JP2022524218A - Ａｎｇｐｔｌ２アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡを標的とし、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を低減させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。ＮＧＰＴＬ２タンパク質発現の低減は、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連するようなある医学的障害、例えば、心血管関連疾患または障害の処置に有益である。
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このＰＣＴ出願は、２０１９年４月３日出願の米国仮出願６２／８２８,８６４に基づく優先権の利益を主張し、これは、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
このＰＣＴ出願は、２０１９年４月３日出願の米国仮出願６２／８２８,８６４に基づく優先権の利益を主張し、これは、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
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発明の分野
本発明は、細胞におけるアンギオポエチン様２(ＡＮＧＰＴＬ２)転写物を標的とし、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を低減させる、アンチセンスオリゴマー化合物(ＡＳＯ)に関する。ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現の低減は、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連するものなどの広範な医学的障害(例えば、心血管関連疾患または障害)に有益である。
本発明は、細胞におけるアンギオポエチン様２(ＡＮＧＰＴＬ２)転写物を標的とし、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を低減させる、アンチセンスオリゴマー化合物(ＡＳＯ)に関する。ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現の低減は、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連するものなどの広範な医学的障害(例えば、心血管関連疾患または障害)に有益である。
背景
アンギオポエチン様２(ＡＮＧＰＴＬ２)は、計８個のメンバー(ＡＮＧＰＴＬ１～８)からなる、アンギオポエチン様ファミリーに属する分泌型タンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ２は、主に心臓、脂肪組織、肺、腎臓および骨格筋に発現され、多くの生物学的過程(例えば、組織修復および血管形成)において重要な役割を有する。Kim, I., et al., J Biol Chem 274(37):26523-8 (1999)。ＡＮＧＰＴＬ２の有益な血管新生性質は、ある卒中患者で報告されている。Buga, A.M., et al., Front Aging Neurosci 6:44 (2014)。ＡＮＧＰＴＬ２はまた造血幹細胞および前駆細胞の生存および拡大、腸上皮再生の制御および有益な自然免疫応答の促進に重要な役割を有することも記載されている。Broxmeyer, H.E., et al., Blood Cells Mol Dis 48(1):25-29 (2012); Horiguchi, H., et al., EMBO J 36(4):409-424 (2017); Yugami, M., et al., J Biol Chem 291(36):18843-52 (2016)。
アンギオポエチン様２(ＡＮＧＰＴＬ２)は、計８個のメンバー(ＡＮＧＰＴＬ１～８)からなる、アンギオポエチン様ファミリーに属する分泌型タンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ２は、主に心臓、脂肪組織、肺、腎臓および骨格筋に発現され、多くの生物学的過程(例えば、組織修復および血管形成)において重要な役割を有する。Kim, I., et al., J Biol Chem 274(37):26523-8 (1999)。ＡＮＧＰＴＬ２の有益な血管新生性質は、ある卒中患者で報告されている。Buga, A.M., et al., Front Aging Neurosci 6:44 (2014)。ＡＮＧＰＴＬ２はまた造血幹細胞および前駆細胞の生存および拡大、腸上皮再生の制御および有益な自然免疫応答の促進に重要な役割を有することも記載されている。Broxmeyer, H.E., et al., Blood Cells Mol Dis 48(1):25-29 (2012); Horiguchi, H., et al., EMBO J 36(4):409-424 (2017); Yugami, M., et al., J Biol Chem 291(36):18843-52 (2016)。
科学の進歩にも関わらず、心臓関連疾患は、世界中で男性および女性の筆頭死亡原因のままである。米国心臓協会は、２０３０年までに、米国人口の約４０％がある形態の血管疾患を有すると推定され、その直接医療費は８１８０億ドルに達すると予測される。Benjamin, E.J., et al., Circulation 135:e146-e603 (2017)。それゆえに、はるかにロバストで費用効果の高い新規処置選択肢が、高度に望まれる。
発明の概要
ここに提供されるのは、アンギオポエチン様２(ＡＮＧＰＴＬ２)転写物内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)である。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％相補性である。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２転写物は、配列番号１、配列番号２、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９および配列番号２０７からなる群から選択される。
ここに提供されるのは、アンギオポエチン様２(ＡＮＧＰＴＬ２)転写物内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)である。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％相補性である。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２転写物は、配列番号１、配列番号２、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９および配列番号２０７からなる群から選択される。
ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を発現しているヒト細胞(例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞)において、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現を低減できる。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現は、ＡＳＯに曝されていないヒト細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低減される。
ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物を発現しているヒト細胞(例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞)において、ＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ)発現を低減できる。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２転写物発現は、ＡＳＯに曝されていないヒト細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２転写物と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低減される。
ある実施態様において、ＡＳＯはギャップマーである。
ある実施態様において、ＡＳＯは、１以上のヌクレオシドアナログを含む。ある実施態様において、ヌクレオシドアナログの１以上は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ(２’－ＯＭｅ)；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ(２’－ＭＯＥ)；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸(ＡＮＡ)；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシドアナログ(ＬＮＡ)；またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、１以上のヌクレオシドアナログは親和性増強２’糖修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。さらなる実施態様において、ＬＮＡは、拘束エチルヌクレオシド(ｃＥｔ)、２’,４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル(ｃＭＯＥ)、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ,４’－Ｃ－エチレン－架橋核酸(ＥＮＡ)、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡおよびこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、ＡＳＯは１以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。
ある実施態様において、ＡＳＯは、(ｉ)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルの低減；(ii)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルの低減；(iii)異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の１以上の症状の低減、軽減または処置；または(iv)これらの何れかの組み合わせが可能である。ある実施態様において、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯの連続ヌクレオチド配列は、(ｉ)配列番号１のヌクレオチド１～２１１；(ii)配列番号１のヌクレオチド４７１～６８６；(iii)配列番号１のヌクレオチド１,０６９～１,３７６；(iv)配列番号１のヌクレオチド１,６６６～８,６７３；(ｖ)配列番号１のヌクレオチド８,９７５～１２,４１５；(vi)配列番号１のヌクレオチド１２,７３９～１８,１１６；(vii)配列番号１のヌクレオチド１８,４２２～２９,８７５；または(viii)配列番号１のヌクレオチド３０,３７３～３５,３８９を含む核酸配列と相補的である。ある実施態様において、ＡＳＯの連続ヌクレオチド配列は、(ｉ)配列番号１のヌクレオチド３７～１６１；(ii)配列番号１のヌクレオチド５２１～６３６；(iii)配列番号１のヌクレオチド１,１１９～１,３２６；(iv)配列番号１のヌクレオチド１,７１６～８,６２３；(ｖ)配列番号１のヌクレオチド９,０２５～１２,３６５；(vi)配列番号１のヌクレオチド１２,７８９～１８,０６６；(vii)配列番号１のヌクレオチド１８,４７２～２９,８２５；または(viii)配列番号１のヌクレオチド３０,４２３～３５,３３９を含む核酸配列と相補的である。さらなる実施態様において、ＡＳＯの連続ヌクレオチド配列は、(ｉ)配列番号１のヌクレオチド８７～１１１；(ii)配列番号１のヌクレオチド５７１～５８６；(iii)配列番号１のヌクレオチド１,１６９～１,２７６；(iv)配列番号１のヌクレオチド１,７６６～８,５７３；(ｖ)配列番号１のヌクレオチド９,０７５～１２,３１５；(vi)配列番号１のヌクレオチド１２,８３９～１８,０１６；(vii)配列番号１のヌクレオチド１８,５２２～２９,７７５；または(viii)配列番号１のヌクレオチド３０,４７３～３５,２８９を含む核酸配列と相補的である。ある実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド２０,１８７～２０,２３４を含む核酸と相補性である。他の実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド２０,２０２～２０,２１９を含む核酸と相補性である。
ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯの連続ヌクレオチド配列は、図２における配列から選択されるヌクレオチド配列を含む(配列番号４～配列番号１９３)。
ある実施態様において、ＡＳＯの連続ヌクレオチド配列は、配列番号８、配列番号２０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８２、配列番号８８、配列番号８５、配列番号９０、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４または配列番号１４６を含む。ある実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４１、配列番号１２２、配列番号８、配列番号３８、配列番号９５、配列番号８８または配列番号１２０を含む。他の実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２またはこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯは、図２のデザインに一致する群から選択されるデザインを有し、ここで、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである。ある実施態様において、ＡＳＯは、１５～２０ヌクレオチド長を有する。
ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯの連続ヌクレオチド配列は、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施態様において、１以上の修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。ある実施態様において、ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％は修飾されている。ある実施態様において、ヌクレオシド間結合の各々はホスホロチオエート結合である。
またここに提供されるのは、ここに開示するＡＳＯを含むコンジュゲートであって、ここで、ＡＳＯは、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合する。ある実施態様において、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの何らかの組み合わせを含む。
またここに提供されるのは、ここに開示するＡＳＯまたはコンジュゲートおよび薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、医薬組成物である。ある実施態様において、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含む。ある実施態様において、さらなる治療剤はＡＮＧＰＴＬ２アンタゴニストである。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２アンタゴニストは抗ＡＮＧＰＴＬ２抗体またはそのフラグメントである。
本発明は、さらに、ここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物および使用のための指示を含むキットを提供する。また開示されるのは、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物および使用のための指示を含む、診断キットである。
ここに提供されるのは、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現を阻害または低減する方法であって、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を発現する細胞にここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することを含み、ここで、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現が投与後阻害または低減されるものである、方法である。ある態様において、本発明は、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現を阻害または低減するインビトロ方法であって、ここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物とＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を発現する細胞を接触させることを含み、ここで、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現が接触後阻害または低減されるものである、方法に関する。
ある実施態様において、ＡＳＯは、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を、投与後または接触後阻害または低減する。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現は、ＡＳＯに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低減される。さらなる実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現は、ＡＳＯに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％低減される。ある実施態様において、細胞は脳細胞、例えば、神経芽細胞(neuroblast cell)(例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞)である。
またここに提供されるのは、処置を必要とする対象における異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の１以上の症状を低減、軽減または処置する方法であって、対象にここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法である。本発明はまた、医薬の製造のための、ここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物の使用も提供する。ある実施態様において、医薬は、処置を必要とする対象における、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の処置のためのものである。ある実施態様において、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は治療に使用するためのものである。ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、処置を必要とする対象における、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の治療のためのものである。
ある実施態様において、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、心血管疾患または障害は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、静脈血栓症またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、心血管疾患または障害は心不全である。ある実施態様において、心不全は、左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率低下心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率維持心不全(ＨＦｐＥＦ)、境界型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症を含む。
ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、心臓内、経口、非経腸、髄腔内、側脳室内、肺、局所または脳室内投与される。
発明の詳細な記載
Ｉ. 定義
ある物についての単数表現は、その物の１以上をいう；例えば、「ヌクレオチド配列」は、１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、単数表現、用語、「１以上」および「少なくとも１つ」は、ここでは、相互交換可能に使用され得る。
Ｉ. 定義
ある物についての単数表現は、その物の１以上をいう；例えば、「ヌクレオチド配列」は、１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、単数表現、用語、「１以上」および「少なくとも１つ」は、ここでは、相互交換可能に使用され得る。
さらに、「および／または」は、ここで使用するとき、２つの特定の特性または成分の、他方を伴うまたは伴わない各々として解釈されるべきである。故に、ここでの「Ａおよび／またはＢ」などの表現において使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの表現において使用される用語「および／または」は、次の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
