JP2022524218A - Angptl2アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents

Angptl2アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2022524218A
JP2022524218A JP2021559064A JP2021559064A JP2022524218A JP 2022524218 A JP2022524218 A JP 2022524218A JP 2021559064 A JP2021559064 A JP 2021559064A JP 2021559064 A JP2021559064 A JP 2021559064A JP 2022524218 A JP2022524218 A JP 2022524218A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
aso
angptl2
nucleotides
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021559064A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020206115A5 (ja
Inventor
アール アンダーソン,ブライアン
イー オルソン,リチャード
エム マクドナルド,アイバー
イー マーサー,スティーブン
ヘーイドーン,ピーター
レアベック イェンセン,マリアンネ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Innovation Center Copenhagen AS
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Roche Innovation Center Copenhagen AS
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Innovation Center Copenhagen AS, Bristol Myers Squibb Co filed Critical Roche Innovation Center Copenhagen AS
Publication of JP2022524218A publication Critical patent/JP2022524218A/ja
Publication of JPWO2020206115A5 publication Critical patent/JPWO2020206115A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04Anorexiants; Antiobesity agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06Antiarrhythmics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12Antihypertensives
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/11Antisense
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/31Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315Phosphorothioates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/32Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/34Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341Gapmers, i.e. of the type ===---===

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、細胞におけるANGPTL2 mRNAを標的とし、ANGPTL2タンパク質の発現を低減させる、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。NGPTL2タンパク質発現の低減は、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連するようなある医学的障害、例えば、心血管関連疾患または障害の処置に有益である。

