MX2009001099A - Vacunas mejoradas y metodos para el uso de las mismas. - Google Patents

Vacunas mejoradas y metodos para el uso de las mismas.

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Abstract

Se describen los inmunógenos anti-VIH mejorados, y las moléculas de ácidos nucleicos que las codifican. Los inmunógenos descritos incluyen aquellos que tienen secuencias de consenso para la proteína de envoltura del subtipo A del VIH, aquellas que tiene secuencias de consenso para la proteína de envoltura del subtipo B del VIH, aquellas que tienen secuencias de consenso de la proteína de envoltura del subtipo C del VIH, aquellas que tienen secuencias de consenso para la proteína de envoltura del subtipo D del VIH, aquellas que tiene secuencias de consenso para la proteína Nef-Rev de consenso del subtipo B del VIH y aquellas que tienen secuencias de consenso para los subtipos A, B, C y D de la proteína Gag de VIH. Los inmunógenos anti-VPH mejorados y las moléculas de ácido nucleico que las codifican; los inmunógenos mejorados anti-VHC y las moléculas de ácido nucleico que los codifican; los inmunógenos hTERT mejorados y las moléculas de ácido nucleico que los codifican; y los inmunógenos anti-influenza mejorados y las moléculas de ácido nucleico que los codifican, son también descritos. Se describen también las composiciones farmacéuticas, las vacunas recombinantes que comprenden los patógenos atenuados vivos, así como los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra VIH, VPH, VHC, hTERT y la influenza.

Description

VACUNAS MEJORADAS Y METODOS PARA EL USO DE LAS MISMAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a las vacunas contra el VIH, VPH, VHC, Influenza y cáncer, los métodos mejorados para inducir respuestas inmunitarias , y para inmunizar profiláctica y/o terapéuticamente a individuos contra el VIH, VPH, VHC, Influenza y cáncer.
Antecedentes de la Invención El genoma del virus de inmunodeficiencia humana (VIH por sus siglas en inglés) es altamente plástico debido a una alta proporción de mutación y compensación funcional. Esta alta proporción de mutación es impulsada por al menos dos mecanismos: la baja fidelidad de la transcriptasa inversa viral (RT por sus siglas en inglés) dando como resultado al menos una mutación por ciclo de replicación, y los efectos dobles del gen del factor celular anti-retroviral AP0BEC3G y el gen accesorio del factor de infectividad viral Vif. Los genomas con cada posible mutación y muchas dobles mutaciones son generados durante cada ciclo de replicación, dando como resultado una diversidad antigénica tremenda. En consecuencia, se ha argüido que una vacuna cándidata derivada de un aislado individual no puede promover suficiente reactividad cruzada para proteger contra los diversos virus REF. : 199871 del VIH en circulación. Los estudios recientes han sugerido que los inmunógenos de consenso (Gao. F., et al. 2005. Antigenidity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein J Virol 79:1154-63; Scriba, TV J. , et al. 2005. Functionally-inactive and immunogenic Tat, Rev and Nef DNA vaccines derived from sub-Saharan subtype C human immunodeficiency virus type 1 consensus sequences. Vaccine 23: 1158-69) o los inmunógenos ancestrales (Doria-Rose, N. A., et al. 2005. Human Immunodeficiency Virus Type 1 subtype B Ancestral Envelope Protein Is Functional and Elicits Neutralizing Antibodies in Rabbits Similar to Those Elicited by a Circulating Subtype B Envelope. J. Virol. 79: 11214-1 1224; Gao, F. , et al. 2004. Centralized immunogens as a vaccine strategy to overeóme VIH-I diversity. Expert Rev. Vaccines 3: S161-S168; Mullins, J. I, et al. 2004, Immunogen sequence: the fourth tier of AIDS vaccine design. Expert Rev. Vaccines 3:S151-S159; Nickle, D. C, et al. 2003. Consensus and ancestral state VIH vaccines. Science 299: 1515-1517) pueden ser útiles a este respecto. Sin embargo, los estudios iniciales, de estos procedimientos mostraron mejoramiento inmunitario celular relativamente modesto, inducido por estos inmunógenos . Recientemente Derdeyn et al. analizaron las secuencias de glucoproteina de la envoltura del subtipo C del VIH-1 en ocho parejas de transmisión heterosexual Africanas, y encontraron que los glicanos de longitud más corta VI, V2 y V4 y menos glicanos son las características comunes compartidas por las secuencias obtenidas de los transmisores tempranos (Derdeyn; C, A., et al. 2004. Envelope-constrained neutralization-sensitive VIH-I after heterosexual transmission. Science 303: 2019-2022). Este dato sugiere que los antígenos que imitan tales virus pueden tener relevancia para los virus tempranamente transmitidos. Sin embargo, tales estructuras transmisoras tempranas no han sido observadas para todos los subtipos (Chohan, B, et al. 2005 Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop sequences occurs during transmission of certain genetic subtypes and may impact viral RNA levéis. J. Virol. 79: 6528-6531). Sin embargo, la incorporación de bucles V más cortos en un inmunogeno de envoltura puede tener otros beneficios, tales como el mejoramiento de la sensibilidad de CD4 soluble (Pickora, C, et al. 2005. Identification of two N-linked glycosylation sites within the core of the Simian Immunodificiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD . J. Virol. 79: 12575-12583), y deben ser considerados. Los estudios han mostrado la importancia de las respuestas de CTL específicas de VIH-1, en el control de la carga viral durante la infección aguda y asintomática , y el desarrollo del SIDA. Sin embargo, no es claro si las vacunas de ADN basadas en la envoltura, actuales, son tan potentes como se necesita. Han sido utilizados varios métodos para incrementar los niveles de expresión de inmunógenos de VIH-1, tales como la optimización de codón (Andre, S., et al. 1998, Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J Virol 72: 1497-503; Deml, L., et al. A. 2001. Múltiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candlidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein. J. Virol. 75: 10991-13001), la optimización del ARN (Muthumani, K., et al. 2003. Novel engineered VIH-I East African Clado-A gpl60 plasmid construct induces strong humoral and cell-mediated immune responses in vivo. Virology 314: 134-46; Schneider, R., M. et al. 1997. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation. J. Virol 71: 4892-4903) y la adición de secuencias guia de inmunoglobulina que tienen una estructura secundaria de ARN débil (Yang, J, S., et al. 2001., Induction of potent Thl-Type immune responses from a novel DNÁ vaccine for West Nile Virus New York Isolate (WNV-NY1999) . J. Infect Diseases 184: 809-816). El Virus del papiloma humano (VPH) tiene un genoma de dsADN circular (7,000 a 8,000 pares de bases). Existen hasta 200 genotipos diferentes. Filogenéticamente, el VPH está altamente conservado. Los VPH mucosales son Clasificados como de "Alto Riesgo" o "Bajo Riesgo". El grupo de Bajo Riesgo incluye los tipos 6, 11, 42 y otros. Las Enfermedades Asociadas incluyen: Verrugas Genitales; displasia cervical, anal, vulvar, y vaginal de bajo grado; y papilomatosis respiratoria recurrente. El grupo de alto riesgo incluye los tipos 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58 y otros. Las Enfermedades Asociadas incluyen: la causa esencial del cáncer cervical, displasia pre-cancerigena ; la causa mayor del cáncer anal, vulvar, vaginal, amigdalino; y el co-factor para otro cáncer aerodigestivo . Cada día, 800 mujeres mueren de cáncer cervical . Las proteínas E6 y E7 de VPH son antígenos específicos de tumor, requeridos para la tumorigenesis y mantenimiento del estado tumoral. Las respuestas inmunitarias específicas de E7 son suprimidas en pacientes con cáncer cervical. Las proteínas E6 y E7 interactúan específicamente con los productos de los genes supresores del tumor humano celular, É6 con p53 y E7 con Rb (el gen supresor del tumor de retinoblastoma) . E6 y E7 son objetivos inmunoterapéuticos ideales . hTERT es una transcriptasa inversa de la telomerasa humana que sintetiza una etiqueta TTAGGG sobre el extremo de los telómeros, para prevenir la muerte celular debida a acortamiento cromosómico. Las células embrionarias y algunas células de linea germinal expresan normalmente hTERT para regular la homeostasis de las poblaciones celulares. Las células cancerígenas, no obstante, explotan este mecanismo de regulaciqn para perturbar la homeostasis de las poblaciones celulares. Por ejemplo, la sobre-expresión de HTERT ocurre en más de 85% de las células cancerígenas humanas. Por lo tanto, hTERT es un objetivo inmunoterapéutico ideal. hTERT puede también mejorar la inmunoterapéutica contra las células hiperproliferativas que expresan hTERT, debido a la infección por el VHC o el VPH. La oncoproteína E6 proveniente de los tipos de VPH de alto riesgo, activa la transcripción de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) en keratinocitos humanos. Legiones displásicas y legiones neoplásicas tempranas' dentro del hígado también expresan hTERT a niveles anormalmente altos. De este modo, la inmunoterapia contra el VPH y VHC puede ser mejorada al dirigirse a las células que expresan hTERT a niveles anormales. La inmunoterapia en combinación utilizando hTERT y las proteínas VPH o VHC o los ácidos nucleicos que codifican para tales proteínas, es una inmunoterapia atractiva. La Hemaglutinina de la Influenza (HA) es expresada sobre la superficie de las partículas virales de influenza y es responsable del contacto inicial entre los virus y su célula hospedera, HA es un inmunógeno bien conocido. La cepa H1N5 de la influenza aviar, particularmente amenaza a la población humana debido a su proteina HA la cual, si es ligeramente genéticamente reordenado por mutación natural, tiene una infectividad incrementada en gran medida de las células humanas, en comparación a otras cepas del virus. La infección de infantes y ancianos o humanos adultos inmunocomprometidos, con la cepa viral H1N5 está a menudo correlacionada a un pobre resultado clínico. Por lo tanto, HA y otras moléculas de influenza de la cepa H1N5 de influenza, son objetivos inmunoterapéuticos ideales.
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a las construcciones de ácido nucleico y a las proteínas purificadas por éstos, qué proporcionan objetivos inmunogénicos mejorados contra los cuales puede ser generada una respuesta inmunitaria anti-VIH. La presente invención proporciona las secuencias de consenso para la proteína de envoltura del subtipo A del VIH, las secuencias de consenso de la proteína de envoltura del subtipo B del VIH, las secuencias de consenso para la proteína de envoltura del subtipo C del VIH, las secuencias de consenso para la proteína de envoltura del subtipo D del VIH, las secuencias de consenso para la proteína de Nef-Rev de consenso del subtipo B del VIH, y las secuencias de consenso forman los subtipos de proteina Gag del VIH, A, B, C y D. La presente invención proporciona las construcciones que codifican para tales secuencias de proteínas, las vacunas que comprenden tales proteínas y/o las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales proteínas, y los métodos de inducción de las respuestas inmunitarias anti-VIH. La presente invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: la SEQ ID NO: 1, fragmentos de la SEQ ID NO: 1; las secuencias tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 1; fragmentos de secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, fragmentos de la SEQ ID NO: 3; las secuencias tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 3; fragmentos de secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5, fragmentos de la SEQ ID NO: 5; las secuencias tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 5; fragmentos de secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, fragmentos de la SEQ ID NO: 7; las secuencias tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 7; fragmentos de secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 9, fragmentos de la SEQ ID NO: 9; las secuencias tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 9; fragmentos de secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 11; fragmentos de secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 11. La presente invención se refiere a la moléculas de ácido nucleico que codifica para una proteína seleccionada del grupo que: consiste de SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21. La presente invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: las secuencias nucleotídicas que codifican para la SEQ ID NO: 2; las secuencias nucleotídicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; los fragmentos de las secuencias nucleotídicas que codifican para la SEQ ID NO: 2; los fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; las secuencias nucleotídicas que codifican para la SEQ ID NO: 4; las secuencias nucleotídicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; los fragmentos de las secuencias nucleotídicas que codifican para la SEQ ID NO: 4; los fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; las secuencias nucleotidicas que codifican para la SEQ ID NO: 6; las secuencias ' nucleotidicas que codifican; para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; los fragmentos de las secuencias nucleotidicas que codifican para la SEQ ID NO: 6; los fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; las secuencias nucleotidicas que codifican, para la SEQ ID NO: 8; las secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; los fragmentos de las secuencias nucleotidicas que codifican para la SEQ ID NO: 8; los fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; las secuencias nucleotidicas que codifican! para la SEQ ID NO: 10; las secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 10; los fragmentos de las secuencias nucleotidicas que codifican para la SEQ ID NO: 10; los fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología! a la SEQ ID NO: 10; las secuencias nucleotidicas que codifican para la SEQ ID NO: 12; las secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; los fragmentos de las secuencias nucleotidicas que codifican para la SEQ ID NO: 12; los fragmentos de una secuencia nucleotidica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; La presente invención proporciona además las composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y su uso en los métodos para la inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VIH, que comprenden administrarle a un individuo una composición que comprende tales moléculas de ácido nucleico. La presente invención proporciona además la vacuna recombinante que comprende tales moléculas de ácido nucleico y su uso en los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo, contra el VIH, que comprende administrarle a un individuo tal vacuna recombinante. La presente invención proporciona además los patógenos atenuados vivos que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y su uso en los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VIH, que comprende el administrarle a un individuo tales patógenos atenuados vivos. La presente invención proporciona además las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la SEQ ID NO: 2; las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; fragmentos de la SEQ ID NO: 2; fragmentos de las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; la SEQ ID NO: 4; las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; fragmentos de la SEQ ID NO: 4; fragmentos de las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; la SEQ ID NO: 6; las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; fragmentos de la SEQ ID NO: 6; fragmentos de las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; la SEQ ID NO: 8; las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; fragmentos de la SEQ ID NO: 8; fragmentos de las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; la SEQ ID NO: 10; las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 10; fragmentos de la SEQ ID NO: 10; fragmentos de las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 10; la SEQ ID NO: 12; las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; fragmentos de la SEQ ID NO: 12; y fragmentos de las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; La presente invención proporciona además las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21.
La presente invención proporciona además las composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas y su uso en los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo, contra el VIH, que comprende administrarle a un individuo una composición que comprende tales proteínas. La presente invención proporciona además la vacuna recombinante que comprende tales proteínas y su uso en los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo., contra el VIH, que comprende administrarle a un individuo tal vacuna recombinante. La presente invención proporciona además los patógenos atenuados vivos que comprenden tales proteínas y su uso en los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VIH, que comprende el administrarle a un individuo tales patógenos atenuados vivos. Las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidbs E6-E7 del genotipo 16 del VPH, de consenso, y las moléculas: de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídlica que codifica para tales proteínas, son también proporcionadas . La presente invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 22; fragmentos de la misma; las secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 22; y fragmentos de las mismas. La presente invención también se refiere a las moléculas, de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 23; una secuencia de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 24; una secuencia de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 25; una secuencia de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 26; y una secuencia de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 27. La presente invención también se refiere a la composición farmacéutica de tales moléculas de ácido nucleico, y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo, contra el VPH, que comprende el administrarle al individuo una composición que comprende tales . moléculas de ácido nucleico. La presente invención se refiere además a las vacunas recombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo, contra el VPH, que comprende administrarle al individuo tal vacuna recombinante . La presente invención se refiere además al patógeno vivo atenuado que comprende tales moléculas de ácido nucleico, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo;, contra el VPH, que comprende administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. La presente invención también se refiere a las moléculasi de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 23, fragmentOiS de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90%' de homología a la SEQ ID NO: 23; y fragmentos de la misma. La presente invención también se refiere a las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27. La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo' contra el VPH, que comprende administrarle al individuo una composición que comprende tales proteínas. La presente invención también se refiere a las vacunas recombinantes que comprenden tales proteínas y al método de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VPH, que comprende administrarle al individuo tales vacunas recombinantes. La presente invención también se refiere a los patógenosl atenuados vivos que comprenden tal proteina, y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo^ contra el VPH, que comprende el administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. Las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos E1-E2 del genotipo la y Ib del VHC, de consenso, y las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica para tales proteínas, son también proporcionadas en la presente. La presente invención se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 30; fragmentos de la misma; las secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 30; y fragmentos de las mismas. La presente invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 31. La presente invención también se refiere a la composición farmacéutica de tales moléculas de ácido nucleico, y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo, contra el VHC, que comprende el administrarle al individuo una composición que comprende tales moléculas de ácido nucleico. La presente invención se refiere además a las vacunas recombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo, contra el VHC, que comprende administrarle al individuo tal vacuna recombinante . La presente invención se refiere además al patógeno vivo atenuado que comprende tales moléculas de ácido nucleico, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo,, contra el VHC, que comprende administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. La presente invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 31, fragmentos de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31; y fragmentos de la misma . La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VHC, que comprende administrarle al individuo una composición que comprende tales proteínas. La presente invención también se refiere a las vacunas recombinantes que comprenden tales proteínas y al método de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VHC, que comprende administrarle al individuo tales vacunas recombinantes. La presente invención también se refiere a los patógenos atenuados vivos que comprenden tal proteína, y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VHC, que comprende el administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. Son proporcionadas las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos de hTERT de consenso y las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica para tales proteínas. La presente invención se refiere además a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 34; fragmentos de la misma; las secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 34; y fragmento^ de las mismas. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica de tales moléculas de ácido nucleico, y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra las células hiperproliferativas que expresan hTERT, que comprende administrarle al individuo una composición que comprende tales moléculas de ácido nucleico.
La presente invención se refiere además a las vacunas recombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico, y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra las células hiperproliferativas que expresan hTERT, que comprende administrarle al individuo tal vacuna recombinante . La presente invención se refiere además a los patógenos atenuados vivos que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra las células hiperproliferativas que expresan hTERT, que comprende administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. La presente invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 35, fragmentos de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 35; y fragmentos de la misma. La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas y a los métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo contra las células hiperproliferativas que expresan hTERT, que comprende administrarle al individuo una composición que comprende tales proteínas. La presente invención también se refiere a las vacunas recombinantes que comprenden tales proteínas, y al método de inducción de una respuesta inmunitaria en un individua contra las células hiperproliferativas que expresan hTERT, que comprende administrarle al individuo tales vacunas recombinantes . La presente invención también se refiere a los patógenos atenuados vivos que comprenden tal proteína, y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra las células hiperproliferativas que expresan hTERT, que comprende administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. Las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos HA de consenso de influenza H5N1, las secuencias de aminoácidos NA de consenso de influenza H1N1 y H5N1, las secuencias de aminoácidos MI de consenso de la influenza H1N1 y H5N1, y las secuencias de aminoácidos M2E-NP de consenso de la influenza H5N1, y las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica para tales proteínas, son también proporcionadas. : La presente invención se refiere además a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 36; fragmentos de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 36; y fragmentos de las mismas. La presente invención se refiere además a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 38; fragmentos de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 38; y fragmentos de las mismas. La presente invención se refiere además a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 40; fragmentos de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 40; y fragmentos de las mismas. La presente invención se refiere además a las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 42; fragmentos de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 42; y fragmentos de las mismas. La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra VPH, VHC y virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo una composición que comprende tales moléculas de ácido nucleico. La presente invención se refiere además a las vacunas itecombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra VPH, VHC, y virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo tal vacuna recombinante . La presente invención se refiere además a los patógenos atenuados vivos que comprenden las moléculas de ácido nucleico, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra VPH, VHC y el virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos . La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra VPH, VHC y virus de la influenza,, que comprende administrarle al individuo una composición que comprende tales moléculas de ácido nucleico. La presente invención se refiere además a las vacunas recombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra VPH, VHC, y virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo tal vacuna recombinante.
La presente invención se refiere además a los patógenos atenuados vivos que comprenden las moléculas de ácido nuóleico, y los mé'todos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra VPH, VHC y el virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. La presente invención se refiere además a las moléculas de proteina que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 37; fragmentos de la misma; secuencias nucleotidicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; y fragmentos de las mismas. La presente invención se refiere además a las moléculas de proteína que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 39; fragmentos de la misma; secuencias nucleotidicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 39; y fragmentos de las mismas. La presente invención se refiere además a las moléculas de proteína que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 41; fragmentos de la misma; secuencias nucleotidicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; y fragmento^ de las mismas. La presente invención se refiere además a las moléculas de proteína que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 43; fragmentos de la misma; secuencias nucleotídicas que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43; y fragmentos de las mismas. La presente invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de proteína y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo una composición que incluye tales moléculas de proteína. La presente invención se refiere además a las vacunas recombinantes que comprenden tales moléculas de proteína y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo tal vacuna recombinante . La presente invención se refiere además a los patógenos atenuados vivos que comprenden tales moléculas de proteína, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el virus de la influenza, que comprende el administrarle al individuo tales patógenos atenuados vivos. La presente invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de proteína y a los métodos de inducción de una respuesta inmunitar|ia en un individuo contra el virus de la influenza, que comptende el administrarle al individuo una composición que inclujye tales moléculas de proteína. La presente invención se refiere además a las vacunas recombinantes que comprenden tales moléculas de proteína, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitarda en un individuo contra el virus de la influenza, que comprende el administrarle al individuo tal vacuna recombinamte . La presente invención se refiere además a los patógenos atenuados vivos que comprenden tales moléculas de proteína, y los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un individuo contra el virus de la influenza, que comprende administrarle al individuo tales patógenos atenuados; vivos.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra una comparación de las secuencials de aminoácidos de EY2E1-B y EK2P-B. La secuencia guía de IgE está subrayada. Las regiones con recuadro muestran regiones variables. El * denota seis residuos importantes involucrados en la utilización de CCR5. El sitio de escisión es indicado por una flecha. El dominio transmemb|ranal es mostrado por la línea discontinua.
