NL9020389A

NL9020389A - Systeem voor het in de gastheer selecteren van recombinant-pokkenvirussen.

Info

Publication number: NL9020389A
Application number: NL9020389A
Authority: NL
Original assignee: Health Research Inc
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1990-03-02
Publication date: 1991-12-02
Also published as: AT400955B; AU625584B2; GB2245272A; IE900814L; LU88000A1; US5453364A; CA2011654A1; BE1004212A5; JP3044062B2; IT9019623A0; JPH04503904A; GB9117996D0; IT1239987B; CA2011654C; DE4090351T1; WO1990010693A1; IE62441B1; DK157091A; ATA902490A; AU5332090A

Description

Systeem voor het in de gastheer selecteren van recombinant-pokkenvirussen.

Deze uitvinding gebeurde met steun van het Amerikaanse Government en onder contract DAM17-85-C-5232 van het Amerikaanse Ministerie van Defensie. Het Government heeft zekere rechten op deze uitvinding. Deze uitvinding betreft recombinant-virussen, werkwijzen voor het tot expresie brengen van genprodukten in een gastheer met behulp van zulke gemodificeerde recombinant-virussen en vaccins die zulke gemodificeerde recombinant-virussen bevatten.

Deze uitvinding betreft ook een gemodificeerd pokkenvirus, in het bijzonder een gemodificeerd koepokvi-rus, en werkwijzen voor het maken en selecteren daarvan. Meer het in bijzonder betreft de uitvinding een selectie-systeem voor het klonen en tot expresie brengen van een open afleeskader in recombinant-pokkenvirus, in het bijzonder in recombinant-koepokvirus.

In deze beschrijving wordt met arabische cijfers tussen haakjes naar meerdere publikaties verwezen. De volledige citatie van deze literatuur vindt men aan het einde van de beschrijving, direct voorafgaande aan de conclusies. Deze verwijzingen beschrijven de stand der techniek waarop deze uitvinding voortbouwt.

Achtergrond van de uitvinding

Koepok-virussen en korter geleden ook andere pokkenvirussen zijn gebruikt voor het inbouwen en tot expressie brengen van vreemde genen. De basistechniek voor het inbouwen van vreemde genen in levend en infectieus koepok-virus bestaat uit het in een donorplasmide recombi-neren van vreemde genen met DNA-reeksen van pokken die een vreemd genetisch element in een donorplasmide en in het reddende pokkenvirus flankeren (32).

Om precies te zijn worden recombinant-pokkenvirus-sen in twee in de techniek bekende stappen opgebouwd, analoog aan de werkwijze voor het in het Amerikaanse 4.603.112 beschreven scheppen van synthetische recombinanten in koepokvirus.

Eerst wordt de DNA-reeks van het in het virus op te nemen gen (in het bijzonder een open afleeskader van niet-pokken-herkomst) in een plasmide van E.coli geplaatst, waarvan het DNA homoloog is aan een niet-essentieel deel van het DNA van het pokkenvirus. Afzonderlijk daarvan wordt het in te bouwen DNA-gen aan een promotor geligeerd. De promotor-gen-koppeling wordt in het plasmide geplaatst zodat die promotor-gen-koppeling aan beide uiteinden geflankeerd wordt door DNA dat homoloog is aan een DNA-reeks die een niet-essentieel deel van het pokken DNA flankeert. Het ontstane plasmide wordt dan vermeerderd door het opkweken van E.colie-bacteriën (4) waarin ze zitten en isoleren daaruit (5,22).

Daarna worden gekweekte cellen, bijv. kuiken-embryo-fibroblasten getransfecteerd met de in te voegen DNA-reeks, samen met het pokkenvirus. Recombinatie van het homologe pokken-DNA in het plasmide met het virusgenoom geeft, door de aanwezigheid van vreemde DNA-reeksen in een niet-essentieel gebied van het genoom, een gemodificeerd pokkenvirus. De term "vreemd DNA" geeft exogeen DNA aan, in het bijzonder DNA van niet-pokken-herkomst, dat voor produkten codeert die gewoonlijk niet door dat genoom gemaakt worden.

Genetische recombinatie is in het algemeen de uitwisseling van homologe stukken DNA tussen twee DNA-strengen. In bepaalde virussen kan RNA het DNA vervangen. Homoloog nucleïnezuur zijn stukken nucleïnezuur (DNA of RNA) met de zelfde reeksen nucleotiden.

Genetische recombinatie kan van nature optreden bij de vermeerdering van nieuw virusgenoom in de geïnfecteerde gastheercel. Genetische recombinatie van virusgenen kan dus optreden tijdens de vermeerderingscyclus die in een gastheercel optreedt welke met twee of meer verschillende virussen of andere genetische constructies geïnfecteerd is. Een stuk DNA van een eerste genoom wordt verwisselbaar gebruikt bij het opbouwen van het genoom van een tweede mede-infecterend virus waarvan het DNA homoloog is met dat van het eerste virusgenoom.

Maar recombinatie kan ook tussen stukken DNA van verschillende genomen optreden die niet volmaakt homoloog zijn. Als één zo'n deel uit een eerste genoom homoloog is met een deel van een ander genoom, behalve dat er in het eerste deel bijvoorbeeld een genetisch merk of een voor een antigene determinant coderend gen in een deel van .het homologe DNA zit, kan recombinatie toch nog optreden, en de produkten van die combinatie zijn dan te herkennen aan de aanwezigheid van het genetische merk of het gen in het recombinantgenoom.

Voor succesvolle expressie van het ingevoegde DNA door het gemodificeerde infectieuse virus moet aan twee voorwaarden voldaan zijn. Ten eerste moet het invoegsel in een niet-essentieel gebied van het virus zitten opdat het gemodificeerde virus levenskrachtig blijft. Een tweede voorwaarde voor de expressie van het ingevoegde DNA is de aanwezigheid van een promotor in de juiste plaats en oriëntatie ten opzichte van het ingevoegde DNA. De promotor moet zodanig geplaatst zijn dat die bovenstrooms van de tot expressie te brengen DNA-reeks zit.

Onverstoorde, succesvolle recombinatie treedt op met een frequentie van ongeveer 0,1 %.

Een basisstrategie voor het terugvinden van succesvol door recombinatie gemodificeerde virussen bestaat uit een in situ hybridiseren van recombinanten op replica-filters met een radioactief gemerkte probe die homoloog is aan de ingevoegde reeksen (26, 28). Een aantal modificaties is gezegd de efficiëntie van de recombinatie zelf te verhogen, of althans het identificeren van de recombinanten te vergemakkelijken. Onder die modificaties heeft men: het gebruik van enkelstrengig donor-DNA (38), het identificeren van recombinanten die unieke enzym-functies tot expressie brengen, zoals het opnemen van 125jooddeoxycytidine in DNA door expressie van thymidine-kinase in het virus Herpes simplex (28), chromogene substraten voor de (mede-)expressie van vreemde genen samen met het gen voor /3-galactosida-se (3, 29), selectie op expressie van thymidine-kinase (20, 28), reacties op basis van antilichamen voor het zichtbaar maken van recombinant-plaques (21), gebruik van voorwaardelijk lethale of door drugs bepaalde mutanten (9, 18), selectie van recombinanten met behulp van het gen voor neomycine-resistentie uit Tn5 en het antibioticum G418 (11), en selectiedruk met mycofenolzuur en het gpt-gen uit E.coli (2,8).

Nadelig bij deze bekende werkwijzen voor het identificeren of selecteren van recombinant-pokkenvirussen is dat er bij al die methoden een omslachtige meertrapsi-dentificatie der recombinanten, het invoeren van radioche-micaliën, chromogene substraten of voor de selectie nodige biochemicaliën zoals mycofenolzuur of broomdeoxyuridine nodig zijn, welke schadelijk (mutageen) voor het virusgenoom zelf kunnen zijn of het gebruik van serologische reagentia wat besmetting zou kunnen invoeren, en veelal de aanwezigheid van een exogeen gen in de uiteindelijke recombinant, naast het vreemde genetische element waar het om ging.

Men kan dus inzien dat het verschaffen van een werkwijze voor het maken en selecteren van pokkenvirusrecombinanten, in het bijzonder koepokkenvirus-recombinan-ten, en dan zonder de hierboven genoemde problemen een zeer wenselijke vooruitgang van de stand der techniek zal betekenen.

Eerder zijn werkwijzen ontwikkeld die het scheppen van recombinant-koepokvirussen en -vogelpokvirussen door het inbouwen van DNA van wat voor herkomst ook (bijv. viraal, procaryotisch, eucaryotisch of synthetisch) in een niet-essentieel gebied van koepok- of vogelpokken-genoom mogelijk maken, waaronder DNA-reeksen die voor de antigene determinanten van een pathogeen organisme coderen. Met deze werkwijze geschapen koepokkenvirussen zijn gebruikt voor het invoeren van specifieke immuniteit tegen een aantal zoogdier-pathogenen in zoogdieren, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.603.112. Met deze werkwijzen geschapen vogelpokken-virussen zijn gebruikt voor het in vogels en in andere soorten uitlokken van specifieke immuniteiten (41,42).

Niet-gemofificeerd koepokken-virus heeft een lange geschiedenis van betrekkelijk veilig en doeltreffend gebruik voor het inenten tegen pokken. Maar sinds pokken uitgeroeid zijn, door het op grote schaal verstrekken van niet gemodificeerde koepokken-virus is er een bescheiden maar reeël risico voor complicaties in de vorm van algemene, pokkeninfectie, vooral bij hen die aan eczeem of aan verzwakte immuniteit lijden. Een andere zeldzame maar mogelijke complicatie die van inenten met pokkenvirus het resultaat kan zijn is encephalitis na de vaccinatie. De meeste van die reacties traden op bij individuën met huidziekten als eczeem of met verzwakte immuunsystemen, en bij individuen in huishoudens waar anderen eczeem of verzwakte immunologische respons hadden. Koepokken zijn een levend virus en normaliter onschadelijk voor het gezonde individu. Maar meerdere weken na het inenten kunnen ze van het ene individu op het andere overgebracht worden. Als een individu met zwakkere dan normale immuunrespons geïnfecteerd wordt, hetzij door inenten hetzij door besmettelijke overdracht uit een recent ingeënt individu kunnen de consequenties ernstig zijn.

Geschikt gemodificeerde virus-mutanten, met exogene genen die in een gastheer tot expressie komen doordat de gastheer antilichamen tegen een pathogeen gaat maken, zijn nieuwe vaccins die de bezwaren van de gebruikelijke vaccins met gedode of verzwakte levende organismen ondervangen. De produktie van vaccins uit gedode organismen vereist bijvoorbeeld het kweken van grote hoeveelheden van die organismen, gevolgd door een behandeling die selectief hun infectiviteit vernietigt maar hun antigeniteit in stand laat. Aan de andere kant blijven vaccins die verzwakte levende organismen bevatten de mogelijk houden van een terugslag van het verzwakte organisme tot de pathogène toestand. Indien daarentegen een geschikt gemodificeerd recombinant-pokkenvirus als vaccin gebruikt wordt, voorkomt men de mogelijkheid van terugslag tot een pathogeen organisme, daar het pokkenvirus alleen het gen bevat dat voor de antigene determinant van het ziekte-veroorzakende organisme codeert en niet die genetische delen van het organisme die verantwoordelijk zijn voor de vermeerdering van het pathogeen.

Men zal dus inzien dat een werkwijze die de stand der techniek de voordelen laat van het inenten met levend virus maar de hierbvoen besproken nadelen wegneemt of vermindert een zeer wenselijke vooruitgang van de stand van de techniek zou betekenen. Dat is heden ten dage nog belangrijker met de opkomst van een ziekte bekend als verworven immuundifficiëntiesyndroom (AIDS). Slachtoffers van deze ziekte functioneren immunologisch slecht en zouden gemakkelijk beschadigd kunnen worden door een anders veilig preparaat van levend virus als ze direct of via contact met een recent met dat vaccin geïmmuniseerd persoon in contact zouden komen.

Oogmerken van de uitvinding

Het is dus een doel van deze uitvinding een vaccin te verschaffen voor het in een gastheer uitlokken van een immunologische respons, met de voordelen van een vaccin van levend virus, maar met geen of weinig van de nadelen van een levend virus of gedood virus zoals hierboven uiteengezet.

Een ander doel van deze uitvinding is gemodificeerde recombinant-virussen te verschaffen die men in zulke vaccins gebruikt.

Deze en andere oogmerken en voordelen van de uitvinding zullen duidelijk worden na het in overweging nemen van het volgende:

Definitie van de uitvinding

Een aspect van deze uitvinding betreft een gemodificeerd recombinant-virus waaruit de genen voor de gast-heerverscheidenheid weggelaten zijn, zodat het virus in een gastheer zich maar beperkt vermeerdert, waarbij dat gemodi-ceerde recombinant-virus DNA bevat dat in de gastheer voor een genprodukt codeert en dat tot expressie brengt met een beperkte vermeerdering van dat virus in de gastheer. Het virus volgens deze uitvinding is met voordeel een pokkenvirus, vooral een koepokkenvirus.

Een ander aspect van deze uitvinding betreft een werkwijze voor het in een gastheer tot expressie brengen van een genprodukt door die gastheer in te enten met een gemodificeerd recombinant-virus waaruit de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zijn zodat het virus zich in de gastheer maar beperkt vermeerdert. Het gemodificeerde recombinant-virus bevat DNA dat in de gastheer voor het genprodukt codeert en dat tot expressie brengt, zelfs bij een beperkte vermeerdering van dat virus in de gastheer. Het bij de werkwijze volgens deze uitvinding gebruikte virus is met voordeel een pokkenvirus, vooral een koepokkenvirus. Het in de gastheer tot expressie gebrachte genprodukt is met voordeel een antigeen. Meer in het bijzonder is de gastheer een gewervelde en lokt het antigeen een immunologische respons in die gewervelde uit.

Nog een ander aspect van deze uitvinding betreft een vaccin voor het in een gastheer uitlokken van een immunologische respons, welk vaccin bestaat uit een drager en een gemodificeerd recombinant-virus waaruit de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zijn, zodat dat virus zich in de gastheer maar beperkt vermeerdert. Het gemodificeerde recombinant-virus bevat DNA dat voor een genprodukt codeert en dat tot expresie brengt zelfs bij een beperkte vermeerdering van het virus in de gastheer. Het in de vaccins volgens de uitvinding gebruikte virus is met voordeel een pokkenvirus, in het bijzonder een koepokkenvi- rus.

Nog een ander aspect van deze uitvinding betreft een werkwijze voor het selecteren van een recombinant-pokkenvirus in een gastheer door donor-DNA met het gemodificeerde pokkenvirus te combineren tot een recombinant-pokkenvirus, en het recombinant-pokkenvirus te identificeren door zijn vermogen zich in de gastheer te vermeerderen. Nog een ander aspect betreft een werkwijze voor het klonen en tot expressie brengen van een open afleeskader in een recombinant-pokkenvirus in een gastheer door donor-DNA en een gemodificeerd pokkenvirus te combineren tot een recombinant-pokkenvirus, dat recombinant-pokkenvirus in de gastheer tot vermeerdering te brengen en het open afleeskader tot expressie te brengen. Volgens deze uitvinding is uit het gemodificeerde pokkenvirus een gen voor gastheer-verscheidenheid weggelaten zodat het gemodificeerde pokken-, virus zich in de gastheer niet vermeerdert en het donor-DNA heeft een open afleeskader van niet-pokken-herkomst en het gen voor gastheerverscheidenheid, waardoor het recombinantr-pokkenvirus zich in de gastheer kan vermeerderen.

Nog een ander aspect van deze uitvinding betreft· een donorplasmide voor het maken van het recombinant-pokkenvirus van het selectiesysteem. Het donorplasmide heeft een open afleeskader van niet-pokken-herkomst en een gen voor gastheerverscheidenheid waardoor het recombinant-pokkenvirus zich in de gastheer kan vermeerderen. Met voordeel heeft het donorplasmide ook bovenstrooms van het gen voor de gastheerverscheidenheid een promotor en benedenstrooms van die promotor een startcodon voor de vertaling, gevolgd door meerdere unieke restrictieplaatsen, afbreeksignalen voor het vertalen en voor het overschrijven.

Korte beschrijving van de tekeningen

Een beter begrip van deze uitvinding krijgt men aan de hand van deze tekeningen, waarvan fig. IA schematisch een werkwijze voor het opbouwen van de koepokvirus-recombinant vP293 laat zien, fig. IB een kaart is van het linkereinde van het reddende koepokvirus VTK 79 tot en met HindlII K, fig. 1C een kaart van het linkereinde van de koepokvirus-recombinant vP293 tot en met HindlII K is, fig. 2A schematisch een werkwijze voor het klonen van het gen voor de gastheerverscheidenheid KIL in plasmide pMP528L en zijn inbouwen in vP293 tot koepokvirus vP457 laat zien, fig. 2B een kaart van het linkereinde van vP293 tot en met HindlII K is, fig. 2C een kaart van het linkereinde van vP457 tot en met HindlII K is, fig. 3A schematisch een werkwijze voor het opbouwen van plasmiden pMP528HRH en pHESl-4 laat zien, fig. 3B de DNA-volgorde van de synthetische H6 promotor en van de benedenstroomse restrictieplaatsen in PMP528HRH laat zien, fig. 3C de DNA-volgorde (met restrictieplaatsen, stopcodons en vroeg beëindigingssignaal van de vertaling) laat zien die in plasmide pHESl het tussen haakjes staande deel van fig. 3B vervangt, fig. 3D de DNA-reeks (met restrictieplaatsen, stopcodons en vroeg beëindigingssignaal van de vertaling)· laat zien die in plasmide pHES2 het tussen haakjes staande deel van fig. 3B vervangt, fig. 3E de DNA-reeks (met restrictieplaatsen, stopcodons en vroeg beëindigingssignaal van de vertaling) laat zien die in plasmide pHES3 het tussen haakjes staande deel van fig. 3B vervangt, fig. 3F de DNA-reeks (met restrictieplaatsen, stopcodons en vroeg beëindigingssignaal van de vertaling) laat zien die in plasmide pHES4 het tussen haakjes staande deel van fig. 3B vervangt, fig. 4A schematisch een werkwijze voor het opbouwen van plasmiden pHES31-34 laat zien, fig. 4B de DNA-reeksen van de synthetische oligo-nucleotiden HRL15-22 laat zien, fig. 5 de DNA-volgorde in de in plasmiden pHES31- 34 aanwezige koepokpromotor u laat zien. Bovendien laat fig. 5 tussen vierkante haken de in pHES31-33 aanwezige restrictieplaatsen, stopcodons en vroege beëindigingssigna-len van de vertaling zien en in pHES31-33 de aanwezige startcodons, fig. 6A laat schematisch een werkwijze voor het opbouwen van plasmiden pHES61-64 zien, fig. 6B de DNA-volgorden van de synthetische oligonucleotiden HRL33-40, fig. 7 laat de DNA-volgorde van de in plasmiden pHES61-64 aanwezige synthetische ATI-promotor zien. Bovendien laat fig. 7 tussen vierkante haken de restrictieplaat-se, stopcodons en vroege beginsignalen in pHES61-64 zien en de startcodons in pHES61-63, fig. 8 toont de DNA-volgorde (met restrictieplaatsen) van 15.537 bp nabij het linker uiteinde van de Kopen-hagen-stam van koepokvirus, fig. 9 toont schematisch een werkwijze voor het opbouwen van recombinanten vP548 en vP661, fig. 10 is een kaart van het linker einde van het genoom van het koepokvirus, fig. 11 laat schematisch een werkwijze zien voor het testen van mogelijke koepok-genen voor de gastheerspe-cificiteit in het systeem vP293, fig. 12 laat schematisch een werkwijze zien voor het opbouwen van recombinanten vP665, vP683, vP706 en VP716, fig. 13 laat schematisch een werkwijze zien voor het opbouwen van plasmiden pCP3 en pCP5 en voor het testen van een mogelijk koepokkengen voor de gastheerspecificiteit in het koepok-systeem, fig. 14 laat schematisch een werkwijze voor het opbouwen van recombinanten vP664 en vP668 zien, fig. 15 laat schematisch een werkwijze voor het opbouwen van een serie van pMPCTKlA afgeleide plasmiden zien, fig. 16 laat de DNA-volgorden van de synthetische oligonucleotiden MPSYN238, MPSYN239, MPSYN250-255 en MPSYN271-274 zien, fig. 17 laat het in plasmiden pMPCS-1 en pMPCS-4 aanwezige synthetische DNA zien, met restrictieplaatsen, stopcodons en vroege beëindigingssignalen voor het vertalen. Bovendien laat fig. 17 het in pC0PCS-3H en pC0PCS-5H t/m pCOPCS—10H aanwezige synthetische promotorgebied H6 zien. Bovendien toont fig. 17 tussen vierkante haken de in pC0PCS-3H en pC0PCS-5H t/m pCOPCS-lOH aanwezige restrictieplaatsen, stopcodons en vroege beëindigingssignalen van de vertaling en de startcodons van pC0PCS-6H t/m pCOPCS-lOH, fig. 18 laat schematisch een werkwijze voor het opbouwen van plasmiden pMPLENDA en pMPRENDA zien, fig. 19 laat de DNA-reeks van 13.978 bp vanaf het HindlII C van de Kopenhagen-variant van het koepokkenvirus zien, inclusief de coderende reeksen die links van de in fig. 8 getekende reeks liggen, fig. 20 toont de complete DNA-reeks voor HindlII F direct rechts van HindlII K van fig. 8, en fig. 21 toont de DNA-reeks die in HindlII B nabij het rechter uiteinde van het koepokvirus-genoom ligt.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

Deze uitvinding is gericht op gemodificeerde recombinant-virussen waaruit de genen voor gastheerver-scheidenheid weggelaten zijn zodat het virus zich in de gastheer maar beperkt vermeerderen kan en die DNA bevatten dat in de gastheer met beperkte vermeerdering van een virus in die gastheer voor een genprodukt codeert. De uitvinding is ook gericht op een selectiesysteem voor koepok-recombi-nanten en op het klonen en tot expressie brengen van een open afleeskader in pokkenvirus, in het bijzonder in koepokvirus met behulp van een voorwaardelijk lethale mutant van het pokkenvirus wat de gastheerverscheidenheid betreft.