用語「含む」を使用してここで態様が記載されているとき、「からなる」および／または「から本質的になる」の用語で記載される以外類似する態様も提供されることは理解される。
他に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示において使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)により認められた形態で記載される。数値範囲は、該範囲を規定する数値を含む。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’配向で左から右に記載する。アミノ酸配列はアミノからカルボキシ配向で左から右に記載する。ここで提供する「見出し」は、本明細書を全体と見て得られる、本発明の種々の態様の限定ではない。従って、以下に定義する用語は、本明細書をその全体を見て、より完全に定義される。
用語「約」は、近似、おおよそ、周辺または領域内を意味する。用語「約」が数値範囲と共に使用されるとき、範囲は、示される数値境界の上および下に延ばされることにより修飾される。一般に、用語「約」は、数値を、記載する値の、例えば、１０パーセント上回るまたは下回る(高いまたは低い)幅まで、修飾され得る。例えば、「ＡＳＯは、ＡＳＯ投与後細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパクの発現を少なくとも約６０％低減する」との記載があるとき、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルは、５０％～７０％の範囲で減少されることが含意される。
用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、複数の核酸を包含することを意図する。ある実施態様において、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、インビボまたはインビトロの標的配列、例えば、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡまたはＤＮＡをいう。本用語が標的配列における核酸またはヌクレオチドをいうとき、核酸またはヌクレオチドは、細胞における天然に存在する配列であり得る。他の実施態様において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本発明のＡＳＯにおける配列をいう。本用語がＡＳＯにおける配列をいうとき、核酸またはヌクレオチドは天然に存在しない、すなわち、化学的に合成されたもの、酵素により産生されたもの、組み換えにより産生されたものまたはこれらの何れかの組み合わせである。ある実施態様において、ＡＳＯにおける核酸またはヌクレオチドは合成または組み換えにより産生されるが、天然に存在する配列またはそのフラグメントではない。他の実施態様において、ＡＳＯにおける核酸またはヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも１つヌクレオチドアナログを含むため、天然に存在しない。用語「核酸」または「ヌクレオシド」はポリヌクレオチドに存在する、単一核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのアナログをいう。「核酸」または「ヌクレオシド」は、天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。ある実施態様において、用語「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は相互交換可能に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列をいうとき、指すのはＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵおよびそのアナログなどの塩基の配列である。
ここで使用する用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分およびホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基などの共有結合した基(結合基)を含むグリコシドをいい、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドならびにここでは「ヌクレオチドアナログ」とも称する修飾糖および／または塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチドの両方をカバーする。ここで、単一ヌクレオチド(単位)は、モノマーまたは核酸単位とも称され得る。ある実施態様において、用語「ヌクレオチドアナログ」は、修飾糖部分を有するヌクレオチドをいう。修飾糖部分(例えば、ＬＮＡ)を有するヌクレオチドの非限定的例は、本明細書の他の箇所に開示される。他の実施態様において、用語「ヌクレオチドアナログ」は、修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドをいう。修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドは、５－メチル－シトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンを含むが、これらに限定されない。
用語「核酸塩基」は、核酸ハイブリダイゼーションで水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部分を含む。ここで使用する用語「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中機能的である修飾核酸塩基も含む。本明細書で、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しないバリアントの両方をいう。このようなバリアントは、例えば、Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載される。核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示すことができ、ここで、各文字は所望により同等な機能の修飾核酸塩基を含み得る。例えば、例示オリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５－メチルシトシンから選択される。
ここで使用する用語「ヌクレオシド」は、糖部分および塩基部分を含むグリコシドをいい、それゆえに、ＡＳＯのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合により共有結合される、ヌクレオチド単位をいうとき、使用され得る。バイオテクノロジーの分野で、用語「ヌクレオチド」は、しばしば核酸モノマーまたは単位をいうために使用される。ＡＳＯの場合、用語「ヌクレオチド」は塩基単独、すなわち、糖主鎖およびヌクレオチド間結合の存在が含意される、シトシン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、グアニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、アデニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、チミン(ＤＮＡ)およびウラシル(ＲＮＡ)を含む核酸塩基配列をいい得る。同様に、特にヌクレオチド間結合基の１以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は「ヌクレオシド」をいい得る。例えば、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定するときも、使用され得る。
ここで使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(ＡＳＯ)は、標的核酸、特に標的核酸の連続配列とハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調節できるオリゴヌクレオチドとして同定される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、それゆえにｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。ある実施態様において、ここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。ここに開示する一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己間または自己内相補性の程度が、オリゴヌクレオチドの全長にわたり５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二本鎖構造(同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二本鎖)を形成し得る。ここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾オリゴヌクレオチドである。ここで使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列全体、または、ある実施態様において、その連続ヌクレオチド配列を意味し得る。
ここで相互交換可能に使用される用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」および「ＲＮＡ干渉剤」は、ここでのＲＮＡヌクレオシドを含み、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)経路を経てＲＮＡ転写物の標的化開裂に介在する、物質をいう。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)の過程を経てｍＲＮＡの配列特異的分解を指示する。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象内の細胞の標的核酸の発現を調節、例えば、阻害する。ＲＮＡｉ剤は、一本鎖ＲＮＡｉ剤および二本鎖ｓｉＲＮＡ、ならびに短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)を含む。本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、ＲＮＡｉ剤の形であるかまたはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤の一部を形成することができる。本発明のある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列はｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤である。
用語ｓｉＲＮＡは、低分子干渉リボ核酸ＲＮＡｉ剤をいう。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ分子種であり、当分野で低分子干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られる。ｓｉＲＮＡは、一般にセンス鎖(パッセンジャー鎖とも称される)およびアンチセンス鎖(ガイド鎖とも称される)を含み、ここで、各鎖は１７～３０ヌクレオチド長、一般に１９～２５ヌクレオシド長であり、アンチセンス鎖は標的核酸(適切には成熟ｍＲＮＡ配列)に完全相補的など相補的であり、センス鎖はセンス鎖とアンチセンス鎖が二本鎖または二本鎖領域を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である。ｓｉＲＮＡ鎖は平滑末端二本鎖を形成できまたは有利にセンス鎖およびアンチセンス鎖３’末端は、例えば、１個、２個または３個のヌクレオシドの、３’オーバーハングを形成し得る。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖両者は２ｎｔ ３’オーバーハングを有する。二本鎖領域は、それゆえに、例えば１７～２５ヌクレオチド長、例えば２１～２３ヌクレオチド長であり得る。
細胞内に入ったら、アンチセンス鎖はＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、これは標的核酸の標的分解または標的阻害に介在し得る。ｓｉＲＮＡは、一般にＲＮＡヌクレオシドに加えて修飾ヌクレオシドを含む。またはある実施態様において、ｓｉＲＮＡ鎖のヌクレオチドの全ては修飾され得る。修飾の非限定的例は、ＬＮＡ(例えばＷＯ２００４０８３４３０、ＷＯ２００７０８５４８５参照)、２’フルオロ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－メトキシエチルなどの２’糖修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は不連続であり得る(例えばＷＯ２００７１０７１６２参照)。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のシード領域で生ずる熱不安定化ヌクレオチドの取り込みは、ｓｉＲＮＡのオフ・ターゲット活性の低減に有用であることが報告されている(例えばＷＯ１８０９８３２８参照)。
ある実施態様において、本発明のｓｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つ修飾ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、センス鎖の実質的に全ヌクレオチドは修飾を含む；アンチセンス鎖の実質的に全ヌクレオチドは修飾を含むまたはセンス鎖の実質的に全ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の実質的に全ヌクレオチドは修飾を含む。さらに他の実施態様において、センス鎖の全ヌクレオチドは修飾を含む；アンチセンス鎖の全ヌクレオチドは修飾を含む；またはセンス鎖の全ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全ヌクレオチドは修飾を含む。
ある実施態様において、修飾ヌクレオチドは、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン(ｄＴ)ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体構造固定されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、塩基性ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、非連結ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１,５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチドおよび２－Ｏ－(Ｎ－メチルアセトアミド)修飾ヌクレオチドおよびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され得る。適当なｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に５’－ホスフェート基または５’－ホスフェート模倣体を含む。ある実施態様において、アンチセンス鎖の５’末端はＲＮＡヌクレオシドである。
ある実施態様において、ｄｓＲＮＡ剤は、さらに少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合を含む。
ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合は一方または両方の鎖(例えば、アンチセンス鎖；またはセンス鎖)の３’末端であり得る；またはホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合は一方または両方の鎖(例えば、アンチセンス鎖；またはセンス鎖)の５’末端であり得る；またはホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合は一方または両方の鎖(例えば、アンチセンス鎖；またはセンス鎖)の５および３’両末端であり得る。ある実施態様において、残りのヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合である。
ｄｓＲＮＡ剤はさらにリガンドを含み得る。ある実施態様において、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
生物学的分布に関して、ｓｉＲＮＡは、例えば、ターゲティングリガンドにコンジュゲートされるおよび／または脂質ナノ粒子に製剤化されることができる。
本発明の他の態様は、治療用に適するｓｉＲＮＡ分子などのこれらｄｓＲＮＡを含む医薬組成物および、例えば、ここに開示する種々の疾患状態の処置のために、本発明のｓｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ分子を投与することによる、標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、１以上の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドをいう。用語「キメラオリゴヌクレオチド」は、糖修飾ヌクレオシドおよび非糖修飾ヌクレオシド両方を含むオリゴヌクレオチドをいうために、文献において使用されている用語である。ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合成により製造されたオリゴヌクレオチドであり、単離または精製された形態であり得る。
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸と相補的であるオリゴヌクレオチドの領域をいう。本用語は、ここでは用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と相互交換可能に使用される。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域などの連続ヌクレオチド配列を含み、所望によりさらなるヌクレオチド、例えば連続ヌクレオチド配列に官能基を結合させるために使用し得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸と相補的であってもなくてもよい。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド自体より長くてはならず、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列より短くてはならないことは理解される。
ここで使用する用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または(核酸)塩基部分の１以上の修飾により修飾されたヌクレオシドをいう。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドは、用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と相互交換可能にも使用され得る。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、ここではＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、ワトソン・クリック塩基対形成が可能であるならば、なお一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２個のヌクレオシドを共有結合する、ホスホジエステル(ＰＯ)結合以外の結合として当業者に一般に理解されるとおり、定義される。ある実施態様において、修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ここで使用する用語「ヌクレオチド長」は、ヌクレオシドアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列またはその連続ヌクレオチド配列などのある配列におけるヌクレオチド(モノマー)の総数を意味する。例えば、tacatattatattactcctc(配列番号１５８)の配列は２０ヌクレオチドを有し、故に、本配列のヌクレオチド長は２０である。用語「ヌクレオチド長」は、それゆえにここでは、「ヌクレオチド数」と相互交換可能に使用される。
当業者には認識されるとおり、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、５’ヌクレオチド間結合基を含まないが、５’末端基は含み得る。
ここで使用する用語「アルキル」は、単独でまたは組み合わせて、１～８炭素原子の直鎖または分岐鎖アルキル基、特に１～６炭素原子の直鎖または分岐鎖アルキル基、より特に１～４炭素原子の直鎖または分岐鎖アルキル基を示す。直鎖または分岐鎖Ｃ１－Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチルおよび異性体オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの具体例はメチルである。アルキルのさらなる例は、モノ、ジまたはトリフルオロメチル、エチルまたはプロピル、例えばシクロプロピル(ｃＰｒ)またはモノ、ジまたはトリフルオロシクロプロピルである。
用語「アルコキシ」は、単独でまたは組み合わせて、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ.ブトキシおよびｔｅｒｔ.ブトキシなどの、式アルキル－Ｏ－(式中、用語「アルキル」は先に示した意味を有する)の基を意味する。特定の「アルコキシ」はメトキシである。
用語「保護基」は、単独でまたは組み合わせて、化学反応が他の保護されていない反応部位で選択的に起こり得るように、多官能性化合物において、反応部位を選択的に遮断する基をいう。保護基は除去され得る。保護基の例は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
