ES2389519T3 - Casetes de inmunización de ADN de vif atenuados para vacunas genéticas - Google Patents

Abstract

Una proteína vif no funcional, atenuada y aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5.

Description

Casetes de inmunización de ADN de vif atenuados para vacunas genéticas

Campo de la invención

La invención se refiere a la preparación y al uso de casetes de inmunización de vif del VIH no funcionales y atenuados como vacunas genéticas para genes patógenos.

Antecedentes de la invención

La vacunación y la inmunización generalmente se refieren a la introducción de un agente no virulento contra el que un sistema inmunitario del individuo puede iniciar una respuesta inmunitaria que luego estará disponible para defender contra la exposición a un patógeno. El sistema inmunitario identifica composiciones y agentes “extraños” invasores principalmente identificando proteínas y otras moléculas grandes que normalmente no están presentes en el individuo. La proteína extraña representa una diana contra la que se hace la respuesta inmunitaria.

El sistema inmunitario puede proporcionar múltiples medios para eliminar dianas que se identifican como extrañas. Estos medios incluyen respuestas humorales y celulares que participan en el reconocimiento y la eliminación de antígenos. Brevemente, la respuesta humoral implica linfocitos B que producen anticuerpos que se unen específicamente a antígenos. Hay dos brazos de la respuesta inmunitaria celular. El primero implica linfocitos T colaboradores que producen citocinas y provocan la participación de células inmunitarias adicionales en la respuesta inmunitaria. El segundo implica linfocitos T citolíticos, también conocidos como linfocitos T citotóxicos (CTL), que son células que pueden reconocer antígenos y atacar al antígeno, incluyendo la célula o partícula a la está unida.

La vacunación ha sido particularmente responsable de conferir protección inmunitaria contra varios patógenos humanos. En la búsqueda de vacunas seguras y eficaces para inmunizar individuos contra agentes patógenos infecciosos como virus, bacterias y organismos eucariotas infecciosos, hasta la fecha se han empleado varias estrategias. Cada estrategia aspira a alcanzar el objetivo de proteger al individuo contra la infección por patógenos administrando al individuo una proteína diana asociada al patógeno que puede provocar una respuesta inmunitaria. Por tanto, cuando el individuo se expone a un patógeno infeccioso, el sistema inmunitario del individuo puede reconocer la proteína y organizar una defensa eficaz contra la infección. Hay varias estrategias de vacunas para presentar las proteínas de patógeno que incluyen presentar la proteína como parte de un agente no infeccioso o menos infeccioso o como una composición de proteína discreta.

Una estrategia para inmunizar contra infección usa vacunas muertas o inactivadas para presentar las proteínas de patógeno a un sistema inmunitario del individuo. En tales vacunas, el patógeno está tanto muerto como inactivado de otro modo usando medios tales como, por ejemplo, calor o agentes químicos. La administración de patógeno muerto o inactivado a un individuo presenta el patógeno al sistema inmunitario del individuo en una forma no infecciosa y entonces el individuo puede organizar una respuesta inmunitaria contra él. Las vacunas de patógenos muertos o inactivados proporcionan protección generando directamente respuestas inmunitarias de linfocitos T colaboradores y humorales contra los inmunógenos patógenos. Debido a que el patógeno está muerto o inactivado de otra forma, hay poco riesgo de infección.

Otro procedimiento de vacunación contra patógenos es proporcionar una vacuna atenuada. Las vacunas atenuadas son esencialmente vacunas vivas que presentan una infectividad reducida. Las vacunas atenuadas se producen frecuentemente sometiendo a pases varias generaciones del patógeno a través de un huésped permisivo hasta que los agentes de la progenie ya no sean virulentos. Usando una vacuna atenuada, un agente que muestra infectividad limitada puede emplearse para provocar una respuesta inmunitaria contra el patógeno. Manteniendo un cierto nivel de infectividad, la vacuna atenuada produce una infección de bajo nivel y provoca una respuesta inmunitaria más fuerte que las vacunas muertas o inactivadas. Por ejemplo, las vacunas atenuadas vivas, tales como vacunas contra el virus de la poliomielitis y la viruela, estimulan inmunidades de linfocitos T colaboradores, T citotóxicos y humorales protectoras durante su infección no patógena del huésped.

Otros medios de inmunización contra patógenos se proporcionan por medio de vacunas recombinantes. Hay dos tipos de vacunas recombinantes: uno es un patógeno en el que genes específicos son delecionados con el fin de convertir el agente resultante en no virulento. Esencialmente, este tipo de vacuna recombinante es atenuada por diseño y requiere la administración de un agente infeccioso no virulento activo que, tras establecerse por sí mismo en un huésped, produce o hace que se produzcan antígenos usados para provocar la respuesta inmunitaria. El segundo tipo de vacuna recombinante emplea vectores no virulentos infecciosos en los que se inserta el material genético que codifica antígenos diana. Este tipo de vacuna recombinante requiere similarmente la administración de un agente no virulento infeccioso activo que, tras establecerse por sí mismo en un huésped, produce o hace que se produzca el antígeno usado para provocar la respuesta inmunitaria. Tales vacunas emplean esencialmente agentes no virulentos infecciosos para presentar los antígenos de patógeno que luego pueden servir de dianas para una respuesta inmunitaria anti-patógeno. Por ejemplo, el desarrollo de la variolovacuna como sistema de expresión para la vacunación ha simplificado teóricamente la seguridad y el desarrollo de estrategias de vacunación infecciosas con respuestas inmunitarias de linfocitos T más amplias.

Otro procedimiento de inmunización contra la infección usa vacunas de subunidad. Las vacunas de subunidad generalmente consisten en una o más proteínas aisladas derivadas del patógeno. Estas proteínas actúan de antígenos diana contra los que un individuo puede organizar una respuesta inmunitaria. Las proteínas seleccionadas para la vacuna de subunidad son expresadas por el patógeno de manera que tras la infección de un individuo por el patógeno el sistema inmunitario del individuo reconoce el patógeno y organiza una defensa contra él. Debido a que las vacunas de subunidad no son agentes completamente infecciosos, son incapaces de volverse infecciosos. Por tanto, no presentan riesgo de infectividad virulenta no deseable que está asociada a otros tipos de vacunas. Se ha informado que las vacunas de subunidad recombinantes tales como la vacuna del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) estimulan una respuesta inmunitaria de linfocitos T colaboradores y humoral protectora más específica contra un único antígeno. Sin embargo, el uso de esta tecnología para estimular la amplia protección contra diversos patógenos tiene que confirmarse.

La construcción de vacunas eficaces se complica debido a varios factores que incluyen la patobiología del patógeno y las especificidades de la respuesta inmunitaria del huésped. Recientemente se ha puesto a disposición una novedosa herramienta para el entendimiento del componente inmunitario de estas interacciones en forma de inmunización genética o vacunación con ADN. Tang y col., Nature, 1992, 356, 152; Fynan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 11478; Ulmer y col., Science, 1993, 259, 1745; y Wang y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1993, 90, 4156. La capacidad de este enfoque se demostró que producía amplias respuestas inmunitarias contra productos génicos estructurales y enzimáticos del VIH-1 y dio una idea general de una estrategia para el desarrollo de una posible vacuna profiláctica para el VIH-1. Esta estrategia usó múltiples casetes de expresión génica que codificaban gag/po//rev, además de env/rev y inmunógenos de genes accesorios. Los estudios demostraron claramente que roedores y primates pueden inmunizarse satisfactoriamente con genes estructurales y de la envoltura del VIH-1. Wang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4156 y Wang y col., DNA Cell Biol., 1993,12,

799. Se necesita una estrategia genética para la construcción de casetes de expresión de inmunógeno a partir de un gen patógeno que pueda aplicarse ampliamente con el fin de usar inmunógenos de ADN contra diversos patógenos.

Los genomas lentivíricos de primates contienen genes que codifican proteínas reguladoras y accesorias novedosas, además de proteínas con funciones estructurales y enzimáticas. Los genes reguladores, tat y rev, y los genes accesorios, nef, vif, vpr, vpu y vpx, están bien conservados en muchos lentivirus, que incluyen el VIH y el VIS. La naturaleza bien conservada de estos genes implica que sus productos de proteína desempeñan una función crítica en la patogénesis vírica in vivo. Pareció que los experimentos in vitro iniciales demostraron que tat y rev fueron esenciales para la replicación vírica, mientras que los genes accesorios se consideraron no esenciales. Cullen y col., Cell, 1989, 58, 423 y Desrosiers, AIDS Res. Human Retroviruses, 1992, 8, 411. Sin embargo, otros análisis han revelado que los defectos dentro del gen accesorio producen alteración grave o retraso en la replicación vírica in vitro (Gabudza y col., J. Virol., 1992, 66, 6489 y Gibbs y col., AIDS Res. Human Retroviruses, 1994, 10, 343) e in vivo (Aldrovandi y col., J. Virol., 1996, 70, 1505). Se ha informado de genes accesorios defectuosos nativos in vivo y pueden ser un producto final de una respuesta inmunitaria huésped eficaz. Por tanto, los genes accesorios se considera actualmente que son determinantes de la virulencia del virus. Trono, Cell, 1995, 82, 189. Contienen pocos “puntos calientes” y pueden ser menos susceptibles a mutaciones, conduciendo a la producción de variantes de virus de “escape”, poniendo énfasis en su importancia en el ciclo de vida vírico. Además, los productos de proteína de estos genes son inmunogénicos in vivo. Como grupo, representan el veinte por ciento de las dianas inmunitarias antivíricas posibles. Ameisen y col., Int. Conf. AIDS, 1989, 5, 533 y Lamhamedi-Cherradi y col., AIDS, 1992, 6, 1249. Su inmunogenicidad y baja mutagenicidad funcional se combinan para hacer que los genes accesorios sean elementos atractivos en el diseño de futuros agentes terapéuticos inmunitarios antivíricos. Sin embargo, la producción de inmunógenos de genes accesorios plantea complicaciones inmunológicas y patógenas específicas para un diseño de vacuna vírica debido a la función de los productos de proteína de genes accesorios como determinantes de la virulencia vírica. Una posible vacuna genética basada en genes accesorios necesitaría estar accesible a la respuesta inmunitaria del huésped contra productos génicos accesorios víricos nativos sin potenciar la replicación vírica. Por consiguiente, un objetivo importante es diseñar una vacuna contra el VIH segura y eficaz que incluyera el gen accesorio vif (factor de infectividad del virión) como parte de un inmunógeno genético de múltiples componentes.