Description

関連出願の相互参照
このPCT出願は、2019年4月3日出願の米国仮出願62/828,864に基づく優先権の利益を主張し、これは、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
EFS-WEBにより電子的に提出された配列表の記載
本出願の提出に際し、電子的に提出された配列表の内容(名称:3338.144PC01_Seqlisting_ST25.txt、サイズ:149,978バイト;および作成日:2020年4月2日)は、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
発明の分野
本発明は、細胞におけるアンギオポエチン様2(ANGPTL2)転写物を標的とし、ANGPTL2タンパク質の発現を低減させる、アンチセンスオリゴマー化合物(ASO)に関する。ANGPTL2タンパク質発現の低減は、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連するものなどの広範な医学的障害(例えば、心血管関連疾患または障害)に有益である。
背景
アンギオポエチン様2(ANGPTL2)は、計8個のメンバー(ANGPTL1~8)からなる、アンギオポエチン様ファミリーに属する分泌型タンパク質である。ANGPTL2は、主に心臓、脂肪組織、肺、腎臓および骨格筋に発現され、多くの生物学的過程(例えば、組織修復および血管形成)において重要な役割を有する。Kim, I., et al., J Biol Chem 274(37):26523-8 (1999)。ANGPTL2の有益な血管新生性質は、ある卒中患者で報告されている。Buga, A.M., et al., Front Aging Neurosci 6:44 (2014)。ANGPTL2はまた造血幹細胞および前駆細胞の生存および拡大、腸上皮再生の制御および有益な自然免疫応答の促進に重要な役割を有することも記載されている。Broxmeyer, H.E., et al., Blood Cells Mol Dis 48(1):25-29 (2012); Horiguchi, H., et al., EMBO J 36(4):409-424 (2017); Yugami, M., et al., J Biol Chem 291(36):18843-52 (2016)。
科学の進歩にも関わらず、心臓関連疾患は、世界中で男性および女性の筆頭死亡原因のままである。米国心臓協会は、2030年までに、米国人口の約40%がある形態の血管疾患を有すると推定され、その直接医療費は8180億ドルに達すると予測される。Benjamin, E.J., et al., Circulation 135:e146-e603 (2017)。それゆえに、はるかにロバストで費用効果の高い新規処置選択肢が、高度に望まれる。
発明の概要
ここに提供されるのは、アンギオポエチン様2(ANGPTL2)転写物内の核酸配列に相補的な10~30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2転写物内の核酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%相補性である。ある実施態様において、ANGPTL2転写物は、配列番号1、配列番号2、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199および配列番号207からなる群から選択される。
ある実施態様において、ここに開示するASOは、ANGPTL2タンパク質を発現しているヒト細胞(例えば、SK-N-AS細胞)において、ANGPTL2タンパク質発現を低減できる。ある実施態様において、ANGPTL2タンパク質発現は、ASOに曝されていないヒト細胞におけるANGPTL2タンパク質発現と比較して、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%低減される。
ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2転写物を発現しているヒト細胞(例えば、SK-N-AS細胞)において、ANGPTL2転写物(例えば、mRNA)発現を低減できる。ある実施態様において、ANGPTL2転写物発現は、ASOに曝されていないヒト細胞におけるANGPTL2転写物と比較して、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%低減される。
ある実施態様において、ASOはギャップマーである。
ある実施態様において、ASOは、1以上のヌクレオシドアナログを含む。ある実施態様において、ヌクレオシドアナログの1以上は、2’-O-アルキル-RNA;2’-O-メチルRNA(2’-OMe);2’-アルコキシ-RNA;2’-O-メトキシエチル-RNA(2’-MOE);2’-アミノ-DNA;2’-フルオロ-RNA;2’-フルオロ-DNA;アラビノ核酸(ANA);2’-フルオロ-ANA;二環式ヌクレオシドアナログ(LNA);またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、1以上のヌクレオシドアナログは親和性増強2’糖修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、親和性増強2’糖修飾ヌクレオシドはLNAである。さらなる実施態様において、LNAは、拘束エチルヌクレオシド(cEt)、2’,4’-拘束2’-O-メトキシエチル(cMOE)、α-L-LNA、β-D-LNA、2’-O,4’-C-エチレン-架橋核酸(ENA)、アミノ-LNA、オキシ-LNA、チオ-LNAおよびこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、ASOは1以上の5’-メチル-シトシン核酸塩基を含む。
ある実施態様において、ASOは、(i)SK-N-AS細胞におけるANGPTL2 mRNAレベルの低減;(ii)SK-N-AS細胞におけるANGPTL2タンパク質レベルの低減;(iii)異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の1以上の症状の低減、軽減または処置;または(iv)これらの何れかの組み合わせが可能である。ある実施態様において、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、2型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ここに開示するASOの連続ヌクレオチド配列は、(i)配列番号1のヌクレオチド1~211;(ii)配列番号1のヌクレオチド471~686;(iii)配列番号1のヌクレオチド1,069~1,376;(iv)配列番号1のヌクレオチド1,666~8,673;(v)配列番号1のヌクレオチド8,975~12,415;(vi)配列番号1のヌクレオチド12,739~18,116;(vii)配列番号1のヌクレオチド18,422~29,875;または(viii)配列番号1のヌクレオチド30,373~35,389を含む核酸配列と相補的である。ある実施態様において、ASOの連続ヌクレオチド配列は、(i)配列番号1のヌクレオチド37~161;(ii)配列番号1のヌクレオチド521~636;(iii)配列番号1のヌクレオチド1,119~1,326;(iv)配列番号1のヌクレオチド1,716~8,623;(v)配列番号1のヌクレオチド9,025~12,365;(vi)配列番号1のヌクレオチド12,789~18,066;(vii)配列番号1のヌクレオチド18,472~29,825;または(viii)配列番号1のヌクレオチド30,423~35,339を含む核酸配列と相補的である。さらなる実施態様において、ASOの連続ヌクレオチド配列は、(i)配列番号1のヌクレオチド87~111;(ii)配列番号1のヌクレオチド571~586;(iii)配列番号1のヌクレオチド1,169~1,276;(iv)配列番号1のヌクレオチド1,766~8,573;(v)配列番号1のヌクレオチド9,075~12,315;(vi)配列番号1のヌクレオチド12,839~18,016;(vii)配列番号1のヌクレオチド18,522~29,775;または(viii)配列番号1のヌクレオチド30,473~35,289を含む核酸配列と相補的である。ある実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチド20,187~20,234を含む核酸と相補性である。他の実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチド20,202~20,219を含む核酸と相補性である。
ある実施態様において、ここに開示するASOの連続ヌクレオチド配列は、図2における配列から選択されるヌクレオチド配列を含む(配列番号4~配列番号193)。
ある実施態様において、ASOの連続ヌクレオチド配列は、配列番号8、配列番号20、配列番号38、配列番号46、配列番号79、配列番号84、配列番号82、配列番号88、配列番号85、配列番号90、配列番号89、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号101、配列番号111、配列番号116、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号132、配列番号142、配列番号141、配列番号143、配列番号144または配列番号146を含む。ある実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号141、配列番号122、配列番号8、配列番号38、配列番号95、配列番号88または配列番号120を含む。他の実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、配列番号116、配列番号118、配列番号117、配列番号120、配列番号119、配列番号121、配列番号122またはこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ここに開示するASOは、図2のデザインに一致する群から選択されるデザインを有し、ここで、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はDNAである。ある実施態様において、ASOは、15~20ヌクレオチド長を有する。
ある実施態様において、ここに開示するASOの連続ヌクレオチド配列は、1以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施態様において、1以上の修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。ある実施態様において、ヌクレオシド間結合の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%は修飾されている。ある実施態様において、ヌクレオシド間結合の各々はホスホロチオエート結合である。
またここに提供されるのは、ここに開示するASOを含むコンジュゲートであって、ここで、ASOは、少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合する。ある実施態様において、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの何らかの組み合わせを含む。
またここに提供されるのは、ここに開示するASOまたはコンジュゲートおよび薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、医薬組成物である。ある実施態様において、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも1つのさらなる治療剤をさらに含む。ある実施態様において、さらなる治療剤はANGPTL2アンタゴニストである。ある実施態様において、ANGPTL2アンタゴニストは抗ANGPTL2抗体またはそのフラグメントである。
本発明は、さらに、ここに開示するASO、コンジュゲートまたは医薬組成物および使用のための指示を含むキットを提供する。また開示されるのは、本発明のASO、コンジュゲートまたは医薬組成物および使用のための指示を含む、診断キットである。
ここに提供されるのは、細胞におけるANGPTL2タンパク質発現を阻害または低減する方法であって、ANGPTL2タンパク質を発現する細胞にここに開示するASO、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することを含み、ここで、細胞におけるANGPTL2タンパク質発現が投与後阻害または低減されるものである、方法である。ある態様において、本発明は、細胞におけるANGPTL2タンパク質発現を阻害または低減するインビトロ方法であって、ここに開示するASO、コンジュゲートまたは医薬組成物とANGPTL2タンパク質を発現する細胞を接触させることを含み、ここで、細胞におけるANGPTL2タンパク質発現が接触後阻害または低減されるものである、方法に関する。
ある実施態様において、ASOは、細胞におけるANGPTL2転写物(例えば、mRNA)の発現を、投与後または接触後阻害または低減する。ある実施態様において、ANGPTL2転写物(例えば、mRNA)の発現は、ASOに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または約100%低減される。さらなる実施態様において、ANGPTL2タンパク質の発現は、ASOに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%低減される。ある実施態様において、細胞は脳細胞、例えば、神経芽細胞(neuroblast cell)(例えば、SK-N-AS細胞)である。
またここに提供されるのは、処置を必要とする対象における異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の1以上の症状を低減、軽減または処置する方法であって、対象にここに開示するASO、コンジュゲートまたは医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法である。本発明はまた、医薬の製造のための、ここに開示するASO、コンジュゲートまたは医薬組成物の使用も提供する。ある実施態様において、医薬は、処置を必要とする対象における、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の処置のためのものである。ある実施態様において、本発明のASO、コンジュゲートまたは医薬組成物は治療に使用するためのものである。ある実施態様において、ここに開示するASO、コンジュゲートまたは医薬組成物は、処置を必要とする対象における、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の治療のためのものである。
ある実施態様において、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、2型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、心血管疾患または障害は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、静脈血栓症またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、心血管疾患または障害は心不全である。ある実施態様において、心不全は、左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率低下心不全(HFrEF)、駆出率維持心不全(HFpEF)、境界型心不全(HFmrEF)、肥大型心筋症(HCM)、高血圧性心疾患(HHD)または高血圧性肥大型心筋症を含む。
ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、本発明のASO、コンジュゲートまたは医薬組成物は、心臓内、経口、非経腸、髄腔内、側脳室内、肺、局所または脳室内投与される。
図1Aは、ヒトANGPTL2ゲノム配列を表す(Accession No. NC_000009.12のNCBI Reference Sequenceの残基127,087,349~127,122,765の逆相補体に相当)。配列番号1は、配列番号1におけるヌクレオチド「t」がmRNA前駆体においてウラシル「u」に置換されている以外、ANGPTL2 mRNA前駆体配列と同一である。図1Bは、配列番号2におけるヌクレオチド「t」がmRNAにおいてウラシル「u」に置換されている以外、ヒトANGPTL2 mRNA配列(Accession No. NM_012098.2)を示す。図1Cは、ヒトCAMK2Dタンパク質配列(Accession No. NP_036230.1)(配列番号3)を示す。図1Dは、選択的スプライシングにより生じ得る2つの異性体を示す。ANGPTL2アイソフォームX1の配列(Accession No. XP_006717093.1、配列番号194)は、図1Cにおけるカノニカル配列と次のとおり異なる:274~274:P→L;および275~493:欠損。ANGPTL2アイソフォーム2の配列(Accession No. Q9UKU9-2、配列番号195)は、図1Cにおけるカノニカル配列と次のとおり異なる:1~302:欠損。
図2は、ANGPTL2 mRNA前駆体を標的とする例示的ASOを示す。図2の各カラムは、ASOのみの配列について指定された配列番号、ANGPTL2 mRNA前駆体配列上の標的開始および終了部位、デザイン番号(DES No.)、デザインでのASO配列、ASO番号(ASO No.)および化学構造でのASO配列を示す。ASOデザインについて、大文字はヌクレオシドアナログを示し、小文字はDNAを示す。
図3は、実施例2に記載する種々のASOとインビトロ培養後の、SK-N-AS細胞におけるANGPTL2 mRNA発現のパーセント減少を示す。細胞を25μMまたは5μMのASOで処理した。ANGPTL2 mRNA発現の減少(アクチンに対して正規化)を対照のパーセントとして示す。
図4は、インビトロでのSK-N-AS細胞におけるANGPTL2 mRNA発現の低減における、種々のASOの効力(IC50)を示す。実施例2に記載のとおり、SK-N-AS細胞を、試験した種々のASOの10点タイトレーションと共にインビトロで培養し、ASOの効力(IC50)を、ANGPTL2対アクチン発現(M)の比として示す。
図5は、マウスにおけるインビボでのANGPTL2 mRNA発現減少における例示的ASOの有効性を示す。有効性は、食塩水投与対照マウスにおける対応する発現と比較した、ANGPTL2 mRNA発現のパーセント減少(ギャップDHに対して正規化)として示す。
発明の詳細な記載
I. 定義
ある物についての単数表現は、その物の1以上をいう;例えば、「ヌクレオチド配列」は、1以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、単数表現、用語、「1以上」および「少なくとも1つ」は、ここでは、相互交換可能に使用され得る。
さらに、「および/または」は、ここで使用するとき、2つの特定の特性または成分の、他方を伴うまたは伴わない各々として解釈されるべきである。故に、ここでの「Aおよび/またはB」などの表現において使用される用語「および/または」は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(単独)および「B」(単独)を含むことが意図される。同様に、「A、Bおよび/またはC」などの表現において使用される用語「および/または」は、次の態様の各々を包含することが意図される:A、BおよびC;A、BまたはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);およびC(単独)。
用語「含む」を使用してここで態様が記載されているとき、「からなる」および/または「から本質的になる」の用語で記載される以外類似する態様も提供されることは理解される。
他に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示において使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(SI)により認められた形態で記載される。数値範囲は、該範囲を規定する数値を含む。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は、5’から3’配向で左から右に記載する。アミノ酸配列はアミノからカルボキシ配向で左から右に記載する。ここで提供する「見出し」は、本明細書を全体と見て得られる、本発明の種々の態様の限定ではない。従って、以下に定義する用語は、本明細書をその全体を見て、より完全に定義される。
用語「約」は、近似、おおよそ、周辺または領域内を意味する。用語「約」が数値範囲と共に使用されるとき、範囲は、示される数値境界の上および下に延ばされることにより修飾される。一般に、用語「約」は、数値を、記載する値の、例えば、10パーセント上回るまたは下回る(高いまたは低い)幅まで、修飾され得る。例えば、「ASOは、ASO投与後細胞におけるANGPTL2タンパクの発現を少なくとも約60%低減する」との記載があるとき、ANGPTL2タンパク質レベルは、50%~70%の範囲で減少されることが含意される。
用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、複数の核酸を包含することを意図する。ある実施態様において、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、インビボまたはインビトロの標的配列、例えば、mRNA前駆体、mRNAまたはDNAをいう。本用語が標的配列における核酸またはヌクレオチドをいうとき、核酸またはヌクレオチドは、細胞における天然に存在する配列であり得る。他の実施態様において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本発明のASOにおける配列をいう。本用語がASOにおける配列をいうとき、核酸またはヌクレオチドは天然に存在しない、すなわち、化学的に合成されたもの、酵素により産生されたもの、組み換えにより産生されたものまたはこれらの何れかの組み合わせである。ある実施態様において、ASOにおける核酸またはヌクレオチドは合成または組み換えにより産生されるが、天然に存在する配列またはそのフラグメントではない。他の実施態様において、ASOにおける核酸またはヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも1つヌクレオチドアナログを含むため、天然に存在しない。用語「核酸」または「ヌクレオシド」はポリヌクレオチドに存在する、単一核酸セグメント、例えば、DNA、RNAまたはそのアナログをいう。「核酸」または「ヌクレオシド」は、天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。ある実施態様において、用語「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は相互交換可能に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列をいうとき、指すのはA、T、G、CまたはUおよびそのアナログなどの塩基の配列である。
ここで使用する用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分およびホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基などの共有結合した基(結合基)を含むグリコシドをいい、DNAまたはRNAなどの天然に存在するヌクレオチドならびにここでは「ヌクレオチドアナログ」とも称する修飾糖および/または塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチドの両方をカバーする。ここで、単一ヌクレオチド(単位)は、モノマーまたは核酸単位とも称され得る。ある実施態様において、用語「ヌクレオチドアナログ」は、修飾糖部分を有するヌクレオチドをいう。修飾糖部分(例えば、LNA)を有するヌクレオチドの非限定的例は、本明細書の他の箇所に開示される。他の実施態様において、用語「ヌクレオチドアナログ」は、修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドをいう。修飾核酸塩基部分を有するヌクレオチドは、5-メチル-シトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび2-クロロ-6-アミノプリンを含むが、これらに限定されない。
用語「核酸塩基」は、核酸ハイブリダイゼーションで水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部分を含む。ここで使用する用語「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中機能的である修飾核酸塩基も含む。本明細書で、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しないバリアントの両方をいう。このようなバリアントは、例えば、Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載される。核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基の文字コード、例えば、A、T、G、CまたはUにより示すことができ、ここで、各文字は所望により同等な機能の修飾核酸塩基を含み得る。例えば、例示オリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分はA、T、G、Cおよび5-メチルシトシンから選択される。
ここで使用する用語「ヌクレオシド」は、糖部分および塩基部分を含むグリコシドをいい、それゆえに、ASOのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合により共有結合される、ヌクレオチド単位をいうとき、使用され得る。バイオテクノロジーの分野で、用語「ヌクレオチド」は、しばしば核酸モノマーまたは単位をいうために使用される。ASOの場合、用語「ヌクレオチド」は塩基単独、すなわち、糖主鎖およびヌクレオチド間結合の存在が含意される、シトシン(DNAおよびRNA)、グアニン(DNAおよびRNA)、アデニン(DNAおよびRNA)、チミン(DNA)およびウラシル(RNA)を含む核酸塩基配列をいい得る。同様に、特にヌクレオチド間結合基の1以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は「ヌクレオシド」をいい得る。例えば、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定するときも、使用され得る。
