LU88000A1

LU88000A1 - Systeme de selection d'hotes de poxvirus du recombinaision

Info

Publication number: LU88000A1
Application number: LU88000A
Authority: LU
Original assignee: Health Research Inc
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1991-09-04
Publication date: 1992-03-11
Also published as: DE4090351T1; IT1239987B; IT9019623A0; NL9020389A; WO1990010693A1; GB2245272A; AU5332090A; JP3044062B2; ATA902490A; BE1004212A5; CA2011654C; JPH04503904A; CA2011654A1; DK157091A; IE62441B1; CH682669A5; GB2245272B; US5453364A; AT400955B; IE900814L

Description

La présente invention est relative à un poxvirus modifié et à des procédés pour produire et utiliser celui-ci. Plus particulièrement, l'invention est relative à un poxvirus recombinant, qui exprime des produits de gène d'un gène du virus de l'herpès, et à des vaccins qui.impartissent une immunité protectrice contre des infections provoquées par le virus de l'herpès.

On se réfère à plusieurs publications dans la présente demande de brevet ; celles-ci sont désignées par des nombres en chiffres arabes entre parenthèses. La citation complète de ces publications antérieures se trouve à la fin de la présente description immédiatement avant les revendications. Ces publications antérieures décrivent l'état de l'art auquel l'invention appartient.

Le virus de la vaccine et plus récemment d'autre poxvirus ont été utilisés pour l'insertion et l'expression de gènes étrangers. La technique de base pour insérer des gènes étrangers dans des poxvirus infectieux vivants implique la recombinaison entre les séquences d'ADN du pox qui flanquent un élément génétique étranger dans un plasmide donneur et de séquences homologues présentes dans le poxvirus de sauvetage (28).

Spécifiquement, les poxvirus recombinants sont construits en deux étapes connues, dans la technique et qui sont analogues aux procédés pour créer des recombinants synthétiques du virus de la vaccine décrits dans le brevet US n° 4.603.112, l'enseignement de ce brevet étant incorporé dans la présente par référence.

Tout d'abord, dans une première étape, la séquence d'ADN du gène à être insérée dans le virus, particulièrement un cadre de lecture ouvert provenant d'une source qui n'est pas un pox, est placée dans la structure ou construction de plasmide d'E,. Coli dans lequel de l'ADN homologue à une section d'ADN du poxvirus a été inséré. Séparément, la séquence de l'ADN du gène à insérer est liée à un promoteur.

Le groupe de liaison ou linkage promoteur-gène est positionné dans la structure du plasmide de sorte que le linkage promoteur-gène soit flanqué aux deux extrémitées par de l'ADN homologue à une séquence d'ADN qui flanque une région de l'ADN du pox contenant un locus non essentiel.. La structure du plasmide résultant est ensuite amplifiée par croissance dans la bactérie E.. Coli (11) puis isolée (12, 20).

Ensuite, dans une seconde étape, le plasmide isolé, contenant la séquence d'ADN du gène à être inséré, est transfecté dans une culture de cellules, par exemple des fibroblastes d'embryons de poulet, en même temps que le poxvirus. La recombinaison entre l'ADN du pox homologue dans le plasmide et le génome viral respectivement donne un poxvirus modifié par la présence, dans une région non essentielle de son génome, de séquences d'ADN étranger. Le qualificatif "étranger" appliqué à l'ADN désigne un ADN exogène, en particulier de l'ADN à partir d'une source qui n'est pas un pox, qui code pour des produits de gène qui ne sont ordinairement pas produits par le génome dans lequel l'ADN exogène est placé.

La recombinaison génétique est en général l'échange de sections homologues d'ADN entre deux brins d'ADN. Dans certains virus, l'ARN peut remplacer l'ADN. Des sections homologues d'acide nucléique sont des sections d'acide nucléique (ADN, ARN) qui ont la même séquence de bases de nucléotide.

La recombinaison génétique peut avoir lieu naturellement pendant la réplication ou la fabrication de génomes viraux nouveaux à l'intérieur de la cellule hôte infeccée. Ainsi, la recombinaison génétique entre des gènes viraux peut se produire pendant le cycle de réplication virale qui se produit dans une cellule hôte qui est co-infectée par deux ou plusieurs virus différents ou autres structures génétiques. Une section d'ADN d'un premier génome est utilisée d'une manière interchangeable dans la construction de la section du génome d'un second virus co-infectant dans lequel l'ADN est homologue à celui du premier génome viral.

Toutefois, la recombinaison peut également avoir lieu entre des sections d'ADN dans des génomes différents, qui ne sont pas parfaitement homologues. Si une telle section provient d'un premier génome homologue à une section d'une autre génome à part la présence dans la première section de, par exemple, un marqueur génétique ou d'un gène codant pour un déterminant antigénique inséré dans une portion de l'ADN homologue, la recombinaison peut encore avoir lieu et les produits de cette recombinaison sont alors détectables par la présence de ce marqueur génétique ou gène dans le génome viral recombinant.

L'expression réussie de la séquence génétique de l'ADN inséré par le virus infectieux modifié exige deux conditions. La première est que l'insertion doit être faite dans une région non essentielle du virus afin que le virus modifié reste viable. La seconde condition pour l'expression de l'ADN inséré est la présence d'un promoteur en relation correcte avec l'ADN inséré. Le promoteur doit être placé de sorte qu'il soit localisé en amont de la séquence d'ADN à exprimer.

Il existe deux sous-types de virus de l'herpès chevalin, qui, bien qu'ils contiennent des épitopes se neutralisant l'un l'autre, peuvent être distingués par leurs profils antigéniques, leurs empreintes digitales d'endonucléase de restriction et leur action pathogène à l'égard des chevaux (1). Le virus de l'herpès chevalin 1 (EHV-1) est associé à une maladie de la voie respiratoire, des désordres du système nerveux central et des avortements herpétiques classiques, alors que le virus de l'herpès chevalin 4 (EHV-4) est associé d'une manière prédominante à une maladie de la voie respiratoire (1, 48). Les virus de l'herpès chevalin font partie de la sous-famille des alphaherpèsvirus et manifestent un grand nombre des caractéristiques biologiques et biochimiques typiques des virus de l'herpès humain, tels que l'isomérisation génomique, la régulation de l'expression des gènes, l'établissement d'infections latentes,, la production de particules de virus interférantes défectueuses, l'induction de désordres neurologiques et la transformation oncogénique in vitro (1, 4, 23). Ainsi, le EHV peut être avantageusement utilisé pour étudier les conséquences biologiques variées des infections par le virus de l'herpès.

Les glycoprotéines du virus de l'herpès interviennent dans des fonctions virales essentielles, telles que l'attachement et la pénétration cellulaires, l'extension de cellule à cellule du virus et, d'une manière importante, déterminent le profil de pathogénicité de l'infection. Les glycoprotéines du virus de l'herpès sont des composants critiques dans l'interaction avec le système immunitaire de l'hôte (36, 37).

Les glycoprotéines bien caractérisées du virus de l'herpès simplex comprennent gB, gC, gD, gE, gG, gH et ci (36, 37, 49-55). Un certain nombre d'études ont montré l'importance des glycoprotéines du virus de l'herpès simplex pour provoquer des réponses immunitaires. C'est pourquoi, il a été rapporté que gB et gD peuvent provoquer des réponses immunitaires importantes (6, 8, 13, 18, 21, 22, 26, 27, 30, 44, 46, 47). gC peut stimuler des lymphocytes cytotoxiques à restriction de la classe I .(15, 32), alors que gD peut stimuler des réponses de cellules T cytotoxiques de la classe II (21, 22, 44, 46, 47). gG s'est révélé être une cible pour la neutralisation de virus sous la direction d'anticorps compléments dépendants (38, 39). Plusieurs glycoprotéines en provenance d'autres virus de l'herpès sont également connues pour provoquer des réponses immunitaires importantes (5, 10, 36, .56).

Chacun des deux sous-types de EHV , exprime six glycoprotéines abondantes (1, 3, 43). Les portions génomiques des séquences d'ADN codant pour gp2, gplO, gp!3, çpl4, gpl7/18 et gp21/22a ont été déterminés en utilisant des vecteurs d'expression lamba gtll et des anticorps monoclonaux (3). Les glycoprotéines gpl3 et gpl4 ont été localisées dans les mêmes emplacements dans le composant L du génome auquel sont homologues gC et gD, respectivement, de’ la carte du virus de l'herpès simplex (3). L'EHV-1 semble se singulariser parmi les virusalphaherpès dont les gènes de glycoprotéine ont été cartographiés, en ce que cinq de ses six glycoprotéines principales ont été codées à partir de séquences dans le composant de génome L, alors que seulement une glycoprotéine (gpl7/18) est cartographiée dans la région Us. En analysant ces données, on a prédit que certaines des glycoprotéines en faible abondance identifiées dans les virions EHV-l, aussi bien que les glycoprotéines EHV-l non encore identifiées, s'appliquent en carte sur le composant S du génome (3). Les glycoprotéines d'enveloppe sont les immunogènes principaux des virus de l'herpès impliqués pour provoquer des réponses immunitaires chez l'hôte, à la fois humorales et cellulaires (5, 8, 73-75) et sont donc du plus grand intérêt pour ceux qui tentent de réaliser des vaccins.

Récemment, la séquence de nucléotides de la souche Kentucky T431 de l'unité transcriptionnelle de EHV-l qui code gpl3 a été rapportée (2). Un cadre de lecture ouvert code un produit de traduction primaire de 468 acides aminés, de 51 kDa. La protéine a les traits caractéristiques d'une protéine enjambant la membrane avec neuf sites potentiels de glycosylation à liaison par l'azote (Asn-X-Ser/Thr) présents dans le domaine de surface entre le signal putatif et les portions d'ancrage trans-membrane de la protéine (2). La glycoprotéine s'est révélée être homologue à (HSV) gC-Ι et gC-2 du virus de l'herpès simplex, à (PRV) gill du virus de la pseudo-rage et à (VZV) gpV du virus de la varicelle zoster (2). EKV-1 çpl3 est donc l'homologue structural des glycoprotéines, analogues à gC, du virus de l'herpès.

La séquence des nucléotides de EHV-l gpl4 (71, 72) a été rapportée récemment. L'analyse de la séquence prédite des acides aminés de la glycoprotéine gpl4 a révélé une homologie significative avec la glycoprotéine correspondante de HSV, à savoir gp.

Les anticorps monoclonaux dirigés contre certaines glycoprotéines EHV-1 sont neutralisant d'après-ce qui a été montré (76). Des expériences d'immunisation passive ont démontré que les anticorps monoclonaux dirigés contre gpl3 ou gpl4 (77) ou contre gpl3, gpl4 ou gpl7/18 (78) pourraient protéger les hamsters contre une attaque mortelle. D'autres analogues des glycoprotéines gB et gC sont également impliqués dans la protection contre des maladies causées par ces alphaherpèsvirus (8, 10, 73). La glycoprotéine EKV-1 gp!7/18, bien que caractérisée comme un autre immunogène protecteur potentiel, n'a pas jusqu'à présent de contre-partie structurelle connue parmi les plusieurs protéines codées par le composant S dans les autres alphaherpèsvirus (66, 79, 80). du fait de sa position génomique, on a spéculé que gpl7/13 pourrait être l'analogue de HSV gS (2).

Le virus de la pseudo-rage (PRV), qui est un alphaherpèsvirus, est l'agent qui provoque la maladie d'Aujesky. La maladie est hautement infectieuse en provoquant des pertes économiques importantes dans l'industrie porcine. La maladie est associée à une morbidité et une mortalité élevées parmi les porcelets et elle est caractérisée par des maladies respiratoires sévères, des avortements, une dimension réduite de la litière et des taux de croissance diminués chez les survivants. Une encéphalite fatale est une conséquence fréquente de l'infection. Des infections virales latentes, une caractéristique des virus de l'herpès, peuvent s'établir, ce qui permet aux cochons adultes s'étant rétabli de la maladie de servir comme porteurs chroniques du virus. Pour une revue extensive récente de la question/ voir Wittman et Rziha (81).

Le génome de ?RC consiste en ADN double brin de 90 X 106 daltons (82) séparé par des séquences répétées inversées en un segment long unique (¾) ou en un segment court unique (üs) (83, 84). Le génome PRV code approximativement 100 polypeptides dont l'expression est réglée d'une manière en cascade semblable aux autres virus de l'herpès (85, 86). A l'heure présente, cinq glycoprotéines gpl, -gpll, gpllï, gp63 et gp50 ont été montrées comme associées à l'enveloppe virale et associées aux diverses structures membraneuses des cellules infectées par PRV (80, 86-91). Une sixième protéine codée par PRV (gX) est libérée dans le milieu de culture (92). L'emplacement ou localisation physique de ces glycoprotéines du génome de PRV et leurs séquences d'ADN sont bien connus (62, 80, 91-98). Comme pour les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès, les glycoprotéines de PRV contrôlent des fonctions virales essentielles, telles que l'attachement aux cellules, la pénétration dans les cellules et/ou la libération à partir des cellules. Les glycoprotéines de PRV sont critiques dans le profil de pathogénicité de l'infection par PRV et sont des constituants critiques dans la résolution de la maladie et l'état immunitaire.

PRV pgl est non-essentiel pour la réplication du virus in vitro et in vivo et est absent de la plupart des souches de PRV atténuées (99). La nature atténuée de ces souches daont on a supprimé gl indique également un rôle possible de gl dans la virulence (99, 100). D'autres protéines de PRV semblent toutefois être impliquées dans cette fonction étant donné que l'expression de gl seul n'est pas suffisante pour produire de hauts niveaux de virulence (100).

Le rôle que joue gl dans la provocation de la réponse immunitaire contre PRV n'est pas claire. Des anticorps monoclonaux contre gl peuvent neutraliser le virus in vitro (101) et protéger passivement des souris immunisées contre une attaque mortelle par PRV (81). Kost et al. (98) ont récemment décrit l'expression de PRV gpl dans les recombinants du virus de la vaccine, soit seul soit en association avec gp50 et gp63. L'inoculation intracraniale des recombinants de la vaccine dans des souris a produit une virulence accrue, particulièrement lorsque PRV gpl était associé à la co-expression de gp50 et gp63.

Chez les cochons, toutefois, des anticorps neutralisant contre gl ne sont pas produits (5). En outre, un virus recombinant de la vaccine exprimant des polypeptides codés par PRV gl (98) ne protègent pas les souris contre une attaque mortelle par PRV (relativement à la protection impartie par le virus de la vaccine de souche sauvage ce contrôle). Ces données, prises ensemble, suggèrent que PRV gpl est plus approprié pour constituer une sonde de diagnostic que comme composant d'un vaccin subunitaire.

La glycoprotéine gp63 de PRV est localisée adjacente à gp50 dans la région Us du génome de PRV (80). La séquence de codage pour PRV gp63 commence avec trois codons ATG consécutifs, environ 20 nucléotides en aval du codon d'arrêt de gp50. Il n'y a pas de motif de signal transcriptionnel reconnaissable et la traduction ou transcription se produit probablement à partir du même transcripteur que gp50. PRV gp63 est non essentiel in vitro. PRV gp63, en tant que séquence d'ADN continue avec PRV gp50, a été exprimé dans le virus de la vaccine comme rapporté par Kost et al. (98). La contribution de PRV gp63 à la protection des souris contre l'attaque par PRV est difficile à établir étant donné que ces études n'ont pas disséqué les contributions de PRV çp50 et gp63.

La glycoprotéine gX de PRV est une glycoprotéine non structurale dont le produit final est secrété dans le fluide extra-cellulaire (85, 92). Aucune neutralisation in vitro de PRV n'a été obtenue ni avec les sérums polygonaux ni avec les sérums monoclonaux vis-à-vis de PRV gX (102, 103) et les vaccins gX subunitaires n'étaient pas protecteurs contre l'attaque (104).

La glycoprotéine gp5Q de PRV est l'analogue de (HSV- 1) gD du virus de l'herpès simplex type 1. Le cadre de lecture ouvert d'ADN code 402 acides aminés (95). La forme glycosylatée mature (50-60 kDa) contient des carbohydrates à liaison par l'oxygène sans glycosylation à liaison par l'azote (95). Le sérum porçin est hautement réactif avec PRV gp50, ce qui suggère son importance comme immunogène. Les anticorps monoclonaux pour gp50 neutralisent PRV in vitro avec ou sans complément (97, 105, 106) et protègent passivement les souris (102, 105, 106) et les cochons (102). Les recombinants du virus de la vaccine exprimant PRV gp50 induisent des anticorps neutralisant le sérum et protègent à la fois les souris et les cochons contre l'attaque mortelle par le PRV (98, 107, 108).

Le gène de PRV gpIII est localisé dans la région Ür, du génome. Le cadre de lecture ouvert de 1437 bp code une protéine de 479 acides aminés. Le produit de traduction primaire déduit de 50,9 kDa comporte huit sites potentiels de glycosylation à liaison par l'azote (87). PRV gill est l'analogue du HSV-1 gC (96). Le remplacement fonctionnel de PRV gill par HSVgC n'a pas été observé (109). Bien que PRV glïl soit non essentiel pour la réplication in vitro (110, 111), la forme glycosylatée mature (98 kDa) est un constituant abondant de l'enveloppe de PRV. Des anticorps monoclonaux anti-gpIII neutralisent le virus in vitro avec ou sans complément (86, 106, 110) et peuvent protéger passivement les souris et les cochons (102). La glycoprotéine gill de PRV peut protéger les souris et les cochons contre l'attaque mortelle par PRV après immunisation avec une protéine de fusion Cro/glII exprimée dans Ξ. Coli (Robbins, A., R. Watson, L. Enquist, demande de brevet européen 0.162.738A1) ou exprimée dans une vaccine recombinante (Panicali, D., L. Gritz, G. Mazzara, demande de brevet européen 0.2617940A2).

Un des constituants principaux de l'enveloppe de PRV est complexe à liaison disulfure de trois glycoprotéines (120 kDa, 67 kDa et 58 kDa) désigné PRV gpll suivant la nomencla ture de Hampl (86). La séquence d'ADN codant PRV gll est localisée à l'extrémité gauche de UL. Le cadre de lecture ouvert de 2976 nucléotides code un produit de. traduction primaire de 913 acides aminés de 110 kDA. PRV gpll est l'homologue de HSV-1 gB (62). Il a été montré que les anticorps monoclonaux dirigés contre PRV gpll neutralisent le virus in vitro (5) avec ou sans complément (81). En outre, les études d'immunisation passive ont démontré que les anticorps monoclonaux neutralisants protégeaient partiellement les cochons mais ne protégeaient pas les souris contre l'attaque du virus virulent (102). A ce jour, l'immunisation active des cochons avec la glycoprotéines PRV gpll n'a pas été rapportée.

Pendant les 20 dernières années, l'incidence des infections génitales provoquées par le virus type 2 de l'herpès simplex (HSV2) a augmenté d'une manière significative. Des estimations récentes indiquent qu'aux Etats-Unis 5-20 millions de personnes ont l'herpès génital (112). Bien que l'on ait montré que le traitement oral avec l'ayclovir réduit la sévérité des infections primaires (113) et supprime les épisodes récurants ((114), le contrôle et le traitement de ces infections est loin d'être idéal. On a donc besoin d'un vaccin pour empêcher les infections primaires et récurantes.

Le génome du virus type 1 de l'herpès simplex (KSV1) code au moins huit glycoprotéines antigénétiquement distinctes gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl et gJ (115). Les homologues ce ces gènes semblent être présents dans HSV2 (116-119). Etant donné que ces glycloprotéines sont présentes à la fois dans l'enveloppe du virion et la membrane du plasma de la cellule infectée, ils peuvent induire des réponses immunitaires protectrices humorales et via les cellules (37).

L'importance relative de l'immunité, humorale et cellulaire dans la protection contre les infections du virus de l'heroès simplex n'a pas été complètement élucidée. Des souris immunisées avec HSVl gB, gC ou gD purifié sont protégées contre l'attaque mortelle par HSVl (120). Des souris ont été également protégées contre l'attaque mortelle par HSVl ou HSV2 par immunisation passive avec des anticorps vis-à-vis du virus total HSVl (121) ou HSV2 (122) total et avec des anticorps vis-à-vis des glycoprotéines individuelles HSV2 gB, gC, gD ou gE (123). Cette protection semble toutefois être dépendante d'une réponse des cellules T compétentes étant donné que les animaux immuno-supprimés par irradiation, la cyclophosphamide ou le sérum anti-thymocyte n'étaient pas protégés (124).

La contribution des glycoprotéines individuelles pour "provoquer une réponse immunitaire protectrice n'est pas complètement comprise. L'expression de ces glycoprotéines dans un système hétérologue, telle que la vaccine, a permis l'analyse de certains de ces paramètres. Par exemple, on a montré que les vecteurs du virus de la vaccine exprimant HSVl gB (125) et HSVl gC (32) induisent des réponses de cellules T cytotoxiques. En outre, il a été montré que des souris immunisées avec le virus recombinant de la vaccine exprimant: HSVl gB (8), HSVl gC (126) ou HSVl gD (26) sont protégées contre une attaque mortelle par HSVl. Un virus recombinant de la vaccine exprimant HSVl gD s'est révélé également être protecteur contre HSV2 dans un système modèle de cochon d'Inde (cobaye). On ne sait pas cependant si l'expression d'antigènes (HSV) multiples résulte dans la potentialisation (effet de synergie) de cette réponse protectrice.

Le virus 1 de l'herpès bovin (BHV1) est responsable d'une variété de maladies du bétail, y compris la conjonctivite, la vulvo-vaginite et l'avortement (127). Il est également l'un des agents les plus importants de la maladie respiratoire bovine, en agissant soit directement, soit comme facteur prédisposant dans l'infection bactérienne (128).

BHV1 spécifie plus de 30 polypeptides structuraux, dont 11 sont glycosylatés (129). Quatre de ces glycoprotéines gl, gil, gill et gIV ont été caractérisées et on a montré qu'elles sont homologues aux glycoprotéines gB, gC, gD et çE du virus (HSV) de l'herpès simplex (130, 131).

Les vaccins subunitaires consistant en gl, gill et/ou gIV se sont révélés protéger le bétail de la maladie (en utilisant un modèle d'attaque par aérosol hémolytique BHVl/Pasteurella), mais non pas ce l'infection. Ces résultats indiquent l'importance de ces glycoprotéines pour provoquer une réponse immunitaire réussie contre BHV1.

gl et gill ont également été clonés dans le virus de la vaccine et du bétail immunisé avec ces recombinants se sont révélés produire des anticorps neutralisant vis-à-vis du BHV1 (56, 133).

La rhinotrachéite féline est une maladie, commune et mondialement répandue, des chats ; elle est provoquée par un alphaherpèsvirus désigné comme virus de l'herpès félin type 1 (FHV-1). Comme d'autres virus de l'herpès, FKV-1 établit une infection latente qui résulte dans une réactivation périodique (134). Les infections de FHV-1 dans les colonies ou stations d'élevage sont caractérisées par un taux élevé de mortalité chez les chatons. Des infections secondaires de la voie respiratoire supérieure sont très débilitantes pour les adultes. Le contrôle de cette maladie est tenté actuellement en utilisant des vaccins vivants modifiés ou des vaccins inactivés qui peuvent supprimer le développement des signes cliniques, mais n'empêchent pas l'infection qui produit la dissémination du virus. Ainsi, des chats vaccinés sans symptômes peuvent disséminer le virus virulent et des infections latentes ne peuvent pas être empêchées par les vaccins existants (135) ou par des vaccins subunitaires purifiés, plus sûrs, en cours de développement (136, 137).

Les glycoprotéines du virus de l'herpès interviennent dans la fixation du virion à la cellule hôte et sont extrêmement importantes dans l'infectivité virale (133, 139). Elles déterminent également la spécificité de sous-type du virus (140). Les antigènes des glycoprotéines du virus de l'herpès sont reconnues à la fois par les sytèmes immunitaires humoraux et les systèmes immunitaires cellulaires et se sont révélés provoquer des réponses immunitaires protectrices chez les hôtes vaccinés (44, 107, 141, 132). Ori a montré que FHV-1 contient au moins 23 protéines différentes (143, 144). Parmi celles-ci, au moins 5 sont glycosylatées (144, 145) avec des masses moléculaires rapportées s'étalant de 120 kDa à 60 kDa. On a montré que les glycoprotéines de FHV-1 sont immunogènes (143, 145).

Comme plusieurs autres alphaherpèsvirus, FHV-1 apparaît comme ayant un homologue de la glycoprotéine 3 (ç3) de HSV-1, et une séquence partielle du gène FHV-1 gB a été récemment rapportée (146). Le FHV-1 gB est exigé pour l'entrée du virus et la fusion cellulaire (147, 149). Le HSV-1 gB et les analogues de g3 d'autres virus de l'herpès ont, comme on l'a montré, provoqué un anticorps circulant important, aussi bien que des réponses immunitaires induites via les cellules (8, 10, 37, 47, 73, 150). La glycoprotéine FKV- I gB est un complexe de 134 kDa qui est dissocié par le 3-mercaptoéthanol en deux glycoprotéines de 66 kDa et de 60 kDa. Le génome d'ADN de FHV-1 a une taille d'environ 134 kb (153) .

Le virus d'Epstein-3arr (EBV), un virus de l'herpès lymphotropique humain B, est un membre du genre lymphocrypto-virus qui appartient à la sous-famille des gammaherpèsvirus.

II constitue l'agent qui provoque la mononucléose infectieuse (154) et la lymphomase des cellules B. EBV est associé à deux affections malignes humaines : le lymphome endémique de Burkitt et le carcinome nasopharyngien non différencié.

Etant donné que le génome de l'EBV a été complètement séquencé (207) comme les génomes de VZV (66) et HSV1 (158), on a décrit de nombreuses homologies entre ces différents virus de l'herpès (159). Dans certains cas, ces homologies ont été utilisées pour prédire des fonctions potentielles de certains cadres de lecture ouverts (ORF) ce EBV. Les gènes de EBV homologues aux gènes de HSV1 impliqués dans l'immunité ont un intérêt particulier. Ainsi> le gène ce EBV BALF4 a des homologies avec HSVl gB (68) et le gène d'EBV BXLF2 a des homologies avec HSVl gH (161). Finalement, le gène de EBV BBRF3 comporte des homologies avec une protéine de membrane de CMV (162).

Parmi les protéines de EBV, les deux principales glycoprotéines de l'enveloppe, à savoir gp340 et gp220, sont les antigènes de vaccination potentiels les mieux caractérisés. Elles sont dérivées du même gène par épissage eu splicing sans changement dans le cadre de lecture (163, 164). Des anticorps monoclonaux et des sérums polyclonaux dirigés contre gp340 neutralisent l'EBV in vitro (165). Le "cottcn-top tamarind" (marmouset ou ouistiti sud-américain doté ce griffes), le seul animal susceptible, peut être protégé par une immunisation avec du gp340 purifié (166) et avec un virus recombinant de la vaccine EBV gp340 (167). Dans ce cas, la protection a été obtenue avec un recombinant dérivé de la souche de vaccine WR, mais non avec un recombinant dérivé de la souche de la vaccine Wyeth. La souche Wyeth a été largement utilisée en tant que souche de vaccin.

Les anticorps monoclonaux dirigés contre le çp85, l'homologue de EBV au HSVl gH, ont été décrits comme des anticorps neutralisant in vitro (168, 169).

Le cytomégalovirus humain (HCMV) est un membre ce la sous-famille des bétaherpèsvirus (famille des herpès viri-dés ) . HCMV peut provoquer une infection productrice persistante en face de l'immunité spécifique substantielle. Même si HCMV possède une pathogénicité faible, en général, une infection intra-utérine provoque des dommages au cerveau ou la surdité dans environ 0,15 % des nouveaux-nés et est la complication infectieuse la plus habituelle de·' la transplantation d'organes (170). Bien que l'efficacité d'un vaccin HCXV (souche Towne) atténué vivant expérimental a été démon tré, des préoccupations à propos des souches de vaccins vivants a entraîné des efforts d'identification des protéines de HCMV utilisables comme vaccin subunitaire. * Dans cette perspective, l'identification des glycoprotéines du virion et leur évaluation comme agents protecteurs est une étape importante .

On a décrit (172) trois familles immunologiquement distinctes de glycoprotéines associées à l'enveloppe de HCMV : gCI (gp55 et gp93-130) ; gCII (gp47-52) ; et gCIII (pg55-pl45).

Le gène codant pour gCI est homologue à HSVI gB. Les glycoprotéines gcll sont codées par une famille de cinq gènes (XHLF) disposés en tandem et partageant une ou deux régions d'homologie. Plus probablement gCII est codée par seulement deux de ces gènes (172, 173). Le gène qui code pour gCIII est homologue à HSVI gH (174).

