CN110234763A - 针对hbv cccdna的寡核苷酸靶向策略 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了靶向乙型肝炎病毒(HBV)的共价闭合环状(ccc)DNA的寡核苷酸组合物。本文还公开了用于治疗被诊断患有或疑似患有HBV感染和/或HBV相关障碍，例如慢性乙型肝炎感染、肝衰竭或肝硬化和肝细胞癌的受试者的方法。

Description

针对HBV CCCDNA的寡核苷酸靶向策略
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2016年11月11日提交的美国专利申请62/420,801和 2017年9月14日提交的美国专利申请62/558,770的权益和优先权，上述专利申请中的内容据此全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及靶向乙型肝炎病毒(HBV)的共价闭合环状(ccc)DNA 的寡核苷酸组合物，以及使用所述组合物治疗被诊断有或疑似患有HBV感染和/或HBV相关障碍，例如慢性乙型肝炎感染的受试者的方法。
背景技术
以下对本公开背景的描述只是作为对理解本公开的帮助而提供，并不旨在承认此类公开是本公开的现有技术。
HBV是在复制过程中利用逆转录酶的少数DNA病毒中的一种，该复制过程涉及多个阶段，包括侵入、脱壳和病毒基因组转运到核。最初， HBV基因组的复制涉及产生RNA中间体，该RNA中间体然后逆转录以产生DNA病毒基因组。HBV在感染细胞时，将病毒基因组松弛环状DNA (rcDNA)转运到细胞核中并转化成附加型双链共价闭合环状DNA (cccDNA)，其用作病毒mRNA的转录模板。在转录和核输出后，细胞质病毒前基因组RNA(pgRNA)与HBV聚合酶和衣壳蛋白组装形成核衣壳，其中聚合酶催化的逆转录产生负链DNA，其随后被拷贝成正链DNA 形成子代rcDNA基因组。然后成熟的核衣壳被病毒包膜蛋白包装以作为病毒体颗粒离开或穿梭到细胞核，以通过细胞内cccDNA扩增途径扩增 cccDNA储库。cccDNA是HBV复制周期的基本组分，并负责建立感染和病毒持续性。
全世界至少有2.5亿人慢性感染乙型肝炎病毒(HBV)，它是一种通过逆转录复制的嗜肝DNA病毒。慢性感染极大地增加了终末期肝病的风险。由于被称为共价闭合环状(ccc)DNA的细胞内病毒复制中间体的难治性，目前的治疗很少实现完全治愈。在感染时，cccDNA由进入病毒体中的蛋白质连接的松弛环状(RC)DNA基因组作为质粒样附加体在宿主细胞核中产生。cccDNA用作所有病毒RNA的模板，因此用作新病毒体的模板。 cccDNA在从急性HBV感染恢复的患者中持续存在数十年。
越来越多的证据展示由于cccDNA的持久性，单是目前的抗病毒治疗，诸如核苷(酸)类似物(NA)或干扰素(IFN)，尚不能治愈大多数慢性乙型肝炎(CHB)患者。NA通过直接抑制病毒聚合酶来抑制HBV复制，而IFN增强宿主对HBV感染的免疫力。中止抗病毒治疗之后通常会发生病毒反弹。
因此，需要靶向cccDNA或含cccDNA的肝细胞的新型抗病毒试剂以治愈慢性HBV感染。
发明内容
本公开涉及寡核苷酸及其药物组合物。寡核苷酸包含与SEQ ID NO： 100的HBVcccDNA基因组序列内的多个核苷酸互补的序列。在实施方案中，寡核苷酸包含与HBVcccDNA基因组内的至少12个核苷酸互补的序列。在实施方案中，寡核苷酸与HBV cccDNA基因组的增强子I区域内的至少12个核苷酸互补。在实施方案中，寡核苷酸包含与在对应于HBV cccDNA基因组的核苷酸位置967至核苷酸位置1322的区域中存在的至少 12个核苷酸互补的序列。在实施方案中，寡核苷酸的序列是SEQ ID NO：1- 65中的任一种。
在实施方案中，本发明所公开的寡核苷酸包含至少一个第一核苷酸，其具有对第二核苷酸的硫代磷酸酯(PS)键或硫代氨基磷酸酯(NPS) 键。在实施方案中，第一核苷酸还在2’位置处由取代基进一步修饰，所述取代基包括氟(F)或O-烷基，诸如O-甲基(O-Me)、O-乙基(O-Et) 等。O-烷基可进一步被烷氧基诸如O-甲基(O-Me)、O-乙基(O-Et)等取代。在实施方案中，具有胞嘧啶核碱基的任何第一核苷酸被进一步修饰为甲基胞嘧啶。
在实施方案中，本发明所公开的寡核苷酸的每个核苷酸包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键或硫代氨基磷酸酯(NPS)键连同2’位置处的O- 甲基取代基，并且任何具有胞嘧啶核碱基的核苷酸被进一步修饰为包括甲基胞嘧啶核碱基。在实施方案中，具有SEQ IDNO：1-65的寡核苷酸的每个核苷酸被修饰为包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键或硫代氨基磷酸酯 (NPS)键连同2’位置处的O-甲基取代基，并且任何具有胞嘧啶核碱基的核苷酸被进一步修饰为包括甲基胞嘧啶核碱基。在实施方案中，寡核苷酸的序列是SEQ ID NO：66-79中的任一种。
在实施方案中，本发明所公开的寡核苷酸被修饰成包含缀合至寡核苷酸的至少一个靶向部分。该缀合至寡核苷酸的靶向部分可以是GalNAc、棕榈酰或生育酚衍生物。在实施方案中，具有SEQ ID No：1-79的寡核苷酸被修饰成包含缀合至寡核苷酸的至少一个靶向部分。在实施方案中，寡核苷酸的序列是SEQ ID NO：80-82中的任一种。
在实施方案中，药物组合物包含至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与HBVcccDNA基因组内的至少12个核苷酸互补的序列。在实施方案中，寡核苷酸与HBV cccDNA基因组的增强子I区域内的至少12个核苷酸互补。在实施方案中，寡核苷酸包含与在对应于HBV cccDNA基因组的核苷酸位置967至核苷酸位置1322的区域中存在的至少12个核苷酸互补的序列。在实施方案中，寡核苷酸的至少一个第一核苷酸被修饰成包含对第二核苷酸的硫代磷酸酯(PS)键或硫代氨基磷酸酯(NPS)键，以及在2’位置处的氟(F)或O-烷基(任选地还被烷氧基取代)取代基，并且任何胞嘧啶核碱基被进一步修饰为甲基胞嘧啶。在实施方案中，寡核苷酸被靶向部分修饰，诸如在寡核苷酸的3’和/或5’末端处缀合的GalNAc、棕榈酰或生育酚衍生物。在实施方案中，药物组合物中的寡核苷酸的序列是SEQ ID NO：1-82中的任一种。
本公开还涉及在对其有需要的受试者中治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸或其药物组合物。在实施方案中，寡核苷酸的序列是SEQ ID NO：1-82中的任一种。在实施方案中，寡核苷酸的施用导致受试者中的HBeAg水平、HBsAg 水平或HBV DNA水平中的至少一个的减少。在实施方案中，寡核苷酸的施用导致受试者中的HBV cccDNA的减少。
本公开的方法还包括向所述受试者独立、顺序地或同时施用一种或多种附加的治疗剂，所述附加的治疗剂选自由以下项组成的组：抗病毒剂、核苷酸类似物、核苷类似物、逆转录酶抑制剂、免疫调节剂、治疗疫苗、病毒侵入抑制剂、衣壳抑制剂、siRNA、反义寡核苷酸和cccDNA抑制剂。
此外，本公开涉及本发明所公开的用于治疗HBV的寡核苷酸。
在一个方面，本公开提供了包含选自由SEQ ID NO：1-82组成的组的序列或其修饰的寡核苷酸。本公开还提供了包含SEQ ID NO：1-82中任一种的互补序列或其修饰的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向在HBV cccDNA基因组的增强子I区域内的HBV DNA序列(即，位于HBV基因组的核苷酸位置 960和1330之间并且包括该核苷酸位置960和1330的靶核苷酸序列)。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置 969和位置987之间的任何位置的HBV DNA序列。在某些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1094和位置1116之间的任何位置的HBV DNA序列。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于 HBV基因组的位置1136和位置1155之间的任何位置的HBV DNA序列。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1174 和位置1194之间的任何位置的HBV DNA序列。在其他实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1194和1216之间的任何位置的 HBV DNA序列。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1297和位置1315之间的任何位置的HBV DNA序列。
在一个方面，本公开提供了用于在对其有需要的受试者中治疗HBV感染或HBV相关障碍，和/或治疗HBV感染或HBV相关障碍的病征或症状的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种寡核苷酸，其中至少一种寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：1-82组成的组的序列。
在一个方面，本公开提供了用于在HBV cccDNA中诱导D-环形成的方法，所述方法包括使HBV cccDNA与具有SEQ ID NO：1-82中任一种的序列的寡核苷酸接触。在另一方面，本公开提供了用于在HBV cccDNA中诱导D-环形成的方法，所述方法包括使由核苷酸位置900-1310组成的HBV cccDNA基因组的靶区域(增强子I区域)与和HBV cccDNA的靶区域至少90％互补的寡核苷酸接触。在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸与HBV cccDNA杂交以诱导抗原D-环结构的形成。在一些实施方案中，D-环形成的诱导刺激先天免疫。
在一个方面，本公开提供了一种寡核苷酸，其包含与HBV cccDNA基因组的增强子I附近或之内的多个核苷酸互补的序列，其中增强子1对应于SEQ ID NO：100的HBV cccDNA基因组序列的核苷酸位置900至核苷酸位置1310。在一些实施方案中，寡核苷酸与HBV cccDNA基因组的增强子I 区域内的至少15个核苷酸互补。在某些实施方案中，寡核苷酸与HBVcccDNA基因组的增强子I区域内的至少19个核苷酸互补。
在另一方面，本公开提供了一种寡核苷酸，其包含与在对应于HBV cccDNA基因组的核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因组区域中存在的至少15个核苷酸互补的序列，其中HBV cccDNA基因组序列为SEQ ID NO：100。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与在对应于HBV cccDNA基因组的核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因组区域中存在的至少19个核苷酸互补的序列。除此之外或另选地，在一些实施方案中，寡核苷酸的序列选自由SEQ IDNO：1-82组成的组。除此之外或另选地，在上述实施方案中的任一个中，寡核苷酸包含至少一种第一核苷酸，其具有与第二核苷酸的PS键，其中所述第一核苷酸在2’位置处被选自由F和O-烷基组成的组的取代基修饰，其中所述O-烷基任选地被烷氧基取代。除此之外或另选地，在上述实施方案中的任一个中，寡核苷酸的每个核苷酸通过PS键连接至寡核苷酸的另一个核苷酸，并且在2’位置处被O-Me修饰。
在另一方面，本公开提供了一种在对其有需要的受试者中治疗HBV的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的寡核苷酸中的任一种。在一些实施方案中，寡核苷酸与HBV cccDNA基因组的增强子I区域内的至少15个核苷酸互补。在某些实施方案中，寡核苷酸包含与在对应于HBV cccDNA基因组的核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因组区域中存在的至少19个核苷酸互补的序列。除此之外或另选地，在一些实施方案中，寡核苷酸的序列选自由SEQ ID NO：1-82组成的组。
在某些实施方案中，寡核苷酸的施用导致受试者中的HBeAg水平、 HBsAg水平或HBV DNA水平中的至少一个的减少。除此之外或另选地，在一些实施方案中，寡核苷酸的施用导致受试者中的HBV cccDNA的肝水平减少。寡核苷酸可口服施用、局部施用、全身施用、静脉内施用、皮下施用、经皮施用、鞘内施用、鼻内施用、腹膜内施用、肝内施用或肌内施用。
除此之外或另选地，在一些实施方案中，该方法还包括向受试者独立、顺序地或同时施用一种或多种附加的治疗剂，所述附加的治疗剂选自由以下项组成的组：抗病毒剂、核苷酸类似物、核苷类似物、逆转录酶抑制剂、免疫刺激剂、治疗疫苗、病毒侵入抑制剂、衣壳抑制剂、siRNA、反义寡核苷酸和cccDNA抑制剂。
在另一方面，本公开提供了用于治疗HBV的寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含与HBVcccDNA基因组的增强子I附近或之内的多个核苷酸互补的序列，其中增强子I对应于SEQ IDNO：100的HBV cccDNA基因组的核苷酸位置900至核苷酸位置1310。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与在对应于HBV cccDNA基因组的核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因组区域中存在的至少15个核苷酸互补的序列。在某些实施方案中，寡核苷酸的序列选自由SEQ IDNO：1-82组成的组。
附图说明
图1示出了HBV基因组的物理图谱。HBV基因组的长度为大约3200 个核苷酸，其中增强子I区域的核苷酸序列在位置900处开始并在位置 1310处结束。
图2A示出了用不同浓度的SEQ ID NO：71处理的HBV感染的PHH的 Southern印迹结果。图2B示出了用不同浓度的SEQ ID NO：71处理的HBV 感染的PHH的qPCR结果。图2C示出了用不同浓度的SEQ ID NO：71处理的HBV感染的PHH中的cccDNA水平的减少％。图2D示出了用不同浓度的SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：70处理的HBV感染的 PHH的Southern印迹结果。在图2A-2D中，PHH在第0天用HBV感染，并在第4天用指定的cccDNA靶向寡核苷酸处理。在第11天，使用Hirt DNA提取方法从PHH提取HBV cccDNA。
图3A示出了在施用后24小时、72小时或168小时，小鼠中的SEQ ID NO：71和SEQ IDNO：80(具有3’GalNAc的SEQ ID NO：71)的体内肝浓度。图3B示出了小鼠中SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：80的肝Cmax和肝半衰期。对于图3A-3B，在C57Bl/6雌性小鼠(n＝3)中皮下递送10mg/kg所示的寡核苷酸。
图4A示出了用SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72处理的HBV感染的 PHH表现出IFN刺激的基因表达增加。图4B示出了在与SEQ ID NO：71、 SEQ ID NO：72、PBS(阴性对照)和瑞喹莫德(R848)(阳性对照)接触的PBMC(来源于HBV阴性供体)中观察到的细胞因子诱导水平。
图5A-5B示出了共有HBV基因组序列(SEQ ID NO：100)。
具体实施方式
目前的抗病毒疗法抑制细胞质HBV基因组复制，但不是治愈性的，因为这些疗法不直接影响核HBV cccDNA，其是成为病毒转录模板并维持病毒持续性的基因组形式。因此，直接靶向cccDNA调节的新型方法是高度期望的。开发直接靶向cccDNA的小分子药物或治疗抗体具有挑战性。
本公开提供能够减少HBV cccDNA的表达和/或活性的寡核苷酸组合物。本公开的寡核苷酸与HBV cccDNA分子的增强子I区域处或附近的靶序列杂交，从而在增强子I区域处或附近产生D-环。不希望受理论的束缚，据信在cccDNA分子中产生D-环结构可充当受试者中的DNA编辑和 DNA修复机制的提示，并且可能导致HBV cccDNA的破坏(Kasamatsu， H.；Robberson，D.L.；Vinograd，J.，Proc Natl Acad Sci.68(9)：2252-2257 (1971)；Sebesta，M.等人，DNA Repair 12(9)：691-698(2013))，并且还可通过宿主RNA聚合酶II干扰HBVcccDNA的转录。在一些实施方案中，D 环结构的产生刺激感染HBV cccDNA的受试者中的先天性免疫识别。
定义
如本文所用，涉及数值的术语“约”一般被认为包括落入在该数值的任一方向上(大于或小于)1％、5％或10％范围内的数值，除非另外指明或以其他方式从上下文中显而易见(除非此类数值将小于0％或超过可能值的 100％)。