ここで使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(ASO)は、標的核酸、特に標的核酸の連続配列とハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調節できるオリゴヌクレオチドとして同定される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、それゆえにsiRNAまたはshRNAではない。ある実施態様において、ここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。ここに開示する一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己間または自己内相補性の程度が、オリゴヌクレオチドの全長にわたり50%未満である限り、ヘアピンまたは分子間二本鎖構造(同じオリゴヌクレオチドの2分子間の二本鎖)を形成し得る。ここに開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾オリゴヌクレオチドである。ここで使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列全体、または、ある実施態様において、その連続ヌクレオチド配列を意味し得る。
ここで相互交換可能に使用される用語「iRNA」、「RNAi剤」、「iRNA剤」および「RNA干渉剤」は、ここでのRNAヌクレオシドを含み、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路を経てRNA転写物の標的化開裂に介在する、物質をいう。iRNAは、RNA干渉(RNAi)の過程を経てmRNAの配列特異的分解を指示する。iRNAは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象内の細胞の標的核酸の発現を調節、例えば、阻害する。RNAi剤は、一本鎖RNAi剤および二本鎖siRNA、ならびに短ヘアピンRNA(shRNA)を含む。本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、RNAi剤の形であるかまたはsiRNAまたはshRNAなどのRNAi剤の一部を形成することができる。本発明のある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列はsiRNAなどのRNAi剤である。
用語siRNAは、低分子干渉リボ核酸RNAi剤をいう。siRNAは、二本鎖RNA分子種であり、当分野で低分子干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られる。siRNAは、一般にセンス鎖(パッセンジャー鎖とも称される)およびアンチセンス鎖(ガイド鎖とも称される)を含み、ここで、各鎖は17~30ヌクレオチド長、一般に19~25ヌクレオシド長であり、アンチセンス鎖は標的核酸(適切には成熟mRNA配列)に完全相補的など相補的であり、センス鎖はセンス鎖とアンチセンス鎖が二本鎖または二本鎖領域を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である。siRNA鎖は平滑末端二本鎖を形成できまたは有利にセンス鎖およびアンチセンス鎖3’末端は、例えば、1個、2個または3個のヌクレオシドの、3’オーバーハングを形成し得る。ある実施態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖両者は2nt 3’オーバーハングを有する。二本鎖領域は、それゆえに、例えば17~25ヌクレオチド長、例えば21~23ヌクレオチド長であり得る。
細胞内に入ったら、アンチセンス鎖はRISC複合体に取り込まれ、これは標的核酸の標的分解または標的阻害に介在し得る。siRNAは、一般にRNAヌクレオシドに加えて修飾ヌクレオシドを含む。またはある実施態様において、siRNA鎖のヌクレオチドの全ては修飾され得る。修飾の非限定的例は、LNA(例えばWO2004083430、WO2007085485参照)、2’フルオロ、2’-O-メチルまたは2’-O-メトキシエチルなどの2’糖修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、siRNAのパッセンジャー鎖は不連続であり得る(例えばWO2007107162参照)。siRNAのアンチセンス鎖のシード領域で生ずる熱不安定化ヌクレオチドの取り込みは、siRNAのオフ・ターゲット活性の低減に有用であることが報告されている(例えばWO18098328参照)。
ある実施態様において、本発明のsiRNAなどのdsRNA剤は、少なくとも1つ修飾ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、センス鎖の実質的に全ヌクレオチドは修飾を含む;アンチセンス鎖の実質的に全ヌクレオチドは修飾を含むまたはセンス鎖の実質的に全ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の実質的に全ヌクレオチドは修飾を含む。さらに他の実施態様において、センス鎖の全ヌクレオチドは修飾を含む;アンチセンス鎖の全ヌクレオチドは修飾を含む;またはセンス鎖の全ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全ヌクレオチドは修飾を含む。
ある実施態様において、修飾ヌクレオチドは、デオキシ-ヌクレオチド、3’末端デオキシ-チミン(dT)ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体構造固定されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、塩基性ヌクレオチド、2’-アミノ修飾ヌクレオチド、2’-O-アリル修飾ヌクレオチド、2’-C-アルキル修飾ヌクレオチド、2’-ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、2’-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’-O-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、非連結ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、5’-ホスフェートを含むヌクレオチド、5’-ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチドおよび2-O-(N-メチルアセトアミド)修飾ヌクレオチドおよびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択され得る。適当なsiRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に5’-ホスフェート基または5’-ホスフェート模倣体を含む。ある実施態様において、アンチセンス鎖の5’末端はRNAヌクレオシドである。
ある実施態様において、dsRNA剤は、さらに少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合を含む。
ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合は一方または両方の鎖(例えば、アンチセンス鎖;またはセンス鎖)の3’末端であり得る;またはホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合は一方または両方の鎖(例えば、アンチセンス鎖;またはセンス鎖)の5’末端であり得る;またはホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合は一方または両方の鎖(例えば、アンチセンス鎖;またはセンス鎖)の5および3’両末端であり得る。ある実施態様において、残りのヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合である。
dsRNA剤はさらにリガンドを含み得る。ある実施態様において、リガンドは、センス鎖の3’末端にコンジュゲートされる。
生物学的分布に関して、siRNAは、例えば、ターゲティングリガンドにコンジュゲートされるおよび/または脂質ナノ粒子に製剤化されることができる。
本発明の他の態様は、治療用に適するsiRNA分子などのこれらdsRNAを含む医薬組成物および、例えば、ここに開示する種々の疾患状態の処置のために、本発明のsiRNAなどのdsRNA分子を投与することによる、標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、1以上の糖修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドをいう。用語「キメラオリゴヌクレオチド」は、糖修飾ヌクレオシドおよび非糖修飾ヌクレオシド両方を含むオリゴヌクレオチドをいうために、文献において使用されている用語である。ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合成により製造されたオリゴヌクレオチドであり、単離または精製された形態であり得る。
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸と相補的であるオリゴヌクレオチドの領域をいう。本用語は、ここでは用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と相互交換可能に使用される。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、F-G-F’ギャップマー領域などの連続ヌクレオチド配列を含み、所望によりさらなるヌクレオチド、例えば連続ヌクレオチド配列に官能基を結合させるために使用し得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸と相補的であってもなくてもよい。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド自体より長くてはならず、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列より短くてはならないことは理解される。
ここで使用する用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価なDNAまたはRNAヌクレオシドと比較して、糖部分または(核酸)塩基部分の1以上の修飾により修飾されたヌクレオシドをいう。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドは、用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と相互交換可能にも使用され得る。非修飾DNAまたはRNA糖部分を有するヌクレオシドは、ここではDNAまたはRNAヌクレオシドと称される。DNAまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、ワトソン・クリック塩基対形成が可能であるならば、なお一般にDNAまたはRNAと称される。
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、2個のヌクレオシドを共有結合する、ホスホジエステル(PO)結合以外の結合として当業者に一般に理解されるとおり、定義される。ある実施態様において、修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ここで使用する用語「ヌクレオチド長」は、ヌクレオシドアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列またはその連続ヌクレオチド配列などのある配列におけるヌクレオチド(モノマー)の総数を意味する。例えば、tacatattatattactcctc(配列番号158)の配列は20ヌクレオチドを有し、故に、本配列のヌクレオチド長は20である。用語「ヌクレオチド長」は、それゆえにここでは、「ヌクレオチド数」と相互交換可能に使用される。
当業者には認識されるとおり、オリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオチドは、5’ヌクレオチド間結合基を含まないが、5’末端基は含み得る。
ここで使用する用語「アルキル」は、単独でまたは組み合わせて、1~8炭素原子の直鎖または分岐鎖アルキル基、特に1~6炭素原子の直鎖または分岐鎖アルキル基、より特に1~4炭素原子の直鎖または分岐鎖アルキル基を示す。直鎖または分岐鎖C-Cアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチルおよび異性体オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの具体例はメチルである。アルキルのさらなる例は、モノ、ジまたはトリフルオロメチル、エチルまたはプロピル、例えばシクロプロピル(cPr)またはモノ、ジまたはトリフルオロシクロプロピルである。
用語「アルコキシ」は、単独でまたは組み合わせて、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec.ブトキシおよびtert.ブトキシなどの、式アルキル-O-(式中、用語「アルキル」は先に示した意味を有する)の基を意味する。特定の「アルコキシ」はメトキシである。
用語「保護基」は、単独でまたは組み合わせて、化学反応が他の保護されていない反応部位で選択的に起こり得るように、多官能性化合物において、反応部位を選択的に遮断する基をいう。保護基は除去され得る。保護基の例は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
本発明の出発物質または化合物の一つが、1以上の反応工程の反応下で不安定なまたは反応性である1以上の官能基を含むならば、適切な保護基(例えば、"Protective Groups in Organic Chemistry" by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New Yorkに記載のとおり)を、当分野で周知の方法を適用して、重要な工程の前に導入され得る。このような保護基は、文献に記載の標準的方法を使用して、合成の後の段階で除去され得る。保護基の例は、tert-ブトキシカルボニル(Boc)、9-フルオレニルメチルカルバメート(Fmoc)、2-トリメチルシリルエチルカルバメート(Teoc)、カルボベンジルオキシ(Cbz)およびp-メトキシベンジルオキシカルボニル(Moz)である。
ここに記載する化合物は、数か所の不斉中心を含み得て、光学的に純粋なエナンチオマー、例えば、ラセミ体などのエナンチオマー混合物、ジアステレオ異性体混合物、ジアステレオ異性ラセミ体またはジアステレオ異性ラセミ体混合物の形で存在し得る。
ここで使用する用語「二環式糖」は、二環式構造をもたらす第二の環を形成するために、4~7員環の2つの原子を接続する架橋を含む、4~7員環を含む修飾糖部分をいう。ある実施態様において、架橋は、LNAヌクレオシドで観察される、ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’を接続する(すなわち、2’-4’架橋)。
ここで使用する「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「停止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)は、一般にアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなされ得て、一方、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「UTR」)などはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、一般に得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする5’末端での開始コドンおよび得られたポリペプチドのカルボキシル末端をコードする3’末端での翻訳停止コドンにより決定される。
ここで使用する用語「非コード領域」は、コード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例は、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域(「UTR」)、非コーディングエクソンなどを含むが、これらに限定されない。エクソンの一部は、完全に各転写物の5’非翻訳領域(5’UTR)または3’非翻訳領域(3’UTR)であるかまたは一部である。非翻訳領域は、転写物の効率的翻訳ならびに翻訳速度および転写物の半減期の制御に重要である。
用語「領域」は、ヌクレオチド配列の文脈で使用するとき、その配列の部分をいう。例えば、用語「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」は、それぞれ特定のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補体内に位置する、該ヌクレオチド配列より短いが少なくとも10ヌクレオチドより長い配列をいう。用語「部分-配列」または「部分配列」も、ヌクレオチド配列の領域をいい得る。
用語「下流」は、ヌクレオチド配列をいうとき、核酸またはヌクレオチド配列が対照ヌクレオチド配列の3’に位置することを意味する。ある実施態様において、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
用語「上流」は、対照ヌクレオチド配列の5’に位置するヌクレオチド配列をいう。
ここで使用する用語「制御領域」は、コード領域の上流(5’非コード配列)、内部または下流(3’非コード配列)に位置し、付随するコード領域の転写、RNAプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。制御領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、UTRおよびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核生物細胞での発現について意図されるならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写停止配列は、通常コード配列の3’に位置する。
ここで使用する用語「転写物」は、DNAの転写により合成され、プロセシング後メッセンジャーRNA(mRNA)になる、すなわち、前駆体メッセンジャーRNA(mRNA前駆体)およびプロセシングされたmRNA自体である、一次転写物をいう。用語「転写物」は、「mRNA前駆体」および「mRNA」と相互交換可能に使用され得る。DNA鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNAおよびその他などの種々のタンパク質およびRNAを産生するために、成熟した、機能的形態に変換されるように、いくつかの方法で修飾される。故に、用語「転写物」は、エクソン、イントロン、5’UTRおよび3’UTRを含み得る。
ここで使用する用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、RNAまたはポリペプチドを産生する過程をいう。ポリヌクレオチドのメッセンジャーRNA(mRNA)への転写およびmRNAのポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。発現は、「遺伝子産物」を産生する。ここで使用する遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されたメッセンジャーRNAまたは転写物から翻訳されたポリペプチドであり得る。ここに記載する遺伝子産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングされた核酸または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合またはタンパク分解性開裂されたポリペプチドを含む。
ここで使用する用語「同一性」は、連続ヌクレオチド配列にわたり、対照配列(例えば、配列モチーフ)と同一である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)における連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの比(パーセントで表す)をいう。同一性のパーセンテージは、故に、2つの配列(本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および対照配列)間で同一(マッチ)である整列させた核酸塩基数を計数し、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの総数で除し、100倍することにより計算される。それゆえに、同一性のパーセンテージ=(マッチ×100)/整列させた領域の長さ(例えば連続ヌクレオチド配列)である。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性決定に際し、核酸塩基の化学修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対形成する機能的能力を保持する限り、無視される(例えば、5-メチルシトシンは、%同一性の計算の目的で、シトシンと同一と考えられる)。
ポリヌクレオチド対照配列と整列させた単一ポリヌクレオチド標的配列内の異なる領域は、各々、それら自体のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は、1/10で四捨五入できることは留意される。例えば、80.11、80.12、80.13および80.14は80.1に切り下げ、一方80.15、80.16、80.17、80.18および80.19は80.2に切り上げる。長さの値は常に整数であることも留意される。
ここで使用する用語「相同」および「相同性」は、用語「同一性」および「同一」と相互交換可能である。
用語「その天然に存在するバリアント」は、マウス、サルおよびヒトなどの哺乳動物などの規定された分類群内で天然に存在するANGPTL2ポリペプチド配列またはANGPTL2核酸配列(例えば、転写物)のバリアントをいう。一般に、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」をいうとき、本用語はまた染色体転座または複製により染色体位置9q33.3でみられるANGPTL2コード化ゲノムDNAのあらゆるアレルバリアント(すなわち、GenBank Accession No. NC_000009.12の残基127,087,349~127,122,765の逆相補体)およびそれ由来のmRNAなどのRNAも包含し得る。「天然に存在するバリアント」はまたANGPTL2 mRNAの選択的スプライシング由来のバリアントも含み得る。特定のポリペプチド配列をいうとき、例えば、本用語はまたタンパク質の天然に存在する形態も含み、それは、それゆえに、例えばシグナルペプチド開裂、タンパク分解性開裂、グリコシル化などの同時翻訳または翻訳後修飾によりプロセシングされ得る。
用語「対応する」および「に対応する」は、2つの別の核酸またはヌクレオチド配列をいうとき、相同性および/または機能性に基づき、互いに対応するまたは類似する配列の領域を明示するために使用できるが、特定配列のヌクレオチドは数が異なり得る。例えば、遺伝子転写物の種々のアイソフォームが、選択的スプライシングおよび/または他の修飾に基づき、各アイソフォームでナンバリングが異なり得る、類似のまたは保存されたヌクレオチド配列の部分を有し得る。さらに、核酸またはヌクレオチド配列を特徴づけるとき、種々のナンバリングシステム(例えば、遺伝子転写物および配列のナンバリングを翻訳開始コドンから開始するかまたは5’UTRを含むか)が用いられ得ることは認識される。さらに、遺伝子または遺伝子転写物の種々のバリアントの核酸またはヌクレオチド配列は異なり得る。しかしながら、ここで使用する核酸またはヌクレオチド配列相同性および/または機能性を共有するバリアントの領域は、互いに「対応する」と考えられる。例えば、配列番号1(「対照配列」)のヌクレオチドX~Yに対応するANGPTL2転写物のヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチドX~Yと同一配列または類似の配列を有するANGPTL2転写物配列(例えば、ANGPTL2 mRNA前駆体またはmRNA)をいい、ここで、Xは開始部位であり、Yは末端部位である(図2に示すとおり)。当業者は、ANGPTL2転写物配列と配列番号1の整列により、ANGPTL2転写物配列における対応するXおよびY残基を同定できる。
用語「対応するヌクレオチドアナログ」および「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチドアナログにおける核酸塩基と天然に存在するヌクレオチドが、同じ対形成またはハイブリダイズ能を有することを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの2-デオキシリボース単位がアデニンに結合しているとき、「対応するヌクレオチドアナログ」は、アデニンに結合したペントース単位(2-デオキシリボースと異なる)を含む。
用語「相補性」は、ヌクレオシド/ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対形成の能力をいう。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)およびアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含み得て、例えば5-メチルシトシン(シトシンの対応するヌクレオチドアナログ例)はしばしばシトシンの代わりに使用され、そのようなものとして、用語相補性は、非修飾および修飾核酸塩基間のワトソン・クリック塩基対形成を包含するとして理解される(例えばHirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1参照)。ここで使用する用語「逆相補体」、「逆相補的」および「逆相補性」は、用語「相補体」、「相補的」および「相補性」と相互交換可能である。ある実施態様において、用語「相補的」は、ANGPTL2転写物内の連続核酸配列と100%マッチまたは相補性(すなわち、完全相補的)をいう。ある実施態様において、用語「相補的」は、ANGPTL2転写物内の連続核酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%マッチまたは相補性をいう.37 1.4.1)。
