg atcaagcagc tctttccaac atccaacaaa acacaccctt 7020
gtgctgacct gaaagctatt tctacttatt cagtcaacag tgagtaacat gcaagctgca 7080
tctcagccat taaacaaaca agcacctttt attcatactg gttgaagaga caatcttgat 7140
gcaaggcagg gtttggacct agcagttgac agctaaatcc cagttgtgat atttacttcc 7200
aagtgatctt gaacaagcga cctaaccttt ctagacttgg gtttcctcta ctgccaaatg 7260
cagatataat acctttctct taggtaatgg gatcatatag tttgttgctc agtcaggaca 7320
atattgagag tgaaaagggg gtgctattaa taactacata agaccgcaac cagcatggcg 7380
aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaat tagccaggtg tggtgacagg cacctgtaat 7440
cctagctgct caggaggttg aggcaggaga actgcttgaa agcgggaggc agaggttgca 7500
gtgagctgag atggtgccat tgcactccag cctgggtgac aagagcgaaa ctccatctca 7560
aaataataat aataataata ataattacgt aagacaacag acctcaactg gggccaacca 7620
ggatgtatgg tcccctactc atagagctat taagagccaa tgagatagag tacagctggg 7680
cacccaaatt cacaacaaac gacagccatt attagcaata ctactggtca cctgatcagc 7740
tgggcctttt ccttcatctg gatccctccc acatcttgga ttaccaactg gtttggatac 7800
ttccctacca gcacaccata catttcaaca gcttagtagg aacacctgct agctaatgtt 7860
gatgttttca tctgtcttct gtcctgatga tagtttcaca aacttgattc atgctcaggt 7920
ccaccagact cactcaagca cagctcaggc ttctagcttc ccagaacccc gacgtcaggg 7980
gccagctggc agttccagat tccctgactg ccttggcaga ggcccgcttc tcaggcctcc 8040
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gaccaatggg cagtgctgac cagaggacgg gtggtgaggg ggtggttctg taagtcctcc 8160
aggcaggact acaacctgga ctgatgatga atcaactcct gagatccgga tttaatttgg 8220
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tagagggtca gagaacaacc tcttttgggt ttccagtcac tttggcactt tggtttctct 8340
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attaatttgt gatttgggca aatgactcac gatcctcaaa tctcaatagt ttcctcaact 8460
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aaaattgcta caatataaat ataaaaaaca taaagactat gaatgtgagt tgtgtcccct 8580
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cttccgaggg ctgttgggaa gattaagtga gataatgtat ataaagtgct tgagccatag 8700
tgacaattta ttgttgttat tcttttaatt gctggaactt ttctcatttc taacctttgg 8760
ggtgaactca aaagaggatc ccaggccggc agcttctgct gcagggcaga acacacagct 8820
ccatctgatg aaaatgacag ctcttcccac aaagtggccc cttgcttggg ctgtggcacc 8880
acagtggtga gagggatgcg gacacatgat gtgtggcccc accacatcag gccaagcggg 8940
gacattcaga ggcagcccac cggagactgg gtgggaccca agccctggag aggctgcctc 9000
ccagtgtaca aaggctgtca cgtggcacag tcacaccagc ctcacttgtg gggagggaaa 9060
acccatgcgt gatggaaact cctcacaata caatgtggaa aagcaatttt aagaatcgtt 9120
tttattttaa ttctgaagcc aaggaaaaca gttggatttg cttttctttg ttggacacag 9180
gaaaaaagtg aggagcatca ctttgattgg agttgagttc ttcttcagtc ctaagatggc 9240
tggaatgccg gggtgggggt ggggggtgtt acttctcttg agatacaatg agttgaataa 9300
atatcaagag agcaaaagta aacaaactta ttactgccca ttaagagccg ccaaactggc 9360
aaaaaactgc tggggggagg ggaggaattg gggttggagt cttggactcc aaggaaaata 9420
aatgactctg aggctcaaag agaagcccaa ggagcatggc ccttggtatc aggttgaccc 9480
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ttacctggga caatgtatgt caggcgccca gcacagtgcc ctgttccttc ccttccttcc 9660
tgtaacccaa tcagttctga gtcaccccca ctaagcctag gccccacaga ggtgtaacag 9720
taggactcag aatcaatgta gttacaagag gtcccactgc tcgcaacatg acctcaaagt 9780
cagctacccc tacacctttt tgagcttcag tttcctcagc ctagaaatgg gcataacact 9840
agtaagtcac tctgagtgtt ggaatgatta gatgagagaa tgttgatgtg aagggtctgg 9900
aagccctaaa gccctgtgca agcattagtc aaggagatgg tgtgagtgct tggcacactg 9960
cctggcccac acccagcatc ctcactgttg ttggttttgt ttcagctttg ttgttcttgc 10020
tatcgtattg ctaacacatt attccaatct cccgcttctg atgcacttcc atgctgctca 10080
cctagtgtgc aaggtgggtt ggatcatccc atttcacaga aaagactcag cctttgaggt 10140
ctcaagtgca atggcaagaa ctctgtcggg gagctgtgag agcccatgtt tgggagagga 10200
tagaactcaa ccataaatag tgcaaatcaa atctggaggt ccaggaaggc ttggaaacca 10260
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ccctgcgccc acatgggcac agagaggtgt ctgtcaccca ctgcctcagg tgagcagcct 10380
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aggccatagg aatcatgctt gggctttgtc atttaagtgg aaaacagctc agcaaggccc 10680
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ccagggtcct cactggagaa gcccccaaag gggttcaggg aggacaaaat ctttaggtcc 10800
tgtgtcatac ttgttatttt agcacagatt aatgtgaaat cagaaagtag tgatgctaat 10860
acccttttac tagtaaaaac cagattaaat acatgcctgt gtcatcgtta agagttagca 10920
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aacagtatct accttaaaag gagattatga gaacacggga aactggaaaa cacttgcaaa 11100
atgtttagtc cagggtcagg tatatagcgg accttggtca atggatgtta ttaataaata 11160
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tccctgcccc aatctatccc tctttccagc actcccagct gctcagcagc tgttggcagg 11280
tgtgtcttgt cattccatca acaaatattt attgagctcc tatgtatttc aggccacgtg 11340
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cattcaaggg aacggggagg agacagcgtg tatcttatgg tgataaggac actggagggg 11460
gaatgtggtg aggtcacaat cttaaatcag cagggagggt ctaactgaga aggtggtatt 11520
tcagcaaaga ttgaaagagg taagggaaca aacaacgaag aagggggcag ggaccagcaa 11580
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ccaggtggtt ggaggagatg atcgtagggg agaggggtca gagatgagac cagggaggaa 11700
gtgggggcca gatcatagag tgccttggag acccactagc ttttcctcca agatggtgag 11760
ccactggggg gttttgaata gaagagtgac cccgtttgac tttttaaaaa ggaccactct 11820
ggctgtgaag ttgaggacag aaggtaggat gggcaaggct ggggcaggga ggctagttag 11880
gaaattactc caatagtcca ggtaaatgat gcaggtgggt tgcaacaggg tggtggcagg 11940
gaggtgggga gacacaggac tctaagaata tttctggcat cgtaatttgg cggtgaatta 12000
gatgtggggt atgaaagaaa gaaaggcgtc taggatgact tcaagacttt cggcctgagc 12060
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aatgtcaaaa aagcagctgt atgtatgagt ctagagtcct ggggagagtt ccagaaataa 12240
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aggtaaagaa aattctgagg actgagtttt gggtcccctc aacagtagag aaaggacagg 12360
aatatgagga tgaaccagca caggctctga ggaggaacag ccggcaagac aggaggcagg 12420
gtggcgctct ggaaaggaag gtcaagaagg gagcccaact gtatcccaca gtgtgagagg 12480
gaaaatatta atgaggatca agaaccagcc cttccatctg gcaaacagac aggggatcct 12540
gtctagggca acctagaatg aaggggagcg ggcaaagcct gatgagggtg ggctcaagag 12600
agaccaggaa gagaggaact ttctggaaat ggtgagtgca ggcatctctt tggaggcttt 12660
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gggttttaag ttgagagaaa aaaccgtatg attataggaa aaccatcctg atgttgggga 12780
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acacatcctt ccactgatat tgtccactaa accctgaatg tattccataa catgtctaac 13380
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cctccctctg cctcccctcc ccagcctgaa gctgcctgga tacgattctc aggctctagg 13680
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ttcaggcttt catagattct attcacaaag aataaccacc attttgcaag gaccatgagg 14040
ccactgtgcg tgacatgctg gtggctcgga ctgctggctg ccatgggagc tgttgcaggc 14100
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cgagtgcata agcaggagct agagctgctc aacaatgagc tgctcaagca gaagcggcag 14340
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gggtctcaga gccaggcacc aggcttccct tggctgtgtc cacaaatggg gaaaagccat 14940
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tgttcaccaa ataaacaatg ggccaaaaga aaagaaagta ttacccatgt taagaatatg 15300
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gtaggctggc ttggatttaa atccggtttc caccactgat tagctctggg acattaggca 16200
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agtaggtgac aattgtggtc cctgacctcc agaaactcag tctggggtag acggcaggtg 16980
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ttaaaatgag ctctgggaac aaaggtggta gatttgttat tagaacatgg ttccaatgac 19080
acaaaacact gtcgctacca acccaccaac atcatgctcc ccctccctag gcctagcagg 19140
aaccagccaa gctccccagt agaaagtaca acgtgcacct gactcccagc aaatggaccc 19200
aactgaagtc taatttttaa tttttatcaa atctggacat atcctctggg gttccttcta 19260
ctcagcattt caatgtatag ctaagtcttt caacatatag ctaagtgtga agttctgatt 19320
tctttaaatg ttagccctga ctgtataaat gtcagtagac atgaccttcc cttgggacca 19380
catgaggagg tccccacatt gcttcactga caagagtgct agcaggaagc caccccatct 19440
cacaacagat gggctattgg gctatggcca ggatggcatg gacaacttga acaagagtgt 19500
tttcctagat ggattttcca cctgtatttt attccaccct ataaggtagg aaatacgtac 19560
acgattgtgg ttccccagca caatggtatg ttttaaaaca gagaaatata tgatgttgta 19620
gctcccattc tttctggagg tcaagcaagc aaccaggtga aaaggtgtca acccatgtgt 19680
ggctgggtca gcttcagtag gctgggcatc caggcccaag cactgcagag aggtggagaa 19740
gcacagggtg tgtgtggtga tggtggcgag tgagggtgac tctgcccatc ctgagtcagc 19800
cttcaaggtc acagaggctg agggaaaagc ccacacaggt ctcctgcctc cagagcgtgt 19860
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ttcttcctaa acaaaatcta ctctaggaag atggcccacc tggatgatgg ttccaggagg 20040
gccagctccc ttattgcttt gctttctctt cctcctcttc tggtaccttg gggaactgat 20100
cacaaagagc cttttgaggg tgatggaaag ctacccctcc attcctcagg cagttttcca 20160
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tgttactgtt aaaaaaatct tgagatctgg gatcttgatg cctgaaaatc ccaagattgg 20280