On a décrit (174, 176) des anticorps neutralisant in vitro spécifiquement dirigés contre chacune de ces familles.

Des mutants de poxvirus convenablement modifiés portant des gènes de virus de l'herpès chevalin exogène, qui ont été exprimés dans un hôte en tant que déterminant antigénique provoquant la production par l'hôte d'anticorps vis-à-vis des antigènes du virus de l'herpès, représentent des vaccins nouveaux qui évitent les inconvénients des vaccins classiques utilisant des organismes tués ou des organismes vivants atténués. Ainsi, par exemple, la production de vaccins à partir d'organismes tués exige la culture de grandes quantités d'organismes suivie par un traitement qui détruit sélectivement leur pouvoir infectieux sans affecter leur antigénicité. D'un autre côté, des vaccins contenant des organismes vivants atténués présentent toujours la possibilité d'une réversion de l'organisme atténué pour passer à un état pathogène. Au contraire, lorsque un poxvirus recombinant, convenablement modififé avec un gène du virus de l'herpès chevalin codant pour un déterminant antigènique d'un virus de l'herpès produisant une maladie, est utilisé comme vaccin, la possibilité de réversion pour donner un organismes pathogène est évitée, étant donné que l'e poxvirus contient seulement le gène qui code pour le. déterminant antigénique de l'organisme produisant la maladie et non pas ces portions génétiques de l'organisme responsables pour la réplication de l'agent pathogène.

PRV infecte d'une manière mortelle de nombreuses espèces de mammifères (bétail, chiens, etc...). Les cochons adultes, cependant, survivent généralement à l'infection et représentent de ce fait un réservoir de virus important. Etant donné que le PRV provoque des pertes économiques importantes, la vaccination des porcs avec des vaccins atténués ou tués est pratiquée dans de nombreux pays.

Des tentatives pour contrôler l'infection par le PRV chez les cochons et pour réduire les pertes économiques ont été effectuées par immunisation active au moyen de vaccins vivants modifiés ou de vaccins inactivés. Les vaccins atténués, qui induisent généralement une immunité de longue durée et sont intéressants au point de vue prix, présentent le risque d'une atténuation insuffisante ou d'une instabilité génétique. Les vaccins inactivés sont moins efficaces, exigent plusieurs immunisations et contiennent généralement des adjuvants puissants. Ces dernières formulations peuvent induire des réactions allergiques après vaccination telles que le manque d'appétit, 1'hyperthermie ou l'avortement chez les truies enceintes. Ces types de vaccin souffrent également de certains inconvénients en ce qui concerne l'empêchement d'infections latentes, la lutte contre les effets des anticorps maternels sur l'efficacité de la vaccination et l'élimination de l'utilisation potentielle d'un test de diagnostic sérologique pour distinguer les animaux vaccinés de ceux précédemment infectés par le PRV.

Des stratégies de vaccination alternatives, par exemple l'utilisation de poxvirus recombinants qui expriment des produits de gène de PRV immunologiquement pertinents auraient certains avantages : (a) éliminer les souches de vaccin du PRV atténué·vivant hors du champ ; et (b) permettre la distinction des animaux vaccinés d'une part et des animaux infectés ou séropositifs d'autre part. Ce dernier avantage pourrait être' accompli par l'utilisation de réactifs de diagnostic appropriés qui distingueraient d'une manière précise les animaux vaccinés des animaux naturellement infectés. Ceci est une considération importante étant donné les réglement existants qui contrôlent le déplacement des animaux séro-positifs. En outre, la vaccination est plus économique et préférable au test et à l'élimination des animaux infectés dans les lors d'animaux. Le développement de tels vaccins exige une connaissance des contributions faites par les antigènes de PRV, appropriés, à l'induction d'une immunité protectrice. Dans le cas du PRV, comme des autres membres de la famille du virus de l'herpès, les glycoprotéines sont des candidats importants pour constituer les antigènes destinés à être présents dans un vaccin recombinant subunitaire effectif.

La technologie de production de recombinants du virus de la vaccine a récemment été étendue à d'autres membres de la famille des poxvirus qui ont un domaine de réception par l'hôte plus restreint. En particulier, des poxvirus aviaires, qui se répliquent dans les espèces aviaires (oiseaux), ont été bâtis pour exprimer des produits de gène immunologiquement pertinents. L'inoculation d'espèces aviaires (42, 177) et non aviaires (41) avec des recombinants du poxvirus aviaire a provoqué des réponses immunitaires protectrices contre l'agent pathogène correspondant.

Des vaccins vivants atténués et des vaccins inactivés vis-à-vis du BHV1 sont disponibles depuis plus de 30 ans et ont réduit avec succès l'incidence des maladies liées au BHV1. Ces vaccins toutefois n'empêchent pas l'infection latente ou la réinfection avec des virus de souche sauvage.

Ils compliquent également la différenciation entre les animaux infectés et les animaux vaccinés.

Les deux types de vaccin ont d'autres inconvénients importants. La vaccination de vaches enceintes avec des vaccins vivants atténués peut provoquer la mort de foetus et un avortement subséquent (127). En outre, on a montré que les animaux vaccinés pouvaient disséminer le virus (178). C'est pourquoi les animaux vaccinés maintenus avec des vaches enceintes peuvent répandre le virus infectieux à un animal qui est en gestation et provoquer l'avortement du foetus.

Les vaccins inactivés n'induisent pas des avortements ni ne provoquent une excrétion virale. Toutefois, ils exigent l'utilisation d'adjuvants et peuvent provoquer des réactions d'hypersensibilisation ayant une issue fatale (anaphylaxie) et une inflammation et une fièvre non fatales (179).

Un des problèmes les plus importants de la vaccination est de surmonter ou d'éviter l'immunité maternelle. A cet égard, si une mère est immune vis-à-vis d'un agent pathogène particulier, 1immunité” de la mère passe au nouveau-né par l'intermédiaire des anticorps présents dans le colostrum et/ou par des voies additionnelles. Toutefois, le nouveau-né ne peut pas être vacciné avec succès tant que le niveau d'immunité maternelle n'a diminué d'une manière suffisante. C'est pourquoi il existe une fenêtre étroite permettant la vaccination avec succès du nouveau-né en présence de l'immunité maternelle qui diminue.

On peut ainsi apprécier que la mise à disposition d'un poxvirus recombinant du virus de l'herpès et de vaccins qui produisent une immunité protectrice contre les infections de l'herpès virus, qui confèrent les avantages, par rapport à la technique antérieure, de l'inoculation de virus vivants, mais qui réduisent ou éliminent les problèmes qui viennent d'être discutés, serait un progrès hautement désirable par rapport à l'état actuel de la technologie.

C'est pourquoi, la présente invention a pour objet de produire des poxvirus recombinants qui expriment des produits de gène du virus de l'herpès et de ' fournir un procédé pour fabriquer de tels poxvirus recombinants.

Un objet supplémentaire de l'invention consiste à réaliser le clonage et l'expression de séquences de codage du virus de l'herpès dans un vecteur de poxvirus, particulièrement un vecteur de virus de la vaccine, un vecteur de poxvirus des volailles ou un vecteur de poxvirus du canari.

C'est un autre objet de l'invention de mettre à disposition un vaccin qui est capable de provoquer des anticorps neutralisant le virus de l'herpès et une immunité protectrice contre une attaque mortelle par le virus de l'herpès.

Ces objets et avantages ainsi que d'autres objets et avantages, de la présente invention apparaîtront aisément après considération de ce qui suit.

Suivant un premier aspect, la présente invention est relative à un poxvirus recombinant contenant une séquence d'ADN du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome du poxvirus. Avantageusement, le virus de l'herpès est un membre de la sous-famille des alphaherpèsvirus, bétaher-pèsvirus et gammaherpèsvirus. En particulier, la séquence d'ADN du virus de l'herpès code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès. PLus particulièrement encore, la glycoprotéine du virus de l'herpès est choisie dans le groupe constitué par le gpl3 du virus de l'herpès chevalin, gpl4 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gS duvirus de l'herpès chevalin, gp50 du virus de la pseudo-rage, gpll du virus de la pseudo-rage, gpIII du virus de la pseudo-rage, gpl du virus de la pseudo-rage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, gD du virus' de l'herpès simplex, gl du virus de l'herpès bovin, gB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, gp340 du virus d'Epstein-Barr, gB du virus d'Epstein-Barr, gH du virus d'Epstein-Barr et gB du cytomégalovirus humain.

Conformément à la présente invention, -le poxvirus recombinant exprime des produits de gènes du gène du virus de l'herpès étranger. En particulier, la séquence d'ADN étrangère code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès et l'ADN étranger est exprimé dans un hôte par la production de la glycoprotéine du virus de l'herpès. Avantageusement, plusieurs glycoprotéines du virus de l'herpès sont co-exprimées dans l'hôte par le poxvirus recombinant. Le poxvirus est avantageusement un virus de la vaccine ou un poxvirus aviaire, tel que le poxvirus des volailles ou le poxvirus du canari.

Sous un deuxième aspect, la présente invention est relative à un vaccin pour induire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec le vaccin, ce vaccin comprenant un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de l'ADN du virus de l'herpès. Plus particulièrement, l'ADN code en exprime une glycoprotéine du virus de l'herpès. Avantageusement, plusieurs glycoprotéines du virus de l'herpès sont co-exprimées chez l'hôte par le poxvirus. Le poxvirus utilisé dans le vaccin selon la présente invention est avantageusement un virus de la vaccine ou un poxvirus aviaire tel que le poxvirus des volailles ou le poxvirus du canari.

Sous un troisième aspect, la présente invention est relative aux mécanismes pour contourner le problème de l'immunité maternelle. Si la barrière est due à la présence d'anticorps vis-à-vis d'un antigène donné ou d'antigènes donnés, alors la barrière d'immunité maternelle peut être surmontée ou évitée en utilisant, sélectivement, des vecteurs exprimant des sous-ensembles définis d'antigènes. Par exemple, l'animal en gestation peut être vacciné avec un virus recombinant de la vaccine exprimant la glycoprotéine gp5Q du virus de la pseudo-rage et le descendant peut être vacciné à la naissance, ou peu de temps après, avec les recombinants de la vaccine exprimant d'autres glycloprotéines gpll ou gpIII, ou des combinaisons de celles-ci,.du virus de la pseudo-rage. D'un autre côté, si la barrière présentée par l'immunité maternelle est due au vecteur, alors on peut vacciner d'une manière différencielle la mère avec un vecteur (vaccine ou poxaviaire) et vacciner la progéniture avec l'autre vecteur. Ce procédé prend en considération bien entendu non seulement l'utilisation de vecteurs différents, mais également de vecteurs exprimant une constellation différente de glycoprotéines. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé pour surmonter ou éviter l'immunité maternelle qui, autrement, empêcherait une immunisation réussie chez une progéniture nouvellement née. Par la présente invention, la progéniture nouvellement née est inoculée avec un poxvirus recombinant contenant de l'ADN provenant d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du poxvirus, ledit ADN codant pour un premier antigène d'un agent pathogène de la progéniture nouvellement née, et ledit antigène est différent d'un second antigène du même agent pathogène utilisé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis du même agent pathogène chez la mère de la progéniture nouvellement née. Egalement par la présente invention, la progéniture nouvellement née est inoculée avec un premier poxvirus recombinant contenant l'ADN d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du premier poxvirus, cet ADN codant pour un antigène d'un agent pathogène de la progéniture nouvellement née, et ledit premier poxvirus étant différent d'un second poxvirus recombinant utilisé pour induire une réponse immunologique au même agent pathogène chez la mère de la progéniture nouvellement née.

Une meilleure compréhension de la présente invention sera obtenue à l'examen des dessins annexés, sur lesquels :

La Figure 1 représente schématiquement un procédé pour la construction ou formation du virus recombinant de la vaccine, vP425 ;

La Figure 2 illustre la séquence d'ADN d*un fragment de 1,88 Kb de EHV-1 contenant les séquences .de codage de gpl 3 ?

La Figure 3 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant de la vaccine, v?483, contenant le gène de EHV-1 gpl3 ;

La Figure 4 illustre schématiquement un procédé pour former le virus recombinant de la vaccine, vP458 ;

La Figure 5 illustre schématiquement un procédé pour construire le virus recombinant de la vaccine, vP577, contenant le gène de EHV-1 gpl4 ;

La Figure 6 illustre la séquence d'ADN d'un fragment de 3,35 kb de EHV-1 contenant la séquence de codage de gpl4 ;

La Figure 7 est un graphique de l'hydrophilicité relative pour les séquences de codage de EHV-1 gpl4 ;

La Figure 8 illustre schématiquement un procédé pour la construction ou la formation du virus recombinant du pox aviaire, vFP44, contenant le gène de EHV-1 gpl3 ;

La Figure 9 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant du poxvirus du canari, vCP48, contenant le gène de EHV-1 gpl3 ;

La Figure 10 illustre schématiquement un procédé pour la construction ou la préparation des plasmides donneurs pHES-MP63, pHES-MPl et DHES-HP34 contenant des versions modifiées du gène de EKV-1 çpl4 ;

La Figure 11 est une carte des sites de coupure par BamHI de la souche Kentucky D de EHV-1, indiquant les répétitions inversées du génome par des boîtes, montrant l'emplacement des six gènes principaux de glycoprotéines de EHV-1 et montrant également une expansion de la région du génome qui inclut les gènes gD, gp63 et gE ;

La Figure 12 illustre la séquence de nucléotides d'un fragment de 6402 paires de bases de EHV-1 contenant les séquences de codage de gD, gp63 et gEe ;

La Figure 13 est une représentation hydropathique de la séquence de 402 acides aminés composant EHV-1 gD ;

La Figure 14 est une représentation hydropathique de la séquence de 413 acides aminés composant ÈHV-1 gp63 ;

La Figure 15 est une représentation hydropathique de la séquence de 552 acides aminés composant EHV-1 gE ;

La Figure 15 illustre schématiquement un procédé pour la construction de plasmides donneurs pJCA006, pJCA0007 et pJCA008 contenant le gène de EHV-1 gD, de EHV-1 gE et de EHV-1 gp63, respectivement, et la formation du virus recombinant de la vaccine contenant ces gènes ;

La Figure 17 illustre schématiquement un procédé pour la construction de plasmides donneurs pJCA009 (contenant les gènes de EHV-1 gD et gp53) et pJCAOlO (contenant les gènes de EHV-1 gD, gp63 et gE), et la production du virus recombinant de vaccine contenant ces gènes ;

La figure 18 représente schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur PR18 contenant le gène de PRV çpll, et la formation du virus recombinant de la vaccine exprimant le gène de PRV gpll ;

La Figure 19 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpll ;

La Figure 20 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pPR24 contenant le gène de PRV gpIII, et la production du virus recombinant de la vaccine exprimant le gène de PRV gpIII ;

La Figure 21 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpIII ;

La Figure 22 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pPR26 contenant le gène de PRV gp50, et la production du virus recombinant de la vaccine exprimant le gènede PRV gp50 ;

La Figure 23 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gp50 ;

La Figure 24 illustre schématiquement un procédé pour la construction des plasmides pSD478VC et pSD479VCBG et l'insertion de beta-galactoside dans le virus de la vaccine ;

La Figure 25 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pMP13PP ;

La figure 26 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pFPPRVU contenant le gène de PRV gpll ;

La Figure 27 illustre schématiquement un procédé pour la construction du recombinant du poxvirus du canari, vCP55, exprimant le gène de PRV gpll ;

La Figure 28 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant de la vaccine, VP717, exprimant le gène de PRV gl ;

La Figure 29 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP569 et vP734, exprimant le gène de HSV-2 gB ;

La Figure 30 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP579, vP748 et vP776, exprimant le gène de HSV-2 gC ;

La Figure 31 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, VP570, vP761, vP775 et VP777, exprimant le gène de HSV-2 gD ;

La Figure 32 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, VP637 et vP724, exprimant le gène de BHV-1 gl ;

La Figure 33 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pJCAOOl contenant le gène de FHV-1 gB et pour la construction du virus recombinant de la vaccine, vP717, exprimant le gène de FHV-1 gB ?

La Figure 34 illustre la séquence de nucléotides du segment, de 3400 bp, de l'ADN de FHV-1 codant pour la glycoprotéine gB ;

La Figure 35 est une représentation hydropahique de la séquence de 947 acides aminés composant FHV-1 gB ;

La Figure 36 illustre schématiquement un procédé pour la construction des plasmides donneurs 409gp220 contenant le gène de EBV gp220, et 4Û9gp340, contenant le gène de EBV gp340 ;

La Figure 37 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 409 çB contenant le gène de EBV gB ;

La Figure 38 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 486çH contenant le gène de E3V çH ;

La Figure 39 illustre schématiquement la structure du plasmide donneur de la vaccine 513gHgBgp34Û contenant les gènes d'EBV gp340, gB et gH ;

La Figure 40 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 409CMVgB contenant le gène de C14V gB ;

La Figure 41 illustre les séquences de nucléotides et d'acides aminés du gène de KCMV (souche de Towne) HXLF1 ; et enfin

La Figure 42 montre les séquences de nucléotides et d'acides aminés du gène de HCMV (souche de Towne) HXLF2.

Les exemples qui suivent sont destinés à mieux faire comprendre l'invention et ses nombreux avantages, ces

exemples étant uniquement illustratifs et non limitatifs. Exemple 1 - CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DU VIRUS DE LA VACCINS EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE σρ13 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN

Remplacement du cène HA de la vaccine par le cène de l'E. Coli beta-calactosidase

La souche de Copenhague du virus de la vaccine obtenue de Rhone Hérieux, Inc. (Athens, Géorgie) a été utilisée dans cet exemple. Le virus a été propagé à partir d'un isolat de plaque purifié soit sur cellules· de VERO (ATCC n° CCL81) ou de MRC-5 (ATCC n° CCL171) dans un milieu essentiel minimal d'Eagle (MEK) avec 10 % de sérum foetal bovin (FBS). Un dérivé du virus de souche sauvage, dont toute la séquence de codage pour le gène de la thymidine kinase a été supprimée par des méthodes classiques (25,.28), a été isolé et désigné VP410. Ce mutant à suppression de la thymidine kinase a été utilisé pour des manipulations ultérieures. On a construit des plasmides .qui ont été sélectionnés et qu'on a cultivé par des procédures classiques (27, 28).

En se référant maintenant à la Figure 1, le fragment SalIF de 13 kb du virus de la vaccine qui recouvre la jonction du fragment HindiII A/B a été lié à pUC8 digéré par Sali, en engendrant pSD419VC. Le bras droit de pSD419VC correspondant à la portion HindiII B du fragment Sali F a été enlevé par digestion avec HindlII et re-ligation, engendrant pSF456VC. pSD456VC contient ainsi l'extrémité de droite du fragment par HindlII A dans lequel se trouve toute la région de codage pour le gène (HA) de l'hémaglutinine (35) flanqué par approximativement des séquences supplémentaires de vaccine de 0,4 kb Ode chaque côté.

Pour engendrer un vecteur plasmidique virtuellement privé de séquences de codage de HA, pSD455VC a été coupé (partiellement digéré) au site Rsal en amont du gène HA et au site Baal 80 bp à partir de l'extrémité 3' du gène HA. Le fragment Rsal/Baal d'environ 3,5 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose.

Des oligonucléotides synthétiques MPSYN59-62 ont été préparés pour remplacer la région depuis le site Rsal jusqu'à la position 2 en amont de la séquence de codage de HA, immédiatement suivi par les sites de restriction ΒσΙΙΙ, Smal et PstI et une extrémité cohesive Eaal. La séquence de HPSYN59-62, avec les sites de restriction comme indiqué est la suivante :

51 -ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTT&ATAGAACAA 31 -TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAACÏATCTTGTT

AATACATAATTTTGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCTCCCGGGCTGCAGC-31 TTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTÇTÀGAûûûÇÇÇGAÇûTÇüÇÇGG-S1

Soin Sral PstI Eacl

Le mélange MPSYN59-52 ayant subi un traitement de réforme ou dénaturation (anneding) a été lié au fragment Rsal/Eacl de 3,5 kb provenant de pSD456VC, en engendrant pSD465VC. Ainsi, dans le pSD4 66VC, le gène HA a été remplacé par une région de polyliaison (polylinker).

A fragment BolII/BamHI (partiel) de 3,2 kb contenant le gène E,. Coli beta-galactosidase provenant de pMC1871 (34) sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de vaccine de 11 kDa (7), a été cloné en pSD466VC qui a été digéré avec Belli. Un plasmide contenant la cassette promoteur de 11 kDa/gène de béta-galactosidase dans une orientation de la gauche vers la droite par rapport aux bras de vaccine sur les flancs a été désigné pSD466VCBGA et recombiné en un mutant à suppression de thimidine kinase, vP410, de la souche Copenhague du virus de la vaccine, en engendrant le recombinant de la vaccine vP425 exprimant la betagalactosidase. On a retenu 80 paires de bases à l'extrémité carboxy du gène HA de manière à ne pas rompre un court cadre de lecture ouvert potentiel transcrit de la droite vers la gauche par rapport au génome de la vaccine.

Le virus recombinant de la vaccine, vP425 (184), a été identifié sur la base de la formation de plaques bleues en présence du substrat chromogène X-gal, comme décrit par d'autres (9, 24). La substitution du gène de béta-galactosi-dase par encore un autre gène étranger dans des recombinants subséquents de la vaccine pourrait être déterminée facilement en isolant des plaques incolores au lieu de plaques bleues.

Pour faciliter les phases futures de clonage, le site Smal dérivé de la région de multiclonage.de pUC8 a été éliminé par digestion de pSD466VC par BamHI/EcoRI, la formation d'une extrémité franche avec le fragment de Klenow de l'E. Coli polymérase et re-ligation. Ainsi, le seul site

Smal restant dans le plasmide résultant, pSD467VC, est dans la région de polyliaison de la suppression de HA.

Identification des séquences d'ADN codant le cène EHV-1 ctp13

La séquence d'ADN codant la glycoprotéine EHV-1 gpl3 réside dans le fragment BamHI-H de 7,3 kb de EHV-1 (3). Les données concernant la séquence de nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de la région pUC (BamHI-H) en utilisant des sous-clones chevauchants par utilisation de l'enzyme T7 modifiée SEQUENASE (40) provenant de U.S. Bioche-micals, Cleveland, Ohio. Les réactions classiques de terminaison de chaîne didéoxy (33) ont été réalisées sur des modèles ou matrices de plasmides à double brin qui ont été dénaturés dans un alcali. Les amorces M13, avant et arrière, ont été utilisées pour obtenir la séquence initiale de chaque clone. Les amorces sur mesure 16-17-mer, synthétisées en utilisant la technique chimique classique (Biosearch 8700, San Rafael, CA : Applied Riosystems 3803, Foster City, CA), ont été utilisées pour se déplacer le long du fragment restant. Le programme d'analyse de séquences I3I Pustell a été utilisé dans toutes les analyses de données de séquences (29).

L'analyse de séquences d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 1 404 bp codant 468 acides aminés avec un produit de traduction primaire prédit de 50,9 kDa. Une homologie significative des acides aminés dans la moitié carboxy du cadre de lecture ouvert de gpl3 putatif a été observée avec Gc des virus de 1'herpes simplex type 1 et type 2, gill du virus de la pseudo-rage et gpV du virus de la varicelle-zoster ce qui suggère que gpl3 est un membre des glycoprotéines du type gC des virus de l'herpès. En outre, une analyse détaillée du cadre de lecture ouvert de EHV-1 gpl3 a été présentée dans une publication antérieure (2). Pour faciliter la description du clonage et de l'expression de EHV-1 çpl3 dans les vecteurs du virus de la vaccine, le cadre de lecture ouvert de gpl3 plus des séquences additionnelles 5' et 3' sont illustrés sur la Figure 2. Sur cette Figure, une boîte TATA présumée et des acides aminés comprenant des signaux putatifs et des éléments d'ancrage de membrane sont soulignés. Le site de coupure potentiel de la séquence de signal est noté avec une flèche suivant le signal de coupure ASA (cercles ouverts). Potentiellement, neuf sites de glycosylation à liaison par l'azote existent à l'intérieur des séquences de signal et d'ancrage, comme défini par le motif Asn-X-Ser/Thr (astérisques).

Clonaae du cène de EHV-1 ctp!3 dans un olasmide donneur du virus de la vaccine

Un promoteur du virus de la vaccine précoce/tardif, H6, a été utilisé pour l'expression de gènes étrangers dans des vecteurs du virus de pox aviaire (41, 42). Cet élément de promoteur correspond aux séquences d'ADN immédiatement en amont du cadre de lecture ouvert de H6 dans le fragment de vaccine HindiII-H (31).

En se référant maintenant à la Figure 3, pour faire muter et insérer le promoteur H6 dans pSD467VC, on a synthétisé des oligonucléotides H6SYN oligos A-D. La séquence de H6SYN oligos A-D, avec les bases modifiées comme souligné et les sites de restriction comme indiqué est la suivante :

' BolII

5 1 -GATCTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTT 3 ’ -AGAAATAAGATATGAATTTTTÇACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAA

GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA

CACAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATT

GTTTGTATCGTACCC-3* CAAACATAGCATGGG-5·

Smal

Les bases soulignées dénotent une modification de la séquence du promoteur natif Ηβ.

L'ADN double brin de longueur totale 130 bp, formé par le traitement de réforme (annealing) de H6SYN oligos A-D a été purifié par électro-élution à partir d'un gel d'agarose et lié à des fragments Smal/HindiII de 0,5 kb et ΒσΙΙΙ/ HindlII de 3,1 kb, dérivés de pSD457VC‘. Le plasmide résultant, pTP15 (184), possède le codon d'initiation ou d'amorçage ATG modifié en CCC comme partie du site Smal gui est immédiatement suivi par un site PstI. Un agent de liaison (linker) de Nsil, à savoir 5 '-TGCATGCATGCA.-3 ' (New England Biolabs, Beverly, HA) a été inséré au site Smal de pTP15 pour engendrer le plasmide pNSI.

Un fragment EHV-1 EcoRI/Narl, dans lequel le site BcoRI se trouve 120 bp en amont du codon d'iniation ou d'amorçage ATG et dans lequel le site Narl se trouve 23 bp en amont du codon de terminaison TAG de EHV-1 çpl3, a été cloné dans le phage M13mpl9 en engendrant le phage recombinant H13EcoRnar. En utilisant la mutagénèse dirigée par oligonucléotide (17) un site Nsil a été introduit en changeant la séquence TTGCCT (bases 130-135 sur la Figure 2) dans le gène de EHV-1 gpl3 en ATGCAT. Le fragment EcoRI/Narl provenant du phage mutant H13EcoRnar a été cloné en pUC8 au site ScoRI/N-arl en engendrant le plasmide pNSIEN.

Deux 42-mer oligonucléotides ont été synthétisé ayant la séquence, avec des sites de restriction comme indiqué, ci-après :

Narl gpl3 Extrémité 3' Ndel 5'-CGCCGTACAAGAAGTCTGACTTTTAGATTTTTATCTGCAGCA-3* 3' -GGCATGTTCTTCAGACTGAAAATCTAAAAATAGACGTÇGTAT-5 *

PstI

Dans cet oligonucléotide, le codon de terminaison (TAG) est suivi immédiatement par un agent de terminaison de transcription précoce de la vaccine (ATTTTTAT). Le fragment d'ADN double brin obtenu par traitement de réforme (annea- ling) de la paire de 42-mers contient une extrémité cohesive Narl, suivie par l'extrémité 3' de la séquence de codage pour le gène de EHV-1 gpl3, aussi bien qu'un signal de. terminaison de transcription précoce de la vaccine (45), un site PstI et une extrémité cohesive Ndel. Ce fragment a été inséré entre les sites Narl/Ndel de pNSIEN, en engendrant pNSIENPN (Figure 3).

Le fragment de Nsil/PstI de pNSIENPN a été isolé et cloné aux sites Nsil/PstI du plasmide pNSI, en engendrant le plasmide pVHA6ql3NsiI (Figure 3). pVKA.6gl3Nsiî a été coupé au site EcoRV dans le promoteur H6 et le site Nsil qui a été introduit au voisinage du commencement du gène de EHV-1 gpl3. Ce fragment de vecteur comportait une extrémité franche avec la nucléase de fève de Mung (Hung bean). Deux 32-mer oligonucléotides complémentaires ont été synthétisés ayant la séquence, avec le site de restriction comme indiqué, ci-après :

EcoRV

5 r -ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGGTTGCC-3 1 3 ' -TAGGCAATTCAAACATAGCATTACACCAACGG-5 ' H6 promoteur çrpl 3 extrémité 5'

Ces oligonucléotides ont été traités pour réforme (annealing) et liés dans le fragment de vecteur pVHA6gl3NsiI, en produisant le plasmide pVHA6gl3, qui contient une jonction précise au codon d'initiation ou d'amorçage ATG (souligné dans la séquence du 32-mer) du promoteur II6 et du gène de EHV-1 gpl3.

pVHA6gl3 a été transfecté en des cellules infectées par vP425 pour engendrer un recombinant de la vaccine, vP483, contenant le gène de EHV-1 gpl3 (Figure 3).