El gen vif codifica una proteína vírica tardía de 23 kDa (vif) de un transcrito de 5 kb dependiente de rev cortado y empalmado individualmente. Arya y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1986, 83, 2209; Garrett y col., J. Virol., 1991, 65, 1653; Schwartz y col., Virol., 1991, 183, 677; y Sodroski y col., Science, 1986, 231, 1549. Vif está altamente conservado entre las cepas aisladas del VIH-1 y está presente en otros lentivirus, tales como el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), el virus Visna, VIH-2 y VIS. Myers y col., Human Retrovir. AIDS, 1991 y Shackett y col., Virol., 1994, 204, 860. Análisis anteriores de variación genética de vif in vivo han mostrado que la mayoría de las secuencias de vif son marcos de lectura intactos y la presencia de vif intacto no tiene una correlación con el estado de enfermedad. Sova y col., J. Virol., 1995, 69, 2557 y Wieland y col., Virol., 1994, 203, 43. Sin embargo, los análisis secuenciales de una región que contiene genes vif, vpr, vpu, tat y rev de un progresor a largo plazo infectado por el VIH-1 revelaron la presencia de mutaciones inactivantes en el 64 % de los clones. Michael y col., J. Virol., 1995, 69, 4228. Se ha mostrado que los sujetos infectados por el VIH-1 llevan anticuerpos que reconocen la proteína vif recombinante (Kan y col., Science, 1986, 231, 1553; Schwander y col., J. Med Virol., 1992, 36, 142; y Wieland y col., AIDS Res. Human Retrovir., 1991, 7, 861), sugiriendo que la proteína se expresa y es inmunogénica durante la infección natural (Volsky y col., Curr. Topics Micro. Immunol., 1995, 193, 157.

AEGiS-AIDS Weekly: Conference Coverage: Accessory Genes Improve Apollon HIV DNA Vaccine; 23 de junio de 1997, desvela que una vacuna de ADN desnudo que codifica versiones atenuadas de genes accesorios del VIH-1 tal que incluyen vif provocan respuestas humorales y celulares en estudios en animales.

Debido a la capacidad de vif para activar la replicación vírica en trans, en la presente invención se empleó un diseño de vacuna genética atenuada, similar a aquellas usadas en la producción de vacunas derivadas de componentes víricos, bacterianos o parasíticos tóxicos. Se analizó la variación de secuencias y el potencial inmunogénico presente en los genes vif derivados de sujetos infectados por el VIH-1. Se seleccionaron variantes genéticas prototípicas y se estudió la capacidad de aquellos clones para inducir respuestas humorales y celulares inmunitarias en animales. Las variantes de genes vif seleccionadas también se caracterizaron funcionalmente por ensayos de transcomplementación usando células infectadas por un clon del VIH-1 defectuoso en vif. Se demuestra que los clones de vif no funcionales atenuados inducen respuestas inmunitarias que pueden destruir patógenos nativos.

Resumen de la invención

La invención proporciona una proteína vif no funcional, atenuada y aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vif no funcional atenuada de la invención.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de la invención en un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención en un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.

La invención también proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención también proporciona una célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención también proporciona un anticuerpo purificado dirigido específicamente contra la proteína vif no funcional atenuada de la invención.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico de la invención para su uso en inmunizar un mamífero contra un virus administrando la molécula de ácido nucleico a células de dicho mamífero, en la que dicha molécula de ácido nucleico se expresa en dichas células.

La invención también proporciona un plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vif no funcional, atenuada y aislada de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de vif derivado de madres transmisoras y no transmisoras con clones moleculares del VIH-1 bien caracterizados PNL43, SF-2 y Zr6. T-#, clones del sujeto transmisor; N-#, clones del sujeto no transmisor; --, identidad con la secuencia consenso (Con; SEC ID Nº: 1); .., representa hueco; *, un codón de terminación. La Figura 2 muestra 10 % de SDS-PAGE de inmunoprecipitados. Expresión de clones de vif del VIH-1 derivados de madres transmisoras y no transmisoras. Se usaron plásmidos de expresión de vif para la transcripción/traducción in vitro acoplada según las instrucciones del fabricante (Promega). La inmunoprecipitación de las proteínas traducidas in vitro se realizó con antisuero de vif como se describe en el presente documento. La designación de los clones de vif se indica en la parte superior. Los números de clones designados con T-** y N-** se derivan de las madres transmisoras y no transmisoras, respectivamente. pCVif es el plásmido de expresión de vif del VIH-1SF2. Las Figuras 3A y 3B muestran los resultados de un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) de respuestas de anticuerpos anti-vif en ratones después de la inmunización con una construcción de ADN que expresa vif. Se diluyeron sueros de ratón en tampón de bloqueo a una dilución de 1:500 y se ensayaron como se describe en el presente documento. En la Figura 3A, los ratones se inmunizaron con 50 µg de ADN. En la Figura 3B, los ratones se inmunizaron con 100 µg de ADN por inyección. La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo de liberación de cromo mediante la lisis de dianas murinas (p815) que expresan la proteína vif por esplenocitos de ratones inmunizados con construcciones de expresión de vif. Se infectaron células p815 (1 x 105/ml) con variolovacuna que expresa vif (VV:gag) y se incubaron durante 16 horas para expresar la proteína vif. Las células diana se marcaron con 51Cr durante 1-2 horas y se usaron para incubar los esplenocitos estimulados durante 6 horas. Se calculó la lisis específica ( %) según la fórmula descrita en el presente documento. Las Figuras 5A, 5B, 5C y 5D muestran los resultados de un ensayo de liberación de cromo mediante la lisis

de células HeLa CD4+/Dd infectadas con cepas aisladas del VIH-1 clínicas por esplenocitos de ratones inmunizados con el casete de expresión de vif. Se infectaron células HeLa CD4+/Dd (106) con cepa aislada clínica del VIH-1 sin células seguido de una incubación de una semana para permitir que las células infectaran y expresaran proteínas víricas. Una semana después de la infección, las células diana se marcaron con 51Cr durante 1-2 horas y se usaron para incubar los esplenocitos estimulados durante 6 horas. Se calculó la lisis específica ( %) según la fórmula descrita en el presente documento. La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo de proliferación que muestra la activación y la respuesta proliferativa de linfocitos T a vif recombinante. Vif recombinante (10 µg/ml) se sembró en cada pocillo para estimular la proliferación de linfocitos T. Se usó la lectina PHA (10 µg/ml) como control positivo del estimulante policlonal. El índice de estimulación se calculó como el nivel de radiactividad detectada a partir de las células estimuladas con proteína específica dividido entre el nivel detectado de las células en medios. Los carriles 1a y 1b son de ratones inmunizados con 50 y 100 µg de pCVif; los carriles 2a y 2b son de ratones inmunizados con 50 y 100 µg del clon T-35; los carriles 2a y 2b son de ratones inmunizados con 50 y 100 µg del clon N-15. Las Figuras 7A-7F muestran las secuencias de aminoácidos de proteínas vif no funcionales atenuadas preferidas de la presente invención. Las Figuras 8A-8E muestran las secuencias de nucleótidos de proteínas vif no funcionales atenuadas preferidas de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Uno de los principales objetivos de la investigación del SIDA es el desarrollo de una vacuna contra el virus VIH-1. Una vacuna eficaz debería provocar una fuerte respuesta humoral junto con una respuesta de CTL eficiente y amplia. Esta tarea es complicada debido a la heterogeneidad genética del virus VIH-1. La transcriptasa inversa (RT) del VIH-1 tiene tendencia a error y carece de capacidad para la corrección, produciendo una tasa de mutación de 104 por ciclo y por genoma. Dougherty y col., J. Virol. , 62, 2817. La variación de las secuencias del genoma del VIH-1 se ha observado en virus aislados de diferentes individuos, además de en virus aislado de una única persona en diferentes momentos de tiempo. Fisher y col., Nature, 1988, 334, 444 y Meyerhans y col., Cell, 1989, 58, 901. Basándose en un gran número de análisis de datos de secuencias, es evidente que los genes estructurales env, gag y pol son la principal diana para las mutaciones que conducen a virus de variante de escape en pacientes cambiando el anticuerpo neutralizante y/o epítopes de CTL. Pircher y col., Nature, 1990, 346, 629; Reitz y col., Cell, 1988, 54, 57; y Wolfs y col., Virol., 1991, 185, 195. A pesar de esto, experimentos previos han indicado que los genes estructurales y enzimáticos del VIH-1 pueden usarse satisfactoriamente como vacunas basadas en ácidos nucleicos en diferentes modelos animales (Wang y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1993, 90, 4156; y Wang y col., AIDS, 1995, 9 (Suppl A) S159) y han comenzado estudios profilácticos, además de terapéuticos, para vacunas de ADN. La presente invención se refiere al desarrollo de vif, un gen accesorio del VIH-1, como un casete de inmunogén. Si se usa conjuntamente con otros genes del VIH-1 puede inducirse una amplia respuesta inmunitaria contra todos los componentes víricos, imitando así muchos aspectos de las respuestas inmunitarias inducidas por una vacuna atenuada viva.

