KR100858465B1 - 올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도 - Google Patents

올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1 이상의 뉴클레오시드간 3'-NHP(O)(S)O-5' 결합을 함유하는 신규 당-포스페니트 주쇄를 가지는 올리고뉴클레오티드, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 합성 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 모(母) 올리고뉴클레오티드 N3'→P5'포스포라미데이트의 높은 RNA 결합 친화상을 보유하며, 보다 높은 산 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

Description

올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트, 이의 합성 및 용도 {OLIGONUCLEOTIDE N3'→P5' THIOPHOSPHORAMIDATES: THEIR SYNTHESIS AND USE}
본원은 1999. 9. 10. 출원된 미국 특허출원 제60/153,201호 및 1999. 10. 19. 출원된 미국 특허출원 제60/160,444호를 우선권주장의 기초로 한다. 상기 우선권주장의 기초 출원의 전체 내용을 본 명세서에 참고로 인용한다.
본 발명은 뉴클레오시드 간의 3'-NHP(O)(S)O-5' 결합을 함유하는 신규 당-포스페이트 주쇄(backbone)를 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 티오포스포라미데이트(thiophosphoramidate) 올리고뉴클레오티드 조성물, 이의 진단제 또는 치료제로서의 용도, 및 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법에 관한 것이다.
핵산 고분자 화학은 약제, 진단 및 분석 분야, 보다 구체적으로는 이들의 하위 분야인 안티센스(antisense) 및 항-유전자(anti-gene) 치료, 종합 화학, 측쇄(branched) DNA 신호 증폭, 및 배열에 기초한(array-based) DNA 진단 및 분석 분야에 있어서의 수많은 기술 개발에 중요한 역할을 한다(예: Uhlmann과 Peyman의 문헌[Chemical Reviews, 90:543-584, 1990]; Milligan 등의 문헌[J. Med. Chem. 36:1923-1937, 1993]; DeMesmaeker 등의 문헌[Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355, 1995]; Roush의 문헌[science, 276:1192-1193, 1997]; Thuong 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:666-690, 1993]; Brenner 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 89:5381-5383, 1992]; Gold 등의 문헌[Ann. Rev. Biochem., 64:763-797, 1995]; Gallop 등의 문헌[J. Med. Chem. 37:1233-1258, 1994]; Gordon 등의 문헌[J. Med. Chem. 37:1385-1401, 1994]; Gryaznov의 국제 출원 PCT/US94/07557; Urdea 등의 미국 특허 제5,124,246호; Southern 등의 문헌[Genomics, 13:1008-1017; 1992]; McGall 등의 미국 특허 제5,412,087호; Fodor 등의 미국 특허 제5,424,186호; Pirrung 등의 미국 특허 제5,405,783호).
상기 핵산 고분자 화학 중 다수는 천연 핵산 고분자(예: DNA)의 뉴클레아제 내성, 결합 강도 및 특이성을 개선시키는 것에 관한 것이다. 불행하게도, 하나의 특성(예: 뉴클레아제 내성)에 있어서의 개선은 종종 다른 특성(예: 결합 강도)에 대한 악화를 수반한다. 상기 악화의 예로는 주로 다음과 같은 것을 들 수 있다: 펩티드 핵산(PNAs)은 우수한 뉴클레아제 내성 및 결합 강도를 나타내지만, 시험 배양 내의 세포의 흡수(uptake)를 감소시키는 것(예컨대, Hanvey 등의 문헌[Science, 258:1481-1485, 1992]를 참조하라); 포스포로티오에이트(phosporothioate)는 우수한 뉴클레아제 내성 및 용해도를 나타내지만, 일반적으로 P-키랄 혼합물로서 합성되고 몇몇 서열 비특이성(sequence-non-specific) 생물학적 효과를 나타내는 것(예컨대, Stein 등의 문헌[Science, 261:1004-1012, 1993]을 참조하라); 메틸포스포네이트는 우수한 뉴클레아제 내성 및 세포의 흡수를 나타내지만, 일반적으로 P-키랄 혼합물서 합성되고 이중(duplex) 안정성을 감소시키는 것(예컨대, 상기 인용된 Mesmaeker 등의 문헌을 참고하라) 등이다.
최근, 새로운 유형(class)의 올리고뉴클레오티드 유사체는 양호한 결합 특성, 뉴클레아제 내성 및 용해도를 나타내는 소위 N3'→P5' 포스포라미데이트 뉴클레오시드간 결합을 갖도록 개발되어 왔다(Gryaznov와 Letsinger 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 20:3403-3409, 1992]; Chen 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 23:2661-2668, 1995]; Gryaznov의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 92:5798-5802, 1995]; 및 Gryaznov 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc., 116:3143-3144, 1994] 등을 참조하라). 포스포라미데이트 화합물은 3'-산소 원자를 치환하는 각각의 2'-데옥시푸라노스 잔기에 3'-아미노기를 함유한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 포스포라미데이트의 합성 및 특성은 Gryaznov 등의 미국 특허 제5,591,607호; 제5,599,922호; 제5,726,297호; 및 Hirschbein 등의 미국 특허 제5,824,793호에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 포스포라미데이트는 상보적인 DNA 및 특수 RNA 가닥을 가지는 현저히 안정한 듀플렉스(duplex)뿐만 아니라 DNA 듀플렉스을 가지는 안정한 트리플렉스(triplexes)를 형성시킨다(Chen 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 23:2661-2668, 1995]; Gryaznov 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 92:5798-5802, 1995]을 참조하라). 더욱이, 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 포스포라미데이트는 시험관내 및 생체내에서 포스포로티오에이트 유도체보다 강력한 안티센스 제제이다(Skorski 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 94:3966-3971, 1997]을 참조하라). 동시에, 포스포라미데이트는 세포내 및 세포외 단백질에 대한 낮은 친 화성, 및 천연 포스포디에스테르 카운터파트(counterpart)에 비하여 상대적으로 증가된 산성을 띠는 경향(acid liability)을 가짐이 명백하다(Gryaznov 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 24:1508-1514, 1996]을 참조하라). 이러한 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 특징은 일부 용도의 경우 약물학적 특성에 잠재적으로 악영향을 미친다. 특히, 올리고뉴클레오티드의 산 안정성은 경구투여용 약제로서 올리고뉴클레오티드 제제를 사용하는 경우에 요구되는 중요한 특성이다.
올리고뉴클레오티드 유사체와 연관된 전술한 문제점을 극복하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 포스포라미드 및 포스포로티오에이트로부터 최상의 특성을 구현시키는 새로운 유형의 화합물을 추구하였다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트의 합성, 특성 및 용도에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명의 조성물 및 방법은 서브유니트간 결합에 의해 연결된 인접 뉴클레오시드 서브유니트를 가지는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 2 이상의 인접 서브유니트는 3'-[NH-P(=O)(-SR)-O-]-5' 식에 의해 정의되는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합에 의해 연결되는데, 상기 식 중 R은 수소, 알킬, 아릴 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서브유니트간 결합 모두가 N3'→P5' 티오포스포라미데이트이도록 구성될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 제2 유형의 서브유니트간 결합(예: 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포 네이트, P3'→N5' 포스포라미데이트, N3'→P5' 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트 결합)을 함유할 수 있다.
대표적인 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합은 하기 식을 가진다:
Figure 112002007045259-pct00001
[상기 식 중, B는 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유사체이고; Z는 OR, SR 또는 메틸이며; R은 수소, 알킬, 아릴 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고; R1은 수소, O-R2, S-R2 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되며; R2는 H, 알킬 또는(CH2)nW(CH2)mH이다(n은 1 내지 10의 정수이고, m은 0 내지 10의 정수이며, W는 O, S 또는 NH임). 단, Z가 메틸 또는 OMe인 경우 R1은 H가 아니다]. 폴리뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오시드 서브유니트는 한정된 서열(예컨대, 단일 가닥 핵산 표적 서열 또는 폴리뉴클레오티드와 표적 듀플렉스 사이의 트리플렉스 구조의 형성을 가능하게 하는 서열에 상보적인 염기 서열) 내에 있도록 선택될 수 있다. 전술한 바와 같이, 1 이상의 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합에 의해 연결된 뉴클레오시드 서브유니트는 산 가수분해에 대한 우수한 내성을 가지나, 포스포라미데이트 서브유니트 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드와 비교시 동일한 열 안정성을 보유한다.
또한, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트를 합성하는 방법을 포함한다. 이 방법에 있어서, 제1 뉴클레오시드인 5'숙시닐-3'-아미노트리틸-2',3'-디데옥시 뉴클레오시드를 고체 상 지지체에 부착시킨다. 또한, 상기 제1 뉴클레오시드는 3' 아미노기를 보호한다. 그 후, 보호된 아미노기를 탈보호하여 제2 뉴클레오시드가 첨가되는 유리 3' 아미노기를 형성시킨다. 제1 뉴클레오시드의 유리 3' 아미노기를 3'-보호된 아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포라미디트 단량체와 반응시켜 뉴클레오시드간 N3'→P5' 티오포스포라미디트 결합을 형성시킨다. 그 후, 뉴클레오시드 간의 포스포라미디트기를 황화시켜 제1 뉴클레오시드와 제2 뉴클레오시드 사이의 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 뉴클레오시드간 결합을 형성시킨다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 DNA 또는 RNA 표적에 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화하는 방법을 제공한다. 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드는 하기 식에 의해 정의되는 1 이상의 서브유니트에 의해 연결되는 뉴클레오시드 서브유니트 서열을 포함한다:
Figure 112002007045259-pct00002
[상기 식 중, B는 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유사체이고; Z는 OR, SR 또는 메틸이며; R1은 수소, O-R2 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2는 H, 알킬 또는(CH2)nW(CH2)mH이다(n은 1 내지 10의 정수이고, m은 0 내지 10의 정수이며, W는 O, S 또는 NH임). 단, Z가 메틸 또는 OMe인 경우 R1은 H가 아니다]. 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드를 RNA 표적과 접촉시켜 폴리뉴클레오티드와 RNA 표적 사이의 하이브리드 형성(hybridization) 복합체의 형성을 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같이 1 이상의 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 결합을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트(kit)를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제(telomerase) 효소 활성의 저해를 비롯하여 항-유전자 및 안티센스 용도와 같은, 하이브리드화에 기초한 경구투여용 치료제 용도에 특히 유용하다.
정의
"알킬기"는 1개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 알킬 또는 치환된 알킬기(예: 메틸, 에틸, 프로필 등)를 의미한다. 일반적으로, 저급 알킬은 C1 내지 C5 알킬을 의미한다.
"아릴기"는 5개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 방향족 고리기[예: 페닐기, 나프틸기, 안트릴기 또는 치환된 아릴기(예: 알킬 치환, 또는 톨릴, 에틸페닐, 비페닐 등과 같은 아릴 치환체)]를 의미한다. 상기 아릴기는 고리 내에 1 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 가지는 헤테로사이클릭 방향족 고리기도 포함한다.
일반적으로, "올리고뉴클레오티드"는 약 3개 내지 약 50개의 인접 서브유니트를 가지는 뉴클레오시드 서브유니트 중합체를 의미한다. 뉴클레오시드 서브유니트는 각종 서브유니트간 결합(도 1A 내지 도 1C에 도시된 것들을 포함하나 이에 한정되는 것은 아님)에 의해 연결될 수 있다. 또한, "올리고뉴클레오티드"는 당 주쇄(예: 리보스 또는 데옥시리보스 서브유니트), 당(예: 2' 치환체), 염기, 및 3'및 5'말단에 당업자에게 공지된 변형을 가해 생성되는 변형물을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오티드"는 "올리고뉴클레오티드"가 "폴리뉴클레오티드"와 호환성있게 사용되는 것과 같은 의미이다.
"ATGUCCTG"와 같은 문자의 서열에 의해 올리고뉴클레오티드를 나타낼 경우, 뉴클레오티드는 왼쪽에서 오른쪽으로 5'→3'순서임을 이해할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "뉴클레오시드"는 예컨대, Komberg와 Baker의 문헌[DNA Replication, 제2판(Freeman, San Fransisco, 1992)]에 기재되어 있는 바와 같은 2'데옥시 및 2' 히드록실 형태를 비롯한 천연 뉴클레오시드, 및 그 유사체를 포함한다. 뉴클레오시드의 "유사체"는, 예컨대 Scheit의 문헌[Nucleotide Analogs(John Wiley, New York, 1980)]에 기술된 바와 같이 변형된 염기 부분 및/또는 변형된 당 부분을 가지는 합성 뉴클레오시드를 포함한다. 상기 유사체는 Uhlmann과 Peyman의 문헌[Chemical Reviews, 90:543-584, 1990]에 기술된 바와 같이 결합 특성(예: 안정성, 특이성 등)을 포함한다.
"염기"는 (ⅰ) 전형적인 DNA 및 RNA 염기(우라실, 티민, 아데닌, 구아닌 및 시토신), 및 (ii) 변형된 염기 또는 염기 유사체(예: 5-메틸-시토신, 5-브로모우라실 또는 이노신)를 포함하는 것으로 본 명세서에서 정의된다. 염기 유사체는 그 분자 구조가 전형적인 DNA 또는 RNA 염기의 분자 구조와 유사한 화학물질이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "피리미딘"은 시토신, 티민, 우라실, 및 이들의 통상의 유사체(예: 옥시, 메틸, 프로피닐, 메톡시, 히드록시, 아미노, 티오, 할로 등의 치환기를 함유하는 유사체)를 비롯한 천연 뉴클레오시드에서 생기는 피리미딘을 의미한다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같은 상기 용어는 부착된 통상의 보호기(예: N4-벤조일시토신)를 가지는 피리미딘을 포함한다. 또한, 통상의 피리미딘 보호기는 Beaucage와 Lyer의 문헌[Tetrahedron 48:223-2311, 1992]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "퓨린"은 아데닌, 구아닌, 하이포크산틴, 및 이들의 통상의 유사체(예:옥시, 메틸, 프로피닐, 메톡시, 히드록시, 아미노, 티오, 할로 등의 치환기를 함유하는 유사체)를 비롯한 천연 뉴클레오시드에서 생기는 퓨린을 의미한다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같은 상기 용어는 부착된 통상의 보호기(예: N2-벤조일구아닌, N2-이소부티릴구아닌, N6-벤조일아데닌 등)를 가지는 퓨린을 포함한다. 또한, 통상의 퓨린 보호기는 상기 인용된 Beaucage와 Lyer의 문헌에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 화학명의 성분으로서의 용어 "-보호된-"이란 화합물의 특정 부분에 대한 당업계에 인지된(art-recognized) 보호기를 의미한다. 예컨대, 뉴클레오시드에 관한 "5' 보호된 히드록실"은 트리페닐메틸(즉, 트리틸), p-아니실디페닐메틸(즉, 모노메톡시트리틸 또는 MMT), 디-p-아니실페닐메틸(즉, 디메톡시트리틸 또는 DMT) 등을 포함한다. 당업계에 인지된 보호기는 하기 문헌들에 기재되어 있는 것들을 포함한다: [Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1984)]; [Amarnath 및 Broom, Chemical Reviews, 77:183-217, 1977]; [Pon 등, Biotechniques, 6:768-775, 1988]; [Ohtsuka 등, Nucleic Acids Research, 10:6553-6570, 1982]; [Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1991)]; [Green 및 Wuts, Protective Groyps in Organic Synthesis, 제2판,(John Wiley & Sons, New York, 1991)]; [Narang, editor, Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press, New York, 1987)]; 상기 인용된 Beaucage 및 Lyer의 문헌 등.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는 클로로, 브로모, 플루오로 또는 요오도 치환기를 칭하는 통상의 의미로 사용된다. 본 명세서 및 청구범위에 기재되어 있는 화합물에 있어서, 할로겐 치환기는 일반적으로 플루오로, 브로모 또는 클로로이고, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로이다.
