NL195085C - Herpesvirus recombinant pokkenvirus. - Google Patents

Description

1 195085 us recombinant pokkenvirus

Verwijzing naar verwante octrooiaanvragen.

Deze octrooiaanvrage is een continuation-in-part van de op 16 augustus 1989 ingediende Amerikaanse 5 octrooiaanvrage 394.488, die weer een continuation-in-part van de op 17 april 1989 ingediende Amerikaanse octrooiaanvrage 339.004 is.

Gebied van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een gemodificeerd pokkenvirus en op methoden om dit te 10 bereiden en te gebruiken. De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op recombinant pokkenvirus, welk virus genproducten van een herpesvirusgen tot expressie brengt en op vaccins die een beschermende immuniteit tegen herpesvirusinfecties geven.

In deze aanvrage zijn vele publicaties met Arabische cijfers zonder haken aangegeven. Een volledige vermelding van deze referenties is te vinden aan het einde van de beschrijving, direct voor de conclusies.

15 Deze referenties beschrijven de stand der techniek waarop deze uitvinding betrekking heeft.

Achtergrond van de uitvinding.

Vaccinia virus en recenter andere pokkenvirussen zijn toegepast voor het invoegen en tot expressie brengen van vreemde genen. De basistechniek voor het invoeren van vreemde genen in levend infectueus 20 pokkenvirus brengt recombinatie van pokken DNA volgorden die een vreemd genetisch element in een donorplasmide flankeren en homologe volgorden aanwezig in het reddende pokkenvirus (28) met zich mede.

Specifiek worden de recombinant pokkenvirussen volgens twee, uit de stand der techniek bekende methoden geconstrueerd, analoog aan de methoden voor het verkrijgen van synthetische recombinanten 25 van het vacciniavirus, beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.603.112.

Allereerst wordt de in het virus in te voegen DNA genvolgorde, in het bijzonder een open afleesraam uit een niet-pokkenbron, geplaatst in een E. coli plasmideconstructie waarin DNA homoloog aan een gedeelte van het DNA van het pokkenvirus is ingevoegd. Afzonderlijk wordt de DNA genvolgorde die moet worden ingevoegd gebonden aan een promotor. De promotor-genbinding wordt geplaatst in de plasmideconstructie, 30 zodanig dat de promotor-genbinding aan beide uiteinden wordt geflankeerd door DNA homoloog aan een DNA volgorde die een gebied van pokken DNA die een niet-essentieel gebied bevat flankeert. De verkregen plasmideconstructie wordt daarna door groei in E. coli bacteriën (11) vermeerderd en geïsoleerd (12, 20).

Ten tweede wordt het geïsoleerde plasmide dat de in te voegen DNA genvolgorde bevat door transfectie overgebracht in een eetcultuur, bijvoorbeeld kippenembryofibroblasten, tezamen met het pokkenvirus.

35 Recombinatie tussen respectievelijk homoloog pokken DNA in het plasmide en het virale genoom geeft een pokkenvirus dat door de aanwezigheid, in een niet-essentieel gebied van het genoom ervan, van vreemde DNA volgorden is gemodificeerd. De aanduiding “vreemd” DNA duidt op exogeen DNA, in het bijzonder DNA uit een niet-pokkenbron, dat codeert voor genproducten die niet gewoonlijk worden geproduceerd door het genoom waarin het exogene DNA is gebracht.

40 Genetische recombinatie is in het algemeen de uitwisseling van homologe gedeelten van het DNA tussen twee DNA strengen. In bepaalde virussen kan RNA DNA vervangen. Homologe gedeelten van het nucleïnezuur zijn nucleïnezuurgedeelten (DNA of RNA) die dezelfde volgorde van nucleotidebasen bezitten.

Genetische recombinatie kan natuurlijk tijdens de replicatie of bereiding van nieuwe virale genomen in de geïnfecteerde gastheercel plaatsvinden. Zo kan dus genetische recombinatie tussen virale genen tijdens de 45 virale replicatiecyclus die plaatsvindt in de gastheercel die geco-infecteerd is met twee of meer verschillende virussen van andere genetische constructies plaatsvinden. Een gedeelte van het DNA uit een eerste genoom wordt onderling uitwisselbaar toegepast voor de constructie van het gedeelte van het genoom van een tweede co-infecterend virus, waarin het DNA homoloog is aan dat van het eerste virale genoom.

Recombinatie kan echter eveneens plaatsvinden tussen delen van het DNA in verschillende genomen die 50 niet perfect homoloog zijn. Indien een dergelijk gedeelte van een eerste genoom homoloog is met een gedeelte van een ander genoom, afgezien van de aanwezigheid in het eerste gedeelte van bijvoorbeeld een genetische marker of een gen coderend voor een antigene determinant ingevoegd in een gedeelte van het homologe DNA, kan recombinatie toch plaatsvinden en de producten van deze recombinatie kunnen dan worden aangetoond door de aanwezigheid van die genetische marker of gen in het recombinant virale 55 genoom.

Een succesvolle expressie van de ingevoegde DNA genetische volgorde door het gemodificeerde infectueuze virus hangt van twee factoren af. Ten eerste moet het invoegen plaatsvinden in een niet- 195085 2 essentieel gedeelte van het virus opdat het gemodificeerde virus levensvatbaar blijft. De tweede voorwaarde voor de expressie van het ingevoegde DNA is de aanwezigheid van een promotor in het juiste verband met het ingevoegde DNA. De promotor moet zodanig zijn geplaatst dat het stroomopwaarts van de tot expressie te brengen DNA volgorde aanwezig is.

5 Er zijn twee ondertypen van paard herpesvirus, die, hoewel ze kruis-neutraliserende epitopen bevatten, kunnen worden onderscheiden door hun antigene profielen, restrictieëndonuclease vingerafdrukken en hun pathogeniciteit voor paarden (1). Paard herpesvirus 1 (EHV-1) is geassocieerd met een ziekte van het ademhalingsstelsel, aandoeningen van het centrale zenuwstelsel en klassieke herpetische afwijkingen, terwijl het paard herpesvirus 4 (EHV-4) overwegend geassocieerd is met een ziekte van het ademhalings-10 stelsel (1, 48). Paard herpesvirussen zijn leden van de a-herpesvinjsonderfamiiie en vertonen vele van de typerende biologische en biochemische kenmerken van humane herpesvirussen, zoals genomische isomerisatie, regulering van de genexpressie, het verkrijgen van latente intecties, ontwikkeling van onvolkomen interfererende virusdeeltjes, inductie van neurologische aandoeningen en in vitro oncogene transformatie (1, 4, 23). EHV kan dus geschikt worden toegepast voor het onderzoek van de verschillende 15 biologische consequenties van herpesvirusinfecties.

Herpesvirus glycoproteïnen mediëren essentiële virale functies, zoals de aanhechting van cellen en de penetratie van cellen, de van cel tot cel verspreiding van het virus en, hetgeen belangrijk is, bepaling van het pathogeniteitsprofiel van de infectie. Herpesvirus glycoproteïnen zijn kritische bestanddelen bij de interactie met het immuunsysteem van de gastheer (36,37).

20 Onder de goed gekarakteriseerde glycoproteïnen van het herpes simplex virus vallen gB, gC, gD, gE, gG, gH en gl (36,37,49-55). Een aantal van deze onderzoekingen heeft het belang van herpes simplex virusglycoproteïnen bij het opwekken van immuunresponsen aangegeven. Zo is vermeld dat gB en gD belangrijke immuunresponsen kunnen opwekken (6,8,13,18,21,22,26,27,30,44,46,47). gC kan klasse I beperkte cytotoxische lymfocyten stimuleren (15,32), terwijl gD klasse II cytotoxische T celresponsen kan 25 stimuleren (21,22,44,46,47). Aangetoond werd dat gG een doelwit was voor complement-afhankelijke, op antilichamen gerichte virusneutralisatie (38,39). Eveneens werd aangetoond dat een aantal glycoproteïnen uit andere herpes virussen belangrijke immuunresponsen opwekken (5,10,36,56).

Beide ondertypen van EHV brengen zes overvloedige glycoproteïnen tot expressie (1,3,43). De genome gedeelten van de DNA volgorden coderende voor gp2, gp10, gp13, gp 14, gp17/18 en gp21/22a zijn bepaald 30 onder toepassing van lambda gt11 expressie-vectoren en monoklonale antilichamen (3). De glycoproteïnen gp 13 en gp 14 zijn aanwezig in dezelfde locaties in de L component van het genoom waartoe respectievelijk de gC en gB homologen van de herpes simplex virusmap behoren (3). EHV-1 schijnt uniek onder de alfa herpesvirussen waarvan de glycoproteïne genen in kaart zijn gebracht te zijn omdat vijf van de zes iloofdglycoproteïnen ervan zijn gecodeerd uit volgorden in het genoom L component, terwijl slechts één 35 (gp17/18) in kaart is gebracht in het Us gebied. Deze gegevens analyserend, werd voorspeld dat enkele van de low-abundance glycoproteïnen geïdentificeerd in EHV-1 virusdeeltjes evenals EHV-1-glycoproteïnen die nog niet zijn geïdentificeerd behoren tot de S component van het genoom (3). De envelop glycoproteïnen zijn de belangrijkste immunogenen van herpesvirussen die betrokken zijn bij het opwekken van zowel humorale als cellulaire gastheerimmuunresponsen (5,8.73-75) en zijn aldus van het grootste belang voor 40 diegenen die vaccins ontwikkelen.

Onlangs is de nucleotidevolgorde van de Kentucky T431 stam van de EHV-1 transcriptionale eenheid coderende voor gpl3 vermeld (2). Een open afleesframe codeert voor een 468 aminozuren bevattend primair translatieproduct van 51 kDa. Het eiwit heeft de karakteristieke eigenschappen van een membraan-spanning eiwit met negen potentiële N-verknoopte glycosyleringsplaatsen (Asn-X-Ser/Thr) aanwezig in het 45 oppervlaktegebied tussen het veronderstelde signaal en transmembraanankergedeelten van het eiwit (2).

Het glycoproteïne bleek homoloog aan het herpes simplex virus (HSV) gC-1 en gC-2, het pseudorabies virus (PRV) glll en het varicella-zoster virus (VZV), gpV (2) te zijn. EHV-1 gp13 is dus het structurele homoloog van de herpes virus gC-achtige glycoproteïnen.

Onlangs is de nucleotidevolgorde van EHV-1 gp14 (71,72) vermeld. Analyse van de voorspelde 50 aminozuurvolgorde van het gp14 glycolproteïne onthulde een significante homologie met het overeenkomstige glycoproteïne van HSV, gB.

Monoklonale antilichamen die gericht zijn tegen enkele EHV-1 glycoproteïnen bleken neutraliserend te zijn (76). Uit passieve immunisatieonderzoekingen bleek dat monoklonale antilichamen gericht tegen gp13 of gp14 (77) of tegen gp13, gp14 of gp17/18 (78) hamsters konden beschermen tegen een letale provoca-55 tie. Andere gB en gC glycoproteïneanaloga zijn eveneens betrokken bij de bescherming tegen ziekten veroorzaakt door alfa herpesvirussen (8,10, 73). Het EHV-1 gp17/18 glycoproteïne, hoewel gekarakteriseerd als een ander potentieel beschermend immunogeen, had tot nu toe geen bekende structurele tegenhanger 3 195085 onder de vele glycoproteïnen gecodeerd uit het S-bestanddeel in de andere alfaherpesvirussen (66,79,80). Op basis van de genomische plaats ervan, werd gespeculeerd dat gpl 7/18 het HSV gE analogon zou zijn (2).

Pseudorabies virus (PRV), een alfaherpesvirus, is de veroorzaker van de ziekte van Aujesky. De ziekte is 5 zeer infectueus en veroorzaakt ernstige economische verliezen in de varkensindustrie. De ziekte gaat gepaard met een grote morbiditeit en mortaliteit onder de biggetjes en is gekenmerkt door ernstige ziekte van de ademhalingswegen, miskramen, kleinere afmeting van de jongen en kleinere groeisnelheden van de overlevenden. Fatale encefalitis is een vaak voorkomend gevolg van de infectie. Latente virale infecties, een kenmerk van herpesvirussen, kunnen worden vastgesteld en maken het dus mogelijk om herstelde 10 volwassen varkens te laten dienen als chronische dragers van het virus. Voor een recent uitgebreid overzicht zie Wittmann en Rziha (81).

Het PRV genoom bestaat uit 90 x 106 dalton dubbelstrengs DNA (82) gescheiden door omgekeerde, zich herhalende eenheden in uniek lange (UL) of uniek korte (Us) segmenten (83,84). Het PRV genoom codeert voor ongeveer 100 polypeptiden waarvan de expressie wordt geregeld op een cascade-achtige wijze, 15 analoog aan andere herpesvirussen (85,86). Tot op heden is van vijf glycoproteïnen gpl, gpll, gplll, gp63 en gp50 aangetoond dat ze geassocieerd zijn met de virale envelop en geassocieerd zijn met de verschillende membraanstructuren van met PRV geïnfecteerde cellen (80,86-91). Een zesde door PRV gecodeerd glycoproteïne (gX) wordt in het cultuurmedium vrijgemaakt (92). De fysische locatie van deze glycoproteïnen op het PRV genoom en hun DNA volgorde zijn tegenwoordig bekend (62,80,91-98). Zoals bij de glycopro-20 teïnen van andere herpesvirussen, mediëren de PRV glycoproteïnen essentiële virale functies, zoals cellulaire hechting aan en penetratie in of vrijmaking uit de cellen. De PRV glycoproteïnen zijn kritisch in het pathogeniciteitsprofiel van de PRV infectie en zijn kritische bestanddelen bij het genezen van de ziekte en de immuunstatus.

PRV gpl is niet-essentieel voor de virusreplicatie (in vitro en in vivo) en ontbreekt in de meest verzwakte 25 PRV stammen (99). De verzwakte aard van deze gl-gedeleteerde stammen geeft eveneens een mogelijke rol voor gl bij virulentie aan (99,100). Andere PRV eiwitten schijnen echter bij deze functie te zijn betrokken, aangezien expressie van gl alleen niet voldoende is om een hoge mate van virulentie te geven (100).

De rol die gl speelt bij het opwekken van een immuunrespons tegen PRV is onduidelijk. Monoklonale antilichamen tegen gl kunnen het virus in vitro neutraliseren (101) en passief geïmmuniseerde muizen tegen 30 een letale PRV provocatie beschermen (81). Kost en medewerkers (98) hebben onlangs de expressie van PRV gpl in vaccinia virus recombinanten, hetzij alleen, hetzij tezamen met gp50 en gp63, beschreven. Inenting via de schedel van de vaccinia recombinanten bij muizen leidde tot een verhoogde virulentie, in het bijzonder indien PRV gpl was geassocieerd met co-expressie van gp50 en gp63.

Bij varkens worden echter geen neutraliserende antilichamen tegen gl geproduceerd (5). Bovendien 35 beschermt een recombinant vaccinia virus dat PRV gl-gecodeerde polypeptiden (98) tot expressie brengt geen muizen tegen een letale PRV provocatie (ten opzichte van de bescherming die verkregen werd met de vaccinia virus blanco van het wilde type). Deze gegevens, samengenomen, suggereren dat PRV gpl geschikter als diagnostische probe is dan als een bestanddeel in een sub-eenheidsvaccin.

Het PRV glycoproteïne gp63 is naast gp50 in het Us gebied van het PRV genoom geplaatst (80). De 40 coderende volgorde voor PRV gp63 begint met drie op elkaar volgende ATG codons ongeveer 20 nucleoti-den stroomafwaarts van het stopcodon van gp50. Er is geen herkenbaar transcriptioneel signaal motief en translatie vindt waarschijnlijk plaats uit hetzelfde transcript als gp50. PRV gp63 is in vitro niet essentieel.

PRV gp63 als een continue DNA volgorde met PRV gp50 is tot expressie gebracht in vaccinia virus, zoals is beschreven door Kost en medewerkers (98). De bijdrage van PRV gp63 aan bescherming van muizen 45 tegen de PRV provocatie is moeilijk te beoordelen, aangezien deze onderzoekingen niet de bijdragen van PRV gp50 en gp63 onderscheiden.

PRV glycoproteïne gX is een niet-structureel glycoproteïne waarvan het eindproduct wordt afgescheiden in de extracellulaire vloeistof (85,92). Er werd geen in vitro neutralisatie van PRV verkregen met hetzij polyklonale of monoklonale sera voor PRVgX (102,103) en sub-eenheid gX vaccins waren niet bescher-50 mend tegen provocatie (104).

PRV glycoproteïne gp50 is het Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) gD analogon (97). Het DNA open afleesframe codeert voor 402 aminozuren (95). De rijpe geglycosyleerde vorm (50-60 kDa) bevat O-gebonden koolhydraat zonder N-gebonden glycosylering (95). Varkensserum is zeer reactief met PRV gp50, hetgeen het belang ervan als immunogeen suggereert. Monoklonale antilichamen voor gp50 55 neutraliseren in vitro PRV met of zonder complement (97,105,106) en beschermen passief muizen (102,105,106) en varkens (102). Vaccinia virus recombinanten die PRV gp50 tot expressie brengen induceren serumneutraliserende antilichamen en beschermen zowel muizen als varkens tegen letale PRV

195085 4 provocatie (98,107,108).

Het PRV gplll gen is geplaatst in het UL gebied van het genoom. Het 1437 bp open afleesframe codeert voor een eiwit met 479 aminozuren. Het 50,9 kDa gededuceerde primaire translatieproduct heeft acht potentiële, met N-gebonden glycosyleringsplaatsen (96). PRV glll is het HSV-1 gC analogon (96). Functio-5 nele vervanging van PRV glll door HSVgC werd niet waargenomen (109). Hoewel PRV glll niet essentieel voor replicatie in_vitro is (110 ,111), is de rijpe geglycosyleerde vorm (98 kDa) een overbodig bestanddeel van de PRV envelop. Anti-gplll monoklonale antilichamen neutraliseren het virus in vitro met of zonder complement (86,106,110) en kunnen passief muizen en varkens (102) beschermen. Het PRV glycoproteïne glll kan muizen en varkens tegen letale PRV provocatie beschermen na immunisatie met een Cro/glll fusie 10 proteïne, tot expressie gebracht in E. coli (Robbins, A., R. Watson, L. Enquist, Europese octrooiaanvrage 0162738A1) of tot expressie gebracht in een vaccinia recombinant (Panicali, D., L.Gritz, G. Mazzara, Europese octrooiaanvrage 0261940A2).

Een van de belangrijkste bestanddelen van de PRV envelop is een via een disulfide verknoopt complex van drie glycoproteïnen (120 kDa, 67 kDa en 58 kDa) volgens de nomenclatuur van Hampl (86) aangeduid 15 als PRV gpll. De DNA volgorde coderend PRV gpll is geplaatst aan het linker uiteinde van UL Het open afleesframe van 2976 nucleotiden codeert voor een primair translatieproduct van 913 aminozuren of 110 kDa. PRV gpll is het HSV-1 gB homoloog (62). Aangetoond is dat monoklonale antilichamen gericht tegen PRV gpll het virus in vitro (5) met of zonder complement (81) neutraliseren. Bovendien demonstreren passieve immunisatieonderzoekingen dat neutraliserende monoklonale antilichamen ten dele varkens 20 beschermen doch faalden muizen tegen virulente virusprovocatie te beschermen (102). Tot nu toe is nog geen actieve immunisatie van varkens met PRV gpll glycoproteïne gemeld.

Gedurende de laatste 20 jaren is het voorkomen van genitale infecties veroorzaakt door het herpes simplex virus type 2 (HSV2) aanzienlijk toegenomen. Recente schattingen geven aan dat in de Verenigde Staten 5-20 miljoen mensen genitale herpes hebben (112). Hoewel gebleken is dat orale behandeling met 25 acyclovir de ernst van primaire infecties vermindert (113) en zich herhalende episoden onderdrukt (114), is de bestrijding en de behandeling van deze infecties verre van ideaal. Daarvoor is een vaccin ter verhindering van primaire en zich herhalende infecties nodig.

Het herpes simplex virus type 1 (HSV1) genoom codeert voor ten minste acht antigeen verschillende glycoproteïnen: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl en gj (115). Homologen voor deze genen schijnen aanwezig te 30 zijn in HSV2 (116-119). Aangezien deze glycoproteïnen zowel in de virion envelop als in het geïnfecteerde celplasmamembraan aanwezig zijn, kunnen ze humorale en via een cel gemedieerde, beschermende immuunresponsen geven (37).

Het relatieve belang van humorale en cellulaire immuniteit bij de bescherming tegen herpes simplex virusinfecties is niet volledig opgehelderd. Muizen die met gezuiverd HSV1 gB, gC of gD waren geïmmuni-35 seerd zijn beschermd tegen letale HSV1 provocatie (120). Muizen zijn eveneens beschermd tegen letale HSV1 of HSV2 provocatie door passieve immunisatie met antilichamen tegen het totale HSV1 (121) of HSV2 (122) virus en met antilichamen tegen de individuele HSV2 gB, gC, gD of gE glycoproteïnen (123). Deze bescherming schijnt echter afhankelijk te zijn van een competente T-celrespons, aangezien dieren waarvan de immuniteit was onderdrukt door bestraling, cyclofosfamide of anti-thymocytenserum niet werden 40 beschermd (124).

De bijdragen van de afzonderlijke glycoproteïnen bij het opwekken van een beschermende immuun-respons is niet volledig opgehelderd. Expressie van deze glycoproteïnen in een heteroloog systeem, zoals vaccinia, heeft het mogelijk gemaakt dat enkele van deze parameters werden geanalyseerd. Zo is bijvoorbeeld gebleken dat vaccinia virus vectoren die HSV1 gB (125) en HSV1 gC (32) tot expressie 45 brengen cytotoxische T-celresponsen induceren. Bovendien is gebleken dat muizen geïmmuniseerd met recombinant vaccinia virus, die tot expressie brengen hetzij HSV1 gB (8), HSV1 gC (126) of HSV1 gD (26) beschermd zijn tegen een letale provocatie van HSV1. Een recombinant vaccinia virus dat HSV1 gD tot expressie brengt blijkt eveneens beschermend ten opzichte van HSV2 in een guinees biggetje model-systeem te zijn (44). Het is echter niet bekend of expressie van vele HSV antigenen tot een potentiëring van 50 deze beschermende respons zal leiden.

Runder herpesvirus 1 (BHV1) is verantwoordelijk voor verschillende ziekten bij vee, waaronder conjunctivitis, vulvovaginitis en miskraam (127). Het is eveneens één van de meest belangrijke veroorzakers van de ademhalingsziekte bij rundvee, hetzij rechtstreeks werkende, hetzij als een van te voren vatbaar makende factor voor bacteriële infectie (128).

55 Een specificatie van BHV1 omvat meer dan 30 structurele polypeptiden, waarvan 11 geglycosyleerd zijn (129). Vier van deze glycoproteïnen, gl, gil, glll en glV, zijn gekarakteriseerd en bleken homoloog aan de herpes simplex virus (HSV) glycoproteïnen gB, gC, gD en gE te zijn (130,131).

5 195085

Sub-eenheidvaccins die uit gl, gill en/of gIV bestaan bleken vee tegen ziekte (onder toepassing van een BHV1/Pasteurella hemolytica aerosol provocatiemodel) te beschermen, doch niet tegen infectie (132). Uit deze resultaten blijkt het belang van deze glycoproteïnen bij het opwekken van een succesvolle immuun-respons tegen BHV1.

5 gl en glll zijn eveneens gekloond in vaccinia virus en het is gebleken dat vee dat met deze recombinanten is geïmmuniseerd neutraliserende antilichamen tegen BHV1 produceren (56,133).

Katten rhinotracheitis is een gebruikelijke en over de hele wereld voorkomende ziekte van katten die wordt veroorzaakt door een a herpesvirus, aangeduid als feline herpesvirus type 1 (FHV-1). Evenals andere herpesvirussen, geeft FHV-1 een latente infectie die leidt tot een periodieke reactivering (134). FHV-1 10 infecties bij gefokte koloniën worden gekenmerkt door een hoog mortaliteitspercentage bij poesjes.

Secundaire infecties van het bovenste gedeelte van het ademhalingsstelsel zijn tamelijk verzwakkend bij de volwassen dieren. De bestrijding van deze ziekte geschiedt tegenwoordig door gebruik te maken van gemodificeerde levende of geïnactiveerde vaccins die de ontwikkeling van klinische signalen kunnen onderdrukken, doch niet infectie, die leidt tot verspreiding van het virus, kan verhinderen. Zo kunnen dus 15 asymptomatisch gevaccineerde katten virulent virus verspreiden en latente infecties kunnen niet worden verhinderd door de bestaande vaccins (135) of met de veiliger, gezuiverde sub-eenheidvaccins die onder ontwikkeling zijn (136,137).

Herpesvirus glycoproteïnen mediëren het hechten van het virion aan de gastheercel en zijn uiterst belangrijk bij virale infecties (138,139). Ze bepalen eveneens de sub-type specificiteit van het virus (110).

20 Herpesvirus glycoproteïnen antigenen worden herkend door zowel de humorale als cellulaire immuunsystemen en het is gebleken dat ze beschermende immuunresponsen bij gevaccineerde gastheren opwekken (44,107,141,142). FHV-1 bleek ten minste 23 verschillende eiwitten te bevatten (143,144).

Hiervan zijn ten minste vijf geglycosyleerd (144,145) met vermelde moleculaire massa’s variërende van 120 kDa tot 60 kDa. De FHV-1 glycoproteïnen bleken immunogeen te zijn (143,145).

25 Evenals vele andere a-herpesvirussen, bleek FHV-1 een homoloog van glycoproteïne B (gB) van HSV-1 te hebben en een gedeeltelijke volgorde van het FHV-1 gB gen is onlangs beschreven (146). Het HSV-1 gB is nodig voor de virusintrede en voor de celfusie (147-149). Het HSV-1 gB en de gB analoga van andere herpesvirussen bleken belangrijke circulerende antilichamen evenals cel-gemedieerde immuunresponsen op te wekken (8,10,37,47,73,150). Het FHV-1 gB glycoproteïne is een 134 kDa complex dat met B-mercapto-30 ethanol wordt gedissocieerd in twee glycoproteïnen van 66 kDa en 60 kDa. Het FHV-1 DNA genoom heeft een afmeting van ongeveer 134 Kb (153).

Epstein Barr virus (EBV), een humaan B lymfotropisch herpesvirus, is een lid van de genus lymfocrypto-virus die behoort tot de sub-familie γ-herpesvirus (115). Het is de veroorzaker van infectueuze mononucleosis (154) en van B-cel lymfomas (156). EBV is geassocieerd met twee humane kwaadaardige ziekten, het 35 endemische Burkitt’s lymfoma en het niet-gedifferentieerde nasofaryngeale carcinoom (156).

Sinds het EBV genoom volledig is gesequenceerd (207) als de genomen VZV (66) en HSV1 (158), zijn talrijke homologieën tussen deze verschillende herpesvirussen beschreven (159). In enkele gevallen zijn deze homologieën toegepast voor de voorspelling van de potentiële functies van enkele open afleesframe (ORFs) van EBV. De EBV genen homoloog aan de HSV1 genen betrokken bij immuniteit zijn van bijzonder 40 belang. Zo heeft het EBV BALF4 gen homologieën met HSV1 gB (68) en het EBV BXLF2 gen met HSV1 gH (161). Tenslotte bevat het EBV BBRF3 gen homologieën met een CMV membraaneiwit (162).

Van de EBV eiwitten, zijn de twee belangrijkste envelop glycoproteïnen gp340 en gp220 de best gekarakteriseerde potentiële vaccinerende antigenen. Zij zijn afgeleid van hetzelfde gen door splicing, zonder een verandering van het afleesframe (163,164). Monoklonale antilichamen en polyklonale sera 45 gericht tegen gp340 neutraliseren EBV in vitro (165). De cottontop tamarinds, het enige, gevoelige dier, kan worden beschermd door een immunisatie met gezuiverd gp340 (166) en met een recombinant EBV gp340 vaccinia virus (167). In dit geval werd de bescherming verkregen met een recombinant afgeleid van de WR vaccinia stam, doch niet met een recombinant afgeleid van de Wyeth vaccinia stam. De Wyeth stam wordt op grote schaal toegepast als een vaccinstam.

50 Monoklonale antilichamen gericht tegen gp85, het EBV homoloog van HSV1 gH, zijn beschreven als in vitro neutraliserende antilichamen (168,169).

Humaan-cytomegalovirus (HCMV) is een lid van de β-herpesvirinae subfamilie (familie Herpesviridae). HCMV kan een aanhoudende, productieve infectie tegenover substantiële specifieke immuniteit produceren. Zelfs indien HCMV een lage pathogeniciteit in het algemeen bezit, veroorzaakt intrauterineinfectie hersen-55 beschadigingen of doofheid bij ongeveer 0,15 % van alle pasgeborenen en het is de meest voorkomende infectueuze complicatie van orgaantransplantatie (170). Hoewel de doeltreffendheid van een experimenteel, levend, verzwakt (Towne stam) HCMV vaccin is gedemonstreerd (171), hebben bezorgdheid betreffende 195085 6 levende vaccinslammen tot pogingen geleid om de identificatie van HCMV eiwitten die bruikbaar zijn als een sub-eenheidsvaccins te identificeren. In dit opzicht is de identificatie van virion glycoproteïnen en hun beoordeling als beschermende middelen een belangrijke stap.

Er zijn drie immunologisch bepaalde families van glycoproteïnen geassocieerd met de HCMV envelop 5 beschreven (172): gCI (gp55 en gp93-130); gCII (gp47-52); en gCIII (gp85-p145).

Het gen coderende voor gCI is homoloog aan HSVI gB. De gCII glycoproteïnen worden gecodeerd door een familie van vijf genen (HXLF), gerangschikt in een tandem en delende één of twee homologiegebieden. Waarschijnlijker wordt gCII slechts door twee van deze genen gecodeerd (172,173). Het gen coderende voor gCIII is homoloog aan HSVI gH (174).

10 In vitro neutraliserende antilichamen die specifiek gericht zijn tegen elk van deze families zijn beschreven (174-176).

Geschikt gemodificeerde pokkenvirusmutanten die exogene paard herpesvirus genen bevatten die tot expressie zijn gebracht in een gastheer als een antigene determinant die de productie door de gastheer van antilichamen tegen herpesvirus antigenen opwekt, vormen nieuwe vaccins die de nadelen van gebruikelijke 15 vaccins, onder toepassing van gedode ot verzwakte levende organismen, missen. Zo vereist bijvoorbeeld de bereiding van vaccins uit gedode organismen de groei van grote hoeveelheden van de organismen, gevolgd door een behandeling die selectief hun infectievermogen zal doden zonder hun antigeniciteit aan te tasten. Aan de andere kant hebben vaccins die verzwakte, levende organismen bevatten altijd de mogelijkheid van een omkering van het verzwakte organisme in een pathogene toestand. Indien daarentegen een recombi-20 nant pokkenvirus dat geschikt gemodificeerd is met een paard herpesvirus gen coderende voor een antigene determinant van een ziekte teweeg brengende herpesvirus als vaccin wordt toegepast, wordt de mogelijkheid van reversie in een pathogeen organisme vermeden, aangezien het pokkenvirus slechts het gen coderende voor de antigene determinant van het ziekte teweeg brengende organisme en niet die genetische gedeelten van het organisme dat verantwoordelijk is voor de replicatie van het pathogeen, bevat. 25 PRV infecteert fataal vele zoogdierspecies (rundvee, honden enz.). Volwassen varkens overleven echter gewoonlijk de infectie en vormen daardoor een belangrijk virusreservoir. Omdat PRV ernstige economische verliezen veroorzaakt, wordt in vele landen vaccinatie van varkens met verzwakte of gedode vaccins uitgevoerd.

Pogingen PRV infectie in varkens te bestrijden en economische verliezen te verminderen werden 30 uitgevoerd door actieve immunisatie met gemodificeerde, levende of geïnactiveerde vaccins. Verzwakte vaccins die in het algemeen een langdurende immuniteit induceren en wat kosten betreft doeltreffend zijn houden echter het risico van een onvoldoende verzwakking of genetische instabiliteit in. Geïnactiveerde vaccins zijn minder doeltreffend, vereisen vele immunisaties en bevatten gewoonlijk krachtige adjuvantia. Deze laatste preparaten kunnen na het vaccineren allergische reacties induceren, zoals gebrek aan eetlust, 35 hyperthermie of miskramen bij drachtige zeugen. Deze vaccintypen lijden eveneens aan bepaalde nadelen wat betreft het voorkomen van latente infecties, overwinnen van de effecten van maternale antilichamen of doeltreffendheid van de vaccinatie en elimineren het potentiële gebruik van een serologisch diagnostisch onderzoek ter onderscheiding van gevaccineerde dieren van die welke vooraf met PRV zijn geïnjecteerd.

Alternatieve vaccinatiestrategieën, 2oals het gebruik van recombinant pokkenvirussen die immunologisch 40 belangrijke PRV genproducten tot expressie brengen zullen bepaalde voordelen bezitten: (a) elimineren levende, verzwakte PRV vaccinstammen uit het gebied en (b) maken het onderscheid tussen gevaccineerde en geïnfecteerde of seropositieve dieren mogelijk. Dit laatste zal geschieden door toepassing van geschikte, diagnostische reagentia die nauwkeurig gevaccineerde van natuurlijk geïnfecteerde dieren onderscheiden.

Dit is een belangrijke overweging gezien de bestaande voorschriften die het vervoer van seropositieve 45 dieren regelen. Verder is de vaccinatie economischer en verdient aanbeveling wat het onderzoek en elimineren van geïnfecteerde dieren uit de groepen betreft. Het ontwikkelen van dergelijke vaccins vereist een kennis van de bijdragen die door geschikte PRV antigenen aan de inductie van beschermende immuniteit wordt geleverd. In het geval van PRV, evenals bij andere leden van de herpesvirusfamilie, zijn de glycoproteïnen belangrijke kandidaten voor antigenen die in een doeltreffend subeenheid recombinant 50 vaccin aanwezig zijn.