ここで使用する用語「%相補的」は、連続ヌクレオチド配列にわたる核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)における連続ヌクレオチド配列の、対照配列(例えば、標的配列または配列モチーフ)と相補的であるヌクレオチドの比率(パーセント)をいう。相補性のパーセンテージは、故に、2つの配列間(標的配列5’-3’および3’-5’でのオリゴヌクレオチド配列を整列させたとき)で相補的(ワトソン・クリック塩基対)である、整列させた核酸塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの総数で除し、100倍することにより計算される。このような比較において、整列(塩基対を形成)しない核酸塩基/ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の%相補性の計算において許容されない。相補性の決定に際し、核酸塩基の化学修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対形成する機能的能力を保持する限り、無視される(例えば、5’-メチルシトシンは、%同一性の計算の目的で、シトシンと同一と考えられる)。
用語「完全に相補的」は、100%相補性をいう。
ここで使用する用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズ」は、逆の鎖の塩基対間で水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する、2つの核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)として理解される。2つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖となる温度として定義される、融解温度(T)としてしばしば表される。生理学的条件で、Tは親和性と厳密に比例しない(Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態ギブス自由エネルギーΔG°は、結合親和性をより正確に表し、ΔG°=-RTln(K)(式中、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である)により反応の解離定数(K)と相関する。それゆえに、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の反応の極めて低いΔG°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔG°は、水性濃度が1M、pHが7および温度が37℃であるときの反応と関連するエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、自発反応であり、自発反応について、ΔG°は0未満である。ΔG°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38およびHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayにより記載された等温滴定熱量測定(ITC)方法の使用により、実験的に測定され得る。当業者は、ΔG°測定に市販装置が利用可能であることを知っている。ΔG°はまたSugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216およびMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405により記載の適切に導かれた熱力学パラメーターを使用して、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465により記載の最近傍モデルを使用して数値的に推定もされ得る。ハイブリダイゼーションによるその意図された核酸標的の調節を可能性とするために、本発明のオリゴヌクレオチドは、10~30ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて、-10kcal未満の推定ΔG°値で標的核酸とハイブリダイズする。ある実施態様において、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔG°により測定される。オリゴヌクレオチドは、8~30ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて、-10kcal未満の範囲、例えば-15kcal、例えば-20kcalおよび例えば-25kcalの推定ΔG°値で、標的核酸とハイブリダイズし得る。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、-10~60kcal、例えば-12~40、例えば-15~30kcalまたは-16~27kcal、例えば-18~25kcalの推定ΔG°値で標的核酸とハイブリダイズする。
ここで使用する用語「DES番号」または「DES No」は、ヌクレオシド(例えば、DNA)およびヌクレオシドアナログ(例えば、LNA)の特定のパターンを有するヌクレオチド配列に付与された特有の番号をいう。ここで使用するASOのデザインは、大文字と小文字の組み合わせにより示す。例えば、DES-0190は、LLDDDDDDDDDDDDLL(すなわち、GAgcctttacatgcCG)(ここで、L(すなわち、大文字)はヌクレオシドアナログ(例えば、LNA)を示し、D(すなわち、小文字)はヌクレオシド(例えば、DNA)を示す)のASOデザインを有する、gagcctttacatgccg(配列番号5)のASO配列をいう。
ここで使用する用語「ASO番号」または「ASO No」は、成分、例えば、ヌクレオシド(例えば、DNA)、ヌクレオシドアナログ(例えば、ベータ-D-オキシ-LNA)、核酸塩基(例えば、A、T、G、C、UまたはMC)および主鎖構造(例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル)の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に付与された特有の番号をいう。例えば、ASO-0190は、(5’~3’)オキシGsオキシAsDNAgsDNAcsDNAcsDNAtsDNAtsDNAtsDNAasDNAcsDNAasDNAtsDNAgsDNAcsオキシMCsオキシGをいい得る。
ASO化学の注釈は次のとおりである:ベータ-D-オキシLNAヌクレオチドはオキシNにより指定され、ここで、Nはチミン(T)、ウリジン(U)、シトシン(C)、5-メチルシトシン(MC)、アデニン(A)またはグアニン(G)などのヌクレオチド塩基を指定し、故に、オキシA、オキシT、オキシMC、オキシCおよびオキシGを含む。DNAヌクレオチドはDNAnにより指定され、ここで、小文字nは、チミン(t)、ウリジン(u)、シトシン(c)、5-メチルシトシン(Mc)、アデニン(a)またはグアニン(g)などのヌクレオチド塩基を指定し、故に、DNAa、DNAt、DNAc、DNAMcおよびDNAgを含む。Cまたはcの前の文字Mは、5-メチルシトシンを示す。文字sはホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示す。
「効力」は、通常、特に断らない限りIC50またはEC50値で、μM、nMまたはpMで表される。効力はまたパーセント阻害としても表され得る。IC50は、治療分子の中央阻害性濃度である。EC50は、媒体または対照(例えば、食塩水)に対する治療分子の中央有効濃度である。機能的アッセイにおいて、IC50は、治療分子により達成される、生物学的応答の50%の生物学的応答、例えば、mRNAの転写またはタンパク質発現の低減をする、治療分子の濃度である。機能的アッセイにおいて、EC50は、生物学的応答、例えば、mRNAの転写またはタンパク質発現の50%を生ずる治療分子の濃度である。IC50またはEC50は、当分野で知られるいくつもの手段により計算され得る。
ここで使用する、例えば、ANGPTL2遺伝子転写物および/またはANGPTL2タンパク質の発現の「阻害」なる用語は、細胞または組織におけるANGPTL2遺伝子転写物および/またはANGPTL2タンパク質の発現を低減するASOをいう。ある実施態様において、用語「阻害」は、ANGPTL2遺伝子転写物またはANGPTL2タンパク質の完全阻害(100%阻害または検出不可能なレベル)をいう。他の実施態様において、用語「阻害」は、細胞または組織におけるANGPTL2遺伝子転写物および/またはANGPTL2タンパク質発現の少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%阻害をいう。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後予測または治療が望まれる、あらゆる対象、特に哺乳動物対象をいう。哺乳動物対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含む、ヒト、家庭用動物、農業用動物、競技用動物および動物園の動物を含む。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、組成物が投与される対象に許容できないほど毒性であるさらなる成分を含まない、調製物をいう。このような組成物は無菌であり得る。
ここに開示するASOの「有効量」は、具体的に述べた目的の実施に十分である量である。「有効量」は、記載する目的に関連して、経験的にかつ日常的な方法で決定され得る。
「処置する」または「処置」または「処置のため」または「軽減する」または「軽減のため」などの用語は、(1)診断された病的状態または障害の症状の治癒、減速、低減および/または進行停止をする治療的手段および(2)標的病的状態または障害の発症を予防および/または遅延させる、予防または防止的手段の両者をいう。故に、処置を必要とするものは、既に障害を有するもの;障害を有する素因があるもの;および障害が予防されるべきものを含む。ある実施態様において、対象は、患者が、疾患または障害と関連する症状の、例えば、完全な、部分的または一過性の軽減または排除を示すならば、本明細書の他の箇所に開示する疾患または状態が成功裏に「処置」される。
II. ANGPTL2をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ANGPTL2 mRNA前駆体およびANGPTL2 mRNAまたは哺乳動物ANGPTL2をコードするこのような核酸分子の天然に存在するバリアントを含む、ANGPTL2核酸、例えば、ANGPTL2転写物などの哺乳動物ANGPTL2をコードする核酸分子の機能の調節に使用するためにアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を用いる。本明細書の文脈における用語「ASO」は、2以上のヌクレオチド(すなわち、オリゴヌクレオチド)の共有結合により形成された分子をいう。
ASOは、約10~約30、例えば10~20、14~20、16~20または15~25ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ここに開示するASOは、15~20ヌクレオチド長である。ここで使用する用語「アンチセンスASO」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、用語「ASO」と相互交換可能である。
配列番号の引用は、特定の核酸塩基配列を含むが、如何なるデザインも完全化学構造は含まない。さらに、ここでの図に示されるASOは、代表的デザインを表すが、特に断らない限り、図に示される特定のデザインに限定されない。ここで、単一ヌクレオチド(単位)は、モノマーまたは単位とも称し得る。本明細書で特定のASO番号が引用されるとき、引用は、配列、特定のASOデザインおよび化学構造を含む。本明細書で特定のDES番号が引用されるとき、引用は、配列および特定のASOデザインを含む。例えば、特許請求の範囲(またはこの明細書)で配列番号5が引用されるときは、gagcctttacatgccgのヌクレオチド配列のみを含む。特許請求の範囲(またはこの明細書)でDES-0190が引用されるとき、GAgcctttacatgcCGのASOデザインを伴うgagcctttacatgccgのヌクレオチド配列を含む。あるいは、ASO-0190のデザインは配列番号5としても記載でき、ここで、5’末端からの最初のヌクレオチド、2番目のヌクレオチド、15番目のヌクレオチドおよび16番目のヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えば、LNAであり、他のヌクレオチドの各々は非修飾ヌクレオチド(例えば、DNA)である。ASO番号は、配列およびASOデザインならびにASOの特定の詳細を含む。それゆえに、例えば、本明細書で記載されるASO-0190は、オキシGsオキシAsDNAgsDNAcsDNAcsDNAtsDNAtsDNAtsDNAasDNAcsDNAasDNAtsDNAgsDNAcsオキシMCsオキシGをいい、ここで、「s」はホスホロチオエート結合を示す。
種々の実施態様において、本発明のASOはRNA(単位)を含まない。ある実施態様において、ASOは1以上のDNA単位を含む。ある実施態様において、本発明のASOは直鎖状分子であるかまたは直鎖状分子として合成される。ある実施態様において、ASOは、一本鎖分子であり、同じASO(すなわち二本鎖)内の等価な領域と相補的である、例えば、少なくとも3、4または5連続ヌクレオチドの、短領域を含まない - これに関して、ASOは(本質的に)二本鎖ではない。ある実施態様において、ASOは、本質的に二本鎖ではない。ある実施態様において、ASOはsiRNAではない。種々の実施態様において、本発明のASOは、連続ヌクレオチド領域全体を構成し得る。故に、ある実施態様において、ASOは実質的に自己相補的ではない。
他の実施態様において、本発明は、ASOのフラグメントを含む。例えば、本発明は、ここに開示するASOの少なくとも1つのヌクレオチド、少なくとも2つの連続ヌクレオチド、少なくとも3つの連続ヌクレオチド、少なくとも4つの連続ヌクレオチド、少なくとも5つの連続ヌクレオチド、少なくとも6つの連続ヌクレオチド、少なくとも7つの連続ヌクレオチド、少なくとも8つの連続ヌクレオチドまたは少なくとも9つの連続ヌクレオチドを含む。ここに開示する配列の何れかのフラグメントは、本発明の一部として意図される。
II.A. 標的
適切には、本発明のASOは、ANGPTL2 mRNAまたはタンパク質発現の下方制御(例えば、低減または除去)が可能である。これに関して、本発明のASOは、一般にヒト細胞などの哺乳動物細胞において、ANGPTL2 mRNAレベルの減少を介するANGPTL2タンパク質の間接的阻害に影響し得る。特に、本発明は、ANGPTL2 mRNA前駆体の1以上の領域を標的とするASOに関する(例えば、イントロン領域、エクソン領域および/またはエクソン-イントロン接合部領域)。
アンギオポエチン関連タンパク質2(ANGPTL2)は、アンギオポエチン様タンパク質2、ARP2、HARP、ARAP1およびアンギオポエチン様2としても知られる。ANGPTL2遺伝子の配列は、公開されているGenBank Accession No. NC_000009.12の下に見られ得る。ANGPTL2 mRNA前駆体転写物の配列(配列番号1)は、NC_000009.12の残基127,087,349~127,122,765の逆相補体に対応する。ANGPTL2タンパク質の配列は、公開されているAccession Nos. NP_036230.1(カノニカル配列)、XP_006717093.1およびQ9UKU9-2の下に入手できる。
ヒトANGPTL2遺伝子産物のバリアントは知られる。例えば、ANGPTL2アイソフォームX1の配列(Accession No. XP_006717093.1;配列番号194)は、カノニカル配列(配列番号3)と次のように異なる:274~274:P→L;および275~493:欠損。ANGPTL2アイソフォーム2の配列(Accession No. Q9UKU9-2;配列番号195)は、カノニカル配列(配列番号3)と次のように異なる:1~302:欠損。従って、ここに開示するASOは、ANGPTL2タンパク質の天然バリアントの発現を低減または阻害するためにデザインされ得る。
ASOの標的核酸配列の例はANGPTL2 mRNA前駆体である。配列番号1は、ヒトANGPTL2ゲノム配列を表す(すなわち、GenBank Accession No. NC_000009.12のヌクレオチド127,087,349~127,122,765の逆相補体)。配列番号1は、配列番号1におけるヌクレオチド「t」がmRNA前駆体において「u」として示される以外、ANGPTL2 mRNA前駆体配列と同一である。ある実施態様において、「標的核酸」は、ANGPTL2タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれ由来のRNA核酸、例えば、mRNA前駆体のイントロンを含む。他の実施態様において、標的核酸は、ANGPTL2タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれ由来のRNA核酸、例えば、mRNA前駆体のエクソン領域を含む。さらに他の実施態様において、標的核酸は、ANGPTL2タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントおよびそれ由来のRNA核酸、例えば、mRNA前駆体のエクソン-イントロン接合部を含む。ある実施態様において、例えば研究または診断において使用されるとき、「標的核酸」は、cDNAまたは上記DNA由来の合成オリゴヌクレオチドまたはRNA核酸標的であり得る。ANGPTL2 mRNA前駆体によりコードされるANGPTL2タンパク質配列は、配列番号3として示す。図1Cおよび1D参照。他の実施態様において、標的核酸は、ANGPTL2タンパク質コード化核酸またはその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、5’UTR、3’UTRまたは両方を含む。
ある実施態様において、本発明のASOは、ANGPTL2転写物、例えば、配列番号1のイントロン内の領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、本発明のASOは、ANGPTL2転写物、例えば、配列番号1のエクソン内の領域とハイブリダイズする。他の実施態様において、本発明のASOは、ANGPTL2転写物、例えば、配列番号1のエクソン-イントロン接合部内の領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、本発明のASOは、ANGPTL2転写物(例えば、イントロン、エクソンまたはエクソン-イントロン接合部)、例えば、配列番号1内の領域とハイブリダイズし、ここで、ASOは、本明細書の他の箇所(例えば、セクションII.G)に記載する式:5’ A-B-C 3’のデザインを有する。
ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2タンパク質の特定のアイソフォームをコードするmRNAを標的とする。図1Dのアイソフォーム参照。ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2タンパク質の全アイソフォームを標的とする。
ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2転写物内の核酸配列、例えば、配列番号1に対応する領域と相補的である、連続ヌクレオチド配列(例えば、10~30ヌクレオチド長)を含む。ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2転写物の核酸配列または配列内の領域(「標的領域」)とハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、核酸配列は、(i)配列番号1のヌクレオチド1~211;(ii)配列番号1のヌクレオチド471~686;(iii)配列番号1のヌクレオチド1,069~1,376;(iv)配列番号1のヌクレオチド1,666~8,673;(v)配列番号1のヌクレオチド8,975~12,415;(vi)配列番号1のヌクレオチド12,739~18,116;(vii)配列番号1のヌクレオチド18,422~29,875;または(viii)配列番号1のヌクレオチド30,373~35,389に対応し、ここで、所望により、ASOは、本明細書に記載するデザインまたは本明細書の他の箇所に示す化学構造の一つを有する(例えば、図1)。
ある実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド87~111に対応する。他の実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド571~586に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド1,169~1,276に対応する。さらなる実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド1,766~8,573に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド9,075~12,315に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド12,839~18,016に対応する。さらなる実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド18,522~29,775に対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド30,473~35,289に対応する。
ある実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド87~111±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。他の実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド571~586±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド1,169~1,276±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド1,766~8,573±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド9,075~12,315±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。さらなる実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド12,839~18,016±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド18,522~29,775±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド30,473~35,289±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。
ある実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド20,103~20,282に対応する。他の実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド20,103~20,282±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80または±90ヌクレオチドに対応する。ある実施態様において、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド20,202~20,221に対応する。ある実施態様において、標的領域は、3’末端および/または5’末端で配列番号1のヌクレオチド20,202~20,221±1、±5、±10、±15、±20または±25ヌクレオチドに対応する。
ある実施態様において、本発明のASOは、ANGPTL2転写物(例えば、mRNA前駆体、配列番号1)内の複数標的領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2転写物内の2つの異なる標的領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、ASOは、ANGPTL2転写物内の3つの異なる標的領域とハイブリダイズする。ある実施態様において、ANGPTL2転写物(例えば、mRNA前駆体、配列番号1)内の複数領域とハイブリダイズするASOは、ANGPTL2転写物(例えば、mRNA前駆体、配列番号1)内の一領域とハイブリダイズするASOと比較して、ANGPTL2発現の低減がより強力(例えば、低EC50を有する)である。