Mutanten in gastheerverscheidenheid van de virussen voor konijnenpokken (24,13) en koepokken (6,7,12,17,23 en 36) zijn bekend.

Geloofd wordt dat het de mutanten in gastheerspe- cificiteit van het konijnenpokkenvirus ontbreekt aan één of andere regelfunctie van de virusvermenigvuldiging (10) . Daarna heeft genoomanalyse van deze mutanten in gastheer-verscheidenheid uitgebreide weglatingen bij de uiteinden van het DNA (tot 30 kb toe) laten zien (19, 25).

Mutagenese van de Kopenhagen-stam- van koepokvirus met salpeterigzuur maakte het Drillien c.s. mogelijk (6) uit de meeste menselijke cellen een in vermeerdering gebrekkige mutant in gastheerverscheidenheid te isoleren. Genoomanalyse van die mutant liet een uitgebreide weglating van ongeveer 18 kb nabij het linker uiteinde zien (6) . Uitvoerige analyse met overbrengen van merker wees voor wat betreft de genetische functie waaraan men de gastheerverscheidenheid kon toeschrijven op een EcoRi-fragment van 5,2 kb (14) en tenslotte op een open afleeskader van 855 bp dat de HindlII M/K-fragmenten overlapte (15).

In stam WR van het koepokvirus ligt het gen voor de gastheerverscheidenheid (27, 30) tussen 24 en 25 kb vanaf het linker uiteinde van het genoom. Dit gen voor gastheerverscheidenheid, naar links toe afgeschreven vanaf. HindlII K tot HindlII M, wordt hier aangeduid als het K1L-gen, zulks volgens de door Rosel c.s. (33) aanbevolen nomenclatuur.

Een mutant van stam WR waaruit het gen voor de gastheerverscheidenheid weggelaten is werd gegenereerd door inbouwen van het gen voor resistentie tegen neomycine uit transposon Tn5 en selectie met antibioticum G418. Deze weglatings/recombineer-variant vP293 mist, beginnende bij 3,8 kb vanaf het linker uiteinde van het genoom, ongeveer 21,7 kb aan DNA. vP293 is, in twee apencellijnen (BSC-40 en VERO), in staat in kippenembryo-fibroblasten plaques te maken, maar niet tot duplicering in de menselijke cellijn MRC-5.

Inbouwen van het gastheerverscheidenheidsgen KIL in vP293 herstelt het vermogen op MRC-5-cellen te groeien.

Er werd een serie plasmiden opgebouwd, die, naast het gastheerverscheidenheidsgen KIL, een vroeg/laat-koepok-virus H6 bevatten, bij voorkeur gevolgd door een unieke meervoudige koppelingsreeks die voor meerdere restrictie-plaatsen kloont, begin- en beëindigingscodons voor het vertalen en een vroeg beëindigingssignaal voor het overschrijven. Deze plasmiden, pMP528HRH en pHESl-4, maken het snelle klonen in één enkele stap en expressie van ieder open afleeskader mogelijk indien met VP293 gerecombineerd en reeds beoordeeld op groei in MRC-5-cellen.

Inbouwen van een vreemd open afleeskader in deze plasmiden, gevolgd door recombinatie met vP293 zal tegelijkertijd de functie van de gastheerverscheidenheid (het K1L-gen) herstellen en het vreemde open afleeskader in het reddende virus, vP293, invoeren. De recombinant-virussen worden geïdentificeerd aan hun vermogen op MRC-5-cellen plaques te geven.

Voordelen van dit systeem zijn dat ieder niet uit koepokken afkomstig exogeen gen anders dan het genetische element in kwestie afwezig is, dat er geen genetische terugslag van het gen is doordat vP293 een weglatingsmutant van KIL is, en de snelle ééntrapsidentificatie van de recombinanten. Deze ene stap kan ook gebruikt worden voor het snel af zoeken op expressie van het vreemde gen, bijvoorbeeld voor het in kaart brengen van de epitopen. --

Nog meer plasmiden met het gastheerverscheiden-heidsgen KIL zijn opgebouwd, waarin de vroeg/laat-promotor H6 vervangen was door een strikt vroege of een strikt late koepokpromotor. Met die aanvullende plasmiden kunnen de subtiliteiten van het tijdelijke regelen van de expressie van vreemde genetische elementen bestudeerd worden.

De in gastheerverscheidenheid beperkte systemen volgens deze uitvinding kunnen met voordeel gebruikt worden in vaccins voor het invoeren van immunologische responsen in een met dat vaccin ingeënte gastheer. In dit opzicht bestaat het vaccin uit een drager en een gemodificeerd recombinant -virus . Uit het gemodificeerde recombinant-virus zijn de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zodat het virus zich in de gastheer maar beperkt kan vermeerderen. Bovendien bevat het gemodificeerde recombinant-virus DNA dat in de gastheer voor een genprodukt codeert en dat tot expressie brengt, met beperkte vermeerdering van dat virus in de gastheer. Er zijn gemodificeerde recombinant-virussen opgebouwd die genprodukten tot expressie brengen, vooral antigenen, met een beperkte vermeerdering van dat virus ten gevolge van het weglaten van genen voor de gastheerver-scheidenheid. Bij een uitvoeringsvorm is .de gastheer een gewervelde en lokt het antigeen een immunologische respons in die gewervelde uit. Bij een andere uitvoeringsvorm is de gastheer een in vitro gekweekte cellijn.

Men kan gemakkelijk inzien dat nog meer virussen en soorten, naast de in deze octrooibeschrijving genoemde, beoordeeld kunnen worden op beperkte gastheerverscheiden-heid. Bovendien kan men makkelijk inzien dat er in pokkenvirus nog meer "genen voor gastheerverscheidenheid" bestaan. Bovendien kan men gemakkelijk inzien dat een verscheidenheid van vreemde genen in deze gastheerverscheiden-. heids-mutanten gebruikt kunnen worden.

Een beter begrip van deze uitvinding en van de vele voordelen daarvan kan men krijgen uit de volgende voorbeelden die alleen ter toelichting dienen.

In sommige van deze voorbeelden werd de WR-stam van het koepokvirus gebruikt. De herkomst daarvan en de omstandigheden waaronder het opgekweekt wordt zijn eerder beschreven (27) . In sommige van deze voorbeelden werd de Kopenhagen-stam van het koepokvirus gebruikt. Zijn herkomst en kweekomstandigheden zijn eerder beschreven (50). Primaire kippenembryo-fibroblasten (CEF), apencellijnen (VERO, ATCC# CCL81 en BSC40) en de menselijke cellijn MRC-5 (ATCC# CCL171) werden in het minimaal-essentiële medium van Eagle gekweekt, welke 5 % (voor VERO en BSC40) of 10 % (voor MRC-5 of CEF) foetaal runderserum (FBS) bevatten.

Plasmiden werden opgebouwd, afgezocht en opgekweekt met standaardprocedures (22, 31, 32).

Voorbeeld 1

Opbouw van plasmide pMP528PiN en genereren van VP293

Onder verwijzing naar fig. IA werd uit pAG5 een EcoRI/Sall fragment koepokvirus met de 3,8 kb van het linker uiteinde geïsoleerd (30) en dat werd ingebouwd in pUC13 dat eerder met EcoRI en Sali opengeknipt was. Het ontstane plasmide, pMP5, werd met HindlII en Sali verteerd en geligeerd met een HindlII/SalI-fragment van 3,8 kb dat de koepokvirus-reeksen bevatte overeenkomende met het rechter uiteinde van het met HindlII verkregen koepokvirus-fragment K. Het aldus verkregen plasmide pMP528 bevat dus de 3,8 kb van het linker uiteinde van het koepokvirusr genoom en de 3,8 kb van het rechter uiteinde van het met HindlII verkregen K-fragment; de daartussen gelegen 21,7 kb tussen Sall-plaatsen op de 3,8 kb en 25,5 kb vanaf het linker uiteinde van het genoom, zijn er dus uit weggelaten. De unieke Sall-plaats van pMP528 werd in een Smal-plaats omgezet door er synthetische verbindingsstukken aan toe te voegen (deze worden in de handel gebracht door de Collaborative Research Ine. te Bedford, Mass.) en dat gaf pMP528L.. Een Smal-fragment van 1,4 kb, dat het uit transposon Tn5 afkomstige gen voor neomycine-fosfotransferase bevatte (1). werd uit pSV2-neo (35, ATCC# 37149) geïsoleerd en onder controle van een vroege koepokvirus-promotor geplaatst (hier aangeduid als Pi).

De promotor Pi uit het Aval H-gebied van het koer pokvirus is beschreven (37). Meer in het bijzonder is deze promotor afgeleid uit het Aval H-gebied van de L-variant van koepokvirus-stam WR, waarvan de promotor overschrijven van rechts naar links regelt. De plaats van deze promotor op de kaart is ongeveer 1,3 kb links van het einde van Aval H, ongeveer 12,5 kb van het linker einde van het koepokvi-rus-genoom en ongeveer 8,5 kb van de HindlII-koppeling C/N. Van de promotor werd met standaardtechnieken (karteren) de plaats bepaald. De DNA-reeks van het Pi komt overeen met het bovenstroomse gebied van een open afleeskader dat voor een recent beschreven (40) glycinerijk eiwit van 5 kDa codeert. Van deze promotor is aangetoond dat het al vroeg na de infectie vreemde genen in koepokvirus-recombinanten tot expressie brengt (37).

Een Pi-promotor/neogen-cassette met Smal-einde werd op de Smal-plaats van pMP528L ingebouwd, wat pMP528PiN

gaf. pMP528PiN heeft 0,4 kb koepok-virus-sequenties afgeleid van een Sau3A-subkloon van Aval H die het Pi-promotor-gebied bevat, gevolgd door 1 kb aan Tn5-reeksen vanaf de plaats BglII tot en met de plaats Smal (1).

Met standaardprocedures werd primair CEF tegelijkertijd met pMP528PiN en met reddende koepokvirus VTK 79 getransfecteerd. Recombinant-virus werd er uit geselecteerd en op primair CEF gekweekt in aanwezigheid van 300 μg/ml 6418 (1, 11, 35).

De genoom-configuraties van het recombinant-koepokvirus vP293 werden met Southern-blot-analyse bevestigd. Uit het recombinant-koepokvirus vP293 was, zoals voorspeld, 21,7 kb aan koepokvirus verwijderd, en daar zat nog het vreemde gen in dat voor neo** codeert. De restric-tiekaart van het linker uiteinde van het reddende virus VTK 79 en van het recombinant-virus vP293 dat het gen voor neor tot expressie brengt en in aanwezigheid van G418 op primair CEF geselecteerd was ziet men in figuren 1B en 1C.

Bij afwezigheid van het antibioticum G418 geeft vP293 grote plaques op primair CEF en goede plaques op BSC40- en VERO-cellen, hoewel vP293-plaques duidelijk kleiner waren dan van het moeder-VTK 79 op VERO-cellen. Significant is dat vP293 geen meetbare vermeerdering gaf en op de menselijke cellijn MRC-5 geen plaques kon vormen.

Voorbeeld 2

Opbouw van VP293 met het gastheerverscheidenheidsgen KIL

Om aan te tonen dat het gen KIL voor gastheerver-scheidenheid, bij reconstitutie in weglatings mutant vP293 van de koepokvirus stam WR, het mogelijk zal maken dat het virus zich in menselijke cellen vermeerdert werd KIL in plasmide pMP528L gekloond en in vP293 ingebouwd.

Onder verwijzing naar fig. 2A werd het DNA van het koepokvirus, met de rechterarm van pMP528L (fig. IA en 2A) bekort om er de ongewenste restrictieplaatsen uit te verwijderen en het latere klonen te vergemakkelijken. pMP528L werd met EcoRV en HindlII doorgeknipt, stomp gemaakt met het Klenow-fragment van polymerase uit E.coli en met zichzelf geligeerd. Op die wijze werd het DNA van het ontstaande plasmide pMP528E met 0,4 kb bekort.

Een met Hpal en (gedeeltelijk met) BglII verkregen fragment met de complete coderende en promotor-reeks van het gastheerverscheidenheidsgen KIL (15) werd uit pSD452VC bereid, een subkloon van de Kopenhagen-stam van het koepok-virus dat de met HindlII M en K verkregen reeksen bevat. Het KIL bevattende fragment werd in pUC8 met het meervoudige verbindingsgebied gekloond, enkel met het doel het gen met geschikte restrictieplaatsen te flankeren. Het ontstane plasmide pUC8HR werd met HindlII en Smal verteerd, zodat men het KIL bevattende fragment kon isoleren. Het HindlII-einde werd opgevuld met het Klenow-fragment van het DNA-polymerase uit E. coli en dat fragment werd in de Smal-plaats van pMP528E gekloond. Een plasmide pMP528HR met de oriëntatie van het gastheerverscheidenheidsgen KIL, dat naar links toe af te lezen was (zoals in fig. 2A afgebeeld) werd met standaardprocedures geïsoleerd.

Procedures voor het recombineren en hybridiseren op nitrocellulose-filters waren zoals in het vak bekend en zoals eerder beschreven (28) met de volgende modificaties.

Het donorplasmide pMP528HR werd samen met VP293 door elektroporatie in VERO- of MRC-5-cellen gebracht. Vervloeiende monolagen van VERO- of MRC-5-cellen werden 1 uur met het reddende virus geïnfecteerd. De cellen werden met trypsine geoogst, met met Hepes gebufferde zout-oplos-sing (HeBS) uitgewassen en ondergingen in aanwezigheid van 25 μg plasmide-DNA elektroporatie in HeBS. Met virus geïnfecteerde cellen ondergingen elektroporatie in een Gene Puiser van Bio-Rad, voorzien van een capaciteitsvergroter. Van de celsuspensie werd 0,8 ml in een daarvoor bedoelde cuvette 10 minuten op ijs geplaatst, kreeg dan pulsen van 200 V (capaciteit 960 μΈΌ) en werd dan nog eens 10 minuten op ijs gehouden. De cellen werden dan met MEM + 5 % FBS tot 8 ml verdund, op Petrischalen van 60 mm uitgeplaat (deze bevatten monolagen van de overeenkomstige VERO- of MRC-cellen) (4 ml per plaat) en overnacht bij 37°C geïncubeerd.

De nakomelingen werden geoogst en uitgeplaat, hetzij op VERO- hetzij op MRC-5-cellen. Het aantal op VERO-cellen verkregen plaques was 10 tot 100 maal groter dan op de MRC-5-cellen. Geïsoleerde plaques (van uniforme grootte) werden zowel van MRC-5- als van VERO-celkweken geoogst (zowel grote als kleine plaques). Deze plaques werden opnieuw uitgeplaat op VERO-cellen en drie dagen later werden de ontstane plaques van de tweede generatie op nitrocellulose-filterschijfjes overgebracht, die in situ voor hybridiseren klaargemaakt waren (26). Alle van MRC-5-cellen afkomstige plaques en de grotere (maar niet de kleinere) plaques van de VERO-cellen gaven positieve hybridiseringssignalen met een met 32P gemerkte probe op de voor KIL coderende reeksen. Dat is in overeenstemming met het herstel van de in KIL aanwezige reeksen die voor de gastheerfuncties coderen.

Een uit MRC-5-cellen verkregen isolaat werd verder gezuiverd en kreeg de aanduiding vP457. In vP457 was het gen KIL hersteld en lag het in de weglating met zijn oorspronkelijke oriëntatie van rechts naar links. De K1L-. reeksen waren vervangen door de in vP293 aanwezige genencassette voor de Pi-promotor en voor het neomycine-fosfo-transferase, zoals fig. 2B en 2C laten zien. Vergeleken met het genoom van de L-variant van het pokkenvirus (30, 27). heeft vP457 een weglating van 291 bp rechts van het KIL-gen en een weglating van 20,2 kb links van het KIL-gen.

Voorbeeld 3

Opbouw van plasmiden pMP528HRH en pHESl-4

Om aan te tonen dat de voorwaardelijk lethale mutatie in vP293 benut zou kunnen worden voor het opbouwen van donorplasmiden waarin nog andere open afleeskaders gekloond zouden kunnen worden werd een serie plasmiden, pMP528HRH en pHESl-4, opgebouwd. Recombinatie van een open afleeskader van buiten in een plasmide met het gen KIL voor de gastheerverscheidenheid in vP293 zou een . eenvoudige methode kunnen zijn voor het opbouwen van koepokvirus-recombinanten met een grote verscheidenheid in mogelijke gastheren.

Een koepokken-promotor, H6, werd bovenstrooms van het gen KIL aan pMP528HR toegevoegd. Deze vroeg/late promotor was eerder geïdentificeerd door standaard in kaart brengen van het overschrijven en door bepaling van de DNA-volgorde. Tussen plaatsen -125 en +3 zit daarin de reeks: ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGT - -GTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTA AGTTTGTATCGTAATG. Deze reeks is door Rosel c.s. (33) beschreven als wat er bovenstrooms ligt van het open afleeskader H6.

