NL195016C - Recombinant pokkenvirus, vaccin dat dit virus bevat, geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul, geïsoleerd polypeptide, nucleïnezuurvector die dit nucleïnezuurmolecuul bevat en vaccin die deze vector bevat. - Google Patents
Recombinant pokkenvirus, vaccin dat dit virus bevat, geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul, geïsoleerd polypeptide, nucleïnezuurvector die dit nucleïnezuurmolecuul bevat en vaccin die deze vector bevat. Download PDFInfo
- Publication number
- NL195016C NL195016C NL9020677A NL9020677A NL195016C NL 195016 C NL195016 C NL 195016C NL 9020677 A NL9020677 A NL 9020677A NL 9020677 A NL9020677 A NL 9020677A NL 195016 C NL195016 C NL 195016C
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- virus
- ehv
- vaccinia
- recombinant
- gene
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 89
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 31
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 14
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 title claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 7
- 241000701081 Equid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 276
- 101700012268 Holin Proteins 0.000 claims description 139
- 101710124413 Portal protein Proteins 0.000 claims description 139
- 101710112672 Probable tape measure protein Proteins 0.000 claims description 139
- 101710194975 Uncharacterized protein gp14 Proteins 0.000 claims description 139
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 94
- 101710099276 Probable metalloendopeptidase Proteins 0.000 claims description 92
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 74
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 66
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 63
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 60
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 21
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 claims description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 114
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 103
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 97
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 37
- 239000000047 product Substances 0.000 description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 29
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 23
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 21
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 20
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 19
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 17
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 17
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 16
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 101150061732 M2L gene Proteins 0.000 description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 11
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 10
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 9
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 9
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 9
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 9
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 241000712469 Fowl plague virus Species 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 101710104895 DNA replication protein 17 Proteins 0.000 description 7
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 7
- 101710152616 Probable major capsid protein gp17 Proteins 0.000 description 7
- 102100030350 Prolactin-inducible protein Human genes 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 101900120730 Equine herpesvirus 1 Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 6
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 6
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 5
- ANVAOWXLWRTKGA-NTXLUARGSA-N (6'R)-beta,epsilon-carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\[C@H]1C(C)=CCCC1(C)C ANVAOWXLWRTKGA-NTXLUARGSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010081175 Equid herpesvirus glycoprotein 13 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710189078 Helicase Proteins 0.000 description 3
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 101150036031 gD gene Proteins 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 101150118312 gp63 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 2
- 101000686824 Enterobacteria phage N4 Virion DNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000644628 Escherichia phage Mu Tail fiber assembly protein U Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 2
- 101710113540 ORF2 protein Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710090523 Putative movement protein Proteins 0.000 description 2
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIAKOEWBCMPCQR-YBXAARCKSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-(4-aminophenoxy)-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MIAKOEWBCMPCQR-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- 101150078635 18 gene Proteins 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 101150052384 50 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 1
- 229930091051 Arenine Natural products 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101150044735 C7L gene Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000701089 Equid alphaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000001203 Smallpox Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101100382201 Vaccinia virus (strain Copenhagen) C7L gene Proteins 0.000 description 1
- 101900123149 Varicella-zoster virus Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
- C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
1 195016
Recombinant pokkenvirus, vaccin dat dit virus bevat, geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul, geïsoleerd polypeptide, nucleïnezuurvector die dit nucleïnezuurmolecuul bevat en vaccin die deze vector bevat
De uitvinding heeft betrekking op een recombinant pokkenvirus.
5 Een dergelijk virus is bijvoorbeeld bekend uit publicatie 28 uit de literatuurlijst aan het einde van deze beschrijving.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een gemodificeerd pokkenvirus en op methoden om dit te bereiden en te gebruiken. De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op recombinant pokkenvirus, welk virus genproducten van een herpesvirusgen tot expressie brengt en op vaccins die een beschermende 10 immuniteit tegen herpesvirusinfecties geven.
In deze aanvrage zijn vele publicaties met arabische cijfers zonder haken aangegeven. Een volledige vermelding van deze referenties is te vinden aan het einde van de beschrijving, direct voor de conclusies. Deze referenties beschrijven de stand der techniek waartoe deze uitvinding betrekking heeft
Vaccinia virus en recenter andere pokkenvirussen zijn toegepast voor het invoegen en tot expressie 15 brengen van vreemde genen. De basistechniek voor het invoeren van vreemde genen in levend infectueus pokkenvirus brengt recombinantie van pokken DNA volgorden die een vreemd genetisch element in een donorplasmide flankeren en homologe volgorden aanwezig in het reddende pokkenvirus (28) met zich mede.
Specifiek worden de recombinant pokkenvirussen volgens twee, uit de stand der techniek bekende 20 methoden geconstrueerd, analoog aan de methoden voor het verkrijgen van synthetische recombinanten van het vacciniavirus, beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.603.112.
Allereerst wordt de in het virus in te voegen DNA genvolgorde, in het bijzonder een open afleesraam uit een niet-pokkenbron, geplaatst in een E. coli plasmideconstructie waarin DNA homoloog aan een gedeelte van het DNA van het pokkenvirus is ingevoegd. Afzonderlijk wordt de DNA genvolgorde die moet worden 25 ingevoegd gebonden aan een promotor. De promotor-genbinding wordt geplaatst in de plasmideconstructie, zodanig dat de promotor-genbinding aan beide uiteinden wordt geflankeerd door DNA homoloog aan een DNA volgorde die een gebied van pokken DNA die een niet-essentieel gebied bevat flankeert. De verkregen plasmideconstructie wordt daarna door groei in E.coli bacteriën (11) vermeerderd en geïsoleerd (12,20).
Ten tweede wordt het geïsoleerde plasmide dat de in te voegen DNA genvolgorde bevat door transfectie 30 overgebracht in een celcultuur, bijvoorbeeld kippenembryofibroblasten, tezamen met het pokkenvirus.
Recombinatie tussen respectievelijk homoloog pokken DNA in het plasmide en het virale genoom geeft een pokkenvirus dat door de aanwezigheid, in een niet-essentieel gebied van het genoom ervan, van vreemde DNA volgorden is gemodificeerd. De aanduiding "vreemd” DNA duidt op exogeen DNA, in het bijzonder DNA uit een niet-pokkenbron, dat codeert voor genproducten die niet gewoonlijk worden geproduceerd door 35 het genoom waarin het exogene DNA is gebracht.
Genetische recombinatie is in het algemeen de uitwisseling van homologe gedeelten van het DNA tussen twee DNA strengen. In bepaalde virussen kan RNA DNA vervangen. Homologe gedeelten van het nucleïnezuur zijn nucleïnezuurgedeelten (DNA of RNA) die dezelfde volgorde van nucleotidebasen bezitten.
Genetische recombinatie kan natuurlijk tijdens de replicatie of bereiding van nieuwe virale genomen in de 40 geïnfecteerde gastheercel plaats vinden. Zo kan dus genetische recombinatie tussen virale genen tijdens de virale replicatiecyclus die plaats vindt in de gastheercel die geco-infecteerd is met twee of meer verschillende virussen van andere genetische constructies plaats vinden. Een gedeelte van het DNA uit een eerste genoom wordt onderling uitwisselbaar toegepast voor de constructie van het gedeelte van het genoom van een tweede co-infecterend virus, waarin het DNA homoloog is aan dat van het eerste virale genoom.
45 Recombinatie kan echter eveneens plaatsvinden tussen delen van het DNA in verschillende genomen die niet perfect homoloog zijn. Indien een dergelijk gedeelte van een eerste genoom homoloog is met een gedeelte van een ander genoom, afgezien van de aanwezigheid in het eerste gedeelte van bijvoorbeeld een genetische marker of een gen coderend voor een antigene determinant ingevoegd in een gedeelte van het homologe DNA, kan recombinatie toch plaats vinden en de producten van deze recombinatie kunnen dan 50 worden aangetoond door de aanwezigheid van die genetische marker of gen in het recombinant virale genoom.
Een succesvolle expressie van de ingevoegde DNA genetische volgorde door het gemodificeerde infectueuze virus hangt van twee factoren af. Ten eerste moet het invoegen plaatsvinden in een niet-essentieel gedeelte van het virus opdat het gemodificeerde virus levensvatbaar blijft. De tweede voorwaarde 55 voor de expressie van het ingevoegde DNA is de aanwezigheid van een promotor in het juiste verband met het ingevoegde DNA. De promotor moet zodanig zijn geplaatst dat het stroomopwaarts van de tot expressie te brengen DNA volgorde aanwezig is.
195016 2
Er zijn twee ondertypen van paard herpesvirus, die, hoewel ze kruis-neutraliserende epitopen bevatten, kunnen worden onderscheiden door hun antigene profielen, restrictieéndonuclease vingerafdrukken en hun pathogenidteit voor paarden (1). Paard herpesvirus 1 (EHV-1) is geassocieerd met een ziekte van het ademhalingsstelsel, aandoeningen van het centrale zenuwstelsel en klassieke herpetische afwijkingen, 5 terwijl het paard herpesvirus 4 (EHV-4) overwegend geassocieerd is met een ziekte van het ademhalingsstelsel (1, 48). Paard herpesvirussen zijn leden van de a-herpesvirusonderfamilie en vertonen vele van de typerende biologische en biochemische kenmerken van humane herpesvirussen, zoals genomische isomerisatie, regulering van de genexpressie, het verkrijgen van latente infecties, ontwikkeling van onvolkomen interfererende virusdeeltjes, inductie van neurologische aandoeningen en in vitro oncogene 10 transformatie (1,4, 23). EHV kan dus geschikt worden toegepast voor het onderzoek van de verschillende biologische consequenties van herpesvirusinfecties.
Herpesvirus glycoproteTnen mediëren essentiële virale functies, zoals de aanhechting van cellen en de penetratie van cellen, de van cel tot cel verspreiding van het virus en, hetgeen belangrijk is, bepaling van het pathogeniteitsprofiel van de infectie. Herpesvirus glycoproteTnen zijn kritische bestanddelen bij de 15 interactie met het immuunsysteem van de gastheer (36, 37).
Onder de goed gekarakteriseerde glycoproteTnen van het herpes simplex virus vallen gB, gC, gD, gE, gG, gH en gl (36, 37, 49-55). Een aantal van deze onderzoekingen heeft het belang van herpes simplex virusglycoproteïnen bij het opwekken van immuunresponsen aangegeven. Zo is vermeld dat gB en gD belangrijke immuunresponsen kunnen opwekken (6, 8, 13, 18, 21, 22, 26, 27, 30, 44, 46, 47). gC kan 20 klasse I beperkte cytotoxische lymfocyten stimuleren (15, 32), terwijl gD klasse II cytotoxische T cel- responsen kan stimuleren (21, 22, 44, 46, 47). Aangetoond werd dat gG een doelwit was voor complement-afhankelijke, op antilichamen gerichte virusneutralisatie (38, 39). Eveneens werd aangetoond dat een aantal glycoproteTnen uit andere herpes virussen belangrijke immuunresponsen opwekken (5, 10, 36, 56).
Beide ondertypen van EHV brengen zes overvloedige glycoproteTnen tot expressie (1, 3, 43). De genome 25 gedeelten van de DNA volgorden coderende voor gp2, gplo, gp13, gp14, gp17/18 en gp21/22a zijn bepaald onder toepassing van lambda gt11 expressie-vectoren en monoklonale antilichamen (3). De glycoproteTnen gp13 en gp14 zijn aanwezig in dezelfde locaties in de L component van het genoom waartoe respectievelijk de gC en gB homologen van de herpes simplex virusmap behoren (3). EHV-1 schijnt uniek onder de alfa herpesvirussen waarvan de glycoproteine genen in kaart zijn gebracht te zijn omdat vijf van de zes 30 hoofdglycoproteïnen ervan zijn gecodeerd uit volgorden in het genoom L component, terwijl slechts één (gp17/18) in kaart is gebracht in het Us gebied. Deze gegevens analyserend, werd voorspeld dat enkele van de low-abundance glycoproteTnen geïdentificeerd in EHV-1 virusdeeltjes evenals EHV-1 glycoproteTnen die nog niet zijn geïdentificeerd behoren tot de S component van het genoom (3). De envelop glycoproteTnen zijn de belangrijkste immunogenen van herpesvirussen die betrokken zijn bij het opwekken van zowel 35 humorale als cellulaire gastheerimmuunresponsen (5, 8, 73-75) en zijn aldus van het grootste belang voor diegenen die vaccins ontwikkelen.
Onlangs is de nucleotidevolgorde van de Kentucky T431 stam van de EHV-1 transcriptionale eenheid coderende voor gp13 vermeld (2). Een open afleesframe codeert voor een 468 aminozuren bevattend primair translatieproduct van 51 kDa. Het eiwit heeft de karakteristieke eigenschappen van een membraan-40 spanning eiwit met negen potentiële N-verknoopte glycosyleringsplaatsen (Asn-X-Ser/Thr) aanwezig in het oppervlaktegebied tussen het veronderstelde signaal en transmembraanankergedeelten van het eiwit (2).
Het glycoproteine bleek homoloog aan het herpes simplex virus (HSV) gC-1 en gC-2, het pseudorabies virus (PRV) glll en het varicella-zoster virus (VZV) gpV (2) te zijn. EHV-1 gp13 is dus het structurele homoloog van de herpes virus gC-achtige glycoproteTnen.
45 Onlangs is de nucleotidevolgorde van EHV-1 gp14 (71, 72) vermeld. Analyse van de voorspelde aminozuurvolgorde van het gp14 glycoproteine onthulde een significante homologie met het overeenkomstige glycoproteine van HSV, gB.
Monoklonale antilichamen die gericht zijn tegen enkele EHV-1 glycoproteTnen bleken neutraliserend te zijn (76). Uit passieve immunisatieonderzoekingen bleek dat monoklonale antilichamen gericht tegen gp13 50 of gp14 (77) of tegen gp13, gp14 of gp17/18 (78) hamsters konden beschermen tegen een letale provocatie. Andere gB en gC glycoproteïneanaloga zijn eveneens betrokken bij de bescherming tegen ziekten veroorzaakt door alfa herpesvirussen (8,10, 73). Het EHV-1 gp17/18 glycoproteine, hoewel gekarakteriseerd als een ander potentieel beschermend immunogeen, had tot nu toe geen bekende structurele tegenhanger onder de vele glycoproteTnen gecodeerd uit het S-bestanddeel in de andere alfaherpesvirussen 55 (66, 79, 80). Op basis van de genomische plaats ervan, werd gespeculeerd dat gp17/18 het HSV gE analogon zou zijn (2).
Geschikt gemodificeerde pokkenvirusmutanten die exogene paard herpesvirus genen bevatten die tot 3 195016 expressie zijn gebracht in een gastheer als een antigene determinant die de productie door de gastheer van antilichamen tegen herpesvirus antigenen opwekt, vormen nieuwe vaccins die de nadelen van gebruikelijke vaccins, onder toepassing van gedode of verzwakte levende organismen, missen. Zo vereist bijvoorbeeld de bereiding van vaccins uit gedode organismen de groei van grote hoeveelheden van de organismen, gevolgd 5 door een behandeling die selectief hun infectievermogen zal doden zonder hun antigeniciteit aan te tasten. Aan de andere kant hebben vaccins die verzwakte, levende organismen bevatten altijd de mogelijkheid van een omkering van het verzwakte organisme in een pathogene toestand. Indien daarentegen een recombinant pokkenvirus dat geschikt gemodificeerd is met een paard herpesvirus gen coderende voor een antigene determinant van een ziekte teweeg brengende herpesvirus als vaccin wordt toegepast, wordt de 10 mogelijkheid van reversie in een pathogeen organisme vermeden, aangezien het pokkenvirus slechts het gen coderende voor de antigene determinant van het ziekte teweeg brengende organisme en niet die genetische gedeelten van het organisme dat verantwoordelijk is voor de replicatie van het pathogeen, bevat.
De technologie van het ontwikkelen van vaccinia virus recombinanten is onlangs uitgebreid met andere leden van de pokkenvirusfamilie die een beperkter gastheergebied hebben. In het bijzonder vogelpokken-15 virussen, die zich vermeerderen in vogelspecies, zijn geconstrueerd teneinde immunologische, van belangzijnde genproducten tot expressie te brengen. Inenting van vogel (42,177) en niet-vogel species (41) met vogelpokkenvirusrecombinanten wekken beschermende immuunresponsen tegen het overeenkomstige pathogeen op.
Het zal dus duidelijk zijn dat het verschaffen van een herpesvirusrecombinant pokkenvirus en van 20 vaccins die een beschermende immuniteit tegen herpesvirusinfecties verlenen, die de stand der techniek de voordelen van inenting met levend virus bieden, doch de hiervoor besproken moeilijkheden verminderen of wegnemen, een zeer gewenst voordeel boven de gangbare stand van de techniek zullen bieden.
Een doel van deze uitvinding is het verschaffen van recombinant pokkenvirussen, welke virussen genproducten van het paard herpesvirus tot expressie brengen en het verschaffen van een methode voor 25 het bereiden van dergeiijke recombinant pokkenvirussen.
Een ander doel van deze uitvinding is het kloneren en tot expressie brengen van herpes virus coderende volgorden in een pokkenvirusvector, in het bijzonder een vaccinia virus, pluimveepokkenvirus of kanarie-pokkenvirusvector.
Weer een ander aspect van deze uitvinding is het verschaffen van een vaccin dat in staat is herpesvirus 30 neutraliserende antilichamen op te wekken en een beschermende immuniteit tegen letale herpesvirus-provocatie te geven.
Het recombinante pokkenvirus volgens de uitvinding is een recombinant pokkenvirus, gekenmerkt doordat het DNA van paard herpesvirus in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusgenoom bevat.
Het DNA van paard herpesvirus in het recombinante pokkenvirus volgens de uitvinding codeert voor en 35 brengt tot expressie, volgens een voorkeursuitvoeringvorm van de uitvinding, een paard herpesvirus glycoproteïne, in het bijzonder een paard herpesvirus glycoproteïne gekozen uit de groep bestaande uit paard herpesvirus gp13, paard herpesvirus gp14, paard herpesvirus gD, paard herpesvirus gp63 en paard herpesvirus gE.
Het DNA van paard herpesvirus in het recombinante pokkenvirus volgens de uitvinding codeert volgens 40 een voorkeursuitvoeringvorm voor en brengt tot expressie ten minste twee paard herpesvirus glycopro-teïnen.
Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm is het recombinante pokkenvirus volgens de uitvinding een vaccinia virus of een vogelpokkenvirus, gekozen uit de groep bestaande uit pluimveepokkenvirus en kanariepokkenvirus.
45 Verder heeft de uitvinding betrekking op een vaccin voor het induceren van een immunologische respons bij een gastheerdier ingeënt met het genoemde vaccin, welk vaccin een drager en een recombinant pokkenvirus bevattend, in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusgenoom, DNA van paard herpesvirus, bevat.
De sequentie voor paard herpesvirus gp13 wordt beschreven door Allen et al. in Journal of Virology, 50 volume 62, nummer 8, bladzijdes 2850-2858, maar de sequentie voor paard herpesvirus gD wordt daarin niet beschreven.
Derhalve heeft de uitvinding volgens een andere voorkeursuitvoeringsvorm betrekking op een geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul, dat een nucleïnezuursequentie die codeert voor paard herpesvirus gD (EHV-1 gD) zoals weergegeven in figuur 12 omvat, volgens een nadere voorkeursuitvoeringsvorm op een geïsoleerd 55 polypeptide, dat een aminozuursequentie van paard herpesvirus gD (EHV-1 gD) zoals weergegeven in figuur 12 omvat. De uitvinding heeft voorts betrekking op een nucleïnezuurvector die dit nucieïnezuurmole-cuul bevat, waarbij deze vector volgens voorkeursuitvoeringsvorm een pokkenvirus, vaccinia virus, 195016 4 vogelpokkenvirus of pluimveepokkenvirus is, en op een vaccin die deze vector en een drager bevat.
Er zal een beter begrip van de onderhavige uitvinding worden verkregen door verwijzing naar de bijgesloten tekeningen, waarin 5 figuur 1 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP425 geeft, figuur 2 de DNA volgorde van een EHV-1 1,88 Kb fragment bevattende de gp13 coderende volgorden laat zien, figuur 3 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP483 bevattende het EHV-1 gp13 gen afbeeldt, 10 figuur 4 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP458 afbeeldt, figuur 5 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant vaccinia virus vP577 bevattende het EHV-1 gp14 gen geeft, figuur 6 de DNA volgorde van een EHV-1 3,35 Kb fragment bevattende de gp14 coderende volgorde 15 vertoont, figuur 7 een grafiek van de relatieve hydrofieliciteit voor de EHV-1 gp14 coderende volgorden is, figuur 8 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant gevogelte pokkenvirus vFP44 bevattende het EHV-1 gp13 gen vertoont, figuur 9 schematisch een methode voor de constructie van het recombinant kanariepokkenvirus vCP48 20 bevattende het EHV-1 gp13 gen geeft, figuur 10 schematisch een methode voor de constructie van de donorplasmiden pHES-MP63, pHES-MP1 en pHES-MP34, bevattende gemodificeerde versies van het EHV-1 gp14 gen, vertoont, figuur 11 een kaart van de BamHI splitsingsplaatsen van de EHV-1 Kentucky D stam geeft, aanduidende de omgekeerde herhalingen van het genoom door rechthoeken, aantonende de plaats van de zes hoofd 25 EHV-1 glycoproteïnegenen en vertonende een uitbreiding van het gebied van het genoom dat de gD, gp63 en gE genen bevat, figuur 12 de nucleotidevolgorde van een EHV-1 6402 basepaarfragment bevattende de gD, gp63 en gE coderende volgorden vertoont, figuur 13 een hydropathie grafiek van de volgorde van 402 aminozuren samen vormende EHV-1 gD is, 30 figuur 14 een hydropathie grafiek van de volgorde van 413 aminozuren, samen vormende EHV-1 gp63 is, figuur 15 een hydropathie grafiek van de volgorde van 552 aminozuren, samen vormende EHV-1 gE is, figuur 16 schematisch een methode voor de constructie van donorplasmiden pJCA006, pJCA007 en pJCA008 bevattende respectievelijk het EHV-1 gD gen, het EHV-1 gE gen en het EHV-1 gp63 gen, en 35 ontwikkeling van recombinant vaccinia virus bevattende deze genen vertoont, figuur 17 schematisch een methode voor de constructie van de donorplasmiden pJCA009 (bevattende de EHV-1 gD en gp63 genen) en pJCA010 (bevattende het EHV-1 gD, gp63 en gE genen) en ontwikkeling van recombinant vaccinia virus bevattende deze genen vertoont.