De technologie van het ontwikkelen van vaccinia virus recombinanten is onlangs uitgebreid met andere leden van de pokkenvirusfamilie die een beperkter gastheergebied hebben. In het bijzonder vogelpokken-virussen, die zich vermeerderen in vogelspecies, zijn geconstrueerd teneinde immunologische, van belangzijnde genproducten tot expressie te brengen. Inenting van vogel (42,177) en niet-vogel species (41) 55 met vogelpokkenvirusrecombinanten wekken beschermende immuunresponsen tegen het overeenkomstige pathogeen op.

Verzwakte levende vaccins en geïnactiveerde vaccins voor BHV1 zijn meer dan 30 jaar beschikbaar en 7 195085 hebben met succes het voorkomen van met BHV1 verwante ziekten verminderd. Deze vaccins verhinderen echter niet latente infectie of herinfectie met wildtype virus. Ze bemoeilijken eveneens de differentiatie tussen geïnfecteerde en gevaccineerde dieren.

Beide typen vaccins hebben andere belangrijke nadelen. De vaccinatie van zwangere koeien met 5 verzwakte, levende vaccins kunnen de dood van het foetus en daarna een miskraam veroorzaken (127). Bovendien bleken gevaccineerde dieren het virus te verspreiden (178). Daarom kunnen gevaccineerde dieren die met zwangere koeien tezamen worden gehouden infectueus virus naar het zwangere dier verspreiden en een miskraam van de foetus veroorzaken.

Geïnactiveerde vaccins induceren geen miskramen en veroorzaken geen virale excretie. Ze maken 10 echter het gebruik van adjuvantia nodig en kunnen fatale hypersensibiliteitsreacties (anafylaxis) en niet-fatale ontstekingen en koorts (179) veroorzaken.

Eén van de belangrijkere aspecten van de vaccinatie is het overwinnen of vermijden van de moeder-immuniteit. In dit opzicht wordt opgemerkt dat indien een moeder immuun is voor een speciale pathogeen, de "immuniteit” in de moeder via de antilichamen die in het colostrum aanwezig zijn en/of via andere wegen 15 zal overgaan op de pasgeborene. Desalniettemin kan de pasgeborene niet met succes worden gevaccineerd totdat de mate van moederimmuniteit voldoende is verminderd. Er is daarom een nauw gebied waarin de pasgeborene met succes kan worden gevaccineerd in aanwezigheid van afnemende moederimmuniteit.

Het zal dus duidelijk zijn dat het verschaffen van een herpesvirusrecombinant pokkenvirus en van vaccins die een beschermende immuniteit tegen herpesvirusintectles verlenen, die de stand der techniek de 20 voordelen van inenting met levend virus bieden, doch de hiervoor besproken moeilijkheden verminderen of wegnemen, een zeer gewenst voordeel boven de gangbare stand van de techniek zullen bieden.

Doelstellingen van de uitvinding.

Daarom is een doel van deze uitvinding het verschaffen van recombinant pokkenvirussen, welke virussen 25 genproducten van het herpesvirus tot expressie brengen en het verschaffen van een methode voor het bereiden van dergelijke recombinant pokkenvirussen.

Een ander doel van deze uitvinding is het kloneren en tot expressie brengen van herpes virus coderende volgorden in een pokkenvirusvector, in het bijzonder een vaccinia virus, pluimveepokkenvirus of kanarie-pokkenvirusvector.

30 Weer een ander aspect van deze uitvinding is het verschaffen van een vaccin dat in staat is herpesvirus neutraliserende antilichamen op te wekken en een beschermende immuniteit tegen letale herpesvirusprovocatie te geven.

Deze en andere doelstellingen en voordelen van de onderhavige uitvinding zullen duidelijker worden na kennisneming van het volgende.

35

Verklaring van de uitvinding.

Een aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een recombinant pokkenvirus dat daarin een DNA volgorde van herpesvirus in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusgenoom bevat. Het is gunstig indien het herpesvirus een lid van de u-herpesvirus, β-herpesvirus of γ-herpesvirus onderfamilie is.

40 In het bijzonder codeert de DNA volgorde uit herpesvirus voor een herpesvirus glycoproteïne. Meer in het bijzonder wordt het herpesvirus glycoproteïne gekozen uit de groep bestaande uit paard herpesvirus gpl 3, paard herpesvirus gpl4, paard herpesvirus gD, paard herpesvirus gp63, paard herpesvirus gE, pseudora-bies virus gp 50, pseudorabies virus gpll, pseudorabies virus gplll, pseudorabies virus gpl, herpes simplex virus gB, herpes simplex virus gC, herpes simplex virus gD, runder herpes virus gl, kat herpes virus gB, 45 Epstein-Barr virus gp220, Epstein-Barr virus gp340, Epstein-Barr virus gB, Epstein-Barr virus gH en humaan cytomegalovirus gB.

Volgens de onderhavige uitvinding brengt het recombinant pokkenvirus genproducten van het vreemde herpesvirusgen tot expressie. In het bijzonder codeert de vreemde DNA volgorde voor een herpesvirus glycoproteïne en wordt het vreemde DNA in een gastheer tot expressie gebracht door de vorming van een 50 herpesvirus glycoproteïne. Het is gunstig indien een aantal herpesvirus glycoproteïnen samen in de gastheer door de recombinant pokkenvirus tot expressie wordt gebracht. Het pokkenvirus is geschikt een vaccinia virus of een vogelpokkenvirus, zoals een pluimveepokkenvirus of kanariepokkenvirus.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een vaccin voor het induceren van een immunologische respons in een gastheerdier dat met het vaccin is ingeënt, welk vaccin een drager en 55 een recombinant pokkenvirus, bevattende, in een niet-essentieel gebied daarvan, DNA van herpesvirus, bevat. Meer in het bijzonder codeert het DNA voor en brengt tot expressie een herpesvirus glycoproteïne. Geschikt wordt een aantal herpesvirus glycoproteïnen samen in de gastheer door het pokkenvirus tot 195085 8 expressie gebracht. Het pokkenvirus dat in het vaccin volgens de onderhavige uitvinding wordt toegepast is geschikt een vaccinia virus of een vogelpokkenvirus, zoals gevogeltepokkenvirus of kanariepokkenvirus.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op mechanismen om het aspect van de moederimmuniteit te mijden. Indien de belemmering is toe te schrijven aan de aanwezigheid van antilicha-5 men voor een bepaald antigeen(en), dan kan de barrière van de moederimmuniteit worden overwonnen of vermeden door, selectief, gebruik te maken van vectoren die bepaalde ondergroepen van antigenen tot expressie brengen. Zo kan bijvoorbeeld het zwangere dier worden gevaccineerd meteen recombinant vaccinia virus dat pseudorabies virus glycoproteïne gp50 tot expressie brengt en het nakomelingschap kan bij de geboorte of kort daarna worden gevaccineerd met vaccinia recombinanten die andere pseudorabies 10 virus glycoproteïnen gpll of gplll of combinaties daarvan, tot expressie brengen. Indien aan de andere kant de barrière van de moederimmuniteit is toe te schrijven aan de vector, kan men verschillend de moeder met één vector (vaccinia of vogelpokken) en het nakomelingschap met de andere vector vaccineren. Deze procedure houdt natuurlijk niet alleen het gebruik van verschillende vectoren in, doch eveneens van factoren die een verschillende constellatie van glycoproteïnen tot expressie brengen. De onderhavige uitvinding heeft 15 dus betrekking op een methode voor het overwinnen of vermijden van moederimmuniteit, welke anders een succesvolle immunisatie bij pasgeborenen zal verhinderen. Volgens de onderhavige uitvinding wordt de nakomenschap van pasgeborenen ingeënt met een recombinant pokkenvirus dat daarin DNA van een niet-pokkenvirusbron in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusgenoom bevat, welk DNA codeert voor een eerste antigeen van een pathogeen van de nakomelingschap van pasgeborenen en welk antigeen 20 verschilt van een tweede antigeen van hetzelfde pathogeen dat wordt toegepast voor het induceren van een immunologische respons op hetzelfde pathogeen in de moeder van de nakomelingschap van pasgeborenen. Eveneens wordt volgens de onderhavige uitvinding de nakomelingschap van pasgeborenen ingeënt met een recombinant eerste pokkenvirus dat daarin DNA van een niet-pokkenbron in een niet-essentieel gebied van het eerste pokkenvirusgenoom bevat, welk DNA codeert voor een antigeen van een pathogeen van de 25 nakomelingschap van pasgeborenen en welk eerste pokkenvirus verschilt van een recombinant tweede pokkenvirus dat gebruikt wordt voor het induceren van een immunologische respons op hetzelfde pathogeen in de moeder van de nakomelingschap van pasgeborenen.

Korte beschrijving van de tekeningen.

30 Er zal een beter begrip van de onderhavige uitvinding worden verkregen door verwijzing naar de bijgesloten tekeningen, waarin figuur 1 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP425 geeft, figuur 2 de DNA volgorde van een EHV-1 1,88 Kb fragment bevattende de gp13 coderende volgorden laat zien, 35 figuur 3 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP483 bevattende het EHV-1 gp13 gen afbeeldt, figuur 4 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP458 afbeeldt, figuur 5 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP577 40 bevattende het EHV-1 gp14 gen geeft, figuur 6 de DNA volgorde van een EHV-1 3,35 Kb fragment bevattende de gp14 coderende volgorde vertoont, figuur 7 een grafiek van de relatieve hydrofieliciteit voor de EHV-1 gp14 coderende volgorden is, figuur 8 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant gevogelte pokkenvirus 45 vFP44 bevattende het EHV-1 gp13 gen vertoont, figuur 9 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant kanariepokkenvirus vCP48 bevattende het EHV-1 gp13 gen geeft, figuur 10 schematisch een methode voor de constructie van de donorplasmiden pHES-MP63t pHES-MP1 en pHESMP34, bevattende gemodificeerde versies van het EHV-1 gp14 gent vertoont 50 figuur 11 een kaart van de BamHI splitsingsplaatsen van de EHV-1 Kentucky D stam geeft, aanduidende de omgekeerde herhalingen van het genoom door rechthoeken, aantonende de plaats van de zes hoofd EHV-1 glycoproteïnegenen en vertonende een uitbreiding van het gebied van het genoom dat de gD, gp63 en gE genen bevat, figuur 12 de nucleotidevolgorde van een EHV-1 6402 basepaarfragment bevattende de gD, gp63 en gE 55 coderende volgorden vertoont, figuur 13 een hydropathie grafiek van de volgorde van 402 aminozuren samen vormende EHV-1 gD is, figuur 14 een hydropathie grafiek van de volgorde van 413 aminozurent samen vormende EHV-1 gp63 9 195085 is, figuur 15 een hydropathie grafiek van de volgorde van 552 aminozuren, samen vormende EHV-1 gE is, figuur 16 schematisch een methode voor de constructie van donorplasmiden pJCA006, pJCA007 en pJCA008 bevattende respectievelijk het EHV-1 gD gen, het EHV-1 gE gen en het EHV-1 gp63 gen, en 5 ontwikkeling van recombinant vaccinia virus bevattende deze genen vertoont, figuur 17 schematisch een methode voor de constructie van de donorplasmiden pJCA009 (bevattende de EHV-1 gD en gp63 genen) en pJCA010 (bevattende het EHV-1 gD, gp63 en gE genen) en ontwikkeling van recombinant vaccinia virus bevattende deze genen vertoont, figuur 18 schematisch een methode voor de constructie van donorplasmide PR18 bevattende het PRV 10 gpll gen en vorming van recombinant vaccinia virus dat het PRV gpll gen tot expressie brengt, geeft, figuur 19 de DNA volgorde van het PRV gpll open afleesframe geeft, figuur 20 schematisch een methode voor de constructie van donorplasmide pPR24 bevattende het PRV gplll gen en vorming van recombinant vaccinia virus uitdrukkende het PRV gplll gen vertoont, figuur 21 de DNA volgorde van het PRV gplll open afleesframe aangeeft, 15 figuur 22 schematisch een methode voor de constructie van het donorplasmide pPR26 bevattende het PRV gp50 gen en vorming van recombinant vaccinia virus dat het PRV gp50 gen tot expressie brengt, geeft, figuur 23 de DNA volgorde van het PRV gp50 open afleesframe vertoont, figuur 24 schematisch een methode voor de constructie van de plasmiden pSD478VC en pSD479VCBG 20 en invoeging van β-galactoside in vaccinia virus afbeeldt, figuur 25 schematisch een methode voor de constructie van plasmide pMP13PP vertoont, figuur 26 schematisch een methode voor de constructie van het plasmide pFPPRVII, bevattende het PRV gpll gen, weergeeft, figuur 27 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant kanariepokkenvirus vCP55, 25 tot expressie brengend het PRV gpll gen, weergeeft, figuur 28 schematisch een methode voor de constructie van de recombinant vaccinia virus vP717, tot expressie brengend het PRV gl gen, geeft, figuur 29 schematisch een methode voor de constructie van de recombinant vaccinia virussen vP569 en vP734, tot expressie brengen het HSV-2 gB gen, geeft, 30 figuur 30 schematisch een methode voor de constructie van de recombinant vaccinia virussen vP579, vP748 en vP776, toont, expressie brengend het HSV-2 gC gen, vertoont, figuur 31 schematisch een methode voor de constructie van de recombinant vaccinia virussen vP570, vP761, vP775 en vP777, tot expressie brengend het HSV-2 gD gen, weergeeft, figuur 32 schematisch een methode voor de constructie van de recombinant vaccinia virussen vP637 en 35 vP724, tot expressie brengend het BHV-1 gen, weergeeft, figuur 33 schematisch een methode voor de constructie van het donorplasmide pJCAOOI bevattende het FHV-1 gB gen en voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP713, tot expressie brengend het FHV-1, gB gen weergeeft, figuur 34 de nucleotidevolgorde van het 3400 bp segment van FHV-1 DNA coderende glycoproteïne gB 40 afbeeldt, figuur 35 een hydropathie grafiek van de volgorde van 947 aminozuren vormende FHV-1 gB afbeeldt, figuur 36 schematisch een methode voor de constructie van de donorplasmiden 409gp220 bevattende het EBV gp220 gen en 409gp340, bevattende het EBV gp340 gen, weergeeft, figuur 37 schematisch een methode voor de constructie van het vaccinia donorplasmide 409gB, 45 bevattende het EBV gB gen, weergeeft, figuur 38 schematisch een methode voor constructie van het vaccinia donorplasmide 486gH bevattende het EBV gH gen weergeeft, figuur 39 schematisch de structuur van het vaccinia donorplasmide 513gHgBgp340, bevattende de EBV genen gp340, gB en gH voorstelt, 50 figuur 40 schematisch een methode voor de constructie van het vaccinia donorplasmide 409CMVgB bevattende het CMV gB gen geeft, figuur 41 de nucleotide en aminozuurvolgorden van HCMV (Towne stam) HXLF1 gen weergeeft, en figuur 42 de nucleotide en aminozuurvolgorden van HCMV (Towne stam) HXLF2 gen voorstelt.

55 Uitvoerige beschrijving van de uitvinding.

Een beter begrip van de onderhavige uitvinding en van de vele voordelen ervan kan nu worden ontleend aan de volgende voorbeelden die ter illustratie worden gegeven.

195085 10

Voorbeeld 1:

Constructie van vaccinia virus recombinanten die het paard herpesvirus gp13 glycoproteïne tot expressie brengen.

5 Vervanging van het HA gen van vaccinia door het E. coli fi-gaiactosidasegen.

In dit voorbeeld werd de Kopenhagenstam van het vaccinia virus verkregen van Rhone Merieux, Ine. (Athens, Georgia) gebruikt. Het virus werd gekweekt uit een gezuiverd plaque isolatieproduct op hetzij VERO (ATCC# CCL81) of MRC-5 (ATCCff CCL171) cellen in Eagle’s minimaal essentieel medium (MEM) plus 10 % foetaal runderserum (FBS). Een derivaat van het wildtype virus waaruit volgens standaard-10 methoden (25,28) de volledige coderingsvolgorde voor het thymidinekinasegen was deleted werd geïsoleerd en aangeduid met vP410. Deze thymidinekinasedeletiemutant werd toegepast voor verdere behandelingen. Plasmiden werden geconstrueerd, onderzocht en deze liet men volgens standaardmethoden groeien (20,27,28).

Onder verwijzing nu naar figuur 1, werd het 13 Kb Sail fragment van het vaccinia virus dat de Hindlll A/B 15 fragmentverbinding omspant gebonden aan Sail gedigereerd pUC8 ontwikkelend pSD419VC. De rechterarm van pSD419VC overeenkomende met het Hirndlll B gedeelte van het Sail fragment werd verwijderd door digereren met Hindlll en weer gebonden onder vorming van pSD456VC. pSD456VC bevat dus het rechter uiteinde van het Hindlll A fragment, waarin het volledige, coderende gedeelte voor het hemagglutinine (HA) gen (35) geflankeerd door ongeveer 0,4 Kb extra vacciniavolgorden aan elke kant aanwezig is.

20 Ter verkrijging van een plasmidevector die vrijwel zonder HA coderende volgorden is, werd pSD456VC geknipt (gedeeltelijk gedigereerd) bij de Rsal plaats stroomopwaarts van het HA gen en bij de Eagl plaats 80 bp van het 3' einde van het HA gen. Het benaderde 3,5 Kb Rsal/Eagl fragment werd uit een agarosegel geïsoleerd.

Synthetische oligonucleotiden MPSYN59-62 werden bereid ter vervanging van het gebied van de Rsal 25 plaats tot plaats 2 stroomopwaarts van de HA coderende volgorde, onmiddellijk gevolgd door de Bglll, Smal en Psti restrictieplaatsen en een Eagl sticky uiteinde. De volgorde van MPSYN59-62 met de aangegeven restrictieplaatsen is als volgt: 5'-ACACG AAT GATTTT CT AAAGT ATTTGG AAAGTTTT AT AGGTAGTT GAT AG AACAA 3'-T GTGCTT ACTAAAAGATT1CATAAACC177 CAAAAT ATCCATCAACT AT CTTGTT 30 AATACATAATTTTGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCTCCCGGGCTGCAGC-3' TT AT GT ATT AAAACATTTTT ATTT AGT GAAAAAT AT GATT CT AG AGGGCCCGACGT CGCCGG-5'

Bglll Smal Pstl Eagl 35 Het annealed MPSYN59-62 mengsel werd gebonden aan het 3.5 Kb Rsal/Eagl fragment van pSD456VC, onder vorming van pSD466VC. Zo is dus in pSD466VC het HA gen vervangen door een polylinkergebied.

Een 3,2 Kb BglIl/BamHI (partieel) fragment bevattende het E. coli β-galactosidase gen van pMC1871 (34) onder de transcriptionele controle van de vaccinia 11 kDa promotor (7) werd gekloneerd in pSD466VC, dat was gedigereerd met Bglll. Een plasmide dat de 11 kDa promotor/p-galactosidase gen cassette in een 40 van links tot rechts oriëntatie ten opzichte van de flankerende vaccinia armen bevatte werd met pSD466VCBGA aangeduid en gerecombineerd in een thymidinekinasedeletiemutant, vP410, van de Kopenhagenstam van het vaccinia virus onder vorming van de vaccinia recombinant vP425 tot expressie brengend het β-galactosidase. 80 baseparen bij het carboxyluiteinde van het HA gen werden behouden, teneinde niet een korte, potentiële open afleesframe overgeschreven van rechts naar links ten opzichte van 45 het vacciniagenoom te verbreken.

Het recombinant vaccinia virus, vP425 (184) werd geïdentificeerd op basis van blauwe plaquevorming in aanwezigheid van het chromogene substraat, X-gal, zoals door anderen is beschreven (9,24). Vervanging van het β-galactosidasegen door nog een ander vreemd gen in opeenvolgende vaccinia recombinanten kon gemakkelijk worden gevolgd door isolatie van kleurloze plaques in plaats van blauwe plaques.

50 Ter vergemakkelijking van toekomstige kloningsstappen, werd de Smal-plaats afgeleid van het pUC8 multiklonerend gebied geëlimineerd door digereren van pSD466VC met BamHI/EcoRI, blunt eindigende met het KlenowTragment van E. coli polymerase en weer verknoping. Zo is dus de enkelvoudige Smal plaats die achterblijft in het verkregen plasmide, pSD467VC, in het polylinkergebied van de HA deletie aanwezig.

55 Identificatie van DNA volgorden coderende het EHV1 gp13 gen.

De DNA volgorde coderende voor het glycoproteïne EHV-1 gp13 is aanwezig in het 7,3 Kb BamHI-H fragment van EHV-1 (3). De nucleotidevolgordewaarden voor beide strengen werd verkregen uit het pUC

195085 12

In dit oligonucleotide, wordt de terminatiecodon (TAG) onmiddellijk gevolgd door een vaccinia vroege transcriptie terminator (AÏTTTTAT). Het dubbelstrengs DNA fragment verkregen door annealing het paar van 42-mers bevat een Narl sticky uiteinde, gevolgd door het 3' uiteinde van de coderende volgorde voor het EHV-1 gp 13 gen, evenals een vaccinia vroeg transcriptie terminatiesignaal (45), een Pstl plaats en een 5 Ndel sticky uiteinde. Dit tragment werd ingevoegd tussen de Narl/Ndel plaatsen van pNSIEN dat pNSIENPN vormt (figuur 3).

Het Nsil/Pstl fragment uit pNSIENPN werd geïsoleerd en gekloneerd in de Nsil/Pstl plaatsen van het plasmide pNSl, onder vorming van het plasmide pVHA6g13Nsil (figuur 3). pVHA6g13Nsil werd geknipt op de EcoRI plaats in de H6 promotor en de Nsil plaats die was ingevoerd bij het begin van het EHV-1 gp13 10 gen. Dit vectorfragment werd blunt ended met Mung Bean nuclease. De complementaire 32-mer oligonu-cleotiden werden gesynthetiseerd met de volgende volgorde, met de aangegeven restrictieplaats:

EcoRV

5'-ATCCGTT AAGTTT GT AT CGT AATGT GGTT GCC-3' 3'-T AGGCAATT CAAACAT AGCATT ACACCAACGG-5' 15 H6 promotor gp13 5' einde

Deze oligonucleotiden werden annealed en gebonden in het pVHA6g13Nsil vectorfragment, onder vorming van het plasmide pVHA6g13, dat een nauwkeurige verbinding bij het ATG initiëringscodon (onderstreept in de 32-mer volgorde) van de H6 promotor en EHV-1 gpl 3 gen (figuur 3) bevat.

20 pVHA6g13 werd door transfectie gebracht in met vP425 geïnfecteerde cellen ter vorming van het vaccinia recombinant vP483, dat het EHV-1 gp13 gen (figuur 3) bevat.

Constructie van vaccinia virus recombinanten.

Werkwijzen voor transfectie van recombinant donorplasmiden in weefselcultuurcellen geïnfecteerd met een 25 gered vaccinia virus en identificatie van recombinanten door in situ hybridisatie op nitrocellulosefilters werd op een hiervoor beschreven wijze uitgevoerd (25,28). Ter constructie van vP425 waarin het E. coli β-galactosidase gen de vaccinia HA coderingsvolgorden vervangt, werd het plasmide DNA (25 pg pSD466VCBGA in HeBS (16)) geëlektroporeerd (Biorad Gene Pulser, capaciteit 960, 200 volt) in VERO cellen. Subconfluent monolagen van cellen werden 1 uur voor het gebruik geïnfecteerd tot 10 pfu/cel met 30 vP410. De geïnfecteerde cellen werden gewonnen met trypsine en voor de elektroporatie gewassen met HeBS. De cellen werden 24 uur geïncubeerd in MEM + 5% foetaal runderserum bij 37°C, gewonnen en progeny virus plated op VERO monolagen. Recombinant virus β-galactosidase tot expressie brengend werd gedetecteerd als blauwe plaques in aanwezigheid van X-gal substraat (9,24) Ter vorming van recombinant vaccinia virus waarin het EHV-1 gp13 het β-galactosidase gen in vP425 vervangt, werd een overeenkomstig 35 protocol gevolgd, behalve dat het donorplasmide pVHA6g13 en het reddende virus vP425 was. De vaccinia recombinant vP483, bevattende EHV-1 gp13, werd gedetecteerd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal en bevestigd als een echte recombinant door DNA-hybridisatie na 3 cycli van plaquezuivering.

Expressie van het EHV-1 gp13 gen op het oppervlak van cellen geïnfecteerd met het recombinant vaccinia 40 virus vP483.

BSC-40 cellen werden geënt op glazen dekplaatjes van 22 mm in schalen van 35 mm met 5 x 105 cellen/schaal. Bij ongeveer 80% samenvloeiing werden de dieren geïnfecteerd met 2 pfu/cel. Na een adsorptieperiode van een uur werd de virusentstof verwijderd en werd MEM plus 2% foetaal runderserum toegevoegd. 20 uur na infecteren werden de dekplaatjes gewassen met een met fosfaat gebufferde 45 zoutoplossing (PBS) die 0,2% BSA en 0,1% NaN3 (PBS+) bevatte en blootgesteld aan 0,1 ml anti-gp13 monoklonaal antilichaam, 14H& (3) verdund tot een duizendste in PBS+. Na 1 uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur werden de cellen driemaal gewassen in PBS+. Deze procedure werd herhaald met fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerd geit anti-muis IgG. Tenslotte werden de cellen 20 minuten in 2%-ige paraformaldehyde in PBS gefixeerd. De dekplaatjes werden gemonteerd in 80% glycerol in PBS 50 bevattende 3% n-propylgallaat en de fluorescentie werd met behulp van een microscoop waargenomen.

Het eiwit voorspeld uit de DNA volgorde heeft de typische kenmerken die kenmerkend zijn voor een membraan overspannend glycoproteïne (14). Bij een productieve EHV-1 infectie wordt dit gp13 glycopro-teïne opgenomen in de verschillende membraansystemen van de cel en wordt getransporteerd in het cytoplasmische membraan en kan op het uitwendige oppervlak van de geïnfecteerde cel worden aange-55 toond. EHV-1 gp13 is bovendien een bestanddeel van het EHV-1 virion. Daarom werden immunofluorescen-tieonderzoekingen uitgevoerd ter bepaling of EHV-1 gpl3 tot expressie gebracht door het vaccinia virus recombinant, vP483, eveneens op het cytoplasmische membraan van geïnfecteerde cellen aanwezig was.

11 195085 (BamHI-H) gebied, onder toepassing van overlappende sub-klonen onder toepassing van het gemodificeerde T7 enzym SEQUENASE (40) (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH). Standaard didesoxy ketenbeëindi-gende reacties (33) werden uitgevoerd op dubbelstrengs plasmidematrijzen die waren gedenatureerd in een alkali. De M13 voorwaartse en omgekeerde primers werden toegepast ter verkrijging van de aanvankelijke 5 volgorde van elke kloon. Custom 16-17-mer primers, gesynthetiseerd onder toepassing van standaard-chemie (Biosearch 8700, San Rafael, CA; Applied Biosystems 380B, Foster City, CA) werden toegepast bij het gaan langs het overblijvende fragment. Het IBI Pustell volgorde-analyseprogramma werd bij alle analyses ter bepaling van de volgorde toegepast (29).

DNA sequence analyses gaven een open afleesframe van 1.404 bp coderende voor 468 aminozuren met 10 een voorspeld primair translatieproduct van 50,9 kDa. Een significante aminozuurhomologie in de carboxyl-helft van het vermeende gp13 open afleesframe werd waargenomen bij gC van de herpes simplex virussen type 1 en type 2, gill van het pseudorabies virus en gpV van het varicella-zoster virus suggererende dat gp13 een lid was van de gC achtige glycoproteïnen van herpesvirussen. Een verdere uitvoerige analyse van het EHV-1 gp13 open afleesframe werd aangeboden in een voorgaande publikatie (2). Ter vergemakkelij-15 king van de beschrijving van het klonen en de expressie van het EHV-1 gp13 in vaccinia virus vectoren zijn het gp 13 open afleesframe plus extra 5' en 3' volgorden weergegeven in figuur 2. In figuur 2 zijn een vermoedelijke TATA box en aminozuren die vermeende signalen en membraanankerelementen bevatten onderstreept. De potentiële splitsingsplaats van de signaalvolgorde is aangegeven met een pijl die het splitsingssignaal ASA (open cirkels) volgt. Potentieel zijn er negen N-verbonden glycosyleringsplaatsen in de 20 signalen ankervolgorden, zoals is gedefinieerd door het Asn-XSer/Thr motief (sterretjes).

Klonering van het EHV-1 gp13 gen in een vaccinia virus donorplasmide.

Een vroeg-laat vaccinica viruspromotor, H6, werd toegepast voor de expressie van vreemde genen in pluimveepokkenvirusvectoren (41, 42). Dit promotoreiement correspondeert met de DNA volgorden 25 onmiddellijk stroomopwaarts van het H6 open afleesframe in het vaccinia Hindlll-H fragment (31).

Onder verwijzing nu naar figuur 3, werden ter mutering en invoeging van het H6 promotor in pSD467VC oligonucleotiden H6SYN oligos A-D gesynthetiseerd. De volgorde van H6SYN oligos A-D, met gemodificeerde base zoals is onderstreept en restrictieplaatsen zoals is aangegeven, is als volgt:

Bglll

30 5'-GATCTCTTTATT CTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTT 3' -AG AAAT AAG AT AT G AATTTTT CACTTTT AT TT AT GTTT CCAAG AACT CCCAA

GT GTT AAATT G AAAGCG AG AAAT AAT CAT AAATT ATTT CATT AT CGCG AT AT CCGTT AA CACAAT1T AACTTTCGCTCTTT ATT AGTATTT AAT AAAGT AAT AGCGCTAT AGGCAATT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 GTTT GT AT CGT ACCC-3' 2 CAAACAT AGCAT GGG:5'' 3

Smal 4

De onderstreepte basen duiden op modificatie van de natieve H6 promotorvolgorde.

5

Het 130 bp volle lengte, dubbelstrengs DNA gevormd door annealing van H6SYN oligos A-D werd 6 gezuiverd door elektroelutie uit een agarosegel en verbonden met 0,5 Kb Smal/Hindlll en 3,1 Kb Bglll/ 7

Hindlll fragmenten afgeleid van pSD467VC. Het verkregen plasmide, pTP15 (184), heeft de ATG initiatieco- 8 don gemodificeerd tot CCC als deel van de Smal plaats, die onmiddellijk wordt gevolgd door een Psti 9 plaats. Een Nsil linker, 5'-TGCATGCATGCA-3', (New [England Biolabs, Beverly, MA) werd ingevoegd op de 10

Smal plaats van pTP15 ter vorming van het plasmide pNSI.

11

Een EHV-1 EcoRI/Narl fragment waarin de EcoRI plaats is 120 bp stroomopwaarts van de ATG initiatie 12 codon en waarin de Na_rl plaats is 23 bp stroomopwaarts van het TAG terminatie codon van EHV-1 gp 13 13 werd gekloneerd in faag M13mp19 onder vorming van de recombinantfaag Ml3EcoRNar. Onder toepassing 14 van oligonucleotide-gerichte mutagenese (17) werd een Nsil plaats geïntroduceerd door verandering van de 15 volgorde TTGCCT (basen 130-135 in figuur 2) in het EHV-1 gp13 gen in ATGCAT. Het EcoRI/Narl fragment 16 uit mutantfaag M13EcoRNar werd gekloneerd in pUC8 bij de EcoRI/Narl plaatsen onder vorming van het 17 plasmide pNSIEN, 18

Twee 42-mer oligonucleotiden werden gesynthetiseerd met de volgende, met de aangeduide restrictie 19 plaatsen, volgorde: 20

Narl gp13 3' einde Ndel 21 5'-CGCCGTACAAGAAGTCTGACTTTTAGATTTTTATCTGCAGCA-3' 3' -GGCATGTT CTTCAG ACT GAAAATCT AAAAATAG ACGTCGT AT-5'

Pstl 13 195085

Anti-gp 13 specifiek monoklonaal antilichaam gevolgd door fluoresceïne-geconjugeerd geit anti-muis IgG gaf een slerke membraan immunofluorescentie in met vP483 geïnfecteerde cellen doch niet in met vaccinia virus vP410 geïnfecteerde cellen. Dit doet vermoeden dat het EHV-1 gp13 tot expressie gebracht door het recombinant vaccinia virus vP483 aanwezig is op het cytoplasmische membraan, zoals verwacht werd voor 5 de authentieke synthese van een membraan overspannend glycoproteïne.

Immunoprecipitatie van EHV-1 gpl3 producten gesynthetiseerd uit met recombinant vaccinia virus vP483 geïnfecteerde cellen.

Twee miljoen cellen die een samenvloeiende monolaag in een schaal van 60 mm vormden werden 10 geïnfecteerd met 10 pfu/cel. Het enten werd uitgevoerd in een medium dat geen methionine bevatte. Na de adsorptieperiode, werd de entstof verwijderd en werd 2 ml geen methionine bevattend medium bevattende 20 μ Ci/ml 1S-methionine toegevoegd. Men liet de infectie 24 uur verlopen waarna de cellen werden gelyseerd door toevoeging van 1 ml van 3 x buffer A bevattende 3% NP-40, 30 mM Tris pH 7,4, 450 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,03% natriumazide en 0,6 mg/ml PMSF. De gelyseerde cellen en de bovenstaande 15 vloeistof werden gewonnen, geroerd en geklaard door 15 minuten te centrifugeren bij 10.000 g.

Proteïne A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Cat. No.17.0780.01) werd bereid als een 1:1 suspensie in 1X Buffer A. Een rat anti-muis conjugaat (Boehringer Mannheim, Cat. No. 605 500) werd verdund tot 1:100 in de suspensie en 4 uur bij kamertemperatuur onder schudden gebonden aan de kralen. Daarna werden de kralen goed gewassen met 6 wasporties van 1 ml in buffer A, ter verwijdering van het niet-gebonden 20 conjugaat. Een monoklonaal antilichaam specifiek voor gp13 werd daarna gedurende 4 uur bij kamertemperatuur aan de kralen gebonden. De overmaat antilichaam werd door goed wassen verwijderd. 1 ml van het geklaarde, geïnfecteerde cellysaat werd van te voren geklaard door incubatie met Proteïne A-Sepharose kralen waaraan normaal muizenserum was gebonden. Deze kralen werden door centrifugeren verwijderd. Daarna werd 1 ml van het geklaarde, voorgeklaarde lysaat gemengd met 100 pl van de kralen waaraan het 25 specifieke, monoklonale antilichaam was gebonden. Dit mengsel werd 4 uur bij kamertemperatuur geschud. Daarna werden de kralen door centrifugeren verwijderd en innig gewassen door viermaal wassen in 1X Buffer A en tweemaal wassen in 10 mM Tris pH 7,4 bevattende 0,2 M LiCI en 2M ureum. Daarna werd het antilichaam-antigeencomplex van de kralen verwijderd en verbroken door toevoeging van 50 pl 2 x Laemmli Disrupting Solution (60,195). Vervolgens werd het monster voor de elektroforese 5 minuten gekookt.