Wijzen wij nu op fig. 3. DNA overeenkomende met plaatsen -124 tot -1 (met op plaats -102 G in plaats van A om het invoeren van een mogelijke startcodon te voorkomen) en gevolgd door de restrictieplaatsen Xhol, Kpnl en Smal, werd chemisch gesynthetiseerd (fig. 3B) en op de Smal-plaats van pMP528HR gekloond, wat pMP528HRH gaf (fig. 3A). PMP528HRH heeft dus bovenstrooms van het gen KIL, die onder controle van de endogene KIL-promotor tot expressie komt, de promotor H6. Beide hebben ten opzichte van de koepokvi-rus-armen (het genoom) de juiste oriëntatie van rechts naar links. De promotor H6 in pMP528HRH is direct bovenstrooms van de unieke restrictieplaatsen Xhol, Kpnl en Smal.

Om het nut van het systeem nog verder te verhogen werd een serie plasmiden pHESl t/m 4, afgeleid van pMP528HRH op de volgende wijze in elkaar gezet: pMP525HRH werd met Xhol en Xmal doorgeknipt, en op die plaats werden de oligonucleotiden HRL1 5 ' ( TCGACCATGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAATTTTTAT ) 3 ' en HRL2 5 ' (CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCATGG) 3 ' gekloond. pHES2, pHES3 en pHES4 werden net zo in elkaar gezet. pHES2 werd opgebouwd met oligonucleotiden HRL3 51(TCGACCATGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAAT TTTTAT)3' en HRL4 5'(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCC CCATGG)3', .pHES3 met de oligonucleotiden HRL5 5'(TCGACCATGGGGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTCGAGTAAATAAATAAT TTTTAT)3' en HRL6 51(CCGGATAAAAATTATTTATTTACTCGAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCC CATGG)3· en pHES4 met de oligonucleotiden HRL7 5'(TCGAGGATCCCGGGTACCGAGCTCTAAATAAATAATTTTTAT)3' en HRL8 5'(CCGGATAAAAATTATTTATTTAGAGCTCGGTACCCGGGATCC)3'.

De hier van belang zijnde elementen van DNA-volgorde, restrictieplaatsen en signalen voor overschrijven en vertalen van pMP528HRH en pHESl-4 waren de volgende:

De reeks in de synthetische promotor H6 (plaatsen -124 t/m -1, met de veranderde base op plaats -102 onderstreept) en de benedenstroomse restrictie in pMP528HRH zijn afgebeeld in fig. 3B.

De tussen haakjes staande reeks is vervangen in plasmiden pHESl-4, met de restrictieplaatsen, stopcodons en het vroege beëindigingssignaal voor het overschrijven zoals aangegeven, voor pHESl in fig. 30, voor pHES2 in fig. 3D, voor pHES3 in fig. 3E en voor pHES4 in fig. 3F.

Naast de door pMP528HRH omvatte elementen bevat ieder plasmide van pHESl t/m 3 een begincodon voor het vertalen benedenstrooms van de promotor H6, gevolgd door unieke plaatsen voor meervoudige restrictie, beëindigings-signalen voor het vertalen en een voor koepokkenvirus specifiek vroeg beëindigingssignaal voor het vertalen (39). Ieder plasmide pHESl t/m 3 heeft in één van de drie aflees-kaders een startcodon voor het vertalen. Daardoor kan iedere DNA-reeks die een open afleeskader heeft tot expressie komen indien in één van deze plasmiden gekloond en met het koepokvirus gerecombineerd.

Het vierde plasmide, pHES4, omvat geen startcodon voor het vertalen, maar wel een unieke restrictieplaats voor meervoudige restrictie, reeksen voor het beëindigen van de vertaling en een vroeg beëindigingssignaal voor het overschrijven. Een DNA-reeks die een open afleeskader en een startcodon omvat kan tot expressie komen indien in pHES4 gekloond en met het koepokvirus gerecombineerd.

Voorbeeld 4

Inbouw van het bacteriële lacZ-gen in het koepokvirus en selectie van de recombinant-virussen op basis van de beperking in gastheerverscheidenheid.

Om het nut van het gastheerselectiesysteem van pHESl-4/vP293 aan te tonen werd een recombinant-koepokvirus met het E.coli-gen voor lacZ, dat voor /3-galactosidase codeert, in elkaar gezet. Een BamHI-fragment met codonen 8 t/m het einde van het gen voor lacZ werd uit pMC1871 verkregen (34). Dit BamHI-fragment voor lacZ werd in de unieke BamHI-plaats van de plasmiden pHESl-4 gekloond.

VERO-cellen werden met de verkregen plasmiden PHESLZ1-4 getransfecteerd en daarin met de gastheerver-scheidenheidsmutant vP293 gerecombineerd.

24 uur na de infectie werden de nakomelingen van dat virus door opvriezen en ontdooien geoogst en op VERO-cellen (tabel IA) of op MRC-5-cellen (tabellen 1B en 1C) uitgeplaat.

Met neutraalrood aangekleurde monolagen van VERO en MRC-5 (tabellen IA en 1B) werden na 3 dagen opgepikt en op nitrocellulose-filters overgebracht en daarop klaargemaakt voor in situ hybridiseren (26) met een met 32P gemerkte genprobe. Monolagen van VERO (gegevens niet getoond) en van MRC-5 (tabel 1C) werden blootgesteld aan X-gal (5-broom-4-chloorindolyl-3-/3-D-galactopyranoside, Boehringer Mannheim) en na 8 uur ontwikkelen werd de blauwe kleur gemeten.

Als nakomelingen op VERO-cellen uitgeplaat werden en de expressie van /3-galactosidase in aanwezigheid van X-gal bepaald werd, zag men geen blauwe plaques bij met pHESLZl, 2 of 4 getransfecteerde cellen. Significant was 20 % van de met het plasmide pHESLZ3 gevormde plaques blauw in aanwezigheid van X-gal (geen cijfers genoteerd).

Als nakomelingen op VERO-cellen uitgeplaat werden en de recombinantvirussen door hybridiseren in situ afgetast werden gaf 12 tot 22 % der plaques positieve hybridi- seringssignalen op lacZ (tabel IA). Bij analyseren op DNA-hybridiseren in situ (26) toonde iedere plaque op MRC-5 de aanwezigheid van het gen voor lacZ (tabel 1B). 0-galactosi-dase-werking zag men echter alleen bij plaques op MRC-5 die afgeleid waren van pHESLZ3 (tabel 1C). Alleen de plasmide-constructie pHESLZ3 had het gen voor lacZ in kader met het startcodon voor de vertaling.

Voorbeeld 5

Opbouw van plasmiden pHES31-34 en pHES61-64.

Om aan te tonen dat de voorwaardelijk lethale mutatie van VP293 benut kan worden voor het opbouwen van nog andere donorplasmiden en voor het uitbouwen van het gastheerselectiesysteem op basis van koepokvirus WR vP293 werd de serie pHES-plasmiden (voorbeeld 3) uitgebreid door de vroeg/late koepokpromotor H6 daarin te vervangen door andere tijdelijk geregelde promotoren. Plasmiden pHES31-34 en plasmide-serie pHES61-64 werden gegenereerd om de expressie van vreemde genen er vroeg, respectievelijk laat in te regelen.

De plaats van en de volgorde in een gen voor een eiwit van 38 kDa in het koepokkenvirus, nodig voor de vorming van rode (met bloed doorlopen) pokken op het chorioallantoisch membraan van kuikens (CAM) is al eens beschreven (43) . Dit gen, u, komt al vroeg na de infectie sterk tot expressie. Het gen u is op de kaart aanwezig in een NcoI-HaelII-fragment van 1465 bp.

Het gebied van het koepokkenvirus (van de Kopenhagen- stam) dat het equivalent van het koepokken-gen u bevatte werd door Southern-blot-analyse (44) met gekloond koepokken-DNA als sonde vastgesteld. Het Kopenhagen-equiva-lent van het koepokken-gen u tekent de kaart voor HindlII B en komt volgens een recent onderzoek (45) overeen met de plaats van gen u in koepokvirus stam WR.

In koepokkenvirus ligt het promotorgebied u bij -294, benedenstrooms van een Ncol-aangrijpingspunt (43). Van DNA dat het equivalent van gen u van de Kopenhagen-stam en een promotor bevat werd de volgorde bepaald (46). Het equivalent van gen u van de Kopenhagen-stam is niet functioneel, die maakt dat op CAM gekweekt virus witte pokken geeft ten gevolge van mutaties in het coderende gebied (verwisselingen in het afleeskader). Het bovenstroomse gebied is sterk homoloog aan het promotorgebied van de koepokken en is functioneel. Recombinant-pokkenvirus met expressie van /3-lactosidase uit E.coli onder controle van promotor u van de Kopenhagen-stam geeft blauwe plaques in aanwezigheid van het chromogene substraat X-gal. Net als bij koepokken bevat het Kopenhagen-genoom bovenstrooms van het promotorgebied u een aangrijpingspunt voor Ncol.

Om het Kopenhagen-promotorgebied u in het pHES-systeem over te brengen werd een HindlII-plaats bovenstrooms van promotor u aan de Ncol-plaats toegevoegd door ligeren met het uit zichzelf afgestompte oligonucleotide HRL14 (51-CATGGAAGCTTC-31. HindlII-plaats onderlijnd). Een HindlII/Clal-fragment van 299 bp, met daarin het promotorgebied u vanaf de Ncol-plaats tot en met de Clal-plaats bij -6 werd geïsoleerd. De promotor H6 werd uit pHESl verwijderd (voorbeeld 3) door gedeeltelijke vertering met HindlI-I, gevolgd door vertering met KpnI. Let men nu op fig. 4. Het 7,8 kb HindlII en KpnI vectorfragment werd uit een agarose-gel geïsoleerd (fig. 4A). Om de promotorreeks benedenstrooms van de Clal-plaats en de meervoudige verbin-dingsreeksen tot en met de Kpnl-plaats te vervangen werden er acht oligonucleotiden gesynthetiseerd, HRL15 t/m HRL22 (fig. 4B). Paren oligonucleotiden werden samen stomp gemaakt en met het HindlII/Kpnl-vectorfragment uit pHESl van 7,8 kb geligeerd, en het HindlII/Clal-promotorfragment u gaf daarmee plasmiden pHES31 t/m 34 (fig. 4A).

In fig. 5 ziet men dat de ontstane plasmiden pHES31 t/m pHES34 benedenstrooms van het Kopenhagen-promo-torgebied u bepaalde eenvoudige verbindingsgebieden bevatten. Het stuk DNA van 0,3 kb dat de promotor u specificeert is in fig. 5 alleen bij plasmide pHES31 aangeduid. Precies dezelfde reeks vindt men ook in plasmiden pHES32 t/m pHES34. Het stuk tussen vierkante haken na het promotorge-bied in pHES31 is in pHES32 t/m pHES34 vervangen door de daarbij behorende gebieden tussen vierkante haken. Restric-tieplaatsen zijn aangegeven. In pHES31 t/m pHES33 ligt het meervoudige verbindingsgebied benedenstrooms van het begin-ATG in de drie verschillende afleeskaders. Plasmide pHES34 heeft geen begin-ATG. In alle leden van de pHES-familie wordt het meervoudige verbindingsgebied gevolgd door een stopcodon voor de vertaling dat in fig. 5 in alle drie afleeskaders onderlijnd is, gevolgd door de bovenlijnde reeks TTTTTAT, waarvoor aangetoond is dat die in vroege genen van het koepokvirus het afbreken van het overschrij-ven bepaalt.

Net als met de plasmiden pHESl t/m pHES4 is met pHES31 t/m pHES34 de expressie van vreemde, in het meervoudige verbindingsgebied ingevoegde reeksen mogelijk. Vreemde coderende reeksen die een begincodon hebben worden onder controle van koepokvirus u tot expressie gebracht door inbouwen in pHES34. Vreemde coderende reeksen zonder begincodon worden in een geëigend afleeskader tot expressie gebracht door inbouwen in pHES31, pHES32 of pHES33. Net als met de oorspronkelijke pHES-serie bevatten pHES31 t/m pHES34 het menselijke gen voor gastheerverscheidenheid KIL (15). Recombineren van de weglatingsmutant van het koepok- virus VP293 (voorbeeld 1) met alle plasmide-derivaten van de pHES-serie leidt tot recombinant-koepokvirussen die op menselijke cellen voort kunnen groeien.

Om het plasmidesysteem pHES verder aan te passen aan de expressie van vreemde genen in recombinant-pokkenvi-rus laat na de infectie werd het ATI-gen van pokkenvirus voor 160 kDa gekozen (47). Van het gebied van 533 bp direct bovenstrooms van het ATI-gen uit koepokken is aangetoond dat het, bij inbouwen in een koepokvirus hoge expressie-niveaus van vreemde genen laat na de infectie bepaalt (48). De 63 bp DNA die zich bovenstrooms van de BglII-plaats uitstrekken tot het begincodon zijn voldoende om als promotor te werken bij de expressie van vreemde genen in koepokvirus. DNA dat dit promotorgebied specificeert werd gesynthetiseerd en op de hierna in detail aan te geven wijze in het pHES-systeem ingebouwd.

Door pHESl (voorbeeld 3) gedeeltelijk met HindlII en daarna met BamHI te verteren werd de promotor H6 eruit verwijderd. Zoals in fig. 6A aangegeven werd het met HindlII en BamHI verkregen vectorfragment van 7,8 kb uit een agarose-gel geïsoleerd. Om de promotorreeksen H6 door promotorreeksen ATI te vervangen en de BamHI-plaats aan de meervoudige verbindingstukken te koppelen werden acht oligonucleotiden gesynthetiseerd, HRL33 t/m HRL40 (fig. 6B). Paren oligonucleotiden werden onderling uitgevlakt en geligeerd met het uit pHESl met HindlII en BamHI verkregen vectorfragment van 7,8 kb, wat plasmiden pHES61-64 gaf. Ieder afgestompt paar van oligonucleotiden heeft, zoals aangegeven, het synthetische ATI-promotorgebied uit pokkenvirus van 63 bp, geflankeerd door de restrictieplaatsen voor HindlII en BamHI.

De verkregen plasmiden pHES61 t/m pHES64 hebben benedenstrooms van het late promotorgebied ATI meervoudige verbindingsgebieden (fig. 7). De met de koepokken-promotor ATI identieke reeks, ook aanwezig in pHES61 t/m pHES64, is alleen in pHES61 onderlijnd. Het gebied tussen haakjes na het promotorgebied in pHES61 is in pHES62 t/m pHES64 vervangen door de tussen vierkante haken geplaatste reek- sen. Restrictieplaatsen zijn aangegeven. In pHES61 t/m pHES63 is het meervoudige verbindingsgebied in de drie verschillende afleeskaders benedenstrooms van het startco-don ATG. Plasmide pHES64 heeft het startcodon ATG niet.

Net als bij de pHES-plasmidenserie met andere promotors hebben alle leden van de plasmidenserie pHES61 t/m pHES64 meervoudige verbindingsgebieden gevolgd door signalen voor het vertalen (onderstreept) en voor het overschrijven (bovenstreept). Daar derivaten van pHES61 t/m 64 het menselijke gen KIL voor pokkenvirus-gastheerver-scheidenheid bevatten, werden de nakomelingen van deze plasmiden met vP293 geselecteerd op hun vermogen in menselijke cellen voort te groeien.

Voorbeeld 6

Opbouw van recombinanten VP548 en vP66l

De DNA-reeks van 15.537 bp nabij het linker einde van het Kopenhagen-genoom ziet men in fig. 8 van links naar rechts. Die reeks omvat de 7218 bp tussen de rechtse Sall-plaats in HindlII C en de HindlII C/N-koppeling, en strekt zich uit over de complete reeksen voor HindlII N (1544 bp, plaatsen 7919-8762), HindlII M (2219 bp, plaatsen 8763-10981) en HindlII K (4551 bp, plaatsen 10982-15532)·. Duidelijkheidshalve zijn in fig. 8 de plaatsen van sommige basen (om de 120) .aangegeven. Zoals gebruikelijk zijn de open afleeskader binnen ieder HindlII-fragment van links naar rechts genummerd (33). Daar de verschillende pokkenvirusstammen duidelijke verschillen nabij het linker einde van HindlII C hebben (het linker einde van het pokkenvirusgenoom) , zijn de open afleeskaders binnen het HindlII C-fragment van het pokkenvirus hier vanaf de HindlII C/N-koppeling van rechts naar links genummerd. Bij deze nomenclatuur staat het afleeskader C1L helemaal rechts in het HindlII C-fragment van het DNA van de Kopenhagen-stam.

Zoals in fig. 9 aangegeven werden plasmiden opgebouwd waaruit het menselijke gen KIL voor gastheerver-scheidenheid zou leiden tot het verlies van het vermogen zich in menselijke cellen te vermeerderen. Het Knpl-frag- ment D van de Kopenhagen-stam, dat 2,5 kb DNA links van de in fig. 8 aangegeven reeks bevat en zich rechts tot en met plaats 12998 uitstrekt, werd op de KpnI-plaats in pUC18 ingebouwd, wat tot pSD435 leidde (fig. 9) . (NB: in fig. 9 zijn plasmiden van de pSD-serie met DNA-invoegsels van de Kopenhagen-stam van het koepokvirus aangeduid met de niet voorgeschreven toelichting "VC" d.w.z. pSD435 staat daar als "pSD435VC". Die toevoeging "VC" is in fig. 10 weggelaten) . Het Kpn D-fragment omvat het gen KIL (plaatsen 11030-10179). Om het manipuleren van het gen KIL en het flankerende gebied daarvan, pSD452, te vergemakkelijken werd een onderkloon van pSD435 opgebouwd met daarin tussen de Sphl-plaats (nr. 9478) in HindlII M en de Clal-plaats in HindlII K (nr. 11731) zekere reeksen. Het gen KIL is met een gearceerde rechthoek aangegeven, met de richting van overschrijven volgens de pijl. pSD452, nu met twee aangrijpingspunten voor Hpal (plaatsen 9561 en 10155) werd door vertering met Hpal opengeknipt en met BglII-verbindings-stukken geligeerd op de Hpal-plaats (nr. 10155) direct benedenstrooms van het gen KIL. Het ontstane plasmide werd met BglII opengeknipt en met zichzelf geligeerd, wat pSD453 gaf. Gen KIL en de promotor daarvan zijn uit pSD453 weggelaten. De weglatingsplaats is in fig. 9-2 met een driehoek aangegeven.

Een fragment met reeksen die voor j8-galactosidase coderen (gestippelde rechthoek, richting van het gen met een pijl aangegeven) onder controle van de late koepokpro-motor van 11 kDa (donkere pijl) (49) werd in pSD453 op de BglII-plaats ingevoegd, wat pSD453BG gaf (fig. 9-2). pSD453BG werd als donorplasmide gebruikt bij de recombina-tie met vP410, een derivaat van de Kopenhagen-stam van het koepokvirus dat negatief in thymidine-kinase is (50). Virusnakomelingen werden in aanwezigheid van X-gal onderzocht. Blauwe plaques werden eruit gepikt en door kweken op VERO-cellen gezuiverd. Zoals verwacht, werd van de ontstane recombinant, vP548, met met 32P gemerkte KIL-reeksen als probe, aangetoond dat die het gen KIL mist. Verrassenderwijs geeft vP548 wel met MRC-5-cellen plaques.

Om na te gaan of de aanwezigheid van het gen voor 0-galactosidase in vP548 een rol speelt bij zijn vermogen op MRC-5-cellen plaques te geven werd de 11 kDa/0-galacto-sidase-cassette uit vP548 verwijderd door recombinatie met het donorplasmide pSD453. De ontstane -weglatingsrecombi-nant, vP661, gaf op MRC-5-cellen ook plaques.

Voorbeeld 7

Identificatie van het gen voor gastheerverscheidenheid C7L in de Kopenhagen-stam van koepokvirus.

