ES2589013T3

ES2589013T3 - Vacunas mejoradas para abordar la telomerasa

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Publication number: ES2589013T3
Application number: ES13187666.6T
Authority: ES
Inventors: David B. Weiner; Jian Yan
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2007-07-30
Publication date: 2016-11-08
Anticipated expiration: 2027-07-30
Also published as: WO2008014521A3; KR20210151987A; JP2015012874A; KR102511874B1; KR20170024131A; AU2007278831B2; JP2020103317A; AU2013201592B2; KR101562888B1; JP2016029105A; MX340880B; AU2024200014A1; KR20190083680A; HK1218427A1; EP2708549A3; JP6186333B2; DK3037429T3; KR20160038075A; EP3489251B1; KR101848867B1

Abstract

Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 35 y fragmentos de la SEQ ID NO: 35 que comprende 1140 o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 35, en la que dichos fragmentos son inmunógenos que potencian respuestas inmunitarias celulares contra hTERT.

Description

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envuelta del subtipo B consenso de VIH-1 y MN de VIH-1 en 29 combinaciones de 14-15 péptidos por combinación, respectivamente, y se realizó el ensayo ELISpot de IFN-γ como se ha descrito anteriormente. Estos diferentes conjuntos de 29 estimuladores combinados se usaron en un ensayo de matriz que facilita el mapeo de epítopos.

Análisis estadístico. Se usó el ensayo t de Student para muestras relacionadas para la comparación de la respuesta inmunitaria celular entre ratones inmunizados con pEY2E1-B y pEK2P-B. En este estudio, p<0,05 se ha considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Construcción y diseño de un novedoso gen de envuelta basado en consenso de transmisión prematura de subtipo B. La secuencia consenso de subtipo B de VIH-1 se generó a partir de 42 secuencias de subtipo B recuperadas de GenBank. Como se resume en la Fig. 1, se realizaron varias modificaciones después de generar la secuencia consenso. En resumen, para producir una versión CCR5 trópica de envuelta de VIH-1 que imitara los virus transmitidos por vía mucosa, se diseñaron seis aminoácidos importantes en el bucle V3 de acuerdo con las secuencias de aislados de transmisión prematura. Además, también se detectaron diez aminoácidos en el bucle V1 y un aminoácido en el bucle V2 a partir de la secuencia consenso. Se fusionó una secuencia líder altamente eficaz en fase cadena arriba del codón de inicio para facilitar la expresión. El dominio transmembrana se mantuvo intacto para facilitar la expresión superficial y el sitio de escisión se mantuvo intacto para obtener un plegamiento apropiado y la escisión por proteinasa del hospedador de la proteína de envuelta. La cola citoplasmática se retiró para evitar el reciclado de la envuelta y para promover una expresión más estable y altamente superficial (Berlioz-Torrent, C., et al. 1999. Interactions of the cytoplasmic domains of human and simian retroviral transmembrane proteins with components of the clathrin adaptor complexes modulate intracellular and cell surface expression of envelope glycoproteins. J. Virol. 73:1350-1359; Bultmann, A., et al., 2001. Identification of two sequences in the cytoplamic tail of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein that inhibit cell surface expression. J. Virol. 75:5263-5276). Además, para obtener un mayor nivel de expresión, se adaptó el uso de codones de este gen a la desviación de codones de los genes de Homo sapiens (Andre, S., et al. B. 1998. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol 72:1497-503; Deml, L., et al. 2001. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 gag protein. J. Virol. 75:10991-11001). Además, también se realizó optimización del ARN (Schneider, R., et al., 1997. Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation.

J. Virol. 71:4892-4903): se evitaron regiones de un contenido muy alto (>80 %) o muy bajo (<30 %) de GC y los motivos de secuencia de acción en cis tales como cajas TATA internas, sitios chi y sitios de entrada al ribosoma. El gen EY2E1-B sintético modificado por ingeniería se construyó y era de 2734 pb de longitud. El gen EY2E1-B se subclonó en pVAX en las sitios BamHI y NotI para estudio adicional.

Análisis filogenético. Para evaluar la distribución de la distancia desde una secuencia de subtipo B de envuelta muestreada de forma aleatoria con la secuencia EY2E1-B, se realizó un análisis filogenético. Como se muestra en la Fig. 2, hubo una cercanía relativa observada de la secuencia EY2E1-B a todas las secuencias muestreadas. La secuencia EY2E1-B, en comparación con la secuencia EK2P-B del aislado primario, tiene distribuciones comparables de valores de similitud (Tabla 1). El valor del porcentaje de similitud promedio para EY2E1-B fue del 85,7 %, mientras que fue del 79,4 % para EK2P-B.

Tabla 1

Valores de porcentaje de similitud promedio: Intervalo de valores de porcentaje de similitud

EY2E1-B: 85,7 92,1-79,6

EK2P-B: 79,4 86,3-73,9

Tabla 1. El promedio y el intervalo de valores de porcentaje de similitud entre los candidatos potenciales de vacuna de envuelta y una alineación de las secuencias de envuelta de subtipo B.