本発明の出発物質または化合物の一つが、１以上の反応工程の反応下で不安定なまたは反応性である１以上の官能基を含むならば、適切な保護基(例えば、"Protective Groups in Organic Chemistry" by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New Yorkに記載のとおり)を、当分野で周知の方法を適用して、重要な工程の前に導入され得る。このような保護基は、文献に記載の標準的方法を使用して、合成の後の段階で除去され得る。保護基の例は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル(Ｂｏｃ)、９－フルオレニルメチルカルバメート(Ｆｍｏｃ)、２－トリメチルシリルエチルカルバメート(Ｔｅｏｃ)、カルボベンジルオキシ(Ｃｂｚ)およびｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル(Ｍｏｚ)である。
ここに記載する化合物は、数か所の不斉中心を含み得て、光学的に純粋なエナンチオマー、例えば、ラセミ体などのエナンチオマー混合物、ジアステレオ異性体混合物、ジアステレオ異性ラセミ体またはジアステレオ異性ラセミ体混合物の形で存在し得る。
ここで使用する用語「二環式糖」は、二環式構造をもたらす第二の環を形成するために、４～７員環の２つの原子を接続する架橋を含む、４～７員環を含む修飾糖部分をいう。ある実施態様において、架橋は、ＬＮＡヌクレオシドで観察される、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を接続する(すなわち、２’－４’架橋)。
ここで使用する「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「停止コドン」(ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ)は、一般にアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなされ得て、一方、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「ＵＴＲ」)などはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、一般に得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端での開始コドンおよび得られたポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端での翻訳停止コドンにより決定される。
ここで使用する用語「非コード領域」は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例は、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「ＵＴＲ」)、非コーディングエクソンなどを含むが、これらに限定されない。エクソンの一部は、完全に各転写物の５’非翻訳領域(５’ＵＴＲ)または３’非翻訳領域(３’ＵＴＲ)であるかまたは一部である。非翻訳領域は、転写物の効率的翻訳ならびに翻訳速度および転写物の半減期の制御に重要である。
用語「領域」は、ヌクレオチド配列の文脈で使用するとき、その配列の部分をいう。例えば、用語「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」は、それぞれ特定のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補体内に位置する、該ヌクレオチド配列より短いが少なくとも１０ヌクレオチドより長い配列をいう。用語「部分－配列」または「部分配列」も、ヌクレオチド配列の領域をいい得る。
用語「下流」は、ヌクレオチド配列をいうとき、核酸またはヌクレオチド配列が対照ヌクレオチド配列の３’に位置することを意味する。ある実施態様において、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
用語「上流」は、対照ヌクレオチド配列の５’に位置するヌクレオチド配列をいう。
ここで使用する用語「制御領域」は、コード領域の上流(５’非コード配列)、内部または下流(３’非コード配列)に位置し、付随するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。制御領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ＵＴＲおよびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核生物細胞での発現について意図されるならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写停止配列は、通常コード配列の３’に位置する。
ここで使用する用語「転写物」は、ＤＮＡの転写により合成され、プロセシング後メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)になる、すなわち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ前駆体)およびプロセシングされたｍＲＮＡ自体である、一次転写物をいう。用語「転写物」は、「ｍＲＮＡ前駆体」および「ｍＲＮＡ」と相互交換可能に使用され得る。ＤＮＡ鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびその他などの種々のタンパク質およびＲＮＡを産生するために、成熟した、機能的形態に変換されるように、いくつかの方法で修飾される。故に、用語「転写物」は、エクソン、イントロン、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含み得る。
ここで使用する用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程をいう。ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)への転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。発現は、「遺伝子産物」を産生する。ここで使用する遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されたメッセンジャーＲＮＡまたは転写物から翻訳されたポリペプチドであり得る。ここに記載する遺伝子産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングされた核酸または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合またはタンパク分解性開裂されたポリペプチドを含む。
ここで使用する用語「同一性」は、連続ヌクレオチド配列にわたり、対照配列(例えば、配列モチーフ)と同一である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)における連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの比(パーセントで表す)をいう。同一性のパーセンテージは、故に、２つの配列(本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および対照配列)間で同一(マッチ)である整列させた核酸塩基数を計数し、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの総数で除し、１００倍することにより計算される。それゆえに、同一性のパーセンテージ＝(マッチ×１００)／整列させた領域の長さ(例えば連続ヌクレオチド配列)である。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性決定に際し、核酸塩基の化学修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対形成する機能的能力を保持する限り、無視される(例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的で、シトシンと同一と考えられる)。
ポリヌクレオチド対照配列と整列させた単一ポリヌクレオチド標的配列内の異なる領域は、各々、それら自体のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は、１／１０で四捨五入できることは留意される。例えば、８０.１１、８０.１２、８０.１３および８０.１４は８０.１に切り下げ、一方８０.１５、８０.１６、８０.１７、８０.１８および８０.１９は８０.２に切り上げる。長さの値は常に整数であることも留意される。
ここで使用する用語「相同」および「相同性」は、用語「同一性」および「同一」と相互交換可能である。
用語「その天然に存在するバリアント」は、マウス、サルおよびヒトなどの哺乳動物などの規定された分類群内で天然に存在するＡＮＧＰＴＬ２ポリペプチド配列またはＡＮＧＰＴＬ２核酸配列(例えば、転写物)のバリアントをいう。一般に、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」をいうとき、本用語はまた染色体転座または複製により染色体位置９ｑ３３.３でみられるＡＮＧＰＴＬ２コード化ゲノムＤＮＡのあらゆるアレルバリアント(すなわち、GenBank Accession No. NC_000009.12の残基１２７,０８７,３４９～１２７,１２２,７６５の逆相補体)およびそれ由来のｍＲＮＡなどのＲＮＡも包含し得る。「天然に存在するバリアント」はまたＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡの選択的スプライシング由来のバリアントも含み得る。特定のポリペプチド配列をいうとき、例えば、本用語はまたタンパク質の天然に存在する形態も含み、それは、それゆえに、例えばシグナルペプチド開裂、タンパク分解性開裂、グリコシル化などの同時翻訳または翻訳後修飾によりプロセシングされ得る。
用語「対応する」および「に対応する」は、２つの別の核酸またはヌクレオチド配列をいうとき、相同性および／または機能性に基づき、互いに対応するまたは類似する配列の領域を明示するために使用できるが、特定配列のヌクレオチドは数が異なり得る。例えば、遺伝子転写物の種々のアイソフォームが、選択的スプライシングおよび／または他の修飾に基づき、各アイソフォームでナンバリングが異なり得る、類似のまたは保存されたヌクレオチド配列の部分を有し得る。さらに、核酸またはヌクレオチド配列を特徴づけるとき、種々のナンバリングシステム(例えば、遺伝子転写物および配列のナンバリングを翻訳開始コドンから開始するかまたは５’ＵＴＲを含むか)が用いられ得ることは認識される。さらに、遺伝子または遺伝子転写物の種々のバリアントの核酸またはヌクレオチド配列は異なり得る。しかしながら、ここで使用する核酸またはヌクレオチド配列相同性および／または機能性を共有するバリアントの領域は、互いに「対応する」と考えられる。例えば、配列番号１(「対照配列」)のヌクレオチドＸ～Ｙに対応するＡＮＧＰＴＬ２転写物のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチドＸ～Ｙと同一配列または類似の配列を有するＡＮＧＰＴＬ２転写物配列(例えば、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ)をいい、ここで、Ｘは開始部位であり、Ｙは末端部位である(図２に示すとおり)。当業者は、ＡＮＧＰＴＬ２転写物配列と配列番号１の整列により、ＡＮＧＰＴＬ２転写物配列における対応するＸおよびＹ残基を同定できる。
用語「対応するヌクレオチドアナログ」および「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチドアナログにおける核酸塩基と天然に存在するヌクレオチドが、同じ対形成またはハイブリダイズ能を有することを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの２－デオキシリボース単位がアデニンに結合しているとき、「対応するヌクレオチドアナログ」は、アデニンに結合したペントース単位(２－デオキシリボースと異なる)を含む。
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対形成の能力をいう。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン(Ｇ)－シトシン(Ｃ)およびアデニン(Ａ)－チミン(Ｔ)／ウラシル(Ｕ)である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含み得て、例えば５－メチルシトシン(シトシンの対応するヌクレオチドアナログ例)はしばしばシトシンの代わりに使用され、そのようなものとして、用語相補性は、非修飾および修飾核酸塩基間のワトソン・クリック塩基対形成を包含するとして理解される(例えばHirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1参照)。ここで使用する用語「逆相補体」、「逆相補的」および「逆相補性」は、用語「相補体」、「相補的」および「相補性」と相互交換可能である。ある実施態様において、用語「相補的」は、ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の連続核酸配列と１００％マッチまたは相補性(すなわち、完全相補的)をいう。ある実施態様において、用語「相補的」は、ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の連続核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％マッチまたは相補性をいう.３７ １.４.１)。
ここで使用する用語「％相補的」は、連続ヌクレオチド配列にわたる核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)における連続ヌクレオチド配列の、対照配列(例えば、標的配列または配列モチーフ)と相補的であるヌクレオチドの比率(パーセント)をいう。相補性のパーセンテージは、故に、２つの配列間(標的配列５’－３’および３’－５’でのオリゴヌクレオチド配列を整列させたとき)で相補的(ワトソン・クリック塩基対)である、整列させた核酸塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの総数で除し、１００倍することにより計算される。このような比較において、整列(塩基対を形成)しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定に際し、核酸塩基の化学修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対形成する機能的能力を保持する限り、無視される(例えば、５’－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的で、シトシンと同一と考えられる)。
用語「完全に相補的」は、１００％相補性をいう。
ここで使用する用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズ」は、逆の鎖の塩基対間で水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する、２つの核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)として理解される。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖となる温度として定義される、融解温度(Ｔｍ)としてしばしば表される。生理学的条件で、Ｔｍは親和性と厳密に比例しない(Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ(Ｋｄ)(式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である)により反応の解離定数(Ｋｄ)と相関する。それゆえに、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の反応の極めて低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７および温度が３７℃であるときの反応と関連するエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、自発反応であり、自発反応について、ΔＧ°は０未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38およびHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayにより記載された等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)方法の使用により、実験的に測定され得る。当業者は、ΔＧ°測定に市販装置が利用可能であることを知っている。ΔＧ°はまたSugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216およびMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405により記載の適切に導かれた熱力学パラメーターを使用して、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465により記載の最近傍モデルを使用して数値的に推定もされ得る。ハイブリダイゼーションによるその意図された核酸標的の調節を可能性とするために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて、－１０kcal未満の推定ΔＧ°値で標的核酸とハイブリダイズする。ある実施態様において、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて、－１０kcal未満の範囲、例えば－１５kcal、例えば－２０kcalおよび例えば－２５kcalの推定ΔＧ°値で、標的核酸とハイブリダイズし得る。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、－１０～６０kcal、例えば－１２～４０、例えば－１５～３０kcalまたは－１６～２７kcal、例えば－１８～２５kcalの推定ΔＧ°値で標的核酸とハイブリダイズする。
ここで使用する用語「ＤＥＳ番号」または「DES No」は、ヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)およびヌクレオシドアナログ(例えば、ＬＮＡ)の特定のパターンを有するヌクレオチド配列に付与された特有の番号をいう。ここで使用するＡＳＯのデザインは、大文字と小文字の組み合わせにより示す。例えば、ＤＥＳ－０１９０は、LLDDDDDDDDDDDDLL(すなわち、GAgcctttacatgcCG)(ここで、Ｌ(すなわち、大文字)はヌクレオシドアナログ(例えば、ＬＮＡ)を示し、Ｄ(すなわち、小文字)はヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)を示す)のＡＳＯデザインを有する、gagcctttacatgccg(配列番号５)のＡＳＯ配列をいう。
ここで使用する用語「ＡＳＯ番号」または「ASO No」は、成分、例えば、ヌクレオシド(例えば、ＤＮＡ)、ヌクレオシドアナログ(例えば、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ)、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＭＣ)および主鎖構造(例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル)の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に付与された特有の番号をいう。例えば、ＡＳＯ－０１９０は、(５’～３’)オキシＧｓオキシＡｓＤＮＡｇｓＤＮＡｃｓＤＮＡｃｓＤＮＡｔｓＤＮＡｔｓＤＮＡｔｓＤＮＡａｓＤＮＡｃｓＤＮＡａｓＤＮＡｔｓＤＮＡｇｓＤＮＡｃｓオキシＭＣｓオキシＧをいい得る。
ＡＳＯ化学の注釈は次のとおりである：ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオチドはオキシＮにより指定され、ここで、Ｎはチミン(Ｔ)、ウリジン(Ｕ)、シトシン(Ｃ)、５－メチルシトシン(ＭＣ)、アデニン(Ａ)またはグアニン(Ｇ)などのヌクレオチド塩基を指定し、故に、オキシＡ、オキシＴ、オキシＭＣ、オキシＣおよびオキシＧを含む。ＤＮＡヌクレオチドはＤＮＡｎにより指定され、ここで、小文字ｎは、チミン(ｔ)、ウリジン(ｕ)、シトシン(ｃ)、５－メチルシトシン(Ｍｃ)、アデニン(ａ)またはグアニン(ｇ)などのヌクレオチド塩基を指定し、故に、ＤＮＡａ、ＤＮＡｔ、ＤＮＡｃ、ＤＮＡＭｃおよびＤＮＡｇを含む。Ｃまたはｃの前の文字Ｍは、５－メチルシトシンを示す。文字ｓはホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示す。
「効力」は、通常、特に断らない限りＩＣ５０またはＥＣ５０値で、μM、nMまたはpMで表される。効力はまたパーセント阻害としても表され得る。ＩＣ５０は、治療分子の中央阻害性濃度である。ＥＣ５０は、媒体または対照(例えば、食塩水)に対する治療分子の中央有効濃度である。機能的アッセイにおいて、ＩＣ５０は、治療分子により達成される、生物学的応答の５０％の生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡの転写またはタンパク質発現の低減をする、治療分子の濃度である。機能的アッセイにおいて、ＥＣ５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡの転写またはタンパク質発現の５０％を生ずる治療分子の濃度である。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、当分野で知られるいくつもの手段により計算され得る。