如本文所用，试剂、药物或化合物对受试者的“施用”包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可通过任何合适的途径进行，包括口服、鼻内、鞘内、非肠道(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、局部、肝内、透皮或本文所述的任何其他途径。施用包括自我施用和由另一人施用。
如本文所用，相对于核酸序列的术语“扩增”是指增加样品中核酸序列群的代表性的方法。核酸扩增方法诸如PCR、等温方法、滚环方法等是技术人员所熟知的。参见，例如，Saiki，“Amplification of Genomic DNA” in PCR PROTOCOLS，Innis等人编辑，AcademicPress，San Diego，Calif.1990 年，第13-20页；Wharam等人，Nucleic Acids Res.2001年6月1日； 29(11)：E54-E54；Hafner等人，Biotechniques，2001年4月；30(4)：852-6， 858，860passim。在扩增反应中体外产生的特定核酸序列的拷贝被称为“扩增子”或“扩增产物”。
如本文所用，关于多核苷酸(即核苷酸序列，诸如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补的”或“互补性”是指碱基配对规则。如本文所用，核酸序列的互补序列是指当与核酸序列比对使得一个序列的5’末端与另一个序列的3’端配对时，处于“反平行结合”的寡核苷酸。例如，序列“5’-A- G-T-3”’与序列“3’-T-C-A-5”互补。在天然存在的核酸中不常见的某些碱基可包括在本文所述的核酸中。这些包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性不必是完美的；稳定的双链可以包含错配的碱基对、简并的或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可鉴于许多变量，包括例如，寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生率，以经验的方式确定双链体的稳定性。互补序列也可以是与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且也可以为 cDNA。
如本文所用，“对照”是出于比较目的用于实验中的替代样品。对照可以为“阳性”或“阴性”。例如，在实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗功效的相关性的情况下，通常采用阳性对照(已知表现出期望治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受治疗或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，“D-环(置换环)”是指通过使HBV的双链cccDNA分子与本公开的寡核苷酸接触而产生的乙型肝炎病毒基因组的新形成的三链区，其中cccDNA分子的两个链分开一段并由对应于本公开的寡核苷酸的第三链保持分开。第三链具有与cccDNA的一条链互补并与其配对的碱基序列，从而置换该区域中的另一条互补cccDNA链。置换链形成“D”环。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，导致本文所述的疾病或病症或者与本文所述的疾病或病症相关联的一种或多种病征或症状减少的量。在治疗或预防应用的情况中，施用于受试者的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重度以及个体的特征(诸如总体健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性) 而变化。技术人员根据这些和其它因素将能够确定适当的剂量。组合物还可与一种或多种附加治疗化合物组合施用。在本文所述的方法中，可将治疗组合物施用于具有本文所述疾病或病症的一种或多种病征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”是指其中疾病或病症的生理效应得以改善或消除的组合物水平。治疗有效量可按照一次或多次施用来给予。
如本文所用，“乙型肝炎病毒”或“HBV”是指属于嗜肝DNA病毒科的众所周知的非致细胞病变的嗜肝DNA病毒。HBV基因组是具有重叠阅读框的部分双链的、环状DNA。存在由HBV基因组编码的四种已知基因，称为C、X、P和S(参见图1)。核心蛋白由基因C编码 (HBcAg)。HBeAg(包膜抗原)通过前核芯(前C)蛋白的蛋白分解加工来制备。HBV DNA聚合酶由基因P编码。基因S编码表面抗原 (HBsAg)。HBsAg基因是一个长的开放阅读框，其包含三个框内“起始”(ATG)密码子，所述密码子将基因分为三个区域，前S1、前S2和 S。由于有多个起始密码子，产生了具有三种不同尺寸的多肽，称为大 (L)、中(M)和小(S)(分别为前S1+前S2+S、前S2+S、或 S)。基因X编码诱饵蛋白，其允许血液中的HBsAg螯合抗HBsAg抗体并允许感染性病毒颗粒逃避免疫检测。已鉴定出八种HBV基因型，其被命名为A至H，每种基因型具有不同的区域分布。术语“HBV”包括HBV的八种基因型(A至H)中的任一种。如本文所用，术语“HBV”还指HBV 基因组的天然存在的DNA序列变异。
如本文所用，术语“乙型肝炎病毒相关疾病”或“HBV相关疾病”是指由HBV感染和/或复制导致或与HBV感染和/或复制相关的疾病或障碍，包括急性乙型肝炎、急性暴发性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝衰竭、终末期肝病、肝硬化和肝细胞癌。
如本文所用，术语“杂交”是指其中两条基本上互补的核酸链(在至少14至25个核苷酸的一段内至少约65％互补，至少约75％，或至少约 90％互补)在适当严格条件下，通过在介于互补碱基对之间形成的氢键，彼此退火以形成双链或异源双链的方法。杂交通常并且优选地用探针长度核酸分子进行，优选地长度为15-100个核苷酸，更优选地长度为18-50个核苷酸。核酸杂交技术是本领域所熟知的。参见例如Sambrook等人的1989 年，《分子克隆：实验室手册》，第二版，冷泉港出版社，纽约州，普莱恩维尤(1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)。杂交和杂交的强度(即，核酸之间缔合的强度)受诸如核酸之间的互补性程度，所涉及的条件的严格性以及所形成的杂交体的热解链温度(Tm)因素的影响。本领域的技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性，使得具有至少所期望的互补性水平的序列将稳定杂交，而具有较低互补性的那些不会稳定杂交。关于杂交条件和参数的示例，参见例如Sambrook等人的1989年，《分子克隆：实验室手册》，第二版，冷泉港出版社，纽约州，普莱恩维尤(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborPress， Plainview，N.Y.)；Ausubel，F.M.等人的1994，《分子生物学实验室指南》，约翰·威利父子公司，新泽西州，斯考克斯市(1994，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Secaucus，N.J.)。在一些实施方案中，特异性杂交在严格杂交条件下发生。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸或多核苷酸(例如探针或引物)将在适宜的条件下与靶核酸“杂交”。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以为单独的生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一个优选的实施方案中，个体、患者或受试者为人。
在寡核苷酸的上下文中，术语“修饰”包括但不限于(a)末端修饰，例如5’末端修饰或3’末端修饰，(b)核碱基(或“碱基”)修饰，包括碱基替换或移除，(c)糖修饰，包括在2’、3’和/或4’位置处的修饰，和 (d)主链修饰，包括磷酸二酯键修饰或替换。
术语“修饰的核苷酸”通常是指具有对碱基、糖和磷酸二酯键或主链部分(包括核苷酸磷酸酯)中的一者或多者的化学结构的修饰的核苷酸。
如本文所用，“寡核苷酸”是指在主链上具有核酸碱基序列的分子，该主链主要由相同单体单元以限定间隔构成。碱基以这样的方式布置在主链上，使得其能够与具有与寡核苷酸的碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常用的寡核苷酸具有糖磷酸酯单元的主链。可区分在2’位置处不具有羟基基团的寡脱氧核糖核苷酸和在2’位置处具有羟基基团的寡核糖核苷酸。寡核苷酸还可包括衍生物，其中羟基的氢被有机基团例如烯丙基基团替换。该方法中用作引物或探针的寡核苷酸通常为至少约10-15个核苷酸长，并且更优选地至少约14至25个核苷酸长，但在该方法中可使用更短或更长的寡核苷酸。确切的尺寸将取决于许多因素，所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。可以任何方式产生寡核苷酸，包括，例如化学合成、DNA复制、质粒或噬菌体DNA的限制性内切核酸酶消化、逆转录、 PCR、或它们的组合。寡核苷酸可例如通过添加甲基基团、生物素或地高辛部分、荧光标记或通过使用放射性核苷酸进行修饰。
如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸，当其置于诱导与靶核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，即，在含不同核苷酸三磷酸和聚合酶的适当缓冲液的存在下(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等) 且在合适温度下，其能够充当核酸序列合成的起始点。引物的核苷酸中的一者或多者可例如通过添加甲基基团、生物素或地高辛部分、荧光标记或通过使用放射性核苷酸来进行修饰。引物序列不需要反映模板的确切顺序。例如，可将非互补核苷酸片段附接到引物的5’端，其中引物序列的其余部分基本上与该链互补。如本文所用，术语引物包括可合成的引物的所有形式，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、标记的引物等。如本文所用，术语“正向引物”是指与dsDNA的反义链退火的引物。“反向引物”与dsDNA的有义链退火。
如本文所用，“探针”是指经由杂交与靶核酸相互作用的核酸。探针可与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补性的程度将取决于许多因素，这些因素一般基于探针的功能。探针可标记或未标记，或以本领域熟知的多种方式中的任一种进行修饰。探针可与靶核酸特异性杂交。探针可以为 DNA、RNA或RNA/DNA杂交体。探针可以是寡核苷酸、人工染色体、片段化人工染色体、基因组核酸、片段化基因组核酸、RNA、重组核酸、片段化重组核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸、环状杂环寡聚体、或核酸的缀合物。探针可包含经修饰的核碱基、经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间键。探针的长度通常为至少约10个、15个、20个、25个、30个、35个、 40个、50个、60个、75个、100个核苷酸或更多。
如本文所用，术语“样品”是指得自患者的临床样品。在优选的实施方案中，样品得自生物来源(即，“生物样品”)，诸如从受试者收集的组织或体液。样品源包括但不限于粪便、粘液、痰(处理或未处理)、支气管肺泡灌洗(BAL)、支气管冲洗(BW)、血液、体液、脑脊液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如，活检材料)。
如本文所用，术语“有义链”意指包含功能性蛋白的编码序列的至少一部分的双链DNA(dsDNA)的链。“反义链”意指作为有义链的反向互补序列的dsDNA链。
如本文所用，术语“独立”治疗应用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“顺序地”治疗应用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，顺序应用是指在施用一种或多种其他成分开始之前完全施用活性成分中的一种。因此，在施用一种或多种其它活性成分之前，可以在数分钟、数小时或数天内施用活性成分中的一种。在这种情况下，不存在同时治疗。
如本文所用，术语“同时”治疗应用是指通过相同途径并且在同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“严格杂交条件”是指至少与以下一样严格的杂交条件：在50％甲酰胺、5xSSC、50mM NaH2PO4、pH 6.8、0.5％SDS、 0.1mg/mL超声处理过的鲑鱼精DNA和5xDenhart的溶液，在42℃下杂交过夜；用2x SSC、0.1％SDS在45℃下洗涤；并用0.2x SSC、0.1％SDS在 45℃下洗涤。在另一个示例中，严格杂交条件不应允许在涵盖20个连续核苷酸的一段上相差超过两个碱基的两个核酸的杂交。
如本文所用，术语“基本上互补的”意指两个序列在严格杂交条件下杂交。技术人员将会理解，基本上互补的序列不需要沿着它们的整个长度杂交。具体地，基本上互补的序列可包含不与靶序列杂交的连续碱基序列，其定位在严格杂交条件下与靶序列杂交的连续碱基序列的3’或5’。
如本文所用，术语“靶序列”是指存在于样品中并且能够杂交至本公开的寡核苷酸的目标核酸序列。在一些实施方案中，靶序列位于HBV cccDNA分子的增强型I区域处或附近。在另一个实施方案中，靶序列与本公开的寡核苷酸的杂交导致HBV cccDNA分子被宿主DNA修复机制破坏。
如本文所用，“治疗的”或“治疗”涵盖受试者(例如人类)中的疾病或病症(例如，HBV感染和/或HBV相关障碍)的治疗，并且包括：(i) 减少疾病或病症的发生或抑制疾病或病症，即，阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，导致疾病或病症消退；(iii)减慢疾病或病症的进展；和/或(iv) 抑制、减轻、延缓疾病或病症的一种或多种症状的发作或减慢其进展。在一些实施方案中，治疗导致HBV感染和/或HBV相关障碍的完全治愈。
HBV感染或HBV相关障碍可由一种或多种HBV基因型，诸如HBV 基因型A、HBV基因型B、HBV基因型C、HBV基因型D、HBV基因型 E、HBV基因型F、HBV基因型G或HBV基因型H导致。在一些实施方案中，HBV相关障碍为慢性乙型肝炎、肝衰竭、肝硬化或肝细胞癌。在某些实施方案中，受试者是人。
在该方法的一些实施方案中，与正常对照受试者相比，受试者表现出升高的HBVcccDNA水平。在某些实施方案中，用寡核苷酸治疗减少受试者中HBV cccDNA的水平。除此之外或另选地，在该方法的一些实施方案中，与正常对照受试者相比，受试者表现出升高的HBV cccDNA的肝水平。在某些实施方案中，用寡核苷酸治疗减少受试者中HBV cccDNA的肝水平。在上述实施方案中的任一个中，HBV cccDNA水平在施用寡核苷酸后约1小时至约80小时减少。
与HBV感染和/或HBV相关障碍相关联的症状包括但不限于存在肝 HBV cccDNA、存在血清和/或肝HBV抗原(例如HBsAg和/或HBeAg)、升高的ALT、升高的AST、不存在抗HBV抗体或其水平偏低、肝损伤、肝硬化、丁型肝炎、急性乙型肝炎、急性暴发性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纤维化、终末期肝病、肝细胞癌、血清病样综合征、厌食症、恶心、呕吐、低烧、肌肉痛、易疲劳、味觉紊乱和嗅觉紊乱(厌恶食物和香烟)、右上腹部和上腹部痛(间歇性，轻微至中度)、肝性脑病、嗜睡症、睡眠模式紊乱、精神错乱、昏迷、腹水、消化道出血、凝血病、黄疸、肝肿大(轻度增大、软肝)、脾肿大、手掌红斑、蜘蛛状痣、肌肉萎缩、蜘蛛痣、血管炎、静脉曲张出血、外周性水肿、男性乳房发育、睾丸萎缩、腹部侧支静脉(脐周静脉曲张)、高水平的丙氨酸转氨酶(ALT) 和天冬氨酸转氨酶(AST)(在1000-2000IU/mL范围内)、ALT水平高于 AST水平、升高的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和/或碱性磷酸酶(ALP)水平、减少的白蛋白水平、升高的血清铁水平、白血球减少症(即，粒细胞减少)、淋巴球增多、增加的红细胞沉降率(ESR)、缩短的红血球存活期、溶血反应、血小板减少症、国际标准化比率(INR)延长、存在血清 HBVDNA、转氨酶升高(＜ULN的5倍)、增加的胆红素水平、延长的前凝血酶时间(PT)、血球蛋白过多、存在组织非特异性抗体诸如抗平滑肌抗体(ASMA)或抗细胞核抗体(ANA)、存在组织特异性抗体诸如对抗甲状腺的抗体、升高的类风湿因子(RF)的水平、高胆红素血症、低血小板和白血球计数、AST水平高于ALT水平、伴有退行性和再生性肝细胞改变的小叶炎症、以及主要在小叶中心的坏死。“治疗”也可意指与不做治疗的情况下的预期生存期相比延长生存期。