En la presente invención se ha observado que la inducción de respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas para vif en ratones establece una correlación directa entre la concentración de ADN inyectado y el número de refuerzos. Se observaron resultados similares en ensayos de proliferación de linfocitos T y de CTL, demostrando que los genes vif son inmunogénicos in vivo. Se sabe que vif se presenta en forma tanto soluble como asociada a la membrana. Goncalves y col., J. Virol., 1994, 68, 704. Aunque se han mostrado anticuerpos anti-vif y respuestas de CTL específicas para vif en pacientes positivos para el VIH-1, todavía no se han definido los epítopes implicados en la presentación de vif al sistema inmunitario. Lamhamedi-Cherradi y col., AIDS, 1992, 6, 1249. Cómo vif se expone al sistema inmunitario humoral no está claro en estos estudios. La diferente respuesta inmunitaria observada en los clones de la presente invención sugiere que las mutaciones en T-35, N-15 y pCVif pueden asociarse a cambios en respuestas de anticuerpo/CTL.

Es significativo observar que algunas de las mutaciones puntuales presentes en todos los clones derivados de T o N indican que estas mutaciones pueden ser responsables de la diferencia en la complementación y/o respuestas inmunitarias observadas. Otros análisis mutacionales de vif ayudan a resolver repuestas de las regiones implicadas en la complementación. Sitios propuestos de actividad de vif incluyen síntesis de ADN vírico, síntesis y transporte de gp120 y procesamiento de gag. Borman y col., J. Virol., 1995, 69, 2058; Sakai y col., J. Virol., 1993, 67, 1663; y Von Schwedler y col., J. Virol., 1993, 67, 4945. Los experimentos de transcomplementación con provirus del VIH-1 defectuoso en vif y líneas celulares que expresan vif del VIH-1 natural indican que vif actúa en un estadio tardío en la replicación/maduración de virus y que la transcomplementación de vif se produce a través de cepas del VIH-1. Blanc y col., Virol., 1993, 193, 186 y Hevey y col., Virus Res., 1994, 33, 269. Experimentos anteriores han mostrado que sueros del sujeto no transmisor (N1) contienen un alto título de anticuerpos contra la proteína de la envoltura y virus no replicantes; mientras que sueros del paciente transmisor (T1) contienen títulos muy bajos de anticuerpos contra proteínas de la envoltura y virus altamente replicantes. Velpandi y col., DNA Cell Biol., 1996, 15, 571. Estos resultados establecen una correlación con los resultados de transcomplementación observados en la presente invención.

La presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vif no funcional atenuada. Como se usa en el presente documento, el término “proteína vif no funcional atenuada” se refiere a proteínas vif que no tienen o tienen función de infectividad del virión reducida en comparación con vif natural. En algunas realizaciones de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos codifican una proteína vif no funcional atenuada en la que la secuencia de nucleótidos comprende deleciones, adiciones, una mutación puntual (mutaciones puntuales), múltiples sustituciones o introducción de un codón de terminación para convertirla en una proteína acortada. En realizaciones preferidas de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas de la invención codifican una proteína vif que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5. En otras realizaciones preferidas de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas codifican una proteína vif y comprenden una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 28.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse a partir de pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana como se describe más adelante en los ejemplos. Alternativamente, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse usando la secuencia de nucleótidos de vif natural. El plásmido de expresión de vif, pCVif, contiene el gen vif del clon molecular del VIH-1 bien caracterizado, pHXB2, bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), dentro del plásmido esqueleto, pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) como se describe en Nagashunmugam y col., DNA Cell Biol., 1996, 15, 353. Esta molécula de ácido nucleico puede usarse para preparar moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican proteínas vif no funcionales atenuadas.

Pueden usarse varios procedimientos para diseñar mutaciones específicas en moléculas de ácidos nucleicos naturales para producir moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas vif no funcionales atenuadas. Por ejemplo, la mutagénesis mediada por oligonucleótidos se usa comúnmente para añadir, delecionar o sustituir nucleótidos en un segmento de ADN cuya secuencia es conocida. Tales procedimientos se enseñan en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, segunda ed. Cold Spring Harbor Press (1989), página 15.51 a 15.73. Brevemente, el protocolo para la mutagénesis mediada por oligonucleótidos implica las siguientes etapas: 1) clonación de un fragmento de ADN apropiado, tal como la secuencia de nucleótidos de vif del plásmido de expresión pCVif, en un vector del bacteriófago M13; 2) preparación de ADN monocatenario a partir del bacteriófago recombinante M13; 3) diseño y síntesis de oligonucleótidos mutagénicos; 4) hibridación de los oligonucleótidos mutagénicos con el ADN diana; 5) extensión del oligonucleótido hibridado por ADN polimerasa; 6) transfección de bacterias susceptibles; 7) cribado de placas de bacteriófago para aquellas que llevan la mutación deseada; 8) preparación de ADN monocatenario a partir del bacteriófago recombinante mutagenizado; 9) confirmación por secuenciación de que el ADN del bacteriófago M13 mutagenizado lleva la mutación deseada y no otra mutación; 10) recuperación del fragmento de ADN mutado de la forma replicativa bicatenaria del bacteriófago recombinante M13; y 11) sustitución del fragmento mutagenizado por el segmento correspondiente de ADN natural en el vector de expresión deseado.

El diseño y la síntesis de los oligonucleótidos mutagénicos, que son confeccionados para la mutación deseada en la molécula de ácido nucleico que codifica vif, se describen en detalle en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, segunda ed. Cold Spring Harbor Press (1989), páginas 15.54 a 15.56. Por ejemplo, para sustituir, añadir o delecionar un único nucleótido en la secuencia de nucleótidos de vif natural, se preparan oligonucleótidos de aproximadamente 17-19 nucleótidos de longitud que llevan el nucleótido desapareado en el centro o en una de las dos posiciones de nucleótidos inmediatamente a 3' del centro. Para sustituir, añadir o delecionar dos o más nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de vif natural se preparan oligonucleótidos de aproximadamente 25 o más nucleótidos de longitud. Estos oligonucleótidos comprenden aproximadamente 12 a 15 nucleótidos perfectamente apareados en cada lado de la región del bucle de salida central que contiene los nucleótidos añadidos o sustituidos, o representa la porción del ADN natural que está conectada con el bucle de salida. Usando la estrategia descrita anteriormente, un experto en la materia puede preparar moléculas de ácidos nucleicos que tienen deleciones, adiciones, sustituciones o codones de terminación prematuros que codifican proteínas vif no funcionales atenuadas. Los procedimientos de mutagénesis mediada por oligonucleótidos son ampliamente conocidos para aquellos expertos en la materia.

Alternativamente, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse usando sintetizadores de ADN mediante la metodología de ADN convencional. Un experto en la materia entiende fácilmente que el código genético es degenerado y, por tanto, podrían prepararse numerosas secuencias de ADN que codifican la misma proteína. Además, un experto en la materia entiende fácilmente que los aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos de forma que se hagan sustituciones conservativas. Por consiguiente, un experto en la materia puede preparar moléculas de ácidos nucleicos de la invención que codifican proteínas vif no funcionales atenuadas.

Moléculas de ácidos nucleicos preferidas de la invención codifican proteínas vif no funcionales atenuadas que tienen las secuencias de aminoácidos (a.a.) y de nucleótidos (nt.) (representadas por números de SEC ID particulares) en la Tabla 1. Las secuencias de aminoácidos específicas se muestran en la Figura 1 y las Figuras 7A-7F. Las secuencias de nucleótidos específicas se muestran en las Figuras 8A-8E.

Tabla 1

Proteína vif

SEC ID Nº: Proteína vif SEC ID Nº:

a.a.

nt. a.a. nt.

N13

4 27 T3 14 37

N15

5 28 T4 15 38

N17

6 29 T35 16 39

N22

7 30 T37 17 40

N23

8 31 T38 18 41

N24

9 32 T39 19 42

N26

10 33 T40 20 43

N27

11 34 T42 21 44

N29

12 35 T43 22 45

N30

13 36 T44 23 46

La presente invención también se refiere a vectores o vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vif no funcional atenuada. Como se usa en el presente documento, el término “vector de expresión recombinante” se refiere a un plásmido, fago, partícula vírica u otro vector que, cuando se introduce en un huésped apropiado, contiene los elementos genéticos necesarios para dirigir la expresión de la secuencia codificante que codifica una proteína vif no funcional atenuada. En algunas realizaciones de la invención, el vector o vector de expresión recombinante codifica una proteína vif no funcional atenuada en la que la secuencia de nucleótidos comprende deleciones, adiciones, mutación puntual (mutaciones puntuales), múltiples sustituciones o introducción de un codón de terminación para convertirla en una proteína acortada. En realizaciones preferidas de la invención, los vectores o vectores de expresión recombinantes de la invención codifican una proteína vif que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5. En otras realizaciones preferidas de la invención, los vectores o vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína vif que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 28.

Un experto en la materia puede aislar la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína vif no funcional atenuada e insertarla en un vector de expresión usando técnicas convencionales y materiales de partida fácilmente disponibles. La secuencia codificante está operativamente ligada a las secuencias reguladoras necesarias. Los vectores de expresión son muy conocidos y están fácilmente disponibles. Ejemplos de vectores de expresión incluyen plásmidos, fagos, vectores víricos y otras moléculas de ácidos nucleicos o molécula de ácido nucleico que contiene vehículos útiles para transformar células huésped y facilitar la expresión de secuencias codificantes. Los vectores de expresión recombinantes de la invención son útiles para transformar huéspedes que expresan una proteína vif no funcional atenuada.

La presente invención también se refiere a una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vif no funcional atenuada. En algunas realizaciones de la invención, la célula huésped comprende el vector o vector de expresión recombinante que codifica una proteína vif no funcional atenuada en la que la secuencia de nucleótidos comprende deleciones, adiciones, mutación puntual (mutaciones puntuales), múltiples sustituciones o introducción de un codón de terminación para convertirla en una proteína acortada. En realizaciones preferidas de la invención, las células huésped comprenden vectores o vectores de expresión recombinantes que codifican una proteína vif que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5. En otras realizaciones preferidas de la invención, la célula huésped comprende vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 28. Células huésped para su uso en sistemas de expresión recombinantes muy conocidos para la producción de proteínas son muy conocidas y están fácilmente disponibles.