30 Er zijn twee producten van ongeveer 44 en 47 kDa die kunnen worden aangetoond en die enigszins kleiner zijn dan het voorspelde primaire translatieproduct (51 kDa) en een groter product van ongeveer 90 kDa dat overeenkomt met een volledig geglycosyleerde vorm van het EHV-1 gp13 genproduct. Geen equivalente polypeptiden werden uit met controle, vaccinia virus geïnfecteerde cellen neergeslagen.

35 Voorbeeld 2

Constructie van vaccinia virus recombinanten die het paard herpesvirus gp14 glycoproteïne tot expressie brengen.

Vervanging van het M2L gen in vaccinia virus door het E. coli β-galactosidase gen.

40 Teneinde de EHV-1 gp14 coderende volgorden in een vaccinia virusvector in te voegen, werd een recombinant vaccinia virus vP458, dat het E. coli LacZ gen tot expressie brengt, geconstrueerd. Substitutie van de LacZ coderende volgorden in het recombinantvirus, vP458, door de volgorden die EHV-1 gp14 coderen, maakt een blauw tot kleurloos plaque onderzoeksysteem voor het identificeren van EHV-1 gp14 bevattende recombinantvirussen (9,24) in aanwezigheid van X-gal, een chromogeen 45 β-galactosidasesubstraat, mogelijk. Bovendien werd, met de bedoeling van het construeren van vaccinia virusrecombinanten die zowel EHV-1 gp14 als EH-1 gp13 tot expressie brengen, een invoegingsplaats voor EHV-1 gp14 uniek uit de hemagglutinine deleted plaats toegepast voor het invoegen van EHV-1 gp13 in voorbeeld 1 bereid op de M2L plaats van Hindlli M. De volledige coderende volgorde van het M2L gen in het vaccinia Hindlli M fragment werd verwijderd en vervangen door het E. coH LacZ gen coderende 50 β-galactosidase. De kloneringsstappen voor de constructie van vP458 zijn schematisch weergegeven in figuur 4.

Onder verwijzing nu naar figuur 4 wordt opgemerkt, dat een open afleesframe lezende van rechts naar links ten opzichte van het vacciniagenoom en coderende voor een vermeend eiwit van 220 aminozuren volledig binnen het Hindlli M fragment van de Kopenhagenstam van het vaccinia virus links van, de unieke 55 Bglll plaats is geplaatst. Volgens de conventie (31) werd dit gen, dat onmiddellijk rechts van M1L (58) is geplaatst, met M2L aangeduid. Deletieonderzoekingen gericht op het vaccinia (WR) genoom dat zich links van de unieke Bcjjll plaats in het Hindlli fragment M (57) uitstrekt, geven aan dat met vaccinia coderende 195085 14 volgorden aanwezig in Hindlll M links van de Bglll plaats niet essentieel voor de replicatie van het virus in een weefselcultuur zijn.

Ter vergemakkelijking van de toepassing van het M2L gebied als invoegingsplaats voor vreemde genen, werd een plasmidenvector, pMP409DVC, gevormd waarin de volledige M2L coderende volgorde op de 5 volgende wijze was vervangen door een Bglll plaats. pSD409VC, dat bestaat uit het Kopenhagen vaccinia Hindlll M fragment gekloond op de Hindlll plaats van pUC8, werd gedigereerd met BamHI/BgIll en zelf gebonden, aldus verwijderend het rechter uiteinde van HindllIM en opheffing van de Bglll plaats. Het verkregen plasmide, pMP409BVC werd lineair gemaakt met Sphl, dat knipt in het M2L open afleesframe en werd 2 minuten onderworpen aan Bal-31 exonuclease digerering. Mutagenese werd uitgevoerd op het 10 verkregen DNA (19) onder toepassing van een synthetisch 49 mer (5'-TTTCTGTATATTTGCAACAA- I I IAGATCTTACTCAAAATATGTAACAAT- 3', Bglll plaats onderstreept). In het gemutageniseerde plasmide pMP409DVC werden de M2L coderende volgorden uit plaats +3 tot het einde van het open afleesframe verwijderd. De G van het initiatiecodon ATG werd gewijzigd in een C ter vorming van een unieke Bglll plaats (AGATCT) op het deletieknooppunt.

15 Een 3,2 Kb BglIl/BamHI partieel fragment, bevattende 3,1 Kb van het E. coli β-galactosidase gen tussen de BamHI plaatsen van pMCl871 (34) onder de transcriptionale controle van de 0,1 Kb vaccinia 11 kDa late promotor (7) werd gekloneerd in de unieke Bglll plaats van pMP409DVC. Een recombinantplasmide dat de 11 kDa promotor/[3-galactosidase gencassette in de rechter tot linker oriëntatie ten opzichte van flankerende vaccinia armen en genoom bevatte werd met pMP409DVCBG aangeduid. pMP409DVCBG 20 werd toegepast als donorplasmide voor recombinatie met gered vacciniavirus, vP410, beschreven in voorbeeld 1. De nieuwe vacciniarecombinant, aangeduid met vP458, tot expressie brengend het β-galactosidasegen ingevoegd op de M2L deletieplaats, werd gedetecteerd onder toepassing van het chromogene X-gal substraat (9.24) en gezuiverd door herhaalde plaque-klonering.

25 Kloneren van het EHV-1 gp14 gen.

Onder verwijzing nu naar figuur 5, omspant de EHV-1 gp14 coderende volgorde de binding tussen de BamHI restrictiefragmenten a en i (3). De EHV-1 DNA fragmenten BamHI-a (21,3 Kb) en i (7,1 Kb) (59) werden geïsoleerd uit agarosegelen. Plasmide pUC (BamHI-i) werd gevormd door invoeging van het EHV-1 BamHI-i fragment in plasmide pUC8 bij de BamHI plaats. Het EHV-1 BamHI-a fragment werd gedigereerd 30 met EcoRI en gebonden in met EcoRI/BamHI gedigereerde pUC8. Plasmide pUC (BamHI-a/EcoRI) bevat een 10 Kb EHV-1 BamHI/EcoRI inlas. Op basis van de vermelde fragmentafmetingbepalingen (59), wordt opgemerkt dat de DNA volgorden in dit invoegsel grenzen aan die van het BamHI-i fragment in het EHV-1 genoom. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Nucleotide sequence analyses.

2

Nucleotide sequence analyses werden uitgevoerd onder toepassing van verschillende subklonen uit pUC

3 (BamHI-a/EcoRI) en pUC (BamHI-i) plasmiden. Sequencing van het plasmide pUC (BamHI-a/EcoRI) werd 4 uitgevoerd op de BamHI plaats, omdat het EHV-1 gp14 gen de BamHI-a/i verbinding omspant (3). De 5 oriëntatie van het pUC (BamHI-i) plasmide werd bepaald door digereren met restrictie-enzym. Aangezien 6 het EHV-1 BamHI eindstandige gedeelte het dichtst bij de EcoRI plaats in pUC (BamHI-i) de BamHI plaats 7

bij de BamHI-a/i verbinding bleek te zijn, werd sequencing van het fragment begonnen vanaf dit BamHI

8 einde.

9

Sequence-waarden voor beide strengen werden op de wijze als beschreven in voorbeeld 1 verkregen.

10

De nucleotidevolgorde van het 3.351 bp fragment bevattende de EHV-1 gp14 coderende volgorde is 11 weergegeven in figuur 6. De nummering van de linker en rechter grenzen geldt voor respectievelijk de 12 aminozuur- en nucleïnezuurvolgorde. De vermeende CAT en TATA rechthoeken zijn onderstreept.

13

Aminozuren in het signaal en membraan overspannende gebied zijn eveneens onderstreept met de pijl die 14 een potentiële signaalpeptidesplitsingsplaats aangeeft. De dertien potentiële glycosyleringsplaatsen onder 15 toepassing van de consensusvolgorde (Asn-X-Ser/Thr) zijn door een sterretje aangeduid.

16 DNA sequence analyses duiden op een open afleesframe dat zich uitstrekt van de nucleotideplaatsen 17

300 tot 3239 aflezende van links naar rechts ten opzichte van het EHV-1 genoom, dat wil zeggen het ATG

18 startcodon was aanwezig in het BamHI-a/EcoRU fragment en het stopcodon TAA was aanwezig in het 19

BamHI-i fragment (3,59).

20

Vermoedelijke transcriptionale regelsignalen werden aangetroffen in het 5' gebied van het ATG

21 initiëringscodon op plaats 300. Een TATA rechthoek met de volgorde AAATATAT (nucleotiden 148 tot 155) was 70 nucleotiden stroomafwaarts van een vermoedelijke CAT rechthoek op de plaatsen 71-77 met de volgorde GGTCAAT geplaatst. Een polyadenyleringssignaal AATAAA (nucleotiden 3251-3256) was 15 195085 8 nucleotiden stroomafwaarts van de TAA terminatiecodon (nucleotiden 3240-3242) geplaatst. Negen van de elf nucleotiden in de volgorde 5'-TCCTGCGCGCA-3' (de nucleotiden 218-228) zijn complementair aan de 18S ribosomale RNA volgorde 3'-AGGAAGGCGT-5' (61) en kunnen dienen als de ribosoombindings-plaats.

5

Analyse van de EHV-1 gQ14 structuur.

Het EHV-1 gp14 open afleesframe codeert voor 980 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 109,8 kDa. Analyse van de aminozuurvolgorde duidt op een aantal kenmerken die gebruikelijk zijn voor membraan-geassocieerde glycoproteïnen. Een gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 58 tot 99 had 10 een kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en het is voorgesteld dat dit de signaalvolgorde is (figuur 6). Een ongebruikelijk aspect van het EHV-1 gp14 genproduct is dat de lange hydrofobe signaalvolgorde wordt voorafgegaan door een lange hydrofiele volgorde. Dit kenmerk is eveneens opgemerkt voor het pseudora-bies virus (PRV) gil (62) en voor het runderherpesvirus 1 (BHV-1) gl gen (63), welke beide eveneens HSV gB homologen zijn. Voorspeld is dat een hydrofoob gebied bestaande uit 45 aminozuren (de aminozuren 15 826-870) functioneert als een transmembraan ankergebied. Het hydrofiele cytoplasminegebied bevat 110 aminozuren.

Er zijn elf Asn-X-Thr/Ser (waarin X elk aminozuur, uitgezonderd proline kan zijn) plaatsen voor potentiële, met N-verbonden, glycosylering (64). Een ongebruikelijk aspect is dat er eveneens twee potentiële glycosyleringsplaatsen in het cytoplasmische gebied zijn (figuur 6).

20 Een hydrofieliciteitsgrafiek van de EHV-1 gp14 coderende volgorde is weergegeven in figuur 7. De hydropathie-index van EHV-1 gp14 is berekend met de methode van Kyte en Doolittle (65) met een raam van zeven aminozuren zonder veteffening. De punten onder de horizontale lijn geven oppervlakken met een grotere hydrofobiciteit aan, waarvoor het potentiaal signaal en/of membraan ontspannende gebieden zijn aangegeven. De kenmerken van een membraan omspannend glycoproteïne omvatten signaal- en 25 ankerelementen en het lange hydrofiele gebied dat voor de signaalvolgorde komt zijn aangetroffen voor de EHV-1 gp14 coderende volgorde.

Lokalisatie van de antigene determinant herkend door het anti-EHV-1 gp14 monoklonale antilichaam, 3F6. Lambda gt11 expressievectoren en monoklonale antilichamen waren bruikbaar voor de identificatie van 30 EHV-1 DNA volgorden coderende voor de belangrijkste EHV-1 glycoproteïnen (3). Een lambda gt11 recombinant, 4a1, bleek een EHV-1 gp14 epitoop tot expressie te brengen, herkend door het specifieke, monoklonale antilichaam 3F6 (3). Teneinde de identiteit van dit epitoop te bepalen, werd het EHV-1 DNA aanwezig in 4a1 sequenced en vergeleken met de DNA volgorde van de EHV-1 gp14 coderende volgorde (figuur 6). Ter sequencing werd het DNA fragment overeenkomende met het EHV-1 gp14 epitoop in het 35 λ gt11 recombinant 4al herkend door anti-EHV-1 gp14 monoklonaal 3F6 (3) 4al gedigereerd met EcoRI, het EHV-1 fragment geïsoleerd op agarosegelen en gebonden aan de EcoRI plaats van pUC8. DNA sequencing werd op de hiervoor beschreven wijze uitgevoerd met de M13 universele voorwaartse en reverse primers.

Uit de nucleotidevolgorderij blijkt dat dit epitoop aanwezig was binnen het gebied van de 66 aminozuren 40 overeenkomende met 107 (Thr) - 172 (Val) van het gededuceerde primaire translatieproduct. Het epitoop is dus binnen het amino-eindstandige gedeelte van het gededuceerde EHV-1 gp14 oppervlaktegebied geplaatst.

Vergelijking van de EHV-1 gp14 aminozuurvolgorde met andere herpesvirus glycoproteïnen.

45 Vergelijking van de aminozuursamenstelling van het EHV-1 gp14 gen openbaarde een grote homologie met glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo is het EHV-1 gp14 homoloog met gil van PRV (62), gl van BHV-1 (63), gil van het varicella-zoster virus (VZV) (66), gB van hel herpes simplex virus (HSV) (67,71,72) evenals met glycoproteïnen in het Epstein-Barr virus (EBV) (68) en humaan cytomegalovirus (HCMV) (10).

50 Oliqonucleotide-gerichte mutagenese van het 5'-eindstandige gedeelte van de EHV-1 gp14 coderende volgorde.

Onder verwijzing weer naar figuur 5, werd plasmide Blue (Knpl/BamHI) gevormd door invoeging van een Kpnl/BamHI fragment uit pUC (BamHI-a/EcoRI) in het plasmide Bluescript SK+ gedigereerd met Kpnl/ BamHI. Oligonucleotide gerichte mutagenese werd uitgevoerd volgens een modificatie van de werkwijze van 55 Kunkel (17) onder toepassing van uracil-bevattende DNA matrijzen uit plasmide Blue (Kpnl/BamHI) gevormd in de dut ung gastheer E. coli stam CJ236. In het gemutageniseerde plasmide werd een Nsil plaats bij codons 1 en 2 van het EHV-1 gp14 gen gevormd, waarbij de volgorde ATG/TCC (Met/Ser) werd veranderd 195085 16 in ATG/CAT (Met/His). De gemuteerde volgorde werd bevestigd met DNA sequence analyse. Het Kjonl/ BamHI fragment uit de mutant werd overgebracht naar met Kgnl/BamHI gedigereerd pUC18 onder vorming van het plasmide pUC (Kpnl/BamHI).

Een plasmide, pUCg14 , dat het volledige EHV-1 gp14 gen met de Nsil plaats mutatie bevatte werd 5 gevormd door invoeging van het EcoRI/BamHI fragment uit pUC (Kpnl/BamHI) en met EcoRI/BamHI gedigereerd pUC (BamHI/Pstl), een 3,9 Kb subkloon van pUC (BamHI-i).

Constructie van het chimere donorplasmide van pVM2LH6g14.

pMP409DVC werd geknipt met Bglll en verbonden met synthetisch, dubbelstrengs DNA dat de gemodifi-10 ceerde vaccinia H6 (vroeg/laat) promotor bevatte, beschreven in voorbeeld 1, geflankeerd door restrictie-plaatsen. De restrictieplaatsen voor Nsil, Sacl, Pstl en EcoRI werden onmiddellijk stroomafwaarts van het endogene initiatiecodon in de H6 promotor gevormd. In pMG11 is de polylinkervolgorde stroomafwaarts van de H6 promotor ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. De unieke Nsil plaats, bevattende het H6 initiatiecodon (onderstreept), wordt onmiddellijk gevolgd door de unieke Sacl, Pstl en EcoRI plaatsen.

15 Het FcoRI/Nsil DNA fragment uit pUCg14 bevattende het EHV-1 gebied stroomafwaarts van de EHV-1 gp14 initiatiecodon werd vervangen door het EcoRI/Nsil fragment uit plasmide pMG11, aldus vormende plasmide pMRHg14. dat de rechter arm van vaccinia Hindi11 M, de H6 promotor en de volledige lengte van het EHV-1 gp14 gen bevat. Het Hpal/Pstl EHV-1 gp14 bevattende fragment van het plasmide pMRHg14 werd overgebracht naar het vectorplasmide pMG11 geknipt met Hpal/Pstl, onder vorming van plasmide 20 pVM2LH6g14. pVM2LH6g14 bevat de volledige EHV-1 gp14 coderende volgorde (met codon 2 veranderd van TCC (Ser) in CAT (His) zoals is aangegeven en ongeveer 1,2 Kb EHV-1 DNA stroomafwaarts van het EHV-1 gp14 gen) onder de controle van de H6 promotor, ingevoegd in een rechts tot links oriëntatie met betrekking tot flankerende vacciniavolgorden ten opzichte van het vacciniagenoom met als doelwit het invoegen van het EHV-1 gp14 gen op de M2L plaats.

25 Recombinatie werd uitgevoerd onder toepassing van vP458 als reddend virus en pVM2LH6g14 als donorplasmide. Kleurloze plaques werden uitgezócht en geanalyseerd op de aanwezigheid van EHV-1 gp14 coderende volgorden onder toepassing van een specifieke EHV-1 gp14 probe gelabeld met 3?p. Na herhaald plaque-kloneren werd de vaccinia recombinant aangeduid met vP577.

30 Truncatie van de EHV-1 gpl4 hydrofiele aanloopseguencies.

Onder toepassing van variaties van de mutagenese en kloningsmanipulaties, zoals hiervoor is beschreven, werd chimeer donorplasmide pVM2LH6g14-1 geconstrueerd. Ter verkrijging van pVM2LH6g14-1, dat een deletie van de codons 2-34 van EHV-1 gp14 met de substitutie van vier codons, bevat, werd in vitro mutagenese (17) uitgevoerd op plasmide Blue (Kpnl/BamHI), onder vorming van een Nsil plaats in codons 35 32-34 in plaats van in codons 1 en 2. Het Nsil/BamHI fragment uit het nieuw gemutageniseerde Blue (Kpnl/BamHI) plasmide werd gesubstitueerd voor het Nsil/BamHI fragment in pVM2LH6g14. Veelvuldige Nsil linkers (New England Biolabs, Beverly, MA) werden gebonden op de Nsil plaats, teneinde het oorspronkelijke ATG in frame te brengen met de rest van de EHV-1 gp14 coderende volgorde. Het uiteindelijk verkregen plasmide, pVM2LH6g14-1, bevat de volgorde ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/ 40 GCT....coderende voor Met/His/Ala/Cys/lle/Ala......waarin GCT (Ala) is codon 35 van EHV-1 gp14. De rest van het pVM2LH6g14-1 is identiek aan dat in pVM2LH6g14.

Het vaccinia recombinant vP613 werd verkregen door recombinatie met het reddend virus vP548 en het donorplasmide pVM2LH6g14-1.

45 Voorbeeld 3

Constructie van vaccinia virus recombinanten vP633 en vP634 die elk het paard herpesvirus gp13 en gpt4 glycoproteïne tot expressie brengen.

Teneinde vaccinia recombinanten te vormen die te zowel gp13 als gp14 EHV-1 glycoproteïnen tot expressie brengen, werd de recombinatie uitgevoerd met vP577 of vP613 als reddend virus en het donorplasmide 50 pVHA6g13 (beschreven in voorbeeld 1) dat het EHV-1 gp13 gen onder de controle van de vaccinia H6 promotor ingevoegd op de HA deletieplaats van vaccinia bevat. Het invoegen van de EHV-1 gp13 volgorden in recombinantvirussen werd geïdentificeerd door in situ DNA hybridisatie (25,28). Recombinatie van pVHA6g13 met vaccinia virus recombinant vP577 (bevattende EHV-1 gp14 in volle lengte) vormde de dubbele vaccinia virus recombinant vP633; recombinatie met vP613 (bevattende het truncated EHV-1 gp14) 55 vormde de dubbele vaccinia recombinant vP634. De vaccinia virus dubbele recombinanten vP633 en vP634 werden in plaque gekloond en de aanwezigheid van zowel EHV-1 gpl3 als gp14 coderende volgorden werden bevestigd door DNA hybridisatieanalyse en door expressieonderzoekingen (zie hierna).

17 195085

Immunoprecipitatie van EHV-1 gp13 en gp14 glycoproteïnen tot expressie gebracht in vaccinia virus recombinanten.

Ter bepaling van de EHV-1 gp13 en gp14 glycoproteïnen tot expressie gebracht door vaccinia virus recombinanten, werden VERO cellen geïnfecteerd met de recombinanten en eiwitten metabolisch gemerkt 5 met 35S-methionine en, zoals beschreven in, voorbeeld 1, geïmmunoprecipiteerd. Het specifieke monoklo-nale antilichaam voor EHV-1 gp13 (14H7) of EHV-1 gp14 (3F6) (3) werd in een verdunning van 1:1000 gedurende 4 uur gebonden bij kamertemperatuur. Monsters werden geanalyseerd door SDS polyacrylamide gelelektroforese op een 10% polymeergel bij 30 rnA (constante stroom) gedurende ongeveer 6 uur. Autoradiogrammen werden gemaakt.

10 Geen belangrijke producten werden geïmmunoprecipiteerd door het specifieke anti-EHV-1 gp13 monoklonale 14H7 (3) of door het specifieke anti-EHV-1 gp14 monoklonale 3F6 (3) uit hetzij niet geïnfecteerde VERO cellen of VERO cellen geïnfecteerd met het controle hemagglutinine minus vaccinia virus vP452 (184). Met EHV-1 gp 13 geradiolabelde producten werden neergeslagen met monoklonaal 14H7 uit VERO cellen geïnfecteerd met vP483, een vaccinia recombinant die slechts het EHV-1 gp13 tot expressie 15 brengt of de vaccinia virus dubbele recombinanten die zowel EHV-1 gp 13 met hetzij intact gp14, vP633, hetzij getrunceerd gpl4, vP634 tot expressie brengt. Er zijn twee producten van ongeveer 44 en 47 kDa die kunnen worden aangetoond, die enigszins kleiner zijn dan het voorspelde primaire translatieproduct (51 kDa) en een groter product van ongeveer 90 kDa dat overeenkomt met een volledig geglycosyleerde vorm van het EHV-1 gp13 genproduct. Het is belangrijk dat de kwaliteit en kwantiteit van de expressie van EHV-1 20 gpl3 niet wordt beïnvloed door co-expressie van een van de vormen van EHV-1 gp14 in de vaccinia dubbele recombinanten vP633 en vP634.

VERO cellen werden geïnfecteerd met respectievelijk vP633, vP634, vP613 en vP577 en geïmmunoprecipiteerd met het specifieke anti-EHV-1 gp14 monoklonale 3F6 (3). Met vP633 (bevattende gp14 met volle lengte plus gp13) en met vP577 (bevattende gp14 met volle lengte), werden hoofdbanden bij ongeveer 34, 25 47, 60-64 en 90 kDa waargenomen; terwijl met vP634 (bevattende truncated gp14 plus gp13) en met vP613 (bevattende truncated gp 14) hoofdbanden bij 34, 47, 57, 72-82 en 116 kDa werden waargenomen. Ook nu weer werden geen significante verschillen bij de synthese van EHV-1 gp14 van elke vorm tijdens de co-expressie met EHV-1 gpl3 waargenomen.

30 Immunofluorescentieanalvses van EHV-1 gp13 en gp14 producten gesynthetiseerd door recombinant vaccinia virussen.

Immunofluorescentie van met recombinant vacciniavirus geïnfecteerde VERO cellen werd uitgevoerd op de wijze als beschreven in voorbeeld 1, onder toepassing van EHV-1 gp13 of gp14 specifieke monoklonale antilichamen.

35 EHV-1 gp13 kon gemakkelijk worden aangetoond op het oppervlak van VERO cellen geïnfecteerd met de vaccinia recombinanten vP483, vP633 en vP634 evenals intern na fixatie met aceton. Geen significante interne of oppervlakimmunoreactiviteit ten opzichte van gp13-specifieke antilichamen werd aangetroffen in met vP410, vP577 of vP613 geïnfecteerde cellen. Expressie van EHV-1 gp14 kon makkelijk worden aangetoond in met aceton gefixeerde VERG cellen geïnfecteerd met de vaccinia recombinanten vP577, 40 vP613, vP633 en vP634. Geen significante interne immunofluorescentie ten opzichte van gp14-specifieke antilichamen werd gevonden bij met vP410 of vP483 geïnfecteerde cellen. Onder toepassing van gp14-specifieke, monoklonale antilichamen, 3F6, werd een zwakke oppervlak immunofluorescentie waargenomen in cellen geïnfecteerd met vP613 of vP634, die de truncated vorm van EHV-1 gp14 tot expressie brengen en geen significante oppervlakrespons boven de controle virussen vP410 en vP483 werd verkregen met de 45 recombinant vaccinia virussen vP577 en vP633, welke het EHV-1 gp14 gen met volle lengte tot expressie brengen (zie eveneens voorbeeld 8).

Voorbeeld 4

Immunisatie van guinese biggetjes met de vaccinia recombinant vP483.

50 Ter bepaling van de immunogeniciteit van het gp13 paard herpes virus genproduct tot expressie gebracht door de vaccinia recombinant vP483, werden guinese biggetjes ingeënt met het virus en de aanwezigheid van serum neutraliserende antilichamen tegen zowel vaccinia virus als runder herpesvirus werd onderzocht.

Men verdeelde 15 guinese biggetjes met een gewicht van ongeveer 450 gram in groepen van vijf. Eén groep ontving 1 ml van de vaccinia recombinant (108TCIDso/ml) op dag 0 gevolgd door een 1 ml booster op 55 dag 21 door subcutane injectie. De tweede groep ontving overeenkomstige inentingen doch met vaccinia vP452 (108TCID5O/ml). De derde groep werd niet gevaccineerd. Men nam voor de eerste vaccinatie en op de dagen 21 en 35 bloed van alle guinese biggetjes af. Men bereidde sera en onderzocht op de aanwezig- 195085 18 heid van neutraliserende antilichamen van zowel vaccinia ais EHV-1 (stam Kentucky), onder toepassing van 50 TCICb0 virus onderzocht met varkens testiculaire cellen.

Zoals uit tabel blijkt wekt de EHV-1 gp13 vaccinia recombinant vP483 een duidelijke seroconversie bij guinese biggetjes op. Serum neutraliserende titers verkregen met vaccinia virus zijn aangegeven tussen 5 haken in tabel 1. Zowel vaccinia als EHV-1 serum neutraliserende antilichamen kunnen 21 dagen na de eerste injectie worden aangeloond en een signiticante toename van de titer van serum neutraliserende antilichamen wordt twee weken na een tweede inenting van virus op dag 21 verkregen. Er wordt op gewezen dat de serum vaccinia neutraliserende titers verkregen bij guinese biggetjes die zijn ingeënt met het recombinantvirus dat EHV-1 gp13 tot expressie brengt significant hoger zijn (t = 7,2) dan de titers 10 verkregen uit guinese biggetjes die met het vaccinia vP452 zijn ingeënt.

TABEL 1

Serum neutraliserende antilichamen die aanwezig zijn in guinese biggetjes die zijn ingeënt met hetzij een vaccinia recombinant die EHV-1 gp13 tot expressie brengt of een controle vaccinia virus, vP452.

15-------------

Serum neutraliserende titer (logn0) op de dagen

Entvirus Dier no. 0 21 35 20 Niet-gevaccineerd 26 0,24 (0,35) - 0,24 (0,70)

Controles 27 0,24 (0,35) - 0,56 (1,05) 28 0,24 (0,35) - 0,80 (0,70) 29 0,24 (0,35) - 0,40 (0,70) 30 0,24 (0,35) - 0,32 (0,35) 25-----------------------------------------------------------

Controle 191 0,24 (0,35) 0.36 (0,47) 0,72 (1,75)

Vacciniavirus 192 0,24 (0,35) 0,21 (0,93) 0,24 (2,30) vP452 193 0,24 (0,35) 0,48 (0,58) 194 0,24 (0,35) 0,24 (0,82) 0.24 (2,10) 30 195 0,24 (0,35) -

Recombinant 186 0,24 (0,35) 0,48 (1,28) 1,20 (2,57)

Vacciniavirus 187 0,24 (0,35) 0,72 (1,63) 1,68 (2,57) vP483 188 0,24 (0,35) 0,24 (1,52) 1,68 (2,57) 35 189 0,24 (0,35) 0,36 (1,40) 1,56 (2,22) 190 0,24 (0,35) 0,48 (1,63) 1,56 (3,00)

Voorbeeld 5 40 Immunisatie van guinese biggetjes met de vacciniarecombinanten vP577 en vP613.

Guinese biggetjes werden geïmmuniseerd ter beoordeling van hun respons tegen EHV-1 gp14 tot expressie gebracht door de vaccinia recombinanten vP577 en vP613. Guinese biggetjes met een gewicht van ongeveer 450 gram ontvingen 10r’ TCIDS0 van vP577 of vP613 vaccinia recombinant via de sub-cutane weg, 1 ml op dag 0 en dag 21. Men nam op de dagen 0, 21 en 35 bloed van de guinese biggetjes af, 45 bereidde sera en onderzocht deze op EHV-1 antilichamen. De neutralisatieproeven werden uitgevoerd op varkens testiculaire cellen tegen 50 TCID60 van het EHV-1 virus, stam Kentucky. De vaccinia antilichamen werden getitreerd met ELISA onder toepassing van een anti IgG peroxydaseconjugaat.

De resultaten zijn weergegeven in tabel 2. Er werd geen serum neutraliserende werking tegen EHV-1 verkregen bij guinese biggetjes geïmmuniseerd met de vaccinia recombinant vP577 die de gehele lengte 50 van het EHV-1 gp14 gen bevat (geen gegevens vermeld). Aan de andere kant induceerden guinese biggetjes geënt met het recombinant vaccinia virus, vP613, een truncated EHV-1 gp14 gen tot expressie brengend, overeenkomstige spiegels van EHV-1 serum neutraliserende antilichamen (tabel 2), zoals de vaccinia recombinant, vP483, EHV-1 gp13 tot expressie brengend (tabel 1). Hoewel EHV-1 serum neutraliserende antilichamen drie weken na de eerste infectie kunnen worden gedetecteerd, wordt een 55 significantere spiegel twee weken na de tweede immunisatie waargenomen (tabel 2). Bij alle geïmmuniseerde dieren werden responsen waargenomen indien vaccinia antilichamen werden onderzocht met ELISA.

119 195085 TABEL 2

Serum neutraliserende antilichamen aanwezig in guinese biggetjes ingeënt met een vaccinia recombinant die EHV-1 gp14 tot expressie brengt.

5 Serum neutraliserende titel (log10) op de dagen

Entvirus 0 21 35

Recombinant vaccinia virus vP613 0,4 0,7 1,3 10 0,2 0,7 1,2 0,2 0,7 1,7 0,2 1,1 1,6 0,2 1,0 1,6 15 Niet gevaccineerde controles 0,2 - 0,4 0,6 - 0,4 0,7 - 0,8 0,6 - 0,2 0,4 - 0,4

Voorbeeld 6

Bescherming van gevaccineerde hamsters tegen provocatie met EHV-1.

Ter bepaling van de doeltreffendheid van het vaccinia recombinant vP483 dat EHV-1 gp13 tot expressie 25 brengt werd aan hamsters een primaire of primaire plus booster vaccinatie toegediend en ze werden, tezamen mei een niet-ingeënte controlegroep of een groep die tweemaal met een controle vaccinia virus, vP452, waren ingeënt, intraperitoneaal geprovoceerd met een hamster aangepaste Kentucky stam van EHV-1.

Men scheidde 40 Syrische hamsters (40 dagen oud met een gewicht tussen 55 en 65 gram) in vier 30 groepen. Groep A ontving een enkele, subcutane (1 ml) inenting van 10®, 106 of 104 TCID60 van de vaccinia recombinant vP483, vijf dieren per dosis. Groep B werd gevaccineerd met vP483 op dag 0 gevolgd door een booster op dag 14. De (1 ml) primaire en booster doses werden subcutaan toegediend aan groepen van 5 dieren onder toepassing van 108, 106 of 104 TCICÜÜ. Groep C bestond uit 5 hamsters en deze dieren ontvingen twee sub-cutane injecties (10® TCICb0 per injectie) op de dagen 0 en 14 van vaccinia vP452. Vijf 35 hamsters in groep D werden als niet-gevaccineerde controles gehouden. Alle hamsters ontvingen 200 LD50 van een hamster aangepaste Kentucky stam van EHV-1 via de intraperitoneale weg 14 dagen na de laatste immunisatie. Overlevenden werden 7 dagen na de provocatie geteld.

De resultaten zijn weergegeven in tabel 3. Alle niet-gevaccineerde en met vaccinia vP452 virus gevaccineerde hamsters stierven binnen 5 dagen provocatie.

TABEL 3

Bescherming van hamsters gevaccineerd met vaccinia recombinant, EHV-1 gp13 tot expressie brengend, tegen EHV-1 provocatie.

