JP3246735B2 - ヘルペスウイルス組換えポックスウイルスワクチン - Google Patents

ヘルペスウイルス組換えポックスウイルスワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本出願は、米国特許出願第３
３９００４号（１９８９年４月１７日出願）の部分継続
出願である米国特許出願第３９４４８８号（１９８９年
８月１６日出願）の部分継続出願である。
【０００２】本発明は、修飾ポックスウイルス並びに該
修飾ポックスウイルスの作成方法と使用方法に関する。
本発明は、より詳細には、ヘルペスウイルス遺伝子産物
を発現するような組換えポックスウイルス並びにヘルペ
スウイルス感染に対する防御免疫を賦与するワクチンに
関する。
【０００３】本出願においては、括弧内のアラビア数字
で示す刊行物を多数引用した。これらの引用文献の詳細
は本明細書の最後の「配列表」の直前に記載した。これ
らの引用文献には、本発明の関連技術分野の技術水準が
記載されている。
【０００４】
【従来の技術】外来遺伝子の挿入及び発現にワクシニア
ウイルス(vaccinia virus)が使用されており、最近で
は他のポックスウイルス(poxvirus)も使用されるように
なっている。生きた感染性ポックスウイルス中に外来遺
伝子を挿入するための基本的技術としては、外来遺伝要
素を挟みこんだドナープラスミド中のポックスＤＮＡ配
列と救援ポックスウイルス中に存在する相同配列との間
の組換えがある（28）。
【０００５】組換えポックスウイルスは、詳細には、米
国特許第４，６０３，１１２号に記載されたワクシニア
ウイルスの合成組換え体の作成法などの公知の二段階法
によって構築されている。
【０００６】最初の段階では、ウイルスに挿入すべきＤ
ＮＡ遺伝子配列（特に非ポックス起源の解読枠(open r
eading frame)）を、ポックスウイルスのＤＮＡ部分と
相同なＤＮＡを予め挿入しておいた大腸菌(E. coli)プ
ラスミド構造体中に導入する。別個に、挿入すべきＤＮ
Ａ遺伝子配列をプロモーターに連結する。このプロモー
ター‐遺伝子連結体を上記プラスミド構造体中に導入し
て、ポックスＤＮＡの非必須遺伝子座のフランキングＤ
ＮＡ配列と相同なＤＮＡで該プロモーター‐遺伝子連結
体の両端が挟み込まれるようにする。得られたプラスミ
ド構造体を次いで大腸菌中で増殖させて増幅し（11）、
単離する（12,20）。
【０００７】第２段階では、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配
列を含有する単離プラスミドを、ポックスウイルスと共
に、培養細胞（例えばニワトリ胚繊維芽細胞）に感染さ
せる。プラスミドとウイルスゲノムに存在する互いに相
同なポックスＤＮＡ間の組換えによって、ポックスウイ
ルスゲノムの非必須領域内に外来ＤＮＡ配列が存在する
修飾ポックスウイルスが得られる。「外来」ＤＮＡとい
う用語は、外在性のＤＮＡ、特に非ポックス起源のＤＮ
Ａで、それらを導入すべきゲノムが通常には産生しない
遺伝子産物をコードするものを指す。
【０００８】遺伝子組換えは、一般的には、２本のＤＮ
Ａ鎖間のＤＮＡの相同部分の交換を意味する。核酸の相
同部分とは塩基配列が同一であるような核酸（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）の部分をいう。
【０００９】遺伝子の組換えは、感染宿主細胞中で新た
にウイルスゲノムが複製又は生産される際に自然に起こ
り得る。従って、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、
２種類以上の異なるウイルス又はその他の遺伝子構造体
に同時に感染した宿主細胞内中で展開されるウイルスの
複製周期の間に起こることもある。第一のウイルスゲノ
ムのＤＮＡと相同なＤＮＡを有する第二のウイルスが同
時に感染した場合、第二のウイルスゲノムの一部分を構
築する際に前者のゲノムに由来するＤＮＡ部分が交換し
て用いられる。
【００１０】ただし、遺伝子の組換えは、異なるゲノム
中の完全には相同とはいえないＤＮＡ部分間でも起こり
得る。仮に、かかる部分の一方が第一のゲノム由来のも
ので、もう一方のゲノムのある部分と相同ではあるが、
前者の相同なＤＮＡ部分中に例えば遺伝マーカー又は抗
原決定基をコードする遺伝子の挿入された非相同部分が
存在していたとしても、組換えは依然として起こり得る
し、その組換え産物も組換えウイルスゲノム中の遺伝マ
ーカー又は遺伝子の存在によって検出できる。
【００１１】かかる感染性修飾ウイルス中での挿入ＤＮ
Ａ遺伝子配列の発現を成功させるためには２つの条件が
必要である。まず第一に、かかる修飾ウイルスが生存し
続けるように挿入をウイルスの非必須領域中で行なう必
要がある。挿入ＤＮＡに関する第二の条件は、該挿入Ｄ
ＮＡに適したプロモーターが存在することである。プロ
モーターは、発現すべきＤＮＡ配列の上流に位置するよ
うに導入しなければならない。
【００１２】ウマヘルペスウイルス(equine herpesvir
us)には２つの亜型(subtype)が存在する。これらは交差
反応性中和エピトープ(cross-neutralizing epitope)
を含んではいるが、それぞれの抗原特性、制限酵素フィ
ンガープリント及びウマに対する病原性によって区別で
きる（1）。ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）
が呼吸器系の疾患、中枢神経系の障害及び古くから知ら
れているヘルペス性流産に関連するのに対して、ウマヘ
ルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）は主に呼吸器系の疾
患だけに関連している。ウマヘルペスウイルスは、アル
ファヘルペスウイルス(alpha herpesvirus)亜科の一種
で、ゲノムの異性化、遺伝子発現の調節、潜伏感染の成
立、欠陥干渉ウイルス粒子の産生、神経障害の誘発並び
にインビトロ発がん性形質転換などのヒトヘルペスウイ
ルス(human herpesvirus）に特徴的な生物学的及び生
化学的性質を示す（1,4,23）。従って、ＥＨＶはヘルペ
スウイルス感染に関する種々の生物学的因果関係の研究
に好適に使用できる。
【００１３】ヘルペスウイルス(herpesvirus)の糖タン
パク質は、例えば細胞への付着及び侵入、細胞間におけ
るウイルスの伝播などのウイルスの基本的機能を媒介
し、さらに感染時の病原性をも決定する。ヘルペスウイ
ルスの糖タンパク質は、宿主免疫系との相互作用に決定
的な役割を果たす構成要素である（36,37）。
【００１４】単純ヘルペスウイルス(herpes simplex
virus)の糖タンパク質で十分に特徴付けられているもの
としては、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ、ｇＧ、ｇＨ
及びｇＩが挙げられる（36,37,49-55）。数多くの研究
から免疫反応の誘起に対する単純ヘルペスウイルス糖タ
ンパク質の重要性が指摘されている（6,8,13,18,21,22,
26,27,30,44,46,47）。ｇＣがクラスＩ認識(Class I
restricted)細胞障害性リンパ球を活性化し得るのに対
して（15,32）、ｇＤはクラスII細胞障害性Ｔ細胞の応
答を活性化し得る（21,22,44,46,47）。ｇＧは、補体依
存性抗体によって支配されるウイルス中和反応の標的と
なることが示されている（38,39）。その他のヘルペス
ウイルス由来の数多くの糖タンパク質についても、重要
な免疫反応を誘起することが示されている（5,10,36,5
6）。
【００１５】ＥＨＶの２つの亜型は共に６種類の主要糖
タンパク質を発現する（1,3,43）。ｇｐ２、ｇｐ１０、
ｇｐ１３、ｇｐ１４、ｇｐ１７／１８及びｇｐ２１／２
２ａをコードするＤＮＡ配列のゲノム部分が、λｇｔ１
１発現ベクターとモノクローナル抗体を用いて決定され
ている（3）。糖タンパク質ｇｐ１３とｇｐ１４はゲノ
ムＬ領域内の、それぞれ単純ヘルペスウイルスのｇＣと
ｇＢ相同物の位置する場所と同じ位置に位置している。
ＥＨＶ−１は、その６種類の主要糖タンパク質のうちの
５種類がゲノムＬ領域内の塩基配列によってコードされ
ており、１種類（ｇｐ１７／１８）だけしかＵＳ領域に
ないという点で、糖タンパク質遺伝子の位置の判明して
いるアルファヘルペスウイルスの中では独特である。こ
れらのデータの解析から、ＥＨＶ−１ウイルス粒子の余
り豊富には存在しない既同定糖タンパク質の若干、さら
には未同定のＥＨＶ−１糖タンパク質が、ゲノムＳ領域
に位置していることが予想されている（3）。エンベロ
ープの糖タンパク質はヘルペスウイルスの主たる免疫原
であって、宿主の体液性免疫及び細胞性免疫反応双方の
誘起に関与しており（5,8,73〜75）、ワクチンの設計を
試みる者にとっては非常に関心のあるものである。
【００１６】ケンタッキー(Kentucky)Ｔ４３１株のｇｐ
１３をコードするＥＨＶ−１転写単位の塩基配列が最近
報告されている（2）。この解読枠(open reading fra
me)は４６８残基のアミノ酸からなる５１kDaの１次翻訳
産物をコードする。このタンパク質は膜貫通性タンパク
質に特有の性質を有しており、タンパク質のシグナルペ
プチドと思われる部分と膜貫通性アンカー部分との間の
膜表在性ドメインに９カ所の潜在的Ｎ−グリコシル化部
位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が存在している
（2）。この糖タンパク質は単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ）のｇＣ−１及びｇＣ−２、仮性狂犬病ウイルス
（pseudorabies virus，略してＰＲＶ）のｇIII、並び
に水痘帯状疱疹ウイルス（varicella-zoster virus，
略してＶＺＶ）のｇｐVと相同であることが判明してい
る（2）。従って、ＥＨＶ−１のｇｐ１３は構造上ヘル
ペスウイルスｇＣ様糖タンパク質の相同物である。
【００１７】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４の塩基配列が最近報
告された（71,72）。ｇｐ１４糖タンパク質の予想アミ
ノ酸配列の解析から、ＨＳＶの糖タンパク質ｇＢとかな
りの相同性を有していることが判明した。
【００１８】幾つかのＥＨＶ−１糖タンパク質に対する
モノクローナル抗体が中和抗体であることが示されてい
る（76）。受動免疫実験によって、ｇｐ１３もしくはｇ
ｐ１４に対するモノクローナル抗体（77）又はｇｐ１
３、ｇｐ１４もしくはｇｐ１７／１８に対するモノクロ
ーナル抗体（78）が、致死量のウイルスからハムスター
を防御できることが実証された。その他のｇＢ及びｇＣ
糖タンパク質アナログもアルファヘルペスウイルスに起
因する病気の防御機構に関与している（8,10,73）。Ｅ
ＨＶ−１のｇｐ１７／１８糖タンパク質は、これとは別
の潜在的防御免疫原として特徴付けられるが、他のアル
ファヘルペスウイルスのＳ領域にコードされた幾つかの
糖タンパク質の中でこれと構造的に対応するものは未だ
に発見されていない（66,79,80）。ｇｐ１７／１８はそ
のゲノム内の位置に基づいてＨＳＶｇＥアナログらしい
と推測されている。
【００１９】アルファヘルペスウイルスの一種である仮
性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）はアウジェスキー病の原因
となる病原体である。この病気は感染力が非常に強く、
養豚産業に多大な経済的損失をもたらす。この病気は子
豚の罹患率と致死率が高く、重い呼吸器系疾患、流産、
一度に生まれる子豚の数の減少、並びに生き残った豚の
成長速度の低下によって特徴付けられる。感染によって
致命的な脳炎に至ることもしばしばある。ヘルペスウイ
ルスに特徴的なウイルスの潜伏感染が成立することもあ
るが、この場合回復した成豚はウイルスの慢性キャリヤ
ーとなる。最近の詳細な総説としては、ウィットマン(W
ittman)及びジーハ(Rziha)のもの（81）を参照された
い。
【００２０】ＰＲＶゲノムは９０×１０６ダルトンの二
本鎖ＤＮＡで構成されており（82）、逆方向反復配列に
よってユニークロングセグメント（ＵＬ）とユニークシ
ョートセグメント（ＵＳ）とに隔てられている。ＰＲＶ
ゲノムはおよそ１００個のポリペプチドをコードしてお
り、それらの発現は他のヘルペスウイルスと同様にカス
ケード式に調節されている（85,86）。現在までのとこ
ろ、５種類の糖タンパク質ｇｐI、ｇｐII、ｇｐIII、ｇ
ｐ６３及びｇｐ５０がこのウイルスのエンベロープに関
連しており、さらにＰＲＶ感染細胞の種々の膜構造にも
関連していることが示されている（80,86〜91）。ＰＲ
Ｖにコードされた６番目の糖タンパク質（ｇX）は培地
中に放出される（92）。これらの糖タンパク質のＰＲＶ
ゲノム上での位置並びにそれらのＤＮＡ配列は現在公知
である（62,80,91〜98）。他のヘルペスウイルスの場合
と同様に、ＰＲＶ糖タンパク質は、細胞への付着及び侵
入並びに細胞からの放出のようなウイルスの基本的機能
を媒介している。ＰＲＶ糖タンパク質はＰＲＶ感染時の
病原性に非常に重要な役割を果たしており、しかも病気
の消散及び免疫状態に決定的な役割を果たす構成要素で
ある。
【００２１】ＰＲＶ ｇｐIはウイルスのインビトロ(in
vitro)及びインビボ(in vivo)での複製には必須でな
く、弱毒化ＰＲＶ株の多くには存在していない（99）。
これらのｇI欠失株が弱毒性であることは、gIが毒性に
何等かの役割を果たしている可能性のあることを示唆し
ている（99,100）。ただし、ｇIが発現しただけではさ
ほど強い毒性を生じないので、他のＰＲＶタンパク質も
この機能に関与しているらしい（100）。
【００２２】ＰＲＶに対する免疫反応の誘起においてｇ
Iの果たす役割は明らかでない。ｇIに対するモノクロー
ナル抗体はインビトロでウイルスを中和し（100）、受
動免疫マウスを致死量のＰＲＶから防御する（81）。ワ
クシニアウイルス組換え体中で、ＰＲＶ由来ｇｐIを単
独又はｇｐ５０及びｇｐ６３と一緒に発現させること
が、コスト(Kost)他によって記載されている（98）。ワ
クシニア組換え体をマウス頭蓋骨に接種すると、特にＰ
ＲＶ ｇｐIをｇｐ５０及びｇｐ６３と一緒に発現させ
た場合に毒性が増大する。
【００２３】しかしながら、ブタにおいてはｇｐIに対
する中和抗体は産生されない（5）。さらに、ＰＲＶ
ｇｐIにコードされるポリペプチドを発現する組換え体
ワクシニアウイルス（98）はマウスを（野生型ワクシニ
アの対照の与える防御と比較して）致死量のＰＲＶから
防御しない。これらの事実を参酌すると、ＰＲＶ ｇｐ
Iはサブユニットワクチンの構成成分としてよりも、む
しろ診断用プローブとして適しているものと思われる。
【００２４】ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ６３は、ＰＲＶゲ
ノムのＵ８領域内のｇｐ５０の隣に位置している（8
0）。ＰＲＶ ｇｐ６３のコード鎖は、ｇｐ５０の終止
コドンの約２０ヌクレオチド上流に位置する３つの連続
したＡＴＧコドンで始まる。転写シグナルと認め得るモ
チーフは存在せず、おそらくｇｐ５０と同じ転写物から
翻訳されるものと思われる。ＰＲＶのｇｐ６３はインビ
トロでは必須ではない（88）。コスト(Kost)他の報告
（98）によれば、ＰＲＶ ｇｐ６３がＰＲＶ ｇｐ５０
との連続ＤＮＡ配列としてワクシニアウイルス中で発現
した。この研究ではＰＲＶのｇｐ６３とｇｐ５０のそれ
ぞれの寄与を別個に分析していないので、ＰＲＶ ｇｐ
６３がＰＲＶ感染に対するマウスの防御において如何な
る寄与を果たしているかは評価し難い。
【００２５】ＰＲＶ糖タンパク質ｇXは非構造糖タンパ
ク質であり、その最終産物は細胞外液中に分泌される
（85,92）。ＰＲＶのｇXに対するポリクローナル血清又
はモノクローナル血清のいずれを用いてもインビトロで
のＰＲＶの中和は起こらず（102,103）、サブユニット
ｇXワクチンは感染に対して非防御性であった（104）。
【００２６】ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ５０は、単純ヘル
ペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のｇＤアナログである
（97）。そのＤＮＡ解読枠は４０２残基のアミノ酸をコ
ードする（95）。グリコシル化された成熟型（５０〜６
０kDa）はＯ−結合による炭水化物を含んでいるが、Ｎ
−グリコシル結合は含んでいない（95）。ブタ血清はＰ
ＲＶ ｇｐ５０と強く反応し、その免疫原としての重要
性を示唆している。ｇｐ５０に対するモノクローナル抗
体はインビトロにおいて補体と共に或いは補体なしでＰ
ＲＶを中和し（97,105,106）、マウス（102,105,106）
及びブタ（102）を受動的に防御する。ｇｐ５０を発現
するワクシニアウイルス組換え体は血清中和抗体を誘発
し、致死量のＰＲＶに対してマウス及びブタを防御する
（98,107,108）。
【００２７】ＰＲＶ ｇｐIII遺伝子はゲノムのＵＬ領
域に位置している。１４３７bpの解読枠は４７９残基の
アミノ酸をコードする。予想される５０．９kDaの１次
翻訳産物は８カ所の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有す
る（96）。ＰＲＶ ｇｐIIIはＨＳＶ−１ ｇＣアナロ
グである（96）。ＰＲＶ ｇｐIIIをＨＳＶ ｇＣで機
能的に置き換えることはできなかった（109）。ＰＲＶ
ｇｐIIIはインビトロにおける複製には非必須であるが
（110,111）、グリコシル化された成熟型（９８kDa）は
ＰＲＶエンベロープの主要構成成分である。抗ｇｐIII
モノクローナル抗体はインビトロにおいて補体と共に或
いは補体なしでウイルスを中和し（86,106,110）、マウ
ス及びブタを受動的に防御する（102）。ＰＲＶ糖タン
パク質ｇIIIは、大腸菌（欧州特許出願第０１６２７３
８号）又はワクシニア組換え体（欧州特許出願第０２６
１９４０号）中で発現させたＣｒｏ／ｇIII融合タンパ
ク質による免疫後、致死量のＰＲＶに対してマウス及び
ブタを防御する。
【００２８】ＰＲＶエンベロープの主要構成成分の一つ
として、ハンプル(Hampl)の命名法によればＰＲＶ ｇ
ｐIIと名付けられている３種類の糖タンパク質のジスル
フィド結合複合体（１２０kDa、６７kDa及び５８kDa）
がある。ＰＲＶ ｇｐIIをコードするＤＮＡ配列はＵＬ
の左端に位置している。２９７６個のヌクレオチドから
なる解読枠は、９１３残基のアミノ酸からなる（１１０
kDa）１次翻訳産物をコードしている。ＰＲＶのｇｐII
はＨＳＶ−１ ｇＢ相同物である（62）。ＰＲＶ ｇｐ
IIに対するモノクローナル抗体はインビトロにおいて
（5）補体と共に或いは補体なしで（81）ウイルスを中
和する。さらに、受動免疫実験の結果、中和モノクロー
ナル抗体はブタを部分的に防御したが、ビルレントウイ
ルス感染からマウスを防御することはできなかった（10
2）。ＰＲＶのｇｐII糖タンパク質によるブタの能動免
疫はこれまで報告されていない。
【００２９】ここ２０年間、単純ヘルペスウイルス２型
（ＨＳＶ２）による陰部感染の発生率は大幅に上昇し
た。最近の推計では、米国内で５百万人から２千万人が
陰部ヘルペスを保有している（112）。ＡＣＧ(acyclovi
r)による経口治療によって１次感染の重篤度が減少し
（113）かつ再発的な症状の再現が抑制される（114）こ
とが示されてはいるが、これらの感染症の制御及び治療
は理想からはほど遠い。従って１次感染及び再発感染を
防ぐワクチンが必要である。
【００３０】単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ゲ
ノムは少なくとも８種類の抗原性の異なる糖タンパク
質、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ及びｇ
Ｊをコードしている（115）。これらの遺伝子に相同な
遺伝子がＨＳＶ2に存在するらしい（116〜119）。これ
らの糖タンパク質はウイルス粒子のエンベロープと感染
細胞の細胞質膜の両方に存在するので、体液性免疫防御
反応及び細胞性免疫防御反応を誘起し得る（37）。
【００３１】単純ヘルペスウイルス感染に対する防御に
おける体液性免疫と細胞性免疫の相対的重要性は十分に
は解明されていない。ＨＳＶ１の精製ｇＢ、ｇＣ又はｇ
Ｄで免疫したマウスは致死量のＨＳＶ１感染から防御さ
れる（120）。ＨＳＶ１（121）もしくはＨＳＶ２ウイル
ス全体（122）に対する抗体又はＨＳＶ２の糖タンパク
質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤもしくはｇＥの各々に対する抗体
（123）で受動免疫したマウスは致死量のＨＳＶ１又は
ＨＳＶ２感染から防御される。ただし、放射線照射、シ
クロホスファミド又は抗胸腺細胞血清で免疫抑制した動
物は防御されないので（124）、この防御は受容能を有
するＴ細胞の応答(competent T-cell response)に依
存しているらしい。
【００３２】免疫防御反応の誘起において、個々の糖タ
ンパク質が如何なる寄与をしているかはまだ十分には理
解されていない。ただし、これらの糖タンパク質をワク
シニアなどの異種系中で発現させることによって若干の
要因が解析できるようになった。例えばＨＳＶ１ ｇＢ
（125）又はＨＳＶ１ ｇＣ（32）を発現するワクシニ
アウイルスベクターは細胞障害性Ｔ細胞応答を誘起する
ことが示されている。さらに、ＨＳＶ１ ｇＢ（8）、
ＨＳＶ１ ｇＣ（126）又はＨＳＶ１ ｇＤ（26）のい
ずれかを発現する組換えワクシニアウイルスで免疫した
マウスは、致死量のＨＳＶ１に対して防御されることが
示されている。ＨＳＶ１ ｇＤを発現する組換えワクシ
ニアウイルスは、また、モルモットを用いたモデル系に
おいて、ＨＳＶ２に対する防御力のあることが示されて
いる（44）。しかしながら、多重ＨＳＶ抗原を発現させ
たときに上記防御反応が強化されるか否かは不明であ
る。
【００３３】ウシヘルペスウイルス１型（bovine herp
esvirus type 1，略してＢＨＶ−１）は結膜炎、外陰
部腟炎及び流産などの畜牛の種々の病気の病原体である
（127）。このウイルスはウシ呼吸器病の最も重要な病
原体の一つであり、直接作用することもあるし、細菌感
染に対する素因病原体として作用することもある（12
8）。
【００３４】ＢＨＶ−１には３０種類以上の特異的構造
ポリペプチドが存在し、そのうちの１１種類はグリコシ
ル化されている（129）。これらの糖タンパク質のうち
の４つ、即ちｇI、ｇII、ｇIII及びｇIVが既に特徴付け
られており、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タン
パク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及びｇＥの相同物であることが
判明している（130,131）。
【００３５】ｇI、ｇIII及び／又はｇIVからなるサブユ
ニットワクチンが畜牛を病気から防御することは（ＢＨ
Ｖ／パスツリア・ヘモリティカ(Pasteurella haemolyt
ica)エーロゾル感染モデル系を用いて）示されている
が、感染を防ぐことはできない（132）。これらの結果
は、ＢＨＶ−１に対する免疫反応を十分に誘起する上で
のこれらの糖タンパク質の重要性を示している。
【００３６】ｇI及びｇIIIはワクシニアウイルスにもク
ローン化されており、これらの組換え体で免疫した畜牛
はＢＨＶ−1に対する中和抗体を産生する（56,133）。
【００３７】ネコの鼻気管炎は世界中に蔓延している猫
の病気であって、ネコヘルペスウイルス１型（feline
herpes-virus type 1，略してＦＨＶ−１）と名付け
られたアルファヘルペスウイルスによって引き起こされ
る。他のヘルペスウイルスと同様に、ＦＨＶ−１は潜伏
感染を成立し、周期的に再活性化される（134）。繁殖
集団中でのＦＨＶ−１感染は子猫の死亡率が高いことを
特徴とする。上部気道で２次感染が起きると成体を非常
に衰弱させる。修飾生ワクチン又は不活性ワクチンを用
いてこの病気を制御する試みが現在なされている。かか
るワクチンは症状の発展を抑制することはできるが、感
染を防ぐことはできず、ウイルスが発散してしまう。従
って、無症状のワクチン接種猫はビルレントウイルスを
伝播することがあり、既存のワクチン（135）又は開発
中のより安全な精製サブユニットワクチン（136,137）
では潜伏感染を防ぐことはできない。
【００３８】ヘルペスウイルス糖タンパク質は宿主細胞
へのウイルス粒子の付着を媒介し、ウイルスの感染力に
非常に重要である（138,139）。これらはウイルスの亜
型特異性をも決定する（140）。ヘルペスウイルス糖タ
ンパク質抗原は体液性及び細胞性免疫系の双方によって
認識され、ワクチン接種した宿主中での免疫防御反応を
誘発することが示されている（44,107,141,142）。ＦＨ
Ｖ−１は少なくとも２３種類の異なるタンパク質を含ん
でいる（143,144）。これらの中の少なくとも５種類の
タンパク質がグリコシル化されており（144,145）、そ
れらの分子量は１２０kDaから６０kDaの範囲にあると報
告されている。ＦＨＶ−１糖タンパク質は免疫原性を有
することが示されている（143,145）。
【００３９】幾つかの他のアルファヘルペスウイルスと
同様、ＦＨＶ−１はＨＳＶ−１の糖タンパク質Ｂ（ｇ
Ｂ）の相同物を有するらしく、ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子
の部分的塩基配列が最近報告された（146）。ＨＳＶ−
１ ｇＢはウイルスの侵入及び細胞融合に必要とされる
（147〜149）。ＨＳＶ−１ ｇＢ及び他のヘルペスウイ
ルスのｇＢアナログは重要な循環抗体並びに細胞性免疫
反応を誘起する（8,10,37,47,73,150）。ＦＨＶ−１の
ｇＢ糖タンパク質は１３４kDaの複合体で、β-メルカプ
トエタノールによって６６kDaと６０kDaの２つの糖タン
パク質に解離する。ＦＨＶ−１のＤＮＡゲノムの大きさ
はおよそ１３４Kbである（153）。
【００４０】ヒトＢリンパ球指向性ヘルペスウイルスで
あるエプスタイン・バールウイルス（Epstein−Barr v
irus，略してＥＢＶ）は、ガンマヘルペスウイルス(gam
maherpesvirus)亜科のリンホクリプトウイルス属(Lymph
ocryptovirus)の一種である（115）。このウイルスは伝
染性単核症（154）及びＢ細胞リンパ腫（156）の病原体
である。ＥＢＶは２種類のヒトの悪性腫瘍、即ち風土的
なバーキットリンパ腫並びに未分化上咽頭がんと関係し
ている（156）。
【００４１】ＶＺＶ（66）及びＨＳＶ１（158）のゲノ
ムと同様にＥＢＶゲノムの塩基配列は完全に決定されて
おり（207）、これらの異なるヘルペスウイルス間にお
ける多くの相同性が判明している（159）。かかる相同
性に基づいてＥＢＶの幾つかの解読枠（open reading
frame；略してＯＲＦ）の潜在的機能が予想されたこと
もある。免疫に関連するＨＳＶ１遺伝子と相同なＥＢＶ
遺伝子が特に興味深い。ＥＢＶ ＢＡＬＦ４遺伝子はＨ
ＳＶ１ ｇＢ（68）と、ＥＢＶ ＢＸＬＦ２遺伝子はＨ
ＳＶ１ ｇＨ（161）と相同性を有している。また、Ｅ
ＢＶ ＢＢＲＦ３遺伝子はＣＭＶの膜タンパク質（16
2）との相同性部位を含んでいる。
【００４２】ＥＢＶタンパク質の中でワクチン抗原とし
て使用できそうなもののうち最も特徴付けられているの
は、２つの主要エンベロープ糖タンパク質、即ちｇｐ３
４０とｇｐ２２０である。この２つの糖タンパク質は同
一の遺伝子からスプライシングによって得られる。この
とき読取り枠に変化はない（163,164）。ｇｐ３４０に
対するモノクローナル抗体及びポリクローナル血清はイ
ンビトロでＥＢＶを中和する（165）。精製ｇｐ３４０
（166）並びに組換えＥＢＶ ｇｐ３４０ワクシニアウ
イルス（167）で免疫するによって、唯一の罹患性動物
である綿毛タマリン(cottontop tamarin)を防御するこ
とができる。この場合、ワクシニアＷＲ株由来の組換え
体では防御できたが、ワクシニアのワイエス(Wyeth)株
由来の組換え体では防御できなかった。ワイエス株はワ
クチン株として広範に使用されているものである。
【００４３】ｇｐ８５（ＥＢＶにおけるＨＳＶ１ ｇＨ
相同物）に対するモノクローナル抗体はインビトロ中和
抗体であると記載されている（168,169）。
【００４４】ヒトサイトメガロウイルス（human cytom
egalovirus，略してＨＣＭＶ）は、ベータヘルペスウイ
ルス(betaherpes virus)亜科（ヘルペスウイルス科）
の一種である。ＨＣＭＶは、特異的免疫が実質的に成立
していても、増殖性の持続感染を生じ得る。ＨＣＭＶは
普通余り高い病原性は有さないとはいっても、子宮内感
染は新生児全体の約０．１５％に脳障害又は難聴をもた
らし、かつ臓器移植時の最も一般的な感染性合併症であ
る（170）。実験的な弱毒化生ＨＣＭＶワクチン（タウ
ン(Towne)株）の効能が実証されてはいるものの（17
1）、生ワクチン株についての懸念から、サブユニット
ワクチンとして使用可能なＨＣＭＶタンパク質の同定に
研究が方向付けられている。かかる研究においては、ウ
イルス粒子の糖タンパク質の同定並びにそれらの予防薬
としての評価が重要なステップとなる。
【００４５】ＨＣＭＶエンベロープ関連糖タンパク質と
して免疫学的に区別される３つの群が記載されている
（172）。即ち、ｇＣI（ｇｐ５５及びｇｐ９３−１３
０）、ｇＣII（ｇｐ４７−５２）及びｇＣIII（ｇｐ８
５−ｐ１４５）である。
【００４６】ｇＣIをコードする遺伝子はＨＳＶ１ ｇ
Ｂと相同である。ｇＣII糖タンパク質は、直列に配置さ
れかつ１カ所もしくは２カ所の相同性領域を有する５つ
の遺伝子のファミリー（ＨＸＬＦ）でコードされてい
る。ただし、ｇＣIIは５つの遺伝子の中の２つの遺伝子
だけでコードされている可能性が高い（172,173）。ｇ
ＣIIIをコードする遺伝子はＨＳＶ１ ｇＨと相同であ
る（174）。
【００４７】上記の３つの群のそれぞれに対して特異的
なインビトロ中和抗体が記載されている（174〜176）。
【００４８】ヘルペスウイルス抗原に対する抗体の産生
（宿主による）を誘起する抗原決定基として宿主中で発
現するような外来ウマヘルペスウイルス遺伝子を保有す
る適切に修飾されたポックスウイルス変異株は、新規ワ
クチンを与えるが、かかる新規ワクチンは従前の死滅又
は弱毒化生ウイルスを用いるワクチンの欠点を有さな
い。従って、例えば死滅ウイルスからワクチンを生産す
るには、大量のウイルスを増殖させ、次いで抗原性に影
響を与えずにその感染力を選択的に破壊処理する必要が
ある。一方、弱毒化生ウイルスを含有するワクチンに
は、該弱毒化ウイルスが病原状態に復帰する可能性が常
に存在する。これに対して、病原性ヘルペスウイルスの
抗原決定基をコードするウマヘルペスウイルス遺伝子で
適切に修飾した組換えポックスウイルスをワクチンとし
て用いる場合、かかるポックスウイルスは病原性ウイル
スの抗原決定基をコードする遺伝子しか含んでおらず、
病原体の複製を担う遺伝子部分は含んでいないので病原
性ウイルスに復帰する可能性はない。
【００４９】ＰＲＶは多くの哺乳類（牛や犬など）に感
染してその命を奪う。しかしながら、成豚は感染しても
通常は生き残るので、重要なウイルス保菌宿主である。
ＰＲＶは多大な経済的損失をもたらすので、弱毒化又は
死滅ワクチンによる豚のワクチン接種は多くの国々で行
なわれている。
【００５０】豚のＰＲＶ感染を抑制し、かつ経済的損失
を軽減する試みは、修飾生ワクチン又は不活化ワクチン
を用いる能動免疫によって行なわれてきた。弱毒化ワク
チンは一般に長期間持続する免疫を誘起し、価格面での
効果も高いが、弱毒化が不十分である危険性や遺伝的に
不安定である危険性がある。不活化ワクチンは有効性が
低く、何度も免疫する必要があり、強いアジュバントを
含んでいるのが普通である。このようなアジュバントを
配合すると、ワクチン接種後に食欲不振、高熱又は妊娠
中の雌豚の流産などのアレルギー反応を起こす場合があ
る。かかるタイプのワクチンにはさらに、潜伏感染の予
防、ワクチンの効能に対する母性抗体の効果の克服、並
びにワクチン接種動物をＰＲＶ既感染動物から識別する
ための血清学的診断検定の使用の可能性の消失の面で欠
点がある。
【００５１】免疫学的関連性を有するＰＲＶ遺伝子産物
を発現する組換えポックスウイルスの使用などのような
別のワクチン法には、(a) 場から弱毒化生ＰＲＶワク
チン株を排除できること、並びに(b) ワクチン接種動
物と感染もしくは血清学的陽性動物との識別ができるこ
となどの、幾つかの利点がある。後者は、ワクチン接種
動物を自然感染動物と正確に識別するような適当な診断
薬を使用することによって達成できる。このことは、血
清学的に陽性な動物の移動を取締まる規制が存在するの
で、考慮すべき重要な事項である。ワクチン接種は、さ
らに、ある集団から感染動物を試験し排除するのに、よ
り経済的で都合がよい。かかるワクチンの開発には、防
御免疫を誘起する際のＰＲＶ抗原の寄与に関する知識を
必要とする。ＰＲＶの場合は、ヘルペスウイルス科の他
のウイルスと同様に、糖タンパク質が、有効なサブユニ
ット組換えワクチン中に存在せしめるべき抗原の重要候
補である。
【００５２】最近、ワクシニアウイルス組換え体の作成
技術が、ポックスウイルス科のさらに宿主域の限定され
た他のウイルスにまで拡張された。特に、鳥類の中で複
製するアビポックスウイルスが、免疫学的関連性を有す
る遺伝子産物を発現するように遺伝子工学的に組換えら
れている。アビポックス組換え体を鳥類（42,177）及び
非鳥類（41）に接種すると、対応する病原体に対する免
疫防御反応を誘起する。
【００５３】ＢＨＶ−１に対する弱毒化生ワクチン及び
不活化ワクチンは、３０年以上も利用されておりＢＨＶ
−１関連病の発生率を十分に低下させてきた。しかしな
がら、これらのワクチンは潜伏感染や野生型ウイルスに
よる再感染を予防しない。これらのワクチンは、感染動
物とワクチン接種動物との識別を複雑化させる。
【００５４】どちらのタイプのワクチンも他の重大な欠
点を有する。妊娠中の雌牛に弱毒化生ワクチンを接種す
ると、胎児が死んで流産することもある（127）。さら
に、ワクチン接種動物はウイルスを発散することが示さ
れている（178）。従って、妊娠中の雌牛と一緒に飼育
しているワクチン接種動物は、妊娠中の雌牛に感染性ウ
イルスを伝播し、胎児を流産させてしまうこともある。
【００５５】不活化ワクチンは流産を誘発したりウイル
スの放出を引き起こすことはない。しかしながら、不活
化ワクチンはアジュバントを必要とし、過敏症（アナフ
ィラキシー）及び非致命的炎症及び発熱を引き起こす場
合がある（179）。
【００５６】ワクチン接種における最も重要な問題の一
つは、母性免疫を克服もしくは回避することである。こ
れに関して、仮に母親がある特定の病原体に対する免疫
を獲得していると、母親における「免疫」は初乳中に存
在する抗体及び／又は他の経路を介して新生児に伝達さ
れる。しかしながら、新生児には母性免疫のレベルが十
分に薄れるまでワクチン接種してもうまくいかない。従
って、効能をなくすような母性免疫の存在下で新生児に
成功裡にワクチン接種することのできる余地は僅かしか
ない。
【００５７】従って、ヘルペスウイルス組換えポックス
ウイルス並びにヘルペスウイルス感染に対して防御免疫
を賦与するワクチンを提供することは、現技術に生ウイ
ルス接種の利点を与え、かつ上述の問題を軽減もしくは
解消するものであって、現在の技術水準をはるかに超え
た進歩である。
【００５８】
【発明が解釈しようとする課題】本発明の目的は、従っ
て、ヘルペスウイルスの遺伝子産物を発現するような組
換えポックスウイルスを供すること、並びにかかる組換
えポックスウイルスの作成方法を供することである。
【００５９】ポックスウイルスベクター、特にワクシニ
アウイルス、ニワトリポックスウイルス(fowlpox viru
s)又はカナリアポックスウイルス(canarypox virus)ベ
クター中でヘルペスウイルスのコード配列をクローニン
グ及び発現のための方法を供することも本発明の別の目
的の一つである。
【００６０】致死量のヘルペスウイルス感染に対して、
ヘルペスウイルス中和抗体及び防御免疫を誘起すること
のできるワクチンを供することも本発明のまた別の目的
である。
【００６１】本発明の上記及びその他の目的と利点は、
本明細書の以下の記載に照らせば、よりいっそう容易に
理解できるはずである。
【００６２】
【課題を解決するための手段】本発明は、その一つの態
様において、ポックスウイルスゲノムの非必須領域中に
ヘルペスウイルス由来のＤＮＡ配列を含有する組換えポ
ックスウイルスに関する。好適には、上記ヘルペスウイ
ルスはアルファヘルペスウイルス亜科、ベータヘルペス
ウイルス亜科又はガンマヘルペスウイルス亜科の一種で
ある。詳細には、上記ヘルペスウイルス由来のＤＮＡ配
列はヘルペスウイルス糖タンパク質をコードする。より
詳細には、上記ヘルペスウイルス糖タンパク質は、ウマ
ヘルペスウイルスｇｐ１３、ウマヘルペスウイルスｇｐ
１４、ウマヘルペスウイルスｇＤ、ウマヘルペスウイル
スｇｐ６３、ウマヘルペスウイルスｇＥ、仮性狂犬病ウ
イルスｇｐ５０、仮性狂犬病ウイルスｇｐII、仮性狂犬
病ウイルスｇｐIII、仮性狂犬病ウイルスｇｐI、単純ヘ
ルペスウイルスｇＢ、単純ヘルペスウイルスｇＣ、単純
ヘルペスウイルスｇＤ、ウシヘルペスウイルスｇＩ、ネ
コヘルペスウイルスｇＢ、エプスタイン・バールウイル
スｇｐ２２０、エプスタイン・バールウイルスｇｐ３４
０、エプスタイン・バールウイルスｇＢ、エプスタイン
・バールウイルスｇＨ及びヒトサイトメガロウイルスｇ
Ｂからなる群から選択される。
【００６３】本発明においては、該組換えポックスウイ
ルスは外来ヘルペスウイルス遺伝子の遺伝子産物を発現
する。詳細には、上記外来ＤＮＡ配列はヘルペスウイル
ス糖タンパク質をコードするものであり、該外来ＤＮＡ
配列はヘルペスウイルス糖タンパク質の産生によって宿
主中で発現する。好適には、組換えポックスウイルスに
よって複数のヘルペスウイルス糖タンパク質を宿主中で
同時発現させる。ポックスウイルスは好適にはワクシニ
アウイルス又はアビポックスウイルス（ニワトリポック
スウイルスもしくはカナリアポックスウイルスなど）で
ある。
【００６４】本発明は、別の態様において、ワクチン接
種した宿主動物中で免疫応答を誘起させるためのワクチ
ンにして、ヘルペスウイルス由来のＤＮＡをポックスウ
イルスゲノムの非必須領域中に含有する組換えポックス
ウイルスと担体とを含むワクチンに関する。より詳細に
は、上記ＤＮＡはヘルペスウイルス糖タンパク質をコー
ドし、発現する。好適には、上記ポックスウイルスによ
って複数のヘルペスウイルス糖タンパク質を宿主中で同
時発現させる。本発明で使用するポックスウイルスは、
好適には、ワクシニアウイルス又はアビポックスウイル
ス（ニワトリポックスウイルスもしくはカナリアポック
スウイルスなど）である。
【００６５】本発明は、別の態様において、母性免疫の
問題を回避する機構に関する。投与抗原に対する抗体が
存在することが障害になっているとすると、母性免疫に
よる障害は、ある部分集合に限定した抗原群を発現する
ベクターを選択的に使用することによって解決もしくは
回避できる。例えば、妊娠中の動物には、仮性狂犬病ウ
イルス糖タンパク質ｇｐ５０を発現する組換えワクシニ
アウイルスワクチンを接種することができ、その子に
は、出産時もしくは出産後まもなく、別の仮性狂犬病ウ
イルス糖タンパク質ｇｐII又はｇｐIII又はその組合わ
せを発現するワクシニア組換え体ワクチンを接種するこ
とができる。一方、母性免疫による障害がベクターによ
るものであるとすれば、母親をあるベクター（ワクシニ
ア又はアビポックス）で、子を別のベクターで差別的に
ワクチン接種すればよい。この手順は、無論、異なるベ
クターを使用することのみならず、異なる型の糖タンパ
ク質を発現するベクターを使用することをも考慮に入れ
たものである。従って、本発明は他の方法では新生児に
うまく免疫賦与することのできない母性免疫を解決もし
くは回避する方法に関する。本発明では、ポックスウイ
ルスゲノムの非必須領域に非ポックス由来のＤＮＡを含
有する組換えポックスウイルスを新生児に接種するが、
該ＤＮＡは新生児の病原体の第一の抗原をコードするも
ので、しかも該抗原は該新生児の母親において同一病原
体に対する免疫応答を誘起するために使用した同一病原
体の第二の抗原とは異なるものである。また、本発明で
は、第一のポックスウイルスゲノムの非必須領域に非ポ
ックス由来のＤＮＡを含有する第一の組換えポックスウ
イルスを新生児に接種するが、該ＤＮＡは新生児の病原
体の抗原をコードするもので、該第一のポックスウイル
スは該新生児の母親において同一病原体に対する免疫応
答を誘起するために使用した第二の組換えポックスウイ
ルスとは異なるものである。
【００６６】
【発明の実施の形態】本発明とその利点は、説明のため
に挙げる以下の実施例から、より深く理解されるであろ
う。
【００６７】
【実施例】例１‐ウマヘルペスウイルスｇｐ１３糖タン
パク質を発現する組換えワクシニアウイルスの構築 大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子によるワクシニアＨ
Ａ遺伝子の置き換え この例で使用したワクシニアウイルスコペンハーゲン株
は、ローヌ・メリュー社（(Rhone Merieux, Inc.)、
ジョージア州アセンズ(Athens)）から入手した。
【００６８】このウイルスは、１０％ウシ胎児血清（Ｆ
ＢＳ）を含有するイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）中
のＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ８１）又はＭＲＣ
−５（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１７１）上の精製プラーク単
離物から増殖させた。野生型ウイルスから、常法（25,2
8）によりチミジンキナーゼ遺伝子の全コード配列を欠
失させた誘導型を単離し、これをｖＰ４１０と命名し
た。このチミジンキナーゼ欠失変異株をそれ以降の操作
に使用した。プラスミドの構築、スクリーニング及び増
殖は常法（20,27,28）に従った。
【００６９】図１を参照して説明する。ワクシニアウイ
ルスの１３Kb ＳａｌI Ｆフラグメント（ＨｉｎｄIII
Ａ／Ｂフラグメント連結部にまたがる）をＳａｌI消
化ｐＵＣ８に連結して、ｐＳＤ４１９ＶＣを得た。ｐＳ
Ｄ４１９ＶＣの右側アーム(arm)（ＳａｌI Ｆフラグメ
ントのＨｉｎｄIII Ｂ部分に対応する）をＨｉｎｄIII
で消化して除去し、次いで連結してｐＳＤ４５６ＶＣを
得た。ｐＳＤ４５６ＶＣは従ってＨｉｎｄIII Ａフラ
グメントの右端を含んでおり、この中には赤血球凝集素
（ＨＡ）遺伝子（35）の全コード領域及びその両隣の約
０．４Kbのワクシニア配列が存在する。
【００７０】実質上ＨＡコード配列を含まないプラスミ
ドベクターを作成するために、ｐＳＤ４５６ＶＣをＨＡ
遺伝子上流のＲｓａI部位で切断（部分消化）し、かつ
ＨＡ遺伝子の３′末端から８０塩基対離れたＥａｇI部
位で切断した。約３．５KbのＲｓａI／ＥａｇIフラグメ
ントをアガロースゲルから単離した。
【００７１】ＲｓａI部位からＨＡコード配列の２塩基
上流までの領域を置き換え、その直後にＢｇｌII、Ｓｍ
ａI及びＰｓｔI制限酵素部位並びにＥａｇI付着末端が
続くように、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９−
６２を調製した。ＭＰＳＹＮ５９−６２の配列とその上
記制限酵素部位は以下のとおりである。
【００７２】
【化１】
【００７３】アニールさせたＭＰＳＹＮ５９−６２混合
物を、ｐＳＤ４５６ＶＣ由来の上記３．５KbのＲｓａI
／ＥａｇIフラグメントに連結して、ｐＳＤ４６６ＶＣ
を得た。従って、ｐＳＤ４６６ＶＣにおいては、ＨＡ遺
伝子がポリリンカー領域に置き換っている。
【００７４】ワクシニア１１kDaプロモーター（7）の転
写調節下に置かれたｐＭＣ１８７１（34）由来の大腸菌
β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３．２KbのＢｇ
ｌII／ＢａｍＨI（部分）フラグメントを、ＢｇｌIIで
消化しておいたｐＳＤ４６６ＶＣ中にクローン化した。
１１kDaプロモーター／β-ガラクトシダーゼ遺伝子カセ
ット（両隣のワクシニアアームに対して左から右の方向
に置かれている）を含有するプラスミドをｐＳＤ４６６
ＶＣＢＧＡと命名した。このプラスミドを、ワクシニア
ウイルスコペンハーゲン株のチミジンキナーゼ欠失変異
株ｖＰ４１０と組換えて、β−ガラクトシダーゼを発現
するワクシニア組換え体ｖＰ４２５を得た。ワクシニア
ゲノムに対して右から左に転写される短い潜在的解読枠
を破壊しないように、ＨＡ遺伝子のカルボキシ末端の８
０bpを残した。
【００７５】組換えワクシニアウイルスｖＰ４２５（18
4）は、文献記載のとおり（9,24）、発色基質Ｘ−ｇａ
ｌ存在下での青色プラーク形成に基づいて同定した。後
続のワクシニア組換え体においてβ-ガラクトシダーゼ
遺伝子をさらに別の外来遺伝子で置き換えた場合、青色
プラークの代りに無色のプラークを単離することによっ
て容易に獲得することができる。
【００７６】以降のクローニング工程を簡単にするため
に、ｐＳＤ４６６ＶＣをＢａｍＨI／ＥｃｏＲIで消化
し、大腸菌ポリメラーゼのクレノウフラグメントで平滑
末端とし、かつ再連結することによって、ｐＵＣ８マル
チクローニング領域由来のＳｍａI部位を除去した。従
って、得られたプラスミドｐＳＤ４６７ＶＣに残ってい
る唯一のＳｍａI部位はＨＡ欠失部のポリリンカー領域
中にある。
【００７７】ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子をコードする
ＤＮＡの同定 糖タンパク質ＥＨＶ−１ ｇｐ１３をコードするＤＮＡ
配列は、ＥＨＶ−１の７．３Kb ＢａｍＨI−Ｈフラグ
メント中に存在する（3）。ｐＵＣ(ＢａｍＨI−Ｈ)領域
から、重複サブクローンを利用し、修飾Ｔ７酵素「シー
ケナーゼ(SEQUENASE)」（40）（ＵＳバイオケミカルズ
社(U.S. Biochemicals)製、オハイオ州クリーブラン
ド）を用いて、それぞれの鎖について塩基配列に関する
データを得た。アルカリ中で変性した二本鎖鋳型プラス
ミドについて標準的なジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法（33）を行なった。正逆両方向のＭ１３プライマ
ーを用いて各クローンの最初の塩基配列を得た。標準的
な化学的手法（バイオサーチ８７００(Biosearch 870
0)（カリフォルニア州サンラファエル(San Rafae
l)）、アプライド・バイオシステムズ３８０Ｂ(Applied
Biosystems 380B)（カリフォルニア州フォスターシ
ティー(Foster City)））で合成した１６〜１７量体プ
ライマーを用いて残りのフラグメントの塩基配列を決定
した。塩基配列のデータ解析にはすべてＩＢＩパステル
(IBI Pustell)配列決定プログラム（29）を使用した。
【００７８】ＤＮＡ配列の解析から、４６８残基のアミ
ノ酸からなる推定５０．９kDaの１次翻訳生成物をコー
ドする１４０４bpの解読枠が明らかになった。ｇｐ１３
解読枠の予想アミノ酸配列のカルボキシ末端側は、単純
ヘルペスウイルス１型及び２型のｇＣ、仮性狂犬病ウイ
ルスのgIII及び水痘帯状疱疹ウイルスのｇｐVとかなり
の相同性を有しており、ｇｐ１３がヘルペスウイルスの
ｇＣ様糖タンパク質群に属することを示唆している。Ｅ
ＨＶ−１ ｇｐ１３解読枠のより詳細な解析は先行文献
（2）に記載されている。ワクシニアベクター中でのＥ
ＨＶ−１ ｇｐ１３解読枠のクローニング及び発現に関
する説明を容易にするために、ｇｐ１３解読枠並びに
５′及び３′側の配列を図２及び３（配列番号３及び
４）に示してある。図２及び３においては、ＴＡＴＡボ
ックスと推定される塩基配列、並びにシグナルペプチド