Construction formation de recombinants du virus- de la vaccine

Les procédés de transfection des plasmides donneurs recombinants dans des cellules de culture de tissu infectés avec un virus de la vaccine de sauvetage et d'identification de recombinants par hybridation in. situ sur des filtres de nitrocellulose ont été effectués comme décrit précédemment (25, 28). Pour construire vP425 dans lequel le'gène E.. Coli de béta-galactosidase remplace les séquences de codage HA ce la vaccine, l'ADN du plasmide [25ug de pSD466VCBGA dans HeBS (16)] a été électroporé (BioRad Gene Puiser, capacitance de 960, 200 volts) dans des cellules de VERO. Des monocouches subconfluentes de cellules ont été infectées à 10 pfu par cellule avec vP410 une heure avant l'utilisation. Les cellules infectées ont été collectées avec de la trypsine et lavées avec HeBS avant électroporation. Les cellules ont été soumises à une incubation dans HEM + 5 % de sérum foetal bovin à 37°C pendant 24 heures, récoltées, et le virus constituant la progéniture plaqué sur des monocouches de VERO. Le virus recombinant exprimant la beta-galactosidase a été détecté sous forme de plaques bleues en présence du substrat X-gal (9,24). Pour engendrer le virus recombinant de la vaccine dans lequel le gène de EHV-1 gpl3 remplaçait le gène de béta-galactosidase dans vP425, on a suivi un protocole similaire excepté que le plasmide donneur était pVHA6g!3 et le virus de sauvetage vP425. Le recombinant de la vaccine vP483, contenant EHV-1 gpl3 a été détecté en tant que plaque incolore en présence de X-gal et confirmé en tant que recombinant véritable par hybridation d'ADN après trois cycles de purification sur plaque.

Expression du cène de EHV-1 σο!3 sur la surface de cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP483

Des cellules de BSC-40 ont été ensemencées sur des plaquettes en verre de 22 mm dans des boîtes de 35 mm à 5 X 105 cellules par boîte. Avec une confluence d'environ 80 %, les cellules ont été infectées à 2 pfu par cellule. Après une période d'adsorption d'une heure, 1'inoculum de virus a été enlevé et on a ajouté HEM plus 2 % de sérum foetal bovin. 20 heures après l'infection, les plaquettes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,2 % de BSA et 0,1 % de NaN3 (PBS+) et exposées à 0,1 ml d'anticorps monoclonal anti-gpl3, 14H7 (3) dilué à 1°/oa dans pBS+. Après 1 heure dans une chambre humidifiée à la température ambiante, les cellules ont été lavées trois fois dans du PBS+. Ce procédé a été répété avec IgG caprin anti-souris de l'isothiocyanate de fluoresceine. Finalement, les cellules ont été fixées pendant 20 minutes dans la formaldéhyde à 2 % dans PBS. Les plaquettes ont été montées dans du glycérol à 20 % dans PBS contenant 3 % de n-propul gallate et on a observé la fluorescence au moyen d'un microscope.

La protéine prédite d'après la séquence d'ADN présente les traits typiques caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane (14). Dans une infection productrice de EHV-1, cette glycoprotéine gpl3 est incorporée dans différents systèmes de membrane de la cellule et elle est transportée dans la membrane cytoplasmique et est détectable sur la surface externe de la cellule infectée. EHV-1 gpl3 est additionnellement un composant du virion de EHV-1. C'est pourquoi des études d'immunofluorescence ont été réalisées pour déterminer si EHV-1 gpl3, exprimé par le virus recombinant de la vaccine, vP483, est de manière similaire présent sur la membrane cytoplasmique des cellules infectées. L'anticorps monoclonal spécifique anti-gpl3 suivi par l'IgG anti-souris caprin conjugué à la fluoresceine a révélé une immunofluorescence forte de la membrane dans les cellules infectées par vP483 mais non pas dans les cellules infectées par le virus de la vaccine vP410. Ceci suggère que la EHV-1 gpl3 exprimé par le virus recombinant de la vaccine v?483 est présente sur la membrane cytoplasmique comme attendu pour la synthèse authentique de la glycoprotéine enjambant la membrane.

Immunoprécipitation des produits de EHV-1 ctp13 synthétisés à partir de cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP483 Deux millions de cellules formant une monocouche confluente dans une boîte de 60 mm ont été infectées au taux de 10 pfu par cellule. L'inoculation a été réalisée dans un milieu exempt de méthionine. Après la période d'adsorption, 1'inoculum a été enlevé et on ajouté 2 ml de milieu exempt de méthionine contenant 20 μ Ci/ml de 35S-méthionine ajoutés. On a laissé se poursuivre l'infection pendant 24 heures et alors les cellules ont été lysées par l'addition de 1 ml de 3x tampon A contenant 3 % de NP-40, 30 mM Tris pH 7,4, 450 mL NaCl, 3 mM EDTA, 0,03 % d'azide de sodium et 0,6 mg/ml de PMSF. Les cellules lysées et le produit surnageant ont été récoltés, soumis à un voretex et clarifiés par centrifugation à 10 000 g pendant 15 minutes.

On a préparé la protéine A-Sépharose CL-4B (Pharmacia, Cat. n° 17.0780.01) en tant qu'un coulis 1:1 dans le Ix tampon A. Un conjugué de rat anti-souris (Boehringer Mannheim, Cat. n° 605.500) a été dilué au centième dans le coulis et lié à des perles à la température ambiante pendant 4 heures avec balancement. Les perles ont été ensuite lavées complètement avec six lavements de 1 ml dans le tampon A pour éliminer le conjugué non lié. On a ensuite lié aux perles un anticorps monoclonal spécifique à gpl3, à température ambiante, pendant 4 heures. L'anticorps en excès a été éliminé par lavage poussé. 1 ml de lysat de cellules infectées, clarifié, a été préclarifié par incubation avec des perles ou billes de protéine A-Sepharose auquel du sérum de souris normal a été lié. Ces perles ont été éliminées par centrifugation. 1 ml du lysat préclarifié, clarifié, a été ensuite mélangé à 100 μΐ des perles auquel a été lié l'anticorps monoclonal spécifique. Ce mélange a été oscillé à température ambiante pendant 4 heures. Les perles ont été éliminées par centrifugation et lavées complètement par 4 lavages dans lx tampon A et deux lavages dans 10 mM Tris pH 7,4 contenant 0,2 M LiCl et d'urée 2M. Le complexe anticorps- antigène est ensuite éliminé des perles et rompu par l'addition de 50 μΐ de 2 X solution de rupture Laemmli (60, 195). On a ensuite fait bouillir l'échantillon pendant 5 minutes avant électrophorèse.

Deux produits d'approximativement 44 et 47 kDa sont détectables et ils sont quelque peu plus petits que le produit de traduction primaire prédit (51 kDa) et un produit plus grand d ' approximativement 90 kDa qui est consistant avec une forme complètement glycosylatée du produit de gène de EHV-1 gpl3. Aucun polypeptide équivalent n'a été précipité à partir des cellules infectées du virus de la vaccine qui sont servi de contrôle.

Exemple 2 - CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DE VIRUS DE LA VACCINE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE CPl4 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN Remplacement du cène M2L dans le virus de la vaccine par le cène d'E. Coli beta-calactosidase Pour insérer les séquences de codage de EHV-1 gpl4 dans un vecteur du virus de la vaccine, un virus recombinant de la vaccine, vP458, exprimant le gène d'E.. Coli LacZ a été fabriqué. La substitution des séquences de codage de LacZ dans le virus recombinant, vP458, avec les séquences codant EHV-1 gpl4 permet un système de sélection par plaques bleues ou incolores afin d'identifier EHV-1 gpl4 contenant des virus recombinants (9', 24) en présence de X-gal, un substrat de béta-galactosidase chromogénique. En outre, dans le but de construire des virus recombinants de la vaccine exprimant à la fois EHV-1 gpl4 et EH-1 gpl3, un locus d'insertion pour EHV-1 gpl4 unique, à partir du locus supprimé de l'hémagluti-nine, utilisé pour l'insertion de EHV-1 gp!3 dans l'Exemple 1, a été préparé au locus K2L de HindlII H. La séquence de codage complète du gène de M2L dans le fragment de vaccine HindlII M a été éliminée et remplacée par le gène d'E.. Coli LacZ codant la beta-galactosidase. Les étapes de clonage pour la construction de vp458 sont représentées schématiquement sur la Figure 4.

En se référant maintenant à la Figure 4, un cadre de lecture ouvert, lu de la droite vers la gauche par rapport au génome de la vaccine et codant une protéine putative de 220 acides aminés est logé entièrement à l'intérieur du fragment HindiII M de la souche Copenhague du virus de la vaccine à la gauche du site unique Belli. Conformément à la convention (31), ce gène, qui est situé immédiatement à droite de MIL (58) a été désigné M2L. Des études de suppression appliquées au génome de la vaccine (WR) s'étendant à gauche à partir du site unique Belli dans le fragment M de HindlII (57) indiquent que les séquences de codage de la vaccine contenues dans KindIII M à gauche du site Belli ne sont pas essentielles pour la réplication du virus dans les cultures de tissu.

Pour faciliter l'utilisation de la région M2L en tant que endroit ou locus d'insertion pour des gènes étrangers, un vecteur de plasmide, pMP409DVC, a été créé dans lequel toute la séquence de codage de M2L a été remplacée par un site Belli comme suit. pSD409VC, qui consiste en un fragment de HindlII M de la vaccine de Copenhague clonée dans le site HindlII de pUC8, a été digéré avec BaroHI/3olII et auto-lié, éliminant ainsi l'extrémité droite de HindlII M et détruisant le site Belli. Le plasmide résultant pMP4093VC, a été linéarisé au moyen de Sohl qui coupe à l'intérieur du cadre de lecture ouvert de M2L et a été soumis à une digestion par l'hexonucléase Bal-31 pendant 2 minutes. Une mutagé-nèse a été réalisée sur l'ADN résultant (19) en utilisant un 49 mer ( 5 ' -TTTCTGTATATTTGCAACAATTTAGATCTTACTCAAAATATGTAACAAT-3' ; le site Belli étant souligné) synthétique. Dans le plasmide ayant subi la mutagénèse, pMP409DVC, les séquences de codage de M2L ont été supprimées depuis la position +3 jusqu'à l'extrémité du cadre de lecture ouvert. Le G du codon d'amorçage ou d'initiation ATG a été changé .-en un C pour créer un site Belli unique (AGATÇT) à la jonction de suppression .

Un fragment de ΒσΙΙΙ/BamHI partiel de 3,2 kb contenant 3,1 kb du gène de béta-galactosidase d'E.. Coll entre les sites BamHI, de pMC1871 (34) sous le contrôle transcriptionnel du promoteur tardif de 11 kDa ‘de la vaccine de 0,1 kb a été cloné au site Belli unique de pMA409DVC. Un plasmide recombinant contenant la cassette de promoteur de 11 kDa/gène de beta-galactosidase dans l'orientation de la droite vers la gauche par rapport aux bras de vaccine de flanc et le génome a été désigné pMP409DVCBG. pMP409DVC3G a été utilisé comme plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de la vaccine de sauvetage, vP410, décrit dans l'Exemple 1. Le nouveau recombinant de la vaccine, désigné vP458, exprimant le gène de béta-galactosidase inséré dans le locus de suppression de M2L a été détecté en utilisant un substrat X-gal chromogénique (9, 24) et purifié par clonage sur plaque répété.

Clonaae du cène de EHV-1 σο!4

En se référant maintenant à la Figure 5, la séquence de codage de EHV-1 gpl4 chevauche la jonction entre des fragments de restriction BamHI, a et i (3). Les fragments d'ADN de EHV-1, BamHI-a (21,3 kb) et i (7,1 kb (59) ont été isolés à partir de gels d'agarose. On a construit le plasmide pUC (BamHI-i) en insérant le fragment EHV-1 BamHI-i dans le plasmide pUC8 au site BamHI. Le fragment BamHI-i de EHV-1 a été digéré au moyen d ' EcoRi et lié en dans le pUC8 digéré par EcoRI/BamHI. Le plasmide pUC iBamHI-a/EcoRI) contient une insertion de EHV-1 BamHI/EcoRI de 10 kb. En se basant sur les déterminations de dimensions de fragments rapportées (59), les séquences d'ADN dans cette insertion sont contiguës à celle du fragment de BamHi-i dans le génome de EHV-1.

Analyse de la séquence de nucléotides L'analyse de la séquence de nucléotides a été obtenue en utilisant différents sous-clones' à partir de plasmides de pUC (BamHI-a/EcoRI) et pUC (BamHI-i). La détermination de la séquence du plasmide pUC (BamHI-a/EcoRI) a été commencée au site BamHI du fait que le gène de EKV-1 gpl4 enjambe la jonction BamHI-a/i (3). L'orientation du plasmide pUC ( (BamHI-i) a été déterminée par digestion au moyen d'enzyme de restriction. Etant donné que la terminaison de EKV-1 BamHI la plus voisine du site EcoRI dans pUC ( BamHI -i) a été trouvée comme étant le site BamHi à la jonction BamHI-a/i, on a commencé la détermination de la séquence du fragment à partir de cette extrémité BamHi.

Les données de séquence pour les deux brins ont été obtenues comme décrit dans l'Exemple 1. La séquence de nucléotides du fragment de 3 351 bp contenant la séquence de codage de EKV-1 gp 14 est illustrée sur la Figure δ. La numérotation dans les marges de gauche et de droite concerne les séquences d'acides aminés et d'acides nucléiques, respectivement. Les boîtes CAT et TATA putatives sont soulignées. Les acides aminés dans la région de signal et enjambant la membrane sont également soulignés avec une flèche indiquant un site potentiel de coupure de peptide de signal. Les treize sites de glycosylation potentiels en utilisant la séquence de concensus (Asn-X-Ser/Thr) cnt été indiqués par un astérisque.

L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert s'étendant à partir des positions de ciunéo-tides 300 à 3 239 en lisant de la gauche vers la droite par rapport au génome de EHV-1, c'est-à-dire que le codon de départ ATG était contenu dans le fragment BamHI-a/EcoRI et le codon d'arrêt TAA était contenu dans le fragment BamHi-i (3, 59).

Des signaux putatifs réglant la transcription ont été trouvés dans la région 5' du codon d'initiation ATG en position 300. Une boîte TATA ayant la séquence AAATATAT (nucléotides 148 à 155) a été localisé 70 nucléotides en aval d'une boîte CAT putative aux positions 71 à 77 ayant la séquence GGTCAAT. Un signal de polyadénylation AATAAA (nucléotides 3251 à 3256) a été localisé 8 nucléorides en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 3240 à 3242). Neuf des onze nucléotides dans la séquence 5'-TCCTGCGCGCA-3' (nucléotides 218 à 228) sont complémentaires de'la séquence d'ARN ribosomal (18S) à savoir 3'AGGAZGGCGT-5' (61) et peuvent servir comme site de liaison du ribosome.

Analyse de la structure de EHV-1 ctp!4'

Le cadre de lecture ouvert de EHV-1 gpl4 code 980 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 109,8 kDa. L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 58 à 69 a un profil d'hydrophobicité caractéristique et on l'a propose comme étant la séquence de signal (Figure 6). Une caractéristique inhabituelle du produit de gène de EHV-1 gpl4 est que la longue séquence de signal hydrophobe est précédée par une longue séquence hydrophyle. Cette caractéristique a également été notée pour les gènes du virus de la pseudo-rage (PRV) çll (62) et pour le virus de l'herpès bovin 1 (BHV-1) gl (63) ces deux gènes étant également des homologues de HSV çB. Une région hydrophobe constituée par 45 acides aminés (acides aminés 825 à 870) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Le domaine cytoplasmique hydrophile contient 110 acides aminés.

Il existe onze sites Asn-X-Thr/Ser (X pouvant être tout acide aminé exepté la proline) pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote (64). Une caractéristique inhabituelle est constituée par le fait qu'il y a également deux sites potentiels de glycosylation dans le domaine cytoplasmique (Figure 5).

Une représentation d'hydrophilicité de la séquence de codage de EHV-1 gpl4 est illustrée sur la Figure 7. L'index hydropathique de EHV-1 gpl 4 est calculé par la méthode de Kyte et Doolittle (65) avec une fenêtre de sept acides aminés et pas de lissage. Les points sous la ligne horizontale représentent des zones d'hydrophobicité pius élevée ce qui indique donc des régions de signal potentiel et/ou d'enjambement de membrane. Les caractéristiques ce glycoprotéines qui enjambent la membrane comprennent des éléments de signal et d'ancrage et la longue -région hydrophile qui précède la séquence de signal sont trouvées pour la séquence de codage de EHV-1 gpl4.

Localisation du déterminant antioènioue reconnu par l'anticorps monoclonal anti-SHV-1 σρ!4, à savoir 3E5 Les vecteurs d'expression de lambda gtll et les anticorps monoclonaux ont été utilisés pour identifier les séquences d'ADN de EHV-1 codant les principales glycoprctéi-nes de EHV-1 (3). Un recombinant lambda gtll, à savoir 4 à 1 a montré qu'il exprimait l'épitope de EHV-1 gpl4 reconnu par l'anticorps monoclonal spécifique 3FS (3). En vue de déterminer l'identité de cet épitope, l'ADN de EHV-1 contenu à l'intérieur de 4 à 1 a été séquencé et comparé avec la séquence d'ADN de la séquence de codage de EHV-1 çpl4 (Figure 6). Pour séquencer le fragment d'ADN correspondant à l'épitope de EHV-1 gpl4 dans le recombinant lambda gtll, à savoir 4 à 1 reconnu par l'agent monoclonal anti-EKV-1 g?14, à savoir 3F6 (3), on a digéré 4 à 1 avec EcoRI, le fragment ce EHV-1 a été isolé sur des gels d'agarose et lié au site EccRi de pUC8. Le séquençage d'ADN a été réalisé comme décrit ci-dessus avec les promoteurs avant et arrière universels 2413.

L'alignement de la séquence de nucléotides à indiqué que cet épitope était contenu dans la région des 66 acides aminés correspondant à 107 (Thr) à 172 (Val) du produit de traduction primaire déduit. L'épitope est donc localisé à l'intérieur de la région amino-terminale du domaine de surface déduit de EHV-1 gpl4.

Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1 op14 avec d'autres glycoprotéines du virus de 1'herpès -

La comparaison de la composition des acides aminés du gène de EHV-1 gpl4 a révélé une homologie étendue avec les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, EHV-1 çpl4 est homologue à gll de PRV (62), gl de BHV-1 (63), gll du virus de la varicelle-zoster (VZV) (66), gB du virus de l'herpès simplex (HSV) (67, 71, 72), aussi bien qu'à des glycoprotéines du virus d'Epstein-Barr (EBV) et du cytomégalovirus humain (HCMV) (10).

Mutacrénèse dirigée par les oligonucléotides de la terminaison 5' de la séquence de codage de 5HV-1 σο!4

En se référant maintenant de nouveau à la Figure 5, le plasmide bleu (Konil/BamHI) a été engendré en insérant un fragment de Konl/BamHi provenant de pUC (BamHI-a/EcoRI) dans la transcription du plasmide Bluescript SK-ί- digéré par Konl/ BamHI. La mutagénèse dirigée par les oligonucléotides a été réalisée par une modification du procédé de Kunkel (17) en utilisant des modèles d'ADN contenant de l'uracile à partir du plasmide bleu (Kpn1/BamHI) produit chez l'hôte "dut ung" JL* Coli souche CJ236. Dans le plasmide mutagéné, on a créé un site Nsiï aux codons 1 et 2 du gène de EHV-1 çpl4 en changeant la séquence ATG/TCC (Met/Ser) en A.TG/CAT (Met/His). La séquence ayant subi la mutation a été vérifiée par analyse de la séquence d'ADN. Le fragment Knol/BamHI du mutant a été transféré au pUC18 digéré par Konl/BamHI en engendrant le plasmide (Konl/BamHI).

Un plasmide, à savoir pUCgl4, contenant le gène complet de EHV-1 gpl4 avec la mutation de site Nsiï a été construit en insérant le fragment EcoRI/BamHI à partir de pUC (Kon1/BamHI) en pUC (BamHI/PstI) digéré par EcoRI/BamHI. un sous-clone de 3,9 kb de pUC (BamllI-i) .

Construction de plasmide donneur chimère pVM2LH6al4 pMP409DVC a été coupé au moyen de Belli et lié avec de l'ADN double brin synthétique contenant le promoteur (précoce/tardif) H6 de la vaccine modifié,.- décrit dans l'Exempple I, flanqué par des sites de restriction. Les sites de restriction pour Nsiï, Sacl, Pstl et EcoRI*ont été créé immédiatement en aval du codon d'initiation endogène dans le promoteur H6. Dans pMGll, la séquence de polyliaison en aval du promoteur H6 est ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. Le site unique Nsil contenant le codon d'initiation K6 (souligné) est immédiatement suivi par les sites uniques Sacl. PstI et EcoRI.

Le fragment d'ADN EcoRI/Nsil de pUCgl4 contenant la région d'ADN de EHV-1 en amont du codon d'initiation de EKV-1 gpl4 a été remplacé par le fragment EcoRI/Nsil à partir du plasmide pMGll, en engendrant ainsi le plasmide pMRHgl4 qui contient le bras droit de HINDIII M de la vaccine, le promoteur H6 et toute la longueur du gène de EHV-1 gpl4. Le fragment Hoal/Pstl contenant EKV-1 gpl4 en provenance du plasmide pMRHgl4 a été transféré au plasmide vecteur pMGll coupé au moyen de Hoal/Pstl en créant le plasmide pVM2LH6gl4. pVM2LH6gl4 contient la totalité de la séquence de codage de EHV-1 gpl4 (avec le codon 2 changé de TCC (Ser) en CAT (His) comme indiqué et approximativement 1,2 kb d'ADN de SHV-l en aval du gène de EHV-1 gpl4) sous le contrôle du promoteur K5, inséré dans une orientation de la droite vers la gauche par rapport aux séquences flanquantes de vaccine par rapport au génome de vaccine dirigeant au but l'insertion du gène de EHV-1 gpl4 au locus M2L.

On a réalisé la recombinaison en utilisant v?458 comme virus de sauvetage et pVM2LH6gl4 comme plasmide donneur. Des plaques incolores ont été prélevées et analysées pour la présence de séquences de codage de EHV-1 gpl4 en utilisant une sonde spécifique de EHV-1 gpl4 marquée au moyen de 32p. Après clonage sur plaque répété, le recombinant de la vaccine a été désigné vP577.

Troncature des séquences leader hydrophilique de EHV-1 σο!4

En utilisant des variantes des manipulations de mutagénèse et de clonage décrites ci-dessus, on a construit un plasmide donneur chimère pVM2LH6gl4-l. Pour créer pVM2LH6-gl4.1, qui contient une suppression des codons 2 à 34 de EHV- 1 gpl4 avec la substitution de 4 codons, on a réalisé une mutagénèse in_ vitro (17) sur le plasmide bleu (KpnI/BamHI) en créant un site Nsil aux codons 32 à 36 plutôt qu'aux codons 1 et 2. Le fragment Nsil/BamHI à partir du plasmide bleu /KpnI/BamHI) nouvellement mutagéné a été substitué au fragment Nsil/BamHI dans pVH2LH6gl4. Des agents de liaison Nsil multiples (New England 3ioLabs, Beverly, MA) ont été liés dans le site Nsil pour amener l'ATG initial dans le cadre du restant de la séquence de codage de EHV-1 gp!4. Le plasmide final pVM2LH6gl4-l contient la séquence ATG/CAT/ GCA/TGC/ATT/GCT .... qui code Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala... où GCT (Ala) est le codon 35 de EHV-1 gpl4. Le restant de pVM2-LH6gl4.1 est identique à celui dans pVM2LH6gl4.

La vaccine recombinante vP6l3 a été obtenue par recombinaison avec· le virus de sauvetage vP458 et le plasmide donneur pVM2LH6gl4-l.

Exemple 3 - CONSTRUCTION DE VIRUS RECOMBINANTS DE LA VACCINE VP633 et VP634 EXPRIMANT CHACUNS DES GLYCOPROTEINES cp!3 et gpl4 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN

En vue de construire des recombinants de vaccine exprimant à la fois des glycoprotéines gpl3 et gpl4 de EKV-1, on a réalisé la recombinaison avec soit vP577 soit vP613 comme virus de sauvetage et le plasmide donneur pVHA6gl3 (décrit dans l'Exemple 1) qui contient le gène de EKV-1 gpl3 sous le contrôle du promoteur H6 de LA vaccine inséré au locus de suppression HA de la vaccine. L'insertion des séquences de EHV-1 gpl3 dans des virus recombinants a été identifiée par hybridation d'ADN in situ (25, 28). La recombinaison de pVHA6gl3 avec le recombinant vP577 du virus de la vaccine (contenant EHV-1 gpl4 de longueur complète) a engendré le double virus recombinant de la vaccine vP633 ; la recombinaison avec vP613 (contenant EHV-1 gpl 4 tronqué) a engendré le recombinant vP634 double de la- vaccine. Les recombinants doubles du virus de la vaccine vP633 et v?S34 ont été clonés sur plaques et la présence simultanée des séquences de EHV-1 gpl3 et gpl4 a été confirmée par analyse d'hybridation d'ADN et par des essais d'expression (voir ci-dessous).

Immunoprécipitation des glycoprotéines gpl 3 et col 4 de EHV-1 exprimées dans les virus recombinants ce la vaccine

En vue d'établir les glycoprotéines gpl3 et gpl4 de EHV-1 exprimées par les virus recombinants de la vaccine, on a infecté des cellules de VERO avec les recombinants et on a marqué métaboliquement les protéines au moyen de 3iS-méthic-nine et on a réalisé une immuno-précipitation comme décrit dans l'Exemple 1. L'anticorps monoclonal spécifique vis-à-vis de EHV-1 gpl3 (14H7) ou EHV-1 gpl4 (3F6) (3) a été lié dans une dilution à 1°/00 pendant 4 heures à la température ambiante. On a analysé des exemples au moyen d'électrophorèse par gel de SDS polyacrylamide sur un gel polymère à 10 % à 30mA (courant d'intensité constante) pendant approximativement 5 heures. On a préparé des autoradiogrammes.

On n'a pas immuno-précipité de produit significatif par le produit monoclonal spécifique anti-EHV-1 gpl3, désigné 14H7 (3) ou par l'agent monoclonal spécifique anti-EKV-1 çpl4 désigné 3F6 (3) ni des cellules de VERO non infectées, ni des cellules de VERO infectées au moyen du virus de la vaccine d'hémaglutinine minus de contrôle, à savoir vP452 (184). Les produits marqués radioactivement de EHV-1 gpl 3 ont été précipités par le produit monoclonal 14H7 des cellules de VERO infectées au moyen de vP483, une vaccine recombinante exprimant seulement le EHV-1 gpl3, ou les recombinants doubles du virus de la vaccine exprimant à la fois EHV-1 gpl 3 avec soit du gpl4 intact, à savoir vP633, soit du gpl4 tronqué, à savoir vP634. Il existe deux produits d'approximativement 44 et 47 kDa détectables qui sont quelque peu plus petits que le produit de traduction primaire prédit (de 51 kDa) et un produit plus grand d'approximativement 90 kDa, ce qui est consistant avec une forme complètement glycosylatée du produit de gène de EHV-1 gpl3. D'une manière significative, la qualité et la quantité de l'expression de EHV-1 gpl3 n'est pas affectée par la co-expression de l'une ou l'autre forme de EHV-1 gpl4 dans les recombinants doubles de la vaccine vP633 et vP634.

Des cellules de VERO ont été infectées au moyen de vP633, vP634, vP6l3 et vP577, respectivement, et ont subi une immuno-précipitation par le produit monoclonal 3F6 spécifiquement anti-EHV-1 gp!4 (3). Avec vP633 (contenant gpl4 de longueur complète + gpl3) et avec vP577 (contenant gpl4 de longueur complète), on a observé des bandes principales à environ 34, 47, 60-64 et 90 kDa ; alors qu'avec vP634 (contenant gpl4 tronqué + gpl3) et avec vP613 (contenant gpl4 tronqué), on a observé des bandes principales à 34, 47, 57, 72-82 et 116 kDa. Une fois encore, on n'a pas observé de différence significative dans la synthèse de EHV-1 gpl4 de l'une ou l'autre des formes pendant la co-expression avec EHV-1 gpl3.