还应当理解，本文所述的疾病或病症的各种治疗模式旨在意指“实质的”，其包括完全治疗，而且包括不完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。治疗可为对于慢性疾病的连续长期治疗或用于治疗急性病症的一个或很少时间的施用。
本公开的寡核苷酸组合物
本公开提供能够减少HBV cccDNA的表达和/或活性的寡核苷酸和寡核苷酸组合物。本公开的寡核苷酸与HBV cccDNA分子的增强子I区域处或附近的靶序列杂交，从而在增强子I区域处或附近产生D-环。图1示出了增强子I区域的核苷酸序列在核苷酸位置900处开始并且在核苷酸位置 1310处结束，并且图5A-5B是共有HBV基因组序列。
本公开的寡核苷酸靶向HBV cccDNA基因组的区域，该区域由核苷酸位置900-1310(增强子I区域)和与HBV cccDNA的靶区至少90％互补的寡核苷酸组成。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向HBV DNA序列，该HBV DNA序列在增强子I区域内(即，靶核苷酸序列位于HBV基因组的核苷酸位置900和1310之间并且包括该核苷酸位置900和1310)。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向增强子I区域上游的不超过50个碱基对、不超过45个碱基对、不超过40个碱基对、不超过35个碱基对、不超过30个碱基对、不超过25个碱基对、不超过20个碱基对、不超过15个碱基对、不超过10个碱基对、或不超过5个碱基对的HBV DNA 序列。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向增强子I区域下游的不超过50个碱基对、不超过45个碱基对、不超过40个碱基对、不超过35个碱基对、不超过30个碱基对、不超过25个碱基对、不超过20个碱基对、不超过15个碱基对、不超过10个碱基对、或不超过5个碱基对的HBV DNA 序列。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置 969和位置987之间的任何位置的HBV DNA序列。在某些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1094和位置1116之间的任何位置的HBV DNA序列。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于 HBV基因组的位置1136和位置1155之间的任何位置的HBV DNA序列。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1174 和位置1194之间的任何位置的HBV DNA序列。在其他实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1194和1216之间的任何位置的 HBV DNA序列。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸靶向位于HBV基因组的位置1297和位置1315之间的任何位置的HBV DNA序列。
本公开的寡核苷酸的示例示于表1中。
表1
在某些实施方案中，SEQ ID NO：1-65例如如本公开所述进行修饰。
在本公开的寡核苷酸的一些实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一个或其互补序列的一个或多个核碱基可被选自以下的经修饰核碱基置换：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、 5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6- 甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、3’- 氨基-2’-脱氧-2，6-二氨基嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶 (假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8- 羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(具体地5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2- 吡啶酮。
在本公开的寡核苷酸的一些实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一种或其互补序列的一种或多种核碱基可被选自以下的经修饰核碱基置换：三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G形钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)- 酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3，2，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。
除此之外或另选地，在一些实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一种或其互补序列的一种或多种核碱基的糖可被选自以下的经修饰的糖置换：2’- OH(核糖)核苷、2’-O-甲基化(2’-O-Me)核苷、2’-O-甲氧基乙基(2′-MOE)核苷、2’-核糖-F核苷、2’-阿拉伯糖-F核苷、2′-Me核苷和2’-Me-2’-F核苷。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一种或其互补序列的一种或多种核碱基的糖可被选自以下的经修饰的糖置换：2’-F和2’-O-烷基，其中所述O-烷基任选地被烷氧基取代。
除此之外或另选地，在一些实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一种或其互补序列的一种或多种核碱基的初始主链键可被选自以下的另选亚基间键替换：磷酸二酯亚基间键、硫代磷酸酯亚基间键、氨基磷酸酯亚基间键和硫代氨基磷酸酯亚基间键。
在一些实施方案中，核苷酸中的一者或多者包括糖环的2’位置的修饰或核苷酸间亚基键的修饰。例如，一些实施方案包括一个或多个2’-F或2’- O-烷基，其中所述O-烷基任选地被烷氧基取代，例如，一些实施方案包括 2’-OMe和/或2’-F修饰。在一些实施方案中，核苷酸间亚基键中的一者或多者为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，核苷酸间亚基键中的一者或多者为氨基磷酸酯键。在一些实施方案中，核苷酸间亚基键中的一者或多者为硫代氨基磷酸酯键。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸包括经修饰的核苷酸。例如，本公开的化合物可包括式(I)的核苷酸：
其中R为H或带正电的抗衡离子，B在每种情况下独立地为天然或未修饰的核碱基或修饰的核碱基，Y为O或S，R1为-(CR’2)2OCR’3，并且R’在每种情况下独立地为H或F。
在式(I)的核苷酸中，R1为-(CR’2)2OCR’3。在一些实施方案中，在每种情况下，R’为H。在其他实施方案中，至少一个R’为F，例如1、2、3、 4、5、6或7个R’为F。在一些实施方案中，CR’3包含1、2或3个F部分。例如，在实施方案中，R1选自由以下项组成的组：-CH2CH2OCH3(或MOE)、-CF2CH2OCH3、-CH2CF2OCH3、-CH2CH2OCF3、-CF2CF2OCH3、 -CH2CF2OCF3、-CF2CH2OCF3、-CF2CF2OCF3、-CHFCH2OCH3、- CHFCHFOCH3、-CHFCH2OCFH2、-CHFCH2OCHF2和-CH2CHFOCH3。在实施方案中，式I的核苷酸为：
在实施方案中，本公开的化合物包括式(II)的至少一个核苷酸：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，B为核碱基，R2为-CR’3、 -CR’2OCR’3、-(CR’2)3OCR’3或-(CR’2)1-2CR’3，或者R2为-(CR’2)2OCR’3，并且Y为O，并且R’在每种情况下独立地为H或F。
在式(II)的核苷酸中，R2为-CR’3、-(CR’2)1-3OCR’3、或-(CR’2)1-2CR’3。在一些实施方案中，R2为-CR’3或-CR’2CR’3。在一些实施方案中，在每种情况下，R’为H。在其他实施方案中，至少一个R’为F，例如1、2、3、4 或5个R’为F。在一些实施方案中，CR’3包含1、2或3个F部分。例如，在实施方案中，R1选自由以下项组成的组：-CH3(或Me)、-CFH2、- CHF2、CF3、-CH2OCH3、-CFH2OCH3、-CHF2OCH3、-CF3OCH3、- CH2OCFH2、-CH2OCHF2、-CH2OCF3、-CFH2OCH3、-CFH2OCFH2、- CFH2OCHF2、-CFH2OCF3、-CHF2OCH3、-CHF2OCFH2、-CHF2OCHF2、- CHF2OCF3、-(CR’2)3OCR’3、-CH2CH3(或Et)、-CFH2CH3、-CHF2CH3、 -CF3CH3、-CH2CFH2、-CH2CHF2、-CH2CF3、-CFH2CH3、-CFH2CFH2、- CFH2CHF2、-CFH2CF3、-CHF2CH3、-CHF2CFH2、-CHF2CHF2、- CHF2CF3、-CH2CH2CH3、CF2CH2CH3、CH2CF2CH3、CH2CH2CF3、 CF2CF2CH3、CH2CF2CF3、CF2CH2CF3、CF2CF2CF3、CHFCH2CH3、 CHFCHFOCH3、CHFCH2CFH2、CHFCH2CHF2和CH2CHFCH3。在实施方案中，R1为-CH3(或Me)或-CH2CH3(或Et)。在实施方案中，式II核苷酸选自由以下项组成的组：
在式(I)或(II)的化合物中，Y可以为O或S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为S(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30等)。在其他实施方案中，在至少一种情况下，Y为S，并且在至少另一种情况下，Y为O。在其他实施方案中，Y在每种情况下为S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为O(例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30等)。
本发明所公开的寡核苷酸包含式(I)的至少一个核苷酸。在实施方案中，本发明所公开的寡核苷酸包含式(I)的1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个核苷酸。在实施方案中，本发明所公开的寡核苷酸包含式(II)的1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含2至40个核苷酸，例如8至26个核苷酸或介于其间的整数。
在包含多于一个式(I)的核苷酸的实施方案中，该核苷酸可以相同或不同。在一些实施方案中，包含一个或多个式(II)的核苷酸，并且这些核苷酸可以相同或不同。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式(I)的核苷酸和至少一个式(II)的核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式(I)的核苷酸，其中至少一个R1为MOE，和至少一个式(II)的核苷酸，其中R2为Me或Et。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少2个式(I)和式(II)交替的核苷酸。例如，具有交替的2’修饰 (例如，Me-MOE-Me-MOE...或Et-MOE-Et-MOE-Et-MOE...)的2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含式(IIIa)和/或(IIIb)的2’-氟核苷酸：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，并且B为核碱基。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少4个式(I)或(II)和(IIIa) 交替的核苷酸。例如，寡核苷酸包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个交替的核苷酸。
式(I)、(II)、(IIIa)和(IIIb)的核苷酸的核碱基B可各自独立地为天然或未修饰的核碱基或修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括2，6-二氨基嘌呤核碱基，但任选地不包括腺嘌呤。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括2，6-二氨基嘌呤核碱基，但不包括腺嘌呤，并且包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。
式(I)、(II)、(IIIa)和(IIIb)的每个核苷酸中的Y可独立地为 O或S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为S(例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)。在其他实施方案中，在至少一种情况下，Y为S，并且在至少另一种情况下，Y为O。在其他实施方案中，Y在每种情况下为S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y 为O(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)。
在包含式(I)、(II)、(IIIa)和(IIIb)各自的多于一个核苷酸的实施方案中，多于一个此类式的核苷酸可以相同或不同。例如，在一些实施方案中，除了至少一个式(I)的核苷酸之外，该核苷酸还包含至少一个式(I)、(II)、(IIIa)和(IIIb)的核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸包含至少2个式(I)和/或式(II)和/或(III)交替的核苷酸。例如，所公开的寡核苷酸可包括具有交替的2’修饰的2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸包含上述修饰中的一种或多种，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列对核HBV cccDNA具有亲和性或与在HBV cccDNA分子的增强子I区域处或附近的靶序列杂交，从而在增强子I区域处或附近产生/保持D-环。例如，在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸包含上述修饰中的一种或多种和根据本文所列的序列中的一种的核碱基序列。
在一些实施方案中，本发明技术的寡核苷酸包括修饰的核苷酸。例如，本公开的化合物包括式(I)的核苷酸：
其中R为H或带正电的抗衡离子，B在每种情况下独立地为天然或未修饰的核碱基或修饰的核碱基，R1为-(CR’2)2OCR’3，并且R’在每种情况下独立地为H或F。
在式(I’)的核苷酸中，R1为-(CR’2)2OCR’3。在一些实施方案中，在每种情况下，R’为H。在其他实施方案中，至少一个R’为F，例如1、2、 3、4、5、6或7个R’为F。在一些实施方案中，CR’3包含1、2或3个F部分。例如，在实施方案中，R1选自由以下项组成的组：-CH2CH2OCH3(或 MOE)、-CF2CH2OCH3、-CH2CF2OCH3、-CH2CH2OCF3、-CF2CF2OCH3、 -CH2CF2OCF3、-CF2CH2OCF3、-CF2CF2OCF3、-CHFCH2OCH3、- CHFCHFOCH3、-CHFCH2OCFH2、-CHFCH2OCHF2和-CH2CHFOCH3。在实施方案中，式I的核苷酸为：
在实施方案中，本公开的化合物包括至少一个式(I’)的核苷酸和/或至少一个式(II’)的核苷酸：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，B为核碱基，R2为-CR’3、 -CR’2OCR’3、-(CR’2)3OCR’3或-(CR’2)1-2CR’3，或者R2为-(CR’2)2OCR’3，并且Y为O，并且R’在每种情况下独立地为H或F。