La Figura 2 muestra las relaciones filogenéticas de dos secuencias de envoltura del subtipo B del VIH-1. Cuarenta y dos secuencias de envoltura del subtipo B del VIH-1. EY2E1-B, EK2P-B, dos secuencias del subtipo D y dos del subtipo C (grupo externo) fueron incluidas en el análisis filogenético . Las secuencias de envoltura del subtipo B que representan una muestra amplia de diversidad fueron provenientes de los siguientes 11 países: Argentina (1), Australia (6); China (1); Francia (4); Alemania (1); Gran Bretaña (2); Italia (1); Japón (1); Holanda (4); España (1); Estados Unidos (20). Las secuencias EY2E1-B y EK2P-B son mostradas en cuadros negros. Las Figuras 3A-3B muestran la expresión de los inmunógenos de envoltura. La figura 3A muestra los resultados del análisis de transferencia de Western de los genes EY2E1-B y EK2P-B. Las células RD fueron transfectadas con diferentes plásmidos. 48 horas más tarde, fueron recolectados los lisados celulares. Las muestras fueron analizadas mediante transferencia de Western y sondeadas con el anticuerpo monoclonal gpl20 para el VIH-1 (2G12). Respecto al control de carga, la transferencia fue depurada y sondeada nuevamente con un anticuerpo monoclonal anti-actina. La figura 3B muestra los resultados del ensayo de inmunofluorescencia de los genes EY2E1-B y EK2P-B. Las células RD transfectadas que expresan las proteínas de envoltura mostraron fluorescencia roja típica. El anticuerpo monoclonal F105 específico de la envoltura del HVI-1 sirvió como la fuente del anticuerpo primario . Las Figuras 4A-4C muestran los títulos totales del anticuerpo IgG en los sueros de los ratones inmunizados. -La figura 4A muestra la medición de las respuestas del anticuerpo específico de la envoltura del subtipo B. La figura 4B muestra la medición de las respuestas del anticuerpo específico de la envoltura del subtipo A/E. La figura 4C muestra la medición de las respuestas del anticuerpo específico de la envoltura del subtipo C. Las respuestas inmunitarias humorales después de la inmunización con las construcciones de ADN, pEY2El-B y pEK2P-B fueron detectadas mediante el ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) . Cada ratón fue inmunizado intramuscularmente con tres veces cada uno de 100 pg de ADN a intervalos bisemanales. Los ratones provenientes de cada grupo (n=3) fueron sangrados una semana después de la tercera inmunización y los sueros igualmente combinados fueron diluidos en amortiguador de bloqueo y analizados como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Los sueros combinados recolectados de ratones inmunizados con pVAX fueron utilizados como un control. La absorbancia (OD) fue medida a 450 nm. Cada punto de datos representa tres valores de OD promediados provenientes de tres sueros de ratón por grupo y los valores representan la media de ELISA obtenida en tres ensayos separados . Las Figuras 5A-5E muestran la inducción de las respuestas inmunitarias mediadas por células por pEY2El-B en ratones BalB/C y los ratones transgénicos HLA-A2. Las frecuencias de las células formadoras de puntos de IFN-? específicos de la envoltura de consenso del subtipo B (SFC) por millón de esplenocitos después de la vacunación con el ADN con pEY2El-B y pEK2P-B fueron determinadas mediante el ensayo de ELISpot en ratones BalB/C (figura 5A) y ratones transgénicos (Figura ' 5C) . Las frecuencias de las células formadoras de punto de IFN-? como específicas de envoltura de consenso de subtipo B agotadas en CD8, por millón de esplenocitos después de la vacunación con ADN con pEY2El-B y pEK2P-B, fueron también determinadas en ratones BalB/C (Figura 5B) y ratones transgénicos (Figura 5D) . Los esplenocitos fueron aislados de ratones inmunizados individuales (tres ratones por grupo) y estimulados in vitro con combinados peptídicoiS de envoltura del subtipo B de consenso, traslapadlos. Los ratones inmunizados con pVAX de columna vertebral fueron incluidos como un control negativo. Los valores son las medias ± las desviaciones estándares de las medias de los SFCs de IFN-?. (Figura 5E) caracterización de los epitopos dominantes específicos de envoltura de consenso del subtipo B. Los esplenocitos recolectados de ratones BalB/C vacunados con pEY2El-B y pEK2P-B respectivamente, fueron cultivados con 29 combinados peptidicos de envoltura de consenso de subtipo B del VIH-1, por 24 horas. Las células secretorals de IFN-? fueron determinadas mediante el ensayo ELISpot como se describe anteriormente. Las Figuras 6A-6J muestran la reactividad cruzada inducida por pEY2El-B en ratones BalB/C y ratones transgénicos HLA-A2. Las respuestas inmunitarias de células T aditivas en ratones B¡alB/C inducidas por vacunación con pEY2El-B y pEK2P-B contra ouatro combinados peptidicos individuales de los péptidos de envoltura MN de VIH-1 (figura 6A) , grupo M de VIH-1 (figura 6B) , péptidos de envoltura de consenso del subtipo C (figura 6C) y dos péptidos de envoltura del aislado del tipo C (Figura 6D y figura 6E) fueron medidas mediante el ensayo ELISpot de IFN-?. Las respuestas inmunitarias de células T aditivas en ratones transgénicos HLA-A2, inducidas por vacunación con pEY2El-B y pEK2P-B contra cuatro combinados individuales peptidicos de los péptidos de envoltura de MN del VIH-1 (figura 6F) , grupo M del VIH-1 (figura 6G) , péptidos de envoltura de consenso del subtipo C (figura 6H) y dos péptidos de envoltura del aislado del subtipo C (figura 61 y 6J) fueron también medidas. Los ratones inmunizados con pVAX de columna vertebral fueron incluidos como un control negativo. Las Figuras 7A-7B muestran la caracterización de los epitopos dominantes específicos de la envoltura MN del subtipo B en ratones BalB/C (figura 7A) y ratones transgénicos HLA-A2 (figura 7B) inmunizados con pEY2El-B y pEK2P-B. Los esplenocitos recolectados de ratones BalB/C vacunados con pEY2El-B ¡y pEK2P-B y los ratones transgénicos respectivamente, fueron cultivados con 29 combinados peptidicos de envoltura MN del subtipo B del VIH-1, por 24 horas. Las células secretoras de IFN-? fueron determinadas mediante el ensayo de ELISpot como se describe anteriormente. La Figura 8 muestra una representación esquemática de dominios funcionales de E72E1-B (aproximadamente 700+ aminoácidos) . La Figura 9 muestra un mapa de la construcción de E72E1-B. Las Figuras 10A-10B muestran que una respuesta inmunitaria celular fuerte es inducida por E72E1-B. Las Figuras 11A-11B, muestran que respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada, fuertes y amplias son inducidas por E72E1-B. Las Figuras 12A-12D muestran que las respuestas inmunitarias celulares de clase cruzada fuerte, son inducidas por E72E1-B. La Figura 13 describe el inmunógeno diseñado para el estudio eh el Ejemplo 2. La Figura 14 muestra las relaciones filogenéticas : treinta y seis secuencias de envoltura del subtipo C del VIH-1, EY3E1^C, EK3P-C, dos secuencias del subtipo B, una del subtipo A y una del subtipo D (grupo externo) fueron incluidas en el análisis filogenético . Las secuencias de envoltura del subtipo C que representan una muestra amplia de diversidad fueron provenientes de 12 países. Las Figuras 15A y 15B muestran los datos provenientes de estudios de la respuesta celular promovida por pEY3El-C. La Figura 16 muestra los datos de estudios de respuestas celulares promovidas por pEY3El-C. Las Figuras 17A-17D muestran los datos provenientes de estudios de las respuestas celulares de reactividad cruzada promovidas por pEY3El-C dentro de la misma clase (ciado) . Las Figuras 18A y 18B muestran los datos provenientes de estudios de respuestas celulares de reactividad cruzada promovidas por pEY3El-C. La figura 18A muestra los datos provenientes de ELISpot de IFN-? específico de envoltura del subtipo C (Uruguay) . La figura 18B muestra los datos provenientes del ensayo de ELISpot de IFN-? específico de envoltura del subtipo C (Sudáfrica) . Las Figuras 19A-19F muestran los datos provenientes de estudios de respuestas celulares de reactividad cruzada, promovidas por pEY3El-C entre CLADOS (agrupaciones naturales de organismos con un origen común) . Las Figuras 20A-20X muestran los datos provenientes de estudios de las respuestas inmunitarias promovidas por las construcciones de consenso gag del VIH-1. La Figura 21 ilustra el ciclo de vida del VPH en el epitelio del tracto genital. La Figura 22 muestra un mapa de la organización del genoma del VPH-16. La Figura 23 muestra el diseño de inmunógeno: * se refiere a las supresiones o mutaciones importantes para el enlace y degradación de p53; ? se refiere a las mutaciones en el sitio de enlace de Rb. La Figura 24 incluye una ilustración de la construcción genética pl667 que incluye las secuencias de codificación para las proteínas E6 y E7 del VPH, y pVAX, el plásmido de columna vertebral que carece del inserto del VPH y es utilizado como un control negativo. Las Figuras 25A-25D muestran las respuestas inmunitarias celulares inducidas por el inmunógeno de ADN pl667. La Figura 26 muestra los resultados del mapeo de epitopo inmunodominante . La Figura 27 muestra los resultados de los experimentos profilácticos utilizando la vacuna de ADN E6/E7 para estudiar la protección en ratones C57/BL6. La Figura 28 muestra los resultados de los experimentos de regresión tumoral utilizando la vacuna de ADN E6/E7 para estudiar la protección en ratones C57/BL6.
La Figura 29 muestra los datos provenientes de experimentos que detectan los linfocitos positivos de tetrámero E7 en bazos. La Figura 30 muestra los datos provenientes de experimentos que detectan los linfocitos positivos de tetrámeroi E7 en tumores. La Figura 31 muestra los datos provenientes de un estudio de protección de vacuna de ADN en ratones transgénicos . La Figura 32 muestra las respuestas inmunitarias celulares mejoradas, para los inmunógenos de consenso del VIH-1 con co-inyección intramuscular IL-12 codificada por plásmido, seguido por electroporación (EP) . Los ELISpots de IFNy fueron realizados dos semanas después de la (a) primera inmunización, (b) segunda inmunización, y (c) tercera inmunización (como se observa en comparación a los otros tres) . Las respuestas a env son descritas como barras negras, y gag son descritas como barras blancas con los datos mostrados como las respuestas medias de grupo apilado ± SEM. La Figura 33 muestra las respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada, mejoradas, con electroporación intramuscular. Después de tres inmunizaciones, la respuesta inmunitaria total de células T en macacos inmunizados con pEY2El-B contra cuatro combinados peptidicos de los péptidos del grupo M del VIH-1, fueron determinadas mediante ELISpot de IFNy. Los datos son mostrados como las medias del grupo apilado ± SEM. La Figura 34 muestra las respuestas de memoria aumentada para los inmunógenos del VIH-1 con electroporación intramuscular y el plásmido IL-12. Cinco meses después de la última inmunización, los ensayos de ELISpot fueron realizados para determinar las respuestas de memoria especifica del antigeno a gag y env en los grupos inmunizados con IM y EP con y sin la seo-inmunización con el plásmido IL-12. Los datos son mostrados como las respuestas medias grupales ± SEM.
Descripción Detallada de la Invención Definiciones Como se utiliza en la presente, la frase "condiciones de hibridación estrictas o exigentes" o "condiciohes estrictas" se refieren a las condiciones bajo las cuales una molécula de ácido nucleico se hibridará a otra molécula de ácido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones estrictas son dependientes de la secuencia, y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas se hibridan específicamente a más altas temperaturas. En general, las condiciones estrictas son seleccionadas para ser de aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica definida y pH definido. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico definida) a la cual 50% de las sondas complementarias a la secuencia objetivo, se hibridan a la secuencia objetivo en el equilibrio. Ya que las secuencias objetivo están en general presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas son ocupadas en el equilibrio. Típicamente, las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal sea menor de aproximadamente 1.0 M de ion sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de ion sodio (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es al menos de aproximadamente 30°C para sondas, cebadores u oligonucleótidos cortos (por ejemplo de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas, cebadores u oligonucleótidos más largos. Las condiciones estrictas pueden ser también logradas con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. La homología secuencial para los nucleótidos y los aminoácidos puede ser determinada utilizando los análisis FASTA, BLAST y BLAST de espacio vacío (Altschul et al, Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389, la cual es incorporada por referencia en la presente en su totalidad) y el software PAUP* 4. OblO (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts) . "El porceintaje de similitud" es calculado utilizando software PAUP* 4. OblO (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts). La similitud promedio de la secuencia de consenso es calculada en comparación a todas las secuencias en el árbol filogenético (ver Figuras 2 y 14). En resumen, el algoritmo BLAST, el cual significa Herramienta de Investigación de Alineación Local Básica es adecuado para determinar la similitud secuencial (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . El software para realizar los análisis BLAST es públicamente disponible a través de el National Center for Biotechnology Information (http://wiww.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primeramente la identificación del par de secuencia de alta calificación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud en la secuencia de búsqueda que concuerdan o que satisfacen alguna calificación de umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es denominado como el umbral de calificación de palabra de vecindario (Altschul et al., supra) . Estos aciertos de palabra de vecindario inicial, actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar los HSPs que las contienen. Los aciertos de palabra son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tan lejos como la calificación de alineación acumulativa pueda ser incrementada. La extensión para los aciertos de palabra en cada dirección son interrumpidas cuando: 1) la calificación de alineación acumulativa decae por la cantidad X desde su valor máximo alcanzado:; 2) la calificación acumulativa va hacia cero o más abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de calificación negativa; o 3) el final de secuencia es alcanzado. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) las alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST (Karlin et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) y el BLAST de espacio vacio realizan un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurre probablemente una concordancia entre dos secuencias nucleotídicas . Por ejemplo, un ácido nucleico es considerado similar a otro si la probabilidad de suma más pequeña en comparación del ácido nucleico de prueba al otro ácido nucleico es menor de aproximadamente 1, preferentemente menor de aproximadamente 0.1, más preferentemente menor de aproximadamente 0.01, y lo más preferentemente menor de aproximadamente 0.001. Como se utiliza en la presente, el término "construcción genética" se refiere a las moléculas de ADN o ARN que 'comprenden una secuencia nucleotidica que codifica para la proteína. La secuencia de codificación incluye las señales de inicio y terminación operablemente enlazadas a elementos reguladores que incluyen un promotor y la señal de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células del individuo a quien es administrada la molécula de ácido nucleico. Como se utiliza en la presente, el término "forma expresable" se refiere a las construcciones génicas que contienen los elementos reguladores necesarios operablemente enlazados a una secuencia de codificación que codifica para una proteína, tal que cuando está presente en las células del individuo, será expresada la secuencia de codificación.
Panorama General La presente invención proporciona vacunas mejoradas mediante la utilización de una estrategia de fases múltiples para aumeintar las respuestas simultáneas celulares inducidas por los inmunógenos. Las secuencias de consenso codificadas para los inmunógenos fueron generadas. Las modificaciones genéticas que incluyen la optimización de codón, la optimización de ARN, y la adición de una secuencia guía de mmunoglobulma altamente eficiente para incrementar la inmunogenicidad de las construcciones, son también descritos. Los nuevbs inmunógenos han sido diseñados para promover respuestas inmunitarias celulares más fuertes y más amplias que los inmunógenos correspondientes optimizados por codón. La invención proporciona vacunas mejoradas para el VIH, VPH, VHC, influenza y cáncer al proporcionar proteínas y construcciones genéticas que codifican para las proteínas con epitopos que las hacen particularmente efectivas como inmunógenos contra los cuales pueden ser inducidas respectivamente las respuestas inmunitarias anti-VIH, anti-VPH, anti-VHC, anti-influenza y anti-hTert. En consecuencia, pueden ser proporcionadas las vacunas para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica. En algunas modalidades, los medios para distribuir el inmunógeno son una vacuna die ADN, una vacuna recombinante, una vacuna de subunidad proteica, una composición que comprende el inmunógeno, una vacuna atenuada o una vacuna muerta. En algunas modalidades, la vacuna comprende una combinación seleccionada de los grupos que consiste de: una o más vacunas de ADN, una o más vacunas recombinantes , una o más vacunas subunitarías de proteína, una o más composiciones que comprenden el inmunógeno, una o más vacunas atenuadas y una o más vacunas muertas. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, una vacuna de acuerdo a la invención es distribuida a un individuq para modular la actividad del sistema inmunitario del individuo y con esto mejorar la respuesta inmunitaria contra VIH, VPH, VHC, influenza o hTERT. Cuando una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteina es recogida o absorbida por las células del individuo, la secuencia nucleotidica es expresada en las células y la proteina es con esto distribuida al individuo. Los aspectos de la invención proporcionan los métodos de distribución de las secuencias de codificación de la proteina sobre la molécula de ácido nucleico tal como plásmido, como parte de las vacunas recombinaintes y como parte de las vacunas atenuadas, como proteínas aisladas o proteínas parte de un vector. De acuerdo a algunos aspectos de la presente invención, son proporcionadas las composiciones y métodos que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo contra el VIH, VPH, VHC, influenza y cáncer. La presente invención se refiere a las composiciones para distribuir las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia nucleotidica que codifica para una proteína de la invención operablemente enlazada a los elementos reguladoras . Los aspectos de la presente invención se refieren a las composiciones de una vacuna recombinante que comprende una secuencia nucleotidica que codifica para una proteína de la invención; un patógeno atenuado vivo que codifica para una proteina de la invención y/o incluye una proteina de la invención; un patógeno muerto incluye una proteina de la invención; o una composición tal como una vacuna liposomal o subunitaria que comprende una proteina de la invención. La presente invención se refiere además a las composiciones farmacéuticas inyectables que comprenden las composiciones .