40 Een beter begrip van de onderhavige uitvinding en van de vele voordelen ervan kan nu worden ontleend aan de volgende voorbeelden die ter illustratie worden gegeven.
Voorbeeld 1: 45 Constructie van vaccinia virus recombinanten die het paard herpesvirus gp13 glycoproteïne tot expressie brengen
Vervanging van het HA gen van vaccinia door het E.coli β-galactosidasegen
In dit voorbeeld werd de Kopenhagenstam van het vaccinia vims verkregen van Rhone Merieux, Ine. (Athens, Georgia) gebruikt. Het virus werd gekweekt uit een gezuiverd plaque isolatieproduct op hetzij 50 VERO (ATCC# CCL81) of MRC-5 (ATCC# CCL171) cellen in Eagle’s minimaal essentieel medium (MEM) plus 10 % foetaal runderserum (FBS). Een derivaat van het wildtype virus waaruit volgens standaardmethoden (25, 28) de volledige coderingsvolgorde voor het thymidinekinasegen was deleted werd geïsoleerd en aangeduid met vP410. Deze thymidinekinasedeletiemutant werd toegepast voor verdere behandelingen. Plasmiden werden geconstrueerd, onderzocht en deze liet men volgens standaardmethoden 55 groeien (20, 27, 28).
Onder verwijzing nu naar figuur 1, werd het 13 Kb Sail fragment van het vaccinia virus dat de Hindlll A/B fragmentverbinding omspant gebonden aan Sail gedigereerd pUC8 ontwikkelend pSD419VC. De rechterarm 5 195016 van pSD419VC overeenkomende met het Hindlll B gedeelte van het Sail fragment werd verwijderd door digereren met Hindlll en weer gebonden onder vorming van pSD456VC. pSD456VC bevat dus het rechter uiteinde van het Hindlll A fragment, waarin het volledige, coderende gedeelte voor het hemagglutinine (HA) gen (35) geflankeerd door ongeveer 0,4 Kb extra vacciniavolgorden aan elke kant aanwezig is.
5 Ter verkrijging van een plasmidevector die vrijwel zonder HA coderende volgorden is, werd pSD456VC geknipt (gedeeltelijk gedigereerd) bij de Rsal plaats stroomopwaarts van het HA gen en bij de Eagl plaats 80 bp van het 3' einde van het HA gen. Het benaderde 3,5 Kb Rsal/Eagl fragment werd uit een agarosegel geïsoleerd.
Synthetische oligonucleotiden MPSYN59-62 werden bereid ter vervanging van het gebied van de Rsal 10 plaats tot plaats 2 stroomopwaarts van de HA coderende volgorde, onmiddellijk gevolgd door de Bglll, Smal en Pstl restrictieplaatsen en een Eagl sticky uiteinde. De volgorde van MPSYN59-62 met de aangegeven restrictïeplaatsen is als volgt: 5'-ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGA TAGAACAA 3'-TGTG CTTACT AAA AG ATTT CAT AAAC CTTT C AAAATAT CC ATC AACT ATCTTGTT 15 AATACATAATTTTGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCTCCCGGGC-TGC AGC-3' TTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTCTA GAGGGCCCGACGTCGCCGG-5'
Bglll Smal Pstl Eagl
Het annealed MPSYN59-62 mengsel werd gebonden aan het 3, 5 Kb Rsal/Eagl fragment van pSD456VC, onder vorming van pSD466VC. Zo is dus in pSD466VC het HA gen vervangen door een 20 polylinkergebied.
Een 3,2 Kb BglIl/BamHI (partieel) fragment bevattende het E.coli B-galactosidase gen van pMC187l (34) onder de transcriptionele controle van de vaccinia 11 kDa promotor (7) werd gekloneerd in pSD466VC, dat was gedigereerd met Bglll. Een plasmide dat de 11 kDa promotor/B-galactosidase gen cassette in een van links tot rechts oriëntatie ten opzichte van de flankerende vaccinia armen bevatte werd met pSD466VCBGA 25 aangeduid en gerecombineerd in een thymidinekinasedeletiemutant, vP410, van de Kopenhagenstam van het vaccinia virus onder vorming van de vaccinia recombinant vP425 tot expressie brengend het B-galactosidase. 80 baseparen bij het carboxyluiteinde van het HA gen werden behouden, teneinde niet een korte, potentiële open afleesframe overgeschreven van rechts naar links ten opzichte van het vacciniage-noom te verbreken.
30 Het recombinant vaccinia virus, vP425 (184) werd geïdentificeerd op basis van blauwe plaquevorming in aanwezigheid van het chromogene substraat, X-gal, zoals door anderen is beschreven (9, 24). Vervanging van het Bgalactosidasegen door nog een ander vreemd gen in opeenvolgende vaccinia recombinanten kon gemakkelijk worden gevolgd door isolatie van kleurloze plaques in plaats van blauwe plaques.
Ter vergemakkelijking van toekomstige kloningsstappen, werd de Smal-plaats afgeleid van het pUC8 35 multiklonerend gebied geëlimineerd door digereren van pSD466VC met BamHI/EcoRI, blunt eindigende met het Klenow-fragment van E.coli polymerase en weer verknoping. Zo is dus de enkelvoudige Smal plaats die achterblijft in het verkregen plasmide, pSD467VC, in het polylinkergebied van de HA deletie aanwezig.
Identificatie van DNA volgorden coderende het EHV-1 gp13 gen 40 De DNA volgorde coderende voor het glycoproteïne EHV-1 gp13 is aanwezig in het 7,3 Kb BamHI-H fragment van EHV-1 (3). De nucleotidevolgordewaarden voor beide strengen werd verkregen uit het pUC (BamHI-H) gebied, onder toepassing van overlappende sub-klonen onder toepassing van het gemodificeerde T7 enzym SEQUENASE (40) (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH). Standaard didesoxy ketenbeêindi-gende reacties (33) werden uitgevoerd op dubbelstrengs plasmidematrijzen die waren gedenatureerd in een 45 alkali. De M13 voorwaartse en omgekeerde primers werden toegepast ter verkrijging van de aanvankelijke volgorde van elke kloon. Custom 16-17-mer primers, gesynthetiseerd onder toepassing van standaard-chemie (Biosearch 8700, San Rafael, CA; Applied Biosystems 380B, Foster City, CA) werden toegepast bij het gaan langs het overblijvende fragment. Het IBI Pustell volgorde-analyseprogram werd bij alle analyses ter bepaling van de volgorde toegepast (29).
50 DNA sequence analyses gaven een open afleesframe van 1.404 bp coderende voor 468 aminozuren met een voorspeld primair translatieproduct van 50,9 kDa. Een significante aminozuurhomologie in de carboxyl-helft van het vermeende gp13 open afleesframe werd waargenomen bij gC van de herpes simplex virussen type 1 en type 2, gill van het pseudorabies virus en gpV van het varicella-zoster virus, suggererende dat gp13 een lid was van de gC achtige glycoproteïnen van herpesvirussen. Een verdere uitvoerige analyse van 55 het EHV-I gp13 open afleesframe werd aangeboden in een voorgaande publicatie (2). Ter vergemakkelijking van de beschrijving van het klonen en de expressie van het EHV-1 gp13 in vaccinia virus vectoren zijn het gp13 open afleesframe plus extra 5' en 3' volgorden weergegeven in figuur 2. In figuur 2 zijn een vermoe- 195016 6 delijke TATA box en aminozuren die vermeende signalen en membraanankerelementen bevatten onderstreept. De potentiële splitsingsplaats van de signaalvolgorde is aangegeven met een pijl die het splitsings-signaal ASA (open cirkels) volgt. Potentieel zijn er negen N-verbonden glycosyleringsplaatsen in de signaal-en ankervolgorden, zoals is gedefinieerd door het Asn-X-Ser/Thr motief (sterretjes).
5
Klonering van het EHV-1 gp13 gen in een vaccinia virus donorplasmide -Een vroeg-laat vaccinica viruspromotor, H6, werd toegepast voor de expressie van vreemde genen in pluimveepokkenvirusvectoren (41, 42). Dit promotorelement correspondeert met de DNA volgorden onmiddellijk stroomopwaarts van het H6 open afleesframe in het vaccinia Hindlll-H fragment (31).
10 Onder verwijzing nu naar figuur 3, werden ter mutering en invoeging van het H6 promotor in pSD467VC oligonucleotiden H6SYN oligos A-D gesynthetiseerd. De volgorde van H6SYN oligos A-D, met gemodificeerde base zoals is onderstreept en restrictieplaatsen zoals is aangegeven, is als volgt:
Bglll 5'-GATCTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTC TTGAGGGTT 15 3'-AG AAATAAGATATGAATT IT TCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACT CCCAA GTGTTAAATTGAAAGC-GAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA CACAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAG-TATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATT GTTTGTATCGT ACCC-3' CAAACATAGCATGGG-5' 20 Smal
De onderstreepte basen duiden op modificatie van de natieve H6 promotorvolgorde.
Het 130 bp volle lengte, dubbelstrengs DNA gevormd door annealing van H6SYN oligos A-D werd gezuiverd door efektroelutie uit een agarosegel en verbonden met 0,5 Kb Smal/Hindlll en 3,1 Kb Bglll/ Hindlll fragmenten afgeleid van pSD467VC. Het verkregen plasmide, pTP15 (184), heeft de ATG initiatieco- 25.. don gemodificeerd tot CCC als deel van de Smal plaats, die onmiddellijk wordt gevolgd door een Pstl plaats. Een Nsil linker, 5'-TGCATGCATGCA-3', (New [England Biolabs, Beverly, MA) werd ingevoegd op de Smal plaats van pTP15 ter vorming van het plasmide pNSI.
Een EHV-1 EcoRI/Narl fragment waarin de EcoRI plaats is 120 bp stroomopwaarts van de ATG initiatie codon en waarin de Narl plaats is 23 bp stroomopwaarts van het TAG terminatie codon van EHV-1 gp13 30 werd gekloneerd in faag M13mp19 onder vorming van de recombinantfaag M13EcoRNar. Onder toepassing van oligonucleotide-gerichte mutagenese (17) werd een Nsil plaats geïntroduceerd door verandering van de volgorde TTGCCT (basen 130-135 in figuur 2) in het EHV-1 gp13 gen in ATGCAT. Het EcoRI/Narl fragment uit mutantfaag M13EcoRNar werd gekloneerd in pUC8 bij de EcoRI/Narl plaatsen onder vorming van het plasmide pNSIEN.
35 Twee 42-mer oligonucleotiden werden gesynthetiseerd met de volgende, met de aangeduide restrictieplaatsen, volgorde:
Narl gp13 3' einde Ndel 5'-CGCCGTACAAGAAGTCTGACTTTTAGATTTTTATCTGCAGCA-3 3'-GGCATGTTCTTCAGACTGAAAATCTAAAAATAGACGTCGTAT-5 40 Pstl
In dit oligonucleotide, wordt de terminatiecodon (TAG) onmiddellijk gevolgd door een vaccinia vroege transcriptie terminator (ATTTTTAT). Het dubbelstrengs DNA fragment verkregen door annealing het paar van 42-mers bevat een Narl sticky uiteinde, gevolgd door het 3' uiteinde van de coderende volgorde voor het EHV-1 gp13 gen, evenals een vaccinia vroeg transcriptie terminatiesignaal (45), een Pstl plaats en een 45 Ndel sticky uiteinde. Dit fragment werd ingevoegd tussen de Narl/Ndel plaatsen van pNSIEN dat pNSIENPN vormt (figuur 3).
Het Nsil/Pstl fragment uit pNSIENPN werd geïsoleerd en gekloneerd in de Nsil/Pstl plaatsen van het plasmide pNSI, onder vorming van het plasmide pVHA6g13Nsil (figuur 3). pVHA6g13Nsil werd geknipt op de EcoRI plaats in de H6 promotor en de Nsil plaats die was ingevoerd bij het begin van het EHV-1 gp13 50 gen. Dit vectorfragment werd blunt ended met Mung Bean nuclease. De complementaire 32-mer oligonucleotiden werden gesynthetiseerd met de volgende volgorde, met de aangegeven restrictieplaats:
EcoRV
5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGGTTGCC-3' 3'-TAGGCAATTCAAACATAGCATTACACCAACGG-5' 55 H6 promotor gp13 5'einde. ,
Deze oligonucleotiden werden annealed en gebonden in het pVHA6g13Nsil vectorfragment, onder vorming van het plasmide pVHA6g13, dat een nauwkeurige verbinding bij het ATG initiëringscodon 7 195016 (onderstreept in de 32-mer volgorde) van de H6 promotor en EHV-1 gp13 gen (figuur 3) bevat.
pVHA6g13 werd door transfectie gebracht in met vP425 geïnfecteerde cellen ter vorming van het vaccinia recombinant vP483, dat het EHV-1 gp13 gen (figuur 3) bevat.
5 Constructie van vaccinia virus recombinanten
Werkwijzen voor transfectie van recombinant donorplasmiden in weefselcultuurcellen geïnfecteerd met een gered vaccinia virus en identificatie van recombinanten door in situ hybridisatie op nitrocellulosefilters werd op een hiervoor beschreven wijze uitgevoerd (25, 28). Ter constructie van vP425 waarin het E.coli β-galactosidase gen de vaccinia HA coderingsvolgorden vervangt, werd het plasmide DNA (25 pg 10 pSD466VCBGA in HeBS (16)) geëlektroporeerd (Biorad Gene Pulser, capaciteit 960, 200 volt) in VERO cellen. Subconfluent monolagen van cellen werden 1 uur voor het gebruik geïnfecteerd tot 10 pfu/cel met vP410. De geïnfecteerde cellen werden gewonnen met trypsine en voor de elektroporatie gewassen met HeBS. De cellen werden 24 uur geïncubeerd in MEM + 5 % foetaal runderserum bij 37°C, gewonnen en progeny virus plated op VERO monolagen. Recombinant virus β-galactosidase tot expressie brengend werd 15 gedetecteerd als blauwe plaques in aanwezigheid van X-gal substraat (9, 24). Ter vorming van recombinant vaccinia virus waarin het EHV-1 gp13 het β-galactosidase gen in vP425 vervangt, werd een overeenkomstig protocol gevolgd, behalve dat het donorplasmide pVHA6g13 en het reddende virus vP425 was. De vaccinia recombinant VP483, bevattende EHV-1 gp13, werd gedetecteerd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gai en bevestigd als een echte recombinant door DNA-hybridisatie na 3 cycli van plaquezuivering.
20
Expressie van het EHV-1 gp13 gen op het oppervlak van cellen geïnfecteerd met het recombinant vaccinia virus vP483 BSC-40 cellen werden geënt op glazen dekplaatjes van 22 mm in schalen van 35 mm met 5 x 105 cellen/schaal.
25 Bij ongeveer 80 % samenvloeiing werden de dieren geïnfecteerd met 2 pfu/cel. Na een adsorptieperiode van een uur werd de virusentstof verwijderd en werd MEM plus 2 % foetaal runderserum toegevoegd. 20 Uur na infecteren werden de dekplaatjes gewassen met een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,2 % BSA en 0,1 % NaN3 (PBS+) bevatte en blootgesteld aan 0,1 ml anti-gp13 monoklonaal antilichaam, 14H7 (3) verdund tot een duizendste in PBS+. Na 1 uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur 30 werden de cellen driemaal gewassen in PBS+. Deze procedure werd herhaald met fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerd geit anti-muis IgG. Tenslotte werden de cellen 20 minuten in 2%-ige paraformaldehyde in PBS gefixeerd. De dekplaatjes werden gemonteerd in 80% glycerol in PBS bevattende 3% n-propylgallaat en de fluorescentie werd met behulp van een microscoop waargenomen.
Het eiwit voorspeld uit de DNA volgorde heeft de typische kenmerken die kenmerkend zijn voor een 35 membraan overspannend glycoproteïne (14). Bij een productieve EHV-1 infectie wordt dit gp13 glycoproteïne opgenomen in de verschillende membraansystemen van de cel en wordt getransporteerd in het cytoplasmische membraan en kan op het uitwendige oppervlak van de geïnfecteerde cel worden aangetoond. EHV-1 gp13 is bovendien een bestanddeel van het EHV-1 virion. Daarom werden immunofluorescen-tieonderzoekingen uitgevoerd ter bepaling of EHV-1 gp13 tot expressie gebracht door het vaccinia virus 40 recombinant, vP483, eveneens op het cytoplasmische membraan van geïnfecteerde cellen aanwezig was.
Anti-gp13 specifiek monoklonaal antilichaam gevolgd door fluoresceïne-geconjugeerd geit anti-muis IgG gaf een sterke membraan immunofluorescentie in met vP483 geïnfecteerde cellen doch niet in met vaccinia virus vP410 geïnfecteerde cellen. Dit doet vermoeden dat het EHV-1 gp13 tot expressie gebracht door het recombinant vaccinia virus vP483 aanwezig is op het cytoplasmische membraan, zoals verwacht werd voor 45 de authentieke synthese van een membraan overspannend glycoproteïne.
Immunoprecipitatie van EHV-1 gp13 producten gesynthetiseerd uit met recombinant vaccinia virus vP483 geïnfecteerde cellen
Twee miljoen cellen die een samenvloeiende monolaag in een schaal van 60 mm vormden werden 50 geïnfecteerd met 10 pfu/cel. Het enten werd uitgevoerd in een medium dat geen methionine bevatte. Na de adsorptieperiode, werd de entstof verwijderd en werd 2 ml geen methionine bevattend medium bevattende 20 μ Ci/ml 35S-methionine toegevoegd. Men liet de infectie 24 uur verlopen waarna de cellen werden gelyseerd door toevoeging van 1 ml van 3 x buffer A bevattende 3% NP-40, 30 mM Tris pH 7,4, 450 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,03% natriumazide en 0,6 mg/ml PMSF. De gelyseerde cellen en de bovenstaande 55 vloeistof werden gewonnen, geroerd en geklaard door 15 minuten te centrifugeren bij 10.000 g.
Proteïne A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Cat. No. 17.0780.01) werd bereid als een 1:1 suspensie in 1X Buffer A. Een rat anti-muis conjugaat (Boehringer Mannheim, Cat. No. 605 500) werd verdund tot 1:100 in ____________ί 195016 8 de suspensie en 4 uur bij kamertemperatuur onder schudden gebonden aan de kralen. Daarna werden de kralen goed gewassen met 6 wasporties van 1 ml in buffer A, ter verwijdering van het niet-gebonden conjugaat. Een monoklonaal antilichaam specifiek voor gp13 werd daarna gedurende 4 uur bij kamertemperatuur aan de kralen gebonden. De overmaat antilichaam werd door goed wassen verwijderd. 1 ml van het 5 geklaarde, geïnfecteerde cellysaat werd van te voren geklaard door incubatie met Proteïne A-Sepharose kralen waaraan normaal muizenserum was gebonden. Deze kralen werden door centrifugeren verwijderd. Daarna werd 1 ml van het geklaarde, voorgeklaarde lysaat gemengd met 100 pl van de kralen waaraan het specifieke, monoklonale antilichaam was gebonden. Dit mengsel werd 4 uur bij kamertemperatuur geschud. Daarna werden de kralen door centrifugeren verwijderd en innig gewassen door viermaal wassen in 1X 10 Buffer A en tweemaal wassen in 10 mM Tris pH 7,4 bevattende 0,2 M LiCI en 2M ureum. Daarna werd het antilichaam-antigeencomplex van de kralen verwijderd en verbroken door toevoeging van 50 pl 2 x Laemmli Disrupting Solution (60,195). Vervolgens werd het monster voor de elektroforese 5 minuten gekookt.
Er zijn twee producten van ongeveer 44 en 47 kDa die kunnen worden aangetoond en die enigszins kleiner zijn dan het voorspelde primaire translatieproduct (51 kDa) en een groter product van ongeveer 15 90 kDa dat overeenkomt met een volledig geglycosyleerde vorm van het EHV-1 gp13 genproduct. Geen equivalente polypeptiden werden uit met controle, vaccinia virus geïnfecteerde cellen neergeslagen.
Voorbeeld 2
Constructie van vaccinia virus recombinanten die het paard herpesvirus gp14 giycoproteïne tot expressie 20 brengen
Vervanging van het M2L gen in vaccinia virus door het E. coli β-galactosidase gen Teneinde de EHV-1 gp14 coderende volgorden in een vaccinia virusvector in te voegen, werd een recombinant vaccinia virus vP458, dat het E. coli LacZ gen tot expressie brengt, geconstrueerd. Substitutie van de LacZ coderende volgorden in het recombinantvirus, vP458, door de volgorden die EHV-1 gp14 25 coderen,-maakt een blauw tot kleurloos plaque onderzoeksysteem voor het identificeren van EHV-1 gp14 bevattende recombinantvirussen (9,24) in aanwezigheid van X-gal, een chromogeen β-galactosidasesubstraat, mogelijk. Bovendien werd, met de bedoeling van het construeren van vaccinia virusrecombinanten die zowel EHV-1 gp14 als EH-1 gp13 tot expressie brengen, een invoegingsplaats voor EHV-1 gp14 uniek uit de hemagglutinine deleted plaats toegepast voor het invoegen van EHV-1 gp13 in 30 voorbeeld 1 bereid op de M2L plaats van Hindlll M. De volledige coderende volgorde van het M2L gen in het vaccinia Hindlll M fragment werd verwijderd en vervangen door het E. coli LacZ gen coderende β-galactosidase. De kloneringsstappen voor de constructie van vP458 zijn schematisch weergegeven in figuur 4.
Onder verwijzing nu naar figuur 4 wordt opgemerkt, dat een open afleesframe lezende van rechts naar 35 links ten opzichte van het vacciniagenoom en coderende voor een vermeend eiwit van 220 aminozuren volledig binnen het Hindlll M fragment van de Kopenhagenstam van het vaccinia virus links van, de unieke Bglll plaats is geplaatst. Volgens de conventie (31) werd dit gen, dat onmiddellijk rechts van M1L (58) is geplaatst, met M2L aangeduid. Deletieonderzoekingen gericht op het vaccinia (WR) genoom dat zich links van de unieke Bglll plaats in het Hindlll fragment M (57) uitstrekt, geven aan dat met vaccinia coderende 40 volgorden aanwezig in Hindlll M links van de Bglll plaats niet essentieel voor de replicatie van het virus in een weefselcultuur zijn.
