DK176464B1 - Rekombinant poxvirus og vaccine mod herpesvirus indeholdende dette - Google Patents

Rekombinant poxvirus og vaccine mod herpesvirus indeholdende dette Download PDF

Info

Publication number
DK176464B1
DK176464B1 DK199101743A DK174391A DK176464B1 DK 176464 B1 DK176464 B1 DK 176464B1 DK 199101743 A DK199101743 A DK 199101743A DK 174391 A DK174391 A DK 174391A DK 176464 B1 DK176464 B1 DK 176464B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
recombinant
virus
gene
ehv
plasmid
Prior art date
Application number
DK199101743A
Other languages
English (en)
Other versions
DK174391D0 (da
DK174391A (da
Inventor
Enzo Paoletti
Original Assignee
Health Research Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Health Research Inc filed Critical Health Research Inc
Publication of DK174391D0 publication Critical patent/DK174391D0/da
Publication of DK174391A publication Critical patent/DK174391A/da
Priority to DK200701150A priority Critical patent/DK200701150A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK176464B1 publication Critical patent/DK176464B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

i DK 176464 B1
Opfindelsen angår et modificeret poxvirus og metoder til fremstilling og anvendelse deraf. Navnlig angår opfindelsen rekombinant poxvirus, der udtrykker genprodukter af et herpesvirusgen, og vacciner, der giver beskyttende 5 immunitet overfor infektioner med herpesvirus.
I beskrivelsen henvises der ved arabiske tal i parentes til adskillige publikationer. I slutningen af beskrivelsen, umiddelbart før kravene, er der en fuldstændig over-10 sigt over disse henvisninger, der beskriver det stade af teknikken, som den nærværende opfindelse forholder sig til.
Opfindelsens baggrund 15
Vacciniavirus, og for nylig andre poxviruser, er blevet anvendt til indsættelse og udtrykkelse af fremmede gener.
Den grundlæggende teknik til indsættelse af fremmede gener i levende infektiøse poxviruser indebærer rekombi-20 nation mellem pox-DNA-sekvenser, der flankerer et fremmed genetisk element i et donorplasmid, og homologe sekvenser til stede i hjælperpoxviruset (28).
Nærmere betegnet konstrueres de rekombinante poxviruser i 25 to trin, der er kendte inden for teknikken og er analoge med de metoder, der anvendes til dannelse af syntetiske rekombinanter af vacciniavirus, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4 603 112, hvis indhold er inkorporeret heri ved henvisning.
30 Først placeres den DNA-gensekvens, der skal indsættes i viruset, især en åben læseramme fra en ikke-pox-kilde, i en E. coli plasmidkonstruktion, hvori er indsat DNA homolog med en DNA-sektion fra poxviruset. Den DNA-35 sekvens, der skal indsættes, ligeres separat til en promoter. Promoter-gen-koblingen anbringes i plasmid-konstruktionen således, at promoter-gen-koblingen i begge 2 DK 176464 B1 ender er flankeret af DNA, der er homolog med en DNA-sekvens, der flankerer et pox-DNA-område indeholdende et ikke-essentielt locus. Den herved fremkomne plasmid-konstruktion amplificeres ved vækst i E. coli-bakterier 5 (11) og isoleres (12,20).
Dernæst transficeres det isolerede plasmid indeholdene den DNA-gensekvens, der skal indsættes, ind i en cellekultur, f.eks. kyllingefoster-fibroblaster, sammen med 10 poxviruset. Rekombination mellem homolog pox-DNA i henholdsvis plasmidet og det virale genom giver et poxvirus, der i et ikke-essentielt område af sit genom er modificeret ved tilstedeværelsen af fremmede DNA-sekvenser. Udtrykket "fremmed" DNA angiver exogen DNA, især DNA fra en 15 ikke-pox-kilde, der koder for genprodukter, der ikke normalt dannes af det genom, hvori den exogene DNA anbringes.
Genetisk rekombination er generelt udveksling af homologe 20 DNA-stykker mellem to DNA-strenge. I visse viruser kan RNA erstatte DNA. Homologe nukleinsyrestykker er stykker af nukleinsyre (DNA eller RNA), der har samme nukleotid-basesekvens.
25 Genetisk rekombination kan forekomme naturligt under replikationen eller ved dannelsen af nye virale genomer inde i den inficerede værtcelle. Således kan der forekomme genetisk rekombination mellem virale gener under den virale replikationscyklus, der foregår i en 30 værtcelle, der er co-inficeret med to eller flere forskellige viruser eller andre genetiske konstruktioner. Et DNA-stykke fra et første genom anvendes konvertibelt til konstruktionen af det område af genomet i et andet co-inficerende virus, i hvilket DNAen er homolog med det 35 første virale genoms DNA.
3 DK 176464 B1
Imidlertid kan rekombination også finde sted mellem DNA-stykker i forskellige genomer, der ikke er helt homologe.
Hvis et sådant stykke er fra et første genom, der er homologt med et stykke af et andet genom bortset 5 fra, at der i det første stykke er indsat f.eks. en genetisk markør eller et gen kodende for en antigen determinant, i en del af den homologe DNA, kan der stadig ske rekombination, og produkterne af en sådan rekombination kan da påvises ved tilstedeværelsen af den 10 genetiske markør eller genet i det rekombinante virale genom.
For vellykket udtrykkelse i det modificerede infektiøse virus af den indsatte DNA-gensekvens kræves to betingel-15 ser opfyldt. For det første skal indsættelsen være i et ikke-essentielt område af viruset, således at det modificerede virus forbliver levedygtigt. Den anden betingelse for udtrykkelse af indsat DNA er tilstedeværelsen af en promoter med korrekt forbindelse med den indsatte DNA.
20 Promoteren skal være placeret således, at den befinder sig opstrøms fra den DNA-sekvens, der skal udtrykkes.
Der er to undertyper af herpesvirus equi, der, skønt de indeholder krydsneutraliserende epitoper, kan skelnes ved 25 deres antigene profiler, restriktionsendonuklease- særpræg og deres patogenicitet for heste (1). Herpesvirus equi 1 (EHV-1) er forbundet med luftvejslidelser, lidelser i centralnervesystemet og klassiske herpes-aborter, hvorimod herpesvirus equi 4 (EHV-4) overvejende 30 er forbundet med luftvejslidelser (1,48). Herpesvirus equi tilhører a-herpesvirus-underfamilien og udviser mange af de typiske biologiske og biokemiske karakteristika af humane herpesviruser, såsom genomisk isomerisation, regulering af genudtrykkelse, etablering af 35 latente infektioner, dannelse af defekte interfererende viruspartikler, inducering af neurologiske lidelser og in vitro oncogen transformation (1,4,23). EHV kan således 4 DK 176464 B1 med fordel anvendes til at undersøge de forskellige biologiske konsekvenser af infektion med herpesviruser.
Herpesvirus-glycoproteiner formidler essentielle virale 5 funktioner, såsom cellulær fasthæftning og penetrering, spredning af virusen fra celle til celle og, hvad der er vigtigt, bestemmer infektionens patogenicitetsprofil. Herpesvirus-glycoproteiner er kritiske komponenter i samspillet med værtsinunmunsystemet (36,37).
10
De velkarakteriserede glycoproteiner af herpes simplex virus omfatter gB, gC, gD, gE, gG, gH og gi (36,37,49-55). Et antal undersøgelser har indikeret vigtigheden af herpes simplex virus glycoproteiner til fremkaldelse af 15 immunresponser. Det er således rapporteret, at gB og gD
kan fremkalde vigtige immunresponser (6,8,13,18,21,22, 26,27,30,44,46,47). gC kan stimulere klasse I restrik-tionsbundne cytotoxiske lymfocyter (15,32), hvorimod gD kan stimulere klasse II cytotoxiske T-celleresponser 20 ( 21,22,44,46,47). gG vistes at være et mål for virus neutralisering ved komplementafhængigt antistof (38,39).
Et antal glycoproteiner fra andre herpesviruser er også vist at fremkalde vigtige immunresponser (5,10,36,56).
25 Begge undertyper af EHV udtrykker seks glycoproteiner (1,3,43), der forekommer i stor mængde. De genomiske dele af de DNA-sekvenser, der koder for gp2, gplO, gpl3, gpl4, gpl7/18 og gp21/22a, er blevet bestemt ved brug af Agtll-udtrykkelsesvektorer og monoklonale antistoffer (3).
30 Glycoproteinerne gpl3 og gpL4 var beliggende i de samme steder indenfor genomets L-komponent, hvor henholdsvis gC- og gB-homologerne af herpes simplex virus er beliggende (3). EHV-1 lader til at være unik blandt de a-herpesviruser, hvis glycoproteingener er blevet kortlagt, 35 derved, at fem af dets seks i størst mængde forekommende glycoproteiner kodes fra sekvenser indenfor genomets L-komponent, mens kun én (gp!7/18) befinder sig i U - 5 DK 176464 B1 området. Ved analyse af disse data er det forudsagt, at nogle af de i lav mængde forekommende glycoproteiner, der er identificeret i EHV-1 virioner, såvel som endnu ikke identificerede EHV-l-glycoproteiner, kan kortlægges til 5 genomets S-komponent (3). Kappe-glycoprotelnerne er de vigtigste immunogener hos herpesviruser og er forbundet med fremkaldelse af både humorale og cellulære immunresponser hos værten (5,8,73-75) og er således af stor interesse for udformning af vacciner.
10
For nylig er nukleotidsekvensen for Kentucky T431-stammens EHV-1 transkriptionsenhed, der koder for gp!3, blevet rapporteret (2). En åben læseramme koder for et 468 aminosyrer stort primært translationsprodukt på 51 15 kDa. Proteinet har de karakteristiske egenskaber for et protein, der spænder over membranen, med ni potentielle N-bundne glycosyleringssteder (Asn-X-Ser/Thr) til stede i overfladedomænet mellem de formodede signaldele og trans-membranelt forankrende dele af proteinet (2). Glyco-20 proteinet vistes at være homologt med herpes simplex virus (HSV) gC-1 og gC-2, med pseudorabies virus (PRV) gill og varicella-zoster virus (VZV gpv (2). EHV-1 gpl3 er således den strukturelle homolog af herpesvirus gC-lignende glycoproteiner.
25 .
Nukleotidsekvensen for EHV-1 gpl4 (71,72) er for nylig blevet rapporteret. Analyse af den beregnede aminosyre-sekvens for gpl4-glycoprotein viste signifikant homologi med det tilsvarende glycoprotein af HSV, gB.
30
Monoklonale antistoffer rettet mod nogle EHV-1 glycoproteiner er vist at være neutraliserende (76). Passive immuniseringsforsøg viste, at monoklonale antistoffer rettet mod gpl3 eller gpl4 (77) eller mod gpl3, gpl4 35 eller gpl7/18 (78) kunne beskytte hamstere mod en dødelig udsættelse for antigen påvirkning. Andre gB og gC glyco-proteinanaloge er også involveret i beskyttelse mod syg- 6 DK 176464 B1 domme forårsaget af e-herpesviruser (8,10,73). EHV-1 gpl7/18 glycoproteinet, skønt karakteriseret som et andet potentielt beskyttende immunogen, havde indtil nu ikke noget kendt strukturelt modstykke blandt de adskillige 5 glycoproteiner, der kodes fra S-komponenten i de andre a- herpesviruser (66,79,80). Baseret på dets genomiske position, har det været overvejet, om gpl7/18 kunne være den analoge til HSV gE (2).
10 Pseudorabies virus (PRV), en α-herpesvirus, er årsag til Aujeszky's sygdom. Sygdommen er meget smitsom og medfører alvorlige økonomiske tab inden for svineindustrien. Sygdommen er forbundet med høj sygelighed og dødelighed blandt smågrise og er karakteriseret ved alvorlig respi-15 ratorisk sygdom, aborter, reduceret kuldstørrelse og nedsat vækstrate hos de overlevende dyr. En hyppig konsekvens af infektion er dødelig encephalitis. Latente virale infektioner, der er karakteristisk for herpes viruser, kan etableres, hvorved helbredte voksne svin 20 fungerer som kroniske bærere af viruset. For et nyere omfattende review, se Wittmann og Rziha (81).
PRV-genomet består af en 90 x 10 dalton dobbeltstrenget DNA (82) adskilt ved inverterede repeterende sekvenser i 25 unikke lange (UL) eller unikke korte (Ug) segmenter (83,84). PRV-genomet koder for ca. 100 polypeptider, hvis udtrykkelse reguleres på kaskadelignende vis i lighed med andre herpesviruser (85,86). Indtil nu er fem glycoprote-iner, gpl, gpll, gplli, gp63 og gp50, vist at være for-30 bundet med den virale kappe og forbundet med de forskellige membranstrukturer i PRV-inficerede celler (80,86-91). Et sjette PRV-kodet glycoprotein (gX) frigives i kulturmediet (92). Disse glycoproteiners fysiske beliggenhed på PRV-genomet og deres DNA-sekvens er almin-35 deligt kendt (62,80,91-98). Som det er tilfældet for glycoproteinerne fra andre herpesviruser, formidler PRV-glycoproteinerne essentielle virale funktioner, såsom 7 DK 176464 B1 cellulær fasthæftning og penetrering ind i eller frigørelse fra celler. PRV-glycoproteinerne er kritiske i patogenicitetsprofilen ved PRV-infektion og er kritiske komponenter ved sygdomshelbredelse og immunstatus.
5 PRV gpl er ikke-essentiel for virusreplikation in vitro og in vivo og er fraværende i de fleste attenuerede PRV-stammer (99). Den attenuerede natur af disse gpl-deleterede stammer indikerer også en mulig rolle for gpl ved virulens (99,100). Andre PRV-proteiner lader imidlertid til at være involveret i denne funktion, da udtrykkelse af gpl alene ikke er tilstrækkeligt til at frem-10 bringe høje virulensniveauer (100).
Det er uklart, hvilken rolle gpl spiller ved udløsning af et immunrespons mod PRV. Monoklonale antistoffer mod gpl kan neutralisere virus in vitro (101) og passivt beskytte immuniserede mus mod en dødelig udsættelse for antigen 15 påvirkning med PRV (81). Kost et al. (98) har for nylig beskrevet udtrykkeisen af PRV gpl i vacciniavirus-rekombinanter enten alene eller i forbindelse med gp50 og gp63. Intracranial inokulering af mus med vaccinia-rekombinanterne resulterede i øget virulens, især når PRV gpl var forbundet med koekspression af gp50 og gp63.
20 I svin dannes der imidlertid ikke neutraliserende antistoffer mod gpl (5). Endvidere beskytter et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker PRV gpl-kodede polypeptider (98), ikke mus mod en dødelig udsættelse for antigen påvirkning med PRV (i forhold til den beskyttelse der gives af vildtype-vacciniavirus-25 kontrollen). Tilsammen tyder disse data på, at PRV gpl er mere passende som en diagnostisk sonde end som en komponent i en underenhedsvaccine.
PRV glycoprotein gp63 er beliggende ved siden af gp50 i Us - området af PRV-genomet (80). Kodningssekvensen for PRV
8 DK 176464 B1 gp63 begynder med tre på hinanden følgende ATG-codoner beliggende ca. 20 nukleotider nedstrøms for gp50's stop-codon. Der er ikke noget genkendeligt transkriptions-signal-tema, og translation sker formentlig fra det samme 5 transkript som gp50. PRV gp63 er ikke-essentiel in vitro (88). PRV gp63 i form af en med PRV gp50 kontinuerlig DNA-sekvens er blevet udtrykt i vacciniavirus som rapporteret af Kost et al. (98). Det er vanskeligt at fastlægge PRV gp63's bidrag til beskyttelse i mus mod udsættelse 10 for antigen påvirkning med PRV, da undersøgelserne ikke adskiller bidragene fra PRV gp50 og PRV gp63.
PRV glycoprotein gX er et ikke-strukturelt glycoprotein, hvis slutprodukt udskilles i ekstracellulærvæsken 15 (85,92). Der opnåedes ingen in vitro neutralisering af PRV med hverken polyklonale eller monoklonale sera mod PRVgX (102,103), og gX-underenheds-vacciner beskyttede ikke mod udsættelse for antigen påvirkning (104).
20 PRV glycoprotein gp50 er analogen til Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) gD (97). Den åbne DNA-læseramme koder for 402 aminosyrer (95). Den modne glycosylerede form (50-60 kDa) indeholder O-koblet carbonhydrat uden tilkoblet glycosylering (95). Svineserum reagerer kraftigt 25 med PRV gp50, hvilket tyder på, at det er et vigtigt immunogen. Monoklonale antistoffer mod gp50 neutraliserer PRV in vitro med eller uden komplement (97,105,106) og giver passiv beskyttelse til mus (102,105,106) og svin (102). Vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker PRV 30 gp50, inducerede serumneutraliserende antistoffer og be skyttede både mus og svin mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med PRV (98,107,108).
PRV gpIII-genet er beliggende i genomets UL-område. Den 35 1437 bp åbne læseramme koder for et protein på 479 amino syrer. Det 50,9 kDa deducerede primære translationsprodukt har otte potentielle N-koblede glycosylerings- 9 DK 176464 B1 steder (96). PRV gplll er analog til HSV-1 gC (96). Der observeredes ikke funktionel udskiftning af PRV gplll med HSVgC (109). Skønt PRV gplll ikke er essentielt for replikation in vitro (110,111), er den modne glycosylerede form (98 kDa) en i rigelig mængde forekommende bestanddel af PRV-5 kappen. Anti-gplll monoklonale antistoffer neutraliserer viruset in vitro med eller uden komplement (86,106,110) og kan passivt beskytte mus og svin (102). PRV-glycoprotein gplll kan beskytte mus og svin mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med PRV efter immunisering med et Cro/gplll-fusionsprotein udtrykt i E. coli (Robbins, A., R. Watson, L Enquist, EP an-10 søgning nr. 0162738A1) eller ved udtrykkelse i en vaccinia-rekombinant (Pa-nicali, D., L. Gritz, G. Mazzara, EP ansøgning nr. 0261940A2).
En af hovedbestanddelene af PRV-kappen er et disulfidkoblet kompleks af tre glycoproteiner (120 kDa, 67 kDa og 58 kDa) betegnet PRV gpll ifølge 15 Hampl's nomenklatur (86). DNA-sekvensen, der koder for PRV gpll er beliggende i den venstre ende af UL. Den åbne læseramme på 2976 nukleotider koder for et primært translationsprodukt på 913 aminosyrer eller 110 kDa.
PRV gpll er homolog med HSV-1 gB (62). Monoklonale antistoffer rettet mod PRV gpll er vist at neutralisere viruset in vitro (5) med eller uden komplement 20 (81). Endvidere har undersøgelser af passiv immunisering vist, at neutralise rende monoklonale antistoffer delvis beskytttede svin, men ikke beskyttede mus mod udsættelse for antigen påvirkning med virulent virus (102). Til dato er der ikke rapporteret om aktiv immunisering af svin med PRV gpll glycoprotein.
25 I de sidste 20 år er hyppigheden af genitale infektioner forårsaget af herpes simplex virus type 2 (HSV2) tiltaget signifikant. Nyere beregninger tyder på, at i USA har 5-20 millioner mennesker genital herpes (112). Skønt det er vist, at peroral behandling med acyclovir kan reducere 10 DK 176464 B1 sværhedsgraden af primære infektioner (113) og undertrykke tilbagevendende episoder (114), er kontrollen og behandlingen af disse infektioner langt fra ideel. Der er derfor behov for en vaccine til forebyggelse af primære 5 og tilbagevendende infektioner.
Herpes simplex virus type 1 (HSV1) genomet koder for mindst otte antigent distinkte glycoproteiner: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gi og gj (115). Det lader til, at der 10 findes homologe til disse gener i HSV2 (116-119). Da disse glycoproteiner er til stede både i virionkappen og i den inficerede celleplasmamembran, kan de inducere humoral og celle-medieret beskyttende immunrespons (37).
15 Man har ikke fuldstændig belyst den relative vigtighed af humoral og cellulær immunitet ved beskyttelse mod infektioner med herpes simplex virus. Mus immuniseret med oprenset HSV1 gB, gC eller gD er beskyttet mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med HSV1 (120). Mus er 20 også blevet beskyttet mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med HSV1 eller HSV2 ved passiv immunisering med antistoffer mod total HSVl- (121) eller HSV2-virus (122) og med antistoffer mod de individuelle HSV2 gB-, gC-, gD- eller gE-glycoproteiner (123). Denne beskyttelse 25 synes imidlertid at være afhængig af et kompetent T- celle-respons, da dyr, der var immunsupprimeret ved bestråling, cyclophosphamid eller anti-thymocyt-serum, ikke var beskyttet (124 ).
30 Man forstår ikke helt, hvilken rolle de individuelle glycoproteiner spiller ved fremkaldelsen af et beskyttende immunrespons. Udtrykkelse af disse glycoproteiner i et heterologt system, såsom vaccinia, har gjort det muligt at analysere nogle af disse parametre. For eksem-35 pel er det vist, at vacciniavirus-vektorer, der udtrykker HSVl gB (125) og HSVl gC (32), inducerer cytotoxisk T-celle respons. Endvidere er det vist, at mus immuniseret 11 DK 176464 B1 med rekombinant vacciniavirus, der udtrykker enten HSV1 gB (8), HSV1 gC (126) eller HSV1 gD (26) er beskyttet mod en udsættelse for dødelig antigen påvirkning med HSV1.
Et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker HSV1 gD er 5 også vist at have en beskyttende virkning over for HSV2 i et marsvine-modelsystem (44). Det vides imidlertid ikke, om udtrykkelse af multiple HSV-antigener vil resultere i en forstærkning af dette beskyttende respons.
10 Bovin herpesvirus 1 (BHV1) er ansvarlig for forskellige sygdomme hos kvæg, herunder conjunctivitis, vulvovaginitis og abort (127). Det er også en af de vigtigste faktorer ved bovin respiratorisk sygdom, hvor det enten virker direkte eller som en prædisponerende faktor for 15 bakterieinfektion (128).
BHVI udtrykker over 30 strukturelle polypeptider, hvoraf 11 er glycosylerede (129). Man har karakteriseret fire af disse glycoproteiner, gi, gll, gill og giv, og de er 20 fundet at være homologe med herpes simplex virus (HSV) glycoproteinerne gB, gC, gD og gE (130,131).
Underenheds-vacciner bestående af gi, gill og/eller gIV er vist at beskytte kvæg mod sygdom (ved anvendelse af en 25 BHVl/Pasteurella haemolytica aerosol-udsættelsesmodel), men ikke mod infektion (132). Disse resultater antyder disse glycoproteiners betydning for frembringelse af et vellykket imunresponse mod BHVl.
30 gi og giil er også ved gensplejsning blevet indsat i vacciniavirus, og kvæg immuniseret med disse rekom-binanter er vist at danne neutraliserende antistoffer mod BHVl (56,133).
35 Rhinotracheitis felis er en almindelig sygdom hos katte med global udbredelse, der forårsages af en a-herpesvirus betegnet felin herpesvirus type 1 (FHV-1). I lighed med 12 DK 176464 B1 andre herpesviruser etablerer FHV-1 en latent infektion, der resulterer i periodisk reaktivering (134). Infektioner med FHV-1 i ynglende kolonier er kendetegnet ved en høj dødelighed blandt killinger. Sekundære infektioner i 5 de øvre luftveje medfører svækkelse hos voksne katte. Man forsøger for tiden at kontrollere denne sygdom ved anvendelse af modificerede levende vacciner eller inaktiverede vacciner, der kan undertrykke udviklingen af kliniske symptomer, men som ikke forhindrer infektion, der 10 medfører spredning af virus. Vaccinerede katte uden symptomer kan således sprede virulent virus, og latente infektioner kan ikke forebygges med de eksisterende vacciner (135) eller ved de mere sikre vacciner af oprensede underenheder, der er under udvikling (136,137).
15
Glycoproteiner af herpesvirus formidler fasthæftning af virionet til værtcellen og er yderst vigtige ved viral infektion (138,139). De bestemmer også virusets undertypespecificitet (140). Herpesvirus glycoprotein-anti-20 gener genkendes af såvel det humurale som det cellulære immunsystera og er vist at vække beskyttende immunresponser i vaccinerede værter (44,107,141,142). FHV-1 er vist at indeholde mindst 23 forskellige proteiner (143,144). Ud af disse er mindst fem glycosylerede 25 (144,145) og har rapporterede molekylmasser spændende fra 120 kDa til 60 kDa. FHV-1 glycoproteinerne er vist at være immunogene (143,145).
I lighed med flere andre α-herpesviruser lader det til, 30 at FHV-1 har en homolog til glycoprotein B (gB) fra HSV-1, og den delvise sekvens af FHV-1 gB-genet er for nylig rapporteret (146). HSV-1 gB er nødvendig for indtrængen af virus og for cellefusion (147-149). HSV-1 gB og de gB-analoge fra andre herpesviruser er vist at fremkalde 35 vigtigt cirkulerende antistof såvel som cellemedierede immunresponser (8,10,37,47,73,150). FHV-1 gB-glyco-proteinet er et 134 kDa kompleks, der dissocieres med B- 13 DK 176464 B1 mercaptoethanol til to glycoproteiner på 66 kDa og 60 kDa. FHV-1 DNA-genomet er ca. 134 kb stort (153).
Epstein Barr Virus (EBV), et humant B-lymfotropt herpes-5 virus, er et medlem af slægten lymphocryptovirus, der tilhører underfamilien t-herpesvirus (115). Det forårsager infektiøs mononucleosis (154) og B-celle lymfomer (156). EBV er forbundet med to maligne sygdomme hos mennesker: det endemiske Burkitt's lymfom og udifferen- 10 tieret nasopharyngealt carcinom (156).
Siden EBV-genomet, ligesom det er tilfældet for genomerne af VZV (66) og HSV1 (158), blev fuldstændigt sekventeret (207), er der beskrevet talrige homologier mellem disse 15 forskellige herpesviruser (159). I nogle tilfælde er disse homologier blevet anvendt til at forudsige de potentielle funktioner af en åben læseramme (ORF) i EBV.
De EBV-gener, der er homologe med HSV1-generne involveret i immunitet, er af særlig interesse. Således har EBV 20 BALF4-genet homologier med HSV1 gB (68) og EBV BXLF2- genet med HSV1 gH (161). Endelig indeholder EBV BBRF3-genet homologier med et CMV-membranprotein (162).
Blandt EBV-proteinerne er de to vigtigste kappeglyco-25 proteiner, gp340 og gp220, de best karakteriserede potentielle vaccine-antigener. De er afledt fra det samme gen ved splejsning uden ændring i læserammen (163,164). Monoklonale antistoffer og polyklonale sera rettet mod gp340 neutraliserer EBV in vitro (165). Cottontop 30 tamarin (en art egernabe), der er det eneste modtagelige dyr, kan beskyttes ved en immunisering med oprenset gp340-vacciniavirus (166) og med et rekombinant EBV-gp340-vacciniavirus (167). X dette tilfælde blev beskyttelsen opnået med en rekombinant afledt fra WR-vaccinia-35 stammen, men ikke med en rekombinant afledt fra Wyeth-vaccinia-stammen. Wyeth-stammen har været almindeligt anvendt som vaccinestamme.
14 DK 176464 B1
Monoklonale antistoffer rettet mod gp85, der er EBV-homo-logen til HSV1 gH, er beskrevet som in vitro neutraliserende antistoffer (168,169).
5 Human cytomegalovirus (HCMV) er et medlem af &-herpes-virinae-underfamilien (familie Herpesviridae). HCMV kan danne en hårdnakket produktiv infektion på trods af betydelig specifik immunitet. Selv om HCMV i almindelighed har en lav patogenicitet, forårsager intrauterin in-10 fektion hjerneskade eller døvhed hos ca. 0,15% af alle nyfødte, og det er den mest almindelige infektiøse komplikation ved organtransplantation (170). Skønt man har vist effektiviteten af en eksperimentel levende atte-nueret (Towne-stamme) HCMV-vaccine (171), har betænkelig-15 hed ved levende vaccinestammer ledt bestræbelserne i retning af identifikation af HCMV-proteiner, der kan bruges som underenhedsvaccine. I disse undersøgelser er et vigtigt skridt identifikationen af virion-glycoproteiner og evalueringen af dem som beskyttende midler.
20
Der er beskrevet tre immunologisk distinkte glycoprotein-familier forbundet med HCMV-kappen (172): gCI (gp55 og gp93-130); gCII (gp47-52); og gCIII (gp85-pl45).
25 Genet, der koder for gCI, er homologt med HSVI gB.
gCIII-glycoproteinerne kodes af en familie bestående af fem gener (HXLF) arrangeret i tandem og med ét eller to homologe områder. Det er sandlynligt, at gCII kodes af kun to af disse gener (172,173). Det gen, der koder for 30 gCIII, er homologt med HSVI gH (174).
Der er beskrevet in vitro neutraliserende antistoffer specielt rettet mod hver af disse familier (174-176).
35 Passende modificeret poxvirus-mutanter, der bærer exogene herpesvirus equi-gener, der i en vært udtrykkes som en antigen determinant, der udløser værtens dannelse af 15 DK 176464 B1 antistoffer mod herpesvirusantigener, repræsenterer hidtil ukendte vacciner, der undgår konventionelle vacciners ulemper ved at anvende dræbte eller attenuerede levende organismer. Således kræver fremstilling af vacciner ud 5 fra dræbte organismer for eksempel vækst af store mængder af organismerne efterfulgt af en behandling, der selektivt ødelægger deres infektionsevne uden at berøre deres antigenicitet. På den anden side frembyder vacciner indeholdende attenuerede levende organismer altid muligheden 10 for en reversion af den attenuerede organisme til en patogen tilstand.
I modsætning hertil undgås muligheden for reversion til en patogen organisme, når man som vaccine anvender et 15 rekombinant pox-virus, der på passende vis er modificeret med et herpesvirus equi gen kodende for en antigen determinant af et sygdomsfremkaldende herpesvirus, da poxviruset kun indeholder det gen, der koder for den antigene determinant af den sygdomsfremkaldende organisme 20 og ikke de genetiske dele af organismen, der er ansvarlig for replikationen af patogenet.
PRV inficerer på dødelig vis mange pattedyrarter (kvæg, hunde, etc.). Voksne grise overlever imidlertid sædvan-25 ligvis infektion, og udgør derfor et vigtigt virus reservoir. Fordi PRV medfører alvorlige økonomiske tab, foretager man i mange lande vaccination af grise med attenuerede eller dræbte vacciner.
30 Forsøg på at kontrollere PRV-infektion hos svin og reducere økonomiske tab er blevet gjort ved aktiv immunisering med modificeret levende eller inaktiverede vacciner. Attenuerede vacciner, der almindeligvis inducerer langvarig immunitet og er fordelagtige, hvad angår ora-35 kostninger, udgør en risiko for utilstrækkelig attenu- ering eller genetisk ustabilitet. Inaktiverede vacciner er mindre effektive, kræver flere immuniseringer og inde- 16 DK 176464 B1 holder sædvanligvis potente adjuvanser. Disse sidstnævnte formuleringer kan inducere post-vaccinale allergiske reaktioner, såsom appetitløshed, feber eller .abort hos drægtige søer. Disse vaccinetyper lider også af visse 5 ulemper med hensyn til forebyggelse af latente infek tioner, overvindelsen af virkningerne af moderens antistoffer på vaccinationseffektivitet og elimineringen af potentiel anvendelse af et serologisk diagnostisk assay til at skelne vaccinerede dyr fra dyr, der tidligere er 10 inficeret med PRV.
Alternative vaccinationsstrategier, såsom brugen af rekombinante poxviruser, der udtrykker immunologisk relevante PRV-genprodukter, ville have visse fordele: 15 (a) fjerne levende attenuerede PRV-vaccinestammer fra om rådet og (b) tillade skelnen mellem vaccinerede og inficerede eller seropositive dyr. Det sidste kunne udføres ved brug af passende diagnostiske reagenser, der præcist ville skelne vaccinerede fra naturligt inficerede dyr.
20 Dette er et vigtigt hensyn på grund af gældende regler til styring af flytningen af seropositive dyr. Endvidere er vaccination mere økonomisk og at foretrække fremfor testning og eliminering af inficerede dyr fra områderne. Udviklingen af sådanne vacciner kræver et kendskab til de 25 bidrag der ydes af passende PRV-antigener til induktion af beskyttende immunitet. Når det drejer sig om PRV, ligesom det gælder for andre medlemmer af herpesvirus-familien, er glycoproteiner vigtige kandidater for antigener der er til stede i en effektiv vaccine af rekom-30 binante underenheder.
Teknologien til frembringelse af vacciniavirus-rekombi-nanter er for nylig blevet udvidet til andre medlemmer af poxvirus-familien, der har et mere begrænset værtsområde.
35 Især er avipoxviruser, der replikerer i fuglearter, blevet konstrueret til at udtrykke immunologisk relevante genprodukter. Inokulering af fuglearter (42,177) og ikke- 17 DK 176464 B1 fuglearter (41) med avipoxvirus-rekombinanter fremkaldte beskyttende immunresponser overfor det tilsvarende patogen.
5 Attenuerede levende vacciner og inaktiverede vacciner mod BHVl har været tilgængeligt i mere end 30 år og har med held reduceret forekomsten af BHVl-relaterede sygdomme.
Disse vacciner forebygger imidlertid ikke latent infektion eller reinfektion med vildtypevirus. De gør det også 10 kompliceret at skelne mellem inficerede og vaccinerede dyr.
Begge vaccinetyper har andre væsentlige ulemper. Vaccinering af drægtige køer med attenuerede levende vacciner 15 kan forårsage fosterdød og efterfølgende abort (127).
Endvidere er det vist, at vaccinerede dyr kan sprede virus (178). Derfor kan vaccinerede dyr, der går sammen med drægtige køer, sprede infektiøs virus til de drægtige dyr og forårsage abort af fosteret.
20
Inaktiverede vacciner inducerer ikke aborter eller provokerer viral ekskretion. Imidlertid nødvendiggør de brug af adjuvanser og kan forårsage dødelige hypersensitive-tetsreaktioner (anafylaksi) og ikke-dødelig inflammation 25 og feber (179).
Et de af vigtigere problemer i forbindelse med vaccination er at overvinde eller undgå maternel immunitet. Hvis en moder er immun over for et bestemt patogen, vil 30 "immuniteten" i moderen blive overført til den nyfødte via de antistoffer, der er til stede i kolostrum, og/eller ad andre overførselsveje. Alligevel kan den nyfødte ikke med held vaccineres, indtil niveauet af maternel immunitet er aftaget i tilstrækkelig grad. Der 35 er derfor et snævert tidsrum, inden for hvilket den nyfødte med held kan vaccineres i nærvær af aftagende maternel immunitet.
18 DK 176464 B1
Det vil således forstås, at tilvejebringelse af et med herpesvirus rekombineret poxvirus og af vacciner, der giver beskyttende immunitet over for herpesvirusinfektio-ner, der tilfører teknikken fordelene ved inokulering med 5 levende virus, men som reducerer eller eliminerer de oven for diskuterede problemer, ville være en i høj grad ønskelig fordel i forhold til den kendte teknik.
Opfindelsens formål 10
Det er derfor et formål med denne opfindelse at angive rekombinante poxviruser, der udtrykker herpesvirus-genprodukter, og at angive en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne rekombinante poxviruser.
15
Det er endvidere et formål med opfindelsen at angive kloning og udtrykkelse af herpesvirus-kodende sekvenser i en poxvirusvektor, især en vacciniavirus-, fjerkræpoxvirus-eller kanariepoxvirusvektor.
20
Et yderligere formål med opfindelsen er at angive en vaccine, der kan udløse herpesvirus-neutraliserende antistoffer og beskyttende immunitet mod udsættelse for en dødelig antigen påvirkning med herpesvirus.
25
Disse og andre formål og fordele ved opfindelse vil fremgå af det efterfølgende.
Opfindelsen angår et rekombinant poxvirus indeholdende en 30 DNA-sekvens fra herpesvirus i et ikke-essentielt område af poxvirusgenomet. Herpesviruset kan med fordel tilhøre a-herpesvirus-, 0-herpesvirus- eller r-herpesvirus-underfamilien. DNA-sekvensen fra herpesvirus koder specielt for et herpesvirusglycoprotein. Nærmere bestemt er 35 herpesvirusglycoproteinet valgt blandt herpesvirus equi gpl3, herpesvirus equi gpl4, herpesvirus equi gD, herpesvirus equi gp63, herpesvirus equi gE, pseudorabies virus 19 DK 176464 B1 gp 50, pseudorabies virus gpll, pseudorabies virus gpIII, pseudorabies virus gpl, herpes simplex virus gB, herpes simplex virus gC, herpes simplex virus gD, bovint herpes virus gi, felint herpes virus gB, Epstein-Barr virus 5 gp220, Epstein-Barr virus gp340, Epstein-Barr virus gB,
Epstein-Barr virus gH og humant cytomegalovirus gB.
Ifølge opfindelsen udtrykker de rekombinante poxviruser genprodukter fra det fremmede herpesvirusgen. I særdeles-10 hed koder den fremmede DNA-sekvens for et herpesvirus-glycoprotein, og det fremmede DNA udtrykkes i en vært ved dannelsen af herpesvirusglycoproteinet. Med fordel udtrykker det rekombinante poxvirus flere herpesvirusglyco-proteiner samtidigt i værten. Poxviruset er med fordel et 15 vacciniavirus eller et avipoxvirus, såsom fjerkræpoxvirus eller kanariepoxvirus.
Desuden angår opfindelsen en vaccine til inducering af et immunologisk respons i et værtsdyr inokuleret med vacci-20 nen, idet vaccinen indeholder en bærer og et rekombinant poxvirus indholdende, i et ikke-essentielt område, DNA fra herpesvirus. I særdeleshed koder DNAen for og udtrykker et herpesvirusglycoprotein. Med fordel udtrykker det rekombinante poxvirus flere herpesvirusglycoproteiner 25 samtidigt i værten. Det poxvirus, der anvendes i vaccinen ifølge opfindelsen, er med fordel et vacciniavirus eller et avipoxvirus, såsom fjerkræpoxvirus eller kanariepoxvirus .