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ccccctccac ccccaccccc acaaaaaaaa taaataaagt agtattaagt tagcctcata 20460
caaatgctgg caccatgctc ctggacttct cagcctccat aactgtgagc caaataaact 20520
tcctttcttt ataaattacc cagtctatgc tattctgtta tagcagcaga aaatggacta 20580
tgttcagtct tgtaaaagta atgaagtata tacttccagt ggtttatacc cacatcagtg 20640
aaggatgcag gcagcagaga cctcttgatg ggaacactgg agatgatctt tcctactatc 20700
cccgcatcac cactgcctca acttcggctc tccctggcat gaatctggtc aaagattatg 20760
ctgaaaataa gcctgatggt cctcatctta tatctcaaga tgagcctgtg gaactacagg 20820
gcctggagta tttatgtgat cctttgttta aaaaaaaata agttactttt ccctgatatt 20880
tttgaataca gtaagtcaaa actactatac acacagagaa aaatcttgct aagacaattt 20940
gtttacgtta taaatgcaac agctcctaaa tgttgaaatt aagtatctta gatggtatgt 21000
ctagagtagg gtccaaatga acaaaaaatc cactcatctg gcaccatccc agacataatg 21060
tgcagagaga ccactacaaa ctgtccaggc tttcccacaa agcaggtttc ctttgccagg 21120
gtttggtctg gatgtggatt atcatctgtt gtggggtctc tctttccaga tggatttatt 21180
attattggtt ctcagctgga aagcacagaa tgaaggtagc aaaggggatg cagctcagga 21240
tggtgaagga tggagggtga aggatggagg gtcaaggata gaggattgaa ggatggaggg 21300
aggcacacag agcattgagg gactcatgga gtgagcctgc aagggttcct gcctgaaagg 21360
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gcacagaagg tggacctgag ttctaatccc agatcctcca ctttccagtc atgtgatcct 21480
cttgagccct ggctttctca caggtgcagg ggcttatgag gatgaaatga aacggtgtgc 21540
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agtagagata aatatacaaa gcattttggg aacactgaaa aggataaagt agctttcctg 21660
gggttgggga aagcttcctg aaggaggtga tgaggaaggt aagggccttg tggtgctctc 21720
agaaccacca ccagtgatag tcaagaaatc atgaagacaa gtcttggtgc cagacaaatg 21780
tcctgctttc agaaaaagaa tgcataccag aaatcacata caactggctt gtggtgaagc 21840
cccagtaaaa ttatagaaaa gagtacacaa agggttcgtg agcatttgga agattaaaag 21900
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ttggaaaggg ttaatacact cgccaactat gggactgcta cctgtccata tctgtggatt 22020
gtagtcatgg gtctgataag ttcttccatg atgtgcctgc aggacagcac cacagtctct 22080
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ttttttaaaa tgtctttaaa gcccctgttt ctcctcctgc ccaacagcgc tggtggaaac 22320
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tctcccgagg tcaaatgagc agaaacagga cctttataag ccctttctgg gccctaagag 22440
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taatagaatt tttactggaa caattttgaa aggatttaat acttttgctt ttaaaattat 22560
ttggctaaga gtaactcaat taatttatgg ttggatctca tttctcagta aacatcaagc 22620
atattcagga attcttggga agtgaaaaaa atctaaccta caagttgttt tcaaaagtag 22680
taacattttc atgaagacaa aatttaacaa ttaatgaact tgacaagatg tcacactttg 22740
tagtaattta attacataca ataaattttg attttgcagt tttcttttca tattttagag 22800
ccagtaagtc tttttaggcc tcaaacattt tcatcaactc ctgaaacact cattggcccc 22860
aggcaccatg cccatcgttt gagggctaaa gcggcctgaa agcaggcaca agcatttgga 22920
ccttttccct ggaatgatca gaaatgacat gtgtgatatc aactctgagg ttctgcagga 22980
actgaaatgc ctttgggacc atacaagcta ttcctgtgtt taggttattg ttttgtactc 23040
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tctcctgtta gaaaaatgtt tcagggagtg gtaagaagac tttttggaga cagaccatca 23400
gtgagagtaa ctgaaaacag catacagttc tcatgaaaag cagactgcat cttagtgata 23460
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cctggcctag gtgccggttc taactcagct tgaccagaaa ggccctgtgt tgggagtagc 24000
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ctccaacact taccagggta tggcagtggg gtccgggctg agacctgtgt acttggtact 24180
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acttaaaaat acatggaaaa catctactgg taaatatctt acatttagtc ttgtattgaa 24660
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ccatcagtga tgtttctgac ctttgccact ggtgccttta atgtgtgaaa aggaaatgtg 25260
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gttctaagga cacagagcta agtcagcatg gatccctcat tcttgagttc gttctggttg 25740
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cttggcagca aaattcagca tgatgtgata atgccaagag ttttatggaa atatctttcc 33060
tttgtgaagt aatacaaaaa attgtttgga tggaatacaa gctggggagg actggaggag 33120
catttcttct taaacacttt ctttgtcatt ctttaaagac tcctgatcca acagtttcaa 33180
ctcaaaaatt cctaagaaaa agcttttctc cctccccgcc cacctcaggc catctccatt 33240
tcctatcaga acacaaggtg tggagttccc ttggggcctc ctttgcaccc agccctgggc 33300
taggtgtcaa gtacgcatcc tcattcaatc ctcagagccg ccctgtgcgg caggcgtcat 33360
ttttattctc attttacaga tgaggataca gtggctggga gaggtcaagt cacttgtctg 33420
agatcacaca gctagttagt tacaaagctg agcctcaaag gcgggcctga agcatggcct 33480
ctcaccaccc atggagacgg gtccaccttt caagcgttct tgctccagat gcctcccaga 33540
gagggctttg ccgaaagccc tgagcactat ggacgcaagt agaatggcct cctcccagac 33600
accctctcac tgccttctct cttgcaggaa actgtgccca ctaccagaag ggaggctggt 33660
ggtataacgc ctgtgcccac tccaacctca acggggtctg gtaccgcggg ggccattacc 33720
ggagccgcta ccaggacgga gtctactggg ctgagttccg aggaggctct tactcactca 33780
agaaagtggt gatgatgatc cgaccgaacc ccaacacctt ccactaagcc agctccccct 33840
cctgacctct cgtggccatt gccaggagcc caccctggtc acgctggcca cagcacaaag 33900
aacaactcct caccagttca tcctgaggct gggaggaccg ggatgctgga ttctgttttc 33960
cgaagtcact gcagcggatg atggaactga atcgatacgg tgttttctgt ccctcctact 34020
ttccttcaca ccagacagcc cctcatgtct ccaggacagg acaggactac agacaactct 34080
ttctttaaat aaattaagtc tctacaataa aaacacaact gcaaagtacc ttcataatat 34140
acatgtgtat gagcctccct tgtgcacgta tgtgtatacc acatatatat gcatttagat 34200
atacatcaca tgtgatatat ctagatccat atataggttt gccttagata cctaaataca 34260
catatattca gttctcagat gttgaagctg tcaccagcag ctttgctctt aggagaaaag 34320
catttcatta gtgttgtatt acttgagtct aagggtagat cacagactgt gtggtctcaa 34380
ctgaaaggat cacccttggc atctgtgtgc ctggattctt ccagaatgtc tacaatgcta 34440
atctctcaca tagaggttcc cagcttctta agaacccctt ttggcaccta atcaaatttc 34500
aaaatccctc cccccacatt ttcatacttt tccccattct caggactttt caccatccat 34560
cacccactta tcccttcatt tgacaccatt cattaagtgc cttctgtgtg tcagtccctg 34620
gccactcact gcagttcaag gccccctttc cgctctgctg tactcctcgc ctacctactc 34680
cttgcctttt ctgtcgcaca gccccttctt tccaggcgag attcctcagc ttctgagtag 34740
gaaacactcc gggctccagg tttctggttg ggaagggaag gccaggccaa aagctccacc 34800
ggccgtatag ataatgtact cgcagttttg tatcttccat tcatacttta acctacaggt 34860
catttgagtc ttcacacaaa taataaccta tctggccagg agaattatct cagaacagaa 34920
gtcatcagat catcagagcc cccagatggc tacagaccag agattccacg ctctcaggct 34980
gactagagtc cgcatctcat ctccaaacta cacttccctg gagaacaagt gccacaaaaa 35040
tgaaaacagg ccacttctca ggagttgaat aatcaggggt caccggaccc cttggttgat 35100
gcactgcagc atggtggctt tctgagtcct gttggccacc aagtgtcagc ctcagcactc 35160
ccgggactat tgccaagaag gggcaaggga tgagtcaaga aggtgagacc cttcccggtg 35220
ggcacgtggg ccaggctgtg tgagatgttg gatgtttggt actgtccatg tctgggtgtg 35280
tgcctattac ctcagcattt ctcacaaagt gtaccatgta gcatgttttg tgtatataaa 35340
agggagggtt tttttaaaaa tatattccca gattatcctt gtaatgacac gaatctgcaa 35400
taaaagccat cagtgct 35417
<210> 2
<211> 3572
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 2
gcctttctgg ggcctggggg atcctcttgc actggtgggt ggagagaagc gcctgcagcc 60
aaccagggtc aggctgtgct cacagtttcc tctggcggca tgtaaaggct ccacaaagga 120
gttgggagtt caaatgaggc tgctgcggac ggcctgagga tggaccccaa gccctggacc 180
tgccgagcgt ggcactgagg cagcggctga cgctactgtg agggaaagaa ggttgtgagc 240
agccccgcag gacccctggc cagccctggc cccagcctct gccggagccc tctgtggagg 300
cagagccagt ggagcccagt gaggcagggc tgcttggcag ccaccggcct gcaactcagg 360
aacccctcca gaggccatgg acaggctgcc ccgctgacgg ccagggtgaa gcatgtgagg 420
agccgccccg gagccaagca ggagggaaga ggctttcata gattctattc acaaagaata 480
accaccattt tgcaaggacc atgaggccac tgtgcgtgac atgctggtgg ctcggactgc 540
tggctgccat gggagctgtt gcaggccagg aggacggttt tgagggcact gaggagggct 600
cgccaagaga gttcatttac ctaaacaggt acaagcgggc gggcgagtcc caggacaagt 660
gcacctacac cttcattgtg ccccagcagc gggtcacggg tgccatctgc gtcaactcca 720
aggagcctga ggtgcttctg gagaaccgag tgcataagca ggagctagag ctgctcaaca 780
atgagctgct caagcagaag cggcagatcg agacgctgca gcagctggtg gaggtggacg 840
gcggcattgt gagcgaggtg aagctgctgc gcaaggagag ccgcaacatg aactcgcggg 900
tcacgcagct ctacatgcag ctcctgcacg agatcatccg caagcgggac aacgcgttgg 960
agctctccca gctggagaac aggatcctga accagacagc cgacatgctg cagctggcca 1020
gcaagtacaa ggacctggag cacaagtacc agcacctggc cacactggcc cacaaccaat 1080
cagagatcat cgcgcagctt gaggagcact gccagagggt gccctcggcc aggcccgtcc 1140
cccagccacc ccccgctgcc ccgccccggg tctaccaacc acccacctac aaccgcatca 1200
tcaaccagat ctctaccaac gagatccaga gtgaccagaa cctgaaggtg ctgccacccc 1260
ctctgcccac tatgcccact ctcaccagcc tcccatcttc caccgacaag ccgtcgggcc 1320
catggagaga ctgcctgcag gccctggagg atggccacga caccagctcc atctacctgg 1380
tgaagccgga gaacaccaac cgcctcatgc aggtgtggtg cgaccagaga cacgaccccg 1440
ggggctggac cgtcatccag agacgcctgg atggctctgt taacttcttc aggaactggg 1500
agacgtacaa gcaagggttt gggaacattg acggcgaata ctggctgggc ctggagaaca 1560