Ter vergemakkelijking van de toepassing van het M2L gebied als invoegingsplaats voor vreemde genen, werd een plasmidevector, pMP409DVC, gevormd waarin de volledige M2L coderende volgorde op de volgende wijze was vervangen door een Bglll plaats. pSD409VC, dat bestaat uit het Kopenhagen vaccinia 45 Hindlll M fragment gekloond op de Hindlll plaats van pUC8, werd gedigereerd met BamHI/BgIll en zelf gebonden, aldus verwijderend het rechter uiteinde van Hindlll M en opheffing van de Bglll plaats. Het verkregen plasmide, pMP409BVC werd lineair gemaakt met Sphl, dat knipt in het M2L open afleesframe en werd 2 minuten onderworpen aan Bal-31 exonuclease digerering. Mutagenese werd uitgevoerd op het verkregen DNA (19) onder toepassing van een synthetisch 49 mer 50 (5'-TTTCT GTATATTT G C AAC AATTTAG AT CTTACT C AA AAT ATGTA AC AAT-3', Bglll plaats onderstreept). In het gemutageniseerde plasmide pMP409DVC werden de M2L coderende volgorden uit plaats +3 tot het einde van het open afleesframe verwijderd. De G van het initiatiecodon ATG werd gewijzigd in een C ter vorming van een unieke Bglll plaats (AGATCT) op het deletieknooppunt.
Een 3,2 Kb BglIl/BamHI partieel fragment, bevattende 3,1 Kb van het E. coli β-galactosidase gen tussen 55 de BamHI plaatsen van pMC1871 (34) onder de transcriptionale controle van de 0,1 Kb vaccinia 11 kDa late promotor (7) werd gekloneerd in de unieke Bglll plaats van pMP409DVC. Een recombinantplasmide dat de 11 kDa promotor/B-galactosidase gencassette in de rechter tot linker oriëntatie ten opzichte van 9 195016 flankerende vaccinia armen en genoom bevatte werd met pMP409DVCBG aangeduid. pMP409DVCBG werd toegepast als donorplasmide voor recombinatie met gered vacciniavirus, vP410, beschreven in voorbeeld 1. De nieuwe vacciniarecombinant, aangeduid met vP458, tot expressie brengend het B-galactosidasegen ingevoegd op de M2L deletieplaats, werd gedetecteerd onder toepassing van het 5 chromogene X-gal substraat (9,24) en gezuiverd door herhaalde plaque-klonering.
Kloneren van het EHV-1 gp14 gen
Onder verwijzing nu naar figuur 5, omspant de EHV-1 gp14 coderende volgorde de binding tussen de BamHI restrictiefragmenten a en i (3). De EHV-1 DNA fragmenten BamHI-a (21,3 Kb) en i (7,1 Kb) (59) 10 werden geïsoleerd uit agarosegelen. Plasmide pUC (BamHI-i) werd gevormd door invoeging van het EHV-1 BamHI-i fragment in plasmide pUC8 bij de BamHI plaats. Het EHV-1 BamHI-a fragment werd gedigereerd met EcoRI en gebonden in met EcoRI/BamHI gedigereerde pUC8. Plasmide pUC (BamHI-a/EcoRI) bevat een 10 Kb EHV-1 BamHI/EcoRI inlas. Op basis van de vermelde fragmentafmetingbepalingen (59), wordt opgemerkt dat de DNA volgorden in dit invoegsel grenzen aan die van het BamHI-i fragment in het EHV-1 15 genoom.
Nucleotide sequence analyses
Nucleotide sequence analyses werden uitgevoerd onder toepassing van verschillende subklonen uit pUC (BamHI-a/EcoRI) en pUC (BamHI-i) plasmiden. Sequencing van het plasmide pUC (BamHI-a/EcoRI) werd 20 uitgevoerd op de BamHI plaats, omdat het EHV-1 gpl4 gen de BamHI-a/i verbinding omspant (3). De oriëntatie van het pUC (BamHI-i) plasmide werd bepaald door digereren met restrictieënzym. Aangezien het EHV-1 BamHI eindstandige gedeelte het dichtst bij de EcoRI plaats in pUC (BamHI-i) de BamHI plaats bij de BamHI-a/i verbinding bleek te zijn, werd sequencing van het fragment begonnen vanaf dit BamHI einde. Sequence-waarden voor beide strengen werden op de wijze als beschreven in voorbeeld 1 verkregen.
25 De nucleotidevolgorde van het 3,351 bp fragment bevattende de EHV-1 gp14 coderende volgorde is weergegeven in figuur 6. De nummering van de linker en rechter grenzen geldt voor respectievelijk de aminozuur- en nucleïnezuurvolgorde. De vermeende CAT en TATA rechthoeken zijn onderstreept. Aminozuren in het signaal en membraan overspannende gebied zijn eveneens onderstreept met de pijl die een potentiële sïgnaalpeptidesplitsingsplaats aangeeft. De dertien potentiële glycosyleringsplaatsen onder 30 toepassing van de consensusvolgorde (Asn-X-Ser/Thr) zijn door een sterretje aangeduid.
DNA sequence analyses duiden op een open afleesframe dat zich uitstrekt van de nudeotideplaatsen 300 tot 3239 aflezende van links naar rechts ten opzichte van het EHV-1 genoom, dat wil zeggen het ATG startcodon was aanwezig in het BamHI-a/EcoRU fragment en het stopcodon TAA was aanwezig in het BamHI-i fragment (3,59).
35 Vermoedelijke transcriptionale regelsignalen werden aangetroffen in het 5' gebied van het ATG
initieringscodon op plaats 300. Een TATA rechthoek met de volgorde AAATATAT (nucleotiden 148 tot 155) was 70 nucleotiden stroomafwaarts van een vermoedelijke CAT rechthoek op de plaatsen 71-77 met de volgorde GGTCAAT geplaatst. Een polyadenyleringssignaal AATAAA (nucleotiden 3251-3256) was 8 nucleotiden stroomafwaarts van de TAA terminatiecodon (nucleotiden 3240-3242) geplaatst. Negen van de 40 elf nucleotiden in de volgorde 5'-TCCTGCGCGCA-3' (de nucleotiden 218228) zijn complementair aan de 18S ribosomale RNA volgorde 3'-AGGAAGGCGT-5' (61) en kunnen dienen als de ribosoombindingsplaats.
Analyse van de EHV-1 gp14 structuur
Het EHV-1 gp14 open afleesframe codeert voor 980 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 45 109,8 kDa. Analyse van de aminozuurvolgorde duidt op een aantal kenmerken die gebruikelijk zijn voor membraan-geassocieerde glycoproteïnen. Een gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 58 tot 99 had een kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en het is voorgesteld dat dit de signaalvolgorde is (figuur 6). Een ongebruikelijk aspect van het EHV-1 gp14 genproduct is dat de lange hydrofobe signaalvolgorde wordt voorafgegaan door een lange hydrofiele volgorde. Dit kenmerk is eveneens opgemerkt voor het pseudora-50 bies virus (PRV) gil (62) en voor het runder herpesvirus 1 (BHV-1) gl gen (63), welke beide eveneens HSV gB homologen zijn. Voorspeld is dat een hydrofoob gebied bestaande uit 45 aminozuren (de aminozuren 826-870) functioneert als een transmembraan ankergebied. Het hydrofiele cytoplasminegebied bevat 110 aminozuren.
Er zijn elf Asn-X-Thr/Ser (waarin X elk aminozuur, uitgezonderd proline kan zijn) plaatsen voor potentiële, 55 met N-verbonden, glycosylering (64). Een ongebruikelijk aspect is dat er eveneens twee potentiële glycosyleringsplaatsen in het cytoplasmische gebied zijn (figuur 6).
Een hydrofieliciteitsgrafiek van de EHV-1 gp14 coderende volgorde is weergegeven in figuur 7. De 195016 10 hydropathie-index van EHV-1 gp14 is berekend met de methode van Kyte en Doolittle (65) met een raam van zeven aminozuren zonder vereffening. De punten onder de horizontale lijn geven oppervlakken met een grotere hydrofobiciteit aan, waarvoor het potentiaal signaal en/of membraan ontspannende gebieden zijn aangegeven. De kenmerken van een membraan omspannend glycoproteïne omvatten signaal- en 5 ankerelementen en het lange hydrofiele gebied dat voor de signaalvolgorde komt zijn aangetroffen voor de EHV-1 gpi4 coderende volgorde.
Lokalisatie van de antigene determinant herkend door het anti-EHV-1 gp14 monoklonale antilichaam, 3F6 Lambda gt11 expressievectoren en monoklonale antilichamen waren bruikbaar voor de identificatie van EHV-1 DNA volgorden coderende voor de belangrijkste EHV-1 glycoproteïnen (3). Een lambda gt11 10 recombinant, 4a1, bleek een EHV-1 gp14 epitoop tot expressie te brengen, herkend door het specifieke, monoklonale antilichaam 3F6 (3). Teneinde de identiteit van dit epitoop te bepalen, werd het EHV-1 DNA aanwezig in 4a1 sequenced en vergeleken met de DNA volgorde van de EHV-1 gp14 coderende volgorde (figuur 6). Ter sequencing werd het DNA fragment overeenkomende met het EHV-1 gp14 epitoop in het λ gt11 recombinant 4al herkend door anti-EHV-1 gp14 monoklonaal 3F6 (3) 4al gedigereerd met EcoRI, het 15 EHV-1 fragment geïsoleerd op agarosegelen en gebonden aan de EcoRI plaats van p(JC8. DNA sequencing werd op de hiervoor beschreven wijze uitgevoerd met de M13 universele voorwaartse en reverse primers.
Uit de nucleotidevolgordenj blijkt dat dit epitoop aanwezig was binnen het gebied van de 66 aminozuren overeenkomende met 107 (Thr) - 172 (Val) van het gededuceerde primaire translatieproduct. Het epitoop is 20 dus binnen het amino-eindstandige gedeelte van het gededuceerde EHV-1 gp14 oppervlaktegebied geplaatst.
Vergelijking van de EHV-1 gp14 aminozuurvolgorde met andere herpesvirus glycoproteïnen Vergelijking van de aminozuursamensteiling van het EHV-1 gp14 gen openbaarde een grote homologie met 25 glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo is het EHV-1 gp14 homoloog met gil van PRV (62), gl van BHV-1 (63), gil van het varicella-zoster virus (VZV) (66), gB van het herpes simplex virus (HSV) (67,71,72) evenals met glycoproteïnen in het Epstein-Barr virus (EBV) (68) en humaan cytomegalovirus (HCMV) (10).
Oligonucleotide-gerichte mutagenese van het 5'-eindstandige gedeelte van de EHV-1 gpl4 coderende 30 volgorde
Onder verwijzing weer naar figuur 5, werd plasmide Blue (Knpl/BamHI) gevormd door invoeging van een Kpnl/BamHI fragment uit pUC (BamHI-a/EcoRI) in het plasmide Bluescript SK+ gedigereerd met Kpnl/ BamHI. Oligonucleotide gerichte mutagenese werd uitgevoerd volgens een modificatie van de werkwijze van Kunkel (17) onder toepassing van uracilbevattende DNA matrijzen uit plasmide Blue (Kpnl/BamHI) gevormd 35 in de dut ung gastheer E. coli stam CJ236. In het gemutageniseerde plasmide werd een Nsil plaats bij codons 1 en 2 van het EHV-1 gp14 gen gevormd, waarbij de volgorde ATG/TCC (Met/Ser) werd veranderd in ATG/CAT (Met/His). De gemuteerde volgorde werd bevestigd met DNA sequence analyse. Het Kpnl/ BamHI fragment uit de mutant werd overgebracht naar met Kpnl/BamHI gedigereerd pUC18 onder vorming van het plasmide pUC (Kpnl/BamHI).
40 Een plasmide, pUCg14, dat het volledige EHV-1 gp14 gen met de Nsil plaats mutatie bevatte werd gevormd door invoeging van het EcoRI/BamHI fragment uit pUC (Kpnl/BamHI) en met EcoRI/BamHI gedigereerd pUC (BamHI/Pstl),een 3,9 Kb subkloon van pUC (BamHI-i).
Constructie van het chimere donorplasmide pVM2LH6g14 45 pMP409DVC werd geknipt met Bglll en verbonden met synthetisch, dubbelstrengs DNA dat de gemodificeerde vaccinia H6 (vroeg/laat) promotor bevatte, beschreven in voorbeeld 1, geflankeerd door restrictie-plaatsen. De restrictieplaatsen voor Nsil, Sacl, Pstl en EcoRI werden onmiddellijk stroomafwaarts van het endogene initiatiecodon in de H6 promotor gevormd. In pMG11 is de polylinkervolgorde stroomafwaarts van de H6 promotor ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. De unieke Nsil plaats, bevattende het 50 H6 initiatiecodon (onderstreept), wordt onmiddellijk gevolgd door de unieke Sacl, Pstl en EcoRI plaatsen.
Het EcoRI/Nsil DNA fragment uit pUCg14 bevattende het EHV-1 gebied stroomafwaarts van de EHV-1 gp14 initiatiecodon werd vervangen door het EcoRI/Nsil fragment uit plasmide pMG11, aldus vormende plasmide pMRHg14, dat de rechter arm van vaccinia Hindill M, de H6 promotor en de volledige lengte van het EHV-1 gp14 gen bevat. Het Hpal/Pstl EHV-1 gp14 bevattende fragment van het plasmide pMRHg14 55 werd overgebracht naar het vectorplasmide pMG11 geknipt met Hpal/Pstl, onder vorming van plasmide pVM2LH6g14. pVM2LH6g14 bevat de volledige EHV-1 gpl4 coderende volgorde (met codon 2 veranderd van TCC (Ser) in CAT (His) zoals is aangegeven en ongeveer 1,2 Kb EHV-1 DNA stroomafwaarts van het 11 195016 EHV-1 gpl4 gen) onder de controle van de H6 promotor, ingevoegd in een rechts tot links oriëntatie met betrekking tot flankerende vacciniavolgorden ten opzichte van het vacciniagenoom met als doelwit het invoegen van het EHV-1 gp14 gen op de M2L plaats.
Recombinatie werd uitgevoerd onder toepassing van vP458 als reddend virus en pVM2LH6g14 als 5 donorplasmide. Kleurloze plaques werden uitgezocht en geanalyseerd op de aanwezigheid van EHV-1 gp14 coderende volgorden onder toepassing van een specifieke EHV-1 gp14 probe gelabeld met “P. Na herhaald plaque-kloneren werd de vaccinia recombinant aangeduid met vP577.
Truncatie van de EHV-1 gp14 hydrofiele aanloopseguencies
Onder toepassing van variaties van de mutagenese en kloningsmanipulaties, zoals hiervoor is beschreven, 10 werd chimeer donorplasmide pVM2LH6g14-1 geconstrueerd. Ter verkrijging van pVM2LH6g14-1, dat een deletie van de codons 2-34 van EHV-1 gp14 met de substitutie van vier codons, bevat, werd in vitro mutagenese (17) uitgevoerd op plasmide Blue (Kpnl/BamHI), onder vorming van een Nsil plaats in codons 32-34 in plaats van in codons 1 en 2. Het Nsil/BamHI fragment uit het nieuw gemutageniseerde Blue (Kpnl/BamHI) plasmide werd gesubstitueerd voor het Nsil/BamHI fragment in pVM2LH6g14. Veelvuldige 15 Nsil linkers (New England Biolabs, Beverly, MA) werden gebonden op de Nsil plaats, teneinde het oorspronkelijke ATG in frame te brengen met de rest van de EHV-1 gp14 coderende volgorde. Het uiteindelijk verkregen plasmide, pVM2LH6g14-1, bevat de volgorde ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/ GCT....coderende voor Met/His/Ala/-Cys/lle/Ala......waarin GCT (Ala) is codon 35 van EHV-1 gp14. De rest van het pVM2LH6g14-1 is identiek aan dat in pVM2LH6g14.
20 Het vaccinia recombinant vP613 werd verkregen door recombinatie met het reddend virus vP548 en het donorplasmide pVM2LH6g14-1.
Voorbeeld 3
Constructie van vaccinia virus recombinanten vP633 en vP634 die elk het paard herpesvirus gp13 en gp14 25 glycoproteïne tot expressie brengen .......
Teneinde vaccinia recombinanten te vormen die zowel gp13 als gp14 EHV-1 glycoproteïnen tot expressie brengen, werd de recombinatie uitgevoerd met vP577 of vP613 als reddend virus en het donorplasmide pVHA6g13 (beschreven in voorbeeld 1) dat het EHV-1 gp13 gen onder de controle van de vaccinia H6 promotor ingevoegd op de HA deletieplaats van vaccinia bevat. Het invoegen van de EHV-1 gp13 volgorden 30 in recombinantvirussen werd geïdentificeerd door in situ DNA hybridisatie (25,28). Recombinatie van pVHA6g13 met vaccinia virus recombinant vP577 (bevattende EHV-1 gp14 in volle lengte) vormde de dubbele vaccinia virus recombinant vP633 ; recombinatie met vP613 (bevattende het truncated EHV-1 gp14) vormde de dubbele vaccinia recombinant vP634. De vaccinia virus dubbele recombinanten vP633 en vP634 werden in plaque gekloond en de aanwezigheid van zowel EHV-1 gp13 als gpl4 coderende 35 volgorden werden bevestigd door DNA hybridisatieanalyse en door expressieonderzoekingen (zie hierna).
Immunoprecipitatie van EHV-1 gp13 en gp14 glycoproteïnen tot expressie gebracht in vaccinia virus recombinanten.
Ter bepaling van de EHV-1 gp13 en gp14 glycoproteïnen tot expressie gebracht door vaccinia virus 40 recombinanten, werden VERO cellen geïnfecteerd met de recombinanten en eiwitten metabolisch gemerkt met 35S-methionine en, zoals beschreven in voorbeeld 1, geïmmunoprecipiteerd. Het specifieke monoklo-nale antilichaam voor EHV-1 gp13 (14H7) of EHV-1 gp14 (3F6) (3) werd in een verdunning van 1:1000 gedurende 4 uur gebonden bij kamertemperatuur. Monsters werden geanalyseerd door SDS polyacrylamide gelelektroforese op een 10 % polymeergel bij 30 mA (constante stroom) gedurende ongeveer 6 uur.
45 Autoradiogrammen werden gemaakt.
Geen belangrijke producten werden geïmmunoprecipiteerd door het specifieke anti-EHV-1 gp13 monoklonale 14H7 (3) of door het specifieke anti-EHV-1 gp14 monoklonale 3F6 (3) uit hetzij niet geïnfecteerde VERO cellen of VERO cellen geïnfecteerd met het controle hemagglutinine minus vaccinia virus vP452 (184). Met EHV-1 gp13 geradiolabelde producten werden neergeslagen met monoklonaal 14H7 uit 50 VERO cellen geïnfecteerd met vP483, een vaccinia recombinant die slechts het EHV-1 gp13 tot expressie brengt of de vaccinia virus dubbele recombinanten die zowel EHV-1 gp13 met hetzij intact gp14, vP633, hetzij getrunceerd gp14, vP634 tot expressie brengt. Er zijn twee producten van ongeveer 44 en 47 kDa die kunnen worden aangetoond, die enigszins kleiner zijn dan het voorspelde primaire translatieproduct (51 kDa) en een groter product van ongeveer 90 kDa dat overeenkomt met een volledig geglycosyleerde vorm 55 van het EHV-1 gp13 genproduct. Het is belangrijk dat de kwaliteit en kwantiteit van de expressie van EHV-1 gp13 niet wordt beïnvloed door co-expressie van een van de vormen van EHV-1 gp14 in de vaccinia dubbele recombinanten vP633 en vP634.
195016 12 VERO cellen werden geïnfecteerd met respectievelijk vP633, vP634, vP613 en vP577 en geïmmunopre-cipiteerd met het specifieke anti-EHV-1 gp14 monoklonale 3F6 (3). Met vP633 (bevattende gp14 met volle lengte plus gp13) en met vP577 (bevattende gp14 met volle lengte), werden hoofdbanden bij ongeveer 34, 47, 60-64 en 90 kDa waargenomen; terwijl met vP634 (bevattende truncated gp14 plus gp13) en met 5 vP613 (bevattende truncated gp14) hoofdbanden bij 34, 47, 57, 72-82 en 116 kDa werden waargenomen. Ook nu weer werden geen significante verschillen bij de synthese van EHV-1 gp14 van elke vorm tijdens de co-expressie met EHV-1 gp13 waargenomen.
Immunofluorescentieanalyses van EHV-1 gp13 en gp14 producten gesynthetiseerd door recombinant 10 vaccinia virussen
Immunofluorescentie van met recombinant vacciniavirus geïnfecteerde VERO cellen werd uitgevoerd op de wijze als beschreven in voorbeeld 1, onder toepassing van EHV-1 gp13 of gp14 specifieke monoklonale antilichamen.
EHV-1 gp13 kon gemakkelijk worden aangetoond op het oppervlak van VERO cellen geïnfecteerd met 15 de vaccinia recombinanten vP483, vP633 en vP634 evenals intem na fixatie met aceton. Geen significante interne of oppervlakimmunoreactiviteit ten opzichte van gp13-specifieke antilichamen werd aangetroffen in met vP410, vP577 of vP613 geïnfecteerde cellen. Expressie van EHV-1 gp14 kon makkelijk worden aangetoond in met aceton gefixeerde VERO cellen geïnfecteerd met de vaccinia recombinanten vP577, vP613, vP633 en vP634. Geen significante interne immunofluorescentie ten opzichte van gp14-specifieke 20 antilichamen werd gevonden bij met vP410 of vP483 geïnfecteerde cellen. Onder toepassing van gp14-specifieke, monoklonale antilichamen, 3F6, werd een zwakke oppervlak immunofluorescentie waargenomen in cellen geïnfecteerd met vP613 of vP634, die de truncated vorm van EHV-1 gp14 tot expressie brengen en geen significante oppervlakrespons boven de controle virussen vP410 en vP483 werd verkregen met de recombinant vaccinia virussen vP577 en vP633, welke het EHV-1 gp14 gen met volle lengte tot expressie 25 brengen (zie eveneens voorbeeld 8).
Voorbeeld 4
Immunisatie van guinese biggetjes met de vaccinia recombinant vP483
Ter bepaling van de immunogeniciteit van het gp13 paard herpes virus genproduct tot expressie gebracht 30 door de vaccinia recombinant vP483, werden guinese biggetjes ingeënt met het virus en de aanwezigheid van serum neutraliserende antilichamen tegen zowel vaccinia virus als runder herpesvirus werd onderzocht.