30 Endvidere angår opfindelsen mekanismer til at omgå problemet med maternel immunitet. Hvis barrieren skyldes tilstedeværelsen af antistoffer mod et eller flere givne antigener, så kan barrieren af maternel immunitet overvindes eller undgås ved selektivt at anvende vektorer, 35 der udtrykker definerede antigen-delmængder. For eksempel kan det drægtige dyr vaccineres med et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker pseudorabiesvirus-glycopro- 20 DK 176464 B1 tein gp50, og afkommet kan vaccineres ved fødslen eller kort derefter med vacciniarekombinanter, der udtrykker de andre pseudorabiesvirus-glycoproteiner gpll eller gpIII eller kombinationer deraf. Hvis på den anden side bar-5 rieren, der frembydes af maternel immunitet, skyldes vektoren, så kan man vaccinere moderen med én vektor (vaccinia eller avipox) og vaccinere afkommet med en anden vektor. Ved denne procedure tages naturligvis i betragtning, ikke blot brugen af forskellige vektorer, men 10 også af vektorer, der udtrykker en forskellig sammensætning af glycoproteiner. Således angår opfindelsen en fremgangsmåde til at overvinde eller undgå maternel immunitet, der ellers ville forhindre vellykket immunisering af nyfødt afkom. Ved den foreliggende opfindelse 15 inokuleres det nyfødte afkom med et rekombinant poxvirus, der i et ikke-essentielt område af poxvirusgenomet indeholder DNA fra en ikke-poxkilde, idet denne DNA koder for et første antigen fra et patogen fra det nyfødte afkom, og dette antigen er forskelligt fra et andet antigen fra 20 det samme patogen, der anvendes til at inducere et immunologisk respons mod det samme patogen hos moderen til det nyfødte afkom. Ligeledes ved den foreliggende opfindelse inokuleres det nyfødte afkom med et rekombinant første poxvirus, der i et ikke-essentielt område af 25 det første poxvirusgenom indeholder DNA fra en ikke-pox kilde, idet denne DNA koder for et antigen fra et patogen fra det nyfødte afkom, og idet det første poxvirus er forskelligt fra et rekombinant andet poxvirus anvendt til at inducere et immunologisk respons mod det samme patogen 30 hos moderen til det nyfødte afkom.
Beskrivelse af tegningen
Opfindelsen forklares nærmere på tegningen, hvor:
Fig. 1 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante vacciniavirus vP425, 35 21 DK 176464 B1
Fig. 2 viser DNA-sekvensen for et EHV-1 fragment på 1,88 kb indeholdende gpl3-kodningssekvensen,
Fig. 3 skematisk viser en metode til konstruktion af 5 den rekombinante vacciniavirus vP483 indeholden- de EHV-1 gp13-genet,
Fig. 4 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante vacciniavirus vP458, 10
Fig. 5 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante vacciniavirus vP577 indeholdende EHV-1 gpl4-genet, 15 Fig. 6 viser DNA-sekvensen for et EHV-1 fragment på 3,35 kb indeholdende gpl4-kodningssekvensen,
Fig. 7 er et diagram over relativ hydrofili for EHV-1 gpl4-kodningssekvensen, 20
Fig. 8 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante fjerkræpoxvirus vFP44 indeholdende EHV-1 gpl3-genet, 25 Fig. 9 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante kanariepoxvirus vCP48 indeholdende EHV-1 gpl3-genet,
Fig. 10 skematisk viser en metode til konstruktion af 30 donorplasmiderne pHES-MP63, pHES-MPl og pHES- MP34 indeholdende modificerede versioner af EHV-1 gpl4-genet,
Fig. li er et kort over BamHI-skæringsstederne i EHV-1 35 Kentucky D-stammen, hvorpå er vist de invertere de gentagelser i genomet angivet ved boxe, beliggenheden af de seks vigtigste EHV-l-glyco- 22 DK 176464 B1 proteingener samt en ekspansion af det område af genomet, der indeholder gD-, gp63- og gE-gener-ne.
5 Fig. 12 viser nukleotidsekvenserne for et 6402 basepar EHV-l-fragment indeholdende gD-, gp63- og gE-kodningssekvenserne.
Fig. 13 er et hydropatidiagram over den sekvens på 402 10 aminosyrer, der udgør EHV-1 gD,
Fig. 14 er et hydropatidiagram over den sekvens på 413 aminosyrer, der udgør EHV-1 gp63, 15 Fig. 15 er et hydropatidiagram over den sekvens på 552 aminosyrer, der udgør EHV-1 gE,
Fig. 16 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmiderne pJCA006, pJCA007 og pJCA008 20 indeholdende henholdsvis EHV-1 gD-genet, EHV-1 gE-genet og EHV-1 gp63-genet og frembringelse af rekombinant vacciniavirus indeholdende disse gener, 25 Fig. 17 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmiderne pJCA009 (indeholdende EHV-1 gD-og gp63-generne) og pJCAOlO (indeholdende EHV-1 gD-, gp63- og gE-generne) og frembringelse af rekombinant vacciniavirus indeholdende disse 30 gener,
Fig. 18 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmid pPR18 indeholdende PRV gpll-genet og frembringelse af rekombinant vacciniavirus, 35 der udtrykker PRV gpll-genet, 23 DK 176464 B1
Fig. 19 viser DNA-sekvensen for den åbne læseramme af PRV gpll.
5 Fig. 20 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmid pPR24 indeholdende PRV gpIII-genet og frembringelse af rekombinant vacciniavirus, der udtrykker PRV gpIII-genet, 10 Fig. 21 viser DNA-sekvensen for den åbne læseramme af PRV gpIII.
Fig. 22 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmid pPR26 indeholdende PRV gp50-genet 15 og frembringelse af rekombinant vacciniavirus, der udtrykker PRV gp50-genet,
Fig. 23 viser DNA-sekvensen for den åbne læseramme af PRV gp50.
20
Fig. 24 skematisk viser en metode til konstruktion af plasmid PSD478VC og pSD479VCBG og indsættelse af Æ-galactosid i vacciniavirus, 25 Fig. 25 skematisk viser en metode til konstruktion af plasmid pMP13PP,
Fig. 26 skematisk viser en metode til konstruktion af plasmid pFPPRVII indeholdende PRV gpll-genet, 30
Fig. 27 skematisk viser en metode til konstruktion af det rekombinante kanariepoxvirus vCP55, der udtrykker PRV gpll-genet, 35 Fig. 28 skematisk viser en metode til konstruktion af det rekombinante vacciniavirus vP717, der udtrykker PRV gi-genet.
24 DK 176464 B1
Fig. 29 skematisk viser en metode til konstruktion af de rekombinante vacciniaviruser vP569 og vP734, der udtrykker HSV-2 gB-genet, 5 Fig. 30 skematisk viser en metode til konstruktion af de rekombinante vacciniaviruser vP579, vP748 og vP776, der udtrykker HSV-2 gC-genet,
Fig. 31 skematisk viser en metode til konstruktion af de 10 rekombinante vacciniaviruser vP570, vP761, vP775 og vP777, der udtrykker HSV-2 gD-genet,
Fig. 32 skematisk viser en metode til konstruktion af de rekombinante vacciniaviruser vP637 og vP724, der 15 udtrykker BHV-1 gi-genet,
Fig. 33 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmid pJCAOOl indeholdende FHV-1 gB-genet og til konstruktion af det rekombinante 20 vacciniavirus vP713, der udtrykker FHV-1 gB- genet.
Fig. 34 viser nukleotidsekvensen for 3400 bp segmentet af FHV-1 DNA, der koder for glycorpotein gB, 25
Fig. 35 er et hydropatidiagram over den sekvens på 947 aminosyrer, der udgør FHV-1 gB,
Fig. 36 skematisk viser en metode til konstruktion af
30 donorplasmiderne 409gp220 indeholdende EBV
gp220-genet og 409gp340 indeholdende EBV gp340-genet,
Fig. 37 skematisk viser en metode til konstruktion af 35 vaccinia-donorplasmid 409gB indeholdende EBV gB- genet, 25 DK 176464 B1
Fig. 38 skematisk viser en metode til konstruktion af vaccinia-donorplasmid 486gH indeholdende EBV gH-genet, 5 Fig. 39 skematisk viser strukturen af vaccinia-donor-plasmid 513gHgBgp340 indeholdende EBV-generne gp340, gB og gH,
Fig. 40 skematisk viser en metode til konstruktion af 10 vaccinia-donorplasmid 409CMVgB indeholdende CMV
gB-genet,
Fig. 41 viser nukleotid- og aminosyresekvenserne for HCMV (Towne-stamme) HXLF1-genet, og 15
Fig. 42 viser nukleotid- og aminosyresekvenserne for HCMV (Towne-stamme) HXLF2-genet.
Detaljeret beskrivelse af opfindelsen 20
De efterfølgende eksempler tjener til at belyse opfindelsen og give en forståelse af de mange fordele, der kan opnås derved.
25 EKSEMPEL 1 - Konstruktion af vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker herpesvirus equi gp!3-glyco-proteinet
Udskiftning af HA-genet i vaccinia med E. coli ΰ-30 galactosidase-genet. I dette eksempel blev anvendt
Copenhagen-stammen af vacciniavirus opnået fra Rhone Merieux, Inc. (Athens, GA). Viruset blev opformeret fra et oprenset plak-isolat på enten VERO-celler (ATCC CCL81) eller MRC-5-celler (ATCC CCL171) i Eagle's 35 minimal-essentielt medie (MEM) plus 10% føtal bovint serum (FBS). Et derivat af vildtypeviruset, hvorfra den fulde kodningssekvens for thymidinkinasegenet var delete- 26 DK 176464 B1 ret ved standardmetoder (25,28) blev isoleret og betegnet VP410. Denne thymidinkinase-deletionsmutant blev anvendt til yderligere manipulationer. Plasmider blev konstrueret, screenet og dyrket ved standardprocedurer 5 (20,27,28).
Der henvises nu til fig. 1. Sall F-fragmentet på 13 kb fra vacciniavirus, der spænder over Hindlll A/B-fragment-forbindelsen, blev ligeret ind i pUC8 nedbrudt med Sall 10 til dannelse af pSD419VC. Den højre arm af pSD419VC, der svarer til Hindlll B-delen af Sall F-fragmentet, blev fjernet ved skæring med Hindlll og religering til dannelse af pSD456VC. pSD456VC indeholder således den højre ende af Hindlll A-fragmentet, indenfor hvilket er det 15 fulde kodningsområde for hæmagglutinin (HA) genet (35) flankeret af ca. 0,4 kb yderligere vacciniasekvenser på hver side.
For at frembringe en plasmidvektor, der praktisk taget er 20 fri for HA-kodningssekvenser, blev pSD456VC skåret (par tiel nedbrydning) i Rsal-stedet opstrøms for HA-genet og i Eagl-stedet 80 bp fra 3'-enden af HA-genet. Rsal/Eagl-fragmentet på ca. 3,5 kb blev isoleret fra en agarosegel.
25 Syntetiske oligonukleotider MPSYN59-62 blev fremstillet til at erstatte området fra Rsal-stedet gennem position 2 opstrøms for HA-kodningssekvensen, umiddelbart efterfulgt af Bglll-, Smal- og Pstl-restriktionsstederne og en Eagl-kohæsiv ende. Sekvensen for MPSYN59-62 med de angivne 30 restriktionssteder er følgende: 5'-acacgaatgattttctaaagtatttggaaagttftataggtagttgatagaacaa
3' -TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAACTATCTTGTT
35 AATACATAATTTTGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCTCCCGGGCTGCAGC-3' TTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTCTAGÅGGGCCCGACGTCGCCGG-5'
Bglll Smal PstI Eagl 27 DK 176464 B1
Den annelerede MPSYN59-62-blanding blev ligeret ind i 3,5 kb RsaI/EagI-fragmentet fra pSD456VC til dannelse af pSD466VC. I pSD466VC er HA-genet således blevet erstattet med et polylinker-område.
5
Et 3,2 kb Bglll/BamHI (partielt) fragment indeholdende E. coli Ø-galactosidase-genet fra pMC1871 (34) under tran-skriptionel kontrol af vaccinia-promoteren på 11 kDa (7) blev indføjet i pSD466VC, der først var nedbrudt med 10 Bglll. Et plasmid indeholdende 11 kDa promoter//5- galactosidase-genkassetten i en retning fra venstre mod højre i forhold til flankerende vaccinia-arme blev betegnet pSD466VCBGA og rekombineret ind i en thymidin-kinase-deletionsmutant, vP4lO, af Copenhagen-stammen af 15 vacciniavirus til dannelse af vaccinia-rekombinanten vP425, der udtrykker Ø-galactosidase. Der blev bibeholdt 80 bp i carboxyl-terminus af HA-genet for ikke at forstyrre en kort potentiel åben læseramme transkriberet fra højre mod venstre i forhold til vacciniagenomet.
20
Det rekombinante vacciniavirus, vP425 (184), blev identificeret på basis af blå plaquedannelse i nærvær af det chromogene substrat, X-gal, som beskrevet af andre (9,24). Substitution af Ø-galactosidasegenet med endnu et 25 andet fremmed gen i efterfølgende vaccinia-rekombinanter kunne nemt udtages ved at isolere farveløse plaques i stedet for blå plaques.
For at lette fremtidige gensplejsningstrin blev Smal-30 stedet afledt fra pUC8-multikloning-området elimineret ved nedbrydning af pSD466VC med BamHI/EcoRI, dannelse af stumpe ender med Klenow-fragmentet af E. coli polymerase og religering. Det enkelte Smal-sted, der er tilbage i det resulterende plasmid, pSD467VC, er således i poly-35 linkerområdet af HA-deletionen.
28 DK 176464 B1
Identifikation af DNA-sekvenser, der koder for EHV-1 gP!3-genet. DNA-sekvensen, der koder for glycoproteinet EHV-1 gpl3, er beliggende i 7,3 kb BamHI-H fragmentet af EHV-1 (3). Nukleotidsekvens-data for begge strenge blev 5 opnået fra pUC (BamHI-H) området ved brug af overlappende subkloner, idet der anvendtes det modificerede T7-enzym Sequenase (40) (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH). Der blev udført standard dideoxy kædetermineringsreaktioner (33) på dobbeltstrengede piasmid-skabeloner, der var de-10 natureret i alkali. Ml3-forward- og revers-primere blev anvendt til opnåelse af den indledende sekvens af hver klon. Specialfremstillede 16-17-mer-primere syntetiseret ved standard kemiske metoder (Biosearch 8700, San Rafael, CA; Applied Biosystems 380B, Foster City, CA) 15 blev anvendt til vandring langs resten af fragmentet. IBI Pustell-sekvensanalyseprogram blev anvendt ved alle sekvensdataanalyser (29).
DNA-sekvensanalyse afslørede en åben læseramme på 1404 20 bp, der koder for 468 aminosyrer med et beregnet primært translationsprodukt på 50,9 kDa. I carboxylhalvdelen af den formodede åbne læseramme for gpl3 blev der observeret signifikant aminosyrehomologi med gC af herpes simplex virus type 1 og type 2, glll af pseudorabies virus og gpV 25 af varicella-zoster virus, hvilket tyder på, at gpl3 er et medlem af de gC-lignende glycoproteiner af herpes-' viruser. Yderligere detaljeret analyse af den åbne læse ramme for EHV-1 gpl3 er fremlagt i en tidligere publikation (2). For at lette beskrivelsen af indsættelse og ud-30 trykkelse af EHV-1 gpl3 i vacciniavirus-vektorer er den åbne læseramme for EHV-1 gpl3 samt yderligere 5’- og 3'-sekvenser vist i fig. 2. I fig. 2 er en formodet TATA-box og aminosyrer omfattende formodede signaler og membran-fasthæftningselementer understreget. Det potentielle skæ-35 ringssted i signalsekvensen er fremhævet med en pil efter skæringssignalet ASA (åbne cirkler). Potentielt forekommer der ni N-koblede glycosyleringssteder inden 29 DK 176464 B1 for signal- og fasthæftningssekvenserne, som det er angivet ved Asn-X-Ser/Thr-mønsteret (stjerner).
Indsættelse af EHV-1 qpl3-qenet i et vacciniavirus-donor-5 plasmid. En tidlig/sen vacciniavirus-promoter, H6, er blevet brugt til udtrykkelse af fremmede gener i fjerkræ-poxvirus-vektorer (41,42). Dette promoterelement svarer til DNA-sekvensen beliggende umiddelbart opstrøms for den åbne H6 læseramme i vaccinia HindIII-H fragment (31).
10
Der henvises nu til fig. 3. For at mutere og indsætte H6-promoteren i pSD467VC blev oligonukleotiderne H6SYN oligo A-D syntetiseret. Sekvensen af H6SYN oligo A-D, med modificeret base understreget og restriktionssteder som 15 angivet, er som følger:
Bglll
5'-GATCTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTT 3' -AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAA
20
GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA
cacaatttaactttcgctctttattagtatttaataaagtaatagcgctataggcaatt gtttgtatcgtaccc-3' 25 CAAACATAGCATGGG-5’
Smal
De understregede baser angiver modifikation i forhold til den native H6-promotersekvens.
30
Den 130 bp dobbeltstrengede DNA af fuld længde, dannet ved annellering af H6SYN oligoerne A-D, blev oprenset ved elektroeluering fra en agarosegel og ligeret til 0,5 kb Smal/Hindlll- og 3,1 kb BgllI/HindIII-fragmenter afledt 35 fra pSD467VC. Det resulterende plasmid, pTP15 (184) har ATG-initieringscodonen modificeret til CCC som en del af
Smal-stedet, der umiddelbart efterfølges af et Fstl-sted.
30 DK 176464 B1
En Nsil-linker, 5’-TGCATGCATGCA-3', (New England Biolabs,
Beverly, MA) blev indsat i Smal-stedet i pTP15 til dannelse af plasmidet pNSI.
5 Et EHV-2 EcoRI/Narl fragment, hvori EcoRI-stedet er 120 bp opstrøms for ATG-initieringscodonen, og hvori Narl-stedet er 23 bp opstrøms for EHV-1 gpl3's TAG-termine-ringscodon, blev indsat i fag M13mpl9 til dannelse af den rekombinante fag M13EcoRNar.. Ved brug af oligonukleotid-10 rettet mutagenese (17) blev et Nsil-sted indført ved at ændre sekvensen TTGCCT (baserne 130-135 i fig. 2) i EHV-1 gpl3-genet til ATGCAT. EcoRi/Narl-fragmentet fra mutantfag Ml3EcoRNar blev indsat i pUC8 i EcoRI/Narl-steder til dannelse af plasmid pNSIEN, 15
Der blev syntetiseret to 42-mer oligonukleotider med følgende sekvens og med restriktionssteder som angivet:
Narl gpl3 3'-ende Ndel 20 5'-CGCCGTACAAGAAGTCTGACTTTTAGATTTTTATCTGCAGCA-3' 3’ -GGCATGTTCTTCAGACTGAAAATCTAAAAATAGACGTCGTAT-5’
PstI
I dette oligonukleotid efterfølges termineringscodonen 25 (TAG) umiddelbart af en vaccinia-tidlig-transkriptions-terminator (ATTTTTAT). Det dobbeltstrengede DNA-fragment, der opnås ved at annelere de to 42-merer, indeholder en Narl-kohæsiv ende efterfulgt af 3'-enden af kodningssekvensen for EHV-1 gpl3-genet såvel som et vaccinia-30 tidligt-transkriptionssignal (45), et Pstl-sted og en
Ndel-kohæsiv ende. Dette fragment blev indsat mellem Narl/Ndel-stederne i pNSIEN til dannelse af pNSXENPN (fig. 3).
35 Nsil/Pstl-fragmentet fra pNSIENPN blev isoleret og indsat i Nsil/Pstl-stederne i plasmid pNSI til dannelse af plasmid pVHA6gl3Nsil (fig. 3)- pVHA6gl3NsiI blev skåret i 31 DK 176464 B1
EcoRV-stedet i H6-promoteren og i Nsil-stedet, der var blev indført tæt ved begyndelsen af EHV-1 gpl3-genet.
Dette vektorfragment blev gjort stump-endet med mung-bønnenuklease- Der blev syntetiseret to komplementære 32-5 mer oligonukleotider med følgende sekvens og med restriktionssteder som angivet:
EcoRV
5'-ATCCGTTÅAGTTTGTÅTCGTAATGTGGTTGCC-3' 10 3’-TAGGCAATTCAAACATAGCATTACACCAACGG-5' H6-promoter gpl3 5'-ende
Disse oligonukleotider blev anneleret og ligeret ind i pVHA6gl3NsiI-vektorfragmentet til dannelse af plasmid 15 pVHA6gl3, der indeholder en nøjagtig forbindelse i ATG-initieringscodonen (understreget i 32-mer-sekvensen) af H6-promoteren og EHV-1 gpl3-genet (fig. 3).
pVHA6gl3 blev transficeret ind i celler inficeret med 20 vP425 til dannelse af vaccinia-rekombinant vP483 inde holdende EHV-1 gpl3-genet (fig. 3).
Konstruktion af vacciniavirus-rekombinanter.
25 Procedurer til transfektion af rekombinante donorplasmi- der i vævskulturceller inficeret med en hjælpervaccinia-virus og identifikation af rekombinanter ved in situ hybridisering på nitrocellulosefiltre var som tidligere beskrevet (25,28). Til konstruktion af vP425, hvor E.
30 coli Ø-galactosidasegenet erstatter vaccinia HA-kodnings-sekvenserne, blev plasmid D (25 ug pSD466VCBGA i HeBS (16)) elektroperforeret (BioRad Gene Pulser, kapacitet 960, 200 volt) ind i VERO-celler. Subkonfluente monolag af celler blev inficeret med 10 pfu/celle med vP410 en 35 time før brug. De inficerede celler blev høstet med trypsin og vasket med HeBS før elektroperforering.
Cellerne blev inkuberet i MEM + 5% føtal bovint serum ved 32 DK 176464 B1 37 °C i 24 timer, høstet, og afkom af virus blev udpladet på VERO-monolag. Rekombinant virus, der udtrykker 0-galactosidase, blev påvist som blå plaques i nærvær af X-gal-substrat (9,24). Til dannelse af rekombinant 5 vacciniavirus, hvor EHV-1 gpl3-genet erstattede Ø-galac-tosidase-genet i vP425, fulgte man en lignende fremgangsmåde med undtagelse af, at donorplasmidet var pVHA6gl3, og hjælpervirus var vP425. Vaccinia-rekombinan-ten vP483 indeholdende EHV-1 gpl3 blev påvist som en 10 farveløs plaque i nærvær af X-gal og bekræftet som værende en sand rekombinant ved DNA-hybridisering efter 3 plaque-oprensningscykler.
Udtrykkelse af EHV-1 gpl3-qenet på overfladen af celler 15 inficeret med det rekombinante vacciniavirus vP483. BSC- 40-celler blev podet på 22 mm dækglas i 35 mm petriskåle 5 med 5 x 10 celler/skal. Ved ca. 80% konf luens blev cellerne inficeret ved 2 pfu/celle. Efter en adsorptionsperiode på 1 time blev virusinokulum fjernet, og der 20 tilsattes MEM + 2% føtal bovint serum. 20 timer efter infektionen blev dækglassene vasket med phosphatpufret saltopløsning (PBS) indeholdende 0,2% BSA og 0,1% NaN^ (PBS+) og udsat for 0,1 ml anti-gpl3 monoklonalt antistof, 14H7, (3) fortyndet 1 til 1000 i PBS+. Efter 1 25 time i et fugtighedskammer ved stuetemperatur blev cellerne vasket 3 gange i PBS+. Denne procedure blev gentaget med fluorescein-isothiocyanat-konjugeret gede-anti-muse-IgG. Til slut blev cellerne fixeret i 20 minutter i 2% paraformaldehyd i PBS. Dækglassene blev anbragt i 80% 30 glycerol i PBS indeholdende 3% n-propylgallat, og fluorescens observeredes i et mikroskop.
Det ud fra DNA-sekvensen beregnede protein har de typiske egenskaber, der karakteriserer et glycoprotein, der spæn-35 der over membranen (14). Ved en produktiv EHV-l-infektion inkorporeres dette gpl3-glycoprotein i cellens forskellige membransystemer og transporteres ind i cytoplasma- 33 DK 176464 B1 membranen og kan påvises på den eksterne overflade af den inficerede celle. EHV-1 gpl3 er yderligere en komponent af EHV-1-virionet. Man udførte derfor immunfluorescens-undersøgelser til bestemmelse af, om EHV-1 gpl3 udtrykt 5 af vacciniavirus-rekombinanten vP483 på lignende måde blev præsenteret på cytoplasmamembranen af inficerede celler. Specifikt anti-gpl3 monoklonalt antistof efterfulgt af fluorescein-konjugeret gede-anti-muse-IgG udviste en stærk membranimmunfluorescens i celler inficeret 10 med vP483, men ikke i celler inficeret med vacciniavirus vP410. Dette tyder på, at EHV-1 gpl3 udtrykt af det re-kombinante vacciniavirus vP483 præsenteres på cytoplasmamembranen, som det forventes ved autentisk syntese af et glycoprotein, der spænder over membranen.
15
Immunpræcipitation af EHV-1 qp!3-produkter syntetiseret fra celler inficeret med rekombinant vacciniavirus vP483.
To millioner celler, der udgjorde et konfluent monolag i en 60 mm petriskål, blev inficeret med 10 pfu/celle.
20 Inokulationen blev udført i methioninfrit medium. Efter adsorptionsperioden fjernedes inokulumet, og der tilsattes 2 ml methioninfrit medium indeholdende 20 uCi/ml 35 S-methionin. Infektionen fik lov at fortsætte i 24 timer, efter hvilket tidspunkt cellerne lyseredes ved 25 tilsætning af 1 ml 3x Buffer A indeholdende 3% NP-40, 30 niM Tris pH 7,4, 450 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,03% natriumazid og 0,6 mg/ml PMSF. De lyserede celler og supernatanten blev høstet, hvirvelstrømsblandet og klaret ved centrifugering ved 10.000xg i 15 minutter.
30
Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, katalog nr. 17.0780.01) blev fremstillet som en 1:1 opslæmning i lx Buffer A. Et rotte-anti-muse-konjugat (Boehringer Mannheim, katalog nr. 605 500) blev fortyndet til 1:100 i 35 opslæmningen og bundet til kuglerne ved stuetemperatur i 4 timer og holdt i bevægelse. Kuglerne blev derpå vasket grundigt med 6 en ml vaskninger i Buffer A til fjernelse 34 DK 176464 B1 af ubundet konjugat. Et monoklonalt antistof specifikt for gpl3 blev derpå bundet til kuglerne ved stuetemperatur i 4 timer. Overskydende antistof blev fjernet ved grundig vask. En ml klaret lysat af inficerede celler 5 blev for-klaret ved inkubation med protein A-Sepharose- kugler, hvortil var bundet normalt museserum. Disse kugler blev fjernet ved centrifugering. En ml af det klarede for-klarede lysat blev derpå blandet med 100 ul af kuglerne, hvortil det specifikke monoklonale antistof 10 var bundet. Denne blanding blev holdt i bevægelse ved stuetemperatur i 4 timer. Kuglerne blev derpå fjernet ved centrifugering og vasket grundigt med 4 gange vask i lx Buffer A og 2 gange vask i 10 mM Tris pH 7,4 indeholdende 0,2M LiCl og 2M urinstof. Antistof-antigen-komplekset 15 blev derpå fjernet fra kuglerne og sprængt ved tilsætning af 50 ii 1 2x Laemmli Disrupting Solution (60,195). Herefter blev prøven kogt i 5 minutter før elektroforese.
Der kan påvises to produkter på ca. 44 og 47 kDa, der er 20 noget mindre end det beregnede primære translations produkt (51 kDa), og et større produkt på ca. 90 kDa, der passer med en fuldt glycosyleret form af EHV-1 gpl3-genproduktet. Der udfældedes ingen ækvivalente poly-peptider fra vacciniavirus-inficerede kontrolceller.
25 EKSEMPEL 2 - Konstruktion af vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker herpesvirus equi gpl4-qlyco-proteinet 30 Udskiftning af M2L-genet i vacciniavirus med E. coli &-galactosidase-genet. Med henblik på at indsætte EHV-1 gpl4-kodningssekvenserne i en vacciniavirus-vektor konstrueredes et rekombinant vacciniavirus, vP458, der udtrykker LacZ-genet fra E. coli. Substitution af LacZ-35 kodningssekvenserne i det rekombinante virus, vP458, med sekvenser, der koder for EHV-1 gpl4, giver et blåt til farveløst plaque screeningsystem til identificering af 35 DK 176464 B1 rekombinante viruser indeholdende EHV-1 gpl4 (9,24) i nærvær af X-gal, et chromogent Ø-galactosidasesubstrat. Endvidere blev der, med det formål at konstruere vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker både EHV-1 5 gpl4 og EHV-1 gpl3, i M2L-locuset af Hindlll fremstillet et indsaettelseslocus for EHV-1 gpl4 helt anerledes end det hæmagglutinin-deleterede locus anvendt til indsæts teisen af EHV-1 gpl3 i eksempel 1. Den fulde kodningssekvens for M2L-genet i vaccinia Hindlll M-fragmentet 10 blev elimineret og erstattet med E. coli LacZ-genet, der koder for Ø-galactosidase. Trinene til konstruktion af vP458 er skematisk vist i fig. 4.
Der henvises nu til fig 4. En åben læseramme med læse-15 retning fra højre til venstre i forhold til vaccinia-genomet og som koder for et formodet protein på 220 aminosyrer, er beliggende helt inden for Hindlll M-fragmentet fra Copenhagen-stammen af vacciniavirus til venstre for det unikke Bglll-sted. Ifølge praksis (31) 20 blev dette gen, der er beliggende umiddelbart til højre for MIL (58) betegnet M2L. Deletionsundersøgelser rettet mod vaccinia (WR) genomet, der er beliggende i retning mod venstre fra det unikke Bglll-sted i Hindlll M-fragmentet (57), indikerer, at vaccinia-kodnings-25 sekvenser indeholdt i Hindlll M til venstre for Bglll- stedet ikke er essentielle for replikation af virus i vævskultur.
For at gøre det lettere at bruge M2L-området som et ind-30 sættelseslocus for fremmede gener, blev der skabt en plasmidvektor, pMP409DVC, hvori hele M2L-kodningssekven-sen blev erstattet med et Bglll-sted på følgende måde. pSD409VC, der består af Copenhagen vaccinia Hindlll M-fragmentet indsat i Hindlll stedet af pUC8, blev nedbrudt 35 med BamHI/BgIII og selvligeret, hvorved den højre ende af Hindlll M blev fjernet og Bglll-stedet ødelagt. Det herved fremkomne plasmid, pMP409BVC, blev lineariseret med 36 DK 176464 B1
Sphl, der skærer inden for den åbne M2L læseramme, og blev underkastet nedbrydning med Bal31-exonuklease i 2 minutter. Der blev udført mutagenese på det resulterende DNA (19) ved anvendelse af en syntetisk 49-mer 5 ( 5'-TTTCTGTÅTATTTGCÅACAATTTAGATCTTÅCTCAAAÅTATGTAACAÅT-3';
Bglll-stedet understreget). I det mutageniserede plasmid, pMP409DVC, er M2L-kodningssekvenserne blevet deleteret fra position +3 til og med enden af den åbne læseramme. G i Initieringscodonen ATG blev ændret til et C for at 10 danne et unikt Bglll-sted (AGATCT) i deletionsforbindel sen.
Et 3,2 kb Bglll/BamHI partielt fragment indeholdende 3,1 kb af E. coli Ø-galactosidase-genet mellem BamHI-stederne 15 i pMC1871 (34) under transkriptionel kontrol af 0,1 kb vaccinia 11 kDa sen promoteren (7) blev indsat i det unikke Bglll-sted i pMP409DVC. Et rekombinant plasmid indeholdende 11 kDa promoter/Ø-galactosidase-genkassetten i retning fra højre mod venstre i forhold til flankerende 20 vaciniaarme og -genom blev betegnet pMP409DVCBG.
pMP409DVCBG blev anvendt som donorplasmid til rekombination med hjælper-vacciniavirus, vP4lO, beskrevet i eksempel 1. De hidtil ukendte vacciniarekombinanter, betegnet vP458, der udtrykker Ø-galactosidase-genet indsat 25 i M2L-deletionslocuset, blev påvist ved anvendelse af det chromogene x-gal-substrat (9,24) og oprenset ved gentagen plaque-kloning.
Kloning af EHV-1 gp!4-genet. Der henvises til fig. 5.
30 EHV-1 gpl4-kodningssekvensen spænder over forbindelsen mellem BamHI-restriktionsfragmenterne a og i (3). EHV-1 DMA-fragmenterne BamHI-a (21,3 kb) og BamHI-i (7,1 kb) (59) blev isoleret fra agarosegeler. Plasmid pUC (BamHI-i) blev konstrueret ved at indsætte EHV-1 BamHI-i-frag-35 mentet i BamHI-stedet i plasmid pUC8. EHV-1 BamHI-a-frag-mentet blev nedbrudt med EcoRI og ligeret ind i pUC8 nedbrudt med EcoRI/BamHI. Plasmid pUC (BamHI-a/EcoRI) inde- 37 DK 176464 B1 holder en 10 kb EHV-1 BamHI/EcoRI-indsættelse. Baseret på de rapporterede bestemmelser af fragmentstørrelse (59), er DNA-sekvenser i denne indsættelse kontinuerlige med DNA-sekvenserne fra BamHI-i-fragmentet i EHV-l-genomet.
5
Nukleotidsekvensanalyse. Der opnåedes nukleotidsekvens-analyse ved brug af forskellige subkloner fra plasmiderne pUC-(BamHI-a/EcoRI) og pUC-(BamHI-i). Sekventering af plasmidet pUC-(BamHI-a/EcoRI) påbegyndtes i BamHI-stedet, 10 fordi EHV-1 gpl4-genet spænder over BamHI-a/i-forbindel-sen (3), Orienteringen af pUC-(BamHI-i)-plasmidet blev bestemt ved restriktionsenzymnedbrydning. Da EHV-1 BamHI-terminusen nærmest EcoRI-stedet i pUC-(BamHl-i) fandtes at være BamHI-stedet i BamHI-a/i-forbindelsen, på- 15 begyndtes sekventering af fragmenteret fra denne BamHl-ende.
Sekvensdata for begge strenge blev opnået som beskrevet i eksempel 1. Nukleotidsekvensen for 3351 bp fragmentet 20 indeholdende EHV-1 gpl4-kodningsekvensen er vist i fig.
6. Nummereringen i venstre og højre margener henviser til henholdsvis aminosyre- og nukleinsyresekvenserne. De formodede CAT- og TATA-boxe er understreget. Aminosyrer i signalområdet og området, der spænder over membranen, er 25 også understreget, idet pilen angiver et potentielt signalpeptid-skæringssted. De 13 potentielle glycosyle-ringssteder med den fælles sekvens (Asn-x-Ser/Thr) er angivet med en stjerne.
30 DNA-sekvensanalyse viste en åben læseramme spændende fra nukleotidpositionerne 300 til 3239, der læses fra venstre mod højre i forhold til EHV-l-genomet, d.v.s. ATG-start-codonen var indeholdt i BamHl-a/EcoRI-fragmentet, og stopcodonen TAA var indeholdt i BamHI-i-fragmentet 35 (3,59).
38 DK 176464 B1
Formodede transkriptionelle reguleringssignaler fandtes i området beliggende i 5'-retningen fra ATG-initieringscodonen i position 300. En TATA-box med sekvensen AAATATAT (nukleotideme 148 til 155) var beliggende 70 nukleotider nedstrøms for en formodet CAT-box i position 71 til 77 med se-5 kvensen GGTCAAT. Et polyadenyleringssignal AATAAA {nukleotideme 3251 til 3256) var beliggende 8 nukleotider nedstrøms for TAA-termineringscodonen (nukleotideme 3240 til 3242). 9 ud af 11 nukleotider i sekvensen 5'-TCCTGCGCGCA-3' (nukleotideme 218 til 228) er komplementære til den 18S ribosomale RNA-sekvens 3'-AGGAAGGCGU-5’ (61) og fun-10 gerer måske som ribosombindingsstedet.
Analyse af EHV-1 qp14-strukturen. Den til EHV-1 gp14 hørende åbne læseramme koder for 980 aminosyrer med en beregnet molekylmasse på 109,8 kDa. Analyse af aminosyresekvensen afslørede et antal egenskaber, der er 15 fælles for membranbundne glycoproteiner. Et område spændende fra amino-syrerne 58 til 99 havde en karakteristisk hydrofob sammensætning og antages at være signalsekvensen (fig. 6). En usædvanlig egenskab ved EHV-1 gp14-genproduktet er, at der forud for den lange hydrofobe signalsekvens er en lang hydrofil sekvens. Denne egenskab er også blevet bemærket for 20 pseudorabies virus (PRV) Gll-genet (62) og for bovint herpesvirus 1 (BHV-1) gl-genet (63), der begge også er HSV gB homologe. Et hydrofobt område bestående af 45 aminosyrer (aminosyreme 826 til 870) antages at fungere som et transmembranelt forankringsdomæne. Det hydrofile cytoplasmiske domæne indeholder 110 aminosyrer.
25
Der er 11 Asn-X-Thr/Ser-steder (hvor X kan være enhver aminosyre med undtagelse af prolin) for potentiel N-koblet glycosylering (64). En usædvand-lig egenskab er, at der også er to potentielle glycosyleringssteder i det cytoplasmiske domæne (fig. 6).
30 39 DK 176464 B1 I fig. 7 er vist et hydrofili-diagram for EHV-1 gpl4-kodningssekvensen. Hydropati-indexet for EHV-1 gpl4 er udregnet ved metoden ifølge Kyte og Doolittle (65), med et vindue på 7 aminosyrer og ingen udjævning. Punkter 5 beliggende under den horisontale linje repræsenterer områder med højere hydrofobicitet og angiver derfor potentielle signalområder og/eller områder, der spænder over membranen. De karakteristiske egenskaber for et glycoprotein, der spænder over membranen, deriblandt 10 signal- og forankringselementer og det lange hydrofile område forud for signalsekvensen, ses i kodningssekvensen for EHV-1 gpl4.
Lokalisering af den antigene determinant, der genkendes 15 af anti-EHV-1 gp!4 monoklonalt antistof 3F6. λ-gtll-udtrykkelsesvektorer og monoklonale antistoffer har været nyttige til identificering af de EHV-1 DNA-sekvenser, der koder for de vigtigste EHV-1 glycoproteiner (3). En λ-gtll rekombinant, 4al, vistes at udtrykke en EHV-1 gpl4-20 epitop, der genkendes af det specifikke monoklonale antistof 3F6 (3). For at bestemme identiteten af denne epitop blev det i 4al indeholdte EHV-1 DNA sekventeret og sammenlignet med DNA-sekvensen for EHV-1 gpl4-kodnings-sekvensen (fig. 6). Til sekvensbestemmelse af DNA-frag-25 mentet svarende til EHV-1 gpl4-epitopen i λ-gtll-rekombi-nanten 4al, og som genkendes af anti-EHV-1 gpl4 monoklonalt 3F6 (3), blev 4al nedbrudt med EcoRI, EHV-1- fragmentet isoleret på agarosegeler og ligeret ind i EcoRI-stedet i pUC8. DNA-sekventering blev udført som 30 beskrevet ovenfor med de universelle M13 forward- og revers-primere.
Sammenholdning af nukleotidsekvenser indikerede, at denne epitop var indeholdt i området på 66 aminosyrer svarende 35 til 107 (Thr) til og med 172 (Val) i det deducerede primære translationsprodukt. Epitopen er derfor beliggende inden for det aminoterminale område af det deducerede a 40 DK 176464 B1 EHV-1 gpl4-overfladedomæne.
Sammenligning af EHV-1 gpl4-aminosyresekvensen med andre herpesvirus-glycoproteiner. Sammenligning af aminosyre-5 sammensætningen for EHV-1 gpl4-genet med glycoproteiner fra andre herpesviruser udviste stor homologi. Således er EHV-1 gpl4 homologt med GI I fra PRV (62), GI fra BHV-1 (63), GII fra varicella-zoster virus (VZV) (66), gB fra herpes simplex virus (HSV) (67,71,72), såvel som med 10 glycoproteiner i Epstein-Barr virus (EBV) og human cytomegalovirus (HCMV) (10).
Oligonukleotid-rettet mutagenese af EHV-1 gpl4-kodnings-sekvensens 5 *-terminus. Der henvises igen til fig. 5.
15 Plasmid Blue (KpnI/BamHI) blev dannet ved at indsætte et KpnI/BamHI-fragment fra pUC (BamHI-a/EcoRI) i plasmid Bluescript SK+ skåret med KpnI/BamHI. Oligonukleotid-rettet mutagenese blev foretaget ved en modifikation af proceduren ifølge Kunkel (17), idet der anvendtes uracil-20 holdige DNA-skabeloner fra plasmid Blue (KpnI/BamHI) dannet i dut ung værten E. coli stamme CJ236. I det mutageniserede plasmid blev dannet et NSil-sted i codon 1 og 2 i EHV-1 gpl4-genet, hvilket ændrede sekvensen ATG/TCC (Met/Ser) til ATG/CAT (Met/His). Den muterede 25 sekvens blev verificeret ved DNA-sekvensanalyse.
KpnI/BamHI-fragmentet fra mutanten blev overført til KpnI/BamHI-nedbrudt pUC18 til dannelse af plasmidet pUC (KpnI/BamHI) i EcoRI/BamHI-nedbrudt pUC (KpnI/BamHI).
30 Et plasmid, pUCgl4, indeholdende det komplette EHV-1 gpl4-gen med Nsil-sted-mutationen blev konstrueret ved at indsætte EcoRI/BamHI-fragmenet fra pUC (KpnI/BamHI) i EcoRI/BamHI-nedbrudt pUC (BamHl/Pstl), en 3,9 kb subklon af pUC (BamHI-i).
Konstruktion af kimærisk donorplasmid pVN2LH6g!4. pMP409DVC blev skåret med Bglll og ligeret med syntetisk 35 41 DK 176464 B1 dobbeltstrenge-t DNA indeholdende den i eksempel 1 beskrevne modificerede vaccinia H6 (tidlig/sen) promoter flankeret af restriktionssteder. Restriktionssteder for Nsil, SacI, PstI og EcoRI blev dannet umiddelbart ned-5 strøms for den endogene initierinscodon i H6-promotoren.
I pMGll er polylinker-sekvensen nedstrøms for H6-promotoren ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. Det unikke NsiI-sted indeholdende H6-initieringscodonen (understreget) efterfølges umiddelbart af unikke SacI-, 10 PstI- og EcoRI-steder.
EcoRI/Nsil-DNA-fragmentet fra pUCgl4 indeholdende EHV-1-DNA-området opstrøms fra EHV-1 gpl4-initieringscodonen blev erstattet med EcoRl/Nsil-fragmentet fra plasmid 15 pMGll, hvorved dannedes plasmid pMRHgl4, der indeholder den højre arm af vaccinia Hindlll M, H6-promoteren og den fulde længde af EHV-1 gpl4-genet. Hpal/PstI-fragmentet fra plasmid pMRHgl4 indeholdende EHV-1 gpl4 blev overført til vektorplasmidet pMGll skåret med Hpal/PstI, hvorved 20 dannedes plasmid pVM2LH6gl4. pVM2LH6gl4 indeholder den fulde EHV-1 gpl4-kodningssekvens (med codon 2 ændret fra TCC (Ser) til CAT (His) som angivet, og ca. 1,2 kb EHV1-DNA nedstrøms fra EHV-1 gpl4-genet) under kontrol af H6-promoteren indsat i en orientering fra højre til venstre 25 med hensyn til flankerende vaccinia-sekvenser i forhold til vacciniagenomet, hvorved indsættelsen af EHV-1 gpl4-genet målrettes til M2L-locuset.
Der blev udført rekombination ved brug af vP458 som 30 hjælpervirus og pVM2LH6hl4 som donorplasmid. Farveløse plaques blev udtaget og analyseret for tilstedeværelse af EHV-1 gpl4-kodningssekvenser under anvendelse af en 32 specifik EHV-1 gpl4-sonde mærket med P. Efter gentagen plaque-kloning blev vaccinia-rekombinanten betegnet 35 vP577.
42 DK 176464 B1
Afkortning af de hydrofile EHV-1 gp!4-ledersekvenser.
Under anvendelse af variationer af de ovenfor beskrevne mutagenese- og gensplejsningsmanipulationer konstrueredes kimærisk donorplasmid pVM2LH6gl4-l. Til dannelse af 5 pVM2LH6gl4-l, der indeholder en deletion af codonerne 2 til og med 34 af EHV-1 gpl4 med substitution af 4 codoner, udførtes in vitro mutagenese (17) på plasmid Blue (Kpnl/BamHI), hvorved dannedes et Nsil-sted i codonerne 32 til og med 34 i stedet for codonerne 1 og 2.