tttactggct gacgaaccaa ggcaactaca aactcctggt gaccatggag gactggtccg 1620
gccgcaaagt ctttgcagaa tacgccagtt tccgcctgga acctgagagc gagtattata 1680
agctgcggct ggggcgctac catggcaatg cgggtgactc ctttacatgg cacaacggca 1740
agcagttcac caccctggac agagatcatg atgtctacac aggaaactgt gcccactacc 1800
agaagggagg ctggtggtat aacgcctgtg cccactccaa cctcaacggg gtctggtacc 1860
gcgggggcca ttaccggagc cgctaccagg acggagtcta ctgggctgag ttccgaggag 1920
gctcttactc actcaagaaa gtggtgatga tgatccgacc gaaccccaac accttccact 1980
aagccagctc cccctcctga cctctcgtgg ccattgccag gagcccaccc tggtcacgct 2040
ggccacagca caaagaacaa ctcctcacca gttcatcctg aggctgggag gaccgggatg 2100
ctggattctg ttttccgaag tcactgcagc ggatgatgga actgaatcga tacggtgttt 2160
tctgtccctc ctactttcct tcacaccaga cagcccctca tgtctccagg acaggacagg 2220
actacagaca actctttctt taaataaatt aagtctctac aataaaaaca caactgcaaa 2280
gtaccttcat aatatacatg tgtatgagcc tcccttgtgc acgtatgtgt ataccacata 2340
tatatgcatt tagatataca tcacatgtga tatatctaga tccatatata ggtttgcctt 2400
agatacctaa atacacatat attcagttct cagatgttga agctgtcacc agcagctttg 2460
ctcttaggag aaaagcattt cattagtgtt gtattacttg agtctaaggg tagatcacag 2520
actgtgtggt ctcaactgaa aggatcaccc ttggcatctg tgtgcctgga ttcttccaga 2580
atgtctacaa tgctaatctc tcacatagag gttcccagct tcttaagaac cccttttggc 2640
acctaatcaa atttcaaaat ccctcccccc acattttcat acttttcccc attctcagga 2700
cttttcacca tccatcaccc acttatccct tcatttgaca ccattcatta agtgccttct 2760
gtgtgtcagt ccctggccac tcactgcagt tcaaggcccc ctttccgctc tgctgtactc 2820
ctcgcctacc tactccttgc cttttctgtc gcacagcccc ttctttccag gcgagattcc 2880
tcagcttctg agtaggaaac actccgggct ccaggtttct ggttgggaag ggaaggccag 2940
gccaaaagct ccaccggccg tatagataat gtactcgcag ttttgtatct tccattcata 3000
ctttaaccta caggtcattt gagtcttcac acaaataata acctatctgg ccaggagaat 3060
tatctcagaa cagaagtcat cagatcatca gagcccccag atggctacag accagagatt 3120
ccacgctctc aggctgacta gagtccgcat ctcatctcca aactacactt ccctggagaa 3180
caagtgccac aaaaatgaaa acaggccact tctcaggagt tgaataatca ggggtcaccg 3240
gaccccttgg ttgatgcact gcagcatggt ggctttctga gtcctgttgg ccaccaagtg 3300
tcagcctcag cactcccggg actattgcca agaaggggca agggatgagt caagaaggtg 3360
agacccttcc cggtgggcac gtgggccagg ctgtgtgaga tgttggatgt ttggtactgt 3420
ccatgtctgg gtgtgtgcct attacctcag catttctcac aaagtgtacc atgtagcatg 3480
ttttgtgtat ataaaaggga gggttttttt aaaaatatat tcccagatta tccttgtaat 3540
gacacgaatc tgcaataaaa gccatcagtg ct 3572
<210> 3
<211> 493
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 3
Met Arg Pro Leu Cys Val Thr Cys Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Met Gly Ala Val Ala Gly Gln Glu Asp Gly Phe Glu Gly Thr Glu Glu
20 25 30
Gly Ser Pro Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Gln Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
50 55 60
Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val Leu Leu
65 70 75 80
Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val
100 105 110
Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu
130 135 140
Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Tyr Gln His Leu Ala Thr Leu Ala His Asn
180 185 190
Gln Ser Glu Ile Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro
195 200 205
Ser Ala Arg Pro Val Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Pro Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Thr Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Asp Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln
305 310 315 320
Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr
325 330 335
Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe
370 375 380
Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr
385 390 395 400
His Gly Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Trp His Asn Gly Lys Gln Phe
405 410 415
Thr Thr Leu Asp Arg Asp His Asp Val Tyr Thr Gly Asn Cys Ala His
420 425 430
Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
450 455 460
Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0001
<400> 4
ttacatgccg ccagaggaa 19
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0190
<400> 5
gagcctttac atgccg 16
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0095
<400> 6
atagcaggga gtgacc 16
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0189
<400> 7
gaaatgttat ctaatact 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0094
<400> 8
tgtttggaaa tgttatct 18
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0188
<400> 9
gctctcataa tcctac 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0093
<400> 10
ttctcctaga aagcagt 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0187
<400> 11
acagggaaag aatttgggtc 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0092
<400> 12
atcaataggc agacaggc 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0186
<400> 13
atgaagtcag tcagagcct 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AASO-0091
<400> 14
agtgagagga agtcaggg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0185
<400> 15
tgatgtggtg agacagta 18
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0090
<400> 16
atttactgtc tgcccag 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0184
<400> 17
gtcatagaaa ctacccc 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0089
<400> 18
ccacacccaa catttta 17
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0183
<400> 19
tggacaacta ggcagca 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0088
<400> 20
acagagacta ggcattt 17
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<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0182
<400> 21
acacccaaga ctcagat 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0087
<400> 22
aggggctatg actatcc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 23
ctagtgtgct ctggagc 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
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attttgagat tcccccaaag 20
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<213> Artificial Sequence
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ttgagattcc cccaaag 17
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<213> Artificial Sequence
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attttgagat tcccccaaa 19
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<213> Artificial Sequence
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ttttgagatt cccccaaa 18
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
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attttgagat tcccccaa 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ccattttgag attcccccaa 20
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
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cattttgaga ttccccca 18
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<213> Artificial Sequence
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cattttgaga ttccccc 17
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 33
aaccattttg agattcccc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 34
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<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
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accattttga gattccc 17
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 36
gaaccatttt gagattccc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0175
<400> 37
aaccattttg agattccc 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0079
<400> 38
aaccattttg agattcc 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0173
<400> 39
gaaccatttt gagattcc 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0078
<400> 40
ccacccattt agccttc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0172
<400> 41
taatggctga gatgcag 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0077
<400> 42
ccttttcact ctcaatat 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0171
<400> 43
aagctgttga aatgtatg 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ctccaaatta aatccg 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ASO-0170
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acaactcaca ttcatag 17
<210> 46
<211> 17
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<213> Artificial Sequence
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gtattgtgag gagtttc 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0169
<400> 47
cttaatgggc agtaata 17
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0074
<400> 48
gttatgccca tttctagg 18
<210> 49
<211> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 49
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<213> Artificial Sequence
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<223> ASO-0073
<400> 50
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0127
<400> 131
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ASO-0032
<400> 132
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0126
