FR2757177A1 - Composes d'acides nucleiques de proteine et de polynucleoti de codant pour la sous-unite catalytique de telomerase humai ne, production et applications - Google Patents

Composes d'acides nucleiques de proteine et de polynucleoti de codant pour la sous-unite catalytique de telomerase humai ne, production et applications Download PDF

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protein
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Joachim Lingner
Toru Nakamura
Karen B Chapman
Gregg B Morin
Calvin B Harley
William H Andrews
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Geron Corp
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Abstract

Dans le domaine du génie génétique, l'invention concerne des séquences d'amino acides liées à la transcriptase reverse de télomérase humaine, qui est une sous-unité de protéine catalytique de télomérase humaine. Ces polynucléotides et polypeptides peuvent servir à produire des compositions pour le diagnostic, le pronostic et le traitement de maladies humaines, pour modifier la capacité de prolifération de cellules, et pour identifier et rechercher des composés et traitements utiles dans le domaine médical. Exemples d'application: recherche et dépistage de cancers et d'altérations dues au vieillissement.

Description

DOMA.NE DE L' LFNVEETOn C L k rFL - -);L' L J i-L 1- i -. ' Luo- -L'-ÀL-i
7- CIe ci -L\aaieL -,=zU nuclélces cc ant pour la sous- lunl r u ie sous-motif catalytique de la télomérase et des polypeptides apparentés. En particulier, la présente invention vise
la sous-unité catalytique de la télomérase humaine.
L'invention propose des procédés et des compositions concernant la médecine, la biologie moléculaire, la chimie, la pharmacologie et la technologie de
diagnostic médicai et de pronostic médical.
ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
L' exposé ci-après es t destiné à it;LLrOl -- e le
domaine de la présente invention pour le lecteur.
il est admis depuis longtemps qu'une réplication complète des extrémités des chromosomes d'eucaryotes exige des constituants cellulaires spécialisés (Watson, 1972, Nature New Biol., 239:197; Olovnikov, 1973, J. Theor. Biol., 41:181). La réplication d'un brin d'ADN (acide désox-y nucléique) linéaire par des polymérases d'ADN traditionnelles exige une amorce de type ARN (acide désoxv ribonucléique), et elle ne peut s'effectuer que de 5' vers 3'. Quand l'ARN fixé aux extrémités 5' extrêmes des brins d'ADN de chromosomes d'eucaryotes est enlevé, une brèche est introduite, conduisant à un raccourcissement progressif des brins qui en résultent avec chaque tour de réplication. On pense que ce raccourcissement de télomères, les structures d'ADN protéinique physiquement situé sur les extrémités de chromosomes, joue un rôle dans e phénomène de la sénescence cellulaire ou du vieil!issement {voir, par exemple, Goldstein, 1990,
Science 249:1129; Martin et al., 1979, Lab. Invest.
23:86; Goldstein et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 64:155; et Schneider et Mitsui, 1976, Proc. Nacl.
Acad. Sci. USA, 73:3584) de cellules somatiques humaines normales, "in vitro" (en verrerie de
laboratoire) et "in vivo" (chez l'être vivant).
La longueur et l'intégrité des télomères ont ainsi un rapport avec l'entrée d'une cellule dans une étape de sénescence (c'est-à-dire une perte de capacité de prolifération). En outre, l'aptitude d'une cellule à maintenir (ou à augmenter) la longueur des télomères peut permettre à une cellule d'échapper à la sénescence, c'est-à-dire lui permettre de devenir immortelle. La structure de télomères et de l'ADN télomère a été étudiée dans de nombreux systèmes (voir, par
exemple, Harley et Villeponteau, 1995, Curr. Opin.
Genet. Dev. 5:249). Dans la plupart des organismes, l'ADN télomère consiste en un réseau en tandem de séquences très simples; chez les êtres humains et d'autres vertébrés, l'ADN télomère consiste en des centaines à des milliers de répétitions en tandem de la séquence TTAGGG. Des procédés pour déterminer et moduler la longueur des télomères dans les cellules sont décrits dans les publications PCT WO 93/23572 et
WO 96/41016.
La maintenance d'entretien de télomères est une fonction ou est un rôle d'une polymérase d'ADN, spécifique d'un télomère, que l'on connaît sous le nom de télomérase. La télomérase est une ribonucléoprotéine (RNP) qui utilise une partie de son fragment ARN comme matrice pour la synthèse d'ADN pour répétition de télomère (Morin, 1997, Eur. J. Cancer 33:750; Yu et al., 1990, Nature 344:126; Singer et Gottschling, 1994, Science 266:404; Autexier et Greider, 1994, Genes Develop., 8:563; Gilley et al., 1995, Genes Develop., 9:2214; McEachern et Blackburn, 1995, Nature 367:403; Blackburn, 1992, Ann. Rev. Biochem., 61:113; Greider, 1996, Ann. Rev. Biochem., 63:337). Les constituants de type ARN de télomérases humaines et d'autres télomérases ont été clones et caractérisés (voir la publication PCT WO 96/01835 et Feng et al., 1995, Science 269:1236). Cependant, la caractérisation des constituants protéiniques d'une télomérase a été difficile. Cela est dû en partie au fait qu'il s'est avéré difficile de purifier la RNP de télomérase, qui est présente en des taux extrêmement faibles dans les cellules dans lesquelles elle est exprimée. Par exemple, il a été estimé que des cellules humaines connues pour exprimer des taux élevés d'activité de télomérase ne peuvent comporter qu'environ une centaine
de molécules de l'enzyme par cellule.
En accord avec la relation entre des télomères et la télomérase, d'une part, et la capacité de prolifération d'une cellule, d'autre part (c'est-à-dire l'aptitude de la cellule à se diviser indéfiniment), l'activité de télomérase est décelée dans des lignées de cellules immortelles et dans un groupe extraordinairement divers de tissus de tumeur, mais elle n'a pas été décelée (c'est-à-dire qu'elle était absente ou se situait au-dessous du seuil de détection par un dosage) dans des cultures de cellules somatiques normales ou de tissus normaux au voisinage d'une tumeur (voir les brevets US-A-5 629 154; US-A-5 489 508; US-A-5 648 215 et US-A-5 639 613; voir également, Morin, 1989, Cell 59:521; Shay et Bacchetti 1997, Eur. J. Cancer 33:787; Kim et al., 1994, Science 266:2011; Counter et al., 1992, EMBO J. 11:1921; Counter et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 2900; Counter et al., 1994, J. Virol. 68:3410). En outre, la corrélation entre le taux ou le niveau d'activité de télomérase dans une tumeur et le pronostic clinique probable pour un patient a été décrite (voir, par exemple, le brevet US-A-5 639 613, cité ci-dessus, Langford et al., 1997, Hum. Pathol. 28:416). De l'activité de télomérase a également été décelée dans des cellules germinales humaines, dans une souche en prolifération ou dans des cellules de progéniteur, et dans des lymphocytes activés. Dans des lignées somatiques ou des cellules de progéniteur, et dans des lymphocytes activés, une activité de télomérase est typiquement très basse ou bien elle n'est exprimée que transitoirement (voir Chiu et al., 1996, Stem Cells 14:239; Bodnar et al., 1996, Exp. Cell Res. 228:58,
Taylor et al., 1996, J. Invest. Dermatology 106:759).
De la télomérase humaine constitue une cible idéale pour le diagnostic et le traitement de maladies humaines concernant, ou liées à, une prolifération cellulaire et à de la sénescence, comme du cancer. Des méthodes pour diagnostiquer et traiter le cancer et d'autres maladies apparentées à de la télomérase chez des êtres humains sont décrites dans les brevets US-A-5 489 508, US-A-5 639 613 et US-A-5 645 986. Des procédés pour prédire la progression d'une tumeur par la surveillance de la télomérase sont décrits dans le brevet US-A-5 639 613. La découverte et la caractérisation de la sous-unité de protéine catalytique de télomérase humaine peut permettre des dosages supplémentaires utiles (d'analyse quantitative ou qualitative) de la télomérase et servir au diagnostic et au traitement des maladies. En outre, le clonage et la détermination de la séquence primaire de la sous-unité de protéine catalytique pourrait permettre des thérapies plus efficaces de cancers humains et d'autres maladies apparentées à la capacité de prolifération des cellules et à la sénescence de ces cellules.
BREF RESUME DE L'INVENTION
La prsent invention propose une préparaioni de protéine isolée, essentiellement pure ou recombinante, d'une protéine de transcriptase reverse de télomérase, ou une variante d'une telle protéine, ou un fragment de cette protéine. Dans une forme de réalisation, la protéine se caractérise comme ayant un motif défini qui a une séquence des aminoacides: Trp-R,-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-Xs-g9-R3-R3-ArgR4-X2-Trp dans laquelle X désigne n'importe quel aminoacide et un indice désigne le nombre de restes consécutifs; R1 représente la leucine ou l'isoleucine, R2 représente la glutamine ou l'arginine, R3 représente la phénylalanine ou la tyrosine; et R4 représente la lysine ou l'histidine. Dans une forme de réalisation, la protéine a une séquence de TRT humaine. Dans d'autres formes de réalisation, l'invention concerne des peptides et des polypeptides partageant une identité de séquence substantielle avec une sous-séquence de telles
protéines.
Dans une forme apparentée de réalisation, l'invention propose un acide nucléique isolé, essentiellement pur ou recombinant, qui code pour une protéine de transcriptase reverse de télomérase. Dans une forme de réalisation, l'acide nucléique code pour une protéine comprenant une séquence d'aminoacides: Trp-R1-X,-R!-R1R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-Xg-9-R3-R3-Arg-R4-X_-Trp. Dans une autre forme de réalisation, l'acide nucléique
a une séquence qui code pour la protéine TRT humaine.
Dans d'autres formes de réalisation, l'invention concerne des oligonucléotides et des polynucléotides ayant en commun une forte identité des séquences ou qui sont complémentaires d'une sous-séquence de tels acides nucléiques. Dans une forme de réalisation, l'invention concerne une protéine de type transcriptase reverse de télomérase humaine (hTRT). Ainsi, dans une forme de réalisation, l'invention propose une préparation de protéine isolée, essentiellement pure ou recombinante d'une protéine de type hTRT, ou une variante de cette protéine, ou un fragment de cette protéine. Dans une forme de réalisation, la protéine se caractérise par l'existence d'une séquence d'aminoacides comportant au moins 75% environ ou au moins 80% environ d'identité de séquence avec la protéine hTRT de la figure 17 (SEQUENCE ID N 2), ou une variante de cette protéine ou un fragment de cette protéine. Dans un aspect apparenté, la protéine de type hTRT a la séquence de la SEQUENCE ID N 2. Dans certaines formes de réalisation, la protéine possède une ou plusieurs activités de télomérase, comme de l'activité catalytique. Dans une forme de réalisation, le fragment de protéine de type
hTRT comporte au moins 6 restes aminoacides.
L'invention propose également une composition comprenant une protéine de type hTRT et un acide ribonucléique (ARN). L'ARN peut être un ARN de télomérase, comme de l'ARN de télomérase humaine. Dans une forme de réalisation, la protéine de hTRT et l'ARN de télomérase humaine (hTR) proviennent d'un complexe
ribonucléoprotéinique ayant une activité de télomérase.
Dans une forme de réalisation, l'invention propose de la télomérase humaine isolée, comprenant de la protéine de type hTRT, comme une télomérase humaine essentiellement pure comprenant de la protéine de type hTRT et comprenant hTR. Dans une forme de réalisation, la télomérase présente une pureté d'au moins 95% environ. La télomérase peut être isolée à partir d'une cellule, comme une cellule hôte recombinante ou une
cellule qui exprime de l'activité de télomérase.
Dans un autre aspect, l'invention propose un polynucléotide isolé, synthétique, essentiellement pur ou recombinant, comprenant une séquence d'acides
nucléiques qui code pour une protéine de type hTRT.
Dans une forme de réalisation, le polynucléotide comporte une séquence de nucléotides codant pour une protéine de type hTRT ayant une séquence d'aminoacides telle que présentée sur la figure 17 (SEQUENCE ID N 2) ou une séquence qui comprend une ou plusieurs substitutions d'aminoacides (ou de codons) de conservation ou une ou plusieurs substitutions d'aminoacides (ou de codons) altérant l'activité dans ladite séquences des aminoacides. Dans un aspect apparenté, le polynucléotide se fixe dans des conditions sévères par hybridation sur un polynucléotide ayant la séquence indiquée à la figure 16 (SEQUENCE ID N 1). Dans un autre aspect apparenté, la séquence des nucléotides des polynucléotides comporte une plus faible probabilité totale, inférieure à environ 0,5, en comparaison d'une séquence des nucléotides telle que présentée à la figure 16 (SEQUENCE ID N 1), quand on utilise l'algorithme BLAST
avec des paramètres de défaut.
Dans un autre aspect, l'invention propose un polynucléotide ayant une séquence de promoteur liée fonctionnellement à la séquence codant pour la protéine de type hTRT. Le promoteur peut être un promoteur autre que le promoteur de type hTRT naturel. Dans un aspect apparenté, l'invention propose un vecteur d'expression
comprenant le promoteur de la hTRT.
L'invention propose également un polynucléotide isolé, synthétique, sensiblement pur ou recombinant, qui a une longueur d'au moins dix nucléotides et comprend une séquence contiguë d'au moins dix nucléotides, qui est identique à, ou exactement complémentaire de, une séquence contiguë dans un gène de hTRT naturel ou de ARNm de hTRT. Dans certaines formes de réalisation, le polynucléotide est un ARN, un ADN ou il contient un ou plusieurs nucléotides synthétiques n'existant pas dans la nature. Dans un aspect, le polynucléotide est identique à, ou exactement complémentaire de, la séquence contiguë d'au moins dix nucléotides contigus dans un gène de hTRT naturel ou de ARNm de hTRT. Par exemple, le
polynucléotide peut être un polynucléotide anti-sens.
Dans une forme de réalisation, le polynucléotide anti-
sens comprend au moins environ 20 nucléotides.
L'invention propose en outre un procédé pour préparer de la télomérase recombinante, par mise en contact d'une protéine de type hTRT recombinante avec un constituant d'ARN de télomérase dans des conditions telles que ladite protéine recombinante et ledit constituant d'ARN de télomérase s'associent pour former une télomérase, enzyme capable de catalyser l'addition de nucléotides sur un substrat de télomérase. Dans une forme de réalisation, la protéine de type hTRT comporte une séquence telle qu'indiquée à la figure 17 (SEQUENCE ID N 2). La protéine de type hTRT peut être produite dans un système d'expression "in vitro" et mélangée avec un ARN de télomérase ou bien, dans une autre forme de réalisation, l'ARN de télomérase peut être co-exprimé dans le système d'expression in vitro. Dans
une forme de réalisation, l'ARN de télomérase est hTR.
Dans une autre forme de réalisation, la mise en contact se produit dans une cellule, par exemple dans une cellule humaine. Dans une forme de réalisation, la cellule ne possède pas d'activité de télomérase avant la mise en contact de la hTRT et de l'ARN, ou bien avant l'introduction, par exemple par transfection, d'un polynucléotide de type hTRT. Dans une forme de réalisation, l'ARN de télomérase est exprimé
naturellement par ladite cellule.
L'invention propose également une cellule, comme une cellule humaine, de souris ou de levure, contenant les polynucléotides recombinants de l'invention, comme un polynucléotide avec une séquence de codage de protéine de type hTRT liée fonctionnellement à un promoteur. Dans des aspects particuliers, la cellule est une cellule de vertébré, comme une cellule provenant d'un mammifère, par exemple d'un être humain, et elle a une capacité de prolifération accrue par rapport à une cellule qui est par ailleurs identique mais ne comprend pas le polynucléotide recombinant ou possède un niveau accru d'activité de télomérase par rapport à une cellule qui est par ailleurs identique
mais ne comprend pas de polynucléotides recombinants.
Dans certaines formes de réalisation, la cellule est immortelle. Dans des formes apparentées de réalisation, l'invention propose des organismes et des cellules comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide de transcriptase reverse de type télomérase humaine, comme un organisme non humain transgénique comme une levure, une plante, une bactérie ou un animal non humain, par exemple une souris. L'invention propose également des animaux transgéniques et des cellules dont un gène de hTRT a été enlevé (éliminé), ou bien effectue une mutation telle que le gène n'exprime pas un produit de type gène de hTRT naturel. Ainsi, dans d'autres formes de réalisation, l'animal transgénique non humain possède un gène de télomérase ayant fait l'objet d'une mutation, est un animal présentant une carence en de l'activité de télomérase, est un animal dont la carence en TRT résulte d'un gène ayant fait l'objet d'une mutation et qui code pour une TRT ayant un niveau réduit d'activité de télomérase, en comparaison d'une TRT de type sauvage et est un animal ayant un gène de TRT ayant muté et ayant subi une ou plusieurs mutations, ce qui comprend une mutation de faux sens, et des insertions ou des délétions. L'invention propose également un anticorps isolé ou recombinant, ou un fragment d'un tel anticorps, qui
se fixe spécifiquement sur une protéine de type hTRT.
Dans une forme de réalisation, l'anticorps se fixe avec une affinité d'au moins environ 108M-O. L'anticorps peut êLLe iMoUnoloilal ou bien ii peuL s' aiL d' une
composition polyclonale, comme un antisérum polyclonal.
Dans un aspect apparenté, l'invention propose une cellule capable de sécréter l'anticorps, comme des
hybridomes.
L'invention propose également un procédé pour déterminer si un composé ou un traitement est un modulateur d'une activité de transcriptase reverse de télomérase ou d'une expression de hTRT. Le procédé implique la détection ou la surveillance d'une variation d'activité ou d'expression dans une cellule, dans un animal ou dans une composition comprenant une protéine de type hTRT ou un polynucléotide, après administration du composé ou du traitement. Dans une forme de réalisation, le procédé inclut les étapes consistant à obtenir une composition de TRT, à mettre la TRT en contact avec le composé d'essai et à mesurer l'activité de la TRT, une variation de l'activité de TRT en présence du composé d'essai constituant un indicateur du fait que le composé d'essai module l'activité de TRT. Dans certaines formes de réalisation, la composition est une cellule, un organisme, un organisme transgénique ou un système "in vitro", comme un système d'expression, qui contient un polynucléotide recombinant codant pour un polypeptide de type hTRT. Ainsi, la hTRT du procédé peut être un produit d'une expression "in vitro". Dans diverses formes de réalisation, la détection de l'activité de télomérase ou d'une expression peut s'effectuer par détection d'une variation de l'abondance d'un produit de type gène de hTRT, par la surveillance de l'incorporation d'un nucléotide de marquage dans un substrat de télomérase, par la surveillance d'une hybridation d'une sonde se fixant sur un substrat de télomérase étendu, la surveillance d'une amplification d'un substrat de télomérase étendu, la surveillance de la longueur des télomères d'une cellule exposée au composé d'essai, la surveillance de la perte d'aptitude de la télomérase à se fixer sur un chromosome, ou la mesure de l'accumulation ou de la perte de structure de télomère. Dans un aspect, l'invention propose un procédé de détection d'un produit de type gène de hTRT dans un échantillon biologique, par mise de l'échantillon biologique en contact avec une sonde qui fixe spécifiquement le produit de type gène, la sonde et le produit de type gène formant un complexe, et la détection du complexe, la présence du complexe étant en corrélation avec la présence du produit de type gène de hTRT dans l'échantillon biologique. Le produit de type
gène peut être de i'ARN, de l'ADN ou un polypeptide.
Des exemples de sonde pouvant servir pour la détection comprennent, sans que cette liste soit limitative, des
acides nucléiques et des anticorps.
Dans une forme de réalisation, le produit de type gène est un acide nucléique qui est décelé par amplification du gène et détection du produit de l'amplification, la présence du complexe ou du produit de l'amplification étant mise en corrélation avec la présence du produit de type gène de hTRT dans
l'échantillon biologique.
Dans une forme de réalisation, l'échantillon biologique provient d'un patient, tel qu'un patient humain. Dans une autre forme de réalisation, l'échantillon biologique inclut au moins une cellule provenant d'une culture de cellules "in vitro", comme
une culture de cellules humaines.
L'invention propose en outre un procédé pour déceler la présence d'au moins une cellule humaine immortelle ou présentant un dispositif de télomérase dans un échantillon biologique comprenant des cellules humaines, par l'obtention de l'échantillon biologique comprenant des cellules humaines; et la détection de la présence, dans l'échantillon, d'une cellule ayant un taux ou niveau élevé d'un produit de type gène de hTRT, la présence d'une cellule ayant un taux ou niveau élevé d'un produit de type gène de hTRT étant en corrélation avec la présence de cellules immortelles ou de cellules positives à l'essai de la télomérase dans l'échantillon biologique. L'invention propose également un procédé pour effectuer le diagnostic d'un état apparenté à un effet de télomérase, chez un patient, par l'obtention d'un échantillon de cellule(s) ou de tissu provenant du patient, la détermination de la quantité d'un produit de type gène de hTRT dans la cellule ou dans le tissu, et la comparaison de la quantité du produit de type gène de hTRT de la cellule ou du tissu avec la quantité présente dans une cellule ou un tissu sain du même type, une différence de quantité de produit du type gène de hTRT dans l'échantillon provenant du patient et dans la cellule ou tissu sain constituant un signe diagnostique d'un état apparenté à un effet de télomérase. Dans une forme de réalisation, l'état apparenté à un effet de télomérase est du cancer, et une plus grande quantité de produit du type gène de
hTRT est décelée dans l'échantillon.
L'invention propose en outre un procédé pour effectuer le diagnostic du cancer chez un patient, par l'obtention d'un échantillon biologique provenant du patient et la détection d'un produit de type gène de hTRT dans l'échantillon provenant du patient, la détection du produit de type gène de hTRT dans l'échantillon étant en corrélation avec un diagnostic
de cancer.
L'invention propose en outre un procédé pour effectuer le diagnostic du cancer chez un patient, par l'obtention d'un échantillon provenant du patient, la détermination de la quantité d'un produit de type gène de hTRT dans l'échantillon provenant du patient, et la comparaison de la quantité du produit de type gène de hTRT avec une valeur normale ou une valeur témoin, une quantité du produit de type gène de hTRT qui chez le patient est supérieure à la valeur normale ou à la valeur témoin constituant un signe diagnostique de cancer. L'invention propose également un procédé pour effectuer le diagnostic du cancer chez un patient, par l'obtention d'un échantillon provenant du patient et contenant au moins une cellule; la détermination de la quantité d'un produit de type gène de hTRT dans une cellule de l'échantillon; et la comparaison de la quantité du produit de type gène de hTRT dans la cellule avec une valeur normale pour la cellule, une quantité de produit de type gène de hTRT supérieure à la valeur normale constituant un signe diagnostique du cancer. Dans une forme de réalisation, on pense que
l'échantillon contient au moins une cellule maligne.
L'invention propose également un procédé pour effectuer un pronostic de cancer chez un patient en déterminant la quantité d'un produit de type gène de hTRT dans une cellule cancéreuse obtenue sur le patient; et la comparaison de la quantité de la hTRT dans la cellule cancéreuse avec une valeur de pronostic de hTRT correspondant bien à un pronostic de cancer, la quantité de hTRT dans l'échantillon, c'est-à-dire à la valeur de pronostic, fournissant le pronostic
particulier.
L'invention propose également un procédé pour surveiller l'aptitude d'un traitement anticancer à diminuer la capacité de prolifération de cellules cancéreuses chez un patient, par la réalisation d'une première mesure de la quantité d'un produit de type gène de hTRT dans au moins une cellule cancéreuse provenant du patient; la réalisation d'une seconde mesure du taux de produit de type gène de hTRT dans au moins une cellule cancéreuse provenant du patient, le traitement anticancer étant administré au patient avant la seconde mesure, et la comparaison des première et seconde mesures, un plus faible taux de produit de type gène de hTRT dans la seconde mesure étant en corrélation avec l'aptitude d'un traitement anticancer à diminuer la capacité de prolifération de cellules
cancéreuses chez le patient.
L'invention propose également des trousses ou nécessaire pour la détection de gène de hTRT ou d'un produit de type gène de telle hTRT. Dans une forme de réalisation, la trousse comprend un récipient incluant une molécule choisie parmi un acide nucléique à rôle de hTRT ou un dérivé d'un tel acide, un polypeptide de hTRT ou un composé qui en dérive, et un anticorps anti-hTRT. L'invention propose également des procédés pour traiter des maladies humaines. Dans une forme de réalisation, l'invention propose un procédé pour augmenter la capacité de prolifération d'une cellule de vertébré, comme une cellule de mammifère, par introduction d'un polynucléotide recombinant dans la cellule, ledit polynucléotide comprenant une séquence codant pour un polypeptide de type hTRT. Dans une forme de réalisation, le polypeptide de type hTRT a une séquence telle que représentée sur la figure 17. Dans une forme de réalisation, la séquence est liée fonctionnellement à un promoteur. Dans une forme de réalisation, la hTRT représente une activité catalytique de télomérase. Dans une forme de réalisation, la cellule est humaine, comme une cellule de patient humain. Dans une autre forme de réalisation, la cellule est cultivée in vitro. Dans une forme apparentée de réalisation, la cellule est introduite
dans un patient humain.
L'invention propose en outre un procédé pour traiter une maladie humaine par introduction d'un polynucléotide de type hTRT recombinant dans au moins une cellule d'un patient. Dans une forme de
réalisation, on utilise un vecteur de thérapie génique.
Dans une forme apparentée de réalisation, le procédé consiste tout d'abord à introduire dans la cellule un polynucléotide comprenant une séquence codant pour hTR, par exemple un polynucléotide de type hTR lié
fonctionnellement à un promoteur.
L'invention propose également un procédé pour augmenter la capacité de prolifération d'une cellule de vertébré, ledit procédé comprenant l'introduction dans la cellule d'une quantité efficace d'un polypeptide de type hTRT. Dans une forme de réalisation, le polypeptide de type hTRT est doué d'une activité catalytique de télomérase. L'invention propose en outre des cellules et des descendances de cellules ayant une
capacité accrue de prolifération.
L'invention propose également un procédé pour traiter un état associé à un niveau ou taux élevé d'activité de télomérase au sein d'une cellule, comprenant l'introduction dans ladite cellule d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un inhibiteur de ladite activité de télomérase, ledit inhibiteur étant un polypeptide de type hTRT ou un polynucléotide de type hTRT. Dans une forme de réalisation, l'inhibiteur est un polypeptide ou un polynucléotide comprenant, par exemple, au moins une sous-séquence d'une séquence présentée sur la figure 16, 17 ou 20. Dans des formes additionnelles de réalisation, le polypeptide ou le polynucléotide inhibe une activité de TRT, comme la liaison de fixation de TRT endogène à l'ARN de télomérase. L'invention propose également un vaccin comprenant un polypeptide de type hTRT et un adjuvant. L'invention propose également des compositions pharmacologiques contenant un véhiculeou excipient pharmaceutiquement acceptable et une molécule choisie parmi: un polypeptide de type hTRT; un polynucléotide codant pour un polypeptide de type hTRT et un acide nucléique de
type hTRT ou un dérivé qui en découle.
DESCRIPTION DES FIGURES
Lla f ue I moLntre des restes 1autm eiLLe=nt clJrI1eL--v= dans des motifs de TRT provenant d'un être humain de S. pomnbe (tezl), S. cerevisiae (EST2) et Euplotes aediculatus (p123). Des aminoacides identiques sont indiqués par un astérisque (*) [légèrement surélevé], cependant que les restes d'aminoacides similaires sont indiqués par un point (e). Le motif "O" de la figure est également appelé Motif T; le Motif "3" est également appelé Motif A. La figure 2 montre l'emplacement de motifs de séquences spécifiques de télomérase et spécifiques de RT de protéines de type télomérase et d'autres transcriptases reverses. Les emplacements du motif T spécifiques de télomérase et des motifs 1, 2 et A-E de RT conservée sont indiqués par des cartouches. Le rectangle ouvert marqué HIV-1RT délimite la partie de
cette protéine représentée sur la figure 3.
La figure 3 montre la structure cristalline de la sous-unité ou du sousmotif p66 de transcriptase reverse de HIV-1 (code de Brookhaven: 1HNV). La vue a lieu à partir de l'arrière à droite pour permettre de
montrer tous les motifs.
La figure 4 montre de multiples alignements de séquences de RT télomérase (SpTrtlp, S. pombe TRT [ fT.......- "tel l"l-.... M _ M l_ -... ^ [ gqa'lement a pp ee S îC_ __Z jL J,j; . 1f\L Z L II ,LL-LWiiC, Eap123, Euplotes p123, ScEst2p, S. cerevisiae Est2p) In -u 'es nue-'res d autres dattie e ' (Sc a'l, proele CL. e L.1e LLCLLULCJ SJ ULJ.C úLO L ú\L codée par de l'intron 1 de groupe II de cytochrome oxydase provenant de mitochondries de S. cerevisiae; DmTart, de la transcriptase reverse provenant de TART rétrotransposable de LTR); HIV-1; transcriptase reverse du virus de l'immunodéficience humaine ou sida). TRT con et RT con représentent des séquences de consensus
pour des RT de télomérase et des RT de non-télomérase.
Les aminoacides sont désignés par un h: hydrophobe; p: polaire; c: chargé. Des triangles montrent des restes qui sont conservés parmi des protéines de type télomérase mais sont différents dans d'autres RT. Le trait plein au-dessous du motif E souligne la région de
saisie ou de fixation de l'amorce.
La figure 5 montre l'expression de l'ARN de type hTRT dans des souches de cellules mortelles négatives en ce qui concerne la télomérase et des lignées de cellules immortelles positives pour la télomérase, comme décrit dans l'exemple 2. La figure 6 montre un arbre phylogénétique possible de télomérase et de rétroéléments reliés à des
polymérases d'ARN dépendant de l'ARN.
La figure 7 montre une carte de restriction de
clone lambda G45.
La figure 8 montre une carte de chromosome 5p avec indication de l'emplacement du marqueur de STS D5S678
(situé près du gène hTRT).
La figure 9 montre la construction d'un plasmide
promoteur-reporteur de hTRT.
La figure 10, en deux pages, montre une coexpression in vitro de hTRT et de hTR pour produire
de la télomérase humaine à activité catalytique.
La figure 11, sur deux pages, montre un alignement de séquences provenant de quatre protéines TRT et identifie des motifs intéressants. TRT con montre une séquence de consensus de TRT. RT con montre des restes de consensus pour d'autres transcriptases reverses. Des restes de consensus dans la ligne supérieure indiquent
une conservation absolue dans des protéines de TRT.
La figure 12 montre un site de clivage de Topoisomérase II et des motifs de site de liaison de fixation de NFkB dans un intron de hTRT, la séquence
présentée correspondant à la "séquence ID N 7".
La figure 13, sur deux pages, montre la séquence de l'ADN codant pour la sous-unité de protéine de
télomérase de Euplotes 123 kDa (Euplotes TRT).
La figure 14 montre la séquence des aminoacides de la sous-unité protéinique de télomérase de Euplotes
123 kDa (protéine de Euplotes TRT).
La figure 15, sur cinq pages, montre les séquences d'ADN et d'aminoacides de la sous-unité catalytique de
télomérase de S. pombe (TRT de S. pombe).
La figure 16, sur deux pages, montre la séquence d'ADNc de hTRT, la séquence montrée correspondant à la
"SEQUENCE ID N 1".
La figure 17 montre la protéine hTRT codée par 1'ADNc de la figure 16. La séquence protéinique montrée
correspond à la "SEQUENCE ID N 2".
La figure 18 montre la séquence de clone 712562, la séquence présentée correspondant à la "SEQUENCE ID N 3" La figure 19 montre une protéine formée de 259 restes, codée par le clone 712562, la séquence
présentée correspondant à la "SEQUENCE ID N 10".
La figure 20 montre, sur sept pages, la séquence d'un acide nucléique avec un cadre de lecture ouvert codant pour un polypeptide variant A182, la séquence présentée correspondant à la "SEQUENCE ID N 4". Cette figure montre également la séquence des aminoacides du polypeptide variant A182, la séquence des aminoacides
présentée correspondant à la "SEQUENCE ID N 5".
La figure 21 montre, sur six pages, la séquence provenant d'un clone de génome de hTRT, la séquence montrée correspondant à la "SEQUENCE ID N 6". Des motifs et des éléments de consensus sont indiqués, comprenant des séquences caractéristiques d'un site de clivage de topoisomérase II, des sites de liaison de NFkB, une séquence Alu et d'autres éléments de
séquences.
La figure 22 montre l'effet de la mutation du gène
de TRT dans une levure, comme décrit à l'exemple 1.
La figure 23 montre la séquence de EST AA281296,
correspondant à la "SEQUENCE ID N 8".
La figure 24 montre la séquence des paires de bases 182 ne figurant pas dans le clone 712562, la
séquence montrée correspondant à la "SEQUENCE ID N 9".
La figure 25 montre les résultats d'un essai de dosage d'activité de télomérase provenant de cellules de BJ transfectées par un vecteur d'expression codant pour une protéine de type hTRT (pGRN133) ou un plasmide
témoin (pBBS212), comme décrit à l'exemple 13.
La figure 26 est un diagramme schématique de la purification par affinité de télomérase, montrant les
étapes de fixation et d'élution pour déplacement.
La figure 27 est une photographie d'un déplacement d'ARN (technique de Northern) de préparations de télomérase obtenues au cours d'un protocole de purification, comme décrit à l'exemple 1. La voie ou piste 1 contenait 1,5 fmole d'ARN de télomérase, la voie 2 contenait 4,6 fmoles d'ARN de télomérase, la voie 3 contenait 14 fmoles d'ARN de télomérase, la voie 4 contenait 41 fmoles d'ARN de télomérase, la voie 5 contenait de l'extrait nucléaire (42 fmoles de télomérase), la voie 6 contenait de la télomérase purifiée à l'aide d'héparine sur un gel par affinité "Affi-Gel" (47 fmoles de télomérase), la voie 7 contenait de la télomérase purifiée par affinité (68 fmoles), et la voie 8 contenait de la télomérase purifiée à l'aide d'un gradient de glycérol
(35 fmoles).
La figure 28 montre l'activité de télomérase dans le cas d'un protocole ou mode opératoire de
purification.
La figure 29 est une photographie d'un gel
SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide-
dodécyl-sulfate de sodium), montrant la présence d'un polypeptide d'environ 123 kDa (kilodaltons) et un doublet d'environ 43 kDa provenant de Euplotes aediculatus. La figure 30 est un graphique montrant le coefficient de sédimentation de télomérase provenant de Euplotes aediculatus. La figure 31 est une photographie d'un gel polyacrylamide/urée avec 36% de formamide, montrant l'utilisation sur le substrat de télomérase provenant d'Euplotes. La figure 32 montre les alignements supposés d'une matrice d'ARN de télomérase, et des amorceurs en
épingle à cheveux avec de l'ARN de télomérase.
La figure 33 est une photographie des voies 25-30 du gel présenté sur la figure 31, que l'on montre à un
plus faible niveau d'exposition.
La figure 34 montre la séquence d'ADN du gène codant pour la sous-unité protéinique de télomérase de
43 kDa provenant de Euplotes.
La figure 35 montre, sur quatre pages, la séquence d'ADN, ainsi que les séquences d'aminoacides de l'ensemble des trois cadres ouverts de lecture de la sous-unité protéinique de télomérase de 43 kDa
provenant de Euplotes.
La figure 36 montre une comparaison de séquences entre la sous- unité protéinique de télomérase de 123 kDa de Euplotes (séquence supérieure) et la sous-unité polypeptidique de 80 kDa de T. thermophila
(séquence inférieure).
La figure 37 montre une comparaison de séquences entre la sous- unité protéinique de télomérase de 123 kDa de E. aediculatus (séquence supérieure) et le polypeptide de télomérase de 95 kDa de T. thermophila
(séquence inférieure).
La figure 38 montre l'alignement de meilleur ajustement entre une partie de "domaine La" de la sous-unité protéinique de télomérase de 43 kDa de E. aediculatus (séquence supérieure) et une partie de la sous-unité polypeptidique de 95 kDa de
T. thermophila (séquence inférieure).
La figure 39 montre l'alignement de meilleur ajustement entre une partie du "domaine La" de la sous-unité protéinique de télomérase à 43 kDa de E. aediculatus (séquence supérieure) et une partie de la sous- unité polypeptidique à 80 kDa de T. thermophila
(séquence inférieure).
La figure 40 montre l'alignement et les motifs du domaine de polymérase de la sous-unité protéinique de télomérase à 123 kDa de E. aediculatus et des domaines de polymérase de diverses transcriptases reverses comprenant une protéine I codée par de l'intron 1 de groupe II de cytochrome oxydase de mitochrondrie de S. cerevisiae (al S.c. (groupe II)), Dong (LINE), et
ESTp de levure (L8543.12).
La figure 41 montre l'alignement d'un domaine de la sous-unité protéinique de télomérase à 43 kDa avec
diverses protéines de type La.
La figure 42 montre la séquence des nucléotides codant pour la sous- unité protéinique à 80 kDa de
T. thermophila.
La figure 43 montre la séquence des aminoacides de
la sous-unité protéinique à 80 kDa de T. thermophila.
La figure 44 montre la séquence des nucléotides codant pour la sous- unité protéinique à 95 kDa de
T. thermophila.
La figure 45 montre la séquence des aminoacides de
la sous-unité protéinique à 95 kDa de T. thermophila.
La figure 46 montre la séquence des aminoacides de
L8543.12 ("Est2p").
La figure 47 montre l'alignement de la séquence des aminoacides codée par le produit PCR d'Oxytricha
avec la séquence p123 d'Euplotes.
La figure 48 montre la séquence d'ADN de Est2.
La figure 49 montre une séquence partielle d'aminoacides provenant d'un clone de ADNc codant pour
des motifs peptidiques de télomérase humaine.
La figure 50 montre une séquence partielle d'ADN d'un clone d'ADNc codant pour des motifs peptidiques de
télomérase humaine.
La figure 51 montre la séquence des aminoacides de
tezl., que l'on appelle également S. pombe trt.
La figure 52 montre, sur deux pages, la séquence d'ADN de tezl. Des régions d'introns et d'autres régions de non-codage sont présentées en petites lettres et des exons (c'est-à-dire des régions de
codage) sont présentés en majuscules.
La figure 53 montre l'alignement de séquences de EST2p, d'Euplotes et de Tetrahymena, ainsi qu'une
séquence (type de) consensus.
La figure 54 montre la séquence de peptides pouvant utilement servir à produire des anticorps anti-hTRT. La figure 55 est un résumé schématique des
expériences de séquençage de tezl+.
La figure 56 montre deux amorces dégénérées utilisées en PCR (ACP; amplification en chaîne par
U LLL L j LLL)LpUo1Lr LLCLiúJIeILL - UCC... d e JL2ILLkCC..
séquences p123 de E. aediculatus.
La figure 57 montre les quatre bandes majeures produites dans une amplification en chaîne par polymérase (PCR; ACP) utilisant des amorces dégénérées pour identifier l'homologue de S. pombe des séquences
pl23 de E. aediculatus.
La figure 58 montre l'alignement du produit de ACPM2 avec des séquences protéiniques de télomérase de pl23 de E. aediculatus, de télomérase S. cerevisiae et
de télomérase d'Oxytricha.
La figure 59 est une présentation schématique de la stratégie d'amplification en chaîne par polymérase de 3'RT pour l'identification de l'homologue de
S. pombe de pl23 de E. aediculatus.
La figure 60 montre les caractéristiques des bibliothèques servant au dépistage des séquences protéiniques de télomérase de S. pombe et la figure montre des résultats du dépistage des bibliothèques de recherche des séquences protéiniques de télomérase de
S. pombe.
La figure 61 montre les résultats positifs obtenus avec des clones de génome positif après digestion par HindIII, contenant de la séquence de télomérase de
S. pombe.
La figure 62 est un schéma montrant la stratégie d'amplification en chaîne par télomérase en 5'RT servant à obtenir une pleine longueur de clone de TRT
de S. pombe.
La figure 63 montre l'alignement des domaines de RT (de télomérase) de sous-unité de télomérase catalytique provenant de S. pombe (S.p.), de
S. cerevisiae (S.c.) et de E. aediculatus (E.a.).
La figure 64 montre l'alignement des séquences provenant de Euplotes ("Ea pl23"), de S. cerevisiae Sc Est-p") e e. upS.e ( Sp_Tz"iÀ Dan s ie ) panneau A, les zones hachurées indiquent les restes en commun entre deux séquences. Dans le panneau B, les zones hachurées indiquent les restes en commun entre
tois séquences.
La figure 65 montre la rupture utilisée avec les
gènes de télomérase dans S. pombe.
La figure 66 montre les résultats expérimentaux
confirmant la rupture de tezl.
La figure 67 montre le raccourcissement progressif des télomères dans S. pombe en raison de la rupture de tezl. La figure 68 montre, sur quatre pages, l'ADN et l'aminoacide du cadre ouvert de lecture codant pour une protéine de type télomérase d'environ 63 kDa ou un fragment d'une telle protéine codée par l'insert de
EcoRI-NotI de clones 712562.
La figure 69 montre un alignement de motifs de transcriptase reverse provenant de diverses sources La figure 70 montre une carte de restriction et
des fonctions du plasmide pGRN121.
La figure 71 montre, sur deux pages, les résultats des analyses de séquençage préliminaire d'acides
nucléiques d'une séquence d'ADNc de hTRT.
La figure 72 montre, sur dix pages, la séquence d'acides nucléiques préliminaires de hTRT et des séquences d'un cadre de lecture ouverte déduit dans
trois cadres de lecture.
La figure 73 fournit une carte de restriction et
des fonctions de plasmide pGRN121.
La figure 74 montre, sur huit pages, la séquence des acides nucléiques épurée ("raffinée") et les séquences de cadre de lecture ouverte provenant de hTRT. La figure 75 montre une carte de restriction du
clone lambda 25-1.1.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
I. INTRODUCTION
La LLbUIelLa.r Ciniqes uNr comprleAe ribonucléoprotéinique (RNP) comprenant un constituant ARN (acide ribonucléique) et un constituant de protéine catalytique. La présente invention concerne le clonage et la caractérisation du constituant de protéine catalytique de télomérase, que l'on désigne ci-après comme étant de la "TRT" (transcriptase reverse de Loue=w=e / sLa i R est CaL R es I j.... J.. ar....e.. ue ctteL protéine joue le rôle d'une polymérase d'ADN dépendant de l'ARN (transcriptase reverse), utilisant le composant ARN de télomérase (que l'on appelle ci-après "TR") pour diriger la synthèse des séquences répétées d'ADN de télomère. En outre, la TRT est reliée de manière évolutive à d'autres transcriptases reverses
(voir l'exemple 12).
Dans un aspect, la présente invention concerne le clonage et la caractérisation du constituant protéinique catalytique de la télomérase humaine, que l'on désigne ci-après comme étant "hTRT". La télomérase valeur parce que, comme noté ci-dessus, l'activité de télomérase dans des cellules humaines (et dans d'autres cellules de mammifère) est en corrélation avec la capacité de prolifération des cellules, l'immortalité des cellules et le développement d'un phénotype néoplastique. Par exemple, l'activité de télomérase et, comme montré à l'exemple 2 ci-après, les taux de type gène de type TRT humain sont produits et sont élevés dans des cellules humaines immortelles (comme des cellules de tumeurs malignes et des lignées de cellules immortelles), par rapport à des cellules mortelles (comme la plupart des cellules somatiques de l'être humain). La présente invention propose en outre des procédés et des compositions intéressants pour le diagnostic, le pronostic et le traitement de maladies humaines et d'états maladifs, comme décrit de façon assez détaillée ci-après. On propose également des procédés et des réactifs pouvant utilement servir à rendre immortelles des cellules ("in vivo" et "ex vivo"), pour la production d'animaux transgéniques ayant des caractéristiques intéressantes, et pour de nombreuses autres utilisations, dont un grand nombre sont décrites ci-après. L'invention propose également des procédés et des réactifs pouvant utilement servir à préparer, à cloner ou à recloner des gènes de TRT et des protéines de TRT provenant de ciliés (protozoaires) de champignons, de vertébrés comme des mammifères, et
d'autres organismes.
Comme décrit en détail ci-après, la TRT (transcriptase reverse de télomérase) a été initialement caractérisée après purification d'une télomérase provenant du cilié Euplotes aediculatus. Une purification poussée de télomérase de E. aediculatus, utilisant une chromatographie d'affinité d'ARN et d'autres méthodes, a donné la protéine "p123". Chose étonnante, la protéine p123 n'est pas reliée à des protéines que l'on considérait précédemment comme constituant les sous-unités de protéine de l'holoenzyme de télomérase (c'est-à-dire les protéines p80 et p95 de Tetrahymena thermophila). Une analyse des séquences de l'ADN de p123 et des protéines (Genbank, n d'accès U95964, figures 13 et 14) a révélé des motifs de transcriptase reverse (RT) correspondant bien au rôle de p123 comme sous-unité catalytique de télomérase (voir, par exemple, les figures 1, 4 et 11). En outre, pl23 est apparenté à une protéine de S. cerevisiae (levure), Est2p, que l'on savait jouer un rôle dans le maintien et l'entretien des télomères dans S. cerevisiae (Numéro d'accès de Genbank S5396), mais, avant la présente invention, on n'admettait pas que p123 code pour une protéine de sous-unité catalytique de télomérase (voir, par exemple, Lendvay et al., 1996,
Genetics, 144:1399).
Dans un aspect, la présente invention propose des réactifs et des procédés pour identifier et cloner de nouvelles TRT, en utilisant des sondes et amorces formées par ou comportant des acides nucléiques engendrés par, ou provenant des, polynucléotides de type TRT révélés (par exemple, pour le clonage des gènes de TRT et de l'ADNc); des anticorps qui reconnaissent spécifiquement les motifs ou la séquence des motifs ou d'autres épitopes de TRT (par exemple, pour le clonage avec expression de gènes de TRT ou la purification de protéines de type TRT), par examen rapide de bases de données d'ordinateur; ou par d'autres moyens. Par exemple, comme décrit dans l'exemple 1, une amplification par réaction en chaîne de polymérase (ACP) d'ADN S. pombe a été effectuée avec des amorces de séquences dégénérées provenant de motifs B' et C de polymérase p123 d'Euplotes. Parmi quatre produits principaux engendrés, l'un a codé pour une séquence peptidique homologue de pl23 d'Euplotes et de Est2p de S. cerevisiae. En utilisant ce produit d'amplification comme sonde, on a obtenu la séquence complète de la TRT homologue de S. pombe, en examinant l'ADNc de S. pombe et les bibliothèques de génome et en amplifiant l'ARN de S. pombe par transcription reverse et amplification en chaîne par polymérase (ACP-RP). La séquence complète du gène de S. pombe ("trtl"; n d'accession en GenBank AF015783; figure 15) a révélé que l'homologie avec pl23 et avec Est2p était particulièrement élevée dans des motifs de transcriptase reverse. trtl de S. pombe est également
*désigné comme étant tzel.
Une amplification utilisant des amorces dégénérées provenant de motifs de télomérase a également servi à obtenir des séquences de gène de TRT (transcriptase reverse de télomérase) dans Oxytricha trifallax et
Tetrahymena thermophila, comme décrit dans l'exemple 1.
Les séquences d'acides nucléiques p123 d'Euplotes, trtl de S. pombe et Est2p de S. cerevisiae de l'invention ont servi dans une recherche d'une base de données d'un ordinateur de marqueur du type séquence d'expression humaine (EST), en utilisant le programme
BLAST (Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403).
L'examen de recherche effectué dans cette base de données avec la séquence Est2p n'a pas indiqué une correspondance, mais la recherche avec des séquences de p123 et de trtl a identifié une EST humaine (n d'accès en Genbank AA281296; voir la "SEQUENCE ID N 8"), comme décrit à l'exemple 1, que l'on suppose codée pour une protéine homologue. Le séquençage complet du clone d'ADNc contenant l'EST (ci-après "clone 712562"; voir la "SEQUENCE ID N 3") a montré la présence de sept motifs de télomérase. Cependant, ce clone n'a pas codé pour une TRT humaine contiguë comportant l'ensemble des sept motifs, parce que les motifs B', C, D et E étaient contenus dans un cadre ouvert de lecture (ORF) différents des motifs terminaux NH2,. En outre, la distance entre les motifs A et B' a été nettement plus courte que celle des trois TRT caractérisée précédemment. Le clone 712562 a été obtenu chez I.M.A.G.E. Consortium; Lennon et al., 1996, Genomics
33:151.
Un clone d'ADNc, pGRN121, codant pour une TRT humaine (voir la figure 16, "SEQUENCE ID N 1") a été isolé à partir d'une bibliothèque d'ADNc provenant de la lignée de cellules 293 humaines, comme décrit dans l'exemple 1. Une comparaison du clone 712562 avec pGRN121 a montré que le clone 712562 présentait une absence ou délétion de paires des bases 182 (voir la figure 24, "SEQUENCE ID N 9") entre les motifs A et B'. Les paires de bases 182 supplémentaires présentes dans pGRN121 placent la totalité des motifs TRT dans un seul cadre ouvert de lecture, et augmentent la distance entre les régions du motif A et du motif B' jusqu'a obtenir une distance correspondant bien aux autres TRT connues. Comme décrit ci-après dans les exemples (par exemple, l'exemple 7), la "SEQUENCE ID N 1" code pour une protéine de type télomérase catalytiquement active ayant la séquence de la "SEQUENCE ID N 2". Le polypeptide de la "SEQUENCE ID N 2" comporte 1132 restes et a un poids moléculaire calculé d'environ
127 kilodaltons (kD).
Comme étudié ci-après, et décrit dans l'exemple 9, ci-après, des ADNc de TRT, présentant l'absence ou délétion de la paire de bases 182 du clone 712562, sont décelés après transcription reverse d'ARN de cellules à réponse positive à l'essai de télomérase (par exemple, des cellules de testicules et 293). Les ARN de hTRT ne comportant pas cette séquence de la paire de bases 182 sont désignés de façon générale comme étant des "variantes A182" et peuvent représenter une, deux ou plusieurs espèces. Bien qu'il soit peu probable que les variantes de hTRT dépourvues de la séquence de la paire de bases 182 et que l'on trouve dans l'ADNc de pGRN121 codent pour une enzyme catalytique, télomérase, entièrement active, elles peuvent jouer un rôle dans la régulation des télomérases, comme étudié ci-après, et/ou avoir une activité de télomérase partielle, comme une activité de liaison de fixation des télomères ou
une activité de liaison de hTR, comme étudié ci-après.
Ainsi, dans un aspect, la présente invention propose un polynucléotide isolé ayant une séquence d'un gène de TRT humain naturel ou d'ARNm, comprenant, sans que ce soit limitatif, un polynucléotide ayant la séquence représentée sur la figure 16 ("SEQUENCE ID N 1"). Dans un aspect apparenté, l'invention propose un polynucléotide codant pour une protéine de type hTRT, un fragment, une variante ou un dérivé de cette protéine. Dans un autre aspect apparenté, l'invention propose des acides nucléiques sens et anti-sens qui se fixent sur un gène de hTRT ou sur ARNm. L'invention propose en outre des protéines de type hTRT, qu'elles soient obtenues par synthèse ou par purification de sources naturelles, ainsi que des anticorps et d'autres agents qui fixent spécifiquement une protéine hTRT ou un fragment d'une telle protéine. La présente invention propose également de nombreux procédés nouveaux, comprenant des procédés qui utilisent les compositions précitées, par exemple en fournissant des compositions pour des essais d'examen et de dosage de diagnostic et de pronostic pour les maladies humaines, des procédés pour développer des thérapeutiques et des procédés de traitement thérapeutique, une identification de protéines associées à de la télomérase, et des procédés pour la recherche de dépistage d'agents capables d'activer ou d'inhiber une activité de télomérase. De nombreux autres aspects et de nombreuses autres formes
de réalisation de l'invention sont présentés ci-après.
Un aspect de l'invention consiste en l'utilisation d'un polynucléotide ayant une longueur d'au moins dix nucléotides à environ 10 kb ou davantage et qui comprend une séquence contigue d'au moins dix nucléotides, qui est identique à, ou exactement complémentaire de, une séquence contigue en présence ou dans un gène de hTRT naturel ou dans de l'ARNm de hTRT, pour doser ou dépister une séquence de gène de hTRT d'ARNm de hTRT, ou pour préparer une cellule hôte recombinante. Un autre aspect de l'invention réside en l'utilisation d'un agent augmentant l'expression de hTRT dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un état caractérisé par l'augmentation de la capacité de prolifération d'une cellule de vertébré, le médicament pouvant éventuellement servir à inhiber
les effets du vieillissement.
Un autre aspect encore de l'invention réside en l'utilisation d'un inhibiteur de l'activité de télomérase dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un état associé à un niveau élevé
d'activité de télomérase dans une cellule humaine.
Les protéines, variantes et fragments selon l'invention, et les polynucléotides codeurs ou leurs fragments, sont également proposés dans un autre aspect de la présente invention pour servir de produit pharmaceutique. L'invention comprend en outre l'utilisation d'une protéine, d'une variante ou d'un fragment, ou d'un polynucléotide ou d'un fragment, dans chaque cas selon la définition ici donnée, pour la fabrication d'un médicament, par exemple pour la fabrication d'un médicament destiné à inhiber un effet du vieillissement
ou à inhiber du cancer.
Dans certaines formes de réalisation de la présente invention, les polynucléotides hTRT sont différents des polynucléotides comportant 389 nucléotides de la "SEQUENCE ID N 8" et/ou sont différents du clone712562, le plasmide contenant un insert, la séquence dudit insert étant présentée sur la
figure 18 ("SEQUENCE ID N 3").
La description ci-dessous est organisée par un
centre d'intérêts. La partie II décrit en outre des motifs d'aminoacides caractéristiques de protéines de TRT, ainsi que des gènes de TRT codant pour des protéines ayant de tels motifs. Les parties III à VI décrivent, notamment, des acides nucléiques, des protéines, des anticorps et des compositions purifiées selon l'invention, avec concentration particulière ou focalisation particulière sur des compositions apparentées à de la TRT humaine. La partie VII décrit notamment des procédés et compositions de l'invention, utiles pour le traitement d'une maladie humaine. La partie VIII décrit la production et l'identification de lignées de cellules humaines immortalisées. La partie IX décrit, notamment, des utilisations des acides nucléiques, des polynucléotides et autres compositions
de l'invention pour le diagnostic de maladies humaines.
La partie X décrit, notamment, des procédés et compositions de l'invention utiles pour le dépistage et l'identification d'agents et de traitements qui modulent (par exemple inhibent ou favorisent) une
activité de télomérase ou une expression de télomérase.
La partie XI décrit, notamment, des animaux transgéniques (par exemple des animaux et des cellules dépourvus de télomérase). La partie XII est un
glossaire de termes utilisés dans les parties I à XI.
La partie XIII décrit des exemples concernant des
formes spécifiques de réalisation de l'invention.
L'organisation de la description de l'invention, par
centre d'intérêt et sous-centre d'intérêt, est destinée à assurer la clarté d'exposition et nullement à jouer
un rôle limitatif.
) II. GENES ET PROTEINES de TRT (transcriptase reverse de La présente invention propose des gènes et des protéines isolé(e)s et/ou recombinant(e)s ayant une séquence de protéine de sous-unité catalytique de télomérase (c'est-à-dire de transcriptase reverse de télomérase, TRT), comprenant, sans que ce soit limitatif, les formes naturelles de tels gènes et de
telles protéines, sous forme isolée ou de recombinant.
Typiquement, les TRT sont de grosses protéines basiques ayant des motifs d'aminoacides de transcriptase reverse (RT) et spécifique de télomérase (T), comme indiqué ici. Puisque ces motifs sont conservés dans le cas de divers organismes, on peut obtenir des gènes de TRT de nombreux organismes en utilisant les procédés de l'invention ou on peut les identifier en utilisant des amorces, des sondes constituées par des acides nucléiques et des anticorps selon l'invention, comme des anticorps spécifiques d'une ou plusieurs des
séquences des motifs.
Les sept motifs de RT que l'on trouve dans les TRT, tout en ressemblant à ceux trouvés dans d'autres transcriptases reverses, ont des caractéristiques particulières. Par exemple, comme montré sur la figure 4, dans les motifs TRT RT, il y a un certain nombre de substitutions d'aminoacides (marquées par des flèches) dans des restes hautement conservés parmi les autres RT. Par exemple, dans le motif C, les deux restes acide aspartique (DD) assurent la liaison de coordination d'ions métalliques à site actif (voir Kohlstaedt et al., 1992, Science 256:1783; Jacobo-Molina et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 90:6320; Patel et al., 1995, Biochemistry 34:5351) se présentent dans le contexte hxDD(F/Y) des RT de télomérase comparés à (F/Y)xDDh dans des autres RT ("h" étant un aminoacide hydrophobe, et "x" étant n'importe quel aminoacide; voir Xiong et al., 1990, EMBO J. 9:3353; Eickbush, dans The Evolutionary Biology of Viruses [biologie évolutive des virus], (S. Morse, Ed., Raven Press, NY, p. 121, 1994)). Une autre modification systématique caractéristique du sous-groupe de télomérase se présente dans le motif E, o WxGxSx est une séquence de consensus ou est conservé parmi les protéines de télomérase, alors que hLGxxh est caractéristique d'autres RT (Xiong et al., ci-dessus; Eickbush ci-dessus). Ce motif E est appelé la "prise ou poignée d'amorçage" et il a été indiqué que des mutations dans cette région affectent l'amorçage d'ARN mais non pas celui d'ADN (Powell et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:13262). Puisque la télomérase exige un ADN d'amorçage d'une amorce par ADN (par exemple l'extrémité 3' de chromosome), il n'est pas inattendu que la télomérase diffère d'autres TR dans la région de la prise ou poignée d'amorçage. En outre, la distance entre les motifs A et B' est plus grande dans les types RT que ce n'est typique pour d'autres RT, ce qui peut représenter une insertion au sein de la région des "doigts" de la structure, ce qui ressemble à une main droite (figure 3; voir Kohlstaedt et al., ci-dessus; Jacobo-Molina et al., ci-dessus; et Patel et al.,
ci-dessus).
En outre, comme noté ci-dessus, le motif T est une caractéristique supplémentaire des protéines TRT. Ce motif T, est comme montré, par exemple sur la figure 4
(W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-
X-R-K-X-X-W [X représenEe n'importe quel aminoacide; h est hydrophobe; p est polaire]), comprend une séquence pouvant être décrite quand on utilise la formule: Trp-R1-X7-R,-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu -X_-R3-R3- Arg-R -X -Trp dans laquelle X représente n'importe quel aminoacide et les indices désignent le nombre de restes consécutifs; RI représente la leucine ou l'isoleucine; RE représente la glutamine ou l'arginine; R3 représente la phényalanine ou la tyrosine; et R4 représente la lysine
ou l'histidine.
Le motif T peut également être décrit en utilisant la formule
Trp-R1 -X4-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-
X-p-X3-p-X2-3-R3R3-Arg-R4-X2-Trp dans laquelle X représente n'importe quel aminoacide et un indice désigne le nombre de restes consécutifs; RI représente la leucine ou l'isoleucine; R2 représente la glutamine ou l'arginine; R3 représente la phényalanine ou la tyrosine; R4 représente la lysine ou l'histidine; h est un aminoacide hydrophobe choisi parmi Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp et Met, et p est un aminoacide polaire choisi parmi Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn et Gln. Dans une forme de réalisation, la présente invention propose des protéines de type TRT, isolées, naturelles et recombinantes, comprenant un ou plusieurs des motifs représentés sur la figure 11, par exemple: Motif T W-X12FFY-X-TE-X-o-l0-R-X3-W-X- -I Motif T' E-X2-V-X Motif 1 X3-R-X2-PK-X3 Motif 2 X-R-X-I-X Motif A X4F-X3-D-X4-YD-X Motif B' Y-X4-G-X -QG-X3-S-X8 Motif C X,-DD-X-L-X-X dans laquelle la protéine TRT représentée contient plus d'un motif TRT, l'ordre (NH7->COOH) étant comme
représenté sur la figure 11.
Dans une forme de réalisation, la présente invention propose des protéines TRT isolées, naturelles, comprenant le supermotif suivant:
(NH2) -X300o-D0-W-X,2FFY-X-TE-Xlo10-l1-R-X3-W-X-I -X -2n-E-X2-V-X-
X _--,-X3-R-X--PK-X-;-R-X-I-X-X:-:-X4- F-X-D-X -YD-X-X -:3,
Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8-X5 35-X6-DD-X-L-X3X-10-20-X12-K
I1 apparaîtra à l'homme du métier que, muni des réactifs comprenant les séquences TRT ici décrites pour ces réactifs et les procédés et le guide que l'on fournit ici (comprenant des méthodologies spécifiques décrites ci-après), on peut obtenir des gènes et protéines de type TRT, isolés et produits sous forme recombinante par une personne ayant une expérience ordinaire. Par exemple, on propose des amorces (par exemple des amorces d'amplification de dégénération) qui se fixent par hybridation sur des séquences de gène
codant pour des motifs RT et T caractéristiques de TRT.
Par exemple, une ou plusieurs amorces ou amorces de dégénérescence qui se fixent par hybridation sur des séquences codant pour la région FFYXTE du motif T, d'autres motifs TRT (comme étudié ci- après) ou des combinaisons de motifs ou de séquences consensus, peuvent être préparés sur la base de l'utilisation de codon de l'organisme cible, et servir à amplifier la séquence de gène TRT provenant de l'ADN ou de l'ADNc de
génome préparé à partir de l'organisme cible.
L'utilisation d'amorces de dégénérescence est bien connue en pratique et implique l'utilisation de groupes d'amorces qui se fixent par hybridation sur le groupe des séquences d'acides nucléiques pouvant potentiellement coder pour les aminoacides du motif cible, en tenant compte des préférences de codon et de l'utilisation de l'organisme cible, et en utilisant des conditions d'amplification (par exemple une amplification PCR ou en chaîne par polymérase) appropriées pour permettre des non-concordances de bases dans les étapes d'annelage de PCR. Typiquement, on utilise deux groupes d'amorces; cependant, des systèmes d'amplification à une seule amorce (ou, dans ce cas, un simple groupe ou un seul groupe d'amorces de dégénérescence) sont bien connus et peuvent servir pour
obtenir des gènes de TRT.
Le tableau 1 propose des amorces illustrant l'invention et que l'on peut utiliser pour amplifier de nouveaux acides nucléiques TRT, en particulier ceux provenant de vertébrés (par exemple des êtres humains et d'autres mammifères). "N" est un mélange équimolaire de l'ensemble des quatre nucléotides, et des nucléotides placés entre parenthèses sont des mélanges
équimolaires des nucléotides spécifiés.
TABLEAU I
EXEMPLES ILLUSTRATIFS D'AMORCES DE DEGENERESCENCE POUR
AMPLIFICATION D'ACIDES NUCLEIQUES TRT
Motif Direction 5'-séquence-3' a FFYVTE Avant TT(CT)TT(CT)TA(CT)GTNACNGA b FFYVTE Arrière TCNGTNAC(GA)TA(GA)AA(GA)AA c RFIPKP Avant (CA)GNTT(CT)AT(ACT)CCNAA(AG)CC d RFIPKP Arrière GG(TC)TTNGG(TGA)AT(GA)AANC e AYDTI Avant GCNTA(CT)GA(CT)AGNAT f AYDTI Arrière TANGT(GA)TC(GA)TANGC g GIPQG Avant GGNAT(ACT)CCNCA(AG)GG h GIPQGS Arrière (GC)(AT)NCC(TC)TGNGG(TGA)ATNCC i LVDDFL Avant (CT)TNGTNGA(CT)GA(CT)TT(CT)(CT)T j DDFLLVT Arrière GTNACNA(GA)NA(GA)(GA)AA(GA)TC(GA)TC Combinaison préférée d'amorces (y = oui. n = non) Arrière Avant b d f h i a- n y y y y c- n n y y y e- n n n y y g- n n n n y i- n n n n n Dans une forme de réalisation, un acide nucléique de TRT (télomérase) amplifié sert de sonde d'hybridation pour l'hybridation en colonie et formation d'une bibliothèque (par exemple une bibliothèque d'ADNc) réalisée à partir de l'organisme cible, de sorte qu'un acide nucléique ayant la totalité de la séquence de codage de protéine TRT (télomérase) ou ayant une très forte partie de cette séquence, est identifié et isolé ou clone. Des réactifs et des procédés tels que ceux que l'on vient juste de décrire ont servi selon les procédés décrits ici pour obtenir des séquences de gène de télomérase (TRT) d'Oxytricha trifallax et de Tetrahymena thermophila, comme décrit en détail ci-après. On reconnaîtra que, après clonage d'un gène de TRT (télomérase) précédemment non caractérisé, la séquence peut être déterminée par des procédés routiniers et le polypeptide formé par codage peut être synthétisé et soumis à un essai de détection ou de dosage de l'activité de TRT, comme de l'activité catalytique de télomérase (comme décrit ici et/ou par des essais de détection ou de dosage de télomérase
connus en pratique).
Il apparaîtra également à l'homme du métier que des gènes de TRT peuvent être clones à l'aide de l'une quelconque des diverses méthodes de clonage de l'invention, car les séquences de motifs de TRT et les acides nucléiques de l'invention comprenant de telles séquences peuvent servir dans une large variété de tels procédés. Par exemple, on peut utiliser une hybridation utilisant une sonde sur la base de la séquence d'une TRT connue, sur des bibliothèques d'ADN ou d'autres bibliothèques d'acides nucléiques de l'organisme cible, comme décrit dans l'exemple 1. On comprendra que des amorces dégénérées d'amplification en chaîne par polymérase (ACP) ou bien leurs produits d'amplification comme ceux décrits ci-dessus, peuvent être eux- mêmes marqués et servir de sonde d'hybridation. Dans une autre forme de réalisation, on utilise des procédés de clonage pour expression. Par exemple, un ou plusieurs anticorps qui fixent spécificement des peptides étalant un motif de télomérase (TRT) ou un autre épitope de TRT, comme le motif FFYXTE, peuvent servir à isoler un complexe ribosomique comprenant une protéine de télomérase et l'ARNm qui en effectue le codage d'introduction. Pour engendrer de tels anticorps de l'invention, les immunogènes peptidiques ont typiquement une longueur comprise entre 6 et 30
aminoacides, plus souvent environ 10 à 20 aminoacides.
Les anticorps peuvent également servir à sonder une bibliothèque d'expression d'ADNc provenant de l'organisme intéressant pour identifier un clone codant pour une séquence de TRT. Dans une autre forme de réalisation, des recherches, sur ordinateur, de bases de données d'ADN, pour trouver des ADN contenant des séquences conservées avec des TRT (télomérase) connus, peuvent également servir à identifier un clone
comprenant une séquence de TRT.
Dans un aspect, la présente invention propose des compositions comprenant un polypeptide isolé ou recombinant ayant la séquence des aminoacides d'une protéine de TRT naturelle. Habituellement, la TRT naturelle a un poids moléculaire compris entre environ 000 daltons (D) et environ 150 000 daltons, plus souvent entre environ 95 000 D et environ 130 000 D. Typiquement, la TRT naturelle a une charge positive nette à pH 7 (valeur calculée de pI typiquement supérieure à 9). Dans une forme de réalisation, le polypeptide présente une activité de télomérase selon la définition donnée ici. Dans une forme apparentée de réalisation, le polypeptide a une séquence formant région spécifique de TRT (motif T) et présente une activité de télomérase. L'invention propose en outre des fragments de tels polypeptides. La présente invention propose également des polynucléotides isolés ou recombinants ayant la séquence d'un gène naturel codant pour une protéine de TRT. L'invention propose des réactifs pouvant utilement servir à isoler une séquence de TRT de non- vertébré (comme une levure) et de vertébré, comme des mammifères (par exemple souris ou être humain). Le polynucléotide isolé peut être associé à d'autres séquences d'acide nucléique formant
des vecteurs, naturels ou recombinants ou synthétiques.
Typiquement, l'acide nucléique isolé a moins d'environ 300 kb, souvent moins d'environ 50 kb, plus souvent encore moins d'environ 20 kb, fréquemment moins d'environ 10 kb et parfois moins d'environ 5kb ou 2 kb de longueur. Dans certaines formes de réalisation, le polynucléotide de télomérase isolé est même plus petit, comme dans le cas d'un fragment de gène, une amorce, ou une sonde ayant moins d'environ 1 kb ou moins de 0,1 kb
(kb = kilobase).
III. ACIDES NUCLEIQUES
A) GENERALITES
La présente invention propose des acides nucléiques isolés et recombinants ayant une séquence de
polynucléotide codant pour une protéine formant sous-
unité catalytique de télomérase (TRT), comme un gène de TRT recombinant obtenu à partir de Euplotes, Tetrahymena, S. pombe ou des êtres humains. Des exemples de polynucléotides sont présentés sur la figure 13 (Euplotes), la figure 15 (S. pombe) et la figure 16 (origine humaine, n d'accès en GenBank AF015950). La présente invention propose des polynucléotides sens et anti- sens ayant une séquence de gène de TRT, comprenant des sondes, des amorces, des polynucléotides codant pour de la protéine TRT, etc. B) TRT (télomérase) humaine La présente invention propose des acides nucléiques ayant une séquence d'une sous-unité catalytique de télomérase provenant d'êtres humains
(c'est-à-dire une hTRT).
Dans un aspect, l'invention propose un polynucléotide ayant une séquence ou une sous-séquence d'un gène ou ARN de TRT humain. Dans une forme de réalisation, le polynucléotide de l'invention comporte une séquence de "SEQUENCE ID N 1" présentée sur la Figure 16 ou une sous-séquence de celle-ci. Dans une autre forme de réalisation, le polynucléotide comporte une séquence de "SEQUENCE ID N 3" (Figure 18), "SEQUENCE ID N 4" (Figure 20) ou des sous-séquences de celles-ci. L'invention propose également des polynucléotides dont les séquences sont essentiellement identiques aux séquences d'acides nucléiques de hTRT ici décrites, comprenant par exemple, sans que cette liste soit limitative, les "SEQUENCES ID N : 1" [Figure 16], 4 [Figure 20], 6 [Figure 21], et 7). Ainsi, l'invention propose des allèles naturels de séquences de gènes humains de TRT et des séquences de polynucléotide variant comportant une ou plusieurs délétion(s), insertion(s) ou substitution(s) de nucléotide par rapport à une séquence d'acides nucléiques de hTRT ici décrite. Comme décrit ci-après, des acides nucléiques variants peuvent être produits à l'aide des procédés de recombinaison ou de synthèse
décrits ci-après, ou par d'autres moyens.
L'invention propose également des polynucléotides isolés et recombinants ayant une séquence provenant d'une région de flanc ou de bord d'un gène de TRT humain. De tels polynucléotides comprennent ceux provenant de séquences de génome de régions non translatées de l'ARNm de hTRT. Un exemple de séquence de génome est présenté sur la Figure 21 ("SEQUENCE ID N 6). Comme décrit à l'exemple 4, la "SEQUENCE ID N 6" a été obtenue par séquençage d'un clone, XGI5
isolé à partir d'une bibliothèque de génome humain.
Lambda G'5 contient un insert de 15 paires de kilobases (pkb) comprenant des séquences codant pour environ 13 000 bases 5' vers la hTRT. Ce clone contient des séquences de promoteur de hTRT et d'autres séquences de régulation de gène de hTRT (par exemple des amplificateurs). L'invention propose également des polynucléotides isolés et recombinants ayant une séquence provenant d'une région d'intron d'un gène de TRT humaine. Un exemple de séquence d'intron est présenté sur la Figure 21 ("SEQUENCE ID N 7; voir l'exemple 3). Dans certaines formes de réalisation, des introns de type hTRT sont inclus dans des "minigènes" pour une meilleure expression de protéines de hTRT dans des
cellules d'eucaryotes.
Dans un aspect apparenté, la présente invention propose des polynucléotides qui codent pour des protéines de hTRT ou des fragments de telles protéines, ce qui comprend des polypeptides de hTRT modifiés, altérés et variants. Dans une forme de réalisation, la protéine de hTRT introduite par codage ou le fragment de cette protéine comporte des séquences d'aminoacides, comme représenté sur la Figure 17 ("SEQUENCE ID N 2") ou comporte des substitutions conservatrices de la "SEQUENCE ID N 2". Dans une forme de réalisation, la protéine de hTRT introduite par codage ou son fragment comporte des substitutions qui modifient une activité de la protéine (par exemple une activité catalytique de télomérase). On comprendra que, par suite de la dégénérescence du code génétique, l'acide nucléique codant pour la protéine hTRT (télomérase humaine) n'a pas besoin d'avoir la séquence d'un gène naturel producteur de hTRT, mais qu'une multitude de polynucléotides peuvent coder pour un polypeptide hTRT ayant une séquence des aminoacides correspondant à la "SEQUENCE ID N 2". La présente invention propose chaque variation possible de séquence des nucléotides que l'on peut produire en choisissant des combinaisons basées sur des choix possibles de codons effectués selon des codes génétiques de triplet connus, et toutes ces variations sont spécifiquement ainsi exposées. Ainsi, bien que l'on préfère dans certains cas une séquence de nucléotides codant pour les polypeptides de type hTRT qui sont capables de se fixer par hybridation sur la séquence des nucléotides de la séquence naturelle (dans des conditions de rigueur choisies de façon appropriée), il peut être avantageux dans d'autres cas de produire des séquences de nucléotide codant pour hTRT et utilisant un codon essentiellement différent et qui, ainsi, ne se fixe pas par hybridation sur des
acides nucléiques présentant la séquence naturelle.
Dans des formes particulières de réalisation, l'invention propose des oligonucléotides et des
polynucléotides de type hTRT qui comprennent une sous-
séquence d'un acide nucléique de type hTRT que l'on
décrit ici (par exemple les "SEQUENCES ID N 1 et 6").
Les acides nucléiques de l'invention comprennent typiquement au moins environ 10, plus souvent au moins environ 12 ou environ 15 bases consécutives du polynucléotide de type hTRT cité en exemple. Souvent, l'acide nucléique de l'invention va comprendre une plus longue séquence, ayant par exemple une longueur correspondant à environ 25, environ 50, environ 100, environ 200 ou au moins environ 500 à 3000 bases, par exemple lors de l'expression d'un polypeptide, ou bien on entend obtenir ou l'on vise la pleine longueur de la
protéine de type hTRT.
Dans d'autres formes encore de réalisation, la présente invention propose des polynucléotides "A182hTRT", ayant une séquence identique à ou complémentaire (de la séquence) des polynucléotides de type hTRT, naturels ou non naturels, comme la "SEQUENCE ID N 3" ou la "SEQUENCE ID N 4", qui ne contiennent pas la séquence des 182 nucléotides ("SEQUENCE ID N 9" [Figure 24]) que l'on trouve dans pGRN121 (et qui est également absente dans le clone 712562). Ces polynucléotides sont souvent intéressants, en partie parce qu'ils codent pour des polypeptides contenant des combinaisons, des agencements ou arrangements de motifs TRT différents de ceux que l'on trouve dans le polypeptide hTRT "de pleine longueur" ("SEQUENCE ID N 2"), tel que codé par pGRN121. Comme étudié ci-après, on envisage la possibilité que ces polypeptides jouent un rôle biologique dans la nature (par exemple dans la régulation de l'expression de télomérase dans les cellules) et/ou trouvent une utilisation à titre de produits thérapeutiques (par exemple comme produits à réaction négative en face de facteurs dominants, et qui inhibent le rôle de protéines du type sauvage), ou la possibilité d'avoir d'autres rôles et utilisations, par exemple décrits ici. Par exemple, par contraste avec le polypeptide codé par pGRN121, le clone 712562 code pour une protéine comportant 259 restes et ayant un poids moléculaire calculé d'environ 30 kD (que l'on désigne ci-après comme étant la "hTRT712562"). Le polypeptide de hTRT712562 ("SEQUENCE ID N 10" [Figure 19]) contient des motifs T, 1, 2 et A, mais non pas des motifs B', C, D et E (voir Figure 4). De façon similaire, un polypeptide de type hTRT variant, ayant des activités thérapeutiques et d'autres activités, peut être exprimé à partir d'un acide nucléique semblable à l'ADNc de pGRN121, mais ne comportant pas les 182 paires de bases manquantes dans le clone 712562, ayant par exemple la séquence représentée sur la Figure 20 ("SEQUENCE ID N 4"). Cet acide nucléique (appelé ci-après "hTRTpro90"), qui peut être synthétisé à l'aide de procédés routiniers de synthèse ou de recombinaison, comme décrit ici, code pour une protéine de 807 restes (poids moléculaire calculé d'environ kD), qui possède et partage la même séquence terminale d'aminoacides que la protéine de type hTRT codée par la "SEQUENCE ID N 1", mais diverge à la région carboxylique terminale (les 763 premiers restes sont communs, les 44 derniers restes de hTRTpro90 sont différents de la hTRT "de pleine longueur"). Le polypeptide de type hTRTpro90 contient des motifs T, 1, 2 et A, mais pas de motifs B, C, D, E et, ainsi, il a peut-être certaines activités de télomérase mais n'a
probablement pas toutes les activités de télomérase.
C) PRODUCTION D'ACIDES NUCLEIQUES DE TYPE TRT
HUMAINS
Les polynucléotides de l'invention ont de nombreuses utilisations comprenant, sans que cette liste soit limitative, l'expression de polypeptides codant pour hTRT ou des fragments de hTRT, l'utilisation à titre de sonde ou d'amorce sens ou anti-sens pour une hybridation et/ou une amplification de gènes ou d'ARN de type hTRT naturels (par exemple pour des applications à du diagnostic ou à un pronostic) et comme agents thérapeutiques (par exemple dans des compositions anti-sens, triplexes, ou de ribozyme). Ainsi qu'il apparaîtra au passage en revue du présent exposé, ces utilisations vont avoir un impact énorme sur le diagnostic et le traitement de maladies humaines liées au vieillissement, au cancer et à la fécondité ainsi qu'à la croissance, la reproduction et la fabrication de produits à base de cellule(s). Comme décrit dans les sections qui suivent, les acides nucléiques du type hTRT de l'invention peuvent être produits (par exemple par clonage, synthèse ou amplification) à l'aide de techniques bien
connues en pratique.
1) PRODUCTION PAR CLONAGE, AMPLIFICATION ET A
L'AIDE DE RECOMBINANTS
Dans une forme de réalisation, les gènes de type hTRT ou les ADNc sont clones à l'aide d'une sonde d'acides nucléiques se fixant spécifiquement par hybridation sur un ARNm de type hTRT, un ADNc ou un ADN de génome. Une sonde convenant dans ce but est un polynucléotide comportant la totalité ou une partie de la séquence présentée sur la Figure 16 ("SEQUENCE ID N 1"), comme par exemple une sonde comprenant une sous-séquence de cette séquence. Typiquement, l'ADN de génome de type hTRT ou l'ADNc constituant une cible est ligaturé en formant un vecteur (par exemple un chromosome artificiel de plasmide, de phage, de virus, de levure ou analogues) et peut être isolé à partir d'une bibliothèque d'ADN de génome ou d'ADNc (par
exemple une bibliothèque d'ADNc de placenta humain).
Une fois un acide nucléique de type hTRT identifié, il peut être isolé selon des méthodes normalisées connues de l'homme du métier. Un exemple illustratif d'un passage en revue de dépistage d'une bibliothèque d'ADNc humain pour déceler le gène hTRT est présenté à l'exemple 1; de façon similaire, un exemple de passage en revue d'une bibliothèque de génome humain se trouve aux exemples 3 et 4. Des procédés de clonage sont bien connus et ils sont décrits, par exemple, dans Sambrook et al., ci-dessus; Berger et Kimmel, ci-dessus; Ausubel et al., ci-dessus; Cashion et al., brevet US-A-5 017 478; et Carr, brevet européen n O 246 864; Ausubel et ai. "Current Protocols in Molecular Biology" [Protocoles actuels en biologie moléculaire], Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997);
Berger et Kimmel (1987) "METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.
152; "GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES" [GUIDE DE
TECHNIQUES DE CLONAGE MOLECULAIRE], San Diego, Academic Press, Inc.; Sambrook et al. (1989) "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL" [CLONAGE MOLECULAIRE, MANUEL DE LABORATOIRE],
2e édition, Volumes 1 à 3, Cold Spring Harbor
Laboratory, ci-après appelé "Sambrook".
L'invention propose également des acides nucléiques de génome de type hTRT ou de type ADNc, isolés par des méthodes d'amplification comme la réaction en chaîne par polymérase (RCP). Dans une forme de réalisation, la séquence codant pour une protéine hTRT est amplifiée à partir d'un échantillon de ARN ou de ADNc (par exemple, de l'ADNc à double brin de placenta (Clontech, Palo
Alto, Californie)) en utilisant les amorces 5'-
GTGAAGGCACTGTTCAGCG-3' ("TCP1.1") et 5'- CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3 ("TCP 1.15"). Dans certaines formes de réalisation, une troisième amorce ou une seconde paire d'amorces peuvent être utilisées, par exemple pour de la "RCP limitée ou avec emboîtement", pour augmenter la spécificité. Un exemple d'une seconde paire d'amorces est représenté par '-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA-3' ("billTCP6") et
'-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3' ("TCP1.14").
Il apparaîtra à l'homme de métier que la présente invention propose de nombreuses autres amorces et combinaisons d'amorces, pouvant utilement servir à une
amplification des acides nucléiques de type hTRT.
En outre, l'invention propose des amorces qui amplifient n'importe quelle région spécifique (par exemple des régions de codage, des régions de promoteur et/ou des introns) ou une sous-séquence d'ADN, d'ADNc ou d'ARN de génome de type hTRT. Par exemple, l'intron de type hTRT en position 274/275 de la "SEQUENCE ID N 1" (voir l'exemple 3) peut être amplifié (par exemple pour la détection de clones de génome) à l'aide d'amorces TCP1.57 et TCP1.52 (paire 1 d'amorces) ou des amorces TCP1.49 et TCP1.50 (paire 2 d'amorces). (Les noms des amorces se réfèrent à des amorces énumérées dans le tableau 2 ci-après). Les paires d'amorces peuvent servir individuellement ou dans une RCP avec emboîtement, avec l'utilisation tout d'abord du premier groupe 1 d'amorces. Un autre exemple illustratif concerne des amorces qui amplifient spécifiquement et détectent ainsi l'extrémité 5' de l'ARNm de type hTRT ou l'exon codant pour l'extrémité 5' du gène hTRT (par exemple pour établir la taille ou l'état d'achèvement d'un clone d'ADNc). Les paires suivantes d'amorces peuvent utilement servir à amplifier l'extrémité 5' de hTRT: les amorces K320 et K321 (paire 3 d'amorces), les amorces K320 et TCP1.61 (paire 4 d'amorces); les amorces K320 et K322 (paire 5 d'amorces). Les groupes d'amorces peuvent servir dans une RCP avec emboîtement dans le groupe 5, puis dans le groupe 4 ou le groupe 3,
ou bien le groupe 4 ou le groupe 5, puis le groupe 3.
Un autre exemple illustratif implique des amorces choisies pour amplifier ou déceler spécifiquement la région du motif conservé de TRT hTRT comprenant approximativement le tiers médian de l'ARNm (par exemple pour servir de sonde pour hybridation afin d'identifier des clones de TRT provenant, par exemple, d'organismes non humains). Les paires suivantes d'amorces peuvent utilement servir à amplifier la région de motif TRT des acides nucléiques de type hTRT: les amorces K304 et TCP1.8 (paire 6 d'amorces) ou des amorces LT1 et TCPl. 15 (paire 7 d'amorces). Les groupes d'amorces peuvent servir dans une expérience de RCP
avec emboltement dans le groupe 6 puis le groupe 7.
Les conditions convenables d'amplification par RCP sont connues de l'homme du métier et comprennent (sans que cette liste soit limitative) une unité Taq de polymérase (Perkin Elmer, Norwalk CT), NTPd de 100 AiM chacune (ATPd, CTPd, GTPd, TTPd), tampon pour amplification (KCl 50 mM, tris 10 mM, pH 8,3 à la température ambiante, MgCl2 1,5 mM, gélatine à 0,01%) et des amorces de 0,5 AM, avec une marche d'amplification durant 30 cycles environ à 94 pendant 45 secondes, 55 pendant 45 secondes et 72 durant 90 secondes. L'homme du métier comprendra que d'autres polymnérases d'ADN thermostable, d'autres conditions de réaction et d'autres paramètres de travail cyclique vont également permettre une amplification convenable. D'autres procédés d'amplification "in vitro" convenables, pouvant servir pour obtenir des acides nucléiques de type hTRT comprennent, sans que cette liste soit limitative, ceux indiqués ci-après ici. Une fois amplifiés, les acides nucléiques de type hTRT peuvent être clones, si on le désire, en donnant n'importe lequel de divers vecteurs, quand on utilise des procédés de biologie moléculaire routiniers ou peuvent être décelés ou utilisés d'une autre façon selon les
procédés de l'invention.
L'homme du métier comprendra que les acides nucléiques de type hTRT amplifiés ou clones, que l'on obtient comme décrit ci-dessus, peuvent être préparés ou propagés à l'aide d'autres procédés, comme de la synthèse chimique ou une réplication par transformation en des systèmes bactériens, comme E. coli (voir, par exemple, Ausubel et al., ci-dessus) ou des systèmes d'expression d'eucaryotes, comme des systèmes d'expression de mammifères. De façon similaire, de l'ARN de type hTRT peut être exprimé selon les procédés actuels "in vitro", ou dans les systèmes bactériens comme E. coli, en utilisant, par exemple, des vecteurs disponibles dans le commerce et contenant des promoteurs reconnus par une polymérase d'ARN, comme T7, T3 ou SP6, ou par transcription d'ADN engendré par amplification par RCP, en utilisant des amorces
contenant un promoteur de polymérase ARN.
La présente invention propose en outre des acides nucléiques de type hTRT, altérés ou modifiés. L'homme du métier comprendra que les acides nucléiques de type hTRT clones ou amplifiés que l'on obtient peuvent être modifiés (par exemple tronqués, soumis à la production de dérivés, modifiés ou altérés) par des procédés bien connus en pratique (par exemple de la mutagénèse visant un ou des sites, de la mutagénèse d'exploration à l'aide d'un lieur) ou simplement par synthèse "de novo", comme décrit ci-après. Les acides nucléiques de type hTRT, altérés ou modifiés, peuvent utilement servir à diverses applications comprenant, sans que cette liste soit limitative, la facilitation du clonage ou de la manipulation d'un gène de hTRT ou d'un produit de type gène, ou l'expression d'un produit de type gène de hTRT variant. Par exemple, dans une forme de réalisation, la séquence de gène de type hTRT est altérée ou modifiée de façon qu'elle code pour un polypeptide hTRT ayant des propriétés ou activités modifiées ou altérées, comme étudié en détail ci-après, par exemple, par mutation dans un motif conservé de hTRT. Dans un autre exemple illustratif, les mutations dans la région de codage de protéine d'un acide nucléique de type hTRT peuvent être introduites pour modifier des allures de glycosylation, pour modifier la préférence de codons, pour produire des variants pour épissage, pour enlever des sites sensibles à de la protéase, pour créer des domaines antigéniques, pour modifier une activité spécifique, etc. Dans d'autres formes de réalisation, la séquence des nucléotides codant pour hTRT et ses dérivés est modifiée sans altérer les séquences des aminoacides codés, par exemple la production de produits de transcription d'ARN ayant des propriétés plus intéressantes, comme une meilleure efficacité de translation ou une plus grande période ou une plus courte période de demi-vie, en comparaison de produits de transcription obtenue à partir d'une séquence naturelle. Dans une autre forme encore de réalisation, on choisit des codons modifiés pour augmenter la vitesse à laquelle se produit une expression du peptide dans un hôte particulier, procaryte ou eucaryote, d'expression selon la fréquence avec laquelle des codons particuliers sont utilisés par l'hôte. Des techniques faisant appel à des recombinants, utiles "in vitro" et "in vivo", pouvant servir à préparer des polynucléotides de type hTRT variants de l'invention, se trouvent dans Sambrook et
al. et Ausubel et al., tous deux cités ci-dessus.
Comme noté ci-dessus, la présente invention propose des acides nucléiques ayant des séquences latérales ou de flanc (5' ou 3') et d'introns du gène de hTPT. Les acid(es nucl[qu es sornt intressants notamment parce qu'ils contiennent des éléments promoteurs et d'autres éléments régulateurs impliqués dans la régulation de hTRT et pouvant utilement servir S à l'expression de hTRT et d'autres protéines
recombinantes ou d'autres produits de gène de type ARN.
Il apparaîtra que, en plus des séquences d'acide nucléique présentes dans les "SEQUENCES ID N 6 et 7", on peut facilement obtenir en utilisant les techniques routinières de biologie moléculaire, des séquences supplémentaires d'intron de hTRT et des séquences latérales ou de flanc. Par exemple, une séquence supplémentaire de génome de hTRT peut être obtenue à partir du clone Lambda GD5 (n d'accès ATCC 98 505) décrit ci-dessus, et dans l'exemple 4. D'autres clones de génome de hTRT et d'autres séquences peuvent être obtenus par exploration d'une bibliothèque de génome humain en utilisant une sonde d'acide nucléique de type hTRT ayant une séquence ou une sous-séquence provenant de la "SEQUENCE ID N 1". On peut obtenir d'autres clones et d'autres séquences (par exemple plus en amont encore) en utilisant des séquences ou des sous-clones marqués provenant de XG'5 pour sonder des bibliothèques appropriées. D'autres procédés utiles pour une caractérisation supplémentaire des séquences latérales ou de flanc de type hTRT comprennent les procédés généraux décrits dans Gobinda et al., 1993, PCR Meth, Applic. 2:318; Triglia et al., 1988, Nucleic Acids Res.
16:8186, Lagerstrom et al., 1991, PCR Methods Applic.
1:111; et Parker et al., 1991, Nucleic Acids Res.
19:3055.
Des séquences d'introns peuvent être identifiées par des moyens routiniers comme par exemple la comparaison de la séquence de génome de type hTRT avec une séquence d'ADNc de type hTRT (voir, par exemple, l'Exemple 3), par analyse de Si (voir Ausubel et al., ci- dessus, au chapitre 4), ou par divers autres moyens connus en pratique. On peut également trouver des séquences d'introns dans de l'ARNpre-m (c'est-à-dire des précurseurs d'ARNm non épissés ou incomplètement épissés), qui peuvent être amplifiées ou clonées après
transcription reverse de l'ARN cellulaire.
Quand on le désire, la séquence de l'acide nucléique de type hTRT ou un autre acide nucléique de type TRT clonée, amplifiée ou synthétisée d'une autre façon peut être déterminée ou vérifiée à l'aide de procédés de séquençage d'ADN bien connus en pratique (voir, par exemple, Ausubel et al., ci-dessus). Des procédés utiles de séquençage utilisent des enzymes comme le fragment de Klenow d'ADN polymérase I, Sequenase (US Biochemical Corp, Cleveland OH), de la Taq ADN polymérase (Perkin Elmer, Norwalk CT), de la polymérase T7 thermostable (Amersham, Chicago IL), ou des combinaisons de polymérases recombinantes et d'exonucléases à lecture franche comme le système d'amplification "ELONGASE" mis sur le marché par Gibco BRL (Gaithersburg MD). Quand on effectue le séquençage ou que l'on vérifie la séquence d'oligonucléotides (comme de l'oligonucléotide produit "de novo" par synthèse chimique), on peut préférer le procédé de
Maxam et Gilbert (Maxam et Gilbert, 1980, Meth. Enz.