De in voorbeeld 6 beschreven uitkomsten geven de suggestie dat KIL niet het enige koepokkengen voor gast-heerverscheidenheid is dat groei op menselijke cellen mogelijk maakt. De mogelijkheid werd onderzocht dat de uit koepokvirus vP293 weggelaten gebieden en de weglatingsmu-tanten van het koepokvirus (14) nog een ander gen misten dat het KIL maakt op menselijke cellen te groeien. Fig. 10 is de weglatingskaart van het linker einde van het koepok-virusgenoom met de plaatsen van mogelijke genen voor gastheerverscheidenheid. Aangrijpingspunten voor HindlII en EcoRI zijn bovenaan fig. 10 voor het linker einde van het koepokvirusgenoom getekend. Alleen de van belang zijnde EcoRI-plaatsen zijn aangegeven. De mate waarin de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zijn uit koepokvi-rus-weglatingsmutant vP293 en uit de gastheerverscheidenr heidsweglating (14) zijn met zware strepen aangegeven, alsmede het gebied dat bij beide weglatingsmutanten verdwenen is. Het gebied van 15537 bp vanaf de rechtse Sall-plaats tot en met het HindlII K-fragment, waarvoor de volgorde bepaald is, is vergroot getekend. Alleen de van belang zijnde restrictieplaatsen zijn daarin aangegeven. De plaatsen van de besproken genen zijn in de open kastjes aangegeven. De plaatsen van de fragmenten gebruikt voor het testen van genen op hun gastheerverscheidenheid staan boven de troggen. De plaatsen van de koepokvirus-invoegsels in de hier besproken plasmiden zijn, samen met de van belang zijnde restrictieplaatsen, ook aangegeven. Code: S = Slal; E = EcoRI; H = HindlII; Bg = BglII; Kp = Kpnl; B = BamHI;

Sp = Sphl; C = Clal; Hp = Hpal.

Zoals in fig. 10 aangegeven, strekt het aan de gastheerweglating en de weglating in vP293 gemeenschappelijke weglatingsgebied zich uit van een onbepaald punt in EcoRI C tot aan de Sall-plaats in HindlII K (plaats 11412). Vastgesteld is dat een gastheerverspreidingsgen (waarvan de plaats in EcoRI K tussen nr.'s 7550 en 12875 zou zijn (14) en een gastheerverspreidingsgen KIL (tussen plaatsen 11030 en 10179) nu geïdentificeerd is in een BglII D-fragment van 846 bp (plaatsen 10271-11116) binnen het EcoRI K (15). Het BglII A-fragment (plaatsen 8645-10270) uit het EcoRI K herstelde groei op menselijke cellen niet. Maar bij zulk onderzoek kunnen mogelijke gastheergenen in het EcoRI K-fragment, die tussen de EcoRI-plaats (nr. 7749) en de BglII-plaats (nr. 8644) of tussen BglII (plaats 11116) en Clal (plaats nr. 11731) ligt, wel gemist zijn. Ook kunnen, genen die met de EcoRI-, BglII- of Clal-plaatsen (resp. nr.'s 7749, 8644 en 11731) van EcoRI K kruisen en ook de EcoRI-koppelingsplaats (nr. 1295) tussen EcoRI C en J gemist zijn.

Onderzoek van de vertaling van de hier beschreven DNA-reeks van 15,5 kb tot aminozuren laat vier mogelijke genen zien die nooit eerder beproefd zijn (14, 15). Alle vier open afleeskaders zijn van rechts naar links georiënteerd. De plaatsen van deze vier open afleeskaders C7L, N2L, MIL en K2L (resp. 1314-863, 7943-7416, 9329-7985 en 12367-11258) zijn in fig. 10 aangegeven. Het eerste ATG in het open afleeskader MIL ligt op plaats 9403. Daar die plaats bovenstrooms van de in publikaties genoemde plaatsen van startpunten voor overschrijven van MIL ligt (51) en binnen de voor het gen M2L coderende reeksen, kan men het ATG op plaats 9329 interpreteren als het ware startpunt van het gen MIL.

Van de vier mogelijke genen was MIL aanvankelijk de meest waarschijnlijke kandidaat voor de rol van gen voor de gastheerverscheidenheid. Een met 32P gemerkte DNA-probe op KIL geeft in een Southern blot-analyse een zwakke kruisreactie met reeksen voor MIL (44) (geen gegevens getoond).

De DNA-reeks in het gen voor MIL van de Kopenha-gen-stam van het hier beschreven koepokvirus verschilt in zijn amino-einde van de gepubliceerde MIL-reeks van de stam WR van koepokvirus (51). Het invoegen van -twee basen leidt bij de onderhavige reeks tot verschuivingen-van het aflees-kader. Bij de hier beschreven reeks begint de vertaling bij het ATG op plaats 9329. Met de in de literatuur (51) beschreven reeks zou een mogelijke vertaling vanaf dit ATG eindigen bij het stopcodon op plaats 9278 en de vertaling van MIL zou beginnen op plaats 9247. Met de hier beschreven reeks loopt de vertaling vanaf plaats 9329 door tot het eerder beschreven stopcodon voor MIL (plaats 7987). Het netto resultaat is dat het hier beschreven gen voor MIL bij het amino-einde 27 aminozuren extra heeft, alsmede twee aminozuren anders dan met het voor MIL beschreven (51) gen.. De reeks voor het gen WR N2L is ook reeds beschreven (51). Van het hier beschreven Kopenhagen-gen N2L zijn vier aminozuren anders dan bij de gepubliceerde reeks.

Computeranalyse van het door het afleeskader van Kopenhagen-koepokvirus MIL gecodeerde eiwit laat een hogere mate van overeenkomst met het eiwit van Kopenhagen-koepokvirus KIL zien (15) dan met enig ander eiwit van de PIR- of Swiss-Prot-gegevensbases (geen cijfers getoond). Deze cijfers, gekoppeld met de uitkomsten van een Southern blot-analyse, geven de suggestie dat het produkt van het gen MIL net zo'n gastheerverscheidenheidsfunctie zou kunnen vervullen als het produkt van het KIL.

Daarom werd van de vier mogelijke genen voor gastheerverscheidenheid het gen MIL het eerst in koepokvirus vP293 beproefd op zijn vermogen het uitgroeien van koepokvirussen op menselijke cellen mogelijk te maken. Om het gen voor MIL en daarop volgende genen in het selectie-systeem van vP293 te recombineren werden pMP528 (voorbeeld 1) en het derivaat daarvan pMP528E (voorbeeld 2) als vectorplasmiden benut. pMP528 is het oorspronkelijke koepok-weglatingsplasmide waarvan de koepokvirus-recombi-nant vP293 afgeleid is. pMP528 heeft op de weglatingskoppe- ling tussen de koepokken flankerende armen een Sall-plaats van uit het koepokvirus-DNA verkregen gebieden HindlII C en HindlII K. In pMP528E is de rechter flankerende arm, afgeleid van het koepokken-DNA HindlII K wat verkort en op de HindlII C/HindIII K-weglatingskoppeling een aangrijpingspunt voor Smal in plaats van het ^oorspronkelijke aangrijpingspunt voor Sali.

Het beproeven van mogelijke genen voor de gast-heerverscheidenheid in het systeem VP293 is schematisch weergegeven in fig. 11. Op de bovenste lijn staat de HindlII-kaart van het linker uiteinde van het koepokvirus-genoom. Plaatsing van de genen is aangegeven in de kastjes, richting van het overschrijven met de pijlen. De plaatsing van de koepok-fragmenten gebruikt voor het testen van de gastheerverscheidenheid van die genen is aangegeven in de troggen.

Een DNA-fragment dat zich vanaf het 3'-einde van M2L (plaats 9384, 55 basen bovenstrooms van het begincodon van MIL) tot en met de Scal-plaats (nr. 7906) benedenstrooms van het MIL uitstrekte, werd in met Smal opengeknipt pMP528E geligeerd (fig. 11) . Het ontstane plasmide pMP528m, werd als donorplasmide gebruikt voor recombinatie met koepokvirus vP293. Hoewel onderzoek van het gen MIL met een met 32P gemerkte DNA-probe liet zien dat MIL-reeksen in koepokken ingebouwd worden, gaven de nakomelingen van het virus op MRC-5-cellen geen plaques.

Daar de omvang van het promotorgebied. nodig voor het inzetten van de transcriptie van het gen MIL onbekend is, is het mogelijk dat de 55 basen bovenstrooms van de in plasmide pMP528M coderende reeksen uit MIL onvoldoende waren om de transcriptie van het gen MIL te bedingen. Daarom werd een groter fragment van het DNA uit de Kopenha-gen-stam van het koepokvirus, met daarin de complete genen voor M2L, MIL en N2L, beproefd. Een Hpal-fragment van 2849 bp (nr.'s 7307-10155) werd verkregen door pSD420, een Sall-kloon van het DNA van de Kopenhagen-stam van het koepokvirus (plaatsen 1-10477) gedeeltelijk met Hpal te verteren. Dit Hpal-fragment bevat de complete genen van M2L (10043- 9381), MIL (9329-7985) en N2L (7943-7416). Het Hpal-frag-ment werd gekloond in met Smal opengeknipt pMP528E (fig. 11). Het ontstane plasmide, in fig. 3 aangeduid als pMPml2n2, werd als donorplasmide gebruikt bij de recombina-tie met VP293. Hoewel onderzoek met met 32P gemerkte DNA-probes liet zien dat de drie genen in het koepokvirus ingebouwd waren, gaven de nakomelingen op MRC-5-cellen geen plaques. Dit geeft aan dat MIL en N2L niet de veronderstelde genen voor gastheerverscheidenheid zijn. Van M2L verwachte men niet dat het een gen voor gastheerverscheiden-heid was, daar het gen M2L volledig in het eerder beproefde BglII A-fragment van EcoRI K zit (15).

De overblijvende mogelijkheden voor genen voor gastheerverscheidenheid waren K2L, dat in de gastheer-mutant van 18 kb ontbreekt en in vP293 afgeknot is, en C7L, een open afleeskader in HindlII C dat de EcoRI-C/J kopper ling overbrugt en voor een eiwit van 18 kDa kan coderen.

Het hier beschreven gen K2L komt overeen met het eerder vermelde (52) open afleeskader KIL van de koepokken-stam WR, dat in twee aminozuren anders is. Koepokvirus-weglatingsmutant vP293 heeft het grootste deel van de coderingsreeksen K2L direct rechts van de weglatingskoppe.r ling in HindlII K (overeenkomende met het aangrijpingspunt voor Sali op plaats 11412). Om het gen K2L (plaatsen 12367-11258) te beproeven op zijn vermogen groei van koepokvirus op menselijke cellen toe te laten werd het plasmide pMP528 in het 3'-einde van het koepokgen K2L hersteld. Synthetische meervoudige verbindingsstukken MPSYN52 (5'-ATTATTTTTATAAGCTTGGATCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAA TTCT-3') en MPSYN53 (5 *-AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAAT AAT-3') werden afgestompt en op de Sspl-plaats (nr. 11177) benedenstrooms van het gen K2L geligeerd in een plasmide-subkloon van HindlII K van de Kopenhagen-stam, en een Xhol/Sall-fragment dat het 31 -einde van het gen K2L bevatte werd geïsoleerd. Plasmide pMP528 werd met Sali opengeknipt en het XhoI/Sall-fragment met het 3'-einde van het gen K2L werd met de juiste oriëntatie ingevoegd (fig. 11). Het ontstane plasmide pMP528K2 werd gebruikt als donorplasmide bij de recombinatie met koepokvirus vP293. Opnieuw waren de nakomelingen van het recombinant-koepokvirus niet in staat op MRC-5-cellen plaques te vormen, wat aangeeft dat K2L niet het gen voor de gastheerverscheidenheid is.

Het hier beschreven koepokgen C7L komt op amino-zuurniveau precies overeen met het eerder beschreven gen WR voor 18 kDa (40) . Om het gen C7L (plaatsen 1314-863) op zijn vermogen voor gastheerverscheidenheid te beproeven werd plasmide pSD420 met BamHI en BglII opengeknipt en een fragment van 1040 bp, dat zich vanaf de BamHI-plaats (nr. 724) tot de BglII-plaats (nr. 1764) uitstrekte, werd geïsoleerd. Dit BglII/BamHI-fragment, met daarin het complete gen C7L, werd geligeerd in pMP528K2 dat met BamHI opengeknipt was (fig. 11) . Toen het ontstane plasmide, pMP528C7L, als donorplasmide gebruikt werd bij recombinatie met koepokvirus VP293, werden er virusnakomelingen gemaakt die op MRC-5-cellen plaques gaven. Dit geeft aan dat C7L, net als KIL, een gen voor gastheerverscheidenheid is die groei op menselijke cellen kan bepa^llen. Daar het gen C7L de EcoRI C/J-gaping overbrugt, was het niet eerder beproefd (14).

Voorbeeld 8

Weglating van het gen C7L uit de Kopenhagen-stam van het koepokvirus.

Daar het koepokvirusgen C7L, net als KIL, in staat was het vermogen van de koepokken-weglatingsmutant WR tot het vormen van plaques op menselijke cellen te herstellen werd het effect van het weglaten van gen C7L uit de Kopen-hagen-stam van de koepokvirus, onderzocht, zowel als enkelvoudige weglating als samen met het andere gen voor de gastheerverscheidenheid, KIL.

Het opbouwen van plasmiden voor het weglaten van het gen C7L en het daarmee genereren van koepokvirus-recombinanten is schematisch weergegeven in fig. 12. Een

HindlII-kaart van het linker einde van het koepokvirus-genoom staat op de bovenste lijn. Het gen C7L is schematisch aangegeven met een gearceerde rechthoek, de overschrijf richting met een pijl. Het uit pSD420 met BamHI en BglII verkregen DNA-fragment (plaatsen 725-1764) werd met het Klenow-fragment van polymerase uit E. coli stomp gemaakt en geligeerd in pUC18 dat met PvuII opengeknipt was, wat plasmide pMP420BB gaf (fig. 12). pMP420BB werd met EcoRV opengeknipt, dus midden in de reeksen van C7L, en een DNA-fragment van 3,2 kb met een Smal-einde met daarin een cassette van de koepokviruspromotor van 11 kDa (donkere pijl) en gen voor /?-galactosidase (donker gestippelde rechthoek, richting met pijl aangegeven) werd daar ingebouwd. Het ontstane plasmide, pMPC7LKBG, bevatte de cassette van de 11 kDa promotor met /3-galactosidase, in een oriëntatie van links naar rechts. Recombinatie werd uitgevoerd met donorplasmide pMPC7LKBG en het reddende Kopenha-gen-koepokvirus vP410, wat tot koepokkenrecombinant vP665 leidde, dat bij aanwezigheid van X-gal als blauwe plaque geïdentificeerd werd.

Om het gen C7L uit pMP420BB weg te werken werd het plasmide op de unieke Sacl-plaats (nr. 999) in het gen C7L opengeknipt, gevolgd door vertering met exonuclease Bal 31. Mutagenese (53) werd uitgevoerd op de dubbelstrengige matrix met behulp van een synthetisch 46-delig oligonucleotide MPSYN2 34 (5'-TGTCATTTAACACTATACTCATATACTGAATGGATGAA CGAATACC-3'). Uit het ontstane plasmide pMPC7A was het gen C7L weggewerkt (weglatingsplaats in fig. 12 met een driehoekje aangegeven), wat flankerende koepok-armen gaf, 140 bp aan de linkerzijde en 400 bp aan de rechterzijde. pMPC7A werd als donorplasmide gebruikt bij het verwijderen van de onderbroken C7L/11 Kda-promotor//?-galactosidase-reeks uit vP665, wat vP706 gaf, dat bij aanwezigheid van X-gal als kleurloze plaque geïdentificeerd werd. Zowel VP665 als VP706 groeien op MRC-5-cellen. Dat was te verwachten, daar deze recombinanten het gen KIL voor de gastheerverscheiden-heid bevatten.

Om een virus te scheppen dat zowel vrij van KIL

als van C7L is, werd pMPC7LKBG als donorplasmide gebruikt bij het recombineren met de koepokvirus-recombinant vP661 waaruit KIL weggewerkt was. Het ontstane virus VP683 werd in aanwezigheid van X-gal als blauwe plaque geselecteerd. Het gen C7L werd uit de koepokvirus-recombinant vP683 weggewerkt door recombineren met donorplasmide pMPC7A. Het ontstane recombinant-koepokvirus vP716, met dubbele weglating, werd bij aanwezigheid van X-gal als kleurloze plaque geïdentificeerd. Zowel vP683 als vP716 vormen op MRC-5-cellen geen plaques, wat aangeeft dat het wegwerken van de twee genen, KIL en C7L, voldoende is om groei van koepokvirus op menselijke cellen te voorkomen.

Tabel 2 vergelijkt het vermogen van de koepokvi-rus-genen in het herstellen van de gastheerverscheidenheid in koepokvirusmutant vP293. Wat vergeleken wordt is het relatieve vermogen tot vermeerderen op mensen- of apencellen nadat de genoemde genen door recombinatie weer in koepokvirus vP293 gebracht waren.

Voorbeeld 9

Koepokkengen dat voor een produkt van 77 kDa codeert.

Anders dan koepokkenvirus is koepokkenvirus in staat op ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO-cellen) te groeien. Een gebied van het koepokkengenoom dat vermeerdering van koepokkenvirus op CHO-cellen mogelijk maakt is al eens geïdentificeerd (54). Het koepokkengen en de promo tor tekenen een kaart van het Hpa I-fragment van 2,3 kb. Het valt te voorspellen dat het gen voor een vertalingspro-dukt van 77 kDa codeert. Het koepokkengen vertoont op DNA-of eiwitgebied geen noemenswaardige homologie met één der hier beschreven koepokvirusgenen voor gastheerverscheiden-heid (54), noch voor KIL noch voor C7L.

Nu lettende op fig. 13 werd, vooruitlopend op het in de onderhavige virussystemen tot expressie brengen van het koepokkengen in een produkt van 77 kDa, het koepok-DNA met Hpal verteerd en een fragment van 2,3 kb, met daarin het gen en zijn promotor, werden uit een agarose-gel geïsoleerd. Om het gen met de meervoudige verbindingsstukken te flankeren werd het Hpal-fragment van het koepokvirus geligeerd met met Smal verteerd pIBI25 (van de International Biotechnologies, Inc. te New Haven, CT), wat pCP3 gaf (fig. 13). Voor het bouwen in koepokkenvirus werd het koepokkengen in het ATI-weglatingsgebied van het hierna te beschrijven plasmide pSD494VC van de Kopenhagen-vector gekloond.

Van het koepokken-equivalent van het pokken-ATI-gengebied van de stam WR werd aanvankelijk de plaats bepaald door van geëigende WR-klonen de volgorde te bepalen met behulp van aanzetstukken van het 5'-einde van de voor koepokken-ATI coderende reeks (47). Anders dan bij koepokken, waarvan het ATI-gen voor een eiwit van 160 kDa codeert, codeert het gen van de WR-tegenhanger voor een eiwit van 94 kDa (zie ook 48) . In tegenstelling tot WR bevat de Kopenhagen-stam van het koepokvirus een weglating van 4,1 kb die het 5'-einde van het met ATI overeenkomende gen en het 3'-einde van het direct daaraan voorafgaande gen overspant. De resten van de twee open afleeskaders zijn in het kader samengevoegd tot een hybride afleeskader van 966 bp. Plasmide pSD494VC van de Kopenhagen-vector is een Xbal/ BglII-plasmide van het HindlII A-stuk van. de Kopenhagen-stam, waarvan het open hybride afleeskader, ontstaan door versmelting van het ATI-gen van de koepokken-tegenhanger in de Kopenhagen-stam met zijn bovenstroomse buur, door een •meervoudig verbindingsstuk vervangen zijn. Het meervoudige verbindingsstuk bestaat uit de reeks 51-AGATCTCCCGGGAAGCTTGGATCCGAGCTCCTCGAGGAATTCGTTAAC-3' dat restrictieplaatsen BglII, SMal, HindlII, BamHI, SstI, Xhol, EcoRI en Hpal bepaalt. pSD494VC bevat 0,7 kb van het flankerende koepokken-DNA links en 1,3 kb van het flankerende koepokken-DNA rechts van het meervoudige verbindingsgebied .