<400> 133
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<210> 134
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0031
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caaaggcatt tcagttcc 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 135
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 136
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0124
<400> 137
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0029
<400> 138
ccaacactaa ctcggc 16
<210> 139
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0123
<400> 139
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0028
<400> 140
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0027
<400> 141
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aggccaacac taactcg 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ASO-0121
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gcaaaggtca gaaacatc 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
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aatttacagt tctttgtc 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0024
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ataacgccca ctgaga 16
<210> 149
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0118
<400> 149
tagcagatgg ggcacaa 17
<210> 150
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0023
<400> 150
gagttgaagg gaggtgc 17
<210> 151
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0117
<400> 151
cccacaatga gactggt 17
<210> 152
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0022
<400> 152
ccaggcagtt tcttatg 17
<210> 153
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0116
<400> 153
actaaatgaa cttccaca 18
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0021
<400> 154
ttataaagac aagagcct 18
<210> 155
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0115
<400> 155
caggcgtctc tggatga 17
<210> 156
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0020
<400> 156
ttaacagagc catccagg 18
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0114
<400> 157
aagaagttaa cagagccatc 20
<210> 158
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0019
<400> 158
ccagttcctg aagaagtta 19
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0113
<400> 159
ccagttcctg aagaagtt 18
<210> 160
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0018
<400> 160
tttctaaact ctcaccctg 19
<210> 161
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0112
<400> 161
aattactcca cactttca 18
<210> 162
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0017
<400> 162
gcattcctca gacaaatc 18
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0111
<400> 163
cagccagtaa atgttctcca 20
<210> 164
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0016
<400> 164
gttcgtcagc cagtaa 16
<210> 165
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0110
<400> 165
ttggttcgtc agccag 16
<210> 166
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0015
<400> 166
ccagccgcag cttata 16
<210> 167
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0109
<400> 167
tccagggtgg tgaactg 17
<210> 168
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0014
<400> 168
gtgggcagga gaagggac 18
<210> 169
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0108
<400> 169
gtgccaaatc ctagaca 17
<210> 170
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0013
<400> 170
agtagccttc tgaccaa 17
<210> 171
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0107
<400> 171
gagtttggat catagaa 17
<210> 172
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0012
<400> 172
attgtgggtt ggagggc 17
<210> 173
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0106
<400> 173
agtgtttaag aagaaatg 18
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0011
<400> 174
aagagagaag gcagtgagag 20
<210> 175
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0105
<400> 175
tagtgggcac agtttcc 17
<210> 176
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0010
<400> 176
ttctggtagt gggcacag 18
<210> 177
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0009
<400> 177
tccggtaatg gcccc 15
<210> 178
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0104
<400> 178
ctccggtaat ggcccc 16
<210> 179
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0008
<400> 179
gctccggtaa tggccc 16
<210> 180
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0103
<400> 180
ctccggtaat ggccc 15
<210> 181
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0102
<400> 181
gaactcagcc cagtagac 18
<210> 182
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0007
<400> 182
gaactcagcc cagtaga 17
<210> 183
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0101
<400> 183
ttagtggaag gtgttgg 17
<210> 184
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO -0006
<400> 184
actggtgagg agttgtt 17
<210> 185
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0100
<400> 185
tgaaggaaag taggaggga 19
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0005
<400> 186
acatgtatat tatgaaggta 20
<210> 187
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0099
<400> 187
tctcctaaga gcaaagct 18
<210> 188
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0004
<400> 188
gtaggtaggc gaggag 16
<210> 189
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0098
<400> 189
ctggaaagaa ggggctgtg 19
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0003
<400> 190
tgaatggaag atacaaaact 20
<210> 191
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0097
<400> 191
gttctccagg gaagtgta 18
<210> 192
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0002
<400> 192
tgacccctga ttattca 17
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASO-0096
<400> 193
taataggcac acacccagac 20
<210> 194
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 Isomer X1 protein sequence
<400> 194
Met Arg Pro Leu Cys Val Thr Cys Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Met Gly Ala Val Ala Gly Gln Glu Asp Gly Phe Glu Gly Thr Glu Glu
20 25 30
Gly Ser Pro Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Gln Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
50 55 60
Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val Leu Leu
65 70 75 80
Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val
100 105 110
Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu
130 135 140
Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Tyr Gln His Leu Ala Thr Leu Ala His Asn
180 185 190
Gln Ser Glu Ile Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro
195 200 205
Ser Ala Arg Pro Val Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Pro Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Thr Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Leu
<210> 195
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 Isomer 2 protein sequence
<400> 195
Met Arg Pro Leu Cys Val Thr Cys Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Met Gly Ala Val Ala Gly Gln Glu Asp Gly Phe Glu Gly Thr Glu Glu
20 25 30
Gly Ser Pro Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Gln Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
50 55 60
Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val Leu Leu
65 70 75 80
Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val
100 105 110
Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu
130 135 140
Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Tyr Gln His Leu Ala Thr Leu Ala His Asn
180 185 190
Gln Ser Glu Ile Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro
195 200 205
Ser Ala Arg Pro Val Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Pro Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Thr Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Asp Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln
305 310 315 320
Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr
325 330 335
Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe
370 375 380
Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr
385 390 395 400
His Gly Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Trp His Asn Gly Lys Gln Phe
405 410 415
Thr Thr Leu Asp Arg Asp His Asp Val Tyr Thr Gly Asn Cys Ala His
420 425 430
Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
450 455 460
Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
<210> 196
<211> 3444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 mRNA 1
<400> 196
gtctggagct gaggggaggc ccagagcttt tctggggcct gggggatcct cttgcactgg 60
tgggcggaga gaagtgcctg cagccaacca gggtcaggct gtgctcacag tttcctctgg 120
cggcacgtaa aggctccaca aaggacctgg gagttcaact gaggctgctg ctgtcggcct 180
ggggatggac cccaagccct gagtggtgtt gttggaccca ggacctgcaa gaagcatgca 240
ctaaggcagc tgcggaccac actgtgaggg agagcaggtt gggagcagcc ccggtgacac 300
cagagccagc ctcatcccta ggagcttcag agagcataga ctgctgccag ctgaggccag 360
tgaggcaggg ctgctcggcg gccagtccag cctgagactc gggacctctc ctggaggcca 420