45 Vaccinerend virus

Recombinant vaccinia vP483 Controle vaccinia vP452 Geen virus

Primaire Booster Booster 50 Vaccinerende dosis log10 TCID50 8 6 4 8 6 4 8

Hoeveelheid 4 1 2 5 2 0 0 0

Overlevenden 555 555 5 5 195085 20

Significante spiegels van een bescherming legen EHV-1 provocatie werden waargenomen bij hamsters die gevaccineerd waren met de vaccinia recombinant vP483 die EHV-1 gp13 tot expressie brengt. Er werden geen significante verschillen in de beschermingsspiegels waargenomen bij hamsters geïmmuniseerd met primaire of primaire plus booster doses. De beschermende dosis (PDh0) was gelijk PDS0 = 6.32 10g10 voor 5 primaire en 6,12 10g1o voor primaire plus booster. Desalniettemin werd een 100 %-ige bescherming slechts waargenomen in de groep die twee doses 108 TCID50 recombinant virus ontvingen.

Teneinde het beschermende effect van een vaccinia virus recombinant die EHV-1 gp14 alleen of in combinatie met EHV-1 gp13 tot expressie brengt, werden provocatieonderzoekingen op ingeente hamsters uitgevoerd. Men entte 20, één dag oude, Syrische hamsters met een gewicht van ongeveer 60 gram elk 10 subcutaan in met 1 ml controle vaccinia virus of met recombinant vaccinia virussen vP483, vP577, vP613, vP633 en vP634 die EHV-1 gp13 en/ot gp14 tot expressie brengen. De eerste vaccinatie werd gevolgd door een identieke vaccineringsdosis (pfu/ml (log10)) op dag 14. Alle hamsters, waaronder niet ingeente controles, werden 14 dagen na de laatste immunisatie geprovoceerd met een intraperitoneale injectie van 200 LD50 van een EHV-1 hamster geadapteerde Kentucky stam. De overlevenden van de groepen van vijf 15 dieren werden 14 dagen na de provocatie, op welk moment het onderzoek werd beëindigd, berekend. De dosis entstof die 50 % bescherming van de hamsters geeft werd berekend als log,0 TCID;,0/ml entstof.

Zoals uit tabel 4 blijkt zal de vaccinia virus recombinant vP577. die het EHV-1 gp14 gen met volledige lengte tot expressie brengt, de hamsters niet tegen provocatie met een PD50 berekend > 9,0 log10 beschermen. Aan de andere kant gaf het truncated EHV-1 gp14 gen, zoals door de vaccinia recombinant 20 vP613 tot expressie gebracht, een goede bescherming bij provocatie (tabel 4). De berekende PDb0 is wat beter (5,2) dan die verkregen met de EHV-1 gp13 tot expressie brengende vaccinia recombinant, vP483 (6,1), Verrassenderwijze gaf de co-expressie van EHV-1 gp 13 en gp14, zowel het gp14 gen met volledige lengte als het truncated gp14 gen, in respectievelijk de vaccinia virus recombinanten vP633 en vP634, een aanzienlijk betere beschermende werking vergeleken met die van het EHV-1 glycoproteïne dat alleen tot 25 expressie is gebracht. De hoeveelheid virusenlstof ter verkrijging van een 50 %-ige bescherming van de gevaccineerde hamsters daalde dus sterk indien EHV-1 gp13 en gp14 samen in dezelfde vaccinia virus recombinant tot expressie werden gebracht.

TABEL 4 30 Bescherming van hamsters gevaccineerd met de vaccinia recombinanten, EHV-1 gp13 en/of gp14 tot expressie brengend, tegen EHV-1 provocatie.

Entstof EHV-1- Vaccinatiedosis/Overlevenden PD50 proteïnen 35------------------------------------ vP483 gp13 8/5 6/2 4/0 6,1

Geen - 0/0 - VP577 gp14 8/1 6/0 4/0 >9,0 40 Geen - 0/0 vP613 gp14‘ 8,4/5 6,4/4 4,4/1 5,2 vP633 gp13 + gp14 8/5 6/3 4/4 4,3 vP634 gp13+gp14* 7,6/5 5,6/5 3,6/5 <3,6 45 Vaccinia - 8/0 - >9,0

Geen — 0/1 — — ' vP613 en vPG34 brengen de truncated versie van EHV-1 gp14 tot expressie.

50 Voorbeeld 7

Constructie van vogelpokkenvirus recombinanten die het paard herpesvirus gp13 glycoproteïne tot expressie brengen.

Onder verwijzing nu naar figuur 8, werd pVHA6g13 toegepast als bron van het EHV-1 gp 13 gen. Ter isolering van het DNA segment dat het volledige EHV-1 gp13 gen bevat werd pVHA6g13 gedigereerd met 55 Nrul en Hindlll. Een fragment van ongeveer 1,8 Kb bevattende 28 bp van het 3' uiteinde van de vaccinia virus H6 promotor, het volledige EHV-1 gp13 gen en ongeveer 410 bp van vaccinia virusvolgorden werd 21 195085 door deze digerering gevormd. Het 1,8 Kb Nrul/Hindlll fragment werd geïsoleerd voor het invoegen in de vogelpokkenvirusinvoegvectoren pFPCV2 en pCPCVI.

De hoenderpestvirus (FP) invoegvector pFPCV2 verschaft een drager voor de vorming van recombinanten die vreemde genen in een niet-essentieel gebied van het FP genoom aangeduid met het f7 gebied 5 bevat. pFPCV2 werd gevormd uit pRW731.13. Het plasmide pRW731.13 bevat een FP genomisch Pvull fragment van ongeveer 5,5 Kb ingevoegd tussen de twee Pvull plaatsen van pUC9. In het begin werd een veelvoudige kloningsvolgorde (MCS) gebonden aan de unieke Hindi invoegplaats in dit 5,5 Kb Pvull FP genomische fragment. De MCS werd verkregen door annealing oligonucleotiden CE4 (5'-TCGCGAGAATTCGAGCTCGGTACCGGGGAT CCT CTGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGTT-3') en 10 CE5 (5'AACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTAGAGGATCCCCGGTACCGA

GCTCGAATTCTCGCGA-3'). Het plasmide dat de MCS bevatte werd aangeduid met pCE11.

pFeLVIA is een derivaat van de vaccinia invoegvector pTP15 (184) (figuur 3), waarin het kat leukemie-virus (FeLV) env gen (192) is ingevoegd in de Pstl plaats stroomafwaarts van de H6 promotor. Voor het overbrengen van de 2,4 kb expressiecassette naar een FP vector (figuur 8) werden de H6/FeLV env 15 volgorden weggenomen uit pFeLVIA door digereren met Bglll en partieel digereren met Pstl. De Bglll plaats bevindt zich op de 5' grens van de H6 promotorvolgorde. De Pstl plaats is 420 bp stroomafwaarts van het translatie terminatiesignaal voor het FeLV envelop glycoproteïne open afleesframe geplaatst.

De 2,4 Kb H6/FeLV env volgorde werd ingevoegd in pCE11 gedigereerd met BamHI en Pstl. Dit plasmide werd aangeduid met pFeLVFI. Het pFeLVFI plasmide werd daarna gedigereerd met Pstl ter 20 verwijdering van de FeLV env volgorden. Het verkregen plasmide dat de vaccinia virus H6 promotor in pCE11 bevatte werd met pFPCVI aangeduid. De volgorden 5' tot de promotor werden gemutageniseerd (19) ter verwijdering van vreemde volgorden, onder toepassing van oligonucleotide FPCV1 (5'-CAGT AAT ACACGTT ATT GCAG AG A G G ACCATT CTTT ATT CT AT ACTT AAAAAGT-3' ) ter verkrijging van pFPCVI. Het 3' gebied naar de promotor (veelvoudige kloningsplaats) werd gemutageniseerd met 25 oligonucleotide FPCV3 (5'-TAGAGT CGACCTGCAGGCATCCAAGCTTGTTAACGAC-3') ter verwijdering van de Sphl plaats die een ATG bevat. Het verkregen plasmide werd met pFPCV2 aangeduid.

Het hiervoor gedefinieerde 1,8 Kb Nrul/Hindlll EHV-1 gp13 fragment werd ingevoegd in het 8,0 Kb Nrul/ Hindi 11 fragment, verkregen door digereren van pFPCV2. Dit 8,0 Kb Nrul/Hindlll fragment bevatte het 5' gedeelte van de vaccinia virus H6 promotor (100 bp), de FP flankerende volgorden (4,8 Kb stroomopwaarts 30 en 1,5 Kb stroomafwaarts van de invoegplaats) en 2,4 Kb pUC (BRL, Bethesda, MD). Ligatie van deze twee fragmenten leidde tot de vorming van een 9,8 Kb plasmide aangeduid met pFPEHV13A.

Het plasmide pFPEHV13A werd daarna gedigereerd met Kpnl en Hindlll ter verwijdering van een ongeveer 600 bp fragment. Dit fragment bevatte het 3' meeste gebied van het EHV-1 gp13 gen (200 bp) en het 410 bp vacciniavirus DNA segment. Het 600 bp Kpnl/Hindlll fragment werd op de volgende wijze 35 vervangen door een 200 bp fragment afgeleid van pNSIENPN (figuur 3). Een Pstl digerering van pNSIENPN maakte het plasmide lineair. DePstl eindstandige gedeelten werden blunt-ended door het T4 DNA polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) in aanwezigheid van dNTPs (0,5 mM elk). Daarna werden Hindlll linkers (BRL, Bethesda, MD) verbonden tot het blunt-ended fragment. Na digereren met Hindlll werd het lineair gemaakte plasmide gedigereerd met Kpnl, waardoor een 200 bp fragment bevattende het 3' 40 gedeelte van het EHV-1 gp13 gen werd verkregen, waarbij de volgorde die overeenkomt met het terminatie-codon (TAG) en het TTTTTNT sequence-motief bekend staat als een vaccinia virus vroeg transcriptie terminatiesignaal (45). Het recombinant plasmide werd aangeduid met pFPEHV13B en werd toegepast bij de in vitro recombinatie voor het invoegen van het H6 promoted EHV gp13 gen op de f7 plaats van het FP genoom. Het recombinant vogelpokkenvirus werd aangeduid met vFP44.

45 Onder verwijzing naar figuur 9, wordt opgemerkt dat pFPEHV13B eveneens werd toegepast ter verkrijging van een 1,4 Kb Nrul/Hindlll fragment voor het invoegen in pCPCVI. Het pCPCVI plasmide bevat de vaccinia virus H6 promotor op de unieke EcoRI plaats in het 3.3 Kb Pvull kanariepokkenvirus (CP) genomische fragment. Dit invoegplasmide maakt het invoegen van vreemde genen op de C3 plaats van het CP genoom mogelijk. pCPCVI werd verkregen uit pRW764.2, dat een 3,3 Kb Pvull CP genomisch fragment 50 ingevoegd in een pUC vector bevat. pRW764.2 werd lineair gemaakt door digereren met EcoRI. Dit fragment werd blunt-ended onder toepassing van het Klenow-fragment van het E. coli DNA polymerase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) in aanwezigheid van dNTPs (0,5 mM elk). Vaccinia virus H6 promotorvolgorden en een multipel kloningsgebied geplaatst 3' van de promotor werden door digereren met Kpnl/Hpal verwijderd uit pFPCVI. Dit 200 bp fragment werd blunt-ended met T4 DNA 55 polymerase in de aanwezigheid van dNTPs (0,5 mM elk) en ingevoegd in het lineair gemaakte blunt-ended plasmide pRW764,2. Het verkregen plasmide werd aangeduid met pCPCVI. Het plasmide pCPCVI werd gedigereerd met Nml en Hindlll en het 5,8 Kb fragment werd geïsoleerd voor binding met het hiervoor 195085 22 beschreven 1,4 Kb EHV gp13 bevattende fragment. Het verkregen plasmide werd aangeduid met pCPEHV13A. Dit plasmide werd bij in vitro recombinantie-experimenten toegepast voor het invoegen van het H6 promoted EHV gp13 gen in het C3 gebied van het CP genoom. Het recombinant kanariepokkenvirus werd aangeduid met vCP48.

5 Na de in vitro recombinatie, werd recombinant vogelpokkenvirus bevattende het EHV-1 gpl3 gen geïdentificeerd met een standaard plaque hybridisatie-onderzoek. Positieve plaques werden gezuiverd door drie cycli van plaque isolatie, gevolgd door hybridisatie-analyses. Recombinanten werden aangeduid met respectievelijk vFP44 en vCP48 voor FP en CP recombinanten. Beide recombinanten werden geanalyseerd onder toepassing van een Protein A-B-galactosidase immunoscreen assay met een monoklonaal antiserum 10 voor EHV-1 gpl3. Uit de resultaten blijkt dat CEF en VERO celmonolagen geïnfecteerd met vFP44 of vCP48 het EHV-1 gpl 3 op het oppervlak van met virus geïnfecteerde cellen tot expressie brengen.

Voorbeeld 8

Beoordeling van extra vaccinia virus recombinanten die ongemodificeerde en gemodificeerde versies van 15 het gen uit paard herpes virus-l coderende voor glycoproteïne gp14 tot expressie brengen.

Constructie en beoordeling van extra recombinant vaccinia virus dat EHV-1 gp14 tot expressie brengt. De EHV1 gp14 bevattende constructies (voorbeeld 2) werden op drie wijzen gemodificeerd: (a) variëren van de lengte van de EHV-1 gp14 aanloopsequentie, (b) verwijdering van de overmaat EHV-1 DNA 3' uit het gen en (c) invoeging van de gemodificeerde versies van het EHV-1 gp14 gen in een vaccinia virus vP293 20 gastheertraject selectiesysteem (69) voor de beoordeling.

Het EHV-1 gp14 genproduct bevat een ongewoon lange aanloopsequentie. Een lange hydrofobe volgorde die zich uitstrekt over de aminozuren 58-99 wordt voorgesteld als signaalsequentie. Dit gebied wordt voorafgegaan door een lange hydrofiele volgorde. Een overeenkomstig lange aanloopsequentie werd eveneens gevonden voor twee andere gB homologen, pseudorabies virus gil (62) en runderherpesvirus 25 1 gl (63).

Modificatie van het 5' uiteinde van EHV-1 gp14.

Ter bestudering van het effect van de lengte van de aanloopsequentie van EHV-1 gpl 4 bij het verwerken, aanbieden en voor de immunologische werking van het gp14 product tot expressie gebracht in recombinant 30 vaccinia virus, werden plasmiden die het EHV-1 gp14 gen met drie verschillende lengten van de aanloopsequentie geconstrueerd door modificeren van het vroegere EHV-1 gp14 bevattende constructies, hetgeen op de volgende wij2en geschiedde.

Onder verwijzing naar figuur 10, bevat het plasmide pVM2LH6gl4 (voorbeeld 2) de volledige EHV-1 gpl4 coderende volgorde onder de controle van de H6 promotor ingevoegd in de Kopenhagen vaccinia M2L 35 deletieplaats. In pVM2LH6g14 is aminozuurgetal 2 van het EHV-1 gpl4 gen eerder aanwezig als His dan het natieve Ser. Ter verandering van aminozuur 2 in Ser. werd pVM?LH6g14 geknipt met Nsil (herkennings-volgorde ATGCAT) bij codons 1-2 (Met/His). Mutagenese werd uitgevoerd (19) onder toepassing van het synthetische oligonucleotide MPSYN240 (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCT-GTC 3')· Het verkregen plasmide, pMP14M. bevat het volledige ËHV-1 gp14 gen met het natieve codon 40 (Ser) op plaats 2.

Het plasmide pVM2LH6g14-1 (voorbeeld 2) is identiek aan pVM2LH6g14, behalve een truncatie van de aanloopsequentie en invoering van vier codons afgeleid van synthetische Nsil linkers. lnpVM2LH6g14-1 is de volgorde van het 5' truncated uiteinde van het EHV-1 gp 14 gen ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT... coderende voor Met/His/Ala/Cys/lle/Ala.... waarin GCT (Ala) codon 35 is van EHV-1 gp14. pVM2LH6g14-1 45 werd gemodificeerd door mutagenese (19) op twee manieren. Ter verkrijging van een versie van het gp14 gen truncated in ongeveer dezelfde mate als pVM2LH6g14-1, doch nauwkeuriger benaderende de natieve gpl 4 volgorde, werd pVM2LH6g14-1 geknipt met Nsil bij de codons 1-2. Mutagenese werd uitgevoerd onder toepassing van het synthetische oligonucleotide MPSYN241. (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAAT-GAGTGTCCCAGCAGCTGGCTCCTGGATC 3') 50 In het verkregen plasmide, pMPl4M-34 begint de EHV-1 gp14 coderende volgorde met ATG/AGT/GTC/ CCA... Met/Ser/Val/Pro..., waarin CCA (Pro) aminozuur 36 van EHV-1 gp14 is. Het EHV-1 gp14 gen bevat een Nael plaats (GCCGGC) bij de codons 61-63 (Lys/Pro/Ala). Ter verkrijging van een meer uitgesproken truncated versie van het EHV-1 gp 14 gen, werd pVM2LH6g14-1 lineair gemaakt met Nael, gevolgd door digereren met Nsil en isolatie van vectorfragment uit een agarosegel. Mutagenese werd uitgevoerd onder 55 toepassing van synthetisch oligonucleotide MPSYN243 (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCAT-CATCGAGGGTGGGCACAATAGTT 3') 23 195085

In het verkregen plasmide, pMP14M-63, begint de EHV-1 gp14 coderende volgorde met ATG/GCA...Mer/ Ala..., waarin GCA (Ala) is aminozuur 63 van het natieve EHV-1 gp14 is.

Verwijdering van vreemd EHV-1 DNA.

5 In alle, hiervoor besproken, EHV-1 gp14 bevattende plasmiden werden de EHV-gp14 coderende volgorden gevolgd door ongeveer 1200 bp EHV-1 DNA. Het terminatiecodon (TAA) voor het gp14 gen treedt op in een Dral plaats (TTTAAA). Ter verwijdering van overmaat EHV-1 DNA werd pMPl4M-63 onderworpen aan partiele Dral digerering, gevolgd door isolatie van lineair DNA uit een agarosegel en digereren met Pstl, dat knipt bij de verbinding van EHV-1 DNA en de stroomatwaarts gelegen vaccinia flankerende arm. Een 6,5 Kb 10 Dral/Pstl DNA band werd geïsoleerd uit een agarosegel.

Synthetische oligonucleotiden MPSYN247 (5' AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA 3') en MPSYN248 (5' GCTCGAGTTAACAAAAATTT 3') werden annealed en verbonden met het 6,5 Kb fragment. In het verkregen plasmide, pMP14M63P, werden de EHV-1 gp14 coderende volgorden onmiddellijk gevolgd door een volgorde die terminatie van vroege vaccinia transcriptie (45) specificeert, gevolgd door een polylinkerge-15 bied (bevattende Hpal, Xhol, Pstl restrictieplaatsen) en de linker vaccinia flankerende arm verkregen uit HindiII M.

Invoeging van het H6 promotor /EHV-1 gp14 gen in een pHES/vP293 selectiesysteem.

In alle hiervoor besproken EHV-1 gp14 bevattende plasmiden bevindt het EHV-1 gp14 gen zich onder de 20 controle van de vaccinia H6 promotor ingevoegd in het M2L deletiegebied van de Kopenhaagse stam van het vaccinia virus. Aangezien de M2L invoegingsplaats binnen een groter gebied van het genoom is geplaatst dan kan worden deleted (69), werd de herplaatsing van de H6 promotor/EHV-1 gp14 expressie-cassette naar een potentieel stabielere invoegplaats onderzocht. Als voorbereidende stap werden EHV-1 gp14 constructies die verschillende lengten van de aanloopsequentie bevatten verplaatst naar het op WR 25 pHES/vP293 gebaseerde gastheertraject-selectiesysteem (69) teneinde een snelle vorming van vaccinia recombinanten voor een vergelijkend onderzoek mogelijk te maken.

Plasmide pHES-4 bevat de vaccinia H6 promotor, gevolgd door een polylinkergebied en het KIL humaan gastheertrajecten (70), alle ingevoegd tussen WR vaccinia armen die een 21,7 Kb deletie (69) flankeren. pHES-4 bevat twee Nrul plaatsen, één in de H6 promotor en één in de flankerende vaccinia volgorden.

30 pHES-4 werd door partieel digereren met Nrul lineair gemaakt en de band die lineair DNA met volle lengte bevatte werd uit een agarosegel geïsoleerd. Dit lineaire DNA werd op de Xhol plaats in het polylinkergebied geknipt. pMP14M-63P bevat twee Nrul plaatsen, één in de H6 promotor en de andere in EHV-1 gp14 coderende volgorden, 0,2 Kb van het 3' uiteinde van het gen. pMPl4M-63P werd lineair gemaakt met Nrul, gevolgd door digereren met Xhol. Een 2,8 Kb Nrul (partieel)/Xhol fragment werd uit een agarosegel 35 geïsoleerd. Dit fragment bevat een gedeelte van de H6 promotor, gevolgd door de vorm van het gemodificeerde EHV-1 gp14 gen bevattende de kortste versie van de aanloopsequentie. Het 2,8 Kb H6 promotor/ EHV1 gpl4 bevattende fragment afgeleid van pMP14-63P werd verbonden met het Nrul (partiële)/Xhol vector-fragment afgeleid van pHES-4. Het verkregen plasmide, pHES-MP63, bevat de H6 promotor/EHV-1 gp14 gencassette, zonder vreemd EHV-1 DNA. Voor de overdracht van de H6 promotor/RHV-l gp14 5' 40 uiteinden bevattende de volle lengte of matig truncated aanloopsequenties, werden de plasmiden pMP14M en pMP14M-34 geknipt met Nnjl en respectievelijk de 2,8 Kb en 2,7 Kb banden geïsoleerd uit agarosege-len. pHES-MP63 werd onderworpen aan partiële Nrul digerering en een 7,2 Kb fragment werd geïsoleerd uit een agarosegel. Het 7,2 Kb vectorfragment komt overeen met pHES-MP63, waaruit het 2,6 Kb Nrul fragment bevattende het H6 promotor/EHV-1 gp14 5' uiteinde was verwijderd. Het 7,2 Kb Nrul (partieel) 45 vectorfragment afgeleid van pHES-MP63 werd verbonden met het 2,8 Kb Nrul fragment uit pMP14M, onder vorming van pHES-MP1. Het 7,2 Kb Nml (partiële) vectorfragment afkomstig van pHES-MP63 werd eveneens verbonden met het 2,7 Kb Nrul fragment uit pMPl4M34, onder vorming van pHES-MP34. De kloneringsstappen die leiden lot de vorming van de plasmiden pHES-MP63, pHES-MP1 en pHES-MP34 zijn schematisch weergegeven in figuur 10.

50 De plasmiden pHES-MP1, pHES-MP34 en pHES-MP63 werden toegepast als donorplasmide voor recombinatie met vP293 (69), onder vorming van respectievelijk de recombinant vaccinia virussen vP753, vP765 en vP721. Recombinant nakomelingschap werd geselecteerd met humane MRC-5 cellen.

Beoordeling van vaccinia de op vP293-gebaseerde virus recombinanten die het RHV-1 gp14 gen tot 55 expressie brengen.

Ter bepaling of de drie vormen van het EHV-1 gp14 genproduct tot expressie gebracht in recombinant vaccinia virussen vP753, vP765 en vP721 aanwezig waren op het oppervlak van geïnfecteerde cellen, 195085 24 werden VERO celmonolagen geïnfecteerd met de drie EHV-1 gp14-bevattende recombinant vaccinia virussen. De geïnfecteerde celmonolagen werden geanalyseerd op oppervlak-immunofluorescentie onder toepassing van het EHV-1 gp14-specifieke monoklonale antilichaam 3F6. Oppervlakimmunofluorescentie was positief voor cellen geïnfecteerd met alle drie vaccinia virale recombinanten vP753, vP765 en vP721.

5 Dit wijst er op dat goed trafficking van het EHV-1 gp14 genproduct in met vaccinia geïnfecteerde cellen niet wordt beïnvloed door variatie van de lengte van de aanloopsequence.

Ter vergelijking van de EHV-1 gp14 genproducten tot expressie gebracht door de drie EHV-1 gp14-bevattende vaccinia virusrecombinanten, werden MRC-5 cellen geïnfecteerd met vP753, vP765 en vP721 en eiwitten werden metabolisch gelabeld met 35S-methionine. Immunoprecipitaties werden uitgevoerd met 10 de geradiolabelde cellysaten onder toepassing van EHV-1 gp14-specifiek monoklonaal antilichaam 3F6.

Geïmmunoprecipiteerde eiwitten uit cellen geïnfecteerd met vP753, vP765 en vP721 kunnen niet van elkaar worden onderscheiden en zijn equivalent aan de eiwitten die zijn geïmmunoprecipiteerd uit vP613, de EHV-1 gp14-bevattende vaccinia recombinant gevormd uit plasmide pVM2LH6g141. Uit deze resultaten blijkt dat de variaties in de lengte van de EHV-1 gpl4 aanloopsequentie onderzocht in deze recombinanten 15 noch verbeteren, noch invloed uitoefenen op het goed verwerken van het eindproduct.

Ter beoordeling van de beschermende doeltreffendheid van recombinant vaccinia virus dat de verschillende vormen van EHV-1 gp14 tot expressie brengt, werden hamsters ingeënt met variërende doses vP753, vP765 en vP721 en geprovoceerd met de EHV-1 hamster aangepaste Kentucky stam. Alle drie EHV-1 gp14-bevattende vaccinia recombinanten waren beschermend, met een log10 PD50 van 6,2 of beter.

20 Verschillen wat betreft de bescherming onder de drie vaccinia virus recombinanten zijn statistisch niet significant.

In tegenstelling met vP577, vertoonde een volgende vaccinia virus recombinant die eveneens was verkregen door recombinatie van pVM2LH6g14 en vP458 een identiek EHV1 gp14 immunoprecipitatiepa-troon met dat van vP613, vP753, vP765 en vP721, en, evenals de2e EHV-1 gp14 tot expressie brengende 25 recombinant vaccinia virus, bracht het EHV-1 gp14 eiwit op het oppervlak van geïnfecteerde cellen tot expressie.

De hiervoor vermelde gegevens doen veronderstellen dat het EHV-1 gp14 tot expressie gebracht in vaccinia virus recombinant vP577, onvolkomen is en dat het defect waarschijnlijk optrad tijdens de recombinatie tussen donorplasmide pVM2LH6g14 en het vaccinia virus vP458.

30

Voorbeeld 9

De nucleotidevolgorde van drie nieuwe genen uit paard herpesvirus type 1 en expressie in vaccinia virus recombinanten.

Ter identificatie en isolatie van het EHV-1 gen coderende voor gpl7/18 alvorens het tot expressie te 35 brengen in een vaccinia recombinant virus, werd het grootste gedeelte van het UK gebied van het EHV-1 genoom sequenced en de verschillende open afleesframes aangetroffen in dit DNA fragment werden tot expressie gebracht. Drie nieuwe EHV-1 genen gecodeerd door het S bestanddeel werden geïdentificeerd en geanalyseerd: EHV-1 gD dat bij sequentie homologie met de producten van de HSV gD en PRV gp50 genen vertoonde. EHV-1 gp63 dat homologie met de producten van de HSV US7 en PRV gp63 genen 40 vertoonde en EHV-1 gE dat homologie met de producten van de HSV gE en PRV genen vertoonde. Alle drie genen, individueel of tezamen, werden gekloneerd in een gastheertrajectselectiesysteem van de Kopenhagen vaccinia stam voor snelle expressieonderzoekingen. Uit immunofluorescentie verkregen met een anti-EHV-1 konijn serum bleek de expressie van EHV-1 specifieke producten.

45 Kloneren van het EHV-1 BamHI D fragment.

Zoals het EHV-1 gpl 7/18 gen werd gelokaliseerd op het S bestanddeel van hef EHV-1 genoom (3), werd het BamHI D fragment, dat het grootste gedeelte van het Us gebied (59) vertegenwoordigd, geïsoleerd en gekloneerd. EHV-1 genomisch DNA van de Kentucky D stam werd gedigereerd met BamHI. Het 11,0 Kb BamHI D fragment werd geïsoleerd uit agarosegel (Geneclean, Biol01, Inc., La Jolla, CA) en gekloneerd in 50 plasmide plBI24 als plasmide pEHVBamHID. Een restrictiemap van dit fragment werd opgesteld (figuur 11).

Identificatie van DNA volgorden coderende EHV-1 gD, gp63 en gE.

Nucleotidesequentiewaarden voor beide strengen werden verkregen uit verschillende sub-klonen van het BamHI D fragment dat gesubkloneerd was in plBI24, zoals is beschreven in voorbeeld 1. Volgorden van de 55 verbindingen tussen opeenvolgende fragmenten werden onderzocht op de beginkloon pEHVBamHID. Het PC/GENE software package (Intelligenetics Inc., Mountain View, CA) werd toegepast bij alle sequentie-waardenanalyses.

25 195085 DNA sequentieanalyse van de EHV-1 gD, gp63 en gE genen.

De DNA volgordeanalyse van het 6402 bp gebied sequenced van het BamHI D fragment (dat het grootste gedeelte van het unieke, korte gebied vertegenwoordigt) openbaart het voorkomen van ten minste drie volledige open afleesframes die alle van dezelfde streng aflezen. Deze volgorde is weergegeven in figuur 12 5 als de van rechts 5' naar 3' streng. De basissamenstelling is 50,44 % G + C.

Het eerste open afleesframe (ORF1) loopt van de nucleotideplaatsen 971 tot 2176. Vermeende transcriptionele regulerende signalen werden aangetroffen in het gebied van 5' tot de meest waarschijnlijke ATG initiatiecodon op plaats 971. Een TATA box met de volgende TATATTAA (nucleotiden 871 tot 878) was 60 nucleotiden stroomafwaarts van een vermeende CAT box op de plaatsen 811-817 met de volgorde 10 TGACAAT geplaatst. Geen polyadenyleringssignaal (AATAAA) werd stroomafwaarts van de TAA terminatie-codon (nucleotiden 2177 tot 2179) aangetroffen. Zeven van de tien nucleotiden in de volgorde 5' TCCCTTCGCC 3' (nucleotiden 890 tot 899) waren complementair aan de 18S ribosomale RNA volgorde 3' AGGAAGGCGT 5' (61) en kunnen dienen als de ribosoombindingsplaats. Een scanningmodel is voorgesteld waarmee eukaryotische mRNAs translatie initieert (151). De belangrijkste regel van dit model is dat 15 ribosomen binden aan het 5' uiteinde van het mRNA en lineair het mRNA molecuul scannen. Binding aan de translatie-initiatie is gewoonlijk bij het eerste 5' proximale ATG codon, hoewel uitzonderingen zijn waargenomen (152). Een purine op de -3-plaats is essentieel voor translatie-initiëring en de translatie wordt gestimuleerd door C op de plaatsen -1 en -2 wanneer de rest van de volgorde sub-optimaal is (155). De volgordecontext rondom het voorgestelde initiatiecodon AGCATGT (nucleotiden 968 tot 974) kwalificeert 20 zich als een functionele volgordecontext voor de translatie-initiëring van eukaryotisch mRNA. Er zijn twee andere mogelijke ATG initiëringscodons respectievelijk aanwezig op de plaatsen 989 tot 991 en 992 tot 994. De samenhang van deze twee codons CTTATGATGG kwalificeert zich niet als functioneel voor translatie-initiatie. Het EHV-1 ORF1 codeert voor 402 aminozuren met een berekend molecuulgewicht. van 45239 dalton.

25

Analyse van de EHV-1 ORF1 eiwitstructuur.

Analyse van de aminozuurvolgorde leverde een aantal aspecten gemeen met de met membraan geassocieerde glycoproteïnen op. Het gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 1 tot 26 had een kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en is voorgesteld als de signaalvolgorde. Een hydrofoob gebied bestaande uit 30 24 aminozuren (de aminozuren 351-374) is voorspeld te functioneren als een transmembraan ankergebied. Er zijn vier Asn-X-Thr/Ser (waarin X elk aminozuur, behalve proline, kan zijn) plaatsen voor potentiële, met N-verbonden, glycosylering (157). Het hydrofobiciteitsprofiel van de EHV-1 ORF1 aminozuurvolgorde is weergegeven in figuur 13. De kenmerken van een membraan overspannend glycoproteïne waaronder signaal- en ankerelementen zijn duidelijk gedefinieerd. Van de twee meest hydrofobe gebieden bij het N- en 35 dichtbij het C-eindstandige gedeelte wordt voorspeld dat ze respectievelijk de signaalvolgorde en het transmembraan overspannend gebied van het glycoproteïnemolecuul weergeven.

Vergelijking van de EHV-1 ORF1 aminozuurvolgorde met ander herpesvirusglycoproteïnen.

Vergelijking van de aminozuursamenstelling van het vermoedelijke EHV-1 ORF1 eiwit duidt op een 40 significante homologie met glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo komt het EHV-1 ORF1 proteïne overeen met PRV gp50 (95) en HSV-1 gD (79, 160).

Het tweede open afleesframe (ORF2 ) strekt zich uit van de nucleotideplaatsen 2287 tot 3525. Geen veronderstelde transcriptionele regulerende signalen werden in het gebied 5' tot het ATG initiatiecodon op plaats 2287 aangetroffen. Geen AATAAA polyadenyleringssignaal werd stroomafwaarts van het TGA 45 terminatiecodon (de nucleotiden 3526-3528) gevonden, doch twee potentiële YGTGTTYY polyadenylerings-signalen (180) zijn stroomafwaarts van dit terminatiecodon bij ongeveer 40 en 70 bp aangetroffen. Het volgordeverband rondom het voorgestelde initiëringscodon GCTATGG komt overeen met de regels van Kozak (151, 155). Er zijn ten minste twee andere mogelijke ATG initiëringscodons op de plaatsen 2305-2307 en 2332 tot 2334, doch het volgordeverband van deze twee codons (GGGATGT en TCTATGG) 50 kwalificeert niet als functioneel voor translatie-initiatie. Het EHV-1 ORF2 codeert een polypeptide met 413 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 45431 dalton.

Analyse van de EHV-1 ORF2 eiwitstructuur.