본 발명의 화합물은 텔로머라제 효소 활성 및/또는 텔로머라제 활성을 가지는 세포의 증식을 저해하거나 감소시키는데 사용할 수 있다. 이 경우, 효소 활성 및/또는 세포 증식의 저해 또는 감소는, 효소 또는 세포가 시험 화합물로 처리되지 않은 대조군 실험에 비하여 측정된 활성의 레벨이 상대적으로 낮다는 것을 의미한다. 특정 실시태양에 있어서, 측정된 활성에 있어서의 저해 또는 감소는 10% 이상의 저해 또는 감소이다. 20% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상의 측정된 활성의 저해 또는 감소가 특정 용도를 위해 바람직할 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다.
일반적으로, 본 발명은 1 이상의 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드의 합성 방법, 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 치료제 화합물로서 사용하거나 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다.
예컨대, 하기 식을 가지는 올리고뉴클레오티드를 예시한다:
Figure 112002007045259-pct00003
[상기 식 중,
B는 각각 독립적으로 우라실, 티민, 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸시토신, 5-브로모우라실 및 이노신과 같은, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z1은 O 또는 NH이며;
Z2는 OR, SR 또는 메틸이고(여기서, R은 수소, 알킬, 아릴 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택됨);
R1은 O-R2, S-R2, NHR2 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되며(여기서, R2는 H, 알킬 또는(CH2)nW(CH2)mH(n은 1 내지 10의 정수, m은 0 내지 10의 정수, W는 O, S 또는 NH)임);
R3 및 R4는 히드록실, 아미노 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
m2는 1 내지 50의 정수이다].
본 발명의 폴리뉴클레오티드 뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오시드 서브유니트는 한정된 서열 내에 있도록 선택될 수 있다: 예컨대, 단일 가닥 핵산 표적 서열, 또는 폴리뉴클레오티드와 표적 듀플렉스 사이의 트리플렉스 구조의 형성을 가능하게 하는 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 염기 서열. 바람직하게는, 뉴클레오시드 서브유니트의 서열은 하기 식에 의해 정의되는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트인 1 이상의 서브유니트간 결합에 의해 연결된다:
Figure 112002007045259-pct00004
[상기 식 중,
B는 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유사체이고;
Z는 OR, SR 또는 메틸이며(여기서, R은 수소, 알킬, 아릴 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택됨);
R1은 O-R2, S-R2, NHR2 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된다(여기서, R2는 H, 알킬 또는(CH2)nW(CH2)mH(n은 1 내지 10의 정수, m은 0 내지 10의 정수, W는 O, S 또는 NH)). 단, Z가 메틸 또는 OMe인 경우 R1은 H가 아니다].
예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 서브유니트간 결합은 모두 하기 식에 의해 정의되는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합일 수 있다.
Figure 112002007045259-pct00005
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열(예: RNA 및 DNA)에 하이브리드화하는데 사용할 수 있다. 경우에 따라, 리포터(reporter)기(예: 방사능 표지, 비오틴 표지, 형광 표지 등)로 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 표지함으로써, 폴리뉴클레오티드 자체, 및 예컨대 하이브리드화 복합체 내의 폴리뉴클레오티드의 존재의 검출을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 샘플로부터 표적 RNA를 분리하거나 검출하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 하기 식에 의해 정의되는 1 이상의 결합에 의해 연결되는 뉴클레오시드 서브유니트의 한정된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 함유한다:
Figure 112002007045259-pct00006
[상기 식 중, B는
퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유사체이고; Z는 OR, SR 또는 메틸이며; R1은 O-R2, S-R2, NHR2 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된다(여기서, R2는 H, 알킬 또는(CH2)nW(CH2)mH(n은 1 내지 10의 정수, m은 0 내지 10의 정수, W는 O, S 또는 NH)). 단, Z가 메틸 또는 OMe인 경우 R1은 H가 아니다.] 올리고 뉴클레오티드는 표적 RNA에 하이브리드화한다.
또한, 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자의 과발현과 관련된 질병 상태에 있는 세포 내의 전사 또는 번역의 약학적 저해제로 제제화할 수 있다.
바람직하게는, 뉴클레오시드 서브유니트의 서열은 N3'→P5' 티오포스포라미데이트인 1 이상의 서브유니트간 결합에 의해 연결된다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드의 서브유니트간 결합은 모두 하기 식에 의해 정의되는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합이다:
Figure 112002007045259-pct00007
다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 Nelson 등의 포스포라미디트 전이 방법론(J. Organic Chemistry, 62:7278-7287, 1997)을 변형시켜 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트를 합성하는 고체상(solid phase) 방법에 관한 것이다. 합성 전략은 Cruachem(미국 펜실베니아주 아스톤 소재) 및 JBL Scientific, Inc.(미국 캘리포니아주 샌 루이스 오비스포 소재)로부터 구입한 3'-NH-트리틸 보호된 3'-아미노뉴클레오시드 5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포라미디트(Nelson 등의 상기 인용 문헌 참조)를 이용하였다. 하기 화학 공정을 사용하여 모든 합성 사이클(도 2 참조)을 수행하였다: 1) 탈트리틸화(detritylation), 2) 커플링, 3) 캡핑(capping), 4) 황화(sulfurization). 커플링 공정 후에 형성된 뉴클레오시드 간의 포스포라미디트기의 순차적(step-wise) 황화 공정의 경우, 고체황(elemental sulfur) S8에 의하거나 또는 통상적으로 사용되는 뷰케이지(Beaucage) 시약, 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥시드(Iyer 등의 문헌[J. Organic Chemistry, 55:4693-4699, 1990] 참조)에 의하여, 요오드/물을 주성분으로 하는 산화제를 황화제(sulfurizing agent)로 치환하였다. 황화제로서 무수 아세토니트릴 중의 뷰케이지 시약 1% 용액 또는 99/1(vol/vol)의 CS2/Et3N 중의 15% S8을 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하였다(1 μmol의 합성 규모).
키메라 N3'→P5' 포스포라미데이트-포스포르티오아미데이트 올리고뉴클레오티드는, 포스포라미데이트 뉴클레오시드간 기의 형성을 초래하는 커플링 공정 후, 산화 공정(들)을 사용함으로써 제조할 수 있다. 마찬가지로, 포스포디에스테르-포스포르티오아미데이트는 단량체 빌딩 블록(building block)으로서 5'-포스포라미디트-3'-O-DMTr 보호된 뉴클레오티드를 사용함으로써 제조할 수 있다. 이들 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다.
모델 포스포라미데이트 티미딘 디뉴클레오시드 TnpsTn은 2가지 유형의 황화제를 사용하여 제조하였으며, 이는 3'-NHP(O)(S)O-5' 뉴클레오시드간 기를 갖는다. 반응 혼합물을 분석하고, 이온 교환(IE) 및 역상(RP) HPLC, 및 31P NMR에 의해 화합물의 구조를 확인하였다. 상기 분석에 의하면, 뷰케이지 시약을 사용하는 뉴클레오시드간 포스포라미디트기의 황화는 3'-NHP(O)(O)O-5' 포스포라미데이트 결합을 가 지는 약 10% 내지 15%의 산화된 디뉴클레오시드(31P NMR δ, D2O 중 7.0 ppm)의 형성을 야기시킨다는 것이 밝혀졌다. 대안으로, 분자 황 S8을 사용하는 황화는 31P NMR 및 IE HPLC 분석에 의해 평가되듯이 실질적으로 정량적인 수율로 3'-NHP(O)(O)O-5' 뉴클레오시드간 기를 함유하는 소정의 디뉴클레오티드를 생산하였다(31P NMR δ, D2O, Rp, Sp 중 56.4, 59.6 ppm).
모델 올리고뉴클레오티드 11-mer GTTAGGGTTAG(서열번호 1)의 합성의 경우 황화 효율에 관한 유사한 결과를 얻었는데, 뷰케이지 시약을 사용하는 황화는 반응 혼합물의 31P NMR 분석에 의해 평가되듯이 약 15%의 포스포라미데이트 결합을 함유하는 전장(full length) 생성물을 생성하였다. 주요 피크에 대한 화학적 이동은 티오포스포라미데이트기 및 포스포라미데이트기에 각각 상응하는 약 57 및 60 ppm[광역 이중선(broad doublet)] 및 약 7 ppm[광역 삼중선(broad triplet)]이었다. 이와 대조적으로, 31P NMR 분석에 따르면 S8을 사용하는 황화는 11-mer 생성물 내에 단지 약 2%의 포스포라미데이트 결합을 생산하였다. 올리고머의 IE HPLC 분석은 31P NMR 스펙트럼과 거의 일치한다. 최종 올리고뉴클레오티드 생성물의 구조 및 순도는 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석, 31P NMR, 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석에 의해 확인하였다. 티오포스포라미데이트 올리고머 GT2AG3T2AG(서열번호 1)과 TAG3T2AGACA2(서열번호 2)에 대한 분자량은 각각 3,577.11과 4,202.69인 것으로 측정되었다. 티오포스포라미데이트 올리고머 GT2AG3T2AG((서열번호 1)과 TAG3T2AGACA2(서열번호 2)에 대한 분자량은 MALDI-TOF 질량분석법에 의해 실험적으로 측정한 결과 각각 3,577과 4,203이었고, 등서열(isosequential)의 포스포라미데이트에 대한 15% PAGE 중의 상대적인 운동성(mobility)는 각각 0.95와 0.97이었다.
IE HPLC 및 31P NMR에 의해 평가되듯이(31P NMR δ7.0 ppm), 55 ℃에서 15분 동안 1/4/0.1(vol/vol)의 피리딘/THF/H2O 중의 0.1 M 요오드 용액으로 처리함으로써, 모델 포스포라미데이트 뉴클레오시드 TnpsTn을 정량적으로 포스포라미에이트의 카운터파트 TnpsTn으로 전환시켰다(도 3 참조). 55 ℃에서 48 시간 동안 10% 아세트산으로 TnpsTn 디뉴클레오티드를 처리하면, 뉴클레오시드간 포스포라미데이트 결합의 일부(약 10%)만이 가수분해된다. 이와 대조적으로, 상기 조건하에서 모(母) 포스포라미데이트 이합체 TnpsTn은 전부 가수분해되었다. IE HPLC 및 31P NMR에 의해 밝혀지듯이(도 3 참조), 디뉴클레오티드 티오포스포라미데이트 내의 N-P 결합의 절단은 생성되는 포스포라미데이트 -NHP(O)(O)O-기의 신속한 가수분해에 의해 수반되는 부수(concomitant) 탈황화 공정(약 15%)에 의해 수행한다.
전술한 바와 같이, 2'-R3 N3'→P5' 티오포스포라미데이트는 상응하는 포스포라미데이트로부터 수득할 수 있다. 2'-R3 N3'→P5' 포스포라미데이트는 올리고뉴클 레오티드 N3'→P5' 포스포라미데이트의 합성을 위해 고안된 포스포라미디트 전이 방법에 의해 수득하였다. 2'-O-알킬 N3'→P5' 티오포스포라미데이트의 합성은 상기 방법의 설명 부분에 상세히 기술되어 있다.
적당히 보호된 2'-O-알킬-3'아미노뉴클레오시드-5'-포스포라미디트 빌딩 블록 4, 6, 11 및 15(여기서, 알킬은 메틸임)는 하기 도식 1-3에 나타난 일련의 화학적 형질전환에 따라 제조하였다. 상기 화합물의 제조를 위한 본 발명의 공정은 피리미딘의 이미노 작용성 또는 퓨린의 N-7 원자의 존재하에 2'-히드록실기의 선택적 메틸화이었다. 2가지 피리미딘계 단량체는 공지의 3-아지도-2'-O-아세틸-5'-O-톨루일-3'-데옥시-β-D-리보푸라노실우라실(1)로부터 수득하였다. 일반적으로, 화합물(1)의 N-3/O-4 이미노 질소를, 예컨대 디메틸아미노피리딘의 존재하에 메틸 프로피올레이트의 반응에 의해 먼저 보호기로 보호하였다(도식 1). 이어서, 조(粗) 반응 생성물은 2'-O-의 선택적 탈아세틸화하하고, 그 후 생성되는 2'-히드록실기는 예컨대 요오도메탄 및 은 산화물을 사용하는 메틸화 반응에 의해 알킬화하였다.
Figure 112002007045259-pct00008
N-3 보호기를 제거하고, 3'-아지도기를 아민으로 환원시킨 직후, 예컨대 4-모노메톡시트리틸클로라이드와의 반응에 의해 아민을 보호하여 전구체(3)을 제공하였다. 이어서, 알칼리 용액을 사용하여 5'-톨루오일 에스테르를 절단한 후, 공지의 프로토콜을 사용하여 포스피틸화(phosphitylation)하여 소정의 2'-O-메틸 우리딘 포스포라미디트 단량체(4)를 제공하였다. 2'-O-메틸 시토신 포스포라미디트는 우리딘 중간체(3)의 3'-아미노시티딘 유사체(5)로의 전환에 의해 수득하였다.
2'-O-알킬 아데노신 유사체의 합성은 2'-히드록실기의 메틸화 반응 기간 중 N-7의 알킬화를 방지하기 위해 주로 외향고리(exocyclic) 아민에 대한 부피가 큰 보호기의 사용을 필요로 한다(도식 2). 먼저, 3'-아지도-2'-O-아세틸-5'-O-톨루오일-N6-벤조일-3'-데옥시아데노신(7)을 예컨대 NH3/MeOH(1/1, v/v)와의 반응에 의해 탈보호하여 3'-아지도-3'-데옥시아데노신을 제공하였다. 이어서, 부피가 큰 보호기(예: t-부틸디페닐실릴기 또는 4-모노메톡시트리틸기)로 N-6 부분을 선택적으로 재보호한다. 5'-O 및 N-6 위치에서의 2개의 큰 치환기의 조합은 N-7을 입체적으로 폐쇄시킴으로써, 2' 위치에서의 메틸기의 선택적 도입을 허용하여 중간체(8)을 생성시킨다. 이어서, 예컨대 유기 용매(예: 디클로로메탄) 중의 3% 트리클로로아세트산으로 처리함으로써, N-6 4-모노메톡시트리틸기를 제거한 후, N-6의 재보호를 수행하였다. N-6의 재보호를 위한 벤조일 클로라이드의 사용은 2개의 벤조일기의 첨가를 초래한다. 염기 처리에 의해 제2 벤조일기를 연이어 제거하여, 중간체(9)를 생산하였다. 이어서, 아지드기를 환원시킨 후, 그 결과로 생성되는 3'-아미노기를 4-모노메톡시트리틸로 보호하여 화합물(10)을 형성시켰다. 마지막으로, 5'-실릴 보호기를 절단하고, 포스피틸화에 의해 2'-O-메틸 포스포라미디트 단량체(11)을 생성시켰다.