VIH La presente invención proporciona las vacunas anti- VIH mejoradas, mediante la utilización de una estrategia de fases múltiples para aumentar las respuestas inmunitarias celulares inducidas por los inmunógenos de VIH. Las secuencias de consenso modificadas para los inmunógenos fueron generadas. Se describen también las modificaciones genéticas que incluyen la optimización de codón, la optimización de ARN y la adición de una secuencia guia de inmunoglobulina de alta eficiencia para incrementar la inmunogenicidad de las construcciones. Los nuevos inmunógenos han sido diseñados para promover respuestas inmunitarias celulares más fuertes y más amplias que un inmunógeno optimizado con codón correspondiente . La SEQ ID NO: 1 es una construcción de la secuencia de ADN de, la envoltura de consenso del subtipo A. La SEQ ID NO: 1 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna de VIH que comprende una secuencia guía de IgE enlaza a una secuencia de consenso para la proteína de envoltura del subtipo A. La SEQ ID NO: 2 comprende la secuencia, de aminoácidos para la construcción de la secuencia de vacuna de VIH que comprende una secuencia guía de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteína de envoltura del subtipo A. La secuencia guía de IgE es la SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 16 es una secuencia de proteína de envoltura de consenso del subtipo A. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 16, fragmentos de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 16, o fragmentos de la misma. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 2 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 1. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia guía de IgE SEQ ID NO: 15 o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 1 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 1 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 360 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 450 o más nucleótidos ; en algunas modalidades, 540 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 630 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 720 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 810 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 900 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 990 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1080 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1170 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1260 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1350 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1440 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1530 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1620 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1710 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1800 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1890 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1980 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2070 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 1 pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 1 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidps, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 450 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos ; en algunas modalidades menos de 630 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 810 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 990 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1170 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1350 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1440 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1530 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1710 nucleótidos; en alguna¡s modalidades menos de 1800 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1890 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1980 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 1020 nucleótidos; y en algunas modalidades menos de 2070 nucleótidos . ¦Los fragmentos de la SEQ ID NO: 2 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 2 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 90 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 120 o más aminoácidos en algunas modalidades, 150 o más aminoácidos en algunas modalidades, 180 o más aminoácidos en algunas modalidades, 210 o más aminoácidos en algunas modalidades, 240 o más aminoácidos en algunas modalidades, 270 o más aminoácidos en algunas modalidades, 300 o más aminoácidos en algunas modalidades, 330 o más aminoácidos en algunas modalidades, 360 o más aminoácidos en algunas modalidades, 390 o más aminoácidos en algunas modalidades, 420 o más aminoácidos en algunas modalidades, 450 o más aminoácidos en algunas modalidades, 480 o más aminoácidos en algunas modalidades, 510 o más aminoácidos en algunas modalidades, 540 o más aminoácidos en algunas modalidades, 570 o más aminoácidos en algunas modalidades, 600 o más aminoácidos en algunas modalidades, 630 o más aminoácidos en algunas modalidades, 660 o más aminoácidos en algunas modalidades, 690 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 270 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 300 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 330 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 360 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 390 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 420 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 450 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 480 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 540 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 600 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 660 aminoácidos, y en algunas modalidades menos de 690 aminoácidos. La SEQ ID NO: 3 es una construcción de secuencia de ADN de envoltura de consenso de subtipo B. La SEQ ID NO: 3 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna del VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura del subtipo B. La SEQ ID NO: 4 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de la secuencia de vacuné de VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura, del subtipo B. La secuencia guia de IgE es la SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de proteina de envoltura de consenso del subtipo B. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 17, fragmentos de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 17, o fragmentos de la misma. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 4 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 3. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia guia de IgE, SEQ ID NO: 15 o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 3 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 3 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 360 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 450 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 540 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 630 o más nucleótidos; en algunas 'modalidades, 720 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 810 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 900 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 990 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1080 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1170 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1260 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1350 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1440 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1530 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1620 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1710 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1800 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1890 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1980 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2070 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2160 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2250 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2340 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2430 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2520 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2620 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2700 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 3 pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 3 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 450 nucleótidos, en algunas modalidades menos de -540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 630 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 810 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 990 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1170 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1350 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1440 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1530 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1710 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1800 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1890 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1980 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2070 nucleótid;os , en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 450 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 540 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 630 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 810 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 990 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1080 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1170 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1350 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1440 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1530 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1710 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1800 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1890 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1980 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 1020 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2070 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2160 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2250 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2340 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2430 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2520 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2610 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2700 nucleotidos. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 4 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 4 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 90 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 120 o más aminoácidos en algunas modalidades, 150 o más aminoácidos en algunas modalidades, 180 o más aminoácidos en algunas modalidades, 210 o más aminoácidos en algunas modalidades, 240 o más aminoácidos en algunas modalidades, 270 o más aminoácidos en algunas modalidades, 300 o más aminoácidos en algunas modalidades, 330 o más aminoácidos en algunas modalidades, 360 o más aminoácidos en algunas modalidades, 390 o más aminoácidos en algunas modalidades, 420 o más aminoácidos en algunas modalidades, 450 o más aminoácidos en algunas modalidades, 480 o más aminoácidos en algunas modalidades, 510 o más aminoácidos en algunas modalidades, 540 o más aminoácidos en algunas modalidades, 570 o más aminoácidos en algunas modalidades, 600 o más aminoácidos en algunas modalidades, 630 o más aminoácidos en algunas modalidades, 660 o más aminoácidos en algunas modalidades, 690 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 270 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 300 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 330 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 360 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 390 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 420 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 450 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 480 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 540 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 600 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 660 aminoácidos, y en algunas modalidades menos de 690 aminoácidos. La SEQ ID NO: 5 es una construcción de secuencia de ADN de envoltura de consenso de subtipo C. La SEQ ID NO : 5 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna djel VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura del subtipo C. La SEQ ID NO: 6 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de la secuencia de vacuna de VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura del subtipo C. La secuencia guia de IgE es la SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de proteina de envoltura de consenso del subtipo C. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 18, fragmentos de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 18, o fragmentos de la misma. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 6 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 5. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia guia de IgE, SEQ ID NO: 15 o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 5 pueden comprender 90 o más nucleotidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 5 pueden comprender 180 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 360 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 450 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 540 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 630 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 720 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 810 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 900 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 990 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1080 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1170 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1260 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1350 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1440 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1530 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1620 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1710 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1800 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1890 o más nucleotidos; en algunas modalidades, 1980 o más nucleotidos; en algunás modalidades, 2070 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 5 pueden comprendeír secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 5 pueden no comprender secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótido, en algunas modalidades, menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos en algunás modalidades menos de 450 nucleótidos en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 630 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 810 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 990 nucleótid'os, en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1170 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1350 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1440 nuqleótidos , en algunas modalidades menos de 1530 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1710 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1800 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1890 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1980 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2070 nucleótidos . Los fragmentos de la SEQ ID NO: 6 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 6 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 90 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 120 o más aminoácidos en algunas modalidades, 150 o más aminoácidos en algunas modalidades, 180 o más aminoácidos en algunas modalidades, 210 o más aminoácidos en algunas modalidades, 240 o más aminoácidos en algunas modalidades, 270 o más aminoácidos en algunas modalidades, 300 o más aminoácidos en algunas modalidades, 330 o más aminoácidlos en algunas modalidades, 360 o más aminoácidos en algunas modalidades, 390 o más aminoácidos en algunas modalidades, 420 o más aminoácidos en algunas modalidades, 450 o más aminoácidos en algunas modalidades, 480 o más aminoácidos en algunas modalidades, 510 o más aminoácidos en algunas ;modalidades , 540 o más aminoácidos en algunas modalidades, 570 o más aminoácidos en algunas modalidades, 600 o más aminoácidos en algunas modalidades, 630 o más aminoácidos en algunas modalidades, 660 o más aminoácidos en algunas modalidades, 690 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 270 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 300 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 330 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 360 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 390 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 420 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 450 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 480 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 540 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 600 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 660 aminoácidos, y en algunas modalidades menos de 690 aminoácidos. La SEQ ID NO: 7 es una construcción de secuencia de ADN de envoltura de consenso de subtipo D. La SEQ ID NO: 7 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna del VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura del subtipo D. La SEQ ID NO: 8 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de la secuencia de vacuna de VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura del subtipo D. La secuencia guia de IgE es la SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de proteina de envoltura de consenso del subtipo D. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 19, fragmentos de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 19, o fragmentos de la misma. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 8 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 7. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia guia de IgE, SEQ ID NO: 15 o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 7 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 7 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 360 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 450 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 540 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 630 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 720 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 810 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 900 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 990 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1080 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1170 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1260 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1350 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1440 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1530 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1620 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1710 o más nucleótidos ; en algunas modalidades, 1800 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1890 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1980 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 2070 o más nucleótidos; y en algunas modalidades, 2140 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragtnentos de la SEQ ID NO: 7 pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 7 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótido, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 450 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 630 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 810 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 990 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1170 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1350 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1440 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1530 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1710 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1800 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1890 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1980 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1020 nucleótidos, y en algunas modalidades menos de 2070 nucleótidos y en algunas modalidades, menos de 2140 nucleótidos . Los fragmentos de la SEQ ID NO: 8 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 8 pueden comprender 60 o más aminoácidos, en algunas modalidades, 90 o más aminoácidos, en algunas modalidades, 120 o más aminoácidos en algunas modalidades, 150 o más aminoácidos en algunas modalidades, 180 o más aminoácidos en algunas modalidades, 210 o más aminoácidos en algunas modalidades, 240 o más aminoácidos en algunas modalidades, 270 o más aminoácidos en algunas modalidades, 300 o más aminoácidos en algunas modalidades, 330 o más aminoácidos en algunas modalidades, 360 o más aminoácidos en algunas modalidades, 390 o más aminoácidos en algunas modalidades, 420 o más aminoácidos en algunas modalidades, 450 o más aminoácidos en algunas modalidades, 480 o más aminoácidos en algunas modalidades, 510 o más aminoácidos en algunas modalidades, 540 o más aminoácidos en algunas modalidades, 570 o más aminoácidos en algunas modalidades, 600 o más aminoácidos en algunas modalidades, 630 o más aminoácidos en algunas modalidades, 660 o más aminoácidos en algunas modalidades, 690 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 270 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 300 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 330 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 360 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 390 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 420 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 450 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 480 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 540 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 600 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 660 aminoácidos, y en algunas modalidades menos de 690 aminoácidos. La SEQ ID NO: 9 es una construcción de secuencia de ADN de envoltura de consenso de subtipo B Nef-Rev. La SEQ ID NO: 9 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna del VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura del subtipo B Nef-Rev. La SEQ ID NO: 10 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de la secuencia de vacuna de VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina de envoltura del subtipo B Nef-Rev. La secuencia guia de IgE es la SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de proteína de envoltura de consenso del subtipo B Nef-Rev. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 20, fragmentos de la misma, uria molécula de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 20, o fragmentos de la misma. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 10 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 9. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia guía de IgE, SEQ ID NO: 15 o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 9 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 9 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 360 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 450 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 540 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 630 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 720 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 810 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 900 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 990 o más nucleótidos ; en algunas modalidades. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 9 pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 9 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótido, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 450 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 630 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 810 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos; en algunas modalidades menos de 990 nucleótidos. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 2 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 2 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 90 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 120 o más aminoácidos en algunas modalidades, 150 o más aminoácidos en algunas modalidades, 180 o más aminoácidos en algunas modalidades, 210 o más aminoácidos en algunas modalidades, 240 o más aminoácidos en algunas modalidades, 270 o más aminoácidos en algunas modalidades, 300 o más aminoácidos en algunas modalidades, 330 o más aminoácidos . La SEQ ID NO: 11 es una secuencia de ADN de consenso de Gag de la construcción de la secuencia de ADN del subtipo A, B, C y D. La SEQ ID NO: 11 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna del VIH que comprende la secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina del subtipo A, B, C y D de consenso de Gag. La SEQ ID NO: 12 comprende la secuencia de aminoácidos para la construcción de la secuencia de vacuna de VIH que comprende una secuencia guia de IgE enlazada a una secuencia de consenso para la proteina del subtipo A, B, C y D de Gag. La secuencia guia de IgE es la SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de proteina del subtipo A, B, C y D de Gag, de consenso . En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 21, fragmentos de la misma, una molécula de ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 21, o fragmentos de la misma. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 12 o una molécula de ácido nucleico que la codifica. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 11. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia guia de IgE, SEQ ID NO: 15 o una secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 11 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 11 pueden comprender 180 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 270 o más nucleótidos ; en algunas modalidades, 360 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 450 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 540 o más nucleóticjos ; en algunas modalidades, 630 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 720 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 810 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 900 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 990 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1080 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1170 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1260 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1350 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1440 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1530 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1620 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1710 o más nucleótidos; en algunas modalidades, 1800 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 11 pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 11 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 450 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 630 nucleótidos en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 810 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 990 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos en algunas modalidades menos de 1170 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1350 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1440 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1530 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1710 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1800 nucleótidos. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 12 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 12 pueden comprender 60 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 90 o más aminoácidos; en algunas modalidades, 120 o más aminoácidos en algunas modalidades, 150 o más aminoácidos en algunas modalidades, 180 o más aminoácidos en algunas modalidades, 210 o más aminoácidos en algunas modalidades, 240 o más aminoácidos en algunas modalidades, 270 o más aminoácidos en algunas modalidades, 300 o más aminoácidos en algunas modalidades, 330 o más aminoácidos en algunas modalidades, 360 o más aminoácidos en algunas modalidades, 390 o más aminoácidos en algunas modalidades, 420 o más aminoácidos en algunas modalidades, 450 o más aminoácidos en algunas modalidades, 480 o más aminoácidos en algunas modalidades, 510 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprender menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 270 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 300 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 330 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 360 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 390 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 420 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 450 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 480 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 510 aminoácidos .
VPH La SEQ ID NO: 22 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna de VPH que comprende una secuencia guia de IgE, una secuencia de consenso para VPH E6, enlazada a una secuencia de consenso para VPH E7 por una secuencia de escisión proteolitica . La secuencia de consenso para VPH E6 incluye el epitopo inmunodominante descrito en la SEQ ID NO: 24. La secuencia de consenso para VPH E7 incluye el epitopo inmunodominante descrito en la SEQ ID NO: 25. La secuencia de consenso para VPH E6 es la SEQ ID NO: 26. La secuencia de consenso para VPH E6 es la SEQ ID NO: 27. La secuencia de IgE es la SEQ ID NO: 28. Una secuencia de escisión proteolitica útil para enlazar las dos secuencias de consenso es la SEQ ID NO: 29. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25, o la secuencia de ácido nucleico que codifica para una o ambas de ellas. Las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 27 y/o la SEQ ID NO: 28, o las secuencias de ácido nucleico que codifican para una o ambas de ellas. Las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 27 enlazada a la SEQ ID NO: 28 por una secuencia de escisión proteolitica tal como la SEQ ID NO: 29, o la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteina de fusión. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia guia de IgE SEQ ID NO: 28 o la secuencia de ácido nucleico que codifica la misma. Las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 22. En algunas modalidades, las proteínas comprenden fragmentos de la SEQ ID NO: 23. En algunas modalidades, las proteínas consisten de los fragmentos de la SEQ ID NO: 23. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos comprenden el fragmento de la SEQ ID NO: 22. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos consisten de un fragmento de la SEQ ID NO: 22. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 30 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 45 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 60 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 75 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 90 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 120 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 150 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 180 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 210 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 240 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 270 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 300 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 360 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 420 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 480 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID jNO: 22 pueden comprender 540 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitolpo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 600 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 300 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 660 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 720 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender 780 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican, para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 pueden comprender secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 22 no comprenden secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 60 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 75 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 90 nucleótidos, en algunás modalidades menos de 120 nucleótidos en algunas modalidades menos de 150 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 210 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 240 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 300 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 420 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 480 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 600 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 660 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, y en algunas modalidades menos de 780 nucleótidos , Los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 15 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas mbdalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 18 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 21 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 24 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 30 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 36 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 42 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 48 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 54 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 60 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 18 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 72 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 90 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 120 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 150 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 180 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 210 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 240 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 23 pueden comprender 260 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NQ: 23 pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmento;s de la SEQ ID NO: 23 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 24 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 30 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 36 aminoácidos en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos en algunas modalidades menos de 42 aminoácidos en algunas modalidades menos de 48 aminoácidos en algunas modalidades menos de 54 aminoácidos en algunas modalidades menos de 60 aminoácidos en algunas modalidades menos de 72 aminoácidos en algunas modalidades menos de 90 aminoácidos en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos en algunas mpdalidades menos de 260 aminoácidos.
VHC La SEQ ID NO: 30 comprende la secuencia de codificación para la secuencia de vacuna de VHC que comprende una secuencia guia de IgE, una secuencia de consenso para el VHC El, enlazada a una secuencia de consenso para el VHC E2 por una secuencia de escisión proteolitica . La frecuencia de consenso para el VHC El es la SEQ ID NO: 32. La secuencia de consenso para el VHC E2 es la SEQ ID NO: 33. En algunas modalidades, las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 32 y/o la SEQ ID NO: 33, o la secuencia de ácido nucleico que codifica para una o ambas de ellas. Las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 32 enlazada a la SEQ ID NO: 33 por una secuencia de escisión proteolitica tal como la SEQ ID NO: 29, o la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteina de fusión. Las vacunas de la presente invención incluyen preferentemente la secuencia de IgE SEQ ID NO: 28 o la secuencia de ácido nucleico que codifica para la misma. Las vacunas de la invención incluyen preferentemente la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 30. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención incluyen la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de ácido nucleico de la misma, seleccionadas del siguiente grupo: SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y cualquier combinación de las mismas. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 30 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 45 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 60 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 75 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 120 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 150 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 180 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 210 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 240 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 270 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30: pueden comprender 300 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 360 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 420 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 480 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 540 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 600 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 660 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 720 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 780 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 840 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 900 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentois de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 960 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1020 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1080 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1140 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1200 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1260 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1320 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1380 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1440 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1500 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1560 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1620 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1680 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender 1740 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 30 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 60 nucleótido, en algunas modalidades menos de 75 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 90 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 120 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 150 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 210 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 240 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 300 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 420 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 480 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 600 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 660 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 780 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 75 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 840 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 960 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1020 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1140 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1200 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1320 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1380 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1440 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1500 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1560 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1680 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1740 nucleótidos. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 15 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 45 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 60 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 75 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 90 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 105 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentds de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 120 o más aminoácidos . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 150 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprendeir 180 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 210 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 240 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden compréndete 270 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 300 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 360 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 420 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 480 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 540 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 31 pueden comprender 575 o más aminoácidos. Los fragmentos pueden comprendet menos de 30 aminoácidos, en algunas modalidades menos de i 45 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 60 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 75 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 270 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 300 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 360 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 420 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 480 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 540 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 575 aminoácidos. hTERT hTERT es una transcriptasa inversa de telomerasa humana que sintetiza una etiqueta TTAGGG sobre el extremo de los telómeros para prevenir la muerte celular debida al acortamiento cromosómico. Las células hiperproliferativas con expresión anormalmente alta de hTERT pueden ser tratadas mediante inmunoterapia . Estudios recientes también apoyan la expresión anormal de hTERT sobre las células hiperproliferativas infectadas con VHC y VPH. De este modo, la inmunoterapia para el VPH y el VHC puede ser aumentada al dirigir las células que expresan hTERT a niveles anormales. Estudios recientes demuestran que la expresión de hTERT en células dendriticas transíectadas con los genes de hTERT puede inducir a las células T citotóxicas CD8+ y promover las células T CD4+ de una manera especifica del antigeno. Por lo tanto, el uso de la expresión hTERT dentro de las células presentadoras de antigeno (APCs) para retardar la senectud y sostener su capacidad para presentar el antigeno de elección, es atractivo en el desarrollo de nuevos métodos de inmunoterapia . De acuerdo a algunas modalidades de la invención, los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en individuos contra un inmunógeno, comprenden administrarle al individuo la proteina hTERT y los fragmentos funcionales de la misma o secuencias de codificación expresables de la misma, en combinación con una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para la proteina de la invención y/o una vacuna recombinante que codifica para la proteina de la invención y/o una vacuna subunitaria de la proteina de la invención y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna muerta. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención incluyen la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácido nucleico de las mismas, seleccionadas del siguiente grupo: SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y cualquier combinación de las mismas. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención comprenden la SEQ ID NO: 34 o la SEQ ID NO: 35. La SEQ ID NO: 34 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para hTERT. La SEQ ID NO: 35 comprende la secuencia de aminoácidos para hTERT. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención comprenden la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 34 o la SEQ ID NO: 35. El uso de secuencias de ácido nucleico que codifican para hTERT y/o la proteina de hTERT en combinación con los inmunógenos de VPH, aumentan la respuesta inmunitaria mediada por células contra las células infectadas por el VPH. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 30 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 45 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 60 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 75 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 90 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 120 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 150 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 180 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprenden 210 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 240 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 270 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 300 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 360 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 420 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante.
En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 480 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 540 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 600 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 300 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 660 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 720 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 780 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 840 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 900 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 960 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1020 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1080 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1140 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1200 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1260 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1320 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1380 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1440 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1500 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1560 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1620 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1680 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1740 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1800 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1860 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante.
En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1920 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 1980 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2040 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2100 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En alguna,s modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2160 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2220 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2280 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2340 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2400 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprendejr 2460 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2520 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2580 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2640 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2700 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2670 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2820 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2880 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuéncias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 2940 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3000 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3060 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3120 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3180 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3240 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3300 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3360 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante.
En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender 3420 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprendqr 3480 o más nucleótidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 34 pueden comprender secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 34 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprender menos de 60 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 75 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 90 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 120 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 150 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 210 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 240 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 300 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 420 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 480 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 600 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 660 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 780 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 840 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 960 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1020 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1140 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1200 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1320 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1380 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1440 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1500 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1560 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1680 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1740 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1800 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1860 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1920 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1980 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2040 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2100 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2160 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2220 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2280 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2340 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2400 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2460 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2520 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 2580 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2640 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2700 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2760 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2820 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2860 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 2940 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3000 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3060 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3120 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3180 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3240 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3300 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3360 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3420 nucleotidos, en algunas modalidades menos de 3480 nucleotidos, y en algunas modalidades menos de 3510 nucleotidos. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 15 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 18 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 21 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 24 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 30 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 36 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 42 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 48 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 54 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 60 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 66 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 72 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 90 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 120 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 150 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 180 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 210 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 240 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 270 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodorainante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 300 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 330 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 360 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 390 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 450 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 480 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 510 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 540 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 570 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitoipo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 600 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 630 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 660 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 690 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 720 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 750 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 780 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 810 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 840 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 870 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 900 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 930 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 960 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 990 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante.
En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1020 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1050 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1080 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1110 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1140 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1170 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1200 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1230 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden icomprender 1260 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID !NO: 35 pueden comprender 1290 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragménteos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1320 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1350 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1380 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID ¡NO: 35 pueden comprender 1410 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1440 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1470 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante . En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 pueden comprender 1500 o más aminoácidos, incluyendo preferentemente las secuencias que codifican para un epitopo inmunodominante. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35, pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 35 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos pueden comprende menos de 24 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 30 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 36 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 42 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 48 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 54 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 60 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 72 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 260 aminoácidós, en algunas modalidades menos de 290 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 320 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 350 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 380 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 410 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 440 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 470 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 500 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 530 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 560 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 590 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 620 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 650 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 680 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 710 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 740 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 770 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 800 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 830 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 860 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 890 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 920 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 950 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 980 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1010 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1040 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1070 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1200 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1230 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1260 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1290 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1320 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1350 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1380 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1410 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1440 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 1470 aminoácidos, y en algunas modalidades menos de 1500 aminoácidos .