Expresión in vivo y determinación antigénica de EY2E1-B. Para ensayar la expresión in vivo de pEY2E1-B y pEK2P-B, se transfectaron células RD con estos plásmidos como se describe en la sección de materiales y métodos. Se extrajeron las proteínas totales de los lisados celulares después de la transfección y se inmunotransfirieron con el anticuerpo monoclonal específico de envuelta 2G12 mencionado en la sección de materiales y métodos para detectar la expresión de pEY2E1-B. Los resultados de transferencia de Western indicaron que estas dos construcciones expresaban la proteína de envuelta (Fig. 3A). La proteína de envuelta detectada era de aproximadamente 120 kDa. La Tabla 2 muestra una comparación de pEY2E1-B y pEK2P-B.

Tabla 2 15

Consenso/Primaria: Transmisión prematura Codones-optimizados ARN-optimizado IgELS Cola citoplasmática

EY2E1-B: Consenso Sí Sí Sí Sí No

EK2P-B: Primaria No Sí Sí Sí No

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Para determinar los epítopos antigénicos, las proteínas de envuelta expresadas a partir de los lisados celulares RD se inmunoprecipitaron con tres anticuerpos diferentes específicos de gp120 2G12, 4G10 e ID6. Después de la inmunoprecipitación, se realizó transferencia de Western para detectar las proteínas inmunoprecipitadas. Nuestros resultados mostraron que el inmunógeno sintético podía unirse a los anticuerpos 2G12 e ID6, pero no a 4G10. Como el anticuerpo 2G12 neutraliza una amplia diversidad de aislados primarios y reacciona con un epítopo conformacional y dependiente de carbohidratos gp120, y el anticuerpo ID6 se une a gp120 y gp160 y está dirigido contra los primeros 204 aa de gp120, nuestros resultados sugerían que el inmunógeno sintético modificado por ingeniería EY2E1-B podría ser capaz de plegarse en una conformación relativamente nativa y conservar algunos epítopos antigénicos nativos. Además, como el anticuerpo 4G10 es un anticuerpo monoclonal contra LAI/BRU V3 de VIH-1 que reconoce LAI gp160, una cepa adaptada a la línea de células T, nuestros datos también sugerían que esta envuelta sintética no utilizaría el correceptor CXCR4.

Para confirmar adicionalmente la expresión y determinar los epítopos antigénicos, se realizó un ensayo inmunofluorescente indirecto usando células RD transfectadas. Se observó alta expresión específica al microscopio fluorescente en las células transfectadas con pEY2E1-B y pEK2P-B. El anticuerpo monoclonal contra env de VIH-1 F105 que reacciona con un epítopo discontinuo o conformacional de gp120 se usó en este ensayo. Como se indica en la Fig. 3B, las células transfectadas que expresaban proteínas Env mostraban la fluorescencia típica de rodamina, sugiriendo de nuevo que la proteína sintética expresaba y tenía una conformación relativamente nativa. Como control, no se detectó la expresión en células RD transfectadas con pVAX.

Inducción de respuesta humoral. Para determinar si el inmunógeno sintético podría provocar una respuesta de anticuerpo específica de envuelta de mayor título, se recogieron sueros de ratones BalB/C inmunizados con pVAX, pEY2E1-B y pEK2P-B y se realizó ELISA. Como se muestra en la Fig. 4A, se observó un nivel relativamente mayor de respuestas de anticuerpos específicos de envuelta de clado B con sueros recogidos de ratones inmunizados con pEY2E1-B en comparación con los de ratones inmunizados con pEK2P-B. En contraste, los ratones con vector en solitario no desarrollaban respuestas de anticuerpos específicas. Sin embargo, no hubo ninguna respuesta detectable de anticuerpos contra proteínas de clado A/E y clado C tanto en ratones a los que se han inyectado pEY2E1-B como pEK2P-B (Fig. 4B y 4C), lo que indica que, aunque el inmunógeno basado en consenso sintético tiene una conformación relativamente nativa y conserva epítopos antigénicos nativos, puede no ser capaz de inducir amplias respuestas inmunitarias de anticuerpos de clado cruzado.

Respuestas inmunitarias celulares fuertes y amplias medidas por ELISpot. Los ratones BalB/C se inmunizaron con pEY2E1-B y pEK2P-B y se realizó análisis ELISpot para determinar la cantidad de células secretoras de IFN-γ específicas de antígeno en respuesta a cuatro combinaciones de péptidos de proteína de subtipo B consenso de VIH-1 (Fig. 5A). La magnitud de la respuesta medida por la cantidad de unidades formadoras de manchas (SFU) por millón de células varió de 27,5 a 520 en ratones vacunados con pEY2E1-B. En comparación, esplenocitos de ratones vacunados con pEK2P-B solamente mostraron el intervalo de manchas de 2 a 237,5 (p<0,05). La frecuencia aditiva de SFU/por millón de esplenocitos para las cuatro combinaciones en ratones inmunizados con pEY2E1-B fue de 1976,25 + 260, aunque la cantidad de SFU/por millón de células en ratones inmunizados con pEK2P-B fue de 519 + 45. Las células de ratones inmunizados con vector pVAX se usaron como control negativo, que muestra solamente 60 + 5 SFU/por millón de esplenocitos para combinaciones de péptidos de envuelta B consenso (p < 0,05). Se observaron resultados similares en tres estudios diferentes. Por lo tanto, la construcción pEY2E1-B es hasta cuatro veces más potente en dirigir respuestas inmunitarias mediadas por células. También se determinó si los linfocitos CD8+ eran responsables de la secreción de IFN-γ detectada en ratones BalB/C inmunizados con pEY2E1-