Figure 112002007045259-pct00009
구아노신계 2'-O-알킬 포스포라미디트(15)의 합성은 도식 3에 기술되어 있다. 3'-아지도-2'-O-아세틸-5'-O-톨루오일-N2-이소부틸-O6-디페닐카르바모일-3'-데옥시구아노신(12)는 염기로 처리함으로써 탈블록하였다. 5' O- 및 O-6은 t-부틸디페닐실릴클로라이드와의 반응에 의해 재보호하였다. 이어서, 비스-실릴화된 중간체를 2'-O 알킬화하였다. O-6 실릴기를 선택적으로 탈보호하여 화합물(13)을 제공하였다. N-2 기를 재보호하고, 3'-아지도기를 환원시키고, 그 결과로 생성되는 3'-아미노기를 보호하여 뉴클레오시드(14)를 수득하였다. 마지막으로, 2'-O-알킬 구아노신 포스포라미디트 단량체(15)는 5' 보호기의 제거 후, 차폐되지 않은 5'-히드록실기의 포스피틸화에 의해 수득하였다.
Figure 112002007045259-pct00010
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 올리고뉴클레오티드 내의 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합에 의해 결합된 서브유니트를 배치시킴으로써, 올리고뉴클레오티드의 산 안정성을 증가시킨다. 포스포디에스테르 또는 포스포라미데이트 서브유니트간 결합을 가지는 상보적인 DNA 또는 RNA 가닥에 대하여 상대적인 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화 특성을 검측하였다. 포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 및 포스포디에스테르 올리고머로부터 생성되는 듀플렉스에 대한 열 안정성 데이타는 표 1(실시예 3)에 요약하였다.
상보적인 핵산과 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 형성은 서열 특이적이고, 적당한 와트손-크리크(Watson-Crick) 염기 쌍에 의해 측정된다. 텔로머라제의 RNA 표적 성분과의 단일 염기 부적정 대합을 가지는 포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 서열번호 3에 의해 형성되는 듀플렉스(실시예 6, 표 2, 실험예 2)는 텔로머라제의 RNA 성분에 전부 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열번호 1에 의해 형성되는 듀플렉스(실시예 6, 표 2, 실험예 1)보다 실질적으로 덜 안정적이다.
뉴믈레오시드간 3'-NHP(O)(S)O-5' 티오포스파라미데이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 용도
올리고뉴클레오티드 서열번호 2 3'-NHP(O)(S)O-5' 티오포스파라미데이트를 합성하였다. 이 화합물은 놀랍게도 산에 안정하였고, 상보적인 RNA 표적과 안정한 복합체를 형성하였다. 본 발명의 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드는 안티센스 및 항-유전자 진단/치료 용도를 위한 커다란 잠재성(potential)을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다.
A. 텔로머라제 저해 용도
최근, 정상 세포가 노화(senescence) 상태, 즉 세포가 세포의 노쇠(aging) 과정에서 통상적으로 겪는 증식능(proliferative capacity)의 손실에 도달하는 메카니즘에 대한 이해가 출현하기 시작하였다. 통상, 진핵생물의 염색체 말단의 DNA 또는 진핵생물의 텔로미어는 직렬로 반복되는 단순한 서열로 구성되어 있다. 과학자들은 텔로미어가 염색체의 구조 및 기능을 유지하는데 중요한 생물학적 역할을 한다는 것을 오랫동안 인지하고 있었다. 보다 최근에, 과학자들은 반복되는 세포 분열에 대한 텔로미어 DNA의 누적 손실이 세포 노화 및 노쇠의 계기로 작용할 수 있고, 텔로머라제, 즉 텔로미어 길이의 유지와 관련된 효소의 조절은 중요한 생물학적 관련성을 가진다고 추측하였다. 예컨대, Harley의 문헌[Mutation Research, 256:271-282, 1991]을 참조하라. Bodnar 등에 의한 실험은 배양된 정상 인간 세포의 복제 수명(replicative lifespan)을 조절함에 있어서 텔로미어 및 텔로머라제의 중요성을 확인하였다. Bodnar 등의 문헌[Science 279:349-352, 1998]을 참조하라.
텔로머라제는 효소의 RNA 성분 내에 함유된 서열을 주형으로 사용하여 텔로미어 DNA의 한 가닥을 합성하는 리보핵산 단백질 효소이다. Blackburn의 문헌[Annu. Rev. Biochem., 61:113-129, 1992]을 참조하라. 인간 텔로머라제의 RNA 성분은 그 서열이 결정되었고, 그 길이는 텔로미어 반복에 상보적인 일련의 11개 염기 서열의 반복을 포함하여 460 뉴클레오티드이다. 인간 텔로머라제의 활성은 텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 각종 올리고뉴클레오티드에 의해 저해되었다. Norton 등의 문헌[Nature Biotechnology, 14:615, 1996]; Pitts 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 95:11549-11554, 1998]; 및 Glukhov 등의 문헌[Bioch. Biophys. Res. Commun., 248:368-371, 1999]를 참조하라. 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA의 10개 내지 50개의 뉴클레오티드에 상보적이다. 바람직하게는, 본 발명의 텔로머라제 저해제 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA에 상보적인 10개 내지 20개의 순차(consecutive) 염기 서열을 가진다.
또한, 텔로미어 길이 및 테로머라제 활성의 조절에 의한 세포 노화 및 불사화(immortalization)의 치료 및 진단 방법과 함께, 텔로머라제 활성을 검출하는 방법, 및 텔로머라제 활성을 조절하고 텔로머라제 활성에 영향을 미치는 화합물을 동정하는 방법이 기술되어 있었다. Feng 등의 문헌[Science, 269:1236-1241, 1995]; Kim 등의 문헌[Science, 266:2011-2014, 1994]; 1993. 11. 25. 발행된 PCT 특허 공보 제93/23572호; 미국 특허 제5,656,638호, 제5,760,062호, 5,767,278호, 제5,770,613호 및 제5,863,936호를 참조하라.
텔로머라제 활성을 저해하는 화합물의 동정은 인간 질병을 치료하려는 노고에 중요한 잇점을 제공한다. 생물학적으로 관련된 레벨에서(즉, 다수의 세포 분열에 대하여 텔로미어 길이를 유지하기에 충분한 레벨에서) 암 세포는 텔로머라제 활성을 발현시키고, 정상적인 인간 체세포는 텔로머라제 활성을 소유하지 않기 때문에, 텔로머라제 활성을 저해하는 화합물은 텔로머라제 매개 질환(예: 암)을 치료하는데 사용할 수 있다. 불행하게도, 소수의 상기 화합물, 특히 높은 역가 또는 활성을 가지는 화합물 및 경구투여 후 생물학적으로 이용가능한 화합물을 동정하고 특성화하였다. 따라서, 지금부터는 상대적으로 높은 역가 또는 활성을 가지며 경구 투여시 생물학적으로 이용가능한 텔로머라제 저해제로서 작용하는 화합물, 텔로머라제 활성이 비정상적으로 존재하는 암 또는 기타 질병의 치료용 조성물, 및 상기 질병의 치료 방법을 필요로 한다.
본 발명의 신규 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 화합물은 산에 안정하고, 따라서 예컨대 인간의 암 치료에 있어서 유해한 텔로머라제 활성의 저해제로서 다수의 귀중한 용도를 갖는다. 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 약학 조성물은 생체내에서 암 세포가 저해되는 치료법에 이용될 수 있고, 생체외에서 암 세포를 저해하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암을 치료하는 치료용 화합물 및 조성물, 포유동물[예: 암소, 말, 양, 수송아지(steer), 돼지, 및 고양이와 개와 같은 가축]의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 다른 텔로머라제 매개 질환 또는 질병[예: 과 증식성(hyperproliferative) 질환 또는 자가면역 질환]을 치료하는데 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 세포의 불사화는 특히 텔로머라제의 활성을 포함한다. 보다 구체적으로, 불멸 상태로 남아있기 위한 텔로머라제 활성과 다수의 종양 세포주의 성능 간의 관계(connection)는 텔로머라제 활성의 분석에 의해 입증되었다(상기 Kim 등의 문헌을 참조하라). 텔로머라제 길이의 감축이 정상 세포에서의 복제 노화에 대한 신호를 제공할 수 있다(PCT 출원 제93/23572호를 참조하라)는 것을 지시하는 데이타에 의해 보충되는 상기 분석은 텔로머라제 활성의 저해가 효과적인 항암 요법일 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 텔로머라제 활성은 다수의 세포 분열 후 정상 체세포에서 일어날 수 있는 세포 복제의 동시 정지, 및 텔로미어 길이의 정상적인 감소를 방지함으로써 다른 정상적인 복제 노화의 개시를 방지할 수 있다. 악성 표현형이 세포 주기 또는 성장 조절의 손실 또는 다른 유전적 손상에 기인하는 암 세포에 있어서, 텔로머라제 활성의 부재(不在)는 세포 분열 기간 중 텔로미어 DNA의 손실을 허용하고, 그럼으로써 궁극적으로 세포의 사멸을 초래하는 염색체 전위(rearrangement) 및 이상(異常; abberation)을 야기시킨다. 그러나, 텔로머라제 활성을 가지는 암 세포에 있어서, 텔로미어 DNA는 세포 분열 기간 중 손실되지 않으며, 그럼으로써 암 세포의 불멸을 허용하여 환자의 종말 예후(terminal prognosis)를 초래한다. 종양 세포 내의 텔로머라제 활성을 저해할 수 있는 제제는 텔로머라제 활성을 가지는 불사화 세포가 질병의 진행에 있어서의 인자이거나 텔로머라제 활성의 저해가 치료 목적을 위해 바람직한 각종 암 및 기타 질환(예: 진균 감염)에 관하여 치료상의 잇점을 제공한다. 또한, 본 발명의 텔로머라제 저해는 생식 세포 계열에 있어서의 텔로머라제 활성을 저해하는데 사용할 수 있고, 이는 피임약 목적에 유용할 수 있다.
또한, 암의 치료를 위한 치료상의 잇점이 다른 항암제(예컨대, 미국 특허 제5,656,638호, 제5,760,062호, 제5,767,278호, 5,770,613호 및 제5,863,936호에 기재되어 있는 다른 텔로머라제 저해제를 포함함)와 본 발명의 텔로머라제 저해제를 배합함으로써 인식될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 상기 배합의 선택은 각종 인자[질병의 유형, 환자의 나이 및 일반적인 건강 상태, 질병 진행의 진척도(aggressiveness), 치료 대상인 질병이 있는 세포의 TRF 길이 및 텔로머라제 활성, 및 상기 배합물을 포함하는 제제에 견딜 수 있는 환자의 능력을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아님)에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 종양의 진행이 진전된(advanced) 상태에 도달된 경우, 본 발명의 텔로머라제 저해 화합물을 종양의 크기를 감소시키는데 효과적인 치료 요법(예: 방사선 방사, 외과 수술, 화학요법 및/또는 호르몬 치료) 및 다른 제제와 병용하는 것이 적당할 수 있다. 또한, 어떤 경우에는, 본 발명의 텔로머라제 저해 제제를 질병의 부작용을 치료하는 1 이상의 제제[예컨대, 진통제, 또는 환자 자신의 면역 반응을 자극하는데 효과적인 제제(예: 콜로니 자극 인자)]와 병용하는 것이 적당할 수 있다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 생체내에서 텔로머라제 활성에 대한 저해 활성이 있음이 입증된다. 또한, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 본 발명의 시험관내 활성을 입증하였다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "시험 관내"는 조직 배양 내의 살아있는 세포를 사용하여 수행된 시험을 의미한다. 또한, 상기 방법은 "생체외"라 칭하기도 한다.
일반적으로, 이 단락에 기재되어 있는 올리고뉴클레오티드 텔로머라제 저해제는 텔로머라제 RNA 성분에 상보적인 서열을 포함한다. 인간 텔로머라제 RNA 성분의 서열은 미국 특허 제5,776,679호에 기재되어 있다. 또한, 치료 대상에 따라 다르겠지만, 다른 종(species)의 텔로머라제 RNA 성분을 사용할 수도 있다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제에 대한 특이성이 있는 약 10개 내지 100개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(즉, 상기 뉴클레오티드는 보다 낮은 농도에서, 또는 표적 세포 또는 치료 바이스탠더(bystander) 세포 내에 존재하고 기능적으로 활성이 있을 것이라고 기대되는 다른 RNA 효소 성분 또는 다른 RNA 분자와 하이브리드를 형성하는 것보다 엄격한 조건하에서 텔로머라제 RNA 성분과 하이브리드르 형성한다). 올리고뉴클레오티드는 약 10개 내지 25개의 뉴클레오티드를 포함하고, 예컨대 하기 실시예에 있어서는 약 12개 내지 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 다수의 환경에서, 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제 RNA 내의 동일한 길이의 순차 서열에 정확히 상보적일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 올리고뉴클레오티드 내에 부적정 대합 잔기, 간극(gap) 또는 부가물(addition)이 있는 경우, 특히 RNA 내의 상응하는 상보적 서열의 길이가 15개 이상의 뉴클레오티드인 경우에도 하이브리드 형성은 특이성이 있을 수 있다고 이해된다.
텔로머라제 활성을 저해하는 특이성 서열을 가지는 본 발명의 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드를 동정하는데 사용되는 한 방법은 텔로머라제 활성에 적합한 완충액 내에서 텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 몇몇 공지의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 농축물과 접촉하는 텔로머라제를 함유하는 세포, 조직, 또는 바람직하게는 세포 추출물이나 기타 제제를 배치하는 단계를 포함한다. 각각의 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드 농축물에 대한 텔로머라제 활성의 레벨을 측정하였다. 텔로머라제 저해제의 투여 전후(前後), 표준 시약 및 방법을 사용하여 텔로머라제 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어, TRAP 활성 분석법을 사용하여 배양된 세포 내의 텔로머라제 활성을 측정할 수 있다(Kim 등의 문헌[Science 266:2011, 1997]; Weinrich 등의 문헌[Nature Genetics 17:498, 1997]). 하기 분석 키트는 연구 목적을 위해 시판된다: TRAPeze
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XK 텔로머라제 검출 키트(Cat. s7707; 미국 뉴욕주 퍼처스 소재 Intergen Co.); 및 TeloTAGGG 텔로머라제 PCR ELISAplus(Cat. 2,013,89; 미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재 Roche Diagnostics).
