TW201831684A - 用於ｃｃｃＤＮＡ之寡核苷酸標靶策略 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供靶向B型肝炎病毒(HBV)之共價閉合環狀(ccc)DNA的寡核苷酸組成物。本文亦揭露用於治療經診斷患有或懷疑患有HBV感染及/或HBV相關病症(例如慢性B型肝炎感染、肝衰竭或肝硬化、及肝細胞癌)的個體之方法。

Description

用於cccDNA之寡核苷酸標靶策略 【相關申請案之交互參照】
本申請案主張2016年11月11日提出申請之美國專利申請案第62/420,801號及2017年9月14日提出申請之美國專利申請案第62/558,770號之權益及優先權，其等之全部內容以引用方式併入本文中。
本揭露係關於靶向B型肝炎病毒(HBV)之共價閉合環狀(ccc)DNA的寡核苷酸組成物、及使用該等寡核苷酸組成物治療經診斷患有或懷疑患有HBV感染及/或HBV相關病症(例如慢性B型肝炎感染)的個體之方法。
以下對本揭露之背景的描述僅僅提供為理解本揭露之幫助，而並非旨在承認此等揭露係本揭露之先前技術。
HBV是在複製過程中利用反轉錄酶的少數DNA病毒之一，該複製過程涉及多個階段，包括病毒基因組進入、脫殼、及運輸到細胞核。最初，HBV基因組的複製涉及RNA中間體的產生，然後該RNA中間體經反轉錄以產生DNA病毒基因組。在用HBV感染細胞後，病毒基因組鬆弛環狀DNA(rcDNA)會被轉運至細胞核中並轉變 為附加型(episomal)雙鏈共價閉合環狀DNA(cccDNA)，作為病毒mRNA的轉錄模板。在轉錄及出核後，細胞質病毒前基因組RNA(pgRNA)與HBV聚合酶及殼體蛋白(capsid protein)組裝形成核殼體(nucleocapsid)，在裡面聚合酶催化的反轉錄會產出負鏈(minus-strand)DNA，其隨後被複製成正鏈DNA以形成子代rcDNA基因組。成熟的核殼體接著經病毒套膜蛋白(envelope protein)包裝以作為病毒顆粒離開，或者穿梭到細胞核以透過細胞內cccDNA擴增路徑擴增cccDNA儲庫。cccDNA是HBV複製週期的必要組分，並負責建立感染及病毒持續性(viral persistence)。
全世界至少有2.5億人長期感染B型肝炎病毒(HBV)，其為一種透過反轉錄複製的趨肝性(hepatotropic)DNA病毒。慢性感染大大地增加終末期肝病的風險。由於被稱為共價閉合環狀(ccc)DNA的細胞內病毒複製中間體的難治性質，目前的療法很少能達到完全治愈。感染後，在宿主細胞核中從進來的病毒粒子(virion)中的蛋白質連接之鬆弛環狀(RC)DNA基因組產生作為質體樣附加體(plasmid-like episome)的cccDNA。cccDNA作為所有病毒RNA的模板，從而成為新的病毒粒子。cccDNA能夠持續存在於從急性HBV感染恢復的患者中達數十年。
越來越多的證據證實，由於cccDNA的持續性質，目前單獨的抗病毒治療(諸如核苷(酸)類似物(NA)或干擾素(IFN))無法治愈大多數慢性B型肝炎(CHB)患者。NA藉由直接抑制病毒聚合酶 來抑制HBV複製，而IFN則是增強宿主對抗HBV感染的免疫力。病毒回彈(viral rebound)經常在停止抗病毒治療後發生。
因此需要靶向cccDNA或含cccDNA之肝細胞的新穎抗病毒劑，以用於治癒慢性HBV感染。
本揭露係關於一種寡核苷酸及其醫藥組成物。該寡核苷酸包含與SEQ ID NO：106之HBV cccDNA基因組序列內的複數個核苷酸互補的序列。在實施例中，該寡核苷酸包含與該HBV cccDNA基因組內的至少12個核苷酸互補的序列。在實施例中，該寡核苷酸與該HBV cccDNA基因組之增強子I區域內的至少12個核苷酸互補。在實施例中，該寡核苷酸包含與存在對應於該HBV cccDNA基因組之核苷酸位置967至核苷酸位置1322的區域中之至少12個核苷酸互補的序列。在實施例中，該寡核苷酸的序列係SEQ ID NO：1至65中之任一者。
在實施例中，所揭露之寡核苷酸含有至少一個第一核苷酸，其與第二核苷酸具有硫代磷酸酯(PS)鍵聯或硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯。在實施例中，該第一核苷酸在2'位進一步經包括氟(F)或O-烷基(諸如O-甲基(O-Me)、O-乙基(O-Et)、及類似者)的取代修飾。該O-烷基可進一步經烷氧基(諸如O-甲基(O-Me)、O-乙基(O-Et)、及類似者)取代。在實施例中，具有胞嘧啶核鹼基的任何第一核苷酸經進一步修飾成甲基胞嘧啶。
在實施例中，所揭露之寡核苷酸的各核苷酸含有核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯與2'位的O-甲基取代，並且具有胞嘧啶核鹼基的任何核苷酸經進一步修飾以包括甲基胞嘧啶核鹼基。在實施例中，具有SEQ ID NO：1至65之寡核苷酸的各核苷酸經修飾，以含有核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯與2'位的O-甲基取代，並且具有胞嘧啶核鹼基的任何核苷酸經進一步修飾以包括甲基胞嘧啶核鹼基。在實施例中，該寡核苷酸的序列係SEQ ID NO：66至79中之任一者。
在實施例中，所揭露之寡核苷酸經修飾以含有至少一個接合至該寡核苷酸的靶向部份。接合至該寡核苷酸的該靶向部份可為GalNAc、棕櫚醯基、或生育酚衍生物。在實施例中，具有SEQ ID NO：1至79之寡核苷酸經修飾以含有至少一個接合至該寡核苷酸的靶向部份。在實施例中，該寡核苷酸的序列係SEQ ID NO：80至82中之任一者。
在實施例中，該醫藥組成物包含至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有與該HBV cccDNA基因組內的至少12個核苷酸互補的序列。在實施例中，該寡核苷酸與該HBV cccDNA基因組之增強子I區域內的至少12個核苷酸互補。在實施例中，該寡核苷酸包含與存在對應於該HBV cccDNA基因組之核苷酸位置967至核苷酸位置1322的區域中之至少12個核苷酸互補的序列。在實施例中，該寡核苷酸的至少一個第一核苷酸經修飾以含有至第二核苷酸的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯、及在2'位的氟(F)或O-烷基(可選地 進一步經烷氧基取代)取代，並且任何胞嘧啶核鹼基經進一步修飾成甲基胞嘧啶。在實施例中，將該寡核苷酸以在該寡核苷酸之3'及/或5'端接合的靶向部份(諸如GalNAc、棕櫚醯基、或生育酚衍生物)修飾。在實施例中，該醫藥組成物中之該寡核苷酸的序列係SEQ ID NO：1至82中之任一者。
本揭露進一步關於治療有需要之個體的B型肝炎病毒(HBV)感染之方法。該等方法包含向該個體投予有效量的本揭露之寡核苷酸或其醫藥組成物。在實施例中，該寡核苷酸的序列係SEQ ID NO：1至82中之任一者。在實施例中，該寡核苷酸的投予導致該個體中HBeAg水平、HBsAg水平、或HBV DNA水平中之至少一者降低。在實施例中，該寡核苷酸的投予導致該個體中HBV cccDNA減少。
本揭露之方法進一步包含分開地、依序地、或同時地向該個體投予一或多種選自由下列所組成之群組的額外治療劑：抗病毒劑、核苷酸類似物、核苷類似物、反轉錄酶抑制劑、免疫調節劑、治療性疫苗、病毒進入抑制劑、殼體抑制劑、siRNA、反義寡核苷酸、及cccDNA抑制劑。
此外，本揭露係關於所揭露之寡核苷酸用於治療HBV。
在一態樣中，本揭露提供一種寡核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO：1至82所組成之群組的序列或其修飾。本揭露亦提供一 種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1至82中任一者之互補序列或其修飾。
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向該HBV cccDNA基因組之增強子I區域內的HBV DNA序列(即位於HBV基因組的核苷酸位置960與1330之間並包括該等核苷酸位置的標靶核苷酸序列)。
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置969與位置987之間任何位置的HBV DNA序列。在某些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1094與位置1116之間任何位置的HBV DNA序列。在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1136與位置1155之間任何位置的HBV DNA序列。在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1174與位置1194之間任何位置的HBV DNA序列。在其他實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1194與位置1216之間任何位置的HBV DNA序列。在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1297與位置1315之間任何位置的HBV DNA序列。
在一態樣中，本揭露提供用於治療有需要之個體的HBV感染或HBV相關病症、及/或治療有需要之個體的HBV感染或HBV相關病症之體徵或症狀的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量的至少一種寡核苷酸，其中該至少一種寡核苷酸包含選自由SEQ ID NO：1至82所組成之群組的序列。
在一態樣中，本揭露提供一種用於在HBV cccDNA中誘導D環形成的方法，該方法包含使HBV cccDNA與具有SEQ ID NO：1至82中任一者之序列的寡核苷酸接觸。在另一態樣中，本揭露提供一種用於在HBV cccDNA中誘導D環形成的方法，該方法包含使由核苷酸位置900至1310(增強子I區域)所組成之HBV cccDNA基因組的標靶區域與寡核苷酸接觸，該寡核苷酸與該HBV cccDNA的該標靶區域有至少90%互補。在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸與HBV cccDNA雜交以誘導抗原性D環結構的形成。在一些實施例中，誘導D環形成會刺激先天性免疫。
在一態樣中，本揭露提供一種寡核苷酸，其包含與HBV cccDNA基因組之增強子I附近或其內的複數個核苷酸互補的序列，其中增強子I對應於SEQ ID NO：106之HBV cccDNA基因組序列的核苷酸位置900至核苷酸位置1310。在一些實施例中，該寡核苷酸與該HBV cccDNA基因組之增強子I區域內的至少15個核苷酸互補。在某些實施例中，該寡核苷酸與該HBV cccDNA基因組之增強子I區域內的至少19個核苷酸互補。
在另一態樣中，本揭露提供一種寡核苷酸，其包含與存在對應於HBV cccDNA基因組之核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因組區域中之至少15個核苷酸互補的序列，其中該HBV cccDNA基因組序列係SEQ ID NO：106。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與存在對應於該HBV cccDNA基因組之核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因組區域中之至少19個核苷酸互補的序列。另外或 替代地，在一些實施例中，該寡核苷酸的序列係選自由SEQ ID NO：1至82所組成之群組。另外或替代地，在任何上述實施例中，該寡核苷酸含有至少一個與第二核苷酸具有PS鍵聯的第一核苷酸，其中該第一核苷酸在2'位經選自由F及O-烷基所組成之群組的取代修飾，其中該O-烷基可選地經烷氧基取代。另外或替代地，在任何上述實施例中，該寡核苷酸的各核苷酸係藉由PS鍵聯與該寡核苷酸的另一個核苷酸連接，並在2'位經O-Me修飾。
在另一態樣中，本揭露提供一種治療有需要之個體的HBV之方法，該方法包含向該個體投予有效量的任何本文所揭露之寡核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸與該HBV cccDNA基因組之增強子I區域內的至少15個核苷酸互補。在某些實施例中，該寡核苷酸包含與存在對應於該HBV cccDNA基因組之核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因組區域中之至少19個核苷酸互補的序列。另外或替代地，在一些實施例中，該寡核苷酸的序列係選自由SEQ ID NO：1至82所組成之群組。
在某些實施例中，該寡核苷酸的投予導致該個體中HBeAg水平、HBsAg水平、或HBV DNA水平中之至少一者降低。另外或替代地，在一些實施例中，該寡核苷酸的投予導致該個體中HBV cccDNA的肝臟水平減少。該寡核苷酸可以口服、局部、全身、靜脈內、皮下、經皮、鞘內、鼻內、腹膜內、肝內、或肌內投予。
另外或替代地，在一些實施例中，該方法進一步包含分開地、依序地、或同時地向該個體投予一或多種選自由下列所組成之 群組的額外治療劑：抗病毒劑、核苷酸類似物、核苷類似物、反轉錄酶抑制劑、免疫刺激劑、治療性疫苗、病毒進入抑制劑、殼體抑制劑、siRNA、反義寡核苷酸、及cccDNA抑制劑。
在另一態樣中，本揭露提供一種用於治療HBV的寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含與HBV cccDNA基因組之增強子I附近或其內的複數個核苷酸互補的序列，其中增強子I對應於SEQ ID NO：106之HBV cccDNA基因組的核苷酸位置900至核苷酸位置1310。在一些實施例中，該寡核苷酸包含與存在對應於該HBV cccDNA基因組之核苷酸位置960至核苷酸位置1330的基因組區域中之至少15個核苷酸互補的序列。在某些實施例中，該寡核苷酸的序列係選自由SEQ ID NO：1至82所組成之群組。
圖1顯示HBV基因組的物理圖譜。HBV基因組長大約3200個核苷酸，其中增強子I區域的核苷酸序列從位置900開始並在位置1310結束。
圖2A顯示用不同濃度的SEQ ID NO：71處理之HBV感染的PHH之南方墨點法(Southern Blot)結果。圖2B顯示用不同濃度的SEQ ID NO：71處理之HBV感染的PHH之qPCR結果。圖2C顯示用不同濃度的SEQ ID NO：71處理之HBV感染的PHH中cccDNA水平之減少%。圖2D顯示用不同濃度的SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：72、及SEQ ID NO：93處理之HBV感染的 PHH之南方墨點法結果。在圖2A至圖2D中，PHH在第0天以HBV感染，並在第4天用所指示之靶向cccDNA的寡核苷酸處理。在第11天使用Hirt DNA萃取法從PHH萃取出HBV cccDNA。