ここで使用する、例えば、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子転写物および／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現の「阻害」なる用語は、細胞または組織におけるＡＮＧＰＴＬ２遺伝子転写物および／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を低減するＡＳＯをいう。ある実施態様において、用語「阻害」は、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子転写物またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の完全阻害(１００％阻害または検出不可能なレベル)をいう。他の実施態様において、用語「阻害」は、細胞または組織におけるＡＮＧＰＴＬ２遺伝子転写物および／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％阻害をいう。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後予測または治療が望まれる、あらゆる対象、特に哺乳動物対象をいう。哺乳動物対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含む、ヒト、家庭用動物、農業用動物、競技用動物および動物園の動物を含む。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、組成物が投与される対象に許容できないほど毒性であるさらなる成分を含まない、調製物をいう。このような組成物は無菌であり得る。
ここに開示するＡＳＯの「有効量」は、具体的に述べた目的の実施に十分である量である。「有効量」は、記載する目的に関連して、経験的にかつ日常的な方法で決定され得る。
「処置する」または「処置」または「処置のため」または「軽減する」または「軽減のため」などの用語は、(１)診断された病的状態または障害の症状の治癒、減速、低減および／または進行停止をする治療的手段および(２)標的病的状態または障害の発症を予防および／または遅延させる、予防または防止的手段の両者をいう。故に、処置を必要とするものは、既に障害を有するもの；障害を有する素因があるもの；および障害が予防されるべきものを含む。ある実施態様において、対象は、患者が、疾患または障害と関連する症状の、例えば、完全な、部分的または一過性の軽減または排除を示すならば、本明細書の他の箇所に開示する疾患または状態が成功裏に「処置」される。
II. ＡＮＧＰＴＬ２をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体およびＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡまたは哺乳動物ＡＮＧＰＴＬ２をコードするこのような核酸分子の天然に存在するバリアントを含む、ＡＮＧＰＴＬ２核酸、例えば、ＡＮＧＰＴＬ２転写物などの哺乳動物ＡＮＧＰＴＬ２をコードする核酸分子の機能の調節に使用するためにアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)を用いる。本明細書の文脈における用語「ＡＳＯ」は、２以上のヌクレオチド(すなわち、オリゴヌクレオチド)の共有結合により形成された分子をいう。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体およびＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡまたは哺乳動物ＡＮＧＰＴＬ２をコードするこのような核酸分子の天然に存在するバリアントを含む、ＡＮＧＰＴＬ２核酸、例えば、ＡＮＧＰＴＬ２転写物などの哺乳動物ＡＮＧＰＴＬ２をコードする核酸分子の機能の調節に使用するためにアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)を用いる。本明細書の文脈における用語「ＡＳＯ」は、２以上のヌクレオチド(すなわち、オリゴヌクレオチド)の共有結合により形成された分子をいう。
ＡＳＯは、約１０～約３０、例えば１０～２０、１４～２０、１６～２０または１５～２５ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯは、１５～２０ヌクレオチド長である。ここで使用する用語「アンチセンスＡＳＯ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、用語「ＡＳＯ」と相互交換可能である。
配列番号の引用は、特定の核酸塩基配列を含むが、如何なるデザインも完全化学構造は含まない。さらに、ここでの図に示されるＡＳＯは、代表的デザインを表すが、特に断らない限り、図に示される特定のデザインに限定されない。ここで、単一ヌクレオチド(単位)は、モノマーまたは単位とも称し得る。本明細書で特定のＡＳＯ番号が引用されるとき、引用は、配列、特定のＡＳＯデザインおよび化学構造を含む。本明細書で特定のＤＥＳ番号が引用されるとき、引用は、配列および特定のＡＳＯデザインを含む。例えば、特許請求の範囲(またはこの明細書)で配列番号５が引用されるときは、gagcctttacatgccgのヌクレオチド配列のみを含む。特許請求の範囲(またはこの明細書)でＤＥＳ－０１９０が引用されるとき、GAgcctttacatgcCGのＡＳＯデザインを伴うgagcctttacatgccgのヌクレオチド配列を含む。あるいは、ＡＳＯ－０１９０のデザインは配列番号５としても記載でき、ここで、５’末端からの最初のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチドおよび１６番目のヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡであり、他のヌクレオチドの各々は非修飾ヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)である。ＡＳＯ番号は、配列およびＡＳＯデザインならびにＡＳＯの特定の詳細を含む。それゆえに、例えば、本明細書で記載されるＡＳＯ－０１９０は、オキシＧｓオキシＡｓＤＮＡｇｓＤＮＡｃｓＤＮＡｃｓＤＮＡｔｓＤＮＡｔｓＤＮＡｔｓＤＮＡａｓＤＮＡｃｓＤＮＡａｓＤＮＡｔｓＤＮＡｇｓＤＮＡｃｓオキシＭＣｓオキシＧをいい、ここで、「ｓ」はホスホロチオエート結合を示す。
種々の実施態様において、本発明のＡＳＯはＲＮＡ(単位)を含まない。ある実施態様において、ＡＳＯは１以上のＤＮＡ単位を含む。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは直鎖状分子であるかまたは直鎖状分子として合成される。ある実施態様において、ＡＳＯは、一本鎖分子であり、同じＡＳＯ(すなわち二本鎖)内の等価な領域と相補的である、例えば、少なくとも３、４または５連続ヌクレオチドの、短領域を含まない － これに関して、ＡＳＯは(本質的に)二本鎖ではない。ある実施態様において、ＡＳＯは、本質的に二本鎖ではない。ある実施態様において、ＡＳＯはｓｉＲＮＡではない。種々の実施態様において、本発明のＡＳＯは、連続ヌクレオチド領域全体を構成し得る。故に、ある実施態様において、ＡＳＯは実質的に自己相補的ではない。
他の実施態様において、本発明は、ＡＳＯのフラグメントを含む。例えば、本発明は、ここに開示するＡＳＯの少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも２つの連続ヌクレオチド、少なくとも３つの連続ヌクレオチド、少なくとも４つの連続ヌクレオチド、少なくとも５つの連続ヌクレオチド、少なくとも６つの連続ヌクレオチド、少なくとも７つの連続ヌクレオチド、少なくとも８つの連続ヌクレオチドまたは少なくとも９つの連続ヌクレオチドを含む。ここに開示する配列の何れかのフラグメントは、本発明の一部として意図される。
II.Ａ. 標的
適切には、本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の下方制御(例えば、低減または除去)が可能である。これに関して、本発明のＡＳＯは、一般にヒト細胞などの哺乳動物細胞において、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルの減少を介するＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の間接的阻害に影響し得る。特に、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体の１以上の領域を標的とするＡＳＯに関する(例えば、イントロン領域、エクソン領域および／またはエクソン－イントロン接合部領域)。
適切には、本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の下方制御(例えば、低減または除去)が可能である。これに関して、本発明のＡＳＯは、一般にヒト細胞などの哺乳動物細胞において、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルの減少を介するＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の間接的阻害に影響し得る。特に、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体の１以上の領域を標的とするＡＳＯに関する(例えば、イントロン領域、エクソン領域および／またはエクソン－イントロン接合部領域)。
アンギオポエチン関連タンパク質２(ＡＮＧＰＴＬ２)は、アンギオポエチン様タンパク質２、ＡＲＰ２、ＨＡＲＰ、ＡＲＡＰ１およびアンギオポエチン様２としても知られる。ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の配列は、公開されているGenBank Accession No. NC_000009.12の下に見られ得る。ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体転写物の配列(配列番号１)は、NC_000009.12の残基１２７,０８７,３４９～１２７,１２２,７６５の逆相補体に対応する。ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の配列は、公開されているAccession Nos. NP_036230.1(カノニカル配列)、XP_006717093.1およびQ9UKU9-2の下に入手できる。
ヒトＡＮＧＰＴＬ２遺伝子産物のバリアントは知られる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ２アイソフォームＸ１の配列(Accession No. XP_006717093.1；配列番号１９４)は、カノニカル配列(配列番号３)と次のように異なる：２７４～２７４：Ｐ→Ｌ；および２７５～４９３：欠損。ＡＮＧＰＴＬ２アイソフォーム２の配列(Accession No. Q9UKU9-2；配列番号１９５)は、カノニカル配列(配列番号３)と次のように異なる：１～３０２：欠損。従って、ここに開示するＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の天然バリアントの発現を低減または阻害するためにデザインされ得る。
ＡＳＯの標的核酸配列の例はＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体である。配列番号１は、ヒトＡＮＧＰＴＬ２ゲノム配列を表す(すなわち、GenBank Accession No. NC_000009.12のヌクレオチド１２７,０８７,３４９～１２７,１２２,７６５の逆相補体)。配列番号１は、配列番号１におけるヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡ前駆体において「ｕ」として示される以外、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体配列と同一である。ある実施態様において、「標的核酸」は、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれ由来のＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ前駆体のイントロンを含む。他の実施態様において、標的核酸は、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれ由来のＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ前駆体のエクソン領域を含む。さらに他の実施態様において、標的核酸は、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれ由来のＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ前駆体のエクソン－イントロン接合部を含む。ある実施態様において、例えば研究または診断において使用されるとき、「標的核酸」は、ｃＤＮＡまたは上記ＤＮＡ由来の合成オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ核酸標的であり得る。ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体によりコードされるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質配列は、配列番号３として示す。図１Ｃおよび１Ｄ参照。他の実施態様において、標的核酸は、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたは両方を含む。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物、例えば、配列番号１のイントロン内の領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物、例えば、配列番号１のエクソン内の領域とハイブリダイズする。他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物、例えば、配列番号１のエクソン－イントロン接合部内の領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、イントロン、エクソンまたはエクソン－イントロン接合部)、例えば、配列番号１内の領域とハイブリダイズし、ここで、ＡＳＯは、本明細書の他の箇所(例えば、セクションII.Ｇ)に記載する式：５’ Ａ－Ｂ－Ｃ ３’のデザインを有する。
ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の特定のアイソフォームをコードするｍＲＮＡを標的とする。図１Ｄのアイソフォーム参照。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の全アイソフォームを標的とする。
ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の核酸配列、例えば、配列番号１に対応する領域と相補的である、連続ヌクレオチド配列(例えば、１０～３０ヌクレオチド長)を含む。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物の核酸配列または配列内の領域(「標的領域」)とハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、核酸配列は、(ｉ)配列番号１のヌクレオチド１～２１１；(ii)配列番号１のヌクレオチド４７１～６８６；(iii)配列番号１のヌクレオチド１,０６９～１,３７６；(iv)配列番号１のヌクレオチド１,６６６～８,６７３；(ｖ)配列番号１のヌクレオチド８,９７５～１２,４１５；(vi)配列番号１のヌクレオチド１２,７３９～１８,１１６；(vii)配列番号１のヌクレオチド１８,４２２～２９,８７５；または(viii)配列番号１のヌクレオチド３０,３７３～３５,３８９に対応し、ここで、所望により、ＡＳＯは、本明細書に記載するデザインまたは本明細書の他の箇所に示す化学構造の一つを有する(例えば、図１)。
ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド８７～１１１に対応する。他の実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド５７１～５８６に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド１,１６９～１,２７６に対応する。さらなる実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド１,７６６～８,５７３に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド９,０７５～１２,３１５に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド１２,８３９～１８,０１６に対応する。さらなる実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド１８,５２２～２９,７７５に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド３０,４７３～３５,２８９に対応する。
ある実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド８７～１１１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。他の実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド５７１～５８６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド１,１６９～１,２７６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド１,７６６～８,５７３±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド９,０７５～１２,３１５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。さらなる実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド１２,８３９～１８,０１６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド１８,５２２～２９,７７５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド３０,４７３～３５,２８９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。
ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド２０,１０３～２０,２８２に対応する。他の実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド２０,１０３～２０,２８２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０または±９０ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド２０,２０２～２０,２２１に対応する。ある実施態様において、標的領域は、３’末端および／または５’末端で配列番号１のヌクレオチド２０,２０２～２０,２２１±１、±５、±１０、±１５、±２０または±２５ヌクレオチドに対応する。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ前駆体、配列番号１)内の複数標的領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の２つの異なる標的領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、ＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の３つの異なる標的領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ前駆体、配列番号１)内の複数領域とハイブリダイズするＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ前駆体、配列番号１)内の一領域とハイブリダイズするＡＳＯと比較して、ＡＮＧＰＴＬ２発現の低減がより強力(例えば、低ＥＣ５０を有する)である。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、生理的条件、すなわち、インビボ条件下、標的核酸(例えば、ＡＮＧＰＴＬ２転写物)とハイブリダイズすることができる。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、インビトロで標的核酸(例えば、ＡＮＧＰＴＬ２転写物)とハイブリダイズすることができる。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ストリンジェントな条件下、インビトで標的核酸(例えば、ＡＮＧＰＴＬ２転写物)とハイブリダイズすることができる。インビトロでのハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件は、とりわけ、産生細胞取り込み、ＲＮＡ到達性、温度、結合自由エネルギー、塩濃度および時間による(例えば、Stanley T Crooke, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Edition, CRC Press (2007)参照)。一般に、高～中ストリンジェンシーの条件が、実質的に類似の核酸間のハイブリダイゼーションを可能とするために、インビトロハイブリダイゼーションで使用されるが、似てない核酸間ではされない。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５×食塩水－クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)緩衝液(０.７５Ｍ 塩化ナトリウム／０.０７５Ｍ クエン酸ナトリウム)で１時間、４０℃でハイブリダイゼーション、続いてサンプルの１×ＳＳＣで４０℃で１０回および１×ＳＳＣ緩衝液で室温で５回の洗浄を含む。インビボハイブリダイゼーション条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列のハイブリダイゼーションを決定する細胞内条件(例えば、生理学的ｐＨおよび細胞内イオン条件)からなる。インビボ条件は、比較的低ストリンジェンシー条件により、インビトロを模倣し得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、２×ＳＳＣ(０.３Ｍ 塩化ナトリウム／０.０３Ｍ クエン酸ナトリウム)、０.１％ＳＤＳで３７℃でインビトロで実施され得る。４×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを含む洗浄溶液を３７℃で、１×ＳＳＣで４５℃の最終洗浄と共に使用できる。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、１以上の種(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシおよびクマ)からのＡＮＧＰＴＬ２転写物を下方制御できる。ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯは、ヒトおよび齧歯類(例えば、マウスまたはラット)両者のＡＮＧＰＴＬ２転写物を下方制御できる。従って、ある実施態様において、ＡＳＯは、ヒトおよび齧歯類(例えば、マウスまたはラット)両社におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡまたはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を下方制御(例えば、低減または除去)できる。