と膜アンカーペプチドと推定されるアミノ酸部分に下線
を施した。切断シグナル「ＡＳＡ」（中抜きの丸印で示
した部分）に続くシグナル配列の仮想切断部位を矢印で
示した。潜在的に、シグナル配列とアンカー配列との間
にＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフで定まるＮ−グ
リコシル化部位が９カ所存在する（星印の部分）。
【００７９】ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子のワクシニア
ドナープラスミド中へのクローニング ニワトリポックスウイルスベクター（41,42）中で外来
遺伝子を発現させるために、ワクシニアウイルスの初期
／後期プロモーターであるＨ６を使用した。このプロモ
ーター要素は、ワクシニアＨｉｎｄIII−Ｈフラグメン
ト中のＨ６解読枠のすぐ上流にあるＤＮＡ配列に対応す
る（31）。
【００８０】今度は図４を参照して説明する。Ｈ６プロ
モーターに変異を導入してｐＳＤ４６７ＶＣに挿入する
ために、オリゴヌクレオチド対Ｈ６ＳＹＮ ｏｌｉｇｏ
ｓＡ−Ｄを合成した。Ｈ６ＳＹＮ ｏｌｉｇｏｓ Ａ−
Ｄの配列を、修飾塩基（下線部）及び制限酵素部位と共
に、以下に示す。
【００８１】
【化２】
【００８２】下線部の塩基は、ネイティブなＨ６プロモ
ーター配列を修飾した部位を示す。
【００８３】Ｈ６ＳＹＮ ｏｌｉｇｏｓ Ａ−Ｄのアニ
ーリングによってできた全長１３０bpの二本鎖ＤＮＡを
アガロースゲルから電気的に溶出し、ｐＳＤ４６７ＶＣ
由来の０．５KbのＳｍａI／ＨｉｎｄIIIフラグメント及
び３．１KbのＢｇｌII／ＨｉｎｄIIIフラグメントに連
結した。得られたプラスミドｐＴＰ１５（184）は、Ａ
ＴＧ開始コドンがＣＣＣに修飾されてＳｍａI部位の一
部となっており、その直後にＰｓｔI部位が続いてい
る。ｐＴＰ１５のＳｍａI部位に、ＮｓｉIリンカー
［５′−ＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡ−３′］（ニュー・
イングランド・バイオラボズ(New England BioLabs)
社製、マサチューセッツ州ベヴァリー(Beverly)）を挿
入して、プラスミドｐＮＳＩを得た。
【００８４】ＥＨＶ−１のＥｃｏＲI／ＮａｒIフラグメ
ント（ＥｃｏＲI部位はＡＴＧ開始コドンの１２０bp上
流であり、ＮａｒIはＥＨＶ−１ ｇｐ１３のＴＡＧ終
止コドンの２３bp上流である）をＭ１３ｍｐ１９ファー
ジにクローン化して、組換えファージＭ１３ＥｃｏＲＮ
ａｒを得た。オリゴヌクレオチド特異的変異導入法（1
7）を用いてＥＨＶ−１ ｇｐ１３のＴＴＧＣＣＴ配列
（図２及び３の１３０〜１３５番目の塩基）をＡＴＧＣ
ＡＴに変えることによって、ＮｓｉI部位を導入した。
変異ファージＭ１３ＥｃｏＲＮａｒから得たＥｃｏＲI
／ＮａｒIフラグメントを、ｐＵＣ８のＥｃｏＲI／Ｎａ
ｒI部位にクローン化して、プラスミドｐＮＳＩＥＮを
得た。
【００８５】以下に示す配列及び制限酵素部位を有する
２つの４２量体オリゴヌクレオチドを合成した。
【００８６】
【化３】
【００８７】このオリゴヌクレオチドにおいては、終止
コドン（ＴＡＧ）の直後にワクシニア初期転写ターミネ
ーター（ＡＴＴＴＴＴＡＴ）がある。該４２量体オリゴ
ヌクレオチド対をアニールして得た二本鎖ＤＮＡフラグ
メントには、ＮａｒI付着端、それに続いてＥＨＶ−１
ｇｐ１３遺伝子のコード配列の３′末端、並びにワク
シニア初期転写終結シグナル（４５）、ＰｓｔＩ部位、
及びＮｄｅＩ付着端が含まれている。このフラグメント
をｐＮＳＩＥＮのＮａｒI／ＮｄｅI部位に挿入して、ｐ
ＮＳＩＥＮＰＮを得た（図４）。
【００８８】ｐＮＳＩＥＮＰＮからＮｓｉＩ／ＰｓｔＩ
フラグメントを単離し、プラスミドｐＮＳＩのＮｓｉI
／ＰｓｔI部位にクローン化して、プラスミドｐＶＨＡ
６ｇ１３ＮｓｉＩを得た（図４）。ｐＶＨＡ６ｇ１３Ｎ
ｓｉＩを、Ｈ６プロモーター内のＥｃｏＲV部位、及び
ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子の始点付近に導入しておい
たＮｓｉI部位で切断した。このベクターフラグメント
をムング・ビーン(MunｇＢean)ヌクレアーゼで平滑末端
とした。以下に示す配列及び制限酵素部位を有する相補
的３２量体オリゴヌクレオチド対を合成した。
【００８９】
【化４】
【００９０】上記オリゴヌクレオチド対をアニールし、
ｐＶＨＡ６ｇ１３ ＮｓｉIベクターフラグメントに連
結して、Ｈ６プロモーターのＡＴＧ開始コドン（上記３
２量体の配列の下線部）とＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子
とがきちんとつながったプラスミドｐＶＨＡ６ｇ１３を
作成した（図４）。
【００９１】ｖＰ４２５感染細胞にｐＶＨＡ６ｇ１３を
トランスフェクションして、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝
子を含有するワクシニア組換え体ｖＰ４８３を得た（図
４）。
【００９２】ワクシニアウイルス組換え体の構築 救援ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞に対す
る組換えドナープラスミドのトランスフェクション並び
にニトロセルロースフィルター上でのインシトゥ(in s
itu)ハイブリダイゼーションは、文献記載の方法に従っ
て行なった（25,28）。大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝
子がワクシニアＨ６コード配列に置き換ったｖＰ４２５
を構築するために、プラスミドＤＮＡ（ＨｅＢＳ中のｐ
ＳＤ４６６ＶＣＢＧＡ、２５μｇ）をＶＥＲＯ細胞中に
電気穿孔法で導入した（バイオラッド・ジーン・パルサ
ー(Bio-Rad Gene Pulser)、キャパシタンス９６０、
２００ボルト）。亜集密的細胞単層(subconfluent mon
olayer)に細胞当り１０pfuのｖＰ４１０を１時間感染さ
せた。感染細胞をトリプシンを用いて採集し、ＨｅＢＳ
で洗浄した後に電気穿孔を行なった。細胞をＭＥＭ＋５
％ウシ胎児血清培地中において３７℃で２４時間インキ
ュベートし、プロジェニィウイルスをＶＥＲＯ細胞単層
上に撒いた。β-ガラクトシダーゼを発現する組換えウ
イルスを、基質Ｘ−ｇａｌの存在下における青色プラー
クとして検出した（9,24）。ｖＰ４２５中のβ-ガラク
トシダーゼ遺伝子がＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子で置き
換った組換えワクシニアウイルスを作成するために、ｐ
ＶＨＡ６ｇ１３ドナープラスミドかつｖＰ４２５を救援
ウイルスとしたことを除いては上記と同様のプロトコル
を用いた。ＥＨＶ−１由来ｇｐ１３含有ワクシニア組換
え体ｖＰ４８３を、基質Ｘ−ｇａｌの存在下における無
色プラークとして検出し、プラーク精製を３回繰返した
後にＤＮＡハイブリダイゼーションを行なって真の組換
え体であることを確認した。
【００９３】組換えワクシニアウイルスｖＰ４８３感染
細胞の細胞表面上におけるＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子
の発現 ３５mmシャーレ中の２２mmカバーガラス上に、シャーレ
当り５×１０５個のＢＳＣ−４０細胞を植えた。細胞の
集密度が約８０％となったところで、細胞当り２pfuの
ウイルスを感染させた。１時間吸着させた後、ウイルス
接種液を除去して、ＭＥＭ＋２％ウシ胎児血清培地を加
えた。感染後２０時間後に、カバーガラスを０．２％Ｂ
ＳＡ及び０．１％ＮａＮ３含有リン酸含塩類緩衝液（Ｐ
ＢＳ＋）で洗浄し、ＰＢＳ＋で千倍に稀釈した抗ｇｐ１
３モノクローナル抗体１４Ｈ７（3）に暴露した。室温
の加湿チャンバー中に１時間置いた後、細胞をＰＢＳ＋
で３回洗浄した。フルオレセインイソチオシアネート抱
合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して、上記操作を繰り
返した。最後に、リン酸含有塩類緩衝液（ＰＢＳ）中の
２％パラホルムアルデヒド中で２０分間細胞を固定し
た。カバーガラスを、３％没食子酸ｎ−プロピル含有Ｐ
ＢＳ中の８０％グリセロール中にマウントし、顕微鏡で
蛍光を観察した。
【００９４】ＤＮＡ配列から予想されるタンパク質は、
膜貫通性糖タンパク質に典型的な特徴を有している（1
4）。増殖性ＥＨＶ−１感染においては、ｇｐ１３糖タ
ンパク質は細胞の様々な膜系に取込まれ、細胞質膜中に
輸送されて、感染細胞の外表面上で検出され得る。ＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１３はさらにＥＨＶ−１ウイルス粒子の構
成成分である。従って、免疫蛍光法を用いて、ワクシニ
アウイルス組換え体ｖＰ４８３によって発現されるＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１３が感染細胞の細胞質膜上にも同様に存
在するか否かを調べた。抗ｇｐ１３モノクローナル抗
体、続いてフルオレセン抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で
標識すると、ｖＰ４８３感染細胞には膜上に強い免疫蛍
光がみられたが、ワクシニアウイルスｖＰ４１０感染細
胞ではみられなかった。この事実は、ワクシニアウイル
ス組換え体ｖＰ４８３によって発現されるＥＨＶ−１
ｇｐ１３が、膜貫通性糖タンパク質の真の合成について
予想されるとおり、感染細胞の細胞質膜上にも存在する
ことを示唆している。
【００９５】ワクシニアウイルス組換え体ｖＰ４８３感
染細胞で合成されるＥＨＶ−１ ｇｐ１３産物の免疫沈
降反応 ６０mmシャーレ中で集密的細胞単層を形成した２百万個
の細胞に、細胞当り１０pfuのウイルスを感染させた。
無メチオニン培地中で接種した。吸着後、ウイルス接種
液を除去して、２μCi／mlの３５Ｓ−メチオニンを含有
する無メチオニン培地２ｍｌを加えた。２４時間感染反
応を続けた後、３％ＮＰ−４０，３０mMＴｒｉｓ(pH
７．４)，４５０mM ＮａＣｌ，３mM ＥＤＴＡ，０．
０３％ＮａＮ３及び０．６mg／ml ＰＭＳＦを含む３×
緩衝液Ａを１ml添加して細胞を溶解した。溶解細胞及び
上清を回収して、ボルテックスし、１００００×ｇで１
５分間遠心して、無細胞抽出液を得た。
【００９６】１×緩衝液Ａ中で１：１スラリーとして、
プロテインＡ‐セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社
製、カタログ番号17.0780.01）を調製した。ラット抗マ
ウス抱合体（ベーリンガー・マンハイム社製、カタログ
番号605500）を上記スラリー中に１：１００に稀釈し
て、室温で振盪しながら４時間上記ビーズに結合させ
た。ビーズを１mlの緩衝液Ａで６回洗浄して結合してい
ない抱合体を除去した。次に、ｇｐ１３に対するモノク
ローナル抗体を室温で４時間ビーズに結合させた。十分
に洗浄して過剰の抗体を除去した。１mlの感染細胞溶解
液を、正常マウス血清を結合させておいたプロテインＡ
‐セファロースで予備処理した。ビーズを遠心で除い
た。このように予備処理した感染細胞溶解液１mlを、特
異的モノクローナル抗体を結合させておいたビーズ１０
０μlと混合した。この混合物を室温で４時間振盪し
た。遠心によってビーズを除去し、１×緩衝液Ａで４回
洗浄し、次いで０．２M ＬｉＣｌ及び２M尿素を含有す
る１０mM Ｔｒｉｓ(pH ７．４)で２回洗浄した。抗体
−抗原複合体からビーズを除去し、レームリ(Laemmli)
の解離溶液５０μlを添加して解離させた（60,195）。
試料を５分間煮沸処理した後、電気泳動にかけた。
【００９７】約４４kDaと約４７kDaの２種類の産物（こ
れらは予想された１次翻訳産物（５５kDa）よりも若干
小さい）、並びに約９０kDaの大きな産物（この値はＥ
ＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子産物が完全にグリコシル化さ
れたものに一致する）が検出された。対照ワクシニアウ
イルス感染細胞からは、これらに相当する沈降物は得ら
れなかった。
【００９８】例２‐ウマヘルペスウイルスｇｐ１４糖タ
ンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスの構築 大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子によるワクシニアＭ
２Ｌ遺伝子の置き換え ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列をワクシニアウイルス
ベクター中に挿入するために、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を
発現する組換えワクシニアウイルスｖＰ４５８を構築し
た。組換えウイルスｖＰ４５８中のｌａｃＺコード配列
をＥＨＶ−１ｇｐ１４のコード配列で置き換えると、Ｘ
−ｇａｌ（β-ガラクトシダーゼに対する発色性基質）
存在下での、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４含有組換えウイルス
同定用の青色→無色プラークスクリーニング系（9,24）
が得られる。さらに、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４及びＥＨＶ
−１ ｇｐ１３双方を発現するワクシニアウイルス組換
え体を構築するために、例１においてＥＨＶ−１ ｇｐ
１３の挿入に用いた赤血球凝集素欠失座とは別のＥＨＶ
−１ ｇｐ１４のための挿入座をＨｉｎｄIIIＭのＭ２
Ｌ座に作成した。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｍフラグメ
ント中のＭ２Ｌ遺伝子の全コード配列を除去して、β-
ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子で
置き換えた。ｖＰ４５８を構築するためのクローニング
段階を図５に図解した。
【００９９】今度は図５を参照して説明する。推定２２
０残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしかつワ
クシニアゲノムに対して右から左に読取る解読枠全体
が、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株のＨｉｎｄ
III Ｍフラグメント内の唯一のＢｇｌII部位の左側に
位置している。従来の命名法（31）に従って、Ｍ１Ｌ
（58）のすぐ右側に位置するこの遺伝子をＭ２Ｌと呼
ぶ。ＨｉｎｄIIIフラグメントＭ内の唯一のＢｇｌII部
位から左側方向についてのワクシニア（ＷＲ株）ゲノム
の欠失に関する研究（57）から、ＨｉｎｄIII Ｍ内の
ＢｇｌII部位の左側に含まれるワクシニアコード配列が
組織培養細胞中のウイルスの複製には必須ではないこと
が示されている。
【０１００】Ｍ２Ｌ領域を外来遺伝子の挿入座として使
い易くするために、Ｍ２Ｌコード配列全体がＢｇｌII部
位で置き換えられたプラスミドベクターｐＭＰ４０９Ｄ
ＶＣを以下に述べるとおり作成した。ｐＳＤ４０９ＶＣ
（コペンハーゲン株のワクシニアＨｉｎｄIII Ｍフラ
グメントをｐＵＣ８のＨｉｎｄIII部位にクローン化し
たもの）をＢａｍＨI／ＢｇｌIIで消化して自己連結し
て、ＨｉｎｄIII Ｍの右端を除去し、ＢｇｌII部位を
破壊した。得られたプラスミドｐＭＰ４０９ＢＶＣをＳ
ｐｈI（Ｍ２Ｌ解読枠内で切断する）で線状化し、２分
間Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼ消化処理に付した。得
られたＤＮＡに、合成４９量体（５′−ＴＴＴＣＴＧＴ
ＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＡＧＡＴＣＴＴＡＣ
ＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＡＴ−３′，下線部が
ＢｇｌII部位）を用いて変異を導入した（19）。変異導
入プラスミドｐＭＰ４０９ＤＶＣにおいては、Ｍ２Ｌコ
ード配列が＋３番目の位置から解読枠の端まで欠失して
いる。開始コドンＡＴＧのＧをＣに換えて、欠失連結部
で唯一のＢｇｌII部位（ＡＧＡＴＣＴ）を生じさせた。
【０１０１】ｐＭＣ１８７１（34）のＢａｍＨI部位間
にある３．１Kbの大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子を
０．１Kbワクシニア１１kDaプロモーター（7）の転写調
節下に含有する３．２Kb ＢｇｌII／ＢａｍＨI部分フ
ラグメントを、ｐＭＰ４０９ＤＶＣの唯一のＢｇｌII部
位にクローン化した。１１kDaプロモーター／β-ガラク
トシダーゼ遺伝子カセット（両隣のワクシニアアームに
対して右から左の方向に置かれている）及びゲノムを含
有する組換えプラスミドをｐＭＰ４０９ＤＶＣＢＧと命
名した。ｐＭＰ４０９ＤＶＣＢＧを、例１に記載したと
おり、救援ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えに
おけるドナープラスミドとして用いた。ｖＰ４５８と名
付けた新規ワクシニア組換え体（Ｍ２Ｌ欠失座に挿入さ
れたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する）を、発色
性基質Ｘ−ｇａｌを用いて検出し（9,24）、プラークク
ローニングを繰返して精製した。
【０１０２】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４のクローニング 今度は図６を参照して説明する。ＥＨＶ−１ ｇｐ１４
コード配列は、ＢａｍＨI切断フラグメントａとｉ（3）
との間の連結部にまたがっている。ＥＨＶ−１の２つの
ＤＮＡフラグメントＢａｍＨI−ａ（２１．３Kb）とＢ
ａｍＨI−ｉ（７．１Kb）（59）をアガロースゲルから
単離した。ＥＨＶ−１ ＢａｍＨI-iをプラスミドｐＵ
Ｃ８のＢａｍＨI部位に挿入して、プラスミドｐＵＣ(Ｂ
ａｍＨI−ｉ)を構築した。ＥＨＶ−１ ＢａｍＨI−ａ
フラグメントをＥｃｏＲIで消化して、ＥｃｏＲI／Ｂａ
ｍＨI消化ｐＵＣ８に連結した。プラスミドｐＵＣ(Ｂａ
ｍＨI−ａ／ＥｃｏＲI)は、１０KbのＥＨＶ−１ Ｂａ
ｍＨI／ＥｃｏＲI挿入部を含んでいる。報告されたフラ
グメントの大きさによれば（59）、この挿入部のＤＮＡ
配列はＥＨＶ−１ゲノム内のＢａｍＨI−ｉフラグメン
トのＤＮＡ配列と隣接している。
【０１０３】塩基配列の解析 ｐＵＣ(ＢａｍＨI−ａ／ＥｃｏＲI)とｐＵＣ(ＢａｍＨI
−ｉ)の２つのプラスミドから得た異なるサブクローン
を使用して塩基配列の解析を行なった。ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１４遺伝子はＢａｍＨI−ａ／ｉ連結部にまたがって
いるので（3）、プラスミドｐＵＣ(ＢａｍＨI−ａ／Ｅ
ｃｏＲI)の塩基配列決定はＢａｍＨI部位から始めた。
プラスミドｐＵＣ(ＢａｍＨI−ｉ)の配置を制限酵素消
化で決定した。ｐＵＣ(ＢａｍＨI−ｉ)のＥｃｏＲI部位
に最も近いＥＨＶ−１ ＢａｍＨI末端はＢａｍＨI−ａ
／ｉ連結部のＢａｍＨI部位であることが判明したの
で、このフラグメントの塩基配列決定はこのＢａｍＨI
端から開始した。
【０１０４】例１に記載した方法で、それぞれの鎖につ
いて塩基配列に関するデータを得た。ＥＨＶ−１ ｇｐ
１４コード配列を含有する３３５１bpフラグメントの塩
基配列を図７〜９（配列番号１２）に示す。欄の左端と
右端に付けた番号はそれぞれアミノ酸配列と塩基配列に
関するものである。ＣＡＴボックス及びＴＡＴＡボック
スと推定される塩基配列に下線を施した。シグナル及び
膜貫通領域にも下線を施し、シグナルペプチドの推定切
断部位を矢印で示した。コンセンサス（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓ
ｅｒ／Ｔｈｒ）配列からなる１３カ所の潜在的グリコシ
ル化部位を星印で示した。
【０１０５】ＤＮＡ配列解析から、ＥＨＶ−１ゲノムに
対して左から右に読み取る３００番目の塩基から３２３
９番目の塩基までの解読枠が判明した。即ち、ＡＴＧ開
始コドンはＢａｍＨI−ａ／ＥｃｏＲIフラグメントに含
まれており、終始コドンＴＡＡはＢａｍＨI−ｉフラグ
メントに含まれていた（3,59）。
【０１０６】転写調節シグナルと思われる配列が、ＡＴ
Ｇ開始コドン（３００番目）の５′側に見つかった。配
列「ＡＡＡＴＡＴＡＴ」（１４８番目から１５５番目の
塩基）を有するＴＡＴＡボックスが、７１番目から７７
番目の配列「ＧＧＴＣＡＡＴ」を有するＣＡＴボックス
の７０塩基下流に位置している。ポリアデニル化シグナ
ル「ＡＡＴＡＡＡ」（３２５１番目から３２５６番目の
塩基）が、ＴＡＡ終始コドン（３２４０番目から３２４
２番目の塩基）の８塩基下流に位置している。配列
「５′−ＴＣＣＴＧＣＧＣＧＣＡ‐３′」（２１８番目
から２２８番目の塩基）中の１１個の塩基のうち９個の
塩基が１８ＳリボソームＲＮＡの配列「３′−ＡＧＧＡ
ＡＧＧＣＧＴ−５′」（61）と相補的であり、リボソー
ム結合部位として機能している可能性がある。
【０１０７】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４構造の解析 ＥＨＶ−１ ｇｐ１４解読枠は９８０残基のアミノ酸を
コードしており、その分子量は１０９．８kDaであると
計算される（配列番号１３）。アミノ酸配列の解析か
ら、膜関連糖タンパク質に共通する多くの特徴が明らか
になった。５８番目から９９番目までのアミノ酸領域
は、特徴的な疎水的性質を有しており、シグナル配列で
あると思われる（図７〜９）。ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺
伝子産物に特徴的な性質は、この長い疎水性シグナル配
列の前に長い親水性配列が存在することである。この特
徴は、仮性狂犬病ウイルスウイルス（ＰＲＶ）ｇII（6
2）とウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）ｇI遺伝
子にもみられるが、この２つは共にＨＳＶ ｇＢ相同物
である。４５残基のアミノ酸（８２６から８７０番目）
からなる疎水性領域は、膜貫通性アンカードメインとし
て機能していると思われる。細胞質内に存在する親水性
ドメインは１１０残基のアミノ酸を含んでいる。
【０１０８】Ｎ−グリコシル化される可能性のある（6
4）Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外の
アミノ酸である）部位が１１カ所存在する。特徴的な点
は、細胞質内ドメインにも２カ所の潜在的グリコシル化
部位が存在することである（図７〜９）。
【０１０９】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列の親水性
度をプロットしたものを図１０に示す。ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１４の疎水性度を、カイト(Kyte)及びドリトル(Dooli
ttle)の方法（65）に従って、７個のアミノ酸を１ウイ
ンドー(window)としてスムージング(smoothing)せずに
計算した。真中の線よりも下の点は高疎水性域を表して
おり、シグナル及び／又は膜貫通性領域の可能性のある
部分を示している。膜貫通性糖タンパク質に特徴的なシ
グナル及びアンカー成分並びにシグナル配列の前にある
長い親水性領域がＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列にも
みられる。
【０１１０】抗ＥＨＶ−１ ｇｐ１４モノクローナル抗
体３Ｆ６によって認識される抗原決定基の位置 λｇｔ１１発現ベクターとモノクローナル抗体が、主要
ＥＨＶ−１糖タンパク質をコードするＥＨＶ−１ ＤＮ
Ａ配列の同定に使用されている（3）。λｇｔ１１の組
換え体４ａｌは、特異的モノクローナル抗体３Ｆ６によ
って認識されるＥＨＶ−１ ｇｐ１４エピトープを発現
することが判明している（3）。このエピトープの身元
を決定するために、４ａｌ内に含まれるＥＨＶ−１ Ｄ
ＮＡの塩基配列を決定し、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード
配列のＤＮＡ配列（図７〜９）と比較した。λｇｔ１１
組換え体４ａｌ中の（抗ＥＨＶ−１ ｇｐ１４モノクロ
ーナル抗体３Ｆ６によって認識される）ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１４エピトープ（3）に対応するＤＮＡフラグメント
の塩基配列を決定するために、４ａｌをＥｃｏＲIで消
化し、アガロースゲルからＥＨＶ−１フラグメントを単
離してｐＵＣ８のＥｃｏＲI部位に連結した。正逆両方
向のＭ１３汎用プライマーを用いて前述のとおりＤＮＡ
の塩基配列を決定した。
【０１１１】決定した塩基配列から、このエピトープは
推定１次翻訳生成物の１０７番目（Ｔｈｒ）から１７２
番目（Ｖａｌ）に対応する６６残基のアミノ酸領域内に
含まれていることが示された。従って、該エピトープは
推定されるＥＨＶ−１ ｇｐ１４表面ドメインのアミノ
末端領域内に位置している。
【０１１２】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４のアミノ酸配列と他
のヘルペスウイルス糖タンパク質との比較 ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子のアミノ酸配列との比較か
ら、他のヘルペスウイルス糖タンパク質とかなりの相同
性を有していることが判明した。即ち、ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１４は、ＰＲＶのｇII（62）、ＢＨＶ−１のｇI（6
3）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）のｇII（66）、
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｇＢ（67,71,72）、
並びにエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）（68）
及びヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）（10）の糖
タンパク質に相同であった。
【０１１３】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列の５′末
端のオリゴヌクレオチド特異的変異導入 再び図６を参照して説明する。ｐＵＣ(ＢａｍＨI−ａ／
ＥｃｏＲI)由来のＫｐｎI／ＢａｍＨIフラグメントをＫ
ｐｎI／ＢａｍＨIで消化しておいたプラスミドＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＳＫ＋に挿入して、プラスミドＢｌｕｅ
(ＫｐｎI／ＢａｍＨI)を得た。クンケル(Kunkel)の方法
（17）を修正して、宿主ｄｕｔ−ｕｎｇ−大腸菌ＣＪ２
３６株中で作成したプラスミドＢｌｕｅ(ＫｐｎI／Ｂａ
ｍＨI)由来のウラシル含有ＤＮＡ鋳型を用いてオリゴヌ
クレオチド特異的変異導入を行なった。該変異導入プラ
スミド中において、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子のコド
ン１及び２にＮｓｉI部位を生じさせ、配列ＡＴＧ／Ｔ
ＣＣ（Ｍｅｔ／Ｓｅｒ）をＡＴＧ／ＣＡＴ（Ｍｅｔ／Ｈ
ｉｓ）に変えた。この変異を導入した塩基配列はＤＮＡ
配列解析によって確認した。該変異株由来のＫｐｎI／
ＢａｍＨIフラグメントを、ＫｐｎI／ＢａｍＨI消化ｐ
ＵＣ１８に移し換えてプラスミドｐＵＣ(ＫｐｎI／Ｂａ
ｍＨI)を得た。
【０１１４】ｐＵＣ(ＫｐｎI／ＢａｍＨI)由来のＥｃｏ
ＲI／ＢａｍＨIフラグメントをｐＵＣ(ＢａｍＨI−ｉ)
の３．９KbサブクローンであるＢａｍＨI／ＰｓｔI消化
ｐＵＣ(ＢａｍＨI／ＰｓｔI)に挿入して、ＮｓｉI部位
変異を含んだＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子全体を含むプ
ラスミドｐＵＣｇ１４を構築した。
【０１１５】キメラプラスミドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４の
構築 ｐＭＰ４０９ＤＶＣをＢｇｌIIで切断し、制限酵素部位
と隣接する例１記載の修飾ワクシニアＨ６（初期／後
期）プロモーターを含有する合成二本鎖ＤＮＡと連結し
た。ＮｓｉI、ＳａｃI、ＰｓｔI及びＥｃｏＲI制限酵素
部位をＨ６プロモーターの内在性開始コドンのすぐ下流
につくった。ｐＭＧ１１におけるＨ６プロモーター下流
のポリリンカー配列はＡＴＧ ＣＡＴ ＧＡＧ ＣＴＣ
ＴＧＣＡＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＡＴＣ Ｔ であ
る。Ｈ６開始コドンを含んだ唯一のＮｓｉI部位（下線
部）の直後にＳａｃI、ＰｓｔI及びＥｃｏＲIが続いて
いる。
【０１１６】ｐＵＣｇ１４由来のＥｃｏＲI／ＮｓｉI
ＤＮＡフラグメント（ＥＨＶ−１ｇｐ１４開始コドン上
流のＥＨＶ−１ ＤＮＡ領域を含む）を、プラスミドｐ
ＭＧ１１由来のＥｃｏＲI／ＮｓｉIフラグメントで置き
換えて、プラスミドｐＭＲＨｇ１４を得た。該ｐＭＲＨ
ｇ１４は、ワクシニアＨｉｎｄIII Ｍの右側アーム、
Ｈ６プロモーター及びＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子全体
を含有する。プラスミドｐＭＲＨｇ１４由来の Ｈｐａ
I／ＰｓｔI ＥＨＶ−１ ｇｐ１４含有フラグメント
を、ＨｐａI／ＰｓｔIで切断しておいたベクタープラス
ミドｐＭＧ１１に移し換えて、プラスミドｐＶＭ２ＬＨ
６ｇ１４を作成した。ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４は、Ｈ６プ
ロモーターの制御下に置かれたＥＨＶ−１ ｇｐ１４全
コード配列（コドン２をＴＣＣ（Ｓｅｒ）からＣＡＴ
（Ｈｉｓ）に変えたもの、及びＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺
伝子下流の約１．２Kb ＥＨＶ−１ ＤＮＡ）を含有し
ており、この配列は、Ｍ２Ｌ遺伝子座へのＥＨＶ−１
ｇｐ１４遺伝子の挿入の目標としたワクシニアゲノムに
関するフランキングワクシニア配列に対して右から左に
挿入されている。
【０１１７】ｖＰ４５８を救援ウイルスとし、ｐＶＭ２
ＬＨ６ｇ１４をドナープラスミドとして組換えを行なっ
た。無色のプラークを採取して、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４
に対して特異的な３２Ｐ標識プローブを用いてＥＨＶ−
１ ｇｐ１４コード配列の存在について分析した。プラ
ーククローニングを繰返した後、得られたワクシニア組
換え体をｖＰ５７７と命名した。
【０１１８】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４親水性リーダー配列
の切断 上述の変異導入及びクローニング操作を種々変更して、
キメラドナープラスミドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１を構
築した。ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１（ＥＨＶ−１ ｇｐ
１４のコドン２から３４までが欠失し、かつ４つのコド
ンが置き換っている）を作成するために、プラスミドＢ
ｌｕｅ（ＫｐｎI／ＢａｍＨI)上でインビトロ変異導入
（17）を行なって、コドン１及び２ではなくコドン３２
〜３４にＮｓｉI部位を生じさせた。新たに変異を導入
したＢｌｕｅ(ＫｐｎI／ＢａｍＨI)プラスミド由来のＮ
ｓｉI／ＢａｍＨIフラグメントを、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１
４のＮｓｉI／ＢａｍＨIフラグメントと置き換えた。該
ＮｓｉI部位に多重ＮｓｉIリンカー（New England Bi
oLabs社製）を連結して、開始ＡＴＧコドンを残りのＥ
ＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列の枠内に適合させた。最
終的に得られたプラスミドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１
は、Ｍｅｔ／Ｈｉｓ／Ａｌａ／Ｃｙｓ／Ｉｌｅ／Ａｌ
ａ．．．をコードする配列ＡＴＧ／ＣＡＴ／ＧＣＡ／Ｔ
ＧＣ／ＡＴＴ／ＧＣＴ．．．を含んでいる。ここで、Ｇ
ＣＴ（Ａｌａ）はＥＨＶ−１ ｇｐ１４の３４番目のコ
ドンであり、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１の残りの部分は
ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４のものと同一である。
【０１１９】救援ウイルスｖＰ４５８とドナープラスミ
ドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１との間で組換えを行なっ
て、ワクシニア組換え体ｖＰ６１３を得た。
【０１２０】例３‐ウマヘルペスウイルスｇｐ１３及び
ｇｐ１４糖タンパク質を発現するワクシニアウイルス組
換え体ｖＰ６３３及びｖＰ６３４の構築 ｇｐ１３及びｇｐ１４ ＥＨＶ−１糖タンパク質を共に
発現するワクシニア組換え体を構築するために、ｖＰ５
７７もしくはｖＰ６１３のいずれかを救援ウイルスとし
て、例１記載のドナープラスミドｐＶＨＡ６ｇ１３（ワ
クシニアのＨＡ欠失座に挿入されたワクシニアＨ６プロ
モーターの制御下にあるＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子を
含有する）との組換えを行なった。組換えウイルス中へ
のＥＨＶ−１ ｇｐ１３配列の挿入は、インシトゥＤＮ
Ａハイブリダイゼーション法（25,28）によって同定し
た。ｐＶＨＡ６ｇ１３とワクシニアウイルス組換え体ｖ
Ｐ５７７（全ＥＨＶ−１ ｇｐ１４を含有する）との組
換えによって、ワクシニアウイルス二重組換え体ｖＰ６
３３が得られ、ｐＶＨＡ６ｇ１３とワクシニアウイルス
組換え体ｖＰ６１３（先端の欠けたＥＨＶ−１ ｇｐ１
４を含有する）との組換えによって、ワクシニアウイル
ス二重組換え体ｖＰ６３４が得られた。ワクシニアウイ
ルス二重組換え体ｖＰ６３３及びｖＰ６３４のプラーク
をクローニングし、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３及びＥＨＶ−
１ ｇｐ１４配列の存在をＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン分析法並びに発現アッセイ法（後述）で確認した。
【０１２１】ワクシニアウイルス組換え体中で発現され
るＥＨＶ−１ ｇｐ１３及びｇｐ１４糖タンパク質の免
疫沈降反応 ワクシニアウイルス組換え体によって発現されるＥＨＶ
−１ ｇｐ１３及びｇｐ１４糖タンパク質を調べるため
に、ＶＥＲＯ細胞に該組換え体を感染させて、代謝によ
ってタンパク質を３５Ｓ−メチオニンで標識して、例１
記載の方法で免疫沈降反応を行なった。室温で４時間、
１：１０００に稀釈したＥＨＶ−１ ｇｐ１３特異的モ
ノクローナル抗体（１４Ｈ７）又はＥＨＶ−１ ｇｐ１
４特異的モノクローナル抗体（３Ｆ６）（3）を結合さ
せた。試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
（１０％ゲル、定電流３０mA、６時間）にかけ、オート
ラジオグラムを作成した。未感染ＶＥＲＯ細胞又は赤血
球凝集素欠失ワクシニアウイルスｖＰ４５２（184）感
染対照ＶＥＲＯ細胞の産生したもので、抗ＥＨＶ−１ｇ
ｐ１３特異的モノクローナル抗体１４Ｈ７（3）又は抗
ＥＨＶ−１ ｇｐ１４特異的モノクローナル抗体３Ｆ６
（3）によって免疫沈降したものはなかった。これに対
して、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３だけを発現するワクシニア
組換え体ｖＰ４８３、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３とインタク
トなｇｐ１４双方を発現するワクシニアウイルス二重組
換え体（ｖＰ６３３）、又はＥＨＶ−１ ｇｐ１３と先
端の欠けたｇｐ１４双方を発現するワクシニアウイルス
二重組換え体（ｖＰ６３４）で感染したＶＥＲＯ細胞か
らは、放射性標識されたＥＨＶ−１ ｇｐ１３産物がモ
ノクローナル抗体１４Ｈ７によって免疫沈降した。予想
される１次翻訳生成物（５５kDa）よりも若干小さい約
４４kDaと約４７kDaの２種類の生成物並びにＥＨＶ−１
ｇｐ１３が完全にグリコシル化された形に相当する約
９０kDaのやや大きい生成物が検出された。ワクシニア
二重組換え体ｖＰ６３３及びｖＰ６３４において、ＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１３発現の質及び量が、どちらの形のＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１４と同時発現させてもその影響を受けな
かったことは重要である。
【０１２２】ｖＰ６３３、ｖＰ６３４、ｖＰ６１３及び
ｖＰ５７７でそれぞれ感染させたＶＥＲＯ細胞は、抗Ｅ
ＨＶ−１ ｇｐ１４特異的モノクローナル抗体３Ｆ６
（3）によって免疫沈降した。ｖＰ６３３（全ｇｐ１４
とｇｐ１３を含む）及びｖＰ５７７（全ｇｐ１４を含
む）については、約３４、４７、６０〜６４及び９０kD
aの位置に主要バンドが観察されたが、ｖＰ６３４（ｇ
ｐ１３と先端の欠けたｇｐ１４とを含む）及びｖＰ６１
３（先端の欠けたｇｐ１４を含む）では約３４、４７、
５７、７２〜８２及び１１６kDaの位置に主要バンドが
観察された。ＥＨＶ−１ ｇｐ１３と同時発現させた
際、どちらの形のＥＨＶ−１ ｇｐ１４を合成させても
有意の差異はみられなかった。
【０１２３】組換えワクシニアウイルスによって合成さ
れるＥＨＶ−１ ｇｐ１３及びｇｐ１４産物の免疫蛍光
分析 ＥＨＶ−１ ｇｐ１３又はｇｐ１４のいずれかに特異的
なモノクローナル抗体を使用して、組換えワクシニアウ
イルスに感染したＶＥＲＯ細胞の免疫蛍光分析を例１記
載の方法によって行なった。
【０１２４】ワクシニア組換え体ｖＰ４８３、ｖＰ６３
３及びｖＰ６３４に感染したＶＥＲＯ細胞においては、
その細胞表面上並びにアセトン固定細胞内にＥＨＶ−１
ｇｐ１３が容易に検出できた。ｖＰ４１０、ｖＰ５７
７又はｖＰ６１３に感染したＶＥＲＯ細胞においては、
ＥＨＶ−１ ｇｐ１３特異的抗体に対する免疫反応性は
細胞内部にも表面上にもみられなかった。ワクシニア組
換え体ｖＰ５７７、ｖＰ６１３、ｖＰ６３３及びｖＰ６
４４に感染させたＶＥＲＯ細胞をアセトン固定すると、
ＥＨＶ−１ ｇｐ１４の発現が容易に検出できた。ｖＰ
４１０又はｖＰ４８３で感染させた細胞においては、Ｅ
ＨＶ−１ ｇｐ１４特異的抗体に対するはっきりとした
内部免疫蛍光はみられなかった。ＥＨＶ−１ ｇｐ１４
に特異的なモノクローナル抗体３Ｆ６を用いると、先端
欠損型ＥＨＶ−１ ｇｐ１４を発現するｖＰ６１３又は
ｖＰ６４４に感染した細胞には弱い表面免疫蛍光が観察
されたが、対照ウイルスｖＰ４１０及びｖＰ４８３並び
に組換えワクシニアウイルスｖＰ５７７又はｖＰ６４４
（ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子全体を発現する）におい
てははっきりとした表面反応はみられなかった（例８も
参照されたい）。
【０１２５】例４‐ワクシニア組換え体ｖＰ４８３によ
るモルモットの免疫 ワクシニア組換え体ｖＰ４８３によって発現されるｇｐ
１３ウマヘルペスウイルス遺伝子産物の免疫原性を決定
するために、該ウイルスをモルモットに接種し、ワクシ
ニアウイルス及びウマヘルペスウイルス双方に対する血
清中和抗体の存在をアッセイした。
【０１２６】体重約４５０ｇの１５匹のモルモットを５
匹ずつのグループに分けた。一つのグループには、皮下
接種によって、初日（０日）に１mlのワクシニア組換え
体（１０８ ＴＣＩＤ５０／ml）を接種し、次いで２１
日目に１mlの２次免疫を行なった。第二のグループに
は、ワクシニアｖＰ４５２（１０８ ＴＣＩＤ５０／m
l）で同様の接種を行なった。第三のグループには、ワ
クチン接種を行なわなかった。全モルモットについて、
１次ワクチン接種前並びに２１日目及び３５日目に血液
採取した。血清を調製して、ワクシニア及びＥＨＶ−１
（ケンタッキー株）双方の中和抗体の存在について、Ｔ
ＣＩＤ５０＝５０のウイルスを用いてブタ精巣細胞上で
アッセイした。
【０１２７】表１に示すとおり、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３
ワクシニア組換え体ｖＰ４８３は、モルモット中で明ら
かな血清変換を誘起する。ワクシニアウイルスについて
得られた血清中和力価は表１の括弧内に示してある。１
次接種から２１日後にはワクシニア及びＥＨＶ−１双方
の中和抗体が検出でき、２１日目に２次接種して２週間
後には血清中和抗体力価の顕著な増加がみられた。ＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１３発現組換えウイルスを接種したモルモ
ットについて得られた血清ワクシニア中和力価が、ワク
シニアｖＰ４５２ウイルスを接種したモルモットで得ら
れた力価よりもかなり高い（ｔ＝７．２）ことに注目す
べきである。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】例５‐ワクシニア組換え体ｖＰ５７７及び
ｖＰ６１３によるモルモットの免疫 モルモットを免疫して、ワクシニア組換え体ｖＰ５７７
及びｖＰ６１３によって発現されたＥＨＶ−１ ｇｐ１
４に対するモルモットの反応を評価した。体重約４５０
ｇのモルモットに、１０５ ＴＣＩＤ５０のｖＰ５７７
もしくはｖＰ６１３を、初日（０日）及び２１日目にそ
れぞれ１mlずつ皮下接種した。０日目、２１日及び３５
日目に、モルモットから血液を採取した。
【０１３０】ＴＣＩＤ５０＝５０のＥＨＶ−１ウイルス
（ケンタッキー株）に対する中和試験をブタ精巣細胞上
で行なった。ワクシニア抗体の力価は、抗ＩｇＧ（Ｈ＆
Ｌ）ペルオキシダーゼ抱合体を用いたＥＬＩＳＡ法で決
定した。
【０１３１】結果を表２に示す。ワクシニア組換え体ｖ
Ｐ５７７（ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子全体を含有す
る）で免疫したモルモットにおいては、ＥＨＶ−１に対
する血清中和活性は全くみられなかった（データは示し
ていない）。これに対して、先端欠損型ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１４遺伝子を発現するワクシニア組換え体ｖＰ６１３
を接種したモルモットは、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３を発現
するワクシニア組換え体ｖＰ４８３の場合（表１）と同
じ程度のＥＨＶ−１血清中和抗体を誘起した（表２）。
１次ワクチン接種から３週間後にＥＨＶ−１血清中和抗
体が検出されるが、２次免疫してから２週間後にはより
高レベルの血清中和抗体が観察される。ＥＬＩＳＡ法で
ワクシニア抗体をアッセイしたところ、免疫したすべて
の動物において、反応がみられた。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】例６‐ワクチン接種ハムスターのＥＨＶ−
１感染からの防御 ＥＨＶ−１ ｇｐ１３を発現するワクシニア組換え体ｖ
Ｐ４８３の効能を評価するために、ハムスターにワクチ
ンによる１次免疫或いは１次免疫＋２次免疫を施し、非
接種対照群又は対照ワクシニアウイルスｖＰ４５２を２
回接種した群と共に、ＥＨＶ−１のハムスター適応ケン
タッキー株を腹膜内に投与して感染させた。
【０１３４】４０匹のゴールデンハムスター（４０日
齢、体重５５〜６５ｇ）を４つのグループに分けた。グ
ループＡには、１０８、１０６もしくは１０４ ＴＣＩ
Ｄ５０のワクシニア組換え体ｖＰ４８３を、各接種量に
ついて５匹ずつ、１回皮下接種した（１ml）。グループ
Ｂには、０日目にｖＰ４８３をワクチン接種し、続いて
１４日目に２次接種した。このとき、１次及び２次接種
（１ml）は５匹ずつの群に１０８、１０６又は１０４
ＴＣＩＤ５０を皮下接種した。５匹のハムスターからな
るグループＣには、ワクシニアｖＰ４５２を０日目と１
４日目の２度（１回当り１０８ ＴＣＩＤ５０）皮下注
射した。グループＤの５匹は非ワクチン接種対照群とし
てそのままにしておいた。最後に免疫してから１４日後
に、すべてのハムスターについて、２００ ＬＤ５０量
のＥＨＶ−１（ハムスター適応ケンタッキー株）を腹膜
内投与によって感染させた。感染後７日目に生存数を数
えた。
【０１３５】結果を表３に示す。非ワクチン接種ハムス
ター並びにワクシニアｖＰ４５２接種ハムスターは、す
べてＥＨＶ−１感染後５日以内に死亡した。ＥＨＶ−１
ｇｐ１３発現ワクシニア組換え体ｖＰ４８３をワクチ
ン接種したハムスターでは、ＥＨＶ−１感染に対してか
なりのレベルの防御がみられた。１次免疫だけのハムス
ターと１次及び２次免疫したハムスターとの間で防御レ
ベルに差異はみられなかった。半防御量（ＰＤ５０）
は、１次免疫についてのｌｏｇ１０ＰＤ５０＝６．３
２、１次免疫＋２次免疫についてのｌｏｇ１０ＰＤ５０
＝は６．１２で、同程度の値であった。しかしながら、
１００％防御は、１０８ ＴＣＩＤ５０の組換えウイル
スを２回接種した群についてのみ観察された。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４を単独又はＥＨＶ−
１ ｇｐ１３と一緒に発現するワクシニア組換え体の防
御効果を評価するために、ワクチン接種ハムスターにつ
いてウイルス感染実験を行なった。ハムスターにワクチ
ンによる１次免疫或いは１次免疫＋２次免疫を施し、非
接種対照群又は対照ワクシニアウイルスｖＰ４５２を２
回接種した群と共に、ＥＨＶ−１のハムスター適応ケン
タッキー株を腹膜内に感染した。体重約６０ｇの２１日
齢のゴールデンハムスターに、それぞれ１mlの対照ワク
シニア又はＥＨＶ−１ ｇｐ１３及び／又はｇｐ１４を
発現する組換えワクシニアウイルスｖＰ４８３、ｖＰ５
７７、ｖＰ６１３、ｖＰ６３３及びｖＰ６３４を皮下接
種した。１次ワクチン接種に続いて１４日目に同量（lo
g10pfu／ml）のワクチンを接種した。最後に免疫してか
ら１４日後に、非接種対照群を含めたすべてのハムスタ
ーに、２００ ＬＤ５０量のＥＨＶ−１ハムスター適応
ケンタッキー株を腹膜内注射して感染させた。感染後１
４日目に、５匹からなる群の生存数を数えて実験を終え
た。ハムスターの５０％を防御するワクチン接種量をｌ
ｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ml接種量として評価した。
【０１３８】表４に示すとおり、全ＥＨＶ−１ ｇｐ１
４遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体ｖＰ５
７７では、ｌｏｇ１０ＰＤ５０≧９．０と計算され、感
染に対する防御力を賦与しなかった。これに対して、ワ
クシニア組換え体ｖＰ６１３によって発現される先端欠
損型ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子は、感染に対して十分
な防御力を賦与した（表４）。計算されたＰＤ
５０（５．２）は、ＥＨＶ−１ｇｐ１３発現ワクシニア
組換え体ｖＰ４８３で得られた値（５．４）よりも若干
良い値であった。驚くべきことに、ＥＨＶ−１ ｇｐ１
３及びｇｐ１４を同時発現させると、それぞれワクシニ
アウイルス組換え体ｖＰ６３３及びｖＰ６３４中の全ｇ
ｐ１４遺伝子又は先端欠損型ｇｐ１４遺伝子のいずれに
ついても、ＥＨＶ−１糖タンパク質を単独で発現させた
場合よりも防御力が著しく増大した。従って、同一ワク