표준 기법을 사용하여 폴리뉴클레오티드의 IC50(동일한 제제에 대해 관찰된 활성이 최초값 또는 대조군 값의 절반으로 떨어지는 것으로 관찰될 때의 폴리뉴클레오티드의 농도)를 측정한다. 텔로머라제에 대한 본 발명의 화합물의 저해 농도를 측정하는 한 방법을 이용할 수 있는데, 이는 본 명세서에 기초하여 당업자에게 자명할 것이기 때문이다.
전술한 방법으로 본 발명의 몇몇 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 IC50 값을 측정하였는데, 그 값은 10 nM 이하임이 밝혀졌다(표 2, 실시예 6 참 조).
텔로머라제의 RNA 성분에 상보적인 티올스포라미데이트 폴리뉴클레오티드를 사용하여 악성 질병을 치료하는 경우, 텔로머라제-양성(telomerase-positive) 세포주에 위기(crisis)를 유도하는 것으로 예측된다. 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 서열번호 2로 동시에 불사화된 HME50-5E 인간 유방 상피 세포를 처리하면, 텔로미어 길이의 감소에 의해 입증되듯이 텔로머라제 활성의 저해를 초래하였다(실시예 6 및 도 4 참조). 또한, 텔로머라제의 RNA 서열 성분에 상보적인 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드로 다른 텔로머라제-양성 세포주(예: HEK-293 및 HeLa 세포)를 처리하면, 처리된 세포 내의 텔로미어 길이의 감소를 유도하는 것으로 예측된다.
또한, 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 인간 종양 세포주(예: 난소암 세포주 OVCAR-5 및 SK-OV-3)에서의 세포 분열 기간 중 텔로미어 감소를 유도하는 것으로 예측된다. 그러나, 대조군으로 사용되는 정상 인간 세포(예: 섬유아세포 기원의 BJ 세포)에 있어서, 관찰되는 텔로미어 길이 감소는 대조군 물질(예: 상보적인 텔로머라제 RNA 표적과의 1 이상의 단일 염기 부적정 대합을 가지는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드)로 처리된 세포와 상이하지 않다고 예측된다는 것이 중요하다. 또한, 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 약 20 μM 이하의 정상 세포 농도에서 유의적인 세포독성 효과가 없음이 입증되는 것으로 예측된다.
또한, 하이브리드 형성 시험을 수행하고, 텔로머라제에 대한 활성(IC50)과 필수 RNA 성분(예: 리보뉴클레아제 P)을 함유하는 것으로 공지된 다른 효소에 대한 활성(IC50)을 비교함으로써, 텔로머라제 RNA에 대한 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 특이성을 측정할 수 있다. 스크리닝되는 다른 효소에 대한 IC50 값에 비하여 텔로머라제에 대한 IC50 값이 더 낮은 화합물은 텔로머라제에 대한 특이성을 갖는다고 한다.
또한, 예컨대 OVCAR-5 종양 세포가 누드 마우스 상에 이식되는 마우스 이종이식(xenograft) 모델을 사용하여 생체내 시험을 수행할 수도 있는데, 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드로 처리된 마우스는 평균적으로 일정 기간 동안 초기 용량을 증가시킬 수 있으나 연속 처리로 질량이 감축되기 시작하는 종양 질량을 갖는 것으로 예측된다. 이와 대조적으로, 대조군(예: 상보적인 텔로머라제 RNA 표적과의 1 이상의 단일 염기 부적정 대합을 가지는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드)으로 처리된 마우스는 계속하여 증가하는 종양 질량을 갖는 것으로 예측된다.
전술한 내용으로부터, 본 발명은 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 투여를 포함하는 치료 요법을 선택하는 방법도 제공한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 목적으로, 텔로머(T2AG3)N 서열 이외의 서열에 대한 특이성이 있는 제한효소로 소화시킴으로써, 종양 세포로부터의 DNA를 분석하는 말단 제한 단편(terminal restriction fragment; TRF) 분석을 수행하는 것이 유용할 수 있다. DNA 소화 후, 겔 전기영동을 수행하여 크기에 따른 제한 단편을 분리한다. 이어서, 텔로머 서열에 대한 특이성이 있는 핵산 프로브(probe)로 분리된 단편을 탐사하여, 샘플 내의 세포의 텔로머 DNA를 함유하는 말단 단편의 길이를 측정한다. 텔로머 DNA의 길이를 측정함으로써, 얼마나 긴 텔로머라제 저해제를 투여해야 하는지 여부, 및 다른 치료 방법(예: 외과 수술, 화학요법 및/또는 방사선 방사)도 이용해야 하는지 여부를 평가할 수 있다. 또한, 치료 기간 중, 세포를 시험하여 진행하는 세포 분열에 대한 텔로미어 길이의 감소가 일어나는지를 측정함으로써 치료 효능을 입증할 수 있다.
따라서, 일 실시양태에 있어서, 본 발명은 암과의 전쟁에서 텔로머라제를 발현시키는 악성종양(malignancy); 피부암, 결합 조직 종양, 지방 종양, 유방암, 폐암, 위암, 췌장암, 난소암, 경부암, 자궁암, 신장암, 방광암, 결장암, 전립선암, 중추신경계(CNS) 종양, 망막암 및 순환기 종양(예: 백혈병 및 림프종)을 포함하는 종양에 대항하는 중요한 무기로서 역할을 할 수 있는 화합물을 제공한다. 특히, 본 발명의 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드는 고도로 변이된 인간 종양 세포주 및 텔로머라제 활성을 가지는 종양에 의해 입증되듯이, 다수의 악성종양을 치료하는 매우 일반적인 방법(비록, 가장 일반적인 방법은 아닐지라도)을 제공할 수 있다. 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드가 악성 세포와 정상 세포를 고도로 식별하는 치료법을 제공하고, 분열하는 세포를 무분별하게 사멸시키는 제제에 의존하는 가장 최근의 화학요법에 존재하는 다수의 유해한 부작용을 회피하는데 효과적일 수 있다는 것이 보다 중요하다.
B. 다른 안티센스 용도
안티센스 치료법은 세포 내에 위치한 표적 핵산에, 일반적으로는 RNA 분자에 결합하는 외인성 올리고뉴클레오티드의 투여를 포함한다. 올리고뉴클레오티드가 세포 생성물을 암호화하는 mRNA 분자["의미 가닥(sense strand)"]에 일반적으로 상보적이기 때문에, 안티센스라는 용어를 부여한 것이다.
본 명세서에 기재되어 있는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 유전자 발현의 안티센스 저해에 유용하다(Matsukura 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 86:4244-4248, 1989]; Agrawal 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 86:7790-7794, 1989]; Zamecnik 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 83:4143-4146, 1986]; Rittner와 Sczakiel의 문헌[Nucleic Acids Research, 19:1421-1426, 1991]; Stein과 Cheng의 문헌[Science, 261:1004-1012, 1993]). N3'→P5' 티오포스포라미데이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 다수의 의학적으로 유의성있는 표적의 치료 용도(암 세포 증식의 억제 및 전염성 바이러스의 방해를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아님)를 갖는다. N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 가축 및 인간을 위한 용도에 유용하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 높은 산 안정성 및 저농도에서 안티센스 분자로서 효과적으로 작용할 수 있는 성능(하기 참조)은 상기 올리고뉴클레오티드가 치료용 안티센스 제제로서 적합하도록 한다.
일반적으로, 안티센스 제제는 모든 표적 RNA 분자를 연속적으로 결합시킴으로써, 상기 표적 RNA 분자를 불활성화하거나 대안으로 기질에 내인성 리보뉴클레아제 H(Rnase H) 활성을 제공할 필요가 있다. Rnase H 소화에 대한, 본 발명의 방법 에 의해 생기는 RNA/올리고뉴클레오티드 복합체의 감수성은 표준 방법에 의해 검측할 수 있다(Donia 등의 문헌[J. Biol. Chem., 268:14541-14522, 1993]; Kawasaki 등의 문헌[J. Medicinal Chem., 36:831-841, 1993]).
본 발명의 화합물 및 방법은 보다 많은 종래의 안티센스 제제에 비하여 몇가지 장점을 제공한다. 첫째, 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 상응하는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드로서의 RNA 표적에 보다 강하게 결합한다. 둘째, 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 산 조건에 의한 분해(degradation)에 대한 보다 큰 내성이 있다. 세째, 화합물의 세포 흡수에 있어서, 대전된 올리고뉴클레오티드보다 대전되지 않은 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드 주쇄가 세포 내로의 포스포라미데이트 얼리고뉴클레오티드의 보다 효율적인 유입(entry)을 가능하게 한다.
또한, RNA가 대부분 듀플렉스 표적 서열의 퓨린 가닥에 의해 암호화되는 경우, 듀플렉스에 표적된 포스포라미데이트 유사체 올리고뉴클레오티드도 DNA를 불활성화시킬 잠재력, 즉 단일 가닥 형태 및 이중 가닥 형태로 병원체를 불활성화시킬 수 있는 성능을 가진다(하기 항-유전자 치료법에 관한 기재 부분을 참조하라).
서열 특이성 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 분자는 몇몇 방법으로 RNA를 포함하는 임의의 질병 또는 질환에 필수적인 잠재적으로 강력한 치료제이다. 그 서열이 치료 용도를 위해 표적화될 수 있는 대표적인 유형(mode)은 다음과 같은 것들을 포함한다:
a) 전염성인자(infectious agent)[예: 박테리아, 바이러스, 효모 및 기타 진 균]의 증식 및/또는 유지와 관련된 생성물을 발현시키는 RNA 서열(예컨대, 전염성인자에 의해 암호화되는 특이성 mRNA)의 표적화;
b) RNA의 절단(예컨대, RNA/DNA 하이브리드 듀플렉스 분자의 Rnase H 절단)의 유도를 야기시키는 듀플렉스 분자의 형성;
c) RNA 서열과 단백질의 상호작용(예컨대, TAT와 TAR의 상호작용, 하기 참조)의 차단; 및
d) 세포 유전자[예컨대, 세포 주기 조절; 소염 방법; 평활근 세포(SMC) 증식; 유주(遊走; migration) 및 매트릭스 형성(Liu등의 문헌[Circulation, 79:1374-1387, 1989]); 특정 유전 질환; 및 암(원종양유전자)과 연관된 유전자]의 부적절한 발현 또는 증식을 야기시키는 서열의 표적화.
일 실시태양에 있어서, 부적절하게 발현된 세포 뉴전자의 RNA 프로세싱(processing), 또는 번역을 차단시킨다. 대표적인 잠재성 표적 서열은 예컨대 다음과 같은 것들을 포함하나 이들에 한정되지 아니하는 원종양유전자이다: c-myc, c-myb, c-kit, ras, BCR/ABL(예: Wickstrom, Editor, Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, Wiley-Liss, 뉴욕주 뉴욕, 1991; Zalewski 등, Circulation Res., 88:1190-1195, 1993; Calabretta 등, Seminars in Cancer Biol., 3:391-398, 1992; Calabretta 등, Cancer Treatment Rev. 19:169-179, 1993), 종양유전자(예: p53, Bayever 등, Antisense Research and Development, 3:383-390, 1993), 전사 인자(예: NF.kappa.B, Cogswell 등, J. Immunol., 150:2794-2804, 1993), 및 바이러스 유전자(예: 파필로마바이러스, Cowsert 등, Antimicrob. Agents and Chemo., 37:171-177, 1993; 단순 헤르페스 바이러스, Kulka 등, Antiviral Res., 20:115-130, 1993). 이상증식(hyperplasia)에 있어서의 안티센스 치료를 위한 다른 적당한 표적은 종종 텔로머라제 발현에 있어서의 제한 성분인, 텔로머라제의 단백질 성분이다(WO 99/50279 참조). 인간 텔로머라제 역전사효소의 서열은 발행된 미국 특허 제6,093,809호, WO 98/14592 및 pGRN121(ATCC 접수번호 제209016호)에 기재되어 있다. 추가 설명을 한다면, 본 발명의 방법에 의해 표적화될 수 있는 HIV-1의 2개의 RNA 영역은 REV-단백질 반응 요소(RRE) 및 TAT-단백질 전사활성 반응 요소(TAR)이다. REV 활성화는 HIV 외피(envelope) 유전자 내에 위치한 REV 반응 요소(RRE)의 존재를 필요로 한다(Malim 등의 문헌[Nature, 338:254-257, 1989]; Malim 등의 문헌[Cell, 58:205-214, 1989]).
RRE는 4개의 줄기-루프(stem-loop) 구조 및 1개의 분지된 줄기-루프 구조를 형성시키는 것으로 여겨지는 234-뉴클레오티드 영역에 위치 결정된다(Malim 등의 문헌[Nature, 338:254-257, 1989]). 풋프린팅(footprinting) 실험으로부터 수득한 데이타(Holland 등의 문헌[J. Virol., 64:5966-5975, 1990]; Kjems 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 88:683-687, 1991])는 REV가 1개의 줄기 구조 내의 6개의 염기 쌍 및 RRE의 인접 줄기-루프 구조 내의 3개의 뉴클레오티드에 결합한다는 것을 시사한다. Cook 등(문헌[Nucleic Acids Research, 19:1577-1583])은 줄기-루프 II 내의 약 40개의 뉴클레오티드의 최소 REV 결합 영역을 동정하였다. 본 발명의 방법에 따라 1 이상의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 사용하여, RNA/DNA 듀플렉스의 생성을 위해 이 결합 영역을 표적화할 수 있다(예: Li 등의 문헌[J. Viol., 67:6882-6888, 1993]).
HIV-1 TAT는 바이러스 복제에 필수적이고, 긴 말단 반복(long terminal repeat; LTR) 지향 바이러스 유전자 발현의 강력한 전사활성인자이다(Dayton 등의 문헌[Cell, 44:941-947, 1986]; Fisher 등의 문헌[Nature, 320:367-371, 1986]). TAT 단백질에 의해 유도되는 전사활성은 바이러스 mRNA 요소의 번역되지 않은 5' 말단 내에 위치한 TAR 요소(미국 특허 제5,837,835호 참조)의 존재를 필요로 한다.
TAR 요소는 안정한 줄기-루프 구조를 형성시킬 수 있다(Muesing 등의 문헌[Cell, 48:691-701, 1987]). TAR의 줄기 및 줄기 상의 3 뉴클레오티드(nt) 벌즈(bulge)의 완전성(integrity)이 TAR 요소에의 TAT 단백질의 특이성 및 고친화성 결합에 필수적이라는 것이 입증되었다(Roy 등의 문헌[Genes Dev., 4:1365-1373, 1990]; Cordingley 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 87:8985-8989, 1990]; Dingwall 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., 86:6925-6929, 1989]; Weeks 등의 문헌[Science, 249:1281-1285, 1990]). 이 영역은 본 발명의 방법에 따른 안티센스 치료를 위해 표적화될 수 있다.
REV, RRE 및 TAT 단백질의 RNA 결합 부위의 표적화 이외에, REV 및 TAT 단백질 자체를 위한 RNA 암호화 서열을 표적화하여 단백질의 발현을 차단시킬 수 있다.