マウスＡＮＧＰＴＬ２転写物の配列は当分野で知られる。例えば、マウスＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の配列は、公開されているGenBank Accession Number NC_000068.7の下に入手し得る。マウスＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体転写物の配列は、NC_000068.7の残基３３,２１５,９５１～３３,２４７,７２５に対応する。マウスＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ転写物の配列は知られ、Accession Numbers: NM_011923.4(配列番号１９６)、XM_006498051.1(配列番号１９７)、BC138610.1(配列番号１９８)およびBC138609.1(配列番号１９９)として入手可能である。マウスＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の配列は、公開されているAccession Numbers: NP_036053.2(配列番号２００)、Q9R045.2(配列番号２０１)、EDL08598.1(配列番号２０２)、EDL08597.1(配列番号２０３)、AAI38611.1(配列番号２０４)、AAI38610.1(配列番号２０５)およびXP_006498114.1(配列番号２０６)の下に入手し得る。
ラットＡＮＧＰＴＬ２転写物の配列も当分野で知られる。ラットＡＮＧＰＴＬ２遺伝子は、公開されているGenBank Accession Number NC_005102.4の下に見られ得る。ラットＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体転写物の配列は、NC_005102.4の残基１２,２６２,８２２～１２,２９２,６６５に対応する。ラットＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ転写物の配列は知られ、Accession Number: NM_133569.1(配列番号２０７)として入手可能である。ラットＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の配列は、公開されているAccession Number: NP_598253.1(配列番号２０８)およびEDL93193.1(配列番号２０９)の下に入手され得る。
II.Ｂ. ＡＳＯ配列
本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物、例えば、配列番号１に対応するヌクレオチド配列の領域の相補体に対応する連続ヌクレオチド配列を含む。
本発明のＡＳＯは、ＡＮＧＰＴＬ２転写物、例えば、配列番号１に対応するヌクレオチド配列の領域の相補体に対応する連続ヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、本発明は、１０～３０、例えば１０～１５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチドまたは１０～２５ヌクレオチド長(例えば、１５～２０ヌクレオチド長)のＡＳＯを提供し、ここで、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１またはその天然に存在するバリアントなどのＡＮＧＰＴＬ２転写物の相補体内の領域と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％配列同一性を有する。故に、例えば、ＡＳＯは、配列番号１の配列またはその一部を有する一本鎖核酸分子とハイブリダイズする。
ＡＳＯは、哺乳動物ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質をコードする核酸(例えば、配列番号１)の等価な領域と十分に相補的(完全に相補的)である連続ヌクレオチド配列を含み得る。ＡＳＯは、配列番号１のヌクレオチドＸ－Ｙに対応する核酸配列または配列内の領域と十分に相補的(完全に相補的)である連続ヌクレオチド配列を含み得て、ここで、ＸおよびＹは、図２に示すとおりそれぞれ開始部位および末端部位である。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、配列番号４～１９３(すなわち、図２における配列)から選択される配列と少なくとも約８０％配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％配列同一性、少なくとも約９７％配列同一性、少なくとも約９８％配列同一性、少なくとも約９９％配列同一性、例えば約１００％配列同一性(相同)を有する。ある実施態様において、ＡＳＯは本明細書の他の箇所に記載するデザインまたは本明細書の他の箇所に示す化学構造を有する(例えば、図２)。
ある実施態様において、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号４～１９３またはその少なくとも１０連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するＡＮＧＰＴＬ２転写物と比較したとき、１個または２個のミスマッチを含む。
ある実施態様において、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号４～１９３またはその少なくとも１２連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するＡＮＧＰＴＬ２転写物と比較したとき、１個または２個のミスマッチを含み得る。
ある実施態様において、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号４～１９３またはその少なくとも１４連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するＡＮＧＰＴＬ２転写物と比較したとき、１個または２個のミスマッチを含み得る。
ある実施態様において、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号４～１９３またはその少なくとも１５または１６連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ＡＳＯ(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するＡＮＧＰＴＬ２転写物と比較したとき、１個または２個のミスマッチを含み得る。
ある実施態様において、ＡＳＯは、配列番号８、配列番号２０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４６およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
ある実施態様において、ＡＳＯは、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、標的核酸配列(例えば、ＡＮＧＰＴＬ２転写物)に結合し、ＡＮＧＰＴＬ転写物の発現を、細胞における正常(すなわち、対照)発現レベルと比較して、少なくとも１０％または２０％、例えば、正常発現レベル(例えば、ＡＳＯに曝されていない細胞における発現レベル)と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％阻害または低減する。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、インビトロでＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡの発現を、細胞が２５μMのＡＳＯに接触したとき、ＡＳＯと接触していない(例えば、食塩水と接触)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％低減できる。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、インビトロでＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡの発現を、細胞が５μMのＡＳＯに接触したとき、ＡＳＯと接触していない(例えば、食塩水と接触)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％低減できる。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、(ｉ)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２をコードするｍＲＮＡレベルの低減；(ii)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２のタンパク質レベルの低減；(iii)心血管疾患または障害の１以上の症状の低減、軽減または処置および(iv)これらの何らかの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの性質を有する。
ある実施態様において、ＡＳＯまたはその連続ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズしたとき、１個または２個のミスマッチを許容でき、標的になお十分に結合し、所望の効果、すなわち、標的ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の下方制御を示す。ミスマッチは、例えば、本明細書の他の箇所に開示される、ＡＳＯヌクレオチド配列の長さの延長および／またはヌクレオチドアナログの数の増加により相殺され得る。
ある実施態様において、ＡＳＯまたはその連続ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズするとき、１個を超えないミスマッチを含む。他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズするとき、１個を超えないミスマッチを含み、有利にはミスマッチを含まない。
II.Ｃ. ＡＳＯ長
ＡＳＯは、計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み得る。ＡＳＯまたは連続ヌクレオチド配列長について範囲が示されるとき、範囲は、提供される範囲の最短および最長の長さを含む、例えば１０～３０(または１０および３０の間)は１０および３０両方を含む。
ＡＳＯは、計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み得る。ＡＳＯまたは連続ヌクレオチド配列長について範囲が示されるとき、範囲は、提供される範囲の最短および最長の長さを含む、例えば１０～３０(または１０および３０の間)は１０および３０両方を含む。
ある実施態様において、ＡＳＯは、計約１５～２０、１５、１６、１７、１８、１９または２０連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
II.Ｄ. ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログ
本発明のある態様において、ＡＳＯは、１以上の天然に存在しないヌクレオシドアナログを含む。ここで使用する「ヌクレオシドアナログ」は、糖および／または塩基部分における修飾により、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドなどの天然ヌクレオシドのバリアントである。アナログは、原則として、オリゴヌクレオチドに関して天然ヌクレオシドに対して単に「無変化」または「等価」である、すなわちオリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現阻害に作用する過程に機能的効果はない。このような「等価な」アナログは、例えば、製造が容易であるかもしくは安価であるかまたは保存もしくは製造条件により安定であるかまたはタグまたは標識を表すならば、そうであっても有用であり得る。しかしながら、ある実施態様において、アナログは、例えば標的に対する結合親和性増加および／または細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性増加および／または細胞への輸送の容易さ増加により、ＡＳＯが発現阻害に作用する過程において機能的効果を有する。ヌクレオシドアナログの具体例は、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213およびスキーム１に記載される。
本発明のある態様において、ＡＳＯは、１以上の天然に存在しないヌクレオシドアナログを含む。ここで使用する「ヌクレオシドアナログ」は、糖および／または塩基部分における修飾により、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドなどの天然ヌクレオシドのバリアントである。アナログは、原則として、オリゴヌクレオチドに関して天然ヌクレオシドに対して単に「無変化」または「等価」である、すなわちオリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現阻害に作用する過程に機能的効果はない。このような「等価な」アナログは、例えば、製造が容易であるかもしくは安価であるかまたは保存もしくは製造条件により安定であるかまたはタグまたは標識を表すならば、そうであっても有用であり得る。しかしながら、ある実施態様において、アナログは、例えば標的に対する結合親和性増加および／または細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性増加および／または細胞への輸送の容易さ増加により、ＡＳＯが発現阻害に作用する過程において機能的効果を有する。ヌクレオシドアナログの具体例は、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213およびスキーム１に記載される。
II.Ｄ.１. 核酸塩基
用語核酸塩基は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部分をいう。本開示において、用語核酸塩基はまた天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中機能的である、修飾核酸塩基も包含する。ある実施態様において、核酸塩基部分は、核酸塩基の修飾または置換により修飾される。本明細書で、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しないバリアントの両者をいう。このようなバリアントは、例えばHirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載される。
用語核酸塩基は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部分をいう。本開示において、用語核酸塩基はまた天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中機能的である、修飾核酸塩基も包含する。ある実施態様において、核酸塩基部分は、核酸塩基の修飾または置換により修飾される。本明細書で、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しないバリアントの両者をいう。このようなバリアントは、例えばHirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載される。
ある実施態様において、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンの、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチル－シトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２,６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基などの置換プリンまたは置換ピリミジンなどの修飾プリンまたはピリミジンへの変更により修飾される。
核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され得て、ここで、各文字は、所望により同等な機能の修飾核酸塩基を含む。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５－メチル－シトシンから選択される。所望により、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチル－シトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
II.Ｄ.２. 糖修飾
本発明のＡＳＯは、修飾糖部分、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較したとき、修飾された糖部分を有する、１以上のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分が修飾された多数のヌクレオシドが、主に親和性および／またはヌクレアーゼ抵抗性などのオリゴヌクレオチドのある性質の改善を目的として製造されている。
本発明のＡＳＯは、修飾糖部分、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較したとき、修飾された糖部分を有する、１以上のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分が修飾された多数のヌクレオシドが、主に親和性および／またはヌクレアーゼ抵抗性などのオリゴヌクレオチドのある性質の改善を目的として製造されている。
このような修飾は、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環(ＨＮＡ)または、一般にリボース環(ＬＮＡ)のＣ２’炭素とＣ４’炭素間にビラジカル架橋を有する二環式環、またはＣ２’炭素とＣ３’炭素間の結合を一般に欠く非連結リボース環(例えば、ＵＮＡ)への置換により修飾されたものを含む。他の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソース核酸(ＷＯ２０１１／０１７５２１)または三環式核酸(ＷＯ２０１３／１５４７９８)を含む。修飾ヌクレオシドは、例えば、ペプチド核酸(ＰＮＡ)またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分に置換されたヌクレオシドも含む。
糖修飾はまたリボース環の置換基の、ＲＮＡヌクレオシドで天然に見られる水素または２’－ＯＨ基以外の基への変更を介してなされる修飾も含む。置換基は、例えば、２’位、３’位、４’位または５’位に導入され得る。修飾糖部分を有するヌクレオシドはまた２’置換ヌクレオシドなどの２’修飾ヌクレオシドも含む。実際、２’置換ヌクレオシドの開発にはるかに焦点が絞られており、多数の２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに取り込まれたとき、ヌクレオシド抵抗性および親和性増強などの有益な性質を有することが判明している。
II.Ｄ.２.ａ ２’修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有する(２’置換ヌクレオシド)または２’結合ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシドおよびＬＮＡ(２’－４’ビラジカル架橋)ヌクレオシドを含む。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに増強した結合親和性(例えば、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシド)および／または増加したヌクレアーゼ抵抗性を提供し得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ(ＭＯＥ)、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸(ＡＮＡ)および２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例について、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213;およびDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。下記は、一部２’置換修飾ヌクレオシドの図である。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有する(２’置換ヌクレオシド)または２’結合ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシドおよびＬＮＡ(２’－４’ビラジカル架橋)ヌクレオシドを含む。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに増強した結合親和性(例えば、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシド)および／または増加したヌクレアーゼ抵抗性を提供し得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ(ＭＯＥ)、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸(ＡＮＡ)および２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例について、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213;およびDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。下記は、一部２’置換修飾ヌクレオシドの図である。