Uit pCP3 werd een EcoRI/BamHI-fragment van 2,3 kb geïsoleerd dat het koepokkengen voor een eiwit van 77 kDa en de promotor daarvan bevatte. Dit fragment werd geligeerd aan het meervoudige verbindingsgebied van pSD494VC, dat met EcoRI en BamHI opengeknipt was, hetgeen plasmide pCP5 gaf (fig. 13). Zoals verwacht gaf recombineren van het pCP5 dat het koepokkengen voor 77 kDa bevatte met het Kopenhagen-koepokvirus vP410 een recombinant-virus VP695, dat op CHO-cellen plaques kon vormen.

Om na te gaan of het 77 kDa koepokkengen voor CHO als gastheer ook de groei van het pokkenvirus specifiek op menselijke cellen kan richten werd een recombinatie uitgevoerd van plasmide vP293, waarvan de mutant met weggelaten gen voor gastheerverscheidenheid op menselijke cellen geen plaques vormt. De nakomelingen van dat virus, vP698, vormden op MRC-5-cellen plaques. Dit geeft aan dat het 77 kD koepokgen behalve een gen voor inwerken op CHO-cellen ook een gen voor inwerken op menselijke cellen is (fig. 13).

In het licht van de waarneming dat het koepokken-virus-gen van 77 kDa zowel het voortgroeien van koepokvirus op CHO-cellen als op menselijke MRC-5-cellen kan richten, was het van belang de rollen van C7L en KIL, de twee koepokvirus-genen voor gastheerverscheidenheid, bij het vermogen van koepokvirussen om in vitro te repliceren op uit andere soorten afkomstige cellen na te gaan. Ook was het van belang of er voor het voortgroeien van koepokvirussen op cellen van andere soorten nog andere door dit koepokvirus gecodeerde genen nodig zijn. Aanvankelijk werden de mutanten van het koepokvirus, waaruit C7L en KIL weggelaten waren, getest op hun vermogen plaques te vormen op LLC-PKl-cellen, een van varkensnier afgeleide cellijn.

Vervloeiende monolagen van VERO- MRC-5- en LLC-PKl-cellen in Petrischalen van 60 mm werden met 200 μΐ in series van 10 verdunde virussuspensies in MEM van Eagles + 2 % serum uit pasgeboren kalveren geïnfecteerd. Na 1 uur adsorptie werd de ent verwijderd en werden de monolagen af gedekt met 5 ml MEM van Eageles met 0,7 % Seakem Le Agarose en 10 % serum van pasgeboren kalveren. Dit afdekken der platen gebeurde bij 37°C. Vier dagen na de infectie werden de monolagen aangekleurd door ze nog eens af te dekken met 5 ml 0,6 % agarose dat 0,04 % neutraalrood bevatte. Zes uur na het kleuren keek men naar de plaques.

Zoals fig. 3A laat zien vertonen de Kopenhagenweglat ingsmutanten op LLC-PKl-cellen uit de varkensnier en op menselijke MRC-5-cellen precies hetzelfde plaquevormende vermogen. Recombinantvirussen waaruit of KIL of C7L weggelaten waren (resp. vP661 en vP706) onder behoud van het andere gen voor de gastheerverscheidenheid, gaven zowel op MRC-5- als op LLC-PKl-cellen plaques. Recombinantvirus waaruit zowel KIL als C7L weggelaten was (vP716) gaf noch op MRC-5- noch LLC-PKl-cellen plaques. Op basis van het plaquevormend vermogen in vitro op de cellijn LLC-PK1 zijn beide menselijke genen KIL en C7L ook varkensgenen. .Zoals met de menselijke cellijn MMR-5 waar te nemen was, is of de aanwezigheid van KIL of van C7L in het pokkenvirusgenoom voldoende voor plaquevorming van het Kopenhagen-pokkenvirus op varkensniercellen LLC-PK1. Net als in het geval van op menselijke cellen inwerkende pokkenvirussen zijn KIL en C7L de enige genen uit op varkens inwerkende cellen die in de Kopenhagen-stam van het pokkenvirus gecodeerd zijn, daar recombinant-pokkenvirus vP716 (KIL, C7L) op LLC-PKl-cellen geen plaques vormt.

Deze uitkomsten werden bevestigd bij gebruik van koepokvirus-recombinanten die genen voor gastheerverscheidenheid ingebouwd hadden in de weglatingsmutant vP293 van stam WR (tabel 3B). Zoals verwacht mist vP293, waaruit een groot stuk weggelaten is dat het gebied C7L tot en met KIL omvat, het vermogen op LLC-PKl-cellen plaques te vormen. Inbouwen van het gen voor KIL in vP293 is voldoende om de dan verkregen recombinant (vP457) op LLC-PKl-cellen te laten groeien. Maar zoals men bij menselijke MRC-5-cellen ziet is inbouwen van het gen MIL in de weglatingsmutant vP293 van de WR-stam niet voldoende voor plaquevorming van het dan verkregen virus (vP596) op LLC-PKl-cellen (tabel 3B).

Als hetzij het koepokvirusgen C7L hetzij gen KIL hetzij het koepokvirusgen 77 kDa in de weglatingsmutant vP293 van de WR-stam ingebouwd wordt, wordt het vermogen tot plaquevorming op menselijke MRC-5-cellen hersteld (tabel 3B).

Evenzo vormen koepokvirus-recombinanten op basis van vP293 die hetzij C7L hetzij het gen voor 77 kDa bevatten (resp. vP638 en vP698) op LLC-PKl-cellen plaques. Behalve dat het koepokgen voor 77 kDa een gastheerverschei-denheidsgen voor het ovarium van de Chinese hamster (54) en menselijke cellen is is het ook een gastheerverscheiden-heidsgen voor varkenscellen.

Voorbeeld 10

Groei van Kopenhagen-weglatingsmutanten op menselijke cellijnen.

Onder gebruikelijke groeiomstandigheden (3 dagen met een afdekkende laag Noble Difco agar) maakte wegla-tingsmutant vP293 van de WR-stam op monolagen van menselijke MRC-5-cellen geen plaques. Maar met een langere incubatie of opgelegde afdekking met agar kan vP293 op monolagen van MRC-5-cellen kleine plaques vormen. Om precies te zijn, gebruik van 0,6 % of 1 % Seakem-agarose of laagsmeltende agarose voor de afdekkende laag in plaats van agar begunstigt de vorming van kleine plaques van virus vP293 op MRC-5-cellen. De nakomelingen van recombinant-pokkenvirus, gevormd door recombinatie van vP293 met plasmiden op basis van pHES, die het gen KIL bevatten (voorbeeld 3) geven op een monolaag van MRC-5 grote plaques, die duidelijk te onderscheiden zijn van de achtergrond met kleine plaques van vP293 zelf. Daarom werd het vermogen van vP293 en van de Kopenhagense serie van weglatingsmutanten om onder afdekking met vloeistof een beperkte infectie van MRC-5- en VERO-cellen te veroorzaken, onderzocht.

T-75-kolven werden in duplo beënt met 5 x 106 MRC-5- of VERO-cellen, zoals aangegeven. Na twee dagen werden de vervloeiende monolagen conform tabel 3 met gemiddeld 0,01 pve per cel (dus 103 pve per kolf) aan koepokvirus in 0,5 ml MEM + serum van pasgeboren kalveren beënt. Na 1 uur adsorptie werd 10 ml medium aan iedere kolf toegevoegd. Eén kolf van iedere serie werd direct ingevroren (het monster van 1 uur). De overige kolven werden tot 96 uur na de infectie bij 37°C geïncubeerd en dan ingevroren. Uit alle monsters werd het virus geoogst door drie cycli van bevriezen en opdooien; de virus-titer werd op VERO-cellen bepaald.

MRC-5- en VERO-cellen werden beënt met gemiddeld 0,01 pve per cel. Na 96 uur incuber en werd het virus geoogst en werd op VERO-cellen de titer ervan bepaald. Kopenhagen-mutanten met weglatingen of van het gen voor infecteren van menselijke cellen (vP661, C7L+' K1L-) en vP706 (C7L“, K1L+) vertoonden ongeveer een zelfde vermenigvuldiging (3 tot 4 10 log) op zowel MRC-5- als op VERO-cellen, overeenkomende met die van de blanco VP410 (C7L+, K1L+) . Kopenhagen-mutanten waaruit zowel de genen voor groei op menselijke cellen [vP716 (C7L-, KIL- en vP668 (C7L t/m KIL)-] alsmede de weglatingsmutant vP293 van de WR-stam (weglating van 21,7 kb) vertoonden op VERO-cellen een vermenigvuldiging ongeveer overeenkomende met die van vP410, vP661 en vP706. Vermenigvuldiging van de weglatingsmutanten vP716, vP668 en vP293 was op menselijke MRC-5-cellen uitgesproken positief, hoewel duidelijk minder dan de vermeerdering van deze virussen op VERO-cellen. Onder de hier toegepaste omstandigheden zijn alle drie koepokvirus-sen, VP716, VP668 en vP293, waaruit genen KIL en C7L weggelaten zijn, tot zelfvermeerdering in staat, hoewel duidelijk minder tot infectie van menselijke MRC-5-cellen • (na 96 uur infectie was er ongeveer 10 maal zoveel van nodig). Deze uitkomsten, getoond in tabel 4, zijn in overeenstemming met een eerdere vermelding van 2,3 maal zo hoge titer op 36 uur na de infectie (6).

(1) De titer van de inzet was 103.

(2) Verhouding van de titer 96 uur na de infectie tot de titer na 1 uur (einde van de adsorptie).

Om na te gaan of koepokvirus, waaruit de genen voor het infecteren van menselijke cellen, C7L en KIL weggelaten waren, in staat is tot een beperkte vermeerdering op menselijke cellijnen anders dan MRC-5, werd de vermenigvuldiging van virusmutant VP668 van de Kopenhagen-stam [C7L t/m KIL weggelaten] op nog drie andere menselijke cellijnen vergeleken met die op MRC-5- en VERO-cellen (tabel 5).

Twee dagen voor de infectie werden er cellen uitgezet in Petri-schalen van 60 mm, 1,5 x -106 per schaal. In 0,5 ml MEM + 5 % serum uit pasgeboren kalveren werd koepokvirus vP410 of vP668 in een concentratie van 0,01 pve per cel in duplo toegediend. Na een adsorptie van 1 uur werd 4 ml medium in elke schaal gebracht en de helft van de

Petri-schalen werd bevroren (monsters van 1 uur na infectie) . De overige schalen werden 96 uur bij 37°C geïncubeerd en dan ingevroren (monsters na 96 uur). Alle monsters werden geoogst door drie maal opvriezen en weer ontdooien, en de virustiter op de VERO-cellen werd bepaald. Na iedere te noemen tijd werden er twee schalen opgenomen en werd er de titer in bepaald; opgegeven zijn de gemiddelden daarvan. Vermeerdering van ieder virus op iedere cellijn is uitgedrukt in de verhouding van de titer 96 uur na infectie tot de titer 1 uur na infectie.

(1) Gebruikte cellijnen; VERO: Apennier ATCC CCL 81; MRC-5: longen van het menselijke embryo ATCC CCL 171; HeLa: epitheel-carcinoom van de menselijke cervix ATCC CCI 2; WISH: Menselijk amnion (HeLa merken) ATCC CCI 25; Detroit: Menselijke voorhuid ATCC CCI 54.

(2) % Opbrengst aan vP668/vP410 is bij iedere cellijn de verhouding tussen de vermeerdering van het vP668 (96 hpi/1 hpi) gedeeld door die verhouding van het vP410 (96 hpi/1 hpi) X 100.

Virus vP668 vertoont op MRC-5-cellen na 96 uur incubatie een vermeerdering” van één log-eenheid. Opbrengsten van virus vP668 96 uur na de infectie is op Detroit-cellijn (menselijke voorhuid) 2,8 maal de titer 1 uur na de infectie. Bij WISH-cellen (van het menselijke amnion) en HeLa cellen (carcinoom van het menselijke cervix epitheel) waren de opbrengsten van virus vP668 96 uur na infectie minder dan wat men na 1 uur vond, wat aangeeft dat er geen vermeerdering van de gastheerweglatingsmutant op deze Kopenhagen-cellijnen was. Alle cellijnen lieten groei van koepokvirus toe, wat blijkt uit vermeerdering van het blanco virus vP410. Anderen hebben ook verschillen gevonden tussen de vermogens van de diverse menselijke cellijnen voor het toelaten van groei van de daarvoor specifieke mutanten (6).

Voorbeeld 11

Koepokvirus-mutanten voor diverse gastheren als vectoren van vaccins.

Gastheer-mutanten van koepokvirus zouden voordelen geven als vectoren van recombinant-vaccins. Beperking of afwezigheid van de vermeerdering zou een veiliger gevoel geven daar de virusfactor zich in de bedoelde soort, bijvoorbeeld mens of varken, moeilijker vermeerdert, zoals hierboven beschreven is. Dit zou met voordeel de kans op een uit de hand gelopen infectie ten gevolge van vaccineren wegnemen en ook de overdracht van gevaccineerde op niet-gevaccineerde personen alsmede besmetting van de omgeving verminderen.

Hiertoe zijn deze gastheer-mutanten nuttige vaccin-vectoren. De wegelatingsmutant vP293 (voorbeeld 3) herbergt een vreemd genetisch element. Zijn ook recombinanten met genen voor het pseudorabies-virus (beslist een varkensvaccin) en recombinanten die het glycoproteïne van rabies-virus (niet alleen van veterinair belang maar ook voor menselijke toepassingen) hier opgebouwd en zijn hier beschreven. Men kan makkelijk inzien dat een verscheidenheid van vreemde genen in deze gastheermutanten gebruikt kan worden. Verder kan men makkelijk inzien dat nog andere soorten, naast de in deze beschrijving genoemde, in aanmerking komen voor beperking van hun gastheren met de hier beschreven methoden.

Verder kan men makkelijk inzien dat er in het pokkenvirus nog meer genen voor de gastheerverscheidenheid bestaan. Bijvoorbeeld wordt de MVA-stam van koepokvirus gezegd verzwakt te zijn, vooral in dieren met onderdrukte immuniteit. Kortgeleden is vermeld dat het menselijke gen voor gastheerschap KIL in MVA gedeeltelijk weggelaten is (55). Onderhavig onderzoek van het MVA-genoom bevestigt het vermelde wegwerken van het gen KIL, maar geeft aan dat het tweede menselijke gen voor gastheerschap, C7L, in MVA aanwezig is, zelfs al geeft het koepokvirus MVA op menselijke cellen geen plaques. Het promotorgebied bovenstrooms van het gen C7L in MVA is identiek aan het hier getoonde bovenstroomse gebied van de Kopenhagen-stam. De aminozuur-volgorde in het beweerde vertalingsprodukt van C7L van MVA is identiek aan dat van de Kopenhagen-stam. Dat geeft aan dat het menselijke gen voor gastheerschap C7L, dat zowel in WR als in Kopenhagen functioneel gelijkwaardig lijkt te zijn aan het menselijke gen KIL voor gastheerschap, zelf niet in staat is groei van het koepokvirus MVA op menselijke cellen te bepalen. Verder geeft vervangen van het beschadigde gen KIL in MVA door intact gen KIL uit de Kopenhagen-stam het hybride virus nog niet het vermogen op menselijke cellen te groeien.

Het koepokvirus MVA is ook beschadigd in zijn vermogen op apencellen te groeien, wat de suggestie geeft van nog andere, tot nog toe niet geïdentificeerde genen voor het gastheerschap. Met net zulke benaderingen als hier toegepast zou het dus mogelijk zijn de genen voor deze beperkingen te definiëren.

Verder wordt goed ingezien dat andere pokkenvirussen zoals voor vogelpokken en varkenspokken voor vermeerdering beperkt zijn tot vogels en varkens als gastheer. Deze gastheerbeperkingen geven duidelijk de suggestie van het bestaan van een aantal genen voor gastheerschap in de pokkenvirussen. Definitie van deze genen door in deze octrooibeschrijving gedefinieerde benaderingen kan het repertoir van de opgebouwde verscheidenheid aan pokkenvirus -vectoren uitbreiden.

Voorbeeld 12

Inbouwen van het rabies-gen voor glycoproteïne in de TK-weglatingsplaats van diverse weglatingsmutanten van de Kopenhagen-pokkenvirussen.

Het gen voor rabies-glycoproteïne werd gekozen als model voor een in diverse weglatingsmutanten van de Kopen-hagen-pokkenvirusstam in te bouwen vreemde antigenen zodat een vergelijkend onderzoek van de effecten van deze weglatingen ten opzichte van elkaar mogelijk was. Het gen voor het rabies-glycoproteïne (18, 42) werd onder controle van de synthetische promotor H6 van het koepokvirus geplaatst. Deze expressie-cassette werd in het vectorplasmide pSD513VC van de Kopenhagen-stam geplaatst. pSD513VC is een onderkloon van het HindlII J-fragment van het Kopenhagen-pokken-virus waarin het voor thymidine-kinase coderende gen (56) vervangen is door een meervoudig verbindingsgebied. Het meervoudige verbindingsgebied omvat de reeks 5'-CCCGGGAGATCTCTCGAGCTGCAGGGCGCCGGATCC-3' die de restrictieplaatsen Smal, BglII, Xhol, PstI, Narl en BamHI omvat. Het verkregen plasmide dat het gen voor rabies-glycoproteïne bevatte kreeg de aanduiding pRW842. In pRW842 zijn de reeksen van het koepokvirusgen TK vervangen door de cassette met promotor H6 en gen voor rabies-glycoproteïne, welke ten opzichte van de flankerende armen van rechts naar links georiënteerd is. Recombinatie van pRW842 met welk koepokvirus dan ook leidt tot een TK”-virus waarin het gen voor het rabies-glycoproteïne onder controle van promotor H6 staat.

Recombinatie werd uitgevoerd van pRW842 met een serie Kopenhagen-koepokvirussen waaruit één van de of beide genen voor menselijke gastheren weggelaten was. De verkregen serie van koepokvirus-recombinanten met het gen voor rabies-glycoproteïne zijn opgesomd in tabel 6. VERO-cellen (uit apen) werden met deze serie koepokvirus-recombinanten met het rabiesgen geïnfecteerd. Met een monoklonaal voor rabies-glycoproteïne specifiek antilichaam (42) werden immuunprecipitaties uitgevoerd. Alle recombinanten brengen dit gen tot expressie.