cggccaggct gtgctgctga tggcaccgtg aggcatgtga agcgctgctc cagggccaag 480
caggagagaa gaggctttca gttcataaag accaaccagc acactgcaag gaccatgagg 540
ccactgtgta tgacctactg gtggcttgga ctgctggcca cggtcggagc tgctacaggc 600
ccagaggctg acgttgaggg cacagaggat ggttcacaga gagagtacat ttacctcaac 660
aggtacaagc gggcaggtga gtcccccgac aagtgcacct acactttcat tgtgccccag 720
cagcgggtca caggtgccat ttgtgtcaac tccaaggagc ctgaggtgca cctggagaac 780
cgtgtgcaca agcaggagct ggagctgctc aacaatgagc tgcttaagca gaagcggcag 840
atcgagacgc tgcagcagct ggtagaggta gacggaggca tcgtgagcga ggtgaagctg 900
ctgcgcaagg agagccgcaa catgaactcg agagtcacgc agctgtacat gcaacttcta 960
catgagatca ttcgaaagcg agacaatgcg ctggagctct cccagctgga gaacaggatc 1020
ctgaaccaga cagctgacat gctgcagctg gctagcaagt acaaggacct ggagcacaag 1080
ttccagcacc tggctatgct ggcacacaac caatcagagg tcattgctca gctcgaagag 1140
cactgccaac gcgtacctgc agccaggcct atgccccagc cacccccagc agctccacct 1200
cgggtctacc aaccacccac ctacaaccgc atcatcaacc agatttccac caatgagatc 1260
cagagtgacc agaatctgaa ggtgctgccg ccctccttgc ccaccatgcc tgcccttacc 1320
agtctcccat cttccactga taagccatca ggtccatgga gagactgcct gcaagccctg 1380
gaagatggtc acagcaccag ctccatctac ctggtgaagc ctgagaatac caaccgcctg 1440
atgcaggtgt ggtgtgacca gagacatgac cctggaggtt ggactgtcat ccagagacgc 1500
ctggatggct ctgtcaactt cttcaggaac tgggagacct ataagcaagg gtttgggaac 1560
atcgatggtg agtactggct gggcctggag aacatctact ggctgacgaa ccaaggcaac 1620
tacaaactgc tggtaaccat ggaggactgg tctggccgta aagtctttgc tgagtatgcc 1680
agtttccgac tggagccaga aagcgagtac tataagctgc ggctggggcg ttatcatggc 1740
aatgcaggcg actcctttac ctggcacaac ggcaaacagt ttaccaccct ggacagggac 1800
catgatgtct acacaggaaa ctgtgcccac tatcagaagg gaggatggtg gtataacgcc 1860
tgtgctcact ccaacctcaa tggggtctgg taccgtgggg gccattaccg gagcagatac 1920
caggacgggg tctactgggc tgagttccga ggaggctctt actcactcaa gaaggtggtg 1980
atgatgattc ggcccaaccc caacaccttc cactaagctc tccctgcctg gccactaaca 2040
ccatggccag aagccatccc agccgtgtga cctcagcaca gctcttcgct ggcccacctc 2100
aggctggagg actgtgcttt ccaatgtggc tctgtcagac gatggaaatg aacagtgttc 2160
tctgtcccta ctgcgttctt ttacacctaa cagctccttg tattccagga taggatagaa 2220
ctgcagagtc ttccaatcag ttaagtccct ttaataaaga cacaactgcc aatatcgcca 2280
gatctgacag acatgcacac gagccaccag gtgtatgctc ttagacacac atcacacgtg 2340
ggatgtcgag atacacatat gggtttccac atatacttac cttttcctgc tcagttctca 2400
ggtgctgact ccagcaccat agctttgcgc ttaagacaat gtatgtctca ttgtctaagg 2460
acagaacagg cattgtagcc ctgatttcaa aaacagtcct tggcactgcc tggattttcc 2520
cagaatgtcc tcaagctcat ctctcacata ggggctcctg gccttctctc cttgagcccc 2580
acctcccctc agactgttgc acttcccctc tcaggacggc tcagcatccc tccgtacagt 2640
tacccctcag cctgcacctc ctgtgcctta gtctctggct gctcactgga agtcaagtcc 2700
tcttctccct gctcccctgg cctctccttt tctgccacac agagctttat ttctggcaca 2760
attcgttggc ctctgggcag gaaacagtct gggctcaggt cctggctgag aagggaaggc 2820
caggccagaa gccacagagg cagcggcata gacctgtatt cagttctgca ccttccattc 2880
atactttagc ctccacagaa ttttaacctc tacacaaaca gtaccctgct ttgccagaga 2940
caccccactg gagagaagtc gctgccaata ggttggggtc cccagacagc tgcagatttg 3000
aggtcctgtg ctcatgggga acaatcttca ccctgtcacc aagctacatc tcctcagaag 3060
atgaggccac agaaagaaaa actgactttc catgagttgc catgccatca ggggctcctg 3120
acacactgca gcagggtggc ttcctgagtc ttgtttagag ttaccagatg actgcaatgc 3180
caggggcaac atataagtca agaagttgag accctcccag tgggtgtgtg tgccaggtgt 3240
gtgaggtgtg gggcatttgg tactgtccac atctgggtgc actgccctgt tacctcagca 3300
tttctcccag tgtaccatgt agcatgttct gtgtatatat aaaagggagg ttttgttcgt 3360
ttatgttttt aaaaatatat tgccagacac aaatctgtgt attgtaatga cacaaatctg 3420
caataaaagc catcagtgtt acgt 3444
<210> 197
<211> 3524
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 mRNA 2
<400> 197
gcccgcccct gtctggagct gaggggaggc ccagagcttt tctggggcct gggggatcct 60
cttgcactgg tgggcggaga gaagtgcctg cagccaacca gggtcaggct gtgctcacag 120
tttcctctgg cggcacgtaa aggctccaca aaggacctgg gagttcaact gaggctgctg 180
ctgtcggcct ggggatggac cccaagccct gagtggtgtt gttggaccca ggacctgcaa 240
gaagcatgca ctaaggcagc tgcggaccac actgtgaggg agagcaggtt gggagcagcc 300
ccggtgacac cagagccagc ctcatcccta ggagcttcag agagcataga ctgctgccag 360
ctgaggccag tgaggcaggg ctgctcggcg gccagtccag cctgagactc gggacctctc 420
ctggaggcca cggccaggct gtgctgctga tggcaccgtg aggcatgtga agcgctgctc 480
cagggccaag caggagagaa gagttcttgg gaactctggt gacatggaag ccctgtgaga 540
gcagccatac ccccaacatc gagctttcag ttcataaaga ccaaccagca cactgcaagg 600
accatgaggc cactgtgtat gacctactgg tggcttggac tgctggccac ggtcggagct 660
gctacaggcc cagaggctga cgttgagggc acagaggatg gttcacagag agagtacatt 720
tacctcaaca ggtacaagcg ggcaggtgag tcccccgaca agtgcaccta cactttcatt 780
gtgccccagc agcgggtcac aggtgccatt tgtgtcaact ccaaggagcc tgaggtgcac 840
ctggagaacc gtgtgcacaa gcaggagctg gagctgctca acaatgagct gcttaagcag 900
aagcggcaga tcgagacgct gcagcagctg gtagaggtag acggaggcat cgtgagcgag 960
gtgaagctgc tgcgcaagga gagccgcaac atgaactcga gagtcacgca gctgtacatg 1020
caacttctac atgagatcat tcgaaagcga gacaatgcgc tggagctctc ccagctggag 1080
aacaggatcc tgaaccagac agctgacatg ctgcagctgg ctagcaagta caaggacctg 1140
gagcacaagt tccagcacct ggctatgctg gcacacaacc aatcagaggt cattgctcag 1200
ctcgaagagc actgccaacg cgtacctgca gccaggccta tgccccagcc acccccagca 1260
gctccacctc gggtctacca accacccacc tacaaccgca tcatcaacca gatttccacc 1320
aatgagatcc agagtgacca gaatctgaag gtgctgccgc cctccttgcc caccatgcct 1380
gcccttacca gtctcccatc ttccactgat aagccatcag gtccatggag agactgcctg 1440
caagccctgg aagatggtca cagcaccagc tccatctacc tggtgaagcc tgagaatacc 1500
aaccgcctga tgcaggtgtg gtgtgaccag agacatgacc ctggaggttg gactgtcatc 1560
cagagacgcc tggatggctc tgtcaacttc ttcaggaact gggagaccta taagcaaggg 1620
tttgggaaca tcgatggtga gtactggctg ggcctggaga acatctactg gctgacgaac 1680
caaggcaact acaaactgct ggtaaccatg gaggactggt ctggccgtaa agtctttgct 1740
gagtatgcca gtttccgact ggagccagaa agcgagtact ataagctgcg gctggggcgt 1800
tatcatggca atgcaggcga ctcctttacc tggcacaacg gcaaacagtt taccaccctg 1860
gacagggacc atgatgtcta cacaggaaac tgtgcccact atcagaaggg aggatggtgg 1920
tataacgcct gtgctcactc caacctcaat ggggtctggt accgtggggg ccattaccgg 1980
agcagatacc aggacggggt ctactgggct gagttccgag gaggctctta ctcactcaag 2040
aaggtggtga tgatgattcg gcccaacccc aacaccttcc actaagctct ccctgcctgg 2100
ccactaacac catggccaga agccatccca gccgtgtgac ctcagcacag ctcttcgctg 2160
gcccacctca ggctggagga ctgtgctttc caatgtggct ctgtcagacg atggaaatga 2220
acagtgttct ctgtccctac tgcgttcttt tacacctaac agctccttgt attccaggat 2280
aggatagaac tgcagagtct tccaatcagt taagtccctt taataaagac acaactgcca 2340
atatcgccag atctgacaga catgcacacg agccaccagg tgtatgctct tagacacaca 2400
tcacacgtgg gatgtcgaga tacacatatg ggtttccaca tatacttacc ttttcctgct 2460
cagttctcag gtgctgactc cagcaccata gctttgcgct taagacaatg tatgtctcat 2520
tgtctaagga cagaacaggc attgtagccc tgatttcaaa aacagtcctt ggcactgcct 2580
ggattttccc agaatgtcct caagctcatc tctcacatag gggctcctgg ccttctctcc 2640
ttgagcccca cctcccctca gactgttgca cttcccctct caggacggct cagcatccct 2700
ccgtacagtt acccctcagc ctgcacctcc tgtgccttag tctctggctg ctcactggaa 2760
gtcaagtcct cttctccctg ctcccctggc ctctcctttt ctgccacaca gagctttatt 2820
tctggcacaa ttcgttggcc tctgggcagg aaacagtctg ggctcaggtc ctggctgaga 2880
agggaaggcc aggccagaag ccacagaggc agcggcatag acctgtattc agttctgcac 2940
cttccattca tactttagcc tccacagaat tttaacctct acacaaacag taccctgctt 3000
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gcagatttga ggtcctgtgc tcatggggaa caatcttcac cctgtcacca agctacatct 3120
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ctgcaatgcc aggggcaaca tataagtcaa gaagttgaga ccctcccagt gggtgtgtgt 3300
gccaggtgtg tgaggtgtgg ggcatttggt actgtccaca tctgggtgca ctgccctgtt 3360
acctcagcat ttctcccagt gtaccatgta gcatgttctg tgtatatata aaagggaggt 3420
tttgttcgtt tatgttttta aaaatatatt gccagacaca aatctgtgta ttgtaatgac 3480
acaaatctgc aataaaagcc atcagtgtta cgtggataca ccca 3524
<210> 198
<211> 1853
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 mRNA 3
<400> 198
ccaagccctg agtggtgttg ttggacccag gacctgcaag aagcatgcac taaggcagct 60
gcggaccaca ctgtgaggga gagcaggttg ggagcagccc cggtgacacc agagccagcc 120
tcatccctag gagcttcaga gagcatagac tgctgcctga ggccagtgag gcagggctgc 180
tcggcggcca gtccagcctg agactcggga cctctcctgg aggccacggc caggctgtgc 240
tgctgatggc accgtgaggc atgtgaagcg ctgctccagg gccaagcagg agagaagagg 300
ctttcagttc ataaagacca accagcacac tgcaaggacc atgaggccac tgtgtatgac 360
ctactggtgg cttggactgc tggccacggt cggagctgct acaggcccag aggctgacgt 420
tgagggcaca gaggatggtt cacagagaga gtacatttac ctcaacaggt acaagcgggc 480
aggtgagtcc cccgacaagt gcacctacac tttcattgtg ccccagcagc gggtcacagg 540
tgccatttgt gtcaactcca aggagcctga ggtgcacctg gagaaccgtg tgcacaagca 600
ggagctggag ctgctcaaca atgagctgct taagcagaag cggcagatcg agacgctgca 660
gcagctggta gaggtagacg gaggcatcgt gagcgaggtg aagctgctgc gcaaggagag 720