II.Ｄ.２.ｂ ロック核酸ヌクレオシド(ＬＮＡ)。
「ＬＮＡヌクレオシド」は、２’修飾ヌクレオシドであって、リボース環の立体構造を制限またはロックする、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’およびＣ４’を連結するビラジカルを含む「２’－４’架橋」)、２’修飾ヌクレオシドである。これらヌクレオシドは文献では架橋核酸または二環式核酸(ＢＮＡ)とも称される。リボースの立体構造のロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対してオリゴヌクレオチドに取り込まれたとき、ハイブリダイゼーションの親和性(二本鎖安定化)の増強と関連する。これは、オリゴヌクレオチド／相補体二本鎖の融解温度の測定により、常法で決定され得る。
「ＬＮＡヌクレオシド」は、２’修飾ヌクレオシドであって、リボース環の立体構造を制限またはロックする、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’およびＣ４’を連結するビラジカルを含む「２’－４’架橋」)、２’修飾ヌクレオシドである。これらヌクレオシドは文献では架橋核酸または二環式核酸(ＢＮＡ)とも称される。リボースの立体構造のロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対してオリゴヌクレオチドに取り込まれたとき、ハイブリダイゼーションの親和性(二本鎖安定化)の増強と関連する。これは、オリゴヌクレオチド／相補体二本鎖の融解温度の測定により、常法で決定され得る。
非限定的例示的ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81およびMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238およびWan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667に記載される。
さらなる非限定的例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。
ある実施態様において、ＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば(Ｓ)－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ(ＳｃＥＴ)または／およびＥＮＡである。ある実施態様において、ＬＮＡはベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
II.Ｅ ヌクレアーゼ介在分解
ヌクレアーゼ介在分解は、相補的ヌクレオチド配列と二本鎖を形成したとき、そのような配列の分解に介在できるオリゴヌクレオチドである。
ヌクレアーゼ介在分解は、相補的ヌクレオチド配列と二本鎖を形成したとき、そのような配列の分解に介在できるオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ、特におよびエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)、例えばＲＮａｓｅ Ｈ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ１の動員ができるところで、標的核酸のヌクレアーゼ介在分解を経て機能し得る。ヌクレアーゼ介在機構を経て作用するオリゴヌクレオチドデザインの例は、一般に少なくとも５または６ＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、片側または両側に親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテイルマーが隣接したオリゴヌクレオチドである。
II.Ｆ. ＲＮａｓｅ Ｈ活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二本鎖であるとき、ＲＮａｓｅ Ｈを動員するおよび相補的ＲＮＡ分子の分解を誘導する能力をいう。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力の決定に使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定のためのインビトロ方法を提供する。一般に、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸配列と共に提供されたとき、pmol／ｌ／分で測定して、試験する修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドにおける全モノマー間がホスホロチオエート結合である、オリゴヌクレオチドを使用して、かつＷＯ０１／２３６１３の実施例９１～９５に提供される方法を使用して、決定された初期速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％を超える初期速度を有するならば、ＲＮａｓｅ Ｈを動員できるとみなされる。ある実施態様において、組み換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１を使用して、相補的ＲＮＡ分子と二本鎖であるときＲＮａｓｅ Ｈを動員するおよび相補的ＲＮＡ分子の分解を誘導するオリゴヌクレオチドの能力を決定し得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二本鎖であるとき、ＲＮａｓｅ Ｈを動員するおよび相補的ＲＮＡ分子の分解を誘導する能力をいう。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力の決定に使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定のためのインビトロ方法を提供する。一般に、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸配列と共に提供されたとき、pmol／ｌ／分で測定して、試験する修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドにおける全モノマー間がホスホロチオエート結合である、オリゴヌクレオチドを使用して、かつＷＯ０１／２３６１３の実施例９１～９５に提供される方法を使用して、決定された初期速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％を超える初期速度を有するならば、ＲＮａｓｅ Ｈを動員できるとみなされる。ある実施態様において、組み換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１を使用して、相補的ＲＮＡ分子と二本鎖であるときＲＮａｓｅ Ｈを動員するおよび相補的ＲＮＡ分子の分解を誘導するオリゴヌクレオチドの能力を決定し得る。
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸と共に提供されたとき、pmol／ｌ／分で測定して、試験するオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、２’置換がなく、オリゴヌクレオチドにおける全モノマー間がホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドを使用して、かつＷＯ０１／２３６１３の実施例９１～９５に記載された方法を使用して決定し、決定された初期速度の２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満のＲＮａｓｅ Ｈ初期速度を有するならば、ＲＮａｓｅ Ｈの動員が本質的に不可能であるとみなされる。
II.Ｇ. ＡＳＯデザイン
本発明のＡＳＯは、ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログ両者を含むヌクレオチド配列を含み得て、ギャップマー、ブロックマー、ミクスマー、ヘッドマー、テイルマーまたはトータルマーの形であり得る。本発明のＡＳＯで使用できるギャップマー、ブロックマー、ミクスマー、ヘッドマー、テイルマーまたはトータルマーの配置の例は、米国特許公開２０１２／０３２２８５１に記載される。
本発明のＡＳＯは、ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログ両者を含むヌクレオチド配列を含み得て、ギャップマー、ブロックマー、ミクスマー、ヘッドマー、テイルマーまたはトータルマーの形であり得る。本発明のＡＳＯで使用できるギャップマー、ブロックマー、ミクスマー、ヘッドマー、テイルマーまたはトータルマーの配置の例は、米国特許公開２０１２／０３２２８５１に記載される。
ここで使用する用語「ギャップマー」は、５’および３’で１以上の親和性増強修飾ヌクレオシド(隣接部)に隣接された、ＲＮａｓｅ Ｈ動員オリゴヌクレオチドの領域(ギャップ)を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドをいう。用語「ヘッドマー」および「テイルマー」は、隣接部の一方が欠損しているとき、すなわち、オリゴヌクレオチドの末端の一方のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含むとき、ＲＮａｓｅ Ｈを動員できるオリゴヌクレオチドをいう。ヘッドマーについて、３’隣接部が欠損し(すなわち、５’隣接部は親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)、テイルマーについて、５’隣接部が欠損する(すなわち、３’隣接部は親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)。用語「ＬＮＡギャップマー」は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも一方がＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドをいう。用語「混合ウィングギャップマー」は、隣接領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドおよび少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドまたは非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ(ＭＯＥ)、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸(ＡＮＡ)および２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドなどを含むＬＮＡギャップマーをいう。
「ミクスマー」と称される他の「キメラ」ＡＳＯは、(ｉ)ＲＮａｓｅにより認識可能かつ開裂可能であるＤＮＡモノマーまたはヌクレオシドアナログモノマーおよび(ii)非ＲＮａｓｅ動員ヌクレオシドアナログモノマーの交互組成からなる。
「トータルマー」は、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのみを含む一本鎖ＡＳＯをいう。
ある実施態様において、ＡＳＯの標的領域への親和性増強に加えて、あるヌクレオシドアナログは、ＲＮａｓｅ(例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ)結合および開裂も介在する。α－Ｌ－ＬＮＡモノマーがある程度ＲＮａｓｅ Ｈ活性を動員するため、ある実施態様において、α－Ｌ－ＬＮＡモノマーを含むＡＳＯのギャップ領域(例えば、ここで領域Ｂと称する)は、ＲＮａｓｅ Ｈにより認識可能かつ開裂可能であるモノマーの数が少なく、ミクスマー構造において、より高い柔軟性が導入される。
II.Ｇ.１. ギャップマーデザイン
ある実施態様において、本発明のＡＳＯはギャップマーであり、ここで領域Ｂ(Ｂ)と称される、ＲＮａｓｅ ＨなどのＲＮａｓｅの動員が可能なヌクレオチドの連続ストレッチ(例えば、１以上のＤＮＡ)を含み、ここで、領域Ｂは、５’および３’両者で、領域Ｂのヌクレオチドの連続ストレッチに対して５’および３’でヌクレオシドアナログの領域が隣接する － これらの領域は、それぞれ領域Ａ(Ａ)およびＣ(Ｃ)と称する。ある実施態様において、ヌクレオシドアナログは、糖修飾ヌクレオシド(例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド)である。ある実施態様において、領域ＡおよびＣの糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するＡＳＯの親和性を増強する(すなわち、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシド)。ある実施態様において、糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡまたは２’－ＭＯＥなどの高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯはギャップマーであり、ここで領域Ｂ(Ｂ)と称される、ＲＮａｓｅ ＨなどのＲＮａｓｅの動員が可能なヌクレオチドの連続ストレッチ(例えば、１以上のＤＮＡ)を含み、ここで、領域Ｂは、５’および３’両者で、領域Ｂのヌクレオチドの連続ストレッチに対して５’および３’でヌクレオシドアナログの領域が隣接する － これらの領域は、それぞれ領域Ａ(Ａ)およびＣ(Ｃ)と称する。ある実施態様において、ヌクレオシドアナログは、糖修飾ヌクレオシド(例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド)である。ある実施態様において、領域ＡおよびＣの糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するＡＳＯの親和性を増強する(すなわち、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシド)。ある実施態様において、糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡまたは２’－ＭＯＥなどの高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。
ギャップマーにおいて、領域Ｂの最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ領域ＡおよびＣのヌクレオシドアナログ(例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド)に隣接して配置される。ある実施態様において、領域ＡおよびＣは、領域Ｂから最も遠位の末端(すなわち、領域Ａの５’末端および領域Ｃの３’末端)に、ヌクレオシドアナログを有することにより、さらに定義され得る。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、式(５’から３’)Ａ－Ｂ－Ｃのヌクレオチド配列を有し、ここで、(Ａ)(５’領域または第一ウィング配列)は少なくとも１つヌクレオシドアナログ(例えば、１～５個のＬＮＡ単位)を含み；(Ｂ)は、(ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ標的などの相補的ＲＮＡ分子と二本鎖を形成したとき)ＲＮａｓｅの動員ができる少なくとも４つの連続ヌクレオシド(例えば、４～２８個のＤＮＡ単位)を含み；そして(Ｃ)(３’領域または第二ウィング配列)は、少なくとも１つヌクレオシドアナログ(例えば、１～５個のＬＮＡ単位)を含む。
II.Ｈ. ヌクレオチド間結合
ここに記載するＡＳＯのモノマーは、結合基を介して結合される。適切には、各モノマーは、結合基を介して３’隣接モノマーに結合される。
ここに記載するＡＳＯのモノマーは、結合基を介して結合される。適切には、各モノマーは、結合基を介して３’隣接モノマーに結合される。
当業者は、本開示において、ＡＳＯの末端での５’モノマーは、５’結合基を含まないが、５’末端基を含んでも含まなくてもよいことは理解する。
用語「結合基」または「ヌクレオシド間結合」は、２個のヌクレオシドの供給結合ができる基を意味することが意図される。特定のかつ好ましい例は、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を含む。
本発明のＡＳＯのヌクレオシドまたはその連続ヌクレオシド配列は、結合基を介して結合される。適切には、各ヌクレオシドは結合基を介して３’隣接ヌクレオシドに結合される。
ある実施態様において、ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％は修飾されている。
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間の全ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
II.Ｉ. コンジュゲート
ここで使用する用語コンジュゲートは、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第三領域)に共有結合したＡＳＯをいう。
ここで使用する用語コンジュゲートは、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第三領域)に共有結合したＡＳＯをいう。
本発明のＡＳＯの１以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、ＡＳＯの活性、細胞分布、細胞取り込みまたは安定性に影響することにより、ＡＳＯの薬理作用を改善し得る。ある実施態様において、非ヌクレオチド部分は、ＡＳＯの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および／または細胞取り込みの改善により、ＡＳＯの薬物動態を修飾または増強する。ある実施態様において、非ヌクレオチド部分は、ＡＳＯを特定の臓器、組織または細胞型に向かわせ、それにより、その臓器、組織または細胞型におけるＡＳＯの有効性を増強させ得る。他の実施態様において、非ヌクレオチド部分は、ＡＳＯの非標的細胞型、組織または臓器における活性、例えば、オフ・ターゲット活性または非標的細胞型、組織または臓器における活性を減少させる。ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は、適当なコンジュゲート部分を提供する。さらに適当なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体(ＡＳＧＰｒ)に結合できるものである。特に、三価Ｎ－アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰｒへの結合に適する(例えば、ＷＯ２０１４／０７６１９６、ＷＯ２０１４／２０７２３２およびＷＯ２０１４／１７９６２０参照)。
ある実施態様において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えばカプシド)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
II.Ｊ. 活性化ＡＳＯ
ここで使用する用語「活性化ＡＳＯ」は、ここに記載するコンジュゲートを形成するように、ＡＳＯの１以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能とする少なくとも１つの官能部分に共有結合した(すなわち、官能化された)ＡＳＯをいう。一般に、官能部分は、例えば、アデニン塩基の３’－ヒドロキシル基または環外ＮＨ２基を介して、ＡＳＯに共有結合できる、化学基、親水性であり得るスペーサーおよびコンジュゲート部分の結合が可能な末端基(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を含む。ある実施態様において、この末端基は保護されていない、例えば、ＮＨ２基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のものなどの何らかの適当な保護基により保護されている。
ここで使用する用語「活性化ＡＳＯ」は、ここに記載するコンジュゲートを形成するように、ＡＳＯの１以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能とする少なくとも１つの官能部分に共有結合した(すなわち、官能化された)ＡＳＯをいう。一般に、官能部分は、例えば、アデニン塩基の３’－ヒドロキシル基または環外ＮＨ２基を介して、ＡＳＯに共有結合できる、化学基、親水性であり得るスペーサーおよびコンジュゲート部分の結合が可能な末端基(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を含む。ある実施態様において、この末端基は保護されていない、例えば、ＮＨ２基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のものなどの何らかの適当な保護基により保護されている。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、ＡＳＯの５’末端へのコンジュゲート部分の共有結合を可能とするために、５’末端で官能化される。他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、３’末端で官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、主鎖に沿ってまたはヘテロ環式塩基部分を官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、５’末端、３’末端、主鎖および塩基から独立して選択される１を超える箇所で官能化され得る。