Analyse par immuno-fluorescence des produits de EHV- 1 σο13 et cp!4 synthétisés par des virus recombinants de la vaccine L'immunofluorescence de cellules de VERO infectées par le virus recombinant de la vaccine a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant l'anticorps monoclonal spécifique soit de EHV-1 gpl3 soit gpl4.

EHV-1 gpl3 était facilement détectable sur la surface des cellules de VERO infectées avec les recombinants de la vaccine vP483, vP633 et vP634 aussi bien qu'intérieurement après fixation au moyen d'acétone. Aucune immunoréactivité significative interne ou de surface vis-à-vis de l'anticorps gpl3-spécifique n'a été observée dans les cellules infectées par vP410, vP577 ou vP613. L*expression ce EHV-1 gpl4 a été facilement détectable dans des cellules de VERO fixées à l'acétone infectées avec des recombinants de la vaccine vP577, VP613, vP633 et vP634. Aucune iranuno-fluorescence interne significative vis-à-vis de l'anticorps gpl4 spécifique n'a été observée dans les cellules infectées par vP41Q ou vP483. En utilisant un anticorps monoclonal spécifique vis-à-vis de gP14, à savoir 3F6, on a observé une faible immuno-fluorescence de surface dans les cellules infectées par vP613 ou vP634 qui expriment la forme tronquée de EHV-i gpl4 et aucune réponse de surface significative au-dessus des virus de contrôle vP410 et vP483 n'a été obtenue avec les virus recombinants de la vaccine vP577 et vP633 qui expriment le gène EHV-1 gpl4 de longueur complète (voir également 1'Exemple 8).

Exemple 4 - IMMUNISATION DE COCHONS D'INDE lCOBAYES) AU MOYEN DE VACCINE RECOMBINANTE vP483

En vue de déterminer l'immunogénécité du produit de gène du virus de l'herpès chevalin gpl3 exprimé par la vaccine recombinante vP483, on a inoculé des cochons d'Inde au moyen du virus et la présence d'anticorps neutralisant du sérum actif contre le virus de la vaccine et le virus de l'herpès chevalin a été testée.

Quinze cochons d'Inde (cobayes) pesant environ 450 grammes ont été divisés en groupes de cinq. Un groupe a reçu 1 ml de la vaccine recombinante (108TCID50/ml) au jour 0 suivi par une dose de rappel de 1 ml au jour 21 par inoculation sous-cutanée. Le second groupe a reçu des inoculations similaires mais avec la vaccine vP452 (108TCID50/ml) . Le troisième groupe n'a pas été vacciné. Tous les cobayes ont été saignés avant la vaccination primaire et aux jours 21 et 35. Des sérums ont été préparés et essayés pour déterminer la présence d'anticorps neutralisants vis-à-vis à la fois de la vaccine et de EHV-1 (souche Kentucky) en utilisant 50 TCIDi0 de virus essayé sur des cellules de testicules porcins.

Comme montré sur le Tableau I, la vaccine recombinante d'EHV-1 gpl3, à savoir vP483, provoque une séroconversion évidente chez les cochons d'Inde. Les titres de neutralisation du sérum obtenus avec le virus de la vaccine sont indiqués entre parenthèses dans le Tableau I. Les anticorps neutralisant le sérum à la fois de la vaccine et de EHV-1 sont détectables 21 jours après l'inoculation primaire et une augmentation significative du titre des anticorps neutralisant du sérum est obtenue deux semaines après une seconde inoculation du virus au jour 21. On doit noter que les titres de neutralisation de la vaccine du sérum obtenus chez les cochons d'Inde inoculés avec le virus recombinant exprimant EHV-1 gpl3 sont significativement plus élevés (t=7,2) que les titres obtenus à partir de cochons d'Indes ou cobayes inoculés avec le virus vP452 de la vaccine.

Tableau 1

Anticorps neutralisant le sérum présent chez les cochon d'Inde inoculés soit avec la vaccine recombinante exprimant. EHV-1 ctp!3 ou un virus de la vaccine de contrôle vP452

Titre neutralisant du sérum /loom) sur jours

Virus d'inoculum Animal n° 0 2_1 35

Animaux de 26 0,24 (0,35) — 0,24 (0,70) contrôle 27 0,24 (0,35) — 0,56 (1,05) non vaccinés 28 0,24 (0,35) — 0,80 (0,70) 29 0,24 (0,35) — 0,40 (0,70) 30 0,24 (0,35) — 0,32 (0,35)

Virus de la 191 0,24 (0,35) 0,36 (0,47) 0,72 (1,75) vaccine de 192 0,24 (0,35) 0,21 (0,93) 0,24 (2,30) contrôle VP452 193 0,24 (0,35) 0,48 (0,58) 194 0,24 (0,35) 0,24 (0,82) 0,24 (2,10) 195 0,24 (0,35) —

Virus 186 0,24 (0,35) 0,48 (1,28) 1,20 (2,57) recombinant de 187 0,24 (0,35) 0,72 (1,63) 1,68 (2,57) la vaccine 188 0,24 (0,35) 0,24 (1,52) 1,68 (2,57) VP483 189 0,24 (0,35) 0,36 (1,40) 1,56 (2,22) 190 0,24 (0,35) 0,48 (1,63) 1,56 (3,00)

Exemple 5 - IMMUNISATION DE COCHONS D'INDE AU MOYEN DE VACCINE RECOMBINANTE vP577 et VP613

Des cochons d'Inde ont été immunisés pour évaluer leur réponse vis-à-vis de EHV-1 çpl4 exprimé par les vaccines recombinantes vP577 et vP513. Des cochons d'Inde pesant environ 450 grammes ont reçu 1Q5 TCID50 de vaccine recombinante soit vP577, soit vP613 par la voie sous-cutanée, 1 ml les jours 0 et 21. Les cochons d'Inde ont été saignés aux jours 0, 21 et 35, des sérums préparés et essayés au point de vue anticorps de EHV-1. Des essais de neutralisation ont été réalisés sur des cellules testiculaires porcines contre 50 TCID50 de virus EKV-1, souche Kentucky. Des anticorps de vaccine ont été titrés par ELISA en utilisant un conjugué de péroxydase anti-IgG (H&L).

Les résultats sont donnés dans le Tableau 2. On n'a pas obtenu d'activité de neutralisation du sérum contre EEV-1 chez les cochons d'Inde immunisés avec la vaccine recombinante vP517, contenant le gène de EHV-1 gpl4 de longueur complète (données non indiquées). D'un autre côté, des cochons d'Inde inoculés avec le virus recombinant de la vaccine vP613 exprimant un gène EHV-1 gpl4 tronqué ont induit des niveaux similaires des anticorps de neutralisation du sérum EHV-1 (Tableau 2) que la vaccine recombinante v?483 exprimant EHV-1 gpl3 (Tableau 1). Bien que les anticorps de neutralisation du sérum EHV-1 sont détectables trois semaines après la vaccination primaire, un niveau plus significatif a été observé deux semaines après l'immunisation secondaire (Tableau 2). Dans tous les animaux immunisés, des réponses étaient obtenues lorsque les anticorps de la vaccine ont été testés par ELISA.

Tableau 2

Anticorps neutralisant le sérum présent dans les cochons d'Inde inoculés au moven d'une vaccine recombinante exprimant eHV-1 σρ!4

Titre de neutralisation du sérum floc^ en jours

Virus d'inoculum 0. 21_ 35

Virus recombinant 0,4 0,7 1,3 de la vaccine vP613 0,2 0,7 1,2 0,2 0,7 1,7 0,2 1,1 1,6 0,2 1,0 1,6

Animaux de contrôle 0,2 --- 0,4 non vaccinés 0,6 --- 0,4 0,7 --- 0,8 0,6 --- 0,2 0,4 — 0,4

Exemple 6 - PROTECTION DE HAMSTERS VACCINES CONTRE L'ATTAQUE PAR EHV-1

En vue d'établir l'efficacité de la vaccine recombinante vP483 exprimant EHV-1 gpl3, des hamsters ont reçu soir une vaccination primaire, soit une vaccination primaire suivie d'une vaccination de rappel et ils ont, en même temps qu'un groupe de contrôle non inoculé ou un groupe inoculé deux fois avec un virus de la vaccine de contrôle vP54, été soumis à une attaque inter-péritonéale avec une souche Kentucky de EHV-1 adaptée à 1'hamster.

Quarante hamsters syriens (âgés de 40 jours eu pesant entre 55 et 65 g) ont été séparés en quatre groupes. Le groupe A a reçu une seule inoculation sous-cutanée (1 mi) soit de 10s, 10â ou 104 TCID50 de la vaccine recombinante vP483, cinq animaux par dose. Le groupe 3 a été vacciné avec vP483 au jours 0 suivi par un rappel au jour 14. Les doses primaires et de rappel (1 ml) ont été administrées par voie sous-cutanée à des groupes de cinq animaux en utilisant 10s, 10s ou 104 TCID50 · Le groupe C consistant en 5 hamsters a reçu deux injections sous-cutanées (108TCID5O par injection) aux jours 0 et 14 de vaccine vP452. 5 hamsters du groupe D ont . été laissés pour constituer des animaux de contrôle non vaccinés. Tous les hamsters ont reçu 200 LD50 d'une souche Kentucky, adaptée aux hamsters, de EHV-1 par la voie interpéritonéale 14 jours après la dernière immunisation. Les survivants ont été comptés 7 jours après l'attaque.

Les résultats sont montrés dans le Tableau 3. Tous les hamsters non vaccinés et les hamsters vaccinés par le virus vP452 de la vaccine sont morts dans les 5 jours de 1'attaque.

Des niveaux significatifs de protection contre l'attaque par EHV-1 ont été observés chez des hamsters vaccinés avec la vaccine recombinante vP483 exprimant EHV-1 gpl3. Aucune différence significative dans les niveaux de protection n'a été observée chez des hamsters immunisés au moyen de doses soit primaires soit primaires et de rappel. La dose protectrice (PD50) était similaire PD50 =. 6,32 loç10 primaire et 6,12 log10 primaire plus le rappel. Cependant une protection de 100 % n'a été observée que dans le groupe recevant deux doses de 108 TCID50 de virus recombinant.

Tableau 3

Protection des hamsters vaccinés au moven de' la vaccine recombinante exprimant EHV-1 gpl3 contre 1'attaque par EHV- 1.

Virus de vaccination

Vaccine recombinante Vaccine de Pas contrôle de vp452 virus

Primaire Rappel Rappel

Dose de vaccin 864 864 8

Log10 TCID50

Proportion de 4 12 5.2.0. 0. 0.

survivants 555 555 5 5

En vue de déterminer l'efficacité protectrice d'un virus recombinant de la vaccine exprimant EHV-1 gpl4 seul ou en combinaison avec EHV-1 gpl3, des études d'attaque ont été réalisées sur des hamsters vaccinés. 20 hamsters syriens âgés de 21 jours, pesant environ S0 g chacun ont été inoculés par voie sous-cutanée par 1 ml de virus de la vaccine de contrôle ou avec les virus recombinants de la vaccine vP483, vp577, vP613, vP633 et vP634 exprimant EHV-1 gpl3 et/ou gpl4. La vaccination primaire a été suivie par une dose de vaccination identique [pfu/ml (log10)] au jour 14. Tous les hamsters, y compris les animaux de contrôle non inoculés, ont été soumis 14 jours après la dernière immunisation à une injection interpéritonéale de 200 LD50 de la souche Kentucky adaptée au hamster de EHV-1. Les survivants des groupes de 5 ont été calculés 14 jours après l'attaque au moment où l'expérience a été terminée. La dose d'inoculum donnant une protection de 50 % des hamsters est évaluée en tant que logj0 TCID50/mi d'inoculant.

Comme montré sur le Tableau 4, le virus recombinant de la vaccine vP577 exprimant le gène EHV-1 gpl4 de longueur complète n'a pas protégé les hamsters contre l'attaque par une dose de PD50 calculée > 9,0 log!0. D'un autre côté, le gène EHV-1 gpl4 tronqué, tel qu'exprimé par la vaccine recombinante vP613, a donné une bonne protection en réponse à l'attaque (Tableau 4). Le ?D50 calculé est quelque peu meilleur (5,2) que celui obtenu avec la vaccine recombinante exprimant EHV-1 gp!3, à savoir vP483 (6,1). D'une manière surprenante, la co-expression de EHV-1 gpl3 et gpl4, que ce soit pour le gène gpl4 de longueur complète ou le gène gpl4 tronqué dans les virus recombinants de la vaccine vP633 et vP634, respectivement, ont fourni une efficacité protectrice notablement améliorée comparée à l'efficacité pour les glycoprotéines d'EHV-1 exprimées séparément. Far conséquent, la quantité d'inoculum de virus pour obtenir une protection à 50 % des hamsters vaccinés a diminué d'une manière siçnifi- cative lorsque EHV-1 gpl3 et gpl4 ont été coexpriinés dans Ie même virus recombinant de la vaccine.

Tableau 4

Protection des hamsters vaccinés avec des recombinants de la vaccine, exprimant EHV-1 et13 et/ou qp14 contre l'attacue par EHV-1

Inoculum Protéine de EHV-1 Dose de vaccin/ PD^

Survivants VP483 gpl3 8/5 6/2 4/0 6,1

Aucun --- 0/0 --- --- --- VP577 gpl 4 8/1 6/0 4/0 >9,0

Aucun --- 0/0 --- --- --- vP613 gpl4* 8,4/5 6,4/5 4,4/1 5,2 VP633 gpl3 + gpl4 8/5 6/3 4/4 4,3 vP634 gpl3 + gpl4 7,6/5 5,6/5 3,6/5 <3,6

Vaccin --- 3/0 --- --- >9,0

Aucun --- 0/1 --- --- --- *vP613 et vP634 expriment la version tronquée de EHV-1 gpl4.

Exemple 7 - CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DE POXVIRUS AVIAIRE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE cp13 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN

En se référant maintenant à la Figure 8, en a utilisé pVHA6G13 comme source de gène de EHV-1 gpl3. Pour isoler le fragment d'ADN contenant tout le gène de EHV-1 gpl3, on a digéré pVHA6gl3 par Nrul et HindllI. Un fragment d'approximativement 1,8 Kb contenant 28 bp de l'extrémité 3' du promoteur H6 du virus de la vaccine, la totalité du gène EHV-1 gpl3, et approximativement 410 bp de séquences du virus de la vaccine ont été engendrés par cette digestion. Le fragment de 1,8 Kb Nrul/HindiII a été isolé par insertion dans les vecteurs d'insertion de poxvirus aviaire pF?CV2 et pCPCVl.

Le vecteur pFPCV2 d'insertion du poxvirus des volailles (FP) fournit un véhicule pour engendrer des recombinants qui abritent des gènes étrangers dans une région non essentielle du génome de FP qui désignait le locus F7. pFPCV2 a été dérivé de pRW731.13. Le plasmide pRvî731.13 contient un fragment PvuII génomique de FP d'approximativement 5,5 Kb inséré entre les deux sites P vu II de pUC9. Initialement, une séquence de clonage multiple (MCS) a été liée au site d'insertion unique Hindi dans le fragment génomique P vu II de FP de 5,5 Kb. Le MCS a été dérivé par traitement de réforme des oligonucléotides CE4 (5'-TCGC GAGAATTCGAGCTCGGTACCGGGGATCCTCTGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGTT 63') et CE5 (5')- AACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTAGAGGATC C C CGG TACCGAGC TCGAATTC -TCGCGA-3'). Le plasmide contenant le MCS a été désigné pCEll.

pFeLVIA est un dérivé du vecteur d'insertion de vaccine pTP15 (184) (Figure 3) dans lequel le gène du virus de la leucose féline (FeLV) env (192) est inséré dans le site PstI en aval du promoteur H6. Pour transférer la cassette d'expression de 2,4 kb à un vecteur FP (Figure 8), les séquences de H6/FeLV env ont été excisées de pFeLVIA par digestion avec Belli et digestion partielle avec Pstl. Le site Belli se trouve à la limite 5' de la -séquence du promoteur H6. Le site Pstl est situé 420 bp en aval du signal de terminaison de traduction pour le cadre de lecture ouverte de la glycoprotéine d'enveloppe de FeLV.

La séquence H6/FeLV env de 2,4 Kb a été insérée dans pCEll digéré par BamHI et Pstl. Ce plasmide a été désigné pFeLVFl. Le plasmide pFeLVFl a été ensuite digéré par Pstl pour enlever les séquence FeLV env. Le plasmide résultant contenant le promoteur H6 du virus de la vaccine dans pCEll a été désigné pFPCVl. Les séquences de 5'au promoteur ont été mutagénées (19) pour éliminer les séquences externes en utilisant l'oligonucléotide FPCV1 (5' CAGTAATACACGTTATTGCAGAGAGGACCATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT- 3 ' ) pour produire pFPCVl. La région 3' au promoteur (site de clonage multiple) a subi une mutagénèse par l'oligonucléotide FPCV3 (5'-TAGAGT CGACCTGCAGGCATCCAAGCTTGTTAACGAC-3') pour éliminer le site SphI, qui contient un ATG. Le plasmide résultant a été désigné pFPCF2.

Le fragment de EHV-l gpl3 NruI/HindlII de 1,8 kb, défini ci-dessus, a été inséré dans un fragment NruI/KindiII de 8,0 kb dérivé par digestion de pFPCV2. Ce fragment NruI/Hindi!I de 8,0 kb contenait la portion 5' du virus du promoteur K6 du virus de la vaccine (100 bp), les séquences de flancs de FP' (4,8 kb en amont· et 1,5 kb en aval à partir du site d'insertion) et 2,4 kb de pUC (BRL, Bethesda, MD). La liaison ou ligation de ces deux fragments a résulté dans la formation d'un plasmide de 9,8 kb désigné pFPEHV13A.

Le plasmide pFPEHVl3A a été ensuite digéré par KonI et HindlII pour enlever un fragment d'environ 600 bp. Ce fragment contenait la plus grande partie de région 3' du gène de EHV-l gpl3 (200 bp) et le segment d'ADN du virus de la vaccine de 410 bp. Le fragment Kpnl/HindlII de' 600 bp a été remplacé par un fragment de 200 bp dérivé de pNSIENPN (Figure 3) comme suit. Une digestion par Pstl de pNSIENPN a linéarisé le plasmide. Les terminaisons de PstI ont été affectées d'une coupure franche au moyen de T4 ADN polymérase (New England Biolabs, Beverly, MA) en présence de dNTPS (0,5 .mM chacun). Les agents de liaison HindiII (BRL, Bethesa, Med) ont été ensuite liés au fragment à coupure franche. Après digestion par HindlII, le plasmide linéarisé a été digéré-par Kpnl pour donner un fragment de 200 bp contenant la portion 3' du gène de EHV-1 gpl3, la séquence correspondant au codon de terminaison (TAG) et le motif de séquence TTTTTNT qui est connu pour être le signal de terminaison de la transcription précoce du virus de la vaccine (45). Le plasmide recombinant a été désigné pFPEHV133 et a été utilisé dans une recombinaison in vitro pour l'insertion du gène de EHV gpl3 promu par H6 dans le locus f7 du génome de FP. Le poxvirus de volaille recombinant a été désigné vFP44.

En se référant maintenant à la Figure 9, en a également utilisé pFPEHV13B pour engendrer un fragment Nril/Hindi II de 1,4 kb pour insertion dans pCPCVl. Le plasmide pCPCVl contient le promoteur H6 du virus de la vaccine dans le site unique EcoRI dans le fragment génomique du poxvirus du canari (CP) P vu II de 3,3 kb. Ce plasmide d'insertion permet l'insertion de gènes étrangers au locus C3 du génome CP. pCPCVl a été dérivé de pRW764,2, qui contient un fragment génomique PvuII CP de 3,3 kb inséré dans un vecteur pUC. pRW764,2 a été linéarisé par digestion par EccRI. Ce fragment a été doté d'une coupure franche en utilisant un fragment de Klenow de l'ADN polymérase de l'E. Coli (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) en présence de dNTPs (0,5 mM chacun). Les séquences du promoteur H6 du virus de la vaccine et une région de clonage multiple située en 3' par rapport au promoteur ont été excisées de pFPCVl par digestion avec Kpnl/Hpal. Ce fragment de 200 bp a été doté d'une coupure franche au moyen de la:T4 ADN polymérase en présence de dNTPS (0,5 mM chacun) et inséré dans le plasmide pRW764.2, à coupure franche, et - linéarisé. Le plasmide résultant a été appelé pCPCVl. Le plasmide pCPCVl a été digéré par NruI et HindlII et le fragment de 5,8 kb a été isolé pour ligation au fragment de 1,4 kb contenant EHV gpl3 décrit ci-dessus. Le plasmide résultant a été appelé pCPEHV13A. Ce plasmide a été utilisé dans des expériences de recombinaison in vitro pour insertion du gène de SHV gpl3 promu par H6 au locus C3 du génome CP. Le poxvirus du canari recombinant a été appelé vCP48.

Suivant la recombinaison in vitro, le poxvirus aviaire recombinant contenant le gène EHV-1 gpl3 a été identifié par un essai d'hybridation classique sur plaques. Les plaques positives ont été purifiées par 3 cycles d'isolation de plaques suivis par des analyses d'hybridation. Les recombinants ont été désignés vFP44 et vFP48 pour les recombinants FP et CP respectivement. Les deux recombinants ont été analysés en utilisant un test immunotriage par la protéine A-B-galactosidase avec un anti-sérum monoclonal vis-à-vis de EHV-1 gpl3. Les résultats ont montré que les monocouches de cellules de CEF et VERO infectées soit par vFP44 soit par vFP48 expriment EHV-1 gpl3 à la surface des cellules infectées par le virus.

. Exemple 8 - EVALUATION DE VIRUS RECOMBINANTS ADDITIONNELS DE LA VACCINE EXPRIMANT DES VERSIONS MODIFIEES ET NON CODIFIEES DU GENE DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN 1 CODANT LA GLYCOPROTEINE ctp14 Construction et évaluation de virus recombinants additionnels de la vaccine exprimant EHV-1 σο!4 Des produits construits contenant EHV-1 gpl4 (Exemple 2) ont été modifiés de trois manières : (a) en faisant varier la longueur de la séquence leader ou de tête de EHV-1 gpl4 ; (b) en éliminant l'excès d'ADN 3' EHV-1 du gène ; et (e) en insérant les versions modifiées du gène EHV-1 gpl4 dans un système de sélection du domaine' de réplication chez l'hôte du virus de la vaccine vP293 (69) pour évaluation.

Le produit de gène de EHV-1 gpl4 contient une séquence leader ou de tête inhabituellement longue. Une séquence hydrophobe longue s'étendant des acides aminés 59 jusqu'à 99 est proposée pour être la séquence de signal. Cette région est précédée par une longue séquence hydrophile. Une séquence leader ou de tête également longue a été également notée chez deux autres homologues de gB, à savoir le virus de la pseudo-rage gll (62) et le virus de l'herpès bovin 1 gl (63).

Modification de l'extrémité 5' de EHV-1 σο14

Pour étudier l'effet de la longueur de la séquence leader de EHV-1 gpl4 sur le traitement, la présentation et l'efficacité immunologique du produit gpl4 exprimé dans un virus recombinant de la vaccine, des plasmides contenant le gène de EHV-1 gpl4 avec trois longueurs différentes pour la séquences leader ont été construits en modifiant le EHV-1 gpl4 précédent, qui contient des constructions, des manières suivantes.

En se référant maintenant à la Figure 10, le plasmide pVM2LH6gl4 (Exemple 2) contient toute la séquence de codage de EKV-1 gpl4 sous le contrôle du promoteur H6 inséré dans le locus de suppression M2L de la vaccine de Copenhague. Dans pVM2LH6gl4, l'acide aminé n°2 du gène de EKV-1 gpl4 est présent plutôt comme His que comme Ser natif. Pour changer l'acide aminé n°2 en Ser, on a coupé pVM2LH6gl4 au moyen de Nsil (séquence de reconnaissance ATGCAT) aux codons 1-2 (Met/His). La mutagénèse a été réalisée (19) en utilisant le nucléotide synthétique MPSYN240 (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCTGTC3').

Le plasmide résultant, pMP14M, contient la totalité du gène de EHV-1 gpl4 avec le codon natif (Ser) en position 2.

Le plasmide pVM2LH6gl4-l (Exemple 2) "est identique à pVM2LH6gl4 exepté pour une troncature de la séquence leader et introduction de quatre codons dérivés des agents de liaison Nsil synthétiques. Dans pVM2LH6gl4-l, la séquence de l'extrémité tronquée 5' du gène de EHV-1 gpl4 est ATG/CAT/ GCA/TGC/ATT/GCT... codant Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala...où GCT (Ala) est le codon 35 de EHV-1 gpl4. pVM2LH6gl4-l a été modifié par mutagénèse (19) de deux manières. Pour produire une version du gène de gpl4 tronqué approximativement au même degré que pVK2LH6gl4-l, mais de manière à s'approcher davantage de la séquence de gpl4 natif, on a coupé pVM2LH6gl4-l au moyen de Nsil aux codons 1-2. La mutagénèse a été réalisée en utilisant l'oligonucléotide synthétique MPSYN241 ( 5 ' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTGTCCCAGCAGCTGGCTCCTGGATC 3 ' ) . Dans le plasmide résultant, pMP14M-34, la séquence de codage de EHV-1 gpl4 commence avec ATG/AGT/GTC/CCA... Met/Ser/Val /Pro ... où CCA (Pro) est l'acide aminé n° 35 de EKV-1 gpl4. Le gène de EHV-1 gpl4 contient un site Nael (GCCGGC) aux codons 61-63 (Lys/Pro/Ala). Pour produire une version plus sévèrement tronquée du gène de EHV-1 gpl4, on a linéarisé pVM2LH6gl4-l au moyen de Nael puis digestion par Nsil et isolement du fragment de vecteur à partir d'un gel d'agarose. La mutagénèse a été réalisée en utilisant l'oligonucléotide synthétique HPSYN243 ( 5 ' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCATCATCGAGGGTGGGCACAATAGTT 3 ' ) . Dans le plasmide résultant, pMP14M-63, la séquence de codage de EHV-1 gpl4 commence avec ATG/GCA... MEt/Ala... où GCA (Ala) est l'acide aminé n® 63 du EHV-1 gp 14natif.

Elimination de l'ADN de EKV-1 étranger Dans tous les plasmides contenant EHV-1 gpl4 discutés ci-dessus, les séquences de codage de EHV-gpl4 sont suivies par approximativement 1200 bp d'ADN de EHV-1. Le codon de terminaison (TAA) pour le gène gpl4 se produit dans le site Dr al (TTTAAA). Pour éliminer l'excès d'ADN de EHV-1, on a soumis pMP14M-63 à une digestion partielle par Dral suivie par l'isolement de l'ADN linéaire à partir d'un gel d'agarose et la digestion par PstI qui coupe'à la jonction entre l'ADN de EHV-1 et le bras de flanc aval 'de la vaccine.

Une bande d'ADN Dral/PstI de 6,5 kb a été isolée à partir d'un gel d'agarose. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN247 (5' AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA 3 ' ) et MPSYN 24 8 (5' GCTCGAGTTAACAAAAATTT 3') ont été soumis à un traitement de réforme et liés avec un fragment de 6,5 kb. Dans le plasmide résultant, pMP14M-63P, les séquences de codage de EHV-1 gpl4 sont suivies immédiatement par une séquence spécifiant la terminaison de la transcription précoce de la vaccine (45), suivie par une région de polyliaison (contenant une suite de sites de restriction Hoal, Xhol, PstI) et le bras de flanc gauche de la vaccine dérivé de HindiII M.

Insertion du promoteur H6/crène de EHV-1 cp14 dans un système de sélection pHES/vP293

Dans tous les plasmides contenant EHV-1 gp!4 discutés ci-dessus, le gène de EHV-1 gpl4 se trouve sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine inséré dans le locus de suppression M2L du virus de la vaccine, souche Copenhague. Etant doné que le locus d'insertion M2L est disposé dans une large région du génome qui peut être supprimée, la remise en place de la cassette d'expression promoteur H6/EHV-1 gpl4 en un site d'insertion potentiellement plus stable a été investiguée. A titre d'étape préliminaire, des structures de gène de EHV-1 gpl4 contenant différentes longueurs de la séquence leader ont été déplacées vers le système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte basé sur WP pHES/vP293 (69) pour permettre la production rapide de vaccines recombinantes pour une évaluation comparative.