Tabel 6

Weqlatinqsmutanten van de Kopenhaoen-stam die het qlvcoproteïne-gen van rabies bevatten

Moeder- Plasmide- Recombinant- Dele- Expressie van virus donor virus ties het rabies- _qlvcoproteïne VP410 pRW842 VP744 TK + VP661 pRW842 VP745 TK, KIL + VP706 pRW842 VP746 TK, C7L + VP716 pRW842 VP750 TK, C7L, KIL + VP668 pRW842 VP752 TK, [C7L - KIL] +

Koepokvirus-recombinant vP750 bevat het gen voor rabies-glycoproteïne in een achtergrond van C7L, KIL. VP752 bevat het rabiesgen in een achtergrond waaruit C7L t/m KIL weggelaten zijn. Daar beide genen voor menselijke gastheer-, verscheidenheid in deze beide koepokvirus-recombinanten ontbreken was infectie van menselijke cellen door deze recombinanten niet te verwachten. Om na te gaan of het rabiesgen bij afwezigheid van menselijke genen voor gast-heerverscheidenheid in menselijke cellen tot expressie kan komen werden MRC-5-cellen met de complete serie koepokvirus-recombinanten geïnfecteerd, waaronder ook vP750 en VP752. In alle gevallen werd op het oppervlak van de geïnfecteerde cellen immunofluorescentie waargenomen.

Voorbeeld 13

Klonen en expressie van pseudorabies-genen op een achtergrond van VP668.

Als basisvector werd VP668 gekozen, de Kopenhagen-stam van de weglatingsmutant waaruit een stuk weggelaten is -dat de afstand tussen het menselijke en het varkensgen voor gastheerverscheidenheid overspant (C7L t/m KIL). vP668 vormt noch op menselijke cellen MRC-5 noch op varkensnier-cellen LLC-PK1 plaques (zie tabel 3) . Pseudorabies-genen gil, gill en gp50, die homologie met genen gB, gC en gD van het virus voor herpes simplex vertonen (resp. 57, 58 en 59) werden op de hieronder te schetsen wijze in de vector vP668 ingebouwd.

A. Inbouwen van het PRV-gen gil voor glycoproteïne in de HA-weglatingsplaats van het Kopenhagen-koepokvirus.

DNA van PRV werd met BamHI verteerd en de ontstane fragmenten werden gekloond in pBR322 dat met BamHI opengeknipt was. Plasmide pPR9,25, met daarin het BamHI-fragment 1 van PRV (60) bevat het complete gen voor PRV-glycopro-teïne gil. Delen van pPR9,25 met daarin het gen voor gil werden ondergekloond in pBR322, in pUC18 en in faag M13. De nucleotidenvolgorde in het gen gil is aleens bepaald (46).

De coderende reeksen van het PRV-gen voor ' gil werden ingebouwd in het vectorplasmide pTP15 van het pokkenvirus (50). In het ontstane plasmide pPR18 was het gen voor gil geplaatst in de ruimte vrijgekomen door het weglaten van het hemagglutinine-gen van het Kopenhagen-, koepokvirus dat onder controle van promotor H6 staat. Recombineren van plasmide pPR18 met de weglatingsmutant VP668 van het Kopenhagen-koepokvirus leidde tot de koepok-recombinant vP726. In vP726 zit het PRV-gen voor gil in de HA-weglatingsplaats die onder controle van de vroeg/late promotor voor H6 staat. Al het DNA dat 5' of 3' ten opzichte van het PRV-gen lag was verwijderd. Een reeks die de beëindiging van het vroege overschrijven van koepokvirus bepaalt (39) is benedenstrooms van de voor gil coderende PRV-reeksen ingevoegd.

B. Inbouwen van het PRV-gen gp50 in de ATI-weglatingsplaats van het Kopenhagen-koepokvirus.

Het gen dat voor het PRV-glycoproteïne gp50 codeert zit in het BamHI-fragment 7 van het PRV-genoom (61). Plasmide pPR7.1 bevat het BamHI-fragment 7 van PRV, gekloond op de BamHI-plaats van het pBR322. Een met Stul en Ndel verkregen subfragment van pPR7.1 bevat het complete gen voor het PRV-eiwit gp50 en werd in pIBI25 ondergekloond, wat plasmide pPR22 gaf. De nucleotidenvolgorde van het gen voor gp50 is bepaald (46).

De in PRV voor gp50 coderende reeksen werden onder controle geplaatst van de vroeg/late koepok-promotor overeenkomende met de direct bovenstroomse reeksen van I3L (62, 63) . Dit promotorelement is eerder gebruikt voor het tot expressie brengen van vreemde genen in koepokvirus-recombi- . nanten (31, 64). DNA overeenkomende met de promotorreeksen bovenstrooms van het open afleeskader I3L (62) werd gesynthetiseerd met een polymerasekettingreactie (65) uitgaande van synthetische oligonucleotiden als aanzetstukken P50PPBAM

(5'-ATCATCGGATCCCGGTGGTTTGCGATTCCG-3'), P5OPPATG (5'-GATTAAACCTAAATAATTG-31) en pMPlVC, een onderkloon van Kopenhagen-HindlII I als matrix. Het ontstane fragment werd met BamHI verteerd, wat aan het 5'-einde van de promotor-reeks een kleverig einde gaf. Het 3'-einde bleef stomp.

De PRV-reeksen die voor gp50 coderen werden uit plasmide pPR22 geknipt. Plasmide pPR22 werd met -Nsil verteerd, dat 7 baseparen bovenstrooms van ATG doorknipt en een overhangend 3'-einde geeft. De 3'-overhang werd met DNA-polymerase uit T4 in aanwezigheid van 2 mM dNTPs stomp gemaakt. Het ontstane DNA werd gedeeltelijk met BglII verteerd en een BglII-fragment van 1,3 kb met stomp uiteinde, met daarin het PRV-gen voor gp50 werd geïsoleerd.

Het promotorfragment I3L van 126 bp (BamHI/stomp) en het genfragment van 1,3 kb voor gp50 (stomp/BglII) werden in plasmide pBS-SK geligeerd (van Stratagene te La Jolla, CA) dat van te voren met BamHI verteerd was. Het ontstane plasmide kreeg de aanduiding pBSPRV5013. De ex-pressiecassette, met daarin promotor I3L gekoppeld aan PRV-gen voor gp50 werd door vertering, eerst met BamHI en daarna gedeeltelijk met Smal, verwijderd. Een fragment van 1,4 kbp met daarin promotor I3L en het PRV-gen voor gp50, werd geïsoleerd en met het Klenow-fragment van DNA-polymerase uit E.coli stomp gemaakt.

pSD541 is een Kopenhagen-weglatingsplasmide waarvan de flankerende armen aan het ATI-weglatingsgebied (zie pSD494VC) gegenereerd werden door polymerase-ketting-reactie (PCR) (65) met subklonen van Kopenhagen-HindlII A als matrix. Synthetische oligonucleotiden MPSYN267 (5'-GGGCTGAAGCTTGCGGCCGCTCATTAGACAAGCGAATGAGGGAC-3·) en MPSYN268 (5'-AGATCTCCCGGGCTCGAGTAATTAATTAATTTTTATTACACCAGAAAAGAC GGCTTGAGATC-3') werden als aanzetstukken gebruikt voor het maken van de koepokkenarm van 420 bp rechts van de weglating. Synthetische oligonucleotiden MPSYN269 (5'-TAATTACTCGAGCCCGGGAGATCTAATTTAATTTAATTTATATAACTCAT TTTTTGAATATACT-3') en MPSYN270 (5'-TATCTCGAATTCCCGCGGCTTTAAATGGACGGAACTCTTTTCCCC-3·) werden als aanzetstukken bij het maken van de koepokkenarm van 420 bp links van de weglating. De aldus gemaakte linker- en rechter-koepokarmen werden met elkaar gemengd en verder verlengd door polymerasekettingreactie, wat een DNA-fragment gaf dat zowel de rechter als de linker flankerende koepokarm had, gescheiden door een meervoudig verbindingsgebied met daarin de restrictieplaatsen BglII, Smal en Xhol. Het met polymerase kettingreactie gemaakte fragment werd er met HindlII en EcoRI uitgeknipt (en had toen kleverige uiteinden) en in pUC8 geplakt dat met HindlII en EcoRI opengeknipt was. Het ontstane plasmide is pSD541.

Het fragment van 1,4 kb met stomp uiteinde, met daarin de promotor I3L en het PRV-gen voor gp50 werd ingebouwd in het vectorplasmide pSD541 dat met Smal verteerd was. In het ontstane plasmide, pATIp50, lag het PRV-gen voor gp50 in de Kopenhagen-ATI-weglatingsplaats onder controle van het promotorelement I3L van 126 bp. In pATIpSO is al het DNA dat 3' ten opzichte van het gen ligt verwijderd. Van die PRV-reeks was 7 bp overgebleven direct boven-strooms van het PRV-ATG voor gp50. Een reeks voor het vroeg beëindigen van het overschrijven (39) lag benedenstrooms van de voor gp50 coderende reeksen. Recombineren van pATIp50 en de Kopenhagen-weglatingsmutant vP668 werd uitgevoerd.

C. Invoegen van het PRV-gen voor glycoproteïne gill in de TK-weglatingsplaats van het Kopenhagen-koepokken-virus.

De reeksen die voor PRV-glycoproteïne gill coderen tekenen kaart aan BamHI-fragmenten 2 en 9 van het PRV-genoom (58). Plasmiden pPR9.9 en pPR7.35 bevatten respectievelijk BamHI-fragmenten 2 en 9 van pRV die in de HamHI-plaats van pBR322 gekloond zijn. Een met Sphl en BamHI verkregen fragment dat het 51-einde van het PRV-gen voor gill bevatte werd uit pPR9.9 geïsoleerd. Een met Ncol en BamHI verkregen fragment dat de rest van het gen voor gill bevatte werd uit pPR7.35 geïsoleerd. Het complete PRV-gen voor gill werd in elkaar gezet door de twee fragmenten in pIBI25 te ligeren, wat tot plasmide pPR17 leidde. De nucleotidenvolgorde in het gen gill is al bepaald (46).

Het PRV-gen voor gill werd onder controle geplaatst van een koepokken-promotorelement u, wat tot plasmide pPR24 leidde (koepokken-promotorelement u is beschreven in voorbeeld 5 en fig. 5). Een expressiecassette die koepokken-promotorelement u van 120 bp en het complete' v PRV-gen voor gpIII bevatte werd door vertering met SnaBI uit plasmide pPR24 geknipt (op plaats -120 bovenstrooms van het startcodon en met Dral benedenstrooms van het PRV-gen voor gill). Een fragment van 1,5 kb met stomp uiteinde, met daarin de promotor u en het PRV-gen voor gpIII werd geïsoleerd en in het Smal opengeknipte vectorplasmide pSD513VC geligeerd wat pPRVIIIVCTK gaf. In pPRVIIIVCTK zijn de voor koepokken-TK coderende reeksen vervangen door het PRV-gen voor gill dat met een oriëntatie van rechts naar links onder controle van het -koepokken-promotorelement u staat. Alle PRV-reeksen 5 * en 3' buiten het gen voor gill waren nu verwijderd. Recombineren van plasmide pPRVIIIVCTK met de koepokken-weglatingsmutant vP668 werd uitgevoerd.

D. Expressie van PRV gil in koepokken-recombinant VP726.

Expressie van het PRV-DNA voor gil in de koepokkenrecombinant VP726 werd beproefd in VERO-, LLC-PK1- en MRC-5-cellen. Het VP726 bevat het PRV-DNA voor gil op een achtergrond van VP668 (C7L t/m KIL weggelaten) en dus mag men er geen produktieve infectie van verwachten van LLC-KPl-cellen uit varkensnier of met menselijke MRC-5-cellen. Desalniettemin vond men bij immunofluorescentie-analyse met een monoklonaal, voor PRV-DNA voor gpll specifiek antili-chaam verrassenderwijs de expressie van het produkt gpll van het PRV-DNA in varkens-, apen- en menselijke cellen.

E. Constructie van dubbele en drievoudige PRV-recombinanten in een achtergrond van koepokkenvirus vP668.

Recombineren werd uitgevoerd bij het opbouwen van koepok-recombinanten die meervoudige PRV-genen bevatten. Recombinaties zijn uitgevoerd met donorplasmiden pATIp50 (PRV voor gp50 met ATI-weglatingsplaats) en pPRVIIIVCTK (met PRV-DNA voor gill en een TK-weglatingsplaats) met het reddende virus vP726 en de koepokken-recombinant met het PRV-gen voor gil in de HA-weglatingsplaats met een achtergrond waaruit C7L t/m KIL weggelaten waren. Deze recombinaties leiden tot koepok-recombinanten met dubbele invoegingen, van respectievelijk PRV-genen gil + gp50 en gil + gill. Van deze dubbele PRV-recombinanten werd er één gebruikt als reddend virus bij het recombineren met het geëigende plasmide voor het genereren van de drievoudige recombinant die de PRV-genen gil, gp50 en gill bevatte.

Voorbeeld 14

Constructie van een Kopenhagen-koepokvirus op basis van het gastheerverscheidenheidssysteem.

Om een gastheerverscheidenheidssysteem op basis van een Kopenhagen-koepokvirus op te bouwen werden plasmi-den gemaakt voor het weglaten van het DNA dat het gehele gebied van gen voor C7L links tot en met het gen voor KIL rechts omvat (fig. 8). Koepokkenvirus -dat deze weglating omvat mag niet verwacht worden op menselijke cellen te groeien daar hieruit zowel gen C7L (voorbeeld 7) als gen KIL (15) weggelaten zijn. Ook werden plasmiden opgebouwd waaruit het gebied weggelaten is dat zich van C6L t/m KIL uitstrekt. Daar de weglating van C6L t/m KIL het menselijke gen voor gastheerverscheidenheid C7L niet verwijdert mag men van die koepokkenvirussen verwachten dat ze op menselijke cellen groeien.

Let nu op fig. 14. Een plasmide pSD420, met daarin een Sall-kloon van het koepokkenvirus-DNA (fig. 8, 10) werd bereid. Een fragment van het HindlII C-gebied van dat koepokken-virus van de Kopenhagen-stam werd hiervan afgeleid door pSD420 op plaats 685 met Xbal open te knippen, gevolgd door stomp maken van het uiteinde met het Klenow-fragment van DNA-polymerase uit E. coli en door splitsing met BglII op plaats 1764. Het verkregen fragment van 1079 bp werd over een agarose-gel geïsoleerd. pSD451 (fig. 9, 14) is een plasmide dat het koepokken-DNA tussen de aangrijpingspunten voor Sphl in HindlII M (plaats 9478) en voor Kpnl in HindlII K (plaats no. 12998) omvat. Een fragment van het HindlII K-gebied van de Kopenhagen-stam van het koepokvirus werd uit pSD451 afgeleid door splitsing met BglII (plaats 11116) en met EcoRV (plaats 11834). Het restrictiefragment van 718 bp werd over een agarose-gel geïsoleerd. Beide fragmenten werden geligeerd in pUC8 dat met HindlII opengeknipt, met het Klenow-fragment van DNA-polymerase uit E. coli stomp gemaakt en met Smal verder doorgesneden was (fig. 14). Het ontstane plasmide kreeg de aanduiding pMP581CK. pMP581CK omvat het gen C7L (zwart segmentje, richting van overschrijven met pijl aangegeven). pMP581CK heeft een unieke BglII-plaats, aan de linker zijde geflankeerd door een van HindlII C afgeleide koepokvirusarm (plaatsen 685-1764) en rechts door een van HindlII K afgeleide koepokvirus-arm (plaatsen 11116-11834). De linker koepokvirusarm bevat het complete gen voor C7L (plaatsen 1340-863). Ten opzichte van het Kopenhagen-koepokvirusge-noom zijn de twee armen gescheiden door een weglating van 9351 bp (plaatsen 1315-11115). De weglating tussen HindlII

C- en HindlII K-reeksen is in fig. 14 met een driehoekje aangegeven.

Om de overmaat DNA bij de weglatingskoppeling te verwijderen werd pMP581CK met BglII opengeknipt, gevolgd door vertering met exonuclease Bal 31. Mutagenese (53) werd op het dubbelstrengige matrix uitgevoerd met behulp van een synthetisch 49-delig oligonucleotide MPSYN228 (5 ' -TTTCTTAATAAATATTATTTTTATTTAAATTCGTAGCGATATATAAAAC-3 ' ) . Het ontstane plasmide, pMPCTKlA, heeft nog het menselijke gastheerverscheidenheidsgen C7L. De plaatsen 1513 t/m 11165 zijn eruit weggelaten, en evenzo de elf genen C6L t/m KIL (fig. 8). Recombineren van plasmiden pMPCTKlA en vP458, een recombinant van het Kopenhagen-koepokvirus met het gen uit E.coli voor lacZ, in de M2L-weglatingsplaats leidde tot de koepokvirus-recombinant vP664. Zoals verwacht kan vP664 op menselijke cellen geen plaques vormen, daar het nog een intact gen C7L bevat.

Om de voor C7L coderende reeksen en de overmaat DNA (plaatsen 1314-863) uit de weglatingskoppeling weg te werken werd pMP581CK met Ncol doorgeknipt, gevolgd door vertering met exonuclease Bal31. Mutagenese (53) werd uitgevoerd op het dubbelstrengige matrix met behulp van een 44-delig oligonucleotide MPSYN233 (5'-TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3'). Uit het ontstane plasmide, pMPCSKlA, werd het stuk tussen plaatsen 862 en 11163 weggelaten en ook de twaalf genen C7L t/m KIL. Recombineren van plasmiden pMPCSKlA en vP458 gaf de koepokvirus-recombinant vP668. Zoals verwacht was vP668 niet in staat op menselijke cellen plaques te vormen, daar beide genen voor menselijke gastheren, KIL en C7L, er aan ontbreken.

Een serie plasmiden werd afgeleid van pMPCTKlA door er op de weglatingskoppeling het meervoudige verbindingsstuk DNA aan toe te voegen. Opbouw· van plasmiden gastheerselectiesystemen op basis van het Kopenhagen-koepokvirus is weergegeven in fig. 15 t/m 17. DNA-reeksen voor alle synthetische nucleotiden die bij het opbouwen van •deze plasmiden gebruikt werden zijn in fig. 15-17 aangege- ven.

Plasmide ρΜΡΟΤΚΙΔ (fig. 14) onderging gedeeltelijke vertering door Dral en een onvertakt stuk DNA werd over een agarose-gel geïsoleerd. Synthetische oligonucleotiden MPSYN238 en MPSYN239 werden afgestompt en in pMPCTKlA geligeerd in de weglatingskoppeling met een oriëntatie van rechts naar links, wat tot plasmide pMPCS-1 leidde.

Om een stopcodon toe te voegen aan een klein open afleeskader dat van links in het meervoudige verbindingsgebied steekt (ATG op plaats 1485) werd pMPCS-1 met PstI opengeknipt. Mutagenese (53) werd uitgevoerd met een synthetisch 72-delig oligonucleotide MPSYN249 (5'-GTTTGTTTTATATATCGCTACGAATTTAAATAAAAATTATTTATTTAT AGATCTAGAGTCGACCCGGGTACC-3'). Het ontstane plasmide, pCOPCS-4 (in fig. 17 met zijn andere benaming pMPCS-4 aangeduid) heeft geen open afleeskaders die in of juist uit het meervoudige verbindingsgebied steken.

Om de koepokkenpromotor H6 aan het meervoudige verbindingsgebied te koppelen werd pMPCS-1 met HindlII en Asp718 doorgeknipt. Een synthetisch HindIII/Asp718-fragment van het DNA, met daarin de gemodificeerde promotor H6 (voorbeeld 3) werd er ingevoegd, wat tot plasmide pC0PCS-3H leidde (de DNA-volgorde opgegeven in fig. 17). Alle daarop volgende plasmiden, pC0PCS-5H t/m pCOPCS-lOH, afgeleid van PC0PCS-3H, bevatten het promotorgebied H6 dat. in fig. 17 voor pC0PCS-3H aangegeven is. Het stuk tussen vierkante haken na het promotorgebied in pC0PCS-3H is door de voor pC0PCS-5H t/m pCOPCS-lOH aangegeven stukken tussen vierkante haken vervangen. Het startcodon ATG voor plasmiden pC0PCS-6H t/m pCOPCS-lOH zijn onderstreept. Merk op dat pC0PCS-3H en pC0PCS-5H geen begincodon ATG bovenstrooms van het meervoudige verbindingsgebied bevatten. Het vertalings-kader dat in plasmiden pC0PCS-6H t/m pCOPCS-lOH met het ATG beginnen is aangegeven. Om een stopcodon aan het hierboven al genoemde kleine open afleeskader pMPCS-1 toe te voegen werd met MPSYN249 net zo’n mutagenese uitgevoerd op pCOPCS-3H, wat tot plasmide pC0PCS-5H leidde.