Men verdeelde 15 guinese biggetjes met een gewicht van ongeveer 450 gram in groepen van vijf. Eén groep ontving 1 ml van de vaccinia recombinant (lO^CID,*, /ml) op dag 0 gevolgd door een 1 ml booster op dag 21 door subcutane injectie. De tweede groep ontving overeenkomstige inentingen doch met vaccinia 35 vP452 (10eTCIDso /ml). De derde groep werd niet gevaccineerd. Men nam voor de eerste vaccinatie en op de dagen 21 en 35 bloed van alle guinese biggetjes af. Men bereidde sera en onderzocht op de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen van zowel vaccinia als EHV-1 (stam Kentucky), onder toepassing van 50 TCICso virus onderzocht met varkens testiculaire cellen.
Zoals uit tabel 1 blijkt wekt de EHV-1 gp13 vaccinia recombinant vP483 een duidelijke seroconversie bij 40 guinese biggetjes op. Serum neutraliserende titers verkregen met vaccinia virus zijn aangegeven tussen haken in tabel 1. Zowel vaccinia als EHV-1 serum neutraliserende antilichamen kunnen 21 dagen na de eerste injectie worden aangetoond en een significante toename van de titer van serum neutraliserende antilichamen wordt twee weken na een tweede inenting van virus op dag 21 verkregen. Er wordt op gewezen dat de serum vaccinia neutraliserende titers verkregen bij guinese biggetjes die zijn ingeënt met 45 het recombinantvirus dat EHV-1 gp13 tot expressie brengt significant hoger zijn (t = 7,2) dan de titers verkregen uit guinese biggetjes die met het vaccinia vP452 zijn ingeënt.
TABEL 1 50 Serum neutraliserende antilichamen die aanwezig zijn in guinese biggetjes die zijn ingeënt met hetzij een vaccinia recombinant die EHV-1 gp13 tot expressie brengt of een controle vaccinia virus, vP452
Serum neutraliserende titer (log10) op de dagen 55 Entvirus Dier 0 21 35 no.
13 195016 TABEL 1 (vervolg)
Serum neutraliserende antilichamen die aanwezig zijn in guinese biggetjes die zijn ingeënt met hetzij een vaccinia recombinant die EHV-1 gp13 tot expressie brengt of een controle vaccinia virus, vP452 5 -
Niet-gevaccineerd 26 0,24 (0,35) - 0,24 (0,70)
Controles 27 0,24 (0,35) - 0,56 (1,05) 28 0,24 (0,35) - 0,80 (0,70) 29 0,24 (0,35) - 0,40 (0,70) 10 30 0,24 (0,35) - 0,32 (0,35)
Controle 191 0,24 (0,35) 0,36 (0,47) 0,72 (1,75)
Vacciniavirus 192 0,24 (0,35) 0,21 (0,93) 0,24 (2,30) VP452 193 0,24 (0,35) 0,48 (0,58) 194 0,24 (0,35) 0,24 (0,82) 0,24 (2,10) 15 195 0,24 (0,35) -
Recombinant 186 0,24 (0,35) 0,48 (1,28) 1,20 (2,57)
Vaccinia- 187 0,24 (0,35) 0,72 (1,63) 1,68 (2,57) virus VP483 188 0,24 (0,35) 0,24 (1,52) 1,68 (2,57) 189 0,24 (0,35) 0,36 (1,40) 1,56 (2,22) 20 190 0,24 (0,35) 0,48 (1,63) 1,56 (3,00)
Voorbeeld 5
Immunisatie van guinese biggetjes met de vacciniarecombinanten vP577 en vP613 25 Guinese.biggetjes werden geïmmuniseercLter beoordeling van hun respons tegen EHV-1 gp14 tot expressie gebracht door de vaccinia recombinanten vP577 en vP613. Guinese biggetjes met een gewicht van ongeveer 450 gram ontvingen 10s TCID^, van vP577 of vP613 vaccinia recombinant via de sub-cutane weg, 1 ml op dag 0 en dag 21. Men nam op de dagen 0, 21 en 35 bloed van de guinese biggetjes af, bereidde sera en onderzocht deze op EHV-1 antilichamen. De neutralisatieproeven werden uitgevoerd op 30 varkens testiculaire cellen tegen 50 TCIDS0 van het EHV-1 virus, stam Kentucky. De vaccinia antilichamen werden getitreerd met ELISA onder toepassing van een anti IgG peroxydaseconjugaat.
De resultaten zijn weergegeven in tabel 2. Er werd geen serum neutraliserende werking tegen EHV-1 verkregen bij guinese biggetjes geïmmuniseerd met de vaccinia recombinant vP577 die de gehele lengte van het EHV-1 gp14 gen bevat (geen gegevens vermeld). Aan de andere kant induceerden guinese 35 biggetjes geënt met het recombinant vaccinia virus, vP613, een truncated EHV-1 gp14 gen tot expressie brengend, overeenkomstige spiegels van EHV-1 serum neutraliserende antilichamen (tabel 2), zoals de vaccinia recombinant, vP483, EHV-1 gp13 tot expressie brengend (tabel 1). Hoewel EHV-1 serum neutraliserende antilichamen drie weken na de eerste infectie kunnen worden gedetecteerd, wordt een significantere spiegel twee weken na de tweede Immunisatie waargenomen (tabel 2). Bij alle geïmmuni-40 seerde dieren werden responsen waargenomen indien vaccinia antilichamen werden onderzocht met ELISA.
TABEL 2
Serum neutraliserende antilichamen aanwezig in guinese biggetjes ingeënt met een vaccinia recombinant 45 die EHV-1 gp14 tot expressie brengt
Serum neutraliserende titer (log10) op de dagen
Entvirus 0 21 35
Recombinant vaccinia virus 0,4 0,7 1,3 50 VP613 0,2 0,7 1,2 0,2 0,7 1,7 0,2 1,1 1,6 0,2 1,0 1,6
Niet gevaccineerde 0,2 - 0,4 55 controle’s 0,6 - 0,4 0,7 - 0,8 195016 14 TABEL 2 (vervolg)
Serum neutraliserende antilichamen aanwezig in guinese biggetjes ingeënt met een vaccinia recombinant die EHV-1 gp14 tot expressie brengt 5 - 0,6 - 0,2 ------- 0,4 - 0,4 10 Voorbeeld 6
Bescherming van gevaccineerde hamsters tegen provocatie met EHV-1
Ter bepaling van de doeltreffendheid van het vaccinia recombinant vP483 dat EHV-1 gp13 tot expressie brengt werd aan hamsters een primaire of primaire plus booster vaccinatie toegediend en ze werden, tezamen met een niet-ingeënte controlegroep of een groep die tweemaal met een controle vaccinia virus, 15 vP452, waren ingeënt, intraperitoneaal geprovoceerd met een hamster aangepaste Kentucky stam van EHV-1.
Men scheidde 40 Syrische hamsters (40 dagen oud met een gewicht tussen 55 en 65 gram) in vier groepen. Groep A ontving een enkele, subcutane (1 ml) inenting van 10®, 10® of 104 TCID,*, van de vaccinia recombinant vP483, vijf dieren per dosis. Groep B werd gevaccineerd met vP483 op dag 0 gevolgd 20 door een booster op dag 14. De (1 ml) primaire en booster doses werden subcutaan toegediend aan groepen van 5 dieren onder toepassing van 10®, 10® of 104 TCIC,*,. Groep C bestond uit 5 hamsters en deze dieren ontvingen twee sub-cutane injecties (10® TCIC^ per injectie) op de dagen 0 en 14 van vaccinia vP452. Vijf hamsters in groep D werden als niet-gevaccineerde controles gehouden. Alle hamsters ontvingen 200 LD^, van een hamster aangepaste Kentucky stam van EHV-1 via de intraperitoneale weg 25 14 dagen na de laatste immunisatie. Overlevenden werden 7 dagen na de provocatie geteld.
De resultaten zijn weergegeven in tabel 3. Alle niet-gevaccineerde en met vaccinia vP452 virus gevaccineerde hamsters stierven binnen 5 dagen provocatie.
TABEL 3 30 -
Bescherming van hamsters gevaccineerd met vaccinia recombinant, EHV-1 gp13 tot expressie brengend, tegen EHV-1 provocatie
Vaccinerend virus 35 Recombinant vaccinia vP483 Controle vaccinia vP452 Geen virus
Primaire Booster Booster
Vaccinerende dosis log10 TCID50 8 6 4 8 6 4 8
Hoeveelheid 4 1 2 5 2 0 0 0
Overlevenden 555 555 5 5 40 -
Significante spiegels van een bescherming tegen EHV-1 provocatie werden waargenomen bij hamsters die gevaccineerd waren met de vaccinia recombinant vP483 die EHV-1 gp13 tot expressie brengt. Er werden geen significante verschillen In de beschermingsspiegels waargenomen bij hamsters geïmmuniseerd met 45 primaire of primaire plus booster doses. De beschermende dosis (PD,*,) was gelijk PDso = 6,32 log10 voor primaire en 6,12 log10 voor primaire plus booster. Desalniettemin werd een 100 %-ige bescherming slechts waargenomen in de groep die twee doses 10® TCID^, recombinant virus ontvingen.
Teneinde het beschermende effect van een vaccinia virus recombinant die EHV-1 gp14 alleen of in combinatie met EHV-1 gp13 tot expressie brengt, werden provocatieonderzoekingen op ingeënte hamsters 50 uitgevoerd. Men entte 20, één dag oude, Syrische hamsters met een gewicht van ongeveer 60 gram elk subcutaan in met 1 ml controle vaccinia virus of met recombinant vaccinia virussen vP483, vP577, vP613, vP633 en vP634 die EHV-1 gp13 en/of gp14 tot expressie brengen. De eerste vaccinatie werd gevolgd door een identieke vaccineringsdosis (pfu/ml (log10)) op dag 14.
Alle hamsters, waaronder niet ingeënte controles, werden 14 dagen na de laatste immunisatie geprovo-55 ceerd met een intraperitoneale injectie van 200 LD.*, van een EHV-1 hamster geadapteerde Kentucky stam. De overlevenden van de groepen van vijf dieren werden 14 dagen na de provocatie, op welk moment het onderzoek werd beëindigd, berekend. De dosis entstof die 50 % bescherming van de hamsters geeft werd 15 195016 berekend als log10 TCID^/ml entstof.
Zoals uit tabel 4 blijkt zal de vaccinia virus recombinant vP577, die het EHV-1 gp14 gen met volledige lengte tot expressie brengt, de hamsters niet tegen provocatie met een PD^, berekend < 9,0 log10 beschermen. Aan de andere kant gaf het truncated EHV-1 gp14 gen, zoals door de vaccinia recombinant 5 vP613 tot expressie gebracht, een goede bescherming bij provocatie (tabel 4). De berekende PD^ is wat beter (5,2) dan die verkregen met de EHV-1 gp13 tot expressie brengende vaccinia recombinant, vP483 (6,1). Verrassenderwijze gaf de co-expressie van EHV-1 gp13 en gp14, zowel het gp14 gen met volledige lengte als het truncated gp14 gen, in respectievelijk de vaccinia virus recombinanten vP633 en vP634, een aanzienlijk betere beschermende werking vergeleken met die van het EHV-1 glycoproteïne dat alleen tot 10 expressie is gebracht. De hoeveelheid virusentstof ter verkrijging van een 50 %-ige bescherming van de gevaccineerde hamsters daalde dus sterk indien EHV-1 gp13 en gp14 samen in dezelfde vaccinia virus recombinant tot expressie werden gebracht.
TABEL 4 15 -----
Bescherming van hamsters gevaccineerd met de vaccinia recombinanten, EHV-1 gp13 en/of gp14 tot expressie brengend, tegen EHV-1 provocatie
Entstof EHV-1- Vaccinatiedosis/Overievenden PDS0 20 proteïnen vP483 gp13 8/5 6/2 4/0 6,1
Geen - 0/0 VP577 gp14 8/1 6/0 4/0 >9,0
Geen 0/0 - 25 _vP613- gp141 8,4/5 6,4/5 4,4/1 5,2 vP633 gp13+ 8/5 6/3 4/4 4,3 9P14 vP634 gp13 + 7,6/5 5,6/5 3,6/5 <3,6 gp141 30 Vaccinia - 8/0 - >9,0
Geen -0/1--- vP613 en vP634 brengen de truncated versie van EHV-1 gp14 tot expressie.
35
Voorbeeld 7
Constructie van vogelpokkenvirus recombinanten die het paard herpesvirus gp13 glycoproteïne tot expressie brengen
Onder verwijzing nu naar figuur 8, werd pVHA6g13 toegepast als bron van het EHV-1 gp13 gen. Ter 40 isolering van het DNA segment dat het volledige EHV-1 gp13 gen bevat werd pVHA6g13 gedigereerd met Nrul en Hindlll. Een fragment van ongeveer 1,8 Kb bevattende 28 bp van het 3' uiteinde van de vaccinia virus H6 promotor, het volledige EHV-1 gp13 gen en ongeveer 410 bp van vaccinia virusvolgorden werd door deze digerering gevormd. Het 1,8 Kb Nrul/Hindlll fragment werd geïsoleerd voor het invoegen in de vogelpokkenvirusinvoegvectoren pFPCV2 en pCPCVI.
45 De hoenderpestvirus (FP) invoegvector pFPCV2 verschaft een drager voor de vorming van recombinanten die vreemde genen in een niet-essentieel gebied van het FP genoom aangeduid met het f7 gebied bevat. pFPCV2 werd gevormd uit pRW731.13. Het plasmide pRW731.13 bevat een FP genomisch Pvull fragment van ongeveer 5,5 Kb ingevoegd tussen de twee Pvull plaatsen van pUC9. In het begin werd een veelvoudige kloningsvolgorde (MCS) gebonden aan de unieke Hindi invoegplaats in dit 5,5 Kb Pvull FP 50 genomische fragment. De MCS werd verkregen door annealing oligonucleotiden CE4 (5'- TCGCGAGAATTCGAGCTCGGTACCGGGGAT CCTCTGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGTT-3') en CE5 (5'- AACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTAGAGGATCCCCGGTACCGA GCTCGAATTCTCGCGA-3'). Het plasmide dat de MCS bevatte werd aangeduid met pCE11.
pFeLVIA is een derivaat van de vaccinia invoegvector pTP15 (184) (figuur 3),waarin het kat leukemie-55 virus (FeLV) env gen (192) is ingevoegd in de Pstl plaats stroomafwaarts van de H6 promotor. Voor het overbrengen van de 2,4 kb expressiecassette naar een FP vector (figuur 8) werden de H6/FeLV env volgorden weggenomen uit pFeLVI A door digereren met Bglll en partieel digereren met Pstl. De Bglll plaats 195016 16 bevindt zich op de 5' grens van de H6 promotorvolgorde. De Pstl plaats is 420 bp stroomafwaarts van het translatie terminatiesignaal voor het FeLV envelop glycoproteïne open afleesframe geplaatst.
De 2,4 Kb H6/FeLV env volgorde werd ingevoegd in pCE11 gedigereerd met BamHI en Pstl. Dit plasmide werd aangeduid met pFeLVFI. Het pFeLVFI plasmide werd daarna gedigereerd met Pstl ter 5 verwijdering van de FeLV env volgorden. Het verkregen plasmide dat de vaccinia virus H6 promotor in pCE11 bevatte werd met pFPCVI aangeduid. De volgorden 5' tot de promotor werden gemutageniseerd (19) ter verwijdering van vreemde volgorden, onder toepassing van oligonucleotide FPCV1 (5'-CAGTAATACACGTTATTGCAGAGA GGACCATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3') ter verkrijging van pFPCVI. Het 3' gebied naar de promotor (veelvoudige kloningsplaats) werd gemutageniseerd met 10 oligonucleotide FPCV3 (5'-TAGAGT CGACCTGCAGGCATCCAAGCTTGTTAACGAC-3') ter verwijdering van de Sphl plaats die een ATG bevat. Het verkregen plasmide werd met pFPCV2 aangeduid.
Het hiervoor gedefinieerde 1,8 Kb Nrul/Hindlll EHV-1 gp13 fragment werd ingevoegd in het 8, 0 Kb Nrul/ Hindlll fragment, verkregen door digereren van pFPCV2. Dit 8,0 Kb Nrul/Hindlll fragment bevatte het 5' gedeelte van de vaccinia virus H6 promotor (100 bp), de FP flankerende volgorden (4,8 Kb stroomopwaarts 15 en 1,5 Kb stroomafwaarts van de invoegplaats) en 2,4 Kb pUC (BRL, Bethesda, MD). Ligatie van deze twee fragmenten leidde tot de vorming van een 9,8 Kb plasmide aangeduid met pFPEHV13A. Het plasmide pFPEHVI 3A werd daarna gedigereerd met Kpnl en Hindlll ter verwijdering van een ongeveer 600 bp fragment. Dit fragment bevatte het 3' meeste gebied van het EHV-1 gp13 gen (200 bp) en het 410 bp vacciniavirus DNA segment. Het 600 bp Kpnl/Hindlll fragment werd op de volgende wijze vervangen door 20 een 200 bp fragment afgeleid van pNSIENPN (figuur 3). Een Pstl digerering van pNSIENPN maakte het plasmide lineair. De Pstl eindstandige gedeelten werden blunt-ended door het T4 DNA polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) in aanwezigheid van dNTPs (0,5 mM elk). Daarna werden Hindlll linkers (BRL, Bethesda, MD) verbonden tot het blunt-ended fragment. Na digereren met Hindlll werd het lineair gemaakte plasmide gedigereerd met Kpnl, waardoor een 200 bp fragment bevattende het 3' gedeelte van 25 het EHV-1 gp13 gen werd verkregen, waarbij de volgorde die overeenkomt met het terminatiecodon (TAG) en het TTTTTNT sequence-motief bekend staat als een vaccinia virus vroeg transcriptie terminatiesignaal (45). Het recombinant plasmide werd aangeduid met pFPEHV13B en werd toegepast bij de in vitro recombinatie voor het invoegen van het H6 promoted EHV gp13 gen op de f7 plaats van het FP genoom. Het recombinant vogelpokkenvirus werd aangeduid met vFP44.
30 Onder verwijzing naar figuur 9, wordt opgemerkt dat pFPEHV13B eveneens werd toegepast ter verkrijging van een 1,4 Kb Nrul/Hindlll fragment voor het invoegen in pCPCVI. Het pCPCVI plasmide bevat de vaccinia virus H6 promotor op de unike EcoRI plaats in het 3, 3 Kb Pvull kanariepokkenvirus (CP) genomische fragment. Dit invoegplasmide maakt het invoegen van vreemde genen op de C3 plaats van het CP genoom mogelijk. pCPCVI werd verkregen uit pRW764.2, dat een 3,3 Kb Pvull CP genomisch fragment 35 ingevoegd in een pUC vector bevat. pRW764.2 werd lineair gemaakt door digereren met EcoRI. Dit fragment werd blunt-ended onder toepassing van het Klenow-fragment van het E. coli DNA polymerase (Boehringer Mannheim Biochemicais, Indianapolis, IN) in aanwezigheid van dNTPs (0,5 mM elk). Vaccinia virus H6 promotorvolgorden en een multipel kloningsgebied geplaatst 3' van de promotor werden door digereren met Kpnl/Hpal verwijderd uit pFPCVI. Dit 200 bp fragment werd blunt-ended met T4 DNA 40 polymerase In de aanwezigheid van dNTPs (0,5 mM elk) en ingevoegd in het lineair gemaakte blunt-ended plasmide pRW764.2. Het verkregen plasmide werd aangeduid met pCPCVI. Het plasmide pCPCVI werd gedigereerd met Nrul en Hindlll en het 5,8 Kb fragment werd geïsoleerd voor binding met het hiervoor beschreven 1,4 Kb EHV gp13 bevattende fragment. Het verkregen plasmide werd aangeduid met pCPEHV13A. Dit plasmide werd bij in vitro recombinantie-experimenten toegepast voor het invoegen van 45 het H6 promoted EHV gp13 gen in het C3 gebied van het CP genoom. Het recombinant kanariepokkenvirus werd aangeduid met vCP48.
Na de in vitro recombinatie, werd recombinant vogelpokkenvirus bevattende het EHV-1 gp13 gen geïdentificeerd met een standaard plaque hybridisatie-onderzoek. Positieve plaques werden gezuiverd door drie cycli van plaque isolatie, gevolgd door hybridisatie-analyses. Recombinanten werden aangeduid met 50 respectievelijk vFP44 en vCP48 voor FP en CP recombinanten. Beide recombinanten werden geanalyseerd onder toepassing van een Protein A-B-galactosidase immunoscreen assay met een monokionaal antiserum voor EHV-1 gp13. Uit de resultaten blijkt dat CEF en VERO celmonolagen geïnfecteerd met vFP44 of vCP48 het EHV-1 gp13 op het oppervlak van met virus geïnfecteerde cellen tot expressie brengen.
17 195016
Voorbeeld 8
Beoordeling van extra vaccinia virus recombinanten die ongemodificeerde en gemodificeerde versies van het gen uit paard herpes virus-1 coderende voor glycoproteïne gp14 tot expressie brengen Constructie en beoordeling van extra recombinant vaccinia virus dat EHV-1 gp14 tot expressie brengt. De 5 EHV-1 gp14 bevattende constructies (voorbeeld 2) werden op drie wijzen gemodificeerd: (a) variëren van de lengte van de EHV-1 gpl4 aanloopsequentie, (b) verwijdering van de overmaat EHV-1 DNA 3' uit het gen en (c) invoeging van de gemodificeerde versies van het EHV-1 gp14 gen in een vaccinia virus vP293 gastheertraject selectiesysteem (69) voor de beoordeling.
Het EHV-1 gp14 genproduct bevat een ongewoon lange aanloopsequentie. Een lange hydrofobe 10 volgorde die zich uitstrekt over de aminozuren 56-99 wordt voorgesteld als signaalsequentie. Dit gebied wordt voorafgegaan door een lange hydrofiele volgorde. Een overeenkomstig lange aanloopsequentie werd eveneens gevonden voor twee andere gB homologen, pseudorabies virus gil (62) en runder herpesvirus 1 gl (63).
15 Modificatie van het 5' uiteinde van EHV-1 gp14
Ter bestudering van het effect van de lengte van de aanloopsequentie van EHV-1 gp14 bij het verwerken, aanbieden en voor de immunologische werking van het gp14 product tot expressie gebracht in recombinant vaccinia virus, werden plasmiden die het EHV-1 gp14 gen met drie verschillende lengten van de aanloopsequentie geconstrueerd door modificeren van het vroegere EHV-1 gp14 bevattende constructies, hetgeen 20 op de volgende wijzen geschiedde.