Ί0 NsiI/BamHI-fragmentet fra det nyligt mutageniserede Blue (Kpnl/BamHI) plasmid blev substitueret for Nsil/BamHI-fragmentet i pVM2LH6gl4. Multiple Nsil-linkere (New England Biolabs, Beverly, MA) blev ligeret ind i Nsilstedet for at bringe det initiale ATG i ramme med resten 15 af EHV-1 gpl4-kodningssekvensen. Det endelige plasmid, pVM2LH6gl4-l, indeholder sekvensen ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT_____ der koder for
Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala...., hvor GCT (Ala) er codon 35 i EHV-1 gpl4. Resten af pVM2LH6gl4-l er identisk med 20 pVM2LH6gl4.
Vaccinia-rekombinant vP613 blev opnået ved rekombination med hjælpervirus vP458 og donorplasmid pVM2LH6gl4-l.
25 30 35 43 DK 176464 B1 EKSEMPEL 3 - Konstruktion af vacciniavirus-rekombinanter vP633 og vP634, der udtrykker både herpesvirus equi-glycoproteinerne gp!3 og gp!4 5 Med henblik på at konstruere vaccinia-rekombinanter, der udtrykker både EHV-l-glycoproteinerne gpl3 og gpl4, udførtes rekombination med enten vP577 eller vP613 som hjælpervirus og donorplasmidet pVHA6gl3 (beskrevet i eksempel 1), der indholder EHV-l gpl3-genet under kontrol 10 af vaccinia H6-promoteren indsat i HA-deletionslocuset i vaccinia. Indsættelse af EHV-l gpl3-sekvenserne i rekombinante viruser blev identificeret ved in situ DNA-hybridisering (25,28). Rekombination af pVHA6gl3 med vacciniavirus-rekombinant vP577 (indeholdende EHV-l gpl4 15 i fuld længde) førte til den dobbelte vacciniavirus-rekombinant vP633; rekombination med vP613 (indeholdende afkortet EHV-l gpl4) førte til den dobbelte vaccinia-rekombinant vP634. Vacciniavirus-dobbeltrekombinanterne, vP633 og vP634, blev plaque-klonet, og tilstedeværelsen 20 af både EHV-l gpl3- og gpl4-kodningssekvenserne bekræftedes ved DNA-hybridiseringsanalyse og ved udtrykkelses-assays (se nedenfor).
Immunpræcipitation af EHV-l qpl3- og gpl4-glycoproteiner- 25 ne udtrykt i vacciniavirus-rekombinanter. For at bedømme EHV-l gpl3- og gpl4-glycoproteinerne udtrykt af vacciniavirus-rekombinanter, blev VERO-celler inficeret med rekombinanterne, og proteinerne blev metabolisk 35 mærket med S-methionin og immunpræcipiteret som 30 beskrevet i eksempel 1. Det specifikke monoklonale antistof mod EHV-l gpl3 (14H7) eller mod EHV-l gpl4 (3F6) (3) blev bundet i en fortynding på 1:1000 i 4 timer ved stuetemperatur. Prøver blev analyseret ved SDS polyacrylamid-gel-elektroforese på en 10% polymergel ved 30 mA (kon-35 stant strøm) i ca. 6 timer. Der fremstilledes autoradio-grammer.
44 DK 176464 B1
Ingen signifikante produkter blev immunpræcipiteret med det specifikke anti-EHV-1 gpl3 monoklonale antistof, 14H7, (3) eller med det specifikke anti-EHV-1 gpl4 monoklonale antistof, 3F6, (3) hverken fra uinficerede 5 VERO-celler eller VERO-celler inficeret med kontrol-hæm-agglutinin-minus vacciniavirus, vP452 (184). Radioaktivt mærkede EHV-1 gpl3-produkter blev præcipiteret af monoklonalt antistof 14H7 fra VERO-celler inficeret med vP483, en vaccinia-rekombinant, der kun udtrykker EHV-1 10 gpl3, eller vacciniavirus-dobbeltrekombinanterne, der både udtrykker både EHV-1 gpl3 sammen med enten intakt gpl4, vP633, eller med afkortet gpl4, vP634. Der kan påvises to produkter på ca. 44 og 47 kDa, der er noget mindre end det primære translationsprodukt (51 kDa), og 15 et større produkt på ca. 90 kDa, der stemmer overens med en fuldt glycosyleret form af EHV-1 gpl3-genproduktet.
Det er signifikant, at kvaliteten og kvantiteten af udtrykkeisen af EHV-1 gpl3 er upåvirket ved koekspression med begge former af EHV-1 gpl4 i vaccinia- 20 dobbeltrekombinanterne vP633 og vP634.
VERO-celler blev inficeret med henholdsvis vP633, vP634, vP613 og vP577 og immunpræcipiteret med det specifikke anti-EHV-1 gpl4 monoklonale antistof 3F6 (3). Med vP633 25 (indeholdende gpl4 af fuld længde plus gpl3) og med vP577 (indeholdende gpl4 af fuld længde) sås kraftige bånd ved ca. 34, 47, 60-64 og 90 kDa, hvorimod der med vP634 (indeholdende afkortet gpl4 plus gpl3) og med vP613 (indeholdende afkortet gpl4) sås kraftige bånd ved 34, 30 47, 57, 72-82 og 116 kDa. Igen observeredes der ingen signifikante forskelle i syntesen af nogen af EHV-1 gpl4-formerne under koekspression med EHV-1 gpl3.
Immunfluorescensanalyse af EHV-1 qp!3- og gp!4-produkter 35 syntetiseret_af_rekombinante_vaccini aviruser.
Immunfluorescens af VERO-celler inficeret med rekombinant vacciniavirus blev foretaget som beskrevet i eksempel 1, 45 DK 176464 B1 idet der anvendtes monoklonale antistoffer mod enten EHV-1 gpl3 eller gpl4.
EHV-1 gpl3 påvistes nemt på overfladen af VERO-celler in-5 ficeret med vaccinia-rekombinanter vP483, vP633 og vP634, såvel som indvendigt efter fixering med acetone. Der sås ingen signifikant immunoreaktivitet, hverken indvendig eller på overfladen, over for gpl3-specifikt antistof i celler inficeret med vP410, vP577 eller vP613. Udtryk- 10 kelse af EHV-1 gpl4 var let påviselig i acetonefixerede VERO-celler inficeret med vaccinia-rekombinanterne vP577, vP613, vP633 og vP634. Der sås ingen signifikant ind vendig immunfluorescens over for gpl4-specifikt antistof i celler inficeret med vP410 eller vP483. Ved brug af 15 gpl4-specifikt monoklonalt antistof 3F6 observeredes en svag overflade-immunfluorescens i celler inficeret med vP613 eller vP634, der udtrykker den afkortede form af EHV-1 gpl4, og der opnåedes ikke signifikant større overfladerespons end for kontrolviruserne vP4lO og vP483 20 med rekombinante vacciniaviruser vP577 og vP633, der udtrykker EHV-1 gpl4-genet i fuld længde (se også eksempel 8).
EKSEMPEL 4 - Immunisering af marsvin med vaccinia-rekom-25 binanten vP483
Med henblik på at bestemme immunogeniteten af herpesvirus equi genproduktet gpl3 udtrykt af vaccinia-rekombinanten vP483 blev marsvin inokuleret med viruset, og der blev 30 udført assay for tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer i serum mod såvel vacciniavirus som herpesvirus equi.
Femten marsvin med en vægt på ca. 450 g blev opdelt i 35 grupper på fem hver. En gruppe blev indgivet 1 ml af
Q
vaccinia-rekombinanten (10 TCID^Q/ml) på dag 0 efterfulgt af en 1 ml booster-injektion på dag 21 ved subcutan 46 DK 176464 B1 inokulation. Den anden gruppe fik lignende inokulationer,
O
men med vaccinia vP452 (10 TCID,_Q/ml). Den tredie gruppe blev ikke vaccineret. Der blev udtaget blodprøver af alle marsvinene før den primære vaccination og på dagene 21 og 5 35. Der blev fremstillet sera, og man testede for til stedeværelsen af neutraliserende antistoffer mod såvel vaccinia som EHV-1 (Kentucky-stammen) ved anvendelse af 50 TCIDj-q virus prøvet ved assay på testikelceller fra svin.
10
Som vist i tabel 1 udløser EHV-1 gpl3 vaccinia-rekombinanten vP483 en evident serokonversion i marsvin. Serumneutraliserende titere opnået med vacciniavirus er vist i parentes i tabel 1. Såvel vaccinia- som EHV-1-15 neutraliserende antistoffer kan påvises 21 dage efter den primære inokulation, og en signifikant forøgelse i titeren af serumneutraliserende antistoffer opnås 2 uger efter en anden inokulation med virus på dag 21, Det skal bemærkes, at de vaccinianeutraliserende titere i serum 20 opnået i marsvin inokuleret med det rekombinante virus, der udtrykker EHV-1 gpl3, er signifikant højere (t=7,2) end titerne opnået fra marsvin inokulert med vacciniavirus vP452.
25 30 35 47 DK 176464 B1
Tabel 1. Serumneutraliserende antistoffer -e marsvin inokuleret med enten ez rekombinant, der udtrykker EHV-1 gp-kontrol vacciniavirus, vP452 5 -
Inokulum Dyr Serumneutraliserende tit virus nr. på dagene 0_ 21
Uvaccinerede 26 0,24 (0,35) 10 kontroller 27 0,24 (0,35) 28 0,24 (0,35) 29 0,24 (0,35) 30 0,24 (0,35) 15 Kontrol 191 0,24 (0,35) 0,36 (0,47) vaccinia- 192 0,24 (0,35) 0,21 (0,93) virus 193 0,24 (0,35) 0,48 (0,58) VP452 194 0,24 (0,35) 0,24 (0,82) 195 0,24 (0,35) 20 ----------------------------------------------
Rekombinant 186 0,24 (0,35) 0,48 (1,28) vaccinia- 187 0,24 (0,35) 0,72 (1,63) virus 188 0,24 (0,35) 0,24 (1,52) vF483 189 0,24 (0,35) 0,36 (1,40) 25 190 0,24 (0,35) 0,48 (1,63) 30 35 I __ 48 DK 176464 B1 , , EKSEMPEL 5 - Immunisering af marsvin med vaccinia-rekombinanterne vP577 og vP613
Marsvin blev immuniseret; for at bedømme deres respons mod 5 EHV-1 gpl4 udtrykt af vaccinia-rekombinanterne vP577 og vP613. Marsvin med en vægt på ca. 450 g blev subcutant indgivet 10^ TCID^ af enten vacciniarekombinant vP577 eller vP613, 1 ml på hver af dagene 0 og 21. Marsvinene fik udtaget blodprøver på dagene 0, 21 og 35, sera blev 10 fremstillet og prøvet ved assay for EHV-1 antistoffer.
Neutralisationstests blev udført på testikelceller fra svin over for 50 TCID^q EHV-1 virus, Kentucky-stammen. Vaccinia-antistoffer blev titreret ved ELISA under anvendelse af et anti-IgG (H&L) peroxidasekonjugat-15
Resultaterne er vist i tabel 2. Der opnåedes ingen EHV-1-neutraliserende aktivitet i serum i marsvin immuniseret med vaccinia-rekombinanten vP577, der indeholder EHV-1 gpl4-genet i fuld længde (data ikke vist). På den anden 20 side inducerede marsvin inokuleret med det rekombinante vacciniavirus vP613, der udtrykker et afkortet EHV-1 gpl4-gen, lignende niveauer af EHV-1-neutraliserende antistoffer i serum (Tabel 2), som det var tilfældet for vaccinia-rekombinanten vP483, der udtrykker EHV-1 gpl3 25 (tabel 1). Skønt EHV-l-neutraliserende serum-antistoffer kan påvises tre uger efter den primære vaccination, observeres der et mere signifikant niveau to uger efter den sekundære immunisering (tabel 2). Ved ELISA-prøvning af vaccinia-antistoffer opnåedes respons i alle immunise-30 rede dyr.
35 49 DK 176464 B1
Tabel 2. Neutraliserende antistoffer i serum i marsvin inokuleret med en vaccinia-rekombinant, der udtrykker EHV-1 gpl4 5 Neutraliserende titer i serum (log^) på dagene
Inokulum-virus 0__ 21 35
Rekombinant 0,4 0,7 1,3 10 vaccinia virus 0,2 0,7 1,2 vP613 0,2 0,7 1,7 0,2 1,1 1,6 0,2 1,0 1,6 15 Uvaccinerede 0,2 --- 0,4 kontroller 0,6 --- 0,4 0,7 --- 0,8 0,6 --- 0,2 0,4 --- 0,4 20------- 25 30 35 50 DK 176464 B1 EKSEMPEL 6 - Beskyttelse af vaccinerede hamstere mod udsættelse for antigen påvirkning med EHV-1
Med henblik på at vurdere virkningsgraden af vaccinia-5 rekombinanten vP483, der udtrykker EHV-1 gpl3, blev hamstere indgivet enten en primær eller en primær plus en booster vaccination, og de blev, sammen med en u-inokuleret kontrolgruppe eller en gruppe inokuleret to gange med en kontrol vacciniavirus, vP452, udsat for 10 antigen påvirkning ved intraperitoneal injektion med en hamster-adapteret Kentucky-stamme af EHV-1.
Fyrre guldhamstere (40 dage gamle med en vægt på 55-65 g) blev opdelt i 4 grupper. Gruppe A blev indgivet en 15 enkelt subcutan (1 ml) inokulation af enten 10®, 10® 4 eller 10 TCID^q af vaccinia-rekombinanten vP483, 5 dyr pr. dosis. Gruppe B blev vaccineret med vP483 på dag 0 efterfulgt af en booster-injektion på dag 14. De primære doser og booster-doserne blev indgivet subcutant (1 ml) 8 6 20 til grupper på 5 dyr, idet der anvendtes 10 , 10° eller 4 10 TCID--.. Gruppe C bestod af 5 hamstere og fik 2 DU q subcutane injektioner af vaccinia vP452 (10 TCID^q pr. injektion) på dagene 0 og 14. Fem hamstere i gruppe D fungerede som uvaccinerede kontroller. Alle hamsterne 25 blev intraperitonealt indgivet 200 LD^-q af en hamsteradapteret Kentucky-stamme af EHV-1 14 dage efter den sidste immunisering. De overlevende dyr blev talt 7 dage efter udsættelsen for antigen.
30 Resultaterne er vist i tabel 3. Alle uvaccinerede hamstere og hamstere vaccineret med vaccinia vP452 døde inden for 5 dage efter udsættelsen. Der observeredes signifikante niveauer af beskyttelse mod EHV-l-udsættelse i hamstere vaccineret med vaccinia-rekombinanten vP483, der 35 udtrykker EHV-1 gpl3. Der observeredes ingen signifikante forskelle i beskyttelsesniveauerne hos hamstere immuniseret med enten primære doser eller primære doser plus 51 DK 176464 B1 booster. Den beskyttende dosis (PD^q) var omtrent den samme, PD5q = 6,32 log^Q primær og 6,12 log1Q Primær plus booster. Ikke desto mindre sås der kun 100%
Q
beskyttelse i den gruppe, der fik to doser 10 TCID^q 5 rekombinant virus.
Tabel 3. Beskyttelse af hamstere vaccineret med vaccinia-rekombinanten, der udtrykker EHV-1 10 gpl3, mod udsættelse for antigen påvirkning med EHV-1
Vaccine-virus 15 Rekombinant Kontrol Ingen vaccinia vP483 vaccinia vP452 virus Primær Booster Booster
Dosis anvendt 864 864 8 20 ved vaccinering log10 TCID50
Proportion 412 520 0 0 25 overlevende 555 555 5 5 30 35 52 DK 176464 B1 «
Til bestemmelse af den beskyttende effektivitet af en vacciniavirus-rekombinant, der udtrykker EHV-1 gpl4 alene eller i kombination med EHV-1 gpl3, blev der på vaccinerede hamstere foretaget undersøgelser med antigen ud-5 saattelse. Tyve 1 dag gamle guldhamstere hver med en vægt på ca. 60 g blev inokuleret subcutant med 1 ml kontrol-vacciniavirus eller med de rekombinante vacciniaviruser vP483, vP577, vP6l3, vP633 og vP634, der udtrykker EHV-1 gpl3 og/eller gpl4. Primær vaccination blev efterfulgt af 10 en identisk vaccinedosis (pfu/ml (log^)) på dag 14. Alle hamstere, inklusive ikke-inokulerede kontroller, blev 14 dage efter den sidste immunisering udsat for antigen påvirkning ved en intraperitoneal injektion af 200 ld5q af hamsteradapteret EHV-1, Kentucky-stamme. De over-15 levende fra grupper på fem blev talt 14 dage efter udsættelsen, på hvilket tidspunkt forsøget blev standset. Den dosis inokulum, der giver 50% beskyttelse af hamsterne beregnes som log^Q TCID^/ml inokulant.
20 Som vist i tabel 4 lykkedes det ikke for vacciniavirus-rekombinanten vP577, der udtrykker EHV-1 gpl4-genet i sin fulde længde, at beskytte hamstere mod udsættelse for antigen påvirkning med en PD5Q beregnet ^9,0 iog1Q. På den anden side gav det afkortede EHV-1 gpl4-gen udtrykt 25 af vaccinia-rekombinanten vP613 god beskyttelse ved udsættelse for antigen påvirkning (tabel 4). Den beregnede PDj-q er noget bedre (5,2) end den opnået med vaccinia-rekombinanten vP483, der udtrykker EHV-1 gpl3 (6,1). Den samtidige udtrykkelse af EHV-1 gpl3 og gpl4, uanset om 30 det er gpl4-genet i sin fulde længde eller det afkortede gpl4-gen, i henholdsvis vacciniavirus-rekombinanterne vP633 og vP634, gav overraskende nok signifikant forbedret beskyttende virkning sammenlignet med den virkning, der sås ved enkeltvis udtrykkelse af EHV-l-glyco-35 proteinerne. Således var mængden af virusinokulum til opnåelse af 50% beskyttelse af de vaccinerede hamstere signifikant nedsat, ved koekspression af EHV-1 gpl3 og DK 176464 B1 53 gpl4 i den samme vacciniavirus-rekombinant.
Tabel 4. Beskyttelse af hamstere vaccineret med 5 vaccinia-rekombinanterne, der udtrykker EHV-1 gpl3 og/eller gpl4, mod udsættelse for antigen EHV-1
Inokulum EHV-1- Vaccinedosis/Overlevende PD50 10 proteiner vP483 gpl3 8/5 6/2 4/0 6,1
Ingen --- 0/0 --- --- --- 15--- v577 gpl4 8/5 6/2 4/0 *9,0
Ingen --- 0/0 --- --- --- VP613 gpl4* 8,4/5 6,4/5 4,1/1 5,2 20 vP633 gpl3+gpl4 8/5 6/3 4/4 4,3 VP634 gpl3+gpl4* 7,6/5 5,6/5 3,6/1 *3,6
Vaccinia --- 8/0 --- --- *9,0
Ingen --- 0/1 --- --- --- 25 * vP613 og vP634 udtrykker den afkortede version af EHV-1 gpl4.
30 35 54 DK 176464 B1 EKSEMPEL 7 - Konstruktion af avipoxvirus-rekombinanter, der udtrykker herpesvirus egui qlycoprotei-net gp!3 5 Der henvises til fig. 8. pVHA6gl3 blev anvendt som kilde til EHV-1 gpl3-genet. For at isolere DNA-segmentet indeholdende det fulde EHV-1 gpl3-gen blev pVHA6g!3 nedbrudt med Nrul og Hindlll. Der blev ved denne nedbrydning dannet et fragment på ca. 1,8 kb indeholdende 10 28 bp af 3'-enden af vacciniavirus-H6-promotoren, hele EHV-1 gpl3-genet og ca. 410 bp vacciniavirus-sekvenser. NruI/Hindlll-fragmentet på 1,8 kb blev isoleret for indsættelse i avipoxvirus-indsættelsesvektorerne pFPCV2 og pFPCVl.
15
Fjerkraepoxvirus (FP) indsættelsesvektoren pFPCV2 giver et vehikel til dannelse af rekombinanter indeholdende fremmede gener i et ikke-essentielt område af FP-genomet, der betegnes f7-locuset. pFPCV2 var afledt fra pRW731.13.
20 Plasmidet pRW731.13 indeholder et PvuII-fragment af FP-genomet på ca. 5,5 kb indsat mellem de to PvuII-steder i pUC9. Først blev en multipel kloningssekvens (MCS) ligeret ind i det unikke HincII-indsættelsessted beliggende inden for dette 5,5 kb PvuII FP-genomiske fragment. MCS 25 blev opnået ved annelering af oligonukleotiderne CE4 ( 5 ’ -TCGCGAGAATTCGAGCTCGGTACCGGGGATCCTCTGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGTT-3' ) og CE5 ('5-AACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTAGAGGATCCCCGGTACCGAGCTCGAATCTCGCGA-3'). Plasmidet indeholdende MCS blev betegnet pCEll.
30 pFeLVlA er et derivat af vaccinia-indsættelsesvektor pTPl5 (184) (fig. 3), hvori env-genet fra felint leukæmi-virus (FeLV) (192) indsættes i pstl-stedet nedstrøms for H6-promoteren. For at overføre 2,4 kb udtrykkelses-35 kassetten til en FP-vektor (fig. 8) blev H6/FeLV env-sekvenserne udskåret fra pFeLVlA ved nedbrydning med Bglll og partiel nedbrydning med Pstl. Bglll-stedet er 55 DK 176464 B1 beliggende på H6-promotersekvensens 5'-grænse. Pstl-stedet er beliggende 420 bp nedstrøms for translations-termineringssignalet for FeLV kappeglycoproteinets åbne læseramme.
5 H6/FeLV env-sekvensen på 2,4 kb blev indsat i pCEll nedbrudt med BamHI og Pstl. Dette plasmid blev betegnet pFeLVFl. pFeLVFl-plasmidet blev derpå nedbrudt med pstl for at fjerne FeLv env-sekvenserne. Det herved dannede 10 plasmid indeholdende vacciniavirus H6-promoteren inde i pCEll blev betegnet pFPCVl. Sekvenserne beliggende 5' for promoteren blev mutageniseret (19) til fjernelse af fremmede sekvenser ved anvendelse af oligonukleotidet FPCV1 15 (5'-CAGTAATACACGTTATTGCAGAGAGGACCATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3’) til dannelse af pFPCVl. Området beliggende 3' for promoteren (multipelt kloningssted) blev mutageniseret med oligonukleotid FPCV3 (5'-TAGAGT CGACCTGCAGGCATCCAAGCTTGTTAACGAC-3') til fjer-20 nelse af SphI-stedet, der indeholder en ATG. Det resulterende plasmid blev betegnet pFPCV2.
Det ovenfor definerede 1,8 kb Nrul/Hindlll EHV-1 gpl3-fragment blev indsat i 8,0 kb NruI/Hindlll-fragmentet 25 dannet ved nedbrydning a f pFPCV2. Dette 8,0 kb
Nrul/Hindlll-fragment indeholdt 5'-delen af vacciniavirus H6-promoteren (100 bp), de flankerende FP-sekvenser (4,8 kb opstrøms og 1,5 kb nedstrøms for indsættelsesstedet) og 2,4 kb af pUC (BRL, Bethesda, MD). Ligering af disse 30 to fragmenter resulterede i dannelsen af et 9,8 kb plasmid, der betegnedes pFPEHV13A.
Plasmidet pFPEHV13A blev derpå nedbrudt med Kpnl og Hindlll til fjernelse af et fragment på ca. 600 bp. Dette 35 fragment indeholdt det område af EHV-1 gpl3-genet, der ligger nærmest 3'-enden (200 bp) og vacciniavirus-DNA-segmentet på 410 bp. KpnI/HindlIl-fragmentet på 600 bp 56 DK 176464 B1 blev erstattet med et 200 bp fragment afledt fra pNSIENPN (fig. 3) på følgende måde. Ved nedbrydning af pNSIENPN med PstI blev plasmidet lineariseret, PstI-terminalerne blev gjort stump-endede med T4 DNA-polymerase (New 5 England Biolabs, Beverly, MA) i nærvær af dNTP'er (0,5 mM af hver). Hindlll-linkere (BRL, Bethesda, MD) blev derpå ligeret til det stumpendede fragment. Efter nedbrydning med HindiII blev det lineariserede plasmid nedbrudt med Kpnl til opnåelse af et 200 bp fragment indeholdende 3'-10 delen af EHV-1 gpl3-genet, sekvensen svarende til termineringscodonen (TAG) og TTTTTNT-sekvensmotivet, der vides at være et vacciniavirus tidligt transkriptions-termineringssignal (45). Det rekombinante plasmid blev betegnet pFPEHV13B og blev anvendt i in vitro rekombi-15 nation til indsættelse af det H6-promotede EHV-1 gpl3-gen i f7-locuset af FP-genomet. Det rekombinante fjerkrævirus blev designeret vFP44.
Med henvisning til fig. 9 blev pFPEHVl3B også anvendt til 20 dannelse af et 1,4 kb NruI/HindIII-f ragment til ind sættelse i pCPCVl. pCPCVl-plasmidet indeholder vacciniavirus H6-promoteren i det unikke EcoRi-sted inden for det 3,3 kb PvuII genomfragment fra kanariepox (CP) virus.
Dette indsættelsesplasmid tillader indsættelse af fremme-25 de gener i C3-locuset af CP-genomet. pCPCVl blev afledt fra pRW764.2, der indeholder et 3,3 kb PvuII CP-genomisk fragment indsat i en pUC-vektor. pRW764.2 blev lineariseret ved nedbrydelse med EcoRI. Dette fragment blev gjort stump-endet ved anvendelse af Klenow-fragmen-30 tet af E. coli-polymerase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) i nærvær af dNTP'er (0,5 mM af hver). Vacciniavirus H6-promotersekvenser og et multipelt kloningsområde beliggende 3' for promoteren blev udskåret fra pFPCVl ved nedbrydelse med KpnI/Hpal.
35 Dette 200 bp fragment blev gjort stump-endet med T4 DNA-polymerase i nærvær af dNTP'er (0,5 mM af hver) og indsat i det lineariserede stump-endede plasmid pRW764.2. Det 57 DK 176464 B1 resulterende plasmid blev betegnet pCPCVl. Plasmidet pCPCVl blev nedbrudt med Nrul og Hindlll, og fragmentet på 5,8 kb blev isoleret for ligering til det ovenfor beskrevne 1,4 kb fragment indeholdende EHV-1 gpl3. Det 5 resulterende plasmid blev designeret pCPEHV13A. Dette plasmid blev brugt i in vitro rekombinationsforsøg til indsættelse af det H6-promotede EHV-1 gpl3-gen i C3-locuset af CP-genomet. Det rekombinante kanariepoxvirus betegnedes vCP48.
10
Efter in vitro rekombinationen blev rekombinant avi-poxvirus indeholdende EHV-1 gpl3-genet identificeret ved et standard plaque hybridiseringsassay. Positive plaques blev oprenset ved 3 cykluser af plaque isolering efter-15 fulgt af hybridiseringsanalyser. Rekombinanter blev be tegnet vFP44 og vCP48 for henholdsvis FP- og CP-rekombi-nanter. Begge rekombinanter blev analyseret ved anvendelse af et Protein A-B-galactosidase immunoscreen assay med et monoklonalt antiserum mod EHV-1 gpl3.
20 Resultaterne viste, at CEF- og VERO-cellemonolag inficeret med enten vFP44 eller vCP48 udtrykker EHV-1 gpl3 på overfladen af virusinficerede celler.
EKSEMPEL 8 - Evaluering af yderligere vacciniavirus-25 rekombinanter, der udtrykker umodificerede og modificerede versioner af det gen fra herpesvirus equi-1, der koder for glycoprotein gpl4 30 Konstruktion og evaluering af yderligere rekombinant vacciniavirus, der udtrykker EHV-1 gpl4. Konstruktionerne indeholdende EHV-1 gpl4 (eksempel 2) blev modificeret på tre måder: (a) ved at variere længden af EHV-1 gpl4- ledersekvensen, (b) ved at fjerne overflødigt EHV-1 DNA 35 3' for genet, og (c) ved at indsætte de modificerede versioner af EHV-1 gpl4-genet i et vacciniavirus vP293 værtsområde-selektionssystem (69) med henblik på bestem- 58 DK 176464 B1 melse.
EHV-1 gpl4-genproduktet indeholder en usædvanligt lang ledersekvens. En lang hydrofob sekvens, der strækker sig 5 fra aminosyre 58 til 99, antages at være signalsekvensen.
Forud for dette område er der en lang hydrofil sekvens.
En lignende lang ledersekvens er også set hos to andre gB-homologe, pseurorabies virus gll (62) og bovint herpesvirus-1 gi (63).
10
Modifikation af 5'-enden af EHV-1 gp!4. For at undersøge virkningen af længden af EHV-1 gpl4's ledersekvens på bearbejdning, præsentering og immunologisk effektivitet af gpl4-produktet udtrykt i rekombinant vacciniavirus, blev 15 der, ved modifikation af de tidligere konstruktioner indeholdende EHV-1 gpl4, på følgende måder dannet plas-mider indeholdende EHV-1 gpl4-genet med tre forskellige længder af ledersekvensen, 20 Der henvises nu til fig. 10. Plasmid pVM2LH6gl4 (eksempel 2) indeholder den fulde EHV-1 gpl4-kodningssekvens under kontrol af H6-promoteren indsat i Copenhagen vaccinia M2L-deletionslocuset. I pVM2LH6gl4 er EHV-1 gpl4-genets aminosyre nr. 2 til stede som His i stedet for det native 25 Ser. For at ændre aminosyre 2 til Ser blev pVM2LH6gl4 skåret med Nsil (genkendelsessekvens ATGCAT) i codonerne 1-2 (Met/His). Mutagenese blev udført (19) ved brug af syntetisk oligonukleotid MPSYN240 ( 5 ' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCTGTC 3 ' ) .
30 Det resulterende plasmid, pMF14M, indeholder hele EHV-1 gpl4-genet med den native codon (Ser) i position 2.
Plasmid pVM2LH6gl4-l (eksempel 2) er identisk med pVM2LH6gl4 med undtagelse af en afkortning af leder-35 sekvensen og indførelse af fire codoner afledt fra syntetiske Nsil-linkere. I pVM2LH6gl4-l er sekvensen af den 5' afkortede ende af EHV-1 gpl4-genet 59 DK 176464 B1 ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT----, der koder for
Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala.... , hvor GCT (Ala) er codon 35 i EHV-1 gpl4. pVM2LH6gl4-l blev modificeret ved mutagenese på to måder. For at danne en version af gpl4-genet, der 5 er afkortet i nogenlunde samme grad som pVM2LH6gl4-l, men med større tilnærmelse til den native gpl4-sekvens, blev pVM2LH6gl4-l skåret med Nsil i codonerne 1-2. Mutagenese blev udført ved brug af syntetisk oligonukleotid MPSYN241 10 (5’ ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTGTCCCAGCAGCTGGCTCCTGGATC 3’).
I det resulterende plasmid, pMP14M-34, begynder EHV-1 gpl4-kodningssekvensen med ATG/AGT/GTC/CCA....
Met/Ser/Val/Pro...., hvor CCA (Pro) er aminosyre 36 i EHV-1 gpl4. EHV-1 gpl4-genet indeholder et Nael-sted 15 (GCCGGC) i codonerne 61 - 63 (Lys/Pro/Ala). Til dannelse af en i højere grad afkortet version af EHV-1 gpl4-genet blev pVM2LH6gl4-l lineariseret med Nael efterfulgt af nedbrydning med Nsil og isolering af vektorfragment fra en agarosegel. Mutagenese blev udført ved brug af 20 syntetisk oligonukleotid MPSYN243 (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCATCATCGAGGGTGGGCACAATAGTT 3').
I det resulterende plasmid, pMP14M-63, begynder EHV-1 gpl4-kodningssekvensen med ATG/GCA....Met/Ala..., hvor GCA (Ala) er aminosyre 63 i det native EHV-1 gpl4.
25
Fjernelse af overflødigt EHV-1 DNA. I alle de i det foregående nævnte plasmider indeholdende EHV-1 gpl4 er EHV-1 gpl4-kodningssekvenserne efterfulgt af ca. 1200 bp EHV-1-DNA. Termineringscodonen (TAA) for gpl4-genet fore-30 kommer inden for et Dral-sted (TTTAAA). For at fjerne overflødigt EHV-l-DNA blev pMPl4M-63 underkastet delvis DraI-nedbrydning efterfulgt af isolation af lineært DNA fra en agarosegel og nedbrydning med PstI, der skærer i forbindelsen mellem EHV-l-DNA og den nedstrøms beliggende 35 flankerende vaccinia-arm. Et 6,5 kb Dral/PstI DNA-bånd blev isoleret fra en agarosegel. Syntetiske oligo-nukleotider MPSYN247 (5 ’ AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA 3' ) 60 DK 176464 B1 og MPSYN248 (5' GCTCGAGTTAACAAAAATTT 3') blev anneleret og ligeret med 6,5 kb fragmentet. I det resulterende plasmid, pMP14M-63P, efterfølges EHV-1 gpl4-kodningssekvenserne umiddelbart af en sekvens, der angiver termi-5 nering af tidlig vaccinia-transkription (45) efterfulgt af et polylinkerområde (indeholdende Hpal-, Xhol-, Pstl-restriktionssteder) og den venstre flankerende arm af vaccinia afledt fra Hindlll M.
10 Indsættelse af H6-promoter/EHV-l gp!4-genet i et pHES/vP293 selektionssystem. I alle de i det foregående nævnte plasmider indeholdende EHV-1 gpl4 er EHV-1 gpl4-genet under kontrol af vaccinia H6-promoteren indsat i M2L-deletionslocuset af vacciniavirus Copenhagen-stammen.
15 Da M2L-indsættelseslocuset er beliggende inden for et større område af genomet, der kan deleteres (69), undersøgte man mulighederne for relokalisering af H6-promoter/EHV-1 gpl4-udtrykkelseskassetten til et potentielt mere stabilt indsættelsessted. Som et første trin 20 blev EHV-1 gpl4-genkonstruktioner indeholdende forskel lige længder af ledersekvensen flyttet til det WR pHES/vP293-baserede værtsområde-selektionssystem (69) for at muliggøre hurtig udvikling af vaccinia-rekombinanter med henblik på komparativ evaluering.
25
Plasmid pHES-4 indeholder vaccinia H6-promoteren efterfulgt af et polylinkerområde og KlL-genet for humant værtsområde (70), alt indsat mellem WR vaccinia-arme, der flankerer en 21,7 kb deletion (69). pHES-4 indeholder to 30 Nrul-steder, ét beliggende inden for H6-promoteren og ét inden for flankerende vacciniasekvenser. pHES-4 blev lineariseret ved partiel nedbrydning med Nrul, og båndet indeholdende lineært DNA af fuld længde blev isoleret fra en agarosegel. Dette lineære DNA blev skåret i Xhol-35 stedet i polylinkerområdet. pMP14M-63P indeholder to Nrul-steder, det ene inden for H6-promoteren og det andet inden for EHV-1 gpl4-kodningssekvensen, 0,2 kb fra genets 61 DK 176464 B1 3'-ende. pMP14M-63P blev gjort lineært med Nrul efterfulgt af nedbrydning med Xhol. Et 2,8 kb Nrul(partiel)/Xhol-fragment blev isoleret fra en agarose-gel. Dette fragment indeholder en del af H6-promoteren 5 efterfulgt af den form af det modificerede EHV-1 gpl4-gen, der indeholder den korteste version af ledersekvensen. Fragmentet på 2,8 kb indeholdende H6-promoter/EHV-1 gpl4 afledt fra pMPl4-63P blev ligeret med Nrul(partiel)/Xhol-vektorfragmentet afledt fra pHES-4.
10 Det resulterende plasmid, pHES-MP63, indeholder H6-promoter/EHV-1 gpl4-genkassetten uden overflødigt EHV-1-DNA. For at overføre 5'-enderne af H6-promoter/EHV-l gpl4 indeholdende ledersekvenser i fuld længde eller moderat afkortet, blev plasmiderne pMPl4M og pMP14M-34 skåret med 15 Nrul, og båndene på henholdsvis 2,8 kb og 2,7 kb isoleret fra agarosegeler. pHES-MP63 blev underkastet partiel NruX-nedbrydning og et fragment på 7,2 kb isoleret fra en agarosegel. Vektorfragmentet på 7,2 kb svarer til pHES-MP63, hvorfra Nrul-fragmentet på 2,6 kb indeholdende 5'-20 enden af H6-promoter/EHV-l gpl4 er fjernet. Nrul (partiel) vektorfragmentet afledt fra pHES-MP63 blev ligeret med 2,8 kb Nrul-fragmentet fra pMP14M, hvorved dannedes pHES-MPl. Nrul (partiel) vektorfragmentet på 7,2 kb afledt fra pHES-MP63 blev også ligeret med 2,7 kb 25 Nrul-fragmentet fra pMPl4M-34, hvorved dannedes pHES- MP34. Gensplejsningstrinene, der fører til dannelse af plasmiderne pHES-MP63, pHES-MPl og pHES-MP34 er vist skematisk i fig. 10.
30 Plasmiderne pHES-MPl, pHES-MP34 og pHES-MP63 blev brugt som donorplasmider til rekombination med vP293 (69), hvorved dannedes henholdsvis rekombinant vacciniavirus vP753, vP765 og vP721. Rekombinant afkom blev selekteret på humane MRC-5 celler.
35 62 DK 176464 B1
Evaluering af vP293-baserede vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker EHV-1 gp!4-genet. Til bestemmelse af, om de tre former af EHV-1 gpl4-genproduktet udtrykt i rekom-binant vacciniavirus vP753, vP765 og vP721 var til stede 5 på overfladen af inficerede celler, blev monolag af VERO-celler inficeret med de tre rekombinante vacciniaviruser indeholdende EHV-1 gpl4. Monolag af inficerede celler blev analyseret for overfladeimmunfluorescens ved brug af det EHV-1 gpl4-specifikke monoklonale antistof 3F6. Over-10 fladeimmunfluorescens var positiv for celler inficeret med alle tre vacciniavirus-rekombinanter, vP753, vP765 og vP721. Dette tyder på, at korrekt bevægelse af EHV-1 gpl4-genproduktet i vaccinia-inficerede celler ikke påvirkes af varierende længde af ledersekvensen.
15
For at sammenligne EHV-1 gpl4-genprodukterne udtrykt af de tre vacciniavirus-rekombinanter indeholdende EHV-1 gpl4 blev MRC-5-celler inficeret med vP753, vP765 og 35 vP721, og proteiner blev metabolisk mærket med S- 20 methionin. Immunpræcipitationer blev udført med de radio aktivt mærkede cellelysater ved brug af EHV-1 gpl4-specifikt monoklonalt antistof 3F6.
Immunpræcipiterede proteiner fra celler inficeret med 25 vP753, vP765 og vP721 kan ikke skelnes fra hinanden og er ækvivalente med proteinerne immunpræcipiteret fra vP613, den EHV-1 gpl4-indeholdende vaccinia-rekombinant dannet ud fra plasmid pVM2LH6gl4-l. Disse resultater tyder på, at de variationer i længden af EHV-1 gpl4-ledersekvensen, 30 der er afprøvet i disse rekombinanter, hverken fremmer eller indvirker på korrekt bearbejdning af genproduktet.
For at bestemme den beskyttende effekt af rekombinant vacciniavirus, der udtrykker de forskellige former af 35 EHV-1 gpl4, blev hamstere inokuleret med varierende doser af vP753, vP765 og vP721 og udsat for antigen påvirkning med hamster-adapteret EHV-1, Kentucky stammen. Alle tre 63 DK 176464 B1 vaccinia-rekombinanter indeholdende EHV-1 gp!4 virker beskyttende, med en log^Q PD^-q på 6,2 eller bedre- Forskelle i beskyttelse blandt de tre vacciniavirus-rekombi-nanter er ikke statistisk signifikante.
5 I modsætning til vP577 udviste en efterfølgende, ligeledes ved rekombination mellem pVM2LH6gl4 og vP458 dannet vacciniavirus-rekombinant, et identisk EHV-1 gpl4-immunpræcipitationsmønster som det, der ses for vP613, 10 vP753, vP765 og vP721, og udtrykte, ligesom disse EHV-1 gpl4-udtrykkende rekombinante vacciniaviruser, EHV-1 gpl4-proteinet på overfladen af inficerede celler.
Ovenstående data tyder på, at det i vacciniavirus-15 rekombinant vP577 udtrykte EHV-1 gpl4 er defekt, og defekten opstod formentlig under rekombinationen mellem donorplasmidet pVM2LH6gl4 og vacciniavirus vP458.
EKSEMPEL 9 - Nukleotidsekvens af tre hidtil ukendte gener 20 fra Herpesvirus equi type 1 og udtrykkelse i vacciniavirus-rekombinanter
For at identificere og isolere det EHV-1-gen, der koder for gpl7/18, før det udtrykkes i en rekombinant vaccinia-25 virus, blev det meste af EHV-l-genomets Ug-område sekven-teret, og de forskellige åbne læserammer, der fandtes på dette DNA-fragment, blev udtrykt. Der blev identificeret og analyseret tre hidtil ukendte EHV-1-gener kodet af S-komponenten: EHV-1 gD, der ved sekventering udviste homo-30 logi med HSV gD- og PRV gp50-genprodukterne, EHV-1 gp63, der udviste homolog! med HSV US7- og PRV gp6 3-genprodukterne, og EHV-1 gE, der udviste homologi med HSV gE- og PRV g I-genprodukterne. Alle tre gener, enten individuelt eller sammen, blev indføjet i et værtsområde-35 selektionssystem af vaccinia Copenhagen-stammen med henblik på hurtige udtrykkelsesundersøgelser. Immuno-fluorescens opnået med et anti-EHV-l-kaninserum afslørede 64 DK 176464 B1 udtrykkeisen af EHV-1-specifikke produkter.
Kloning af EHV-1 BamHI D-fragmentet. Da EHV-1 gpl7/18-genet var beliggende på S-komponenten af EHV-l-genomet 5 (3), blev BamHI D-fragmentet, der udgør det meste af U - området (59), isoleret og indsat. Genomisk DNA fra EHV-1 Kentucky D-stammen blev nedbrudt med BamHI. BamHI D-fragmentet på 11,0 kb blev isoleret fra agarosegel (Geneclean, BiolOl, Inc., La Jolla, CA) og indsat i plas-10 mid pIBl24 som plasmid pEHVBamHlD. Der blev udarbejdet et restriktionskort over dette fragment (fig. 11).
Identifikation af DNA-sekvenser, der koder for EHV-1 gD, gp63 og gE. Nukleotidsekvensdata for begge strenge blev 15 opnået fra adskillige subkloner af BamHI D-fragmentet subklonet i pIBI24 som beskrevet i eksempel 1. Sekvenser af forbindelserne mellem på hinanden følgende fragmenter blev kontrolleret på den initiale klon pEHVBamHlD. Til alle sekvensdata-analyser anvendtes PC/GENE-software 20 package (Intelligenetics Inc., Mountain View, CA).
DNA-sekvensanalyse af EHV-1 gD-, gp63- og gE-generne. DNA-sekvensanalysen af det 6402 bp store område sekven-teret fra BamHI D-fragmentet (der repræsenterer det meste 25 af det unikke korte område) afslørede eksistensen af mindst tre komplette åbne læserammer, alle læst fra samme streng. Denne sekvens er vist i fig. 12 som den i retning mod højre gående 5’ til 3' streng. Basesammensætningen er 50,44% G + C.
30
Den første åbne læseramme (0RF1) strakte sig fra nukleotidposition 971 til 2176. Der fandtes formodede transkriptionelle reguleringssignaler i området 5' for den mest sandsynlige ATG-initieringscodon i position 971.
35 En TATA-box med sekvensen TATATTAA (nukleotiderne 871 til 878) var beliggende 60 nukleotider nedstrøms for en formodet CAT-box i positionerne 811 til 817 med sekvensen 65 DK 176464 B1 TGACAAT. Man fandt ikke noget polyadenyleringssignal (AATAAA) ned-strøms for TAA-termineringscodonen (nukleotiderne 2177 til 2179). Syv ud af ti nukleotider i sekvensen 5’ TCCCTTCGCC 3' (nukleotiderne 890 til 899) er komplementære til 18S ribosom RNA-sekvensen 3' AGGAAGGCGU 5' (61) 5 og kan være ribosombindingsstedet. Der er foreslået en aflæsningsmodel, ved hvilken eukaryot mRNA initierer translation (151). Kardinalreglen ved denne model er, at ribosomer binder til 5'-enden af mRNA og aflæser mRNA-molekylet lineært. Binding til translationsinitieringen er sædvanligvis i den første 5'-proximale ATG-codon, skønt undtagelser herfra er set (152). En pu-10 rin i position -3 er altafgørende for translationsinitiering, og translation stimuleres ved C i positionerne -1 og -2, når resten af sekvensen er suboptimal (155). Sekvenskonteksten rundt om den antagede initieringscodon AG-CATGT (nukleotiderne 968 til 974) kvalificerer som værende en funktionel sekvenskontekst for translationsinitiering af eukaryot mRNA. Der er to andre 15 mulige ATG-initieringscodoner beliggende henholdsvis i positionerne 989 til 991 og 992 til 994. Konteksten af disse codoner, CTTATGATGG, kvalificerer ikke som værende funktionel for translationsinitiering. EHV-1 ORF1 koder for 402 aminosyrer med en beregnet molekylmasse på 45239 dalton.