在式(II’)的核苷酸中，R2为-CR’3、-(CR’2)1-3OCR’3、或-(CR’2)1-2CR’3。在一些实施方案中，R2为-CR’3或-CR’2CR’3。在一些实施方案中，在每种情况下，R’为H。在其他实施方案中，至少一个R’为F，例如1、 2、3、4或5个R’为F。在一些实施方案中，CR’3包含1、2或3个F部分。例如，在实施方案中，R1选自由以下项组成的组：-CH3(或Me)、- CFH2、-CHF2、CF3、-CH2OCH3、-CFH2OCH3、-CHF2OCH3、- CF3OCH3、-CH2OCFH2、-CH2OCHF2、-CH2OCF3、-CFH2OCH3、-CFH2OCFH2、-CFH2OCHF2、-CFH2OCF3、-CHF2OCH3、-CHF2OCFH2、- CHF2OCHF2、-CHF2OCF3、-(CR’2)3OCR’3、-CH2CH3(或Et)、- CFH2CH3、-CHF2CH3、-CF3CH3、-CH2CFH2、-CH2CHF2、-CH2CF3、-CFH2CH3、-CFH2CFH2、-CFH2CHF2、-CFH2CF3、-CHF2CH3、- CHF2CFH2、-CHF2CHF2、-CHF2CF3、-CH2CH2CH3、CF2CH2CH3、 CH2CF2CH3、CH2CH2CF3、CF2CF2CH3、CH2CF2CF3、CF2CH2CF3、 CF2CF2CF3、CHFCH2CH3、CHFCHFOCH3、CHFCH2CFH2、CHFCH2CHF2和CH2CHFCH3。在实施方案中，R1为-CH3(或Me)或-CH2CH3(或 Et)。在实施方案中，式II核苷酸选自由以下项组成的组：
在式(I’)或(II’)的化合物中，Y可以为O或S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为S(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30等)。在其他实施方案中，在至少一种情况下，Y为S，并且在至少另一种情况下，Y为O。在其他实施方案中，Y在每种情况下为S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为O(例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)。
本发明所公开的寡核苷酸包含式(I’)的至少一个核苷酸。在实施方案中，本发明所公开的寡核苷酸包含式(I’)的1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个核苷酸。在实施方案中，本发明所公开的寡核苷酸包含式(II’)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含2至40个核苷酸，例如8至26个核苷酸或介于其间的整数。
在包含多于一个式(I’)的核苷酸的实施方案中，该核苷酸可以相同或不同。在一些实施方案中，包含一个或多个式(II’)的核苷酸，并且这些核苷酸可以相同或不同。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式(I’)的核苷酸和至少一个式(II’)的核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个式(I’)的核苷酸，其中至少一个R1为MOE，和至少一个式(II’)的核苷酸，其中R2为Me或Et。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少2个式(I’)和式(II)交替的核苷酸。例如，具有交替的2’修饰(例如，Me-MOE-Me-MOE...或Et-MOE-Et-MOE-Et-MOE...)的2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24个核苷酸。
在一些实施方案中，可包含式(I’)和/或式(II’)的核苷酸，并且该核苷酸由下式表示：
在一些实施方案中，寡核苷酸包含式(I)的核苷酸和/或包含式(IIIa’)和/或(IIIb’)的2’-氟核苷酸：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，并且B为核碱基。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少4个式(I’)和(IIIa’)交替的核苷酸。例如，寡核苷酸包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个交替的核苷酸。
某些实施方案包括包含4-40个核苷酸的寡核苷酸，并且包含式 (IV’)：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，B为核碱基，R1为- (CR’2)2OCR’3，R2选自-OCR’3、-OCR’2OCR’3、-O(CR’2)3OCR’3或- O(CR’2)1-2CR’3和F，R’在每种情况下独立地为H或F，并且a为1-10的整数，并且b为1-10的整数，其中至20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
本公开的化合物包括包含下式(III’)的化合物：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，并且B在每种情况下独立地为天然或未修饰的核碱基或修饰的核碱基；并且任选地包含式(I)、 (II)和/或(IV)中的一种或多种。
式(I’)、(II’)、(IIIa’)、(IIIb’)、(IV’)和(V’)的核苷酸的核碱基B可各自独立地为天然或未修饰的核碱基或修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括2，6-二氨基嘌呤核碱基，但任选地不包括腺嘌呤。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括 2，6-二氨基嘌呤核碱基，但不包括腺嘌呤，并且包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。
在式(II’)、(IIIa’)、(IIIb’)、(IV’)和(V’)的每个核苷酸中的Y可独立地为O或S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为S (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)。在其他实施方案中，在至少一种情况下，Y为S，并且在至少另一种情况下，Y为 O。在其他实施方案中，Y在每种情况下为S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为O(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30等)。
在包含式(I’)、(II’)、(IIIa’)、(IIIb’)、(IV’)和(V’)各自的多于一个核苷酸的实施方案中，多于一个此类式的核苷酸可以相同或不同。例如，在一些实施方案中，除了至少一个式(I)的核苷酸之外，该核苷酸还包含至少一个式(II’)、(III’)、(IV’)、(V’)和/或(V’)的核苷酸。在一些实施方案中，该核苷酸包含至少2个式(I’)和/或式(II’) 和/或(III’)和/或(IV’)、(V’)和/或(V’)交替的核苷酸。例如，所公开的寡核苷酸可包括具有交替的2’修饰的2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个核苷酸。
在实施方案中，寡核苷酸的核苷酸选自由以下项组成的组：
其中B可以为任何天然或修饰的碱基。
本公开的化合物包括包含下式(V”)的化合物：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，B在每种情况下独立地为天然或未修饰的核碱基或修饰的核碱基，A为-(CR”R”)1-2-并且R”在每种情况下独立地为H、F或Me，并且任选地包括式(I’)、(II’)、 (III’)、(IV’)或(V’)中的一种或多种。
在包含式(V”)的化合物中，A为-(CR”R”)1-2-。在一些实施方案中，A为-(CR”R”)-，在其他实施方案中，A为-(CR”R”)2-。R”在每种情况下独立地为H或Me。在一些实施方案中，一个R”为Me，并且剩余为 H。在其他实施方案中，所有R”为H。
在一些实施方案中，当A为CH2时，则Y为S。在其他实施方案中，当A为CH2CH2时，则Y为O或S。在一些实施方案中，A为CH2CH(Me) 或CH(Me)，并且Y为O或S。
在包含式(V”)的化合物中，Y为O或S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为S(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30等)。在其他实施方案中，在至少一种情况下，Y为S，并且在至少另一种情况下，Y为O。在其他实施方案中，Y在每种情况下为S。在一些实施方案中，在至少一种情况下，Y为O(例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30等)。
式(V”)(以及任选的式(I′)、(II′)、(III′)、(IV′)和/或 (V′))的化合物可以为寡核苷酸的一部分。在一些实施方案中，包含式 (IV′)(以及任选的式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)和/或(V’)) 的化合物为包含式(V”)(和式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)和/或 (V’))的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含2至40个核苷酸，例如8至26个核苷酸或介于其间的整数。
在包含多于一个式(V’)的核苷酸的实施方案中，该多于一个式 (V’)的核苷酸可以相同或不同。在一些实施方案中，包含式(I’)、 (II’)、(III’)、(IV’)和/或(V’)的一个或多个核苷酸，并且这些核苷酸可以相同或不同。例如，在一些实施方案中，该核苷酸包含至少一个式(V’)的核苷酸和至少一个式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)和/或 (V’)的核苷酸。在一些实施方案中，该核苷酸包含至少2个式(V”)和式(I’)和/或式(II’)交替的核苷酸。例如，具有交替的2’修饰的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24个核苷酸。
在一些实施方案中，包括式(V’)(以及任选的式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)和/或(V’))的核苷酸在内的核苷酸还包含具有以下结构的2-氟核苷酸：
其中Y、R和B与式(I’)相同。在一些实施方案中，核苷酸包含至少4个式(V’)和2-氟核苷酸交替的核苷酸。
本公开的化合物包括包含下式(V’)的化合物：
其中Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，并且B在每种情况下独立地为天然或未修饰的核碱基或修饰的核碱基；并且任选地包含式(I’)、 (II’)、(III’)、(IV’)、(V’)和/或(V”)中的一种或多种。
以下缩写用于该公开中。2’-H(脱氧核糖)核苷由对应于核碱基的大写字母表示，例如A、C、G和T。2’-O-甲基化(2’-O-Me)核苷由小写m 和对应于核碱基的大写字母来表示，例如mA、mC、mG和mU。2’-O- Me，5-甲基胞嘧啶缩写为5mmC。
对于核苷酸的主链或亚基间的键、磷酸二酯亚基间的键被称为“PO”，或通常不包括在序列细节中；硫代磷酸酯亚基间的键缩写为小写的“ps”；氨基磷酸酯亚基间的键缩写为小写的“np”；并且硫代氨基磷酸酯亚基间的键缩写为小写的“nps”。
在实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一者的至少一种核苷酸被修饰为包括5-甲基胞嘧啶核碱基、在2’位置处的O-Me修饰(mA、5mmC、mG 和mU)和核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。在实施方案中，SEQ ID NO： 1-65中任一者的每个核苷酸如下进行修饰：
(a)具有胞嘧啶核碱基的每个核苷酸均被修饰成2’-O-Me，5-甲基胞嘧啶(5mmC)；
(b)每个其他核苷酸也被修饰成在2’位置处包括O-Me修饰(mA、 mG和mU)；以及
(c)每个核苷酸包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
例如，SEQ ID NO：1-13可如表2中所示进行修饰。SEQ ID NO：1的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：66。SEQ ID NO：2的寡核苷酸可被修饰为 SEQ ID NO：67。SEQ ID NO：3的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：68。 SEQ ID NO：4的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：69。SEQID NO：5的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：70。SEQ ID NO：6的寡核苷酸可被修饰为 SEQID NO：71。SEQ ID NO：7的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：72。 SEQ ID NO：8的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：74。SEQ ID NO：9的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：75。SEQ ID NO：10的寡核苷酸可被修饰为 SEQ ID NO：76。SEQ ID NO：11的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：77。 SEQ ID NO：12的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：78。SEQ ID NO：13的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：79。
在实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一者的至少一种核苷酸被修饰为包括5-甲基胞嘧啶核碱基、在2’位置处的O-Me修饰(mA、5mmC、mG 和mU)和核苷酸之间的硫代氨基磷酸酯(NPS)键。在实施方案中，SEQ ID NO：1-65中任一者的每个核苷酸如下进行修饰：
(a)具有胞嘧啶核碱基的每个核苷酸均被修饰成2’-O-Me，5-甲基胞嘧啶(5mmC)；
(b)每个其他核苷酸也被修饰成在2’位置处包括O-Me修饰(mA、 mG和mU)；以及
(c)每个核苷酸包含核苷酸之间的硫代氨基磷酸酯(NPS)键。
例如，SEQ ID NO：7的寡核苷酸可被修饰为SEQ ID NO：73，如表2 中所示。
表2
在实施方案中，配体靶向部分缀合到寡核苷酸。靶向部分包括GalNAc 诸如GalNAc-1-13。例如，在一些实施方案中包括以下GalNAc衍生物。以下示出了附接到接头或载体的GalNAc部分，如结构中所指示的。
GalNAc-1
GalNAc-2-CPG
GalNAc-3-CPG
GalNAc-4-CPG
GalNAc-5-CPG
GalNAc-6
GalNAc-7
GalNAc-8
GalNAc-9
GalNAc-10
GalNAc-11
GalNAc-12
GalNAc-13
可在本公开的寡核苷酸的3’和/或5’末端处缀合GalNAc衍生物。例如，SEQ ID NO：71的寡核苷酸可包括3’GalNAc(SEQ ID NO：80)。其他靶向部分可包括棕榈酰修饰或生育酚修饰。例如，SEQ ID NO：71的寡核苷酸可包括3’棕榈酰基(SEQ ID NO：81)或3’生育酚基(SEQ ID NO：82)。
治疗和预防方法
以下的讨论仅以举例的方式给出，并非旨在进行限制。
本公开的一个方面包括用于治疗被诊断为患有、疑似患有HBV感染和 /或HBV相关障碍或处于患有HBV感染和/或HBV相关障碍风险的受试者的方法。在治疗应用中，以足以治愈、或至少部分停止疾病的症状(包括该疾病发展中的其并发症和中间病理表型)的量，将包含本公开的寡聚核苷酸的组合物施用于疑似、或已经患有此类疾病的受试者(例如，在受试者的血清和/或肝脏中持续存在HBV cccDNA，存在HBV抗原(例如， HBsAg和/或HBeAg)，或升高的HBV病毒负载水平)。
患有HBV感染和/或HBV相关障碍的受试者可通过本领域已知的诊断或预后测定中的任一种或组合(包括检测本文所述的HBV感染和/或HBV 相关障碍的典型症状)来鉴定。
本公开提供了用于治疗被诊断为患有或疑似患有HBV感染和/或HBV 相关障碍的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸组合物。