圖3A顯示投予後24小時、72小時、或168小時小鼠中SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：103(具有3，GalNAc的SEQ ID NO：71)的體內(in vivo)肝臟濃度。圖3B顯示小鼠中SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：103的肝臟Cmax及肝臟半衰期。關於圖3A至圖3B，10mg/kg的所指示之寡核苷酸經皮下遞送進C57Bl/6雌性小鼠(n=3)。
圖4A顯示經SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：72處理之HBV感染的PHH展現出IFN刺激的基因表現增加。圖4B顯示在與SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、PBS(陰性對照)、及雷西莫特(resiquimod)(R848)(陽性對照)接觸的PBMC(衍生自HBV陰性供體)中所觀察到之細胞介素誘導水平。
圖5A至圖5B顯示共有的HBV基因組序列(SEQ ID NO：100)。
目前的抗病毒療法抑制細胞質的HBV基因組複製，但不能治愈，因為這些療法不直接影響細胞核的HBV cccDNA(作為病毒轉錄模板並維持病毒持續性的基因組形式)。因此，直接靶向cccDNA調控的新方法是高度所欲的。直接靶向cccDNA的小分子藥物或治療性抗體之開發是具有挑戰性的。
本揭露提供能夠減少HBV cccDNA之表現及/或活性的寡核苷酸組成物。本揭露之寡核苷酸與位於HBV cccDNA分子之增強子I區域或其鄰近處的標靶序列雜交，從而在該增強子I區域或其鄰近處產生D環。雖然不希望受到理論束縛，但據信在cccDNA分子中D環結構的產生可能作用為個體中DNA編輯及DNA修復機制的提示信號，並且可能造成HBV cccDNA的破壞(Kasamatsu,H.；Robberson,D.L.；Vinograd,J.,Proc Natl Acad Sci.68(9)：2252-2257(1971)；Sebesta,M.et al.,DNA Repair 12(9)：691-698(2013))，且亦可能藉由宿主RNA聚合酶II干擾HBV cccDNA的轉錄。在一些實施例中，D環結構的產生會在感染HBV cccDNA的個體中刺激先天性免疫識別。
定義
本文中提到數字時所使用之用語「約(about)」通常被認為包括落在該數字任一方向(大於或小於)的1%、5%、或10%範圍內的數字，除非另有說明或另外從上下文顯而易見(除非此數字會小於可能值的0%或超過可能值的100%)。
本文所使用之將藥劑、藥物、或化合物「投予」至個體包括向個體引入或遞送化合物以執行其預期功能的任何路徑。可藉由任何合適的路徑進行投予，包括口服、鼻內、鞘內、腸胃外(靜脈內、肌內、腹膜內、或皮下)、局部、肝內、經皮、或本文所述之任何其他路徑。投予包括自我投予及由另一者投予。
本文所使用之關於核酸序列的用語「擴增(amplify或amplification)」係指在樣本中增加一群核酸序列表現的方法。核酸擴增方法如PCR、等溫法(isothermal method)、滾動循環法(rolling circle method)等係所屬技術領域中具有通常知識者所習知的。見例如Saiki，「Amplification of Genomic DNA」於PCR PROTOCOLS，Innis et al.,Eds.,Academic Press,San Diego,Calif.1990,pp 13-20；Wharam et al.,Nucleic Acids Res.2001 Jun 1；29(11)：E54-E54；Hafner et al.,Biotechniques 2001 Apr；30(4)：852-6,858,860 passim。在擴增反應中體外(in vitro)產生的特定核酸序列之拷貝(copy)係稱為「擴增物(amplicon)」或「擴增產物(amplification product)」。
本文中提到多核苷酸(即核苷酸序列，例如寡核苷酸或標靶核酸)時所使用的用語「互補(complementary)」或「互補性(complementarity)」係指鹼基配對規則。本文所使用的核酸序列的互補體係指一寡核苷酸，其與該核酸序列比對而使一個序列的5'端與另一個序列的3'端配對時係處於「反向平行締合(antiparallel association)」。例如，序列「5'-A-G-T-3」係與序列「3'-T-C-A-5」互補。在天然存在的核酸中不常見的某些鹼基可被包括在本文所述之核酸中。這些包括例如肌苷、7-去氮鳥嘌呤、鎖核酸(Locked Nucleic Acid(LNA))、及肽核酸(Peptide Nucleic Acid(PNA))。互補性不需要完美；穩定的雙鏈體(duplex)可能含有錯誤配對的鹼基對、變性或未配對的鹼基。核酸技術領域中具有通常知識者可以經驗為依據地考慮許 多變數來判定雙鏈體穩定性，該等變數包括例如寡核苷酸的長度、寡核苷酸的鹼基組成及序列、離子強度及錯誤配對鹼基對的發生率。互補序列亦可為與該DNA序列或其互補序列互補的RNA序列，且亦可為cDNA。
本文所使用的用語「對照組(control)」係在實驗中為了比較目的所使用的替代樣本。對照組可為「陽性(positive)」或「陰性(negative)」。例如，在該實驗之目的是判定治療劑功效對於治療特定類型疾病的相關性的情況下，一般會採用陽性對照組(已知會展現出所欲治療效果的化合物或組成物)及陰性對照組(未接受治療或接受安慰劑的個體或樣本)。
本文所使用的用語「D環(D-loop)(置換環)(displacement loop)」係指B型肝炎病毒基因組中新形成的三鏈區，其係藉由使HBV之雙鏈cccDNA分子與本揭露之寡核苷酸接觸而產生，其中該cccDNA分子之兩鏈有一段被分開並且被對應於本揭露之寡核苷酸的第三鏈保持分開。該第三鏈具有與該cccDNA的其中一鏈互補的鹼基序列並與之配對，從而使該區域中另一條互補的cccDNA鏈移位。該移位的鏈形成「D」環。
本文所使用的用語「有效量(effective amount)」係指足以實現所欲治療及/或疾病預防效果的量，例如導致本文所述之疾病或病況減少的量、或導致一或多種與本文所述之疾病或病況相關的體徵或症狀減少的量。在治療性或疾病預防性應用的上下文中，向個體投予之組成物的量將取決於該組成物、疾病的程度、類型、及嚴重性、 以及個體的特性(諸如整體健康狀況、年齡、性別、體重、及對藥物的耐受性)而變化。所屬技術領域中具有通常知識者將能夠根據這些因素和其他因素來判定合適的劑量。組成物亦可與一或多種額外治療性化合物組合投予。在本文所述之方法中，治療性組成物可被投予至具有本文所述之疾病或病況的一或多種體徵或症狀的個體。本文所使用之組成物的「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指改善或消除疾病或病況之生理效應的組成物水平。可用一或多次投予來給予治療有效量。
本文所使用之「B型肝炎病毒(Hepatitis B virus)」或「HBV」係指屬於肝病毒科(Hepadnaviridae family)的習知非細胞病變性嗜肝DNA病毒。HBV基因組係部分雙鏈的環狀DNA，其具有重疊的讀框(reading frame)。HBV基因組編碼四種已知基因，稱為C、X、P、及S(見圖1)。核心蛋白係由基因C(HBcAg)編碼。HBeAg(套膜抗原)係藉由蛋白分解加工(proteolytic processing)前核心(pre-C)蛋白而產生。HBV DNA聚合酶係由基因P編碼。基因S編碼表面抗原(HBsAg)。HBsAg基因係一個長的開讀框，其含有三個框內「起始」(ATG)密碼子，其將該基因分成前S1、前S2、及S三個區域。由於有多個起始密碼子，故會產生稱為大(L)、中(M)、及小(S)(分別為前S1+前S2+S、前S2+S、或S)之三種不同大小的多肽。基因X編碼一種誘餌蛋白(decoy protein)，其讓血液中的HBsAg與抗HBsAg抗體隔絕，並使感染性病毒顆粒得以逃脫免疫檢測。已辨識出八種HBV基因型，分別命名為A至H，各基因型具有不同的地理分佈。用 語「HBV」包括八種HBV基因型(A至H)中的任何一種。本文所使用的用語「HBV」亦指HBV基因組之天然存在的DNA序列變異。
本文所使用的用語「B型肝炎病毒相關疾病(Hepatitis B virus-associated disease)」或「HBV相關疾病(HBV-associated disease)」係指由HBV感染及/或複製所引起或與其相關的疾病或病症，包括急性B型肝炎、急性猛爆性B型肝炎、慢性B型肝炎、肝衰竭、末期肝病、肝硬化、及肝細胞癌。
本文所使用的用語「雜交(hybridize)」係指一過程，其中兩個實質上互補的核酸鏈(在至少14至25個核苷酸的片段上至少約65%互補、至少約75%互補、或至少約90%互補)在適當的嚴格條件(stringent condition)下彼此黏合(anneal)，以藉由在互補鹼基對之間形成氫鍵來形成雙鏈體或異源雙鏈體。雜交一般而言且較佳地係用探針長度的核酸分子進行，長度較佳為15至100個核苷酸，長度更佳為18至50個核苷酸。核酸雜交技術係所屬技術領域中所習知。見例如Sambrook,et al.,1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y。雜交及雜交的強度(即核酸之間的締合強度)受到如下因素的影響：核酸之間的互補程度、所涉及條件的嚴格性、及所形成的雜交體的熱熔點(Tm)。所屬技術領域中具有通常知識者了解如何評估並調整雜交條件的嚴格性，使得至少具有所欲互補水平的序列將會穩定雜交，而具有較低互補性的序列則不會。關於雜交條件及參數的實例，見例如Sambrook,et al.,1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.； Ausubel,F.M.et al.1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Secaucus,N.J。在一些實施例中，特異性雜交發生在嚴格的雜交條件下。對標靶核酸具有特異性的寡核苷酸或多核苷酸(例如探針或引子)將在合適的條件下與該標靶核酸「雜交」。
本文所使用的用語「個體(individual)」、「患者(patient)」、或「個體(subject)」可為個體生物、脊椎動物、哺乳動物、或人類。在一較佳實施例中，該個體、患者、或個體係人類。
在寡核苷酸上下文中的用語「修飾(modification)」包括但不限於(a)末端修飾，例如5'端修飾或3'端修飾、(b)核鹼基(或「鹼基」)修飾，包括鹼基的置換或去除、(c)糖修飾，包括在2'、3'、及/或4'位的修飾、及(d)骨架修飾，包括磷酸二酯鍵的修飾或置換。
用語「經修飾的核苷酸(modified nucleotide)」通常係指在一或多個鹼基、糖、及磷酸二酯鍵或骨架部分(包括核苷酸磷酸酯)之化學結構具有修飾的核苷酸。
本文所使用的「寡核苷酸(oligonucleotide)」係指在骨架上具有核酸鹼基序列的分子，該骨架主要由具有界定間隔的相同單體單元所組成。該等鹼基以彼等可與具有與該寡核苷酸之鹼基互補的鹼基序列之核酸結合的方式排列在該骨架上。最常見的寡核苷酸具有糖磷酸單元的骨架。在2'位沒有羥基的寡去氧核糖核苷酸與在2'位具有羥基的寡核糖核苷酸之間可能會進行區分。寡核苷酸亦可包括其中 羥基的氫被有機基團(例如烯丙基)置換的衍生物。在方法中用作為引子或探針的寡核苷酸通常至少約10至15個核苷酸長，更佳地至少約14至25個核苷酸長，雖然在該方法中可使用更短或更長的寡核苷酸。確切的大小將取決於許多因素，而這些又取決於寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以任何方式產生，包括例如化學合成、DNA複製、質體或噬菌體DNA的限制性核酸內切酶消化、反轉錄、PCR、或其組合。寡核苷酸可藉由例如加入甲基、生物素或長葉毛地黃配質(digoxigenin)部份、螢光標籤或藉由使用放射性核苷酸來修飾。
本文所使用的用語「引子(primer)」係指一種寡核苷酸，當其被置於與標靶核酸鏈互補的引子延伸產物之合成被誘導的條件下時，即在不同的核苷酸三磷酸及聚合酶的存在下、在合適的緩衝液(「緩衝液」包括pH、離子強度、輔因子等)中、並在合適的溫度下時，能夠作為核酸序列合成的起始點。該引子的一或多個核苷酸可藉由例如加入甲基、生物素或長葉毛地黃配質(digoxigenin)部份、螢光標籤或藉由使用放射性核苷酸來修飾。引子序列不需要反映模板的確切序列。例如，可將非互補核苷酸片段附接至引子的5'端，而引子序列的其餘部分則與鏈實質上互補。本文所使用的用語引子包括所有形式的可合成引子，包括肽核酸引子、鎖核酸引子、硫代磷酸酯修飾的引子、經標示的引子、及類似者。本文所使用的用語「正向引子(forward primer)」意指與dsDNA的反義鏈(anti-sense strand)黏合(anneal)的引子。「反向引子(reverse primer)」與dsDNA的有義鏈(sense-strand)黏合。
本文所用的「探針(probe)」係指經由雜交與標靶核酸交互作用的核酸。探針可與標靶核酸序列完全互補或部分互補。互補性水平將取決於許多因素，通常係基於該探針的功能。探針可為經標示或未經標示的，或者可以所屬技術領域中習知的許多方式中之任一種進行修飾。探針可與標靶核酸特異性雜交。探針可為DNA、RNA、或RNA/DNA雜合體。探針可為寡核苷酸、人工染色體、斷裂的人工染色體、基因組核酸、斷裂的基因組核酸、RNA、重組核酸、斷裂的重組核酸、肽核酸(PNA)、鎖核酸、環狀雜環寡聚物、或核酸的接合物。探針可包含經修飾的核鹼基、經修飾的糖部份、及經修飾的核苷酸間鍵聯(internucleotide linkage)。探針的長度一般為至少約10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100個核苷酸或更多。
本文所使用的用語「樣本(sample)」係指從患者獲得的臨床樣本。在較佳的實施例中，樣本係從生物來源獲得(即「生物樣本(biological sample)」)，諸如從個體收集的組織或體液。樣本來源包括但不限於：糞便、黏液、痰(經處理或未經處理的)、支氣管肺泡灌洗液(BAL)、支氣管沖洗液(BW)、血液、體液、腦脊髓液(CSF)、尿、血漿、血清、或組織(例如活體組織切片(biopsy)材料)。
本文所使用的用語「有義鏈」意指雙鏈DNA(dsDNA)的鏈，其包括至少一部分功能性蛋白質的編碼序列。「反義鏈」意指dsDNA之與該有義鏈反向互補的鏈。
本文所使用的用語「分開(separate)」在治療上使用係指藉由不同路徑同時或實質上同時投予至少兩種活性成分。
本文所使用的用語「依序(sequential)」在治療上使用係指在不同時間投予至少兩種活性成分，投予路徑相同或不同。更具體而言，依序使用係指完整投予其中一種活性成分後，才開始投予另一種或其他活性成分。因此可以在數分鐘、數小時、或數天內投予其中一種活性成分後，才開始投予另一種或其餘活性成分。在此情況下沒有同時治療。
本文所使用的用語「同時(simultaneous)」在治療上使用係指藉由相同路徑且同時或實質上同時投予至少兩種活性成分。