20 Analyse af EHV-1 ORF1-proteinstrukturen. Analyse af aminosyresekvensen viste et antal egenskaber, der er almene for membranassocierede glycopro-teiner. Et område strækkende sig fra aminosyrerne 1 til 26 havde en karakteristisk hydrofobiprofil og antages at være signalsekvensen. Et hydrofobt område bestående af 24 aminosyrer (aminosyrerne 351 til 374) antages at fun-25 gere som et transmembranelt forankringsdomæne. Der er fire Asn-X-Thr/Ser-steder (hvor X kan være enhver aminosyre med undtagelse af prolin) for potentiel N-koblet glycosylering (157). EHV-1 ORF1 aminosyresekvensens hydrofob) 30 66 DK 176464 B1 profil er vist i fig. 13. De karakteristiske egenskaber for et glycoprotein, der spænder over membranen, herunder signal- og forankringselementer, er klart defineret. De to mest hydrofobe områder ved N-terminalen og nær C-5 terminalen antages at udgøre henholdsvis glycoproteinets signalsekvens og det område, der spænder over membranen.
Sammenligning af EHV-1 0RF1 aminosyresekvensen med andre herpesvirus glycoproteiner. Sammenligning af aminosyre-10 sammensætningen af det formodede EHV-1 ORFl-protein viste signifikant homologi med glycoproteiner fra andre herpes-viruser. Således ligner EHV-1 ORFl-proteinet PRV gp50 (95) og HSV-1 gD (79,160).
15 Den anden åbne læseramme (0RF2) strakte sig fra nukleotidposition 2287 til 3525. Der fandtes ikke nogen formodede transkriptionsregulerende signaler i området 5' for ATG-initieringscodonen i position 2287. Der fandtes ingen AATAAA-polyadenyleringssignaler nedstrøms for TGA-20 termineringscodonen (nukleotiderne 3526 til 3528), men to potentielle YGTGTTYY polyadenyleringsignaler (180) findes nedstrøms for denne termineringscodon ved ca. 40 og 70 bp. Sekvenskonteksten rundt om den antagede initierings-codon GCTATGG stemmer overens med Kozak's love (151,155).
25 Der er mindst to andre mulige ATG-initieringscodoner i positionerne 2305 til 2307 og 2332 til 2334, men sekvenskonteksten for disse to codoner (GGGATGT og TCTATGG) kvalificerer ikke som værende funktionel for translationsinitiering. EHV-1 0RF2 koder for et 413 30 aminosyrer stort polypeptid med en beregnet molekylmasse på 45431 dalton.
Analyse af EHV-1 0RF2-proteinstrukturen. Analyse af aminosyresekvensen viste et antal egenskaber, der er 35 almene for membranassocierede glycoproteiner. Et område strækkende sig fra aminosyrerne 1 til 22 havde en karakteristisk hydrofobiprofil og antages at være signal- 67 DK 176464 B1 sekvensen (skønt computerbedømmelsen for det formodede skæringssted var lav). Et hydrofobt område bestående af 32 aminosyrer (aminosyrerne 315 til 346) antages at fungere som et transmembranelt forankringsdomæne. Der er 5 syv Asn-X-Thr/Ser-steder for' potentiel N-koblet glycosy-lering. Et hydrofobidiagram for EHV-1 0RF2 er vist i fig.
14. De karakteristiske egenskaber for et glycoprotein, der spænder over membranen, herunder signal- og forankringselementer, er klart defineret. De to mest hydro-10 fobe områder i N- og nær C-terminalerne antages at udgøre henholdsvis glycoproteinets signalsekvens og det område, der spænder over membranen.
Sammenligning af EHV-1 0RF2 aminosyresekvensen med andre 15 herpesvirus glycoproteiner. Sammenligning af aminosyre- sammensætningen af EHV-1 0RF2 viste signifikant homologi med glycoproteiner fra andre herpesviruser. Således er EHV-1 0RF2-proteinet homologt med PRV gp63 (80), VZV gpIV (181) og HSV-1 US7 (79), 20
Den tredie åbne læseramme (0RF3) strakte sig fra nukleotidposition 3796 til 5451. Der fandtes formodede transkriptionsregulerende signaler i området 5' for ATG-initieringscododen i position 3796. En TATA-box med 25 sekvensen GTTTAAA (nukleotiderne 3705 til 3711) var beliggende 50 nukleotider nedstrøms for en formodet CAT-box i positionerne 3649 til 3654 med sekvensen GCAATG.
Der var ikke noget tydeligt polyadenyleringssignal nedstrøms for TGA-termineringscodonen (nukleotiderne 5452 30 til 5454). Sekvenskonteksten rundt om den antagede initieringscodon ACAATGG stemmer overens med Kozak's love (151,155). EHV-1 0RF3 koder for et 552 aminosyrer stort polypeptid med en beregnet molekylmasse på 61493 dalton.
35 Analyse af EHV-1 0RF3-proteinstrukturen. Analyse af aminosyresekvensen viste et antal egenskaber, der er almene for membranassocierede glycoproteiner. Et område 68 DK 176464 B1 strækkende sig fra aminosyrerne 1 til 23 havde en karakteristisk hydrofobiprofil og antages at være signalsekvensen. Et hydrofobt område bestående af 38 aminosyrer (aminosyrerne 404 til 437) antages at fungere som et 5 transmembranelt forankringsdomæne. Der er fem Asn-X-
Thr/Ser-steder for potentiel N-koblet glycosylering. Et hydrofobidiagram for EHV-1 0RF3 er vist i fig. 15. De karakteristiske egenskaber for et glycoprotein, der spænder over membranen, herunder signal- og forankrings-10 elementer, er klart defineret. De to mest hydrofobe områder ved N-terminalen og nær C-terminalen antages at udgøre henholdsvis glycoproteinets signalsekvens og det område, der spænder over membranen.
15 Sammenligning af EHV-1 QRF3 aminosyresekvensen med andre herpesvirus glycoproteiner. Sammenligning af aminosyre- sammensætningen af EHV-1 0RF3 viste signifikant homologi med glycoproteiner fra andre herpesviruser. Således er EHV-1 0RF3-proteinet homologt med PRV gpl (80), VZV gE 20 (181) og HSV-1 gE (79).
Konstruktion af et Copenhagen vacciniavirus-baseret værtsområde-selektionssystem. Der blev konstrueret et Copenhagen vacciniavirus-baseret værtsområde-selektions-25 system, i lighed med WR pHES/vP293 værtsområde-selektionssystemet (69).
Copenhagen vacciniavirus-deletionsmutant vP668 deleteres for 12 gener fra HindIII-C til og med HindIII-K området, 30 inclusive begge human-værtsområde-generne KIL (70) og C7L, et gen, der er beliggende i HindIII-C. vP668 kan ikke vokse på humane MRC-5-celler. Medlemmer af COPCS-plasmidserien indeholder C7L-genet inden for flankerende vacciniaarme, hvilket muliggør rekombination med vP668 og 35 gengivelse af virusets evne til at vokse på MRC-5-celler.
Evnen af rekombinant vaccinia-afkom dannet ved rekombination under anvendelse af vP668/COPCS-værtsområde- 69 DK 176464 B1 selektionssystemet til plaquedannelse på humane MRC-5-celler giver en måde til hurtig identifikation af disse rekombinanter. Plasmid pCOPCS657 indeholder den syntetiske H6-vacciniapromoter efterfulgt af et polylinker-5 kloningsområde til indsættelse af fremmede gener. Poly-linkerområdet efterfølges af stopcodoner og et vaccinia-transkriptionstermineringssignal (45).
Indsættelse af EHV-1 gD-genet i pCOPCS657. Idet der nu 10 henvises til fig. 16, blev plasmid pEHVBamHID nedbrudt med Hindlll, og et 1240 bp Hindlll DNA-fragment indeholdende EHV-1 gD blev isoleret fra en agarose gel (Geneclean, BiolO, Inc., La Jolla, CA) og repareret under anvendelse af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase. Det 15 reparerede fragment blev derpå ligeret ind i plasmid pCOPCS657 nedbrudt med Smal. Det resulterende plasmid, pJCA006, har ATG-initieringscodonen ca. 10 bp fra H6-promotoren (fig. 16).
20 Indsættelse af EHV-1 gp63-genet i pCOPCS657. Plasmid pEHVBamHID blev nedbrudt med Hindlll, EcoRI og PvuII, og det 1300 bp store Hindlll-PvuII DNA-fragment indeholdende EHV-1 gp63 blev isoleret fra en agarose gel og repareret med Klenow. Det reparerede fragment blev derpå ligeret 25 ind i plasmid pCOPCS657 nedbrudt med Smal. Det resulterende plasmid med EPH-1 gp63 med den rigtige orientering i forhold til H6-promotoren fik betegnelsen pJCA008 (fig.
16).
30 Indsættelse af EHV-1 gE-genet i pCOPCS657. Plasmid pEHVBamHID blev nedbrudt med Aatll og Apal, og et 2630 bp Aatll-Apall DNA-fragment indeholdende EHV-1 gE blev isoleret fra en agarose gel og repareret med Klenow. Det reparerede fragment blev derpå indsat i plasmid pCOPCS657 35 nedbrudt med Smal. Det resulterende plasmid med EPH-1 gE-genet med den rigtige orientering i forhold til H6-promotoren fik betegnelsen pJCA007 (fig. 16).
70 DK 176464 B1
Indsættelse af EHV-1 qd-gp63-genet i pCOPCS657. Idet der nu henvises til fig. 17, blev plasmid pEHVBamHID nedbrudt med EcoRI og PvuII, og det 1832 bp store EcoRI-PvuII DNA-fragment (A) blev isoleret fra en agarose gel.
5 Plasmid pJCA006 blev nedbrudt med Clal og EcoRI, og det 1450 bp store Clal-EcoRI DNA-fragment (B) blev isoleret fra en agarosegel. Plasmid pCOPCS657 blev nedbrudt med Clal og Smal, og det 3700 bp store Clal-Smal DNA-fragment (C) blev isoleret fra en agarosegel. Fragmenterne A, B og 10 C blev derpå ligeret sammen, og det resulterende plasmid fik betegnelsen pJCA009 (fig. 17).
Indsættelse af EHV-1 gP-gp63-gE-fragmentet i pCOPCS657.
Plasmid pEHVBamHID blev nedbrudt med EcoRI og Sacll, og 15 det 4240 bp store EcoRI-Sad I DNA-fragment (D) blev isoleret fra en agarose gel. Fragment D blev derpå ligeret med fragmenterne B og C (se ovenfor) med tilsætning af dNTPer for at sikre reparation af forbindelsen SacII-Smal. Det resulterende plasmid fik betegnelsen 20 pJCAOlO (fig. 17).
Konstruktion af rekombinante vacciniaviruser vP773, vP803, vP809, vP810 og vP822, der udtrykker de EHV-1 U_ åbne læserammer. Med henblik på hurtigt at kunne 25 kontrollere udtrykkeisen af de ovenfor beskrevne EHV-1 åbne læserammer blev der konstrueret et antal rekombinante vacciniaviruser ved brug af COPCS værtsområdeselektionssystemet. De tre åbne læserammer identificeret ud fra sekvensanalysen blev indsat enten individuelt 30 eller sammen ("dobbelt" og "tredobbelt") i plasmid pCOPCS657 (fig. 16,17). De resulterende plasmider blev derpå anvendt til rekombination med vacciniarekombinant vP668 som hjælpervirus. De forskellige rekombinante vacciniaviruser, der stammer fra disse rekombinationer, 35 er vist i tabel 5.
71 DK 176464 B1
Tabel 5. Betegnelse for vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker EHV-1 gD-, gE- og GP63-generne.
5 Donor- EHV-1- Hjælper- plasmid indsættelse virus Rekombinant PJCA006 gD vP668 vP773 pJCA007 gE vP668 vP803 10 pJCAOOS gp63 vP668 vP822 pJCA009 gD-gp63 vP668 vP809 pJCAOlO gD-gp63-gE vP668 VP810 15 Vacciniarekombinant vP773 blev opnået ved rekombination foretaget med donorplasmid pJCA006 indeholdende EHV-1 gD-genet. Vacciniarekombinant vP822 blev opnået ved rekombination foretaget med donorplasmid pJCA008 indeholdende EHV-1 gp63-genet. Vacciniarekombinant vP803 blev opnået 20 ved rekombination foretaget med donorplasmid pJCA007 indeholdende EHV-1 gE-genet. Vacciniarekombinant vP809 blev opnået ved rekombination foretaget med donorplasmid pJCA009 indeholdende EHV-1 gD-gp63-fragmentet, og vacciniarekombinant vP810 blev opnået ved rekombination 25 foretaget med donorplasmid pJCAOlO indeholdende EHV-1 gD-gp63-gE-fragmentet (tabel 5).
Immunfluorescensanalyse af EHV-1 0RF1 (gD), 0RF2 (gp63) og ORF3 (gE) produkter syntetiseret af enkelt eller mul-30 tipelt rekombinante vacciniaviruser. Immunfluorescens af VERO- og MRC-5-celler inficeret med rekombinant vaccinia-virus blev udført som beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse af anti-EHV-l-specifikt polyklonalt kaninserum R5935 (1:200) (tabel 6).
35 72 DK 176464 B1
Tabel 6. Immunfluorescens af celler inficeret med rekom-binant vacciniavirus, udført ved anvendelse af anti-EHV-l-kaninserum R5935.
5 EHV-1 rekombinant R5935 indvendig overflade gD positiv negativ gp63 positiv negativ 10 gE negativ negativ gD-gp63 positiv negativ gD-gp63-gE positiv negativ 15 EKSEMPEL 10 - Immunologisk evaluering i mus og svin af pseudorabies virus glycoproteinerne gpll, gpIII og gp50/ udtrykt individuelt eller i 20 kombination af vaccinlavirus-rekombinanter- I dette eksempel anvendtes Copenhagen-stammen af vacciniavirus og derivaterne vP410, vP425 og vP458 (184) deraf.
25
Kloning af PRV-generne, der koder for gpll, gpIII og gp50. PRV NIAg-virus (182) blev dyrket på NIL2-celle-kultur (183). Cellulære rester blev fjernet fra super-natanten ved centrifugering ved 3.000xg i 30 min.
30 Virionerne blev oprenset ved centrifugering gennem en 40% (vægt/volumen) saccharosepude ved 40.000 omdr./min i 60 min i en 45 Ti Beckman rotor efterfulgt af en diskontinuerlig 30-50% (vægt/volumen) saccharosegradient (SW25 Beckman rotor ved 23.000 omdr./min i 5 timer).
35 Virionbånd blev opsamlet, fortyndet med TNE-puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 150 mM NaCl og 10 mM EDTA) og pelleteret ved 30.000 omdr./min i 1 time i en SW40 73 DK 176464 B1
Beckman rotor. Den virale pellet blev resuspenderet i TE-puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM EDTA) og lyseret ved tilsætning af natriumdodecylsulfat til en slut-koncentration på 0,5% (vægt/volumen) og proteinase K til 5 100 mg/ml. Efter inkubation ved 37 °C i 2 timer blev lysatet ekstraheret en gang med phenol:chloroform (1:1) og en gang med chloroform:3-methylbutanol (24:1). DNAen blev præcipiteret med ethanol og genopløst i ^0. Efter komplet nedbrydning med BamHI blev fragmenterne indsat i 10 BamHI-stedet i pBR322, der først var behandlet med kalve-tarm-alkalisk phosphatase (CIAP). Ligeringsblandingen blev brugt til transformering af kompetent E. coli stamme NM522 (20).
15 Der henvises nu til fig. 18 og 19. DNA-sekvensen, der koder for gpll-genet befinder sig i BamHI-fragment 1 og
Sall-subfragmenterne 1A og IB af PRV-genomet (62,94).
Plasmidet med betegnelsen pPR9.25 indeholdende PRV BamHI- fragment 1 indsat i BamHI-stedet af pBR322 blev nedbrudt 20 med Ncol. Det resulterende nedbrydningsprodukt blev
fraktioneret på en 0,8% agarosegel, og ved anvendelse af TM
Gene Clean -procedure (BiolOl, Inc., La Jolla, CA) blev et 6,2 kb Ncol DNA-fragment oprenset og bagefter indsat i Ncol-stedet i pBR328 (Boehringer Mannhein Biochemicals, 25 Indianapolis, IN) behandlet med CIAP. Det resulterende plasmid pPR2.15 blev nedbrudt med Sphl og fraktioneret på en agarose gel. Fragmenterne på 2,7 og 1,8 kb blev oprenset og indsat i SphI-stedet i phosphatasebehandlet pUCl8 til dannelse af plasmiderne pPRl og pPR2 (fig. 18) 30 og i M13-fag. Nukleotidsekvens blev bestemt som ovenfor beskrevet. DNA-sekvensanalysen viste en åben læseramme på 2742 bp kodende for 913 amimosyrer. Som forventet observeredes der signifikant aminosyrehomologi med HSV-1 gB (62). For at lette beskrivelsen af de til udtrykkelse 35 af PRV gpll i vacciniavirus-vektorer anvendte gensplejsningsmanipulationer, er DNA-sekvensen for den PRV gp11-åbne-læseramme plus yderligere 5' og 3' ikke- 74 DK 176464 B1 kodende sekvenser vist i fig. 19.
Der henvises nu til fig. 20 og 21. DNA-sekvensen, der koder for PRV glycoprotein gpIII befinder sig i BamHI-5 fragmenterne 2 og 9 af PRV-genomet (96). Plasmidet pPR9.9 indeholdende BamHI-fragment 2 indsat i BamHI-stedet af pBR322 (fig. 20) blev nedbrudt med BamHI og Sphl. Plasmidet pPR7.5 indeholdende BamHI-fragment 9 indsat i BamHI-stedet af pBR322 blev nedbrudt med Ncol og BamHI. Det 10 resulterende DNA fra begge nedbrydninger blev fraktioneret på en agarosegel. Sphl-BamHI-fragmentet på 2,35 kb og Ncol-BamHI-fragmentet på 1,1 kb blev oprenset og ligeret ind i EcoRl-Sphl-stederne af phosphatasebehandlet IBI25 (fig. 20) ved anvendelse af en NcoI-EcoRI phospho-15 ryleret linker MRSYN21/MRSYN22
Ncol EcoRI
MRSYN21 5’ CATGGGTCTGCAGTCG 3' MRSYN22 3' CCAGACGTCAGCTTAA 5’ 20
Der blev isoleret et plasmid betegnet pPR17, der indeholdt et 3450 bp SphI-NcoI-fragment indeholdende det fuldstændige PRV gplll-gen (fig. 20). Nukleotidsekvensen blev opnået ud fra dobbeltstrengede plasmidskabeloner 25 denatureret med alkali og fra enkeltstrengede skabeloner efter indsættelse i M13-fag. DNA-sekvensanalysen viste en åben læseramme på 1440 bp kodende for 479 aminosyrer (fig. 21). Som tidligere rapporteret (96) sås der signifikant homologi med HSV gC.
30
Der henvises nu til fig. 22 og 23. DNA-sekvensen, der koder for PRV glycoprotein gp50 befinder sig i BamHI-fragment 7 af PRV-genomet (95). Plasmidet pPR7.1 (fig.
22) indeholdende PRV BamHI-fragment 7 indsat i BamHI-35 stedet af pBR322 blev nedbrudt med Stul og Ndel og behandlet med mungbønnenuklease. Fragmentet på 1,7 kb blev oprenset fra en agarosegel, indsat i HindI-stedet 75 DK 176464 B1 af phosphatasebehandlet IBI25. Dette plasmid, pPR22, (fig. 22) indeholder hele PRV gp50-genet. Bestemmelse af nukleotidsekvensen viste en 1215 bp åben læseramme kodende for 404 aminosyrer (fig. 23). Som tidligere 5 rapporteret (95) observeredes signifikant homologi med HSV-1 gD.
Indsættelse i vacciniavirus-indsættelsesdonorplasmider af PRV-generne, der koder for gpll, gpIII og qp50. PRV 10 Sphl-Nhel-fragmentet på 1060 bp fra pPRl (fig. 18-1) blev isoleret fra en agarosegel og efter behandling med CIAP under anvendelse af en BamHI-Nhel phosphoryleret linker MRSYN1/MRSYN2 indsat i BamHl-Sphl-stederne i pIBl25 efter behandling med CIAP 15
BamHl Nhel MRSYN1 5' GATCCATT CCATGGT TG 3' MRSYN2 3' GTAAGGTACCAACGATC 5' 20 til dannelse af plasmid pPR6 (fig. 18-1).
pPR6 blev nedbrudt med Hindi 11 og Apal og behandlet med CIAP. Apal-stedet er beliggende 32 bp nedstrøms for ATG-initieringscodonen af PRV gpll (fig. 19). Der opnåedes et 25 dobbeltstrenget DNA-fragment ved at annelere det synte tiske phosphorylerede oligonukleotidpar MRSYN3/MRSYN4.
Dette fragment indeholder DNA, der koder for vaccinia H6-promoteren fra EcoRV-stedet til og med ATG (understreget), umiddelbart efterfulgt af PRV gpll-kodnings-30 sekvenser,
HindlllEcoRV Apal MRSYN3 5' AGCTTGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCC 3' MRSYN4 3’ ACTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 5' 35
Den syntetiske DNA blev ligeret til 3920 bp Hindlll-Apal-fragmentet afledt fra pPR6 til dannelse af plasmid pPR9 76 DK 176464 B1 (fig. 18-1).
Plasmid pPR9 blev nedbrudt med BamHI og Nhel, behandlet med C1AP og ved anvendelse af en phosphoryleret BamHl-5 SphI-linker
Sphl BamHI
MRSYN7 5' CCCAGATCTCCTTG 3' MRSYN8 3' GTACGGGTCTAGAGGAACCTAG 5' 10 ligeret til et 1640 bp Sphl-Nhel-fragment opnået fra pRPl til dannelse af plasmid pPR12 (fig. 18-1, 18-2).
HinclI-Sphl-f ragmentet på 1030 bp fra pPR2 (fig. 18-1) 15 blev isoleret fra en agarosegel og indsat i Hindi-Sphl-stederne i phosphatasebehandlet pUC18. Det resulterende plasmid pPRIO blev nedbrudt med HindiII og Nael og behandlet med CIAP. Nael-stedet er beliggende 44 bp opstrøms for TAG-termineringscodonen (fig. 19). Et dobbelt-20 strenget DNA-fragment opnået ved annelering af det phos-phorylerede syntetiske oligonukleotidpar MRSYN9/MRSYN10
Nael Xmalll Hindlll MRSYN9 5' GGCACTACCAGCGCCTCCAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTGTAGAATTTTTATCGCCCGA 3’ 25 MRSYN10 3 ‘ CCGTGATGGTCGCGGAGCTCTCGCTCCTGGGGCTGCGGGACATCTTAAAAATAGCCGGCTTCGA 5’ blev ligeret til 3720 bp Nael-Hindlll-fragmentet opnået fra pPRIO til dannelse af plasmidet pPRll.
30 De understregede sekvenser svarer til PRV gpll-termine-ringscodonen og til et vaccinia tidlig transkriptions-termineringssignal (45). Sphl-HincII-fragmentet på 770 bp fra pPR2 blev oprenset fra en agarosegel og ved brug af en BamHI-Sphl phosphoryleret linker (MRSYN7/MRSYN8) ind-35 sat i BamHI-HincII-stederne i CIAP-behandlet pPRll til dannelse af pPRl3 (fig. 18-1, 18-2). Plasmid pPR12 ned brudt med EcoRI og Sphl og behandlet med CIAP blev ved 77 DK 176464 B1 brug af en phosphoryleret Hindlll-EcoI-linker (MRSYN19/MRSYN20)
Hindlll EcoRI
5 MRSYN19 5' AGCTTCTGCAGCCATGGCGATCGG 3' MRSYN20 3’ AGACGTCGGTACCGCTAGCCTTAA 5’ ligeret til et 990 bp Hindlll-Sphl isoleret fragment opnået fra pRPl3 til dannelse af plasmid pPR15 (fig. 18-2).
10
Det med Hindlll-EcoRV nedbrudte 2780 bp fragment fra pPR15 blev behandlet med mungbønnenuklease, oprenset fra en agarosegel og indsat i plasmid pTPl5 (184) (fig. 3), der var nedbrudt med Xmalli-EcoRV, behandlet med mung-15 bønnenuklease og CIAP, til dannelse af plasmid pPRl8 (fig. 18-2). I pPR18 kobles PRV gpll med den syntetiske vaccinia H6-promoter i vaccinia-hæmagglutinin-deletions-locuset. Dette plasmid blev transficeret ind i celler inficeret med vacciniavirus til dannelse af vaccinia-20 rekombinanterne vP534, vP644, vP621 og vP692 indeholdende PRV gpll-genet (se nedenfor).
PRV gpIII-genet var blevet manipuleret til at kunne udtrykkes under kontrol af den tidlige vacciniavirus-25 promoter, u, (se nedenfor) beliggende i vaccinia Hindlll B-fragmentet. Ved brug af stedsspecifik mutagenese indførtes et Nsil-sted ved at ændre sekvensen CGC (baserne 192-194) (fig. 21) i PRV gpIII til ATG, og et Xbal-sted blev indført ved at ændre sekvensen GTGACGT til TTCTAGA 30 (baserne 1632-1638) (fig. 21). For at gøre dette blev der ved brug af en hjælpefag R408 (Stratagene, La Jolla, CA) dannet enkeltstrenget DNA fra plasmid pPRl7 (185). Den stedsdirigerede mutagenese blev udført ved anvendelse af to oprensede phosphorylerede syntetiske oligonukleotider 35 MRSYN5 og MRSYN6
Nsil MRSYN5 5’ GCGAGCGAGGCCATGCATCGTGCGAATGGCCCC 3’ 78 DK 176464 B1
Xbal MRSYN6 5' GGGGGGACGCGCGGGTCTAGAAGGCCCCGCCTGGCGG 3' 5 og selektion på E. coli dut ung stamme CJ236 (IBI, New Haven, CT) (17,186).
Ved disse mutationer dannedes plasmid pPR28. Plasmid pPR28 blev nedbrudt med Nsil og Xbal og behandlet med 10 mungbønnenuklease. Et 1440 bp fragment blev oprenset fra en agarosegel og indsat i Bglll-Hpai-stederne af pSD478VC (fig. 20, 24) efter behandling med mungbønnenuklease og C1AP. Plasmid pPR24 blev transficeret ind i celler inficeret med vacciniavirus til dannelse af vacciniavirus-15 rekombinanter vP604, vP644, vP691 og vP692 indeholdende PRV gpIII-genet (se nedenfor).
PRV gp50-genet blev manipuleret til at kunne udtrykkes under kontrol af en tidlig/intermediær vacciniavirus-20 promoter, I3L, (187). Ved brug af stedsspecifik muta- genese indførtes et NsiI-sted ved at ændre sekvensen CCTGCCAGCGC (baserne 177-187) (fig. 23) i PRV gp50 til ATGCATTTAAT, og et Bglll-sted blev indført ved at ændre sekvensen CCTCCGCAGTACCGG i baserne 1404-1418 til 25 ATTTTTTATAGATCT. Der blev brugt tidligere beskrevne mutageneseprocedurer (17,185,186) til at frembringe plasmid pPR29 ud fra pPR22 ved brug af oprensede, phosphory-lerede syntetiske oligonukleotider MRSYN12 og MRSYN13 (fig. 22).
30
Nsil MRSYN12 5' GGTTCCCATACACTCAATGCATTTAATCATGCTGCTCGCAGCGC 3'
Bglll 35 MRSYN13 5' GCAGCCCGGTCCGTAGAATTTTTATAGATCTCGTCGATGATGATGGT 3' 79 DK 176464 B1 pPR29 blev nedbrudt med Nsil, behandlet med mungbønne-nuklease og delvis nedbrudt med Bglll til dannelse af et: 1290 bp fragment. Plasmid pMP13PP (fig. 22, 25) blev nedbrudt med EcoRI, behandlet med mungbønnenuklease og derpå 5 med BamHI til dannelse af et 140 bp fragment indeholdende vaccinia l3L-promoteren. Fragmenterne på 1290 bp og 140 bp blev oprenset fra agarosegeler og ligeret ind i det phosphatasebehandlede Bglll-sted i pMP409DVC (fig. 4, 22). Det resulterende plasmid, pPR26, blev brugt til 10 rekombination til dannelse af vacciniavirus-rekombinan-terne vP591, vP621, vP691 og vP692 indeholdende gp50-genet (se nedenfor).
Konstruktion af vaccinia-rekombinanter, der udtrykker PRV 15 glycoproteinerne gpll, gplll og gp50 individuelt eller i kombination. For at vurdere de tre PRV-glycoproteiners (gpll, gplll og gp50) immunogenicitet og relative kontri-bution ved beskyttelsen af immuniserede dyr mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med PRV, konstruerede 20 man en serie vaccinia-rekombinanter, der udtrykte de tre PRV-glycoproteiner alene eller i kombination.
Under henvisning til fig. 24 konstrueredes rekombinant vacciniavirus, vP533, der udtrykker ft-galactosidase-genet 25 på følgende måde: Som bestemt ved Southern blot analyse (189) indeholder et 1 Kb område i vaccinia-Hind Ill-frag-ment B, der spænder over Sall F/l-forbindelsen i Copenhagen-genomet, DNA-homologi med det hæmoragiske (μ) gen i kokoppevirus (188). μ-genet koder for et poly-30 peptid, der har ligheder med serinproteaseinhibitorer og biologisk er ansvarligt for hæmoragisk kokoppedannelse af virus på chorio-allantoin-membranen. Copenhagen-genomets DNA-sekvens afslørede, at μ-genækvivalenten indeholdt multiple forskydningsmutationer og var biologisk ikke-35 funktionel. Plasmid pSD419VC (184) (fig. 24) indeholder den venstre del af u-området. Plasmid pSD422VC, der indeholder Copenhagen Sall fragment I indsat i pUC8, 80 DK 176464 B1 indeholder den resterende del af μ-området. For at fjerne uønskede vaccinia-sekvenser til venstre blev pSD419VC nedbrudt med Ncol og Smal, gjort stump-endet med Klenow-fragmentet af E. coli polymerase og religeret til 5 dannelse af pSD476VC (fig. 24). Plasmid pSD422VC blev nedbrudt med Hpal og Nrul og et ca. 0,3 kb fragment beliggende umiddelbart til højre for μ-området isoleret fra en agarosegel. Dette fragment blev ligeret ind i pSD476VC skåret med Hindi (der genkender Sall-steder) til dannel-10 se af plasmid pSD477VC. Til udtrykkelse af Ø-galactosi-dase under kontrol af Copenhagen-vaccinia μ-promoter-området blev syntetiske oligonukleotider 22mer/20mer fremstillet. Sekvensen af 22mer/20mer med angivelse af restriktionssteder og ATG-initieringscodon understreget 15 er som følger:
Clal Hpal 22rner 5’ CGATTACTATCAAGGATCCGTT 3’ 20mer 3' TAATGATACTTCCTAGGCAA 5’ 20
Den annelerede 22mer/20mer-blanding blev ligeret ind i pSD477VC nedbrudt med Clal og Hindi, hvilket førte til det hidtil ukendte plasmid pSD479VC (fig. 24). Et 3,1 kb BamHI-fragment indeholdende E. coli fi-galactosidase-25 kodningssekvenserne fra pMC1871 (34) uden initierings- codon og promoter blev ligeret ind i pSD479VC skåret med BamHI. Det resulterende plasmid indeholdende lacZ-genet i korrekt orientering under kontrol af Copenhagen μ-pro- moteren blev betegnet pSD479VCBG. Dette indsættelses-30 donorplasmid blev rekombineret ind i vacciniavirus vP410 (184). På basis af blå plaque-dannelse i nærvær af det chromogene substrat X-gal (9,24), blev et rekombinant vacciniavirus identificeret, plaque-klonet og betegnet vP533 (fig. 24).
35
Til konstruktion af et vektorplasmid for indsættelse af fremmede gener blev syntetiske oligonukleotider 81 DK 176464 B1 42mer/40mer fremstillet.
Clal Bglll SacI Smal Xhol BamHI Hpal 42mer 5' CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGGATCCGTT 3' 5 4Omer 3' TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCCTAGGCAA 5'
Den annelerede 42mer/40mer-blanding blev ligeret ind i pSD477VC nedbrudt med Clal og HincII, hvilket førte til det hidtil ukendte plasmid pSD478VC (fig. 24). Dette 10 plasmid indeholder ca. 0,3 kb vacciniasekvenser på hver side af multikloningområdet, der fuldstændigt erstatter det u-kodende område af Copenhagen-stammen af vaccinia. pSD478VC blev anvendt til dannelse af pPR24 (fig. 20) indeholdende PRV gplll-kodningssekvenser og vaccinia-15 rekombinanterne vP6G4, vP644, vP691 og vP692.
Der henvises nu til fig. 25. Plasmid pMP419 indeholder et 850 bp BamHI-fragment fra vaccinia HindiII-fragment I indeholdende I3L-promoteren indsat i BamHI-stedet i pUC8 20 (fig. 25). l3L-promoterelementet svarer til DNA-sekvenser opstrøms for den I3L åbne læseramme i vaccinia Hindlll-fragment I (187) og er tidligere blevet anvendt til ud-trykkelse af fremmede gener i vacciniavirus-rekombinanter (27,190). pMP419 blev gjort lineært i det unikke Clal-25 sted inden for I3L-kodningssekvenser og underkastet nedbrydning med Bal31 efterfulgt af nedbrydning med EcoRI og gjort stump-endet ved behandling med Klenow-fragmentet af E. coli polymerase. Det resulterende plasmid, pMP419-5, (fig. 25) indeholder I3L-promotersekvenserne opstrøms for 30 nukleotid -8 koblet til et EcoRl-sted. Promoterelementet blev som et EcoRI-Mspl-fragment isoleret fra pMP419-5 og indsat i EcoRI-Clal-nedbrudt pUC13C, et pUC13-derivat indeholdende en Clal-linker i Smal-stedet. Det resulterende plasmid, pMP13PP, (fig. 22, 25) indeholder I3L- 35 promotersekvenserne fra position -126 til og med position -8 efterfulgt af et EcoRI-sted i position -8.
82 DK 176464 B1 PRV gp50 drevet af vaccinia l3L-promoteren blev indsat i M2L-deletionsplasmidvektoren pMP409DVC (fig. 4), hvilket førte til pPR26 (fig. 22). pPR26 blev brugt til dannelse af vaccinia-rekombinanter vP591, vP621 og vP691 og vP692.
5
Isolering af rekombinante vacciniaviruser. Rekombinante vacciniaviruser indeholdende PRV-generne blev identificeret og oprenset som beskrevet ovenfor. Rekombinante vacciniaviruser, der udtrykker de tre PRV-glycoproteiner 10 gpll, gplil og gp50 alene eller i kombination er anført i tabel 7.
Tabel 7. Betegnelse af vacciniavirus-rekorabinanter, der 15 udtrykker PRV glycoproteinerne gpll, gplil og gp50.
Rekombinant Ophav Donorplasmid PRV glycoproteiner 20 VP534 vP425 pPRlS gpll vP59l vP458 pPR26 gp50 VP604 vP533 pPR24 gplil vP621 vP534 pPR26 gpll + gp50 VP644 vP604 pPR18 gpll + gplil 25 vP69l vP604 pPR26 gplil + gp50 vP692 vP644 pPR26 gpll + gplil + gp50 30 In vitro evaluering af PRV-glycoproteinerne udtrykt af vacciniavirus-rekombinanter. PRV-glycoproteinerne gpll, gpllI og gp50 er typiske glycoproteiner forbundet med PRV-inficerede cellers membranstruktur og er endvidere komponenter af viruset. Specifikke anti-gpll-, anti-35 gplil- og anti-gp50-monoklonale antistoffer efterfulgt af fluoresceinkonjugeret gede-anti-muse-IgG gav en stærk immunfluorescens på overfladen af celler inficeret med de 83 DK 176464 B1 rekombinante vacciniaviruser, men ikke celler inficeret med vildtype-vacciniavirus.
In vivo evaluering af det immunogene potentiale af PRV-5 glycoproteinerne gpll, gpIII og gp50 udtrykt af vaccinia-virus-rekombinanter i mus og svin. Med henblik på at bedømme den relative immunogenitet af de tre PRV-glyco-proteiner udtrykt af vacciniavirus-rekombinanter blev mus inokuleret i fodpuden med 50-100 μΐ af forskellige doser 10 af de rekombinante viruser. Fjorten dage efter immuniseringen blev musene udsat for antigen påvirkning med 10 LD^q af den virulente Kojnock-stamme af PRV ved intra-peritoneal indgivning. Ved for-forsøg var alle PRV-glyco-proteinerne vist at være virkningsfulde til beskyttelse 15 af inokulerede mus mod udsættelse for virulent antigen påvirkning. I en mere omfattende forsøgsserie med over 500 mus bedømtes virkningsgraden af vaccinia-rekombinan-ter, der udtrykker PRV-glycoproteiner. Den vaccinedosis, der kan beskytte 50% af musene udsat for antigen påvirk-20 ning (PD,_q) blev beregnet, og resultaterne af disse undersøgelser er vist i tabel 8. Rekombinant vaccinia-virus, der udtrykker PRV-glycoproteinerne gpll, gp50 og gpIII individuelt, fører til beregnede PD5Q-værdier på henholdsvis 6,4, 5,4 og 5,8 (log1Q). Ved udtrykkelse af 25 en kombination af glycoproteinerne er de beregnede PD^q-værdier signifikant bedre. Vaccinia-rekombinanten, der udtrykker PRV gpll + gp50, gav en PD^q-værdi på 3,3, og den vaccinia-rekombinant, der udtrykker PRV gp50 + gpIII, resulterer i en i alt væsentligt lignende PD^Q-værdi 30 (3,6). Rekombinanten, der udtrykker PRV-glycoproteinerne gpll + gpIII, er tilsyneladende mere virkningsfuld, idet der opnås en PD,_q på 1,5.
Koekspression af alle tre PRV-glycoproteiner gpll, gpIII 35 09 gp50 i et rekombinant vacciniavirus giver ikke en signifikant lavere PD^Q-værdi end den opnået med de rekombinante viruser, hvor de tre PRV-glycoproteiner 84 DK 176464 B1 udtrykkes individuelt. Den forstærkede virkningsgrad opnået med vaccinia-rekombinanten, der udtrykker gpll og gpIII, sammenlignet med rekombinant vacciniavirus, der udtrykker generne individuelt, ligner de i eksempel 6 5 rapporterede resultater for koekspression af herpesvirus equi-glycoproteinerne gp!3 og gpl4.
Tabel 8. Potens af vacciniavirus-rekombinanter, der ud-10 trykker pseudorabies glycoproteinerne gp50, gpll og gpIII.
Rekombinant virus PRV gener udtrykt PD^q 15 VP534 gpll 6,4 vP591 gp50 5,4 VP604 gpIII 5,8 vP621 gpll + gp50 3,3 vP644 gpll + gpIII 1,5 20 VP691 gp50 + gpm 3,6 vP692 gp50 + gpll + gpIII 5,1
Skønt mus frembyder et interessant modelsystem til eva-25 luering af PRV-glycoproteinimmunogenitet, er svin den vigtigste målart for en PRV-vaccine. For at vurdere validiteten af fremgangsmåden, der benytter rekombinant vacciniavirus, i svin udførtes derfor følgende forsøg. Smågrise på ca. 25 kg blev inokuleret intramuskulaert med 30 2 ml af de vaccinia-rekombinanter, der udtrykker kombina tioner af PRV-glycoproteinerne gpll, gpIII og gp50. Virusinokulum blev fortyndet i PBS. 35 dage efter denne inokulation blev smågrisene udsat for antigen påvirkning ved en intranasal injektion (1 ml i hvert næsebor) af 35 suspension af et virulent PRV-isolat NIA3. Vaccinationens effektivitet blev bedømt ved at måle komparativ vægtforøgelse for vaccinerede smågrise og for kontrolsmågrise 85 DK 176464 B1 i 7 dage efter den antigene udsættelse. Relativ vægtforøgelse beregnes som den gennemsnitlige daglige procentdel vægtforøgelse observeret i vaccinerede grise minus den gennemsnitlige daglige procentdel vægtforøgelse 5 af uvaccinerede kontrolgrise- Normal vægtforøgelse for grise under uforstyrrede forhold er større end 1,1 kg.
Som vist ved dataene i tabel 9 er vægtudviklingen under 7-dagsperioden efter udsættelse for PRV stærkt forøget i de vaccinerede smågrise i forhold til kontrolgruppen 10 inokuleret med vildtypevirus. En enkelt inokulering med vacciniavirus-rekombinanterne giver signifikant beskyttelse mod vægttab efter udsættelse for virulent PRV.
15 Tabel 9. Evaluering i smågrise af vacciniavirus- rekombinanter, der udtrykker kombinationer af PRV-glycoproteinerne gp50, gpll og gplll.
Inokulum PRV-gener Vaccinerings- Relativ 20 virus udtrykt dosis vægtfor- logiO TCIDj-Q/ml øgelse VP452 gplll 107'7 -0,31 vP621 gpll + gp50 107'7 2,89 25 vP644 gpll + gplll 107'7 2,15 vP691 gp50 + gplll 107'3 1,21 vP692 gp50 + gpll + gplll 107'3 2,67 30 Tilgængeligheden af vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker de 3 dominerende PRV-glycoproteiner individuelt eller i kombination, giver en række fordele ved bekæmpelsen af PRV-infektioner i marken: (a) en signifikant for del er, at de rekombinante vacciniaviruser som vaccinati-35 onsmidler kun udtrykker et begrænset antal PRV-gener, og der derfor ikke er nogen ledsagende risiko for reversion af en attenueret PRV-vaccinestamme til en virulent form.
86 DK 176464 B1 og der derfor ikke sker nogen fortsat indførelse af PRV-virus i miljøet; (b) da kun et begrænset antal PRV-antigener udtrykkes af vacciniavirus-rekombinant-PRV-vaccinekandidaterne, giver dette mulighed for at skelne 5 mellem vaccinerede og naturligt inficerede dyr, da diagnostiske reagenser bestående af andre PRV-antigener kunne samles, så de skelner mellem vaccinerede og naturligt inficerede dyr; og (c) sådanne rekombinante vacciner kunne være nyttige til at afbryde den naturlige vertikale 10 overførelse af PRV fra so til afkom. Dette kunne opnås ved at vaccinere den drægtige so med en vacciniavirus-rekombinant, der udtrykker et begrænset sæt PRV-glyco-proteiner. Maternel immunitet skulle beskytte afkommet mod PRV-infektion. Dernæst kunne afkommet blive vaccine-15 ret med en vacciniavirus-rekombinant, der udtrykker en anden konfiguration af PRV-antigener, forskellige fra dem, der blev anvendt til at vaccinere soen. Dette er én potentiel måde til at bryde gennem maternel immunitet. En anden måde at overvinde problemet med maternel immunitet 20 ville være at udtrykke PRV-glycoproteinerne i hvilken som helst kombination i en fuldstændig heterolog vektor.
Dette opnås ved konstruktion af avipoxvirus-rekombinan-ter, der udtrykker PRV-glycoproteiner. Anvendeligheden af avipoxvirus-rekombinanter, hvis naturlige værtsområde er 25 indskrænket til fuglearter, til vaccination af ikke-fuglearter er blevet vist (41). Der foreligger således to måder at overvinde problemet med barrieren tilvejebragt ved maternel immunitet: (1) vektorerne og (2) konstel lationen af antigenerne udtrykt af disse vektorer.
30 EKSEMPEL 11 - Avipoxvektorer, der udtrykker pseudorabies virus glycoprotein gpll