ある実施態様において、本発明の活性化ＡＳＯは、合成中の官能部分に共有結合する１以上のモノマーの取り込みにより、合成される。他の実施態様において、本発明の活性化ＡＳＯは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、ＡＳＯは合成完了後官能化される。
III. 医薬組成物および投与経路
本発明のＡＳＯは、医薬製剤および組成物で使用され得る。ある実施態様において、このような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。薬学的に許容される希釈剤は、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含み、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩およびカリウム塩を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、薬学的に許容される希釈剤は無菌リン酸緩衝化食塩水である。医薬組成物は、それゆえにここに開示されるオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩およびリン酸緩衝化食塩水などの薬学的に許容される希釈剤(あるいは薬学的に許容される溶媒とも称される)を含む、医薬溶液であり得る。
本発明のＡＳＯは、医薬製剤および組成物で使用され得る。ある実施態様において、このような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。薬学的に許容される希釈剤は、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含み、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩およびカリウム塩を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、薬学的に許容される希釈剤は無菌リン酸緩衝化食塩水である。医薬組成物は、それゆえにここに開示されるオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩およびリン酸緩衝化食塩水などの薬学的に許容される希釈剤(あるいは薬学的に許容される溶媒とも称される)を含む、医薬溶液であり得る。
ある実施態様において、ここに開示するＡＳＯは、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩などの薬学的に許容される塩などの塩の形である。
ある実施態様において、ここに開示されるＡＳＯまたはコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩は、固体形態、例えば、粉末(例えば、凍結乾燥粉末)または乾燥物(dessicate)の形である。
本発明のＡＳＯは、患者に治療有効量を送達するのに十分な量で、薬学的に許容される担体または希釈剤になど単位製剤に含まれ得る。
本発明の医薬組成物は、局所または全身処置が望まれるかおよび処置すべき部位により、多数の方法で投与され得る。例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴などの非経腸投与が使用され得る；ある実施態様において、ＡＳＯは、ボーラス注射として心臓内または脳室内に投与される。ある実施態様において、ＡＳＯは皮下投与される。
好都合は単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の慣用技術により製剤され得る。このような技術は、活性成分と医薬担体または添加物を結合する段階を含む。一般に、製剤は、活性成分と液体担体または粉砕固体担体または両方を均一かつ密接に結合させ、次いで、必要であれば、製品を成型することにより調製される。
医薬製剤は、無菌希釈剤、緩衝液、張性制御剤および抗細菌剤を含み得る。活性ＡＳＯは、制御放出性質を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む、分解または体からの即時の排除から保護する担体を用いて調製され得る。非経腸または経腸、心臓内または脳室内投与のために、担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝化食塩水であり得る。２００７年３月２２日公開の国際公開ＷＯ２００７／０３１０９１(Ａ２)は、適当な薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントをさらに提供する。
IV. 診断
本発明は、さらに異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の診断中に有用な診断方法を提供する。ある実施態様において、このような疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌およびこれらの組み合わせを含む。
本発明は、さらに異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の診断中に有用な診断方法を提供する。ある実施態様において、このような疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌およびこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、本発明のＡＳＯにより診断され得る疾患または障害は、心血管疾患である。心血管疾患の非限定的例は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患および静脈血栓症を含む。ある実施態様において、心不全は、左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率が低下した心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率が保たれた心不全(ＨＦｐＥＦ)、境界型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症を含む。
本発明のＡＳＯは、個体からの組織または体液におけるＡＮＧＰＴＬ２転写物の発現を測定するのに使用でき、測定した発現レベルと正常組織または体液の標準ＡＮＧＰＴＬ２転写物発現レベルを比較し、それにより、正常と比較した発現レベルの増加は、本発明のＡＳＯで処置可能な障害の指標である。
本発明のＡＳＯを、当業者に知られるあらゆる方法を使用して、生物学的サンプルにおけるＡＮＧＰＴＬ２転写物レベルのアッセイに使用し得る(Touboul et. al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et. al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91)。
用語「生物学的サンプル」は、個体、細胞株、組織培養またはＡＮＧＰＴＬ２転写物を発現する可能性のある細胞の他の供給源から得た、あらゆる生物学的サンプルをいう。哺乳動物からこのような生物学的サンプルを得る方法は、当分野で周知である。
Ｖ. ＡＳＯを含むキット
本発明は、さらにここに記載するＡＳＯを含み、ここに記載する方法の実施に使用され得る、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、１以上の容器に少なくとも１つのＡＳＯを含む。ある実施態様において、キットは、全対照、アッセイを実施するための指示ならびに結果の分析および提示のために必要なソフトウェアを含む、検出アッセイの実施に必要なおよび／または十分な成分の全てを含む。当業者は、開示されるＡＳＯが、当分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に取り込まれ得ることを、すぐに認識する。
本発明は、さらにここに記載するＡＳＯを含み、ここに記載する方法の実施に使用され得る、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、１以上の容器に少なくとも１つのＡＳＯを含む。ある実施態様において、キットは、全対照、アッセイを実施するための指示ならびに結果の分析および提示のために必要なソフトウェアを含む、検出アッセイの実施に必要なおよび／または十分な成分の全てを含む。当業者は、開示されるＡＳＯが、当分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に取り込まれ得ることを、すぐに認識する。
VI. 使用方法
本発明のＡＳＯは、例えば、診断、治療および予防のための、研究試薬として利用され得る。
本発明のＡＳＯは、例えば、診断、治療および予防のための、研究試薬として利用され得る。
研究では、このようなＡＳＯは、細胞および実験動物におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の合成を特異的に阻害(一般にｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによる)するために使用でき、それにより標的の機能的分析または治療介入のための標的としての有用性の評価が促進される。さらに提供されるのは、細胞または組織と、インビトロまたはインビボで、ここに開示されるＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物の１以上の有効量を接触させることを含む、細胞または組織におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡおよび／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を下方制御する方法である。
診断において、ＡＳＯは、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションまたは類似の技術により、細胞および組織におけるＡＮＧＰＴＬ２転写物発現の検出および定量に使用され得る。
治療について、ＡＮＧＰＴＬ２転写物の発現および／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の調節により処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、本発明により、ＡＳＯを投与することにより処置する。さらに提供されるのは、本発明のＡＳＯまたは組成物の１以上の治療または予防有効量を投与することによる、ＡＮＧＰＴＬ２転写物の発現および／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の増加が関連する疾患または状態を有するまたはその素因があることが疑われる哺乳動物を処置、例えば、ヒトを処置する方法である。本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。ある実施態様において、本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートは治療に使用される。
本発明は、さらに１以上の異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の処置のために使用するＡＳＯを提供する。ある実施態様において、このような疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、疾患または障害は心血管疾患である。心血管疾患非の限定的例は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患および静脈血栓症を含む。
ある実施態様において、疾患、障害または状態は、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子転写物および／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の過発現と関連する。
本発明はまた細胞または組織におけるＡＮＧＰＴＬ２遺伝子転写物および／またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を阻害(例えば、低減による)する方法であって、細胞または組織を、インビトロまたはインビボで、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたはその医薬組成物の１以上の有効量と接触させて、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子転写物の発現の低下を起こし、それによりＡＮＧＰＴＬ２タンパク質低減を含む、方法も提供する。
本発明は、ここに記載する障害の処置またはここに記載する障害の処置方法のための医薬の製造における、本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートの使用も提供する。
本発明は、さらに本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートを細胞に投与し、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を阻害または減少させることを含む、ＡＮＧＰＴＬ２を発現する細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を阻害または低減する方法も提供する。
本発明は、本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートを投与することを含む、それを必要とする対照における、運動神経の興奮性亢進(例えば、心筋細胞でみられるような)を低減、軽減、予防または処置する方法も含む。
本発明はまたここに記載する障害を処置する方法であって、ここに記載する本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートおよび／または本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法も提供する。
本発明のＡＳＯおよび他の組成物は、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の過発現と関連する状態の処置に使用され得る。
概説するならば、本発明のある態様は、異常なＡＮＧＰＴＬ２レベルと関連する状態を有するまたは疑われる哺乳動物を処置する方法であって、該哺乳動物に１以上のＬＮＡ単位を含むＡＮＧＰＴＬ２転写物を標的とするＡＳＯの治療有効量を投与することを含む方法に関する。本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。
本発明の重要な態様は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置のための医薬の製造における、ここに定義するＡＳＯ(化合物)またはここに定義するコンジュゲートの使用である。
本発明の方法は、異常なＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のレベルおよび／または活性が原因の疾患の処置または予防に使用され得る。ある実施態様において、異常なＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のレベルおよび／または活性が原因の疾患は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌およびこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、疾患は心血管疾患である。ここで使用する心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患および静脈血栓症を含み得る。
ある実施態様において、心血管疾患は、左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率が低下した心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率が保たれた心不全(ＨＦｐＥＦ)、境界型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症を含み得る心不全である。
換言すると、ある実施態様において、本発明は、さらにＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のレベル異常を処置する方法であって、本発明のＡＳＯまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に関する。
本発明はまた医薬として使用するための、ここに定義するＡＳＯ、組成物またはコンジュゲートに関する。
本発明は、さらにＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のレベル異常またはＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の変異体(例えば、ここに記載する疾患の一つと関連するアレルバリアント)の発現の処置のための医薬の製造のための、ここに定義する化合物、組成物またはコンジュゲートの使用に関する。
処置を必要とする患者は、疾患または障害を有するまたは有する可能性がある患者である。
本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の慣用の技術を用いる。このような技術は、文献に十分説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)参照。
以下の実施例は、説明のために提供し、限定のためではない。
実施例１：ＡＳＯの構築
ここに記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体(配列番号１)の種々の領域を標的とするようデザインした。配列番号１は、GenBank Accession No. NC_000009.12の残基１２７,０８７,３４９～１２７,１２２,７６５の逆相補体に対応する、ゲノムＡＮＧＰＴＬ２配列を提供する。例えば、ＡＳＯは、図２に示す、配列番号１の開始および終了部位を使用して、表示された領域を標的とするよう構築した。本発明のＡＳＯの例示的配列は図２に提供する。ある実施態様において、ＡＳＯは、図２に示すとおり、ギャップマーとしてデザインした。本発明のギャップマーは、ロック核酸 － ＬＮＡ(大文字) － を含むように構築した。例えば、ギャップマーは、５’末端および３’末端にベータ－デオキシＬＮＡを有し、ホスホロチオエート主鎖を有し得る。しかし、ＬＮＡはまた何らかの他のヌクレオシドアナログで置換され得て、主鎖は他のタイプの主鎖(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの何らかの組み合わせ)であり得る。
ここに記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ前駆体(配列番号１)の種々の領域を標的とするようデザインした。配列番号１は、GenBank Accession No. NC_000009.12の残基１２７,０８７,３４９～１２７,１２２,７６５の逆相補体に対応する、ゲノムＡＮＧＰＴＬ２配列を提供する。例えば、ＡＳＯは、図２に示す、配列番号１の開始および終了部位を使用して、表示された領域を標的とするよう構築した。本発明のＡＳＯの例示的配列は図２に提供する。ある実施態様において、ＡＳＯは、図２に示すとおり、ギャップマーとしてデザインした。本発明のギャップマーは、ロック核酸 － ＬＮＡ(大文字) － を含むように構築した。例えば、ギャップマーは、５’末端および３’末端にベータ－デオキシＬＮＡを有し、ホスホロチオエート主鎖を有し得る。しかし、ＬＮＡはまた何らかの他のヌクレオシドアナログで置換され得て、主鎖は他のタイプの主鎖(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの何らかの組み合わせ)であり得る。
ＡＳＯは、当分野で周知の方法を使用して、合成した。このようなＡＳＯの製造方法の例は、Barciszewski et al., Chapter 10 - "Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)に記載される。
実施例２：ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ発現の減少を測定するためのｑＰＣＲアッセイ
本発明のＡＳＯを、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞(ATCC(登録商標)CRL-2137TM)におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ発現を低減する能力について試験した。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞を、細胞培養培地(ＤＭＥＭ高グルコース(Ｄ６５４６)、非必須アミノ酸添加(０.１mM、Ｍ７１４５)、Ｌ－グルタミン(２mM、Ｇ７５１３)および１０％ＦＢＳ)で増殖させた。５日毎に、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、続いて０.２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２～３分間インキュベーションし、粉末化して、その後細胞播種することによりトリプシン化した。細胞を、１５継代まで賠償で維持した。
本発明のＡＳＯを、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞(ATCC(登録商標)CRL-2137TM)におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ発現を低減する能力について試験した。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞を、細胞培養培地(ＤＭＥＭ高グルコース(Ｄ６５４６)、非必須アミノ酸添加(０.１mM、Ｍ７１４５)、Ｌ－グルタミン(２mM、Ｇ７５１３)および１０％ＦＢＳ)で増殖させた。５日毎に、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、続いて０.２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２～３分間インキュベーションし、粉末化して、その後細胞播種することによりトリプシン化した。細胞を、１５継代まで賠償で維持した。