シニアウイルス組換え体中でＥＨＶ−１ ｇｐ１３及び
ｇｐ１４を同時発現させると、ワクチン接種したハムス
ターを５０％防御するのに必要なウイルス接種量は著し
く減少した。
【０１３９】
【表４】
【０１４０】例７‐ウマヘルペスウイルスｇｐ１３糖タ
ンパク質を発現するアビポックスウイルス組換え体の構
築 次に図１１を参照する。ｐＶＨＡ６ｇ１３をＥＨＶ−１
ｇｐ１３遺伝子源として使用した。全ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１３遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを単離するため
に、ｐＶＨＡ６ｇ１３をＮｒｕIとＨｉｎｄIIIで消化し
た。この消化によって、ワクシニアウイルスＨ６プロモ
ーターの３′末端の２８bp、全ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺
伝子及び約４１０bpのワクシニアウイルス配列を含む約
１．８Kbのフラグメントが得られた。この１．８KbのＮ
ｒｕI／ＨｉｎｄIIIフラグメントを単離して、アビポッ
クスウイルス挿入ベクターｐＦＰＣＶ２及びｐＣＰＣＶ
１への挿入に使用した。
【０１４１】ニワトリポックスウイルス（ＦＰ）挿入ベ
クターｐＦＰＣＶ２は、ＦＰゲノムのｆ７遺伝子座と呼
ばれる非必須領域中に外来遺伝子の挿入された組換え体
を作成するためのビヒクル(vehicle)を提供する。ｐＦ
ＰＣＶ２をｐＲＷ７３１．１３から誘導した。プラスミ
ドｐＲＷ７３１．１３は、ｐＵＣ９の２カ所のＰｖｕII
部位間にＦＰゲノムのＰｖｕIIフラグメント（約５．５
Kb）が挿入されたものである。まず最初に、この５．５
Kb ＦＰゲノム由来ＰｖｕIIフラグメント内に存在する
非反復ＨｉｎｃII挿入部位に多重クローニング配列（Ｍ
ＣＳ）を連結した。このＭＣＳは、オリゴヌクレオチド
ＣＥ４（５′−ＴＣＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣ
ＧＧＴＡＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＣＧＡＣ
ＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴ−３′）
とＣＥ５（５′−ＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣ
ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡ−
３′）とのアニーリングによって誘導したものである。
【０１４２】ｐＦｅＬＶ１Ａはワクシニア挿入ベクター
ｐＴＰ１５（184）（図４）の誘導体であって、Ｈ６プ
ロモーター下流のＰｓｔI部位にネコ白血病ウイルス
（ＦｅＬＶ）のｅｎｖ遺伝子（192）が挿入されたもの
である。２．４Kbの発現カセットをＦＰベクターに移し
換えるために（図１１）、ｐＦｅＬＶ１ＡをＢｇｌIIで
消化し、ＰｓｔI部分消化して、Ｈ６／ＦｅＬＶ ｅｎ
ｖ配列を切り出した。該ＢｇｌII部位はＨ６プロモータ
ー配列の５′末端の境界にあり、該ＰｓｔI部位はＦｅ
ＬＶエンベロープ糖タンパク質の解読枠の翻訳終結シグ
ナルの４２０bp下流に位置している。
【０１４３】２．４Kbの上記Ｈ６／ＦｅＬＶ ｅｎｖ配
列を、ＢａｍＨIとＰｓｔIで消化したｐＣＥ１１に挿入
した。このプラスミドをｐＦｅＬＶＦ１と命名した。ｐ
ＦｅＬＶＦ１プラスミドを次にＰｓｔIで消化してＦｅ
ＬＶ ｅｎｖ配列を除去した。得られたプラスミド（ｐ
ＣＥ１１中にワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含
む）をｐＦＰＣＶ１と命名した。外来の配列を除去する
ために、５′から該プロモーターまでの配列にオリゴヌ
クレオチドＦＰＣＶ１（５′−ＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣ
ＧＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＴＴＣＴＴＴ
ＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴ−３′）を使用
して変異を導入し（19）、ｐＦＰＣＶ１を得た。オリゴ
ヌクレオチドＦＰＣＶ３（５′‐ＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣ
ＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＣＧ
ＡＣ−３′）で、３′から該プロモーターまでの領域
（マルチクローニング部位）に変異を導入して、Ｓｐｈ
Ｉ部位（ＡＴＧを含む）を除去した。得られたプラスミ
ドをｐＦＰＣＶ２と命名した。
【０１４４】上述の１．８Kb ＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ ＥＨＶ−１ ｇｐ１３フラグメントを、ｐＦＰＣＶ
２を消化して得た８．０KbのＮｒｕI／ＨｉｎｄIIIフラ
グメントに挿入した。この８．０Kb ＮｒｕI／Ｈｉｎ
ｄIIIフラグメントは、ワクシニアウイルスＨ６プロモ
ーターの５′末端部分（１００bp）、ＦＰフランキング
配列（挿入部位の４．８Kb上流及び１．５Kb下流）並び
に２．４KbのｐＵＣ断片（ＢＲＬ社製、メリーランド州
ベセスダ(Bethesda)）を含んでいた。これら２つのフラ
グメントの連結によって、ｐＦＰＥＨＶ１３Ａと名付け
た９．８Kbのプラスミドが得られた。
【０１４５】プラスミドｐＦＰＥＨＶ１３ＡをＫｐｎI
とＨｉｎｄIIIで消化して約６００bpのフラグメントを
除去した。このフラグメントは、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３
遺伝子の３′側領域（２００bp）と４１０bpのワクシニ
アウイルスＤＮＡ断片とを含んでいた。この６００bpの
ＫｐｎI／ＨｉｎｄIIIフラグメントを、以下の手順で、
pＮＳＩＥＮＰＮ（図４）由来の２００bpフラグメント
に置き換えた。pＮＳＩＥＮＰＮをＰｓｔIで消化して、
該プラスミドを線状化した。該ＰｓｔI末端を、各ｄＮ
ＴＰ（０．５mMずつ）の存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（New EnglandBioLabs社製）を作用させて、平滑
末端とした。次にＨｉｎｄIIIリンカー（ＢＲＬ社製）
をこの平滑末端フラグメントに連結した。ＨｉｎｄIII
で消化した後、該線状化プラスミドをＫｐｎIで消化し
て、ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子の３′末端部分、終止
コドン（ＴＡＧ）に相当する配列、並びにワクシニアウ
イルス初期転写終結シグナルとして公知の（45）「ＴＴ
ＴＴＴＮＴ」配列を含む２００bpのフラグメントを得
た。この組換えプラスミドをｐＦＰＥＨＶ１３Ｂと名付
けて、Ｈ６プロモーター付きＥＨＶ ｇｐ１３遺伝子を
ＦＰゲノムのｆ７座に挿入するためのインビトロ組換え
に使用した。得られた組換えニワトリポックスウイルス
をｖＦＰ４４と名付けた。
【０１４６】次に図１２を参照する。ｐＦＰＥＨＶ１３
Ｂは、ｐＣＰＣＶ１への挿入用１．４Kb ＮｒｕI／Ｈ
ｉｎｄIIIフラグメントの作成にも利用した。ｐＣＰＣ
Ｖ１プラスミドは、カナリアポックスウイルス（ＣＰ）
ゲノムの３．３Kb ＰｖｕIIフラグメント内に存在する
非反復ＥｃｏＲI部位にワクシニアウイルスＨ６プロモ
ーターを含んでいる。この挿入プラスミドを用いると、
ＣＰゲノムのＣ３座に外来遺伝子を挿入することが可能
になる。ｐＣＰＣＶ１をｐＲＷ７６４．２（ｐＵＣベク
ターに３．３KbのＣＰゲノム由来ＰｖｕIIフラグメント
が挿入されている）から誘導した。ｐＲＷ７６４．２を
ＥｃｏＲIで消化して線状化した。このフラグメント
を、各ｄＮＴＰ（０．５mMずつ）の存在下で大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノウフラグメント（Boehringer
Mannheim Biochemicals社製）を作用させて、平滑末端
とした。ｐＦＰＣＶ１をＫｐｎI／ＨｐａIで消化して、
ワクシニアウイルスＨ６プロモーター配列とマルチクロ
ーニング領域（該プロモーターの３′末端に位置する）
を切取った。この２００bpのフラグメントを、各ｄＮＴ
Ｐ（０．５mMずつ）の存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させて、平滑末端とし、上記の線状化しかつ平
滑末端としたプラスミドｐＲＷ７６４．２に挿入した。
得られたプラスミドをｐＣＰＣＶ１と名付けた。プラス
ミドｐＣＰＣＶ１をＮｒｕIとＨｉｎｄIIIで消化して
５．８Kbのフラグメントを単離し、上述の１．４Kb Ｅ
ＨＶ ｇｐ１３含有フラグメントに連結した。得られた
プラスミドをｐＣＰＥＨＶ１３Ａと名付けた。このプラ
スミドを使用して、Ｈ６プロモーター付きＥＨＶ ｇｐ
１３遺伝子をＣＰゲノムのＣ３座に挿入するためのイン
ビトロ組換え実験を行なった。この組換えカナリアポッ
クスウイルスをｖＣＰ４８と名付けた。
【０１４７】インビトロ組換え後、ＥＨＶ−１ ｇｐ１
３遺伝子を有する組換えアビポックスウイルスを標準的
なプラークハイブリダイゼーション法によって同定し
た。プラーク単離を３回繰返して陽性プラークを精製し
た後、ハイブリダイゼーション法による分析を行なっ
た。ＦＰ組換え体とＣＰ組換え体を、それぞれｖＦＰ４
４及びｖＣＰ４８と名付けた。これらの組換え体を、Ｅ
ＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子に対するモノクローナル抗血
清を用いたプロテインＡ‐β−ガラクトシダーゼ免疫ス
クリーング法で分析した。その結果、ＣＥＦ及びＶＥＲ
Ｏ細胞単層にｖＦＰ４４又はｖＣＰ４８を感染させると
該ウイルス感染細胞表面上にＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝
子が発現することが実証された。
【０１４８】例８‐ウマヘルペスウイルス１型の糖タン
パク質ｇｐ１４をコードする遺伝子の未修飾及び修飾型
遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体の評価 ＥＨＶ−１ ｇｐ１４を発現する他の組換えワクシニア
ウイルスの構築と評価 含ＥＨＶ−１ ｇｐ１４構築体（例２）を、(a) ＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１４リーダー配列の長さを変える、(b)
遺伝子の３′側にある過剰のＥＨＶ−１ ＤＮＡを除去
する、並びに(c) ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子の修飾
型遺伝子を評価用ワクシニアウイルスｖＰ２９３宿主域
選択系（69）に挿入する、という３通りの方法で修飾し
た。
【０１４９】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子産物は非常に
長いリーダー配列を含んでいる。５８番目のアミノ酸か
ら９９番目のアミノ酸までの長い疎水性配列はシグナル
配列であると思われる。この領域の前には長い親水性配
列が存在している。同様の長いリーダー配列は、他の２
つのｇＢ相同物、即ち、仮性狂犬病ウイルスのｇII（6
2）とウシヘルペスウイルス１型のｇI（63）にも認めら
れる。
【０１５０】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４の５′末端の修飾 組換えワクシニアウイルス中で発現するｇｐ１４産物の
プロセシング、提示及び免疫力に及ぼすＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１４のリーダー配列の長さの影響を研究するため、既
述の含ＥＨＶ−１ ｇｐ１４構築体を以下のとおり修飾
することによって、３つの異なる長さのリーダー配列を
有するＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子含有プラスミドを作
成した。
【０１５１】ここで図１３を参照する。プラスミドｐＶ
Ｍ２ＬＨ６ｇ１４（例２）は、Ｈ６プロモーターの制御
の下に置かれた全ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列（コ
ペンハーゲン株ワクシニアＭ２Ｌ欠失座に挿入されてい
る）を含有する。ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４においては、Ｅ
ＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子の２番目のアミノ酸が本来の
ＳｅｒではなくてＨｉｓとして存在している。２番目の
アミノ酸をＳｅｒに変えるために、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１
４をコドン１〜２（Ｍｅｔ／Ｈｉｓ）においてＮｓｉI
（認識配列ＡＴＧＣＡＴ）で切断した。合成オリゴヌク
レオチドＭＰＳＹＮ２４０（５′‐ＡＴＣＣＧＴＴＡＡ
ＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴ
ＧＣＣＧＴＴＣＴＧＴＣ−３′）を使用して変異を導入
した（19）。得られたプラスミドｐＭＰ１４Ｍは、本来
のコドン２（Ｓｅｒ）を有するＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺
伝子全体を含んでいる。
【０１５２】プラスミドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１（例
２）は、リーダー配列の先端が欠けていること(truncat
ion)並びに合成ＮｓｉIリンカー由来のコドンが４つ導
入されていること以外、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４と同一で
ある。ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１におけるＥＨＶ−１
ｇｐ１４遺伝子の５′末端配列はＭｅｔ／Ｈｉｓ／Ａｌ
ａ／Ｃｙｓ／Ｉｌｅ／Ａｌａ．．．をコードするＡＴＧ
／ＣＡＴ／ＧＣＡ／ＴＧＣ／ＡＴＴ／ＧＣＴ．．．であ
り、ここでＧＣＴ（Ａｌａ）はＥＨＶ−１ ｇｐ１４の
コドン３５である。変異導入法（19）によって、ｐＶＭ
２ＬＨ６ｇ１４−１を２通りに修飾した。ｐＶＭ２ＬＨ
６ｇ１４−１とほぼ同じ程度まで先端を切取ってはいる
がｇｐ１４の本来の配列により近い修飾型遺伝子を作成
するために、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１をコドン１〜２
においてＮｓｉIで切断した。合成オリゴヌクレオチド
ＭＰＳＹＮ２４１（５′‐ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴ
ＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣ
ＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣ−３′）を使用して変異導
入を行なった。得られたプラスミドｐＭＰ１４Ｍ−３４
においては、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列はＭｅｔ
／Ｓｅｒ／Ｖａｌ／Ｐｒｏ．．．をコードするＡＴＧ／
ＡＧＴ／ＧＴＣ／ＣＣＡ．．．で始まるが、ここでＣＣ
Ａ（Ｐｒｏ）はＥＨＶ−１ ｇｐ１４の３６番目のアミ
ノ酸である。ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子はコドン６１
〜６３（Ｌｙｓ／Ｐｒｏ／Ａｌａ）にＮａｅI部位（Ｇ
ＣＣＧＧＣ）を含んでいる。より多くの先端を切取った
修飾型ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子を作成するために、
ＮａｅIでｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１を線状化し、次い
でＮｓｉIで消化して、ベクターフラグメントをアガロ
ースゲルから単離した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳ
ＹＮ２４３（５′‐ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡ
ＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧ
ＣＡＣＡＡＴＡＧＴＴ−３′）を使用して変異導入を行
なった。得られたプラスミドｐＭＰ１４Ｍ−６３におい
ては、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列はＭｅｔ／Ａｌ
ａ．．．をコードするＡＴＧ／ＧＣＡ．．．で始まる
が、ここでＧＣＡ（Ａｌａ）はネイティブなＥＨＶ−１
ｇｐ１４の６３番目のアミノ酸である。
【０１５３】余剰ＥＨＶ−１ ＤＮＡの除去 上記のすべてのＥＨＶ−１ ｇｐ１４含有プラスミドに
おいては、ＥＨＶ ｇｐ１４コード配列の後に約１２０
０bpのＥＨＶ−１ ＤＮＡが続いている。ｇｐ１４遺伝
子の終止コドン（ＴＡＡ）はＤｒａI部位（ＴＴＴＡＡ
Ａ）中に存在する。過剰のＥＨＶ−１ ＤＮＡを除去す
るために、ｐＭＰ１４Ｍ−６３をＤｒａIで部分消化し
て、線状ＤＮＡをアガロースゲルから単離して、次いで
ＰｓｔI消化によってＥＨＶ−１ ＤＮＡと下流のワク
シニアフランキングアームとの連結部を切断した。アガ
ロースゲルから６．５KbのＤｒａI／ＰｓｔI ＤＮＡバ
ンドを単離した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２
４７（５′−ＡＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧ
ＣＴＧＣＡ−３′）とＭＰＳＹＮ２４８（５′−ＧＣＴ
ＣＧＡＧＴＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴ−３′）をアニー
ルして、上記６．５Kbフラグメントと連結した。得られ
たプラスミドｐＭＰ１４Ｍ−６３Ｐにおいては、ＥＨＶ
−１ ｇｐ１４コード配列の直後に初期ワクシニア転写
終止を支配する配列が続き（45）、その後にポリリンカ
ー領域（ＨｐａI、ＸｈｏI、ＰｓｔI制限部位を含む）
とＨｉｎｄIII Ｍ由来の左側ワクシニアフランキング
アームが続いている。
【０１５４】Ｈ６プロモーター／ＥＨＶ−１ ｇｐ１４
遺伝子のｐＨＥＳ／ｖＰ２９３選択系への挿入 上記のすべてのＥＨＶ−１ ｇｐ１４含有プラスミドに
おいては、ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子は、コペンハーゲ
ン株ワクシニアウイルスのＭ２Ｌ欠失座に挿入されたワ
クシニアＨ６プロモーターの制御下に置かれている。Ｍ
２Ｌ挿入座は欠失させることのできるゲノムのより大き
な領域内に位置している（69）ので、潜在的により安定
な挿入部位にＨ６プロモーター／ＥＨＶ−１ ｇｐ１４
発現カセットを移すことについて検討した。予備段階と
して、異なる長さのリーダー配列を含有するＥＨＶ−１
ｇｐ１４遺伝子構築体をＷＲ ｐＨＥＳ／ｖＰ２９３
宿主域選択系（69）に移し換えることによって、比較対
照用のワクシニア組換え体の迅速な作成が可能になっ
た。
【０１５５】プラスミドｐＨＥＳ−４は、ワクシニアＨ
６プロモーターとそれに続くポリリンカー領域及びＫ１
Ｌヒト宿主域遺伝子（70）を含んでいるが、これらはす
べて２１．７Kb欠失部の両隣のＷＲワクシニアアーム間
に挿入されている（69）。ｐＨＥＳ−４は２カ所のＮｒ
ｕI部位を含んでいるが、その一つはＨ６プロモーター
内にあり、もう一つはワクシニアフランキング配列内に
ある。ｐＨＥＳ−４を、ＮｒｕIで部分消化して線状化
し、アガロースゲルから完全な長さの線状ＤＮＡを含む
バンドを単離した。この線状ＤＮＡをポリリンカー領域
内のＸｈｏI部位で切断した。ｐＭＰ１４Ｍ−６３Ｐは
２カ所のＮｒｕI部位を含んでいるが、その一つはＨ６
プロモーター内にあり、もう一つはＥＨＶ−１ ｇｐ１
４コード配列内（遺伝子の３′末端から０．２Kbの位
置）にある。ｐＭＰ１４Ｍ−６３ＰをＮｒｕIで線状化
した後ＸｈｏIで消化した。２．８KbのＮｒｕI（部分）
／ＸｈｏIフラグメントをアガロースゲルから単離し
た。このフラグメントは、Ｈ６プロモーターの一部とそ
れに続く修飾型ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子（リーダー
配列が最も短い型）を含んでいる。ｐＭＰ１４Ｍ−６３
Ｐ由来の２．８Kb Ｈ６プロモーター／ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ１４含有フラグメントを、ｐＨＥＳ−４由来のＮｒｕ
I（部分）／ＸｈｏIベクターフラグメントに連結した。
得られたプラスミドｐＨＥＳ−ＭＰ６３は、Ｈ６プロモ
ーター／ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子カセットを含んで
はいるが、余剰ＥＨＶ−１ ＤＮＡは有していない。全
長又は適度に先端の切取られたリーダー配列を含むＨ６
プロモーター／ＥＨＶ−１ ｇｐ１４の５′末端を移し
換えるために、プラスミドｐＭＰ１４Ｍ及びｐＭＰ１４
Ｍ−３４をＮｒｕIで切断して、それぞれ、２．８Kbと
２．７Kbのバンドをアガロースゲルから単離した。ｐＨ
ＥＳ−ＭＰ６３をＮｒｕIで部分消化して、７．２Kbの
フラグメントをアガロースゲルから単離した。この７．
２Kbベクターフラグメントは、Ｈ６プロモーター／ＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１４の５′末端を含む２．６KbＮｒｕIフ
ラグメントがｐＨＥＳ−ＭＰ６３から除去されたもので
ある。このｐＨＥＳ−ＭＰ６３由来７．２Kb ＮｒｕI
（部分）ベクターフラグメントを、ｐＭＰ １４Ｍ由来
の上記２．８Kb ＮｒｕIフラグメントと連結して、ｐ
ＨＥＳ−ＭＰ１を得た。ｐＨＥＳ−ＭＰ６３由来７．２
Kb ＮｒｕI（部分）ベクターフラグメントを、ｐＭＰ
１４Ｍ−３４由来の上記２．７Kb ＮｒｕIフラグメン
トに連結して、ｐＨＥＳ−ＭＰ３４を得た。プラスミド
ｐＨＥＳ−ＭＰ６３、ｐＨＥＳ−ＭＰ１及びｐＨＥＳ−
ＭＰ３４を作成するためのクローニング工程を図１３に
図解した。
【０１５６】プラスミドｐＨＥＳ−ＭＰ１、ｐＨＥＳ−
ＭＰ３４及びｐＨＥＳ−ＭＰ６３を、ｖＰ２９３（69）
との組換え用ドナープラスミドとして使用して、それぞ
れ、組換えワクシニアウイルスｖＰ７５３、ｖＰ７６５
及びｖＰ７２１を得た。ヒトＭＲＣ−５細胞上で組換え
プロジェニィを選択した。
【０１５７】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子を発現するｖ
Ｐ２９３系ワクシニアウイルス組換え体の評価 組換えワクシニアウイルスｖＰ７５３、ｖＰ７６５及び
ｖＰ７２１中で発現させた３種類のＥＨＶ−１ ｇｐ１
４遺伝子産物が、感染細胞表面上に存在するか否かを決
定するために、ＶＥＲＯ細胞単層に３種類のＥＨＶ−１
ｇｐ１４含有組換えワクシニアウイルスを感染させ
た。ＥＨＶ−１ ｇｐ１４に特異的なモノクローナル抗
体３Ｆ６を使用して、感染させた細胞単層の表面免疫蛍
光を測定した。３種類のワクシニアウイルス組換え体、
ｖＰ７５３、ｖＰ７６５及びｖＰ７２１に感染させた細
胞すべてについて表面免疫蛍光は陽性であった。この結
果は、リーダー配列の長さを変化させてもワクシニア感
染細胞中におけるＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子産物の適切
な輸送には影響がないことを示している。
【０１５８】３種類のＥＨＶ−１ ｇｐ１４含有ワクシ
ニアウイルス組換え体によって発現されるＥＨＶ−１
ｇｐ１４遺伝子産物を比較するために、ｖＰ７５３、ｖ
Ｐ７６５及びｖＰ７２１をＭＲＣ−５細胞に感染させ、
代謝されるタンパク質を３５Ｓ−メチオニンを使用して
標識した。ＥＨＶ−１ ｇｐ１４に特異的なモノクロー
ナル抗体３Ｆ６を使用して、放射性標識細胞溶解物につ
いて免疫沈降反応を行なった。
【０１５９】ｖＰ７５３、ｖＰ７６５及びｖＰ７２１に
感染した細胞から得られた免疫沈降タンパク質は、互い
に識別不能で、プラスミドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１か
ら作成したＥＨＶ−１ ｇｐ１４含有ワクシニア組換え
体であるｖＰ６１３由来の免疫沈降タンパク質と等価で
あった。これらの結果は、上記組換え体で試したように
ＥＨＶ−１ ｇｐ１４リーダー配列の長さを変化させて
も、遺伝子産物の適切なプロセシングは促進も妨害もさ
れないことを示している。
【０１６０】異なる型のＥＨＶ−１ ｇｐ１４を発現す
る組換えワクシニアウイルスの防御効果を評価するため
に、ハムスターにｖＰ７５３、ｖＰ７６５及びｖＰ７２
１を量を変化させて接種し、ＥＨＶ−１のハムスター適
応ケンタッキー株を感染させた。３種類のＥＨＶ ｇｐ
１４含有ワクシニア組換え体はすべて防御力があり、そ
のｌｏｇ１０ＰＤ５０値は６．２もしくはそれより優れ
ていた。これら３種類のワクシニアウイルス組換え体の
間で、防御力に統計的有意差はみられなかった。
【０１６１】ｖＰ５７７とは対照的に、同じくｐＶＭ２
ＬＨ６ｇ１４とｖＰ４５８との間の組換えによって得ら
れた別のワクシニアウイルス組換え体は、ｖＰ６１３、
ｖＰ７５３、ｖＰ７６５及びｖＰ７２１でみられるＥＨ
Ｖ−１ ｇｐ１４免疫沈降パターンと同じ免疫沈降パタ
ーンを示し、かつこれらのＥＨＶ−１ ｇｐ１４発現組
換えワクシニアウイルスと同様に、感染細胞表面上にＥ
ＨＶ−１ ｇｐ１４タンパク質を発現した。
【０１６２】この結果は、ワクシニアウイルス組換え体
ｖＰ５７７中で発現したＥＨＶ−１ｇｐ１４に欠陥があ
り、この欠陥がおそらくドナープラスミドｐＶＭ２ＬＨ
６ｇ１４とワクシニアウイルスｖＰ４５８との組換えの
際に生じたことを示唆している。
【０１６３】例９‐ウマヘルペスウイルス１型に由来す
る３種類の新規遺伝子の塩基配列とワクシニアウイルス
組換え体中での発現 ｇｐ１７／１８をコードするＥＨＶ−１遺伝子をワクシ
ニア組換えウイルス中で発現させるに先立って該遺伝子
を同定・単離するために、ＥＨＶ−１ゲノムのＵ８領域
のほとんどの配列を決定し、このＤＮＡフラグメント上
で発見した複数の異なる解読枠を発現させた。該Ｓ領域
にコードされた以下の３種類の新規ＥＨＶ−１遺伝子、
即ち、決定した塩基配列から、 ＨＳＶ ｇＤ遺伝子
及びＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子産物との相同性を示すＥＨ
Ｖ−１ ｇＤ、 ＨＳＶ ＵＳ７遺伝子及びＰＲＶ
ｇｐ６３遺伝子産物との相同性を示すＥＨＶ−１ ｇｐ
６３、及び ＨＳＶ ｇＥ遺伝子及びＰＲＶ ｇＩ遺
伝子の産物との相同性を示すＥＨＶ−１ ｇＥを同定
し、解析した。これら３種類の遺伝子をすべて、個別又
は一緒に、迅速発現研究用コペンハーゲンワクシニア株
宿主域選択系にクローン化した。ウサギの抗ＥＨＶ−１
血清を用いた免疫蛍光法によって、ＥＨＶ−１有の遺伝
子産物が発現されることが判明した。
【０１６４】ＥＨＶ−１ ＢａｍＨI Ｄフラグメント
のクローニング ＥＨＶ−１ ｇｐ１７／１８遺伝子はＥＨＶ−１ゲノム
のＳ領域に位置しているので（３）、ＵＳ領域の大部分
に相当するＢａｍＨI Ｄフラグメント（59）を単離し
てクローニングした。ケンタッキーＤ株のＥＨＶ−１ゲ
ノムＤＮＡをＢａｍＨIで消化した。アガロースゲル（G
eneclean、Bio101, Inc社製、カリフォルニア州ラジョ
ラ(La Jolla)）から１１．０KbのＢａｍＨI Ｄフラグ
メントを単離し、プラスミドｐＩＢＩ２４にクローン化
して、プラスミドｐＥＨＶＢａｍＨＩＤとした。このフ
ラグメントの制限酵素地図を得た（図１４）。
【０１６５】ＥＨＶ−１ ｇＤ、ｇｐ６３及びｇＥをコ
ードするＤＮＡ配列の同定 例１記載の手順で、ｐＩＢＩ２４にサブクローン化した
ＢａｍＨI Ｄフラグメントの幾つかのサブクローンか
ら二本鎖に関する塩基配列を得た。連続フラグメント間
の連結部の配列は、最初のクローンpＥＨＶＢａｍＨIＤ
上でチェックした。一切の配列データの解析にはＰＣ／
ＧＥＮＥソフトウェアーパッケージ（Intelligenetics
Inc.社製、カリフォルニア州マウンテン・ビュー(Moun
tain View)）を使用した。
【０１６６】ＥＨＶ−１ ｇＤ、ｇｐ６３及びｇＥ遺伝
子のＤＮＡ塩基配列解析 塩基配列を決定したＢａｍＨI Ｄフラグメント（特有
の短鎖領域の大部分に相当する）由来の６４０２bp領域
のＤＮＡ配列を解析することによって、少なくとも３つ
の完全な解読枠（すべて同一鎖から読取られる）が存在
することが明らかになった。この配列を、図１５〜２６
（配列番号２３、配列番号２４〜２６）に、５′→３′
鎖を右方向に示した。塩基組成はＧ＋Ｃ含量５０．４４
％である。
【０１６７】第一の解読枠（ＯＲＦ１）は、９７１番目
の塩基から２１７６番目の塩基までである。転写調節シ
グナルと思われる配列が、ＡＴＧ開始コドンである可能
性の最も高い９７１番目の塩基の５′側領域にみつかっ
た。配列ＴＡＴＡＴＴＡＡ（ヌクレオチド８７１〜８７
８）を有する「ＴＡＴＡボックス」は、８１１番目から
８１７番目に位置する配列ＴＧＡＣＡＡＴを有する仮想
「ＣＡＴボックス」の６０塩基下流に位置していた。ポ
リアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は、ＴＡＡ終止
コドン（ヌクレオチド２１７７〜２１７９）の下流には
みられなかった。配列５′ＴＣＣＣＴＴＣＧＣＣ３′
（ヌクレオチド８９０〜８９９）の１０個の塩基のうち
の７個は、１８ＳリボソームＲＮＡの配列３′ＡＧＧＡ
Ａ ＧＧＣＧＴ５′（61）と相補的であり、リボソーム
結合部位として機能している可能性がある。真核生物の
ｍＲＮＡの翻訳開始に関する移動(scanning)モデルが提
案されている（151）。このモデルの基本法則は、リボ
ソームがｍＲＮＡの５′末端に結合して、ｍＲＮＡ分子
上を直線的に移動するということである。翻訳の開始に
関する符号は、例外も知られてはいるが（152）通常は
最初の５′基部ＡＴＧコドンである。−３位のプリンは
翻訳開始に必須であり、配列の残りの部分が最適でなけ
れば、−１番目及び−２番目の塩基Ｃによって翻訳が促
進される。上述の開始コドンＡＧＣＡＴＧＴ（ヌクレオ
チド９６８〜９７４）付近の配列状態は、真核生物のｍ
ＲＮＡの翻訳の開始に必要な機能的配列状態を満足す
る。さらに２つの潜在的ＡＴＧ開始コドンがヌクレオチ
ド９８９〜９９１及び９９２〜９９４に位置している。
これら２つのコドンＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧの前後状況
は、翻訳開始の役割を果たし得るものではない。ＥＨＶ
−１ ＯＲＦ１は計算上４５２３９ダルトンの分子量を
有する４０２個のアミノ酸をコードする。
【０１６８】ＥＨＶ−１ ＯＲＦ１タンパク質構造の解
析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通す
る多くの性質が明らかになった。１番目のアミノ酸から
２６番目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を
有しており、シグナル配列であると思われる。２４残基
のアミノ酸（３５１〜３７４）からなる疎水性領域は膜
貫通性アンカー領域として機能すると予想される。Ｎ−
グリコシル化される可能性のあるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／
Ｓｅｒ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸である）部位が４
カ所存在する（157）。ＥＨＶ−１ ＯＲＦ１アミノ酸
配列の疎水的性質を図２７に示す。シグナル及びアンカ
ー成分などの膜貫通性糖タンパク質の特徴が明瞭に現れ
ている。Ｎ末端とＣ末端付近に存在する２つの最も疎水
性の高い領域は、それぞれ糖タンパク質分子のシグナル
配列及び膜貫通性領域であろうと思われる。
【０１６９】ＥＨＶ−１ ＯＲＦ１アミノ酸配列と他の
ヘルペスウイルス糖タンパク質との比較 予想されるＥＨＶ−１ ＯＲＦ１のアミノ酸組成の比較
から、他のヘルペスウイルスの糖タンパク質とのかなり
の相同性が明らかになった。たとえば、ＥＨＶ−１ Ｏ
ＲＦ１タンパク質は、ＰＲＶ ｇｐ５０（95）及びＨＳ
Ｖ１ ｇＤ（79,160）に類似している。
【０１７０】第二の解読枠（ＯＲＦ２）は２２８７番目
の塩基から３５２５番目の塩基までである。２２８７番
目のＡＴＧ開始コドンの５′側領域には、転写調節シグ
ナルと思われる配列はみつからなかった。ＴＧＡ終止コ
ドン（ヌクレオチド３５２６〜３５２８）の下流には、
ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルはみられなかった
が、潜在的ＹＧＴＧＴＴＹＹ配列ポリアデニル化シグナ
ル（180）が、上記終止コドンの約４０bp下流及び７０b
p下流の２カ所に位置していた。予想される開始コドン
ＧＣＴＡＴＧＧ付近の配列状態はコザック(Kozak)の法
則（151,155）に合致している。そのほかに少なくとも
２つの潜在的ＡＴＧ開始コドンが、ヌクレオチド２３０
５〜２３０７及び２３３２〜２３３４に存在している
が、これら２つのコドンの配列状態（ＧＧＧＡＴＧＴと
ＴＣＴＡＴＧＧ）は翻訳開始の役割を果たし得るもので
はない。ＥＨＶ−１ ＯＲＦ２は、計算上４５４３１ダ
ルトンの分子量を有する４１３残基のアミノ酸からなる
ポリペプチドをコードしている。
【０１７１】ＥＨＶ−１ ＯＲＦ２タンパク質構造の解
析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通す
る多くの性質が明らかになった。１番目のアミノ酸から
２２番目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を
有しており、シグナル配列であると思われる（コンピュ
ーター解析からは、該部位が切断部位として機能する可
能性は低いという結果がでた）。３２残基のアミノ酸
（３１５から３４６までの位置）からなる疎水性領域は
膜貫通性アンカー領域として機能すると予想される。Ｎ
−グリコシル化される可能性のあるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ
／Ｓｅｒ部位が７カ所存在する。ＥＨＶ−１ ＯＲＦ２
アミノ酸配列の疎水的性質を図２８に示す。シグナルと
アンカー成分を含む膜貫通性糖タンパク質の特徴が明瞭
に現れている。Ｎ末端及びＣ末端付近に存在する２つの
最も疎水的な領域は、それぞれ糖タンパク質分子のシグ
ナル配列及び膜貫通性領域であろうと思われる。
【０１７２】ＥＨＶ−１ ＯＲＦ２アミノ酸配列の他の
ヘルペスウイルス糖タンパク質との比較 予想されるＥＨＶ−１ ＯＲＦ２のアミノ酸組成の比較
によって、その他のヘルペスウイルスの糖タンパク質と
のかなりの相同性が明らかになった。ＥＨＶ−１ ＯＲ
Ｆ２タンパク質はＰＲＶ ｇｐ６３（80）、ＶＺＶ ｇ
ｐIV（181）及びＨＳＶ１ ＵＳ（79）と類似してい
る。
【０１７３】第三の解読枠（ＯＲＦ３）は、ヌクレオチ
ド３７９６〜５４５１までである。転写調節シグナルと
思われる配列が、３７９６番目のＡＴＧ開始コドンの
５′側領域中にみつかった。配列「ＧＴＴＴＡＡＡ」
（ヌクレオチド３７０５〜３７１１）を有するＴＡＴＡ
ボックスが、ＣＡＴボックスであると思われる３６４９
〜３６５４に位置する配列「ＧＣＡＡＴＧ」の５０塩基
下流に位置していた。はっきりとしたポリアデニル化シ
グナルは、ＴＧＡ終止コドン（ヌクレオチド５４５２〜
５４５４）の下流にはみられなかった。予想開始コドン
ＡＴＡＡＴＧＧ付近の配列状態はコザックの法則（151,
155）に合致している。ＥＨＶ−１ ＯＲＦ３は、計算
上６１４９３ダルトンの分子量を有する５５２残基のア
ミノ酸からなるポリペプチドをコードする。
【０１７４】ＥＨＶ−１ ＯＲＦ３タンパク質構造の解
析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通す
る多くの特徴が明らかになった。１番目のアミノ酸から
２３番目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を
有しており、シグナル配列であると思われる。３８残基
のアミノ酸（４０４〜４３７）からなる疎水性領域は膜
貫通性アンカー領域として機能すると予想される。Ｎ−
グリコシル化される可能性のあるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／
Ｓｅｒ部位が５カ所存在する。ＥＨＶ−１ ＯＲＦ３ア
ミノ酸配列の疎水的性質を図２９に示す。シグナルとア
ンカー成分を含む膜貫通性糖タンパク質の特徴が明瞭に
現れている。Ｎ末端及びＣ末端付近に存在する２つの最
も疎水的な領域は、それぞれ糖タンパク質分子のシグナ
ル配列及び膜貫通性領域に相当すると予想される。
【０１７５】ＥＨＶ−１ ＯＲＦ３アミノ酸配列の他の
ヘルペスウイルス糖タンパク質との比較 ＥＨＶ−１ ＯＲＦ３タンパク質のアミノ酸組成の比較
によって、その他のヘルペスウイルスの糖タンパク質と
のかなりの相同性が明らかになった。たとえば、ＥＨＶ
−１ ＯＲＦ３タンパク質は、ＰＲＶ ｇＩ（80）、Ｖ
ＺＶ ｇＥ（181）及びＨＳＶ１ ｇＥ（79）に類似し
ている。
【０１７６】コペンハーゲンワクシニアウイルス宿主域
選択系の構築 ＷＲ ｐＨＥＳ／ｖＰ２９３宿主域選択系（69）に類似
の、コペンハーゲンワクシニアウイルス系列の宿主域選
択系を構築した。
【０１７７】コペンハーゲンワクシニアウイルス欠失突
然変異体ｖＰ６６８は、ＨｉｎｄIII ＣからＨｉｎｄI
II Ｋまでの領域に存在する１２個の遺伝子を欠失して
おり、該欠失遺伝子の中には２つのヒト宿主域遺伝子Ｋ
１Ｌ（70）とＣ７Ｌ（ＨｉｎｄIII Ｃに位置する）が
含まれている。ｖＰ６６８はヒトＭＲＣ−５細胞中では
増殖できない。ＣＯＰＣＳプラスミド系のプラスミドは
ワクシニアフランキングアーム内にＣ７Ｌ遺伝子を含ん
でおり、ｖＰ６６８との組換えが可能であり、ＭＲＣ−
５細胞上でのウイルスの増殖能を復元させる。ｖＰ６６
８／ＣＯＰＣＳ宿主域選択系を用いた組換えによって生
まれた組換えワクシニアプロジェニィのヒトＭＲＣ−５
細胞上におけるプラーク形成能力の有無に基づいて、か
かる組換え体を迅速に同定することができる。プラスミ
ドｐＣＯＰＣＳ６５７は、合成Ｈ６ワクシニアプロモー
ター並びにそれに続いて外来遺伝子挿入用のポリリンカ
ークローニング領域を含んでいる。該ポリリンカー領域
の後には終止コドンとワクシニア転写終結シグナルが続
いている（45）。
【０１７８】ＥＨＶ−１ ｇＤ遺伝子のｐＣＯＰＣＳ６
５７へのクローニング ここでは図３０を参照する。プラスミドｐＥＨＶＢａｍ
ＨIＤをＨｉｎｄIIIで消化し、１２４０bpのＥＨＶ−１
ｇＤ含有ＨｉｎｄIII ＤＮＡフラグメントをアガロ
ースゲル（Geneclean, Bio101社製）から単離して、Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて一
本鎖部分を埋めた。該修復フラグメントを、ＳｍａI消
化プラスミドｐＣＯＰＣＳ６５７に連結した。得られた
プラスミドｐＪＣＡ００６は、Ｈ６プロモーターから約
１０bp離れた位置にＡＴＧ開始コドンを有している（図
３０）。
【０１７９】ＥＨＶ−１ ｇｐ６３遺伝子のｐＣＯＰＣ
Ｓ６５７へのクローニング プラスミドpＥＨＶＢａｍＨIDをＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲ
I及びＰｖｕIIで消化し、１３００bpのＥＨＶ−１ ｇ
ｐ６３含有ＨｉｎｄIII-ＰｖｕII ＤＮＡフラグメント
をアガロースゲルから単離し、クレノウフラグメントで
一本鎖部分を埋めた。該修復フラグメントを、ＳｍａI
消化プラスミドｐＣＯＰＣＳ６５７に連結した。得られ
たプラスミドｐＪＣＡ００８において、ＥＨＶ−１ ｇ
ｐ６３はＨ６プロモーターに対して適当な位置にある
（図３０）。
【０１８０】ＥＨＶ−１ ｇＥ遺伝子のｐＣＯＰＣＳ６
５７へのクローニング プラスミドpＥＨＶＢａｍＨIＤをＡａｔII及びＡｐａI
で消化し、アガロースゲルから２６３０bpのＥＨＶ−１
ｇＥ含有ＡａｔII−ＡｐａI ＤＮＡフラグメントを
単離して、クレノウフラグメントで一本鎖部分を埋め
た。該修復フラグメントを、ＳｍａIプラスミドｐＣＯ
ＰＣＳ６５７に挿入した。得られたプラスミドをｐＪＣ
Ａ００７と命名したが、これはＨ６プロモーターに対し
て適当な位置に置かれたＥＨＶ−１ ｇＥを含有する
（図３０）。
【０１８１】ＥＨＶ−１ ｇＤ−ｇｐ６３フラグメント
のｐＣＯＰＣＳ６５７へのクローニング 次に図３１を参照する。プラスミドｐＥＨＶＢａｍＨI
ＤをＥｃｏＲI及びＰｖｕIIで消化し、１８３２bpのＥ
ｃｏＲI-ＰｖｕII ＤＮＡフラグメント（Ａ）をアガロ
ースゲルから単離した。プラスミドｐＪＣＡ００６をＣ
ｌａIとＥｃｏＲIで消化し、１４５０bpのＣｌａI-Ｅｃ
ｏＲI ＤＮＡフラグメント（Ｂ）をアガロースゲルか
ら単離した。プラスミドｐＣＯＰＣＳ６５７をＣｌａI
とＳｍａIで消化し、３７００bpのＣｌａI-ＳｍａI Ｄ
ＮＡフラグメント（Ｃ）をアガロースゲルから単離し
た。上記のフラグメントＡとＢとＣを連結し、得られた
プラスミドをｐＪＣＡ００９と名付けた（図３１）。
【０１８２】ＥＨＶ−１ ｇＤ−ｇｐ６３−ｇＥフラグ
メントのｐＣＯＰＣＳ６５７へのクローニング プラスミドpＥＨＶＢａｍＨIＤをＥｃｏＲIとＳａｃII
で消化し、アガロースゲルから４２４０bpのＥｃｏＲI-
ＳａｃII ＤＮＡフラグメント（Ｄ）を単離した。Ｓａ
ｃII-ＳｍａI連結部の修復を確実にするためにｄＮＴＰ
を添加して、フラグメントＤをフラグメントＢ及びＣ
（上記参照）と連結した。得られたプラスミドをｐＪＣ
Ａ０１０と命名した（図３１）。
【０１８３】ＥＨＶ−１ Ｕ Ｓ 解読枠を発現する組換え
ワクシニアウイルスｖＰ７７３、ｖＰ８０３、ｖＰ８０
９、ｖＰ８１０及びｖＰ８２２の構築 上記ＥＨＶ−１解読枠の発現を迅速にチェックするため
に、ＣＯＰＣＳ宿主域選択系を用いて、多数のワクシニ
ア組換えウイルスを構築した。プラスミドｐＣＯＰＣＳ
６５７に、塩基配列の解析から同定された３つの解読枠
を単独もしくは一緒に（「二重」及び「三重」）クロー
ン化した。得られたプラスミドを、ワクシニア組換え体
ｖＰ６６８（救援ウイルス）との組換えに使用した。か
かる組換えによって生じた様々な組換えワクシニアウイ
ルスを表５に示す。
【０１８４】ＥＨＶ−１ ｇＤ遺伝子を含有するドナー
プラスミドｐＪＣＡ００６との組換えによって、ワクシ
ニア組換え体ｖＰ７７３を得た。ＥＨＶ−１ ｇｐ６３
遺伝子を含有するドナープラスミドｐＪＣＡ００８との
組換えによって、ワクシニア組換え体ｖＰ８２２を得
た。ＥＨＶ−１ ｇＥ遺伝子を含有するドナープラスミ
ドｐＪＣＡ００７との組換えによって、ワクシニア組換
え体ｖＰ８０３を得た。ＥＨＶ−１ ｇＤ−ｇｐ６３フ
ラグメントを含有するドナープラスミドｐＪＣＡ００９
との組換えによって、ワクシニア組換え体ｖＰ８０９を
得た。さらに、ＥＨＶ−１ ｇＤ−ｇｐ６３−ｇＥフラ
グメントを含有するドナープラスミドｐＪＣＡ０１０と
の組換えによって、ワクシニア組換え体ｖＰ８１０を得
た（表５）。
【０１８５】
【表５】
【０１８６】単独又は多重組換えワクシニアウイルスに
よって合成されたＥＨＶ−１ ＯＲＦ１（ｇＤ）、ＯＲ
Ｆ２（ｇｐ６３）及びＯＲＦ３（ｇＥ）産物の免疫蛍光
分析 組換えワクシニアウイルスに感染したＶＥＲＯ及びＭＲ
Ｃ−５細胞の免疫蛍光分析を、ウサギ抗ＥＨＶ特異的ポ
リクローナル血清Ｒ５９３５（１：２００）を使用し
て、例１記載の手順で行なった（表６）。
【０１８７】
【表６】
【０１８８】例１０‐ワクシニアウイルス組換え体によ
って単独又は一緒に発現する仮性狂犬病ウイルス糖タン
パク質ｇｐII、ｇｐIII及びｇｐ５０のマウス及びブタ
における免疫学的検定 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株及びその誘導体ｖ
Ｐ４１０、ｖＰ４２５及びｖＰ４５８（184）を本例で
使用した。
【０１８９】ｇｐII、ｇｐIII 及びｇｐ５０をコード
するＰＲＶ 遺伝子のクローニング ＰＲＶ ＮＩＡ３ウイルス（182）をＮＩＬ２培養細胞
（183）上で増殖させた。３０００×ｇで３０分間遠心
分離して、上清から細胞残渣を除去した。ウイルス粒子
は、まず４０％(wt／vol)のショ糖層に乗せて４０００
０rpmで６０分間（ベックマン(Beckman)社の４５Ｔｉロ
ーター使用）遠心し、次に３０〜５０％(wt／vol)の不
連続ショ糖密度勾配に乗せて（Beckman社のＳＷ２５ロ
ーター使用）２３０００rpmで５時間遠心することによ
って精製した。ウイルス粒子層を回収し、ＴＮＥ緩衝液
（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH ７．８)、１５０mM
ＮａＣｌ及び１０mM ＥＤＴＡ）で希釈して、さらに３
００００rpmで１時間（BeckmanＳＷ４０ローター使用）
遠心を行なってペレットとした。ウイルスペレットをＴ
Ｅ緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH ７．８)、１
０mM ＥＤＴＡ）に再び懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウ
ムを終濃度で０．５％(wt／vol)及びプロテイナーゼＫ
を１００mg／ml添加して溶解した。３７℃で２時間イン
キュベートした後、ウイルス溶解物をフェノール：クロ
ロホルム（１：１）で１回、次にクロロホルム：イソア
ミルアルコール（２４：１）で１回抽出した。ＤＮＡを
エタノールで沈殿させ、水に再溶解した。ＢａｍＨIで
完全に消化した後、仔牛腸由来のアルカリホスファター
ゼ（ＣＩＡＰ）で予備処理したｐＢＲ３２２のＢａｍＨ
I部位にクローン化した。この連結体をコンピテントな
大腸菌ＮＭ５２２株（20）の形質転換に使用した。
【０１９０】次に図３２及び３３、及び図３４〜３７
（配列番号２７）を参照する。ｇｐII遺伝子をコードす
るＤＮＡ配列はＰＲＶゲノムのＢａｍＨIフラグメント
１並びにＳａｌIサブフラグメント１Ａ及び１Ｂ中に存
在する（62,94）。ｐＰＲ９．２５と呼ばれるプラスミ
ド（ＰＲＶ ＢａｍＨI フラグメント１をｐＢＲ３２
２のＢａｍＨI 部位に挿入したもの）をＮｃｏIで消化
した。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で分
画して、６．２KbのＮｃｏI ＤＮＡフラグメントをＧ
ｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（登録商標、Bio101社製）を用いて
精製し、続いて、ＣＩＡＰ処理したｐＢＲ３２８（Boeh
ringer ManＮｈｅim Biochemicals社製）のＮｃｏI部
位に挿入した。得られたプラスミドｐＰＲ２．１５をＳ
ｐｈIで消化してアガロースゲル上で分画した。２．７K
bと１．８Kbのフラグメントを精製し、ホスファターゼ
で分解したｐＵＣ１８のＳｐｈI部位に挿入してプラス
ミドｐＰＲ１及びｐＰＲ２を作成し（図３２及び３
３）、Ｍ１３ファージに挿入した。塩基配列を上述の手
順で決定した。ＤＮＡ配列解析から、９１３残基のアミ
ノ酸をコードする２７４２bpの解読枠が明らかになっ
た。予想どおり（62）、ＨＳＶ１ ｇＢとかなりの相同
性を有するアミノ酸配列が観察された。ワクシニアウイ
ルスベクター中でＰＲＶ ｇｐIIを発現させるためのク
ローニング操作についての説明を簡単にするために、Ｐ
ＲＶ ｇｐII解読枠のＤＮＡ配列、並びに５′及び３′
側に存在する非コード配列を図３４〜３７に示した。