일반적으로, 잠재성 안티센스 표적 부위를 결합시키는 것에 관한 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 오리고뉴클레오티드의 초기 스크리닝은 생성되는 RNA/DNA 듀플렉스의 열 안정성에 대한 시험을 포함한다. 선택된 RNA 표적 서열을 결합시키는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 동정하는 경우, 시험관내에서 올리고뉴클레오티드의 RNA 기능 저해에 대해 추가로 시험한다. 세포 배양 분석 시스템은 상기 시험관내 분석을 위해 사용된다(예: 단순 헤르페스 바이러스, Kulka 등, Antiviral Res., 20:115-130, 1993; HIV-1, Li 등, J. Virol., 67:6882-6888, 1993, Vickers 등, Nucleic Acids Research, 19:3359-3368, 1991; 재발협착증에 있어서의 관상동맥 평활근 세포 증식, Zalewski 등, Nucleic Acids Research, 15:1699-1715, 1987; IL-2R, Grigoriev 등, Proc. Natl. Sci., 90:3501-3505, 1993; c-myb, Baer 등, Blood, 79:1319-1326, 1992; c-fos, Cutry 등, J. Biol. Chem., 264:19700-19705, 1989; BCR/ABL, Szczylik 등 Science, 253:562-565, 1991).
C. 항-유전자 용도
트리플렉스의 형성에 의해 유전자 발현이 저해된다는 것은 이전에 입증되었다(Cooney 등의 문헌[Science, 241:456-459, 1989]; Orson 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 19:3435-3441, 1991]; Postel 등의 문헌[Natl. Acad. Sci., 88:8227-8231, 1991]). 제3 가닥 티오포스포라미데이트 유사체 올리고뉴클레오티드를 이용할 때 형성되는 트리플렉스 구조의 증가된 안정성은 가축 및 인간 치료 용도를 비롯한 항-유전자 용도를 위한 강력한 도구를 제공한다.
트리플렉스 형성을 위한 표준 규칙을 사용하여 공지의 서열을 기초로 선택의 표적 영역을 선택한다(Helene과 Toulme의 문헌[Biochem. Biophys. Acta, 1049:99-125, 1990]). 일반적으로, 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 서열은, 한 가닥은 주로 퓨린을 함유하고, 다른 한 가닥은 주로 피리미딘을 함유하는 이중 가닥 유전 서열에 대항하여 표적화된다.
밴드 이동(band shift) 분석법을 사용하여, 선택된 표적 서열에 대항하는 트리플렉스 형성에 대하여 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 시험한다(예컨대, 미국 특허 제5,726,297호, 실시예 4를 참조하라). 일반적으로, 밴드 이동 분석에 고함량의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하고, 변성 조건(Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, 펜실베니아주 메디아 소재 Hohn Wiley and Sons, Inc.]; Sauer 등의 문헌[Methods in Enzymology Protein/DNA Interaction, Academic Press, 1991]; Sambrook 등의 문헌[In Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Vol. 2, 1989])을 조절하여 임의의 비특이성 백그라운드(background) 결합을 조절한다.
듀플렉스 표적을 표지하고(예컨대, 방사능 뉴클레오티드를 사용하여), 제3 가닥 올리고뉴클레오티드와 혼합하고, 표적 듀플렉스와 트리플렉스 구조를 형성시킬 수 있는 성능에 대해 시험한다. 표지된 듀플렉스 올리고뉴클레오티드의 운동성의 이동은 트리플렉스 구조를 형성시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드의 성능을 지시한다.
밴드 이동 분석에서, 표지된 듀플렉스 구조에 비하여 표지된 트리플렉스 구조의 겔에서의 상대적으로 감소된 운동성은 트리플렉스 형성을 지시한다.
본 발명의 방법에 의하여 길이 및 복합성(complexity)이 다양한 전범위의 DNA 서열로부터 선택되는 표적 부위를 비롯한 수많은 잠재성 표적 부위를 검측할 수 있다. 서열 특이성 티오포스포라미데이트 유사체 결합 분자는 몇몇 방법으로 DNA를 포함하는 임의의 질병 또는 질환에 필수적인 잠재적으로 강력한 치료제이다. 상기 치료제를 위한 대표적인 표적 서열은 a) 전염성인자(예: 박테리아, 바이러스, 효모 및 기타 진균)의 증식 및/또는 유지와 관련된 DNA 서열(예컨대, 전염성인자의 대사를 붕괴시키는 DNA 서열); 및 b) 세포 유전자(예: 종양유전자)의 부적절한 발현 또는 증식을 일으키는 서열[예컨대, 부적절하게 발현된 세포 유전자(예: 특정 유전 질환과 연관된 유전자)의 전사를 차단하거나 감소시키는 서열]을 포함한다.
필요한 조절 단백질(또는 분자)가 결합하는 것으로 공지된 영역 내에 트리플렉스 구조를 생성시킴으로써 유전자 발현 또는 복제를 차단할 수 있다(예: 프로모터 개시 부위 및 SP1 결합 부위와 같은 HIV 전사 관련 인자[McShan 등, J. Biol. Chem., 267:5712-5721, 1992]). 대안으로, 유전자(예: 종양유전자)의 단백질 암호화 영역 내의 특이성 서열도 표적화할 수 있다.
전술한 겔 밴드 이동 운동성 분석에 의해 시험하는 선택된 듀플렉스 표적 서열을 결합시키는 티오포스포라미데이트 유사체 올리고뉴클레오티드를 동정하는 경우, 시험관내에서 안정한 트리플렉스 구조를 형성시킬 수 있는 성능에 대해 상기 유사체를 추가로 시험한다. 세포 배양 및 시험관내 분석 시스템(예: 미국 특허 제5,631,135호에 기재되어 있는 시스템)을 사용한다.
유전자의 조절 영역, 예컨대 조절 단백질의 결합 부위 또는 전사 개시 부위 내에서 표적 부위를 선택할 수 있다(Helene과 Toulme, 1990; Birg 등, 1990; Postel 등, 1991; Cooney 등, 1988). 또한, mRNA 서열(즉, 전사된 서열) 내에 표적 이 존재하고, 올리고뉴클레오티드가 안티센스 매개인자(mediator)로서도 기능하는 부위에 대향하도록 표적 부위를 선택할 수 있다(상기 참조).
또한, 티오포스포라미데이트 변형된 DNA 분자는 제3 가닥 표적과의 트리플렉스 분자(즉, 단일 가닥 핵산)를 형성시키는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 선택된 표적 제3 가닥 분자와 트리플렉스 구조를 형성시킬 수 있는 2개의 영역을 가지는 DNA 분자를 합성할 수 있다. 일반적으로, 제3 가닥과 2개의 영역의 연관이 트리플렉스를 형성하도록 하는 가요성 영역(flexible region)에 의해 2개의 영역을 결합시킨다.
힌즈 영역(hinge region)은 2개의 트리플렉스가 계속하여 상기 영역을 형성하도록 하고, 상기 영역이 제3 가닥과 연관되도록 하여 트리플렉스를 형성시키는 임의의 가요성 영역을 포함할 수 있다. 적당한 퓨린/피리미딘 함량을 갖는 제3 가닥 표적을 선택함으로써, 트리플렉스 분자의 형성을 가능하게 할 수 있다.
가요성 결합은 표적의 염기 서열의 성질에 의존하는 임의의 선택된 배향(orientation)으로 2개의 트리플렉스 형성 영역(일반적으로, 상보적인 DNA 가닥)을 연결시킬 수 있다. 예를 들어, 2개의 트리플렉스 형성 영역은 각각 5' 및 3' 말단을 가지며, 가요성 힌즈 영역에 의해 다음과 같은 배향으로 5' 및 3' 말단을 연결시킬 수 있다: 5'에서 3', 3'에서 5', 3'에서 3' 및 3' 에서 5'.
또한, 각 가닥 내에 1 이상의 티오포스포라미데이트 결합을 함유하는 듀플렉스 DNA 분자는 전사 인자 또는 DNA 결합 단백질(예: c-myb)을 위한 유인(decoy) 분자로 사용할 수 있다.
또한, 예컨대 헤어핀(hairpin) 구조를 함유하는 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합을 사용하면서, 단일 가닥 DNA를 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 위한 표적 핵산으로 사용할 수 있다. 단일 가닥 DNA 표적 지향 결합을 위해 2개의 티오포스포라미데이트 유사체 올리고뉴클레오티드를 선택할 수 있다. 단일 가닥 DNA 표적에의 2개의 포스포라미데이트 유사체 가닥의 결합은 트리플렉스의 형성을 야기시킨다.
D. 약학 조성물
본 발명은 안티센스 및 항유전자 치료에 유용한 약학 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 유효량의 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 포함한다. 1 이상의 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 임의의 소정 제제에 포함될 수 있다.
N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 치료제 용도로 이용하는 경우, N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 다른 것을 첨가하지 않거나 또는 약학적 허용 담체를 첨가하여 제제화할 수 있다. 약학적 허용 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 이어서, 상기 제제를 필요로 하는 피험자(subject)에게 치료 유효량의 상기 제제를 투여한다.
액체 담체는 용액, 유제(emulsion), 현탁제 및 가압(pressurized) 조성물의 제조에 사용할 수 있다. N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 약학적 허용 액체 부형제 중에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다. N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 제제의 비경구적 투여용 액체 담체의 적당한 예는 물[첨가제(예: 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 용액)를 부분적으로 함유함], 알콜[일가 알콜 및 다가 알콜(예; 글리콜)] 및 그 유도체, 및 오일[예: 분류(分溜)된 코코넛 오일 및 땅콩 오일]을 포함한다. 액체 담체는 다음과 같은 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 기타 적당한 약학적 허용 첨가제를 함유할 수 있다: 용해보조제, 현탁화제, 유화제, 완충제, 농후화제(thickning agent), 착색제, 점도 조절제, 보존제, 안정화제 및 삼투 몰농도 조절제.
N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 비경구 투여의 경우, 담체는 오일성 에스테르(예: 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트)일 수도 있다. 무균 담체는 비경구 투여용 무균 액체형 조성물에 유용하다.
무균 액체 약학 조성물, 용액 또는 현탁제는 예컨대 복강내 주사, 피하 주사, 정맥 투여 또는 국소 투여에 의해 사용할 수 있다. 예를 들어, 레티날 사이토메갈로바이러스 감염에 배향하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 점안(eyedrop)에 의해 국소적으로 투여될 수 있다. 또한, N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 즉시 상처를 수반하는 편재된 항재발협착증 효과를 제공하는 풍선 도자(baloon catheterization) 기간 중에 혈관내로 투여하거나 또는 마이코콜산으로 침지된 혈관 스텐트(vascular stent)를 경유하여 투여할 수 있다.
가압 조성물용 액체 담체는 할로겐화된 탄화수소 또는 다른 약학적 허용 추진제(propellant)일 수 있다. 또한, 상기 가압 조성물은 흡입에 의해 송달하기 위해 캡슐화된 액체일 수 있다. 비강내 또는 기관지내 흡입 또는 통기(insuffilation)에 의한 투여의 경우, N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 수성 또는 부분적 수성 용액으로 제제화한 후, 예컨대 뉴모시스티스 카르니(Pneumocystis carnii)와 같은 것에 의한 폐 감염의 치료를 위해 에어로졸 형태로 사용할 수 있다.
N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 활성 화합물을 함유하는 약학적 허용 부형제와의 제제화에 의해 용액 제제, 크림제 또는 로숀제로서 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 성병성 사마귀(genital wart) 치료의 경우.
N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 리포솜 담체 내에 투여할 수 있다. 세포 흡수를 촉진시키는 리포솜의 용도는 예컨대 미국 특허 제4,897,355호 및 미국 특허 제4,394,448호에 기재되어 있다. 리포솜 제제 및 그 제조에 대하여는 다수의 간행물에 기재되어 있다.
N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드로 치료하는데 필요한 용량은 사용되는 특정 조성물, 투여 경로, 나타난 증후의 심각성, N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 제형 및 치료 대상인 특정 피험자에 따라 달라질 수 있다.
일반적으로, 약학 제제 내에 활성 성분으로서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 제조되는 혼합물 내에 존재하는 다른 반응성 성분 또는 잠재적 면역원성 성분으로부터 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 정제한다. 일반적으로, 기능 분석, 크로마토그래피 또는 겔 전기영동에 의해 측정시 약 90% 이상, 바람직하게는 95% 또는 99%의 균일성을 갖도록 각각의 활성 성분을 제공한다. 이어서, 약학 제제의 제조를 위해 일반적으로 허용되는 공정에 따라 활성 성분을 배합하여 치료제로 제조한다. 임의의 임상적으로 바람직한 결과를 달성하는데 유효한 양의 제제의 형태로 피험자에게 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수 있다. 암 치료의 경우, 바람직한 결과는 종양 질량[촉진 또는 영상 처리에 의해(예컨대, 라디오그래피, CAT 스캔 또는 MRI에 의해) 측정함]의 감소, 종양 성장 속도(예컨대, 생체검사 표본의 조직화학 분석에 의해 측정함)의 감소, 생화학적 표지[일반적인 표지(예: ESR) 및 종양 특이성 표지(예: 혈청 PSA) 및 생활의 질[임상적 평가(예; 카르노프스키 점수)에 의해 측정함] 향상을 포함한다. 바이러스 감염 치료의 경우, 바람직한 결과는 감염의 감소 또는 제거, 감염성 입자의 형성 또는 질병 관련 징후의 소산(resolution)을 포함한다.
이러한 효과를 달성하는데 필요한 용량 및 그 용량 당 올리고뉴클레오티드의 양은 시험관내 시험 및 동물 모델을 사용하여 실험적으로 측정할 수 있다(실시예 9 참조). 분리된 텔로머라제 또는 배양된 세포로 측정된 50% 저해 농도로부터 시험을 위한 적당한 범위를 평가할 수 있다. 미국 특허 제5,968,506호에 따라 분리된 텔로머라제의 제제를 수득할 수 있다. 일반적으로, 제제 및 투여 경로는 1 μM 내지 1nM의 국소 농도의 질병 부위에 효소 특이성 표적 RNA 서열과 100% 동일한 12-15개의 뉴클레오시드의 안정한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 투여 프로토콜에 대한 궁극적인 책임은 조작하는 임상의(clinician)에게 있다.
일반적으로, 임의의 해롭거나 유해한 부작용을 일으키지 않으면서 효과적인 결과를 부여하는 농도(예: 유효량)로 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레 오티드를 투여한다. 상기 농도는 단일 단위 용량의 투여, 또는 하루 중 적당한 간격을 두고 투여하기에 편리한 서브유니트로 분할된 용량의 투여에 의해 달성할 수 있다.
E. 진단 용도
또한, 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 소정의 표적 서열을 가지는 RNA 또는 DNA의 검출을 위한 진단 분석에 유용하다. 한 일반적 용도에 있어서, 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 표지하고(예컨대, 동위원소 또는 기타 검출가능한 리포터 기로 표지함), 고체 지지체(예: 나일론 막)에 결합되는 DNA 또는 RNA 샘플용 프로브로서 사용한다.