B. Como se muestra en la Fig. 5B, la cantidad de SFU/por millón de células se redujo hasta 127,5 + 11 después de la reducción CD8+, lo que indica que hubo aproximadamente un 90 % de disminución en las frecuencias de células productoras de IFN-γ observadas por ELISpot reducido en células T CD8+. La producción de IFN-γ inducida por pEY2E1-B está mediada principalmente por células T CD8+.

Además, para modelar las respuestas inmunitarias de células T humanas contra antígenos presentados por HLA-A2 e identificar esos antígenos, se realizó el mismo ensayo ELISpot mencionado anteriormente usando ratones transgénicos HLA-A2.1/H2-Dd. Como se muestra en la Fig. 5C, la frecuencia aditiva de SFU/por millón de esplenocitos para las cuatro combinaciones de ratones transgénicos inmunizados con pEY2E1-B fue de 2362 + 257, aunque la cantidad de SFU/por millón de células en ratones transgénicos inmunizados con pEK2P-B fue solamente de 493 + 57. Estos resultados indicaron que la construcción pEY2E1-B es hasta cuatro veces más potente en dirigir las respuestas inmunitarias mediadas por células en los ratones transgénicos. Los datos de ELISpot después de la reducción de CD8 sugirieron que la producción de IFN-γ inducida por pEY2E1-B está principalmente mediada por células CD8+ (Fig. 5D).

Además, se puso interés en detallar adicionalmente las respuestas inmunitarias celulares que se observaron en el ensayo ELISpot. Por consiguiente, se realizó un conjunto adicional de ensayo ELISpot contra bibliotecas de péptidos que abarcaban la proteína de envuelta de subtipo B consenso. Se usó un conjunto completo de péptidos de 15 monómeros solapados por 11 aminoácidos, que comprendían la proteína de envuelta consenso de subtipo B, para realiza este estudio de mapeo. El estudio ilustró que no había un epítopo dominante claro inducido por la envuelta sintética. Sin embargo, el análisis ELISpot de IFN-γ de esplenocitos derivados de los ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B reveló que había 18 combinaciones de las 29 combinaciones que mostraban más de 50 manchas,

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aunque hubo solamente seis combinaciones en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B (Fig. 5E). Estos resultados ilustraron que hay un aumento significativo en la amplitud y magnitud de respuestas inmunitarias celulares inducidas por el inmunógeno EY2E1-B.

Respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada fuertes inducidas por pEY2E1-B. Para determinar si el inmunógeno EY2E1-B podía inducir respuestas inmunitarias celulares amplias y de reactividad cruzada, se realizó ELISpot de IFN-γ tanto en ratones BalB/C como en ratones transgénicos HLA-A2 usando péptidos de envuelta de grupo M de VIH-1, subtipo C consenso, MN de VIH-1 (aislado de subtipo B), C.UY.01.TRA3011 y C.ZA.01.J54Ma de VIH-1 (dos aislados de subtipo C). Estos ensayos determinarán adicionalmente si los resultados observados en la Fig. 5A, C y E en solitario están relacionados con las dianas peptídicas o se deben realmente al aumento en la amplitud inmunitaria. Como se muestra en la Fig. 6A, la cantidad aditiva de SFU/por millón de esplenocitos contra cuatro combinaciones de péptidos de envuelta MN de VIH-1 en ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B fue de 1855 + 215,8, que era aproximadamente dos veces mayor que la de ratones BalB/C inmunizados con pEK2P-B (SFU/por millón de esplenocitos era de 700 + 168,2), lo que indica que pEY2E1-B tenía reactividad cruzada más fuerte que pEK2P-B dentro del subtipo B. Las cantidades de manchas de IFN-γ en respuesta a estimulación con cuatro combinaciones de péptidos de envuelta consenso de grupo M (Fig. 6B) y subtipo C (Fig. 6C) de VIH en ratones BalB/C inmunizados con pEY2E1-B fueron de 1150 + 191,3 y 715 + 116,1, respectivamente. En comparación con las cantidades de manchas contra péptidos del grupo M y subtipo C que fueron de 635 + 152,3 y 345 + 82,3 en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B, estos datos ilustran que las respuestas inmunitarias del clado cruzado provocadas por pEY2E1-B son aproximadamente un 45 % más fuertes que las inducidas por pEK2P-B en ratones BalB/C.