Influenza De acuerdo a algunas modalidades de la invención, los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en individuos contra un inmunógeno comprenden administrarle al individuo la proteina hemaglutinina (HA) de la influenza cepa H5N1, y fragmentos funcionales de la misma, o las secuencias de codificación expresables de la misma, en combinación con una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para la proteina de la invención, y/o una vacuna recombinante que codifica para la proteina de la invención, y/o una vacuna subunitaria de la proteina de la invención, y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna muerta. En algunas modalidades, las composiciones de vacuna para la influenza y los métodos comprenden el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteina HA de especies del virus de la influenza. En algunas modalidades, las composiciones de vacuna de la influenza y el método comprenden el uso de las secuencias de ácido nucleico que codifican para HA proveniente de la influenza viral de la cepa H1N5, y las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas de la influenza, seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, y SEQ ID NO: 42. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención comprenden la SEQ ID NO: 36 o las SEQ ID NO: 37. La SEQ ID NO: 36 comprende las secuencias de ácido nucleico que codifican para HA de H1N5 del virus de la influenza. La SEQ ID NO: 37 comprende la secuencia de aminoácidos para HA de H1N5 del virus de la influenza. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención comprenden la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 39. La SEQ ID NO: 38 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para las secuencias de consenso NHA de la influenza H1N1 y H5N1. La SEQ ID NO: 39 comprende la secuencia de aminoácidos para las secuencias de consenso NA de la influenza H1N1 y H5N1. En algunas modalidades de la invención, la vacuna de la invención comprenden la SEQ ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 41. La SEQ ID NO: 40 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para las secuencias de consenso MI de la influenza H1N1 y H5N1. La SEQ ID NO: 41 comprende la secuencia de aminoácidos para las secuencias de consenso MI de la influenza H1N1 y H5N1. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención comprenden la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43. La SEQ ID NO: 42 comprende las secuencias de ácido nucleico que codifica para la secuencia de consenso M2E-NP de la influenza H5N1. La SEQ ID NO: 43 comprende la secuencia de aminoácidos para la secuencia, de consenso M2E-NP de la influenza H5N1. En algunas modalidades de la invención, las vacunas de la invención incluyen la SEQ ID NO: 36 y una secuencia seleccionada del siguiente grupo: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y cualquier combinación de las mismas. La secuencia de consenso para HA del virus de la influenza cepa H5N1, incluye el epitopo inmunodominante descrito en la SEQ ID NO: 36. La secuencia de aminoácidos de HA del virus de la influenza H5N1, codifica por la SEQ ID NO: 36 es la SEQ ID NO: 37. La secuencia de consenso para NA del virus de la influenza H1N1/H5N1 incluye el epitopo inmunodominante descrito en la SEQ ID NO: 38. La secuencia de aminoácidos NA del virus de la influenza cepas H1N1/H5N1, codificada por la SEQ ID NO: 38, es la SEQ ID1 NO: 39. La secuencia de consenso para MI del virus de la influenza cepas H1N1H5N1 incluye el epitopo inmunodominante descrito en la SEQ ID NO: 40. La secuencia de aminoácidos MI del virus de la influenza H1N1/H5N1, codificada por la SEQ ID NO: 40 es la SEQ ID NO: 41. La secuencia de consenso para M2E-NP del virus de la influenza H5N1, incluye el epitopo inmunodominante descrito en la SEQ ID NO: 42. La secuencia de aminoácidos M2E-NP del virus de la influenza H5N1, codificada por la SEQ ID NO: 42, es la SEQ ID NO: 43. Las vacunas de la presente invención pueden incluir productos proteicos codificados por las moléculas de ácido nucleico definidas anteriormente o cualesquiera fragmentos de las proteínas . Los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 30 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 45 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 60 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 75 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 90 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 120 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 150 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 180 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 210 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 240 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 270 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 300 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 360 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 420 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 480 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 540 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 600 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 660 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 720 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 780 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 840 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 900 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 960 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1020 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1080 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1140 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1200 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1260 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1320 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1380 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1440 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1500 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1620 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1680 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender 1740 o más nucleótidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36, pueden comprender las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 no comprenden las secuencias de codificación para las secuencias guia de IgE. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 36 pueden comprender menos de 60 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 75 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 90 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 120 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 150 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 180 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 210 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 240 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 270 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 300 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 360 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 420 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 480 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 540 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 600 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 660 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 720 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 780 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 840 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 900 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 960 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1020 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1080 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1140 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1200 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1260 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1320 nualeótidos, en algunas modalidades menos de 1380 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1440 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 75 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1500 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1560 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1620 nucleótidos, en algunas modalidades menos de 1680 nucleótidos, y en algunas modalidades menos de 1740 nucleótidos . Los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 15 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 30 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 45 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 60 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentós de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 75 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 90 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 105 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 120 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 150 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 180 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 210 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 240 o más aminoácidos. En algunas modalidad'es, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 270 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 300 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 360 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 420 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 480 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 540 o más aminoácidos. En algunas modalidades, los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 pueden comprender 565 o más aminoácidos. Los fragmentos de la SEQ ID NO: 37 piüeden comprender menos de 30 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 45 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 60 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 75 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 90 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 120 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 150 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 180 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 210 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 240 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 270 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 300 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 360 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 420 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 480 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 540 aminoácidos, en algunas modalidades menos de 565 aminoácidos. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en individuos, contra un inmunógeno, comprenden administrarle al individuo la proteina NA de la influenza cepa H1N1 e influenza cepa H5N1, y fragmentos funcionales de la misma, o las secuencias de codificación expresables de la misma, en combinación con una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para la proteina de la invención, y/o una vacuna recombinante que codifica para la proteina de la invención, y/o una vacuna subunitaria de esa proteína de la invención, y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna muerta. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en individuos, contra un inmunógeno, comprenden administrarle al individuo la proteína MI de la influenza cepa H1N1 e influenza cepa H5N1, y fragmentos funcionales de la misma, o las secuencias de codificación expresables de la misma, en combinación con una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para la proteína de la invención, y/o una vacuna recombinante que codifica para la proteína de la invención, y/o una vacuna subunitaria de esa proteína de la invención, y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna muerta . De acuerdo a algunas modalidades de la invención, los métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en individuos, contra un inmunógeno, comprenden administrarle al individuo la proteína M2E-NP de la influenza cepa H5N1, y fragmentos funcionales de la misma, o las secuencias de codificación expresables de la misma, en combinación con una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para la proteína de la invención, y/o una vacuna recombinante que codifica para la proteína de la invención, y/o una vacuna subunitaria de esa proteína de la invención, y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna muerta.
Vacunas La invención proporciona las vacunas mejoradas por la provisión de proteínas y construcciones genéticas que codifican para las proteínas, con epitopos que las hace particularmente efectivas como inmunógenos contra los cuales pueden ser inducidas respuestas inmunitarias . En consecuencia, pueden ser proporcionadas las vacunas para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica. En algunas modalidades, el medio para distribuir el inmunógeno es una vacuna de ADN, una vacuna recombinante, una vacuna de subunidad de proteína, una composición que comprende el inmunógeno, una vacuna atenuada o una vacuna muerta. En algunas modalidades, la vacuna comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste de: una o más vacunas de ADN, una o más vacunas recombinantes , una o más vacunas subunitarias de proteína, una o más composiciones que comprenden el inmunógeno, una o más vacunas atenuadas y una o más vacunas muertas. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, una vacuna de acuerdo a la invención es distribuida a un individuo para modular la actividad del sistema inmunitario del individuo y con esto mejorar la respuesta inmunitaria. Cuando una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína es regida por las células del individuo, la secuencia de nucleótidos es expresada en las células y la proteína es con esto distribuida al individuo. Los aspectos de la invención proporcionan los métodos de distribución o administración de las secuencias de codificación de la proteina sobre la molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, como parte de las vacunas recombinantes y como parte de las vacunas atenuadas, como proteínas aisladas o parte de proteínas de un vector. De acuerdo a algunos aspectos de la presente invención, son proporcionados las composiciones y métodos que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo. Las vacunas de ADN son descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,593,972, 5,739,118, 5,817.637, 5,830.876, 5,962,428, 5,981,505, 5.580,859, 5,703,055, 5,676.594, y las solicitudes de prioridad citadas en éstas, que son cada una incorporadas por referencia en la presente. Además de los protocolos de distribución descritos en esas solicitudes, son descritos los métodos alternativos de distribución del ADN en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.945,050 y 5,036,006, las cuales se incorporan por referencia en la presente. La presente invención se refiere a las vacunas vivas atenuadas, mejoradas, a las vacunas muertas mejoradas y a las vacunas mejoradas que utilizan vectores recombinantes para distribuir genes extraños que codifican para antígenos y también vacunas de subunidades y de glucoproteína . Los ejemplos de vacunas atenuadas vivas, aquellas que utilizan vectores recombinantes para distribuir antigenos extraños, vacunas subunitarias y vacunas de glucoproteina , se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,510,245; 4, 797, 368¡; 4, 722, 848; 4, 790, 987; 4,920, 209; 5, 017, 487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,3 64: 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5.643,579¡; 5, 650,309; 5, 698,202; 5, 955, 088; 6, 034,298; 6, 042,836i; 6,156,319 y 6, 589, 529, las cuales se incorporan por referencia en la presente. Cuando es recogida o absorbida por una célula, la construcción genética puede permanecer presente en la célula como una molécula extracromosómica funcional y/o integrarse dentro del ADN cromosómico de la célula. El ADN puede ser introducido dentro de las células donde éste permanece como un material genético separado en la forma de un plásmido o plásmidos. Alternativamente, el ADN lineal que puede integrarse dentro del cromosoma puede ser introducido dentro de la célula. Cuando se introduce ADN dentro de la célula, los reactivos que promueven la integración del ADN dentro de los cromosomas pueden ser agregados. Las secuencias de ADN que son útiles para promover la integración pueden ser también incluidas en la molécula de ADN. Alternativamente, el ARN puede ser administrado a la célula. Se contempla también proporcionar la construcción genética como un minicromosoma lineal que incluye un centrómero, telómeros y un origen de replicación. Las construcciones génicas pueden seguir siendo parte del material genético en los microorganismos atenuados vivos o los vectores microbianos recombinantes que viven en las células. Las construcciones génicas pueden ser parte de los genomas de las vacunas virales recombinantes donde el material genético se integra ya sea dentro del cromosoma de la célula o permanece extracromosómico . Las construcciones genéticas incluyen elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ácido nucleico. Los elementos incluyen: un promotor, un codón de inicio, un codón de detención, y una señal de poliadenilación . Además, frecuentemente son requeridos aumentadores para la expresión del gen, de la secuencia que codifica para la proteina objetivo o la proteina inmunomoduladora . Es necesario que estos elementos sean operablemente enlazados a la secuencia que codifica para las proteínas deseadas, y que los elementos reguladores sean operables en el individuo a quien éstos son administrados . Los codones de inicio y los codones de detención son en general considerados como parte de una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína deseada. No obstante, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo a quien es administrada la función génica. Los codones de inicio y de terminación deben estar en la estructura con la secuencia de codificación. Los promotores y las señales de poliadenilación utilizados, deben ser funcionales dentro de las células del individuo . Los ejemplos de promotores útiles para practicar la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen, pero no están limitados a promotores del virus 40 de simio (SV49) , el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) , el virus de inmunódeficiencia humana (MV) tal como el promotor de la repetición larga de BIV (LTR) , el virus de Moloney, ALV, el citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato del CMV, virus de Epstein Barr (EBV) , virus de sarcoma de Rous (RSV) asi como los promotores provenientes de genes humanos tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y metalotioneina humana. Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para practicar la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no están limitados a las señales de poliadenilación del SV40 y las señales de poliadenilación de LTR. En particular, se utiliza la señal de poliadenilación del SV40 que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego California), denominada como la señal de poliadenilación del SV40. Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión del ADN, pueden ser también incluidos otros elementos en la molécula de ADN. Tales elementos adicionales incluyen los aumentadores . El aumentador puede ser seleccionado del grupo que incluye, pero no está limitado a: actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y aumentadores virales, tales como aquellos provenientes de CMV, RSV y EBV. Las construcciones genéticas pueden ser proporcionadas con el origen de replicación de mamífero con el fin de mantener la construcción extracromosómicamente , y producir copias múltiples de la construcción en la célula. Los plásmidos pVAXl, pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región de codificación EBNA-1 del antígeno nuclear que produce una replicación episómica de alto número de copias, sin integración. En algunas modalidades preferidas relacionadas a las aplicaciones de inmunización, las moléculas de ácido nucleico son distribuidas, las cuales incluyen secuencias nucleotídicas que codifican para la proteína de la invención, y, además, los genes para las proteínas que aumentan además la respuesta inmunitaria contra tales proteínas objetivo. Los ejemplos de tales genes son aquellos que codifican para otras citocinas y linfocings tales como el alfa-interferón, gamma-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa; TNF GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , IL-I, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MHC, CD80,CD8ó e IL-15 incluyendo IL-15 que tiene la secuencia de señal suprimida, y que incluye opcionalmente el péptido de señal de la IgE. Otros geines que pueden ser útiles incluyen aquellos que codifican para: MCP-I, MIP-l , MIP-lp, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GIyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1 , VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2. LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inactiva, SAP K, SAP-I, JNK, genes de respuesta al interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5 , TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, LIGANDO RANK, Ox40, ligando 0x40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de los mismos. Un elemento adicional puede ser agregado, el cual sirve como un objetivo para la destrucción celular si es deseable eliminar células que reciben la construcción genética por alguna razón. Un gen de la timidina-cinasa (tk) del herpes, en una forma expresable, puede ser incluido en la construcción genética. El fármaco ganciclovir puede ser administrado al individuo, y ese fármaco provocará la muerte selectiva de cualquier célula que produzca tk, proporcionando de este modo los medios para la destrucción selectiva de las células con la construcción genética. Con el fin de elevar al máximo la producción de la proteina, pueden ser seleccionadas secuencias reguladoras que son muy Adecuadas para la expresión de genes en las células dentro de, las cuales es administrada la construcción. Además, pueden ser seleccionados los codones que son más eficientemente transcritos en la célula. Una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica puede producir construcciones de ADN que son funcionales en las células. En algunas modalidades, las construcciones génicas pueden ser proporcionadas, en las cuales las secuencias de codificación para las proteínas descritas en la presente, son enlazadas al péptido de señal de IgE. En algunas modalidades, las proteínas descritas en la presente están enlazadas al péptido de señal de IgE. En algunas modalidades para la cual se utiliza la proteína, por ejemplo, una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica puede, utilizando técnicas bien conocidas, producir y aislar la proteína de la invención utilizando técnicas bien conocidas. En algunas modalidades para las cuales se utiliza la proteina, por ejemplo, alguien que tenga experiencia ordinaria en la materia puede, utilizando técnicas bien conocidas, insertar las moléculas de ADN que codifican para una proteina de la invención, dentro de un vector de expresión comercialmente disponible, para el uso en sistemas de expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido comercialmente disponible pSE420 (Invitrogen, San Diego, Cálif.) puede ser utilizado para la producción de la proteina en E. coli. El plásmido comercialmente disponible pYES2 (invitrogen, San Diego, Calif.) puede ser por ejemplo utilizado para la producción en cepas de levadura de S. cerevisiae . El sistema de expresión baculoviral completo MAXBACMR comercialmente disponible (Invitrogen. San Diego, Calif.) puede ser por ejemplo utilizado para la producción en células de insecto. El plásmido comercialmente disponible pcDNA 1 o pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.) puede ser por ejemplo utilizado para la producción en células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino. Alguien que tenga experiencia ordinaria en la técnica puede utilizar estos vectores de expresión comerciales y los sistemas u otros para producir la proteína mediante técnicas rutinarias y materiales iniciales fácilmente disponibles. (Ver por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed, Cold Spring Harbor Press (1989) la cual se incorpora por referencia en la presente) . De este modo, las proteínas deseadas pueden ser preparadas en sistemas procarióticos y eucarióticos , dando como resultado un espectro de formas procesadas de la proteína. Alguien que tenga experiencia ordinaria en la materia puede utilizar otros vectores de sistemas de expresión comercialmente disponibles, o producir los vectores utilizando métodos bien conocidos y los materiales iniciales fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias de control requeridas, tales como promotores y señales de poliadenilación, y preferentemente aumentadores , son fácilmente disponibles y conocidos en la materia para una variedad de hospederos. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989). Las construcciones genéticas incluyen la secuencia de codificación de la proteína operablemente enlazada a un promotor que es funcional en la línea celular dentro de la cual son transíectadas las construcciones. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen promotores provenientes del citomegalovirus o del SV40. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el virus de la leucemia mamaria de ratón o los promotores de la metalotioneina . Aquellas personas que tengan experiencia ordinaria en la técnica pueden producir fácilmente construcciones genéticas útiles para transfectarse con las células, con el ADN que codifica la proteína de la invención, a partir de materiales iniciales fácilmente disponibles. El vector de expresión que incluye el ADN que codifica para la proteína, es utilizado para transformar el hospedero compatible el cual es luego cultivado y mantenido bajo condiciones en donde tiene lugar la expresión del ADN extraño. La proteína producida es recuperada del cultivo, ya sea mediante lisis de las células o a partir del medio de cultivo, como sea apropiado y conocido para aquellos expertos en la materia. Alguien que tenga experiencia ordinaria en la técnica puede, utilizando técnicas bien conocidas, aislar la proteína que es producida utilizando tales sistemas de expresión. Los métodos de purificación de proteína provenientes de fuentes naturales utilizando anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína específica como se describe anteriormente, pueden ser igualmente aplicados para purificar la proteína producida mediante metodología de ADN recombinante . Además de producir proteínas mediante técnicas recombinantes , los sintetizadores peptídicos automatizados pueden ser también empleados para producir proteína aislada esencialmente pura. Tales técnicas son bien conocidas por aquellos que tengan experiencia ordinaria en la materia, y son útiles si no son proporcionados derivados que tengan sustituciones para la producción de proteína codificada por el ADN . Las moléculas de ácido nucleico pueden ser distribuidas utilizando cualquiera de varias tecnologías bien conocidas, incluyendo la inyección de ADN (también denominada como vacunación de ADN) , vectores recombinantes tales como el adenovirus recombinante, el virus asociado al virus recombinante y la vaccinia recombinante. Las rutas de administración incluyen, pero no están limitadas a, las rutas intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intradérmica , subcutánea, intravenosa, intraarterial , intraocular, y oral, así como tópicamente, transdérmicamente , por inhalación o supositorios o para el tejido mucosal, tal como mediante el lavado al tejido vaginal, rectal, uretral, bucal y sublingual. Las rutas preferidas de administración incluyen la inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. Las construcciones genéticas pueden ser administradas por medios que incluyen, pero no están limitados a, jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin aguja, o "pistolas de bombardeo de microproyectiles". En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico es distribuida a las células en conjunto con la administración de un aumentador de la función del polinucleótido o un agente facilitador de la vacuna genética. Los aumentadores de la función de los polinucleótidos son descritos en las solicitudes de los Estados Unidos Número de Serie 5,593,972, 5,962,428 y la Solicitud Internacional Número de Serie PCT/US94 /00899 presentada el 26 de enero de 1994, las cuales sé incorporan cada una por referencia en la presente. Los agentes facilitadores de la vacuna genética son descritos en la Solicitud de los Estados Unidos Número de Serie 021,579 presentadla el 1 de abril de 1994, la cual se incorpora por referencia en la presente. Los co-agentes que son administrados en conjunto con las moléculas de ácido nucleico pueden ser administrados como una mezcla con la molécula de ácido nucleico, o administrados separadamente, de manera simultánea, antes o después de las moléculas de ácido nucleico. Además, otros agentes que pueden funcionar como agentes de transfección y/o agentes de replicación y/o agentes inflamatorios, y los cuales pueden ser co-administrados con un GVF, incluyen factores de crecimiento, citocinas y linfocinas tales como a-interferon, gamma-interferón, GM-CSF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , IL-L IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 y IL-15 asi como el factor de crecimiento de fibroblasto, agentes activos de superficie tales como complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluyendo monofosforil-lipido A ( L) , muramil-péptidos , análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y ácido hialurónico pueden ser también administrados en conjunto con la construcción genética. En algunas modalidades, puede ser utilizada una proteina inmunomoduladora como un GVF. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico es proporcionada en asociación con PLG para aumentar la distribución/absorción. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 1 nanogramo hasta aproximadamente 2000 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo á la presente invención comprenden aproximadamente 5 nanogramos hasta aproximadamente 1000 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 10 nanogramos hasta aproximadamente 800 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 0.1 nanogramos hasta aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 1 nanogramo hasta aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 25 nanogramos hasta aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 100 nanogramos hasta aproximadamente 200 microgramos de ADN. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención son formuladas de acuerdo al modo de administración que va a ser utilizado. En casos donde las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, éstas son estériles, libres de pirógenos y libres de partículas. Es preferentemente utilizada una formulación isotónica. En general, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, las soluciones isotónicas tales como solución salina amortiguada con fosfato, son preferidas. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En algunas modalidades, es agregado un agente de vasoconstricción a la formulación . De acuerdo a algunas modalidades de la invención, son proporcionados métodos para inducir respuestas inmunitarias . La vacuna puede ser una basada en proteína, una vacuna atenuada viva, una vacuna celular, una vacuna recombinante o una vacuna de ácido nucleico o de ADN. En algunas modalidades, los métodos de inducción a una respuesta inmunitaria en individuos contra un inmunógeno, incluyendo métodos de inducción de las respuestas inmunitarias mucosales, comprenden administrarle al individuo una o más proteínas CTACK, proteina TECK, proteina MEC y fragmentos funcionales de las mismas, o secuencias de codificación expresable de las mismas en combinación con una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para la proteina de la invención y/o una vacuna recombinante que codifica para la proteina de la invención y/o una vacuna subunitaria de la proteina de la invención y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna muerta. Una o más de una proteina CTACK, proteina TECK, proteina MEC y fragmentos funcionales de las mismas, pueden ser administrados antes de, simultáneamente con o después de la administración de la molécula aislada de ácido nucleico, que codifica para un inmunógeno; y/o la vacuna recombinante que codifica para un inmunógeno y/o la vacuna subunitaria que comprende un inmunógeno y/o una vacuna atenuada viva y/o una vacuna muerta. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de: CTACK, TECK, MEC y fragmentos funcionales de las mismas es administrada al individuo.
EJEMPLOS Ejemplo 1 MATERIALES Y MÉTODOS Secuencias de envoltura del VIH-1 subtipo B. Para generar la secuencia de envoltura de consenso del VIH-1 del subtipo B, cuarenta y dos secuencias de genes de la envoltura del subtipo B, recolectadas de once países, fueron seleccionadas de GenBank para evitar desviación de muestreo. Cada secuencia representa un paciente diferente. Todas las secuencias utilizadas son no recombinantes . Alineación múltiple. El procedimiento de alineación aplicado en el estudio filogenético incluyó la aplicación de Clustal X (versión 1.81) (Thompson, J. D., et al. 1997. The ClustalX Windows interface: flexible strategies for múltiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25:4876-4882). Los parámetros de alineación apareados fueron descritos para la programación dinámica "precisión lenta", utilizando 10 como la penalidad de abertura de espacio vacío y 0.1 como la penalidad por extensión de espacio vacío. Múltiples parámetros de alineación incluyeron una penalidad por extensión de espacio vacío igual a 0.2. Construcción de la secuencia de consenso de la envoltura de subtipo B del VIH-1. La secuencia nucleotídica de consenso de la envoltura del VIH-1 subtipo B fue obtenida después de la realización de múltiples alineamientos y ajuste manual final menor. Las secuencias deducidas de aminoácidos fueron utilizadas para guiar la introducción de los espacios vacíos de alineación, de modo que éstos fueran insertados entre codones. La secuencia de aminoácidos de consenso fue obtenida mediante la traducción de la secuencia nucleotídica de consenso. Árbol filogenético . Se empleó el método de unión de vecino (ÉJJ) para la construcción del árbol filogenético de aminoácidos utilizando el programa PAUP* 4.0bl0 (Swofford, D. L. 1999. PAUP* 4.0: phyiogenetic analysis using parsimony (* y other methods), versión 4.0b2a. Sinauer Associates, Inc.,, Sunderland, Mass.). Dos secuencias adicionales del subtipo D (K03454 y AAA44873) y dos secuencias del subtipo C (AAD 12103 y AAD1 2112) fueron utilizadas como un grupo externo para el enraizami nto (Kuiken, C, B. T. Korber, y R. W. Shafer. 2003. VIH sequeince databases. AIDS Rev. 5: 52-61) . Modificaciones de la secuencia de consenso de la envoltura del VIH-1 subtipo B. Fueron realizadas varias modificaciones después de obtener la secuencia de envoltura de consenso del VIH-1 subtipo B: las regiones VI y V2 altamente variables fueron acortadas, el bucle V3 fue diseñado para la utilización de CCR5, la región de cola citoplásmica fue removida del extremo C, una secuencia guia y una secuencia Kozak con dirección 5' fueron agregadas al extremo N, la optimización del codón y la optimización del ARN fueron realizados mediante el uso de GeneOptimizerMR (GENEART, Alemania) . Inmunógenos de Envoltura: El gen que codifica para la glucoproteina de envoltura de consenso del transmisor temprano del VIH-1 subtipo B, modificada (EY2E1-B) fue sintetizada y la secuencia verificada mediante GENEART. La EY2E1-B sintetizada fue digerida con BamHI y Notl, clonada dentro del vector de expresión pVAX (Invitrogen) bajo el control del promotor temprano inmediato de citomegalovirus y esta construcción fue nombrada como pEY2El-B. El inmunógeno del subtipo B primario (EK2P-B) fue generado a partir de un gen de la envoltura gp 140 del aislado 6101 del subtipo B primario, desviado por codón humano, que fue una donación de M. Sidhm (Wyeth) . Básicamente, el gen de la envoltura 6101 optimizado fue mutado mediante la eliminación de la secuencia guia nativa y la cola citoplásmica . Luego, fueron introducidas la secuencia guia de IgE y la secuencia Kozak mediante diseño de los cebadores específicos delantero e inverso: Env-F; 5'- GTCGCTCCGCTAGCTTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACC-5 ' (SEQ ID NO: 13) Env-R: 5 ' -GGTCGGATCCTTACTCCACCACTCTCCTTTTTGCC-5 ' (SEQ ID NO: 14) . El producto de PCR purificado fue clonado dentro del vector plásmido pVAX, el cual fue también linearizado con EcoRI y Xbal. Esta construcción fue nombrada como pEK2P-B. Expresión y Reactividad In Vivo de EY2E1-B con Anticuerpos Monoclonales . Las células de rabdomiosarcoma humano (RD) (2 x 106) fueron transfectados en cajas de 60 mm con 3 µg de los plásmidos pEY2El-B y pEK2P-B utilizando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche, Alemania) , respectivamente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron lavadas tres veces con 1 x PBS y lisadas en 150 µ? de amortiguador de lisis (Cell Signaling Technology) . 50 yg de los Usados de proteina total fueron fraccionados sobre un gel SDS-PAGE, transferidos a una membrana de PVDF (Amersham) . Los análisis de inmunotransferencia fueron realizados con un anticuerpo monoclonal 2G12 especifico de la envoltura (NIH AIDS Research y Referelnce Reagent Program, Rockville, MD, EUA) y un anticuerpo monoclonal anti-actina ( Sigma-Aldrich) y visualizados con la IgG anti-humana, de cabra, conjugada a HRP (Sigma-Aldrich) utilizando un sistema de análisis de transferencia de Western ECLTM (Amersham) . La actina fue utilizada como un control de carga para la transferencia de Western . Para detectar la reactividad de EY2E1-B con los anticuerpos monoclonales , los Usados proteicos totales provenientes de la transfección (100 µ?) fueron inmunoprecipitados con 5 µg de anticuerpos monoclonales específicos de envoltura, incluyendo 2G12, 4G10 e ID6 (NIH AIDS Research y Reference Reagent Program, Rockville, MD, EUA) . La misma cantidad de los Usados de proteína total provenientes de las células transfectadas con el vector vacío pVAX, se utilizó como un control negativo. Las proteínas inmunoprecipitadas fueron fraccionadas sobre un gel SDS-PAGE y detectadas mediante transferencia de Western como se describe anteriormente.
Ensayo de Inmunofluorescencia Indirecta. Se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para confirmar la expresión de los genes EY2E1-B y EK2P-B. Células de rabdomiosarcoma humano (RD) fueron sembradas en placa en portaobjetos con cámara de cultivo de tejido (BD Biosciences) , a una densidad para obtener 60 a 70% de confluencia al siguiente día en el medio DMEM completo con 10% de FBS (GIBCO) y permitir adherirse toda la noche. Al siguiente día las células fueron transfectadas con pEY2El-B, pEK2P-B y el plásmido control pVAX (1 µg/pozo) utilizando el reactivo de transfección FuGEN 6 (Roche) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron lavadas dos veces con 1XPBS frío y fijadas sobre portaobjetos utilizando metanol por 15 minutos. Después de la eliminación de los solventes residuales a partir de los portaobjetos, las células fueron incubadas con el anticuerpo monoclonal F105 anti-envoltura del VIH-1 de ratón (NIH AIDS Research y Reference Reagent Program, Rockville. MD, EUA) por 90 minutos. Los portaobjetos fueron luego incubados con el anticuerpo secundario conjugado a TRITC (Sigma-Aldrich) por 45 minutos. Se agregó clorhidrato de 4 ' , 6-diamido-2-fenilindol (Sigma-Aldrich) a la solución del anticuerpo secundario para contar los núcleos teñidos, para mostrar los núcleos del número total de células disponibles en el campo dado. Los portaobjetos fueron montados con el medio de montaje que contiene el reactivo antidesvanecimiento (Molecular Probes) . Las imágenes fueron analizadas utilizando el programa Fase 3 Pro para microscopía de fluorescencia (Media Cyibernetics ) . Determinación del Anticuerpo específico de envoltura. La medición de los anticuerpos IgG específicos para la envoltura, se realizó mediante ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzima) en ratones inmunizados y ratones control. Las placas Nunc-ImmunoTM (Nalge Nunc International, Rochester, NY) fueron recubiertas con 1 µg/ml de gpl60 soluble de glucoproteína IIIB de VIH-1 recombinante del ciado B (Immuno Diagnostics, MA) , gpl20 93TH975 de VIH-1 de envoltura primaria del ciado A/E y gpl20 de 96ZM651 del VIH-1 de la proteína de envoltura primaria del ciado C (NIH AIDS Research y Reference Reagent Program, Rockville, MD, EUA) , respectivamente, e incubadas toda la noche a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas fueron bloqueadas con 3% de BSA en PBST (1 x PBS + 0.05% de Tween 20) por 1 hora a 37 °C. Luego las placas fueron lavadas nuevamente e incubadas con los sueros de ratón específicos, diluidos con 3% de BSA en PBST toda la noche a 4°C, seguido por incubación con una dilución 1/10,000 de la IgG de cabra anti-ratón conjugada a HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) por 1 hora a 37°C. La reacción fue revelada con el sustrato TMB (3, 3', 5, 5' tetrametilbencidina) (Sigma-Aldrich) . La reacción fue detenida con 100 µ? de ácido sulfúrico 2.5 M por pozo y las placas fueron leídas sobre un lector de placa EL808 (Biotech Instrument Inc.) a una densidad óptica (OD) de 450 nm. Inmunización de Ratones BALB/c Hembras de 4 a 6 semanas de edad, fueron publicados de The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Los pares de crianza de ratones transgénicos B6.Cg-Tg (HLA-A/H2-D) 2Enge/J fueron adquiridos de Jackson Laboratory y criados por el Dr. Michelle Kutzler en nuestro laboratorio. Estos ratones transgénicos expresan un gen MHC de la clase I híbrido interespecie, AAD, el cual contiene los dominios alfa-1 y alfa-2 del gen HLA-A2.1 humano y los dominios transmembranal alfa-3 y citoplásmico del gen H-2Dd de ratón, bajo la dirección del promotor humano HLA-A2.1. La expresión del dominio alfa-3 de ratón aumenta la respuesta inmunitaria en este sistema. En comparación a HLA-A2.1 no modificado, la molécula de la Clase I de MHC quimérica HLA-A2.1/H2-Dd medió la selección positiva eficiente de las células T de ratón para proporcionar un repertorio de células T más completo, capaz de reconocer los péptidos presentados por las moléculas de Clase I de HLA-A2.1. . Los epitopos peptídicos presentados y reconocidos por las células T de ratón en el contexto de la molécula HLA-A2.1 de la Clase I son los mismos que aquellos presentados en humanos positivos a HLA-A2.1. Ratones transgénicos hembra de 4 a 6 semanas de edad fueron utilizados para el estudio posterior descrito más adelante. Su cuidado estuvo de acuerdo con los lineamientos de los Institutos Nacionales de la Salud y el Comité de Cuidado y Uso de la Universidad en Pennsylvania (IACUC). Cada ratón fue inmunizado intramuscularmente tres veces, cada vez con 100 µ? de ADN a intervalos bisemanales. Existen tres ratones en cada grupo y el grupo control fue vacunado con el ADN de pVAX. Los ratones fueron sacrificados una semana después de la tercera inmunización y los bazos fueron removidos asépticamente. Las células del bazo fueron recolectadas y resuspendidas en amortiguador de lisis de RBC para eliminar los eritrocitos. Después de la lisis, los esplenocitos provenientes del mismo grupo fueron combinados y resuspendidos en el medio RPMI 1640 con 10% de PBS . Las células fueron contadas y preparadas para el análisis. Ensayo ELISpot de IFN-?. Placas MultiscrenMR de 96 pozos de Alto Enlace de Proteina IP (Millipore, Bedfor, MA, EUA) fueron utilizadas. Las placas fueron recubiertas con el anticuerpo monoclonal para IFN-? de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN) diluidos en 1XPBS, toda la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS y luego bloqueadas por 2 horas a temperatura ambiente con 1XPBS suplementado con 1% de BSA y 5% de sucrosa. Los esplenocitos de los ratones fueron agregados por triplicado a un número de células de entrada de 2 x 105 células por pozo, resuspendidas en el medio de cultivo completo (RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y antibióticos) . Seis grupos de péptidos cada uno conteniendo 15 residuos de aminoácidos que se traslapan por 11 aminoácidos, que representan las secuencias de consenso de proteina completa del VIH-1 subtipo B, subtipo C, grupo M y las secuencias de proteina completas del MN del VIH-1 (un aislado del subtipo B) , VIH-1 C . UY .01. TRA3011 y CZA.01. J54 a (dos aislados de subtipo C) envoltura, fueron obtenidos de NIH AIDS Research y Reference Reagent Program. Cada grupo de péptidos de env fueron combinados a una concentración de 2 g/péptid¡o en 4 combinados como antigenos para la estimulación especifica de la liberación de IFN-?. Se utilizaron concavalina A ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) , a 5 g/ml y medio de cultivo completo como un control positivo y negativo, respectivamente. Las placas fueron lavadas cuatro veces después de un periodo de incubación de 24 horas a 37 °C, en una incubadora con una atmósfera de 5% de C02. Luego, se agregó un anticuerpo de detección de anti-INF-? de ratón, biotinilado, y las placas se incubaron toda la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas, y el desarrollo del color fue seguido de acuerdo a las instrucciones del fabricante (ELISPOT Blue Color Module, R&D Systems, Minneapolis, MN) . Las placas fueron secadas al aire y las manchas fueron contadas utilizando un sistema lector ELISPOT automatizado (CTL Analyzers, Cleveland, OH) con el software ImmnunoSpot®. El número promedio de células formadoras de puntos (SFC) fue ajustado a 1 x 106 esplenocitos por dato visualizado. El ensayo ELISpot fue repetido tres veces en tres experimentos separados . Estudio de agotamiento de células T CD8+. Los linfocitos CD8 fueron agotados de los esplenocitos mediante el uso de esferas inmunomagnéticas recubiertas con el anticuerpo para CD8 (Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del agotamiento de las células T CD8+, se realizó el ensayo de ELISpot de IFN-? como se describe anteriormente. Estudio de mapeo de epitopo. Con el fin de mapear los epitopos reactivos, dos grupos de péptidos que contenían 15 residuos de aminoácidos que se traslapan por 11 aminoácidos que representan las proteínas de envoltura completas del subtipo B de consenso del VIH-1 y MN VIH-1, fueron combinadas en 29 combinados de 14-15 péptidos/por combinado, respectivamente, y se realizó el ensayo de ELISpot de IFN-? como se describe anteriormente. Estos diferentes grupos de 29 estimuladores combinados fueron utilizados en el ensayo de matriz que facilita el mapeo del epitopo. Análisis Estadístico. Se utilizó la prueba t de Student apareada para la comparación de la respuesta inmunitaria celular entre ratones inmunizados con pEY2El-B y pEK2P-B. En este estudio, p < 0.05 ha sido considerado estadísticamente significativo.
Resultados Construcción y diseño de un nuevo gen de envoltura basado en consenso del transmisor temprano del subtipo B. La secuencia, de consenso del VIH-1 subtipo B fue generada a partir de 42 subtipos de secuencias B recuperadas de GenBank. Como se resume en la figura 1, fueron llevadas a cabo varias modificaciones después de la generación de la secuencia de consenso. En resumen, para producir una versión tópica de CCR5 de la envoltura del VIH-1 que imitó los virus mucosalmente transmitidos, seis importantes aminoácidos en el núcleo V3 fueron diseñados de acuerdo a las secuencias de los aislados del transmisor temprano. Además, diez aminoácidos en el bucle VI y un aminoácido en el bucle V2 fueron también suprimidos de la secuencia de consenso. Una secuencia guia altamente eficiente fue fusionada intraestructuralmente con dirección 5' del codón de inicio, para facilitar la expresión. El dominio transmembranal fue obtenido intacto para facilitar la expresión superficial y el sitio de escisión fue mantenido intacto para obtener el plegamiento adecuado y la escisión de la proteinasa hospedera de la proteina de envoltura. La cola citoplásmica fue removida para prevenir el reciclamiento de la envoltura y para promover una expresión superficial más estable y más alta (Berlioz-Torrent , C, et al, 1999. Interactions . of the cytoplasmic domains of human and simian retroviral transmembrane proteins with components of the clathrin adaptor complexes modulate intracellular and cell surface expression of envelope glycoproteins . J. Virol. 73:1350-1359; Bultmann, A. , et al.. 2001. Identification of t o secuencias in the cytoplamic tail of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein that inhibit cell surface expression. J. Virol. 75:5263-5276). Además, con el fin de tener un más alto nivel de expresión, el uso de codón de este gen fue adaptado a la desviación de codón de los genes de Homo Sapiens (Andre, S., et al. B. 1998. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J Virol 72:1497-503; Demi, L., et al. 2001. Múltiple effects of codon usage optimization on expression and immunogcnictty of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein. J. Virol. 75:10991-11001). Además, la optimización del ARN (Schneider, R., et al. 1997. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation, J. Virol. 71:4892- 903) fue también realizada: las regiones de muy alto (> 80%) o muy bajo (< 30%) contenido de GC y las porciones de secuencia de acción en posición cis- tales como las cajas TATA internas, los sitios chi- y los sitios de entrada ribosomales, fueron evitados. El gen EY2É1-B manipulado por ingeniería, sintético, fue construido y fue de 2734 pares de bases de longitud. El gen EY2E1-B fue subclonado dentro de pVAX en los sitios BamHI y Notl para el estudio posterior. Análisis filogenético . Para evaluar la distribución de la distancia a partir de una secuencia del subtipo B de envoltura, aleatoriamente mostrada, a la secuencia de EY2E1-B, se realizó un análisis filogenético . Como se muestra en la figura 2, se observó una cercanía relativa de la secuencia EY2E1-B a todas las secuencias muestreadas. La secuencia EY2E1-B, cuando se comparó con la secuencia EK2P-B del aislado primario, tiene contribuciones comparables de calificaciones de similitud (Tabla 1). La calificación de similitud porcentual promedio para EY2E1-B fue de 85.7%, mientras que ésta fue de 79.4% para EK2P-B. Tabla 1 Tabla 1. El promedio y el intervalo de calificaciones de similitud porcentuales entre los candidatos de vacuna de envoltura, potenciales, y un alineamiento de las secuencias de envoltura del subtipo B.
Expresión in vivo y determinación antigénica de EY2E1-B. Con el fin de probar la expresión in vivo de pEY2ET-B y pEK2¡P-B, las células RD fueron transfectadas con estos plásmidos como se describe en la sección de sección de Materiales y Métodos. Las proteínas totales fueron extraídas de los lisados celulares después de la transfección y sometidas a inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal 2G12 específico de envoltura, mencionada en la sección de Materiales y Métodos para detectar la expresión de pEY2El-B. Los resultados de la transferencia de Western indicaron que estas dos construcciones expresaron la proteína de envoltura (figura 3A) . La proteína de envoltura detectada fue de aproximadamente 120 KD. La tabla 2 muestra una comparación de pEY2El-B y pEK2P-B.
Tabla 2 Para determinar los epitopos antigénicos, las proteínas de envoltura expresadas provenientes de los lisados de células RD, fueron sometidos a inmunoprecipitación con tres diferentes anticuerpos específicos de gpl20, a saber, 2G12, 4G10 e ID6. Después de la inmunoprecipitación, se realiza la transferencia de Western para detectar las proteínas inmunoprecipitadas . Los presentes resultados mostraron que el inmunógeno sintético podría enlazarse a los anticuerpos 2G12 e ID6, pero no a 4G10. Ya que el anticuerpo 2G12 neutraliza una amplia variedad de aislados primarios y reacciona con un epitopo gpl20 conformacional y dependiente de carbohidrato, y el anticuerpo 1D6 se enlazan a gpl20 y a gpl60 y es dirigido contra los primeros 204 aminoácidos de gpl20, los presentes resultados sugirieron que el inmunógeno EY2E1-B manipulado por ingeniería genética, sintético, puede ser capaz de plegarse en una conformación relativamente nativa, y preservar algunos epitopos antigénicos. Además, ya que el anticuerpo 4G10 es un anticuerpo monoclonal V3 de VIH-1 LAI/BRU, que reconoce gpl60 de LAI, una cepa adaptada a la línea de células T, los presentes datos también sugirieron que esta envoltura sintética no podría utilizar el co-receptor CXCR4. Para confirmar adicionalmente la expresión y determinar los epitopos antigénicos, un ensayo de inmunofluorescia indirecta fue realizado utilizando las células RD transíectadas . Se observó una alta expresión específica bajo microscopio de fluorescencia en las células transfectadas con pEY2El-B y pEK2P-B. El anticuerpo monoclonal F105 de env de VIH-1, que reacciona con un epitopo gpl20 discontinuo o conformacional , fue utilizado en el ensayo. Como se indica en la figura 3B, las células transfectadas que expresan las proteínas Env mostraron la fluorescencia típica de la rodamina, sugiriendo nuevamente la proteína sintética expresada y tuvieron una conformación relativa nativa. Como un control, no se detectó la expresión en las células RD transfectadas con pVAX. Inducción de la respuesta humoral. Para determinar si el inmunógeno sintético podría promover la respuesta de anticuerpo específica de envoltura, de más alto título, fueron recolectados los sueros de ratón BalB/C inmunizados con pVAX, pEY2El-B y pEK2P-B, y se realizó la prueba de ELISA. Como se muestra ein la figura 4A, se observó el nivel relativamente más alto de las respuestas de anticuerpo específicas de la envoltura del ciado B con sueros recolectados de ratones inmunizados con pEY2El-B en comparación a aquellos en los ratones inmunizados con pEK2P-B. En contraste, los ratones con el vector solo no desarrollaron respuestas específicas de anticuerpo. No obstante, no existieron respuestas de anticuerpo detectables contra las proteínas del ciado A/E y ciado C en los ratones inyectados con pEY2El-B y pEK2P-B (Figuras 4B y 4C) , indicando que aunque el inmunógeno basado en el consenso, sintético, tiene una conformación relativamente nativa y preserva los epitopos antigénicos nativos, no puede ser posible inducir respuestas inmunitarias de anticuerpo de ciado cruzada, amplias.
Respuestas inmunitarias celulares fuertes y amplias medidas mediante ELISpot. Los ratones BalB/C fueron inmunizados con pEY2El-B y pEK2P-B y se realizaron el análisis de ELISA para determinar el número de células secretoras de IFN-? especificas del antigeno, en respuesta a cuatro combinados de los péptidos provenientes de la proteina de subtipo B de consenso del VIH-1 (Figura 5A) . La magnitud de la respuesta como se midió por el número de unidades formadoras de puntos (SFU) por millón de células estuvo en el intervalo de 27.5 a 520 en los ratones vacunados con pEY2El-B. En comparación, los esplenocitos provenientes de los ratones vacunados con pEK2P-B mostraron únicamente el intervalo de puntos desde 2 hasta 237.5 (p < 0.05) . La frecuencia aditiva de SFU/por millón de esplenocitos para los cuatro combinados en los ratones inmunizados con pEY2El-B, fue de 1976.25 + 260, mientras que el número de SFU/por millón de células en los ratones inmunizados con pEK2P-B fue de 519 + 45. Las células provenientes de ratones inmunizados con el vector pVAX se utilizó cómo un control negativo, mostrando únicamente 60 + 5 SFU/por millón de esplenocitos por combinado de péptidos de envoltura B de consenso (p < 0.05). Se observaron resultados similares en tres estudios separados. Por lo tanto, la reconstrucción de pEY2El-B es hasta cuatro veces más potente en impulsar las respuestas inmunitarias mediadas por células. Se determinó también si los linfocitos CD8+ eran responsables de la secreción de IFN-? detectadas en ratones BalBVC inmunizados con pEY2El-B. Como se muestra en la Figura 5B, el número de SFU/por millón de células fue reducido a 127.5 + 11 después del agotamiento de CD8+, indicando que existió aproximadamente 90% de la disminución de las frecuencias de las células productoras de IFN-? observadas por ELISpot agotado por células CD8+. La producción de IFN-? inducida por pEY2El-B es medida principalmente por las células CD8+. Además, con el fin de modelar las respuestas inmunitarias de células T humanas a los antigenos presentados por HLA-A2 e identificar esos antigenos, se realizó el mismo ensayo de ELISpot mencionado anteriormente utilizando ratones transgénicos HLA-A2.1/H2-Dd. Como se muestra en la Figura 5C, la frecuencia aditiva de SFU/por millón de esplenocitos para todos los combinados en ratones transgénicos inmunizados con pEY2El-B, fue de 2362 - 257, mientras que el número de SFU/por millón de células en ratones transgénicos inmunizados con pEK2P-B, fue únicamente de 493 + 57. Estos resultados indicaron que la construcción pEY2El-B es hasta cuatro veces más potente en impulsar las respuestas inmunitarias medidas por células, en ratones transgénicos. Los datos de ELISpot después del agotamiento de CD8 sugirieron que la producción de IFN-? inducida por pEY2El-B es principalmente mediada por las células CD8 + T (Figura 5D) . Además, se tuvo el interés en detallar adicionalmente las respuestas inmunitarias celulares que fueron observadas en el ensayo de ELISpot. En consecuencia, se realizó un grupo adicional de ensayos de ELISpot contra bibliotecas de péptidos que abarcan la proteina de la envoltura del subtipo B de consenso. Un grupo completo de péptidos 15-mer traslapados por 11 aminoácidos, que comprenden la proteina de envoltura de consenso del subtipo B se utilizó para realizar estudios de mapeo. El estudio ilustró que no existió epitopo dominante claro inducido por la envoltura sintética. Sin embargo, el análisis ELISpot de IFN-? de esplenocitos derivados de ratones BalB/C vacunados con pEY2El-B reveló que existieron 18 combinados de los 29 combinados que muestran más de 50 puntos, mientras que existieron únicamente 6 combinados en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B (Figura 5E) . Estos resultados ilustraron que existe un incremento significativo en la amplitud de la magnitud de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por el inmunógeno EY2E1-B. Respuestas inmunitarias celulares de la actividad cruzada fuerte, inducidas por pEY2El-B. Para determinar si el inmunógeno EY2E1-B pudiera inducir respuestas inmunitarias celulares amplias y de reactividad cruzada, se realizó ELISpot de IFN-? en ratones transgénicos BalB/C y HLA-A2 utilizando los péptidos de envoltura VIH-1 del grupo M, el subtipo C de consenso, MN del VIH-1 (aislado de subtipo B) , VIH-1 CUY.01.TRA3011 y C.ZA.01 J54Ma (dos aislados de subtipo C) .
Estos ensayos determinarán adicionalmente si los resultados observados en las Figuras 5A, 5C y 5E solos, están relacionados a los objetivos peptidicos o son efectivamente adheridos al incremento en la amplitud inmunitaria. Como se muestra en la Figura 6A, el número aditivo de SFU/por millón de esplenocitos contra cuatro combinados de los péptidos de envoltura MN de VIH-1 en ratones BalB/C vacunados con pEY2El-B fue de 1855 + 215.8, lo cual fue aproximadamente dos veces mayor que aquellos en ratones BalB/C inmunizados con pEK2P-B (SFU/por millón de esplenocitos fue de 700 + 168.2), indicando que pEY2El-B tuvo reactividad cruzada más fuerte que pEK2P-B dentro del subtipo B. Los números de puntos de IFN-? en respuesta a la estimulación con cuatro combinados peptidicos de envoltura de consenso VIH grupo M (Figura 6B) y subtipo C (Figura 6C) en ratones BalB/C inmunizados con pEY2El-B, fueron de 1150 +191.3 y 715 + 116.1, respectivamente. En comparación a los números de puntos contra los péptidos del grupo M y el subtipo C que fueron de 635 + 152.3 y 345 + 82.3 en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B, estos datos ilustran que las respuestas inmunitarias de ciado cruzada promovidas por pEY2Fl-B es aproximadamente 45% más fuerte que aquellas inducidas por pEK2P-B en ratones BalB/C. De manera importante, se observaron muchas respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada, mucho más fuertes, inducidas por pEY2El-B en ratones transgénicos (Figura 6F-6J) . El número aditivo de SFU por millón de esplenocitos contra los cuatro combinados de los péptidos de envoltura MN del VIH-1 en ratones transgénicos vacunados con pBY2El-B, fue de 1087 + 153, que fue aproximadamente tres veces mayor que aquellos en los ratones HLA-A2 inmunizados con pEK2P-B (SFU/por millón de esplenocitos fue de 316 + 63} (Figura -6F) , indicando que pEY2El-B podría también promover la reactividad cruzada más fuerte que pEK2P-B dentro del subtipo B en ratones transgénicos. Los números de puntos de IFN-? en respuesta a la estimulación con cuatro combinados peptídicos de envoltura de consenso del VIH grupo (Figura 6G) y del subtipo C (Figura 6H) en ratones transgénicos inmunizados con pEY2El-B, fueron de 2116 + 216 y 893 + 154, respectivamente. En comparación a los números de puntos contra los péptidos del grupo M y el subtipo C que fueron de 473 + 50 y 266 + 55 en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B, estos datos indicaron que las respuestas inmunitarias de ciado cruzada promovidas por pEY2El-B es aproximadamente tres a cuatro veces que aquellas inducidas por pEKC2P-B en ratones transgénicos. Además, dos grupos de péptidos aislados del subtipo C que deberían servir como un control estricto para evaluar la amplitud de la reactividad cruzada lograda por otros grupos de péptidos fueron utilizados para determinar adicionalmente las respuestas inmunitarias de ciado C cruzada. Aunque no existieron muchas diferencias de reactividad cruzada contra estos dos grupos de aislados del subtipo C promovidos por pEY2El-B y pEK2P-B en ratones BalB/C (Figura 6D y 6E) , la reactividad de ciado cruzada contra dos grupos de aislados del subtipo C inducidos por pEY2El-B es aproximadamente tres veces más fuerte que aquellas inducidas por pEK2P-B (Figuras 61 y 6J) . Los números de puntos contra los péptidos C.ZA.0U54Ma y C.UY.01.TRA3011 fueron de 1080 + 206 y 890 + 150 en ratones transgénicos vacunados con pEY2El-B, mientras que los miembros fueron únicamente de 305 + 38 y 310 + 62 en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B. Finalmente, se determinó si existia también un incremento en la amplitud de las respuestas inmunitarias celares de reactividad cruzada contra objetivos específicos de subtipo, inducidos por el inumnógeno EY2E1-B, al detallar las respuestas inmunitarias celulares contra el MN del VIH-1 observadas anteriormente en ratones transgénicos BalB/C y HLA-A2. Un ensayo de mapeo de epitopo fue realizado contra la biblioteca de péptidos que abarcan la proteína de envoltura MN del subtipo B. Los resultados sugirieron que no existieron epitopos dominante claro inducido por la envoltura sintética en ambas cepas de ratón. No obstante, el análisis ELISpot de IFN-? de los esplenocitos derivados de los ratones BalB/C vacunados con pEY2EI-B, reveló que existían 14 puntos de los 29 combinados que muestran más de 50 puntos, mientras que existieron únicamente 9 combinados en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B (Figura 7A) . Similarmente , en ratones transgénicos, existieron 18 combinados de 29 combinados que muestran más de 50 puntos en los ratones transgénicos inmunizadios con pEY2El-B, mientras que existieron únicamente 6 combinados en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B (Figura 7B) . Estos datos indicaron que existe un incremento significativo en la amplitud y la magnitud de las respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada, inducidas por el inmunógeno EY2E1-B en ratones transgénicos BalBC y HLA-A2.
Discusión Los esfuerzos de vacunación con ADN del VIH-1 a nivel mundial, han sido guiados con el principio en que las respuestas de células T especificas del VIH, pueden proporcionar una contribución a la protección contra la infección o el control de la replicación post-infección . Las vacunas de ADN pueden impactar la replicación viral aunque en general éstas no son tan potentes en la inducción inmunitaria como en los vectores virales de virus atenuados (Almond, N., et al., 1995. Protection by attenuated simian immunodeficiency virus in macaques against challenge with virus-infected cells. Lancet 345:1342-1344; Berman, P. ., et al. 1996, Protection of MN-rgpl20-immunized chimpanzees from heterologous infection with a primary isolate of human immunodeficiency vims type 1.
J Infect Dis 173:52-9; Boyer, J. , et al. 1997. Protection of chimpanzees from high-dose heterologous VIH-1 challenge by DNA vaccination. Nat Med 3:526-532; Daniel, M. C, et al. 1992. Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene. Science 258: 1938-1941). Las estrategias dirigidas a mejorar la amplitud y magnitud de las respuestas inmunitarias celulares son por lo tanto importantes. La presente invención proporciona un novedoso antigeno utilizando diversas características de inmunogenos que han sido reportados en la literatura como procedimientos separados, pero no han sido previamente ensamblados entre sí en una modalidad de vacuna. Como prueba de concepto, un inmunógeno de envoltura basado en consenso, manipulado por ingeniería genética, sintético, fue desarrollado y comparado con un inmunógeno de secuencia primaria utilizado para la inducción de respuestas inmunitarias divididas por células. Los datos de expresión mostraron que este nuevo gen de envoltura manipulado por ingeniería, podría ser eficientemente expresado en líneas celulares de mamífero aunque los niveles de expresión de estos dos inmunogenos fueron similares (Figura 3A) . Se observó en los estudios de inmunogenicidad que las respuestas inmunitarias celulares inducidas por este inmunógeno funcional, mostraron diversidad y magnitud incrementadas en comparación a la vacuna de envoltura primaria. Los datos de mapeo de epitopo obtenidos en ratones transgénicos BalB/C y HLA-A2 demostraron que esta diversidad y el mejoramiento de la magnitud fueron mantenidos a través de estos háplotipos. Para confirmar adicionalmente este hallazgo, se desarrolló también un inmunogeno de envoltura del subtipo C basado en consenso, y se le comparó con un inmunogeno del subtipo C primario, contra el inmunogeno de envoltura del subtipo C basado en consenso, sintético, demostró diversidad y magnitud aumentadas de las respuestas inmunitarias celulares, en comparación al inmunogeno primario C (datos no publicados) . Desde el punto de vista de estrategias de diseño de vacunas, la inmunología secuencial entre el candidato de vacuna y la infección o el reto con el virus, pueden ser una consideración importante. Un procedimiento efectivo para reducir al mínimo el grado de no similitud de secuencia entre una cepa de vacuna y los virus circulantes contemporáneos, es crear secuencias artificiales que son "centrales" a estos virus. Una estrategia para diseñar tal secuencia es utilizar una secuencia de consenso derivada del aminoácido más común en cada posición en una alineación. En este estudio, se desarrolló una vacuna de envoltura del subtipo B, basada en consenso, y se pensó que este inmunogeno sintético podría tener reactividad cruzada más alta. Los presentes resultados se mostraron que existe una diversidad de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por la vacuna pEY2El-B. Los resultados del mapeo peptidico en ratones Balb/c y transgénicos también indicó que el inmunógeno EY2E1-B amplió las respuestas inmunitarias . Además, los resultados del estudio de respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada indicó que pEY2El-B podría promover respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada significativamente más fuertes y más amplias. Por lo tanto, los inmünógenos de envoltura de consenso artificiales contienen epitopos más conservados que los que son encontrados en cualquier aislado natural individual, y éstos inducen respuesta CTL de ciado cruzada, más amplias. Una secuencia de consenso teóricamente tiene ventajas y desventajas. Ya que una secuencia de consenso es generada con base en aislados contemporáneos, ésta puede ser genéticamente más parecida a las cepas virales circulantes, actuales que cualquier aislado de virus natural dado. No obstante, ya que el secuenciamiento global es en general conducido con virus muestrados durante infecciones crónicas, en vez de los virus muestrados durante la infección aguda, el desarrollo de una respuesta de vacuna de consenso sobre epitopos que en su mayor parte han escapado, puede ser una desventaja. Para reducir al mínimo esta desventaja, una estrategia útil para el diseño de vacuna podría tomar en cuenta las secuencias transmisoras tempranas. Las proteínas de envoltura están entre las proteínas del VIH más difíciles de construir artificialmente, debida a que las regiones hipervariables en el gen de envoltura del VIH-1 evolucionan por inserción o supresión rápida y no por mutación puntual. La diferencia de las regiones hipervariables en longitudes hace difícil generar las secuencias de consenso de estas regiones. Recientemente, Gao et al. (Gao, F. , E et al. 2005. Antigenicity and imniunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 grupo m consensus envelope glycoprotein . J Virol 79:1 154-63) generó una secuencia de envoltura de consenso del grupo M, no obstante, las secuencias de no consenso provenientes de regiones correspondientes de una cepa recombinante CRF08 BC, fueron utilizadas en estas regiones variables. Los estudios han indicado que los virus de subtipo C que codifican para las glucoproteinas de envoltura con regiones de VI, V2 y V4 más cortas, son transmitidas en recipientes con una frecuencia significa ivamente mayor que la que podria ser esperada por probabilidad. Las secuencias de envoltura del subtipo A provenientes de la infección temprana tuvieron también secuencias de bucle VI y V2 significativamente más cortas, y menos sitios de glucosilación N-ligados, potenciales (Chohan, B., D. et al. 2005. Selection for Human Immunodeficiency Virus Type 1 envelope glycosylation variants with shorter V1-V2 loop secuencias occurs during transmission of certain genetic subtipos and may impact viral RNA levéis. J. Virol. 79:6528- 6531) . En contraste, las variantes del subtipo B recientemente transmitidas no tuvieron bucles de VI y V2 más cortos. Sin embargo, puede ser importante hacer notar que los casos de infección por el subtipo B fueron principalmente resultado de transmisión homosexual o uso de inyección de drogas o fármacos. Además, los estudios han sugerido que una posible consecuencia funcional de tener una región VI, V2 compacta, es incrementar la exposición del dominio de enlace CD4, y luego aumentar la susceptibilidad a la neutralización (Edwards, T. G. , et al. 2001. Relationships between CD4 independence, neutralization sensitivity, and exposure of a CD4-induced epitope in a Human Immunodeficiency Virus type 1 envelope protein. J. Virol. 75:5230- 5239; Kolchinsky, P., et al. 2001. Increased neutralization sensitivity of CD4-independent Human Immnuodeficiency Virus variants. J. Virol. 75:2041-2050; Pickora, C, et al. 2005. Identification of two N-linked glycosylation sites ithin the core of the Simian Immunodificiency virus glycoprotein whose removal enhances sensitivity to soluble CD4. J. Virol. 79: 12575-12583; Puffer, B. A., et al. 2002. CD4 independent of Simian Immunodeficiency Virus Envs is associated with macrophage tropism, neutraliziation sensitivity, and attenuated pathogenicity . J. Virol. 76:2595-2605). Se acortaron las regiones VI y V2 cuando se generó la secuencia de consenso del subtipo B. La fase temprana de la infección para el VIH-1 es dominante por virus no inductores de sincitio (NSI) , los cuales se replican lentamente y utilizan CCR5 como su receptor principal. Los virus inducidos de sincitio (SI) emergen en aproximadamente 50% de los individuos infectados que preceden una declinación acelerada de células CD4, y el curso clínico progresivo de la infección, utilizan CXCR4 como el co-receptor principal. Un uso del co-receptor diferencial de las variantes del VIH ha sido demostrado para todos los subtipos. Los virus' del subtipo C parecen ser diferentes de la mayoría de los otros subtipos, debido a que ha sido frecuentemente reportada una subrepresentación de CXCR4 utilizando variantes de la VIH en el subtipo C. Por lo tanto, la utilización de CCR5 debería ser una consideración muy crucial para un diseño de vacuna. Los reportes previos mostraron que la región V3 de gpl20 juega un papel importante en la utilización del co-receptor. Seis residuos en el bucle V3 han sido identificados como críticos para la interacción con CCR5 : arginina307, lisina314, isoleucina316, arginina322, fenilanina324 y alanina337. Sin embargo, con base en las secuencias de los transmisores tempranos del subtipo C, el residuo en la posición 322 podría ser glutamina en vez de arginina. En resumen, con base en los estudios previos que muestran residuos importantes para la utilización de CCR5 y las secuencias de los transmisores tempranos, se diseñó el inmunógeno de envoltura del consenso del subtipo B que podría impulsar las respuestas inmunitarias que ponen en teoría dirigirse en la utilización del co-receptor CCR5. Para elevar al máximo la reactividad cruzada potencial, una secuencia de envoltura de consenso del grupo del VIH-1 ha sido creada. Sin embargo, es posible que las vacunas de consenso de envoltura específica de subtipo pueden representar un compromiso para la similitud de secuencia completa del antígeno de vacuna, con relación a los virus circulantes al menos al nivel de las respuestas inmunitarias celulares,. Los estudios han mostrado que existen altas proporciones de selección identificadas en diferentes regiones de las proteínas de envoltura del subtipo B y C. Esto puede ser provocado por diferente presión inmunitaria sobre diferentes regiones de la proteína de envoltura en el subtipo B y C. Por lo tanto, pueden existir ventajas en el uso de una vacuna de envoltura específica de un subtipo, ya que las respuestas inmunitarias a la vacuna y los virus circulantes podrían compartir dominios antigénicos. Más experimentos que comparen el grupo M y las vacunas de envoltura específica del subtipo, son necesarias para aclarar adicionalmente este asunto . Otro interés importante respecto al uso de una secuencia de consenso, es que su secuencia puede asociar polimorfismo en combinaciones no encontradas en ninguno de los virus naturales, dando como resultado potencialmente de este modo conformaciones de proteina inadecuadas. Los estudios previos han indicado que un inmunógeno de consenso del grupo M podría plegarse en conformación activa, preservar los epitopos antígenos de envoltura y promover una respuesta de anticuerpo neutralizador débil. Con base en los hechos de que la proteína sintética podrían enlazarse a los anticuerpos 2G12, ID6 y F105, se piensa que pEY2El-B puede tener confirmaciones estructurales nativas en cierto modo. De manera importante, los presentes datos también demostraron que el inmunógeno EY2E1-B podría inducir un específico de la envoltura del subtipo B de título más alto, indicando que este inmunógeno sintético puede preservar también más epitopos de la clase II. Serán importantes más estudios en esta área. Con la generación de las nuevas estrategias de vacuna del VIH-1, existe una demanda creciente para predecir la eficacia de estas vacunas en humanos utilizando modelos pre-clínicos . En el presente estudio, los ratones transgénicos HLA-A2 fueron utilizados para estudiar las respuestas inmunitarias celulares promovidas por el inmunógeno sintético. Los estudios han mostrado que esta cepa transgénica es un modelo pre-clínico importante para el diseño y prueba de vacunas para enfermedades infecciosas que involucran estimulación óptima de las células T citolíticas CD8+. En este modelo, los' resultados indicaron que EY2E1-B podría promover respuestas inmunitarias celulares mucho más amplias y más fuertes en comparación a EK2P-B, sugiriendo que esta nueva vacuna puede tener más potencial para inducir respuestas celulares restringidas a HLA-A2. Además el estudio adicional de este inmunógeno en primates no humanos está siendo planeado. Tomados conjuntamente, los presentes resultados sugieren que EY2E1-B puede servir como un inmunógeno que incrementa la magnitud y la amplitud de las respuestas de CTL como un cásete de vacuna de ADN . En términos más generales, esta construcción puede ser útil en otras plataformas para la inducción de respuestas inmunitarias celulares más fuertes y más amplias contra las cepas del VIH en procedimientos de vectores no ADN.