대안으로, 부동화 포스포라미데이트 유사체에의 하이브리드 형성에 기초하여, 샘플의 다른 성분으로부터 분리된 샘플 내의 상동성 RNA 또는 DNA, 및 고체 지지체(예: 자기 비드)에 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 결합시킬 수 있다. 종래의 방법에 의해 고체 지지체에의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 결합을 수행할 수 있다. 예컨대, 제2 표지된 리포터 또는 중합효소 연쇄 반응을 사용하는 표준 공정(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호)에 의해, 결합된 RNA 또는 DNA의 존재를 검출할 수 있다.
표적 영역에의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 하이브리드 형성을 가능하게 하는 하이브리드 형성 조건을 적당히 조절하면서 표준 공정에 따라 진단 분석을 수행할 수 있다. 또한, 상승된 온도에서 결합할 수 있는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 성능은 진단 샘플 내에 존재하는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 프로브와 임의의 상응하는 단일 가닥 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 사이의 표적 서열에의 결합에 대한 경쟁을 최소화하는데 도움을 줄 것이다.
본 명세서에 기재된 하이브리드 형성 분석 및 다른 프로토콜에 사용하기 위해 설계된 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 키트 형태로 일괄할 수 있다. 장기간 저장에 적합한 용기 내에(일반적으로는 완충액 내에) 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 반응을 수행하는데 유용한 다른 시약, 표준물질 또는 대조군을 임의로 첨가한다. 일반적으로, 상기 키트는 제품 설명서 또는 키트의 배포 또는 마케팅과 관련된 문자로서 하이브리드 형성 반응 또는 진단 분석에서의 올리고뉴클레오티드의 사용을 위해 쓰여진 지시 사항도 첨부될 수 있다.
F. 기타 용도
일 실시양태에 있어서, 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 샘플로부터의 RNA 또는 DNA의 분리를 증강시키는 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같이 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 고착될 수 있고, 예컨대 폴리A 단편으로부터의 특이성 mRNA의 정제에 의해 상보적인 핵산 서열을 분리하는데 사용될 수 있다(Goldberg 등의 문헌[Methods in Enzmology, 68:206, 1979]). 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 표준 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드보다 RNA 및 듀플렉스 DNA와 더 안정한 상호작용을 형성시킬 수 있기 때문에 상기 용도에 대한 잇점이 있다.
분자 생물학에 있어서의 다수의 용도는 리포터 표지된 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드, 특히 샘플 내의 RNA의 검출에 대하여 찾을 수 있다. 방사성 리포터(3H, 14C, 32P 또는 35S 뉴클레오시드), 비오틴 또는 형광 표지로 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 표지할 수 있다(Gryaznov 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 20:3403-3409, 1992]). 표지된 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 예컨대 RNA 하이브리드 형성 반응에 있어서의 효율적인 프로브로서 사용될 수 있다(Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, 펜실베니아주 메디아 소재 Hohn Wiley and Sons, Inc.]; Sambrook 등의 문헌[In Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol.2, 1989]).
또한, 각각의 가닥이 1 이상의 티오포스포라미데이트 결합을 함유하는 이중 가닥 DNA 분자는 DNA-듀플렉스 결합 단백질의 분리에 사용할 수 있다. 이 실시태양에 있어서, 일반적으로 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합을 함유하는 듀플렉스를 고체 지지체에 첨부한 후, DNA 표적에의 단백질의 결합을 촉진시키는 완충제 조건 하에서 지지체 위에 유력한(suspected) 결합 단백질을 함유하는 샘플을 통과시킨다. 일반적으로, 완충제 조건을 교체함으로써 칼럼으로부터 단백질을 용출시킨다.
티오포스포라미데이트의 변형된 결합을 함유하는 전술한 트리플렉스 형성 DNA 분자는 예컨대 샘플 내의 DNA 분자의 존재를 검출하는 진단 시약으로도 사용할 수 있다.
또한, N3'→P5' 티오포스포라미데이트 서브유니트간 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 복합체는 유용한 소분자 또는 결합 단백질을 스크리닝하는데 사용할 수 있다: 예를 들어, 듀플렉스 DNA를 가지는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 복합체는 트리플렉스 구조를 추가로 안정화시킬 수 있는 소분자를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 유사한 스크리닝은 단일 가닥 DNA 및 RNA 분자와 형성되는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 복합체에 유용하다.
G. 변이
본 발명의 방법에 사용되는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 상의 변이는 세포에 의한 올리고뉴클레오티드의 흡수를 촉진시키는 변형(Letsinger의 미국 특허 제4,958,013호); 다른 서브유니트간 결합을 사용하는 키메라 올리고뉴클레오티드의 생산(Goodchild의 문헌[Bioconjugate Chem., 1:165-187, 1990]); 삽입제를 이용하는 변형(예컨대, 삽입제를 안정화시키는 트리플렉스, Wilson 등의 문헌[Biochemistry, 32:10614-10621, 1993]); 및 데옥시리보스 서브유니트 대신 리보스의 사용을 포함한다.
추가의 변형은 올리고뉴클레오티드(예: -OH, -OR, -NHR, -NH2 및 콜레스테롤)의 5' 및 3' 말단의 변형을 포함한다. 또한, 리보스의 2'위치는 수많은 변형[할로겐화(예: -F)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아님] 부위일 수 있다.
또한, N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 특이성 세포에 의해 흡수되는 폴리펩티드에의 접합(conjugation)에 의해 변형될 수 있다. 상기 유용한 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 항원 및 항체를 포함한다. 예를 들어, 신생물성 세포의 유형에 특이적인 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 오리고뉴클레오티드 송달을 야기시키는 신생물성 세포에 의해 특이적으로 흡수되는 폴리펩티드를 선택할 수 있다. 당업계에 공지된 수단(예컨대, PCT 국제출원 공개공보 제PCT/US89/02363호, Ramachandr K 등의 1989. 12. 14.에 공개된 WO8912110을 참조하라)에 의해 폴리펩티드와 올리고뉴클레오티드를 커플링시킬 수 있다.
상기 변형된 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 특성은 본 발명의 방법에 적용될 경우 본 명세서에 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다.
첨부되는 도면과 함께 상세한 설명을 참조함으로써 보다 잘 이해할 수 있는 것처럼, 본 발명의 상기 실시양태 및 이에 수반하는 다수의 장점을 보다 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
도 1A는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트의 뉴클레오시드간 결합 구조를 도시한 것이다.
도 1B는 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 뉴클레오시드간 결합 구조를 도시한 것이다.
도 1C는 본 발명의 대표적인 올리고뉴클레오티드 티오포스포라미데이트의 뉴클레오시드간 결합 구조를 도시한 것이다.
도 2는 균일하게 변형된(modified) 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 단계별(step-by-step) 합성을 개략적으로 도식화한 것이다.
도 3은 티오포스포라미데이트의 이의 포스포라미데이트 카운터파트로의 전환, 및 디뉴클레오티드 티오포스포라미데이트의 가수분해에 기인하는 생성물을 개략적으로 도식화한 것이다.
도 4는 텔로머라제 RNA에 상보적인 서열번호 2, 또는 뉴클레오티드 부적정 대합(不適正 對合; mismatch)을 함유하는 서열번호 4의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 사용량을 증가시키면서 수행한 시험관내 텔로머라제 저해 분석의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 텔로머라제 RNA에 상보적인 서열번호 10의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 사용량을 증가시키면서 수행한 시험관내 텔로머라제 저해 분석의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 텔로머라제 RNA에 상보적인 서열번호 2 및 10, 및 HME50-5E 세포 성장에 대한 뉴클레오티드 부적정 대합을 함유하는 서열번호 4의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HME50-5E 세포의 텔로머라제 길이에 대한 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 티오포스포라미데이트 서열번호 2에 대하여 측정한 IC50 값을 나타낸 것이다.
실시예 1
일반적 방법
Varian 400 Mhz 분광계 상에 31P NMR 스펙트럼을 수득하였다. 85% 수성 인산에 대비하여 31P NMR 스펙트럼을 참조하였다. Pharmacia Biotech Mono Q HR 5/5 또는 10/16 이온 교환 칼럼이 장착된 Dionex DX 500 크로마토그래피 시스템을 사용하여 음이온 교환 HPLC를 수행하였다. 미국 캘리포니아주 소재 Mass Consortium사의 질량분석계에 의하여 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 지연 추출형 PerSpective Biosystems Voyager Elite 질량분석계에 의해 올리고뉴클레오티드의 MALDI-TOF 분석을 수행하였다. Cary Bio 100 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광계 상에서 열 해리 실험을 실행하였다.
특별히 언급하지 않는 한, 질소 대기 하에서 오븐 건조된 유리 기구(glassware) 내에서 모든 반응을 수행하였다. Glen Research(미국 버지니아주 스터링 소재)로부터 시판되는 DNA 함성 시약을 구입하였다. Aldrich(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 시판되는 무수 피리딘, 톨루엔, 디클로로메탄, 디이소프로필에틸 아민, 트리에틸아민, 무수 아세트산, 1,2-디클로로에탄 및 디옥산을 구입하였다.
커플링 방법에 기초한 포스포라미디트용 표준 프로토콜(Caruther, Acc. Chem. Res., 24:278-284, 1991)을 사용하여 ABI 392 또는 394 DNA 합성 장치 상에서 모든 비(非)-티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 합성을 위한 쇄 집합 사이클(chain assembly cycle)은 다음과 같다:(ⅰ) 탈트리틸화(detritylation), 디클로로메탄 중 3% 트리클로로아세트산, 1 분;(ⅱ) 커플링, 아세토니트릴 중 0.1 M 포스포라미디트 및 0.45 M 테트라졸, 10 분;(ⅲ) 캡핑(capping), THF/루티딘[1/1(v/v)] 중 0.5 M 무수 이소부티르산, 15 초;(ⅳ) 산화, THF/피리딘/물[10/10/1(v/v/v)] 중 0.1 M 요오드, 30 초.
상기 사이클 내의 화학 공정의 수행 후, 0.2-0.4 분 동안 아세토니트릴 세척 및 무수 아르곤 조홍(潮紅; flushing)을 수행하였다. 55 ℃에서 6 시간 동안 암모니아/EtOH[3/1(v/v)]로 처리함으로써, 지지체로부터의 절단, 및 염기와 포스포라미데이트 보호기의 제거를 수행하였다. 진공 건조로 올리고뉴클레오티드를 농축시킨 후, 25 ℃에서 4-16 시간 동안 THF 중 1 M TBAF로 처리함으로써 2'-t-부틸디메틸실릴기를 제거하였다. 물로 반응 혼합물을 희석시키고, 0.45 나일론 아크로디스크( 미국 미시시피주 안 아버 소재 Gelman Sciences로부터 구입)을 통해 여과시켰다. 그 후, IE HPLC에 의해 올리고뉴클레오티드를 분석하고, 정제하며, Pharmacia NAP-5 또는 NAP-25 칼럼 상에서의 겔 여과를 이용하여 탈염(脫鹽)하였다. IE HPLC용 구배(gradient) 조건: 용매 A(10 mM NaOH), 용매 B(10 mM NaOH 및 1.5 M NaCl); 3 분 동안 용매 A에서 수행 후 50 분 내에 용매 B에서 수행시 0-80%의 직선 구배.
실시예 2
아라비노-플루오로올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 포스포라미데이트
올리고-2'-아라비노-플루오로뉴클레오티드 N3'→P5' 포스포라미데이트의 고 체상 합성은 3'-MMTr-보호된-3'-아미노-2'-아라-플루오로뉴클레오시드의 단량체 빌딩 블록-5'-(O-시아노에틸-N,N'-디이소프로필아미노)-포스포라미디트를 기초로 한다. 뉴클레오시드 단량체의 제조는 도식 4에 기술되어 있다.
Figure 112002007045259-pct00012
당 전구체 1(Pfanstiehl로부터 구입)을 당 C-1 입체배치가 보류된 α-1-브로모 중간체 2로 전환시킨다. 이어서, 실릴화된 우라실 및 티미딘 염기와의 SN-2 타입 글리코실화 반응을 위해 분리없이 화합물 2를 사용하여, 뉴클레오시드 3을 형성시킨다. 글리코실화 반응의 입체 선택성은 형성된 뉴클레오시드 3(반응 혼합물의 1H NMR 분석에 의해 판단할 수 있듯이 소정의 β-아노머 입체배치를 가졌다)의 90%보다 훨씬 높았다. 에탄올로부터의 결정화에 의해 순수한 β-이성질체를 분리하였다. 연이어, 메탄올성 암모니아로 처리함으로써 화합물 3의 5'- 및 3'- O-벤조일 보호기를 거의 정량적인 수율로 제거하였다. 이어서, 미쯔노부(Mitsunobu) 반응 조건 하에, 생성되는 5'-, 3'-히드록실기 함유 뉴클레오시드 생성물을 2,3'-무수뉴클레 오시드 4로 전환시켰다. 리튬 아지드로 2,3'-무수뉴클레오시드를 처리하여 중요한 3'-아지도 전구체 5를 수득하였다. 이어서, 수소화(hydrogenation)에 의한 3'-아지도의 3'-아미노기로의 촉매 환원 후, 3'-트리틸화, 5'-O-탈보호 및 5'-포스피틸화에 의해 상기 화합물을 포스포라미데이트 7t,u로 전환시켰다. 우라실 ↔시토신 전환 방법을 사용하여 3'-아지도 전구체로부터 시티딘 포스포라미디트 7c를 수득하였다. 포스포라미디트 7c,t,u의 총 수율은 출발물질인 당 전구체 1을 기준으로 8-12%의 범위이다. 1H, 31P, 19F NMR 및 질량분석에 의해 단량체의 구조를 확인하였다. 이어서, 후술하는 바와 같이, 자동화된 DNA/RNA ABI 394 합성 장치 상에서 2'-아라비노-플루오로뉴클레오티드 단량체를 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하였다.
실시예 3
올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트의 합성
ABI 합성 장치 상에서 아미디트 전이 반응에 의해 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트를 제조하였다. 완전히 보호된 단량체 빌딩 블록은 3'-아미노트리틸 뉴클레시드-5'-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필) 포스포라미디트(여기서, 뉴클레오시드는 3'-데옥시-티미딘, 2', 3'-디데옥시-N2-이소부티릴-구아노신, 2',3'-디데옥시-N6-벤조일-아데노신 또는 2',3'-디데옥시-N4-벤조일-시티딘임)이었다. 장쇄 공극 조절형 유리(controlled pore glass)(LCAA-CPG)를 함유하는 아미노기와 5'-숙시닐-3'-아미노트리틸-2',3'-디데옥시 뉴클레오시드를 커플링시키고, 고체지지체로 사용하였다. 5'에서 3' 방향으로 합성을 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트의 집합을 위해 하기 프로토콜을 수행하였다:(ⅰ) 탈트리틸화, 디클로로메탄 중 3% 트리클로로아세트산; (ⅱ) 커플링, 아세토니트릴 중 0.1 M 포스포라미디트 및 0.45 M 테트라졸, 25 초; (ⅲ) 캡핑(capping), 캡 A로서의 무수 이소부티르산/2,6-루티딘/THF[1/1/8(v/v/v)] 및 표준 캡 B 용액; (ⅳ) 황화, 1% 트리에틸아민을 함유하는 이황화탄소 중 15% S8. 황화 공정 전후, 순수한 이황화탄소로 칼럼을 세척하여 고체황의 침전을 방지하였다. 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드 티오포스포라미데이트를 절단하고, 진한 암모니아수로 탈보호시켰다. HPLC에 의해 화합물을 분석하고 정제하였다. 1.5 M NaCl 중 10 mM NaOH의 1%/분 직선 구배 및 1 ml/분의 유속으로 pH 12(10 mM NaOH)에서 DIONEX DNAPac
Figure 112007018785910-pct00013
이온 교환 칼럼을 사용하여 이온 교환(IE) HPLC를 수행하였다. Sephadex NAP-5 겔 여과 칼럼(Pharmacia) 상에서 생성물을 탈염하고, 진공에서 동결건조하였다. 중수(重水)에서 31P NMR을 수행하여 황화 정도를 분석하였다(31P NMR δ, ppm 58, 60 광범위 신호 Rp,Sp 이성질체).