:499; Ausubel et al., ci-dessus, chapitre 7).
Les séquences de hTRT ou d'autres ARNm de type TRT non translatées en 5' peuvent être déterminees directement par clonage d'un ADNc de type hTRT "de pleine longueur" ou d'un autre ANDc, à l'aide de procédés traditionnels comme la transcription reverse d'ARNm, ce qui est suivi d'un clonage et d'un séquençage de l'ADNc résultant. On peut faire appel à des bibliothèques d'oligo(dT) amorces préférés pour l'exploration ou l'amplification d'ADNc de pleine longueur, qui ont été choisis en fonction de leur taille pour inclure de plus gros ADNc. Des bibliothèques amorcées au hasard peuvent également convenir et comprennent souvent une plus grande
proportion de clones contenant les régions 5' de gènes.
D'autres procédés bien connus pour l'obtention de séquences d'ARN en 5', comme le protocole "RACE" décrit par Frohman et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci USA 85:8998, peuvent également servir. Si on le désire, le site de début de transcription d'un ARNm de hTRT ou d'un ARNm d'autres TRT peut être déterminé par des procédés routiniers utilisant les acides nucléiques ici proposés (qui ont par exemple une séquence du type "SEQUENCE ID N 1"). Un procédé consiste en l'analyse de nucléase S1 (Ausubel et al., ci-dessus), utilisant un ADN marqué ayant une séquence provenant de la région ' de la "SEQUENCE ID N 1".
2) SYNTHESE CHIMIQUE D'ACIDES NUCLEIQUES
La présente invention propose également des polynucléotides de type hTRT (ARN, ADN ou d'acide modifié) qui sont produits par synthèse chimique directe. La synthèse chimique est généralement préférée pour la production d'oligonucléotides ou pour des oligonucléotides et des polynucléotides contenant des nucléotides non courants (par exemple des sondes, des amorces et des oligonucléotides anti- sens). Une synthèse chimique directe d'acides nucléiques peut être réalisée par des procédés connus en pratique, comme le procédé au phosphotriester de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; le procédé au phosphodiester de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109 (1979); le procédé
au diéthylphosphoramidite de Beaucage et al., Tetra.
Lett., 22:1859 (1981); et le procédé sur support solide du brevet US-A-4 458 066. La synthèse chimique produit typiquement de l'oligonucléotide à brin simple, qui peut être converti en de l'ADN à double brin par hybridation avec une séquence complémentaire, ou par polymérisation avec une ADN polymérase et une amorce d'oligonucléotide, en utilisant le brin simple comme gabarit. L'homme du métier reconnaîtra que si la synthèse chimique d'ADN est souvent limitée à des séquences d'environ 100 ou 150 bases, on peut obtenir des séquences plus longues par la ligation de séquences plus courtes ou par des procédés plus élaborés de synthèse. On comprendra que les polynucléotides et oligonucléotides de type hTRT (ou hTR ou autres) de l'invention peuvent être obtenus grâce à l'utilisation de bases non courantes (par exemple autres que l'adénine, la cytidine, la guanine, la thymine et l'uridine) ou à l'aide d'une structure de charpente non courante pour obtenir des propriétés intéressantes (par exemple une plus grande résistance à la nucléase, de la liaison plus étroite, de la stabilité ou d'une Tf voulue). Des techniques destinées à rendre des oligonucléotides résistants à de la nucléase comprennent des techniques décrites dans la publication PCT WO 94/12633. On peut produire de larges variétés d'oligonucléotides modifiés utiles, ce qui comprend les oligonucléotides ayant une charpente peptide-acide nucléique (PAN) (Nielsen et al., 1991, Science 254:1497) ou incorporant des 2'-O-méthyl ribonucléotides connus, des nucléotides de type phosphorothioate, des nucléotides de type phosphonate de méthyle,' des nucléotides de phosphotriester, des nucléotides de type phosphorothioate, des phosphoramidates. D'autres oligonucléotides encore utiles peuvent contenir des fragments sucre à substituants alkyle et halogéno, comprenant l'un des substituants suivants en position 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH30(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 ou O(CH2),CH3, o n vaut 1 à environ 10; un groupe alkyle inférieur en Ci à C,0, alkyle inférieur substitué, alkaryle ou aralkyle; C1; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- ou N-alkyle; O-,S- ou N-alcényle; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; un
groupe hétérocycloalkyle; un groupe hétérocyclo-
alkaryle, aminoalkylamino; poiyalkylamino; silyle substitué; un groupe de clivage d'ARN; un groupe cholestéryle; un groupe folate; un groupe de report; un intercalateur; un groupe destiné à améliorer les propriétés pharmacocinétiques d'un oligonucléotide; ou un groupe destiné à améliorer les propriétés pharmacodynamiques d'un oligonucléotide et d'autres substituants ayant des propriétés similaires. Des groupes folate, cholestérol et autres, qui facilitent l'absorption des oligonucléotides, comme des analogues de lipide, peuvent être conjugués directement ou par l'intermédiaire d'un lieur à la position 2' de n'importe quel nucléoside ou sur la position 3' ou 5' du nucléoside terminal en 3' ou du nucléoside terminal en 5', respectivement. On peut utiliser un ou plusieurs de ces conjugués. Des oligonucléotides peuvent également comporter des groupes mimant le sucre, comme des groupes cyclobutyle, à la place du groupe pentofuranosyle. D'autres formes de réalisation peuvent inclure au moins une forme de base modifiée ou de "base universelle" comme l'inosine, ou l'inclusion d'autres bases non courantes ou "non standard" comme de la queosine et de la wybutosine ainsi que des formes d'adénine, de cytidine, de guanine, de thymine et d'uridine à modification acétyle, méthyle, thio et à modification similaire, qui ne sont pas reconnues aussi facilement par des endonucléases endogènes. L'invention propose en outre des oligonucléotides ayant des analogues de charpente comme du phosphodiester, du
phosphorothioate, du phosphorodithioate, du méthyl-
phosphonate, du phosphoramidate, du phosphotriester d'alkyle, du sulfamate, du 3'-thioacétal, du méthylène(méthylimino), du 3'-N-carbamate, du morpholino carbamate, des méthylphosphonates chiraux, des nucléotides comportant des groupes alkyle ou cycloalkyle à courte chaîne pour la liaison entre sucres, des liaisons intersucres ("de charpente") hétéroatomiques ou hétérocycliques en courte chaîne, ou
des charpentes CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2-O-
N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 et O-N(CH3)-CH2-CH2 dans lesquelles le phosphodiester est O-P-O-CH2) ou des mélanges de ces groupes. Sont également utiles des oligonucléotides et des structures de charpente de type
morpholino (brevet US-A-5 034 506).
Des références utiles comprennent "Oligonuclétotides and Analogues, A Practical Approach" [oligonucléotides et analgoues; approche pratique], ouvrage publié par F. Eckstein, chez IRL Press à Oxford University Press (1991); "Anti-sens Strategies", Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, publié sous la direction de Baserga et Denhardt (NYAS 1992); Milligan et al., 9 juillet 1993, J. Med. Chem. 36(14):1923-1937; Anti-sense Research and Applications
[Recherche et Applications dans le domaine de l'anti-
sens] (1993, CRC Press), dans sa totalité et plus particulièrement le chapitre 15 de Sanghvi, intitulé "Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisens oligonucleotides" [Modifications de bases hétérocycliques dans des acides nucléiques et leurs applications dans des oligonucléotides anti-sens]; Antisense Therapeutics, de Sudhir Agrawal (Humana Press, Totowa, New Jersey,
1996).
D) MARQUAGE D'ACIDES NUCLEIQUES
Il est souvent utile de marquer les acides nucléiques de l'invention, par exemple, lorsque les oligonucléotides de type hTRT ou d'autres oligonucléotides ou des polynucléotides doivent être utilisés à titre de sondes formées par des acides nucléiques. Les marques (voir ci-après) peuvent être incorporées par n'importe lequel d'un certain nombre de moyens bien connus de l'homme du métier. Dans une forme de réalisation, un acide nucléique non amplifié (par exemple ARNm, du poly ARMm, ADNc) est marqué. Des moyens pour produire les acides nucléiques marqués sont bien connus de l'homme du métier et ils comprennent, par exemple, une translation de coupure, le marquage par une amorce aléatoire, le marquage d'extrémité (en utilisant par exemple une kinase) et une conjugaison chimique (par exemple de la photobiotinylation) ou de la synthèse. Dans une autre forme de réalisation, la marque est simultanément incorporée au cours d'une étape d'amplification lors de la préparation des acides nucléiques simples. Ainsi, par exemple, des procédés de réaction en chaîne par polymérase (RCP) ou un autre procédé d'amplification d'acide nucléique avec des amorces marquées ou avec des nucléotides marqués va fournir un produit d'amplification marqué. Dans une autre forme de réalisation, une amplification avec transcription utilisant un nucléotide marqué (par exemple UTP et/ou CTP marqué par la fluorescéine)
incorpore une marque aux acides nucléiques transcrits.
Un produit d'amplification peut également, ou en variante, être marqué après achèvement de
l'amplification.
E) EXEMPLE ILLUSTRATIF D'OLIGONUCLEOTIDES
Comme noté ci-dessus et étudié en détail ci-après, on utilise des oligonucléotides pour diverses utilisations, ce qui comprend le rôle d'amorces, de sondes, d'oligonucléotides thérapeutiques ou d'autres oligonucléotides anti-sens, d'oligonucléotides en triplex et de nombreuses autres utilisations qui apparaîtront à l'étude du présent exposé. Le tableau 2
fournit certains exemples illustratifs d'oligo-
nucléotides spécifiques pouvant servir dans la pratique de l'invention. On comprendra que de nombreux autres oligonucléotides utiles, de l'invention, peuvent être synthétisés par un homme du métier qui suit les règles
de guidage ici présentées.
Sur le tableau 2, "seq" signifie que l'amorce a servi, ou est utile, pour du séquençage; "RCP" signifie que l'amorce a servi, ou est utile, pour de la RCP; "AS" signifie que l'amorce a servi, ou est utile, pour une inhibition anti-sens d'activité de télomérase; "CL" signifie que l'amorce a servi, ou est utile, dans des régions de clonage de gènes de type hTRT ou d'ARN; "mut" signifie que l'amorce a servi, ou est utile, pour la construction de mutants de gènes de type hTRT ou de produits de type gène ou dérivant de gènes. "Maj" signifie des "lettres majuscules" et "min" signifie des "lettres minuscules". Des absences de correspondances et des insertions (relativement à la "SEQUENCE ID N 1") sont indiquées par soulignement; des délétions sont indiquées par un "-". On comprendra que, dans le tableau 2, rien n'est destiné à limiter l'utilisation de n'importe quel oligonucléotide particulier à une utilisation unique seulement ou un groupe
d'utilisations particulières.
IALEA U 2
OLIGONUCI.LOTIDES UTIL.ES
IJtilisatiorn Amnorce 5'-séqulence-3' Notes Correspondalcc?* _ePCFRAS!CL MiiT' TCPi I GIGAAG(iGCAC'ITTI'CAG(iCC x x TCPI 2 GI GGA'GAN-rC_(T'G'l'(3G x x TCPI 4 CTGGACAC('A(r(CAG(CCC 1TCG x x TCPI 5 GCAGG(iTGTGCCI'GGACACT x x TCPI 6 T-FI'GATGATGCT'GGC(cGAG x x TCPI 7 G(iGGCTCGTCY'CTACAGG Y x x TCPI 8 CAGCAGGAGGATCTT''G'I AGC x x TCPI 9 TGACCCCACGGA3TGGC.ACG( x x TCPI 10 TCAAGCT(iACTCGGAC ACCG x x TCPI 11 CGGCGT'(ACAGCi(iC'I'((GC x x TCPI 12 GCTCGAAGGCTrGGAGT(TCC x x TCP I 13TAGT'CCAI'GTTCACAjA\'[CG x x TCPI 14 C'GI GC'TG(GCCTGG'jACGATA x x TCPI 15 CCGTGGGT(i(i3(AGGTCAGGT'G x x TCPI 16 TT'TCCG'TCT1'GAGTG'TFC x x TCPI 17 GTCACCGTG'G'[TGCGCAGG x x TCPI 19 (CTACPCTGCC(CAACAC((iG x x TCPI 20 GC GCGAAGAACGIG('TG;G x x TCPI 21 CACTGC'TCC Fr'GTCGCCTC Y x x TCPI 22 TTCCCAA(iGAClI-FG'VIq'(!C x x TCPI 24 TGTTCCTCAAGACG(CACI'G Y x x TCPI 25 TACTGCGTGC'GTC(G I'A FG x x TCPI 26 GGTCiGC'G('(iG(CTGAAG''(ilG x x TCPI1 27TGGi'CACCTGCT(GCACG x x PO
TCPI 28 G'I GGiI'CT'('i'(i'liG[GC x x -
TCPI 29 GACAC(CA(AC'AGAAA(C('AC x x
TCPI 30 G'IGCCA(i(CAG(G'(FGAACC'AU x x "-
TCPI 3213GCA(iT(CG'C'I-[GAGGAGC x x TCPI 33 TGGAAC1CA'1AGCG rCAGGGAG x x TCPI 34 GCCCTCCC(F(GAC('I'A'3GTT x x
TABLEAU 2.
(suite) TCPI.35 CC'(GT)C(GGCGCCTGCCACTCA(G x x TCP1I.35t GCTC'G(iCGCTGCCACTCACG TCPI.36 AC'G(C(iAGACCAAGCAC]r'C x x TCPI.38 CCAAA(GAGG TiGGC 'I CTTCG x x TCPI.39 AAG(iCCAGC ACGTi'C'I-I'CGC x x TCPI.40 CAC(iT'C(IT(iC(iGCGCCTC x x TCP1.41 CCTI CACCA(CCAGCG I'GCG x x TCPI.42 GGCG(ACGACGTGCT(GTC' x x TCPI1.43 G(GCTCAGi(GGGCACCGCCAC( x x TCPI.44 CIGGCG(iCiGTGTACG(iC'ITC x x TCPI.45 GCGTGG(ACCG'AGJGAC(CGGGTrT( x x TCPI.46 GAC(TGG''G3CCGC(iATGTG''G(i x x TCPI 47 GAAG(TT(CTCCG r3CCCAAGAG x x TCPI1. 48GACAC('ACACAGAAACCA('CGi(TCAC x x TCPI.49 CGCCC(C-C(CT.-C('GCCAGGT' xx TCPI1. 50CCiAAG(CGiAAGC'C/CAG(ACGFTCT' x x TCPI 51 GCGT(iGCCC('G,GTGC1 GCAGA(GG x x TCPI.52 G'AG(CTGC('GCACGC(TGCTGGTGAAGi x x TCPI.53 TGG(;C(iAt'CGACG'I GC('TCG'I'C(A x x TCPI.54 TATCG'-C('CAGG(CCCGTCGCA CC x x TCPI.55 CCA(iCTGCGCCTAC-CAG(iGTGTG(' x x TCPI 56 GC(CCTCCC(T(iACGCTATGGTICCA(i x x TCPI1.57GGT(;C-G(CCGC'IGGCCA.CG(il-I'CG( x x TCP1.58 TCCC A(;G( CACGCACACCAGG(CAC'r x x TCP1.59 GTACA(iGGiC AACCTFFGCTCA(CI(TC x x TCPI.60 TCGAC(A(2GTAACACAC'ICATCAGC(' x x TCPI.61 AGCC(IGCACACCT' C( CiG-.?A('TCiGC x x TCPI.62 CCACCAG(T('C'ITCAGGCAGCGGA('AC( x x TCPI.63 CCA(iGG(C'FT(CCCACGTGCCCAGC(A(3 x x TCPI.64 CCiCAC(iAAC3TGGCC A(CG(GCAGCA x x TCPI.65 TG ACCGTGG'FrTCTGTGFGGTGT x x TCP1 66 CCCTC'I'rCAAG.'GCT'rGCTGAFICC x x TCF'1.67A'TCGCGG(i(CCACCAC('GTCCC T x x TCPI.68 TGCCTI'CCA(;ACAC'ICGC'K'CCGT'A(;A,\ x x
TABLEAU 2
(suite') TCPI 69 AC GAA(iCC('G'lACACC'I'GCC' x x TCPI 72 CcACA'AlCc(CTGCq;rFC'rf&T'C3Ci'Tr C x TCPI 73 CACTGCT(iGGCCTCAFriCAGGG x x TCPI 74 GCGACAr(GAGGAACAA(iC x x TCPI 75 GCAGCC('ATACTCA3GGACAC
x x TCP1 76 CCATCCTCCI'CACiGCTGCTC' x x TCPI 77 GCGAT(iACCTCCG I'GAGCCTGC x x TCP1 78 CC CAG(GiACA'GGCTCACGGit. x x bilITC'PICCTCTICAA(iT(iC'GTCT'GATI'CC x x bilITCP2 CAG('TCGAC(3ACGT'rACACAC'I'CA''TC( x x billTCP4 CTGACG(iT('CAGAC [CCGCTTCA'r x x biI1TCP6 ACCTT1'C'TTCC('ATGTC(GCCtG AG x x rp:rin/O lGACC('T(AGCAGCT'C(,AC GA/C(I'ACACAC TICAT'C x x Lt I GCGTCC'(GAGCTG(3C I'C,GG1 C x x Lt2 ACGCAC(iC'FGAACAG (iGCCIT x x Lt3 GACC(T(iA(iCAGCTCGAC GAC x x Lt4 AACGiCACT'rG'r(CAGCCGI GCT x x Lt5 CC,G(_C(CAGTCi',Z1TGG TACiCAA Y x x Lt6 CGGATGAA(GCGGACGrTCTGA x x BamHI Lt7ATGiATCCGTCGTCG(T('GAGCG'CAGG('r(TCT Baml i site Y x x SaIlLt8 Al CACKTGAGCCGCIcTGAAC/AGTGCC'-C F1vu I site (nct Sal I) Y x x K303 GTCTClCCGT'(iACATAAAAGAAA(iAC x x K304 GCCAAtGT'CCTGCAC GGCT x x K305 GC'C'TGI-rCT-rTI'G/AAGGTGGTCT x x K306 X:XGC(CTG'rTCTYI'GAAACGTGCGI'TCT 'X = biotin, = K305 x x K3 11i GTCAA(GATGCCTGGAAGA/AiC x x K312 TGCITA G(CTI'GTG(iGGiGTGTCA x x K313 TGC1TAGCTFI'GTG(KiG3GTGTCA x x K320 GC'TGC(iTC(C'TGCTGCGCACGT' x x K321 CAGC(Cj(iGGAGCCCCG('GG3CATC x x K322 TGG;GCCAC(CAGCGCC CG(GAAA x x slanti. ICCG(_(CAGCC-CGICAG CTT'GGG(iGC Y x x slanti.2 CCGACiG(_('TCCC'GCACrCT(:CCACC(C Y x x slanti. 3CCrTACACAC'CAT(AZ iCCAG C AG'GAúACT rGGC x x
TA BLE-A U 2
suite) slanti.4 CCC(iCC(C(]C'ICGf'AGTTGA GCA(CGCT(}AAC AGTGCCT'C x x slanti.5 GCG(iAC3TC'TG(GAC(i'G1 CAGCAG (GCC(i(iC'll(CCCG x x UTi1R2 A1TTGACCCACAG'GGCACCCCCAI'CCAG(' x x FW5 A'I GAC(G('CCTCC'TCiTGAG x x Nam I GCCACCCC(CGCGA'GCC x x Nam2 A G CCCTGGCC'CCGGCCA x x Nam3 TCCCAC'(il'GG('C('A,3GCAG x x Nam4 AGCA(GGAC(}CA(C ((CT(; x x PE0 1 CC,C(i('l'A(il't iGCT(iCGCA(iCAG(JGAG(C(iCAC(GC x x PE02 CCA(C;G('l-C('CACC'lGTlCGC A(iCAGG(ACGCAGCGC x LMl]l0I C1 AiGI'CTAGATCATG('AG(GTAATCTTCGAACATCGlA Site] de Xba/inarqueur IIAJh''RT TGCG{;TA/(Gi''CCAG(A' GGiTC- T[GAAGTC c n rGliRN121 LMN1103 TACCA1T(iGCTACCC\TACGA CG'ICCAGA T'I'\CGCfCA Insertion d'un marqueutr IIA dans un site N de 1 à l'extrtSmité 5' de hTRRF LMNI104 TATC A(iC(7'1YFCTA'[C AACGI'C(iTAT(;GG'AGCCCATGG Annc:lage sur LMI 03l
LMI105 GIGl'A(CG'.-C(Gl(TGAG(CT'CCTCACG'lC''(i(GCC'[T-r] Modification=F5i59A.
A'I'GICACGGAG (pheala) LMI106 G1 G1'ACG'.C(iTC(GAG(CTCCTCAC,(i'TCTI'C(iCT'VATGTT( Modification=F5S(OA AC G(AX iGA ACC (phe>ala) LM 107 CC TC A( iG('C'.-rF'C'l-FI'G('T((CACGGA(IA, CAA('CG '[T? Mod tfication= Y565 1 A CAA.AGAACAG (t r>ala) LN108 GGTCT'I'C1'TLIAl'C(iCG(GAGACAAC(GI]'I' Mvodificationi=T5i3A CAA.tA(iAA\CAG (tir>ala) LM[109 C'TTC1TI' I'A'FGTCAC (i(;C(GACA.CGT'FFCAAAA(AACA Modification=E5(cMA LMI FFYT A1 GAGTG''GTACGI'CG'TCGAGCTCCTC(A(GTCT'rACCAC(G Délé.ionr dc: FI'YVTIE CAAAAGAACAGGC T'C'F TI-TC (aa 559-5(4) TCPO01: G(Cl'GA(iT(iAGTGiTGGTIACGTC(GTCG(A (omplment de TCPI.61 Il UrNI):AC G'l'C('lC'CGrTiACA'AAAAGAA pour mot: f DD, conçu pour tut)
annelge eéventuel sur mTRT (.
HIUMO)2: AGTCiGlC]TITAT( i'lAC( iA pour mot f DD, conçu pour unl J annelage éventuel suru' mIR
-rUM'Z3:CACAGtCCCCC3TC(GCCTiG'lGGC conçu Foulr urn annelagc é6enluel.
sur mrRT
TAH I.EAI 2
(suite) HIrM(4: CCGAi('TC'IGGACG'lCA(.,CAGGGC conçu pour un aniielege éve:ntutel sur mTRTI SLWFIN c gggatCecgtaactaaaATGCC(iCGCGCTCCCC(C'l'IGC pour fusion de GSF (:'82 à 163,5) UC=séquenoe hlRr; mni sate Bainlll + 2 codons d'arnêt SLW-IC ccç.auttc ttggttact'.aCAAA(iAGG'FG3GCl-FC'F FCGGC pour la lfusicn de GST (782 à 1636) IJC=squen:e hTTl; lmi=site BaminlIl amplifier un fragment de 893 nt +3 codons c'aniêt SLIW 3IM/SI, W FIC de pGRN121 (782 a 1636) SLWF2N cçcggZitcLtatiactaaaGC CA.C(T(1i(1',(iGiAG3(GTGCcCr Construction par fusion pour GST 51625 à 2458) UC =séquence hTRT lc = site BAMIII + 2 codons d'arrêt SLWE2C ccçgLttcgM]tt!actaA(iACCT(iAG(CAGCTCGACGAC Construction par fusion pour GST (1625 à 2458) UC = séquence hTRT, lc = site EcoR 1 + 3 codons d'arrêt SLWf 3N cgiggSttccgtaactaaaA'l GAG- I'G-G'ACGC('(i'3TC'CGAC, pour fusion de GST (2426 à 3274) SLWF 3C ccggattcgttagttact'aGA'l CC CCT(;GCAC( ( ACG UC(=siquencede hTRT; min=slte O BamnIll = 2 zodons d'arrêt pour fusion d(le GSTl (2426 à 3274) UC=s4quen:e de hTRT'; min=site EcoR I + 3 codons d'arrêt SLWF4N cgçgg!itcgtgactaaaAICCCG(CAG(iGCTCCAT'rCCTC pour fusion de GST (3272 à 4177) UC=s,.quence de hTRT; mini=stte Baml1 I + 2 codons d'arrêt SL W F4C ccú gFttcgtg!gtact.aG'l'CCA GG(A'rGGTC'G aAG'lIC pour fusion de GST (3272 à 4177) UC=squence de hlRT; rmini=site EcooR.I -- 3 codon: d&.aTit -60 GGCATCG G(i(iGGú, (iGCCG(G phosphorcthioate x 260-23() G(;AA(AC'['(iGCGGAPG(i(iAGG((G phosphorcthioate x 1 500-520 GCGT('CAGCAGG'( AAC(CAG pho sphorc.thioate x.1 770-790 C'CA G(iG( ICA(GCG(C( A('G(CT phosphorcthioate x" 885-90)5 AGGTGGC'IT C ((C GCC phoGphorcthioate x1 1000-1020 GGACAAGGCGTG'I Cl CAG(iGGA pho phorcthioati x 1300- 1320 GCTGG(CiT G'l'GACCGCA (i(l'CTCGC( pho sphorc thioate x
TABLEAU 2
(suite) 1520-1540 GATGAAC-I'C(TTG(GGTG('lTCCT phosphorothioate x 21102130 GTGCGC(CAG(GCCC I'(IGTGGATA phosphorothioate x 2295-2315 GCCCATGGGCCrGCCTTCTGGA phospjihorothioate x 2450-24X0 GAGGC CACTGCTGGCCTCATI phosphorothioate x 1670-26S0 GGGTGAGGTGAGCTGTCCA(CCA phosphorothioate x 3080- 3110GC TGCGC(ACACA rGCG TCAA(CCTGTA CC,C phosphorothioate x 3140-3160 GA. CCGC(iA&G3AAAAAT(;rT(iGG( phosphorothioate x 369)0- 3710CCGAG('GCCAGCCTGTGGG(iGA phosphorothioate x -.75 CAGCGGG<GAGCGC GCGG(CATC phosphorothioate x 151-1'71 CAGCAC(CTC(CG(G FA(TjGCTC phosphorothioate x TP1. I TCAAGC'C/AACCTGAATCTGA( x TPI.2 CCCCGA(TGAATCT ff'nrAC'D 3C x TP'1.3 GICIC'ICKi;C/GTT', 'C('(A'rC('CCC x TPI.4 T'TAGC CAT('CTCCC3AGCACA
x
IV. PROTEINES ET PEPTIDES DE TYPE TRT
A) GENERALITES
L'invention propose des protéines de type hTRT très diverses, utiles notamment pour la production d'une activité de télomérase, une inhibition de l'activité de télomérase dans une cellule, l'induction d'une réponse immunitaire anti-hTRT, comme réactif thérapeutique, comme produit standard ou témoin dans un essai de dosage pour diagnostic, comme cible dans un dépistage destiné à sélectionner des composés capables d'activation ou d'inhibition d'une activité de hTRT ou de télomérase, et pour de nombreuses autres utilisations qui apparaîtront à l'homme du métier ou qui sont par ailleurs ici décrites. Les hTRT de l'invention comprennent des protéines fonctionnellement actives (utiles, par exemple pour conférer de l'activité de télomérase dans une cellule ne comportant pas d'activité de télomérase) et des variants, des variants inactifs (utiles par exemple pour inhiber l'activité de télomérase dans une cellule), des polypeptides de type hTRT et des RNP (ribonucléoprotéines) de télomérase (par exemple des complexes de ribonucléoprotéine comprenant les protéines) qui présentent une, plusieurs ou la totalité des activités fonctionnelles de hTRT naturelles et de télomérase, comme étudié plus en détail à des fins
illustratives ci-après.
Dans une forme de réalisation, la protéine de type hTRT de l'invention est un polypeptide ayant une séquence telle qu'indiquée sur la figure 17 ("SEQUENCE ID N 2") ou un fragment de cette séquence. Dans une autre forme de réalisation, le polypeptide du type hTRT diffère de la "SEQUENCE ID N 2" par des délétions internes, des insertions ou des substitutions conservatoires de restes d'aminoacides. Dans une forme apparentée de réalisation, l'invention propose des polypeptides de type hTRT ayant une forte ressemblance à de la "SEQUENCE ID N 2". L'invention propose en outre des polypeptides de type hTRT qui sont modifiés, par rapport à la séquence des aminoacides de la "SEQUENCE ID N 2", d'une certaine manière, par exemple par troncature, mutation, production de dérivés ou fixation par fusion sur d'autres séquences (par exemple pour former une protéine de fusion). En outre, la présente invention propose des ribonucléoprotéines de type télomérase comprenant une protéine de type hTRT de l'invention complexée avec un ARN formant gabarit ou matrice (par exemple hTR). Dans l'autre forme de réalisation, une ou plusieurs protéines associées à la télomérase est ou sont associées à de la protéine de
type hTRT et/ou à hTR.
L'invention propose également d'autres espèces de type hTRT naturelles ou des variantes non naturelles, comme des protéines ayant la séquence ou étant fortement similaires à la "SEQUENCE ID N 5" [Figure ], à la SEQUENCE ID N 10 [Figure 19] et des fragments, des variants ou des dérivés de ces séquences. L'invention propose encore d'autres espèces hTRT et leurs variants. Un exemple d'un variant hTRT peut résulter du décalage ou de la mutation du cadre de lecture de ribosome de l'ARNm codé par le clone 712562 ("SEQUENCE ID N 3 [Figure 18]) ou la hTRT variante pro90 présentée dans la "SEQUENCE ID N 4" Figure 20] et cela peut aboutir à la synthèse de polypeptides de type hTRT contenant la totalité des motifs TRT (pour un exemple général, voir, par exemple, Tsuchihashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2516; Craigengen et al., 1987, Cell 50:1, Weiss, 1990, Cell 62:117). Le décalage de lecture du cadre de ribosome peut se produire quand des structures d'ARNm spécifiques ou des structures secondaires obligent le ribosome à "s'arrêter" et à enjamber un nucléotide vers l'avant ou vers l'arrière dans la séquence. Ainsi, un cas de décalage de lecture de cadre de ribosome sur l'ARNm 712562 risque de provoquer la synthèse d'un polypeptide comportant environ 523 restes d'aminoacides. Un cas de décalage de lecture de ribosome sur la séquence pro90 risque d'aboutir à une protéine comportant environ 1071 restes. On comprendra que des protéines résultant de décalage de lecture de cadre de ribosome peuvent également être exprimées par des techniques de synthèse
ou de recombinaison proposés par l'invention.
On peut obtenir des protéines de type TRT humaines, des peptides et des protéines qui en sont des équivalents fonctionnels, par purification, par synthèse chimique ou par production de recombinant(s),
comme étudié plus en détail ci-après.
B) ACTIVITES DES PROTEINES DE TYPE TRT
Les polypeptides de type TRT de l'invention (ce qui comprend des fragments, des variants, des produits d'allèles alternatifs et des protéines de fusion) peuvent comporter une ou plusieurs ou la totalité des
activités fonctionnelles associées à de la hTRT native.
Sauf ce qui est noté, comme utilisé ici, hTRT ou un autre polypeptide de type TRT est considéré comme ayant une activité spécifiée si l'activité est présentée par la protéine de type hTRT sans ARN associé (par exemple hTR) ou dans un complexe d'ARN associé à hTRT (par exemple hTR). L'activité de liaison de hTR caractérisant hTRT est un exemple de l'activité associée à la protéine de type hTRT. Des procédés pour produire des complexes d'acides nucléiques (par exemple hTR) et des polypeptides de type hTRT de l'invention
sont décrits ci-après.
Une modification de la protéine hTRT (par exemple par des moyens chimiques ou l'utilisation de recombinants, ce qui comprend une mutation ou une modification d'un polynucléotide codant pour le polypeptide hTRT, ou la synthèse chimique d'un polynucléotide ayant une séquence différente de la séquence d'un polynucléotide natif), en vue d'obtenir un complément d'activités différent d'une hTRT native peut être utile dans des applications thérapeutiques ou dans une recherche de dépistage de modulateurs spécifiques d'une activité de hTRT ou de télomérase. En outre, des compositions pour des essais de recherche et des dosages de diverses activités de type hTRT peuvent être particulièrement utiles pour l'identification d'agents (par exemple des agents de modulation d'activité) qui intéragissent avec une hTRT ou une
* télomérase pour modifier l'activité de télomérase.
Les activités de la hTRT native, comme étudié ci-après, comprennent une activité catalytique de télomérase (qui peut être une activité opératoire ou non opératoire); une activité opératoire de télomérase; une activité traditionnelle de transcriptase reverse; une activité nucléolytique; une activité de liaison d'amorce ou de substrat (substrat ou amorce de télomère ou de télomérase synthétique); une activité de liaison, de fixation de dNTP (nucléoside triphosphotase); une activité de liaison d'ARN (c'est-à-dire de hTR); et une activité de liaison de protéine (par exemple la liaision de fixation sur des protéines associées à de la télomérase, des protéines de liaison de fixation de télomère ou sur un complexe protéine/ADN télomère). On comprendra, cependant, que la présente invention propose également des compositions de type hTRT dépourvues de toute activité de hTRT particulière mais comportant une certaine activité utile apparentée à celle de protéines de type hTRT ou d'autres protéines de TRT (par exemple certains peptides immunogènes typiquement courts, des peptides inhibiteurs).
1. ACTIVITE CATALYTIQUE DE TELOMERASE
Tel qu'utilisé ici un polypeptide de l'invention possède une "activité catalytique de télomérase" quand le polypeptide est capable d'étendre une amorce d'ADN jouant le rôle d'un substrat de télomérase en ajoutant une répétition partielle, une, ou plus d'une répétition d'une séquence (par exemple TTAGGG) codée par un acide nucléique à rôle de matrice (par exemple hTR). Cette activité peut être opératoire et répétitive ou bien non répétitive. Une activité répétitive se produit lorsqu'une RNP de télomérase ajoute de multiples répétitions à une amorce ou à une télomérase avant le dégagement de libération de l'ADN par le complexe comportant l'enzyme. Une activité non répétitive se produit lorsqu'une télomérase ajoute une répétition partielle, ou une seule répétition, sur une amorce et
est ensuite libérée "In vivo" [chez l'être vivant].
Cependant, une réaction non répétitive pourrait ajouter de nombreuses répétitions par des opérations successives d'association, d'extension et de dissociation. Cela peut se produire "in vitro" aussi bien, mais ce n'est pas typiquement observé dans des dosages typiques, en raison du très grand excès molaire d'amorce par rapport à la télomérase dans des
conditions d'un dosage standardisé.
Pour caractériser un polypeptide de type hTRT comme ayant une activité non répétitive, on effectue une réaction traditionnelle de télomérase en utilisant des conditions favorisant une réaction non répétitive, par exemple des températures élevées (c'est-à-dire 35 à C, typiquement 37 C), de faibles concentrations de dGTP (égales ou inférieures à 1 iM), des concentrations élevées en de l'amorce (égales ou supérieures à 5 AM), et des concentrations élevées de dATP/TTP (égales ou supérieures à 2 mM), la température et la concentration de dGTP ayant typiquement le plus grand effet. Pour caractériser un polypeptide de type hTRT comme ayant une activité répétitive, on effectue une réaction de télomérase traditionnelle en utilisant des conditions qui favorisent une réaction répétitive (par exemple 27 à 34 C, typiquement 30 C), une concentration élevée en dGTP (égale ou supérieure à 10 AM), une faible concentration en de l'amorce (égale ou inférieure à 1 AM), et/ou une faible concentration en dATP et en TTP (0,3 à 1 mM), la température et la concentration de dGTP ayant typiquement l'effet le plus critique. En variante, on peut utiliser un essai de recherche ou de dosage de type TRAP (pour déceler une activité répétitive ou modérément répétitive) ou les essais de recherche et de dosage de type double capture sur nitrocellulose ("dot-blot") et sur gel ("gel-blot") (pour déceler une activité répétitive). Le polypeptide de type hTRT de l'invention peut posséder une activité non répétitive, mais non pas une activité répétitive (par exemple si une altération du polypeptide hTRT diminue ou élimine l'aptitude à une translocation), il peut être seulement répétitif ou bien il peut posséder
les deux types d'activités.
a) Activité non répétitive Une activité catalytique de télomérase non répétitive peut étendre l'amorce d'ADN depuis la position dans laquelle l'extrémité 3' se fixe par annelage sur la matrice d'ARN jusqu'à l'extrémité 5' de la séquence de matrice, ce qui se termine typiquement par l'addition du premier reste G (comme, par exemple, lorsque la matrice est hTR). Comme montré sur le tableau 3, le nombre exact de nucléotides fixés par addition dépend de la position des nucléotides terminaux en 3' de l'amorce dans la séquence répétée
TTAGGG.
TABLEAU 3
nrT, Irrlli4 X{>i nRE rL rm TT,v i) --TTAGGGttag (ADN)
3' ----AUCCCAAUC--------5' (ARN)
ii) ---------TTAGggttag (ADN)
3'----AUCCCAAUC--------5' (ARN)
Dans ADN, UC = amorce; Ic = nucléotides ajoutés Ainsi, 4 nucléotides sont fixés par addition sur l'amorce --TTAGGG (i), cependant que 6 nucléotides sont fixés par addition sur l'amorce --TTAG (ii). La première répétition ajoutée par la télomérase dans une réaction répétitive équivaut à cette étape; cependant, dans une réaction répétitive, la télomérase effectue une étape de translocation dans laquelle l'extrémité 3' est libérée et refixée sur la région 3' de la matrice en une position suffisante pour une addition d'un autre
motif répété (voir Morin, 1997, Eur. J. Cancer 33:750).
Une réaction entièrement non répétitive ne produit qu'une bande dans un essai de dosage et de recherche traditionnel quand on utilise une seule amorce synthétique. Puisque ce résultait pourrait également être produit par d'autres enzymes, comme dans le cas d'une activité de transférase terminale, il peut s'avérer souhaitable dans certaines applications de vérifier que le produit est bien le résultat d'une activité catalytique de télomérase. Une bande engendrée par de la télomérase (ce qui comprend hTRT) peut être distinguée par plusieurs caractéristiques supplémentaires. Le nombre de nucléotides fixés par addition sur l'extrémité de l'amorce doit bien correspondre à la position de l'extrémité 3' de l'amorce. Ainsi, une amorce de type --TTAGGG devrait comporter 4 nucléotides fixés par addition et une amorce de type --TTAG devrait comporter 6 nucléotides fixés par addition (voir ci- dessus). En pratique, on peut utiliser deux ou plusieurs amorces à séquences permutées, qui ont la même longueur globale mais des extrémités 5' et 3' différentes. Comme exemple illustratif, l'extension non répétitive des amorces '- TTAGGGTTAGGGTTAGGG et 5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG va engendrer des produits dont la longueur absolue présentera une différence d'un nucléotide (addition de 4 nucléotides sur 5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG pour une longueur totale de 22 nucléotides, et 5 nucléotides ajoutés sur 5'-GTTAGGGTTAGGGTTAGG pour une longueur totale de 23 nucléotides). La dépendance de la réaction par rapport aux nucléotides doit bien correspondre à la position de l'extrémité d'amorce. Ainsi, un produit obtenu à l'aide d'une amorce de type --TTAGGG exigerait dGTP, TTP et dATP, mais non pas dCTP, et un produit obtenu à l'aide d'une amorce de type --AGGGTT exigerait des dGTP et dATP, mais non pas TTP ou dCTP. L'activité doit être sensible à un prétraitement par de la RN-ase ou de la nucléase de microcoque (voir Morin, 1989, Cell 59:521) dans des conditions qui vont dégrader hTR et
éliminer ainsi la matrice.
b) Activité répétitive En pratique, une activité répétitive est facilement observée grâce à l'apparition d'une "échelle" de six nucléotides dans un essai de dosage ou de recherche traditionnel, dans un essai TRAP, ou dans un essai de type double capture sur gel. On peut également utiliser un essai de double capture de type "dot-blot", mais l'on ne décèle pas d'échelle dans une telle méthode. L'essai de recherche et de dosage traditionnel est décrit dans Morin, 1989, Cell 59:521, qui est incorporé ici dans sa totalité et à toutes fins
utiles. L'essai TRAP est décrit dans le brevet US-A-
5 629 154; voir également la publication PCT WO 97/15687, la publication PCT WO 95/13381; Krupp et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:919; et Wright et al., 1995, Nuc. Acids Res. 23:3794, chacun de ces textes étant incorporé ici dans sa totalité et à toutes fins utiles. L'essai de double capture de type dot-blot peut servir dans un format dans lequel une activité non répétitive, qui ne fixe pas par addition les 3 motifs répétés ou le plus grand nombre de motifs répétés nécessaires pour une hybridation stable de la sonde (CCCUAA)n servant à déceler l'activité, est testé avec des composés ou des variantes de type hTRT pour déterminer s'il y a la même génération d'une répétitivité, c'est-à-dire si la sonde décèle un substrat de télomérase attendu, puis le composant ou le mutant est alors capable de modifier l'activité non répétitive en donnant une activité répétitive. On peut également utiliser d'autres essais de détection d'une activité catalytique de télomérase répétitive, par exemple l'essai d'allongement par amplification en chaîne par polymérase (ACP) de Tatematsu et al., 1996, Oncogène 13:2265. L'essai de type "gel-blot", qui est une combinaison de l'essai traditionnel et de l'essai de type "dot blot", peut également servir. Dans cette variante opératoire, on effectue un essai traditionnel sans nucléotide radiomarqué et avec des concentrations élevées en dGTP (par exemple 0,1 à 2 mM). Après réalisation de l'essai traditionnel, on sépare par une opération PAGE dénaturante l'ADN ainsi obtenu par synthèse et on le transfère sur une membrane (par exemple en nitrocellulose). L'ADN télomère (le produit de télomérase amorce ou substrat étendu par télomérase) peut ensuite être décelé par des procédés comme une hybridation utilisant des sondes de type ADN télomère marqué (par exemple des sondes contenant la séquence CCCTAA, comme utilisée dans l'essai "dot blot", ci- dessus). Un avantage de cette technique est qu'elle est plus sensible que l'essai traditionnel et elle donne des informations concernant la taille des fragments obtenus par synthèse et le caractère
répétitif de la réaction.
c) Déterminations d'activité L'activité de télomérase d'un polypeptide de type hTRT peut être déterminée à l'aide d'un polypeptide de type hTRT non purifié, partiellement purifié ou quasi totalement purifié (par exemple en association avec hTR), "in vitro'!, ou après expression "in vivo". Par exemple, une activité de télomérase dans une cellule (par exemple une cellule exprimant un polypeptide hTRT recombinant de l'invention) peut être décelée et dosée par détection d'une augmentation ou d'une diminution de la longueur des télomères. Typiquement, on effectue des essais de détection d'une activité catalytique de télomérase en utilisant une hTRT complexée avec hTR; cependant, on peut utiliser à la place d'autres ARN formant matrice de télomérase, ou bien on peut conduire les essais pour mesurer une autre activité, comme la fixation télomérase-amorce. Des essais pour déterminer la longueur de télomères sont connus en pratique et comprennent une fixation par hybridation de sondes sur de l'ADN télomère (une étape d'amplification peut être incluse) et une analyse de FRT c'est-à-dire l'analyse de fragments de restriction d'ADN télomère après une digestion par endonucléase de restriction; voir les publications PCT WO 93/23572 et WO 96/41016; Counter et al., 1992, EMBO J. 11:1921; Allsopp et al., 1992, Proc. Nart'l. Acad. Sci. USA 89:10114; Sanno, 1996, Am. J. Clin. Pathol 106:16 et Sanno, 1997, Neuroendocrinology :299. L'activité catalytique de télomérase d'un polypeptide de type hTRT peut être déterminée d'un certain nombre de façons en utilisant les essais indiqués ci- dessus et d'autres essais de détermination de l'activité catalytique de télomérase. Selon un procédé, la protéine hTRT est exprimée (par exemple comme décrit ci-après) dans une cellule humaine ayant donné un résultat négatif de la recherche de
télomérase, dans laquelle hTR est exprimée (c'est-à-
dire normalement dans la cellule ou par expression de recombinant) et on détermine la présence ou l'absence d'activité de télomérase dans la cellule ou dans le lysat de cellule. Des exemples de cellules convenables donnant un résultat négatif à la recherche de la télomérase sont des cellules IMR 90 (ATCC, n CCL-186) ou des cellules BJ (lignée de fibroblastes de prépuce humain; voir par exemple Feng et al., 1995, Science 269:1236). D'autres exemples comprennent des cellules épithéliales pigmentées de la rétine (EPR), des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (CEVUH; ATCC n CRL-1730), des cellules endothéliales d'aorte humaine (CEAH; Clonetics Corp, n CC-2535) et des cellules épithéliales mammaires humaines (EMH; Hammond et al., 1984, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5435; Sampfer, 1985, J. Tissue Culture Methods 9:107). Dans une autre forme de réalisation, le polypeptide de type hTRT est exprimé (par exemple par transfection avec un vecteur d'expression de hTRT) dans une cellule positive à l'essai de recherche de télomérase, et l'on décèle une augmentation d'activité de télomérase dans la cellule, en comparaison d'une cellule témoin non transfectée, si le polypeptide a une activité catalytique de télomérase. Habituellement, l'activité catalytique de télomérase dans une cellule transfectée par un vecteur d'expression convenable exprimant hTRT va être nettement augmentée, par exemple environ 2 fois au moins, au moins environ 5 fois ou même au moins environ 10 fois à 100 fois ou même 1000 fois supérieure à ce qui existe dans les cellules
(témoin) non transfectées.
Dans une autre forme de réalisation en variante, la protéine hTRT est exprimée dans une cellule (par exemple une cellule négative à l'essai de recherche de télomérase et dans laquelle hTR est exprimée) sous forme d'une protéine de fusion (voir ci-après) ayant une marque ou une "étiquette d'épitope" pour faciliter la purification. Dans une forme de réalisation, la RNP (ribonucléoprotéine) est récupérée à partir de la cellule à l'aide d'un anticorps qui reconnaît spécifiquement la marque. Les marques préférées sont typiquement courtes ou petites et elles peuvent comprendre un site de clivage ou une autre propriété permettant d'enlever la marque du polypeptide hTRT. Des exemples de marques convenables comprennent l'épitope "XpressTMI (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) et d'autres fragments que l'on peut spécifiquement fixer à l'aide d'un anticorps ou d'un acide nucléique ou d'un autre
procédé équivalent comme ceux décrits dans l'exemple 6.
D'autres marques comprennent celles introduites par codage par des séquences insérées, par exemple dans la "SEQUENCE ID N 1" en amont du codon ATG qui amorce une translation de la protéine de la "SEQUENCE ID N 2", ce qui peut inclure l'insertion d'un nouveau codon
d'amorçage de méthionine dans la séquence en amont.
On comprendra que, lorsqu'un variant de hTRT est exprimé dans une cellule (par exemple sous forme d'une protéine de fusion) et est isolé par la suite (par exemple sous forme d'un complexe de ribonucléoprotéine), d'autres protéines cellulaires (c'est-à-dire des protéines associées à la télomérase) peuvent être associées (fixées directement ou indirectement sur) le complexe isolé. Dans de tels cas, il sera parfois intéressant de doser l'activité de télomérase pour rechercher et déceler le complexe
contenant hTRT, hTR et les protéines associées.
2) AUTRES ACTIVITES DE TELOMERASE OU DE PROTEINES
DE TYPE TRT
Des polypeptides de type hTRT de l'invention comprennent des variants dépourvus d'une activité catalytique de télomérase mais concernant une ou plusieurs autres activités de télomérase. Ces autres activités et les procédés de l'invention pour mesurer de telles activités comprennent (sans que cette liste soit limitative) ceux étudiés dans les sections qui suivent. a) Activité de transcriptase reverse traditionnelle Une activité de transcriptase reverse traditionnelle de télomérase est décrite, par exemple dans Morin, 1997, ci-dessus, et Spence et al., 1995, Science 267:988. Puisque hTRT contient des motifs aminoacides conservés, qui sont nécessaires pour une activité catalytique de transcriptase reverse, hTRT a la capacité de transcrire certains ARN exogènes (par exemple non-hTR). Un essai traditionnel de détection ou de mesure de RT mesure l'aptitude de l'enzyme à transcrire une matrice d'ARN par extension de l'amorce d'ADN annelée. Une activité de transcriptase reverse peut être mesurée de nombreuses façons connues en pratique, par exemple par la surveillance de l'augmentation de taille d'une amorce de type acide nucléique marqué (par exemple ARN ou ADN), ou par incorporation de dNTP marqué. Voir, par exemple,
Ausubel et al., ci-dessus.
Puisque hTRT se fixe spécifiquement par associations sur hTR, on peut comprendre que la matrice amorce d'ADN/ARN pour un essai traditionnel de recherche de RT peut être modifiée de façon à avoir les caractéristiques concernant hRT et/ou une amorce de type ADN télomère. Par exemple, l'ARN peut comporter la séquence (CCCTAA),, o n vaut au moins 1, ou au moins 3, ou au moins 10 ou davantage. Dans une forme de réalisation, la région de (CCCTAA)r. se trouve à l'extrémité 5' ou au voisinage de l'extrémité 5' de l'ARN (de façon semblable aux emplacements 5' de régions formant matrice dans des ARN de télomérase). De façon similaire, l'amorce de type ADN peut comporter une extrémité 3' contenant des portions de la séquence télomère TTAGGG, par exemple XrTTAG,XnAGGG, Xn(TTAGGG)qTTAG, etc., o X est une séquence non-télomère et n vaut 8 à 20 ou 6 à 30, et q vaut 1 à 4. Dans une autre forme de réalisation, l'amorce de type ADN comporte une extrémité 5' qui n'est pas complémentaire de la matrice ARN, de sorte que, lorsque l'amorce est fixée par annelage sur l'ARN, l'extrémité 5' de l'amorce demeure non liée. D'autres modifications d'essais normalisés de transcription reverse pouvant être appliquées au procédé de
l'invention sont connus en pratique.
b) Activité nucléolytique Une activité nucléolytique de télomérase est décrite, par exemple, dans Morin, 1997, ci-dessus; Collins and Grieder, 1993, Genes and Development 7:1364. La télomérase possède une activité nucléolytique (Joyce et Steitz, 1987, Trends Biochem. Sci. 12:288); cependant, une activité de télomérase possède des caractéristiques bien définies. Une télomérase enlève de préférence des nucléotides, habituellement un seul, de l'extrémité 3' d'un oligonucléotide lorsque l'extrémité 3' de l'ADN est placée à la limite 5' de la séquence formant matrice d'ADN, chez les êtres humains et Tetrahymena; ce nucléotide est le premier G de la répétition télomère (TTAGG chez les êtres humains). La télomérase enlève préférentiellement les restes G mais possède une
activité nucléolytique contre d'autres nucléotides.
Cette activité peut être surveillée. Deux procédés différents sont décrits ici à titre illustratif. Un procédé implique une réaction de télomérase traditionnelle avec une amorce qui fixe la totalité de la séquence formant matrice (c'est-à-dire avec terminaison à la limite de la matrice; 5'-TAGGGATTAG chez les êtres humains). Une activité nucléolytique est observée par surveillance du remplacement du dernier reste dG par un restedGTP radiomarqué fourni dans la composition d'essai. Le remplacement est surveillé par l'apparition d'une bande ayant la taille de l'amorce de départ, comme montré par électrophorèse sur gel et par
autoradiographie.
Un procédé préféré utilise une amorce de type ADN et comporte une extrémité 3' "bloquée" qui ne peut être étendue par la télomérase. L'amorce bloquée en 3' peut servir dans un essai normalisé de recherche ou de mesure de télomérase, mais elle ne peut être étendue, à moins que le nucléotide 3' soit enlevé par l'activité nucléolytique de télomérase. L'avantage de ce procédé consiste en ce que l'activité de télomérase peut être surveillée par n'importe lequel des divers moyens classiques, et le signal est fort et facile à quantifier. Le blocage de l'extrémité 3' de l'amorce peut être réalisé de différentes façons. Un procédé consiste à ajouter un reste 3'- désoxy-dNTP sur l'extrémité 3' de l'amorce en utilisant des techniques traditionnelles de synthèse des oligonucléotides. Cette extrémité comporte un groupe OH en 2' mais non pas le
groupe OH en 3' nécessaire pour de la télomérase.
D'autres moyens de blocage de l'extrémité 3' existent, par exemple une extrémité de type 3'-didésoxy, une extrémité de type 3'-amine et d'autres. Un exemple d'une amorce pour un essai de dosage nucléolytique de hTRT est constitué par le fragment 5'-TTAGGGTTAGGGTTA (G3.H), dans lequel le dernier reste désigne un reste
3'-désoxy-guanosine (Glen Research, Sterling, VA).
L'homme du métier connaît, en se fondant sur l'exposé,
de nombreuses autres variantes d'une amorce convenable.
c) Activité de fixation d'amorce (télomère) Une activité de liaison ou de fixation d'amorce de télomérase (télomère) est décrite, par exemple, dans Morin 1997, ci-dessus; Collins et al., 1995, Cell 81:677; Harrington et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:8893. On pense que de la télomérase comporte deux sites qui fixent une amorce d'ADN télomère. Des motifs RT associés à la fixation d'amorce indiquent que hTRT et/ou hTRT/hTR possèdent une activité de fixation d'amorce ADN. Il existe plusieurs façons de tester une activité de liaison ou d'amorce; cependant, une étape commune à la plupart des procédés consiste en une incubation d'une amorce de type ADN marqué avec hTRT ou hTRT/hTR ou d'autres combinaisons de type TRT/TR, en opérant dans des conditions appropriées de liaison par fixation. De même, la plupart des procédés utilisent un moyen de séparer l'ADN non lié de l'ADN fixé à de la protéine; ces procédés comprennent les suivants: i) Essais de déplacement sur gel (également appelés essais de déplacement par électrophorèse/ mobilité): ce sont ceux dans lesquels une amorce de type ADN non fixée est séparée d'une amorce de type ADN fixée à la protéine, la séparation étant réalisée par électrophorèse sur un gel non dénaturant (Ausubel et
al., ci-dessus).
ii) Des essais de fixation de matrice comprennent plusieurs variantes de la technique de base, laquelle implique la fixation de la hTRT ou du complexe hTRT/hTR sur une matrice (par exemple de la nitrocellulose), avant ou après incubation avec l'amorce marquée. Par la fixation de hTRT sur une matrice, on peut mécaniquement séparer l'amorce non liée de l'amorce liée. De l'ADN résiduel non lié peut être enlevé par lavage de la membrane avant quantification. L'homme du métier admet qu'il existe plusieurs moyens de coupler des protéines avec de telles matrices, des supports solides et des membranes, ce qui comprend des interactions chimiques, photochimiques, une liaison dans l'ultraviolet, des méthodes anticorps/épitope, des méthodes non- covalentes
(hydrophobe, électrostatique, etc.).
L'amorce de type ADN peut être n'importe quel ADN ayant une activité pour de la télomérase, comme, par exemple, une amorce d'ADN télomère comme (TTAGGG),, o n peut valoir 1 à 10 et vaut typiquement 3 à 5. Les extrémités 3' et 5' peuvent se terminer en n'importe quelle position de la séquence répétée. L'amorce peut également comporter les extensions en 5' et 3' par de l'ADN non-télomère, ce qui peut facilier le marquage ou la détection. L'amorce peut également être soumise à la formation de dérivés, par exemple pour faciliter une
détection ou un isolement.
d) Activité de fixation de dNTP Une activité de fixation de dNTP de télomérase est décrite, par exemple, dans Morin, 1997, ci- dessus; Spence et al., ci-dessus. Une télomérase exige des dNTP pour effectuer la synthèse d'ADN. La protéine de type hTRT comporte une activité de liaison de nucléotide et peut être dosée pour déceler la liaison de dNTP, d'une manière semblable à d'autres protéines capables de lier des nucléotides (Kantrowitz et al., 1980, Trends Biochem. Sci. 5:124). Typiquement, une liaison de dNTP marqué ou d'un analogue de dNTP peut être surveillée comme cela est connu en pratique pour des protéines de
type RT non-télomérase.
e) Activité de liaison d'ARN (c'est-à-dire de hTR) Une activité de liaison d'ARN de télomérase (c'est-à-dire de hTR) est décrite, par exemple, dans Morin, 1997, ci-dessus; Harrington et al., 1997,
Science 275:973; Collins et al., 1995, Cell 81:677.
L'acEivité de liaison d'ARN d'une protéine de type TRT de l'invention peut être décelée d'une manière similaire à l'essai de détection d'une liaison d'amorce de type ADN que l'on décrit ci-dessus, en utilisant une sonde qui est de l'ARN marqué. Des procédés pour séparer de l'ARN lié d'avec l'ARN non lié et pour déceler l'ARN sont bien connus en pratique et ils peuvent être appliqués à des essais de détection de dosage d'activité de l'invention, d'une manière similaire à ce qui est décrit pour l'essai de détection ou de dosage de la liaison d'amorce de type ADN. L'ARN peut être de la hTR de pleine longueur, constituée de fragments de hTR ou d'autres ARN dont il est démontré qu'ils possèdent de l'activité pour de la télomérase ou pour de la hTRT. Voir le brevet US-A-5 583 016 et la
publication PCT n 96/40868.
3) MOTIFS DE TELOMERASE A TITRE DE CIBLES
La présente invention, comme noté ci-dessus, propose en plus de hTRT recombinant ayant un plein complément d'activité (comme décrit ci-dessus), des polypeptides de type hTRT ayant moins que la totalité des activités de complément de télomérase, de l0 télomérase naturelle ou hTRT ou d'autres protéines de type TRT. On comprendra, en tenant compte de l'exposé présenté ici concernant des motifs de type RT et des motifs spécifiques de télomérase de TRT, qu'une altération ou une mutation des restes aminoacides conservés, comme on en trouve dans les séquences de motifs étudiées ci-dessus, va aboutir à donner des mutants présentant une perte d'activité et qui sont utiles à des fins thérapeutiques, de recherche, de dépistage et de caractérisation de substances actives de médicament, et pour d'autres utilisations. Par exemple, comme décrit à l'exemple 1, une délétion de motifs B à D dans les domaines RT du gène de TRT endogène dans S. pombe a eu pour résultat l'obtention de cellules haploïdes dans lesquelles le télomère s'est progressivement raccourci jusqu'au point o une hybridation par fixation d'une sonde de télomère sur des motifs télomères répétés est devenue presque indécelable, indiquant une perte d'activité catalytique de télomérase. De façon similaire, des altérations du site WxGxS du motif E peuvent affecter la fixation de liaison, ou le rôle, de l'amorce de type ADN de télomérase. En outre, les altérations des aminoacides dans les motifs A, B' et C peuvent affecter l'activité catalytique de la télomérase. Une mutation du motif DD de hTRT peut diminuer fortement ou même abolir
l'activité de télomérase (voir l'exemple 16).
C) SYNTHESE DE HTRT ET D'AUTRES POLYPEPTIDES DE
TYPE TRT
L'invention propose divers procédés pour produire la hTRT et les autres polypeptides de type TRT ici révélés. Dans les sections qui suivent, on décrit de façon assez détaillée la synthèse chimique et l'expression par recombinant de protéines de type hTRT,
y compris des protéines de fusion.
1) SYNTHESE CHIMIQUE
L'invention propose des polypeptides de type hTRT synthétisés entièrement ou en partie, à l'aide de méthodes chimiques générales bien connues en pratique (voir, par exemple, Caruthers et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 215-223; et Horn et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 225-232). Par exemple, on peut effectuer une synthèse de peptides en utilisant diverses techniques en phase solide (Roberge et al., 1995, Science 269:202), ce qui comprend une synthèse automatisée (par exemple on utilise l'appareil de synthèse de peptides Perkin Elmer ABI 431A selon les instructions et le mode d'emploi fournis par le fabricant). Lorsqu'on désire obtenir une protéine de pleine longueur, on peut effectuer la fusion de polypeptides plus courts en réalisant une condensation des groupes amino terminaux d'une molécule avec des groupes carboxyle terminaux de l'autre molécule pour
former une liaison peptide.
Le peptide nouvellement synthétisé peut être fortement purifié, par exemple, par chromatographie de préparation de liquide à haute performance (par exemple Creighton, PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR
PRINCIPLES [PROTEINES, STRUCTURES ET PRINCIPES
MOLECULAIRES], WH Freeman and Ce, New York NY [1983].
La composition des peptides synthétiques (ou de n'importe quels autres peptides ou polypeptides de l'invention) peut être confirmée par une analyse des aminoacides ou par un séquençage (par exemple le mode opératoire de dégradation de Edman; Creighton, voir ci-dessus). Chose importante, la séquence des aminoacides de hTRT, ou n'importe quelle partie de cette molécule, peut être modifiée au cours d'une synthèse directe et/ou combinée à l'aide de méthodes chimiques avec des séquences provenant d'autres protéines ou, par ailleurs, ou avec n'importe quelle partie de cette séquence ou pour n'importe quel but, afin de produire un polypeptide variant selon
l'invention.
2) EXPRESSION DE RECOMBINANT DE hTRT ET
D'AUTRES PROTEINES DE TYPE TRT
La présente invention propose des méthodes, des réactifs, des vecteurs et des cellules pouvant utilement servir à l'expression de polypeptides de type hTRT et d'acides nucléiques, en utilisant des systèmes d'expression de recombinant "in vitro" (sans cellule), "ex vivo" ou "in vive" (opération effectuée à l'aide ou dans une cellule ou dans un organisme vivants). Dans une forme de réalisation, l'expression de la protéine de type hTRT, ou d'un fragment de cette protéine, comprend l'insertion de la séquence de codage dans un vecteur d'expression approprié (c'est-à-dire un vecteur qui contient les éléments nécessaires pour la transcription et la translation de la séquence de codage insérée, nécessaire pour le système d'expression que l'on utilise). Ainsi, dans un aspect, l'invention propose un polynucléotide dont la séquence est essentiellement identique à celle d'une séquence codant pour un gène de type hTRT comportant au moins 25 nucléotides et de préférence pour de nombreuses applications 50 à 100 nucléotides ou même davantage, des ADNc de type hTRT ou des gènes de l'invention, qui est fonctionnellement relié à un promoteur pour former une unité de transcription capable d'exprimer un polypeptide de type hTRT. On peut utiliser des procédés bien connus de l'homme du métier pour construire les vecteurs d'expression contenant une séquence de type hTRT et des témoins appropriés de transcription ou de translation fournis par la présente invention (voir, par exemple, Sambrook et al., ci-dessus, Ausubel et al.
ci-dessus, et le présent exposé).
Les polypeptides de type hTRT fournis par l'invention comprennent des protéines de fusion qui contiennent des polypeptides de type hTRT ou des fragments de la protéine hTRT. Les protéines de fusion sont typiquement produites par des moyens de recombinaison, bien qu'elles puissent egalement être obtenues par synthèse chimique. Les protéines de fusion peuvent utilement servir à fournir une expression amplifiée des constructions de polypeptide de type hTRT, ou pour la production de polypeptides de type hTRT ayant d'autres propriétés souhaitables, et comprenant par exemple une marque (comme un groupe rapporteur ou indicateur enzymatique), un groupe de liaison, ou un épitope d'anticorps. Un exemple de protéine de fusion, comprenant des séquences de hTRT et une protéine à fluorescence verte accrue (EGFP), est décrit dans l'exemple 15 ci-après. Il apparaîtra à l'homme du métier que les utilisations et applications étudiées dans l'exemple 15 et ailleurs dans le présent exposé ne sont pas limitées à la protéine de fusion particulière, mais constituent des exemples illustratifs des utilisations de diverses protéines de fusion. Les systèmes de protéine de fusion de l'invention peuvent également servir à faciliter une production efficace et un isolement efficace de protéines de type hTRT ou de peptides. Par exemple, dans certaines formes de réalisation, la partie séquence non-hTRT de la protéine de fusion comprend un peptide court qui peut être spécifiquement lié à une molécule immobilisée, de sorte que la protéine de fusion peut être séparée des constituants non liés ou non fixés (comme des protéines non apparentées dans un lysat de cellules). Un exemple est constitué par une séquence peptidique qui est fixée à un anticorps spécifique. Un autre exemple est constitué par un peptide comprenant des groupes polyhistidine, par exemple (His)6 ou des séquences histidine- tryptophane pouvant être fixées par une
résine contenant des ions nickel ou cuivre (c'est-à-
dire une chromatographie d'affinité métal-chélate).
D'autres exemples comprennent des domaines ou fragments de protéines A, qui permettent une purification d'une immonuglobuline immobilisée, et le domaine utilisé dans le système de purification extension/affinité "FLAGS" (Immunex Corp, Seattle WA, Etats-Unis d'Amérique). Dans certaines formes de réalisation, la protéine de fusion inclut un site de clivage de sorte que la séquence de hTRT ou une autre séquence de polypeptide de TRT peut être facilement séparée du peptide ou de la séquence de protéine non-hTRT. Dans ce cas, le clivage peut être chimique (par exemple à l'aide de bromure de
cyanogène, de 2-(2-nitrophénylsulphényl)-3-méthyl-3'-
bromoindolène, d'hydroxylamine ou à bas pH), ou enzymatique (par exemple à l'aide du facteur Xa, de l'entérokinase). Le choix des systèmes de fusion et de
clivage peut dépendre en partie de la portion (c'est-à-
dire de la séquence) du polypeptide de type hTRT soumis à expression. Des protéines de fusion sont décrites de façon générale dans Ausubel et al., ci-dessus, Ch. 16, Kroll et al., 1993, ADN Cell. Biol. 12:441, et dans le catalogue Invitrogen 1997 (Invitrogen Inc., San Diego, CA). D'autres exemples de protéines de fusion de l'invention, avec des marques sur épitope ou des sites de marquage et de clivage, sont présentés dans
l'exemple 6 ci-après.
L'homme du métier comprendra que, bien que les systèmes d'expression étudiés dans cette section se focalisent sur l'expression des polypeptides de type hTRT, on peut utiliser les cellules, vecteurs et procédés identiques ou similaires pour exprimer des polynucléotides de type hTRT de l'invention, ce qui comprend des polynucléotides sens et anti-sens, sans nécessairement désirer la production de polypeptides de type hTRT. Typiquement, l'expression d'un polypeptide exige un codon d'amorçage convenable (par exemple la méthionine), un cadre ouvert de lecture et des signaux de régulation de translation (par exemple un site de liaison de ribosome, un codon de terminaison), que l'on peut omettre lorsque l'on ne désire pas une translation d'une séquence d'acides nucléiques pour produire une
protéine.
L'expression de polypeptides de type hTRT et de polynucléotides peut être effectuée en vue d'obtenir l'un quelconque des divers avantages apparentés fournis par la présente invention. Un avantage illustratif est l'expression de polypeptides de type hTRT que l'on peut ensuite isoler de la cellule dans laquelle ils sont exprimés (par exemple pour la production de grandes quantités de hTRT pour servir de vaccin ou bien dans des applications de dépistage pour identifier les composés qui modulent l'activité de télomérase). Un second exemple d'avantage est l'expression de hTRT dans une cellule pour modifier le phénotype de la cellule
(comme dans des applications à la thérapie génique).
Les cellules de non mammifères peuvent servir pour l'expression de hTRT pour une purification, cependant que des cellules d'eucaryotes, notamment de mammifère (par exemple des cellules humaines) peuvent servir non seulement pour l'isolement et la purification de la hTRT mais aussi pour l'expression de hTRT quand on désire une modification du phénotype dans une cellule (par exemple pour effectuer une modification de la capacité de prolifération comme dans des applications du type thérapie génique). A titre d'illustration et nullement de limitation, on peut indiquer que des polypeptides de type hTRT, ayant une ou plusieurs activités de télomérase (par exemple une activité catalytique de télomérase) peuvent être exprimées dans une cellule hôte pour augmenter la capacité de prolifération d'une cellule (par exemple pour immortaliser une cellule) et, inversement, des polynucléotides anti-sens hTRT ou des polypeptides inhibiteurs, typiquement, peuvent être exprimés pour diminuer la capacité de prolifération d'une cellule (par exemple une cellule de tumeur maligne donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase). De nombreuses applications spécifiques sont décrites ici, par exemple dans l'étude d'utilisation des réactifs et procédés de l'invention pour des applications
thérapeutiques, ci-apres.
Des exemples illustratifs de systèmes utiles d'expression (cellules, éléments régulateurs, vecteurs et expression) de la présente invention comprennent un certain nombre de systèmes sans cellule, comme du lysat de réticulocytes et des systèmes de germe de blé utilisant des polynucléotides de type hTRT selon des procédés généraux bien connus en pratique (voir, par
exemple, Ausubel et al., ci-dessus au chapitre 10).
Dans d'autres formes de réalisation, l'invention fournit des réactifs et des procédés pour exprimer la hTRT dans des cellules de procaryotes ou d'eucaryotes. Ainsi, la présente invention propose des acides nucléiques codant pour des polynucléotides de type hTRT, des protéines, des sous-séquences de protéine, ou des protéines de fusion que l'on peut exprimer dans des bactéries, des champignons, des plantes, des insectes et des animaux, y compris des systèmes d'expression dans les cellules humaines connus en pratique, ce qui comprend des cellules isolées, des lignées de cellules, des cultures de cellule, des tissus et des organismes entiers. Comme l'homme du métier le comprendra, le polynucléotide de type hTRT introduit dans une cellule hôte, ou le système d'expression sans cellule, va habituellement être relié fonctionnellement à des séquences témoins appropriées d'expression pour chaque
hôte ou chaque système dépourvu de cellule.
D'utiles systèmes bactériens d'expression comprennent E. coli, des bacilles (comme Bacillus subtilus), d'autres antérobactériacées (comme Salmonella, Serratia, et diverses espèces de Pseudomonas) ou d'autres hôtes bactériens (par exemple Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, 3( Bifidobacterium breve, et Bifidobacterium iongum). Les protéines d'expression de type hTRT utiles dans des procaryotes comprennent des bactériophages recombinants, du plasmide ou des vecteurs d'expression d'ADN de cosmide, ou des agents analogues, et ils
comprennent typiquement des séquences de promoteurs.
Des exemples illustrant des promoteurs comprennent des promoteurs inductibles, comme le promoteur lac, le promoteur hybride lacZ du phage Buescript7 [Stratagene, La Jolla CA] ou pSportl [Gibco BRL]; des systèmes de promoteurs lambda de phage, un système de promoteur à l'aide de tryptophane (trp); et des hybrides ptrp-lac, etc. Des constructions d'expression bactérienne comprennent éventuellement un site de liaison de ribosome et des séquences de régulation de signaux de terminaison de transcription. Des exemples illustratifs de vecteurs spécifiques utiles pour une expression comprennent, par exemple, pTrcHis2, (Invitrogen, San Diego CA), pThioHis A, B & C, et de nombreux autres connus en pratique ou que l'on peut développer (voir, par exemple, Ausubel). D'utiles vecteurs pour des bactéries comprennent ceux qui facilitent la production de protéines de fusion de type hTRT. D'utiles vecteurs pour des taux élevés d'expression de protéines de fusion dans des cellules bactériennes comprennent, sans que ce soit limitatif, les vecteurs de clonage et d'expression multifonctionnels de E. coli, comme Bluescript7 (Stratagene), noté ci-dessus, dans lequel la séquence codant pour la protéine du type hTRT, une protéine de fusion de hTRT ou un fragment de type hTRT peuvent être fixées par ligature dans le vecteur avec des séquences pour la Met à groupe amino terminal et les 7 restes subséquents de P- galactosidase, de sorte qu'il y a production d'une protéine hybride (par exemple, les vecteurs pIN; Van Heeke et Schuster, 1989, 3<) J. Bold. Chem., 264:5503). Des vecteurs comme les vecteurs pGEX (par exemple, pGEX-2TK; Pharmacia Biotech) peuvent également servir à exprimer des polypeptides étrangers, comme de la protéine de type
hTRT, sous forme de protéines de fusion avec de la S-
transférase de glutathion (GST). De telles protéines de fusion peuvent être purifiées à partir de cellules
lysées, par adsorption sur des perles de glutathion-
gélose ou agarose, ce qui est suivi d'une élution en présence de gluthation libre. Des protéines produites dans de tels systèmes comprennent souvent de l'entérokinase, de la thrombine ou des sites de clivage de protéase de facteur Xa, de sorte que le polypeptide clone intéressant peut être libéré du fragment GST à volonté, selon ce qui est utile pour la purification ou pour d'autres applications. D'autres exemples sont constitués par des protéines de fusion comprenant hTRT et la protéine de liaison de Maltose (BLM) de E. coli ou d'un thioredoxine de E. coli. Des exemples illustratifs de constructions d'expression de type hTRT utiles dans des cellules bactériennes sont présentés à
l'exemple 6 ci-après.
L'invention propose en outre des polypeptides de hTRT exprimés dans des systèmes fongiques, comme Dictyostelium et, de préférence, de la levure, comme Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsis holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha et Candida pseudotropicalis. Quand de la hTRT est exprimée dans de la levure, un certain nombre de vecteurs convenables sont disponibles, ce qui comprend des vecteurs de type plasmide et chromosomes artificiels de levure. Les vecteurs comprennent typiquement des séquences de commande d'expression ou des séquences témoins, comme promoteurs constitutifs ou inductibles (par exemple, comme les facteurs alpha, de l'alcool-oxydase, PGH et de la 3-phosphoglycérate kinase ou d'autres enzymes glycolytiques), et une origine de réplication, des séquences de terminaison, etc., selon les désirs. Des vecteurs convenant pour servir dans Pichia comprennent pPICZ, His6/pPICZB, pPICZalpha, pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B & C, pGAP2alpha A, B et C (Invitrogen, San Diego, CA) et de
nombreux autres connus en pratique ou à développer.
Dans une forme de réalisation, on utilise le vecteur His6/pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) pour exprimer une protéine de fusion HisóhTRT dans la levure Pichia pastoris. Un exemple d'un vecteur utile dans Saccharomyces est représenté par pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA). Des exemples illustratifs de constructions d'expression de hTRT, utiles dans de la levure, sont
présentés à l'exemple 6 ci-après.
Les polypeptides de type hTRT de l'invenrion peuvent également être exprimés dans les systèmes de cellules végétales transfectées par des vecteurs d'expression de végétaux ou de virus de végétaux (par exemple le virus de la mosaïque du chou-fleur, CaMV; le virus de la mosaïque du tabac, TMV) ou ils peuvent être transformés à l'aide de vecteurs bactériens
d'expression (par exemple le plasmide Ti ou pBR322).
Lorsque l'on utilise des vecteurs d'expression de virus végétaux, l'expression d'une séquence codant pour hTRT peut être commandée par l'un quelconque d'un certain nombre de promoteurs. Par exemple, des promoteurs viraux comme les promoteurs 35S et 19S de CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514) peuvent servir isolément ou en combinaison avec la séquence de tête omega de TMV (virus de la mosaïque du tabac; Takamatsu et al., 1987, EMBO J., 6:307-311). En variante, des promoteurs végétaux comme ceux provenant du petit gène de sous-unité de RTJBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J., 3:1671- 1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838:843) ou des promoteurs d'un choc thermique (Winter et Sinibaldi, 1991, Results Probl. Cell Differ., 17:85), ou des promoteurs de gène de protéine de stockage peuvent servir. Ces constructions peuvent être introduites dans les cellules végétales par transformation directe d'ADN ou par une transfection avec médiation par un organisme pathogène (pour le passage en vue de telles techniques, voir Hobbs ou Murry, 1992, dans MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill New York, NY, pages 191-196 [1992]; ou Weissbach et Weissbach, 1988, "METHODS FOR
PLANT MOLECULAR BIOLOGY" [METHODES DE BIOLOGIE
MOLECULAIRE VEGETALE], Academic Press, New York NY,
pages 421-463).
Un autre système d'expression fourni par l'invention pour l'expression d'une protéine de type hTRT est un système utilisant un insecte. Un système préféré utilise un promoteur de type polyédrine de baculovirus. Dans un tel système, du virus polyédrique nucléaire d'Autographa californica (AcNPV) sert de vecteur pour exprimer des gènes étrangers dans des cellules de Spodoptera frugiperda ou dans des larves de Trichoplusia. La séquence codant pour le gène intéressant peut être clonée dans une région non essentielle du virus, comme le gène polyédrique, et placée sous la commande du promoteur polyédrique. Une insertion couronnée de succès de la séquence, par exemple codant la protéine de type hTRT, va rendre inactif le gène polyédrique et produire du virus recombinant dépourvu d'une protéine de revêtement. Les virus recombinants servent ensuite à infecter des cellules de S. frugiperda ou des larves de Truchoplusia, dans lesquels la séquence hTRT est ensuite exprimée (voir, pour les procédés généraux, Smith et al., J. Virol., 46:584 [1983]; Engelhard et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227 [1994]).
D'utiles vecteurs pour une expression dans baculovirus comprennent pBlueBacHis2 A, B & C, pBlueBac4,5, pMelBacB et de nombreux autres connus en pratique ou à développer. Des exemples illustratifs des constructions d'expression de hTRT, utiles dans des cellules
d'insectes, sont présentés à l'exemple 6, ci-après.
La présente invention propose également des systèmes d'expression dans des mammifères et dans des cellules de mammifère. Comme noté ci-dessus, des polynucléotides de type hTRT peuvent être exprimés dans des cellules demammifère (par exemple des cellules humaines) pour la production de fortes quantités de polypeptides de type hTRT (par exemple pour une purification) ou pour modifier le phénotype d'une cellule cible (par exemple pour de la thérapie génique,
une immortalisation de cellules ou pour d'autres fins).
Dans le dernier cas, le polynucléotide de type hTRT exprimé peut coder ou ne pas coder pour un polypeptide
ayant une activité catalytique de télomérase. C'est-à-
dire que l'expression peut être celle d'un polynucléotide sens ou anti-sens, d'un polypeptide inhibiteur ou stimulant, d'un polypeptide ayant zéro, une ou plusieurs activités de télomérase, et d'autres combinaisons et variants ici décrits ou qui apparaîtront à l'homme du métier lors du passage en
revue du présent expose.
Des cellules de culture de tissu d'hôte de mammifère convenable pour exprimer les acides nucléiques de l'invention comprennent n'importe quelle cellule normale, mortelle, ou bien immortelle normale ou anormale, animale ou humaine, ce qui comprend: de la lignée CVl de rein de singe transformée par SV40 (COS-7, ATCC CRL 165i); de la lignée de rein d'embryon humain (293; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); des cellules de rein de bébé hamster (BHK, ATCC CCL 10); CHO (ATCC CCL 61 et CRL 9618); des
cellules de sertoli de souris (TM4, Mather, Biol.
Reprod. 23:243-251 (1980)); des cellules de rein de singe (CVl ATCC CCK 70); des cellules de rein de singe gris d'Afrique (VERO-76, ATCC CRL 1587); des cellules d'un carcinome cervical humain (HeLa, ATCC CCL 2); des cellules de rein de chien (MDCK, ATCC CCL 34); des cellules de foie de rat (BRL 3A, ATCC CRL 1442); des cellules de poumon humain (W138, ATCC CCL 75); des cellules de foie humain (Hep G2, HB 8065); une tumeur de mamelle de souris (MMT 060562, ATCC CCL51); des cellules TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-46 (1982); des cellules MDCK (ATCC CCL 34 et CRL 6253); des cellules HEK 293 (ATCC CRL 1573); et des cellules WI-38 (ATCC CCL 75; ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD). L'utilisation de cultures de cellules de tissu de mammifère pour exprimer des polypeptides est étudiée de façon générale dans Winnacker, "FROM GENES TO CLONES" (VCH Publishers,
N.Y., N.Y., 1987).
Pour des cellules d'un hôte mammifère, on propose des systèmes d'expression à base virale et des systèmes non viraux. Des vecteurs et systèmes non viraux comprennent des plasmides et des vecteurs épisomiques, typiquement avec une cassette d'expression pour exprimer une protéine ou l'ARN, et des chromosomes artificiels humains (voir, par exemple, Harrington et al., 1997, Nat Genet 15:345). Par exemple, des vecteurs non viraux pouvant utilement servir à l'expression de polynucléotides et de polypeptides de type hTRT chez des mammifères (par exemple, dans des cellules humaines) comprennent ADN3pc.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), des vecteurs de type MPSV, d'autres décrits dans le catalogue Invitrogen 1997 (Invitrogen Inc., San Diego, CA), qui est incorporé dans sa totalité ici, et de nombreux autres vecteurs
connus en pratique pour l'obtention d'autres protéines.
Des exemples illustratifs et des produits de construction pour l'expression de hTRT, utiles dans des
cellules de mammifère, sont présentés à l'exemple 6 ci-
après. D'utiles vecteurs viraux comprennent des vecteurs à base de rétrovirus, d'adénovirus, des virus adénoassociés, des virus de l'herpès, des vecteurs à base de SV40, le virus de papillome, le virus HBP d'Epstein-Barr, des vecteurs de virus pour vaccin et le virus de Semliki Forest (SFV). SFV et des vecteurs pour vaccin sont étudiés de façon générale dans Ausubel et al., ci-dessus, chapitre 16. Ces vecteurs sont souvent constitués de deux constituants, un génome virai modifié et une structure de revêtement entourant ce
génome (voir de façon générale Smith, 1995, Annu. Rev.
Microbiol. 49:807), bien que parfois des vecteurs viraux soient introduits sous forme nue ou revêtus de protéines autres que les protéines virales. Cependant, l'acide nucléique viral présent dans un vecteur peut être changé de nombreuses façons, par exemple, quand le tout est conçu pour une thérapie génique. Les buts de ces changements et variations sont d'empêcher une croissance du virus dans les cellules hôtes tout en maintenant l'aptitude du virus à croître dans une forme de vecteur dans des cellules "d'emballage" ou auxilaires disponibles, pour conférer de la place au sein du génome viral en vue de l'insertion de séquences d'ADN exogène, et pour incorporer de nouvelles séquences codant pour une expression appropriée du gène intéressant et permettant une telle expression. Ainsi, des acides nucléiques de vecteur comprennent de façon générale deux constituants: des séquences virales essentielles, à action en cis, pour une réplication et un emballage dans une lignée auxiliaire, et une unité
de transcription pour l'obtention du gène exogène.
D'autres fonctions virales sont exprimées en "trans" dans une lignée spécifique de cellules d'emballage ou auxiliaires. Des vecteurs d'adénovirus (par exemple, destinés à servir dans de la thérapie génique pour être humain) sont décrits, par exemple, dans Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143; dans les publications PCT WO 94/12650; 94/12649 et 94/12629. En cas d'utilisation d'un adénovirus comme vecteur d'expression, une séquence codant pour hTRT peut être fixée par ligature dans un complexe de transcription/translation d'adénovirus consistant en la séquence de promoteur et en la séquence tripartite de tête. Une insertion dans une région El ou E3 non essentielle du génome de virus va aboutir à l'obtention d'un virus viable, capable de s'exprimer dans des cellules hôtes infectées (Logan and Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:3655). Des vecteurs de rétrovirus présentant une carence de leur rôle de réplication et englobant une séquence de polynucléotides thérapeutiques faisant partie du génome de rétrovirus sont décrits dans, par exemple, Miller et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4239, Kolberg, 1992, J.
NIH Res. 4:43 et Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther.
2:215.
Dans des systèmes de cellules de mammifère, des promoteurs provenant de gènes de mammifère ou provenant de virus de mammifère sont souvent appropriés. Des promoteurs convenables peuvent être constitutifs, spécifiques d'un type de cellule, spécifiques d'une étape et/ou modulables ou régulables (par exemple, par des hormones comme des glucocorticoides). D'utiles promoteurs comprennent, sans que cette liste soit limitative, le promoteur de métallothionéine, le promoteur majeur d'adénovirus constitutif, le promoteur de MMTV inductible par de la dexaméthasone, le promoteur SV40, le promoteur MRP polIII, le promoteur constitutif MPSV, le promoteur de CVM inductible par la
tétracycline (comme le promoteur de CMV immédiat-
précoce humain), le promoteur de CMV constitutif et des combinaisons promoteur-amplificateur connues en pratique. D'autres éléments régulateurs peuvent également être requis ou désirés pour une expression efficace d'un polynucléotide hTRT et/ou pour la translation
d'une séquence codant pour des protéines de type hTRT.
Pour une translation, ces éléments comprennent typiquement un codon d'amorçage ATG et un site de liaison de ribosome voisin ou d'autres séquences. Pour des séquences codant pour la protéine de type hTRT, à la condition que le codon d'amorçage et les séquences de promoteur en amont soient insérés dans un vecteur d'expression, des signaux non additionnels de translation ou d'autres signaux de commande peuvent ne pas être nécessaires. Cependant, quand seule une séquence codante, ou une partie d'une telle séquence, est insérée, il faut souvent faire appel à des signaux exogènes de transcription et/ou de commande de translation (par exemple, le promoteur, le site de liaison de ribosome, et du codon d'amorçage ATG). En outre, le codon d'amorçage doit typiquement être dans le cadre correct de lecture pour garantir la translation de la protéine voulue. Des éléments exogènes de transcription et des codons d'amorçage exogènes peuvent être de diverses origines, naturelles et synthétiques. En outre, l'efficacité de l'expression peut être amplifiée par l'inclusion d'amplificateurs appropriés dans le système cellulaire en service
(Scharf et al., 1994, Results Probi. Celi Differ.
:125; et Bittner et al. 1987, Meth. Enzymol., 153:516). Par exemple, l'amorceur SV40 ou l'amorceur CMV peuvent servir à augmenter l'expression dans des
cellules hôtes de mammifère.
Une expression des produits formant des gènes de type hTRT peut également être réalisée (accrue) par activation d'un promoteur de hTRT ou d'un amplificateur dans une cellule telle qu'une cellule humaine, par exemple une lignée de cellules négatives pour la recherche de la télomérase. Une activation peut être effectuée de diverses façons, ce qui comprend l'administration d'un agent exogène d'activation de promoteur, ou l'inhibition d'un constituant cellulaire qui supprime l'expression du gène de hTRT. On comprendra que, inversement, une inhibition du rôle de promoteur, selon ce qui est décrit ci-après, va
diminuer l'expression de gène de hTRT.
L'invention propose une expression, inductible et répressible, de polypeptides de type hTRT, utilisant un système comme le système d'expression inductible par ecdysone ("Ecdysone-Inducible Expression System" (Invitrogen)), et les systèmes régulés par tétracycline "Tet-On" et "Tet-off" de Clontech. Le système d'expression inductible par ecdysone utilise l'analogue ecdysone d'une hormone stéroidienne, la muristérone A, pour activer l'expression d'une protéine recombinante par l'intermédiaire d'un récepteur nucléaire hétérodimère (No et al., 1996,, Proc. Nat]. Acad. Sci. USA 93:3346). Dans une forme de réalisation de l'invention, de la hTRT est clonée dans le vecteur pIND (Clontech), qui contient cinq éléments de réponse à de l'ecdysone modifiée (E/GREs) en amont d'un promoteur de
choc thermique minimal et du site de clonage multiple.
La construction est ensuite transfectée dans des lignées de cellules exprimant de façon stable le récepteur d'ecdysone. Après transfection, les cellules sont traitées par de la muristérone A pour induire une expression intracellulaire provenant de pIND. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, du polypeptide de type hTRT est exprimé à l'aide du système d'expression "Tet-On" et "Tef-off" (Clontech) pour donner un niveau ou taux élevé d'expression de gène régulée (Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547; Gossen et al., 1995, Science
268:1766).
Les vecteurs de hTRT de l'invention peuvent être introduits par divers procédés dans une cellule, un tissu, un organe, un patient ou un animal. Les vecteurs d'expression d'acides nucléiques (typiquement ADNds) de l'invention peuvent être transférés, dans une cellule hôte choisie, par des procédés bien connus comme une transformation à l'aide de chlorure de calcium (pour les systèmes bactériens), de l'électroporation, un traitement par du phosphate de calcium, une transformation avec médiation de liposomes, de l'injection et de la microinjection, des méthodes ballistiques, des virosomes, des immunoliposomes, des conjugués polycation: acide nucléique, de l'ADN nu, des virions artificiels, de la fusion sur la protéine de structure de virus de l'herpès VP22 (Elliot et O'Hare, Cell 88:223), une absorption, amplifiée par un agent, d'ADN, et de la transduction "ex vivo". D'utiles procédés de transfert d'ADN avec médiation par des liposomes sont décrits dans les brevets US-A-5 049 386, US-A-4 946 787 et US-A-4 897 355; les publications PCT WO 91/17424, WO 91/16024; Wang et Huang, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:980; Wang et Huang, 1989, Biochemistry 28:9508; Litzinger et Huang, 1992, Biochem. Biophys. Acta 1113:201; Gao et Huang, 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:280. Des immunoliposomes ont été décrits comme étant des supports porteurs de polynucléotides exogènes (Wang et Huang, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7851; Trubetskoy et al., 1992, Biochem. Biophys. Acta 1131:311) et ils peuvent avoir une spécificité de type cellulaire amélioré en comparaison de liposomes, du fait de l'inclusion d'anticorps spécifiques qui, probablement, se fixent sur les antigènes de surface de type spécifique de cellule. Behr et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6982 rapportent l'utilisation d'une lipopolyamine comme réactif pour
jouer un rôle de médiation de la transfection elle-
méme, sans la nécessité d'une addition quelconque de phospholipide pour former des liposomes. Des procédés de délivrance convenables seront choisis par les praticiens tenant compte de pratiques acceptables et d'exigences de régulation ou de réglementation (par exemple, pour la thérapie génique ou la production de lignées de cellules pour l'expression de protéines recombinantes). On comprendra que les procédés de délivrance énumérés ci-dessus peuvent servir pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules à des fins de thérapie génique, de transfert dans des
cellules de culture de tissu et dans les cas analogues.
Pour une production à long terme avec des rendements élevés de protéines recombinantes, une expression stable sera souvent souhaitée. Par exemple, des lignées de cellules qui expriment de façon stable hTRT peuvent être préparées à l'aide de vecteurs d'expression de l'invention, qui contiennent des origines virales de réplication ou des éléments d'expression endogène et un gène marqueur pouvant être choisi. Après l'introduction du vecteur, on peut laisser les cellules croitre durant 1 à 2 journées dans des milieux enrichis, avant de les faire passer dans des milieux sélectifs. Le but du marqueur choisissable est de conférer de la résistance à la sélection, et sa présence permet la croissance de cellules qui expriment avec succès les séquences introduites dans des milieux choisis. Des cellules transfectées de manière stable et résistantes peuvent être soumises à prolifération à l'aide de techniques de culture de tissu appropriées au type de cellule. Une étape d'amplification, par exemple par administration de méthyltrexate à des cellules transférées par un gène DHFR selon des procédés bien
connus en pratique, peut être incluse.
En outre, on peut choisir une souche de cellules hôtes pour son aptitude à moduler l'expression des séquences insérées ou pour traiter la protéine exprimée de la façon souhaitée. De telles modifications du polypeptide comprennent, sans que cela soit limitatif, une acétylation, une carboxylation, une phosphorylation, une lipidation et une acylation. Un traitement post-translation peut également être important pour une insertion correcte, du pliage et/ou le fonctionnement. Des cellules hôtes différentes possèdent une machinerie cellulaire et des mécanismes caractéristiques spécifiques de chaque cellule pour de telles activités post- translation et, ainsi, une cellule particulière peut être choisie en vue de garantir la modification correcte et le traitement
correct de la protéine étrangère introduite.