本文所使用的術語「嚴格雜交條件(stringent hybridization condition)」係指至少與下列條件一樣嚴格的雜交條件：在50%甲醯胺、5×SSC、50mM NaH2PO4(pH 6.8)、0.5% SDS、0.1mg/mL超聲處理(sonicated)的鮭魚精子DNA、及5× Denhart溶液中於42℃雜交整夜；以2× SSC、0.1% SDS於45℃洗滌；及以0.2×SSC、0.1% SDS於45℃洗滌。在另一實例中，嚴格雜交條件應使在20個連續核苷酸的片段上有超過兩個鹼基不同的兩個核酸無法雜交。
本文所使用的用語「實質上互補」意指兩個序列在嚴格雜交條件下雜交。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，實質上互補的序列不需要沿其整個長度雜交。特別的是，實質上互補的序列可包含不與標靶序列雜交的鹼基連續序列，其位於在嚴格雜交條件下與標靶序列雜交的鹼基連續序列的3'或5'。
本文所使用的用語「標靶序列(target sequence)」係指存在於樣本中並且能夠與本揭露之寡核苷酸雜交的所關注之核酸序列。在一些實施例中，標靶序列位於HBV cccDNA分子的增強子I區域或其鄰近處。在一進一步的實施例中，標靶序列與本揭露之寡核苷酸的雜交導致宿主DNA修復機制破壞HBV cccDNA分子。
本文所使用的「治療(treating或treatment)」涵蓋對個體(諸如人)之疾病或病況(例如HBV感染及/或HBV相關病症)的治療，並且包括：(i)減少疾病或病況的發生或抑制疾病或病況，即阻止其發展；(ii)緩解疾病或病況，即造成疾病或病況的消退；(iii)減緩疾病或病況的進展；及/或(iv)抑制、緩解該疾病或病況的一或多種症狀、延緩其發作、或減緩其進展。在一些實施例中，治療導致HBV感染及/或HBV相關病症的完全治愈。
HBV感染或HBV相關病症可能由一或多種HBV基因型所引起，諸如HBV基因型A、HBV基因型B、HBV基因型C、HBV基因型D、HBV基因型E、HBV基因型F、HBV基因型G、或HBV基因型H。在一些實施例中，該HBV相關病症係慢性B型肝炎、肝衰竭、肝硬化、或肝細胞癌。在某些實施例中，該個體係人類。
在該方法的一些實施例中，該個體與正常的對照個體相比表現出升高的HBV cccDNA水平。在某些實施例中，用該寡核苷酸治療會減少該個體中的HBV cccDNA水平。另外或替代地，在該方法的一些實施例中，該個體與正常的對照個體相比表現出升高的HBV cccDNA肝臟水平。在某些實施例中，用該寡核苷酸治療會減少該個體中的HBV cccDNA肝臟水平。在任何上述實施例中，在投予該寡核苷酸後，HBV cccDNA水平會減少約1小時至約80小時。
與HBV感染及/或HBV相關病症有關的症狀包括但不限於存在肝臟HBV cccDNA、存在血清及/或肝臟HBV抗原(例如HBsAg及/或HBeAg)、升高的ALT、升高的AST、抗HBV抗體不存在或低水平、肝損傷、肝硬化、D型肝炎、急性B型肝炎、急性猛爆性B型肝炎、慢性B型肝炎、肝纖維化、末期肝臟疾病、肝細胞癌、類血清病症候群、厭食症、噁心、嘔吐、輕微發燒、肌痛、易疲勞性、味覺敏銳度及嗅覺感知失調(厭惡食物及香煙)、右上腹部和上腹部疼痛(間歇性、輕度至中度)、肝性腦病(hepatic encephalopathy)、嗜眠症、睡眠模式紊亂、精神錯亂、昏迷、腹水、胃腸道出血、凝血病變、黃疸、肝腫大(輕度增大、軟肝)、脾腫大、手掌紅斑、蜘蛛痣、肌肉萎縮、蜘蛛血管瘤、血管炎、靜脈曲張出血、外周水腫(peripheral edema)、男性女乳症、睪丸萎縮、腹部側支靜脈(臍周靜脈曲張(caput medusa))、高水平的丙胺酸轉胺酶(ALT)及天門冬胺酸轉胺酶(AST)(在1000至2000IU/mL的範圍內)、ALT水平高於AST水平、升高的γ-麩胺醯基轉肽酶(GGT)及/或鹼性磷酸酶(ALP)水平、降低的白蛋白水平、升高的血清鐵水平、白血球減少症(即顆粒球減少症)、淋巴球增多症、增加的紅血球沉降率(ESR)、縮短的紅血球存活期、溶血、血小板減少症、國際標準化比值(INR)的延長、存在血清HBV DNA、胺基轉移酶的升高(<5倍 ULN)、增加的膽紅素水平、延長的凝血酶原時間(PT)、高球蛋白血症、存在組織非特異性抗體(諸如抗平滑肌抗體(ASMA)或抗核抗體(ANA))、存在組織特異性抗體(諸如抗甲狀腺抗體)、升高的類風濕因子(RF)水平、高膽紅素血症、低血小板及白血球計數、AST水平高於ALT水平、肝小葉發炎(lobular inflammation)伴隨退化性和再生性肝細胞變化、及主要地肝小葉中心壞死(centrilobular necrosis)。「治療」亦可意指與沒有治療時預期的存活相比延長存活。
亦應當理解，本文描述的各種治療疾病或病況的模式旨在意指「實質的(substantial)」，其包括總體治療但也包括少於總體的治療，並且其中實現了一些生物學或醫學相關的結果。該治療可為用於慢性疾病的持續長期治療，或者可為用於治療急性病況的單次或數次投予。
本揭露之寡核苷酸組成物
本揭露提供能夠減少HBV cccDNA之表現及/或活性的寡核苷酸及寡核苷酸組成物。本揭露之寡核苷酸與位於HBV cccDNA分子之增強子I區域或其鄰近處的標靶序列雜交，從而在該增強子I區域或其鄰近處產生D環。圖1顯示增強子I區域的核苷酸序列從核苷酸位置900開始並在核苷酸位置1310結束，且圖5A至圖11B係共有的HBV基因組序列。
本揭露之寡核苷酸靶向由核苷酸位置900至1310(增強子I區域)所組成之HBV cccDNA基因組區域，其中一寡核苷酸與該HBV cccDNA的標靶區域至少90%互補。
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向增強子I區域內的HBV DNA序列(即位於該HBV基因組的核苷酸位置900與1310之間並包括該等核苷酸位置的標靶核苷酸序列)。
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向該增強子I區域上游不超過50個鹼基對、不超過45個鹼基對、不超過40個鹼基對、不超過35個鹼基對、不超過30個鹼基對、不超過25個鹼基對、不超過20個鹼基對、不超過15個鹼基對、不超過10個鹼基對、或不超過5個鹼基對的HBV DNA序列。在某些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向該增強子I區域下游不超過50個鹼基對、不超過45個鹼基對、不超過40個鹼基對、不超過35個鹼基對、不超過30個鹼基對、不超過25個鹼基對、不超過20個鹼基對、不超過15個鹼基對、不超過10個鹼基對、或不超過5個鹼基對的HBV DNA序列。
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置969與位置987之間任何位置的HBV DNA序列。在某些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1094與位置1116之間任何位置的HBV DNA序列。在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1136與位置1155之間任何位置的HBV DNA序列。在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1174與位置1194之間任何位置的HBV DNA序列。在其他實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1194與位置1216之間任何位置的HBV DNA序列。在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸靶向位於該HBV基因組的位置1297與位置1315之間任何位置的HBV DNA序列。
本揭露之寡核苷酸的實例係呈現於表1中。
在某些實施例中，SEQ ID NO：1至65經修飾，例如如本揭露中所描述者。
在本揭露之寡核苷酸的一些實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之一或多個核鹼基或其互補物可用選自下列的經修飾核鹼基取代：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧 啶(U)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤(xanthine)、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、3'-胺基-2'-去氧-2,6-二胺基嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶及胞嘧啶及其他嘧啶鹼基的炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(偽尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代的腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(特別是5-嗅基)、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-胺基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤及8-氮腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-胺吡啶及2-吡啶酮。
在本揭露之寡核苷酸的一些實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之一或多個核鹼基或其互補物可用選自下列的經修飾核鹼基取代：三環嘧啶，諸如啡胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并-2(3H)-酮)、啡噻胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻-2(3H)-酮)、G型夾(G-clamp)(諸如經取代的啡胞苷(例如9-(2-am-oelhoxy)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并-2(3H)-酮))、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3,2,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
另外或替代地，在一些實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之一或多個核鹼基或其互補物的糖可用選自下列的經修飾糖 取代：2'-OH(核糖)核苷、2'-O-甲基化(2’-O-Me)核苷、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)核苷、2'-核糖-F(2'-ribo-F)核苷、2'-阿拉伯糖-F(2'-arabino-F)核苷、2'-Me核苷、及2'-Me-2'-F核苷。在一些實施例中，SEQ ID NO：1至82中任一者之一或多個核鹼基或其互補物的糖可用選自2'-F及2'-O-烷基的經修飾糖取代，其中該O-烷基可選地經烷氧基取代。
另外或替代地，在一些實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之一或多個核鹼基或其互補物的原始主鏈鍵聯可用選自下列的替代性次單元間的鍵聯置換：磷酸二酯次單元間的鍵聯、硫代磷酸酯次單元間的鍵聯、胺基磷酸酯次單元間的鍵聯、及硫代胺基磷酸酯次單元間的鍵聯。
在一些實施例中，一或多個核苷酸包括在糖環2'位之修飾或核苷酸次單元間的鍵聯之修飾。例如，一些實施例包括一或多個2'-F或2'-O-烷基，其中該O-烷基可選地經烷氧基取代，例如一些實施例包括2'-OMe及/或2'-F修飾。在一些實施例中，一或多個核苷酸次單元間的鍵聯係硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，一或多個核苷酸次單元間的鍵聯係胺基磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，一或多個核苷酸次單元間的鍵聯係硫代胺基磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸包括經修飾的核苷酸。例如，本揭露之化合物可包括式(I)之核苷酸： 其中R係H或帶正電荷的反離子，B在各情況下獨立為天然或未經修飾的核鹼基、或經修飾的核鹼基，Y係O或S，R1係-(CR’2)2OCR’3，且R’在各情況下獨立為H或F。
在式(I)之核苷酸中，R1係-(CR’2)2OCR’3。在一些實施例中，R’在各情況下為H。在其他實施例中，至少一個R’為F，例如1、2、3、4、5、6、或7個R’為F。在一些實施例中，CR’3含有1、2、或3個F部份。例如，在實施例中，R1係選自由-CH2CH2OCH3(或MOE)、-CF2CH2OCH3、-CH2CF2OCH3、-CH2CH2OCF3、-CF2CF2OCH3、-CH2CF2OCF3、-CF2CH2OCF3、-CF2CF2OCF3、-CHFCH2OCH3、-CHFCHFOCH3、-CHFCH2OCFH2、-CHFCH2OCHF2及-CH2CHFOCH3所組成之群組。在實施例中，式I之核苷酸係
在實施例中，本揭露之化合物包括至少一式(II)之核苷酸： 其中Y係S或O，R係H或一帶正電荷的反離子，B係一核鹼基，R2係-CR’3、-CR’2OCR’3、-(CR’2)3OCR’3或-(CR’2)1-2CR’3，或R2係-(CR’2)2OCR’3且Y係O且R’在各情況下獨立為H或F。
在式(II)之核苷酸中，R2係-CR’3、-(CR’2)1-3OCR’ 3、或-(CR’2)1-2CR’3。在一些實施例中，R2係-CR’3或-CR’2CR’3。在一些實施例中，R’在各情況下為H。在其他實施例中，至少一個R’為F，例如1、2、3、4、或5個R’為F。在一些實施例中，CR’3含有1、2、或3個F部份。例如，在實施例中，R1係選自由-CH3(或Me)、-CFH2、-CHF2、CF3、-CH2OCH3、-CFH2OCH3、-CHF2OCH3、-CF3OCH3、-CH2OCFH2、-CH2OCHF2、-CH2OCF3、-CFH2OCH3、-CFH2OCFH2、-CFH2OCHF2、-CFH2OCF3、-CHF2OCH3、-CHF2OCFH2、-CHF2OCHF2、-CHF2OCF3、-(CR’2)3OCR’3、-CH2CH3(或Et)、-CFH2CH3、-CHF2CH3、-CF3CH3、-CH2CFH2、-CH2CHF2、-CH2CF3、-CFH2CH3、-CFH2CFH2、-CFH2CHF2、-CFH2CF3、-CHF2CH3、-CHF2CFH2、-CHF2CHF2、-CHF2CF3、-CH2CH2CH3、CF2CH2CH3、CH2CF2CH3、CH2CH2CF3、CF2CF2CH3、CH2CF2CF3、CF2CH2CF3、CF2CF2CF3、CHFCH2CH3、CHFCHFOCH3、CHFCH2CFH2、CHFCH2CHF2及CH2CHFCH3所組 成之群組。在實施例中，R1係-CH3(或Me)或-CH2CH3(或Et)。在實施例中，式II之核苷酸係選自由下列所組成之群組：