ccgcaacatg aactcgagag tcacgcagct gtacatgcaa cttctacatg agatcattcg 780
aaagcgagac aatgcgctgg agctctccca gctggagaac aggatcctga accagacagc 840
tgacatgctg cagctggcta gcaagtacaa ggacctggag cacaagttcc agcacctggc 900
tatgctggca cacaaccaat cagaggtcat tgctcagctc gaagagcact gccaacgcgt 960
acctgcagcc aggcctatgc cccagccacc cccagcagct ccacctcggg tctaccaacc 1020
acccacctac aaccgcatca tcaaccagat ttccaccaat gagatccaga gtgaccagaa 1080
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cactgataag ccatcaggtc catggagaga ctgcctgcaa gccctggaag atggtcacag 1200
caccagctcc atctacctgg tgaagcctga gaataccaac cgcctgatgc aggtgtggtg 1260
tgaccagaga catgaccctg gaggttggac tgtcatccag agacgcctgg atggctctgt 1320
caacttcttc aggaactggg agacctataa gcaagggttt gggaacatcg atggtgagta 1380
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cctcaatggg gtctggtacc gtgggggcca ttaccggagc agataccagg acggggtcta 1740
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<210> 199
<211> 1853
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 mRNA 4
<400> 199
ccaagccctg agtggtgttg ttggacccag gacctgcaag aagcatgcac taaggcagct 60
gcggaccaca ctgtgaggga gagcaggttg ggagcagccc cggtgacacc agagccagcc 120
tcatccctag gagcttcaga gagcatagac tgctgcctga ggccagtgag gcagggctgc 180
tcggcggcca gtccagcctg agactcggga cctctcctgg aggccacggc caggctgtgc 240
tgctgatggc accgtgaggc atgtgaagcg ctgctccagg gccaagcagg agagaagagg 300
ctttcagttc ataaagacca accagcacac tgcaaggacc atgaggccac tgtgtatgac 360
ctactggtgg cttggactgc tggccacggt cggagctgct acaggcccag aggctgacgt 420
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ccgcaacatg aactcgagag tcacgcagct gtacatgcaa cttctacatg agatcattcg 780
aaagcgagac aatgcgctgg agctctccca gctggagaac aggatcctga accagacagc 840
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tatgctggca cacaaccaat cagaggtcat tgctcagctc gaagagcact gccaacgcgt 960
acctgcagcc aggcctatgc cccagccacc cccagcagct ccacctcggg tctaccaacc 1020
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caccagctcc atctacctgg tgaagcctga gaataccaac cgcctgatgc aggtgtggtg 1260
tgaccagaga catgaccctg gaggttggac tgtcatccag agacgcctgg atggctctgt 1320
caacttcttc aggaactggg agacctataa gcaagggttt gggaacatcg atggtgagta 1380
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gccagaaagc gagtactata agctgcggct ggggcgttat catggcaatg caggcgactc 1560
ctttacctgg cacaacggca aacagtttac caccctggac agggaccatg atgtctacac 1620
aggaaactgt gcccactatc agaagggagg atggtggtat aacgcctgtg ctcactccaa 1680
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<210> 200
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 1
<400> 200
atgaggccac tgtgtatgac ctactggtgg cttggactgc tggccacggt cggagctgct 60
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ctcaacaggt acaagcgggc aggtgagtcc cccgacaagt gcacctacac tttcattgtg 180
ccccagcagc gggtcacagg tgccatttgt gtcaactcca aggagcctga ggtgcacctg 240
gagaaccgtg tgcacaagca ggagctggag ctgctcaaca atgagctgct taagcagaag 300
cggcagatcg agacgctgca gcagctggta gaggtagacg gaggcatcgt gagcgaggtg 360
aagctgctgc gcaaggagag ccgcaacatg aactcgagag tcacgcagct gtacatgcaa 420
cttctacatg agatcattcg aaagcgagac aatgcgctgg agctctccca gctggagaac 480
aggatcctga accagacagc tgacatgctg cagctggcta gcaagtacaa ggacctggag 540
cacaagttcc agcacctggc tatgctggca cacaaccaat cagaggtcat tgctcagctc 600
gaagagcact gccaacgcgt acctgcagcc aggcctatgc cccagccacc cccagcagct 660
ccacctcggg tctaccaacc acccacctac aaccgcatca tcaaccagat ttccaccaat 720
gagatccaga gtgaccagaa tctgaaggtg ctgccgccct ccttgcccac catgcctgcc 780
cttaccagtc tcccatcttc cactgataag ccatcaggtc catggagaga ctgcctgcaa 840
gccctggaag atggtcacag caccagctcc atctacctgg tgaagcctga gaataccaac 900
cgcctgatgc aggtgtggtg tgaccagaga catgaccctg gaggttggac tgtcatccag 960
agacgcctgg atggctctgt caacttcttc aggaactggg agacctataa gcaagggttt 1020
gggaacatcg atggtgagta ctggctgggc ctggagaaca tctactggct gacgaaccaa 1080
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Val Gly Ala Ala Thr Gly Pro Glu Ala Asp Val Glu Gly Thr Glu Asp
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Gly Ser Gln Arg Glu Tyr Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Pro Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
50 55 60
Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val His Leu
65 70 75 80
Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val
100 105 110
Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu
130 135 140
Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Phe Gln His Leu Ala Met Leu Ala His Asn
180 185 190
Gln Ser Glu Val Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro
195 200 205
Ala Ala Arg Pro Met Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Ala Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln
305 310 315 320
Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr
325 330 335
Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe
370 375 380
Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr
385 390 395 400
His Gly Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Trp His Asn Gly Lys Gln Phe
405 410 415
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420 425 430
Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
450 455 460
Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 3
<400> 202
Gly Arg Ala Ala Arg Arg Pro Val Gln Pro Glu Thr Arg Asp Leu Ser
1 5 10 15
Trp Arg Pro Arg Pro Gly Cys Ala Ala Asp Gly Thr Val Arg His Val
20 25 30
Lys Arg Cys Ser Arg Ala Lys Gln Glu Arg Arg Gly Phe Gln Phe Ile
35 40 45
Lys Thr Asn Gln His Thr Ala Arg Thr Met Arg Pro Leu Cys Met Thr
50 55 60
Tyr Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Thr Val Gly Ala Ala Thr Gly Pro
65 70 75 80
Glu Ala Asp Val Glu Gly Thr Glu Asp Gly Ser Gln Arg Glu Tyr Ile
85 90 95
Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly Glu Ser Pro Asp Lys Cys Thr
100 105 110
Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg Val Thr Gly Ala Ile Cys Val
115 120 125
Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val His Leu Glu Asn Arg Val His Lys Gln
130 135 140
Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile
145 150 155 160
Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu
165 170 175
Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Asn Met Asn Ser Arg Val Thr
180 185 190
Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn
195 200 205
Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala
210 215 220
Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Lys Asp Leu Glu His Lys Phe
225 230 235 240
Gln His Leu Ala Met Leu Ala His Asn Gln Ser Glu Val Ile Ala Gln
245 250 255
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260 265 270
Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn
275 280 285
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Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Leu Pro Thr Met Pro Ala Leu Thr Ser
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu
325 330 335
Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys
340 345 350
Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln Val Trp Cys Asp Gln Arg His
355 360 365
Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val
370 375 380
Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr Lys Val Arg Pro Leu Gly Leu
385 390 395 400
Tyr Ala Leu Pro Val Arg
405
<210> 203
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 4
<400> 203
Met Arg Pro Leu Cys Met Thr Tyr Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Thr
1 5 10 15
Val Gly Ala Ala Thr Gly Pro Glu Ala Asp Val Glu Gly Thr Glu Asp
20 25 30
Gly Ser Gln Arg Glu Tyr Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Pro Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
50 55 60
Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val His Leu
65 70 75 80
Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val
100 105 110
Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu
130 135 140
Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Phe Gln His Leu Ala Met Leu Ala His Asn
180 185 190
Gln Ser Glu Val Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro
195 200 205
Ala Ala Arg Pro Met Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Ala Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln
305 310 315 320
Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr
325 330 335
Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe
370 375 380
Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr
385 390 395 400
His Gly Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Trp His Asn Gly Lys Gln Phe
405 410 415
Thr Thr Leu Asp Arg Asp His Asp Val Tyr Thr Gly Asn Cys Ala His
420 425 430
Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
450 455 460
Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
<210> 204
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 5
<400> 204