La présente invention propose également des animaux transgéniques (c'est-à-dire, des mammifères transgéniques pour une séquence de gène humaine ou une autre séquence de gène de type TRT) exprimant un polynucléotide ou polypeptide de type hTRT ou d'un autre tvype de TRT. Dans une forme de réalisation, de la hTRT est sécrétée dans le lait d'un mammifère transgénique, comme un bovin, une chèvre ou un lapin transgéniques. Des procédés de production de tels animaux se trouvent, par exemple, dans le document de
Heyneker et al., PCT WO 91/08216.
Les protéines et complexes de hTRT de l'invention, y compris ceux produits à l'aide des systèmes d'expression ici révélés ci- dessus, peuvent être purifiés à l'aide de diverse méthodes générales connues en pratique, selon les méthodes spécifiques proposées
par la présente invention (voir par exemple ci-après).
L'homme du métier va reconnaître qu'après synthèse chimique, expression biologique ou purification, la protéine de type hTRT peut posséder une conformation différente d'une conformation native de la télomérase naturelle. Dans certains cas, il peut s'avérer utile ou même nécessaire de dénaturer (par exemple d'inclure une réduction de liaisons ou termes de type disulfure ou autres) le polypeptide, puis de provoquer le repli à nouveau du polypeptide en la conformation préférée. Du repli productif peut également exiger la présence de hTR (ou de fragments de hTR). Des procédés pour réduire et dénaturer des protéines et pour induire un repli à nouveau sont bien connus de l'homme du métier (voir, par exemple Debinski et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:14065; Kreitman et Pastan, 1993, Bioconjug. Chem., 4:581; et Buchner et al., 1992, Anal. Biochem.,
205:263; et McCaman et al., 1985, J. Biotech. 2:177!.
Voir également la publication PCT WO 96/40868, citée
ci-dessus.
D) COMPLEXES DE TRT HUMAINE ET D'ARN DE TYPE
TELOMERASE HUMAINE, PROTEINES ASSOCIEES A LA
TELOMERASE, ET AUTRES BIOMOLECULES PRODUITES PAR
COEXPRESSION ET PAR D'AUTRES MOYENS
Les polypeptides de type hTRT de l'invention peuvent s'associer "in vivo" (dans les êtres vivants) et "in vitro" (en verrerie de laboratoire) avec d'autres biomolécules, ce qui comprend des ARN (par exemple, hTR), des protéines (par exemple, des protéines associées à de la télomérase), de l'ADN (par exemple de l'ADN télomère, [T2AG3]N) et des nucléotides, comme des (désoxy)ribonucléotide triphosphates. Ces associations peuvent être exploitées pour vérifier ou quantifier la présence ou le rôle de hTRT, pour identifier ou purifier hTRT ou des molécules associées à de la télomérase, et pour analyser hTRT ou la structure ou le rôle de télomérase selon les procédés
de la présente invention.
Dans une forme de réalisation, la présente invention propose hTRT complexée avec (par exemple, associée à ou fixée à) un acide nucléique, habituellement un ARN, par exemple pour produire une holoenzyme de type télomérase. Dans une forme de réalisation, l'ARN lié ou fixé est capable de jouer le rôle de matrice pour la synthèse d'ADN à médiation de télomérase. Des exemples d'ARN qui peuvent être complexés avec le polypeptide de type hTRT comprennent un ARN de télomérase de cellule hôte naturelle, un ARN de télomérase humaine (par exemple, hTR; brevet US-A-5 583 016), une sous-séquence ou un domaine de hTR, un ARN synthétique ou d'autres ARN. Le complexe ARN-protéine de type hTRT (une ribonucléoprotéine, RNP) présente typiquement une ou plusieurs activités de télomérase, comme des activités catalytiaues de télomérase. Ces complexes de RNP de type hTRT-hTR (ou d'autres complexes hTRT-ARN) peuvent être produits par divers procédés, comme décrit ci-après à titre illustratif, ce qui comprend une reconstitution "in vitro", par expression de hTRT et de HTR (ou d'un autre ARN) "in vitro" (c'est-à- dire dans un système dépourvu de cellule), une reconstitution "in vivo", ou une
reconstitution "ex vivo".
Ainsi, la présente invention propose, dans une forme de réalisation, un complexe de type hTRT-hTR (ou un autre complexe de type hTR-ARN) formé "in vitro" par le mélangeage de constituants séparément purifiés "reconstitution in vitro" (voir, par exemple, le brevet
US-A-5 583 016 pour une description de reconstitution;
voir également Autexier et al., EMBO J. 15:5928). Dans une autre forme de réalisation, l'invention propose de la RNP de type télomérase produite par coexpression du polypeptide de type hTRT et d'un ARN (par exemple hTR) in vitro dans un système de transcription- translation sans cellule (par exemple, du
germe de blé ou du lysat de réticulocytes de lapin).
Comme montré à l'exemple 7, une co-expression "in vitro" d'un polypeptide de type hTRT recombinant et de type hTR aboutit à la production d'une activité catalytique de télomérase (telle que mesurée par un
essai TRAP).
La présente invention propose en outre des RNP de type télomérase produites par expression du polypeptide de type hTRT dans une cellule, par exemple une cellule de mammifère, dans laquelle hTR est exprimée naturellement ou dans laquelle hTR (ou un autre ARN capable de former un complexe avec la protéine de type hTRT) est introduit(e) ou exprimé(e) par des moyens de recombinaison. Ainsi, dans une forme de réalisation, la hTRT est exprimée dans une cellule humaine negative à la recherche de télomérase, cellule dans laquelle il y a présence de hTR (par exemple, des cellules BJ ou IMP90), en laissant les deux molécules se rassembler et former une RNP. Dans une autre forme de réalisation, 3(0 hTRT est exprimée dans une cellule humaine ou non humaine dans laquelle hTR est exprimée par recombinaison. Des procédés pour l'expression de hTR dans une cellule se trouvent dans le brevet US-A-5 583 016. En outre, un clone contenant un ADNc codant pour un constituant d'ARN de télomérase a été mis en dépôt sous la désignation pGRN33 (ATCC 75926) Des séquences de génome codant pour le constituant ARN de télomérase humaine sont également en dépôt dans l'insert à -15 kb de SauIIIA1 vers HindIII du clone lambda 28-1 (ATCC 75925). Pour une expression dans des cellules d'eucaryote, la séquence de type hTRT sera typiquement liée fonctionnellement à une séquence d'amorçage de transcription (site de liaison de polymérase de type ARN) et des séquences de terminaison de transcription (voir, par exemple, Publication PCT
WO 96/01835; Feng et al., 1995, Science 269:1236).
La présente invention propose en outre des polypeptides de type hTRT produits par recombinaison ou essentiellement purifiés, coexprimés et/ou associés à ce que l'on appelle des "protéines associées à la télomérase". Ainsi, la présente invention propose de la hTRT coexprimée avec, ou complexée avec, d'autres protéines (par exemple, des protéines associées à la télomérase). Des protéines associées à la télomérase sont des protéines qui sont copurifiées avec de la télomérase humaine et/ou qui peuvent jouer un rôle de modulation du rôle de télomérase ou de l'activité de télomérase, par exemple en participant à l'association de la télomérase avec de l'ADN de têlomère. Des exemples de protéines associées à la télomérase comprennent (sans que cela soit limitatif), les protéines suivantes et/ou leurs homologues humains: de la nucléoline (voir, Srivastava et al., 1989, FEBS Letts. 250:99), EF2H (homologue de facteur 2 d'allongement; voir Nomura et al. 1994, ADN Res. (Japon) 1:27, GENBANK numéro d'accession D21163); TPI/TLPI (Harrington et al., 1997, Science 275:973; Nakayama, 1997, Cell 88:875); l'homologue humain de la Tetrahymena p95 ou p95 elle-même (Collins et al., 1995, Cell 81:677); TPC2 (une protéine de régulation de la longueur de télomère; numéro d'accession ATCC 97708; TPC3 (également une protéine de régulation de la longueur de télomère; numéro d'accession ATCC 97707; une protéine de fixation d'ADN B (dbpB; Horwitz et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:14130; et des facteurs de liaison de répétitions de télomère (TRF 1 & 2; Chang et al., 1995, Science 270:1663; Chong et al., 1997, Hum Mol Genet 6:69); EST1, 3 et 4 (Lendvay et al., 1996, Genetics 144:1399; Nugent et al., 1996, Science 274:249; Lundblad et al., 1989, Cell 57:633); et un facteur de coiffage d'extrémité (Cardenas et al., 1993,
Genes Dev. 7:883).
Des protéines associées à la télomérase peuvent être identifiées sur la base de la copurification, avec ou de la fixation sur de la protéine de type hTRT ou de la RNP de type hTRT-hTR. En variante, elles peuvent être identifiées sur la base de la fixation sur une protéine de fusion de type hTRT, par exemple, une protéine de fusion GST-hTRT ou analogue, comme déterminé par purification par affinité (voir, Ausubel et al. chapitre 20). Une technique particulièrement utile pour établir des interactions protéine-protéine, qui est applicable à l'identification de protéines associées à la hTRT, est la méthode de Chien et al. de dépistage par écran de deux hybrides (Prcc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578 [1991]; voir également Ausubel et al., ci-dessus, au chapitre 20). Ce dépistage par cet écran identifie une interaction de protéine-protéine "in vivo" par la reconstitution d'un activateur de transcription, la protéine de transcription Gal4 de levure (voir, Fields et Song, 1989, Nature 340-245). Le procédé se fonde sur les propriétés de la protéine Gal4 de levure, qui consiste en des domaines séparables responsables de l'activation de liaison d'ADN et de transcription. Il y a construction de polynucléotide, habituellement des vecteurs d'expression codant pour deux protéines hybrides. Un polynucléotide comprend le domaine de fixation d'ADN Gal4 de levure fusionné sur une séquence de polypeptide d'une protéine à essayer pour vérifier une interaction de hTRT (par exemple, la nucléoline ou EF2H). En variante, le domaine de liaison d'ADN Gal4 de levure est fusionné à de l'ADNc provenant d'une cellule humaine, en créant ainsi une bibliothèque de protéines humaines fusionnées sur le domaine de liaison d'ADN Gal4 pour le dépistage de protéines associées à la télomérase. L'autre polynucléotide comprend le domaine d'activation de Gal4 fusionné à une séquence de polypeptide de type hTRT. Les produits ainsi construits sont introduits dans une cellule hôte de levure. Lors de l'expression, une liaison intermoculaire entre hTRT et la protéine d'essai peut reconszituer le domaine de liaison d'ADN de Ga14 avec un domaine d'activation de Gal4. Cela conduit à l'activation de transcription d'un gène rapporteur (par exemple, lacZ, HIS3) fonctionnellement lié à un site de
liaison de Gal4. En choisissant le rapporteur-
indicateur ou en dosant le rapporteur, on peut identifier des colonies de cellules qui contiennent une protéine interagissant avec hTRT ou une protéine associée de la télomérase. L'homme du métier comprendra qu'il existe de nombreuses variantes de l'écran de dépistage à deux hybrides, par exemple, le système LexA (Bartel et al., 1993, dans "Cellular Interactions in
Development: A Pratical Approach Ed. Hartlev, D.A.
(Oxford Univ. Press), pages 153-179).
Un autre procédé utile pour identifier des protéines associées à la télomérase est le système à trois hybrides (voir, par exemple, Zhang et al., 1996, Anal. Biochem. 242:68; Licitra et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12817). Le constituant ARN de télomérase peut servir dans ce système avec la protéine de type TRT ou hTRT et une protéine d'essai. Un autre procédé utile pour identifier des protéines interagissantes, notamment (c'est-à-dire, des protéines qui hétérodimérisent ou forment des hétéromultimères d'ordre supérieur), est le système de dépistage interactif de E. coli/BCCP (voir, Germino et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:933; Guarente (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1639).
La présente invention propose également des complexes de protéines fixant des télomères (qui peuvent ou non être des protéines associées à la télomérase) et la hTRT (qui peut ou non être complexée avec hTR, d'autres ARN, ou une ou plusieurs protéines associées à de la télomérase). Des exemples de protéines fixant des télomères comprennent TRF1 et TRF2 (voir ci-dessus); rnpA1, rnpA2, RAP1 (Buchman et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:210, Buchman et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:5086), SIR3 et SIR4(Aparicio et al., 1991, Cell. 66:1279), TELi (Greenwell et al., 1995, Cell. 82:823, Morrow et al., 1995, Cell. 82:831); ATM (Savitsky et al., 1995, Science 268:1749), du facteur de coiffage d'extrémité (Cardenas et al., 1993, Genes Dev. 7:883), et des homologues humains correspondants. Les complexes précités peuvent être produits de façon générale comme décrit ci-dessus pour des complexes de hTRT et de hTR ou de protéines associées à de la télomérase, par exemple, par
mélangeage ou coexpression "in vitro" ou "in vivo".
3)
V. ANTICORPS ET AUTRES AGENTS DE FIXATION OU DE
LIAISON
Dans un aspect apparenté, la présente invention propose des anticorps qui sont spécifiquement immunoréactifs avec hTRT, ce qui comprend des anticorps polyclonaux et monoclonaux, des fragments d'anticorps, des anticorps monocaténaires des anticorps chimériques et humains, y compris des anticorps ou fragments d'anticorps fusionnés à des protéines de revêtement de phage ou de surface de cellule, et autres connus en pratique et décrits ici. Les anticorps de l'invention peuvent spécifiquement reconnaître des polypeptides et fixer des polypeptides qui ont une séquence d'aminoacides essentiellement identique à la séquence des aminoacides présentée sur la figure 17 (SEQUENCE ID N 2), ou un fragment immunoqène de cette séquence ou un épitope sur la protéine ainsi définie. Les anticorps de l'invention peuvent présenter une affinité de liaison spécifique pour hTRT d'au moins environ 10, lu, iu ou 1u i, eL ii peuvenL êLre poiyciOnaux, monoclonaux, recombinants ou produits d'une autre façon. L'invention propose également des anticorps anti-hTRT, qui reconnaissent un épitope de conformation de hTRT (par exemple, un épitope à la surface de la protéine de type hTRT ou de RNP de télomérase) Des épitopes de conformation peuvent également être identifiés, si on le désire, par analyse assistée par un ordinateur de la séquence protéinique de hTRT, en comparaison avec la conformation de transcriptases reverses apparentées, comme sous- unité p66 de HIV-1 (voir, par exemple, la figure 3), ou empiriquement. Des anticorps anti-hTRT, qui reconnaissent des épitopes de conformation, peuvent servir, notamment, à la détection et à la purification de télomérase humaine et dans le
* diagnostic et le traitement d'une maladie humaine.
Dans la production d'anticorps anti-hTRT, on peut immuniser des hôtes comme des chèvres, des moutons, des vaches, des cobayes, des lapins, des rats ou des souris, par injection d'une protéine du type hTRT ou d'une partie, d'un fragment ou d'un oligopeptide quelconque de cette protéine conservant des propriétés immunogéniques. Lors du choix des polypeptides de type hTRT pour une induction d'anticorps, il n'est pas nécessaire de conserver une activité biologique; cependant, le fragment de protéine ou l'oligopeptide doit être immunogène et de préférence antigénique. Une immunogénicité peut être déterminée par injection d'un polypeptide et d'un adjuvant à un animal (par exemple un lapin) et recherche de l'apparition d'anticorps dirigés contre le polypeptide injecté (voir, par exemple, Harlow et Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY
MANUAL, [ANTICORPS: MANUEL DE LABORATOIRE], COLD SPRING
HARBOR LABORATORY, New York (1988), qui est incorporé ici en totalité et à toutes fins, par exemple, voir le chapitre 5). Des peptides servant à induire des anticorps spécifiques ont typiquement une séquence d'aminoacides consistant en au moins 5 aminoacides, de préférence au moins 8 aminoacides et encore mieux au moins 10 aminoacides. Habituellement, ils vont mimer ou avoir une identité substantielle de séquence avec, la totalité ou une partie contigue de la séquence d'aminoacides de la protéine de "SEQUENCE ID N 2". De courtes fractions des aminoacides de la protéine de type hTRT peuvent être fusionnées avec celles d'une autre protéine, comme l'hémocyanine de mollusque (patelle) servant de trou de serrure, et un anticorps anti-hTRT produit contre la molécule chimérique. Selon l'espèce hôte, on peut utiliser divers adjuvants pour
augmenter la réponse lmmunologique.
L'antigène est présenté au système immunitaire d'une façon déterminée par les procédés appropriés à l'animal. Ces paramètres et d'autres encore sont de
façon générale bien connus des immunologistes.
Typiquement on effectue des injections dans les coussinets ou la pulpe de patte, par voie intramusculaire, intradermique, dans les nodules ou
ganglions de périlymphe ou par voie intrapéritonéale.
Les immunoglobulines produites par l'hôte peuvent être précipitées, isolées et purifiées par des méthodes routinières, ce qui comprend une purification par affinité. Des exemples illustrant des peptides immunogènes de type hTRT sont présentés à l'exemple 8. En outre, l'exemple 8 décrit la production et l'utilisation
d'anticorps polyclonaux anti-hTRT.
A) ANTICORPS MONOCLONAUX
Des anticorps monoclonaux de protéines de type hTRT et de peptides de type hTRT peuvent être préparés selon les procédés de l'invention, en utilisant n'importe quelle technique assurant la production de molécules d'anticorps par des lignées continues de cellules en culture. Ces procédés comprennent, sans que cette liste soit limitative, la technique de l'hybridome décrite à l'origine par Koehler et Milstein (Nature 256:495 [1975]), la technique d'hybridome de cellules humaines B (Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72, Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026) et la technique d'hybridome de EBV (Cole et al., "MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY [ANTICORPS MONOCLAUX ET THERAPIE DU CANCER], Alan R
Liss Inc., New York, pages 77-96 [1985]).
Dans une forme de réalisation, on choisit des animaux appropriés et l'on suit le protocole approprié d'immunisation. La production d'anticorps monoclonaux non humains, provenant par exemple de souris, de lagomorpha, d'équidés, est bien connue et peut être réalisée, par exemple, par immunisation de l'animal à l'aide d'une préparation contenant de la hTRT ou des fragments de hTRT. Dans un procédé, après la période appropriée de temps, les rates des animaux sont excisées et des cellules individuelles de rate sont soumises à fusion, typiquement, sur des cellules de myélome immortalisées dans des conditions appropriées de sélection. Puis, les cellules sont séparées par obtention de clone et les liquides surnageant chaque clone (par exemple, de l'hybridome) sont soumis à des essais pour déceler la production d'un anticorps
approprié spécifique de la région voulue de l'antigène.
Des techniques pour produire des anticorps sont bien connues en pratique. Voir, par exemple, Goding et al.,
"MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE
[ANTICORPS MONOCLONAUX: PRINCIPES ET PRATIQUES] (2e édition) Acad. Press, N.Y., et Harlow et Lane, ci-dessus, textes dont chacun est incorporé dans sa totalité et à toutes fins. D'autres techniques convenables impliquent l'exposition "in vitro" de lymphocytes aux polypeptides antigéniques ou, en variante, une sélection de bibliothèques d'anticorps dans du phage ou dans des vecteurs analogues (voir ci-après).
B. ANTICORPS HUMAINS
Dans un autre aspect de l'invention, on propose des anticorps humains agissant contre un polypeptide de type hTRT. Des anticorps monoclonaux humains, agissant contre un antigène connu, peuvent également être obtenus à l'aide d'animaux transgéniques ayant des éléments d'un système immunitaire humain (voir, par exemple, les brevets US-A-5 569 825 et US-A-5 545 806, qui sont tous deux incorporés dans leur totalité, par référence, à toutes fins) ou à l'aide de cellules ou globules de sang périphérique humain (Casali et al., 1986, Science 234:476). Certains anticorps humains sont choisis par des expériences de fixation compétitive, ou d'une autre façon, de manière qu'ils aient la même spécificité, à l'égard des épitopes, que l'anticorps
particulier de souris.
Dans une autre forme de réalisation, on peut produire des anticorps humains anti-polypeptide de type hTRT en soumettant à dépistage une bibliothèque d'ADN provenant de cellules ou globules B humains selon le protocole général souligné par Huse et al., 1989,
Science 246:1275, qui est incorporé ici par référence.
On choisit des anticorps qui se fixent par liaison sur le polypeptide de type hTRT. Des séquences codant pour de tels anticorps (ou des fragements à rôle de liaison) sont ensuite clones et amplifiés. Le protocole décrit par Huse sert souvent avec la technologie d'affichage.à
l'aide de phages.
C) ANTICORPS HUMANISES OU CHIMERIQUES
L'invention propose également des anticorps anti-
hTRT qui sont rendus chimériques, analogues à des anticorps humains ou humanisés, pour en diminuer le caractère antigénique potentiel, sans en abaisser l'affinité pour leur cible. Des préparations d'anticorps chimériques, analogues à des produits humains et humanises ont été décrites dans la pratique (voir, par exemple, les brevets US-A-5 585 089 et US-A-5 530 101; Queen et al., 1989, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 86:10029; et Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; textes qui, chacun, sont incorporés par
référence dans leur totalité et à toutes fins utiles).
Des immunoglobulines humanisées ont des régions variables de cadre provenant essentiellement de l'immunoglobuline humaine (appelée une immunoglobuline d'accepteur) et des régions déterminantes complémentaires provenant d'une immunoglobuline essentiellement non humaine (par exemple de souris) (que l'on appelle l'immunoglobuline de donneur). La ou les région(s) constante(s), s'il y en a, proviennent
aussi essentiellement d'une immunoglobuline humaine.
Dans certaines applications, comme de l'administration à des patients humains, les anticorps humanisés (aussi bien que les anticorps humains) anti-hTRT de la présente invention offrent plusieurs avantages par rapport à des anticorps d'espèces murines ou d'autres espèces: (1) le système immunitaire humain ne devrait pas reconnaître le cadre ou la région constante de l'anticorps humanisé comme étant un élément étranger et, donc, la réponse contre un tel anticorps injecté (réponse à l'action d'un anticorps) devrait être moindre que contre un anticorps de souris entièrement étranger ou un anticorps chimérique partiellement étranger; (2) puisque la portion d'effecteur de l'anticorps humain est humaine, elle peut interagir mieux avec d'autres parties du système immunitaire humain; et (3) des anticorps humanisés injectés ont une période de demi-vie qui équivaut essentiellement à celle d'anticorps humains naturels, ce qui permet l'administration de doses plus faibles et moins fréquentes que dans le cas d'anticorps d'une autre espèce. Comme cela ressort implicitement de ce qui précède, les anticorps anti-hTRT peuvent être
appliqués dans le traitement d'une maladie, c'est-à-
dire pour cibler des cellules considérées comme
positives en cas de recherche de télomérase.
D) AFFICHAGE DE PHAGES
La présente invention propose également des anticorps anti-hTRT (ou des compositions liantes) produites par des procédés d'affichage de phages (voir, par exemple Dower et al., WO 91/17271, et McCafferty et al., WO 92/01047; et Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309; chacun de ces textes étant incorporé en totalité par référence à toutes fins utiles). Dans ces procédés, il y a production de bibliothèques de phages dans lesquelles les membres présentent des anticorps différents sur leurs surfaces externes. Les anticorps sont habituellement affichés comme étant des fragments de Fv ou de Fab. Les anticorps d'affichage de phages ayant une spécificité voulue sont choisis par enrichissement par affinité
avec un polypeptide de type hTRT.
Dans une variante du procédé d'affichage de phages, il peut y avoir production d'anticorps humanisés ayant la spécificité de liaison d'un anticorps murin choisi. Dans ce procédé, on utilise comme matériau de départ, la région variable, à chaîne lourde ou légère, de l'anticorps murin choisi. Si, par exemple, on choisit comme matériau de départ une région variable à chaîne légère, il y a construction d'une bibliothèque de phages dans laquelle des membres affichent la même région variable à chaîne légère (c'est-à-dire le matériau murin de départ) et une région variable différente à chaîne lourde. Les régions variables à chaîne lourde sont obtenues à partir d'une bibliothèque de régions variables, à chaîne lourde, humaine réarrangée. Un phage montrant une forte liaison spécifique pour le polypeptide de type hTRT (par exemple, au moins 10" et de préférence au moins 10 M-) ebL cliulb. L LguiQMi vd ii drle d Ch i IE2 luLdu hum=L ilI de ce phage sert ensuite de matériau de départ pour construire une autre bibliothèque de phages. Dans cette bibliothèque, chaque phage présente la même région variable à chaîne lourde (c'est-à-dire la région identifiée à partir de la première bibliothèque d'affichage) et une région variable différente à chaîne légère. Les régions variables à chaîne légère sont obtenues à partir d'une bibliothèque de régions humaines réarrangées, variables à chaîne légère. Dans ce cas également, on choisit un phage montrant une forte liaison spécifique. Ce phage montre les régions variables d'anticorps anti-hTRT entièrement humains. Ces anticorps ont habituellement la même spécificité, ou une spécificité similaire, d'épitope que le matériau
murin de départ.
E) ANTICORPS HYBRIDES
L'invention propose également des anticorps hybrides, qui ont en partage la spécificité d'anticorps contre un polypeptide de type hTRT mais sont capables également de réaliser une liaison spécifique sur un second fragment. Dans de tels anticorps hybrides, une paire de chaînes, lourde et légère, provient habituellement d'un anticorps-anti-hTRT et l'autre paire provient d'un anticorps obtenu contre un autre épitope ou une autre protéine. Cela aboutit à la
propriété d'une valence multifonctionnelle, c'est-à-
dire l'aptitude à fixer au moins deux épitopes différents, simultanément, au moins un épitope étant
l'épitope sur lequel l'anticorps anticomplexe se fixe.
De tels hybrides peuvent être formés par fusion d'hybridomes produisant les anticorps composants respectifs, ou par des techniques de recombinaison. De tels hybrides peuvent servir à transporter un compose (par exemple un médicament ou une drogue) vers une cellule positive dans la recherche de télomérase (c'est-à-dire qu'un agent cytotoxique est délivré à une
cellule de cancer).
Les immunoglobulines de la présente invention peuvent également subir une fusion avec des régions fonctionnelles provenant d'autres gènes (par exemple des enzymes) pour produire des protéines de fusion par
exemple des immunotoxines) ayant d'utiles propriétés.
F) ANTICORPS ANTI-IDIOTYPIQUES
Sont également utiles des anticorps anti-
idiotypiques que l'on peut isoler par le mode opératoire ci- dessus. On peut préparer des anticorps anti-idiotypiques, par exemple, par immunisation d'un animal à l'aide de l'anticorps primaire (c'est-à-dire des anticorps anti-hTRT ou des fragments de ces anticorps fixant hTRT). Comme anticorps anti-hTRT, on choisit des anticorps anti- idiotypes dont la liaison à l'anticorps primaire est inhibée par un polypeptide de
type hTRT ou par des fragments de ce polypeptide.
Puisque l'anticorps anti-idiotypique et le polypeptide de type hTRT ou leurs fragments fixent tous deux
l'immunoglobuline primaire, l'immunoglobuline anti-
idiotypique peut représenter l'"image interne" d'un épitope et peut ainsi remplacer le polypeptide de type hTRT dans des compositions ou opérations de
détermination de dosage ou peut servir à fixer (c'est-
à-dire inactiver) des anticorps anti-hTRT, par exemple chez un patient. Des anticorps anti-idiotypes peuvent également interagir avec des protéines associées à de la télomérase. L'administration de tels anticorps peut affecter le rôle de télomérase en entrant en compte dans un titrage ou en entrant en compétition avec hTRT pour la liaison de fixation sur des protéines associées
à hTRT.
G) GENERALITES
Les anticorps de l'invention peuvent être de n'importe quel isotype, par exemple, IgM, IgD, IgG, IgA, et IgE, mais l'on préfère souvent IgG, IgA et IgM.' Des anticorps humanisés peuvent comprendre des séquences provenant de plus d'une classe ou de plus
d'un isotype.
Dans une autre forme de réalisation de l'invention, des fragments d'anticorps intacts décrits ci-dessus sont proposés. Typiquement, ces fragments peuvent entrer en compétition avec l'anticorps intact dont ils dérivent pour une liaison de fixation spécifique sur le polypeptide de type hTRT et ils se
7 - 1
fixent avec une affinité d'au moins 107, 108, 109 M, ou 1010 M-1 Des fragments d'anticorps comprennent des chaînes lourdes séparées, des chaînes légères, Fab, Fab'F(ab')2, Fabc et Fv. Des fragments peuvent être produits par séparation enzymatique ou chimique d'immunoglobulines intactes. Par exemple, on peut obtenir un fragment F(ab')2 à partir d'une molécule d'IgG par digestion protéolytique avec de la pepsine à pH 3,0-3,5, en utilisant des méthodes courantes ou normalisées comme celles décrites dans Harlow et Lane, ci-dessus. Des fragments Fab peuvent être obtenus à partir de fragments F(ab')2 par réduction limitée ou à partir d'un anticorps complet par digestion avec de la papaine en présence d'agents réducteurs (voir de façon générale, Paul, W., ed "FUNDEMENTAL IMMUNOLOGY" [IMMUNOLOGIE FONDAMENTALE], 2ND Raven Press, N.Y., 1989, chapitre 7, incorporé dans sa totalité ici à toutes fins). Des fragments peuvent également être produits à l'aide des techniques utilisant de l'ADN recombinant. Des segments d'acides nucléiques codant pour des fragments choisis sont produits par digestion de séquences codantes de pleine longueur avec des
enzymes de restriction, ou par synthèse "de novo".
Souvent, des fragments sont exprimés sous forme de
protéines de fusion de phage-enveloppe.
Un grand nombre des immunoglobulines décrites ci-dessus peuvent subir des substitutions par des aminoacides non critiques, des additions ou des délétions dans les régions variables et constantes, sans perte de la spécificité de liaison ou des fonctions d'effecteur, ou une réduction intolérable de l'affinité de liaison (c'est-à-dire au-dessous d'environ 107 M-1). Habituellement, des immunoglobulines comportant de telles altérations présentent une identité substantielle de séquence avec une immunoglobuline de référence à partir de laquelle elles proviennent. On peut choisir une immunoglobuline ayant subi de la mutation et ayant la même spécificité et la même affinité accrue en comparaison d'une immunoglobuline de référence dont elle dérive. La technologie d'affichage de phage offre d'utiles
techniques pour le choix de telles immunoglobulines.
Voir, par exemple, Dower et al., WO 91/17271 McCafferty
et al., WO 92/01047; et Huse, WO 92/06204.
Les anticorps de la présente invention peuvent servir avec ou sans modification. Fréquemment, les anticorps seront marqués par jonction, covalente ou non covalente, avec un marqueur décelable. Comme entités de liaison marquées, les anticorps de l'invention sont particulièrement utiles dans des applications à du diagnostic. Les anticorps anti-hTRT de l'invention peuvent être purifiés à l'aide de procédés connus. Les anticorps entiers, leurs dimères, des chaînes individuelles légères et lourdes ou d'autres formes d'immunoglobuline de la présente invention peuvent être purifiés à l'aide de procédés et de réactifs de la présente invention, selon les modes opératoires normalisés en pratique, ce qui comprend une précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, des colonnes d'affinité, de la chromatographie sur colonne, de l'électrophorèse sur gel et des modes opératoires analogues (voir de façon générale Scopes, "PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE" 3e EDITION (Springer-Verlag, N.Y., 1993)). On préfère des immunoglobulines essentiellement pures ayant une homogénéité d'au moins 90 à 95% environ ou même de 98 à
99% ou davantage.
VI. PURIFICATION DE TELOMERASE HUMAINE
La présente invention propose de la télomérase humaine isolée, ayant une pureté sans précédent. En particulier, la présente invention propose de la hTRT purifiée d'origine recombinante ou non recombinante; des complexes purifiés hTRT-hTR (c'est-à-dire des RNP) d'origine recombinante, non recombinante ou mixte, comprenant éventuellement une ou plusieurs protéines associées à de la télomérase; de la télomérase humaine naturelle purifiée, etc. En outre, l'invention propose des procédés et des réactifs pour purifier partiellement, essentiellement ou très fortement les molécules ci-dessus et les complexes ci-dessus, y compris des variants, des protéines de fusion, des protéines naturelles, etc. (que l'on désigne collectivement comme étant des "hTRT et/ou des
complexes de type hTRT".
Avant le présent exposé, des tentatives ont été effectuées en vue de purifier le complexe de télomérase-enzyme et les tentatives d'obtention d'un produit homogène n'ont eu qu'un succès limité. Les procédés proposés dans les applications précitées fournissent une purification de télomérase allant jusqu'à environ 60 0000 fois ou davantage, en comparaison des extraits cellulaires bruts. La présente invention propose de la hTRT et des complexes de hTRT ayant même une plus grande pureté, en partie du fait de nouveaux réactifs d'immunoaffinité (par exemple des anticorps antihTRT) de la présente invention, et/ou les réactifs, les cellules et les procédés ici proposés pour une expression recombinante de hTRT. Une expression recombinante de hTRT et les complexes de hTRT facilitent la purification, parce qu'il est possible de produire les molécules voulues à des niveaux ou taux bien supérieurs à ceux que l'on trouve dans la plupart des cellules exprimantes naturelles et/ou parce que des cellules de hTRT recombinantes peuvent être modifiées (par exemple par fusion avec un épitope) de sorte que
la molécule peut être facilement purifiée.
On comprendra que de la télomérase naturelle peut être purifiée à partir de n'importe quelle cellule donnant un résultat positif à la recherche de télomérase, et que l'on peut exprimer et purifier de la hTRT recombinante et des complexes de hTRT, notamment, en utilisant n'importe lequel des systèmes d'expression "in vitro", "in vivo", "ex vivo" ou végétal ou animal décrits ci-dessus, ou d'autres systèmes connus en pratique. Dans une forme de réalisation, on purifie la hTRT, la télomérase et d'autres compositions de l'invention en utilisant une étape d'immunoaffinité, isolément ou
en combinaison avec d'autres étapes de purification.
Typiquement, on met un anticorps anti-hTRT, immobilisé ou immobilisable, tel que fourni par la présente invention, en contact avec un échantillon, comme un lysat de cellules,qui contient de la hTRT voulue ou le complexe voulu contenant de la hTRT, dans des conditions dans lesquelles l'anticorps anti-hTRT fixe l'antigène hTRT. Après enlèvement des constituants non liés de l'échantillon, par des méthodes bien connues en pratique, on peut éluer la composition de hTRT, si on le désire, pour la séparer de l'anticorps, sous forme essentiellement pure. Dans une forme de réalisation, on utilise des méthodes de chromatographie par immunoaffinité, bien connues en pratique (voir, par exemple, Harlow et Lane, ci- dessus; et Ausubel, ci-dessus; Hermansan et al., 1992, "IMMOBILIZED
AFFINITY LIGAND TECHNIQUES" [TECHNIQUES UTILISANT DES
LIGANDS D'AFFINITE IMMOBILISES] (Academic Press, San Diego)) selon le procédé de l'invention. Dans une autre forme illustrative de réalisation, on effectue une immunoprécipitation de complexe anti- hTRT/ immunoglobuline/hTRT en utilisant de la protéine A immobilisée. De nombreuses variantes et de nombreux protocoles alternatifs de purification par immunoaffinité, convenant pour servir selon les procédés et les réactifs de l'invention, sont bien
connus de l'homme du métier.
Dans une autre forme de réalisation, on peut purifier des protéines de type hTRT recombinantes, par suite de leur niveau élevé d'expression, en utilisant des procédés routiniers de purification des protéines, comme une précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, des colonnes d'affinité (par exemple, d'immunoaffinité), de l'exclusion en fonction de la taille, de la chromatographie d'échange d'anions et de cations, de l'élecErophorèse sur gel et des procédés analogues (voir, de façon générale, R. Scopes, "PROTEIN PURIFICATION" Springer-Verlag, N.Y. (1982) et Deutscher
"METHODES IN ENZYMOLOGY VOL. 182: GUIDE TO PROTEIN
PURIFICATION, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)) au lieu, ou en plus, des procédés d'immunoaffinité. Des procédés d'échange de cations peuvent être particulièrement utiles en raison du pI basique de la protéine de type hTRT. Par exemple, on peut utiliser du phosphate immobilisé à titre de groupe fonctionnel d'échange de cations (par exemple, de la phosphocellulose P-11, catalogue Whatman n 4071, ou de la "Cellulose Phosphate", catalogue de Sigman n C 3145. Du phosphate immobilisé possède deux caractéristiques avantageuses pour la purification de hTRT: c'est une résine d'échange de cations, et il présente de la ressemblance physique avec la charpente de phosphate de l'acide nucléique. Cela peut permettre une chromatographie d'affinité parce que hTRT fixe hTR et l'ADN télomère. D'autres procédés de chromatographie par affinité d'acides nucléiques, spécifiques et non spécifiques, peuvent également servir à la purification
(par exemple, Alberts et al., 1971, "Methods Enzymol.
21:198"; Arnt-Jovin et al. 1975, Eur. J. Biochem.
54:411; catalogue Pharmacia n 27-5575-02).
L'exploitation supplémentaire de ce rôle de liaison de fixation de hTRT pourrait inclure l'utilisation d'une chromatographie d'affinité d'acide nucléique spécifique (par exemple, amorce de télomérase ou hTR) pour la
purification (Chodosh et al., 1986, Mol. Cell. Biol.
6:4723; Wu et al., 1987, Science 238:1247. Kadonaga, 1991, Methods Enzymol. 208:10); le colorant bleu Cibricon immobilisé, qui présente de la ressemblance physique avec des nucléotides, constitue une autre résine utile pour la purification de hTRT (catalogue Pharmacia n 17-0948-01 ou catalogue Sigman n C 1285), en raison de la liaison de hTRT avec des nucléotides (par exemple, à titre de substrats pour la synthèse
d'ADN).
Dans une forme de réalisation, on isole directement des protéines hTRT à partir d'un système d'expression "in vitro" ou "in vivo", dans lequel d'autres constituants de type télomérase ne sont pas coexprimés. On comprendra que de la protéine hTRT isolée peut être également facilement obtenue à partir de télomérase humaine purifiée ou de complexes de hTRT, par exemple, par rupture de la RNP de télomérase (par exemple, par exposition à un dénaturant doux ou à un autre dénaturant) et séparation des constituants de la RNP (par exemple, par des moyens routiniers comme de la chromatographie ou de la chromatographie d'immunoaffinité). La purification de télomérase peut être surveillée à l'aide d'un essai de dosage d'activité de télomérase (par exemple, l'essai TRAP, l'essai traditionnel, ou un essai amorce-fixation), par mesure de l'enrichissement en hTRT (par exemple, par ELISA), par mesure de l'enrichissement en hTR,ou par d'autres procédés
connus en pratique.
La télomérase humaine purifiée, les protéines de type hTRT et les complexes de hTRT proposés par la présente invention sont, dans une forme de réalisation, hautement purifiés (c'est-à-dire homogènes à au moins 90% environ, plus souvent homogènes à au moins environ %). L'homogénéité peut être déterminée par des moyens classiques ou standard comme une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et par d'autres moyens connus en pratique (voir, par exemple, Ausubel et al., ci-dessus). On comprendra que, bien que l'on souhaite parfois de la télomérase humaine hautement purifiée, des formes de la protéine de type hTRT ou des complexes de hTRT qui sont sensiblement purifiés (par exemple, à au moins 75 %
d'homogénéité) ou qui sont au moins partiel-
lement purifiés par exemple, à au moins 20 % d'homogénéité) sont utiles dans de nombreuses applications, et sont également proposés par la présente invention. Par exemple, de la télomérase partiellement purifiée est utile pour soumettre des composés d'essai à un dépistage de l'activité de modulation de télomérase, et pour d'autres utilisations (voir, ci-après et ci-dessus;
voir le brevet US-A-5 645 986).
VII. TRAITEMENT D'UNE MALADIE APPARENTEE A OU ASSOCIEE
A DE LA TELOMERASE
A) INTRODUCTION
La présente invention propose des polynucléotides de type hTRT, des polypeptides et des anticorps pouvant utilement servir au traitement de maladies humaines et des états maladifs. Les produits du type gène recombinant et hTRT synthétique (protéine et ARNm) de l'invention peuvent servir à créer ou à augmenter l'activité de télomérase dans une cellule, ainsi qu'à inhiber l'activité de télomérase dans des cellules dans lesquelles elle n'est pas souhaitée. Ainsi, une inhibition, l'activation ou modification d'une autre façon de l'activité de télomérase (par exemple, une activité catalytique de télomérase, de la fidélité et possibilité de mise en oeuvre de télomérase, la liaison par fixation de télomérase, etc.) peuvent servir dans une cellule à modifier la capacité de prolifération de la cellule. Par exemple, une diminution de l'activité de télomérase dans une cellule immortalisée, comme une cellule de tumeur maligne, peut rendre la cellule mortelle. Inversement, l'augmentation de l'activité de télomérase dans une cellule mortelle (par exemple, la plupart des cellules somatiques humaines) peut
augmenter la capacité de prolifération de la cellule.
Par exemple, l'expression d'une protéine de type hTRT dans des fibroblastes dermiques, ce qui augmente la longueur de télomère, va aboutir à une plus grande capacité de prolifération de fibroblastes; une telle expression peut ralentir ou inverser le ralentissement, qui dépend de l'àge, d'une fermeture de blessure (voir,
par exemple, West, 1994, Arch. Derm. 130:87).
Ainsi, dans un aspect, la présente invention propose des réactifs et des procédés pouvant utilement servir à traiter des maladies et des étapes caractérisées par la présence, par l'absence ou par la quantité d'une activité de télomérase humaine dans une cellule et qui sont sensibles àun traitement utilisant des compositions et procédés ici révélés. Ces maladies comprennent, comme décrit plus entièrement ci-après, des cancers, d'autres maladies liées à une prolifération cellulaire (notamment des maladies du
vieillissement), des troubles immunologiques, la non-
fécondité (ou la fécondité), etc.
B. TRAITEMENT D'UN CANCER
La présente invention propose des procédés et des compositions pour diminuer l'activité de télomérase
dans des cellules de tumeur et pour traiter du cancer.
Les compositions comprennent des oligonucléotides anti-sens, des peptides, des vecteurs de thérapie. génique codant pour des oligonucléotides anti-sens ou des protéines à rôle d'altération d'activité, et des anticorps anti-hTRT. Des cellules de cancer (par exemple, des cellules d'une tumeur maligne), qui expriment une activité de télomérase (cellules positives à la recherche de la télomérase) peuvent être rendues mortelles par diminution ou inhibition de l'activité de télomérase endogène. En outre, puisque les taux de télomérase sont en corrélation avec des caractéristiques de la maladie comme un potentiel de métastases (voir, par exemple, les brevets US-A-5 639 613; US-A-5 648 215;
US-A-5 489 508; Pandita et al., 1996, Proc. Am. Ass.
Cancer Res. 37:559), n'importe quelle diminution de l'activité de télomérase est susceptible d'abaisser la nature agressive d'un cancer pour la faire parvenir à un état de maladie mieux traitable (augmentation de
l'efficacité d'interventions traditionnelles).
L'invention propose des compositions et des procédés utiles pour traiter des cancers appartenant à n'importe lequel des types très variés, ce qui comprend des tumeurs solides et des leucémies. Des types de cancer pouvant être traités comprennent (sans que cette liste soit limitative): des adénocarcinomes du sein, de la prostate et du colon; toutes formes de carcinome bronchogène du poumon; un état myéloïde; du mélanome; de l'hépatome; des neuroblastomes; des papillomes; des apudomes; des choristomes; des branchiomes, un syndrome carcinoide malin; une maladie du coeur carcinoïde; du carcinome (par exemple, celui de Walker, une cellule de base, basosquameux, de Brown- Pearce, une tumeur de conduit, une tumeur d'Ehrlich, in situ, une tumeur de Krebs 2, une cellule de type merkel, un poumon à cellules de muqueuse non petites, la cellule grumeleuse ou "d'avoine", papillaire, squirreuse, bronchiole, bronchiogénique, une cellule squameuse, et une cellule de type de transition), des troubles histiocytiques; de la leucémie (par exemple, à cellules B, à cellules mixtes, à cellules nulles, à cellules en T, chroniques à cellules en T, associées à HTLV-II, lymphocytique aigué, lymphocytique chronique, à cellules polynucléaires basophiles, et myéloïdes); une histiocytose maligne; une maladie de HodgkinS; l'immunoprolifération de petites cellules; du lymphome qui n'est pas celui de Hodgkins; du plasmacytome; de la réticuloendothéliose; du mélanome; du chondroblastome; du chondrome; du chondrosarcome; du fibrome; du fibrosarcome; des tumeurs à cellules géantes; des histiocytomes; du lipome; du liposarcome; du mésothéliome; du myxome; du myxosarcome; de l'ostéome; de l'ostéosarcome; le sarcome d'Ewings; de synoviome; de l'adénofibrome; de l'adénolymphome; du carcinosarcome; du chordome; du craniopharyngiome; du dysgerminome; de l'hamartome; du mésenchymome; du mésonéphrome; du myosarcome; de l'améloblastome; du cémentome; de l'ondotome; du tératome; du thymome; une tumeur trophoblastique; de l'adénocarcinome; de l'adénome; du cholangiome; du cholestéatome; du cylindrome; du cystadénocarcinome; du cystadénome; de la tumeur à cellules granuleuses; du gynandroblastome; de l'hépatome; de l'hidradénome; une tumeur de cellules en ilots; une tumeur de cellules de Leydig; du papillome; une tumeur à cellules de Sertoli; une tumeur à cellules de théca; du léiomyome; du leiomyosarcome; du myoblastome; du myome; du myosarcome; du rhabdomyome; du rhabdomyosarcome; de l'épendymome; du ganglioneurome; du gliome; du médulloblastome; du méningiome; du neurilemmome; du neuroblastome; du neuroéopithéliome; du neurofibrome; du neurome; du paragangliome; du paragangliome non chromaffine; de l'angiokératome; de l'hyperplasie angiolymphoide avec des eosinophiles; de la sclérose d'angiome; de l'angiomatose; du glomangiome; de l'hémangioendothéliome; de l'hémangiome; de l'hémangiopéricytome; de l'hémangiosarcome; du lymphangiome; du lymphangiomyome; du lymphangiosarcome; du pinéalome; du carcinosarcome; du chondrosarcome; du cystosarcome. phyllodes; du fibrosarcome; de l'hémangiosarcome; du léiomyosarcome; du leucarsarcome; du liposarcome; du lymphangiosarcome; du myosarcome; du myxosarcome; un carcinome ovarien; du rhabdomyosarcome; du sarcome (par exemple, de Ewings, expérimental, de Kaposi et à cellules polynucléaires basophiles); des néoplasmes (par exemple, des os, du sein, de l'appareil digestif, de la zone colorectale, du foie, du pancréas, de la glande pituitaire, des testicules, des orbites, de la tête et du cou, le système nervreux central, de l'appareil acoustique, pelvique, de l'appareil respiratoire, et urogénital); de la neurofibromatose et de la dysplasie cervicale) L'invention propose des compositions et des procédés utiles pour traiter d'autres états dans lesquels des cellules sont devenues immortalisées ou hyperproliférantes, par exemple, par mauvaise régulation (par exemple, par une expression anormalement élevée) de hTRT, de l'enzyme de télomérase, ou de
l'activité de télomérase.
La présente invention propose en outre des compositions et des procédés pour la prévention de cancers, ce qui comprend des vaccins anti-hTRT, des vecteurs de thérapie génique qui empêchent une activation de télomérase, et des vecteurs de thérapie génique qui aboutissent à une mort spécifique
de cellules positives à la recherche de télomérase.
Dans un aspect apparenté, les procédés de thérapie par remplacement de gène que l'on décrit ci-après peuvent servir à "traiter" une prédilection génétique pour
l'apparition de cancers.
C) TRAITEMENT D'AUTRES ETATS
La présente invention propose également des compositions et des procédés utiles pour le traitement des maladies et d'états maladifs (en plus de cancers)
caractérisés par une sous-expression ou une sur-
expression de télomérase ou de produits liés à des gènes de hTRT. Des exemples comprennent: des maladies de type de profilération cellulaire, des maladies résultant d'une sénescence des cellules (notamment des maladies liées au vieillissement), des troubles immunologiques, la stérilité, des maladies liées à un dysfonctionnement du système immunitaire, etc. Certaines maladies du vieillissement sont caractérisées par des modifications associées à une sénescence des cellules, ce qui est dû à une diminution de la longueur des télomères (en comparaison de cellules plus jeunes), résultant de l'absence (ou de taux bien plus faibles) d'activité de télomérase dans la cellule. Une diminution de la longueur des télomères et une diminution de la capacité de réplication contribuent à des maladies telles que celles décrites ci-après. L'activité de télomérase et la longueur des télomères peuvent être augmentées, par exemple, par augmentation du taux des produits de type gène hTRT (protéine et ARNm) dans la cellule. Une liste partielle d'états associés à de la sénescence cellulaire, dans lesquels l'expression de hTRT peut avoir un rôle thérapeutique, comprend la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie d'Huntington et une
attaque brusque, des maladies associées à l'âge de l'in-
tègrement interne comme une atrophie dermique, de l'élastolyse et des rides de la peau, de l'hyperplasie des glandes cébacées, du lentigo (des grains de beauté) sénile, le grisonnement de la chevelure et la perte de cheveux, des ulcères chroniques de la peau, et des difficultés, liées à l'âge, de guérison de cicatrisation de blessures; une maladie de dégénérescence des articulations; de l'ostéoporose; des difficultés du système immunitaire associées à l'âge (impliquant par exemple les cellules comme les lymphocytes B et T, des monocytes, des neutrophiles, des eosinophiles, des basophiles, des cellules NK et leurs progéniteurs respectifs); des maladies, liées à l'âge, du système vasculaire, ce qui comprend l'athérosclérose, de la calcification, de la thrombose, et des anévrismes;le diabète, une atrophie musculaire, des maladies respiratoires, des maladies du foie et de l'appareil digestif, des maladies métaboliques, des maladies endocrines (par exemple, des troubles de la glande pituitaire et de la glande surrénale), des maladies de la reproduction, et de la dégénérescence, liées à l'âge, de la macula de l'oeil. Ces maladies et états peuvent être traités par élévation des taux des produits de type gène de hTRT dans la cellule pour augmenter la longueur des télomères, en restaurant ainsi la capacité de réplication de la cellule ou en
lui conférant une plus grande capacité de réplication.
De tels procédés peuvent être effectués sur des cellules cultivées "ex vivo" ou sur des cellules "in vivo". Dans une forme de réalisation, les cellules sont tout d'abord traitées pour activer la télomérase et allonger les télomères, puis elles sont traitées pour inactiver le gène de type hTRT et l'activité de télomérase. Dans une forme préférée de réalisation, une activité de télomérase est engendrée par un vecteur de l'invention dans un germe d'embryon ou dans une cellule
souche avant ou pendant la différenciation.
La présente invention propose également des procédés et des compositions utiles pour traiter la stérilité. Les cellules de lignée germinale humaines (par exemple des cellules de spermatogonie, leurs progéniteurs ou leurs descendances) sont capables d'une prolifération indéfinie et elles se caractérisent par une grande activité de télomérase. Des taux anormaux ou diminués du produit de gène hTRT peuvent entraîner, par exemple, une production inadéquate ou anormale de spermatozoïdes, conduisant à la stérilité ou à des troubles de la reproduction. Donc, une stérilité "à base de télomérase" peut être traitée à l'aide de procédés et compositions que l'on décrit ici pour augmenter les taux de télomérase. De façon similaire, puisqu'une inhibition de la télomérase peut avoir un effet négatif sur la spermatogénèse, l'oogénèse et la viabilité du sperme et des oeufs,les compositions pour l'inhibition de la télonérase selon l'invention peuvent avoir des effets contraceptifs quand on les utilise pour diminuer les taux de produit de type gène de hTRT dans
des cellules de la lignée germinale.
En outre, l'invention propose des procédés et des compositions pouvant servir à diminuer le potentiel de prolifération de cellules donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase, comme des lymphocytes activés et des cellules de la souche hématopoiétique, par diminution de l'activité de télomérase. Ainsi, l'invention propose des moyens pour effectuer une immunosuppression. Inversement, les procédés et réactifs de l'invention peuvent utilement servir à augmenter l'activité de télomérase et le potentiel de prolifération dans des cellules, comme des cellules souches, qui expriment un faible taux de télomérase ou pas de télomérase du tout avant une intervention thérapeutique.
D) MODES D'INTERVENTION
Ainsi qu'il ressort clairement de l'exposé ci-dessus, une modulation du taux de télomérase ou de l'activité de télomérase dans une cellule peut avoir un effet profond sur le potentiel de prolifération de la cellule et peut avoir ainsi une grande utilité pour le traitement d'une maladie. Comme cela ressort clairement aussi, cette modulation peut être une diminution de l'activité de télomérase ou bien une augmentation de cette activité. Les molécules à rôle de modulation de télomérase de l'invention peuvent agir par un certain nombre de mécanismes; certains de ces mécanismes sont décrits dans la présente sous-section et dans les sections suivantes pour faciliter au praticien le choix des agents thérapeutiques. Cependant, les demandeurs n'entendent pas être limités à un mécanisme particulier d'action quelconque pour les nouveaux composés,
compositions et procédés thérapeutiques ici décrits.
L'activité de télomérase peut être diminuée par l'un quelconque de plusieurs mécanismes ou par des combinaisons de mécanismes. Un mécanisme consiste en la diminution de l'expression de gène de type hTRT pour diminuer l'activité de télomérase. Cette diminution peut se situer au niveau de la transcription du gène de hTRT dans ARNm du traitement (par exemple de l'épissure), du transport nucléaire ou de la stabilité de l'ARNm, la translation de l'ARNm pour produire de la protéine de type hTRT ou influer sur la stabilité et le rôle de la protéine de type hTRT. Un autre mécanisme consiste en une interférence avec une ou plusieurs activités de télomérase (par exemple, l'activité de catalyse et de transcription réverse, ou l'activité de liaison de fixation de hTR) utilisant des acides nucléiques inhibiteurs, des polypeptides ou d'autres agents (par exemple, des produits mimétiques, de
petites molécules, des médicaments et des pro-
médicaments), que l'on peut identifier à l'aide des procédés révélés ici ou qui sont fournis ou proposés par les compositions révélées ici. D'autres mécanismes comprennent la séquestration de protéines associées à hTR et/ou à de la télomérase, et une interférence avec un assemblage de la RNP de télomérase à partir de ses sous-unités constituantes. Dans un mécanisme apparenté, une séquence de promoteur de hTRT est fonctionnellement liée à un gène codant pour une toxine et elle est introduite dans une cellule, si ou bien quand les activateurs de transcription de hTRT sont exprimés ou activés dans la cellule, la toxine va alors être exprimée, ce qui aboutit à une destruction spécifique
de la cellule.
Un procédé apparenté pour diminuer la capacité de prolifération d'une cellule implique l'introduction d'un variant de hTRT à basse fidélité (c'est-à-dire, un variant comportant un taux d'erreur élevé, par exemple supérieur à 1%), ce qui provoque la synthèse de répétitions de télomères aberrantes. Ces répétitions aberrantes affectent la liaison de fixation de protéines de télomères et conduisent à des ré-arrangements de chromosomes et à des aberrations et/ou conduisent à la
mort de la cellule.
De façon similaire, l'activité de télomérase peut être augmentée grâce à l'un quelconque des divers mécanismes ou par une combinaison de mécanismes. Cela inclut l'augmentation de la quantité de hTRT dans une cellule. Habituellement, cela est effectué par l'introduction dans la cellule d'un polynucléotide codant pour un polypeptide de type hTRT (par exemple un polypeptide produit par recombinaison comprenant une séquence d'ADN de hTRT fonctionnellement liée à un promoteur, ou un ARNm de type hTRT stable). En variante, un polypeptide de type hTRT catalytiquement actif peut être lui-même introduit dans une cellule ou dans du tissu, par exemple par microinjection ou d'autres moyens connus en pratique. Dans d'autres mécanismes, l'expression provenant du gène hTRT endogène ou la stabilité des produits de type gène hTRT dans la cellule peut être augmentée. L'activité de télomérase dans une cellule peut également être augmentée par interférence avec l'interaction d'inhibiteurs endogènes de télomérase et de RNP de télomérase, ou bien des répresseurs endogènes et de transcription de hTRT et de gène de hTRT, par augmentation de l'expression ou de l'activité d'activateurs de transcription de hTRT, et d'autres moyens qui apparaîtront à l'homme du métier passant en
revue le présent expose.
E) AGENTS D'INTERVENTION
1) PROTEINES & PEPTIDES DE TYPE TRT
Dans une forme de réalisation, l'invention propose
des polypeptides modulateurs de la télomérase (c'est-à-
dire des protéines, des polypeptides et des peptides) qui augmentent ou diminuent l'activité de télomérase, que l'on peut introduire directement dans une cellule cible (par exemple, par injection, fusion avec médiation par des liposomes, application d'un hydrogel à la surface de la tumeur [par exemple, un mélanome], fusion ou fixation avec la protéine VP22 de structure du virus de l'herpès, et d'autres moyens décrits ici et connus en pratique). Dans une seconde forme de réalisation, les protéines et peptides modulateurs de télomérase, de l'invention, sont exprimés dans une cellule par introduction d'un acide nucléique (par exemple, un vecteur d'expression d'ADN ou de l'ARNm) codant pour la
protéine voulue ou un, peptide dans la cellule.
L'expression peut être constitutive ou inductible selon le vecteur et le choix du promoteur (voir une étude ci-après). Des préparations d'ARN messager (ARNm) codant pour hTRT sont particulièrementutiles quand on souhaite seulement une expression transitoire (par exemple, l'activation transitoire de télomérase). Des procédés pour introduire et pour obtenir l'expression d'acides nucléiques dans une cellule sont bien connus en pratique (voir également quelque part ci-après et dans le présent exposé, par exemple dans les sections
concernant les oligonucléotides et les procédés de trai-
tement par les gènes).
Dans un autre aspect de l'invention, un polypeptide modulant la télomérase et qui augmente
l'activité de télomérase dans une cellule est proposé.
Dans une forme de réalisation, le polypeptide est un polypeptide de type hTRT catalytiquement actif, capable (de concert avec une matrice d'ARN comme hTR) de diriger la synthèse d'ADN télomère humain. Cette activité peut être mesurée, comme étudié ci-dessus, par exemple à l'aide d'une composition de dosage d'activité de télomérase comme une composition d'essai TRAP. Dans une forme de réalisation, le polypeptide est une protéine de type hTRT de pleine longueur, ayant une séquence de, ou sensiblement identique à, la séquence de 1132 restes dela "SEQUENCE ID N 2". Dans une autre forme de réalisation, le polypeptide est un variant de la protéine de type hTRT de la SEQUENCE ID N 2, comme un polypeptide de fusion, un produit de dérivation de polypeptide, un polypeptide tronqué, un polypeptide à substitution(s) conservatrice(s), un polypeptide à activité modifiée, etc. Une protéine de fusion ou un dérivé de protéine peut inclure un fragment à rôle de recherche de cible, qui augmente l'aptitude du polypeptide à traverser une membrane de cellule ou provoque la délivrance du polypeptide à un type spécifié de cellules (par exemple des cellules du foie ou des cellules d'une tumeur) de manière préférentielle ou à un compartiment de cellules (par exemple un compartiment nucléaire), de préférence. Des exemples de fragments à rôle de recherche de cible comprennent des queues de lipides, des séquences d'aminoacides comme du peptide "antennapoedia" ou un signal de localisation nucléaire (LSN; par exemple de la nucléoplasmine de Xenopus, Robbins et al., 1991, Cell 64:615). De la protéine de type hTRT naturelle (ayant par exemple une séquence ou étant sensiblement identique à la "SEQUENCE ID N 2" agit dans le noyau de cellule. Ainsi, il est probable qu'une ou plusieurs sous- séquences de la "SEQUENCE ID N 2", comme des restes 193-196 (PRRR) et des restes 235-240 (PKRPRR) agissent comme constituant un signal de localisation nucléaire. Les petites régions sont probablement des SLN, si l'on se fonde sur l'observation selon laquelle les nombreux SLN comprennent un groupe de 4 restes composés d'aminoacides basiques (K ou R), ou composés de 3 aminoacides basiques (K ou R) et de H ou P; un motif ou modèle de départ avec P et suivi, dans 3 restes, par un segment basique contenant 3 restes K ou R sur 4 restes (voir, par exemple, Nakai et al., 1992, Genomics 14:897). On s'attend à ce qu'une délétion d'une séquence ou des deux et/ou des séquences supplémentaires de localisation interfèrent avec le transport de hTRT vers le noyau et/ou augmentent la rotation de hTRT, et peut servir à éviter l'accès de la télomérase à ses substrats nucléaires et à diminuer le potentiel de prolifération. En outre, un polypeptide de type hTRT variant et manquant de SLN peut se former et s'assembler dans une RNP mais ne sera pas capable de conserver la longueur de télomère parce que l'enzyme résultante ne peut pénétrer dans le noyau. Les polypeptides de type hTRT de l'invention vont typiquement être associés dans la cellule cible à un ARN de télomérase, comme hTR, notamment quand ils servent à augmenter l'activité de télomérase dans une cellule. Dans une forme de réalisation, un polypeptide de type hTRT introduit s'associe avec une hTR endogène pour former une RNP (ribonucléoprotéine) catalytiquement active (par exemple une RNP comprenant hTR et un polypeptide de pleine longueur ayant une séquence de la "SEQUENCE ID N 2"). La RNP ainsi formée peut aussi s'associer à d'autres protéines, par exemple les protéines associées à la télomérase. Dans d'autres formes de réalisation, de la RNP de télomérase (contenant de la protéine de type hTRT, hTR et éventuellement d'autres constituants) est introduite
sous forme de complexe dans la cellule cible.
Dans une forme apparentée de réalisation, un vecteur d'expression de hTRT est introduit dans une cellule (ou dans une descendance d'une cellule) dans laquelle un vecteur d'expression d'ARN de télomérase (par exemple hTR) est simultanément introduit, a été
introduit par la suite ou a été précédemment introduit.
Dans cette forme de réalisation, la protéine de type hTRT et l'ARN de télomérase sont co-exprimés dans la cellule et s'assemblent pour former une RNP de télomérase. Un ARN de télomérase préféré est hTR. Un vecteur d'expression utile pour l'expression de hTR dans une cellule est décrit ci-dessus (voir le brevet US-A-5 583 016). Dans une autre forme encore de réalisation, le polypeptide de type hTRT et i'ARN de hTR (ou un équivalent) sont associés "in vitro" pour former un complexe qui est ensuite introduit dans les cellules cibles, par exemple, par un transfert réalisé
avec médiation par des liposomes.
Dans un autre aspect, l'invention propose des polypeptides de type hTRT utiles pour abaisser l'activité de télomérase dans une cellule. Comme ci-dessus, ces polypeptides "inhibiteurs" peuvent être introduits directement, ou par expression d'acides nucléiques recombinants dans la cellule. On comprendra que les agents mimant ou ressemblant à des peptides ou des polypeptides comprenant des aminoacides non standard (c'est-à-dire autres que les 20 aminoacides codés par le code génétique ou leurs dérivés normaux)
vont typiquement être introduits directement.
Dans une forme de réalisation, une inhibition de l'activité de télomérase provient de la séquestration d'un composant nécessaire pour un allongement précis de télomère. Des exemples de tels composants sont représentés par hTRT et par hTR. Ainsi, l'administration d'un polypeptide qui fixe hTR, mais qui n'a pas d'activité catalytique de télomérase, peut diminuer l'activité de télomérase endogène dans la cellule. Dans une forme apparentée de réalisation, le polypeptide de type hTRT peut fixer un constituant cellulaire autre que hTR, comme une ou plusieurs protéines associées à de la télomérase, en interférant avec ou en gênant l'activité de télomérase dans la cellule. Dans une autre forme de réalisation, des polypeptides de type hTRT de l'invention interfèrent (par exemple, par compétition) avec l'interaction d'une protéine de type hTRT à expression endogène et avec un autre constituant cellulaire nécessaire pour la fonction de télomérase, comme hTR, de l'ADN télomère, des protéines associées à de la télomérase, des protéines associées à des télomères, des télomères, des protéines de "contrôle" ou de maîtrise des cycles cellulaires, des enzymes de réparation d'ADN, des protéines chromosomiques de type ou comportant de l'histone ou ne comportant pas d'histone, etc. Lors du choix de molécules (par exemple, des polypeptides) de l'invention qui affectent l'interaction d'une protéine de type hTRT à expression endogéne et d'autres constituants cellulaires, on peut préférer des molécules qui comprennent un ou plusieurs des motifs conservés de laprotéine de type hTRT comme décrit ici. La conservation évolutive de ces régions indique le rôle important dans le fonctionnement approprié d'une télomérase humaine à laquelle ces motifs contribuent, et les motifs sont ainsi généralement des sites utiles pour modifier le rôle de la protéine de type hTRT pour créer des protéines variantes de type hTRT de l'invention. Ainsi, des polypeptides de type hTRT, variant et ayant des mutations dans les motifs conservés, seront particulièrement utiles pour certaines applications de l'invention. Dans une autre forme de réalisation, l'expression du gène de hTRT endogène est réprimée par introduction dans la cellule d'une grande quantité de polypeptides de type hTRT (par exemple, typiquement, au moins 2 fois environ plus que le taux endogène, plus souvent au moins environ 10 à environ 100 fois), agissant par l'intermédiaire d'une boucle de rétroaction pour inhiber la transcription du gène de hTRT, le traitement de pré-ARNm de hTRT, la translation de l'ARNm de hTRT, ou l'assemblage et le transfert de la RNP de télomérase.
2) OLIGONUCLEOTIDES
a) CONSTRUCTIONS ANTI-SENS L'invention propose des procédés et des réactifs du type oligonucléotide ou polynucléotide anti-sens, pouvant servir à diminuer l'expression "in vitro" ou
"in vivo" des produits de type gène hTRT.
L'administration des réactifs anti-sens de l'invention à une cellule cible a pour résultat une diminution d'activité de télomérase, et cela est particulièrement utile pour le traitement de maladies caractérisées par une activité élevée de la télomérase (par exemple, des cancers). Sans entendre se limiter par un mécanisme particulier quelconque, on pense que des oligonucléotides anti-sens se fixent sur l'ARNm de type hTRT de sens et interfèrent avec la translation. En variante, la molécule anti-sens peut rendre l'ARNm de type hTRT sensible à une digestion par de la nucléase, peut interférer avec de la transcription, interférer avec des processus de traitement, avec la localisation ou agir d'une autre façon avec les précurseurs de l'ARN ("pré-ARNm"), réprimer la transcription de l'ARNm à partir du gène de type hTRT, ou agir par quelque autre mécanisme. Cependant, le mécanisme particulier par lequel la molécule anti-sens diminue l'expression de
hTRT n'est pas fondamental.
Les polynucléotides anti-sens de l'invention comprennent une séquence anti-sens d'au moins 7 à 10 à typiquement 20 ou plus de 20 nucléotides qui se fixent par hybridation sur une séquence d'ARNm codant pour hTRT ou ARNm transcrit par le gène de type hTRT. Plus souvent, le polynucléotide anti-sens de l'invention a une longueur correspondant à environ 10 à environ nucléotides ou a une longueur d'environ 14 à environ nucléotides. Dans d'autres formes de réalisation, les polynucléotides anti-sens sont des polynucléotides ayant moins d'environ 100 nucléotides ou ayant moins d'environ 200 nucléotides. En général, le polynucléotide anti-sens doit avoir une longueur suffisante pour former un duplex stable mais être assez court, selon le mode de délivrance ou pour permettre une administration "in vivo", si on le désire. La longueur minimale d'un polynucléotide, nécessaire pour une formation d'hybride spécifique par fixation sur une séquence cible, dépend de plusieurs facteurs, comme la teneur en G/C, la position des bases non accordées (s'il y en a), le degré de caractère unique de la séquence en comparaison de la population de polynucléotides cibles, et la nature chimique du polynucléotide (par exemple, un squelette de méthylphosphonate, de l'acide nucléique de peptide, du
phosphorothioate), parmi d'autres facteurs.
De façon générale, pour garantir une hybridation spécifique, la séquence anti-sens est essentiellement complémentaire de la séquence d'ARNm de type hTRT constituant une cible. Dans certaines formes de réalisation, la séquence anti-sens est exactement complémentaire de la séquence cible. Les polynucléotides anti-sens peuvent également comprendre, cependant, des substitutions de nucléotides, des additions, des délétions de nucléotides, des transitions, des transpositions ou des modifications, ou d'autres séquences d'acides nucléiques ou des fragments qui ne sont pas de l'acide nucléique, tant qu'une liaison spécifique de fixation sur la séquence cible pertinente, correspondant à l'ARN de type hTRT ou à son gène, est conservée comme propriété fonctionnelle
du polynucléotide.
Dans une forme de réalisation, la séquence anti-
sens est complémentaire de séquences relativement accessibles de l'ARNm de type hTRT (par exemple,
relativement dépourvue d'une structure secondaire).
Cela peut être déterminé par l'analyse de structures secondaires d'ARN prédites en utilisant, par exemple, le programme MFOLD (Genetics Computer Group, Madison Wi, Etats-Unis d'Amérique) et en effectuant des essais "in vitro" ou "in vivo" comme cela est connu en pratique. Des exemples d'oligonucléotides pouvant être testés dans des cellules pour déceler une suppression anti-sens de fonction hTRT sont ceux capables de se fixer par hybridation sur (c'est-à- dire, d'être essentiellement complémentaires de) les positions suivantes de la "SEQUENCE ID N 1": 40-60; 260-280;
500-520; 770-790; 885-905; 1000-1020; 1300-1320;
1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470; 2670-2690;
3080-3110; 3140-3160; et 3690-3710. Un autre procédé utile pour identifier les compositions anti-sens efficaces utilise des réseaux constituant des combinaisons d'oligonucléotides (voir, par exemple,
Milner et al., 1997, Nature Biotechnology 15:537).
L'invention propose également un polynucléotide anti-sens qui a des séquences en plus de la séquence anti-sens (c'est-à-dire en plus de la séquence anti-sens hTRT). Dans ce cas, la séquence anti-sens est contenue
au sein d'un polynucléotide d'une plus grande séquence.
Dans une autre forme de réalisation, la séquence du polynucléotide consiste essentiellement en la séquence
anti-sens ou est constituée par la séquence anti-sens.
Les acides nucléiques anti-sens (ADN, ARN, modifiés, analogues, etc.) peuvent être obtenus à l'aide de n'importe quel procédé convenable pour produire un acide nucléique, comme la synthèse chimique et les procédés de recombinaison ici décrits. Dans une forme de réalisation, par exemple, des molécules d'ARN anti-sens de l'invention peuvent être préparées par synthèse chimique "de novo" ou par clonage. Par exemple, un ARN anti-sens, qui se fixe par hybridation sur l'ARNm de type hTRT, peut être produit par insertion (ligature) d'une séquence d'ADN de type hTRT (par exemple, la "SEQUENCE ID N 1", ou des fragments de cette séquence) dans une orientation réverse fonctionnellement liée à un promoteur dans un vecteur (par exemple, un plasmide). A la condition que le promoteur et, de préférence, des signaux de terminaison et de polyadénylation, soient positionnés de façon appropriée, le brin de la séquence insérée correspondant au brin non codant va être transcrit et jouer le rôle d'un oligonucléotide anti-sens de l'invention. Les oligonucléotides anti-sens de l'invention peuvent servir à inhiber une activité de télomérase dans des extraits dépourvus de cellule, dans des cellules et dans des animaux, ce qui comprend des mammifères et êtres humains. Par exemple, les oligonucléotides anti-sens de type phosphorothiate:
A) 5'-GGCATCGCGGGGGTGGCCGGG
B) 5'-CAGCGGGGAGCGCGCGGCATC
C) 5'-CAGCACCTCGCGGTAGTGGCT
D) 5'-GGACACCTGGCGGAAGGAGGG
peuvent servir à inhiber une activité de télomérase. A une concentration 10 micromolaire de chaque oligonucléotide, des mélanges des oligonucléotides A et B; A, B, C et D; et A, C et D ont inhibé l'activité de télomérase dans 293 cellules en cas de traitement une fois par jour durant sept jours. On a également observé une inhibition quand on a utilisé une molécule de hTR anti-sens (5'- GCTCTAGAATGAAGGGTG-3') en combinaison avec des oligonucléotides A, B et C; A, B et D; et A et C. D'utiles oligonucléotides de commande dans de telles expériences comprennent: Si) 5'-GCGACGACTGACATTGGCCGG
S2) 5'-GGCTCGAAGTAGCACCGGTGC
S3) 5'-GTGGGAACAGGCCGATGTCCC
Pour déterminer l'oligonucléotide anti-sens de l'invention qui est optimal pour l'application particulière intéressante, on peut effectuer un balayage en utilisant des groupes d'oligonucléotides anti-sens de l'invention. Un groupe illustratif est le groupe de 30 oligonucléotides mères qui couvrent l'ARNm de type hTRT et qui sont décalés l'un par rapport au suivant de 15 nucléotides (c'est-à-dire, que ON1 correspond aux positions 1-30 et est TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 correspond aux positions 16- 45 et est GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, et ON3 correspond aux positions 31-60 et est GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT, et ainsi de suite jusqu'à la fin de l'ARNm). Chaque membre de ce groupe peut être testé pour déceler l'activité d'inhibition, comme ici décrit. Les oligonucléotides qui montrent une activité d'inhibition dans les conditions intéressantes identifient alors une région intéressante, et d'autres oligonucléotides de l'invention correspondant à la région intéressante (c'est-à-dire, des régions à 8-mères, 10-mères, 15-mères, etc.) peuvent être soumis à des essais pour identifier l'oligonucléotide ayant
l'activité préférée pour l'application.
Pour des procédés généraux concernant les polygonucléotides anti-sens, voir "ANTISENSE RNA AND
DNA, (1988), [ARN ET ADN ANTI-SENS],(1988), D.A.
Melton, Ed. Cold Sping Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EtatsUnis d'Amérique. Voir également,
Dagle et al., 1991, Nucleic Acids Research, 19:1805.
Pour un passage en revue d'une thérapie anti-sens, voir, par exemple, Uhlmann et al., Chem. Reviews,
:543-584 (1990).
b) OLIGO- ET POLY-NUCLEOTIDES EN TRIPLEX La présente invention propose des oligonucléotides et des polynucléotides (par exemple, l'ADN, ARN, PNA ou analogues) qui se fixent sur des acides nucléiques de type hTRT à double brin ou en duplex (par exemple, dans une région pliée de l'ARN de type hTRT ou dans le gène de type hTRT), en formant un acide nucléique contenant
une hélice triple ou un acide nucléique "en triplex".
Une formation d'hélice triple aboutit à inhiber l'expression de hTRT, par exemple, en empêchant la transcription du gène de type hTRT, ce qui diminue ou élimine l'activité de télomérase dans une cellule. Sans vouloir se lier par un mécanisme particulier quelconque, on pense que la combinaison d'appariement en hélice triple compromet l'aptitude de la double hélice à s'ouvrir suffisamment pour que se produise la liaison de polymérases, ou que se présentent des facteurs de transcription ou des molécules régulatrices. La construction en triplex d'oligonucléotides et de polynucléotides de l'invention est effectuée en utilisant les règles concernant les paires de bases de la formation d'une hélice triple (voir, par exemple, Cheng et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:15110; Ferrin et Camerini-Otero, 1991, Science 354:1494; Ramdas et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:17395; Strobel et al., 1991, Science 254:1639; et Rigas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9591; chacun de ces textes étant incorporé ici par référence) et la séquence d'ARNm de type hTRT et/ou la séquence de gène. Typiquement, les oligonucléotides formant l'invention, formateurs de triplex, comprennent une séquence spécifique d'environ à environ 25 nucléotides ou une séquence plus longue "complémentaire" d'une séquence spécifique dans l'ARN de type hTRT ou dans le gène (c'est-à-dire suffisamment grande pour former une hélice triple stable mais assez petite, selon le mode de délivrance, pour une administration "in vivo", si on le désire). Dans le contexte, "complémentaire" signifie capable de former une hélice triple stable. Dans une forme de réalisation, des oligonucléotides sont destinés à se fixer spécifiquement sur les régions régulatrices du gène de type hTRT (par exemple, la séquence de flanc en ' de type hTRT, des promoteurs, et des amplificateurs) ou sur le site d'amorçage de transcription (par exemple entre -10 et +10 à partir du site d'amorçage de transcription). Pour un passage en revue de progrès thérapeutiques récents utilisant de l'ADN en triplex, voir Gee et al., dans Huber et Carr, 1994, "MOLECULAR
AND IMMUNOLOGIC APPROACHES" [APPROCHES MOLECULAIRES ET
IMMUNOLOGIQUES], Futura Publishing Co, Mt Kisco NY (Etats-Unis d'Amérique) et Rinisland et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5854, qui sont tous deux
incorporés ici par référence.
c) RIBOZYMES (ou ribosomes) La présente invention propose également des ribozymes pouvant utilement servir à inhiber une activité de télomérase. Les ribozymes de l'invention fixent, clivent spécifiquement et inactivent l'ARNm de type hTRT. D'utiles ribozymes peuvent comprendre des séquences terminales en 5' et en 3' complémentaires de l'ARNm de type hTRT, et l'homme du métier peut les traiter sur la base de la séquence d'ARNm de type hTRT ici décrite (voir la publication PCT WO 93/23572, ci-dessus). Les ribozymes de l'invention comprennent celles ayant des caractéristiques de ribozymes d'intron de groupe I (Cech, 1995, Biotechnology 13:323) et d'autres ribozymes en forme de tête de marteau
(Edgington! 1992, Biotechnology 10:256).
Les ribozymes de l'invention comprennent celles
* ayant des sites de clivage comme GUA, GUU et GUC.
D'autres sites de clivage optimal pour une inhibition avec médiation par des ribozymes d'une activité de télomérase selon la présente invention comprennent ceux décrits dans les publications PCT WO 94/02595 et WO 93/23569, publications qui sont toutes deux incorporées ici par référence. Des oligonucléotides courts de type ARN, ayant une longueur comprise entre et 20 ribonucléotides et correspondant à la région du gène de type hTRT constituant une cible contenant le site de clivage, peuvent être évalués pour en déterminer des caractéristiques de structure secondaire pouvant rendre l'oligonucléotide plus intéressant. La convenabilité des sites de clivage peut également être évaluée par une vérification de l'accessibilité à une hybridation à l'aide d'oligonucléotides complémentaires en utilisant des dosages de protection par de la ribonucléase, ou par des essais de vérification d'activité de ribozymes "in vitro" selon des modes opératoires courants ou normalisés connus en pratique. Comme décrit par Hu et al., dans la publication PCT WO 94/03596, incorporée ici par référence, des fonctions anti-sens et ribozymes peuvent être combinées dans un seul oligonucléotide. En outre, des ribozymes peuvent comprendre un ou plusieurs nucléotides modifiés ou des liaisons modifiées entre des nucléotides, comme
décrit ci-dessus à propos de la description
d'oligonucléotides anti-sens constituant des exemples
de l'invention.
Dans une forme de réalisation, les ribozymes de l'invention sont engendrés "in vitro" et introduits dans une cellule ou dans un patient. Dans une autre forme de réalisation, des méthodes de thérapie génique servent à l'expression de ribozymes dans une cellule
cible, "ex vivo" ou "in vivo".
d) ADMINISTRATION D'OLIGONUCLEOTIDES Typiquement, les procédés thérapeutiques de il'invention impliquent l'administration d'un oligonucléotide qui a pour rôle d'inhiber ou de stimuler l'activité de télomérase dans des conditions physiologiques de l'être vivant ("in vive") et qui est relativement stable dans ces conditions pendant une période de temps suffisante pour obtenir un effet thérapeutique. Comme noté ci-dessus, des acides nucléiques modifiés peuvent utilement servir à conférer une telle stabilité, ainsi qu'à réaliser une délivrance de l'oligonucléotide au tissu, à l'organe ou à la
cellule que l'on souhaite atteindre comme cible.
Des oligonucléotides et des polynucléotides peuvent être délivrés directement sous forme d'un médicament dans une formulation pharmaceutique convenable, ou indirectement par introduction d'un acide nucléique dans une cellule, ce qui comprend des liposomes, des immunoliposomes, une introduction balistique, une introduction directe dans des cellules, et des méthodes analogues, comme décrit ici. Pour traiter une maladie, les oligonucléotides de l'invention seront administrés à un patient en une quantité thérapeutiquement efficace. Une quantité thérapeutiquement efficace est une quantité suffisante pour influer dans un sens favorable (pour "améliorer") les symptômes de la maladie ou pour moduler une activité de télomérase dans la cellule cible, comme cela peut par exemple être mesuré à l'aide d'un essai de dosage TRAP ou à l'aide d'un autre essai de dosage convenable du rôle biologique de télomérase. Des procédés pouvant utilement servir à la délivrance d'oligonucléotides à des fins thérapeutiques sont décrits dans le brevet US-A-5 272 065, incorporé ici par référence. D'autres détails d'administration de composés pharmaceutiquement actifs sont présentés ci-après. Dans une autre forme de réalisation, des polygonucléotides et des polynucléotides peuvent être délivrés à l'aide d'une thérapie génique et de plasmides d'expression d'ADN recombinant de l'invention.
3) THERAPIE GENIQUE
L'expression de thérapie génique se réfère à l'introduction d'un polynucléotide par ailleurs exogène, qui produit un effet phénotypique médicalement utile sur une ou des cellules de mammifère (typiquement) dans laquelle ou lesquelles il est transféré. Dans un aspect, la présente invention propose des procédés et des compositions de thérapie génique pour traiter des états associés à un effet de télomérase. Dans des exemples de forme de réalisation, la thérapie génique implique l'introduction dans une cellule d'un vecteur qui exprime un produit de type gène de hTRT (comme une protéine de type hTRT essentiellement semblable au polypeptide de type hTRT ayant une séquence de "SEQUENCE ID N 2, par exemple pour augmenter l'activité de télomérase, ou un polypeptide de type hTRT inhibiteur pour abaisser l'activité), qui exprime un acide nucléique ayant un
gène de hTRT ou une séquence d'ARNm (comme un ARN anti-
sens, par exemple pour diminuer une activité de télomérase), qui exprime un polypeptide ou un polynucléotide qui, sinon, influe sur l'expression de produit de type gène de hTRT (par exemple une ribozyme visant ARNm de type hTRT pour diminuer une activité de télomérase), ou qui remplace ou rompt une séquence de hTRT endogène (par exemple du remplacement de gène et de "l'élimination de gène", respectivement). De nombreuses autres formes de réalisation seront évidentes pour l'homme du métier qui passera en revue le présent exposé. Dans une forme de réalisation, un vecteur codant pour hTR est également introduit. Dans une autre forme de réalisation, des vecteurs codant pour les protéines associées à la télomérase sont
également introduits avec ou sans un vecteur pour hTR.
Les vecteurs utiles dans la thérapie génique de hTRT peuvent être viraux ou non viraux, et ils comprennent ceux décrits ci-dessus à propos du système d'expression de hTRT de l'invention. L'homme du métier comprendra que les vecteurs de thérapie génique peuvent comprendre des promoteurs et autres séquences régulatrices ou de traitement, telles qu'elles sont décrites dans le présent exposé. Habituellement, le vecteur va comprendre un promoteur et, éventuellement, un amplificateur (séparé de n'importe quel amplificateur contenu au sein de la séquence de promoteur), servant à entraîner une transcription d'un oligonucléotide, ainsi que d'autres éléments régulateurs qui assurent un maintien d'entretien épisomique ou une intégration de chromosomes et d'une transcription d'un niveau élevé, si on le désire. Un plasmide utile pour de la thérapie génique peut comprendre d'autres éléments fonctionnels, comme des marqueurs choisissables, des régions d'identification et d'autres séquences. Les séquences supplémentaires peuvent avoir pour rôles deconférer de la stabilité à l'extérieur et aussi bien à l'intérieur d'une cellule, de cibler la délivrance de séquences de nucléotides de type hTRT (sens ou anti-sens) vers un organe spécifié, un tissu ou vers une population de cellules, de jouer un rôle de médiation dans l'entrée dans une cellule, de médiation dans l'entrée dans le noyau d'une cellule et/ou de médiation dans l'intégration au sein d'ADN nucléaire. Par exemple, des structures d'ADN de type aptamère ou d'autres sites de fragments de liaison de protéine peuvent servir à assurer une liaison, par médiation d'un vecteur, à des récepteurs superficiels d'une cellule ou à des protéines de sérum qui se fixent sur un récepteur, de façon à augmenter l'efficacité du transfert d'ADN dans la cellule. D'autres sites d'ADN et d'autres structures peuvent se fixer directement ou indirectement à des récepteurs présents dans la membrane du noyau ou sur d'autres protéines pénétrant dans le noyau, en facilitant ainsi une absorption d'un vecteur par le noyau. D'autres séquences d'ADN peuvent affecter directement ou indirectement l'efficacité de
l'intégration.
Des vecteurs convenables pour une thérapie génique peuvent, ou ne peuvent pas, avoir une origine de réplication. Par exemple, il est utile d'inclure une origine de réplication dans un vecteur pour la propagation du vecteur avant administration à un patient. Cependant, l'origine de la réplication peut souvent être enlevée avant l'administration, si le vecteur est conçu en vue de s'intégrer dans l'ADN de chromosome de l'hôte ou pour se fixer sur de l'ARNm ou de l'ADN de l'hôte. Dans certaines situations (par exemple des cellules de tumeur), il peut ne pas s'avérer nécessaire que l'ADN exogène s'intègre de façon stable à la cellule soumise à transduction, car une expression transitoire peut suffire à tuer des
cellules de la tumeur.
Comme noté, la présente invention propose également des procédés et des réactifs pour une thérapie de remplacement de gène (c'est-à-dire remplacement par recombinaison homologue d'un gène de
type hTRT endogène remplacé par un gène recombinant).
Des vecteurs spécifiquement conçus pour une intégration
par recombinaison homologue peuvent utilement servir.
Les facteurs importants pour l'optimisation d'une recombinaison homologue comprennent le degré d'identité de séquence et la longueur d'homologie avec des séquences de chromosome. La séquence spécifique exerçant un rôle de médiation sur la recombinaison homologue est également importante, parce qu'une intégration se produit bien plus facilement dans de l'ADN ayant une activité de transcription. Des procédés et des matières pour construire des produits homologues à rôle de recherche de cible sont décrits, par exemple, par Mansour et al., 1988, Nature 336:348; Bradley et al., 1992, Bio/Technology 10:534. Voir également, les brevets US-A-5 627 059; US-A-5 487 992; US-A-5 631 153; et US-A-5 464 764. Dans une forme de réalisation, une thérapie de remplacement de gène implique la modification ou le remplacement de la totalité ou d'une partie des séquences régulatrices commandant ("contrôlant") l'expression du gène de type hTRT qui est à réguler. Par exemple, les séquences de promoteur de hTRT (par exemple telles qu'on les trouve dans la "SEQUENCE ID N 6") peuvent être rompues (pour diminuer l'expression de hTRT ou pour abolir un site de commande de transcription) ou bien un promoteur exogène (destiné par exemple à augmenter une expression de hTRT) peut
être introduit comme substituant.
L'invention propose également des procédés et des réactifs pour une "élimination de gène" de type hTRT (c'es-à-dire une délétion ou une rupture par recombinaison homologue d'un gène de type hTRT endogène
en utilisant un vecteur produit par recombinaison).
Dans une élimination de gène, les séquences constituant des cibles peuvent être des séquences régulatrices (par exemple le promoteur de type hTRT) ou des séquences
codant pour de l'ARN ou pour une protéine.
L'utilisation d'une recombinaison homologue pour altérer l'expression de gènes endogènes est décrite en détail dans les brevets US-A-5 272 071 (et les brevets des Etats-Unis d'Amérique ci-dessus), les éléments de brevet WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411; WO 95/31560 et WO 91/12650. Voir également Moynahan et
al., 1996, Hum. Mol. Genet. 5:875.
L'invention propose en outre des procédés pour tuer spécifiquement des cellules donnant un résultat positif à la recherche de télomérase, ou pour empêcher une transformation de cellules, donnant un résultat négatif à la recherche de télomérase, vers un état de résultat positif à la recherche de télomérase, en utilisant le promoteur de gène de type hTRT pour réguler l'expression d'une protéine toxique pour la cellule. Comme montré dans l'exemple 14, une séquence de promoteur de type hTRT peut être liée fonctionnellement à un gène rapporteur de sorte qu'une activation du promoteur aboutit à l'expression de la protéine codée par le gène rapporteur. Si, au lieu d'une protéine de report, la protéine contrôlée par codage est toxique pour la cellule, une activation du promoteur conduit à une morbilité ou à une mort de la cellule. Dans une forme de réalisation de la présente invention, un vecteur comprenant un promoteur de type hTRT fonctionnellement lié à un gène codant pour une protéine toxique est introduit dans des cellules, comme des cellules humaines, par exemple des cellules présentes dans un patient humain, ce qui aboutit à la mort de cellules dans lesquelles des facteurs d'activation du promoteur de type hTRT sont exprimés, comme des cellules de cancer. Dans une forme apparentée de réalisation, la protéine introduite par codage n'est pas elle-même toxique pour une cellule, mais elle code pour provoquer une activité rendant la cellule sensible à un médicament par ailleurs non toxique. Par exemple, les tumeurs peuvent être traitées par introduction, dans des cellules de tumeur, d'une construction de fusion de gène de thymidine-kinase (TK) d'herpès et de promoteur de type hTRT, et l'administration de gancyclovir ou d'un équivalent (voir, par exemple,
Moolton et Wells, 1990, J. Nat'l Canc. Inst. 82:297).
La pratique connait de nombreuses autres protéines toxiques ou potentiellement toxiques et de nombreux systèmes de ce type -: (utilisant des séquences de promoteur autres que de type hTRT) pouvant être modifiés et appliqués selon la présente invention par l'homme du métier, lorsqu'il
examine et passe en revue le présent exposé.
Des vecteurs de thérapie génique peuvent être introduits dans des cellules ou des tissus "in vivo", "in vitro" ou "ex vivo". Pour une thérapie ex vivo, des vecteurs peuvent être introduits dans des cellules, par exemple des cellules de souche, prélevées sur le patient et ayant subi une propagation par formation de clone pour un retour par transplantation autologue au
même patient (voir, par exemple, les brevets US-A-
399 493 et US-A-5 437 994, dont les exposés sont incorporés ici par référence). Des cellules pouvant constituer des cibles pour une thérapie par gène de type hTRT visant à augmenter l'activité de télomérase d'une cellule cible comprennent, sans que cette liste soit limitative, des cellules de souche embryonnaire ou de germe, en particulier des cellules de primate ou d'être humain, comme noté ci-dessus, des cellules de la souche hématopoiétique (SIDA et post- chimiothérapie), des cellules endothéliales vasculaires (maladie vasculaire cardiaque et cérébrale), desfibroblastes de la peau et des kératinocytes de peau basique (cicatrisation de plaies et brûlures), des chondrocytes (arthrite), des astrocytes de cerveau et des cellules monogliales (maladie d'Alzheimer), des ostéoblastes (ostéoporose), des cellules rétiniennes (maladie des yeux) et des cellules des îlots pancréatiques (diabète de type I) et n'importe laquelle des cellules énumérées au tableau 3 ci-après, ainsi que tous autres types de
cellules dont on sait qu'elles se divisent.