Ejemplo 2 - Desarrollo de una Nueva Vacuna de ADN de la Envoltura del VIH-1 Ciado C, Manipulado por Ingeniería Genética que Aumenta la Diversidad y la Amplitud de la Respuesta Inmunitaria Celular Promovida Las respuestas de CTL especificas del VIH-1 fuertes, tienen un papel importante en el manejo de la carga viral durante la infección aguda y asintomática . Sin embargo, estudios recientes sobre los inmunógenos de consenso no han sido capaces de demostrar notablemente las respuestas inmunitarias celulares mejoradas. Aquí, se probó un nuevo inmunógeno de envoltura basado en el contexto de la Ciado C, manipulado por ingeniería, para la respuesta inmunitaria celular mejorada. La novedosa vacuna (pEY3El-C) fue creada a partir de la secuencia de envoltura de consenso del Ciado C de VIH-1. Fueron realizadas varias modificaciones incluyendo el acortamiento de las regiones VI y V2 altamente variables, con base en la secuencia transmisora temprana, la retención del bucle V3 para la utilización de CCR5, la eliminación de la región de cola citoplásmica desde el extremo C para prevenir el reciclamiento de la envoltura, y la retención del sitio de escisión y TMD para el plegamiento adecuado. También, se agregó una secuencia guía de IgE al extremo N. Esta vacuna de ADN de consenso fue también optimizada por ARN y optimizada por codón. La respuesta inmunitaria celular fue estudiada en ratones BalB/C por medio de los ensayos de ELISpot y mapeo de epitopos. Cuando se estudió como una vacuna de ADN, comparada a pEK3P-C (derivada de un aislado primario de env del Ciado C) , la presente construcción (pEY3El-C) fue más efectiva al promover una respuesta inmunitaria celular. pEY3El-C promovió una respuesta inmunitaria celular más grande en magnitud que pEK3P-C cuando fue estimulada por los péptidos de consenso del Ciado C. Adicionalmente, el inmunógeno de consenso promovió un incremento en la magnitud de la respuesta inmunitaria celular cuando fue estimulado por otros dos grupos de péptidos de aislado primario también provenientes del Ciado C. Además de la magnitud aumentada, la amplitud aumentada de la respuesta de CTL fue soportada por la habilidad de pEY3El-C para inducir al menos 15 de los 29 combinados peptidicos fuertemente reactivos (que tienen más de 50 puntos por millón de esplenocitos ) , mientras que pEK3P-C únicamente indujo 3 de los 29 combinados y 9 de los 29 combinados con reactividad fuerte, en respuesta a dos grupos de péptidos de aislado primario, los cuales fueron seleccionados por su característica única y habilidad para servir como un control estricto para evaluar la amplitud. Además, pEY3El-C promovió una respuesta inmunitaria celular de Ciado cruzada, más fuerte cuando fue estimulada con péptidos del Ciado B. El inmunógeno de consenso pEY3El-C aumenta la magnitud y la amplitud de la respuesta al CTL como un cásete de vacuna de ADN, sugiriendo que el potencial para los inmunógenos de consenso, para servir como un ántígeno componente en un cóctel de vacuna con VIH, amerita un examen adicional. Con la diversidad genética amplia, la mutación rápida, y la recombinación de las cepas existentes, es tremenda la dificultad para generar una vacuna efectiva. Una vacuna de ADN candidata derivada de un aislado individual puede no ser capaz de promover una reactividad cruzada, necesaria para la protección contra diversas cepas circulantes del VIH-1. Adicionalmente, se ha reportado que las vacunas de ADN que expresan la glucoproteína de envoltura del VIH-1 no son muy inmunogénicas . Hemos utilizado una estrategia de fases múltiples para incrementar la potencia de la respuesta de CTL promovida por la vacuna de AND, para proporcionar posiblemente protección contra la cepa circulante del virus. Estudios recientes han mostrado que un inmunógeno de consenso puede superar el obstáculo de diversidad creado por el virus del VIH-1 que evoluciona rápidamente. En Derdeyn el al., encontraron que una región V1-V4 más corta es característica del virus del subtipo C de transmisión temprana, y la presente construcción ha sido diseñada para llevar esta característica, la cual puede ser útil en la producción y una respuesta inmunitaria resultante de los virus tempranamente transmitidos. Además, los niveles de expresión de la presente vacuna de ADN han sido aumentados por optimización de codón, optimización de ARN, y la adición de una secuencia guía de inmunoglabulina . Las respuestas de CTL específicas del VIH-1 han mostrado que son importantes en el control de la carga viral durante la infección aguda y asintomática, y el desarrollo del SIDA, de este modo, los siguientes datos se enfocan a las respuestas de CTL promovidas por nuestro novedoso inmunógeno. La Figure 13 describe el diseño del inmunógeno para el desarrollo de una nueva vacuna del ADN de la envoltura del Ciado C del VIH-1, manipulada por ingeniería, que aumenta la diversidad y la amplitud de las respuestas inmunitarias celulares promovidas. La Figura 14 muestra las relaciones filogenéticas : treinta y seis secuencias de envoltura del VIH-1 subtipo C, EY3E1-C, EK3P-C, dos secuencias de subtipo B, una del subtipo A y una del subtipo D (grupo externo) fueron incluidas en el análisis filogenético . Las secuencias de envoltura del subtipo C que representan una muestra amplia de diversidad, fueron provenientes de doce países. La Tabla 3 muestra el promedio y el intervalo de calificaciones de similitud porcentuales entre los candidatos de vacuna de envoltura potenciales y un alineamiento de las secuencias de envoltura del subtipo C.
Tabla 3 Tres grupos de tres ratones Balb/C fueron inducidos con 100 pg de ADN 3 veces con dos semanas entre inmunizaciones. En la séptima semana, los bazos fueron cosechados para los estudios celulares. Como se muestra en la Figura 15A y 15B, la respuesta celular fuerte que fue promovida por pEY3El-C. La Figura 16 muestra las respuestas celulares fuertes y amplias promovidas por pEY3El-C. Cuando se estimularon por 29 combinados de los ratones vacunados con los péptidos env de consenso C: pEY3El-C, promovieron más de 50 puntos/por millón de esplenocitos a partir de 23 combinados; los ratones vacunados con pEK3P-C promovieron más de 50 puntos/por millón de esplenocitos a partir de 2 combinados. Las Figuras 17A-17D muestran fuertes respuestas celulares de reactividad cruzada promovidas por pEYSEl-C dentro del mismo ciado. Las Figuras 18A y 18B muestran respuestas celulares de reactividad cruzada, fuertes y amplias, promovidas por pEY3El-C. La figura 18A muestra los datos del ensayo ELISpot de IFN-? especifico de env del subtipo C (Uruguay) . Cuando se estimularon con 29 combinados de los ratones vacunados con péptido env Ciado C (Uruguay) : pEY3El-C, promovieron más de 50 puntos/por millón de esplenocitos a partir de 12 combinados; los ratones vacunados con pEK3P-C promovieron más de 50 puntos/por millón de esplenocitos a partir de 3 combinados. La figura 18B muestra que los datos del ensayo de ELISpot de IFN-? especifico de env del subtipo C (S. África). Cuando se estimularon con 29 combinados de los ratones vacunados con péptido env Ciado C (Sudáfrica) : pEY3El-C promovieron más de 50 puntos/por millón de esplenocitos a partir de 13 combinadas; los ratones vacunados con pEK3P-C promovieron más de 50 puntos/por millón de esplenocitos a partir de 5 combinados . Las Figuras 19A-19F, muestran respuestas celulares de reactividad cruzada, fuertes, promovidas por pEY3El-C entre ciados . Existe un incremento significativo en la amplitud y la magnitud de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por el inmunógeno EOC . Una reactividad más amplia de ciado cruzado, aparece como un beneficio adicional de este inmunógeno .
Ejemplo 3: Eficacia de una nueva vacuna de ADN de VPH-16, manipulada por ingeniería genética, que codifica para una proteína de fusión E6/E7 El inmunógeno ha sido diseñado para ser expresado como una poliproteina mediante la cual la secuencia E6 y El son separadas por un sitio de escisión proteolitica . La poliproteina es también expresada con una secuencia guia de IgE. El diseño de poliproteina incluye supresiones o mutaciones en la secuencia E6 que son importantes para el enlace de p53 y la degradación y las mutaciones en el sitio de enlace Rb sobre la proteina E7. La Figura 23 proporciona una ilustración del diseño del inmunógeno. Las secuencias de codificación que codifican para la poliproteána fueron insertadas dentro del vector pVAX para producir el plásmido pl667. La Figura 24 muestra los mapas de pVax y p!667. Las células tumorales TC1 fueron inmortalizadas con VPH-16 E7 y transformadas con el oncogen c-Ha-ras. Estas células expresan bajos niveles de E7 y son muy tumorigénicas . En el estudio de inmunogenicidad en ratones, 3 ratones/por grupo de los ratones C57BL6 fueron administrados con 100 yg de ADN/por ratón. Los grupos incluyeron 1). de control que fueron administrados con el vector control pVAX y 2 ) de prueba que fueron administrados con pl667. Los ratones fueron vacunados en los días 0, 14 y 28. En el día 35, los ratones fueron sacrificados y se realizó el ensayo ELISPOT (Foco sobre CMI). Los datos para las respuestas inmunitarias celulares inducidas por el inmunógeno pl667 de ADN se muestran en las Figuras 25A-25D. Los péptidos E6 y E7 de consenso del VPH16 (37, 15-mers que se traslapan por 9 aminoácidos) fueron utilizados en dos combinados - combinado 1: 18 péptidos; combinado 2: 19 péptidos. Las figuras 25A y 25C muestran los datos provenientes de los esplenocitos totales. Las figuras 25B y 25D muestran los datos provenientes de muestras con agotamiento de CD8. La Figura 26 muestra los resultados del mapeo de epitopo inmunodominante . Son notadas dos secuencias. En experimentos profilácticos en ratones, 5 ratones/por grupo de ratones C57BL6 fueron administrados con 100 pg de ADN/por ratón. Los grupos incluyeron 1) intactos (inyectados con PBS) , 2) control que fueron administrados con el vector control de pVAX y 3) de prueba que fueron administrados con pl667. Los ratones fueron vacunados en los días 0, 14 y 28. En el día 35, los ratones fueron retados con células TC-1 y después de esto se realizaron mediciones del tamaño dé los tumores. Los resultados se muestran en la Figura 27. Los datos provenientes de un grupo en el cual la construcción de IL-15 fue co-administrada, son también mostradas,. En experimentos de regresión tumoral en ratones, 5 ratones/por grupo de ratones C57BL6 fueron administrados con 100 g dé ADN/por ratón. Los grupos incluyeron 1) intactos (inyectados con PBS), 2) control que fueron administrados con el vector control de pVAX y 3) de prueba que fueron administrados con pl667. Los ratones fueron retados con 5 x 104 células TC-1 en el dia 0. Los ratones fueron administrados con la vacuna de ADN en los días 3, 10 y 17. Los tumores fueron medidos comenzando en el dia 8. Los resultados son mostrados en la Figura 28. Los datos provenientes de un grupo en el cual la construcción de ÜL-15 fue co-administrada, son también mostrados. Se determinó el nivel de linfocitos positivos al tetrámero E7, en los bazos. La Figura 29 muestra los datos como el porcentaje de linfocitos positivos al tetrámero E7. La vacuna de ADN pl667 induce la activación de las células T CD8+ especificas de E7, que son CD62L10 dentro de los bazos. Se determinó el nivel de los linfocitos positivos al tetrámero E7 en los tumores. La Figura 30 muestra los datos como el porcentaje de linfocitos positivos al tetrámero E7. La vacuna de ADN pl667 induce la activación de las células T de CD8+ especificas de E7, que son CD62L10 dentro de los tumores . El estudio de protección de vacunas de ADN E6/E7 en ratones transgénicos fue emprendido. Se realizó una comparación entre intacto, pVAX, pl667, pl667 + IL-15 y E7/HisB. Los datos son mostrados en la Figura 31. pl667 y pl667 + IL-15 protegieron completamente. Los datos presentados en la presente apoyan las siguientes conclusiones. La construcción pl667 induce una respuesta inmunitaria celular fuerte capaz de inducir linfocitos CD8+ específicos de E7, que son mediadores de respuestas elevadas de IFN-?. Se identificaron los epitopos de VPH-16 dominantes y sub-dominantes nuevos contra los cuales son generados CTL específicos del antígeno después de la administración de la construcción de ADN. La construcción pl667 es capaz de prevenir el crecimiento tumoral y provocar la regresión de los tumores en ratones C57/BL6 y transgénicos. La vacuna de ADN pl667 muestra un gran potencial para una novedosa estrategia terapéutica para dirigirse al cáncer asociado a VPH, microscópico.
Ejemplo 4 Las secuencias de ácido nucleico que codifican para las secuencias de consenso Env del VIH pueden ser administradas como vacunas de ADN en combinación con las secuencias de ácido nucleico que codifican para otras diversas proteínas del VIH, tales como Gag, Pol, Gag/Pol, Nef, Vif, y Vpr, utilizando por ejemplo, la tecnología de electroporacion para la distribución intramuscular o intradérmica . Construcciones de vacuna del VIH multivalentes/polivalentes pueden proporcionar una respuesta inmunitaria mejorada y son particularmente útiles. En algunas modalidades, las secuencias de codificación IL-12 son adicionalmente proporcionadas. La Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación número 20070106062, que es incorporada por referencia en la presente, describe una vacuna de ADN de Vif del VIH. La Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación número 20040106100, que es incorporada por referencia en la presente, describe las vacunas de VIH que comprenden las proteínas accesorias de VIH así como las secuencias de tales proteínas que pueden ser utilizadas para preparar construcciones de vacuna adicionales. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,468,982, 5,817,637, y 5,593,972, que son incorporadas en la presente por referencia, describen las vacunas de ADN que comprenden las construcciones gag de VIH, pol de VIH y gag/pol de VIH. La electroporación es descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 7, 245, 963, la cual es incorporada por referencia. La Solicitud del PCT, PCT/US97/19502, que es incorporada por referencia en la presente, describe las construcciones IL-12. La Solicitud de los Patente de los Estados Unidos Publicación No. 20070041941 que es incorporada por referencia en la presente, describe las construcciones que codifican para IL-15.
Ejemplo 5 Dos grupos de macacos fueron inmunizados intramuscularmente tres veces con las construcciones plasmídicas de gag y env optimizadas, con o sin el plásmido de IL-12. Se utilizó la misma estrategia de inmunización para dos grupos adicionales, pero los plásmidos distribuidos con o sin electroporación in vivo. Las respuestas celulares fueron examinadas mediante ELISpot de IFNy después de cada inmunización, y cinco meses más tarde para la respuesta de memoria. A todo lo largo del estudio, las respuestas humorales fueron evaluadas mediante ELISA dé p24 y gpl60 recombinantes . La capacidad proliferativa de las células T especificas del antigeno, fueron determinadas por tinción con CFSE. Tinción de citocina intracelular fue realizada para caracterizar adicionalmente las características funcionales de la respuesta inducida de células T. El plásmido IL-12 aumentó las respuestas celulares a las presentes construcciones optimizadas. No obstante, el uso de la electroporacion para aumentar la distribución de los plásmidos fue capaz de mejorar la respuesta celular y humoral, en comparación a la inmunización intramuscular con el plásmido IL-12. La combinación de plásmido IL-12 y la electroporacion dieron como resultado, mejores respuestas inmunitarias , primarias · y de memoria, como se midieron por una variedad de parámetros . Las construcciones de ADN optimizadas que codifican para gag y env del VIH en macacos rhesus, en presencia o ausencia del plásmido IL-12 como un adyuvante de ADN, fueron comparadas. La IL-12 pudo incrementar sustancialmente la respuesta de células T 5 veces en un formato de ELISpot cuantitativo, dando como resultado sustancialmente mejores respuestas de células T de memoria. Sin embargo, el ADN distribuido EP fue más eficiente al generar respuestas en células T y memoria que fueron dos veces mayores en comparación a la vacuna de ADN adyuvada intramuscular de IL-12. Las mejores respuestas fueron observadas en el brazo de combinación EP + adyuvante de IL-12. Las respuestas de memoria en este brazo fueron 10 veces más altas que el ADN intramuscular, solo, y casi 2 veces más altas que EP solo. Se observó también una expansión inmunitaria 4 veces mejor por CFSE en el brazo de EP + IL-12 en comparación a EP solo. La presencia de células T polifuncionales también sugirió que el brazo de ADN + citocina + EP es el más efectivo.
Materiales y Métodos Animales : Macacos Rhesus {Macaco, mulatta) fueron alojados en BIOQUAL, Inc. (Rockville, MD) , de acuerdo con los estándares de la Asociación Norteamericana para la Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) . Los animales se dejaron aclimatar por al menos 30 días en cuarentena antes de cualquier experimento.
Inmunización : Cinco macacos rhesus fueron inmunizados a las semanas 0, 4, y 11 con 1.0 mg de pGag4Y y pEY2El-B. El ADN en cada inmunización de punto de tiempo fue distribuido en dos sitios de inyección, una en cada músculo del cuadríceps. Tres de los macacos fueron sometidos a electroporesis después de la inyección intramuscular. Otro grupo más de cinco macacos fueron inmunizados en las semanas 0, 4, y 8 con 1.0 mg de pGag4Y, pEY2El-B, y LV104. De los cinco animales, dos animales recibieron inmunización por inyección intramuscular y tres animales fueron sometidos a electroporesis después de la inyección intramuscular. Todos los procedimientos de electroporación fueron realizados utilizando el dispositivo CellectraMR de corriente constante (VGX Immune Therapeutics División of VGX Pharmaceuticals , The Woodlands, TX) . Las condiciones de electroporación fueron 0.5 Amperios, 3 pulsos, longitud de pulso de 52 msegrundos con 1 segundo entre pulso. Este dispositivo controlado por software fue diseñado para medir la resistencia tisular inmediatamente antes de la distribución del plásmido y la generación de pulsos de onda cuadrada de corriente constante, eliminando riesgos de distribución fuera del tejido muscular y pérdida potencial del plásmido .
Recolección de Sangre: Los animales fueron sangrados cada dos semanas por la duración del estudio. Se recolectaron 10 mi de sangre en tubos con EDTA. Las. PBMCs fueron aisladas mediante centrifugación estándar de Ficoll-hypaque y luego se resuspendieron en medio de cultivo completo (RPMI 1640 con 2 mM/1 de L-glutamina suplementada con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 IU/ml de penicilina, 100 µ?/p?? de estreptomicina, y 55 µ?/l de ß-mercaptoetanol . ) Las RBCs fueron lisadas con el amortiguador de lisis ACK (Cambrex Bio Science, East Rutherford, NJ) .
Plásmidos y construcciones de plásmidos : Gag4Y contiene un cásete de expresión que codifica para una secuencia de consenso de la proteina gag de VIH ciados A, B, C, y D con varias modificaciones que incluyen: la adición de una secuencia kozak, una secuencia guia de IgE sustituida, optimización por codón de ARN para la expresión en células de mamífero (la SEQ ID No. : 11 describe la secuencia de consenso Gag de VIH) . El gen Gag4Y fue subclonado dentro del vector de expresión, pVax, para el estudio posterior. pEY-2El-B contiene un cásete de expresión que codifica para una secuencia de consenso de la envoltura de VIH ciado B. (la SEQ ID No.: 3 describe la secuencia de consenso de Env de VIH) . WLV104M es un plásmido que codifica para un gen IL-12 de rhesus. Los plásmidos son reproducidos en Aldevron (Fargo, ND) , y reformulados en VGX Immune Therapeutics (The Woodlands, TX), en agua estéril para inyección con sal de sodio de po 1 i - L-gl ut ama t o al 0.1% de bajo peso molecular.
CFSE de PBMCs crio-preservadas Las PBMCs crio-preservadas fueron descongeladas rápidamente en un medio de agua a 37 °C y lavadas con medio completo., Las células fueron incubadas toda la noche en una incubadora a 37°C y las cuentas celulares fueron obtenidas al siguiente dia. Las células fueron concentradas por centrifugación y resuspendidas en 1 mi de CFDA SE (Molecular Probes. Eugene, OR) en PBS (dilución 1:2000). Las células fueron incubadas a 37°C por 10 minutos. Las células fueron lavadas con medio completo y resuspendidas a una concentración de 1 x 106 células/100 ul y sembradas en placas de fondo redondo de 96 pozos con 100 ul de p24 ó gpl20 del VIH-1 recombinante, a 2 pg/ml ( ImmunoDiagnostics , oburn, MA) más los combinados peptidicos. Se utilizaron como controles 5 pg/ml de Concavalina A (positivo) y medio completo (negativo) . Los cultivos fueron incubados por 5 dias. Las células fueron primeramente teñidas con el colorante violeta Vivid, un marcador celular vivo/muerto, por 15 minutos sobre hielo. Las células fueron lavadas una vez con PBS. Las células fueron luego teñidas utilizando CD3-PE anti-humano (clon SP34-2) (BD Pharmingen) y CD4-PerCP anti-humano (clon L200), CD8-APC antihumano (SKI) por 1 hora a 4°C. Las células fueron lavadas dos veces con PBS y fijadas con 1% de paraformaldehido . Los datos fueron recolectados utilizando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) . Los datos de citometria de flujo fueron analizados utilizando el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) , entrando sobre los linfocitos CD3+. De treinta a cuarenta mil linfocitos CD3+ fueron recolectados por muestra .
Ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) : Placas de noventa y seis pozos fueron recubiertas toda la noche con 100 ng/pozo de p24 o gpl20 del VIH-IIIB recombinante (ImmunoDiagnostics) para determinar la respuesta de gag y env del VIH, respectivamente. Las placas recubiertas con 100 ng/pozo de albúmina sérica bovina sirvieron como un control negativo. Las placas fueron bloqueadas con 3% de BSA-PBST por 1 hora a 37°C. Las placas fueron luego incubadas con diluciones de suero seriales cuatro veces por 1 hora a 37°C. El anticuerpo conjugado a la peroxidasa de rábano, IgG de cabra anti-mono, fue luego agregada a una dilución de 1:10,000 (MP Biomedicals, Aurora, OH) a las placas y se incubaron por 1 hora a 37°C. Se utilizó tetrametilbencidina (R&D systems. Minneapolis, MN) para revelar las placas y las reacciones fueron detenidas con H2SO 2N. Se midieron luego las densidades ópticas (OD) . Los títulos de punto final de IgG fueron definidos como la dilución sérica recíproca que dio como resultado valores de OD que fueron mayores de dos veces el valor OD promedio de los pozos de BSA.