Kanariepoxvirus blev formeret på primære kyllingeembryon-35 fibroblaster (CEF) fra 10-11 dage gamle embryonerede æg opnået fra SPAFAS, Inc. (Norwich, CT), idet der anvendtes tidligere beskrevne betingelser (41,42). Virus blev 87 DK 176464 B1 oprenset fra værtscellekontaminanter ved saccharose-gradientcentrifugering under anvendelse af metoden be-skrevet af Joklik (191). Celler fra grisenyre (PK-1) blev opnået fra American Type Culture Collection, Rockville, 5 MD (ATCC #CL101).
Konstruktion af en kanariepox-rekombinant, der udtrykker pseudorabiesvirus gpll-glycoproteinet. Der henvises nu til fig. 26. Plasmidet pPR15 (fig. 18) blev brugt som 10 kilde for PRV gpll-genet. Til isolering af DNA-segmentet indeholdende det fulde PRV gpll-gen blev pPR15 nedbrudt med EcoRV og Hindlll, Ved denne nedbrydning blev dannet et fragment på ca. 2,8 kb indeholdende 21 bp af 3'-enden af vacciniavirus (VV) H6-promoteren og det fulde PRV 15 gpll-gen. EcoRV/HindlIl-fragmentet på 2,8 kb blev isoleret til indsættelse i pFPCV2 (fig. 8, 26). EcoRV/Hindlll-fragmentet på 2,8 kb (defineret ovenfor) blev indsat i 8,0 kb pFPCV2-fragmentet afledt ved fuldstændig nedbrydelse med Hindlll og partiel nedbrydelse med EcoRV.
20 Ligering af disse to fragmenter førte til dannelse af et 10,8 kb plasmid betegnet pFPPRVII.
Der henvises nu til fig. 27. Plasmid pFPPRVII blev brugt til at danne et 2,8 kb Nrul/Hindlll-fragment til indsæt-25 telse i pCPCVl (fig. 9). pCPCVl-plasmidet muliggør indsættelse af fremmede gener i C3-locuset af CP-genomet. Plasmidet pCPCVl blev nedbrudt med Nrul og Hindlll, og fragmentet på 5,8 kb blev isoleret for at blive ligeret til det ovenfor definerede 2,8 kb fragment. Det resulte-30 rende plasmid blev betegnet pCPPRVII.
Den dominerende selekterbare markør E. coli xanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (Eco gpt) blev indsat i pCPPRVII til selektering af vækst af CP/PRVgpII-rekombi-35 nanter. Tidligere rapporter har beskrevet brugen af Eco gpt som en selekterbar markør ved dannelsen af pox-virusrekombinanter (193,194). Eco gpt-genet blev opnået 9 88 DK 176464 B1 fra plasmidet pSV2gpt (ATCC #37X45). Bglll/Dral-frag-mentet på 670 bp indeholdende Eco gpt-genet blev isoleret fra dette plasmid og indsat i Bglll/Smal-stedet i pSD486vC. Det resulterende plasmid, pGPT-1, indeholder 5 Eco gpt-genet mellem de flankerende arme af VV μ-genet og under transkriptionel regulering af n-promoteren. Plasmid pSD486VC blev afledt fra pSD478VC (fig. 24) på følgende måde. pSD478VC blev nedbrudt med EcoRI i MCR, udfyldt ved Klenow standard reaktion i nærvær af dNTP (0,5 mM af 10 hver) og religeret til dannelse af pSD478E- VC. Dette plasmid blev nedbrudt med Hpal og BamHI, og annelerede oligonukleotider HEM 5 (5'-GATCCGATTCTAGCT-3') og HEM 6 (5'-AGCTAGAATCG-3') blev indsat til dannelse af pSD486VC.
15 Ved nedbrydning af pGPT-1 med Ncol og EcoRI blev frigivet et 1,0 kb fragment indeholdende Eco gpt genet (670 bp) og VV μ-promoteren (330 bp). Ncol- og Ecol-enderne blev gjort stumpe med Klenow-fragmentet fra E. coli DNA-polymerase i nærvær af 0,5 mM dNTPer. Hindlll-linkere 20 (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) blev sat på det stump-endede fragment. DNAen blev nedbrudt med Hindlll og 1,0 kb fragmentet udvundet fra en agarosegel.
Dette 1,0 kb HindiII-fragment blev derpå indsat i Hindlll-stedet i pCPPRVII. Det resulterende plasmid inde-25 holdende Eco gpt- og PRV gplI-generne koblet til hinanden i en ende-mod-ende-konfiguration blev betegnet pCPPRVII gpt. Dette plasmid blev brugt i in vitro rekombinationsforsøg til indsættelse i C3-locuset af CP-genomet. Selektion af rekombinanter indeholdende Eco gpt-genet blev 30 foretaget i nærvær af 100 tig/ml mycophenolsyre, og de Eco gpt-positive rekombinanter blev bagefter screenet for tilstedeværelse af PRV gpll-genet ved plaque-hybridise-ringsanalyser. Plaques positive for Eco gpt og PRV gpll blev oprenset ved tre plaque-isoleringscykler og rene 35 populationer dyrket til høje titere og betegnet pCP55.
Southern blot analyser bekræftede, at disse to gener rent faktisk var genetisk koblet i disse CP-rekombinanter. CP- 89 DK 176464 B1 rekombinanten blev betegnet vCP55.
Immunfluorescens af vCP55-inficerede celler. Immunfluo-rescensundersøgelser blev udført for at påvise den 5 cellulære beliggenhed af det udtrykte PRV gpll i celler inficeret med vCP55. CEF- eller PK-l-celler blev podet på 22 mm dækglas i 35 mm petriskåle med 5 x 10 celler/skål.
CEP- og PK-l-celler blev inficeret med enten vCP55 eller CP-parenteral-viruset. Infektioner og inkubationer til 10 immunfluorescensassayet blev udført som beskrevet i eksempel 1, idet der blev anvendt monoklonalt antistof 75N10 fortyndet i PBS+ i forholdet 1 til 100.
De inficerede celler blev analyseret for såvel indven-15 digt beliggende udtrykkelse som overfladeudtrykkelse.
Der observeredes ingen signifikant overfladeudtrykkelse af gpll i nogen af de med vCP55 inficerede cellesystemer. Indvendigt beliggende udtrykkelse af gpll-genproduktet sås imidlertid i både CEF- og PK-l-celler inficeret med 20 vCP55. De indvendigt beliggende fluorescenssignaler i begge celletyper blev lokaliseret til granuler i det perinukleære område af de inficerede celler. Disse resultater tyder på, at PRV gpll ud trykt af CP føres til golgikomplekset, men ikke til plasmamembranen. Dette 25 resultat adskiller sig fra resultaterne opnået med gpll udtrykt i vacciniavirus, der blev påvist på overfladen af inficerede celler.
Immunpræcipitation af PRV gpll fra CEP- og PK-1-30 inficerede celler. Udtrykkelse af PRV gpll-genproduktet af vCP55 blev analyseret ved immunpræcipitation fra lysa-ter af inficerede celler. Cellemonolag blev inficeret med 5 PFU/celle. Immunpræcipitationsassay blev udført som beskrevet i eksempel 1 ved brug af monoklonalt antistof 35 75N10.
90 DK 176464 B1
De i størst mængde forekommende polypeptidarter, præcipi-teret med kanin-anti-PRV-serum fra celler inficeret med CEF og PK-1, vandrede med en tilsyneladende molekylmasse på ca. 120 kDa, 67 kDa og 58 kDa. Disse polypeptider re-5 præsenterer henholdsvis prækursoren og proteolytisk nedbrudte former af PRV gpll påvist i PRV-inficerede celler, der er kompleksbundne via disulfidbindinger (86,101, 196). Der observeredes også i mindre mængde forekommende arter med tilsyneladende molekylmasse på ca. 26 kDa, der 10 kan være resultat af yderligere proteolytisk nedbrydning af gpll i disse CR/PRV-rekombinant-inficerede celler. Der præcipiteredes ingen ækvivalente polypeptider fra kontrolceller inficeret med CP-virus og lysater af uinfi-cerede celler.
15
Beskyttelsesundersøgelser. I musesystemet analyserede man vCP55’s evne til at fremkalde et beskyttende immunrespons over for udsættelse for antigen påvirkning med levende PRV. Mus blev inokuleret i fodpuden med 50-100 ul 20 prøver indeholdende forskellige doser af vCP55 som vist i tabel 10. Fjorten dage efter immunisering modtog musene intraperitonealt 16 LD^q af PRV Kojnock-stammen intra-peritonealt. Overlevende mus blev optalt 14 dage efter udsættelsen for antigen påvirkning, på hvilket tidspunkt 25 forsøget blev sluttet. Som vist i tabel 10 beskyttede inokulering af mus med en enkelt dosis på 10°' TCID^q otte ud af ti mus mod en letal antigen påvirkning med PRV. De afprøvede lavere doser af vCP55 gav ingen grad af beskyttelse. Antigen påvirkning med levende PRV dræbte 30 syv ud af otte uvaccinerede mus. Ud fra de i tabel 10 viste resultater blev en PD™ (beskyttende dosis 50%) 6 i 6 beregnet til at være 10 ' for vCP55-rekombinanten.
Virkningsgraden af vCP55 som immuniserende middel over 35 for udsættelse for antigen påvirkning med levende PRV
blev også beregnet i målarten, som er smågrise. Femten smågrise med en vægt på næsten 25 kg blev opdelt i tre 91 DK 176464 B1 grupper. vCP55-gruppen og CP-parental-virus-gruppen modtog hver to intramuskulære inokulationer (2 ml, ækviva-
Q
lent til 2x10 TCID^^) på dagene 0 og 28. Fem smågrise forblev uvaccinerede som kontrol. Alle smågrisene fik 5 intranasalt indgivet den patogene NIA3-stamme af PRV på dag 35. Virkningsgraden blev overvåget ved at sammenligne den vægtmæssige udvikling af vCP55-vaccinerede grise og kontrolgrise i løbet af de 7 dage efter indgivelse af antigen. Vægtudviklingen beregnes som 10 aGMQR værdier (i kg) = middel GMQR % vaccinerede grise - middel GMQR % uvaccinerede grise.
I den uvaccinerede gruppe bukkede alle smågrisene under for den antigene påvirkning med PRV-virus (2 på dag 5, 2 15 på dag 6 og 1 på dag 7). I gruppen inokuleret med vild-typevirus (CP) bukkede 4 ud af 5 smågrise under for den antigene påvirkning (3 på dag 6, 1 på dag 7). Alle smågrisene i gruppen vaccineret med vCP55 overlevede udsættelsen for antigen påvirkning med PRV og trivedes.
20
Hos smågrise inokuleret med vCP55, der udtrykker PRV gpll-glycoprotein, observeredes der signifikante beskyttelsesniveauer over for udsættelse for antigen påvirkning med levende PRV (tabel 11). Dyr vaccineret med 25 vCP55 havde en signifikant netto vægtforøgelse i løbet af forsøgsperioden, hvorimod de to kontrolgrupper havde et signifikant vægttab i løbet af perioden efter PRV-udsættelsen. Endvidere observeredes der ingen dødsfald i gruppen vaccineret med vCP55, mens en dødelighed på 80% 30 til 100% observeredes i kontrolgrupperne efter udsættelsen for levende PRV.
35 92 DK 176464 B1
Tabel 10. Virkningsgraden af vCP55 i mus.
5
Dosis Beskyttelse logl0 TCID50 6,85 8/10 10 4,85 0/10 2,80 0/10 0,85 0/10 15 20 Tabel 11. Beskyttelse af vaccinerede (vCP55) smågrise mod udsættelse for antigen påvirkning med PRV, bestemt ved død og vægtforøgelse.
Behandling Dødelighed Vægtforøgelse 25 ------
Uvaccineret 5/5 -2,12
Vildtype (CP) 4/5 +0,61
Rekombinant (vCP55) 0/5 +2,51 30 35 93 DK 176464 B1 EKSEMPEL 12 - Vaccinia-rekombinairter, der udtrykker PRV gi-glycoproteiner
Copenhagen-stammen af vacciniavirus og rekombinanter af-5 ledt derfra blev anvendt i dette eksempel.
Indsættelse af PRV gi-genet i kanariepox- og vaccinia-virus-donorplasmider. Der henvises nu til fig. 28. Et plasmid, pGPI, indeholdende PRV gi-genet (NlA3-stamme) 10 blev opnået fra Rhone Merieux, Lyon, Frankrig, gi-genet (sekvensreference (80)) blev isoleret fra dette plasmid og indsat nedstrøms for den syntetiske vaccinia H6-promoter (69). Dette blev udført ved indsætning af 2330 bp Xhol-Ncol (partiel) fragmentet af pGPI i 6400 bp Xhol-15 Ncol-fragmentet af pGBC2. (pGBC2 blev dannet ved indsættelse af HSV2 gB-genet i 3200 bp Bglll-fragmentet af pRW764.5. pRW764.5 blev konstrueret ved at indsætte et 0,8 kb PvuII-fragment fra kanariepox-DNA i 2360 bp PvuII-fragmentet af pUC18.) Plasmidet dannet ved denne manipu-20 lation betegnes pPGl2.
H6-promoterens initieringscodon blev derpå bragt på linje med gi-genets initieringscodon. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne PRVL5 5' - 25 ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTC-3' og PRVL6 5'- CTGCGCGGCGCGCAGCAGAAAGGGCCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' i 5900 bp EcoRV-AlwNI (partiel) fragmentet af pPGl2. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pPGl3.
30
Overflødige PRV gi 3'-ikke-kodende sekvenser blev derpå elimineret. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne, PRVL3 5’- CTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGGCCCAACTATGGCGTGAC 35 CGCCAGCCGCCTGTTGAATGCCCGCCCCGCTTAACTGCAGAATTCGGATCCGAGCT- 3' og PRVL4 5'-
CGGATCCGAATTCTGCAGTTAAGCGGGGCGGGCATTCAACAGGCGGCTGGCGGTCAC
94 DK 176464 B1 gccatagttgggcccattcgtcacttccggtttctccggatcgcggaaccagacgt- 3', i 5200 bp Sacl-Aatll (partiel) fragmentet af pPGI3. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pPGl6.
5 Det H6-promotede gi-gen blev derpå indsat i et vacciniavirus-donorplasmid. Dette blev udført ved at indsætte 1750 bp NruI-BamHl-fragmentet af pPGl6 i 5000 bp NruI-BamHI-fragmentet af pBP14. (pBP14 indeholder bovin leukæmivirus gag-genet under kontrol af den syntetiske 10 vaccinia H6-promoter i vaccinia-vektorplasmid pSD494VC. pSD494VC er en subklon af Copenhagen-vacciniavirus HindiII A-fragmentet, hvori kodningssekvensen for vacciniagenet indeholdende homolog! med kopox ATI-genet (210) er udskiftet med et polylinkerområde.) Herved pla-15 ceres det H6-promotede gi-gen mellem vacciniavirus (Copenhagen) sekvenserne, der flankerer ATI-genet. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pPGI7.
Det rekombinante vacciniavirus vP717 blev dannet ved at 20 transficere pFGI7 ind i vP410-inficerede celler.
Konstruktion af vP717. gi-genet fra PRV blev indsat i en vacciniavirus-vektor. Fremgangsmåden anvendt til konstruktion af denne vacciniavirus-rekombinant, vP717, er 25 vist i fig. 28. PRV gi-genet indeholdt i vP717 er indsat mellem vacciniavirus-sekvenserne, der flankerer ATI-genet, og bruger vacciniavirus-tidlig-sen-promoteren, H6 (41,42,69).
30 Immunfluorescens af det PRV-kodede polypeptid på vP717- inficerede celler. I celler inficeret med PRV udtrykkes gi på plasmamembranen. Immunfluorescensanalyser af vP717-inficerede celler med det PRV gi-specifikke monoklonale antistof 42M17 indikerer, at det PRV-kodede polypeptid 35 dannet i disse celler også udtrykkes på plasmamembranen.
95 DK 176464 B1
Evaluering af vP717 i mus. Ved anvendelse af standard procedurer indikerede in vivo evaluering af vP717 i mus nogen beskyttelse mod udsættelse for antigen påvirkning med PRV (tabel 12).
5
Tabel 12. Evaluering i mus af vacciniavirus-rekombinant vP717, der udtrykker PRV gpl.
10 vP717-inokuleringsdosis Overlevelse ved udsæt- logig TCID^q telse for PRV-antigen 7.3 4/10 15 5,3 5/10 3.3 0/10 1.3 2/10 20 EKSEMPEL 13 - Udtrykkelse af herpes simplex virus type 2 glycoproteineme qB, gC og gD i vaccinia-virus -rekombinanter enten individuelt eller i kombinationer 25 HSV2 (stamme G) (American Type Culture Collection,
Bethesda, MD) (ATCC #VR734) anvendt i dette eksempel blev propageret i VERO-celler (ATCC #CCL8l) og oprenset ved centrifugering på en saccharosegradient (197).
30
Indsættelse af HSV2 gB-genet i vacciniavirus-donor-plasmider. Nukleotidsekvensen af HSV2 gB-genet er tidligere blevet offentliggjort (116). Der henvises nu til fig. 29. Et BglII-fragment på 12 kb indeholdende HSV2 gB-35 genet blev isoleret fra HSV2 (stamme G) genomisk DNA og indsat i BamHl-stedet af pUCl9 til dannelse af plasmid pJ4.
96 DK 176464 B1 gB-genet blev derpå indsat mellem flankerende arme af vacciniavxrus (Copenhagen). Dette blev udført ved at indsætte 2700 bp Sstll-Sacl (partiel) fragmentet af pJ4 i Sstll-SacI fragmenterne af pMP409DVC3. (pMP409DVC3 er et 5 derivat af pMP409DVC (184) (fig. 4), hvori Bglll-stedet er udskiftet med et polylinker-område). Herved placeres vB-genet mellem vacciniasekvenserne, der flankerer M2L-genet. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGBl.
10
En termineringscodon i ramme blev derpå føjet til 3'-enden af gB-genet. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne GBL3 5'-CTAATAG-3' og GBL4 5'-GATCCTATTAGAGCT-3' i 6300 bp BamHI-SacI (partiel) 15 fragmentet af pGBl. Plasmidet dannet ved denne manipula tion betegnes pGB2.
H6-promoteren blev derpå indsat opstrøms for gB-genet.
Dette blev udført ved at indsætte 370 bp BgllI-fragmentet 20 af pBLVH14, der indeholder H6-promoteren, i Bglll-stedet af pGB2 (pBLVH14 indeholder det H6-promotede bovine leukæmivirus-kappegen i vaccinia HA-deletionslocuset). Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGB3.
25 H6-promoterens initieringscodon blev derpå bragt på linje med gB-genets initieringscodon. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne GBLl 5'- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGCGGGGGGGGCTTGATTTGCGCGCTGGTCGTG 30 GGGGCGCTGGTGGCCGC-3' og GBL2 5'- GGCCACCAGCGCCCCCACGACCAGCGCGCAAATCAAGCCCCCCCCGCGCATTACGAT ACAAACTTAACGGAT-3' i 6300 bp Sstll-EcoRV (partiel) fragmentet af pGB3. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGB5. I plasmid pGB5 er HSV gB-genet under 35 kontrol af vaccinia H6-promoteren indsat i vaccinia-M2L-deletionslocuset. Da M2L-indsættelseslocuset er beliggende inden for et større område af genomet, der kan 97 DK 176464 B1 deleteres, blev det H6-promotede gB-gen indsat i et andet indsættelsessted i et andet vacciniavirus-donorplasmid.
Dette blev udført ved at indsætte 2800 bp Bglll-BamHI-fragmentet af pGB5 i Bglll-stedet i pSD513VCVQ.
5 (pSD513VCVQ er en subklon af Copenhagen vacciniavirus
HindiII J-fragmentet, hvori kodningssekvensen for thymidinkinase (TK) genet er udskiftet med et poly-linkerområde). Herved placeres det Ηδ-promotede gB-gen mellem vacciniasekvenserne, der flankerer TK-genet. Plas-10 midet dannet ved denne manipulation betegnes pGB6.
Indsættelse af HSV2 gC-genet i vacciniavirus-donorplas-mider. Nukleotidsekvensen for HSV2 gC-genet er tidligere blevet offentliggjort (117). Der henvises nu til fig. 30.
15 Et Sall-fragment på 2900 bp indeholdende HSV2 gC-genet blev isoleret fra HSV2 (stamme G) genomisk DNA og indsat i Sall-stedet af pIBI25 til dannelse af plasmid pGC3.
gC-genet blev derpå indsat mellem flankerende arme af 20 vacciniavirus (Copenhagen). Dette blev udført ved at indsætte 2900 bp Xhol-BamHI-fragmentet fra pGC3 i Xhol-BamHI-stedet i pGC2. pCG2 blev dannet ved at indsætte 370 bp Bglll-fragmentet af pBLVH14 indeholdende vacciniavirus H6-promoteren i Bglll-stedet i pSD486VC. pSD486VC er en 25 subklon af Copenhagen vacciniavirus HindiII B-fragmentet, hvori kodningssekvensen for n-genet er erstattet med et polylinkerområde. Herved placeres gC-genet mellem vacciniavirus-sekvenserne, der flankerer u-genet. Plasmi-det dannet ved denne manipulation betegnes pGC5.
30
Initieringscodonen fra H6-promoteren blev derpå bragt på linje med gC-genets initieringscodon. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne GCL1 5' -ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCCTTGGACGGGTGGGCCTAGCCGTGGGCCTG 35 TG-3' og GCL2 5'- AGGCCCACGGCTAGGCCCACCCGTCCAAGGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' i 5400 bp Nrul-Sfil-fragmentet af pGC5. Plasmidet 98 DK 176464 B1 dannet ved denne manipulation betegnes pGClO.
Overflødig 3'-ikke-kodende sekvens blev derpå elimineret fra pGCIO, Dette blev udført ved at recirkularisere det 5 med E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) behandlede 4900 bp Sall-Smal (partiel) fragment af pGCIO. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGCll.
Derpå blev yderligere 3’-ikke-kodende sekvens elimineret 10 fra pGCll. Dette blev udført ved at indsætte oligo- nukleotidet GCL3 5’-CTAGGGCC-3' i 4900 bp Xbal-Apal (partiel) fragmentet af pGCll. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGC12. I plasmid pGC12 er HSV gC-genet under kontrol af H6-promoteren indsat i μ-dele-15 tionslocuset i vaccinia. Da μ-indsættelseslocuset er beliggende inden for et større område af genomet, der kan deleteres, blev det H6-promotede gC-gen indsat i ATI-indsættelsesstedet i et vacciniavirus-donorplasmid. Dette blev udført ved at indsætte 1550 bp NruI-BamHI-fragmentet 20 af pGC12 i 5000 bp NruI-BamHI-fragmentet i pBP14. Herved placeres det H6-promotede gC-gen mellem vacciniavirus (Copenhagen) sekvenserne, der flankerer ATI-genet. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGC13.
25 Indsættelse af HSV2 gD-genet i vacclniavirus-donorplasmi-der, Nukleotidsekvensen for HSV2 gD-genet er tidligere blevet offentliggjort (118). Der henvises nu til fig. 31.
Et Xbal-fragment på 7,5 kb indeholdende HSV2 gD-genet blev isoleret fra HSV2 (stamme G) genomisk DNA og indsat 30 i Xbal-stedet af plBl25 til dannelse af plasmid pGDl.
gD-genet blev derpå indsat nedstrøms for H6-promoteren og mellem vacciniavirus (Copenhagen) flankerende arme. Dette blev udført ved at indsætte 1500 bp Dral-PstI-fragmentet 35 fra pGDl i Smal-Pstl-stedet i pTP15 (184) (fig. 3).
Herved placeres gD-genet nedstrøms for H6-promoteren og mellem vacciniavirus-sekvenserne, der flankerer HA-genet.
99 DK 176464 B1
Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGD2.
H6-promoterens initieringscodon blev derpå bragt på linje med gD-genets initieringscodon. Dette blev udført ved at 5 indsætte oligonukleotiderne GDL1 5’-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGGCGTTTGACCTCCGG-3' og GDL2 5'-CGCCGGAGGTCAAACGCCCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3’ i 5100 bp EcoRV-Ahall (partiel) fragmentet af pGD2. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGD5.
10
Overflødig 3'-ikke-kodende sekvens blev derpå elimineret.
Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne GDL3 5'-
GGCAGTACCCTGGCGGCGCTGGTCATCGGCGGTATTGCGTTTTGGGTACGCCGCCGG 15 CGCTCAGTGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCC
CCCTCGCACCAGCCATTGTTTTACTAGCTGCA-31 og GDL4 5'- GCTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAGGGGGGCGCGTCGTCATCCCGGATGTGGGGGA GACGTAGGCGCTTGGGGGCCACTGAGCGCCGGCGGCGTACCCAAAACGCAATACCGC 20 CGATGACCAGCGCCGCCAGGGTACTGCC-3' i 4800 bp Nael-Pstl- fragmentet af pGD5. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGD7.
Yderligere sekvens blev derpå tilføjet 5' for H6-promo-25 teren. Dette blev udført ved at indsætte 150 bp Bglll-EcoRV-fragmentet af pGB6 (fig. 30) i 4800 bp Bglll-EcoRV-fragmentet af pGD7. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pGD8.
30 Konstruktion af rekombinante vacciniaviruser. Den strategi, der bruges til at indsætte HSV2 gB-, gC- og gD-generne i vacciniavirus, er angivet i henholdsvis fig.
29, 30 og 31. Alle konstruktioner udnytter vacciniavirus-tidlig-sen-promoteren, H6 (41,42,184). Hvert HSV2-gen er 35 imidlertid indsat et forskelligt sted i vacciniavirus-genomet. Det H6-promotede gB-gen er indsat mellem sekvensen, der flankerer M2L-genet (vP569), eller 100 DK 176464 B1 sekvensen, der flankerer TK-genet (vP734, vP775 og vP776). Det H6-promotede gC-gen er indsat mellem sekvensen, der flankerer μ-genet (vP579) eller sekvensen, der flankerer ATI-genet (vP748, vP776 og vP777). Det H6-5 . promotede gD-gen er indsat mellem sekvensen, der flankerer HA-genet (vP570, vP761, vP775 og vP777). Det rekombinante vacciniavirus vP569 blev frembragt ved at transficere pGB5 ind i vP458-inficerede celler. vP734 blev frembragt ved at transficere pGB6 ind i vP618-10 inficerede celler. vP579 blev frembragt ved at transficere pGCll ind i vP533-inficerede celler. vP748 blev frembragt ved at transficere pGC13 ind i vP618-inficerede celler. vP570 blev frembragt ved at transficere pGCll ind i vP533-inficerede celler. vP761 15 blev frembragt ved at transficere pGD8 ind i vP618- inficerede celler.
vP425 er en variant af vildtype-vacciniavirus (Copenhagen), hvorfra TK-genet er blevet deleteret, og 20 HA-genet er blevet erstattet med Ø-galactosidase (eksempel 1) (184). vP458 er en variant af vildtype-vaccinia virus, hvorfra TK-genet er blevet deleteret, og M2L-genet er blevet erstattet med Ø-galactosidase (eksempel 2).vP533 er en variant af vildtype-vacciniavirus, hvorfra 25 TK-genet er blevet deleteret, og μ-genet er blevet erstattet med Ø-galactosidase (eksempel 2).vP618 er en variant af vildtype-vacciniavirus, hvorfra TK-, μ- og ATI-generne er blevet deleteret.
30 Der blev også konstrueret rekombinant vacciniavirus indeholdende to HSV2-glycoproteingener. vP775 indeholder gB-og gD-generne, vP776 indeholder gB- og gC-generne, og vP777 indeholder gC- og gD-generne. vP775 blev frembragt ved at transficere pGD8 ind i vP734-inficerede celler.
35 vP776 blev frembragt ved at transficere pGC13 ind i vP734-inficerede celler. vP777 blev frembragt ved at transficere pGD8 ind i vP748-inficerede celler.
101 DK 176464 B1
Der blev også konstrueret et rekombinant vacciniavirus indeholdende tre HSV2-glycoproteingener. vP812 indeholder gB-, gC- og gD-generne fra HSV-2. vP812 blev frembragt ved at transficere pGD8 ind i vP776-inficerede celler.
5
Immunfluorescens af HSV2-glycoproteiner i celler inficeret med rekombinant vacciniavirus. I celler inficeret med HSV2 udtrykkes gB, gC og gD (såvel som andre HSV2-kodede glycoproteiner) på plasmamembranen. Immun-10 fluorescensundersøgelser udført på celler inficeret med de rekombinante vacciniaviruser indeholdende HSV2-gener tyder på, at HSV2-polypeptiderne dannet i celler inficeret med disse rekombinante vacciniaviruser også udtrykkes på plasmamembranen.
15
Immunpraecipitation af HSV2-qlycoproteiner i celler inficeret med rekombinant vacciniavirus. HSV2 gB-glyco-protein dannet i HSV2-inficerede celler har en molekyl-masse på ca. 117 kDa (198,199). Celler inficeret med 20 rekombinante vacciniaviruser indeholdende HSV2 gB-genet (vP569, vP734, vP775 og vP776) danner også et HSV2-kodet polypeptid med en molekylmasse på ca. 117 kDa. Ved immunpraecipitation af celler inficeret med vP569 med antisera mod hel-HSV2-virus præcipiteres to i stor mængde 25 forekommende proteiner med molekylmasser på ca. 117 kDa og 110 kDa og tre i mindre mængde forekommende proteiner med molekylmasser på 50 kDa, 45 kDa og 30 kDa. Ved immunpraecipitation af celler inficeret med vP734, VP775 og vP776 præcipiteres to i stor mængde forekommende pro-30 teiner med molekylmasser på ca. 110 kDa og 90 kDa og fem i mindre mængde forekommende proteiner med molekylmasser på ca. 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa og 30 kDa.
HSV2 gC-glycoprotein dannet i HSV2-inficerede celler har 35 en molekylmasse på ca. 63 kDa (199,200). Celler inficeret med rekombinante vacciniaviruser indeholdende HSV2 gC-genet (vP579, vP748, vP776 og vP777) danner også et HSV2- 102 DK 176464 B1 kodet polypeptid med en molekylmasse på ca. 63 kDa. Ved immunpræcipitation af celler inficeret med vP579, vP748, vF776 og VP777 med antisera mod hel-HSV2-virus præcipi-teres et i stor mængde forekommende protein med molekyl-5 masse på ca* 65 kDa og et i mindre mængde forekommende protein med molekylmasse på ca. 85 kDa. Kanin-antisera mod hel-HSV2-virus blev opnået fra DAKO Corporation (Santa Barbara, CA; kode nr. B116) og anvendt i en fortynding på 1:100.
10 HSV2 gD-glycoprotein dannet i HSV2-inficerede celler har en molekylmasse på ca. 51 kDa (198,199). Celler inficeret med rekombinante vacciniaviruser indeholdende HSV2 gD-genet (vP570, vP761, vP775 og vP777) danner også et HSV2-15 kodet polypeptid med en molekylmasse på ca. 51 kDa. Ved immunpræcipitation af celler inficeret med vP570, vP761, vP775 og vP777 med antisera mod hel-HSV2-virus præcipi-teres et i stor mængde forekommende protein med molekylmasse på ca. 48 kDa og to i mindre mængde forekommende 20 proteiner med molekylmasse på ca. 40 kDa og 31 kDa.
In vivo evaluering. Alle de rekombinante vaccinia-viruser, der udtrykker de forskellige konstruktioner af HSV2-glycoproteiner beskyttede immuniserede mus mod 25 efterfølgende dødelig udsættelse for HSV-antigen i forsøg, der lignede forsøgene beskrevet af Paoletti et al.
(26).
EKSEMPEL 14 - Udtrykkelse af det bovine herpesvirus 1-30 glycoprotein gi i vacciniavirus-rekombinan- ter
Indsættelse af BHVl-gl-qenet i vacciniavirus-donor-plasmider. BHV1 gi-genets nukleotidsekvens er tidligere 35 blevet publiceret (63). Der henvises nu til fig. 32. Et plasmid pIBRS6 indeholdende BHV1 gi-genet (Straub-stamme) blev opnået fra Rhone Merieux, Lyon, Frankrig, gl-genets 103 DK 176464 B1 5'-ende blev indsat nedstrøms for H6-promoteren (41,42,69) og mellem flankerende arme af vacciniavirus (Copenhagen). Dette blev udført ved at indsætte 540 bp Sall-Pstl-fragmentet af pIBRS6 i 4400 bp Sall-Pstl-5 fragmentet af pGD5 (pGD5 blev dannet ved at indsætte HSV2 gD-genet i pTP15 (184) (fig. 3). Herved placeres gi-genet nedstrøms for H6-promoteren og mellem flankerende arme af vacciniavirus HA. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pIBR2.
10 H6-promoterens initieringscodon blev derpå bragt på linje med gi-genets initieringscodon. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne IBRLl 5 ' - 15 atccgttaagtttgtatcgtaatggccgctcgcggcggtgctgaacgcgccgc-3 * og IBRL2 5'- GGCGCGTTCAGCACCGCCGCGAGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' i 3800 bp NruI-Sstll-fragmentet af pIBR2. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes plBR4.
20
Derpå dannedes et for fremtidige manipulationer nødvendigt Ncol-sted. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne IBRL3 5' -CCATGGTTTAATGCA-3' og IBRL4 5' -TTAAACCATGGTGCA-3' i Pstl-stedet i pIBR4. Plasmidet dan-25 net ved denne manipulation betegnes pIBR5.
gi-genets 3'-ende blev derpå indsat i pIBR5. Dette blev udført ved at indsætte 1740 bp Tthllll-Ncol-fragmentet af pIBRS6 i 3700 bp Tthllll-Nco-fragmentet af pIBR5. Plas-30 midet dannet ved denne manipulation betegnes pIBR7.
Derpå dannedes et for fremtidige manipulationer nødvendigt Bglll-sted. Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne IBRL5 5'-CATGGTTTAAGATCTC-3' og IBRL6 5'-35 CATGGAGATCTTAAAC-3’ i Ncol-stedet i pIBR7. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes plBR8.
104 DK 176464 B1
Derpå blev en del af gi-genets lange hydrofile ledersekvens deleteret (63). Dette blev udført ved at indsætte oligonukleotiderne IBRL7 5' - ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCGCTAGCCGCTGCCCTGCTATGGGCGACG 5 TGGGCC-3' og IBRL8 5’- CACGTCGCCCATAGCAGGGCAGCGGCTAGCGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGG AT-3' i 4400 bp Nrul-Apal (partiel) fragmentet af pIBR8.
Herved elimineres 132 bp af den hydrofile ledersekvens. Plasmidet dannet ved denne manipulation betegnes pIBR9 * 10
Derpå blev det H6-promotede afstumpede gi-gen indsat i et andet vacciniavirus-donorplasmid. Dette blev udført ved at indsætte 1700 bp Nrul-Bglll-fragmentet af pIBR9 i 4900 bp Nrul-BamHI-fragmentet af pBR14 (211). Plasmidet dannet 15 ved denne manipulation betegnes pIBRIO.
Konstruktion af rekombinante vacciniaviruser. Strategien anvendt til at indsætte BHV1 gi-genet i vacciniavirus er skitseret i fig. 32. Det rekombinante vacciniavirus vP637 20 blev dannet ved at transficere pIBR7 ind i celler inficeret med vP410. vP724 blev dannet ved at transficere pIBRIO ind i celler inficeret med vP410. vP637 indeholder det fulde BHV1 gi-gen. vP724 indeholder et gi-gen, hvorfra 132 bp af 5'-signalsekvensen er deleteret (63).
25 Begge konstruktioner bruger vacciniavirus tidlig-sen- promoteren, H6 (41,42,184). gi-genet i vP637 indsættes mellem de sekvenser, der flankerer HA-genet. gi-genet i vP724 indsættes mellem de sekvenser, der flankerer ATI-genet.
30
Immunfluorescens og detektion af et BHVl-kodet polypeptid i celler inficeret med rekombinant vacciniavirus. I celler inficeret med BHV1 udtrykkes gi på plasma-membranen. Immunfluorescensundersøgelser af-celler infi-35 ceret med vP637 eller vF724 tyder på, at det BHVl-kodede polypeptid dannet i disse celler også udtrykkes på plasmamembranen. Immunfluorescens blev udført som be- 105 DK 176464 B1 skrevet i eksempel 1. De BHV1 gl-specifikke monoklonale antistoffer, 4203 og 5106, blev anvendt (201).
EKSEMPEL 15 - Udtrykkelse af felint herpesvirus qlyco-5 protein gB i en vacciniavirus-rekombinant I dette eksempel anvendtes WR-stammen af vacciniavirus (202). Som hjælpervirus blev anvendt det af WR-stammen afledte rekombinante vacciniavirus vP293 (69).
10
Ekstraktion af FHV-1 DNA og indsættelse af FHV-1 SacI-SacI-fragmentet på 3,2 kb. FHV-1 DNA blev ekstraheret og oprenset fra C O stammen. FHV-1 DNA-genomet blev nedbrudt med EcoRI og ligeret i plasmid pBR322 ved standard 15 procedurer (20). Denne FHV-1 bank blev screenet med DNA- sonder afledt fra PRVgll- (62) og BHV-1 gB- (203) generne. Efterfølgende hybridiseringer med subkloner afledt fra de to EcoRI-kloner fundet positive ved hybridisering tillod mere præcis kortlægning af FHV-1 gB-20 genet. Et 3,2 kb SacI-SacI-fragment indeholdende FHV-1 gB-genet blev indsat i pUC18, hvorved dannedes plasmid pFHVgBC.
Sekventering af SacI-Sad-fragmentet, der koder for FHV-1 25 gB. Nukleotidsekvensdata for begge strenge blev opnået fra pFHVgBC og pFHVgBC-afledte subkloner ved brug af modificeret T7 Sequenase som beskrevet ovenfor.
Indsættelse af FHV-1 gB-genet i et vacciniavirus-donor-30 plasmid. Der henvises nu til fig. 33. FHV-1-genet blev indsat i pHES4, et af plasmiderne designet for værtsområde- selektionssystemet i vacciniavirus WR-stammen (69) (fig. 10). Dette plasmid bærer værtsområdegenet KIL, der tillader deletionsmutanten vP293 at replikere på humane 35 celler. FHV-1 gB-genet blev indsat umiddelbart nedstrøms for den syntetiske vaccinia H6-promoter (69). Plasmid pFHVgBC blev nedbrudt med Kpnl og SacI, og 3150 bp 106 DK 176464 B1 restriktionsfragmentet indeholdende FHV-1 gB blev isoleret fra en agarosegel og derpå ligeret ind i plasmid pHES4, der først var nedbrudt med Kpnl og Sacl. Det herved opnåede plasmid blev betegnet pJCAOOl (fig. 33).
5 DNA-sekvensanalvse af FHV-1 qB-qenet. Der henvises nu til fig. 34. DNA-sekvensanalyse viste en åben læseramme, der strakte sig fra nukleotidposi-tionerne 337 til 3177. I området 5' for ATG-initieringscodonen i position 337 fandt man formodede transkriptionsregulerende signaler. En TATA-box med sekvensen AAATATAT (nukleotiderne 184 til 191) var beliggende 80 nukleo-10 tider nedstrøms for en formodet CAT-box med sekvensen GGTGAGTA. Et polyadenyleringssignal AATAAA (nukleotiderne 3251 til 3256) var beliggende 50 nukleotider nedstrøms for TAA-termineringscodonen (nukleotiderne 3178 til 3180). Otte ud af 11 nukleotider i sekvensen 5' TCATTCTAGCA 3' (nukleotiderne 200 til 210) er komplementære til den 18S ribosomale RNA-sekvens 15 3’ AGGAAGGCGU 5’ (61) og kan tjene som ribosombindingsstedet. Der er fremsat en scanningmodel, i henhold til hvilken eukaryote mRNAer initierer translation (151,155). Sekvenskonteksten omkring den foreslåede initie-ringscodon ATCATGT (nukleotiderne 334 til 340) kvalificerer som en funktionel sekvenskontekst for initiering af translation af eukaryot mRNA. Den FHV-20 1 gB åbne læseramme koder for 947 aminosyrer med en beregnet molekyl- masse på 106,2 kDa. Indholdet af G + C er 45,8%.
Analyse af FHV-1 qB-proteinstrukturen. Analyse af aminosyresekvensen viste en række egenskaber, der er fælles for membranbundne glycoproteiner.
25 Et område fra aminosyre 23 til 73 havde en karakteristisk hydrofobiprofil og antages at være signalsekvensen (fig. 34). Med henvisning til fig. 35 er der en hydrofil sekvens på 22 aminosyrer forud for den lange hydrofobe signalsekvens. Denne egenskab er også bemærket for pseudorabies (PRV) gll-genet (62), for bovint herpesvirus-1 (BHV-1) gi-genet 30 107 DK 176464 B1 (63) og for gp-14-generne i herpesvirus egui 1 (EHV-1) (71) og herpesvirus equi 4 (EHV-4) (72), der alle tillige er HSV gB-homologe. Et hydrofobt område bestående af 42 aminosyrer (aminosyrerne 789 til 831) antages at fungere 5 som et transmembranelt forankringsdomæne. Det hydrofile cytoplasmiske domæne indeholder 116 aminosyrer. Der er ti Asn-X-Thr/Ser-steder (hvor X kan være enhver aminosyre undtagen prolin) for potentiel N-koblet glycosylering (64) , idet et sted er beliggende i signalsekvensen. Der 10 er to efter hinanden følgende og nært beliggende potentielle proteolytiske spaltningssteder (Arg-Arg-Ser) (positionerne 504 til 506 og 516 til 518), der er identiske med dem, der findes i PRVgll (94), VZV gpll og HCMV gB (71) og EHV-1 gpl4 (71,72). FHV-1 gB- 15 aminosyresekvensens hydrofobiprofil er vist i fig. 35.
Sammenligning af FHV-1 qB aminosyresekvensen med andre herpesvirus qlycoproteiner. Ved sammenligning af FHV-1 gB-genets aminosyresammensaetning med glycoproteiner fra 20 andre herpesviruser sås omfattende homologi. Således er FHV-1 gB homolog med PRV gll (62), BHV-1 gi (63), varicella zoster virus (VZV) gll (66,204), HSV-1 gB (67), HSV-2 gB (205), EHV-1 gpl4 (71), såvel som med glycoproteiner fra Epstein-Barr virus (EBV) (68,206) og human 25 cytomegalovirus (HCMV) (10).
Konstruktion af vaccinia-rekombinanten vP713, der udtrykker FHV-1 gB-glycoproteinet. De FHV-1 gB-kodende sekvenser blev indsat i en vacciniavirus-vektor ved brug af WR 30 vacciniavirus-værtsområde-selektionssystemet pHES4/vP293 (69). Det, at rekombinant vaccinia-afkom dannet ved rekombination under anvendelse af WR vacciniavirus vP293/pHES værtsområde-selektionsystemet kan danne plaque på humane MRC-5-celler, tillader hurtig identifikation af 35 disse rekombinanter (69). Vacciniavirus-rekombinant vP7l3 blev opnået ved rekombination foretaget med plasmid pJCAOOl som donorplasmid og vP293 som hjælpervirus (fig.
33).
108 DK 176464 B1
Immunfluorescens af FHV-1 gB-glycoprotein syntetiseret af vP713 Immunfluorescens af VERO- og MRC-5-celler infice-5 ret med rekombinant vacciniavirus vP713 blev udført som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af anti-FHV-l-gB-specifikt fåreserum nr. 2854. Der anvendtes en multipel infektion på 2 pfu pr. celle. FITC æsel-anti-fåre-IgG blev brugt som det andet antistof.