De forma importante, se observaron respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada mucho más fuertes inducidas por pEY2E1-B en ratones transgénicos (Fig. 6F-J). La cantidad aditiva de SFU/por millón de esplenocitos contra cuatro combinaciones de péptidos de envuelta MN de VIH-1 en ratones transgénicos vacunados con pEY2E1-B fue de 1087 + 153, que era aproximadamente tres veces mayor que la de ratones HLA-A2 inmunizados con pEK2P-B (SFU/por millón de esplenocitos fue de 316 + 63) (Fig. 6F), lo que indica que pEY2E1-B también podía provocar reactividad cruzada más fuerte que pEK2P-B dentro del subtipo B en ratones transgénicos. Las cantidades de manchas de IFN-γ en respuesta a estimulación con cuatro combinaciones de péptidos de envuelta consenso de grupo M (Fig. 6G) y subtipo C (Fig. 6H) de VIH en ratones transgénicos inmunizados con pEY2E1-B fueron de 2116

+ 216 y 893 + 154, respectivamente. En comparación con las cantidades de manchas contra péptidos del grupo M y el subtipo C que fueron de 473 + 50 y 266 + 55 en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B, estos datos indicaron que las respuestas inmunitarias de clado cruzado provocadas por pEY2E1-B son aproximadamente tres a cuatro veces más fuertes que las inducidas por pEK2P-B en ratones transgénicos. Además, se usaron dos conjuntos de péptidos de aislado de subtipo C que deben servir como control riguroso para evaluar la amplitud y reactividad cruzada conseguida por otro péptido, para determinar adicionalmente las respuestas inmunitarias de clado C cruzado. Aunque no hubo demasiadas diferencias en la reactividad cruzada contra estos dos conjuntos de aislados de subtipo C provocada por pEY2E1-B y pEK2P-B en ratones BalB/C (Fig. 6D y E), la reactividad de clado cruzado contra estos dos conjuntos de aislados de subtipo C inducida por pEY2E1-B es aproximadamente tres veces más fuerte que la inducida por pEK2P-B (Fig. 6I y J). Las cantidades de manchas contra los péptidos C.ZA.01.J54Ma y C.UY.01.TRA3011 fueron de 1080 + 206 y 890 + 150 en ratones transgénicos vacunados con pEY2E1-B, mientras que las cantidades fueron solamente de 305 + 38 y 310 + 62 en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B.

Finalmente, se determinó si también había un aumento en la amplitud de las respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada contra dianas específicas de subtipo inducidas por el inmunógeno EY2E1-B detallando las respuestas inmunitarias celulares contra MN de VIH-1 observadas anteriormente tanto en ratones BalB/C como en ratones transgénicos HLA-A2. Se realizó un ensayo de mapeo de epítopos contra la biblioteca de péptidos que abarcan la proteína de envuelta MN de subtipo B. Los resultados sugirieron que no había un epítopo dominante claro inducido por la envuelta sintética en ambas cepas de ratones. Sin embargo, el análisis ELISpot de IFN-γ de esplenocitos derivados de los ratones BalB/C vacunados con pEY2E1-B reveló que había 14 combinaciones de las 29 combinaciones que mostraban más de 50 manchas, mientras que había solamente 9 combinaciones en ratones BalB/C vacunados con pEK2P-B (Fig. 7A). Asimismo, en ratones transgénicos, hubo 18 combinaciones de 29 combinaciones que mostraban más de 50 manchas en ratones transgénicos inmunizados con pEY2E1-B, mientras que había solamente 6 combinaciones en ratones transgénicos vacunados con pEK2P-B (Fig. 7B). Estos datos indicaron que hay un aumento significativo en la amplitud y magnitud de las respuestas inmunitarias celulares de reactividad cruzada inducidas por el inmunógeno EY2E1-B tanto en ratones BalB/C como en ratones transgénicos HLA-A2.

Análisis

Los esfuerzos mundiales por vacunas de ADN de VIH-1 se han guiado por el principio de que respuestas de células T específicas de VIH pueden proporcionar alguna contribución a la protección contra la infección o control de la replicación posinfección. Las vacunas de ADN pueden impactar sobre la replicación vírica, aunque en general no son tan potentes en la inducción inmunitaria como los vectores víricos vivos atenuados (Almond, N., et al.. 1995. Protection by attenuated simian immunodeficiency virus in macaques against challenge with virus-infected cells. Lancet 345:1342-1344; Berman, P. W., et al. 1996. Protection of MN-rgp120-immunized chimpanzees from

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acortaron las regiones V1 y V2 cuando se generó la secuencia consenso de subtipo B.