Dans une forme de réalisation de l'invention, on utilise un promoteur inductible fonctionnellement lié à une séquence codant pour TRT, comme hTRT (ou une variante) pour moduler la capacité de prolifération de cellules "in vivo" ou "in vitro ". Dans une forme particulière de réalisation, par exemple, on introduit chez un patient des cellules pancréatriques, productrices d'insuline, transfectées par un vecteur d'expression de hTRT sous la commande ou le contrôle d'un promoteur inductible. On peut ensuite contrôler ou maîtriser la capacité de prolifération des cellules en administrant au patient l'agent d'activation du promoteur (par exemple, de la tétracycline) pour permettre aux cellules de se multiplier davantage que ce n'aurait été, sinon, possible. Un médecin traitant peut ensuite, selon les désirs, terminer, poursuivre ou
réamorcer la prolifération des cellules.
4) VACCINS ET ANTICORPS
Des peptides ou polypeptides immunogéniques, ayant une séquence de type hTRT, peuvent servir à susciter une réponse immunitaire anti- hTRT chez un patient (c'est-à-dire jouer le rôle d'un vaccin). Des exemples de peptides et polypeptides immunogènes de type hTRT sont décrits ci-après dans les exemples 6 et 8. Une réponse immune peut également être soulevée par la délivrance de vecteurs de plasmide codant pour le polypeptide intéressant (c'est-à- dire, par l'administration de "ADN nu"). Les acides nucléiques intéressants peuvent être délivrés par injection, à l'aide de liposomes, ou par d'autres moyens d'administration. Dans une forme de réalisation, on choisit des modes d'immunisation qui suscitent chez le sujet une réponse des lymphocytes cytotoxiques limités à MHC de classe I, contre des cellules exprimant de la télomérase. Une fois immunisé, l'individu ou l'animal va susciter une réponse immune accrue contre des cellules exprimant des taux élevés de télomérase (par
exemple, des cellules malignes).
On peut également administrer à un patient (par exemple par immunisation passive) des anticorps anti-hTRT, par exemple des anticorps monoclonaux de souris, d'origine humaine ou humanisés, pour réaliser une réponse immune contre des cellules exprimant de la télomérase.
F) COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
Dans des aspects apparentés, l'invention propose des compositions pharmaceutiques qui comprennent des oligonucléotides et des polynucléotides de type hTRT, des polypeptides et des anticorps, des agonistes, des antagonistes ou des inhibiteurs, isolément ou en combinaison avec au moins un autre agent, tel qu'un composé stabilisant, un diluant, un support ou un autre
ingrédient actif ou un autre agent actif.
Les agents thérapeutiques de l'invention peuvent être administrés dans n'importe quel support ou excipient pharmaceutique stérile, biocompatible, ce qui comprend, sans que cette liste soit limitative, une solution saline, une solution saline tamponnée, du dextrose et de l'eau. N'importe laquelle de ces molécules peut être administrée à un patient isolément, Cu en combinaison avec d'autres agents, d'autres médicaments ou des hormones, dans des compositions pharmaceutiques dans lesquelles cette molécule est mélangée à un ou des excipients convenables, à des adjuvants et/ou des véhicules ou supports pharmaceutiquement acceptables. Dans une forme de réalisation de la présente invention, le support pharmaceutiquement acceptable est inerte du point de
vue pharmaceutique.
L'administration de compositions pharmaceutiques est réalisée par voie orale ou parentérale. Des procédés de délivrance parentérale comprennent une administration topique (locale), intra- artérielle (par exemple, directement vers la tumeur), intramusculaire, sous-cutanée, intramédullaire, intrathécale, intraventriculaire, intraveineuse, intrapéritonéale ou intranasale. En plus des ingrédients actifs, ces compositions pharmaceutiques peuvent contenir des supports ou véhicules pharmaceutiquement acceptables et convenables, ce qui comprend des excipients et d'autres composés qui facilitent la mise des composés actifs sous forme de préparations pouvant servir par voie pharmaceutique. D'autres détails sur des techniques de formation et d'administration peuvent se trouver dans l'édition la plus récente de "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES" (Maack Publishing Co., Easton
PA, Etats-Unis d'Amérique).
Des compositions pharmaceutiques pour l'administration par voie orale peuvent être formulées à l'aide de véhicules ou supports pharmaceutiquement acceptables, bien connus en pratique, en des doses convenant pour une administration par voie orale. De tels supports permettent la formulation des compositions pharmaceutiques sous la forme de comprimés, de pilules, de dragées, de capsules, de liquides, de gels, de sirops, de suspensions, etc., convenant pour une ingestion par le patient. Voir la
publication PCT WO 93/23572.
Des préparations pharmaceutiques pour l'administration par voie orale peuvent être obtenues par combinaison de composés actifs avec de l'excipient solide, éventuellement broyage d'un mélange résultant et traitement du mélange de granules, après addition de composés additionnels convenables, si on le désire, pour obtenir des comprimés ou des coeurs ou des noyaux de comprimés et de dragées. Des excipients convenables sont des glucides (des hydrates de carbone) ou des charges protéiniques comprennent, sans que cette liste soit limitative, des sucres, notamment du lactose, du saccharose, du mannitol ou du sorbitol; de l'amidon ou de la fécule provenant du blé ou du mais, du riz, de la pomme de terre ou d'autres plantes; de la cellulose
comme de la méthylcellulose, de I'hydroxypropylméthyl-
cellulose ou de lacarboxyméthylcellulose sodique, et des gommes comprenant la gomme arabique et la gomme adragante; ainsi que des protéines comme de la gélatine et du collagène. Si on le désire, on peut ajouter les agents de désagrégation ou de solubilisation, comme de la polyvinylpyrrolidone réticulée, de la gélose ou agar-agar, de l'acide alginique, ou un sel de cet
acide, comme de l'alginate de sodium.
Des noyaux de dragées sont pourvus d'enrobages convenables, comme des solutions concentrées de sucre, qui peuvent contenir également de la gomme arabique, du talc, de la polyvinylpyrrolidone, du gel de type "Carbopol", du polyéthylène glycol et/ou du dioxyde de titane, des solutions de laques ou vernis et des solvants ou mélanges de solvants organiques convenables. Des colorants ou des pigments peuvent être ajoutés au revêtement d'enrobage des comprimés ou des dragées pour une identification du produit ou pour caractériser la quantité ou la dose du composé actif
(c'est-à-dire le dosage).
Des préparations pharmaceutiques pouvant servir par voie orale comprennent des capsules assemblées par pression et réalisées en de la gélatine, ainsi que des capsules molles scellées réalisées en de la gélatine et comportant un enrobage comme du glycérol ou du sorbitol. Des capsules obtenues par ajustage par pression peuvent contenir des ingrédients actifs mélangés à une charge ou à des liants comme du lactose ou des amidons ou fécules, des lubrifiants comme du talc ou du stéarate de magnésium et, éventuellement, des stabilisants. Dans des capsules molles, des composés actifs peuvent être dissous ou en suspension dans des liquides convenables, comme des huiles grasses, de la paraffine liquide ou du polyéthylène
glycol liquide, avec ou sans stabilisants.
Des formulations pharmaceutiques pour administration par voie parentérale comprennent des solutions aqueuses de composés actifs. Pour une injection, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en des solutions aqueuses, de préférence dans des tampons physiologiquement compatibles comme de la solution de Hank, de la solution de Ringer ou une solution saline physiologiquement tamponnée. Des suspensions aqueuses pour injection peuvent contenir des substances qui augmentent la viscosité de la suspension, comme de la carboxyméthylcellulose sodique, du sorbitol ou du dextranne. En outre, des suspensions des composés actifs peuvent être préparées sous forme de suspensions huileuses appropriées pour une injection. Des solvants lipophiles convenables ou des véhicules convenables comprennent des huiles grasses comme l'huile de sésame, ou des esters d'acides gras synthétiques, comme de l'oléate d'éthyle ou des triglycérides, ou des liposomes. Eventuellement, la suspension peut également contenir des stabilisants ou des agents convenables, qui augmentent la solubilité des composés pour permettre la préparation de solutions hautement concentrées. Pour administration locale (topique) ou par voie nasale, on utilise dans la formulation des agents de pénétration appropriés à la barrière particulière à traverser par perméation. De tels agents de pénétration
sont de façon générale connus en pratique.
Les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent être fabriquées d'une manière similaire à ce qui est connu en pratique (par exemple à l'aide d'opérations traditionnelles de mélangeage, de dissolution, de granulation, de production de dragées, de lévigation, d'émulsification, d'encapsulation,
d'emprisonnement ou de lyophilisation).
La composition pharmaceutique peut être proposée sous forme d'un sel et elle peut être formée à l'aide de nombreux acides, ce qui comprend, sans que cette liste soit limitative, les acides chlorhydrique, sulfurique, acétique, lactique, tartrique, malique, succinique, etc. Des sels tendent à être plus solubles dans des solvants aqueux ou dans d'autres solvants protoniques que les formes du type base libre correspondantes. Dans d'autres cas, la préparation préférée peut être une poudre lyophilisée dans de l'histidine 1 mM à 50 mM, à 0,1% à 2% de saccharose, 2% à 7% de mannitol à un pH compris entre 4,5 et 5,5, ce
qui est combiné à du tampon avant utilisation.
Après la préparation de compositions pharmaceutiques comprenant un composé de l'invention formulé dans un véhicule ou support acceptable, on peut placer les compositions dans un récipient approprié et les marquer pour faire connaître qu'il s'agit du traitement d'un état indiqué. Pour l'administration de protéines de type télomérase humaine et d'acides nucléiques, un tel marquage inclurait les indications
de quantité, de fréquence et de mode d'administration.
Les compositions pharmaceutiques convenant pour servir dans la présente invention comprennent des compositions dans lesquelles les ingrédients actifs sont contenus en une quantité efficace pour atteindre le but visé. Une "quantité thérapeutiquement efficace" ou une "quantité pharmacologiquement efficace" sont des expressions bien admises et se réfèrent à la quantité d'un agent efficace pour produire le résultat pharmacologique visé. Ainsi, une quantité thérapeutiquement efficace est une quantité suffisante pour améliorer la sensation des symptômes de la maladie soumise à traitement. Un dosage utile pour établir une quantité efficace pour une application donnée (par exemple une quantité thérapeutiquement efficace) consiste à mesurer l'effet, sur l'activité de télomérase, dans une cellule cible. La quantité administrée en fait dépendra de l'individu auquel le traitement est à appliquer, et il s'agira de préférence d'une quantité optimisée telle que l'effet voulu soit obtenu sans effets secondaires importants. La détermination d'une dose thérapeutiquement efficace entre bien dans la compétence et la capacité de l'homme
du métier.
Pour n'importe quel composé, la dose thérapeutiquement efficace peut être estimée initialement dans des essais de dosage sur culture de
tissu ou dans n'importe quel modèle animal approprié.
Le modèle animal sert également à obtenir un intervalle de concentration souhaitable et un mode d'administration. De tels renseignements peuvent ensuite servir à déterminer les doses utiles et des
voies d'administration à des êtres humains.
Une quantité thérapeutiquement efficace se réfère à la quantité de protéine, de polypeptide, de peptide, d'anticorps, d'oligonucléotide ou de polynucléotide, d'agonistes ou d'antagonistes améliorant la sensation
des symptômes ou améliorant l'état de l'être traité.
L'efficacité thérapeutique et la toxicité de tels composés peuvent être déterminées par les modes opératoires pharmaceutiques courants ou normalisés dans des cultures-de cellulesou sur des animaux d'expérience (par exemple, DE50, la dose thérapeutiquement efficace pour 50% de la population et DL50, la dose léthale pour 50% de la population). Le rapport entre la dose correspondant à un effet thérapeutique et la dose correspondant à un effet toxique est l'indice thérapeutique, et il peut être exprimé sous forme du rapport DE50/DLs5o. Des compositions pharmaceutiques présentant de grands indices thérapeutiques sont préférées. Les données obtenues grâce à des essais et dosages effectués sur des cultures de tissu et grâce à des études sur des animaux servent à formuler toute une
gamme de doses de posologie pour utilisation humaine.
La dose de tels composés se situe de préférence dans un intervalle de concentrations en circulation comprenant la DE50 avec peu ou pas de toxicité. La dose ou posologie varie dans cet intervalle selon la forme dosée utilisée, la sensibilité du patient, et le mode
d'administration.
La dose exacte est choisie par le médecin personnel en tenant compte du patient à traiter. La posologie et l'administration sont ajustées de façon à fournir des taux suffisants du fragment actif ou de façon à maintenir et conserver l'effet voulu. Des facteurs supplémentaires qui peuvent être pris en compte comprennent la gravité (la "sévérité") de l'état maladif (par exemple la taille d'une tumeur et son emplacement; l'âge, le poids et le sexe du patient; l'origine, le moment et la fréquence de l'administration, la ou les combinaisons de médicaments ou de drogues, les sensibilités et réactions, et la tolérance/réponse au traitement). Des compositions pharmaceutiques à longue durée d'action pourraient être administrées tous les 3 ou 4 jours,chaque semaine, ou une
fois toutes les deux semaines selon la période de demi-
vie et le taux de clairance de la formulation particulière. Des règles de guidage concernant les doses et posologies particulières et les modes de délivrance figurent dans la littérature (voir, les brevets US-A-4 657 760, US-A-5 206 344 et US-A-5 225 212, incorporés ici par référence). L'homme du métier va typiquement utiliser pour des nucléotides des formulations différentes de celles pour des protéines ou leurs inhibiteurs. De façon similaire, la délivrance de polynucléotides ou de polypeptides peut être spécifique à des cellules particulières, à des états particuliers, àdesemplacements particuliers, etc.
VIII. AUGMENTATION DE LA CAPACITE DE PROLIFERATION ET
PRODUCTION DE CELLULES IMMORTALISEES, DE LIGNEES
DE CELLULES ET D'ANIMAUX
Comme étudié ci-dessus, la plupart des cellules de vertébré vieillissent après un nombre bien défini de divisions en culture (par exemple, de 50 à 100 divisions). Certaines cellules variantes, cependant, sont capables de se diviser indéfiniment dans une culture (par exemple, les cellules HeLa, les cellules 293) et, pour cette raison, elles sont utiles pour la
recherche et les applicatons industrielles.
Habituellement, ces lignées de cellules immortelles dérivent de tumeurs à apparition spontanée, ou par transformation par exposition à un rayonnement ou à un
virus ou à un produit chimique inducteur de tumeur.
Malheureusement, on ne dispose que d'un choix limité de lignées de cellules, en particulier des lignées de cellules humaines représentant un rôle cellulaire différencié. En outre, les lignées de cellules immortelles actuellement disponibles se caractérisent par des anomalies chromosomiques (par exemple, de l'aneuploidie, des réarrangements ou transpositions de gène(s) ou des mutations). En outre, de nombreuses lignées de cellules établies depuis longtemps sont relativement indifférenciées (par exemple elles ne produisent pas de produits hautement spécialisés du genre caractérisant de façon unique des tissus ou organes particuliers). Ainsi, on a besoin de nouveaux procédés pour engendrer des cellules immortelles, en particulier des cellules humaines. Une utilisation de cellules immortalisées réside dans la production de protéines naturelles et de protéines recombinantes (par exemple des polypeptides thérapeutiques comme de l'érythropoiétine, l'hormone de croissance humaine, l'insuline, etc.) ou des anticorps, pour lesquels on préfère une lignée de cellules stables, génétiquement normale. Pour la production de certaines protéines recombinantes, on peut également préférer des types de cellules spécialisées (par exemple des cellules pancréatiques pour la production d'une insuline humaine). Une autre utilisation de cellules immortalisées ou même de cellules mortelles ayant une capacité accrue de prolifération (par rapport à des cellules non modifiées) réside dans l'introduction dans un patient pour de la thérapie génique, ou pour
remplacer des cellules ou du tissu malade ou endommagé.
Par exemple, des cellules immunes autologues, contenant ou exprimant un gène ou polypeptide de type hTRT recombinant de l'invention, peuvent servir à remplacer des cellules chez un patient, après un traitement agressif du cancer, par exemple une irradiation du corps entier. Une autre utilisation de cellules immortalisées consiste en une production "ex vivo" de tissus ou organes "artificiels" (par exemple, de la peau) pour une utilisation thérapeutique. Une autre utilisation pour de telles cellules consiste à permettre un examen de dépistage ou de validation de drogues et médicaments, comme des drogues inhibant la télomérase, ou consiste à servir à produire des vaccins ou des réactifs biologiques. Des utilisations supplémentaires des cellules de l'invention
apparaîtront à l'homme du métier.
On obtient les cellules et lignées de cellules immortalisées, ainsi que les cellules et lignées de cellules ayant une capacité simplement accrue de réplication, de l'invention en augmentant l'activité de télomérase dans la cellule. On peut utiliser n'importe quel procédé ici décrit pour augmenter l'activité de télomérase. Ainsi, dans une forme de réalisation, on rend immortelles des cellules en augmentant la quantité d'un polypeptide de type hTRT dans la cellule. Dans une forme de réalisation, on augmente les taux de hTRT en introduisant dans la cellule un vecteur d'expression de
hTRT (et l'on préfère parfois une transfection stable).
Comme étudié ci-dessus, la séquence codant pour hTRT est habituellement liée fonctionnellement à un promoteur, qui peut être inductible ou actif de manière
constitutive dans la cellule.
Dans une forme de réalisation, on introduit dans la cellule un polynucléotide comprenant une séquence codant pour un polypeptide de la "SEQUENCE ID N 2", cette séquence étant liée fonctionnellement à un promoteur (par exemple, un promoteur exprimé de manière constitutive, par exemple, une séquence de "SEQUENCE ID N 6"). Dans une autre forme de réalisation, le polynucléotide comprend une séquence de "SEQUENCE ID N 1". De préférence, le polynucléotide comprend des signaux de polyadénylation et de terminaison. Dans d'autres formes de réalisation, des éléments supplémentaires, comme des amplificateurs ou autres étudiés ci-dessus, sont inclus. Dans une autre forme de réalisation, le polynucléotide n'inclut pas de séquence de promoteur, une telle séquence étant fournie par le génome endogène de la cellule cible après intégration (par exemple, une recombinaison, par exemple, une
recombinaison homologue) du polynucléotide introduit.
Le polynucléotide peut être introduit dans la cellule cible par n'importe quel procédé, ce qui comprend n'importe quel procédé ici décrit, comme de la lipofection, de l'électroporation, des virosomes, des liposomes, des immunoliposomes, des conjugués
polycation: acide nucléique, de l'ADN nu).
En utilisant les procédés de l'invention, on peut obliger n'importe quelle cellule de vertébré à avoir une capacité accrue de prolifération ou même la rendre
immortelle et la maintenir indéfiniment en culture.
Dans une forme de réalisation, les cellules sont des cellules de mammifère, et l'on préfère des cellules humaines pour de nombreuses applications. Des exemples de cellules humaines pouvant être rendues immortelles
comprennent les cellules énumérées au tableau 3.
On comprendra que les compositions pour des essais et dosages "diagnostiques" de l'invention que l'on décrit ci-après vont servir à identifier et à
caractériser les cellules immortalisées de l'invention.
TABLEAU 3
CELLULES HUMAINES DANS LESQUELLES
L'EXPRESSION DE hTRT PEUT ETRE AUGMENTEE Cellules épithéliales pour kératinisation kératinocyte de l'épiderme (cellule épidermique en cours de différenciation) cellule basale de l'épiderme (cellule souche) kératinocyte d'ongles de doigts et d'ongles d'orteils cellule basale du lit d'ongle (cellule souche) cellules de tige de poils et cheveux médullaire, corticale, cuticulaire; cellules de gaine de racines de cheveux, cuticulaire, de la couche de Huxley, de la couche de Henle externe; cellule de matrice de cheveux (cellule souche) Cellules d'épithélium formant barrière stratifiée humide cellule épithéliale superficielle d'un épithélium squameux stratifié de la langue, de la cavité buccale, de l'oesophage, du canal anal, de l'urètre distal, du vagin cellule de base de ces épithéliums (cellule souche) cellule de l'épithélium de cornée externe cellule de l'épithélium urinaire (chemisant la vessie et les conduits urinaires) Cellules épithéliales spécialisées pour des sécrétions exocrines cellules de la glande salivaire cellule de muqueuse (sécrétion riche en du polysaccharide) cellule séreuse (sécrétion riche en des enzymes glycoprotéiniques) cellule de la glande de von Ebner dans la langue (sécrétion destinée à enlever par lavage les éléments du goût) cellule de la glande mammaire, sécrétant du lait cellule de la glande lacrymale, sécrétant des larmes cellule de la glande produisant du cérumen dans l'oreille, sécrétant de la cire cellule de glande exocrine de sueur, sécrétant des glycoprotéines (cellule foncée) cellule de glande exocrine de sueur sécrétant de ! petites molécules (cellule limpide) cellule de glande sudoripare apocrine (sécrétion odorante, sensible à de l'hormone sexuelle) cellule de glande de Moll dans la paupière (glande sudoripare spécialisée) cellule de glande sébacée, sécrétant du sébum riche en lipides, cellule de la glande de Bowman dansle nez (sécrétion pour laver l'épithélium olfactif) cellule de la glande de Brunner dans le duodénum, sécrétant une solution alcaline de mucus et des enzymes cellule de vésicule séminale, sécrétant des constituants du fluide séminal, comprenant du fructose (comme matière énergétique ou "carburant" pour le sperme qui nage) cellule de la glande de prostate, sécrétant d'autres constituants du fluide séminal cellule de la glande bulbouréthrale, sécrétant du mucus cellule de la glande de Bartholin, sécrétant du lubrifiant vaginal cellule de la glande de Littré, sécrétant du mucus cellule de l'endomètre de l'utérus, sécrétant surtout des hydrates de carbone ou glucides cellule épithéliale caliciforme isolée des tubes respiratoire et digestif, sécrétant du mucus cellule sécrétant du mucus de chemisage de l'estomac cellules zimogéniques de glande gastrique, sécrétant du pepsinogène cellule oxyntique de glande gastrique, sécrétant HCi cellule en grappes de pancréas, sécrétant des enzymes digestives et du bicarbonate cellule de Paneth de l'intestin grêle, sécrétant du lysozyme pneumocyte de type II du poumon, sécrétant du tensioactif cellule de Clara du poumon Cellules spécialisées pour la sécrétion d'hormones Cellules de la glande pituitaire antérieure, sécrétant de l'hormone de croissance, de l'hormone de stimulation des follicules, de l'hormone de lutéinisation, de la prolactine, de l'hormone adrénocorticotrope, et de l'hormone stimulant la thyroïde cellule de glande pituitaire intermédiaire, sécrétant de l'hormone stimulant les mélanocytes cellules de la glande pituitaire postérieure, sécrétant de l'oxytocine, de!a vasopressine cellules de l'intestin, sécrétant la sérotinine, l'endorphine, la somatostaine, la gastrine, la sécrétine, la cholécystokinine, de l'insuline et du glucagon cellules de la glande thyroïde, sécrétant de l'hormone thyroïdienne, de la calcitonine cellules de la glande parathyroide, sécrétant de l'hormone de parathyroide, cellule oxyphile cellules de la glande surrénale, sécrétant de l'épinéphrine, de la norépinéphrine et des hormones stéroidiennes; des corticoides minéraux des glucocorticoides cellules de gonades, sécrétant de la testostérone (cellule de Leydig du testicule) de l'oestrogène (cellule de la couche interne du follicule ovarien) de la progestérone (cellule de corps jaune de follicule ovarien rompu) cellules de l'appareil juxtaglomérulaire du rein cellule de type juxtaglomérulaire (sécrétant de la rénine) cellule dense de macula cellule péripolaire cellule mésangiale Cellules épithéliales absorbantes de l'intestin, glandes exocrines et du tube urogénital cellule ciliée de l'intestin (avec des microvillosités) cellule de conduit strié de glandes exocrines cellule épithéliale de la vésicule biliaire cellule ciliée de tubule proximal de rein cellule de tubule distal de rein cellule non ciliée de conduit efférent cellule d'épididyme principal cellule d'épididyme de base Cellules spécialisées pour du métabolisme et du stockage hépatocyte (cellule du foie) cellules grasses graisse blanche graisse brune lipocyte du foie Cellules épithéliales jouant principalement un rôle de barrière, revêtant le poumon, l'intestin, les glandes exocrines et le conduit urogénital pneumocyte de type I (revêtant l'espace réservé à l'air dans le poumon) cellule de conduite pancréatique (cellule centroacinaire) cellule de conduit non strié de glande sudoripare, de glande salivaire, de glande mammaire cellule pariétale de glomérule du rein podocyte de glomérule du rein cellule du segment mince de la boucle de Henle (dans le rein) cellule de conduit collecteur (dans le rein) Cellules de conduit de vésicule séminale, glande de prostate Cellules épithéliales revêtant des cavités internes closes du corps cellules endothéliales vasculaires de vaisseaux sanguins et lymphatiques fenestrées continues spléniques cellule synoviale (revêtant des cavités d'articulation, sécrétant dans une large mesure de l'acide hyaluronique) cellule séreuse (revêtant les cavités péritonéale, pleurale, et péricardiaque) cellule squameuse revêtant l'espace périlymphatique de l'oreille cellule revêtant l'espace endolymphatique de l'oreille cellule squameuse cellules en colonne du sac endolymphatiqueavec des microvillosités sans microvillosités cellule "foncée" cellule de membrane vestibulaire (ressemblant à une cellule de plexus choroidien) cellule basale vasculaire striée cellule marginale vasculaire striée cellule de Claudius cellule de Boettcher cellule de plexus choroidien (sécrétant du fluide cérébro-spinal) cellule squameuse de pie-mère arachnoide (lepto méninge) cellules de l'épithélium des cils de l'oeil pigmentées non pigmentées cellule "endothéliale" de cornée Cellules ciliées à rôle propulsif du tube respiratoire de l'oviducte et de l'endomètre de l'utérus (chez les femmes) du testicule et du petit conduit efférent (chez l'homme) du système nerveux central (cellule d'épendyme revêtant les cavités cérébrales Cellules spécialisée pour une sécrétion de matrice extracellulaire épithéliale: améloblaste (sécrétant l'émail des dents) cellule plane semi-lunaire de l'appareil vestibulaire de l'oreille (sécrétant du protéoglycane) cellule interdentale de l'organe de Corti (sécrétant de la "membrane" tectoriale recouvrant les cellules des poils de l'organe de Corti) non épitheliale (tissu conjonctif) fibroblastes (divers de tissu conjonctif lâche, de la cornée, du tendon, du tissu réticulaire de la moelle osseuse, etc.) péricyte de capillaire sanguin cellule pulpeuse de noyau du disque intervertébral cémentoblaste/cémentocyte (sécrétant du cément, analogue à de l'os, de la racine des dents) odontoblaste/od'ontocyte (sécrétant la dentine de dent) chondrocytes de cartilage hyalin, de fibrocartilage, de cartilage élastique ostéoblaste/ostéocyte cellule ostéoprogénitrice (cellule souche d'ostéoblastes) hyalocyte du corps vitreux de l'oeil cellule stellaire de l'espace périlymphatique de l'oreille Cellules contractiles cellules de muscle moteur (muscle "squelettique") rouge (lente) blanche (rapide) intermédiaire sac nucléaire de fibre musculaire chaîne nucléaire de fibre musculaire cellule satellite (cellule souche) cellules du muscle cardiaque ordinaire nodale fibre de Purkinje cellules de muscle lisse cellules myoépithéliales de l'iris de glandes exocrines Cellules du sang et du système immunitaire globule rouge du sang mégakaryocyte macrophages monocyte macrophage de tissu conjonctif (divers) cellule de Langerhans (dans l'épiderme) ostéoblaste (dans l'os) cellule dendritique (dans les tissus lymphoides) cellule microgliale (dans le système nerveux central) neutrophiles eosinophiles basophiles cellule polynucléaire basophile lymphocyte T cellule T auxiliaire cellule T de suppresseur cellule T destructrice Lymphocyte B IgM IgG IgA IgE cellule destructrice cellules souche pour le sang et le système immunitaire (diverses) Transducteurs sensoriels photorécepteurs en tige en cône sensible au bleu sensible au vert sensible au rouge audition cellule épithéliale interne, munie de fins prolongements,de l'organe de Corti cellule externe épithéliale, munie de fins prolongements,de l'organe de Corti accélération et gravité cellule épithéliale de type I, munie de fins prolongements, de l'appareil vestibulaire de l'oreille cellule épithéliale munie de fins prolongements, de type II, de l'appareil vestibulaire de l'oreille goût cellule du goût de type 11 odeur neurone olfactif cellule basale de l'épithélium olfactif (cellule souche pour des neurones olfactifs) pH du sang cellule de carotide type I type II toucher cellule de Merkel de l'épiderme neurones sensoriels primaires spécialisés pour le toucher température neurones sensoriels primaires spécialisés pour la température sensibles au froid sensibles au chaud douleur neurones sensoriels primaires spécialisés pour la douleur configurations et forces dans le système moteur (muscles et squelette) neurones sensoriels primaires centripètes Neurones autonomes cholinergiques adrénergiques peptidergiques Cellules de support des organes des sens et des neurones périphériques cellules de support de l'organe de Corti cellule de pilier interne cellule de pilier externe cellule de phalange interne cellule de phalange externe cellule limite cellule de Hensen cellule de support ou de soutien de l'appareil vestibulaire cellule de support des papilles (cellule de papille ou de goût de type I) cellule de support de l'épithélium olfactif cellule de Schwann cellule satellite (encapsulant des corps cellulaires nerveux périphériques) cellule gliale entérique Neurones et cellules gliales du système nerveux central neurones cellules gliales astrocyte oligodendrocyte Cellules de lentille cellule épithéliale de lentille antérieure fibres de lentille (cellule contenant de la matière cristalline ou cristallin) Cellules pigmentées mélanocyte cellule épithéliale pigmentée de la rétine Cellules germinales oogonium/oocyte spermatocyte spermatogonium (cellule souche pour le spermatocyte) Cellules d'entretien ou de -nutrition cellule de follicule ovarien cellule de Sertoli (dans le testicule) cellule épithéliale du thymus Cellules souche cellule souche embryonnaire cellule germinale embryonnaire cellule souche adulte cellule souche foetale
IX. DOSAGE ET EXAMEN DIAGNOSTIQUES
A) INTRODUCTION
1) DOSAGE ET DETECTION DE TRT
La présente invention propose une large variété de dosages et compositions de détection pour TRT, de préférence hTRT, et de la télomérase. Ces produits et compositions de dosage et de recherche fournissent notamment la base de dosages et recherches sensibles, peu onéreux, commodes et largement applicables pour le diagnostic et le pronostic d'un certain nombre de maladies humaines, parmi lesquelles le cancer constitue un exemple illustratif. Comme noté ci-dessus, les produits du type gène de hTRT (protéine et ARNm) sont habituellement présents en dose élevée dans des cellules humaines immortelles par rapport à la plupart des cellules mortelles normales (c'est-à-dire des cellules donnant un résultat négatif à la recherche de la télomérase et la plupart des cellules somatiques adultes normales donnant un résultant positif à la recherche de la télomérase). Ainsi, dans un aspect, l'invention propose des produits de recherche et de dosage utiles pour déceler ou mesurer la présence, l'absence ou la quantité d'un produit de gène de hTRT dans un échantillon provenant de, ou contenant, des cellules humaines ou d'autres mammifères ou des cellules eukaryotes pour caractériser les cellules comme étant immortelles (comme des cellules d'une tumeur maligne) ou mortelles (comme la plupart des cellules somatiques normales d'adultes) ou comme donnant un résultat positif ou négatif à la recherche
de la télomérase.
N'importe quel état caractérisé par la présence ou
l'absence d'un produit de gène de type hTRT (c'est-à-
dire de la protéine ou ARN) peut être diagnostiqué à l'aide des procédés et des matières que l'on décrit ici. Cela comprend, comme décrit plus amplement ci-après, des cancers, d'autres maladies à prolifération accélérée des cellules, des troubles immunologiques, la fécondité, la stérilité, et d'autres états. En outre, puisque le degré d'élévation du taux d'activité de télomérase dans des cellules cancéreuses est en corrélation avec des caractéristiques de la tumeur, comme le potentiel de production de métastases, la surveillance des taux de hTRT, ARNm ou de protéine peut servir à estimer et à prédire la progression
future probable d'une tumeur.
Dans un aspect, les procédés de diagnostic et de pronostic de l'invention impliquent la détermination du fait qu'un produit de gène de TRT humainest ou non présent dans un échantillon biologique (provenant par exemple d'un patient). Dans un second aspect, l'abondance d'un produit de gène de type hTRT dans un échantillon biologique (provenant par exemple d'un patient) est déterminée et comparée à l'abondance dans un échantillon témoin (par exemple des cellules ou des tissus normaux). Dans un troisième aspect, la localisation cellulaire ou intracellulaire d'un produit de type gène de hTRT est déterminée dans un échantillon de cellule ou de tissu. Dans un quatrième aspect, des cellules hôtes (provenant par exemple d'un patient) sont soumises à des essais destinés à identifier les acides nucléiques ayant des caractéristiques de séquence d'une propension héritable pour une expression anormale de gène de type hTRT (quantité, régula- tion ou produit anormal(e)),comme cela est utile dans le dépistage génétique ou dans le domaine du conseil génétique. Dans un cinquième aspect, les compositions d'essais de dosage de l'invention servent à déceler la présence d'anticorps anti-hTRT (par exemple dans le sérum d'un patient). Les procédés décrits ci- après de façon assez détaillée constituent des indications d'essais utiles qui peuvent être effectués à l'aide des séquences et relations que l'on décrit ici. Cependant, de nombreuses variations ou d'autres applications de ces essais de dosage et de dépistage apparaîtront à l'homme du métier ayant une expérience ordinaire et
tenant compte du présent expose.
On reconnaîtra que, bien que les essais ci-après soient présentés en termes de procédés pour diagnostic et pronostic, ils peuvent servir chaque fois o il faut déceler, quantifier ou caractériser un gène de type hTRT, un produit du type gène ou un variant. Ainsi, par exemple, les procédés "diagnostiques" décrits ci-après peuvent utilement servir à des essais de dosage de hTRT ou de la télomérase au cours de la production et de la purification de hTRT ou d'une télomérase humaine pour la caractérisation de lignées cellulaires provenant de cellules humaines (par exemple, pour identifier des lignées immortelles), pour caractériser des cellules, des animaux non humains, des plantes, des champignons, des bactéries et d'autres organismes qui comprennent un gène de TRT humain ou un produit du type gène de ce
genre (ou leurs fragments).
Comme utilisé ici, le terme "diagnostic" a son sens habituel d'identification de la présence ou de la nature d'une maladie (par exemple, du cancer), d'un état (par exemple, la stérilité, l'activation) ou d'une situation (par exemple, la fécondité) et l'expression "pronostic" a son sens habituel de prédiction du développement probable et/ou du devenir d'une maladie ou d'un état. Bien que ces deux termes servent de façon légèrement différente en clinique, on comprendra que l'un quelconque des essais de dosage ou de recherche ou des formats d'essais de dosage ou de recherche que l'on décrit ci-après à propos du "diagnostic" conviennent également pour la détermination du pronostic, car il est bien établi que des taux élevés d'activité de télomérase sont associés à des pronostics médiocres pour des patients atteints de cancer et parce que la présente invention propose des procédés de détection spécifiques de hTRT, qui est exprimé à des niveaux en corrélation étroite avec l'activité de télomérase dans
une cellule.
2) DIAGNOSTIC ET PRONOSTIC DU CANCER
La détermination d'un niveau ou taux de gène de type hTRT, d'ARNm ou d'un taux de protéine au delà de l'intervalle normal "standard" constitue une valeur indiquant la présence de cellules donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase, ou immortelles, dont certaines cellules de tumeur constituent des exemples. Puisque certaines cellules embryonnaires et foetales, aussi bien que certaines
cellules souche d'adulte, expriment de la télomérase.
Laprésente invention propose également des procédés pour déterminer d'autres états, comme une grossesse, par la détection ou l'isolement de cellules fetales donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase et provenant du sang maternel. Ces valeurs peuvent servir à poser, ou faciliter la pose, d'un diagnostic, même quand les cellules n'auraient pas été classées comme cancéreuses ou décelées d'une autre façon ou classifiées d'une autre façon à l'aide de méthodes traditionnelles. Ainsi, des procédés de la présente invention permettent la détection ou la vérification d'états cancéreux ou d'autres états associés à de la télomérase, et cela avec un taux accru de confiance et, au moins dans certains cas, à un stade plus précoce. Ces essais de dosage et de détermination de l'invention permettent une discrimination entre différentes classes et différents grades ou qualités de tumeurs humaines ou d'autres maladies à prolifération de cellules, par la fourniture d'essais quantitatifs de détermination du gène de type hTRT et des produits de gène et ils facilitent ainsi le choix de régimes de traitement appropriés et des diagnostics précis. En outre, puisque des taux d'activité de télomérase peuvent servir à effectuer une distinction entre des tumeurs bénignes et des tumeurs malignes (voir, par exemple, le brevet US-A-5 489 508; Hiyama et al., 1997, Proc. Am. Ass. Cancer Res. 38:637), à prédire l'imminence d'une invasion (voir, par exemple, le brevet US-A-5 639 613; Yashima et al., 1997, Proc. Am. Ass. Cancer Res. 38:326) et à effectuer une corrélation avec le potentiel de production de métastases (voir, par exemple, le brevet US-A-5 648 215, Pandita et al., 1996, Proc. Am. Ass. Cancer Res. 37:559), ces procédés et compositions de détection et de dosage seront utiles pour la prophylaxie, la détection et le traitement
d'une large variété de cancers humains.
Pour un pronostic de cancers (ou d'autres maladies ou états caractérisés par un taux élevé de télomérase), une valeur pour pronostic d'un produit de gène hTRT (ARNm ou protéine) ou une activité pour un type particulier, une classe ou une qualité particulière de tumeur, est déterminée comme décrit ci-après. Les taux de protéine de type hTRT ou les taux d'ARNm ou une activité de télomérase chez un patient peuvent également être déterminés (par exemple, en utilisant les procédés et compositions d'essais et de dosage que l'on décrit ici) et comparés au niveau ou taux de pronostic. Selon l'essai de détection de dosage que l'on utilise, dans certains cas l'abondance d'un produit de type gène de hTRT dans un échantillon sera considérée comme élevée chaque fois o ce taux est décelable par l'essai ou le procédé de détection. En raison de la faible abondance de l'ARNm de type hTRT et de la protéine (de type hTRT), même dans des cellules donnant des résultats positifs à la recherche de la télomérase, et en raison de la rareté ou la non existence de ces produits de gène dans des cellules normales ou donnant un résultat négatif à la recherche de la télomérase, il faut des essais de détermination et de dosage sensibles pour déceler un produit de gène hTRT s'il est présent dans des cellules normales. Si l'on choisit des procédés et compositions d'essais moins sensibles, les produits de gène hTRT seront indécelables dans du tissu sain mais seront décelables dans des cellules de cancer donnant un résultat positif, dans un gène de télomérase ou dans d'autres cellules donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase. Typiquement, la quantité de produit de gène hTRT dans un échantillon à taux élevé est au moins 5 fois, fréquemment au moins environ fois, plus souvent au moins 50 fois environ et très souvent au moins 100 fois à 1000 fois environ supérieure aux taux trouvés dans les cellules témoin donnant un résultat négatif à la recherche de la télomérase ou des cellules provenant de tissus sains d'un adulte, pour lequel le pourcentage de cellules normales donnant un résultat positif à la recherche de
la télomérase est très faible.
Des procédés de diagnostic et de pronostic de la présente invention peuvent servir avec n'importe quel type de cellule ou de tissu de n'importe quelle origine, et ils peuvent servir à déceler une cellule immortelle ou néoplastique, ou du tissu de tumeur, ou du cancer, de n'importe quelle origine. Des types de cancer pouvant être décelés comprennent, sans que cette liste soit limitative, tous ceux énumérés cidessus dans l'étude et la discussion d'applications
thérapeutiques de hTRT.
Les essais de dosage et de détermination de l'invention sont également utiles pour la surveillance de l'efficacité d'une intervention thérapeutique chez des patients soumis à un traitement par des régimes et protocoles anticancer. Les régimes et protocoles anticancer pouvant être surveillés comprennent tous les traitements actuellement approuvés (ce qui comprend la chimiothérapie, la thérapie par des rayonnements, et la chirurgie) et cela inclut également des traitements à approuver dans le futur, comme des thérapies d'inhibition de télomérase ou des thérapies d'activation de télomérase, comme décrit ici. (Voir, par exemple, les publications PCT n 96/01835 et 96/40868 et le brevet US-A-5 583 016, tous ces documents étant incorporés ici par référence en leur
totalité).
Dans un autre aspect, les essais de dosage et de détermination décrits ci-après peuvent utilement servir à déceler certaines variations de la séquence de gène hTRT (mutations et allèles héritables de hTRT) qui constituent des indications d'une prédilection ou prédisposition pour des cancers ou pour d'autres états associés à une régulation anormale de l'activité de
télomérase (stérilité, vieillissement prématuré).
3) DIAGNOSTIC D'ETATS AUTRES QUE LE CANCER
En plus du diagnostic de cancers, les procédés et compositions de détection et de dosage de la présente invention ont de nombreuses autres applications. La présente invention propose des réactifs et des procédés pour le diagnostic d'états ou de maladies
caractérisés par une sous-expression ou une sur-
expression de télomérase ou de produits de type gène hTRT dans les cellules. Chez des adultes, un bas taux d'activité de télomérase se trouve normalement en complément limité de cellules somatiques humaines normales, par exemple des cellules souche, des lymphocytes activés et des cellules germinales, et le taux est absent d'autres cellules somatiques. Ainsi, la détection de l'activité de hTRT ou de télomérase dans des cellules dans lesquelles elle est normalement absente ou inactive, ou la détection à des taux anormaux (c'est-à-dire, supérieurs ou inférieurs à la valeur normale) dans des cellules dans lesquelles hTRT est normalement présente à un faible taux ou niveau (comme des cellules souche, des lymphocytes activés et des cellules germinales), peuvent permettre le diagnostic d'une maladie ou d'un état apparenté à la présence de télomérase ou servir à identifier ou à isoler un type spécifique de cellule (c'est-à-dire, à isoler les cellules souche). Des exemples de telles maladies et de tels états comprennent: des maladies de prolifération cellulaire, des troubles immunologiques, la stérilité, des maladies du fonctionnement des cellules immunes, la grossesse, des anomalies de foetus, un vieillissement prématuré, etc. En outre, les essais de dosage et de détection de l'invention peuvent utilement servir à surveiller l'efficacité d'une intervention thérapeutique (ce qui comprend, sans que cette liste soit limitative, des drogues et médicaments qui modulent l'activité de télomérase) chez un patient ou dans un essai de dosage ou de détection basé sur
l'examen d'une cellule ou sur l'examen d'un animal.
Dans un aspect, l'invention propose des essais de détection et de dosage utiles pour diagnostiquer la stérilité. Les cellules germinales humaines (par exemple, les cellules de spermatogonie, leurs progéniteurs ou descendants) sont capables d'une prolifération infinie et se caractérisent par une activité élevée de télomérase. Des taux anormaux ou des produits anormaux ou des taux diminués de produits de type gène de hTRT peuvent aboutir à une production inadéquate ou anormale de spermatozoïdes, conduisant à
de la stérilité ou à des troubles de la reproduction.
Donc, l'invention propose des essais (procédés et réactifs) pour le diagnostic et le traitement de troubles de la reproduction "fondé sur (un taux anormal) de télomérase". De façon similaire, les essais peuvent servir à surveiller l'efficacité de contraceptifs (par exemple, des contraceptifs pour hommes) qui ont pour cible ou affectent indirectement la production du sperme (et qui risquent d'abaisser les
taux de hTRT ou d'activité de télomérase).
Dans un autre aspect, l'invention propose des essais de détection et de dosage pour l'analyse de la télomérase et des taux de hTRT et du rôle ou de la fonction de hTRT dans les cellules souche, des cellules foetales, des cellules embryonnaires, des lymphocytes activés et des cellules souche hématopoïétiques. Par exemple, des essais de détection de produit de type gène hTRT peuvent servir à surveiller de façon générale le fonctionnement du système immunitaire (par exemple en surveillant la prévalance de lymphocytes activés ou l'abondance de cellules souche progénitrices), à identifier ou à choisir ou à isoler des lymphocytes activés ou de cellules souche (en se fondant sur des taux élevés de hTRT) et à surveiller l'efficacité d'interventions thérapeutiques visant ces tissus (par exemple, des agents immunosuppresseurs ou une tentative thérapeutique visant à l'expansion d'une population de
cellules souche).
L'invention propose également des essais utiles pour identifier des immunoglobulines anti-télomérase et
anti-TRT (que l'on trouve dans le sérum d'un patient).
Les matières et essais que l'on décrit ici peuvent servir à identifier des patients chez lesquels on trouve des anticorps auto- immunes, en permettant un diagnostic et un traitement de l'état associé aux immunoglobulines.
4) SURVEILLANCE DE CELLULES EN CULTURE
Les essais ici décrits peuvent également servir à surveiller l'expression des produits de gène hTRT et à caractériser des gènes hTRT dans des cellules, "ex vivo" ou "in vitro". Puisque des taux élevés de hTRT sont caractéristiques de cellules immortalisées, les essais de l'invention peuvent servir par exemple à dépister ou à identifier des cellules immortalisées ou à identifier un agent capable de rendre mortelles des cellules immortalisées, en inhibant l'expression de hTRT ou son rôle. Par exemple, l'essai va utilement servir à identifier des cellules immortalisées, par l'expression accrue de hTRT dans la cellule, par exemple par l'expression d'une hTRT recombinante ou par une expression accrue d'une hTRT à codage endogène (par
exemple par activation de promoteur).
De façon similaire, ces essais peuvent servir à surveiller l'expression de hTRT dans des animaux ou des cellules transgéniques (par exemple dans de la levure-,dans-des cellules humaines contenant un gène de type hTRT). En particulier, les effets de certains traitements (par exemple l'application d'antagonistes connus ou supposés de la télomérase) sur les taux de hTRT dans des cellules humaines et non humaines exprimant la hTRT de l'invention peuvent servir à identifier des médicaments utiles et des candidats au rôle de médicament (par exemple, des médicaments modulant l'activité de la télomérase).
B) VALEURS NORMALES, DIAGNOSTIC ET PRONOSTIC
Des essais destinés à déceler la présence ou la quantité de produits du type de gène de hTRT peuvent être effectués et les résultats peuvent être interprétés de diverses façons, selon le format de l'essai, la nature de l'échantillon soumis à l'examen ou à l'essai, et les renseignements recherchés. Par exemple, l'abondance permanente de produits de gène de hTRT est si faible dans la plupart des tissus somatiques humains que ces produits sont indécelables par certains essais. En outre, il n'y a généralement pas d'activité de télomérase dans les cellules de ces ce qui rend tout à fait facile une vérification de l'activité. Inversement, de la protéine de type hTRT et/ou de l'ARNm de hTRT ou de la télomérase est une matière suffisamment abondante dans d'autres tissus donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase, par exemple des tumeurs malignes, de sorte que ces tumeurs peuvent être décelées à l'aide des mêmes essais. Même dans les types de cellules somatiques dans lesauelles de faibles taux d'activité de télomérase peuvent normalement être décelés (par exemple des cellules souche et certaines cellules du système hématopoiétique activées), les taux de hTRT, d'ARNm et d'activité de télomérase constituent une faible fraction (estimée par exemple à environ 1% ou moins encore) des taux existant dans les cellules immortelles; ainsi, des cellules immortelles et des cellules mortelles peuvent être facilement distinguées par les procédés de la présente invention. On comprendra que, quand on utilise un essai "moins sensible", la simple détection du produit de gène de hTRT dans un échantillon biologique peut en soi constituer un diagnostic, sans exiger une analyse supplémentaire. En outre, bien que les essais décrits ci-après puissent être réalisés de façon extrêmement sensible, ils peuvent également, si on le désire, être rendus moins sensibles (par exemple, par un choix judicieux de tampons, de conditions de lavage, de nombres d'étapes d'amplification, de réactifs et/ou par le choix d'amplificateurs de signaux). Ainsi, virtuellement n'importe quel essai peut être conçu en vue de déceler des produits de gène de hTRT seulement dans des échantillons biologiques dans lesquels ils sont présents en une concentration particulière, par exemple en une concentration supérieure à celle existant dans du tissu sain ou dans un autre tissu témoin. Dans ce cas, tout taux décelable d'ARNm de hTRT ou de protéine de type hTRT sera considéré comme élevé dans des cellules provenant d'un tissu somatique humain postnatal (autre que des cellules hématopoiétiques et
d'autres cellules souche).
Dans certains cas, cependant, il sera souhaitable d'établir des valeurs normales ou des valeurs de base (ou des intervalles normaux de base) pour les taux d'expression des produits de type gène de hTRT, notamment quand on utilise des essais très sensibles capables de déceler de très bas taux de produits de gène hTRT qui risquent d'être présents dans des cellules somatiques normales. Des taux normaux d'expression ou des produits normaux d'expression peuvent être déterminés pour n'importe quelle
population particulière, dans n'importe quelle sous-
population ou groupe d'organismes selon des méthodes "standard" ou courantes bien connues de l'homme du métier et en utilisant les procédés et réactifs de l'invention. De façon générale, les niveaux des lignes de base (les niveaux normaux) de protéine de type hTRT ou d'ARNm de type hTRT sont déterminés par quantification de la quantité de protéine de type hTRT et/ou d'ARNm de type hTRT dans des échantillons biologiques (par exemple des fluides, des cellules ou des tissus) obtenus sur des sujets normaux (sains), par exemple un sujet humain. Pour certains échantillons et à certaines fins, on peut souhaiter quantifier la quantité de produit de gène de hTRT sur une base par cellule ou par cellule de tumeur. Pour déterminer la cellularité d'un échantillon, on peut mesurer le niveau ou taux d'un produit de gène exprimé de manière constitutive ou d'un autre produit de gène exprimé à des taux connus dans des cellules du type sur lequel l'échantillon a été prélevé. En variante, les valeurs normales de protéine de type hTRT ou d'ARNm de type hTRT peuvent être déterminées par quantification de la quantité de protéine/ARN de type hTRT dans des cellules ou des tissus connus pour être sains, que l'on obtient sur le même patient sur lequel des cellules malades (ou peut-être malades) sont collectées ou sur un individu sain. En variante, les niveaux de ligne de base peuvent être définis dans certains cas comme étant le niveau présent dans des cellules somatiques humaines non immortelles présentes enculture. Il est possible que des valeurs normales (de ligne de base) puissent varier un peu entre différents types de cellule (par exemple, les niveaux d'ARNm de type hTRT peuvent être plus grands dans les testicules que dans le rein), ou la variation peut avoir lieu selon l'âge, le sexe ou l'état physique d'un patient. Ainsi, par exemple, quand on utilise un essai de dosage ou de détermination pour déterminer des variations des taux de hTRT associés à du cancer, les cellules servant à déterminer 1 'intervalle normal d'expression de produit de gène de type hTRT peuvent être des cellules provenant de personnes ayant le même âge ou ayant un âge différent, selon la nature de l'attaque. L'application de méthodes statistiques standardisées servant en génétique moléculaire permet de déterminer les niveaux de ligne de base d'expression et également cela permet l'identification des écarts significatifs par rapport
aux niveaux des lignes de base.
Dans la réalisation des méthodes de diagnostic et de pronostic de l'invention, comme décrit ci-dessus, il sera parfois utile de se référer à des "valeurs de diagnostic" et à des "valeurs de pronostic". Telle qu'on l'utilise ici, l'expression "valeur de diagnostic" désigne une valeur qui est déterminée pour le produit de gène de type hTRT décelé dans un échantillon et qui, comparé à un intervalle normal (ou "de ligne de base") du produit de gène de type hTRT,
constitue une indication de la présence d'une maladie.
La maladie peut être caractérisée par une activité élevée de télomérase (par exemple du cancer), par l'absence d'activité de télomérase (par exemple de la stérilité) ou présenter une certaine valeur intermédiaire. L'expression de "valeur de pronostic" se réfère à une quantité de produit du gène de type hTRT décelé dans un type donné de cellule (par exemple, une cellule de tumeur maligne), et qui correspond bien à un diagnostic et à un pronostic particuliers de la maladie (par exemple, du cancer) La quantité du produit de gène de type hTRT (ce qui comprend une quantité nulle) décelée dans un échantillon est comparée à la valeur de pronostic de la cellule de façon que la comparaison relative des valeurs indique la présence d'une maladie ou l'apparition probable de la progression de la maladie (par exemple, du cancer). Dans une forme de réalisation, par exemple, pour établir un pronostic de tumeur, on collecte des données pour obtenir une corrélation statistiquement significative des taux ou niveaux de hTRT avec différentes classes de tumeur ou différentes catégories ou qualités de tumeur. Un intervalle prédéterminé de taux ou niveaux de hTRT est établi pour le même échantillon de cellule ou le même échantillon de tissu obtenu sur des sujets ayant des états ou progressions cliniques que l'on connaît. On effectue un nombre suffisant de mesures pour produire une valeur statistiquement significative (ou un intervalle de telles valeurs) avec lequel ou avec laquelle on effectuera une comparaison. L'intervalle prédéterminé de taux ou niveaux de hTRT ou d'activité de hTRT pour un échantillon donné de cellule ou de tissu peut servir à déterminer une valeur ou un intervalle du niveau de produit de gène de type hTRT qui pourrait être en corrélation avec un pronostic favorable (ou moins favorable) (par exemple, un faible taux ou un faible niveau dans le cas d'un cancer). Un intervalle correspondant à un "niveau élevé" en corrélation avec un pronostic défavorable (ou plus défavorable) dans le cas d'un cancer peut de façon similaire être déterminé. Le niveau de produit de gène de type hTRT provenant d'un échantillon biologique (par exemple, un échantillon provenant d'un patient) peut ensuite être déterminé et comparé aux intervalles, bas
et élevés, et servir à prédire un pronostic clinique.
Bien que la discussion ci-dessus se réfère à titre illustratif à du cancer, on comprendra que des valeurs de diagnostic et de pronostic peuvent également être déterminées pour d'autres maladies (par exemple, les maladies liées à une prolifération de cellules) et à d'autres états et que, pour des maladies ou des états autres que le cancer, un niveau "élevé" peut être en corrélation avec le pronostic souhaité et un "faible"
niveau en corrélation avec un pronostic défavorable.
Par exemple, certaines maladies peuvent se caractériser par une déficience (par exemple, par un faible taux ou niveau) d'activité de télomérase dans des cellules souche, des lymphocytes activés ou des cellules de lignée germinale. Dans un tel cas, des taux ou niveaux "élevés" de produits de gène de type hTRT par rapport à des cellules d'un âge et/ou d'un type similaires (provenant par exemple d'autres patients ou d'autres tissus d'un patient particulier) peuvent être en
corrélation avec un pronostic favorable.
On comprendra que les méthodes d'essai et de dosage ne nécessitent pas nécessairement une mesure de valeurs absolues de hTRT, sauf si on le désire, puisque des valeurs relatives sont suffisantes pour de nombreuses applications des procédés de la présente invention. Lorsqu'une quantification est souhaitable, la présente invention propose des réactifs tels qu'on puisse utiliser virtuellement n'importe quel procédé connu pour une quantification des produits provenant
des gènes.
Les essais de dosage et de détermination de l'invention peuvent également servir à évaluer l'efficacité d'un régime de traitement thérapeutique particulier dans des études sur les animaux, dans des essais cliniques ou dans la surveillance du traitement d'un patient individuel. Dans ces cas, il peut s'avérer souhaitable d'établir la ligne de base pour le patient avant de commencer un traitement, et de répéter les essais de dose ou de détermination une ou plusieurs fois au cours du traitement, habituellement sur une base régulière, pour évaluer si des taux de hTRT se déplacent vers le point final voulu (par exemple, une expression réduite de hTRT quand l'essai de dosage ou de détermination concerne du cancer) par suite du traitement. L'homme du métier comprendra que, en plus de la quantité et de l'abondancedes produits provenant du gène de hTRT, des types d'expression de variant ou des types anormaux d'expression (par exemple, des quantités anormales de variants provenant d'un épissage de ARN) ou des produits d'expression de variant ou des produits anormaux (par exemple, des produits de transcription avec mutation, des polypeptides tronqués ou du type non-sens) peuvent également être identifiés par comparaison avec des taux normaux d'expression et avec des produits normaux d'expression. Dans ces cas, la détermination d'une "ligne normale" ou d'une "ligne de base" implique l'identification d'organismes sains et/ou de tissus sains (c'est-à- dire des organismes et/ou des tissus sans dysrégulation d'expression de hTRT ou sans croissance néoplastique) et la mesure des taux d'expression des produits provenant de gène variant de hTRT (par exemple, des variants résultant d'une épissure), ou le séquençage ou la détection du gène de type hTRT, d'ARNm, ou d'ADNc par transcription reverse pour obtenir ou déceler les variations typiques (normales) de séquences. L'application de méthodes statistiques standard servant en génétique moléculaire permet la détermination d'écarts significatifs par
rapport à de tels taux ou niveaux de ligne de base.
C) DETECTION ET QUANTIFICATION DE PRODUITS
PROVENANT D'UN GENE DE TRT
Comme cela a été souligné ici, les produits provenant d'un gène de hTRT se trouvent habituellement à des taux ou niveaux extrêmement bas dans la plupart des cellules somatiques normales. Par exemple, l'ARNm codant pour de la protéine de type hTRT est extrêmement rare ou absente dans tous les types de cellule donnant un résultat négatif à la recherche de la télomérase et que l'on étudie jusqu'à présent. Dans des cellules immortelles, comme les cellules 293, l'ARNm de type hTRT peut être présent en environ 100 exemplaires ou copies seulement par cellule, cependant que des cellules somatiques normales peuvent avoir aussi peu qu'une copie ou zéro copie par cellule. Il apparaîtra ainsi que, quand on souhaite des essais de détermination de dosage extrêmement sensibles pour la détection de produits provenant de gène de type hTRT, il sera parfois avantageux d'incorporer des technologies d'amplification de signaux ou de cible dans le format ou le mode opératoire d'essai. Voir, par exemple, Plenat et al., 1997, Ann. Pathol. 17:17 (fluoresceinyl-tyramide signal amplification); Zehbe et al., 1997, J. Pathol. 150:1553 (catalyzed reporter deposition); d'autres références énumérées ici (par exemple, pour une amplification du signal d'ADNb, pour de l'amplification en chaîne par polymérase, ACP, et de cibre pour d'autres formats d'amplification)et d'autres
techniques connues en pratique.
Comme noté ci-dessus, il n'est souvent pas nécessaire de quantifier l'ARNm de type hTRT ou une protéine correspondante dans les essais de dosage ou de détermination que l'on décrit ici, car la détection d'un produit de gène de hTRT (dans des conditions de dosage ou de détermination dans lesquelles le produit n'est pas décelable dans le témoin, par exemple, dans des cellules donnant un résultat négatif à la recherche de télomérase) suffit en soi pour un diagnostic. Comme autre exemple, lorsque les taux de produit que l'on trouve dans un échantillon d'essai (provenant par exemple, d'une tumeur) et un échantillon témoin (par exemple, une cellule saine) sont directement comparés,
une quantification peut s'avérer superflue.
Quand on le désire, cependant, des quantités du produit de gène de hTRT que l'on mesure dans les essais ici décrits peuvent être décrites de diverses façons, selon la méthode de mesure et la commodité. Ainsi, des quantités normales, pour diagnostic, pour pronostic, des quantités élevées ou basses de protéine de type hTRT/ARNm peuvent être exprimées sous forme d'unités standard de poids par quantité d'échantillon biologique (par exemple, des picogrammes par gramme de tissu, des picogrammes par 1012 cellules), comme un nombre de molécules par quantité de l'échantillon biologique (par exemple, produit de transcription/cellule, moles/cellule), sous forme d'unités d'activité par cellule ou par autre quantité unitaire, ou par des méthodes similaires. La quantité de produit de gène de hTRT peut également être exprimée par rapport à la quantité d'une autre molécule; des exemples comprennent: le nombre de produits de transcription de hTRT dans un échantillon/nombre de produits de transcription d'ARNr 28S dans un échantillon; des nanogrammes de protéine de type hTRT/nanogrammes de protéine totale; etc. Quand on mesure les produits d'un gène de hTRT dans deux (ou plus de deux) échantillons différents, il sera parfois utile d'avoir une base commune de comparaison pour les deux échantillons. Par exemple, quand on compare un échantillon de tissu normal et un échantillon de tissu cancéreux, on peut comparer des quantités égales de tissu (en poids, en volume, en nombre de cellules, etc.). En variante, on peut utiliser des équivalents d'une molécule de marquage (par exemple, ARNr 28S, hTR, activité de télomérase, longueur de télomère, actine). Par exemple, la quantité de protéine de type hTRT dans un échantillon de tissu sain contenant 10 picogrammes d'ARNr 28S peut être comparée à un échantillon de tissu malade contenant la
même quantité d'ARNr 28S.
L'homme du métier comprendra également que virtuellement n'importe lequel des essais ici décrits
peut être conçu pour donner un résultat quantitatif.
Typiquement, une quantité connue ou une source d'un produit de gène de hTRT (par exemple, produit à l'aide des procédés et compositions de l'invention) sert à
étalonner l'essai.
Dans certaines formes de réalisation, on choisit des formats ou modes opératoires d'essai qui décèlent la présence, l'absence ou l'abondance d'un allèle de hTRT ou d'un produit de gène de hTRT dans chaque cellule d'un échantillon (ou dans un échantillonnage représentatif). Des exemples de tels formats comprennent ceux qui décèlent un signal par histologie (par exemple, par immunohistochimie avec des étapes d'amplification de signal ou d'amplification de la cible) ou par des analyses de cellules activées par fluorescence ou par classement de cellules avec activation par fluorescence. Ces formats sont particulièrement avantageux quand on traite une population de cellules hautement hétérogènes (contenant par exemple de nombreux types de cellules dans lesquelles un seul type ou un petit nombre de types comportent des taux élevés de hTRT, ou une population de cellules similaires exprimant de la télomérase à des
*taux différents).
D) COLLECTE DES ECHANTILLONS
Le gène de hTRT ou le produit d'un tel gène (c'est-à-dire ARNm ou du polypeptide) est de préférence
décelé et/ou quantifié dans un échantillon biologique.
De tels échantillons comprennent, sans que cette liste soit limitative, des cellules (comprenant des cellules entières, des fractions de cellule, des extraits de cellule, et des cellules cultivées ou des lignées de cellules), des tissus (ce qui comprend du sang, des globules sanguins (par exemple, des globules blancs) et des échantillons de tissu comme des échantillons de biopsie en fines aiguilles (provenant par exemple, de la prostate, du sein, de la thyroïde, etc.)), des fluides corporels (par exemple de l'urine, du crachat, du fluide amniotique, du sang, du fluide péritonéal, du fluide pleural, de la semence) ou des cellules collectées à partir de tels échantillons (par exemple, des cellules de vessie provenant de l'urine, des lymphocytes provenant du sang), des milieux (provenant de cellules cultivées ou de lignées de cellules), et des produits de lavage (par exemple, de la vessie et du poumon). Des échantillons biologiques peuvent également inclure des sections ou coupes de tissu, comme des
coupes congelées prélevées à des fins histologiques.
Pour un diagnostic et un pronostic de cancer, on
obtiendra un échantillon sur un tissu ou sur une tu-
meur cancéreux ou précancéreux ou supposé cancéreux. Il sera parfois souhaitable de congeler un échantillon biologique pour l'analyser par la suite (par exemple, quand on surveille l'efficacité de traitements par des médicaments). Dans certains cas, les cellules ou tissus peuvent être fractionnés avant analyse. Par exemple, dans une biopsie de tissu prélevé sur un patient, un appareil de classement de cellules (par exemple, un appareil de classement de cellules avec activation par fluorescence) peut servir à classer des cellules selon des caractéristiques comme l'expression d'un antigène de surface (par exemple, un antigène spécifique d'une
tumeur) selon des méthodes bien connues.
Bien que l'échantillon soit typiquement prélevé sur un patient humain ou sur une lignée de cellules, les essais peuvent servir à déceler des gènes homologues de hTRT ou des produits de tels gènes dans des échantillons provenant d'autres animaux. En variante, des gènes de type hTRT ou des produits de tels gènes peuvent être soumis à des essais de détection ou de dosage dans le cas d'animaux transgéniques ou d'organismes exprimant une protéine de
type TRT humaine ou une séquence d'acides nucléiques.
L'échantillon peut être prétraité selon la nécessité, par dilution dans une solution tampon
appropriée ou il peut être concentré, si on le désire.
On peut utiliser n'importe laquelle d'un certain nombre de solutions tampon aqueuses courantes ou normalisées, en utilisant l'un des divers tampons, comme du phosphate, du tampon Tris ou analogues, à des pH
physiologiques.
Un "échantillon biologique" obtenu sur un patient peut être désigné comme étant un "échantillon biologique" ou un "échantillon (prélevé sur ou caractérisant) un patient". On comprendra que l'analyse d'un "échantillon de patient" n'exige pas nécessairement le prélèvement ou l'enlèvement de cellules ou d'un tissu sur le patient. Par exemple, des agents de liaison de hTRT marqués de façon appropriée (par exemple, des anticorps ou des acides nucléiques) peuvent être injectés à un patient et visualisés (quand ils sont liés à la cible), à l'aide d'une technologie standard de formation d'image (par exemple, un test d'agglutination dans les capillaires, TAC, la
résonance magnétique nucléaire, etc.).
E) ESSAIS DE DETECTION OU DE DOSAGE D'ACIDES
NUCLEIQUES
Dans une forme de réalisation, l'invention propose des procédés de détection et/ou de quantification de l'expression d'ARNm de type hTRT (ce qui comprend des variants par épissage ou des variants à séquence spéciale et d'autres allèles). Dans une autre forme de réalisation, l'invention propose des procédés pour déceler et analyser des gènes normaux ou anormaux de type hTRT (ou des fragments de tels gènes). La forme de tels essais qualitatifs ou quantitatifs peut comprendre, sans que ce soit limitatif, des essais à base d'amplification, avec ou sans amplification de signaux, des essais à base d'hybridation, et des essais combinant amplification et hybridation. L'homme du métier comprendra que la distinction entre hybridation et amplification n'est présentée que par souci de commodité.. Comme illustré dans l'exemple ci-après, de nombreux formats d'essais impliquent des éléments d'hybridation et également d'amplification, de sorte que le classement en catégorie est quelquefois
arbitraire dans certains cas.
1) PREPARATION D'ACIDES NUCLEIQUES
Dans certaines formes de réalisation, on effectue des essais de détermination et de dosage d'acide nucléique avec un échantillon d'acide nucléique isolé sur la cellule, le tissu, l'organisme, ou la lignée de cellules à essayer. L'acide nucléique (par exemple, de l'ADN de génome, de l'ARN ou de l'ADNc) peut être "isolé" de l'échantillon selon n'importe lequel d'un certain nombre de procédés bien connus de l'homme du métier. Dans ce contexte, "isolé" se réfère à n'importe quelle séparation de l'espèce ou de la cible à déceler par rapport à n'importe quelle autre substance présente dans le mélange, mais cela n'indique pas nécessairement un degré important ou significatif de purification de la cible. L'homme du métier comprendra que, lorsque des altérations dans la copie du gène de type hTRT sont à
déceler, l'ADN de génome constitue la cible à déceler.
Inversement, quand il faut déceler des niveaux d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes, l'ARN constitue la cible à déceler dans un essai de recherche à base d'acide nucléique. Dans une forme préférée de réalisation, l'échantillon d'acide nucléique est constitué par la totalité de l'ARNm (c'est-à-dire, du poly(A) +ARN) dans un échantillon biologique. Des procédés pour isoler des acides nucléiques sont bien connus de l'homme du métier et ils sont décrits, par exemple, dans l'ouvrage de Tijssen, P. ed.: "LABORATORY
TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:
HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, PART. I. THEORY
AND NUCLEIC ACID PREPARATION" [TECHNIQUES DE
LABORATOIRE EN BIOCHIMIE ET EN BIOLOGIE MOLECULAIRE;
HYBRIDATION AVEC DES SONDES D'ACIDE NUCLEIQUE, lère
PARTIE, THEORIE ET PREPARATION D'ACIDE NUCLEIQUE],
Elsevier, N.Y. (1993), chapitre 3, qui est incorporé ici par référence. Dans une forme de réalisation, la totalité de l'acide nucléique est isolée sur un échantillon donné en utilisant un procédé d'extraction guanidinium-phénol-chloroforme acide et du poly(A)+ANRm est isolé par chromatographie sur colonne d'oligo-dT ou par utilisation (dT) dans des lits magnétiques (voir, par exemple, Sambrook et al., et Ausubel et al., ci-dessus). Dans d'autres formes de réalisation, il n'est pas nécessaire d'isoler des acides nucléiques (par exemple, de i'ARN total ou du polyA+ARN) sur l'échantillon biologique avant d'effectuer des opérations d'amplification, d'hybridation ou d'autres essais. Ces formes de réalisation ont certains avantages quand il s'agit de mesurer de l'ARN de type hTRT, parce qu'elles diminuent la possibilité de perte d'ARNm de type hTRT au cours de l'isolement et de la manutention. Par exemple, de nombreuses techniques d'amplification, comme ACP et ACP-RT que l'on définit ci- dessus peuvent être effectuées à l'aide de cellules perméabilisées (échantillons histologiques et analyses par classification avec amplification par fluorescence), des cellules lysées entières ou des fractions de cellule brutes comme certains extraits de cellule. De préférence, on prend des mesures en vue de préserver l'intégrité de l'acide nucléique de cible (par exemple, l'ARNm), si nécessaire (par exemple, l'addition d'inhibiteurs d'ARN-ase). Des essais par amplification et hybridation peuvent également être réalises "in situ", par exemple, dans de minces coupes de tissu provenant d'un échantillon de biopsie ou sur une monocouche de cellules (par exemple, des globules sanguins ou des cellules d'une culture de tissu désagrégée). Une amplification peut également être effectuée dans une cellule entière intacte ou dans des cellules fixes ou fixées. Par exemple, des procédés d'amplification de type ACP, ACP-RT ou LCR peuvent être effectués, comme cela est bien connu en pratique, "in situ", par exemple, en utilisant une polymérase ou ligase, un ou des amorceur(s), et des (désoxy)ribonucléoside triphosphates (si l'on utilise une polymérase) et de la transcriptase inverse et de l'amorceur (s'il doit y avoir transcription d'ARN et s'il doit y avoir détection d'ADNc) sur des cellules fixes, rendues perméables ou microinjectées pour amplifier l'ARN ou l'ADN de type hTRT constituant une cible. Des cellules contenant de l'ARN de type hTRT (par exemple, des cellules positives à la recherche de la télomérase) ou une séquence intéressante d'ADN de type hTRT peut alors être décelée. Le procédé est souvent utile quand on utilise des dNTP marqués par de la fluorescence, des amorceurs ou d'autres constituants de concert avec une analyse au microscope, par classement avec amplification par fluorescence ou un
procédé équivalent.
2) ESSAIS DE DETECTION DE RECHERCHE BASEE SUR
UNE AMPLIFICATION
Dans une forme de réalisation, les essais de détection de recherche ou de dosage de la présente invention sont des essais à base d'amplification destinés à déceler un gène de hTRT ou un produit d'un tel gène. Dans un essai à base d'amplification, la totalité ou une partie d'un gène de hTRT ou d'un produit de transcription (par exemple, ARNm ou ADNc; ce que l'on désigne également ci-après comme étant une "cible") est amplifiée, et le produit d'amplification est ensuite décelé directement ou indirectement. Quand il n'y a pas de gène ou de produit de gène sous-jacent pour jouer le rôle d'un gabarit, il n'y a pas de production d'un produit d'amplification (par exemple, ayant la taille attendue) ou bien l'amplification n'est pas spécifique et, typiquement, il n'y a pas un produit unique d'amplification. Par contraste, quand le gène ou le produit de gène sous-jacent est présent, la séquence cible est amplifiée, ce qui donne une indication de la présence et/ou de la quantité du gène ou de l'ARNm sous-jacent. Des essais à base d'amplification de cible
sont bien connus de l'homme du métier.
La présente invention propose une large variété d'amorceurs et de sondes pour déceler des gènes de hTRT et des produits de tels gènes. De tels amorceurs et de telles sondes sont suffisamment complémentaires du gène de hTRT ou du produit de ce gène pour former un hybride avec l'acide nucléique cible. Des amorceurs ont typiquement une longueur d'au moins 6 bases, habituellement une longueur comprise entre environ 10 et environ 100 bases, typiquement entre environ 12 et environ 50 bases, et souvent entre environ 14 et environ 25 bases. L'homme du métier, ayant passé en revue le présent exposé, sera capable, en utilisant des méthodes routinières, de choisir des amorceurs pour amplifier en totalité, ou une partie quelconque, du gène de hTRT ou d'un produit de ce gène, ou pour distinguer entre des produits de gène variants, des allèles de hTRT, etc. Le tableau 2 énumère à titre illustratif des amorceurs utiles pour une amplification en chaîne, par polymérase (ACP), de la hTRT ou des produits spécifiques de gène de hTRT ou de régions correspondantes. Comme on le sait bien en pratique, des oligomères simples (voir, par exemple, le brevet US-A-5 545 522), des groupes d'oligomères en amas ou même un ensemble dégénéré d'oligomères peuvent servir à une amplification, par exemple, comme illustré par l'amplification de l'ADNc de type TRT de Tetrahymena,
comme décrit ci-après.
L'invention propose divers procédés pour amplifier et déceler un gène ou un produit de gène de hTRT, ce qui comprend la réaction en chaîne sous l'effet d'une polymérase (comprenant tous les variants, par exemple, l'amplification en chaîne par polymérase avec transcriptase reverse, le système d'amplification "Sunrise" (Oncor, Inc., Gaithersburg MD, Etats-Unis d'Amérique) et de nombreux autres systèmes connus en pratique). Dans une forme de réalisation présentée à titre illustratif, on effectue une amplification en chaîne sous l'effet d'une polymérase dans une solution de 50 l contenant l'échantillon d'acide nucléique (par exemple, ADNc, que l'on obtient par transcription reverse d'ARN de type hTRT), 100 pM dans chaque NTPd (ATPd, CTPd, GTPd et TTPd; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ, Etats-Unis d'Amérique), le ou les amorceur(s) d'une amplification en chaîne par polymérase spécifique de hTRT, une unité/Taq de polymérase (Perkin Elmer, Norwalk, CT, Etats-Unis d'Amérique), lxtampon pour amplification en chaîne par polymérase (50 mM de KC, mM de Tris, pH 8,3 à la température ambiante, 1,5 mM de MgC2, gélatine à 0,01%), l'amplification étant effectuée durant 30 cycles environ à 94 durant 45 sec, à 55 durant 45 sec et 72 durant 90 sec. Cependant, comme on le comprendra, de nombreuses variations peuvent être apportées pour optimiser l'amplification en chaîne par polymérase en vue de n'importe quelle
réaction particulière désirée.
D'autres procédés convenables d'amplification de
cible comprennent la réaction en chaîne avec ligase (réac-
tion en chaîne avec de la ligase, par exemple Wu et Wallace, 1989, Genomics 4:560; Landegren et al., 1988, Science, 241:1077, Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189 et Barringer et al., 1990, Gene, 89:117); une amplification avec déplacement de brins (ADB; voir, par exemple, Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:392-396); une amplification avec transcription (voir, par exemple, Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173); une réplication de séquence auto-entretenue (RSAE; voir, par exemple, Fahy et al., 1992, PCR Methods Appl. 1:25, Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:1874); l'amplification basée sur des séquences d'acide nucléique (ABSAN; NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario, par exemple, Compton, 1991, Nature 350:91); le système d'amplification basée sur une transcription (ABT); et le système de réplication de séquence auto-entretenue (RSAE). Chacune des publications précitées est incorporée ici par référence. Un variant utile de RCP
est "PCR ELISA (par exemple, Boehringer Mannheim Cat.
N 1 636 111), dans le cas duquel de la digoxigénine dUTP est incorporée au produit de RCP. Le mélange de la réaction RCP est dénaturé et il y a formation d'hybride avec un oligonucléotide marqué par de la biotine et conçu pour un annelage sur une séquence interne du produit de RCP. Lesproduits d'hybridation sont immobilisés sur des plaques revêtues de streptavidine et la détection est effectuée à l'aide d'anticorps anti-digoxigénine. Des exemples de techniques suffisantes pour diriger l'homme de l'art dans des méthodes d'amplification "in vitro" se trouvent dans
"PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA
AMPLIFICATION" [TECHNOLOGIE RCP: PRINCIPES ET
APPLICATIONS POUR UNE AMPLIFICATION D'ADN], H. Erlich, Ed. Freeman Press, New York, NY (1992); "PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS", ouvrage publié sous la direction de Innis, Gelfland, Snisky et White, Academic Press, San Diego, Californie (1190); Mattila et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:4967; Eckert et Kundel, (1991), PCR METHODS AND APPLICATIONS 1:17; PCR, eds. McPherson, Quirkes et Taylor, IRL Press, Oxford; brevets US-A-4 683 195; US-A-4 683 202 et US-A-4 965 188; Barringer et al., 1990, Gene, 89:117; Lomell et al., 1989, J. Clin. Chem., 35:1826, dont chacun est incorporé ici à toutes fins utiles. Des produits d'amplification peuvent être directement analysés, par exemple, par la taille telle que déterminée par électrophorèse sur gel; par hybridation sur un acide nucléique cible immobilisé sur un support solide comme une perle, une membrane, une lamelle ou une "puce"; par séquençage; de façon immunologique, par exemple, par PCR- ELISA, par détection d'un signal fluorescent, phosphorescent ou radioactif; ou par
n'importe lequel des divers autres moyens bien connus.
Par exemple, un exemple illustratif d'un procédé de détection utilise des amorces de RCP augmentées par des boucles en épingle à cheveux reliées à de la fluorescéine et à un dérivé de l'acide benzoique servant d'agent d'arrêt, de sorte que la fluorescence est émise seulement lorsque les amorces se déploient pour fixer leurs cibles et qu'une réplication se produit. Puisque de l'ARNm de type hTRT est typiquement exprimé sous forme d'une transcription extrêmement rare, présente à de très faibles taux ou niveaux même dans le cas de cellules positives à la recherche de la télomérase, il est souvent souhaitable d'Qptimiser ou d'augmenter le signal résultant de l'étape d'amplification. Une façon d'y parvenir consiste à augmenter le nombre de cycles d'amplification. Par exemple, bien que 20 à 25 cycles conviennent bien pour une amplification de la plupart des ARNm utilisant une réaction en chaîne par polymérase dans les conditions de réaction standard, une détection de l'ARNm de type hTRT peut exiger dans de nombreux échantillons jusqu'à à 35 cycles d'amplification, selon le format de détection et l'efficacité de l'amplification. On comprendra qu'un choix judicieux des conditions d'amplification, y compris le nombre des cycles d'amplification, peut servir à concevoir un essai aboutissant à un produit d'amplification obtenu seulement quand il y a une quantité seuil de cible dans l'échantillon d'essai (c'est-à-dire que seuls des échantillons présentant un taux élevé d'ARNm de type hTRT donnent un résultat "positif"). En outre, on connaît des procédés pour augmenter le signal produit par l'amplification de la séquence cible. Les procédés pour augmenter l'aptitude à déceler la cible amplifiée comprennent un système d'amplification de signal comme: une amplification de signal d'ADN ramifié (voir, le brevet US- A-5 124 246; Urdea, 1994, Bio/Tech. 12:926); un système d'amplification de signal de tyramide (AST) (DuPont); une amplification de signal catalytique (ASC; Dako); "Q Beta Replicase systems" (Tyagi et al., 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93:5395); ou des systèmes analogues. L'homme du métier va comprendre que, quel que soit le procédé d'amplification que l'on utilise, on peut utiliser divers procédés quantitatifs connus en pratique si on désire effectuer une quantification. Par exemple, quand on le désire, deux ou plus de deux polynucléotides peuvent être co-amplifiés dans un échantillon unique. Ce procédé peut servir de procédé commode de quantification de la quantité d'ARNm de type hTRT dans un échantillon, parce que les réactions de transcription reverse et d'amplification sont effectuées dans la même réaction concernant un polynucléotide cible et témoin. La co-amplification du polynucléotide témoin (habituellement présent en une concentration connue ou en un nombre connu de copies) peut servir pour la normalisation du nombre des cellules présentes dans l'échantillon en comparaison de la quantité de hTRT dans l'échantillon. Des polynucléotides témoins convenant pour des réactions de co- amplification comprennent l'ADN, ARN exprimé par des gènes domestiques, des gènes à expression constitutive et des ARN ou ADN synthétisés in vitro et ajoutés au mélange réactionnel. Des polynucléotides témoins endogènes sont ceux qui sont déjà présents dans l'échantillon, cependant que des polynucléotides témoins exogènes sont ajoutés à un échantillon, en créant une réaction rendue "pointue". Des ARN témoins constituant des illustrations comprennent de l'ARN de 3- actine, de l'ARN GAPDH, des ARNsn, hTR et de l'ARN 28S à expression endogène (voir Khan et al., 1992, Neurosci. Lett. 147:114). Les polynucléotides témoins exogènes comprennent un ARNc AW106 de synthèse, dont la synthèse peut être effectuée comme brin sens à partir de pAW106 par la polymérase T7. On comprendra que, pour que le procédé de co-amplification soit utile pour une quantification, les polynucléotides témoins et cibles doivent typiquement être tous deux amplifiés dans une gamme linéaire. Les protocoles détaillés pour de la RCP quantitative peuvent se trouver dans "PCR PROCOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS", Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990) et Ausubel et al., citation ci-dessus (Unité 15) et Diaco, R. (1995) "Pratical Considerations for the Design of Quantitative PCR Assays" [Considérations pratiques pour la conception d'essais de dosage par RCP quantitative) dans "PCR STRATEGIES, pages 84-108, Innis et al.,
éditeur, Academic Press, New York.
Selon la séquence du standard endogène ou exogène, on peut utiliser différents groupes d'amorce pour la réaction de co-amplification. Dans un procédé, appelé une amplification compétitive, une RCP quantitative implique une co-amplification simultanée d'une quantité connue d'une séquence témoin, en utilisant pour l'amplification les mêmes amorces que pour l'amplification de l'acide nucléique cible (une paire de 2 amorces).Dans une autre forme de réalisation,connue comme étant une compétition non compétitive, la séquence témoin et la séquence cible (par exemple, ADNc de type hTRT), sont amplifiées à l'aide d'amorces différentes (c'est-à-dire, 2 paires de 2 amorces). Dans une autre forme de réalisaiton, appelée amplification semi-quantitative, on utilise trois amorces, dont l'une est spécifique pour hTRT, dont l'une est spécifique pour le témoin et dont l'une est capable de se fixer par annelage aussi bien sur la cible que sur les séquences témoins. Une amplification semicompétitive est décrite dans le brevet US-A-5 629 154, qui est
incorporé ici par référence.
3) ESSAIS DE DETECTION ET DE DOSAGE A BASE
D'HYBRIDATION
a) GENERALITES L'homme du métier connait divers procédés de mesure spécifique d'ADN et d'ARN en utilisant les techniques d'hybridation d'acides nucléiques (voir Sambrook et al., ci-dessus). Des essais à base d'hybridation se réfèrent à des essais de détection ou de dosage dans lesquels un acide nucléique sonde est
soumis à hybridation sur un acide nucléique cible.
Habituellement, des sondes pour hybridation d'acide
nucléique de l'invention sont entièrement ou quasi-
entièrement identiques à une séquence contiguë du gène de hTRT ou de la séquence d'ARN. De préférence, la longueur des sondes de type acide nucléique correspond à au moins 10 bases environ, souvent au moins 20 bases environ et parfois au moins 200 bases environ ou même davantage. Des procédés de choix de séquences de sonde d'acide nucléique pour hybridation d'acide nucléique sont étudiés dans Sambrook et al., ci- dessus. Dans certains formats, au moins l'une, la sonde ou la cible, est immobilisée. L'acide nucléique immobilisé peut être ADN, ARN ou un autre oligonucléotide ou polynucléotide, et cela peut comprendre des nucléotides, des analogues de nucléotides ou des charpentes de type naturel ou non naturel. De tels essais peuvent être effectués en n'importe lequel de divers formats, ce qui comprend les techniques dites "Southern", "Northern", par points et des réseaux de haute densité du polynucléotide ou d'oligonucléotide (par exemple, "Gene Chips Affumetrix), des tiges ou bandes à tremper, des tiges, des morceaux ou puces, ou des perles. Toutes ces techniques sont bien connues en pratique et constituent la base de nombreux ensembles ou "kits" pour diagnostic, disponibles dans le commerce. Des techniques d'hybridation sont décrites de façon générale dans Hames et al., ed. "NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH" IRL Press (1985); Gall et Pardue Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 63:378-383 (1969); et
John et al., Nature, 223:582-587 (1969).
L'homme du métier connaît divers formats d'hybridation d'acides nucléiques. Par exemple, un format courant consiste en l'hybridation directe, dans laquelle un acide nucléique cible est soumis à
hybridation sur une sonde complémentaire marquée.
Typiquement, les acides nucléiques marqués servent pour l'hybridation, la marque fournissant le signal décelable. Un procédé pour évaluer la présence, l'absence ou la quantité d'ARNm de type hTRT consiste à effectuer un transfert de type "Northern" de ARN depuis un échantillon et à effectuer une hybridation d'une sonde d'acide nucléique spécifique de type hTRT, marqué comme illustré dans l'exemple 2. Comme cela a été noté ci-dessus, ARNm de type hTRT, quand il est présent, représente de très faibles quantités dans la plupart des cellules. Donc, quand on utilise une hybridation de type "Northern", il sera souvent souhaitable d'utiliser une étape d'amplification (ou, en variante, de grandes quantités d'ARN de départ). Un procédé utile pour évaluer la présence, l'absence ou la quantité d'ADN codant pour les protéines de type hTRT dans un échantillon implique un transfert de type "Southern" d'ADN depuis un échantilion et une hybridation d'une
sonde d'acide nucléique spécifique de hTRT marqué.
D'autres formats communs d'hybridation comprennent I; les essais en sandwich" et les essais avec compétition ou déplacement. Les essais en sandwich sont des essais d'hybridation utiles à l'échelle commerciale pour déceler ou isoler les séquences d'acides nucléiques. De tels essais utilisent un acide nucléique de "capture", immobilisé par covalence sur un support solide et un acide nucléique pour "signal" marqué en solution. L'échantillon biologique ou clinique va fournir l'acide nucléique cible. L'acide nucléique "pour capture" et la sonde d'acide nucléique "signal" forment un hybride avec l'acide nucléique cible pour former un complexe d'hybridation "en sandwich". Pour être efficace, l'acide nucléique générateur d'un signal ne peut former
un hybride avec l'acide nucléique pour capture.
b) ESSAIS A BASE "DE CHIP" ET ESSAIS A BASE
DE LAMELLE
La présente invention propose également des essais d'hybridation à base de sonde pour des produits de gène de hTRT utilisant des réseaux d'oligonucléotides ou de polynucléotides immobilisés sur lesquels un acide nucléique de type hTRT peut se fixer par hybridation (c'est-à- dire sur une partie, mais habituellement pas sur la totalité ou même sur la majeure partie des oligo- ou poly-nucléotides immobilisés). Des réseaux ou ensembles d'oligonucléotides de haute densité ou des réseaux de polynucléotides fournissent un moyen pour déceler efficacement la présence et les caractéristiques (par exemple, une séquence) d'un acide nucléique cible (par exemple, un gène de type hTRT, ARNm ou ADNc). On connaît des techniques pour produire des réseaux contenant des milliers d'oligonucléotides complémentaires de séquences bien définies, en des endroits définis sur une surface, en utilisant des techniques de photolithographie pour une synthèse sur place ("in situ") (voir, par exemple, les brevets US-A-5 578 832; US-A-5 556 752 et US-A-5 510 270; Fodor et al., 1991, Science 251:767; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022; et Lockhart et al., 1996, Nature Biotech 14:1675) ou d'autres procédés pour une synthèse rapide et un dépôt d'oligonucléotides définis (Blanchard et al., 1996, Biosensors & Bioelectronics 11:687). Quand on utilise ces procédés, on effectue la synthèse directement d'oligonucléotides (par exemple, 20 mères) d'une séquence connue sur une surface comme une lamelle de verre traitée pour l'obtention d'un dérivé. Habituellement, le réseau produit est redondant, et comporte plusieurs sondes d'oligonucléotide sur le morceau ou le "chip"
spécifique du polynucléotide de type hTRT à déceler.
On peut concevoir des combinaisons de sonde de type oligonucléotide pour déceler des ARNm présentant des épissures en alternance, ou pour identifier lequel des divers allèles de type hTRT est exprimé dans un
échantillon particulier.
Dans un exemple de forme de réalisation, de l'ADNc préparé par transcription reverse d'ARN total à partir d'une cellule d'essai est amplifié (par exemple, en utilisant une RCP). Typiquement, le produit de l'amplification est marqué, par exemple par incorporation d'un NTPd marqué par fluorescence. Les ADNc marqués sont ensuite soumis à hybridation sur un morceau ou un "chip" comprenant des sondes
d'oligonucléotides complémentaires de diverses sous-
séquences du gène de type hTRT. Les positions d'hybridation sont déterminées (par exemple, selon les procédés généraux de Shalon et al., 1996, Genome Research 6:639 ou Schena et al., 1996, Genome Res. 6:639) et la séquence (ou un autre renseignement) est déduite du schéma d'hybridation, par des moyens bien
connus en pratique.
Dans une forme de réalisation, deux échantillons d'ADNc, chacun marqué par un groupe fluorescent différent, sont soumis à hybridation sur le même morceau. Le rapport d'hybridation de chaque échantillon marqué sur des sites complémentaires du gène de type hTRT est ensuite soumis à essai de détection. Si les deux échantillons contiennent la même quantité d'ARNm de type hTRT, le rapport entre les deux fluorescences sera de l:l(on comprendra que le signal provenant du groupe fluorescent peut nécessiter d'être ajusté pour tenir compte de toute différence de sensibilité molaire du groupe fluorescent). Par contraste, si un échantillon provient d'un tissu sain (ou d'un tissu témoin) et le second échantillon provient d'un tissu cancéreux, le signal fluorescent
utilisé dans le second échantillon va prédominer.
c) HYBRIDATION SUR PLACE ("IN SITU") Un autre moyen pour déceler l'expression d'un gène codant pour une protéine de type hTRT consiste en une hybridation sur place. Les essais avec hybridation sur place sont bien connus et ils sont décrits de façon générale dans Angerer et ai., METHODS ENZYMOL., 152:649-660 (1987) et dans Ausubel et al., voir ci-dessus. Dans un essai avec hybridation sur place, des échantillons de cellules ou de tissus sont fixés sur un support solide, typiquement à un état perméabilisé, typiquement sur une lamelle de verre. Les cellules sont ensuite mises en contact avec une solution d'hybridation à une température modérée pour permettre l'annelage des sondes d'acide nucléique marquées (par exemple, des ribosondes marquées par 35S, des sondes marquées par fluorescence) entièrement ou quasi entièrement complémentaires de hTRT. De la sonde libre est enlevée par lavage et/ou par digestion par nucléase, et de la sonde marquée est visualisée directement sur la lamelle par autoradiographie ou par des techniques appropriées de formation d'image, comme
cela est bien connu en pratique.