10 FHV-1 gB var detekterbar på overfladen af VERO-celler inficeret med vaccinia-rekombinant vP713 såvel som indvendigt efter fixering med acetone. Der sås hverken indvendigt eller på overfladen nogen signifikant immun-15 reaktivitet med FHV-1 gB i kontrolceller inficeret med vP410.
Immunpræcipitation af FHV-1 gB-glycoprotein syntetiseret af vP713. For at vurdere FHV-1 gB-glycoproteinet udtrykt 20 af vP713 blev VERO-celler inficeret med vP713, og prote- 35 iner blev metabolisk mærket med S-methionin. Immun-præcipitationer blev udført med de radioaktivt mærkede cellelysater ved anvendelse af anti-FHV-l-gB-specifikt fåreserum nr. 2854.
25 g
Monolag af VERO-celler podet med 2 x 10 celler pr. 60 mm petriskål blev inficeret med en lav multipel infektion på 0,1 pfu pr. celle med kontrol (vP410) eller rekombinant vacciniavirus vP713. Immunpraecipitationer blev udført som 30 beskrevet i eksempel 1.
Det specifikke anti-FHV-1 gB serum immunpræcipiterer ingen signifikante produkter hverken fra uinficerede VERO-celler eller VERO-celler inficeret med kontrol 35 vacciniavirus vP410. Radioaktivt mærkede FHV-1 gB produkter blev præcipiteret af serum nr. 2854 fra VERO-celler inficeret med vP713. Især præcipiteres der fem i 109 DK 176464 B1 stor mængde forekommende metabolisk radioaktivt mærkede polypeptider. De to største polypeptider med en tilsyneladende molekylstørrelse på 115 kDa og 110 kDa kunne svare til det ikke-glycosylerede prækursorprotein 5 og det modne protein (teoretiske størrelser henholdsvis 106 kDa og 98 kDa). Et stort bånd ved 68 kDa kunne repræsentere de to glycosylerede underenheder (69 kDa + 66 kDa) resulterende fra proteolytisk spaltning af en glycosyleret prækursor (136 kDa), der mangler her. Tre 10 mindre præcipiterede produkter (59, 53 og 48 kDa) svarer ikke til nogen kendte FHV-1 gB produkter og kan være nedbrydningsprodukter.
EKSEMPEL 16 - Indsættelse og udtrykkelse af Epstein-Barr 15 virus glycoprotein i poxvinis-vektorer
Indsættelse af EBV gp340- og gp220-generne i vaccinia-donorplasmid pMP409DVC. I dette eksempel blev EBV- generne isoleret fra B95-8 EBV-stammen (207), gp340- og 20 gp220-generne var cDNA-kloner (henholdsvis plasmid pMLPgp340 og pMLPgp220), og gB-, gH- og BBRF3-generne blev isoleret fra en BamHI-genbank. Der henvises nu til fig. 36. Et 2100 bp Xmal-Clal-fragment af plasmidet pMLPgp220 blev indsat i Ml3mpl8 nedbrudt med Xmal-Accl.
25 Fagen opnået ved denne manipulation blev betegnet mpl8gp220 (fig. 36). Ved in vitro mutagenese (17) under anvendelse af oligonukleotiderne CM4 (TAAAGTCAATAAATTTTTATTGCGGCCGCTACCGAGCTCGAATTCG) og CM5 (GCTTGCATGCCTGCAGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGCAGCCTTGC) 30 blev gp220-genet modificeret til at kunne udtrykkes under kontrol af vaccinia H6-promoteren. Plasmidet indeholdende det modificerede gp220-gen blev betegnet mpl8gp220(5+4) (fig. 36).
35 Det modificerede gp220-gen blev indsat i plasmidet SPl31NotI, der indeholder den fulde syntetiske H6-promoter (69). Dette blev udført ved at indsætte 2300 bp 110 DK 176464 B1
Narl-EcoRV-fragmentet af mpl8gp220(5+4) i 2940 bp EcoRV-Narl-fragmentet af SPl3lNotI-plasmidet. Det herved opnåede plasmid fik betegnelsen SPl3gp220 (fig. 36).
5 gp340-genet under kontrol af H6-promoteren opnåedes ved at indsættet 2360 bp Scal-Xhol-fragment af pMLPgp340 i det med Xhol-Scal (partiel) nedbrudte SP131gp220-plasmid.
Det herved opnåede plasmid fik betegnelsen SP131gp340 (fig. 36).
10
De H6-promotede gp340- og gp220-gener blev indsat i vacciniavirus M2L indsættelseslocus-plasmidet pMP409DVC (fig. 4; i fig. 36, 40 betegnes dette plasmid MP409).
Dette blev udført ved at indsætte det mungbønnenuklease-15 behandlede 2800 bp Notl-fragment fra plasmidet SP131gp340 og det mungbønnenukleasebehandlede 2100 bp NotI-fragment fra plasmidet SP131gp220 i det mungbønnenuklease-behand-lede Bglll-sted i plasmidet pMP409DVC. De herved opnåede plasmider fik betegnelserne henholdsvis 409H6340 og 20 409H6220 (fig. 36).
Indsættelse af EBV gB-genet i vacciniavirus-donorplas-midet pMP409DVC. Der henvises nu til fig. 37. Et 3500 bp EcoRI-Xmnl-fragment fra EBV DNA BamHI A fragmentet (207) 25 indeholdende EBV gB-genet blev isoleret fra EBV-genom-blblioteket og indsat i 2837 bp HincII-EcoRI-fragmentet af pIBl25. Det herved opnåede plasmid fik betegnelsen p25gB (fig. 37 ).
30 Ved in vitro mutagenese (17,185) under anvendelse af oligonukleotiderne EBVBM5 (CCCTACGCCGAGTCATTACGATACAAACTTAACGGATATCAGAGTCGTACGTAGG) og EBVBM3 (CTGGAAACACTTGGGAATTCAAGCTTCATAAAAAGGGTTATAGAAGAGTCC) 35 blev gB-genet adapteret til udtrykkelse under kontrol af vaccinia H6-promoteren. Det herved opnåede plasmid fik betegnelsen p25gB(5+3).
i 111 DK 176464 B1 2600 bp EcoRV-EcoRl-fragmentet fra p25gB(5+3) blev indsat i 3300 bp EcoRV-EcoRl-fragmentet af SP131. Det herved opnåede plasmid fik betegnelsen SP131gB (fig. 37)* 5 H6-promoter gB-genet blev derpå indsat i vacciniavirus-donorplasmidet pMP409DVC. Dette blev opnået ved at indsætte det mungbønnenuklease-behandlede 2700 bp Hindlll fragment af SPl31gB i det mungbønnenukleasebehandlede Bglll-sted i pMP409DVC. Det herved opnåede plasmid fik 10 betegnelsen 409H6gB (fig. 37).
Indsættelse af EBV gH-genet i vaccinla-donorplasmidet PSD486VC. I EBV BamHl restriktionsfragment-biblioteket, er den åbne læseramme BXLF2 indeholdt i BamHl X- og BamHl 15 T-fragmenterne (207). Som vist i fig. 38 blev den fulde BXLF2-åbne læseramme rekonstitueret ved at indsætte 830 bp Smal-BamHl-fragmentet fra BamHl X i 2880 bp Smal-BamHI fragmentet af pIB124; det herved opnåede plasmid fik betegnelsen 24gH5. 1850 bp BamHI-Hindlll-fragmentet fra 20 BamHl T blev indsat i 3660 bp BamHI-HindllI-fragment af 24gH5. Det herved opnåede plasmid indeholdende det fulde gH-gen fik betegnelsen 24gH (fig. 38).
Ved in vitro mutagenese (17,185) under anvendelse af 25 oligonukleotiderne HM5 (ACACAGAGCAACTGCAGATCTCCCGATTTCCCCTCT), HM4 (GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCTGCG) og HM3 (GCCAGGGTTTTCCCAGAGATCTGATAAAAACGACGGCCAGTG) blev gH-genet modificeret til udtrykkelse under kontrol af 30 vaccinia hæmorrhagisk (u) tidlig promoteren. Oligo- nukleotidet HM4 blev brugt til at fjerne et vaccinia tidligt transkriptionsstopsignal indeholdt i gH-genet (45). Plasmidet indeholdende det modificerede gH-gen fik betegnelsen 24gH(5+4+3).
Der henvises nu til fig. 38. Vaccinia μ-promoteren er indeholdt i plasmidet pSD486VC (fig- 30). (I fig. 38 be- 35 112 DK 176464 B1 tegnes dette plasmid SD486). Det mungbønnenuklease-behandlede 2130 bp Bglll fragment af 24gH(5+4+3) blev indsat i det Bglll-spaltede, mungbønne-nukiease-behandlede pSD486VC. Ved dette sidste indsættelsestrin sættes gH-genet under kontrol af vaccinia μ-promoteren. Plasmidet dannet ved den-5 ne manipulation fik betegnelsen 486gH (fig. 38).
Indsættelse i vacciniavirus-donorplasmidet pCOP$C-5H af den åbne læseramme BBRF3. Den fulde BBRF3 åbne læseramme er indeholdt i BamHi B-fragmentet af EBV DNAet. Dette fragment blev nedbrudt med BspHI, be-10 handlet med E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) og nedbrudt med Bglll. Det i BamHI A-fragmentet indeholdte Bglll-sted er beliggende 10 baser før BBRF3's stopcodon. 1230 BspHI-Bglll-fragmentet blev isoleret og indsat i 4200 bp Smal-Bglll-fragmentet i pCOPSOSH. {Plasmid pCOPCS-5H er identisk med plasmid pCOPCS657 (fig. 16)). Plasmidet dannet ved denne 15 manipulation fik betegnelsen COPSCEBVX.
Indsættelse i vacciniavirus-donorplasmidet PSD513VCVQ af EBV qp340-, qB- og qH-qenerne. Det vacciniavirus-donorplasmid, der anvendtes til dannelse af den tredobbelte EBV-rekombinant, var plasmidet pSD513VCVQ (fig.
20 29). Dette plasmid indeholder en subklon af Copenhagen vacciniavirus Hin- dlll J-fragmentet, hvori kodningssekvensen for thymidinkinasegenet er udskiftet med et polylinkerområde.
Først blev det μ-promotede EBV gH-gen indsat i pSD513VCVQ. Specielt 25 blev 2300 bp SnaBI-Bglll-fragmentet fra 486gH indsat i 4000 bp Smal-Bglll-fragmentet af pSD513VCVQ. Plasmidet dannet ved denne manipulation fik betegnelsen 513UgH.
Som næste trin blev det H6-promotede EBV gp340-gen indsat i 513gH. Spe-30 cielt blev det 2800 bp mungbønne-behandlede 113 DK 176464 B1
NotI-fragment af SP131gp340 indsat i det 6300 bp mungbønnenuklease-behandlede Xhol-Pstl-fragment af 513UgH. Plasmidet dannet ved denne manipulation fik betegnelsen 513UgH340H6.
5
Derefter blev det H6-promotede EBV gp340-gen indsat i 513UgH340H6. Specielt blev det 2700 bp mungbønnenuklease-behandlede HindiII-fragment af SP131gp340 indsat i det 9100 bp mungbønnenuklease-behandlede Bglll-fragment af 10 513UgH340H6. Det herved dannede plasmid fik betegnelsen 513gHgBgp340 (fig. 39).
Konstruktion af rekombinant vacciniavirus. EBV gp340 (donorplasmid 409H6340), EBV gp220 (donorplasmid 15 409H6220) og EBV gB (donorplasmid 409H6gB) blev ved re kombination indsat i vacciniavirus vP458 (M2L sted); disse vacciniavirus-enkelt-rekombinanter betegnes henholdsvis vP474, vP480 og vP561. EBV gH (donorplasmid 486gH) blev ved rekombination indsat i vacciniavirus 20 vP533 (u-indsættelsessted); denne vacciniavirus-enkelt- rekombinant betegnes vP611.
Endelig opnåede man den tredobbelte vacciniavirus-rekom-binant indeholdende gp340, gB og gH ved at rekombinere 25 donorplasmidet 513gHgBgp340 ind i thymidinkinase- indsættelsesstedet af vacciniavirus vP617. Dette rekombi-nante virus betegnes vP712. vP617 er et Copenhagen vacciniavirus deleteret for TK-, HA- og ATI-generne.
30 Immunfluorescens af EBV-proteiner i celler inficeret med rekombinant vacciniavirus. Immunfluorescensundersøgelser udført ved anvendelse af det monoklonale antistof F29-89 (165) på celler inficeret med vP474 (gp340) og vP480 (gp220 viste udtrykkelse af EBV gp340- og EBV gp220-pro-35 teinerne på plasmamembranen.
114 DK 176464 B1
Celler inficeret med vP611 (gH) viste, ved anvendelse af et humant serum, et svagt positivt signal på plasmamembranen .
5 Endelig blev det samme forsøg udført med celler inficeret med vP712 (tredobbelt EBV vacciniarekombinant): der op nåedes et positivt signal på plasmamembranen med de mono-klonale antistoffer F29-89 og NEA 9247 (gB-specificitet opnået fra DuPont).
10
Immunpræcipitation af EBV-proteinerne i celler inficeret med rekombinant vacciniavirus. EBV gp340 glycoproteinet dannet i EBV-inficerede celler har en molekylmasse på ca.
340 kDa (165). Celler inficeret med de rekombinante 15 vacciniaviruser vP474 eller vP7l2 danner også et EBV- kodet protein på ca. 340 kDa (immunpræcipitation foretaget med det monoklonale antistof F29-89). EBV gp220-glycoproteinet har en molekylmasse på 220 kDa (165).
Celler inficeret med det rekombinante vacciniavirus vP480 20 danner et EBV-kodet protein på ca. 220 kDa.
EBV gB-glycoproteinet dannet i EBV-inficerede celler har en molekylmasse på ca. 110 - 125 kDa med en prækursorform på 93 kDa (206,208). Celler inficeret med de rekombinante 25 vacciniaviruser vP561 eller vP712 danner et i stor mængde forekommende protein med en molekylmasse på ca. 125 kDa og fire i mindre mængde forekommende proteiner med molekylmasse på ca. 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa og 45 kDa.
30 EBH gH-glycoproteinet dannet i EBV-inficerede celler har en molekylmasse på 85 kDa med en prækursorform på 70 kDa (209). Celler inficeret med det rekombinante virus vP611 danner et EBV-kodet protein på ca. 85 kDa.
35 Immunisering af kaniner med vacciniarekombinanter, der udtrykker EBV-glycoproteiner. Kaniner blev immuniseret med vP474 (gp340) eller vP480 (gp220) eller vP56l (gB) 115 DK 176464 B1 eller vP611 (gH) eller vP712 (tredobbelt). Efter én booster-injektion blev sera undersøgt ved immunfluorescens på TPA-behandlede B95-8-celler. Der opnåedes positive signaler i hvert tilfælde. Der blev demonstreret 5 in vitro neutraliseringsaktivitet ved anvendelse af sera dannet mod vP474 (gp340).
EKSEMPEL 17 - Indsættelse og udtrykkelse af human cytomegalovirus glycoproteinantigener i 10 poxvirus vektorer
Indsættelse af HCMV gB-genet i vaccinia-donorplasmidet pMP409DVC. Der henvises til fig. 40. 4800 bp Hindlll-
BamHl-fragmentet af Hindlll D-fragmentet fra HCMV DNA 15 blev indsat i 2800 bp HindiII-BamHl-fragmentet af plasmi-det pIBl24. Ved in vitro mutagenese (17,185) under anvendelse af oligonukleotiderne CMVM5 (GCCTCATCGCTGCTGGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAATCCAGGATCTG) og CMVM3 (GACAGATTGTGATTTTTATAAGCATCGTAAGCTGTCA) 20 modificeredes HCMV gB-genet til at kunne udtrykkes under kontrol af vaccinia H6-promoteren. Plasmidet indeholdende det modificerede HCMV gB-gen fik betegnelsen 24CMVgB(5+3) (fig. 40).
25 Dernæst blev 2900 bp EcoRV-BamHI-fragmentet af 24CMVgB(5+3) indsat i 3100 bp EcoRV-BgIII-fragmentet af plasmid pSPl31, der ineholder den syntetiske H6-promoter (69). Ved denne indsættelse sættes HCMV gB-genet under kontrol af vaccinia H6-promoteren. Det herved opnåede 30 plasmid fik betegnelsen SP131gB.
Til slut blev det H6-promotede HCMV gB-gen indsat i vaccinia-donorplasmidet pMP409DVC. Det 3000 bp mung-bønnenuklease-behandlede HindiIl-fragment af SP131gB blev 35 indsat i det mungbønnenuklease-behandlede Bglll-sted i pMP409DVC. Der herved opnåede plasmid fik betegnelsen 409CMVgB (fig. 40).
DK 176464 B1 1X6 a
Konstruktion af rekombinant vacciniavirus. Det Ηβ-promotede CMV gB-gen i plasmid 409CMVgB blev indsat i M2L-stedet i hjælperviruset vP458. Det rekombinante vacciniavirus fik betegnelsen vP525.
5
Immunfluorescens af CMV gB-protein i celler inficeret med rekombinant vacciniavirus. Immunfluorescensundersøgelser af celler inficeret med vP525 ved brug af et monoklonalt antistof eller et marsvine polyklonalt serum viste HCMV 10 gB udtrykt på plasmamembranen.
Immunpræcipitation af CMV gB i celler inficeret med rekombinant vaccinia. CMV gB-glycoproteinet dannet i celler inficeret med CMV har en molekylmasse på 55 kDa 15 med en prækursorform på 130 kDa (172). Celler inficeret med vP525 dannet to CMV gB-kodede proteiner på ca. 130 kDa og 55 kDa.
Nukleotidsekvenser af HXLF1 og HXLF2. HXLF-genfamilien 20 er beliggende i Hindlll X-fragmentet af det HCMV- genomiske DNA (172). Ved anvendelse af specifikke oligo-nukleotid-primere er nukleotidsekvensen af HXLF1 og HXLF2 blevet bestemt (fig. 41, 42). HXLF1 har en længde på 648 nukleotider og koder for et protein på 215 aminosyrer.
25 HXLF2 har en længde på 558 nukleotider og koder for et protein på 185 aminosyrer. Nukleotidsekvenserne for de samme gener (AD169 HCMV-stamme) er offentliggjort (173), og sammenligningsundersøgelser viser 99% homologi for HXLF1 og 96% homologi for HXLF2.
30
Immunisering af marsvin med vaccinia-rekombinanter, der udtrykker HCMV-antigener. Tre marsvin blev immuniseret med vP525. Efter én booster-injektion udviklede dyrene HCMV-neutraliserende antistoffer (middel titer: 518). Det 35 er interessant, at 50 til 87% af den neutraliserende aktivitet af HCMV seropositive humane sera kan ud-absorberes af celler inficeret med vP525. Dette resultat 117 DK 176464 B1 antyder den potentielle betydning af HCMV gB som en underenhedsvaccine.
5 10 15 20 25 30 35 118 DK 176464 B1 REFERENCER: 1. Alien, G.P. and J.T. Bryans, In: Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, Vol. 2, ed. R. Pandey 5 (Basel), pp. 78-144 (1986).
2. Alien, G.P., and L.D. Coogle, J. Virol. 62, 2850-2858 (1988) .
3. Allen, G.P. and M.R. Yeargan, J. Virol. 61, 2454-2461 (1987) .
-|q 4. Baumann, R.P. , D.C. Sulivan, J. Staczek, and D.J.
O'Callaghan, J. Virol. 57, 816-825 (1986).
5. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, B. Lomniczi, and A. Kaplan,
Virology 154. 325-334 (19B6).
6. Berman, P.W., D. Dowbenko, L.A. Lasky, and C.C.
Simonsen, Science 222. 524-527 (1983).
7. Bertholet, C., R. Drillien, and R. Wittek, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82. 2096-2100 (1985).
8. Cantin, E-M., R. Eberle, J.L. Baldick, B. Moss, D.E.
Willey, A.L. Notkins, and H. Openshaw, Proc. Natl.
Acad. sci. USA M, 5908-5912 (1987).
20 9. Chakrabarti, S., K. Brechling, and B. Moss, Mol. Cell.
Biol. 5, 3403-3409 (1985).
10. Cranage, M.P., T. Kouzarides, A.T. Bankier, s.
Satchwell, K. Weston, P. Tomlinson, B. Barreil, H. ·
Hart, S.E. Bell, A.C. Minson, and G.L. Smith, EMBO J.
5, 3057-3063 (1986).
25 11. Clewell, D.B., J. Bacteriol. 110. 667-676 (1972).
12. Clewell, D.B. and D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 62, 1159-1166 (1969).
13. Cremer, K.J., M, Mackett, C. Wohlenberg, A.L. Notkins, and B. Moss, Science 228. 737-740 (1985).
3Q 14. Eisenberg, D., Annu. Rev. Biochem. 53, 595-623 (1984).
15. Glorioso, J. , U. Kees, G. Kumel, H. Kirchner, and P.
Krammer, J. Immunol. 135. 575—582 (1985).
16. Graham, F-L. and A.J. Van der Eb. , Virology 54, 536-539 (1973) .
17. Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 35 (1985).
18. Lasky, L.A., D. Dowbenko, C.C. Simonsen, and P.w.
Berman, Bio-Technology 2, 527—532 (1984).
119 DK 176464 B1 19- Mandecki, W. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7177-7181 (1986) .
5 20. Maniatis, T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor
Laboratory, New York) (1982) .
21. Martin, S. and B.T. Rouse, J. Immunol. 138. 3431-3437 (1987) .
22. Martin, S., B. Moss, P.W. Berman, L.A. Lasky, and B.T.
10 Rouse, J. Virol. 61, 726-734 (1987).
23. O'Callaghan, D.J., B.E. Henry, J.H. Wharton, S.A.
Dauenhauer, R.B. Vance, J. Staczek, and R.A. Robinson, in: Developments in Molecular Virology, Vol. 1, ed. Y.
Decker, pp. 387-418 (1981) .
-)5 24. Panicali, D., A. Grzelecki, and C. Huang, Gene 47., 193- 199 (1986).
25. Panicali, D., and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79, 4927-4931 (1982), 26. Paoletti, E., B.R. Lipinskas, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 193-197 20 (1984) .
27. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas, and E.
Paoletti, Science 229. 981-984 (1985).
28. Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, In: -Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and L. Grossman 25 (Academic Press) pp. 545-563 (1987).
29- Pustell, J., and F.C. Kafatos, Nucleic Acids Res. 12.
643-655 (1984).
30. Rooney, J.F., C. Wohlenberg, K.J. Cremer, B. Moss, and A. L. Notkins, J. Virol. .62, 1530-1534 (1988).
31. Rosel, J.L., P.L. Earl, J.P. Weir, and B. Moss, J.
30 Virol. 60, 436-449 (1986).
32. Rosenthal, K.L., J.R. Smiley, S. South, and D.C.
Johnson, J. Virol. 61, 2438-2447 (1987).
33. Sanger, F., Ξ. Nicklen, and A. Coulson, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74., 5463-5467 (1977).
35 34. Shapira, S.K., J. Chou, F.V. Richaud, and M.J.
Casadaban, Gene £5, 71-82 (1983).
35. Shida, H., Virology 150. 451-462 (1986).
120 DK 176464 B1 36. Spear, P.G., In: The Basis for Serodiagnosis and
Vaccines, Immunochemistcy of viruses, Vol. 2, eds.
M.H.V. Van Regennortel and A.R. Neurath (New York), pp.
_ 425-443 (1985).
o , 37. Spear, P.G., In: The Herpesvirus, Vol. 3, ed. B.
Roizman (New York), pp. 315-356 (1985).
38. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen- Virol. 68, 2587- 2598 (1987).
39. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen. Virol. 69, 859-867 10 (1988) .
40. Tabor, Ξ., and C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84 , 4767-4771 (1987) .
41. Taylor, J., R. Weinberg, B. Lanquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine 6, - 497-503 (1988).
15 42. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. Webster, and E.
Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988).
43. Turtinen, L.W., and G.P. Allen, J. gen. Virol. 63., 481-485 (1982).
44. Wachsman, M., L. Aurelian, C.C. Smith, B.R. Lipinskas, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. Infect. Dis. 155.
20 1188-1197 (1987).
45. Yuen, L. and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84.
6417-6421 (1987).
46. Zarling, J.M., P.A. Moran, L.A. Lasky, and B. Moss, J.
Virol. 59, 506-509 (1986).
2Q 47. Zarling, J.M., P.A. Moran, R.L. Burke, c. Pachl, P.W.
Berman, and L.A. Lasky, J. Immunol. 136. 4669-4673 (1986).
48. O·Callaghan, D.J., G.A. Gentry, and C.C. Randall, In:
The Herpesviruses, Vol. 2, ed- B. Roizman (New York), pp. 215-318 (1983).
30 49. Ackermann, M. , R. Longnecker, B. Roizman, and L.
Pereira, Virology 150, 207-220 (1986).
50. Frink, R.J., M.R. Eisenberg, G. Cohen, and E.K. Wagner, J. Virol. 4j>, 634-647 (1983) .
51. Frame, M.C., H.S. Marsden, and D.J. McGeoch, J. gen.
35 Virol. 67, 745-751 (1986).
121 DK 176464 B1 52. Longnecker, R., S. Chatterjee, R- Whitley, and S.
Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84., 4303-4307 (1987) .
53. Richman, D.D., A. Buckmaster, S. Bell, C. Hodgman and 5 A.C. Minson, J. Virol. 57, 647-655 (1986).
54. Swain, M.A., R.W. Peet, and D.A. Galloway, J. Virol, 53. 561-569 (1985).
55. Zezulak, K.M. , and P.G. Spear, J. Virol. 49^, 741-747 (1984).
10 56. van Drunen Littel-van der Hurk, S., T. Zamb, and L-A.
Babrick, J. Virol. 63, 2159-2168 (1989).
57. Perkus, M.E., D. Panicali, S. Mercer, and E. Paoletti,
Virology 152, 285-297 (1986).
58. Tamin, A., E.C. Villarreal, S.L. Weinrich, and D.E.
Hruby, Virology 165. 141-150 (1988).
15 59. Whalley, J.M. , G.R. Robertson, and A.J. Davidson, J. gen. Virol. 57., 307-323 (1981).
60. Laemmli, U.K., Nature (London) 227. 680-685-(1970).
61. Hagenbuchle, 0., M. Santer, J.A. Steitz, and R.J. Mans,
Cell 13,, 551-563 (1978).
20 62. Robbins, A.K., D.J. Dorney, M.w. Wathen, M.E. Whealey, C. Gold, R.J. Watson, L.E. Holland, S.D. Weed, M.
Levine, J.C. Glorioso, and L.W. Enquist, J. Virol. 61, 2691-2701 (1987) .
63. Whitbeck, J.C., L.Z. Bello, and W.C. Lawrence, J.
Virol. 62, 3319-3327 (1988).
25 64. Montreuil, J., J. Biol. Cell. 51, 115-132 (1984).
65. Kyte, J., and R.F Doolittle, J. Mol. Biol. 157. 105-132 (1982).
66. Davison, A.J., and J.E. Scott, J. gen. Virol. 67, 1759- 1816 (1986).
30 67. Bzik, D.J., B.A. Fox, N.A. DeLuca, and S. Person,
Virology 133. 301-307 (1984).
68. Pellett, P.E., M.D. Biggin, B.L. Barrell, and B.
Roizman, J. Virol. 56, 807-813 (1985).
69. Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol.
63, 3829-3836 (1989).
35 70. Gillard, S-, D. Spehner, R. Drrllien, and A. Kirn,
Proc. Natl, Acad. Sci. USA 83, 5573-5577 (1986), 122 DK 176464 B1 71. Whalley, J-M. , G.R. Robertson, N.A. Scott, G.C. Hudson, C-W. Bell, and L.M. Woodworth, J. gen. Virol. 70, 383-394 (1989)- 5 72. Riggio, M.P., A.A. Cullinane, and D.E. Onions, J.
Virol. 63, 1123-1133 (1989).
73. Glorioso, J., C.H. Schroder, G. Kumel, M. Szczesiul, and M. Levine, J. Virol. 50, 805-812 (1984).
74. Wachsman, M., L. Aurelian, J.C.R. Hunter, M.E. Perkus, and E. Paoletti, Bioscience Reports 8., 323-334 (1988) .
10 75. Wachsman, M., J.H. Luo, L. Aurelian, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. gen. Virol. 70, 2513-2520 (1989).
76- Sinclair, R., R.F. Cook, and J.A. Mumford, J. gen. virol- 70, 455-459 (1989).
77. Shimizu, Μ-, K. Satou, and N- Nishioka, Arch. Virol.
15 104. 169-174 (1989).
78. Stokes, A., G.P. Allen, L.A. Pullen, and P.K. Murray, J. gen. Virol. 70, 1173-1183 (1989).
79. McGeoch, D.J., A. Dolan, Ξ. Donald, and F.J. Rixon, J.
Mol. Biol. 181. 1-13 (1985).
80. Petrovskis, E.A., J.G. Timmins, and L.E. Post, J.
20
Virol. 60, 185-193 (1986).
81. wittmann, G. and H.-J. Rziha, In: Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, ed. G. Wittmann.(Kluwer Academic Publishers) pp. 230-325 (1989).
82. Rubenstein, A-S. and A.S. Kaplan, Virology 6j5, 385-392 25 (1975).
83. Stevely, W.S., J. Virol. 22., 232-234 (1977).
84. Ben-Porat, T., F.J. Rixon, and M.L. Blankenship,
Virology 95, 285-294 (1979).
85. Ben-Porat, T. and A.S. Kaplan, In: The Herpesviruses, gø vol. 3, ed. B. Roizman (Plenum Publishing Corp., New
York) pp. 105-173 (1985).
86. Hampl, Η., T. Ben-Porat, L. Ehrlicher, K-O. Habermehl, and A.S. Kaplan, J. Virol. 52, 583-590 (1984).
87. Ben-Porat, T. In: Organization and replication of viral DNA, ed. A.S. Kaplan (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL) 35 pp. 147-172 (1982).
88. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, J. Pendrys, R.A. Veach, and A.S. Kaplan, J. Virol. 57, 191-196 (1986).
123 DK 176464 B1 89. Ben-Porat, T. and A.S- Kaplan, Virology 4JL, 265-273 (1970) .
90. Killington, R.A., J. Yeo, R.W. Honess, D.H. Watson, B.E. Duncan, l.W. Halliburton, and J. Mumford, J. gen.
Virol. 22, 297-310 (1977).
91. Robbins, A.K., J.H. Weis, L.W. Enquist, and R.J.
Watson, J. Mol. Appl. Genet. 2, 485-496 (1984).
92. Rea, T.J., J.G. Timmins, G.W. Long, and L.E. Post, J.
Virol. 54, 21-29 (1985).
10 93. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and H.-J. Rziha, J.
Virol. 53, 52-57 (1985).
94. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, H.-J. Thiel, C.
Schreurs, and H.-J. Rziha, Virology 152. 66-75 (1986).
95. Petrovskis, E.A., J.G. Timmins, M.A. Armentrout, C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr., and L.E. Post, J. Virol.
59, 216-223 (1986).
96. Robbins, A.K., R.J. Watson, M-E. Whealy, W.W. Hays, and L.W. Enquist, J. Virol. 58, 339-347 (1986).
97. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984) .
20 98. Kost, T.A., E.V. Jones, K.M. Smith, A.P Reed, A.L.
Brown, and T.J. Miller, Virology 171. 365-376 (1989) .
99. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and H.-J- Rziha, J.
Virol. 56, 307-311 (1985).
100. Lomniczi, B., S. Watanabe, T. Ben-Porat, and A.S.
Kaplan, J. Virol. 52, 198-205 (1984).
25 101. Lukacs, N., H.-J. Thiel, T.C. Mettenleiter, and H.-J.
Rziha, J. Virol- 53, 166-173 (1985).
102. Marchioli, c., R.J. Yancey, Jr., J.G. Timmins, L.E.
Post, B.R. Young, and D.A. Povendo, Am. J. Vet. Res.
49. 860-864 (1988).
30 103. Marchioli, C.C-, R.J. Yancey, Jr., R.C. Wardley, D.R.
Thomsen and L-E. Post, Am. J, Vet. Res. 48., 1577-1583 (1987) .
104. Thomsen, D.R. , C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr. and L.E. Post, J. Virol. 61, 229-232 (1987).
105. Wathen, L.M.K-, K.B. Platt, M.W. Wathen, R.A. Van 35 ,
Deusen, C.A. Whetstone, and E-C. Pirtle, Virus Res. 4, 19-29 (1985).
124 DK 176464 B1 106. Eloit, M. , D. Fargeaud, R. L'Haridon and B. Toma, Arch.
Virol. 99, 45-46 (1988).
107. Marchioli, C.C., R.J- Yancey, Jr., E.A. Petrovskis, 5 J.G. Timmins, and L.E- Post, J. Virol. 61. 3977-3982 (1987).
108- Ishii, Η-, Y. Kobayashi, M. Kuroki and Y. Kodama, J. gen. Virol. 69, 1411-1414 (1988).
109- Whealy, M.E., A.K. Robbins and L.W. Enquist, J. Virol.
10 63, 4055-4059 (1989).
110. Wathen, M.W. and L.M-K. Wathen, J. Virol. 58, 173-178 (1986).
111. Robbins, A.K., M.E. Whealy, M.E., R.J. Watson and L.W. Enquist, J. Virol. .59, 635-645 (1986) .
112. Allen, W.P., and F. Rapp, J. Infect. Dis. 145. 413-421 15 (1982).
113. Bryson, Y.J., M. Dillon, M- Lovett, G. Acuna, S.
Taylor, J.p. Cherry, B.L. Johnson, E. Wiesmeier, W.
Growdon, T. Creagh-Kirk, and R. Keeney, N. Engl. J.
Med. M, 916-921 (1983) .
2Q 114. Douglas, J.M., C. Critchlow, J. Benedetti, G.J. Mertz, J.D. Connor, M.A. Hintz, A. Fahnlander, M. Remington, C. Winter, and L. Corey, N. Engl. J. Med. 310. 1551-1556 (1984).
115. Roizman, B. and A.E. Sears, In: Virology, eds. Fields, B.N. and D.M. Knipe (Raven Press, Ltd., New York) pp.
25 1795-1841 (1990).
116. Stuve, L.L., S. Brown-Shimer, C. Pachl, R. Najarian, D.
Dina, and R.L. Burke, 3. Virol. 61, 326-335 (1987).
117. Dowbenko, D.J., and L.A. Lasky, J. Virol. 52, 154-163 (1984).
30 118. Watson, R.J., Gene 26, 307-312 (1983).
119. McGeoch, D.J., H.K.M. Moss, D. McNab and M.C. Frame, J. gen. Virol. 68, 19-38 (1987).
120. Chan, W. , Immunol. 49., 343-352 (1983).
121. Davis, W.B., J.A. Taylor, and J.E. Oakes, J. Infect.
Dis. 140, 534-540 (1979).
122. Oakes, J.E-, and H. Rosemond-Hornbeak, Infect. Immun.
21, 489-495 (1978).
125 DK 176464 B1 123. Balachandran, N-, S. Bacchetti, and W.E. Rawls, Infect.
Immun. 21. 1132-1137 (1982).
124. Oakes, J.E., W.B. Davis, J.A. Taylor, and W.W. Weppner, ® Infect. Immun. £9, 642-649 (1980).
125. McLaughlin-Taylor, E., D.E. Willey, E.M. Cantin, R.
Eberle, B. Moss, and H. Openshav, J. gen. Virol. 69.
1731-1734 (1988).
126. Weir, J.P., M. Bennett, E.M. Alien, K.L. Elkins, S.
10 Martin, and B.T. Rouse, J- gen. Virol. 70, 2587-2594 (1989) .
127. Gibbs, E.P.J., and Μ.M. Rweyemamu, Vet. Bull- 4J7, 317- 343 (1977).
128. Yates, W.D.G., Can. J. Comp. Med. 46, 225-263 (1982).
129. Misra, V., R.M. Blumenthal and L.A. Babiuk, J. Virol.
15 40, 367-378 (1981).
130. Lawrence, W.C., R.C. D'Urso, C.A. Kundel, J.C. Whitbeck and L.J. Bello, J. Virol. 60, 405-414 (1986).
131. Zamb, T. 1987, Abstract No. 330, 68th Annual Meeting of Conference of Research Workers in Animal Disease, 16 2o and 17 November 1987, Chicago, IL., USA.
132. Babiuk, L.A., J. L’ltalien, S. van Drunen Littel-van den Hurk, T. Zamb, M.J.P. Lawman, G. Hughes, and G.A.
Gifford, J. Virol. 159, 57-66 (1987).
133. van Drunen Littel-van den Hurk, S., and L.A. Babiuk, J.
Virol. 59, 401-410 (1986).
25 134. Gaskel, R.M. , and R.C. Povey, Res. Vet. Sci. 22, 167- 174 (1978).
135. Povey R.C., and M.R. Wilson, Feline Practice 8, 35-42 (1978).
136. Chappuis, G. , C. Benoit-Jeanin, and D. Fargeaud, in: gø Develop, biol. Standard., Vol. 52, eds. M. Bonneau, and W. Hennessen, (S. Karger, Basel) pp. 485-491 (1982).
137. Saint-Gerand, A.L., Vaccine 6, 508 (1988).
138. Sarmiento, Μ-, M. Haffey, and P.G. Spear, J. Virol. 29, 1149-1158 (1979).
139. Ruyechan, W.T., L.S. Morse, D.M. Knipe, and B. Roizman, 35 J- Virol. 22, 677-697 (1979).
126 DK 176464 B1 140, Pereira, L., E- Cassai, R.W. Honess, B. Roizman, M.
Terni, and A. Nahmias, Infect. Immun. χ3, 211-220 (1976) .
5 141. Eberle, R. , and R.J. Courtney, J. Virol. , 902-917 (1980).
142. Papp-Vid, G-, and J.B. Derbyshire, Can. J. Comp. Med.
43, 231-233 (1979).
143. Meas, R.K., S.L. Fritsch, L.L. Herr, and P.A. Rota, J.
Virol. §1, 259-262 (1984).
10 144. Fargeaud, D-, C. Benoit Jeannm, F. Kato, and G.
Chappuis, Arch. Virol. 8(), 69-82 (1984).
145. Compton, T., In: Cell Biology of Virus Entry,
Replication, and Pathogenesis, eds. Compans, R.W., A.
Helenius, and M.B.A. Oldstone (Alan R. Liss, Inc.) pp.
15 45-56 (1989).
146. Spatz, S.J., R.K. Meas, and C.E. Beisel, Abstracts of the 14th International Herpesvirus Workshop (Nyborg Strand Denmark) p. 128 (1989).
147. Little, s.P., J.T- Jofre, R.J. Courtney, and P.A.
Schaffer, Virology 114. 149-160 (1981).
20 148. DeLuca, N., D.J. Bzik, V.C. Bond, S. Person, and w. ,
Snipes, Virology 122. 411-423 (1982).
149. Cai, W. , B. Gu, and S. Person, J. Virol. §2, 25-96-2604 (1988).
150. Courtney, R-J-, in: Immunobiology of Herpes Simplex
25 Virus Infection, eds. B.T. Rouse and C. Lopez (CRC
Press, Inc., Boca Raton, FL.) pp. 33-44 (1984).
151. Kozak, M., Microbial Rev. 47, 1-45 (1983).
152. Pelletier, J., and N. Sonenberg, Nature 334. 320-325 (1988) .
153. Rota, P.A., R.K. Maes, and W.T. Ruyechan, Virology 154, 168-179 (1986).
154. Henle, G., W. Henle, and V. Diehl, Proc. Natl. Acad, sci. USA 52, 94-101 (1968).
155. Kozak, M., Cell 44, 283-292 (1986).
156. Miller, G., In: Virology, Second Edition, eds. Fields, 35 B.N. et al. (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1921-1958 (1990).
127 DK 176464 B1 157. Hubbard, S.C., and R.J. Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 50, 555-583 (1981).
158. McGeoch, D,J., M.A. Dalrymple, A.J. Davison, A. Dolan, 5 M.C. Frame, D. McNab, L-J. Perry, J.E. Scott, and P.
Taylor, J- gen. Virol. 69., 1531-1574 (1988).
159. Kieff, E., and D. Liebowitz, In: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N'. et al. (Raven Press, Ltd.,
New York) pp. 1889-1920 (1990).
160. Watson, R.J., J.H. Weis, J.S. Salstrom, and L.W.
10
Enquist, science 218, 381-384 (1982).
161. McGeoch, D.J. and A.J. Davison, Nucleic Acid Res. io.
4281-4292 (1986).
162. Lehner, R. , H. Meyer, and M. Mach, J. Virol. 63., 3792-3800 (1989).
15 163. Biggin, M., P.J. Farrell, and B.G Barreil, EMBO. J. 3, 1083-1090 (1984).
164. Beisel, C., J. Tanner, T. Matsuo, D. Thorley-Lawson, F.
Kezdy, and E. Kieff, J. Virol. 54, 665-674 (1985).
165. Qualtiere, L.F., J.F. Decoteau, and M. Hassan Nasr-el-Din, J. gen. Virol. 68, 535-543 (1987).
20 166. Epstein, M.A., A.J. Morgan, S. Finerty, B.J. Randle, and J.K. Kirkwood, Nature 318. 287-289 (1985) .
167. Morgan, A.J., M. Mackett, S. Finerty, J.R. Arrand, F.T. Scullion, and M.A. Epstein, J. Med. Virol. 25, 189-195 (1988) .
25 168. Strnad, B.C., T. Schuster, R. Klein, R.F. Hopkins, T.
Witmer, R.H. Neubauer, and H. Rabin, J. Virol. 4_1, 258-264 (1982). ’ 169. Miller, N., and L.M. Hutt-Fletcher, J. Virol. 62, 2366-2372 (1988).
170. Plotkin, S.A., H.M. Friedman, S.E. Starr, and E.
30
Gonczol, In: Contemporary Issues in Infectious Diseases, Vol. 8, eds. Root et al, (Churchill Livingstone, New York) pp. 65-92 (1989).
171. Plotkin, S.A., S.E. Starr, H.M. Friedman, E. Gonczol, and R.E. Weibel, J. Inf. Dis. 159. 860-865 (1989).
35 172. Gretch, D.R., B. Kari, L. Rasmussen, R.C. Gehrz, and M.F. Stinski, J. Virol. 62, 875-881 (1988).
128 DK 176464 B1 173. Weston, K., and B.G. Barreil, J. Mol. Biol. 192. 177-208 (1986).
174. Pachl, C. , W.S. Probert, K.M. Hemsen, F.R. Masiarz, L-Rasmussen, T.C. Merigan, and R.R. Spaete, Virology 159, 5 418-426 (1989).
175. Rasmussen, L., M. Nelson, M. Neff, and T.C. Merigan,
Jr., Virology 163, 308-318 (1988).
176. Kari, B. , N. Lussenhop, R. Goertz, M. Wabuke-Bunoti, R.
Radeke, and R. Gehrz, J. Virol. 60, 345-352 (1986).
10 177. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Virus Res. 10, 343-356 (1988).
178. Nettleton, P.F., and J.M. Sharp, Vet. Rec. 107. 379 (1980).
179. Kahrs, R.F., J. Amer. Vet. Med. Assoc. 171, 1055-1064 (1977) .
15 180. McLauchlan, J., D. Gaffney, J.L. Whitton, and J.B.
Clements, Nucleic Acids Res. 13., 1347-1368 (1985) .
181. Davison, A.J., EMBO J. 2, 2203-2209 (1983).
182. Todd, D. and J.B. McFerran, Arch. Virol. 86, 167-176 (1985) .
20 183. Diamond, L., Int. J. Cancer 2, 143-152 (1967).
184. Guo, P., S. Goebel, Ξ. Davis, M.E. Perkus, B. Languet.
P. Desmettre, G. Alien, and E. Paoletti, J. Virol. 63.
4189-4198 (1989).
185. Russel, M-, S. Kidd, and M.R. Kelley, Gene 45, 333-338 (1986) .
25 186. Kunkel, T.A., J.D. Roberts, and R-A. Zakour, In:
Methods in Enzymology, Vol. 154, eds. R. Wu, and L.
Grossman (Academic Press, Inc.) pp. 367-382 (1987).
187. Schmitt, J.F.C. and H.G. Stunnenberg, J. Virol. 6 2 f 1889-1897 (1988).
30 188. Pickup, D.J., B.S. Ink, W. Hu, C.A. Ray, and W.K.
Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83., 7698-7702 (1986).
189. Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975).
190. Bucher, D., S. Popple, M. Baer, A. Mikhail, Y.-F. Gong, C. Whitaker, E. Paoletti, and A. Judd, J. Virol. 63, 35 — 3622-3633 (1989).
191. Joklik, W.K., Virology 18, 9-18 (1962).
129 DK 176464 B1 192. Guilhot, S., A. Hampe, L. D'Auriol, and F. Galibert,
Virology 161. 252-258 (1987) .
193. Falkner, F.G., and B- Moss, J. Virol. 62, 1849-1854 (1988) .
5 194. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Gene _65, 123-128 (1988).
195. Dreyfuss, G., S.A. Adam, and Y.D. Choi, Mol. Cell.
Biol. 4, 415-423 (1984).
196. Kennedy, I.M., D.P. Leader, and W.S. Stevely, .7. gen.
Virol. 65, 1621-1624 (1984).
^ 197. Powell, K.L. and D.H. Watson, J. gen. Virol. 29_. 1(:7- 178 (1975).
198. Marsden, H.S., N.D. Stow, V.G. Preston, M.C. Timbury, and N.M. Wilkie, J. Virol. 28, 624-642 (1978).
199. Marsden, H.S., A. Buckmaster, J.w. Palfreyman, R.G .
15 Hope, and A.C. Minson, J. Virol. 50, 547-554 (1984).
200. Zweig, M., S.D. Showalter, S.V. Bladen, C.J. Heilman,
Jr. and B. Hampar, J. Virol. £7. 185-192 (1983).
201. Marshall, R.L., B.A. Israel, and G.J. Letchworth, III., Virology 165. 338-347 (1988).
202. Panicali, D. , S.W. Davis, S.R. Mercer, and E. Paolett.i, 20 J. Virol. 37, 1000-1010 (1981) .
203. Misra V., R. Nelson, and M. Smith, Virology 166. 542-549 (1988).
204. Keller, P.M., A.J. Davison, R.S. Lowe, C.D. Bennett, and R.W. Ellis, Virology 152. 181-191 (1986).
25 205. Bzik, D.J., C. Debroy, B.A. Fox, N.E. Pederson, and S.
Person, Virology 155, 322-333 (1986).
206. Gong, Μ., T. Ooka, T. Matsuo, and E. Kieff, J. Virol.
61. 499-508 (1987).
207. Baer, R., A.T- Bankier, M.D. Biggin, P.L. Deininger, P,J. Farrell, T.J. Gibson, G. Hatfull, G.S. Hudson, ^ S.C. Satchwell, C. Seguin, P.S. Tuffnell, and B.G.
Barrell, Nature 310, 207-211 (1984).
208. Emini, E.A., J. Luka, M.E. Armstrong, P.M. Keller, R.W.
Ellis, and G.R. Pearson, Virology 157, 552-555 (1987).
209. Heineman, T., M. Gong, J. Sample, and E. Kieff, J.
35 Virol. 62, 1101-1107 (1988).
210. Patel, D.D., and D.J. Pickup, Embo J. 6, 3787-3794 (1987).