Onder verwijzing naar figuur 10, bevat het plasmide pVM2LH6g14 (voorbeeld 2) de volledige EHV-1 gp14 coderende volgorde onder de controle van de H6 promotor ingevoegd in de Kopenhagen vaccinia M2L deletieplaats. In pVM2LH6g14 is aminozuurgetal 2 van het EHV-1 gp14 gen eerder aanwezig als His dan het natieve Ser. Ter verandering van aminozuur 2 in Ser, werd pVM2LH6g14 geknipt met Nsil (herkennings-25 volgorde ATGCAT) bij codons 1-2 (Met/His). Mutagenese werd uitgevoerd (19) onder toepassing van het synthetische oligonucleotide MPSYN240 (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCTGTC 3'). Het verkregen plasmide, pMP14M, bevat het volledige EHV-1 gp14 gen met het natieve codon (Ser) op plaats 2. 1
Het plasmide pVM2LH6g14-1 (voorbeeld 2) is identiek aan pVM2LH6g14, behalve een truncatie van de 30 aanloopsequentie en invoering van vier codons afgeleid van synthetische Nsil linkers. In pVM2LH6g14-1 is de volgorde van het 5' truncated uiteinde van het EHV-1 gp14 gen ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT... coderende voor Met/His/Ala/Cys/lle/Ala..., waarin GCT (Ala) codon 35 is van EHV-1 gp14. pVM2LH6g14-1 werd gemodificeerd door mutagenese (19) op twee manieren. Ter verkrijging van een versie van het gp14 gen truncated in ongeveer dezelfde mate als pVM2LH6g14-1, doch nauwkeuriger benaderende de natieve 35 gp14 volgorde, werd pVM2LH6g14-1 geknipt met Nsil bij de codons 1-2. Mutagenese werd uitgevoerd onder toepassing van het synthetische oligonucleotide MPSYN241. (5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTGTCCCAGCAGCTGGCTCCTG GATC 30
In het verkregen plasmide, pMP14M-34 begint de EHV-1 gp14 coderende volgorde met ATG/AGT/GTC/ j
CCA... Met/Ser/Val/Pro..., waarin CCA (Pro) aminozuur 36 van EHV-1 gp14 is. Het EHV-1 gp14 gen bevat J
40 een Nael plaats (GCCGGC) bij de codons 61 - 63 (Lys/Pro/Ala). Ter verkrijging van een meer uitgesproken truncated versie van het EHV-1 gp14 gen, werd pVM2LH6g14-1 lineair gemaakt met Nael, gevolgd door digereren met Nsil en isolatie van vectorfragment uit een agarosegel. Mutagenese werd uitgevoerd onder toepassing van synthetisch oligonucleotide MPSYN243 (5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCATCATCGAGGGTGGGCACAAT AGTT 30 45 In het verkregen plasmide, pMP14M-63, begint de EHV-1 gp14 coderende volgorde met ATG/GCA...Mer/ '
Ala..., waarin GCA (Ala) aminozuur 63 van het natieve EHV-1 gp14 is.
Verwijdering van vreemd EHV-1 DNA
In alle, hiervoor besproken, EHV-1 gp14 bevattende plasmiden werden de EHV-gp14 coderende volgorden 50 gevolgd door ongeveer 1200 bp EHV-1 DNA. Het terminatiecodon (TAA) voor het gp14 gen treedt op in een Dral plaats (TTTAAA). Ter verwijdering van overmaat EHV-1 DNA werd pMP14M-63 onderworpen aan partiële Dral digerering, gevolgd door isolatie van lineair DNA uit een agarosegel en digereren met Pstl, dat knipt bij de verbinding van EHV-1 DNA en de stroomafwaarts gelegen vaccinia flankerende arm. Een 6,5 Kb Dral/Pstl DNA band werd geïsoleerd uit een agarosegel.
55 Synthetische oligonucleotiden MPSYN247 (5' AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA 30 en MPSYN248 (5' GCTCGAGTTAACAAAAATTT 30 werden annealed en verbonden met het 6,5 Kb fragment. In het 195016 18 verkregen plasmide, pMP14M-63P, werden de EHV-1 gp14 coderende volgorden onmiddellijk gevolgd door een volgorde die terminatie van vroege vaccinia transcriptie (45) specificeert, gevolgd door een polylinkerge-bied (bevattende Hpal, Xhol, Pstl restrictieplaatsen) en de linker vaccinia flankerende arm verkregen uit Hindlll M.
5
Invoeging van het H6 promotor/EHV-1 gp14 gen in een pHES/vP293 selectiesysteem In alle hiervoor besproken EHV-1 gp14 bevattende plasmiden bevindt het EHV-1 gp14 gen zich onder de controle van de vaccinia H6 promotor ingevoegd in het M2L deletiegebied van de Kopenhaagse stam van het vaccinia virus. Aangezien de M2L invoegingsplaats binnen een groter gebied van het genoom is 10 geplaatst dan kan worden deleted (69), werd de herplaatsing van de H6 promotor/EHV-1 gp14 expressie-cassette naar een potentieel stabielere invoegplaats onderzocht. Als voorbereidende stap werden EHV-1 gp14 constructies die verschillende lengten van de aanloopsequentie bevatten verplaatst naar het op WR pHES/vP293gebaseerde gastheertraject-selectiesysteem (69) teneinde een snelle vorming van vaccinia recombinanten voor een vergelijkend onderzoek mogelijk te maken.
15 Plasmide pHES-4 bevat de vaccinia H6 promotor, gevolgd door een polylinkergebied en het K1L humaan gastheertrajectgen (70), alle ingevoegd tussen WR vaccinia armen die een 21,7 Kb deletie (69) flankeren. pHES-4 bevat twee Nrul plaatsen, één in de H6 promotor en één in de flankerende vaccinia volgorden. pHES-4 werd door partieel digereren met Nrul lineair gemaakt en de band die lineair DNA met volle lengte bevatte werd uit een agarosegel geïsoleerd. Dit lineaire DNA werd op de Xhol plaats in het polylinkergebied 20 geknipt. pMP14M-63P bevat twee Nrul plaatsen, één in de H6 promotor en de andere in EHV-1 gp14 coderende volgorden, 0,2 Kb van het 3' uiteinde van het gen. pMP14M-63P werd lineair gemaakt met Nrul, gevolgd door digereren met Xhol. Een 2,8 Kb Nrul (partieel)/Xhol fragment werd uit een agarosegel geïsoleerd. Dit fragment bevat een gedeelte van de H6 promotor, gevolgd door de vorm van het gemodificeerde EHV-1 gp14 gen bevattende de kortste versie van de aanloopsequentie. Het 2,8 Kb H6 promotor/ 25 EHV-1 gp14 bevattende fragment afgeleid van pMP14-63P werd verbonden met het Nrul (partiële)/Xhol vectorfragment afgeleid van pHES-4, Het verkregen plasmide, pHES-MP63, bevat de H6 promotor/EHV-1 gp14 gencassette, zonder vreemd EHV-1 DNA. Voor de overdracht van de H6 promotor/RHV-1 gp14 5' uiteinden bevattende de volle lengte of matig truncated aanloopsequenties, werden de plasmiden pMP14M en pMP14M-34 geknipt met Nrul en respectievelijk de 2,8 Kb en 2,7 Kb banden geïsoleerd uit agarosege-30 len. pHES-MP63 werd onderworpen aan partiële Nrul digerering en een 7,2 Kb fragment werd geïsoleerd uit een agarosegel. Het 7,2 Kb vectorfragment komt overeen met pHES-MP63, waaruit het 2,6 Kb Nrul fragment bevattende het H6 promotor/EHV-1 gp14 5' uiteinde was verwijderd. Het 7,2 Kb Nrul (partieel) vectorfragment afgeleid van pHES-MP63 werd verbonden met het 2,8 Kb Nrul fragment uit pMP14M, onder vorming van pHES-MP1. Het 7,2 Kb Nrul (partiële) vectorfragment afkomstig van pHES-MP63 werd 35 eveneens verbonden met het 2,7 Kb Nrul fragment uit pMP14M-34, onder vorming van pHES-MP34. De kloneringsstappen die leiden tot de vorming van de plasmiden pHES-MP63, pHES-MP1 en pHES-MP34 zijn schematisch weergegeven in figuur 10.
De plasmiden pHES-MP1, pHES-MP34 en pHES-MP63 werden toegepast als donorplasmiden voor recombinatie met vP293 (69), onder vorming van respectievelijk de recombinant vaccinia virussen vP753, 40 vP765 en vP721 . Recombinant nakomelingschap werd geselecteerd met humane MRC-5 cellen.
Beoordeling van de op vP293-gebaseerde vaccinia virus recombinanten die het EHV-1 gp14 gen tot expressie brengen
Ter bepaling of de drie vormen van het EHV-1 gp14 genproduct tot expressie gebracht in recombinant 45 vaccinia virussen vP753, vP765 en vP721 aanwezig waren op het oppervlak van geïnfecteerde cellen, werden VERO celmonolagen geïnfecteerd met de drie EHV-1 gp14-bevattende recombinant vaccinia virussen. De geïnfecteerde celmonolagen werden geanalyseerd op oppervlak-immunofluorescentie onder toepassing van het EHV-1 gp14-specifieke monokionale antilichaam 3F6. Oppervlakimmunofluorescentie was positief voor cellen geïnfecteerd met alle drie vaccinia virale recombinanten vP753, vP765 en vP721.
50 Dit wijst er op dat goed trafficking van het EHV-1 gp14 genproduct in met vaccinia geïnfecteerde cellen niet wordt beïnvloed door variatie van de lengte van de aanloopsequence.
Ter vergelijking van de EHV-1 gp14 genproducten tot expressie gebracht door de drie EHV-1 gp14-bevattende vaccinia virusrecombinanten, werden MRC-5 cellen geïnfecteerd met vP753, vP765 en vP721 en eiwitten werden metabolisch gelabeld met 35S-methionine. Immunoprecipitaties werden uitgevoerd met 55 de geradiolabelde cellysaten onder toepassing van EHV-1 gp14-specifiek monoklonaal antilichaam 3F6.
Geïmmunoprecipiteerde eiwitten uit cellen geïnfecteerd met vP753, vP765 en vP721 kunnen niet van elkaar worden onderscheiden en zijn equivalent aan de eiwitten die zijn geïmmunoprecipiteerd uit vP613, de 19 195016 EHV-1 gpl4-bevattende vaccinia recombinant gevormd uit plasmide pVM2LH6g141. Uit deze resultaten blijkt dat de variaties in de lengte van de EHV-1 gp14 aanloopsequentie onderzocht in deze recombinanten noch verbeteren, noch invloed uitoefenen op het goed verwerken van het eindproduct.
Ter beoordeling van de beschermende doeltreffendheid van recombinant vaccinia virus dat de verschil-5 lende vormen van EHV-1 gp14 tot expressie brengt, werden hamsters ingeënt met variërende doses vP753, vP765 en vP721 en geprovoceerd met de EHV-1 hamster aangepaste Kentucky stam. Alle drie EHV-1 gp14-bevattende vaccinia recombinanten waren beschermend, met een log10 PD^ van 6,2 of beter. Verschillen wat betreft de bescherming onder de drie vaccinia virus recombinanten zijn statistisch niet significant.
10 In tegenstelling met vP577, vertoonde een volgende vaccinia virus recombinant die eveneens was verkregen door recombinatie van pVM2LH6g14 en vP458 een identiek EHV-1 gp14 immunoprecipitatiepa-troon met dat van vP613, vP753, vP765 en vP721, en, evenals deze EHV-1 gp14 tot expressie brengende recombinant vaccinia virus, bracht het EHV-1 gp14 eiwit op het oppervlak van geïnfecteerde cellen tot expressie.
15 De hiervoor vermelde gegevens doen veronderstellen dat het EHV-1 gp14 tot expressie gebracht in vaccinia vims recombinant vP577, onvolkomen is en dat het defect waarschijnlijk optrad tijdens de recombinatie tussen het donorplasmide pVM2LH6g14 en het vaccinia vims vP458.
Voorbeeld 9 20 De nucleotidevolgorde van drie nieuwe genen uit paard herpesvirus type 1 en expressie in vaccinia virus recombinanten
Ter identificatie en isolatie van het EHV-1 gen coderende voor gp17/18 alvorens het tot expressie te brengen in een vaccinia recombinant vims, werd het grootste gedeelte van het Us gebied van het EHV-1 genoom sequenced en de verschillende open afleesframe’s aangetroffen in dit DNA fragment werden tot 25 expressie gebracht. Drie nieuwe EHV-1 genen gecodeerd door het S bestanddeel werden geïdentificeerd en geanalyseerd: EHV-1 gD dat bij sequentie homologie met de producten van de HSV gD en PRV gp50 genen vertoonde, EHV-1 gp63 dat homologie met de producten van de HSV US7 en PRV gp63 genen vertoonde en EHV-1 gE dat homologie met de producten van de HSV gE en PRV genen vertoonde. Alle drie genen, individueel of tezamen, werden gekloneerd in een gastheertrajectselectiesysteem van de 30 Kopenhagen vaccinia stam voor snelle expressieonderzoekingen. Uit immunofluorescentie verkregen met een anti-EHV-1 konijn serum bleek de expressie van EHV-1 specifieke producten.
Kloneren van het EHV-1 BamHI D fragment
Zoals het EHV-1 gp17/18 gen werd gelokaliseerd op het S bestanddeel van het EHV-1 genoom (3), werd 35 het BamHI D fragment, dat het grootste gedeelte van het Us gebied (59) vertegenwoordigt, geïsoleerd en gekloneerd. EHV-1 genomisch DNA van de Kentucky D stam werd gedigereerd met BamHI. Het 11,0 Kb BamHI D fragment werd geïsoleerd uit agarosegel (Geneclean, Bio101, Inc., La Jolla, CA) en gekloneerd in plasmide plBI24 als plasmide pEHVBamHID. Een restrictiemap van dit fragment werd opgesteld (figuur 11).
40 Identificatie van DNA volgorden coderende EHV-1 gD, gp63 en gE
Nucleotidesequentiewaarden voor beide strengen werden verkregen uit verschillende sub-klonen van het BamHI D fragment dat gesubkloneerd was in plBI24, zoals is beschreven in voorbeeld 1. Volgorden van de verbindingen tussen opeenvolgende fragmenten werden onderzocht op de beginkloon pEHVBamHID. Het PC/GENE software package (Intelligenetics Inc., Mountain View, CA) werd toegepast bij alle sequentie-45 waardenanalyses.
DNA seguentieanalyse van de EHV-1 gD, gp63 en gE genen
De DNA volgordeanalyse van het 6402 bp gebied sequenced van het BamHI D fragment (dat het grootste gedeelte van het unieke, korte gebied vertegenwoordigt) openbaart het voorkomen van ten minste drie 50 volledige open afleesframes die alle van dezelfde streng aflezen. Deze volgorde is weergegeven in figuur 12 als de van rechts 5' naar 3' streng. De basissamenstelling is 50,44 % G + C.
Het eerste open afleesframe (ORF1) loopt van de nucleotideplaatsen 971 tot 2176. Vermeende transcriptionele regulerende signalen werden aangetroffen in het gebied van 5' tot de meest waarschijnlijke ATG initiatiecodon op plaats 971. Een TATA box met de volgende TATATTAA (nucleotiden 871 tot 878) 55 was 60 nucleotiden stroomafwaarts van een vermeende CAT box op de plaatsen 811 - 817 met de volgorde TGACAAT geplaatst. Geen polyadenyleringssignaal (AATAAA) werd stroomafwaarts van de TAA terminatiecodon (nucleotiden 2177 tot 2179) aangetroffen. Zeven van de tien nucleotiden in de volgorde 5' 195016 20 TCCCTTCGCC 3' (nucleotiden 890 tot 899) waren complementair aan de 18S ribosomale RNA volgorde S' AGGAAGGCGT 5' (61) en kunnen dienen als de ribosoombindingsplaats. Een scanningmodel is voorgesteld waarmee eukaryotische mRNAs translatie initieert (151). De belangrijkste regel van dit model is dat ribosomen binden aan het 5' uiteinde van het mRNA en lineair het mRNA molecuul scannen. Binding aan 5 de translatie-initiatie is gewoonlijk bij het eerste 5' proximale ATG codon, hoewel uitzonderingen zijn waargenomen (152). Een purine op de -3-plaats is essentieel voor translatie-initièring en de translatie wordt gestimuleerd door C op de plaatsen -1 en -2 wanneer de rest van de volgorde sub-optimaal is (155). De volgordecontext rondom het voorgestelde initiatiecodon AGCATGT (nucleotiden 968 tot 974) kwalificeert zich als een functionele volgordecontext voor de translatie-initièring van eukaryotisch mRNA. Er zijn twee 10 andere mogelijke ATG initiëringscodons respectievelijk aanwezig op de plaatsen 989 tot 991 en 992 tot 994. De samenhang van deze twee codons CTTATGATGG kwalificeert zich niet als functioneel voor translatie-initiatie. Het EHV-1 ORF1 codeert voor 402 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 45239 dalton.
15 Analyse.van de EHV-1. ORF1 eiwitstructuur
Analyse van de aminozuurvolgorde leverde een aantal aspecten gemeen met de met membraan geassocieerde glycoproteïnen op. Het gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 1 tot 26 had een kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en is voorgesteld als de signaalvolgorde. Een hydrofoob gebied bestaande uit 24 aminozuren (de aminozuren 351374) is voorspeld te functioneren als een transmembraan ankergebied. Er 20 zijn vier Asn-X-Thr/Ser (waarin X elk aminozuur, behalve proline, kan zijn) plaatsen voor potentiële, met N-verbonden, glycosylering (157). Het hydrofobiciteitsprofiel van de EHV-1 ORF1 aminozuurvolgorde is weergegeven in figuur 13. De kenmerken van een membraan overspannend glycoproteïne waaronder signaal- en ankerelementen zijn duidelijk gedefinieerd. Van de twee meest hydrofobe gebieden bij het N- en dichtbij het C-eindstandige gedeelte wordt voorspeld dat ze respectievelijk de signaalvolgorde en het 25 transmembraan overspannend gebied van het glycoproteïnemolecuul weergeven.
Vergelijking van de EHV-1 ORF1 aminozuurvolgorde met andere herpesvirusglycoproteïnen Vergelijking van de aminozuursamenstelling van het vermoedelijke EHV-1 ORF1 eiwit duidt op een significante homologie met glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo komt het EHV-1 ORF1 proteïne 30 overeen met PRV gp50 (95) en HSV-1 gD (79,160).
Het tweede open afleesframe (ORF2) strekt zich uit van de nucleotideplaatsen 2287 tot 3525. Geen veronderstelde transcriptionele regulerende signalen werden in het gebied 5' tot het ATG initiatiecodon op plaats 2287 aangetroffen. Geen AATAAA polyadenyleringssignaal werd stroomafwaarts van het TGA terminatiecodon (de nucleotiden 3526 - 3528) gevonden, doch twee potentiële YGTGTTYY polyadenyle-35 ringssignalen (180) zijn stroomafwaarts van dit terminatiecodon bij ongeveer 40 en 70 bp aangetroffen. Het volgordeverband rondom het voorgestelde initiëringscodon GCTATGG komt overeen met de regels van Kozak (151,155). Er zijn ten minste twee andere mogelijke ATG initiëringscodons op de plaatsen 2305 -2307 en 2332 tot 2334, doch het volgordeverband van deze twee codons (GGGATGT en TCTATGG) kwalificeert niet als functioneel voor translatie-initiatie. Het EHV-1 ORF2 codeert een polypeptide met 413 40 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 45431 dalton.
Analyse van de EHV-1 ORF2 eiwitstructuur
Analyse van de aminozuurvolgorde biedt een aantal aspecten die gewoon zijn voor de met membraan geassocieerde glycoproteïnen. Een gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 1 tot 22 had een kenmer-45 kend hydrofobiciteitsprofiel en dit wordt voorgesteld als de signaalvolgorde (hoewel de computerscore voor de veronderstelde splitsingsplaats gering was). Een hydrofoob gebied bestaande uit 32 aminozuren (de plaatsen 315-346) functioneert volgens voorspellingen als een transmembraan-ankergebied. Er zijn zeven Asn-X-Thr/Ser plaatsen voor potentiële N-gebonden glycosylering. Een hydrofobiciteitsgrafiek van de EHV-1 ORF2 aminozuurvolgorde is weergegeven in figuur 14. De kenmerken van een membraan overspannend 50 glycoproteïne waaronder signaal- en ankerelementen zijn duidelijk gedefinieerd. De twee meest hydrofobe gebieden bij het N-eindstandige gedeelte en dichtbij het C-eindstandige gedeelte geven volgens voorspellingen respectievelijk de signaalvolgorde en het transmembraan overspannende gebied van het glycoproteïnemolecuul aan.
55 Vergelijking van de EHV-1 ORF2 aminozuurvolgorde met andere herpesvirus glycoproteïnen
Uit een vergelijking van de aminozuursamenstelling van het EHV-1 ORF2 bleek de significante homologie met glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo is het EHV-1 ORF2 eiwit homoloog met PRV gp63 (80), 21 195016 VZV gpiv (181) en HSV-1 US7 (79).
Het derde open afleesframe (ORF3) strekt zich uit van de nucleotideplaatsen 3796 tot 5451. Vermoedelijke transcriptionaal regulerende signalen werden aangetroffen in het gebied van 5' tot het ATG initiatieco-don op plaats 3796. Een TATA box met de GTTTAAA volgorde (de nucleotiden 3705 - 3711) was 5 50 nucleotiden stroomafwaarts van een vermoedelijke CAT box op de plaatsen 3649 - 3654 met de GCAATG volgorde geplaatst. Geen evident polyadenyleringssignaal werd stroomafwaarts van het TGA terminatiecodon (de nucleotiden 5452 - 5454) aangetroffen. Het volgordeverband rondom het voorgestelde initiatiecodon ACAATGG komt overeen met de regels van Kozak (151, 155). Het EHV-1 ORF3 codeert voor een polypeptide met 552 aminozuren met een berekend molecuulgewicht van 61493 dalton.