4) DETECTION SPECIFIQUE DE VARIANTS
Comme noté ci-dessus et illustré dans les exemples (par exemple, exemple 9), des amorceurs ou sondes pour amplification peuvent être choisis de façon à donner des produits d'amplification étalant des délétions, troncatures et insertions spécifiques, en facilitant ainsi la détection de variants spécifiques ou
d'anomalies dans l'ARNm de type hTRT.
Un exemple d'un produit de gène variant de hTRT que l'on peut déceler est un ARN de type hTRT tel qu'un produit (SEQUENCE ID N 4) décrit ci-dessus et dans l'exemple 9. La fonction biologique éventuelle du ou des variant(s) A182 n'est pas connue; cependant, la protéine de type hTRT tronquée que l'on suppose introduite par codage par le variant peut être impliquée dans la régulation de l'activité de télomérase, par exemple, en assemblant une RNP de télomérase non fonctionnelle qui titre des constituants de la télomérase. En variante, une régulation négative de l'activité de télomérase pourrait être accomplie par direction du traitement de pré-ARNm de type hTRT (ARNm naissant) du traitement d'une manière conduisant à une élimination de l'ARNm de pleine longueur et en abaissant les taux d'ARNm de type hTRT et en augmentant les taux d'ARN de type hTRT A182. Pour ces raisons et pour d'autres, la possibilité de déceler des variants A182 est utile. En outre, il sera parfois souhaitable, dans des échantillons dans lesquels deux espèces d'ARN de type hTRT sont présentes (comme un ARN de type hTRT A182 et de l'ARN de type hTRT codant pour la protéine de type hTRT de pleine longueur) de comparer leur
abondance relative/ou absolue.
L'invention propose divers procédés pour déceler des variants A182. Par exemple, une amplification utilisant des paires d'amorceurs étalant la délétion des 182 paires de bases va aboutir à donner des produits de taille différente correspondant aux ARN de type hTRT avec ou sans délétion, si les deux sont présents, ce que l'on peut distinguer sur la base de la taille (par exemple, par électrophorèse sur gel). Des exemples de paires d'amorceurs utiles pour amplifier la région recouvrant ou étalant la délétion des 182 paires de bases comprennent TCPl.14 et TCPl.15 (groupe 1 d'amorceurs) ou TCP1.25 et bTCP6 (groupe 2 d'amorceurs) (voir tableau 2). Ces paires d'amorceurs peuvent servir individuellement ou dans une expérience de réplication en chaîne par polymérase en amas quand on utilise tout d'abord le groupe 1 d'amorceurs. Il apparaîtra également à l'homme du métier que des procédés d'hybridation (par exemple, une hybridation de type Northern) ou des essais de protection par ARN-ase utilisant une sonde d'acide nucléique de type hTRT de l'invention peut servir à déceler et à distinguer des variants d'ARN de
type hTRT.
Un autre procédé convenable implique une amplification en chaîne par polymérase (ou
l'équivalent) utilisant trois amorceurs). De façon analogue au pro-
cédé quantitatif semi-compétitif d'amplification de chaîne par polymérase que l'on décrit plus en détail ci-dessus, un amorceur est spécifique pour chaque espèce d'ARN de type hTRT (par exemple, comme illustré au tableau 4) et un amorceur est complémentaire des deux espèces (par exemple, TCP1.25 (2270-2288)). Un exemple d'un amorceur spécifique de la SEQUENCE ID N 1 est un amorceur qui provoque un annelage au sein de la séquence des 182 nucléotides (c'est-à-dire, les nucléotides 2345 à 2526 de la SEQUENCE ID N 1), par exemple, TCP1.73 (2465-2445). Par exemple, un amorceur spécifique de la SEQUENCE ID N 4 (un variant A182) est un amorceur qui se fixe par annelage sur les nucléotides 2358 à 2339 de la SEQUENCE ID N 4 (c'est-à-dire le site correspondant à l'insertion de 182 nucléotides dans la SEQUENCE ID N 1). L'abondance absolue de l'espèce ARNm de type hTRT A182 ou son abondance relative en comparaison de l'espèce codant pour la protéine de type hTRT de pleine longueur peut être analysée pour une corrélation avec l'état des cellules (par exemple, la capacité de prolifération indéfinie). On comprendra que de nombreux autres amorceurs ou de nombreux autres procédés d'amplification ou de détection peuvent être choisis
sur la base du présent expose.
TABLEAU 4
EXEMPLES D'AMORCEURS
Amorceur spécifique de l'espèce A182 (par exemple,
SEQUENCE ID N 4):
5'-GGCACTGGACGTAGGACGTG-3
Amorceur spécifique de hTRT (SEQUENCE ID N 1)
(TCP1.73):
'-CACTGCTGGCCTCATTCAGGG-3
Amorceur commun (vers l'avant) (TCP1.25):
5'-TACTGCGTGCGTCGGTATG-3'
D'autres gènes variants de hTRT ou produits de tels gènes pouvant être décelés comprennent ceux caractérisés par des codons d'arrêt prématuré, par des délétions, par des substitutions ou des insertions. Des délétions peuvent être décelées par la diminution de la taille du gène, du produit de transcription d'ARNm ou d'ADNc. De façon similaire, des insertions peuvent être décelées par l'augmentation de la taille du gène, du produit de transcription d'ARNm ou 'ADNc. Des insertions et délétions pourraient également provoquer des décalages dans le cadre de lecture, conduisant à des codons d'arrêt prématuré ou à de plus longs cadres de lecture ouverte. Des substitutions, des délétions et des insertions peuvent également être décelées par formation d'hybride à l'aide de sonde. Des altérations peuvent également être décelées par l'observation de modification de la taille du polypeptide variant de type hTRT (par exemple, par analyse de type Western) ou par hybridation ou par amplification spécifique, selon ce qui est approprié. En variante, des mutations peuvent être déterminées par le séquençage du gène ou du produit de gène selon des méthodes standard. En outre, et comme noté ci-dessus, des essais d'amplification et des sondes d'hybridation peuvent être choisis pour cibler spécifiquement des anomalies particulières. Par exemple, on peut choisir des sondes de type acides nucléiques ou des amorceurs d'amplification qui forment spécifiquement des hybrides avec, ou qui amplifient, respectivement, la région
comprenant la délétion, la substitution ou l'insertion.
Lorsque le gène de type hTRT abrite une telle mutation, la sonde va (1) ne pas réussir à effectuer une hybridation ou une réaction d'amplification ne va pas réussir à devenir une amplification spécifique ou provoquer une modification de la taille du produit d'amplification ou un signal d'hybridation, ou (2) la sonde ou la réaction d'amplification englobe la totalité de la délétion ou l'une ou l'autre extrémité de la délétion (jonction de délétion), ou (3) de façon similaire, on peut choisir des sondes et des amorceurs d'amplification qui ciblent spécifiquement des
mutations ponctuelles ou des insertions ponctuelles.
5) DETECTION D'ALLELES MUTANTS DE TYPE hTRT Des mutations dans le gène de type hTRT peuvent être responsables d'un début de maladie ou peuvent contribuer à un état maladif. Des altérations de l'ADN de génome de hTRT peuvent affecter des niveaux de transcription de gène, modifier des restes aminoacides dans la protéine de type hTRT, provoquer la production
de polypeptides tronqués de type hTRT, altérer des pro-
cessus de traitement de pré-ARNm (ce qui peut altérer les taux d'ARNm de type hTRT) et provoquer d'autres
conséquences également.
Des altérations d'ADN de génome dans des endroits non-hTRT peuvent également affecter l'expression de hTRT ou de télomérase en altérant les enzymes ou les processus cellulaires qui sont responsables de la régulation de hTRT, de hTR, et de l'expression et du traitement de protéines associées à la télomérase et à l'assemblage et au transport de RNP. Des altérations qui affectent l'expression de hTRT, le traitement ou l'assemblage de RNP pourraient être importantes pour la progression du cancer, pour des maladies de vieillissement, pour des maladies liées à des
endommagements d'ADN, et dans d'autres cas également.
Une détection de mutations dans ARNm de type hTRT ou dans son gène et dans des éléments de commande de gène peut être réalisée selon les procédés ici décrits, de multiples façons. Des exemples illustratifs comprennent les suivants: une technique appelée dépistage d'amorceur peut être utilisée, des amorceurs d'amplification en chaîne par polymérase sont conçus de façon que les terminaisons 3' se fixent par annelage sur des nucléotides dans un ADN (ou un ARN) d'échantillon qui sont éventuellement soumis à mutation. Si l'ADN (ou l'ARN) est amplifié par les amorceurs, les extrémités ou terminaisons 3' ont bien correspondu aux nucléotides présents dans le gène; si l'ADN n'est pas amplifié, une des extrémités ou terminaisons ou les deux extrémités n'ont pas correspondu aux nucléotides présents dans le gène, ce qui indique la présence d'une mutation. On peut utiliser une conception similaire d'amorceur pour vérifier des mutations ponctuelles en utilisant la réaction en chaine par Ligase (RCL, décrite ci-dessus). Le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (PLFR), (Pourzand, C., Cerutti, P. (1993) Mutat. Res. 288:113-121); constitue une autre technique pouvant être appliquée dans le présent procédé. Un transfert, de type Southern, d'ADN de génome humain ayant subi une digestion avec diverses enzymes de restriction est décelé à l'aide d'une sonde spécifique de hTRT. Des différences de nombre ou des tailles des fragments, entre l'échantillon et un témoin, indiquent une altération de l'échantillon expérimental, habituellement une insertion ou une délétion. Du polymorphisme de conformation à simple brin, PCSB (Orrita, M., et al. (1989), PNAS USA 86:2766- 2770) constitue une autre technique pouvant être appliquée dans le présent procédé. Le PCSB se fonde sur la migration différentielle d'ADN dénaturé de type sauvage et d'ADN mutant à simple brin (habituellement engendré par amplification en chaîne par polymérase). L'ADN à simple brin va prendre une conformation tridimensionnelle qui est spécifique d'une séquence. Des différences de séquence aussi faibles que la modification d'une base simple peuvent aboutir à un décalage par mobilité sur un gel non dénaturant. Le polymorphisme de conformation à simple brin constitue l'un des procédés de dépistage de mutation le plus largement utilisé en raison de sa simplicité. Une électrophorèse sur gel avec gradient de dénaturation, EGGD (Myers, R.M., Maniatis, T. et Lerman, L., (1987), "Methods in Enzymology, 155:501-527) constitue une
autre technique applicable dans le présent procédé.
L'EGGD identifie des mutations fondées sur le comportement en fusion d'ADN à double brin. Un équipement spécialisé d'électrophorèse dénaturante sert à observer le profil de fusion d'ADN expérimentaux et d'ADN témoins: un ADN contenant une mutation va avoir une mobilité différente en comparaison du témoin dans ces systèmes sur gel. Des exemples étudiés illustrent la méthodologie couramment employée; il existe de nombreuses autres techniques connues de l'homme du métier et pouvant être appliquées selon les présents enseignements.
F) ANALYSE DE CARYOTYPE
La présente invention propose en outre des procédés et des réactifs pour une analyse de caryotype ou une autre analyse chromosomique utilisant des sondes formées par des séquences de type hTRT et/ou la détection ou la détermination de l'emplacement de séquences de gène de type hTRT dans des chromosomes provenant d'un patient humain, d'une lignée de cellules humaines ou d'une cellule non humaine. Dans une forme de réalisation, une amplification (c'est-à-dire une modification du nombre des unités ou des copies), une délétion (c'est-à-dire une délétion partielle), uneinsertion, une substitution ou des modifications portées à l'emplacement des chromosomes (par exemple, une translocation) d'un gène de type hTRT peuvent être mises en corrélation avec la présence d'un état pathologique ou avec une prédisposition à développer un
état pathologique (par exemple, le cancer).
Il a été déterminé par les présents inventeurs que, dans des cellules humaines normales, le gène de type hTRT se situe près du télomère du chromosome 5p (voir l'exemple 5, ci-après). Le marqueur STS le plus voisin est D5S678 (voir la figure 8). L'emplacement peut servir à identifier des marqueurs qui sont étroitement liés au gène de type hTRT. Les marqueurs peuvent servir à identifier YACs, STS, des cosmides, BACs, du phage lambda ou Pl, ou d'autres clones qui contiennent des séquences de génome de type hTRT ou des éléments témoins. Les marqueurs ou l'emplacement de gène peuvent servir à examiner des échantillons de tissu humain pour déceler des altérations dans l'emplacement de gène normal de type hTRT, une organisation ou une séquence associée à l'apparition d'un type de cancer ou de maladie. Cette information peut servir dans un diagnostic ou un pronostic concernant la maladie ou le cancer impliqué. En outre, la nature de toutes altérations éventuelles du gène de type hTRT peut donner des renseignements concernant le mode réel de passage des cellules à l'état immortel. Par exemple, une translocation pourrait indiquer qu'il se produit une activation de l'expression de hTRT dans certains cas, par remplacement du promoteur de hTRT par un autre promoteur dirigeant la transcription de hTRT d'une manière inappropriée. Des procédés et réactifs de l'invention de ce type, peuvent servir à inhiber une activation de hTRT. La localisation peut également être utile pour déterminer la nature de la répression du gène de type hTRT dans des cellules somatiques normales, par exemple, si l'emplacement fait partie d'une hétérochromatine non expressive. Des essais de détermination d'une hypersensibilité à une nucléase, pour distinguer de l'hérétochromatine d'avec l'eurochromatine, sont décrits, par exemple, dans Wu et al., 1979 Cell 16:797; Groudine et Weintraub, 1982, Cell 30:131; Gross et Garrard, 1988, Ann. Rev. Biochem.
57:159.
Dans une forme de réalisation, des altérations du gène de type hTRT sont identifiées par une analyse de caryotype, en utilisant n'importe lequel des divers procédés connus en pratique. Une technique utile consiste en une hybridation effectuée sur place ("in situ"; ISH). Typiquement, quand on utilise des techniques d'hybridation sur place (in situ) pour une analyse de caryotype, on provoque une hybridation d'une sonde, décelable ou marquée de façon à être décelable, par fixation sur un échantillon de chromosome sur place pour situer une séquence de gène de type hTRT. De façon générale, une ISH (hybridation sur place) comprend une ou plusieurs des étapes suivantes: (1) fixation du tissu, de la cellule ou d'une autre structure biologique à analyser; (2) traitement de préhybridation de la structure biologique pour augmenter l'accessibilité de l'ADN cible (par exemple, une dénaturation avec de la chaleur ou une substance alcaline), et pour diminuer la liaison non spécifique (par exemple, par blocage de la capacité d'hybridation de séquences répétitives, par exemple, en utilisant de l'ADN de génome humain); (3) hybridation d'une ou plusieurs sondes de type acide nucléique (par exemple, des acides nucléiques traditionnels, des PNA ou des sondes contenant d'autres analogues d'acide nucléique) sur l'acide nucléique présent dans la structure biologique ou dans le tissu; (4) des lavages après hybridation pour enlever des fragments d'acide nucléique non fixés dans l'hybridation; et (5) une détection des fragments d'acides nucléiques fixés par hybridation. Les réactifs utilisés dans chacune de ces étapes et les conditions de leur utilisation varient en fonction de l'application particulière. On comprendra que ces étapes peuvent être modifiées de diverses
façons bien connues de l'homme du métier.
Dans une forme de réalisation de l'hybridation sur place, la sonde de hTRT est marquée à l'aide d'une marque fluorescente (hybridation sur place avec fluorescence; HSPF). Typiquement, il est souhaitable d'utiliser une hybridation sur place avec fluorescence en deux couleurs, dans laquelle on utilise deux sondes,
chacune marquée par un colorant fluorescent différent.
Une sonde d'essai indique que l'hybridation par fixation sur la séquence de hTRT intéressante est marquée par un colorant, et une sonde témoin indique qu'elle se fixe par hybridation sur une région
différente et elle est marquée par un second colorant.
L'acide nucléique qui se fixe par hybridation sur une partie stable de chromosome intéressant, comme la région centrale de centromère, peut servir de sonde témoin. De cette façon, on peut tenir compte de différences entre l'efficacité d'hybridation d'un
échantillon à l'autre.
Les procédés d'hybridation sur place pour déceler des anomalies chromosomiques (par exemple, HSPF) peuvent être mis en ouvre sur des quantités de l'ordre du nanogramme des acides nucléiques en cause. On peut utiliser des coupes de tissu normal ou de tumeur enfouies dans de la paraffine, de même que l'on peut utiliser de la matière, du tissu ou des coupes fraîches ou congelées. Puisque la technique HSPF peut être appliquée à de la matière limitée, on peut également utiliser des préparations à la touche, préparées à partir de tumeurs primaires non cultivées (voir, par exemple, Kallioniemi et al., 1992, Cytogenet. Cell Genet. 60:190). Par exemple, de petits échantillons de tissu de biopsie provenant de tumeurs peuvent servir pour des préparations à la touche (voir, par exemple, Kallioniemi et al., ci-dessus). Des petits nombres de cellules que l'on obtient par biopsie par aspiration ou des cellules présentes dans des fluides corporels (par exemple, du sang, de l'urine, du crachat, etc.), peuvent également être analysés. Pour un diagnostic prénatal, des échantillons appropriés vont inclure du fluide amniotique, du sang maternel, etc. Des protocoles utiles pour une hybridation et applicables aux procédés et réactifs décrits ici, sont décrits dans Pinkel et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, :9138; Publication OEB n 430 402; Choo, ed.,
"METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY", VOL. 33:IN SITU
HYBRIDIZATION PROTOCOLS; Humana Press, Totowa, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique (1994); et Kallioniemi et
al., ci-dessus.
D'autres techniques utiles pour des analyses de caryotype comprennent, par exemple, des techniques comme du transfert quantitatif d'ADN, de type "Southern blotting", de l'amplification (ACP) quantitative ou une hybridation de génome comparative (Kallioniemi et al., 1992, Science, 258:818), en utilisant les sondes et amorces de type hTRT de l'invention, pouvant servir à identifier des amplifications, de la délétion, de l'insertion, de la substitution ou d'autres réarrangements des séquences de type hTRT dans des chromosomes présents dans un
échantillon biologique.
G) ESSAIS DE DETECTION ET DE DOSAGE DE
POLYPEPTIDES DE TYPE TRT
1) GENERALITES
La présente invention propose des procédés et des réactifs pour déceler et quantifier des polypeptides de type hTRT. Ces procédés comprennent des procédés biochimiques analytiques comme de l'électrophorèse, de la spectroscopie de masse, du décalage sur gel, de l'électrophorèse en capillaire, des procédés chromatographiques comme de la chromatographie d'exclusion en fonction de la taille, de la chromatographie de liquide à haute performance ("HPLC"), de la chromatographie en couche mince (CCM), de la chromatographie d'hyperdiffusion, etc., ou divers procédés immunologiques comme les réactions de précipitation sur gel ou fluide, de l'immunodiffusion (simple ou double), de l'immunoélectrophorèse, du dosage radioimmunologique, des essais de dosage avec immunosorption liée à des enzymes ("ELISA"), des essais avec immunofluorescence, du transfert d'ADN de type "western blotting", de la spectrométrie de masse, et d'autres procédés décrits ci-après et qui apparaîtront à l'homme du métier passant en revue le présent exposé.
2) ESSAIS ELECTROPHORETIQUES
Dans un mode de réalisation, les polypeptides de type hTRT sont décelés dans une séparation de protéines par électrophorèse; dans un aspect, on emploie un système d'électrophorèse bidimensionnel. Des moyens de déceler des protéines à l'aide de techniques d'électrophorèse sont bien connus de l'homme du métier (voir de façon générale, R. Scopes (1982), "PROTEIN PURIFICATION", Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990)
"METHODS IN ENZYMOLOGY", VOL. 182: GUIDE TO PROTEIN
PURIFICATION, Academic Press, Inc., N.Y., Etats-Unis d'Amérique). Dans une forme apparentée de réalisation, on utilise un essai de déplacement en fonction de la mobilité (voir, par exemple, Ausubel et al., ci-dessus). Par exemple, de la hTR marquée va s'associer à de la hTRT et migrer avec une mobilité altérée en cas d'électrophorèse dans un gel de
polyacrylamide non dénaturant ou d'une façon analogue.
Ainsi, par exemple, si une sonde de type hTR (éventuellement marquée) ou une amorce de télomérase (éventuellement marquée) est mélangée à un échantilon contenant hTRT, ou s'il y a coexpression avec hTRT (par exemple, dans un système d'expression sans cellule), la présence de la protéine de type hTRT (ou d'un nucléotide codant pour hTRT) dans l'échantillon va aboutir à une altération décelable de la mobilité
de hTR.
3) ESSAIS DE DETECTION ET DE DOSAGE PAR
IMMUNOLOGIE
a) GENERALITES La présente invention propose également des procédés pour déceler des polypeptides de type hTRT, en utilisant un ou plusieurs réactifs de type anticorps de l'invention (c'est-à-dire, des essais de détection et de dosage par immunologie). Tel qu'il sert ici, un essai immunologique est un essai qui utilise un anticorps (comme défini en gros ici et qui comprend spécifiquement des fragments, des chimères et autres agents de liaison) qui se fixent spécifiquement sur un polypeptide de type hTRT ou un épitope. Des anticorps de l'invention peuvent être produits par divers moyens bien connus de l'homme du métier, par exemple comme
décrit ci-dessus.
Un certain nombre de formats d'essai de liaison immunologique convenant pour la pratique de l'invention sont connus (voir, par exemple, les brevets US-A-4 366 241; US-A-4 376 110; US-A-4 517 288; et US-A-4 837 168). Voir, par exemple, "METHODS IN CELL
BIOLOGY", VOLUME 37: "ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY",
Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); "BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY", 7e Edition, Stites & Terr, eds. (1991); Harlow et Lane, ci-dessus [par exemple, chapitre 14], et Ausubel et al., ci-dessus [par exemple, chapitre 11], textes dont chacun est incorporé par
référence dans sa totalité et à toutes fins utiles.
Typiquement, des essais de liaison immunologique (ou des essais immunologiques) utilisent un "agent de capture" pour se fixer spécifiquement sur l'analyte et, souvent, immobiliser cet analyte. Dans une forme de réalisation, l'agent de capture est un fragment qui se fixe spécifiquement sur un polypeptide de type hTRT ou
sur une sous-séquence, comme un anticorps anti-hTRT.
Dans une variante de réalisation, l'agent de capture peut fixer une protéine associée à hTRT ou ARN dans des conditions dans lesquelles la molécule associée à hTRT demeure fixée à la hTRT (de sorte que, si la molécule associée à hTRT est immobilisée, la protéine de type hTRT est de façon similaire immobilisée). On comprendra que, dans des essais dans lesquels une molécule associée à hTRT est capturée, la protéine de type hTRT associée va habituellement être présente et peut ainsi être décelée, par exemple à l'aide d'un anticorps anti- hTRT ou de façon analogue. Des essais immunologiques pour déceler des complexes protéiniques sont connus en pratique (voir, par exemple, Harlow et
Lane, ci-dessous, à la page 583).
Habituellement, le produit de gène de hTRT que l'on soumet à essai est décelé directement ou indirectement à l'aide d'une marque décelable. La marque particulière ou le groupe décelable que l'on utilise dans l'essai ne constitue habituellement pas un aspect critique de l'invention, tant que cette marque ou ce groupe ne gêne pas fortement la fixation spécifique de l'anticorps ou des anticorps servant dans l'essai. La marque peut être fixée par covalence à l'agent de capture (par exemple, un anticorps anti-tRT) ou bien elle peut être fixée à un troisième fragment, tel qu'un autre anticorps, qui se fixe spécifiquement sur, par exemple, le polypeptide de type hTRT (à un épitope différent de celui reconnu par l'agent de
capture), l'agent de capture (par exemple, une anti-
(premier anticorps) immunoglobuline); un anticorps anti-TRT; un anticorps qui se fixe sur un anticorps anti-TRT, ou un complexe anticorps/télomérase (par exemple, par l'intermédiaire d'une fixation sur une molécule associée, comme une protéine associée à de la télomérase). D'autres protéines capables de fixer un anticorps servant dans l'essai, comme de la protéine A
ou de la protéine G, peuvent également être marquées.
Dans certaines formes de réalisation, il sera utile d'utiliser plus d'une molécule marquée (par exemple, des molécules pouvant être distinguées l'une de l'autre). En outre, quand la cible fixée ou liée (par exemple, immobilisée) par l'agent de capture (par exemple, un anticorps anti-hTRT) est un complexe (c'est-à-dire un complexe de hTRT et d'une protéine associée à TRT, ou d'autres molécules associées à TRT), on peut utiliser un anticorps marqué, qui reconnaît la protéine ou l'ARN associé(e) à la protéine de type hTRT. Quand le complexe est un complexe protéine/acide nucléique (par exemple, TRT-hTR), la molécule indicatrice peut être un polynucléotide ou une autre molécule (par exemple, de l'enzyme) qui reconnaît le
constituant ARN du complexe.
Certains formats d'essais immunologiques n'exigent pas l'utilisation de constituants ou composants marqués. Par exemple, des essais par agglutination peuvent servir à déceler la présence des anticorps constituant des cibles. Dans ce cas, des particules revêtues d'un antigène sont agglutinées par des échantillons comprenant des anticorps cible. Dans ce format, les composants n'ont pas besoin d'être marqués, et la présence de l'anticorps cible peut être décelée
par simple inspection visuelle.
b) FORMATS D'ESSAIS NON COMPETITIFS La présence invention propose des procédés et des réactifs pour des dosages et essais immunologiques compétitifs et non compétitifs en vue de déceler des polypeptides de type hTRT. Des essais immunologiques non compétitifs sont des essais dans lesquels la quantité des analytes capturés (dans ce cas hTRT) est directement mesurée. Un tel essai est un essai immunologique à deux sites, à base monoclonale, utilisant des anticorps monoclonaux pouvant réagir avec deux épitopes non gênants fixés sur la protéine de type
hTRT. Voir, par exemple, Maddox et al., 1983, J. Exp.
Med., 158:1211 pour une information d'arrière-plan technologique. Dans un essai préféré "en sandwich", l'agent de capture (par exemple, un anticorps anti-TRI est fixé directement à un substrat solide sur lequel l'agent est immobilisé. Ces anticorps immobilisés capturent ensuite toute protéine de type hTRT présente dans l'échantillon d'essai. Une hTRT ainsimobilisée peut ensuite être marquee, c'est-à-dire par fixation sur un second anticorps anti-hTRT portant une marque. En variante, le second anticorps anti-hTRT peut ne pas comporter de marque, mais être fixé ou lié par un troisième anticorps marqué spécifique des anticorps de l'espèce dont provient le second anticorps. Ce second anticorps, en variante, peut être modifié à l'aide d'un fragment décelable, comme de la biotine, fragment auquel une troisième molécule marquée peut se lier spécifiquement, comme de la streptavidine marquée par
de l'enzyme.
c) FORMATS D'ESSAIS COMPETITIFS Dans des essais impliquant une compétitivité (des essais compétitifs), la quantité de protéine de type hTRT présente dans l'échantillon est mesurée indirectement par la mesure de la quantité d'une hTRT ajoutée (exogène) déplacée (ou enlevée par compétition) d'un agent de capture (par exemple, un anticorps anti-TRT) par la protéine de type hTRT présente dans l'échantillon. Dans un essai compétitif, une quantité connue de protéine de type hTRT marquée est ajoutée à l'échantillon et l'échantillon est ensuite mis en contact avec un agent de capture (par exemple, un anticorps qui fixe de manière spécifique de la protéine de type hTRT). La quantité de protéine de type hTRT exogène (marquée) fixée à l'anticorps est inversement proportionnelle à la concentration de la protéine de type hTRT présente dans l'échantillon. Dans une forme de réalisation, l'anticorps est immobilisé sur un substrat solide. La quantité de protéine de type hTRT fixée à l'anticorps peut être déterminée par la mesure de la quantité de protéine de type hTRT présente dans un complexe TRT/anticorps ou, en variante, par la mesure de la quantité de protéine de type TRT demeurant non complexée. La quantité de protéine de type hTRT peut être décelée grâce à la fourniture d'une molécule
de hTRT marquée.
Un essai d'inhibition d'haptène constitue un autre exemple d'un essai compétitif. Dans cet essai, de la protéine de type hTRT est immobilisée sur un substrat solide. Une quantité connue d'anticorps anti-TRT est ajoutée à l'échantillon, et l'échantillon est ensuite mis en contact avec la protéine de type hTRT immobilisée. Dans ce cas, la quantité d'anticorps anti-TRT fixé sur la protéine de type hTRT immobilisée est inversement proportionnelle à la quantité de protéine de type hTRT présente dans l'échantillon. La quantité d'anticorps immobilisé peut être décelée par la détection de la fraction immobilisée d'anticorps ou de la fraction d'anticorps demeurant en solution. Dans cet aspect, la détection peut être directe, quand l'anticorps est marqué, ou elle peut être indirecte quand la marque est fixée à une molécule qui se lie
spécifiquement à l'anticorps, comme décrit ci-dessus.
d) AUTRES FORMATS D'ESSAIS L'invention propose également des réactifs et des procédés pour déceler et quantifier la présence de hTRT dans l'échantillon, par l'utilisation d'un format ou d'un mode opératoire ou technique de transfert d'ADN ("Western blot"). Dans cette technique ou ce format, des polypeptides de type hTRT présents dans un échantillon sont séparés d'autres constituants de l'échantillon par électrophorèse sur gel (par exemple, sur la base du poids moléculaire), les protéines séparées sont transférées sur un support solide convenable (comme un filtre en nitrocellulose, un filtre en polyamide de type "Nylon", un filtre en dérivé de "Nylon" ou un support analogue), et le support est mis à incuber avec des anticorps anti-TRT de l'invention. Les anticorps anti- TRT se fixent spécifiquement sur hTRT ou autres TRT du support solide. Ces anticorps peuvent être directement marqués ou bien, en variante, ils peuvent être décelés par la suite à l'aide d'anticorps marqués (par exemple, des anti-souris de chèvre marqués) ou d'autres réactifs de marquage qui se fixent spécifiquement sur un anticorps
anti-TRT.
D'autres techniques d'essai comprennent des immunoessais utilisant des liposomes, qui utilisent des liposomes conçus pour fixer spécifiquement des molécules (par exemple, des anticorps) et dégager des réactifs ou marqueurs encapsulés. Ces produits chimiques libérés peuvent ensuite être décelés selon les techniques classiques ou standard (voir, Monroe et
al., 1986, Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34).
Comme noté ci-dessus, des formats ou modes opératoires d'essai utilisantdes classeurs de cellules avec activation par fluorescence (et des instruments ou procédés équivalents) ont des avantages quand on mesure des produits de gène de hTRT dans un échantillon hétérogène (comme un échantillon de biopsie contenant à la fois des cellules normales et des cellules malignes). e) SUBSTRATS, SUPPORTS SOLIDES, MEMBRANES,
FILTRES
Comme noté ci-dessus, selon l'essai, divers composants, ce qui comprend l'antigène, l'anticorps cible, ou de l'anticorps anti-hTRT, peuvent être fixés sur une surface ou un support solide (par exemple, un substrat, une membrane ou du papier filtre). De nombreux procédés pour immobiliser des biomolécules sur diverses surfaces solides sont connus en pratique. Par exemple, la surface solide peut être une membrane (par exemple, en nitrocellulose), une plaquette pour microtitrage (par exemple, en PVC [polychlorure de vinyle], en polypropylène ou en polystyrène), un tube à essais (en verre ou en matière plastique), une languette ou un bâtonnet à tremper (par exemple, en verre, en PVC, en polypropylène, en polystyrène, en latex ou en un matériau analogue), un tube pour microcentrifugeage ou une perle de verre ou de matière plastique. Le composant voulu peut être lié par covalence ou fixé de manière non covalente par l'intermédiaire d'une liaison
non spécifique.
Divers polymères organiques et minéraux, aussi bien naturels que synthétiques, peuvent servir de matière ou de matériel pour constituer la surface solide. Des exemples de polymères comprennent du polyéthylène, du polypropylène, du poly(4-méthylbutène), du polystyrène, du polyméthacrylate, du poly(téréphtalate d'éthylène), de la rayonne, du polyamide de type "Nylon", du poly(butyrate de vinyle), du poly(difluorure de vinylidène) (PVDF), des silicones, du polyformaldéhyde, de la cellulose, de l'acétate de cellulose, de la nitrocellulose et des matières analogues. D'autres matières utilisables comprennent du papier, des verres, des matériaux céramiques, des métaux, des métalloïdes, des matières semi- conductrices, des ciments ou matériaux analogues. En outre, on peut utiliser des substances formant des gels, comme des protéines (par exemple, des gélatines), des lipopolysaccharides, des silicates, de la gélose ou agarose et des polyacrylamides. Des polymères formant plusieurs phases
aqueuses, comme des dextranes, des polyalkylène glycols ou des tensio-
actifs, comme des phospholipides, des sels d'alkyl ammonium à longue chaîne (12 à 24 atomes de C), etc. Quand la surface solide est poreuse,
on peut utiliser diverses tailles de pore selon la nature du système.
Pour préparer la surface, on peut employer plusieurs matières différentes, notamment sous forme de stratifiés, pour obtenir diverses propriétés. Par exemple, on peut utiliser des revêtements par des protéines, comme de la gélatine, pour éviter une fixation non spécifique, pour simplifier une conjugaison par covalence, pour amplifier la détection
d'un signal ou pour un effet analogue.
Si l'on désire une liaison par covalence entre un composé et la surface, la surface sera habituellement polyfonctionnelle ou capable d'être rendue polyfonctionnelle. Des groupes fonctionnels, pouvant être presents sur la surface et que l'on peut utiliser pour la liaison, peuvent comprendre des acides carboxyliques, des aldéhydes, des groupes amino, des groupes cyano, des groupes éthylène, des groupes hydroxyles, des groupes mercapto et des groupes analogues. La façon de lier des composés très divers à diverses surfaces est bien connue et elle est amplement illustrée dans la littérature. Voir, par exemple, Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978, et Cuatrecasas (1970) J. Biol. Chem.
245 3059.
En plus d'une liaison par covalence, on peut utiliser divers procédés non covalents pour fixer un composant d'essai. Une fixation non covalente est typiquement une
absorption non spécifique d'un composé sur la surface.
L'homme du métier comprendra qu'il est souvent souhaitable de diminuer la liaison de fixation non spécifique dans des essais immunologiques. En particulier, quand l'essai implique un antigène ou un anticorps immobilisé sur un substrat solide, il est souhaitable de réduire à son minimum la quantité de liaison non spécifique au substrat. Les moyens pour diminuer une telle liaison non spécifique sont bien connus de l'homme du métier. Typiquement, cela implique
de revêtir le substrat par une composition protéinique.
En particulier, on utilise largement des compositions de protéinescomme de la sérum albumine de bovin, de la poudre de lait non grasse, et de la gélatine avec parfois une préférence pour de la poudre de lait. En variante, la surface est conçue de façon à fixer de manière non spécifique un composant ou à ne pas fixer de manière importante ou significative un autre composant. Par exemple, une surface portant une lectine, comme de la Concanavaline A, va fixer un composé contenant du glucide (ou de l'hydrate de carbone), mais ne va pas fixer une protéine marquée ne comportant pas de glycosylation. Diverses surfaces solides destinées à servir à une fixation non covalente de composants d'essai sont passées en revue dans les
brevets US-A-4 447 576 et US-A-4 254 082.
H) ESSAIS DE DETECTION OU DE DOSAGES
D'ANTICORPS ANTI-TRT
La présente invention propose également des réactifs et des essais pour déceler des immunoglobulines spécifiques de hTRT. Dans une forme de réalisation, une hTRT immobilisée (par exemple de la hTRT recombinante fixée à un creux de plaque pour microessai) est mise à incuber avec du sérum provenant d'un patient, dans des conditions dans lesquelles des anticorps anti-hTRT, s'ils sont présents, fixent la hTRT immobilisée. Après lavage pour enlever de l'immunoglobuline liée de façon non spécifique, on peut déceler des anticorps de sérum lié, s'ils sont présents, par l'addition d'anticorps anti(Ig humaine) marqués de façon décelable (d'autres formes de réalisation et diverses variantes sont bien connues de l'homme du métier, voir, par exemple, Harlow, ci-dessus, au chapitre 14). Ces essais sont utiles pour déceler des anticorps anti-hTRT dans n'importe quelle source comprenant du sérum animal ou humain ou dans un véhicule comme une solution saline. Dans une forme de réalisation, les essais servent à déceler ou à surveiller une réponse immunitaire à des protéines de type hTRT chez un patient, en particulier une réponse autoimmune (par exemple anti- télomérase). Les anticorps anti-hTRT peuvent être présents dans le sérum ou dans d'autres tissus ou fluides provenant d'un patient souffrant d'une maladie autoimmune ou présentant un
autre état.
I) COMBINAISONS D'ESSAIS
Les essais pour diagnostic et pour pronostic que l'on décrit ici peuvent être effectués en diverses combinaisons et ils peuvent également être effectués de concert avec d'autres tests pour diagnostic ou pour pronostic. Par exemple, quand on utilise les présents procédés pour déceler la présence de cellules cancéreuses dans un échantillon provenant d'un patient, la présence de hTRT peut servir à déterminer le stade de la maladie, ou indiquer si une tumeur particulière risque d'envahir le tissu avoisinant ou d'envoyer des métastases en un endroit éloigné, ou d'indiquer si une récurrence du cancer est probable. Des tests pouvant fournir des renseignements supplémentaires comprennent une analyse au microscope d'échantillons de biopsie, la détection d'antigènes (par exemple des marqueurs de surface de cellule) associée à un caractère de formation de tumeur (par exemple, on utilise de l'histocytochimie, desclasseurs de cellules avec amplification par fluorescence, ou des moyens analogues), des procédés d'imagerie (par exemple, lors
* de l'administration à un patient d'anticorps anti-
tumeur marqués), des essais de détection d'activité de télomérase, des essais de détermination de la longueur de télomères, des essais de détection de hTR ou des essais analogues. En combinaison, de tels essais peuvent fournir des renseignements utiles concernant la
progression d'une maladie.
On comprendra également que les combinaisons d'essais peuvent fournir des renseignements utiles. Par exemple, et comme noté ci- dessus, les essais de détection d'ARNm du type hTRT peuvent être combinés à des essais de détection de hTR (ARN de télomérase humaine) ou d'activité de télomérase (c'est-à-dire, des essais de type "TRAP", pour fournir les renseignements
concernant de l'assemblage et du rôle de télomérase.
J) NECESSAIRES OU "KITS"
La présente invention propose également des nécessaires ou "kits" utiles pour le dépistage, la surveillance, le diagnostic et le pronostic de patients présentant un état associé à de la télomérase, ou pour déterminer le niveau ou taux d'expression de hTRT dans les cellules ou dans des lignées de cellules. Les nécessaires comprennent un ou plusieurs réactifs pour déterminer la présence ou l'absence d'un produit de gène hTRT (ARN ou protéine) ou pour quantifier l'expression du gène de type hTRT. Les réactifs préférés comprennent des acides nucléiques amorceurs et des sondes qui se fixent spécifiquement sur le gène de type hTRT, sur ARN, sur ADNc ou sur des parties ou portions de ces entités, ainsi que des protéines, des peptides, des anticorps et des amorceurs témoins, des sondes, des oligonucléotides, des protéines, des peptides et des anticorps. D'autres matières, ce qui comprend des enzymes (par exemple, des transcriptases reverses, des polymérases d'ADN, des ligases), des tampons, des réactifs (des marqueurs, des dNTP) peuvent
également être inclus.
Les nécessaires peuvent inclure en variante, ou en combinaison avec l'un quelconque des autres composants ici décrits, un anticorps qui se fixe spécifiquement
sur des polypeptides de type hTRT ou sur leurs sous-
séquences. L'anticorps peut être monoclonal ou polyclonal. L'anticorps peut être conjugué à un autre fragment, comme un marqueur et/ou il peut être immobilisé sur un support solide (un substrat). Le ou les nécessaire(s) peut ou peuvent également contenir un second anticorps pour déceler des complexes polypeptides de type hTRT/anticorps ou pour déceler des sondes formées d'hybrides dérivant d'acide nucléique, comme aussi d'un ou plusieurs peptides ou d'une ou plusieurs protéines de type hTRT pour servir de témoin ou
d'autres réactifs.
L'anticorps ou la sonde résultant de l'hybridation peut être libre ou immobilisé(e) sur un support solide tel qu'un tube à essai, une plaque pour microtitrage, une languette ou un bâton à tremper et des objets analogues. Le nécessaire peut contenir aussi des instructions enseignant l'utilisation de l'anticorps ou de la sonde résultant d'une hybridation dans un essai destiné à déceler TRT. Le nécessaire peut contenir des réactifs appropriés pour la détection de marqueurs, ou pour marquer des témoins positifs et négatifs, des solutions de lavage, des tampons de dilution, etc. Dans une forme de réalisation, le nécessaire comprend une paire d'amorces pour amplifier ARNm de type hTRT. Un tel nécessaire peut également inclure une sonde pour déceler de l'ADN amplifié de type hTRT, et/ou une polymérase, un tampon, dNTP, etc. Dans un autre cas, le nécessaire comprend une sonde, éventuellement une sonde marquée. Dans un autre cas, le
nécessaire comprend un anticorps.
X. IDENTIFICATION DE MODULATEURS DE L'ACTIVITE DE
TELOMERASE
A. GENERALITES
L'invention propose des composés et des traitements qui modulent l'activité ou l'expression d'une télomérase ou d'un composant de télomérase (par exemple, une protéine de type hTRT). L'invention propose également des essais et des procédés de dépistage (comprenant des dépistages à débit élevé) pour identifier des composés et des traitements qui
modulent l'activité de télomérase ou une expression.
Ces modulateurs de l'activité de télomérase et de l'expression (que l'on désigne ci-après comme étant des "modulateurs") comprennent des agonistes de la télomérase (qui augmentent l'activité de télomérase et/ou l'expression de télomérase) et les antagonistes de la télomérase (qui diminuent l'activité et/ou l'expression de la télomérase)/ Les modulateurs de l'invention ont diverses utilisations. Par exemple, il est envisagé que les modulateurs de la télomérase soient des agents thérapeutiques efficaces pour le traitement de maladies humaines. Un dépistage d'une activité d'agoniste et d'activateurs de transcription ou de translation fournit des compositions qui augmentent l'activité de télomérase dans une cellule (y compris une capacité de réplication dépendant de télomères ou une activité de télomérase "partielle"). De telles compositions d'agonistes permettent de disposer de procédés pour rendre immortelles des cellules non transformées, par ailleurs normales, y compris des cellules pouvant exprimer des protéines utiles. De tels agonistes peuvent également servir dans des procédés de maîtrise du vieillissement cellulaire. Inversement, le dépistage de recherche d'une activité d'antagoniste donne les compositions qui diminuent la capacité de réplication dépendant des télomères, en rendant mortelles des cellules par ailleurs immortelles, comme des cellules de cancer. Le dépistage d'une activité d'antagoniste permet de disposer de compositions qui diminuent l'activité de télomérase, en évitant ainsi une division cellulaire non limitée s'appliquant à des cellules présentant une croissance cellulaire non régulée, comme des cellules d'un cancer. Des exemples de maladies et d'états pouvant être traités à l'aide de modulateurs sont énumérés ici, par exemple, dans les sections VII et IX ci-dessus. En général, les modulateurs de l'invention peuvent servir chaque fois o l'on désire augmenter ou diminuer une activité de télomérase dans une cellule ou dans un organisme. Ainsi, en plus de servir au traitement d'une maladie, un modulateur qui augmente les taux d'expression de hTRT peut servir à produire une lignée de cellules humaines cultivées ayant des propriétés telles que celles décrites de façon générale dans la section VIII ci-dessus, et le modulateur peut avoir diverses autres utilisations qui
apparaîtront à l'homme du métier.
Un composé ou un traitement module "l'expression" de la télomérase ou d'un composant de télomérase lorsque l'administration du composé ou lorsque le traitement modifie la vitesse ou le niveau ou taux de transcription du gène codant pour un composant de télomérase (par exemple, le gène codant pour ARNm de type hTRT), il affecte la stabilité ou le traitement de post-transcription de l'ARN codant pour un composant de télomérase (par exemple, du transport, des épissures, de la polyadénylation ou une autre modification), il affecte la translation, la stabilité, le traitement post-translation ou la modification d'une protéine introduite par codage (par exemple hTRT) ou il modifie d'une autre façon le taux de ribonucléoprotéine (RNP) du type télomérase fonctionnelle (ayant, par exemple, une activité catalytique). Un composé ou un traitement affecte une "activité" de télomérase quand l'administration du composé ou quand le traitement modifie une activité de télomérase telle que l'une quelconque des activités décrites dans la section IV(B) ci-dessus (par exemple, une activité catalytique de télomérase efficace ou non efficace, une capacité d'activité de télomérase; une activité traditionnelle de transcriptase reverse; une activité nucléolytique; une activité de fixation d'amorce ou sur substrat; une activité de fixation de dNTP; une activité de fixation d'ARN; un assemblage de RNP de télomérase; et une activité de fixation de protéine). On comprendra qu'il n'existe pas nécessairement une délimitation nette entre des modifications "d'activité" et des modifications "d'expression", et que ces termes servent
pour la facilité de l'exposé et non à titre limitatif.
On comprendra également que les modulateurs de l'invention doivent spécifiquement affecter l'activité de télomérase ou une expression de télomérase (par exemple, sans modifier de façon générale l'expression de protéines domestiques comme l'actine) plutôt que, par exemple, de diminuer l'expression de composants de télomérase par un empoisonnement non spécifique d'une cellule cible.
B. ESSAIS POUR IDENTIFICATION DE MODULATEURS
DE TELOMERASE
L'invention propose des procédés et des réactifs pour dépister des compositions ou des composés capables d'affecter l'expression d'une télomérase ou d'un composé de télomérase, capable de modifier la capacité de réplication de l'ADN caractérisant la télomérase, ou de modifier d'une autre façon l'aptitude de l'enzyme de télomérase et de la protéine de type TRT à effectuer la
synthèse d'ADN de télomère(de "pleine activité").
L'invention propose également des dépistages pour rechercher des modulateurs de l'une quelconque ou de la totalité des "activités partielles" de hTRT. Ainsi, la présente invention propose des essais pouvant servir à dépister des agents qui augmentent l'activité de télomérase, par exemple, en provoquant l'expression d'une protéine de type hTRT ou de télomérase dans une cellule dans laquelle, l'expression ne se produit pas normalement ou en augmentant les taux d'activité de télomérase dans des cellules donnant un résultat
positif à la recherche de télomérase.
Des protéines de type télomérase ou de sous-
unités de télomérase, ou leurs fragments catalytiques ou immunogéniques, ou leurs oligopeptides, peuvent servir à dépister des composés thérapeutiques dans l'une quelconque des diverses techniques de dépistage de médicaments et de drogues.Le fragment utilisé dans un tel essai peut être libre en solution, fixé à un support solide, porté sur une surface cellulaire ou logé à l'intérieur d'une cellule. La formation de complexes de liaison.entre la télomérase ou la protéine de
sous-unité et l'agent soumis à essai, peut être mesurée.
Dans diverses formes de réalisation, l'invention inclut des procédés pour dépister les antagonistes qui se fixent sur le site actif d'une enzyme, inhibent l'association de son fragment d'ARN, sur les protéines associées de la télomérase, sur des nucléotides ou l'ADN de télomère sur de la télomérase ou la protéine de type hTRT; qui favorisent ladissociation du complexe convenant à l'enzyme; qui interfèrent dans la transcription du fragment d'ARN de télomérase (par exemple, hTR); ou inhibent l'une quelconque des "activités partielles" ici décrites. L'invention propose des procédés pour dépister ou examiner des compositions qui inhibent l'association de compositions associées à de l'acide nucléique et/ou à de la télomérase hTRT, comme l'association de hTR avec hTRT ou l'association de hTRT avec les homologues humains de p80 ou p95 ou une autre protéine associée, ou l'association de hTRT avec un télomère ou avec un nucléotide; le dépistage d'examen de compositions qui favorisent la dissociation ou favorisent l'association (c'est-à-dire, l'assemblage) du complexe d'enzyme, comme un anticorps visant hTR ou hTRT; un dépistage d'examen d'agents qui réalisent le caractère efficace de l'enzyme; et le dépistage d'examen d'acides nucléiques et d'autres compositions qui se fixent sur de la télomérase, comme un acide nucléique complémentaire de hTR. L'invention envisage en outre le dépistage d'examen de compositions qui augmentent ou diminuent la transcription du gène de hTRT et/ou la translation du produit de gène de hTRT. L'invention envisage également un procédé d'examen ou de dépistage de modulateurs de télomérase chez les animaux, dans une forme de réalisation par reconstitution d'une activité de télomérase, ou d'une activité anti-télomérase, chez un animal comme un animal transgénique. L'invention propose des systèmes d'essais "in vivo" qui incluent des modèles "d'expulsion", dans lesquels un ou plusieurs motifs de la télomérase endogène, du fragment d'ARN de télomérase et/ou des protéines associées à de la télomérase ont subi une délétion ou ont été inhibés. L'activité de télomérase endogène, entière ou partielle, peut demeurer ou être absente. Dans une forme de réalisation, une activité de télomérase exogène,
entière ou partielle, est reconstituée.
Dans une forme de réalisation de l'invention, il est fourni divers essais de recherche de télomérase à activité partielle, pour identifier diverses classes
différentes de modulateurs de l'activité de télomérase.
Les essais de type "activité partielle" de l'invention permettent l'identification de classes de modulateurs de l'activité de télomérase qui risqueraient, sinon, de ne pas être décelées dans un essai de recherche de télomérase "de pleine activité". Un essai du type d'activité partielle inclut l'activité non-processive de TRT et d'une télomérase. La nature "processive" de la télomérase est décrite par Morin (1989) Cell 59:521-529; voir également Prowse (1993) "Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA :1493-1497. Un autre essai de recherche d'activité partielle selon l'invention exploite l'activité
"analogue à de la transcriptase reverse" de télomérase.
Dans ces essais, on recherche l'activité de transcriptase reverse de la protéine de type hTRT. Voir Lingner (1997) "Reverse transcriptase motifs in the
catalytic subunit of telomerase" Science 276:561-567.
Un autre essai du type activité partielle selon l'invention exploite "l'activité nucléolytique" de hTRT et de télomérase, impliquant l'enlèvement de l'enzyme d'au moins un nucléotide, typiquement la guanosine, du brin 3' d'une amorce. L'activité nucléolytique a été observée dans de la télomérase de Tetrahymena par Collins (1993) "Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation" Genes Dev 7:1364-1376. Un autre essai lié à l'activité partielle de l'invention implique l'analyse de l'aptitude de hTRT et de la télomérase à fixer des nucléotides comme constituant une partie de son activité de polymérisation d'ADN à rôle enzymatique. Un autre essai d'activité partielle selon l'invention implique l'analyse de l'aptitude de hTRT ou de télomérase à fixer son fragment d'ARN, c'est-à- dire, hTR pour les cellules humaines, servant de cadre ou de gabarit pour la synthèse de télomères. Des essais supplémentaires de détection d'activité partielle selon l'invention impliquent l'analyse de l'aptitude de hTRT et de la télomérase à fixer des chromosomes "in vivo" ou à fixer des amorces du type oligonucléotide "in vitro" ou dans le système reconstitué, ou à fixer des protéines associées à de la structure de chromosome (voir, un exemple d'une telle protéine, Harrington (1995) J. Biol. Chem. 270:8893-8901). Des structures de chromosome qui fixent hTRT comprennent, par exemple, de l'ADN de répétition de télomère, des protéines télomères, des histones, la protéine de matrice nucléaire, des protéines commandant la division cellulaire/les cycles cellulaires, etc. Dans une forme de réalisation, un mode opératoire d'essai pour identification de modulateurs comprend la
mise en contact d'une ou plusieurs cellules (c'est-à-
dire des "cellules d'essai") avec un composé d'essai, et la détermination du fait que le composé d'essai affecte ou non l'expression ou l'activité d'une télomérase (ou d'un composant de télomérase) dans la cellule. Habituellement, cette détermination comprend la comparaison de l'activité ou de l'expression, dans la cellule d'essai, en comparaison avec une cellule ou des cellules similaire(s) (c'est-à-dire des cellules témoins) qui n'ont pas été mises en contact avec le composé d'essai. En variante, on peut utiliser des
extraits de cellule à la place de cellules intactes.
Dans une forme apparentée de réalisation, le composé d'essai est administré à un organisme multicellulaire (par exemple, une plante ou un animal). La télomérase ou le composant de télomérase peut être entièrement endogène pour la cellule ou pour l'organisme multicellulaire (c'est-à-dire introduit par codage par des gènes endogènes naturels), ou bien il peut s'agir d'une cellule recombinante ou d'un organisme transgénique comprenant un ou plusieurs composants de télomérase exprimés par recombinaison (par exemple, hTRT, HTR, des protéines associées à de la télomérase), ou bien il peut avoir à la fois des composants endogènes et des composants recombinants. Ainsi, dans une forme de réalisation, on administre des modulateurs
de l'activité de télomérase à des cellules mortelles.
Dans une autre forme de réalisation, on administre des modulateurs de l'activité de télomérase à des cellules immortelles. Par exemple, des antagonistes d'une réplication d'ADN avec médiation par de la télomérase peuvent être identifiés par administration de la composition supposée inhibitrice à une cellule connue pour présenter de fortes quantités (des quantités "significatives") d'activité de télomérase, comme des cellules cancéreuses, et mesure du fait que l'on observe ou non une diminution de l'activité de télomérase, de la longueur de télomère ou de la capacité de prolifération, tous ces signes étant
indicatifs d'un composé ayant une activité antagoniste.
Dans une autre forme de réalisation, on identifie un modulateur en surveillant une modification d'activité de télomérase d'un complexe de ribonucléoprotéine (RNP) comprenant une TRT (par exemple, une hTRT) et un ARN formant gabarit (par exemple, hTR), cette RNP étant reconstituée in vitro
(par exemple, comme décrit à l'exemple 7 ci-après).
Dans une autre forme encore de réalisation, le modulateur est identifié par la surveillance d'une modification de l'expression d'un produit de gène de TRT (par exemple, à de l'ARN ou une protéine) dans une cellule, dans un animal, dans un système d'expression in
vitro ou dans un autre système d'expression.
Dans une autre forme encore de réalisation, le modulateur est identifié par modification de l'expression d'un gène rapporteur,comme ce qui est décrit à l'exemple 15, dont l'expression est régulée, en totalité ou en partie, par un élément régulateur de
TRT naturel, comme un promoteur ou un amplificateur.
Dans une forme apparentée de réalisation, on essaie de déterminer l'aptitude d'un composé d'essai à se fixer sur un composant de télomérase (par exemple, hTRT), sur de l'ARN ou sur une séquence régulatrice de gène (par
exemple, le promoteur de gène de TRT).
Dans une autre forme de réalisation, le modulateur est identifié par observation des modifications apparaissant dans le processus de traitement pré-ARNm de hTRT, par exemple, par des produits présentant d'autres épissures, par des cas d'une autre poly-adénylation, par du clivage d'ARN, etc. Dans une forme apparentée de réalisation, l'activité du modulateur peut être observée par surveillance de la production de polypeptides de type hTRT variants, dont certains peuvent posséder une activité de régulation de télomérase dominante ou négative. Des formats ou modes opératoires d'essais pour identification de composés qui affectent l'expression et l'activité de protéines sont bien connus dans les industries de la biotechnologie et les industries pharmaceutiques, de nombreux essais et modes opératoires supplémentaires d'essais et des variations des essais cités à titre illustratif ci-après
apparaîtront à l'homme du métier.
Des modifications d'activité de télomérase ou d'expression peuvent être mesurées par n'importe quel procédé convenable. Des modifications de niveaux ou taux d'expression d'un composant de télomérase (par exemple, une protéine de type hTRT) ou d'un précurseur (par exemple, ARNm de hTRT) peuvent faire l'objet d'essais de détermination à l'aide de procédés bien connus de l'homme du métier, dont certains sont décrits ci-dessus, par exemple dans la Section IX et qui comprennent la surveillance de taux ou niveaux de produits de gène de TRT (par exemple, de la protéine et des ARN) par hybridation (par exemple, en utilisant les sondes de TRT et les amorceurs de l'invention), par des essais immunologiques (par exemple, en utilisant les anticorps anti-TRT de l'invention), des essais de protection d'ARN, des essais d'amplification, ou n'importe quel autre moyen convenable de détection ici décrit ou connu en pratique. La détection, par quantification, des quantités d'acides nucléiques dans un échantillon (par exemple, l'évaluation des taux ou niveaux d'ARN, par exemple, d'ARNm de hTR ou de hTRT) est également utile pour évaluer le régulateur de
transcription en cis ou en trans.
De façon similaire, on peut mesurer des modifications de l'activité de télomérase en utilisant des procédés tels que ceux décrits ici (par exemple, à la Section IV(B), ci-dessus), ou d'autres essais de détermination de fonctions de télomérase. Une quantification de l'activité de télomérase, quand on le souhaite, peut être effectuée par n'importe quel procédé, ce qui comprend ceux ici décrits. Des antagonistes de la télomérase, pouvant provoquer ou accélérer une perte de structure de télomère, peuvent être identifiés par surveillance de leur effet sur l'activité de
télomérase in vitro, in vivo ou ex vivo, ou par surveillance d'ef-
fets exercés sur la longueur des télomères (selon la mesure ou la
détection par coloration, utilisation de sondes marquées par hybri-
dation ou par d'autres moyens) ou, tout simplement, par l'inhibi-
tion de la division cellulaire de cellules cancéreuses donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase (un raccourcissement critique des télomères conduit à un phénomène appelé "crise" ou sénescence M2 (Shay, 1991) Biochem. Biophys. Acta 1072:1-7); ces cellules cancéreuses ayant été contournées par l'activation de la télomérase mais, en l'absence de téLomérase, conduisant à leur sénescence ou à leur mort par délétion chromosomique et réarrangement). La reconstitution in vivo de l'activité de télomérase humaine donne un procédé de dépistage de modulateurs de la télomérase dans des cellules et dans des animaux de n'importe quelle origine. De tels agonistes peuvent être identifiés dans un essai de détermination d'activité selon l'invention, ce qui comprend des
mesures de modification de longueur des télomères.
D'autres exemples d'essais mesurant l'activité de télomérase dans des cellules comprennent des essais pour la détection de l'accumulation ou de la perte de structure de télomère, l'essai TRAP ou un essai de réaction en chaîne quantitative sous l'effet d'une polymérase. Dans une forme de réalisation, les essais de l'invention comprennent également un procédé dans lequel le composé d'essai produit une diminution, statistiquement significative, de l'activité de hTRT telle que mesurée par l'incorporation d'un nucléotide marqué dans un substrat, en comparaison de la quantité relative de marqueur incorporée dans une réaction, en comparaison avec le cas d'un milieu réactionnel parallèle manquant
du composé d'essai, ce qui permet de déterminer le fait que le com-
posé d'essai est un inhibiteur de télomérase.
Les procédés de l'invention peuvent être soumis à des adaptations provenant de protocoles ou modes opératoires décrits dans la littérature scientifique et la littérature des brevets et qui sont connus en pratique. Par exemple, quand on utilise une télomérase ou une protéine de type TRT de la présente invention pour identifier des compositions agissant comme des modulateurs des activités de télomérase, on peut soumettre à un examen de dépistage, en un essai unique,
de grands nombres de molécules potentiellement utiles.
Les modulateurs peuvent avoir un effet inhibiteur (antagoniste) ou de potentialisation (agoniste) sur l'activité de télomérase. Par exemple, si un groupe de 1 000 inhibiteurs est à examiner, on peut potentiellement placer l'ensemble des 1 000 inhibiteurs dans un seul creux de plaquette pour microtitrage et effectuer simultanément des essais. Si un tel inhibiteur est découvert, l'ensemble formé par les 1 000 candidats peut être subdivisé en 10 ensembles de candidats, et le procédé peut être répété jusqu'à
identification d'un inhibiteur individuel.
Dans l'examen de recherche et de dépistage de drogues et médicaments, on examine de grands nombres de composés pour en déterminer l'aptitude à agir à titre de modulateurs de la télomérase, ce procédé étant grandement accéléré par les techniques d'examen de dépistage à grand débit. Les essais de détermination de l'activité de télomérase, entière ou partielle, que l'on décrit ici peuvent être adaptés pour servir dans une technique à grand débit. L'homme du métier apprécie le fait qu'il existe de nombreux procédés pour parvenir
à cette fin.
Une autre technique d'examen de dépistage des médicaments, que l'on peut appliquer pour l'examen de dépistage à grand débit de composés ayant une affinité
de liaison convenable avec la télomérase,ou d'une sous-
unité protéinique de télomérase, est décrite en détail dans "Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity" de Geysen (demande de brevet international 84/03564, publiée le 13 septembre 1984, incorporée ici par référence). En résumé, de grands nombres de différents petits composés d'essai de peptide sont synthétisés sur un substrat solide, tel que des pointes ou aiguilles en matière plastique ou sur quelque autre surface. On fait réagir les composés d'essai de type peptide avec des fragments de télomérase ou de sous-unité protéinique de télomérase et on lave. La télomérase liée ou la sous-unité protéinique de télomérase est ensuite décelée par des procédés bien connus en pratique. De la télomérase essentiellement purifiée, ou de la sous-unité protéinique de télomérase, peuvent également être appliquées en traitement direct sur des plaques destinées à servir dans les techniques précitées d'examen de dépistage de médicaments. En variante, on peut utiliser des anticorps non neutralisants pour capturer le peptide et l'immobiliser sur un support
solide.
La présente invention envisage également l'utilisation d'essais d'examen de dépistage de médicaments se déroulant avec une compétition, essais dans lesquels des anticorps neutralisants, capables de fixer spécifiquement de la télomérase ou de la ou des protéine(s) de sous-unité, entrent spécifiquement en compétition avec un composé d'essai pour réaliser une liaison de fixation de télomérase ou d'une sous-unité protéinique. Des anticorps peuvent également servir à déceler la présence de n'importe quel peptide ayant, en commun avec la télomérase ou avec une sous-unité
protéinique, un ou plusieurs déterminants antigéniques.
Les procédés supplémentaires pour identifier des modulateurs d'une activité de télomérase ont été décrits dans le brevet US-A-5 645 986, qui est incorporé ici par référence. On comprendra que la présente invention fournit des perfectionnements aux procédés antérieurement connus,partiellement par la fourniture de réactifs tels que des polynucléotides, des sondes et des amorces de type hTRT, de la hTR, de la hTRT et de la télomérase hautement purifiées, ainsi que des anticorps anti-télomérase et anti-TRT, qui peuvent tous servir dans des essais, par exemple à titre de témoin, d'étalon, d'agent de liaison ou
d'hybridation, ou servir d'une autre manière.
On comprendra que la télomérase produite par la technique de recombinaison et la TRT (par exemple de la hTRT) de l'invention vont utilement servir dans des essais pour l'identification de modulateurs. L'essai d'examen par dépistage peut utiliser de la télomérase ou de la hTRT provenant d'une reconstitution entière ou partielle de l'activité de télomérase, ou d'une augmentation de l'activité existante. L'essai ou les examens de dépistage fournis par l'invention peuvent servir à effectuer des essais de recherche de l'aptitude de la télomérase à synthétiser de l'ADN télomère ou pour effectuer des essais de recherche de l'une quelconque ou de la totalité des "activités partielles" de hTRT et de TRT, en général, comme décrit ci-dessus. L'essai peut incorporer une modification ex vivo de cellules qui ont subi des manipulations pour exprimer de la télomérase avec ou sans son fragment d'ARN ou des protéines associées, et ces produits peuvent être réimplantés dans un animal, qui peut servir à des essais in vivo. Ainsi, la présente invention propose des essais à réaliser in vivo et des animaux transgéniques pouvant utilement servir à cet effet. Ces sytèmes d'essais in vivo peuvent employer des cellules ayant fait l'objet d'une "expulsion", cellules dans lesquelles une ou plusieurs unités du complexe de l'enzyme télomérase endogène ont été enlevées par délétion ou ont été inhibées, ainsi que des cellules dans lesquelles une activité de télomérase
exogène ou endogène est reconstituée ou activée.
Des télomérases et des protéines de type TRT, qui ont été modifiées d'une manière spécifique à du site (par mutation spécifique à ce site) pour modifier ou éliminer l'une quelconque ou la totalité des fonctions de l'enzyme télomérase ou de la protéine de type TRT peuvent également servir dans les examens de dépistage selon l'invention pour découvrir des agents thérapeutiques. Par exemple, la TRT peut être traitée de façon à perdre son aptitude à fixer de l'ADN servant de substrat, à fixer son fragment ARN (sous forme de hTR), à catalyser l'addition d'ADN de télomère, à fixer du désoxynucléotide servant de substrat, à présenter une activité nucléolytique, à fixer des protéines associées à des télomères ou des structures de chromosome, etc. Les "protéines mutantes" résultantes ou des "mutantes" peuvent servir à identifier des composés modulant spécifiquement une, ou toutes les fonctions ou activités de la protéine de type TRT ou de la télomérase.
C. EXEMPLES DE MODULATEURS DE LA TELOMERASE
1) GENERALITES
Les composés précités peuvent être constitués par l'un quelconque d'un grand nombre de composés très divers, aussi bien naturels que synthétiques, organiques et minéraux, et cela comprend des polymères (par exemple des oligopeptides, des polypeptides, des
oligonucléotides et des polynucléotides, de petites mo-
lécules, des anticorps (tels que définis ici en gros),
des sucres, des acides gras, des nucléotides et des ana-
logues de nucléotides, des analogues de structures natu-
relles (par exemple des espèces mimant des peptides, des
analogues d'acides nucléiques, etc.) et de nombreux autres composés.
L'invention propose des modulateurs de tous types, sans se limiter à un mécanisme particulier quelconque d'action. A des fins illustratives, on peut indiquer que des exemples de modulateurs comprennent des composés ou des traitements qui: (i) se fixent sur le polypeptide de type hTRT (par exemple, le site actif de l'enzyme) ou d'autres composants de télomérase, et affectent une activité de télomérase; (ii) inhibent ou favorisent une association, ou bien inhibent ou favorisent une dissociation, d'un composant de télomérase (par exemple, hTRT ou la RNP de type hTRT-hTR) avec une protéine associée à la télomérase ou pour séparation d'avec une telle protéine (comprenant par exemple, celle décrite à la Section IV(D) ci-dessus; (iii) inhibent ou favorisent une association, ou bien inhibent ou favorisent une dissociation, de polypeptides de type télomérase (par exemple, hTRT) avec un ARN de télomérase (par exemple, hTR) ou pour la séparation d'avec un tel polypeptide; (iv) inhibent ou favorisent une association, ou bien inhibent ou favorisent une dissociation, de polypeptides de type télomérase (par exemple, hTRT) (avec des chromosomes (par exemple des télomères) ou de l'ADN de chromosome (par exemple, de l'ADN télomère) ou pour une séparation d'avec les chromosomes; (v) augmentent ou diminuent l'expression d'un produit de gène de composant de télomérase (par exemple, des produits du gène de hTRT), ce qui comprend une modification de la vitesse ou du taux de transcription du gène de TRT, ou une translation, un transport ou la stabilité d'un produit de gène, ou analogue, par fixation sur le gène ou sur le produit de gène (par exemple, par interaction avec un facteur (par exemple, une protéine régulatrice de transcription)) qui affecte la transcription du gène de hTRT ou d'un
autre composant de télomérase).
2) MODULATEURS PEPTIDIQUES
Des modulateurs potentiels de l'activité de télomérase comprennent également des peptides (par exemple, des modulateurs peptidiques inhibiteurs (antagonistes) et activateurs (agonistes)). Par exemple, des oligopeptides comportant des séquences engendrées au hasard peuvent être soumis à des examens par dépistage pour découvrir des modulateurs peptidiques (agonistes ou inhibiteurs) de l'activité de télomérase. De tels peptides peuvent servir directement de médicaments ou pour trouver l'orientation ou la position d'un groupe fonctionnel pouvant inhiber une activité de télomérase, ce qui, à son tour, conduit à concevoir et essayer un inhibiteur du type petite molécule, ou pouvant devenir la charpente de modifications chimiques augmentant l'utilité pharmacologique. Les peptides peuvent être des produits ressemblant par leur structure, et on peut utiliser des programmes de modélisation moléculaire pour concevoir des produits mimétiques fondés sur la structure secondaire caractéristique et/ou sur la structure tertiaire de l'enzyme télomérase et de la protéine de type hTRT. De tels produits à structure mimétique ou ressemblante peuvent également servir en thérapeutique, in vivo, à titre de modulateurs de l'activité de télomérase (agonistes et antagonistes). Des produits ressemblant par leur structure peuvent également servir d'immunogènes pour susciter la production d'anticorps
protéiniques anti-télomérase ou anti-TRT.
3) COMPOSES NATURELS INHIBITEURS A TITRE DE
MODULATEURS DE L'ACTIVITE DE TELOMERASE
En outre, un grand nombre de composés modificateurs d'activité, potentiellement utiles, peuvent être soumis à des examens par dépistage dans des extraits provenant de produits naturels, comme source de matière. Des sources de tels extraits peuvent provenir d'un grand nombre d'espèces et de champignons, des actinomycètes, des algues, des insectes, des protozoaires, des plantes et des bactéries. Les extraits montrant une activité inhibitrice peuvent
ensuite être analysés afin d'isoler la molécule active.
Voir, par exemple, Turner (1996) J. Ethnopharmacol
51(1-3):39-43; Suh (1995) Anticancer Res. 15:233-239.
4) OLIGONUCLEOTIDES INHIBITEURS
Un groupe particulièrement utile d'inhibiteurs fournis par la présente invention comprend des oligonucléotides capables de fixer de la protéine de type hTRT codant pour de l'ARNm ou se fixer sur le gène de hTRT, en évitant ou en inhibant dans l'un ou l'autre cas, la production d'une protéine à fonction de hTRT. D'autres oligonucléotides de l'invention interagissent avec du fragment d'ARN de télomérase, comme hTR, ou sont capables d'empêcher la fixation de télomérase ou de hTRT à l'ADN qui en constitue la cible, ou la fixation d'un composant de télomérase sur un autre, ou sur un substrat. De tels oligonucléotides peuvent également fixer l'enzyme de télomérase, de la protéine de type hTRT ou les deux protéines et l'ARN et inhiber une activité partielle, comme décrit ci-dessus (comme son activité de progression de traitement, son activité de transcriptase reverse, son activité nucléolytique, etc.). L'association peut s'effectuer par l'intermédiaire d'une hybridation spécifique de séquence sur un autre acide nucléique ou par fixation générale, comme dans un aptamère, ou par les deux mécanismes. L'activité de télomérase peut être inhibée par l'action d'ARNm de type hTRT recherchant comme cible les oligonucléotides antisens capables de fixer l'ARNm
de type hTRT.
Une autre classe utile d'inhibiteurs comprend des oligonucléotides provoquant une inactivation ou un clivage d'ARNm de type hTRT ou de hTR. C'est-à-dire que l'oligonucléotide est chimiquement modifié, ou possède une activité d'enzyme, provoquant un tel clivage, comme cela est le cas pour un ribozyme, un oligonucléotide fixé à de l'EDTA, ou un oligonucléotide fixé par covalence, comme un oligonucléotide fixé à un psoralène ou à un autre réactif de réticulation. Comme noté ci-dessus, on peut examiner par dépistage un groupe de très nombreux oligonucléotides très différents de ce
genre pour déceler ceux ayant l'activité voulue.
Une autre classe utile d'inhibiteurs comprend des oligonucléotides qui fixent des polypeptides. Des ADN à double brin ou à simple brin ou des molécules d'ARN à double brin ou à simple brin, qui se fixent sur des polypeptides spécifiques constituant des cibles, sont des molécules appelées "aptamères". L'association spécifique oligonucléotidepolypeptide peut subir les effets d'une interaction électrostatique. Par exemple, des aptamères se fixent spécifiquement sur des exosites pour fixation d'anion sur de la thrombine, et se fixent physiologiquement sur l'héparine polyanionique (Bok (1992) Nature 355:564-566). Puisque de la protéine de type hTRT fixe à la fois hTR et son substrat d'ADN, et puisque la présente invention fournit des protéines de type hTRT et d'autres protéines de type TRT sous forme purifiée que l'on obtient en grande quantité, l'homme du métier peut facilement, en utilisant les procédés de l'invention, effectuer des examens par dépistage pour
déceler des aptamères à rôle de fixation de TRT.
Des oligonucléotides (par exemple, des oligonucléotides de type ARN), qui fixent de la télomérase, hTRT, hTR ou des portions de ces produits, peuvent être engendrés à l'aide des techniques de SELEX (Tuerk, 1997, Methods Mol. Biol. 67:2190). Dans cette technique, on fixe un très grand ensemble d'acides nucléiques à séquences aléatoires (106-109) sur la cible (par exemple hTRT) en utilisant des conditions provoquant une grande quantité de discrimination entre des molécules ayant une grande affinité et des molécules
ayant une faible affinité pour la fixation de la cible.
Les molécules fixées sont séparées des molécules non fixées, et les molécules fixées sont amplifiées du fait de la présence à leurs extrémités d'une séquence spécifique d'acides nucléiques et à l'aide de réactifs convenant bien pour une amplification. Ce procédé est recommencé plusieurs fois jusqu'à ce qu'il reste un nombre relativement faible de molécules possédant une grande affinité de liaison pour la cible. Ces molécules peuvent alors être soumises à des essais de détermination de leur aptitude à moduler une activité
de télomérase, comme décrit ici.
Des antagonistes d'une réplication d'ADN avec médiation par de la télomérase peuvent également être fondés sur une inhibition de hTR (Norton (1996) Nature Biotechnology 14:615-619) par l'intermédiaire d'une reconnaissance de séquences complémentaires ou d'un
clivage, par exemple, à l'aide de ribozymes.
Les oligonucléotides inhibiteurs, de l'invention, peuvent être transférés dans la cellule à l'aide de diverses techniques bien connues en pratique. Par exemple, des oligonucléotides peuvent être délivrés dans le cytoplasme sans modification spécifique. En variante, ils peuvent être délivrés par l'utilisation de liposomes qui fusionnent avec la membrane cellulaire ou sont endocytosés, c'est-à-dire, par emploi de ligands fixés aux iiposomes ou directement à de l'oligonucléotide, et qui se fixent sur les récepteurs protéiniques superficiels de membrane de la cellule, ce qui aboutit à de l'endocytose. En variante, les cellules peuvent être rendues perméables pour augmenter le transport des oligonucléotides dans la cellule, sans léser les cellules hôtes. On peut utiliser une protéine fixant de l'ADN, par exemple, HBGF-1, dont on sait qu'elle transporte un oligonucléotide jusqu'à
l'intérieur d'une cellule.
) RIBOZYMES INHIBITEURS
Les ribozymes agissent par fixation sur un ARN cible, par l'intermédiaire de la partie à rôle de fixation d'ARN cible d'un ribozyme qui est maintenu en étroite proximité d'une partie enzymatique du ribozyme clivant l'ARN cible. Ainsi, le ribozyme reconnaît et fixe un ARN cible, habituellement par l'intermédiaire d'une formation de paires complémentaires, et une fois fixé au site correct, il a une action enzymatique pour
cliver et inactiver l'ARN cible. Le clivage,d'une tel-
le manière, d'un ARN cible va détruire son aptitude à diriger la synthèse d'une protéine introduite par codage, si le clivage se produit dans la séquence codante. Après fixation d'un ribozyme et clivage de sa cible ARN, ce ribozyme est typiquement libéré de l'ARN et peut ainsi fixer et cliver de façon répétée de
nouvelles cibles.
6) IDENTIFICATION DE PROTEINES ASSOCIEES A DE
LA TELOMERASE QUI EST DESTINEE A SERVIR
D'AGENTS MODULATEURS
Dans une forme de réalisation de l'invention, de la télomérase sert à identifier des protéines associées à de la télomérase, c'est-à-dire des protéines à rôle accessoire sur la télomérase et qui modulent ou
complètent d'une autre façon l'activité de télomérase.
Comme noté ci-dessus, ces protéines ou leurs fragments peuvent moduler la fonction en provoquant la dissociation ou en évitant l'association du complexe comportant de l'enzyme télomérase, en évitant l'assemblage du complexe de télomérase, en empêchant hTRT de se fixer à son complément d'acide nucléique ou à son cadre ou gabarit d'ADN, en empêchant hTRT de fixer des nucléotides ou en évitant, en augmentant ou en inhibant une quelconque, plusieurs ou toutes les activités partielles de l'enzyme télomérase d'une
protéine de type hTRT, comme décrit ci-dessus.
L'homme du métier peut utiliser des procédés de l'invention pour identifier les portions (par exemple, les domaines) par l'intermédiaire desquel(le)s les protéines associées à de la télomérase viennent au contact de la télomérase. Dans une forme de réalisation de l'invention, ces protéines associées à de la télomérase ou leurs fragments servent de modulateurs de
l'activité de télomérase.
7) PROTEINES ASSOCIEES A DE LA TELOMERASE A
TITRE DE MUTANTS NEGATIFS DOMINANTS
Dans une forme de réalisation de l'invention, des protéines associées à de la télomérase servent de modulateurs de l'activité de télomérase. Les protéines associées à de la télomérase comprennent des structures chromosomiques, comme des histones, des protéines de matrice nucléaire, des protéines commandant la division cellulaire et commandant les cycles cellulaires, etc. D'autres protéines associées à de la télomérase, qui peuvent servir de modulateurs pour le but visé par l'invention, comprennent des protéines p80 et p95 et leurs homologues humains, comme TP1 et TRF-1 (Chong, 1995, Science 270:1663-1667). En outre, des fragments de ces protéines associées à de la télomérase peuvent être identifiés par une personne expérimentée opérant selon les procédés de l'invention et peuvent servir de
modulateurs de l'activité de télomérase.
8) MUTANTS NEGATIFS DOMINANTS
Huit motifs hautement 'conservés ont été identifiés entre des TRT de différentes espèces non humaines, comme décrit ci-dessus (voir également Lingner (1997) Science 276:561-567). La figure 4 montre un schéma de séquence d'amino acides de type TRT humaine (provenant de pGRN121) et des motifs RT, en comparaison avec S. pombe Trlp, Euplotes p123 et S. cerevisiae Est2p. La présente invention propose des acides nucléiques recombinants et synthétiques dans lesquels les codons pour les restes d'amino acidesconservés dans chaque codon, isolément ou de concert avec un ou plusieurs codons supplémentaires, de l'ensemble des huit motifs ont été modifiés en chacun des autres codons. Diverses séquences codantes résultantes expriment une hTRT non fonctionnelle. Voir, par exemple, l'exemple 16. Ainsi, la présente invention propose, par exemple, des enzymes télomérase "mutées" très diverses et des protéines de type TRT qui ont une activité partielle mais non pas la pleine activité de la télomérase. Par exemple, une telle télomérase est capable de fixer des structures télomères, mais non pas
de fixer de l'ARN associé à de la télomérase (c'est-à-
dire hTR). En cas d'expression à des taux ou niveaux assez élevés, une telle télomérase mutante peut épuiser un composant de télomérase nécessaire (par exemple, hTR) et jouer ainsi le rôle d'inhibiteur d'une activité de télomérase de type sauvage. Une télomérase ayant muté et agissant de cette manière constitue un antagoniste ou ce que l'on appelle un mutant "à
dominante négative".
9) ANTICORPS
En général, les anticorps de l'invention peuvent servir à identifier, à purifier ou à inhiber une quelconque ou la totalité des activités de l'enzyme télomérase et d'une protéine de type hTRT. Des anticorps peuvent jouer le rôle d'antagonistes de l'activité de télomérase de diverses façons, par exemple, en empêchant le complexe de télomérase ou un nucléotide de se fixer sur ses substrats de type ADN, en empêchant les composants de télomérase de former un complexe actif, en maintenant une structure quaternaire fonctionnelle (complexe de télomérase) ou en se fixant sur l'un des sites actifs de l'enzyme ou sur d'autres sites ayant des effets allostériques sur l'activité (les différentes activités partielles de la télomérase sont décrites en détail dans une autre partie du
présent exposé).
D) SYNTHESE DE MODULATEURS
On envisage de produire les modulateurs de télomérase de l'invention en utilisant des procédés bien connus dans les arts pharmaceutiques, ce qui comprend des méthodes de combinaison et des techniques
de conception rationnelle de médicament.
1) METHODOLOGIE DE CHIMIE COMBINATOIRE
La création et l'examen de dépistage simultané de grandes bibliothèques de molécules synthétiques peuvent être une opération effectuée à l'aide de techniques bien connues dans la chimie combinatoire, voir par exemple, van Breemen (1997) Anal. Chem. 69:2159-2164;
Lam (1997) Anticancer Drug Des 12:145-167 (1997).
Comme noté ci-dessus, la méthodologie de la chimie combinatoire sert à créer de très grands nombres d'oligonucléotides (ou d'autres composés) pouvant être rapidement examinés par dépistage pour déceler des oligonucléotides spécifiques (ayant des affinités appropriées de liaison et ayant certaines spécificités à l'égard de n'importe quelle cible, comme les protéines de type TRT de l'invention (pour des informations d'arrière-plan
général, voir Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-
13584).
2) RECHERCHE ET CONCEPTION RATIONNELLE DE
MEDICAMENTS
Une recherche et une conception rationnelle de médicaments- impliquent un groupe intégré de méthodologies comprenant une analyse de la structure de molécules constituant des cibles, des chimies de synthèse et des outils (avancés) de calcul. Quand on l'utilise pour concevoir des modulateurs, comme des antagonistes/inhibiteurs de cibles protéiniques, comme de l'enzyme télomérase et de la protéine de type hTRT, l'objectif d'une conception rationnelle des médicaments consiste à comprendre une forme tridimensionnelle de molécule et sa chimie. Une recherche et une conception rationnelle de médicaments sont aidées par des données cristallographiques à l'aide de rayons X ou des données de RMN (résonance magnétique nucléaire), que l'on peut maintenant déterminer pour la protéine de type hTRT et pour l'enzyme télomérase, en opérant selon les procédés,
et en utilisant les réactifs, proposés par l'invention.
Des calculs concernant des caractéristiques
électrostatiques, des hydrophobicités et l'accessi-
bilité à des solvants peuvent également servir. Voir, par exemple, Coldren (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:6635-6640.
E) NECESSAIRES ET "KITS"
L'invention propose également des nécessaires ou lIf kits pouvant servir à faciliter la détermination du fait qu'un composé d'essai est ou non un modulateur d'activité de TRT. Le nécessaire va typiquement inclure un ou plusieurs des composants suivants: un polypeptide ou polynucléotide de type TRT, essentiellement purifié (ce qui comprend des sondes et amorces); un plasmide capable d'exprimer une TRT (par exemple, hTRT) quand il est introduit dans une cellule ou dans un système d'expression sans cellule; un plasmide capable d'exprimer une TR (par exemple, hTR) quand il est introduit dans une cellule ou dans un système d'expression sans cellule; des cellules ou lignées de cellules; une composition pour déceler une variation d'activité de TRT; et un matériel d'instructions enseignant un moyen de déceler et de mesurer une modification de l'activité de TRT, indiquant qu'une modification de l'activité de télomérase en présence du composé d'essai constitue un indicateur du fait que le composé d'essai module l'activité de télomérase, et un ou plusieurs récipients. Le nécessaire peut également inclure un ou des moyens, comme des réactifs pour un essai TRAP ou des réactifs pour une réaction quantitative en chaîne à l'aide de polymérase, pour mesurer une variation d'activité de TRT. Le nécessaire peut également inclure du matériel d'instruction enseignant un moyen de déceler et de mesurer une modification de l'activité de TRT, indiquant qu'une variation d'activité de télomérase en présence du composé d'essai constitue un indicateur du fait que le
composé d'essai module l'activité de télomérase.
XI. ORGANISMES TRANSGENIQUES (CELLULES ET MODELES
ANIMAUX ELIMINANT LA TELOMERASE)
L'invention propose également des organismes multicellulaires transgéniques non humains (par exemple des plantes et des animaux non humains) ou des organismes unicellulaires (par exemple de la levure) comprenant une séquence de gène de TRT exogène, qui peut être une séquence codante ou une séquence régulatrice (par exemple, un rôle de promoteur). Dans une forme de réalisation, l'organisme exprime un polypeptide TRT exogène, ayant une séquence de protéine TRT humaine. Dans une forme apparentée de réalisation, l'organisme exprime également un composant de type ARN
de télomérase (par exemple, hTR).
L'invention propose également des organismes unicellulaires et multicellulaires (ou des cellules qui en proviennent), dans lesquels au moins un gène codant pour l'introduction d'un composant de type télomérase (par exemple, TRT ou TR) ou une protéine associée à de la télomérase est soumis à mutation ou à délétion (c'est-à-dire dans une région de codage ou région régulatrice) de sorte que de la télomérase native n'est pas exprimée, ou est exprimée à des taux réduits ou avec des activités différentes en comparaison des cellules ou organismes de type sauvage. De telles cellules et de tels organismes sont souvent désignés comme étant des cellules ou des organismes "pour expulsion de gène" L'invention propose en outre des cellules et des organismes dans lesquels un gène de télomérase endogène (par exemple, TRT de souris) est présent ou a éventuellement subi une mutation ou une délétion et un gène de télomérase exogène ou un variant d'un tel gène (par exemple, TRT humaine) est introduit et soumis à expression. Des cellules et organismes de ce type seront utiles, par exemple, comme système modèle pour identifier des modulateurs de l'activité de hTRT ou d'une expression de hTRT; pour déterminer les effets de mutation dans les gènes de composant de télomérase, et pour d'autres utilisations comme la détermination du programme temporel de développement et de l'emplacement de l'activité de télomérase dans du tissu (par exemple, pour établir quand administrer un modulateur de télomérase et pour établir l'existence de tous effets
secondaires potentiels éventuels).
Des exemples d'organismes multicellulaires comprennent des plantes, des insectes et des animaux non humains, comme des souris, des rats, des lapins, des singes, des primates, des porcs et autres mammifères non humains. Un exemple d'un organisme
unicellulaire est constitué par une levure.
Des procédés pour modifier, altérer ou rompre des gènes spécifiques (par exemple des gènes de TRT endogène) sont bien connus de l'homme du métier, voir, par exemple, Baudin et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21:3329; Wach et al. 1994, Yeast 10:1793; Rothstein, 1991, Methods Enzymol. 194:281; Anderson, 1995, Methods Cell Biol. 48:31; Pettit et al., 1996, Development 122:4149-4157; Ramirez- Solis et al., 1993, Methods Enzymol. 225:855; et Thomas et al., 1987, Cell 51:503, chacun de ces documents étant incorporé ici par
référence, en sa totalité, à toutes fins utiles.
Les cellules et animaux de l'invention, à rôle "éliminateur", comprennent des cellules et animaux dans lesquels une ou plusieurs unités ou un ou plusieurs motifs du complexe comportant l'enzyme télomérase endogène ont subi une délétion ou une inhibition. Une reconstitution de l'activité de télomérase va sauver la cellule ou l'animal de la sénescence ou bien, dans le cas de cellules cancéreuses, une mort des cellules provoquée par l'inaptitude des cellules à conserver des télomères. Des procédés pour altérer ou modifier l'expression de gènes endogènes sont bien connus de l'homme du métier. Typiquement, de tels procédés impliquent l'altération ou le remplacement de la totalité ou d'une partie des séquences régulatrices "contrôlant" ou dirigeant l'expression du gène particulier à réguler. Les séquences régulatrices, par exemple, le promoteur natif, peuvent être altérées. La technique traditionnelle pour une mutation ciblée de gènes implique le placement d'un fragment d'ADN de génome, contenant le gène intéressant, dans un vecteur, ce qui est suivi par le clonage des deux bras du génome associés au gène visé autour d'une cassette de résistance à la néomycine, pouvant être choisi, dans un vecteur contenant de la thymidine kinase. Cette construction "pour élimination" est ensuite introduite par transfection dans la cellule hôte appropriée, c'est-à-dire une cellule de souche embryonnaire de souris, qui est ensuite soumise à une sélection positive (en utilisant G418, par exemple, pour le choix de la résistance à la néomycine) et à une sélection négative (utilisant, par exemple, FIAU pour exclure des cellules manquant de thimydine kinase), en laissant s'effectuer la sélection de cellules ayant subi une
recombinaison homologue avec le vecteur d'exclusion. Cette approche conduit à une inactivation du gène intéressant. Voir, par
exemple, les brevets US-A-5 464 764, US-A-5 631 153, US-A-5 487 992 et
US-A-5 627 059.
L'expression "avec élimination" d'un gène endogène peut également être réalisée grâce à l'utilisation d'une recombinaison homologue pour introduire un acide nucléique hétérologue dans des séquences régulatrices (par exemple, de promoteur) du gène intéressant. Pour éviter l'expression d'une enzyme ou d'un produit fonctionnel(le), des mutations simples qui altèrent ou modifient le cadre de lecture ou rompent le promoteur peuvent convenir. Pour réguler pleinement l'expression, un promoteur natif peut être remplacé par un promoteur hétérologue qui induit des niveaux ou taux plus élevés de transcription. De même, on peut utiliser une "insertion de piège de gène", pour rompre un gène hôte, et des cellules ES de souris peuvent servir à produire des animaux transgéniques présentant une délétion, comme décrit, par exemple, dans Holzschu (1997) Transgenic
Res 6:97-106.
Une modification de l'expression de gènes endogènes par recombinaison homologue peut également être réalisée par l'utilisation de séquences d'acides nucléiques comprenant le gène structurel en cause. On utilise des séquences d'amont pour cibler des produits de construction par recombinaison hétérologue. En utilisant une information de séquence de gène structurel de type TRT, comme la SEQUENCE ID N 1, l'homme du métier peut créer, avec seulement une expérimentation de routine, des produits de construction par recombinaison homologue. Une recombinaison homologue pour modifier l'expression de gènes endogènes est décrite dans les brevets USA-5 272 071 et WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 et WO 91/12650. Une recombinaison homologue dans des mycobactéries est décrite par Azad (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4787; Baulard (1996) J. Bacteriol. 178:3091; et Pelicic (1996) Mol. Microbiol. 20:919. Une recombinaison homologue chez les animaux a été décrite par Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet. 5:875, et des
plantes par Offringa (1990) EMBO J. 9:3077.
XII. GLOSSAIRE
Les termes et expressions ci-après sont définis ci-dessous pour fournir à l'homme du métier des renseignements supplémentaires de guidage dans la pratique de l'invention: adjuvant, allèle (et séquence allélique), amino acides (ce qui comprend des amino acides hydrophobes, polaires, chargés), substitution conservatoire, éléments de commande et de contrôle (et séquences régulatrices), dérivatisation, marque décelable, niveau ou taux élevé, épitope, pronostic favorable et défavorable, protéine de fusion, produit de gène, hTR, immortel, immunogène et immunogénique, isolé, modulateur, motif, acide nucléique (et polynucléotide), oligonucléotides (et oligomères), liaison fonctionnelle, polypeptide, sonde (ce qui comprend des sondes de type acide nucléique et des sondes de type anticorps), recombinant, système de sélection, séquence, liaison spécifique, conditions strictes d'hybridation (et caractère strict), identité substantielle (et similarité substantielle),
substantiellement pure (et substantiel-
lement purifiée), cellules donnant un résultat négatif à la recherche de télomérase et cellules donnant un résultat positif à la recherche de télomérase, activité catalytique de télomérase,
apparenté à la télomérase, et composé d'essai.