【０１９１】次いで図３８及び図３９（配列番号３１）
を参照する。ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐIIIをコードする
ＤＮＡ配列はＰＲＶゲノムのＢａｍＨIフラグメント２
及び９中に存在する（96）。ｐＢＲ３２２のＢａｍＨI
部位に挿入されたＢａｍＨIフラグメント２を含有する
プラスミドｐＰＲ９．９（図３８）をＢａｍＨI及びＳ
ｐｈIで消化した。ｐＢＲ３２２のＢａｍＨI部位に挿入
されたＢａｍＨIフラグメント９を含有するプラスミド
ｐＰＲ７．５をＮｃｏI及びＢａｍＨIで消化した。上記
２通りの消化で得られたＤＮＡをアガロース上で分画し
た。２．３５KbのＳｐｈI-ＢａｍＨIフラグメントと
１．１KbのＮｃｏI-ＢａｍＨIフラグメントを精製し
て、以下のＮｃｏI-ＥｃｏＲIホスホリル化リンカーＭ
ＲＳＹＮ２１／ＭＲＳＹＮ２２を使用して、ホスファタ
ーゼ分解ＩＢＩ２５（図３８）のＥｃｏＲI-ＳｐｈI部
位に連結した。
【０１９２】
【化５】
【０１９３】ｐＰＲ１７と命名したプラスミドを単離し
たが、このプラスミドは全ＰＲＶｇｐIII遺伝子（図３
８）を含有する３４５０bpのＳｐｈI−ＮｃｏIフラグメ
ントを含んでいた。Ｍ１３ファージにクローニングした
後、アルカリ変性二本鎖プラスミド鋳型と一本鎖の鋳型
から塩基配列を決定した。ＤＮＡ配列の解析から、４７
９残基のアミノ酸をコードする１４４０bpの解読枠が明
らかになった（図３９）。以前報告されたとおり（9
6）、ＨＳＶ ｇＣとのかなりの相同性がみられた。
【０１９４】次に図４０及び図４１（配列番号３３）を
参照する。ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ５０をコードするＤ
ＮＡ配列はＰＲＶゲノムのＢａｍＨIフラグメント７中
に存在する（95）。ｐＢＲ３２２のＢａｍＨI部位に挿
入されたＰＲＶ ＢａｍＨIフラグメント７を含有する
プラスミドｐＰＲ７．１（図４０）をＳｔｕI及びＮｄ
ｅIで消化し、ムング・ビーンヌクレアーゼで処理し
た。１．７Kbのフラグメントをアガロースゲルから精製
し、ホスファターゼ処理したＩＢＩ２５のＨｉｎｃII部
位に挿入した。このプラスミドｐＰＲ２２（図４０）は
ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子全体を含んでいる。塩基配列の
決定によって、４０４残基のアミノ酸をコードする１２
１５bpの解読枠が明らかになった（図４１）。以前報告
されたとおり（95）、ＨＳＶ１ ｇＤとのかなりの相同
性がみられた。
【０１９５】ワクシニアウイルス挿入ドナープラスミド
へのｇｐII、ｇｐIII及びｇｐ５０をコードするＰＲＶ
遺伝子のクローニング ｐＰＲ１（図３２）から得られた１０６０bpのＰＲＶ
ＳｐｈI-ＮｈｅIフラグメントをアガロースゲルから単
離し、ＣＩＡＰ処理後、以下のＢａｍＨI-ＮｈｅIホス
ホリル化リンカーＭＲＳＹＮ１／ＭＲＳＹＮ２を使用し
て、ｐＩＢＩ２５のＢａｍＨI-ＳｐｈI部位に挿入し
て、プラスミドｐＰＲ６（図３２）を得た。
【０１９６】
【化６】
【０１９７】ｐＰＲ６をＨｉｎｄIII及びＡｐａIで消化
し、ＣＩＡＰで処理した。ＡｐａI部位はＰＲＶ ｇｐI
IのＡＴＧ開始コドンの３２bp下流に位置している（図
３４〜３７）。合成ホスホリル化オリゴヌクレオチドＭ
ＲＳＹＮ３／ＭＲＳＹＮ４対をアニールして二本鎖ＤＮ
Ａフラグメントを得た。このフラグメントは、ＥｃｏＲ
V部位からＡＴＧ（下線部）までのワクシニアＨ６プロ
モーターを指定するＤＮＡとそのすぐ後に続くＰＲＶ
ｇｐIIコード配列を含有する。
【０１９８】
【化７】
【０１９９】この合成ＤＮＡを、３９２０bpのｐＰＲ６
由来ＨｉｎｄIII-ＡｐａIフラグメントに連結して、プ
ラスミドｐＰＲ９（図３２）を得た。
【０２００】プラスミドｐＰＲ９をＢａｍＨI及びＮｈ
ｅIで消化し、ＣＩＡＰ処理後、以下のホスホリル化Ｂ
ａｍＨI-ＳｐｈIリンカーを使用して、ｐＰＲ１から得
られた１６４０bpのＳｐｈI-ＮｈｅIフラグメントに連
結してプラスミドｐＰＲ１２（図３２及び３３）を得
た。
【０２０１】
【化８】
【０２０２】１０３０bpのｐＰＲ２由来ＨｉｎｃII-Ｓ
ｐｈIフラグメント（図３２）をアガロースゲルから単
離し、ホスファターゼ処理したｐＵＣ１８のＨｉｎｃII
-ＳｐｈI部位に挿入した。得られたプラスミドｐＰＲ１
０をＨｉｎｄIII及びＮａｅIで消化し、ＣＩＡＰで処理
した。ＮａｅI部位はＴＡＧ終止コドンの４４bp上流に
位置している（図３４〜３７）。以下のホスホリル化合
成オリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ９／ＭＲＳＹＮ１０対
をアニールして得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントを、
３７２０bpのｐＰＲ１０由来ＮａｅI-ＨｉｎｄIIIフラ
グメントに連結してプラスミドｐＰＲ１１を得た。
【０２０３】
【化９】
【０２０４】下線部の配列は、ＰＲＶ ｇｐII終止コド
ン及びワクシニア初期転写終結シグナルに相当する（4
5）。ｐＰＲ２由来の７７０bp ＳｐｈI-ＨｉｎｃIIフ
ラグメントをアガロースゲルから精製し、ＢａｍＨI-Ｓ
ｐｈIホスホリル化リンカー（ＭＲＳＹＮ７／ＭＲＳＹ
Ｎ８）を使用して、ＣＩＡＰ処理したｐＰＲ１１のＢ
ａｍＨI-ＨｉｎｃII部位に挿入してｐＰＲ１３（図３２
及び３３）を得た。ＥｃｏＲIとＳｐｈIで消化し、かつ
ＣＩＡＰで処理したプラスミドｐＰＲ１２を、以下のホ
スホリル化ＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲIリンカー（ＭＲＳＹ
Ｎ１９／ＭＲＳＹＮ２０）を使用して、９９０bpのｐＰ
Ｒ１３由来ＨｉｎｄIII-ＳｐｈI単離フラグメントに連
結してプラスミドｐＰＲ１５を得た（図３３）。
【０２０５】
【化１０】
【０２０６】ＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲVで消化したｐＰＲ
１５由来の２７８０bpフラグメントをムング・ビーンヌ
クレアーゼで処理し、アガロースゲルから精製した。こ
のフラグメントを、ＸｍａIII-ＥｃｏＲV、ムング・ビ
ーンヌクレアーゼ及びＣＩＡＰで予め消化しておいたプ
ラスミドｐＴＰ１５（184）（図４）に挿入してプラス
ミドｐＰＲ１８を得た（図３３）。ｐＰＲ１８におい
て、ＰＲＶ ｇｐIIは、ワクシニア赤血球凝集素欠失座
の合成ワクシニアＨ６プロモーターと連結している。こ
のプラスミドをワクシニアウイルス感染細胞にトランス
フェクトして、ＰＲＶ ｇｐII遺伝子を含有するワクシ
ニア組換え体ｖＰ５３４、ｖＰ６４４、ｖＰ６２１及び
ｖＰ６９２を得た（以下の項を参照）。
【０２０７】ＰＲＶ ｇｐIII遺伝子を操作して、ワク
シニアＨｉｎｄIII Ｂフラグメント中に位置するワク
シニアウイルス初期プロモーターμ（以下の項を参照）
の制御下で発現させた。部位特異的変異導入法を用い
て、ＰＲＶ ｇｐIIIに存在する配列ＣＧＣ（ヌクレオ
チド１９２〜１９４）（図３９）をＡＴＧに変えてＮｓ
ｉI部位を導入し、配列ＧＴＧＡＣＧＴをＴＴＣＴＡＧ
Ａ（ヌクレオチド１６３２〜１６３８）（図３９）に変
えてＸｂａI部位を導入した。これを実行するため、ヘ
ルパーファージＲ４０８（ストラタジーン（Stratagen
e）社製）（185）を使用して、プラスミドｐＰＲ１７か
ら一本鎖ＤＮＡを得た。上記部位特異的変異導入は、以
下の精製した合成ホスホリル化オリゴヌクレオチド対
（ＭＲＳＹＮ５及びＭＲＳＹＮ６）を使用し、大腸菌ｄ
ｕｔ−ｕｎｇ−株ＣＪ２３６（IBI社製）（17,186）上
で選択することによって行なった。
【０２０８】
【化１１】
【０２０９】上記の変異導入によってプラスミドｐＰＲ
２８が得られた。プラスミドｐＰＲ２８をＮｓｉIとＸ
ｂａIで消化し、ムング・ビーンヌクレアーゼで処理し
た。アガロースゲルから１４４０bpのフラグメントを精
製し、ムング・ビーンヌクレアーゼとＣＩＡＰで処理し
た後、ｐＳＤ４７８ＶＣ（図３８、図４２）のＢｇｌII
-ＨｐａI部位に挿入した。プラスミドｐＰＲ２４をワク
シニアウイルス感染細胞にトランスフェクトしてＰＲＶ
ｇｐIII遺伝子を含有するワクシニア組換え体ｖＰ６
０４、ｖＰ６４４、ｖＰ６９１及びｖＰ６９２を得た
（以下の項を参照）。
【０２１０】ＰＲＶ ｇｐ５０を操作して、ワクシニア
ウイルス初期／中期プロモーターＩ３Ｌ（187）の制御
下で発現させた。部位特異的変異導入法を用いて、ｇｐ
５０に存在する配列ＣＣＴＧＣ ＣＡＧＣＧＣ（ヌクレ
オチド１７７〜１８７）（図４１）をＡＴＧＣＡＴＴ
ＴＡＡＴに変えてＮｓｉＩ部位を導入し、配列ＣＣＴＣ
ＣＧＣＡＧＴＡＣＣＧＧ（ヌクレオチド１４０４〜１４
１８）（図４１）をＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＴ ＣＴ
に変えてＢｇｌII部位を導入した。前述の変異導入法
（17,185,186）を用いて、以下の精製した合成ホスホリ
ル化オリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ１２及びＭＲＳＹＮ
１３（図４０）を使用して、ｐＰＲ２２からプラスミド
ｐＰＲ２９を得た。
【０２１１】
【化１２】
【０２１２】ｐＰＲ２９をＮｓｉIで消化し、ムング・
ビーンヌクレアーゼで処理し、ＢｇｌIIで部分消化して
１２９０bpのフラグメントを得た。プラスミドｐＭＰ１
３ＰＰ（図４０、図４３）をＥｃｏＲIで消化し、ムン
グ・ビーンヌクレアーゼで処理し、次いでＢａｍＨIで
処理して、ワクシニアＩ３Ｌプロモーターを含有する１
４０bpのフラグメントを得た。上記の１２９０bpと１４
０bpのフラグメントをアガロースゲルから精製して、ホ
スファターゼ処理したｐＭＰ４０９ＤＶＣ（図５、図４
０）のＢｇｌII部位に連結した。得られたプラスミドｐ
ＰＲ２６を組換えに用いて、ｇｐ５０遺伝子を含有する
ワクシニアウイルス組換え体ｖＰ５９１、ｖＰ６２１、
ｖＰ６９１及びｖＰ６９２を得た（以下の項を参照）。
【０２１３】ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐII、ｇｐIII及び
ｇｐ５０を単独又は一緒に発現するワクシニア組換え体
の構築 毒性を有するＰＲＶ感染からの免疫動物の防御におけ
る、３種類のＰＲＶ糖タンパク質（ｇｐII、ｇｐIII及
びｇｐ５０）の免疫原性と相対的寄与を評価するため
に、かかる３種類のＰＲＶ糖タンパク質を単独又は一緒
に発現するような一連のワクシニア組換え体を構築し
た。
【０２１４】ここで図４２を参照する。β-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスｖＰ
５３３を以下のように構築した。コペンハーゲンゲノム
のＳａｌI Ｆ／Ｉ連結部にまたがるワクシニアＨｉｎ
ｄIIIフラグメントＢ内の１Kbの領域は、サザン・ブロ
ット法（189）で決定されたカウポックスの出血性
（μ）遺伝子（188）と相同なＤＮＡを含有している。
このμ遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターに類
似したポリペプチドをコードしており、生物学的には奬
尿膜上のウイルス性の出血性痘瘡の形成要因である。コ
ペンハーゲンゲノムのＤＮＡ配列から、μ遺伝子に相当
する遺伝子は多くのフレームシフト変異を含んでおり、
生物学的に機能していないことが明らかになった。プラ
スミドｐＳＤ４１９ＶＣ（184）（図４２）はμ領域の
左側部分を含んでいる。μ領域の残りの部分は、コペン
ハーゲンＳａｌIフラグメントＩがｐＵＣ８にクローン
化されたプラスミドｐＳＤ４２２ＶＣに含まれている。
不必要な左側ワクシニア配列を除くために、ｐＳＤ４１
９ＶＣをＮｃｏIとＳｍａIで消化し、大腸菌ポリメラー
ゼのクレノウフラグメントで平滑末端とした後、再び連
結してプラスミドｐＳＤ４７６ＶＣ（図４２）を得た。
プラスミドｐＳＤ４２２ＶＣをＨｐａIとＮｒｕIで消化
し、μ領域の直ぐ右側に位置する約０．３Kbのフラグメ
ントをアガロースゲルから単離した。このフラグメント
を、ＨｉｎｃII（ＳａｌI部位を認識する）で切断した
ｐＳＤ４７６ＶＣに連結してプラスミドｐＳＤ４７７Ｖ
Ｃを得た。コペンハーゲンワクシニアμプロモーター領
域の制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現させるため
に、合成オリゴヌクレオチド２２量体／２０量体を調製
した。該２２量体／２０量体の配列を、制限部位並びに
ＡＴＧ開始コドン（下線部）と共に示す。
【０２１５】
【化１３】
【０２１６】上記２２量体／２０量体をアニールしたも
のを、ＣｌａIとＨｉｎｃIIで消化したｐＳＤ４７７Ｖ
Ｃに連結して、新規プラスミドｐＳＤ４７９ＶＣ（図４
２）を得た。大腸菌β−ガラクトシダーゼコード配列を
含有するｐＭＣ１８７１由来の３．１Kb ＢａｍＨIフ
ラグメント（開始コドンとプロモーターを欠く）（34）
を、ＢａｍＨIで切断したｐＳＤ４７９ＶＣに連結し
た。このようにして得られたプラスミド（コペンハーゲ
ンμプロモーター制御下の適切な位置にｌａｃＺ遺伝子
が置かれている）をｐＳＤ４７９ＶＣＢＧと命名した。
この挿入ドナープラスミドを、ワクシニアウイルスｖＰ
４１０（184）と組換えた。発色性基質Ｘ−ｇａｌ（9,2
4）存在下における青色プラーク形成に基づいて組換え
ワクシニアウイルスを同定し、プラークをクローニング
して、ｖＰ５３３（図４２）と命名した。
【０２１７】外来遺伝子挿入用のベクタープラスミドを
構築するために、以下の合成オリゴヌクレオチド４２量
体／４０量体を調製した。
【０２１８】
【化１４】
【０２１９】上記４２量体／４０量体をアニールしたも
のを、ＣｌａIとＨｉｎｃIIで切断したｐＳＤ４７７Ｖ
Ｃ中に連結して新規プラスミドｐＳＤ４７８ＶＣ（図４
２）を得た。このプラスミドは、ワクシニアのコペンハ
ーゲン株のμコード領域と完全に置き換わったマルチク
ローニング領域の両側に約０．３Kbのワクシニア配列を
含んでいる。ｐＳＤ４７８ＶＣを用いて、ＰＲＶ ｇｐ
IIIコード配列を含有するｐＰＲ２４（図３８）並びに
ワクシニア組換え体ｖＰ６０４、ｖＰ６４４、ｖＰ６９
１及びｖＰ６９２を得た。
【０２２０】今度は図４３を参照する。プラスミドｐＭ
Ｐ４１９はワクシニアＨｉｎｄIIIフラグメントＩ由来
の８５０bp ＢａｍＨIフラグメントを含んでいるが、
その中にはｐＵＣ８（図４３）のＢａｍＨI部位に挿入
されたＩ３Ｌプロモーターを含まれる。Ｉ３Ｌプロモー
ター成分は、ワクシニアＨｉｎｄIIIフラグメントＩ（1
87）中のＩ３Ｌ解読枠の上流ＤＮＡ配列に相当し、ワク
シニアウイルス組換え体中で外来遺伝子を発現させるの
に以前から使用されている（27,190）。ｐＭＰ４１９を
Ｉ３Ｌコード配列内の非反復ＣｌａI部位で線状化し、
Ｂａｌ３１消化を行って、次にＥｃｏＲIで消化し、大
腸菌ポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理して平
滑末端とした。得られたプラスミドｐＭＰ４１９−５
（図４３）はＥｃｏＲI部位（ヌクレオチド−８）と連
結した上流Ｉ３Ｌプロモーター配列を含有する。ｐＭＰ
４１９−５からプロモーター成分をＥｃｏＲI−ＭｓｐI
フラグメントとして単離し、ＥｃｏＲI-ＣｌａI消化ｐ
ＵＣ１３Ｃ（ＣｌａIリンカーをＳｍａI部位に含むｐＵ
Ｃ１３誘導体）に挿入した。得られたプラスミドｐＭＰ
１３ＰＰ（図４０、図４３）は、Ｉ３Ｌプロモーター配
列（ヌクレオチド−１２６〜−８）とそれに続くＥｃｏ
ＲI部位（ヌクレオチド−８）を含んでいる。
【０２２１】ワクシニアＩ３Ｌプロモーターの制御下に
あるＰＲＶ ｇｐ５０を、Ｍ２Ｌ欠失プラスミドベクタ
ーｐＭＰ４０９ＤＶＣ（図５）に挿入して、ｐＰＲ２６
（図４０）を得た。ｐＰＲ２６を用いてワクシニア組換
え体ｖＰ５９１、ｖＰ６２１、ｖＰ６９１及びｖＰ６９
２を得た。
【０２２２】組換えワクシニアウイルスの単離 前述の手順で、ＰＲＶ遺伝子含有組換えワクシニアウイ
ルスを同定・精製した。３種類のＰＲＶ糖タンパク質ｇ
ｐII、ｇｐIII及びｇｐ５０を単独又は一緒に発現する
組換えワクシニアウイルスを表７に示す。
【０２２３】
【表７】
【０２２４】ワクシニアウイルス組換え体によって発現
したＰＲＶ糖タンパク質のインビトロ検定 ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐII、ｇｐIII及びｇｐ５０は、
ＰＲＶ感染細胞の膜構造と関連する典型的な糖タンパク
質であり、ウイルスの成分でもある。抗ｇｐII、抗ｇｐ
III及び抗ｇｐ５０モノクローナル抗体で処理し、次い
でフルオレセイン抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で処理す
ると、組換えワクシニアウイルスに感染した細胞表面上
には強い免疫蛍光がみられたが、野生型ワクシニアウイ
ルスに感染した細胞ではみられなかった。
【０２２５】ワクシニアウイルス組換え体によりマウス
及びブタ中で発現させたＰＲＶ糖タンパク質ｇｐII、ｇ
ｐIIIびｇｐ５０の免疫原性についてのインビトロにお
ける評価 ワクシニアウイルス組換え体で発現した３種類のＰＲＶ
糖タンパク質の相対的な免疫原性を評価するために、組
換えウイルスをマウスの足に１μｌから１００μｌの間
の種々の接種量で接種した。免疫後１４日目に、１０
ＬＤ５０量の毒性ＰＲＶ Kojnock株をマウス腹腔内に
投与した。予備実験において、各ＰＲＶ糖タンパク質を
マウスに接種すると、毒性ＰＲＶの感染防御に有効であ
ることを確認した。５００匹を超えるマウスについて行
なった一連のより詳細な実験で、ＰＲＶ糖タンパク質を
発現するワクシニア組換え体の効果を評価した。毒性ウ
イルスを投与したマウスを５０％防御することができる
ワクチン接種量（ＰＤ５０）を算定したが、その結果を
表８に示す。ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐII、ｇｐIII及び
ｇｐ５０を単独で発現する組換えワクシニアウイルスの
ｌｏｇ１０ＰＤ５０は、それぞれ６．４、５．４及び
５．８であった。糖タンパク質が一緒に発現したとき、
著しく良好なＰＤ５０値が得られた。ＰＲＶのｇｐIIと
ｇｐ５０を一緒に発現するワクシニア組換え体のｌｏｇ
１０ＰＤ５０値は３．３で、ＰＲＶのｇｐ５０とｇｐII
Iを同時に発現するワクシニア組換え体でもほぼ同様な
ｌｏｇ１ ０ＰＤ５０値（３．６）が得られた。１．５の
ｌｏｇ１０ＰＤ５０値を与えたＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ
II＋ｇｐIII発現組換え体がさらに有効であるのは明ら
かである。３種類のＰＲＶ糖タンパク質ｇｐII、ｇｐII
I及びｇｐ５０すべてを同一の組換えワクシニアウイル
ス中で発現させても、これら３種類のＰＲＶ糖タンパク
質を単独で発現する組換えウイルスについて得られたＰ
Ｄ５０値よりもさほど低いＰＤ５０値は得られない。ｇ
ｐII及びｇｐIIIを発現するワクシニア組換え体を用い
た場合に遺伝子を単独で発現するワクシニア組換えウイ
ルスよりも高い効果が得られることは、例６に記載した
ウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３及びｇｐ１
４を同時に発現させた場合の結果と類似している。
【０２２６】
【表８】
【０２２７】マウスはＰＲＶ糖タンパク質の免疫原性を
評価する際の興味あるモデル系を提供するが、ＰＲＶワ
クチンの一番の目的となる種はブタである。従って、組
換えワクシニアウイルス法のブタにおける有効性を評価
するために、以下の実験を行なった。ＰＲＶ糖タンパク
質ｇｐII、ｇｐIII及びｇｐ５０を一緒に発現するワク
シニア組換え体２mlを、約２５kgの子ブタに筋肉内接種
した。接種ウイルスはＰＢＳに希釈した。接種後３５日
目に、毒性単離ＰＲＶのＮＩＡ３懸濁液を子ブタ鼻腔内
（１匹当り１mlずつ）に投与した。投与後７日間、ワク
チン接種群と対照群の相対的な体重増加を測定すること
によって、ワクチン接種の効果を評価した。相対的な体
重増加は、ワクチン接種群について観察した日々の体重
増加率から、非ワクチン接種対照群について観察した日
々の体重増加率を差し引いた値である。正常な状態にお
けるブタの通常の体重増加は１．１kg以上である。表９
に示すデータにみられるように、毒性ＰＲＶ投与後７日
間の体重増加は、ワクチン接種群のほうが野生型ウイル
スを接種した対照群よりも大幅に高い。ワクシニアウイ
ルス組換え体を１回接種することによって、毒性ＰＲＶ
投与後の体重減少を大幅に防ぐことができる。
【０２２８】
【表９】
【０２２９】ＰＲＶの３つの主要糖タンパク質を単独又
は一緒に発現するワクシニアウイルス組換え体が利用で
きると、ＰＲＶ感染を抑制する上で以下に述べるような
多くの利点が得られる。(a) 一つの重大な利点は、ワ
クチン製剤としての組換えワクシニアウイルスはほんの
限られた数のＰＲＶ遺伝子しか発現しないので、弱毒化
ＰＲＶワクチン株が毒性型に戻るという付随的な危険性
がなく、また、ＰＲＶウイルスが周囲の環境にもたらさ
れることも全くないことである。(b) ＰＲＶワクチン
として有望な組換えワクシニアウイルスはほんの限られ
た数のＰＲＶ抗原しか発現しないので、ワクチン接種動
物と自然感染した動物とを区別できるように他のＰＲＶ
抗原からなる診断薬を調合することができ、従って接種
動物と自然感染した動物との区別が可能である。(c)
かかる組換え体ワクチンは、雌豚からその子供へのＰＲ
Ｖの自然な垂直感染を阻止するのに役立てることができ
る。これは別個のＰＲＶ糖タンパク質を発現するワクシ
ニアウイルス組換え体を妊娠中の雌豚にワクチン接種す
ることによって達成できるであろう。母性免疫はその子
供をＰＲＶ感染から防御すべきである。一方、雌豚のワ
クチンに使用したものとは異なる構成のＰＲＶ抗原を発
現するワクシニアウイルス組換え体をワクチンとしてそ
の子供に接種することもできるであろう。これは、母性
免疫の問題を解決することもできる方法の一つである。
母性免疫の問題に対処するもう一つの方法は、全く異な
る種類のベクター中で、ＰＲＶ糖タンパク質（その組合
わせを問わず）を発現させることである。これは、ＰＲ
Ｖ糖タンパク質を発現するアビポックスウイルス組換え
体を構築することによって達成される。天然宿主域が鳥
類に制限されているアビポックスウイルス組換え体を、
鳥類以外の動物のワクチンとして利用できることが実証
されている（41）。このように、母性免疫に伴なう障害
の問題対処に、(1) 複数ベクター及び(2) これらのベ
クターによって発現する抗原の群、という二つの方法を
利用することができる。
【０２３０】例１１‐仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質
ｇｐII発現アビポックスベクター 以前に報告された条件（41,42）を用いて、SPAFAS社
（コネチカット州ノーウィック(Norwich)）から入手し
た１０乃至１１日齢のニワトリ有胚卵から培養した初代
ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）上で、カナリアポック
スウイルスを増殖させた。ジョクリック(Joklik)の記載
した方法（191）を用いて、ショ糖密度勾配遠心法によ
って親細胞由来の汚染源からウイルスを精製した。ブタ
腎臓細胞（ＰＫ−１）は、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション(American Type CulturＥｃｏlle
ction)（メリーランド州ロックビル(Rockville)）から
入手した（ＡＴＣＣ番号ＣＬ１０１）。
【０２３１】仮性狂犬病ウイルスｇｐII糖タンパク質発
現カナリアポックスウイルス組換え体の構築 ここでは図４４を参照する。プラスミドｐＰＲ１５（図
３２及び３３）をＰＲＶ ｇｐII遺伝子源として用い
た。全ＰＲＶ ｇｐII遺伝子を含有するＤＮＡ部分を単
離するために、ｐＰＲ１５をＥｃｏＲVとＨｉｎｄIIIで
消化した。この消化によって、ワクシニアウイルス（Ｖ
Ｖ）Ｈ６プロモーターの３′末端側２１bpと全ＰＲＶ
ｇｐII遺伝子を含有する約２．８Kbのフラグメントを得
た。ｐＦＰＣＶ２に挿入するために、この２．８Kb Ｅ
ｃｏＲV／ＨｉｎｄIIIフラグメントを単離した（図１
１、図４４）。
【０２３２】ｐＦＰＣＶ２をＨｉｎｄIIIで完全に消化
しかつＥｃｏＲVで部分消化して得た８．０Kbフラグメ
ントに、上記の２．８Kb ＥｃｏＲV／ＨｉｎｄIIIフラ
グメントを挿入した。この２つのフラグメントの連結に
よって、ｐＦＰＰＲＶIIと名付けた１０．８Kbのプラス
ミドが生じた。
【０２３３】次に図４５を参照する。プラスミドｐＦＰ
ＰＲＶIIを用いて、ｐＣＰＣＶ１挿入用の２．８KbのＮ
ｒｕI／ＨｉｎｄIIIフラグメントを作成した（図１
２）。ｐＣＰＣＶ１プラスミドは、ＣＰゲノムの３．３
Kb ＰｖｕIIフラグメント内の非反復ＥｃｏＲI部位
に、ＶＶ由来のＨ６プロモーターを含んでいる。この挿
入プラスミドを用いて、ＣＰゲノムのＣ３座に外来遺伝
子を挿入することが可能になる。プラスミドｐＣＰＣＶ
１をＮｒｕIとＨｉｎｄIIIで消化して、上記２．８Kbフ
ラグメントに連結するための５．８Kbフラグメントを単
離した。得られたプラスミドをｐＣＰＰＲＶIIと命名し
た。
【０２３４】優性選択マーカーである大腸菌キサンチン
‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子
（Ｅｃｏ ｇｐｔ）をｐＣＰＰＲＶIIに挿入して、ＣＰ
／ＰＲＶ ｇｐII組換え体の増殖選択手段とした。ポッ
クスウイルス組換え体作成時の選択マーカーとしてＥｃ
ｏ ｇｐｔを使用することは既に報告されている（193,
194)。Ｅｃｏ ｇｐｔ遺伝子はプラスミドｐＳＶ２ｇｐ
ｔ（ＡＴＣＣ番号３７１４５）から得た。このプラスミ
ドからＥｃｏ ｇｐｔ遺伝子を含有する６７０bpのＢｇ
ｌII／ＤｒａIフラグメントを単離して、ｐＳＤ４８６
ＶＣのＢｇｌII／ＳｍａI部位に挿入した。得られたプ
ラスミドｐＧＰＴ−１はワクシニアウイルスμ遺伝子フ
ランキングアームに挟まれたＥｃｏ ｇｐｔ遺伝子を含
んでおり、該遺伝子はμプロモーターの転写制御下に置
かれている。上記プラスミドｐＳＤ４８６ＶＣは、以下
の手順でｐＳＤ４７８ＶＣから得た（図４２）。ｐＳＤ
４７８ＶＣのＭＣＲをＥｃｏＲIで消化し、ｄＮＴＰ存
在下（各０．５mM）でクレノウフラグメントを用いる常
法によって一本鎖部分を埋め、再連結することによって
ｐＳＤ４７８Ｅ−ＶＣを得た。このプラスミドをＨｐａ
IとＢａｍＨIで消化し、オリゴヌクレオチドＨＥＭ５
（５′−ＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＴＡＧＣＴ−３′）とＨ
ＥＭ６（５′−ＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＧ−３′）とのア
ニーリング対を挿入して、ｐＳＤ４８６ＶＣを得た。
【０２３５】ｐＧＰＴ−１をＮｃｏIとＥｃｏＲIで消化
して、Ｅｃｏ ｇｐｔ遺伝子（６７０bp）とVVμプロモ
ーター（３３０bp）を含有する１．０Kbフラグメントを
切り離した。そのＮｃｏI及びＥｃｏＲI末端を、０．５
mM ｄＮＴＰの存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのク
レノウフラグメントを用いて平滑末端とした。Ｈｉｎｄ
IIIリンカー（Bethesda Research Laboratories社
製、メリーランド州ベセスダ）を該平滑末端フラグメン
トに付加させた。このＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し
て、１．０Kbのフラグメントをアガロースゲルから回収
した。該１．０KbＨｉｎｄIIIフラグメントをｐＣＰＰ
ＲＶIIのＨｉｎｄIII部位に挿入した。ぴったりと連結
したＥｃｏ ｇｐｔとＰＲＶ ｇｐII遺伝子とを含む生
成プラスミドをｐＣＰＰＲＶII ｇｐtと命名した。こ
のプラスミドを用いて、ＣＰゲノムのＣ３座へ挿入する
ためのインビトロ組換え実験を行なった。１００μg／m
lミコフェノール酸（mycophenolic acid）の存在下で
Ｅｃｏ ｇｐｔ遺伝子含有組換え体の選択を行ない、次
いでプラークハイブリダイゼーション法によってＰＲＶ
ｇｐII遺伝子の存在をスクリーニングした。Ｅｃｏ ｇ
ｐtとＰＲＶ ｇｐIIに陽性のプラークをプラークの単
離を３回繰り返すことによって精製し、高感染価で増殖
する純粋な集団を、ｐＣＰ５５と命名した。これらのＣ
Ｐ組換え体において上記２つの遺伝子が遺伝学的に連鎖
していることをサザンブロット法で確認した。このＣＰ
組換え体をｖＣＰ５５と命名した。
【０２３６】ｖＣＰ５５感染細胞の免疫蛍光 免疫蛍光実験を行なって、ｖＣＰ５５感染細胞中で発現
したＰＲＶ ｇｐIIの細胞局在性を明らかにした。３５
mmシヤーレ中の２２mmのカバーガラスの上に、シャーレ
当り５×１０５個のＣＥＦ又はＰＫ−１細胞を植えた。
ＣＥＦ及びＰＫ−１細胞に、ｖＣＰ５５もしくはＣＰ親
ウイルスのいずれかを感染させた。ＰＢＳ＋で１乃至１
００倍に希釈したモノクローナル抗体７５Ｎ１０を用い
て、例１に記載したとおり感染及びインキュベートして
免疫蛍光アッセイを行なった。
【０２３７】細胞内部及び表面上における発現について
感染細胞を分析した。ｖＣＰ５５に感染した細胞系で
は、いずれも、表面上でのｇｐIIの発現は観察されなか
った。しかしながら、ｖＣＰ５５に感染したＣＥＦ細胞
及びＰＫ−１細胞において、細胞内部でのｇｐII遺伝子
産物の発現がみられた。これらの細胞内部においてみら
れる蛍光は該感染細胞の核の周辺領域に存在する顆粒に
局在化していた。これらの結果は、ＣＰによって発現し
たＰＲＶ ｇｐIIがゴルジ複合体には輸送されるものの
原形質膜には輸送されなかったことを示している。この
結果は、ワクシニアウイルスによって発現するｇｐIIの
結果（感染細胞の表面上に検出された）とは異なる。
【０２３８】ＣＥＦ及びＰＫ−１感染細胞から得られた
ＰＲＶ ｇｐIIの免疫沈降反応 ｖＣＰ５５によるＰＲＶ ｇｐII遺伝子産物の発現を、
感染細胞溶解物の免疫沈降反応によって分析した。細胞
当り５pfuのウイルスを細胞単層に感染させた。モノク
ローナル抗体７５Ｎ１０を用いて、例１記載のとおり、
免疫沈降反応を行なった。
【０２３９】ウサギ抗ＰＲＶ血清を用いて、見掛けの分
子量（電気泳動の移動度に基づく）約１２０kDa、６７k
Da及び５８kDaの感染ＣＥＦ及びＰＫ−１細胞由来の主
要ポリペプチドを沈降させた。上記のポリペプチドはそ
れぞれ、ＰＲＶ感染細胞で検出されたＰＲＶ ｇｐII
（ジスルフィド結合で複合体を形成している）の前駆体
と２種類のタンパク質分解型である（86,101,196）。見
掛けの分子量約２６kDaのものも少量観察されたが、こ
れはＣＰ／ＰＲＶ組換え体感染細胞内でｇｐIIがさらに
タンパク質分解処を受けていることを反映しているもの
と思われる。対照ＣＰウイルス感染細胞並びに非感染細
胞の細胞溶解物については、対応するポリペプチドの沈
降は全くみられなかった。
【０２４０】防御実験 ｖＣＰ５５の生ＰＲＶ感染に対する防御免疫反応誘発力
をマウス系で分析した。種々の量のｖＣＰ５５を含有す
る５０μlから１００μlの試料（表１０）をマウスの足
蹠に接種した。免疫後１４日目に、１６ ＬＤ５０量の
ＰＲＶ Kojnock株のをマウス腹膜内に投与した。投与
後１４日目にマウスの生存数を数えて実験を終えた。表
１０に示すとおり、１０６．８５ ＴＣＩＤ５０量のワ
クチンを１回マウスに接種すると、１０匹のうちの８匹
が致死量のＰＲＶ感染から防御された。試験したｖＣＰ
５５接種量より低いと、防御レベルに達しなかった。ワ
クチンを接種しなかったマウスにおいては、生ＰＲＶ感
染によって８匹のうちの７匹が死亡した。表１０に示し
た結果から、ｖＣＰ５５組換え体のＰＤ５０（判防御
量）は１０６．１６であると計算された。
【０２４１】
【表１０】
【０２４２】目的とする種である子豚においても、生Ｐ
ＲＶ感染に対する免疫賦与剤としてのｖＣＰ５５の効力
を評価した。約２５kgの子豚１５匹を３群に分けた。
「ｖＣＰ５５群」並びに「ＣＰ親ウイルス群」に対し
て、０日目と２８日目の２回のワクチン接種（２×１０
８ ＴＣＩＤ５０量を２ｍｌ）を筋肉注射によって行な
った。残る５匹の子豚は非ワクチン接種対照群であっ
た。３５日目に、ＰＲＶの毒性ＮＩＡ３株をすべての子
豚に鼻腔内投与した。投与してから７日間の、ｖＣＰ５
５ワクチン接種群の体重増加と対照群の体重増加とを比
較することによってその効力をモニターした。重量変化
をΔＧＭＱＲ値（kg）として計算した。ここで、ΔＧＭ
ＱＲ値（kg）＝（ワクチン接種群の平均ＧＭＱＲ％−非
ワクチン接種群の平均ＧＭＱＲ％）である。
【０２４３】非ワクチン接種群においては、ＰＲＶウイ
ルス感染によってすべての子豚が死亡した（５日目に２
匹、６日目に２匹、そして７日目に１匹）。野生型ウイ
ルス（ＣＰ）を接種した群においては、感染によって５
匹のうち４匹が死んだ（６日目に３匹、７日目に１
匹）。ｖＣＰ５５をワクチンとして接種群の子豚は、Ｐ
ＲＶ感染させても全員生存し、成長した。
【０２４４】ＰＲＶ ｇｐII糖タンパク質を発現するｖ
ＣＰ５５を接種した子豚においては、生ＰＲＶ感染対す
るかなりの防御が観察された（表１１）。２つの対照群
ではＰＲＶ感染後の期間を通してかなりの体重減少がみ
れれたが、ｖＣＰ５５をワクチンとして接種した動物は
実験期間を通じて正味体重の有意の増加がみられた。さ
らに、生ＰＲＶ感染によって、対照群は８０％から１０
０％の死亡率を示したが、ｖＣＰ５５接種群では死亡し
たものはいなかった。
【０２４５】
【表１１】
【０２４６】例１２‐ＰＲＶ ｇI糖タンパク質発現ワ
クシニア組換え体 この例では、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株及
びそれから誘導した組換え体を使用した。
【０２４７】ＰＲＶ ｇＩ遺伝子のカナリアポックス及
びワクシニアウイルスドナープラスミドへのクローニン
グ ここでは図４６及び４７を参照する。ＰＲＶ ｇI遺伝
子（ＮＩＡ３株）を含有するプラスミドpＧＰIはRhone
Merieux社（フランス国リヨン）から入手した。このプ
ラスミドからｇI遺伝子（配列は（80）を参照）を単離
し、ワクシニア合成Ｈ６プロモーター（69）の下流にク
ローン化した。これはpＧＰIの２３３０bp ＸｈｏI-Ｎ
ｃｏI（部分）フラグメントを、pＧＢＣ２の６４００bp
ＸｈｏI-ＮｃｏIフラグメントにクローン化して行な
った。（pＧＢＣ２は、ｐＲＷ７６４．５の３２００bp
ＢｇｌIIフラグメントにＨＳＶ２ ｇＢ遺伝子をクロ
ーン化することによって作成した。ｐＲＷ７６４．５
は、ｐＵＣ１８の２３６０bpＰｖｕIIフラグメントにカ
ナリアポックスＤＮＡ由来の０．８Kb ＰｖｕIIフラグ
メントをクローン化することによって作成した）。この
操作で得られたプラスミドをｐＰＧＩ２と命名した。
【０２４８】次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇ
I遺伝子の開始コドンと整列させた。この操作は、ｐＰ
ＧＩ２の５９００bp ＥｃｏＲＶ−ＡｌｗＮＩ（部分）
フラグメントにオリゴヌクレオチドＰＲＶＬ５（５′−
ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣ
ＧＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＡ
ＧＣＴＣ−３′）とＰＲＶＬ６（５′‐ＣＴＧＣＧＣＧ
ＧＣＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＴＡ
ＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３′）をク
ローン化することによって行なった。この操作で得られ
たプラスミドをｐＧＩ３と命名した。
【０２４９】次に、ＰＲＶ ｇＩ３′側外領域の余剰非
コード配列を欠失させた。この操作は、ｐＧＩ３の５２
００bp ＳａｃI-ＡａｔII（部分）フラグメントにオリ
ゴヌクレオチドＰＲＶＬ３（５′‐ＣＴＧＧＴＴＣＣＧ
ＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＣＧ
ＡＡＴＧＧＧＣＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧＣＧＴＧＡＣＣＧ
ＣＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＣＣ
ＣＧＣＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧ
ＡＧＣＴ−３′）及びＰＲＶＬ４（５′‐ＣＧＧＡＴＣ
ＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧ
ＧＣＡＴＴＣＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧＴＣＡ
ＣＧＣＣＡＴＡＧＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡＣ
ＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＧＣＧＧＡＡＣ
ＣＡＧＡＣＧＴ−３′）をクローン化することによって
行なった。この操作で得られたプラスミドをｐＰＧＩ６
と命名する。
【０２５０】次いで、Ｈ６プロモーター付きｇI遺伝子
をワクシニアウイルスドナープラスミドにクローン化し
た。この操作は、ｐＰＧＩ６の１７５０bp ＮｒｕI-Ｂ
ａｍＨIフラグメントをｐＢＰ１４の５０００bp Ｎｒ
ｕI-ＢａｍＨIフラグメントにクローン化することによ
って行なった。（ｐＢＰ１４は、ワクシニアベクタープ
ラスミドｐＳＤ４９４ＶＣ中の合成ワクシニアＨ６プロ
モーターの制御下に置かれたウシ白血病ウイルスｇａｇ
遺伝子を含有する。ｐＳＤ４９４ＶＣは、コペンハーゲ
ンワクシニアウイルスのＨｉｎｄIII Ａフラグメント
のサブクローンであり、カウポックスＡＴＩ遺伝子（21
0）と相同なワクシニア遺伝子のコード配列がポリリン
カー領域で置換されている）。このようにして、ＡＴＩ
遺伝子の両隣のワクシニアウイルス（コペンハーゲン）
配列の間にＨ６プロモーター付きｇI遺伝子が配置され
る。この操作で得たプラスミドをｐＰＧＩ７と命名し
た。
【０２５１】ｐＰＧＩ７をｖＰ４１０感染細胞にトラン
スフェクトすることによって、組換えワクシニアウイル
スｖＰ７１７を得た。
【０２５２】ｖＰ７１７の構築 ＰＲＶのｇＩ遺伝子をワクシニアウイルスベクターにク
ローン化した。このワクシニアウイルス組換え体ｖＰ７
１７の構築に使用した方法の概要を図４６及び４７に示
す。ｖＰ７１７に含まれるＰＲＶ ｇＩ遺伝子をＡＴＩ
遺伝子の両隣のワクシニアウイルス配列の間にクローン
化し、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＨ６
（41,42,69）を用いた。
【０２５３】ＰＲＶにコードされたポリペプチドのｖＰ
７１７感染細胞上での免疫蛍光 ＰＲＶ感染細胞においては、原形質膜上でｇIが発現す
る。ｖＰ７１７感染細胞を、ＰＲＶ ｇI特異的モノク
ローナル抗体４２Ｍ１７を用いて分析したところ、これ
らの細胞内で生産されるＰＲＶ 由来ポリペプチドも原
形質膜上で発現することが判明した。
【０２５４】マウスにおけるｖＰ７１７の評価 マウスにおいてｖＰ７１７をインビトロで評価したとこ
ろ、標準的な操作を用いたＰＲＶ感染に対する若干の防
御がみられた（表１２）。
【０２５５】
【表１２】
【０２５６】例１３−ワクシニアウイルスにおける単純
ヘルペスウイルス２型糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ及びｇＤ
の単独又は同時発現 本例で使用したＨＳＶ２（Ｇ株）（American Type Cu
lturＥｃｏllectionから入手，ＡＴＣＣ番号ＶＲ７３
４）は、ＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ８１）上で
増殖させ、ショ糖密度勾配遠心法によって精製した（19
7）。
【０２５７】ＨＳＶ2 ｇＢ遺伝子のワクシニアウイル
スドナープラスミドへのクローニング ＨＳＶ2 ｇＢ遺伝子の塩基配列は既に文献に記載され
ている（116）。ここで図４８及び４９を参照する。Ｈ
ＳＶ２（Ｇ株）ゲノムＤＮＡから、ＨＳＶ2 ｇＢ遺伝
子を含有する１２Kb ＢｇｌIIフラグメントを単離し、
ｐＵＣ１９のＢａｍＨI 部位に挿入して、プラスミドp
J4を得た。
【０２５８】次に、ｇＢ遺伝子をワクシニアウイルス
（コペンハーゲン）フランキングアーム間にクローン化
した。この操作は、ｐＪ４の２７００bp ＳｓｔII-Ｓ
ａｃI（部分）フラグメントをｐＭＰ４０９ＤＶＣ３の
ＳｓｔII-ＳａｃIフラグメントにクローン化することに
よって行なった。（ＰＭＰ４０９ＤＶＣ３は、ＢｇｌII
部位がポリリンカー領域で置換されたＰＭＰ４０９ＤＶ
（184）（図５）の誘導体である）。これによって、Ｍ
２Ｌ遺伝子の両隣のワクシニア配列の間にｇＢ遺伝子が
配置される。この操作で得られたプラスミドをpＧＢ1と
命名した。
【０２５９】次に、ｇＢ遺伝子の３′末端に枠内終結コ
ドンを付加した。この操作は、ｐＧＢ１の６３００bp
ＢａｍＨI-ＳａｃI（部分）フラグメントにオリゴヌク
レオチドＧＢＬ３（５′‐ＣＴＡＡＴＡＧ−３′）及び
ＧＢＬ４（５′‐ＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴ−
３′）をクローン化することによって行なった。この操
作で得られたプラスミドをｐＧＢ２と命名した。
【０２６０】次に、Ｈ６プロモーターをｇＢ遺伝子の上
流にクローン化した。この操作は、ｐＧＢ２のＢｇｌII
部位に、Ｈ６プロモーターを含有するｐＢＬＶＨ１４の
３７０bp ＢｇｌIIフラグメントをクローン化すること
によって行なった。（ｐＢＬＶＨ１４は、Ｈ６プロモー
ター付きウシ白血病ウイルスエンベロープ遺伝子をワク
シニアＨＡ欠失座に含んでいる）。この操作で得られた
プラスミドをｐＧＢ３と命名した。
【０２６１】次いで、Ｈ６プロモーターの開始コドンを
ｇＢ遺伝子の開始コドンと整列させた。この操作は、ｐ
ＧＢ３の６３００bp ＳｓｔII-ＥｃｏＲV（部分）フラ
グメントにオリゴヌクレオチドＧＢＬ１（５′−ＡＴＣ
ＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＧＣＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＧＧＴ
ＣＧＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣ−３′）
及びＧＢＬ２（５′−ＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣ
ＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＧＣＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴ
ＡＡＣＧＧＡＴ−３′）をクローン化することによって
行なった。この操作で得られたプラスミドをｐＧＢ５と
命名した。プラスミドｐＧＢ５においては、ワクシニア
Ｈ６プロモーターの制御下に置かれたＨＳＶ ｇＢ遺伝
子がワクシニアＭ２Ｌ欠失座に挿入されている。Ｍ２Ｌ
挿入座は、欠失する可能性のあるゲノムのより大きな領
域内に位置しているので、異なるワクシニアウイルスド
ナープラスミドの異なる挿入部位にＨ６プロモーター付
きｇＢ遺伝子をクローン化した。この操作は、ｐＧＢ５
の２８００bp ＢｇｌII-ＢａｍＨIフラグメントをｐＳ
Ｄ５１３ＶＣＶＱのＢｇｌII部位にクローン化すること
によって行なった。（ｐＳＤ５１３ＶＣＶＱはコペンハ
ーゲンワクシニアウイルスＨｉｎｄIII Ｊフラグメン
トのサブクローンであり、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺
伝子コード配列がポリリンカー領域で置換されてい
る）。こうすることによって、ＴＫ遺伝子両隣のワクシ
ニアウイルス配列の間にＨ６プロモーター付きｇＢ遺伝
子が配置される。この操作で得られたプラスミドをｐＧ
Ｂ６と命名した。
【０２６２】ＨＳＶ２ ｇＣ遺伝子のワクシニアウイル
スドナープラスミドへのクローン化 ＨＳＶ２ ｇＣ遺伝子の塩基配列は、既に決定されてい
る（117）。今度は図５０〜５２を参照する。ＨＳＶ２
（Ｇ株）ゲノムＤＮＡからＨＳＶ２ ｇＣ遺伝子を含有
する２９００bp ＳａｌIフラグメントを単離し、これ
をｐＩＢＩ２５のＳａｌI部位に挿入して、プラスミドp
ＧＣ3を得た。
【０２６３】次に、ｇＣ遺伝子をワクシニアウイルス
（コペンハーゲン）フランキングアーム間にクローン化
した。この操作は、ｐＧＣ３の２９００bp ＸｈｏI-Ｂ
ａｍＨIフラグメントをｐＧＣ２のＸｈｏI-ＢａｍＨI部
位にクローン化することによって行なった。ｐＧＣ２
は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有するｐ
ＢＬＶＨ１４の３７０bp ＢｇｌIIフラグメントをｐＳ
Ｄ４８６ＶＣのＢｇｌII部位にクローン化することによ
って作成した。ｐＳＤ４８６ＶＣはコペンハーゲンワク
シニアウイルスＨｉｎｄIII Ｂフラグメントのサブク
ローンであり、μ遺伝子コード配列がポリリンカー領域
で置換されている。これによって、μ遺伝子両隣のワク
シニアウイルス配列の間にｇＣ遺伝子が配置される。こ
の操作で得たプラスミドをｐＧＣ５と命名した。
【０２６４】次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇ
Ｃ遺伝子の開始コドンと整列させた。この操作は、ｐＣ
Ｇ５の５４００bp ＮｒｕI−ＳｆｉIフラグメントにオ
リゴヌクレオチドＧＣＬ１（５′‐ＡＴＣＣＧＴＴＡＡ
ＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣ
ＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧ
−３′）及びＧＣＬ２（５′−ＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣ
ＴＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＴＴ
ＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３′）を
クローン化することによって行なった。この操作で得ら
れたプラスミドをｐＧＣ１０と命名した。
【０２６５】次いで、ｐＧＣ１０から３′側外領域の余
剰非コード配列を欠失させた。この操作は、ｐＧＣ１０
の４９００bp ＳａｌI−ＳｍａI（部分）フラグメント
を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメン
ト）で処理して再び環状形にすることによって行なっ
た。この操作で得たプラスミドをｐＧＣ１１と命名し
た。
【０２６６】次に、ｐＧＣ１１から３′側外領域の余剰
非コード配列を欠失させた。この操作は、ｐＧＣ１１の
４９００bp ＸｂａI-ＡｐａI（部分）フラグメントに
オリゴヌクレオチドＧＣＬ３（５′−ＣＴＡＧＧＧＣＣ
−３′）をクローン化することによって行なった。この
操作で得られたプラスミドをｐＧＣ１２と命名した。プ
ラスミドｐＧＣ１２においては、ワクシニアのμ欠失座
に、Ｈ６プロモーターの制御下に置かれたＨＳＶ ｇＣ
遺伝子が挿入されている。μ欠失座は欠失する可能性の
あるゲノムのより大きな領域内に位置しているので、続
いて該Ｈ６プロモーター付きｇＣ遺伝子をワクシニアウ
イルスドナープラスミドのＡＴＩ挿入部位にクローン化
した。これは、ｐＧＣ１２の１５５０bp ＮｒｕI-Ｂａ
ｍＨIフラグメントをｐＢＰ１４の５０００bp ＮｒｕI
-ＢａｍＨIフラグメントにクローン化することによって
行なった。これによって、ＡＴＩ遺伝子の両隣のワクシ