10
Analyse van de EHV-1 ORF3 eiwitstructuur
Uit analyse van de aminozuurvolgorde blijkt een aantal aspecten die gemeenschappelijk met de membraan-geassocieerde glycoproteïnen te zijn. Een gebied dat zich uitstrekt van de aminozuren 1-23 had een kenmerkend hydrofobiciteitsprofiel en is voorgesteld als signaalvolgorde. Een hydrofoob gebied bestaande 15 uit 38 aminozuren (de plaatsen 404-437) functioneert volgens voorspellingen als een transmembraan· ankergebied. Er zijn vijf Asn-X-Thr/Ser plaatsen voor potentiële, met N-gebonden glycosylering. Een hydrofobiciteitsgrafiek van de EHV-1 ORF3 aminozuurvolgorde is weergegeven in figuur 15. De kenmerken van een membraan overspannend glycoproteïne waaronder signaal- en ankerelementen zijn duidelijk gedefinieerd. Van de twee meest hydrofobe gebieden bij het N- en dichtbij het C-eindstandige gedeelte is 20 voorspeld dat ze respectievelijk de signaalvolgorde en het transmembraan overspannend gebied van het glycoproteïnemolecuul weergeven.
Vergelijking van de EHV-1 ORF3 aminozuurvolgorde met andere herpesvirus glycoproteïnen Uit een vergelijking van de aminozuursamenstelling van het EHV-1 ORF3 proteïne blijkt een significante 25 homologie met de glycoproteïnen van andere herpesvirussen. Zo is het EHV-1 ORF3 eiwit homoloog met PRV gl (80),VZV gE (181) en HSV-1 gE (79).
Constructie van een op Kopenhagen vaccinia virus gebaseerd gastheertraject-selectiesysteem Een op Kopenhagen vaccinia virus gebaseerd gastheertraject-selectiesysteem analoog aan het WR 30 pHES/vP293 gastheertraject-selectiesysteem (69) werd geconstrueerd.
De Kopenhagen vaccinia virusdeletiemutant vP668 is deleted voor 12 genen uit het Hindlll C - Hindlll K gebied, waaronder beide humane gastheertrajectgenen KIL (70) en C7L, een gen dat behoort tot Hindlll C.
vP668 is niet in staat om op humane MRC-5 cellen te groeien. Leden van de COPCS plasmide serie bevatten het C7L gen zonder flankerende vaccinia armen, waardoor recombinatie met vP668 en herstel van 35 het vermogen van het virus om op MRC-5 cellen te groeien wordt hersteld. Het vermogen van de recombinant vaccinia nakomenschap gevormd door recombinatie onder toepassing van het VP668/COPCS gastheertraject-selectiesysteem om een plaque te vormen op humane MRC-5 cellen verschaft een methode voor snelle identificatie van deze recombinanten. Plasmide pCOPCS657 bevat de synthetische H6 vaccinia promotor gevolgd door een polylinker kloneringsgebied voor het invoegen van vreemde genen. Het 40 polylinkergebied wordt gevolgd door stopcodons en een vaccinia transcriptionaal terminatiesignaal (45).
Kloneren van het EHV-1 gD gen tot pCOPCS657
Onder verwijzing naar figuur 16, werd het plasmide pEHVBamHID gedigereerd met Hindlll en een 1240 bp Hindlll DNA fragment bevattende EHV-1 gD werd geïsoleerd uit een agarosegel (Geneclean, BiolO, Ine., La 45 Jolla, CA) en hersteld onder toepassing van het Klenow fragment van DNA polymerase. Het herstelde fragment werd daarna gebonden aan plasmide pCOPCS657 gedigereerd met Smal. Het verkregen plasmide, pJCA006 had het ATG initiatiecodon ongeveer 10 bp van de H6 promotor (figuur 16).
Kloneren van het EHV-1 gp63 gen tot pCOPCS657 50 Plasmide pEHVBamHID werd gedigereerd met Hindlll, EcoRI en Pvull en het 1300 bp Hindlll-Pvull DNA fragment dat EHV-1 gp63 bevatte werd geïsoleerd uit een agarosegel en hersteld met Klenow. Het herstelde fragment werd daarna verbonden met het plasmide pCOPCS657 gedigereerd met Smal. Het verkregen plasmide met EHV-1 gp63 in de juiste oriëntatie ten opzichte van de H6 promotor werd met pJCA008 (figuur 16) aangeduid.
55
Kloneren van het EHV-1 gE gen tot pCOPCS657
Plasmide pEHVBamHID werd gedigereerd met Aatll en Apal en een 2630 bp Aatll-Apal DNA fragment _ _____ 195016 22 bevattende EHV-1 gE werd geïsoleerd uit een agarosegel en hersteld met Klenow. Het herstelde fragment werd daarna gevoegd in het plasmide pCOPCS657 gedigereerd met Smal. Het verkregen plasmide met het EHV-1 gE gen in de juiste oriëntatie ten opzichte van de H6 promotor werd aangeduid met pJCA007 (figuur 16).
5
Klonen van het EHV-1 gD-gp63 fragment in pCOPCS657
Onder verwijzing naar figuur 17, werd het plasmide pEHVBamHID gedigereerd met EcoRI en Pvull en het 1832 bp EcoRI-Pvull DNA fragment (A) werd uit een agarosegel geïsoleerd. Plasmide pJCA006 werd gedigereerd met Clal en EcoRI en het 1450 bp Clal-EcoRI DNA fragment (B) werd geïsoleerd uit een 10 agarosegel. Plasmide pCOPCS657 werd gedigereerd met Clal en Smal en het 3700 bp Clal-Smal DNA fragment (C) werd geïsoleerd uit een agarosegel. De fragmenten A, B en C werden daarna samen gekoppeld en het verkregen plasmide werd aangeduid met pJCA009 (figuur 17).
Kloneren van het EHV-1 gD-gp63-gE fragment in pCOPCS657 15 Het plasmide pEHVBamHID werd gedigereerd met EcoRI en Sacll en het 4240 bp EcoRI-Sacll DNA
fragment (D) werd uit een agarosegel geïsoleerd. Daarna werd fragment D gekoppeld aan fragmenten B en C (zie hiervoor) onder additie van dNTPs ter verzekering van het herstel van de binding Sacll-Smal. Het verkregen plasmide werd aangeduid met pJCA010 (figuur 17).
20 Constructie van de recombinant vaccinia virussen vP773, vP803, vP809, vP810 en vP822 die de EHV-1 U open afleesframe’s tot expressie brengen
Teneinde snel de expressie van de hiervoor beschreven EHV-1 open afleesframe’s na te gaan, werd een aantal vaccinia recombinant virussen geconstrueerd onder toepassing van het COPCS gastheertraject-selectiesysteem. De drie open afleesframe’s geïdentificeerd uit de sequence analyse werden afzonderlijk of 25 tezamen-(”dubbel”-en "drievoudig”) in plasmide pCOPCS657 (figuren 16,17) gekloneerd. De verkregen plasmiden werden daarna toegepast voor recombinatie met vaccinia recombinant vP668 als reddend virus. De verschillende recombinant vaccinia virussen uit deze recombinaties zijn weergegeven in tabel 5.
Vaccinia recombinant vP773 werd verkregen bij recombinatie uitgevoerd met het donorplasmide pJCA006 dat het EHV-1 gD gen bevatte. Vaccinia recombinant vP822 werd verkregen door recombinatie 30 uitgevoerd met donorplasmide pJCA008 bevattende het EHV-1 gp63 gen. Vaccinia recombinant vP803 werd verkregen bij recombinatie uitgevoerd met het donorplasmide pJCA007 bevattende het EHV-1 gE gen. Vaccinia recombinant vP809 werd verkregen door recombinatie uitgevoerd met het donorplasmide pJCA009 bevattende het EHV-1 gD-gp63 fragment en vaccinia recombinant vP810 werd verkregen door recombinatie uitgevoerd met het donorplasmide pJCA010 bevattende het EHV-1 gD-gp63-gE fragment (tabel 5).
35
Immunofluorescentieanalyse van EHV-1 ORF1 (gD), ORF2 (gp63) en ORF3 (gE) producten gesynthetiseerd door enkelvoudige of veelvoudige recombinant vaccinia virussen
Immunofluorescentie van met recombinant vaccinia virus geïnfecteerd VERO en MRC-5 cellen werd uitgevoerd op de wijze zoals beschreven in voorbeeld 1, onder toepassing van anti-EHV-1 specifiek 40 polyklonaal konijnenserum R5935 (1:200) (tabel 6).
TABEL 5
Aanduiding van vaccinia virus recombinanten die EHV-1 gD, Ge en gp63 genen tot expressie brengen 45 -:-
Donorplasmide EHV-invoegsel Reddend virus Recombinant pJCA006 gD vP668 vP773 PJCA007 gE vP668 vP803 pJCA008 gp63 vP668 vP822 50 pJCA009 gD-gp63 vP668 vP809 pJCA010 gD-gp63-gE vP668 vP810 23 195016 TABEL 6
Immunofluorescentie van met recombinant vaccinia virus geïnfecteerde cellen uitgevoerd onder toepassing van anti-EHV-1 konijn serum R5935 5 ------ EHV-1 recombinant R5935 intern oppervlak gD positief negatief gp63 positief negatief 10 gE negatief negatief gD-gp63 positief negatief gD-gp63-gE positief negatief
15 REFERENCES
1. Allen, G.P. and J.T. Bryans, In: Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, Vol. 2, ed.
R. Pandey (Basel), pp. 78-144 (1986).
2. Allen, G.P., and L.D. Coogle, J. Virol. 62, 2850-2858 (1988).
3. Allen, G.P. and M.R. Yeargan, J. Virol. 61, 2454-2461 (1987).
20 4. Baumann, R.P., D.C. Sulivan, J. Staczek, and D.J. O’Callaghan, J. Virol. 57, 816-825 (1986).
5. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, B. Lomniczi, and A. Kaplan, Virology 154, 325-334 (1986).
6. Berman, P.W., D. Dowbenko, L.A. Lasky, and C.C. Simonsen, Science 222, 524-527 (1983).
7. Bertholet, C„ R. Drillien, and R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985).
8. Cantin, E.M., R. Eberle, J.L. Baldick, B. Moss, D.E. Willey, A.L. Notkins, and H. Openshaw, Proc. Natl.
25 Acad. Sci. USA 84, 5908-5912 (1987).
9. Chakrabarti, S., K. Brechling, and B. Moss, Mol. Cell. Biol. 5, 3403-3409 (1985).
10. Cranage, M.P., T. Kouzarides, A.T. Bankier, S. Satchwell, K. Weston, P. Tomlinson, B. Barrell, H.
Hart, S.E. Bell, A.C. Minson, and G.L. Smith, EMBO J. 5, 3057-3063 (1986).
11. Clewed, D.B., J. Bacteriol. 110, 667-676 (1972).
30 12. Clewed, D.B. and D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969).
13. Cremer, K.J..M. Mackett, C. Wohlenberg, A.L. Notkins, and B. Moss, Science 228, 737-740 (1985).
14. Eisenberg, D., Annu. Rev. Biochem. 53, 595-623 (1984).
15. Glorioso, J., U. Kees, G. Kumel, H. Kirchner, and P. Krammer, J. Immunol. 135, 575-582 (1985).
16. Graham, F.L. and A.J. Van der Eb., Virology 54, 536-539 (1973).
35 17. Kunkel, T.A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985).
18. Lasky, L.A., D. Dowbenko, C.C. Simonsen, and P.W. Berman, Bio-Technology 2, 527-532 (1984).
19. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1986).
20. Maniatis, T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (1982).
40 21. Martin, S. and B.T. Rouse, J. Immunol. 138, 3431-3437 (1987).
22. Martin, S., B. Moss, P.W. Berman, L.A. Lasky, and B.T. Rouse, J. Virol. 61, 726-734 (1987).
23. O'Callaghan, D.J., B.E. Henry, J.H. Wharton, S.A. Dauenhauer, R.B. Vance, J. Staczek, and R.A. Robinson, In: Developments in Molecular Virology, Vol. 1, ed. Y. Decker, pp. 387-418 (1981).
24. Panicali, D., A. Grzelecki, and C. Huang, Gene 47, 193-199 (1986).
45 25. Panicali, D., and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).
26. Paoletti, E., B.R. Lipinskas, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 193-197 (1984).
27. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas, and E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985).
28. Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, In: Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and L.
50 Grossman (Academic Press) pp. 545-563 (1987).
29. Pustell, J., and F.C. Kafatos, Nucleic Acids Res. 12, 643-655 (1984).
30. Rooney, J.F., C. Wohlenberg, K.J. Cremer, B. Moss, and A.L. Notkins, J. Virol. 62,1530-1534 (1988).
31. Rosel, J.L., P.L. Earl, J.P. Weir, and B. Moss, J. Virol. 60, 436-449 (1986).
55 32. Rosenthal, K.L., J.R. Smiley, S. South, and D.C. Johnson, J. Virol. 61, 2438-2447 (1987).
33. Sanger, F., S. Nicklen, and A. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).
34. Shapira, S.K., J. Chou, F.V. Richaud, and M.J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983).
195016 24 35. Shida, H., Virology 150, 451-462 (1986).
36. Spear, P.G., In: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines, Immunochemistry of Viruses, Vol. 2, eds.
M.H.V. Van Reganmortel and A.R. Neurath (New York), pp. 425-443 (1985).
37. Spear, P.G., In: The Herpesvirus, Vol. 3, ed. B. Roizman (New York), pp. 315-356 (1985).
5 38. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen. Virol. 68, 2587-2598 (1987).
39. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen. Virol. 69, 859-867 (1988).
40. Tabor, S., and C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987).
41. Taylor, J., R. Weinberg, B. Lanquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988).
42. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. Webster, and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988).
10 43. Turtinen, L.W., and G.P. Allen, J. gen. Virol. 63, 481-485 (1982).
44. Wachsman, M., L Aurelian, C.C. Smith, B.R. Lipinskas, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. Infect. Dis. 155, 1186-1197(1987).
45. Yuen, L. and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6417-6421 (1987).
46. Zarling, J.M., P.A. Moran, L.A. Lasky, and B. Moss, J. Virol. 59, 506-509 (1986).
15 47. Zarling, J.M., P.A. Moran, R.L. Burke, C. Pachl, P.W. Berman, and L.A. Lasky, J. Immunol. 136, 4669-4673 (1986).
48. O'Callaghan, D.J., G.A. Gentry, and C.C. Randall, In: The Herpesviruses, Vol. 2, ed. B. Roizman (New York), pp. 215-318 (1983).
49. Ackermann, M., R. Longnecker, B. Roizman, and L. Pereira, Virology 150, 207-220 (1986).
20 50. Frink, R.J., M.R. Eisenberg, G. Cohen, and E.K. Wagner, J. Virol. 45, 634-647 (1983).
51. Frame, M.C., H.S. Marsden, and D.J. McGeoch, J. gen. Virol. 67, 745-751 (1986).
52. Longnecker, R., S. Chatterjee, R. Whitley, and B. Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4303-4307 (1987).
53. Richman, D.D., A. Buckmaster, S. Bell, C. Hodgman and A.C. Minson, J. Virol. 57, 647-655 (1986). 25 - - 54-Swain, M.A., R.W. Peet, and D.A. Galloway, J. Virol, 53, 561-569 (1985).
55. Zezulak, K.M., and P.G. Spear, J. Virol. 49, 741-747 (1984).
56. van Drunen Littel-van der Hurk, S., T. Zamb, and L.A. Babrick, J. Virol. 63, 2159-2168 (1989).
57. Perkus, M.E., D. Panicali, S. Mercer, and E. Paoletti, Virology 152, 285-297 (1986).
58. Tamin, A., E.C. Villarreal, S.L. Weinrich, and D.E. Hruby, Virology 165,141-150 (1988).
30 59. Whalley, J.M., G.R. Robertson, and A.J. Davidson, J. gen. Virol. 57, 307-323 (1981).
60. Laemmli, U.K., Nature (London) 227, 680-685 (1970).
61. Hagenbuchle, 0., M. Santer, J.A. Steitz, and R.J. Mans Cell 13, 551-563 (1978).
62. Robbins, A.K., D.J. Domey, M.W. Wathen, M.E. Whealey, C. Gold, R.J. Watson, L.E. Holland, S.D. Weed, M. Levine, J.C. Glorioso, and L.W. Enquist, J. Virol. 61, 2691-2701 (1987).
35 63. Whitbeck, J.C., L.Z. Bello, and W.C. Lawrence, J. Virol. 62, 3319-3327 (1988).
64. Montreuil, J., J. Biol. Cell. 51, 115-132 (1984).
65. Kyte, J., and R.F Doolittle, J. Mol. Biol. 157,105-13 (1982).
66. Davison, A.J., and J.E. Scott, J. gen. Virol. 67,1759-1816 (1986).
67. Bzik, D.J., B.A. Fox, N.A. DeLuca, and S. Person, Virology 133, 301-307 (1984).
40 68. Pellett, P.E., M.D. Biggin, B.L. Barrell, and B. Roizman, J. Virol. 56, 807-813 (1985).
69. Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).
70. Gillard, S., D. Spehner, R. Drillien, and A. Kim, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5573-5577 (1986).
71. Whalley, J.M., G.R. Robertson, N.A. Scott, G.C. Hudson, C.W. Bell, and L.M. Woodworth, J. gen. Virol. 70, 383-394 (1989).
45 72. Riggio, M.P., A.A. Cullinane, and D.E. Onions, J. Virol. 63,1123-1133 (1989).
73. Glorioso, J..C.H. Schroder, G. Kumel, M. Szczesiul, and M. Levine, J. Virol. 50, 805-812 (1984).
74. Wachsman, M., L. Aurelian, J.C.R. Hunter, M.E. Perkus, and E. Paoletti, Bioscience Reports 8, 323-334 (1988).
75. Wachsman, M., J.H. Luo, L. Aurelian, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. gen. Virol. 70, 2513-2520 50 (1989).
76. Sinclair, R., R.F. Cook, and J.A. Mumford, J. gen. Virol. 70, 455-459 (1989).
77. Shimizu, Μ., K. Satou, and N. Nishioka, Arch. Virol. 104, 169-174 (1989).
78. Stokes, A., G.P. Allen, L.A. Pullen, and P.K. Murray, J. gen. Virol. 70, 1173-1183 (1989).
79. McGeoch, D.J., A. Dolan, S. Donald, and F.J. Rixon, J. Mol. Biol. 181,1-13 (1985).
55 80. Petrovskis, E.A., J.G. Timmins, and L.E. Post, J. Virol. 60,185-193 (1986).
81. Wittmann, G. and H.-J. Rziha, In: Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, ed. G. Wittmann (Kluwer Academic Publishers) pp. 230-325 (1989).
25 195016 82. Rubenstein, A.S. and A.S. Kaplan, Virology 66, 385-392 (1975).
83. Stevely, W.S., J. Virol. 22, 232-234 (1977).
84. Ben-Porat, T., F.J. Rixon, and M.L. Blankenship, Virology 95, 285-294 (1979).
85. Ben-Porat, T. and A.S. Kaplan, In: The Herpesviruses, vol. 3, ed. B. Roizman (Plenum Publishing 5 Corp., New York) pp. 105-173 (1985).
86. Hampl, H„ T. Ben-Porat, L. Ehrlicher, K-O. Habermehl, and A.S. Kaplan, J. Virol. 52, 583-590 (1984).
87. Ben-Porat, T. In: Organization and replication of viral DNA, ed. A.S. Kaplan (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL) pp. 147-172 (1982).
10 88. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, J. Pendrys, R.A. Veach, and A.S. Kaplan, J. Virol. 57,191-196 (1986).
89. Ben-Porat, T. and A.S. Kaplan, Virology 41, 265-273 (1970).
90. Killington, R.A., J. Yeo, R.W. Honess, D.H. Watson, B.E. Duncan, I.W. Halliburton, and J. Mumford, J. gen. Virol. 37, 297-310 (1977).
91. Robbins, A.K., J.H. Weis, L.W. Enquist, and R.J. Watson, J. Mol. Appl. Genet. 2, 485-496 (1984). j 15 92. Rea, T.J., J.G. Timmins, G.W. Long, and L.E. Post, J. Virol. 54, 21-29 (1985).
93. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and H.-J. Rziha, J. Virol. 53, 52-57 (1985).
94. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, H.-J. Thiel, C. Schreurs, and H.-J. Rziha, Virology I52, 66-75 (1986).
95. Petrovskis, E.A., J.G. Timmins, M.A. Armentrout, C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr., and L.E. Post, J.
Virol. 59, 216-223 (1986).
20 96. Robbins, A.K., R.J. Watson, M.E. Whealy, W.W. Hays, and L.W. Enquist, J. Virol. 58, 339-347 (1986).
97. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984).
98. Kost, T.A., E.V. Jones, K.M. Smith, A.P Reed, A.L. Brown, and T.J. Miller, Virology 171,365-376 (1989).
25 99. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and H.-J. Rziha, J. Virol. 56, 307-311 (1985).
100. Lomniczi, B., S. Watanabe, T. Ben-Porat, and A.S. Kaplan, J. Virol. 52,198-205 (1984).
101. Lukacs, N., H.-J. Thiel, T.C. Mettenleiter, and H.-J. Rziha, J. Virol. 53, 166-173 (1985).
102. Marchioli, C., R.J. Yancey, Jr., J.G. Timmins, L.E. Post, B.R. Young, and D.A. Povendo, Am. J. Vet.
Res. 49, 860-864 (1988).
30 103. Marchioli, C.C., R.J. Yancey, Jr., R.C. Wardley, D.R. Thomsen and L.E. Post, Am. J. Vet. Res. 48, 1577-1583 (1987).
104. Thomsen, D.R., C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr. and L.E. Post, J. Virol. 61, 229-232 (1987).
105. Wathen, L.M.K..K.B. Platt, M.W. Wathen, R.A. Van Deusen, C.A. Whetstone, and E.C. Pirtle, Virus Res. 4, 19-29 (1985).
35 106. Eloit, M., D. Fargeaud, R. L’Haridon and B. Toma, Arch Virol. 99, 45-46 (1988).
107. Marchioli, C.C., R.J. Yancey, Jr., E.A. Petrovskis, J.G. Timmins, and L.E. Post, J. Virol. 61, 3977-3982 (1987).
108. Ishii, Η., Y. Kobayashi, M. Kuroki and Y. Kodama, J. gen. Virol. 69,1411-1414 (1988).
109. Whealy, M.E., A.K. Robbins and L.W. Enquist, J. Virol. 63, 4055-4059 (1989).
40 110. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 58, 173-178 (1986).