在式(I)或式(II)之化合物中，Y可為O或S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等等)種情況下為S。在其他實施例中，Y在至少一種情況下為S且在至少另一種情況下為O。在其他實施例中，Y在各情況下為S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等等)種情況下為O。
所揭露之寡核苷酸包含至少一個式(I)之核苷酸。在實施例中，所揭露之寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個式(I)之核苷酸。在實施例中，所揭露之寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24個式(II)之核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸包含2至40個核苷酸，例如8至26個核苷酸或其間的整數。
在包括多個式(I)之核苷酸的實施例中，該核苷酸可為相同或不同的。在一些實施例中包括一或多個式(II)之核苷酸，且該核苷酸可為相同或不同的。例如，在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少一個式(I)之核苷酸及至少一個式(II)之核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少一個式(I)之核苷酸(其中至少一個R1係MOE)及至少一個式(II)之核苷酸(其中R2係Me或Et)。在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少2個交替的式(I)及式(II)之核苷酸。例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個核苷酸，其具有交替的2’修飾(例如Me-MOE-Me-MOE...或Et-MOE-Et-MOE-Et-MOE...)。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含式(IIIa)及/或式(IIIb)之2’-氟代核苷酸(fluoronucleotide)： 其中Y係S或O，R係H或帶正電荷的反離子，且B係核鹼基。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少4個交替的式(I)或式(II)及式(IIIa)之核苷酸。例如，該寡核苷酸包含4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個交替的核苷酸。
式(I)、式(II)、式(IIIa)、及式(IIIb)之核苷酸的核鹼基(B)可各自獨立為天然或未經修飾的核鹼基、或經修飾的核鹼基。在一些實施例中，該等經修飾的核苷酸包括2,6-二胺基嘌呤核鹼基，但可選地不包括腺嘌呤。在一些實施例中，該等經修飾的核苷酸包括5-甲基尿嘧啶核鹼基，但可選地不包括尿嘧啶。在一些實施例中，該等經修飾的核苷酸包括2,6-二胺基嘌呤核鹼基(但不包括腺嘌呤)及5-甲基尿嘧啶核鹼基(但可選地不包括尿嘧啶)。
各式(I)、式(II)、式(IIIa)、及式(IIIb)之核苷酸中的Y可獨立地為O或S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)種情況下為S。在其他實施例中，Y在至少一種情況下為S且在至少另一種情況下為O。在其他實施例中，Y在各情況下為S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等等)種情況下為O。
在包括各式(I)、式(II)、式(IIIa)、及式(IIIb)之多個核苷酸的實施例中，此等式之多個核苷酸可為相同或不同的。例如，在一些實施例中，核苷酸除了至少一個式(I)之核苷酸外，還包含至少一個式(I)、式(II)、式(IIIa)、及式(IIIb)之核苷酸。在一些實施例中，核 苷酸包含至少2個交替的式(I)及/或式(II)及/或式(III)之核苷酸。例如，所揭露之寡核苷酸可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個核苷酸，其具有交替的2’修飾。
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸含有一或多個上述修飾，並且具有對細胞核HBV cccDNA具有親和力的核鹼基序列或與位於該HBV cccDNA分子之增強子I區域或其鄰近處的標靶序列雜交，從而在該增強子I區域或其鄰近處產生/維持D環。例如，在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸含有一或多個上述修飾以及根據本文所列序列之一者的核鹼基序列。
在一些實施例中，本技術之寡核苷酸包括經修飾的核苷酸。例如，本揭露之化合物包括式(I)之核苷酸： 其中R係H或帶正電荷的反離子，B在各情況下獨立為天然或未經修飾的核鹼基、或經修飾的核鹼基，R1係-(CR’2)2OCR’3，且R’在各情況下獨立為H或F。
在式(I’)之核苷酸中，R1係-(CR’2)2OCR’3。在一些實施例中，R’在各情況下為H。在其他實施例中，至少一個R’為F，例如1、2、3、4、5、6、或7個R’為F。在一些實施例中，CR’3含有1、 2、或3個F部份。例如，在實施例中，R1係選自由-CH2CH2OCH3(或MOE)、-CF2CH2OCH3、-CH2CF2OCH3、-CH2CH2OCF3、-CF2CF2OCH3、-CH2CF2OCF3、-CF2CH2OCF3、-CF2CF2OCF3、-CHFCH2OCH3、-CHFCHFOCH3、-CHFCH2OCFH2、-CHFCH2OCHF2及-CH2CHFOCH3所組成之群組。在實施例中，式I之核苷酸係
在實施例中，本揭露之化合物包括至少一式(I’)之核苷酸及/或至少一式(II’)之核苷酸： 其中Y係S或O，R係H或一帶正電荷的反離子，B係一核鹼基，R2係-CR’3、-CR’2OCR’3、-(CR’2)3OCR’3或-(CR’2)1-2CR’3，或R2係-(CR’2)2OCR’3且Y係O且R’在各情況下獨立為H或F。
在式(II’)之核苷酸中，R2係-CR’3、-(CR’2)1-3OCR’3、或-(CR’2)1-2CR’3。在一些實施例中，R2係-CR’3或-CR’2CR’3。在一些實施例中，R’在各情況下為H。在其他實施例中，至少一個R’為F， 例如1、2、3、4、或5個R’為F。在一些實施例中，CR’3含有1、2、或3個F部份。例如，在實施例中，R1係選自由-CH3(或Me)、-CFH2、-CHF2、CF3、-CH2OCH3、-CFH2OCH3、-CHF2OCH3、-CF3OCH3、-CH2OCFH2、-CH2OCHF2、-CH2OCF3、-CFH2OCH3、-CFH2OCFH2、-CFH2OCHF2、-CFH2OCF3、-CHF2OCH3、-CHF2OCFH2、-CHF2OCHF2、-CHF2OCF3、-(CR’2)3OCR’3、-CH2CH3(或Et)、-CFH2CH3、-CHF2CH3、-CF3CH3、-CH2CFH2、-CH2CHF2、-CH2CF3、-CFH2CH3、-CFH2CFH2、-CFH2CHF2、-CFH2CF3、-CHF2CH3、-CHF2CFH2、-CHF2CHF2、-CHF2CF3、-CH2CH2CH3、CF2CH2CH3、CH2CF2CH3、CH2CH2CF3、CF2CF2CH3、CH2CF2CF3、CF2CH2CF3、CF2CF2CF3、CHFCH2CH3、CHFCHFOCH3、CHFCH2CFH2、CHFCH2CHF2及CH2CHFCH3所組成之群組。在實施例中，R1係-CH3(或Me)或-CH2CH3(或Et)。在實施例中，式II之核苷酸係選自由下列所組成之群組：
在式(I’)或式(II’)之化合物中，Y可為O或S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)種情況下為S。在其他實施例中，Y在 至少一種情況下為S且在至少另一種情況下為O。在其他實施例中，Y在各情況下為S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等等)種情況下為O。
所揭露之寡核苷酸包含至少一個式(I’)之核苷酸。在實施例中，所揭露之寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個式(I’)之核苷酸。在實施例中，所揭露之寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個式(II’)之核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸包含2至40個核苷酸，例如8至26個核苷酸或其間的整數。
在包括多個式(I’)之核苷酸的實施例中，該核苷酸可為相同或不同的。在一些實施例中，包括一或多個式(II’)之核苷酸，且該核苷酸可為相同或不同的。例如，在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少一個式(I’)之核苷酸及至少一個式(II’)之核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少一個式(I’)之核苷酸(其中至少一個R1係MOE)及至少一個式(II’)之核苷酸(其中R2係Me或Et)。在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少2個交替的式(I’)及式(II)之核苷酸。例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個核苷酸，其具有交替的2’修飾(例如Me-MOE-Me-MOE...或Et-MOE-Et-MOE-Et-MOE...)。
在一些實施例中，可包括式(I’)及/或式(II’)之核苷酸，其係由以下表示：
在一些實施例中，該包含式(I)之核苷酸及/或的寡核苷酸包含式(IIIa’)及/或式(IIIb’)之2’-氟代核苷酸(fluoronucleotide)： 其中Y係S或O，R係H或帶正電荷的反離子，且B係核鹼基。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少4個交替的式(I’)及式(IIIa’)之核苷酸。例如，該寡核苷酸包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個交替的核苷酸。
某些實施例包括一種寡核苷酸，其包含4至40個核苷酸，並包含式(IV’)： 其中Y係S或O，R係H或一帶正電荷的反離子，B係一核鹼基，R1係-(CR’2)2OCR’3，R2係選自-OCR’3、-OCR’2OCR’3、-O(CR’2)3OCR’3或-O(CR’2)1-2CR’3及F，R’在各情況下獨立為H或F，且a係1至10的整數，b係1至10的整數，其中該至20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20。
本揭露之化合物包括包含下面式(III’)的化合物： 其中Y係S或O，R係H或一帶正電荷的反離子，且B在各情況下獨立為一天然或未經修飾的核鹼基或一經修飾的核鹼基；並可選地包含一或多個式(I’)、式(II’)、及/或式(IV’)。
式(I’)、式(II’)、式(IIIa’)、式(IIIb’)、式(IV’)、及式(V’)之核苷酸的核鹼基(B)可各自獨立為天然或未經修飾的核鹼基、或 經修飾的核鹼基。在一些實施例中，該等經修飾的核苷酸包括2,6-二胺基嘌呤核鹼基，但可選地不包括腺嘌呤。在一些實施例中，該等經修飾的核苷酸包括5-甲基尿嘧啶核鹼基，但可選地不包括尿嘧啶。在一些實施例中，該等經修飾的核苷酸包括2,6-二胺基嘌呤核鹼基(但不包括腺嘌呤)及5-甲基尿嘧啶核鹼基(但可選地不包括尿嘧啶)。
各式(II’)、式(IIIa’)、式(IIIb’)、式(IV’)、及式(V’)之核苷酸中的Y可獨立地為O或S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)種情況下為S。在其他實施例中，Y在至少一種情況下為S且在至少另一種情況下為O。在其他實施例中，Y在各情況下為S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等等)種情況下為O。
在包括各式(I’)、式(II’)、式(IIIa’)、式(IIIb’)、式(IV’)、及式(V’)之多個核苷酸的實施例中，此等式之多個核苷酸可為相同或不同的。例如，在一些實施例中，該核苷酸除了至少一個式(I)之核苷酸外，還包含至少一個式(II’)、式(III’)、式(IV’)、式(V’)、及/或式(V’)之核苷酸。在一些實施例中，該核苷酸包含至少2個交替的式(I’)及/或式(II’)及/或式(III’)及/或式(IV’)、式(V’)、及/或式(V’)之核苷酸。例如，所揭露之寡核苷酸可包括2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個核苷酸，其具有交替的2’修飾。
在實施例中，該寡核苷酸之核苷酸係選自由下列所組成之群組： 其中B可為任何天然或經修飾的鹼基。
本揭露之化合物包括包含下面式(V”)的化合物： 其中Y係S或O，R係H或帶正電荷的反離子，B在各情況下獨立為天然或未經修飾的核鹼基、或經修飾的核鹼基，A係-(CR”R”)1-2-且R”在各情況下獨立為H、F、或Me，並可選地包含一或多個式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、或式(V’)。
在包含式(V”)的化合物中，A係-(CR”R”)1-2-。在一些實施例中，A係-(CR”R”)-，在其他實施例中，A係-(CR”R”)2-。R”在各情況下獨立為H或Me。在一些實施例中，一個R”為Me且其餘的為H。在其他實施例中，所有的R”均為H。
在一些實施例中，當A為CH2時，則Y為S。在其他實施例中，當A為CH2CH2時，則Y為O或S。在一些實施例中，A係CH2CH(Me)或CH(Me)且Y係O或S。
在包含式(V”)的化合物中，Y係O或S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)種情況下為S。在其他實施例中，Y在至少一種情況下為S且在至少另一種情況下為O。在其他實施例中，Y在各情況下為S。在一些實施例中，Y在至少一(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等等)種情況下為O。