ニアウイルス（コペンハーゲン）配列の間にＨ６プロモ
ーター付きｇＣ遺伝子が配置される。この操作で得られ
たプラスミドをｐＧＣ１３と名付けた。
【０２６７】ＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子のワクシニアウイル
スドナープラスミドへのクローニング ＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子の塩基配列は既に決定されている
（118）。次に図５３及び５４を参照する。ＨＳＶ２
（Ｇ株）ゲノムＤＮＡから、ＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子を含
有する７．５Kb ＸｂａIフラグメントを単離し、ｐＩ
ＢＩ２５のＸｂａI部位に挿入してプラスミドｐＧＤ１
を得た。
【０２６８】次に、ｇＤ遺伝子をＨ６プロモーター下流
のワクシニアウイルス（コペンハーゲン）フランキング
アーム間にクローン化した。この操作は、ｐＧＤ１の１
５００bp ＤｒａI-ＰｓｔIフラグメントをｐＴＰ１５
のＳｍａI-ＰｓｔI部位にクローン化することによって
行なった。この操作によって、ｇＤ遺伝子はＨ６プロモ
ーター下流で、かつＨＡ遺伝子の両隣のワクシニアウイ
ルス配列間に配置される。この操作で得られたプラスミ
ドをpＧＤ２と命名した。
【０２６９】次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇ
Ｄ遺伝子の開始コドンと整列させて。この操作は、ｐＧ
Ｄ２の５１００bp ＥｃｏＲV-ＡｈａII（部分）フラグ
メントにオリゴヌクレオチドＧＤＬ１（５′‐ＡＴＣＣ
ＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＧ
ＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧ−３′）及びＧＤＬ２（５′
‐ＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＧＣＣＣＣＡＴＴＡ
ＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３′）をク
ローン化することによって行なった。この操作で得られ
たプラスミドをｐＧＤ５と命名した。
【０２７０】次に、３′側外領域の余剰非コード配列を
欠失させた。この操作は、ｐＧＤ５の４８００bp Ｎａ
ｅI-ＰｓｔIフラグメントにオリゴヌクレオチドＧＤＬ
３（５′−ＧＧＣＡＧＴＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴ
ＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＧＴＴＴＴＧＧ
ＧＴＡＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣ
ＣＣＡＡＧＣＧＣＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＴ
ＣＣＧＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧ
ＣＡＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＴＧＣ
Ａ−３′）及びＧＤＬ４（５′−ＧＣＴＡＧＴＡＡＡＡ
ＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＧＡＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧ
ＴＣＧＴＣＡＴＣＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣ
ＧＴＡＧＧＣＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧ
ＣＣＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＣＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＴＡ
ＣＣＧＣＣＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧ
ＴＡＣＴＧＣＣ−３′）をクローン化することによって
行なった。この操作で得られたプラスミドをｐＧＤ７と
命名した。
【０２７１】次いで、Ｈ６プロモーターの５′側に追加
配列を付加した。この操作は、ｐＧＢ６（図５０〜５
２）の１５０bp ＢｇｌII-ＥｃｏＲVフラグメントをｐ
ＧＤ７の４８００bp ＢｇｌII-ＥｃｏＲVフラグメント
にクローン化することによって行なった。この操作で得
られたプラスミドをｐＧＤ８と命名した。
【０２７２】組換えワクシニアウイルスの構築 ワクシニアウイルスにＨＳＶ２ ｇＢ、ｇＣ及びｇＤ遺
伝子をクローン化するのに用いた方法の概要を、それぞ
れ図４８及び４９、図５０〜５２、及び図５３及び５４
に示した。これらの構築体はすべてワクシニアウイルス
初期／後期プロモーターＨ６（41,42,184）を利用す
る。各ＨＳＶ２遺伝子はワクシニアウイルスゲノムの異
なる部位にクローン化されている。Ｈ６プロモーター付
きｇＢ遺伝子は、Ｍ２Ｌ遺伝子のフランキング配列間
（ｖｐ５６９）又はＴＫ遺伝子のフランキング配列間
（ｖＰ７３４、ｖＰ７７５及びｖＰ７７６）にクローン
化されている。Ｈ６プロモーター付きｇＣ遺伝子は、μ
遺伝子のフランキング配列間（ｖＰ５７９）又はＡＴＩ
遺伝子のフランキング配列間（ｖＰ７４８、ｖＰ７７６
及びｖＰ７７７）にクローン化されている。Ｈ６プロモ
ーター付きｇＤ遺伝子はＨＡ遺伝子のフランキング配列
間にクローン化されている（ｖＰ５７０、ｖＰ７６１、
ｖＰ７７５及びｖＰ７７７）。ｐＧＢ５をｖＰ４５８感
染細胞にトランスフェクトして組換えワクシニアウイル
スｖＰ５６９を得た。ｐＧＢ６をｖＰ６１８感染細胞に
トランスフェクトしてｖＰ７３４を得た。ｐＧＣ１１を
ｖＰ５３３感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ５７９
を得た。ｐＧＣ１３をｖＰ６１８感染細胞にトランスフ
ェクトしてｖＰ７４８を得た。ｐＧＤ５をｖＰ４２５感
染細胞にトランスフェクトしてｖＰ５７０を得た。ｐＧ
Ｄ８をｖＰ６１８感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ
７６１を得た。
【０２７３】ｖＰ４２５は野生型ワクシニアウイルス
（コペンハーゲン）の一変種であり、ＴＫ遺伝子が欠失
し、かつＨＡ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼで置換され
ている（例１）（184）。ｖＰ４５８は野生型ワクシニ
アウイルスの一変種であり、ＴＫ遺伝子が欠失し、かつ
Ｍ２Ｌ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼで置換されている
（例２）。ｖＰ５５３は野生型ワクシニアウイルスの一
変種であり、ＴＫ遺伝子が欠失し、かつμ遺伝子がβ−
ガラクトシダーゼで置換されている。ｖＰ６１８は野生
型ワクシニアウイルスの一変種であり、ＴＫ、μ及びＡ
ＴＩ遺伝子が欠失している。
【０２７４】２種類のＨＳＶ２糖タンパク質遺伝子を含
有する組換えワクシニアウイルスも構築した。ｖＰ７７
５はｇＢ及びｇＤ遺伝子を含有し、ｖＰ７７６はｇＢ及
びｇＣ遺伝子を含有し、ｖＰ７７７はｇＣ及びｇＤ遺伝
子を含有する。ｐＧＤ８をｖＰ７３４感染細胞にトラン
スフェクトしてｖＰ７７５を得た。ｐＧＣ１３をｖＰ７
３４感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ７７６を得
た。ｐＧＤ８をｖＰ７４８感染細胞にトランスフェクト
してｖＰ７７７を得た。
【０２７５】３種類のＨＳＶ２糖タンパク質遺伝子を含
有する組換えワクシニアウイルスも構築した。ｖＰ８１
２は、ＨＳＶ−２のｇＢ、ｇＣ及びｇＤ遺伝子を含有す
る。ｐＧＤ８をｖＰ７７６感染細胞にトランスフェクト
してｖＰ８１２を得た。
【０２７６】組換えワクシニアウイルス感染細胞中のＨ
ＳＶ２糖タンパク質の免疫蛍光 ＨＳＶ２感染細胞においては、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ（並び
にＨＳＶ２にコードされた他の糖タンパク質）が原形質
膜上に発現する。ＨＳＶ２遺伝子を含有する組換えワク
シニアウイルスで感染させた細胞について免疫蛍光実験
を行なったところ、これらの組換えワクシニアウイルス
感染細胞において産生されたＨＳＶ２ポリペプチドも原
形質膜上に発現することが判明した。
【０２７７】組換えワクシニアウイルス感染細胞中のＨ
ＳＶ２糖タンパク質の免疫沈降 ＨＳＶ２感染細胞内で生産されるＨＳＶ２ ｇＢ糖タン
パク質は約１１７kDaの分子量を有する（198,199）。Ｈ
ＳＶ２ ｇＢ遺伝子を含有する組換えワクシニアウイル
ス（ｖＰ５６９、ｖＰ７３４ 、ｖＰ７７５及びｖＰ７
７６）を感染させた細胞も、ＨＳＶ２にコードされた分
子量約１１７kDaのポリペプチドを産生する。ｖＰ５６
９感染細胞について、ＨＳＶ２ウイルス全体に対する抗
血清で免疫沈降反応を行なうと、分子量約１１７kDaと
１１０KDaの２つの主要なタンパク質、並びに分子量５
０kDa、４５kDa及び３０kDaの３つのマイナーなタンパ
ク質が検出される。ｖＰ７３４、ｖＰ７７５及びｖＰ７
７６を感染させた細胞についての免疫沈降反応では、分
子量約１１０kDaと９０kDaの２つの主要なタンパク質、
並びに約１１７kDa、１００kDa、５０kDa、４５kDa及び
３０kDaの５つのマイナーなタンパク質が検出される。
【０２７８】ＨＳＶ２感染細胞内で生産されるＨＳＶ２
ｇＣ糖タンパク質は約６３kDaの分子量を有する（19
9,200）。ＨＳＶ２ ｇＣ遺伝子を含有する組換えワク
シニアウイルス（ｖＰ５７９、ｖＰ７４８、ｖＰ７７６
及びｖＰ７７７）を感染させた細胞も、ＨＳＶ２にコー
ドされた分子量約６３kDaのポリペプチドを産生する。
ｖＰ５７９、ｖＰ７４８、ｖＰ７７６及びｖＰ７７７で
感染させた細胞について、ＨＳＶ２ウイルス全体に対す
る抗血清で免疫沈降反応を行なうと、分子量約８５kDa
の主要なタンパク質と分子量約６５kDaのマイナーなタ
ンパク質が検出される。ＨＳＶ２ウイルス全体に対する
ウサギ抗血清はダコ社（DAKO Corporation，カリフォ
ルニア州サンタバーバラ、コード番号B116）から入手
し、１：１００に希釈して用いた。
【０２７９】ＨＳＶ２感染細胞内で生産されるＨＳＶ２
ｇＤ糖タンパク質は約５１kDaの分子量を有する（19
8,199）。ＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子を含有する組換えワク
シニアウイルス（ｖＰ５７０、ｖＰ７６１、ｖＰ７７５
及びｖＰ７７７）を感染させた細胞も、ＨＳＶ２にコー
ドされた分子量約５１kDaのポリペプチドを産生する。
ｖＰ５７０、ｖＰ７６１、ｖＰ７７５及びｖＰ７７７で
感染させた細胞について、ＨＳＶ２ウイルス全体に対す
る抗血清で免疫沈降反応を行なうと、分子量約４８ｋＤ
ａの１つの主要なタンパク質と、分子量約４０kDaと３
１kDaのマイナーなタンパク質が検出される。
【０２８０】インビボでの評価 パオレッティ(Paoletti)他の記載した実験（26）と同様
な実験において、ＨＳＶ２の種々の糖タンパク質形を発
現する上記組換えワクシニアウイルスのすべてが、免疫
マウスを致死量のＨＳＶ感染から防御した。
【０２８１】例１４‐ワクシニアウイルス組換え体にお
けるウシヘルペスウイルス１型糖タンパク質ｇIの発現
ＢＨＶ1 ｇI型遺伝子のワクシニアウイルスへのクロー
ン化 ＢＨＶ1 ｇI遺伝子の塩基配列は既に文献に記載されて
いる（63）。ここで図５５〜５７を参照する。ＢＨＶ1
ｇI遺伝子を含有するプラスミドｐＩＢＲＳ６（Straub
株）をRhone Merieux社から入手した。ｇI遺伝子の
５′末端を、Ｈ６プロモーター（41,42,69）の下流のワ
クシニアウイルス（コペンハーゲン）フランキングアー
ム間にクローン化した。この操作は、ｐＩＢＲＳ６の５
４０bp ＳａｌI-ＰｓｔIフラグメントをpＧＤ５の４４
００bp ＳａｌI／ＰｓｔIフラグメントにクローン化す
ることによって行なった（pＧＤ５はＨＳＶ２ ｇＤ遺
伝子をｐＴＰ１５にクローン化することによって作成し
た）（184）（図４）。こうして、Ｈ６プロモーターの
下流のワクシニアウイルスＨＡフランキングアーム間に
ｇI遺伝子が配置される。この操作で得たプラスミドを
ｐＩＢＲ２と名付けた。
【０２８２】次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇ
I遺伝子の開始コドンと整列させた。この操作は、ｐＩ
ＢＲ２の３８００bp ＮｒｕI-ＳｓｔIIフラグメントに
オリゴヌクレオチドＩＢＲＬ１（５′‐ＡＴＣＣＧＴＴ
ＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧ
ＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧＣＣＧＣ−３′）
とオリゴヌクレオチドＩＢＲＬ２（５′‐ＧＧＣＧＣＧ
ＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＴＴ
ＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３′）を
クローン化することによって行なった。この操作で得た
プラスミドをｐＩＢＲ４と名付けた。
【０２８３】次いで、後段の操作を行なうために必要な
ＮｃｏI部位を生じさせた。この操作は、ｐＩＢＲ４の
ＰｓｔI部位にオリゴヌクレオチドＩＢＲＬ３（５′‐
ＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＣＡ−３′）とＩＢＲＬ４
（５′‐ＴＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡ−３′）をク
ローン化することによって行なった。この操作で得たプ
ラスミドをｐＩＢＲ５と名付けた。
【０２８４】次に、ｇI遺伝子の３′末端をｐＩＢＲ５
にクローン化した。この操作は、ｐＩＢＲＳ６の１７４
０bp Ｔｔｈ１１１I‐ＮｃｏIフラグメントをｐＩＢＲ
５の３７００bp Ｔｔｈ１１１I‐ＮｃｏIフラグメント
にクローン化することによって行なった。この操作で得
たプラスミドをｐＩＢＲ７と名付けた。
【０２８５】次いで、後段の操作を行なうために必要な
ＢｇｌII部位を生じさせた。この操作は、ｐＩＢＲ７の
ＮｃｏI部位にオリゴヌクレオチドＩＢＲＬ５（５′−
ＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＣ−３′）及びＩＢＲ
Ｌ６（５′−ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＣ−
３′）をクローン化することによって行なった。この操
作で得たプラスミドをｐＩＢＲ８と名付けた。
【０２８６】次に、ｇI遺伝子の長い親水性リーダー配
列の一部分を欠失させた。この操作は、ｐＩＢＲ８の４
４００bp ＮｒｕI／ＡｐａI（部分）フラグメントにオ
リゴヌクレオチドＩＢＲＬ７（５′‐ＡＴＣＣＧＴＴＡ
ＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡ
ＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＣＧＡＣＧＴ
ＧＧＧＣＣ−３′）とＩＢＲＬ８（５′‐ＣＡＣＧＴＣ
ＧＣＣＣＡＴＡＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＡＧＣＧ
ＣＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧ
ＧＡＴ−３′）をクローン化することによって行なっ
た。こうして１３２bpの親水性リーダー配列が欠失す
る。この操作で得たプラスミドをｐＩＢＲ９と名付け
た。
【０２８７】次に、Ｈ６プロモーター付き先端欠失ｇI
遺伝子を別のワクシニアウイルスドナープラスミドにク
ローン化した。この操作は、ｐＢＰ１４の４９００bp
ＮｒｕI-ＢａｍＨIフラグメントにｐＩＢＲ９の１７０
０bp ＮｒｕI-ＢｇｌIIフラグメントをクローン化する
ことによって行なった（211）。この操作で得たプラス
ミドをｐＩＢＲ１０と名付けた。
【０２８８】組換えワクシニアウイルスの構築 ＢＨＶ−１ ｇI遺伝子をワクシニアウイルスにクロー
ン化するのに用いた方法の概要を図５５〜５７に示す。
ｐＩＢＲ７をｖＰ４１０感染細胞にトランスフェクトす
ることによって組換えワクシニアウイルスｖＰ６３７を
得た。ｐＩＢＲ１０をｖＰ４１０感染細胞にトランスフ
ェクトすることによって組換えワクシニアウイルスｖＰ
７２４を得た。ｖＰ６３７は全ＢＨＶ１ ｇI遺伝子を
含有する。ｖＰ７２４は１３２bpの５′シグナル配列の
欠失したｇI遺伝子を含有する（63）。これらの組換え
ウイルスはワクシニアウイルス初期／後期プロモーター
Ｈ６を利用する（41,42,184）。ｖＰ６３７中のｇI遺伝
子はＨＡ遺伝子のフランキング配列間にクローン化され
ている。ｖＰ７２４中のｇI遺伝子はＡＴＩ遺伝子のフ
ランキング配列間にクローン化されている。
【０２８９】組換えワクシニアウイルス感染細胞におけ
る、ＢＨＶ１にコードされたポリペプチドの免疫蛍光と
検出 ＢＨＶ１感染細胞においては、ｇIが原形質膜上に発現
する。ｖＰ６３７又はｖＰ７２４で感染させた細胞につ
いて免疫蛍光実験を行なったところ、これらの細胞内で
生産されたＢＨＶ１にコードされたポリペプチドも原形
質膜上で発現することが判明した。免疫蛍光実験は例１
に記載した手順で行なった。ＢＨＶ１ｇＩに特異的なモ
ノクローナル抗体４２０３及び５１０６を使用した（20
1）。
【０２９０】例１５‐ネコヘルペスウイルス糖タンパク
質ｇＢのワクシニアウイルス組換え体における発現 本例では、ワクシニアウイルスＷＲ株（202）を用い
た。ＷＲ株から誘導した組換えワクシニアウイルスｖＰ
２９３を救援ウイルスとして用いた（69）。
【０２９１】ＦＨＶ−１ ＤＮＡの抽出及びＦＨＶ−１
ＳａｃI‐ＳａｃI ３．２Kbフラグメントのクローニ
ング ＦＨＶ−１ ＤＮＡをＣＯ株から抽出して精製した。Ｆ
ＨＶ−１ ＤＮＡゲノムをＥｃｏＲIで消化し、常法に
よりプラスミドｐＢＲ３２２に連結した（20）。このＦ
ＨＶ−１バンク（bank)を、ＰＲＶ ｇII（62）及びＢ
ＨＶ−１ ｇＢ遺伝子（203）由来のＤＮＡプローブを
用いてスクリーニングした。このハイブリダイゼーショ
ンで陽性であった２つのＥｃｏＲIクローン由来のサブ
クローンを用いてさらにハイブリダイゼーションを行な
うと、ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子のより正確なマッピング
が可能になった。ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子を含有する
３．２Kb ＳａｃI‐ＳａｃIフラグメントをｐＵＣ１８
にクローン化してプラスミドｐＦＨＶｇＢＣを得た。
【０２９２】ＦＨＶ−１ ｇＢをコードするＳａｃI‐
ＳａｃIフラグメントの配列決定 上述のとおり、修飾Ｔ７配列を用いてｐＦＨＶｇＢＣ及
びｐＦＨＶｇＢＣ由来サブクローンから二本鎖双方につ
いて塩基配列に関するデータを得た。
【０２９３】ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子のワクシニアウイ
ルスドナープラスミドへのクローニング ここで図５８を参照する。ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子をｐ
ＨＥＳ４にクローン化した。ｐＨＥＳ４は、ワクシニア
ウイルスＷＲ株における宿主域選択系用に設計されたプ
ラスミドの一つである（69）（図１３）。このプラスミ
ドはヒト宿主域遺伝子Ｋ１Ｌを有しており、欠失変異株
ｖＰ２９３にヒト細胞上での複製能力を与える。ＦＨＶ
−１ ｇＢ遺伝子を、ワクシニア合成Ｈ６プロモーター
のすぐ下流に挿入した（69）。プラスミドｐＦＨＶｇＢ
ＣをＫｐｎIとＳａｃIで消化し、ＦＨＶ−１ ｇＢを含
有する３１５０bp制限フラグメントをアガロースゲルか
ら単離して、予めＫｐｎIとＳａｃIで消化しておいたプ
ラスミドｐＨＥＳ４に連結した。得られたプラスミドを
ｐＪＣＡ００１と名付けた（図５８）。
【０２９４】ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列解析 今度は図５９〜６５（配列番号７４）を参照する。ＤＮ
Ａ配列の解析から、３３７番目から３１７７番目の塩基
からなる解読枠が明らかになった。転写制御調節シグナ
ルと思われる配列が、３３７番目のＡＴＧ 開始コドン
の５′上流領域に見付かった。配列ＡＡＡＴＡＴＡＴ
（ヌクレオチド１８４〜１９１）を有するＴＡＴＡボッ
クスが、ＣＡＴボックスと思われる配列ＧＧＴＧＡＧＴ
Ａの８０塩基下流に位置していた。ポリアデニル化シグ
ナルＡＡＴＡＡＡ（ヌクレオチド３２５１〜３２５６）
はＴＡＡ終止コドンの５０塩基下流に位置していた。配
列５′−ＴＣＡＴＴＣＴＡＧＣＡ−３′（ヌクレオチド
２００〜２１０）の１１個の塩基のうちの８個が１８Ｓ
リボソームＲＮＡの配列３′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴ−
５′（61）と相補性を有しており、リボソーム結合部位
として機能しているものと思われる。真核生物のｍＲＮ
Ａの翻訳開始に関する移動モデルが提案されている（15
1,155）。開始コドンと思われる周囲の配列ＡＴＣＡＴ
ＧＴ（ヌクレオチド３３４〜３４０）の状況は、真核生
物のｍＲＮＡの翻訳開始に対する機能的配列として適格
である。ＦＨＶ−１ ｇＢ解読枠は、計算上１０６．２
kDaの分子量を有する９４７残基のアミノ酸をコードす
る。Ｇ＋Ｃ含量は４５．８％である。
【０２９５】ＦＨＶ−１ ｇＢタンパク質の構造分析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通す
る幾つかの特徴が明らかになった。２３残基目のアミノ
酸から７３残基目のアミノ酸の領域は特徴的な疎水的性
質を有しており、シグナル配列であるものと思われる
（図５９〜６５）。ここで図６６を参照する。この長い
疎水性シグナル配列に先立って、２２残基のアミノ酸か
らなる親水性配列が存在する。この特徴は、仮性狂犬病
（ＰＲＶ）ｇII遺伝子（62）、ウシヘルペスウイルス１
型（ＢＨＶ−１）ｇI遺伝子（63）並びにウマヘルペス
ウイルス１型（ＥＨＶ−１）（71）とウマヘルペスウイ
ルス４型（ＥＨＶ−４）（72）のｇｐ１４遺伝子にも認
められるが、これらはすべてＨＳＶ ｇＢ相同物であ
る。４２残基のアミノ酸（アミノ酸７８９〜８３１）か
らなる疎水性領域は膜貫通性アンカー領域として機能す
ると予想される。親水性の細胞質ドメインは１１６残基
のアミノ酸からなる。Ｎ−グリコシル化される可能性の
あるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（Ｘはプロリン以外の
アミノ酸である）部位が１０カ所存在し（64）、そのう
ちの１つはシグナル配列中に位置している。タンパク質
分解を受ける可能性のある切断部位（Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｓｅｒ）が２カ所に接近して（アミノ酸５０４〜５０６
及び５１６〜５１８）存在するが、この配列はＰＲＶ
ｇII（94）、ＶＺＶ ｇｐII及びＨＣＭＶ ｇＢ（71）
並びにＥＨＶ−１ ｇｐ１４（71,72）に存在するもの
と同一である。ＦＨＶ−１ｇＢのアミノ酸配列の疎水的
性質を図６６に示す。
【０２９６】ＦＨＶ−１ ｇＢアミノ酸配列と他のヘル
ペスウイルス糖タンパク質との比較 ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子のアミノ酸組成の比較から、他
のヘルペスウイルスの糖タンパク質との著しい相同性が
明らかになった。たとえばＦＨＶ−１ ｇＢは、ＰＲＶ
ｇII（62）、ＢＨＶ−１ ｇI（63）、水痘帯状疱疹
ウイルス（ＶＺＶ）ｇII（66,204）、ＨＳＶ１ ｇＢ
（67）、ＨＳＶ−２ ｇＢ（205）、ＥＨＶ−１ ｇｐ
１４（71）、並びにエプスタイン・バールウイルス（Ｅ
ＢＶ）（68,206）とヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭ
Ｖ）（10）の糖タンパク質と相同である。
【０２９７】ＦＨＶ−１ ｇＢ糖タンパク質を発現する
ワクシニア組換え体ｖＰ７１３の構築 ＷＲワクシニアウイルス宿主域選択系ｐＨＥＳ４／ｖＰ
２９３（69）を用いて、ＦＨＶ−１ ｇＢコード配列を
ワクシニアウイルスベクターに挿入した（69）。ＷＲワ
クシニアウイルスｖＰ２９３／ｐＨＥＳ宿主域選択系を
用いた組換えによって生じる組換えワクシニア子孫（プ
ロジェニィ）はヒトＭＲＣ−５細胞上でプラークを形成
する能力を有するので、かかる組換え体の同定を迅速に
行なうことができる（69）。プラスミドｐＪＣＡ００１
をドナープラスミド、ｖＰ２９３を救援ウイルスとして
用いた組換えで、ワクシニアウイルス組換え体ｖＰ７１
３が得られた（図５８）。
【０２９８】ｖＰ７１３の産生するＦＨＶ−１ ｇＢ糖
タンパク質の免疫蛍光 ヒツジ抗ＦＨＶ−１ ｇＢ血清Ｎｏ．２８５４を用い
て、例１に記載されているとおり、組換えワクシニアウ
イルスｖＰ７１３を感染させたＶＥＲＯ及びＭＲＣ−５
細胞の免疫蛍光実験を行なった。用いた感染多重度は細
胞当り２pfuであった。ＦＩＴＣロバ抗ヒツジＩｇＧを
２次抗体として用いた。
【０２９９】ＦＨＶ−１ ｇＢは、ワクシニア組換え体
ｖＰ７１３感染ＶＥＲＯ細胞の細胞表面上のみならず、
アセトンで固定した細胞内部にも検出された。ｖＰ４１
０を感染させた対照細胞においては、ＦＨＶ−１ ｇＢ
に対する免疫反応性は細胞表面にも細胞内部にも検出さ
れなかった。
【０３００】ｖＰ７１３の産生するＦＨＶ−１ ｇＢ糖
タンパク質の免疫沈降 ｖＰ７１３の発現するＦＨＶ−１ ｇＢ糖タンパク質を
評価するために、ＶＥＲＯ細胞にｖＰ７１３を感染させ
て代謝されるタンパク質を35Ｓ−メチオニンで標識し
た。放射性標識した細胞溶解物の免疫沈降反応をヒツジ
抗ＦＨＶ−１ ｇＢ血清Ｎｏ．２８５４を用いて行なっ
た。
【０３０１】６０mmシャーレ当り２×１０６個の細胞を
植えたＶＥＲＯ細胞単層に、細胞当り０．１pfuと低い
感染多重度で、対照（ｖＰ４１０）又は組換えワクシニ
アウイルスｖＰ７１３を感染させた。免疫沈降反応を例
１に記載した手順で行なった。
【０３０２】非感染ＶＥＲＯ細胞又は対照ワクシニアウ
イルスｖＰ４１０を感染させたＶＥＲＯ細胞のいずれに
も、特異的抗ＦＨＶ−１ ｇＢ血清によって免疫沈降し
た生成物はなかった。ｖＰ７１３を感染させたＶＥＲＯ
細胞からは、血清Ｎｏ．２８５４によって、ＦＨＶ−１
ｇＢ放射性標識生成物が沈降した。５種類の代謝的に
放射性標識された主要ポリペプチドが特異的に沈降し
た。見掛けの分子量１１５kDaと１１０kDaの２つの大ポ
リペプチドはグリコシル化されていない前駆体タンパク
質と成熟形タンパク質に相当するものであろう（理論的
分子量はそれぞれ１０６kDaと９８kDaである）。６８kD
aの幅の広いバンドは、この実験では観察されなかった
グリコシル化前駆体（１３６kDa）のタンパク質分解に
よって生ずる２つのグリコシル化サブユニット（６９kD
a ＋ ６６kDa）ではないかと思われる。３つの小さな
沈降生成物（５９kDa、５３kDa及び４８kDa）はどんな
既知ＦＨＶ−１ ｇＢ生成物にも相当せず、分解産物で
あると思われる。
【０３０３】例１６‐エプスタイン・バールウイルス糖
タンパク質のポックスウイルスベクターにおけるクロー
ニング及び発現 ＥＢＶ ｇｐ３４０及びｇｐ２２０遺伝子のワクシニア
ドナープラスミドｐＭＰ４０９ＤＶＣへのクローニング この例において、ＥＢＶ遺伝子はＥＢＶ Ｂ９５−８株
から単離し（207）、ｇｐ３４０及びｇｐ２２０遺伝子
はcＤＮＡクローン（それぞれプラスミドｐＭＬＰｇｐ
３４０及びｐＭＬＰｇｐ２２０）であり、ｇＢ、ｇＨ及
びＢＢＲＦ３遺伝子はＢａｍＨI遺伝子バンクから単離
した。今度は図６７〜７０を参照する。ｐＭＬＰｇｐ２
２０プラスミドの２１００bp ＸｍａI-ＣｌａIフラグ
メントを、ＸｍａI‐ＡｃｃIで消化したＭ１３ｍｐ１８
にクローン化した。この操作で得たファージをｍｐ１８
ｇｐ２２０と名付けた（図６７〜７０）。オリゴヌクレ
オチドＣＭ４（ＴＡＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴ
ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴ
ＴＣＧ）及びＣＭ５（ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡ
ＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡ
ＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣ）を用いたインビトロ
変異導入法（17）によって、ｇｐ２２０遺伝子をワクシ
ニアＨ６プロモーターの制御下で発現するように修飾し
た。修飾ｇｐ２２０遺伝子を含有するプラスミドをｍｐ
１８ｇｐ２２０（５＋４）と命名した（図６７〜７
０）。
【０３０４】修飾ｇｐ２２０遺伝子を、完全Ｈ６合成プ
ロモーターを含有するプラスミドＳＰ１３１ＮｏｔＩに
クローン化した。この操作は、ｍｐ１８ｇｐ２２０（５
＋４）の２３００bp ＮａｒI-ＥｃｏＲVフラグメント
をＳＰ１３１ＮｏｔＩプラスミドの２９４０bp Ｅｃｏ
ＲV-ＮａｒIフラグメントにクローン化することによっ
て行なった。得られたプラスミドをＳＰ１３１ｇｐ２２
０と命名した（図６７〜７０）。
【０３０５】Ｈ６プロモーターの制御下に置かれたｇｐ
３４０遺伝子を、ＸｈｏI‐ＳｃａI（部分）消化ＳＰ１
３１ｇｐ２２０プラスミドにｐＭＬＰｇｐ３４０の２３
６０bp ＳｃａI-ＸｈｏIフラグメントをクローン化す
ることによって得た。得られたプラスミドをＳＰ１３１
ｇｐ３４０と命名した（図６７〜７０）。
【０３０６】Ｈ６プロモーター付きｇｐ３４０及びｇｐ
２２０遺伝子を、ワクシニアウイルスＭ２Ｌ挿入座プラ
スミドｐＭＰ４０９ＤＶＣ（図５、ただし図６７〜７
０、及び図７６及び７７においては、このプラスミドは
ＭＰ４０９と記載されている）にクローン化した。この
操作は、プラスミドｐＭＰ４０９ＤＶＣのＢｇｌIIムン
グ・ビーンヌクレアーゼ処理部位に、プラスミドＳＰ１
３１ｇｐ３４０の２８００bpムング・ビーンヌクレアー
ゼ処理ＮｏｔIフラグメント及びプラスミドＳＰ１３１
ｇｐ２２０の２１００bpムング・ビーンヌクレアーゼ処
理ＮｏｔIフラグメントをクローン化することによって
行なった。得られたプラスミドをそれぞれ４０９Ｈ６３
４０及び４０９Ｈ６２２０と命名した（図６７〜７
０）。
【０３０７】ＥＢＶ ｇＢ遺伝子のワクシニアウイルス
ドナープラスミドｐＭＰ４０９ＤＶＣへのクローニング 次に図７１及び７２を参照する。ＥＢＶゲノムライブラ
リーから、ＥＢＶ ＤＮＡのＢａｍＨI Ａフラグメン
ト（207）の３５００bp ＥｃｏＲI‐ＸｍｎIフラグメ
ント（ＥＢＶ ｇＢ遺伝子を含有する）を単離して、ｐ
ＩＢＩ２５の２８３７bp ＨｉｎｃII-ＥｃｏＲIフラグ
メントにクローン化した。得られたプラスミドをｐ２５
ｇＢと命名した（図７１及び７２）。
【０３０８】オリゴヌクレオチドＥＢＶＢＭ５（ＣＣＣ
ＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣ
ＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＧＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＡ
ＧＧ）及びＥＢＶＢＭ３（ＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＴＴＧ
ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴ
ＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣ）を用いたインビトロ変異
導入法（17,185)によって、ｇＢ遺伝子がワクシニアＨ
６プロモーターの制御下で発現されるように修飾した。
得られたプラスミドをｐ２５ｇＢ（５＋３）と命名し
た。
【０３０９】ｐ２５ｇＢ（５＋３）の２６００bp Ｅｃ
ｏＲV-ＥｃｏＲIフラグメントをＳＰ１３１の３３００b
p ＥｃｏＲV-ＥｃｏＲIフラグメントにクローン化し
た。得られたプラスミドをＳＰ１３１ｇＢと命名した
（図７１及び７２）。
【０３１０】次に、Ｈ６プロモーターｇＢ遺伝子をワク
シニアウイルスドナープラスミドｐＭＰ４０９ＤＶＣに
クローン化した。この操作は、ｐＭＰ４０９ＤＶＣのＢ
ｇｌIIムング・ビーンヌクレアーゼ処理部位にＳＰ１３
１ｇＢの２７００bp ＨｉｎｄIIIムング・ビーンヌク
レアーゼ処理フラグメントをクローン化することによっ
て行なった。得られたプラスミドを４０９Ｈ６ｇＢと命
名した（図７１及び７２）。
【０３１１】ＥＢＶ ｇＨ遺伝子のワクシニアドナープ
ラスミドｐＳＤ４８６ＶＣへのクローニング ＥＢＶ ＢａｍＨIクローン化制限フラグメントライブ
ラリーにおいて、解読枠ＢＸＬＦ２はＢａｍＨI Ｘ及
びＢａｍＨI Ｔフラグメントに含有されている（20
7）。図７３及び７４に示すように、ＢＸＬＦ２の完全
な解読枠を、ＢａｍＨI Ｘの８３０bp ＳｍａI−Ｂａ
ｍＨIフラグメントをｐＩＢＩ２４の２８８０bp Ｓｍ
ａI-ＢａｍＨIフラグメントにクローン化することによ
って再構成した。得られたプラスミドを２４ｇＨ５と命
名した。ＢａｍＨI Ｔの１８５０bpＢａｍＨI-Ｈｉｎ
ｄIIIフラグメントを２４ｇＨ５のＢａｍＨI-ＨｉｎｄI
IIフラグメントにクローン化した。生じた全ｇＨ遺伝子
を含有するプラスミドを２４ｇＨと命名した（図７３及
び７４）。
【０３１２】オリゴヌクレオチドＨＭ５（ＡＣＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＡＴＴＴＣＣ
ＣＣＴＣＴ）、ＨＭ４（ＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡ
ＡＡＴＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＴＧＣＧ）及びＨＭ３
（ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡ
ＴＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ）を用いたイン
ビトロ変異導入法によって、ｇＨ遺伝子がワクシニア出
血性（μ）初期プロモーターの制御下で発現されるよう
に修飾した。オリゴヌクレオチドＨＭ４を用いて、ｇＨ
遺伝子に含まれるワクシニア初期転写終結シグナル（4
5）を除去した。かかる修飾ｇＨ遺伝子を含有するプラ
スミドを２４ｇＨ（５＋４＋３）と命名した。
【０３１３】次いで図７３及び７４を参照する。ワクシ
ニアμプロモーターはプラスミドｐＳＤ４８６ＶＣに含
まれている（図５０〜５２）。（このプラスミドは図７
３及び７４においてはＳＤ４８６と記載されている）。
２４ｇＨ（５＋４＋３）の２１３０ｂｐ ＢｇｌIIムン
グ・ビーンヌクレアーゼ処理フラグメントを、ＢｇｌII
ムング・ビーンヌクレアーゼ処理ｐＳＤ４８６ＶＣにク
ローン化した。この最後のクローニング操作によって、
ｇＨ遺伝子がワクシニアμプロモーターの制御下に置か
れる。この操作によって生じたプラスミドを４８６ｇＨ
と命名した（図７３及び７４）。
【０３１４】解読枠ＢＢＲＦ３のワクシニアウイルスド
ナープラスミドｐＣＯＰＳＣ−５Ｈへのクローニング すべてのＢＢＲＦ３解読枠がＥＢＶ ＤＮＡのＢａｍＨ
I Ｂフラグメントに含まれている。このフラグメント
をＢｓｐＨIで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノウフラグメント）で処理し、ＢｇｌIIで消化し
た。ＢａｍＨIＡフラグメント内のＢｇｌII部位は、Ｂ
ＢＲＦ３の終止コドンの１０塩基前方に位置する。上記
１２３０bp ＢｓｐｈI-ＢｇｌIIフラグメントを単離
し、プラスミドｐＣＯＰＳＣ−５Ｈの４２００bp Ｓｍ
ａI-ＢｇｌIIフラグメントにクローン化した（プラスミ
ドｐＣＯＰＣＳ−５ＨはプラスミドｐＣＯＰＣＳ６５７
と同一である（図３０））。この操作で得たプラスミド
をＣＯＰＳＣＥＢＶＸと命名した。
【０３１５】ＥＢＶ ｇｐ３４０、ｇＢ及びｇＨ遺伝子
のワクシニアウイルスドナープラスミドｐＳＤ５１３Ｖ
ＣＶＱへのクローニング 三重ＥＢＶ組換え体の作成に使用したワクシニアウイル
スドナープラスミドは、プラスミドｐＳＤ５１３ＶＣＶ
Ｑであった（図４８及び４９）。このプラスミドはコペ
ンハーゲンワクシニアウイルスＨｉｎｄIII Ｊフラグ
メントのサブクローンを含んでいるが、チミジンキナー
ゼ遺伝子コード配列がポリリンカー領域によって置換さ
れている。
【０３１６】第一の操作段階において、μプロモーター
付きＥＢＶ ｇＨ遺伝子をｐＳＤ５１３ＶＣＶＱにクロ
ーン化した。詳細に述べると、４８６ｇＨの２３００bp
ＳｎａＢI-ＢｇｌIIフラグメントをｐＳＤ５１３ＶＣ
ＶＱの４０００bp ＳｍａI-ＢｇｌIIフラグメントにク
ローン化した。この操作で得たプラスミドを５１３Ｕｇ
Ｈと命名した。
【０３１７】次に、Ｈ６プロモーター付きＥＢＶ ｇｐ
３４０遺伝子を５１３ＵｇＨにクローン化した。詳細を
述べると、ＳＰ１３１ｇｐ３４０の２８００bp Ｎｏｔ
Iムング・ビーン処理フラグメントを５１３ＵｇＨの６
３００bp ＸｈｏI-ＰｓｔIムング・ビーンヌクレアー
ゼ処理フラグメントにクローン化した。この操作で得た
プラスミドを５１３ＵｇＨ３４０Ｈ６と命名した。
【０３１８】次いで、Ｈ６プロモーター付きＥＢＶ ｇ
Ｂ遺伝子を５１３ＵｇＨ３ ４０Ｈ６にクローン化し
た。詳細を述べると、ＳＰ１３１ｇｐ３４０の２７００
bp ＨｉｎｄIIIムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラ
グメントを５１３ＵｇＨ３４０Ｈ６の９１００bp Ｂｇ
ｌIIムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラグメントにク
ローン化した。得られたプラスミドを５１３ｇＨｇＢｇ
ｐ３４０と命名した（図７５）。
【０３１９】組換えワクシニアウイルスの構築 ＥＢＶ ｇｐ３４０（ドナープラスミド４０９Ｈ６３４
０）、ＥＢＶ ｇｐ２２０（ドナープラスミド４０９Ｈ
６２２０）及びＥＢＶ ｇＢ（ドナープラスミド４０９
６Ｈ６ｇＢ）を、ワクシニアウイルスｖＰ４５８（Ｍ２
Ｌ部位）と組換えた。これらのワクシニアウイルス単一
組換え体をそれぞれｖＰ４７４、ｖＰ４８０及びｖＰ５
６１と命名した。ＥＢＶ ｇＨ（ドナープラスミド４８
６ｇＨ）をワクシニアウイルスｖＰ５３３（μ挿入部
位）に組換えた。このワクシニアウイルス単一組換え体
をｖＰ６１１と名付けた。
【０３２０】最後に、ｇｐ３４０、ｇＢ及びｇＨを含有
するワクシニアウイルス三重換え体を、ドナープラスミ
ド５１３ｇＨｇＢｇｐ３４０をワクシニアウイルスｖＰ
６１７と組換えてｖＰ６１７のチミジンキナーゼ挿入部
位に組込むことによって得た。この組換えウイルスをｖ
Ｐ７１２と名付けた。ｖＰ６１７はＴＫ、ＨＡ及びＡＴ
Ｉ遺伝子欠失コペンハーゲンワクシニアウイルスであ
る。
【０３２１】組換えワクシニアウイルス感染細胞におけ
るＥＢＶタンパク質の免疫蛍光 ｖＰ４７４（ｇｐ３４０）及びｖＰ４８０（ｇｐ２２
０）感染細胞について、モノクローナル抗体Ｆ２９−８
９（165）を用いて免疫蛍光実験を行なったところ、Ｅ
ＢＶ ｇｐ３４０及びＥＢＶ ｇｐ２２０タンパク質が
原形質膜上に発現した。
【０３２２】ｖＰ６１１（ｇＨ）感染細胞は、ヒト血清
を用いると、原形質膜上に弱い陽性シグナルを示した。
【０３２３】最後に、ｖＰ７１２（三重ＥＢＶワクシニ
ア組換え体）を感染させた細胞について同じ実験を行な
った。モノクローナル抗体Ｆ２９−８９及びＮＥＡ ９
２４７（デュポン(DuPont)社から入手したｇＢ特異的抗
体）を用いると、原形質膜上に陽性シグナルが得られ
た。
【０３２４】組換えワクシニアウイルス感染細胞におけ
るＥＢＶタンパク質の免疫沈降 ＥＢＶに感染した細胞内で産生されるＥＢＶ ｇｐ３４
０糖タンパク質は約３４０kDaの分子量を有する（16
5）。組換えワクシニアウイルスｖＰ４７４又はｖＰ７
１２感染細胞も約３４０kDaのＥＢＶタンパク質を産生
した（モノクローナル抗体Ｆ２９−８９を用いて行なっ
た免疫沈降反応）。ＥＢＶ ｇｐ２２０糖タンパク質は
２２０kDaの分子量を有する（165）。組換えワクシニア
ウイルスｖＰ４８０感染細胞も約２２０kDaのＥＢＶタ
ンパク質を産生する。
【０３２５】ＥＢＶ感染細胞内で生産されるＥＢＶ ｇ
Ｂ糖タンパク質は１１０kDaから１２５kDaの分子量を有
しており、その前駆体は９３kDaの分子量を有している
（206,208）。組換えワクシニアウイルスｖＰ５６１又
はｖＰ７１２を感染させた細胞は、分子量約１２５kDa
の主要ＥＢＶタンパク質、並びに分子量約８０kDa、６
０kDa、５０kDa及び４５kDaの４つのマイナーなタンパ
ク質を産生する。
【０３２６】ＥＢＶ感染細胞内で生産されるＥＢＶ ｇ
Ｈ糖タンパク質は８５kDaの分子量を有しており、その
前駆体は７０kDaの分子量を有している（209）。組換え
ウイルスｖＰ６１１を感染された細胞は、約８５kDaの
ＥＢＶにコードされたタンパク質を産生する。
【０３２７】ＥＢＶ糖タンパク質発現ワクシニア組換え
体を用いたウサギの免疫 ｖＰ４７４（ｇｐ３４０）、ｖＰ４８０（ｇｐ２２
０）、ｖＰ５６１（ｇＢ）、ｖＰ６１１（ｇＨ）又はｖ
Ｐ７１２（三重）のいずれかでウサギを免疫した。２次
免疫を１回行なった後、得られた血清を、ＴＰＡ処理Ｂ
９５−８細胞上での免疫蛍光によって試験した。それぞ
れについて陽性シグナルが得られた。ｖＰ４７４（ｇｐ
３４０）で感作させた血清を用いると、インビトロ中和
活性がみられた。
【０３２８】例１７‐ヒトサイトメガロウイルス糖タン
パク質抗原のポックスウイルスベクターにおけるクロー
ニング及び発現 ＨＣＭＶ ｇＢ遺伝子のワクシニアドナープラスミドｐ
ＭＰ４０ ９ＤＶＣへのクローニング ここで図７６及び７７を参照する。ＨＣＭＶ ＤＮＡの
ＨｉｎｄIII Ｄフラグメントの４８００bp ＨｉｎｄI
II-ＢａｍＨIフラグメントを、プラスミドｐＩＢＩ２４
の２８００bp ＨｉｎｄIII-ＢａｍＨIフラグメントに
クローン化した。オリゴヌクレオチドＣＭＶＭ５（ＧＣ
ＣＴＣＡＴＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡ
ＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡ
ＴＣＴＧ）及びＣＭＶＭ３（ＧＡＣＡＧＡＴＴＧＴＧＡ
ＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＣＡＴＣＧＴＡＡＧＣＴＧＴＣ
Ａ）を用いたインビトロ変異導入法（17,185）によっ
て、ＨＣＭＶ ｇＢ遺伝子がワクシニアＨ６プロモータ
ーの制御下で発現されるように修飾した。この修飾ＨＣ
ＭＶ ｇＢ遺伝子を含有するプラスミドを２４ＣＭＶｇ
Ｂ（５＋３）と命名した（図７６及び７７）。
【０３２９】次に、２４ＣＭＶｇＢ（５＋３）の２９０
０bp ＥｃｏＲV-ＢａｍＨIフラグメントを、合成Ｈ６
プロモーターを含有するプラスミドｐＳＰ１３１（69）
の３１００bp ＥｃｏＲV-ＢｇｌIIフラグメントにクロ
ーン化した。このクローニング操作によって、ＨＣＭＶ
ｇＢ遺伝子がワクシニアＨ６プロモーターの制御下に
置かれる。得られたプラスミドをＳＰ１３１ｇＢと命名
した。
【０３３０】最後に、Ｈ６プロモーター付きＨＣＭＶ
ｇＢ遺伝子をワクシニアドナープラスミドｐＭＰ４０９
ＤＶＣにクローン化した。ＳＰ１３１ｇＢの３０００bp
ＨｉｎｄIIIムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラグ
メントをｐＭＰ４０９ＤＶＣのＢｇｌＩＩムング・ビー
ンヌクレアーゼ処理部位にクローン化した。得られたプ
ラスミドを４０９ＣＭＶｇＢと命名した（図７６及び７
７）。
【０３３１】組換えワクシニアウイルスの構築 プラスミド４０９ＣＭＶｇＢ中のＨ６プロモーター付き
ＣＭＶ ｇＢ遺伝子を救援ウイルスｖＰ４５８のＭ２Ｌ
部位に挿入した。得られた組換えワクシニアウイルスを
ｖＰ５２５と命名した。
【０３３２】ＣＭＶ ｇＢタンパク質の組換えワクシニ
アウイルス感染細胞における免疫蛍光 ｖＰ５２５を感染させた細胞について、モノクローナル
抗体又はモルモットポリクローナル血清を用いて免疫蛍
光実験を行なったところ、ＨＣＭＶ ｇＢが原形質膜上
に発現することが判明した。
【０３３３】ＣＭＶ ｇＢの組換えワクシニア感染細胞
における免疫沈降 ＣＭＶ感染細胞内で生産されるＣＭＶ ｇＢ糖タンパク
質は５５kDaの分子量を有しており、その前駆体は１３
０kDaの分子量を有する（172）。ｖＰ５２５を感染させ
た細胞は、約１３０kDa及び５５kDaの２種類のＣＭＶ
ｇＢにコードされるタンパク質を産生した。
【０３３４】ＨＸＬＦ１及びＨＸＬＦ２の塩基配列 ＨＸＬＦ遺伝子ファミリーは、ＨＣＭＶゲノムＤＮＡの
ＨｉｎｄIII Ｘフラグメント中に局在化している（17
2）。特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
ＨＸＬＦ１及びＨＸＬＦ２の塩基配列を決定した（図７
８及び７９；配列番号８５及び８７）。ＨＸＬＦ１は６
４８個の塩基からなっており、２１５残基のアミノ酸か
らなるタンパク質をコードしている。ＨＸＬＦ２は５５
８個の塩基からなっており、１８５残基のアミノ酸から
なるタンパク質をコードする。同じ遺伝子の塩基配列
（ＡＤ１６９ ＨＣＭＶ株）が文献に記載されているが
（173）、これらを比較したところ、ＨＸＬＦ１につい
ては９９％の相同性、ＨＸＬＦ２については９６％の相
同性を有していた。
【０３３５】ＨＣＭＶ抗原発現ワクシニア組換え体によ
るモルモットの免疫 ３匹のモルモットをｖＰ５２５で免疫した。２次免疫を
１回行なうと、モルモットはＨＣＭＶ中和抗体を生じた
（平均力価、５１８）。興味深いことに、ＨＣＭＶ陽性
ヒト血清の中和活性の５０％から８７％をｖＰ５２５感
染細胞に吸収させることができる。この結果はＨＣＭＶ
ｇＢのサブユニットワクチンの潜在的に重要性を有し
ていることを示している。
【０３３６】文 献 1. Allen, ＧＰ. 及び J.T.Bryans著、「Progress