在一些实施方案中，用本公开的寡核苷酸组合物治疗的受试者将表现出以下症状中一种或多种的改善或消除：存在肝HBV cccDNA、存在血清和/或肝HBV抗原(例如HBsAg和/或HBeAg)、不存在抗HBV抗体或其水平偏低、肝损伤、肝硬化、丁型肝炎、急性乙型肝炎、急性暴发性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纤维化、终末期肝病、肝细胞癌、血清病样综合征、厌食症、恶心、呕吐、低烧、肌肉痛、易疲劳、味觉紊乱和嗅觉紊乱 (厌恶食物和香烟)、右上腹部和上腹部痛(间歇性，轻微至中度)、肝性脑病、嗜睡症、睡眠模式紊乱、精神错乱、昏迷、腹水、消化道出血、凝血病、黄疸、肝肿大(轻度增大、软肝)、脾肿大、手掌红斑、蜘蛛状痣、肌肉萎缩、蜘蛛痣、血管炎、静脉曲张出血、外周性水肿、男性乳房发育、睾丸萎缩、腹部侧支静脉(脐周静脉曲张)、ALT水平高于AST水平、白血球减少症(即，粒细胞减少)、减少的白蛋白水平、升高的血清铁水平、淋巴球增多、增加的红细胞沉降率(ESR)、缩短的红血球存活期、溶血反应、血小板减少症、国际标准化比率(INR)延长、存在血清 HBV DNA、延长的前凝血酶时间(PT)、血球蛋白过多、存在组织非特异性抗体诸如抗平滑肌抗体(ASMA)或抗细胞核抗体(ANA)、存在组织特异性抗体诸如对抗甲状腺的抗体、高胆红素血症、低血小板和白血球计数、AST水平高于ALT水平、伴有退行性和再生性肝细胞改变的小叶炎症、以及主要在小叶中心的坏死。
在一些实施方案中，与患有HBV感染和/或HBV相关障碍的未治疗受试者相比，用本公开的寡核苷酸组合物治疗的受试者将表现出一种或多种生物标记物的表达水平减少，所述生物标记物选自：丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、胆红素和类风湿因子(RF)。
在一些实施方案中，向患有HBV感染和/或HBV相关疾病的受试者施用靶向HBVcccDNA的寡核苷酸，使得与在施用该寡核苷酸之前在受试者中观察到的水平相比，例如在受试者的细胞、组织、血液或其他生物流体中的HBV cccDNA水平、HBV抗原水平、HBV病毒负载水平、ALT水平、和/或AST水平中的一种或多种减少至少约10％、11％、12％、13％、 14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、 25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、 36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、 47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、 58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％或更多。
在一些实施方案中，向患有HBV感染和/或HBV相关疾病的受试者施用靶向HBVcccDNA的寡核苷酸，使得与在施用该寡核苷酸之前在受试者中观察到的水平相比，例如在受试者的细胞、组织、血液或其他生物流体中的抗HBV抗体的水平增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、 16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、 38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、 49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％或更多。
本公开的方法包括施用本文所述的寡核苷酸组合物使得HBV cccDNA 水平减少并持续约1小时、2小时、3小时、45小时、6小时、7小时、8 小时、12小时、16小时、18小时、24小时、28小时、32小时、36小时、 40小时、44小时、48小时、52小时、56小时、60小时、64小时、68小时、72小时、76小时、或约80小时。在一个实施方案中，HBV cccDNA 水平减小并持续延长的持续时间，例如至少约两天、三天、四天、五天、六天、七天或更多，或约一周、两周、三周或约四周或更多。
在一些实施方案中，施用本公开的寡核苷酸组合物使例如患者的细胞、组织、血液、尿液或器官中的肝HBV cccDNA的存在、HBV DNA (例如，rcDNA)水平、血清和/或肝HBV抗原(例如，HBsAg和/或HBeAg)的存在、ALT水平、和/或AST水平减少至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、 19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、 30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、 41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、 59％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、 74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、或至少约99％或更多，例如至低于测定的检测水平。
除此之外或另选地，在一些实施方案中，施用本公开的寡核苷酸组合物使例如患者的细胞、组织、血液、尿液或器官中的血清和/或肝抗HBV 抗体的存在增加至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、 13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、 24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、 35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、 46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、 57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、 79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％或更多。
在一个方面，本公开提供了用于在HBV cccDNA中诱导D-环形成的方法，所述方法包括使HBV cccDNA与具有SEQ ID NO：1-82中任一种的序列的寡核苷酸接触。在另一方面，本公开提供了用于在HBV cccDNA中诱导D-环形成的方法，所述方法包括使由核苷酸位置900-1310组成的HBV cccDNA基因组的靶区域(增强子I区域)与和HBV cccDNA的靶区域至少90％互补的寡核苷酸接触。在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸与 HBV cccDNA杂交以诱导抗原D-环结构的形成。在一些实施方案中，D-环形成的诱导刺激先天免疫。
就治疗应用而言，向受试者施用本公开的寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物一次、两次、三次、四次或五次。在一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物多于五次。除此之外或另选地，在一些实施方案中，每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、或每六天施用寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，每周、每两周、每三周或每月施用寡核苷酸组合物。在一些实施方案中，施用寡核苷酸组合物一周、两周、三周、四周或五周的时间段。在一些实施方案中，施用寡核苷酸组合物六周或更长时间。在一些实施方案中，施用寡核苷酸组合物十二周或更长时间。在一些实施方案中，施用寡核苷酸组合物少于一年的时间段。在一些实施方案中，施用寡核苷酸组合物多于一年的时间段。
在本公开的方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物并持续 1周或更长时间。在本公开的方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物并持续2周或更长时间。在本公开的方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物并持续3周或更长时间。在本公开的方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物并持续4周或更长时间。在本公开的方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物并持续6周或更长时间。在本公开的方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸组合物并持续12周或更长时间。
可例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减少、生活质量，维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标记物的水平或适合待治疗的给定疾病的任何其他可测量参数来评估疾病的治疗功效。通过测量此类参数中的任一个或参数的任意组合来监测治疗功效，这完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可通过定期监测病毒载量和转氨酶水平来评估 CHB的治疗功效。比较较后读数与初始读数提供治疗是否有效的指示。
施用模式
本公开提供了包含本公开的寡核苷酸的药物组合物和制剂。该药物组合物可用于治疗与HBV感染相关的疾病或障碍。
在某些实施方案中，药物组合物包括如本文所述的寡核苷酸，和药学上可接受的载体。此类药物组合物基于递送模式来配制。
本公开的药物组合物可以多种方式施用，这取决于是否期望局部治疗或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部施用、肝内施用、透皮施用(例如通过透皮贴剂)、肺部施用(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器施用)、气管内施用、鼻内施用、表皮施用、口服施用、直肠施用、或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注，真皮下施用，例如经由植入装置，或颅内施用，例如通过脑实质内、鞘内或心室内施用。
在一些实施方案中，药物组合物被配制用于经由肠胃外递送来全身施用，例如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、真皮下施用、颅内施用或皮下施用。在某些实施方案中，药物组合物被配制用于直接递送到脑实质中，例如通过连续泵输注而输注到脑中。
在一些实施方案中，施用经由积存注射来进行。积存注射可在延长的时间段内以一致方式释放寡核苷酸。因此，积存注射可减少获得期望的治疗或预防效果所需的给药频率。积存注射也可提供更一致的血清浓度。积存注射可包括皮下注射或肌内注射。
在一些实施方案中，施用通过泵来进行。所述泵可以是外部泵或外科植入式泵。在某些实施方案中，泵为皮下植入的渗透泵。在其他实施方案中，泵为输液泵。输液泵可用于静脉输注、皮下输注、动脉输注或硬膜外输注。在某些实施方案中，输液泵为皮下输液泵。在其他实施方案中，泵是向肝脏递送寡核苷酸的外科植入式泵。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉末。可包括常规的药物载体，水性、粉末状或油性基质、增稠剂等。合适的局部用制剂包括其中本公开中表征的寡核苷酸与局部递送试剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。合适的脂质和脂质体可以为中性的(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)，阴离子的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油 DMPG)或阳离子的(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开中表征的寡核苷酸可包封在脂质体内或可与其形成络合物，具体地与阳离子脂质体形成络合物。另选地，寡核苷酸可络合至脂质，具体地阳离子脂质。合适的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油基酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。典型的制剂描述于美国专利6,747,014中，该专利文献以引用方式并入本文。
对于口服施用，可使用液体或固体制剂。此类制剂的示例包括片剂、明胶胶囊、丸剂、锭剂、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片、口香糖等。如本领域从业人员所理解的，本公开的寡核苷酸可与合适的药物载体(溶媒)或赋形剂混合。载体和赋形剂的示例包括淀粉、乳、糖、某些类型的粘土、明胶、乳酸、硬脂酸或其盐(包括硬脂酸镁或硬脂酸钙)、滑石、植物脂肪或油、树胶和二醇。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可与赋形剂合并使用，并以片剂、锭剂或胶囊(例如明胶胶囊)的形式使用。口服组合物还可使用流体载体制备，以用作漱口水。可包含药物相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含以下成分中的任一种，或类似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖、崩解剂诸如藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶态二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂如胡椒薄荷、水杨酸甲酯、或橙子调味剂。
本公开的药物组合物可以以足以靶向HBV的cccDNA的剂量施用。
在一个实施方案中，将本公开的寡核苷酸以基于体重的剂量施用于受试者。“基于体重的剂量”(例如，以mg/kg为单位的剂量)是随受试者的体重而变化的寡核苷酸的剂量。在另一个实施方案中，将寡核苷酸以固定剂量施用于受试者。“固定剂量”(例如，以mg为单位的剂量)意指对于全部受试者使用相同寡核苷酸剂量，不考虑任何特定的受试者相关因素，诸如体重。在一个具体实施方案中，本公开的寡核苷酸的固定剂量基于预定的体重或年龄。
一般来讲，本公开的寡核苷酸的合适剂量将在约0.0001毫克/千克受体体重/天至约200.0毫克/千克受体体重/天的范围内，或在约1mg/千克体重/ 天至50mg/千克体重/天的范围内。例如，寡核苷酸可以以每天约 0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约 2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、或约 40mg/kg、或约50mg/kg来施用。