Tel qu'on l'utilise ici, le terme "adjuvant" se réfère à son sens ordinaire pour indiquer toute substance qui amplifie la réponse immunitaire à un antigène avec lequel il est mélangé. Des adjuvants utiles dans la présente invention comprennent, sans que cette liste soit limitative, l'ajuvant de Freund, des gels minéraux comme de l'hydroxyde d'aluminium, et des substances tensioactives comme de la lysolécithine, des polyols pluroniques, des polyanions, des peptides, des émulsions dans de l'huile, de l'hémocyanine d'escargot en forme de trou de serrure, et du dinitrophénol. Le BCG (bacille de Calmette- Guerin) et Corynebacterium parvum constituent des adjuvants potentiellement
utiles.
Tels qu'ils servent ici, les termes "allèle" ou "séquence allélique" se réfèrent à, une forme alternative" ou une autre forme d'une séquence d'acides nucléiques (c'est-à-dire, un acide nucléique codant pour une protéine de type hTRT). Les allèles proviennent de mutations (par exemple, des modifications de la séquence des acides nucléiques) et de façon générale, ils produisent des ARNm ou des polypeptides altérés et/ou régulés de façon différente, dont la structure et/ou la fonction peut ou peuvent ou non être altérées. Des modifications provoquant des mutations courantes et donnant naissance à des allèles sont généralement attribuées à des délétions naturelles, à des additions ou à des substitutions de nucléotides qui peuvent ou non affecter des amino acides introduits par codage. Chacun de ces types de modifications peut se produire isolément, en combinaison avec les autres ou une ouplusieurs fois au sein d'un gène donné, d'un chromosome ou d'un autre acide nucléique cellulaire donné. N'importe quel gène donné peut avoir zéro, une ou de nombreuses formes alléliques. Tel qu'on l'utilise ici, le terme "allèle" désigne un gène ou un ARNm transcrit du gène, ou les deux. Tels qu'on les utilise ici, les termes "amino acides" sont parfois spécifiés en utilisant un code standard de désignation par une lettre: Alanine (A), Sérine (S), Thréonine (T), acide aspartique (D), acide glutamique (E), Asparagine (N), Glutamine (Q), Arginine (R), Lysine (K), Isoleucine (I), Leucine (L), Méthionine (M), Valine (V), Phénylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophane (W), Proline (P), Glycine (G), Histidine (H), Cystéine (C).Ont été inclus des analogues d'amino acides synthétiques et n'existant pas dans la nature (et/ou des liaisons ou chaînons peptidiques). Telle qu'elle sert ici, l'expression "amino acides hydrophobes" désigne A, L, I, V, P, F, W et M. Telle qu'elle sert ici, l'expression "amino acides polaires" désigne G, S, T, Y, C, N et Q. Telle qu'elle sert ici, l'expression "amino acides chargés" désigne D, E, H, K et R. Telle qu'elle sert ici, l'expression "substitution conservatoire", quand elle décrit une protéine, se réfère à une modification de la composition des amino acides de la protéine qui n'altère pas nettement l'activité de la protéine. Ainsi, des "variations avec modification conservatoire" d'une séquence particulière d'amino acides désigne des substitutions d'amino acides remplaçant des amino acides qui ne sont pas critiques pour l'activité de la protéine ou une substitution d'amino acides par d'autres amino acides ayant des propriétés similaires (par exemple, des amino acides acides, basiques, chargés positivement ou négativement, polaires ou non polaires, etc.), de sorte que les substitutions, même quand elles portent sur des amino acides critiques, ne modifient pas essentiellement l'activité. Les tableaux et tables de substitution conservatoire, indiquant des amino acides fonctionnellement similaires, sont bien connus en pratique. Les six groupes suivants contiennent chacun des amino acides qui constituent des substitutions conservatoires de l'un par rapport à l'autre: 1) Alanine (A), Sérine (S), Thréonine (T); 2) acide aspartique (D), acide glutamique (E); 3) Asparagine (N), Glutamine (Q); 4) Arginine (R), Lysine (K); ) Isoleucine (I), Leucine (L), Méthionine (M), Valine (V); et 6) Phénylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophane
(W), (voir également Creighton (1984) Proteins, W.H.
Freeman and Company). L'homme du métier va comprendre que les substitutions identifiées ci-dessus ne constituent pas les seules substitutions conservatoires possibles. Par exemple, on peut considérer tous les amino acides chargés comme pouvant faire l'objet de substitutions conservatoires de remplacement de l'un
par l'autre, que la charge soit positive ou négative.
En outre, des substitutions individuelles, des délétions ou des additions qui altèrent ou modifient, ajoutent ou enlèvent un seul amino acide ou un petit pourcentage d'amino acides dans une séquence introduite par codage peuvent également constituer des "variations modifiées de façon conservatoire". On peut également effectuer une "substitution conservatoire" dans une protéine recombinante en utilisant un ou plusieurs codons qui diffèrent des codons utilisés par le gène natif ou de type sauvage. Dans ce cas, une substitution conservatoire comprend également le remplacement par un codon d'un amino acide ayant un codon différent pour le
même amino acide.
Telles qu'elles servent ici, les expressions "éléments de commande ou de contrôle", ou "séquences régulatrices" comprennent des amplificateurs, des promoteurs, des terminateurs de transcription, des origines de réplication, des séquences d'intégration chromosomique, des régions 5' et 3' non translatées, avec lesquelles des protéines ou d'autres biomolécules interagissent pour effectuer une transcription et une translation. Pour des cellules d'eucaryote, les séquences de commande vont inclure un promoteur et de préférence un amplificateur, par exemple, provenant de gènes d'immunoglobulines, SV40, de cytomégalovirus, et d'une séquence de polyadénylation, et cela peut comprendre des séquences de donneurs et d'accepteurs d'épissures. Selon le système de vecteur et d'autres que l'on utilise, on peut utiliser un nombre quelconque d'éléments convenables de transcription et de
translation, ce qui comprend des promoteurs.
constitutifs et inductibles.
Telle que l'expression sert ici, un polynucléotide, un oligonucléotide ou un acide nucléique "soumis à dérivation" (ou un dérivé de polynucléotides, d'oligonucléotides ou d'acides nucléiques) désigne des oligonucléotides et des polynucléotides qui comprennent un substituant qui a été soumis à dérivation. Dans certaines formes de réalisation, le substituant n'interfère essentiellement pas avec une hybridation donnant des polynucléotides complémentaires. Des oligonucléotides ou des polynycléotides qui ont été soumis à dérivation et qui ont été modifiés par fixation de substituant(s) chimique(s) (par exemple, par modification d'un oligonucléotide ou polynucléotide déjà synthétisé, ou par incorporation d'un analogue modifié de base ou de charpente pendant la synthèse) peuvent être introduits dans une cellule métaboliquement active d'eucaryote pour réaliser l'hybridation avec un ADN de type hTRT, avec un ARN ou une protéine en produisant une modification d'altération ou une modification chimique d'un ADN, d'un ARN ou d'une protéine local(e). En variante, les oligonucléotides ou les polynucléotides ayant subi une dérivation peuvent interagir avec des polypeptides de type hTRT et les modifier, avec des protéines associées à de la télomérase, ou avec d'autres facteurs qui interagissent avec de l'ADN de type hTRT ou avec des produits de gène de hTRT, ou qui modifient ou modulent l'expression ou la fonction de l'ADN de type hTRT, de l'ARN ou de la protéine. Des exemples de substituants chimiques fixés comprennent: de la téxaphyrine d'europium (III), des agents de réticulation, du psoralène, des chélates de métaux (par exemple, une chélate fer/EDTA pour un clivage catalysé par du fer), des topoisomérases, des endonucléases, des exonucléases, des ligases, des phosphodiestérases, des porphyrines photodynamiques, des médicaments chimiothérapeutiques (par exemple, l'adriamycine, la doxirubicine), des agents d'intercalation, des agents de modification de base, des chaînes d'immunoglobulines, et des oligonucléotides. Des chélates fer/EDTA [acide éthylène diamine tétraacétique], constituent des substituants chimiques souvent utilisés lorsqu'on désire obtenir un clivage local d'une séquence de polynucléotides (Hertzberg et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104:313; Hertzberg et Dervan, 1984, Biochemistry 23:3934; Taylor et al., 1984, Tetrahedron 40:457; Dervan, 1986, Science 232:464. Des exemples de chimies de fixation comprennent: une liaison directe, par exemple, par l'intermédiaire d'un groupe amino réactif fixé à l'appendice (Corey et Schultz (1988) Science 238:1401, qui est incorporé ici par référence) et d'autres chimies de liaisons directes, quoiqu'on puisse également utiliser des procédés de liaison
streptavidine/biotine et digoxigénine/anticorps anti-
digoxigénine. Des procédés pour lier ou fixer des substituants chimiques sont présentés dans les brevets US-A-5 135 720, US-A-5 093 245 et US-A-5 055 556, qui sont incorporés ici par référence. D'autres chimies de liaison peuvent servir à la discrétion ou au bon
vouloir du praticien.
* Telle qu'elle sert ici, l'expression "marque décelable" a son sens ordinaire en pratique et désigne un atome (par exemple, un radionucléide), une molécule (par exemple, de la fluorescéine) ou un complexe, qui sert ou qui peut servir à déceler (par exemple, en raison d'une propriété physique ou chimique), à indiquer la présence d'une molécule ou à permettre la liaison d'une autre molécule sur laquelle il est lié par covalence ou il est associé d'une autre manière. Le terme "marque" désigne également les molécules liées par covalence ou associées d'une autre manière (par exemple, une biomolécule comme une enzyme), qui agit sur un substrat pour produire un atome, une molécule ou un complexe décelables. Des marques décelables convenant pour servir dans la présente invention comprennent n'importe quelle composition décelable par des moyens de spectroscopie, de photochimie, de biochimie, d'immunochimie, électriques, optiques ou chimiques. Des marques utiles dans la présente invention comprennent de la biotine pour une coloration avec un conjugué de streptavidine marqué, des perles magnétiques (par exemple, "Dynabeads "), des colorants fluorescents (par exemple, la fluorescéine, le rouge de Texas, la rhodamine, une protéine fluorescente verte, une protéine fluorescente verte amplifiée, de la lissamine, de la phycoérytrine, Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Cy7, "FluorX" [Amersham], du vert SyBR I & II [Sondes moléculaires], etc.), des radiomarques (par exemple, 3H, 125I, 35S, 14C, ou 32p), des enzymes (par exemple, des hydrolases, en particulier des phosphatases comme de la phosphatase alcaline, des estérases et des glycosidases, ou des oxydoréductases, en particulier des peroxydases comme de la peroxydase de Raifort, et d'autres couramment utilisés dans les essais ELISA), des substrats, des cofacteurs, des inhibiteurs, des groupes chimioluminescents, des agents chromogènes et des marques colorimétriques comme des perles d'or colloïdal ou de verre coloré ou de matière plastique (par exemple du polystyrène, du polypropylène, du latex, etc.). Des brevets enseignant l'utilisation de telles marques comprennent les brevets
US-A-3 817 837; US-A-3 850 752; US-A-3 939 350;
US-A-3 996 345, US-A-4 277 437; US-A-4 275 149; et US-A-4 366 241. Des moyens pour déceler de telles marques sont bien connus de l'homme du métier. Ainsi, par exemple, on peut déceler des radiomarques et des marques chimioluminescentes en utilisant du film photographique ou des compteurs de scintillation, des marqueurs fluorescents peuvent être décelés à l'aide d'un photodétecteur pour déceler la lumière émise (par exemple, comme dans le cas d'un classement de cellules avec activation par fluorescence). Des marques enzymatiques sont typiquement décelées par la fourniture d'un substrat pour l'enzyme et la détection du produit de réaction obtenu par l'action de l'enzyme sur le substrat, et des marques colorimétriques sont
décelées par simple visualisation de la marque colorée.
Ainsi, une marque est constituée par n'importe quelle composition décelable par un moyen spectroscopique, photochimique, biochimique, immunochimique, électrique, optique ou chimique. La marque peut coupler directement ou indirectement au composant voulu de la composition d'essai selon les procédés bien connus en pratique. Des marques non radioactives sont souvent fixées par les moyens indirects. De façon générale, une molécule formant ligand (par exemple, de la biotine) est reliée par covalence à la molécule. Le ligand se fixe ensuite sur une molécule d'anti-ligand (par exemple de la streptavidine) qui est décelable de façon inhérente ou liée par covalence à un système générateur de signal, comme une enzyme décelable, un composé fluorescent ou un composé chimioluminescent. On peut utiliser un certain nombre de ligands et d'anti-ligands. Quand un ligand possède un anti- ligand naturel, par exemple, la biotine, la thyroxine et le cortisol, ce ligand peut servir de concert avec les anti-ligands marqués et naturels. En variante, on peut utiliser n'importe quel composé hapténique ou antigénique en combinaison avec un anticorps. Les molécules peuvent également être conjuguées directement à des composés générateurs de signaux, par exemple, par conjugaison avec une enzyme ou un fluorophore. Des moyens pour déceler les marqueurs sont bien connus de l'homme du métier. Ainsi, par exemple, quand le marqueur est une marque radioactive, des moyens pour la détection comprennent un compteur de scintillation, un film photographique comme en autoradiographie, ou de l'imagerie phosphorescente de stockage. Là o la marque est une marque fluorescente, elle peut être décelée par excitation du fluorochrome avec la longueur d'onde appropriée de lumière et détection de la fluorescence résultante. La fluorescence peut être décelée visuellement, à l'aide d'un film photographique, grâce à l'utilisation de détecteurs électroniques comme des dispositifs à couplage de charge ou à l'aide de photomultiplicateurs et d'appareils similaires. De façon semblable, des marques enzymatiques peuvent être décelées par la fourniture de substrats appropriés pour l'enzyme et la détection du produit de réaction qui en résulte. De même, des marques colorimétriques simples peuvent être décelées par observation de la couleur associée à la marque. On comprendra que, lorsque l'on utilise des paires de fluorophores dans un essai de détection, on préfère souvent que ces paires aient des spectres distincts d'émission (des longueurs d'onde distinctes), de façon à pouvoir les distinguer facilement. L'expression "niveau ou taux élevé" se réfère à une quantité de produit(s) de gène de hTRT (ou d'une autre substance spécifiée ou d'une autre activité) dans une cellule, taux ou niveau qui est élevé ou supérieur au taux ou niveau existant dans un témoin standard de référence, par exemple pour du diagnostic, le taux dans des cellules normales négatives à la recherche de la télomérase chez les individus ou dans un autre individu ne souffrant pas de cet état, et pour le pronostic, le taux ou niveau dans des cellules de tumeur provenant de diverses qualités ou diverses classes, par exemple de tumeurs. Tel qu'il sert ici, le terme "épitope" a son sens ordinaire d'un site sur un antigène reconnu par un anticorps. Les épitopes sont typiquement des segments d'amino acides qui constituent une faible portion de la protéine totale. Les épitopes peuvent être
conformationnels (c'est-à-dire discontinus). C'est-à-
dire qu'ils peuvent être formés à partir d'amino acides introduits par codage par des parties non contiguës d'une séquence primaire et qui ont été juxtaposés par
le pliage de la protéine.
Les expressions "pronostic favorable" et "pronostic défavorable" sont connues en pratique. Dans le contexte des cancers, un "pronostic favorable" signifie qu'il y a une probabilité de régression de tumeur ou de plus long temps de survie pour des patients ayant un pronostic favorable par rapport à ceux ayant un pronostic défavorable, alors qu'un "pronostic défavorable" signifie que la tumeur risque d'être plus agressive, c'est-à-dire de croître plus rapidement et/ou de former plus rapidement des métastases, ce qui pour le patient a pour résultat une issue médiocre ou un cours plus rapide de progression
de la maladie.
Telle qu'elle sert ici, l'expression "protéine de
fusion" se réfère à une protéine composite, c'est-à-
dire une séquence unique d'amino acides contigus, constituée de deux (ou plus de deux) polypeptides hétérologues distincts, et qui ne sont normalement pas fusionnés ensemble en une seule séquence d'amino acides. Ainsi, une protéine de fusion peut inclure une seule séquence d'amino acides qui contient deux séquences d'amino acides entièrement différentes ou deux séquences de polypeptides similaires ou identiques, à la condition que ces séquences ne se trouvent normalement pas ensemble dans la même configuration dans une séquence unique d'amino acides que l'on trouve dans la nature. Des protéines de fusion peuvent de façon générale être préparées à l'aide de procédés utilisant des acides nucléiques recombinants, c'est- à-dire par suite de transcription et de translation d'un produit de fusion de gène recombinant, cette fusion comprenant un segment codant pour l'introduction d'un polypeptide de l'invention et un segment codant pour l'introduction d'une protéine hétérologue, ou par des méthodes de synthèse chimique bien connues en pratique. La ou les régions de non-hTRT de la protéine de fusion peuvent être fusionnées sur la terminaison amino du polypeptide hTRT ou sur la terminaison carboxyle, ou sur les deux, ou bien la région non-hTRT peut être insérée à l'intérieur de la séquence protéinique (par insertion de fragment(s) ou par remplacement d'amino acide(s), ou bien l'on peut
effectuer des combinaisons des opérations précitées.
Telle qu'elle sert ici, l'expression "produit de gène" désigne une molécule d'ARN transcrite à partir d'un gène, ou une protéine introduite par codage par le
gène ou translatée à partir de i'ARN.
Telle qu'elle sert ici, l'expression "hTR" (ARN de type télomérase humaine) désigne le composant ARN de télomérase humaine et tous les allèles naturels éventuels et tous les variants ou variants recombinants éventuels. hTR est décrite en détail dans le brevet US-A-5 583 016, qui est incorporé ici en sa totalité,
par référence et à toutes fins utiles.
Tel qu'il sert ici, le terme "immortel", quand il désigne une cellule, a le sens normal dans l'art des télomérases et désigne des cellules qui ont apparemment un potentiel illimité de réplication ou de reproduction. Le terme immortel peut également désigner des cellules ayant une capacité accrue de prolifération par rapport à leur contrepartie non modifiée. Des exemples de cellules humaines immortelles sont représentés par des cellules de tumeurs malignes, des cellules de la lignée germinale et certaines lignées de cellules humaines transformées cultivées "in vitro" (par exemple, des cellules qui sont devenues immortelles après transformation par des oncogènes viraux ou d'une autre façon). Par constraste, la plupart des cellules somatiques humaines normales sont mortelles, c'est-à-dire qu'elles ont un potentiel limité de réplication et qu'elles deviennent vieillissantes ou sénescentes après un nombre fini de
divisions cellulaires.
Tels qu'ils servent ici, les termes "immunogène" et "immunogénique" ont leur sens ordinaire en pratique, c'est-à-dire qu'un immunogène est une molécule, comme une protéine ou un autre antigène, qui peut susciter une réponse immune d'adaptation en cas d'injection à
une personne ou à un animal.
Tel qu'il sert ici, le terme "isolé", quand il se réfère à une molécule ou à une composition comme, par exemple, une RNP (par exemple, au moins une protéine et au moins un ARN), signifie que la molécule ou la composition est séparée d'au moins un autre composé, tel qu'une protéine, d'autres ARN ou d'autres contaminants avec lesquels elle est associée "in vivo" ou elle se trouve à son état naturel. Ainsi, une RNP est considérée comme isolée lorsque la RNP a été isolée de n'importe quel autre composant avec lequel elle est naturellement associée, par exemple de la membrane de cellule, comme dans un extrait de cellule. Une composition isolée peut, cependant, être aussi
essentiellement pure.
Tel qu'il sert ici, le terme "modulateur" désigne n'importe quel composé ou n'importe quelle composition, synthétique ou naturel(le), pouvant modifier d'une façon quelconque la "pleine activité" ou n'importe quelle "activité partielle" d'une transcriptase reverse de télomérase (TRT) ou pouvant modifier les deux. Un modulateur peut être un agoniste ou un antagoniste. Un modulateur peut être n'importe quel composé organique et minéral, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, par exemple de petites molécules, des peptides, des protéines, des sucres, des acides nucléiques, des acides gras, etc. Tel qu'il sert ici, le terme "motif" désigne une séquence d'amino acides contigus (ou une séquence d'amine acides qui codent pour l'introduction d'une séquence d'amino acides contigus) qui définit dans une protéine une particularité ou une structure qui est commune à toutes les protéines ou qui est conservée dans toutes les protéines d'une classe bien définie ou d'un type bien défini. Le motif ou la séquence de consensus peut inclure des restes conservés aussi bien que des restes non conservés. Les restes conservés dans la séquence de motif indiquent que le reste conservé ou la classe conservée (c'est-à-dire, une classe hydrophobe, polaire, non polaire ou une autre classe) de restes est typiquement présente à l'endroit indiqué dans chaque protéine (ou chaque gène ou ARNm) de la classe de protéine définie par le motif. Les motifs peuvent différer selon la classe de protéine. Ainsi, par exemple, les enzymes de transcriptase reverse forment une classe de protéine pouvant être définie par un ou plusieurs motifs, et cette classe inclut des enzymes de type télomérase. Cependant, les enzymes de type télomérase peuvent également être définies comme étant la classe d'enzyme comportant des motifs caractéristiques de cette classe. L'homme du métier reconnaîtra que l'identification d'un reste comme étant un reste conservé dans un motif ne signifie pas que chaque membre de la classe définie par le motif possède le reste indiqué (ou la classe de restes) à la position indiquée, et qu'un ou plusieurs membres de la classe peut ou peuvent avoir un reste différent à la position
conservée.
Tels qu'ils servent ici, les termes "acide nucléique" et "polynucléotide" servent de manière interchangeable. L'utilisation du terme "polynucléotide" n'est pas destinée à exclure des oligonucléotides (c'est-à-dire, des polynucléotides courts) et on peut également se référer ainsi à des acides nucléiques synthétiques et/ou n'apparaissant pas normalement dans la nature (c'est-à-dire comprenant des analogues d'acides nucléiques ou des restes à charpente
modifiée ou des liaisons modifiées).
Tels qu'ils servent ici, les termes "oligonucléotides ou "oligomères" désignent une séquence d'acides nucléiques comportant approximativement 7 nucléotides ou un plus grand nombre de nucléotides, et pouvant comprendre jusqu'à nucléotides environ, ce qui peut servir d'amorce, de sonde ou d'amplificateur. Les oligonucléotides ont souvent une longueur comprise entre environ 10 et environ 50 nucléotides, plus souvent entre environ 14 et environ 35 nucléotides, très souvent entre environ et environ 25 nucléotides, et les termes oligonucléotides ou oligomères peuvent également désigner des acides nucléiques synthétiques et/ou non naturels (c'est-à-dire, comprenant des analogues d'acide nucléique ou des restes ou des termes de
liaison ou chaînons à charpente modifiée).
Telle qu'elle sert ici, l'expression "à liaison fonctionnelle" désigne unerelation fonctionnelle entre deux ou plus de deux segments d'acide(s) nucléique(s) (par exemple, de l'ADN), par exemple, un promoteur ou amplificateur est fonctionnellement lié à une séquence codante s'il stimule la transcription de la séquence dans une cellule hôte appropriée ou dans un autre système d'expression. De façon générale, des séquences fonctionnellement liées sont contiguës, et, dans le cas d'une séquence émettant un signal, elles sont à la fois contiguës et en phase de lecture. Cependant, des amplificateurs ne sont pas nécessairement situés à proximité étroite des séquences codantes dont elles
amplifient la transcription.
Tel qu'il sert ici, le terme "polypeptide" sert de façon interchangeable ici avec le terme "protéine" et il désigne un polymère composé de restes d'amino acides reliés par des liaisons amides, ce qui comprend leurs analogues synthétiques, naturels et non naturels (amino acides et liaisons ou chaînons). Des peptides
constituent des exemples de polypeptides.
Telle qu'elle sert ici, l'expression "sonde" désigne une molécule qui fixe spécifiquement une autre I molécule. Un exemple d'une sonde est constitué par une II sonde (de recherche) d'acide(s) nucléique(s), qui fixe spécifiquement (c'est-à-dire qui se fixe par annelage ou par hybridation sur) un acide nucléique essentiellement complémentaire. Un autre exemple d'une sonde est une "sonde à anticorps", qui se lie à ou se fixe spécifiquement sur un antigène ou épitope correspondant. Tel qu'il sert ici, le terme "recombinant" désigne un polynucléotide synthétisé ou manipulé d'une autre façon "in vitro" (par exemple, du "polynucléotide recombinant"), des procédés d'utilisation de polynucléotides recombinants pour produire des produits de gène dans les cellules ou dans d'autres systèmes biologiques, ou un polypeptide ("protéine recombinante") introduit(e) par codage par un
polynucléotide recombinant.
Telle qu'elle sert ici, l'expression "système de sélection" dans le contexte de lignées cellulaires transformées de manière stable, désigne un procédé pour identifier et/ou sélectionner des cellules contenant un acide nucléique recombinant intéressant. On connaît des systèmes de sélection très divers pour identifier des cellules transformées et ils conviennent pour servir avec la présente invention. Par exemple, les cellules transformées par des plasmides ou par d'autres vecteurs peuvent être choisies en fonction de la résistance à des antibiotiques conférée par des gènes contenus dans les plasmides, comme les gènes bien connus amp, gpt, neo et hyg, ou d'autres gènes comme la thymidine kinase de virus de l'herpès simplex (Wigler et al., Cell 11:223-232 [1977]) et de l'adéline phosphoribosyltransférase (Lowy et ai., Cell 22:817 [1980]), gènes qui peuvent servir respectivement dans des cellules tk ou aprt. De même, de la résistance à des antimétabolites, à des antibiotiques ou à des herbicides peut servir de base pour une sélection; par exemple, "dhfr", qui confère de la résistance au méthotrexate et est également utile pour une amplification de gène (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:3567 [1980]); npt, qui confère de la résistance aux aminoglycosides néomycine et G-418 (Colbere- Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 [1981] et als ou pat, qui confère de la résistance à du chlorosulfuron et à de la phosphinotricine acétyltransférase, respectivement (Murry, dans McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY, pp 191-196 [1992]). D'autres gènes pouvant être choisis ont été décrits, par exemple, des gènes conférant de la résistance à l'hygromycine, trpB, qui permettent à des cellules d'utiliser de l'indole à la place de tryptophane, ou hisD, qui permettent à des cellules d'utiliser de l'histinol à la place de l'histidine (Hartman et Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8047 [1988]). Récemment, l'utilisation de marqueurs visibles a gagné de la popularité dans le cas
de marqueurs comme des anthocyanines, de la beta-
glucuronidase et son substrat, GUS, et de la luciférase et son substrat, la luciférine, servant largement non seulement pour identifier des transformants, mais aussi pour quantifier l'expression de protéine(s) transitoire(s) ou stable(s) attribuable(s) à un système spécifique de vecteur (Rhodes et al., Meth. Mol. Biol.,
:121 [1995]).
Telle qu'elle sert ici, la "séquence" d'un gène (sauf indication spécifique contraire), d'acides nucléiques, de protéines ou de peptides se réfère à l'ordre de succession de nucléotides dans l'un des brins ou dans les deux brins d'une molécule d'ADN à double brin, par exemple, la séquence du brin codant et de son complément, ou d'une molécule d'acide nucléique à brin simple, ou l'ordre de succession d'amino acides
dans un peptide ou dans une protéine.
Telle qu'elle sert ici, l'expression "liaison spécifique" désigne l'aptitude d'une molécule, typiquement un anticorps ou un polynucléotide, à venir au contact d'une autre molécule spécifique et de s'associer avec celle-ci, même en présence de nombreuses autres molécules diverses. Par exemple, un polynucléotide à brin simple peut spécifiquement se fixer sur un polynucléotide à brin simple qui a une séquence complémentaire, et un anticorps qui fixe spécifiquement ("ou est spécifiquement immunoréactif
avec") son antigène correspondant.
Tels qu'ils servent ici, les termes "conditions rigoureuses d'hybridation" ou "caractère rigoureux" se réfèrent à des conditions comprises dans un intervalle allant d'environ 5 C à environ 20 C ou 25 C au-dessous de la température de fusion (Tf) de la séquence cible et une sonde ayant une complémentarité exacte ou quasi exacte avec la cible. Telle qu'elle sert ici, l'expression de température de fusion désigne la température à laquelle une population de molécules
d'acides nucléiques à double brin devient à demi-
dissociée en des simples brins. Des procédés pour calculer la T, d'acides nucléiques sont bien connus en pratique (voir, par exemple, Berger et Kimmel (1987)
"METHODS IN ENZYMOLOGY", VOL. 152: GUIDE TO MOLECULAR
CLONING TECHNIQUES, San Diego: Academic Press, Inc.; et Sambrook et al. (1989) "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", seconde édition, volumes 1 à 3, Cold Spring Harbor Laboratory, que l'on désigne ci- après par l'expression "Sambrook"), tous deux incorporés ici par référence). Comme indiqué par des références classiques, une estimation simple de la valeur de T, peut être calculée à l'aide de l'équation Te = 81,5 + 0,41(%G+C), quand un acide nucléique est en solution aqueuse contenant 1 M de NaCk (voir, par exemple, Anderson et Young, "Quantitative Filter Hybridization" dans NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985)). D'autres références comprennent des calculs plus sophistiqués qui prennent en compte des caractéristiques de structure aussi bien que des caractéristiques de séquence pour le calcul de TE. La température de fusion d'un hybride (et ainsi des conditions pour une hybridation rigoureuse) est ou sont affectées par divers facteurs comme la longueur et la nature (ADN, ARN, composition des bases) de la sonde et la nature de la cible (ADN, ARN, composition des bases, présente en solution ou en immobilisation, etc.) et la concentration de sels et d'autres composants (par exemple, la présence ou l'absence de formamide, de sulfate de dextrane, de polyéthylène glycol). Les effets de ces facteurs sont bien connus et ils sont étudiés dans des références classiques en pratique, voir par exemple, Sambrook (ci- dessus) et Ausubel et al., ci-dessus. Typiquement, des conditions rigoureuses d'hybridation sont constituées par des concentrations de sel inférieures à environ 1,0 M d'ion sodium ou, typiquement environ 0,01 à 1,0 M d'ion sodium à pH 7,0 à 8,3, et des températures allant d'au moins 30 C environ pour des sondes courtes (par exemple, 10 à nucléotides) et au moins 60 C environ pour des sondes longues (ayant par exemple, plus de 50 nucléotides). Comme noté, les conditions rigoureuses peuvent également être obtenues avec l'addition d'agents de déstabilisation comme du formamide, dans ce
cas, on peut utiliser des températures plus faibles.
Telles qu'elles servent ici, les expressions "identité substantielle", "identité substantielle de séquence" ou "similarité substantielle", dans le contexte d'acides nucléiques, désignent une mesure de similarité de séquences entre deux polynucléotides. Une identité substantielle de séquences peut être déterminée par hybridation dans des conditions rigoureuses, par comparaison directe ou par d'autres moyens. Par exemple, deux polynucléotides peuvent être identifiés comme ayant une identité substantielle de séquences s'ils sont capables de réaliser une hybridation spécifique de liaison l'un avec l'autre dans des conditions rigoureuses d'hybridation. D'autres degrés d'identité de séquences (par exemple, l'identité inférieure à "substantielle") peuvent se caractériser par hybridation dans des conditions différentes de caractère rigoureux. En variante, une identité substantielle de séquences peut être décrite comme correspondant à un pourcentage d'identité entre deux séquences de nucléotides (ou de polypeptides). Deux séquences sont considérées comme essentiellement identiques lorsqu'elles sont identiques à au moins 60% environ, de préférence au moins 70% environ d'identité ou au moins 80% environ d'identité, ou au moins 90% environ d'identité, ou au moins 95% ou 98% à 100% d'identité. Un pourcentage d'identité de séquence (nucléotides ou amino acides) se calcule typiquement par détermination de l'alignement optimal entre deux séquences et par la comparaison des deux séquences. Par exemple, une transcription exogène servant d'expression de protéine peut se décrire comme ayant un certain pourcentage d'identité ou de similarité en comparaison d'une séquence de référence (par exemple, la séquence endogène correspondante). Un alignement optimal de séquences peut être conduit à l'aide de l'algorithme
d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) Adv.
Appl. Math. 2:482, par l'algorithme d'alignement par
homologie de Needleman et Wunsch (1970) J. Mol. Biol.
48:443, par la recherche d'un procédé de similarité de Pearson et Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. :2444, par des utilisations calculées de ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, Etats-Unis d'Amérique) ou par inspection. On choisit le meilleur alignement (c'est-à-dire celui aboutissant au pourcentage le plus élevé d'identité) engendré par les divers procédés. Typiquement, ces algorithmes comparent les deux séquences sur une "fenêtre de comparaison" (ayant habituellement une longueur d'au moins 18 nucléotides) pour identifier et comparer des régions locales de similarité de séquence, ce qui permet de petites additions ou de petites délétions (c'est-à-dire des intervalles). Les additions et délétions représentent typiquement 20 pour-cent ou un plus faible pourcentage de la longueur de la séquence par rapport à la séquence de référence, ne comprenant pas les additions ou délétions. Il est parfois souhaitable de décrire une identité de séquences entre deux séquences en se référant à une longueur particulière ou à une région particulière (par exemple, deux séquences peuvent être décrites comme ayant au moins 95% d'identité sur une longueur d'au moins 500 paires de bases). Habituellement, la longueur sera d'au moins environ 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 paires de bases, d'amino acides ou d'autres restes. Le pourcentage d'identité de séquences est calculé par comparaison de deux séquences alignées de façon optimale dans la région de comparaison, détermination du nombre de positions auxquelles la base des acides nucléiques identiques (par exemple, A, T, C, G ou U) se produit dans les deux séquences pour donner le nombre de positions appariées et la détermination du nombre (ou du pourcentage) de positions appariées en comparaison du nombre total de bases présentes dans la séquence ou la région de référence de comparaison. Un algorithme supplémentaire, qui convient pour déterminer la similarité de séquences, est l'algorithme BLAST, qui
est décrit àans Altschul (1990) J. Mol. Biol.
215:403-410; et Shpaer (1996) Genomics 38:179-191.
Du logiciel pour effectuer des analyses BLAST est publiquement disponible au "National Center for Biotechnology Information" [Centre National d'Information en Biotechnologies] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Cet algorithme implique tout d'abord l'identification de paires de séquences à score élevé (HSP) par identification de mots courts ayant une longueur W dans la recherche de séquences qui correspondent à ou satisfont à un certain seuil de score T à valeur positive en cas d'alignement avec un mot de même longueur dans une séquence de bases de données. T est désigné comme étant le seuil du score de mots voisins (Altschul et ai, ci-dessus). Cette caractéristique de voisinage initial des mots joue un rôle de germes pour amorcer des recherches en vue de trouver des HSP plus longs les contenant. Les caractéristiques ou "bits" de mots sont étendus dans les deux directions le long de chaque séquence aussi loin que le score d'alignement cumulatif peut être augmenté. L'extension des groupes de mots dans chaque sens est arrêtéequand: le score d'alignement cumulatif s'écarte de la quantité X de la valeur maximale obtenue; le score cumulatif tend vers zéro ou au-dessous, en raison de l'accumulation d'un ou plusieurs alignements de restes à score négatif, ou bien l'extrémité de l'une ou l'autre séquence est atteinte. Les paramètres de l'algorithme BLAST, W, T et X, déterminent la sensibilité et la vitesse de l'alignement. Le programme BLAST utilise comme défaut une longueur de mots (W) de 11, la matrice de score BLOSUM62 (voir Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) des alignements (B) de 50, des attentes (E) de 10, M=5, N=4, et une comparaison des deux brins. Le terme "BLAST" désigne l'algorithme BLAST qui effectue une analyse statistique de la similarité entre deux séquences; voir, par exemple, Karlin (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Une mesure de similarité produite par l'algorithme BLAST est la probabilité de la plus faible somme (P(N)), fournissant une indication de la probabilité d'apparition de la correspondance d'appariement entre deux séquences de nucléotides ou d'amino-acides. Par exemple, un acide nucléique peut être considéré comme similaire d'un acide nucléique TRT si la probabilité de la plus faible somme dans une comparaison entre l'acide nucléique d'essai et un acide nucléique TRT est inférieure à environ 0,5, à 0,2, à 0,1, à 0,01 ou 0,001. En variante, une autre indication que deux séquences d'acides nucléiques sont semblables est que le polypeptide introduit par codage par le premier acide nucléique est capable d'une réaction croisée immunologique avec le polypeptide introduit par codage
par le second acide nucléique.
Tels qu'ils servent ici, les termes "identité substantielle", "identité substantielle de séquence" ou "similarité substantielle" se réfèrent, dans le contexte d'un polypeptide, à un degré de similarité entre deux polypeptides, dans lesquels un polypeptide comprend une séquence présentant au moins 70% d'identité de la séquence avec une séquence de référence ou 80% ou 85% ou jusqu'à 100% d'identité de séquence par rapport à la séquence de référence ou, encore mieux, 90% d'identité sur une fenêtre de
comparaison d'environ 10 à 20 restes d'amino acides.
Une similarité entre des séquences d'amino acides, ou une identité de ces séquences, est déterminée par optimisation de correspondances de restes, si nécessaire, par introduction d'intervalles selon les
nécessités. Voir Needleham et al. (1970), J. Mol. Biol.
48:443-453; et Sankoff et al., 1983, Time Warps, String Edits, and Macromolecules, The Theory and Practice of Sequence Comparison, Chapitre un, Addison-Wesley, Reading, MA, Etats-Unis d'Amérique; et des lots ou ensembles de logiciels provenant de IntelliGenetics, Mountain View, CA, Etats-Unis d'Amérique et the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI, Etats- Unis d'Amérique. Ainsi qu'il apparaîtra à l'homme du métier, les termes "identité substantielle", "similarité substantielle" et "identité substantielle des séquences" peuvent servir de manière interchangeable en ce qui concerne des polypeptides ou
des polynucléotides.
Telle qu'elle sert ici, l'expression "essentiellement pure" ou "essentiellement purifiée", quand on se réfère à une composition comprenant un réactif spécifié, tel qu'un anticorps (par exemple, un anticorps anti-hTRT), signifie que le réactif spécifié représente au moins environ 75%, ou au moins environ %, ou au moins 95%, ou au moins environ 99% ou même davantage de la composition (sans tenir compte, par exemple, du solvant ou du tampon). Ainsi, par exemple, une préparation d'immunoglobuline préférée de l'invention, qui fixe spécifiquement un polypeptide
hTRT, est essentiellement purifiée.
Telle qu'elle sert ici, l'expression: une cellule "donnant un résultat négatif à la recherche de télomérase", est une cellule dans laquelle la télomérase n'est pas exprimée, c'est-à-dire qu'on ne peut pas déceler d'activité catalytique de télomérase quand on utilise un essai de recherche traditionnel ou un essai TRAP pour déceler l'activité catalytique de télomérase. Telle qu'elle sert ici, l'expression; cellule "à résultat positif dans la recherche de la télomérase", est une cellule dans laquelle la télomérase est exprimée (c'est-à-dire qu'on peut y
déceler une activité de télomérase).
Telle qu'elle sert ici, l'expression: maladie ou état "apparenté(e) à de la télomérase", est une maladie ou un état chez un sujet qui est en corrélation avec un taux ou niveau anormalement élevé d'activité de télomérase dans les cellules de l'individu, ce qui peut inclure n'importe quelle activité de télomérase pour la plupart des cellules somatiques normales, ou ce qui est en corrélation avec un faible niveau d'activité de télomérase aboutissant à altérer une fonction cellulaire normale. Des exemples d'états apparentés de la télomérase comprennent, par exemple, du cancer (activité élevée de télomérase dans des cellules malignes) et de la stérilité (faible activité de
télomérase dans des cellules de lignées germinales).
Tels qu'ils servent ici, les termes "composé d'essai" ou "agent" désignent n'importe quel(le)
composé ou composition synthétique ou naturel(le).
L'expression inclut tous les composés organiques et minéraux, y compris, par exemple, de petites molécules, des peptides, des protéines, des sucres, des acides nucléiques, des acides gras, etc.
XIII. EXEMPLES
Les exemples suivants sont présentés en vue d'illustrer la présente invention, et nullement à titre limitatif. Dans les sections qui suivent, les abréviations suivantes s'appliquent: eq (équivalents); M (Molaire); uM (micromolaire); N (Normal); mol (moles); mmol (mmilimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (grammes); mg (milligrammes); pg (microgrammes); ng (nanogrammes); 1 ou L (litres); ml (millilitres); u1 (microlitres); cm (centimètres); mm (millimètres); pm (micromètres); nm (nanomètres); OC (degrés Centigrades); RPN (ribonucléoprotéine); mreN(2'-O)méthylribonucléotides); dNTP (désoxyribonucléotide); dH20 (eau distillée); DDT (dithiothréitol); PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle); TE (Tris HCk 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2 environ); KGlu (glutamate de potassium); SSC: tampon de sel et de citrate de sodium; SDS: dodécyl sulfate de sodium; PAGE: électrophorèse sur gel de polyacrylamide; NOVEX (Novex, San Diego, CA); BioRad: Bio-Rad Laboratories Hercules, CA);
Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Etats-
Unis d'Amérique); Boehringer-Mannheim (Boehringer-
Manneheim Corp., Concord, CA, Etats-Unis d'Amérique), Amersham (Amersham, Inc., Chicago, IL, Etats-Unis d'Amérique); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, Etats-Unis d'Amérique); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA, Etats-Unis d'Amérique); Pierce (Pierce Chemical Co., Rockfort, IL, Etats-Unis d'Amérique); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA, Etats-Unis d'Amérique); Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA, Etats-Unis d'Amérique);
Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, WI, Etats-
Unis d'Amérique); et Molecular Dynamics (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA, Etats-Unis d'Amérique).
EXEMPLE 1
IjrOULErLi'.1191, DE PRO T1E LN DU TY1 E 1 Lr iD1ti.DER EL DE LLON4ElS L'exemple suivant détaille les isolements de protéines et de clones de type télomérase à partir de divers organismes, ce qui comprend les euplotes p. 123, hTRT, TRT et les clones de type ADNc de télomérase TRT
de S. pombe.
A. Arrière-plan i) Introduction La présente section propose une vue d'ensemble de la purification et du clonage de gènes de TRT, ce qui est décrit plus en détail dans les sections
subséquentes du présent exemple. Alors que des sous-
unités d'ARN de télomérase ont été identifiées dans des ciliés, de la levure et des mammifères, des sous-unités de protéine de l'enzyme n'ont pas été identifiées en tant que telles avant la présente invention. La purification de télomérase du protozoaire cilié Euplotes aediculatus a donné deux protéines, appelées p123 et p43 (voir ci-après; Lingner (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10712). Euplotes aediculatus est un cilié hypotriche ayant un macronoyau contenant environ 8 x 105 télomères et environ 3 x 105 molécules de télomérase. Après purification, le complexe de télomérase active a une masse moléculaire d'environ 250 kD, ce qui correspond à une sous-unité d'ARN de 66 kD et à deux protéines d'environ 123 kD et 43 kD (Lingner (1996), ci-dessus). Des expériences de liaison photocroisée ont indiqué que la protéine p123, plus grosse, était impliquée dans de la liaison spécifique
du substrat ADN télomère (Lingner (1996), ci-dessus).
Les protéines p123 et p43 ont été séquencées, et les clones d'ADNc qui ont introduit par codage ces protéines ont été isolés. Ces séquences de Euplotes sesont avérées sans relation avec les protéines p80 et p95 associées à la télomérase de Tetrahymena. L'analyse des séquences de p123 d'Euplotes a révélé des motifs de transcriptase reverses (RT). En outre, une analyse des séquences de pl23 d'Euplotes, par comparaison avec d'autres séquences, a révélé un homologue de levure,
appelé protéine Est2 (Lingner (1997) Science 276:561).
Il a précédemment été montré que Est2 de levure est essentielle pour l'entretien de télomères in vivo (Lendvay (1996) Genetics 144:1399), mais cela n'avait pas été identifié comme étant une protéine catalytique à rôle de télomérase. Une mutagénèse spécifique de site a montré que les motifs RT de Est2 de levure sont essentiels pour la synthèse, in vivo et in vitro d'ADN
télomère (Lingner (1997) ci-dessus).
ii) Identification et caractérisation de télomérase de S. pombe Une amplification en chaîne par polymérase de l'ADN de S. pombe a été effectuée avec des amorces de séquences dégénérées obtenues à partir de motifs pl23 RT de Euplotes comme décrit ci-après. Parmi les quatre produits principaux engendrés par cette amplification en chaîne par polymérase, une bande comportant 120 paires de bases a introduit par codage une séquence peptidique homologue de p123 et de Est2. Ce produit d'amplification en chaîne par polymérase a servi de sonde dans une hybridation de colonies et a identifié deux clones qui se superposent et proviennent d'une bibliothèque de génome de S. pombe et trois clones provenant d'une bibliothèque d'ADNc de S. pombe. Une analyse de séquence a révélé qu'aucun des trois clones d'ADNc de S. pombe n'avait une pleine longueur, de sorte que l'on a utilisé une amplification en chaîne par polymérase de RT pour obtenir les séquences codant
pour la terminaison azotée de la protéine.
Un séquençage complet de ces clones a révélé un gène de RT de télomérase probable de S. pombe, trtl. La séquence complète des nucléotides de tEtl a été déposée
chez GenBank, n d'accès AF015783 (voir figure 15).
Pour tester trtl de S. pombe (comme sous-unité catalytique), on a créé deux constructions comportant des délétions. Une analyse de la séquence a montré que trtl a codé pour une protéine basique ayant une masse moléculaire prédite de 116 kD. Il a été trouvé qu'une homologie avec p123 et Est2 était spécialement élevée dans les sept motifs de transcriptase reverse, soulignés et désignés comme étant les motifs 1, 2, A, B, C, D et E (voir figure 63). Un motif spécifique de télomérase additionnelle, désigné comme étant le motif T, a également été trouvé. Quinze introns, dont la taille était comprise entre 36 et 71 paires de bases,
ont interrompu la séquence codante.
Pour tester trtl de S. pombe à titre de sous-unité catalytique, deux constructions avec délétion ont été créées. L'une a enlevé seulement les motifs B à D dans les domaines RT. La seconde a enlevé 99% du
cadre de lecture ouverte.
Des cellules haploïdes obtenues à partir de spores de deux mutants de S. pombe ont montré un raccourcissement progressif de télomères jusqu'au point o une hybridation sur des répétitions de télomères était devenue quasi indécelable. Un diploïde trtli/trtl a été sporulé et les tétrades résultantes ont été disséquées et soumises à germination sur un milieu d'extrait de levure additionné d'amino acides (une plaque YES, Alfa (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). On a fait croître à 32 C durant trois jours des colonies provenant de chaque spore et on les a étalées en rangées successives sur des plaques YES fraîches tous les trois jours. Une colonie provenant de chaque épisode a été placée dans six mk de culture liquide YES à 32 C et a été cultivée jusqu'à phase stationnaire. De l'ADN de génome a été préparé. Après digestion avec Apal, on a soumis l'ADN à électrophorèse sur un gel à 2,3% de gélose ou agarose, on a coloré avec du bromure d'éthidium pour confirmer une charge approximativement égale dans chaque piste puis on a transféré vers une membrane en "Nylon" et l'on a formé
un hybride par fixation sur une sonde d'ADN télomère.
De la sénescence ou du vieillissement a été indiqué par le retard de l'apparition de la croissance ou par l'absence de croissance sur de la gélose (typiquement au quatrième étalement après germination) et par la présence de colonies ayant des bords de plus en plus échancrés (la morphologie des colonies est présentée sur la figure 22C) et par des fractions de plus en plus élevées de cellules allongées (comme montré sur la figure 22D). Des cellules ont été placées sur des plaques de "Minimal Medium" (Alfa (1993) ci-dessus) avec remplacement du chlorure d'ammonium par de l'acide glutamique durant deux jours à 32 C avant photographie. Quand des cellules individuelles agrandies ont été séparées sur le microscope de dissection, on a trouvé que la majeure partie des cellules n'avait pas subi de division supplémentaire. La même population de cellules donnant un résultat négatif à la recherche de télomérase (trtl-) a toujours contenu des cellules de taille normale qui ont continué à se diviser mais qui ont fréquemment produit de la progéniture ne se divisantpas. Les survivants donnant un résultat négatif à la recherche de télomérase peuvent servir de mode recombinant d'entretien de télomère, comme cela apparaît dans des souches de levure en bourgeonnement comportant l'absence par délétion de divers gènes de réplication de télomère (Lendvay (1996) ci-dessus,
Lundblad (1993) Cell 73:347).
iii) Identification et Caractérisation de la Télomérase Humaine Une EST (marqueur de séquence exprimée) provenant d'ADNc (hTRT) à rôle de transcriptase reverse de télomérase humaine a été identifiée par une recherche BLAST appliquée à la base de données ou Genbank dbEST (marqueur de séquence exprimée) grâce à l'utilisation du peptide de 123 kDa de Euplotes et de séquences d'acides nucléiques, ainsi que la protéine de Schizosaccharomyces et des séquences correspondantes d'ADNc (tezl). La EST, appelée "Genbank AA28196", a une longueur de 389 nucléotides et elle correspond aux positions 1679 à 2076 du clone 712562 (figure 18), elle a été obtenue chez I.M.A.G. E. Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, Etats-Unis d'Amérique). On a obtenu ce clone à partir d'une bibliothèque d'ADNc de cellules germinales B obtenues par classement dynamique de cellules en forme d'amande. Un séquençage complet de ce clone d'ADNc de type hTRT a montré la présence de
l'ensemble des huit motifs RT (TRT) de télomérase.
Cependant, ce clone de hTRT n'a pas introduit par codage une partie contiguë d'une TRT, parce que les motifs B', C, D et E étaient contenus dans un cadre de lecture ouverte différent des motifs RT à terminaison azotée plus nombreux. En outre, la distance entre les motifs A et B de RT est nettement plus courte que la distance des trois TRT antérieurement connues (non humaines). Pour isoler une pleine longueur de clone d'ADNc, on a passé en revue par dépistage une bibliothèque d'ADNc provenant de la lignée de cellules humaines 293 (lignée décrite ci-dessus), qui exprime des taux élevés de l'activité de télomérase. Une bibliothèque d'ADNc lambda provenant de la lignée des cellules 293 a été subdivisée en 25 groupes contenant environ 200 000 plaques chacun. Chaque groupe a été soumis à un passage en revue par dépistage par PCR (amplification en chaîne par polymérase), avec la paire d'amorceurs '-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' et 5'- GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'. Six sous-groupes d'un groupe primaire positif ont été en outre passés en revue par amplification en chaîne par polymérase en utilisant la même paire d'amorceurs. Pour les deux sous- groupes, durant le passage en revue du sous-groupe primaire et du sous- groupe secondaire, hTRT a été amplifiée pendant une période totale de 31 cycles à: 94 C, 45 secondes; 60 C, 45 secondes; et 72 C, secondes. Comme témoin, ARN de l'enzyme domestique GAPDH a été amplifiée à l'aide de la paire d'amorceurs '-CTCAGACACCATGGGGGAAGGTGA-3' et 5'- ATGATCTTGAGGCTGTTGT CATA-3', pendant une période totale de 16 cycles à 94 C,
45 secondes; 55 C, 45 secondes; et 72 C, 90 secondes.
Un sous-groupe positif hTRT, provenant du passage en revue secondaire, a été passé en revue par dépistage avec hybridation sur plaque à l'aide d'une sonde provenant de la région 5' du clone n 712562. Un phage a été identifié positivement (appelé phage 25-1,1 lambda, ATCC 209024, déposé le 12 mai 1997). Il contient un insert d'environ quatre kilobases qui a été excisé et sous-cloné dans le site EcoRI du vecteur
pBluescript II SK+ (Stratagene, San Diego, CA, Etats-
Unis d'Amérique) sous forme d'un fragment de EcoRI. Ce
plasmide contenant du clone ADNc a été appelé pGRN121.
L'insert d'ADNc comporte au total environ 4 kilopaires de bases. La séquence complète de nucléotides de l'ADNc de hTRT humaine (pGRN121) a été déposée à Genbank (numéro d'accès AF015950) et le plasmide a été déposé à
l'ATCC (ATCC 209016, dépôt du 6 mai 1997).
B. Croissance de Euplotes aediculatus Dans le présent exemple, on a obtenu du Dr David Prescott, MCDB, Université de Colorado, des cultures de E. aediculatus. Le Dr Prescott a isolé à l'origine cette culture dans de l'eau stagnante, bien que cet organisme soit également disponible à l'ATCC (ATCC n 30859). Des cultures ont été obtenues comme décrit par Swanton et al., (Swanton et al. Chromosoma 77:203 [1980]), dans des conditions non stériles, dans des récipients en verre de 15 litres de capacité contenant Chlorogonium comme source alimentaire. Des organismes ont été récoltés à partir des cultures quand la densité
a atteint environ 104 cellules/mX.
C. Préparation d'Extraits "Nucléaires" (de noyaux) Dans le présent exemple, les extraits nucléaires de E. aediculatus ont été préparés à l'aide du procédé de Lingner et ai. (Lingner et ai., Genes Develop., 8:1984 [1994]), avec des modifications mineures indiquées ci-après. En bref, des cellules cultivées comme décrit à la partie B ont été concentrées avec des
filtres "Nytex" de 15 pm et refroidies sur de la glace.
Le culot des cellules a été remis en suspension dans un volume final de 110 ma de tampon de phosphate TMS/PMSF/spermidine. La solution de réserve de tampon TMS/PMSF/phosphate de spermidine a été préparée par addition de 0,075 g de phosphate de spermidine (USB) et 0,75 mX de PMSF (provenant d'une solution de réserve de mM préparée dans de l'éthanol) à 150 mX de TMS. Le TMS comprenait 10 mM d'acétate de tris, 10 mM de MgC12, ,5752 g de saccharose par litre et 0,33297 g de
CaCX2/litre, pH 7,5.
Après avoir remis en suspension dans du tampon TMS/PMSF/phosphate de spermidine, on a ajouté 8,8 mX de NP-40 à 10% et 94,1 g de saccharose, 'et l'on a placé le mélange dans un bêcher en verre silicone, avec une tige d'agitation en acier inoxydable fixée à un moteur placé en tête. Le mélange a été soumis à agitation jusqu'à lyse complète des cellules (environ 20 minutes). Le mélange a été ensuite centrifugé durant 10 minutes à 7500 tours/minute (8950 x g) à 4 C, en utilisant un rotor oscillant Beckman JS-13. Le liquide surnageant a été enlevé et le culot des noyaux a été remis en suspension dans du tampon TMS/PMSF/phosphate de spermidine, et centrifugé à nouveau durant 5 minutes à 7500 tours/minute (8950 x q) à 4 C, en utilisant un
rotor oscillant Beckman JS-13.
Le liquide surnageant a été enlevé et le culot des noyaux a été remis en suspension dans du tampon constitué de 50 mM d'acétate de tris, 10 mM de MgCl2, du glycérol à 10%, 0,1% de NP-40, 0,4 M de KGlu, 0,5 mM de PMSF, pH 7,5, à un volume de tampon de 0,5 mX pour 10 g de cellules récoltées. Les noyaux remis en suspension ont été ensuite disséminés dans un homogénéisateur en verre avec environ 50 courses, puis soumis à centrifugation durant 25 minutes à 14 000 tours/minute à 4 C dans une centrifugeuse Eppendorf. Le liquide surnageant contenant l'extrait nucléaire a été collecté, congelé dans de l'azote liquide et conservé à
-800C jusqu'à utilisation.
D. Purification de Télomérase Dans le présent exemple, on a utilisé des extraits nucléaires, préparés comme décrit à la partie C, pour purifier de la télomérase de E. aediculatus. Dans ce protocole de purification, la télomérase a été tout d'abord enrichie par chromatographie sur une colonne de gel Affi-héparine, puis purifiée de façon poussée par purification par affinité avec un oligonucléotide antisens. La région de gabarit d'ARN de télomérase étant accessible à une hybridation dans la particule de ribonucléoprotéine de télomérase, on a effectué la synthèse d'un oligonucléotide antisens (c'est- à-dire l'"oligonucléotide d'affinité") qui était complémentaire à cette région de gabarit, à titre d'agent d'attraction par affinité de la télomérase. Un reste de biotine a été inclus à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide pour l'immobilisation sur une colonne d'avidine. Après la liaison de fixation de la télomérase à l'oligonucléotide et après lavage poussé, la télomérase a été éluée par utilisation d'un oligonucléotide de déplacement. L'oligonucléotide d'affinité a compris des bases de type ADN qui n'étaient pas complémentaires de l'ARN de télomérase en 5' de la séquence spécifique de télomérase. Comme l'oligonucléotide de déplacement était complémentaire de l'oligonucléotide d'affinité sur la totalité de sa longueur, il a été capable de former un duplex plus thermodynamiquement stable que la télomérase fixée à l'oligonucléotide d'affinité. Ainsi, l'addition de l'oligonucléotide de déplacement a abouti
à l'élution de la télomérase de la colonne.
Les extraits nucléaires préparés à partir de cultures de 45 litres ont été congelés jusqu'à collecte
d'une quantité totale de 34 mX d'extrait nucléaire.
Cela a correspondu à 630 litres de culture (c'est-à-
dire environ 4 x I09 cellules). L'extrait nucléaire a été dilué avec un tampon à 410 mÀ pour obtenir les concentrations finales de 20 mM de tris-acétate, 1 mM de MgCl2, 0,1 mM de EDTA, 33 mM de KGlu, 10% (en volume/volume) de glycérol, 1 mM de dithiothreitol (DTT) et 0,5 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle
(PMSF) à un pH de 7,5.
L'extrait nucléaire dilué a été appliqué à une colonne de gel d'héparineGel-Affi (Bio-Rad), ayant un volume de lit de 230 mA et un diamètre de 5 cm, mise en équilibre avec le même tampon et éluée avec un gradient de 2 litres de 33 à 450 mM de KGlu. La colonne a été utilisée à 4 C, à un débit de 1 volume de colonne par heure. On a collecté des fractions ayant 50 mX chacune que l'on a soumises à des essais de recherche d'activité de télomérase, comme décrit à la partie E. La télomérase a été éluée de la colonne à environ mM de KGlu. Des fractions contenant de la télomérase (environ 440 mi) ont été regroupées et ajustées à 20 mM de tris-acétate, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 300 mM de KGlu, 10% de glycérol, 1 mM de DTT et
1% de "Nonidet P-40". Ce tampon a été appelé "WB".
A cette préparation, on a ajouté 1,5 nmole de chacun des deux oligonucléotides de type ADN en compétition (5'TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3' (et 'TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3', 50 pg d'ARN de levure (Sigma), et 0,3 nmole d'oligonucléotide spécifique de télomérase avec marquage par de la
biotine (5'-biotine-TAGACCTGTTA-(mreG)2-(rmeU)4-(rmeG)h-
remG-3'), par mX de la masse. Les 2-O-
méthylribonucléotides des oligonucléotides spécifiques de télomérase étaient complémentaires de l'ARN de type télomérase; dans la région de gabarit; les
désoxyribonucléotides n'étaient pas complémentaires.
L'inclusion des oligonucléotides de type ADN compétiteurs, non spécifiques, a augmenté l'efficacité de la purification, car les effets de protéine de liaison d'acides nucléiques et d'autres composants, présents dans le mélange et qui risqueraient de se fixer à l'oligonucléotide d'affinité ou d' enlever la
télomérase du mélange, étaient réduits à leur minimum.
Cette matière a été ensuite ajoutée à de la matière de colonne, neutravidine plus, immobilisée "Ultralink" (Pierce), à raison d'un volume de 60 il de suspension par mX de la masse groupée. La matière de la colonne a été pré-bloquée ou coiffée deux fois durant 15 minutes à chaque blocage, avec une préparation de WB contenant 0,01% de Nonidet P- 40, 0,5 mg de sérum albumine de bovin, 0,5 mg/mX de lysozyme, 0,05 mg/mk de glycogène et 0,1 mg/mr d'ARN de levure. Le blocage a été conduit à 4 C, à l'aide d'une roue rotative pour bloquer ou immobiliser entièrement la matière de la colonne. Après le premier blocage, et avant la seconde étape de blocage, la matière de la colonne a été centrifugée à 200 xg durant 2 minutes pour mettre la
matrice sous forme d'un culot de centrifugation.
Le mélange de la colonne a été soumis à incubation durant 8 minutes à 30 C puis durant 2 heures supplémentaires à 4 C sur une roue rotative (environ lOtours/minute; Labindustries) pour permettre la fixation. Le mélange du contenu de la colonne a été ensuite centrifugé à 200 xg durant 2 minutes, et le liquide surnageant, contenant la matière non liée, a été enlevé. Le mélange du contenu de la colonne a été ensuite lavé. Le processus de lavage a inclus les étapes consistant à rincer le mélange du contenu de la colonne avec WB à 4 C, à laver le mélanqe durant minutes avec WB à 4 C, à rincer avec WB, à laver durant 5 minutes à 300C avec WB contenant 0,6 Mc de KGlu et pas de Nonidet P-40, à laver 5 minutes à 25 C avec WB et enfin à rincer à nouveau avec WB. Le volume demeurant après le lavage final a été maintenu petit, afin d'obtenir un rapport entre le tampon et la matière
de la colonne valant environ 1:1.
La télomérase a été éluée de la matière de la colonne par addition de 1 nmole de désoxyoligonucléotide de déplacement (5'CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3'); par m. de matière de la colonne et mis à incubation à 25 C durant minutes. La matière a été centrifugée durant
2 minutes à 14 000 tours/minute dans une microcen-
trifugeuse (Eppendorf) et l'éluat a été collecté. Le mode opératoire d'élution a été répété deux fois encore, en utilisant à chaque fois de l'oligonucléotide de déplacement frais. Comme mentionné ci-dessus, puisque l'oligonucléotide de déplacement était complémentaire de l'oligonucléotide d'affinité, il a formé avec l'oligonucléotide d'affinité un complexe thermodyna- miquement plus stable que P-40. Ainsi, l'addition de l'oligonucléotide de déplacement à une télomérase liée par affinité a abouti à une élution efficace de la télomérase dans des conditions natives. La télomérase a semblé être pure à environ 50% à ce stade, à en juger par une analyse sur un gel protéinique. La purification par affinité de la télomérase et l'élution avec un oligonucléotide de déplacement est présentée sur la figure 26 (panneaux A et B, respectivement). Dans cette figure, les 2'-O- méthyl-sucres de l'oligonucléotide d'affinité sont indiqués par la ligne ondulée. Les formes noires et hachurées ovales de cette figure sont destinées à représenter graphiquement les sous-unités
protéiniques de la présente invention.
Les concentrations de protéine de l'extrait et de la matière obtenue après chromatographie sur colonne Affi-Gel-héparine ont été déterminées à l'aide du procédé de Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72:248 [1976]), en utilisant de la sérum albumine de bovin comme témoin normal. Seule une fraction de la préparation de télomérase a été purifiée davantage
encore avec un gradient de glycérol.
Le coefficient de sédimentation de la télomérase a été déterminé par centrifugation avec gradient de glycérol, comme décrit dans la partie I. Le tableau 5 ci-après est un tableau de purification pour la télomérase purifiée selon le procédé du présent exemple. La télomérase a été enrichie 12 fois dans des extraits nucléaires, en comparaison d'extraits cellulaires complets, avec une récupération
de 80 %; 85 % de la télomérase ont été solubilisés à par-
tir de noyaux après extraction.
Tableau 5 - Purification de télomérase l _ lr,. r" _,..,, l. i. I riraction i rroeine i eTiomerase T elomerase/ recuperaiion Facteur de (mg) (pmole de I proteme/pmole (/o) Punticatlon ] {l I RNP)*** I deRNP/mg { In. * I I I I I Ext'ait vov | 1 I NuciéeaireI.|I_ I IH.l.. I 125 I 1040 I 8,3 I 6 10
I--.. ... I, I
Affinité I 0,3+** I 680 I 2270 40 2670 I Cradlient de i NA*i NA* I NA* 25 NA* I fl.,,.'o rr. I _ _ _ _ _ __ I _ _ _ _ _ _ _ _ I _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
IV.....D I! I
*NA = résultat non disponible.
**Cette valeur a été calculée à partir de la quantité mesurée de télomérase (680 pmoles) en supposant une pureté de 50% (basée sur un gel protéinique).
***RNP = ribonucléoprotéine.
E. Activité de télomérase A chaque étape de la purification de télomérase, la préparation a été analysée par trois essais séparés, dont l'un était la recherche d'activité, comme décrit dans le présent exemple. En général, les essais de recherche de télomérase ont été effectués dans 40 ul contenant 0,003-0,3 ul d'extrait molaire, 50 mM de tris-Cl (pH 7,5), 50 mM de KGlu, 10 mM de MgCli, 1 mM de DTT, 125 pM de dTTP, 125 _M de dGTP et environ 0,2 pmole de substrat d'oligonucléotide marqué par '- _32P (c'est-à-dire environ 400 000 coups/minute). Les uligonuclélutide c d: YuLydge uCiL eLé t uilUL ebd pdL
chauffage avant leur addition au mélange réactionnel.
Les mélanges réactionnels ont été assemblés sur de la glace et mis à incuber durant 30 minutes à 25 C. Les réactions ont été arrêtées par addition de 200 ul de 10 mM tris-Cl (pH 7,5), 15 mM de EDTA, 0, 6% de SDS [dodécylsulfonate de sodium] et 0,05 mg/ml de protéinase K, et les mélanges ont été mis à incuber durant 30 minutes au moins à 45 C. Après précipitation à l'aide d'éthanol, les produits ont été analysés sur des gels dénaturants PAGE à 8%, comme on le sait bien
en pratique (voir, par exemple, Sambrook et al. (1989).
F. Quantification de l'Activité de Télomérase Dans le présent exemple, la quantification de l'activité de télomérase par un mode opératoire de purification est décrite. La quantification a été effectuée par des essais de recherche d'allongement des oligonucléotides d'amorçage en présence de dGTP et de [a-32P1dTTP. En bref, on a étendu 1 uM de 5'- (G4T4) -3' oiLgoiluiéutide UdnilS un vol ue de 20 i de m n lieil y réactionnel en présence de 2 ul de ra-32P1dTTP ( 10 ILCi/iLLi, 400 Ci/'ltUtoie; i Ci=37 GBq) et 125 Vil dGTP comme décrit (Lingner et al., Genes Develop., 8:1984 [1994]) et on a chargé sur un gel de séquençage à 8% de
PAGE, comme décrit.
Les résultats de cette étude sont présentés sur la figure 28. Dans la piste 1, il n'y a pas présence de télomérase (c'est-à-dire qu'il s'agit d'un témoin négatif); les pistes 2, 5, 8 et 11 contenaient 0,14 fmole de télomérase; les pistes 3, 6, 9 et 12 contenaient 0,42 fmole de télomérase, et les pistes 4,
7, 10 et 13 contenaient 1,3 fmole de télomérase.
L'activité a été quantifiée à l'aide d'un appareil d'imagerie "PhosphorImager" (Molecular Dynamics), en utilisant les instructions du fabricant. Il a été déterminé que, dans ces conditions, 1 fmole de télomérase purifiée par affinité incorporait 21 fmoles
de dTTP en 30 minutes.
Comme montré sur la figure 28, l'activité spécifique'de la télomérase n'a pas changé nettement du fait des opérations de purification. De la télomérase
purifiée par affinité a été entièrement active.
Cependant, il a été déterminé qu'à des concentrations élevées, une activité inhibitrice a été décelée et
l'activité d'extraits bruts n'a pas été linéaire.
Ainsi, dans l'essai représenté sur la figure 28, l'extrait brut a été dilué de 700 à 7 000 fois. Après purification, cette activité inhibitrice a été enlevée et l'on n'a pas décelé d'effet inhibiteur dans les préparations de télomérase purifiée, méme à des
concentrations élevées en de l'enzyme.
G. Electrophorèse sur gel de transfert d'ADN de type Northern Blots Comme indiqué à la partie E, à chaque étape de la purification de la télomérase, la préparation a été analysée par trois essais séparés. Le présent exemple décrit les modes opératoires d'électrophorèse sur gel et le transfert d'ADN ("blotting") servant à quantifier l'ARN de télomérase présent dans les fractions et à analyser l'intégrité de la particule de
ribonucléoprotéine de télomérase.
i) Gels dénaturants et transferts de types Northern Blots Dans le présent exemple, de l'ARN de télomérase synthétique, avec transcription T7, de concentration connue, a servi de témoin. Pendant toute l'investigation, le composant ARN a servi de mesure de télomérase. Une construction pour transcription par polymérase d'ARN du phage T7 de l'ARN de télomérase de E. aediculatus a été produite, en utilisant de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). Le gène d'ARN de télomérase a été amplifié à l'aide d'amorces qui se sont fixées par annelage à l'une ou l'autre extrémité du gène. L'amorce qui s'est fixée par annelage à l'extrémité 5' a également codé pour, ou introduit par codage, une séquence de ribozyme en forme de tête de marteau pour engendrer l'extrémité 5' naturelle après clivage de l'ARN transcrit, une séquence de promoteur de T7, et un site EcoRI pour sous- clonage. La séquence de cette amorce en 5' a été
5'-GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGAA
AGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTAG-3'.
L'amorce en 3' a inclus un site Earl pour la terminaison de la transcription à l'extrémité 3' naturelle, et un site BamHI pour le clonage. La séquence de cette amorce en 3' a été '-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3'. Le produit de l'amplification en chaine par polymérase a été clivé avec EcoRI et BamHI, et sous-cloné en des sites respectifs de pUC19 (NEB), ce qui a donné "pEaT7". Le caractère correct de cette insertion a été confirmé par séquençage d'ADN. La transcription de T7 a été effectuée comme décrit par Zaug et al., Biochemistry 33:14935 [1994], avec du plasmide linéarisé à l'aide de Earl. L'ARN a été purifié sur gel et la concentration était déterminée (un A260 de 1 = 40 gg/m). Cet ARN a servi de témoin standard pour déterminer l'ARN de télomérase présent dans diverses préparations de télomérase. Le signal d'hybridation a été proportionnel à la quantité d'ARN de télomérase, et les concentrations d'ARN ainsi obtenues correspondaient bien, mais en étant légèrement supérieures, à celles obtenues par électrophorèse native sur gel. Une comparaison de la quantité d'ARN de télomérase complète dans de l'ARN de cellule complète avec des dilutions en série de produit connu de transcription d'ARN T7 a indiqué que chaque cellule de E. aediculatus contenait environ 300 000
molécules de télomérase.
La visualisation de la télomérase a été effectuée par hybridation, par transfert de type "Northern blot", sur son constituant ARN, en utilisant des procédés tels que décrits (Linger et al., Genes Develop., 8:1984 [1994]). En bref, de l'ARN (quantité inférieure ou égale à 0,5 pg/piste) a été résolu sur un gel à 8% de PAGE, et soumis à électrophorèse ("electroblot") sur une membrane Hybond-N (Amersham), comme cela est connu
en pratique (voir, par exemple, Sambrook et al., 1989).
La tache a été soumise à hybridation durant la nuit dans 10 mX de 4xSSC, 10x solution de Denhardt, 0,1% de
SDS et 50 ug/m; d'ADN de sperme de hareng dénaturé.
Après pré-hybridation durant 3 heures, on a ajouté 2 x v coups par minute (cpm) de sonde/mX de solution d'hybrldaLion La SoIne ImLaquee de açoun aléaLoilLe était un produit d'amplification en chaîne par polymérase, qui a couvert la totalité du gène d'ARN de télomérase. La tache a été lavée avec plusieurs changements de tampon durant 30 minutes dans 2xSSC, 0,1% de SDS puis lavage durant 1 heure dans 0,lxSCC et
0,1% de SDS (dodécylsulfonate de sodium) à 45 C.
ii) Gels natifs et transferts de type Northern Blots Dans cette expérience, la préparation de télomérase purifiée a été utilisée sur des gels natifs (c'est-à-dire non dénaturants) de 3,5% de polyacrylamide et 0,33% d'agarose ou gélose, comme cela est connu en pratique et décrit (Lamond et Sproat [1994], ci- dessus). La télomérase a migré
approximativement avec le colorant cyanol de xylène.
Les résultats obtenus sur gel natif ont indiqué que la télomérase était maintenue conservée sous forme de RNP (ribonucléoprotéine) pendant tout le mode opératoire du protocole de purification. La figure 27 est une photographie d'un transfert de type "Northern blot", montrant la mobilité de la télomérase dans différentes fractions sur un gel non dénaturant ainsi
que dans le cas de télomérase transcrite "in vitro".
Sur cette figure, la piste 1 contenait 1,5 fmole d'ARN de type télomérase, la piste 2 contenait 4,6 fmoles d'ARN de télomérase, la piste 3 contenait 14 fmoles d'ARN de télomérase, la piste 4 contenait 41 fmoles d'A4N de télomérase, la piste 5 contenait de l'extrait nucléaire (42 fmoles de télomérase), la piste 6
contenait de la télomérase purifiée sur "Affi-Gel-
héparine" (47 fmoles de télomérase), la piste 7 contenait de la télomérase purifiée par affinité (68 fmoles), et la piste 8 contenait de la télomérase
purifiée avec gradient de glycérol (35 fmoles).
Comme montré sur la figure 27, dans les extraits nucléaires, la télomérase a été assemblée en une particule de RNP (ribonucléoprotéine) qui a migré plus lentement que l'ARN de télomérase sans assemblage. Ce
procédé a permis de déceler moins de 1% d'ARN libre.
Cependant, le complexe de ribonucléoprotéine de télomérase migrant plus lentement a été parfois aussi décelé dans les extraits. Lors de la purification sur la colonne de Affi-Gel-héparine, la particule de RNP de télomérase n'a pas changé de mobilité (figure 27, piste 6). Cependant, après purification par affinité, la mobilité de la particule d'ARN a légèrement augmenté (figure 27, piste 7), ce qui indique peut-être qu'une
sous-unité ou un fragment protéinique a été perdu(e).
Lors d'opérations de gradients de glycérol, la télomérase purifiée par affinité n'a pas changé de taille, mais on a pu déceler environ 2% d'ARN de type télomérase libre (figure 27, piste 8), ce qui suggère qu'une faible quantité de désassemblage de la particule
de RNP s'est produite.
H. Composition de la Protéine de type Télomérase Dans le présent exemple, on décrit l'analyse de la
composition de protéine de type télomérase purifiée.
Des fractions obtenues à l'aide d'un gradient de glycérol, comme décrit dans la partie D, ont été séparées sur un gel à 4-20% de polyacrylamide ("Novex"). Après électrophorèse, le gel a été coloré avec du bleu brillant Coomassie. La figure 29 montre une photographie du gel. Les pistes 1 et 2 contenaient des marqueurs de masse moléculaire (Pharmacia), comme
indiqué sur le côté gauche du gel montré sur la figure 29. Les pis-
tes 3-5 contenant les fractions obtenues avec gradients de glycérol,
comme indiqué sur le dessus du gel (c'est-à-dire que la piste 3 con-
tenait les fractions 9-14, la piste 4 contenait les fractions 15-22 et la piste 5,contenait les fractions 23-32). La piste 4 contenait la masse groupée comportant 1 pmole d'ARN de type télomérase. Dans les pistes 6 à 9, on a utilisé des étalons comportant de la sérum albumine de bovin, à des concentrations indiquées au-dessus du gel sur la figure 29 (c'est-à-dire que la piste 6 contenait 0,5 pmole de sérum albumine de bovin, la piste 7 contenait 1,5 pmole de sérum albumine de bovin, la piste 8 contenait 4,5 pmoles de sérum albumine de bovin et la piste 9 contenait 15 pmoles de
sérum albumine de bovin).
* Comme montré sur la figure 29, les polypeptides ayant des masses moléculaires de 120 et de 43 kDa ont été co-purifiés avec la télomérase. On a observé que le polypeptide de 43 kDa était un doublet. On a noté que le polypeptide ayant une masse d'environ 43 kDa dans la piste 3 a migré de façon différente de celle du doublet de la piste 4; il peut s'agir d'une protéine non apparentée. Le doublet à 120 kDa et celui à 43 kDa ont été chacun colorés avec du bleu brillant Coomassie au niveau approximatif de 1 pmole, en comparaison des étalons comportant de la sérum albumine de bovin.
Puisque cette fraction contenait 1 pmole d'ARN de type télomérase, dont la totalité était assemblée en une particule de ribonucléoprotéase (voir figure 27, piste 8), il semble y avoir deux sous-unités de polypeptide qui sont stoechiométriques avec l'ARN de type télomérase. Cependant, il est possible également que les deux protéines d'environ 40 kDa soient des
sous-unités séparées d'enzyme.
La télomérase purifiée par affinité, qui n'a pas été soumise à du fractionnement à l'aide d'un gradient de glycérol, contenait des polypeptides supplémentaires ayant des masses moléculaires apparentes de 35 et de 37 kDa, respectivement. On a estimé que cette dernière fraction était pure à au moins 50%. Cependant, les polypeptides à 35 kDa et à 37 kDa, qui étaient présents dans la matière purifiée par affinité, n'ont pas été séparés de façon reproductible par centrifugation avec les gradients de glycérol. Ces polypeptides peuvent être des contaminants, car ils n'ont pas été visibles
dans toutes les préparations contenant de l'activité.
I. Coefficient de sédimentation Le coefficient de sédimentation pour la télomérase a été déterminé par centrifugation avec les gradients de glycérol. Dans le présent exemple, de l'extrait nucléaire et de la télomérase purifiée par affinité ont été fractionnés avec des gradients de glycérol de 15 à %, contenant 20 mM de tris-acétate, avec 1 mM de MgCl2, 0,1 mM de EDTA, 300 mM de KGlu et 1 mM de DTT, à pH 7,5. Les gradients de glycérol ont été versés dans des tubes de 5 ml (13 x 51 mm), et ont été soumis à centrifugation à l'aide d'un rotor SW55Ti (Beckman) tournant à 55 000 tours par minute pendant 14 heures
à 4 C.
Des protéines de marquage ont été examinées dans un essai à gradient parallèle et elles avaient un coefficient de sédimentation de 7,6 S pour de l'alcool déshydrogénase (ADH), de 113 S pour de la catalase, 17,3 S pour de l'apoferritine et 19,3 S pour de la thyroglobuline. Le pic de télomérase a été identifié par électrophorèse sur gel natif avec des fractions de
gradient suivi par transfert par hybridation, sur son composant ARN.
La figure 30 est un graphique montrant le
coefficient de sédimentation pour de la télomérase.
Comme montré sur cette figure, de la télomérase purifiée par affinité a co-sédimenté avec de la catalase à 11,5 S, cependant que de la télomérase présente dans des extraits nucléaires a sédimenté légèrement plus vite, avec un pic voisin de 12,5 S. Donc, en correspondance avec la mobilité de l'enzyme dans des gels natifs, la télomérase purifiée semble avoir perdu un fragment protéolytique ou une sous-unité
associée de façon lâche.
La masse moléculaire calculée pour la télomérase, si elle est supposée consister en une sous-unité protéinique de 120 kDa, une sous-unité de 43 kDa et une sous-unité d'ARN de 66 kDa, arrive à un total de 229 kDa. Ceci correspond très étroitement avec la masse moléculaire de 232 kDa de catalase. Cependant, le coefficient de sédimentation est fonction de la masse moléculaire, aussi bien que du volume spécifique partiel et du coefficient dede frottement de la molécule, ces deux facteurs étant inconnus dans le cas de la
ribonucléoprotéase de type télomérase des Euplotes.
J. Utilisation d'un substrat Dans le présent exemple, les demandes en substrat de la télomérase d'Euplotes ont été étudiées. Un modèle simple de réplication finale de l'ADN prédit qu'après une réplication semi-conservatoire d'ADN, la télomérase étend des molécules d'ADN double brin, à extrémités franches. Dans une variation de ce modèle, une extrémité 3' à simple brin est créée par une hélicase ou nucléase après réplication. Cette extrémité 3' est ensuite utilisée par la télomérase pour fixation et extension. Pour déterminer si la télomérase est capable d'allonger des molécules à extrémités franches, on a effectué la synthèse d'épingles à cheveux modèles ayant des répétitions de télomères positionnées à leurs extrémités 3'. Ces substrats d'amorçage ont été purifiés sur du gel, marqués en position 5' par de la polynucléotide kinase, chauffés à 0,4 pM jusqu'à 80 C durant 5 minutes puis lentement refroidis jusqu'à la température ambiante dans un bloc de chauffage pour permettre le retour à la structure naturelle et la formation en hélice des épingles à cheveux. La mobilité des substrats sur un gel non dénaturant a indiqué qu'une formation en épingle à cheveux très efficace
était présente, en comparaison d'une dimérisation.
Des essais ont été effectués avec 125 pM de dGTP sans marque, 125 pM de dTTP, et 0,02 pM d'amorce marquée à l'extrémité 5' (substrat d'oligonucléotide marqué par 32p-5') dans 10 pl de mélanges réactionnels contenant 20 mM d'acétate de tris, avec 10 mM de MgCl2, mM de KGlu et 1 mM de DTT, à pH 7,5. On a soumis ces mélanges à incubation à 25 C durant 30 minutes. Les réactions ont été arrêtées par addition d'un tampon de charge contenant du formamide (c'est-à-dire TBE, du formamide, du bleu de bromothymol et du cyanol,
Sambrook, 1989, ci-dessus).
On a fait incuber des amorces sans télomérase ("-"), avec 5,9 fmoles de télomérase purifiée par affinité ("+") ou avec 17,6 fmoles de télomérase purifiée par affinité ("+++"). La télomérase purifiée par affinité et utilisée dans cet essai a été dialysée avec une membrane ayant un pouvoir de coupure moléculaire de 100 kDa, afin d'enlever l'oligonucléotide de déplacement. Les produits de réaction ont été séparés sur un gel à 8% de PAGE/urée, contenant 36% de formamide, pour dénaturer les épingles à cheveux. Les séquences des amorces utilisées dans cette étude, ainsi que les attributions et correspondances avec des pistes, sont des
renseignements présentés au tableau 6.
TABLEAU 6 - Séquences d'amorces Piste Séquence d'amorce (5' vers 3')
1-3 C4(A4C4)3CACA(G4T4)3G4
4-6 C2(A4C4)3CACA(G4T4)3G4
7-9 (A4C4)3CACA(G4T4)3G4
-12 A2C4(A4C4)2CACA(G4T4)3G4
13-15 C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
16-18 (A4C4)3CACA(G4T4)3
19-21 A2C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
22-24 C4(A4C4)2CACA(G4T4)3
-27 C2(A4C4)2CACA(G4T4)3
28-30 (A4C4)2CACA(G4T4)3
Les résultats obtenus sur du gel sont présentés à la figure 31. Les pistes 1 à 15 contenaient des substrats ayant des répétitions de télomères se terminant par quatre restes G. Les pistes 16 à 30 contenaient des substrats comportant des répétitions de télomères se terminant par quatre restes T. L'alignement supposé sur le gabarit d'ARN de type télomérase est indiqué sur la figure 32. On a supposé que l'amorce se fixe par annelage en deux positions très différentes dans le gabarit montré sur la figure 32 (c'est-à-dire panneau A et panneau B, respectivement). Cela risque d'avoir
affecté leur vitesse de fixation et/ou d'allongement.
La figure 33 montre une exposition plus légère des pistes 25 à 30 de la figure 31. L'exposition plus légère de la figure 33 a été prise pour permettre la visualisation des nucléotides qui sont ajoutés et les positions de pause dans des produits allongés. Le pourcentage de substrat allongé, pour la troisième piste de chaque groupe, a été quantifié sur un appareil
"PhosphorImager, comme indiqué au bas de la figure 31.
On a comparé les efficacités ou rendements de substrat de ces épingles à cheveux avec des substrats analogues à des télomères à double brin avec des superpositions de différentes longueurs. Un substrat modèle, qui se terminait par 4 restes G (voir les pistes 1 à 15 de la figure 31) n'a pas été allongé quand il a été obtenu avec des extrémités franches (voir les pistes 1 à 3). Cependant, on a observé un léger allongement avec une longueur de superposition de deux bases; l'allongement est devenu efficace quand la
superposition a été d'une longueur d'au moins 4 bases.
La télomérase a agi de façon similaire avec un substrat à double brin se terminant par quatre restes T, avec nécessité d'une superposition de 6 bases pour un allongement hautement efficace. Sur la figure 31, les bandes pâles au-dessous des amorces dans les pistes 10 à 15, qui sont indépendantes de la télomérase, représentent des oligonucléotides plus courts obtenus
dans les préparations d'amorces.
L'exposition plus légère ou plus claire des pistes à 30 sur la figure 33 montre une échelle de produits allongés, les bandes les plus foncées étant en corrélation avec la limite 5' supposée du gabarit (comme décrit par Lingner et ai., Genes Develop., 8:1984 [1994]). L'abondance de produits correspondant à d'autres positions dans le gabarit a suggéré qu'une pause et/ou une dissociation se produit à des sites autres que le site de translocation avec la télomérase
purifiée.
Comme montré sur la figure 31, des oligonucléotides à double brin, à extrémité franche, n'étaient pas des substrats pour de la télomérase. Pour déterminer si ces molécules se fixeraient sur de la télomérase, on a effectué une expérience avec compétition. Dans cette expérience, on a soumis 2 nM de substrat marqué à l'extrémité 5' avec la séquence (G4T4)2, ou un substrat en épingle à cheveux avec une superposition de six bases, à extension avec 0,125 nM de télomérase (figure 31, pistes 25 à 27). Bien que les mêmes substrats d'oligonucléotide non marqués entrent efficacement en compétition avec des substrats marqués pour une extension, on n'a pas observé de réduction d'activité quand les oligonucléotides en épingle à cheveux à double brin, à extrémité franche, ont servi de compétiteurs, même en présence d'un excès de
fois d'épingles à cheveux.
Ces résultats ont indiqué que des oligonucléotides à double brin, à extrémités franches, ne peuvent se fixer sur de la télomérase aux concentrations et conditions essayées dans le présent exemple. Au contraire, il faut une extrémité 3' à simple brin pour la fixation. Il est probable que cette extrémité 3' est nécessaire pour obtenir une paire de bases avec le
gabarit d'ARN de type télomérase.
K. Clonage et séquençage du polypeptide de 123 kDa Dans le présent exemple, le clonage du polypeptide à 123 kDa de télomérase d'Euplotes (c'est-à-dire la sous-unité protéinique de 123 kDa) est décrit. Dans cette étude, un fragment interne du gène de télomérase a été soumis à amplification par amplification en chaîne par polymérase, avec des amorces de type oligonucléotide conçu pour bien correspondre à des séquences peptidiques obtenues à partir du polypeptide purifié, lui-même obtenu à la partie D ci-dessus. La séquence de polypeptide a été déterminée à l'aide des méthodes de spectroscopie de masse en tandem de type nanoES, connue en pratique et décrite par Calvio et al., RNA 1:724-733 [1995]. Les oligonucléotides d'amorçage utilisés dans le présent exemple avaient les séquences suivantes, avec des positions qui étaient
dégénérées et montrées entre parenthèses en 5'-
TCT(G/A):
AA(G/A)TA(G/A)TG(T/G/A)GT(G/A/T/C)A(T/G/A)(G/A)TT(G/A)TTCAT-3',
et
'-GCGGATCCATGAA(T/C)CC(A/T)GA(G/A)AA(T/C)CC(A/T)AA(T/C)GT-3'
Un mélange réactionnel de 50 u1 contenait 0,2 mM de dNTP, 0,15 pg d'ADN de chromosome de E. aediculatus, 0,5 pl de Taq (Boehringer- Mannheim), 0,8 pg de chaque
amorce et lx tampon de réaction (Boehringer-Mannheim).
On a fait incuber le mélange réactionnel dans un appareil de thermocyclage (Perkin-Elmer), en utilisant le plan suivant: 5 minutes à 95 C, puis 30 cycles d'l minute à 94 C, 1 minute à 52 C et 2 minutes à 72 C. La réaction a été achevée par 10 minutes d'incubation à 72 C. On a préparé une bibliothèque d'ADN de génome à partir de l'ADN de E. aediculatus chromosomique, par clonage d'ADN à extrémité franche introduit dans le site Smal du vecteur plasmide de pCR-Script de la figure 14 (Stratagene). Cette bibliothèque a été passée en revue par hybridation de colonies, avec le produit, purifié sur gel et radiomarqué, d'une amplification en chaîne par polymérase. On a préparé et séquencé l'ADN de plasmide de clone positif, par la méthode dite didésoxy (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463:[1977]) ou manuellement, par utilisation d'un séquenceur automatisé (ABI). La séquence d'ADN du gène codant pour ce polypeptide est présentée sur la figure 13. Le codon de départ dans cette séquence, provenant de la séquence d'ADN, est situé à la position de nucléotide 101, et le cadre de lecture ouverte se termine en position 3193. Le code génétique de Euplotes diffère de celui d'autres organismes du fait que le codon "UGA" code pour un reste cystéine. La séquence des amino acides du polypeptide supposé provenir de la séquence d'ADN est présentée sur la figure 14 et cela suppose qu'il n'y a pas eu d'amino acides inhabituels insérés au cours de la translation et qu'il ne se
produit pas de modification par post-translation.
L. Clonage et séquençage du polypeptide de 43 kDa Dans le présent exemple, le clonage du polypeptide de 43 kDa de télomérase (c'est-à-dire la sous-unité protéinique,à43 kDa) est décrit. Dans cette étude, un fragment interne du gène de télomérase correspondant a été amplifié par amplification en chaîne par polymérase, avec des oligonucléotides d'amorçage conçus pour correspondre à des séquences peptidiques qui étaient obtenues à partir du polypeptide purifié,lui-même obtenu à la partie D ci-dessus. La séquence polypeptidique a été déterminée à l'aide de méthodes de spectroscopie de masse en tandem de type nanoES, méthode connue en
pratique et décrite par Calvio et al., voir ci-dessus.
Les oligonucléotides d'amorçage utilisés dans le
présent exemple avaient les séquences suivantes--
'-NNNGTNAC(C/T/A)GG/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3', et
'-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3'.
Dans cette séquence, "N" indique la présence de l'un quelconque des quatre nucléotides (c'est-à-dire, A, T, G
ou C).
L'amplification en chaîne par polymérase a été effectuée comme décrit dans la partie K. On a préparé une bibliothèque d'ADN de génome et on l'a passée en revue comme décrit à la partie K. La séquence d'ADN du gène codant pour le polypeptide est présentée sur la figure 34. Trois cadres de lecture potentielle sont présentés pour cette séquence, comme montré sur la figure 35. Pour la clarté, la séquence des amino acides est indiquée en dessous de la séquence des nucléotides dans les trois cadres de lecture. Les cadres de lecture sont désignés en "a", "b" et "c". Un codon de départ possible est introduit par codage à la position de nucléotide 84 dans le cadre de lecture "c" La région de codage pourrait se terminer à la position 1501 dans le cadre de lecture "b". Des codons d'arrêt précoce, indiqués par des astérisques dans cette figure, se présentent dans l'ensemble des trois cadres de lecture entre la position 337 et 350 des nucléotides.
Le "domaine La" est indiqué en caractère gras.