Claims (13)

130 DK 176464 B1
1. Rekombinant poxvirus, kendetegnet ved, at det, i et ikke-essentielt område af poxvirusgenomet og nedstrøms af en pro mote rsekvens, som er i 5 stand til at fremme ekspressionen af de DNA-indsatte kodede proteiner gennem den rekombinante virus i en vært, indeholder en DNA-indsættelse, som koder for et herpesvirus-glycoprotein valgt blandt herpesvirus equi gp13, et virksomt område af herpesvirus equi gp14, der er et N-terminusafkortet glycoprotein gp14 med en sletning fra aminosyre 2 til og med en vilkårlig 10 aminosyre mellem aminosyre 2 og aminosyre 62, pseudorabiesvirus-glycoprotein gpll, felint-herpesvirus-glycoprotein gB og Epstein-Barr-Virus-glycoprotein gp220, gB eller gH.
2. Rekombinant poxvirus ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 DNA-indsættelsen indeholder DNA, som koder for såvel herpesvirus equi gp13 såvel som en virksom del af herpesvirus equi gp14, og er i stand til at udtrykke dette glycoprotein i en vært.
3. Rekombinant poxvirus kendetegnet ved, at det, i et ikke-essentielt 20 område af poxvirusgenomet og nedstrøms af en promotersekvens, som er i stand til at fremme ekspressionen af proteinerne kodet af DNA-indsættelsen gennem den rekombinante virus i en vært, indeholder en DNA-indsættelse, som både koder for herpesvirus equi glycoprotein gp13 samt herpesvirus equi glycoprotein gp14. 25
4. Rekombinant poxvirus ifølge kravene 1-3, kendetegnet ved, at den rekombinante poxvirus er en rekombinant Vaccinia-virus.
5. Rekombinant poxvirus ifølge kravene 1-3, kendetegnet ved, at den 30 rekombinante poxvirus er en rekombinant avi-poxvirus. 131 DK 176464 B1
6. Rekombinant poxvirus ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den rekombinante avi-poxvirus er en rekombinant fjerkræ-poxvirus eller en rekombinant kanarie-poxvirus.
7. Sammensætning, der er i stand til inducering af et antigen og/eller et immunologisk respons i et værtsdyr, hvis det vaccineres med sammensætningen, kendetegnet ved, at sammensætningen omfatter en rekombinant poxvirus ifølge krav 1 til 6 sammenblandet med et bærestof.
8. Fremgangsmåde til fremstilling af et herpesvirus-glycoprotein ved in vitro infektion af en værtscelle med en rekombinant virus, som er i stand til at udtrykke glycoproteinet i værtscellen, kendetegnet ved, at der anvendes en rekombinant poxvirus ifølge kravene 1-6.
9. Herpesvirus glycoprotein opnået ved udtrykkelse af en rekombinant virus ifølge kravene 1-6, hvorved in vivo udtrykkelse er umuligt, kendetegnet ved, at den rekombinante virus koder for et virksomt område af herpesvirus equi glycoprotein gp14 ifølge definitionen i krav 1.
10. Herpesvirus glycoprotein opnået ved in vivo udtrykkeisen af en rekombinant virus ifølge et af kravene 1-6 i en værtscelle, kendetegnet ved, at den rekombinante virus koder for et virksomt område af herpes equi glycoprotein gp14 ifølge definitionen i krav 1. 25 11. Sæt af vacciner til vaccinering af nyfødt afkom og moderen til dette afkom til forebyggelse af en maternel immunitet i det nyfødte afkom, idet kittet indeholder en første vaccine til vaccinering af moderen før fødslen af afkommet, og en anden vaccine til vaccinering af det nyfødte afkom, kendetegnet ved, at 132 DK 176464 B1 den første vaccine indeholder en første rekombinant poxvirus ifølge krav 1 til 6, som er i stand til, ved vaccination af moderen at udtrykke det indsatte herpesvirus glycoprotein og hvorved 5 den anden vaccine indeholder en anden rekombinant poxvirus ifølge krav 1 til 6, som er i stand til, ved vaccination af afkom at udtrykke det indsatte herpervirus glycoprotein, hvorved det første og andet herpesvirus glycoprotein svarer til hinanden og at det 10 første og andet rekombinante poxvirus er forskellige rekombinante poxvirus som hver i sær er i stand til at inducere et immunologisk respons på det første og andet herpesvirus glycoprotein.
12. Sæt af vacciner til vaccinering af nyfødt afkom og moderen til dette afkom 15 til forebyggelse af en maternel immunitet i afkommet, idet kittet indeholder en første vaccine til vaccinering af moderen før fødslen af afkommet, og en anden vaccine til vaccinering af det nyfødte afkom, kendetegnet ved, at 20 den første vaccine, indeholder en første rekombinant poxvirus ifølge krav 1 til 6, som er i stand til, ved vaccination af moderen at udtrykke det indsatte herpesvirus glycoprotein og hvorved den anden vaccine, indeholder en anden rekombinant poxvirus ifølge krav 1 25 til 6, som er i stand til, ved vaccination af afkom at udtrykke det indsatte herpervirus glycoprotein, hvorved det første og andet herpesvirus glycoprotein er forskellige, men fra samme patogen og at det første og andet rekombinante poxvirus er de samme 30 rekombinante poxvirus som hver i sær er i stand til at inducere et immunologisk respons på det pågældende herpesvirus glycoprotein. 133 DK 176464 B1
13. Anvendelse afen rekombinant poxvirus ifølge ethvert af kravene 1-6 til fremstillingen af et kit ifølge kravene 11 eller 12.
DK199101743A 1989-04-17 1991-10-15 Rekombinant poxvirus og vaccine mod herpesvirus indeholdende dette DK176464B1 (da)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK200701150A DK200701150A (da) 1989-04-17 2007-08-13 Rekombinant poxvirus og vaccine mod herpesvirus indeholdende dette