Om het startcodon in alle afleeskaders beneden- strooms van het meervoudige verbindingsgebied H6, toe te voegen werd pC0PCS-5H in de promotor H6 op de Nrul-plaats en in het meervoudige verbindingsgebied op de BglII-plaats doorgeknipt. Het vectorfragment werd over een agarose-gel geïsoleerd. Synthetische oligonucleotiden MPSYN250 en MPSYN251 werden afgevlakt en in vector pC0PCS-5H ingebouwd, wat tot plasmide pC0PCS-6H leidde.

Synthetische oligonucleotiden MPSYN252 en MPSYN253 werden afgestompt en in vector pC0PCS-5H ingevoegd, wat tot plasmide pC0PCS-7H leidde.

Synthetische oligonucleotiden MPSYN254 en MPSYN255 werden afgevlakt en in de vector pC0PCS-5H ingebouwd, wat tot plasmide pC0PCS-8H leidde.

pC0PCS-6H, PC0PCS-7H en pC0PCS-8H hebben in de drie verschillende afleeskaders de promotor H6 met het startcodon ATG direct gevolgd door de restrictieplaatsen. De eerste twee in deze plasmiden gecodeerde aminozuren zijn: met/val voor pC0PCS-6H, met/gly bij pC0PCS-7H en met/gly bij pC0PCS-8H. Daar het motief met/gly in sommige contexten (66) mesitylering van het vertaalde polypeptide kan afdwingen werd plasmide pC0PCS-6H zodanig gemodificeerd dat het startcodonen ATG in de andere twee afleeskaders heeft, waarin, net als in pC0PCS-6H, de vertaling niet met het tweetal met/gly begint. pC0PCS-6H werd met Nrul en Asp718 doorgeknipt en het vectorfragment werd over een agarose-gel geïsoleerd. Synthetische oligonucleotiden MPSYN271 en MPSYN272 werden afgevlakt en in vector pCOPCS-6H ingevoegd, wat tot plasmide pC0PCS-9H leidde.

Synthetische oligonucleotiden MPSYN273 en MPSYN274 werden afgevlakt en in vector pC0PCS-6H ingebouwd, wat tot plasmide pCOPCS-lOH leidde. De eerste twee aminozuren die door deze plasmiden gecodeerd worden zijn: met/ser voor pC0PCS-9H en met/thr voor pCOPCS-lOH.

In de uiteindelijke gastheerselectieserie op basis van Kopenhagen-koepokvirus werd DNA met daarin de coderende reeks en zijn promotor voor expressie in pCOPCS-4 ingebouwd; coderende reeksen met een ATG werden voor expressie ingebouwd in pC0PCS-5H, en coderende reeksen zonder start- codon ATG werden voor expressie in het geëigende afleeska-der van één of meer leden van de serie pC0PCS-6H t/m pCOPCS-lOH. De ontstane plasmiden werden in de weglatings-mutant vP668 van het Kopenhagen-koepokkenvirus ingebouwd, wat het vermogen van het koepokkenvirus op menselijke cellen plaques te geven herstelde.

Voorbeeld 15

Nut van het COPCS-systeem voor de analyse van de promotor-sterkte.

Het vermogen van de nakomelingen van recombinaties van het Kopenhagen-koepokvirus VP668 met plasmiden van het gastheerselectiesysteem om op MRC-5-cellen plaques te vormen maakt een snelle identificatie van recombinanten mogelijk. Het vP668/C0PCS-systeem kan gebruikt worden voor het genereren van koepokvirus-recombinanten voor uiteenlor pende doeleinden.

Plasmide pCOPCS-4, een lid van de COPCS-serie dat bovenstrooms van zijn meervoudig verbindingsgebied geen promotor heeft, werd met BglII opengeknipt. Een BglII-fragment met het complete afleeskader voor het gen voor rabies-glycoproteïne (18, 42) werd in pCOPCS-4 ingebouwd, met een oriëntatie van rechts naar links, wat tot plasmide pCOPCS-RAB leidde. In pCOPCS-RAB ligt het meervoudige verbindingsgebied bovenstrooms van het rabies-gen. Een verscheidenheid van synthetische promotorgebieden en van het koepokkenvirus of andere pokkenvirussen afgeleide promotoren is in het meervoudige verbindingsgebied van pCOPCS-jRAB ingebouwd, bovenstrooms van het gen voor rabies-glycoproteïne. De ontstane plasmiden werden in combinatie met de weglatingsmutant vP668 van het Kopenhagen-koepokkenvirus gebruikt. Nakomelingen van deze recombinant werden geselecteerd op hun vermogen op MRC-5-cellen plaques te geven. De relatieve promotorsterkte kan vastgesteld worden door expressie van het gen voor rabies-glycoproteïne in de nakomelingen van dit recombinant-virus met een monoklonaal antilichaam kwantitatief te maken. Andere mogelijkheden zijn vergelijkbaar met die van het gastheerselectiesysteem van vP293.

Voorbeeld 16

Weglaten van de omgekeerde eindstandige herhalingen van het koepokvirus.

Er kan uit koepokvirus veel DNA weggelaten worden zonder dat het vermogen tot groeien in weefselkweek verloren gaat. Om de stabiliteit van het koepokvirusgenoom te verhogen en niet-essentiële genen te verwijderen die met virulentie geassocieerd zouden kunnen worden werd één enkele recombinant opgebouwd uit 32,7 kb DNA van het linker uiteinde en 14,9 kb DNA van het rechter uiteinde.

Het genoom van het koepokvirus bestaat uit dubbel-strengig DNA. Bij ieder uiteinde is het DNA van de complementaire strengen verknoopt met een DNA-streng die een eindstandige lus met incomplete baseparing vormt (67). Direct binnen de eindstandige lus heeft het genoom series van tandem-herhalingen. Een gekloonde versie van het WR-genoom wordt gezegd nabij ieder uiteinde 13 tandem-kopieën van een herhalingseenheid van 70 bp te hebben, gescheiden door 450 bp niet-herhalend DNA uit een aanvullend blok van 17 tandem-kopieën van de herhalingseenheid van 70 bp (68). De eindstandige lus en het herhalende DNA vormen de veraf gelegen delen van de omgekeerde herhaling van het pokkenvirus. De omgekeerde eindstandige herhaling die bij de gekloonde versie van WR op 10 kb geschat wordt (69) heeft een aantal genen die, daar ze zowel in de linker als in de rechter kopie van de omgekeerde eindstandige herhaling zitten in het koepokkengenoom in twee kopieën aanwezig zijn.

Als DNA uit de via plaques gekloonde voorraad van hier gebruikte Kopenhagen-koepokvirus (VC-2) met restric-tie-enzymen verteerd en over een agarose-gel geanalyseerd wordt, vertonen de eindstandige fragmenten heterogeniteit. In plaats van als één enkele band te lopen verschijnen de eindstandige fragmenten als een ladder, die in grootte door ongeveer 1 kb gescheiden worden. Ongeveer 80 % van de van plaque-isolaten uit VC-2 of derivaten daarvan afgeleide virus-recombinanten blijken bij restrictieanalyse die heterogene uiteinden nog te hebben. In de overige 20 % van de koepokvirus-recombinanten is de heterogeniteit van de uiteinden verloren gegaan en verschijnen de restrictiefrag-menten van het uiteinde-DNA als afzonderlijke banden. Als nieuwe recombinanten afgeleid worden van virussen met duidelijke uiteinden worden die recombinanten altijd gevonden met duidelijke uiteinden.

Daar de uiteinden van het voorraadvirus VC-2 heterogeen waren verkozen wij in een plasmide het eindstan-dige fragment te klonen van een recombinant-virus vP452, een afgeleide van VC-2 met duidelijke uiteinden. vP452 mist de pokkenvirus-genen voor thymidinekinase en hemagglutinine (TK en HA) (50) . DNA werd uit vP452 geëxtraheerd en met Xhol verteerd, en de eindstandige band van 2 mol, van ongeveer 7 kb, werd over een agarose-gel geïsoleerd. Het geïsoleerde fragment onderging een beperkte vertering met het exonuclease Bal-31, gevolgd door stomp maken met het Klenow-fragment van DNA-polymerase uit E. coli. Het stomp gemaakte fragment werd op de Smal-plaats in pUC8 gekloond, wat pSD522VC gaf (fig. 18).

Het bepalen van de volgorde van het DNA van pSD522VC liet, net als bij de WR-koepokkenvirus, zien dat de uiteinden van de Kopenhagen-recombinant vP452 tandem-herhalingseenheden heeft. Naast de blokken van tandem-herhalingen van 70 bp, die voor de via plaques geïsoleerde WR-isolaten opgegeven worden, hebben de uiteinden van VP452 tandem-herhalingseenheden van 54 bp, die binnen de tandem-herhalingseenheden van 70 bp en tegenover de coderende reeksen liggen. Fig. 19 geeft een lijst van de volgorden in een deel van het Kopenhagen-genoom, beginnende met de meest inwendige kopie van de tandem-herhalingseenheid van 54 bp (plaatsen 1-54). De in fig. 19 weergegeven volgorde van 13978 bp was afgeleid van pSD522VC en van diverse klonen van het VC-2-Kopenhagen-DNA van plasmiden op basis van pUC. Daartoe behoren ook reeksen die in HindlII C rechts van het eindstandige blok van tandem-herhalingen coderen. De in fig. 19 weergegeven volgorde eindigt bij de Sall-plaats, welke het begin is van de in fig. 8 weergegeven DNA-reeks van het Kopenhagen-virus.

Om een plasmide te genereren dat het DNA bevat, dat zich in het einde van vP452 herhaalt maar uit de voor koepokvirus coderende reeksen weggelaten is werd pSD522VC met Clal en HindiII verteerd en werd er een fragment van 7 kb geïsoleerd.

Synthetische oligonucleotiden MPSYN261 (5'-CGATTCAGACACACGCTTTGAGTTTTGTTGAATCGAGATCTA-3') en MPSYN262 (5'-AGCTTAGATCTCGATTCAACAAAACTCAAAGCGTGTGTCTGAAT-3») werden afgevlakt en in het vectorfragment pSD522VC geligeerd, wat PMPVCEND gaf. pMPVCEND bevat het koepokvirus-DNA van het einde van pSD522VC (ongeveer 50 bp van het einde van het genoom) tot en met alle blokken van tandem-herhalingen en het eindigt bij het aangrijpingspunt voor Clal op plaats 338 (zie fig. 19). Een klein afleeskader (plaatsen 292-336) dat op plaats 305 het Clal-aangrijpingspunt kruiste, werd opgebouwd in de synthetische oligonucleotiden MPSYN261 en MPSYN262, die voor een gemakkelijker klonen in de toekomst ook een aangrijpingspunt voor BglII invoerden. pMPVCEND, dat vanuit het inwendige koepokvirus-DNA geen afleeskader naar het uiteinde had uitsteken, werd als plasmidevector gebruikt en als uitwendige arm bij het scheppen van plasmi-den bedoeld voor het wegwerken van genen uit linker en rechter uiteinden van het koepokvirus.

Nabij het linker einde werden alle genen tot en met het gen dat voor de kleine ondereenheid van het ribonu-cleotide-reductase codeert, dat in HindlII ligt (70) weggelaten. De DNA-volgorde werd in het Kopenhagen-HindlII F bepaald, en dat ziet men in fig. 20. Koepokvirus-HindlII F ligt direct rechts van HindlII K. De in fig. 20 weergegeven reeks DNA ligt direct naast de in fig. 8 weergegeven reeks, die de complete DNA-reeks van HindlII K omvat. De kleine voor ribonucleotide-reductase coderende ondereenheid wordt gecodeerd door het open afleeskader van F4 (plaatsen 3506-2547, fig. 20).

Om na te gaan of de tien genen (K2L t/m F4L) direct rechts van de weglating van vP668 (C7L t/m KIL) niet wezenlijk waren werd als volgt een nieuw plasmide, pMPCTFRA, opgebouwd. pSD521VC is een subkloon van het HindlII F-deel van de Kopenhagen-stam, dat reeksen van de Hind III K/F-koppeling (fig. 8 en fig. 20) en aanhangsels A/C van de unieke BamHI-plaats van HindlII F bevat (plaats 5663, fig. 20). Om rechts van F4 een flankerende arm te krijgen werd pSD521VC op plaats 3576 (bovenstrooms van de voor F4 coderende reeksen) met Clal opengeknipt en op plaats 2841 met BglII, binnen de voor F4L coderende reeksen.

Synthetische oligonucleotiden MPSYN256 (5'-CGATGTACAAAAAATCCAAGTACAGGCATATAGATAACTGA-3') en MPSYN257 (5'-GATCTCAGTTATCTATATGCCTGTACTTGGATTTTTTGTACAT-3') werden afgevlakt en in vectorplasmide pSD521VC tussen de aangrijpingspunten voor Clal en BglII geligeerd. In het ontstane plasmide, pMP256/257, is het promotorgebied bovenstrooms van het open afleeskader F4 opnieuw aanwezig, gekoppeld aan de aangrijpingsplaats voor BglII. Om een rechter flankerende am te verkrijgen werd pMP256/257 met BglII en EcoRI opengeknipt, en een fragment van 2,3 kb met de koepokkenvi-rus-reeksen bovenstrooms van het gen F4 werd geïsoleerd. De linker flankerende arm van dat koepokvirus werd uit HindlII C verkregen uit plasmide pCOPCS-4 (voorbeeld 14) dat het gen C7L bevat en nog 140 bp van het koepokken-DNA links daarvan. pCOPCS-4 werd met BglII en EcoRI opengeknipt en het fragment van 3,5 kb werd gekoppeld aan een fragment van 2,3 kb dat de rechter arm uit HindlII F bevatte. Het ontstane plasmide, pMPCTFRA, heeft een linker koepokvirus-arm uit HindlII C en een rechter arm uit HindlII F die een weglating van 20 genen (C6L t/m F4L) flankeert. pMPCTFRA werd gebruikt als donorplasmide bij de recombinatie met vP668 (voorbeeld 9) en recombinant-virussen werden er door kweken op MRC-5-cellen uit geselecteerd. Levenskrachtige virus-nakomelingen, vP749 (C6L t/m F4L weggelaten) werden gewonnen, wat bewijst dat alle genen in het weggelaten gebied niet essentieel zijn.

Om alle genen van het linker einde van het koepok-virus t/m F4L te verwijderen werd als volgt plasmide PMPLENDa opgebouwd (fig. 18) . Een rechter flankerende arm van HindlII F werd verkregen door pMPCTFRA te verteren met Smal en BglII, gevolgd door isoleren van het fragment van 2,3 kb. pMPVCEND (fig. 18) dat tandemherhalingen van het DNA van het uiteinde van VP452 bevat, werd met HindlII verteerd, gevolgd door afstompen met het Klenow-fragment van DNA-polymerase uit E. coli en doorknippen met BglII. De twee fragmenten werden samen geligeerd, wat pMPLENDA gaf. In pMPLENDA bestaat de linkerarm van het pokkenvirus uit tandem-herhalingen en bestaat de rechterarm uit van HindlII F afkomstig DNA. In plasmide pMPLENDA zijn de 38 meest linkse genen (C23L t/m F4L) uit het Kopenhagen-genoom weggewerkt/ in totaal 32.681 bp (uit HindlII C van fig. 19 plaatsen 340 tot aan het einde, in totaal 13.638 bp, uit HindlII C van fig. 8 N, M en K, in totaal 15.537 bp, en uit HindlII F van fig. 20 plaatsen 1 t/m 3506).

Om genen van het rechtereinde van het genoom weg te werken werd plasmide pMPRENDA opgebouwd voor het verstrekken van koepokvirusarmen voor het wegwerken van het koepokken-bloedingsgebied u (voorbeeld 5) en alle genen rechts van dat gebied. De reeks van HindlII B, het meest rechtse HindlII-fragment van het genoom, werd geanalyseerd door diverse klonen op basis van pUC in dit gebied de volgorde te bepalen (fig. 21) . Vergelijken van de reeksen afgeleid van de linker en rechter gebieden van dit genoom laat zien dat de eindstandige herhalingen zich uitstrekken tot plaats 8104 (fig. 19) . De omgekeerde eindstandige herhaling in de hier onderzochte Kopenhagen-stam van het koepokvirus bestaat dus uit 8,1 kb aan coderend gebied naast de blokken van tandem-herhalingen. De negen meest linkse afleeskaders in HindlII C, kaders C23L t/m C15L, komen overeen met de negen meest rechtse afleeskaders in HindlII B, kaders B29R t/m B21R. Fig. 21 bevat de DNA-reeks van het HindlII B uit de Kopenhagen-stam, beginnende bij de koppeling van HindlII A met HindlII B en zich naar rechts uitstrekkende tot het verste afleeskader dat met unieke DNA-reeksen begint (B20R). De rechter kopie van de eind-standige herhaling begint op plaats 17.132 (fig. 21), 14 bp voor het einde van het afleeskader B20R.

pSD477VC is een Ncoï/NruI-onderkloon van HindlII B van het Kopenhagen-koepokvirus op basis van pUC (plaatsen 9713-11299 in fig. 21) met daarin het bloedingsgebied u (open afleeskaders B13R en B14R). pSD478VC (fig. 18) is een derivaat van pSD477VC waarvan het complete gebied u (plaatsen 10.024-11.014 in fig. 21) door een meervoudig klonings-gebied vervangen is, dat ook een aangrijpingspunt voor BglII omvat. Het paar synthetische oligonucleotiden dat daartoe afgevlakt werd waren het 41-delige (5'-CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT-3') en het 39-delige (5'-AACGGATCCCTCGAGCCCGGGGAGCTCAGATCTAGTAAT-3·). Om een flankerende koepokvirusarm links van het gebied u te verkrijgen werd pSD478VC met EcoRI doorgeknipt op de koppelingspunten van pUC met koepokvirus-reeksen, en dat werd stomp gemaakt met het Klenow-fragment van DNA-polyme-rase uit E. coli, en dan met BglII doorgeknipt. Een fragment van 0,3 kb dat het promotorgebied voor bloedingsgebied u en flankerende gebieden links van dat gebied u bevatte werd geïsoleerd. Dit fragment werd geligeerd met een vector verkregen door pMPVCEND met HindlII door te knippen, dat met het Klenow-fragment van DNA-polymerase uit E. coli stomp te maken, en met BglII door te knippen. Het ontstane plasmide, pMPRENDA, bevat de linker koepokkenvirusarm die afgeleid is van het DNA uit HindlII B bovenstrooms van het open afleeskader B13R, inclusief het promotorgebied u uit B13R. De rechter koepokvirusarm van pMPRENDA bevat blokken van tandem-herhalingen, en is identiek met de linker koepokvirusarm van het linker uiteinde-weglatingsplasmide pMPLENDA. De twee armen van pMPRENDA flankeren een weglating van 17 afleeskaders (B13R t/m B29R). De totale grootte van de weglating tussen de flankerende koepokvirusarmen in het rechter uiteinde-weglatingsplasmide pMPRENDA is 14.873 bp, alle uit HindlII B (de reeks is weergegeven in fig. 21, plaatsen 10.024 t/m 17.145, zich voortzettende in de omgekeerde uiteindeherhaling, waaruit de reeks weggelaten is die overeenkomt met wat in fig. 19 door plaatsen 8090 t/m 340 voorgesteld wordt). De strategie voor dit opbouwen van weglatingsplasmiden pMPLENDA en pMPRENDA is schematisch weergegeven in fig. 18. Opgevulde segmenten geven DNA van Kopenhagen-koepokvirus aan, bestaande uit tandem-herhalin-gen afgeleid van het uiteinde van VP452; open segmenten geven andere DNA van het Kopenhagen-koepokvirus aan. De plaatsing van de weglatingen in plasmiden pMPCTFRA, pSD478VC, pMPLENDA en pMPRENDA is met driehoekjes aangegeven.