式(V”)(及可選地式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、及/或式(V’))之化合物可為寡核苷酸的一部分。在一些實施例中，包含式(IV’)(及可選地式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、及/或式 (V’))的化合物係一種寡核苷酸，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個式(V”)(及式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、及/或式(V’))之核苷酸。在一些實施例中，該寡核苷酸包含2至40個核苷酸，例如8至26個核苷酸或其間的整數。
在包括多個式(V’)之核苷酸的實施例中，該等多個式(V’)之核苷酸可為相同或不同的。在一些實施例中，包括一或多個式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、及/或式(V’)之核苷酸，且該核苷酸可為相同或不同的。例如，在一些實施例中，該核苷酸包含至少一個式(V’)之核苷酸及至少一個式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、及/或式(V’)之核苷酸。在一些實施例中，該核苷酸包含至少2個交替的式(V”)及式(I’)及/或式(II’)之核苷酸。例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個核苷酸，其具有交替的2’修飾。
在一些實施例中，包含式(V’)(及可選地式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、及/或式(V’))之核苷酸的核苷酸進一步包含具有下面結構的2-氟代核苷酸： 其中Y、R、及B與式(I’)中的相同。在一些實施例中，該核苷酸包含至少4個交替的式(V’)之核苷酸及2-氟代核苷酸。
本揭露之化合物包括包含下面式(V’)的化合物： 其中Y係S或O，R係H或一帶正電荷的反離子，且B在各情況下獨立為一天然或未經修飾的核鹼基或一經修飾的核鹼基；並可選地包含一或多個式(I’)、式(II’)、式(III’)、式(IV’)、式(V’)、及/或式(V”)。
在本揭露中使用下列縮寫。2’-H(去氧核糖)核苷係由對應於核鹼基的大寫字母表示，例如A、C、G、及T。2’-O-甲基化(2’-O-Me)核苷係由小寫字母m及對應於核鹼基的大寫字母表示，例如mA、mC、mG、及mU。2’-O-甲基化5-甲基胞嘧啶係簡稱為5 mmC。
關於核苷酸的骨架或次單元間的鍵聯，磷酸二酯次單元間的鍵聯係稱為「PO」或通常不包括在序列的詳細信息中；硫代磷酸酯次單元間的鍵聯係簡稱為小寫「ps」；胺基磷酸酯次單元間的鍵聯係簡稱為小寫「np」；且硫代胺基磷酸酯次單元間的鍵聯係簡稱為小寫「nps」。
在實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之至少一個核苷酸經修飾以包括5-甲基胞嘧啶核鹼基、在2'位的O-Me修飾 (mA、5 mmC、mG、及mU)、及核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之各核苷酸經修飾如下：(a)各具有胞嘧啶核鹼基的核苷酸經修飾成2'-O-甲基化5-甲基胞嘧啶(5 mmC)；(b)各其他核苷酸亦經修飾以包括在2'位的O-Me修飾(mA、mG、及mU)；及(c)各核苷酸在核苷酸之間含有硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
例如，SEQ ID NO：1至13可如表2所示經修飾。SEQ ID NO：1之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：66。SEQ ID NO：2之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：67。SEQ ID NO：3之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：68。SEQ ID NO：4之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：69。SEQ ID NO：5之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：70。SEQ ID NO：6之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：71。SEQ ID NO：7之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：72。SEQ ID NO：8之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：74。SEQ ID NO：9之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：75。SEQ ID NO：10之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：76。SEQ ID NO：11之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：77。SEQ ID NO：12之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：78。SEQ ID NO：13之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：79。
在實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之至少一個核苷酸經修飾以包括5-甲基胞嘧啶核鹼基、在2'位的O-Me修飾 (mA、5 mmC、mG、及mU)、及核苷酸之間的硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯。在實施例中，SEQ ID NO：1至65中任一者之各核苷酸經修飾如下：(a)各具有胞嘧啶核鹼基的核苷酸經修飾成2'-O-甲基化5-甲基胞嘧啶(5 mmC)；(b)各其他核苷酸亦經修飾以包括在2'位的O-Me修飾(mA、mG、及mU)；及(c)各核苷酸在核苷酸之間含有硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯。
例如，SEQ ID NO：7之寡核苷酸可經修飾為SEQ ID NO：96，如表2所示。
在實施例中，該寡核苷酸與配體靶向部份接合。靶向部份包括GalNAc，諸如GalNAc-1-13。例如，在一些實施例中包括下列的GalNAc衍生物。以下顯示附接至連接子(linker)或支持物(support)的GalNAc部份，如結構中所指示。
GalNAc衍生物可在本揭露之寡核苷酸的3'及/或5'端接合。例如，SEQ ID NO：71之寡核苷酸可包括3’GalNAc(SEQ ID NO：80)。其他靶向部份可包括棕櫚醯基或生育酚修飾。例如，SEQ ID NO：71之寡核苷酸可包括3’棕櫚醯基(SEQ ID NO：81)或3’生育酚(SEQ ID NO：82)。
治療及疾病預防方法
下面的討論僅以示例的方式呈現，而非意欲有所限制。
本揭露的一個態樣包括用於治療經診斷為具有HBV感染及/或HBV相關病症、懷疑具有HBV感染及/或HBV相關病症、或有HBV感染及/或HBV相關病症之風險的個體之方法。在治療應用中，將包含本揭露之寡核苷酸的組成物投予至懷疑或已經罹患這種疾病的個體(諸如例如持續存在HBV cccDNA、在該個體的血清及/或肝臟中存在HBV抗原(例如HBsAg及/或HBeAg)、或升高的HBV病毒負荷量水平)，其量足以治愈或至少部分地阻止該疾病的症狀，包括其併發症及疾病發展中的中間病理表型。
可藉由任何所屬技術領域中已知的診斷或預後測定或其組合來鑑定罹患HBV感染及/或HBV相關病症的個體，包括檢測本文所述之HBV感染及/或HBV相關病症的典型症狀。
本揭露提供一種用於治療經診斷為具有或懷疑具有HBV感染及/或HBV相關病症的個體之方法，該方法包含向該個體投予有效量的本揭露之寡核苷酸組成物。
在一些實施例中，經本揭露之寡核苷酸組成物治療的個體將顯示出改善或消除下列症狀中之一或多者：存在肝臟HBV cccDNA、存在血清及/或肝臟HBV抗原(例如HBsAg及/或HBeAg)、抗HBV抗體不存在或低水平、肝損傷、肝硬化、D型肝炎、急性B型肝炎、急性猛爆性B型肝炎、慢性B型肝炎、肝纖維化、末期肝臟疾病、肝細胞癌、類血清病症候群、厭食症、噁心、嘔吐、輕微發燒、肌痛、易疲勞性、味覺敏銳度及嗅覺感知失調(厭惡食物及香煙)、右上腹部和上腹部疼痛(間歇性、輕度至中度)、肝性腦病(hepatic encephalopathy)、嗜眠症、睡眠模式紊亂、精神錯亂、昏迷、腹水、胃腸道出血、凝血病變、黃疸、肝腫大(輕度增大、軟肝)、脾腫大、手掌紅斑、蜘蛛痣、肌肉萎縮、蜘蛛血管瘤、血管炎、靜脈曲張出血、外周水腫(peripheral edema)、男性女乳症、睪丸萎縮、腹部側支靜脈(臍周靜脈曲張(caput medusa))、ALT水平高於AST水平、白血球減少症(即顆粒球減少症)、降低的白蛋白水平、升高的血清鐵水平、淋巴球增多症、增加的紅血球沉降率(ESR)、縮短的紅血球存活期、溶血、血小板減少症、國際標準化比值 (INR)的延長、存在血清HBV DNA、延長的凝血酶原時間(PT)、高球蛋白血症、存在組織非特異性抗體(諸如抗平滑肌抗體(ASMA)或抗核抗體(ANA))、存在組織特異性抗體(諸如抗甲狀腺抗體)、高膽紅素血症、低血小板及白血球計數、AST水平高於ALT水平、肝小葉發炎(lobular inflammation)伴隨退化性和再生性肝細胞變化、及主要地肝小葉中心壞死(centrilobular necrosis)。
在一些實施例中，經本揭露之寡核苷酸組成物治療的個體與未經治療的罹患HBV感染及/或HBV相關病症的個體相比，將顯示出一或多種生物標記的表現水平減少，該生物標記係選自丙胺酸轉胺酶(ALT)、天門冬胺酸轉胺酶(AST)、γ-麩胺醯基轉肽酶(GGT)、鹼性磷酸酶(ALP)、膽紅素、及類風濕因子(RF)。
在一些實施例中，將靶向HBV cccDNA的寡核苷酸投予至具有HBV感染及/或HBV相關疾病的個體，使得例如在該個體之細胞、組織、血液、或其他生物流體中的HBV cccDNA水平、HBV抗原水平、HBV病毒負荷量水平、ALT水平、及/或AST水平中之一或多者，與在投予該寡核苷酸之前在該個體中觀察到的水平相比減少至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或更多。
在一些實施例中，將靶向HBV cccDNA的寡核苷酸投予至具有HBV感染及/或HBV相關疾病的個體，使得例如在該個體之細胞、組織、血液、或其他生物流體中的抗HBV抗體水平與在投予該寡核苷酸之前在該個體中觀察到的水平相比增加至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或更多。
本揭露之方法包括投予本文所述之寡核苷酸組成物，使得HBV cccDNA水平減少約1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、或約80小時。在一個實施例中，HBV cccDNA水平會降低持續 一段時間，例如至少約二、三、四、五、六、七天或更多天，或約一週、兩週、三週、或約四週或更多週。
在一些實施例中，投予本揭露之寡核苷酸組成物會使例如患者之細胞、組織、血液、尿、或器官中的肝臟HBV cccDNA之存在、HBV DNA之水平(例如rcDNA)、血清及/或肝臟HBV抗原(例如HBsAg及/或HBeAg)之存在、ALT水平、及/或AST水平減少至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或更多，例如減少至低於測定的檢測水平。
另外或替代地，在一些實施例中，投予本揭露之寡核苷酸組成物會使例如患者之細胞、組織、血液、尿、或器官中的血清及/或肝臟抗HBV抗體之存在增加至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、 30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或更多。
在一態樣中，本揭露提供一種用於在HBV cccDNA中誘導D環形成的方法，該方法包含使HBV cccDNA與具有SEQ ID NO：1至82中任一者之序列的寡核苷酸接觸。在另一態樣中，本揭露提供一種用於在HBV cccDNA中誘導D環形成的方法，該方法包含使由核苷酸位置900至1310(增強子I區域)所組成之HBV cccDNA基因組的標靶區域與寡核苷酸接觸，該寡核苷酸與該HBV cccDNA的該標靶區域有至少90%互補。在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸與HBV cccDNA雜交以誘導抗原性D環結構的形成。在一些實施例中，誘導D環形成會刺激先天性免疫。
關於治療應用，將本揭露之寡核苷酸組成物投予至個體。在一些實施例中，每天投予一次、兩次、三次、四次、或五次寡核苷酸組成物。在一些實施例中，每天投予寡核苷酸組成物超過五次。另外或替代地，在一些實施例中，將寡核苷酸組成物每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、或每六天投予一次。在一些實施例 中，將寡核苷酸組成物每週、每兩週、每三週、或每月投予一次。在一些實施例中，將寡核苷酸組成物持續投予一週、兩週、三週、四週、或五週。在一些實施例中，將寡核苷酸組成物投予達六週或更長時間。在一些實施例中，將寡核苷酸組成物投予達十二週或更長時間。在一些實施例中，將寡核苷酸組成物持續投予不到一年的時間。在一些實施例中，將寡核苷酸組成物持續投予超過一年的時間。
在本揭露之方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸組成物持續1週以上。在本揭露之方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸組成物持續2週以上。在本揭露之方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸組成物持續3週以上。在本揭露之方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸組成物持續4週以上。在本揭露之方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸組成物持續6週以上。在本揭露之方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸組成物持續12週以上。
評估治療疾病的功效可例如藉由測量疾病進展、疾病緩解、症狀嚴重性、疼痛減輕、生活品質、維持治療效果所需的藥物劑量、疾病標記的水平、或任何其他適用於治療中之給定疾病的可測量參數。藉由測量任何一種此類參數或任何參數組合來監測治療的功效係完全在所屬技術領域中具有通常知識者的能力範圍之內。例如，可藉由例如定期監測病毒負荷量及轉胺酶水平來評估治療CHB的功效。將後來讀數與初始讀數比較以提供該治療是否有效的指示。
投予模式