하기 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 티오포스포라미데이트 5'-GTTAGGGTTAG-3'(서열번호 1)을 합성하였다. ABI 모델 394 합성 장치에 3'-트리틸아미노-2',3'-디데옥시-N6-벤조일-아데노신(N2-이소부티릴-구아노신, 및 티미딘) 5'-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포라미디트를 공급하였다. 관측 지점(station) #10의 시약병에 순수한 이황화탄소를 충전하고, 시약병 #15에 1% 트리에틸아민을 함유하는 이황화탄소 중의 15% S8 용액을 충전하였다. 활성인자로서, 시판되는 아세토니트릴 중 0.45 M 테트라졸 용액을 사용하였다. 캡 A 용액(관측 지점 #11)을 테트라히드로푸란/무수 이소부티르산/2,6-루티딘[8/1/1(v/v/v)] 용액으로 대체하였다. 또한, 캡 B는 시판되는 시약이다. 관측 지점 #10에서 칼럼으로 이황화탄소를 송달하기 위해 새로운 기능을 창출하였다. 생략성(default) 황 합성 사이클을 다음과 같은 방법으로 변형시켰다: 황화 시간을 1 분으로 설정하고, 황화 전후에 20 초 동안 이황화탄소를 칼럼에 송달하였다. 합성 칼럼에 1 μmol의 고체 지지체 N2-이소부티릴-3'-(트리틸)아미노-2',3'-디데옥시구아노신-5'-숙시닐이 적재된 CPG(공극조절형 유리)를 충전하였다. 화합물의 서열은 GATTGGGATTG(5'→3')(서열번호 11)로 설정하였다. 합성 종말부에서 트리틸기를 제거하고, 이황화탄소 및 아세토니트릴을 사용하여 수작업으로 칼럼을 세척하였다. 칼럼으로부터 고체 지지체를 제거하고, 빈틈없이 폐쇄된 유리 바이알 내에서 55 ℃ 에서 6 시간 동안 1 ml의 진한 암모니아수로 처리하였다. 여과 후, 대부분의 암모니아를 증발시키고, Sephadex
Figure 112007018785910-pct00014
NAP-5 겔 여과 칼럼(Pharmacia)를 사용한 후 진공에서 동결건조함으로써, 잔류 용액을 탈염하였다. 전술한 바와 같이 생성물을 분석하고 정제하였다. 전술한 방법을 사용하여 표 2에 열거된 다른 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드(서열번호 2-4) 모두를 합성하였다.
실시예 4
올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트의 산 안정성 및 듀플 렉스 형성 특성
의외로, 올리고뉴클레오티드 티오포스포라미데이트가 포스포라미데이트의 카운터파트에 비하여 상대적으로 증가된 산 안정성이 있음이 입증되었다. 황 대 산소의 전자 공여 특성(이는 3' NH의 양성자 부가를 용이하게 할 수 있음)의 차이 때문에, 뉴클레오티드간 포스페이트기의 비가교형(non-bridge) 산소를 황으로 치환하면 포스포라미데이트의 산 안정성이 감소된다고 예상할 수 있었다. 그러나, 이러한 예상과는 반대로, 티오포스포라미데이트 뉴클레오티드간 결합이 옥소-포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드보다 더 산에 안정하다는 것이 밝혀졌다.
IE HPLC 분석에 따르면, 실온에서 40% 수성 아세트산 중의 티오포스포라미데이트 TAG3T2AGACA2(서열번호 2)와 이의 포스포라미데이트 카운터파트의 반감기는 각각 약 6 시간 및 약 0.5 시간이었다. 더욱이, 티오포스포라미데이트와 이의 포스포라미데이트 카운터파트 간에 가수분해 생성물의 조성은 상이하였다. 포스포라미데이트의 경우와 같이, 티오포스포라미데이트의 산 가수분해가 처음에는 뉴클레오시드간 N-P기의 절단보다는 탈황화를 야기시키는 것처럼 보였다. 이러한 결과는 티오포스포라미데이트의 산 조건에 대한 내성이 포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 산 조건에 대한 내성보다 크다는 것을 나타냈고, 따라서 이러한 새로운 유형의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드가 다른 포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드와 비교하였을 때 경구용 올리고뉴클레오티드 치료제의 개발에 대한 잠재력을 향상시킨다는 것을 나타냈다.
실험 올리고머 유형a Tm, ℃b -Tm, ℃c 산 안정성d
1 GTTAGGGTTAG 서열번호 1 po 44.2
2 TAGGGTTAGACAA 서열번호 2 po 45.2
3 실험 1과 동일 np 72.1 27.9
4 실험 2와 동일 np 71.7 26.5 0.5 시간
5 실험 1과 동일 nps 71.5 27.3
6 실험 2와 동일 nps 70.0 24.8 6 시간
apo, np, nps는 각각 포스포디에스테르기, N3'→P5' 포스포라미데이트기 및 티오포스포라미데이트기에 해당하고;
Tm, ℃b는 150 mM의 NaCl과 10 mM의 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 중의 상보적인 천연 RNA 올리고머와 형성된 듀플렉스의 융점, Tm(±0.5 ℃)에 해당하며;
Tm, ℃c는 천연 포스포디에스테르 카운터파트에 비교시의 상대적인 Tm의 증가에 해당하고;
산 안정성d는 실온에서 40% 수성 아세트산 중의 올리고뉴클레오티드의 반감기에 해당한다.
열 해리 실험을 이용하여 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 상보적인 RNA 가닥과의 듀플렉스 형성 특성을 검측하였다. 그 결과를 표 1에 요약하였다. 제시된 데이타는 올리고뉴클레오티드 티오포스포라미데이트가 등서열의 천연 포스포디에스테르 올리고머보다 유의적으로 안정한 복합체를 형성하였다(여기서, Tm의 차이는 올리고머 당 약 25-27 ℃임)는 것을 나타낸다. 또한, 듀플렉스의 열 안정성의 증가는 포스포라미데이트 올리고머에 대하여 관찰된 것과 유사하였다. 뉴클레오시 드간 포스포라미데이트기 중 비가교형 산소의 황으로의 치환은 3'-아미노뉴클레오시드의 N-타입 당 주름 발생(puckering) 및 증가된 당-포스페이트 주쇄 수화에 의해 측정되는, 상기 화합물의 RNA 결합 특성을 유의적으로 변경시키지 않는다.
실시예 5
텔로머라제 활성을 가지는 친화성 정제된 추출물의 제조
텔로머라제 저해제를 스크리닝하는데 사용되는 추출물은 텔로머라제(hTERT)의 단백질 촉매 서브유니트를 과발현시키는 293 세포로부터 제조하는 것이 관례이다. 이러한 세포는 모(母) 293 세포보다 2-5배 높은 텔로머라제 활성을 가짐이 밝혀졌다. 200 ml의 충전된 세포(100 리터의 배양으로부터 수확됨)를 동일한 부피의 저장(低張) 완충액(10 mM Hepes pH 7.9, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 mM KCl, 1 mM PMSF) 중에 재현탁시키고, 도운스 호모게나이저(dounce homogenizer)를 사용하여 용해시켰다. 글리세롤 농도를 10%로 조절하고, NaCl을 서서히 첨가하여 최종 농도가 0.3 M이 되도록 하였다. 30 분 동안 용해된 세포를 교반한 후, 1 시간 동안 100,000 ×g에서 펠렛화하였다. S100 상청액에 고체 황산암모늄을 첨가하여 42% 포화에 도달하도록 하였다. 재료를 원심분리하고, 최초 부피의 5분의 1로 펠렛을 재현탁시키며, 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 'A'에 거슬러 투석하였다. 투석 후, 25,000 ×g에서 30 분 동안 추출물을 원심분리하였다. 친화성 크로마토그래피 이전에, Triton X-100
Figure 112007018785910-pct00015
(0.5%), KCl(0.3 M) 및 tRNA(50 ㎍/ml)를 첨가하였다. 추출물에 친화성 올리고(5' 비오틴TEG-비오틴TEG-비오틴TEG-GTA GAC CTG TTA CCA guu agg guu ag 3'[서열번호 5]; 소문자 케이스(lower case)는 2' O-메틸 리보뉴클레오티드를 나타내고, 대문자 케이스(upper case)는 데옥시뉴클레오티드를 나타낸다)를 첨가하였다(추출물 10 ml 당 1 nm). 30 ℃에서 10 분 동안 항온배양 후, 뉴트라비딘 비드[피어스(Pierce); 250 ㎕의 50% 현탁액)를 첨가하고, 4 ℃에서 밤새도록 혼합물을 회전시켰다. 상기 비드를 펠렛화하고, 0.3 M KCl 함유 완충액 'B'로 3회, 0.6 M KCl 함유 완충액 'B'로 2회, 0.3 M KCl 함유 완충액 'B'로 2회 이상 세척하였다. 실온에서 30 분 동안 0.3 M KCl, 0.15% Triton X-100
Figure 112007018785910-pct00016
및 2.5 몰 초과의 치환(displacement) 올리고(충전된 뉴트라비딘 비드 125 ㎕ 당 0.5 ml에서 5'-CTA ACC CTA ACT GGT AAC AGG TCT AC-3'[서열번호 6])를 함유하는 완충액 'B'에 텔로머라제를 용출시켰다. 일반적으로, 정제된 추출물은 10 fmol(혼입된 뉴클레오티드)/분/㎕(추출물), 또는 200 뉴클레오티드/분/㎎(총 단백질)을 가졌다.
완충액 'A' 완충액 'B'
20 mM Hepes pH 7.9 20 mM Hepes pH 7.9
1 mM MgCl2 1 mM EDTA
1 mM DTT 1 mM DTT
1 mM EGTA 10% 글리세롤
10% 글리세롤 0.5 Triton X-100
Figure 112007018785910-pct00017
실시예 6
올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포라미데이트에 의한 텔로머라제 저해
3가지 개별 100 ㎕ 텔로머라제 분석에 하기 완충액을 지급하였다: 50 mM 트리스 아세테이트(pH 8.2), 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 100 mM 아세트산칼륨, 500 μM TTP, 10 μM [32P-]dGTP(25 Ci/mmol) 및 100 nM d(TTAGGG)3[서열번호 7]. 개별 반응 혼합물에 2.5, 5 또는 10 ㎕의 친화성-정제된 텔로머라제(실시예 4 참조)를 첨가하고, 37 ℃에서 반응 혼합물을 항온배양하였다. 45 ℃에서 90 분 동안 각 반응 혼합물로부터 40 ㎕의 분취량을 제거하고, 160 ㎕의 스톱(Stop) 오나충액(100 mM NaCl, 10 mM 나트륨 피로포스페이트, 0.2% SDS, 2 mM EDTA, 100 ㎍/ml tRNA)을 첨가하였다. 10 ㎕의 트리클로로아세트산(TCA)(100%)을 첨가하고, 30 분 동안 얼음 상에서 샘플을 항원배양하였다. 15 분 동안 원심분리기(12000 ×g force) 내에서 샘플을 펠렛화하였다. 1 ml의 95% 에탄올로 펠렛을 세척하고, 5 분 동안 원심분리기(12000 ×g force) 내에서 다시 펠렛화하였다. 50 ㎕의 dH2O 중에 펠렛을 재현탁시키고, 2.5 ml의 5% TCA 빙냉 용액 및 10 mM의 나트륨 피로포스페이트를 함유하는 12 ×75 유리 시험관에 옮겼다. 30 분 동안 얼음 상에서 샘플을 항온배양하였다. 진공 여과 다기관(manifold) 상의 2.5 ㎝ 습식(dH2O) GFC막(S&S)을 통해 샘플을 여과하였다. 여과기를 진공 하에서 5 ml의 빙냉 1% TCA로 3회 세척하고, 5 ml의 95% 에탄올로 1회 세척하였다. 여과기를 선조시키고 신틸레이션 유체를 사용하여 신틸레이션 카운터로 계산하였다. 방사능 추적자(tracer)의 비(比)활성으로부터, 혼입된 뉴클레오티드의 fmol을 측정하였다. 혼입된 dNTP를 기초로 추출물을 활성을 측정하고, fmol(dNTP)/분/㎕(추출물)로 표현하였다.
텔로머라제 활성 분석
Bio-Tel FlashPlate 분석
본 발명은 비오틴화된 텔로머라제 기질 프라이머에 TTAGGG 텔로미어 반복을 첨가함으로써 텔로머라제 활성을 검출 및/또는 측정하는 분석법을 제공한다; 텔로머라제에 의해 촉매되는 반응. 스트렙타비딘이 코팅된 미량희석 평판 내에 비오틴화된 생성물을 포착하였다. 후술하는 바와 같이, 33P로 표지된 3.5 텔로미어 반복에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 텔로머라제 생성물을 측정하는데 사용한다. 세척에 의해 비결합 프로브를 제거하고, 포착된 텔로머라제에 서냉복원하는 프로브의 양을 신틸레이션 카운팅에 의해 측정한다.
방법:
Ⅰ. 농축된 원액(stock)으로서 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 저장하고, PBS 중에 용해시켰다.
Ⅱ. 시험하기 위해, PBS 중의 15×사용 원액으로 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 희석시키고, 96-웰 미량희석 접시의 2개의 웰에 2 ㎕를 분배하였다.
Ⅲ. 텔로머라제 희석 완충액 중의 0.04-0.09 fmol(혼입된 dNTP)/분/㎕의 비활성을 갖도록 테로머라제 추출물을 희석시키고, 각 샘플 웰에 18 ㎕를 첨가하여 실온에서 30 분 동안 화합물과 함께 예비 항온배양하였다.
Ⅳ. 텔로머라제 추출물 및 시험 대상 올리고뉴클레오티드 화합물을 함유하는 웰에 10 ㎕의 마스터 믹스(Master Mix)를 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 평판을 밀봉시키고, 37 ℃에서 90 분 동안 항온배양하였다.
Ⅴ. 10 ㎕의 HCS의 첨가에 의해 반응을 정지시켰다.