Le plasmide pHES-4 contient le promoteur H6 de la vaccine, suivi par une région de polyliaison et le gène du domaine de l'hôte humain K1L (70), tous insérés entre les bras de vaccine WR qui flanquent une suppression de 21,7 kb (69). pHES-4 contient deux sites Nril, à savoir l'un dans le promoteur H6 et l'autre dans les séquences de flanc de la vaccine. pHES-4 a été linéarisé par digestion partielle par

NruI et la bande contenant l'ADN linéaire de longueur complète a été isolée à partir d'un gel d'agarose. Cet ADN linéaire a été coupé au site Xhol dans la région de polyliai-son. pMP14M-63P contient deux sites NruI, à savoir l'un dans le promoteur H6 et l'autre dans les séquences de codage de EHV-1 gpl4/ 0,2 kb à partir de l'extrémité 3' du gène. pMP14M-63P a été soumis à une linéarisation par NruI, suivie d'une digestion par Xhol. Un fragment NruI (partiel)/Xhol de 2,8 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Ce fragment contient une partie du promoteur H6, suivie par la forme du gène de EHV-1 gp!4 modifié contenant la version la plus courte de la séquence leader. Le fragment contenant promoteur H6/EKV-1 gpl4 de 2,8 kb dérivé de pMP14-63P a été lié avec le fragment de vecteur NruI (partiel)/Xhol dérivé de pHES-4. Le plasmide résultant, à savoir pHES-KP63, contient la cassette promoteur H6/gène de EHV-1 gpl4 sans ADN de EHV-1 étranger. Pour transférer les extrémités 5' de la cassette promoteur H6/EHV-1 gpl4 contenant des séquences leader de longueur totale ou modérément tronquées, on a coupé les plasmides pMP14M et pM?142£-34 par NruI et les bandes de 2,8 kb et 2,7 kb, respectivement, ont été isolées à partir de gels d'agarose. pHES-MP63 a été soumis à une digestion partielle par NruI et un fragment de 7,2 kb isolé à partir d'un gel d'agarose. Le fragment de vecteur de 7,2 kb correspond à pHES-2ÎP63 dont le fragment NruI de 2,6 kb contenant l'extrémité 5' de la cassette promoteur H6/EHV-1 gpl4 a été éliminé. Le fragment de vecteur NruI (partiel) de 7,2 kb dérivé de pHES-MP63 a été lié avec un fragment NruI de 2,8 kb à partir de pMP14M en engendrant pHES-MPl. Le fragment de vecteur NruI (partielà de 7,2 kb dérivé de pHES-MP63 a également été lié au fragment NruI de 2,7 kb provenant de pMP14M-34, engendrant pHES-MP34. Les étapes de clonage conduisant à la production des plasmides pHES-MP63, pHES-MPl et pHES~MP34 ont été représentées schématiquement sur la Figure 10.

On a utilisé des plasmides pHES-MPl, pHES-MP34 et pHES-MP63 comme plasmides donneurs pour recombinaison avec vP293 (69)/ en engendrant des virus recombinants de la vaccine vP753, vP765 et vP721, respectivement. La descendance recombinante a été sélectionnée sur des cellules MRC-5 humaines.

Evaluation de recombinants du virus de la vaccine basés sur vP293 exprimant le cène de EHV-1 σο!4

Pour déterminer si les trois formes du produit de gène de EHV-1 gpl4 exprimées dans les virus recombinants ce la vaccine VP753, vP765 et vP721 étaient présents à la surface des cellules infectées, on a infecté des monoccuches de cellules de VERO avec les trois virus recombinants de la vaccine contenant EHV-1 gpl4..-Les monocouches cellulaires infectées ont été analysées pour connaître leur immunofluorescence de surface en utilisant l'anticorps monoclonal 3F5 spécifique à EHV-1 gpl4. L'immunofluorescence de surface était positive pour les cellules infectées avec tous les trois recombinants viraux de la vaccine, vP743, vp765 et vP721. Ceci indique qu'une circulation convenable du produit: de gène de EHV-1 gpl4 dans les cellules infectées de la vaccine n'est pas affectée par la longueur de la séquence leader.

Pour comparer les produits de gène de EKV-1 gpl4 exprimés dans les trois recombinants du virus de la vaccine contenant EHV-1 gpl4, on a infecté des cellules de MRC-5 par vP753, vp765 et vP721 et les protéines ont été métabolique-ment marquées au moyen de '5S-méthionine. Des immuno-précipi-tations ont été réalisées avec les lysats de cellules radioactivement marquées en utilisant l'anticorps monoclonal 3F6 spécifique vis-à-vis de EHV-1 gpl4.

Les protéines immuno-précipitées à partir de cellules infectées par vP753, vP765 et vP721 sont indistinguables l'une de l'autre et sont équivalentes aux protéines immuno-précipitées à partir de vP613, la vaccine recombi-nante contenant EHV-1 gpl4 produite à partir du plasmide pVM2LH6gl4-l. Ces résultats indiquent que les variations de longueur de la séquence leader de EHV-1 gpl4 testées dans ces recombinants n'améliorent ni n'interviennent dans le traitement convenable du produit de gène.

Pour évaluer l'efficacité protectrice du virus recombinant de la vaccine exprimant les différentes formes ce EHV-1 gpl4, on a inoculé des hamsters au moyen de doses différentes de vP753, vP765 et vP721 et attaqué ceux-ci par la souche Kentucky adaptée à 1'hamster de EHV-1. Les trois vaccines recombinantes contenant EHV-1 gpl4 ont été protectrices, avec un logi0 PD50 de 6,2 ou meilleur. Les différences de protection entre les trois recombinants du virus de la vaccine ne sont pas statistiquement significatifs.

Contraitement au vP577, un virus recombinant de la vaccine ultérieur qui a été également produit par recombinai-son entre pVM2LH6gl4 et vP458 montre une structure d'immunoprécipitation vis-à-vis de EHV-1 gpl4 identique à celle avec vP753, vP765 et vP721 et, comme ces virus recombinants de la vaccine exprimant EHV-1 gpl4, exprime la protéine de EHV-1 gpl4 à la surface des cellules infectées.

Les données précitées suggèrent que le EHV-1 gpl4 exprimé dans le virus recombinant vP577 de la vaccine est défectueux et que le défaut s'est produit probablement pendant la recombinaison entre le plasmide donneur pVM2LH6gl4 et le virus de la vaccine vP458.

Exemple 9 - SEQUENCE DE NUCLEOTIDES DE TROIS NOUVEAUX GENES A PARTIR DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN TYPE 1 ET EXPRESSION DANS DES VIRUS RECOMBINANTS DS LA VACCINE

Pour identifier et isoler le gène de EHV-1 codant gpl7/18 avant de l'exprimer dans un virus recombinant de la vaccine, on a établi la séquence de la plus grande partie de la région Us du génome de EHV-1 et on a exprimé les différents cadres de lecture ouverts trouvés sur ce fragment d'ADN. On a identifié et analysé trois nouveaux gènes de EHV- 1 codés par le composant S : EHV-1 gD qui, lorsqu'on en a établi la séquence, a montré une homologie avec les produits des gènes HSV gD et PRV gp50 ; EHV-1 gp63 qui a montré une homologie avec les produits des gènes HSV US7 et PRV gp63 ; et EHV-1 gE qui a montré une homologie avec les produits des gènes de HSV gE et PRV gl. Tous ces trois' gènes, soit individuellement, soit en association, ont été clonés dans un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte de la souche de vaccine de Copenhague pour des études d'expression rapide. L'immunofluorescence obtenue avec un sérum de lapin anti-EHV-1 a révélé l'expression de produits spécifiques de EHV-1.

Clonace du fragment de EHV-1 par BamHI D .Etant donné que le gène de EHV-1 gpl7/18 a été localisé sur le composant S du génome de EHV-1 (3), le fragment par BamHI D, qui représente la plus grande partie de la région Us (59), a été isolé et cloné. L'ADN génomique de EHV-1 de la souche Kentucky D a été digéré par BamHI. Le fragment BamHI D de 11,0 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose (Geneclean, BiolOl, Inc., La Jolla, CA) et cloné dans le plasmide pIBI24 en tant que plasmide pEHVBamHID. Une carte de restriction de ce fragment en a été déduite (Figure 11).

Identification de séquences d'ADN codant EHV-1 σΡ, σο63 et cE Les données de séquence des nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de plusieurs sous-clones du fragment BamHI D sous-cloné dans pIBI24, comme décrit dans l'Exemple 1. Les séquences des jonctions entre fragments successifs ont été examinées sur le clone initial pEHVBamHID. On a utilisé dans toutes les analyses de données de séquences le package de logiciel PC/GENE (Intelligenetics Inc., Mountain View, CA).

Analyse de la séquence d'ADN des gènes de EHV-l·' oD, gp63 et σΞ L'analyse de la séquence d'ADN de la région de 6402 bp séquencée du fragment BamHI D (représentant 'la plus grande partie de la région courte unique) a révélé l'existence d'au moins trois cadres de lecture ouverts complets lisant tous à partir du même brin. Cette séquence est présentée sur la Figure 12 en tant que brin 5' à 3' en direction de la droite. La composition des bases est 50/44 %G+C.

Le premier cadre de lecture ouvert (0RF1) s'étend des positions 971 à 2176 de nucléotides. On a trouvé des signaux putatifs de régulation transcriptionnelle dans la région depuis 5' jusqu'au codon d'initiation ATG le plus probable en position 971. Une boîte TATA ayant la séquence TATATTAA (nucléotides 871 à 878) a été localisée 60 nucléotides en aval à partir d'une boîte CAT putative aux positions 811 à 817 ayant la séquence TGACAAT. On n'a trouvé aucun signal de polyadénylation (AATAAA) en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 2177 à 2179). Sept parmi les dix nucléotides dans la séquence 5' TCCCTTCGCC 3' (nucléotides 890 à 899) sont complémentaires à la séquence d'ARN ribosomal 18S, à savoir 3' AGGAAGGCGT 5' (61) et peuvent servir comme site de liaison de ribosome. Un modèle de balayage a été proposé par lequel des mARN eukaryotiques amorcent ou initient la traduction (151). La règle fondamentale de ce modèle est que des ribosomes se lient à l'extrémité 5' du mARN et balayent linéairement la molécule de mARN. L'engagement à l'amorçage ou initiation de la traduction est généralement au premier codon A.TG proximal de 5’, bien que des exceptions aient été notées (152). Une purine en position -3 est essentielle pour l'amorçage de la traduction et la traduction est stimulée par C dans les positions -1 et -2 lorsque le reste de la séquence est suboptimal (155). Le contexte de la séquence autour du codon d'amorçage proposé AGCATGT (nucléotides 968 à 974) se qualifie comme un contexte de séquence fonctionnelle pour l'amorçage de la traduction de mARN eukariotique. Il y a deux autres codons "d'amorçage ATG possibles localisés respectivement dans les positions 989 à 991 et 992 à 994. Le contexte de ces deux codons CTTATGATGG

ne les qualifie pas en tant que fonctionnels pour l'amorçage de la traduction. Le EHV-1 0RF1 code 402 acides aminés avec une masse moléculaire calculée de 45 239 daltons.

Analyse de la structure de la proteine de EHV-1 0RF1 L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 25 a un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour reconstituer la séquence de signal. Une région hydrophobe consistant en 24 acides aminés (acides aminés 351 à 374) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Il y a quatre sites Asn-X-Thr/Ser (X pouvant être tout acide aminé excepté la proline) pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote (157). Le profil d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de EHV-1 0RF1 est illustrée sur la Figure 13. Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane et comprenant des éléments de signal et d'ancrage sont clairement définis. Les deux régions les plus hydrophobes à la terminaison N- et au voisinage des terminaisons C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la molécule de glycoprotéine.

Comparaison de la sécruence d'acides aminés de EHV-1 0RF1 avec d'autres clvcoprotéines du virus ce l'herpès

La comparaison de la composition en acides aminés ce la protéine putative EHV-1 0RF1 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de EHV-1 0RF1 est semblable à PRV gp50 (95) et HSV-1 gD (79, 160).

Le second cadre de lecture ouvert (0RF2) s'étend des positions de nucléotide 2287 à 3525. Aucun signal putatif réglant la transcription n'a été trouvé dans la-région depuis 5' jusqu'au codon d'amorçage ATG en position 2287. Aucun signal de polyadénylation AATAAA n'a été trouvé en aval du codon de terminaison TGA (nucléotides 3526 à 3528), mais on a localisé deux signaux potentiels de polyadénylation YGTGTTYY (180) en aval de ce codon de terminaison à approximativement 40 et 70 bp. Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé GCTATGG est conforme aux règles de Kozak (151, 155). Il y a au moins deux autres codons possibles d'amorçage ATG dans les positions 2305 à 2307 et 2332 à 2334, mais le contexte de séquence de ces deux codons (GGGATGT et TCTATGG) ne les qualifient pas comme fonctionnels pour l'initiation de la traduction. Le EHV-1 0RF2 code un polypeptide de 413 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 45 431 daltons.

Analyse de la structure de la protéine de EHV-1 ORF2 L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 22 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour constituer la séquence de signal (bien que le comptage par ordinateur pour le site de coupure putatif est faible). Une région hydrophobe consistant en 32 acides aminés (positions 315 à 346) a été prédite comme fonctionnant en domaine d'ancrage transmembrane. Il existe sept sites Asn-X-Thr/Ser pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote. Une détermination d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de la séquence EHV-1 0RF2 est illustrée sur la Figure 14. Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane, y compris des éléments de signal et d'ancrage sont clairement définies. Les deux régions les plus hydrophobes à l'extrémité N- et au voisinage de l'extrémité C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane.., respectivement, de la molécule de glycoprotéine.

Comparaison de la séquence d'acides aminés de SHV-1 0RF2 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès

La comparaison de la composition en acides aminés de EHV-1 0RF2 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de EHV-1 ORF2 est homologue à PRV gp63 (80), VZV gplV (181) et HSV-1 US7 (79).

Le troisième cadre de lecture ouvert (0RF3) s'étend des positions de nucléotide 3796 à 5451. des signaux putatifs réglant la transcription ont été trouvés dans la région depuis 5' jusqu'au codon d'amorçage ATG en position 3795. Une boîte TATA ayant la séquence GTTTAAA (nucléotides 3705 à 3711) est située 50 nucléotides en aval d'une boîte CAT putative aux positions 3649 à 3654 ayant la séquence GCAATG. Aucun signal évident de polvadénylation n'a été découvert en aval du codon de terminaison TGA (nucléotides 5452 à 5454). Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé ACAATGG est conforme aux règles de Kosak (151, 155). La EHV-1 0RF3 code un polypeptide de 552 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 61 493 daltons.

Analyse de la structure de la protéine de EHV-1 0RF3 L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certainN nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 23 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour constituer la séquence de signal. Une région hydrophobe consistant en 38 acides aminés (positions 404 à 437) est prédite comme fonctionnant en domaine d'ancrage transmembrane. Il y a cinq sites Asn-X-Thr/Ser pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote. Un tracé d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de EHV-1 0RF3 est représenté sur la Figure 15. Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane, y compris les éléments de signal et d'ancrage, sont clairement définies. Les deux régions les plus hydrophobes à la terminaison N et au voisinage de la terminaison C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la molécule de glycoprotéine.

Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1 0RF3 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès

La comparaison de la composition en acides aminés de la protéine de EHV-1 0RF3 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de EHV-1 0RF3 est homologue à PRV gl (80), VZV gE (191) et HSV-1 gE (79).

Construction d'un virus de la vaccine Copenhague basé sur un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte

Un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte basé sur le virus de la vaccine Copenhague, semblable au système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte WR pHES/vP293 (69), a été construit.

Le mutant vP668 de suppression du virus de la vaccine Copenhague est supprimé pour douze gènes dans la .région de HindiII C à HindiII K, y compris les gènes KIL, du domaine de réplication chez l'hôte humain (70), et C7L, un gène qui donne la carte de HindiII C. vP668 est incapable de se développer sur des cellules humaines KRC-5. Les membres de la série de plasmides CQPCS contiennent le gène C7L avec des bras de vaccine de flanc permettant la recombinaison avec VP668 et la restauration de la capacité du virus de se développer sur des cellules de KRC-5. La capacité de la descendance de vaccine recombinante engendrée par la recombinaison en utilisant le système de sélection de domaine de réplication chez l'hôte vP668/COPCS pour constituer des plaques sur les cellules humaines MRC-5 fournit un moyen d'identification rapide de ces recombinants. Le plasmice pCOPCS657 contient le promoteur synthétique H6 pour la vaccine suivi par une région de clonage de polyliaison pour l'insertion de gènes étrangers. La restriction de polyliaison est suivie par des codons d'arrêt et un signal de-terminaison transcriptionnel de la vaccine (45).

Clonage du cène de EHV-1 oD dans PCOPCS657 En sa référant maintenant à la Figure 16, on a digéré le plasmide pEHVBamHID par HindiII et on a isolé à partir de gel d'agarose un fragment d'ADN HindiII de 1240 bp contenant EKV-1 gD (Geneciean, BiolO, Inc., La Jolla, CA) et on a repairé celui-ci en utilisant le fragment de Klenow d'ADN polymérase. Le fragment repairé a été ensuite lié au plasmide pCOPOCS657 digéré par Smal. Le plasmide résultant, à savoir pJCA006, a le codon d'initiation ATG approximativement à 10 bp du promoteur H6 (Figure 16).

Clonage du gène de EHV-1 ctp63 en DCOPCS657 Le plasmide pEHVBamHID est digéré par HindiII, EccRI et P vu II et le fragment d'ADN Hindi II-PvuII de 1300 bp, contenant EHV-1 çp63, a été isolé à partir d'un gel de sagarcse et repairé avec Klenow. Le fragment repairé a été ensuite lié en plasmide pCOPCS657 et digéré par Smal. Le plasmide résultant avec EHV-1 gp63 dans l'orientation convenable par rapport au promoteur H6 a été appelé jPCA008 (Figure 16).

Clonage du gène de EHV-1 gE en PCOPCS657 Le plasmide pEHVBamHID est digéré par Aatll-Aoal et un fragment d'ADN Aatll-Aoal de 2630 bp contenant EKV-1 gE a été isolé à partir d'un gel d'agarose et repairé avec Klenow. Le fragment repairé a été ensuite inséré dans le plasmide pCOPCS567 digéré par Smal. Le plasmide résultant avec le gène de EKV-1 gE dans la bonne orientation relativement au promoteur H6 a été appelé pJCA007 (Figure 16).

Clonage du fragment de EHV-1 σΡ-σο63 en PCOPCS557

En se référant maintenant à la --Figure 17, le plasmide pEHVBamHID a été digéré par EcoRI ët PuvII et le fragment (A) d'ADN EcoRI/PuvII de 1832 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le plasmide pJCA006 a été digéré par Clal et EçoRI et le fragment (B) d'ADN Clal-EcoRI de 1450 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le plasmide pCOPCS657 a été digéré par Clal et Smal et le fragment (C) d'ADN Clal-Smal de 3700 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Les fragments A, B et C ont été - ensuite liés ensemble et le plasmide résultant a été appelé pJCA009 (Figure 17).

Clonage du fragment de EHV-1 oD-gp63-oS en PCQPCS657

Le plasmide pEHVBamHID a été digéré par EcoRI et SacII et le fragment (D) d'ADN EcoRI/SacII de 4240 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le fragment (D) a été ensuite lié aux fragments B et C (voir au-dessus) avec addition de dNTP pour assurer le 'repairage de la jonction SacII-Smal. Le plasmide résultant a été appelé pJCA.010 (Figure 17).

Construction des virus recombinants de la vaccine vP773, vP803, vP809f vP81û et vP822 exprimant les cadres de lecture ouverts de SHV-1 IL En vue de vérifier rapidement l'expression des cadres de lecture ouverts de EHV-1 décrits ci-dessus, on a construit un certain nombre de virus recombinants de la vaccine en utilisant le système de sélection de domaine de réplication chez l'hôte COPCS. Les trois cadres de lecture ouverts identifiés par l'analyse de séquence ont été clonés soit individuellement, soit en association ("double" et "triple) en plasmide pCOPCS657 (Figures 16 et 17). Les plasmides résultants ont alors été utilisés pour recombinaison avec le recombinant de la vaccine vP668 comme virus de sauvetage. Les différents virus recombinants de la vaccine issus de ces recombinaisons sont représentés dans le Tableau 5.

Le recombinant de la vaccine vP773 a/oété obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCAOOS contenant le gène de EHV-1 gD. Le recombinant· de la vaccine vP822 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA008 contenant le gène EHV-1 gp63. Le recombinant de la vaccine vP803 a été obtenu par recombinai-son réalisée avec le plasmide donneur pJCA0Q7. contenant le gène EHV-1 gpE. Le recombinant de la vaccine vP809 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA009 contenant le fragment de EHV-1 gp63 ; et on a obtenu le recombinant de la vaccine vP810 par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCAOlO contenant le fragment de EHV-1 gD-gp63-gE (Tableau 5).

Tableau 5 Désignation des virus recombinants de la vaccine exprimant les gènes de EHV-1 oD, aE et qp63

Plasmide EHV-1 Virus de ' recombinant donneur d'insertion sauvetage pJA006 gD vP668 vP773 pJA007 gE vP668 vP803 PJA008 gp63 vP668 v?822 pJA009 gD-gp63 vP668 vP809 pJAOlO gD-gp63-gE vP668 vP810

Analyse par immuno-fluorescence des produits de 5KV-1 0RF1 foDU ORF2 fgp63^ et 0RF3 fuEU synthétisés par les virus recombinants de la vaccine simples ou multiples L'immuno-fluorescence de cellules de VERO et de MRC-infectées par des virus recombinants de la vaccine a été éalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant un sérum e lapin polyclonal anti-EHV-l spécifique, R5935 (1:200)

Tableau 6).

Exemple 10 - EVALUATION IMMUNOLOGIQUE. CHEZ LES SOURIS ET LES COCHONS, DES GLYCOPROTEINES σρΙΙ, QPlII et gp50 DU VIRUS DE LA PSEUDO-RAGE> EXPRIMEES INDIVIDUELLEMENT OU EN COMBINAISON, PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE LA VACCINE '

La souche Copenhague du virus de la vaccine et ses dérivés vP410, vP425 et vP458 (184) ont été utilisés dans cet exemple.

Clonage des gènes PRV codant σρΙΙ, ctpIII et op50

Le virus PRV NIA3 (182) a été propagé sur une culture de cellules NIL2 (183). Les débris cellulaires ont été éliminés de la fraction surnageante par centrifugation à 3000 g pendant 30 mn. On a purifié les virions par centrifugation à travers un coussin de sucrose à 40 % (en poids/volume) à 40 000 tours/mn pendant 60 mn dans un rotor Beckman 45 Ti suivi par un gradient discontinu de sucrose à 30-50 % (en poids/volume) (rotor Beckman SW25 à 23 000 tours/mn pendant 5 heures). Des virions par bandes ont été collectés, dilués au moyen d'un tampon TNE (50 mM Tris-HCl, pH7,8, 150 mM NaCl et 10 mM EDTA) et on a fait un comprimé à 30 OOO tours/mn pendant 1 heure dans un rotor Beckman SW4Q. Le comprimé viral a été remis en suspension dans un tampon TE (50 mM Tris-HCl pH7,8, 10 mM EDTA) et lysé par addition de dodécyl-sulfate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,5 % (poids/volume) et de protéinase K à 100 mg/ml. Après incubation à 37°C pendant 2 heures, le lysat a été extrait une fois avec un mélange phénol-chloroforme (1:1) et une fois avec un mélange chloroforme :iscmaylalcool (24:1). L'ADN a été précipité avec de l'éthanol et redissous dans H20. Après digestion complète par BamHI, les fragments ont été clonés au site BamHI de pBR322 préalablement traité à la phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIAP). Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer la souche nM522 d'S. Coli compétente (20).

En se référant maintenant aux Figures 18 et 19, la

Tableau 6

Immuno-fluorescence de cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine réalisée en utilisant du sérum de lapin anti-EHV-1 R5935 · EHV-1 recombinant R5935 interne surface gD positif négatif gp63 positif négatif gE négatif négatif gD-gp63 positif négatif gD-gp63-gE positif négatif séquence d'ADN qui code le gène gpll réside dans le fragment 1 de BamHI et les sous-fragments IA et IB de Sali du génome PRV (62, 94). Le plasmide appelé pPR9.25 contenant le fragment 1 BamHI de PRV, inséré au site BamHI de pBR322 a été digéré par Ncol. Le résultat de digestion -d'ADN a été fractionné sur gel d'agarose à 0,8 % et un fragment d'ADN par Ncol de 6,2 kb a été purifié en utilisant la procédure Gene Clean (marque déposée) (BiolOl, Inc., La Jolla, CA) puis inséré au site Ncol de pBR328 (Boehringer Mannheim Biochemi-cals, Indianapolis, IN) traité avec CIAP. Le plasmide résultant, pPR2.15, a été digéré par SphI et fractionné sur un gel d'agarose. Les fragments de 2,7 et 1,8 kb ont été purifiés et insérés au site SphI de pUC18 phosphatasé pour créer des plasmides pPRl et pPR2 (Figure 18) et dans le phage M13. On a déterminé la séquence de nucléotides comme décrit ci-dessus. L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 2742 bp codant 913 acides aminés. Une homologie significative des acides aminés avec le HSV-1 gB a été observée comme attendu (62). Pour faciliter la description des manipulations de clonage pour l'expression de PRV gpll dans les vecteurs de virus de la vaccine, la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpll avec en plus des séquences supplémentaires non codantes 5' et 3' est illustrée sur la Figure 19.

En se référant maintenant aux Figures 20 et 21, la séquence d'ADN codant la glycoprotéine gpIII de PRV réside dans les fragments 2 et 9 par BamHI du génome de PRV (96). Le plasmide pPR9.9, contenant le fragment par BamHI inséré au site BamHI de PBR322 (Figure 20) a été digéré par BamHI et SphI. Le plasmide pPR7.5 contenant le fragment 9 par 3amHI inséré au site 3amHI de PBR322 a été digéré par Ncol et par BamHI. L'ADN résultant des deux digestions a été fractionné sur un gel d'agarose. Le fragment SphI-BamHI de: 2,35 kb et le fragment NcoI-BamHI de 1,1 kb ont été purifiés et liés aux sites EcoRI-SphI de I3I25 phosphatasé (Figure 20) en utili- sant un agent de liaison phosphorylaté NcoI-EcoRI à savoir MRSYN21/MRSYN22.

Ncol EcoRI

MRSYN21 5' CATGGGTCTGCAGTCG 3 ' MRSYN22 3' CCAGACGTCAGCTTAA 5'

Un plasmide appelé pPR17 a été isolé et il contient un fragment Sohl-Ncol de 3450 bp comprenant le gène complet de PRV gpIII (Figure 20). La séquence de nucléotides a été obtenue à partir de modèles ou matrices de plasmide double brin dénaturés au moyen d'un alcali et à partir de modèles ou matrice simple seul brin après clonage en phage Ml3. L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 1440 bp codant 479 acides aminés (Figure 21). On a observé une homologie significative avec HSV gC comme observé précédemment (96).

En se référant maintenant aux Figures 22 et 23, la séquence d'ADN codant la glycoprotéine gp50 de PRV réside dans le fragment 7 par BamHI du génome de PRV (95). Le plasmide pPR7.1 (Figure 22) contenant le fragment 7 par BamHI de PRV, inséré au site BamHI de pBR322 a été digéré par StuI et Ndel et traité avec une nucléase de fève de Mung (Mung bean). Le fragment de 1,7 Jcb a été purifié à partir d'un gel d'agarose, inséré au site Hindi de IBI25 phosphatasé. Ce plasmide, pPR22 (Figure 12), contient la totalité du gène de PRV gp50. La détermination de la séquence de nucléotide a révélé un cadre de lecture ouvert de 1215 bp codant 404 acides aminés (Figure 23). Une homologie significative avec le HSV-1 gD a été observée comme rapporté précédemment (95).

Clonace des cènes de PRV codant crpll, cpIII et σο50 dans des plasmides donneurs d'insertion du virus de la vaccine

Le fragment Sohl-Nhel de PRV de 1060-.bp à partir de pPRl (Figure 18A) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites BamHI-SphI de pIBI25 après traitement avec CIAP' en utilisant un agent de liaison phosphorilaté BamHI-Nhel, à savoir MRSYN1/MRSYN2

BamHl Nbel KRSYN1 5' GATCCATTCCATGGTTG 3' MRSYN2 3' GTAAGGTACCAACGATC 5' pour engendrer le plasmide pPR6 (Figure 18A).

pPR5 a été digéré par HindlII et Apal et traité par CIAP. Le site Apal est localisé 32 bp en aval du codon d'initiation ATG de PRV gpll (Figure 19). Un fragment d'ADN double brin a été obtenu par traitement de réforme (annealing) de la paire d'oligonucléotides phophorylatés synthétiques MRSYN3/ MRSYN4. Ce fragment contient de l'ADN spécifiant le promoteur H6 de vaccine du site EcoRV jusqu'à l'ATG (souligné), suivi immédiatement par des séquences de codage de PRV gpll.