本揭露提供包含本揭露之寡核苷酸的醫藥組成物及配方。該醫藥組成物可用於治療與HBV感染相關的疾病或病症。
在某些實施例中，該醫藥組成物包括如本文所述之寡核苷酸及醫藥上可接受之載劑。此類醫藥組成物係基於遞送模式配製。
本揭露之醫藥組成物可以多種方式投予，其取決於所欲的是局部或全身治療以及待治療的區域。投予可為局部、肝內、經皮(例如藉由經皮貼劑)、肺部(例如藉由吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括藉由噴霧器)、氣管內、鼻內、表皮、口服、直腸、或腸胃外。腸胃外投予包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、或肌內注射或輸注、真皮下(subdermal)(例如經由植入裝置)、或顱內(例如藉由實質內、鞘內、或室內)投予。
在一些實施例中，該醫藥組成物係配製成用於經由腸胃外遞送(例如靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內、真皮下、顱內、或皮下)的全身投予。在某些實施例中，該醫藥組成物係配製成用於直接遞送進腦實質中，例如藉由連續的泵輸注輸注進腦中。
在一些實施例中，該投予係經由長效儲存式注射(depot injection)。長效儲存式注射可在一延長的時段內以一致的方式釋放該寡核苷酸。因此，長效儲存式注射可減少要獲得所欲治療或疾病預防效果所需的給藥頻率。長效儲存式注射亦可提供更一致的血清濃度。長效儲存式注射可包括皮下注射或肌內注射。
在一些實施例中，該投予係經由泵。該泵可為外部泵或手術植入泵。在某些實施例中，該泵係皮下植入的滲透泵。在其他實 施例中，該泵係輸注泵。輸注泵可用於靜脈內、皮下、動脈、或硬膜外輸注。在某些實施例中，該輸注泵係皮下輸注泵。在其他實施例中，該泵係手術植入泵，其將該寡核苷酸遞送至肝臟。
用於局部投予的醫藥組成物及配方可包括經皮貼劑、軟膏、乳液、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體、及粉劑。可包括習用的藥物載劑、水性、粉末、或油性基質、增稠劑、及類似者。合適的局部配方包括其中本揭露特徵之寡核苷酸與局部遞送劑(諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑、及界面活性劑)混合的那些配方。合適的脂質及脂質體可為中性的(例如二油醯基磷脂醯基DOPE乙醇胺(dioleoylphosphatidyl DOPE ethanolamine)、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼DMPC(dimyristoylphosphatidyl choline DMPC)、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼(distearolyphosphatidyl choline))、陰離子(例如二肉荳蔻醯基磷脂醯基甘油DMPG(dimyristoylphosphatidyl glycerol DMPG))、或陽離子(例如二油醯基四甲基胺丙基DOTAP(dioleoyltetramethylaminopropyl DOTAP)及二油醯基磷脂醯基乙醇胺DOTMA(dioleoylphosphatidyl ethanolamine DOTMA))。本揭露特徵之寡核苷酸可被包封在脂質體內或可與其形成複合物，特別是與陽離子脂質體形成複合物。替代地，寡核苷酸可與脂質複合，特別是與陽離子脂質複合。合適的脂肪酸及酯包括但不限於花生油酸、油酸、二十酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘 油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼(acylcarnitine)、醯基膽鹼(acylcholine)、或C1-20烷基酯(例如肉荳蔻酸異丙酯IPM)、單甘油酯、雙甘油酯、或其醫藥上可接受的鹽。局部配方在美國專利第6,747,014號中有詳細的描述，其以引用方式併入本文中。
關於口服投予，可使用液體或固體配方。此類配方的實例包括片劑、明膠膠囊、丸劑、口含錠、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片(wafer)、咀嚼錠、及類似者。如所屬技術領域中從業人員所理解的，本揭露之寡核苷酸可與合適的藥物載劑(媒劑)或賦形劑混合。載劑及賦形劑的實例包括澱粉、乳、糖、某些類型的黏土、明膠、乳酸、硬脂酸或其鹽(包括硬脂酸鎂或硬脂酸鈣)、滑石、植物脂肪或油、樹膠、及二醇(glycol)。
口服組成物通常包括惰性稀釋劑或可食用的載劑。為了口服治療性投予之目的，活性化合物可與賦形劑合併並以片劑、口含錠、或膠囊(例如明膠膠囊)的形式使用。口服組成物亦可使用流體載劑製備以用作漱口水。可包括醫藥上相容的黏合劑及/或佐劑材料作為該組成物的一部分。該等片劑、丸劑、膠囊、口含錠、及類似者可含有任何下列成分或具有類似性質的化合物：黏合劑(諸如微晶纖維素、黃蓍膠、或明膠)；賦形劑(諸如澱粉或乳糖)、崩散劑(諸如海藻酸、Primogel、或玉米澱粉)；潤滑劑(諸如硬脂酸鎂或Sterotes)；助滑劑(諸如膠體二氧化矽)；甜味劑(諸如蔗糖或糖精)；或調味劑(諸如薄荷、水楊酸甲酯、或橙味調味劑)。
本揭露之醫藥組成物可以足以靶向HBV之ccc DNA的劑量投予。
在一個實施例中，本揭露之寡核苷酸係以基於重量的劑量投予至個體。「基於重量的劑量(weight-based dose)」(例如，以mg/kg為單位的劑量)係取決於個體之重量而變化的寡核苷酸劑量。在另一個實施例中，寡核苷酸係以固定劑量投予至個體。「固定劑量(fixed dose)」(例如，以mg為單位的劑量)意指對所有個體使用相同的寡核苷酸劑量，而不管任何具體的個體相關因素(諸如重量)。在一個特定的實施例中，本揭露之寡核苷酸的固定劑量係基於預定的重量或年齡。
通常，本揭露之寡核苷酸的合適劑量將會在每天每公斤接受者體重約0.0001至約200.0毫克的範圍內，或在每天每公斤體重約1至50mg的範圍內。例如，該寡核苷酸可每天投予約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約1.5mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約10mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約40mg/kg、或約50mg/kg。
可向個體投予治療有效量的本揭露之寡核苷酸，諸如約0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2 mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4.0mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5.0mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6.0mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7.0mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8.0mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9.0mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、或約50mg/kg寡核苷酸。在所述值中間的值和範圍亦被認為是本揭露之一部分。
在一些實施例中，該寡核苷酸可以約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、 3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或約10mg/kg的劑量投予。在所述值中間的值和範圍亦被認為是本揭露之一部分。
在另一實施例中，該寡核苷酸係以約0.1至約50mg/kg、約0.25至約50mg/kg、約0.5至約50mg/kg、約0.75至約50mg/kg、約1至約50mg/kg、約1.5至約50mg/kg、約2至約50mg/kg、約2.5至約50mg/kg、約3至約50mg/kg、約3.5至約50mg/kg、約4至約50mg/kg、約4.5至約50mg/kg、約5至約50mg/kg、約7.5至約50mg/kg、約10至約50mg/kg、約15至約50mg/kg、約20至約50mg/kg、約25至約50mg/kg、約30至約50mg/kg、約35至約50mg/kg、約40至約50mg/kg、約45至約50mg/kg、約0.1至約45mg/kg、約0.25至約45mg/kg、約0.5至約45mg/kg、約0.75至約45mg/kg、約1至約45mg/kg、約1.5至約45mg/kg、約2至約45mg/kg、約2.5至約45mg/kg、約3至約45mg/kg、約3.5至約45mg/kg、約4至約45mg/kg、約4.5至約45mg/kg、約5至約45mg/kg、約7.5至約45mg/kg、約10至約45mg/kg、約15至約45mg/kg、約20至約45mg/kg、約25至約45mg/kg、約30至約45mg/kg、約35至約45mg/kg、約40至約45 mg/kg、約0.1至約40mg/kg、約0.25至約40mg/kg、約0.5至約40mg/kg、約0.75至約40mg/kg、約1至約40mg/kg、約1.5至約40mg/kg、約2至約40mg/kg、約2.5至約40mg/kg、約3至約40mg/kg、約3.5至約40mg/kg、約4至約40mg/kg、約4.5至約40mg/kg、約5至約40mg/kg、約7.5至約40mg/kg、約10至約40mg/kg、約15至約40mg/kg、約20至約40mg/kg、約25至約40mg/kg、約30至約40mg/kg、約35至約40mg/kg、約0.1至約30mg/kg、約0.25至約30mg/kg、約0.5to約30mg/kg、約0.75至約30mg/kg、約1至約30mg/kg、約1.5至約30mg/kg、約2至約30mg/kg、約2.5至約30mg/kg、約3至約30mg/kg、約3.5至約30mg/kg、約4至約30mg/kg、約4.5至約30mg/kg、約5至約30mg/kg、約7.5至約30mg/kg、約10至約30mg/kg、約15至約30mg/kg、約20至約30mg/kg、約25至約30mg/kg、約0.1至約20mg/kg、約0.25至約20mg/kg、約0.5至約20mg/kg、約0.75至約20mg/kg、約1至約20mg/kg、約1.5至約20mg/kg、約2至約20mg/kg、約2.5至約20mg/kg、約3至約20mg/kg、約3.5至約20mg/kg、約4至約20mg/kg、約4.5至約20mg/kg、約5至約20mg/kg、約7.5至約20mg/kg、約10至約20mg/kg、或約15至約20mg/kg的劑量投予。在所述值中間的值和範圍亦被認為是本揭露之一部分。
在一些實施例中，該寡核苷酸可以約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或約10mg/kg的劑量投予。在所述值中間的值和範圍亦被認為是本揭露之一部分。
在某些實施例中，可向個體投予單一治療有效量的寡核苷酸，諸如約0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.725、0.75、0.775、0.8、0.825、0.85、0.875、0.9、0.925、0.95、0.975、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、105、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、 17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或約50mg/kg。在所述值中間的值和範圍亦被認為是本揭露之一部分。
在其他實施例中，向個體投予多劑量的治療有效量的寡核苷酸，例如一劑量約0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.725、0.75、0.775、0.8、0.825、0.85、0.875、0.9、0.925、0.95、0.975、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或約50mg/kg。多劑量方 案可包括每日投予治療有效量的寡核苷酸並持續諸如兩天、三天、四天、五天、六天、七天、或更長時間。
在其他實施例中，向個體投予重複劑量的治療有效量的寡核苷酸，例如一劑量約0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.725、0.75、0.775、0.8、0.825、0.85、0.875、0.9、0.925、0.95、0.975、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或約50mg/kg。重複劑量方案可包括定期投予治療有效量的寡核苷酸，諸如每隔一天一次、每三天一次、每四天一次、每週兩次、每週一次、每隔一週一次、或每月一次。
例如，本揭露之寡核苷酸(例如於醫藥組成物中的寡核苷酸)可以約0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、或約0.5mg/kg的劑量投予。在上述列舉值中間的值亦旨在成為本揭露之一部分。
在一些實施例中，該寡核苷酸係以在約100mg至約900mg之間、在約100mg至約850mg之間、在約100mg至約800mg之間、在約100mg至約750mg之間、在約100mg至約700mg之間、在約100mg至約650mg之間、在約100mg至約600mg之間、在約100mg至約550mg之間、在約100mg至約500mg之間、在約200mg至約850mg之間、在約200mg至約800mg之間、在約200mg至約750mg之間、在約200mg至約700mg之間、在約200mg至約650mg之間、在約200mg至約600mg之間、在約200mg 至約550mg之間、在約200mg至約500mg之間、在約300mg至約850mg之間、在約300mg至約800mg之間、在約300mg至約750mg之間、在約300mg至約700mg之間、在約300mg至約650mg之間、在約300mg至約600mg之間、在約300mg至約550mg之間、在約300mg至約500mg之間、在約400mg至約850mg之間、在約400mg至約800mg之間、在約400mg至約750mg之間、在約400mg至約700mg之間、在約400mg至約650mg之間、在約400mg至約600mg之間、在約400mg至約550mg、或在約400mg至約500mg之間的固定劑量投予。