Plus en aval, la séquence protéinique semble être introduite par codage par différents cadres de lecture, car aucun des trois cadres n'est interrompu par des codons d'arrêt. En outre, des séquences peptidiques provenant de la protéine purifiée sont introduites par codage dans l'ensemble des trois cadres. Donc, le gène semble contenir des séquences intermédiaires, ou bien, dans l'alternative, l'ARN est édité. D'autres possibilités incluent un décalage de cadre de ribosome ou des erreurs de séquences. Cependant, l'homologie avec la séquence de protéine La demeure d'un intérêt significatif. Dans ce cas à nouveau, dans Euplotes, le codon "UGA" code pour un reste cystéine. M. Comparaisons entre des Amino Acides et des Acides Nucléiques Dans le présent exemple, on a effectué des comparaisons entre diverses séquences citées et les
séquences des polypeptides correspondant à des sous-
unités de type télomérase de 123 kDa et de 43 kDa.
i) Comparaisons avec la sous-unité de télomérase de 123 kDa de E. aediculatus La séquence des amino acides du polypeptide de 123 kDa d'Euplotes aediculatus a été comparée avec la séquence de la sous-unité protéinique de télomérase de kDa de Tetrahymena thermophila (n d'accession à GenBank U25641) pour en investiguer la similarité. La séquence de nucléotides telle qu'obtenue de GenBank et qui code pour cette protéine est présentée sur la figure 42. La séquence des amino acides de cette protéine, telle qu'obtenue de GenBank, est présentée à la figure 43. La comparaison entre les séquences de 123 kDa de E. aediculatus et de 80 kDa de T. thermophila est présentée à la figure 36. Sur cette figure, la séquence de E. aediculatus est la séquence supérieure, cependant que la séquence de T. thermophila est la séquence inférieure. L'identité observée a été déterminée comme étant d'environ 19%, cependant que le pourcentage de similarité était d'environ 45%, des valeurs similaires à celles que l'on observerait avec
n'importe quelle séquence de protéine prise au hasard.
Sur les figures 36 à 39, les identités sont indiquées par des barres verticales, cependant que les points simples entre les séquences indiquent des amino acides un peu similaires et que des doubles points entre les
séquences indiquent des amino acides plus similaires.
La séquence des amino acides du polypeptide de 123 kDa de Euplotes aediculatus a également été comparée avec la séquence de la sous- unité protéinique de télomérase, de 95 kDa, de Tetrahymena thermophila (n d'accès à GenBank U25642), pour en investiguer la similarité. La séquence de nucléotides,telle qu'obtenue de GenBank et codant pour cette protéine, est montrée sur la figure 44. La séquence des amino acides de cette protéine, telle qu'obtenue de GenBank, est montrée sur la figure 45. Cette comparaison des séquences est présentée sur la figure 37. Sur cette figure, la séquence de E. aediculatus est la séquence supérieure, cependant que la séquence T. thermophila est la séquence inférieure. L'identité observée a été déterminée comme valant approximativement 20%, cependant que le pourcentage de similarité était d'environ 43%, ces valeurs étant similaires à ce que l'on observerait dans le cas de n'importe quelle
séquence de protéines prises au hasard.
De façon significative, la séquence des amino acides du polypeptide de 123 kDa de E. aediculatus contient les cinq motifs caractéristiques de transcriptases reverses. Le polypeptide de 123 kDa a également été comparé avec les domaines de polymérase de diverses transcriptases reverses. La figure 40 montre l'alignement du polypeptide de 123 kDa avec l'homologue supposé de levure (L8543.12 ou ESTp). La séquence des amino acides de L8543.12 obtenue de
GenBank est présentée sur la figure 46.
Quatre motifs (A, B, C et D) ont été inclus dans cette comparaison. Dans cette figure 40, des restes hautement conservés sont indiqués par des lettres blanches sur un fond noir. Des restes des séquences de E. aediculatus, qui sont conservés dans l'autre séquence, sont indiqués en gras; le "h" indique la présence d'un amino acide hydrophobe. Les chiffres situés entre des restes d'amino acides des motifs indiquent la longueur des intervalles dans les séquences. Par exemple, le "100" montré entre les motifs A et B reflète un intervalle de 100 amino
acides dans la séquence entre les motifs.
Comme noté ci-dessus, des recherches de Genbank ont identifié une protéine de levure (n d'accès Genbank U20618), et le gène L8543.12 (Est2) contenant ou codant pour une séquence d'amino acides présentant un peu d'homologie avec la sous-unité de télomérase de 123 kDa de E. aediculatus. Sur la base des observations selon lesquelles les deux protéines contiennent des motifs de transcriptase reverse dans leurs régions terminales en C, les protéines ont en commun de la similarité dans des régions situées à l'extérieur du motif de transcriptase reverse; les protéines sont basiques de façon similaire (pI = 10,0 pour E. aediculatus et pI=10,0 pour la levure); et les deux protéines sont grosses (123 kDa pour E. aediculatus et 103 kDa pour la levure), ces séquences comprennent le noyau catalytique de leurs télomérases respectives. Sur la base de cette observation d'homologie dans deux organismes phylogénétiquement distincts comme E. aediculatus et de la levure, il a été envisagé la possibilité que la télomérase humaine contienne une protéine ayant les mêmes caractéristiques (c'est-à-dire des motifs de transcriptase reverse,
qu'elle soit basique et grosse [>100 kDa]).
ii) Comparaisons avec la sous-unité de télomérase de 43 kDa de E. aediculatus La séquence des amino acides du "domaine La" du polypeptide de 43 kDa de Euplotes aediculatus a été comparée avec la séquence de la sous-unité protéinique de télomérase de 95 kDa de Tetrahymena thermophila
(décrite ci-dessus) pour en étudier la similarité.
Cette comparaison des séquences est montrée sur la figure 38, alors que la séquence de T. thermophila est la séquence inférieure. Il a été déterminé que l'identité observée était d'environ 23%, cependant que le pourcentage de similarité était d'environ 46%, ces valeurs étant similaires à celles que l'on observerait avec n'importe quelle séquence protéinique prise au
hasard.
La séquence des amino acides du "domaine La" du polypeptide de 43 kDa de Euplotes aediculatus a été comparée avec la séquence de la sous-unité protéinique de télomérase de 80 kDa de Tetrahymena thermophila
(décrite ci-dessus) pour en étudier la similarité.
Cette comparaison entre les séquences est montrée sur la figure 39. Sur cette figure, la séquence de E. aediculatus est la séquence supérieure, tandis que la séquence de T. thermophila est la séquence inférieure. Il a été déterminé que l'identité observée était d'environ 26%, cependant que le pourcentage de similarité était d'environ 49%, ces valeurs étant similaires à celles que l'on observerait dans le cas de n'importe quelle séquence d'une protéine prise au
hasard.
La séquence des amino acides d'un domaine du polypeptide de 43 kDa de E. aediculatus a été également comparée avec les protéines La provenant de divers autres organismes. Ces comparaisons sont présentées sur la figure 41. Sur cette figure, des restes hautement conservés sont indiqués par des lettres blanches sur un fond noir. Des restes de séquences de E. aediculatus, qui sont conservés dans l'autre séquence, sont indiqués
en gras.
N. Identification des Sous-unités Protéinique de Télomérase dans un autre Organisme Dans le présent exemple, les séquences identifiées dans les exemples précédents ci-dessus ont servi à identifier les sous-unités protéiniques de télomérase de Oxytricha trifallax, un cilié qui est apparenté de façon très éloignée à E. aediculatus. Des amorces ont été choisies sur la base de la région conservée du polypeptide de 123 kDa de E. aediculatus, ce qui comprenait les motifs de domaine de transcriptase reverse. Des amorces convenables ont été synthétisées et ont servi dans une réaction d'amplification en chaîne par polymérase avec de l'ADN total provenant de Oxytricha. L'ADN de Oxytricha a été préparé selon des procédés connus en pratique. Les produits de cette amplification ont été ensuite clonés et séquences, en
utilisant des procédés connus en pratique.
Les séquences d'oligonucléotides servant d'amorce ont été les suivantes:
5'-(T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)
(C/T)A(G/A)GG-3' et
'-G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-
3'). Des positions qui ont été dégénérées sont présentées entre parenthèses, avec les bases alternatives indiquées entre les parenthèses. "N"
représente l'un quelconque des quatre nucléotides.
Dans la réaction d'amplification en chaîne par polymérase, on a soumis un mélange réactionnel de Pl, contenant 0,2 mM de dNTP, 0,3 pg d'ADN chromosomique d'Oxytricha trifallax, 1 pl de polymérase Taq (Boehringer-Mannheim), 2 micromoles de chaque
amorce, lx de tampon de réaction (Boehringer-Mannheim).
On a fait incuber le mélange réactionnel dans un appareil pour thermocycles ("Perkin-Elmer") dans les conditions suivantes: 5 min à 95 C, 30 cycles consistant en 1 min à 94 C, 1 min à 53 C et 1 min à 72 C, ce qui est suivi d'une période d'incubation durant 10 min à 72 C. Le produit de cette amplification a été purifié sur gel et séquencé par le procédé de type didésoxy (voir par exemple, Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467 (1977)).
La séquence des amino acides ainsi déduite du produit de cette amplification a été déterminée et comparée avec la séquence de E. aediculatus. La figure 47 montre l'alignement de ces séquences, avec la séquence de O.trifallax montrée dans la rangée supérieure, et la séquence de E. aediculatus montrée dans la rangée inférieure. Comme il ressort de cette figure, il y a une grande quantité d'homologie entre la séquence de polypeptide de O.trifallax identifiée dans le présent exemple et la séquence de polypeptide de E. aediculatus. Ainsi, il est bien clair que les séquences identifiées dans la présente invention sont utiles pour l'identification de sous- unités protéiniques de télomérase homologues dans d'autres organismes eucaryotes. En fait, le développement de la présente invention a identifié des séquences de télomérase homologue dans de multiples espèces diverses, comme
décrit ici.
O. Identification des Séquences de Télomérase de Tétrahymena Dans le présent exemple, il a été produit un clone de Tetrahymena ayant de l'homologie avec des séquences
d'Euplotes, et EST2p.
La présente expérience a utilisé une amplification en chaîne par polymérase, avec des amorces d'oligonucléotides dénégérés dirigés contre les motifs conservés afin d'identifier des régions d'homologie entre les séquences de Tetrahymena, d'Euplotes et de EST2p. Le procédé d'amplification en chaîne utilisé dans le présent exemple est un nouveau procédé conçu pour amplifier spécifiquement des séquences rares d'ADN provenant de mélanges complexes. Ce procédé évite le problème de l'amplification de produits d'ADN avec la même amorce d'amplification en chaîne aux deux extrémités (c'est- à-dire des produits d'une seule amorce) que l'on rencontre couramment dans les procédés
de clonage avec amplification en chaîne par polymérase.
Ces produits dérivant d'une seule amorce produisent un arrière-plan non souhaité et peuvent souvent obscurcir l'amplification et la détection du produit voulu provenant de deux amorces. Le procédé utilisé dans la présente expérience choisit de façon préférentielle des produits de deux amorces. En particulier, une amorce est biotinylée et l'autre ne l'est pas. Après plusieurs étapes d'amplification en chaîne par polymérase, les produits sont purifiés à l'aide de perles magnétiques de streptavidine et les produits dérivant de deux amorces sont spécifiquement élues à l'aide d'une dénaturation par la chaleur. Ce procédé trouve une utilisation dans des montages autres que les expériences décrites dans le présent exemple. En fait, ce procédé trouve une utilisation dans l'application dans laquelle on souhaite spécifiquement amplifier des séquences rares d'ADN, comprenant les étapes préliminaires dans des méthodes de clonage comme RACE en 5' et 3, et n'importe quelle méthode utilisant des amorcesdégénérées dans une amplification en chaîne par
polymérase.
Une première amplification en chaîne par polymérase a été conduite en utilisant de l'ADN macronucléaire de gabarit de Tetrahymena, isolé à l'aide de procédés connus en pratique, cbmme amorce de 24 mères vers l'avant avec la séquence 5'-biotine-
GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3'
appelée "K231", correspondant à la région FFYXTE, et l'amorce reverse de 23 mères comportant la séquence
'-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3',
appelée "K220", correspondant à la région DDFL(FIL)I. Ce mélange réactionnel d'amplification en chaîne par polymérase contenait 2,5 pl d'ADN (50 ng), 4 pi de chaque amorce (20 pM), 3 pl de tampon lOx pour amplification en chaîne, 3 p1 lOx de dNTP, 2 il de Mg, 0,3 pl de Taq et 11,2 pI de dH2O. Le mélange a été soumis à 8 cycles à 94 C durant 45 secondes, 37 C durant
secondes et 72 C durant 1 minute.
Le mélange de réaction d'amplification en chaîne par polymérase a été fixé sur 200 pl de perles magnétiques de streptavidine, cela a été lavé avec pl de TE, remis en suspension dans 20 pl de dH2O puis dénaturé par chauffage à l'ébullition à 100 C durant 2 minutes. Les perles ont été lavées et l'éluat enlevé. Puis, on a soumis 2,5 pl de cet éluat à une nouvelle amplification subséquente, en utilisant les conditions ci-dessus, sauf que l'on a inclus 0,3 upl de a-32P-dATP, et que l'amplification en chaîne a été effectuée durant 33 cycles. Cette réaction a été
effectuée sur un gel dénaturant à 5 % de polyacry-
lamide, et la région appropriée a été découpée sur le gel. Ces produits ont été ensuite réamplifiés pendant 34 cycles supplémentaires, dans les conditions indiquées ci-dessus, sauf que l'on a utilisé une température
d'annelage de recuit de 42 C.
On a effectué une seconde amplification en chaîne en utilisant du gabarit d'ADN macronucléaire de Tetrahymena isolé à l'aide de procédés connus en pratique, et en utilisant l'amorce vers l'avant de 23 mères comportant la séquence 5'-ACAATG(GA)G(GATC) (TCA)T (GATC)(TCA)T(GATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3', appelée "K228", correspondant à la région R(LI) (LI)PKK, et une amorce reverse avec la séquence 5'-ACGAATC(GT)GATC)GG(TAG)AT (GATC)GC)(TA)(AG)TC(AG)TA(AG)CA-3', appelée "K224", correspondant à la région CYDSIPR. Le mélange de réaction d'amplification en chaine contenait 2,5 pi d'ADN (50 ng), 4 pl de chaque amorce (20pM), 3 pl de tampon 10x réaction d'amplification, 3 pl 10x dnTP, 2 pl de Mg, 0,3 pm d'a-32PdaTP, 0,3 pl de Taq et 10,9 H1 de dH2O. Cette réaction a été effectuée sur un gel dénaturant à 5% de polyacrylamide, et la région appropriée a été découpée sur le gel. Ces produits ont été réamplifiés pendant 34 cycles supplémentaires, dans les conditions énumérées ci-dessus, sauf que l'on a
utilisé une température de recuit de 42 C.
Dix pl du produit de la réaction provenant de l'essai i ont été fixés sur des perles magnétiques à revêtement de streptavidine dans 200 pl de TE. Les perles ont été lavées avec 200 ipl de TE, puis remises en suspension dans 20 pl de dH2O, dénaturées par chauffage et l'éluat a été enlevé. Le produit de la réaction provenant de l'essai n 2 a été a ensuite ajouté aux perles et dilué avec 30 pl de 0,5xSSC. Le mélange a été chauffé de 94 C à 50 C. L'éluat a été enlevé et les
perles ont été lavées trois fois dans 0,5xSSC à 55 C.
Les perles ont été ensuite remises en suspension dans pl de dH2O, dénaturées par chauffage et l'éluat a, été enlevé, il a été appelé "éluat 1 tour' et il a été conservé. Pour isoler la bande de Tetrahymena, l'éluat 1 tour a été amplifié à nouveau avec l'amorce avant K228 et l'amorce reverse K227 avec la séquence
'-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GAT)T
C-3', correspondant à la région DIKSCYD. Les réactions d'amplification en chaîne ont été conduites comme décrit ci-dessus. Les produits de la réaction ont été traités sur un gel à 5% de polyacrylamide; la bande correspondant à environ 295 nucléotides a été découpée
sur le gel et soumise à séquençage.
Le clone appelé 168-3 a été séquencé. On a trouvé que la séquence d'ADN (comprenant les séquences des amorces) était:
GATTACTCCCGAAGAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAAGGAC
AAGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTAAATTAAATTCTAATGGATAGCCAACTTGT
GTTTAGGAATTTAAAAGACATGCTGGGATAAAAGATAGGATACTCAGTCTTTGATA
ATAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGA
AGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTAGACATAAAGACTTGCTAC.
On a obtenu une séquence supplémentaire du gène par réaction d'amplification en chaîne par polymérase, en utilisant une seule amorce destinée à correspondre à la séquence partant de 168-3 ("K297") avec la séquence '-GAGTGACATAATATACGTGA-3'; et l'amorce K231 (FFYXTE). La séquence du fragment obtenu à partir de cette réaction, avec 168-3, est la suivante (sans les séquences des amorces):
AAACACAAGGAAGGAAGTCAAATATTCTATTACCGTAAACCAATATGGAAATTAGT
GAGTAAATTAACTATTGTCAAAGTAAGAATTTAGTTTTCTGAAAAGAATAAATAAA
TGAAAAATAATTTTTATCAAAAAATTTAGCTTGAAGAGGAGAATTTGGAAAAAGTT
GAAGAAAAATTGATACCAGAAGATTCATTTTAGAAATACCCTCAAGGAAAGCTAAG
GATTATACCTAAAAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAAGGACA
AGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTAAATTAAATTCTAATGGATAGCCAACTTGTG
TTTAGGAATTTAAAAGACATGCTGGGATAAAAGATAGGATACTCAGTCTTTGATAA
TAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGAA
GACCTCAGCTATATTATGTCACTCTA.
On a trouvé que la séquence des amino acides correspondant à ce fragment d'ADN était:
KHKEGSQIFYYRKPIWKLVSKLTIVKVRIQFSEKNKQMKNNFYQKIQLEEENLEKV
EEKLIPEDSFQKYPQGKLRIIPKKGSFRPIMTFLRKDKQKNIKLNLNQILMDSQLV
FRNLKDMLGQKIGYSVFDNKQISEKFAQFIEKWKNKGRPQLYYVTL.
Cette séquence des amino acides a été ensuite alignée avec d'autres gènes de télomérase (EST2p et
Euplotes). L'alignement est présenté sur la figure 53.
Une séquence de consensus est également présentée sur
cette figure.
P. Identification des Séquences de Télomérase de Schizosaccharomyces pombe Dans le présent exemple, la séquence tezl de S. pombe a été identifiée comme homologue de pl23 de
E. aediculatus et de Est2p de S. cerevisiae.
La figure 55 montre un résumé global de ces expériences. Sur cette figure, la partie supérieure (Panneau A) montre la relation entre deux clones de génome superposés et la partie de 5825 paires de bases qui a été séquencée. La région appelée "tezlP" est la région de codage de protéine, avec indication des séquences de flanc, le caisson au-dessous de la région de 5825 paires de bases est un fragment HindIII d'environ 2 kb qui a servi à obtenir la construction de
rupture de tezl, comme décrit ci-après.
La moitié inférieure de la figure 55 (Panneau B) est un schéma "rapproché" de cette même région d'ADN. La séquence appelée "PCR d'origine" estle fragment de PCR (réaction d'amplification en chaîne par polymérase) dégénéré qui a été engendré avec une paire d'amorces de type oligonucléotide dégénéré, appelée, sur la base du motif 4 de séquence de Euplotes (B') et du motif 5 (C),
comme décrit.
i) Amplification en Chaîne de Polymérase avec des Amorces Dégénérées On a utilisé des amplifications en chaîne par polymérase, faisant appel à des amorces dégénérées, pour trouver l'homologue de pl23 de E. aediculatus dans S. pombe. La figure 56 montre les séquences des amorces dégénérées (appelées "poly 4" et "poly 1"), utilisées dans cette réaction. Les essais d'amplification en chaîne par polymérase ont été conduits avec utilisation du même tampon que celui décrit dans l'exemple précédent (voir par exemple, la partie K ci-dessus), avec un temps de 5 minutes de montée à 94 C, ce qui est suivi de 30 cycles de 94 C durant 30 secondes, 50 C durant secondes et 72 C durant 30 secondes, et 7 minutes à 72 C, suivi par une conservation à 4 C. Des essais d'amplification en chaîne par polymérase ont été conduits dans diverses conditions (c'est-à-dire diverses concentrations d'ADN de S. pombe et diverses concentrations de MgCl2). Les produits de cette amplification ont été traités sur des gels de gélose et colorés avec du bromure d'éthidium comme décrit ci-dessus. Plusieurs essais d'amplification en chaîne par polymérase ont abouti à la production de trois bandes (appelées "T", "M" et "B"). Ces bandes ont été réamplifiées et traitées sur des gels en utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. On a observé quatre bandes après cette réamplification ("T", "Mi", "M2" et "B"), comme montré sur la figure 57. Ces quatre bandes ont été ensuite réamplifiées en utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci- dessus. La troisième bande à partir du haut de la piste de la figure 57 a été identifiée comme contenant la séquence correcte pour une protéine de télomérase. On a trouvé que le produit de cette amplification, appelé "M2", montrait une correspondance raisonnable avec d'autres
protéines de télomérase, comme indiqué sur la figure 58.
En plus de l'alignement montré, cette figure montre également la séquence trouvée pour tezl. Sur cette figure, les astéristiques indiquent les restes communs aux quatre séquences ("Ot d'Oxytricha", "Eapl23" de E. aediculatus, "Sc_plO3" de S. cerevisiae, et M2), cependant que les cercles (c'est-à-dire les points)
indiquent des restes d'amino acides similaires.
ii) Amplification en chaîne par polymérase de 3'RT Pour obtenir une information supplémentaire sur les séquences, on a conduit des amplifications en chaîne par polymérase en 3' et 5'RT sur le candidat identifié sur la figure 58 pour une télomérase. La figure 59 montre un schéma de la stratégie d'amplification
en chaîne par polymérase en 3'RT qui a servi.
Tout d'abord, on a préparé de l'ADNc à partir
d'ARNm en utilisant l'amorce d'oligonucléotide "QT" (5'-
CCA CTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT
TTT TTT TT-3'), puis en utilisant cet ADNc comme gabarit pour une amplification en chaîne avec "Qo"(5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3'), et une amorce désignée sur la base de la réaction d'amplification en chaîne dégénérée d'origine (c'est-à-dire, "M2-T" ayant la séquence 5'-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3'). La
seconde réaction d'amplification en chaîne (c'est-à-
dire, une réaction d'amplification en chaîne avec emboîtement) a été effectuée avec "QI" (5'-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3'), et une autre amorce pour une réaction d'amplification en chaîne conçue avec une séquence provenant de la réaction d'amplification en chaîne désignée d'origine ou "M2-T2" (5'-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAF AAA GGA TCA GTG-3'). Les tampons utilisés dans cette réaction d'amplification ont été les mêmes que ceux décrits ci-dessus, avec une amplification conduite en commençant avec 5 minutes de chauffage à 94 , puis 30 cycles à 94 durant secondes, 55 C durant 30 secondes et 72 C durant 3 minutes, ce qui est suivi de 7 minutes à 72 C. Les produits de cette réaction ont été conservés à 4 C jusqu'à leur utilisation. iii) Passage en revue ou Dépistage des Bibliothèques de Génome et d'ADNc Après obtention de cette information supplémentaire sur les séquences, on a passé en revue plusieurs bibliothèques de génome et d'ADNc pour identifier les bibliothèques contenant du gène candidat comme télomérase. L'approche utilisée, ainsi que les bibliothèques et les résultats obtenus, sont présentés que la figure 60. Sur cette figure, le panneau A énumère les bibliothèques essayées dans cette expérience, le panneau B montre les régions utilisées; les panneaux C et D montrent les résultats d'une hybridation obtenus avec ces bibliothèques. Les bibliothèques positives ont été ensuite passées en revue, par dépistage, par hybridation de colonies pour obtenir la version de génome et d'ADNc du gène tezl. Dans cette expérience, on a examiné environ 3 x 104 colonies provenant de la bibliothèque de génome de HindIII, et six clones positifs ont été identifiés (environ 0,01%). On a ensuite préparé de l'ADN à partir de deux clones indépendants (A5 et B2). La figure 61 montre les résultats obtenus avec les clones de génome positifs A5
et B2 obtenus après digestion par HindIII.
En outre, on a utilisé des bibliothèques REP d'ADNc. On a examiné environ 3 x l05 colonies, et l'on a identifié 5 clones positifs (0,002%). De l'ADN a été préparé à partir de trois clones indépendants (2-3, 4-1) et 5-20). Dans des expériences ultérieures, il a été déterminé que les clones 2-3 et 5-20 contenaient des
inserts identiques.
iv) Amplification en Chaîne en 5'RT Comme la version d'ADNc de gène produite jusqu'alors n'était pas complète, on a conduit une amplification en chaine en 5'RT pour obtenir un clone de pleine longueur. La stratégie est schématiquement montrée sur la figure 62. Dans cette expérience, on a préparé de l'ADNc en utilisant de l'ADN d'oligonucléotide amorceur "M2-B" (5'- CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3') et "M2-B2" (5'-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3'), amorce désignée à partir de régions connues de tezi précédemment identifié. On a ensuite fixé par ligature à l'extrémité 3' de cet ADNc un olygonucléotide de liaison pour amplification en chaîne de type "Adapt SfiI" comportant une extrémité 5' phosphorylée ("P") (P-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC- 3'; et cette construction a servi de gabarit pour une réaction d'amplification en chaine avec emboîtement. Dans la première étape de cette amplification, on a utilisé comme amorce "Adapt SfiII" et M2-B, cependant que l'on a utilisé comme amorce "Adapt SfiII"
(5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC
CC-3'), et M2-B2 dans la seconde étape. On a utilisé une amplification en chaîne avec emboitement pour augmenter la
spécificité de réaction.
v) Alignements des Séquences Une fois la séquence de tezl identifiée, elle a
été préparée avec des séquences précédemment décrites.
La figure 63 montre l'alignement des domaines RT (télomérase) de sousunités catalytiques de télomérase
de S. pombe ("Tezlp de S.p."), de S. cerevisiae ("S.c.
Est2p"), et de E. aediculatus pl23 ("E.a. p123"). Sur cette figure, "h" indique des restes hydrophobes, cependant que, "p" indique de petits restes polaires, et "c" indique des restes chargés. L'alignement des restes d'amino acidesindiqué ci-dessus montre un motif RT de consensus connu de Y. Xiong et T.H. Eickbush (Y. Xiong et T.H. Eickbush, EMBO J.,9: 3353-3362 [1990]). Les astériques indiquent les restes qui sont conservés pour l'ensemble des trois protéines. Le "motif O" est indiqué ici et sur la figure 63 comme étant un motif spécifique de cette unité de télomérase et que l'on ne trouve pas en général dans des transcriptases reverses. Il est donc intéressant dans l'identification d'autres séquences d'amino acides comme étant des sous- unités catalytiques
de télomérase.
La figure 64 montre l'alignement des séquences entières de Euplotes ("Eapl23"), de S. cerevisiae ("ScEst2p") et de S. pombe ("Sp_Tezlp"). Dans le panneau A, les zones hachurées indiquent des restes présents en commun dans deux séquences. Dans le panneau B, les zones hachurées indiquent des restes présents en
commun dans l'ensemble des trois séquences.
vi) Rupture Génétique de tezl Dans le présent exemple, les effets de rupture de tezl ont été étudiés. Comme de la télomérase est impliquée dans la conservation de télomère, on a supposé que si tezl était un composant de télomérase, une rupture de tezl provoquerait un raccourcissement graduel
de télomère.
Dans ces expériences, on a utilisé une recombinaison homologue pour effectuer la rupture du gène tezl dans S. pombe spécifiquement. Cette approche est schématiquement illustrée sur la figure 65. Comme indiqué sur la figure 65, du tezl de type sauvage a été remplacé par un fragment contenant le marqueur ura4 ou LEU2. La rupture ou disruption du gène tezl a été confirmée par amplification en chaîne par télomérase (Figure 66), et l'on a effectue un transfert de type
"Southern blot" pour vérifier la longueur des télomères.
La figure 67 montre les résultats de ce transfert "Southern blot" pour cette expérience. Puisqu'un site d'enzyme de restriction Apal est présent immédiatement au voisinage de la séquence télomère dans S. pombe, une digestion par Apal des préparations d'ADN de génome de
S. pombe permet une analyse de longueur de télomère.
Ainsi, de l'ADN provenant de S. pombe a été soumis à digestion par Apal, et les produits de digestion ont été traités sur un gel de gélose et sondés à l'aide d'une sonde spécifique de séquence télomère pour déterminer si les télomères de cellules rompues de S. pombe étaient raccourcis. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 67. Il ressort clairement de ces résultats que la disruption du gène tezl a provoqué un raccourcissement
des télomères.
Q. Clonage et Caractérisation de Protéine de Télomérase Humaine et d'ADNc Dans le présent exemple, des renseignements sur la séquence des amino acides et des acides nucléiques ont été déterminés pour de la télomérase humaine. Des séquences homologues partielles ont été tout d'abord identifiées dans une recherche de type BLAST conduite à l'aide du peptide de 123 kDa de Euplotes et des séquences d'acides nucléiques, ainsi que des séquences de protéine de Schizosaccharomyces et d'ADNc correspondant (tezl). Les séquences humaines (également appelées "hTCP1.1") ont été identifiées sur un clone d'ADNc partiel (clone 712562). Les séquences provenant de ce clone ont été alignées avec les séquences
déterminées comme décrit dans les exemples précédents.
La figure 1 montre l'alignement de séquences de Euplotes ("pl23"), de Schizosaccharomyces ("tezl"), de Est2p (c'est-à-dire la protéine de S. cerevisiae codée par la séquence des acides nucléiques de Est2, et également désignée ici comme étant "L8543.12"), et l'homologue humain identifié dans cette recherche de comparaison. La figure 51 montre la séquence des amino acides de tezl, cependant que la figure 52 montre la séquence d'ADN de tezl. Sur la figure 52, les introns et autres régions non codantes sont montrés en minuscule, cependant que les exons (c'est-à-dire les régions
codantes) sont montrés en majuscule.
Comme montré sur les figures, il existe des régions qui sont hautement conservées parmi ces protéines. Par exemple, comme montré sur la figure 1, il existe des régions d'identité dans le "Motif O", le "Motif 1", le "Motif 2" et le "Motif 3". Les amino acides identiques sont indiqués par un astérisque (*), cependant que les restes d'amino acides similaires sont indiqués par un cercle ('). Cela indique qu'il existe des régions, au sein des motifs de télomérase, qui sont conservées parmi des eucaryotes très divers, allant de la levure à des ciliés et à des êtres humains. On envisage et suppose que d'autres organismes vont contenir également de telles régions conservées de la séquence. La figure 49 montre la séquence partielle des amino acides des motifs de télomérase humaine, cependant
que la figure 50 montre la séquence d'ADN correspondant.
On a utilisé un séquençage de type didésoxy de Sanger et d'autres procédés, tels qu'ils sont connus en pratique, pour obtenir des informations complètes de séquences du clone 712562. Certaines des amorces utilisées dans le séquançage sont présentées sur le tableau 7. Ces amorces ont été prévues pour se fixer par hybridation sur le clone, sur la base de la complémentarité des séquences, de la séquence charpente de plasmide ou de la séquence d'insert ADNc humain dans le clone. Tableau 7 - Amorces Amorces Séquence
TCP 1.1 GTGAAGGCACTGTTCAGCG
TCP1.2 GTGGATGATTTCTTGTTGG
TCP 1.3 ATGCTCCTGCGTTTGGTGG
TCP 1.4 CTGGACACTCAGCCCTTGG
TCPI.5 GGCAGGTGTGCTGGACACT
TCP1.6 lTTTGATGATGCTGGCGATG
TCP1.7 GGGGCTCGTCTTCTACAGG
TCPI.8 CAGCAGGAGGATCTTGTAG
TCP1.9 TGACCCCAGGAGTGGCACG
TCP 1.10 TCAAGCTGACTCGACACCG
TCP I.11 CGGCGTGACAGGGCTGC
TCP 1.12 GCTGAAGGCTGAGTGTCC
TCP 1.13 TAGTCCATGTTCACAATCG
A partir de ces expériences, il a été déterminé que l'insert EcoRI-NotI du clone 712562 contient seulement un cadre de lecture ouverte partiel pour la protéine de télomérase humaine, bien qu'il puisse coder pour un fragment actif de cette protéine. Le cadre de lecture ouverte dans le clone code pour une protéine d'environ 63 kD. La séquence du plus long cadre de lecture ouverte identifié est présentée sur la figure 68. Le cadre de lecture ouverte commence au codon ATG avec le "met" indiqué sur la figure. La queue de type poly A à l'extrémité 3' de la séquence est également montrée. La figure 69 montre un essai d'alignement préliminaire de protéine de transcriptase reverse de télomérase provenant de la séquence humaine (protéine 1 de noyau de télomérase humaine, "Hs TCP1"), de pl23 de E. aediculatus ("Ep p123), de tezl de S. pombe ("Sp Tezl"), de EST2 de S. cerevisiae (Sc Est2"), et d'une séquence de consensus. Sur cette figure, divers motifs
sont indiqués.
Pour obtenir un clone de pleine longueur, on a utilisé un sondage d'une bibliothèque d'ADNc et de '-RACE pour obtenir des clones codant pour des parties des régions précédemment non clonées. Dans ces expériences, on a utilisé "RACE" ("Rapid Amplification of cDNA Ends" [Amplification Rapide d'Extremité d'ADNc], voir par exemple, M.A. Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends dans Innis et ai. (eds), "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" [1990], pp. 28-38; et Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8998-9002 [1988]) pour engendrer de la matière pour une analyse de séquences. Quatre clones de ce genre ont été engendrés et ont servi à fournir des renseignements complémentaires sur la séquence en 5'
(pFWRP5, 6, 19 et 20).
En outre, des bibliothèques d'ADNc humain (inséré dans lambda) ont été sondées avec les fragments EcoRI-NotI du clone. Un clone lambda, appelé "lambda 25-1.1" (numéro d'accès ATCC 209024) a été identifié comme contenant des séquences complémentaires. La figure
montre une carte de restriction de ce clone lambda.
L'insert d'ADNc humain de ce clone a été sous-cloné comme fragment de restriction EcoRI dans le site de EcoRI de phagemidepBluescriptIISK+ disponible dans le commerce (Stratagene), pour créer le plasmide "pGRN121",
qui a été déposé à ATCC (numéro d'accès ATCC 209016).
Des résultats préliminaires ont indiqué que le plasmide pGRN121 contient la totalité de la séquence du cadre de lecture ouverte codant pour la protéine de télomérase humaine. L'insert de l'ADNc du plasmide pGRN121 a été séquencé à l'aide de techniques connues en pratique. La figure 70 montre un site de restriction et une carte de fonction du plasmide pGRN121 identifié sur la base de ce travail préliminaire. Les résultats de cette analyse préliminaire de séquence sont présentés sur la figure 71. A partir de cette analyse, et comme montré dans la figure 70, un site de départ supposé pour la région de codage a été identifié à environ 50 nucléotides du site EcoRI (situé en position 707), et les emplacements des motifs spécifiques de télomérase "FFYVTE", "PKP", "AYD", "QG" et "DD" ont été identifiés, en plus d'un site d'arrêt supposé au nucléotide n 3571 (voir figure 72, qui montre l'ADN et les séquences des amino acides correspondants pour les cadres de lecture ouverte dans la séquence ("a", "b" et "c"). Cependant, en raison de la nature préliminaire du premier travail de séquençage, on a constaté que les cadres de lecture ne sont en
alignement pour les divers motifs.
Une analyse supplémentaire conduite sur pGRN121 a indiqué que le plasmide contenait des portions importantes, depuis l'extrémité 5' de la séquence de codage, non présentes sur le clone 712562. En outre, on a trouvé que pGRN121 contenait une séquence codante
variante qui inclut un insert d'environ 182 nucléotides.
On a trouvé que cet insert est absent du clone. Comme dans le cas des séquences de E. aediculatus, de tels variants peuvent être soumis à des essais de recherche de fonction, comme des essais de recherche de télomérase pour déceler la présence de télomérase fonctionnel dans
un échantillon.
Une analyse supplémentaire de séquence a résolu la séquence d'ADNc de pGRN121 et a fourni un cadre contigu de lecture ouverte codant pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 127 000 daltons, et comportant 1132 amino acides, comme montré sur la figure 74. Une carte "raffinée" de pGRN121, sur la base de cette analyse, est montrée sur la figure 73. Les résultats d'une analyse supplémentaire de séquence de !'ADNc de hTRT sont présentés sur la figure 16 (SEQUENCE
ID N 1)
*EXEMPLE 2
CORRELATION ENTRE L'ABONDANCE DE HTRT ET
L'IMMORTALITE DES CELLULES
L'abondance relative de l'ARNm de hTRT (télomérase humaine) a été établie en six souches de cellules mortelles donnant un résultat négatif à la recherche de la télomérase et six lignées de cellules immortelles donnant un résultat positif à la recherche de la télomérase (figure 5). Le niveau en régime permanent de l'ARNm de hTRT a été nettement augmenté dans des lignées de cellules immortelles dont on a précédemment montré montré qu'elles comportaient de la télomérase active. De plus faibles taux ou niveaux de l'ARNm de hTRT ont été décelés dans certaines souches de cellules donnant un
résultat négatif à la recherche de la télomérase.
On a effectué une amplification en chaîne par polymérase pour hTRT, hTR, TP1 (protéine associée à la télomérase et apparentée à Tetrahymena p80 [Harrington et al., 1997, Science 275:973; Nakayama et al., 1997, Cell 88:875]) et GAPDH (pour normaliser pour des quantités égales de gabatit d'ARN) sur de l'ARN provenant des cellules suivantes: (1) des fibroblastes GFL de poumon de foetus humain; (2) des fibroblastes GFS de la peau de foetus humain; (3) des fibroblastes 31 YO de stromal de prostate d'adulte; (4) des fibroblastes HS de synovie de genou de foetus humain; (5) des fibroblastes BJ de prépuce néonatal; (6) des fibroblastes IMR90 de poumon de foetus humain, et des lignées de cellules immortalisées; (7) LOX IMVI de mélanome; (8) U251 de leucémie; (9) carcinome de poumon NCI H23; (10) adénocarcinome SW620 de colon; (11) MCF7 de tumeur du sein; (12) lignée de cellules de rein embroyonnaire humain ayant subi une transformation E1
par de l'adénovirus 293.
De l'acide nucléique hTRT (de télomérase humaine) a été amplifié à partir d'ADNc, en utilisant des amorces LT5 et LT6 de type oligonucléotide (tableau 2) sur un
total de 31 cycles (94 C, 45s; 60 C, 45s; 72 C, 90s).
GAPDH a été amplifié à l'aide d'amorces K136 (5'- CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) et K137 (5'-ATGATCTTGAGGCTT GAGGCTGTTGTCATA) pour un total de 16 cycles (94 C, 45s; 55 C, 45s; 72 C, 90s). hTR a été amplifiée à l'aide d'amorces F3b (5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) et R3c (5'-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) pour un total de 22 cycles (94 C, 45s; 55 C, 45s; 72 , 90s). De l'ARNm de TP1 a été amplifié à l'aide d'amorces TP1.1 et TP1.2, sur 28 cycles (les cycles étant les mêmes que pour hTRT). Les produits de réaction ont été résolus sur un gel à 8% de polyacrylamide, colorés avec du vert SYBR (sondes moléculaires) et visualisés par balayage sur un appareil "Storm860" (Molecular Dynamics). Les résultats présentés sur la figure 5 ont montré que les taux d'ARNm de hTRT sont en corrélation directe avec les niveaux ou taux d'activité de télomérase dans les cellules soumises
aux essais.
EXEMPLE 3
CARACTERISATION D'UNE SEQUENCE D'INTRON DE hTRT On a tout d'abord identifié un intron supposé, par amplification en chaîne par polymérase d'ADN de génome humain, comme décrit dans le présent exemple, et cela a été ensuite confirmé par séquençage du clone de génome XGD5 (voir l'exemple 4). Une amplification en chaine par polymérase a été effectuée à l'aide de la sonde avant TCP1.57, appariée individuellement avec les sondes reverses TCP1.46, TCP1.48, TCO1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 et TCP1.58 (voir le tableau 2). Les produits provenant d'amplifications d'ADN de génome de TCP1.57/TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54 ou TCP1.56, étaient plus grands d'environ 100 paires de
bases que les produits des amplifications de pGRN121.
L'amplification de TCP1.57/TCP1.58 a été la même sur l'ADN de génome ou sur l'ADN de pGRN121. Cela a indiqué que l'ADN de génome contenait une insertion entre les sites correspondant à TCP1.58 et à TCP1.50. Les produits de l'amplification de TCP1.57/TCP1.50 et de TCP1.57/TCP1.52 ont été séquencés directement, sans sous-clonage, à l'aide des amorces TCP1.39, TCP1.57 et
TCP1.49.
Comme montré ci-après, la séquence d'intron de 104 bases (SEQUENCE ID N 7) est insérée dans l'ARNm de hTRT (montré en gras)â la jonction correspondant aux bases 274 et 275 de la figure 16:
CCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAG/GTGGGCCTCCCCGGGGTCGGCGTCCGGCTG
GGGTTGAGGGCGGCCGGGGGGAACCAGCGACATGCGGAGAGCAGCGCAGGCGACTCA
GGGCGCTTCCCCCGAG/GTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGGTGGCCCGAGTGCTGCAG
Le "/" indique les jonctions d'épissures; la séquence montre de bonnes correspondances avec les séquences de sites d'épissures de consensus 5' et 3', typiques pour
des introns humains.
Cet intron contient des motifs caractéristiques d'un site de clivage par topoisomérase II et un site de liaison NFkB (voir figure 21). Ces motifs sont intéressants, en partie, parce que l'expression de la topoisomérase II est régulée dans la plupart des tumeurs. Elle a pour rôle de relâcher l'ADN par coupure et réenroulement de l'ADN, en augmentant ainsi l'expression de gènes particuliers. On a montré que des inhibiteurs de la topoisomérase II agissent comme des agents anti-timeur. Dans le cas de NFkB, le facteur de transcription peut jouer un rôle dans la régulation de la télomérase au cours de la différenciation terminale, comme dans une répression précoce de télomérase au cours du développement et ainsi constitue une autre cible pour une intervention thérapeutique en vue de réguler
l'activité de télomérase dans des cellules.
EXEMPLE 4
CLONAGE DU PHAGE LAMBDA G(P5 ET CARACTERISATION DES
SEQUENCES DE GENOME DE TYPE hTRT A. Lambda G(5 Une bibliothèque d'ADN de génome humain a été passée en revue et examinée par amplification en chaîne par polymérase et par hybridation pour identifier un clone de génome contenant des séquences de codage d'ARN de type hTRT. La bibliothèque était une bibliothèque de génome de fibroblastes humains obtenue à l'aide d'ADN provenant de cellules de type fibroblaste de poumon WI38 (Stratagene, numéro de catalogue 946204). Dans cette bibliothèque, des fragments partiels Sau3AI sont fixés par ligation dans le site Xhol du vecteur Lambda FIX II
(Stratagene), avec un site d'insert de 9-22 kb.
La bibliothèque de génome a été divisée en des groupes de 150 000 phages chacun, et chaque groupe a été soumis à un examen de dépistage par amplification en chaîne par polymérase avec emboîtement (paire d'amorces extérieures TCP1.52 et TCP1.57; paire intérieure TCP1.49 et TCP1.50, voir le tableau 1). Ces paires d'amorces recouvrent un intron supposé (voir l'exemple 3 ci-dessus) dans l'ADN de génome de hTRT et ont garanti que le produit de l'amplification provenait d'une source de génome et non pas d'une contamination par le clone d'ADNc de hTRT. Des groupements positifs ont été encore
subdivisés jusqu'à obtention d'un groupe de 2000 phages.
Ce groupe a été étalé sur plaque, en faible <tensité, et examiné par dépistage à l'aide d'une hybridation avec un fragment d'ADN englobant 1552-2108 paires de bases de la figure 16 (sites de restriction SphI et EcoRV, respectivement). Deux clones positifs ont été isolés et réexaminés par dépistage à l'aide d'une amplification en chaîne par polymérase avec emboîtement, comme décrit ci-dessus, les
deux clones étaient positifs selon cette amplification.
L'un des deux clones (kG05) a été soumis à digestion avec NotI, ce qui a révélé une taille d'insert d'environ 20 kb. Une cartographie subséquente (voir ci-après) a indiqué que la taille de l'insert était de 15 kb et que le phage G15 contient environ 13 kb d'ADN en amont du
site de départ de la séquence d'ADNc.
Le phage GP5 a été cartographié par digestion à
l'aide d'une enzyme de restriction et séquençage d'ADN.
La carte résultante est présentée sur la figure 7. L'ADN de phage a été soumis à digestion avec NcoI et des fragments clonés en pBBS167. Les sous-clones résultants ont été examinés par dépistage par amplification en chaîne par polymérase pour identifier ceux contenant la
séquence correspondant à la région 5' de l'ADNc de hTRT.
Un sous-clone (pGRN140), contenant un fragment NcoI de 9 kb (avec séquence de gène de hTRT et séquence de vecteur lambda de 4-5 kb) a été partiellement séquencé pour déterminer l'orientation de l'insert. pGRN140 a été soumis à digestion à l'aide de SalI pour enlever les
séquences de vecteur lambda, ce qui a abouti à pGRN144.
pGRN144 a été ensuite séquencé. Les résultats du séquençage sont présentés sur la figure 21. L'extrémité 5' de l'ARNm de hTRT correspond à la base 2441 de la figure 21. Comme indiqué sur la figure 7, deux éléments à séquence Alu sont situés à 1700 paires de base en amont de l'extrémité 5' d'ADNc de hTRT et ces éléments fournissent une limite probable en amont de la région de promoteur de hTRT. La séquence révèle également un intron placé aux bases 4173 de la figure 21, en 3' par
rapport à l'intron décrit à l'exemple 3 ci-dessus.
B. Clones Supplémentaires de Génome En plus du clone de génome décrit cidessus, il y a deux clones de bactériophage Pi et un clone BAC humain, comme exemple de forme de réalisation de l'invention. Les inserts P1 comportent habituellement 75 à 100 kb (kb), et les inserts BAC comportent
habituellement plus de 100 Kb.
Les clones P1 (DMPC-HFF n l(477(F6)-GS n 15371 et DMPC-HEF n 11103(H6)-GS n 15372) ont été obtenus par examen par dépistage par amplification en chaîne d'une bibliothèque de P1 humain provenant de cellules fibroblastes de prépuce humain (Shepherd et al., 1994, PNAS USA 91:2629), avec utilisation des amorces TCP1.12 et UTR2, qui amplifient l'extrémité 3' de hTRT. Ces clones étaient tous deux négatifs (ne réussissaient pas à subir une amplification) avec des amorces qui amplifient l'extrémité 5' de hTRT (télomérase humaine) Le clone BAC humain (326E 20) a été obtenu avec un examen par dépistage par hybridation d'une bibliothèque de génome humain BAC, en utilisant un fragment de 1143 paires de bases Sphl/Xmnl de pGRN121 (figure 16; bases 1552-2695), qui englobent la région de motif RT. On pense que le clone inclut l'extrémité 5' du gène. On pense que, dans cet exemple, les clones de génome de
type hTRT englobent la totalité du gène hTRT.
EXEMPLE 5
EMPLACEMENT CHROMOSOMIQUE DU GENE hTRT Le gène de hTRT a été situé sur Sp de chromosome par cartographie d'hybride par rayonnement (Boehnke et al., 1991, Am. J. Hum. Genet. 49:1174; Walter et al., 1994, Nature Genet 7:22), en utilisant le panneau Stanford G3 à résolution moyenne de 83 clones RH du génome humain entier (créé au "Stanford Human Genome Center). Une lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines (donneur: rM) a été exposée à 10 000 rads de rayons X et a été ensuite soumise à fusion avec des cellules réceptrices de hamster non irradiées (A3). On a isolé 83 clones hybrides indépendants de cellules somatiques, et chacun représente un événement de fusion entre une cellule
de donneur irradiée et une cellule d'hamster récepteur.
Le panneau d'ADN G3 a servi à ordonner des marqueurs dans la région intéressante ainsi qu'à établir la
distance entre ces marqueurs.
Des amorces utilisées pour la cartographie RH ont été TCPl.12 et UTR2, avec comme conditions d'amplification 94 C durant 45 sec, 55 C durant 45 sec, 72 C durant 45 sec, pendant 45 cycles en utilisant du
tampon Taq. de Boehringer Mannheim et Taq de Perkin-
Elmer. Les 83 ensembles ont été amplifiés indépendamment et 14 (17%) se sont avérés positifs pour hTRT (par l'apparition d'une bande de 346 paires de bases). Les résultats de l'amplification ont été soumis à un serveur Stanfort RH, qui a fourni l'emplacement de la carte, 5p,
et le marqueur le plus voisin, STS D5S678.
L'interrogation du site de "web" de cartographie de génome Genethon a indiqué l'emplacement de cartes identifiées comme étant YAC contenant le marqueur STS D5S678: CEPH YAC 780_C_3 taille: 390 660 kb. Ce YAC contient également 17 marqueurs de chromosome. Ce résultat a indiqué que le gène de hTRT se trouve sur le chromosome 5, près de l'extrémité de télomère. Il y a un nombre accru d'exemplaires de 5p dans un certain nombre de tumeurs. Le syndrome de "cri-du-chat" a également été cartographié pour indiquer des délétions dans cette région.
EXEMPLE 6
CONCEPTION ET CONSTRUCTION DE VECTEURS POUR L'EXPRESSION
DE PROTEINES ET DE POLYNUCLEOTIDES DU TYPE hTRT Expression de hTRT dans des Bactéries La partie suivante du présent exemple détaille la conception de bactéries exprimant hTRT et de vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes pour produire de grandes quantités de hTRT biologiquement active et de pleine longueur. La formation de la protéine hTRT biologiquement active, de cette manière, est utile pour des essais de reconstitution de télomérase, des essais de détection de modulateurs d'activité de télomérase, l'analyse de l'activité d'espèces nouvellement isolées de hTRT, l'identification et l'isolement de composés qui s'associent spécifiquement à hTRT, l'analyse de l'activité d'une protéine variante de hTRT qui a subi une mutation spécifique au site, et à titre d'immunogène, pour ne citer qu'un petit nombre
d'exemples.
Vecteur d'Expression Bactérienne pThioHis A/hTRT Pour produire de grandes quantités de hTRT de pleine longueur, le vecteur d'expression bactérienne pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA, Etats-Unis
d'Amérique) a été choisi comme système d'expression.
L'insert codant pour hTRT inclut des nucléotides 707 à 4776 de l'insert hTRT dans le plasmide pGRN121. Cette séquence de nucléotides inclut la séquence de codage
complet de la protéine hTRT.
Ce vecteur d'expression de l'invention est destiné à l'expression inductible dans des bactéries. Le vecteur peut être induit pour, exprimer, dans E. coli, des niveaux ou taux élevés d'une protéine de fusion composée d'un fragment de thiorédoxine marquée HIS et clivable,
et une protéine de type hTRT de pleine longueur.
L'utilisation du système d'expression a été réalisée en
accord substantiel avec les instructions du fabricant.
La séquence des amino acides de la protéine de fusion introduite par codage par le vecteur résultant de l'invention est présentée ci-après; (-*-) désigne un site de clivage d'entérokinase:
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAHWCGPC'KMIAPILDEIADEYQGKLTVAK
LRIDHNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGDD
DDK- * -VPMHELEIFEFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHY
REVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSC
LKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGG P PEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGS
GAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASG
PRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTP
VGQGSWA.UHPGRTRC-GPSDRGFCVS P.SRPAP E EA- SLEGALSGTRHSIHPSVGRQH1EAGPP
STSRPPRPWDTPCPPVYAET'KHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFL
GSRPWMPGTPRRLPRLPQRY'WQMRPLFLELLGN}-LAQCPYGVLLLKTHCPLRAAVTPAAG
VCARE:KPQGSVA APEEED'mDPRRLVQLLRQHSSP WQVYGr V.PACLRRLVP PGLWGSRH NERRFLRNTTKKFr I S LGK(AKLSLQELTWKMSVRDCAWILRRS PGVGCVPkAEHRLREE I l _. KF _:-5.F[,-S-r"rZVELR.S F-,ezYTFQKNiRLFYR.KS WS KL QS IG?.QP'-RV"?QL RELS EAEVRQHRE.AR PALLTSRLRF I PKPDGLRP I ViM<DY%-VGARTFRRE KPAERLTS RVKAL FSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVD"vT GAYDT I PQDRLTEV iAS I K PQNTYCVRRYAVWQK KAGPY'.H%.AAFKS-gSSTLTDLQPY
MRQFVAHLQETS PLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRRFMCCHHAVRIRGKSYVQCQG
IPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTLLAKTFLRTLV
RGVP EYGCCVVNLRKTVVNF PVEDEALGGTAFVQMIPAH.GLF FPrCGLLLDTRTLEVQSDY SS YARTS T RASLTFNRGrFKAGRN<4RRKLFGVLRLKCH-SLFLDLQVNSLQTVCTNIYKI LLLQAYRFriACVLQLPFHQQVW<NPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKG.AA
GPLPS EAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAAN
PALPSDFKTILD
pGEX-2TK avec des nucléotides de type hTRT 3272 à 4177 de pGRN121 Cette construction de l'invention sert à produire de la protéine de fusion pour, par exemple, obtenir des anticorps polyclonaux et monoclonaux de la protéine de type hTRT. Des fragments de hTRT peuvent également servir à d'autres fins, par exemple pour moduler une activité de télomérase, par exemple comme mutants dominante négative ou pour éviter l'association d'un composant télomérase avec d'autres protéines ou d'autres
acides nucléiques.
Pour produire de grandes quantités d'un fragment protéinique de type hTRT, on a choisi le vecteur d'expression dans E. coli pGEX-2TK( Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J, Etats-Unis d'Amérique) et on a utilisé ce vecteur essentiellement selon les instructions du fabricant pour obtenir un vecteur d'expression selon l'invention. La construction résultante contient un insert provenant des nucléotides 3272 à 4177 de l'insert hTRT dans le plasmide pGRN121. Le vecteur dirige l'expression dans E. coli de taux ou niveaux élevés d'une protéine de fusion composée d'une séquence de glutathion-S-transférase (souligné ci-après), d'une séquence de clivage de thrombine (double soulignement), d'une séquence de reconnaissance de protéine kinase de muscle cardiaque (en italique), des restes introduits par clonage (entre crochets (GSVTK]) et d'un fragment de protéine de hTRT (en gras), comme montré ci-après: MS P!.GYWKI:KGLVOPTRLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELLEF- PNLPVpy
!DGDVKLTOSMA IIRYIADKHMLGGCPKEREISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFE
TLKvFLSKLPEMLCE FEDRLCHKTYTLNGDDVTHPDFMLYDALDVVL'MDPMCLDAFP KLVCFKKRiEAIPOTDKYLKSSKYViAWPLOGWOATGGGDHPPKSDLVPRGSRPASV[
GSVTK]IPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKT
FLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLILLDTRTL
EVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVC
TNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSL
GAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTA
LEAAANPALPSDFKTILD
Quand cette protéine de fusion a été exprimée, elle a formé des agrégats insolubles. Elle a été traitée généralement comme décrit ci-dessus, dans la section intitulée purification de protéines provenant de corps d'inclusion. Plus particulièrement, des cellules induites ont été mises en suspension dans PBS (20 mM de phosphate de sodium, pH 7, 4; 150 mM NaCl) et elles ont
été soumises à rupture par traitement aux ultrasons.
"NP-40" a été ajouté en une proportion de 0,1%, et le mélange a été mis à incuber durant 30 minutes à 4 C avec mélangeage modéré. La matière insoluble a été collectée par centrifugation à 25 000 G durant 30 minutes à 4 C. La matière insoluble a été lavée une fois dans de l'urée 4M dans PBS, collectée par centrifugation, puis lavée à nouveau dans PBS. On a estimé que le culot ainsi
collecté contenait plus de 75% de protéine de fusion.
Cette matière a été séchée sous un vide poussé, puis mise en suspension dans de l'adjuvant pour injection à des souris et à des lapins en vue de la formation d'anticorps. La séparation de la protéine recombinante par rapport au fragment glutathion-S-transférase est réalisée par protéolyse spécifique du site, en utilisant
de la thrombine sur les instructions du fabricant.
pGEX-2TK avec des Nucléotides de type hTRT 2426 à 3274 de pGRN121 avec marquage par HIS-8 Pour produire de grandes quantités d'un fragment de hTRT, on a préparé une autre construction pGEX-2TK comme vecteur d'expression dans E. coli. Cette construction contient un insert provenant des nucléotides 2426 à 3274 de l'insert hTRT dans le plasmide pGRN121 et une séquence codant pour huit restes consécutifs d'histidine (marquage par HIS-8). Pour insérer cette marque HIS-8 TAG, le vecteur pGEX-2TK comportant des nucléotides hTRT 2426 à 3274 de pGRN121 a été linéarisé avec BamH1. Cela a ouvert le plasmide à la jonction entre la protéine kinase de muscle cardiaque GST-thrombine et la séquence de codage de hTRT. Un oligonucléotide à double brin, comportant des extrémités compatibles avec BamH1, a été fixé par ligature au plasmide linéarisé, ce qui a abouti à l'introduction dans le cadre de huit restes histine en amont de la
séquence hTRT.
Le vecteur dirige l'expression, dans E. coli, de taux élevés d'une protéine de fusion composée d'une séquence de glutathion-S- transférase (soulignée); d'une séquence de clivage de thrombine (double soulignement); d'une séquence de reconnaissance de protéine kinase de muscle cardiaque (en italique); un groupe de trois et un groupe de cinq restes introduits par clonage figure entre crochets ([GSV] et [GSVTK]); huit histidines consécutives (également soulignée en double) et un fragment de protéine hTRT (en gras):
MSPILGYWK]KGLVOPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFP
NLPYYIDGDVKLTOSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEiSMLEGAVLD[RYGVS RIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDAL
DVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPOIDKYLKSSKY1AWPLOGWOATFGG GDHPPKSDLVPRGSRRA4SIGSV]HHHHHHHH[GSVTK]MSVYVVELLRSFFYV TETTFQK. NRLFFYPSV SKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARP ALLTSRLRFIP KPDGLRPIVNMDYVVG ARTFRREKRAERLTS RVKALFSVL30 NYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTG AYDTIP Q DRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQ KAAHG HVRKAFKSHVSTL
TDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHA VRIRGKSYVQCQGI
Chacun des vecteurs de pGEX-2TK de l'invention peut servir à produire de la protéine de fusion dans le but de la formation d'anticorps polyclonaux et monoclonaux de la protéine hTRT. En outre, cette protéine de fusion peut servir à purifier par affinité des anticorps obtenus par rapport à des peptides de type hTRT qui sont englobés dans la protéine de fusion. Une séparation de la protéine recombinante d'avec le fragment glutathion S-transférase peut être réalisée par protéolyse spécifique de site en utilisant de la
thrombine selon les instructions du fabricant.
pGEX-2TK avec les nucléotides de type hTRT 2426 à 3274 de pGRN121, pas de marquage par HIS-8 Pour produire de grandes quantités de hTRT, on a préparé une autre construction pGEX-2TK de vecteur
d'expression E. coli.
Cette construction contient un insert provenant des nucléotides 2426 à 3274 de l'insert hTRT dans le plasmide pGRN121, mais sans le marquage HIS-8 de la construction décrite ci-dessus. Le vecteur dirige l'expression dans E. coli de taux élevé d'une protéine de fusion composée de glutathion-S-transférase (soulignée), d'une séquence de clivage par de la thrombine (double soulignement), d'une séquence de reconnaissance de protéine kinase du muscle cardiaque (en italique), de restes introduits par clonage (entre crochets ([GSVTK]) et d'un fragment de protéine de type hTRT (en gras):
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AHLQETS PLRDAVVWIEQS S SLNEASGLFDVFLRFMCHiAVRIRGKSYVQCQGI pGEX-2TK avec des Nucléotides de type hTRT 1625 à 2458 de pGRN121 Pour produire de grandes quantités d'un fragment de protéine de type hTRT, on a préparé une autre
construction pGEX-2TK de vecteur d'expression dans E. coli.
Cette construction contient un insert provenant des nucléotides 1625 à 2458 de l'insert hTRT dans le plasmide pGRN121. Le vecteur dirige l'expression dans E. coli de taux élevés d'une protéine de fusion composée de glutathion-S-transférase (soulignée), d'une séquence de clivage par thrombine (double soulignement), d'une séquence de reconnaissance de protéine kinase de muscle cardiaque (en italique), de restes introduits par clonage (entre crochets ([GSVTK]) et d'un fragment de protéine de type hTRT (en gras):
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S pGEX-2TK avec le nucléotide de type hTRT 782 à 1636 de pGRN121 Pour produire de grandes quantités d'un fragment de protéine de type hTRT, on a préparé une autre
construction pGEX-2TK de vecteur d'expression dans E. coli.
La construction contient un insert provenant des nucléotides 782 à 1636 de l'insert hTRT dans le plasmide pGRN121. Le vecteur dirige l'expression dans E. coli de taux élevés d'une protéine de fusion composée de glutathion-S-transférase (soulignée), d'une séquence de clivage par de la thrombine (double soulignement), d'une séquence de reconnaissance de protéine kinase de muscle cardiaque (en italique), de restes introduits par clonage, (entre crochets ([GSVTK]) et d'un fragment de protéine de type hTRT (en gras): ISPILG'YrKI KGLVOPTRLLLEYLE EYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGL-EFDNLPYY EDGDVKLTOST4AIRY!AKH LG GCPKEESMLEGAVLDIRYGVSRiAYSKDF
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pT7FLhTRT avec de l'ADNc de hTRT sans séquence de non-codage en 5' Comme décrit ci-dessus, dans une forme de réalisation, l'invention propose une hTRT qui est modifiée d'une manière spécifique à du site pour faciliter le clonage dans des vecteurs d'expression dans des bactéries,des mammifères, de la levure et des insectes, sans aucune séquence hTRT non translatée en 5'. Dans certaines circonstances, la réduction a son minimum de la quantité de la séquence ne codant pas pour de la protéine permet d'améliorer la production de protéine (d'améliorer le rendement) et d'augmenter la stabilité de l'ARNm. Dans cette forme de réalisation de l'invention, la région de non-codage en 5' du gène hTRT
a été enlevée avant clonage dans un vecteur d'expres-
sion dans une bactérie (vecteur "bactérien"). Cela a été réalisé en créant un site supplémentaire pour de l'endonucléase de restriction juste en amont (5') du codon de départ (ATG) de la séquence codant pour hTRT (figure 16). La création d'un site de restriction juste en 5' de la région de codage de la protéine permet une production efficace de vecteurs très divers, qui codent pour des protéines de fusion, comme des protéines de fusion comprenant des marques et des marquages "TAG" de peptide, pour de
l'immunodétection et de la purification.
Plus particulièrement, l'oligonucléotide 'CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3' a servi comme décrit ci-dessus pour modifier Les nucléotides 779 à 781 d'ADNc de hTRT (figure 16) de GCG vers CAT. Ces 3 nucléotides sont les derniers nucléotides avant le codon de départ ATG, de sorte qu'ils ne modifient pas la séquence protéinique. La modification de séquence aboutit à la création d'un site unique de restriction NdeI dans l'ADNc de hTRT. On a utilisé de 1'ADN de type hTRT à simple brin comme source d'ADN pour la mutagénèse visant le site. Le plasmide résultant a été séquencé
pour confirmer le succès de la mutagénèse.
Cette modification a permis la construction du plasmide suivant de l'invention, appelé pT7FLhTRT. La séquence de hTRT modifiée spécifiquement pour le site (addition du site de restriction NdeI) a été soumise à digestion avec NdeI et NotI pour engendrer un fragment d'acide(s) nucléique(s) codant pour hTRT. Le fragment a ensuite été cloné dans un plasmide pSL3418 préalablement soumis à digestion de restriction avec NdeI et SmaI (qui
est également un organe de coupure à extrémité franche).
pSL 3418 est un plasmide pAED4 modifié dans lequel une séquence de marquage ("FLAG") (Immunex Corp, Seattle WA, Etats-Unis d'Amérique) et une séquence d'entérokinase sont insérées juste en amont du site NdeI précité. Le plasmide appelé pT7FLhTR permet l'expression de hTRT de pleine longueur (avec une marque à son extrémité 5') dans une souche de E. coli exprimant la polymérase
ARN T7.
Plasmides avec de l'ADNc de hTRT sans Séquence de non-
codage en 3' Comme étudié ci-dessus, l'invention prévoit des vecteurs d'expression contenant des acides nucléiques codant pour TRT et dans lesquels certaines ou toutes les
séquences non-codantes ont été enlevées par délétion.
Dans certaines circonstances, la réduction à son minimum de la quantité deséquences ne codant pas pour de la protéine permet une meilleure production de protéine (un
meilleur rendement) et augmente la stabilité de l'ARNm.
Dans cette forme de réalisation de l'invention, la région non translatée en 3' de hTRT est enlevée par délétion avant clonage dans un plasmide d'expression
dans une bactérie.
Le plasmide pGRN121, contenant l'ADNc de type hTRT de pleine longueur, comme étudié ci-dessus, a été tout d'abord débarrassé par délétion de la totalité des sites Apal. Cela a été suivi de la délétion du fragment sensible à une enzyme de digestion et de restriction de type hTRT MscI-HincII contenant le 3'UTR. Le fragment sensible à une digestion de restriction par NcoI-XbaI, contenant le codon d'arrêt de type hTRT, a été ensuite inséré dans le site de NcoI-XbaI de pGRN121 pour obtenir un plasmide équivalant à pGRN121, appelé pGRN124, sauf
l'absence de 3'UTR.
Vecteurs d'Expression dans des bactéries,utilisant des Marqueurs de Sélection par des Antibiotiques L'invention propose également des vecteurs d'expression dans des bactéries,pouvant contenir des marqueurs de sélection pour conférer un phénotype choisissable à des cellules transformées et à des séquences codant pour un entretien épisomique et uneréplication de sorte qu'une intégration dans le génome de l'hôte n'est pas nécessaire. Par exemple, le marqueur peut coder pour une résistance à de l'antibiotique, notamment une résistance à du chloramphénicol (voir Harrod (1997) Nucleic Acids Res. 25:1720-1726), à de la kanamycine, à G418, à de la bléomycine et à de l'hydromycine, pour permettre la sélection de cellules transformées ayant la séquence d'ADN voulue, voir, par exemple, Blondelet-Rouault (1997) Gene 190:315-317 et Mahan (1995) Proc. Natl Acad
Sci USA 92:669-673.
Dans une forme de réalisation de l'invention, la hTRT de pleine longueur a été clonée dans un vecteur qui est un plasmide BlueScript modifié (Stratagene, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique), appelé pBBS235, dans lequel un gène de résistance à l'antibiotique chloramphénicol a été inséré. Le fragment NotI de pGRN124 (décrit ci- dessus), contenant l'ORF de type hTRT dans le site NotI de pBBS235, de sorte que l'ORF de type TRT se trouve dans une orientation opposée du promoteur Lac de vecteur. Cela fait un plasmide convenant pour une mutagénèse d'insert de plasmide, comme des acides nucléiques de type TRT de l'invention. Cette construction de plasmide, appelée pGRN125, peut servir dans les procédés de l'invention impliquant une mutagénèse de l'enzyme télomérase et des séquences codant pour de la protéine TRT et pour une transcription "in vitro" de hTRT, utilisant le promoteur T7 (et la transcription in vitro de hTRT antisens en utilisant le
promoteur T3).
Dans une autre forme de réalisation de l'invention, des fragments de digestion par l'enzyme de restriction NotI de pGRN124 contenant l'ORF hTRT ont été
sous-clonés dans le site de NotI de pBBS235 (décrit ci-
dessus), de sorte que l'ORF TRT se trouve dans la même orientation que le promoteur Lac de vecteur. Cela donne un plasmide, appelé pGRN126, pouvant servir pour l'expression de hTRTde pleine longueur dans E. coli. Le produit exprimé va contenir 29 amino acides introduits par codage par le vecteur pBBS235, suivis de 18 amino acides introduits par codage par l'UTR 5' de hTRT, ce qui est suivi de la protéine de type hTRT de pleine
longueur.
Dans une autre forme de réalisation de l'invention, une mutagénèse "in vitro" de pGRN125 a été effectuée pour convertir le codon ATG d'amorçage de hTRT en une séquence de consensus de Kozak et créer des sites de digestion de restriction par EcoRI et BgIII afin de faciliter le
clonage dans des vecteurs d'expression.
L'oligonucléotide 5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAatt CcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3'(les nucléotides altérés sont indiqués en minuscule) a servi dans le mode opératoire de mutagénèse. Le vecteur d'expression
résultant a été appelé pGRN127.
Dans une autre forme de réalisation de l'invention, le second Asp du "motif DD" de TRT a été converti en une alanine pour créer une enzyme télomérase non fonctionnelle, en créant ainsi une protéine mutante de type TRT destinée à servir de mutant dominant/négatif. La séquence de codage hTRT a été soumise à mutagénèse "in vitro", en utilisant l'oligonucléotide 5'- CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcg TTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3' pour convertir le codon asparagine pour le reste 869 (Asp869) en un codon alanine (Ala). Cela a également créé un site d'enzyme de restriction MluI. Le plasmide d'expression résultant a été appelé pGRN130, qui contient également la séquence de consensus de Kozak, comme décrit pour pGRN127. L'invention propose également un vecteur conçu
pour exprimer un fragment de séquence antisens de hTRT.
Le plasmide pGRN126 a été découpé jusqu'à complétion avec les enzymes de restriction MscI et SmaI et soumis à nouvelle ligation pour perdre par délétion plus de 95% de l'ORF de type hTRT. Un fragment de SmaI-MscI a été réinséré au cours de l'opération pour recréer une activité CAT. Ce plasmide non purifié a été ensuite soumis à nouvelle digestion avec SalI et EcoRI et le fragment contenant le codon d'amorçage de l'ORF de type hTRT a été inséré dans les sites SalI-EcoRI de pBB212 pour produire un plasmide d'expression antisens exprimant la séquence antisens couvrant la 5'UTR et les restes de 73 paires de bases de l'ORF de type hTRT dans des cellules de mammifère. Ce plasmide a été appelé pGRN135. Expression de Télomérase de type hTRT dans de la Levure La présente invention propose également des vecteurs d'expression dans de la levure,exprimant hTRT pour produire de grandes quantités de hTRT biologiquement
actives et de pleine longueur.
Vecteur d'Expression pBICZ B de hTRT de pleine longueur
dans Pichia pastoris.
Pour produire de grandes quantités de hTRT
biologiquement actives et. de pleine longueur,le vecteur d'expres-
sion dans Picha pastoris, pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique) a été choisi. L'insert formant séquence de codage de hTRT provenait des nucléotides 659 à 4801 de l'insert de type hTRT dans le plasmide pGRN121. Cette séquence de nucléotide inclut la séquence de pleine longueur codant pour hTRT. Ce vecteur d'expression est conçu pour une expression inductible dans P-pastoris de taux élevés d'une protéine de type hTRT non modifiée, de pleine longueur. L'expression est pilotée par un promoteur dans de la levure, mais la séquence exprimée utilise les codons d'amorçage et de terminaison de type hTRT. Des codons exogènes n'ont pas été introduits par le clonage. Le vecteur B/hTRT de type
pPICZ résultant a servi à transformer la levure.
Vecteur d'Expression hTRT/His6/pPICZ B dans Pichia iDastoris. Un second vecteur d'expression de l'invention dans Pichia pastoris, provenant de pPICZ B, contient également la séquence de pleine longueur codant pour hTRT provenant des nucléotides 659 à 4801 de l'insert de type hTRT dans le plasmide pGRN121. Ce vecteur d'expression hTRT-His6/pPICZ B code pour la protéine de type hTRT de pleine longueur fusionnée à son extrémité C à l'épitope Myc et aux séquences de marquage de rapporteur His6. Le codon a'arrêt de hTRT a été enlevé et remplacé par des séquences de vecteur codant pour l'épitope Myc et la marque de rapporteur His6 ainsi qu'un codon d'arrêt. Ce vecteur est conçu pour diriger dans de la levure une expression inductible à un haut niveau de protéine de fusion suivante, qui consiste en une séquence de type hTRT (soulignée), des séquences de vecteur (entre croches ([L) et [NSAVD]), l'épitope Myc (double soulignement), et la marque His6 (en italique)
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPOGRLVORQGDPAAFRALVA
OCLVCVPWDA RPPPAAPSFROVSCLKELVARVLORLCERGAKNVLAFGFALL
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NM'\DYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIH
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KTVVNFPVEDEALGGTAFVMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSI
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AGPLPSEAVQWLCHOAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQOTOLSRKLPGCTTLTA
LE.,\AANP.ALPSDFKTILD[L]EQKLISEEDLrSAVD]HHHHHH Expression de hTRT dans des Cellules d'Insectes La présente invention procure également des vecteurs d'expression, dans des cellules d'insectes, de la télomérase de type hTRT, ces vecteurs produisant de grandes quantités de hTRT biologiquement actives et de
pleine longueur.
Baculovirus, Vecteur d'Expression pVL1393 de hTRT de pleine longueur La séquence codant pour la télomérase et qui est intéressante a été clonée dans le vecteur d'expression,
baculovirus, pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA, Etats-
Unis d'Amérique). Cette construction a été ensuite cotransfectée dans des cellules de Spodoptera fungupeida (sf-9) avec de l'ADN linéarisée provenant de virus de
polyédrose nucléaire Autograph california (Baculogold-
AcMNPV). Les baculovirus recombinants ainsi obtenus ont été par la suite purifiés sur plaque et soumis à
expansion selon des protocoles habituels.
Ce vecteur d'expression permet, dans des cellules d'insectes, l'expression de taux élevés d'une protéine de type hTRT de pleine longueur. L'expression est entraînée ou pilotée par un promoteur de type gène de polyédrine de baculovirus. Il n'y a pas eu
d'introduction, par le clonage, de codons exogènes.
Vecteur d'Expression, Baculovirus pBlueBacHis2 B/de hTRT de pleine longueur Pour produire de grandes quantités de hTRT (télomérase humaine), biologiquement actives et de pleine longueur, le vecteur d'expression baculovirus, pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique) a été choisi comme source d'éléments témoins. L'insert codant pour hTRT a consisté en les nucléotides 707 à 4776 de l'insert de type hTRT dans le
plasmide pGRN121.
Une hTRT de pleine longueur comportant des marques ou étiquettes His6 et Anti-Xpress (Invitrogen) a également été construite. Ce vecteur contient également un insert consistant en des nucléotides 707 à 4776 de
l'insert de type hTRT provenant des plasmides pGRN121.
Ce vecteur dirige l'expression, dans des cellules d'insectes, de taux élevés d'une protéine de type hTRT de pleine longueur fusionnée à des étiquettes ou marques clivables 6-histidine et Anti-Xpress, et la séquence des amino acides de la protéine de fusion est présentée ci- après; (-*-) indique le site de clivage par l'entérokinase:
MPRGSHHHHHHGMASMTGGQQM.GRDLYDDDDL-*-DPSSRSAAGTME
F.AAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVR
RLGPQGVWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPVDARPPPAAPSFRQVSCLKELV
ARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGS
GAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARP
PPHASGPRRRLGCERAW'INHISVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKYRPR
RGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGT
RHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWVDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFL
LSSLRPSLTGARKRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNH
AQCPYGVLLKTHCPLRAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLR
QHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQ
ELTWKVi4SVRDCAWLRRSPGVGCVPA.AEHRLREEILAKFLHWLLMSVYVVELLR
SFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREA
RPALLTS RLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLN
YERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYD
* TIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAA-.HGHVRKAFKSHVSTLTDLQPY
vIRQFVAHLQETSPLRDAVV'IEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMICHHHAVRIRGKSY
VQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTH
AKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWC
GLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSfRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHS LFLDLQVN'SLQTVCTNIY'KILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVW'K.iPTFFLRVISD
TASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYV
PLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
Vecteur d'Expression, Baculovirus pBlueBac4.5 et Protéine de type hTRT de pleine longueur Pour produire de grandes quantités de hTRT biologiquement active et de pleine longueur, un second vecteur d'expression, baculovirus pBlueBac4.5 (Invitrogen, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique) a été construit. L'insert codant pour hTRT a également consisté en des nucléotides 707 à 4776 de la hTRT
provenant du plasmide pGRN121.
Vecteur d'Expression Baculovirus pMeIBacB et Protéine de type hTRT de pleine longueur Pour produire de grandes quantités de hTRT biologiquement active et de pleine longueur, un troisième vecteur d'expression, baculovirus pMelBacB (Invitrogen, San Diego, CA, Etats- Unis d'Amérique) a été construit. Un insert codant pour hTRT consiste également en les nucléotides 707 4776 de l'insert de type hTRT provenant du plasmide pGRN121. pMelBacB dirige l'expression de hTRT de pleine longueur dans des cellules d'insert vers le milieu extracellulaire en passant par le trajet de sécrétion
utilisant la séquence produisant un signal de mélittine.
Des taux élevés de hTRT de pleine longueur sont ainsi sécrétés. La séquence de signal de melittine est clivée lors d'une excrétion, mais dans une partie de la masse protéinique demeurant à l'intérieur des cellules. Pour cette raison, elle est indiquée entre parenthèses dans la séquence suivante. La séquence de la protéine de fusion introduite par codage par le vecteur est présentée ci-après:
(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA)-*-DPSSRSAAGTMEFAASTQRCVLL
RTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQ
RGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPA.APSFRQVSCLKELVARVLQRLCERG
AKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGA WGLLLRRV
GDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPL YQLGAATQARPPPHASGPRRRL
GCERAWN'HSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRG.,-APEPERTP
VGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQH
HiAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGAR
RLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKT
HCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYG
FVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLR.NTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRD
CAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQ
KNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRF
IPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLL
GASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVI
ASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQ
ETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSI
LSTLLCSLCYGDMIENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRG
VPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEV
QSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQ
TVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQV\VKINPTFFLRVISDTASLCYSILKA
KNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQT
QLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
Expression de hTRT dans des cellules de mammifère La présente invention propose également des vecteurs pour produire hTRT en de grandes quantités, sous forme d'une protéine biologiquement active et de pleine longueur, dans diverses lignées de cellules de mammifère, vecteur qui est utile dans de nombreuses formes de réalisation de l'invention, comme décrit ci-dessus. Plasmides d'Expression de MPSV- hTRT L'invention propose également un système d'expression destiné à servir dans des cellules de mammifère et qui donne la plus grande expression possible d'une protéine recombinante, comme de la télomérase, sans modifier en fait la séquence codante (par exemple en optimisant l'usage du codon). Dans une forme de réalisation, l'invention propose des plasmides d'expression de MPSV dans des mammifères (provenant du plasmide pBBS212 décrit comme étant pMPSV- TM dans J-H (1994) Gene 47:287-292) capable d'exprimer les TRT de l'invention. Les plasmides MPSV peuvent être exprimés
sous forme de clones stables ou transitoires.
Dans ce système d'expression, alors que la séquence codant pour hTRT n'est elle-même pas modifiée, des éléments exogènes de commande de transcription sont incorporés au vecteur. Le virus de sarcome myéloproliférant (MPSV), promoteur de LTR (MPSV-LTR), amplifié par l'amplificateur cytomégalovirus (CMV), est incorporé pour le début d'une transcription. Le promoteur montre de façon constante des taux supérieurs d'expression dans des lignées de cellules (voir Lin J-H (1994) ci-dessus). Une séquence de consensus de Kozak peut être incorporée pour amorcer la translation (voir Kozak (1996) Mamm. Genome 7:563-574). Toutes les séquences étrangères en 5' et 3' de hTRT non translatées peuvent être enlevées pour garantir que ces séquences ne gênent pas l'expression, comme étudié ci-dessus. Le plasmide MPSV contenant la séquence codant pour hTRT complète avec inclusion de toutes les séquences étrangères est appelé pGRN133. Un plasmide "antisens" de type hTRT témoin a également été construit. Le vecteur est identique, pGNR133, sauf que l'insert TRT est la séquence antisens de hTRT (l'antisens, ce témoin de
commande pouvant servir de vecteur est appelé pGNR134).
Le plasmide MPSV, contenant la séquence de codage de hTRT complète, avec enlèvement de toutes les autres séquences étrangères et contenant la séquence de
consensus de Kozak est appelée pGRN145.
Deux marqueurs de sélection, PAC (Puromycin-N-
acetyl-transferase = Puromycine résistance; résistance à la pyromycine) et HygB (Hygromycin B = résistance à l'hydromycine) sont présents pour la sélection des plasmides après transfection (comme étudié dans le cas des marqueurs choisissables, ci-dessus). Une double sélection, utilisant des marqueurs sur les deux côtés du polyliant vecteur, devrait augmenter la stabilité de la séquence codant pour hTRT. Une séquence codant pour DHFR (dihydrofolate réductase) est incluse pour permettre une amplification de la cassette d'expression après production de clones stables. D'autres moyens d'amplification de gènes peuvent également servir pour
augmenter les rendements en de la protéine recombinante.
L'invention propose également des plasmides MPSV pour expression dans des mammifères, contenant des protéines de fusion de hTRT. Dans une forme de réalisation, la séquence de type hTRT, tout en retenant sa région non translatée en 5', est liée à une marque d'épitope, comme la marque IBI FLAG (International
Biotechnologies Inc. (IBI), Kodak, New Haven, CT, Etats-
Unis d'Amérique) et elle est insérée dans le plasmide d'expression MPSV (appelé pGRN147). Cette construction particulière contient un site d'amorçage de translation de Kozak. La protéine de fusion, exprimée, peut être purifiée à l'aide de l'anticorps monoclonal M-1
anti-FLAG octapeptide.
Dans une autre forme de réalisation, hTRT est l'objet d'une modification spécifique concernant un site. Un codon de reste d'amino acide, soumis à mutagénèse, modifie l'acide aspartique à la position 869 en la transformant en alanine. Ce mutant de hTRT Asp-869-->Ala retenant sa région non translatée en 5' et incorporant une séquence de Kozak, a été inséré dans un plasmide d'expression MPSV, et appelé pGRN146. Le mutant ASP869-*HTRT a été ensuite traité pour contenir la séquence de marquage "FLAG", comme décrit ci-dessus, et l'insert introduit par clonage dans un plasmide d'expression MPSV. Le plasmide d'expression est appelé pGRN154. Plus particulièrement, pour pGRN154, un fragment de digestion de restriction par EamllO51, provenant de pGRN146 et contenant la séquence de Kozak contenant "l'extrémité avant" (segment 5') de hTRT est introduit par clonage dans les sites Eaml1051 de pGRN147 (voir ci-dessus) pour produire un plasmide d'expression MPSV capable d'exprimer hTRT avec une séquence de Kozak, la mutation D869->A et la marque IBI que l'on décrit ci-dessus. Une autre forme de réalisation de l'invention est constituée par un plasmide d'expression provenant de pGRN146. Le plasmide d'expression dans des mammifères, appelé pGRN152, a été engendré par excision du fragment EcoRI du plasmide pGRN146 (contenant ORF de hTRT) et introduit par clonage dans le site EcoRI de pBBS212 pour enlever la 5'UTR de hTRT. La hTRT est orientée de façon que son expression soit commandée par le promoteur de MPSV. Cela donne un plasmide d'expression dans un mammifère, qui exprime hTRT comportant une séquence de consensus de Kozak et la mutation D869-A, et utilise le
promoteur MPSV.
L'invention propose un vecteur d'expression dans un mammifère, dans lequel hTRT est orientée de façon que la séquence codant pour hTRT est pilotée par le promoteur MPSV. Par exemple, un fragment de digestion par l'enzyme de restriction EcoRI, provenant de pGRN137 et contenant le cadre de lecture ouverte de hTRT (ORF) a été cloné dans le site EcoRI de pBBS212 (voir ci-après), ce qui enlève la région non translatée en 5' (5'-UTR) de hTRT. pGRN137 a été construit par excision d'un fragment SalI-Sse83871 de pGRN130, décrit ci-après, contenant la mutation de Kozak de hTRT dans les sites Sal 1-SSE 83871 de pGRN136, ce qui produit un plasmide d'expression dans un mammifère, exprimant hTRT contenant une séquence de consensus de Kozak enlevée du promoteur MPSV. Le plasmide pGRN136 a été construit par excision d'un fragment HindIII SalI de pGRN136 contenant le cadre de lecture ouverte de hTRT et en l'introduisant par clonage dans les sites HindIII SalI du plasmide, pBBS242, en produisant un plasmide d'expression dans un mammifère exprimant hTRT provenant du promoteur MPSV). Cela produit un plasmide d'expression dans un mammifère, appelé pGRN145, qui exprime hTRT avec une séquence de consensus de Kozak, en utilisant le promoteur MPSV. Voir également le vecteur d'expression, décrit ci-après, dans un mammifère et entraîné par le promoteur MPSV de pGRN152. hTRT exprimée dans 293 cellules en utilisant un Vecteur Episomique pEBVHis Un vecteur épisomique, pEBVHis (Invitrogen, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique) a été traité de façon à exprimer une protéine de fusion de hTRT comprenant hTRT fusionnée sur une marque épitope d'extension à terminaison N, l'épitope Xpress (Invitrogen, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique) (appelé pGRN122). Le fragment hTRT de NotI provenant de pGRN121 contenant le cadre de lecture ouverte de hTRT a été introduit par clonage dans le site NotI de pEBVHisA, de sorte que le cadre de lecture ouverte de hTRT est dans la même orientation que le promoteur virus de sarcome Rous (Rous Sarcoma Virus, RSV) servant de vecteur. Dans cette orientation, la marque His6 a été relativement plus proche de la
terminaison N de hTRT.
Un vecteur a également été construit, contenant comme insert la séquence antisens de hTRT et la marque d'épitope (le plasmide appelé pGRN123, qui peut servir de témoin). Le vecteur a été introduit par transfection dans 293 cellules et la hTRT translatée a été identifiée et isolée à l'aide d'un anticorps spécifique de l'épitope Xpress. pEBVHis est un vecteur épisomique EBV résistant à l'hygromycine, qui exprime la protéine intéressante fusionnée sur un peptide par terminaison N. Des cellules portant le vecteur sont choisies et soumises à expansion, puis des extraits nucléaires et cytoplasmiques sont préparés. Ces extraits et des extraits témoins sont soumis à immunoprécipitation avec de l'anticorps anti-Xpress, et les perles immunoprécipitées sont soumises à des essais de détection de l'activité de télomérase, activité
recherchée par un essai traditionnel.
hTRT recombinante d'Expression dans des Cellules Humaines Diploïdes Normales, Mortelles Dans une forme de réalisation de l'invention, de la hTRT recombinante et des composants nécessaires du complexe télomérase-enzyme peuvent être exprimés dans des cellules mortelles diploïdes normales pour en augmenter la capacité de prolifération ou pour les rendre immortelles, ou pour faciliter leur immortalisation. Cela permet d'obtenir des cellules diploïdes immortelles ayant un phénotype et un caryotype par ailleurs normaux. Comme étudié ci-dessus, cette utilisation de la télomérase a une énorme utilité à
l'échelle commerciale.
De la hTRT du type sens (figure 16) et de la hTRT antisens ont été introduites par clonage dans un vecteur CMV. Ces vecteurs ont été purifiés et introduits par transfection provisoire dans deux clones de cellules humaines diploïdes mortelles normales. Les clones humains étaient de jeunes souches de cellules diploïdes
humaines de passage, BJ et IMR90.
L'analyse de l'activité de télomérase en utilisant un essai TRAP (utilisant le nécessaire "TRAPeze Kit" (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD, Etats-Unis d'Amérique) a montré qu'une transfection de hTRT du type sens -mais non pas de hTRT antisens- a engendré une activité de télomérase dans les souches de cellules BJ et aussi dans
les souches de cellules IMR90.
Expression de hTRT Recombinante dans des Cellules Humaines IMR90 rendues Immortelles En utilisant la même construction de type sens hTRT introduite par clonage dans les vecteurs CMV servant dans les études sur des souches de cellules humaines BJ et IMR90 humaines diploïdes décrites ci-dessus, on a transfecté provisoirement une lignée de cellules du trajet SW13 ALT immortalisées (une cellule IMR90 immortalisée avec de l'antigène SV40). Un essai TRAP (TRAPeze, Oncor, Inc, Gaithersburg, MD, Etats-Unis d'Amérique) a démontré que de l'activité de télomérase était engendrée dans les cellules transfectées de la
construction de type sens.
Vecteurs pour une Expression Régulée de hTRT dans des Cellules de Mammifères: Expression Inductible et Répressible de hTRT L'invention propose des vecteurs pouvant être traités ("manipulés") pour induire ou réprimer l'expression des TRT (des télomérases) de l'invention, comme hTRT (télomérase humaine). Par exemple, la séquence codant pour hTRT peut être introduite par clonage dans le système d'expression inductible Ecdysone de Invitrogen (San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique) et les systèmes "TetOn" et "Tet-off" régulés par de la tétracycline, de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, Etats-Unis d'Amérique). De tels systèmes d'expression inductible sont proposés pour servir dans les procédés de l'invention lorsqu'il est important de maîtriser le niveau ou le taux ou la vitesse de transcription d'une TRT transfectée. Par exemple, l'invention propose des lignées de cellules rendues immortelles grâce à l'expression de hTRT, de telles cellules pouvant être rendues "mortelles" par inhibition de l'expression de hTRT par le vecteur grâce à des commandes de maîtrise de la transcription, comme ce qui est fourni par le système "Tet-Off". L'invention propose également des procédés d'expression de TRT, de façon uniquement transitoire, pour éviter l'expression constitutive de hTRT, pouvant conduire à une "immortalisation" non souhaitée des cellules
transfectées, comme étudié ci-dessus.
Le système d'expression inductible Ecdysone" pour mammifère est conçu pour permettre une expression régulée du gène intéressant dans les cellules de mammifère. Le système se distingue par un mécanisme étroitement régulé permettant une expression de base pratiquement non décelable et une inductibilité supérieure à 200 fois dans des cellules de mammifère. Le système d'expression se fonde sur le récepteur d'ecdysone hétérodimère de la drosophile. Le système d'expression inductible par ecdysone utilise un analogue de l'hormone stéroidienne ectysone, la muristérone A, pour activer l'expression de hTRT par l'intermédiaire d'un vecteur nucléaire hétérodimère. Il a été indiqué des taux d'expression excédant 200 fois par rapport à des taux de base sans effet sur la physiologie des cellules de mammifère "Ecdysone-Inducible Gene Expression in Mammalian Cells and Transgenic Mice" [Expression de gène inductible par ecdysone dans des cellules de mammifère et dans des souris transgéniques] (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351). Une fois que le récepteur fixe l'ecdysone ou la muristénone, qui est un analogue de l'ecdysone, le récepteur active un promoteur sensible à l'ecdysone pour donner une expression réglée du gène intéressant. Dans le système d'expression, inductible par ecdysone, chez les mammifères, les deux monomères durécepteur hétérodimère sont exprimés de manière constitutive par le même vecteur, pVgRXR. Le promoteur sensible à l'ecdysone, qui finalement pilote l'expression du gène intéressant, est situé sur un second vecteur, pIND, qui pilote la
transcription du gène intéressant.