HindlIIScoRV Ä2I2 KRSYN3 5’ AGCTTGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGCCC 3’ HYSYN4 3’ ACTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 5’ L'ADN synthétique a été lié au fragment HindiII-Apal de 3920 bp dérivé de pPRS pour engendrer le plasmide pPR9 (Figure 18A).

Le plasmide pPR9 a été digéré par BamHI et Nhel, traité avec CIAP et lié en utilisant un agent de liaison BamHI-SphI phosphorylaté

Sohl SamHI

KRSYH7 5’ CCCAGATCTCCTTG 3 ’ KRSYN8 3’ GTACGGGTCTAGAGGAACCTAG 5’ à un fragment Sohl-Nhel de 1640 bp obtenu à partir de pPRl, en engendrant le plasmide pPR12 (Figures 18A,'18B).

Le fragment HincII-SphI de 1030 bp provenant de p?R2 (Figure 18A) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites Hindi et SphI de pUC18 phosphatasé. Le plasmide résultant pPRIO a été digéré par HindlII et Nael et traité avec CIAP. Le site Nael est localisé 44 bp en aval du codon de terminaison TAG (Figure 19). Un fragment d'ADN double brin obtenu par traitement de réforme (annealing) de la paire d'oligonucléotides synthétiques phosphorisatés MRSYN9/MRSYN10

Nael Xr.alII Hir.dli: KRSYN9 5’ GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGÄCGCCCTGTÄGÄATTTTTÄTCGGCCGÄ 3’ ÆRSYN10 3’ CCGTGATGGTCGCGGAGCTCTCGCTCCTGGGGCTGCGGGACATCTTAAAAATAGCCGGCTTCGA 5' a été lié au fragment Nael-HindlII de 3720 bp dérivé de pPRIO pour engendrer le plasmide pPRll.

Les séquences soulignées correspondent au codon de terminaison de PRV gpll et au signal de terminaison de transcription précoce de la vaccine (45). Le fragment Sohl-HincII de 770 bp de pPR2 a été purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré, en utilisant un agent de liaison phos-phorylaté BamHI-Sohl (HRSYN7/MRSYN8), aux sites BamHI-HincII de pPRll traité par CIAP, pour engendrer pPR13 (Figures 18A, 18B). Le plasmide pPR12, digéré par EcoRI et Sohl et traité par CIAP, a été lié, en utilisant un agent de liaison Hindi11-EcoRI phosphorylaté (MRSYN19/MRSYN2Q )

HindlII EcoRI

HRSYN19 5’ AGCTTCTGCAGCCATGGCGATCGG 3* XRSYN20 3’ AGÄCGTCGGTACCGCTAGCCTTAA 5’ à un fragment isolé HindlII-SphI de 990 bp dérivé de p?R13, pour engendrer le plasmide pPR15 (Figure 18B).

Le fragment de 2780 bp HincIII-EcoRV de pPR15 a été traité avec la nucléase de la fève de Hung, purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré dans le plasmide pTP15 (184) (Figure 3) digéré par XmalII-EcoRV, la nucléase de la fève de Mung et CIAP, pour engendrer le plasmide pPR18 (Figure 18B).

Dans pPRl8, pRV gpll est connecté au promoteur H6 synthétique de la vaccine au locus de suppression de l'hémaglutinine ce la vaccine. Ce plasmide a été transfecté dans des cellules infectées par le virus de la vaccine pour engendrer des recombinants de la vaccine vP534, vP644, vP621 et vP692 contenant le gène de PRV gpll (voir ci-dessous).

Le gène de PRV gpIII a été manipulé pour être exprimé sous le contrôle du promoteur précoce de virus de la vaccine, à savoir μ (voir ci-dessous) localisé dans le fragment HindlII B de la vaccine. En utilisant une mutagénèse spécifique au point de vue site, un site Nsil a été introduit en changeant la séquence CGC (bases 192-194) (Figure 21) dans pPRV gpIII en ATG et un site Xbal a été introduit en changeant la séquence GTGACGT en TTCTAGA (bases 1632-1638) (Figure 21). A cet effet, de l'ADN simple brin a été engendré à partir du plasmide pPR17 en utilisant un phage d'aide R408 (Stratagène, La Jolla, CA) (185). La mutagénèse digirée vers le site a été réalisée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques phosphorylatés purifiés, à savoir MRSYN5 et MRSYN6.

Nsil HRSYN5 S'GCGAGCGAGGCCATOCATCGTGCGAATGGCCCC 3’

Xbal KRSYNS 5' GGGGGGACGCGCGGGTCTAGÂAGGCCCCGCCTGGCGG 3' puis on a effectué une sélection sur la souche CJ236 de Ξ. Coli dut ung (I3I, New Haven, CT) (17, 186).

Ces mutations ont engendré le plasmide pPR28. Ce plasmide pPR28 a été digéré par Nsil et xbal et traité avec un nucléase de fève de Mung. Un fragment de 1140 bp a été purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites BalII-Htal de pSDA78VC (Figures 20 et 24) après traitement avec la nucléase de fève de Mung et CIAP. Le..plasmide pPR24 a été transfecté dans des cellules infectées par le virus de la vaccine pour engendrer les recombinants du virus de la vaccine vP604, vP644, vP68l et vP692 contenant le gène de ?RV gpIII (voir ci-dessous).

PRV gp50 a été manipulé pour être exprimé sous le contrôle d'un promoteur de virus de la vaccine précoce/ intermédiaire, à savoir I3L (187). En utilisant une mutagé-nèse spécifique quant au site, on a introduit un site Nsil en changeant la séquence CCTGCCAGCGC (bases 177-187) (Figure 23) dans gp50 en ATGCATTTAAT et on a introduit un site BallI en changeant la séquence CCTCCGCAGTACCGG aux bases 1404-1418 (Figure 23) en AATTTTTATAGATCT. Des procédures décrites précédemment (17, 185, 186) de mutagénèse ont été utilisées pour engendrer le plasmide pPR29 à partir de pPR22 en utilisant des oligonucléotides synthétiques phosphorylatés purifiés MRSYN13 et MRSYN 13 (Figure 22).

Nsil HRSYN12 5’ GGTTCCCATACACTCÄATGCÄTTTAATCÄTGCTGCTCGCÄGCGC 3’

BoIII

HRSYN13 5’GCAGCCCGGTCCGTAGAATTTTTATAGATCTCGTCGÄTGATGATGGT 3' pPR29 a été digéré par Nsil, traité avec la nucléase .de fève de üung et partiellement digéré par Belli pour engendrer un fragment de 1290 bp. Le plasmide p2£P13P? (Figures 22, 25) a été digéré par EcoRI et traité par la nucléase de fève de Mung et ensuite par BamHI pour engendrer un fragment de 140 bp contenant le promoteur I3L de la vaccine. Les fragments de 1290 et 140 bp ont été purifiés à partir de gel d'agarose et liés au site Belli phosphatasé de pMP409DVC (Figures 4, 22). Le plasmide résultant pPR26 a été utilisé en recombinaison pour produire Les recombinants du virus de la vaccine vP591, vP621, vP691 et vP692 contenant le gène gp50 (voir ci-dessous).

Construction de recombinants de la vaccine exprimant les glycoprotéines σοΙΙ, σοΙΙΙ et σο50 de PRV. individuellement ou en combinaisons

En vue d'établir 1'immunogénéicité et la contribution relative des trois glycoprotéines de PRV (gpll, gplII et gp50) pour la protection des animaux immunisés contre l'attaque par PRV virulent, on a construit une série de recombinants de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines de PRV seules ou en combinaison.

En se référant maintenant à la Figure 24, le virus recombinant de la vaccine, à savoir vP533, exprimant le gène de beta-galactosidase a été construit comme suit : Une région de 1 kb dans le fragment B par HindlII de la vaccine enjambant la jonction Sali F/I du génome de Copenhague contient une homologie d'ADN avec le gène hémorragique (μ) du poxvirus de la vache (cow poxvirus) (188) comme déterminé par l'analyse par Southern blot (189). Le gène μ code un polypeptide présentant une similarité avec les inhibiteurs de sérine protéase et est biologiquement responsable pour la formation de pustules hémorragiques par le virus sur la membrane chorioallantoique. La séquence d'ADN du génome de Copenhague a révélé que l'équivalent du gène μ contient des mutations multiples de déplacement de cadre et était biologiquement non fonctionnel. Le plasmide pSD419VC (184) (Figure 24) contient la portion de gauche de la région μ. Le plasmide pSD422VC, qui contient le fragment I par Sali de Copenhague coloné dans pUC8, contient le restant de la région μ. Pour éliminer les séquences de vaccine non désirées vers la gauche, pSD419VC a été digéré par Ncol et Smal, doté d'une terminaison franche par un fragment de Klenow de E. Coli polymérase et re-lié, ce qui a donné le plasmide pSD476VC (Figure 24). Le plasmide pSD422VC a été digéré par Ht>al et NruI et on a isolé à partir d'un gel d'agarose un fragment d'environ 0,3 kb localisé immédiatement à la droite de la région μ. Ce fragment a été lié en pSD476VC, coupé par Hindi (qui reconnaît les sites Sali), ce qui a donné le plasmide pSD477VC. Pour exprimer la béta-galactosidase sous le contrôle de la région de promoteur μ de la vaccine de Copenhague, on a préparé des oligonucléo- tides synthétiques 22mer/20mer. La séquence de 22mer/20mer avec les sites de restriction indiqués etle codon d'initiation ATG souligné est la suivante :

Clal Hoal 22mer 5’ CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3’ 2 Orner 3* TAATGÄTACTTCCTAGGCAA 5’

Le mélange 22mer/20mer ayant subi un traitement de réforme ("annealed") a été lié en pSD477VC, digéré par Clal et Hindi, ce qui a donné le nouveau plasmide pSD479VC (Figure 24). Un fragment BamHI de 3,1 kb contenant les séquences de codage pour la béta-galactosidase de J3. Coli à partir de pMC1871 (34) exempt de codon d'initiation et de promoteur a été lié en pSD479VC et coupé par BamHI. Le plasmide résultant, contenant le gène lacZ dans l'orientation convenable sous le contrôle du promoteur μ de Copenhague, a été appelé pSD479VCBG. Le plasmide donneur d'insertion a été recombiné en virus de la vaccine vP410 (184). Un virus recombinant de la vaccine a été identifié sur la base de la formation de plaque bleue en présence d'un substrat chromogène, X-gal (9, 24) cloné sur plaque et appelé vP533 (Figure 24).

Pour construire un plasmide vecteur pour l'insertion de gènes étrangers, on a préparé des oligonucléotides synthétiques 42mer/40mer

Clal Sal II Sacl Smal Xhol BamHI Hoal 42mer 5’ CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGGATCCGTT 3' 4 Orner 3’ TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCCTAGCCAA 5’

Le mélange 42mer/40mer soumis à un traitement de réforme (annealing) a été lié en pSD477VC coupé par Clal et HincIII. ce qui a donné le nouveau plasmide pSD478VC (Figure 24). Le plasmide contient environ 0,3 kb de séquences;· de la vaccine de chaque côté de la région de multiclonage qui remplace complètement la région de codage μ de la souche Copenhague de la vaccine. On a utilisé pSD478VC pour engendrer pPR24 (Figure 20) contenant des séquences de codage de PRV gpllï et des recombinants de la vaccine vP6Q4, VP644, vP691 et vP692.

En se référant maintenant à la Figure 25, le plasmide pMP419 contient un fragment BamHI de 85û bp du fragment I par HindlII de la vaccine contenant le promoteur I3L inséré dans le site BamHI de pUC8 (Figure 25). L'élément promoteur I3L correspond à des séquences d'ADN en amont du cadre de lecture ouvert I3L dans le fragment I par HindlII de la vaccine (187) et a été utilisé précédemment pour exprimer les gènes étrangers dans des recombinants du virus de la vaccine (27, 190). On a linéarisé pMP419 au site unique Clal dans les séquences de codage I3L et on l'a soumis à une digestion par Bal 31 suivie d'une digestion par EcoRI et formation d'une extrémité franche par traitement avec le fragment de Klenow de la E. Coli polymérase. Le plasmide résultant, à savoir pMP419-5 (Figure 25), contient les séquences du promoteur I3L en amont du nucléotide - 8 connecté à un site EcoRI. L'élément promoteur a été isolé en tant que fragment EcoRI-MsoI de pMP419-5 et inséré dans pUC13C digéré par EcoRI-Clal, un dérivé de pUC13 contenant un agent de liaison Clal au site Smal. Le plasmide résultant, à savoir pMP13PP (Figures 22 et 25), contient les séquences du promoteur I3L de la position - 126 jusqu'à la position - 8 suivies par un site EcoRI en position - 8.

On a inséré PRV gp5Q, entraîné par le promoteur I3L de la vaccine, dans le vecteur plasmide de suppression M2L, à savoir pMP409DVC (Figure 4), ce qui a donné pPR26 (Figure 22). On a utilisé pPR26 pour engendrer les recombinants de la vaccine vP591, vP621, vP691 et vP592.

Isolement de virus recombinant de la vaccine

Des virus recombinants de la vaccine contenant les gènes de PRV ont été identifiés et purifiés comme décrit ci-dessus. Les virus recombinants de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines gpll, gpllï et gp50 de PRV, soit seules soit en combinaison sont énumérés dans le Tableau 7.

Tableau 7

Désignation des virus recombinants de la vaccine exprimant les glycoprotéines ctpH, ctdIII et ~ctp50 de PRV

Recombinant Parent Plasmide Glycoprotéine

donneur de PRV

vP534 VP425 pPR18 gll vP591 vP458 pPR26 gp50 VP604 VP533 pPR24 gill vP621 vP534 pPR26 gll + gp50 vP644 VP604 pPR18 gll + gill VP691 VP604 pPR26 gill + gp50 vP692 vPS44 pPR26 gll + gill + gp50

Evaluation in vitro des glycoprotéines de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine

Les glycoprotéines gpll, gpIII et gp50 de PRV sont des glycoprotéines typiques associées à la structure membraneuse des cellules infectées par PRV et sont de plus des constituants du virus. Des anticorps monoclonaux spécifiques anti-gpll, anti-gpIII et anti-gp50 suivis par IgG anti-souris caprin/ conjugué à la fluoresceine, ont donné une forte immuno-fluorescence de surface sur des cellules infectées par des virus recombinants de la vaccine, mais non sur des cellules infectées par le virus de souche sauvage de la vaccine.

Evaluation in vivo du potentiel immunogénique des glycoprotéines σοΙΙ, qpIII et σρ50 de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine chez les souris et les cochons En vue d'établir l'immunogénicité relative des trois glycoprotéines de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine, on a inoculé des souris dans le coussinet ce pied au moyen de 50 à 100 ul de doses différentes des virus recombinants. 14 jours après immunisation, les souris ont été soumises à une attaque avec 10 LDÎ0 de la souche virulente de Kojnock de PRV par la route interpéritonéale. Dans des expériences préliminaires, chacune des glycoprotéines de PRV s'est révélée efficace pour protéger des souris inoculés contre une attaque par PRV virulent. Dans une série plus étendue d'expériences utilisant plus de 500 souris, on a établi l'efficacité des recombinants de la vaccine exprimant des glycoprotéines de PRV. La dose de vaccination capable de protéger 50 % des souris soumises à l'attaque (PDS0) a été calculée et les résultats de cette étude sont donnés dans le Tableau 8. Le virus recombinant de la vaccine exprimant individuellement les protéines gpll, gp50 et gplII de PRV engendre les valeurs calculées PD50 de 6,4, 5,4 eu 5,8 (log10), respectivement. Lorsque les glycoprotéines sont exprimées en combinaison, on a calculé des valeurs nettement meilleures pour PD50. La vaccine recombinante exprimant gpll + gp50 de PRV a donné une valeur PD50 de 3,3, et la vaccine recombinante exprimant gp50 + gplII de PRV a donné une valeur PD50 essentiellement similaire (3,6). Apparemment, le recombii-nant exprimant les glycoprotéines gpll + gpIII de PRV est plus efficace, un ?D50 de 1,5 étant obtenu. La coexpression de toutes les trois glycoprotéines gpll, gplII et gp50 de PRV dans un virus recombinant de la vaccine ne donne pas une valeur PD50 plus faible d'une manière significative que celles obtenues avec des virus recombinants exprimant les trois glycoprotéines de PRV individuellement. L'efficacité poten- tialisée obtenue avec la vaccine recombinante exprimant gpll et gpIII comparée au virus recombinant de la vaccine exprimant les gènes individuellement est similaire aux résultats rapportés dans l'Exemple 6 pour la coexpression des glycoprotéines gpl3 et gpl4 du virus de l'herpès chevalin.

Tableau 8

Puissance des recombinants du virus de la vaccine exprimant les glycoprotéines cp50, qpII et gpIII du virus de la pseudo-race

Virus recombinant Gènes de PRV exprimés PD^ vP534 gpll 6,4 vP591 gp50 5,4 VP604 gpHI 5/8 VP621 gpll + gp50 3,3 VP644 gpH * gpHI 1/5 vP691 gp50 + gpIII 3,5 vP692 gp50 + gpll + gpIII 5,1

Bien que la souris puisse fournir un système modèle intéressant pour évaluer l'immunogénicité des glycoprotéines de PRV, principale espèce constituant une cible pour le vaccin contre PRV est le cochon. C'est pourquoi, en vue d'établir la validité de l'approche du virus recombinant de la vaccine chez le cochon, on a effectué l'expérience suivante. Des porcelets d'environ 25 kg ont été inoculés intra-musculairement au moyen de 2 ml de recombinant de la vaccine exprimant des combinaisons des glycoprotéines gpll, gpIII et gp50 de PRV. L'inoculum de virus a été dilué dans PBS. 35 jours après cette inoculation, les porcelets ont été soumis à une attaque, par injection intranasale (1 ml dans chaque narine), d'une suspension d'isolat NIA3 de PRV virulent. L'efficacité de la vaccination a été évaluée en mesurant le gain de poids comparatif des porcelets vaccinés et des porcelets de contrôle pendant 7 jours après l'attaque. Le gain de poids relatif est calculé en tant que gain en poids (en pourcentage) moyen journalier observé chez les cochons vaccinés moins le gain en poids (en pourcentage) moyen journalier des cochons de contrôle non vaccinés. Le gain normal en poids des cochons dans des conditions non perturbées.est plus grand que 1,1 kg. Comme démontré par les données du Tableau 9, l'évolution du poids pendant la période de 7 jours suivant l'attaque par PRV est grandement améliorée chez les porcelets vaccinés par rapport au groupe de contrôle inoculé avec le virus de souche sauvage. Une seule inoculation avec les recombinants du virus de la vaccine donne une protection significative contre la perte de poids après l'attaque par PRV virulent.

Tableau 9

Evaluation des recombinants de la vaccine exprimant des combinaisons de glycoprotéines cp50, qpII et ctpIII de PRV

chez les porcelets

Virus Gènes de PRV Dose de Gain de poids d'inoculum exprimés vaccination relatif logio TCID50/ml vP452 Aucun 107,7 - 0,31 vP621 gpll + gp 50 107’7 2,89 vP644 gpll + gpIII 107’7 2,15 vP691 gp50 + gpIII 107'7 ' 1,21 vP692 gp50 + gpll + gpIII 107’7 2,67

La disponibilité de recombinants du virus de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines dominantes de PRV, individuellement ou en combinaison, offre un certain nombre d'avantages pour le contrôle des infections par PRV sur le terrain : (a) un avantage important est le fait que les virus recombinants de la vaccine, en tant qu'agents de vaccination, expriment seulement un nombre limité de gènes de PRV et donc il n'y a pas de risque concommittant de réversion d'une souche de vaccin de PRV atténué vers une forme virulente et donc il n'y a pas d'introduction continue du virus PRV dans l'environnement ; (b) étant donné que seulement un nombre limité d'antigènes de PRV sont exprimés par les candidats de vaccin de PRV à base des virus recombinants de la vaccine, ceci permet de discriminer les animaux vaccinés d'une part et les animaux naturellement infectés d'autre part, étant donné que les réactifs de diagnostic consistant en d'autres antigènes de PRV peuvent être réunis pour discriminer entre les animaux vaccinés et les animaux naturellement infectés ? (c) de tels vaccins recombinants pourraient être utiles pour rompre la transmission verticale naturelle de PRV de la truie à sa descendance. Ceci pourrait être réalisé par la vaccination de la truie enceinte par un virus recombinant de la vaccine exprimant un jeu discret de glycoprotéines de PRV. L'immunité maternelle devrait protéger la descendance de l'infection par PRV. A son tour, la descendance pourrait être vaccinée avec un virus recombinant de la vaccine exprimant toutefois une configuration différente d'antigènes de PRV, distincts de ceux utilisés pour vacciner la truie. Ceci est un moyen potentiel de passer outre l'immunité maternelle. Une autre approche pour traiter le problème de l'immunité maternelle consisterait à exprimer les glycoprotéines de PRV dans une combinaison quelconque dans un vecteur complètement hétérologue. Ceci est réalisé par la construction de recombinants du poxvirus aviaire exprimant les glycoprotéines de PRV. L'utilité des recombinants du poxvirus aviaire, dont le domaine de réplication chez l'hôte est (d'une manière naturelle) restreint à l'espèce aviaire (oiseaux), a été démontrée lors de la vaccination des espèces non-aviaires (41). Ainsi, deux approches sont disponibles pour traiter le problème de la barrière fournie par l'immunité maternelle : (1) les vecteurs et (2) la constellation des antigènes exprimés par ces vecteurs.

Exemple 11 - VECTEURS DE POX AVIAIRE fAVIPOX1) EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE ctpII DU VIRUS DE LA PSEUDO-RAGE Le poxvirus du canari a été propagé sur des fibroblastes primaires d'embryons de poulets (CEF) dérivés d'oeufs embryonnaires âgés de 10 à 11 jours obtenus de SPAFAS, Inc., (Norwich, CT) en utilisant les conditions décrites précédemment (41, 42). Le virus a été purifié des contaminants de la cellule d'hôte par centrifugation sur un gradient de sucrose en utilisant la méthode décrite par Joklik (191). Les cellules de rein de cochon (PK-1) ont été obtenues de 1'American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC n°CL101).

Construction d'un recombinant du poxvirus du canari exprimant la glycoprotéine ctpII du virus de la oseuco-race En se référant maintenant à la Figure 26, on a utilisé le plasmide pPR15 (Figure 18) comme source de gène de PRVgplï. Pour isoler le segment d'ADN contenant tout le gène de PRVgplï, on a digéré pPR15 par EcoRV et HindlII. Un fragment d'approximativement 2,8 kb, contenant 21 bp d'extrémité 3' du promoteur H6 du virus de la vaccine (W) et la totalité du gène de PRVgplï, a été engendré par cette digestion. On a isolé le fragment EcoRV/HindlII de 2,8 kb pour insertion dans pFPCV2 (Figures 8, 26).

Le fragment EcoRV/HindlII de 2,8 kb (défini ci-dessus) a été inséré dans un fragment de pFPCV2 de 8,0 kb dérivé de la digestion complète par HindlII et de la digestion partielle par EcoRV. La ligation de ces 'deux fragments a résulté dans la formation d'un plasmide de 10,8 kb appelé pFPPRVII.

En se référant maintenant à la Figure 27, on a utilisé le plasmide pFPPRVII pour engendrer un fragment NruI/HindlII de 2,8 kb pour insertion dans pCPCVl (Figure 9). Le plasmide pCPCVl contient le promoteur H6 de W au site unique EcoRI dans le fragment génomique PvuII CP de 3,3 kb. Ce plasmide d'insertion permet l'insertion de gènes étrangers au locus C3 du génome CP. Le plasmide pCPCVl a été digéré par NruI et HindlII et le fragment de 5,8 kb a été isolé pour ligation au fragment de 2,8 kb défini ci-dessus. Le plasmide résultant a été appelé pCPPRVII.

On a inséré le marqueur sélectable dominant, E.. Coli xanthineguanine phosphoribosyl transferase (Eco opt), dans pCPPRVII comme moyen de sélection de croissance pour des recombinants de CP/PRVgpII. Des rapports antérieurs ont décrit l'utilisation de Eco cpt comme un marqueur sélectable dans la production de recombinants de poxvirus (193, 194). Le gène Eco gpt a été obtenu à partir du plasmide pSV2gpt (ATCC n°37145). Le fragment ΒσΙΙΙ/DraI de 670 bp, contenant le gène Eco got, a été isolé de ce plasmide et inséré dans le site ΒσΙΙΙ/SmaiI de pSD486VC. Le plasmide résultant, à savoir pGPT-1, contient le gène de Eco apt entre les bras de flanc du gène de W μ et sous la régulation transcriptionnelle du promoteur μ. Le plasmide pSD486VC a été dérivé de pSD478VC (Figure 24) de la manière suivante. On a digéré pSD478VC par EcoRI dans MCR, rempli par la réaction classique de Klenow en présence de dNTP (0,5 mM chacun) et re-lié pour produire pSD478EVC. Ce plasmide a été digéré par Hgal et BamHI et les oligonucléotides ayant subi un traitement de réforme (annealed) HEM 5 (5'GATCCGATTCTAGCT-3') et HEM 6 (5'-AGCTAGAATCG-3') ont été insérés pour produire PSD486VC.

La digestion de pGTP-1 par Ncol et EcoRI a libéré un fragment de 1,0 kb contenant le gène de l'Eco apt (670 bp) et le promoteur de W μ (330 bp). Les extrémités Ncol et EcoRI

ont été rendues franches en utilisant un fragment de Klencw de l'JS. Coli ADN polymérase en présence de 0,5 mM dNTP. On a ajouté des agents de liaison ou adaptateurs de jonction (linkers) HindlII (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) aux fragments à extrémité franche. L'ADN a été digéré par HindlII et le fragment de 1,0 kb récupéré à partir d'un gel d'agarose. Ce fragment HindlII de 1,0 kb a été ensuite inséré au site HindlII de pCPPRVll. Le plasmide résultant contenant les gènes de Eco cpt et PRVgpII, lié en une configuration queue à queue, a été désigné pCPPRVll gpt. Ce plasmide a été utilisé dans des expériences de recombinaison in vitro pour insertion au locus C3 du génome CP. La sélection de recombinants contenant le gène de Eco cpt a été faite en présence de 100 ug/ml d'acide mycophénolique et les recombinants de Eco cpt-positifs ont été ensuite liés pour détecter la présence du gène de PRVgpII par analyses d'hybridation sur plaques. Les plaques positives Eco cpt et PRV gpll ont été purifiées dans trois cycles d'isolation de plaques et des populations pures cultivées pour obtenir un titre plus élevé et ont été appelées pCP55. Les analyses par Southern blot ont confirmé que ces deux gènes sont en vérité génétiquement connectés dans ces recombinants de CP. Le recombinant de CP a été désigné vCP55.

Immuno-fluorescence de cellules infectées par vC?55

Des études d'immuno-fluorescence ont été effectuées pour démontrer la localisation cellulaire de PRV gpll exprimé dans des cellules infectées par vCP55. Des cellules de CEF ou PK-1 ont été ensemencées sur des plaquettes en verre de 22 mm dans des boîtes de 35 mm à une densité de 5 x 10J cellules par boîte. Les cellules de CEF et PK-1 ont été infectées soit avec vC?55 soit avec le virus parental de C? et on a réalisé des infections et des incubations pour le test d'immuno-f luorescence comme décrit dans 1'-Exemple 1, en utilisant l'anticorps monoclonal 75N10, dilué à 1 % dans PBS-r.

Les cellules infectées ont été analysées pour l'expression à la fois interne et de surface. On n'a observé aucune expression de surface significative de gpll ni dans l'un ni dans l'autre des systèmes de cellules infectées par vCP55. L'expression interne du produit de gène de gpll s'est toutefois révélée à la fois dans les cellules de CEF infectées par vCP55 et dans les cellules de PK-1 infectées par vCP55. Les signaux de fluorescence interne dans les deux types de cellules étaient localisés dans des granules de la région périnucléaire des cellules infectées. Ces résultats suggèrent que le PRVgpII exprimé par CP est transmis au complexe de Golgi mais non pas à la membrane du plasma. Ce résultat diffère des résultats avec le gpll exprimé par le virus de la vaccine qui a été détecté sur la surface des cellules infectées.