ある実施態様において、本発明のASOは、生理的条件、すなわち、インビボ条件下、標的核酸(例えば、ANGPTL2転写物)とハイブリダイズすることができる。ある実施態様において、本発明のASOは、インビトロで標的核酸(例えば、ANGPTL2転写物)とハイブリダイズすることができる。ある実施態様において、本発明のASOは、ストリンジェントな条件下、インビトで標的核酸(例えば、ANGPTL2転写物)とハイブリダイズすることができる。インビトロでのハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件は、とりわけ、産生細胞取り込み、RNA到達性、温度、結合自由エネルギー、塩濃度および時間による(例えば、Stanley T Crooke, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Edition, CRC Press (2007)参照)。一般に、高~中ストリンジェンシーの条件が、実質的に類似の核酸間のハイブリダイゼーションを可能とするために、インビトロハイブリダイゼーションで使用されるが、似てない核酸間ではされない。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、5×食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液(0.75M 塩化ナトリウム/0.075M クエン酸ナトリウム)で1時間、40℃でハイブリダイゼーション、続いてサンプルの1×SSCで40℃で10回および1×SSC緩衝液で室温で5回の洗浄を含む。インビボハイブリダイゼーション条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列のハイブリダイゼーションを決定する細胞内条件(例えば、生理学的pHおよび細胞内イオン条件)からなる。インビボ条件は、比較的低ストリンジェンシー条件により、インビトロを模倣し得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、2×SSC(0.3M 塩化ナトリウム/0.03M クエン酸ナトリウム)、0.1%SDSで37℃でインビトロで実施され得る。4×SSC、0.1%SDSを含む洗浄溶液を37℃で、1×SSCで45℃の最終洗浄と共に使用できる。
ある実施態様において、本発明のASOは、1以上の種(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシおよびクマ)からのANGPTL2転写物を下方制御できる。ある実施態様において、ここに開示するASOは、ヒトおよび齧歯類(例えば、マウスまたはラット)両者のANGPTL2転写物を下方制御できる。従って、ある実施態様において、ASOは、ヒトおよび齧歯類(例えば、マウスまたはラット)両社におけるANGPTL2 mRNAまたはANGPTL2タンパク質の発現を下方制御(例えば、低減または除去)できる。
マウスANGPTL2転写物の配列は当分野で知られる。例えば、マウスANGPTL2遺伝子の配列は、公開されているGenBank Accession Number NC_000068.7の下に入手し得る。マウスANGPTL2 mRNA前駆体転写物の配列は、NC_000068.7の残基33,215,951~33,247,725に対応する。マウスANGPTL2 mRNA転写物の配列は知られ、Accession Numbers: NM_011923.4(配列番号196)、XM_006498051.1(配列番号197)、BC138610.1(配列番号198)およびBC138609.1(配列番号199)として入手可能である。マウスANGPTL2タンパク質の配列は、公開されているAccession Numbers: NP_036053.2(配列番号200)、Q9R045.2(配列番号201)、EDL08598.1(配列番号202)、EDL08597.1(配列番号203)、AAI38611.1(配列番号204)、AAI38610.1(配列番号205)およびXP_006498114.1(配列番号206)の下に入手し得る。
ラットANGPTL2転写物の配列も当分野で知られる。ラットANGPTL2遺伝子は、公開されているGenBank Accession Number NC_005102.4の下に見られ得る。ラットANGPTL2 mRNA前駆体転写物の配列は、NC_005102.4の残基12,262,822~12,292,665に対応する。ラットANGPTL2 mRNA転写物の配列は知られ、Accession Number: NM_133569.1(配列番号207)として入手可能である。ラットANGPTL2タンパク質の配列は、公開されているAccession Number: NP_598253.1(配列番号208)およびEDL93193.1(配列番号209)の下に入手され得る。
II.B. ASO配列
本発明のASOは、ANGPTL2転写物、例えば、配列番号1に対応するヌクレオチド配列の領域の相補体に対応する連続ヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、本発明は、10~30、例えば10~15ヌクレオチド、10~20ヌクレオチドまたは10~25ヌクレオチド長(例えば、15~20ヌクレオチド長)のASOを提供し、ここで、連続ヌクレオチド配列は、配列番号1またはその天然に存在するバリアントなどのANGPTL2転写物の相補体内の領域と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%配列同一性を有する。故に、例えば、ASOは、配列番号1の配列またはその一部を有する一本鎖核酸分子とハイブリダイズする。
ASOは、哺乳動物ANGPTL2タンパク質をコードする核酸(例えば、配列番号1)の等価な領域と十分に相補的(完全に相補的)である連続ヌクレオチド配列を含み得る。ASOは、配列番号1のヌクレオチドX-Yに対応する核酸配列または配列内の領域と十分に相補的(完全に相補的)である連続ヌクレオチド配列を含み得て、ここで、XおよびYは、図2に示すとおりそれぞれ開始部位および末端部位である。
ある実施態様において、本発明のASOのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、配列番号4~193(すなわち、図2における配列)から選択される配列と少なくとも約80%配列同一性、例えば、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%配列同一性、少なくとも約97%配列同一性、少なくとも約98%配列同一性、少なくとも約99%配列同一性、例えば約100%配列同一性(相同)を有する。ある実施態様において、ASOは本明細書の他の箇所に記載するデザインまたは本明細書の他の箇所に示す化学構造を有する(例えば、図2)。
ある実施態様において、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号4~193またはその少なくとも10連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するANGPTL2転写物と比較したとき、1個または2個のミスマッチを含む。
ある実施態様において、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号4~193またはその少なくとも12連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するANGPTL2転写物と比較したとき、1個または2個のミスマッチを含み得る。
ある実施態様において、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号4~193またはその少なくとも14連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するANGPTL2転写物と比較したとき、1個または2個のミスマッチを含み得る。
ある実施態様において、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、配列番号4~193またはその少なくとも15または16連続ヌクレオチドの領域からなる群から選択される配列の一つから選択されるかまたはそれを含み、ここで、ASO(または連続ヌクレオチドその一部)は、所望により対応するANGPTL2転写物と比較したとき、1個または2個のミスマッチを含み得る。
ある実施態様において、ASOは、配列番号8、配列番号20、配列番号38、配列番号46、配列番号76、配列番号81、配列番号82、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号90、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号101、配列番号111、配列番号116、配列番号119、配列番号121、配列番号122、配列番号132、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号146およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
ある実施態様において、ASOは、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122およびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
ある実施態様において、本発明のASOは、標的核酸配列(例えば、ANGPTL2転写物)に結合し、ANGPTL転写物の発現を、細胞における正常(すなわち、対照)発現レベルと比較して、少なくとも10%または20%、例えば、正常発現レベル(例えば、ASOに曝されていない細胞における発現レベル)と比較して、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%阻害または低減する。
ある実施態様において、本発明のASOは、インビトロでSK-N-AS細胞におけるANGPTL2 mRNAの発現を、細胞が25μMのASOに接触したとき、ASOと接触していない(例えば、食塩水と接触)SK-N-AS細胞と比較して、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%低減できる。
ある実施態様において、本発明のASOは、インビトロでSK-N-AS細胞におけるANGPTL2 mRNAの発現を、細胞が5μMのASOに接触したとき、ASOと接触していない(例えば、食塩水と接触)SK-N-AS細胞と比較して、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%低減できる。
ある実施態様において、本発明のASOは、(i)SK-N-AS細胞におけるANGPTL2をコードするmRNAレベルの低減;(ii)SK-N-AS細胞におけるANGPTL2のタンパク質レベルの低減;(iii)心血管疾患または障害の1以上の症状の低減、軽減または処置および(iv)これらの何らかの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも1つの性質を有する。
ある実施態様において、ASOまたはその連続ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズしたとき、1個または2個のミスマッチを許容でき、標的になお十分に結合し、所望の効果、すなわち、標的mRNAおよび/またはタンパク質の下方制御を示す。ミスマッチは、例えば、本明細書の他の箇所に開示される、ASOヌクレオチド配列の長さの延長および/またはヌクレオチドアナログの数の増加により相殺され得る。
ある実施態様において、ASOまたはその連続ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズするとき、1個を超えないミスマッチを含む。他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズするとき、1個を超えないミスマッチを含み、有利にはミスマッチを含まない。
II.C. ASO長
ASOは、計10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み得る。ASOまたは連続ヌクレオチド配列長について範囲が示されるとき、範囲は、提供される範囲の最短および最長の長さを含む、例えば10~30(または10および30の間)は10および30両方を含む。
ある実施態様において、ASOは、計約15~20、15、16、17、18、19または20連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
II.D. ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログ
本発明のある態様において、ASOは、1以上の天然に存在しないヌクレオシドアナログを含む。ここで使用する「ヌクレオシドアナログ」は、糖および/または塩基部分における修飾により、DNAまたはRNAヌクレオシドなどの天然ヌクレオシドのバリアントである。アナログは、原則として、オリゴヌクレオチドに関して天然ヌクレオシドに対して単に「無変化」または「等価」である、すなわちオリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現阻害に作用する過程に機能的効果はない。このような「等価な」アナログは、例えば、製造が容易であるかもしくは安価であるかまたは保存もしくは製造条件により安定であるかまたはタグまたは標識を表すならば、そうであっても有用であり得る。しかしながら、ある実施態様において、アナログは、例えば標的に対する結合親和性増加および/または細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性増加および/または細胞への輸送の容易さ増加により、ASOが発現阻害に作用する過程において機能的効果を有する。ヌクレオシドアナログの具体例は、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213およびスキーム1に記載される。
II.D.1. 核酸塩基
用語核酸塩基は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン)部分をいう。本開示において、用語核酸塩基はまた天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中機能的である、修飾核酸塩基も包含する。ある実施態様において、核酸塩基部分は、核酸塩基の修飾または置換により修飾される。本明細書で、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しないバリアントの両者をいう。このようなバリアントは、例えばHirao et al., (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載される。
ある実施態様において、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンの、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-メチル-シトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、5-プロピニル-ウラシル、5-ブロモウラシル、5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、2’チオ-チミン、イノシン、ジアミノプリン、6-アミノプリン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリンおよび2-クロロ-6-アミノプリンから選択される核酸塩基などの置換プリンまたは置換ピリミジンなどの修飾プリンまたはピリミジンへの変更により修飾される。
核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基の文字コード、例えば、A、T、G、CまたはUにより示され得て、ここで、各文字は、所望により同等な機能の修飾核酸塩基を含む。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、A、T、G、Cおよび5-メチル-シトシンから選択される。所望により、LNAギャップマーについて、5-メチル-シトシンLNAヌクレオシドが使用され得る。
II.D.2. 糖修飾
本発明のASOは、修飾糖部分、すなわちDNAおよびRNAに見られるリボース糖部分と比較したとき、修飾された糖部分を有する、1以上のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分が修飾された多数のヌクレオシドが、主に親和性および/またはヌクレアーゼ抵抗性などのオリゴヌクレオチドのある性質の改善を目的として製造されている。
このような修飾は、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環(HNA)または、一般にリボース環(LNA)のC2’炭素とC4’炭素間にビラジカル架橋を有する二環式環、またはC2’炭素とC3’炭素間の結合を一般に欠く非連結リボース環(例えば、UNA)への置換により修飾されたものを含む。他の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソース核酸(WO2011/017521)または三環式核酸(WO2013/154798)を含む。修飾ヌクレオシドは、例えば、ペプチド核酸(PNA)またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分に置換されたヌクレオシドも含む。
糖修飾はまたリボース環の置換基の、RNAヌクレオシドで天然に見られる水素または2’-OH基以外の基への変更を介してなされる修飾も含む。置換基は、例えば、2’位、3’位、4’位または5’位に導入され得る。修飾糖部分を有するヌクレオシドはまた2’置換ヌクレオシドなどの2’修飾ヌクレオシドも含む。実際、2’置換ヌクレオシドの開発にはるかに焦点が絞られており、多数の2’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに取り込まれたとき、ヌクレオシド抵抗性および親和性増強などの有益な性質を有することが判明している。
II.D.2.a 2’修飾ヌクレオシド
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位にHまたは-OH以外の置換基を有する(2’置換ヌクレオシド)または2’結合ビラジカルを含むヌクレオシドであり、2’置換ヌクレオシドおよびLNA(2’-4’ビラジカル架橋)ヌクレオシドを含む。例えば、2’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに増強した結合親和性(例えば、親和性増強2’糖修飾ヌクレオシド)および/または増加したヌクレアーゼ抵抗性を提供し得る。2’置換修飾ヌクレオシドの例は、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)および2’-フルオロ-ANAヌクレオシドである。さらなる例について、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213;およびDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。下記は、一部2’置換修飾ヌクレオシドの図である。
Figure 2022524218000001
II.D.2.b ロック核酸ヌクレオシド(LNA)。
「LNAヌクレオシド」は、2’修飾ヌクレオシドであって、リボース環の立体構造を制限またはロックする、該ヌクレオシドのリボース糖環のC2’およびC4’を連結するビラジカルを含む「2’-4’架橋」)、2’修飾ヌクレオシドである。これらヌクレオシドは文献では架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも称される。リボースの立体構造のロックは、LNAが相補的RNAまたはDNA分子に対してオリゴヌクレオチドに取り込まれたとき、ハイブリダイゼーションの親和性(二本鎖安定化)の増強と関連する。これは、オリゴヌクレオチド/相補体二本鎖の融解温度の測定により、常法で決定され得る。
非限定的例示的LNAヌクレオシドは、WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352、WO2004/046160、WO00/047599、WO2007/134181、WO2010/077578、WO2010/036698、WO2007/090071、WO2009/006478、WO2011/156202、WO2008/154401、WO2009/067647、WO2008/150729、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81およびMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238およびWan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667に記載される。
さらなる非限定的例示的LNAヌクレオシドを、スキーム1に開示する。
Figure 2022524218000002
ある実施態様において、LNAヌクレオシドは、ベータ-D-オキシ-LNA、6’-メチル-ベータ-D-オキシLNA、例えば(S)-6’-メチル-ベータ-D-オキシ-LNA(ScET)または/およびENAである。ある実施態様において、LNAはベータ-D-オキシ-LNAである。
II.E ヌクレアーゼ介在分解
ヌクレアーゼ介在分解は、相補的ヌクレオチド配列と二本鎖を形成したとき、そのような配列の分解に介在できるオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ、特におよびエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ(RNase)、例えばRNase H、例えばRNase H1の動員ができるところで、標的核酸のヌクレアーゼ介在分解を経て機能し得る。ヌクレアーゼ介在機構を経て作用するオリゴヌクレオチドデザインの例は、一般に少なくとも5または6DNAヌクレオシドの領域を含み、片側または両側に親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテイルマーが隣接したオリゴヌクレオチドである。
II.F. RNase H活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性は、相補的RNA分子と二本鎖であるとき、RNase Hを動員するおよび相補的RNA分子の分解を誘導する能力をいう。WO01/23613は、RNase Hを動員する能力の決定に使用され得る、RNase H活性の決定のためのインビトロ方法を提供する。一般に、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸配列と共に提供されたとき、pmol/l/分で測定して、試験する修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、DNAモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドにおける全モノマー間がホスホロチオエート結合である、オリゴヌクレオチドを使用して、かつWO01/23613の実施例91~95に提供される方法を使用して、決定された初期速度の少なくとも5%、例えば少なくとも10%または20%を超える初期速度を有するならば、RNase Hを動員できるとみなされる。ある実施態様において、組み換えヒトRNase H1を使用して、相補的RNA分子と二本鎖であるときRNase Hを動員するおよび相補的RNA分子の分解を誘導するオリゴヌクレオチドの能力を決定し得る。
ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸と共に提供されたとき、pmol/l/分で測定して、試験するオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、DNAモノマーのみを含み、2’置換がなく、オリゴヌクレオチドにおける全モノマー間がホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドを使用して、かつWO01/23613の実施例91~95に記載された方法を使用して決定し、決定された初期速度の20%未満、例えば10%未満、例えば5%未満のRNase H初期速度を有するならば、RNase Hの動員が本質的に不可能であるとみなされる。
II.G. ASOデザイン
本発明のASOは、ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログ両者を含むヌクレオチド配列を含み得て、ギャップマー、ブロックマー、ミクスマー、ヘッドマー、テイルマーまたはトータルマーの形であり得る。本発明のASOで使用できるギャップマー、ブロックマー、ミクスマー、ヘッドマー、テイルマーまたはトータルマーの配置の例は、米国特許公開2012/0322851に記載される。
ここで使用する用語「ギャップマー」は、5’および3’で1以上の親和性増強修飾ヌクレオシド(隣接部)に隣接された、RNase H動員オリゴヌクレオチドの領域(ギャップ)を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドをいう。用語「ヘッドマー」および「テイルマー」は、隣接部の一方が欠損しているとき、すなわち、オリゴヌクレオチドの末端の一方のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含むとき、RNase Hを動員できるオリゴヌクレオチドをいう。ヘッドマーについて、3’隣接部が欠損し(すなわち、5’隣接部は親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)、テイルマーについて、5’隣接部が欠損する(すなわち、3’隣接部は親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)。用語「LNAギャップマー」は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも一方がLNAヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドをいう。用語「混合ウィングギャップマー」は、隣接領域が少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つのDNAヌクレオシドまたは非LNA修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2’置換修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)および2’-フルオロ-ANAヌクレオシドなどを含むLNAギャップマーをいう。
「ミクスマー」と称される他の「キメラ」ASOは、(i)RNaseにより認識可能かつ開裂可能であるDNAモノマーまたはヌクレオシドアナログモノマーおよび(ii)非RNase動員ヌクレオシドアナログモノマーの交互組成からなる。
「トータルマー」は、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのみを含む一本鎖ASOをいう。