Om voordeel te trekken van de selectiedruk bij het genereren van recombinant-koepokvirussen waaruit bij beide uiteinden van het genoom grote hoeveelheden DNA weggelaten zijn werden twee te selecteren merken gebruikt. Het eerste .is gen C7L voor menselijke gastheerverscheidenheid (voorbeeld 7) met selectie op virusnakomelingen op MRC-5-cellen. Het tweede is het gen uit E. coli dat voor guanine-fosfori-bosyl-transferase codeert (Ecogpt-gen) met selectie op virus-nakomelingen die mycofenolzuur benutten (2,8).

Om een over te brengen fragment te scheppen dat alleen het koepokvirusgen C7L en zijn promotor bevat werd pCOPCS-4 met Ncol nabij het 3 ' -einde van het gen C7L doorgeknipt (plaats 870 in fig. 8) en met BamHI 148 bp bovenstrooms van de voor C7L coderende reeks. Het einde van het gen C7L werd met de synthetische oligonucleotiden MPSYN258 (51-CATGGATTAATTAATTÏTTTTG-31) en MPSYN259 (51-GATCCAAAAAAATTAATTAATC-31) opgebouwd, welke afgevlakt en in het vectorfragment geligeerd werden, wat plasmide PMP258/259 gaf. pMP258/259 werd met BglII en BamHI opengeknipt, en een fragment van 660 bp dat het gen C7L en zijn promotor bevatte werd geïsoleerd om het in de linker- en rechter-weglatingsplasmiden, respectievelijk pMPLENDA en pMPRENDA, in te bouwen.

Een BglII/BamHI-fragment van 670 bp dat het Ecogpt-gen bevatte, werd afgeleid uit plasmide pSV2gpt (ATCC #37145) (71) door er op de AhalII-plaats beneden strooms van de coderende reeks (72) een BamHI-verbindings-stuk aan toe te voegen.

Plasmiden pMPLENDA en pMPRENDA, waaruit, respectievelijk nabij het linker en nabij het rechter uiteinde van het koepokvirusgenoom stukken weggewerkt waren, werden met BglII doorgeknipt. De BglII/BamHI-fragmenten · met het gen C7L en met het Ecogpt-gen werden in deze plasmiden ingebouwd, wat in totaal vier plasmiden gaf (tabel 7). Merk op dat het gen C7L zowel in pMPLa C7 als in pMPRaC7 onder controle van zijn eigen promotor staat. Het Ecogpt-gen is in pMPLgpt onder controle van F4L en in pMPRgpt onder controle van B13R. Recombineren van deze twee plasmiden werd uitgevoerd en met de in tabel 7 genoemde reddingsvi-russen. Virusnakomelingen van deze recombinaties, die het gen C7L invoeren, werden geselecteerd door ze op MRC-5-cellen uit te platen; nakomelingen van de recombinaties die het Ecogpt-gen invoeren werden geselecteerd door groei in aanwezigheid van mycofenolzuur. Merk op dat selectie op groei op MRC-5-cellen met voordeel met behulp van een reddingsvirus zoals vP668 gebeurt, waaruit zowel C7L als KIL weggelaten zijn.

Weglatings- en recombinatiemutant van het koepok-virus vP796 werd gegenereerd door recombinatie van het linker einde-weglatingsplasmide dat het selecteerbare merk Ecogpt (pMPLgpt) en het reddingsvirus vP723 bevat, waaruit ook nog de TK- en HA-genen weggelaten zijn alsmede de met ATI en u overeenkomende gebieden. Blijkens DNA-restrictie-analyse is uit vP796 het gebied van C23L t/m F4L weggelaten, alsmede de TK-, HA-, ATI- en u-gebieden. Daar de weglating van 38 genen nabij het linker einde van VP796 ook C7L en KIL omvat werd vP796 als reddend virus gebruikt bij het recombineren van pMPRaC7 met het rechter einde-weglatingsplasmide dat C7L omvat. Het reddingsvirus, de recombinant die weglatingen nabij beide uiteinden bevat, vP811, werd geselecteerd op groei op MRC-5-cellen.

LITERATUUR

1. E. Beck, G. Ludwig, E.A. Auerswald, B. Reiss en H.Schalier - Gene 19 (1982), 327-336.

2. D.B. Boyle en B.E.H. Coupar - Gene 65, (1988) 123-128.

3. S. Chakrabarti, K. Brechling en B. Moss - Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 3403-3409.

4. D.B. Clewell - J. Bacteriol. 110 (1972) 667-676.

5. D.B. Clewell en D.R. Helinski - Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 62 (1969) 1159-1166.

6. R. Drillien, F. Koehren en A. Kirn - Virology 111 (1981) 488-499.

7. R. Drillien, D. Sphner en A. Kirn - J. Virol. 28 (1978) 843-850.

8. F.G. Falkner en B. Moss - J. Virol. 62 (1988) 1849-1854.

9. Z. Fathi, P. Sridhar, R.F. Pacha en R.C. Condit -Virology 155 (1986) 97-105.

10. F. Fenner en J.F. Samrbook - Virology 28. (1966) 600-609.

11. C.A. Franke, C.M. Rice, J.H. Strauss en D.E. Hruby -Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 1918-1924.

12. J.D. Gangemi en D.G. Sharp - Virology 85 (1978) 262-270.

13. A. Geinmell en F. Fenner - Virology 11 )1960) 219-235.

14. S. Gillard, D. Spehner en R. Drillien - J. Virol.

53 (1985) 316-318.

15. S. Gillard, D. Spehner, R. Drillien en A. Kirn -Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 5573-5577.

16. F.L. Graham en A.J. Van der Eb - Virology 54 (1973) 536-539.

17. D.E. Hruby, D.L. Lynn, R. Condit en J.R. Kates -J. Gen. Virol. 47 (1980) 485-488.

18. M.P. Kieny, R. Lathe, R. Drillien, D. Spehner, S. Skory, D. Schmitt, T. Wictor, H. Koprowski en J.P. Lecocq - Nature (Londen) 312 (1984) 163-166.

19. J.R. Lake en P.D. Cooper - J. Gen. Virol. 48 (1980) 135-147.

20. M. Mackett, G.L. Smith en B. Moss - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7415-7419.

21. M, Mackett en J.R. Arrand - EMBO 4 (1985) 3229-3235.

22. T. Maniatis, E.F. Fritsch en J. Sambrook - Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

23. A. Mayr, V. Hochstein-Mintzel en H. Stickl - Infection 3 (1975) 6-14.

24. M.E. McClain - Aust. J- exp. Biol. med. Sci. 43 (1965) 31-44.

25. R.W. Moyer en C.T. Rothe - Virology 102 (1980) 119-132.

26. E. Nakano, D. Panicali en E. Paoletti - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 1593-1596.

27. D. Panicali, S.W. Davis, S.R. Mercer en E. Paoletti -J. Virol. 37 (1981) 1000-1010.

28. D. Panicali en E. Paoletti - Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 79 (1982) 4927-4931.

29. D. Panicali, A. Grzelecki en C. Huang - Gene 47 (1986) 193-199.

30. M.E. Perkus, D. Panicali, S. Mercer en E. Paoletti -Virol. 152 (1986) 285-297.

31. M.E. Perkus, A. Piccini, B.R. Lipinskas en E. Paoletti - Science 229 (1985) 981-984.

32. A. Piccini, M.E. Perkus en E. Paoletti - In: Methods in Enzymology, Vol. 153, ed. Wu, R. en L. Grossman (Academic Press) (1987), biz. 545-563.

33. J.L. Rosel, P.L. Earl, J.P. Weir en B. Moss - J. Virol. 60 (1986) 436-449.

34. S.K. Shapira, J. Chou, F.V. Richaud en M.J. Casadaban -Gene 25 (1983) 71-82.

35. P.H. Southern en P. Berg - J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982) 327-341.

36. I. Tagaya, T. Kitamura en Y. Sano - Nature (Londen) 192 (1961) 381-382.

37. M. Wachsman, L. Aurelian, C.C. Smith, B.R. Lipinskas, M.E. Perkus en E. Paoletti - J. Inf. Dis. 155 (1987) 1188-1197.

38. E.M. Wilson, W.M. Hodges en D.E. Hruby - Gene 49 (1986) 207-213.

39. L. Yuen en B. Moss - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 6417-6421.

40. G.J. Kotwal en B. Moss - Virology 167 (1988) 524-537, 41. J. Taylor, R. Weinberg, Y. Kawaoda, R.G. Webster en en E. Paoletti - Vaccine 6 (1988) 504-508.

42. J. Taylor, R. Weinberg, B. Languet, P. Desmettre en E. Paoletti - Vaccine 6 (1988) 497-503.

43. D.J. Pickup, B.S. Ink, W. Hu, C.A. Ray en W.K. Koklik - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7698-7702.

44. E.M. Southern - J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517.

45. G.J. Kotwal en B. MOss - J. Virol. 63 (1989) 600-606.

46. S. Tabor en C.C. Richardson - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 4767-4771.

47. D.D. Patel en D.J. Pickup - E;BO 6 (1987) 3787-3794.

48. D.D. Patel, C.A. Ray, R.P. Drucker en D.J. Pickup -Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 9431-9435.

49. C. Bertholet, R. Drillien en R. Wittek - Proc. Natl. Acad. sci. USA 82 (1985) 2096-2100.

50. P. Guo, S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen en E. Paoletti - J. Virol. 63 (1989) 4189-4198.

51. A. Tamin, E.C. Villarreal, S.L. Weinrich en D.E. Hruby - Virology 165 (1988) 141-150.

52. M.E.G. Boursnell, I.J. Foulds, J.I. Campbell en M.M. Binns - J. gen. Virol. 69 (1988) 2995-3003.

53. W. Mandecki - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83. (1986) 7177-7181.

54. D. Spehner, S. Gillard, R. Drillien en A. Kirn -J. Virol. 62 (1988) 1297-1304.

55. W. Altenburger, C.P. Suter en J. Altenburger - Arch. Virol. 105 (1989) 15-27.

56. D.E. Hruby, R.A. Maki, D.B. Miller en L.A. Bail -Proc. Natl. Acad. Sci. USA M (1983) 3411-3415.

57. A.K. Robbins, D.J. Dorney, M.W. Wathen, M.E. Whealy, C. Gold, R.J. Watson, L.E. Holland, S.D. Weed, M. Levine, J.C. Glorioso en L.W. Enquist - J. Virol.

61 (1987) 2691-2701.

58. A.K. Robbins, R.J. Watson, M.E. Whealy, W.H. Hays en L.W. Enquist - J. Virol. 58 (1986) 339-347.

59. M.W. Watchen en L.M.K. Wathen - J. Virol. 51 (1984) 57-62.

60. T.C. Mettenleiter, N. Lukacs, H.J. Thiel, C. Schreurs en H.J. Rziha - Virology 152 (1986) 66-75.

61. E.A. Petrovskis, J.G. Timmins, M.A. Armentrout, C.C. Marchioli, R.J. Yancey jr. en L.E. Post -J. Virol. 59 (1986) 216-223.

62. J.F.C. Schmitt en H.G. Stunnenberg - J. Virol. 62 (1988) 1889-1897.

63. J.C. Vos en H.G. Stunnenberg - EMBO 2 (1988) 3487-3492.

64. D. Bucher, S. Popple, M. Baer, A. Mikhail, Y.F. Gong, C. Whitaker, E. Paoletti en A. Judd - J. Virol. 63 (1989) 3622-3633.

65. R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis en H.A. Erlich -Science 239 (1988) 487-491.

66. J.M. Kaplan, G. Mardon, J.M. Bishop en H.E. Varmus -Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 2435-2441.

67. B.M. Baroudy, S. Venkatesan en B. Moss - Cell 28 (1982) 315-324.

68. R. Wittek en B. Moss - Cell 21 (1980) 277-284.

69. R. Wittek, H.K. Muller, A. Menna en R. Wyler -FEBS Letters 90 (1978) 41-46.

70. M. Slabaugh, M. Roseman, R. Davis en C. Mathews -J. Virol. 62 (1988) 519-527.

71. R.C. Mulligan en P. Berg - Science 209 (1980) 1422-1427.

72. D. Pratt en S. Subramani - Nue. Acids Res. 11 (1983) 8817-8823.

Claims

1. Werkwijze voor het selecteren van een recombinant-pokkenvirus in een gastheer, waartoe men donor-DNA en een gemodificeerd pokkenvirus tot een recombinant -pokkenvirus combineert, waarbij uit dat gemodificeerde pokkenvirus de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zijn, zodat het gemodificeerde pokkenvirus zich in de gastheer niet vermeerdert, en dat donor-DNA (a) een open afleeskader uit niet-pokken-herkomst en (b) ten minste één gen voor gastheerverscheidenheid heeft, waardoor dat recombinant-pokkenvirus zich in de gastheer kan vermeerderen, en men het recombinant-pokkenvirus identificeert aan zijn vermogen zich in de gastheer te vermeerderen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij dat pokkenvirus koepokkenvirus is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het open afleeskader van niet-pokken-herkomst een lacZ gen uit E.coli is dat voor /3-galactosidase codeert.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de gastheer een menselijke cellijn is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de menselijke cellijn MRC-5 is.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij het gen voor gastheerverscheidenheid het koepokken-gastheergen KIL of C7L is.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het donor-DNA en het gemodificeerde pokkenvirus tot het recombinant-pokkenvirus gecombineerd worden door recombineren van het donor-DNA en het gemodificeerde pokkenvirus.

8. Werkwijze voor het klonen en tot expressie brengen van een open afleeskader in een recombinant-pokkenvirus in een gastheer, waartoe men donor-DNA en een gemodificeerd pokkenvirus tot een recombinant-pokkenvirus combineert, waarbij uit dat gemodificeerde pokkenvirus een gen voor gastheer- verscheidenheid weggelaten is, zodat het gemodificeerde pokkenvirus zich in de gastheer niet vermeerdert, en dat donor-DNA (a) een open afleeskader van niet-pokken-herkomst en (b) ten minste één gen voor gastheerverschei-denheid heeft waardoor dat recombinant-pokkenvirus zich in de gastheer kan vermeerderen, waarna men het recombinant-pokkenvirus zich in de gastheer laat vermeerderen en het open afleeskader tot expressie brengt.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het pokkenvirus koepokkenvirus is.

10. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het open afleeskader van niet-pokken-herkomst een lacZ-gen uit E.coli is dat voor /3-galactosidase codeert.

11. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij de gastheer een menselijke cellijn is.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij de menselijke cellijn MRC-5 is.

13. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het pokkenvirusgen voor gastheerverscheidenheid het koepokkenvirusgen KIL of C7L is.

14. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het donor-DNA en het gemodificeerde pokkenvirus tot het recombinant-pokkenvirus gecombineerd worden door recombineren van het donor-DNA met het gemodificeerde pokkenvirus.

15. Donor-plasmide dat een pokkenvirusgen voor gastheerverscheidenheid en een open afleeskader van niet-pokken-herkomst' heeft.

16. Donorplasmide volgens conclusie 15 dat bovendien bovenstrooms van het pokkenvirusgen voor gastheerverscheidenheid een promotor heeft.

17. Donorplasmide volgens conclusie 16 dat verder benedenstrooms van de promotor een startcodon voor de vertaling heeft, gevolgd door meerdere unieke aangrijpingspunten voor restrictie-enzymen, afbreeksignalen voor de vertaling en een vroeg afbreeksignaal voor het overschrijven.

18. Donorplasmide volgens conclusie 15 waarvan het pokkenvirusgen voor gastheerverscheidenheid het koepokken- virusgen KIL of C7L is.

19. Gemodificeerd recombinantvirus voor het in een gastheer tot expressie brengen van een gen, uit welk gemodificeerde recombinantvirus de genen voor gastheerver-scheidenheid weggelaten zijn zodat het virus zich in de gastheer maar beperkt kan vermeerderen en waarbij dat recombinantvirus DNA omvat dat in de gastheer voor het genprodukt codeert en dit tot expressie brengt en er zich maar beperkt in vermeerdert.

20. Virus volgens conclusie 19 dat een pokkenvirus is.

21. Virus volgens conclusie 20 dat een koepokkenvirus is.

22. Virus volgens conclusie 19 waarbij het genprodukt een antigeen is.

23. Virus volgens conclusie 22, waarbij de gastheer een gewervelde is en het antigeen in die gewervelde een immunologische respons uitlokt.

24. Virus volgens conclusie 23 waarbij het antigeen een rabies- of pseudorabies-glycoproteïne is.

25. Virus volgens conclusie 19 waarvoor de gastheer uit in vitro gekweekte cellen bestaat.

26. Werkwijze voor het in een gastheer tot expressie brengen van een gen, waarbij men de gastheer beënt met een gemodificeerd recombinantvirus waaruit de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zijn, zodat het virus zich in de gastheer maar beperkt vermeerdert, en waarbij φίφ het gemodificeerde recombinantvirus DNA bevat dat codeert voor het genprodukt in de gastheer en dit tot expressie brengt, en er zich maar beperkt in vermeerdert.

27. Werkwijze volgens conclusie 26, waarbij dat virus een pokkenvirus is.

28. Werkwijze volgens conclusie 27, waarbij dat pokkenvirus een koepokkenvirus is.

29. Werkwijze volgens conclusie 26, waarbij dat gen voor een antigeen codeert.

30. Werkwijze volgens conclusie 29, waarbij de gastheer een gewervelde is en het antigeen in die gewervel- de een immunologische respons uitlokt.

31. Werkwijze volgens conclusie 30, waarbij het antigeen een rabies- of pseudorabies-glycoproteïne is.

32. Werkwijze voor het in in vitro gekweekte cellen tot expressie brengen van -een gen, waarbij men in die cel een gemodificeerd recombinantvirus brengt waaruit de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zijn, en waarbij dat gemodificeerde recombinantvirus DNA omvat dat hefe codeert voor het genprodukt in de cel en dit tot expressie brengt maar er zich maar beperkt in vermeerdert.

33. Vaccin voor het in een daarmee ingeënte gastheer uitlokken van een immunologische respons, welk vaccin uit een drager en een gemodificeerd recombinantvirus bestaat, uit welke recombinantvirus de genen voor gastheerverscheidenheid weggelaten zijn zodat dat virus zich in de gastheer maar beperkt vermeerdert, en waarbij het DNA van dat virus codeert voor het genprodukt in de gastheer en dit tot expressie brengt, en waarbij het virus zich maar beperkt vermeerdert in de gastheer. -o-o-o-o-o-o- UITTREKSEL Bij het kweken van pokkenvirus is het voordelig een virus te gebruiken waaruit de genen voor gastheerver-scheidenheid weggewerkt zijn, maar dat door recombineren een gen gekregen heeft waarmee het zich in een bepaalde gastheer (een bepaalde cellijn) nog wel kan voortplanten. Het werken daarmee is veiliger en geeft ook gevaarloze vaccins. De nog wel te gebruiken gastheer is bij voorkeur de cellijn MRC-5. -o-o-o-o-o-o-