Analyse van de aminozuurvolgorde biedt een aantal aspecten die gewoon zijn voor de met membraan 55 geassocieerde glycoproteïnen. Een gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 1 tot 22 had een kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en dit wordt voorgesteld als de signaalvolgorde (hoewel de computerscore voor de veronderstelde splitsingsplaats gering was). Een hydrofoob gebied bestaande uit 32 aminozuren (de 195085 26 plaatsen 315-346) functioneert volgens voorspellingen als een transmembraan-ankergebied. Er zijn zeven Asn-X-Thr/Ser plaatsen voor potentiële N-gebonden glycosylering. Een hydrofobiciteitsgrafiek van de EHV-1 ORF2 aminozuurvolgorde is weergegeven in figuur 14. De kenmerken van een membraan overspannend glycoproteïne waaronder signaal- en ankerelementen zijn duidelijk gedefinieerd. De twee meest hydrofobe 5 gebieden bij het N-eindstandige gedeelte en dichtbij het C-eindstandige gedeelte geven volgens voorspellingen respectievelijk de signaalvolgorde en het transmembraan overspannende gebied van het glycoproteïne-molecuul aan.

Vergelijking van de EHV-1 ORF2 aminozuurvolgorde met andere herpesvirus glycoproteïnen.

10 Uit een vergelijking van de aminozuursamenstelling van het EHV-1 ORF2 bleek de significante homologie met glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo is het EHV-1 ORF2 eiwit homoloog met PRV gp63 (80), VZV gplV (181) en HSV-1 US7 (79).

Het derde open afleesframe (ORF3) strekt zich uit van de nucleotideplaatsen 3796 tot 5451. Vermoedelijke transcriptionaal regulerende signalen werden aangetroffen in het gebied van 5' tot het ATG initiatieco-15 don op plaats 3796. Een TATA box met de GTTTAAA volgorde (de nucleotiden 3705-3711) was 50 nucleoti-den stroomafwaarts van een vermoedelijke CAT box op de plaatsen 3649-3654 met de GCAATG volgorde geplaatst. Geen evident polyadenyleringssignaal werd stroomafwaarts van het TGA terminatiecodon (de nucleotiden 5452-5454) aangetroffen. Het volgordeverband rondom het voorgestelde initiatiecodon ACAATGG komt overeen met de regels van Kozak (151, 155). Het EHV-1 ORF3 codeert voor een 20 polypeptide met 552 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 61493 dalton.

Analyse van de EHV-1 ORF3 eiwilstructuur.

Uit analyse van de aminozuurvolgorde blijkt een aantal aspecten die gemeenschappelijk met de membraan-geassocieerde glycoproteïnen te zijn. Een gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 1-23 had een 25 kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en is voorgesteld als signaalvolgorde. Een hydrofoob gebied bestaande uit 38 aminozuren (de plaatsen 404-437) functioneert volgens voorspellingen als een transmembraan-ankergebied. Er zijn vijf Asn-X-Thr/Ser plaatsen voor potentiële, met N-gebonden glycosylering. Een hydrofobiciteitsgrafiek van de EHV-1 ORF3 aminozuurvolgorde is weergegeven in figuur 15. De kenmerken van een membraan overspannend glycoproteïne waaronder signaal- en ankerelementen zijn duidelijk 30 gedefinieerd. Van de twee meest hydrofobe gebieden bij het N- en dichtbij het C-eindstandige gedeelte is voorspeld dat ze respectievelijk de signaalvolgorde en het transmembraan overspannend gebied van het glycoproteïnemolecuul weergeven.

Vergelijking van de EHV-1 ORF3 aminozuurvolgorde met andere herpesvirus glycoproteïnen.

35 Uit een vergelijking van de aminozuursamenstelling van het EHV-1 ORF3 proteïne blijkt een significante homologie met de glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo is het EHV-1 ORF3 eiwit homoloog met PRV gl (80), VZV gE (181) en HSV-1 gE (79).

Constructie van een op Kopenhagen vaccinia virus gebaseerd gastheertraject-selectiesvsteem.

40 Een op Kopenhagen vaccinia virus gebaseerd gastheertraject-selectiesysteem analoog aan het WR pHES/vP293 gastheertraject-selectiesysteem (69) werd geconstrueerd.

De Kopenhagen vaccinia virusdeietiemutant vP668 is deleted voor 12 genen uit het Hindlll C - Hindlll K gebied, waaronder beide humane gastheertrajectgenen KIL (70) en C7L, een gen dat behoort tot Hindlll C. vP668 is niet in staat om op humane MRC-5 cellen te groeien. Leden van de COPCS plasmide serie 45 bevatten het C7L gen zonder flankerende vaccinia armen, waardoor recombinatie met vP668 en herstel van het vermogen van het virus om op MRC-5 cellen te groeien wordt hersteld. Het vermogen van de recombinant vaccinia nakomenschap gevormd door recombinatie onder toepassing van het vP668/COPCS gastheertraject-selectiesysteem om een plaque te vormen op humane MRC-5 cellen verschaft een methode voor snelle identificatie van deze recombinanten. Plasmide pCOPCS657 bevat de synthetische H6 vaccinia 50 promotor gevolgd door een polylinker kloneringsgebied voor het invoegen van vreemde genen. Het polylinkergebied wordt gevolgd door stopcodons en een vaccinia transcriptionaal terminatiesignaal (45)

Kloneren van het EHV-1 gD gen tot pCOPCS657.

Onder verwijzing naar figuur 16, werd het plasmide pEHVBamHID gedigereerd met Hindlll en een 1240 bp 55 Hindlll DNA fragment bevattende EHV-1 gD werd geïsoleerd uit een agarosegel (Geneclean, Bio10, Ine., La Jolla, CA) en hersteld onder toepassing van het Klenow fragment van DNA polymerase. Het herstelde fragment werd daarna gebonden aan plasmide pCOPCS657 gedigereerd met Smal. Het verkregen 127 195085 plasmide, pJCAO06 had het ATG initiatiecodon ongeveer 10 bp van de H6 promotor (figuur 16).

Kloneren van het EHV-1 gp63 gen tot pCOPCS657.

Plasmide pEHVBamHID werd gedigereerd met Hindlll, EcoRI en Pvull en het 1300 bp Hindlll-Pvull DNA.

5 fragment dat EHV-1 gp63 bevatte werd geïsoleerd uit een agarosegel en hersteld met Klenow. Het herstelde fragment werd daarna verbonden met het plasmide pCOPCS657 gedigereerd met Smal. Het verkregen plasmide met EHV-1 gp63 in de juiste oriëntatie ten opzichte van de H6 promotor werd met pJCA008 (figuur 16) aangeduid.

10 Kloneren van het EHV-1 gE gen tot pCOPCS657.

Plasmide pEHVBamHID werd gedigereerd met Aatll en Apal en een 2630 bp Aatll-Apal DNA fragment bevattende EHV1 gE werd geïsoleerd uit een agarosegel en hersteld met Klenow. Het herstelde fragment werd daarna gevoegd in het plasmide pCOPCS657 gedigereerd met Smal. Het verkregen plasmide met het EHV-1 gE gen in de juiste oriëntatie ten opzichte van de H6 promotor werd aangeduid met pJCA007 15 (figuur 16).

Klonen van het EHV-1 gD-gp63 fragment in pCOPCS657.

Onder verwijzing naar figuur 17, werd het plasmide pEHVBamHID gedigereerd met EcoRI en Pvull en het 1832 bp EcoRI-Pvull DNA fragment (A) werd uit een agarosegel geïsoleerd. Plasmide pJCA006 werd 20 gedigereerd met Clal en EcoRI en het 1450 bp Clal-EcoRI DNA fragment (B) werd geïsoleerd uit een agarosegel. Plasmide pCOPCS657 werd gedigereerd met Clal en Smal en het 3700 bp Clal-Smal DNA fragment (C) werd geïsoleerd uit een agarosegel. De fragmenten A, B en C werden daarna samen gekoppeld en het verkregen plasmide werd aangeduid met pJCA009 (figuur 17).

25 Kloneren van het EHV-1 gD-gp63-gE fragment in pCOPCS657

Het plasmide pEHVBamHID werd gedigereerd met EcoRI en Sacll en het 4240 bp EcoRI-Sacll DNA fragment (D) werd uit een agarosegel geïsoleerd. Daarna werd fragment D gekoppeld aan fragmenten B en C (zie hiervoor) onder additie van dNTPs ter verzekering van het herstel van de binding Sacll-Smal. Het verkregen plasmide werd aangeduid met pJCA010 (figuur 17).

Constructie van de recombinant vaccinia virussen vP773, vP803, vP809, vP810 en vP822 die de EHV-1 U open afleesframes tot expressie brengen.

Teneinde snel de expressie van de hiervoor beschreven EHV-1 open afleesframes na te gaan, werd een aantal vaccinia recombinant virussen geconstrueerd onder toepassing van het COPCS gastheertraject-35 selectiesysteem. De drie open afleesframes geïdentificeerd uit de sequence analyse werden afzonderlijk of tezamen (“dubbel” en “drievoudig”) in plasmide pCOPCS657 (figuren 16, 17) gekloneerd. De verkregen plasmiden werden daarna toegepast voor recombinatie met vaccinia recombinant vP668 als reddend virus. De verschillende recombinant vaccinia virussen uit deze recombinaties zijn weergegeven in tabel 5.

Vaccinia recombinant vP773 werd verkregen bij recombinatie uitgevoerd met het donorplasmide 40 pJCA006 dat het EHV-1 gD gen bevatte, Vaccinia recombinant vP822 werd verkregen door recombinatie uitgevoerd met donorplasmide pJCA008 bevattende het EHV-1 gp63 gen. Vaccinia recombinant vP803 werd verkregen bij recombinatie uitgevoerd met het donorplasmide pJCA007 bevattende het EHV-1 gE gen. Vaccinia recombinant vP809 werd verkregen door recombinatie uitgevoerd met het donorplasmide pJCA009 bevattende het EHV-1 gD-gp63 fragment en vaccinia recombinant vP810 werd verkregen door recombinatie 45 uitgevoerd met het donorplasmide pJCA010 bevattende het EHV-1 gD-gp63-gE fragment (tabel 5).

Immunofluorescentieanalyse van EHV-1 ORF1 (gD) ORF2 (gp63) en ORF3 (gE) producten gesynthetiseerd door enkelvoudige of veelvoudige recombinant vaccinia virussen.

Immunofluorescentie van met recombinant vaccinia virus geïnfecteerd VERO en MRC-5 cellen werd 50 uitgevoerd op de wijze zoals beschreven in voorbeeld 1, onder toepassing van anti-EHV-1 specifiek polyklonaal konijnenserum R5935 (1:200)(tabel 6).

195085 28 TABEL 5

Aanduiding van vaccinia virus recombinanten die EHV-1 gD, Ge en gp63 genen tot expressie brengen. Donorplasmide EHV-invoegsel Reddend virus Recombinant 5 - PJCA006 gD vP668 vP773 pJCA007 gE vP668 vP803 pJCA008 gp63 vP668 vP822 PJCA009 gD-gp63 vP668 vP809 70 pJCA010 gD-gp63-gE vP668 vP810 TABEL 6

Immunofluorescentie van met recombinant vaccinia virus geïnfecteerde cellen uitgevoerd onder toepassing van anti-EHV-1 konijn serum R5935.

15 _ EHV-1 recombinant R5935 intern oppervlak gD positief negatief gp63 positief negatief gE negatief negatief gD-gp63 positief negatief gD-gp63-gE positief negatief

Voorbeeld 10

Immunologische beoordeling bij muizen en varkens van pseudorabiesvirus glycoproteïnen gpll, Gplll en gp50, individueel of in combinatie met vaccina virus recombinanten tot expressie gebracht.

30 De Kopenhagenstam van vaccinia virus en de derivaten vP410, vP425 en vP458 (184) daarvan werden bij dit voorbeeld toegepast.

Kloneren van de PRV gen coderend gpll, gplll, en gp50.

PRV NlAg virus (182) werd gekweekt op NIL£ celcultuur (183). Celafval werd verwijderd uit de bovenstaande 35 vloeistof door 30 minuten te centrifugeren bij 3000 g. De virusdeeltjes werden gezuiverd door 60 minuten te centrifugeren door een 40 (gew./vol.) %-ig sucrosekussen bij 40.000 omwentelingen per minuut in een 45 Ti Beekman rotor gevolgd door een discontinue 30-50 (gew./vol.) %-ige sucrosegradiënt (SW25 Beekman rotor bij 23.000 opm. gedurende 5 uur). Bandvormige virusdeeltjes werden verzameld, verdund met TNE buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,8, 150 mM NaCI en 10 mM EDTA) en 1 uur bij 30.000 opm. in een SW40 Beekman 40 rotor omgezet in een persstukje. Het virale persstukje werd weer gesuspendeerd in TE buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,8, 10 mM EDTA) en gelyseerd door toevoegen van natriumdodecylsulfaat tot een eind-concentratie van 0,5 % (gew./vol.) en proteinase K tot 100 mg/ml. Na 2 uur incuberen bij 37°C werd het lysaat éénmaal geëxtraheerd met een mengsel van fenol en chloroform (1:1) en éénmaal met een mengsel van chloroform en isoamylalkohol (24:1). Het DNA werd neergeslagen met ethanol en weer opgelost in 45 water. Na een volledige digerering met BamHI werden de fragmenten gekloond in de BamHI plaats van pBR322 dat vooraf was behandeld met kalfsdarm alkalische fosfatase (CIAP). Het ligatiemengsel werd toegepast voor de transformatie van de competente E. coli stam NM522 (20).

Onder verwijzing naar de figuren 18 en 19, is de DNA volgorde coderende het gpll gen aanwezig in het BamHI fragment 1 en de Salll subfragmenten 1A en 1B van het PRV genoom (62, 94). Het plasmide 50 aangeduid met pPR9.25 bevattende het PRV BamHI fragment 1 ingevoegd op de BamHI plaats van pBR322 werd gedigereerd met Ncol. Het verkregen DNA gedigereerde product werd gefractioneerd over een 0,8 % agarosegel en een 6,2 Kb Ncol DNA fragment werd gezuiverd onder toepassing van de Gene Clean™ procedure (Bio101, Inc. La Jolla, CA) en daarna ingevoegd in de Ncolplaats van pBR328 (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) behandeld met CIAP. Het verkregen plasmide 55 pPR2,15 werd gedigereerd met Sphl en gefractioneerd met een agarosegel. De 2,7 en 1,8 Kb fragmenten werden gezuiverd en ingevoegd op de Sphl plaats van gefosfataseerde pUC18 ter vorming van de plasmiden pPR1 en pPR2 (figuur 18) en in de M13 faag. De nucleotidevolgorde werd op de hiervoor 129 195085 beschreven wijze bepaald. Uit DNA sequence analyse bleek dat een open afleesframe van 2742 bp coderende voor 913 aminozuren aanwezig was. Zoals verwacht werd een significante aminozuurhomologie met HSV-1 gB waargenomen (62). Ter vergemakkelijking van de beschrijving van de kloningshandelingen voor de expressie van PRV gpll in vaccinia virusvectoren, is de DNA volgorde van het PRV gpll open 5 afleesframe plus extra 5' en 3' niet-coderende volgorden weergegeven in figuur 19.

Onder verwijzing naar de figuren 20 en 21 wordt opgemerkt, dat de DNA volgorde coderende het PRV glycoproteïne gplll aanwezig is in de BamHI fragmenten 2 en 9 van het PRV genoom (96). Het plasmide pPR9,9 bevattende het BamHI fragment 2 ingevoegd op de BamHI plaats van pBR322 (figuur 20) werd gedigereerd met BamHI en Sphl. Het plasmide pPR7,5 bevattende het BamHI fragment 9 ingevoegd op de 10 BamHI plaats van pBR322 werd gedigereerd met Ncol en BamHI. Het DNA verkregen bij beide digereringen werd gefractioneerd over een agarosegel. Het 2,35 Kb Sphl-BamHI fragment en het 1,1 Kb Ncol-BamHI fragment werden gezuiverd en gekoppeld met de EcoRI-Sphl plaatsen van gefosfataseerd IBI25 (figuur 20) onder toepassing van een Ncol-EcoRI gefosforyleerde linker MRSYN21/MRSYN22 Ncol EcoRI

15 MRSYN21 5' CATGGGTCTGCAGTCG 3' MRSYN22 3' CCAGACGTCAGCTTAA 5'

Een plasmide aangeduid met pPR17 werd geïsoleerd, dat een 3450 bp Sphl-Ncol fragment waaronder het volledige PRV gplll gen (figuur 20) bevatte. De nucleotidevolgorde werd verkregen uit dubbelstrengs 20 plasmide matrijzen gedenatureerd met alkali en uit enkelstrengs matrijzen na kloneren in de M13 faag. De DNA sequence analyse leverde een open afleesframe van 1440 bp coderende 479 aminozuren op (figuur 21). Significante homologie met HSV gC, werd waargenomen zoals hiervoor reeds werd vermeld

Onder verwijzing naar de figuren 22 en 23 wordt opgemerkt, dat de DNA volgorde coderende het PRV 25 glycoproteïne gp50 aanwezig is in het BamHI fragment 7 van het PRV genoom (95). Plasmide pPR7.1 (figuur 22), bevattende het PRV BamHI fragment 7 ingevoegd op de BamHI plaats van pBR322 werd gedigereerd met Stul en Ndel en behandeld met Mung beannuclease. Het 1,7 Kb fragment werd gezuiverd uiteen agarosegel en ingevoegd op de Hindi plaats van gefosfataseerd IBI25. Dit plasmide, pPR22, (figuur 22) bevat het volledige PRV gp50 gen. Bepaling van de nucleotidevolgorde levert een 1215 bp open 30 afleesframe coderende voor 404 aminozuren (figuur 23) op. Er werd een significante homologie met het HSV-1 gD waargenomen, zoals hiervoor reeds werd vermeld (95).

Kloneren van de PRV genencoderende gpll, gplll en gp50 in vaccinia virus invoegdonorplasmiden.

Het 1060 bp PRV Sphl-Nhel fragment uit pPR1 (figuur 18A) werd geïsoleerd uit een agarosegel en 35 ingevoegd op de BamHI-Sphl plaatsen van plBI25 na behandeling met CIAP onder toepassing van een BamHI-Nhel gefosforyleerde linker MRSYN1/MRSYN2 BamHI Nhel MRSYN1 5' GATCCATTCCATGGTTG 3' MRSYN2 3' GTA AGGT ACCAACG AT C 5' 40 ter vorming van het plasmide pPR6 (figuur 18A).

pPR6 werd gedigereerd met Hindlll en Apal en behandeld met CIAP. De Apal plaats is 32 bp stroomafwaarts van het ATG initiatiecodon van PRV gpll (figuur 19) aanwezig. Een dubbelstrengs DNA fragment werd verkregen door annealing het paar synthetisch gefosforyleerde oligonucleotiden MRSYN3/M [RSYN4. Dit fragment bevat DNA specificerende de vaccinia H6 promotor uit de EcoRV plaats via het ATG (onder-45 streept), onmiddellijk gevolgd door PRV gpll coderende volgorden.

HindllIEcoRV Apal MRSYN 5' AGCTT GAT AT CCGTT AAGTTT GTATCGT AATGCCCGCTGGT GGCGGT C-TTTGGCGCGGGCC 3' MYSYN4 3' ACT AT AGGCAATT CAAAC AT AGCATT ACGGGCG ACCACCGCCAG AAA-50 CCGCGC 5'

Het synthetische DNA werd gekoppeld aan het 3920 bp Hindlll-Apal fragment afgeleid van pPR6 ter verkrijging van het plasmide pPR9 (figuur 18A).

Het plasmide pPR9 werd gedigereerd met BamHI en Nhel, behandeld met CIAP en gekoppeld onder 55 toepassing van een gefosforyleerde BamHI-Sphl linker.

195085 30

Sphl BamHI

MRSYN7 5' ~ CCCAGAT CT CCTT G 3' MRSYN8 3' GTACGGGTCTAGAGGAACCTAG 5' tot een 1640 bp Sphl-Nhel fragment verkregen uit pPR1 vormend het plasmide pPR12 (figuren 18A, 18B).

5 Het 1030 bp Hincll-Sphi fragment uit pPR2 (figuur 18A) werd geïsoleerd uit een agarosegel en ingevoegd op de Hincll-Sphl plaatsen van gefosfataseerde pUC18. Het verkregen plasmide pPR10 werd gedigereerd met Hindlll en Nael en behandeld met CIAP. De Nael plaats bevindt zich 44 bp stroomopwaarts van het TAG terminatiecodon (figuur 19). Een dubbelstrengs DNA fragment verkregen door annealing het paar gefosforyleerde synthetische oligonucleotiden MRSYN9/MRSYN10 10 Nael Xmalll Hindlll MRSYN9 5' GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTGTAGAA-TTTTT AT CGGCCGA 3' MRSYN10 3' CCGT GATGGT CGCGGAGCT CT CGCT CCT GGGGCT GCGGGACATCT-T AAAAAT AGCCGGCTT CG A 5' 15 werd gekoppeld aan het 3720 bp Nael-Hindlll fragment, afgeleid van pPR10, ter vorming van het plasmide pPR11.

De onderstreepte volgorden komen overeen met het PRV gpll terminatiecodon en met een vaccinia vroeg transcriptieterminatiesignaal (45). Het 770 bp Sphl-Hincll fragment uit pPR2 werd gezuiverd uit een agarosegel en ingevoegd onder toepassing van een BamHI-Sphl gefosforyleerde linker (MRSYN7/MRSYN8) 20 op de BamHI-Hincll plaatsen van met CIAP behandeld pPR11 ter vorming van pPR13 (figuren 18A, 18B). Plasmide pPR12 gedigereerd met EcoRI en Sphl en behandeld met CIAP werd gekoppeld onder toepassing van een gefosforyleerde HindllI-EcoRI linker (MRSYN19/MRSYN20)

Hindlll EcoRI

MRSYN19 5' AGCTTCTGCAGCCATGGCGATCGG 3' 25 MRSYN20 3' AGACGTCGGTACCGCTAGCCTTAA 5' tot een 990 bp Hindlll-Sphl geïsoleerd fragment afgeleid van pPR13, ter vorming van het plasmide pPR15 (figuur 18B).

Het met HindllI-EcoRV gedigereerde 2780 bp fragment uit pPR15 werd behandeld met Mung beannu-clease, gezuiverd uit een agarosegel en ingevoegd in plasmide pTP15 (184) (figuur 3), dat was gedigereerd 30 met Xmalll-EcoRV, Mung beannuclease en CIAP ter vorming van plasmide pPR18 (figuur 18B). In pPR18 is PRV gpll gekoppeld met de synthetische vaccinia H6 promotor op de vaccinia hemagglutinine deletieplaats. Dit plasmide werd door transfectie gebracht in met vaccinia virus geïnfecteerde cellen, ter vorming van de vaccinia recombinanten vP534, vP644, vP621 en vP692 bevattende het PRV gpll gen (zie hierna).

Het PRV gpll! gen werd gemanipuleerd teneinde het tot expressie te brengen onder de controle van de 35 vroege vacciniavirus promotor, μ, (zie hierna) aanwezig in het vaccinia Hindlll B fragment. Onder toepassing van plaatsspecifieke mutagenese, werd een Nsil plaats ingevoerd door verandering van de volgorde CGC (basen 192-194) (figuur 21) in PRV gplll tot ATG en een Xbal plaats werd ingevoerd door wijziging van de volgorde GTGACGT in TTCTAGA (basen 1632-1638) (figuur 21). Hiertoe werd dit enkelstrengs DNA gevormd uit plasmide pPR17 onder toepassing van een helperfaag R408 (Stratagene, La Jolla, CA) (185).

40 De plaatsgerichte mutagenese werd uitgevoerd onder toepassing van twee gezuiverde, gefosforyleerde, synthetische oligonucleotiden MRSYN5 en MRSYN6.

Nsi I

MRSYN 5' GCGAGCGAGGCCATGCATCGTGCGAATGGCCCC 3'

Xbal 45 MRSYN 5' GGGGGGACGCGCGGGTCTAGAAGGCCCCGCCTGGCGG 3' en selectie op E. coli dut ung stam CJ236 (IBI, New Haven, CT) (17,186).

Deze mutaties vormden plasmide pPR28. Plasmide pPR28 werd gedigereerd met Nsil en Xbal en behandeld met Mung beannuclease. Een 1440 bp fragment werd gezuiverd uit een agarosegel en ingevoegd op de Bglll-Hpal plaatsen van pSD478VC (figuren 20, 24) na behandeling met Mung beannu-50 clease en CIAP. Plasmide pPR24 werd via transfectie gebracht in met vaccinia virus geïnfecteerde cellen ter vorming van vaccinia virus recombinanten vP604, vP644, vP691 en vP692 bevattende het PRV gplll gen (zie hierna).

PRV gp50 werd gemanipuleerd teneinde dit tot expressie te brengen onder de controle van een vroege/intermediaire vaccinia virus promotor, I3L (187). Onder toepassing van plaats-specifieke mutage-55 nese, werd een Nsil plaats ingevoerd door verandering van de volgorde CCTGCCAGCGC (basen 177-187) (figuur 23) in gp50 tot ATGCATTTAAT en een Bglll plaats werd ingevoerd door verandering van de volgorde CCT CCGCAGT ACCGG bij de basen 1404-1418 (figuur 23) in AATTTTT AT AG AT CT. Eerder 31 195085 beschreven methoden (17, 185, 186) van mutagenese werden toegepast ter verkrijging van plasmide pPR29 uit pPR22 onder toepassing van gezuiverde, gefostoryleerde, synthetische oligonucleotiden MRSYN12 en MRSYN13 (figuur 22).

Nsil 5 MRSYN12 5' GGTTCCCATACACTCAATGCATTTAATCATGCTGCTCGCAGCGC 3' MRSYN13 5' GCAGCCCG GTCCGT AG AATTTTT ATAG AT CT CGT CG AT GAT GAT GGT 3' pPR29 werd gedigereerd met Nsil, behandeld met Mung beannuclease en gedeeltelijk gedigereerd met Bglll ter vorming van een 1290 bp fragment. Plasmide pMP13PP (figuren 22, 25) werd gedigereerd met EcoRI, behandeld met Mung beannuclease en daarna met BamHI, ter verkrijging van een 140 bp fragment 10 bevattende de vaccinia I3L promotor. De 1290 en 140 bp fragmenten werden gezuiverd uit agarosegelen en gekoppeld aan de gefosfataseerde Bglll plaats van pMP409DVC (figuren 4, 22). Het verkregen plasmide, pPR26, werd toegepast in recombinatie ter verkrijging van de vaccinia virus recombinanten vP591, vP621, vP691 en vP692 bevattende het gp50 gen (zie hierna).

15 Constructie van vaccinia recombinanten die individueel of in combinaties de PRV glycoproteïnen gpll, en gp50 tot expressie brengen.

Ter bepaling van de immunogeniciteit en de relatieve bijdrage van de drie PRV glycoproteïnen (gpll, gplll en gp50) voor de bescherming van geïmmuniseerde dieren tegen virulente PRV provocatie, werd een reeks vaccinia recombinanten geconstrueerd die de drie PRV glycoproteïnen alleen of in combinatie tot expressie 20 brengen.

Onder verwijzing naar figuur 24 werd het recombinant vaccinia virus, vP533, dat het β-galactosidasegen tot expressie brengt, op de volgende wijze verkregen: Een 1 Kb gebied binnen vaccinia Hindlll fragment B overspannend de Sail F/l verbinding van het Kopenhagen genoom bevat DNA homologie met het hemorrha-gische (μ) gen van koepokkenvirus (188), zoals bepaald met Southern blot analysis (189). Het μ gen 25 codeert een polypeptide met overeenkomst met serineproteaseremmers en is biologisch verantwoordelijk voor hemorrhagische pokkenvorming door het virus op het chorioallantoische membraan. De DNA volgorde van het Kopenhagen genoom laat zien dat het μ gen-equivalent veelvuldige frameshiftmutaties bevatte en biologisch niet functioneel was. Plasmide pSD419VC (184) (figuur 24) bevat het linker gedeelte van het μ gebied. Plasmide pSD422VC, dat het Kopenhagen Sail fragment I gekloond in pUC8 bevat, bevat de rest 30 van het μ gebied. Ter verwijdering van ongewenste vaccinia volgorden naar het linker gedeelte, werd pSD419VC gedigereerd met Ncol en Smal, blunt-ended met het Klenow fragment van E. coli polymerase en weer gekoppeld, hetgeen plasmide pSD476VC (figuur 24) gaf. Plasmide pSD422VC werd gedigereerd met Hpal en Nrul en een ongeveer 0,3 Kb fragment onmiddellijk rechts van het μ gebied geplaatst werd geïsoleerd uit een agarosegel. Dit fragment werd gekoppeld aan pSD476VC geknipt met Hindi (dat Sail 35 plaatsen herkent), hetgeen leidde tot plasmide pSD477VC. Teneinde β-galactosidase tot expressie te brengen onder controle van het Kopenhagen vaccinia μ promotor gebied, werden synthetischeoligonucleoti-den 22mer/20mer bereid. De volgorde van 22mer/20mer met de aangegeven restrictieplaatsen en het ATG initiatiecodon onderstreept is als volgt:

Clal Hpal 40 22mer 5' CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3' 20mer 3' TAATGATACTTCCTAGGCAA 5'

Het annealed 22mer/20mer mengsel werd gekoppeld aan pSD477VC gedigereerd met C|al en Hindi, hetgeen leidde tot het nieuwe plasmide pSD479VC (figuur 24). Een 3,1 Kb BamHI fragment bevattende de E. coli β-galactosidase coderende volgorden uit pMC1871 (34) zonder initiatiecodon en promotor werd 45 gekoppeld aan pSD479VC geknipt met BamHI. Het verkregen plasmide dat het lacZ gen in de juiste oriëntatie onder controle van de Kopenhagen μ promotor bevatte werd aangeduid met pSD479VCBG. Dit invoegdonorplasmide werd gerecombineerd in vaccinia virus vP410 (184). Een recombinant vaccinia virus werd geïdentificeerd op basis van blauwe plaque-vorming in aanwezigheid van het chromogene substraat X-gal (9, 24), plaque gekloond en aangeduid met vP533 (figuur 24).

50 Ter vorming van een vectorplasmide voor het invoegen van vreemde genen, werden synthetische oligonucleotiden 42mer/40mer bereid.

Clal Bglll Sacl Smal Xhol BamHI Hpal 42mer 5' CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGGATCCGTT 3' 40mer 3' T AAT GAT CT AG ACT CGAGGGGCCCG AGCT CCCCT AGGCAA 5' 55 Het annealed 42mer/40mer mengsel werd verknoopt met pSD477VC geknipt met Clal en Hindi, hetgeen leidde tot het nieuwe plasmide pSD478VC (figuur 24). Dit plasmide bevat ongeveer 0,3 Kb vaccinia volgorden aan elke kant van het multiklonerende gebied dat volledig het μ coderende gebied van de 195085 32

Kopenhagen stam van vaccinia vervangt. pSD478VC werd toegepast ter vorming van pPR24 (figuur 20) bevattende PRV gplll coderende volgorden en vaccinia recombinanten vP604, vP644, vP691 en vP692.

Onder verwijzing naar figuur 25 wordt, opgemerkt dat plasmide pMP419 een 850 bp BamHl fragment uit vaccinia Hindlll fragment I bevattende de I3L promotor ingevoegd op de BamHl plaats van pUC8 (figuur 25) 5 bevat. Het I3L promotorelement correspondeert met DNA volgorden stroomopwaarts van het I3L open afleesframe in het vaccinia Hindlll fragment I (187) en werd eerder toegepast voor het tot expressie brengen van vreemde genen in vaccinia virus recombinanten (27, 190). pMP419 werd lineair gemaakt op de unieke Clal plaats in met I3L coderende volgorden en onderworpen aan Bal 31 digerering gevolgd door digerering met EcoRI en blunt-ending door behandeling met het Klenow fragment van E. coli polymerase. Het W verkregen plasmide, pMP419-5, (figuur 25), bevat de I3L promotorvolgorden stroomopwaarts van nucleotide 8 gekoppeld aan een EcoRI plaats. Het promotorelement werd afgescheiden als een EcoRI-Mspl fragment uit pMP419-5 en ingevoegd bij met EcoRI-Clal gedigereerd pUC13C, een pUC13 derivaat bevattende een Clal linker op de Smal plaats. Het verkregen plasmide pMP13PP (figuur 22, 25) bevat de I3L promotorvolgorden van plaats -126 via plaats -8 gevolgd door een EcoRI plaats op plaats -8.

15 PRV gp50 aangezet door de vaccinia I3L promotor werd ingevoegd in de M2L deletie plasmidevector pMP409DVC (figuur 4), leidende tot pPR26 (figuur 22). pPR26 werd toegepast ter vorming van de vaccinia recombinanten vP591, vP621 en vP691 en vP692.

Isolatie van recombinant vaccinia virussen.

20 Recombinant vaccinia virussen die de PRV genen bevatten werden op de hiervoor beschreven wijze geïdentificeerd en gezuiverd. Recombinant vaccinia virussen die de drie PRV glycoproteïnen gpll, gplll en gp50 alleen of in expressie brengen, zijn vermeld in tabel 7.

TABEL 7 25 Benoeming van vaccinia virus recombinanten die de PRV glycoproteïnen gpll, gplll en gp50 tot expressie brengen.

Recombinant Ouder Donorplasmide PRV glycoproteïnen 30 vP534 vP425 pPR18 gil vP591 vP458 pPR26 gp50 vP604 vP533 pPR24 glll vP621 VP534 pPR26 gil + gp50 vP644 vP604 pPR18 gil + glll 35 vP691 vP604 pPR26 glll + gp50 vP692 vP644 pPR26 gil + glll + gp50

In vitro beoordeling van de PRV glycoproteïnen tot expressie gebracht door vaccinia virus recombinanten.

40 De PRV glycoproteïnen gpll, gplll en gp50 zijn typische glycoproteïnen geassocieerd met de membraanachtige structuur van met PRV geïnfecteerde cellen en zijn bovendien bestanddelen van het virus. Anti-gpll, anti-gplll en anti-gp50 specifieke, monoklonale antilichamen gevolgd door fluoresceïne geconjugeerde geit anti-muis IgG gaven een krachtige immunofluorescentie op het oppervlak bij cellen geïnfecteerd met de recombinant vaccinia virussen, doch niet bij met wildtype vaccinia virus geïnfecteerde cellen.

45

In vivo beoordeling van het immunogene potentiaal van PRV glycoproteïnen gpll, gplll en gp50 tot expressie gebracht door vaccinia virus recombinanten in muizen en varkens.