La fase prematura de infección de VIH-1 está dominada por virus no inductores de sincitios (NSI), que se replican lentamente y usan CCR5 como su correceptor principal. Los virus inductores de sincitios (SI), que surgen en aproximadamente el 50 % de los individuos infectados que preceden a una disminución acelerada de células CD4 y un curso clínico progresivo de infección, usan CXCR4 como correceptor principal. Se ha demostrado un uso diferencial de correceptores de las variantes de VIH para todos los subtipos. Los virus del subtipo C parecen ser diferentes de la mayoría de otros subtipos porque se ha presentado frecuentemente una subrepresentación de CXCR4 usando variantes de VIH en el subtipo C. Por lo tanto, la utilización de CCR5 debe ser una consideración crucial para un diseño de vacuna. Los informes previos mostraron que la región V3 de gp120 desempeña un papel importante en la utilización de correceptor. Seis restos en el bucle V3 se han identificado como críticos para la interacción con CCR5: arginina307, lisina314, isoleucina316, arginina322, fenilalanina324 y alanina337. Sin embargo, basándose en las secuencias de los transmisores prematuros de subtipo C, el resto en la posición 322 debe ser glutamina en lugar de arginina. En resumen, basándose en los estudios previos que muestran restos importantes para la utilización de CCR5 y las secuencias de transmisores prematuros, se diseñó el inmunógeno de envuelta consenso de subtipo B que podría dirigir respuestas inmunitarias que en teoría pueden abordar la utilización del correceptor CCR5.

Para maximizar la reactividad cruzada potencial, se ha creado una secuencia de envuelta consenso de grupo M de VIH-1. Sin embargo, es posible que las vacunas consenso de envuelta específicas de subtipo puedan representar un compromiso para la similitud de secuencia global del antígeno de la vacuna respecto a los virus en circulación al menos a nivel de respuestas inmunitarias celulares. Los estudios han demostrado que había altas tasas de selección identificadas en regiones diferentes de proteínas de envuelta de subtipo B y C. Esto puede estar causado por una diferente presión inmunitaria en diferentes regiones de la proteína de envuelta en el subtipo B y C. Por lo tanto, puede haber ventajas en el uso de una vacuna de envuelta específica de subtipo, ya que las respuestas inmunitarias contra la vacuna y el virus en circulación compartirían dominios antigénicos. Se necesitan más experimentos que comparen las vacunas de envuelta de grupo M y específicas de subtipo para aclarar adicionalmente esta cuestión.

Otra cuestión importante acerca del uso de una secuencia consenso es que su secuencia puede asociar polimorfismos en combinaciones no encontradas en cualquier virus natural, provocando por tanto potencialmente conformaciones proteicas inapropiadas. Los estudios previos han indicado que un inmunógeno consenso de grupo M podría plegarse en conformación nativa, conservar los epítopos antigénicos de envuelta y provocar una respuesta débil de anticuerpos neutralizantes. Basándose en los hechos de que la proteína sintética podría unirse a los anticuerpos 2G12, ID6 y F105, creemos que el pEY2E1-B puede tener conformaciones estructurales algo nativas. De forma importante, nuestros datos también demostraron que el inmunógeno EY2E1-B podría inducir un anticuerpo específico de envuelta de subtipo B de mayor título, lo que indica que este inmunógeno sintético puede conservar también más epítopos de Clase II. Serán importantes más estudios en esta área.

Con la generación de nuevas estrategias de vacuna contra VIH-1 también existe una demanda creciente para predecir la eficacia de esas vacunas en seres humanos usando modelos preclínicos. En nuestro estudio, se usaron ratones transgénicos HLA-A2 para estudiar las respuestas inmunitarias celulares provocadas por el inmunógeno sintético. Los estudios han demostrado que esta cepa transgénica es un modelo preclínico importante para el diseño y ensayo de vacunas para enfermedades infecciosas que implican estimulación óptima de células T citolíticas CD8+ humanas. En este modelo los resultados indicaron que EY2E1-B podía provocar respuestas inmunitarias celulares más amplias y más fuertes en comparación con EK2P-B, lo que sugiere que esta nueva vacuna puede tener mayor potencial para inducir respuestas celulares restringidas a EK2P-B. Se están planeando estudios adicionales de este inmunógeno en primates no humanos.

Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que EY2E1-B podría servir como inmunógeno que aumenta tanto la magnitud como la amplitud de las respuestas CTL como casete de vacuna de ADN. En términos más generales esta construcción puede ser útil en otras plataformas para la inducción de respuestas inmunitarias celulares más fuertes y más amplias contra cepas de VIH en enfoques de vector no de ADN.

Ejemplo comparativo 2 desarrollo de una novedosa vacuna de ADN de envuelta de clado C de VIH-1 modificada por ingeniería que potencia la diversidad y amplitud de la respuesta inmunitaria celular provocada

Las respuestas CTL específicas de VIH-1 fuertes tienen un papel importante en el tratamiento de la carga vírica durante infección aguda y asintomática. Sin embargo, los recientes estudios sobre inmunógenos consenso no han sido capaces de demostrar, de forma notable, respuestas inmunitarias celulares mejoradas. Aquí se ensaya un novedoso inmunógeno de envuelta basado en consenso de clado C modificado por ingeniería para una respuesta inmunitaria celular mejorada. La novedosa vacuna (pEY3E1-C) se creó a partir de la secuencia de envuelta consenso de Clado C de VIH-1. Se realizaron varias modificaciones incluyendo el acortamiento de las regiones V1 y V2 altamente variables basándose en la secuencia de transmisión prematura, la retención del bucle V3 para la utilización de CCR5 la retirada de la región de cola citoplasmática desde el extremo C-terminal para evitar el reciclado de la envuelta y la retención del sitio de escisión y TMD para el apropiado plegamiento. Además, se añadió

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Se determinó el nivel de linfocitos positivos a Tetrámero E7 en los bazos. La Figura 29 muestra los datos como el porcentaje de linfocitos positivos a Tetrámero E7. La vacuna de ADN p1667 induce la activación de células T CD8+ específicas de E7 que son CD62Llo dentro de los bazos.

Se determinó el nivel de linfocitos positivos a Tetrámero E7 en los tumores. La Figura 30 muestra los datos como el porcentaje de linfocitos positivos a Tetrámero E7. La vacuna de ADN p1667 induce la activación de células T CD8+ específicas de E7 que son CD62Llo dentro de los tumores.

Se emprendió un estudio de protección por vacuna de ADN E6/E7 en ratones transgénicos. Se hizo una comparación entre vírgenes, pVAX, p1667, p1667 + IL-15 y E7/HisB. Los datos se muestran en la Figura 31. p1667 y p1667 + IL-15 protegieron completamente.

Los datos presentados en este documento apoyan las siguientes conclusiones. La construcción p1667 induce una fuerte respuesta inmunitaria celular capaz de inducir linfocitos CD8+ específicos de E7 que median las elevadas respuestas de IFN-γ. Se han identificado epítopos de HPV-16 tanto dominantes como subdominantes novedosos contra los que se generan CTL específicos de antígeno después de la administración de la construcción de ADN. La construcción p1667 es capaz de prevenir el crecimiento del tumor y causar la regresión de tumores tanto en ratones C57/BL6 como transgénicos. La vacuna de ADN p1667 muestra gran potencial para una novedosa estrategia terapéutica para abordar cáncer asociado a HPV microscópico.

Ejemplo comparativo 4

Pueden administrarse secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias consenso de Env de VIH como vacunas de ADN en combinación con secuencias de ácido nucleico que codifican otras diversas proteínas de VIH tales como Gag, Pol, Gag/Pol, Nef, Vif, y Vpr usando, por ejemplo, tecnología de electroporación para suministro intramuscular o intradérmico. Construcciones de vacuna contra VIH multivalentes/polivalentes pueden proporcionar respuestas inmunitarias potenciadas y ser particularmente útiles. En algunas realizaciones, se proporcionan adicionalmente secuencias codificantes de IL-12. La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.º 20070106062, que se incorpora en este documento por referencia, describe una vacuna de ADN de Vif de VIH. La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos nº 20040106100, que se incorpora en este documento por referencia, describe vacunas contra VIH que comprenden proteínas accesorias de VIH, así como las secuencias de dichas proteínas que pueden usarse para preparar construcciones adicionales de vacuna. Las patentes de Estados Unidos 6.468.982, 5.817.637, y 5.593.972, que se incorporan en este documento como referencia describen vacunas de ADN que incluyen construcciones de gag de VIH, pol de VIH y gag/pol de VIH. La electroporación se describe en la patente de Estados Unidos n. 7.245.963, que se incorpora por referencia. La solicitud PCT PCT/US97/19502, que se incorpora en este documento por referencia, describe construcciones de IL-12. La publicación de solicitud de Estados Unidos n.º 20070041941 que se incorpora en este documento por referencia, describe construcciones que codifican IL-15.

Ejemplo comparativo 5

Se inmunizaron IM por vía intramuscular dos grupos de macacos tres veces con construcciones plasmídicas optimizadas de gag y env con o sin plásmido de IL-12. Se usó la misma estrategia de inmunización para dos grupos adicionales pero los plásmidos se suministraron con o sin electroporación in vivo.

Se determinaron las respuestas celulares por ELISpot de IFN-γ después de cada inmunización y cinco meses después para las respuestas de memoria. Durante todo el estudio, se evaluaron las respuestas humorales por ELISA de p24 recombinante y gp160. Se determinó la capacidad proliferativa de células T específicas de antígeno por tinción con CFSE. Se hizo tinción de citoquinas intracelulares para caracterizar adicionalmente las características funcionales de la respuesta de células T inducida.

El plásmido de IL-12 potenció las respuestas celulares contra nuestras construcciones optimizadas. Sin embargo, el uso de electroporación para potenciar el suministro de plásmidos fue capaz de mejorar tanto la respuesta celular como la humoral en comparación con inmunización IM con el plásmido de IL-12. La combinación de plásmido de IL12 y electroporación provocó las mejores respuestas inmunitarias, tanto primarias como de memoria, medidas por una diversidad de parámetros.

Se compararon las construcciones de ADN optimizadas que codifican gag y env de VIH en macacos rhesus en presencia o ausencia de plásmido de IL-12 como adyuvante de ADN. IL-12 podía aumentar sustancialmente las respuestas de células T 5 veces en un formato de ELISpot cuantitativo que provocaba respuestas de células T de memoria sustancialmente mejores. Sin embargo, el ADN suministrado EP fue más eficaz en generar respuestas de células T y de memoria que eran 2 veces mayores en comparación con la vacuna de ADN con adyuvante IL-12 IM. Las mejores respuestas se observaron en el brazo de combinación de EP + adyuvante de IL-12. Las respuestas de memoria en este brazo fueron 10 veces mayores que el ADN IM en solitario y casi 2 veces mayores que EP solo. También se observó expansión inmunitaria 4 veces mejor por CFSE en el bazo EP + IL-12 en comparación con EP solo. La presencia de células T polifuncionales también sugirió que el bazo de ADN + citoquina + EP es el más

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eficaz.

Materiales y métodos

Animales:

Se alojaron macacos rhesus (Macaca mulatta) en BIOQUAL, Inc. (Rockville, MD), de acuerdo con las normas de la American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Se permitió que los animales se aclimataran durante al menos 30 días en cuarentena antes de cualquier experimentación.

Inmunización:

Se inmunizaron cinco macacos rhesus en las semanas, 0, 4 y 11 con 1,0 mg de pGag4Y y pEY2E1-B. El ADN en cada punto temporal de inmunización se suministró en dos sitios de inyección, uno en cada músculo cuádriceps. Tres de los macacos se sometieron a electroporación después de inyección IM. Otro grupo de cinco macacos se inmunizó en las semanas 0, 4 y 8 con 1,0 mg de pGag4Y, pEY2E1-B, y WLV104. De los cinco animales, dos animales recibieron la inmunización por inyección IM y tres animales se sometieron a electroporación después de inyección IM. Todos los procedimientos de electroporación se realizaron usando el dispositivo de corriente constante Cellectra™ (VGX Immune Therapeutics Division of VGX Pharmaceuticals, The Woodlands, TX). Las condiciones de electroporación fueron 0,5 Amperios, 3 pulsos, 52 ms de longitud de pulso con 1 s entre pulsos. Este dispositivo controlado por software se diseñó para medir la resistencia tisular inmediatamente antes del suministro del plásmido y la generación de pulsos de onda cuadrada de corriente constante, eliminando el riesgo de suministro fuera del tejido muscular y la potencial pérdida de plásmido.

Recogida de sangre:

Los animales se exanguinaron cada dos semanas mientras duró el estudio. Se recogieron 10 ml de sangre en tubos EDTA. Se aislaron las PBMC por centrifugación convencional en Ficoll-hypaque y después se resuspendieron en medio de cultivo completo (RPMI 1640 con 2 mM/L L-glutamina suplementada con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, 100 UI/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, y 55 µM/l de β-mercaptoetanol.) Las RBC se lisaron con tampón de lisis ACK (Cambrex Bio Science, East Rutherford, NJ).

Plásmidos y productos plasmídicos:

Gag4Y contiene un casete de expresión que codifica una secuencia consenso de la proteína gag de VIH de clados A, B, C, y D con varias modificaciones que incluyen: la adición de una secuencia kozak, una secuencia líder de IgE sustituida, optimización de codones y ARN para la expresión en células de mamífero (la SEQ ID NO: 11 describe la secuencia consenso de Gag de VIH.). El gen Gag4Y se subclonó en el vector de expresión, pVax, para estudio adicional. pEY-2E1-B contiene un casete de expresión que codifica una secuencia consenso de la envuelta de VIH de clado B. (La SEQ ID NO: 3 describe la secuencia consenso de Env de VIH.) WLV104M es un plásmido que codifica un gen de IL-12 de rhesus. Los plásmidos se produjeron en Aldevron (Fargo, ND), y se reformularon en VGX Immune Therapeutics (The Woodlands, TX), en agua estéril para inyección con sal sódica de poli-L-glutamato 0,1% de bajo peso molecular.

CFSE de PBMC crioconservadas

Las PBMC crioconservadas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 ºC y se lavaron con medio completo. Las células se incubaron durante una noche en una incubadora a 37 ºC y se obtuvieron los recuentos celulares el siguiente día. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en un 1 ml de CFDA SE (Molecular Probes, Eugene, OR) en PBS (dilución 1:2000). Las células se incubaron a 37 ºC durante 10 min. Las células se lavaron con medio completo y se resuspendieron hasta una concentración de 1x106 células/100 ul y se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocillos con 100 ul de 2 µg/ml de p24 o gp120 de VIH-1 recombinante (ImmunoDiagnostics, Woburn, MA) más combinaciones de péptidos. Se usaron 5 µg/ml de Concavalina A (positivo) y medio completo (negativo) como controles. Los cultivos se incubaron durante 5 días. Las células primero se tiñeron con colorante violeta Vivid, un marcador celular de vida/muerte, durante 15 min en hielo. Las células se lavaron una vez con PBS. Las células después se tiñeron usando anticuerpo anti-CD3 humano-PE (clone SP34-2) (BD Pharmingen) y anticuerpo anti-CD4 humano-PerCP (clone L200), anticuerpo anti-CD8 humano-APC (SKI) durante 1 hora a 4 °C. Las células después se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 1 %. Los datos se recogieron usando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Los datos de citometría de flujo se analizaron usando el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR), sincronizado sobre linfocitos CD3+. Se recogieron de treinta a cincuenta mil linfocitos CD3+ por muestra.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA):

Se recubrieron placas de 96 pocillos durante una noche con 100 ng/pocillo de p24 o gp120 de VIH-1 IIIB recombinante (ImmunoDiagnostics) para determinar las respuestas contra gag y env de VIH respectivamente. Las

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placas recubiertas con 100 ng/pocillo de albúmina sérica bovina sirvieron como control negativo. Las placas se bloquearon con BSA al 3 %-PBST durante 1 hora a 37 ºC. Las placas después se incubaron con diluciones de suero en serie de factor cuatro durante 1 hora a 37 ºC. Después se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de mono conjugado con peroxidasa de rábano rusticano a una dilución 1:10.000 (MP Biomedicals, Aurora, OH) a las placas y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Se usó tetrametilbenzidina (R&D systems, Minneapolis, MN) para revelar las placas y las reacciones se detuvieron con H2SO4 2N. Después se midieron las densidades ópticas (DO).

Se definieron los títulos de punto final de IgG como el recíproco de la dilución de suero que provocaba valores de DO que eran mayores de dos veces el valor promedio de DO de los pocillos de BSA.

Ensayo de inmunotransferencia ligado a enzimas (ELISpot)

Se determinaron las respuestas específicas de antígeno restando la cantidad de manchas en los pocillos de control negativo de los pocillos que contenían péptidos. Los resultados se muestran como el valor medio (manchas por millón de esplenocitos) obtenidos para pocillos triplicados.

1. Tinción de citoquinas intracelulares

Reactivos de anticuerpo

Se obtuvieron anticuerpos conjugados directamente de los siguientes: BD Biosciences (San Jose, CA): IL-2 (PE), CD3 (Pacific Blue), IFN-γ (PE-Cy7), y TNF-α (Alexa Fluor 700), CD8 (APC) y CD4 (PerCP).

Estimulación celular y tinción

Se re-suspendieron PBMC hasta 1 x 106 células/100 ul en RPMI completo y se sembraron en placas de 96 pocillos con péptidos estimulantes, 100 ul de diluciones 1:200. Se incluyó un control no estimulado y positivo (enterotoxina B de Staphylococcus, 1 µg/ml; Sigma-Aldrich) en cada ensayo. Las células se incubaron durante 5 horas a 37 ºC. Después de la incubación, las células se lavaron (PBS) y se tiñeron con anticuerpos superficiales. Las células se lavaron y se fijaron usando el kit Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones. Después de la fijación, las células se lavaron dos veces en el tampón perm y se tiñeron con anticuerpos contra marcadores intracelulares. Después de la tinción, las células se lavaron, se fijaron (PBS que contenía paraformaldehído al 1 %) y se almacenaron a 4 ºC hasta el análisis.

Citometría de flujo

Las células se analizaron en un citómetro de flujo LSR II modificado (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Se recogieron cincuenta mil eventos CD3+ por muestra. El análisis de datos se realizó usando FlowJo versión 8.4.1 (TreeStar, San Carlos, CA). La sincronización inicial usó un diagrama de área de dispersión directa (FSC-A) frente a la altura (FSC-H) para eliminar los dobletes. Los eventos se sometieron a una sincronización de linfocitos por un diagrama de FSC-A frente a SSC. Después de esto, los eventos se sincronizaron secuencialmente sobre eventos CD3+, CD8+ y CD4-frente a IFN-γ para justificar la regulación negativa. Después de la identificación de células T CD8+, se hizo una sincronización para cada función respectiva usando combinaciones que proporcionaban separación óptima. Después de crearse las sincronizaciones para cada función, se usó una plataforma de sincronización Boolean para crear la serie completa de posibles combinaciones, equiparando a 8 patrones de respuesta cuando se ensayaban 3 funciones. Los datos se presentan después de la corrección de fondo. Los umbrales para respuestas positivas fueron 10 eventos o 0,05 %.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron usando el software Prism Graphpad, y se expresan como medias ± ETM.

Resultados

Análisis ELISpot

La inducción de respuesta inmunitaria celular se evaluó después de cada inmunización por ELISpot de IFNγ. Después de una única inmunización (Figura 1), el grupo que recibió ADN plasmídico por inyección IM en solitario presentaba respuestas celulares débiles (74 ± 29 SFU/106 PBMC). La co-inmunización con plásmido de IL-12 rhesus provocó una respuesta mayor (136 ± 51,4 SFU/106 PBMC). El grupo sometido a electroporación (EP) obtuvo una respuesta promedio que era seis veces mayor que la del grupo IM (482 ± 181 SFU/106 PBMC). La combinación de co-inmunización de IL-12 con EP duplicó adicionalmente la cantidad de células productoras de IFNγ (1030 ± 494 SFU/106 PBMC).

Después de dos inmunizaciones (Figura 1), los grupos IM e IM + IL-12 obtuvieron un aumento moderado en los recuentos ELISpot (104 ± 67,9 SFU/106 PBMC y 223 ± 76,6 SFU/106 PBMC, respectivamente). El grupo EP obtuvo

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Claims

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