向受试者施用治疗有效量的本公开的寡核苷酸，诸如约0.01mg/kg、 0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、 0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、 0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、 0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、 1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、 2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、 3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、 3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4.0mg/kg、4.1mg/kg、 4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、 4.8mg/kg、4.9mg/kg、5.0mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、 5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、 6.0mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、 6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7.0mg/kg、7.1mg/kg、 7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、 7.8mg/kg、7.9mg/kg、8.0mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、 8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、 9.0mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、 20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、或约 50mg/kg寡核苷酸。还可想到所列举值中间的值和范围也为本公开的一部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、 0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、 1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、 1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、 2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、 3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、 4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、 4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、 5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、 5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、 7mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、 8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、 8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、 9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9、.或约10mg/kg 的剂量施用。还可想到所列举值中间的值和范围也为本公开的一部分。
在另一个实施方案中，寡核苷酸按以下剂量施用：约0.1mg/kg至约 50mg/kg、约0.25mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg至约50mg/kg、约 0.75mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1.5mg/kg至约 50mg/kg、约2mg/kg至约50mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg、约3mg/kg 至约50mg/kg、约3.5mg/kg至约50mg/kg、约4mg/kg至约50mg/kg、约 4.5mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约7.5mg/kg至约 50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约 20mg/kg至约50mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约35mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约 45mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约45mg/kg、约0.25mg/kg至约 45mg/kg、约0.5mg/kg至约45mg/kg、约0.75mg/kg至约45mg/kg、约 1mg/kg至约45mg/kg、约1.5mg/kg至约45mg/kg、约2mg/kg至约 45mg/kg、约2.5mg/kg至约45mg/kg、约3mg/g至约45mg/kg、约 3.5mg/kg至约45mg/kg、约4mg/kg至约45mg/kg、约4.5mg/kg至约 45mg/kg、约5mg/kg至约45mg/kg、约7.5mg/kg至约45mg/kg、约10mg/kg 至约45mg/kg、约15mg/kg至约45mg/kg、约20mg/kg至约45mg/kg、约 25mg/kg至约45mg/kg、约30mg/kg至约45mg/kg、约35mg/kg至约 45mg/kg、约40mg/kg至约45mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约 0.25mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约40mg/kg、约0.75mg/kg至约 40mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约1.5mg/kg至约40mg/kg、约2mg/kg 至约40mg/kg、约2.5mg/kg至约40mg/kg、约3mg/kg至约40mg/kg、约 3.5mg/kg至约40mg/kg、约4mg/kg至约40mg/kg、约4.5mg/kg至约 40mg/kg、约5mg/kg至约40mg/kg、约7.5mg/kg至约40mg/kg、约10mg/kg 至约40mg/kg、约15mg/kg至约40mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约 25mg/kg至约40mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约35mg/kg至约40mg/kg、约0.1mg/kg至约30mg/kg、约0.25mg/kg至约30mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.75mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约 30mg/kg、约1.5mg/kg至约30mg/kg、约2mg/kg至约30mg/kg、约 2.5mg/kg至约30mg/kg、约3mg/kg至约30mg/kg、约3.5mg/kg至约 30mg/kg、约4mg/kg至约30mg/kg、约4.5mg/kg至约30mg/kg、约5mg/kg 至约30mg/kg、约7.5mg/kg至约30mg/kg、约10mg/kg至约30mg/kg、约15mg/kg至约30mg/kg、约20mg/kg至约30mg/kg、约25mg/kg至约 30mg/kg、约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.25mg/kg至约20mg/kg、约 0.5mg/kg至约20mg/kg、约0.75mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约 20mg/kg、约1.5mg/kg至约20mg/kg、约2mg/kg至约20mg/kg、约 2.5mg/kg至约20mg/kg、约3mg/kg至约20mg/kg、约3.5mg/kg至约 20mg/kg、约4mg/kg至约20mg/kg、约4.5mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg 至约20mg/kg、约7.5mg/kg至约20mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、或 15mg/kg至约20mg/kg。还可想到所列举值中间的值和范围也为本公开的一部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以约0.01mg/kg、0.02mg/kg、 0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、 0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、 0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、 1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、 1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、 2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、 3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、 3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、 4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、 4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、 6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、 6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、7.1mg/kg、 7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、 7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、 8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9、或约10mg/kg的剂量施用。还可想到所列举值中间的值和范围也为本公开的一部分。
在某些实施方案中，可向受试者施用单一治疗有效量的寡核苷酸，诸如约0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、 0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、 0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、0.6mg/kg、 0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、0.7mg/kg、0.725mg/kg、 0.75mg/kg、0.775mg/kg、0.8mg/kg、0.825mg/kg、0.85mg/kg、 0.875mg/kg、0.9mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、1mg/kg、 1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、 1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、 2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、 2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、 4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、 4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、 5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、 5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、 6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、 7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、 8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、 8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、 9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、 10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、 13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、 16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、 19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、 22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、25.5mg/kg、26mg/kg、26.5mg/kg、27mg/kg、27.5mg/kg、28mg/kg、 28.5mg/kg、29mg/kg、29.5mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、 40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、 47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、或约50mg/kg。还可想到所列举值中间的值和范围也为本公开的一部分。
在其他实施方案中，向受试者施用多剂量的治疗有效量的寡核苷酸，诸如以下剂量：约0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、 0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、 0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、 0.475mg/kg、0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、0.7mg/kg、0.725mg/kg、 0.75mg/kg、0.775mg/kg、0.8mg/kg、0.825mg/kg、0.85mg/kg、 0.875mg/kg、0.9mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、1mg/kg、 1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、 2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、 2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、 3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、 4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、 4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、 5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、 6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、 7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、 7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、 8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、 8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、 9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、 13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、 19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、 25.5mg/kg、26mg/kg、26.5mg/kg、27mg/kg、27.5mg/kg、28mg/kg、 28.5mg/kg、29mg/kg、29.5mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、 33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、 47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、或约50mg/kg。多剂量方案可包括每天施用治疗有效量的寡核苷酸，诸如持续两天、三天、四天、五天、六天、七天或更长时间。