Met Arg Pro Leu Cys Met Thr Tyr Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Thr
1 5 10 15
Val Gly Ala Ala Thr Gly Pro Glu Ala Asp Val Glu Gly Thr Glu Asp
20 25 30
Gly Ser Gln Arg Glu Tyr Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Pro Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
50 55 60
Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val His Leu
65 70 75 80
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Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val
100 105 110
Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg
115 120 125
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130 135 140
Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Phe Gln His Leu Ala Met Leu Ala His Asn
180 185 190
Gln Ser Glu Val Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro
195 200 205
Ala Ala Arg Pro Met Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Ala Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln
305 310 315 320
Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr
325 330 335
Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe
370 375 380
Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr
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405 410 415
Thr Thr Leu Asp Arg Asp His Asp Val Tyr Thr Gly Asn Cys Ala His
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Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
450 455 460
Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
<210> 205
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 6
<400> 205
Met Arg Pro Leu Cys Met Thr Tyr Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Thr
1 5 10 15
Val Gly Ala Ala Thr Gly Pro Glu Ala Asp Val Glu Gly Thr Glu Asp
20 25 30
Gly Ser Gln Arg Glu Tyr Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Pro Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
50 55 60
Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val His Leu
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Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu
85 90 95
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100 105 110
Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu
130 135 140
Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn
145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Phe Gln His Leu Ala Met Leu Ala His Asn
180 185 190
Gln Ser Glu Val Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro
195 200 205
Ala Ala Arg Pro Met Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Ala Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
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305 310 315 320
Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr
325 330 335
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340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe
370 375 380
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385 390 395 400
His Gly Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Trp His Asn Gly Lys Gln Phe
405 410 415
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420 425 430
Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
450 455 460
Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
<210> 206
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 7
<400> 206
Met Arg Pro Leu Cys Met Thr Tyr Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Thr
1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
165 170 175
Lys Asp Leu Glu His Lys Phe Gln His Leu Ala Met Leu Ala His Asn
180 185 190
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Ala Ala Arg Pro Met Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val
210 215 220
Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn
225 230 235 240
Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Leu Pro
245 250 255
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260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln
305 310 315 320
Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr
325 330 335
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340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe
370 375 380
Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr
385 390 395 400
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405 410 415
Thr Thr Leu Asp Arg Asp His Asp Val Tyr Thr Gly Asn Cys Ala His
420 425 430
Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
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Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
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<210> 207
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<212> DNA
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<223> ANGPTL2 mRNA 1
<400> 207
aactgaggct gctgctgtcg gcctggggat ggaccccaag ccctgagtgg tgctgttgga 60
cccaggacct gcaaggagca cgcactaagg cagctacgga ccacgctgtg agggagagca 120
ggttgggagc agccccagtg acaccagagc cagcctcatc cctaagagct tctaagagca 180
tagactgctg ccagctgagg ccagtaaggc agggctgctc ggcggccagt ccagcctaag 240
actcgggacc tctcctggag gccacggcca ggctgtcccg ctgatggcac cgggaagcat 300
gtgaagaccc tgctccaggg ccaagcagga gagaagaggt ttcaagagac ctcattcata 360
aagaccaagg agcacactgc aaggaccatg aggccactgt gtatgactta ctggtggctt 420
ggactgctgg ccaccgtggg agctgttaca ggcccagagg ctgatgttga gggcgcagag 480
gatggttcgc agagagagta catttacctc aacaggtaca agagggcagg tgagtcccca 540
gacaagtgca cctacacttt cattgtgccc cagcagcggg tcacaggtgc catttgtgtc 600
aactccaaag agcccgaggt gcacctggag aaccgtgtgc acaagcagga gctggagctg 660
ctcaacaatg agctgcttaa gcagaagcgg cagatcgaga cgctgcagca gctggtagag 720
gtagatggcg gcatcgtgag cgaggtgaag ctcgtgcgca aggagagccg caacatgaac 780
tctcgggtca cacagctgta catgcagctt ctacacgaga tcattcgcaa gcgagacaat 840
gcgctggagc tttcccagct ggagaacagg atcctgaacc agacagctga catgctgcag 900
ctggtgagca agtacaagga cctggagcac aagttccagc acctggatat gctggcacac 960
aaccaatcag aggtcattgc ccagcttgaa gagcactgcc aacgtgtacc tgcagccagg 1020
cctgtgcccc agccaccccc agccacgcca cctcgggtct accagccacc aacctacaac 1080
cgcatcatca accagatctc cactaatgag atccagagtg accagaatct gaaggtgctg 1140
ccaccctccc tgcccaccat gcctgccctt accagtctcc catcttccac tgataagcca 1200
tcaggtccat ggagagattg tctacaggcc ctggaggatg gtcacagcac cagctccatc 1260
tacctggtga agccggagaa taccaaccgc cttatgcagg tgtggtgcga ccagagacat 1320
gaccctgggg gttggactgt catccagaga cgcctggatg gctctgtcaa cttcttcagg 1380
aactgggaga cctataagca agggtttggg aacatcgacg gcgaatactg gctgggcctg 1440
gagaacatct actggctgac gaaccaaggc aactacaaat tgcttgtaac catggaggac 1500
tggtctggcc gcaaagtctt tgcagagtat gctagcttcc gactggagcc agaaagcgag 1560
tactataagc tgcggctggg gcgttatcac ggcaacgcag gcgactcctt tacctggcac 1620
aacggcaaac agttcaccac cctggacagg gaccatgatg tctacacagg aaactgtgcc 1680
cactatcaga agggaggatg gtggtacaat gcctgtgctc actccaacct caatggggtc 1740
tggtaccgtg ggggccatta ccggagccga taccaggatg gggtctactg ggctgagttc 1800
cgaggaggat cttactcact caagaaggtg gtgatgatga ttcggcccaa ccccaacact 1860
ttccattaag ctctctctgc ctggccactt acggcattgc cagaagccat cccaactgtg 1920
cgacgtcagc acagctcttc actggcccac ctcaggctgg gaggacagag tgctggactc 1980
tgctctccaa gtggctgtca gatgatggag atgaaagggc ttctctgccc ctcctgcctt 2040
cttttacacc cagccatccc tgtattccag gacaggacag aactgcaatc ttccaatcag 2100
ttaagtctta ataaaaattt caactgccaa aaaaaaaa 2138
<210> 208
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 1
<400> 208
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1 5 10 15
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35 40 45
Glu Ser Pro Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr
355 360 365
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370 375 380
Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
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Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
<210> 209
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANGPTL2 protein 2
<400> 209
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Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr
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Lys Asp Leu Glu His Lys Phe Gln His Leu Ala Met Leu Ala His Asn
180 185 190
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195 200 205
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Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Thr Met Pro Ala Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser
260 265 270
Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Ser Thr
275 280 285
Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu
435 440 445
Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp
450 455 460
Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys
465 470 475 480
Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His
485 490
Claims (58)
- 안지오포이에틴 유사 2 (ANGPTL2) 전사체 내의 핵산 서열에 상보적인 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO).