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Ala Gly Ser Asp Asn Thr Thr Asn Ala Asn Gly Thr 50 55 60 Glu Ser Thr His Ser His Glu Thr Thr Ile Thr Cys Thr Lys Ser Leu 65 70 75 80 Ile Ser Val Pro Tyr Tyr Lys Ser Val Asp Met Asn Cys Thr Thr Ser 85 90 95 Val Gly Val Asn Tyr Ser Glu Tyr Arg Leu Glu Ile Tyr Leu Asn Gln 100 105 110 Arg Thr Pro Phe Ser Gly Thr Pro Pro Gly Asp Glu Glu Asn Tyr Ile 115 120 125 Asn His Asn Ala Thr Lys Asp Gln Thr Leu Leu Leu Phe Ser Thr Ala 130 135 140 Glu Arg Lys Lys Ser Arg Arg Gly Gly Gln Leu Gly Val Ile Pro Asp 145 150 155 160 Arg Leu Pro Lys Arg Gln Leu Phe Asn Leu Pro Leu His Thr Glu Gly 165 170 175 Gly Thr Lys Phe Pro Leu Thr Ile Lys Ser Val Asp Trp Arg Thr Ala 180 185 190 Gly Ile Tyr Val Trp Ser Leu Tyr Ala Lys Asn Gly Thr Leu Val Asn 195 200 205 Ser Thr Ser Val Thr Val Ser Thr Tyr Asn Ala Pro Leu Leu Asp Leu 210 215 220 Ser Val His Pro Ser Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Arg Ala Thr Cys Val 225 230 235 240 Val Ala Ser Tyr Phe Pro His Ser Ser Val Lys Leu Arg Trp Tyr Lys 245 250 255 Asn Ala Pro Glu Val Asp Phe Thr Lys Tyr Val Thr Asn Ala Ser Ser 260 265 270 Val Trp Val Asp Gly Leu Ile Thr Arg Ile Ser Thr Val Ser Ile Pro 275 280 285 Val Asp Pro Glu Glu Glu Tyr Thr Pro Ser Leu Arg Cys Ser Ile Asp 290 295 300 Trp Tyr Arg Asp Glu Val Ser Phe Ala Arg Ile Ala Lys Ala Gly Thr 305 310 315 320 Pro Ser Val Phe Val Ala Pro Thr Val Ser Val Ser Val Glu Asp Gly 325 330 335 Asp Ala Val Cys Thr Ala Lys Cys Val Pro Ser Thr Gly Val Phe Val 340 345 350 Ser Trp Ser Val Asn Asp His Leu Pro Gly Val Pro Ser Gln Asp Met 355 360 365 Thr Thr Gly Val Cys Pro Ser His Ser Gly Leu Val Asn Met Gln Ser 370 375 380 Arg Arg Pro Leu Ser Glu Glu Asn Gly Glu Arg Glu Tyr Ser Cys Ile 385 390 395 400 Ile Glu Gly Tyr Pro Asp Gly Leu Pro Met Phe Ser Asp Thr Val Val 405 410 415 Tyr Asp Ala Ser Pro Ile Val Glu Asp Arg Pro Val Leu Thr Ser Ile 420 425 430 Ile Ala Val Thr Cys Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Val Val Leu Ile 435 440 445 Thr Ala Val Cys Phe Tyr Cys Ser Lys Pro Ser Gln Ala Pro Tyr Lys 450 455 460 Lys Ser Asp Phe 465 <210> 5 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Sequence: 32-mer 5'-3' <400> 9 atccgttaag tttgtatcgt aatgtggttg cc 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 32-mer 3'-5' <400> 10 taggcaattc aaacatagca ttacaccaac gg 32 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 49 mer <400> 11 tttctgtata tttgcaacaa tttagatctt actcaaaata tgtaacaat 49 <210> 12 <211> 3351 <212> DNA <213> equine herpesvirus-1 gp14 DNA <220> <221> CDS <222> (300)..(3242) <400> 12 aacgttgggt tgttaccgca tctcaaggag gaactagctc ggtttatgat tactgcggct 60 aaaggtaatt ggtcaattag cgagtttcaa aggttttatt gctttgaggg agtgacaggt 120 gtgacggcca cgcagcggct ggcgtggaaa tatatcgggg agctcatcct agccgccgca 180 gtattctcct cggttttcca ctgtggagag gtgcgcctcc tgcgcgcaga tcgtacctac 240 ccggactcca gcggcgcaca gcgctgcgtg agcggcattt acataaccta cgaggcgtc 299 atg tcc tct ggt tgc cgt tct gtc ggc ggc tcc aca tgg ggc aat tgg 347 Met Ser Ser Gly Cys Arg Ser Val Gly Gly Ser Thr Trp Gly Asn Trp 1 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Asp 225 230 235 240 aac atc atg cac cac gcg tac cac gac gac gag gac gag gtg gag ctt 1067 Asn Ile Met His His Ala Tyr His Asp Asp Glu Asp Glu Val Glu Leu 245 250 255 gat ttg gtg ccg tcc aag ttt gca act ccg ggg gcc aga gcc tgg cag 1115 Asp Leu Val Pro Ser Lys Phe Ala Thr Pro Gly Ala Arg Ala Trp Gln 260 265 270 acc acc aac gat act acg tct tac gtg ggg tgg atg cca tgg agg cac 1163 Thr Thr Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Val Gly Trp Met Pro Trp Arg His 275 280 285 tac acg tca acg tct gtc aac tgc atc gtc gag gag gtg gag gcg cgg 1211 Tyr Thr Ser Thr Ser Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Glu Ala Arg 290 295 300 tcc gtc tac ccc tac gac tcc ttc gcc ctg tcc acc ggt gat att gtg 1259 Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp Ile Val 305 310 315 320 tac gcg tct ccg ttt tac ggc ctg agg gct gcc gct cgc ata gag cac 1307 Tyr Ala Ser Pro Phe Tyr Gly Leu Arg Ala Ala Ala Arg Ile Glu His 325 330 335 aat agc tac gcg cag gag cgt ttc agg caa gtt gaa ggg tac agg ccc 1355 Asn Ser Tyr Ala Gln Glu Arg Phe Arg Gln Val Glu Gly Tyr Arg Pro 340 345 350 cgc gac tta gac agt aaa cta caa gcc gaa gag ccg gtt acc aaa aat 1403 Arg Asp Leu Asp Ser Lys Leu Gln Ala Glu Glu Pro Val Thr Lys Asn 355 360 365 ttt atc act acc ccg cat gtc acc gtc agc tgg aac tgg acc gag aag 1451 Phe Ile Thr Thr Pro His Val Thr Val Ser Trp Asn Trp Thr Glu Lys 370 375 380 aaa gtc gag gcg tgt acg ctg acc aaa tgg aaa gag gtc gac gaa ctc 1499 Lys Val Glu Ala Cys Thr Leu Thr Lys Trp Lys Glu Val Asp Glu Leu 385 390 395 400 gtc agg gac gag ttc cgc ggg tcc tac aga ttt act att cga tcc atc 1547 Val Arg Asp Glu Phe Arg Gly Ser Tyr Arg Phe Thr Ile Arg Ser Ile 405 410 415 tcg tct acg ttt atc agt aac act act caa ttt aag ttg gaa agt gcc 1595 Ser Ser Thr Phe Ile Ser Asn Thr Thr Gln Phe Lys Leu Glu Ser Ala 420 425 430 ccc ctt act gaa tgt gta tcc aaa gaa gca aag gaa gcc ata gac tcg 1643 Pro Leu Thr Glu Cys Val Ser Lys Glu Ala Lys Glu Ala Ile Asp Ser 435 440 445 ata tac aaa aag cag tac gag tct acg cac gtc ttt agc ggt gat gtg 1691 Ile Tyr Lys Lys Gln Tyr Glu Ser Thr His Val Phe Ser Gly Asp Val 450 455 460 gaa tat tac ctg gca cgc ggg ggg ttc tta att gca ttc aga cct atg 1739 Glu Tyr Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Leu Ile Ala Phe Arg Pro Met 465 470 475 480 ctc tcc aac gaa ctc gcc agg ctg tac ctg aac gag ctt gtg aga tct 1787 Leu Ser Asn Glu Leu Ala Arg Leu Tyr Leu Asn Glu Leu Val Arg Ser 485 490 495 aac cgc acc tac gac cta aaa aat cta ttg aac ccc aat gca aac aat 1835 Asn Arg Thr Tyr Asp Leu Lys Asn Leu Leu Asn Pro Asn Ala Asn Asn 500 505 510 aac aat aac acc acg cga aga cgc agg tct ctc ctg tca gta cca gaa 1883 Asn Asn Asn Thr Thr Arg Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Val Pro Glu 515 520 525 cct cag cca acc caa gat ggt gtg cat aga gaa caa att cta cat cgc 1931 Pro Gln Pro Thr Gln Asp Gly Val His Arg Glu Gln Ile Leu His Arg 530 535 540 ttg cac aaa cga gca gtg gag gca acg gca ggt acc gat tct tcc aac 1979 Leu His Lys Arg Ala Val Glu Ala Thr Ala Gly Thr Asp Ser Ser Asn 545 550 555 560 gtc acc gcc aaa cag ctg gag ctc atc aaa acc acg tcg tct atc gag 2027 Val Thr Ala Lys Gln Leu Glu Leu Ile Lys Thr Thr Ser Ser Ile Glu 565 570 575 ttt gcc atg cta cag ttt gca tac gat cac atc caa tcc cac gtc aat 2075 Phe Ala Met Leu Gln Phe Ala Tyr Asp His Ile Gln Ser His Val Asn 580 585 590 gaa atg cta agt aga ata gca act gcg tgg tgt acc ctc caa aac aaa 2123 Glu Met Leu Ser Arg Ile Ala Thr Ala Trp Cys Thr Leu Gln Asn Lys 595 600 605 gag cgg acc cta tgg aac gaa atg gtg aag att aac ccg agc gcc ata 2171 Glu Arg Thr Leu Trp Asn Glu Met Val Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile 610 615 620 gtc tcc gca acc ctt gac gag cga gtt gca gcg agg gtc ctg ggg gac 2219 Val Ser Ala Thr Leu Asp Glu Arg Val Ala Ala Arg Val Leu Gly Asp 625 630 635 640 gtg ata gct ata acg cac tgc gcc aaa ata gag ggc aac gtg tac ttg 2267 Val Ile Ala Ile Thr His Cys Ala Lys Ile Glu Gly Asn Val Tyr Leu 645 650 655 caa aac tcc atg cgc tcg atg gac agt aac acg tgc tac tcc cgc ccc 2315 Gln Asn Ser Met Arg Ser Met Asp Ser Asn Thr Cys Tyr Ser Arg Pro 660 665 670 ccc gta aca ttt aca att act aag aat gca aac aac aga ggg tcg ata 2363 Pro Val Thr Phe Thr Ile Thr Lys Asn Ala Asn Asn Arg Gly Ser Ile 675 680 685 gaa ggc cag ctg gga gag gag aac gag att ttc acg gag cgc aag ctg 2411 Glu Gly Gln Leu Gly Glu Glu Asn Glu Ile Phe Thr Glu Arg Lys Leu 690 695 700 atc gag ccg tgc gcc ctc aat cag aag cgc tac ttt aag ttt ggc aaa 2459 Ile Glu Pro Cys Ala Leu Asn Gln Lys Arg Tyr Phe Lys Phe Gly Lys 705 710 715 720 gag tac gtt tac tac gag aac tac acg ttc gtc cgc aaa gtg ccc ccc 2507 Glu Tyr Val Tyr Tyr Glu Asn Tyr Thr Phe Val Arg Lys Val Pro Pro 725 730 735 acg gaa atc gag gtt atc agc acg tac gtt gaa cta aac ttg acc ctt 2555 Thr Glu Ile Glu Val Ile Ser Thr Tyr Val Glu Leu Asn Leu Thr Leu 740 745 750 ttg gaa gac cgc gag ttt ctg ccc ctg gag gtg tac acg cgg gct gag 2603 Leu Glu Asp Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Ala Glu 755 760 765 ctg gag gac acc ggc ctg cta gac tac agc gaa ata cag cgc cgc aac 2651 Leu Glu Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln Arg Arg Asn 770 775 780 cag ctc cac gct ctc agg ttt tac gac atc gac agc gtg gtc aac gtg 2699 Gln Leu His Ala Leu Arg Phe Tyr Asp Ile Asp Ser Val Val Asn Val 785 790 795 800 gac aat acc gca gtg att atg cag ggg atc gcc agc ttt ttc aag ggc 2747 Asp Asn Thr Ala Val Ile Met Gln Gly Ile Ala Ser Phe Phe Lys Gly 805 810 815 ctg ggt aaa gtg ggg gag gcc gtg gga acg ctc gtt ctc ggc gcc gcc 2795 Leu Gly Lys Val Gly Glu Ala Val Gly Thr Leu Val Leu Gly Ala Ala 820 825 830 ggc gct gtt gtt tca acc gta tct gga ata gct tcg ttt tta aac aac 2843 Gly Ala Val Val Ser Thr Val Ser Gly Ile Ala Ser Phe Leu Asn Asn 835 840 845 cca ttt ggg ggg cta gcc atc ggc ctg ctg gta atc gcc ggc ctg gta 2891 Pro Phe Gly Gly Leu Ala Ile Gly Leu Leu Val Ile Ala Gly Leu Val 850 855 860 gct gcg ttt ttt gct tac aga tat gta atg cag atc cgc agt aac ccc 2939 Ala Ala Phe Phe Ala Tyr Arg Tyr Val Met Gln Ile Arg Ser Asn Pro 865 870 875 880 atg aaa gct cta tac ccc ata aca aca aag gcc ttg aaa aac aaa gcc 2987 Met Lys Ala Leu Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Ala Leu Lys Asn Lys Ala 885 890 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Cys Arg Ser Val Gly Gly Ser Thr Trp Gly Asn Trp 1 5 10 15 Arg Gly Asp Gly Gly Asp Leu Arg Gln Arg Arg Val Leu Ser Pro Val 20 25 30 Cys Ser Ala Pro Ala Ala Gly Ser Trp Ile Gly Ser Gln Leu Gly Asn 35 40 45 Val Gly Asn Leu Leu Ala Thr Pro His Pro Leu Gly Lys Pro Ala Ser 50 55 60 Ser Arg Val Gly Thr Ile Val Leu Ala Cys Leu Leu Leu Phe Gly Ser 65 70 75 80 Cys Val Val Arg Ala Val Pro Thr Thr Pro Ser Pro Pro Thr Ser Thr 85 90 95 Pro Thr Ser Met Ser Thr His Ser His Gly Thr Val Asp Pro Thr Leu 100 105 110 Leu Pro Thr Glu Thr Pro Asp Pro Leu Arg Leu Ala Val Arg Glu Ser 115 120 125 Gly Ile Leu Ala Glu Asp Gly Asp Phe Tyr Thr Cys Pro Pro Pro Thr 130 135 140 Gly Ser Thr Val Val Arg Ile Glu Pro Pro Arg Thr Cys Pro Lys Phe 145 150 155 160 Asp Leu Gly Arg Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val Ile Phe Lys Glu 165 170 175 Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe Arg Ala Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Ile 180 185 190 Val Val Thr Arg Val Trp Lys Gly Tyr Ser His Thr Ser Leu Ser Asp 195 200 205 Arg Tyr Asn Asp Arg Val Pro Val Ser Val Glu Glu Ile Phe Gly Leu 210 215 220 Ile Asp Ser Lys Gly Lys Cys Ser Ser Lys Ala Glu Tyr Leu Arg Asp 225 230 235 240 Asn Ile Met His His Ala Tyr His Asp Asp Glu Asp Glu Val Glu Leu 245 250 255 Asp Leu Val Pro Ser Lys Phe Ala Thr Pro Gly Ala Arg Ala Trp Gln 260 265 270 Thr Thr Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Val Gly Trp Met Pro Trp Arg His 275 280 285 Tyr Thr Ser Thr Ser Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Glu Ala Arg 290 295 300 Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp Ile Val 305 310 315 320 Tyr Ala Ser Pro Phe Tyr Gly Leu Arg Ala Ala Ala Arg Ile Glu His 325 330 335 Asn Ser Tyr Ala Gln Glu Arg Phe Arg Gln Val Glu Gly Tyr Arg Pro 340 345 350 Arg Asp Leu Asp Ser Lys Leu Gln Ala Glu Glu Pro Val Thr Lys Asn 355 360 365 Phe Ile Thr Thr Pro His Val Thr Val Ser Trp Asn Trp Thr Glu Lys 370 375 380 Lys Val Glu Ala Cys Thr Leu Thr Lys Trp Lys Glu Val Asp Glu Leu 385 390 395 400 Val Arg Asp Glu Phe Arg Gly Ser Tyr Arg Phe Thr Ile Arg Ser Ile 405 410 415 Ser Ser Thr Phe Ile Ser Asn Thr Thr 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Ala Arg Val Leu Gly Asp 625 630 635 640 Val Ile Ala Ile Thr His Cys Ala Lys Ile Glu Gly Asn Val Tyr Leu 645 650 655 Gln Asn Ser Met Arg Ser Met Asp Ser Asn Thr Cys Tyr Ser Arg Pro 660 665 670 Pro Val Thr Phe Thr Ile Thr Lys Asn Ala Asn Asn Arg Gly Ser Ile 675 680 685 Glu Gly Gln Leu Gly Glu Glu Asn Glu Ile Phe Thr Glu Arg Lys Leu 690 695 700 Ile Glu Pro Cys Ala Leu Asn Gln Lys Arg Tyr Phe Lys Phe Gly Lys 705 710 715 720 Glu Tyr Val Tyr Tyr Glu Asn Tyr Thr Phe Val Arg Lys Val Pro Pro 725 730 735 Thr Glu Ile Glu Val Ile Ser Thr Tyr Val Glu Leu Asn Leu Thr Leu 740 745 750 Leu Glu Asp Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Ala Glu 755 760 765 Leu Glu Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln Arg Arg Asn 770 775 780 Gln Leu His Ala Leu Arg Phe Tyr Asp Ile Asp Ser Val Val Asn Val 785 790 795 800 Asp Asn Thr Ala Val Ile Met Gln Gly Ile Ala Ser Phe Phe Lys Gly 805 810 815 Leu Gly Lys Val Gly Glu Ala Val Gly Thr Leu Val Leu Gly Ala Ala 820 825 830 Gly Ala Val Val Ser Thr Val Ser Gly Ile Ala Ser Phe Leu Asn Asn 835 840 845 Pro Phe Gly Gly Leu Ala Ile Gly Leu Leu Val Ile Ala Gly Leu Val 850 855 860 Ala Ala Phe Phe Ala Tyr Arg Tyr Val Met Gln Ile Arg Ser Asn Pro 865 870 875 880 Met Lys Ala Leu Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Ala Leu Lys Asn Lys Ala 885 890 895 Lys Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Glu Asp Asp Gly Ser Asp Phe Asp 900 905 910 Glu Ala Lys Leu Glu Glu Ala Arg Glu Met Ile Lys Tyr Met Ser Met 915 920 925 Val Ser Ala Leu Glu Lys Gln Glu Lys Lys Ala Ile Lys Lys Asn Ser 930 935 940 Gly Val Gly Leu Ile Ala Ser Asn Val Ser Lys Leu Ala Leu Arg Arg 945 950 955 960 Arg Gly Pro Lys Tyr Thr Arg Leu Gln Gln Asn Asp Thr Met Glu Asn 965 970 975 Glu Lys Met Val 980 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: CE4 <400> 14 gagaattcga gctcggtacc ggggatcctc tgagtcgacc tgcaggcatg caagcttgtt 60 <210> 15 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: CE5 <400> 15 aacaagcttg catgcctgca ggtcgactct tagaggatcc ccggtaccga gctcgaattc 60 tcgcga 66 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: FPCV1 <400> 16 cagtaataca cgttattgca gagaggacca ttctttattc tatacttaaa aagt 54 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: FPCV3 <400> 17 tagagtcgac ctgcaggcat ccaagcttgt taacgac 37 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MPSYN240 <400> 18 atccgttaag tttgtatcgt aatgtcctct ggttgccgtt ctgtc 45 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MPSYN241 <400> 19 atccgttaag tttgtatcgt aatgagtgtc ccagcagctg gctcctggat c 51 <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MPSYN243 <400> 20 atccgttaag tttgtatcgt aatggcatca tcgagggtgg gcacaatagt t 51 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MPSYN247 <400> 21 aaatttttgt taactcgagc tgca 24 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MPSYN248 <400> 22 gctcgagtta acaaaaattt 20 <210> 23 <211> 6402 <212> DNA <213> equine herpesvirus-1 gD, gp63, gE <220> <221> CDS <222> (971)..(2179) <220> <221> CDS <222> (2287)..(3528) <220> <221> CDS <222> (3796)..(5454) <400> 23 caggggtcgt cgggtagcct caggggggtc acacacaaca ccacacccag accgtttgac 60 tccttctcca gacgacacct atgacgatac aaatcaccta acggtaggaa caattcaata 120 gagatcgtgc ctcagctccc gccagaccga cccatcatag agctggggga ggcgactctc 180 agaaaaaact ttatggaggc gtcctgtact gtggagacta actcaggctt ggcgattttt 240 tggaaaatcg gcaagccaag cgtagacgcg tttaatcggg gaactactca tactcggctg 300 atgcgcaatg gggtaccggt ttacgccctc gtatctacgc ttagagttcc gtggttaaat 360 gttattccac taacaaaaat tacttgcgct gcttgcccca cgaatctagt cgccggcgat 420 ggggaggacc tcaactcatg taccaccaaa tcaaccacaa taccgtgtcc gggccaacag 480 cgcacccata tttttttctc tgcaaagggc acagggctgt gtgttatcac atcagaactg 540 gtgtcccagc ccacaataac ttggtcagtt ggatcagata ggttgcgtaa cgatggattt 600 tctcagacgt ggtatggaat acagcccggg gtgtgtggta tactgcgcag caggttcgca 660 ttcaccgcac cacctggcgc tttggatcaa catcaaagga ctatctctgt gaggtcagcg 720 catcggactc aaagacgagc gattacaaag tgctacccaa cgcccactca acttccaact 780 tcgctttagt ggctgcgacc acgctaacag tgacaatttt atgcctgctg tgctgcttgt 840 actgtatgtt aacccgcccc cgagcgtctg tatattaact caaaaattat cccttcgcct 900 ttacaaccag tggtggcgtg tatgcagaag cgtgccaccg ccctggtacg tgtttttcaa 960 taaacgaagc atg tct acc ttc aag ctt atg atg gat gga cgt ttg gtt 1009 Met Ser Thr Phe Lys Leu Met Met Asp Gly Arg Leu Val 1 5 10 ttt gcc atg gca atc gcg atc ttg agc gtt gtg ctc tct tgt gga aca 1057 Phe Ala Met Ala Ile Ala Ile Leu Ser Val Val Leu Ser Cys Gly Thr 15 20 25 tgc gag aaa gcc aag cgt gcg gtt cga gga cgc cag gat agg cca aag 1105 Cys Glu Lys Ala Lys Arg Ala Val Arg Gly Arg Gln Asp Arg Pro Lys 30 35 40 45 gag ttt cca cca ccc cgc tat aac tat aca att tta aca aga tac aac 1153 Glu Phe Pro Pro Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Ile Leu Thr Arg Tyr Asn 50 55 60 gcg act gcg cta gca tca ccg ttt att aac gac caa gta aaa aat gtt 1201 Ala Thr Ala Leu Ala Ser Pro Phe Ile Asn Asp Gln Val Lys Asn Val 65 70 75 gac ttg cgg att gtt act gct acg cgc cca tgt gaa atg ata gcg ctg 1249 Asp Leu Arg Ile Val Thr Ala Thr Arg Pro Cys Glu Met Ile Ala Leu 80 85 90 atc gct aag aca aac ata gac tca atc ctg aag gag ctg gcc gct gcc 1297 Ile Ala Lys Thr Asn Ile Asp Ser Ile Leu Lys Glu Leu Ala Ala Ala 95 100 105 caa aaa act tat tcc gcc aga ctc acc tgg ttt aaa att atg cca acg 1345 Gln Lys Thr Tyr Ser Ala Arg Leu Thr Trp Phe Lys Ile Met Pro Thr 110 115 120 125 tgt gca acg cct ata cac gat gtt agt tat atg aaa tgc aac ccg aag 1393 Cys Ala Thr Pro Ile His Asp Val Ser Tyr Met Lys Cys Asn Pro Lys 130 135 140 cta tca ttt gca atg tgt gat gag aga tca gac ata cta tgg caa gct 1441 Leu Ser Phe Ala Met Cys Asp Glu Arg Ser Asp Ile Leu Trp Gln Ala 145 150 155 agt tta att act atg gct gct gaa act gac gat gaa ctt gga ctt gta 1489 Ser Leu Ile Thr Met Ala Ala Glu Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Val 160 165 170 ctg gca gcc cct gca cat tct gcc tcg gga ctg tat cgc cgt gtt ata 1537 Leu Ala Ala Pro Ala His Ser Ala Ser Gly Leu Tyr Arg Arg Val Ile 175 180 185 gaa atc gac gga agg cga att tac acg gac ttt tct gta act att ccc 1585 Glu Ile Asp Gly Arg Arg Ile Tyr Thr Asp Phe Ser Val Thr Ile Pro 190 195 200 205 agt gaa cgg tgt ccg att gcc ttt gag caa aac ttt ggc aat ccg gat 1633 Ser Glu Arg Cys Pro Ile Ala Phe Glu Gln Asn Phe Gly Asn Pro Asp 210 215 220 cgg tgt aaa act cca gag cag tac tcg cgg gga gaa gtt ttt aca cgt 1681 Arg Cys Lys Thr Pro Glu Gln Tyr Ser Arg Gly Glu Val Phe Thr Arg 225 230 235 cgg ttt ctt ggt gaa ttc aac ttc cca caa gga gag cat atg aca tgg 1729 Arg Phe Leu Gly Glu Phe Asn Phe Pro Gln Gly Glu His Met Thr Trp 240 245 250 ttg aag ttc tgg ttc gtc tac gat ggt gga aac cta cca gtg cag ttt 1777 Leu Lys Phe Trp Phe Val Tyr Asp Gly Gly Asn Leu Pro Val Gln Phe 255 260 265 tat gaa gcc cag gca 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380 gca cag aac ggc ttg act cgc cta cgc tcg acc ttt aag gat gtt aaa 2161 Ala Gln Asn Gly Leu Thr Arg Leu Arg Ser Thr Phe Lys Asp Val Lys 385 390 395 tat acc cag ctt ccg taa acagtgttgc gtaacctgct gggaggtgtc 2209 Tyr Thr Gln Leu Pro 400 cacggcctta aagcttcgcg gtttggagat ataacgcaca acctacaaca aacgcgacac 2269 agcaagtagt agtcgct atg gcc aaa ctc act ggg atg ttc agc gct gcg 2319 Met Ala Lys Leu Thr Gly Met Phe Ser Ala Ala 405 410 ata tta ctg tct atg gct ata tgc tca acc gca atc ata tat cgc gga 2367 Ile Leu Leu Ser Met Ala Ile Cys Ser Thr Ala Ile Ile Tyr Arg Gly 415 420 425 430 gaa cat atg agc atg tac cta aac gcc agc tct gag ttt gcc gtg tac 2415 Glu His Met Ser Met Tyr Leu Asn Ala Ser Ser Glu Phe Ala Val Tyr 435 440 445 ccc act gat cag tcc ctt gtt ttg gtt ggc cac ttg ctc ttt ctc gac 2463 Pro Thr Asp Gln Ser Leu Val Leu Val Gly His Leu Leu Phe Leu Asp 450 455 460 gga caa cgc tta ccc acc acc aac tat agt ggg ctg atc gaa ttg att 2511 Gly Gln Arg Leu Pro Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Leu Ile Glu Leu Ile 465 470 475 cat tac aac tac tcc agc gtt tgc tac act gtt atc caa acg ata tcg 2559 His Tyr Asn Tyr Ser Ser Val Cys Tyr Thr Val Ile Gln Thr Ile Ser 480 485 490 tat gaa tca tgc ccg cgt gta gcc aac aat gct ttc aga tcg tgc ctc 2607 Tyr Glu Ser Cys Pro Arg Val Ala Asn Asn Ala Phe Arg Ser Cys Leu 495 500 505 510 cac aaa act tct aag cac tac cac gac tat ttc cga gtc aat gcc tct 2655 His Lys Thr Ser Lys His Tyr His Asp Tyr Phe Arg Val Asn Ala Ser 515 520 525 gtt gaa acc aac gtt ctc tta aac atc aca aag cca cag cct aca gat 2703 Val Glu Thr Asn Val Leu Leu Asn Ile Thr Lys Pro Gln Pro Thr Asp 530 535 540 tcc ggg gcg tat atc ctt cgc gta aaa ctt gac cac gcg cca acc gca 2751 Ser Gly Ala Tyr Ile Leu Arg Val Lys Leu Asp His Ala Pro Thr Ala 545 550 555 gat gtt ttt gga gtt tcc gcc ttt gtt tac gat cta aaa tct aaa acg 2799 Asp Val Phe Gly Val Ser Ala Phe Val Tyr Asp Leu Lys Ser Lys Thr 560 565 570 gtc ccc gat cca atg ccc acc aca caa acg gta gaa cct aca acg agc 2847 Val Pro Asp Pro Met Pro Thr Thr Gln Thr Val Glu Pro Thr Thr Ser 575 580 585 590 tat gtg tcg act ccc aca tac gac tat acc gat gac gta acc acc gaa 2895 Tyr Val Ser Thr Pro Thr Tyr Asp Tyr Thr Asp Asp Val Thr Thr Glu 595 600 605 act gaa tcc aca tca aca tct acc caa cag gcg atg acc tcc act caa 2943 Thr Glu Ser Thr Ser Thr Ser Thr Gln Gln Ala Met Thr Ser Thr Gln 610 615 620 acc cct agc gct aca tgg gga acc cag cta acc aca gag ctg ccg aca 2991 Thr Pro Ser Ala Thr Trp Gly Thr Gln Leu Thr Thr Glu Leu Pro Thr 625 630 635 aac gaa act gtg gtt att ggt cag gag gcc ctg tta tgc cat tgg ttc 3039 Asn Glu Thr Val Val Ile Gly Gln Glu Ala Leu Leu Cys His Trp Phe 640 645 650 cag cca tcg aca agg gtg ccg acc ctg tat ctg cat ctg ttg gga cgc 3087 Gln Pro Ser Thr Arg Val Pro Thr Leu Tyr Leu His Leu Leu Gly Arg 655 660 665 670 act ggc aat ctc ccg gaa gat gtt cta ctg gtc gaa gac tct gag ttt 3135 Thr Gly Asn Leu Pro Glu Asp Val Leu Leu Val Glu Asp Ser Glu Phe 675 680 685 ctt cgt acc aca tcg cct gca cat agg cct tct gca tca ccc gct gac 3183 Leu Arg Thr Thr Ser Pro Ala His Arg Pro Ser Ala Ser Pro Ala Asp 690 695 700 ggt gat gat ttt aaa cag aca aac tca act tcc ctt aag gcg cgc aac 3231 Gly Asp Asp Phe Lys Gln Thr Asn Ser Thr Ser Leu Lys Ala Arg Asn 705 710 715 aag atc gtc gca atg gtg gtt atc ccg acc gcg tgt gta cta atg ctc 3279 Lys Ile Val Ala Met Val Val Ile Pro Thr Ala Cys Val Leu Met Leu 720 725 730 ctg ttg gtg gtt gtc ggt gcc atc ata aac ggt gcc gtg cgc aaa cat 3327 Leu Leu Val Val Val Gly Ala Ile Ile Asn Gly Ala Val Arg Lys His 735 740 745 750 tta ttg agt tgc gca agc cgc agg atc tac cgc tcc gga cag ggg ggc 3375 Leu Leu Ser Cys Ala Ser Arg Arg Ile Tyr Arg Ser Gly Gln Gly Gly 755 760 765 gca tcg gcg gcc gaa cgg aga cgg ctg act tgc ggt cct act tta gcc 3423 Ala Ser Ala Ala Glu Arg Arg Arg Leu Thr Cys Gly Pro Thr Leu Ala 770 775 780 gcg tca tcg gag tcg ctg gcc gac gat aca acc gtc atc tac ctc caa 3471 Ala Ser Ser Glu Ser Leu Ala Asp Asp Thr Thr Val Ile Tyr Leu