Teneinde de relatieve immunogeniciteit van de drie glycoproteïnen tot expressie gebracht door vaccinia virus recombinanten te bepalen, werden muizen in het voetbed ingeënt met 50 tot 100 pl van verschillende 50 doses van de recombinant virussen. 14 dagen na de immunisatie werden de muizen geprovoceerd met 10 LD50 van de virulente Kojnock stam van PRV via intraperitoneale weg. Volgens voorafgaande onderzoekingen werd aangetoond dat elk van de PRV glycoproteïnen doeltreffend te zijn bij het beschermen van ingeente muizen tegen een virulente PRV provocatie. Volgens een uitgebreidere reeks onderzoekingen waarbij gebruik gemaakt werd van meer dan 500 muizen, werd de werking van vaccinia recombinanten die 55 PRV glycoproteïnen tot expressie brengen onderzocht. Berekend werd de vaccinatiedosis die in staat is 50 % van de geprovoceerde muizen te beschermen (PD50) en de resultaten van deze onderzoekingen zijn weergegeven in tabel 8. Recombinant vaccinia virus dat individueel PRV glycoproteïnen gpll, gp50 en gplll 33 195085 tot expressie brengt geven berekende PD50 waarden van respectievelijk 6,4, 5,4 en 5,8 (log10). Werden de glycoproteïnen in combinatie tot expressie gebracht, dan werden de significant betere PD50 waarden berekend. De vaccinia recombinant die PRV gpll plus gp50 tot expressie brengt gaf een PDS0 waarde van 3,3, terwijl de vaccinia recombinant die PRV gp50 plus gplll tot expressie brengt een vrijwel overeenkom-5 stige PD50 waarde (3,6) geeft. Duidelijk doeltreffender is de recombinant die de PRV glycoproteïnen gpll plus gplll tot expressie brengt, waar een PD50 van 1,5 werd verkregen. Co-expressie van alle drie PRV glycoproteïnen gpll, gplll en gp50 in een recombinant vaccinia virus geeft geen PD50-waarde die significant lager is dan die verkregen met de recombinant virussen die de drie PRV glycoproteïnen afzonderlijk tot expressie brengen. De gepotentieerde werking die met de vaccinia recombinant die gpll en gplll tot 10 expressie brengt vergeleken met het vaccinia recombinant virus dat de genen afzonderlijk tot expressie brengt is overeenkomstig aan de resultaten vermeld in tabel 6 voor de co-expressie van de paard herpesvirus glycoproteïnen gp13 en gp14.

TABEL 8 15 De werking van vaccinia virus recombinanten die de pseudorabies virus glycoproteïnen gp50, gpll en gplll tot expressie brengt.

Recombinant virus PRV genen die tot expressie zijn gebracht PD50 20 VP534 gpll 6,4 vP591 gp50 5,4 vP604 gplll 5,8 vP621 gpll + gp50 3,3 vP644 gpll + gplll 1,5 25 vP691 gp50 + gplll 3,6 vP692 gp50 + gpll + gplll 5,1

Hoewel de muis een interessant modelsysteem voor de beoordeling van PRV glycoproteïne immunogenici-30 teit kan geven, is het belangrijkste doelwitspecies van een PRV vaccin het varken. Daarom, teneinde de geldigheid van de recombinant vaccinia virus aanpak bij varkens te beoordelen, werd het volgende onderzoek uitgevoerd. Biggetjes met een gewicht van ongeveer 25 kg werden intramusculair ingeënt met 2 ml van de vaccinia recombinanten die combinaties van de PRV glycoproteïnen gpll, gplll en gp50 tot expressie brengen. Het virus-entstof werd verdund in PBS. Vijfendertig dagen na deze inenting werden de 35 biggetjes geprovoceerd met een injectie in de neus (1 ml in elk neusgat) van een virulente PRV isolaat NIA3 suspensie. De doeltreffendheid van de vaccininatie werd beoordeeld door 7 dagen na de provocatie de relatieve gewichtstoename van gevaccineerde en controle biggetjes te meten. De relatieve gewichtstoename wordt berekend als het dagelijkse, gemiddelde percentage gewichtstoename dat bij gevaccineerde biggetjes wordt waargenomen verminderd met het dagelijkse gemiddelde percentage gewichtstoename van niet-40 gevaccineerde controle biggetjes. De normale gewichtstoename van biggetjes onder ongestoorde omstandigheden is groter dan 1,1 kg. Zoals uit de waarden vermeld in tabel 9 blijkt, wordt de gewichtsontwikkeling gedurende de periode van 7 dagen na PRV provocatie in sterke mate bij de gevaccineerde biggetjes vergroot ten opzichte van de met wildtype virus ingeente controle groep. Eén enkele inenting met de vaccinia virus recombinanten biedt een aanzienlijke bescherming tegen gewichtsverlies na virulente PRV 45 provocatie, TABEL 9

Beoordeling van vaccinia recombinanten die combinaties van de PRV glycoproteïnen gp50, gpll en gplll in biggetjes tot expressie brengt.

50 -

Entvirus PVR genen die tot Vaccinerende dosis Relatieve gewichtstoename expressie zijn gebracht log10 TCID50/ml vP452 geen 107·7 -0,31 55 vP621 gpll + gp50 107·7 2,89 vP644 gpll + gplll 107·7 2,15 195085 34 TABEL 9 (vervolg)

Beoordeling van vaccinia recombinanten die combinaties van de PRV glycoproteïnen gp50, gpll en gplll in biggetjes tot expressie brengt.

5 Entvirus PVR genen die tot Vaccinerende dosis Relatieve gewichtstoename expressie zijn gebracht log10 TCID50/ml VP691 gp50 +gplll 107·3 1,21 vP692 gp50 + gpll + gplll 107·3 2,67 10 -

De beschikbaarheid van vaccinia virus recombinanten die de drie dominante PRV glycoproteïnen, afzonderlijk of in combinatie, tot expressie brengen, bieden een aantal voordelen ter bestrijding van PRV infecties: (a) een significant voordeel is dat de recombinant vaccinia virussen als vaccinerende middelen slechts een 15 beperkt aantal PRV genen tot expressie brengen, waardoor er geen te verwachten risico van reversie van een verzwakte PRV vaccinstam tot een virulente vorm is en er geen voortgezette invoering van PRV virus in het milieu is, (b) aangezien slechts een beperkt aantal PRV antigenen door de vaccinia virus recombinant PRV vaccin kandidaten tot expressie wordt gebracht, maakt dit de discriminatie van gevaccineerde tegen natuurlijk geïnfecteerde dieren mogelijk, aangezien diagnostische reagentia die uit andere PRV antigenen 20 bestaan kunnen worden bereid ter verkrijging van een onderscheid tussen gevaccineerde en natuurlijk geïnfecteerde dieren, en (c) dergelijke recombinantvaccins bruikbaar kunnen zijn bij het verbreken van de natuurlijke, verticale overdracht van PRV uit varkens naar het nakomelingschap. Dit kan geschieden door vaccinatie van de zwangere zeug met een vaccinia virus recombinant die een discreet stel PRV glycoproteïnen tot expressie brengt. Immuniteit via de moeder zal het nakomelingschap tegen PRV infectie 25 beschermen. Daarna kan het nakomelingschap worden gevaccineerd met een vaccinia virus recombinant die nog een andere configuratie van PRV antigenen verschillend van die welke werden toegepast voor het vaccineren van de zeug tot expressie worden gebracht. Dit is een mogelijke weg om door de immuniteit van de moeder te breken. Een andere benadering om immuniteit via de moeder aan te pakken zal het tot expressie brengen van de PRV glycoproteïnen in welke combinatie dan ook in een volledig heterologe 30 vector zijn. Dit kan worden uitgevoerd door de constructie van vogelpokkenvirus recombinanten die PRV glycoproteïnen tot expressie brengen. De bruikbaarheid van vogelpokkenvirus recombinanten waarvan het natuurlijke gastheertraject beperkt is tot vogelspecies, bij de vaccinatie van niet-vogelspecies, is aangetoond (41). Er zijn dus twee manieren om het aspect van de barrière verschaft door immuniteit van de moeder aan te pakken: (1) de vectoren en (2) de constellatie van de antigenen die door deze vectoren tot expressie zijn 35 gebracht.

Voorbeeld 11

Vogelpokkenvectoren die het pseudorabies virus glycoproteïne gpll tot expressie brengen.

Men liet kanariepokkenvirus groeien op primaire kuikenembryofibroblasten (CEF) verkregen uit 10-11 dagen 40 oude eieren met een embryo betrokken van SPAFAS, Inc. (Norwich, CT) onder de hiervoor beschreven omstandigheden (41, 42). Het virus werd gezuiverd van gastheercelverontreinigingen door sucrosegradiënt-centrifugatie onder toepassing van de methode beschreven door Joklik (191). Varkensnier (PK-1) cellen werden betrokken van de American Type Culture Collection, Rockville, MD(ATCC #CL101).

45 Constructie van een kanariepokkenvirusrecombinant die het pseudorabiesvirus gpll glycoproteïne tot expressie brengt.

Onder verwijzing naar figuur 26, werd het plasmide pPR15 (figuur 18) toegepast als bron van het PRVgpll gen. Ter isolering van het DNA segment dat het volledige PRVgpll gen bevatte, werd pPR15 gedigereerd met EcoRV en Hindlll. Een fragment van ongeveer 2,8 Kb bevattende 21 bp van het 3' uiteneinde van de 50 vaccina virus (VV) H6 promotor en het volledige PRVgpll gen werden bij deze digerering gevormd.

Het 2,8 Kb EcoRV/HindllI fragment werd geïsoleerd voor invoeging in pFPCV2 (figuren 8, 26).

Het 2,8 Kb EcoRV /Hindlll fragment (hiervoor gedefinieerd) werd ingevoegd in het 8,0 Kb pFPCV2 fragment verkregen door volledig digereren met Hindlll en partieel digereren met EcoRV. Koppeling van deze twee fragmenten leidde tot de vorming van een 10,8 Kb plasmide aangeduid met pFPPRVII.

55 Onder verwijzing nu naar figuur 27, werd plasmide pFPPRVII toegepast voor de vorming van een 2,8 Kb Nrul/ Hindlll fragment voor invoeging in pCPCVI (figuur 9). Het pCPCVI plasmide bevat de VV H6 promotor op de unieke EcoRI plaats in het 3,3 Kb Pvull CP genomische fragment. Dit invoegplasmide 35 195085 maakt het invoegen van vreemde genen op de C3 plaats van het CP genoom mogelijk. Het plasmide pCPCVI werd gedigereerd met Nml en Hindlll en het 5,8 Kb fragment werd geïsoleerd voor koppeling aan het hiervoor gedefinieerde 2,8 Kb fragment. Het verkregen plasmide werd aangeduid met pCPPRVII.

De dominante, selecteerbare merker E. coli xanthine-guanine fosforibosyltransferase (Eco gpt) werd 5 ingevoegd in pCPPRVII als middel voor de groeiselectie van CP/PRVgpll recombinanten. Voorgaande publicaties hebben het gebruik van Eco gpt als een selecteerbare merker bij de vorming van pokkenvirusrecombinanten beschreven (193, 194). Het Eco gpt gen werd verkregen uit het plasmide pSV2gpt (ATCC #37145). Het 670 bp Bglll/Dral fragment, bevattende het Eco gpt gen, werd uit dit plasmide geïsoleerd en gebracht op de Bglll/Smal plaats van pSD486VC. Het verkregen plasmide, pGPT-1, bevat het Eco gpt gen 10 tussen de VV μ gen flankerende armen en onder de transcriptionele regulering van de μ promotor. Het plasmide pSD486VC werd op de volgende wijze verkregen uit pSD478VC (figuur 24). pSD478VC werd gedigereerd met EcoRI in het MCR, ingebracht met Klenow standaard reactie in aanwezigheid van dNTP (0,5 mM elk) en weer gekoppeld onder vorming van pSD478E VC. Dit plasmide werd gedigereerd met Hpal en BamHI en annealed oligonucleotide HEM 5 (5'-GATCCGATTCTAGCT-3') en HEM 6 (5'-15 AGCTAGAATCG-3') werden ingevoegd ter verkrijging van pSD486VC.

Door digereren van pGPT-1 met Ncol en EcoRI komt een 1,0 Kb fragment vrij dat het Eco gpt gen (670 bp) en de VV μ promotor (330 bp) bevatte. De Ncol en EcoRI uiteinden werden blunted onder toepassing van het Klenow fragment van de E. coli DNA polymerase in aanwezigheid van 0,5 mM dNTPs. Hindlll linkers (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) werden toegevoegd aan het blunt-ended 20 fragment. Het DNA werd gedigereerd met Hindlll en het 1,0 Kb fragment werd uit een agarosegel gewonnen. Dit 1,0 Kb Hindlll fragment werd daarna ingevoegd op de Hindlll plaats van pCPPRVII. Het verkregen plasmide bevattende de Eco gpt en PRVgpll genen gebonden in een staart tot staartconfiguratie werd aangeduid met pCPPRVII gpt. Dit plasmide werd bij in vitro recombinatie-onderzoekingen toegepast voor invoegen op de C3 plaats van het CP genoom. Selectie van recombinanten die het Eco gpt gen bevatten 25 werden uitgevoerd in aanwezigheid van 100 pg/ml mycofenolisch zuur en de Eco gpt-positieve recombinanten werden daarna onderzocht op de aanwezigheid van het PRVgpll gen door plaquehybridisatieanalyses. Eco gpt en PRV gpll positieve plaques werden gezuiverd door drie cycli van plaqueisolatie en zuivere populaties liet men groeien tot een hoge titer en duidde ze aan met pCP55. Southern blot analyses bevestigde dat deze twee genen inderdaad genetisch in deze CP recombinanten waren gekoppeld. De CP 30 recombinant werd aangeduid met vCP55.

Immunofluorescentie van met vCP55 geïnfecteerde cellen.

Immunoflurescentie-onderzoekingen werden uitgevoerd ter demonstrering van de cellulaire lokalisatie van het tot expressie gebrachte PRV gpll in met vCP55 geïnfecteerde cellen. CEF of PK-1 cellen werden geënt 35 op glazen dekplaatjes van 22 mm in schalen van 35 mm in een hoeveelheid van 5 x 105 cellen/schaal. CEF en PK-1 cellen werden geïnfecteerd met vCP55 of het CP parentale virus. Infecties en incubaties voor de immunofluorescentieproef werden uitgevoerd op de wijze zoals beschreven in voorbeeld 1, onder toepassing van het monoklonale antilichaam 75N10, 1 tot 100 verdund in PBS+.

De geïnfecteerde cellen werden geanalyseerd voor zowel interne als oppervlakexpressie. Er werd geen 40 significante oppervlakexpressie van gpll waargenomen in elk celsysteem dat met vCP55 was geïnfecteerd. Interne expressie van het gpll genproduct werd echter zowel in met vCP55 geïnfecteerde CEF cellen als PK-1 cellen aangetoond. De interne fluorescentiesignalen in beide celtypen werden gelokaliseerd in de korrels in het perinucleaire gebied van de geïnfecteerde cellen. Uit deze resultaten blijkt dat het PRVgpll tot expressie gebracht door CP wordt vervoerd naar het golgi complex doch niet naar het plasmamembraan.

45 Dit resultaat verschilt van de resultaten van met vaccinia virus tot expressie gebracht gpll dat is gedetecteerd op het oppervlak van de geïnfecteerde cellen.

Immunoprecipitatie van PRVgpll uit CEF en met PK-1 geïnfecteerde cellen.

Expressie van het genproduct door vCP55 werd geanalyseerd door immunoprecipitatie uit geïnfecteerde 50 cellysaten. De celmonolagen werden geïnfecteerd met 5 PFU/cel. Het immunoprecipitatie-onderzoek werd uitgevoerd op de wijze als beschreven in voorbeeld 1, onder toepassing van het monoklonale antilichaam 75N10.

De overheersende polypeptidespecies neergeslagen met konijn anti-PRV serum uit met CEF en PK-1 geïnfecteerde cellen migreerden met schijnbare molecuulgewichten van ongeveer 120 kDa, 67 kDa en 55 58 kDa. Deze polypeptiden geven respectievelijk de voorloper en proteolytisch verwerkte vormen van het PRVgpll gedetecteerd in met PRV geïnfecteerde cellen waarvan via disulfidebindingen complexen zijn gevormd aan (86, 101, 196). Kleine species met schijnbare molecuulgewichten van ongeveer 26 kDa 195085 36 werden eveneens waargenomen en kunnen verdere proteolytische verwerkingen van gpll in deze met CP/PRV recombinant geïnfecteerde cellen weergeven. Geen equivalente polypeptiden werden neergeslagen uit controle met CP virus geïnfecteerde cellen en niet-geïnfecteerde cellysaten.

5 Beschermingsonderzoekingen.

Het vermogen van vCP55 een beschermende immuunrespons tegen levende PRV provocatie op te wekken werd bij het muissysteem geanalyseerd. Muizen werden in het voetbed ingeënt met 50 pl tot 100 μΙ monsters die verschillende doses vCP55 bevatten, zoals is weergegeven in tabel 10. Veertien dagen na de immunisatie ontvingen de muizen 16 LD50 van de Kojnock stam van PRV via de intraperitoneale weg.

10 Veertien dagen na de provocatie, op welk tijdstip het onderzoek werd afgesloten, werden de overlevenden geteld. Zoals blijkt uit tabel 10 beschermde inenting van muizen met een enkelvoudige dosis van 106,85 TCID50 acht van de tien muizen tegen een letale provocatie van PRV. De onderzochte lagere doses van VCP55 boden geen enkele bescherming. Provocatie met levend PRV veroorzaakte de dood van zeven van de acht niet-gevaccineerde muizen. Uit de resultaten vermeld in tabel 10 werd een PD50 (beschermende 15 dosis voor 50 %) berekend van 106,16 voor de vCP55 recombinant.

De werking van vCP55 als een immuniserend middel tegen provocatie met levend PRV werd eveneens onderzocht bij de doelwitspecies, het biggetje. Men verdeelde 15 biggetjes met een gewicht van bijna 25 kg in drie groepen. De vCP55 groep en de CP parentale virusgroep ontvingen elk twee inentingen (2 ml gelijk aan 2x10® TCID50), op de dagen 0 en 28, via de intramusculaire weg. Vijf biggetjes werden behouden als 20 niet-gevaccineerde controles. Aan alle biggetjes werd de pathogene NIA3 stam van PRV via de intranasale route op dag 35 toegediend. De werking werd gevolgd door de gewichtsontwikkeling van met vCP55 gevaccineerde en controle biggetjes gedurende de zeven dagen na de provocatie te volgen. De gewichtsontwikkeling werd berekend als Delta GMQR waarden (in kilogram) = gemiddeld GMQR % gevaccineerde biggetjes - gemiddeld GMQR % niet gevaccineerde biggetjes.

25 In de niet-gevaccineerde groep bezweken alle biggetjes aan de PRV virusprovocatie (twee op dag 5, twee op dag 6 en één op dag 7). In de met wildtype virus (CP) ingeente groepen bezweken vier van de vijf biggetjes aan de provocatie (drie op dag 6 en één op dag 7). Alle biggetjes in de met vCP55 gevaccineerde groep overleefden de PRV provocatie en gedijden.

De significante waarden van de bescherming van biggetjes ingeënt met vCP55 die het PRVgpll 30 glycoproteïne tot expressie brengt tegen levende PRV provocatie werd onderzocht (tabel 11). Met vCP55 gevaccineerde dieren hadden een significante netto gewichtstoename gedurende de experimentele periode, terwijl de twee controlegroepen een significant gewichtsverlies gedurende de periode na de PRV provocatie vertoonden. Bovendien werden geen doodsgevallen in de met vCP55 gevaccineerde groep aangetroffen, terwijl een 80 %-100 % mortaliteitsrate bij de controlegroepen na provocatie met levend PRV werd 35 gevonden.

TABEL 10

Werking van vCP55 bij muizen.

40 Dosis log10 TCID50 Bescherming 6.85 8/10 4.85 0/10 2,80 0/10 45 0,85 0/10 TABEL 11

Bescherming van gevaccineerde (vCP55) biggetjes tegen provocatie met PRV, zoals bepaald door het aantal doodsgevallen en gewichtsverlies.

50_____________

Behandeling Mortaliteit Gewichtstoename

Niet-gevaccineerd 5/5 -2,12

Wildtype (CP) 4/5 +0,61 55 Recombinant (vCP55) 0/5 +2,51 37 195085

Voorbeeld 12

Vaccinia recombinanten die PRV g! glycoproteïnen tot expressie brengen.

Bij dit voorbeeld werden het Kopenhagen stam vaccinia virus en daarvan afgeleide recombinanten toegepast.

5

Klonen van het PRVgl gen in kanariepokken en vaccinia virus donorplasmiden.

Onder verwijzing naar figuur 28, werd een plasmide pGPI bevattende het PRVgl gen (NIA3 stam) betrokken van Rhone Merieux, Lyon, Frankrijk. Het gl gen (volgordereferentie (80)) werd uit dit plasmide geïsoleerd en stroomafwaarts van de vaccinia synthetische H6 promotor gekloneerd (69). Dit geschiedde door klonen van 10 het 2,330 bp Xhol-Ncol (partieel) fragment van pGPI in het 6.400 bp Xhol-Ncol fragment van pGBC2. (pGBC2 werd gevormd door klonen van het HSV2 gB gen in het 3.200 bp Bglll fragment van pRW764.5. pRW764.5 werd gevormd door klonen van een 0,8 Kb Pvull fragment uit kanariepokken DNA in het 2.360 bp Pvul fragment van pUC18). Het bij deze manipulatie verkregen plasmide wordt met pPGI2 weergegeven. Het initiëringscodon van de H6 promotor werd daarna op één lijn gebracht met het initiëringscodon van 15 het gl gen. Dit geschiedde door klonen van de oligonucleotiden PRVL5 5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGGCCCTT7 CTGCTGCGCGCCGCGCAGCTC-3' en PRVL6 5'- CTGCGCGGCGCGCAGCAGAAAGGGCCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3', in het 5.900 bp EcoRV-AlwNI (partieel) fragment van pPG12. Het bij deze manipulatie verkregen plasmide wordt met 20 pPGl3 aangeduid.

Daarna werden vreemde PRV gl 3' -niet coderende volgorden geëlimineerd. Dit geschiedde door kloneren van de oligonucleotiden, PRVL3 5'-CTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGG-GCCCAACTATGGCGTGACCGCCAGCCGCCTGTTGAATGCCCGCCCCGCTTAACTGCAGAATTCGGATC-CGAGCT-3' en PRVL4 5-CGGATCCGAATTCTGCAGTTAAGCGGGGCGGGCATTCAACAGGCGGCTGGC-25 GGTCACGCCATAGTTGGGCCCATTC-GTCACTTCCGGTTTCTCCGGATCGCGGAACCAGACGT-3', in het 5.200 bp Sacl-Aatll (partieel) fragment van pPGI3. Het bij deze manipulatie ontwikkelde plasmide werd met pPGI6 aangeduid.

Het H6 promotor gl gen werd daarna gekloond in een vaccinia virusdonorplasmide. Dit geschiedde door klonen van het 1.750 bp Nrul-BamHI fragment van pPGI6 in het 5.000 bp Nrul-BamHI fragment van pBP14. 30 (pBP14 bevat het runderleukemievirus gag gen onder de controle van de synthetische vaccinia H6 promotor in het vaccinia vectorplasmide pSD494VC. pSD494VC is een sub-kloon van het Kopenhagen vaccinia virus HindiII A fragment, waarin de coderende volgorde van het vaccinia gen bevattende homologie met het koepokken ATI gen (210) is vervangen door een polylinkergebied). Dit plaatst het H6 promoted gl gen tussen de vaccinia virus (Kopenhagen) volgorden flankerende het ATI gen. Het plasmide ontwikkeld door 35 deze manipulatie wordt met pPGI7 aangeduid.

Het recombinant vaccinia virus vP717 werd verkregen door transfectie van pPGI7 in het vP410 geïnfecteerde cellen.

Constructie van vP717.

40 Het gl gen van PRV werd gekloond in een vaccinia virusvector. De strategie die werd toegepast voor het construeren van deze vaccinia virus recombinant vP717 is aangegeven in figuur 28. Het PRVgl gen in vP717 werd gekloond tussen de vaccinia virusvolgorden die het ATI gen flankeren en maakt gebruik van de vaccinia virus vroeg-laat promotor H6 (41,42, 69).

45 Immunofluorescentie van het door PRV gecodeerde polypeptide op met vP717 geïnfecteerde cellen.

In met PRV geïnfecteerde cellen wordt gl tot expressie gebracht op het plasmamembraan. Uit immunofluo-rescentieanalyses van met vP717 geïnfecteerde cellen met het voor PRV gl-specifieke monoklonale antilichaam, 42M17, blijkt dat het door PRV gecodeerde polypeptide dat in deze cellen wordt gevormd eveneens op het plasmamembraan tot expressie is gebracht.

Beoordeling van vP717 bij muizen.

in vivo evaluatie van vP717 bij muizen wijst op enige bescherming tegen PRV provocatie (tabel 12), onder toepassing van standaardmethoden.

50 195085 38 TABEL 12

Beoordeling van vaccinia virus recombinant vP717 dat PRV gpl bij muizen tot expressie brengt.

vP717 inentingsdosis log10 TCID50 Overleving bij PRV provocatie 5 ——_ 7.3 4/10 5.3 5/10 3.3 0/10 1.3 2/10 10 -—---—-

Voorbeeld 13

Expressie van herpes simplex virus type 2 glycoproteïnen gB, gC en gD in vaccinia virus recombinanten, individueel of in combinaties.

15 HSV2 (stam G) (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) (ATCC #VR734) die in dit voorbeeld werd toegepast werd gekweekt in VERO cellen (ATCC #CCL81) en gezuiverd door centrifugeren over een sucrosegradiënt (197).

Klonen van het HSV2 gB gen in vaccinia virus donorplasmiden 20 De nucleotidevolgorde van het HSV2 gB gen is reeds eerder gepubliceerd (116). Onder verwijzing naar figuur 29 werd een 12 Kb Bglll fragment bevattende het HSV2 gB gen geïsoleerd uit het HSV2 (stam G) genomisch DNA en ingevoegd bij de BamHI plaats van pUC19, onder vorming van het plasmide pJ4.

Het gB gen werd daarna gekloond tussen vaccinia virus (Kopenhagen) flankerende armen. Dit geschiedde door klonen van het 2.700 bp Sstll-Sacl (partieel) fragment van pJ4 in het Sstll-Sacll fragment 25 van pMP409DVC3. (pMP409DVC3 is een derivaat van pMP409DVC (184) (figuur 4), waarin de Bglll plaats is vervangen door een polylinkergebied). Dit plaatst het gB gen tussen de vacciniavolgorden die het M2L gen flankeren. Het volgens deze manipulatie gevormde plasmide wordt met gGB1 aangeduid.

Daarna werd een in-frame terminatiecodon aan het 3' uiteinde van het gB gen toegevoegd. Dit geschiedde door klonen van de oligonucleotiden GBL3 5'-CTAATAG-3' en GBL4 30 5'-GATCCTATTAGAGCT~3' in het 6.300 bp BamHI-SacI (partieel) fragment van pGB1. Het door deze manipulatie gevormde plasmide werd met pGB2 aangeduid.

De H6 promotor werd daarna stroomopwaarts van het gB gen gekloond. Dit geschiedde door klonen van het 370 bp Bglll fragment van pBLVH14 bevattende de H6 promotor op de Bglll plaats van pGB2 (pBLVH14 bevat het door H6 promoted runder leukemie virus envelopgen in het vaccinia HA deletiegebied). Het door 35 oeletie gevormde plasmide wordt met pGB3 aangeduid.

Het initiatiecodon van de H6 promotor werd daarna op één lijn gebracht met de initiatiecodon van het gB gen. Dit geschiedde door klonen van de oligonucleotiden GBL1-5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGC-GGGGGGGGCTTGATTTGCGCGCTGGTCGTG- GGGGCGCTGGTGGCCGC-3' en GBL2 5'-GGCCACCAG-CGCCCCCACGACCAGCGCGCAAATCA AGCCCCCCCCGCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3', in 40 het 6.300 bp Sstll-EcoRV (partieel) fragment van pGB3. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt aangeduid met pGB5. In plasmide pGB5 is het HSV gB gen onder de controle van de vaccinia H6 promotor ingevoegd op de M2L deletieplaats van vaccinia. Aangezien de M2L invoegplaats aanwezig is in een groter gebied van het genoom dat kan worden deleted, werd het H6-promoted gB gen gekloond in een andere invoegplaats in een ander vaccinia virus donorplasmide. Dit geschiedde door klonen van het 2.800 45 bp BglIl-BamHI fragment van pGB5 op de Bglll plaats van pSD513VCVQ. (pSD513VCVQ is een subkioon van het Kopenhagen vaccinia virus Hindlll J fragment waarin de coderende volgorde voor het thymidineki-nase (TK) gen is vervangen door een polylinkergebied). Dit plaatst het H6-promoted gB gen tussen de vaccinia virusvolgorden die het TK gen flankeren. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met pGB6 aangeduid.

50

Klonen van het HSV2 gC gen in vaccinia virus donorplasmiden

De nucleotidevolgorde van het HSV2 gC gen was reeds eerder bepaald (117). Onder verwijzing naar figuur 30, werd een 2.900 bp Sail fragment bevattende het HSV2 gC gen geïsoleerd uit HSV2 (stam G) genomisch DNA en ingevoegd op de Sail plaats van plBI25 vormende het plasmide pGC3.

55 Het gC gen werd daarna gekloond tussen vaccinia virus (Kopenhagen) flankerende armen. Dit geschiedde door klonen van het 2.900 bp Xhol-BamHl fragment van pGC3 op de Xhol-BamHI plaats van pGC2. pGC2 werd gevormd door klonen van het 370 bp Bglll fragment van pBLVH14, bevattende de 39 195085 vaccinia virus H6 promotor op de Bcjlll plaats van pSD486VC. pSD486VC is een sub-kloon van het Kopenhagen vaccinia virus Hindi 11 B fragment, waarin de coderende volgorde van het μ gen is vervangen door een polylinKergebied. Dit plaatst het gC gen tussen de vaccinia virusvolgorde die het μ gen flankeert. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met pGC5 aangeduid.

5 Het initiatiecodon van de H6 promotor werd daarna op één lijn gebracht met het initiatiecodon van het gC gen. Dit geschiedde door klonen van de oligonucleotiden, GCL1 5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCC-CTTGGACGGGTGGGGCCTAGCCGTGGGCCTGTG-3' en GCL2 5'AGGCCCACGGCTAGGCCCACCCGT-CCAAGGGCCATT ACGAT ACAAACTT AACGGAT-3' in het 5.4000 bp Nrul-Sfil fragment van pGC5. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met 10 pGC10 aangeduid.

De vreemde 3'-niet-coderende volgorde werd daarna uit pGC10 verwijderd. Dit geschiedde door weer ringvormig maken van het met E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) behandelde 4.900 bp Sall-Smal (partieel) fragment van pGC10. Het volgens deze manipulatie verkregen plasmide wordt met pGC11 aangeduid.

15 De extra 3' -niet coderende volgorde werd daarna uit pGC11 verwijderd. Dit geschiedde door kloneren van het oligonucleotide, GCL3 5'-CTAGGGCC-3' in het 4.900 bp Xbal-Apal (partieel) fragment van pGC11. Het door deze manipulatie verkregen plasmide wordt met pGC12 aangeduid. In plasmide pGC12 is het HSV gC gen onder de controle van de H6 promotor ingevoegd op de μ deletieplaats van vaccinia. Aangezien de μ invoegingsplaats geplaatst is in een groter gebied van het genoom dat kan worden weggedaan, werd het 20 H6-promoted gC gen daarna gekloneerd op de ATI invoegplaats in een vaccinia virus donorplasmide. Dit geschiedde door kloneren van het 1.550 bp Nrul-BamHI fragment van pGC12 in het 5.000 bp Nrul-BamHI fragment van pBP14. Dit plaatst het H6-promoted gC gen tussen de vaccinia virus (Kopenhagen) volgorden flankerende het ATI gen. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met pGC13 aangeduid.

25 Kloneren van het HSV2 gD gen in vaccinia virus donorplasmiden.

De nucleotidevolgorde voor het HSV2 gD gen was reeds eerder bepaald (118). Onder verwijzing naar figuur 31 werd een 7,5 Kb Xbal fragment bevattende het HSV2 gD gen geïsoleerd uit HSV2 (stam G) genomisch DNA en ingevoegd op de Xbal plaats van plBI25 onder vorming van het plasmide pGD1.

Het gD gen werd daarna gekloneerd stroomafwaarts van de H6 promotor en tussen de vaccinia virus 30 (Kopenhagen) flankerende armen. Dit geschiedde door kloneren van het 1.500 bp Dral-Pstl fragment van pGD1 op de Smal-Pstl plaats van pTPl5 (184) (figuur 3). Dit plaatst het gD gen stroomafwaarts van de H6 promotor en tussen de vaccinia virusvolgorden die het HA gen flankeren. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met pGD2 aangeduid.

Het initiatiecodon van de H6 promotor werd daarna op één lijn gebracht met de initiatiecodon van het gD 35 gen. Dit geschiedde door kloneren van de oligonucleotiden, GDL1 5'-ATCCGTTAAG I I IGTATCGTAATGG-GGCGTTTGACCTCCGG-3' en GDL2 5'- CGCCGGAGGTCAAACGCCCCATTACGATACAAACTTAACGGA-T-3', in het 5.100 bp EcoRV-AJhall (partieel) fragment van pGD2. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met pGD5 aangeduid.

De vreemde 3'-niet coderende volgorde werd daarna verwijderd. Dit geschiedde door klonering van de 40 oligonucleotiden GDL3 5'-GGCAG- T ACCCT GGCGGCGCT GGT CAT CGGCGGTATTGCGTTTT GGGTACGCCGCCGGCGC TCAGTGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCCC-CCTCGCACCAGCCATT GTTTTACTAGCTGCA-3' en GDL4 5'-GCTAGTAAAA* CAAT GGCT GGT GCGAGGGGGGCGCGT CGT CAT CCCGGAT GT GGGGGAGACGT AGGC-45 GCTTGGGGGCCACTGAGCGCCGGCGGCGTACCCAAAACGCAATACCGCCGATGACC- AGCGCCGCCAGGGTACTGCC-3', in het 4.800 bp Nael-Pstl fragment van pGD5. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met pGD7 aangeduid.