- 제1항에 있어서, ANGPTL2 전사체 내의 핵산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 상보적인 ASO.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, ANGPTL2 전사체가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 196, 서열식별번호: 197, 서열식별번호: 198, 서열식별번호: 199, 및 서열식별번호: 207로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 ASO.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ANGPTL2 단백질을 발현하는 인간 세포 (예를 들어, SK-N-AS 세포)에서 ANGPTL2 단백질 발현을 감소시킬 수 있는 ASO.
- 제4항에 있어서, ANGPTL2 단백질 발현이 ASO에 노출되지 않은 인간 세포에서의 ANGPTL2 단백질 발현과 비교하여 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%만큼 감소되는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, ANGPTL2 전사체 (예를 들어, mRNA)를 발현하는 인간 세포 (예를 들어, SK-N-AS 세포)에서 ANGPTL2 전사체 발현을 감소시킬 수 있는 ASO.
- 제6항에 있어서, ANGPTL2 전사체 발현이 ASO에 노출되지 않은 인간 세포에서의 ANGPTL2 전사체 발현과 비교하여 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%만큼 감소되는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 갭머인 ASO.
- 제8항에 있어서, 1종 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 ASO.
- 제9항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 중 1종 이상이 2'-O-알킬-RNA; 2'-O-메틸 RNA (2'-OMe); 2'-알콕시-RNA; 2'-O-메톡시에틸-RNA (2'-MOE); 2'-아미노-DNA; 2'-플루오로-RNA; 2'-플루오로-DNA; 아라비노 핵산 (ANA); 2'-플루오로-ANA; 비시클릭 뉴클레오시드 유사체 (LNA); 또는 그의 조합을 포함하는 것인 ASO.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 1종 이상의 뉴클레오시드 유사체가 친화도 증진 2' 당 변형된 뉴클레오시드인 ASO.
- 제11항에 있어서, 친화도 증진 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 LNA인 ASO.
- 제12항에 있어서, LNA가 구속성 에틸 뉴클레오시드 (cEt), 2',4'-구속성 2'-O-메톡시에틸 (cMOE), α-L-LNA, β-D-LNA, 2'-O,4'-C-에틸렌-가교된 핵산 (ENA), 아미노-LNA, 옥시-LNA, 티오-LNA, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 ASO.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 5'-메틸-시토신 핵염기를 포함하는 ASO.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (i) SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 mRNA 수준을 감소시킬 수 있거나; (ii) SK-N-AS 세포에서 ANGPTL2 단백질 수준을 감소시킬 수 있거나; (iii) 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 감소, 호전, 또는 치료할 수 있거나; 또는 (iv) 그의 임의의 조합을 가능하게 하는 ASO.
- 제15항에 있어서, 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애가 심혈관 질환, 비만, 대사 질환, 제2형 당뇨병, 암, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 (i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1 - 211; (ii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 471 - 686; (iii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,069 - 1,376; (iv) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,666 - 8,673; (v) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 8,975 - 12,415; (vi) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,739 - 18,116; (vii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,422 - 29,875; 또는 (viii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,373 - 35,389를 포함하는 핵산 서열에 상보적인 것인 ASO.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 (i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 37 - 161; (ii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 521 - 636; (iii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,119 - 1,326; (iv) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,716 - 8,623; (v) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 9,025 - 12,365; (vi) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,789 - 18,066; (vii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,472 - 29,825; 또는 (viii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,423 - 35,339를 포함하는 핵산 서열에 상보적인 것인 ASO.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 (i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 87 - 111; (ii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 571 - 586; (iii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,169 - 1,276; (iv) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1,766 - 8,573; (v) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 9,075 - 12,315; (vi) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 12,839 - 18,016; (vii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 18,522 - 29,775; 또는 (viii) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30,473 - 35,289를 포함하는 핵산 서열에 상보적인 것인 ASO.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,187 - 20,234를 포함하는 핵산에 상보적인 것인 ASO.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 20,202 - 20,219를 포함하는 핵산에 상보적인 것인 ASO.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 1 또는 2개의 미스매치를 갖는 서열식별번호: 4 내지 서열식별번호: 193을 포함하는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 도 2의 서열 (서열식별번호: 4 내지 서열식별번호: 193)로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 93, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 97, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 또는 서열식별번호: 146을 포함하는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 88, 또는 서열식별번호: 120을 포함하는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 ASO.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 도 2의 설계로 이루어진 군으로부터 선택된 설계를 가지며, 여기서 대문자는 당 변형된 뉴클레오시드이고 소문자는 DNA인 ASO.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 15 내지 20개 뉴클레오티드 길이를 갖는 ASO.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인 ASO.
- 제29항에 있어서, 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결인 ASO.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 뉴클레오시드간 연결이 변형된 것인 ASO.
- 제31항에 있어서, 각각의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결인 ASO.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO를 포함하며, 여기서 ASO는 적어도 1개의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티에 공유 부착된 것인 접합체.
- 제33항에 있어서, 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티가 단백질, 지방산 쇄, 당 잔기, 당단백질, 중합체, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 접합체.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO 또는 제33항 또는 제34항의 접합체, 및 제약상 허용되는 희석제, 담체, 염, 또는 아주반트를 포함하는 제약 조성물.
- 제35항에 있어서, 제약상 허용되는 염이 나트륨 염, 칼륨 염, 암모늄 염, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 제약 조성물.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 적어도 1종의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제37항에 있어서, 추가의 치료제가 ANGPTL2 길항제인 제약 조성물.
- 제38항에 있어서, ANGPTL2 길항제가 항-ANGPTL2 항체 또는 그의 단편인 제약 조성물.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO, 제33항 또는 제34항의 접합체, 또는 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제약 조성물, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO, 제33항 또는 제34항의 접합체, 또는 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제약 조성물, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 진단 키트.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO, 제33항 또는 제34항의 접합체, 또는 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 ANGPTL2 단백질을 발현하는 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포에서의 ANGPTL2 단백질 발현은 투여 후에 억제 또는 감소되는 것인, 세포에서 ANGPTL2 단백질 발현을 억제 또는 감소시키는 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO, 제33항 또는 제34항의 접합체, 또는 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 ANGPTL2 단백질을 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 세포에서의 ANGPTL2 단백질 발현은 접촉 후에 억제 또는 감소되는 것인, 세포에서 ANGPTL2 단백질 발현을 억제 또는 감소시키는 시험관내 방법.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, ASO가 투여 후 또는 접촉 후에 세포에서 ANGPTL2 전사체 (예를 들어, mRNA)의 발현을 억제 또는 감소시키는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, ANGPTL2 전사체 (예를 들어, mRNA)의 발현이 ASO에 노출되지 않은 세포와 비교하여 투여 후에 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소되는 것인 방법.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, ANGPTL2 단백질의 발현이 ASO에 노출되지 않은 세포와 비교하여 투여 후에 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 감소되는 것인 방법.
- 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 뇌 세포, 예를 들어 신경모세포 (예를 들어, SK-N-AS 세포)인 방법.
- 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상의 감소, 호전, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO, 제33항 또는 제34항의 접합체, 또는 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 감소, 호전, 또는 치료하는 방법.
- 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO, 제33항 또는 제34항의 접합체, 또는 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 용도.
- 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 ASO, 제33항 또는 제34항의 접합체, 또는 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 용도.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 요법을 필요로 하는 대상체에서 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 요법에 사용하기 위한 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물.
- 제15항, 제48항, 제50항 및 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 비정상적 ANGPTL2 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애가 심혈관 질환, 비만, 대사 질환, 제2형 당뇨병, 암, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 ASO, 방법, 용도, 또는 사용하기 위한 ASO.
- 제53항에 있어서, 심혈관 질환 또는 장애가 아테롬성동맥경화증, 관상 동맥 질환, 졸중, 심부전, 고혈압성 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 심장 판막 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 혈전색전성 질환, 정맥 혈전증, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 ASO, 방법, 용도, 또는 사용하기 위한 ASO.
- 제54항에 있어서, 심혈관 질환 또는 장애가 심부전인 ASO, 방법, 용도, 또는 사용하기 위한 ASO.
- 제55항에 있어서, 심부전이 좌측 심부전, 우측 심부전, 울혈성 심부전, 감소된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFrEF), 보존된 박출 계수를 갖는 심부전 (HFpEF), 중간-범위 박출 계수를 갖는 심부전 (HFmrEF), 비대성 심근병증 (HCM), 고혈압성 심장 질환 (HHD), 또는 고혈압성 비대성 심근병증을 포함하는 것인 ASO, 방법, 용도, 또는 사용하기 위한 ASO.
- 제48항, 제50항, 및 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법, 용도, 또는 사용하기 위한 ASO.
- 제48항, 제50항, 및 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, ASO, 접합체, 또는 제약 조성물이 심장내로, 경구로, 비경구로, 척수강내로, 뇌실내로, 경폐로, 국소로, 또는 심실내로 투여되는 것인 방법, 용도, 또는 사용하기 위한 ASO.
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