Gln 785 790 795 ccc cca aac ctt cga aga aaa cca agt tgg aga ccg atc cgc tta tgg 3519 Pro Pro Asn Leu Arg Arg Lys Pro Ser Trp Arg Pro Ile Arg Leu Trp 800 805 810 aac agc tga accggaaact ggaggccatc aaagaagaat catagttgtg 3568 Asn Ser 815 ggggtagatg gggttggtat taaagtttgt gtattatcga ttttatattt attaaaattt 3628 gtgaaacata aacatcttgt gcaatgttta cattatttgt gattgggacg gtccactggg 3688 aggtggtaca actcgggttt aaagctctgg atgtttggta ggaaactcac agttctccac 3748 tttggcgtca aagcaatcag acgtctaatt cgaagtagaa gctcaca atg gag ctg 3804 Met Glu Leu 820 ttg gcc gca agt cgc gct tgt ata ttt ttt ggg cta gta aca gta ctc 3852 Leu Ala Ala Ser Arg Ala Cys Ile Phe Phe Gly Leu Val Thr Val Leu 825 830 835 gat gcg tgg gga gtc caa caa gtt gaa ctt tcc gag ggg gct tgg gct 3900 Asp Ala Trp Gly Val Gln Gln Val Glu Leu Ser Glu Gly Ala Trp Ala 840 845 850 atg atc gac gga agg gac gtt tta acc cct act aac aca act act cgg 3948 Met Ile Asp Gly Arg Asp Val Leu Thr Pro Thr Asn Thr Thr Thr Arg 855 860 865 gtc aca aag gcc tgg acg ttt ttg gaa acc cct ccc ggt tgc gct ggc 3996 Val Thr Lys Ala Trp Thr Phe Leu Glu Thr Pro Pro Gly Cys Ala Gly 870 875 880 gac ata tca gtt aag aag gtg tgc gtg agc cat agt ctg tgc gaa gat 4044 Asp Ile Ser Val Lys Lys Val Cys Val Ser His Ser Leu Cys Glu Asp 885 890 895 900 aac att ata ata gga aag cac tgt aac ctc tta act ggg gaa cat ggc 4092 Asn Ile Ile Ile Gly Lys His Cys Asn Leu Leu Thr Gly Glu His Gly 905 910 915 att gcg ttg gcc gag ttt aac gta gta aac gga tcg ctg cgc aga aca 4140 Ile Ala Leu Ala Glu Phe Asn Val Val Asn Gly Ser Leu Arg Arg Thr 920 925 930 gac gat gtg tac ttt gtg aat ggt aca gtc ttt cca atc ctt gcc gaa 4188 Asp Asp Val Tyr Phe Val Asn Gly Thr Val Phe Pro Ile Leu Ala Glu 935 940 945 acc cgc agc gtc cta caa atc cat agg gca acc ccc tct atc gca ggg 4236 Thr Arg Ser Val Leu Gln Ile His Arg Ala Thr Pro Ser Ile Ala Gly 950 955 960 gtt tac acc ctc cac gtt tcc atc gac gga atg atg aaa cac tcc gtc 4284 Val Tyr Thr Leu His Val Ser Ile Asp Gly Met Met Lys His Ser Val 965 970 975 980 gtg ctg ctc acc gtc aag aag ccg ccc aaa caa ccg caa ccg caa cca 4332 Val Leu Leu Thr Val Lys 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gtg tat 4668 Ser Phe Thr Ser Pro Ile Arg Ala Thr Lys Ile Leu His Arg Val Tyr 1095 1100 1105 gga aac tgc agc gat cat gga aat tcg tgg cct tct agg tgc cat agc 4716 Gly Asn Cys Ser Asp His Gly Asn Ser Trp Pro Ser Arg Cys His Ser 1110 1115 1120 act ctg ctg ggc aat cgt cta tac ttt att caa cca gca cag aac aga 4764 Thr Leu Leu Gly Asn Arg Leu Tyr Phe Ile Gln Pro Ala Gln Asn Arg 1125 1130 1135 1140 gtg gac ctg ttg ttc aaa gac act ccc gcg tcg gct acc ggg ctg tat 4812 Val Asp Leu Leu Phe Lys Asp Thr Pro Ala Ser Ala Thr Gly Leu Tyr 1145 1150 1155 gtg ttt gta tta ttg tac aac gga cat ccg gag gcg tgg acg tat acg 4860 Val Phe Val Leu Leu Tyr Asn Gly His Pro Glu Ala Trp Thr Tyr Thr 1160 1165 1170 ctg ctg tca acc gca aat cac ttt atg aat gtg ctt act gac gtg acc 4908 Leu Leu Ser Thr Ala Asn His Phe Met Asn Val Leu Thr Asp Val Thr 1175 1180 1185 cgc cca cgg cta gga gag cac ttt tat acg gac ctc ggg cac aaa atc 4956 Arg Pro Arg Leu Gly Glu His Phe Tyr Thr Asp Leu Gly His Lys Ile 1190 1195 1200 atc act cct cat cca tct gta gct acc act gaa gag ttg gga gct tgg 5004 Ile Thr Pro His Pro Ser Val Ala Thr Thr Glu Glu Leu Gly Ala Trp 1205 1210 1215 1220 act cga cac tac ctc gcc ttt ttg ctg gtt att atc tgc acg tgc gcg 5052 Thr Arg His Tyr Leu Ala Phe Leu Leu Val Ile Ile Cys Thr Cys Ala 1225 1230 1235 gcg ctg cta gtt gca ttg gtg gtg tgg ggc tgt att ctc tac atc cga 5100 Ala Leu Leu Val Ala Leu Val Val Trp Gly Cys Ile Leu Tyr Ile Arg 1240 1245 1250 agc aac cgt aag ccg tat gaa gtg ctg aac ccc ttt gaa acg gtt tac 5148 Ser Asn Arg Lys Pro Tyr Glu Val Leu Asn Pro Phe Glu Thr Val Tyr 1255 1260 1265 acg agc gtt cca agc aac gac ccc tcg gac gag gtc ttg gtg ttt gag 5196 Thr Ser Val Pro Ser Asn Asp Pro Ser Asp Glu Val Leu Val Phe Glu 1270 1275 1280 cgc cta gct tcg gac tct gac gac tcc ttc gac tct gat tca gac gaa 5244 Arg Leu Ala Ser Asp Ser Asp Asp Ser Phe Asp Ser Asp Ser Asp Glu 1285 1290 1295 1300 gag ttg gaa tac cca cca cct ccc aaa cca gct cca cag ctc cca cca 5292 Glu Leu Glu Tyr Pro Pro Pro Pro Lys Pro Ala Pro 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acattaaccc ctgtaaacat ccgtttgtct actgtgtatg atagagttaa acccaaccct 5904 agagagttat gtatttaatc ccctgggacc ccgcggaagt catatatccc tcggccccct 5964 catttgggcg cacattgcct gcccggcggc agtcttactc ccttagctcg ccctcttgca 6024 taagataaac tattcccctc ccagctagtt tcacccacca gattaagcga ggttttccct 6084 ctcagcgatc acttttcacc accgaagaac aggccctcat cggtttccct ccgtgttttc 6144 ccatccatct atccaaccac tacattttca tggagaaggc ggaggctgcc gcagttgtta 6204 tacccctgtc agtttccaac cccagctacc gtggaagcgg tatgtccgac caagaagtaa 6264 gcgaagaaca atctgctgga gatgcctggg tgtctgcagc aatggcagcg cagaggcggt 6324 ggctcgtgcc gctacctcca ccggaattga taacactaac gactacacgt acaccgctgc 6384 ttctgagaat ggggatcc 6402 <210> 24 <211> 402 <212> PRT <213> equine herpesvirus-1 gD, gp63, gE <400> 24 Met Ser Thr Phe Lys Leu Met Met Asp Gly Arg Leu Val Phe Ala Met 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ile Leu Ser Val Val Leu Ser Cys Gly Thr Cys Glu Lys 20 25 30 Ala Lys Arg Ala Val Arg Gly Arg Gln Asp Arg Pro Lys Glu Phe Pro 35 40 45 Pro Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Ile Leu 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Thr Pro Ala Pro Ala Ser Pro Glu Ala Gly Ala Val 50 55 60 Ser Thr Pro Pro Val Pro Pro Pro Ser Val Ser Arg Arg Lys Pro Pro 65 70 75 80 Arg Asn Asn Asn Arg Thr Arg Val His Gly Asp Lys Ala Thr Ala His 85 90 95 Gly Arg Lys Arg Ile Val Cys Arg Glu Arg Leu Phe Ser Ala Arg Val 100 105 110 Gly Asp Ala Val Ser Phe Gly Cys Ala Val Phe Pro Arg Ala Gly Glu 115 120 125 Thr Phe Glu Val Arg Phe Tyr Arg Arg Gly Arg Phe Arg Ser Pro Asp 130 135 140 Ala Asp Pro Glu Tyr Phe Asp Glu Pro Pro Arg Pro Glu Leu Pro Arg 145 150 155 160 Glu Arg Leu Leu Phe Ser Ser Ala Asn Ala Ser Leu Ala His Ala Asp 165 170 175 Ala Leu Ala Pro Val Val Val Glu Gly Glu Arg Ala Thr Val Ala Asn 180 185 190 Val Ser Gly Glu Val Ser Val Arg Val Ala Ala Ala Asp Ala Glu Thr 195 200 205 Glu Gly Val Tyr Thr Trp Arg Val Leu Ser Ala Asn Gly Thr Glu Val 210 215 220 Arg Ser Ala Asn Val Ser Leu Leu Leu Tyr Ser Gln Pro Glu Phe Gly 225 230 235 240 Leu Ser Ala Pro Pro Val Leu Phe Gly Glu Pro Phe Arg Ala Val Cys 245 250 255 Val Val Arg Asp Tyr Tyr Pro Arg Arg Ser Val Arg Leu Arg Trp Phe 260 265 270 Ala Asp Glu His Pro Val Asp Ala Ala Phe Val Thr Asn Ser Thr Val 275 280 285 Ala Asp Glu Leu Gly Arg Arg Thr Arg Val Ser Val Val Asn Val Thr 290 295 300 Arg Ala Asp Val Pro Gly Leu Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp Ala Leu 305 310 315 320 Ala Pro Ser Leu Arg Cys Glu Ala Val Trp Tyr Arg Asp Ser Val Ala 325 330 335 Ser Gln Arg Phe Ser Glu Ala Leu Arg Pro His Val Tyr His Pro Ala 340 345 350 Ala Val Ser Val Arg Phe Val Glu Gly Phe Ala Val Cys Asp Gly Leu 355 360 365 Cys Val Pro Pro Glu Ala Arg Leu Ala Trp Ser Asp His Ala Ala Asp 370 375 380 Thr Val Tyr His Leu Gly Ala Cys Ala Glu His Pro Gly Leu Leu Asn 385 390 395 400 Val Arg Ser Ala Arg Pro Leu Ser Asp Leu Asp Gly Pro Val Asp Tyr 405 410 415 Thr Cys Arg Leu Glu Gly Leu Pro Ser Gln Leu Pro Val Phe Glu Asp 420 425 430 Thr Gln Arg Tyr Asp Ala Ser Pro Ala Ser Val Ser Trp Pro Val Val 435 440 445 Ser Ser Met Ile Val Val Ile Ala Gly Ile Gly Ile Leu Ala Ile Val 450 455 460 Leu Val Ile Met Ala Thr Cys Val Tyr Tyr Arg Gln Ala Gly Pro 465 470 475 <210> 33 <211> 1449 <212> DNA <213> pseudorabies virus gp50 <220> <221> CDS <222> (189)..(1403) <400> 33 tgacccggcc ccgcccgact cccccgcgat tccccccctc tctcaccggg tgtccatctt 60 caataaagta tgtctcaaac acctaatttg cgtacggcct tgcttacggg ggggggtgcg 120 atccacgccc agcggtccat aaaattgggt tggcgcccca ggttcccata cactcacctg 180 ccagcgcc atg ctg ctc gca gcg cta ttg gcg gcg ctg gtc gcc cgg acg 230 Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr 1 5 10 acg ctc ggc gcg gac gtg gac gcc gtg ccc gcg ccg acc ttc ccc ccg 278 Thr Leu Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro 15 20 25 30 ccc gcg tac ccg tac acc gag tcg tgg cag ctg acg ctg acg acg gtc 326 Pro Ala Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val 35 40 45 ccc tcg ccc ttc gtc ggc ccc gcg gac gtc tac cac acg cgc ccg ctg 374 Pro Ser Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu 50 55 60 gag gac ccg tgc ggg gtg gtg gcg ctg atc tcc gac ccg cag gtg gac 422 Glu Asp Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp 65 70 75 cgg ctg ctg aac gag gcg gtg gcc cac cgg cgg ccc acg tac cgc gcc 470 Arg Leu Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala 80 85 90 cac gtg gcc tgg tac cgc atc gcg gac ggg tgc gcg cac ctg ctg tac 518 His Val Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr 95 100 105 110 ttt atc gag tac gcc gac tgc gac ccc agg cag atc ttt ggg cgc tgc 566 Phe Ile Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Ile Phe Gly Arg Cys 115 120 125 cgg cgc cgc acc acg ccg atg tgg tgg acc ccg tcc gcg gac tac atg 614 Arg Arg Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met 130 135 140 ttc ccc acg gag gac gag ctg ggg ctg ctc atg gtg gcc ccc ggg cgg 662 Phe Pro Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg 145 150 155 ttc aac gag ggc cag tac cgg cgc ctg gtg tcc gtc gac ggc gtg aac 710 Phe Asn Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn 160 165 170 atc ctc acc gac ttc atg gtg gcg ctc ccc gag ggg caa gag tgc ccg 758 Ile Leu Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro 175 180 185 190 ttc gcc cgc gtg gac cag cac cgc acg tac aag ttc ggc gcg tgc tgg 806 Phe Ala Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp 195 200 205 agc gac gac agc ttc aag cgg ggc gtg gac gtg atg cga ttc ctg acg 854 Ser Asp Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr 210 215 220 ccg ttc tac cag cag ccc ccg cac cgg gag gtg gtg aac tac tgg tac 902 Pro Phe Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr 225 230 235 cgc aag aac ggc tgg acg ctc ccg cgg gcc tac gcc gcc gcc acg ccg 950 Arg Lys Asn Gly Trp Thr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Pro 240 245 250 tac gcc atc gac ccc gcg cgg ccc tcg gcg ggc tcg ccg agg ccc cgg 998 Tyr Ala Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg 255 260 265 270 ccc cgg ccc cgg ccc cgg ccc cgg ccc cgg ccg aag ccc gag ccc gcc 1046 Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala 275 280 285 ccg gcg acg ccc gcg ccc ccc gac cgc ctg ccc gag ccg gcg acg cgg 1094 Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg 290 295 300 gac cac gcc gcc ggg ggc cgc ccc acg ccg cga ccc ccg agg ccc gag 1142 Asp His Ala Ala Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu 305 310 315 acg ccg cac cgc ccc ttc gcc ccg ccg gcc gtc gtg ccc agc ggg tgg 1190 Thr Pro His Arg Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp 320 325 330 ccg cag ccc gcg gag ccg ttc cag ccg cgg acc ccc gcc gcg ccg ggc 1238 Pro Gln Pro Ala Glu Pro Phe Gln Pro Arg Thr Pro Ala Ala Pro Gly 335 340 345 350 gtc tcg cgc cac cgc tcg gtg atc gtc ggc acg ggc acc gcg atg ggc 1286 Val Ser Arg His Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly 355 360 365 gcg ctc ctg gtg ggc gtg tgc gtc tac atc ttc ttc cgc ctg agg ggg 1334 Ala Leu Leu Val Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg Gly 370 375 380 gcg aag ggg tat cgc ctc ctg ggc ggt ccc gcg gac gcc gac gag cta 1382 Ala Lys Gly Tyr Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu 385 390 395 aaa gcg cag ccc ggt ccg tag cctccgcagt 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Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala 180 185 190 Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp 195 200 205 Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe 210 215 220 Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys 225 230 235 240 Asn Gly Trp Thr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala 245 250 255 Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg 260 265 270 Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala 275 280 285 Thr Pro Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His 290 295 300 Ala Ala Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro 305 310 315 320 His Arg Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln 325 330 335 Pro Ala Glu Pro Phe Gln Pro Arg Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Ser 340 345 350 Arg His Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly Ala Leu 355 360 365 Leu Val Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg Gly Ala Lys 370 375 380 Gly Tyr Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu Lys Ala 385 390 395 400 Gln Pro Gly Pro <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN1 5'-3' <400> 35 gatccattcc atggttg 17 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN2 3'-5' <400> 36 gtaaggtacc aacgatc 17 <210> 37 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN3 5'-3' <400> 37 agcttgatat ccgttaagtt tgtatcgtaa tgcccgctgg tggcggtctt tggcgcgggc 60 c 61 <210> 38 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN4 3'-5' <400> 38 actataggca attcaaacat agcattacgg gcgaccaccg ccagaaaccg cgc 53 <210> 39 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN7 5'-3' <400> 39 cccagatctc cttg 14 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN8 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Artificial Sequence: MRSYN6 5'-3' <400> 46 ggggggacgc gcgggtctag aaggccccgc ctggcgg 37 <210> 47 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN12 5'-3' <400> 47 ggttcccata cactcaatgc atttaatcat gctgctcgca gcgc 44 <210> 48 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MRSYN13 5'-3' <400> 48 gcagcccggt ccgtagaatt tttatagatc tcgtcgatga tgatggt 47 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 22mer 5'-3' <400> 49 cgattactat gaaggatccg tt 22 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 20mer 3'-5' <400> 50 taatgatact tcctaggcaa 20 <210> 51 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 42mer 5'-3' <400> 51 cgattactag atctgagctc cccgggctcg aggggatccg tt 42 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 40mer 3'-5' <400> 52 taatgatcta gactcgaggg gcccgagctc ccctaggcaa 40 <210> 53 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PRVL5 5'-3' <400> 53 atccgttaag tttgtatcgt aatgcggccc tttctgctgc gcgccgcgca gctc 54 <210> 54 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PRVL6 5'-3' <400> 54 ctgcgcggcg cgcagcagaa agggccgcat tacgatacaa acttaacgga t 51 <210> 55 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PRVL3 5'-3' <400> 55 ctggttccgc gatccggaga aaccggaagt gacgaatggg cccaactatg gcgtgaccgc 60 cagccgcctg ttgaatgccc gccccgctta actgcagaat tcggatccga gct 113 <210> 56 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PRVL4 5'-3' <400> 56 cggatccgaa ttctgcagtt aagcggggcg ggcattcaac aggcggctgg cggtcacgcc 60 atagttgggc ccattcgtca cttccggttt ctccggatcg cggaaccaga cgt 113 <210> 57 <211> 7 <212> DNA 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ccgtccaagg gccattacga tacaaactta acggat 56 <210> 63 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: GCL3 5'-3' <400> 63 ctagggcc 8 <210> 64 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: GDL1 5'-3' <400> 64 atccgttaac tttgtatcgt aatggggcgt ttgacctccg g 41 <210> 65 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: GDL2 5'-3' <400> 65 cgccggaggt caaacgcccc attacgatac aaacttaacg gat 43 <210> 66 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: GDL3 5'-3' <400> 66 ggcagtaccc tggcggcgct ggtcatcggc ggtattcgct tttgggtacg ccgccggcgc 60 tcagtggccc ccaagcgcct acgtctcccc cacatccggg atgacgacgc gcccccctcg 120 caccagccat tgttttacta gctgca 146 <210> 67 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: GDL4 5'-3' <400> 67 gctagtaaaa caatggctgg tgcgaggggg gcgcgtcgtc atcccggatg tgggggagac 60 gtaggcgctt gggggccact gagcgccggc ggcgtaccca aaacgcaata ccgccgatga 120 ccagcgccgc cagggtactg cc 142 <210> 68 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: IBRL1 5'-3' <400> 68 atccgttaag tttgtatcgt aatggccgct cgcggcggtg ctgaacgcgc cgc 53 <210> 69 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: IBRL2 5'-3' <400> 69 ggcgcgttca gcaccgccgc gagcggccat tacgatacaa acttaacgga t 51 <210> 70 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: IBRL5 5'-3' <400> 70 catggtttaa gatctc 16 <210> 71 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: IBRL6 5'-3' <400> 71 catggagatc ttaaac 16 <210> 72 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: IBRL7 5'-3' <400> 72 atccgttaag tttgtatcgt aatggccgcg ctagccgctg ccctgctatg ggcgacgtgg 60 gcc 63 <210> 73 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: IBRL8 5'-3' <400> 73 cacgtcgccc atagcagggc agcggctagc gcggccatta cgatacaaac ttaacggat 59 <210> 74 <211> 3400 <212> DNA <213> feline herpesvirus-1 gB <220> <221> CDS <222> (337)..(3180) <400> 74 ccccccaaca cagcgtttta tttcagtgtt gagaacgttg gtctgcttcc acatttaaaa 60 gaagaattgg cgggatttat gttaacgtcc acccggggtg ggtggacggt gagtaaattt 120 caaagatttt actatttcgg tgatgatacg tctggcgtca caacaactca gcggttggct 180 tggaaatata tccgtgagct cattctagca tctgccatat tttcctccgt gtttcactgc 240 ggtgaggtga agtctgtacg catctgatcg cacacgaccg gctaatacag gtacccagat 300 cagcccaccc ggcatttatc taacatacga agaatc atg tcc act cgt ggc gat 354 Met Ser Thr Arg Gly Asp 1 5 ctt ggg aag cgg cga cga ggg agt cgt tgg cag gga cac agt ggc tat 402 Leu Gly Lys Arg Arg Arg Gly Ser Arg Trp Gln Gly His Ser Gly Tyr 10 15 20 ttt cga cag aga tgt ttt ttc cct tct cta ctc ggt att gca gcg act 450 Phe Arg Gln Arg Cys Phe Phe Pro Ser Leu Leu Gly Ile Ala Ala Thr 25 30 35 ggc tcc aga cat ggt aac gga tcg tcg gga tta acc aga cta gct aga 498 Gly Ser Arg His Gly Asn Gly Ser Ser Gly Leu Thr Arg Leu Ala Arg 40 45 50 tat gtt tca ttt atc tgg atc gta cta ttc tta gtc ggt ccc cgt cca 546 Tyr Val Ser Phe Ile Trp Ile Val Leu Phe Leu Val Gly Pro Arg Pro 55 60 65 70 gta gag ggt caa tct gga agc aca tcg gaa caa ccc cgg cgg act gta 594 Val Glu Gly Gln Ser Gly Ser Thr Ser Glu Gln Pro Arg Arg Thr Val 75 80 85 gct acc cct gag gta ggg ggt aca cca cca aaa cca act aca gat ccc 642 Ala Thr Pro Glu Val Gly Gly Thr Pro Pro Lys Pro Thr Thr Asp Pro 90 95 100 acc gat atg tcg gat atg agg gaa gct ctc cgt gcg tcc caa ata gag 690 Thr Asp Met Ser Asp Met Arg Glu Ala Leu Arg Ala Ser Gln Ile Glu 105 110 115 gct aac gga cca tcg act ttt tat atg tgt cca cca cct tca gga tct 738 Ala Asn Gly Pro Ser Thr Phe Tyr Met Cys Pro Pro Pro Ser Gly Ser 120 125 130 act gtc gtg cgt tta gag cca cca cgg gcc tgt cca gat tat aaa cta 786 Thr Val Val Arg Leu Glu Pro Pro Arg Ala Cys Pro Asp Tyr Lys Leu 135 140 145 150 ggg aaa aat ttt acc gag ggt ata gct gta ata ttt aaa gaa aat ata 834 Gly Lys Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val Ile Phe Lys Glu Asn Ile 155 160 165 gcg cca tat aaa ttc aag gca aat ata tac tat aaa aac att att atg 882 Ala Pro Tyr Lys Phe Lys Ala Asn Ile Tyr Tyr Lys Asn Ile Ile Met 170 175 180 aca acg gta tgg tct ggg agt tcc tat gcc gtt aca acc aac cga tat 930 Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Ser Tyr Ala Val Thr Thr Asn Arg Tyr 185 190 195 aca gac agg gtt ccc gtg aaa gtt caa gag att aca gat ctc ata gat 978 Thr Asp Arg Val Pro Val Lys Val Gln Glu Ile Thr Asp Leu Ile Asp 200 205 210 aga cgg ggt atg tgc ctc tcg aaa gct gat tac gtt cgt aac aat tat 1026 Arg Arg Gly Met Cys Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Val Arg Asn Asn Tyr 215 220 225 230 caa ttt acg gcc ttt gat cga gac gag gat ccc aga gaa ctg cct ctg 1074 Gln Phe Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asp Pro Arg Glu Leu Pro Leu 235 240 245 aaa ccc tcc aag ttc aac act cca gag tcc cgt gga tgg cac acc acc 1122 Lys Pro Ser Lys Phe Asn Thr Pro Glu Ser Arg Gly Trp His Thr Thr 250 255 260 aat gaa aca tac aca aag atc ggt gct gct gga ttt cac cac tct ggg 1170 Asn Glu Thr Tyr Thr Lys Ile Gly Ala Ala Gly Phe His His Ser Gly 2