Een extra volgorde werd daarna 5' ten opzichte van de H6 promotor toegevoegd. Dit geschiedde door klonering van het 150 bp BglIl-EcoRV fragment van pGB6 (figuur 30) in het 4.800 bp BglIl-EcoRV fragment 50 van pGD7. Het door deze manipulatie gevormde plasmide wordt met pGD8 aangeduid.

Constructie van recombinant vaccinia virussen.

De strategie die werd toegepast voor het kloneren van de HSV2 gB, gC en gD genen in vaccinia virus is toegelicht in respectievelijk de figuren 29, 30 en 31. Bij alle constructies wordt gebruik gemaakt van de 55 vaccinia virus vroeg-laat promotor, H6 (41, 42, 184). Elk HSV2 gen wordt echter op een verschillende plaats in het vaccinia virus genoom gekloneerd. Het H6-promoted gB gen wordt gekloneerd tussen de volgorde die het M2L gen (vP569) flankeert of de volgorde die het TK gen (vP734, vP775 en vP776) flankeert. Het 195085 40 H6-promoted gC gen wordt gekloneerd tussen de volgorde die een μ gen (vP579) flankeert of de volgorde die het ATI gen 8vP748, vP776 en vP777) flankeert. Het H6-promoted gD gen wordt gekloneerd tussen de volgorde die het HA gen (vP570, vP761, vP775 en vP777) flankeert. Het recombinant vaccinia virus vP569 werd verkregen door transfectie van pGB5 in met vP458 geïnfecteerde cellen. vP734 werd gevormd door 5 transfectie van pGB6 in met vP618 geïnfecteerde cellen. vP579 werd verkregen door transfectie van pGC11 in met vP533 geïnfecteerde cellen. vP748 werd gevormd door transfectie van pGC13 in met vP618 geïnfecteerde cellen. vP570 werd verkregen door transfectie van pGD5 in met vP425 geïnfecteerde cellen. vP761 werd verkregen door transfectie van pGD8 in met vP618 geïnfecteerde cellen.

vP425 is een variant van het wildtype vaccinia virus (Kopenhagen) waaruit het TK gen is deleted en het 10 HA gen is vervangen door β-galactosidase (voorbeeld 1) (184). vP458 is een variant van het wildtype vaccinia virus waaruit het TK gen is deleted en het M2L gen is vervangen door β-galactosidase (voorbeeld 2). vP533 is een variant van het wildtype vaccinia virus waaruit het TK gen is deleted en het μ gen is vervangen door β-galactosidase. vP618 is een variant van het wildtype vaccinia virus waaruit TK, μ en ATI genen is verwijderd.

15 Eveneens werden recombinant vaccinia virus bevattende twee HSV2 glycoproteïne genen geconstrueerd. vP775 bevat de gB en gD genen, vP776 bevat de gB en gC genen en vP777 bevat de gC en gD genen. vP775 werd gevormd door transfectie van pGD8 in met vP734 geïnfecteerde cellen. vP776 werd verkregen door transfectie van pGC13 in met vP734 geïnfecteerde cellen. vP777 werd verkregen door transfectie van pGD8 in met vP748 geïnfecteerde cellen.

20 Eveneens werd een recombinant vaccinia virus dat drie HSV2 glycoproteïne genen bevat geconstrueerd. vP812 bevat de gB, gC en gD genen van HSV-2. vP812 werd gevormd door transfectie van pGD8 in met vP776 geïnfecteerde cellen.

Immunofluorescentie van HSV2 glycoproteïnen in met recombinant vaccinia virus geïnfecteerde cellen.

25 In met HSV2 geïnfecteerde cellen, werden gB, gC en gD (evenals andere door HSV2 gecodeerde glycoproteïnen) tot expressie gebracht op het plasmamembraan. Immunofluorescentie-onderzoekingen uitgevoerd op cellen geïnfecteerd met de recombinant vaccinia virussen die HSV2 bevatten genen geven aan dat de HSV2 polypeptiden die in de cellen geïnfecteerd met deze recombinant vaccinia virussen worden gevormd eveneens op het plasmamembraan tot expressie worden gebracht.

30

Immunoprecipitatie van HSV2 glycoproteïnen in met recombinant vaccinia virus geïnfecteerde cellen.

Het HSV2 gB glycoproteïne gevormd in met HSV2 geïnfecteerde cellen heeft een molecuulgewicht van ongeveer 117 kDa (198, 199). Cellen die met recombinant vaccinia virussen bevattende het HSV2 gB gen (vP569, vP734, vP775 en vP776) zijn geïnfecteerd bevatten vormen eveneens een door HSV2 gecodeerd 35 polypeptide met een molecuulgewicht van ongeveer 117 kDa. Immunoprecipitatie van met vP569 geïnfecteerde cellen met antisera voor volledig HSV2 virus slaat twee belangrijke eiwitten met molecuulgewichten van ongeveer 117 kDa en 110 kDa en drie minder belangrijke eiwitten met molecuulgewichten van 50 kDa, 45 kDa en 30 kDa neer. Immunoprecipitatie van met vP734, vP775 en vP776 geïnfecteerde cellen slaat twee belangrijke eiwitten met molecuulgewichten van ongeveer 110 kDa en 90 kDa en vijf minder belang-40 rijke eiwitten met molecuulgewichten van ongeveer 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa en 30 kDa neer.

Het HSV2 gC glycoproteïne geproduceerd in met HSV2 geïnfecteerde cellen heeft een molecuulgewicht van ongeveer 63 kDa (199, 200). Cellen die met recombinant vaccinia virussen bevattende het HSV2 gC (vP579, vP748, vP776 en vP777) zijn geïnfecteerd vormen eveneens een door HSV2 gecodeerd polypeptide met een molecuulgewicht van ongeveer 63 kDa. Immunoprecipitatie van met vP579, vP748, vP776 en 45 vP777 geïnfecteerde cellen met antisera voor volledig HSV2 virus slaat een belangrijk eiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 65 kDa en een minder belangrijk eiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 85 kDa neer. Konijn antisera tegen volledig HSV2 virus werd verkregen van DAKO Corporation (Santa Barbara, CA; code no. B116) en werd in een verdunning van 1:100 gebruikt.

Het HSV2 gD glycoproteïne gevormd in met HSV2 geïnfecteerde cellen heeft een molecuulgewicht van 50 ongeveer 51 kDa (198, 199). Cellen geïnfecteerd met recombinant vaccinia virussen die het HSV2 gD gen (vP570, vP761, vP775 en vP777) bevatten vormen eveneens een door HSV2 gecodeerd polypeptide met een molecuulgewicht van ongeveer 51 kDa. Immunoprecipitatie van met vP570, vP761, vP775 en vP777 · geïnfecteerde cellen met antisera voor het volledige HSV2 virus slaat een belangrijk eiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 48 kDa en twee minder belangrijke eiwitten met molecuulgewichten van 55 ongeveer 40 kDa en 31 kDa neer.

41 195085

In vivo beoordeling.

Alle recombinant vaccinia virussen die de verschillende constructies van HSV2 glycoproteïnen tot expressie brengen beschermden geïmmuniseerde muizen tegen daarna plaats vindende letale HSV provocatie bij onderzoekingen die analoog waren aan die beschreven door Paoletti en med. (26).

5

Voorbeeld 14

Expressie van het runder herpesvirus 1 glycoproteïne gl in vaccinia virus recombinanten.

Kloneren van het BHV1 gl gen in vaccinia virus donorplasmiden.

De nucleotidevolgorde van het BHV1 gl gen is reeds eerder gepubliceerd (63). Onder verwijzing naar 10 tiguur 32 werd een plasmide plBRS6 bevattende het BHV1 gl gen (Straub stam) betrokken van Rhone Merieux, Lyon, Frankrijk. Het 5' uiteinde van het gl gen werd stroomafwaarts van de H6 promotor (41, 42, 69) en tussen vaccinia virus (Kopenhagen) flankerende armen gekloneerd. Dit geschiedde door kloneren van het 540 bp Sall-Pstl fragment van plBRS6 in het 4.400 bp Sall-Pstl fragment van pGD5 (pGD5 werd verkregen door kloneren van het HSV2 gD gen in pTP15 (184) (figuur 3). Dit plaatst het gl gen stroomaf-15 waarts van de H6 promotor en tussen de vaccinia virus HA flankerende armen. Het plasmide verkregen door deze manipulatie wordt met plBR2 aangeduid.

Het initiatiecodon van de H6 promotor werd daarna op één lijn gebracht met het initiatiecodon van het gl gen. Dit geschiedde door kloneren van de oligonucleotiden, IBRL1 5'- 20 ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTGAACGCGCCGC-3' en IBRL2 5'- GGCGCGTTCAGCACCGCCGCGAGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' in het 3.800 bp Nrul-Sstll fragment van plBR2. Het plasmide dat door deze manipulatie wordt verkregen wordt met plBR4 aangeduid.

25 Een Ncol plaats, benodigd door toekomstige manipulaties, werd daarna gevormd. Dit geschiedde door kloneren van de oligonucleotiden IBRL3 5'-CCATGGTTTAATGCA-3' en IB[RL4 5'-TTAAACCATGGTGCA-3' op de Pstl plaats van plBR4. Het door deze manipulatie verkregen plasmide wordt met plBR5 aangeduid.

Het 3'-uiteinde van het gl gen werd daarna gekloneerd in plBR5. Dit geschiedde door kloneren van het 1.740 bp Tth111 l-Ncol fragment van p!BRS6 in het 3.700 bp Tth111 l-Ncol fragment van plBR5. Het door 30 deze manipulatie gevormde plasmide wordt met plBR7 aangeduid.

Daarna werd een Bglll plaats benodigd voor toekomstige manipulaties gevormd. Dit geschiedde door kloneren van de oligonucleotiden IBRL5 5'-CATGGTTTAAGATCTC-3' en IBRL6 5'-CAT GG AG AT CTT AAAC-3 ’op de Ncol plaats van plBR7. Het door deze manipulatie verkregen plasmide wordt met plBR8 aangeduid.

35 Een gedeelte van de lange hydrofiele aanloopsequentie van het gl gen werd daarna deleted (63). Dit geschiedde door kloneren van de oligonucleotiden, IBRL7 S'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCG-CGCTAGCCGCTGCCCTGCTATGGGCGACGTGGGCC-3' en IBRL8 5'-CACGTCGCCCATAGCAGGGC-AGCGGCTAGCGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' in het 4.400 bp Nrul-Apal (partieel) fragment van plBR8. Dit elimineert 132 bp van het hydrofielische aanloopsequentie. Het door deze manipulatie 40 gevormde plasmide wordt met plBR9 aangeduid.

Daarna werd het H6 promoted truncated gl gen gekloneerd in een ander vaccinia virus donorplasmide.

Dit geschiedde door kloneren van het 1.700 bp Nrul-Bglll fragment van plBR9 in het 4.900 bp Nrul-BamHI fragment van pBP14 (211). Het bij deze manipulatie gevormde plasmide wordt met plBR10 aangeduid.

45 Constructie van recombinant vaccinia virussen.

De strategie die wordt toegepast voor het kloneren van het BHV1 gl gen in vaccinia virus is beschreven in figuur 32. Het recombinant vaccinia virus vP637 werd verkregen door transfectie van plBR7 in met vP410 geïnfecteerde cellen. vP724 werd verkregen door transfectie van plBR10 in met vP410 geïnfecteerde cellen. vP637 bevat het volledige BHV1 gl gen. vP724 bevat een gl gen deleted van 132 bp van 5' signaalvolgorde 50 (63). Beide constructies maken gebruik van de vaccinia virus vroeg-laat promotor H6 (41, 42, 184). Het gl gen in vP637 wordt gekloneerd tussen de volgorden die het HA gen flankeren. Het gl gen in vP724 wordt gekloneerd tussen de volgorden die het ATI gen flankeren.

Immunofluorescentie en detectie van een door BHV1 gecodeerd polypeptide in met recombinant vaccinia 55 virus geïnfecteerde cellen.

In met BHV1 geïnfecteerde cellen wordt gl tot expressie gebracht op het plasmamembraan. Uit immunofluorescentie-onderzoekingen van cellen die met vP637 of vP724 waren geïnfecteerd blijkt dat het 195085 42 door BHV1 gecodeerde polypeptide dat in deze cellen wordt gevormd eveneens op het plasmamembraan tot expressie wordt gebracht. De immunofluorescentie werd uitgevoerd op de wijze als beschreven in voorbeeld 1. Gebruik gemaakt werd van de BHV1 gl-specifieke, monoklonale antilichamen 4203 en 5106 (201).

5

Voorbeeld 15

Expressie van kat herpesvirus glycoproteïne gB in een vaccinia virus recombinant

De WRstam van vaccinia virus (202) werd in dit voorbeeld toegepast. Het van de WR stam afgeleide recombinant vaccinia virus vP293 werd toegepast als reddend virus (69).

10

Extractie van FHV-1 DNA en kloneren van het FHV-1 Sacl-Sacl 3,2 Kb fragment.

FHV-1 DNA werd geëxtraheerd en gezuiverd uit de CO stam. Het FHV-1 DNA genoom werd gedigereerd met EcoRI en gekoppeld in het plasmide pBR322 onder toepassing van standaard methoden (20). Deze FHV-1 bank werd onderzocht met DNA proces verkregen uit de PRVhll (62) en BHV-I gB (203) genen.

15 Daaropvolgende hybridisaties met sub-klonen verkregen uit de twee EcoRI klonen die door hybridisatie positief werden bevonden maakt een duidelijker in kaart brengen van het FHV-1 gB gen mogelijk. Een 3,2 Kb Sacl-Sacl fragment bevattende het FHV-1 gB gen werd gekloneerd in pUC18, onder vorming van het plasmide pFHVgBC.

20 Sequencing van het Sacl-Sacl fragment coderende voor FHV-1-gB.

Nucleotide sequencewaarden werden voor beide strengen verkregen uit van pFHVgBC en pFHVgBC afgeleide sub-klonen onder toepassing van gemodificeerd 17 Sequenase, zoals hiervoor is beschreven.

Kloneren van het FHV-1 gB gen in een vaccinia virus donorplasmide.

25 Onder verwijzing naar figuur 33 werd het FHV-1 gB gen gekloneerd in pHES4, één van de plasmiden ontworpen voor het gastheertraject-selectiesysteem WR in de vaccinia virus stam (69) (figuur 10). Dit plasmide bevat het gastheertraject-gen K1L, dat het de deletiemutant vP293 mogelijk maakt op humane cellen te repliceren. Het FHV-1 gB gen werd onmiddellijk stroomafwaarts van de vaccinia synthetische H6 promotor ingevoegd (69). Het plasmide pFHVgBC werd gedigereerd met Kpnl en Sacl en het 3150 bp 30 restrictiefragment bevattende FHV-1 gB werd geïsoleerd uit een agarosegel en daarna gekoppeld aan plasmide pHES4 dat eerder was gedigereerd met Kpnl en Sacl. Het verkregen plasmide werd met pJCA001 (figuur 33) aangeduid.

DNA sequence analyse van het FHV-1 gB gen.

35 Onder verwijzing naar figuur 34 blijkt uit DNA sequence analyse een open afleesframe dat zich uitstrekt van. de nucleotideplaatsen 337 tot 3177. Veronderstelde transcriptionale regelende signalen werden aangetroffen in het 5' gebied ten opzichte van de ATG initiatiecodon op plaats 337. Een TATA box met de volgorde AAATATAT (nucleotiden 184-191) was 80 nucleotiden stroomafwaarts van een vermoedelijke CAT box met de volgorde GGTGAGTA geplaatst. Een polyadenyleringssignaal AATAAA (nucleotiden 3251 tot 3256) was 40 50 nucleotiden stroomafwaarts van deTAA terminatiecodon (nucleotiden 3178-3180) geplaatst. Acht van de elf nucleotiden in de volgorde 5' TCATTCTAGCA 3' (de nucleotiden 200-210) zijn complementair aan de 18S ribosomale RNA volgorde 3' AGGAAGGCGT 5' (61) en kunnen dienen als de ribosoombindingsplaats. Een scannend model werd voorgesteld waarmee de eukaryotische mRNA’s translatie initiëren (151, 155).

De volgordecontext rondom het voorgestelde initiatiecodon ATCATGT (nucleotiden 334 tot 340) kwalificeert 45 als een functionele volgordecontext voor de translatie-initiatie van eukaryotisch mRNA. Het FHV-1 gB open afleesframe codeert voor 947 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 106,2 kDa. Het G + C gehalte bedraagt 45,8 %.

Analyse van de FHV-1 gB eiwitstructuur.

50 Analyse van het aminozuurvolgorde levert een aantal aspecten op die gewoon voor met membraan geassocieerde glycoproteïnen zijn. Een gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 23 tot 73 had een kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en wordt voorgesteld als signaalvolgorde (figuur 34). Onder verwijzing naar figuur 35 wordt opgemerkt dat er een 22 aminozuren lange hydrofiele volgorde voorafgaande aan de lange hydrofobe signaalvolgorde is. Dit kenmerk werd eveneens opgemerkt voor het pseudorabies (PRV) gil 55 gen (62), voor het runder herpesvirus-1 (BHV-1) gl gen (63) en voor de paard herpesvirus-1 (EHV-1) (71) en paard herpesvirus-4 (EHV-4) (72) gp14 genen, die alle eveneens HSV gB homologen zijn. Voorspeld is dat een hydrofoob gebied dat bestaat uit 42 aminozuren (de aminozuren 789-831) functioneren als een 43 195085 transmembraan-ankergebied. Het hydrofiele cytoplasmische gebied bevat 116 aminozuren. Er zijn tien Asn-X-Thr/Ser plaatsen (waarin X elk aminozuur, behalve proline kan zijn) voor potentiële, met N-gebonden glycosylering (64), waarbij één plaats in de signaalvolgorde aanwezig is. Er zijn twee opeenvolgende en wat potentiaal betreft dicht bij elkaar liggende, proteolytische splitsingsplaatsen (Arg-Arg-Ser) (de plaatsen 5 504-506 en 516-518) identiek met die aanwezig in PRVgll (94), VZV gpll en HCMV gB (71) en EHV-1 gp14 (71, 72). Het hydrofobiciteitsprofiel van de FHV-1 gB aminozuurvolgorde is weergegeven in figuur 35.

Vergelijking van de FHV-1 gB aminozuurvolgorde met andere herpesvirus glycoproteïnen.

Vergelijking van de aminozuursamenstelling van het FHV-1 gB gen vertoont een uitgebreide homologie met 10 glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo is het FHV-1 gB homoloog aan PRVgll (62), BHV-1 gl (63), varicella zoster virus (VZV) gil (66, 204), HSV-1 gB (68), HSV-2 gB (205), EHV-1 gp14 (71), evenals met glycoproteïnen in Epstein-Barr virus (EBV) (68, 206) en humaan cytomegalovirus (HCMV)(10).

Constructie van de vaccinia recombinant vP713 die het FHV-1 gB glycoproteïne tot expressie brengt.

15 De FHV-1 gB coderende volgorden werden ingevoegd in een vaccinia virus vector onder toepassing van het WR vaccinia virus gastheertraject-selectiesysteem pHE84/vP293 (69). Het vermogen van recombinant vaccinia nakomelingschap ontwikkeld door recombinatie onder toepassing van het WR vaccinia virus vP293/pHES gastheertraject-selectiesysteem om een plaque te vormen op humane MRC-5 cellen maakt een snelle identificatie van deze recombinanten (69) mogelijk. Vaccinia virus recombinant vP713 werd 20 verkregen door recombinatie uitgevoerd met plasmide pJCA001 als donorplasmide en vP293 als reddend virus (figuur 33).

Immunofluorescentie van FHV-1 gB glycoproteïne gesynthetiseerd door vP713

Immunofluorescentie van met recombinant vaccinia virus vP713 geïnfecteerde VERO en MRC-5 cellen werd 25 uitgevoerd op de wijze als beschreven in voorbeeld 1, onder toepassing van anti-FHV-1 gB specifiek schaapserum #2854. Een multipliciteit van infectie van twee pfu per cel werd toegepast. FITC ezel anti-schaap IgG werd toegepast als het tweede antilichaam.

FHV-1 gB kon worden aangetoond op het oppervlak van VERO cellen geïnfecteerd met vaccinia recombinant vP713 evenals inwendig na acetonfixatie. Geen significante inwendige of oppervlak immuno-30 reactiviteit ten opzichte van FHV-1 gB werd gevonden bij met vP410 geïnfecteerde controle cellen.

immunoprecipitatie van FHV-1 gB glycoproteïne gesynthetiseerd door vP713.

Teneinde het FHV-1 gB glycoproteïne tot expressie gebracht door vP713 te beoordelen, werden VERO cellen geïnfecteerd met vP713 en eiwitten werden metabolisch gelabeld met 35S methionine. Immunoprecipi-35 taties werden uitgevoerd met de geradiolabelde cellysaten onder toepassing van anti-FHV-1 gB specifiek schaapserum #2854.

VERO cel monolagen geënt met 2 x 106 cellen per schalen van 60 mm werden geïnfecteerd met een lage multipliciteit van infectie van 0,1 pfu per cel met controle (vP410) of recombinant vaccinia virus vP713. De immunoprecipitaties werden uitgevoerd op de wijze als beschreven in voorbeeld 1.

40 Geen significante producten werden geïmmunoprecipiteerd door het specifieke anti-FHV-1 gB serum uit zowel niet-geïnfecteerde VERO cellen of VERO cellen geïnfecteerd met het controle vaccinia virus vP410. FHV-1 gB geradiolabelde producten werden neergeslagen met serum #2854 uit VERO cellen geïnfecteerd met vP713. Vijf dominante, metabolisch geradiolabelde polypeptiden werden specifiek neergeslagen. De twee grotere polypeptiden met de schijnbare moleculaire afmetingen 115 kDa en 110 kDa konden 45 overeenkomen met de niet-geglycosyleerde voorloper en rijpe eiwitten (theoretische afmetingen van respectievelijk 106 kDa en 98 kDa). Een grote band bij 68 kDa kan de twee geglycosyleerde onder-eenheden (69 kDa + 66 Kda), het gevolg van de proteolytische splitsing van een geglycosyleerde voorloper (136 kDa), die hier ontbreekt, aangeven. Drie kleinere neergeslagen producten (59, 53 en 48 kDa) komen niet overeen met een van de bekende FHV-1 gB producten en kunnen ontledingsproducten weergeven.

50

Voorbeeld 16

Kloneren en tot expressie brengen van het Epstein-Barr virus glycoproteïne in pokkenvirusvectoren.

Kloneren van de EBV gp340 en gp220 genen in het vaccinia donorplasmide pMP409DVC.

55 In dit voorbeeld werden de EBV genen geïsoleerd uit de B95-8 EBV stam (207), waren de gp340 en gp220 genen cDNA klonen (respectievelijk de plasmiden pMLPgp340 en pMLPgp220) en waren de gB, gH en BBRF3 genen geïsoleerd uit een BamHI genenbank. Onder verwijzing naar figuur 36 werd een 2100 bp 195085 44

Xmal-Clal fragment van het pMLPgp220 plasmide gekloneerd in M13mp18 gedigereerd met Xmal-Accl. De door deze manipulatie verkregen faag werd aangeduid met mp18gp220 (figuur 36). Door in vitro mutage-nese (17) onder toepassing van de oligonucleotiden CM4 (TAAAGTCAATAAATTTTTATTGCGGCCGCTAC-CGAGCTCGAATTCG) en CM5 (GCTTGCATGCCTGCAGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGCA-5 GCCTTGC) werd het gp220 gen gemodificeerd om tot expressie te worden gebracht onder controle van de vaccinia H6 promotor. Het plasmide dat het gemodificeerde gp220 gen bevatte werd aangeduid met mp18gp220 (5+4) (figuur 36).

Het gemodificeerde gp220 gen werd gekloneerd in het plasmide SP131Notl, dat de volledige H6 synthetische promotor (69) bevat. Dit geschiedde door kloneren van het 2300 bp Narl-EcoRV fragment van 10 mp18gp220(5+4) in het 294/ bp EcoRV-Narl fragment van het SP131Notl plasmide. Het verkregen plasmide werd met SP131gp220 (figuur 36) aangeduid.

Het gp340 gen onder de controle van de H6 promotor werd verkregen door kloneren van een 2360 bp Scal-Shol fragment van pMLPgp340 in het Xhol-Scal (partieel) gedigereerde SP131gp220 plasmide. Het verkregen plasmide werd aangeduid met SP131gp340 (figuur 36).

15 De door H6 promoted gp340 en gp220 genen werden gekloneerd in het vaccinia virus M2L invoegplaats-plasmide pMP409DVC (figuur 4; in figuur 36, 40, dit plasmide wordt aangegeven door MP409). Dit geschiedde door kloneren van het met 2800 bp Mung-Bean nuclease behandelde Notl fragment van het plasmide SP131gp340 en het met 2100 bp Mung-Bean nuclease behandelde Notl fragment van het plasmide SP131gp220 in de met Bglll Mung-Bean nuclease behandelde plaats van het plasmide 20 pMP409DVC. De verkregen plasmiden werden respectievelijk aangeduid met 409H6340 en 409H6220 (figuur 36).

Kloneren van het EBV gB gen in het vaccinia virus donorplasmide pMP409DVC.

Onder verwijzing nu naar figuur 37, werd een 3500 bp EcoRI-Xmnl fragment van het EBV DNA BamHI A 25 fragment (207), bevattende het EBV gB gen, geïsoleerd uit de EBV genoombibliotheek en gekloneerd in het 2837 bp Hincll-EcoRI fragment van plBI25. Het verkregen plasmide werd aangeduid met p25gB (figuur 37).

Door in vitro mutagenese (17, 185) werd, onder toepassing van de oligonucleotiden EBVBM5 (CCC-TACGCCGAGTCATTACGATACAAACTTAACGGATATCAGAGTCGTACGTAGG) en EBVBM3 (CTGGAAA-CACTTGGGAATTCAAGCTTCATAAAAAGGGTTATAGAAGAGTCC), het gB gen aangepast om onder de 30 controle van de vaccinia H6 promotor tot expressie te worden gebracht. Het verkregen plasmide werd aangeduid met p25gB(5+3).

Het 2600 bp EcoRV-EcoRI fragment van p25gB (5+3) werd gekloneerd in het 3300 bp EcoRV-EcoRI fragment van SP131. Het verkregen plasmide werd aangeduid met SP131gB (figuur 37).

Het H6 promotor gB gen werd daarna gekloneerd in het vaccinia virus donorplasmide pMP409DVC. Dit 35 geschiedde door kloneren van het met 2700 bp HindiII Mung-Bean nuclease behandelde fragment van SP131gB in de met Bglll Mung-Bean nuclease behandelde plaats van pMP409DVC. Het verkregen plasmide werd aangeduid met 409H6gB (figuur 37).

Kloneren van het EBV gH gen in het vaccinia donorplasmide pSD486VC.

40 In de met EBV BamHI gekloneerde restrictiefragmentenbibliotheek, is het open afleesframe BXLF2 aanwezig in de BamHI X en BamHI T fragmenten (207). Zoals uit figuur 38 blijkt, werd het volledige BXLF2 open afleesframe gereconstitueerd door kloneren van het 830 bp Smal-BamHI fragment van BamHI X in het 2880 bp Smal-BamHI fragment van plBI24; het verkregen plasmide werd aangeduid met 24gH5. Het 1850 bp BamHI-HindllI fragment van BamHI T werd gekloneerd in het 3660 bp BamHI-HindllI fragment van 45 24gH5. Het verkregen plasmide bevattende het volledige gH gen werd aangeduid met 24gH (figuur 38).

Door in vitro mutagenese (17,185) onder toepassing van de oligonucleotiden HM5 (ACACAGAGCAACTGCAGATCTCCCGATTTCCCCTCT), HM4 (GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCTGCG) en HM3 (GCCAGGGTTTTCCCAGAGATCTGATAAAAACGACGGCCAGTG), werd het gh gen gemodificeerd 50 om tot expressie te worden gebracht onder de controle van de vaccinia hemorrhagisch (μ) vroege promotor. Het oligonucleotide HM4 werd toegepast ter verwijdering van een vaccinia vroeg transcriptie-stopsignaal aanwezig in het gH gen (45). Het plasmide dat het gemodificeerde gH gen bevatte werd aangeduid met 24gH(5+4+3).

Onder verwijzing nu naar figuur 38, is de vaccinia μ promotor aanwezig in het plasmide pSD486 VC 55 (figuur 30). (In figuur 38 is dit plasmide aangeduid met SD486). Het met 2130 bp Bglll Mung-Bean nuclease behandelde fragment van 24gH(5+4+3) werd gekloneerd in het met Bglll Mung-Bean nuclease behandelde pSD486VC. Deze laatste kloneringsstap brengt het gH gen onder de controle van de μ promotor. Het door deze manipulatie ontwikkelde plasmide werd aangeduid met 486gH (figuur 38).

45 195085

Kloneren van het open afleesframe BBRF3 in het vaccinia virus donorplasmide pCOPSCSH.

Het volledige BBRF3 open afleesframe is aanwezig in het BamHI B fragment van het EBV DNA. Dit fragment werd gedigereerd met BspHI, behandeld met het E, coli DNA polymerase I (Klenow fragment) en gedigereerd met Bglll. De Bglll plaats in het BamHI A fragment is 10 basen voor het stopcodon van BBRF3 5 geplaatst. Het 1230 bp BspHI-BgIll fragment werd geïsoleerd en gekloneerd in het 4200 bp SmaIBgIll fragment van het plasmide pCOPSC-5H. (Plasmide pCOPCS-5H is identiek aan het plasmide pCOPCS657 (figuur16)). Het plasmide dat bij deze manipulatie wordt gevormd werd aangeduid met COPACEBVX.

Kloneren van de EBV gp340, gB en gH genen in het vaccinia virus donorplasmide pSD513VCVO.

10 Het vaccinia virus donorplasmide dat werd toegepast voor de vorming van de drievoudige EBV recombinant was het plasmide pSD513VCVQ (figuur 29). Dit plasmide bevat een sub-kloon van het Kopenhagen vaccinia virus Hindlll J fragment, waarin de coderende volgorde voor het thymidine kinasegen is vervangen door een polylinkergebied.

Volgens een eerste stap werd het μ promoted EBV gH gen gekloneerd in pSD513VCVQ. In het bij 15 zonder werd het 2300 bp SnaBI-BgIll fragment van 486gH gekloneerd in het 4000 bp Smal-Bglll fragment van pSD513VCVQ. Het plasmide dat door deze manipulatie werd gevormd werd met 513UgH aangeduid.

Daarna werd het H6 promoted EBV gp340 gen gekloneerd in 513gH. In het bijzonder werd het met 2800 bp Notl Mung-Bean behandelde fragment van SP131gp340 gekloneerd in het met 6300 bp Xhol-Pstl Mung-Bean nuclease behandelde fragment van 513UgH. Het volgens deze manipulatie gevormde plasmide 20 werd aangeduid met 513UgH340H6.

Daarna werd het H6 promoted EBV gB gen gekloneerd in 513ügH340H6. In het bijzonder werd het met 2700 bp Hindlll Mung-Bean nuclease behandelde fragment van SP131gp340 gekloneerd in het met 9100 bp Bglll Mung-Bean nuclease behandelde fragment van 513UgH340H6. Het verkregen plasmide werd met 513gHgBgp340 (figuur 39) aangeduid.

25

Constructie van recombinant vaccinia virus.

EBV gp340 (donorplasmide 409H6340), EBV gp220 (donorplasmide 409H6220) en EBV gB (donorplasmide 409H6gB) werden gerecombineerd in het vaccinia virus vP458 (M2L plaats): deze enkelvoudige vaccinia virus recombinanten worden respectievelijk aangeduid met vP474, vP480 en vP561. EBV gH (donor-30 plasmide 486gH) werd gerecombineerd in het vaccinia virus vP533 (μ invoegplaats): deze enkelvoudige vaccinia virus recombinant wordt aangeduid met vP611.

Tenslotte werd de drievoudige vaccinia virus recombinant bevattende gp340, gB en gH verkregen door recombinatie van het donorplasmide 513gHgBgp340 in het vaccinia virus vP617 op de thymidine kinase invoegplaats. Dit recombinant virus wordt aangeduid met vP712. vP617 is een Kopenhagen vaccinia virus 35 deleted voor de TK, HA en ATI genen.

Immunofluorescentie van EBV eiwitten in met recombinant vaccinia virus geïnfecteerde cellen. Immunofluorescentie-onderzoekingen uitgevoerd op cellen geïnfecteerd met vP474 (gp340) en vP480 (gp220) onder toepassing van het monoklonale antilichaam F29-89 (165) toonden aan dat EBV gp340 en 40 EBV gp220 eiwitten op het plasmamembraan tot expressie waren gebracht.

Cellen geïnfecteerd met vP611 (gH), onder toepassing van een humaan serum, vertoonden een zwak positief signaal op het plasmamembraan.

Tenslotte werd hetzelfde onderzoek uitgevoerd op cellen geïnfecteerd met vP712 (drievoudige EBV vaccinia recombinant): een positief signaal op het plasmamembraan werd verkregen met de monoklonale 45 antilichamen F29-89 en NEA 9247 (gB specificiteit verkregen van DuPont).

Immunoprecipitatie van EBV eiwitten in met recombinant vaccinia virus geïnfecteerde cellen.

Het EBV gp340 glycoproteïne gevormd in met EBV geïnfecteerde cellen heeft een molecuulgewicht van ongeveer 340 kDa (165). Cellen geïnfecteerd met de recombinant vaccinia virussen vP474 of vP712 vormen 50 eveneens een door EBV gecodeerd eiwit van ongeveer 340 kDa (immunoprecipitatie uitgevoerd met het monoklonale antilichaam F29-89). Het EBV gp220 glycoproteïne heeft een molecuulgewicht van 220 kDa (165). Cellen geïnfecteerd met het vaccinia recombinant virus vP480 produceren een door EBV gecodeerd eiwit van ongeveer 220 kDa.