Ensayo de inmunomancha ligado a enzima (ELISpot) Fueron determinadas las respuestas especificas del antigeno mediante sustracción del número de puntos o manchas en los pozos de control negativos a partir de los pozos que contenían péptidos. Los resultados se muestran como el valor medio (puntos/millón de esplenocitos ) obtenidos para los pozos por triplicado. 1. Tinción de citocina intracelular Reactivos de anticuerpo Los anticuerpos directamente conjugados fueron obtenidos de los siguientes: BD Biosciences (San José, CA) : 1L-2 (PE), CD3 (Pacific Blue) , IFN-? (PE-Cy7), y TNF-a (Alexa Fluor 700), CDS (APC) y CD4 (PerCP).
Estimulación y tinción celulares Las PBMCs fueron resuspendidas a 1 x 106 células/100 ul en RPMI completo, y separadas en placas de 96 pozos con los péptidos estimuladores a 100 ul de diluciones 1:200. Se incluyó en cada ensayo un control no estimulado y positivo { enterotoxina B del Staphylococcus, 1 µg/mL; Sigma-Aldrich) . Las células fueron incubadas por 5 horas a 37°C. Después de la incubación, las células fueron lavadas con PBS y teñidas con anticuerpos superficiales. Las células . fueron lavadas y fijadas utilizando el kit Cytofix/Cytoperm kit (BD PharMingen, San Diego, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después de la fijación, las células fueron lavadas dos veces en amortiguador perm y teñidas con anticuerpos contra los marcadores intracelulares . Después de la tinción, las células fueron lavadas, fijadas (PBS que contenia 1% de paraformaldehido ) , y almacenadas a 4°C hasta el análisis.
Citometría de flujo Las células fueron analizadas sobre un citómetro de flujo LSRII modificado (BD Immunocytometry Systems, San José, CA) . Cincuenta mil eventos de CD3+ fueron recolectados por muestra. El análisis de datos se realizó utilizando Flow Jo versión 8.4.1 (FreeStar. San Carlos, CA) . La entrada inicial utiliza un área dispersora delantera (FSC-A) versus la gráfica de altura (FSC-H) para eliminar los dobletes. Los dobletes fueron sometidos a una entrada de linfocitos por una gráfica FSC-A vérsus SSC. Después de esto, los eventos son secuencialmente confinados sobre los eventos de CD3+, CD8+ y D4+ versus IFN-? para explicar la subregulación . Después de la identificación de las células T CD8+, se realizó una entrada para función respectiva, utilizando combinaciones que proporcionaron separación óptima. Después de que fueron creadas las entradas para cada función, se utilizó la plataforma de compuerta Booleana para formar el arreglo completo de posibles combinaciones, que es igual a 8 patrones de respuesta cuando se prueban 3 funciones. Los datos son reportados después de la corrección antecedente. Los umbrales para las respuestas positivas fueron de 10 eventos ó 0.05%.
Análisis estadístico Los datos fueron analizados utilizando el software Prism Graphpad, y son expresados como la media ± SE .
Resultados Análisis ELISpot La inducción de la respuesta inmunitaria celular fue evaluada después de cada inmunización por ELISpot IFNy. Después de una inmunización simple (Figura 1), el grupo que recibió el ADN plásmido mediante inyección intramuscular solo mostró respuestas celulares débiles (74 ± 29 SFU/106 de PBMCs) . La co-inmunización con el plásmido IL-12 de mono rhesus dio como resultado una respuesta más alta (136 ± 51.4 SFU/106 de PBMCs) . El grupo sometido a electoporesis (EP) tuvo una respuesta promedio que fue seis veces más alta que el grupo intramuscular (482 ± 181 SFU/106 de PBMCs) . La combinación de co-inmunización con IL-12 con EP duplicó adicionalmente el número de células productoras de IFNy (1030 ± 494 SFU/106 de PBMCs) . Después de dos inmunizaciones (Figura 1), los grupos IM e IM +IL-12 tuvieron un incremento modesto en las cuentas de ELISpot (104 ± 67.9 SFU/106 de PBMCs y 223 ± 76.6 SFU/106 de PBMCs, respectivamente) . El grupo EP tuvo respuestas que fueron casi cuatro veces más altas (1924 x 417 SFU/106 de PBMCs) que la inmunización previa, y el grupo EP + IL-12 tuvo nuevamente duplicado el número de células productoras de IFNy (2819 ± 872 SFU/106 de PBMCs) en comparación al brazo de EP solo . Después de la tercera inmunización (Figura 1), el número de células especificas del antigeno en el grupo de EP fue mayor que un logaritmo más alto que aquel del grupo IM (5300 ± 3781 y 370 ± 1 10 SFU/105 de PBMCs, respectivamente) . El grupo de IM + IL-12 tuvo también un incremento dramático en las respuestas celulares con las cuentas de ELISpot que fueron casi un logaritmo más altas que la inmunización previa (2042 ± 311 SFU/106 de PBMCs) . Como con las' otras dos inmunizaciones, el grupo de EP + IL-12 fue el más potente de todos los grupos de vacunación (7228 ± 2227 SFU/106 de PBMCs) .
Inducción de respuestas de envoltura de reactividad cruzada Una vacuna de VIH exitosa requerirá la inducción de una respuesta inmunitaria de reactividad cruzada, a este respecto fue interesante observar si EP + IL-12 pudo mejorar la magnitud de la reactividad cruzada para bibliotecas peptidicas divergentes. Se compararon las respuestas de CTL de reactividad cruzada inducidas · por el antigeno env utilizando una biblioteca de péptidos proveniente de un grupo de consenso M. Se observó en todos los grupos la reactividad cruzada. No obstante, los resultados mostraron las mismas diferencias de magnitud observadas en el análisis ELISpot del subtipo B (Figura 2). Después de 3 inmunizaciones, el grupo IM tuvo la respuesta más baja a los péptidos de envoltura del grupo M (222 ± SEM SFU/106 de PBMCs) . La adición de IL-12 duplicó la respuesta (540 ± SEM SFU/106 de PBMCs) . Las respuestas más altas de envoltura en el grupo M fueron inducidas con EP (830 ± SEM SFU/106 de PBMCs), que fueron adicionalmente aumentadas con la co-inyección de IL-12 (1238 ± SEM SFU/106 de PBMCs) . 1. Respuesta de células T de memoria Un asunto importante es el ser capaces de mejorar la generación de respuestas de memoria con la plataforma de AND. Se realizó el análisis de ELISpot, cinco meses después de la última vacunación con ADN (Figuras 3A-3B) . En los grupos de IM, la adición del plásmido IL-12 dio como resultado un incremento de casi 10 veces en las células de memoria (751 + 11.1 y 78.6 ± 16.9 SFU/106 de PBMCs). Es claro que IL-12 puede impactar positivamente este fenotipo importante de célula T. El número de células productoras de IFNY, especificas de antigeno, fue sustancial también en el grupo EP, sin e;mbargo, el adyuvante IL-12 + EP dio como resultado la respuesta de memoria más robusta (1231 ± 523.5 y 3795 ± 1336 SFU/106 de PBMCs, respectivamente), una respuesta que muestra que la tecnología combinada impulsa las respuestas de memoria de células T, muy fuertes.
Respuestas inmunitarias humorales a las vacunas de ADN Una debilidad de la tecnología de vacuna de ADN intramuscular radica en su incapacidad para inducir respuestas claras de anticuerpo en primates no humanos y en estudios clínicos en humanos. Se evaluó la habilidad de cada grupo para inducir títulos de anticuerpo específicos de gag y env del VIH-1 para los antígenos p24 y gpl60 recombinantes , en un formato de ELISA. Para ambos antígenos, los grupos IM e IM + IL-12 no mostraron títulos de anticuerpos significativos (< 1:50 de título de punto final). Los grupos sometidos a electroporesis mostraron títulos de anticuerpo gag dramáticamente más altos que fueron capaces de enlazarse a p24 recombinante . Aunque los grupos de EP y EP + IL-12 tuvieron títulos de punto final similares en la semana 12 (22,400 y 12,800, respectivamente), el grupo EP + IL-12 generó una respuesta de anticuerpo más eficiente. Esa respuesta apareció más tempranamente en el esquema de inmunización y se elevó hasta el nivel máximo de la manera más rápida. La respuesta del anticuerpo env también reflejaron los resultados que se observaron con el antigeno gag, aunque con títulos de punto final más bajos.
Proliferación de células T CD4+ y CD8+ Habiendo observado las respuestas ELISpot sustanciales, en seguida se examinaron parámetros adicionales de la inmunidad celular. Se examinó la habilidad de las células T CD4+ y CD8+ específicas de gag para proliferar in vitro después de la estimulación con péptido entre los diferentes brazos de inmunización. Las muestras crio-preservadas, recolectadas dos semanas después de la inmunización final, fueron estimuladas y analizadas mediante el ensayo CFSE. La respuesta de CD4+ promedio se incrementó de manera similar a aquella observada en el ensayo ELISpot. Por comparación, la inducción de la proliferación de CD8 fue mucho más dramática en magnitud. Se observó que IL-12 incrementó la proliferación de las células T CD8+ sobre IM sola, y EP fue sustancialmente más alta. El grupo EP + IL-12 tuvo el más alto porcentaje de células CD8 + que fueron capaces de proliferar después de la estimulación in vitro (2.51 ± SEM % y 4.88 ± SEM%, respectivamente) . Se observaron bandas de proliferación de células T CD8 obvias en el brazo de EP + IL-12, demostrando el potente potencial proliferativo de esta inmunización combinada.
Respuestas de células T CD8+ polifuncionales Aunque se observó claramente la inducción de una respuesta efectora de IFNy robusta después de la coinmunización EP e IL-12, se deseó caracterizar además las funciones de las respuestas de células T CD8+ especificas del antigeno, en los diversos brazos. Las muestras tomadas tres meses después de la inmunización final fueron estimuladas con los péptidos gag y teñidas para la producción de citocina intracelular de IFNy, TNFa e IL-2. De todos los grupos, únicamente un animal en IM + IL-12 y un animal en el grupo con EP únicamente, tuvieron una respuesta de IFNy detectable. No obstante, dos de los tres animales en el grupo inmunizado con EP + IL-12 tuvieron células T CD8+ productora de IFNy, especificas de gag. El respondedor de IM + IL-12 tuvo un porcentaje pequeño de células polifuncionales que se tiñeron para las tres citocinas, asi como una población que había perdido su habilidad para producir IL-2. El respondedor EP tuvo respuestas polifuncionales ligeramente más altas que estuvieron comprendidas de cuatro diferentes poblaciones. La respuesta más dramática fue observada en el segundo animal EP + IL-12. Más del 2% de sus células T CD8+ fueron capaces de producir las tres citocinas, y 2% fueron capaces de producir IFNy y TNFa. Claramente, el número de animales en cada grupo es bajo, y requiere estudios adicionales en primates para confirmar estos resultados, no obstante, colectivamente las tendencias observadas aparecen claras y prometedoras.
Discusión IL-12 como un adyuvante de vacuna de ADN mejoró las respuestas de ELISpot varias veces sobre el plásmido solo. Además, la proliferación fue claramente mejorada. El grupo EP mostró una respuesta promedio más alta que el grupo IM solo, y el brazo IM + IL-12 mostró una respuesta de ELISpot combinada que fue 3 veces más alta que el grupo IM + IL-12. Las mejores respuestas de ELISpot fueron observadas en el brazo de EP + IL-12, qüe fue casi 4 veces sobre el brazo IM + IL-12 19x IM solo . Después de cada inmunización la magnitud de la respuesta especifica de antigeno por ELISpot de IFNy, fue determinada. Después de una inmunización simple, todos los animales en los grupos de EP y EP + IL-12 no solamente tuvieron respuestas detectables, éstos tuvieron promedios que fueron más altos que aquellos observados en el grupo IM después de tres inmunizaciones. Después de dos inmunizaciones, las respuestas de IFNy en los grupos de EP y EP + IL-12 fueron comparables a las respuestas que habían sido reportada-s en estudios utilizando vectores virales. Las respuestas de memoria sustanciales fueron observadas en IM + IL-12 y en ambos grupos de EP, cinco meses después de la última inmunización.
La inmunización intramuscular, con o sin IL-12, no dio como resultado una cantidad significativa de anticuerpo. La electroporación fue capaz de aumentar la respuesta inmunitaria humoral como se reportó previamente. Todos los animales en los grupos en la electroporesis fueron seroconvertidos . Aunque el EP y los grupos EP + IL-12 tuvieron títulos de punto final similares después de tres inmunizaciones, la cinética de la inducción del anticuerpo fue ligeramente más rápida en el grupo EP + IL-12. La capacidad proliferativa de las células T CD8 pareció ser aumentada con EP y el plásmido IL-12, estos datos apoyan la expansión de memoria observada en el ensayo ELISpot, donde la expansión de las células T específica del antígeno es probablemente un resultado del potencial proliferativo aumentado del brazo EP + IL-12. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1; fragmentos de la SEQ ID NO: 1; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID N0:1; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 3; fragmentos de la SEQ ID NO: 3; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID KO: 3: fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5: fragmentos de la SEQ ID NO: 5: secuencias que tienen al menos 901 de homología a la SEQ ID NO: 5; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; fragmentos de la SEQ ID NO: 7; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 7; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; fragmentos de la SEQ ID NO: 9; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 9; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11 ; fragmentos de la SEQ ID NO: 11 ; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 11 ; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 22; fragmentos de la SEQ ID NO: 22; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO:22; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 30; fragmentos de la SEQ ID NO: 30; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 30; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; fragmentos de la SEQ ID NO: 34: secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 34; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; fragmentos de la SEQ ID NO: 36; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 36; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; fragmentos de la SEQ ID NO: 38; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 38; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; fragmentos de la SEQ ID NO: 40; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 40; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; fragmentos de la SEQ ID NO: 42; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 42; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 42. 2. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:l; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO; 11 ; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; y SEQ ID NO: 42. 3. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia que tiene al menos 95% de homología a una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:l; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11 ; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40; y SEQ ID NO:42. 4. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia que tiene al menos 98% de homología a una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:l ; SÉQ ID NO : 3 ; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO : 7 ; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; y SEQ ID NO: 42. 5. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia que tiene al menos 99% de homología a una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO:ll ; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40; y SEQ ID NO:42. 6. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica que codifica para una proteina seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SÉQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:21. SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO: 39: SEQ ID NO: 41 ; y SEQ ID NO: 43, 7. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 2; secuencias nucleotidicas que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO:2; fragmentos de una secuencia nucleotidica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO:2; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 4; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO; 4; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 4; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homolcpgía a la SEQ ID NO: 4; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: ó; secuencias nucleotidicas. que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 6; fragmentos de a secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 8; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 8; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 10; secuencias nucleotidicas que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO; 10; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 10; fragmentos de a secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 30; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 12; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ 10 NO: 12; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 23; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de hdmología a la SEQ ID NO: 23; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 23; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 23; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 31; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 31; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 35; secuencias nucleotidicas que codifican' para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de hdmología a la SEQ ID NO: 35; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 35; fragmentos de secuenciais nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 35; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NG:37; secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NG:37; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 37; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 39; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos ^90% de homología a la SEQ ID NO: 39; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 39; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 39; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 41; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 41; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 43; secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 43; y fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43. 8. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica que codifica para una proteina seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO:20 y SEQ ID N0:21. SÉQ ID NO:23; SEQ ID N0:31 ; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37: SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:43 ; y SEQ ID NO:43. 9. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1; fragmentos de la SEQ ID NO: 1 ; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NQ: 1; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; fragmentos de la SEQ ID NO: 3; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 3; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; fragmentos de la SEQ ID NO: 5; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 5; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 5; SEQ [D NO: 7; fragmentos de la SEQ ID NO: 7; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 7; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NG:7; SEQ ID NO: 9; fragmentos de la SEQ ID NO: 9; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 9; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; fragmentos de SEQ ID NO: 11 ; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 11; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 11. 10. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO:2; secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO1: 2; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 2; fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 4; secuencias nucleotídicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 4; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 6; secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al' menos 90% de homología a la SEQ ID NO; 6; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 6; fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de hpmologia a la SEQ ID NO: 6; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 6; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 8; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 10; secuencias nucleotidicas que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 10; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 10; fragmentos de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 10; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 12; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID KO: 12; y fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; 11. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 22; fragmentos de la SEQ ID NO: 22; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 22; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 22. 12. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 23; secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 23; y fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 23; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 23. 13. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 30; fragmentos de la SEQ ID NO: 30; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 30; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 30. 14. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 31; secuenciais nucleotídicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31; y fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 31; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31. 15. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia, nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 34; fragmentos de la SEQ ID NO: 34; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 34; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 34. 16. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 35; secuencias nucleotídicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 35; y fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 35; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 35. 17. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 36; fragmentos de la SEQ ID NO: 36; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 36; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; fragmentos de la SEQ ID NO: 38; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 38; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; fragmentos de la SEQ ID NO: 40; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 40; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; fragmentos de la SEQ ID NO: 42; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 42; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO:42. 18. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste de: secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 37; secuencias nucleotídicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 37; fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; secuencias nucleotídicas que codifican la SEQ ID NO: 39; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 39; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID KO:39; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 39; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 41; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 41; fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 3; secuencias nucleotidicas que codifican para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43; y fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la SEQ ID NO: 3; y fragmentos de secuencias nucleotidicas que codifican la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43. 19. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque la molécula es un plásmido. 20. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19. 21. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19. 22. Una vacuna recombinante, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18. 23. La vacuna recombinante de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la vacuna recombinante es una vapuna recombinante de la vaccinia. 24. Un patógeno atenuado vivo, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18. 25. Una proteina, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ' ID NO:2; fragmentos de la SEQ ID NO: 2: fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; fragmentos de la SEQ ID NO: 4; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; fragmentos de la SEQ ID NO: 6; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; fragmentos de la SEQ ID NO: 8; fragmentos de la secuencia que tienén al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NQ: 10; fragmentos de la SEQ ID NO: 10; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO; 10; SEQ ID NO: 12; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; fragmentos de la SEQ ID NO: 12; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:23, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 23; fragmentos de la SEQ ID NO: 23; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90'% de homología a la SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 31; secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31; fragmentos de la SEQ ID NO: 31 ; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31 ; SEQ ID NO: 35, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 35; fragmentos de la SEQ ID NO: 35; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; fragmentos de la SEQ ID NO: 37; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 39; fragmentos de la SEQ ID NO: 39; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 39; SEJQ ID NO: 41, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41 ; fragmentos de la SEQ ID NO: 41 ; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43; fragmentos de la SEQ ID NO: 43; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43. 26. La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6: SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 10: y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO 35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:41; y SEQ ID NO:43. 27 La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia que tiene al menos 95% de homología a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO;2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41 ; y SEQ ID NO: 43. 28. La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia que tiene al menos 98% de homología a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO;6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10; y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:41; y SEQ ID NO:43. 29. La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia que tiene al menos 99% de homología a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO: 10; y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO 35; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:41; y SEQ ID NO:43. 30. La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 2, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; fragmentos de la SEQ ID NO: 2; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: , secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 4; fragmentos de la SEQ ID NO: 4; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: ; SEQ ID NO: 6, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; fragmentos de la SEQ ID NO: 6; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; fragmentos de la SEQ ID NO: 8; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 10; fragmentos de la SEQ ID NO: 10; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12, secuencias que tienen al menos 90% de homología; a la SEQ ID NO: 12; fragmentos de la SEQ ID NO: 12; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 12. 31. La proteína de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:21 . 32. La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 23, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 23; fragmentos de la SEQ ID NO: 23; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO:23. 33. La proteína de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; y SEQ ID NO:27. 34. La proteina de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 31, secuencias que tienen al menos 90% de 5 homología a la SEQ ID NO: 31; fragmentos de la SEQ ID NO: 31 ; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 31. 35. La proteína de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque comprende una 10 secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; y SEQ ID NO:33. 36. La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste 15 de: SEQ ID NO: 35, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 35; fragmentos de la SEQ ID NO: 35; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO:35. 37. La proteína de conformidad con la 20. reivindicación 34, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35. 38. La proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste 25 de: SEQ ID NO: 37, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; fragmentos de la SEQ ID NO: 37; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 39; fragmentos de la SE<£) ID NO: 39; fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90¾ de homología a la SEQ ID NO; 39; SEQ ID NO: 41, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; fragmentos de la SEQ ID NO: 41 ; fragmentos de las secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 41; SÉQ ID NO: 43, secuencias que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 43; fragmentos de la SEQ ID NO: 43; y fragmentos de la secuencia que tienen al menos 90% de homología a la SEQ ID NO: 3. 39. La proteína de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41 ; y SEQ ID NO: 43. 40. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-39, 41. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-39. 42. Una vacuna recombinante, caracterizada porque comprende una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-39. 43. La vacuna recombinante de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la vacuna recombinante es una vacuna recombinante de la vaccinia. 44. Un patógeno atenuado vivo, caracterizado porque comprende una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-39. 45. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VIH, caracterizado porque cómprende administrarle al individuo una composición que incluye una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, o una proteina de conformidad con la reivindicación 30 ó 31. 46. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VPH, caracterizado porque comprende administrarle al individuo una composición que incluye una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, o una proteina de conformidad con la reivindicación 32 ó 33. 47. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo contra el VHC, caracterizado porque comprende administrarle al individuo una composición que incluye una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, o una proteina de conformidad con la reivindicación 34 ó 35, 48. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo contra el hTERT, caracterizado porque comprende administrarle al individuo una composición que incluye una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, o una proteina de conformidad con la reivindicación 36 ó 37. 49. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo contra la influenza, caracterizado porque comprende administrarle al individuo una composición que incluye una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, o una proteina de conformidad con la reivindicación 38 ó 39.
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