実験での使用のために、１０,０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに１００μL増殖培地中播種した。ＡＳＯを７５０μM原液から調製し、ＰＢＳに溶解した。細胞播種約２４時間後、ＡＳＯを細胞に加えて、所望の最終濃度(すなわち、５μMまたは２５μM)を得た。次いで、細胞を３日間、何ら培地交換をすることなくインキュベートした。効力決定のために(図３参照)、８濃度のＡＳＯを、１６～５０,０００nMの最終濃度範囲で調製した。インキュベーション後、細胞を培地の除去、続いて１２５μL PURELINK(登録商標)Pro 96 Lysis緩衝液および１２５μL ７０％エタノールの添加により採取した。次いで、ＲＮＡを製造業者の指示により精製し、５０μL 水の最終体積に溶出し、１０～２０ng／μLのＲＮＡ濃度とした。次に、ＲＮＡを水で１０倍希釈し、その後１工程ｑＰＣＲ反応に付した。
一工程ｑＰＣＲ反応について、ｑＰＣＲ－ｍｉｘ(QauntaBioからのqScriptTMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX(登録商標)Low ROX)を、２つのTaqmanプローブと１０：１：１比(ｑＰＣＲ混合物：プローブ１：プローブ２)で混合して、マスターミックスを産生した。Taqmanプローブは、LifeTechnologiesおよびIDTから得た: ANGPTL2_Hs00765776_m1; ACTB_Hs_PT.39a. 22214847。次いで、マスターミックス(６μL)およびＲＮＡ(４μL、１～２ng／μL)を、ｑＰＣＲプレート(MICROAMP(登録商標)optical 384 well, catalog no. 4309849)で混合した。プレートを密封後、プレートを高速回転(１０００ｇで１分間、ＲＴ)に付し、ViiaTM 7 system (Applied Biosystems, Thermo)に移した。次のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分間；９５℃で３分間；４０サイクルの９５℃で５秒間、続いて１.６℃／秒の温度低下、続いて６０℃で４５秒間。データを、QuantStudioTM Real_time PCR Softwareを使用して分析した。ＡＳＯ処置サンプルのパーセント阻害を、対照処置サンプルに対して計算した。結果を図３および４に示す。
実施例３：インビボでのＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ減少の分析
ＡＳＯのインビボでＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルを低減させる効力を評価するために、１０週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、次の例示的ＡＳＯの一つを皮下投与した：ＡＳＯ－００２７、ＡＳＯ－００３７、ＡＳＯ－００９４、ＡＳＯ－００７９、ＡＳＯ－００５０、ＡＳＯ－０１５０およびＡＳＯ－０１３２。ＡＳＯ(無菌食塩水中、約５mg／mL濃度で製剤化)を、３０mg／kg／日の用量で、連続３日間(１日目、２日目および３日目)投与した。マウスを、最初の投与１週間後屠殺し、心臓を摘出し、尖端塊を、RNAlaterに保存した。ＲＮＡ精製を、MagMAX-96総ＲＮＡ単離キット(Thermo AM1830)を使用して実施した。ｃＤＮＡ合成を、Quanta qScript cDNA合成キット(Quanta 95047)を使用して、実施した。１０ngの総ｃＤＮＡを、Angptl2 (ThermoMm00507897_m1)およびギャップＤＨ(Thermo 4352339E)のための二本鎖Taqman反応を使用する、Applied Biosystems ViiA7装置での定量的リアルタイムＰＣＲに使用した。ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルをギャップＤＨに対して正規化し、食塩水投与対照群のパーセント対照として表した。
ＡＳＯのインビボでＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルを低減させる効力を評価するために、１０週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、次の例示的ＡＳＯの一つを皮下投与した：ＡＳＯ－００２７、ＡＳＯ－００３７、ＡＳＯ－００９４、ＡＳＯ－００７９、ＡＳＯ－００５０、ＡＳＯ－０１５０およびＡＳＯ－０１３２。ＡＳＯ(無菌食塩水中、約５mg／mL濃度で製剤化)を、３０mg／kg／日の用量で、連続３日間(１日目、２日目および３日目)投与した。マウスを、最初の投与１週間後屠殺し、心臓を摘出し、尖端塊を、RNAlaterに保存した。ＲＮＡ精製を、MagMAX-96総ＲＮＡ単離キット(Thermo AM1830)を使用して実施した。ｃＤＮＡ合成を、Quanta qScript cDNA合成キット(Quanta 95047)を使用して、実施した。１０ngの総ｃＤＮＡを、Angptl2 (ThermoMm00507897_m1)およびギャップＤＨ(Thermo 4352339E)のための二本鎖Taqman反応を使用する、Applied Biosystems ViiA7装置での定量的リアルタイムＰＣＲに使用した。ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルをギャップＤＨに対して正規化し、食塩水投与対照群のパーセント対照として表した。
図５に示すとおり、試験した全ＡＳＯは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与したとき、ＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルを低減できた。まとめると、ここに提供する結果は、インビトロおよびインビボ両者でのＡＳＯの効力を示し、ＡＮＧＰＴＬ２特異的ＡＳＯが異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性、例えば、心血管関連疾患または障害が関連するような種々の医学的障害処置のための疾患修飾であり得ること支持する。
Claims (58)
- アンギオポエチン様２(ＡＮＧＰＴＬ２)転写物内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)。
- ＡＮＧＰＴＬ２転写物内の核酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％相補的である、請求項１のＡＳＯ。
- ＡＮＧＰＴＬ２転写物が配列番号１、配列番号２、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９および配列番号２０７からなる群から選択される、請求項１または２のＡＳＯ。
- ＡＳＯがＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を発現するヒト細胞(例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞)におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現を低減できる、請求項１～３の何れかのＡＳＯ。
- ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現が、ＡＳＯに曝されていないヒト細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低減される、請求項４のＡＳＯ。
- ＡＮＧＰＴＬ２転写物を発現するヒト細胞(例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞)におけるＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ)発現を低減できる、請求項１～５の何れかのＡＳＯ。
- ＡＮＧＰＴＬ２転写物発現が、ＡＳＯに曝されていないヒト細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２転写物と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％低減される、請求項６のＡＳＯ。
- ＡＳＯがギャップマーである、請求項１～７の何れかのＡＳＯ。
- ＡＳＯが１以上のヌクレオシドアナログを含む、請求項８のＡＳＯ。
- ヌクレオシドアナログの１以上が２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ(２’－ＯＭｅ)；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ(２’－ＭＯＥ)；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸(ＡＮＡ)；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシドアナログ(ＬＮＡ)；またはこれらの組み合わせを含む、請求項９のＡＳＯ。
- １以上のヌクレオシドアナログが親和性増強２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項９または１０のＡＳＯ。
- 親和性増強２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡである、請求項１１のＡＳＯ。
- ＬＮＡが拘束エチルヌクレオシド(ｃＥｔ)、２’,４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル(ｃＭＯＥ)、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ,４’－Ｃ－エチレン－架橋核酸(ＥＮＡ)、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２のＡＳＯ。
- ＡＳＯが１以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む、請求項１～１３の何れかのＡＳＯ。
- ＡＳＯが(ｉ)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡレベルの低減；(ii)ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルの低減；(iii)異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の１以上の症状の低減、軽減または処置；または(iv)これらの何れかの組み合わせが可能である、請求項１～１４の何れかのＡＳＯ。
- 異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害が心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む、請求項１５のＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が(ｉ)配列番号１のヌクレオチド１～２１１；(ii)配列番号１のヌクレオチド４７１～６８６；(iii)配列番号１のヌクレオチド１,０６９～１,３７６；(iv)配列番号１のヌクレオチド１,６６６～８,６７３；(ｖ)配列番号１のヌクレオチド８,９７５～１２,４１５；(vi)配列番号１のヌクレオチド１２,７３９～１８,１１６；(vii)配列番号１のヌクレオチド１８,４２２～２９,８７５；または(viii)配列番号１のヌクレオチド３０,３７３～３５,３８９を含む核酸配列と相補的である、請求項１～１６の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が(ｉ)配列番号１のヌクレオチド３７～１６１；(ii)配列番号１のヌクレオチド５２１～６３６；(iii)配列番号１のヌクレオチド１,１１９～１,３２６；(iv)配列番号１のヌクレオチド１,７１６～８,６２３；(ｖ)配列番号１のヌクレオチド９,０２５～１２,３６５；(vi)配列番号１のヌクレオチド１２,７８９～１８,０６６；(vii)配列番号１のヌクレオチド１８,４７２～２９,８２５；または(viii)配列番号１のヌクレオチド３０,４２３～３５,３３９を含む核酸配列と相補的である、請求項１～１７の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が(ｉ)配列番号１のヌクレオチド８７～１１１；(ii)配列番号１のヌクレオチド５７１～５８６；(iii)配列番号１のヌクレオチド１,１６９～１,２７６；(iv)配列番号１のヌクレオチド１,７６６～８,５７３；(ｖ)配列番号１のヌクレオチド９,０７５～１２,３１５；(vi)配列番号１のヌクレオチド１２,８３９～１８,０１６；(vii)配列番号１のヌクレオチド１８,５２２～２９,７７５；または(viii)配列番号１のヌクレオチド３０,４７３～３５,２８９を含む核酸配列と相補的である、請求項１～１８の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド２０,１８７～２０,２３４を含む核酸と相補性である、請求項１～１９の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド２０,２０２～２０,２１９を含む核酸と相補的である、請求項１～２０の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が１個または２個のミスマッチを有する配列番号４～配列番号１９３を含む、請求項１～２１の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が図２における配列から選択されるヌクレオチド配列を含む(配列番号４～配列番号１９３)、請求項１～２１の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が配列番号８、配列番号２０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８２、配列番号８８、配列番号８５、配列番号９０、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１１１、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４または配列番号１４６を含む、請求項１～２３の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が配列番号１４１、配列番号１２２、配列番号８、配列番号３８、配列番号９５、配列番号８８または配列番号１２０を含む、請求項１～２３の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～２３の何れかのＡＳＯ。
- 図２のデザインに一致する群から選択されるデザインを有し、ここで、大文字が糖修飾ヌクレオシドであり、小文字がＤＮＡである、請求項１～２６の何れかのＡＳＯ。
- １５～２０ヌクレオチド長を有する、請求項１～２７の何れかのＡＳＯ。
- 連続ヌクレオチド配列が１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１～２８の何れかのＡＳＯ。
- １以上の修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項２９のＡＳＯ。
- ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％が修飾されている、請求項２９または３０のＡＳＯ。
- ヌクレオシド間結合の各々がホスホロチオエート結合である、請求項３１のＡＳＯ。
- 請求項１～３２の何れかのＡＳＯを含むコンジュゲートであって、ここで、ＡＳＯが少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合する、コンジュゲート。
- 非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分がタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項３３のコンジュゲート。
- 請求項１～３２の何れかのＡＳＯまたは請求項３３または３４のコンジュゲートおよび薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、医薬組成物。
- 薬学的に許容される塩がナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩またはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項３５の医薬組成物。
- 少なくとも１つのさらなる治療剤をさらに含む、請求項３５または３６の医薬組成物。
- さらなる治療剤がＡＮＧＰＴＬ２アンタゴニストである、請求項３７の医薬組成物。
- ＡＮＧＰＴＬ２アンタゴニストが抗ＡＮＧＰＴＬ２抗体またはそのフラグメントである、請求項３８の医薬組成物。
- 請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物および使用のための指示を含む、キット。
- 請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物および使用のための指示を含む、診断キット。
- 細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現を阻害または低減する方法であって、請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物をＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を発現する細胞に投与することを含み、ここで、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現が投与後阻害または低減されるものである、方法。
- 細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現を阻害または低減するインビトロ方法であって、請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物とＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を発現する細胞を接触させることを含み、ここで、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質発現が接触後阻害または低減されるものである、方法。
- ＡＳＯが細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現を、投与後または接触後阻害または低減する、請求項４２または４３の方法。
- ＡＮＧＰＴＬ２転写物(例えば、ｍＲＮＡ)の発現が、ＡＳＯに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％低減される、請求項４４の方法。
- ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現が、ＡＳＯに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％低減される、請求項４２～４５の何れかの方法。
- 細胞が脳細胞、例えば、神経芽細胞(例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞)である、請求項４２～４６の何れかの方法。
- 処置を必要とする対象における異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の１以上の症状を低減、軽減または処置する方法であって、請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
- 医薬の製造のための、請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物の使用。
- 処置を必要とする対象における、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の処置のための医薬の製造のための、請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物の使用。
- 治療に使用するための、請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物。
- 処置を必要とする対象における、異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害の治療に使用するための、請求項１～３２の何れかのＡＳＯ、請求項３３または３４のコンジュゲートまたは請求項３５～３９の何れかの医薬組成物。
- 異常なＡＮＧＰＴＬ２発現および／または活性と関連する疾患または障害が心血管疾患、肥満、代謝疾患、２型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む、請求項１５のＡＳＯ、請求項４８の方法、請求項５０の使用または請求項５２の使用のためのＡＳＯ。
- 心血管疾患または障害がアテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、静脈血栓症またはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項５３のＡＳＯ、方法、使用または使用のためのＡＳＯ。
- 心血管疾患または障害が心不全である、請求項５４のＡＳＯ、方法、使用または使用のためのＡＳＯ。
- 心不全が左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率が低下した心不全(ＨＦｒＥＦ)、駆出率が保たれた心不全(ＨＦｐＥＦ)、境界型心不全(ＨＦｍｒＥＦ)、肥大型心筋症(ＨＣＭ)、高血圧性心疾患(ＨＨＤ)または高血圧性肥大型心筋症を含む、請求項５５のＡＳＯ、方法、使用または使用のためのＡＳＯ。
- 対象がヒトである、請求項４８および５３～５６の何れかの方法、請求項５０および５３～５６の何れかの使用または請求項５２～５６の何れかの使用のためのＡＳＯ。
- ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物が心臓内、経口、非経腸、髄腔内、側脳室内、肺、局所または脳室内投与される、請求項４８および５３～５７の何れかの方法、請求項５０および５３～５７の何れかの使用または請求項５２～５７の何れかの使用のためのＡＳＯ。
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