Het EBV gB glycoproteïne geproduceerd in met EBV geïnfecteerde cellen heeft een molecuulgewicht van 55 110 kDa tot 125 kDa met een voorlopervorm van 93 kDa (206, 208). Cellen geïnfecteerd met de recombinant vaccinia virussen vP561 of vP712 vormen een EBV hoofdeiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 125 kDa en vier kleinere eiwitten met molecuulgewichten van ongeveer 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa en 45 kDa.

195085 46

Het EBV gH glycoproteïne gevormd in met EBV geïnfecteerde cellen heeft een molecuulgewicht van 85 kDa met een voorlopervorm van 70 kDa (209). Cellen geïnfecteerd met het recombinant virus vP611 vormen een door EBV gecodeerd eiwit van ongeveer 85 kDa.

5 Immunisatie van konijnen met vaccinia recombinanten die EBV glycoproteïnen tot expressie brengen. Konijnen werden geïmmuniseerd met vP474 (gp340) of vP480 (gp220) of vP561 (gB) of vP611 (gH) of vP712 (triple). Na een boost werden de sera onderzocht door immunofluorescentie op met TPA behandelde B95-8 cellen. Telkens werden positieve signalen verkregen. In vitro neutraliserende werking werd gedemonstreerd onder toepassing van de sera gekweekt tegen vP474 (gp340).

10

Voorbeeld 17

Kloneren en expressie van humaan cytomegalovirus glycoproteïne antigenen in pokkenvirusvectoren.

Kloneren van het HCMV gB gen in het vaccinia donorplasmide pMP409DVC.

15 Onder verwijzing nu naar figuur 40 werd het 4800 bp HindllI-BamHI fragment van het Hindlll D fragment van het HCMV DNA gekloneerd in het 2800 bp HindllI-BamHI fragment van het plasmide plBI24. Door in vitro nutagenese (17, 185) onder toepassing van de oligonucleotiden CMVM5 (GCCTCATCGCTGCTGGA-T AT CCGTTAAGTTT GTAT CGTAAT GGAAT CCAGGAT CT G) en CMVM3 (G AC AG ATT GT G ATTTTT AT AAG-CATCGTAAGCTGTCA), werd het HCMV gB gen gemodificeerd om onder de controle van de vaccinia H6 20 promotor tot expressie te worden gebracht. Het plasmide dat het gemodificeerde HCMV gB gen bevatte werd aangeduid met 24CMVgB(5+3) (figuur 40).

Daarna werd het 2900 bp EcoRV-BamHI fragment van 24CMVgB(5+3) gekloneerd in het 3100 bp EcoRV-BgIll fragment van plasmide pSP131 dat de synthetische H6 promotor bevat (69). Deze klonerings-stap brengt het HCMV gB gen onder de controle van de vaccinia H6 promotor. Het verkregen plasmide 25 werd aangeduid met SP131 gB.

Tenslotte werd het H6 promoted HCMV gB gen gekloneerd in het vaccinia donorplasmide pMP409DVC. Het met 3000 bp Hindlll Mung-Bean nuclease behandelde fragment van SP131gB werd gekloneerd in de met Bglll Mung-Bean nuclease behandelde plaats van pMP409DVC. Het verkregen plasmide werd aangeduid met 409CMVgB (figuur 40).

30

Constructie van recombinant vaccinia virus.

Het H6 promoted CMV gB gen in plasmide 409CMVgB werd ingevoegd op de M2L plaats van het reddende virus vP458. Het recombinant vaccinia virus werd aangeduid met vP525.

35 Immunofluorescentie van CMV gB proteïne in met recombinant vaccinia virus geïnfecteerde cellen. Immunofluorescentie-onderzoekingen op cellen geïnfecteerd met vP525 onder toepassing van een monoklonaal antilichaam of een guinees biggetje polyklonaal serum wezen op HCMV gB tot expressie gebracht op het plasmamembraan.

40 Immunoprecipitatie van CMV gB in met recombinant vaccinia geïnfecteerde cellen.

Het CMV gB glycoproteïne geproduceerd in met CMV geïnfecteerde cellen heeft een molecuulgewicht van 55 kDa met een voorlopervorm van 130 kDa (172). Cellen geïnfecteerd met vP525 geven twee met CMV gB gecodeerde eiwitten van ongeveer 130 kDa en 55 kDa.

45 Nucleotidevolgorden van HXLF1 en HXLF2.

De HXLF genfamilie is gelokaliseerd in het Hindlll X fragment van het HCMV genomische DNA (172).

Onder toepassing van specifieke oligonucleotide primers werd de nucleotidevolgorde van HXLF1 en HXLF2 bepaald (figuren 41 en 42). HXLF1 is 648 nucleotiden lang en codeert voor een eiwit met 215 aminozuren. HXLF2 is 558 nucleotiden lang en codeert voor een eiwit met 185 aminozuren. De nucleotidevolgorden van 50 dezelfde genen (AD169 HCMV stam) zijn gepubliceerd (173) en uit vergelijkingsonderzoekingen blijkt een 99%-ige homologie voor HXLF1 en een 96%-ige homologie voor HXLF2.

Immunisatie van guinese biggetjes met vaccinia recombinanten die HXMV antigenen tot expressie brengen. Drie guinese biggetjes werden geïmmuniseerd met vP525. Na één boost ontwikkelden de dieren HCMV 55 neutraliserende antilichamen (gemiddelde titer: 518). Het is interessant dat 50-87% van de neutraliserende werking van HCMV seropositieve humane sera kunnen worden geabsorbeerd uit met vP525 geïnfecteerde cellen. Uit dit resultaat blijkt het potentiële belang van HCMV gB als een sub-eenheidsvaccin.

47 195085

REFERENCES

I. Allen, G.P. and J.T. Bryans, In Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, Vol. 2, ed.

R. Pandey (Basel), pp. 78-144 (1986).

5 2. Allen, G.P., and L.D. Coogle, J. Virol. 62, 2850-2858 (1988).

3. Allen, G.P. and M.R. Yeargan, J. Virol. 61, 2454-2461 (1987).

4. Baumann, R.P., D.C. Sulivan, J. Staczek, and D.J. O’Callaghan, J. Virol. 57, 816-825 (1986).

5. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, B. Lomniczi, and A. Kaplan, Virology 154, 325-334 (1986).

6. Berman, P.W., D. Dowbenko, L.A. Lasky, and C.C. Simonsen, Science 222, 524-527 (1983).

10 7. Bertholet, C., R. Drillien, and R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985).

8. Cantin, E.M., R. Eberle, J.L. Baldick, B. Moss, D.E. Willey, A.L. Notkins, and H. Openshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5908-5912. (1987).

9. Chakrabarti, S., K. Brechling, and B. Moss, Mol. Cello Biol. 5, 3403-3409 (1985).

10. Cranage, M.P., T. Kouzarides, A.T. Bankier, S. Satchwell, K. Westen, P. Tomlinson, B. Barrell, H. Hart, 15 S.E. Bell, A.C. Minson, and G.L. Smith, EHBO J. 5 3057-3063 (1986).

II. Clewed, D.B., J. Bacteriol. 1J0, 667-676 (1972).

12. Clewed, D.B. and D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969).

13. Cremer, K.J., M. Mackett, C.Wohlenberg, A.L. Notkins, and B. Moss, Science 228 737-740 (1985).

14. Eisenberg, D., Annu. Rev. Biochem. 53, 595-623 (1884).

20 15. Glorioso, J., U. Kees, G. Kumel, H. Kirchner, and P. Krammer, J. Immunol. 135, 575-582 (1985).

16. Graham, F.L. and A.J. Van der Eb., Virology 54, 536-539 (1973).

17. Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985).

18. Lasky, L.A., D. Dowbenko, C.C. Simonsen, and P.W. Berman, Bio-Technology 2, 527-532 (1984).

19. Mandecki, W„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1986).

25 20. Maniatis, T..E.F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (1982).

21. Martin, S. and B.T. Rouse, J. Immunol. 138, 3431-3437 (1987).

22. Martin, S., B. Moss, P.W. Berman, L.A. Lasky, and B.T. Rouse, J. Virale 61,726-734 (1987).

23. O'Callaghan, D.J., B.E. Henry, J.H. Wharton, S.A. Dauenhauer, R.B. Vance, J. Staczek, and 30 R.A. Robinson, In: Developments in Molecular Virology, Vol. 1, ed. Y. Decker, pp. 387-418 (1981).

24. Panicali, D., A. Grzelecki, and C. Huang, Gene 47, 193-199 (1986).

25. Panicali, D., and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).

26. Paoletti, E., B.R. Lipinskas, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8T 193-197 (1984).

35 27. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas, and E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985).

28. Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, In: Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and L. Grossman (Academic Press) pp. 545-563 (1987).

29. Pustell, J., and F.C. Kafatos, Nucleic Acids Res. 12, 643-655 (1984).

30. Rooney, J.F., C. Wohlenberg, K.J. Cremer, B. Moss, and A.L. Notkins, J. Virol 62, 1530-1534 (1988).

40 31. Rosel, J.L., P.L. Earl, J.P. Weir, and B. Moss, J. Virale 60, 436-449 (1986).

32. Rosenthal, K.L., J.R. Smiley, S. South, and D.C. Johnson, J. Virol 61, 2438-2447 (1987).

33. Sanger, F., S. Nicklen, and A. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

34. Shapira, S.K., J. Chou, F.V. Richaud, and M.J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983).

35. Shida, H„ Virology 150, 451-462 (1986).

45 36. Spear, P.G., jn: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines, Immunochemistry of Viruses, Vol. 2, eds.

M. R.V. Van Regenmorte! and A.R. Neurath (New York), pp. 425-443 (1985).

37. Spear, P.G., Jn: The Herpesvirus, Vol. 3, ed. B. Roizman (New York), pp. 315-356 (1985).

38. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen. Virol. 68, 2587-2598 (1987).

39. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen. Virol. 69, 859-867 (1988).

50 40. Tabor, S., and C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987).

41. Taylor, J., R. Weinberg, B. Lanquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988).

42. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. Webster, and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988).

43. Turtinen, L.W., and G.P. Allen, J. gen. Virol. 63, 481-485 (1982).

44. Wachsman, M., L. Aurelian, C.C. Smith, B.R. Lipinskas, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. Infect. Dis. 155, 55 1188-1197(1987).

45. Yuen, L. and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6417-6421 (1987).

46. Zarling, J.M., P.A. Moran, L.A. Lasky, and B. Moss, J. Virol. 59, 506-509 (1986).

195085 48 47. Zarling, J.M., P.A. Moran, R.L. Burke, C. Pachl, P.W. Berman, and L.A. Lasky, J. Immunol. 136, 4669-4673 (1986).

48. O’Callaghan, D.J., G.A. Gentry, and C.C. Randall, In: The Herpesviruses, Vol. 2, ed. B. Roizman (New York), pp. 215-318 (1983).

5 49. Ackermann, M., R. Longnecker, B. Roizman, and L. Pereira, Virology 150, 207-220 (1986).

50. Frink, R.J., M.R. Eisenberg, G. Cohen, and E.K. Wagner, J. Virol. 45, 634-647 (1983).

51. Frame, M.C., H.S. Marsden, and D.J. McGeoch, J. gen. Virol. 67, 745-751 (1986).

52. Longnecker, R., S. Chatterjee, R. Whitley, and B. Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4303-4307 (1987) .

70 53. Richman, D.D., A. Buckmaster, S. Bell, C. Hodgman and A.C. Minson, J. Virol. 57, 647-655 (1986).

54. Swain, M.A., R.W. Peet, and D.A. Galloway, J. Virol, 53, 561-569 (1985).

55. Zezulak, K.M., and P.G. Spear, J. Virol. 49, 741-747 (1984).

56. van Drunen Littel-van der Hurk, S., T. Zamb, and L.A. Babrick, J. Virol. 63, 2159-2168 (1989).

57. Perkus, M.E., D. Panicali, S. Mercer, and E. Paoletti, Virology 152, 285-297 (1986).

15 58. Tamin, A., E.C. Villarreal, S.L. Weinrich, and D.E. Hruby, Virology 165, 141-150 (1988).

59. Whalley, J.M., G.R. Robertson, and A.J. Davidson, J. gen. Virol. 57, 307-323 (1981).

60. Laemmli, U.K., Nature (London) 227, 680-685 (1970).

61. Hagenbuchle, O., M. Santer, J.A. Steitz, and R.J. Mans, Cell 13, 551-563 (1978).

62. Robbins, A.K., D.J. Dorney, M.W. Wathen, M.E. Whealey, C. Gold, R.J. Watson, L.E. Holland, 20 S.D. Weed, M. Levine, J.C. Glorioso, and L.W. Enquist, J. Virol. 61, 2691-2701 (1987).

63. Whitbeck, J.C., L.Z. Bello, and W.C. Lawrence, J. Virol. 62, 3319-3327 (1988).

64. Montreuil, J., J. Biol. Cell. 51, 115-132 (1984).

65. Kyte, J., and R.F Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).

66. Davison, A.J., and J.E. Scott, J. gen. Virol. 67, 1759-1816 (1986).

25 67. Bzik, D.J,, B.A. Fox, N.A. DeLuca, and S. Persen, Virology 133, 301-307 (1984).

68. Pellett, P.E., M.D, Biggin, B.L. Barrell, and B. Roizman, J. Virol. 56, 807-813 (1985).

69. Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).

70. Gillard, S., D. Spehner, R. Drillien, and A. Kirn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 5573-5577 (1986).

71. Whalley, J.M., G.R. Robertson, N.A. Scott, G.C. Hudson, C.W. Bell, and L.M. Woodworth, J. gen. Virol. 30 70,383-394(1989).

72. Riggio, M.P., A.A. Cullinane, and D.E. Onions, J. Virol. 63, 1123-1133 (1989).

73. Glorioso, J., C.H. Schroder, G. Kumel, M. Szczesiul, and M. Levine, J. Virol. 50, 805-812 (1984).

74. Wachsman, M., L. Aurelian, J.C.R. Hunter, M.E. Perkus, and E. Paoletti, Bioscience Reports 8, 323-334 (1988) .

35 75. Wachsman; M., J.H. Luo, L. Aurelian, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. gen. Virol. 70, 2513-2520 (1989).

76. Sinclair, R.,R.F. Cook, and J.A. Mumtord, J. gen. Virol 70, 455-459 (1989).

77. Shimizu, Μ., K. Satou, and N. Nishioka, Arch. Virale 104, 169-174 (1989).

78. Stokes, A., G.P. Allen, L.A. Pullen, and P.K. Murray, J. gen. Virol. 70, 1173-1183 (1989).

79. McGeoch, D.J., A. Dolan, S. Donald, and F.J. Rixon, J. Mol. Biol. 181, 1-13 (1985).

40 80. Petrovskis, E.A., J.G. Timmins, and L.E. Post, J. Virol. 60, 185-193 (1986).

81. Wittmann, G. and H.-J. Rziha, In: Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, ed. G. Wittmann (Kluwer Academie Publishers) pp. 230-325 (1989).

82. Rubenstein, A.S. and A.S. Kaplan, Virology 66, 385-392 (1975).

83. Stevely, W.S., J. Virol. 22, 232-234 (1977).

45 84. Ben-Porat, T., F.J. Rixon, and M.L. Blankenship, Virology 95, 285-294 (1979).

85. Ben-Porat, T. and A.S. Kaplan, In: The Herpesviruses, vol. 3, ed. B. Roizman (Plenum Publishing Corp., New York) pp. 105-173 (1985).

86. Hampl, Η., T. Ben-Porat, L. Ehrlicher, K-O. Habermehl, and A.S. Kaplan, J. Virol. 52, 583-590 (1984).

87. Ben-Porat, T. In: Organization and replication of viral DNA, ed. A.S. Kaplan (CRC Press, Inc., Boca 50 Raton, FL) pp. 147-172 (1982).

88. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, J. Pendrys, R.A. Veach, and A.S. Kaplan, J. Virol. 57, 191-196 (1986).

89. Ben-Porat, T. and A.S. Kaplan, Virology 41 265-273 (1970).

90. Killington, R.A., J. Yeo, R.W. Honess, D.H. Watson, B.E. Duncan, I.W. Halliburton, and J. Mumford, J. gen. Virol. 37, 297-310 (1977).

55 91. Robbins, A.K., J.H. Weis, L.W. Enquist, and R.J. Watson, J. Mol. Appl. Genet. 2, 485-496 (1984).

92. Rea, T.J., J.G. Timmins, G.W. Long, and L.E. Post, J. Virol. 54,21-29 (1985).

93. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and.H.-J. Rziha, J. Virol. 53, 52-57 (1985).

49 195085 94. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, H.-J. Thiel, C. Schteurs, and H.-J. Rziha, Virology 152, 66-75 (1986).

95. Pelrovskis, E.A., J.G. Timmins, M.A. Armentrout, C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr., and L.E. Post, J.

Virol. 59, 216-223 (1986).

96. Robbins, A.K., R.J. Watson, M.E. Whealy, W.W. Hays, and L.W. Enquist, J. Virol. 58, 339-347 (1986).

5 97. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984).

98. Kost, T.A., E.V. Jones, K.M. Smith, A.P Reed, A.L. Brown, and T.J. Miller, Virology 171, 365-376 (1989).

99. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and H.-J. Rziha, J. Virol. 56, 307-311 (1985).

100. Lomniczi, B., S. Watanabe, T. Ben-Porat, and A.S. Kaplan, J. Virol. 52, 198-205 (1984).

10 101. Lukacs, N., H.-J. Thiel, T. C. Mettenleiter, and H.-J. Rziha, J. Virol. 53, 166-173 (1985).

102. Marchioli, C., R.J. Yancey, Jr., J.G. Timmins, L.E. Post, B.R. Young, and D.A. Povendo, Am. J. Vet. Res. 49, 860-864 (1988).

103. Marchioli, C.C., R.J. Yancey, Jr., R.C. Wardley, D.R. Thomsen and L.E. Post, Am. J. Vet. Res. 48, 1577-1583 (1987).

15 104. Thomsen, D.R., C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr. and L.E. Post, J. Virol. 61,229-232 (1987).

105. Wathen, L.M.K., K.B. Platt, M.W. Wathen, R.A. Van Deusen, C.A. Whetstone, and E.C. Pirtle, Virus Res. 4, 19-29 (1985).

106. Eloit, M., D. Fargeaud, R. L’Haridon and B. Toma, Arch. Virol. 99, 45-46 (1988).

107. Marchioli, C.C., R.J. Yancey, Jr., E.A. Petrovskis, J.G. Timmins, and L.E. Post, J. Virol 61^, 3977-3982 20 (1987).

108. Ishii, Η., Y. Kobayashi, M. Kuroki and Y. Kodama, J. gen. Virol. 69, 1411-1414 (1988).

109. Whealy, M.E., A.K. Robbins and L.W. Enquist, J. Virol. 63, 4055-4059 (1989).

110. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 58, 173-178 (1986).

111. Robbins, A.K., M.E. Whealy, M.E., R.J. Watsen and L.W. Enquist, J. Virol. 59, 635-645 (1986).

25 112. Allen, W.P., and F. Rapp, J. Infect. Dis. 145, 413-421 (1982).

113. Bryson, Y.J., M. Dillon, M. Lovett, G. Acuna, S. Taylor, J.D. Cherry, B.L. Johnson, E. Wiesmeier, W. Growdon, T. Creagh-Kirk, and R. Keeney, N. Engl. J. Med. 308, 916-921 (1983).

114. Douglas, J.M., C. Critchlow, J. Benedetti, G.J. Mertz, J.D. Connor, M.A. Hintz, A. Fahnlander, M. Remington, C. Winter, and L. Corey, N. Engl. J. Med. 310, 1551-1556 (1984).

30 115. Roizman, B. and A.E. Sears, |n: Virology, eds. Fields, B.N. and D.M. Knipe (Raven Press, Ltd.,

New Yark) pp. 1795-1841 (1990).

116. Stuve, L.L., S. Brawn-Shimer, C. Pachl, R. Najarian, D. Dina, and R.L. Burke, J; Virol. 61, 326-335 (1987).

117. Dowbenko, D.J., and L.A. Lasky, J. Virol. 52, 154-163 (1984).

35 118. Watson, R.J., Gene 26, 307-312 (1983).

119. McGeoch, D.J., H.W.M. Moss, D. McNab and M.C. Frame, J. gen. Virol. 68, 19-38 (1987).

120. Chan, W., Immunol. 49, 343-352 (1983).

121. Davis, W.B., J.A. Taylor, and J.E. Oakes, J. Infect. Dis. 140, 534-540 (1979).

122. Oakes, J.E., and H. Rosemond-Hornbeak, Infect. Immun. 21, 489-495 (1978).

40 123. Balachandran, N., S. Bacchetti, and W.E. Rawls, Infect. Immun. 37, 1132-1137 (1982).

124. Oakes, J.E., W.B. Davis, J.A. Taylor, and W.W. Weppner, Infect. Immun. 29, 642-649 (1980).

125. McLaughlin-Taylor, E., D.E. Willey, E.M. Cantin, R. Eberle, B. Moss, and H. Openshaw, J. gen. Virol.

69, 1731-1734 (1988).

126. Weir, J.P., M. Bennett, E.M. Allen, K.L. Elkins, S. Martin, and B.T. Rouse, J. gen. Virol. 70, 2587-2594 45 (1989).

127. Gibbs, E.P.J., and M.M. Rweyemamu, Vet. Bull. 47, 317-343 (1977).

128. Yates, W.D.G., Can. J. Camp. Med. 46, 225-263 (1982).

129. Misra, V., R.M. Blumenthal and L.A. Babiuk, J. Virol. 40, 367-378 (1981).

130. Lawrence, W.C., R.C. D’Urso, C.A. Kundel, J.C. Whitbeck and L.J. Bello, J. Virol. 60, 405-414 (1986). 50 131. Zamb, T. 1987, Abstract No. 330, 68th Annual Meeting of Conference of Research Workers in Animal

Disease, 16 and 17 November 1987, Chicago, IL., USA.

132. Babiuk, L.A., J. L’ltalien, S. van Drunen Littel-van den Hurk, T. Zamb, M.J.P. Lawman, G. Hughes, and G.A. Gifford, J. Virol. 159, 57-66 (1987).

133. Van Drunen Littel-van den Hurk, S., and L.A. Babiuk, J. Virol. 59, 401-410 (1986).

55 134. Gaskei, R.M., and R.C. Povey, Res. Vet. Sci. 27, 167-174 (1978).

135. Povey R.C., and M.R. Wilson, Feline Practice 8, 35-42 (1978).

136. Chappuis, G., C. Benoit-Jeanin, and D. Fargeaud, ]n: Develop, biol. Standard., Vol. 52, eds.

195085 50 M. Bonneau, and W. Hennessen, (S.Karger, Basel) pp. 485-491 (1982).

137. Saint-Gerand, A.L., Vaccine 6, 508 (1988).

138. Sarmiento, Μ., M. Haffey, and P.G. Spear, J. Virol. 29, 1149-1158 (1979).

139. Ruyechan, W.T., L.S. Morse, D.M. Knipe, and B. Roizman, J. Virol. 29, 677-697 (1979).

5 140. Pereira, L, E. Cassai, R.W. Honess, B. Roizman, M. Terni, and A. Nahmias, Infect. Immun. 13, 211-220 (1976).

141. Eberle, R„ and R.J. Courtney, J. Virol. 35, 902-917 (1980).

142. Papp-Vid, G., and J.B. Derbyshire, Can. J. Camp. Med. 43, 231-233 (1979).

143. Meas, R.K., S.L. Fritsch, L.L. Herr, and P.A. Rota, J. Virol. 51, 259-262 (1984).

10 144. Fargeaud, D., C. Benoit Jeannin, F. Kato, and G. Chappuis, Arch. Virol. 80, 69-82 (1984).

145. Compton, T., In: Cell Biology of virus Entry, Replication, and Pathogenesis, eds. Compans, R.W., A. Helenius, and M.B.A. Oldstone (Alan R. Liss, Inc.) pp. 45-56 (1989).

146. Spatz, S.J., R.K. Meas, and C.E. Beisel, Abstracts of the 14th International Herpesvirus Workshop (Nyborg Strand Denmark) biz. 128 (1989).

15 147. Little, S.P., J.T. Jofre, R.J. Courtney, and P.A. Schaffer, Virology 1J_4, 149-160 (1981).

148. DeLuca, N., D.J. Bzik, V.C. Bond, S. Persen, and W. Snipes, Virology 122, 411-423 (1982).

149. Cai, W„ B. Gu, and S. Persen, J. Virol. 62, 2596-2604 (1988).

150. Courtney, R.J., In: Immunobiology of Herpes Simplex Virus Infection, eds. B.T. Rouse and C. Lopez (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.) pp. 33-44 (1984).

20 151. Kozak, M., Microbial Rev. 47, 1-45 (1983).

152. Pelletier, (1988). J., and N. Sonenberg, Nature 334, 320-325 153. Rota, P.A., R.K. Maes, and W.T. Ruyechan, Virology 154, 168-179 (1986).

154. Henle, G., W. Henle, and V. Diehl, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 94-101 (1968).

155. Kozak, M„ Cell 44, 283-292 (1986).

25 156. Miller, G., In: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. et al. (Raven Press, Ltd., New York) biz. 1921-1958 (1990).

157. Hubbard, S.C., and R.J. Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 50, 555-583 (1981).

158. McGeoch, D.J., M.A. Dalrymple, A.J. Davison, A. Dolan, M.C. Frame, D. McNab, L.J. Ferry, J.E. Scott, and P.Taylor, J. gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).

30 159. Kieff, E., and D. Liebowitz, In: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. et al. (Raven Press, Ltd.,Bew York) pp. 1889-1920 (1990).

160. Watson, R.J., J.H. Weis, J.S. Salstrom, and L.W. Enguist, Science 2t8, 381-384 (1982).

161. McGeoch, D.J. and A.J. Davison, Nucleic Acid Res. 10, 4281-4292 (1986).

162. Lehner, R., H. Meyer, and M. Mach, J. Virol. 63, 3792-3800 (1989).

35 163. Biggin, M„ P.J. Farrell, and B.G Barrell, EHBO. J. 3, 1083-1090 (1984).

164. Beisel, C., J. Tanner, T. Matsuo, D. Thorley-Lawson, F. Kezdy, and E. Kieff, J. Virol. 54, 665-674 (1985) .

165. Qualtiere, L.F., J.F. Decoteau, and M. Hassan Nasr-el-Din, J. gen. Virol. 68, 535-543 (1987).

166. Epstein, M.A., A.J. Morgan, S. Finerty, B.J. Randle, and J.K. Kirkwood, Nature 318, 287-289 (1985).

40 167. Morgan, A.J., M. Mackett, S. Finerty, J.R. Arrand, F.T. Scullion, and M.A. Epstein, J. Med. Virol. 25, 189-195 (1988).

168. Strnad, B.C., T. Schuster, R. Klein, R.F. Hopkins, T. Witmer, R.H. Neubauer, and H. Rabin, J. Virol.

42, 258-264 (1982).

169. Miller, N„ and L.M. Hutt-Fletcher, J. Virol. 62, 2366-2372 (1988).

45 170. Plotkin, S.A.,H.M. Friedman, S.E. Starr, and E. Gonczol, In: Contemporary Issues in Infectious Diseases, Vol. 8 eds. Root et al. (Churchill Livingstone, New York) blz. 65-92 (1989).

171. Plotkin, S.A., S.E. Starr, H.M. Friedman, E. Gonczol, and R.E. Weibel, J. Inf. Dis. 259, 860-865 (1989).

172. Gretch, D.R., B. Kari, L. Rasmussen; R.C. Gehrz, and M.F. Stinski, J. Virol. 62, 875-881 (1988).

173. Weston, K„ and B.G. Barrell, J. Mol. Biol. 292, 177-208 (1986).

50 174. Pachl, C., W.S. Rasmussen, T.C. 418-426 (1989). Probed, K.M. Hermsen, F.R. Masiarz, L. Merigan, and R.R. Spaete, Virology 269, 418-426 (1989).

175. Rasmussen, L., M. Nelson, M. Neff, and T.C. Merigan, Jr., Virology 263, 308-318 (1988).

176. Kari, B., N. Lussenhop, R. Goedz, M. Wabuke-Bunoti, R. Radeke, and R. Gehrz, J. Virol. 60, 345-352 (1986) .

55 177. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Virus Res. 20, 343-356 (1988).

178. Nettleton, P.F., and J.M. Sharp, Vet. Rec. 207, 379 (1980).

179. Kahrs, R.F., J. Amer. Vet. Med. Assoc. 172, 1055-1064 (1977).

Claims (10)

51 195085 180. MeLauchlan, J., D. Gaffney, J.L. Whitfon, and J.B. Clements, Nucleic Acids Res.13, 1347-1368 (1985). 181. Davison, A.J., EHBO J. 2, 2203-2209 (1983). 182. Todd, D. and J.B. McFerran, Arch. Virol. 86, 167-176 (1985). 183. Diamond, L, Int. J. Cancer 2, 143-152 (1967). 184. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989). 185. Russel, M., S. Kidd, and M.R. Kelley, Gene 45, 333-338 (1986). 186. Kunkel, T.A., J.D. Roberts, and R.A. Zakour, In: Methods in Enzymology, Vol. 154, eds. R. Wu, and L. Grossman (Academie Press, Inc.) pp. 367-382 (1987). 187. Schmitt, J.F.C. and H.G. Stunnenberg, J. Virol. 62, 1889-1897 (1988). 188. Pickup, D.J., B.S. Ink, W. Hu, C.A. Ray, and W.K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7698-7702 (1986) . 189. Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975). 190. Bucher, D., S. Popple, M. Baer, A. Mikhail, Y.-F. Gong, C. Whitaker, E. Paoletti, and A. Judd, J. Virol. 15 63,3622-3633(1989). 191. Joklik, W.K., Virology 18, 9-18 (1962). 192. Guilhot, S., A. Hampe, L. D’Auriol, and F. Galibert, Virology 161, 252-258 (1987). 193. Falkner, F.G., and B. Moss, J. Virol. 62, 1849-1854 (1988). 194. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Gene 65, 123-128 (1988). 195. Dreyfuss, G., S.A. Adam, and Y.D. Choi, Mol. Cello Biol. 4, 415-423 (1984). 196. Kennedy, I.M., D.P. Leader, and W.S. Stevely, J. gen. Virol. 65, 1621-1624 (1984). 197. Powell, K.L. and D.H. Watson, J. gen. Virol. 29, 167-178 (1975). 198. Marsden, H.S., N.D. Stow, V.G. Preston, M.C. Timbury, and N.M. Wilkie, J. Virol. 28, 624-642 (1978). 199. Marsden, H.S., A. Buckmaster, J.W. Palfreyman, R.G. Hope, and A. C. Minson, J. Virol. 50, 547-554 25 (1984). 200. Zweig, M., S.D. Showalter, S.V. Bladen, C.J. Heilman, Jr. and B. Hampar, J. Virol. 47, 185-192 (1983). 201. Marshall, R.L., B.A. Israel, and G.J. Letchworth, III., Virology 165, 338-347 (1988). 202. Panicali, D., S.W. Davis, S.R. Mercer, and E. Paoletti, J. Virol. 37, 1000-1010 (1981). 203. Misra V., R. Nelson, and M. Smith, Virology 166, 542-549 (1988). 204. Keller, P.M., A.J. Davison, R.S. Lowe, C.D. Bennett, and R.W. Ellis, Virology 152, 181-191 (1986). 205. Bzik, D.J., C. Debroy, B.A. Fox, N.E. Pederson, and S. Persen, Virology 155, 322-333 (1986). 206. Gong, M„ T.Ooka, T. Matsuo, and E. Kieff, J. Virol. 61 499-508 (1987). 207. Baer, R., A.T. Bankier, M.D. Biggin, P.L. Deininger, P.J. Farrell, T.J. Gibson, G. Hatfull, G.S. Hudson, S.C. Satchwell, C. Seguin, P.S. Tuffnell, and B.G. Barrel!, Nature 310, 207-211 (1984). 208. Emini, E.A., J. Luka, M.E. Armstrong, P.M. Keller, R.W. Ellis, and G.R. Pearson, Virology 157, 552-555 (1987) . 209. Heineman, T., M. Gong, J. Sample, and E. Kieff, J. Virol. 62, 1101-1107 (1988). 210. Patel, D.D., and D.J. Pickup, Embo J. 6, 3787-3794 (1987). 40

1. Recombinant pokkenvirus dat daarin DNA van kat herpesvirus bevat.

2. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1, waarin het DNA aanwezig is in een niet-essentieel gebied 45 van het pokkenvirusgenoom.

3. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1 of 2, waarin het pokkenvirus verder een promotor voor het tot expressie brengen van het DNA bevat.

4. Recombinant pokkenvirus volgens één van de voorgaande conclusies, waarin het pokkenvirus een vaccinia virus of een vogelpokkenvirus, in het bijzonder een pluimveepokkenvirus of een kanariepokken- 50 virus, is.

5. Recombinant pokkenvirus volgens één van de voorgaande conclusies, waarin het DNA codeert voor een kat herpesvirus glycoproteïne.

6. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 5, waarin het DNA codeert voor, of het kat herpesvirus glycoproteïne omvat, kat herpesvirus gB.

7. Werkwijze voor het produceren van een kat herpesvirus glycoproteïne, omvattende het in contact brengen van het recombinante pokkenvirus volgens conclusie 5 of 6 met een gastheercel in vitro onder omstandigheden die geschikt zijn voor expressie van het kat herpesvirus glycoproteïne. 195085 52

8. Gebruik van het recombinante pokkenvirus volgens één van de conclusies 1-6 bij de bereiding van een immunogene of vaccin-samenstelling tegen kat herpesvirus.

9. Samenstelling die het recombinante pokkenvirus volgens één van de conclusies 1-6 omvat.

10. Vaccin voor het induceren van een immunologische respons bij een gastheerdier ingeënt met het 5 vaccin, welk vaccin een drager en het recombinante pokkenvirus volgens één van de conclusies 1-6 omvat. Hierbij 79 bladen tekening