ある実施態様において、ASOの標的領域への親和性増強に加えて、あるヌクレオシドアナログは、RNase(例えば、RNase H)結合および開裂も介在する。α-L-LNAモノマーがある程度RNase H活性を動員するため、ある実施態様において、α-L-LNAモノマーを含むASOのギャップ領域(例えば、ここで領域Bと称する)は、RNase Hにより認識可能かつ開裂可能であるモノマーの数が少なく、ミクスマー構造において、より高い柔軟性が導入される。
II.G.1. ギャップマーデザイン
ある実施態様において、本発明のASOはギャップマーであり、ここで領域B(B)と称される、RNase HなどのRNaseの動員が可能なヌクレオチドの連続ストレッチ(例えば、1以上のDNA)を含み、ここで、領域Bは、5’および3’両者で、領域Bのヌクレオチドの連続ストレッチに対して5’および3’でヌクレオシドアナログの領域が隣接する - これらの領域は、それぞれ領域A(A)およびC(C)と称する。ある実施態様において、ヌクレオシドアナログは、糖修飾ヌクレオシド(例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド)である。ある実施態様において、領域AおよびCの糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するASOの親和性を増強する(すなわち、親和性増強2’糖修飾ヌクレオシド)。ある実施態様において、糖修飾ヌクレオシドは、LNAまたは2’-MOEなどの高親和性2’糖修飾などの2’糖修飾ヌクレオシドである。
ギャップマーにおいて、領域Bの最も5’および3’のヌクレオシドはDNAヌクレオシドであり、それぞれ領域AおよびCのヌクレオシドアナログ(例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド)に隣接して配置される。ある実施態様において、領域AおよびCは、領域Bから最も遠位の末端(すなわち、領域Aの5’末端および領域Cの3’末端)に、ヌクレオシドアナログを有することにより、さらに定義され得る。
ある実施態様において、本発明のASOは、式(5’から3’)A-B-Cのヌクレオチド配列を有し、ここで、(A)(5’領域または第一ウィング配列)は少なくとも1つヌクレオシドアナログ(例えば、1~5個のLNA単位)を含み;(B)は、(mRNA前駆体またはmRNA標的などの相補的RNA分子と二本鎖を形成したとき)RNaseの動員ができる少なくとも4つの連続ヌクレオシド(例えば、4~28個のDNA単位)を含み;そして(C)(3’領域または第二ウィング配列)は、少なくとも1つヌクレオシドアナログ(例えば、1~5個のLNA単位)を含む。
II.H. ヌクレオチド間結合
ここに記載するASOのモノマーは、結合基を介して結合される。適切には、各モノマーは、結合基を介して3’隣接モノマーに結合される。
当業者は、本開示において、ASOの末端での5’モノマーは、5’結合基を含まないが、5’末端基を含んでも含まなくてもよいことは理解する。
用語「結合基」または「ヌクレオシド間結合」は、2個のヌクレオシドの供給結合ができる基を意味することが意図される。特定のかつ好ましい例は、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を含む。
本発明のASOのヌクレオシドまたはその連続ヌクレオシド配列は、結合基を介して結合される。適切には、各ヌクレオシドは結合基を介して3’隣接ヌクレオシドに結合される。
ある実施態様において、ヌクレオシド間結合の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%は修飾されている。
ある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間の全ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
II.I. コンジュゲート
ここで使用する用語コンジュゲートは、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Cまたは第三領域)に共有結合したASOをいう。
本発明のASOの1以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、ASOの活性、細胞分布、細胞取り込みまたは安定性に影響することにより、ASOの薬理作用を改善し得る。ある実施態様において、非ヌクレオチド部分は、ASOの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および/または細胞取り込みの改善により、ASOの薬物動態を修飾または増強する。ある実施態様において、非ヌクレオチド部分は、ASOを特定の臓器、組織または細胞型に向かわせ、それにより、その臓器、組織または細胞型におけるASOの有効性を増強させ得る。他の実施態様において、非ヌクレオチド部分は、ASOの非標的細胞型、組織または臓器における活性、例えば、オフ・ターゲット活性または非標的細胞型、組織または臓器における活性を減少させる。WO93/07883およびWO2013/033230は、適当なコンジュゲート部分を提供する。さらに適当なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPr)に結合できるものである。特に、三価N-アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ASGPrへの結合に適する(例えば、WO2014/076196、WO2014/207232およびWO2014/179620参照)。
ある実施態様において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えばカプシド)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
II.J. 活性化ASO
ここで使用する用語「活性化ASO」は、ここに記載するコンジュゲートを形成するように、ASOの1以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能とする少なくとも1つの官能部分に共有結合した(すなわち、官能化された)ASOをいう。一般に、官能部分は、例えば、アデニン塩基の3’-ヒドロキシル基または環外NH基を介して、ASOに共有結合できる、化学基、親水性であり得るスペーサーおよびコンジュゲート部分の結合が可能な末端基(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を含む。ある実施態様において、この末端基は保護されていない、例えば、NH基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のものなどの何らかの適当な保護基により保護されている。
ある実施態様において、本発明のASOは、ASOの5’末端へのコンジュゲート部分の共有結合を可能とするために、5’末端で官能化される。他の実施態様において、本発明のASOは、3’末端で官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のASOは、主鎖に沿ってまたはヘテロ環式塩基部分を官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のASOは、5’末端、3’末端、主鎖および塩基から独立して選択される1を超える箇所で官能化され得る。
ある実施態様において、本発明の活性化ASOは、合成中の官能部分に共有結合する1以上のモノマーの取り込みにより、合成される。他の実施態様において、本発明の活性化ASOは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、ASOは合成完了後官能化される。
III. 医薬組成物および投与経路
本発明のASOは、医薬製剤および組成物で使用され得る。ある実施態様において、このような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。薬学的に許容される希釈剤は、リン酸緩衝化食塩水(PBS)を含み、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩およびカリウム塩を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、薬学的に許容される希釈剤は無菌リン酸緩衝化食塩水である。医薬組成物は、それゆえにここに開示されるオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩およびリン酸緩衝化食塩水などの薬学的に許容される希釈剤(あるいは薬学的に許容される溶媒とも称される)を含む、医薬溶液であり得る。
ある実施態様において、ここに開示するASOは、ナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩などの薬学的に許容される塩などの塩の形である。
ある実施態様において、ここに開示されるASOまたはコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩は、固体形態、例えば、粉末(例えば、凍結乾燥粉末)または乾燥物(dessicate)の形である。
本発明のASOは、患者に治療有効量を送達するのに十分な量で、薬学的に許容される担体または希釈剤になど単位製剤に含まれ得る。
本発明の医薬組成物は、局所または全身処置が望まれるかおよび処置すべき部位により、多数の方法で投与され得る。例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴などの非経腸投与が使用され得る;ある実施態様において、ASOは、ボーラス注射として心臓内または脳室内に投与される。ある実施態様において、ASOは皮下投与される。
好都合は単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の慣用技術により製剤され得る。このような技術は、活性成分と医薬担体または添加物を結合する段階を含む。一般に、製剤は、活性成分と液体担体または粉砕固体担体または両方を均一かつ密接に結合させ、次いで、必要であれば、製品を成型することにより調製される。
医薬製剤は、無菌希釈剤、緩衝液、張性制御剤および抗細菌剤を含み得る。活性ASOは、制御放出性質を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む、分解または体からの即時の排除から保護する担体を用いて調製され得る。非経腸または経腸、心臓内または脳室内投与のために、担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝化食塩水であり得る。2007年3月22日公開の国際公開WO2007/031091(A2)は、適当な薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントをさらに提供する。
IV. 診断
本発明は、さらに異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の診断中に有用な診断方法を提供する。ある実施態様において、このような疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、2型糖尿病、癌およびこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、本発明のASOにより診断され得る疾患または障害は、心血管疾患である。心血管疾患の非限定的例は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患および静脈血栓症を含む。ある実施態様において、心不全は、左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率が低下した心不全(HFrEF)、駆出率が保たれた心不全(HFpEF)、境界型心不全(HFmrEF)、肥大型心筋症(HCM)、高血圧性心疾患(HHD)または高血圧性肥大型心筋症を含む。
本発明のASOは、個体からの組織または体液におけるANGPTL2転写物の発現を測定するのに使用でき、測定した発現レベルと正常組織または体液の標準ANGPTL2転写物発現レベルを比較し、それにより、正常と比較した発現レベルの増加は、本発明のASOで処置可能な障害の指標である。
本発明のASOを、当業者に知られるあらゆる方法を使用して、生物学的サンプルにおけるANGPTL2転写物レベルのアッセイに使用し得る(Touboul et. al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et. al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91)。
用語「生物学的サンプル」は、個体、細胞株、組織培養またはANGPTL2転写物を発現する可能性のある細胞の他の供給源から得た、あらゆる生物学的サンプルをいう。哺乳動物からこのような生物学的サンプルを得る方法は、当分野で周知である。
V. ASOを含むキット
本発明は、さらにここに記載するASOを含み、ここに記載する方法の実施に使用され得る、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、1以上の容器に少なくとも1つのASOを含む。ある実施態様において、キットは、全対照、アッセイを実施するための指示ならびに結果の分析および提示のために必要なソフトウェアを含む、検出アッセイの実施に必要なおよび/または十分な成分の全てを含む。当業者は、開示されるASOが、当分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に取り込まれ得ることを、すぐに認識する。
VI. 使用方法
本発明のASOは、例えば、診断、治療および予防のための、研究試薬として利用され得る。
研究では、このようなASOは、細胞および実験動物におけるANGPTL2タンパク質の合成を特異的に阻害(一般にmRNAを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによる)するために使用でき、それにより標的の機能的分析または治療介入のための標的としての有用性の評価が促進される。さらに提供されるのは、細胞または組織と、インビトロまたはインビボで、ここに開示されるASO、コンジュゲートまたは組成物の1以上の有効量を接触させることを含む、細胞または組織におけるANGPTL2 mRNAおよび/またはANGPTL2タンパク質の発現を下方制御する方法である。
診断において、ASOは、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションまたは類似の技術により、細胞および組織におけるANGPTL2転写物発現の検出および定量に使用され得る。
治療について、ANGPTL2転写物の発現および/またはANGPTL2タンパク質の調節により処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、本発明により、ASOを投与することにより処置する。さらに提供されるのは、本発明のASOまたは組成物の1以上の治療または予防有効量を投与することによる、ANGPTL2転写物の発現および/またはANGPTL2タンパク質の増加が関連する疾患または状態を有するまたはその素因があることが疑われる哺乳動物を処置、例えば、ヒトを処置する方法である。本発明のASO、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。ある実施態様において、本発明のASOまたはコンジュゲートは治療に使用される。
本発明は、さらに1以上の異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の処置のために使用するASOを提供する。ある実施態様において、このような疾患または障害は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、2型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、疾患または障害は心血管疾患である。心血管疾患非の限定的例は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患および静脈血栓症を含む。
ある実施態様において、疾患、障害または状態は、ANGPTL2遺伝子転写物および/またはANGPTL2タンパク質の過発現と関連する。
本発明はまた細胞または組織におけるANGPTL2遺伝子転写物および/またはANGPTL2タンパク質の発現を阻害(例えば、低減による)する方法であって、細胞または組織を、インビトロまたはインビボで、本発明のASO、コンジュゲートまたはその医薬組成物の1以上の有効量と接触させて、ANGPTL2遺伝子転写物の発現の低下を起こし、それによりANGPTL2タンパク質低減を含む、方法も提供する。
本発明は、ここに記載する障害の処置またはここに記載する障害の処置方法のための医薬の製造における、本発明のASOまたはコンジュゲートの使用も提供する。
本発明は、さらに本発明のASOまたはコンジュゲートを細胞に投与し、細胞におけるANGPTL2タンパク質を阻害または減少させることを含む、ANGPTL2を発現する細胞におけるANGPTL2タンパク質を阻害または低減する方法も提供する。
本発明は、本発明のASOまたはコンジュゲートを投与することを含む、それを必要とする対照における、運動神経の興奮性亢進(例えば、心筋細胞でみられるような)を低減、軽減、予防または処置する方法も含む。
本発明はまたここに記載する障害を処置する方法であって、ここに記載する本発明のASOまたはコンジュゲートおよび/または本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法も提供する。
本発明のASOおよび他の組成物は、ANGPTL2タンパク質の過発現と関連する状態の処置に使用され得る。
概説するならば、本発明のある態様は、異常なANGPTL2レベルと関連する状態を有するまたは疑われる哺乳動物を処置する方法であって、該哺乳動物に1以上のLNA単位を含むANGPTL2転写物を標的とするASOの治療有効量を投与することを含む方法に関する。本発明のASO、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。
本発明の重要な態様は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置のための医薬の製造における、ここに定義するASO(化合物)またはここに定義するコンジュゲートの使用である。
本発明の方法は、異常なANGPTL2タンパク質のレベルおよび/または活性が原因の疾患の処置または予防に使用され得る。ある実施態様において、異常なANGPTL2タンパク質のレベルおよび/または活性が原因の疾患は、心血管疾患、肥満、代謝疾患、2型糖尿病、癌およびこれらの組み合わせを含む。ある実施態様において、疾患は心血管疾患である。ここで使用する心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患および静脈血栓症を含み得る。
ある実施態様において、心血管疾患は、左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率が低下した心不全(HFrEF)、駆出率が保たれた心不全(HFpEF)、境界型心不全(HFmrEF)、肥大型心筋症(HCM)、高血圧性心疾患(HHD)または高血圧性肥大型心筋症を含み得る心不全である。
換言すると、ある実施態様において、本発明は、さらにANGPTL2タンパク質のレベル異常を処置する方法であって、本発明のASOまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に関する。
本発明はまた医薬として使用するための、ここに定義するASO、組成物またはコンジュゲートに関する。
本発明は、さらにANGPTL2タンパク質のレベル異常またはANGPTL2タンパク質の変異体(例えば、ここに記載する疾患の一つと関連するアレルバリアント)の発現の処置のための医薬の製造のための、ここに定義する化合物、組成物またはコンジュゲートの使用に関する。
処置を必要とする患者は、疾患または障害を有するまたは有する可能性がある患者である。
本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えDNAおよび免疫学の慣用の技術を用いる。このような技術は、文献に十分説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)参照。
以下の実施例は、説明のために提供し、限定のためではない。
実施例1:ASOの構築
ここに記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ANGPTL2 mRNA前駆体(配列番号1)の種々の領域を標的とするようデザインした。配列番号1は、GenBank Accession No. NC_000009.12の残基127,087,349~127,122,765の逆相補体に対応する、ゲノムANGPTL2配列を提供する。例えば、ASOは、図2に示す、配列番号1の開始および終了部位を使用して、表示された領域を標的とするよう構築した。本発明のASOの例示的配列は図2に提供する。ある実施態様において、ASOは、図2に示すとおり、ギャップマーとしてデザインした。本発明のギャップマーは、ロック核酸 - LNA(大文字) - を含むように構築した。例えば、ギャップマーは、5’末端および3’末端にベータ-デオキシLNAを有し、ホスホロチオエート主鎖を有し得る。しかし、LNAはまた何らかの他のヌクレオシドアナログで置換され得て、主鎖は他のタイプの主鎖(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの何らかの組み合わせ)であり得る。
ASOは、当分野で周知の方法を使用して、合成した。このようなASOの製造方法の例は、Barciszewski et al., Chapter 10 - "Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)に記載される。
実施例2:SK-N-AS細胞におけるANGPTL2 mRNA発現の減少を測定するためのqPCRアッセイ
本発明のASOを、SK-N-AS細胞(ATCC(登録商標)CRL-2137TM)におけるANGPTL2 mRNA発現を低減する能力について試験した。SK-N-AS細胞を、細胞培養培地(DMEM高グルコース(D6546)、非必須アミノ酸添加(0.1mM、M7145)、L-グルタミン(2mM、G7513)および10%FBS)で増殖させた。5日毎に、細胞をリン酸緩衝化食塩水(PBS)で洗浄し、続いて0.25%トリプシン-EDTA溶液を加え、37℃で2~3分間インキュベーションし、粉末化して、その後細胞播種することによりトリプシン化した。細胞を、15継代まで賠償で維持した。
実験での使用のために、10,000細胞/ウェルを、96ウェルプレートに100μL増殖培地中播種した。ASOを750μM原液から調製し、PBSに溶解した。細胞播種約24時間後、ASOを細胞に加えて、所望の最終濃度(すなわち、5μMまたは25μM)を得た。次いで、細胞を3日間、何ら培地交換をすることなくインキュベートした。効力決定のために(図3参照)、8濃度のASOを、16~50,000nMの最終濃度範囲で調製した。インキュベーション後、細胞を培地の除去、続いて125μL PURELINK(登録商標)Pro 96 Lysis緩衝液および125μL 70%エタノールの添加により採取した。次いで、RNAを製造業者の指示により精製し、50μL 水の最終体積に溶出し、10~20ng/μLのRNA濃度とした。次に、RNAを水で10倍希釈し、その後1工程qPCR反応に付した。
一工程qPCR反応について、qPCR-mix(QauntaBioからのqScriptTMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX(登録商標)Low ROX)を、2つのTaqmanプローブと10:1:1比(qPCR混合物:プローブ1:プローブ2)で混合して、マスターミックスを産生した。Taqmanプローブは、LifeTechnologiesおよびIDTから得た: ANGPTL2_Hs00765776_m1; ACTB_Hs_PT.39a. 22214847。次いで、マスターミックス(6μL)およびRNA(4μL、1~2ng/μL)を、qPCRプレート(MICROAMP(登録商標)optical 384 well, catalog no. 4309849)で混合した。プレートを密封後、プレートを高速回転(1000gで1分間、RT)に付し、ViiaTM 7 system (Applied Biosystems, Thermo)に移した。次のPCR条件を使用した:50℃で15分間;95℃で3分間;40サイクルの95℃で5秒間、続いて1.6℃/秒の温度低下、続いて60℃で45秒間。データを、QuantStudioTM Real_time PCR Softwareを使用して分析した。ASO処置サンプルのパーセント阻害を、対照処置サンプルに対して計算した。結果を図3および4に示す。
実施例3:インビボでのANGPTL2 mRNA減少の分析
ASOのインビボでANGPTL2 mRNAレベルを低減させる効力を評価するために、10週齢雄C57BL/6マウスに、次の例示的ASOの一つを皮下投与した:ASO-0027、ASO-0037、ASO-0094、ASO-0079、ASO-0050、ASO-0150およびASO-0132。ASO(無菌食塩水中、約5mg/mL濃度で製剤化)を、30mg/kg/日の用量で、連続3日間(1日目、2日目および3日目)投与した。マウスを、最初の投与1週間後屠殺し、心臓を摘出し、尖端塊を、RNAlaterに保存した。RNA精製を、MagMAX-96総RNA単離キット(Thermo AM1830)を使用して実施した。cDNA合成を、Quanta qScript cDNA合成キット(Quanta 95047)を使用して、実施した。10ngの総cDNAを、Angptl2 (ThermoMm00507897_m1)およびギャップDH(Thermo 4352339E)のための二本鎖Taqman反応を使用する、Applied Biosystems ViiA7装置での定量的リアルタイムPCRに使用した。ANGPTL2 mRNAレベルをギャップDHに対して正規化し、食塩水投与対照群のパーセント対照として表した。
図5に示すとおり、試験した全ASOは、C57BL/6マウスに投与したとき、ANGPTL2 mRNAレベルを低減できた。まとめると、ここに提供する結果は、インビトロおよびインビボ両者でのASOの効力を示し、ANGPTL2特異的ASOが異常なANGPTL2発現および/または活性、例えば、心血管関連疾患または障害が関連するような種々の医学的障害処置のための疾患修飾であり得ること支持する。