La séquence codant hTRT est clonée dans le vecteur
pIND (Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, Etats-
Unis d'Amérique), lequel contient 5 éléments sensibles à de l'ecdysone modifiée (E/GREs) en amont du promoteur de
choc thermique minimal et du site de clonage multiple.
La construction est ensuite introduite par transfection dans des lignées de cellules qui ont été prétraitées en
vue d'exprimer de façon stable le récepteur d'ecdysone.
Après la transfection, les cellules sont traitées par la muristérone A pour induire une expression intracellulaire provenant de pIND. Les systèmes "Tet-on" et "Tet-off" d'expression (Clontech, Palo Alto, CA, Etats-Unis d'Amérique) donnent accès aux systèmes d'expression de gène régulé, à niveau élevé, décrits par Gossen (1992) "Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsibe promoters" [maîtrise étroite de l'expression de gène dans des cellules de mammifère par des promoteurs sensibles à de la tétracycline], Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:5547-5551, pour le système de répression de transcription "Tet-Off", et Gossen (1995) "Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells" [activation de la transcription par la tétracycline des cellules de mammifère], Science 268:1766-1769, pour le système de transcription inductible "Tet-On". Dans des lignées de cellules transformées "Tet-Off", l'expression de gène est engagée quand de la tétracycline (Tc) ou de la doxycycline ("Dox", qui est un dérivé de Tc) est enlevée du milieu de culture. Par contraste, l'expression est engagée dans des lignées de cellules "Tet-On" par l'addition de Tc ou de Dox au milieu. Les deux systèmes permettent la régulation étroite, en réponse ou sous l'effet de concentrations variables de Tc ou de Dox, de
l'expression de gènes clonés.
Ce système utilise le "pTRE" comme plasmide de
réponse pouvant servir à exprimer un gène intéressant.
Le plasmide pTRE contient un site de clonage multiple (MCS, multiple cloning site" immédiatement en aval du promoteur PhCMV*-1 sensible à Tet. Des gènes ou des ADNc intéressants, insérés dans l'un des sites de clonage multiple, seront sensibles à des protéines régulatrices tTA et rtTA dans les systèmes "Tet-Off" et "Tet-On", respectivement. PhCMV*-l contient l'élément sensible ou responsable à Tet (TRE), qui consiste en sept exemplaires ou copies de la séquence d'opérateur tet de 42 paires de bases (tetO). L'élément TRE est juste en amont du promoteur minimal de CMV (PminCMV), qui ne comporte pas l'amplificateur faisant partie du promoteur complet CMV dans les plasmides pTet. Donc, PhCMV*-l est silencieux en l'absence de la fixation de protéines régulatrices sur les séquences tetO. L'insert cloné doit comporter un codon d'amorçage. Dans certains cas, l'addition d'un site de fixation de ribosome de consensus Kozak peut améliorer les taux ou niveaux d'expression; cependant, de nombreux ADNc ont été exprimés efficacement dans des systèmes Tet sans l'addition d'une séquence de Kozak. Les plasmides pTRE-Gene X sont cotransfectés avec pTK-Hyg pour
permettre le choix de transfectants stables.
L'application d'un système d'expression "Tet-Off" ou "Tet-On" exige en général une transfection consécutive stable pour créer une lignée de cellules "doublement stable" contenant des copies intégrées de gènes codant pour la protéine régulatrice appropriée et TRT sous la commande d'un TRE. Dans la première transfection, la protéine régulatrice appropriée est introduite dans la lignée des cellules de choix par transcription d'un "plasmide régulateur", comme un vecteur pTet-Off ou pTet-On, qui exprime les protéines régulatrices appropriées. La hTRT clonée dans le "plasmide de réponse ou sensible à pTRE" est ensuite introduite dans la seconde transfection pour créer une lignée des cellules doublement stable "Tet-Off" ou "Tet- On". Les deux systèmes donnent une maîtrise très étroite "marche/arrêt" d'expression de gène, d'une induction régulée dépendant de la dose et des taux ou
niveaux absolus élevés d'expression de gène.
Expression de hTRT recombinante avec des Séquences de DHFR et d'Adénovirus La construction du plasmide pGRN155 a été conçue en vue d'une expression transitoire d'ADNc de hTRT dans les cellules de mammifère. Un consensus de Kozak est inséré à l'extrémité 5' de la séquence de hTRT. L'insert de hTRT ne contient pas de UTR en 3' ou 5'. L'ADNc de hTRT est inséré dans le site EcoRI de p91023(B) (Wong (1985) Science 228:810-815). L'insert de hTRT a la même orientation que l'ORF DHFR. Cela rend le vecteur d'expression particulièrement utile pour une expression
provisoire ou transitoire.
Le plasmide pGRN155 contient l'origine SV40 et un amplificateur juste en amont d'un promoteur adénovirus, un gène de résistance à la tétracycline, une origine de
E. coli et une région de gène VAI et VAII d'adénovirus.
Cette cassette d'expression contient, dans l'ordre suivant: le promoteur majeur d'adénovirus; le meneur tripartite d'adénovirus; un intron hybride consistant en un site d'épissure en 5' provenant du premier exon du meneur tripartite et un site d'épissure en 3' provenant du gène d'immunoglobuline de souris; l'ADNc de hTRT; la séquence codant pour DHFR de souris; et le signal de
polyadénylation de SV40.
Il a été déclaré que le meneur tripartite d'adénovirus et les ARN de VA augmentent l'efficacité
avec laquelle des ARNm polycistroniques sont translatés.
Il a été indiqué que les séquences de DHFR augmentent la stabilité de l'ARNm hybride. Les séquences de DHFR peuvent également fournir un marqueur d'une sélection et une amplification des séquences de vecteur. Voir Logan (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655); Kaufman (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689; et Kaufman
(1988) Focus (Life Technologies, Inc.), Vol. 10, n 3).
D'autres plasmides d'expression selon l'invention
sont décrits à titre illustratif.
pGRN121 Le fragment EcoRI du clone lambda 25-1.1.6, contenant la totalité de l'ADNc codant pour la protéine de type hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pBluescriptIISK+, de sorte que l'extrémité 5' de l'ADNc est voisine du promoteur T7 dans le vecteur. Le marqueur choisissable que l'on utilise avec ce vecteur est l'ampicilline. pGRN122 Le fragment NotI de pGRN121, contenant l'ORF de hTRT, a été inséré dans le site NotI pEBVHisA, de sorte que la séquence codante est liée fonctionnellement au promoteur RSV. Le plasmide exprime une protéine de fusion, composée d'un marqueur His6 fusionnée à l'extrémité N de la protéine de type hTRT. Le marqueur choisissable que l'on utilise avec ce vecteur est
l'ampicilline ou l'hygromycine.
pGRN123 Le fragment NotI de pGRN121, contenant l'ORF de type hTRT, a été inséré dans le site NotI de pEBVHisA, de sorte que la séquence codante se trouve dans l'orientation opposée à celle du promoteur RSV, en
exprimant ainsi une hTRT antisens.
pGRN124 Le plasmide pGRN121 a été enlevé par délétion de tous les sites ApaI, puis il y a eu délétion du fragment MscI-HincII contenant le 3'UTR. Le fragment Nco-XbaI contenant le codon d'arrêt de la séquence de codage hTRT a été ensuite inséré dans les sites Nco-XbaI de pGRN121 pour produire un plasmide équivalant à pGRNl21, sauf le manque de 3'UTR, que l'on veut préférer pour obtenir des taux ou niveaux accrus d'expression dans certaines cellules. pGRN125 Le fragment NotI de pGRN124, contenant la séquence codant pour hTRT, a été inséré dans le site NotI de pBBS235 de sorte que le cadre de lecture ouvert a une orientation opposée à celle du promoteur Lac. Le marqueur sélectable que l'on utilise avec ce vecteur est le chlorampbénicol. pGRNl26Le fragment NotI de pGRN124, contenant la séquence codant pour hTRT, a été inséré dans le site NotI de pBBS235, de sorte que la séquence codant pour hTRT est
insérée dans la même orientation que le promoteur Lac.
pGRN127 L'oligonucléotide 5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctg AattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3' a servi pour une mutagénèse "in vitro" de pGRN125 pour convertir le codon ATG d'amorçage de la séquence codant pour hTRT en la séquence de consensus de Kozak et pour créer des sites EcoRI et BgIII pour du clonage. De même, l'oligonucléotide COD2866 a servi à convertir AmpS en AmpR (résistant à l'ampicilline) et l'oligonucléotide COD1941 a servi à convertir CatR (résistant au
chloramphénicol) en CatS (sensible au chloramphénicol).
pGRN128 L'oligonucléotide 5'-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctg AattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3' a servi dans une mutagénèse "in vitro" pour convertir le codon ATG d'amorçage de hTRT en une séquence de consensus de Kozak
et pour créer des sites EcoRI et BgIII pour du clonage.
De me,l'oligonucléotide 5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAA
GGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAG
C-3"' a servi à insérer un marqueur ou drapeau IBI (International Biotechnologies Inc. (IBI), Kodak, New Haven, CT, Etats-Unis d'Amérique) à l'extrémité C et pour créer des sites EcoRI et BgIII pour du clonage. De même, COD2866 a servi à convertir AmpS en AmpR et
COD1941 a servi à convertir CatR en CatS.
pGRN129 L'oligonucléotide 5'-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGG AcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3' a servi à convertir Asp869 en un codon Ala (c'est-à-dire que le second Asp du motif DD a été converti en Alanine pour créer un mutant de hTRT dominant/négatif). Cela a également créé
un site MluI. De même, l'oligonucléotide 5'-
CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAAT
TCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3') a servi à insérer le marqueur ou drapeau IBI à l'extrémité C et à créer des sites EcoRI et BgIII pour du clonage. De même, COD2866 a servi à convertir AmpS en AmpR et COD1941 a
servi à convertir CatR en CatS.
pGRN130 L'oligonucléotide 5'CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAc GcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3' a servi dans une mutagénèse "in vitro" à convertir le codon Asp869 en un codon Ala (c'est-à-dire que le second As du motif DD a été converti en une Alanine pour obtenir une protéine variante dominante/négative). Cela a également créé un
site MluI. De même, l'oligonucléotide 5'-
TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGC TG-3' a servi dans une mutagénèse "in vitro" à convertir le codon d'amorçage ATG de la séquence codant pour hTRT en une séquence consensus de Kozak et à créer des sites EcoRI et BgIII pour du clonage. De même, COD2866 a servi à convertir AmpS en AmpR et COD1941 a servi à convertir CatR. pGRN131 Le fragment EcoRI provenant de pGRN128 et contenant l'ORF hTRT avec séquence de Kozak et des mutations de marqueur ou drapeau "IBI Flag" est inséré dans le site EcoRI de pBBS212 de sorte que l'ORF hTRT est exprimé hors du promoteur MPSV. Le plasmide pBSS212 contient un promoteur MPSV, l'amplificateur CMV et le
site de polyadénylation SV40.
pGRN132 Le fragment EcoRI de pGRN128, contenant 'ORF hTRT avec séquence de Kozak et des mutations de drapeau "IBI Flag" est inséré dans le site EcoRI de pBBS212, de sorte que l'antisens de 'ORF hTRT est exprimé hors du
promoteur MPSV.
pGRN133 Le fragment EcoRI de pGRN121, contenant la séquence codant pour hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pBBS212, de sorte que la protéine hTRT est
exprimée sous la commande du promoteur MPSV.
pGRN134 Le fragment EcoRI de pGRN121, contenant la séquence codant pour hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pBBS212, de sorte que l'antisens de la séquence codant pour hTRT est exprimé sous la commande du promoteur MPSV. Les marqueurs choisissables utilisés
avec ce vecteur sont Chlor/HygB/PAC.
pGRN135 La plasmide pGRN126 a été soumis à digestion complète avec MscI et SmaI et à nouvelle ligation afin d'enlever par délétion plus de 95% de séquence insérée codant pour hTRT. Un fragment SmaI-MscI a été inséré au cours du processus pour recréer l'activité Cat pour une sélection. Ce plasmide non purifié a été ensuite soumis à nouvelle digestion avec SalI et EcoRI et le fragment contenant le codon d'amorçage de la séquence codant pour
hTRT a été inséré dans les sites SalI-EcoRI de pBBS212.
Cela donne un plasmide d'expression antisens, exprimant
l'antisens de 5'UTR et 73 bases de la séquence codante.
Les marqueurs choisissables utilisés avec ce vecteur
sont Chlor/HygB/PAC.
pGRN136 Le fragment HindIII-SalI de pGRN126, contenant la séquence codant pour hTRT, a été inséré dans les sites
HindIII-SalI de pBBS242.
pGRN137 Le fragment SalI-Sse83871, de pGRN130, contenant
la séquence de Kozak, a été inséré dans les sites SalI-
Sse83871 de pGRN136.
pGRN138 Le fragment EcoRI de pGRN124, contenant hTRT moins 3'UTR, a été inséré dans le site EcoRI de pEGFP-C2, de sorte que l'orientation de la hTRT est la même que le
domaine EGFP.
pGRN139 L'oligonucléotide 5'-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGA
CTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAG
CTCCCAGC-3 a servi dans une mutagénèse "in vitro" à insérer le marqueur "IBI Flag" à la terminaison C de hTRT dans pGRN125 et à créer des sites EcoRI et BgIII pour du clonage. De même, COD2866 a servi à convertir AmpS en AmpR et COD1941 a servi à convertir CatR en CatS. pGRN140 Le fragment NcoI, contenant les séquences en amont de hTRT de génome et le premier intron de hTRT de lambdaG55, a été inséré dans le site NcoI de pBBS167. Le fragment est orienté de sorte que la hTRT se trouve dans
la même direction que le promoteur Lac.
pGRN141 Le fragment NcoI, contenant les séquences en amont de hTRT de génome et le premier intron de hTRT provenant
de lambdaG55, a été inséré dans le site NcoI de pBBS167.
Le fragment est orienté de sorte que la hTRT se trouve
dans la direction opposée à celle du promoteur Lac.
pGRN142 Le fragment NotI de lambdaGphi5, contenant l'insert complet de -15 paires de kb de génome, y compris la région du promoteur de gène hTRT, a été inséré dans le site NotI du plasmide pBBS185. Le fragment est orienté de manière que l'ORF hTRT se trouve
dans l'orientation opposée à celle du promoteur Lac.
pGRN143 Le fragment NotI de lambdaGphi5, contenant l'insert complet de -15 paires de kb de génome, y compris la région du promoteur de gène hTRT, a été inséré dans le site NotI du plasmide pBBS185. Le fragment est orienté de manière que l'ORF de hTRT se
trouve dans la même orientation que le promoteur Lac.
pGRN144 Délétion de SAL1 de pGRN140 pour enlever des
séquences lambda.
pGRN145 Ce vecteur a été construit pour l'expression de séquences codant pour hTRT dans des cellules de mammifère. Le fragment EcoRI de pGRN137, contenant des séquences codant pour hTRT, a été inséré dans le cycle EcoRI de pBB212 pour enlever la portion de la séquence correspondant à 5'UTR de l'ARNm de hTRT. La séquence codant pour hTRT est orientée de sorte qu'elle est exprimée sous la commande du promoteur MPSV. Les marqueurs choisissables servant avec ce vecteur sont Chlor/HygB/PAC. pGRN146 Ce vecteur a été construit pour l'expression de séquences codant pour hTRT dans des cellules de mammifère. Le fragment Sse83871-NotI de pGRN130, contenant la mutation D869A de hTRT, a été inséré dans les sites Sse83871-NotI de pGRN137. Les marqueurs choisissables utilisés avec ce vecteur sont
l'Ampicilline/HygB/PAC.
pGRN147 Le fragment SSe83871-NotI de pGRN139, contenant le marqueur "IBI Flag", a été inséré dans les sites
Sse83871-NotI de pGRN137.
pGRN148 Le fragment BgIII-Eco47III de pGRN144, contenant la région de promoteur de hTRT, a été inséré dans les sites BgIII-NruI de pSEAP2 pour produire une
construction du promoteur de hTRT/rapporteur.
pGRN149 Ce vecteur est un vecteur intermédiaire pour la construction d'un vecteur d'expression de protéine de
fusion de hTRT.
L'oligo 5'-cttcaagaccatcctggactttcgaaacgcggccgcca ccgcggtggagctcc-3' mutagénique a servi à ajouter un site CPS45I à terminaison C de hTRT par mutagénèse "in vitro" de pGRN125. Le codon "d'arrêt" de hTRT a été enlevé par délétion et remplacé par un site Csp45I. Le marqueur choisissable que l'on utilise avec ce vecteur est l'ampicilline. Le fragment BgIII-FspI de pGRN144, contenant la région de promoteur de hTRT, a été inséré dans les sites BgIII-NruI de pSEAP2 pour produire une construction de
promoteur de hTRT/rapporteur.
pGRN151 Le vecteur a été construit pour l'expression de séquences de HTRT dans des cellules de mammifère. Le fragment EcoRI provenant de pGRN147, contenant la séquence codant pour hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pBBS212 pour enlever la portion de la séquence correspondant à 5'UTR de l'ARNm de hTRT. La séquence codant pour hTRT est orientée de manière à être exprimée sous la commande du promoteur MPSV. Les marqueurs choisissables utilisés avec ce vecteur sont
Chlor/HygB/PAC.
pGRN152 Le fragment EcoRI de pGRN146, contenant la séquence codant pour hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pBBS212 pour enlever la portion de la séquence correspondant à 5'UTR de hTRT. La séquence codant pour hTRT est orientée de manière à être exprimée sous la
commande du promoteur MPSV.
--pGRN153 Le fragment EcoRI de pGRN130, contenant la mutation D869->A de hTRT (séquence codant pour un variant de hTRT) a été inséré dans les sites Styl de pGRN158 pour produire un plasmide contenant la séquence codant pour hTRT avec une séquence de consensus de Kozak à son extrémité 5', une séquence "IBI Flag" à son extrémité 3' (la région codant pour la terminaison C) et
la mutation D869->A.
pGRN154 La fragment EcoRI de pGRN153, contenant le gène de hTRT, a été inséré dans le site EcoRI du plasmide pBS212 en une orientation telle que l'ORF de hTRT est orientée dans la même direction que le promoteur MPSV. Cela donne un plasmide d'expression dirigé par MPSV qui exprime la protéine de hTRT avec une séquence de consensus de Kozak à son extrémité de terminaison amino, un "IBI FLAG" à son extrémité de terminaison carboxy, et la mutation D869-+A [pGRN153 manquant à l'origine] pGRN155 Ce vecteur a été construit pour l'expression de séquences hTRT dans des cellules de mammifère. L'insert a inclu de l'ADNc de pleine longueur de hTRT moins UTR 5' et 3', et des séquences de Kozak. Le fragment EcoRI de pGRN145, contenant de l'ADNc de hTRT avec le consensus de Kozak et pas de UTR 3' ou 5', a été inséré dans le site EcoRI de p91023(B), de sorte que la hTRT se trouve dans la même orientation que l'ORF DHFR. Cela donne un vecteur d'expression transitoire pour hTRT. Le marqueur choisissable utilisé avec ce vecteur est la tétracycline. pGRN156 Ce vecteur a été construit pour l'expression de séquences de hTRT dans les cellules de mammifère. Le fragment EcoRI de pGRN146, contenant la mutation D869A de l'ADNc de hTRT avec le consensus de Kozak et pas de UTR 3' ou 5', a été inséré dans le site EcoRI de p91023(B), de sorte que la hTRT se trouve dans la même orientation que l'ORF DHFR. Cela donne un vecteur d'expression transitoire pour hTRT. L'insert a inclu la pleine longueur de l'ADNc de hTRT moins UTR 5' et 3, D869A, et des séquences de Kozak. Le marqueur choisissable utilisé avec ce vecteur est la tétracycline. pGRN157 Ce vecteur a été construit pour l'expression de séquences de hTRT dans des cellules de mammifère. Le fragment EcoRI de pGRN147, contenant l'ADNc de hTRT avec "IBI FLAG" à la terminaison C, le consensus de Kozak et pas de UTR 3' ou 5', a été inséré dans le site EcoRI de p91023(B), de manière que la hTRT se trouve dans la même orientation que l'ORF DHFR. Cela donne un vecteur d'expression transitoire pour hTRT. L'insert a inclu de l'ADNC de pleine longueur de hTRT, moins UTR 5' et 3', la séquence "FLAG" et les séquences de Kozak. Le marqueur choisissable utilisé avec ce vecteur est la
tétracycline.
pGRN158 Ce vecteur a été construit pour l'expression et la mutagénèse de séquences de TRT dans E. coli. Le fragment EcoRI de pGRN151, contenant l'ORF correspondant de hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pBBS183, de sorte que l'ORF hTRT est orienté dans la direction opposée à celle du promoteur Lac. L'insert a inclu de l'ADNc de pleine longueur de hTRT. UTR 5' et 3', la séquence "FLAG", et les séquences de Kozak. La séquence codant pour hTRT est pilotée par un promoteur T7. Le marqueur choisissable
utilisé avec ce vecteur est l'ampicilline.
pGRN159 Ce vecteur a été construit pour l'expression et la mutagénèse de séquences de TRT dans E. coli. Le fragment HeI-KnpI de pGRN138, contenant la fusion de EGFP sur hTRT, a été inséré dans les sites XbaI-KpnI de pBluescriptIIKS+. Ceci donne un vecteur d'expression T7 pour la protéine de fusion (la séquence codante est pilotée par un promoteur T7). L'insert a inclu de l'ADNc de pleine longueur de hTRT, moins la 3'UTR comme protéine de fusion avec EGFP. Le marqueur choisissable, ou pour le choix, utilisé avec le vecteur est
l'ampicilline.
pGRN160 Ce vecteur a été conçu pour l'expression de séquences de hTR antisens dans des cellules de mammifère. La séquence codante est fonctionnellement liée à un promoteur MPSV. Le fragment XhoI-NsiI de pGRN90, contenant l'ORF hTR de pleine longueur, a été inséré dans le sites SalI-Sse8387I de pBBS295. Cela donne un vecteur transitoire/stable exprimant de l'ARN antisens de hTR. Un marqueur GPT a été incorporé dans le vecteur. Les marqueurs choisissables ou permettant le choix que l'on utilise avec ce vecteur sont Chlor/gpt/PAC. pGRN161 Ce vecteur a été construit pour l'expression de séquences hTR sens dans des cellules de mammifère. Le fragment XhoI-NniI de pGRN89, contenant l'ORF hTR de pleine longueur, a été inséré dans les sites SalI- Sse83871 de pBBS295. Cela donne un vecteur transitoire/stable exprimant hTR dans l'orientation "sens". La séquence codante est pilotée par un promoteur MPSV. Un marqueur GPT a été incorporé au vecteur. Les marqueurs choisissables ou permettant le choix que l'on
utilise avec ce vecteur sont Chlor/gpt/PAC.
pGRN162 Le fragment XhoI-NsiI de pGRN87, contenant l'ORF hTR de pleine longueur, a été inséré dans les sites SalI-Sse83871 de pBBS295. Cela donne un vecteur transitoire/stable exprimant hTR tronquée (de la
position +108 à +435) dans l'orientation "sens".
pGRN163 Ce vecteur a été construit pour l'expression et la mutagénèse de séquences de TRT dans E. coli. La séquence codante est pilotée par un promoteur T7. On utilise l'oligonucléotide RA45 (5'GCCACCCCCGCGCTGCCTCGAGCTCCCCG CTGC-3') dans de la mutagénèse "in vitro" pour modifier dans hTRT la met d'amorçage en Leu et pour introduire un site XhoI dans les deux codons suivants après le Leu. On a également utilisé COD 1941 pour modifier CatR en CatS, et pour introduire un site BSPH1, et l'on a utilisé COD 2866 pour modifier AmpS en AmpR, en introduisant un site FSP1. Le marqueur permettant le choix ou choisissable que l'on utilise avec ce vecteur est l'ampicilline. pGRN164 Ce vecteur a été construit pour l'expression de séquences de hTR dans E. coli. On a utilisé des amorces hTR+1 5'-GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGG CCTG-3' et hTR+445 5'-CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCCT GGG-3' pour amplifier par amplification en chaîne par polymérase un fragment de pGRN33 contenant la hTR de pleine longueur avec le promoteur T7 sur l'extrémité 5'
(comme dans hTR+1). Un produit de digestion par BamHI-
HindIII du produit de cette amplification a été introduit dans les sites BamHI-HindIII de pUCl19. La séquence codante s'est liée fonctionnellement à un promoteur T7. Le marqueur choisissable ou permettant le choix que l'on a utilisé avec ce vecteur est
l'ampicilline.
pGRN165 Ce vecteur a été construit pour l'expression et la mutagénèse de séquences de type hTRT dans E. coli. La séquence codante est fonctionnellement liée à un promoteur T7. Le fragment EcoRI de pGRN145, contenant l'ORF de type hTRT avec une extrémité avant Kozak, a été inséré dans le site EcoRI de pBluescriptIISK+, de sorte que la hTRT est orientée dans la même direction que le promoteur T7. Le marqueur choisissable ou permettant un choix que l'on a utilisé avec ce vecteur est l'ampicilline. pGRN166 Ce vecteur a été construit pour l'expression et la mutagénèse de séquences de type TRT dans des cellules de mammifère. La séquence codante est fonctionnellement liée à un promoteur T7. Le fragment EcoRI de pGRN151, contenant l'ORF hTRT avec une extrémité avant de Kozak, et une marque "IBI flag" à l'extrémité arrière, a été inséré dans le site EcoRI de pBluescriptIISK+, de sorte que l'ORF hTRT est orientée dans la même direction que le promoteur T7. L'insert a inclu de l'ADNc de pleine longueur de hTRT, moins UTR 5' et 3', la séquence "FLAG" (Immunex Corp., Seattle WA, Etats-Unis d'Amérique) et les séquences Kozak. Le marqueur permettant le choix que
l'on a utilisé avec ce vecteur est l'ampicilline.
pGRN167 Un fragment AvRII-StuI d pGRN144, contenant l'extrémité 5' de l'ORF hTRT, a été inséré dans les
sites XbaI-StuI de pBBS161.
pGRN168 Le fragment EcoRI de pGRN145, contenant la cassette d'expression optimisée de hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pIND de sorte que la séquence codante pour hTRT a la même orientation que le promoteur miniCMV. pGRN169 Le fragment EcoRI de pGRN145, contenant la cassette d'expression optimisée de hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pIND, de sorte que la hTRT se trouve dans l'orientation inverse par rapport au
promoteur miniCMV.
pGRN170 Le fragment EcoRI de pGRN145, contenant la cassette d'expression optimisée de hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pIND (spl), de sorte que la hTRT se trouve dans l'orientation opposée à celle du
promoteur miniCMV.
Les marqueurs utilisés avec ce vecteur et permettant le choix sont l'ampicilline/la néomycine/la kanamycine. pGRN171 Le fragment ECO4777-NarI de pGRN163 a été inséré dans les sites Eco47III-NarI de pGRN167, en classant la mutation MIL dans un fragment de l'ADN de génome de hTRT. pGRN172 Le fragment BamHI-StuI de pGRN171, contenant la mutation Met à Leu dans l'ORF hTRT, a été inséré dans
les sites BgIII-NruI de pSEAP2-Basic.
pGRN173 Le fragment EcoRV-ECo47III de pGRN144, contenant l'extrémité 5' de la région de promoteur de hTRT, a été inséré dans les sites SrfI- Eco47III de pGRN172. Cela donne un plasmide rapporteur de promoteur qui contient la région de promoteur de hTRT depuis environ 2,3 kb en amont du départ de l'ORF hTRT juste au-delà du premier intron dans la région codante, avec la mutation Metl->Leu. pGRN174 Le fragment EcoRI de pGRN145, contenant la cassette d'expression "optimisée" de hTRT, a été inséré dans le site EcoRI de pIND(spl) de sorte que la hTRT se trouve dans la même orientation que le promoteur miniCMV.
EXEMPLE 7
RECONSTITUTION DE L'ACTIVITE DE TELOMERASE
A. Co-Expression de hTRT et de hTR "in vitro" Dans le présent exemple, la coexpression de hTRT et de hTR, en utilisant un système d'expression "in vitro" sans cellule, est décrite. Ces résultats mettent en évidence le fait que le polypeptide de type hTRT introduit par codage par pGRN121 code pour une protéine du type télomérase catalytiquement active et que lareconstitution "in vitro" (in vitro reconstitution; IVR) de la ribonucléoprotéine de type télomérase peut être réalisée à l'aide de hTRT et de hTR exprimées de façon à
être en recombinaison.
L'activité de télomérase a été reconstituée par l'addition de plasmides linéarisés de hTRT (pGRN121; 1 pg d'ADN soumis à digestion avec Xba I) et hTR (phTR+1; 1 pg soumis à digestion avec FspI) à un système de lysat de réticulocytes de transcription-translation (Promega TNT ). phTR+l est un plasmide qui, quand il est linéarisé avec FspI et puis transcrit par de la polymérase de ARN T7, engendre un produit de transcription de 445 nucléotides commençant avec un nucléotide +1 et s'étendant jusqu'au nucléotide 446 de hTR (Autexier et al., 1996, EMBO J 15:5928). Pour un mélange réactionnel de 50 pl, on a ajouté les composants suivants: 2 pl de tampon TNT , 1 pl de polymérase ARN T7 "TNT ", 1 pl de mélange d'amino acides 1 mM, unités d'inhibiteur de Rnase "Rnasin ", 1 ug de chaque matrice d'ADN linéarisé et 25 pl de lysat de réticulocytes TNT . Des composants ont été ajoutés selon le rapport recommandé par le fabricant et ils ont été mis à incuber durant 90 minutes à 30 C. Une transcription a été réalisée sous la direction du promoteur T7 et elle a pu également être réalisée avec des résultats similaires avant l'addition du lysat des réticulocytes. Après incubation, on a soumis 5 et 10 pi du mélange de réaction transcription- translation programmée à des essais de recherche d'activité de télomérase par "TRAP", comme précédemment décrit (Autexier et al., ci-dessus) en utilisant 20 cycles d'amplification en chaîne par polymérase pour amplifier
le signal.
Les résultats de la reconstitution sont présentés sur la figure 10. Pour chaque mélange réactionnel de transcription/translation soumis à essai, il y a eu 3 pistes: les deux premières pistes sont des essais en double et la troisième piste est un échantillon en double dénaturé par chauffage (95 C, 5 minutes) avant la phase "TRAP" pour éliminer les artéfacts engendrés par
l'amplification en chaîne.
Comme montré sur la figure 10, le lysat de réticulocytes ne possède à lui seul pas d'activité de télomérase (piste 6). De façon similaire, on n'observe pas d'activité décelable quand on ajoute hTR seul (piste 1) ou le gène de hTRT de pleine longueur (piste 4) au lysat.Si on ajoute les deux composants (piste 2), de l'activité de télomérase est engendrée comme mis en évidence par le motif caractéristique de répétition en barreau d'échelle. Quand la région de combinaison carboxylée du gène de hTRT est enlevée par digestion du vecteur avec Ncol ("hTRT tronquée"), l'activité de télomérase est abolie (piste 3). La piste montre que la translation de hTRT tronquée seule n'engendre pas d'activité de télomérase. La piste "R8" montre un témoin positif d'une échelle de produit de télomérase engendrée par "TRAP" de TSR8, qui est une télomérase produite par synthèse/ ayant une séquence de
nucléotides de 5'-ATTCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]7-3'.
B. Mélangeage de hTRT et de hTR "in vitro" Une reconstitution "in vitro" de l'activité de télomérase a également été réalisée par mélangeage. hTRT a été transcrite et translatée comme décrit ci-dessus, mais sans l'addition du plasmide de hTR. La reconstitution de la ribunocléoprotéine de télomérase a été ensuite réalisée par mélangeage du mélange de translation de hTRT avec hTR (préalablement engendré par
transcription par polymérase ARN T7 à partir de phTR+l-
Fsp) selon le rapport de 2 pl de hTRT de mélange de translation pour 2 pl de hTR (1 pg), puis incubation durant 90 minutes à 30 C. Cette méthode de reconstitution de hTRT/hTR est appelée "reconstitution liée" ou "IVR liée". L'activité de télomérase est présente (c'est-à-dire qu'elle peut être décelée) dans ce mélange. On a observé un signal amélioré après purification partielle de l'activité par chromatographie DEAE. Dans ce cas, on a utilisé selon les directives du fabricant des dispositifs de filtration avec centrifugation Millipore Ultrafree-MC DEAE. Les tampons utilisés ont été hypo0,1, hypo0,2 et hypol,0, le terme hypo représentant 20 mM de KOH- Hepes, pH 7,9, 2 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 10% de glycérol, 0,1% de NP-40, i mM de DTT, 1 mM de métabisulfite de Na, 1 mM de benzamidine et 0,2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), les expressions de 0,1,
0,2 et de 1,0 désignant 0,1 M, 0,2 M ou 1,0 M de KCL.
Les filtres ont été prétraitéspar hypol,0, lavés avec hypo0,1, la télomérase reconstituée a été chargée, la colonne a été lavée avec hypl,0, puis avec hypoO,2, et la télomérase reconstituée a été éluée avec hypol,0 à la moitié du volume du chargement. Cette formulation a pu être conservée à l'état congelé à -70 C et elle conserve
son activité.
L'activité de télomérase a été soumise à d es essais de détection dans un mode opératoire en deux étapes. Dans l'étape un, on a effectué un essai traditionnel de recherche de télomérase comme décrit dans Morin, 1989, Cell 59:521, sauf que l'on n'a pas utilisé de radiomarquage. Dans l'étape 2, une partie aliquote a été soumise à essai par un mode opératoire
TRAP durant 20 à 30 cycles comme décrit ci-dessus.
L'essai traditionnel a été effectué par l'examen de 1 à 10 upl de télomérase reconstituée dans 40 à 50 p1 de volume final de 25 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM d'acétate de K, 1 mM de EGTA, 1 mM de MgCl2, 2 mM de dATP, 2 mM de TTP, 10 pM de dGTP et 1 pM d'amorce (habituellement M2, 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT) à 30 C durant 60 à 180 minutes. La réaction a été arrêtée par chauffage à 95 C durant 5 minutes et 1 à 10 p1 du mélange de la première étape a ou ont été transférés
dans la région TRAP de la deuxième étape (50 pi).
Dans des expériences supplémentaires, la synthèse de hTRT et de hTR au cours d'une reconstitution "in vitro" a été surveillée par incorporation de S-méthionine et par transfert de type Northern blot, respectivement. Des protéines ayant approximativement la taille prédite ont été synthétisées pour hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) et pro90hTRT (90 kD), en des quantités molaires approximativement égales l'une par rapport à l'autre. L'analyse de type "Northern" a indiqué que la synthèse de hTR avait la taille correcte (445
nucléotides) et était de façon prédominante intacte.
Des variations des protocoles de reconstitution
indiqués ci-dessus apparaîtront à l'homme du métier.
Par exemple, on peut faire varier le temps et la température de reconstitution, et la présence ou la concentration de composants comme du sel monovalent (par exemple, NaCl, KCl, l'acétate de potassium, le glutamate de potassium, etc.), du sel divalent (MgCl2, MnCl2, MgSO4, etc.), des dénaturants (urée, formamide, etc. ), des détergents ("NP-40", "Tween", "CHAPS", etc.), et l'on peut utiliser d'autres modes opératoires perfectionnés de purification (comme une immunoprécipitation, de la chromatographie d'affinité ou de la chromatographie normale ou standard). Ces paramètres et d'autres encore peuvent être variés de façon systématique pour optimiser les conditions pour des essais particuliers de recherche ou de détection
pour d'autres protocoles de reconstitution.
C. Reconstitution à l'aide de Variants de hTRT et Protéines de Fusion La reconstitution de l'activité catalytique de télomérase a eu lieu quand il y a eu coexpression avec hTR de EGFP-hTRT, un produit de fusion de la protéine fluorescente verte amplifiée sur hTRT (voir les exemples 6 et 15) ou sur hTRT marquée sur des épitopes ("IBI FLAG", voir l'exemple 6), tous deux ont reconstitué de l'activité de télomérase à des niveaux correspondant
approximativement au type sauvage.
Par contraste, l'activité de télomérase n'a pas été reconstituée quand on a utilisé hTRT, pro90hTRT (manquant des motifs B', C, D et E de RT). Cela met en évidence le fait que pro90hTRT ne possède pas la pleine activité catalytique de télomérase, bien qu'elle puisse avoir d'autres activités partielles (par exemple, l'aptitude à lier l'ARN [c'est- à-dire hTR] et à jouer le rôle de régulation à dominante négative de télomérase in
vivo, comme décrit ci-dessus).
D. Essai de Détection d'Activité de Télomérase Reconstituée "in vitro" en utilisant un Essai à la Touche sur Gel et un Essai Traditionnel de Recherche de Télomérase L'exemple suivant met en évidence le fait que de la télomérase reconstituée "in vitro" (IVR) est soumise à des essais de détection à l'aide d'essais traditionnels de recherche de télomérase en plus des essais à base d'amplification (c'est-à-dire TRAP). De la télomérase IVR (reconstituée in vitro), comme décrit dans la partie (B) ci- dessus (la méthode de reconstitution liée), ce qui a été suivi d'une purification DEAE, comme décrit ci-dessus, a été soumise à des essais de détection utilisant l'essai à la touche sur gel, en utilisant les conditions suivantes de réaction: 1 à 10 ul de télomérase IVR liée dans 40 pi de volume final de 25 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM d'acétate de K, 1 mM de EGTA, 1 mM de MgCl2, 0,8 mM de dATP, 0,8 mM de TTP, 1,0 mM de dGTP et 1 pM d'amorce (M2, ci-dessus, ou H3.03,5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG) à 30 C durant 180 minutes. L'ADN télomère synthétisé a été isolé par des modes opératoires classiques, il a été séparé sur un gel d'urée 8M, et soumis à sondage en utilisant la ribosonde 32p-_ (CCCTAA)n utilisée dans l'essai dit "dot-blot". La sonde a identifié une échelle de six nucléotides dans la piste représentant 10 pl de télomérase IVR/ce qui équivaut à l'échelle observée pour pl de télomérase nucléaire native purifiée par mono Q et chromatographie à l'aide d'héparine. Les résultats montrent que la télomérase IVR possède de l'activité catalytique de télomérase équivalant à celle de la
télomérase native.
De la télomérase IVR liée a également été soumise à des essais de recherche par l'essai de recherche de
* télomérase par incorporation traditionnelle de 32P-dGTP.
De la télomérase IVR, préparée par la méthode de reconstitution liée, suivie d'une purification DEAE,comme décrit ci-dessus, a été soumise à essai de recherche dans les conditions de réaction avec opérations successives et opérations non successives. Les conditions d'essai ont été l'utilisation de 5 à 10 1l de télomérase IVR liée dans 40 pl de volume final de 25 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM d'acétate de K, 1 mM de EGTA, 1 mM de MgCl2, 2 mM de dATP, 2 mM de TTP, avec 10 pM de 32P-dGTP (72 Ci/mmole) [pour un essai dans des conditions d'opérations successives] ou 1 pM de 32P-dGTP (720 Ci/mmole) [pour les opérations non successives] et 1 pM d'amorce (c'est- à-dire, H3.03, ci-dessus) à 30 C [pour la réaction progressive] ou à 37 C [pour la réaction de réaction non progressive] durant 180 minutes. L'ADN télomère synthétisé a été isolé par des modes opératoires classiques et séparé sur un gel d'urée 8 M à 8% de polyacrylamide pour séquençage. La réaction progressive a montré une échelle à six nucléotides faibles correspondant bien à une réaction de télomérase progressive, et la réaction non progressive a ajouté une répétition, ce qui équivaut à une réaction témoin avec une préparation de télomérase native. Des essais traditionnels de recherche utilisant de la télomérase IVR sont utiles dans des dépistages de modulateurs de télomérase, comme décrit ici, ainsi que pour d'autres utilisations comme l'élucidation de la structure et des
propriétés fonctionnelles de la télomérase.
E. De la Télomérase Reconstituée "in vitro" reconnaît des Terminaisons 3' d'Amorce La présente expérience met en évidence le fait que de la télomérase IVR reconnaît des extrémités 3' d'amorce d'une manière équivalente à l'action de télomérase native (purifiée). La télomérase forme un duplex à pairesde bases entre l'extrémité 3' d'amorce et la région de matrice de hTR et elle ajoute le nucléotide spécifique suivant (Morin, 1989, ci-dessus). Pour vérifier que la télomérase (recombinante) IVR possède la même propriété, on a comparé les réactions d'amorce comportant ou ne comportant pas des terminaisons ---GGG ou ---TAG en 3' (AATCCGTCGAGCAGAGGG et AATCCGTCGAGCAGATAG) avec une amorce ayant une terminaison 3' ---GTT (M2 ci-dessus), en utilisant de la l0 télomérase IVR et de la télomérase native soumise à essai de détection par l'essai TRAP traditionnel à deux étapes détaillé ci-dessus. Les échelles produites par les amorces de type ---GGG et ---TAG ont présenté un décalage +4 et +2, respectivement, en comparaison de l'amorce classique (extrémité 3 à ---GTT), le même effet
que celui observé dans le cas de la télomérase native.
Cette expérience met en évidence le fait que des télomérases IVR et native reconnaissent de manière
similaire les terminaisons des amorces.
Ces résultats (ainsi que les résultats ci-dessus montrant que la télomérase IVR possède une activité catalytique progressive et non progressive) indiquent que de la télomérase IVR a une structure et des propriétés similaires à celles de la télomérase native
ou purifiée.
EXEMPLE 8
PRODUCTION D'ANTICORPS ANTI-hTRT A. Production d'Anticorps Anti-hTRT contre les Peptides hTRT Pour produire des anticorps anti-hTRT, on a effectué la synthèse des peptides suivants à partir de hTRT avec l'addition de C (cystéine) comme reste amino
terminal (voir figure 54).
S-1: FFY VTE TTF QKN RLF FYR KSV WSK
S-2: RQH LKR VQL RDV SEA EVR QHR EA
S-3: ART FRR EKR AER LTS RVK ALF SVL NYE
S-4: PAL LTS RLR FIP KPD GLR PIV NMD YVV
Le fragment cystéine a servi à immobiliser (c'est-à-dire à lier par covalence) les peptides à des protéines de support, sérum albumine de bovin et KLH ["keyhole limpet hemocyanin; hémocyanine de mollusque en forme de trou de serrure]. Les peptides KLH ont servi d'antigène. Les conjugués sérum albumine de bovin/peptides ont servi de matière pour des essais de type "ELISA" pour vérifier la
spécificité d'antisérums immunologiques.
Les conjugués KLH/peptide ont été injectés à des lapins blancs de Nouvelle Zélande. Des injections initiales ont été faites en plaçant le produit injecté
près des nodules lymphatiques axillaires et inguinaux.
Les injections suivantes ont été faites par voie intramusculaire. Pour les injections initiales, l'antigène a été émulsifié avec de l'adjuvant complet de Freund, pour les injections suivantes, on a utilisé de l'adjuvant incomplet de Freund. Des lapins suivent un cycle de rappel de trois semaines, au cours duquel on prélève 50 ml de sang, donnant 20 à 25 ml de sérum, jours après chaque rappel. Des antisérums contre chacun des quatre peptides ont reconnu le fragment hTRT de la protéine de fusion de hTRT recombinante (fragment GST-HIS8-hTRT 2426 à 3274); voir l'exemple 6) sur des
essais de type western blots.
En utilisant une fraction de télomérase partiellement purifiée provenant de 293 cellules humaines (purification d'environ 1000 fois en comparaison d'un extrait nucléaire brut) qui a été produite comme décrit dans la demande de brevet PCT o n 97/06012 et purifiée par affinité, on a pu déceler dans un essai "western blot" des anticorps anti-S-2, un doublet protéinique de 130 kD. On a utilisé une méthode sensible de détection par chimioluminescence (substrats pour chimioluminescence "SuperSignal", Pierce), mais le signal sur la tache a été faible, ce qui suggère que la hTRT est présente en une abondance faible ou très faible dans ces cellules immortelles. L'observation d'un doublet correspond bien à une modification après translation de hTRT, c'est-à-dire une phosphorylation ou
une glycosylation.
Pour une purification par affinité, le peptide S-2 a été immobilisé sur "SulfoLink" (Pierce, Rockford IL, Etats-Unis d'Amérique) par l'intermédiaire de son reste cystéine terminal azoté,selon le protocole indiqué par le fabricant. Un premier sérum prélevé sur un lapin immunisé avec l'antigène peptidique KLH-S-2 a été placé sur le "S-2- SulfoLink" et des anticorps spécifiquement
liés au peptide S-2 ont été élués.
B. Production d'Anticorps Anti-hTRT contre des Protéines de Fusion de hTRT Des protéines de fusion de GST-hTRT ont été exprimées dans E. coli sous forme du fragment GST-hTRT
n 4 (nucléotides 3272 à 4177) et le fragment GST-HIS8-
hTRT n 3 (nucléotides 2426 à 3274) correspondant aux protéines décrites à l'exemple 6. Les protéines de fusion ont été purifiées sous forme d'une protéine insoluble, et la pureté des antigènes a été vérifiée par des gels de polyacrylamide-SDS et l'estimation a indiqué une pureté d'environ 75% pour le fragment GST-hTRT n 4, protéine recombinante, et une pureté de plus de 75% pour
le fragment n 3 GST-HIS8-hTRT, protéine recombinante.
Des méthodes de routine peuvent servir à obtenir ces protéines et d'autres protéinesde fusion ayant une pureté supérieure à 90%. Ces protéines recombinantes ont servi à immuniser des lapins et des souris, comme décrit ci-dessus. Les premier et second produits de soutirage prélevés sur des souris et des lapins ont été essayés pour déceler la présence d'anticorps anti-hTRT après enlèvement des anticorps anti-GST, en utilisant une matrice contenant GST immobilisée. Les anti- sérums ont été soumis à des essais de recherche d'anticorps anti-hTRT par "Western blotting", en utilisant de la protéine de fusion recombinante GST-hTRT immobilisée, et par immunoprécipitation en utilisant de la télomérase, enzyme native partiellement purifiée. On n'a pas observé de signal dans le cas de ces prélèvements précoces, mais les titres d'anticorps anti-hTRT ont augmenté au cours
des prélèvements suivants, comme on s'y attendait.
EXEMPLE 9
DETECTION D'UN ARNm de hTRT CORRESPONDANT
AU VARIANT ARNA182
Du poly A ARN+ provenant de testicules humains et d'une lignée de 293 cellules a été analysé pour déceler de l'ARNm de hTRT, en utilisant une amplification en chaîne et des amorces emboîtées. Le premier groupe des amorces a été TCP1.1 et TCP1.1.5; le second groupe d'amorces a été TCP1.14 et BTCP6. Une amplification à partir de chaque groupe a donné deux produits différant par 182 paires de bases; les produits plus grands et plus petits provenant de l'ARN de testicule ont été soumis à séquençage et on a trouvé qu'ils correspondent exactement à pGRN121 (figure 16) et au clone 712562 (figure 18), respectivement. Le produit ARN variant de type hTRT a été observé dans de l'ARNm provenant de
SW39i, de OVCAR4, 293 et de testicules.
Des expériences supplémentaires ont été effectuées pour mettre en évidence le fait que l'ADNc A182 n'était pas un artéfact de transcription reverse. En bref, on a produit, par transcription "in vitro" de pGRN121 de l'ARN de type hTRT de pleine longueur (c'est-à-dire sans la délétion) pour servir de matrice pour une amplification en chaîne par polymérase de RT. Les réactions séparées de synthèse d'ADNc ont été effectuées à l'aide de transcriptase reverse "Superscript " (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD, Etats-Unis d'Amérique) à 42 ou à 50 C, et avec des amorces prises au hasard ou avec une amorce spécifique. Après 15 cycles d'amplification, le produit plus long a été décelable; cependant, le produit plus petit (c'est-à-dire correspondant à la délétion) n'a pas été décelable, même après 30 cycles ou plus de 30 cycles. Cela indique que le produit de l'amplification en chaîne par polymérase
de RT n'est pas un artéfact.
EXEMPLE 10
SEQUENCAGE DE L'ARNm DE TYPE hTRT DE TESTICULE La séquence de la forme testicule de-l'ARNde typehTRT a été déterminée par séquençage manuel direct de fragments d'ADN générés par amplification en chaîne par polymérase à partir d'ADNc de testicule (Marathon Testes cDNA, Clontech, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique), en utilisant un kit de séquençage avec cycle de terminateur radiomarqué "ThermoSequenase" (Amersham Life Science). L'étape d'amplification a été effectuée à l'aide d'une amplification en chaîne avec emboîtement,comme montré au tableau 8. Dans tous les cas, on a effectué une réaction témoin négative avec des amorces mais sans ADNc. L'absence de produit dans la réaction témoin démontre que les produits provenant de la réaction comportant la présence d'ADNc n'étaient pas dus à une contamination de hTRT de pGRN121 ou d'autres sources cellulaires (par exemple des cellules 293). Les fragments d'ADN ont été excisés de gels d'agarose pour
purifier l'ADN avant le séquençage.
On a obtenu la séquence d'ARNm de testicule correspondant aux bases 27 à 3553 de la séquence d'insert de pGRN121 et contenant la totalité de l'ORF de hTRT (bases 56 à 3451). Il n'y a pas eu de différence entre les séquences de testicule et les séquences de
pGRN121 dans cette région.
Tableau 8
Fragment Groupe 1 d'amorce(s)Groupe 2 d'amorce(s)Taille Amorces pour séquençage finale OA na K320/K322 208 K320,K322
A K320/TCPI.43 TCP1.40/ TCP1.34 556 TCP1I.52, TCP1.39, K322, TCPI.40, TCPI.41, TCPI.30, TCP1I.34, TCPI.49
B TCPl.42/TCPI/32B TCP1.35/ TCP1.21 492 TCPI.35, TCP1.28, TCPI.38, TCP1.21, TCP1.46, TCP1.33, TCPI1.48
C TCPI.65/TCPI.66 TCP1I.67/TCPI.68 818 TCPI.67, TCP1I.32, TCPI.69, TCPI.68, TCPI.24, TCPI.44,K303
D2 K304/bilITCP6 LTI/ TCP1.6 546 LT2,LTI, TCPI.6, bTCP4, TCPI.13, TCPI.77, TCPI.1
D3 TCPI.12/TCPI.7 TCPI.14/TCP1.15 604 TCPI.6, TCPI.14, TCPI.73, TCP1.78, TCP1.25, TCPI.15, TCPI.76
EF na TCP I1.74/TCPI.7 201 TCP I1.74, TCP1.7, TCPI.75, TCPI.15, TCP 1.3
E TCPI.3/ TCP1.4 TCPI.2/TCPI.9 687 TCPI.2, TCPI1.8, TCPI. 9, TCP1.26
F TCPI.26/UTR2 TCPI.10/TCPI.4 377 TCP1.4, TCP1.10, TCPI. 1I
EXEMPLE 11
DETECTION, PAR PROTECTION CONTRE LES EFFETS DE RNASE,
DE L'ARNm DE TYPE hTRT Des essais de protection contre les effets de RNase peuvent servir à déceler, à surveiller ou à diagnostiquer la présence d'un ARNm de type hTRT ou d'un ARNm variant. Un exemple illustrant une sonde de protection contre RNase consiste en un ARN synthétisé "in vitro", constitué de séquences complémentaires des séquences d'ARNm de type hTRT et de séquences supplémentaires non complémentaires. Les dernières séquences sont incluses pour distinguer la sonde de pleine longueur d'avec le fragment de sonde provenant d'un résultat positif dans l'essai. Dans un essai positif, les séquences complémentaires de la sonde sont protégées contre une digestion par RNase, parce qu'elles
sont fixées par hybridation sur de l'ARNm de type hTRT.
Les séquences non complémentaires sont enlevées par digestion de la sonde en présence de RNase et d'un acide
nucléique complémentaire formant cible.
Deux sondes avec protection contre les RNAse sont décrites à titre illustratif, l'une ou l'autre pouvant servir d'essai. Les sondes diffèrent par leurs séquences complémentaires de hTRT, mais elles contiennent des séquences non complémentaires identiques, dans cette forme de réalisation, provenant de la séquence de tête d'ARNm de SV40. A partir de 5'-3', une sonde est constituée de 33 nucléotides de séquence non complémentaire et de 194 nucléotides de séquence complémentaire des nucléotides 2513-2707 de type hTRT pour une taille de sonde de pleine longueur de 227 nucléotides. De 5'-3', la seconde sonde est constituée de 33 nucléotides de séquence non complémentaire et de 198 nucléotides de séquence complémentaire des nucléotides 2837-3035 de type hTRT pour une taille de sonde de pleine longueur de 231 nucléotides. Pour conduire l'essai, on peut fixer par hybridation l'une ou l'autre sonde sur de l'ARN, c'est-à-dire du polyA+ARN, provenant d'un échantillon d'essai, l'on ajoute ensuite de la ribonucléase T1 et la RNase A. Après la digestion, l'ARN de sonde est purifié et analysé par électrophorèse sur gel. La détection d'un fragment de 194 nucléotides de la sonde à 227 nucléotides ou d'un fragment de 198 nucléotides de la sonde à 231 nucléotides est une indication de la présence d'ARNm de type hTRT dans l'échantillon. Les sondes de protection contre les effets de RNAse, présentées à titre illustratif dans le présent exemple, peuvent être engendrées par transcription "in vitro" en utilisant de l'ARN polymérase T7. Des ribonucléotides radioactifs ou marqués d'une autre façon
peuvent être inclus pour la synthèse de sondes marquées.
Les matrices pour la réaction de transcription "in vitro"1 afin de produire les sondes de type ARN,sont des produits d'amplification en chaîne par polymérase. Ces sondes citées à titre illustratif peuvent être synthétisées à l'aide de T7 polymérase après amplification en chaîne par polymérase de l'ADN de pGRN121, en utilisant des amorces qui couvrent la région complémentaire correspondante du gène de hTRT ou de l'ARNm. En outre, l'amorce aval contient des séquences de promoteur d'ARN T7 polymérase et des séquences non complémentaires. Pour engendrer la première sonde de protection contre les effets de RNAse, on utilise le produit d'une amplification en chaîne par polymérase provenant de la paire suivante d'amorceurs(T701 et 01 reverse):
T701 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG
CTGCGCCGGC TGTCA GGCTCCC ACGACGTAGT CCATGTTCAC-3'; et
reverseO1 5'-GGGTCTAGAT CCGGAAGAGTGT CTGGAGCAAG-3'.
Pour engendrer une seconde sonde de protection contre les effets de RNase, on utilise le produit de l'amplification en chaîne par polymérase provenant de la paire suivante d'amorces (T702 et 02 reverse):
T702 5'-GGGAGATCT TAATACGACTCACTATAG ATTCA GGCCATGGTG
CTGCGCCGGC TGTCA GGGCG GCCTTCTGGA CCACGGCATA CC-3'; et
reverse02 5'-G GTCTAGA CGATATCC ACAGGGCCTG GCGC-3'.
EXEMPLE 12
CONSTRUCTION D'UN ARBRE PHYLOGENETIQUE COMPARANT hTRT ET
D'AUTRES TRANSCRIPTASES REVERSES
Un arbre phylogénétique (figure 6) a été construit par comparaison de sept domaines RT définis par Xiong et Eickbush (1990, EMBO J. 9:3353). Après alignement des séquences des motifs 1, 2 et A-E de 4 TRT, 67 RT et 3 ARN polymérases, l'arbre a été construit en utilisant la méthode NJ ("Neighbor Joining") (Saitou et Nei, 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406). Des éléments provenant de la même classe,qui sont situés sur la même branche de l'arbre, sont simplifiés sous la forme d'un caisson d'un boîte. La longueur de chaque boîte correspond à l'élément le plus divergent présent au sein
de cette boîte.
Les TRT semblent être plus étroitement apparentées à des RT associées à des ADNm, des introns de groupe II, et des rétrotransposons non-LTR ("Long Terminal Repeat"; longue répétition des terminaisons) qu'à des retransposons LTR, et à des RT viraux. La relation des télomérases RT avec la branche non-LRT de rétroéléments est intrigante, étant donné que ces derniers éléments ont remplacé la télomérase pour l'entretien des télomères dans la Drosophile. Cependant, la découverte
la plus surprenante est que les TRT forment un sous-
groupe séparé ("discret"), presque aussi étroitement apparentés aux ARN polymérases dépendant de l'ARN de virus à ARN à plusieurs brins, comme des poliovirus,
qu'à n'importe laquelle des RT antérieurement connues.
En considérant que les quatre gènes de télomérase proviennent d'or-
ganismes distants par leur évolution --des protozoaires, des champi-
gnons et des mammifères--, ce groupement séparé ne peut être expliqué par un manque de diversité phylogénétique dans les données utilisées. Aucontraire, cette bifurcation profonde suggère que les RT de télomérase forment un groupe ancien, peut-être provenant des premiers
eucaryotes.
Les numéros d'identification ou d'accession des protéines "GenBank" utilisées dans l'analyse phylogénétique étaient des ADNm (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), des introns de groupe II (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), du plasmide de mitochondrie/RTL (903835, 134084), des rétrotransposons non- LTR (140023, 84806, 103221, 103353,
134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903,
130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), des retransposons LTR (74599, 85105, 130582, 99712, 83589,
84126, 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088,
226407, 101042, 1078824), des hépadnavirus (I 18876, 1706510, 118894), des caulimovirus (331554, 130600, 130593, 934553), des rétrovirus (130601, 325465, 74601,
130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746,
130651, 130635, 1780973, 130646). L'alignement a été analysé à l'aide de "ClustalW 1.5" [J.D. Thompson, D. G. Higgins, T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22, 4673 (1994)] et "PHYLIP 3.5" [J. Felsenstein, Cladisfics 5,
164 (1989)].
EXEMPLE 13
TRANSFECTION DE FIBROBLASTES HUMAINS CULTIVES (BJ) AVEC
DU PLASMIDE TEMOIN ET DU PLASMIDE CODANT POUR hTRT Le présent exemple montre que l'expression de la protéine hTRT recombinante dans une cellule de mammifère
aboutit à la formation d'une télomérase active.
Des fibroblastes BJ subconfluents ont été trypsinisés et remis en suspension dans du milieu frais (DMEM/199 contenant 10% de sérum de foetus de veau) à une concentration de 4 x 106 cellules/ml. Les cellules ont été transfectées à l'aide d'une électroporation avec un électroporateur "BioRad Gene Pulser ". Eventuellement, on peut aussi transfecter des cellules en utilisant du réactif "Superfect " (Qiagen) selon les instructions du fabricant. Pour une électroporation, on a placé 500 4l de la suspension des cellules dans une cuvette pour électroporation (BioRad, 0,4 cm d'intervalle entre les électrodes). De l'ADN de plasmide (2 pg) a été ajouté dans les cuvettes et la suspension a été soumise à mélangeage modéré et à incubation sur de la glace durant minutes. Le plasmide témoin (pBBS212) ne contenait pas d'insert derrière le promoteur MPSV et le plasmide expérimental (pGRN133) a exprimé hTRT à partir du promoteur MPSV. Les cellules ont été soumises à électroporation à 300 volts et 960 pFD. Après délivrance de l'impulsion, les cuvettes ont été placées sur de la glace durant 5 minutes environ avant d'être étalées sur des boîtes pour culture de tissu de 100 mM dans du milieu. Au bout de 6 heures, le milieu a été remplacé par du milieu frais. 72 heures après la transfection, les cellules ont été trypsinisées, lavées une fois avec PBS (solution saline tamponnée par du phosphate),
centrifugées et le culot a été conservé congelé à -80 C.
Les extraits des cellules ont été préparés à une concentration de 25 000 cellules/pl par une méthode de lyse par détergent modifié (voir Bodnar et al., 1996, Exp. Cell. Res. 228:58; Kim et al., 1994, Science 266:2011 et comme décrit dans des brevets et publications concernant l'essai TRAP ci-dessus), et l'activité de télomérase dans les extraits cellulaires a été déterminée à l'aide d'un essai TRAP modifié à base d'amplification en chaîne par polymérase (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). En bref, on a utilisé x 104 équivalents de cellule dans la portion d'extension d'amorce de télomérase de la réaction. Alors que l'extrait est typiquement prélevé directement sur la réaction d'extension de télomérase pour amplification, on peut aussi extraire une fois avec du phénol/chloroforme et une fois avec du chloroforme avant amplification en chaîne par polymérase. On a utilisé un cinquième de la matière dans l'amplification en chaîne par polymérase de la réaction TRAP (environ 10 000 équivalents de cellule). La moitié du mélange réactionnel de TRAP a été placée sur le gel pour analyse, de sorte que chaque piste de la figure 25 représente des produits de réaction de 5 000 équivalents de cellule. Des extraits de cellules transfectées avec pGRN133 donnaient un résultat positif dans la recherche d'activité de télomérase, cependant que des extraits provenant de cellules non transfectées (ce qui n'est pas représenté) ou transfectées par des plasmides témoins ne présentaient pas d'activité de télomérase. Des expériences similaires utilisant des cellules RPE ont
donné le même résultat.
Une reconstitution dans des cellules BJ a également été effectuée à l'aide d'autres constructions de hTRT (c'est-à-dire pGRN145, pGRN155 et pGNR138). Une reconstitution utilisant ces constructions a semblé aboutir à une plus grande activité de télomérase que
dans des cellules transfectées par pGRN133.
Le niveau le plus élevé d'activité de télomérase
a été obtenu à l'aide de pGRNl55.
Comme étudié ci-dessus, pGRNl55 est un vecteur contenant le promoteur majeur d'adénovirus comme élément de commande pour l'expression de hTRT et il a été montré que cela produit la reconstitution de l'activité de télomérase quand il y a transfection dans des
cellules BJ.
Notamment, quand une reconstitution à l'aide de la protéine de fusion hTRT-GFP pGRNl38 (qui se localise sur le noyau, voir l'exemple 15 ciaprès) a été effectuée "in vitro" (voir l'exemple 7) ou "in vivo" (transfection dans les cellules BJ), il en est résulté une activité de télomérase. Par transfection dans des cellules BJ, par exemple, comme décrit ci-dessus, on a constaté une activité de télomérase comparable à celle résultant d'une reconstitution "in vitro" à l'aide de pGRN133 ou
de pGRN145.
Des résultats similaires ont été obtenus lors d'une transfection d'un épithélium pigmenté de rétine humaine normale (retinal pigmented epithelial (RPE)) avec les vecteurs d'expression hTRT de l'invention. On pense que la sénescence ou le vieillissement de cellules RPE contribue à ou provoque la maladie de dégénérescence, liée à l'âge, de la macula. Les cellules RPE traitées selon les méthodes de l'invention, en utilisant les vecteurs d'expression de hTRT de l'invention, devraient présenter une sénescence ou un vieillissement retardé, en comparaison de cellules non traitées, et elles pourraient ainsi être utiles dans des thérapies de transplantation pour traiter, ou éviter, une dégénérescence de la macula apparentée à l'âge ou au vieillissement.
EXEMPLE 14
CONSTRUCTION PROMOTEUR-RAPPORTEUR
Le présent exemple décrit la construction de plasmides dans lesquels des gènes rapporteurs sont fonctionnellement liés à des séquences amont de type hTRT contenant des éléments de promoteur. Les vecteurs ont de nombreuses utilisations, ce qui comprend l'identification de facteurs de régulation de transcription cis et trans "in vivo" et pour l'examen de dépistage d'agents capables de moduler (par exemple d'activer ou d'inhiber) l'expression de hTRT (par exemple, l'examen de dépistage de produits pour médicament). Bien qu'on puisse utiliser un certain nombre de rapporteurs (par exemple, de la luciférase de luciole, de la fl-glucuronidase, de la f- galactosidase, de l'acétyl transférase de chloramphénicol et GFP, etc.), la phosphatase alcaline humaine sécrétée (SEAP; Clone Tech) a servi pour des expériences initiales. Le gène rapporteur SEAP code pour une forme tronquée de l'enzyme de placenta qui manque de domaine d'ancrage sur la membrane, ce qui permet la sécrétion efficace de la protéine par des cellules transfectées. Il a été montré que des taux ou niveaux d'activité de SEAP que l'on décèle dans le milieu de culture sont directement proportionnels à des modifications de concentrations intracellulaires d'ARNm de SEAP et de protéine (Berger
et al., 1988, Gene 66:1; Cullen et al., 1992, Meth.
Enzymol. 216:362).
Quatre constructions (pGRN148, pGRN150, "pSEAP2 basic" (pas de séquence de promoteur = témoin négatif) et "pSEAP2 témoin" (contient le promoteur SV40 et de l'amplificateur) ont été transfectées en triple dans des
cellules mortelles et dans des cellules immortelles.
Le plasmide pGRN148 a été construit comme illustré sur la figure 9. En bref, un fragment Bgl2-Eco47III provenant de pGRNl44 a été soumis à digestion et a été cloné dans le site BgIII-NruI de pSeap2Basic (Clontech, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique). Un second rapporteur-promoteur, le plasmide pGRNl50, incluent des séquences provenant de l'intron de hTRT décrit à l'exemple 3, pour utiliser des séquences régulatrices pouvant être présentes dans l'intron. Le Met d'amorçage est muté ou transformé en Leu, de sorte que le second ATG après la région de promoteur sera l'ATG d'amorçage
de l'ORF SEAP.
Des constructions pGRN148 et pGRN150 (qui comprennent le promoteur de hTRT) ont été transfectées dans des cellules mortelles (cellules BJ) et dans des cellules immortelles (293). Toutes les transfections ont été effectuées en parallèle avec deux plasmides témoins: un plasmide témoin négatif (pSEAP "basic") et un plasmide témoin positif (pSEAP, témoin qui contient le
promoteur de SV40 et l'amplificateur de SV40).
Dans des cellules immortelles, les constructions pGRNl48 et pGRN150 semblent piloter l'expression SEAP aussi efficacement que le témoin positif pSEAP2 (contenant le promoteur de SV40 et l'amplificateur). Par contraste, dans des cellules normales, seul le témoin pSEAP2 a donné une activité décelable. Ces résultats indiquent que, comme on s'y attendait, les séquences de promoteur de type hTRT sont actives dans des cellules de tumeur
mais non pas dans des cellules mortelles.
Des résultats similaires ont été obtenus lors de l'utilisation d'une autre lignée de cellules normales (RPE "retinal pigmental epithelial cells) [cellules épithéliales pigmentées de rétine] dans des cellules RPE transfectées par pGRNl50 (contenant 2,2 kB de séquence de génome en amont), la région de promoteur hTRT était inactive alors que le plasmide témoin pSEAP2 était
actif.
Comme noté ci-dessus, les plasmides dans lesquels les gènes rapporteurs sont fonctionnellement liés à des séquences amont hTRT contenant des éléments promoteurs, sont extrêmement utiles pour l'identification et les examens de dépistage d'agents modulateurs de l'activité de télomérase, quand on utilise des techniques de transfection transitoire aussi bien que des techniques de transfection stable. Dans une approche, par exemple, des transformants stables de pGRN148 sont produits dans des cellules donnant un résultat négatif pour la télomérase et dans des cellules donnant un résultat positif pour la télomérase, par cotransfection avec un marqueur eucaryote permettant un choix ou choisissable (comme du "néo") selon Ausubel et al., 1997, ci- dessus. Les lignées de cellules résultantes servent à l'examen de dépistage d'agents supposés être des modulateurs de la télomérase, par exemple, par la comparaison de l'expression, pilotée par un promoteur de hTRT, en présence ou en l'absence d'un
composé d'essai.
Les vecteurs promoteurs-rapporteurs ou indicateurs (et d'autres) de l'invention peuvent également servir à identifier des éléments régulateurs de transcription et de translation, de type trans et de type cis. Des exemples d'éléments régulateurs de transcription du type cis comprennent des promoteurs et des amplificateurs du gène de télomérase. L'identification et l'isolement d'agents régulateurs du type cis et du type trans fournissent des procédés et réactifs supplémentaires pour identifier des agents qui modulent la transcription
et la translation de la télomérase.
EXEMPLE 15
LOCALISATION SUBCELLULAIRE DE hTRT Une protéine de fusion, comportant des régions protéiniques d'un vert fluorescent de type hTRT et de type amplifié (EGFP; Cormack et al., 1996, Gene 173:33) a été construite comme décrit ci-après. Le fragment EGFP fournit un signe ou signal décelable de sorte que la présence ou l'emplacement de la protéine de fusion peut être facilement déterminé. Puisque les protéines de fusion de EGFP se localisent dans les compartiments cellulaires corrects, la construction peut servir à déterminer l'emplacement subcellulaire de la protéine de
type hTRT.
A. Construction de pGRN138 On a construit un vecteur pour l'expression d'une protéine de fusion de hTRT-EGFP dans des cellules de mammifère, en plaçant l'insert EcoRI de pGRN124 (voir l'exemple 6) dans le site EcoRI de pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA, Etats-Unis d'Amérique). La séquence des amino acides de la protéine de fusion est présentée ci- après. Les restes EGFP sont en caractère gras, les restes codés par la région non-translatée en 5' de l'ARNm de hTRT sont soulignés et la séquence de la protéine de type hTRT est sous forme normale:
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHIFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT
LVTTLTYGVQCFSRYPDH/RQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYRKTRAEVKFEGDTL
VNRIELKG ID FKEDGNI LG}LLEYAFfNS FVYIMADKQKNG iNFKIR/I E-DGSVQLA
DHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRD?24VLLEFVTAAGITLGMDELYKS
GRTQI S S SS FEFAARSTORP;LLRT-,'EAPATP?.MPP-FRCRAVRSLLRSHYREVLPLA
T FVRRLG PQGWIRLVQRGD P. F?-LVAQCLVCVPreDA.RP PkAP S -RQVSCL KELVARVL QRLCERGAKNVLAFGFALLDGAPRGG P PEAFTTSVRSYLPNT7lTD.LRGSGAWGLLLRRVG
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D'autres constructions de fusion de type EGFP peuvent être obtenues en utilisant une séquence de codage de hTRT partielle (par exemple, tronquée) et elles peuvent servir, comme décrit ci-après, à identifier les activités de régions particulières du polypeptide de
type hTRT.
B. Localisation Nucléaire et Utilisations de pGRN138 La transfection de cellules NIH 293 et BJ par pGRN138 a confirmé la localisation nucléaire de hTRT exprimée sous forme recombinante. Des cellules ont été transfectées avec pGRN138 (EGFP-hTRT) et avec une construction témoin (n'exprimant que EGFP). Une localisation nucléaire de EGFP-hTRT apparaît dans les deux types de cellule par examen au microscope à fluorescence. Comme noté cidessus, la protéine de fusion de hTRT-GFP de pGRN138 entretient la reconstitution de l'activité de télomérase dans un système de transcription-translation "in vitro" et également "in vivo" en cas de transfection dans des
cellules BJ.
Les protéines de fusion hTRT-EGFP (ou les protéines de fusion décelables de manière similaire) peuvent servir à diverses applications. Par exemple, la construction de fusion décrite dans le présent exemple, ou une construction de EGFP et d'une forme tronquée de hTRT, peut ou peuvent servir à établir l'aptitude de hTRT et variantes à pénétrer dans un noyau cellulaire et/ou à se localiser aux extrémités des chromosomes. En outre, des cellules transfectées de manière transitoire ou stable avec pGRN138 servent à examiner par dépistage des composés pour identifier des médicaments ou des composés à rôle de modulation de télomérase. Des agents influant sur la localisation nucléaire ou la localisation de télomère peuvent être identifiés comme étant des inhibiteurs de la télomérase. Des lignées de cellules de tumeur exprimant de manière stable EGFP-hTRT peuvent être utiles dans ce but. Des modulateurs potentiels de la télomérase seront administrés à ces cellules transfectées, et la localisation de EGFP-hTRT sera établie. En outre, FACS ou d'autres méthodes à base de fluorescence peuvent servir à choisir des cellules exprimant hTRT pour fournir des populations homogènes pour une recherche par dépistage de drogues, en particulier quand on emploie une transfection provisoire
ou transitoire de cellules.
Dans d'autres applications, des régions de la hTRT peuvent être soumises à mutagénèse pour identifier les régions (par exemple, les restes 193-196 (PRRR) et 235-240 (PKRPRR) nécessaires pour une localisation dans le noyau (localisation nucléaire), qui constitue des cibles pour des médicaments anti-télomérase (des modulateurs de l'activité de la télomérase). D'autres applications comprennent: l'utilisation de la protéine de fusion comme marqueur fluorescent de la transfection efficace de cellule, aussi bien pour des expériences de transfection provisoire que lorsqu'on établit des lignées de cellules stables exprimant EGFP-hTRT; l'expression d'une fusion hTRT-EGFP avec des signaux de localisation nucléaire mutée (manquant dans le cas d'une localisation nucléaire) dans des cellules immortelles, de sorte que la hTRT-EGFP mutante enlève la totalité de la hTR des cellules immortelles, en la retenant dans le cytoplasme et en évitant le maintien d'entretien des télomères; et l'utilisation à titre de protéine marquée pour une immunoprécipitation.
EXEMPLE 16
EFFET D'UNE MUTATION SUR L'ACTIVITE CATALYTIQUE
DE TELOMERASE
Le présent exemple décrit des protéines variantes de hTRT ayant des amino acides altérés ou modifiés et une activité catalytique de télomérase modifiée ou altérée. Des substitutions d'amino acides, suivies d'une analyse fonctionnelle, constituent un moyen normalisé d'établir l'importance et le rôle d'une séquence polypeptidique. Le présent exemple met en évidence le fait que des modifications effectuées dans les motifs de transcriptase reverse (RT) et de télomérase (T)
affectent l'activité catalytique de la télomérase.
On utilise la nomenclature classique pour décrire des mutants: le reste constituant une cible dans la molécule naturelle ou native (hTRT) est identifié par un code à une lettre et par une position, et le reste correspondant dans la protéine mutante est indiqué par un code à une lettre. Ainsi, par exemple, "K626A" spécifie un mutant dans lequel la lysine à la position 626 (c'est-à-dire dans le motif 1) de hTRT est
transformée en une alanine.
A. Mutation du Motif FFYxTE de hTRT Dans une expérimentation initiale, un vecteur codant pour une protéine mutante de type hTRT, "F560A", a été produit, dans lequel l'amino acide 560 de hTRT a été changé pour passer de la phénylalanine (F) à l'alanine (A) par mutagénèse, piloté par un site, de pGRN121, en utilisant des techniques normalisées. Cette mutation rompt le motif FFYxTE de TRT. Il a été montré que le polynucléotide mutant F560A résultant dirigeait la synthèse d'une protéine de type hTRT de pleine longueur, comme établi à l'aide d'un système de transcription/translation de lysat de réticulocytes sans
cellule, en présence de 35S-méthionine.
Quand le polypeptide mutant a été co-translaté avec hTR, comme décrit à l'exemple 7, il n'y a pas eu détection d'une activité de télomérase, selon l'observation faite par "TRAP" en utilisant 20 cycles d'amplification en chaîne par polymérase, cependant qu'une co- translation témoin de hTRT/hTR a reconstitué l'activité. Dans les 30 cycles d'amplification dans l'essai TRAP, une activité de télomérase a été observable avec le mutant hTRT, mais elle était considérablement inférieure à celle de hTRT témoin (de
type sauvage).
B. Mutagénèses Supplémentaires, Dirigées et Pilotées par des Sites, de Restes d'Amino Acides de hTRT Les amino acides conservés dans six motifs RT ont été changés en de l'alanine à l'aide de techniques normalisées de mutagénèse dirigées ou pilotées par un site (voir, par exemple, Ausubel, ci-dessus) pour
établir leur contribution à une activité catalytique.
Les mutants ont été soumis à des essais de détection à l'aide de télomérase IVR, en utilisant l'essai TRAP traditionnel à deux étapes expliqué en détail à
l'exemple 7.
Les mutants K626A (motif 1), R631A (motif 2), D712A (motif A), Y717A (motif A), D868A (motif C) avaient des activités de télomérase grandement réduites ou indécelables, cependant que, les mutants Q833A (motif B) et G932A (motif E) présentaient des niveaux ou taux intermédiaires d'activité. Deux mutations effectuées des motifs RT, R688A et D897A, avaient une
activité équivalente à celle de hTRT de type sauvage.
Ces résultats étaient en bon accord avec des mutations analogues dans des transcriptases reverses (Joyce et al., 1994, Ann. Rev. Biochem. 63:777) et ils sont similaires à des résultats obtenus avec Est2p (voir Lingner, 1997, Science 276:561). Les expériences identifient des restes dans les motifs RT critiques et non critiques pour une activité enzymatique et mettent en évidence le fait que la hTRT constitue la protéine catalytique de la télomérase humaine. Les mutations fournissent des polypeptides de type hTRT variantes, qui peuvent servir, par exemple, de régulateurs
dominants/négatifs dans l'activité de télomérase.
L'alignement des amino acides des TRT connues a identifié un motif spécifique de télomérase, le motif T (voir ci-dessus). Pour déterminer le rôle catalytique de ce motif dans hTRT, on a effectué un enlèvement par délétion de six amino acides dans ce motif (A560-565; FFY-TE), en utilisant des techniques normalisées de mutagénèse dirigées ou pilotées par un site (Ausubel, ci-dessus). La délétion a été étudiée à l'aide de télomérase IVR, en utilisant l'essai TRAP traditionnel à deux étapes décrit en détail à l'exemple 7. Le mutant A560-565 ne comportait pas d'activité de télomérase observable après 25 cycles d'amplification en chaîne par polymérase, alors que la télomérase IVR de type hTRT sauvage produit un signal fort. Chaque amino acide présent dans chaque reste du motif T a été examiné indépendamment d'une manière similaire; les mutants F561A, Y562A, T564 et E565A ont conservé des niveaux ou taux intermédiaires d'activité de télomérase, cependant qu'un mutant témoin, F487A, présentait un effet minimal sur l'activité. Notamment, F561A possédait une activité de télomérase fortement réduite ou indécelable, cependant que l'activité était complètement restaurée dans son "mutant" reverse, F561A561F. F561A561F modifie la position ayant subi une mutation pour la faire revenir à la phénylalanine d'origine. Cela constitue un témoin qui met en évidence qu'il n'y a pas eu d'autres modifications d'amino acide dans le plasmide pouvant expliquer la diminution de l'activité observée. Ainsi, on montre que le motif T constitue le premier motif non-RT absolument indispensable pour une activité de
télomérase.
Le motif T peut servir à l'identification des TRT d'autres organismes et des protéines de type hTRT, comprenant des variantes de ce motif, peuvent servir de
régulateur dominant/négatif de l'activité de télomérase.
Contrairement à la plupart d'autres RT, la télomérase s'associe de manière stable et copie progressivement une petite portion d'un seul ARN (c'est-à-dire hTR), ainsi le motif T peut être impliqué dans une médiation dans la fixation de hTR, la progression de la réaction ou d'autres fonctions caractérisant de manière unique ou
remarquable la télomérase RT.
EXEMPLE 17
EXAMEN DE DEPISTAGE POUR LA RECHERCHE DE MODULATEURS DE
L'ACTIVITE DE TELOMERASE EN UTILISANT DES COMPOSANTS DE
TELOMERASE EXPRIMES SOUS FORME RECOMBINANTE
Le présent exemple décrit l'utilisation d'une télomérase reconstituée "in vitro" pour rechercher par dépistage et identifier des modulateurs de l'activité de télomérase. L'essai décrit s'adapte facilement à des méthodes à grand débit (utilisant par exemple, des plaques à creux multiple et/ou des systèmes automatisés du type robotique. De nombreuses variations concernant les étapes de l'essai apparaîtront à l'homme du métier, après qu'il ait passé en revue cet exposé. Des clones recormbinants pour des composants de télomérase (par exemple, hTRT et hTR) sont transcrits et translatés (hTRT seulement) dans une réaction "in vitro", comme suit, et comme décrit dans l'e::emple 7 ci-dessus, en utilisant le système de lysat de réticulocytes couplé TNT T7 (Promega), qui est décrit dans le brevet US-A-5 324 637, en suivant les instructions du fabricant: Réactif Quantité |.L) par réaction Lysat de réticulocytes de lapin TNT 25 Tampon de réaction TNT 2 ARN Pol. de TNT T7 1 Mélange AA (complet) 1 Inhibiteur de RNase 1 Eau sans nucléase 16 Coupe par Xbal de pGRN121 [hTRT] (0,5 gg) 2 Coupe par Fspl de pGRN164 [hTR] (0,5 gg) 2 On met le mélange réactionnel à incuber à 30 C durant 2 heures. Le produit est ensuite purifié sur un filtre
DEAE ultralibre-MC ("Millipore").
Le produit du type télomérase recombinante IVRP) est soumis à des essais de détection en présence et en l'absence de concentrations multiples de composés d'essai qui sont solubilisés dans DMSO (par exemple, pM-100 uM) Les composés des essais sont soumis à préincubation dans un volume total de 25 pl durant 30 minutes à la température ambiante, en présence de 2,5 pl de IVRP, de DMSO à 2,5% et de tampon 1X TRAP (20 mM de Tris-HCl, pH 8,3; 1,5 mM de MgCl2, 63 mM de KCl, 0,05% de "Twen20", 1,0 mM de EGTA, 0,1 mg/ml de sérum albumine de bovin). Après la préincubation, on ajoute à chaque échantillon 25 pl du mélange de réaction d'essai TRAP. Le mélange de réaction d'essai TRAP se compose de tampon i1X TRAP, 50 pl de dNTP, 2,0 pg/ml de ACX d'amorçage, 4 pg/ml d'amorceur U2, 0,8 attomole/ml de TSU2, 2 unités/50 pl de Taq polymérase (Perkin Elmer) et 2 pg/ml d'amorceur TS marqué à son extrémité 5' par [32p] (3000 Ci/mmole). Les tubes de réaction sont ensuite placés dans un appareil pour thermocyclage d'amplification en chaîne par polymérase (MJ Research) et une amplification en chaîne par polymérase est effectuée comme suit: 60 min. à 30 C, 20 cycles de {30 sec à 94 C, 30 sec à 60 C, 30 sec à 72 C}, 1 min à 72 C, refroidir à 10 C. L'essai TRAP est décrit, comme noté ci-dessus, dans le brevet US-A-5 629 154. Les amorces de substrat que l'on utilise ont les séquences: amorce TS (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'); amorce ACX (5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3'); amorce U2 (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3');
TSU2 (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3')
Après achèvement de l'étape d'amplification, on ajoute 4pl de tampon de charge 10X, contenant du bleu de bromophénol, dans chaque tube de réaction et l'on examine les produits (20 it) sur un dispositif à 12,5% de PAGE non dénaturant dans 0,5X TBE à 400 V. Le gel achevé est ensuite séché et les produits TRAP sont visualisés par passage dans un dispositif "phophorimager" ou par autoradiographie. L'activité de télomérase en présence du composé d'essai est mesurée par comparaison de l'incorporation de marqueur dans le produit de réaction avec un mélange réactionnel
parallèle ne comportant pas d'agent. 4*** Les clones suivants, décrits dans les exemples, ont été déposés à
l'American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852, Etats-Unis d'Amérique: Phage Lambda U25-1,1 Numéro d'accès ATCC 209024 pGRN121 Numéro d'accès ATCC 209016 Phage lambda lA5 Numéro d'accès ATCC 98505 La présente invention propose de nouveaux procédés et de nouvelles matières concernant hTRT et le diagnostic et traitement de maladies liées à la télomérase. Alors que les exemples spécifiques ont été
fournis, la description ci-dessus est illustrative et
nullement restrictive. De nombreuses variantes de détail de l'invention apparaîtront à l'homme du métier lors du
passage en revue de cette description. Le cadre et la
portée de l'invention doivent donc être déterminés, non
pas en se référant à la description ci-dessus, mais au
contraire le cadre et la portée doivent être déterminés
en se référant aux revendications annexées avec leur
plein ensemble d'équivalents.
Toutes les publications et les documents de brevets cités dans le présent exposé sont incorporés par 43; référence dans leur totalité à toutes fins utiles, dans la même mesure que chaque publication individuelle ou chaque document individuel de brevet est ainsi noté(ej
ou décrit(e) individuellement.
REEvNDC-AT- i NS Pr4paration de proeéine:soiée, essentiellement pure ou recombinante, d'une protéine de type transcriptase reverse de télomérase humaine (hTRT), ou d'une variante ou d'un fragment de cette protéine ou de
sa variante.
2.. Protéine de type hTRT isolée, essentiellement pure ou recombinante, cette protéine étant caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'amino acides présentant au moins 75% d'identité de cette séquence avec la protéine de type hTRT de la figure 17, ou une variante de cette protéine, ou un fragment de cette protéine. 3. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence présentée sur la
figure 17.
4. Polynucléotide isolé, synthétique, essentiel-
lement pur ou recombinant, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acides nucléiques qui code pour une protéine de type hTRT ou un fragment d'une telle protéine. 5. Polynucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence telle que
présentée sur la figure 16.
6. Utilisation d'un polynucléotide ayant au moins dix nucléotides de 10 kilobases (kb) de longueur et comprenant une séquence contiguë d'au moins dix nucléotides, qui est identique, ou exactement complémentaire d'une séquence contiguë présente dans un gène de hTRT naturel ou d'un ARNm de type hTRT lors d'un essai de recherche ou de dépistage d'une séquence
de gène hTRT ou d'ARNm de type hTRT.
7. Utilisation d'un polynucléotide, ayant une longueur d'au moins dix nucléotides de 10 kilobases (kb) et comprenant une séquence contigue d'au moins dix nucléot Ldes, qui est identique à, ou exactement complémentaire d'une séquence contiguë présente dans un gène hTRT naturel ou dans de l'ARNm de type hTRT, dans
la préparation d'une cellule hôte et recombinante.
8. Cellule caractérisée en ce qu'elle comprend un
polynucléotide tel que défini à la revendication 7.
9. Anticorps, ou fragment de liaison d'un tel anticorps, caractérisé en ce que l'anticorps ou le fragment -se fixe spécifiquement sur une protéine de
type hTRT.
10. Procédé de détermination si un composé, ou un traitement module une activité ou une expression -de hTRT, ce procédé comprenant, après administration du composé ou du traitement, la détection d'une modification de l'activité ou de l'expression dans une cellule, chez un animal ou dans une composition comprenant une protéine ou du polynucléotide
recombinant de type hTRT.
11. Procédé de détermination si un composé d'essai est un modulateur d'une activité de type hTRT, ce procédé étant caractérisé en c e qu'il comprend les étapes consistant à: (a) mettre une protéine de type hTRT, de la revendication 1, en contact avec le composé d'essai; et (b) mesurer l'activité de la protéine de type hTRT, une modification de l'activité de hTRT, mesurée en présence du composé d'essai en comparaison de l'activité en l'absence du composé d'essai, fournissant une détermination du fait que le composé d'essai module l'activité de transcriptase reverse de télomérase
(TRT).
12. Procédé de préparation d'une télomérase recombinante, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'une protéine de type hTRT recombinante selon la revendication 1 avec un composant d'ARN de t,élomérrase dans des conditions telles que ladite proteine recombinante et ledit composant d'ARN de télomérase s'associent pour former une télomérase, enzyme capable de catalyser l'addition de nucléotides sur un substrat de télomérase. 13. Procédé de détection d'un produit de gène de hTRT dans un échantillon, procédé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) mettre l'échantillon en contact avec une sonde qui fixe spécifiquement le produit de gène, la sonde et le produit de gène formant un complexe, et la détection du complexe; ou bien (b) une amplification spécifique du produit de gène présent dans l'échantillon biologique, ledit produit de gène étant un acide nucléique, et la détection du produit de l'amplification; la présence du complexe ou du produit d'amplification étant en corrélation avec la présence du produit de
gène hTRT dans l'échantillon biologique.
14. Procédé de détection de la présence, dans un échantillon biologique, d'au moins une cellule humaine donnant un résultat positif à la recherche de télomérase, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) mesurer la quantité d'un produit de gène de hTRT dans ledit échantillon; (b) comparer la quantité ainsi mesurée avec un témoin en corrélation avec un échantillon dépourvu de cellules donnant un résultat positif à la recherche de télomérase, la présence d'un taux ou niveaux de produit de gène hTRT dans ledit échantillon, en comparaison dudit témoin, constituant une corrélation avec la présence de cellules, donnant un résultat positif à la recherche de
* télomérase, dans l'échantillon biologique.
4 4 1 1.:c4 d4 pe rmetan- un dLagnos-ic d'4ta, terl à un effet te téloméraseéd'un patient, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) obtenir sur le patient une cellule ou un échantillon de tissu; (b) déterminer la quantité d'un produit de gène de hTRT dans la cellule ou le tissu; et (c) comparer la quantité du produit de gène de hTRT, dans la cellule ou tissu, avec la quantité dans une cellule ou un tissu sain du même type; une quantité de produit de gène de hTRT dans l'échantillon du patient différente de la quantité dans une cellule ou un tissu sain permettant un diagnostic
d'état apparenté à un effet de télomérase.
16. Procédé pour augmenter "in vitro" la capacité de prolifération d'une cellule de vertébré, procédé caractérisé en ce qu'on augmente l'expression de hTRT
dans la cellule.
17. Utilisation d'un agent augmentant l'expression de hTRT dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un état lié à une augmentation de capacité
de prolifération d'une cellule de vertébré.
18. Utilisation telle que définie à la revendication 17, pour la production d'un médicament destiné à inhiber un effet de vieillissement ou de sénescence. 19. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un support ou excipient acceptable et une protéine de type hTRT, une variante ou un fragment de cette protéine selon la revendication 1, un anticorps de hTRT ou un fragment à rôle de liaison selon la revendication 8, un po!ynucéotide codant pour une protéine de type hTRT, une variante cu un fragment selon la définition de la revendication 1, ou un acide nucléique qui code pour une protéine de type hTRT ou
pour un produit qui en dérive.
20. Utilisation d'un inhibiteur d'activité de télomérase dans la fabrication d'un médicament destiné à traiter un état associé avec un taux ou niveau élevé
d'activité de télomérase au sein d'une cellule humaine.
21. Protéine, variante ou fragment selon l'une
quelconque des revendications 1 à 3, destinée à servir
de produit pharmaceutique.
22. Utilisation d'une protéine, d'une variante ou d'un fragment de protéine selon l'une quelconque des
revendications 1 à 3, pour la fabrication d'un
médicament. 23. Utilisation d'une protéine, d'une variante ou
d'un fragment selon l'une quelconque des revendications
1 à 3, dans la fabrication d'un médicament pour inhiber l'effet du vieillissement, de la sénescence ou d'un cancer. 24. Polynucléotide ou fragment selon la revendication 4 ou la revendication 5, destiné à servir
de produit pharmaceutique.
25. Utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment de polynucléotide selon la revendication 4 ou la revendication 5, dans la fabrication d'un
médicament.
26. Utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment selon la revendication 4 ou 5, pour la fabrication d'un médicament destiné à inhiber un effet
de vieillissement, de sénescence ou de cancer.
27. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: (a) l'ADN ayant une séquence telle que présentée sur la figure 16; (b) un polynucléotide d'au moins 10 nucléotides, qui se fixe par hybridation sur l'ADN ci-dessus et qui code pour une protéine de type hTRT ou une variante d'une telle protéine; (c) des séquences d'ADN qui sont dégénérées par suite de l'action du code génétique donnant des séquences d'ADN définies en (a) et en (b) et qui codent pour un polypeptide de type hTRT ou une variante d'un
tel polypeptide.
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