在其他实施方案中，向受试者施用重复剂量的治疗有效量的寡核苷酸，诸如以下剂量：约0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、 0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、 0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、 0.475mg/kg、0.5mg/kg、0.525mg/kg、0.55mg/kg、0.575mg/kg、0.6mg/kg、0.625mg/kg、0.65mg/kg、0.675mg/kg、0.7mg/kg、0.725mg/kg、 0.75mg/kg、0.775mg/kg、0.8mg/kg、0.825mg/kg、0.85mg/kg、 0.875mg/kg、0.9mg/kg、0.925mg/kg、0.95mg/kg、0.975mg/kg、1mg/kg、 1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、 2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、 2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、 3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、 4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、 4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、 5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、 6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7mg/kg、 7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、 7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、 8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、 9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、 13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、 16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、 19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg、21mg/kg、21.5mg/kg、22mg/kg、22.5mg/kg、23mg/kg、23.5mg/kg、24mg/kg、24.5mg/kg、25mg/kg、 25.5mg/kg、26mg/kg、26.5mg/kg、27mg/kg、27.5mg/kg、28mg/kg、 28.5mg/kg、29mg/kg、29.5mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、 33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、 47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、或约50mg/kg。重复剂量方案可包括定期，诸如每隔一天、每三天、每四天、每周两次、每周一次、每隔一周或每月一次来施用治疗有效量的寡核苷酸。
例如，可按以下剂量施用本公开的寡核苷酸，例如药物组合物中的寡核苷酸：约0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、 0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、 0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/g、 0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、 0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、 0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、 0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、 0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、 0.45mg/kg、0.475mg/kg、或约0.5mg/kg。前述所列值的中间值也旨在为本公开的一部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸按以下固定剂量施用：介于约100mg至约900mg之间、介于约100mg至约850mg之间、介于约100mg至约 800mg之间、介于约100mg至约750mg之间、介于约100mg至约700mg 之间、介于约100mg至约650mg之间、介于约100mg至约600mg之间、介于约100mg至约550mg之间、介于约100mg至约500mg之间、介于约 200mg至约850mg之间、介于约200mg至约800mg之间、介于约200mg 至约750mg之间、介于约200mg至约700mg之间、介于约200mg至约 650mg之间、介于约200mg至约600mg之间、介于约200mg至约550mg 之间、介于约200mg至约500mg之间、介于约300mg至约850mg之间、介于约300mg至约800mg之间、介于约300mg至约750mg之间、介于约 300mg至约700mg之间、介于约300mg至约650mg之间、介于约300mg 至约600mg之间、介于约300mg至约550mg之间、介于约300mg至约 500mg之间、介于约400mg至约850mg之间、介于约400mg至约800mg 之间、介于约400mg至约750mg之间、介于约400mg至约700mg之间、介于约400mg至约650mg之间、介于约400mg至约600mg之间、介于约 400mg至约550mg、或介于约400mg至约500mg之间。
在一些实施方案中，该寡核苷酸按以下固定剂量施用：约100mg、约 125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约 275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约 425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约 575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约 725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约 875mg、约900mg。
寡核苷酸可在一段时间内通过静脉内输注施用，诸如在5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22 分钟、23分钟、24分钟或约25分钟的时间段。可例如定期重复施用，诸如每周、每两周(即每两个星期)持续一个月，两个月、三个月、四个月或更长时间。在初始治疗方案之后，可以较不频繁的规律施用所述治疗。例如，每周或每两周施用持续三个月后，可每月重复施用一次持续六个月或一年或更长时间。
药物组合物可每日施用一次，或者可在整个一天中以适当的间隔施用两个、三个或更多个子剂量，或甚至使用连续输注或通过控释制剂递送。在一个实施方案中，每个子剂量中包含的寡核苷酸必须相应地更小以便实现总的每日剂量。剂量单位也可在数天内配混以供递送，例如使用常规持续释放制剂，其在数天的时间段内提供寡核苷酸的持续释放。持续释放制剂是本领域所熟知的，并且特别可用于在特定部位递送药剂。在一个实施方案中，剂量单位包含日剂量的相应倍数。
在其他实施方案中，单一剂量的药物组合物可以是长效的，使得后续剂量以不超过3天、4天或5天的间隔，或以不超过1周、2周、3周或4 周的间隔施用。在一些实施方案中，每周一次施用单一剂量的本公开的药物组合物。在其他实施方案中，每两月施用单一剂量的本公开的药物组合物。在一些实施方案中，每月一次、每隔一月一次、或每季度一次(即，每三月)施用单一剂量的本公开的药物组合物。
本公开所涵盖的独立寡核苷酸的有效剂量和体内半衰期的估计可使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试来进行。
在该方法的一些实施方案中，寡核苷酸可口服施用、局部施用、全身施用、静脉内施用、皮下施用、经皮施用、鞘内施用、鼻内施用、腹膜内施用、肝内施用或肌内施用。
在该方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸并持续1周或更长时间。在该方法的其他实施方案中，每天施用寡核苷酸并持续2周或更长时间。在该方法的某些实施方案中，每天施用寡核苷酸并持续3周或更长时间。在该方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸并持续4周或更长时间。在该方法的其他实施方案中，每天施用寡核苷酸并持续6周或更长时间。在该方法的一些实施方案中，每天施用寡核苷酸并持续12周或更长时间。
联合治疗
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸组合物可与一种或多种附加的治疗剂组合用于改善或治疗HBV感染或和/或HBV相关障碍。应当理解，在联合疗法中，用于HBV感染的本公开的寡核苷酸组合物和一种或多种附加治疗可同时在相同或分开的组合物中施用，或独立、同时或顺序地施用。
可用于联合疗法中的附加治疗剂的示例包括但不限于，抗病毒剂、核苷酸类似物、核苷类似物、逆转录酶抑制剂(例如，富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)、替诺福韦艾拉酚胺、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦 (ETV)、替比夫定、AGX-1009、恩曲他滨、克拉夫定、利托那韦、福韦酯(dipivoxil)、洛布卡韦、泛昔洛韦、FTC、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、 PC1323、theradigm-HBV、胸腺素-α、CMX157、AGX-1009和更昔洛韦)、免疫刺激剂(例如，聚乙二醇化干扰素α-2a(PEG-IFN-Cc2a)、干扰素α-2b、重组人白介素-7和Toll样受体7(TLR7)激动剂)、治疗性疫苗(例如，GS-4774、DV-601、TG1050、Heplislav、ABX203和INO- 1800)、病毒侵入抑制剂(例如，Myrcludex)、siRNA(例如，ARC520、 ARC521、ALN-HBV、ARB-1467等)、反义寡核苷酸(例如，IONIS- HBV-L Rx等)、抑制HBsAg分泌或释放的寡核苷酸(例如，REP 9AC)、衣壳抑制剂(例如，Bay41-4109、NVR-1221、NVR 3-778、JNJ- 379、AB-423、GLS-4、HAP-1和AT-1)、cccDNA抑制剂(例如，IHVR- 25)、TLR激动剂(例如，GS-9620、ARB-1598、ANA975、RG7795(ANA773)、MEDI9197、PF-3512676和IMO-2055)、miRNA模拟物或抑制剂、适体、空间阻断剂、短激活RNA(saRNA)、免疫调节寡核苷酸、或其他治疗剂和/或程序，例如肝移植和化学疗法。
多种治疗剂可以任何顺序或甚至同时施用。如果同时，则多种治疗剂可以单一的、统一的形式或以多种形式(仅以举例的方式，以单一丸剂形式或两种独立丸剂形式)提供。治疗剂中的一种可以多个剂量给出，或者两者均可以多个剂量给出。如果不同时，则多个剂量之间的定时可在多于零周到少于四周的范围内变化。此外，所述组合方法、组合物和制剂不应限于仅使用两种试剂。
在一些实施方案中，除了施用寡核苷酸之外，该方法还包括向受试者独立、顺序地或同时施用一种或多种附加的治疗剂，所述附加的治疗剂选自由以下项组成的组：抗病毒剂、核苷酸类似物、核苷类似物、逆转录酶抑制剂、免疫刺激剂、治疗疫苗、病毒侵入抑制剂、衣壳抑制剂和cccDNA 抑制剂。在一些实施方案中，逆转录酶抑制剂为富马酸替诺福韦二吡呋酯 (TDF)、替诺福韦艾拉酚胺、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦 (ETV)、替比夫定、AGX-1009、恩曲他滨、克拉夫定、利托那韦、福韦酯(dipivoxil)、洛布卡韦、泛昔洛韦、FTC、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、 PC1323、theradigm-HBV、胸腺素-α、CMX157、AGX-1009或更昔洛韦。
在某些实施方案中，免疫刺激剂是聚乙二醇化干扰素α-2a(PEG-IFN- Cc2a)、干扰素α-2b、重组人白介素-7或Toll样受体7(TLR7)激动剂。在一些实施方案中，治疗疫苗为GS-4774、DV-601或TG1050。在其他实施方案中，病毒侵入抑制剂为Myrcludex，并且cccDNA抑制剂为IHVR- 25。在一些实施方案中，衣壳抑制剂为Bay41-4109、NVR-1221、NVR 3- 778或JNJ-379。在一些实施方案中，siRNA为ARC520、ARC521、ALN- HBV或ARB-1467，并且反义寡核苷酸为IONIS-HBV-L Rx。
试剂盒
本公开还提供了靶向乙型肝炎病毒(HBV)的cccDNA的试剂盒。本公开的试剂盒包含一种或多种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：1-82组成的组的序列，或它们的修饰。该试剂盒还可包括使用说明、包装(诸如旨在用于商业销售的包装)等。
实施例
实施例1：本公开的寡核苷酸减少感染的原代人肝细胞中的病毒抗原
所有寡核苷酸均通过固相合成制备。合成了跨越(+)或(-)DNA链的约 200种不同的寡核苷酸。不同寡核苷酸对HBV基因表达(例如HBsAg、HBeAg、tox)的生物效应在HBV(+)原代人肝细胞(PHH)中以3种不同的剂量(0.3、3或30μM)进行筛选。
培养和感染：根据制造商的说明将原代人肝细胞(PHH) (BioreclamationIVT，Baltimore，MD)解冻并接种到BiocoatTMCollagen I Cellware 96孔、24孔或6孔板(CorningInc.，Corning，New York)上。将细胞在37℃下的水浴中解冻，并在原代肝细胞解冻和接种培养基 (ThermoFisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)中以100×g离心10分钟。将细胞重新悬浮并以8×105/ml以平板形式接种于肝细胞维持培养基 (HMM)：补充有FBS、胰岛素、EGF和地塞米松的DMEM (ThermoFisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)。在肝细胞维持培养基 (HMM)中接种后16小时，在4％(重量/体积)PEG 8000(Sigma)存在下，用50GE HBV感染PHH。24小时后，移除含有病毒的培养基，将细胞洗涤四次，并且在HMM中进一步温育4天。在4天时间段后，根据制造商的说明，用0.0015-10μm的寡核苷酸或载体经由用LipofactamineRNAiMax(ThermoFisher)转染来处理PHH。然后将经处理的PHH进一步温育6天，在6天温育时间段的中间点时进行单次培养基更换。
ELISA：根据制造商的说明，HBeAg ELISA和HBsAg ELISA各自分别利用HBe ELISA试剂盒(Autobio Diagnostics Co.Ltd.，Zhengzhou，China) 和sAg ELISA试剂盒(AutobioDiagnostics Co.Ltd.，Zhengzhou，China)针对PHH上清液进行。
qPCR：根据制造商的说明，使用MagMax总核酸分离试剂盒 (ThermoFisherScientific，Waltham，MA)从PHH中提取总HBV DNA，并且使用扩增HBV DNA的核心区域的标准qPCR测定进行定量。
结果：在PHH测定中测试的200个寡核苷酸中，基于用本发明所公开的寡核苷酸处理的PHH上清液中保留的HBeAg和HBsAg的减少得出，靶向从大约核苷酸位置960开始并且在大约核苷酸位置1330结束的HBV cccDNA基因组的增强子I区域周围的序列的寡核苷酸令人惊讶地表现出显著的抗病毒活性。表3示出采用所测试的观察到这种抗病毒活性的三种剂量0.3、3.0和30μM中任一种时的寡核苷酸浓度。
表3