Claims (58)

  1. アンギオポエチン様2(ANGPTL2)転写物内の核酸配列に相補的な10~30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)。
  2. ANGPTL2転写物内の核酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%相補的である、請求項1のASO。
  3. ANGPTL2転写物が配列番号1、配列番号2、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199および配列番号207からなる群から選択される、請求項1または2のASO。
  4. ASOがANGPTL2タンパク質を発現するヒト細胞(例えば、SK-N-AS細胞)におけるANGPTL2タンパク質発現を低減できる、請求項1~3の何れかのASO。
  5. ANGPTL2タンパク質発現が、ASOに曝されていないヒト細胞におけるANGPTL2タンパク質発現と比較して、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%低減される、請求項4のASO。
  6. ANGPTL2転写物を発現するヒト細胞(例えば、SK-N-AS細胞)におけるANGPTL2転写物(例えば、mRNA)発現を低減できる、請求項1~5の何れかのASO。
  7. ANGPTL2転写物発現が、ASOに曝されていないヒト細胞におけるANGPTL2転写物と比較して、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%低減される、請求項6のASO。
  8. ASOがギャップマーである、請求項1~7の何れかのASO。
  9. ASOが1以上のヌクレオシドアナログを含む、請求項8のASO。
  10. ヌクレオシドアナログの1以上が2’-O-アルキル-RNA;2’-O-メチルRNA(2’-OMe);2’-アルコキシ-RNA;2’-O-メトキシエチル-RNA(2’-MOE);2’-アミノ-DNA;2’-フルオロ-RNA;2’-フルオロ-DNA;アラビノ核酸(ANA);2’-フルオロ-ANA;二環式ヌクレオシドアナログ(LNA);またはこれらの組み合わせを含む、請求項9のASO。
  11. 1以上のヌクレオシドアナログが親和性増強2’糖修飾ヌクレオシドである、請求項9または10のASO。
  12. 親和性増強2’糖修飾ヌクレオシドがLNAである、請求項11のASO。
  13. LNAが拘束エチルヌクレオシド(cEt)、2’,4’-拘束2’-O-メトキシエチル(cMOE)、α-L-LNA、β-D-LNA、2’-O,4’-C-エチレン-架橋核酸(ENA)、アミノ-LNA、オキシ-LNA、チオ-LNAおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項12のASO。
  14. ASOが1以上の5’-メチル-シトシン核酸塩基を含む、請求項1~13の何れかのASO。
  15. ASOが(i)SK-N-AS細胞におけるANGPTL2 mRNAレベルの低減;(ii)SK-N-AS細胞におけるANGPTL2タンパク質レベルの低減;(iii)異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の1以上の症状の低減、軽減または処置;または(iv)これらの何れかの組み合わせが可能である、請求項1~14の何れかのASO。
  16. 異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害が心血管疾患、肥満、代謝疾患、2型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む、請求項15のASO。
  17. 連続ヌクレオチド配列が(i)配列番号1のヌクレオチド1~211;(ii)配列番号1のヌクレオチド471~686;(iii)配列番号1のヌクレオチド1,069~1,376;(iv)配列番号1のヌクレオチド1,666~8,673;(v)配列番号1のヌクレオチド8,975~12,415;(vi)配列番号1のヌクレオチド12,739~18,116;(vii)配列番号1のヌクレオチド18,422~29,875;または(viii)配列番号1のヌクレオチド30,373~35,389を含む核酸配列と相補的である、請求項1~16の何れかのASO。
  18. 連続ヌクレオチド配列が(i)配列番号1のヌクレオチド37~161;(ii)配列番号1のヌクレオチド521~636;(iii)配列番号1のヌクレオチド1,119~1,326;(iv)配列番号1のヌクレオチド1,716~8,623;(v)配列番号1のヌクレオチド9,025~12,365;(vi)配列番号1のヌクレオチド12,789~18,066;(vii)配列番号1のヌクレオチド18,472~29,825;または(viii)配列番号1のヌクレオチド30,423~35,339を含む核酸配列と相補的である、請求項1~17の何れかのASO。
  19. 連続ヌクレオチド配列が(i)配列番号1のヌクレオチド87~111;(ii)配列番号1のヌクレオチド571~586;(iii)配列番号1のヌクレオチド1,169~1,276;(iv)配列番号1のヌクレオチド1,766~8,573;(v)配列番号1のヌクレオチド9,075~12,315;(vi)配列番号1のヌクレオチド12,839~18,016;(vii)配列番号1のヌクレオチド18,522~29,775;または(viii)配列番号1のヌクレオチド30,473~35,289を含む核酸配列と相補的である、請求項1~18の何れかのASO。
  20. 連続ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド20,187~20,234を含む核酸と相補性である、請求項1~19の何れかのASO。
  21. 連続ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド20,202~20,219を含む核酸と相補的である、請求項1~20の何れかのASO。
  22. 連続ヌクレオチド配列が1個または2個のミスマッチを有する配列番号4~配列番号193を含む、請求項1~21の何れかのASO。
  23. 連続ヌクレオチド配列が図2における配列から選択されるヌクレオチド配列を含む(配列番号4~配列番号193)、請求項1~21の何れかのASO。
  24. 連続ヌクレオチド配列が配列番号8、配列番号20、配列番号38、配列番号46、配列番号79、配列番号84、配列番号82、配列番号88、配列番号85、配列番号90、配列番号89、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号101、配列番号111、配列番号116、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号132、配列番号142、配列番号141、配列番号143、配列番号144または配列番号146を含む、請求項1~23の何れかのASO。
  25. 連続ヌクレオチド配列が配列番号141、配列番号122、配列番号8、配列番号38、配列番号95、配列番号88または配列番号120を含む、請求項1~23の何れかのASO。
  26. 連続ヌクレオチド配列が配列番号116、配列番号118、配列番号117、配列番号120、配列番号119、配列番号121、配列番号122またはこれらの組み合わせを含む、請求項1~23の何れかのASO。
  27. 図2のデザインに一致する群から選択されるデザインを有し、ここで、大文字が糖修飾ヌクレオシドであり、小文字がDNAである、請求項1~26の何れかのASO。
  28. 15~20ヌクレオチド長を有する、請求項1~27の何れかのASO。
  29. 連続ヌクレオチド配列が1以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項1~28の何れかのASO。
  30. 1以上の修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項29のASO。
  31. ヌクレオシド間結合の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%が修飾されている、請求項29または30のASO。
  32. ヌクレオシド間結合の各々がホスホロチオエート結合である、請求項31のASO。
  33. 請求項1~32の何れかのASOを含むコンジュゲートであって、ここで、ASOが少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合する、コンジュゲート。
  34. 非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分がタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項33のコンジュゲート。
  35. 請求項1~32の何れかのASOまたは請求項33または34のコンジュゲートおよび薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、医薬組成物。
  36. 薬学的に許容される塩がナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩またはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項35の医薬組成物。
  37. 少なくとも1つのさらなる治療剤をさらに含む、請求項35または36の医薬組成物。
  38. さらなる治療剤がANGPTL2アンタゴニストである、請求項37の医薬組成物。
  39. ANGPTL2アンタゴニストが抗ANGPTL2抗体またはそのフラグメントである、請求項38の医薬組成物。
  40. 請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物および使用のための指示を含む、キット。
  41. 請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物および使用のための指示を含む、診断キット。
  42. 細胞におけるANGPTL2タンパク質発現を阻害または低減する方法であって、請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物をANGPTL2タンパク質を発現する細胞に投与することを含み、ここで、細胞におけるANGPTL2タンパク質発現が投与後阻害または低減されるものである、方法。
  43. 細胞におけるANGPTL2タンパク質発現を阻害または低減するインビトロ方法であって、請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物とANGPTL2タンパク質を発現する細胞を接触させることを含み、ここで、細胞におけるANGPTL2タンパク質発現が接触後阻害または低減されるものである、方法。
  44. ASOが細胞におけるANGPTL2転写物(例えば、mRNA)の発現を、投与後または接触後阻害または低減する、請求項42または43の方法。
  45. ANGPTL2転写物(例えば、mRNA)の発現が、ASOに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または約100%低減される、請求項44の方法。
  46. ANGPTL2タンパク質の発現が、ASOに曝されていない細胞と比較して、投与後少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%低減される、請求項42~45の何れかの方法。
  47. 細胞が脳細胞、例えば、神経芽細胞(例えば、SK-N-AS細胞)である、請求項42~46の何れかの方法。
  48. 処置を必要とする対象における異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の1以上の症状を低減、軽減または処置する方法であって、請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
  49. 医薬の製造のための、請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物の使用。
  50. 処置を必要とする対象における、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の処置のための医薬の製造のための、請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物の使用。
  51. 治療に使用するための、請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物。
  52. 処置を必要とする対象における、異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害の治療に使用するための、請求項1~32の何れかのASO、請求項33または34のコンジュゲートまたは請求項35~39の何れかの医薬組成物。
  53. 異常なANGPTL2発現および/または活性と関連する疾患または障害が心血管疾患、肥満、代謝疾患、2型糖尿病、癌またはこれらの組み合わせを含む、請求項15のASO、請求項48の方法、請求項50の使用または請求項52の使用のためのASO。
  54. 心血管疾患または障害がアテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、静脈血栓症またはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項53のASO、方法、使用または使用のためのASO。
  55. 心血管疾患または障害が心不全である、請求項54のASO、方法、使用または使用のためのASO。
  56. 心不全が左側心不全、右側心不全、うっ血性心不全、駆出率が低下した心不全(HFrEF)、駆出率が保たれた心不全(HFpEF)、境界型心不全(HFmrEF)、肥大型心筋症(HCM)、高血圧性心疾患(HHD)または高血圧性肥大型心筋症を含む、請求項55のASO、方法、使用または使用のためのASO。
  57. 対象がヒトである、請求項48および53~56の何れかの方法、請求項50および53~56の何れかの使用または請求項52~56の何れかの使用のためのASO。
  58. ASO、コンジュゲートまたは医薬組成物が心臓内、経口、非経腸、髄腔内、側脳室内、肺、局所または脳室内投与される、請求項48および53~57の何れかの方法、請求項50および53~57の何れかの使用または請求項52~57の何れかの使用のためのASO。
JP2021559064A 2019-04-03 2020-04-02 Angptl2アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用 Pending JP2022524218A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962828864P 2019-04-03 2019-04-03
US62/828,864 2019-04-03
PCT/US2020/026379 WO2020206115A2 (en) 2019-04-03 2020-04-02 Angptl2 antisense oligonucleotides and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022524218A true JP2022524218A (ja) 2022-04-28
JPWO2020206115A5 JPWO2020206115A5 (ja) 2023-04-10