在一些實施例中，該寡核苷酸係以約100mg、約125mg、約150mg、約175mg、約200mg、約225mg、約250mg、約275mg、約300mg、約325mg、約350mg、約375mg、約400mg、約425mg、約450mg、約475mg、約500mg、約525mg、約550mg、約575mg、約600mg、約625mg、約650mg、約675mg、約700mg、約725mg、約750mg、約775mg、約800mg、約825mg、約850mg、約875mg、或約900mg的固定劑量投予。
該醫藥組成物可藉由靜脈內灌注投予一段時間，諸如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或約25分鐘的時段。該投予可例如於定期重複進行，諸如每週一次、雙週一次(即每兩週一次)持續一個月、兩個月、三個月、四個月或更長時間。在初始治療方案之後，該等治療劑 可以較不頻繁的方式投予。例如，在每週或每兩週一次投予三個月之後，可以每月重複一次投予並持續六個月或一年或更久。
該醫藥組成物可每日投予一次，或者該寡核苷酸可在一天內以適當的間隔以兩個、三個、或更多個亞劑量(sub-dose)投予，或者甚至使用連續輸注或透過控制釋放配方的遞送來投予。在一個實施例中，各亞劑量中包含的寡核苷酸必須相應地較小以實現每日總劑量。劑量單位亦可經混合以用於數天遞送，例如使用習用的持續釋放配方，其在數天時段內提供寡核苷酸的持續釋放。持續釋放配方在所屬技術領域中係習知的，並且對於在特定部位遞送藥劑特別有用。在一個實施例中，該劑量單位含有每日劑量的相應倍數。
在其他實施例中，該醫藥組成物的單一劑量(single dose)可持久，使得隨後的劑量以不超過3、4、或5天的間隔、或不超過1、2、3、或4週的間隔投予。在一些實施例中，本揭露之醫藥組成物的單一劑量係每週投予一次。在其他實施例中，本揭露之醫藥組成物的單一劑量係雙月投予一次。在一些實施例中，本揭露之醫藥組成物的單一劑量係每月投予一次、每隔一個月投予一次、或每季(即每三個月)投予一次。
可使用習用方法或基於使用合適的動物模型之體內測試來進行本揭露所涵蓋的個別寡核苷酸之有效劑量及體內半衰期的估計。
在該方法的一些實施例中，該寡核苷酸係以口服、局部、全身、靜脈內、皮下、經皮、鞘內、鼻內、腹膜內、肝內、或肌內投予。
在該方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸持續1週以上。在該方法的其他實施例中，每日投予寡核苷酸持續2週以上。在該方法的某些實施例中，每日投予寡核苷酸持續3週以上。在該方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸持續4週以上。在該方法的其他實施例中，每日投予寡核苷酸持續6週以上。在該方法的一些實施例中，每日投予寡核苷酸持續12週以上。
組合療法
在一些實施例中，本揭露之寡核苷酸組成物可與一或多種額外治療劑組合以用於改善或治療HBV感染及/或HBV相關病症。在組合療法中，應當理解本揭露之寡核苷酸組成物及用於HBV感染的一或多種額外治療劑可在相同或分開的組成物中同時投予，或於同一時間或依序地分開投予。
可用於組合療法的額外治療劑之實例包括但不限於抗病毒劑、核苷酸類似物、核苷類似物、反轉錄酶抑制劑(例如富馬酸替諾福韋二吡呋酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)、替諾福韋艾拉酚胺(Tenofovir alafenamide)、拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韋酯(Adefovir dipivoxil)、恩替卡韋(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine)、AGX-1009、恩曲他濱(emtricitabine)、克拉夫定 (clevudine)、利托那韋(ritonavir)、二吡呋酯(dipivoxil)、洛布卡韋(lobucavir)、泛昔洛韋(famvir)、FTC、N-乙醯半胱胺酸(NAC)、PC1323、Theradigm-HBV、胸腺素α、CMX157、AGX-1009、及更昔洛韋(ganciclovir))、免疫刺激劑(例如聚乙二醇化干擾素α-2a(PEG-IFN-Cc2a)、干擾素α-2b、重組人類介白素-7、及類鐸受體7(TLR7)促效劑)、治療性疫苗(例如GS-4774、DV-601、TG1050、Heplislav、ABX203、及INO-1800)、病毒進入抑制劑(例如米魯德西(Myrcludex))、siRNA(例如ARC520、ARC521、ALN-HBV、ARB-1467等)、反義寡核苷酸(例如IONIS-HBV-L Rx等)、抑制HBsAg分泌或釋放的寡核苷酸(例如REP 9AC)、殼體抑制劑(例如Bay41-4109、NVR-1221、NVR3-778、JNJ-379、AB-423、GLS-4、HAP-1、及AT-1)、cccDNA抑制劑(例如IHVR-25)、TLR促效劑(例如GS-9620、ARB-1598、ANA975、RG7795(ANA773)、MEDI9197、PF-3512676、及IMO-2055)、miRNA模擬物或抑制劑、適體、空間阻斷劑、短活化RNA(saRNA)、免疫調節寡核苷酸、或其他治療劑及/或程序(例如肝移植及化療)。
該等多種治療劑可以任何順序投予或甚至同時投予。如果同時投予，該等多種治療劑可以單一統一的形式或以多種形式提供(僅舉實例而言，可作為單一藥丸或作為兩個單獨的藥丸)。其中一種治療劑可以多劑量給予，或者兩者都可以多劑量給予。如果不是同時投予，則多劑量之間的時間可能會在多於零週到少於四週內變化。 此外，該等組合方法、組成物、及配方並不被限定於僅使用兩種藥劑。
在一些實施例中，除了投予該寡核苷酸之外，該方法進一步包含分開地、依序地、或同時地向該個體投予一或多種選自由下列所組成之群組的額外治療劑：抗病毒劑、核苷酸類似物、核苷類似物、反轉錄酶抑制劑、免疫刺激劑、治療性疫苗、病毒進入抑制劑、殼體抑制劑、及cccDNA抑制劑。在一些實施例中，該反轉錄酶抑制劑係富馬酸替諾福韋二吡呋酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)、替諾福韋艾拉酚胺(Tenofovir alafenamide)、拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韋酯(Adefovir dipivoxil)、恩替卡韋(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine)、AGX-1009、恩曲他濱(emtricitabine)、克拉夫定(clevudine)、利托那韋(ritonavir)、二吡呋酯(dipivoxil)、洛布卡韋(lobucavir)、泛昔洛韋(famvir)、FTC、N-乙醯半胱胺酸(NAC)、PC1323、Theradigm-HBV、胸腺素α、CMX157、AGX-1009、或更昔洛韋(ganciclovir)。
在某些實施例中，該免疫刺激劑係聚乙二醇化干擾素α-2a(PEG-IFN-Cc2a)、干擾素α-2b、重組人類介白素-7、或類鐸受體7(TLR7)促效劑。在一些實施例中，該治療性疫苗係GS-4774、DV-601、或TG1050。在其他實施例中，該病毒進入抑制劑係米魯德西，且該cccDNA抑制劑係IHVR-25。在一些實施例中，該殼體抑制劑係Bay41-4109、NVR-1221、NVR3-778、或JNJ-379。在一些實施例 中，該siRNA係ARC520、ARC521、ALN-HBV、或ARB-1467，且該反義寡核苷酸係IONIS-HBV-L Rx。
套組
本揭露亦提供靶向B型肝炎病毒(HBV)之cccDNA的套組。本揭露之套組包含一或多個寡核苷酸，該寡核苷酸包含選自由SEQ ID NO：1至82所組成之群組的序列或其修飾。該套組亦可包含使用說明、包裝(諸如意欲用於商業銷售的包裝)、及類似者。
實例
實例1：本揭露之寡核苷酸在感染的初代人類肝細胞中減少病毒抗原
所有寡核苷酸係藉由固相合成製備。合成約200個不同的寡核苷酸，其橫跨(+)或(-)DNA鏈。在HBV(+)初代人類肝細胞(PHH)中以3種不同劑量(0.3、3、或30μM)篩選不同寡核苷酸對HBV基因表現(例如HBsAg、HBeAg、tox)的生物學效應。
培養及感染將初代人類肝細胞(PHH)(BioreclamationIVT,Baltimore,MD)解凍並根據製造商的說明鋪於BiocoatTM Collagen I Cellware 96孔、24孔、或6孔盤(Corning Inc.,Corning,New York)。將細胞於37℃水浴中解凍，並在初代肝細胞解凍及鋪盤培養基(Primary Hepatocytes Thawing and Plating Medium)(ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA)中以100×g離心10分鐘。將細胞重新懸浮並在盤格式(plate format)中以8×105/ml鋪盤於 肝細胞維持培養基(hepatocyte maintenance media,HMM)(補充有FBS、胰島素、EGF、及地塞米松(Dexamethasone)的DMEM(ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA))中。將PHH在4%(wt/vol)PEG 8000(Sigma)的存在下接種於肝細胞維持培養基(HMM)中16小時後，用50GE HBV感染。24小時後，除去含有病毒的培養基，將細胞洗滌四次，並進一步在HMM中培養4天。4天期間後，根據製造商的說明，將PHH以0.0015至10μM的寡核苷酸或媒劑處理，經由使用Lipofactamine RNAiMax(ThermoFisher)轉染。然後將處理過的PHH進一步培養6天，在該6天培養期間的中點有單一培養基改變。
ELISA根據製造商的說明，分別使用HBe ELISA套組(Autobio Diagnostics Co.Ltd.,Zhengzhou,China)及sAg ELISA套組(Autobio Diagnostics Co.Ltd.,Zhengzhou,China)對PHH上清液各自執行HBeAg ELISA及HBsAg ELISA。
qPCR：根據製造商的說明，使用MagMax總核酸分離套組(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)從PHH中萃取出總HBVDNA，並使用標準的qPCR測定擴增HBV DNA之核心區域來定量。
結果在PHH測定中測試的200個寡核苷酸中，靶向HBV cccDNA基因組之增強子I區域(從核苷酸位置960附近開始並在核苷酸位置1330附近結束)周圍序列的寡核苷酸出乎意料地顯示了顯著的抗病毒活性，此係基於用所揭露之寡核苷酸處理的PHH上清液中殘留的HBeAg及HBsAg減少。表3列出為三種測試劑量中任一者 之寡核苷酸濃度：0.3、3.0、及30μM，在該濃度觀察到此抗病毒活性。
選擇某些顯示出具有抗病毒活性的寡核苷酸以用於修飾。具體而言，修飾SEQ ID NO：1的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：66的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：2的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：67的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：3的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：68的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：4的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：69的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：5的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：70的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：6的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：71的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：7的寡核苷酸以產生SEQ ID NO： 72的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：8的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：74的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：9的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：75的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：10的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：76的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：11的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：77的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：12的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：78的寡核苷酸。修飾SEQ ID NO：13的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：79的寡核苷酸。根據下列程序修飾該等寡核苷酸。