Ⅵ. 25 ㎕의 반응 혼합물을 96-웰 스트렙타비딘 코팅된 FlashPlate
Figure 112002007045259-pct00018
(NEN)에 옮기고, 완화한 교반을 수행하면서 실온에서 2 시간 동안 항온배양하였다.
Ⅶ. 임의의 항온배양없이 180 ㎕의 2×SSC로 웰을 3회 세척하였다.
Ⅷ. 비오틴화된 텔로머라제 생성물에 서냉복원된 프로브의 양을 신틸레이션 카운터로 측정하였다.
완충액:
텔로머라제 희석 완충액
50 mM 트리스-아세테이트, pH 8.2
1 mM DTT
1 mM EGTA
1 mM MgCl2
830 nM BSA
마스터 믹스(MM)
50 mM 트리스-아세테이트, pH 8.2
1 mM DTT
1 mM EGTA
1 mM MgCl2
150 mM 아세트산칼륨
10 μM dATP
20 μM dGTP
120 μM dTTP
100 nM 비오틴화된 프라이머(5'-비오틴-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')[서열번호 8]
5.4 nM 표지된 프로브(5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-(33P)A1-50-3')[서열번호 9]; 약 109 cpm/㎕ 또는 그 이상의 비활성
하이프리드 형성 포착 용액(HCS)
12×SSC(1×=150 mM NaCl/30 mM 나트륨 시트레이트(Na3 Citrate)
40 mM EDTA
40 mM 트리스-HCl, pH 7.0
전술한 방법을 사용하여, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표현된 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 1.0 nM 이하의 텔로머라제 IC50값을 가지는 것으로 나타났다(표 2, 실험 1 및 3 참조)
텔로머라제 저해제로서의 올리고 1-4의 포스포라미데이트와의 비교 평가
실험 올리고뉴클레오티드 IC50(nM) 포스포라미데이트 IC50(nM) 티오포스포라미데이트
1. 5'-GTTAGGGTTAG-3' 서열번호 1 1.9 0.89
2. 5'-GTTGAGTGTAG-3' 서열번호 3 1000 177.4
3. 5'-TAGGGTTAGACAA-3' 서열번호 2 1.64 0.41
4. 5'-TAGGTGTAAGCAA-3' 서열번호 4 1000 79.3
올리고뉴클레오티드 서열 2(서열번호 3)은 실험 1에 사용된 올리고뉴클레오티드(서열번호 1)에 대한 부적정 대합 대조군이다. 마찬가지로, 올리고뉴클레오티드 서열 4(서열번호 4)는 실험 3에 사용된 올리고뉴클레오티드(서열번호 2)에 대한 부적정 대합 대조군이다.
표 2에 제시된 텔로머라제 저해 데이타는 본 발명의 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드가 카운터파트 포스포라미데이트 올리곤클레오티드에 비하여 상대적으로 약 2-3 배 우수한 텔로머라제 저해 활성이 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 이의 포스포라미데이트 카운터파트에 비하여 보다 우수한 텔로머라제 저해 활성이 있을 뿐만 아니라, 보다 우수한 산에 대한 내성이 있다. 이러한 특징의 조합은 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드에 포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드에 비하여 중요한 잇점을 부여한다.
실시예 7
티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드의 항종양 활성
생체외 실험
a. 종양 세포에 있어서의 텔로미어 길이의 감소
표준 방법 및 재료를 사용하여 인간 유방 상피 세포의 콜로니(동시에 불사화됨)를 제조하였다. 각각의 15 센티미터 접시 내의 약 106개의 세포를 접종함으로써 콜로니를 제조하였다. 상기 접시를 항온배양하여 세포 콜로니가 약 80%의 융합성(confluence)(이 때, 각 콜로니는 2개의 그룹으로 분할됨)으로 성장하도록 하였다. 하기 스플릿(split)을 도말한 후, 예정된 농도(예: 100 nm 내지 약 20 μM)에서 4-8 시간 동안 아급성 용량의 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드 서열번호 2에 제1 세포 그룹을 노출시켰다. 마찬가지로, 부적정 대합 대조군 올리고뉴클레오티드 서열번호 4에 제2 세포 그룹을 노출시켰다.
이어서, 각 세포 그룹이 계속 분할하도록 하고, 다시 각 그룹을 균등하게 분할하였다(거의 근사한 융합성). 계속되는 성장을 위해 동일한 수의 세포를 접종하였다. 최초 부여된 농도에서 시험 대상 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 또는 대조군 올리고뉴클레오티드를 샘플에 4일마다 첨가하였다. 한 실험에서, 제조업자의 지시에 따라 FuGENE6
Figure 112002007045259-pct00019
(Boehringer-Mannhiem)으로 세포를 추가 처리하였다. FuGENE6
Figure 112002007045259-pct00020
은 세포에 의한 올리고뉴클레오티드 흡수를 증강시킨다.
인간 텔로미어의 반복되는 T2AG3 서열 이외의 서열에 특이적인 제한효소를 사용하여 세포 샘플의 DNA를 소화시킴으로써 텔로미어 길이를 측정하였다(TRF 분석). 겔 전기영동의 표준 기법을 사용하여 소화된 DNA를 크기별로 분리함으로써, 텔로미어 DNA 프로브로 탐침 후 고분자량의 DNA(약 2 Kb-15 Kb)의 도말표본(smear)으로서의 겔 상에 나타나는 텔로미어 반복 길이를 측정하였다. 도 4 및 도 5는 이러한 실험예를 나타낸 것이다.
도 4에 제시된 결과는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 서열번호 2가 강력한 생체내 텔로머라제 활성 저해제라는 것을 가리킨다. FuGENE6
Figure 112007018785910-pct00021
의 부재 하에, 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 서열번호 2는 1-20 μM 범위의 HME50-5E 세포와 함께 항온배양되는 경우 텔로미어 길이의 엄청난 감소를 유도하였다. FuGENE6
Figure 112007018785910-pct00022
및 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 서열번호 2와 함께 세포를 항온배양하는 경우, 시험되는 보다 낮은 농도(100 nM)에서 조차도 텔로미어 크기는 대조군 세포에 비하여 감소되었다.
도 5에 제시된 결과는 서열 CAGTTAGGGTTAG(서열번호 10)을 가지는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드가 강력한 생체내 텔로머라제 활성 저해제라는 것을 가리킨다. 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 서열번호 10과 함께 세포를 항온배양하는 경우, 시험되는 보다 낮은 농도(1 nM)에서 조차도 텔로미어 크기는 대조군 세포에 비하여 감소되었다. 따라서, 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 불사화된 인간 유방 상피 세포 내에서 강력한 생체내 텔로머라제 활성 저해제이다.
다른 실험에 있어서, 서열번호 2 및 10에 나타나는 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드 중 하나와 함께 HME50-5E 세포를 항온배양하였다. 대조군으로서 부적정 대합 올리곤클레오티드 서열번호 4를 사용하였다. 전술한 프로토콜을 사용함에 있어서, 약 0.1 μM 내지 약 20 μM의 농도에서 모든 폴리뉴클레오티드를 사용하였다. 도 6에 나타난 세포 성장에 대한 데이타는 본 발명의 시험 대상 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 투여한지 약 100일 이내에 세포가 위기(즉, 세포 기능의 정지)에 직면하였다는 것을 가리킨다.
또한, 표준 방법을 사용하여 수행하는 세포의 TRF 분석(도 7)은 본 발명의 시험 대상 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드가 텔로미어 길이를 감소시키는데 효과적이라는 것을 보여준다. 서열번호 2 및 10에 나타나는 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드 중 하나와 함께 HME50-5E 세포를 항온배양하였다. 대조군으로서 부적정 대합 올리곤클레오티드 서열번호 4를 사용하였다. 전술한 프로토콜을 사용함에 있어서, 약 0.5 μM의 농도에서 모든 폴리뉴클레오티드를 사용하였다. 10일, 20일, 40일 및 80일에 텔로미어 길이를 측정하였다. 대조군의 부적정 대합 올리고뉴클레오티드를 가지는 세포의 경우 90일에 텔로미어 길이를 측정하였고, 이 데이타 지점은 종말점(end point)으로서 역할을 하였다. 전술한 HME50-5E 세포뿐만 아니라, 임의의 텔로머라제-양성 세포주(예: HeLa 세포 또는 HEK-293 세포)로 이 분석을 수행할 수 있다.
b. 특이성
표준 기법을 사용하는 효소 저해 분석 또는 하이브리드 형성 시험을 수행함으로써 텔로머라제 및 RNA 성분을 가지는 것으로 공지된 다른 효소에 대한 활성(IC50)에 대하여 티오포스포라미데이트 폴리뉴클레오티드를 스크리닝하였다. 스크리닝되는 다른 효소에 대한 IC50값에 비하여 텔로머라제에 대한 IC50값이 더 낮은 올리고뉴클레오티드는 텔로머라제에 대한 특이성이 있는 것이라고 한다.
c. 세포독성
HME50-5E, Caki-1, ACHN 및 A549 유형의 세포를 사용하여 세포독성에 대한 세포 사멸(XTT) 분석을 수행하였다. 분석에 사용되는 세포주는, 지질의 존부(存否) 하에 약 1 μM 내지 약 100 μM 범위의 농도에서 72 시간 동안 서열번호 2의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드에 노출시켰다. 이 기간 중, 540 나노미터(nm)의 빛에 대한 샘플의 광학 농도(optical density; OD)를 측정하였다. 이랍ㄴ적으로, 각종 유형의 세포에 대하여 수득한 IC50값은 1 μM 이하였다. 따라서, 100 μM 이하의 농도에서 유의적인 세포독성 효과는 나타나지 않을 것으로 예상된다. 대조군 세포주(예: 정상 인간 BJ 세포)뿐만 아니라 다른 종양 세포주(예: 난소암 세포주 OVCAR-5 및 SK-OV-3)도 세포독성을 측정하는데 사용할 수 있다. 또한, MTT 분석(Berridge 등의 문헌[Biochemica 4:14-19, 1996] 참조) 및 alamarBlue
Figure 112007018785910-pct00023
분석(미국 특허 제5,501,959호 참조)과 같은 세포독성에 대한 다른 분석을 사용할 수 있다.
텔로머라제 저해 효과를 관찰하기 위하여, 세포독성 레벨 이하의 농도로 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것이 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 다수의 암 화학요법제의 효과가 이의 세포독성 효과로부터 유도되기 때문 에, 하학요법제의 효과가 관찰되는 임의의 용량으로 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
생체내 동물 실험
표준 기법 및 재료를 사용하여, OVCAR-5 종양 세포가 누드 마우스 내에 이식되는 인간 종양 이종이식 모델을 구축하였다. 마우스를 2개의 그룹으로 분할하였다. 한 그룹은 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드로 복강내 처리한다. 다른 그룹은 인산염 완충액(PBS)과, 텔로머라제 RNA와 상보적이나 텔로머라제 RNA 서열과의 1 이상의 염기 부적정 대합을 가지는 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 대조군으로 처리한다. 표준 방법 및 재료를 사용하여, 이종이식 후 주기적으로 각 그룹 내의 마우스의 평균 종양 질량을 측정한다.
본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드로 처리된 그룹에 있어서, 평균 종양 질량은 최초 처리 후 일정 기간 동안 증가하지만, 이 기간 경과 후에는 안정화된 후 감소하기 시작하는 것으로 예상된다. 대조군 그룹 내의 종양 질량은 실험 전과정을 통해 안정화되는 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 종양 성장 속도를 극적으로 감소시키고, 궁극적으로 종양 크기의 감소 및 종양의 제거를 유도하는 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은 신규 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드, 텔로머라제 활성을 저해하는 방법, 및 텔로머라제 활성이 유해한 효과, 특히 암을 가지는 질병 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 티오포스포라미데이트 올리고뉴클에오티드는 비악성 세포에 영향을 미치지 않으면서, 불멸 상태를 유지하기 위한 텔로머라제 활성을 필요로 하는 악성 세포를 높은 선택성으로 효과적인 치료를 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 대하여 구체적으로 상술하였지만, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어남이 없이 다양하게 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

Claims (32)

  1. 서브유니트간 결합(inter-subunit linkage)에 의해 연결된 뉴클레오시드 서브유니트로 구성된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로서, 1개 내지 모든 서브유니트간 결합이 식 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'[식 중, R은 수소, 알킬, 아릴 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 아릴은 5~20개의 탄소 원자를 가지는 방향족 고리 또는 고리 내에 질소, 산소 또는 황 원자를 가지는 헤테로사이클릭 방향족 고리를 나타냄]로 정의되는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트이고, 상기 서열이 GTTAGGGTTAG(서열번호 1), TAGGGTTAGACAA(서열번호 2) 또는 CAGTTAGGGTTAG(서열번호 10)으로 구성되고, 상기 올리고뉴클레오티드가 텔로머라제 효소 활성을 저해하거나 감소시킬 수 있는 것인 올리고뉴클레오티드.
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  5. 제1항에 있어서, 모든 서브유니트간 결합이 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 결합인 것인 올리고뉴클레오티드.
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  11. 뉴클레오시드 서브유니트로 구성된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 1개 내지 모든 서브유니트가 하기 식으로 정의되고, 상기 서열이 GTTAGGGTTAG(서열번호 1), TAGGGTTAGACAA(서열번호 2), 또는 CAGTTAGGGTTAG(서열번호 10)으로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드:
    Figure 112008011396912-pct00034
    [상기 식 중, B는 염기이고,
    Z는 SR이며, 여기서 R은 수소, 알킬, 아릴 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 아릴은 5~20개의 탄소 원자를 가지는 방향족 고리 또는 고리 내에 질소, 산소 또는 황 원자를 가지는 헤테로사이클릭 방향족 고리를 나타내며;
    R1은 수소, O-R2, S-R2 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R2는 H, 알킬 또는 (CH2)nW(CH2)mH이며, 여기서 n은 1 내지 10이고, m은 0 내지 10이며, W는 O, S 또는 NH임].
  12. 제11항에 있어서, 모든 서브유니트가 하기 식으로 정의되는 것인 폴리뉴클레오티드:
    Figure 712007004308350-pct00035
    .
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 텔로머라제 효소 활성을 저해하거나 감소시킬 수 있는 것인 폴리뉴클레오티드.
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  18. 제1항 또는 제11항에 있어서, 접합된(conjugated) 지질 또는 폴리펩티드가 부착되어 있는 것인 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제1항 또는 제5항의 올리고뉴클레오티드 또는 제11항 또는 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 약학적 허용 부형제 중에 제제화되는 암 치료용 약학 조성물.
  20. 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 약학적 허용 부형제 중에 제제화되는 암 치료용 약학 조성물.
  21. 제1항의 올리고뉴클레오티드 또는 제11항의 폴리뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 세포 내 텔로머라제 효소 활성을 저해하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 서열이 TAGGGTTAGACAA(서열번호 2)이고, 모든 서브유니트간 결합이 식 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5'[식 중, R은 수소임]로 정의되는 N3'→P5' 티오포스포라미데이트인 것인 올리고뉴클레오티드.
  23. 제22항의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 약학적 허용 부형제 중에 제제화되는 암 치료용 약학 조성물.
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