Family

ID=70465458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021559064A Pending JP2022524218A (ja) 2019-04-03 2020-04-02 Angptl2アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220213484A1 (ja)
EP (1) EP3947680A2 (ja)
JP (1) JP2022524218A (ja)
KR (1) KR20210149107A (ja)
CN (1) CN113906139A (ja)
AU (1) AU2020252374A1 (ja)
BR (1) BR112021019182A2 (ja)
CA (1) CA3135794A1 (ja)
EA (1) EA202192733A1 (ja)
IL (1) IL286826A (ja)
MX (1) MX2021012098A (ja)
SG (1) SG11202110745VA (ja)
WO (1) WO2020206115A2 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3131970B1 (fr) 2022-01-14 2024-02-23 Univ D’Aix Marseille Amu Dispositif pour la simulation en chirurgie abdominale

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0724447B1 (en) 1991-10-24 2003-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
JPH11341989A (ja) * 1998-03-31 1999-12-14 Sanyo Electric Co Ltd Dna断片増幅方法、dna断片増幅装置、微生物群測定方法、微生物群分析方法および汚染物質測定方法
NZ513402A (en) 1999-02-12 2003-06-30 Sankyo Co Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
NZ514348A (en) 1999-05-04 2004-05-28 Exiqon As L-ribo-LNA analogues
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
EP2141233B1 (en) 2002-11-18 2016-10-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense design
AU2004221760B2 (en) 2003-03-21 2010-03-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Short interfering RNA (siRNA) analogues
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
WO2007090071A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1984382B1 (en) 2006-01-27 2012-08-15 Santaris Pharma A/S Lna modified phosphorothiolated oligonucleotides
WO2007107162A2 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Santaris Pharma A/S Small internally segmented interfering rna
JP5441688B2 (ja) 2006-05-11 2014-03-12 アイシス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド 5’修飾二環式核酸類似体
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2388590T3 (es) 2007-05-30 2012-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos con puente aminometileno N-sustituido.
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
CA2692579C (en) 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
US8501805B2 (en) 2008-09-24 2013-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-L-bicyclic nucleosides
JP6250263B2 (ja) * 2009-03-04 2017-12-20 クルナ・インコーポレーテッド サーチュイン1(sirt1)に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるsirt1関連疾患の治療
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2490699A1 (en) 2009-10-20 2012-08-29 Santaris Pharma A/S Oral delivery of therapeutically effective lna oligonucleotides
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2751270B1 (en) 2011-08-29 2018-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2013154798A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
RU2015119411A (ru) 2012-11-15 2017-01-10 Рош Инновейшен Сентер Копенгаген А/С Конъюгаты антисмысловых соединений, направленные на аполипопротеин в
WO2014167529A1 (en) * 2013-04-10 2014-10-16 Institut De Cardiologie De Montreal Methods and compositions for preventing and treating atherosclerosis
RU2019110030A (ru) 2013-05-01 2019-05-06 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы
CN105358692B (zh) 2013-06-27 2020-08-21 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物
UY36550A (es) * 2015-02-04 2016-08-31 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligómeros antisentido de tau y sus usos
KR102645243B1 (ko) 2016-11-23 2024-03-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 표적외 효과가 감소된 변형 rna 작용제

Also Published As

Publication number Publication date
CA3135794A1 (en) 2020-10-08
BR112021019182A2 (pt) 2022-05-31
CN113906139A (zh) 2022-01-07
WO2020206115A2 (en) 2020-10-08
WO2020206115A3 (en) 2020-11-12
SG11202110745VA (en) 2021-10-28
MX2021012098A (es) 2021-11-03
US20220213484A1 (en) 2022-07-07
EP3947680A2 (en) 2022-02-09
EA202192733A1 (ru) 2022-03-14
AU2020252374A1 (en) 2021-11-11
KR20210149107A (ko) 2021-12-08
IL286826A (en) 2021-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11058767B2 (en) CAMK2D antisense oligonucleotides and uses thereof
JP2024056820A (ja) Scn9a発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
JP2023534557A (ja) Rna結合タンパク質部位を標的とするオリゴヌクレオチド
CN112912500A (zh) 用于调节atxn2表达的寡核苷酸
JP2022524218A (ja) Angptl2アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
CN114901821A (zh) Sept9抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
CN114829599A (zh) Scamp3抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
JP2023526096A (ja) Card9のスプライス調節のためのオリゴヌクレオチド
JP2021534759A (ja) Microrna−134バイオマーカー
WO2019215175A1 (en) Oligonucleotides for modulating myh7 expression
US20220403388A1 (en) Oligonucleotide Progranulin Agonists
US20210378652A1 (en) Camk2d antisense oligonucleotides and uses thereof
CN115551519A (zh) 用于治疗神经系统疾病的补体组分c1s抑制剂以及相关的组合物、系统和使用它们的方法
CN115605592A (zh) 用于治疗神经系统疾病的补体组分c1r抑制剂以及相关的组合物、系统和使用它们的方法
EA046329B1 (ru) Антисмысловые олигонуклеотиды camk2d и их применение
WO2021231204A1 (en) Complement component 4 inhibitors for treating neurological diseases, and related compositons, systems and methods of using same
WO2021158810A1 (en) Oligonucleotides for splice modulation of camk2d
JP2023506547A (ja) B型肝炎ウイルス感染を処置するためのcops3阻害剤の使用
CN114829601A (zh) Sbds抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
CN114867856A (zh) Saraf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230331

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230331

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240227

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20240502

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240523