2’-O-Me硫代磷酸酯寡核苷酸的合成。在Mermade 12合成儀(Bioautomation,Plano,Texas)中以1或2μmole規模使用標準固體支持物合成各寡核苷酸，該固體支持物具有由N 6-苯甲醯基-2'-OMe-腺苷、2'-OMe-尿苷、或N 6-異丁醯基-2'-OMe-鳥苷衍生出的長鏈烷基胺控制孔(controlled-pore)。當最3'端的核苷酸係5-甲基-2'-O-甲基胞嘧啶時，則使用通用連接子(universal linker)固體支持物(ChemGenes,MA)來代替。對於3'-GalNac及3'-生育酚接合的寡核苷酸，使用相應的經修飾之固體支持物。所使用的循環遵循以下步驟：去保護基(deblocking)-接合(coupling)-封蓋(capping)-氧化-封蓋。將2'-O-甲基亞磷醯胺製備為於無水乙腈中的0.1M溶液。使用5-乙硫基四唑(5-ethylthiotetrazole)作為活化劑，使用於二氯甲烷中的3%三氯乙酸進行去三苯甲基作用(detritylate)，使用於THF中的乙酐及於THF中的16% N-甲基咪唑進行封蓋，並使用於吡啶中的0.1M黃原膠氫化物(xanthane hydride)溶液進行硫化。進行去三苯甲基作用(2×45)秒。所有鹼基的定量接合都在(2×360)秒內完成。各封蓋步驟進行90 秒。硫化在120秒內完成。用氨甲胺(ammonia methylamine,AMA)在65℃下處理15分鐘以完成去保護及自該固體支持物切割。當使用通用連接子時，在65℃下去保護1小時。過濾除去該固體支持物後，在GeneVac離心蒸發器中於真空下除去去保護溶液。將粗產物溶解於1M PBS中，並以Vivaspin-Hydrosart-2000 MWCO(Generon Ltd.,Berkshire,UK)藉由超濾去鹽。純度及分子量係藉由HPLC分析(60℃，IEX-Thermo DNAPac PA-100，A- 25mM磷酸鈉10%乙腈pH 11，B-1.8M NaBr 25mM磷酸鈉10%乙腈pH 11；RPIP- Waters XBridge OST C18，A- 100mM HFIP 7mM TEA B- 7：3甲醇/乙腈)及使用針對Xcalibur之Promass Deconvolution的ESI-MS分析來判定。純度及分子量係藉由HPLC分析(60℃，IEX-Thermo DNAPac PA-100，A- 25mM磷酸鈉10%乙腈pH 11，B- 1.8M NaBr 25mM磷酸鈉10%乙腈pH 11；RPIP- Waters XBridge OST C18，A- 100mM HFIP 7mM TEA B- 7：3甲醇/乙腈)及使用針對Xcalibur之Promass Deconvolution(Novatia,Newtown,PA)的ESI-MS分析來判定。
此外，根據下列程序修飾SEQ ID NO：7的寡核苷酸以產生SEQ ID NO：73的寡核苷酸。
3’-胺基-2’-去氧硫代磷酸酯寡核苷酸的合成。如Zielinska,D.；Pongracz,K；Gryaznov,S.M.,Tetrahedron Lett.47,4495-4499(2006)中所述合成3’-胺基-2’-去氧硫代磷酸酯寡核苷酸。在Pharmaron訂製合成3’-胺基-2’-去氧硫代磷酸酯亞磷醯胺單體。將 所有單體在具有乾燥劑的真空乾燥器中乾燥(KOH及P2O5，在室溫下持續24小時)。從Prime Synthesis(Aston,PA)獲得具有附接至第一個5'殘基之長鏈烷基胺控制孔的固體支持物。在Mermade 12合成儀(Bioautomation,Plano,Texas)上使用標準寡核苷酸胺基磷酸酯化學，從預載在固體支持物上的寡核苷酸之5'殘基開始，使用去保護基-接合-氧化-接合-氧化-封蓋循環合成RNA寡核苷酸。將亞磷醯胺製備為於無水乙腈中的0.1M溶液。使用5-乙硫基四唑作為活化劑，使用於二氯甲烷中的5%二氯乙酸進行去三苯甲基作用(50秒)。使用異丁酸酐-二甲吡啶(Lutidine)-ACN 1：1：8及於ACN中的N-甲基咪唑進行封蓋，並使用於吡啶中的0.1M黃原膠氫化物溶液進行硫化。所有鹼基在(2×120)秒內達到最佳接合。進行封蓋步驟90秒。在240秒內完成硫化(分成兩個接合)。用氨水在55℃下處理5小時以完成去保護及自該固體支持物切割。過濾除去該固體支持物後，在Genevac離心蒸發器中於真空下除去去保護溶液。然後使用離子交換層析術在GE Akta Explorer上純化粗產物(Source 15Q，20mM NaH2PO4，15% CH3CN，1.8M NaBr，梯度5至50% B超過20倍管柱體積)，並將流份藉由逆相離子對層析術(reverse phase ion pair chromatography)在Thermo HPLC上分析。將純流份彙集並藉由超濾(使用Vivaspin-Hydrosart-2000 MWCO(Generon Ltd.,Berkshire,UK))去鹽，並在GeneVac蒸發器上蒸乾。純度及分子量係藉由HPLC分析(60℃，IEX-Thermo DNAPac PA-100，A- 25mM磷酸鈉10%乙腈pH 11，B- 1.8M NaBr 25mM磷酸鈉10%乙腈pH 11；RPIP- Waters XBridge OST C18，A- 100mM HFIP 7mM TEA B- 7：3甲醇/乙腈)及使用針對Xcalibur之Promass Deconvolution(Novatia,Newtown,PA)的ESI-MS分析來判定。如上所述分析純化的寡核苷酸以用於合成2'-O-Me硫代磷酸酯寡核苷酸。
表4提供經選擇用於進一步修飾的本揭露之寡核苷酸、彼等之核苷酸長度、該等寡核苷酸所靶向的序列、及該寡核苷酸的方向之概述。
表5中總結各寡核苷酸的EC50及CC50值。如表5中所示，本揭露之寡核苷酸在低濃度下有效抑制HBV病毒抗原(HBeAg及HBsAg)的表現水平。確實，該等寡核苷酸對於HBeAg 抑制的EC50值範圍為0.013μM至0.35μM，且對於HBsAg抑制的EC50值範圍為0.018μM至1.12μM。見表5。
這些結果證實，本揭露之寡核苷酸可在HBV感染的肝細胞中減少病毒抗原。因此，本揭露之寡核苷酸在用於治療個體之HBV感染的方法中是有用的。
如表6所示，亦測試SEQ ID NO：70至72、S74、及75所致之HBV DNA減少。
此外，圖2A展示，與未處理的對照組相比，濃度範圍在10μM與0.08μM之間的SEQ ID NO：71在HBV感染的PHH中以劑量依賴性方式降低rcDNA及cccDNA水平。圖2B至圖2C展示，與未處理的對照組相比，用SEQ ID NO：71處理導致cccDNA水平以劑量依賴性方式減少(例如在10μM下減少66.3%)。
圖2D展示，用SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、及SEQ ID NO：75處理導致HBV感染的PHH中cccDNA水平的劑量依賴性減少(cccDNA水平最大減少約50至75%)。SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、及SEQ ID NO：75的IC50值分別為0.03μM、0.04μM、及0.16μM。
圖3A至圖3B顯示C57Bl/6雌性小鼠中SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：80的體內肝臟濃度及肝臟半衰期。SEQ ID NO：71的肝臟半衰期為319小時。SEQ ID NO：80的肝臟半衰期是穩定的。本文揭露之其他靶向cccDNA的寡核苷酸也觀察到類似的模式。這些結果證實本揭露之靶向cccDNA的寡核苷酸在體內被遞送至肝臟。
將免疫功能低下(immunocompromised)的FRG小鼠用HBV感染並在犧牲前使其達到穩定的病毒血症。將感染的肝細胞鋪盤並立即用3種不同濃度的所指示之寡核苷酸(三重複)處理。處理後9天，藉由南方墨點法(Southern Blot)評估HBV cccDNA水平。與未處理的對照組相比，用SEQ ID NO：80處理導致在HBV感染的FRG(Fah-/-/Rag2-/-/I12rg-/-)小鼠離體(ex vivo)肝細胞中cccDNA水平減少>60%。
用HBV感染離體PXB肝細胞並用不同濃度的所指示之寡核苷酸在第-1天(感染前1天)、第0天(感染同一天)、及第1天(感染後1天)處理(自由攝取)。在感染後第12天藉由qPCR評估cccDNA水平。用SEQ ID NO：82處理導致在經HBV感染的離體PXB肝細胞中cccDNA水平減少>50%。表7提供SEQ ID NO：71、80、及82的HBsAg EC50、cccDNA減少、及肝臟AUC之概述。
圖4A顯示在用SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：72處理後，在HBV感染的PHH中IFN刺激的基因(ISG)上調，這與在這些經處理細胞內的D環結構之形成是一致的。
圖4B證實在與SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：72接觸的HBV陰性細胞中細胞介素未被誘導，因此證實圖4A中觀察到的免疫反應對HBV感染的細胞中之cccDNA是特異性的。
這些結果證實，本揭露之寡核苷酸可在HBV感染的肝細胞中以選擇性方式減少病毒抗原及病毒DNA。因此，本揭露之寡核苷酸在用於治療個體之HBV感染的方法中是有用的。
均等物
本揭露不受本申請案中描述之特定實施例的限制，這些特定實施例旨在作為本揭露之個別態樣的單一示例。如所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見的是，可以對本揭露進行許多修改及變化而不脫離其精神及範疇。從前面的描述來看，在本揭露之範疇內的功能上均等的方法及設備(除了本文所列舉者之外)對所屬技術領域中具有通常知識者而言將是顯而易見的。此類修改及變化係意欲落在本揭露之範疇內。應了解的是，本揭露不限於特定方法、試劑、化合物、組成物、或生物系統，其當然可能有所變化。亦應了解的是，本文中所使用的用語僅用於描述具體實施例之目的，並且不意欲為限制性。
此外，在本揭露之特徵或態樣係以馬庫西(Markush)群組描述的情況下，所屬技術領域中具有通常知識者將體認到本揭露亦藉此以該馬庫西群組的任何個別成員或成員子群組描述。
如所屬技術領域中具有通常知識者將理解的，為了任何和所有目的，特別是在提供書面描述方面，本文揭露的所有範圍亦涵蓋任何和所有可能的子範圍以及其子範圍的組合。任何列出的範圍都可容易地被認為是充分描述的，並且能使相同的範圍被至少分解成相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作為非限制性實例，本文討論的各範圍可容易地分解成下三分之一、中三分之一、及上三分之一等。如所屬技術領域中具有通常知識者亦將理解的，諸如「至多」、「至少」、「大於」、「小於」、及類似者的 所有語言包括所列舉的數字，並且係指可以隨後分解成如上所述之子範圍的範圍。最後，如所屬技術領域中具有通常知識者將理解的，一範圍包括各個別成員。因此，例如，具有1至3個單元的群組係指具有1、2、或3個單元的群組。類似地，具有1至5個單元的群組係指具有1、2、3、4、或5個單元的群組等等。
本文所提及或引用的所有專利、專利申請案、臨時專利申請案、及出版物之全部內容皆以引用方式併入本文中，包括所有圖示及表格，只要彼等不與本說明書的明確教示不一致。

Claims (20)

  1. 一種寡核苷酸，其包含與SEQ ID NO：106之HBV cccDNA基因組序列內的複數個核苷酸互補的序列。
  2. 如請求項1所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸與該HBV cccDNA基因組之增強子I區域內的至少12個核苷酸互補。
  3. 一種寡核苷酸，其包含與存在對應於HBV cccDNA基因組之核苷酸位置967至核苷酸位置1322的基因組區域中之至少12個核苷酸互補的序列。
  4. 如請求項3所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的序列係選自由SEQ ID NO：1至65所組成之群組。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸含有至少一個與第二核苷酸具有硫代磷酸酯(PS)鍵聯的第一核苷酸，其中該第一核苷酸在2'位經選自由F及O-烷基所組成之群組的取代修飾，其中該O-烷基可選地經烷氧基取代。
  6. 如請求項5所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸之具有胞嘧啶核鹼基的各核苷酸經修飾成2'-O-甲基化(2'-O-Me)5-甲基胞嘧啶(5 mmC)；各其他核苷酸經修飾以包括在2'位的O-Me修飾(mA、mG及mU)；且各核苷酸在核苷酸之間含有硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
  7. 如請求項6所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的序列係選自由SEQ ID NO：66至72及74至82所組成之群組。
  8. 如請求項1至4中任一項所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸含有至少一個與第二核苷酸具有硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯的第一核苷酸， 其中該第一核苷酸在2'位經選自由F及O-烷基所組成之群組的取代修飾，其中該O-烷基可選地經烷氧基取代。
  9. 如請求項8所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸之具有胞嘧啶核鹼基的各核苷酸經修飾以包括2'-O-甲基化5-甲基胞嘧啶(5 mmC)；各其他核苷酸經修飾以包括在2'位的O-Me修飾(mA、mG及mU)；且各核苷酸在核苷酸之間含有硫代胺基磷酸酯(NPS)鍵聯。
  10. 如請求項9所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的序列係為SEQ ID NO：73。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之寡核苷酸，其進一步包含至少一個與該寡核苷酸接合的靶向部份。
  12. 如請求項11所述之寡核苷酸，其中與該寡核苷酸接合的該靶向部份係選自由GalNAc、棕櫚醯基及生育酚衍生物所組成之群組。
  13. 如請求項12所述之寡核苷酸，其中該寡核苷酸的序列係選自由SEQ ID NO：80至82所組成之群組。
  14. 一種醫藥組成物，其包含至少一種如請求項1至13中任一項所述之寡核苷酸。
  15. 一種治療有需要之個體的HBV之方法，該方法包含向該個體投予治療有效量的如請求項1至13中任一項所述之寡核苷酸或如請求項14所述之醫藥組成物。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該寡核苷酸的序列係選自由SEQ ID NO：1至82所組成之群組。
  17. 如請求項15所述之方法，其中該寡核苷酸的投予導致該個體中HBeAg水平、HBsAg水平或HBV DNA水平中之至少一者降低。
  18. 如請求項15所述之方法，其中該寡核苷酸的投予導致該個體中HBV cccDNA減少。
  19. 如請求項15所述之方法，其進一步包含分開地、依序地或同時地向該個體投予一或多種選自由下列所組成之群組的額外治療劑：抗病毒劑、核苷酸類似物、核苷類似物、反轉錄酶抑制劑、免疫調節劑、治療性疫苗、病毒進入抑制劑、殼體抑制劑、siRNA、反義寡核苷酸及cccDNA抑制劑。
  20. 一種如請求項1至13中任一項所述之寡核苷酸用於治療HBV的用途。
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