Immuno-précipitation de PRVctpII à partir de cellules infectées de CEF et PK-1 L'expression du produit de gène de PRVgpII par vCP55 a été analysée par immuno-précipitation à partir de lysats de cellules infectées. Des monocouches de cellules ont été infectées à 5 PFU/cellule. Le test d'immuno-précipitation a été réalisé comme décrit dans l'Exemple 1, en utilisant l'anticorps monoclonal 75N10.

L'espèce prédominante de polypeptide précipitée avec le sérum de lapin anti-PRV des cellules infectées de CEF et PK-1 a migré avec des.poids moléculaires apparents d'environ 120 kDa, 67 kDa et 58 kDa. Ces polypeptides représentent la forme de précurseur et la forme traitée protéolytiquement, respectivement, de PRVgpII dans les cellules infectées par PRV qui sont complexées par des liaisons disulfures (86, 101, 196). Des espèces moins importantes avec des poids moléculaires apparents d'environ 26 kDa ont également été observées et peuvent refléter des événements de traitement protéolytique plus complet de gpll dans ces cellules infectées par CP/PRV recombinant. Aucun polypeptide équivalent n'a^ précipité de cellules infectées par le virus CP de contrôle et les lysats de cellules non infectées.

Etudes de protection

La capacité de vCP55 de provoquer une réponse immunitaire protectrice contre 1'attaque de PRV vivant a été analysée dans le système de la souris. On à inoculé des souris dans leurs coussinets de pied au moyen d'échantillons de 50 ul à 100 ul contenant des doses variées de VCP55 indiquées dans le Tableau 10. Quatorze jours après l'immunisation, les souris ont reçu 16 LD50 de la souche Kojnock de PRV par la voie intrapéritonéale. On a compté les survivants 14 jours après l'attaque, moment auquel l'expérience a été arrêté. Comme montré dans le Tableau 10, l'inoculation de souris au moyen d'une seule dose de 106’85 TCIDso a protégé 8 souris sur 10 d'une attaque mortelle par PRV. Les doses inférieures de vCP55 qui ont été essayées n'ont fourni aucun niveau de protection. L'attaque avec PRV vivant a tué 7 souris non vaccinées sur 8. A partir des résultats présentés dans le Tableau 10, on a calculé une PD50 (dose protectrice à 50 %) égale à 10é’16 pour le vCP55 recombinant.

Tableau 10

Efficacité de vCP55 chez la souris

Dose Protection logio^CIDso 6.85 8/10 4.85 0/10 2,80 0/10 0,85 0/10 L'efficacité de vCP55 comme agent immunisant contre l'attaque par PRV vivant a également été évaluée chez l'espèce cible, à savoir le porcelet. 15 porcelets pesant environ 25 kg ont été séparés en trois groupes. Le groupe vCP55 et le groupe de virus parental CP ont reçu chacun deux inoculations (2 ml égalant 2 x 108 TCID50) aux jours 0 et 28 par la voie intramusculaire. 5 porcelets ont été laissés comme animaux de contrôle non vaccinés. On a administré à tous les porcelets la souche NIA3 pathogène de PRV par voie intra-nasale au jour 35. On a surveillé l'efficacité en comparant l'évolution du poids des cochons vaccinés au vCP55 et de contrôle pendant les 7 jours qui ont suivi l'attaque. L'évolution en poids est calculée en tant que valeur Delta GMQR (en kilogrammes) - moyenne GMQR % des porcelets vaccinés - moyenne GMQR % des porcelets non vaccinés.

Dans le groupe non vacciné, tous les porcelets ont succombé à l'attaque par le virus PRV (deux le jour 5, deux le jour 6 et un le jour 7 ) . Dans le groupe inoculé par le virus de souche sauvage (CP), quatre des cinq porcelets ont succombé à l'attaque (trois au jour 6, un au jour 7). Tous les porcelets dans le groupe vacciné par vCP55 ont survécu à l'attaque par PRV et ont prospéré.

On a observé des niveaux significatifs de protection chez les porcelets inoculés au moyen de vCP55 exprimant la glycoprotéine de PRVgpïI contre l'attaque par PRV vivant (Tableau 11). Les animaux vaccinés par vCP55 ont montré un gain en poids net et significatif pendant toute la période expérimentale, alors que les deux groupes de contrôle ont manifesté une perte de poids significative pendant la période qui a suivi l'attaque par PRV. En outre, on n'a observé aucune mort dans le groupe vacciné par vCP55, alors que l'on a noté une mortalité de 80 % à 100 % dans les groupes de contrôle après l'attaque par PRV vivant.

Tableau 11

Protection des porcelets vaccinés fpar vCP55^ contre lfattaque oar PRV, comme déterminée par la mortalité et le gain en poids -

Traitement Mortalité Gain en poids

Non vaccinés 5/5 -2,12

Souche sauvage (CP) 4/5 +0,61

Recombinant (vCP55) 0/5 +2,51

Exemple 12 - Recombinants de la vaccine exprimant les glycoprotéines PRV σΐ

La souche de Copenhague du virus de la vaccine et les recombinants gui en dérivent ont été utilisés dans cet exemple.

Clonage du gène de PRVoI dans les plasmides donneurs du pox du canari et du virus de la vaccine En se référant maintenant à la Figure 28, un plasmide pGPI, contenant le gène pRVgl (souche NIA3) a été obtenu de Rhône-Mérieux, Lyon, France. Le gène gl [référence de la séquence (80)] a été isolé de ce plasmide et cloné en aval du promoteur H6 synthétique de la vaccine (69). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Xhol-Ncol (partiel) de 2330 bp de pGPI dans le fragment Xhol-Ncol de 6400 bp de pGBC2. (pGBC2 a été obtenu en clonant le gène de HSV2 gb dans le fragment BolII de 3200 bp de pRW764.5, qui à son tour a été construit par clonage d'un fragment PvuII de 0,8 kb de l'ADN du pox du canari dans le fragment PyuII de 2350 bp de pUC18). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPG12.

Le codon d'initiation ou d'amorçage du promoteur H5 a été alors aligné avec le codon d'amorçage du gène de gl. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides PRVL5 51- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTC-31 et PRVL6 51 - CTGCGCGGCGCGCAGCAGAAAGGGCCGCATTACGATACAAACTTÀACGGAT-3 1 dans le fragment ScoRV-AlwNI (partiel) de 5900 bp de pPGI2.

Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPGI3.

On a ensuite éliminé les séquences étrangères PRV gl 3'-non codantes. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucleotides, FRVL3 5’-CTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGA

ATGGGCCCAACTAÏé£C£7S:-ACCGCCAGCCGCCTGTTGAATGCCCGCCC0GCTTAACTGC

AGAATTCGGATCCG/A(rCT—2*. and PRVL4 yt — CGGATCCGAATTCTGCAgTEAAGCGGGGC

GGGCATTCAACAGGCGGCTî?GCCH?T GGÄGC AT Α£ΤΓ GC CCACT7CC &C-TT TCTCCGGATCGCGA'A'CC AG A CG 1-3' dans le fragment Sacl-Aatll (partiel) de 5200 bp de pPGI3. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPGI6.

Le gène de gl promu par H6 a été ensuite cloné dans le plasmide donneur du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment NruI-BamHI de 1750 bp de pPGI6 dans le fragment NruI-BamHI de 5000 bp de pBP14. (pBP14 contient le gène gag du virus de la leucémie bovine sous le contrôle du promoteur H6 synthétique de la vaccine dans le plasmide vecteur de la vaccine pSF494VC, ce dernier étant un sous-clone du fragment A par HindiII du virus de la vaccine de Copenhague, dans lequel la séquence de codage du gène de la vaccine contenant une homologie avec le gène ATI du cowpox (pox de la vache) (210) est remplacé par une région de polyliaison ou polyjonction). Ceci place le gène de gl promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine (de Copenhague) qui flanquent le gène ATI. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPG17.

On a engendré le virus recombinant de la vaccine, vP717, en transfectant bpG17 dans des cellules infectées par vP410.

Construction de vP717

Le gène gl de PRV a été cloné dans un vecteur de virus de la vaccine. La statégie utilisée pour.construire ce virus recombinant de la vaccine, vP717, est montré sur la Figure 28. Le gène de PRVgl contenu dans vP717 est cloné entre les séquences du virus de la vaccine qui flanquent le gène ATI et utilise le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41, 42, 69).

Immuno-fluorescence du polypeptide codé par PRV sur les cellules infectées par vP717

Dans des cellules infectées par PRV, gl est exprimé sur la membrane du plasma. Des analyses par immuno-fluorescence de cellules infectées par vP717 avec un anticorps monoclonal spécifique du PRV gl, à savoir 42M17, indiquent que le polypeptide codé par PRV produit dans ces cellules est également exprimé sur la membrane de plasma.

Evaluation de vP717 chez les souris L'évaluation in vivo de vP717 chez les souris a indiqué une certaine protection contre l'attaque par PRV (Tableau 12) en utilisant les procédures standard.

Tableau 12

Evaluation du virus recombinant de la vaccine vP717 exprimant PRV ctpI chez les souris

Dose d'inoculation de vP717 Survivance contre 1οσ»η TCID™_ l'attaoue par PRV

7.3 4/10 5.,3 5/10 3.3 0/10 1.3 2/10

Exemple 13 - EXPRESSION DES GLYCOPROTEINES DU VIRUS DS L'HERPES SIMPLEX. A SAVOIR ctB, ctC ET ctD, DANS LES RECOMBINANTS DU VIRUS DE LA VACCINE, SOIT INDIVIDUELLEMENT, SOIT EN COMBINAISONS

Le HSV2 (souche G) (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) (ATCC n°VR734) utilisé dans cet exemple a été développé sur des cellules de VERO (ATCC n°CCL31) et purifié par centrifugation sur un gradient de sucrose (197).

Clonage du cène HSV2 σΒ dans des plasmides donneurs du virus de la vaccine

La séquence de nucléotides du gène HSV2 gB a été précédemment publié (116). En se référant maintenant à la Figure 29, un fragment BctIII de 12 kb contenant le gène HSV2 gb a été isolé à partir de 1'ADN génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site BamHI de pUC19 en engendrant le plasmide pJ4.

Le gène gB a été ensuite cloné entre les bras de flancs du virus de la vaccine (de Copenhage). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Sstll-Sacl (partiel) ce 2700 bp de pJ4 dans le fragment Sstll-Sacl de pMP409DVC3 (pMP409-DVC3 est un dérivé de pMP409DVC (184) (Figure 4) dans lequel le site Belli est remplacé par une région de polyliaison). Ceci place le gène gB entre les séquences de la vaccine qui flanquent le gène de M2L. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGBl.

Un codon de terminaison dans le cadre a été ensuite ajouté à l'extrémité 3' du gène gB. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides GBL3 5 ' -CTAATAG-3 ' et GBL4 5'-GATCCTATTAGAGCT-3' dans le fragment BamHI-SacI (partiel) de 6300 bp de pGBl. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pGB2.

Le promoteur H6 a été ensuite cloné en amont du gène de gB. Ceci a été réalisé en clonant le fragment Belli de 370 bp de pBLVH14, contenant le promoteur H6, dans· le site Belli de pGB2 (pBLVH14 contient le gène de l'enveloppe du virus de la leucémie bovine promu par H6 dans le locus de suppression HA de la vaccine). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGB3.

Le codon d'initiation ou amorçage du promoteur H5 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène ç3. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucélotides GBL1 5'- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGCGGGGGGGGCTTGATTTGCGCGCTGGTCGTGGGG GCGCTGGTGGCCGC-3 * zb GBL2 5·-GGCCACCAGCGCCCCCACGACCAGCGCGCAAATCA AGCCCCCCCCGCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3· dans le fragment SstlI-EcoRV (partiel) de 6300 bp de pGB3. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pG35. Dans le plasmide pGB5, le gène HSV gB est sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine inséré au locus de suppression M2L de la vaccine. Etant donné que le locus d'insertion M2L esc situé dans une plus grande région du génome qui peut être supprimé, le gène gB promu par H6 a été cloné dans un site d'insertion différent dans un plasmide donneur différent du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment ΒσΙΙΙ-BamHI de 2800 bp de pGB5 au site BolII de pSD513VCVQ. (pSD513VCVQ est un sous-clone du fragment J par HindiII du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage pour le gène de thymidine kinase (TK) a été remplacé par une région de polyliaison). Ceci place le gène gB promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine qui flanquent le gène TK. Le plasmide produit par cette manipulation est appelé pGB6.

Clonage du cène de HSV2 qC dans des plasmides donneurs du virus de la vaccine

La séquence de nucléotides du gène HSV2 gC a été déterminée précédemment (117). En se référant maintenant à la Figure 30, un fragment Sali de 2900 bp contenant le gène HSV2 gC a été isolé à partir de l'ADN génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site Sali de pIBI25 en engendrant le plasmide pGC3 .

Le gène gC a été ensuite cloné entre les bras de flancs du virus de la vaccine (de Copenhague)Ceci a été réalisé en clonant le fragment XhoI-BamHI de 2900 bp de pGC3 au site XhoII-BamHI de pGC2. pGC2 a été produit- en clonant le fragment Belli de 370 bp de pBLVH14, contenant* le promoteur H6 du virus de la vaccine, dans le site Belli de pSD486VC. Ce dernier est un sous-clone du fragment B par HindlII du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage du gène μ est remplacé par une région de polyliaison. Ceci place le gène gC entre la séquence du virus de la vaccine qui flanque le gène μ. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGC5.

Le codon d'initiation du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gC. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides GCL1 51- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCCTTGGACGGGTGGGCCTAGCCGTGGGCCTGTG-31 and GCL2 51- AGGCCCACGGCTAGGCCCACCCGTCCAAGGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3 · .

dans le fragment Nrul-Sfil de 5400 bp de pGC5. Le plasmide produit par cette manipulation est appelé pGClO.

La séquence étrangère 3'-non codante a été ensuite éliminée de pGCIO. Ceci a été réalisé en recircularisant le fragment Sall-Smal (partiel) de 4900 bp, traité par la Ξ,. Coli ADN polymérisase (fragment de Klenow), de pGCIO. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGCll.

Une séquence supplémentaire 3'-non codante a été ensuite éliminé de pGCll. Ceci a été réalisé en clonant l'oligonucléotide GCL3 5'-CTAGGGCC-3' dans le fragment Xbal-Aoal (partiel) de 4900 bp de pGCll. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pGC12. Dans' ce plasmide pGC12, le gène HSV gC est sous le contrôle du*promoteur K6 inséré au locus d'insertion μ de la vaccine. Etant donné que le locus d'insertion μ est localisé à l'intérieur d'une région plus large du génome qui peut être supprimée, le gène gC promu par H6 a été cloné dans le site d'insertion ATI dans le plasmide donneur du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment NruI-BamHI de 1550 bp de pGC12 dans le fragment NruI-BamHI de 5000 pb de pBP14. Ceci place le gène gC promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine (de Copenhague) qui flanquent le gène ATI. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGC13.

Clonage du oène HSV2 oD dans les plasmides donneurs du virus de la vaccine

La séquence de nucléotides pour le gène HSV2 çD a été déterminée précédemment (118). En se référant maintenant à la Figure 31, un fragment Xbal de 7,5 kb contenant le gène HSV2 gD a été isolé de l'ADN génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site Xbal de pIBI25 en engendrant le plasmide pGDl.

On a ensuite cloné le gène gD en aval du promoteur HS et entre les bras qui flanquent le virus de la vaccine (ce Copenhague). Ceci a été accompli en clonant le fragment Dral-Pstl de 1500 bp de pGDl dans le site Smal-PstI de pTP15 (184) (Figure 3). Ceci place le gène gD en aval du promoteur H5 et entre les séquences de virus de la vaccine qui flanquent le gène HA. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD2.

Le codon d'initiation ou amorçage du promoteur Ho a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène çD. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides, GDL1 5'- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGGCGTTTGACCTCCGG-31 Jtt GDL2 5f-CGCCGGAGGTCAAACGCCCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3*, dans le fragment EcoRV-AhalI (partiel) de 5100 bp de pGD2. La plasmide engendré par cette manipulation est -appelé pGD5.

On a ensuite éliminé la séquence étrangère 3'-non codante. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides GDL3 5'- GGCAGTACCCTGGCGGCGCTGGTCATCGGCGGTATTGCGTTTTGGGTACGCCGCCGGCGC TCAGTGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCCCCCTCG CACCAGCCATTGTTTTACTAGCTGCA-31 aé GDL4 51-GCTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAGGGGGGCGCGTCGTCATCCCGGATGTGGGGGAGAC GTAGGCGCTTGGGGGCCACTGAGCGCCGGCGGCGTACCCAAAACGCAATACCGCCGATGA CCAGCGCCGCCAGGGTACTGCC-3 · .

dans Ie fragment Nael-PstI de 4800 bp de pGD5. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD7.

On a ensuite ajouté une séquence additionnelle 5' au promoteur H6. Ceci a été réalisé en clonant le fragment ΒσΙΙΙ-EcoRV de 150 bp de pGBG (Figure 30) dans le fragment ΒσΙΙΙ-EcoRV de 4800 bp de pGD7. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD8.

Construction de virus recombinants de la vaccine

La statégie utilisée pour cloner les gènes HSV2 g3, gC et gD dans le virus de la vaccine est illustrée sur les Figures 29, 30 et 31, respectivement. Toutes les constructions utilisent le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41, 42, 184). Chaque gène HSV2 est cependant cloné dans un site différent dans le génome du virus de la vaccine. Le gène gB promu par H6 est cloné entre la séquence flanquant le gène M2L (vP569) ou la séquence flanquant le gène TK (vP734, vP775 et vP776). Le gène gC promu par Ko est cloné entre la séquence qui flanque le gène μ (vP579) ou la séquence flanquant le gène ATI (vP748, vP775 et vp777). Le gène gD promu par H6 est cloné entre la séquence qui flanque le gène HA (vP570, vP761, vP775 et vP777). Le virus recombinant de la vaccine vP569 a été engendré en trans fectant pG35 dans des cellules infectées par vP458. vP734 a été produit en transfectant pGB6 dans des cellules infectées par vP618. vP579 a été produit en transfectant pGCll dans des cellules infectées par vP533. vP748 a été produit en transfectant pGC13 dans des cellules infectées par VP618.' vP570 a été produit en transfectant pGD5 dans des cellules infectées par vP425. vP7 61 a été produit en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP6l8.

VP425 est un variant du virus de la vaccine sauvage (de Copenhague) dont on a supprimé le gène TK et dont le gène HA a été remplacé par la béta-galactosidase (Exemple 1) (184). vP458 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont on a supprimé le gène TK et dont le gène M2L a été remplacé par la béta-galactosidase (Exemple 2). vP533 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont le gène TK a été supprimé et dont le gène μ a été remplacé par la béta-galactosidase. vP618 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont les gènes TK, μ et ATI ont été supprimés.

Le virus recombinant de la vaccine contenant deux gènes de glycoprotéines KSV2 a été également construit. v?755 contient les gènes çB et gD, vp776 contient les gènes gB et gC et vP777 contient les gènes gC et gD. vP775 a été produit en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP734. vP776 a été engendré en transfectant pGC13 dans des cellules infectées par vP734. vP777 a été engendré en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP748.

Un virus recombinant de la vaccine contenant trois gènes de glycoprotéines HSV2 a été également construit. v?812 contient les gènes gB, gC et gD de HSV2. vP812 a été engendré en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par ν?77β.

Immuno-fluorescence des glycoprotéines de HSV2 dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine

Dans des cellules infectées par HSV2, on a exprimé gB, gC et gD (aussi bien que d'autres glycoprotéines codées par HSV2) sur la membrane du plama. Des études d'immunofluorescence réalisées sur des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant des gènes de HSV2 indiquent que les polypeptides de HSV2 produits dans les cellules infectées par ces virus recombinants' de la vaccine sont également exprimés sur la membrane du plama.

immuno-précipitation des glycoprotéines de HSV2 dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine

La glycoprotéine HSV2 gB produite dans des cellules infectées par HSV2 présente un poids moléculaire d'environ 117 kDa (198, 199). Des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant le gène de HSV2 çB (vP569, vP734, vP775 et vP776) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 117 kDa. L'immuno-précipitation de cellules infectées par vP569 avec des anti-sérums vis-à-vis de virus HSV2 entier précipite deux protéines principales ou majeures avec des poids moléculaires d'environ 117 kDa et 110 kDa et trois protéines mineures avec des poids moléculaires de 50 kDa, 45 kDa et 30kDa. L'immuno-précipitation de cellules infectées par vP734, vP775 et vP776 précipite deux protéines majeures avec des poids moléculaires d'environ 110 kDa et 90 kDa et cinq protéines mineures avec des poids moléculaires d'environ 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa et 30 kDa.

La glycoprotéine KSV2 gC produite dans les cellules infectées par HSV2 a un poids moléculaire d'environ 63 kDa (199, 200). Les cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant le gène HSV2 gC (vP579, vP748, vP77 6 et vP777 ) „produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 63 kDa. L'immunoprécipitation de cellules infectées par vP579, vP748, v?776 et vP777 au moyen d'anti-sérums au virus HSV2 entier précipite une protéine majeure avec un poids moléculaire d'environ 65 kDa et une protéine mineure avec un poids moléculaire d'environ 85 kDa. Les anti-sérums de lapin contre le virus HSV2 entier ont été obtenus de la DAKO Corporation (Santa Barbara, CA ; code n° 3116) et utilisés à une dilution de 1:100.

La glycoprotéine HSV2 gD produite dans' les cellules infectées par HSV2 ont un poids moléculaire d'environ 51 kDa (198, 199). Des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant HSV2 gD (vP570, vP761, vP775 et vP777) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 51 kDa. L'immuno-précipitâtion des cellules infectées par vP570, vP761, vP775 et vP777 au moyen d'anti-sérums du virus HSV2 entier précipite une protéine majeure ayant un poids moléculaire d'environ 48 kDa et deux protéines mineures avec des poids moléculaires d'environ 40 kDa et 31 kDA.

Evaluation in vivo

Tous les virus recombinants de la vaccine exprimant les différentes constructions des glycoprotéines de HSV2 protègent des souris immunisées contre l'attaque ultérieure de HSV mortel dans des expériences analogues à celles décrites par Paoletti et al. (26).

Exemple 14 - EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE al DU VIRUS 1 DE L'HERPES BOVIN DANS DES RECOMBINANTS DU VIRUS DE LA VACCINE

Clonaae du cène BHV1 σI dans des plasmides donneurs du virus de la vaccine

La séquence de nucléotides du gène BHV1 gl a été publiée antérieurement (63). En se référant maintenant à la Figure 32, un plasmide pIERSG contenant le gène BHV1 gl (souche de Straub) a été obtenu de Rhône Mérieux, Lyon, France. L'extrémité 5' du gène gl a été clonée en aval du promoteur H6 (41, 42, 69) et entre les bras qui flanquent le virus de la vaccine (de Copenhague). Ceci a été réalisé en clonant le fragment SalI-PstI de 540 bp de pI3RS6 dans un fragment SalI-PstI de 4400 bp de pGD5 [pGD5 a été engendré en clonant le gène HSV2 gD dans pTP15 (184) (Figure 3)]. Ceci place le gène gl en aval du promoteur H6 et entre les bras qui flanquent le virus HA de la vaccine. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR2.

Le codon d'initiation du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gl. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides, IBRL1 51- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTGAACGCGCCGC-3 IBRL2 5’- GGCGCGTTCAGCACCGCCGCGAGCGGCCATTACGATACAAACTTÀACGGAT-3 · , dans le fragment Nrul-Sstll de 3800 bp de pI3R2. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pIBR4.

Un site Ncol, nécessaire pour des manipulations futures, a été engendré. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides IBRL3 5'-CCATGGTTTAATGCA-3' et IBRL4 5'-TTAAACCATGGTGCA-3 ' dans le site PstI de pIBR4. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR5.

L'extrémité 3' du gène gl a été ensuite clonée dans pIBR5. Ceci a été réalisé en clonant le fragment Tthllll-Ncol de 1740 bp de pIBRS6 dans le fragment Tthllll-Ncol de 3700 bp de pIBR5. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR7.

Un site Belli, nécessaire pour de futures manipulations, a été ensuite engendré. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides IBRL5 5'-CATGGTTTAAGATCTC-3' et IBRL6 5 ' -CATGGAGATCTTAAAC-3 ' dans le site Ncol de pIBR7. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR8.

Une portion de la séquence leader hydrophile de grande longueur du gène gl a été ensuite supprimée (63). Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides, IBRL7 5'-

ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCGCTAGCCGCTGCCCTGCTATGGGCGÄCGTGG

GCC-3 1 ^ IBRL8 5 '- CACGTCGCCCATAGCAGGGCAGCGGCTAGCGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT- 3', dans le fragment Nrul-Aoal (partiel) de 4400 bp de pIBR8. Ceci a élimine 132 bp de la séquence de tête hydrophile. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR9.

Le gène gl tronqué promu par K6 a été ensuite cloné dans un plasmide donneur différent du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment NruI-ΒαΙΙΙ de 1700 bp de pIBR9 dans le fragment NruI-BamHI de 4900 bp de p5?14 (211). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBRlO.

Construction de virus recombinant de la vaccine

La statégie utilisée pour cloner le gène BHV1 gl dans le virus de la vaccine est illustrée sur la Figure 32. Le virus recombinant de la vaccine vP637 a été engendré en transfectant pIBR7 dans des cellules infectées par vP410. vP724 a été engendré en transfectant pIBRlO dans des cellules infectées par vP410. vP637 contient la totalité du gène BHVl gl. vP724 contient un gène gl dont on a supprimé 132 bp de la séquence de signal 5' (63). Les deux constructions utilisent le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41, 42, 184). Le gène gl dans v?637 est cloné entre les séquences qui flanquent le gène HA. Le gène gl dans vP724 est cicr.é entre les séquences qui flanquent le gène ATI.

Immuno-fluorescence et détection d'un polypeptide codé par BHVl dans des cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine

Dans des cellules infectées par BHVl, gl est exprimé sur la membrane du plasma. Des études d'immuno-fluorescence de cellules infectées par vP637 ou vP724 indiquent que le polypeptide codé par BHVl produit dans ces cellules est également exprimé sur la membrane du plasma. L'immunofluorescence a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1. Les anticorps monoclonaux de BHVl spécifiques à gl, à savoir 4203 et 5106, ont été utilisés (210).

Exemple 15 - EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE σΒ DU VIRUS DE L'HERPES FELIN DANS UN VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE

La souche WR du virus de la vaccine (202) a été utilisée dans cet exemple. Le virus vP293 de la vaccine recombinante dérivé de la souche de WR a été utilisé comme virus de sauvetage (69).

Extraction de l'ADN de FHV-1 et clonage du fragment:

Sacl-Sacl de 3.2 kb de FHV-1

On a extrait et purifié l'ADN de FHV-1 à partir de la souche C 0. Le génome de l'ADN de FHV-1 a été digéré par EcoRI et lié au plasmide pBR322 en utilisant les procédures classiques (20). On a trié cette banque de FHV-1 au moyen de sondes d'ADN dérivées des gènes de PRVglI (62) et de BHV-1 ç3 (203). Des hybridations subséquentes, au moyen de sous-clones dérivés des deux clones EcoRI trouvés positifs par hybridation, ont permis d'établir une carte plus précise du gène FHV-1 gB. Un fragment Sacl-Sacl de 3,2 kb contenant le gène FHV-1 gB a été cloné dans pUC18, ce qui a engendré le plasmide pFKVgBC.

Sécuencaae du fragment de Sacl-Sacl codant FHV-1 σ3

Les données de la séquence de nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de pFHVgBC et de sous-clones dérivés de pFHVgBC en utilisant une séquenase T7 modifiée comme décrit ci-dessus.

Clonaoe du gène de FHV-1 gB dans un plasmide donneur du virus de la vaccine

En se référant maintenant à la Figure 33, le gène de FHV-1 gB a été cloné en pHES4, un des plasmides conçus pour le système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte dans la souche WR du virus de la vaccine (69) (Figure 10). Ce plasmide porte le gène K1L du domaine de l'hôte, qui permet au mutant de suppression vP293 de se répliquer sur des cellules humaines. Le gène FHV-1 gB a été inséré immédiatement en aval du promoteur H6 synthétique de la vaccine (69). Le plasmide pFHVgBC a été digéré par Konl et Sacl et le fragment de restriction de 3150 bp contenant FHV-1 g3 a été isolé à partir d'un gel d'agarose, puis lié dans le plasmide pHES4 préalablement digéré par Konl et Sacl; Le plasmide résultant a été appelé pJCAOOl (Figure 33).