111. Robbins, A.K., M.E. Whealy, M.E., R.J. Watson and L.W. Enquist, J. Virol. 59, 635-645 (1986).
112. Allen, W.P., and F. Rapp, J. Infect. Dis. 145, 413-421 (1982).
113. Bryson, Y.J., M. Dillon, M. Lovett, G. Acuna, S. Taylor, J.D. Cherry, B.L. Johnson, E. Wiesmeier, W.
Growdon, T. Creagh-Kirk, and R. Keeney, N. Engl. J. Med. 308, 916-921 (1983).
45 114. Douglas, J.M., C. Critchlow, J. Benedetti, G.J. Mertz, J.D. Connor, M.A. Hintz, A. Fahnlander, M.
Remington, C. Winter, and L. Corey, N. Engl. J. Med. 310,1551-1556 (1984).
115. Roizman, B. and A.E. Sears, In: Virology, eds. Fields, B.N. and D.M. Knipe (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1795-1841 (1990).
116. Stuve, L.L., S. Brown-Shimer, C. Pachl, R. Najarian, D Dina, and R.L. Burke, J. Virol. 61, 326-335 50 (1987).
117. Dowbenko, D.J., and L.A. Lasky, J. Virol. 52,154-163 (1984).
118. Watson, R.J., Gene 26, 307-312 (1983).
119. McGeoch, D.J., H.W.M. Moss, D. McNab and M.C. Frame, J gen. Virol. 68, 19-38 (1987).
120. Chan, W., Immunol. 49,343-352 (1983).
55 121. Davis, W.B., J.A. Taylor, and J.E. Oakes, J. Infect. Dis. 140, 534-540 (1979).
122. Oakes,J.E.,and H. Rosemond-Hornbeak, Infect. Immun. 21, 489-495 (1978).
123. Balachandran, N., S. Bacchetti, and W.E. Rawls, Infect. Immun. 37,1132-1137 (1982).
195016 26 124. Oakes, J.E., W.B. Davis, J.A. Taylor, and W.W. Weppner, Infect. Immun. 29, 642-649 (1980).
125. McLaughlin-Taylor, E., D.E. Willey, E.M. Cantin, R. Eberle, B. Moss, and H. Openshaw, J. gen. Virol. 69, 1731-1734 (1988).
126. Weir, J.P., M. Bennett, E.M. Allen, K.L. Elkins, S. Martin, and B.T. Rouse, J. gen. Virol. 70, 5 2587-2594 (1989).
127. Gibbs, E.P.J., and M.M. Rweyemamu, Vet. Bull. 47, 317-343 (1977).
128. Yates, W.D.G., Can. J. Comp. Med. 46, 225-263 (1982).
129. Misra, V., R.M. Blumenthal and L.A. Babiuk, J. Virol. 40, 367-378 (1981).
130. Lawrence, W.C., R.C. D’Urso, C.A. Kundel, J.C. Whitbeck and L.J. Bello, J. Virol. 60, 405-414 10 (1986).
131. Zamb, T. 1987, Abstract No. 330, 68th Annual Meeting of Conference of Research Workers in Animal Disease, 16 and 17 November 1987, Chicago, IL., USA. 132. Babiuk, L.A., J. L’ltalien, S. van Drunen Littel-van den Hurk, T. Zamb, M.J.P. Lawman, G. Hughes, and G.A. Gifford, J. Virol. 159, 57-66 (1987).
15 133. van Drunen Littel-van den Hurk, S., and L.A. Babiuk, J. Virol. 59, 401-410 (1986).
134. Gaskei, R.M., and R.C. Povey, Res. Vet. Sci. 27,167-174 (1978).
135. Povey R.C., and M.R. Wilson, Feline Practice 8, 35-42 (1978).
136. Chappuis, G., C. Benoit-Jeanin, and D. Fargeaud, In: Develop, biol. Standard., Vol. 52, eds. M. Bonneau, and W. Hennessen, (S. Karger, Basel) pp. 485-491 (1982).
20 137. Saint-Gerand, A.L., Vaccine 6, 508 (1988).
138. Sarmiento, Μ., M. Haffey, and P.G. Spear, J. Virol. 29, 1149-1158 (1979).
139. Ruyechan, W.T., L.S. Morse, D.M. Knipe, and B. Roizman, J. Virol. 29, 677-697 (1979).
140. Pereira, L., E. Cassai, R.W. Honess, B. Roizman, M. Temi, and A. Nahmias, Infect. Immun. 13, 211-220 (1976).
25 141. Eberle, R., and R.J. Courtney, J. Virol. 35, 902-917 (1989).
142. Papp-Vid, G., and J.B. Derbyshire, Can. J. Comp. Med. 43, 231-233 (1979).
143. Meas, R.K., S.L. Fritsch, L.L. Herr, and P.A. Rota, J. Virol. 51, 259-262 (1984).
144. Fargeaud, D., C. Benoit Jeannin, F. Kato, and G. Chappuis, Arch. Virol. 80, 69-82 (1984).
145. Compton, T., .In: Cell Biology of Virus Entry, Replication, and Pathogenesis, eds. Compans, R.W., 30 A. Helenius, and M.B.A. Oldstone (Alan R. Liss, Inc.) pp. 45-56 (1989).
146. Spatz.SJ., R.K. Meas, and C.E. Beisel, Abstracts of the 14th International Herpesvirus Workshop (Nyborg Strand Denmark) biz. 128 (1989).
147. Little, S.P., J.T. Jofre, R.J. Courtney, and P.A. Schaffer, Virology 114, 149-160 (1981).
148. DeLuca, N., D.J. Bzik, V.C. Bond, S. Person, and W. Snipes, Virology 122, 411-423 (1982).
35 149. Cai, W., B. Gu, and S. Person, J. Virol. 62, 2596-2604 (1988).
150. Courtney, R.J., In: Immunobiology of Herpes Simplex Virus Infection, eds. B.T. Rouse and C. Lopez (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.) pp. 33-44 (1984).
151. Kozak, M., Microbial Rev. 47, 1-45 (1983).
152. Pelletier, J., and N. Sonenberg, Nature 334, 320-325 (1988).
40 153. Rota, P.A., R.K. Maes, and W.T. Ruyechan, Virology 154,168-179 (1986).
154. Henle, G., W. Henle, and V. Diehl, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 94-101 (1968).
155. Kozak, M., Cell 44, 283-292 (1986).
156. Miller, G., In: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. et al. (Raven Press, Ltd., New York) biz. 1921-1958 (1990).
45 157. Hubbard, S.C., and R.J. Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 50, 555-583 (1981).
158. McGeoch, D.J., M.A. Dalrymple, A.J. Davison, A. Dolan, M.C. Frame, D. McNab, L.J. Perry, J.E. Scott, and P. Taylor, J. gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
159. Kieff, E., and D. Liebowitz, In: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. et al. (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1889-1920 (1990).
50 160. Watson, R.J., J.H. Weis, J.S. Salstrom, and L.W. Enquist, Science 218, 381-384 (1982).
161. McGeoch, D.J. and A.J. Davison, Nucleic Acid Res. 10, 4281-4292 (1986).
162. Lehner, R„ H. Meyer, and M. Mach, J. Virol. 63, 3792-3800 (1989).
163. Biggin, M., P.J. Farrell, and B.G Barrell, EMBO. J. 3,1083-1090 (1984).
164. Beisel, C., J. Tanner, T. Matsuo, D. Thorley-Lawson, F. Kezdy, and E. Kieff, J. Virol. 54, 665-674 55 (1985).
165. Qualtiere, L.F., J.F. Decoteau, and M. Hassan Nasr-el-Din, J. gen. Virol. 68, 535-543 (1987).
166. Epstein, M.A., A.J. Morgan, S. Finerty, B.J. Randle, and J.K. Kirkwood, Nature 318, 287-289 (1985).
27 195016 167. Morgan, A.J., M. Mackett, S. Finerty, J.R. Arrand, F.T. Scullion, and M.A. Epstein, J. Med. Virol. 25, 189-195 (1988).
168. Stmad, B.C., T. Schuster, R. Klein, R.F. Hopkins, T. Witmer, R.H. Neubauer, and H. Rabin, J. Virol. 5 41,258-264(1982).
169. Miller, N., and L.M. Hutt-Fletcher, J. Virol. 62, 2366-2372 (1988).
170. Plotkin, S.A., H.M. Friedman, S.E. Starr, and E. Gonczol, In: Contemporary Issues in Infectious Diseases, Vol. 8, eds. Root et al. (Churchill Livingstone, New York) biz. 65-92 (1989).
171. Plotkin, S.A., S.E. Starr, H.M. Friedman, E. Gonczol, and R.E. Weibel, J. Inf. Dis. 159, 860-865 10 (1989)! 172. Gretch, D.R., B. Kari, L Rasmussen, R.C. Gehrz, and M.F. Stinski, J. Virol. 62, 875-881 (1988).
173. Weston, K., and B.G. Barrel!, J. Mol. Biol. 192, 177-208 (1986).
174. Pachl, C., W.S. Probert, K.M. Hermsen, F.R. Masiarz, L. Rasmussen, T.C. Merigan, and R.R.
Spaete, Virology 169, 418-426 (1989).
15 175. Rasmussen, L, M. Nelson, M. Neff, and T.C. Merigan, Jr., Virology 163, 308-318 (1988).
176. Kari, B., N. Lussenhop, R. Goertz, M. Wabuke-Bunoti, R. Radeke, and R. Gehrz,J. Virol. 60, 345-352 (1986).
177. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Virus Res. 10, 343-356 (1988).
178. Nettleton, P.F., and J.M. Sharp, Vet. Rec. 107, 379 (1980).
20 179. Kahrs, R.F., J. Amer. Vet. Med. Assoc. 171, 1055-1064 (1977).
180. McLauchlan, J., D. Gaffney, J.L. Whitton, and J.B. Clements, Nucleic Acids Res. .13, 1347-1368 (1985) .
181. Davison, A.J., EMBO J. 2, 2203-2209 (1983).
182. Todd, D. and J.B. McFerran, Arch. Virol. 86,167-176 (1985).
25 183. Diamond, L., Int. J. Cancer 2, 143-152 (1967).
184. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).
185. Russel, M., S. Kidd, and M.R. Kelley, Gene 45, 333-338 (1986).
186. Kunkel, T.A., J.D. Roberts, and R.A. Zakour, In: Methods in Enzymology, Vol. 154, eds. R. Wu, and 30 L. Grossman (Academic Press, Inc.) pp. 367-382 (1987).
187. Schmitt, J.F.C. and H.G. Stunnenberg, J. Virol. 62, 1889-1897 (1988).
188. Pickup, D.J., B.S. Ink, W. Hu, C.A. Ray, and W.K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7698-7702 (1986) .
189. Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975).
35 190. Bucher, D., S. Popple, M. Baer, A. Mikhail, Y.-F. Gong, C. Whitaker, E. Paoletti, and A. Judd, J.
Virol. 63, 3622-3633 (1989).
191. Joklik, W.K., Virology 18, 9-18 (1962).
192. Guilhot, S., A. Hampe, L. D’Auriol, and F. Galibert, Virology 161, 252-258 (1987).
193. Falkner, F.G., and B. Moss, J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
40 194. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Gene 65, 123-128 (1988).
195. Dreyfuss, G., S.A. Adam, and Y.D. Choi, Mol. Cell. Biol. 4, 415-423 (1984).
196. Kennedy, I.M., D.P. Leader, and W.S. Stevely, J. gen. Virol. 65,1621-1624 (1984).
197. Powell, K.L. and D.H. Watson, J. gen. Virol. 29,167-178 (1975).
198. Marsden, H.S., N.D. Stow, V.G. Preston, M.C. Timbury, and N.M. Wilkie, J. Virol. 28, 624-642 45 (1978).
199. Marsden, H.S., A. Buckmaster, J.W. Palfreyman, R.G. Hope, and A.C. Minson, J. Virol. 50, 547-554 (1984).
200. Zweig, M., S.D. Showalter, S.V. Bladen, C.J. Heilman, Jr. and B. Hampar, J. Virol. 47,185-192 (1983).
50 201. Marshall, R.L., B.A. Israel, and G.J. Letchworth, III., Virology 165, 338-347 (1988).
202. Panicali, D., S.W. Davis, S.R. Mercer, and E. Paoletti, J. Virol. 37,1000-1010 (1981).
203. Misra V., R. Nelson, and M. Smith, Virology 166, 542-549 (1988).
204. Keller, P.M., A.J. Davison, R.S. Lowe, C.D. Bennett, and R.W. Ellis, Virology 152,181-191 (1986).
205. Bzik, D.J., C. Debroy, B.A. Fox, N.E. Pederson, and S. Person, Virology 155, 322-333 (1986).
55 206. Gong, Μ., T. Ooka, T. Matsuo, and E. Kieff, J. Virol. 61,499-508 (1987).
207. Baer, R., A.T. Bankier, M.D. Biggin, P.L. Deininger, P.J. Farrell, T.J. Gibson, G. Hatfull, G.S.
Hudson, S.C. Satchwell, C. Seguin, P.S. Tuffnell, and B.G. Barrell, Nature 310, 207-211 (1984).
Claims (16)
1. Recombinant pokkenvirus, met het kenmerk, dat het herpesvirus in een niet-essentieel gebied van het 10 pokkenvirusgenoom bevat.
2. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1, waarin het genoemde DNA codeert voor en tot expressie brengt een paard herpesvirus glycoproteïne, in het bijzonder een paard herpesvirus glycoproteins gekozen uit de groep bestaande uit paard herpesvirus gp13, paard herpesvirus gp14, paard herpesvirus gD, paard herpesvirus gp63 en paard herpesvirus gE.
3. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1, waarin het genoemde DNA codeert voor en tot expressie brengt ten minste twee paard herpesvirus glycoproteïnen.
4. Recombinant pokkenvirus volgens conclusie 1, waarin het pokkenvirus een vaccinia virus of een vogelpokkenvirus, in het bijzonder waarin het vogelpokkkenvirus wordt gekozen uit de groep bestaande uit pluimveepokkenvirus en kanariepokkenvirus, is.
5. Vaccin voor het induceren van een immunologische respons bij een gastheerdier ingeënt met het genoemde vaccin, welk vaccin een drager en een recombinant pokkenvirus bevattende, in een niet-essentieel gebied daarvan, DNA uit paard herpesvirus, bevat.
6. Vaccin volgens conclusie 5, waarin het genoemde DNA codeert voor en tot expressie brengt een paard herpesvirus glycoproteïne, in het bijzonder waarin het genoemde paard herpesvirus glycoproteïne wordt 25 gekozen uit de groep bestaande uit paard herpesvirus gp13, paard herpesvirus gp14, paard herpesvirus gD, paard herpesvirus gp63 en paard herpesvirus gE.
7. Vaccin volgens conclusie 5, waarin het genoemde DNA codeert voor en tot expressie brengt ten minste twee paard herpesvirus glycoproteïnen.
8. Vaccin volgens conclusie 5, waarin het pokkenvirus een vaccinia virus of een vogelpokkenvirus is, in het 30 bijzonder waarin het vogelpokkenvirus wordt gekozen uit de groep bestaande uit pluimveepokkenvirus en kanariepokkenvirus.
9. Geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul, dat een nucleïnezuursequentie die codeert voor paard herpesvirus gD (EHV-1 gD) zoals weergegeven in figuur 12 omvat.
10. Geïsoleerd polypeptide, dat een aminozuursequentie van paard herpesvirus gD (EHV-1 gD) zoals 35 weergegeven in figuur 12 omvat.
11. Nucleïnezuurvector, die het nucleïnezuurmolecuul volgens conclusie 9 bevat.
12. Vector volgens conclusie 11, die een pokkenvirus is.
13. Vector volgens conclusie 11, die een vaccinia virus is.
14. Vector volgens conclusie 11, die een vogelpokkenvirus is.
15. Vector volgens conclusie 11, die een pluimveepokkenvirus is.
16. Vaccin, dat een vector volgens één van de conclusies 11-15 en een drager bevat. Hierbij 31 bladen tekening
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9900035A NL195086C (nl) | 1989-04-17 | 2003-07-02 | Herpesvirus recombinant pokkenvirus. |
| NL9900034A NL195085C (nl) | 1989-04-17 | 2003-07-02 | Herpesvirus recombinant pokkenvirus. |
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33900489A | 1989-04-17 | 1989-04-17 | |
| US33900489 | 1989-04-17 | ||
| US39448889A | 1989-08-16 | 1989-08-16 | |
| US39448889 | 1989-08-16 | ||
| US07/502,834 US5338683A (en) | 1981-12-24 | 1990-04-04 | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| US50283490 | 1990-04-04 | ||
| US9002094 | 1990-04-16 | ||
| PCT/US1990/002094 WO1990012882A1 (en) | 1989-04-17 | 1990-04-16 | Herpes virus recombinant poxvirus vaccine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9020677A NL9020677A (nl) | 1992-02-03 |
| NL195016C true NL195016C (nl) | 2003-06-10 |
Family
ID=27407304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9020677A NL195016C (nl) | 1989-04-17 | 1990-04-16 | Recombinant pokkenvirus, vaccin dat dit virus bevat, geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul, geïsoleerd polypeptide, nucleïnezuurvector die dit nucleïnezuurmolecuul bevat en vaccin die deze vector bevat. |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5338683A (nl) |
| JP (2) | JP3083839B2 (nl) |
| KR (1) | KR920700289A (nl) |
| AT (1) | AT405184B (nl) |
| AU (1) | AU625623B2 (nl) |
| BE (1) | BE1004369A5 (nl) |
| CA (1) | CA2014465C (nl) |
| CH (1) | CH682671A5 (nl) |
| DE (2) | DE4090565C2 (nl) |
| DK (1) | DK176464B1 (nl) |
| FR (1) | FR2647808B1 (nl) |
| GB (1) | GB2246784B (nl) |
| IE (1) | IE61098B1 (nl) |
| IT (1) | IT1241119B (nl) |
| LU (1) | LU88018A1 (nl) |
| NL (1) | NL195016C (nl) |
| WO (1) | WO1990012882A1 (nl) |
Families Citing this family (161)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4603112A (en) * | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| US5505941A (en) * | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
| US7767449B1 (en) | 1981-12-24 | 2010-08-03 | Health Research Incorporated | Methods using modified vaccinia virus |
| US7045313B1 (en) | 1982-11-30 | 2006-05-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA |
| US5674735A (en) * | 1990-07-06 | 1997-10-07 | University Court Of The University Of Glasgow | DNA encoding the EHV-4 gH or gC glycoprotein |
| GB9014950D0 (en) * | 1990-07-06 | 1990-08-29 | Univ Glasgow | Ehv-4 glycoprotein vaccine |
| US7374768B1 (en) * | 1990-09-25 | 2008-05-20 | Xenova Research Limited | Viral vaccines |
| DE69132311T2 (de) * | 1990-09-25 | 2000-12-14 | Cantab Pharma Res | Bei einer transkomplementenden zellinie erzeugter defektiver virenimpfstoff |
| US5997878A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories | Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses |
| US5759552A (en) * | 1991-03-07 | 1998-06-02 | Virogenetics Corporation | Marek's disease virus recombinant poxvirus vaccine |
| GB9105383D0 (en) * | 1991-03-14 | 1991-05-01 | Immunology Ltd | An immunotherapeutic for cervical cancer |
| EP0561034B1 (en) * | 1991-08-26 | 1999-06-09 | IMMUNO Aktiengesellschaft | Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome |
| EP1380651A2 (en) * | 1991-08-26 | 2004-01-14 | Baxter Healthcare S.A. | Recombinant fowlpox virus with intact FPV-tk-gene |
| US5869312A (en) * | 1992-01-13 | 1999-02-09 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
| US5925358A (en) * | 1993-02-26 | 1999-07-20 | Syntro Corporation | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
| US6136318A (en) * | 1993-02-26 | 2000-10-24 | Cochran; Mark D. | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
| CA2156423A1 (en) * | 1993-02-26 | 1994-09-01 | Mark D. Cochran | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
| US6010703A (en) * | 1993-07-26 | 2000-01-04 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Recombinant poxvirus vaccine against feline rhinotracheitis |
| DK0752888T3 (da) * | 1994-03-30 | 2007-12-03 | Virogenetics Corp | Nukleotid- og aminosyresekvenser af gB, gC- og gD-hunde-herpesvirus og anvendelser deraf |
| AU694519B2 (en) * | 1994-04-29 | 1998-07-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
| JP2002512501A (ja) | 1996-07-03 | 2002-04-23 | メリアル インコーポレイテッド | 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ） |
| US6183752B1 (en) * | 1997-02-05 | 2001-02-06 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy |
| US6517843B1 (en) | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| US6224882B1 (en) | 1997-11-07 | 2001-05-01 | Protein Science Corp. | Insect cells or fractions as adjuvant for antigens |
| JP4741074B2 (ja) | 1998-02-24 | 2011-08-03 | シスターズ オブ プロビデンス イン オレゴン | Ｏｘ−４０レセプター結合因子又はそれをコードする核酸を含む組成物並びに抗原特異的免疫応答を増強するための方法 |
| CN100352930C (zh) | 1998-02-27 | 2007-12-05 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 疫苗、免疫治疗剂及其应用方法 |
| US6344337B1 (en) | 1999-02-19 | 2002-02-05 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Antigen test to detect equine protozoal myeloencephalitis in horse serum and cerebrospinal fluid |
| KR20070053815A (ko) | 1999-03-03 | 2007-05-25 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 백신 및 유전자요법 조성물 및 이들의 제조 및 사용방법 |
| US7446189B1 (en) | 1999-04-30 | 2008-11-04 | Institut De Recherches Cliniques De Montreal | Nucleic acids encoding mutant human CD80 and compositions comprising the same |
| AU5329300A (en) | 1999-06-10 | 2001-01-02 | Michigan State University | Feline calicivirus isolated from cat urine and vaccines thereof |
| CZ20014392A3 (cs) * | 1999-06-10 | 2002-06-12 | Merial | Vakcína AND pro domácí a sportovní zvířata |
| US7419668B1 (en) | 1999-09-02 | 2008-09-02 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses |
| AU7108700A (en) | 1999-09-02 | 2001-03-26 | Michigan State University | Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses |
| JP2003518073A (ja) * | 1999-12-21 | 2003-06-03 | メリアル | クリプトスポリジウムパルヴァムと他の腸内病原体の抗原を含む組成物およびワクチン |
| ES2307640T3 (es) * | 2000-07-14 | 2008-12-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vacunad de adn codificantes de proteinas accesorias del vih. |
| US20020164349A1 (en) * | 2000-10-04 | 2002-11-07 | Weiner David B. | Compositions and methods of using capsid protein from Flaviviruses and Pestiviruses |
| US7628980B2 (en) * | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| US7097842B2 (en) * | 2000-11-23 | 2006-08-29 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| NZ524661A (en) * | 2000-11-23 | 2005-03-24 | Bavarian Nordic As | Modified vaccinia ankara virus variant |
| US20020108132A1 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-08 | Avigenics Inc. | Production of a monoclonal antibody by a transgenic chicken |
| US7176300B2 (en) * | 2001-03-30 | 2007-02-13 | Avigenics, Inc. | Avian lysozyme promoter |
| WO2002079447A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Avigenics, Inc. | Avian lysozyme promoter |
| US7541512B2 (en) * | 2001-03-30 | 2009-06-02 | Synageva Biopharma Corp. | Avians containing a lysozyme promoter transgene |
| FR2823222B1 (fr) | 2001-04-06 | 2004-02-06 | Merial Sas | Vaccin contre le virus de la fievre du nil |
| US7740863B2 (en) * | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| US20040037848A1 (en) * | 2001-04-06 | 2004-02-26 | Audonnet Jean-Christophe Francis | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| US8216585B2 (en) * | 2001-05-25 | 2012-07-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Targeted particles and methods of using the same |
| US7550650B2 (en) * | 2001-09-18 | 2009-06-23 | Synageva Biopharma Corp. | Production of a transgenic avian by cytoplasmic injection |
| US6875588B2 (en) | 2001-11-30 | 2005-04-05 | Avigenics, Inc. | Ovomucoid promoter and methods of use |
| US7294507B2 (en) * | 2001-11-30 | 2007-11-13 | Avigenics, Inc. | Ovomucoid promoters and methods of use |
| US7335761B2 (en) * | 2001-11-30 | 2008-02-26 | Avigenics, Inc. | Avian gene expression controlling regions |
| US20100333219A1 (en) * | 2001-11-30 | 2010-12-30 | Synageva Biopharma Corp. | Methods of protein production using ovomucoid regulatory regions |
| US7135562B2 (en) * | 2002-03-14 | 2006-11-14 | University Of Cincinnati | Avian iFABP gene expression controlling region |
| US20040241723A1 (en) * | 2002-03-18 | 2004-12-02 | Marquess Foley Leigh Shaw | Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds |
| PT1420822E (pt) * | 2002-04-19 | 2007-09-04 | Bavarian Nordic As | Vírus vacínia modificado ancara para a vacinação de neonatais |
| CN101831411A (zh) * | 2002-05-16 | 2010-09-15 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 表达插入痘病毒基因组中的同源基因的重组痘病毒 |
| CA2494379C (en) * | 2002-09-05 | 2012-11-06 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
| CN1726276A (zh) * | 2002-12-13 | 2006-01-25 | 艾文蒂斯·帕斯图尔公司 | Alvac在禽胚胎干细胞上的生产 |
| CN1980571A (zh) * | 2003-01-24 | 2007-06-13 | 阿维季尼克斯股份有限公司 | 禽类及禽蛋中表达的外源蛋白质 |
| US7262027B2 (en) * | 2003-03-14 | 2007-08-28 | Medical College Of Ohio | Polypeptide and DNA immunization against Coccidioides spp. infections |
| EP1606419A1 (en) | 2003-03-18 | 2005-12-21 | Quantum Genetics Ireland Limited | Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds |
| US7468273B2 (en) | 2003-05-01 | 2008-12-23 | Meial Limited | Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use |
| NZ570709A (en) * | 2003-06-13 | 2010-04-30 | Univ Pennsylvania | Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same |
| EP1633372B1 (en) | 2003-06-13 | 2011-11-30 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Vaccines, immunotherapeutics and methods for using the same |
| MXPA06005424A (es) | 2003-11-13 | 2007-01-25 | Univ Georgia Res Found | Metodos para caracterizar virus de enfermedad bursal infecciosa. |
| US20050202484A1 (en) | 2004-02-19 | 2005-09-15 | The Governors Of The University Of Alberta | Leptin promoter polymorphisms and uses thereof |
| WO2007050095A2 (en) * | 2004-11-19 | 2007-05-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Improved vaccines and methods for using the same |
| CN103059100A (zh) | 2004-11-24 | 2013-04-24 | 奇斯药制品公司 | 用作双重胱天蛋白酶-2/-6 抑制剂的新肽及其生物学应用 |
| WO2006115843A2 (en) | 2005-04-25 | 2006-11-02 | Merial Limited | Nipah virus vaccines |
| BRPI0614119B8 (pt) * | 2005-07-28 | 2017-04-11 | Pah Usa 15 Llc | vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino |
| US20080241184A1 (en) | 2005-08-25 | 2008-10-02 | Jules Maarten Minke | Canine influenza vaccines |
| EP3536704B1 (en) | 2005-11-14 | 2021-08-25 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Gene therapy for renal failure |
| US7771995B2 (en) | 2005-11-14 | 2010-08-10 | Merial Limited | Plasmid encoding human BMP-7 |
| US7745158B2 (en) * | 2005-12-14 | 2010-06-29 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Detection of secreted aspartyl proteases from Candida species |
| AU2007208452B2 (en) * | 2006-01-13 | 2012-07-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines and immunotherapeutics using codon optimized IL-15 and methods for using the same |
| EP1981905B1 (en) | 2006-01-16 | 2016-08-31 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Chlamydia vaccine |
| BRPI0709282B8 (pt) | 2006-03-29 | 2021-05-25 | Merial Ltd | vacina contra estreptococos |
| WO2007136763A2 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Sanofi Pasteur, Inc. | Immunological composition |
| US7862821B2 (en) | 2006-06-01 | 2011-01-04 | Merial Limited | Recombinant vaccine against bluetongue virus |
| JP2009544333A (ja) * | 2006-07-28 | 2009-12-17 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | 改良されたワクチンおよびそれを使用するための方法 |
| US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
| KR101471445B1 (ko) * | 2007-01-26 | 2014-12-15 | 시나게바 바이오파르마, 코포레이션 | 조류에서 이식유전자 발현 |
| EP2147105B1 (en) | 2007-05-02 | 2013-04-24 | Merial Limited | Dna plasmids having improved expression and stability |
| TW200907058A (en) * | 2007-05-30 | 2009-02-16 | Wyeth Corp | Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins |
| US20090246226A1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Zeon Corporation | Avian vaccines possessing a positive marker gene |
| AU2009231559B2 (en) * | 2008-04-04 | 2015-10-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Consensus sequences of Chikungunya viral proteins, nucleic acid molecules encoding the same, and compositions and methods for using the same |
| EP2265715B1 (en) | 2008-04-04 | 2016-12-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines and immunotherapeutics using il-28 and compositions and methods of using the same |
| MX2010012069A (es) | 2008-05-08 | 2010-12-14 | Merial Ltd | Vacuna de la leishmaniasis con el uso del inmunogeno salival de la mosca de la arena. |
| AU2008363596B2 (en) | 2008-10-29 | 2015-04-30 | Inovio Pharmaceuticals, Inc | Improved HCV vaccines and methods for using the same |
| US8921536B2 (en) | 2008-10-29 | 2014-12-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | HCV vaccines and methods for using the same |
| US9050287B2 (en) | 2009-01-23 | 2015-06-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same |
| CA2653478A1 (en) * | 2009-01-23 | 2010-07-23 | Gregg Martin | Automated wash system for industrial vehicles |
| US20100192236A1 (en) * | 2009-01-28 | 2010-07-29 | University Of South Carolina | Modulation of Delta Opioid Receptor Expression |
| DK2998315T4 (da) | 2009-04-03 | 2022-02-07 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Newcastle sygdomsvirus-bårne fuglevacciner |
| US20100284977A1 (en) * | 2009-04-28 | 2010-11-11 | University Of South Carolina | Expression of Anti-Nociceptive Compounds from Endogenously Regulated Promoters |
| CA2760315C (en) | 2009-04-30 | 2019-05-28 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (Chuv) | Modified immunization vectors |
| AR078253A1 (es) | 2009-09-02 | 2011-10-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad |
| KR20120093163A (ko) | 2009-09-14 | 2012-08-22 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | Ｉｌ-15 수용체 알파 및/또는 이를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신 및 면역 치료제, 및 이를 이용하는 방법 |
| CN106987595B (zh) | 2009-11-02 | 2021-07-06 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 口蹄疫病毒病毒(fmdv)共有蛋白质、其编码序列及由其制备的疫苗 |
| US8298820B2 (en) | 2010-01-26 | 2012-10-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom |
| AU2011213559B2 (en) | 2010-02-08 | 2015-05-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecules encoding RANTES, and compositions comprising and methods of using the same |
| US9109007B2 (en) | 2010-08-18 | 2015-08-18 | Purdue Pharma L.P. | MHC-I restricted epitopes containing non-natural amino acid residues |
| US8986706B2 (en) * | 2010-08-31 | 2015-03-24 | Merial, Inc. | Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines |
| AR083533A1 (es) | 2010-10-22 | 2013-03-06 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe |
| BR112013011705B1 (pt) | 2010-11-12 | 2022-04-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Antígenos de próstata de consenso, molécula de ácido nucleico quecodifica os mesmos e vacina e usos compreendendo os mesmos |
| WO2012090073A2 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | The Netherlands Cancer Institute | Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity |
| AU2012212264B2 (en) | 2011-01-31 | 2016-01-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecules encoding novel herpes antigens, vaccine comprising the same, and methods of use thereof |
| PT2672992T (pt) | 2011-02-11 | 2020-07-27 | Univ Pennsylvania | Molécula de ácidos nucleicos codificando proteína nuclear do vírus da hepatite b e vacina compreendendo a mesma |
| US9238679B2 (en) | 2011-02-11 | 2016-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennslyvania | Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same |
| AU2012240240A1 (en) | 2011-04-04 | 2013-05-09 | Netherlands Cancer Institute | Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors |
| WO2012138789A2 (en) | 2011-04-04 | 2012-10-11 | Netherlands Cancer Institute | Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment |
| US9216213B2 (en) | 2011-04-20 | 2015-12-22 | Merial, Inc. | Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile |
| JP6407714B2 (ja) | 2011-04-25 | 2018-10-17 | アドヴァンスド バイオサイエンス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 短縮型ｈｉｖエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）、前記に関連する方法及び組成物 |
| ES2674439T3 (es) | 2011-06-01 | 2018-06-29 | Merial, Inc. | Administración sin aguja de vacunas contra el VSRRP |
| EP2731628B1 (en) | 2011-07-11 | 2019-09-04 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Dna vaccine against lassa virus |
| LT2734230T (lt) | 2011-07-20 | 2019-03-25 | Merial Limited | Rekombinantinė kačių leikemijos viruso vakcina, turinti optimizuotą kačių leukemijos viruso apvalkalo geną |
| CA2844927C (en) | 2011-08-12 | 2017-10-31 | Merial Limited | Vacuum-assisted preservation of biological products, in particular of vaccines |
| AR088028A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-05-07 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal |
| WO2013033092A2 (en) | 2011-09-03 | 2013-03-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Streptococcus suis pilus antigens |
| EP2750703B1 (en) | 2011-10-12 | 2018-07-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same |
| CN103889460B (zh) | 2011-10-24 | 2016-06-15 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 改进的hcv疫苗及其使用方法 |
| CN104245719B (zh) | 2011-12-12 | 2016-09-14 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法 |
| WO2013090294A1 (en) | 2011-12-12 | 2013-06-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Proteins comprising mrsa pbp2a and fragments thereof, nucleic acids encoding the same, and compositions and their use to prevent and treat mrsa infections |
| WO2013093629A2 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Netherlands Cancer Institute | Modular vaccines, methods and compositions related thereto |
| WO2013138776A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Merial Limited | Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g |
| WO2013142371A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Merial Limited | Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein c and uses thereof |
| US10040828B2 (en) | 2012-04-10 | 2018-08-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Human respiratory syncytial virus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same |
| ES2689878T3 (es) | 2013-02-21 | 2018-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento |
| JP6517779B2 (ja) | 2013-03-12 | 2019-05-22 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | ヒトパピローマウイルスの改良型ワクチンおよびその使用方法 |
| EP2968514A1 (en) | 2013-03-12 | 2016-01-20 | Merial, Inc. | Reverse genetics schmallenberg virus vaccine compositions, and methods of use thereof |
| CN114225019A (zh) | 2013-03-15 | 2022-03-25 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 癌疫苗及使用其的治疗方法 |
| ES2817903T3 (es) | 2013-03-15 | 2021-04-08 | Univ Pennsylvania | Proteínas de consenso del virus de la Fiebre Aftosa (VFA), secuencias codificantes y vacunas preparadas a partir de las mismas |
| CA2943816A1 (en) | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine epidemic diarrhea virus vaccine |
| CA2966191A1 (en) | 2014-11-03 | 2016-05-12 | Merial, Inc. | Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus |
| EA201890110A1 (ru) | 2015-06-23 | 2018-05-31 | Мериал, Инк. | Рекомбинантные вирусные векторы, содержащие минорные белки prrsv, и способы их получения и применения |
| DK3344289T3 (da) | 2015-08-31 | 2020-04-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Pestivirusvacciner mod medfødt tremor |
| MX2018003173A (es) | 2015-09-16 | 2018-05-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc | Vacunas de salmonella choleraesuis-salmonella typhimurium. |
| US10619169B2 (en) | 2016-09-20 | 2020-04-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | EHV insertion site ORF70 |
| BR112019005418A2 (pt) | 2016-09-20 | 2019-10-01 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | novos promotores |
| KR102566066B1 (ko) | 2016-09-20 | 2023-08-16 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 신규한 돼지 인플루엔자 백신 |
| UY37405A (es) | 2016-09-20 | 2018-03-23 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vectores de adenovirus canino |
| EP3534945A1 (en) | 2016-11-03 | 2019-09-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Vaccine against porcine parvovirus |
| CA3042584A1 (en) | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof |
| EA201991762A1 (ru) | 2017-01-30 | 2020-01-23 | Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. | Вакцины против коронавируса свиней |
| US11179457B2 (en) | 2017-07-12 | 2021-11-23 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Senecavirus a immunogenic compositions and methods thereof |
| MY201967A (en) | 2017-09-23 | 2024-03-27 | Boehringer Ingelheim Pharma | Paramyxoviridae expression system |
| WO2019092027A1 (en) | 2017-11-09 | 2019-05-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Sapelovirus immunogenic compositions and uses thereof |
| BR112020010499A2 (pt) | 2017-12-13 | 2020-11-24 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | vacinas de câncer de alvo de mesotelina e usos das mesmas |
| ES2938900T3 (es) | 2017-12-13 | 2023-04-17 | Inovio Pharmaceuticals Inc | Vacunas contra el cáncer dirigidas al PRAME y usos de las mismas |
| US11235044B2 (en) | 2017-12-13 | 2022-02-01 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Cancer vaccines targeting MUC16 and uses thereof |
| RU2711907C2 (ru) * | 2017-12-22 | 2020-01-23 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимые фрагменты белков вируса гепатита Е, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е (варианты) |
| AU2019223768A1 (en) | 2018-02-23 | 2020-08-27 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom |
| CA3091960A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New ehv insertion site ul43 |
| EP3768307A1 (en) | 2018-03-19 | 2021-01-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | New ehv with inactivated ul18 and/or ul8 |
| JP7162072B2 (ja) | 2018-03-26 | 2022-10-27 | ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド | 免疫原性組成物を製造する方法 |
| TW202027785A (zh) | 2018-09-20 | 2020-08-01 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 經修飾之pedv棘蛋白 |
| CN112867506A (zh) | 2018-09-20 | 2021-05-28 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 抗猪流行性腹泻的鼻内载体疫苗 |
| EP4100420A1 (en) | 2020-02-06 | 2022-12-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Polypeptides useful for detecting anti-rhabdovirus antibodies |
| JP2023544403A (ja) | 2020-10-05 | 2023-10-23 | ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド | サーコウイルス科カプシドタンパク質を含む融合タンパク質、及びそれから構成されるキメラウイルス様粒子 |
| EP4225776A1 (en) | 2020-10-05 | 2023-08-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Fusion protein useful for vaccination against rotavirus |
| WO2023194913A1 (en) | 2022-04-05 | 2023-10-12 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Immunogenic composition useful for vaccination against rotavirus |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1061898A (en) | 1963-03-07 | 1967-03-15 | Philips Electronic Pharma | Method for protecting dogs against canine distemper |
| US4603112A (en) * | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| US4769330A (en) * | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
| US4722848A (en) * | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
| JPH0795954B2 (ja) * | 1982-11-30 | 1995-10-18 | アメリカ合衆国 | 外来性遺伝子発現のためのポックスウイルス組換え体の製造方法 |
| EP0162738A1 (en) | 1984-04-09 | 1985-11-27 | MOLECULAR GENETICS RESEARCH & DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP | Production of pseudorabies virus subunit vaccines |
| EP0261940A3 (en) * | 1986-09-23 | 1989-07-05 | Applied Biotechnology, Inc. | Pseudorabies vaccines and dna vectors for recombination with pox viruses |
| US5242829A (en) * | 1986-09-23 | 1993-09-07 | Therion Biologics Corporation | Recombinant pseudorabies virus |
| DE3853088T2 (de) * | 1987-03-27 | 1995-10-19 | Nippon Zeon Co | Rekombinantes Avipoxvirus. |
| EP0297924A3 (en) * | 1987-07-01 | 1990-07-11 | City Of Hope | Recombinant vaccinia virus expressing hsv 1 gb |
| DE10399032I1 (de) * | 1987-08-28 | 2004-01-29 | Health Research Inc | Rekombinante Viren. |
| WO1990001546A1 (en) * | 1988-08-05 | 1990-02-22 | Applied Biotechnology, Inc. | Equine herpesvirus-1 vaccine |
| IE71643B1 (en) | 1990-11-20 | 1997-02-26 | Virogenetics Corp | A recombinant poxviral vaccine for canine distemper |
-
1990
- 1990-04-04 US US07/502,834 patent/US5338683A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-12 CA CA002014465A patent/CA2014465C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-16 JP JP02507078A patent/JP3083839B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-16 KR KR1019900702630A patent/KR920700289A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-04-16 NL NL9020677A patent/NL195016C/nl not_active IP Right Cessation
- 1990-04-16 AU AU55520/90A patent/AU625623B2/en not_active Expired
- 1990-04-16 AT AT0902590A patent/AT405184B/de active
- 1990-04-16 CH CH3982/90A patent/CH682671A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1990-04-16 DE DE4090565A patent/DE4090565C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-16 DE DE19904090565 patent/DE4090565T/de active Pending
- 1990-04-16 WO PCT/US1990/002094 patent/WO1990012882A1/en active Application Filing
- 1990-04-17 FR FR9004910A patent/FR2647808B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-17 BE BE9000425A patent/BE1004369A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1990-04-17 IT IT20063A patent/IT1241119B/it active IP Right Grant
- 1990-04-18 IE IE138090A patent/IE61098B1/en not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-27 GB GB9120655A patent/GB2246784B/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-15 DK DK199101743A patent/DK176464B1/da not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 LU LU88018A patent/LU88018A1/fr unknown
-
1993
- 1993-09-21 US US08/124,668 patent/US5482713A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/476,500 patent/US6183750B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-12-28 JP JP37276499A patent/JP3246735B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1990012882A1 (en) | 1990-11-01 |
| DK174391A (da) | 1991-12-12 |
| DE4090565C2 (de) | 2000-03-09 |
| DK174391D0 (da) | 1991-10-15 |
| US5482713A (en) | 1996-01-09 |
| IT1241119B (it) | 1993-12-29 |
| US5338683A (en) | 1994-08-16 |
| JP3246735B2 (ja) | 2002-01-15 |
| IT9020063A1 (it) | 1991-10-17 |
| GB2246784B (en) | 1993-04-28 |
| FR2647808B1 (fr) | 1995-03-03 |
| IE61098B1 (en) | 1994-09-21 |
| BE1004369A5 (fr) | 1992-11-10 |
| JPH04505248A (ja) | 1992-09-17 |
| NL9020677A (nl) | 1992-02-03 |
| ATA902590A (de) | 1998-10-15 |
| AU625623B2 (en) | 1992-07-16 |
| AT405184B (de) | 1999-06-25 |
| CA2014465A1 (en) | 1990-10-17 |
| DE4090565T (nl) | 1992-05-14 |
| KR920700289A (ko) | 1992-02-19 |
| IE901380L (en) | 1990-10-17 |
| CA2014465C (en) | 1999-06-15 |
| US6183750B1 (en) | 2001-02-06 |
| GB9120655D0 (en) | 1991-11-27 |
| FR2647808A1 (fr) | 1990-12-07 |
| JP3083839B2 (ja) | 2000-09-04 |
| IT9020063A0 (it) | 1990-04-17 |
| LU88018A1 (fr) | 1992-03-11 |
| JP2000157292A (ja) | 2000-06-13 |
| DK176464B1 (da) | 2008-03-31 |
| AU5552090A (en) | 1990-11-16 |
| CH682671A5 (fr) | 1993-10-29 |
| GB2246784A (en) | 1992-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL195016C (nl) | Recombinant pokkenvirus, vaccin dat dit virus bevat, geïsoleerd nucleïnezuurmolecuul, geïsoleerd polypeptide, nucleïnezuurvector die dit nucleïnezuurmolecuul bevat en vaccin die deze vector bevat. | |
| Guo et al. | Expression in recombinant vaccinia virus of the equine herpesvirus 1 gene encoding glycoprotein gp13 and protection of immunized animals | |
| LU88000A1 (fr) | Systeme de selection d'hotes de poxvirus du recombinaision | |
| DE69233158T2 (de) | Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe | |
| US5688920A (en) | Nucleotide and amino acid sequences for canine herpesvirus GB, GC and GD and uses therefor | |
| Guo et al. | Coexpression by vaccinia virus recombinants of equine herpesvirus 1 glycoproteins gp13 and gp14 results in potentiated immunity | |
| JP2001520507A (ja) | 組換えポックスウイルス−サイトメガロウイルス組成物および使用 | |
| US6248333B1 (en) | Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD) | |
| DE69535561T2 (de) | NUKLEOTID- UND AMINOSÄURESEQUENZEN gB, gC UND gD DES HERPESVIRUS DES HUNDES UND IHRE VERWENDUNGEN | |
| NL195085C (nl) | Herpesvirus recombinant pokkenvirus. | |
| CA2259047C (en) | Innoculation kits for avoiding maternal immunity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BX | A request for additional search has been filed | ||
| BY | An additional search report has been drawn up | ||
| NP1 | Patent granted (not automatically) | ||
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20100416 |