El sistema procariota más comúnmente usado sigue siendo E. coli, aunque también son útiles otros sistemas tales como B. subtilis y Pseudomonas. Secuencias de control adecuadas para sistemas procariotas incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles que incluyen el promotor lac, el promotor trp, promotores híbridos tales como el promotor tac, el promotor del fago lambda P1. En general, pueden producirse proteínas extrañas en estos huéspedes tanto como proteínas de fusión como maduras. Cuando las secuencias deseadas se producen como proteínas maduras, la secuencia producida puede ir precedida de una metionina que no se elimina necesariamente de manera eficiente. Por consiguiente, los péptidos y proteínas reivindicados en el presente documento pueden ir precedidos de una Met del extremo N cuando se producen en bacterias. Además, pueden prepararse construcciones en las que la secuencia codificante para el péptido va precedida de un péptido señal operable que produce la secreción de la proteína. A este respecto, cuando se producen en huéspedes procariotas, la secuencia señal se elimina tras la secreción. Ejemplos de células huésped procariotas incluyen células bacterianas tales como E. coli y

células de levadura tales como S. cerevisiae.

Ahora también está disponible una amplia variedad de huéspedes eucariotas para la producción de proteínas extrañas recombinantes. Al igual que en bacterias, los huéspedes eucariotas pueden transformarse con sistemas de expresión que producen la proteína deseada directamente, pero más comúnmente se proporcionan secuencias señal para efectuar la secreción de la proteína. Los sistemas eucariotas tienen la ventaja adicional de que pueden procesar intrones que pueden producirse en las secuencias genómicas que codifican proteínas de organismos superiores. Los sistemas eucariotas también proporcionan diversos mecanismos de procesamiento que producen, por ejemplo, glicosilación, amidación del extremo carboxi, oxidación o derivatización de ciertos residuos de aminoácidos, control conformacional, etc. Sistemas eucariotas comúnmente usados incluyen, pero no se limitan a, células de levadura, fúngicas, células de insecto, células de mamífero, células aviares y células de plantas superiores. En realizaciones preferidas de la invención se usan células de insecto tales como S. frugiperda, células de cultivo de tejido de mamífero no humano, células de ovario de hámster chino (CHO) y células de cultivo de tejido humano tales como células HeLa como células huésped. Están disponibles promotores adecuados que son compatibles y operables para su uso en cada uno de estos tipos de huésped, al igual que lo son las secuencias de terminación y potenciadores como, por ejemplo, el promotor del poliedro del baculovirus. Como antes, los promotores pueden ser tanto constitutivos como inducibles. Por ejemplo, en sistemas de mamífero, el promotor de la metalotioneína de ratón puede inducirse mediante la adición de iones de metales pesados.

En algunas realizaciones, por ejemplo, un experto en la materia puede insertar, usando técnicas muy conocidas, moléculas de ADN en un vector de expresión comercialmente disponible para su uso en sistemas de expresión muy conocidos. Por ejemplo, el plásmido pSE420 comercialmente disponible (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la producción de una proteína vif no funcional atenuada en E. coli. El plásmido pYES2 comercialmente disponible (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse, por ejemplo, para la producción en cepas de S. cerevisiae de levadura. El sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC™ comercialmente disponible (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse, por ejemplo, para la producción en células de insecto. El plásmido pcDNA1 o pcDNA3 comercialmente disponible (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse, por ejemplo, para la producción en células de mamífero tal como células de ovario de hámster chino. Un experto en la materia puede usar estos vectores y sistemas de expresión comerciales u otros para producir una proteína vif no funcional atenuada por técnicas rutinarias y materiales de partida fácilmente disponibles. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, segunda ed. Cold Spring Harbor Press (1989).

Un experto en la materia puede usar otros vectores y sistemas de expresión comercialmente disponibles o producir vectores usando procedimientos muy conocidos y materiales de partida fácilmente disponibles. Sistemas de expresión que contienen las secuencias de control necesarias, tal como promotores y señales de poliadenilación, y preferentemente potenciadores, están fácilmente disponibles y son conocidos en la técnica para diversos huéspedes. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, segunda ed. Cold Spring Harbor Press (1989).

Ejemplos de construcciones genéticas incluyen la secuencia codificante de la proteína vif no funcional atenuada operativamente ligada a un promotor que es funcional en la línea celular en la que las construcciones se transfectan. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen promotores del citomegalovirus o SV40. Ejemplos de promotores inducibles incluyen virus de la leucemia mamaria de ratón o promotores de metalotioneína. Aquellos expertos en la materia pueden producir fácilmente construcciones genéticas útiles para transfectar con células con ADN que codifican una proteína vif no funcional atenuada a partir de materiales de partida fácilmente disponibles. Tales construcciones de genes son útiles para la producción de una proteína vif no funcional atenuada.

Moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína vif no funcional atenuada pueden administrarse a células usando una cualquiera de diversos componentes de administración, tales como vectores de expresión víricos recombinantes o cualquier medio de administración adecuado, de manera que afecten su introducción y expresión en células huésped compatibles. En general, los vectores víricos pueden ser virus de ADN tales como adenovirus recombinantes y virus de la variolovacuna recombinantes o virus de ARN tales como retrovirus recombinantes. Otros vectores recombinantes incluyen procariotas recombinantes que pueden infectar células y expresar genes recombinantes. Además de vectores recombinantes también se contemplan otros componentes de administración tales como encapsulación en liposomas, transfección mediada por transferrina y otros medios mediados por receptor. Está previsto que la invención incluya tales otras formas de vectores de expresión y otros medios de administración adecuados que sirvan a funciones equivalentes y que resulten conocidos en la técnica mças adelante.

En una realización preferida de la presente invención se administra ADN a células huésped competentes por medio de un adenovirus. Un experto en la materia entendería fácilmente esta técnica de administrar ADN a una célula huésped por tales medios. Aunque la invención incluye preferentemente adenovirus, está previsto que la invención incluya cualquier virus que sirva a funciones equivalentes.

En otra realización preferida de la presente invención se administra ARN a células huésped competentes por medio de un retrovirus. Un experto en la materia entendería fácilmente esta técnica de administrar ARN a una célula huésped por tales medios. Cualquier retrovirus que sirva para expresar la proteína codificada por el ARN pretende

incluirse en la presente invención.

En otra realización preferida de la presente invención se administra ácido nucleico mediante medios de receptor de folato. La secuencia de ácidos nucleicos que va a administrarse a una célula huésped está ligada a polilisina y el complejo se administra a la célula tumoral por medio del receptor de folato. La patente de EE.UU. 5.108.921 concedida el 28 de abril de 1992 a Low y col. describe tales componentes de administración.

La presente invención también está relacionada con proteínas vif no funcionales atenuadas purificadas. Las proteínas vif de la invención tienen deleciones, adiciones, mutación puntual (mutaciones puntuales), múltiples sustituciones o introducción de codones de terminación para producir péptidos que son atenuados y no funcionales en comparación con la proteína vif natural. En realizaciones preferidas de la invención, las proteínas vif no funcionales atenuadas de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5. En otras realizaciones preferidas de la invención, las proteínas vif no funcionales atenuadas de la invención consisten en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5. Las proteínas vif de la invención pueden prepararse por medios rutinarios usando materiales de partida fácilmente disponibles como se ha descrito anteriormente.

Los detalles para la construcción de sistemas de expresión adecuados para huéspedes deseados son conocidos para los expertos en la materia y se han descrito anteriormente. Para la producción recombinante de la proteína, el ADN que la codifica se liga adecuadamente en el vector de expresión de elección y luego se usa para transformar el huésped compatible que luego se cultiva y se mantiene en condiciones en las que tiene lugar la expresión del gen extraño. Las proteínas de la presente invención así producidas se recuperan del cultivo, tanto lisando las células como a partir del medio de cultivo según convenga y sea conoció para los expertos en la materia. Un experto en la materia puede aislar, usando técnicas muy conocidas, una proteína vif no funcional atenuada que se produce usando tales sistemas de expresión. Los procedimientos de purificación de una proteína vif no funcional atenuada de fuentes naturales usando anticuerpos que se unen específicamente a una proteína vif no funcional atenuada pueden aplicarse igualmente para purificar una proteína vif no funcional atenuada producida por metodología de ADN recombinante.

Además de producirse estas proteínas por técnicas recombinantes, también pueden emplearse sintetizadores de aminoácidos automatizados para producir proteína vpr. Debe observarse adicionalmente que si las proteínas en el presente documento se preparan sintéticamente, también puede hacerse la sustitución por aminoácidos que no están codificados por el gen. Residuos alternativos incluyen, por ejemplo, los ω-aminoácidos de fórmula H2N(CH2)nCOOH en la que n es 2-6. Éstos son aminoácidos no polares neutros como son sarcosina (Sar), tbutilalanina (t-BuAla), t-butilglicina (t-BuGly), N-metilisoleucina (N-MeIle) y norleucina (Nleu). La fenilglicina, por ejemplo, puede estar sustituida con Trp, Tyr o Phe, un aminoácido neutro aromático; la citrulina (Cit) y el sulfóxido de metionina (MSO) son polares, pero la ciclohexilalanina neutra (Cha) es neutra y no polar, el ácido cisteico (Cya) es ácido y la ornitina (Orn) es básica. Las propiedades que confieren la conformación de los residuos de prolina pueden obtenerse si uno o más de éstos está sustituido con hidroxiprolina (Hyp).

Composiciones farmacéuticas según la invención comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable en combinación con tanto una proteína vif no funcional atenuada como una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica la misma. En realizaciones preferidas de la invención, la composición farmacéutica comprende un vector de expresión recombinante que codifica una proteína vif que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5.

En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína vif que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 28. Las formulaciones farmacéuticas son muy conocidas y las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención pueden ser formuladas rutinariamente por un experto en la materia. Vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica inyectable que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la presente invención. El compuesto de la invención es preferentemente estéril y se combina con un vehículo farmacéutico estéril. En algunas realizaciones, por ejemplo, los compuestos de la invención pueden formularse como una disolución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa y 5 % de albúmina de suero humano. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites no volátiles. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulación se esteriliza por técnicas comúnmente usadas.

Una composición inyectable puede comprender un compuesto de la invención en un agente diluyente tal como, por ejemplo, agua estéril, electrolitos/dextrosa, aceites grasos de origen vegetal, ésteres grasos o polioles tales como propilenglicol y polietilenglicol. El inyectable debe ser estéril y estar libre de pirógenos.

Las formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprays, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. Las composiciones para administración por vía oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes. Las composiciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier medio que permita que el agente activo alcance el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de varias formas dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y según el área que vaya a tratarse. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, administración pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación, o administración intratecal o intraventricular.

La dosificación varía dependiendo de factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del agente particular, y su modo y vía de administración; edad, salud y peso del receptor; naturaleza y grado de síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. La formulación de composiciones terapéuticas y su posterior administración se cree que está dentro de la habilidad de aquellos expertos en la materia.

Según la invención, la composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína vif de la invención puede administrarse directamente al individuo o administrarse ex vivo en células extraídas del individuo que son reimplantadas después de la administración. Por cualquier vía, el material genético se introduce en células que están presentes en el cuerpo del individuo. Vías de administración preferidas incluyen inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. Alternativamente, la composición farmacéutica puede introducirse por diversos medios en células que se extraen del individuo. Tales medios incluyen, por ejemplo, transfección, electroporación y bombardeo con microproyectiles. Después de captarse la molécula de ácido nucleico por las células, se reimplantan en el individuo.

Las composiciones farmacéuticas según este aspecto de la presente invención comprenden aproximadamente de 0,1 a aproximadamente 1000 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente de 1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente de 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. Lo más preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 microgramos de ADN.

Las composiciones farmacéuticas según este aspecto de la presente invención se formulan según el modo de administración que vaya a usarse. Un experto en la materia puede formular fácilmente una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína vif de la invención. En los casos en los que la inyección intramuscular sea el modo de administración elegido se usa una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. Pueden usarse disoluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Estabilizadores incluyen gelatina y albúmina.

Los agentes farmacéuticos basados en ADN están siendo desarrollados como una nueva generación de vacunas. Los agentes terapéuticos de ADN son normalmente plásmidos que contienen una o más vacunas de ADN son normalmente plásmidos que contienen uno o más genes de un patógeno particular o célula no deseable. Una vez inyectada, la secuencia codificante de la vacuna de ADN se expresa en el paciente o individuo vacunado como productos de proteína y se induce una respuesta inmunitaria contra el producto de proteína. Ejemplos de protocolos para administrar ADN que pueden adaptarse para su uso con la presente invención se describen en la patente de EE.UU. nº 5.593.972 concedida el 14 de enero de 1997 a Weiner, patente de EE.UU. nº 5.589.466 concedida el 14 de diciembre de 1996 a Felgner y col., patente de EE.UU. número 4.945.050 concedida el 31 de julio de 1990 a Sanford y col., patente de EE.UU. número 5.036.006 concedida el 30 de julio de 1991 a Sanford y col., publicación PCT de número de serie WO 90/11092, publicación PCT de número de serie WO 93/17706, publicación PCT de número de serie WO 93/23552 y publicación PCT de número de serie WO 94/16737.

En realizaciones preferidas de la invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vif no funcional atenuada se administran a un mamífero mediante los procedimientos descritos anteriormente con el fin de inducir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular a la proteína vif. En otras realizaciones de la invención, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden co-administrarse con compuestos adicionales. Tales compuestos adicionales incluyen, por ejemplo, proteínas víricas o moléculas de ácidos nucleicos diferentes que codifican proteínas víricas diferentes. Las proteínas víricas diferentes incluyen, por ejemplo, gag, pol, env, vpr, vpu y tat, y similares. Tales respuestas inmunitarias provocadas son protectoras contra el VIH o virus de animales relacionados.

La presente invención también se refiere a anticuerpos dirigidos contra una proteína vif no funcional atenuada. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a anticuerpos intactos completos y fragmentos Fab y fragmentos F(ab)2 de los mismos. Los anticuerpos intactos completos incluyen anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen específicamente a un epítope de vif o vif no funcional atenuada. Los anticuerpos que se unen a un epítope son útiles para aislar y purificar esa proteína a partir de tanto fuentes naturales como sistemas de expresión recombinantes usando técnicas muy conocidas tales como cromatografía de afinidad. Tales anticuerpos son útiles para detectar la presencia de tal proteína en una muestra y para determinar si las células están expresando la proteína.

Los hibridomas que producen anticuerpos que se unen a proteína vif, y los propios anticuerpos, son útiles en el aislamiento y la purificación de vif y vif no funcional atenuada y complejos de proteína que incluyen vif o vif no funcional atenuada. Además, los anticuerpos pueden ser inhibidores específicos de actividad de vif. Los anticuerpos que se unen específicamente a vif o vif no funcional atenuada pueden usarse para purificar la proteína de fuentes naturales usando técnicas muy conocidas y materiales de partida fácilmente disponibles. Tales anticuerpos también pueden usarse para purificar la proteína a partir del material presente cuando la proteína se produce por metodología de ADN recombinante.

La producción de anticuerpos y las estructuras de proteína de anticuerpos intactos completos, fragmentos Fab y fragmentos F(ab)2 y la organización de las secuencias genéticas que codifican tales moléculas son muy conocidas y se describen, por ejemplo, en Harlow, E. y D. Lane (1988) ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Brevemente, por ejemplo, vif o vif no funcional atenuada, o un fragmento inmunogénico de la misma, se inyecta en ratones. El bazo del ratón se extirpa, las células del bazo se aíslan y se fusionan con células de ratón inmortalizadas. Las células híbridas, o hibridomas, se cultivan y se seleccionan aquellas células que secretan anticuerpos. Los anticuerpos se analizan y, si se encuentra que se unen específicamente a vif o vif no funcional atenuada, el hibridoma que los produce se cultiva para producir un suministro continuo de anticuerpos.

La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no pretenden ser de ningún modo limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Pacientes

En la presente invención se usaron virus de una madre transmisora positiva para el VIH-1 (T1) y una madre no transmisora positiva para el VIH-1 (N1). Linfocitos de sangre periférica (PBL) obtenidos durante el tercer trimestre del sujeto se proporcionaron por el Estudio de cohortes de madre-hijos, Viral Epidemiology Branch, NCI (Rockville, MD). Se realizó un examen de seguimiento en los sujetos y su descendencia con el fin de determinar el estado de transmisión.

Ejemplo 2: Aislamiento del VIH-1

Linfocitos primarios infectados se co-cultivaron con linfocitos de donante normal estimulados con PHA durante 2 semanas. La producción de virus se monitorizó: 1) midiendo los niveles de transcriptasa inversa (RT) del VIH-1 intracelular (Velpandi y col., J. Virol. Meth., 1990, 29, 291) y 2) midiendo la cantidad de antígeno p24 del VIH-1 liberada en el medio usando un kit de antígeno p24 (Coulter Corporation), usado según las pautas del fabricante.

Ejemplo 3: Preparación de ADN y amplificación por PCR

Se preparó ADN (genómico) de alto peso molecular a partir de los PBL infectados y se amplifica por tecnología de PCR como se describe en Velpandi y col., J. Viol. Meth., 1990, 29, 291. Brevemente, la mezcla de PCR contuvo 5 a 10 µg de ADN genómico, KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, Tris/HCl 10 mM (pH 8,0), 800 µM de dNTP, 2,5 unidades de Taq polimerasa, 20 pmoles de cebadores de oligonucleótidos y agua bidesionizada (ddH2O) en un volumen final de 100 µl. Las temperaturas de reacción y los tiempos de ciclado fueron: 94 ºC-desnaturalizante (1 minuto), 55 ºChibridación (1,5 minutos) y 72 ºC-extensión (2 minutos). El ciclo se repitió 35 veces. Las secuencias de cebador son del siguiente modo: Vif(+) 5'-GAAAGCTTATGGAAAACAGATGGCAG-3' (5046-5065) (SEC ID Nº: 2); y Vif(-) 5'-GCAAAGCTTTCATTGTATGGCTC-3' (5609-5626) (SEC ID Nº: 3). Los cebadores se marcaron con un sitio de restricción HindIII (en negrita) para fines de clonación.

Ejemplo 4: Clonación y secuenciación

El producto amplificado por PCR se usó para la clonación como se describe en Velpandi y col., DNA Cell Biol., 1996, 15, 571. El ADN de plásmido positivo para el gen vif se purificó por mini-preparaciones (Qiagen, CA) y se cuantificó mediante espectrofotometría en la preparación para la secuenciación del inserto. Las reacciones de secuenciación se realizaron usando un secuenciador automatizado ABT y reacciones Dye Deoxy (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Ejemplo 5: Análisis de secuencias

Los alineamientos de secuencias se construyeron usando el paquete de software Genetics Computer Group Sequence Analysis adquirido por medio de la Medical School Computer Facility del sistema VAX de la Universidad de Pensilvania. Las comparaciones de homología de secuencias de aminoácidos se llevaron a cabo por programas de alineamiento de secuencias.

Ejemplo 6: Construcción de provirus defectuosos en vif

Se usó ADN provírico del VIH-1, pZr6, para la construcción de un mutante de deleción de vif como se describe en Nagashunmugam y col., DNA Cell Biol., 1996, 15, 353. El clon provírico resultante, p911, contiene una deleción de 80 aminoácidos en el gen vif que no afecta el marco de lectura de 3'. Brevemente, el ADN provírico del VIH-1 pZr6 se derivó de linfocitos de sangre primarios infectados con VHIzr6 como se describe en Srinivasan y col., Gene, 1987, 52, 71-82. Se introdujo una deleción en pZr6 para preparar p911. El mutante se construyó de forma que no interfiriera con el gen pol en la dirección 5' o el gen vpr en la dirección 3'. El plásmido pZr6 contiene dos sitios NdeI en el gen vif en las posiciones de nucleótidos 476 y 716. Srinivasan y col., Gene, 1987, 52, 71-82. El fragmento NdeI (477-716) se delecionó de pZr6 y los extremo se volvieron a ligar a la construcción p911, un mutante en marco que tiene 80 aminoácidos delecionado en la región central de la proteína vif.

Ejemplo 7: Construcción de vectores de expresión de vif

El plásmido de expresión de vif, pCVif, contiene el gen vif del clon molecular del VIH-1 bien caracterizado, pHXB2, bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), dentro del plásmido esqueleto, pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) como se describe en Nagashunmugam y col., DNA Cell Biol., 1996, 15, 353. Los genes vif de las muestras maternas se clonaron en el vector de expresión de Invitrogen, pcDNA3, bajo el control del promotor del CMV. Los marcos de lectura de vif se verificaron por análisis de secuencias usando el cebador directo, T7, y el cebador inverso, SP6. Brevemente, para la construcción de un vector de expresión de vif (pCVif), un fragmento de 1,1 kb de Eco RI-Eco R1 de pHxB2 (coordenadas del mapa 4.647-5.742; Ratner y col., Nature, 1985, 313, 277-284) se clonó bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus en el plásmido pcDNA3 obtenido de Invitrogen. Este fragmento también contiene secuencias flanqueantes de partes de los genes pol y vpr, que no son transcripcionalmente activas como se muestra en una construcción similar por Blanc y col. (Virology, 1993, 193, 186-192).

Ejemplo 8: Traducción in vitro de vif

La transcripción y traducción in vitro se realizó en 1 µg de ADN de construcción de expresión de vif usando la ARN polimerasa T7 según las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). Cinco (5) µl de los productos de reacción de la traducción in vitro se combinaron con 500 µl de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación y se inmunoprecipitaron con antisuero anti-vif de conejo como se describe. Mahalingam y col., Virol., 1995, 214, 647.

Ejemplo 9: Células

Células de rabdomiosarcoma (RD) obtenidas de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) se cultivaron en una monocapa a 37 ºC en 5 % de CO2 en medio Eagle modificado por Dulbecco complementado con 10 % de suero bovino fetal, 1 % de penicilina, 1 % de estreptomicina y 1 % de L-glutamina. Líneas celulares linfocitoides obtenidas de la ATCC se mantuvieron como cultivos en suspensión en medio RPMI 1640 complementado con 10 % de suero bovino fetal, penicilina (100 U/ml) y L-glutamina (540 µg/ml) a 37 ºC con 5 % de CO2. Los PBL estimulados con fitohemaglutinina (10 µ/ml) se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía 10 % de factor de crecimiento de linfocitos T.

Ejemplo 10: Inmunización de ratones con construcciones de vif

Para los experimentos de inmunización en ratones se usaron 3 construcciones de vif diferentes. Los clones de vif seleccionados fueron T-35 (de transmisor), N-15 (de no transmisor) y pCVif (gen vif de VIH-1SF-2). Se usó ADN del vector pcDNA3 como control negativo. Con el fin de potenciar la captación de ADN, los músculos cuádriceps de ratones BALB/c se inyectaron con 100 µl de 0,25 % de bupivacaína 48 horas antes de la inyección de ADN. Se inyectaron cincuenta (50) o 100 µg de cada plásmido de expresión de vif en un volumen final de 100 µl en cada uno de 4 ratones. Los animales se reforzaron 3 veces a intervalos de dos semanas.

Ejemplo 11: Unión de ELISA de suero de ratón a proteína rvif

Se realizó ELISA en suero de ratón como se describe en Wang y col., AIDS, 1995, 9 (Suppl A), S15-9. Brevemente, placas de ELISA se recubrieron con proteína vif recombinante (rvif) a la concentración de 100 ng/pocillo para los ensayos de unión. Los sueros de ratón se diluyeron (1:100 y 1:500) en tampón de bloqueo, se marcaron con anti-IgG de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) y se detectaron por el sustrato TMBlue. La unión no específica y la unión de sueros presangrados se restaron de la unión específica de los sueros de animales inyectados con ADN.

Ejemplo 12: Ensayo de CTL usando variolovacuna que expresa vif

Ratones inyectados con ADN se sacrificaron 7 semanas después de la primera inmunización, y sus bazos se extirparon para ensayos de proliferación de CTL y de linfocitos T como se describe en Wang y col., DNA Cell Biol., 1993, 12, 799. Brevemente, células P815 infectadas con variolovacuna que expresa vif (VV:gag amablemente proporcionada por NIH AIDS Reagent and Reference Program) se usaron como células diana. Se añadieron diez

(10) µCi de Na2CrO4 (51Cr, 534 mCi/mg, Dupont Co.) a 1 x 106/ml células diana que se incubaron posteriormente durante 2 horas a temperatura ambiente. Entonces, las células se lavaron 3 veces con medio sin suero y se diluyeron a un volumen de 1 x 105 células/ml en RPMI 1640/10 % de suero bovino. Las células efectoras del bazo se lavaron una vez, se resuspendieron y se diluyeron a una concentración de 1 x 107 células/ml de medio RPMI. Se hicieron diluciones seriadas 1:2 a partir de esta disolución de células madre (5 x 106, 2,5 x 106 y 1,25 x 106 células/ml). Cien (100) µl de estas disoluciones de células efectoras se tomaron en alícuotas en una placa de microtítulo de fondo plano de 96 pocillos. Se añadieron cien (100) µl de disolución de células diana a cada pocillo. Las relaciones de células efectoras con respecto a diana resultantes fueron 100:1, 50:1, 25:1 y 12,5:1. Con el fin de determinar la liberación de cromo espontánea o máxima, respectivamente, las células diana se mezclaron con tanto 100 µl de medio solo como 1 % de Triton-X. Entonces, las células efectoras y diana se incubaron a 37 ºC en una estufa de incubación con 5 % de CO2 durante 5 horas. Se tomó una alícuota de 100 µl de sobrenadante de cada pocillo y la cantidad de liberación de 51Cr se midió en un contador gamma. La fórmula para el cálculo de la liberación de CTL específica es la siguiente: 100 x [(liberación experimental - liberación espontánea) / liberación máxima liberación espontánea)]. Nota: la máxima liberación se determinó por lisis de células diana en 1 % de Triton X-100.

Ejemplo 13: Ensayo de CTL usando cepas aisladas del VIH-1 clínicas

Células HeLaCD4+ que expresan MHC-I de ratón se infectaron con cepas aisladas clínicas del VIH-1 y se usaron como células diana en el ensayo de CTL. El ensayo de CTL se realizó como se describe en Chada y col., J. Virol., 1993, 67, 3409.

Ejemplo 14: Ensayo de proliferación de linfocitos T

Los ensayos se realizaron por triplicado. Se aislaron esplenocitos tal como se trató anteriormente, se resuspendieron en RPMI 1640 y se diluyeron a una concentración de 3,3 x 106 células/ml. Inmediatamente se añadió una alícuota de 150 µl a cada pocillo de una placa de microtítulo de fondo plano de 96 pocillos. Se añadieron (50) µl de proteína o péptido a cada pocillo a concentraciones finales de 10,0, 1,0 ó 0,1 mg/ml. Las células se incubaron a 37 ºC en una estufa de incubación con 5 % de CO2 durante 3 días. Se añadió un (1) µCi de timidina tritiada a cada pocillo, y las células se incubaron durante la noche bajo las mismas condiciones. Las células se recogieron usando un colector de células automatizado (Tomtec, Orange, CT) y la cantidad de timidina tritiada incorporada se midió en un contador beta. Con el fin de garantizar que las células estuvieran sanas se usaron 5 mg/ml de PHA como un estimulante no específico en una muestra de control positivo.

Ejemplo 15: Transcomplementación de ADN provírico defectuoso en vif con genes vif de muestras maternas

Se cotransfectaron células de RD (1 x 106) con 10 µg de un clon provírico defectuoso en vif, p911, y 10 µg de pCVif

o plásmido de expresión de vif de sujetos transmisores o no transmisores usando lipofectina de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Las células co-transfectadas se lavaron después de una incubación de 8 horas y se resuspendieron en medio DMEM. El sobrenadante de cultivo se recogió después de una incubación de 72 horas, se centrifugó para eliminar el residuo de células, se pasó a través de un filtro de 0,45 µm y se ensayó para la producción de p24 (Coulter Corporation). Se infectaron PBMC (1 x 107) con una cantidad de virus equivalente a 100 ng de antígeno p24. Las células inoculadas con virus se incubaron durante 4-6 horas a 37 ºC y 5 % de CO2, se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron en 10 ml de RPMI 1640 fresco. Una alícuota del sobrenadante de cultivo se recogió cada 3 días con el fin de cuantificar la producción de virus midiendo la cantidad de antígeno p24 liberada en el medio.

Ejemplo 16: Caracterización de virus aislados de pacientes

Las madres transmisoras y no transmisoras positivas para el VIH-1 incluidas en la presente invención se seleccionaron de un estudio de cohortes de SIDA. La madre y la madre no transmisora se denominan T1 y N1, respectivamente. El estado clínico de los sujetos y la cinética de replicación de sus cepas aisladas víricas se presentan en la Tabla 2. Los linfocitos sin cultivar de cada sujeto se usaron con el fin de obtener secuencias naturales sin modificar por condiciones de selección in vitro. En ensayos de co-cultivo de PBMC, muestras víricas de T1 se replicaron muy bien en PBL de donantes normales; mientras que muestras víricas de N1 no se replicaron en tanto linfocitos primarios como macrófagos.

Tabla 2

Sujeto

Estado clínico PCR Cocultivo de virus en PBMC Infección en líneas celulares CD4+

Transmisor

Asintomático +++ +++ +++

No transmisor

Asintomático ++ --- ---

Ejemplo 17: Variación de secuencias del gen vif in vivo

Con el fin de investigar la variabilidad genética del gen vif en estos sujetos, diez clones de cada sujeto se secuenciaron y se alinearon por ordenador por grado de homología. Las secuencias de nucleótidos se tradujeron entonces en secuencias de proteínas. Las secuencias de aminoácidos deducidas se usaron en la comparación final, ya que no todas las probabilidades de secuencias de nucleótidos produjeron cambios de secuencias de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos alineadas de estos pacientes se muestran en la Figura 1. Los números de clones con las designaciones 'T' y 'N' representan variantes aisladas de madres transmisoras y no transmisoras, respectivamente. El alineamiento de secuencias reveló que cada sujeto tenía un conjunto único y altamente conservado de secuencias dentro de su agrupación de virus. La mayoría de los cambios de nucleótidos fueron mutaciones puntuales que generalmente produjeron sustituciones, frente a duplicaciones o inserciones, dentro de la secuencia de proteínas. Tres clones codificaron proteínas atenuadas. El clon T-42 tuvo una deleción de 5 aminoácidos en su extremo 3' debido a un codón de terminación prematuro. El clon N-13 tuvo dos codones de terminación (posiciones 31 y 41) y el clon T-4 tuvo un único codón de terminación (posición 77), cada uno los cuales se introdujo dentro de un conjunto de tres nucleótidos, manteniendo el marco de lectura intacto 3' con respecto a la mutación. El hecho de que la mayoría (17 de 20) de los clones codificara secuencias de longitud completa sugiere que hay pocos genes vif defectuosos presentes dentro de estas agrupaciones víricas del paciente. Es interesante observar que la mayoría de las mutaciones puntuales de vif están presentes en la porción 5' del gen en vez de en la región 3'. Se encontraron diferencias significativas entre los clones en las posiciones 20, 27, 31, 36, 37, 45, 60, 74, 127, 136, 140 y 150.

Con el fin de determinar la naturaleza y la variación de secuencias del gen vif in vivo, los inventores clonaron y analizaron variantes de vif presentes en PBMC sin cultivar de sujetos positivos para el VIH-1. El análisis de 20 secuencias de vif diferentes de dos sujetos (10 de cada sujeto) reveló que vif está altamente conservado (aproximadamente 90 %) dentro de un paciente particular en un momento de tiempo dado. Aunque Wieland y col. (Virol., 1994, 203, 43) informaron que la porción 3' del gen vif es altamente variable, los resultados de la presente invención indican que la porción 5' (aa 20-85) es más variable y la porción 3' está bien conservada. En apoyo de los resultados en el presente documento, los experimentos de mutagénesis previos han mostrado que el extremo C de vif (aa 171 a 192) es esencial para la asociación estable de vif con membranas. Goncalves y col., J. Virol., 1994, 68,

704. Entre las 20 secuencias que analizaron los inventores, sólo dos clones tuvieron codones de terminación prematuros que indican que el 90 % de los genes vif aislados fueron intactos in vivo. Este resultado, junto con los datos previamente publicados, sugiere que un gen vif completo es esencial para la replicación vírica in vivo. Gabudza y col., J. Virol., 1992, 66, 6489; y Sova y col., J. Virol., 1995, 69, 2557.

Las 20 secuencias de proteínas vif deducidas de estos clones presentaron el 75 % de conservación (25 % de variación) con respecto a la longitud entera (192 aa). En particular, dos dominios antigénicos, aa 87-94 (IEWRKKRY) (SEC ID Nº: 24) y aa 172-178 (DRWNKPQ) (SEC ID Nº: 25), reconocidos por sueros positivos para el VIH-1 (Wieland y col., AIDS Res. Human Retrovir., 1991, 7, 861), están bien conservados en los 20 clones. La naturaleza bien conservada de estas dos regiones puede ser responsable de las propiedades antigénicas cruzadas expresadas por estos clones. Además, una secuencia que está conservada en 34/38 lentivirus vif, SLQYLA (144-149) (SEC ID Nº: 26) (Oberste y col., Virus Genes, 1992, 6, 95), también está conservada en cada uno de los 20 clones de vif secuenciados en la presente invención. En estudios previos, los análisis de alineamiento por ordenador han mostrado que los aminoácidos 21 a 30, 103 a 115 y 142 a 150 de vif están altamente conservados entre VIH-1, VIH2 y VIS. Myers y col., Human Retrovir. AIDS, 1988. Sin embargo, los clones analizados en la presente invención fueron generalmente secuencias conservadas dentro de los aa 103-115 y aa 142-150, pero no dentro de los aa 21

30. La proteína vif se ha caracterizado como una cisteína proteasa marcando Cys 114 su sitio activo y considerándose His 48 importante para la actividad. Guy y col., J. Virol., 1991, 65, 1325. En las secuencias de la presente invención, Cys 114, además de Cys 133 (la otra cisteína en vif) y His 48, estuvieron bien conservadas.

El análisis del árbol filogenético (datos no mostrados) encontró 3 familias principales dentro de los clones de 20 pacientes. El noventa (90 %) por ciento de los clones derivados de N formó una familia y el 80 % de de los clones derivados de T formó una familia, mientras que el resto de los clones, N-30, T-3 y T-38, presentaron mayor diversidad y formaron un grupo separado (datos no mostrados). Cuando se realizó la comparación de distancias, la variación entre pacientes entre los clones transmisores fue del 12 %, frente a una variación del 10 % entre clones no transmisores. También se evaluó la similitud entre los clones de variante del sujeto y los clones moleculares de laboratorio establecidos, VIHSF-2, VIHNL43 y VIHzr6. Las cepas aisladas objeto compartieron un mayor grado de homología con otros clones dentro de su grupo de estado de transmisor que con cualquiera de las cepas aisladas víricas mantenidas en laboratorio. Basándose en su variación de secuencias, 4 clones de cada paciente se

seleccionaron para los experimentos de traducción/inmunización preliminares (véase más adelante).

El análisis del árbol filogenético también indicó que, a pesar de la variación entre pacientes, los clones de los sujetos transmisores y no transmisores se agrupaban por separado. La transcripción/traducción in vitro de 8 construcciones (cuatro de cada uno sujeto) produjo la expresión de una proteína de 23 KDa, excepto en el caso del clon N-13 que tiene un codón de terminación prematuro. Esto sugiere que las diversas mutaciones presentes en estas construcciones de vif no afectaron la cinética de expresión y la estabilidad de la proteína.

Ejemplo 18: Expresión de clones de vif

La transcripción/traducción in vitro se realizó en 5 clones de cada grupo con el fin de evaluar sus niveles de expresión de vif. Los resultados se presentan en la Fig. 2. Los productos de las reacciones de traducción in vitro se inmunoprecipitaron con antisuero de vif y se sometieron a electroforesis en gel. Se usaron los provirus de pCVif (vif de longitud completa de la cepa del VIH-1 SF2) y p911 (mutante de vif) como control positivo y negativo, respectivamente. La traducción in vitro con pCVif y cada uno de los plásmidos de expresión de vif de longitud completa produjo una proteína de 23 kDa; mientras que los clones p911 y N-13 no produjeron un producto de proteína de 23 kDa de tamaño, probablemente debido a la presencia de codones de terminación prematuros. Se seleccionaron dos (2) clones de cada grupo de sujetos para la evaluación adicional basándose en características serológicas similares (datos no mostrados). Los clones del paciente seleccionados como representativos de cada grupo fueron T-35 (de transmisor) y N-15 (de no transmisor). Cada uno de estos clones contiene mutaciones características de su grupo particular y representan el mayor nivel de diversidad dentro de estos grupos. Es interesante observar que las mutaciones dentro del clon N-15 están dispersadas por todo el gen de longitud completa; mientras que las mutaciones dentro del clon T-35 están agrupadas en el extremo 5' del gen.

Ejemplo 19: Inducción de respuestas humorales in vivo

Respuestas inmunitarias anti-vif específicas fueron evidentes en sueros recogidos de ratones inmunizados con los plásmidos de expresión T-35, N-15 y pCVif, pero no en sueros de ratones inmunizados por el vector pcDNA3 solo. La inducción de respuesta inmunitaria guardó relación con la concentración de la inyección de ADN, además de con el número y el intervalo de tiempo entre refuerzos. Los sueros de 4 ratones inyectados con tanto 50 como 100 µg de ADN de vif tuvieron reactividad específica con la proteína vif cuando se midió por ELISA (Fig. 3). La inducción de la respuesta humoral fue dependiente de la dosis y del tiempo. La inyección de 50 µg de ADN indujo una respuesta inmunitaria detectable por ELISA a los 15 días tras la primera inyección. Esta respuesta aumentó después de refuerzos posteriores, alcanzando un nivel máximo 45 días después de 2 refuerzos (Panel A). La inyección con 100 µg de ADN indujo una respuesta que alcanzó un nivel máximo sólo 28 días después de un único refuerzo (Panel B). Además, la respuesta de anticuerpos puede elevarse 219 días después de las tres inyecciones con un único refuerzo de ADN (datos no mostrados). El nivel de respuesta de anticuerpos varió entre clones de vif. Y, lo que es más importante, el clon no transmisor, N-15, indujo una mayor respuesta serológica que el clon transmisor, T-38, o pCVif. Esto sugiere que vif no transmisor puede inducir una respuesta dependiente de linfocitos B-T colaboradores más eficiente que la vif transmisora en esta cepa de ratones.

Ejemplo 20: Inducción de respuestas celulares in vivo usando variolovacuna que expresa vif

A cuatro ratones, cada uno inmunizado con una de las construcciones de vif, se les administró un refuerzo adicional 15 días después de la primera inyección. Dos ratones se sacrificaron posteriormente y sus esplenocitos se usaron en un ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL). Como células diana se usaron células p815 infectadas con variolovacuna que expresa vif. Se midió lisis no específica por esplenocitos de ratones inmunizados con ADN de vif y sin tratamiento previo usando células p815 infectadas con variolovacuna que expresa no vif como células diana. La lisis diana específica se presenta en la Fig. 4. El nivel de actividad de CTL específica varió entre las construcciones de vif. Los esplenocitos de ratones inmunizados con el clon pCVif presentaron el 45 % de lisis a una relación de efectoras:diana de 100:1. Los clones T-35 y N-15 presentaron el 17 y el 12 % de lisis, respectivamente, a la misma relación. Estos resultados demuestran claramente que la inmunización con ADN de vif induce respuestas de CTL específicas. Las diferencias en los niveles de actividad de CTL inducida por la inoculación del gen vif entre los diversos clones de pacientes pueden ser debidas a mutaciones dentro de los epítopes de CTL expresados por las dianas de vacuna o diferencias en la sensibilidad inmunitaria en este haplotipo.

Ejemplo 21: Evaluación de respuestas celulares in vivo usando dianas humanas infectadas con una cepa aislada del VIH-1 clínica

Con el fin de evaluar la capacidad de los clones de vif para inducir la lisis de dianas víricamente infectadas, los inventores usaron células HeLa CD4/Dd infectables por el VIH-1 que expresan tanto el receptor CD4 como el elemento de restricción H-2Dd de la clase I murina como dianas en el ensayo de CTL. Estas células se infectaron con una cepa aislada del VIH-1 derivada de un paciente con SIDA sintomático durante 7 días. La Figura 5 (A-D) representa resultados del ensayo de CTL. Los esplenocitos obtenidos de ratones inyectados con cada una de las construcciones de ADN presentaron lisis específica para vif. Los clones T-35, N-15 y pCVif presentaron el 27, 26 y 24 % de lisis, respectivamente, a una relación de efectoras:diana de 50:1. Los tres clones presentaron el 20 % de lisis a una relación de 25:1. Esto demuestra que puede generarse una respuesta inmunitaria celular contra cepas

aisladas del VIH-1 nativas mediante la vacunación genética con vectores de expresión de vif.

Ejemplo 22: Inducción de la proliferación de linfocitos T específicos para antígeno

Las respuestas de proliferación de linfocitos T específicos contra la proteína del VIH-1 vif también se estudiaron en animales inmunizados con ADN. Los linfocitos de ratones inmunizados con vif demostraron una respuesta proliferativa significativa contra la proteína rvif. La Figura 6 ilustra el índice de proliferación de diferentes construcciones de vif frente a concentraciones de inyección de ADN. Los resultados muestran que la respuesta de células Th (colaboradoras) dependientes del MHC de clase II es dependiente de la dosis. Para cada construcción, el índice de estimulación es casi 2 veces superior en ratones inyectados con 100 µg de ADN de vif que en ratones inyectados con 50 µg de ADN de vif. La comparación de las tres construcciones de vif diferentes también indica que, a cada concentración de inyección, el clon T-35 induce un mayor índice de estimulación que N-15 o que pCVif.

Ejemplo 23: Transcomplementación del provirus de vif del VIH-1 con plásmidos de expresión de vif

Como era de esperar, la transfección transitoria de células de RD con ADN provírico (vif-) del VIH-1 y plásmidos de expresión de vif no reveló ninguna diferencia en la producción de virus entre plásmidos derivados de T, derivados de N o de control (datos no mostrados). Cualquier diferencia en la función de vif se demostraría al nivel de nueva infección. Sin embargo, cuando el virus rescatado se usó para infectar linfocitos primarios, se observó una diferencia significativa en la patogénesis de virus entre plásmidos derivados de T y de N y de control (Tabla 3). El clon provírico negativo para vif (p911) solo no pudo infectar PBL primarios como virus libre de células. Cuando el virus transcomplementado (p911 + pCVif) se usó para infectar los PBL, la infectividad fue cinco veces inferior a la del virus natural. A diferencia, cada uno de los clones derivados de T probados pudo rescatar el mutante (vif-) (aproximadamente el 100 % de control de virus positivo). Sin embargo, ninguno de los clones derivados de N pudo infectar eficientemente PBL como virus libre de células. Por tanto, N-15 y clones derivados de N similares pudieron inducir respuestas inmunitarias anti-VIH en ratones en ausencia de funcionalidad.

Tabla 3

Muestras

ADN usado para derivar virus para la infección Cantidad de p24 liberado (ng/ml)

Clon provírico

pZr6 101,846

Mutante de vif

p911 60

Mutante de vif + pCVif

p911 + pCVif p911 + T1-40 p911 + T1-37 p911 + T1-35 p911 + T1-38 22,679 21,896 17,230 19,470 81,570

Mutante de vif + clones transmisores

Mutante de vif + clones no transmisores

p911 + N1-13 p911 + N1-15 p911 + N1-17 p911 + N1-27 p911 + N1-30 520 530 1,090 1,277 715

Ejemplo 24: Observaciones

Se transfectaron células de RD con 10 µg de pZr6, mutante de vif p911, plásmidos de expresión de p911 y vif de diferentes muestras de paciente. Las agrupaciones de virus se prepararon a partir de sobrenadante recogido 72 horas después de la transfección. El virus equivalente a 100 ng de antígeno p24 se usó posteriormente para infectar 10 x 106 PBMC. La infección se monitorizó por la producción de antígeno p24.

Los clones derivados de N se atenuaron en su capacidad para transcomplementar provirus del VIH-1 defectuoso en vif. Uno de los clones analizados, N-15, también fue inmunológicamente funcional y pudo generar una respuesta inmunitaria contra el virus VIH-1 natural. Un clon todavía inmunogénico no funcional, tal como N-1 en la presente invención, podría ser un componente eficaz de una vacuna genética dirigida contra el VIH-1. Se ha mostrado en la presente invención que vif sola puede generar una respuesta eficaz contra el virus VIH-1 nativo in vitro. Tales inmunógenos podrían ser útiles en un entorno terapéutico para elegir como diana la respuesta inmunitaria contra virus que expresan vif nativa. Aunque es probable que las variantes de escape puedan producir virus que expresan vif defectuosas debido a esta selección, ahora podría presentar cinética de crecimiento in vivo atenuada. En un modo similar, una vacuna profiláctica que incluye vif podría servir tanto para limitar el escape vírico como para contribuir a reducir el punto de ajuste vírico durante los acontecimientos de infección tempranos.

5 Listado de secuencias

<110> Ayyavoo, Velpandi Nagashunmugam, Thandavarayan Weiner, David B.

10 Universidad de Pennsilvania

<120> CASETES DE INMUNIZACIÓN DE ADN DE VIF ATENUADOS PARA VACUNAS GENÉTICAS

<130> UPAP-0263 15

<140> ADJUNTO

<141> 18/09/1998

<160> 46 20

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1

<211> 190 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 30

<400> 1 <210> 2

<211> 26 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 2 gaaagcttat ggaaaacaga tggcag 26

<210> 3 15 <211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 3 gcaaagcttt cattgtatgg ctc 23

25 <210> 4

<211> 190

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 4 <210> 5

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 5 <210> 6

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 6 <210> 7

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 7 <210> 8

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 8

<210> 9

<211> 192

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

10 <400> 9 <210> 10

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 10 <210> 11

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 11 <210> 12

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 12 <210> 13

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 13 <210> 14

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 14 <210> 15

<211> 191 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 15 <210> 16

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 16 <210> 17

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 17 <210> 18

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 17 <210> 19

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 19 <210> 20

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 20 <210> 21

<211> 188 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 21 <210> 22

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 22 <210> 23

<211> 192 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 23 <210> 24

<211> 8 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 24

15 <210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 25

<210> 26

<211> 6 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 26

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 29

<210> 30

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 30 20

<210> 31

<211> 579 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 30

<400> 31 <210> 32

<211> 579 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 32

15 <210> 33

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 33

<210> 34

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 34

5 <210> 35

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 35

<210> 36

<211> 584

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

25 <400> 36

30 <210> 37

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 37

<210> 38

<211> 579 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 15

<400> 38

<210> 39

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 39 30

<210> 40

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 40

<210> 41

<211> 579

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

20 <400> 41

<210> 42 25 <211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 42 <210> 43

<211> 579 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 10

<400> 43

15 <210> 44

<211> 578

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 44

<210> 45

<211> 579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa

<400> 45

<210> 46

<211> 579 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia novedosa 15

<400> 46

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una proteína vif no funcional, atenuada y aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 5.

2. 2.

   Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vif no funcional atenuada de la reivindicación 1.

   5 3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 28.
3. 4. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de la reivindicación 1 en un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.
4. 5. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la 10 reivindicación 3 en un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.

5. 6.

   Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

6. 7.

   Una célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

   15 8. Un anticuerpo purificado específicamente dirigido contra la proteína vif no funcional atenuada de la reivindicación

   1.
7. 9. Una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3 para su uso en la inmunización de un mamífero contra un virus administrando la molécula de ácido nucleico a células de dicho mamífero, en la que dicha molécula de ácido nucleico se expresa en dichas células.

   20 10. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en la que dicho virus está seleccionado del grupo que consiste en virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus Visna y virus de la inmunodeficiencia simia.
8. 11. Un plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vif no funcional, atenuada y aislada de la reivindicación 1.

   FIGURA 8A

   N13 (SEC ID Nº: 27)

   N15 (SEC ID Nº: 28)

   N17 (SEC ID Nº: 29)

   N22 (SEC ID Nº: 30)

   FIGURA 8B

   N23 (SEC ID Nº: 31)

   N24 (SEC ID Nº: 32)

   N26 (SEC ID Nº: 33)

   N27 (SEC ID Nº: 34)

   FIGURA 8C

   N29 (SEC ID Nº: 35)

   N30 (SEC ID Nº: 36)

   T3 (SEC ID Nº: 37)

   T4 (SEC ID Nº: 38)

   FIGURA 8D

   T35 (SEC ID Nº: 39)

   T37 (SEC ID Nº: 40)

   T38 (SEC ID Nº: 41)

   T39 (SEC ID Nº: 42)

   FIGURA 8E

   T40 (SEC ID Nº: 43)

   T42 (SEC ID Nº: 44)

   T43 (SEC ID Nº: 45)

   T44 (SEC ID Nº: 46)