Analyse de la séquence d'ADN du cène de FHV-1 σΒ

En se référant maintenant à la Figure 34, l'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert s'étendant des positions de nucléotide 337 à 3177. Des signaux putatifs de régulation transcriptionnelle ont été trouvés dans la région depuis 5' jusqu'au codon d'initiation ATG en position 337. Une boîte TATA ayant la séquence AAATATAT (nucléotides 184 à 191) a été localisée 80 nucléotides en aval d'une boîte putative CAT ayant la séquence GGTGAGTA. Un signal de polyadénylation AATAAA (nucléotides 3251 à 3256) a été localisé 50 nucléotides en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 3178 à 3180). Huit parmi les onze nucléotides de la séquence 5' TCATTCTAGCA 3' (nucléotides 200 à 210) sont complémentaires de la séquence d'ARN ribosomal 18S, 3' AGGAAGGCGT 5' (61), et peuvent servir comme site de fixation pour le ribosome. Un modèle de balayage a été proposé par lequel mARN eukaryotique amorce la traduction (151, 155). Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé ATCATGT (nucléotides 334 à 340) qualifie celui-ci comme contexte de séquence fonctionnelle pour l'initiation de la traduction du mARN eukaryotique. Le cadre de lecture ouvert de FHV-1 gB code 947 acides aminés avec un poids moléculaire de 106,2 kDa. La teneur en G + C est de 45,8 %.

Analyse de la structure de la protéine FHV-1 c3 L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 23 à 73 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour être la séquence de signal (Figure 34). En se référant maintenant à la Figure 35, on constate qu'il y a une séquence hydrophile longue de 22 acides aminés qui précède la séquence de signal hydrophobe de grande longueur. Cette caractéristique a également été notée pour le gène gll de la pseudo-rage (PRV) (62), pour le gène gl du virus 1 de l'herpès bovin-1 (BHV-1), pour le virus de l'herpès chevalin-1 (EHV-1) (71), et les gènes gp 14 du virus de l'herpès chevalin-4 (EHV-4) (72), tous étant également des homologues de HSV gB. Une région hydrophobe constituée par 42 acides aminés (acides aminés 789 à 831) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Le domaine cytoplasmique hydrophile contient 116 acides aminés. Il existe dix sites Asn-X-Thr/Ser (où X peut être tout acide aminé sauf la proline) pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote (64), un site étant localisé dans la séquence de signal. Il y a deux sites de coupure protéolytiques potentiels consécutifs et voisins (Arg-Arg-Ser) (positions 504 à 506 et 516 à 518) identiques à ceux présents dans PRVglI (94), VZV gplï et HCMV çB (71) et EKV-1 gpl4 (71, 72). Le profil d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de FHV-1 gB est illustré sur la Figure 35.

Comparaison de la séquence d'acides aminés de FHV-1 aB avec les glycoprotéines d'autres cellules du virus de l'herpès

La comparaison de la composition en acides aminés du gène de FHV-1 gB a révélé une homologie étendue avec les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Airisi, FHV-1 gB est homologue à PRVglI (62), BHV-1 gl (63), gll du virus de la varicelle zoster (VZV) (66, 204), HSV-1 gB (67), HSV-2 gB (205), EHV-1 gpl4 (71), aussi bien qu'avec les glycoprotéines du virus d'Epstein-3arr (EBV) (68, 206) et du cytomégalovirus humain (HCMV) (10).

Construction du recombinant de la vaccine vP713 exprimant la glycoprotéine de FHV-1 σΒ Les séquences codant FHV-1 gB ont été insérées dans un vecteur du virus de la vaccine utilisant le système de sélection du domaine de réplicabilité chez l'hôte du virus de la vaccine WR, à savoir pHES4/vP293 (69). La capacité de la descendance de la vaccine recombinante engendrée par recombinaison, en utilisant le système de sélection du domaine de réplicabilité chez l'hôte vP293/pHES du virus de la vaccine WR, pour former des plaques sur des cellules MRC-5 humaines permet une identification rapide de ces recombinants (69). Le virus recombinant de la vaccine vP713 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide pJCAOOl comme plasmide donneur et vP293 comme virus de sauvetage (Figure 33) .

Immuno-fluorescence de la glycoprotéine FHV-1 c3 synthétisée par vP713 L'immuno-fluorescence de cellules de VERO et HRC-5 infectées par le virus recombinant de la vaccine vP713 a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant du sérum de brebis spécifique anti-FHV-1 gB, sérum n°2854. On a utilisé plusieurs infections de deux pfu par cellule. On a utilisé comme second anticorps IgG de mulet anti-ovins, FITC.

FHV-1 gB est détectable sur la surface des cellules de VERO infectées au moyen de la vaccine recombinante vP713, aussi bien gu'intérieurement après fixation par l'acétone. Aucune immuno-réactivité, interne ou de surface, significative vis-à-vis de FHV-1 gB n'a été constatée dans les cellules de contrôle infectées par vP410.

Immuno-orécioitation de glycoprotéine FHV-1 c3 synthétisée par vP713

En vue d'établir la glycoprotéine de FHV-1 gB exprimée par vP713, des cellules de VERO ont été infectées par vP713 et les protéines ont été marquées métaboliquement par la 35S méthionine. On a réalisé des immuno-précipitations au moyen de lysats de cellules marquées radio-activement en utilisant un sérum ovin n°2854 spécifiquement anti-FHV-1 gB.

Des monocouches de cellules de VERO, ensemencées au taux de 2 x 106, par boîtes de 60 mm, ont été infectées, à une faible multiplicité d'infection de 0,1 pfu par cellule, avec le virus de contrôle (vP4lO) ou le virus recombinant de la vaccine vP713. Des immuno-précipitations ont été réalisées comme décrit dans l'Exemple 1.

Aucun produit significatif n'a été immuno-précipité par le sérum spécifique anti-FHV-1 gB soit chez les cellules de VERO non infectées, soit chez les cellules de VERO infectées avec le virus de la vaccine de contrôle vP410. Les produits marqués radio-activement de FHV-1 gB ont été précipités par le sérum n°2854 à partir de cellules de VERO infectées par vP713. Cinq polypeptides dominants, métaboli-quement marqués, ont été spécifiquement précipités. Les deux plus grands polypeptides, de poids moléculaire apparent de 115 kDa et 110 kDa, pourraient correspondre au précurseur non-glycosylaté et aux protéines matures (dimensions théoriques respectivement de 106 kDa et 98 kDa). Une large bande de 68 kDa pourrait représenter les deux sous-unités glycosylatés (69 kDa +66 kDa) résultant de la coupure protéolytique d'un précurseur glycosylaté (136 kDa) qui manquent ici. Trois produits précipités de plus faible dimension (59, 53 et 48 kDa) ne correspondent à aucun produit de FHV-1 gB et peuvent représenter des produits de dégradation.

Exemple 16 - CLONAGE ET EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE DU VIRUS D'EPSTEIN-3ARR DANS DES VECTEURS DS FOXVIRUS

Clonaae des cènes de EBV ctp340 et ctp220 dans un plasmide donneur de vaccine PMP409DVC Dans cet exemple, les gènes de EBV ont été isolés de la souche de B95-8 de EBV (207) ; les gènes gp340 et gp220 étaient des clones de cADN (plasmides pl£LPgp340 et pMLPgp220, respectivement) et les gènes de gB, gH et 3BRF3 ont été isolés à partir d'une banque de gènes BamHI. En se référant maintenant à la Figure 36, un fragment Xmal-Clal de 2100 bp du plasmide pMLPgp220 a été cloné dans M13mpl8 digéré par Xmal-ÀccT. Le phage obtenu par cette manipulation a été appelé mpl8gp220 (Figure 36). Par mutagénèse in vitro (17) en utilisant les oligonucléotides CM4 (TAAAGTCAATAAATTTTTATTGCGGCCGCTACCGAGCTCGAATTCG) et CN5 (GCTTGCATGCCTGCAGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGCAGCCTTGC) le gène gp220 a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide contenant le gène gp220 modifié a été appelé mpl8gp220 (5+4) (Figure 36) .

Le gène gp220 modifié a été cloné dans le plasmide SP131NotI qui contient la totalité du promoteur synthétique H6 (69). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Narl-EccRV de 2300 bp de mpl8gp220 (5+4) dans le fragment EcoRI-Narl de 2940 bp du plasmide S?131NotI. Le plasmide résultant a été appelé SP131gp220 (Figure 36).

Le gène gp340 sous le contrôle du promoteur Ko a été obtenu en clonant un fragment Scal-Xhol de 2360 bp de pMLPgp340 dans le plasmide SP131gp220 digéré par Xhol-Scal (partiel). Le plasmide résultant a été appelé SP131çp340 (Figure 36).

Les gènes gp340 et gp220 promus par H6 ont été clonés dans le locus d'insertion I42L du virus de la vaccine du plasmide pMP409DVC (Figure 4 ; sur les Figures 36 et 40, ce plasmide est appelé KP409). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Notl du plasmide SP131gp340, fragment traité par la nucléase de fève de Mung et ayant 2800 bp, et le fragment Notl du plasmide SP131gp220, fragment traité par la nucléase de fève de Mung et ayant 2100 bp, dans le plasmide pMP402DVC au site Belli traité par la nucléase de fève de Mung. Les plasmides résultants ont été appelés 409H6340 et 409H5220, respectivement (Figure 36).

Clonaoe du cène de 5BV ctB dans le plasmide donneur

du virus de la vaccine PMP4Q9DVC

En se référant maintenant à la Figure 37, un fragment EcoRI-Xmnl de 3500 bp du fragment A d'ADN par 3amHI, contenant le gène EBV g3, a été isolé à partir de la librairie génomique de EBV et cloné dans le fragment HincII-ScoRI de 2837 bp de pIBI25. Le plasmide résultant a été appelé p25gB (Figure 37).

Par mutagénèse in vitro (17, 185) en utilisant les nucléotides EBVBM5 (CCCTACGCCGAGTCATTACGATACAAACTTAACGGATATCAGAGTCGTACGTAGG) té EBVBM3 (CTGGAAACACTTGGGAATTCAAGCTTCATAAAAAGGGTTATAGAAGAGTCC), le gène gB a été adapté pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide résultant a été appelé p25gB (5+3).

Le fragment EcoRV-EcoRI de 2600 bp de p25gB (5+3) a été cloné dans le fragment EcoRV-EcoRI de 3300 bp de SP131. Le plasmide résultant a été appelé SP131gB (Figure 37).

Le gène gB du promoteur H6 a été ensuite cloné dans le plasmide donneur pMP409DVC du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment HindiII de 2700 bp traité par la nucléase de fève de Mung, dans le site Belli traité par la nucléase de fève de Mung, de pMP409DVC. Le plasmide résultant a été appelé 409H6gB (Figure 37).

Clonage du cène EBV oH dans le plasmide donneur de

vaccine PSD48SVC

Dans la librairie des fragments de restriction clonés de EBV BamHI, le cadre de lecture ouvert de BXLF2 esc contenu dans les fragments BamHI X et BamHI T (207). Comme montré sur la Figure 38, le cadre de lecture ouvert complet de BXLF2 a été reconstitué en clonant le fragment Smal-BamHI de 830 bp de BamHI X dans, le fragment Smal-BamHI de 2880 bp de pIBI24 ; le plasmide résultant a été appelé 24gH5. Le fragment BamHI-HindlII de 1850 bp de BamHI T a été cloné dans le fragment BamHI-HindlII de 3360 bp de 24gH5. Le plasmide résultan't/ contenant le gène gH complet, a été appelé 24gH (Figure 38).

Par mutagénèse in vitro (17, 185) en utilisant les nucléotides HM5 (ACACAGAGCAACTGCAGATCTCCCGATTTCCCCTCT), KM4 (GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCTGCG) ié HM3 (GCCAGGGTTTTCCCAGAGATCTGATAAAAACGACGGCCAGTG) le gène gH a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur précoce hémorragique (μ) de la vaccine. L'oligonucléotide HM4 a été utilisé pour enlever un signal d'arrêt de transcription précoce de la vaccine contenu dans le gène gH (45). Le plasmide contenant le gène gH modifié a été appelé 24gH (5+4+3).

En se référant maintenant à la Figure 38, le promoteur μ de la vaccine est contenu dans le plasmide pSD486 VC (Figure 30). (Sur la Figure 38, ce plasmide est appelé SD486). Le fragment Belli de 2330 bp , traité par la nucléase de fève de Mung, de 24gH (5+4+3) a été cloné dans le fragment BalII traité par la nucléase de fève de Mung, de pSD486VC. La dernière phase de clonage a mis le gène gH sous le contrôle du promoteur μ de la vaccine. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 486gH (Figure 38).

Clonaae du cadre de lecture ouvert de BBRF3 dans le plasmide donneur du virus de la vaccine PCQPSC-5H Le cadre de lecture ouvert complet BBRF3 est contenu dans le fragment BamHI 3 de l'ADN de EBV. Ce fragment a été digéré par BsoHI, traité par la Ξ. Coli ADN polymérase I (fragment de Klenow) et digéré par BalII. Le site BalII dans le fragment BamHI A est disposé 10 bases avant le codon d'arrêt de BBRF3. Le fragment BsoHI-BalII de 1230 bp a été isolé et cloné dans le fragment Smal-BqlII de 4200 bp du plasmide PCOPCS-5H. [Le plasmide pCOPCS-5H est identique au plasmide pCOPCS657 (Figure 16)]. Le plasmide engendré par cette manipulation est désigné COPSCEBVX.

Clonaae des gènes EBV cro340, aB et aH dans le plasmide donneur du virus de la vaccine PSD513VCVO Le plasmide donneur de virus de la vaccine utilisé pour engendrer le triple recombinant EBV est le plasmide pSD513VCVQ (Figure 29). Ce plasmide contient un sous-clone du fragment HindiII J du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage pour le gène de thymidine kinase est remplacée par une région de polyliaison.

Dans cette première phase, le gène gH de E3V promu par μ, a été cloné dans pSD513VCVQ. En particulier, le fragment SmaBI-ΒσΙΙΙ de 2300 bp a été cloné dans.le fragment SmaBI-BqlII de 4000 bp de pSD513VCVQ. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 513UgH.

Ensuite, le gène EBV gp340 promu par H6 a été cloné dans 513gH. En particulier, le fragment Notl de 2800 bp, traité par la nucléase de fève de Mung, de SP131gp340 a été cloné dans le fragment XhoI-PstI de 6300 bp, traité par la nucléase de fève de Mung, de 5l3UgH. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 513UgH340H6.

Puis, le -gène gB de E3V promu par H6 a été cloné dans 513UgH340H6. En particulier le fragment HindiII de 2700 bp, traité par la nucléase de vève de Mung, de SP131çp340 a été cloné dans le fragment ΒσΐII de 9100 bp,, traité par la nucléase de fève de Mung, de 513UgH340H6. Le plasmide résultant a été appelé 513gHgBp340 (Figure 39).

Construction de virus recombinant de la vaccine EBV gp340 (plasmide donneur 409H634Û), E3V çp220 (plasmide donneur 409H6220) et EBV gB (plasmide donneur 409H6gB) ont été recombinés dans le virus de la vaccine v?458 (site M2L) : ces virus recombinants simples (single) de la •vaccine ont été appelés vP474, vP480 et vP561, respectivement. EBV gH (plasmide donneur 486gH) a été recombiné dans le virus de la vaccine vP533 (site d'insertion μ) : ce virus recombinant de la vaccine simple a été appelé vP611.

Finalement, le virus recombinant triple de la vaccine contenant gp340, gB et gH a été obtenu par recombinaison du plasmide donneur 513gHgBgp340 dans le virus de la vaccine vP617 au site d'insertion de thymidine kinase. Ce virus recombinant est appelé vP712. vP617 est un virus de la vaccine de Copenhague dont on a supprimé les gènes TK, HA et ATI.

Immuno-fluorescence des proteines d'EBV dans les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine

Des études d'immuno-fluorescence réalisées sur des cellules infectées par vP474 (gp340) et vP480 (gp220), en. utilisant l'anticorps monoclonal F29-89 (165), ont révélé des protéines de EBV gp340 et E3V gp220 exprimées sur la membrane du plasma.

Les cellules infectées par vP611 (gH), en utilisant un sérum humain, ont révélé un faible signal positif sur la membrane du plasma.

Finalement, la même expérience a été réalisée avec des cellules infectées par vP712 (triple recombinant de la vaccine EBV) î un signal positif sur la membrane du plasma a été obtenu avec les anticorps monoclonaux F29-89 et NEA 9247 (spécificité g3 obtenue de DuPont).

Immuno-précipitation des protéines EBV dans les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine

La glycoprotéine gp340 de EBV produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire d'approximativement 340 kDa (165). Les cellules infectées par les virus recombinants de la vaccine vP474 ou vP712 produisent également une protéine codée par EBV d'environ 340 kDa (immuno-précipitation réalisée avec l'anticorps monoclonal F29-89). La glycoprotéine gp220 de EBV a un poids moléculaire de 220 kDa (165). Les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP480 produisent une protéine codée par EBV d'approximativement 220 kDa.

La glycoprotéine gH de EBV produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire de 110 kDa à 125 kDa avec une forme de précurseur de 93 kDa (206, 208). Les cellules infectées avec les virus recombinants de la vaccine vP561 ou vP712 produisent une protéine principale d'EBV avec un poids moléculaire d'approximativement 125 kDa et quatre protéines mineures avec des poids moléculaires d'approximativement 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa et 45 kDa.

La glycoprotéine EBV gH produite dans l.es cellules infectées par EBV a un poids moléculaire de 85 kDa avec une forme de précurseur de 70 kDa (209). Les cellules infectées par le virus recombinant vP611 produisent une protéine codée par EBV d'approximativement 85 kDa.

Immunisation de lapins au moven de recombinants de la vaccine exprimant les clvcoprotéines de E3V Des lapins ont été immunisés au moyen de v?474 (gp340) ou vP480 (gp220) ou vP561 (gB) ou vP611 (gH) ou vP712 (triple). Après un rappel, les sérums ont été testés par immuno-fluorescence sur des cellules B95-8 traitées par TPA. Des signaux positifs ont été obtenus dans chaque cas. Une activité de neutralisation in vitro a été démontrée en utilisant des sérums dressés contre vP474 (gp340).

Exemple 17 - CLONAGE ST EXPRESSION DES ANTIGENES DE GLYCOPROTEINE DU CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN DANS DES VECTEURS DE POXVIRUS

Clonace du cène HCMV σ3 dans le plasmide donneur de la vaccine PMP409DVC

En se référant maintenant à la Figure 40, le fragment HindiII-3amHI de 4800 bp du fragmenT HindlII D de HCMV ADN a été cloné dans le fragment HindiII-BamHI de 2800 bp du plasmide pIBI24. Par mutaçénèse in vitro (17, 185) en utilisant les nucléotides CMVM5 (GCCTCATCGCTGCTGGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAATCCAGGATCTG) CHVM3 (GACAGATTGTGATTTTTATAAGCATCGTAAGCTGTCA), le gène HCMV gB a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide contenant le gène MCMV gB modifié a été appelé 24CMVgB (5+3) (Figure 40).

Ensuite, on a cloné le fragment EcoRV-BamHI de 2900 bp de 24CMVgB(5+3) dans le fragment EcoRV-ΒσΙΙΙ de 3100 bp du plasmide pSP131 qui contient le promoteur synthétique H5 (69). La phase de clonage a mis le gène HCMV gB sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide résultant a été appelé SP131gB.

Finalement, le gène HCMV gB promu par H6 a été cloné dans le plasmide donneur de la vaccine pMP409DVC. Le fragment HindiII de 3000 bp, traité par la nucléase de la fève ce Mung, de SP131gB a été cloné dans le site ΒσΙΙΙΙ traîné par la nucléase de fève de Hung, de pHP409DVC. Le plasmide résultant a été appelé 409CKVgB (Figure 40).

Construction du virus recombinant de la vaccine

Le gène CMV gB, promu par H6, dans le plasmide 409CHVgB a été inséré dans le site de M2L du virus de sauvetage vP458. Le virus recombinant de la vaccine a été appelé vP525.

Immuno-fluorescence de la protéine CMV aB dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine

Des études d'immuno-fluorescence sur des cellules infectées par vP525, en utilisant un anticorps monoclonal ou un sérum polyclonal de cobaye, a révélé HCHV g3 exprimé sur la membrane du plasma.

Immuno-précipitation de CMV crB dans des cellules infectées par un recombinant de la vaccine La glycoprotéine CMV gB produite dans des cellules infectées de CMV a un poids moléculaire de 55 kDa avec une forme de précurseur de 130 kDa (172). Des cellules infectées par vP525 produisent deux protéines codées par CMV g3 d'approximativement 130 kDa et 55 kDa.

Séquences de nucléotides de HXLF1 et KXLP2 La famille des gènes HXLF est localisée dans le fragment HindiII X de l'ADN génomique HCMV (172). En utilisant des promoteurs d'oligonucléotide spécifiques, la séquence de nucléotide de HXLF1 et HXLF2 a été déterminée (Figures 41, 42). HXLF1 est long de 648 nucléotides et code pour une protéine de 215 acides aminés. HXLF2 est long de 558 nucléotides et code pour une protéine de 185 acides aminés. Les séquences de nucléotides des mêmes gènes (souche 1D169-HCMV) ont été publiées (173) et des études de comparaison montrent une homologie à 99 % pour IiXLFl et une homologie de 96 % pour HXLF2.

Immunisation de cobayes avec recombinants de la vaccine exprimant des antigènes de HCMV Trois cobayes ont été immunisés par vP525. Après un rappel, les animaux ont développé des anticorps neutralisants de HCHV (titre moyen : 518). De manière intéressante, 50 à 87 % de l'activité neutralisante des sérums humains séropositifs HCMV peuvent être absorbés par des cellules infectées par vP525. Ce résultat indique l'importance potentielle de HCMV gB comme vaccin subunitaire.

Comme il va de soi, l'invention telle que revendiquée ci-après n'est pas limitée aux modes de réalisations décrits mais elle englobe toutes les variantes et modifications qui pourront apparaître à l'homme de l'art.

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Claims

1. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant d'un virus de l'herpès chevalin dans une région non essentielle du génome du poxvirus.

2. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin.

3. Poxvirus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus ce l'herpès chevalin est la glycoprotéine gp!3 du virus ce 1'herpès chevalin.

4. Poxvirus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce eue ladite glycoprotéine du virus de f l'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.

5. Poxvirus dite selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN code pour deux glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin.

6. Poxvirus recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que lescites glycoprotéines du virus ce l'herpès chevalin sont la glycoprotéine gpl3 et la glycoprotéine çpl4 du virus de l'herpès chevalin.

7. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé chez un hôte par la„ production d'une glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin.

8. Poxvirus recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus ce l'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin.

9. Poxvirus recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus ce l'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.

10. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé dans un hôte par la production de deux glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin.

11. Poxvirus recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que lesdites glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin sont la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin et la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.

12. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poxvirus esc un virus de la vaccine.

13. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.

14. Poxvirus recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe constitué par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.

15. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans ledit poxvirus par reccmbinaison.

16. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant du virus de l'herpès chevalin et un promoteur pour exprimer ledit .ADN.

17. Vaccin pour introduire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec ledit vaccin, caractérisé en ce que ledit vaccin comprend un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de l'ADN provenant du virus de l'herpès chevalin.

18. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime une glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin.

19. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin.

20. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.

21. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime deux glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin.

22. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin sont la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin et la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.

23. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que le poxvirus est un virus de la vaccine.

24. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.

25. Vaccin selon la revendication 24, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe ccnsi-tuté par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.

26. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans le poxvirus par recombinaison.

27. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome du poxvirus.

28. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce que ledit virus de l'herpès est un membre de la sous-famille des virus de l'herpès choisis dans le groupe constitué par 1 'alphaherpèsvirus, le betaherpèsvirus et le gammaherpèsvirus .

29. Poxvirus recombinant selon la revendication 28, caractérisé en ce que ledit virus de l'herpès est choisi dans le groupe constitué par le virus de l'herpès chevalin, le virus de la pseudo-rage, le virus de l'herpès simplex, le virus de l'herpès bovin, le virus de l'herpès félin, le virus d'Epstein-3arr et le cytomégalovirus humain.

30. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès.

31. Poxvirus recombinant selon la revendication 30, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès est choisie dans le groupe constitué par gpl3 du virus de l'herpès chevalin, gpl4 du virus de l'herpès chevalin, çD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gE du virus de l'herpès chevalin, çp50 du virus de la pseudo-rage, çpll du virus de la pseudc-raçe, gpIII du virus de la pseudo-rage, gpl du virus de la pseudorage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, çD du virus de l'herpès simplex, gl du virus de l'herpès bovin, çB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, çp340 du virus d'Epstein-Barr, çB du virus d'Epstein-Barr, çH du virus d'Epstein-Barr et ç3 du cytomégalovirus humain.

32. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN code pour au moins deux glycoprotéines du virus de l'herpès.

33. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé chez un hôte par la production d'une glycoprotéine du virus de l'herpès.

34. Poxvirus recombinant selon la revendication 33, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus ce l'herpès chevalin est choisie dans le groupe constitué par gpl3 du virus de l'herpès chevalin, gpl4 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, çp63 du virus ce l'herpès chevalin, gE du virus de l'herpès chevalin, gpSO du virus de la pseudo-rage, çplï du virus de la pseudo-rage, gpIII du virus de la pseudo-rage, gpl du virus de la pseudorage, gB du virus de l'herpès simplex, çC du virus de l'herpès simplex, gD du virus de l'herpès simplex, gl du virus de l'herpès bovin, ç3 du virus de l'herpès félin, çp220 du virus d'Epstein-Barr, çp340 du virus d'Epstein-Barr, ç3 du virus d'Epstein-Barr, gH du virus d'Epstein-Barr et ç3 du cytomégalovirus humain.

35. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé chez un hôte par la production d'au moins deux glycoprotéines du virus de l'herpès.

36. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que le poxvirus est un virus de la vaccine.

37. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.

38. Poxvirus recombinant selon la revendication 37, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe constitué par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.

39. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans ledit poxvirus par recombinaison.

40. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN du virus de l'herpès et un promoteur peur exprimer ledit ADN.

41. Vaccin pour introduire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec ledit vaccin, caractérisé en ce que ledit vaccin comprend un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de l'ADN provenant du virus de l'herpès.

42. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que le virus de l'herpès est un membre de la sous-famille du virus de -l'herpès choisi dans le groupe constitué par l'alphaherpèsvirus, le betaherpèsvirus et le gammaherpèsvi-rus.

43. Vaccin selon la revendication 42, caractérisé en ce que le virus de l'herpès est choisi dans le groupe consitué par le virus de l'herpès chevalin, le virus de la pseudo-rage, le virus de l'herpès simplex, le virus ce l'herpès bovin, le virus de l'herpès félin, le virus d'Eps-tein-Sarr et le cytomégalovirus humain.

44. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime une glycoprotéine du virus de l'herpès.

45. Vaccin selon la revendication 44, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès est choisie dans le groupe constitué par gpl3 du virus de l'herpès chevalin, çpl4 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, çE du virus de l'herpès chevalin, g?50 du virus de la pseudc-raçe, gpll du virus de la pseudo-rage, gplII du virus de la pseudo-rage, gpl du virus de la pseudo-rage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, çD du virus de l'herpès simplex, gl du virus de l'herpès bovin, gB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, gp340 du virus d' Epstein-3arr, g3 du virus d'Epstein-Barr, gH du virus d'Epstein-3arr et gB du cytomégalovirus humain.

46. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime au moins deux glycoprotéines du virus de l'herpès.

47. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que le poxvirus est un virus de la vaccine.

48. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.

49. Vaccin selon la revendication 48, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe constitué par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.

50. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans ledit poxvirus par recombinaison.

51. Jeu de deux vaccins pour éviter l'immunité maternelle chez un nouveau-né, à savoir un premier vaccin destiné à être inoculé au nouveau-né et comportant un poxvirus recombinant contenant de l'ADN à partir d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du poxvirus, ledit ADN codant un premier antigène pathogène du descendant nouveu-né, ledit antigène étant différent d'un second antigène du même pathogène présent dans le second vaccin, destiné à induire une réponse immunologique au même pathogène chez la mère du nouveau-né.

52. Un jeu de deux vaccins destinés à éviter l'immunité maternelle chez un descendant nouveau-né, caractérisé en ce que le premier vaccin qui est destiné à inoculer le nouveau-né comporte un premier poxvirus recombinant contenant de l'ADN à partir d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du premier poxvirus, ledit ADN codant pour un antigène d'un agent pathogène pour le nouveau-né, ledit premier poxvirus étant différent d'un second poxvirus recombinant qui est présent dans le second vaccin utilisé pour induire une réponse immunologique au même agent pathogène chez la mère du descendant nouveau-né.