65 270 275 acc tct gta aat tgc atc gta gag gaa gtg gat gca aga tct gta tat 1218 Thr Ser Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr 280 285 290 cca tat gac tca ttt gct atc tcc act ggt gac gtg att cac atg tct 1266 Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile His Met Ser 295 300 305 310 cca ttc ttt ggg ctg agg gat gga gcc cat gta gaa cat act agt tat 1314 Pro Phe Phe Gly Leu Arg Asp Gly Ala His Val Glu His Thr Ser Tyr 315 320 325 tct tca gac aga ttt caa caa atc gag gga tac tat cca ata gac ttg 1362 Ser Ser Asp Arg Phe Gln Gln Ile Glu Gly Tyr Tyr Pro Ile Asp Leu 330 335 340 gat acg cga tta caa ctg ggg gca cca gtt tct cgc aat ttt ttg gaa 1410 Asp Thr Arg Leu Gln Leu Gly Ala Pro Val Ser Arg Asn Phe Leu Glu 345 350 355 act ccg cat gtg aca gtg gcc tgg aac tgg acc cca aag tct ggt cgg 1458 Thr Pro His Val Thr Val Ala Trp Asn Trp Thr Pro Lys Ser Gly Arg 360 365 370 gta tgt acc tta gcc aaa tgg agg gaa ata gat gaa atg cta cgc gat 1506 Val Cys Thr Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ile Asp Glu Met Leu Arg Asp 375 380 385 390 gaa tat cag ggc tcc tat aga ttt aca gcc aag acc ata tcc gct act 1554 Glu Tyr Gln Gly Ser Tyr Arg Phe Thr Ala Lys Thr Ile Ser Ala Thr 395 400 405 ttc atc tcc aat act tca caa ttt gaa atc aat cgt atc cgt ttg ggg 1602 Phe Ile Ser Asn Thr Ser Gln Phe Glu Ile Asn Arg Ile Arg Leu Gly 410 415 420 gac tgt gcc acc aag gag gca gcc gaa gcc ata gac cgg att tat aag 1650 Asp Cys Ala Thr Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ile Asp Arg Ile Tyr Lys 425 430 435 agt aaa tat agt aaa act cat att cag act gga acc ctg gag acc tac 1698 Ser Lys Tyr Ser Lys Thr His Ile Gln Thr Gly Thr Leu Glu Thr Tyr 440 445 450 cta gcc cgt ggg gga ttt cta ata gct ttc cgt ccc atg atc agc aac 1746 Leu Ala Arg Gly Gly Phe Leu Ile Ala Phe Arg Pro Met Ile Ser Asn 455 460 465 470 gaa cta gca aag tta tat atc aat gaa tta gca cgt tcc aat cgc acg 1794 Glu Leu Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Glu Leu Ala Arg Ser Asn Arg Thr 475 480 485 gta gat ctc agt gca ctc ctc aat cca tct ggg gaa aca gta caa cga 1842 Val Asp Leu Ser Ala Leu Leu Asn Pro Ser Gly Glu Thr Val Gln Arg 490 495 500 act aga aga tcg gtc cca tct aat caa cat cat agg tcg cgg cgc agc 1890 Thr Arg Arg Ser Val Pro Ser Asn Gln His His Arg Ser Arg Arg Ser 505 510 515 aca ata gag ggg ggt ata gaa acc gtg aac aat gca tca ctc ctc aag 1938 Thr Ile Glu Gly Gly Ile Glu Thr Val Asn Asn Ala Ser Leu Leu Lys 520 525 530 acc acc tca tct gtg gaa ttc gca atg cta caa ttt gcc tat gac tac 1986 Thr Thr Ser Ser Val Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Ala Tyr Asp Tyr 535 540 545 550 ata caa gcc cat gta aat gaa atg ttg agt cgg ata gcc act gcc tgg 2034 Ile Gln Ala His Val Asn Glu Met Leu Ser Arg Ile Ala Thr Ala Trp 555 560 565 tgt aca ctt cag aac cgc gaa cat gtg ctg tgg aca gag acc cta aaa 2082 Cys Thr Leu Gln Asn Arg Glu His Val Leu Trp Thr Glu Thr Leu Lys 570 575 580 ctc aat ccc ggt ggg gtg gtc tcg atg gcc cta gaa cgt cgt gta tcc 2130 Leu Asn Pro Gly Gly Val Val Ser Met Ala Leu Glu Arg Arg Val Ser 585 590 595 gcg cgc cta ctt gga gat gcc gtc gcc gta aca caa tgt gtt aac att 2178 Ala Arg Leu Leu Gly Asp Ala Val Ala Val Thr Gln Cys Val Asn Ile 600 605 610 tct agc gga cat gtc tat atc caa aat tct atg cgg gtg acg ggt tca 2226 Ser Ser Gly His Val Tyr Ile Gln Asn Ser Met Arg Val Thr Gly Ser 615 620 625 630 tca acg aca tgt tac agc cgc cct ctt gtt tcc ttc cgt gcc ctc aat 2274 Ser Thr Thr Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Ala Leu Asn 635 640 645 gac tcc gaa tac ata gaa gga caa cta ggg gaa aac aat gaa ctt ctc 2322 Asp Ser Glu Tyr Ile Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Leu 650 655 660 gtg gaa cga aaa cta att gag cct tgc act gtc aat aat aag cgg tat 2370 Val Glu Arg Lys Leu Ile Glu Pro Cys Thr Val Asn Asn Lys Arg Tyr 665 670 675 ttt aag ttt ggg gca gat tat gta tat ttt gag gat tat gcg tat gtc 2418 Phe Lys Phe Gly Ala Asp Tyr Val Tyr Phe Glu Asp Tyr Ala Tyr Val 680 685 690 cgt aaa gtc ccg cta tcg gag ata gaa ctg ata agt gcg tat gtg aat 2466 Arg Lys Val Pro Leu Ser Glu Ile Glu Leu Ile Ser Ala Tyr Val Asn 695 700 705 710 tta aat ctt act ctc cta gag gat cgt gaa ttt ctc cca ctc gaa gtt 2514 Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val 715 720 725 tat aca cga gct gag ctg gaa gat acc ggc ctt ttg gac tac agc gag 2562 Tyr Thr Arg Ala Glu Leu Glu Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu 730 735 740 att caa cgc cgc aac caa ctc cac gcc tta aaa ttt tat gat ata gac 2610 Ile Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Ala Leu Lys Phe Tyr Asp Ile Asp 745 750 755 agc ata gtc aga gtg gat aat aat ctt gtc atc atg cgt ggt atg gca 2658 Ser Ile Val Arg Val Asp Asn Asn Leu Val Ile Met Arg Gly Met Ala 760 765 770 aat ttt ttt cag gga ctc ggg gat gtg ggg gct ggt ttc ggc aag gtg 2706 Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly Asp Val Gly Ala Gly Phe Gly Lys Val 775 780 785 790 gtc tta ggg gct gcg agt gcg gta atc tca aca gta tca ggc gta tca 2754 Val Leu Gly Ala Ala Ser Ala Val Ile Ser Thr Val Ser Gly Val Ser 795 800 805 tca ttt cta aac aac cca ttt gga gca ttg gcc gtg gga ctg tta ata 2802 Ser Phe Leu Asn Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val Gly Leu Leu Ile 810 815 820 tta gct ggc atc gtc gca gca ttc ctg gca tat cgc tat ata tct aga 2850 Leu Ala Gly Ile Val Ala Ala Phe Leu Ala Tyr Arg Tyr Ile Ser Arg 825 830 835 tta cgt gca aat cca atg aaa gcc tta tat cct gtg acg act agg aat 2898 Leu Arg Ala Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Val Thr Thr Arg Asn 840 845 850 ttg aaa cag acg cta aga gcc cgc tca acg gct ggt ggg gat agc gac 2946 Leu Lys Gln Thr Leu Arg Ala Arg Ser Thr Ala Gly Gly Asp Ser Asp 855 860 865 870 ccg gga gtc gat gac ttc gat gag gaa aag cta atg cag gca agg gag 2994 Pro Gly Val Asp Asp Phe Asp Glu Glu Lys Leu Met Gln Ala Arg Glu 875 880 885 atg ata aaa tat atg tcc ctc gta tcg gct atg gag caa caa gaa cat 3042 Met Ile Lys Tyr Met Ser Leu Val Ser Ala Met Glu Gln Gln Glu His 890 895 900 aag gcg atg aaa aag aat aag ggc cca gcg atc cta acg agt cat ctc 3090 Lys Ala Met Lys Lys Asn Lys Gly Pro Ala Ile Leu Thr Ser His Leu 905 910 915 act aac atg gcc ctc cgt cgc cgt gga cct aaa tac caa cgc ctc aat 3138 Thr Asn Met Ala Leu Arg Arg Arg Gly Pro Lys Tyr Gln Arg Leu Asn 920 925 930 aat ctt gat agc ggt gat gat act gaa aca aat ctt gtc taa 3180 Asn Leu Asp Ser Gly Asp Asp Thr Glu Thr Asn Leu Val 935 940 945 ccaaccagac catctctaaa tttttatcca caaaaaaagt tagagataat aaattttgaa 3240 gctcaaaaat atcctgtaat gtcatcattc tccgcccatt cacgtcacgg tctctttaaa 3300 ataaccggtt ttgagggtta ggtacacatt tctctcgcgc cggatcaatc caacacagga 3360 aggctaacac tttttccatc gataacatat catggagctc 3400 <210> 75 <211> 947 <212> PRT <213> feline herpesvirus-1 gB <400> 75 Met Ser Thr Arg Gly Asp Leu Gly Lys Arg Arg Arg Gly Ser Arg Trp 1 5 10 15 Gln Gly His Ser Gly Tyr Phe Arg Gln Arg Cys Phe Phe Pro Ser Leu 20 25 30 Leu Gly Ile Ala Ala Thr Gly Ser Arg His Gly Asn Gly Ser Ser Gly 35 40 45 Leu Thr Arg Leu Ala Arg Tyr Val Ser Phe Ile Trp Ile Val Leu Phe 50 55 60 Leu Val Gly Pro Arg Pro Val Glu Gly Gln Ser Gly Ser Thr Ser Glu 65 70 75 80 Gln Pro Arg Arg Thr Val Ala Thr Pro Glu Val Gly Gly Thr Pro Pro 85 90 95 Lys Pro Thr Thr Asp Pro Thr Asp Met Ser Asp Met Arg Glu Ala Leu 100 105 110 Arg Ala Ser Gln Ile Glu Ala Asn Gly Pro Ser Thr Phe Tyr Met Cys 115 120 125 Pro Pro Pro Ser Gly Ser Thr Val Val Arg Leu Glu Pro Pro Arg Ala 130 135 140 Cys Pro Asp Tyr Lys Leu Gly Lys Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val 145 150 155 160 Ile Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe Lys Ala Asn Ile Tyr 165 170 175 Tyr Lys Asn Ile Ile Met Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Ser Tyr Ala 180 185 190 Val Thr Thr Asn Arg Tyr Thr Asp Arg Val Pro Val Lys Val Gln Glu 195 200 205 Ile Thr Asp Leu Ile Asp Arg Arg Gly Met Cys Leu Ser Lys Ala Asp 210 215 220 Tyr Val Arg Asn Asn Tyr Gln Phe Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asp 225 230 235 240 Pro Arg Glu Leu Pro Leu Lys Pro Ser Lys Phe Asn Thr Pro Glu Ser 245 250 255 Arg Gly Trp His Thr Thr Asn Glu Thr Tyr Thr Lys Ile Gly Ala Ala 260 265 270 Gly Phe His His Ser Gly Thr Ser Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val 275 280 285 Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Ile Ser Thr Gly 290 295 300 Asp Val Ile His Met Ser Pro Phe Phe Gly Leu Arg Asp Gly Ala His 305 310 315 320 Val Glu His Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Arg Phe Gln Gln Ile Glu Gly 325 330 335 Tyr Tyr Pro Ile Asp Leu Asp Thr Arg Leu Gln Leu Gly Ala Pro Val 340 345 350 Ser Arg Asn Phe Leu Glu Thr Pro His Val Thr Val Ala Trp Asn Trp 355 360 365 Thr Pro Lys Ser Gly Arg Val Cys Thr Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ile 370 375 380 Asp Glu Met Leu Arg Asp Glu Tyr Gln Gly Ser Tyr Arg Phe Thr Ala 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ser Ala Thr Phe Ile Ser Asn Thr Ser Gln Phe Glu Ile 405 410 415 Asn Arg Ile Arg Leu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Glu Ala Ala Glu Ala 420 425 430 Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Ser Lys Tyr Ser Lys Thr His Ile Gln Thr 435 440 445 Gly Thr Leu Glu Thr Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Leu Ile Ala Phe 450 455 460 Arg Pro Met Ile Ser Asn Glu Leu Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Glu Leu 465 470 475 480 Ala Arg Ser Asn Arg Thr Val Asp Leu Ser Ala Leu Leu Asn Pro Ser 485 490 495 Gly Glu Thr Val Gln Arg Thr Arg Arg Ser Val Pro Ser Asn Gln His 500 505 510 His Arg Ser Arg Arg Ser Thr Ile Glu Gly Gly Ile Glu Thr Val Asn 515 520 525 Asn Ala Ser Leu Leu Lys Thr Thr Ser Ser Val Glu Phe Ala Met Leu 530 535 540 Gln Phe Ala Tyr Asp Tyr Ile Gln Ala His Val Asn Glu Met Leu Ser 545 550 555 560 Arg Ile Ala Thr Ala Trp Cys Thr Leu Gln Asn Arg Glu His Val Leu 565 570 575 Trp Thr Glu Thr Leu Lys Leu Asn Pro Gly Gly Val Val Ser Met Ala 580 585 590 Leu Glu Arg Arg Val Ser Ala Arg Leu Leu Gly Asp Ala Val Ala Val 595 600 605 Thr Gln Cys Val Asn Ile Ser Ser Gly His Val Tyr Ile Gln Asn Ser 610 615 620 Met Arg Val Thr Gly Ser Ser Thr Thr Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val 625 630 635 640 Ser Phe Arg Ala Leu Asn Asp Ser Glu Tyr Ile Glu Gly Gln Leu Gly 645 650 655 Glu Asn Asn Glu Leu Leu Val Glu Arg Lys Leu Ile Glu Pro Cys Thr 660 665 670 Val Asn Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Phe Gly Ala Asp Tyr Val Tyr Phe 675 680 685 Glu Asp Tyr Ala Tyr Val Arg Lys Val Pro Leu Ser Glu Ile Glu Leu 690 695 700 Ile Ser Ala Tyr Val Asn Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp Arg Glu 705 710 715 720 Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Ala Glu Leu Glu Asp Thr Gly 725 730 735 Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Ala Leu 740 745 750 Lys Phe Tyr Asp Ile Asp Ser Ile Val Arg Val Asp Asn Asn Leu Val 755 760 765 Ile Met Arg Gly Met Ala Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly Asp Val Gly 770 775 780 Ala Gly Phe Gly Lys Val Val Leu Gly Ala Ala Ser Ala Val Ile Ser 785 790 795 800 Thr Val Ser Gly Val Ser Ser Phe Leu Asn Asn Pro Phe Gly Ala Leu 805 810 815 Ala Val Gly Leu Leu Ile Leu Ala Gly Ile Val Ala Ala Phe Leu Ala 820 825 830 Tyr Arg Tyr Ile Ser Arg Leu Arg Ala Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr 835 840 845 Pro Val Thr Thr Arg Asn Leu Lys Gln Thr Leu Arg Ala Arg Ser Thr 850 855 860 Ala Gly Gly Asp Ser Asp Pro Gly Val Asp Asp Phe Asp Glu Glu Lys 865 870 875 880 Leu Met Gln Ala Arg Glu Met Ile Lys Tyr Met Ser Leu Val Ser Ala 885 890 895 Met Glu Gln Gln Glu His Lys Ala Met Lys Lys Asn Lys Gly Pro Ala 900 905 910 Ile Leu Thr Ser His Leu Thr Asn Met Ala Leu Arg Arg Arg Gly Pro 915 920 925 Lys Tyr Gln Arg Leu Asn Asn Leu Asp Ser Gly Asp Asp Thr Glu Thr 930 935 940 Asn Leu Val 945 <210> 76 <211> 46 <212> 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Pro Asp Val Ser Glu Tyr Arg 35 40 45 gta gag tat tcc gag gcg cgc tgc gtg ctc cga tcg ggc ggt cga ctg 192 Val Glu Tyr Ser Glu Ala Arg Cys Val Leu Arg Ser Gly Gly Arg Leu 50 55 60 gag gct ctg tgg acc ctg cgc ggg aac ctg tcc gtg ccc acg ccg aca 240 Glu Ala Leu Trp Thr Leu Arg Gly Asn Leu Ser Val Pro Thr Pro Thr 65 70 75 80 ccc cgg gtg tac tac cag acg ctg gag ggc tac gcg gat cga gtg ccg 288 Pro Arg Val Tyr Tyr Gln Thr Leu Glu Gly Tyr Ala Asp Arg Val Pro 85 90 95 acc ccg gtg gag gac atc tcc gaa agc ctc gtc gca aaa cgc tac tgg 336 Thr Pro Val Glu Asp Ile Ser Glu Ser Leu Val Ala Lys Arg Tyr Trp 100 105 110 ctc cgg gac tat cgt gtt ccc caa cgc aca aaa ctc gtg ttg ttc tac 384 Leu Arg Asp Tyr Arg Val Pro Gln Arg Thr Lys Leu Val Leu Phe Tyr 115 120 125 ttt tcc ccc tgc cat caa tgc caa act tat tat gta gag tgc gaa ccc 432 Phe Ser Pro Cys His Gln Cys Gln Thr Tyr Tyr Val Glu Cys Glu Pro 130 135 140 cgg tgc ctc gtg cct tgg gtt ccc ctg tgg agc tcg tta gag gac atc 480 Arg Cys Leu Val Pro Trp Val Pro Leu Trp Ser Ser Leu Glu Asp Ile 145 150 155 160 gaa cga cta ttg ttc gaa gat cgc cgt cta atg gcg tac tac gcg ctc 528 Glu Arg Leu Leu Phe Glu Asp Arg Arg Leu Met Ala Tyr Tyr Ala Leu 165 170 175 acg att aag tcg gcg cag tat acg ctg atg atg gtg gca gtg att caa 576 Thr Ile Lys Ser Ala Gln Tyr Thr Leu Met Met Val Ala Val Ile Gln 180 185 190 gtg ttt tgg ggg ctg tat gtg aaa ggt tgg ctg cac cga cat ttt ccc 624 Val Phe Trp Gly Leu Tyr Val Lys Gly Trp Leu His Arg His Phe Pro 195 200 205 tgg atg ttt tcg gac cag tgg tga 648 Trp Met Phe Ser Asp Gln Trp 210 215 <210> 86 <211> 215 <212> PRT <213> human cytomegalovirus HXLF1 <400> 86 Met Asn Leu Ile Met Leu Ile Leu Ala Leu Trp Ala Pro Val Ala Gly 1 5 10 15 Ser Met Pro Glu Leu Ser Leu Thr Leu Phe Asp Glu Pro Pro Pro Leu 20 25 30 Val Glu Thr Glu Pro Leu Pro Pro Leu Pro Asp Val Ser Glu Tyr Arg 35 40 45 Val Glu Tyr Ser Glu Ala Arg Cys Val Leu Arg Ser Gly Gly Arg Leu 50 55 60 Glu Ala Leu Trp Thr Leu Arg Gly Asn Leu Ser Val Pro Thr Pro Thr 65 70 75 80 Pro Arg Val Tyr Tyr Gln Thr Leu Glu Gly Tyr Ala Asp Arg Val Pro 85 90 95 Thr Pro Val Glu Asp Ile Ser Glu Ser Leu Val Ala Lys Arg Tyr Trp 100 105 110 Leu Arg Asp Tyr Arg Val Pro Gln Arg Thr Lys Leu Val Leu Phe Tyr 115 120 125 Phe Ser Pro Cys His Gln Cys Gln Thr Tyr Tyr Val Glu Cys Glu Pro 130 135 140 Arg Cys Leu Val Pro Trp Val Pro Leu Trp Ser Ser Leu Glu Asp Ile 145 150 155 160 Glu Arg Leu Leu Phe Glu Asp Arg Arg Leu Met Ala Tyr Tyr Ala Leu 165 170 175 Thr Ile Lys Ser Ala Gln Tyr Thr Leu Met Met Val Ala Val Ile Gln 180 185 190 Val Phe Trp Gly Leu Tyr Val Lys Gly Trp Leu His Arg His Phe Pro 195 200 205 Trp Met Phe Ser Asp Gln Trp 210 215 <210> 87 <211> 558 <212> DNA <213> human cytomegalovirus HXLF2 <220> <221> CDS <222> (1)..(558) <400> 87 atg cta cgc cgg gga agc ctc cgg aac cct ctc gcg acc tgc ctg ttg 48 Met Leu Arg Arg Gly Ser Leu Arg Asn Pro Leu Ala Thr Cys Leu Leu 1 5 10 15 tgg tgg ctg gga gtg gtg gcg gca gct acg gag gag acg aga gaa ccg 96 Trp Trp Leu Gly Val Val Ala Ala Ala Thr Glu Glu Thr Arg Glu Pro 20 25 30 act tac ttt acg tgc ggc tgt gtt att caa aat cat gta ctg aaa ggt 144 Thr Tyr Phe Thr Cys Gly Cys Val Ile Gln Asn His Val Leu Lys Gly 35 40 45 gcg gtg aaa ctc tat gga caa ttc ccc tcg cct aag act ttg cgg gcc 192 Ala Val Lys Leu Tyr Gly Gln Phe Pro Ser Pro Lys Thr Leu Arg Ala 50 55 60 ttg gct tgg cta cac gac ggt gaa aat cac gaa agg cac cgg cag ccc 240 Leu Ala Trp Leu His Asp Gly Glu Asn His Glu Arg His Arg Gln Pro 65 70 75 80 atc ctc gtg gaa ggc acc gcg aca gct acc gag gcg ctc tac att ctg 288 Ile Leu Val Glu Gly Thr Ala Thr Ala Thr Glu Ala Leu Tyr Ile Leu 85 90 95 ctg ccc acg gag cta tcg ccg ccg gaa gga aac cga ccc cga aac tat 336 Leu Pro Thr Glu Leu Ser Pro Pro Glu Gly Asn Arg Pro Arg Asn Tyr 100 105 110 tct gtt acc cta aca ctc gcc tcc cgg gat tgt tat gaa cgc ttc gtg 384 Ser Val Thr Leu Thr Leu Ala Ser Arg Asp Cys Tyr Glu Arg Phe Val 115 120 125 tgt ccg gta tac gat tcc ggg acg ccg atg ggg ctt ttg atg aac ttg 432 Cys Pro Val Tyr Asp Ser Gly Thr Pro Met Gly Leu Leu Met Asn Leu 130 135 140 acg tac ctc tgg tat cta ggc gac tac ggg gcg ata cta aaa att tat 480 Thr Tyr Leu Trp Tyr Leu Gly Asp Tyr Gly Ala Ile Leu Lys Ile Tyr 145 150 155 160 ttc gga ctg ttt tgc cgg ggc tgt gtc atc acc cga tcc ctc ctc ctg 528 Phe Gly Leu Phe Cys Arg Gly Cys Val Ile Thr Arg Ser Leu Leu Leu 165 170 175 ata tgt ggt tat tat cca cct cgc gaa taa 558 Ile Cys Gly Tyr Tyr Pro Pro Arg Glu 180 185 <210> 88 <211> 185 <212> PRT <213> human cytomegalovirus HXLF2 <400> 88 Met Leu Arg Arg Gly Ser Leu Arg Asn Pro Leu Ala Thr Cys Leu Leu 1 5 10 15 Trp Trp Leu Gly Val Val Ala Ala Ala Thr Glu Glu Thr Arg Glu Pro 20 25 30 Thr Tyr Phe Thr Cys Gly Cys Val Ile Gln Asn His Val Leu Lys Gly 35 40 45 Ala Val Lys Leu Tyr Gly Gln Phe Pro Ser Pro Lys Thr Leu Arg Ala 50 55 60 Leu Ala Trp Leu His Asp Gly Glu Asn His Glu Arg His Arg Gln Pro 65 70 75 80 Ile Leu Val Glu Gly Thr Ala Thr Ala Thr Glu Ala Leu Tyr Ile Leu 85 90 95 Leu Pro Thr Glu Leu Ser Pro Pro Glu Gly Asn Arg Pro Arg Asn Tyr 100 105 110 Ser Val Thr Leu Thr Leu Ala Ser Arg Asp Cys Tyr Glu Arg Phe Val 115 120 125 Cys Pro Val Tyr Asp Ser Gly Thr Pro Met Gly Leu Leu Met Asn Leu 130 135 140 Thr Tyr Leu Trp Tyr Leu Gly Asp Tyr Gly Ala Ile Leu Lys Ile Tyr 145 150 155 160 Phe Gly Leu Phe Cys Arg Gly Cys Val Ile Thr Arg Ser Leu Leu Leu 165 170 175 Ile Cys Gly Tyr Tyr Pro Pro Arg Glu 180 185
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えワクシニアウイルスｖＰ４２５の構築方
法を図示したものである。
【図２】ＥＨＶ−１のｇｐ１３コード配列を含有する
１．８８KbフラグメントのＤＮＡ配列を示したものであ
る。
【図３】図２の続きである。
【図４】ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子を含有する組換え
ワクシニアウイルスｖＰ４８３の構築方法を図示したも
のである。
【図５】組換えワクシニアウイルスｖＰ４５８の構築方
法を図示したものである。
【図６】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子を含有する組換え
ワクシニアウイルスｖＰ５７７の構築方法を図示したも
のである。
【図７】ＥＨＶ−１のｇｐ１４コード配列を含有する
３．３５KbフラグメントのＤＮＡ配列を示したものであ
る。
【図８】図７の続きである。
【図９】図８の続きである。
【図１０】ＥＨＶ−１ ｇｐ１４コード配列に対して相
対的親水性度をプロットしたものである。
【図１１】ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子を含有する組換
えニワトリポックスウイルスｖＦＰ４４の構築方法を図
示したものである。
【図１２】ＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子を含有する組換
えカナリアポックスウイルスｖＣＰ４８の構築方法を図
示したものである。
【図１３】修飾型ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子を含有す
るドナープラスミドｐＨＥＳ−ＭＰ６３、ｐＨＥＳ−Ｍ
Ｐ１及びｐＨＥＳ−ＭＰ３４の構築方法を図示したもの
である。
【図１４】ＥＨＶ−１ケンタッキーＤ株のＢａｍＨI切
断部位地図であり、ゲノムの逆方向反復配列は四角で示
してある。６つの主要ＥＨＶ−１糖タンパク質遺伝子の
位置、並びにゲノムの領域の拡張部分（ｇＤ、ｇｐ６３
及びgE遺伝子が含まれる）が示してある。
【図１５】ＥＨＶ−１のｇＤ、ｇｐ６３及びgEコード配
列を含有する６４０２bpフラグメントの塩基配列を示し
たものである。
【図１６】図１５の続きである。
【図１７】図１６の続きである。
【図１８】図１７の続きである。
【図１９】図１８の続きである。
【図２０】図１９の続きである。
【図２１】図２０の続きである。
【図２２】図２１の続きである。
【図２３】図２２の続きである。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】図２４の続きである。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】ＥＨＶ−１ ｇＤを構成する４０２残基のア
ミノ酸配列の疎水性度をプロットしたものである。
【図２８】ＥＨＶ−１ ｇｐ６３を構成する４１３残基
のアミノ酸配列の疎水性度をプロットしたものである。
【図２９】ＥＨＶ−１ ｇＥを構成する５５２残基のア
ミノ酸配列の疎水性度をプロットしたものである。
【図３０】ドナープラスミドｐＪＣＡ００６、ｐＪＣＡ
００７及びｐＪＣＡ００８（それぞれＥＨＶ−１ ｇＤ
遺伝子、ＥＨＶ−１ ｇＥ遺伝子及びＥＨＶ−１ ｇｐ
６３遺伝子を含有する）の構築方法、並びにこれらの遺
伝子を含有する組換えワクシニアウイルスの作成方法を
図示したものである。
【図３１】ドナープラスミドｐＪＣＡ００９（ＥＨＶ−
１由来のｇＤ及びｇｐ６３遺伝子を含有する）及びｐＪ
ＣＡ０１０（ＥＨＶ−１由来のｇＤ、ｇＥ及びｇｐ６３
遺伝子を含有する）の構築方法、並びにこれらの遺伝子
を含有する組換えワクシニアウイルスの作成方法を図示
したものである。
【図３２】ＰＲＶ ｇｐII遺伝子を含有するドナープラ
スミドｐＰＲ１８の構築方法、並びにＰＲＶ ｇｐII遺
伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの作成方法を
図示したものである。
【図３３】図３２の続きである。
【図３４】ＰＲＶ ｇｐII解読枠のＤＮＡ配列を示した
ものである。
【図３５】図３４の続きである。
【図３６】図３５の続きである。
【図３７】図３６の続きである。
【図３８】ＰＲＶ ｇｐIII遺伝子を含有するドナープ
ラスミドｐＰＲ２４の構築方法、並びにＰＲＶ ｇｐII
I遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの作成方
法を図示したものである。
【図３９】ＰＲＶ ｇｐIII解読枠のＤＮＡ配列を示し
たものである。
【図４０】ＰＲＶ ｇｐ５０遺伝子を含有するドナープ
ラスミドｐＰＲ２６の構築方法、並びにＰＲＶ ｇｐ５
０遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの作成方
法を図示したものである。
【図４１】ＰＲＶ ｇｐ５０解読枠のＤＮＡ配列を示し
たものである。
【図４２】プラスミドｐＳＤ４７８ＶＣ及びｐＳＤ４７
９ＶＣＢＧの構築方法、並びにβ−ガラクトシダーゼの
ワクシニアウイルスへの挿入方法を図示したものであ
る。
【図４３】プラスミドｐＭＰ１３ＰＰの構築方法を図示
したものである。
【図４４】ＰＲＶ ｇｐＩＩ遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＦＰＰＲＶIIの構築方法を図示したものである。
【図４５】ＰＲＶ ｇｐII遺伝子を発現する組換えカナ
リアポックスウイルスｖＣＰ５５の構築方法を図示した
ものである。
【図４６】ＰＲＶ ｇｐI遺伝子を発現する組換えワク
シニアウイルスｖＰ７１７の構築方法を図示したもので
ある。
【図４７】図４６の続きである。
【図４８】ＨＳＶ-2 ｇＢ遺伝子を発現する組換えワク
シニアウイルスｖＰ５６９及びｖＰ７３４の構築方法を
図示したものである。
【図４９】図４８の続きである。
【図５０】ＨＳＶ−２ ｇＣ遺伝子を発現する組換えワ
クシニアウイルスｖＰ５７９、ｖＰ７４８及びｖＰ７７
６の構築方法を図示したものである。
【図５１】図５０の続きである。
【図５２】図５１の続きである。
【図５３】ＨＳＶ−２ ｇＤ遺伝子を発現する組換えワ
クシニアウイルスｖＰ５７０、ｖＰ７６１、ｖＰ７７５
及びｖＰ７７７の構築方法を図示したものである。
【図５４】図５３の続きである。
【図５５】ＢＨＶ−１ ｇＩ遺伝子を発現する組換えワ
クシニアウイルスｖＰ６３７及びｖＰ７２４の構築方法
を図示したものである。
【図５６】図５５の続きである。
【図５７】図５６の続きである。
【図５８】ＦＨＶ−１ ｇＢ遺伝子を含有するドナープ
ラスミドｐＪＣＡ００１の構築方法、並びにＦＨＶ−１
ｇＢ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスｖＰ
７１３の構築方法を図示したものである。
【図５９】ＦＨＶ−１の糖タンパク質ｇＢをコードする
ＤＮＡの３４００塩基対部分の塩基配列を示したもので
ある。
【図６０】図５９の続きである。
【図６１】図６０の続きである。
【図６２】図６１の続きである。
【図６３】図６２の続きである。
【図６４】図６３の続きである。
【図６５】図６４の続きである。
【図６６】ＦＨＶ−１ ｇＢを構成する９４７残基のア
ミノ酸配列の疎水性度をプロットしたものである。
【図６７】ＥＢＶ ｇｐ２２０遺伝子を含有するドナー
プラスミド４０９ｇｐ２２０、及びＥＢＶ ｇｐ３４０
遺伝子を含有するドナープラスミド４０９ｇｐ３４０の
構築方法の構築方法を図示したものである。
【図６８】図６７の続きである。
【図６９】図６８の続きである。
【図７０】図６９の続きである。
【図７１】ＥＢＶ ｇＢ遺伝子を含有するワクシニアド
ナープラスミド４０９ｇＢの構築方法を図示したもので
ある。
【図７２】図７１の続きである。
【図７３】ＥＢＶ ｇＨ遺伝子を含有するワクシニアド
ナープラスミド４８６ｇＨの構築方法を図示したもので
ある。
【図７４】図７３の続きである。
【図７５】ＥＢＶ由来のｇｐ３４０、ｇＢ及びｇＨ遺伝
子を含有するワクシニアドナープラスミド５１３ｇＨｇ
Ｂｇｐ３４０の構造を図示したものである。
【図７６】ＣＭＶ ｇＢ遺伝子を含有するワクシニアド
ナープラスミド４０９ＣＭＶｇＢの構築方法を図示した
ものである。
【図７７】図７６の続きである。
【図７８】ＨＣＭＶ（タウン株）のＨＸＬＦ１遺伝子の
塩基配列及びアミノ酸配列を示したものである。
【図７９】ＨＣＭＶ（タウン株）のＨＸＬＦ２遺伝子の
塩基配列及びアミノ酸配列を示したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/065 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 15/00 ＺＮＡＡ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA A61K 39/12 A61K 39/245 A61K 39/275 A61P 31/12 C07K 14/065 C12N 7/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポックスウイルスゲノムの非必須領域中
    であって、宿主中でＤＮＡインサートによりコードされ
    るタンパクの組換えウイルスによる発現をプロモートす
    ることができるプロモーター配列の下流に、先端欠損型
    のウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１４をコード
    するＤＮＡインサートを含有する組換えポックスウイル
    ス。
  2. 【請求項２】 前記ＤＮＡインサートとして、ウマヘル
    ペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３及び先端欠損型のウ
    マヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１４の両方をコー
    ドするＤＮＡを含み、これらの糖タンパク質を宿主中で
    発現することができる、請求項１記載の組換えポックス
    ウイルス。
  3. 【請求項３】 ポックスウイルスゲノムの非必須領域中
    であって、宿主中でＤＮＡインサートによりコードされ
    るタンパクの組換えウイルスによる発現をプロモートす
    ることができるプロモーター配列の下流に、ウマヘルペ
    スウイルス糖タンパク質ｇｐ１３及びウマヘルペスウイ
    ルス糖タンパク質ｇｐ１４をコードするＤＮＡインサー
    トを含有し、これらの糖タンパク質を宿主中で発現する
    ことができる、組換えポックスウイルス。
  4. 【請求項４】 組換えポックスウイルスが、組換えワク
    シニアウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項記
    載の組換えポックスウイルス。
  5. 【請求項５】 組換えポックスウイルスが、組換えアビ
    ポックスウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項
    記載の組換えポックスウイルス。
  6. 【請求項６】 組換えアビポックスウイルスが、組換え
    ファウルポックスウイルス又は組換えカナリーポックス
    ウイルスである、請求項５記載の組換えポックスウイル
    ス。
  7. 【請求項７】 組成物を接種された宿主動物において抗
    原性及び／又は免疫学的応答を誘導することができる組
    成物であって、請求項１〜６のいずれか１項記載の組換
    えポックスウイルスを接種担体との混合で含むことを特
    徴とする組成物。
  8. 【請求項８】 宿主細胞中で糖タンパク質を発現するこ
    とができる組換えウイルスを用いる前記宿主細胞のイン
    ビトロ感染によりヘルペスウイルス糖タンパク質を産生
    させる方法であって、請求項１〜６のいずれか１項記載
    の組換えポックスウイルスを用いる方法。
  9. 【請求項９】 インビボ以外で、請求項１〜６のいずれ
    か１項記載の組換えウイルスの発現により得られる、ヘ
    ルペスウイルス糖タンパク質。
  10. 【請求項１０】 インビボで宿主細胞において、請求項
    １〜６のいずれか１項記載の組換えウイルスの発現によ
    り得られる、ヘルペスウイルス糖タンパク質。
  11. 【請求項１１】 非ヒト新生児における母性免疫を回避
    するためのこの新生児の母親及びこの新生児の接種のた
    めの接種キットであって、前記新生児の出生前の母親へ
    の接種のための第一のワクチンと、前記新生児に接種す
    るための第二のワクチンとを含み、第一のワクチンが請
    求項１〜６のいずれか１項記載の第一の組換えポックス
    ウイルスを含み、第一の組換えポックスウイルスが前記
    母親に接種された場合にＤＮＡインサートによりコード
    されたヘルペスウイルス糖タンパク質を発現することが
    でき、前記第二のワクチンが請求項１〜６のいずれか１
    項記載の第二の組換えポックスウイルスを含み、第二の
    組換えポックスウイルスが前記新生児に接種された場合
    にＤＮＡインサートによりコードされたヘルペスウイル
    ス糖タンパク質を発現することができ、前記第一及び第
    二のヘルペスウイルス糖タンパク質が同一であり、前記
    第一及び第二の組換えポックスウイルスが異なる組換え
    ポックスウイルスであるがそれぞれ同じ第一及び第二の
    ヘルペスウイルス糖タンパク質に対する免疫応答を誘導
    することができる、接種キット。
  12. 【請求項１２】 第一及び第二のヘルペスウイルス糖タ
    ンパク質が、同じ病原体由来であるが異なるタンパク質
    であり、第一及び第二のポックスウイルスが、同じ組換
    えポックスウイルスであり、各々がそれぞれのヘルペス
    ウイルス糖タンパク質に対する免疫応答を誘導すること
    ができる、請求項１１記載の接種キット。
  13. 【請求項１３】 請求項１１記載のキットの製造におけ
    る請求項１〜６のいずれか１項記載の組換えポックスウ
    イルスの使用方法。
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