选择表现出具有抗病毒活性的特定寡核苷酸以用于修饰。具体地， SEQ ID NO：1的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：66的寡核苷酸。SEQ ID NO：2的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：67的寡核苷酸。SEQ ID NO： 3的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：68的寡核苷酸。SEQ ID NO：4的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：69的寡核苷酸。SEQ ID NO：5的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：70的寡核苷酸。SEQ ID NO：6的寡核苷酸被修饰以产生SEQID NO：71的寡核苷酸。SEQ ID NO：7的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：72的寡核苷酸。SEQ ID NO：8的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：74的寡核苷酸。SEQ ID NO：9的寡核苷酸被修饰以产生 SEQ ID NO：75的寡核苷酸。SEQ ID NO：10的寡核苷酸被修饰以产生SEQ IDNO：76的寡核苷酸。SEQ ID NO：11的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：77的寡核苷酸。SEQID NO：12的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO： 78的寡核苷酸。SEQ ID NO：13的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：79的寡核苷酸。根据以下程序对寡核苷酸进行修饰。
2’-O-Me硫代磷酸酯寡核苷酸的合成：每种寡核苷酸在Mermade 12合成仪(Bioautomation，Plano，Texas)中以1μmol或2μmol的规模使用标准固相载体合成，该固相载体具有用N6-苯甲酰基-2’-OMe-腺苷、2’-OMe-尿苷、或N6-异丁酰基-2’-OMe-鸟苷衍生化的长链烷基胺可控孔。当3’最末核苷酸是5-甲基-2’-O-甲基-胞嘧啶时，使用通用接头固相载体 (ChemGenes，MA)代替。对于3’-GalNac和3’-生育酚缀合的寡核苷酸，使用相应的修饰的固相载体。使用的循环遵循以下步骤：解封闭-偶联-封端 -氧化-封端。2’-O-甲基亚磷酰胺制成无水乙腈中的0.1M溶液。5-乙基硫代四唑用作活化剂，3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液用于脱三苯甲基，乙酸酐的 THF溶液和16％N-甲基咪唑的THF溶液用于封端，并且氢化黄原素在吡啶中的0.1M溶液用于硫化。进行脱三苯甲基(2×45)s。对于所有碱基，在(2×360)s内实现定量偶联。每个封端步骤进行90秒。硫化在120秒内完成。在65℃下用氨/甲胺(AMA)实现从固相载体的脱保护和裂解并持续15分钟。当使用通用接头时，将脱保护在65℃下保持1小时。过滤以除去固相载体后，在GeneVac离心蒸发器中在真空下除去脱保护溶液。将粗制物溶于1M PBS中，并用Vivaspin-Hydrosart-2000 MWCO(Generon Ltd.，Berkshire，UK)通过超滤脱盐。通过HPLC分析(60℃，IEX- Thermo DNAPac PA-100，A-25mM磷酸钠/10％乙腈，pH 11，B-1.8M NaBr/25mM磷酸钠/10％乙腈，pH 11；RPIP-Waters XBridge OST C18，A-100mM HFIP 7mM TEA B-7∶3甲醇/乙腈)和ESI-MS分析，使用Promass Deconvolution forXcalibur来测定纯度和分子量。通过HPLC分析(60℃， IEX-Thermo DNAPac PA-100，A-25mM磷酸钠/10％乙腈，pH 11，B-1.8M NaBr/25mM磷酸钠/10％乙腈，pH 11；RPIP-WatersXBrikge OST C18，A- 100mM HFIP 7mM TEA B-7∶3甲醇/乙腈)和ESI-MS分析，使用PromassDeconvolution for Xcalibur(Novatia，Newtown，PA))测定纯度和分子量。
此外，根据以下程序，SEQ ID NO：7的寡核苷酸被修饰以产生SEQ ID NO：73的寡核苷酸。
3’-氨基-2’-脱氧硫代磷酸酯寡核苷酸的合成：3’-氨基-2’-脱氧硫代磷酸酯寡核苷酸如ZZielinska，D.；Pongracz，K；Gryaznov，S.M.，Tetrahedron Lett.47，4495-4499(2006)中所述合成。3-’氨基-2’-脱氧硫代磷酸酯磷酰胺单体在Pharmaron处定制合成。将所有单体在具有干燥剂(KOH和P2O5，室温下持续24小时)的真空干燥器中干燥。具有附接到第一5’残基的长链烷基胺可控孔的固相载体得自Prime Synthesis(Aston，PA)。使用解封闭-偶联-氧化-偶联-氧化-封端循环，从预加载在固相载体上的寡核苷酸的5’残基开始，使用标准寡核苷酸磷酸酰胺化学在Mermade 12合成仪 (Bioautomation，Plano，Texas)上合成RNA寡核苷酸。将亚磷酰胺制成无水乙腈中的0.1M溶液。将5-乙基硫代四唑用作活化剂，5％二氯乙酸的二氯甲烷溶液用于脱三苯甲基(50秒)。将异丁酸酐-二甲基吡啶-ACN 1∶1∶8和N-甲基咪唑的ACN溶液用于封端并且氢化黄原素在吡啶中的0.1M溶液用于硫化。所有碱基在(2×120)s内实现最佳偶联。将封端步骤进行90s。在240s(分成两次偶联)中完成硫化。在55℃下，用氨水实现从固相载体的脱保护和裂解并持续5小时。过滤以除去固相载体后，在Genevac离心蒸发器中在真空下除去脱保护溶液。然后使用离子交换色谱(源15Q， 20mMNaH2PO4，15％CH3CN，1.8M NaBr，在20柱体积上梯度5-50％B) 在GE Akta Explorer上纯化粗产物，并且在Thermo HPLC上通过反相离子对色谱分析级分。合并纯级分并通过超滤(使用Vivaspin-Hydrosart-2000 MWCO(Generon Ltd.，Berkshire，UK))进行脱盐，并且在GeneVac蒸发器上蒸发至干燥。通过HPLC分析(60℃，IEX-Thermo DNAPac PA-100，A- 25mM磷酸钠/10％乙腈，pH 11，B-1.8M NaBr/25mM磷酸钠/10％乙腈，pH 11；RPIP-WatersXBridge OST C18，A-100mM HFIP 7mM TEA B-7∶3甲醇 /乙腈)和ESI-MS分析，使用PromassDeconvolution for Xcalibur (Novatia，Newtown，PA))测定纯度和分子量。如上文针对2’-O-Me硫代磷酸酯寡核苷酸的合成所述的那样分析纯化的寡核苷酸。
表4提供了选择用于进一步修饰的本公开寡核苷酸、其核苷酸长度、由这些寡核苷酸靶向的序列和寡核苷酸的方向的总结。
表4
每个寡核苷酸的EC50和CC50值汇总于表5中。如表5所示，本公开的寡核苷酸在低浓度下有效抑制HBV病毒抗原(HBeAg和HBsAg)的表达水平。实际上，对于HBeAg抑制，寡核苷酸的EC50值在0.013μM至 0.35μM的范围内，并且对于HBsAg抑制在0.018μM至1.12μM的范围内。参见表5。
表5
这些结果展示出本公开的寡核苷酸可减少HBV感染的肝细胞中的病毒抗原。因此，本公开的寡核苷酸可用于治疗受试者中HBV感染的方法中。
还测试了SEQ ID NO：70-72、74和75的HBV DNA减少，如表6所示。
表6
此外，图2A展示出与未经处理的对照相比，在10μM至0.08μM之间范围内的浓度下，SEQ ID NO：71以剂量依赖性的方式减少了HBV感染的 PHH中的rcDNA和cccDNA水平。图2B-2C展示出与未经处理的对照相比，用SEQ ID NO：71处理以剂量依赖性方式引起cccDNA水平的减少 (例如，在10μM下减少66.3％)。
图2D展示出用SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：75处理引起HBV感染的PHH中的cccDNA水平的剂量依赖性减少(cccDNA水平最多减少约50-75％)。SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO： 75的IC50值分别为0.03μM、0.04μM和0.16μM。
图3A-3B示出了C57Bl/6雌性小鼠中SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：80 的体内肝浓度和肝半衰期。SEQ ID NO：71的肝半衰期为319小时。SEQ ID NO：80的肝半衰期是稳定的。在本文所公开的其他cccDNA靶向寡核苷酸的情况下观察到类似的模式。这些结果展示出，本公开的cccDNA靶向寡核苷酸在体内被递送至肝脏。
免疫受损的FRG小鼠被HBV感染，并让其在处死之前达到稳定的病毒血症。接种受感染的肝细胞并用3种不同浓度的所示寡核苷酸(一式三份)立即处理。HBV cccDNA水平在治疗后9天通过Southern印迹法评估。与未经处理的对照相比，利用SEQ ID NO：80处理导致体外HBV感染的FRG(Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-)小鼠肝细胞中的cccDNA水平减少＞60％。
体外PXB肝细胞用HBV感染并在第-1天(感染前1天)、第0天 (感染同一天)和第1天(感染后1天)用不同浓度的所示寡核苷酸(自由摄取)处理。在感染后12天通过qPCR评估cccDNA水平。用SEQ ID NO：82处理导致被HBV感染的体外PXB肝细胞中的cccDNA水平减少＞50％。表7示出SEQ ID NO：71、80和82的HBsAg EC50、cccDNA减少和肝AUC的总结。
表7
*未缀合的亲本寡核苷酸(SEQ ID NO：71)的EC50值
图4A示出在用SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72处理时，IFN刺激的基因(ISG)在HBV感染的PHH中上调，这与这些经处理细胞内的D环结构形成一致。
图4B展示出，在与SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72接触的HBV阴性细胞中未诱导细胞因子，从而展示出在图4A中观察到的免疫应答对于 HBV感染细胞中的cccDNA具有特异性。
这些结果展示出本公开的寡核苷酸可以选择性方式减少HBV感染的肝细胞中的病毒抗原和病毒DNA。因此，本公开的寡核苷酸可用于治疗受试者中HBV感染的方法中。
等同物
本公开不限于本专利申请中所述的具体实施方案，其旨在作为本公开的各个方面的单个说明。本公开的许多修改和变型可在不脱离其实质和范围的情况下进行，这对于本领域的技术人员将是显而易见的。除了本文所列举的那些之外，本公开范围内的功能等同的方法和设备对本领域技术人员而言由上述描述将是显而易见的。此类修改和变型旨在落入本公开的范围内。应当理解，本公开不限于具体的方法、试剂、化合物、组成、或生物系统，当然，该方法、试剂、化合物、组成、或生物系统可发生变化。另外应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。
此外，在本公开的特征或方面以马库什组的方式描述时，本领域的技术人员将认识到本公开也因此以马库什组的任何单个成员或成员的亚组的形式描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，具体地就提供书面描述而言，本文所公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围以及它们的子范围的组合。任何列出的范围可以容易被理解为充分描述并且使得相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，所有语言，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所列出的数字并是指可随后分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域的技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3 个细胞的组是指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞等的组。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公布均全文以引用方式并入，包括所有附图和表格，只要它们与本说明书的明确教导内容不矛盾。

Claims (20)

1.一种寡核苷酸，包含与SEQ ID NO：100的HBV cccDNA基因组序列内的多个核苷酸互补的序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与HBV cccDNA基因组的增强子I区域内的至少12个核苷酸互补。
3.一种寡核苷酸，包含与在对应于HBV cccDNA基因组的核苷酸位置967至核苷酸位置1322的基因组区域中存在的至少12个核苷酸互补的序列。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所述序列选自由SEQ ID NO：1-65组成的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种第一核苷酸，其具有与第二核苷酸的硫代磷酸酯(PS)键，其中所述第一核苷酸在2’位置处被选自由F和O-烷基组成的组的取代基修饰，其中所述O-烷基任选地被烷氧基取代。
6.根据权利要求5所述的寡核苷酸，其中具有胞嘧啶核碱基的所述寡核苷酸的每个核苷酸被修饰为2’O-Me，5-甲基胞嘧啶(5mmC)；每个其他核苷酸被修饰成包括2’位置处的O-Me修饰(mA、mG和mU)；并且每个核苷酸包含核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所述序列选自由SEQ ID NO：66-72和74-82组成的组。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种第一核苷酸，其具有与第二核苷酸的硫代氨基磷酸酯(NPS)键，其中所述第一核苷酸在2’位置处被选自由F和O-烷基组成的组的取代基修饰，其中所述O-烷基任选地被烷氧基取代。
9.根据权利要求8所述的寡核苷酸，其中具有胞嘧啶核碱基的所述寡核苷酸的每个核苷酸被修饰成包括2’O-Me，5-甲基胞嘧啶(5mmC)；每个其他核苷酸被修饰成包括2’位置处的O-Me修饰(mA、mG和mU)；并且每个核苷酸包含核苷酸之间的硫代氨基磷酸酯(NPS)键。
10.根据权利要求9所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的序列是SEQ ID NO：73。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，还包含缀合到所述寡核苷酸的至少一个靶向部分。
12.根据权利要求11所述的寡核苷酸，其中缀合到所述寡核苷酸的所述靶向部分选自由GalNAc、棕榈酰和生育酚衍生物组成的组。
13.根据权利要求12所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所述序列选自由SEQ IDNO：80-82组成的组。
14.一种药物组合物，包含根据权利要求1-13中任一项所述的至少一种寡核苷酸。
15.一种在对其有需要的受试者中治疗HBV的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求14所述的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸的所述序列选自由SEQ ID NO：1-82组成的组。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸的施用导致所述受试者中的HBeAg水平、HBsAg水平或HBV DNA水平中的至少一个的减少。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸的施用导致所述受试者中的HBVcccDNA的减少。
19.根据权利要求15所述的方法，还包括向所述受试者独立、顺序地或同时施用一种或多种附加的治疗剂，所述附加的治疗剂选自由以下项组成的组：抗病毒剂、核苷酸类似物、核苷类似物、逆转录酶抑制剂、免疫调节剂、治疗疫苗、病毒侵入抑制剂、衣壳抑制剂、siRNA、反义寡核苷酸和cccDNA抑制剂。
20.根据权利要求1至13中任一项所述的寡核苷酸，其用于治疗HBV。
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