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33900489A 1989-04-17 1989-04-17
US33900489 1989-04-17
US39448889A 1989-08-16 1989-08-16
US39448889 1989-08-16
US50283490 1990-04-04
US07/502,834 US5338683A (en) 1981-12-24 1990-04-04 Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US9002094 1990-04-16
PCT/US1990/002094 WO1990012882A1 (en) 1989-04-17 1990-04-16 Herpes virus recombinant poxvirus vaccine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK174391D0 DK174391D0 (da) 1991-10-15
DK174391A DK174391A (da) 1991-12-12
DK176464B1 true DK176464B1 (da) 2008-03-31

Family

ID=27407304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK199101743A DK176464B1 (da) 1989-04-17 1991-10-15 Rekombinant poxvirus og vaccine mod herpesvirus indeholdende dette

Country Status (17)

Country Link
US (3) US5338683A (da)
JP (2) JP3083839B2 (da)
KR (1) KR920700289A (da)
AT (1) AT405184B (da)
AU (1) AU625623B2 (da)
BE (1) BE1004369A5 (da)
CA (1) CA2014465C (da)
CH (1) CH682671A5 (da)
DE (2) DE4090565C2 (da)
DK (1) DK176464B1 (da)
FR (1) FR2647808B1 (da)
GB (1) GB2246784B (da)
IE (1) IE61098B1 (da)
IT (1) IT1241119B (da)
LU (1) LU88018A1 (da)
NL (1) NL195016C (da)
WO (1) WO1990012882A1 (da)

Families Citing this family (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US7767449B1 (en) 1981-12-24 2010-08-03 Health Research Incorporated Methods using modified vaccinia virus
US5505941A (en) * 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
GB9014950D0 (en) * 1990-07-06 1990-08-29 Univ Glasgow Ehv-4 glycoprotein vaccine
US5674735A (en) * 1990-07-06 1997-10-07 University Court Of The University Of Glasgow DNA encoding the EHV-4 gH or gC glycoprotein
US7374768B1 (en) * 1990-09-25 2008-05-20 Xenova Research Limited Viral vaccines
EP0550553B1 (en) * 1990-09-25 2000-07-12 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5759552A (en) * 1991-03-07 1998-06-02 Virogenetics Corporation Marek's disease virus recombinant poxvirus vaccine
GB9105383D0 (en) * 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
DE69229390T2 (de) * 1991-08-26 1999-11-11 Immuno Ag, Wien Direkt molekuläre Klonierung eines modifizierten Genoms eines Chordopocken-Virus
ATE253123T1 (de) * 1991-08-26 2003-11-15 Baxter Healthcare Sa Ein intaktes fpv-tk-gen enthaltender rekombinanter virus der vogelpocken
US5869312A (en) * 1992-01-13 1999-02-09 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5925358A (en) * 1993-02-26 1999-07-20 Syntro Corporation Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
US6136318A (en) * 1993-02-26 2000-10-24 Cochran; Mark D. Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
EP0696204A4 (en) * 1993-02-26 1999-03-31 Syntro Corp Recombined chickenpox virus and its use
US6010703A (en) * 1993-07-26 2000-01-04 Board Of Trustees Operating Michigan State University Recombinant poxvirus vaccine against feline rhinotracheitis
DE69535561T2 (de) * 1994-03-30 2008-06-05 Connaught Technology Corp., Greenville NUKLEOTID- UND AMINOSÄURESEQUENZEN gB, gC UND gD DES HERPESVIRUS DES HUNDES UND IHRE VERWENDUNGEN
AU694519B2 (en) * 1994-04-29 1998-07-23 Immuno Aktiengesellschaft Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
EP0979101B1 (en) 1996-07-03 2010-10-27 Merial, Inc. Recombinant canine adenovirus 2 (cav2) containing exogenous dna
US6183752B1 (en) * 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US6224882B1 (en) 1997-11-07 2001-05-01 Protein Science Corp. Insect cells or fractions as adjuvant for antigens
EP1997893A1 (en) 1998-02-24 2008-12-03 Sisters of Providence in Oregon Compositions containing an OX-40 receptor binding agent or a nucleic acid encoding the same and methods for enhancing antigen-specific immune response
ATE512231T1 (de) 1998-02-27 2011-06-15 Univ Pennsylvania Impfstoffe, immuntherapeutika und verfahren zur anwendung derselben
US6344337B1 (en) 1999-02-19 2002-02-05 Board Of Trustees Of Michigan State University Antigen test to detect equine protozoal myeloencephalitis in horse serum and cerebrospinal fluid
KR20010103788A (ko) 1999-03-03 2001-11-23 멕코나시 에블린 에이치. 백신 및 유전자요법 조성물 및 이들의 제조 및 사용방법
WO2000066162A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mutant human cd80 and compositions for and methods of making and using the same
BR0011732B1 (pt) * 1999-06-10 2014-02-04 Vacinas de dna para animais de companhia e de esporte
AU5329300A (en) 1999-06-10 2001-01-02 Michigan State University Feline calicivirus isolated from cat urine and vaccines thereof
AU7108700A (en) 1999-09-02 2001-03-26 Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
US7419668B1 (en) 1999-09-02 2008-09-02 Board Of Trustees Of Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
DK1248646T3 (da) * 1999-12-21 2008-05-19 Merial Sas Præparater og vacciner indeholdende antigen(er) fra cryptosporidium parvum og fra andet enterisk patogen
WO2002006303A2 (en) * 2000-07-14 2002-01-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Dna vaccines encoding hiv accessory proteins
AU2002211524B2 (en) * 2000-10-04 2007-03-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Highly expressible genes
US7628980B2 (en) * 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7097842B2 (en) * 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
WO2002042480A2 (en) * 2000-11-23 2002-05-30 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia ankara virus variant
US20020108132A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-08 Avigenics Inc. Production of a monoclonal antibody by a transgenic chicken
US7541512B2 (en) * 2001-03-30 2009-06-02 Synageva Biopharma Corp. Avians containing a lysozyme promoter transgene
EP1478751A4 (en) * 2001-03-30 2005-10-19 Avigenics Inc LYSOZYM PROMOTER IN BIRDS
US7176300B2 (en) * 2001-03-30 2007-02-13 Avigenics, Inc. Avian lysozyme promoter
US20040037848A1 (en) * 2001-04-06 2004-02-26 Audonnet Jean-Christophe Francis Recombinant vaccine against West Nile Virus
US7740863B2 (en) * 2001-04-06 2010-06-22 Merial Recombinant vaccine against West Nile Virus
FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2004-02-06 Merial Sas Vaccin contre le virus de la fievre du nil
WO2002100317A2 (en) 2001-05-25 2002-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeted particles and methods of using the same
US7550650B2 (en) * 2001-09-18 2009-06-23 Synageva Biopharma Corp. Production of a transgenic avian by cytoplasmic injection
US20100333219A1 (en) * 2001-11-30 2010-12-30 Synageva Biopharma Corp. Methods of protein production using ovomucoid regulatory regions
US7294507B2 (en) * 2001-11-30 2007-11-13 Avigenics, Inc. Ovomucoid promoters and methods of use
US7335761B2 (en) * 2001-11-30 2008-02-26 Avigenics, Inc. Avian gene expression controlling regions
US6875588B2 (en) 2001-11-30 2005-04-05 Avigenics, Inc. Ovomucoid promoter and methods of use
US7135562B2 (en) * 2002-03-14 2006-11-14 University Of Cincinnati Avian iFABP gene expression controlling region
US20040241723A1 (en) * 2002-03-18 2004-12-02 Marquess Foley Leigh Shaw Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
NZ547776A (en) * 2002-04-19 2009-08-28 Bavarian Nordic As Modified vaccinia virus ankara for protecting an animal against an antigen or self-protein
DK1407033T3 (da) * 2002-05-16 2006-05-22 Bavarian Nordic As Intergeniske områder som insertionssteder i genomet af Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA)
PT1434858E (pt) * 2002-09-05 2008-07-28 Bavarian Nordic As Método de amplificação de um poxvírus em condições sem soro
CA2510229A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-08 Aventis Pasteur, Inc. Production of alvac on avian embryonic stem cells
CN1980571A (zh) * 2003-01-24 2007-06-13 阿维季尼克斯股份有限公司 禽类及禽蛋中表达的外源蛋白质
US7262027B2 (en) * 2003-03-14 2007-08-28 Medical College Of Ohio Polypeptide and DNA immunization against Coccidioides spp. infections
EP2390352A1 (en) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
US7468273B2 (en) 2003-05-01 2008-12-23 Meial Limited Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use
NZ570709A (en) * 2003-06-13 2010-04-30 Univ Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
EP1633372B1 (en) 2003-06-13 2011-11-30 The Trustees of The University of Pennsylvania Vaccines, immunotherapeutics and methods for using the same
US20050214316A1 (en) 2003-11-13 2005-09-29 Brown Thomas P Methods of characterizing infectious bursal disease virus
AU2005244673B2 (en) 2004-02-19 2009-12-10 The Governors Of The University Of Alberta Leptin promoter polymorphisms and uses thereof
US20080274140A1 (en) * 2004-11-19 2008-11-06 David B Weiner Vaccines and Methods for Using the Same
CN101223187A (zh) * 2004-11-24 2008-07-16 萨拉普托斯股份公司 用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用
US20080064862A1 (en) * 2004-12-29 2008-03-13 Avigenics, Inc. Transgene expression in a avians
ES2343270T3 (es) 2005-04-25 2010-07-27 Merial Ltd. Vacunas contra el virus nipah.
WO2007012944A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Pfizer Products Inc. Methods of vaccine administration, new feline caliciviruses, and treatments for immunizing animals against feline paraovirus and feline herpes virus
US20080241184A1 (en) 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
US7771995B2 (en) 2005-11-14 2010-08-10 Merial Limited Plasmid encoding human BMP-7
CA2629522A1 (en) 2005-11-14 2007-05-18 Merial Limited Gene therapy for renal failure
US7745158B2 (en) * 2005-12-14 2010-06-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection of secreted aspartyl proteases from Candida species
CA2636867C (en) * 2006-01-13 2015-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines and immunotherapeutics using codon optimized il-15 and methods for using the same
US9259463B2 (en) 2006-01-16 2016-02-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chlamydia vaccine
CA2647566C (en) 2006-03-29 2017-01-03 Merial Limited Vaccine against streptococci
WO2007136763A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Sanofi Pasteur, Inc. Immunological composition
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
CA3184778A1 (en) 2006-07-28 2008-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hiv consensus envelope sequences and methods for using same
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
JP2010525812A (ja) 2007-05-02 2010-07-29 メリアル リミテッド 発現及び安定性が改善されたｄｎａプラスミド
TW200907058A (en) * 2007-05-30 2009-02-16 Wyeth Corp Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins
US20090246226A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 Zeon Corporation Avian vaccines possessing a positive marker gene
JP5744719B2 (ja) * 2008-04-04 2015-07-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア チクングニヤウィルスタンパク質の共通配列、これをコードする核酸分子、並びにこれを使用する組成物および方法
CN105535961A (zh) * 2008-04-04 2016-05-04 宾夕法尼亚大学托管会 使用il-28和组合物的疫苗和免疫治疗及其使用方法
MX2010012069A (es) 2008-05-08 2010-12-14 Merial Ltd Vacuna de la leishmaniasis con el uso del inmunogeno salival de la mosca de la arena.
US8921536B2 (en) 2008-10-29 2014-12-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania HCV vaccines and methods for using the same
AU2008363596B2 (en) 2008-10-29 2015-04-30 Inovio Pharmaceuticals, Inc Improved HCV vaccines and methods for using the same
CA2653478A1 (en) * 2009-01-23 2010-07-23 Gregg Martin Automated wash system for industrial vehicles
US9050287B2 (en) 2009-01-23 2015-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same
US20100192236A1 (en) * 2009-01-28 2010-07-29 University Of South Carolina Modulation of Delta Opioid Receptor Expression
DK2414386T3 (da) 2009-04-03 2016-02-22 Merial Ltd Fuglevacciner med newcastle-sygdomsvirus-vektorer
US20100284977A1 (en) * 2009-04-28 2010-11-11 University Of South Carolina Expression of Anti-Nociceptive Compounds from Endogenously Regulated Promoters
CA2760315C (en) 2009-04-30 2019-05-28 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (Chuv) Modified immunization vectors
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
CN102821790A (zh) 2009-09-14 2012-12-12 宾夕法尼亚大学托管会 包含IL-15受体α和/或编码IL-15受体α的核酸分子的疫苗和免疫治疗剂,以及其使用方法
KR101851699B1 (ko) 2009-11-02 2018-04-24 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 구제역 바이러스(ｆｍｄｖ) 공통 단백질, 이를 위한 코딩 서열 및 이로부터 만들어진 백신
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
CN102781952B (zh) 2010-02-08 2015-09-02 宾夕法尼亚大学托管会 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法
US9109007B2 (en) 2010-08-18 2015-08-18 Purdue Pharma L.P. MHC-I restricted epitopes containing non-natural amino acid residues
PL2611460T3 (pl) * 2010-08-31 2017-02-28 Merial, Inc. Szczepionki przeciw herpeswirusom przenoszone z pomocą wirusa choroby newcastle
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
ES2718846T3 (es) 2010-11-12 2019-07-04 Univ Pennsylvania Antígenos de próstata consenso, molécula de ácido nucleico que los codifica y la vacuna y usos que los comprenden
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
CA2826199A1 (en) 2011-01-31 2012-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecules encoding novel herpes antigens, vaccine comprising the same, and methods of use thereof
EA037377B1 (ru) 2011-02-11 2021-03-22 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Вакцина для индукции иммунного ответа на hbv
US9238679B2 (en) 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
EP2694677A2 (en) 2011-04-04 2014-02-12 Netherland Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
WO2012138789A2 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
WO2012145577A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Merial Limited Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile
EP2701736A1 (en) 2011-04-25 2014-03-05 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
ES2674439T3 (es) 2011-06-01 2018-06-29 Merial, Inc. Administración sin aguja de vacunas contra el VSRRP
JP6117781B2 (ja) 2011-07-11 2017-04-19 イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 交差防御性アレナウイルスワクチンおよびそれらの使用方法
AU2012284558B2 (en) 2011-07-20 2017-06-29 Centre National De La Recherche Scientifique Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
LT2741740T (lt) 2011-08-12 2017-08-10 Merial, Inc. Biologinių produktų, ypatingai vakcinų, vakuuminis konservavimas
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
WO2013033092A2 (en) 2011-09-03 2013-03-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Streptococcus suis pilus antigens
CA2848658C (en) 2011-10-12 2022-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same
WO2013062507A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved hcv vaccines and methods for using the same
KR20140116095A (ko) 2011-12-12 2014-10-01 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Mrsa pbp2a 및 이의 단편들을 포함하는 단백질, 이를 인코딩한 핵산, 및 mrsa 감염을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도
KR102277469B1 (ko) 2011-12-12 2021-07-15 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 개선된 il-12 유전적 컨스트럭트 및 백신을 포함하는 조성물, 면역치료제 및 이를 이용하는 방법
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
WO2013138776A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g
SG11201405847SA (en) * 2012-03-20 2014-10-30 Merial Inc Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein c and uses thereof
EP2836505B1 (en) 2012-04-10 2019-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human respiratory syncytial virus concensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made thereform, and methods of using same
MX360137B (es) 2013-02-21 2018-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas h5 del virus de la influenza h5n1 para usarse como un medicamento.
WO2014165291A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved vaccines for human papilloma virus and methods for using the same
WO2014164697A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Merial Limited Reverse genetics schmallenberg virus vaccine compositions, and methods of use thereof
AU2014228405B2 (en) 2013-03-15 2017-05-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cancer vaccines and methods of treatment using the same
CN114045295A (zh) 2013-03-15 2022-02-15 宾夕法尼亚大学理事会 口蹄疫病毒(fmdv)共有蛋白、其编码序列以及由其制造的疫苗
JP6395855B2 (ja) 2014-04-03 2018-09-26 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド ブタ流行性下痢ウイルスワクチン
AU2015343369B2 (en) 2014-11-03 2018-11-22 Georgia Tech Research Corporation Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
EA201890110A1 (ru) 2015-06-23 2018-05-31 Мериал, Инк. Рекомбинантные вирусные векторы, содержащие минорные белки prrsv, и способы их получения и применения
DK3344289T3 (da) 2015-08-31 2020-04-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pestivirusvacciner mod medfødt tremor
JP2018526454A (ja) 2015-09-16 2018-09-13 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド ブタコレラ菌−ネズミチフス菌ワクチン
KR102618843B1 (ko) 2016-09-20 2024-01-02 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 신규한 ehv 삽입 부위 orf70
KR102566066B1 (ko) 2016-09-20 2023-08-16 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 신규한 돼지 인플루엔자 백신
WO2018057441A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Canine adenovirus vectors
BR112019005418A2 (pt) 2016-09-20 2019-10-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh novos promotores
CA3042584A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof
BR112019009133A2 (pt) 2016-11-03 2019-07-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh vacina contra o parvovírus suíno
CN110545841A (zh) 2017-01-30 2019-12-06 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 猪冠状病毒疫苗
KR20200027479A (ko) 2017-07-12 2020-03-12 베링거 인겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인크. 세네카바이러스 a 면역원성 조성물 및 이의 방법
AR113124A1 (es) 2017-09-23 2020-01-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sistema de expresión de paramyxoviridae
WO2019092027A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sapelovirus immunogenic compositions and uses thereof
US11235044B2 (en) 2017-12-13 2022-02-01 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Cancer vaccines targeting MUC16 and uses thereof
EP3723810A4 (en) 2017-12-13 2022-02-23 Inovio Pharmaceuticals, Inc. ANTI-MESOTHELIN CANCER VACCINES AND THEIR USES
US11338029B2 (en) 2017-12-13 2022-05-24 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Cancer vaccines targeting PRAME and uses thereof
RU2711907C2 (ru) * 2017-12-22 2020-01-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимые фрагменты белков вируса гепатита Е, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е (варианты)
WO2019162294A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
EP3768307A1 (en) 2018-03-19 2021-01-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH New ehv with inactivated ul18 and/or ul8
AU2019239552A1 (en) 2018-03-19 2020-09-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh EHV insertion site UL43
EA202092216A1 (ru) 2018-03-26 2021-06-11 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Способ получения иммуногенной композиции
CN112867505B (zh) 2018-09-20 2024-10-01 勃林格殷格翰动物保健有限公司 经修饰的pedv刺突蛋白
EP3852800A1 (en) 2018-09-20 2021-07-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Intranasal vector vaccine against porcine epidemic diarrhea
WO2021158878A1 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Polypeptides useful for detecting anti-rhabdovirus antibodies
EP4225776A1 (en) 2020-10-05 2023-08-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Fusion protein useful for vaccination against rotavirus
CN116438202A (zh) 2020-10-05 2023-07-14 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 包含圆环病毒科衣壳蛋白的融合蛋白及其构成的嵌合病毒样颗粒
AR128992A1 (es) 2022-04-05 2024-07-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Composición inmunógena útil para la vacunación contra el rotavirus

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1061898A (en) 1963-03-07 1967-03-15 Philips Electronic Pharma Method for protecting dogs against canine distemper
US4722848A (en) * 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4769330A (en) * 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
WO1984002077A1 (en) * 1982-11-30 1984-06-07 Us Health Process for producing poxvirus recombinants for expression of foreign genes
EP0162738A1 (en) 1984-04-09 1985-11-27 MOLECULAR GENETICS RESEARCH & DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP Production of pseudorabies virus subunit vaccines
EP0261940A3 (en) * 1986-09-23 1989-07-05 Applied Biotechnology, Inc. Pseudorabies vaccines and dna vectors for recombination with pox viruses
US5242829A (en) * 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
EP0284416B1 (en) * 1987-03-27 1995-02-22 Nippon Zeon Co., Ltd. Recombinant avipoxyvirus
EP0297924A3 (en) * 1987-07-01 1990-07-11 City Of Hope Recombinant vaccinia virus expressing hsv 1 gb
DE10399031I1 (de) * 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
WO1990001546A1 (en) * 1988-08-05 1990-02-22 Applied Biotechnology, Inc. Equine herpesvirus-1 vaccine
IE71643B1 (en) 1990-11-20 1997-02-26 Virogenetics Corp A recombinant poxviral vaccine for canine distemper

Also Published As

Publication number Publication date
IE61098B1 (en) 1994-09-21
AU625623B2 (en) 1992-07-16
AU5552090A (en) 1990-11-16
US6183750B1 (en) 2001-02-06
NL195016C (nl) 2003-06-10
GB2246784B (en) 1993-04-28
AT405184B (de) 1999-06-25
KR920700289A (ko) 1992-02-19
FR2647808A1 (fr) 1990-12-07
NL9020677A (nl) 1992-02-03
DE4090565T (da) 1992-05-14
GB9120655D0 (en) 1991-11-27
DE4090565C2 (de) 2000-03-09
DK174391D0 (da) 1991-10-15
BE1004369A5 (fr) 1992-11-10
IT9020063A0 (it) 1990-04-17
DK174391A (da) 1991-12-12
JP3246735B2 (ja) 2002-01-15
US5338683A (en) 1994-08-16
CA2014465A1 (en) 1990-10-17
US5482713A (en) 1996-01-09
IE901380L (en) 1990-10-17
LU88018A1 (fr) 1992-03-11
FR2647808B1 (fr) 1995-03-03
CH682671A5 (fr) 1993-10-29
JPH04505248A (ja) 1992-09-17
ATA902590A (de) 1998-10-15
JP3083839B2 (ja) 2000-09-04
IT1241119B (it) 1993-12-29
CA2014465C (en) 1999-06-15
JP2000157292A (ja) 2000-06-13
GB2246784A (en) 1992-02-12
WO1990012882A1 (en) 1990-11-01
IT9020063A1 (it) 1991-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK176464B1 (da) Rekombinant poxvirus og vaccine mod herpesvirus indeholdende dette
LU88000A1 (fr) Systeme de selection d'hotes de poxvirus du recombinaision
US5766599A (en) Trova fowl pox virus recombinants comprising heterologous inserts
US5688920A (en) Nucleotide and amino acid sequences for canine herpesvirus GB, GC and GD and uses therefor
Guo et al. Coexpression by vaccinia virus recombinants of equine herpesvirus 1 glycoproteins gp13 and gp14 results in potentiated immunity
US6605465B1 (en) Methods for avoiding maternal immunity
US6017542A (en) Nucleotide and amino acid sequences of canine herpesvirus GD and uses therefor
CA2259047C (en) Innoculation kits for avoiding maternal immunity
NL195085C (nl) Herpesvirus recombinant pokkenvirus.
AU701599B2 (en) TROVAC fowlpox virus recombinants comprising heterologous inserts

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired