CH682671A5 - Poxvirus recombinant et vaccin contre le virus de l'herpès contenant ce poxvirus. - Google Patents

Poxvirus recombinant et vaccin contre le virus de l'herpès contenant ce poxvirus. Download PDF

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CH682671A5 CH3982/90A CH398290A CH682671A5 CH 682671 A5 CH682671 A5 CH 682671A5 CH 3982/90 A CH3982/90 A CH 3982/90A CH 398290 A CH398290 A CH 398290A CH 682671 A5 CH682671 A5 CH 682671A5
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Description

CH 682 671 A5
Description
La présente invention est relative à un poxvirus modifié et à des procédés pour produire et utiliser celui-ci. Plus particulièrement, l'invention est relative à un poxvirus recombinant, qui exprime des pro-5 duits de gène d'un gène du virus de l'herpès, et à des vaccins qui impartissent une immunité protectrice contre des infections provoquées par le virus de l'herpès.
On se réfère à plusieurs publications dans la présente demande de brevet; celles-ci sont désignées par des nombres en chiffres arabes entre parenthèses. La citation complète de ces publications antérieures se trouve à la fin de la présente description immédiatement avant les revendications. Ces publi-10 cations antérieures décrivent l'état de l'art auquel l'invention appartient.
Le virus de la vaccine et plus récemment d'autre poxvirus ont été utilisés pour l'insertion et l'expression de gènes étrangers. La technique de base pour insérer des gènes étrangers dans des poxvirus infectieux vivants implique la recombinaison entre les séquences d'ADN du pox qui flanquent un élément génétique étranger dans un plasmide donneur et de séquences homologues présentes dans le poxvirus 15 de sauvetage (28).
Spécifiquement, les poxvirus recombinants sont construits en deux étapes connues, dans la technique et qui sont analogues aux procédés pour créer des recombinants synthétiques du virus de la vaccine décrits dans le brevet US n° 4 603 112, l'enseignement de ce brevet étant incorporé dans la présente par référence.
20 Tout d'abord, dans une première étape, la séquence d'ADN du gène à être insérée dans le virus, particulièrement un cadre de lecture ouvert provenant d'une source qui n'est pas un pox, est placée dans la structure ou construction de plasmide d'E. Coli dans lequel de l'ADN homologue à une section d'ADN du poxvirus a été inséré. Séparément, la séquence de l'ADN du gène à insérer est liée à un promoteur.
25 Le groupe de liaison ou linkage promoteur-gène est positionné dans la structure du plasmide de sorte que le linkage promoteur-gène soit flanqué aux deux extrémitées par de l'ADN homologue à une séquence d'ADN qui flanque une région de l'ADN du pox contenant un locus non essentiel. La structure du plasmide résultant est ensuite amplifiée par croissance dans la bactérie £. Coli (11) puis isolée (12, 20).
30 Ensuite, dans une seconde étape, le plasmide isolé, contenant la séquence d'ADN du gène à être inséré, est transfecté dans une culture de cellules, par exemple des fibroblastes d'embryons de poulet, en même temps que le poxvirus. La recombinaison entre l'ADN du pox homologue dans le plasmide et le génome viral respectivement donne un poxvirus modifié par la présence, dans une région non essentielle de son génome, de séquences d'ADN étranger. Le qualificatif «étranger» appliqué à l'ADN dé-35 signe un ADN exogène, en particulier de l'ADN à partir d'une source qui n'est pas un pox, qui code pour des produits de gène qui ne sont ordinairement pas produits par le génome dans lequel l'ADN exogène est placé.
La recombinaison génétique est en général l'échange de sections homologues d'ADN entre deux brins d'ADN. Dans certains virus, l'ARN peut remplacer l'ADN. Des sections homologues d'acide nucléi-40 que sont des sections d'acide nucléique (ADN, ARN) qui ont la même séquence de bases de nucléoti-de.
La recombinaison génétique peut avoir lieu naturellement pendant la réplication ou la fabrication de génomes viraux nouveaux à l'intérieur de la cellule hôte infectée. Ainsi, la recombinaison génétique entre des gènes viraux peut se produire pendant le cycle de réplication virale qui se produit dans une cel-45 Iule hôte qui est co-infectée par deux ou plusieurs virus différents ou autres structures génétiques. Une section d'ADN d'un premier génome est utilisée d'une manière interchangeable dans la construction de la section du génome d'un second virus co-infectant dans lequel l'ADN es homologue à celui du premier génome viral.
Toutefois, la recombinaison peut également avoir lieu entre des sections d'ADN dans des génomes 50 différents, qui ne sont pas parfaitement homologues. Si une telle section provient d'un premier génome homologue à une section d'une autre génome à part la présence dans la première section de, par exemple, un marqueur génétique ou d'un gène codant pour un déterminant antigénique inséré dans une portion de l'ADN homologue, la recombinaison peut encore avoir lieu et les produits de cette recombinaison sont alors détectables par la présence de ce marqueur génétique ou gène dans le séno-55 me viral recombinant.
L'expression réussie de la séquence génétique de l'ADN inséré par le virus infectieux modifié exige deux conditions. La première est que l'insertion doit être faite dans une région non essentielle du virus afin que le virus modifié reste viable. La seconde condition pour l'expression de l'ADN inséré est la présence d'un promoteur en relation correcte avec l'ADN inséré. Le promoteur doit être placé de sorte qu'il 60 soit localisé en amont de la séquence d'ADN à exprimer.
Il existe deux sous-types de virus de l'herpès chevalin, qui, bien qu'ils contiennent des épitopes se neutralisant l'un l'autre, peuvent être distingués par leurs profils antigéniques, leurs empreintes digitales d'endonucléase de restriction et leur action pathogène à l'égard des chevaux (1). Le virus de l'herpès chevalin 1 (EHV-1) est associé à une maladie de la voie respiratoire, des désordres du système ner-65 veux central et des avortements herpétiques classiques, alors que le virus de l'herpès chevalin 4 (EHV-
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 682 671 A5
4) est associé d'une manière prédominante à une maladie de la voie respiratoire (1, 48). Les virus de l'herpès chevalin font partie de la sous-famille des alphaherpèsvirus et manifestent un grand nombre des caractéristiques biologiques et biochimiques typiques des virus de l'herpès humain, tels que l'iso-mérisation génomique, la régulation de l'expression des gènes, l'établissement d'infections latentes, la production de particules de virus interférantes défectueuses, l'induction de désordres neurologiques et la transformation oncogénique in vitro (1, 4, 23). Ainsi, le EHV peut être avantageusement utilisé pour étudier les conséquences biologiques variées des infections par le virus de l'herpès.
Les glycoprotéines du virus de l'herpès interviennent dans des fonctions virales essentielles, telles que l'attachement et la pénétration cellulaires, l'extension de cellule à cellule du virus et, d'une manière importante, déterminent le profil de pathogènicité de l'infection. Les glycoprotéines du virus de l'herpès sont des composants critiques dans l'interaction avec le système immunitaire de l'hôte (36, 37).
Les glycoprotéines bien caractérisées du virus de l'herpès simplex comprennent gB, gC, gD, gE, gG, gH et gl (36, 37, 49-55). Un certain nombre d'études ont montré l'importance des glycoprotéines du virus de l'herpès simplex pour provoquer des réponses immunitaires. C'est pourquoi, il a été rapporté que gB et gD peuvent provoquer des réponses immunitaires importantes (6, 8, 13, 18, 21, 22, 26, 27, 30, 44, 46, 47). gC peut stimuler des lymphocytes cytotoxiques à restriction de la classe I (15, 32), alors que gD peut stimuler des réponses de cellules T cytotoxiques de la classe II (21, 22, 44, 46, 47). gG s'est révélé être une cible pour la neutralisation de virus sous la direction d'anticorps compléments dépendants (38, 39). Plusieurs glycoprotéines en provenance d'autres virus de l'herpès sont également connues pour provoquer des réponses immunitaires importantes (5, 10, 36, 56).
Chacun des deux sous-types de EHV exprime six glycoprotéines abondantes (1, 3, 43). Les portions génomiques des séquences d'ADN codant pour gp2, gp10, gp13, gp14, gp17/18 et gp21/22a ont été déterminés en utilisant des vecteurs d'expression lamba gt11 et des anticorps monoclonaux (3). Les glycoprotéines gp13 et gp14 ont été localisées dans les mêmes emplacements dans le composant L du génome auquel sont homologues gC et gD, respectivement, de la carte du virus de l'herpès simplex (3). L'EHV-1 semble se singulariser parmi les virusalphaherpès dont les gènes de glycoprotéine ont été cartographiés, en ce que cinq de ses six glycoprotéines principales ont été codées à partir de séquences dans le composant de génome L, alors que seulement une glycoprotéine (gp17/18) est cartogra-phiée dans la région Us. En analysant ces données, on a prédit que certaines des glycoprotéines en faible abondance identifiées dans les virions EHV-1, aussi bien que les glycoprotéines EHV-1 non encore identifiées, s'appliquent en carte sur le composant S du génome (3). Les glycoprotéines d'enveloppe sont les immunogènes principaux des virus de l'herpès impliqués pour provoquer des réponses immunitaires chez l'hôte, à la fois humorales et cellulaires (5, 8, 73-75) et sont donc du plus grand intérêt pour ceux qui tentent de réaliser des vaccins.
Récemment, la séquence de nucléotides de la souche Kentucky T431 de l'unité transcriptionnelle de EHV-1 qui code gp13 a été rapportée (2). Un cadre de lecture ouvert code un produit de traduction primaire de 468 acides aminés, de 51 kDa. La protéine a les traits caractéristiques d'une protéine enjambant la membrane avec neuf sites potentiels de giycosylation a liaison par l'azote (Asn-X-Ser/Thr) présents dans le domaine de surface entre le signal putatif et les portions d'ancrage trans-membrane de la protéine (2). La glycoprotéine s'est révélée être homologue à (HSV) gC-1 et gC-2 du virus de l'herpès simplex, à (PRV) glll du virus de la pseudo-rage et à (VZV) gpV du virus de la varicelle zoster (2). EHV-1 gp13 est donc l'homologue structural des glycoprotéines, analogues à gC, du virus de l'herpès.
La séquence des nucléotides de EHV-1 gp14 (71, 72) a été rapportée récemment. L'analyse de la séquence prédite des acides aminés de la glycoprotéine gp14 a révélé une homologie significative avec la glycoprotéine correspondante de HSV, à savoir gp.
Les anticorps monoclonaux dirigés contre certaines glycoprotéines EHV-1 sont neutralisant d'après ce qui a été montré (76). Des expériences d'immunisation passive ont démontré que les anticorps monoclonaux dirigés contre gp13 ou gp14 (77) ou contre gp13, gp14 ou gp17/18 (78) pourraient protéger les hamsters contre une attaque mortelle. D'autres analogues des glycoprotéines gB et gC sont également impliqués dans la protection contre des maladies causées par des alphaherpèsvirus (8, 10, 73). La glycoprotéine EHV-1 gp17/18, bien que caractérisée comme un autre immunogène protecteur potentiel, n'a pas jusqu'à présent de contre-partie structurelle connue parmi les plusieurs protéines codées par le composant S dans les autres alphaherpèsvirus (66, 79, 80), du fait de sa position génomique, on a spéculé que gp17/18 pourrait être l'analogue de HSV gE (2).
Le virus de la pseudo-rage (PRV), qui est un alphaherpèsvirus, est l'agent qui provoque la maladie d'Aujesky. La maladie est hautement infectieuse en provoquant des pertes économiques importantes dans l'industrie porcine. La maladie est associée à une morbidité et une mortalité élevées parmi les porcelets et elle est caractérisée par des maladies respiratoires sévères, des avortements, une dimension réduite de la litière et des taux de croissance diminués chez les survivants. Une encéphalite fatale est une conséquence fréquente de l'infection. Des infections virales latentes, une caractéristique des virus de l'herpès, peuvent s'établir, ce qui permet aux cochons adultes s'étant rétabli de la maladie de servir comme porteurs chroniques du virus. Pour une revue extensive récente de la questiont voir Witt-man et Rziha (81).
Le génome de PRC consiste en ADN double brin de 90 x 106 daltons (82) séparé par des séquences répétées inversées en un segment long unique (Ul) ou en un segment court unique (Us) (83, 84).
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Le génome PRV code approximativement 100 poiypeptides dont l'expression est réglée d'une manière en cascade semblable aux autres virus de l'herpès (85, 86). A l'heure présente, cinq glycoprotéines gpl, gpll, gplll, gp63 et gp50 ont été montrées comme associées à l'enveloppe virale et associées aux diverses structures membraneuses des cellules infectées par PRV (80, 86-91). Une sixième protéine codée par PRV (gX) est libérée dans le milieu de culture (92). L'emplacement ou localisation physique de ces glycoprotéines du génome de PRV et leurs séquences d'ADN sont bien connus (62, 80, 91-98). Comme pour les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès, les glycoprotéines de PRV contrôlent des fonctions virales essentielles, telles que l'attachement aux cellules, la pénétration dans les cellules et/ou ia libération à partir des cellules. Les glycoprotéines de PRV sont critiques dans le profil de pathogéni-cité de l'infection par PRV et sont des constituants critiques dans la résolution de la maladie et l'état immunitaire.
PRV pgl est non-essentiel pour la réplication du virus in vitro et in vivo et est absent de la plupart des souches de PRV atténuées (99). La nature atténuée de ces souches dont on a supprimé gl indique également un rôle possible de gl dans la virulence (99, 100). D'autres protéines de PRV semblent toutefois être impliquées dans cette fonction étant donné que l'expression de gl seul n'est pas suffisante pour produire de hauts niveaux de virulence (100).
Le rôle que joue gl dans la provocation de la réponse immunitaire contre PRV n'est pas claire. Des anticorps monoclonaux contre gl peuvent neutraliser le virus in vitro (101) et protéger passivement des souris immunisées contre une attaque mortelle par PRV (81). Kost et al. (98) ont récemment décrit l'expression de PRV gpl dans les recombinants du virus de la vaccine, soit seul soit en association avec gp50 et gp63. L'inoculation intracraniale des recombinants de la vaccine dans des souris a produit une virulence accrue, particulièrement lorsque PRV gpl était associé à la co-expression de gp50 et gp63.
Chez les cochons, toutefois, des anticorps neutralisant contre gl ne sont pas produits (5). En outre, un virus recombinant de la vaccine exprimant des poiypeptides codés par PRV gl (98) ne protègent pas les souris contre une attaque mortelle par PRV (relativement à la protection impartie par le virus de la vaccine de souche sauvage de contrôle). Ces données, prises ensemble, suggèrent que PRV gpl est plus approprié pour constituer une sonde de diagnostic que comme composant d'un vaccin subunitaire.
La glycoprotéine gp63 de PRV est localisée adjacente à gp50 dans la région Us du génome de PRV (80). La séquence de codage pour PRV gp63 commence avec trois codons ATG consécutifs, environ 20 nucléotides en aval du codon d'arrêt de gp50. Il n'y a pas de motif de signal transcriptionnel recon-naissable et la traduction ou transcription se produit probablement à partir du même transcripteur que gp50. PRV gp63 est non essentiel in vitro. PRV gp63, en tant que séquence d'ADN continue avec PRV gp50, a été exprimé dans le virus de ia vaccine comme rapporté par Kost et al. (98). La contribution de PRV gp63 à la protection des souris contre l'attaque par PRV est difficile à établir étant donné que ces études n'ont pas disséqué les contributions de PRV gp50 et gp63.
La glycoprotéine gX de PRV est une glycoprotéine non structurale dont le produit final est sécrété dans le fluide extra-cellulaire (85, 92). Aucune neutralisation in vitro de PRV n'a été obtenue ni avec les sérums polygonaux ni avec les sérums monoclonaux vis-à-vis de PRV gX (102, 103) et les vaccins gX subunitaires n'étaient pas protecteurs contre l'attaque (104).
La glycoprotéine gp50 de PRV est l'analogue de (HSV-1 ) gD du virus de l'herpès simplex type 1. Le cadre de lecture ouvert d'ADN code 402 acides aminés (95). La forme glycosylatée mature (50-60 kDa) contient des carbohydrates à liaison par l'oxygène sans glycosyiation à liaison par l'azote (95). Le sérum porçin est hautement réactif avec PRV gp50, ce qui suggère son importance comme immunogè-ne. Les anticorps monoclonaux pour gp50 neutralisent PRV in vitro avec ou sans complément (97, 105, 106) et protègent passivement les souris (102, 105, 106) et les cochons (102). Les recombinants du virus de la vaccine exprimant PRV gp50 induisent des anticorps neutralisant le sérum et protègent à la fois les souris et les cochons contre l'attaque mortelle par le PRV (98, 107, 108).
Le gène de PRV gplll est localisé dans la région Ul du génome. Le cadre de lecture ouvert de 1437 bp code une protéine de 479 acides aminés. Le produit de traduction primaire déduit de 50,9 kDa comporte huit sites potentiels de glycosyiation à liaison par l'azote (87). PRV glll est l'analogue du HSV-1 gC (96). Le remplacement fonctionnel de PRV glll par HSVgC n'a pas été observé (109). Bien que PRV glll soit non essentiel pour la réplication in vitro (110, 111), la forme glycosylatée mature (98 kDa) est un constituant abondant de l'enveloppe de PRV. Des anticorps monoclonaux anti-gpll! neutralisent le virus in vitro avec ou sans complément (86, 106, 110) et peuvent protéger passivement les souris et les cochons (102). La glycoprotéine glll de PRV peut protéger les souris et ies cochons contre l'attaque mortelle par PRV après immunisation avec une protéine de fusion Cro/glll exprimée dans E. Coli (Rob-bins, A., R. Watson, L. Enquist, demande de brevet européen 0.162.738A1) ou exprimée dans une vaccine recombinante (Panicali, D., L. Gritz, G. Mazzara, demande de brevet européen 0.2617940A2).
Un des constituants principaux de l'enveloppe de PRV est complexe à liaison disulfure de trois glycoprotéines (120 kDa, 67 kDa et 58 kDa) désigné PRV gpll suivant la nomenclature de Hampl (86). La séquence d'ADN codant PRV gli est localisée à l'extrémité gauche de Ul- Le cadre de lecture ouvert de 2976 nucléotides code un produit de traduction primaire de 913 acides aminés de 110 kDA. PRV gpll est l'homologue de HSV-1 gB (62). Il a été montré que les anticorps monoclonaux dirigés contre PRV gpll neutralisent le virus in vitro (5) avec ou sans complément (81). En outre, les études d'immunisation passive ont démontré que les anticorps monoclonaux neutralisants protégeaient partiellement les
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cochons mais ne protégeaient pas les souris contre l'attaque du virus virulent (102). A ce jour, l'immunisation active des cochons avec la glycoprotéines PRV gpll n'a pas été rapportée.
Pendant les 20 dernières années, l'incidence des infections génitales provoquées par le virus type 2 de l'herpès simplex (HSV2) a augmenté d'une manière significative. Des estimations récentes indiquent qu'aux Etats-Unis 5-20 millions de personnes ont l'herpès génital (112). Bien que l'on ait montré que le traitement oral avec l'ayclovir réduit ia sévérité des infections primaires (113) et supprime les épisodes récurants (114), le contrôle et le traitement de ces infections est loin d'être idéal. On a donc besoin d'un vaccin pour empêcher les infections primaires et récurantes.
Le génome du virus type 1 de l'herpès simplex (HSV1) code au moins huit glycoprotéines antigénéti-quement distinctes gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl et gJ (115). Les homologues de ces gènes semblent être présents dans HSV2 (116-119). Etant donné que ces glycloprotéines sont présentes à la fois dans l'enveloppe du virion et la membrane du plasma de la cellule infectée, ils peuvent induire des réponses immunitaires protectrices humorales et via les cellules (37).
L'importance relative de l'immunité humorale et cellulaire dans la protection contre les infections du virus de l'herpès simplex n'a pas été complètement élucidée. Des souris immunisées avec HSV1 gB, gC ou gD purifié sont protégées contre l'attaque mortelle par HSV1 (120). Des souris ont été également protégées contre l'attaque mortelle par HSV1 ou HSV2 par immunisation passive avec des anticorps vis-à-vis du virus total HSV1 (121) ou HSV2 (122) total et avec des anticorps vis-à-vis des glycoprotéines individuelles HSV2 gB, gC, gD ou gE (123). Cette protection semble toutefois être dépendante d'une réponse des cellules T compétentes étant donné que les animaux immuno-supprimés par irradiation, la cyclophosphamide ou le sérum anti-thymocyte n'étaient pas protégés (124).
La contribution des glycoprotéines individuelles pour provoquer une réponse immunitaire protectrice n'est pas complètement comprise. L'expression de ces glycoprotéines dans un système hétérologue, telle que la vaccine, a permis l'analyse de certains de ces paramètres. Par exemple, on a montré que les vecteurs du virus de la vaccine exprimant HSV1 gB (125) et HSV1 gC (32) induisent des réponses de cellules T cytotoxiques. En outre, il a été montré que des souris immunisées avec le virus recombinant de la vaccine exprimant HSV1 gB (8), HSV1 gC (126) ou HSV1 gD (26) sont protégées contre une attaque mortelle par HSV1. Un virus recombinant de la vaccine exprimant HSV1 gD s'est révélé également être protecteur contre HSV2 dans un système modèle de cochon d'Inde (cobaye). On ne sait pas cependant si l'expression d'antigènes (HSV) multiples résulte dans la potentialisation (effet de synergie) de cette réponse protectrice.
Le virus 1 de l'herpès bovin (BHV1) est responsable d'une variété de maladies du bétail, y compris la conjonctivite, la vulvo-vaginite et l'avortement (127). Il est également l'un des agents les plus importants de la maladie respiratoire bovine, en agissant soit directement, soit comme facteur prédisposant dans l'infection bactérienne (128).
BHV1 spécifie plus de 30 poiypeptides structuraux, dont 11 sont glycosylatés (129). Quatre de ces glycoprotéines gl, gli, glll et gIV ont été caractérisées et on a montré qu'elles sont homologues aux glycoprotéines gB, gC, gD et gE du virus (HSV) de l'herpès simplex (130, 131).
Les vaccins subunitaires consistant en gl, glll et/ou gIV se sont révélés protéger le bétail de la maladie (en utilisant un modèle d'attaque par aérosol hémolytique BHV1/Pasteurella), mais non pas de l'infection. Ces résultats indiquent l'importance de ces glycoprotéines pour provoquer une réponse immunitaire réussie contre BHV1.
gl et glll ont également été clonés dans le virus de la vaccine et du bétail immunisé avec ces recombinants se sont révélés produire des anticorps neutralisant vis-à-vis du BHV1 (56, 133).
La rhinotrachéite féline est une maladie, commune et mondialement répandue, des chats; elle est provoquée par un alphaherpèsvirus désigné comme virus de l'herpès félin type 1 (FHV-1). Comme d'autres virus de l'herpès, FHV-1 établit une infection latente qui résulte dans une réactivation périodique (134). Les infections de FHV-1 dans les colonies ou stations d'élevage sont caractérisées par un taux élevé de mortalité chez les chatons. Des infections secondaires de la voie respiratoire supérieure sont très débilitantes pour les adultes. Le contrôle de cette maladie est tenté actuellement en utilisant des vaccins vivants modifiés ou des vaccins inactivés qui peuvent supprimer le développement des signes cliniques, mais n'empêchent pas l'infection qui produit ia dissémination du virus. Ainsi, des chats vaccinés sans symptômes peuvent disséminer le virus virulent et des infections latentes ne peuvent pas être empêchées par les vaccins existants (135) ou par des vaccins subunitaires purifiés, plus sûrs, en cours de développement (136, 137).
Les glycoprotéines du virus de l'herpès interviennent dans la fixation du virion à la cellule hôte et sont extrêmement importantes dans l'infectivité virale (138, 139). Elles déterminent également la spécificité de sous-type du virus (140). Les antigènes des glycoprotéines du virus de l'herpès sont reconnues à la fois par les sytèmes immunitaires humoraux et les systèmes immunitaires cellulaires et se sont révélés provoquer des réponses immunitaires protectrices chez les hôtes vaccinés (44, 107, 141, 132). On a montré que FHV-1 contient au moins 23 protéines différentes (143, 144). Parmi celles-ci, au moins 5 sont glycosylatées (144, 145) avec des masses moléculaires rapportées s'étalant de 120 kDa à 60 kDa. On a montré que les glycoprotéines de FHV-1 sont immunogènes (143, 145).
Comme plusieurs autres alphaherpèsvirus, FHV-1 apparaît comme ayant un homologue de la glycoprotéine B (gB) de HSV-1, et une séquence partielle du gène FHV-1 gB a été récemment rapportée
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(146). Le FHV-1 gB est exigé pour l'entrée du virus et la fusion cellulaire (147, 149). Le HSV-1 gB et les analogues de gB d'autres virus de l'herpès ont, comme on l'a montré, provoqué un anticorps circulant important, aussi bien que des réponses immunitaires induites via les cellules (8, 10, 37, 47, 73, 150). La glycoprotéine FHV-1 gB est un complexe de 134 kDa qui est dissocié par le B-mercaptoétha-nol en deux glycoprotéines de 66 kDa et de 60 kDa. Le génome d'ADN de FHV-1 a une taille d'environ 134 kb (153).
Le virus d'Epstein-Barr (EBV), un virus de l'herpès lymphotropique humain B, est un membre du genre lymphocryptovirus qui appartient à la sous-famille des gammaherpèsvirus. Il constitue l'agent qui provoque la mononucléose infectieuse (154) et la lymphomase des cellules B. EBV est associé à deux affections malignes humaines: le lymphome endémique de Burkitt et le carcinome nasopharyngien non différencié.
Etant donné que le génome de l'EBV a été complètement séquencé (207) comme les génomes de VZV (66) et HSV1 (158), on a décrit de nombreuses homologies entre ces différents virus de l'herpès (159). Dans certains cas, ces homologies ont été utilisées pour prédire des fonctions potentielles de certains cadres de lecture ouverts (ORF) de EBV. Les gènes de EBV homologues aux gènes de HSV1 impliqués dans l'immunité ont un intérêt particulier. Ainsi, le gène de EBV BALF4 a des homologies avec HSV1 gB (68) et le gène d'EBV BXLF2 a des homologies avec HSV1 gH (161). Finalement, le gène de EBV BBRF3 comporte des homologies avec une protéine de membrane de CMV (162).
Parmi les protéines de EBV, les deux principales glycoprotéines de l'enveloppe, à savoir gp340 et gp220, sont les antigènes de vaccination potentiels les mieux caractérisés. Elles sont dérivées du même gène par épissage ou splicing sans changement dans le cadre de lecture (163, 164). Des anticorps monoclonaux et des sérums polyclonaux dirigés contre gp340 neutralisent l'EBV jn vitro (165). Le «cotton-top tamarind» (marmouset ou ouistiti sud-américain doté de griffes), le seul animal susceptible, peut être protégé par une immunisation avec du gp340 purifié (166) et avec un virus recombinant de la vaccine EBV gp340 (167). Dans ce cas, la protection a été obtenue avec un recombinant dérivé de la souche de vaccine WR, mais non avec un recombinant dérivé de la souche de la vaccine Wyeth. La souche Wyeth a été largement utilisée en tant que souche de vaccin.
Les anticorps monoclonaux dirigés contre le gp85, l'homologue de EBV au HSV1 gH, ont été décrits comme des anticorps neutralisant in vitro (168, 169).
Le cytomégalovirus humain (HCMV) est un membre de la sous-famille des bétaherpèsvirus (famille des herpès viridés). HCMV peut provoquer une infection productrice persistante en face de l'immunité spécifique substantielle. Même si HCMV possède une pathogènicité faible, en général, une infection intra-utérine provoque des dommages au cerveau ou la surdité dans environ 0,15% des nouveaux-nés et est la complication infectieuse la plus habituelle de la transplantation d'organes (170). Bien que l'efficacité d'un vaccin HCMV (souche Towne) atténué vivant expérimental a été démontré, des préoccupations à propos des souches de vaccins vivants a entraîné des efforts d'identification des protéines de HCMV utilisables comme vaccin subunitaire. Dans cette perspective, l'identification des glycoprotéines du virion et leur évaluation comme agents protecteurs est une étape importante.
On a décrit (172) trois familles immunologiquement distinctes de glycoprotéines associées à l'enveloppe de HCMV: gCI (gp55 et gp93-130); gCII (gp47-52); et gCIII (pg55-p145).
Le gène codant pour gCI est homologue à HSV1 gB. Les glycoprotéines geli sont codées par une famille de cinq gènes (XHLF) disposés en tandem et partageant une ou deux régions d'homologie. Plus probablement gCII est codée par seulement deux de ces gènes (172, 173). Le gène qui code pour gCIII est homologue à HSV1 gH (174).
On a décrit (174, 176) des anticorps neutralisant in vitro spécifiquement dirigés contre chacune de ces familles.
Des mutants de poxvirus convenablement modifiés portant des gènes de virus de l'herpès chevalin exogène, qui ont été exprimés dans un hôte en tant que déterminant antigénique provoquant la production par l'hôte d'anticorps vis-à-vis des antigènes du virus de l'herpès, représentent des vaccins nouveaux qui évitent les inconvénients des vaccins classiques utilisant des organismes tués ou des organismes vivants atténués. Ainsi, par exemple, la production de vaccins à partir d'organismes tués exige la culture de grandes quantités d'organismes suivie par un traitement qui détruit sélectivement leur pouvoir infectieux sans affecter leur antigénicité. D'un autre côté, des vaccins contenant des organismes vivants atténués présentent toujours la possibilité d'une réversion de l'organisme atténué pour passer à un état pathogène. Au contraire, lorsque un poxvirus recombinant, convenablement modififé avec un gène du virus de l'herpès chevalin codant pour un déterminant antigénique d'un virus de l'herpès produisant une maladie, est utilisé comme vaccin, la possibilité de réversion pour donner un organisme pathogène est évitée, étant donné que le poxvirus contient seulement le gène qui code pour le déterminant antigénique de l'organisme produisant la maladie et non pas ces portions génétiques de l'organisme responsables pour la réplication de l'agent pathogène.
PRV infecte d'une manière mortelle de nombreuses espèces de mammifères (bétail, chiens, etc.). Les cochons adultes, cependant, survivent généralement à l'infection et représentent de ce fait un réservoir de virus important. Etant donné que le PRV provoque des pertes économiques importantes, la vaccination des porcs avec des vaccins atténués ou tués est pratiquée dans de nombreux pays.
Des tentatives pour contrôler l'infection par le PRV chez les cochons et pour réduire les pertes éco6
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nomiques ont été effectuées par immunisation active au moyen de vaccins vivants modifiés ou de vaccins inactivés. Les vaccins atténués, qui induisent généralement une immunité de longue durée et sont intéressants au point de vue prix, présentent le risque d'une atténuation insuffisante ou d'une instabilité génetique. Les vaccins inactivés sont moins efficaces, exigent plusieurs immunisations et contiennent généralement des adjuvants puissants. Ces dernières formulations peuvent induire des réactions allergiques après vaccination telles que le manque d'appétit, l'hyperthermie ou l'avortement chez les truies enceintes. Ces types de vaccin souffrent également de certains inconvénients en ce qui concerne l'empêchement d'infections latentes, la lutte contre les effets des anticorps maternels sur l'efficacité de la vaccination et l'élimination de l'utilisation potentielle d'un test de diagnostic serologique pour distinguer les animaux vaccinés de ceux précédemment infectés par le PRV.
Des stratégies de vaccination alternatives, par exemple l'utilisation de poxvirus recombinants qui expriment des produits de gène de PRV immunologiquement pertinents auraient certains avantages: (a) éliminer les souches de vaccin du PRV atténué vivant hors du champ; et (b) permettre la distinction des animaux vaccinés d'une part et des animaux infectés ou séropositifs d'autre part. Ce dernier avantage pourrait être accompli par l'utilisation de réactifs de diagnostic appropriés qui distingueraient d'une manière précise les animaux vaccinés des animaux naturellement infectés. Ceci est une considération importante étant donné les règlement existants qui contrôlent le déplacement des animaux séro-positifs. En outre, la vaccination est plus économique et préférable au test et à l'élimination des animaux infectés dans les lots d'animaux. Le développement de tels vaccins exige une connaissance des contributions faites par les antigènes de PRV, appropriés, à l'induction d'une immunité protectrice. Dans le cas du PRV, comme des autres membres de la famille du virus de l'herpès, les glycoprotéines sont des candidats importants pour constituer les antigènes destinés à être présents dans un vaccin recombinant subunitaire effectif.
La technologie de production de recombinants du virus de la vaccine a récemment été étendue à d'autres membres de la famille des poxvirus qui ont un domaine de réception par l'hôte plus restreint. En particulier, des poxvirus aviaires, qui se répliquent dans les espèces aviaires (oiseaux), ont été bâtis pour exprimer des produits de gène immunologiquement pertinents. L'inoculation d'espèces aviaires (42, 177) et non aviaires (41) avec des recombinants du poxvirus aviaire a provoqué des réponses immunitaires protectrices contre l'agent pathogène correspondant.
Des vaccins vivants atténués et des vaccins inactivés vis-à-vis du BHV1 sont disponibles depuis plus de 30 ans et ont réduit avec succès l'incidence des maladies liées au BHV1. Ces vaccins toutefois n'empêchent pas l'infection latente ou la réinfection avec des virus de souche sauvage.
Ils compliquent également la différenciation entre les animaux infectés et les animaux vaccinés.
Les deux types de vaccin ont d'autres inconvénients importants. La vaccination de vaches enceintes avec des vaccins vivants atténués peut provoquer la mort de fœtus et un avortement subséquent (127). En outre, on a montré que les animaux vaccinés pouvaient disséminer le virus (178). C'est pourquoi les animaux vaccinés maintenus avec des vaches enceintes peuvent répandre le virus infectieux à un animal qui est en gestation et provoquer l'avortement du fœtus.
Les vaccins inactivés n'induisent pas des avortements ni ne provoquent une excrétion virale. Toutefois, ils exigent l'utilisation d'adjuvants et peuvent provoquer des réactions d'hypersensibilisation ayant une issue fatale (anaphylaxie) et une inflammation et une fièvre non fatales (179).
Un des problèmes les plus importants de la vaccination est de surmonter ou d'éviter l'immunité maternelle. A cet égard, si une mère est immune vis-à-vis d'un agent pathogène particulier, l'«immunité» de la mère passe au nouveau-né par l'intermédiaire des anticorps présents dans le Colostrum et/ou par des voies additionnelles. Toutefois, le nouveau-né ne peut pas être vacciné avec succès tant que le niveau d'immunité maternelle n'a diminué d'une manière suffisante. C'est pourquoi il existe une fenêtre étroite permettant la vaccination avec succès du nouveau-né en présence de l'immunité maternelle qui diminue.
On peut ainsi apprécier que la mise à disposition d'un poxvirus recombinant du virus de l'herpès et de vaccins qui produisent une immunité protectrice contre les infections de l'herpès virus, qui confèrent les avantages, par rapport à la technique antérieure, de l'inoculation de virus vivants, mais qui réduisent ou éliminent les problèmes qui viennent d'être discutés, serait un progrès hautement désirable par rapport à l'état actuel de la technologie.
C'est pourquoi, la présente invention a pour objet de produire des poxvirus recombinants qui expriment des produits de gène du virus de l'herpès et de fournir un procédé pour fabriquer de tels poxvirus recombinants.
Un objet supplémentaire de l'invention consiste à réaliser le clonage et l'expression de séquences de codage du virus de l'herpès dans un vecteur de poxvirus, particulièrement un vecteur de virus de la vaccine, un vecteur de poxvirus des volailles ou un vecteur de poxvirus du canari.
C'est un autre objet de l'invention de mettre à disposition un vaccin qui est capable de provoquer des anticorps neutralisant le virus de l'herpès et une immunité protectrice contre une attaque mortelle par le virus de l'herpès.
Ces objets et avantages ainsi que d'autres objets et avantages, de la présente invention apparaîtront aisément après considération de ce qui suit.
Suivant un premier aspect, la présente invention est relative à un poxvirus recombinant contenant une séquence d'ADN du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome du poxvirus.
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Avantageusement, le virus de l'herpès est un membre de la sous-famille des alphaherpèsvirus, bétaher-pèsvirus et gammaherpèsvirus. En particulier, la séquence d'ADN du virus de l'herpès code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès. Plus particulièrement encore, la glycoprotéine du virus de l'herpès est choisie dans le groupe constitué par le gp13 du virus de l'herpès chevalin, gp14 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gE du virus de l'herpès chevalin, gp50 du virus de la pseudo-rage, gpll du virus de la pseudo-rage, gplll du virus de la pseudo-rage, gpl du virus de la pseudo-rage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, gD du virus de l'herpès simplex, gl du virus de l'herpès bovin, gB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, gp340 du virus d'Epstein-Barr, gB du virus d'Epstein-Barr, gH du virus d'Epstein-Barr et gB du cytomégalovirus humain.
Conformément à la présente invention, le poxvirus recombinant exprime des produits de gènes du gène du virus de l'herpès étranger. En particulier, la séquence d'ADN étrangère code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès et l'ADN étranger est exprimé dans un hôte par la production de la glycoprotéine du virus de l'herpès. Avantageusement, plusieurs glycoprotéines du virus de l'herpès sont co-exprimées dans l'hôte par le poxvirus recombinant. Le poxvirus est avantageusement un virus de la vaccine ou un poxvirus aviaire, tel que le poxvirus des volailles ou le poxvirus du canari.
Sous un deuxième aspect, la présente invention est relative à un vaccin pour induire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec le vaccin, ce vaccin comprenant un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de l'ADN du virus de l'herpès. Plus particulièrement, l'ADN code et exprime une glycoprotéine du virus de l'herpès. Avantageusement, plusieurs glycoprotéines du virus de l'herpès sont co-exprimées chez l'hôte par le poxvirus. Le poxvirus utilisé dans le vaccin selon la présente invention est avantageusement un virus de la vaccine ou un poxvirus aviaire tel que le poxvirus des volailles ou le poxvirus du canari.
Sous un troisième aspect, la présente invention est relative aux mécanismes pour contourner le problème de l'immunité maternelle. Si la barrière est due à la présence d'anticorps vis-à-vis d'un antigène donné ou d'antigènes donnés, alors la barrière d'immunité maternelle peut être surmontée ou évitée en utilisant, sélectivement, des vecteurs exprimant des sous-ensembles définis d'antigènes. Par exemple, l'animal en gestation peut être vacciné avec un virus recombinant de la vaccine exprimant la-glycopro-téine gp50 du virus de la pseudo-rage et le descendant peut être vacciné à la naissance, ou peu de temps après, avec les recombinants de la vaccine exprimant d'autres glycloprotéines gpll ou gplll, ou des combinaisons de celles-ci, du virus de la pseudo-rage. D'un autre côté, si la barrière présentée par l'immunité maternelle est due au vecteur, alors on peut vacciner d'une manière différencielle la mère avec un vecteur (vaccine ou poxaviaire) et vacciner la progéniture avec l'autre vecteur. Ce procédé prend en considération bien entendu non seulement l'utilisation de vecteurs différents, mais également de vecteurs exprimant une constellation différente de glycoprotéines. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé pour surmonter ou éviter l'immunité maternelle qui, autrement, empêcherait une immunisation réussie chez une progéniture nouvellement née. Par la présente invention, la progéniture nouvellement née est inoculée avec un poxvirus recombinant contenant de l'ADN provenant d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du poxvirus, ledit ADN codant pour un premier antigène d'un agent pathogène de la progéniture nouvellement née, et ledit antigène est différent d'un second antigène du même agent pathogène utilisé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis du même agent pathogène chez la mère de la progéniture nouvellement née. Egalement par la présente invention, la progéniture nouvellement née est inoculée avec un premier poxvirus recombinant contenant l'ADN d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du premier poxvirus, cet ADN codant pour un antigène d'un agent pathogène de la progéniture nouvellement née, et ledit premier poxvirus étant différent d'un second poxvirus recombinant utilisé pour induire une réponse immunologique au même agent pathogène chez la mère de la progéniture nouvellement née.
Une meilleure compréhension de la présente invention sera obtenue à l'examen des dessins annexés, sur lesquels:
La fig. 1 représente schématiquement un procédé pour la construction ou formation du virus recombinant de la vaccine, vP425;
La fig. 2 illustre la séquence d'ADN d'un fragment de 1,88 Kb de EHV-1 contenant les séquences de codage de gp13;
La fig. 3 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant de la vaccine, vP483, contenant le gène de EHV-1 gp13;
La fig. 4 illustre schématiquement un procédé pour former le virus recombinant de la vaccine, vP458;
La fig. 5 illustre schématiquement un procédé pour construire le virus recombinant de la vaccine, vP577, contenant le gène de EHV-1 gp14;
La fig. 6 illustre la séquence d'ADN d'un fragment de 3,35 kb de EHV-1 contenant la séquence de codage de gp14;
La fig. 7 est un graphique de l'hydrophilicité relative pour les séquences de codage de EHV-1 gp14;
La fig. 8 illustre schématiquement un procédé pour la construction ou la formation du virus recombinant du pox aviaire, vFP44, contenant le gène de EHV-1 gp13;
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La fig. 9 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant du poxvirus du canari, vCP48, contenant le gène de EHV-1 gp13;
La fig. 10 illustre schématiquement un procédé pour la construction ou la préparation des Plasmides donneurs pHES-MP63, pHES-MP1 et pHES-MP34 contenant des versions modifiées du gène de EHV-1 gp14;
La fig. 11 est une carte des sites de coupure par BamHI de la souche Kentucky D de EHV-1, indiquant les répétitions inversées du génome par des boîtes, montrant l'emplacement des six gènes principaux de glycoprotéines de EHV-1 et montrant également une expansion de la région du génome qui inclut les gènes gD, gp63 et gE;
La fig. 12 illustre la séquence de nucléotides d'un fragment de 6402 paires de bases de EHV-1 contenant les séquences de codage de gD, gp63 et gEe;
La fig. 13 est une représentation hydropathique de ia séquence de 402 acides aminés composant EHV-1 gD;
La fig. 14 est une représentation hydropathique 5 de la séquence de 413 acides aminés composant EHV-1 gp63;
La fig. 15 est une représentation hydropathique de la séquence de 552 acides aminés composant EHV-1 gE;
La fig. 16 illustre schématiquement un procédé pour la construction de plasmides donneurs pJ-CA006, pJCA0007 et pJCA008 contenant le gène de EHV-1 gD, de EHV-1 gE et de EHV-1 gp63, respectivement, et la formation du virus recombinant de la vaccine contenant ces gènes;
La fig. 17 illustre schématiquement un procédé pour la construction de plasmides donneurs pj-CA009 (contenant les gènes de EHV-1 gD et gp63) et pJCAOIO (contenant les gènes de EHV-1 gD, gp63 et gE), et la production du virus recombinant de vaccine contenant ces gènes;
La fig. 18 représente schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur PR18 contenant le gène de PRV gpll, et la formation du virus recombinant de la vaccine exprimant le gène de PRV gpll;
La fig. 19 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpll;
La fig. 20 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pPR24 contenant le gène de PRV gplll, et la production du virus recombinant de la vaccine exprimant le gène de PRV gplll;
La fig. 21 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gplll;
La fig. 22 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pPR26 contenant le gène de PRV gp50, et la production du virus recombinant de la vaccine exprimant le gè-nede PRV gp50;
La fig. 23 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gp50;
La fig. 24 illustre schématiquement un procédé pour la construction des plasmides pSD478VC et pSD479VCBG et l'insertion de beta-galactoside dans le virus de la vaccine;
La fig. 25 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pMP13PP;
La fig. 26 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pFPPRVIl contenant le gène de PRV gpll;
La fig. 27 illustre schématiquement un procédé pour la construction du recombinant du poxvirus du canari, vCP55, exprimant le gène de PRV gpll;
La fig. 28 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant de la vaccine, VP717, exprimant le gène de PRV gl;
La fig. 29 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP569 et vP734, exprimant le gène de HSV-2 gB;
La fig. 30 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP579, vP748 et vP776, exprimant le gène de HSV-2 gC;
La fig. 31 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP570, vP761, vP775 et vP777, exprimant le gène de HSV-2 gD;
La fig. 32 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP637 et vP724, exprimant le gène de BHV-1 gl;
La fig. 33 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pJCA001 contenant le gène de FHV-1 gB et pour la construction du virus recombinant de la vaccine, vP717, exprimant le gène de FHV-1 gB;
La fig. 34 illustre la séquence de nucléotides du segment, de 3400 bp, de l'ADN de FHV-1 codant pour la glycoprotéine gB;
La fig. 35 est une représentation hydropathique de la séquence de 947 acides aminés composant FHV-1 gB;
La fig. 36 illustre schématiquement un procédé pour la construction des plasmides donneurs 409gp220 contenant le gène de EBV gp220, et 409gp340, contenant le gène de EBV gp340;
La fig. 37 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 409 gB contenant le gène de EBV gB;
La fig. 38 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 486gH contenant le gène de EBV gH;
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La fig. 39 illustre schématiquement la structure du plasmide donneur de la vaccine 513gHgBgp340 contenant les gènes d'EBV gp340, gB et gH;
La fig. 40 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 409CMVgB contenant le gène de CMV gB;
5 La fig. 41 illustre les séquences de nucléotides et d'acides aminés du gène de HCMV (souche de Towne) HXLF1; et enfin
La fig. 42 montre les séquences de nucléotides et d'acides aminés du gène de HCMV (souche de Towne) HXLF2.
10 Les exemples qui suivent sont destinés à mieux faire comprendre l'invention et ses nombreux avantages, ces exemples étant uniquement illustratifs et non limitatifs.
Exemple 1
15 CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DU VIRUS DE LA VACCINE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE gp13 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN
Remplacement du gène HA de la vaccine par le gène de l'E. Coli beta-aalactosidase
20 La souche de Copenhague du virus de la vaccine obtenue de Rhone Mérieux, Inc. (Athens, Geòrgie) a été utilisée dans cet exemple. Le virus a été propagé à partir d'un isolât de plaque purifié soit sur cellules de VERO (ATCC n° CCL81) ou de MRC-5 (ATCC n° CCL171) dans un milieu essentiel minimal d'Eagle (MEM) avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Un dérivé du virus de souche sauvaqe, dont toute la séquence de codage pour le gène de la thymidine kinase a été supprimée par des métho-25 des classiques (25, 28), a été isolé et désigné VP410. Ce mutant à suppression de la thymidine kinase a été utilisé pour des manipulations ultérieures. On a construit des plasmides qui ont été sélectionnés et qu'on a cultivé par des procédures classiques (27, 28).
En se référant maintenant à la fig. 1, le fragment Sali F de 13 kb du virus de la vaccine qui recouvre la jonction du fragment Hindlll A/B a été lié à pUC8 digéré par Sali, en engendrant pSD419VC. Le bras 30 droit de pSD419VC correspondant à la portion Hindlll B du fragment Sali F a été enlevé par digestion avec Hindlll et re-ligation, engendrant pSF456VC. pSD456VC contient ainsi l'extrémité de droite du fragment par Hindlll A dans lequel se trouve toute la région de codage pour le gène (HA) de l'hémaglu-tinine (35) flanqué par approximativement des séquences supplémentaires de vaccine de 0,4 kb Ode chaque côté.
35 Pour engendrer un vecteur plasmidique virtuellement privé de séquences de codage de HA, pSD456-VC a été coupé (partiellement digéré) au site Rsal en amont du gène HA et au site Eagl 80 bp à partir de l'extrémité 3' du gène HA. Le fragment Rsal/Eaal d'environ 3,5 kb a été isolé à partir d'un gel d'aga-rose.
Des oligonucléotides synthétiques MPSYN59-62 ont été préparés pour remplacer la région depuis le 40 site Rsal jusqu'à la position 2 en amont de la séquence de codage de HA, immédiatement suivi par les sites de restriction Balli, Smal et Esll et une extrémité cohesive Eagl. La séquence de MPSYN59-62, avec les sites de restriction comme indiqué est la suivante:
45 5 • -ACACGAAT GATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGUTAGAACAA
3 ' -ÎGTGCTT ACTAAAAGA7T7 CAT AAACCTTT CAAAA7 AT CCAT CAACTAT CTTGTT
AATACATAATTTTGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCTCCCGGGCTGCAGC-3' 50 TTATGTATT AAAACAT TTTT ATT T AGTCAAAAAT AT GAT TCT AGAGGGCCCGACGT CGCCG6- 5 •
Belli Smal PstI Eeol
Le mélange MPSYN59-62 ayant subi un traitement de réforme ou dénaturation (anneding) a été lié 55 au fragment Rsal/Eaql de 3,5 kb provenant de pSD456VC, en engendrant pSD466VC. Ainsi, dans le pSD466VC, le gène HA a été remplacé par une région de polyliaison (polylinker).
A fragment BglII/BamHI (partiel) de 3,2 kb contenant le gène £. Coli beta-galactosidase provenant de pMC1871 (34) sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de vaccine de 11 kDa (7), a été cloné en pSD466VC qui a été digéré avec Bglll. Un plasmide contenant la cassette promoteur de 11 kDa/gène 60 de béta-galactosidase dans une orientation de la gauche vers la droite par rapport aux bras de vaccine sur les flancs a été désigné pSD466VCBGA et recombiné en un mutant à suppression de thimidine kinase, vP410, de la souche Copenhague du virus de la vaccine, en engendrant le recombinant de la vaccine vP425 exprimant la betagalactosidase. On a retenu 80 paires de bases à l'extrémité carboxy du gène HA de manière à ne pas rompre un court cadre de lecture ouvert potentiel transcrit de la droi-65 te vers la gauche par rapport au génome de la vaccine.
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Le virus recombinant de la vaccine, vP425 (184), a été identifié sur la base de la formation de plaques bleues en présence du substrat chromogène X-gal, comme décrit par d'autres (9, 24). La substitution du gène de béta-galactosidase par encore un autre gène étranger dans des recombinants subséquents de la vaccine pourrait être déterminée facilement en isolant des plaques incolores au lieu de plaques bleues.
Pour faciliter les phases futures de clonage, le site Smal dérivé de la région de muiticlonage de pUC8 a été éliminé par digestion de pSD466VC par BamHI/EcoRI. la formation d'une extrémité franche avec le fragment de Klenow de l'£. Cali polymérase et re-ligation. Ainsi, le seul site Smal restant dans le plasmide résultant, pSD467VC, est dans la région de polyliaison de la suppression de HA.
Identification des séquences d'ADN codant le gène EHV-1 qd13
La séquence d'ADN codant la glycoprotéine EHV-1 gp13 réside dans le fragment BamHI-H de 7,3 kb de EHV-1 (3). Les données concernant la séquence de nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de la région pUC (BamHI-H^ en utilisant des sous-clones chevauchants par utilisation de l'enzyme T7 modifiée SEQUENASE (40) provenant de U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio. Les réactions classiques de terminaison de chaîne didéoxy (33) ont été réalisées sur des modèles ou matrices de plasmides à double brin qui ont été dénaturés dans un alcali. Les amorces M13, avant et arriéré, ont été utilisées pour obtenir la séquence initiale de chaque clone. Les amorces sur mesure 16-17-mer, synthétisées en utilisant la technique chimique classique (Biosearch 8700, San Rafael, CA: Applied Riosystems 380B, Foster City, CA), ont été utilisées pour se déplacer le long du fragment restant. Le programme d'analyse de séquences IBI Pustell a été utilisé dans toutes les analyses de données de séquences (29).
L'analyse de séquences d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 1404 bp codant 468 acides aminés avec un produit de traduction primaire prédit de 50,9 kDa. Une homologie significative des acides aminés dans la moitié carboxy du cadre de lecture ouvert de gp13 putatif a été observée avec Gc des virus de l'herpès simplex type 1 et type 2, glll du virus de la pseudo-rage et gpV du virus de la varicelle-zoster ce qui suggère que gp13 est un membre des glycoprotéines du type gC des virus de l'herpès. En outre, une analyse détaillée du cadre de lecture ouvert de EHV-1 gp13 a été présentée dans une publication antérieure (2). Pour faciliter la description du clonage et de l'expression de EHV-1 gp13 dans les vecteurs du virus de la vaccine, le cadre de lecture ouvert de gp13 plus des séquences additionnelles 5' et 3' sont illustrés sur la fig. 2. Sur cette figure, une boîte TATA présumée et des acides aminés comprenant des signaux putatifs et des éléments d'ancrage de membrane sont soulignés. Le site de coupure potentiel de la séquence de signal est noté avec une flèche suivant le signal de coupure ASA (cercles ouverts). Potentiellement, neuf sites de glycosyiation à liaison par l'azote existent à l'intérieur des séquences de signal et d'ancrage, comme défini par le motif Asn-X-Ser/Thr (astérisques).
Clonage du gène de EHV-1 gp13 dans un plasmide donneur du virus de la vaccine
Un promoteur du virus de la vaccine précoce/tardif, H6, a été utilisé pour l'expression de gènes étrangers dans des vecteurs du virus de pox aviaire (41, 42). Cet élément de promoteur correspond aux séquences d'ADN immédiatement en amont du cadre de lecture ouvert de H6 dans le fragment de vaccine Hindlll-H (31).
En se référant maintenant à la fig. 3, pour faire muter et insérer le promoteur H6 dans pSD467VC, on a synthétisé des oligonucléotides H6SYN oligos A-D. La séquence de H6SYN oligos A-D, avec les bases modifiées comme souligné et les sites de restriction comme indiqué est la suivante:
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BsW
5 ' -GATCTCTTTATTCTATÄCTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTT 3 ' -AGAAATAAGATATGAATTTTTÇACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAA
GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA CACAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATT
GTTTGTATCGTACCC-3' CAAACATAGOATGGG-5• Smal
Les bases soulignées dénotent une modification de la séquence du promoteur natif H6.
L'ADN double brin de longueur totale 130 bp, formé par le traitement de réforme (annealing) de H6SYN oligos AD a été purifié par électro-élution à partir d'un gel d'agarose et lié à des fragments Smal/Hindlll de 0,5 kb et Balll/Hindlll de 3,1 kb, dérivés de pSD467VC. Le plasmide résultant, pTP15 (184), possède le codon d'initiation ou d'amorçage ATG modifié en CCC comme partie du site Smal qui est immédiatement suivi par un site Esil. Un agent de liaison (linker) de Nsil. à savoir 5' -TGCATGCA-TGCA-3' (New England Biolabs, Beverly, MA) a été inséré au suite Smal de pTP15 pour engendrer le plasmide pNSI.
Un fragment EHV-1 EcoRI/Narl. dans lequel le site EcoRI se trouve 120 bp en amont du codon d'iniation ou d'amorçage ATG, et dans lequel le site Nari se trouve 23 bp en amont du codon de terminaison TAG de EHV-1 gp13, a été cloné dans le phage M13mp19 en engendrant le phage recombinant M13EcoRnar. En utilisant la mutagénèse dirigée par oligonucléotide (17) un site Nsil a été introduit en changeant la séquence TTGCCT (bases 130-135 sur la fig. 2) dans le gène de EHV-1 gp!3 en ATG-CAT. Le fragment EcoRI/Narl provenant du phage mutant M13EcoRnar a été cloné en pUC8 au site EcoRI/Narl en engendrant le plasmide pNSIEN.
Deux 42-mer oligonucléotides ont été synthétisé ayant la séquence, avec des sites de restriction comme indiqué, ci-après:
Sari gpi3 Extrémité 3 ' JJdel
5 *-CGCCGTACAAGAAGTCTGACTTT2AGATTTTTATCTGCAGCA-3• 31 -GGCATGTTCTTCAGACTGAAAATCTAAAAATAGAÇGTÇGTAT-5•
PstI
Dans cet oligonucléotide, le codon de terminaison (TAG) est suivi immédiatement par un agent de terminaison de transcription précoce de la vaccine (ATTTTTAT). Le fragment d'ADN double brin obtenu par traitement de réforme (annealing) de la paire de 42-mers contient une extrémité cohesive Nari, suivie par l'extrémité 3' de la séquence de codage pour le gène de EHV-1 gp13, aussi bien qu'un signal de terminaison de transcription précoce de la vaccine (45), un site PstI et une extrémité cohesive Ndel. Ce fragment a été inséré entre les sites Narl/Ndel de pNSIEN, en engendrant pNSIENPN (fig. 3).
Le fragment de Nsil/Pstl de pNSIENPN a été isolé et cloné aux sites Nsil/Pstl du plasmide pNSI, en engendrant le plasmide pVHA6a13Nsil (fig. 3). pVHA6a13Nsil a été coupé au site EcoRV dans le promoteur H6 et le site Nsil qui a été introduit au voisinage du commencement du gène de EHV-1 gp13. Ce fragment de vecteur comportait une extrémité franche avec la nucléase de fève de Mung (Mung bean). Deux 32-mer oligonucléotides complémentaires ont été synthétisés ayant la séquence, avec le site de restriction comme indiqué, ci-après:
12
5
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15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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EcoRV
5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGGTTGCC-3 » 31-TAGGCAATTCAAACATAGCATTACACCAACGG-5'
H6 promoteur gpl 3 extrémité 5'
Ces oligonucléotides ont été traités pour réforme (annealing) et liés dans le fragment de vecteur pVHA6a13Nsil. en produisant le plasmide pVHA6g13, qui contient une jonction précise au codon d'initiation ou d'amorçage ATG (souligné dans la séquence du 32-mer) du promoteur H6 et du gène de EHV-1 gp13.
pVHA6g13 a été transfecté en des cellules infectées par vP425 pour engendrer un recombinant de la vaccine, vP483, contenant le gène de EHV-1 gp13 (fig. 3).
Construction formation de recombinants du virus de la vaccine
Les procédés de transfection des plasmides donneurs recombinants dans des cellules de culture de tissu infectés avec un virus de la vaccine de sauvetage et d'identification de recombinants par hybridation in SËU sur des filtres de nitrocellulose ont été effectués comme décrit précédemment (25, 28). Pour construire vP425 dans lequel le gène E, CM de béta-galactosidase remplace les séquences de codage HA de la vaccine, l'ADN du plasmide [25ug de pSD466VCBGA dans HeBS (16)] a été électroporé (Bio-Rad Gene Pulser, capacitance de 960, 200 volts) dans des cellules de VERO. Des monocouches sub-confluentes de cellules ont été infectées à 10 pfu par cellule avec vP410 une heure avant l'utilisation. Les cellules infectées ont été collectées avec de la trypsine et lavées avec HeBS avant électroporation. Les cellules ont été soumises à une incubation dans MEM + 5% de sérum fœtal bovin à 37°C pendant 24 heures, récoltées, et le virus constituant la progéniture plaqué sur des monocouches de VERO. Le virus recombinant exprimant la beta-galactosidase a été détecté sous forme de plaques bleues en présence du substrat X-gal (9,24). Pour engendrer le virus recombinant de la vaccine dans lequel le gène de EHV-1 gp13 remplaçait le gène de béta-galactosidase dans vP425, on a suivi un protocole similaire excepté que le plasmide donneur était pVHA6g13 et le virus de sauvetage vP425. Le recombinant de la vaccine vP483, contenant EHV-1 gpl 3 a été détecté en tant que plaque incolore en présence de X-gal et confirmé en tant que recombinant véritable par hybridation d'ADN après trois cycles de purification sur plaque.
Expression du gène de EHV-1 ap13 sur la surface de cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP483
Des cellules de BSC-40 ont été ensemencées sur des plaquettes en verre de 22 mm dans des boîtes de 35 mm à 5 x 105 cellules par boîte. Avec une confluence d'environ 80%, les cellules ont été infectées à 2 pfu par cellule. Après une période d'adsorption d'une heure, Pinoculum de virus a été enlevé et on a ajouté MEM plus 2% de sérum fœtal bovin. 20 heures après l'infection, les plaquettes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,2% de BSA et 0,1% de NaN3 (PBS+) et exposées à 0,1 ml d'anticorps monoclonal anti-gp13, 14H7 (3) dilué à 1%o dans pBS+. Après 1 heure dans une chambre humidifiée à la température ambiante, les cellules ont été lavées trois fois dans du PBS+. Ce procédé a été répété avec IgG caprin anti-souris de l'isothiocyanate de fluoresceine. Finalement, les cellules ont été fixées pendant 20 minutes dans la formaldéhyde à 2% dans PBS. Les plaquettes ont été montées dans du glycérol à 20% dans PBS contenant 3% de n-pro-pul gallate et on a observé la fluorescence au moyen d'un microscope.
La protéine prédite d'après la séquence d'ADN présente les traits typiques caractéristiques d'une gly-copro téine enjambant la membrane (14). Dans une infection productrice de EHV-1 cette glycoprotéine gpl 3 est incorporée dans différents systèmes de membrane de la cellule et elle est transportée dans la membrane cytoplasmique et est détectable sur la surface externe de la cellule infectée. EHV-1 gp13 est additionnellement un composant du virion de EHV-1. C'est pourquoi des études d'immunofluores-cence ont été réalisées pour déterminer si EHV-1 gp13, exprimé par le virus recombinant de la vaccine, vP483, est de manière similaire présent sur la membrane cytoplasmique des cellules infectées. L'anticorps monoclonal spécifique anti-gp13 suivi par l'IgG anti-souris caprin conjugué à la fluoresceine a révélé une immunofluorescence forte de la membrane dans les cellules infectées par vP483 mais non pas dans les cellules infectées par le virus de la vaccine vP410. Ceci suggère que la EHV-1 gp13 exprimé par le virus recombinant de la vaccine vP483 est présente sur (a membrane cytoplasmique comme attendu pour la synthèse authentique de la glycoprotéine enjambant la membrane.
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Immunoprécipitation des produits de EHV-1 qp13 synthétisés à partir de cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP483
Deux millions de cellules formant une monocouche confluente dans une boîte de 60 mm ont été infectées au taux de 10 pfu par cellule. L'inoculation a été réalisée dans un milieu exempt de méthionine. Après la période d'adsorption, l'inoculum a été enlevé et on ajouté 2 ml de milieu exempt de méthionine contenant 20 p. Ci/ml de 35S-méthionine ajoutés. On a laissé se poursuivre l'infection pendant 24 heures et alors les cellules ont été lysées par l'addition de 1 ml de 3x tampon A contenant 3% de NP-40, 30 mM Tris pH 7,4, 450 mL NaCI, 3 mM EDTA, 0,03% d'azide de sodium et 0,6 mg/ml de PMSF. Les cellules lysées et le produit surnageant ont été récoltés, soumis à un voretex et clarifiés par centri-fugation à 10 000 g pendant 15 minutes.
On a préparé la protéine A-Sépharose CL-4B (Pharmacia, Cat. n° 17 078 001) en tant qu'un coulis 1:1 dans le 1x tampon A. Un conjugué de rat anti-souris (Boehringer Mannheim, Cat. n° 605 500) a été dilué au centième dans le coulis et lié à des perles à la température ambiante pendant 4 heures avec balancement. Les perles ont été ensuite lavées complètement avec six lavements de 1 ml dans le tampon A pour éliminer le conjugué non lié. On a ensuite lié aux perles un anticorps monoclonal spécifique à gp13, à température ambiante, pendant 4 heures. L'anticorps en excès a été éliminé par lavage poussé. 1 ml de lysat de cellules infectées, clarifié, a été préclarifié par incubation avec des perles ou billes de protéine A-Sepharose auquel du sérum de souris normal a été lié. Ces perles ont été éliminées par centrifugation. 1 ml du lysat préclarifié, clarifié, a été ensuite mélangé à 100 fil des perles auquel a été lié l'anticorps monoclonal spécifique. Ce mélange a été oscillé à température ambiante pendant 4 heures. Les perles ont été éliminées par centrifugation et lavées complètement par 4 lavages dans 1x tampon A et deux lavages dans 10 mM Tris pH 7,4 contenant 0,2 M LiCI et d'urée 2M. Le complexe anticorps-antigène est ensuite éliminé des perles et rompu par l'addition de 50 ni de 2 X solution de rupture Laemmli (60, 195). On a ensuite fait bouillir l'échantillon pendant 5 minutes avant élec-trophorèse.
Deux produits d'approximativement 44 et 47 kDa sont détectables et ils sont quelque peu plus petits que le produit de traduction primaire prédit (51 kDa) et un produit plus grand d'approximativement 90 kDa qui est consistant avec une forme complètement glycosylatée du produit de gène de EHV-1 gpl 3. Aucun polypeptide équivalent n'a été précipité à partir des cellules infectées du virus de la vaccine qui sont servi de contrôle.
Exemple 2
CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DE VIRUS DE LA VACCINE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE on14 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN
Remplacement du gène M2L dans le virus de la vaccine par le gène d'E. Coli beta-galactosidase
Pour insérer les séquences de codage de EHV-1 gp14 dans un vecteur du virus de la vaccine, un virus recombinant de la vaccine, vP458, exprimant le gène d'E. Coli LacZ a été fabriqué. La substitution des séquences de codage de LacZ dans le virus recombinant, vP458, avec les séquences codant EHV-1 gp14 permet un système de sélection par plaques bleues ou incolores afin d'identifier EHV-1 gp14 contenant des virus recombinants (9, 24) en présence de X-gal, un substrat de béta-galactosidase chromogénique. En outre, dans le but de construire des virus recombinants de la vaccine exprimant à la fois EHV-1 gp14 et EH-1 gp13, un locus d'insertion pour EHV-1 gp14 unique, à partir du locus supprimé de l'hémagiutinine, utilisé pour l'insertion de EHV-1 gp13 dans l'Exemple 1, a été préparé au locus M2L de Hindlll M. La séquence de codage complète du gène de M2L dans le fragment de vaccine Hindlll M a été éliminée et remplacée par le gène d'E. Coli LacZ codant la beta-galactosidase. Les étapes de clonage pour la construction de vp458 sont représentées schématiquement sur la fig. 4.
En se référant maintenant à la fig. 4, un cadre de lecture ouvert, lu de la droite vers la gauche par rapport au génome de la vaccine et codant une protéine putative de 220 acides aminés est logé entièrement à l'intérieur du fragment Hindlll M de la souche Copenhague du virus de la vaccine à la gauche du site unique Bglll- Conformément à la convention (31), ce gène, qui est situé immédiatement à droite de M1L (58) a été désigné M2L. Des études de suppression appliquées au génome de la vaccine (WR) s'étendant à gauche à partir du site unique Bglll dans le fragment M de Hindlll (57) indiquent que les séquences de codage de la vaccine contenues dans Hindlll M à gauche du site Bal" ne sont pas essentielles pour la réplication du virus dans les cultures de tissu.
Pour faciliter l'utilisation de ia région M2L en tant que endroit ou locus d'insertion pour des gènes étrangers, un vecteur de plasmide, pMP409DVC, a été créé dans lequel toute la séquence de codage de M2L a été remplacée par un site Bglll comme suit. pSD409VC, qui consiste en un fragment de Hindlll M de la vaccine de Copenhague clonée dans le site Hindlll de pUC8, a été digéré avec BamHI/ Bglll et auto-lié, éliminant ainsi l'extrémité droite de Hindlll M et détruisant le site Bglll. Le plasmide résultant pMP409BVC, a été linéarisé au moyen de SPhl qui coupe à l'intérieur du cadre de lecture ouvert de M2L et a été soumis à une digestion par l'hexonucléase Bal-31 pendant 2 minutes. Une mu-
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tagénèse a été réalisée sur l'ADN résultant (19) en utilisant un 49 mer (5'-TTTCTGTATA I l IG-C A AC A ATTTAG AT CTTACT CAAA ATAT GT A AC A AT3': le site Bglll étant souligné) synthétique. Dans le plasmide ayant subi la mutagénèse, pMP409DVC, les séquences de codage de M2L ont été supprimées depuis la position +3 jusqu'à l'extrémité du cadre de lecture ouvert. Le G du codon d'amorçage ou d'initiation ATG a été changé en un C pour créer un site Bglll unique (AGATQT) à la jonction de suppression.
Un fragment de BglII/BamHI partiel de 3,2 kb contenant 3,1 kb du gène de béta-galactosidase d'E. Coli entre les sites BamHI. de pMC1871 (34) sous le contrôle transcriptionnei du promoteur tardif de 11 kDa de la vaccine de 0,1 kb a été cloné au site Ëglll unique de pMA409DVC. Un plasmide recombinant contenant la cassette de promoteur de 11 kDa/gène de beta-galactosidase dans l'orientation de la droite vers la gauche par rapport aux bras de vaccine de flanc et le génome a été désigné pMP409D-VCBG. pMP409DVC3G a été utilisé comme plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de la vaccine de sauvetage, vP410, décrit dans l'Exemple 1. Le nouveau recombinant de la vaccine, désigné vP458, exprimant le gène de béta-galactosidase inséré dans le locus de suppression de M2L a été détecté en utilisant un substrat X-gal chromogénique (9, 24) et purifié par clonage sur plaque répété.
Clonage du gène de EHV-1 ap14
En se référant maintenant à la fig. 5, la séquence de codage de EHV-1 gpl 4 chevauche la jonction entre des fragments de restriction BamHI. a et i (3). Les fragments d'ADN de EHV-1, BamHI-a (21,3 kb) et i (7,1 kb) (59) ont été isolés à partir de gels d'agarose. On a construit le plasmide pUC (BamHI-h en insérant le fragment EHV-1 BamHI-i dans le plasmide pUC8 au site BamHI. Le fragment BamHI-i de EHV-1 a été digéré au moyen d'EcoRi et lié en dans le pUC8 digéré par EcoRI/BamHI. Le plasmide pUC (BamHI-a/EcoRh contient une insertion de EHV-1 BamHI/EcoRI de 10 kb. En se basant sur les déterminations de dimensions de fragments rapportées (59), les séquences d'ADN dans cette insertion sont contiguës à celle du fragment de BamHi-i dans le génome de EHV-1.
Analyse de la séquence de nucléotides
L'analyse de la séquence de nucléotides a été obtenue en utilisant différents sous-clones à partir de plasmides de pUC (BamHI-a/EcoRh et pUC (BamHI-i). La détermination de la séquence du plasmide pUC (BamHI-a/EcoRli a été commencée au site BamHI du fait que le gène de EHV-1 gp14 enjambe la jonction BamHI-a/i (3). L'orientation du plasmide pUC ((BamHI-i) a été déterminée par digestion au moyen d'enzyme de restriction. Etant donné que la terminaison de EHV-1 BamHI la plus voisine du site EcoRI dans pUC (BamHl-H a été trouvée comme étant le site BamHi à la jonction BamHI-a/i. on a commencé la détermination de la séquence du fragment à partir de cette extrémité BamHI.
Les données de séquence pour les deux brins ont été obtenues comme décrit dans l'Exemple 1. La séquence de nucléotides du fragment de 3 351 bp contenant la séquence de codage de EHV-1 gp14 est illustrée sur la fig. 6. La numérotation dans les marges de gauche et de droite concerne les séquences d'acides aminés et d'acides nucléiques, respectivement. Les boîtes CAT et TATA putatives sont soulignées. Les acides aminés dans la région de signal et enjambant la membrane sont également soulignés avec une flèche indiquant un site potentiel de coupure de peptide de signal. Les treize sites de glycosyiation potentiels en utilisant la séquence de concensus (Asn-X-Ser/Thr) ont été indiqués par un astérisque.
L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert s'étendant à partir des positions de clunéotides 300 à 3 239 en lisant de la gauche vers la droite par rapport au génome de EHV-1, c'est-à-dire que le codon de départ ATG était contenu dans le fragment BamHI-a/EcoRI et le codon d'arrêt TAA était contenu dans le fragment BamHI-i (3, 59).
Des signaux putatifs réglant la transcription ont été trouvés dans la région 5' du codon d'initiation ATG en position 300. Une boîte TATA ayant la séquence AAATATAT (nucléotides 148 à 155) a été localisé 70 nucléotides en aval d'une boîte CAT putative aux positions 71 à 77 ayant la séquence GGTCAAT. Un signal de polyadénylation AATAAA (nucléotides 3251 à 3256) a été localisé 8 nucléotides en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 3240 à 3242). Neuf des onze nucléotides dans la séquence 5'-TCCTGCGCGCA-3' (nucléotides 218 à 228) sont complémentaires de ia séquence d'ARN ribosomal (18S) à savoir 3' AGGAZGGCGT-5' (61) et peuvent servir comme site de liaison du ribosome.
Analyse de la structure de EHV-1 ap14
Le cadre de lecture ouvert de EHV-1 gp14 code 980 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 109,8 kDa. L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 58 à 69 a un profil d'hydrophobicité caractéristique et on l'a propose comme étant ia séquence de signal (fig. 6). Une caractéristique inhabituelle du produit de gène de EHV-1 gp14 est que la longue séquence de signal hydrophobe est précédée par une longue séquence hydrophyle. Cette caractéristique a également
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été notée pour les gènes du virus de la pseudo-rage (PRV) gii (62) et pour le virus de l'herpès bovin 1 (BHV-1) gl (63) ces deux gènes étant également des homologues de HSV gB. Une région hydrophobe constituée par 45 acides aminés (acides aminés 826 à 870) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Le domaine cytoplasmique hydrophile contient 110 acides ami-5 nés.
Il existe onze sites Asn-X-Thr/Ser (X pouvant être tout acide aminé exepté la proline) pour une glycosyiation potentielle à liaison par l'azote (64). Une caractéristique inhabituelle est constituée par le fait qu'il y a également deux sites potentiels de glycosyiation dans le domaine cytoplasmique (fig. 6).
Une représentation d'hydrophilicité de la séquence de codage de EHV-1 gp14 est illustrée sur la 10 fig-7. L'index hydropathique de EHV-1 gp14 est calculé par la methode de Kyte et Doolittle (65) avec une fenêtre de sept acides aminés et pas de lissage. Les points sous la ligne horizontale représentent des zones d'hydrophobicité plus élevée ce qui indique donc des régions de signal potentiel et/ou d'enjambement de membrane. Les caractéristiques de glycoprotéines qui enjambent la membrane comprennent des éléments de signal et d'ancrage et la longue région hydrophile qui précède la séquence de si-15 gnal sont trouvées pour la séquence de codage de EHV-1 gp14.
Localisation du déterminant antigénique reconnu par l'anticorps monoclonal anti-EHV-1 gp14. à savoir 3F6
20 Les vecteurs d'expression de lambda gt11 et les anticorps monoclonaux ont été utilisés pour identifier les séquences d'ADN de EHV-1 codant les principales glycoprotéines de EHV-1 (3). Un recombinant lambda gt11, à savoir 4 à 1 a montré qu'il exprimait l'épitope de EHV-1 gp14 reconnu par l'anticorps monoclonal spécifique 3F6 (3). En vue de déterminer l'identité de cet épitope, l'ADN de EHV-1 contenu à l'intérieur de 4 à 1 a été séquencé et comparé avec la séquence d'ADN de la séquence de 25 codage de EHV-1 gp14 (fig. 6). Pour séquencer le fragment d'ADN correspondant à l'épitope de EHV-1 gp14 dans le recombinant lambda gt11, à savoir 4 à 1 reconnu par l'agent monoclonal anti-EHV-1 gp14, à savoir 3F6 (3), on a digéré 4 à 1 avec EcoRI. le fragment de EHV-1 a été isolé sur des geis d'agarose et lié au site EcoRi de pUC8. Le séquençage d'ADN a été réalisé comme décrit ci-dessus avec les promoteurs avant et arrière universels M13.
30 L'alignement de la séquence de nucléotides à indiqué que cet épitope était contenu dans la région des 66 acides aminés correspondant à 107 (Thr) à 172 (Val) du produit de traduction primaire déduit. L'épitope est donc localisé à l'intérieur de la région amino-terminale du domaine de surface déduit de EHV-1 gp14.
35 Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1 gp14 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès
La comparaison de la composition des acides aminés du gène de EHV-1 gp14 a révélé une homolo-gie étendue avec les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, EHV-1 gp14 est homologue à gli 40 de PRV (62), gl de BHV-1 (63), gli du virus de la varicelle-zoster (VZV) (66), gB du virus de l'herpès simplex (HSV) (67, 71, 72), aussi bien qu'à des glycoprotéines du virus d'Epstein-Barr (EBV) et du cy-tomégalovirus humain (HCMV) (10).
Mutaaénèse dirigée par les oligonucléotides de la terminaison 5' de la séquence 45 de codage de EHV-1 gp14
En se référant maintenant de nouveau à la fig. 5, le plasmide bleu (Kpnil/BamHlì a été engendré en insérant un fragment de Kpnl/BamHi provenant de pUC (BamHl-a/EcoRlì dans la transcription du plasmide Bluescript SK+ digéré par Kpnl/BamHI. La mutagénèse dirigée par les oligonucléotides a été réali-50 sée par une modification du procédé de Kunkel (17) en utilisant des modèles d'ADN contenant de l'ura-cile à partir du plasmide bleu (Kpnl/BamHH produit chez l'hôte «dut ung» £. Coli souche CJ236. Dans le plasmide mutagéné, on a créé un site Ngil aux codons 1 et 2 du gène de EHV-1 gp14 en changeant la séquence ATG/TCC (Met/Ser) en ATG/CAT (Met/His). La séquence ayant subi la mutation a été vérifiée par analyse de la séquence d'ADN. Le fragment KnpI/BamHI du mutant a été transféré au pUC18 55 digéré par Kpnl/BamHI en engendrant le plasmide (Kpnl/BamHH.
Un plasmide, à savoir pUCg14, contenant le gène complet de EHV-1 gp14 avec la mutation de site Nsil a été construit en insérant le fragment EcoRI/BamHI à partir de pUC (Kpnl/BamHh en pUC (BamHI/Pstn digéré par EcoRI/BamHI. un sous-clone de 3,9 kb de pUC (Bamlll-iì.
60 Construction de plasmide donneur chimère pVM2LH6g14
pMP409DVC a été coupé au moyen de Baglll et lié avec de l'ADN double brin synthétique contenant le promoteur (précoce/tardif) H6 de la vaccine modifié, décrit dans l'Exemple I, flanqué par des sites de restriction. Les sites de restriction pour Nsil. Sacl. PstI et EcoRI ont été créé immédiatement en aval du 65 codon d'initiation endogène dans le promoteur H6. Dans pMG11, la séquence de polyliaison en aval du
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promoteur H6 est ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. Le site unique Nsil contenant le codon d'initiation H6 (souligné) est immédiatement suivi par les sites uniques Sacl. PstI et EcoRI.
Le fragment d'ADN EcoRI/Nsil de pUCg14 contenant la région d'ADN de EHV-1 en amont du codon d'initiation de EHV-1 gp14 a été remplacé par le fragment EcoRI/Nsil à partir du plasmide pMG11, en engendrant ainsi le plasmide pMRHgl4 qui contient le bras droit de HINDIII M de la vaccine, le promoteur H6 et toute la longueur du gène de EHV-1 gp14. Le fragment Hpal/Pstl contenant EHV-1 gp14 en provenance du plasmide pMRHg14 a été transféré au plasmide vecteur pMG11 coupé au moyen de HPal/Pstl en créant le plasmide pVM2LH6g14. pVM2LH6g14 contient ia totalité de la séquence de codage de EHV-1 gp14 (avec le codon 2 changé de TCC (Ser) en CAT (His) comme indiqué et approximativement 1,2 kb d'ADN de EHV-1 en aval du gène de EHV-1 gp14) sous le contrôle du promoteur H6, inséré dans une orientation de la droite vers la gauche par rapport aux séquences flanquantes de vaccine par rapport au génome de vaccine dirigeant au but l'insertion du gène de EHV-1 gp14 au locus M2L.
On a réalisé la recombinaison en utilisant vP458 comme virus de sauvetage et pVM2LH6g14 comme plasmide donneur. Des plaques incolores ont été prélevées et analysées pour la présence de séquences de codage de EHV-1 gp14 en utilisant une sonde spécifique de EHV-1 gp14 marquée au moyen de 32p. Après clonage sur plaque répété, le recombinant de la vaccine a été désigné vP577.
Troncature des séquences leader hvdrophiliaue de EHV-1 ad 4
En utilisant des variantes des manipulations de mutagénèse et de clonage décrites ci-dessus, on a construit un plasmide donneur chimère pVM2LH6g14-1. Pour créer pVM2LH6-g14.1, qui contient une suppression des codons 2 à 34 de EHV-1 gp14 avec la substitution de 4 codons, on a réalisé une mutagénèse in vitro (17) sur le plasmide bleu (Kpnl/BamHI) en créant un site ÌMI aux codons 32 à 36 plutôt qu'aux codons 1 et 2. Le fragment Nsil/BamHI à partir du plasmide bleu (Kpnl/BamHI) nouvellement mutagéné a été substitué au fragment Nsil/BamHI dans pVM2LH6g14. Des agents de liaison Nsil multiples (New England BioLabs, Beverly, MA) ont été liés dans le site Nsil pour amener l'ATG initial dans le cadre du restant de la séquence de codage de EHV-1 gp14. Le plasmide final pVM2LH6g14-1 contient la séquence ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT .... qui code Met/His/Ala/Cys/lle/Ala... où GCT (Ala) est le codon 35 de EHV-1 gp14. Le restant de pVM2LH6g14.1 est identique à celui dans pVM2LH6g14.
La vaccine recombinante vP613 a été obtenue par recombinaison avec le virus de sauvetage vP458 et le plasmide donneur pVM2LH6g14-1.
Exemple 3
CONSTRUCTION DE VIRUS RECOMBINANTS DE LA VACCINE vP633 et vP634 EXPRIMANT CHACUNE DES GLYCOPROTEINES qp13 et no14 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN
En vue de construire des recombinants de vaccine exprimant à la fois des glycoprotéines gp13 et gp14 de EHV-1, on a réalisé la recombinaison avec soit vP577 soit vP613 comme virus de sauvetage et le plasmide donneur pVHA6g13 (décrit dans l'Exemple 1) qui contient le gène de EHV-1 gp13 sous le contrôle du promoteur H6 de LA vaccine inséré au locus de suppression HA de la vaccine. L'insertion des séquences de EHV-1 gpl 3 dans des virus recombinants a été identifiée par hybridation d'ADN iû situ (25, 28). La recombinaison de pVHA6g13 avec le recombinant vP577 du virus de la vaccine (contenant EHV-1 gp14 de longueur complète) a engendré le double virus recombinant de la vaccine vP633; la recombinaison avec vP613 (contenant EHV-1 gp14 tronqué) a engendré le recombinant vP634 double de la vaccine. Les recombinants doubles du virus de la vaccine vP633 et vP634 ont été clonés sur plaques et ia présence simultanée des séquences de EHV-1 gp13 et gp14 a été confirmée par analyse d'hybridation d'ADN et par des essais d'expression (voir ci-dessous).
Immunoprécipitation des glycoprotéines gp13 et qp14 de EHV-1 exprimées dans les virus recombinants de la vaccine
En vue d'établir les glycoprotéines gp13 et gp14 de EHV-1 exprimées par les virus recombinants de la vaccine, on a infecté des cellules de VERO avec les recombinants et on a marqué métaboliquement les protéines au moyen de 35S-méthionine et on a réalisé une immuno-précipitation comme décrit dans l'Exemple 1. L'anticorps monoclonal spécifique vis-à-vis de EHV-1 gp13 (14H7) ou EHV-1 gp14 (3F6) (3) a été lié dans une dilution à 1%o pendant 4 heures à la température ambiante. On a analysé des exemples au moyen d'électrophorèse par gel de SDS Polyacrylamide sur un gel polymère à 10% à 30 mA (courant d'intensité constante) pendant approximativement 6 heures. On a préparé des autoradiogrammes.
On n'a pas immuno-précipité de produit significatif par le produit monoclonal spécifique anti-EHV-1 gp13, désigné 14H7 (3) ou par l'agent monoclonal spécifique anti-EHV-1 gp14 désigné 3F6 (3) ni des cellules de VERO non infectées, ni des cellules de VERO infectées au moyen du virus de la vaccine d'hémaglutinine minus de contrôle, à savoir vP452 (184). Les produits marqués radioactivement de
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EHV-1 gp13 ont été précipités par le produit monoclonal 14H7 des cellules de VERO infectées au moyen de vP483, une vaccine recombinante exprimant seulement le EHV-1 gp13, ou les recombinants doubles du virus de la vaccine exprimant à la fois EHV-1 gp13 avec soit du gp14 intact, à savoir vP633, soit du gp14 tronqué, à savoir vP634. Il existe deux produits d'approximativement 44 et 47 kDa détectables qui sont quelque peu plus petits que le produit de traduction primaire prédit (de 51 kDa) et un produit plus grand d'approximativement 90 kDa, ce qui est consistant avec une forme complètement glycosylatée du produit de gène de EHV-1 gpl 3. D'une manière significative, la qualité et la quantité de l'expression de EHV-1 gp13 n'est pas affectée par la co-expression de l'une ou l'autre forme de EHV-1 gp14 dans les recombinants doubles de la vaccine vP633 et vP634.
Des cellules de VERO ont été infectées au moyen de vP633, vP634, vP613 et vP577, respectivement, et ont subi une immuno-précipitation par le produit monoclonal 3F6 spécifiquement anti-EHV-1 gp14 (3). Avec vP633 (contenant gp14 de longueur complète + gp13) et avec vP577 (contenant gp14 de longueur complète), on a observé des bandes principales à environ 34, 47, 60-64 et 90 kDa; alors qu'avec vP634 (contenant gp14 tronqué + gp13) et avec vP613 (contenant gp14 tronqué), on a observé des bandes principales à 34, 47, 57, 72-82 et 116 kDa. Une fois encore, on n'a pas observé de différence significative dans la synthèse de EHV-1 gp14 de l'une ou l'autre des formes pendant la co-ex-pression avec EHV-1 gp13.
Analyse par immuno-fluorescence des produits de EHV-1 gp13 et qd14 synthétisés par des virus recombinants de la vaccine
L'immunofluorescence de cellules de VERO infectées par le virus recombinant de la vaccine a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant l'anticorps monoclonal spécifique soit de EHV-1 gp13 soit gp14.
EHV-1 gp13 était facilement détectable sur la surface des cellules de VERO infectées avec les recombinants de la vaccine vP483, vP633 et vP634 aussi bien qu'intérieurement après fixation au moyen d'acétone. Aucune immunoréactivité significative interne ou de surface vis-à-vis de l'anticorps gp13-spécifique n'a été observée dans les cellules infectées par vP410, vP577 ou vP613. L'expression de EHV-1 gp14 a été facilement détectable dans des cellules de VERO fixées à l'acétone infectées avec des recombinants de la vaccine vPS77, vP613, vP633 et vP634. Aucune immuno-fluorescence interne significative vis-à-vis de l'anticorps gp14 spécifique n'a été observée dans les cellules infectées par vP410 ou vP483. En utilisant un anticorps monoclonal spécifique vis-à-vis de gp14, à savoir 3F6, on a observé une faible immuno-fluorescence de surface dans les cellules infectées par vP613 ou vP634 qui expriment la forme tronquée de EHV-1 gp14 et aucune réponse de surface significative au-dessus des virus de contrôle vP410 et vP483 n'a été obtenue avec les virus recombinants de la vaccine vP577 et vP633 qui expriment le gène EHV-1 gp14 de longueur complète (voir également l'Exemple 8).
Exemple 4
IMMUNISATION DE COCHONS D'INDE (COBAYES) AU MOYEN DE VACCINE RECOMBINANTE vP483
En vue de déterminer l'immunogénécité du produit de gène du virus de l'herpès chevalin gp13 exprimé par la vaccine recombinante vP483, on a inoculé des cochons d'Inde au moyen du virus et la présence d'anticorps neutralisant du sérum actif contre le virus de la vaccine et le virus de l'herpès chevalin a été testée.
Quinze cochons d'Inde (cobayes) pesant environ 450 grammes ont été divisés en groupes de cinq. Un groupe a reçu 1 ml de la vaccine recombinante (108TCID5o/ml) au jour 0 suivi par une dose de rappel de 1 ml au jour 21 par inoculation sous-cutanée. Le second groupe a reçu des inoculations similaires mais avec la vaccine vP452 (108TCIDso/ml). Le troisième groupe n'a pas été vacciné. Tous les cobayes ont été saignés avant la vaccination primaire et aux jours 21 et 35. Des sérums ont été préparés et essayés pour déterminer la présence d'anticorps neutralisants vis-à-vis à la fois de la vaccine et de EHV-1 (souche Kentucky) en utilisant 50 TCIDso de virus essayé sur des cellules de testicules porçins.
Comme montré sur le Tableau I, la vaccine recombinante d'EHV-1 gp13, à savoir vP483, provoque une séroconversion évidente chez les cochons d'Inde. Les titres de neutralisation du sérum obtenus avec le virus de la vaccine sont indiqués entre parenthèses dans le Tableau I. Les anticorps neutralisant le sérum à la fois de la vaccine et de EHV-1 sont détectables 21 jours après l'inoculation primaire et une augmentation significative du titre des anticorps neutralisant du sérum est obtenue deux semaines après une seconde inoculation du virus au jour 21. On doit noter que les titres de neutralisation de la vaccine du sérum obtenus chez les cochons d'Inde inoculés avec le virus recombinant exprimant EHV-1 gp13 sont significativement plus élevés (t=7,2) que les titres obtenus à partir de cochons d'Indes ou cobayes inoculés avec le virus vP452 de la vaccine.
18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 682 671 A5
Tableau 1
Anticorps neutralisant le sérum présent chez les cochons d'Inde inoculés soit avec la vaccine recombinante exprimant EHV-1 gp13 ou un virus de la vaccine de contrôle vP452
Titre neutralisant du sérum (logio) sur jours Virus d'inoculum Animal n°
0
21
35
Animaux de contrôle
26
0,24
(0,35)
-
0,24
(0,70)
non vaccinés
27
0,24
(0,35)
-
0,56
(1,05)
28
0,24
(0,35)
-
0,80
(0,70)
29
0,24
(0,35)
-
0,40
(0,70)
30
0,24
(0,35)
-
0,32
(0,35)
Virus de la vaccine
191
0,24
(0,35)
0,36
(0,47)
0,72
(1,75)
de contrôle vP452
192
0,24
(0,35)
0,21
(0,93)
0,24
(2,30)
193
0,24
(0,35)
0,48
(0,58)
-
-
194
0,24
(0,35)
0,24
(0,82)
0,24
(2,10)
195
0,24
(0,35)
-
-
-
-
Virus recombinant
186
0,24
(0,35)
0,48
(1,28)
1,20
(2,57)
de la vaccine vP483
187
0,24
(0,35)
0,72
(1,63)
1,68
(2,57)
188
0,24
(0,35)
0,24
(1,52)
1,68
(2,57)
189
0,24
(0,35)
0,36
(1,40)
1,56
(2,22)
190
0,24
(0,35)
0,48
(1,63)
1,56
(3,00)
Exemple 5
IMMUNISATION DE COCHONS D'INDE AU MOYEN DE VACCINE RECOMBINANTE vP577 et vP613
Des cochons d'Inde ont été immunisés pour évaluer leur réponse vis-à-vis de EHV-1 gp14 exprimé par les vaccines recombinantes vP577 et vP613. Des cochons d'Inde pesant environ 450 grammes ont reçu 105 TCID50 de vaccine recombinante soit vP577, soit vP613 par la voie sous-cutanée, 1 ml les jours 0 et 21. Les cochons d'Inde ont été saignés aux jours 0, 21 et 35, des sérums préparés et essayés au point de vue anticorps de EHV-1. Des essais de neutralisation ont été réalisés sur des cellules testiculaires porcines contre 50 TCID50 de virus EHV-1, souche Kentucky. Des anticorps de vaccine ont été titrés par ELISA en utilisant un conjugué de péroxydase anti-lgG (H&L).
Les résultats sont donnés dans le Tableau 2. On n'a pas obtenu d'activité de neutralisation du sérum contre EHV-1 chez les cochons d'Inde immunisés avec la vaccine recombinante vP517, contenant le gène de EHV-1 gp14 de longueur complète (données non indiquées). D'un autre côté, des cochons d'Inde inoculés avec le virus recombinant de la vaccine vP613 exprimant un gène EHV-1 gp14 tronqué ont induit des niveaux similaires des anticorps de neutralisation du sérum EHV-1 (Tableau 2) que la vaccine recombinante vP483 exprimant EHV-1 gp13 (Tableau 1). Bien que les anticorps de 25 neutralisation du sérum EHV-1 sont détectables trois semaines après la vaccination primaire, un niveau plus significatif a été observé deux semaines après l'immunisation secondaire (Tableau 2). Dans tous les animaux immunisés, des réponses étaient obtenues lorsque les anticorps de la vaccine ont été testés par ELISA.
19
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 682 671 A5
Tableau 2
Anticorps neutralisant le sérum présent dans les cochons d'Inde inoculés au moyen d'une vaccine recombinante exprimant eHV-1 gp14
Titre de neutralisation du sérum (logio) en jours
Virus d'inoculum
0
21
35
Virus recombinant de la vaccine vP613
0,4
0,7
1,3
0,2
0,7
1,2
0,2
0,7
1,7
0,2
1,1
1,6
0,2
1,0
1,6
Animaux de contrôle non vaccinés
0,2
-
0,4
0,6
-
0,4
0,7
-
0,8
0,6
-
0,2
0,4
-
0,4
Exemple 6
PROTECTION DE HAMSTERS VACCINES CONTRE L'ATTAQUE PAR EHV-1
En vue d'établir l'efficacité de la vaccine recombinante vP483 exprimant EHV-1 gp13, des hamsters ont reçu soit une vaccination primaire, soit une vaccination primaire suivie d'une vaccination de rappel et ils ont, en même temps qu'un groupe de contrôle non inoculé ou un groupe inoculé deux fois avec un virus de la vaccine de contrôle VP54, été soumis à une attaque inter-péritonéale avec une souche Kentucky de EHV-1 adaptée à l'hamster.
Quarante hamsters syriens (âgés de 40 jours et pesant entre 55 et 65 g) ont été séparés en quatre groupes. Le groupe A a reçu une seule inoculation sous-cutanée (1 ml) soit de 108, 106 ou 104 TCID50 de la vaccine recombinante vP483, cinq animaux par dose. Le groupe B a été vacciné avec vP483 au jours 0 suivi par un rappel au jour 14. Les doses primaires et de rappel (1 ml) ont été administrées par voie sous-cutanée à des groupes de cinq animaux en utilisant 108, 106 ou 104 TCID50. Le groupe C consistant en 5 hamsters a reçu deux injections sous-cutanées (108TClDso par injection) aux jours 0 et 14 de vaccine vP452. 5 hamsters du groupe D ont été laissés pour constituer des animaux de contrôle non vaccinés. Tous les hamsters ont reçu 200 LD50 d'une souche Kentucky, adaptée aux hamsters, de EHV-1 par la voie inter péritonéale 14 jours après la dernière immunisation. Les survivants ont été comptés 7 jours après l'attaque.
Les résultats sont montrés dans le Tableau 3. Tous les hamsters non vaccinés et les hamsters vaccinés par le virus vP452 de la vaccine sont morts dans les 5 jours de l'attague.
Des niveaux significatifs de protection contre l'attaque par EHV-1 ont été observés chez des hamsters vaccinés avec la vaccine recombinante vP483 exprimant EHV-1 gp13. Aucune différence significative dans les niveaux de protection n'a été observée chez des hamsters immunisés au moyen de doses soit primaires et de rappel. La dose protectrice (PD50) était similaire PD50 = 6,32 logio primaire et 6,12 logio primaire plus le rappel. Cependant une protection de 100% n'a été observée que dans le groupe recevant deux doses de 108 TCID50 de virus recombinant.
Tableau 3
Protection des hamsters vaccinés au moyen de la vaccine recombinante exprimant EHV-1 gp13 contre l'attaque par EHV-1
Vaccine recombinante
Virus de vaccination
Vaccine de contrôle cp452
Pas de virus
Primaire
Rappel
Rappel
Dose de vaccin Log10 TCID50
8 6 4
8 6 4
8
Proportion de survivants
âlZ
52Û
0
0
5 5 5
5 5 5
5
5
20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 682 671 A5
En vue de déterminer l'efficacité protectrice d'un virus recombinant de la vaccine exprimant EHV-1 gp14 seul ou en combinaison avec EHV-1 gp13, des études d'attaque ont été réalisées sur des hamsters vaccinés. 20 hamsters syriens âgés de 21 jours, pesant environ 60 g chacun ont été inoculés par voie sous-cutanée par 1 ml de virus de la vaccine de contrôle ou avec les virus recombinants de ia vaccine vP483, vp577, vP613, vP633 et vP634 exprimant EHV-1 gp13 et/ou gp14. La vaccination primaire a été suivie par une dose de vaccination identique [pfu/ml (logio)] au jour 14. Tous les hamsters, y compris les animaux de contrôle non inoculés, ont été soumis 14 jours après la dernière immunisation à une injection interperitonéale de 200 LDso de la souche Kentucky adaptée au hamster de EHV-1. Les survivants des groupes de 5 ont été calculés 14 jours après l'attaque au moment où l'expérience a été terminée. La dose d'inoculum donnant une protection de 50% des hamsters est évaluée en tant que log« TCIDso/ml d'inoculant.
Comme montré sur le Tableau 4, le virus recombinant de la vaccine vP577 exprimant le gène EHV-1 gp14 de longueur complète n'a pas protégé les hamsters contre l'attaque par une dose de PDso calculée > 9,0 logio. D'un autre côté, le gène EHV-1 gp14 tronqué, tel qu'exprimé par la vaccine recombinante vP613, a donné une bonne protection en réponse à l'attaque (Tableau 4). Le PDso calculé est quelque peu meilleur (5,2) que celui obtenu avec la vaccine recombinante exprimant EHV-1 gp13, à savoir vP483 (6,1). D'une manière surprenante, la co-expression de EHV-1 gp13 et gp14, que ce soit pour le gène gp14 de longueur complète ou le gène gp14 tronqué dans les virus recombinants de la vaccine vP633 et vP634, respectivement, ont fourni une efficacité protectrice notablement améliorée comparée à l'efficacité pour les glycoprotéines d'EHV-1 exprimées séparément. Par conséquent, la quantité d'inoculum de virus pour obtenir une protection à 50% des hamsters vaccinés a diminué d'une manière si-gnifi cative lorsque EHV-1 gp13 et gp14 ont été coexprimés dans le même virus recombinant de la vaccine.
Tableau 4
Protection des hamsters vaccinés avec des recombinants de la vaccine, exprimant EHV-1 gp13 et/ou gp14 contre l'attaque par EHV-1
Inoculum Protéine de EHV-1
Dose de vaccin/Survivants
PDso
VP483
gpi3
8/5
6/2
4/0
6,1
Aucun
-
0/0
-
-
-
vP577
gpi4
8/1
6/0
4/0
> 9,0
Aucun
-
0/0
-
-
-
vP613
gpi4*
8,4/5
6,4/5
4,4/1
5,2
vP633
gp13 + gp14
8/5
6/3
4/4
4,3
VP634
gpl3 + gpi4
7,6/5
5,6/5
3,6/5
<3,6
Vaccin
-
8/0
-
-
>9,0
Aucun
-
0/1
-
-
-
*vP613 et vP634 expriment la version tronquée de EHV-1 gp14.
Exemple 7
CONSTRUCTION DE RECOMRINANTS DE POXVIRUS AVIAIRE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE od13 DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN
En se référant maintenant à la fig. 8, on a utilisé pVHA6G13 comme source de gène de EHV-1 gp13. Pour isoler le fragment d'ADN contenant tout le gène de EHV-1 gp13, on a digéré pVHA6g13 par Nrul et Hindlll. Un fragment d'approximativement 1,8 Kb contenant 28 bp de l'extrémité 3' du promoteur H6 du virus de la vaccine, la totalité du gène EHV-1 gp13, et approximativement 410 bp de séquences du virus de la vaccine ont été engendrés par cette digestion. Le fragment de 1,8 Kb Nrul/Hindlll a été isolé par insertion dans les vecteurs d'insertion de poxvirus aviaire pFPCV2 et pCPCVI.
Le vecteur pFPCV2 d'insertion du poxvirus des volailles (FP) fournit un véhicule pour engendrer des recombinants qui abritent des gènes étrangers dans une région non essentielle du génome de FP qui désignait le locus F7. pFPCV2 a été dérivé de pRW731.13. Le plasmide pRW731.13 contient un fragment Pvull génomique de FP d'approximativement 5,5 Kb inséré entre les deux sites Pvull de pUC9. Initialement, une séquence de clonage multiple (MCS) a été liée au site d'insertion unique Hincll dans le fragment génomique Pvull de FP de 5,5 Kb. Le MCS a été dérivé par traitement de réforme des oligonucléotides
CE4 (5'-TCGCGAGAATTCGAGCTCGGTACCGGATCCTCTGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-GTT 63')
21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 682 671 A5
et CE5
(5')-AACAAGCTTGCATGCCTAGGTCGACTCTTAGAGGATCCCCGGTACCGAGCTCGAATTCTCGCGA-3'). Le plasmide contenant le MCS a été désigné pCE11.
pFeLVIA est un dérivé du vecteur d'insertion de vaccine pTP15 (184) (fig. 3) dans lequel le gène du virus de la leucose féline (FeLV) snv (192) est inséré dans le site Esîl en aval du promoteur H6. Pour transférer la cassette d'expression de 2,4 kb à un vecteur FP (fig. 8), les séquences de H6/FeLV êqy ont été excisées de pFeLVIA par digestion avec Bglll et digestion partielle avec Esîl. Le site Bglll se trouve à la limite 5' de la séquence du promoteur H6. Le site Esîl est situé 420 bp en aval du signal de terminaison de traduction pour le cadre de lecture ouverte de la glycoprotéine d'enveloppe de FeLV.
La séquence H6/FeLV griy de 2,4 Kb a été insérée dans pCE11 digéré par BamHI et Esil. Ce plasmide a été désigné pFeLVFI. Le plasmide pFeLVFI a été ensuite digéré par Est! pour enlever les séquence FeLV env. Le plasmide résultant contenant le promoteur H6 du virus de la vaccine dans pCE11 a été désigné pFPCVI. Les séquences de 5'au promoteur ont été mutagénées (19) pour éliminer les séquences externes en utilisant l'oligonucléotide FPCV1 (5' CAGTAATACACGTTATTGCAGAGAGGAC-CATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3') pour produire pFPCVI. La région 3' au promoteur (site de clonage multiple) a subi une mutagénèse par l'oligonucléotide FPCV3 (5-TAGAGT CGACCTGCAGG-CATCCAAGCTTGTTAACGAC-3') pour éliminer le site Sphl. qui contient un ATG. Le plasmide résultant a été désigné pFPCF2.
Le fragment de EHV-1 gp13 Nrul/Hindlll de 1,8 kb, défini ci-dessus, a été inséré dans un fragment Nrul/Hindlll de 8,0 kb dérivé par digestion de pFPCV2. Ce fragment Nrul/Hindlll de 8,0 kb contenait la portion 5' du virus du promoteur H6 du virus de ia vaccine (100 bp), les séquences de flancs de FP (4,8 kb en amont et 1,5 kb en aval à partir du site d'insertion) et 2,4 kb de pUC (BRL, Bethesda, MD). La liaison ou ligation de ces deux fragments a résulté dans la formation d'un plasmide de 9,8 kb désigné pFPEHV13A.
Le plasmide pFPEHV13A a été ensuite digéré par KPnl 30 et Hindlll pour enlever un fragment d'environ 600 bp. Ce fragment contenait la plus grande partie de région 3' du gène de EHV-1 gp13 (200 bp) et le segment d'ADN du virus de la vaccine de 410 bp. Le fragment KPnl/Hindlll de 600 bp a été remplacé par un fragment de 200 bp dérivé de pNSIENPN (fig. 3) comme suit. Une digestion par Psil de pNSIENPN a linéarisé le plasmide. Les terminaisons de Esîl ont été affectées d'une coupure franche au moyen de T4 ADN polymérase (New England Biolabs, Beverly, MA) en présence de dNTPS (0,5 mM chacun). Les agents de liaison Hindlll (BRL, Bethesda, Med) ont été ensuite liés au fragment à coupure franche. Après digestion par Hindlll. le plasmide linéarisé a été digéré-par KPnl pour donner un fragment de 200 bp contenant la portion 3' du gène de EHV-1 gp13, la séquence correspondant au codon de terminaison (TAG) et le motif de séquence TTTTTNT qui est connu pour être le signal de terminaison de la transcription précoce du virus de la vaccine (45). Le plasmide recombinant a été désigné pFPEHV13B et a été utilisé dans une recombinaison in vitro pour l'insertion du gène de EHV gp13 promu par H6 dans le locus f7 du génome de FP. Le poxvirus de volaille recombinant a été désigné vFP44.
En se référant maintenant à la fig. 9, on a également utilisé pFPEHV13B pour engendrer un fragment Nril/Hindlll de 1,4 kb pour insertion dans pCPCVI. Le plasmide pCPCVI contient le promoteur H6 du virus de la vaccine dans le site unique EcoRI dans le fragment génomique du poxvirus du canari (CP) Pvull de 3,3 kb. Ce plasmide d'insertion permet l'insertion de gènes étrangers au locus C3 du génome CP. pCPCVI a été dérivé de pRW764,2, qui contient un fragment génomique Pvull CP de 3,3 kb inséré dans un vecteur pUC. pRW764,2 a été linéarisé par digestion par EcoRI. Ce fragment a été doté d'une coupure franche en utilisant un fragment de Klenow de l'ADN polymérase de l'£. Coli (Boeh-ringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) en présence de dNTPs (0,5 mM chacun). Les séquences du promoteur H6 du virus de la vaccine et une région de clonage multiple située en 3' par rapport au promoteur ont été excisées de pFPCVI par digestion avec Kpnl/HPal. Ce fragment de 200 bp a été doté d'une coupure franche au moyen de la-T4 ADN polymérase en présence de dNTPS (0,5 mM chacun) et inséré dans le plasmide pRW764.2, à coupure franche, et linéarisé. Le plasmide résultant a été appelé pCPCVI. Le plasmide pCPCVI a été digéré par Nrul et Hindlll et le fragment de 5,8 kb a été isolé pour ligation au fragment de 1,4 kb contenant EHV gp13 décrit ci-dessus. Le plasmide résultant a été appelé pCPEHV13A. Ce plasmide a été utilisé dans des expériences de recombinaison in vitro pour insertion du gène de EHv gp13 promu par H6 au locus C3 du génome CP. Le poxvirus du canari recombinant a été appelé vCP48.
Suivant la recombinaison in vitro, le poxvirus aviaire recombinant contenant le gène EHV-1 gp13 a été identifié par un essai d'hybridation classique sur plaques. Les plaques positives ont été purifiées par 3 cycles d'isolation de plaques suivis par des analyses d'hybridation. Les recombinants ont été désignés vFP44 et vFP48 pour les recombinants FP et CP respectivement. Les deux recombinants ont été analysés en utilisant un test immunotriage par la protéine A-B-galactosidase avec un anti-sérum monoclonal vis-à-vis de EHV-1 gp13. Les résultats ont montré que les monocouches de cellules de CEF et VERO infectées soit par vFP44 soit par vFP48 expriment EHV-1 gp13 à la surface des cellules infectées par le virus.
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 682 671 A5
Exemple 8
EVALUATION DE VIRUS RECONBINANTS ADDITIONNELS DE LA VACCINE EXPRIMANT DES VERSIONS MODIFIEES ET NON MODIFIEES DU GENE DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN 1 CODANT LA GLYCOPROTEINE qpl4
Construction et évaluation de virus recombinants additionnels de la vaccine exprimant EHV-1 qd14
Des produits construits contenant EHV-1 gp14 (Exemple 2) ont été modifiés de trois manières: (a) en faisant varier la longueur de la séquence leader ou de tête de EHV-1 gp14; (b) en éliminant l'excès d'ADN 3' EHV-1 du gène; et (e) en insérant les versions modifiées du gène EHV-1 gp14 dans un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte du virus de la vaccine vP293 (69) pour évaluation.
Le produit de gène de EHV-1 gp14 contient une séquence leader ou de tête inhabituellement longue. Une séquence hydrophobe longue s'étendant des acides aminés 59 jusqu'à 99 est proposée pour être la séquence de signal. Cette région est précédée par une longue séquence hydrophile. Une séquence leader ou de tête également longue a été également notée chez deux autres homologues de gB, à savoir le virus de la pseudo-rage gli (62) et le virus de l'herpès bovin 1 gl (63).
Modification de l'extrémité 5' de EHV-1 oo14
Pour étudier l'effet de la longueur de la séquence leader de EHV-1 gp14 sur le traitement, la présentation et l'efficacité immunologique du produit gp14 exprimé dans un virus recombinant de la vaccine, des plasmides contenant le gène de EHV-1 gp14 avec trois longueurs différentes pour la séquences leader ont été construits en modifiant le EHV-1 gp14 précédent, qui contient des constructions, des manières suivantes.
En se référant maintenant à la fig. 10, le plasmide pVM2LH6g14 (Exemple 2) contient toute la séquence de codage de EHV-1 gp14 sous le contrôle du promoteur H6 inséré dans le locus de suppression M2L de la vaccine de Copenhague. Dans pVM2LH6g14, l'acide aminé n° 2 du gène de EHV-1 gp14 est présent plutôt comme His que comme Ser natif. Pour changer l'acide aminé n° 2 en Ser, on a coupé pVM2LH6g14 au moyen de Nsil (séquence de reconnaissance ATGCAT) aux codons 1-2 (Met/ His). La mutagénèse a été réalisée (19) en utilisant le nucléotide synthétique MPSYN240 (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCTGTC3').
Le plasmide résultant, pMP14M, contient la totalité du gène de EHV-1 gp14 avec le codon natif (Ser) en position 2.
Le plasmide pVM2LH6g14-1 (Exemple 2) est identique à pVM2LH6g14 exepté pour une troncature de la séquence leader et introduction de quatre codons dérivés des agents de liaison Nsil synthétiques. Dans pVM2LH6g14-1, la séquence de l'extrémité tronquée 5' du gène de EHV-1 gp14 est ATG/CAT/ GCA/TGC/ATT/GCT... codant Met/His/Ala/Cys/lle/Ala...où GCT (Ala) est le codon 35 de EHV-1 gp14. pVM2LH6g14-1 a été modifié par mutagénèse (19) de deux manières. Pour produire une version du gène de gp14 tronqué approximativement au même degré que pVM2LH6g14-1, mais de manière à s'approcher davantage de la séquence de gp14 natif, on a coupé pVM2LH6g14-1 au moyen de Nsil aux codons 1-2. La mutagénèse a été réalisée en utilisant l'oligonucléotide synthétique MPSYN241 (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTGTCCCAGCAGCTGGCTCCTGGATC 3'). Dans le plasmide résultant, pMP14M-34, la séquence de codage de EHV-1 gp14 commence avec ATG/AGT/GTC/CCA... Met/Ser/Val /Pro ... où CCA (Pro) est l'acide aminé n° 36 de EHV-1 gp14. Le gène de EHV-1 gp14 contient un site Nael (GCCGGC) aux codons 61-63 (Lys/Pro/Ala). Pour produire une version plus sévèrement tronquée du gène de EHV-1 gp14, on a linéarisé pVM2LH6g14-1 au moyen de Nael puis digestion par Nlsil et isolement du fragment de vecteur à partir d'un gel d'agarose. La mutagénèse a été réalisée en utilisant l'oligonucléotide synthétique MPSYN243
(5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCATCATCGAGGGTGGGCACAATAGTT 3'). Dans le plasmide résultant, pMP14M-63, la séquence de codage de EHV-1 gp14 commence avec ATG/GCA... MEt/Ala... où GCA (Ala) est l'acide aminé n° 63 du EHV-1 gp 14natif.
Elimination de l'ADN de EHV-1 étranger
Dans tous les plasmides contenant EHV-1 gp14 discutés ci-dessus, les séquences de codage de EHV-gp14 sont suivies par approximativement 1200 bp d'ADN de EHV-1. Le codon de terminaison (TAA) pour le gène gp14 se produit dans le site Dral (TTTAAA). Pour éliminer l'excès d'ADN de EHV-1, on a soumis pMP14M-63 à une digestion partielle par Dral suivie par l'isolement de l'ADN linéaire à partir d'un gei d'agarose et la digestion par Psil qui coupe à la jonction entre l'ADN de EHV-1 et le bras de flanc avai de la vaccine.
Une bande d'ADN Dral/Pstl de 6,5 kb a été isolée à partir d'un gel d'agarose. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN247
(5' AAAI I I I IGTTAACTCGAGCTGCA 3') et MPSYN 248 (5' GCTCGAGTTAACAAAAATTT 3') ont été
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soumis à un traitement de réforme et liés avec un fragment de 6,5 kb. Dans le plasmide résultant, pMP14M-63P, les séquences de codage de EHV-1 gp14 sont suivies immédiatement par une séquence spécifiant la terminaison de la transcription précoce de la vaccine (45), suivie par une région de poly-liaison (contenant une suite de sites de restriction Hpal. Xhol. PstI) et le bras de flanc gauche de la vaccine dérivé de Hindlll M.
Insertion du promoteur H6/qène de EHV-1 qd1 4 dans un système de sélection dHES/vP293
Dans tous les plasmides contenant EHV-1 gp14 discutés ci-dessus, le gène de EHV-1 gp14 se trouve sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine inséré dans le locus de suppression M2L du virus de la vaccine, souche Copenhague. Etant doné que le locus d'insertion M2L est disposé dans une large région du génome qui peut être supprimée, la remise en place de la cassette d'expression promoteur H6/EHV-1 gp14 en un site d'insertion potentiellement plus stable a été investiguée. A titre d'étape préliminaire, des structures de gène de EHV-1 gp14 contenant différentes longueurs de la séquence leader ont été déplacées vers le système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte basé sur wP pHES/vP293 (69) pour permettre la production rapide de vaccines recombinantes pour une évaluation comparative.
Le plasmide pHES-4 contient le promoteur H6 de la 30 vaccine, suivi par une région de polyliaison et le gène du domaine de l'hôte humain KIL (70), tous insérés entre les bras de vaccine WR qui flanquent une suppression de 21,7 kb (69). pHES-4 contient deux sites Ml. à savoir l'un dans le promoteur H6 et l'autre dans les séquences de flanc de la vaccine. pHES-4 a été linéarisé par digestion partielle par Nrul et la bande contenant l'ADN linéaire de longueur complète a été isolée à partir d'un gel d'agarose. Cet ADN linéaire a été coupé au site Xhol dans la région de polyliaison. pMP14M-63P contient deux sites Nrul. à savoir l'un dans le promoteur H6 et l'autre dans les séquences de codage de EHV-1 gp14, 0,2 kb à partir de l'extrémité 3' du gène. pMP14M-63P a été soumis à une linéarisation par iJoil. suivie d'une digestion par Xhol. Un fragment Nrul (partielVXhol de 2,8 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Ce fragment contient une partie du promoteur H6, suivie par la forme du gène de EHV-1 gp14 modifié contenant la version la plus courte de la séquence leader. Le fragment contenant promoteur H6/EHV-1 gp14 de 2,8 kb dérivé de pMP14-63P a été lié avec le fragment de vecteur Nrul (partieO/Xhol dérivé de pHES-4. Le plasmide résultant, à savoir pHES-MP63, contient la cassette promoteur H6/gène de EHV-1 gp14 sans ADN de EHV-1 étranger. Pour transférer les extrémités 5' de la cassette promoteur H6/EHV-1 gp14 contenant des séquences leader de longueur totale ou modérément tronquées, on a coupé les plasmides pMP14M et pMP14M-34 par Nrul et les bandes de 2,8 kb et 2,7 kb, respectivement, ont été isolées à partir de gels d'agarose. pHES-MP63 a été soumis à une digestion partielle par Nrul et un fragment de 7,2 kb isolé à partir d'un gel d'agarose. Le fragment de vecteur de 7,2 kb correspond à pHES-MP63 dont le fragment Nrul de 2,6 kb contenant l'extrémité 5' de la cassette promoteur H6/EHV-1 gp14 a été éliminé. Le fragment de vecteur Nrul (partiel) de 7,2 kb dérivé de pHES-MP63 a été lié avec un fragment Nrul de 2,8 kb à partir de pMP14M en engendrant pHES-MPI. Le fragment de vecteur Nrul (partielà de 7,2 kb dérivé de pHES-MP63 a également été lié au fragment Nrul de 2,7 kb provenant de pMP14M-34, engendrant pHES-MP34. Les étapes de clonage conduisant à la production des plasmides pHES-MP63, pHES-MP1 et pHES-MP34 ont été représentées schématiquement sur la fig. 10.
On a utilisé des plasmides pHES-MP1, pHES-MP34 et pHES-MP63 comme plasmides donneurs pour recombinaison avec vP293 (69), en engendrant des virus recombinants de la vaccine vP753, vP765 et vP721, respectivement. La descendance recombinante a été sélectionnée sur des cellules MRC-5 humaines.
Evaluation de recombinants du virus de la vaccine basés sur vP293 exprimant le gène de EHV-1 qp14
Pour déterminer si les trois formes du produit de gène de EHV-1 gp14 exprimées dans les virus recombinants de la vaccine VP753, vP765 et vP721 étaient présents à la surface des cellules infectées, on a infecté des monocouches de cellules de VERO avec les trois virus recombinants de la vaccine contenant EHV-1 gp14. Les monocouches cellulaires infectées ont été analysées pour connaître leur immunofluorescence de surface en utilisant l'anticorps monoclonal 3F6 spécifique à EHV-1 gp14. L'im-munofluorescence de surface était positive pour les cellules infectées avec tous les trois recombinants viraux de la vaccine, vP743, vp765 et vP721. Ceci indique qu'une circulation convenable du produit de gène de EHV-1 gp14 dans les cellules infectées de la vaccine n'est pas affectée par la longueur de la séquence leader.
Pour comparer les produits de gène de EHV-1 gp14 exprimés dans les trois recombinants du virus de la vaccine contenant EHV-1 gp14, on a infecté des cellules de MRC-5 par vP753, vp765 et vP721 et les protéines ont été métaboliquement marquées au moyen de 35S-méthionine. Des immuno-précipi-tations ont été réalisées avec les lysats de cellules radioactivement marquées en utilisant l'anticorps monoclonal 3F6 spécifique vis-à-vis de EHV-1 gp14.
Les protéines immuno-précipitées à partir de cellules infectées par vP753, vP765 et vP721 sont in-
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distinguables l'une de l'autre et sont équivalentes aux protéines immuno-précipitées à partir de vP613, la vaccine recombi nantecontenant EHV-1 gp14 produite à partir du plasmide pVM2LH6g14-1. Ces résultats indiquent que les variations de longueur de la séquence leader de EHV-1 gp14 testées dans ces recombinants n'améliorent ni n'interviennent dans le traitement convenable du produit de gène.
Pour évaluer l'efficacité protectrice du virus recombinant de la vaccine exprimant les différentes formes de EHV-1 gp14, on a inoculé des hamsters au moyen de doses différentes de vP753, vP765 et vP721 et attaqué ceux-ci par la souche Kentucky adaptée à l'hamster de EHV-1. Les trois vaccines recombinantes contenant EHV-1 gpl 4 ont été protectrices, avec un logio PDso de 6,2 ou meilleur. Les différences de protection entre les trois recombinants du virus de la vaccine ne sont pas statistiquement significatifs.
Contraitement au vP577, un virus recombinant de la vaccine ultérieur qui a été également produit par recombinaison entre pVM2LH6g14 et vP458 montre une structure d'immunoprécipitation vis-à-vis de EHV-1 gp14 identique à celle avec vP753, vP765 et vP721 et, comme ces virus recombinants de la vaccine exprimant EHV-1 gp14, exprime la protéine de EHV-1 20 gp14 à la surface des cellules infectées.
Les données précitées suggèrent que le EHV-1 gp14 exprimé dans le virus recombinant vP577 de la vaccine est défectueux et que le défaut s'est produit probablement pendant la recombinaison entre le plasmide donneur pVM2LH6g14 et le virus de la vaccine vP458.
Exemple 9
SEQUENCE DE NUCLEOTIDES DE TROIS NOUVEAUX GENES A PARTIR DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN TYPE 1 ET EXPRESSION DANS DES VIRUS RECOMBINANTS DE LA VACCINE
Pour identifier et isoler le gène de EHV-1 codant gpl 7/18 avant de l'exprimer dans un virus recombinant de la vaccine, on a établi la séquence de la plus grande partie de la région Us du génome de EHV-1 et on a exprimé les différents cadres de lecture ouverts trouvés sur ce fragment d'ADN. On a identifié et analysé trois nouveaux gènes de EHV-1 codés par le composant S: EHV-1 gD qui, lorsqu'on en a établi la séquence, a montré une homologie avec les produits des gènes HSV gD et PRV gp50; EHV-1 gp63 qui a montré une homologie avec les produits des gènes HSV US7 et PRV gp63; et EHV-1 gE qui a montré une homologie avec les produits des gènes de HSV gE et PRV gl. Tous ces trois gènes, soit individuellement, soit en association, ont été clonés dans un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte de la souche de vaccine de Copenhague pour des études d'expression rapide. L'immunofluorescence obtenue avec un sérum de lapin anti-EHV-1 a révélé l'expression de produits spécifiques de EHV-1.
Clonage du fragment de EHV-1 par BamHI D
Etant donné que le gène de EHV-1 gpl 7/18 a été 15 localisé sur le composant S du génome de EHV-1 (3), le fragment par BamHI D, qui représente la plus grande partie de la région Us (59), a été isolé et cloné. L'ADN génomique de EHV-1 de la souche Kentucky D a été digéré par BamHI. Le fragment BamHI D de 11,0 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose (Geneclean, Bio101, Inc., La Jolla, CA) et cloné dans le plasmide plBI24 en tant que plasmide pEHVBamHID. Une carte de restriction de ce fragment en a été déduite (fig. 11).
Identification de séouences d'ADN codant EHV-1 aD qp63 et oE
Les données de séquence des nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de plusieurs sous-clones du fragment BamHI D sous-cloné dans plBI24, comme décrit dans l'Exemple 1. Les séquences des jonctions entre fragments successifs ont été examinées sur le clone initial pEHVBamHID. On a utilisé dans toutes les analyses de données de séquences le package de logiciel PC/GENE (Intel-ligenetics Inc., Mountain View, CA).
Analyse de la séquence d'ADN des gènes de EHV-1 gD. gp63 et gE
L'analyse de la séquence d'ADN de la région de 6402 bp séquencée du fragment BamHI D (représentant la plus grande partie de la région courte unique) a révélé l'existence d'au moins trois cadres de lecture ouverts complets lisant tous à partir du même brin. Cette séquence est présentée sur la fig. 12 en tant que brin 5' à 3' en direction de la droite. La composition des bases est 50,44% G + C.
Le premier cadre de lecture ouvert (ORF1) s'étend des positions 971 à 2176 de nucléotides. On a trouvé des signaux putatifs de régulation transcriptionnelle dans la région depuis 5' jusqu'au codon d'initiation ATG le plus probable en position 971. Une boîte TATA ayant la séquence TATATTAA (nucléotides 871 à 878) a été localisée 60 nucléotides en aval à partir d'une boîte CAT putative aux positions 811 à 817 ayant la séquence TGACAAT. On n'a trouvé aucun signal de polyadénylation (AATAAA) en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 2177 à 2179). Sept parmi les dix nucléotides dans la
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séquence 5' TCCCTTCGCC 3' (nucléotides 890 à 899) sont complémentaires à la séquence d'ARN ri-bosomal 18S, à savoir 3' AGGAAGGCGT 5' (61) et peuvent servir comme site de liaison de ribosome. Un modèle de balayage a été proposé par lequel des mARN eukaryotiques amorcent ou initient la traduction (151). La règle fondamentale de ce modèle est que des ribosomes se lient à l'extrémité 5' du mARN et balayent linéairement la molécule de mARN. L'engagement à l'amorçage ou initiation de la traduction est généralement au premier codon ATG proximal de 5', bien que des exceptions aient été notées (152). Une purine en position 3 est essentielle pour l'amorçage de la traduction et la traduction est stimulée par C dans les positions -1 et -2 lorsque le reste de la séquence est suboptimal (155). Le contexte de la séquence autour du codon d'amorçage proposé AGCATGT (nucléotides 968 à 974) se qualifie comme un contexte de séquence fonctionnelle pour l'amorçage de la traduction de mARN eu-kariotique. Il y a deux autres codons d'amorçage ATG possibles localisés respectivement dans les positions 989 à 991 et 992 à 994. Le contexte de ces deux codons CTTATGATGG ne les qualifie pas en tant que fonctionnels pour l'amorçage de la traduction. Le EHV-1 ORF1 code 402 acides aminés avec une masse moléculaire calculée de 45 239 daltons.
Analyse de la structure de la Proteine de EHV-1 ORF1
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 26 a un profil d'hy-drophobicité caractéristique et est proposée pour reconstituer la séquence de signal. Une région hydrophobe consistant en 24 acides aminés (acides aminés 351 à 374) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Il y a quatre sites Asn-X-Thr/Ser (X pouvant être tout acide aminé excepté la proline) pour une glycosyiation potentielle à liaison par l'azote (157). Le profil d'hy-drophobicité de la séquence d'acides aminés de EHV-1 ORF1 est illustrée sur la fig. 13. Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane et comprenant des éléments de signal et d'ancrage sont clairement définis. Les deux régions les plus hydrophobes à la terminaison N- et au voisinage des terminaisons C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la molécule de glycoprotéine.
Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1 ORF1 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés de la protéine putative EHV-1 ORF1 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de EHV-1 ORF1 est semblable à PRV gp50 (95) et HSV-1 gD (79, 160).
Le second cadre de lecture ouvert (ORF2) s'étend des positions de nucléotide 2287 à 3525. Aucun signal putatif réglant la transcription n'a été trouvé dans la région depuis 5' jusqu'au codon d'amorçage ATG en position 2287. Aucun signal de polyadénylation AATAAA n'a été trouvé en aval du codon de terminaison TGA (nucléotides 3526 à 3528), mais on a localisé deux signaux potentiels de polyadénylation YGTGTTYY (180) en aval de ce codon de terminaison à approxi mativement 40 et 70 bp. Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé GCTATGG est conforme aux règles de Kozak (151, 155). Il y a au moins deux autres codons possibles d'amorçage ATG dans les positions 2305 à 2307 et 2332 à 2334, mais le contexte de séquence de ces deux codons (GGGATGT et TCTATGG) ne les qualifient pas comme fonctionnels pour l'initiation de la traduction. Le EHV-1 ORF2 code un Polypeptide de 413 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 45 431 daltons.
Analyse de la structure de la protéine de EHV-1 ORF2
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 22 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour constituer la séquence de signal (bien que le comptage par ordinateur pour le site de coupure putatif est faible). Une région hydrophobe consistant en 32 acides aminés (positions 315 à 346) a été prédite comme fonctionnant en domaine d'ancrage transmembrane. Il existe sept sites Asn-XThr/Ser pour une glycosyiation potentielle à liaison par l'azote. Une détermination d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de la séquence EHV-1 ORF2 est illustrée sur la fig. 14. Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane, y compris des éléments de signal et d'ancrage sont clairement définies. Les deux régions les plus hydrophobes à l'extrémité N- et au voisinage de l'extrémité C sont predites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la mole-cule de glycoprotéine.
Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1 ORF2 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés de EHV-1 ORF2 a révélé une homologie signifi26
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cative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de EHV-1 ORF2 est homologue à PRV gp63 (80), VZV gplV (181) et HSV-1 US7 (79).
Le troisième cadre de lecture ouvert (ORF3) s'étend des positions de nucléotide 3796 à 5451. Des signaux putatifs réglant la transcription ont été trouvés dans la région depuis 5' jusqu'au codon d'amorçage ATG en position 3796. Une boîte TATA ayant la séquence GTTTAAA (nucléotides 3705 à 3711) est située 50 nucléotides en aval d'une boîte CAT putative aux positions 3649 à 3654 ayant la séquence GCAATG. Aucun signal évident de polyadénylation n'a été découvert en aval du codon de terminaison TGA (nucléotides 5452 à 5454). Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé ACAATGG est conforme aux règles de Kosak (151, 155). Le EHV-1 ORF3 code un polypeptide de 552 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 61 493 daltons.
Analyse de la structure de la protéine de EHV-1 ORF3
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certainN nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 23 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour constituer la séquence de signal. Une région hydrophobe consistant en 38 acides aminés (positions 404 à 437) est prédite comme fonctionnant en domaine d'ancrage transmembrane. Il y a cinq sites Asn-X-Thr/Ser pour une glycosyiation potentielle à liaison par l'azote. Un tracé d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de EHV-1 ORF3 est représenté sur la fig. 15. Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane, y compris les éléments de signal et d'ancrage, sont clairement définies. Les deux régions les plus hydrophobes à la terminaison N et au voisinage de la terminaison C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la molécule de glycoprotéine.
Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1 ORF3 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés de la protéine de EHV-1 ORF3 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de EHV-1 ORF3 est homologue à PRV gl (80), VZV gE (191) et HSV-1 gE (79).
Construction d'un virus de la vaccine Copenhague basé sur un système de sélection du domaine de réolication chez l'hôte
Un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte basé sur le virus de la vaccine Copenhague, semblable au système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte WR pHES/vP293 (69), a été construit.
Le mutant vP668 de suppression du virus de la vaccine Copenhague est supprimé pour douze gènes dans la région de Hindlll C à Hindlll K, y compris les gènes KIL, du domaine de réplication chez l'hôte humain (70), et C7L, un gène qui donne la carte de Hindlll C. vP668 est incapable de se développer sur des cellules humaines MRC-5. Les membres de la série de plasmides COPCS contiennent le gène C7L avec des bras de vaccine de flanc permettant la recombinaison avec vP668 et la restauration de la capacité du virus de se développer sur des cellules de MRC-5. La capacité de la descendance de vaccine recombinante engendrée par la recombinaison en utilisant le système de sélection de domaine de réplication chez l'hôte vP668/COPCS pour constituer des plaques sur les cellules humaines MRC-5 fournit un moyen d'identification rapide de ces recombinants. Le plasmide pCOPCS657 contient le promoteur synthétique H6 pour la vaccine suivi par une région de clonage de polyliaison pour l'insertion de gènes étrangers. La restriction de polyliaison est suivie par des codons d'arrêt et un signal de terminaison transcriptionnel de la vaccine (45).
Clonage du oène de EHV-1 gD dans pCOPCS657
En se référant maintenant à la fig. 16, on a digéré le plasmide pEHVBamHID par Hindlll et on a isolé à partir de gel d'agarose un fragment d'ADN Hindlll de 1240 bp contenant EHV-1 gD (Geneclean, Bio10, Inc., La Jolla, CA) et on a repairé celui-ci en utilisant le fragment de Klenow d'ADN polymérase. Le fragment repairé a été ensuite lié au plasmide pCOPOCS657 digéré par Smal. Le plasmide résultant, à savoir pJCA006, a le codon d'initiation ATG approximativement à 10 bp du promoteur H6 (fig. 16).
Clonaae du oène de EHV-1 ap63 en pCOPCS657
Le plasmide pEHVBamHID est digéré par Hindlll. EcoRI et Pvull et le fragment d'ADN Hindlll-Pvull de 1300 bp, contenant EHV-1 gp63, a été isolé à partir d'un gel de sagarose et repairé avec Klenow. Le fragment repairé a été ensuite lié en plasmide pCOPCS657 et digéré par Smal. Le plasmide résul27
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tant avec EHV-1 gp63 dans l'orientation convenable par rapport au promoteur H6 a été appelé jPCA008 (fig. 16).
Clonage du gène de EHV-1 gE en pCOPCS657
Le plasmide pEHVBamHID est digéré par Aatll-Apal et un fragment d'ADN Aatll-Apal de 2630 bp contenant EHV-1 gE a été isolé à partir d'un gel d'agarose et repairé avec Klenow. Le fragment repairé a été ensuite inséré dans le plasmide pCOPCS567 digéré par Smal. Le plasmide résultant avec le gène de EHV-1 gE dans la bonne orientation relativement au promoteur H6 a été appelé pJCA007
(fig. 16).
Clonage du fragment de EHV-1 gD-gp63 en pCOPCS657
En se référant maintenant à la fig. 17, le plasmide pEHVBamHID a été digéré par EcoRI et Puvll et le fragment (A) d'ADN EcoRI/PuvIl de 1832 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le plasmide pJCA006 a été digéré par Qâl et EcoRI et le fragment (B) d'ADN Clal-EcoRI de 1450 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le plasmide pCOPCS657 a été digéré par Clal et Smal et le fragment (C) d'ADN Clal-Smal de 3700 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Les fragments A, B et C ont été-ensuite liés ensemble et le plasmide résultant a été appelé pJCA009 (fig. 17).
Clonage du fragment de EHV-1 gD-gp63-gE en PCOPCS657
Le plasmide pEHVBamHID a été digéré par EcoRI et Sacll et le fragment (D) d'ADN EcoRI/Sacll de 4240 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le fragment (D) a été ensuite lié aux fragments B et C (voir au-dessus) avec addition de dNTP pour assurer le repairage de la jonction Sacll-Smal. Le plasmide résultant a été appelé pJCA010 (fig. 17).
Construction des virus recombinants de la vaccine vP773. vP803. vP809. vP810 et vP822 exprimant les cadres de lecture ouverts de EHV-1 LU
En vue de vérifier rapidement l'expression des cadres de lecture ouverts de EHV-1 décrits ci-dessus, on a construit un certain nombre de virus recombinants de la vaccine en utilisant le système de sélection de domaine de réplication chez l'hôte COPCS. Les trois cadres de lecture ouverts identifiés par l'analyse de séquence ont été clonés soit individuellement, soit en association («double» et «triple») en plasmide pCOPCS657 (fig. 16 et 17). Les plasmides résultants ont alors été utilisés pour recombinaison avec le recombinant de la vaccine vP668 comme virus de sauvetage. Les différents virus recombinants de la vaccine issus de ces recombinaisons sont représentés dans le Tableau 5.
Le recombinant de la vaccine vP773 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA006 contenant le gène de EHV-1 gD. Le recombinant de la vaccine vP822 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA008 contenant le gène EHV-1 gp63. Le recombinant de ia vaccine vP803 a été obtenu -par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA007 contenant le gène EHV-1 gpE. Le recombinant de la vaccine vP809 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA009 contenant le fragment de EHV-1 gp63; et on a obtenu le recombinant de la vaccine vP810 par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA010 contenant le fragment de 10 EHV-1 gD-gp63-gE (Tableau 5).
Tableau 5
Désignation des virus recombinants de la vaccine exprimant les gènes de EHV-1 gD, gE et gp63
Plasmide donneur
EHV-1 d'insertioin
Virus de sauvetage recombinant pJA006
gD
VP668
vP773
pJA007
gE
vP668
vP803
pJA008
gp63
vP668
vP822
pJA009
gD-gp63
vP668
vP809
pJAOIO
gD-gp63-gE
VP668
vP810
28
5
10
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20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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Analyse par immuno-fluorescence des produits de EHV-1 ORF1 (oD). ORF2 (gp63) et ORF3 (gE). synthétisés par les virus recombinants de la vaccine simples ou multiples
L'immuno-fluorescence de cellules de VERO et de MRC-5 infectées par des virus recombinants de la vaccine a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant un sérum de lapin polyclonal anti-EHV-1 spécifique, R5935 (1:200) (Tableau 6).
Tableau 6
Immuno-fluorescence de cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine réalisée en utilisant du sérum de lapin anti-EHV-1 R5935
EHV-1 recombinant
R5935 interne surface gD
positif négatif gp63
positif négatif gE
négatif négatif gD-gp63
positif négatif gD-gp63-gE
positif négatif
Exemple 10
EVALUATION IMMUNOLOGIQUE. CHEZ LES SOURIS ET LES COCHONS. DES GLYCOPROTEINES gpll. crolli et aa50 DU VIRUS DE LA PSEUDO-RAGE. EXPRIMEES INDIVIDUELLEMENT OU EN COMBINAISON. PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE LA VACCINE
La souche Copenhague du virus de la vaccine et ses dérivés vP410, vP425 et vP458 (184) ont été utilisés dans cet exemple.
Clonage des gènes PRV codant gpll. gplll et op50
Le virus PRV NIA3 (182) a été propagé sur une culture de cellules NIL2 (183). Les débris cellulaires ont été éliminés de la fraction surnageante par centrifugation à 3000 g pendant 30 mn. On a purifié les virions par centrifugation à travers un coussin de sucrose à 40% (en poids/volume) à 40 000 tours/mn pendant 60 mn dans un rotor Beckman 45 Ti suivi par un gradiant discontinu de sucrose à 30-50% (en poids/volume) (rotor Beckman SW25 à 23 000 tours/mn pendant 5 heures). Des virions par bandes ont été collectés, dilués au moyen d'un tampon TNE (SO mM Tris-HCI, pH7,8, 150 mM NaCI et 10 mM EDTA) et on a fait un comprimé à 30 000 tours/mn pendant 1 heure dans un rotor Beckman SW40. Le comprimé viral a été remis en suspension dans un tampon TE (50 mM Tris-HCI pH7,8, 10 mM EDTA) et lysé par addition de dodécyl-sulfate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,5% (poids/volume) et de protéinase K à 100 mg/ml. Après incubation à 37°C pendant 2 heures, le lysat a été extrait une fois avec un mélange phénol-chloroforme (1:1) et une fois avec un mélange chloroforme:isomaylal-cool (24:1). L'ADN a été précipité avec de l'éthanol et redissous dans H2O. Après digestion complète par BamHI. les fragments ont été clonés au site BamHI de pBR322 préalablement traité à la Phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIAP). Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer la souche nM522 d'E. Coli compétente (20).
En se référant maintenant aux fig. 18 et 19, la séquence d'ADN qui code le gène gpll réside dans le fragment 1 de BamHI et les sous-fragments IA et IB de Sali du génome PRV (62, 94). Le plasmide appelé pPR9.25 contenant le fragment 1 BamHI de PRV, inséré au site BamHI de pBR322 a été digéré par Ncol. Le résultat de digestion d'ADN a été fractionné sur gel d'agarose à 0,8% et un fragment d'ADN par Ncol de 6,2 kb a été purifié en utilisant la procédure Gene Clean (marque déposée) (Bio101, Inc., La Jolla, CA) puis inséré au site Ncol de pBR328 (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) traité avec CIAP. Le plasmide résultant, pPR2.15, a été digéré par SPhl et fractionné sur un gel d'agarose. Les fragments de 2,7 et 1,8 kb ont été purifiés et insérés au site SPhl de pUC18 phosphatasé pour créer des plasmides pPRI et pPR2 (fig. 18) et dans le phage M13. On a déterminé la séquence de nucléotides comme décrit ci-dessus. L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 2742 bp codant 913 acides aminés. Une homologie significative des acides aminés avec le HSV-1 gB a été observée comme attendu (62). Pour faciliter la descrip tion des manipulations de clonage pour l'expression de PRV gpll dans les vecteurs de virus de la vaccine, la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpll avec en plus des séquences supplémentaires non codantes 5' et 3' est illustrée sur la fig. 19.
En se référant maintenant aux fig. 20 et 21, la séquence d'ADN codant la glycoprotéine gplll de PRV réside dans les fragments 2 et 9 par BamHI du génome de PRV (96). Le plasmide pPR9.9, contenant
29
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le fragment par BamHI inséré au site BamHI de pBR322 (fig. 20) a été digéré par BamHI et SPhl. Le plasmide pPR7.5 contenant le fragment 9 par BamHI inséré au site BamHI de pBR322 a été digéré par Ncol et par BamHI. L'ADN résultant des deux digestions a été fractionné sur un gel d'agarose. Le fragment SPhl-BamHl de 2,35 kb et le fragment Ncol-BamHl de 1,1 kb ont été purifiés et liés aux sites 5 EcoRI-SPhl de IBI25 phosphatasé (fig. 20) en utilisant un agent de liaison phosphorylaté Ncol-EcoRI à savoir MRSYN21 /MRSYN22.
Ncol EcoRI
MRSYN21 5' CATGGGTCTGCAGTCG 3'
MRSYN22 3r CCAGACGTCAGCTTAA 5'
15 Un plasmide appelé pPR17 a été isolé et il contient un fragment SPhl-Ncol de 3450 bp comprenant le gène complet de PRV gplll (fig. 20). La séquence de nucléotides a été obtenue à partir de modèles ou matrices de plasmide double brin dénaturés au moyen d'un alcali et à partir de modèles ou matrice simple seul brin après clonage en phage M13. L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 1440 bp codant 479 acides aminés (fig. 21). On a observé une homologie significative 20 avec HSV gC comme observé précédemment (96).
En se référant maintenant aux fig. 22 et 23, la séquence d'ADN codant la glycoprotéine gp50 de PRV réside dans le fragment 7 par BamHI du génome de PRV (95). Le plasmide pPR7.1 (fig. 22) contenant le fragment 7 par BamHI de PRV, inséré au site BamHI de pBR322 a été digéré par Siul et Ndel et traité avec une nucléase de fève de Mung (Mung bean). Le fraqment de 1,7 kb a été purifié à 25 partir d'un gel d'agarose, inséré au site Hindi de IBI25 phosphatasé. Ce plasmide, pPR22 (fig. 12), contient la totalité du gène de PRV gp50. La détermination de la séquence de nucléotide a révélé un cadre de lecture ouvert de 1215 bp codant 404 acides aminés (fig. 23). Une homologie significative avec le HSV-1 gD a été observée comme rapporté précédemment (95).
30 Clonage des gènes de PRV codant gp||. gplll et gp50 dans des plasmides donneurs d'insertion du virus de la vaccine
Le fragment SPhl-Nhel de PRV de 1060-bp à partir de pPR1 (fig. 18A) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites BamHI-SPhl de plBI25 après traitement avec CIAP en utilisant un agent 35 de liaison phosphorilaté BamHI-Nhel. a savoir NRSYNI/MRSYN2
BamHI Nhel
HRSYN1 5' GATCCATTCCATGGTTG 3' 40 MRSYN2 3 * GTAAGGTACCAACGATC 5•
pour engendrer le plasmide pPR6 (fig. 18A).
pPR6 a été digéré par Hindlll et Apal et traité par CIAP. Le site Apal est localisé 32 bp en aval du 45 codon d'initiation ATG de PRV gpll (fig. 19). Un fragment d'ADN double brin a été obtenu par traitement de réforme (annealing) de la paire d'oligonucléotides phophorylatés synthétiques MRSYN3/ MR-SYN4. Ce fragment contient de l'ADN spécifiant le promoteur H6 de vaccine du site EcoRV jusqu'à l'ATG (souligné), suivi immédiatement par des séquences de codage de PRV gpll.
50
HlndlIIEcoRV ApaI
HRSYN3 5' AGCTTGATATCCGTXAACTTTGTATCGTAA2GCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCC 3' KYSYN4 3 ' ACTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 5«
55
L'ADN synthétique a été lié au fragment Hindlll-Apal de 3920 bp dérivé de pPR6 pour engendrer le plasmide pPR9 (fig. 18A).
Le plasmide pPR9 a été digéré par BamHI et Nhel. traité avec CIAP et lié en utilisant un agent de 60 liaison BamHI-Sphl phosphorylaté
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30
5
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60
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Sphi BamHI
KRSYN7 5* CCCAGATCTCCTTG 3'
KRSYN8 3* GTACGGGTCTAGAGGAACCTAG 5'
à un fragment Sphl-Nhel de 1640 bp obtenu a partir de pPR1, 20 en engendrant le plasmide pPR12 (fig. 18A, 18B).
Le fragment Hinoll-Sphl de 1030 bp provenant de pPR2 (fig. 18A) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites Hincll et Sphl de pUC18 phosphatasé. Le plasmide résultant pPR10 a été digéré par Hindlll et Nael et traité avec CIAP. Le site Nael est localisé 44 bp en aval du codon de terminaison TAG (fig. 19). Un fragment d'ADN double brin obtenu par traitement de réforme (annealing) de la paire d'oiigonucléotides synthétiques phosphorisatés MRSYN9/MRSYN10
HâÊl XmalII Hindlll
HRSYK9 5' GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTGTRGAATTTTTATCGGCCGA 3' MRSÏKIO 3' CCGTGATGGTCGCGGAGCTCTCGCTCCTGGGGCTGCGGGACATCTTAAAAATAGCCGGCTTCGA 5'
a été lié au fragment Nael-Hindlll de 3720 bp dérivé de pPR10 pour engendrer le plasmide pPR11.
Les séquences soulignées correspondent au codon de terminaison de PRV gpll et au signal de terminaison de transcription précoce de la vaccine (45). Le fragment Sphl-Hincll de 770 bp de pPR2 a été purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré, en utilisant un agent de liaison phosphorylaté BamHI-Sphl (MRSYN7/MRSYN8), aux sites BamHI-Hincll de pPR11 traité par CIAP, pour engendrer pPR13 (fig. 18A, 18B). Le plasmide pPR12, digéré par EcoRI et SPhl et traité par CIAP, a été lié, en utilisant un agent de liaison Hindlll-EcoRI phosphorylaté (MRSYN19/MRSYN20)
Hindlll EcoRI
KRSYN19 5* AGCTTCTGCAGCCATGGCGATCGG 3*
KRSYN20 3' AGÄCGTCGGTACCGCTAGCCTTAA 5'
à un fragment isolé Hindlll-Sphl de 990 bp dérivé de pPR13, pour engendrer le plasmide pPR15 (fig. 18B).
Le fragment de 2780 bp Hinclll-EcoRV de pPR15 a été traité avec la nucléase de la fève de Mung, purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré dans le plasmide pTP15 (184) (fig. 3) digéré par Xmalll-EcoRV. la nucléase de la fève de Mung et CIAP, pour engendrer le plasmide pPR18 (fig. 18B). Dans pPR18, pRV gpll est connecté au promoteur H6 synthétique de la vaccine au locus de suppression de l'hémaglutinine de la vaccine. Ce plasmide a été transfecté dans des cellules infectées par le virus de la vaccine pour engendrer des recombinants de la vaccine vP534, vP644, vP621 et vP692 contenant le gène de PRV gpll (voir ci-dessous).
Le gène de PRV gplll a été manipulé pour être exprimé sous le contrôle du promoteur précoce de virus de la vaccine, à savoir p. (voir ci-dessous) localisé dans le fragment Hindlll B de la vaccine. En utilisant une mutagénèse spécifique au point de vue site, un site IMI a été introduit en changeant la séquence CGC (bases 192-194) (fig. 21) dans pPRV gplll en ATG et un site Xbal a été introduit en changeant la séquence GTGACGT en TTCTAGA (bases 1632-1638) (fig. 21). A cet effet, de l'ADN simple brin a été engendré à partir du plasmide pPR17 en utilisant un phage d'aide R408 (Stratagène, La Jolla, CA) (185). La mutagénèse digirée vers le site a été réalisée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques phosphorylatés purifiés, à savoir MRSYN5 et MRSYN6.
îi£il
KRSYN5 5 ' GCGAGCGAGGCCATGCATCGTGCGAATGGCCCC 3*
Xbal
KRSÏN6 5' GGGGGGACGCGCGGGTCTAGAÄGGCCCCGCCTGOCGG 3'
puis on a effectué une sélection sur la souche CJ236 de iL Coli dut ung (IBI, New Häven, CT) (17, 186).
Ces mutations ont engendré le plasmide pPR28. Ce plasmide pPR28 a été digéré par Nsil et Xbal et traité avec un nucléase de fève de Mung. Un fragment de 1140 bp a été purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites Bglll-Hpal de pSDA78VC (fig. 20 et 24) après traitement avec la nucléase de fève de Mung et CIAP. Le plasmide pPR24 a-été transfecté dans des cellules infectées par le virus de la vaccine pour engendrer les recombinants du virus de la vaccine vP604, vP644, vP681 et vP692 contenant le gène de PRV gplll (voir ci-dessous).
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PRV gp50 a été manipulé pour être exprimé sous le contrôle d'un promoteur de virus de la vaccine précoce/intermédiaire, à savoir I3L (187). En utilisant une mutagénèse spécifique quant au site, on a introduit un site Nsil en changeant la séquence CCTGCCAGCGC (bases 177-187) (fig. 23) dans gp50 en ATGCATTTAAT et on a introduit un site Bglll en changeant la séquence CCTCCGCAGTACCGG aux bases 1404-1418 (fig. 23) en AAl l l l lATAGATCT. Des procédures décrites précédemment (17, 185, 186) de mutagénèse ont été utilisées pour engendrer le plasmide pPR29 à partir de pPR22 en utilisant des oligonucléotides synthétiques phosphorylatés purifiés MRSYN13 et MRSYN 13 (fig. 22).
Nsil
KRSYN12 5'GGTTCCCATACACTCAATGCATTTAATCATGCTGCTCGCAGCGC 3'
SoIII
MRSYN13 5'GCAGCCCGGTCCGTAGAATTTTTATAGATCTCGTCGATGATGATGGT 3'
pPR29 a été digéré par Nsil. traité avec ia nucléase de fève de Mung et partiellement digéré par Baalll pour engendrer un fragment de 1290 bp. Le plasmide pMP13PP (fig. 22, 25) a été digéré par EcoRI et traité par la nucléase de fève de Mung et ensuite par BamHI pour engendrer un fragment de 140 bp contenant le promoteur I3L de la vaccine. Les fragments de 1290 et 140 bp ont été purifiés à partir de gel d'agarose et liés au site Bglll phosphatasé de pMP409DVC (fig. 4, 22). Le plasmide résultant pPR26 a été utilisé en recombinaison pour produire Les recombinants du virus de la vaccine vP591, vP621, vP691 et vP692 contenant le gène gp50 (voir ci-dessous).
Construction de recombinants de la vaccine exprimant les glycoprotéines gpll.
gplll et gp50 de PRV. individuellement ou en combinaisons
En vue d'établir l'immunogénéicité et la contribution relative des trois glycoprotéines de PRV (gpll, gplll et gp50) pour la protection des animaux immunisés contre l'attaque par PRV virulent, on a construit une série de recombinants de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines de PRV seules ou en combinaison.
En se référant maintenant à la fig. 24, le virus recombinant de la vaccine, à savoir vP533, exprimant le gène de beta-galactosidase a été construit comme suit: Une région de 1 kb dans le fragment B par Hindlll de la vaccine enjambant la jonction Sali F/l du génome de Copenhague contient une homologie d'ADN avec le gène hémorragique (ji) du poxvirus de la vache (cow poxvirus) (188) comme déterminé par l'analyse par Southern blot (189). Le gène p code un polypeptide présentant une similarité avec les inhibiteurs de sérine protéase et est biologiquement responsable pour la formation de pustules hémorragiques par le virus sur la membrane chorioallantoique. La séquence d'ADN du génome de Copenhague a révélé que l'équivalent du gène n contient des mutations multiples de déplacement de cadre et était biologiquement non fonctionnel. Le plasmide pSD419VC (184) (fig. 24) contient la portion de gauche de la région fi. Le plasmide pSD422VC, qui contient le fragment I par Sali de Copenhague coloné dans pUC8, contient lé restant de la région n. Pour éliminer les séquences de vaccine non désirées vers la gauche, pSD419VC a été digéré par Ncol et Smal. doté d'une terminaison franche par un fragment de Klenow de £. Coli polymérase et re-lié, ce qui a donné le plasmide pSD476VC (fig. 24). Le plasmide pSD422VC a été digéré par Hpal et Nrul et on a isolé à partir d'un gel d'agarose un fragment d'environ 0,3 kb localisé immédiatement à la droite de la région p.. Ce fragment a été lié en pSD476VC, coupé par Hincll (qui reconnaît les sites Sali), ce qui a donné le plasmide pSD477VC. Pour exprimer la béta-galactosidase sous le contrôle de la région de promoteur n de la vaccine de Copenhague, on a préparé des oligonucléo tides synthétiques 22mer/20mer. La séquence de 22mer/20mer avec les sites de restriction indiqués etle codon d'initiation ATG souligné est la suivante:
Clal Hpal
22mer 5* CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3'
2Omer 3' TAATGATACTTCCTAGGCAA 5'
Le mélange 22mer/20mer ayant subi un traitement de réforme («annealed») a été lié en pSD477VC, digéré par £jal et Hincll. ce qui a donné le nouveau plasmide pSD479VC (fig. 24). Un fragment BamHI de 3,1 kb contenant les séquences de codage pour la béta-galactosidase de £. Coli a partir de pMC1871 (34) exempt de codon d'initiation et de promoteur a été lié en pSD479VC et coupé par BamHI. Le plasmide résultant, contenant le gène lacZ dans l'orientation convenable sous le contrôle du promoteur n de Copenhague, a été appelé pSD479VCBG. Le plasmide donneur d'insertion a été recombiné en virus de la vaccine vP410 (184). Un virus recombinant de la vaccine a été identifié sur la base de la formation de plaque bleue en présence d'un substrat chromogène, X-gal (9, 24) cloné sur plaque et appelé vP533 (fig. 24).
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Pour construire un plasmide vecteur pour l'insertion de gènes étrangers, on a préparé des oligonucléotides synthétiques 42mer/40mer
Clal Bolli Sacl Smal Xhol BamHI Hpal 42mer 5' CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGGATCCGTT 3'
4 Omer 3' TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCCTAGGCAA 5'
Le mélange 42mer/40mer soumis à un traitement de réforme (annealing) a été lié en pSD477VC coupé par dal et Hinclll. ce qui a donné le nouveau plasmide pSD478VC (fig. 24). Le plasmide contient environ 0,3 kb de séquences de la vaccine de chaque côté de la région de multiclonage qui remplace complètement la région de codage n de la souche Copenhague de la vaccine. On a utilisé pSD478VC pour engendrer pPR24 (fig. 20) contenant des séguences de codage de PRV gplll et des recombinants de la vaccine vP604, vP644, vP691 et vP692.
En se référant maintenant à la fig. 25, le plasmide pMP419 contient un fragment BamHI de 850 bp du fragment I par Hindlll de la vaccine contenant le promoteur I3L inséré dans le site BamHI de pUC8 (fig. 25). L'élément promoteur I3L correspond à des séquences d'ADN en amont du cadre de lecture ouvert I3L dans le fragment I par Hindlll de la vaccine (187) et a été utilisé précédemment pour exprimer les gènes étrangers dans des recombinants du virus de la vaccine (27, 190). On a linéarisé pMP419 au site unique dal dans les séquences de codage I3L et on l'a soumis à une digestion par Bal 31 suivie d'une digestion par EcoRI et formation d'une extrémité franche par traitement avec le fragment de Klenow de la £. Coli polymérase. Le plasmide résultant, à savoir pMP419-5 (fig. 25), contient les séquences du promoteur I3L en amont du nucléotide - 8 connecté à un site EcoRI. L'élément promoteur a été isolé en tant que fragment EcoRI-Mspl de pMP419-5 et inséré dans pUC13C digéré par EcoRI-Clal. un dérivé de pUC13 contenant un agent de liaison dal au site Smal. Le plasmide résultant, à savoir pMP13PP (fig. 22 et 25), contient les séquences du promoteur I3L de la position - 126 jusqu'à la position - 8 suivies par un site EcoRI en position - 8.
On a inséré PRV gp50, entraîné par le promoteur I3L de la vaccine, dans le vecteur plasmide de suppression M2L, à savoir pMP409DVC (fig. 4), ce qui a donné pPR26 (fig. 22). On a utilisé pPR26 pour engendrer les recombinants de la vaccine vP591, vP621, vP691 et vP692.
Isolement de virus recombinant de la vaccine
Des virus recombinants de la vaccine contenant les gènes de PRV ont été identifiés et purifiés comme décrit cidessus. Les virus recombinants de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines gpll, gplll et gp50 de PRV, soit seules soit en combinaison sont énumérés dans le Tableau 7
Tableau 7
Désignation des virus recombinants de la vaccine exprimant les glycoprotéines gpll, gplll et gp50 de PRV
Recombinant
Parent
Plasmide donneur
Glycoprotéine de PRV
vP534
vP425
pPR18
g"
vP591
vP458
pPR26
gp50
vP604
vP533
pPR24
gin
VP621
vP534
pPR26
gli + gp50
vP644
vP604
pPR18
gli + glll vP691
vP604
pPR26
glll + gp50
VP692
VP644
pPR26
gli + glll + gp50
Evaluation in vitro des alvcoprotéines de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine
Les glycoprotéines gpll, gplll et gp50 de PRV sont des glycoprotéines typiques associées à la structure membraneuse des cellules infectées par PRV et sont de plus des constituants du virus. Des anticorps monoclonaux spécifiques anti-gpll, anti-gplll et anti-gp50 suivis par IgG anti-souris caprin, conjugué à la fluoresceine, ont donné une forte immuno-fluorescence de surface sur des cellules infectées par des virus recombinants de la vaccine, mais non sur des cellules infectées par le virus de souche sauvage de la vaccine.
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Evaluation in vivo du potentiel immunogéniaue des glycoprotéines qdII. gplll et ap50 de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine chez les souris et les cochons
En vue d'établir Pimmunogénicité relative des trois glycoprotéines de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine, on a inoculé des souris dans le coussinet de pied au moyen de 50 à 100 ul de doses différentes des virus recombinants. 14 jours après immunisation, les souris ont été soumises à une attaque avec 10 LDso de la souche virulente de Kojnock de PRV par la route interpéri-tonéale. Dans des expériences préliminaires, chacune des glycoprotéines de PRV s'est révélée efficace pour protéger des souris inoculés contre une attaque par PRV virulent. Dans une série plus étendue d'expériences utilisant plus de 500 souris, on a établi l'efficacité des recombinants de la vaccine exprimant des glycoprotéines de PRV. La dose de vaccination capable de protéger 50% des souris soumises à l'attaque (PDso) a été calculée et les résultats de cette étude sont donnés dans le Tableau 8. Le virus recombinant de la vaccine exprimant individuellement les protéines gpll, gp50 et gplll de PRV engendre ies valeurs calculées PDso de 6,4, 5,4 et 5,8 (logio), respectivement. Lorsque les glycoprotéines sont exprimées en combinaison, on a calculé des valeurs nettement meilleures pour PDso. La vaccine recombinante exprimant gpll + gp50 de PRV a donné une valeur PDso de 3,3, et la vaccine recombinante exprimant gp50 + gplll de PRV a donné une valeur PDso essentiellement similaire (3, 6). Apparemment, le recombinant exprimant les glycoprotéines gpll + gplll de PRV est plus efficace, un PDso de 1,5 étant obtenu. La coexpression de toutes les trois glycoprotéines gpll, gplll et gpso de PRV dans un virus recombinant de la vaccine ne donne pas une valeur PDso plus faible d'une manière significative que celles obtenues avec des virus recombinants exprimant ies trois glycoprotéines de PRV individuellement. L'efficacité potentialisée obtenue avec la vaccine recombinante exprimant gpll et gplll comparée au virus recombinant de la vaccine exprimant les gènes individuellement est similaire aux résultats rapportés dans l'Exemple 6 pour la coexpression des glycoprotéines gp13 et gp14 du virus de l'herpès chevalin.
Tableau 8
Puissance des recombinants du virus de la vaccine exprimant les glycoprotéines gp50, gpll et gplll du virus de la pseudo-rage
Virus recombinant Gènes de PRV exprimés PDso
VP534
gpii
6,4
VP591
gp50
5,4
vP604
gplll
5,8
vP621
gpll + gp50
3,3
VP644
gpll + gplll
1,5
VP691
gp50 + gplll
3,6
vP692
gp50 + gpll + gplll
5,1
Bien que la souris puisse fournir un système modèle intéressant pour évaluer l'immunogénicité des glycoprotéines de PRV, principale espèce constituant une cible pour le vaccin contre PRV est le cochon. C'est pourquoi, en vue d'établir la validité de l'approche du virus recombinant de la vaccine chez le cochon, on a effectué l'expérience suivante. Des porcelets d'environ 25 kg ont été inoculés intra-musculairement au moyen de 2 ml de recombinant de la vaccine exprimant des combinaisons des glycoprotéines gpll, gplll et gp50 de PRV. L'inoculum de virus a été dilué dans PBS. 35 jours après cette inoculation, les porcelets ont été soumis à une attaque, par injection intranasale (1 ml dans chaque narine), d'une suspension d'isolat NIA3 de PRV virulent. L'efficacité de la vaccination a été évaluée en mesurant le gain de poids comparatif des porcelets vaccinés et des porcelets de contrôle pendant 7 jours après l'attaque. Le gain de poids relatif est calculé en tant que gain en poids (en pourcentage) moyen journalier observé chez les cochons vaccinés moins le gain en poids (en pourcentage) moyen journalier des cochons de contrôle non vaccinés. Le gain normal en poids des cochons dans des conditions non perturbées est plus grand que 1,1 kg. Comme démontré par les données du Tableau 9, l'évolution du poids pendant la période de 7 jours suivant l'attaque par PRV est grandement améliorée chez les porcelets vaccinés par rapport au groupe de contrôle inoculé avec le virus de souche sauvage. Une seule inoculation avec les recombinants du virus de la vaccine donne une protection significative contre la perte de poids après l'attaque par PRV virulent.
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Tableau 9
Evaluation des recombinants de la vaccine exprimant des combinaisons de glycoprotéines gp50, gpll et gplll de PRV chez les Porcelets
Virus d'inoculum
Gènes de PRV exprimés
Dose de vaccination logio TCID5o/ml
Gain de poids relatif vP452
Aucun
107.7
-0,31
vP621
gpll + gp 50
107.7
2,89
vP644
gpll + gplll
107,7
2,15
vP691
gp50 + gplll
107.7
1,21
VP692
gp50 + gpll + gplll
107.7
2,67
La disponibilité de recombinants du virus de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines dominantes de PRV, individuellement ou en combinaison, offre un certain nombre d'avantages pour le contrôle des infections par PRV sur le terrain: (a) un avantage important est le fait que les virus recombinants de la vaccine, en tant qu'agents de vaccination, expriment seulement un nombre limité de gènes de PRV et donc il n'y a pas de risque concommittant de réversion d'une souche de vaccin de PRV atténué vers une forme virulente et donc il n'y a pas d'introduction continue du virus PRV dans l'environnement; (b) étant donné que seulement un nombre limité d'antigènes de PRV sont exprimés par les candidats de vaccin de PRV à base des virus recombinants de la vaccine, ceci permet de discriminer les animaux vaccinés d'une part et les animaux naturellement infectés d'autre part, étant donné que les réactifs de diagnostic consistant en d'autres antigènes de PRV peuvent être réunis pour discriminer entre les animaux vaccinés et les animaux naturellement infectés; (c) de tels vaccins recombinants pourraient être utiles pour rompre la transmission verticale naturelle de PRV de la truie à sa descendance. Ceci pourrait être réalisé par la vaccination de la truie enceinte par un virus recombinant de la vaccine exprimant un jeu discret de glycoprotéines de PRV. L'immunité maternelle devrait protéger la descendance de l'infection par PRV. A son tour, la descendance pourrait être vaccinée avec un virus recombinant de la vaccine exprimant toutefois une configuration différente d'antigènes de PRV, distincts de ceux utilisés pour vacciner la truie. Ceci est un moyen potentiel de passer outre l'immunité maternelle. Une autre approche pour traiter le problème de l'immunité maternelle consisterait à exprimer les glycoprotéines de PRV dans une combinaison quelconque dans un vecteur complètement hétérologue. Ceci est réalisé par la construction de recombinants du poxvirus aviaire exprimant les glycoprotéines de PRV. L'utilité des recombinants du poxvirus aviaire, dont le domaine de réplication chez l'hôte est (d'une manière naturelle) restreint à l'espèce aviaire (oiseaux), a été démontrée lors de la vaccination des espèces non-aviaires (41). Ainsi, deux approches sont disponibles pour traiter le problème de la barrière fournie par l'immunité maternelle: (1 ) les vecteurs et (2) la constellation des antigènes exprimés par ces vecteurs.
Exemple 11
VECTEURS DF POX AVIAIRE f A VI POX) EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE nnll HU VIRUS DE LA PSEIJDO-RAGE
Le poxvirus du canari a été propagé sur des fibroblastes primaires d'embryons de poulets (CEF) dérivés d'œufs embryonnaires âgés de 10 à 11 jours obtenus de SPAFAS, Inc., (Norwich, CT) en utilisant les conditions décrites précédemment (41, 42). Le virus a été purifié des contaminants de la cellule d'hôte par centrifugation sur un gradient de sucrose en utilisant la méthode décrite par Joklik (191). Les cellules de rein de cochon (PK-1) ont été obtenues de l'American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC n° CL101).
Construction d'un recombinant du poxvirus du canari exprimant la glycoprotéine gpll du virus de la pseudo-rage
En se référant maintenant à la fig. 26, on a utilisé le plasmide pPR15 (fig. 18) comme source de gène de PRVgpll. Pour isoler le segment d'ADN contenant tout le gène de PRVgpll, on a digéré pPR15 par EcoRV et Hindlll. Un fragment d'approximativement 2,8 kb, contenant 21 bp d'extrémité 3' du promoteur H6 du virus de la vaccine (VV) et la totalité du gène de PRVgpll, a été engendré par cette digestion. On a isolé le fragment EcoRV/Hindlll de 2,8 kb pour insertion dans pFPCV2 (fig. 8, 26).
Le fragment EcoRV/Hindlll de 2,8 kb (défini ci-dessus) a été inséré dans un fragment de pFPCV2 de 8,0 kb dérivé de la digestion complète par Hindlll et de la digestion partielle par EcoRV. La ligation de ces deux fragments a résulté dans la formation d'un piasmide de 10,8 kb appelé pFPPRVIl.
En se référant maintenant à la fig. 27, on a utilisé le plasmide pFPPRVIl pour engendrer un fragment
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Nrul/Hindlll de 2,8 kb pour insertion dans pCPCVI (fig. 9). Le plasmide pCPCVI contient le promoteur H6 de VV au site unique EcoRI dans le fragment génomique Pvull CP de 3,3 kb. Ce plasmide d'insertion permet l'insertion de gènes étrangers au locus C3 du génome CP. Le plasmide pCPCVI a été digéré par Nryl et Hindlll et le fragment de 5,8 kb a été isolé pour ligation au fragment de 2,8 kb défini ci-dessus. Le plasmide résultant a été appelé pCPPRVII.
On a inséré le marqueur sélectabie dominant, £. Coli xanthineguanine phosphoribosyl transferase (Eco gpt). dans pCPPRVII comme moyen de sélection de croissance pour des recombinants de CP/ PRVgpll. Des rapports antérieurs ont décrit l'utilisation de Eco gpt comme un marqueur sélectabie dans la production de recombinants de poxvirus (193, 194). Le gène Eco gpt a été obtenu à partir du plasmide pSV2gpt (ATCC n°37145). Le fragment Balll/Dral de 670 bp, contenant le gène 20 Eco gpt. a été isolé de ce plasmide et inséré dans le site Bglll/Smail de pSD486VC. Le plasmide résultant, à savoir pGPT-1, contient le gène de Eco gpt entre les bras de flanc du gène de VV n et sous la régulation transcriptionnelle du promoteur n. Le plasmide pSD486VC a été dérivé de pSD478VC (fig. 24) de la manière suivante. On a digéré pSD478VC par EcoRI dans MCR, rempli par la réaction classique de Klenow en présence de dNTP (0,5 mM chacun) et re-lié pour produire pSD478EVC. Ce plasmide a été digéré par Hpal et BamHI et les oligonucléotides ayant subi un traitement de réforme (annealed) HEM 5 (5'-GATCCGATTCTAGCT-3') et HEM 6 (5-AGCTAGAATCG-3') ont été insérés pour produire pSD486VC.
La digestion de pGTP-1 par Ncol et EcoRI a libéré un fragment de 1,0 kb contenant le gène de l'Eco gpt (670 bp) et le promoteur de VV n (330 bp). Les extrémités Ncol et EcoRI ont été rendues franches en utilisant un fragment de Klenow de l'E. CM ADN polymérase en présence de 0,5 mM dNTP. On a ajouté des agents de liaison ou adaptateurs de jonction (linkers) Hindlll (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) aux fragments à extrémité franche. L'ADN a été digéré par Hindlll et le fragment de 1,0 kb récupéré à partir d'un gel d'agarose. Ce fragment Hindlll de 1,0 kb a été ensuite inséré au site Hindlll de pCPPRVII. Le plasmide résultant contenant les gènes de Eco gpt et PRVgpll, lié en une configuration queue à queue, a été désigné pCPPRVII gpt. Ce plasmide a été utilisé dans des expériences de recombinaison jn vitro pour insertion au locus C3 du génome CP. La sélection de recombinants contenant le gène de Eco aPt a été faite en présence de 100 [ig/ml d'acide mycophénolique et les recombinants de Eco gpt-positifs ont été ensuite liés pour détecter la présence du gène de PRV gpll par analyses d'hybridation sur plaques. Les plaques positives Eco gpt et PRV gpll ont été purifiées dans trois cycles d'isolation de plaques et des populations pures cultivées pour obtenir un titre plus élevé et ont été appelées pCP55. Les analyses par Southern blot ont confirmé que ces deux gènes sont en vérité génétiquement connectés dans ces recombinants de CP. Le recombinant de CP a été désigné vCP55.
Immuno-fluorescence de cellules infectées par vCP55
Des études d'immuno-fluorescence ont été effectuées pour démontrer la localisation cellulaire de PRV gpll exprimé dans des cellules infectées par vCP55. Des cellules de CEF ou PK-1 ont été ensemencées sur des plaquettes en verre de 22 mm dans des boîtes de 35 mm à une densité de 5 x 105 cellules par boîte. Les cellules de CEF et PK-1 ont été infectées soit avec vCP55 soit avec le virus parental de CP et on a réalisé des infections et des incubations pour le test d'immuno-fluorescence comme décrit dans l'Exemple 1, en utilisant l'anticorps monoclonal 75N10, dilué à 1 % dans PBS+.
Les cellules infectées ont été analysées pour l'expression à la fois interne et de surface. On n'a observé aucune expression de surface significative de gpll ni dans l'un ni dans l'autre des systèmes de cellules infectées par vCP55. L'expression interne du produit de gène de gpll s'est toutefois révélée à la fois dans les cellules de CEF infectées par vCP55 et dans les cellules de PK-1 infectées par vCP55. Les signaux de fluorescence interne dans les deux types de cellules étaient localisés dans des granules de la région périnuciéaire des cellules infectées. Ces résultats suggèrent que le PRVgpll exprimé par CP est transmis au complexe de Golgi mais non pas à la membrane du plasma. Ce résultat diffère des résultats avec le gpll exprimé par le virus de la vaccine qui a été détecté sur la surface des cellules infectées.
Immuno-précipitation de PRVgpll à partir de cellules infectées de CEF et PK-1
L'expression du produit de gène de PRVgpll par vCP55 a été analysée par immuno-précipitation à partir de lysats de cellules infectées. Des monocouches de cellules ont été infectées à 5 PFU/cellule. Le test d'immuno-précipitation a été réalisé comme décrit dans l'Exemple 1, en utilisant l'anticorps monoclonal 75N10.
L'espèce prédominante de polypeptide précipitée avec le sérum de lapin anti-PRV des cellules infectées de CEF et PK-1 a migré avec des poids moléculaires apparents d'environ 120 kDa, 67 kDa et 58 kDa. Ces poiypeptides représentent la forme de précurseur et la forme traitée protéolytiquement, respectivement, de PRVgpll dans les cellules infectées par PRV qui sont complexées par des liaisons di-sulfures (86, 101, 196). Des espèces moins importantes avec des poids moléculaires apparents d'environ 26 kDa ont également été observées et peuvent refléter des événements de traitement protéolyti-que plus complet de gpll dans ces cellules infectées par CP/PRV recombinant. Aucun polypeptide
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équivalent n'a précipité de cellules infectées par le virus CP de contrôle et les lysats de cellules non infectées.
Etudes de protection
La capacité de vCP55 de provoquer une réponse immunitaire protectrice contre l'attaque de PRV vivant a été analysée dans le système de la souris. On a inoculé des souris dans leurs coussinets de pied au moyen d'échantillons de 50 ul à 100 ul contenant des doses variées de VCP55 indiquées dans le Tableau 10. Quatorze jours après l'immunisation, les souris ont reçu 16 LD50 de la souche Kojnock de PRV par la voie intrapéritonéale. On a compté les survivants 14 jours après l'attaque, moment auquel l'expérience a été arrêté. Comme montré dans le Tableau 10, l'inoculation de souris au moyen d'une seule dose de 106'85 TCID50 a protégé 8 souris sur 10 d'une attaque mortelle par PRV. Les doses inférieures de vCP55 qui ont été essayées n'ont fourni aucun niveau de protection. L'attaque avec PRV vivant a tué 7 souris non vaccinées sur 8. A partir des résultats présentés dans le Tableau 10, on a calculé une PD50 (dose protectrice à 50%) égale à 106.16 pour le vCP55 recombinant
Tableau 10
Efficacité de vCP55 chez la souris
Dose logioTCID5o
Protection
6,85
8/10
4,85
0/10
2,80
0/10
0,85
0/10
L'efficacité de vCP55 comme agent immunisant contre l'attaque par PRV vivant a également été évaluée chez l'espèce cible, à savoir le porcelet. 15 porcelets pesant environ 25 kg ont été séparés en trois groupes. Le groupe vCP55 et le groupe de virus parental CP ont reçu chacun deux inoculations (2 ml égalant 2 x 108 TCID50) aux jours 0 et 28 par la voie intramusculaire. 5 porcelets ont été laissés comme animaux de contrôle non vaccinés. On a administré à tous les porcelets la souche NIA3 pathogène de PRV par voie intra-nasale au jour 35. On a surveillé l'efficacité en comparant l'évolution du poids des cochons vaccinés au vCP55 et de contrôle pendant les 7 jours qui ont suivi l'attaque. L'évolution en poids est calculée en tant que valeur Delta GMQR (en kilogrammes) = moyenne GMQR % des porcelets vaccinés - moyenne GMQR % des porcelets non vaccinés.
Dans le groupe non vacciné, tous les porcelets ont succombé à l'attaque par le virus PRV (deux le jour 5, deux le jour 6 et un le jour 7). Dans le groupe inoculé par le virus de souche sauvage (CP), quatre des cinq porcelets ont succombé à l'attaque (trois au jour 6, un au jour 7). Tous les porcelets dans le groupe vacciné par vCP55 ont survécu à l'attaque par PRV et ont prospéré.
On a observé des niveaux significatifs de protection chez les porcelets inoculés au moyen de vCP55 exprimant la glycoprotéine de PRVgpll contre l'attaque par PRV vivant (Tableau 11). Les animaux vaccinés par vCP55 ont montré un gain en poids net et significatif pendant toute la période expérimentale, alors que les deux groupes de contrôle ont manifesté une perte de poids significative pendant ia période qui a suivi l'attaque par PRV. En outre, on n'a observé aucune mort dans le groupe vacciné par vCP55, alors que l'on a noté une mortalité de 80% à 100% dans les groupes de contrôle après l'attaque par PRV vivant.
Tableau 11
Protection des porcelets vaccinés (par vCP55) contre l'attaque par PRV, comme déterminée par la mortalité et le gain en poids
Traitement
Mortalité
Gain en poids
Non vaccinés
5/5
-2,12
Souche sauvage (CP)
4/5
+0,61
Recombinant (vCP55)
0/5
+2,51
Exemple 12
Recombinants de la vaccine exprimant les alvcoprotéines PRV al
La souche de Copenhague du virus de la vaccine et les recombinants qui en dérivent ont été utilisés dans cet exemple.
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Clonage du gène de PRVgl dans les Plasmides donneurs du pox du canari et du virus de la vaccine
En se référant maintenant à la fig. 28, un plasmide pGPI, contenant le gène pRVgl (souche NIA3) a été obtenu de Rhône-Mérieux, Lyon, France. Le gène gl [référence de la séquence (80)] a été isolé de ce plasmide et cloné en aval du promoteur H6 synthétique de la vaccine (69). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Xhol-Ncol (partiel) de 2330 bp de pGPI dans le fragment Xhol-Ncol de 6400 bp de pGBC2. (pGBC2 a été obtenu en clonant le gène de HSV2 gb dans le fragment Bolli de 3200 bp de pRW764.5, qui à son tour a été construit par clonage d'un fragment Pvull de 0,8 kb de l'ADN du pox du canari dans le fragment Pvull de 2360 bp de pVC18). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPG12.
Le codon d'initiation ou d'amorçage du promoteur H6 a été alors aligné avec le codon d'amorçage du gène de gl. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides
PRVL5 5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTC-3'
et PRVL6
5-CTGCGCGGCGCGCAGCAGAAAGGGCCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3'
dans le fragment EcoRV-AlwNI (partiel) de 5900 bp de pPGI2. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPGI3.
On a ensuite éliminé les séquences étrangères PRV gl 3'-non codantes. Ceci a été réalisé en clonant les oliqonucleotides, PRVL3 5-CTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGA-
ATGGGCCCAACTATGGCGTGACCGCCAGCCGCCTGTTGAATGCCCGCCCCGCTTAACTGC
AGAATTCGGATCCGAGCT-3'
et PRVL4
5'-CGGATCCGAATTCTGCAGTTAAGCGGGGC-
GGGCATTCAACAGGCGGCTGGCGGTGGAGCATAGTTGGGCCCACTTCCGGTT TCTCCGGATCGCGAACCAGACGT-3'
dans le fragment Sacl-Aatll (partiel) de 5200 bp de pPG!3. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPGI6.
Le gène de gl promu par H6 a été ensuite cloné dans le plasmide donneur du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment Nrul-BamHI de 1750 bp de pPGI6 dans le fragment Nrul-BamHI de 5000 bp de pBP14. (pBP14 contient le gène gag du virus de la leucémie bovine sous le contrôle du promoteur H6 synthétique de la vaccine dans le plasmide vecteur de la vaccine pSF494VC, ce dernier étant un sous-clone du fragment A par Hindlll du virus de la vaccine de Copenhague, dans lequel la séquence de codage du gène de la vaccine contenant une homologie avec le gène ATI du cowpox (pox de la vache) (210) est remplacé par une région de polyliaison ou polyjonction). Ceci place le gène de gl promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine (de Copenhague) qui flanquent le gène ATI. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPG17.
On a engendré le virus recombinant de la vaccine, vP717, en transfectant bpG17 dans des cellules infectées par vP410.
Construction de vP717
Le gène gl de PRV a été cloné dans un vecteur de virus de la vaccine. La statégie utilisée pour construire ce virus recombinant de la vaccine, vP717, est montré sur la fig. 28. Le gène de PRVgl contenu dans vP717 est cloné entre les séquences du virus de la vaccine qui flanquent le gène ATI et utilise le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41, 42, 69).
Immuno-fluorescence du polypeptide codé par PRV sur les cellules infectées par vP717
Dans des cellules infectées par PRV, gl est exprimé sur la membrane du plasma. Des analyses par immuno-fluorescence de cellules infectées par vP717 avec un anticorps monoclonal spécifique du PRV gl, à savoir 42M17, indiquent que le polypeptide codé par PRV produit dans ces cellules est également exprimé sur la membrane de plasma.
Evaluation de vP717 chez les souris
L'évaluation in vivo de vP717 chez les souris a indiqué une certaine protection contre l'attaque par PRV (Tableau 12) en utilisant les procédures standard.
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Tableau 12
Evaluation du virus recombinant de la vaccine vP717 exprimant PRV gpl chez les souris
Dose d'inoculation de
Survivance contre l'attaque vP717 logio TCID50
par PRV
7,3
4/10
5,3
5/10
3,3
0/10
1,3
2/10
Exemple 13
EXPRFSSION DFfi GLYCOPROTEINES DV VIRUS DE L'HERPES SIMPLEX. A SAVOIR nB. oC ET oD. DANS LFS RECOMBINANTS DU VIRUS DE LA VACCINE. SOIT INDIVIDUELLEMENT. SOIT EN COMBINAISONS
Le HSV2 (souche G) (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) (ATCC n° VR734) utilisé dans cet exemple a été développé sur des cellules de VERO (ATCC n°CCL81) et purifié par centrifugation sur un gradient de sucrose (197).
Clonage du nfene HSV2 gB dans des plasmides donneurs du virus de la vaccine
La séquence de nucléotides du gène HSV2 gB a été précédemment publié (116). En se référant maintenant à la fig. 29, un fragment Bglll de 12 kb contenant le gène HSV2 gb a été isolé à partir de l'ADN génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site BamHI de pUC19 en engendrant le plasmide pJ4.
Le gène gB a été ensuite cloné entre les bras de flancs du virus de la vaccine (de Copenhage). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Sstll-Sacl (partiel) de 2700 bp de pJ4 dans le fragment Sstll-Sacl de pMP409DVC3 (pMP409DVC3 est un dérivé de pMP409DVC (184) (fig. 4) dans lequel le site Balli est remplacé par une région de polyliaison). Ceci place le gène gB entre les séquences de la vaccine qui flanquent le gène de M2L. Le plasmide engendré par cette 25 manipulation est appelé pGB1.
Un codon de terminaison dans le cadre a été ensuite ajouté à l'extrémité 3' du gène gB. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides GBL3 5'-CTAATAG-3' et GBL4 5'-GATCCTATTAGAGCT-3' dans le fragment BamHI-Sacl (partiel) de 6300 bp de pGB1. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pGB2.
Le promoteur H6 a été ensuite cloné en amont du gène de gB. Ceci a été réalisé en clonant le frag-mant ßglll de 370 bp de pBLVH14, contenant le promoteur H6, dans le site Bglll de pGB2 (pBLVH14 contient le gène de l'enveloppe du virus de la leucémie bovine promu par H6 dans le locus de suppression HA de la vaccine). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGB3.
Le codon d'initiation ou amorçage du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gB. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucélotides GBL1 5'-
ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGCGGGGGGGGCTTGATTTGCGCGCTGGTCGTGGGGGCGCTG
GTGGCCGC-3'
et GBL2
d5'-GGCCACCAGCGCCCCCACGACCAGCGCGCAAATCA AGCCCCCCCCGCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3'
dans le fragment SstlI-EcoRV (partiel) de 6300 bp de pGB3. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pGB5. Dans le plasmide pGB5, le gène HSV gB est sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine inséré au locus de suppression M2L de la vaccine. Etant donné que le locus d'insertion M2L est situé dans une plus grande région du génome qui peut être supprimé, le gène gB promu par H6 a été cloné dans un site d'insertion différent dans un plasmide donneur différent du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment BglII-BamHI de 2800 bp de pGB5 au site Bglll de pSD513VCVQ. (pSD513VCVQ est un sous-clone du fragment J par Hindlll du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage pour le gène de thymidine kinase (TK) a été remplacé par une région de polyliaison). Ceci place le gène gB promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine qui flanquent le gène TK. Le plasmide produit par cette manipulation est appelé pGB6.
Clonage du gène de HSV2 gC dans des Plasmides donneurs du virus de la vaccine
La séquence de nucléotides du gène HSV2 gC a été déterminée précédemment (117). En se référant maintenant à la fig. 30, un fragment Sali de 2900 bp contenant le gène HSV2 gC a été isolé à
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partir de l'ADN génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site Sali de plBI25 en engendrant le plasmide pGC3.
Le gène gC a été ensuite cloné entre les bras de flancs du virus de la vaccine (de Copenhague). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Xhol-BamHI de 2900 bp de pGC3 au site Xholl-BamHI de pGC2. pGC2 a été produit-en clonant le fragment Bglll de 370 bp de pBLVH14, contenant le promoteur H6 du virus de la vaccine, dans le site Ëglll de pSD486VC. Ce dernier est un sous-clone du fragment B par Hindlll du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage du gène ji est remplacé par une région de polyliaison. Ceci place le gène gC entre la séquence du virus de la vaccine qui flanque le gène n. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGC5.
Le codon d'initiation du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gC. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides GCL1
5-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCCTTGGACGGGTGGGCCTAGCCGTGGGCCTGTG3'
et GCL2
5' -AGGCCCACGGCTAGGCCCACCCGTCCAAGGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3'.
dans le fragment Nrul-Sfil de 5400 bp de pGC5. Le plasmide produit par cette manipulation est appelé
pGC10.
La séquence étrangère 3'-non codante a été ensuite éliminée de pGC10. Ceci a été réalisé en recir-cularisant le fragment Sall-Smal (partiel) de 4900 bp, traité par la È. Coli ADN polymérisase (fragment de Klenow), de pGC10. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGC11.
Une séquence supplémentaire 3'-non codante a été ensuite éliminé de pGC11. Ceci a été réalisé en clonant l'oligonucléotide GCL3 5-CTAGGGCC-3' dans le fragment Xbal-Apal (partiel) de 4900 bp de pGC11. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pGC12. Dans ce plasmide pGC12, le gène HSV gC est sous le contrôle du promoteur H6 inséré au locus d'insertion ji de la vaccine. Etant donné que le locus d'insertion n est localisé à l'intérieur d'une région plus large du génome qui peut être supprimée, le gène gC promu par H6 a été cloné dans le site d'insertion ATI dans le plasmide donneur du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment Nrul-BamHI de 1550 bp de pGC12 dans le fragment Nrul-BamHI de 5000 pb de pBP14. Ceci place le gène gC promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine (de Copenhague) qui flanquent le gène ATI. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGC13.
Clonage du gène HSV2 gD dans les plasmides donneurs du virus de la vaccine
La séquence de nucléotides pour le gène HSV2 gD a été déterminée précédemment (118). En se référant maintenant à la fig. 31, un fragment Xbal de 7,5 kb contenant le gène HSV2 gD a été isolé de l'ADN génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site Xbal de plBI25 en engendrant le plasmide pGD1.
On a ensuite cloné le gène gD en aval du promoteur H6 et entre les bras qui flanquent le virus de la vaccine (de Copenhague). Ceci a été accompli en clonant le fragment Dral-Pstl de 1500 bp de pGD1 dans le site Smal-Pstl de pTP15 (184) (fig. 3). Ceci place le gène gD en aval du promoteur H6 et entre les séquences de virus de la vaccine qui flanquent le gène HA. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD2.
Le codon d'initiation ou amorçage du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gD. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides, GDLI 5-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGGCGTTTGACCTCCGG-3'
et GDL2
5-CGCCGGAGGTCAAACGCCCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3',
dans le fragment EcoRV-Ahall (partiel) de 5100 bp de pGD2. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD5.
On a ensuite éliminé la séquence étrangère 3'-non codante. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides GDL3
5-GGCAGTACCCTGGCGGCGCTGGTCATCGGCGGTATTGCGTTTTGGGTACGCCGCCGGCGC TCAGTGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCCCCCTCG CACCA-GCCATTGTTTTACTAGCTGCA-3'
et GDL4
5-GCTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAGGGGGGCGCGTCGTCATCCCGGATGTGGGGGAGAC GTAGGCGCTTGGGGGCCACTGAGCGCCGGCGGCGTACCCAAAACGCAATACCGCCGATGA CCA-GCGCCGCCAGGGTACTGCC-3'.
dans le fragment Nael-Pstl de 4800 bp de pGD5. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD7.
On a ensuite ajouté une séquence additionnelle 5' au promoteur H6. Ceci a été réalisé en clonant le fragment BglII-EcoRV de 150 bp de pGBG (fig. 30) dans le fragment Balll-EcoRV de 4800 bp de pGD7. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD8.
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Construction de virus recombinants de la vaccine
La statégie utilisée pour cloner les gènes HSV2 gB, gC et gD dans le virus de la vaccine est illustrée sur les fig. 29, 30 et 31, respectivement. Toutes les constructions utilisent le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41, 42, 184). Chaque gène HSV2 est cependant cloné dans un site différent dans le génome du virus de la vaccine. Le gène gB promu par H6 est cloné entre la séquence flanquant le gane M2L (vP569) ou la séquence flanquant le gène TK (vP734, vP775 et vP776). Le gène gC promu par H6 est cloné entre la séquence qui flanque le gène n (vP579) ou la séquence flanquant le gène ATI (vP748, vP776 et vp777). Le gène gD promu par H6 est cloné entre la séquence qui flanque le gène HA (vP570, vP761, vP775 et vP777). Le virus recombinant de la vaccine vP569 a été engendré en transfectant pGB5 dans des cellules infectées par vP458. vP734 a été produit en transfec-tant pGB6 dans des cellules infectées par vP618. vP579 a été produit en transfectant pGC11 dans des cellules infectées par vP533. vP748 a été produit en transfectant pGC13 dans des cellules infectées par vP618. vP570 a été produit en transfectant pGD5 dans des cellules infectées par vP425. vP761 a été produit en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP618.
VP425 est un variant du virus de la vaccine sauvage (de Copenhague) dont on a supprimé le gène TK et dont le gène HA a été remplacé par la béta-galactosidase (Exemple 1) (184). vP458 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont on a supprimé le gène TK et dont le gène M2L a été remplacé par la béta-galactosidase (Exemple 2). vP533 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont le gène TK a été supprimé et dont le gène n a été remplacé par la bétagalactosidase. vP618 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont les gènes TK, n et ATI ont été supprimés.
Le virus recombinant de la vaccine contenant deux gènes de glycoprotéines HSV2 a été également construit. vP755 contient les gènes gB et gD, vp776 contient les gènes gB et gC et vP777 contient les gènes gC et gD. vP775 a été produit en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP734. vP776 a été engendré en transfectant pGC13 dans des cellules infectées par vP734. vP777 a été engendré en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP748.
Un virus recombinant de la vaccine contenant trois gènes de glycoprotéines HSV2 a été également construit. vP812 contient les gènes gB, gC et gD de HSV2. vP812 a été engendré en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP776.
Immuno-fluorescence des glycoprotéines de HSV2 dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
Dans des cellules infectées par HSV2, on a exprimé gB, gC et gD (aussi bien que d'autres glycoprotéines codées par HSV2) sur la membrane du plama. Des études d'immunofluorescence réalisées sur des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant des gènes de HSV2 indiquent que les poiypeptides de HSV2 produits dans les cellules infectées par ces virus recombinants de la vaccine sont également exprimés sur la membrane du plama.
Immuno-orécipitation des glycoprotéines de HSV2 dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
La glycoprotéine HSV2 gB produite dans des cellules infectées par HSV2 présente un poids moléculaire d'environ 117 kDa (198, 199). Des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant le gène de HSV2 gB (vP569, vP734, vP775 et vP776) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 117 kDa. L'immuno-précipitation de cellules infectées par vP569 avec des anti-sérums vis-à-vis de virus HSV2 entier précipite deux protéines principales ou majeures avec des poids moléculaires d'environ 117 kDa et 110 kDa et trois protéines mineures avec des poids moléculaires de 50 kDa, 45 kDa et 30 kDa. L'immuno-précipitation de cellules infectées par vP734, vP775 et vP776 précipite deux protéines majeures avec des poids moléculaires d'environ 110 kDa et 90 kDa et cinq protéines mineures avec des poids moléculaires d'environ 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa et 30 kDa.
La glycoprotéine HSV2 gC produite dans les cellules infectées par HSV2 a un poids moléculaire d'environ 63 kDa (199, 200). Les cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant le gène HSV2 gC (vP579, vP748, vP776 et vP777) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 63 kDa. L'immunoprécipitation de cellules infectées par vP579, vP748, vP776 et vP777 au moyen d'anti-sérums au virus HSV2 entier précipite une protéine majeure avec un poids moléculaire d'environ 65 kDa et une protéine mineure avec un poids moléculaire d'environ 85 kDa. Les anti-sérums de lapin contre le virus HSV2 entier ont été obtenus de la DAKO Corporation (Santa Barbara, CA; code n° B116) et utilisés à une dilution de 1:100.
La glycoprotéine HSV2 gD produite dans les cellules infectées par HSV2 ont un poids moléculaire d'environ 51 kDa (198, 199). Des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant HSV2 gD (vP570, vP761, vP775 et vP777) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 51 kDa. L'immuno-précipitation des cellules infectées par vP570, vP761, vP775 et vP777 au moyen d'anti-sérums du virus HSV2 entier précipite une protéine majeure
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ayant un poids moléculaire d'environ 48 kDa et deux protéines mineures avec des poids moléculaires d'environ 40 kDa et 31 kDA.
Evaluation in vivo
Tous les virus recombinants de la vaccine exprimant les différentes constructions des glycoprotéines de HSV2 protègent des souris immunisées contre l'attaque ultérieure de HSV mortel dans des expériences analogues à celles décrites par Paoletti si al. (26).
Exemple 14
FXPRFSSION PF I A Ol YCOPROTEINF gl DLJ VIRUS 1 DE L'HERPES BOVIN DANS DFS RFCOMBINANTS DU VIRUS DE LA VACCINE
Clonage du gène BHV1 gl dans des Plasmides donneurs du virus de la vaccine
La séquence de nucléotides du gène BHV1 gl a été publiée antérieurement (63). En se référant maintenant à la fig. 32, un plasmide plBRS6 contenant le gène BHV1 gl (souche de Straub) a été obtenu de Rhône Mérieux, Lyon, France. L'extrémité 5' du gène gl a été clonée en aval du promoteur H6 (41, 42, 69) et entre les bras qui flanquent le virus de la vaccine (de Copenhague). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Sall-Pstl de 540 bp de plBRS6 dans un fragment Sall-Pstl de 4400 bp de pGD5 [pGD5 a été engendré en clonant le gène HSV2 gD dans pTP15 (184) (fig. 3)]. Ceci place le gène gl en aval du promoteur H6 et entre les bras qui flanquent le virus HA de la vaccine. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé plBR2.
Le codon d'initiation du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gl. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides, IBRL1 5'-
ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTGAACGCGCCGC-3 et IBRL2 5'-
GGCGCGTTCAGCACCGCCGCGAGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3',
dans le fragment Nrul-Sstll de 3800 bp de pIBR2. Le plasmide engendré par cette manipulation a été
appelé plBR4.
Un site Ncol. nécessaire pour des manipulations futures, a été engendré. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides IBRL3 5'-CCATGGTTTAATGCA-3' et IBRL4 5'- TTAAACCATGGTGCA-3' dans le site Esîl de plBR4. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé plBR5.
L'extrémité 3' du gène gl a été ensuite clonée dans plBR5. Ceci a été réalisé en clonant le fragment Tth111l-Ncol de 1740 bp de plBRS6 dans le fragment Tth111l-Ncol de 3700 bp de plBR5. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé p!BR7.
Un site BqIII, nécessaire pour de futures manipulations, a été ensuite engendré. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides IBRL5 5-CATGGTTTAAGATCTC-3' et IBRL6 5-CATGGAGATCT-TAAAC-3' dans le site Ncol de plBR7. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé plBR8.
Une portion de la séquence leader hydrophile de grande longueur du gène gl a été ensuite supprimée (63). Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides, IBRL7
5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCGCTAGCCGCTGCCCTGCTATGGGCGACGTGGGCC-3' et IBRL8
5'-CACGTCGCCCATAGCAGGGCAGCGGCTAGCGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3',
dans le fragment Nrul-Apal (partiel) de 4400 bp de pIBR8. Ceci a élimine 132 bp de la séquence de tête hydrophile. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé plBR9.
Le gène gl tronqué promu par H6 a été ensuite cloné dans un plasmide donneur différent du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment Nrul-Bglll de 1700 bp de plBR9 dans le fragment Nrul-BamHI de 4900 bp de pBP14 (211). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé plBR10.
Construction de virus recombinant de la vaccine
La statégie utilisée pour cloner le gène BHV1 gl dans le virus de la vaccine est illustrée sur la fig. 32. Le virus recombinant de la vaccine vP637 a été engendré en transfectant plBR7 dans des cellules infectées par vP410. vP724 a été engendré en transfectant plBR10 dans des cellules infectées par vP410. vP637 contient la totalité du gène BHVI gl. vP724 contient un gène gl dont on a supprimé 132 bp de la séquence de signal 5' (63). Les deux constructions utilisent le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41, 42, 184). Le gène gl dans vP637 est cloné entre les séquences qui flanquent le gène HA. Le gène gl dans vP724 est cloné entre les séquences qui flanquent le gène ATI.
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Immuno-fluorescence et détection d'un polypeptide codé par BHV1 dans des cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine
Dans des cellules infectées par BHV1, gl est exprimé sur la membrane du plasma. Des études d'immuno-fluorescence de cellules infectées par vP637 ou vP724 indiquent que le polypeptide codé par BHVI produit dans ces cellules est également exprimé sur la membrane du plasma. L'immunofluores-cence a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1. Les anticorps monoclonaux de BHV1 spécifiques à gl, à savoir 4203 et 5106, ont été utilisés (210).
Exemple 15
EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE oB DU VIRUS DE L'HERPES FELIN DANS UN VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE
La souche WR du virus de la vaccine (202) a été utilisée dans cet exemple. Le virus vP293 de la vaccine recombinante dérivé de la souche de WR a été utilisé comme virus de sauvetage (69).
Extraction de l'ADN de FHV-1 et clonage du fragment Sacl-Sacl de 3.2 kb de FHV-1
On a extrait et purifié l'ADN de FHV-1 à partir de la souche C O. Le génome de l'ADN de FHV-1 a été digéré par EcoRI et lié au plasmide pBR322 en utilisant les procédures classiques (20). On a trié cette banque de FHV-1 au moyen de sondes d'ADN dérivées des gènes de PRVgll (62) et de BHV-1 gB (203). Des hybridations subséquentes, au moyen de sous-clones dérivés des deux clones EcoRI trouvés positifs par hybridation, ont permis d'établir une carte plus précise du gène FHV-1 gB. Un fragment Sacl-Sacl de 3,2 kb contenant le gène FHV-1 gB a été cloné dans pUC18, ce qui a engendré le plasmide pFHVgBC.
Séauencaoe du fragment de Sacl-Sacl codant FHV-1 gB
Les données de la séquence de nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de pFHVgBC et de sousclones dérivés de pFHVgBC en utilisant une séquenase T7 modifiée comme décrit ci-dessus.
Clonage du aène de FHV-1 gB dans un Plasmide donneur du virus de la vaccine
En se référant maintenant à la fig. 33, le gène de FHV-1 gB a été cloné en pHES4, un des plasmides conçus pour le système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte dans la souche WR du virus de la vaccine (69) (fig. 10). Ce plasmide porte le gène KIL du domaine de l'hôte, qui permet au mutant de suppression vP293 de se répliquer sur des cellules humaines. Le gène FHV-1 gB a été inséré immédiatement en aval du promoteur H6 synthétique de la vaccine (69). Le plasmide pFHVgBC a été digéré par Kpnl et Sacl et le fragment de restriction de 3150 bp contenant FHV-1 gB a été isolé à partir d'un gel d'agarose, puis lié dans le plasmide pHES4 préalablement digéré par Kpnl et Sacl. Le plasmide résultant a été appelé pJCA001 (fig. 33).
Analyse de la séquence d'ADN du gène de FHV-1 gB
En se référant maintenant à la fig. 34, l'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert s'étendant des positions de nucléotide 337 à 3177. Des signaux putatifs de régulation transcrip-tionnelle ont été trouvés dans la région depuis 5' jusqu'au codon d'initiation ATG en position 337. Une boîte TATA ayant la séquence AAATATAT (nucléotides 184 à 191) a été localisée 80 nucléotides en aval d'une boîte putative CAT ayant la séquence GGTGAGTA. Un signal de polyadénylation AATAAA (nucléotides 3251 à 3256) a été localisé 50 nucleotides en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 3178 à 3180). Huit parmi les onze nucléotides de la séquence 5' TCATTCTAGCA 3' (nucléotides 200 à 210) sont complémentaires de la séquence d'ARN ribosomal 18S, 3' AGGAAGGCGT 5' (61), et peuvent servir comme site de fixation pour le ribosome. Un modèle de balayage a été proposé par lequel mARN eukaryotique amorce ia traduction (151, 155). Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé ATCATGT (nucléotides 334 à 340) qualifie celui-ci comme contexte de séquence fonctionnelle pour l'initiation de la traduction du mARN eukaryotique. Le cadre de lecture ouvert de FHV-1 gB code 947 acides aminés avec un poids moléculaire de 106,2 kDa. La teneur en G + C est de 45,8%.
Analyse de la structure de la protéine FHV-1 oB
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 23 à 73 présente un
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profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour être la séquence de signal (fig. 34). En se référant maintenant à la fig. 35, on constate qu'il y a une séquence hydrophile longue de 22 acides aminés qui précède la séquence de signal hydrophobe de grande longueur. Cette caractéristique a également été notée pour le gène gli de la pseudo-rage (PRV) (62), pour le gène gl du virus 1 de l'herpès bovin-1 (BHV-1), pour le virus de l'herpès chevalin-1 (EHV-1) (71), et les gènes gp 14 du virus de l'herpès chevalin-4 (EHV-4) (72), tous étant également des homologues de HSV gB. Une région hydrophobe constituée par 42 acides aminés (acides aminés 789 à 831 ) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Le domaine cytoplasmique hydrophile contient 116 acides aminés. Il existe dix sites Asn-X-Thr/Ser (où X peut être tout acide aminé sauf la proline) pour une glycosyiation potentielle à liaison par l'azote (64), un site étant localisé dans la séquence de signal, li y a deux sites de coupure protéolytiques potentiels consécutifs et voisins (Arg-Arg-Ser) (positions 504 à 506 et 516 à 518) identiques à ceux présents dans PRVgll (94), VZV gpll et HCMV gB (71) et EHV-1 gp14 (71, 72). Le profil d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de FHV-1 gB est illustré sur la fig. 35.
Comparaison de la séquence d'acides aminés de FHV-1 aB avec les glycoprotéines d'autres cellules du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés du gène de FHV-1 gB a révélé une homologie étendue avec les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, FHV-1 gB est homologue à PRVgll (62), BHV-1 gl (63), gli du virus de la varicelle zoster (VZV) (66, 204), HSV-1 gB (67), HSV-2 gB (205), EHV-1 gp14 (71), aussi bien qu'avec les glycoprotéines du virus d'Epstein-Barr (EBV) (68, 206) et du cytomégalovirus humain (HCMV) (10).
Construction du recombinant de la vaccine vP713 exprimant ta glycoprotéine de FHV-1 gB
Les séquences codant FHV-1 gB ont été insérées dans un vecteur du virus de la vaccine utilisant le système de sélection du domaine de réplicabilité chez l'hôte du virus de la vaccine WR, à savoir pHES4/vP293 (69). La capacité de la descendance de la vaccine recombinante engendrée par recombinaison, en utilisant le système de sélection du domaine de réplicabilité chez l'hôte vP293/pHES du virus de la vaccine WR, pour former des plaques sur des cellules MRC-5 humaines permet une identification rapide de ces recombinants (69). Le virus recombinant de la vaccine vP713 a été obtenu par recombinaison réalisée avec ie plasmide pJCA001 comme plasmide donneur et vP293 comme virus de sauvetage (fig. 33).
Immuno-fluorescence de la glycoprotéine FHV-1 gB synthétisée par vP713
L'immuno-fluorescence de cellules de VERO et MRC-5 infectées par le virus recombinant de la vaccine vP713 a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant du sérum de brebis spécifique anti-FHV-1 gB, sérum n° 2854. On a utilisé plusieurs infections de deux pfu par cellule. On a utilisé comme second anticorps IgG de mulet anti-ovins, FITC.
FHV-1 gB est détectable sur la surface des cellules de VERO infectées au moyen de la vaccine recombinante vP713, aussi bien qu'intérieurement après fixation par l'acétone. Aucune immuno-réactivité, interne ou de surface, significative vis-à-vis de FHV-1 gB n'a été constatée dans les cellules de contrôle infectées par vP410.
Immuno-précipitation de glycoprotéine FHV-1 gB synthétisée par vP713
En vue d'établir la glycoprotéine de FHV-1 gB 25 exprimée par vP713, des cellules de VERO ont été infectées par vP713 et les protéines ont été marquées métaboliquement par la 35S méthionine. On a réalisé des immuno-précipitations au moyen de lysats de cellules marquées radio-activement en utilisant un sérum ovin n° 2854 spécifiquement anti-FHV-1 gB.
Des monocouches de cellules de VERO, ensemencées au taux de 2 x 106, par boîtes de 60 mm, ont été infectées, à une faible multiplicité d'infection de 0,1 pfu par cellule, avec le virus de contrôle (vP410) ou le virus recombinant de la vaccine vP713. Des immuno-précipitations ont été réalisées comme décrit dans l'Exemple 1.
Aucun produit significatif n'a été immuno-précipité par le sérum spécifique anti-FHV-1 gB soit chez les cellules de VERO non infectées, soit chez les cellules de VERO infectées avec le virus de ia vaccine de contrôle vP410. Les produits marqués radio-activement de FHV-1 gB ont été précipités par le sérum n° 2854 à partir de cellules de VERO infectées par vP713. Cinq poiypeptides dominants, métaboliquement marqués, ont été spécifiquement précipités. Les deux plus grands poiypeptides, de poids moléculaire apparent de 115 kDa et 110 kDa, pourraient correspondre au précurseur non-glycosylaté et aux protéines matures (dimensions théoriques respectivement de 106 kDa et 98 kDa). Une large bande de 68 kDa pourrait représenter les deux sous-unités glycosylatés (69 kDa + 66 kDa) résultant de la coupure protéolytique d'un précurseur glycosylaté (136 kDa) qui manquent ici. Trois produits précipités
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de plus faible dimension (59, 53 et 48 kDa) ne correspondent à aucun produit de FHV-1 gB et peuvent représenter des produits de dégradation.
Exemple 16
CLONAGE ET EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE DU VIRUS D'EPSTEIN-BARR DANS DES VFOTEURS DE POXVIRUS
Clonaçie des pênes de EBV pp340 et gp220 dans un plasmide donneur de vaccine pMP409DVC
Dans cet exemple, les gènes de EBV ont été isolés de la souche de B95-8 de EBV (207); les gènes gp340 et gp220 étaient des clones de cADN (plasmides pMLPgp340 et pMLPgp220, respectivement) et les gènes de gB, gH et BBRF3 ont été isolés à partir d'une banque de gènes BamHI. En se référant maintenant à la fig. 36, un fragment Xmal-Clal de 2100 bp du plasmide pMLPgp220 a été cloné dans M13mp18 digéré par Xmal-Accl. Le phage obtenu par cette manipulation a été appelé mp18gp220 (fig. 36). Par mutagénèse in vitro (17) en utilisant les oligonucléotides CM4 (TAAAGTCAATAAATTTTTATTGCGGCCGCTACCGAGCTCGAATTCG)
et CM5
(GCTTGCATGCCTGCAGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGCAGCCTTGC)
le gène gp220 a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide contenant le gène gp220 modifié a été appelé mp18gp220 (5+4) (fig. 36).
Le gène gp220 modifié a été cloné dans le plasmide SP131Notl qui contient la totalité du promoteur synthétique H6 (69). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Narl-EcoRV de 2300 bp de mp18gp220 (5+4) dans le fragment EcoRI-Narl de 2940 bp du plasmide SP131Notl. Le plasmide résultant a été appelé SP131gp220 (fig. 36).
Le gène gp340 sous le contrôle du promoteur H6 a été obtenu en clonant un fragment Scal-Xhol de 2360 bp de pMLPgp340 dans le plasmide SP131gp220 digéré par Xhol-Scal (partiel). Le plasmide résultant a été appelé SP131gp340 (fig. 36).
Les gènes gp340 et gp220 promus par H6 ont été clonés dans le locus d'insertion M2L du virus de la vaccine du plasmide pMP409DVC (fig. 4; sur les fig. 36 et 40, ce plasmide est appelé MP409). Ceci a été réalisé en clonant le fragment Noti du plasmide SP131gp340, fragment traité par la nucléase de fève de Mung et ayant 2800 bp, et le fragment Noti du plasmide SP131gp220, fragment traité par la nucléase de fève de Mung et ayant 2100 bp, dans le plasmide pMP409DVC au site Balli traité par la nucléase de fève de Mung. Les plasmides résultants ont été appelés 409H6340 et 409H6220, respectivement (fig. 36).
Clonage du gène de EBV aB dans le plasmide donneur du virus de la vaccine PMP409DVC
En se référant maintenant à la fig. 37, un fragment EcoRI-Xmnl de 3500 bp du fragment A d'ADN par BamHI. contenant le gène EBV gB, a été isolé à partir de ia librairie génomique de EBV et cloné dans le fragment Hincll-EcoRI de 2837 bp de plBI25. Le plasmide résultant a été appelé p25gB (fig. 37).
Par mutagénèse in vitro (17, 185) en utilisant les nucléotides EBVBM5 (CCCTACGCCGAGTCATTACGATACAAACTTAACGGATATCAG AGT CGTACGTAGG)
et EBVBM3
(CTGGAAACACTTGGGAATTCAAGCTTCATAAAAAGGGTTATAGAAGAGTCC),
le gène gB a été adapté pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide résultant a été appelé p25gB (5 + 3).
Le fragment EcoRV-EcoRI de 2600 bp de p25gB (5+3) a été cloné dans le fragment EcoRV-EcoRI de 3300 bp de SP131. Le plasmide résultant a été appelé SP131gB (fig. 37).
Le gène gB du promoteur H6 a été ensuite cloné dans le plasmide donneur pMP409DVC du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment Hindlll de 2700 bp traité par la nucléase de fève de Mung, dans le site Bgill traité par la nucléase de fève de Mung, de pMP409DVC. Le plasmide résultant a été appelé 409H6gB (fig. 37).
Clonage du gène EBV gH dans le plasmide donneur de vaccine PSD486VC
Dans la librairie des fragments de restriction clonés de EBV BamHI. le cadre de lecture ouvert de BXLF2 est contenu dans les fragments BamHI X et BamHI T (207). Comme montré sur la fig. 38, le cadre de lecture ouvert complet de BXLF2 a été reconstitué en clonant le fragment Smal-BamHI de 830 bp de BamHI X dans le fragment Smal-BamHI de 2880 bp de piBI24; le plasmide résultant a été appelé 24gH5. Le fragment BamHI-Hindlll de 1850 bp de BamHI T a été cloné dans le fragment BamHI-Hindlll de 3360 bp de 24gH5. Le plasmide résultant, contenant le gène gH complet, a été appelé 24gH (fig. 38).
Par mutagénèse in vitro (17, 185) en utilisant les nucléotides HM5 (ACACAGAGCAACTGAGATCTCCCGATTTCCCCTCT),
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HM4 (GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCTGCG)
et HM3 (GCCAGGGTTTTCCCAGAGATCTGATAAAAACGACGGCCAGTG)
le gène gH a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur précoce hémorragique (n) de la vaccine. L'oligonucléotide HM4 a été utilisé pour enlever un signal d'arrêt de transcription précoce de la vaccine contenu dans ie gène gH (45). Le plasmide contenant le gène gH modifié a été appelé 24gH (5+4+3).
En se référant maintenant à la fig. 38, le promoteur ji de la vaccine est contenu dans le plasmide pSD486 VC (fig. 30). (Sur la fig. 38, ce plasmide est appelé SD486). Le fragment Bglll de 2330 bp, traité par la nucléase de fève de Mung, de 24gH (5+4+3) a été cloné dans le fragment Bglll traité par la nucléase de fève de Mung, de pSD486VC. La dernière phase de clonage a mis le gène gH sous le contrôle du promoteur p. de la vaccine. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 486gH (fig. 38).
Clonage du cadre de lecture ouvert de BBRF3 dans le plasmide donneur du virus de la vaccine pCOPSC-5H
Le cadre de lecture ouvert complet BBRF3 est contenu dans le fragment BamHI B de l'ADN de EBV. Ce fragment a été digéré par BspHI. traité par la £. Coli ADN polymérase I (fragment de Klenow) et digéré par Bglll. Le site Ëglll dans le fragment BamHI A est disposé 10 bases avant le codon d'arrêt de BBRF3. Le fragment BspHI-BglIl de 1230 bp a été isolé et cloné dans le fragment Smal-Bglll de 4200 bp du plasmide pCOPCS-5H. [Le plasmide pCOPCS-5H est identique au plasmide pCOPCS657 (fig. 16)]. Le plasmide engendré par cette manipulation est désigné COPSCEBVX.
Clonage des gènes EBV gp340. gB et gH dans le plasmide donneur du virus de la vaccine pSD513VCVO
Le plasmide donneur de virus de la vaccine utilisé pour engendrer le triple recombinant EBV est le plasmide pSD513VCVQ (fig. 29). Ce plasmide contient un sous-clone du fragment Hindlll J du virus de la vaccine de Copenhague dans leguel la séquence de codage pour le gène de thymidine kinase est remplacée par une région de polyliaison.
Dans cette première phase, le gène gH de EBV promu par ji, a été cloné dans pSD513VCVQ. En particulier, le fragment SmaBl-BglII de 2300 bp a été cloné dans le fragment SmaBl-BglII de 4000 bp de pSD513VCVQ. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 513UgH.
Ensuite, le gène EBV gp340 promu par H6 a été cloné dans 513gH. En particulier, le fragment Noti de 2800 bp, traité par la nucléase de fève de Mung, de SP131gp340 a été cloné dans le fragment Xhol-Pstl de 6300 bp, traité par la nucléase de fève de Mung, de 513UgH. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 513UgH340H6.
Puis, le gène gB de EBV promu par H6 a été cloné dans 513UgH340H6. En particulier le fragment Hindlll de 2700 bp, traité par la nucléase de vève de Mung, de SP131gp340 a été cloné dans le fragment Bglll de 9100 bp„ traité par la nucléase de fève de Mung, de 513UgH340H6. Le plasmide résultant a été appelé 513gHgBp340 (fig. 39).
Construction de virus recombinant de la vaccine
EBV gp340 (plasmide donneur 409H6340), EBV gp220 (plasmide donneur 409H6220) et EBV gB (plasmide donneur 409H6gB) ont été recombinés dans le virus de la vaccine vP458 (site M2L): ces virus recombinants simples (single) de la vaccine ont été appelés vP474, vP480 et vP561, respectivement. EBV gH (plasmide donneur 486gH) a été recombiné dans le virus de la vaccine vP533 (site d'insertion (i): ce virus recombinant de la vaccine simple a été appelé vP611.
Finalement, le virus recombinant triple de la vaccine contenant gp340, gB et gH a été obtenu par recombinaison du plasmide donneur 513gHgBgp340 dans le virus de la vaccine vP617 au site d'insertion de thymidine kinase. Ce virus recombinant est appelé vP712. vP617 est un virus de la vaccine de Copenhague dont on a supprimé les gènes TK, HA et ATI.
Immuno-fluorescence des protéines d'EBV dans les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
Des études d'immuno-fluorescence réalisées sur des cellules infectées par vP474 (gp340) et vP480 (gp220), en utilisant l'anticorps monoclonal F29-89 (165), ont révélé des protéines de EBV gp340 et EBV gp220 exprimées sur la membrane du plasma.
Les cellules infectées par vP611 (gH), en utilisant un sérum humain, ont révélé un faible signal positif sur la membrane du plasma.
Finalement, la même expérience a été réalisée avec des cellules infectées par vP712 (triple recombinant de la vaccine EBV): un signal positif sur la membrane du plasma a été obtenu avec les anticorps monoclonaux F29-89 et NEA 9247 (spécificité gB obtenue de DuPont).
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Immuno-précipitation des protéines EBV dans les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
La glycoprotéine gp340 de EBV produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire d'approximativement 340 kDa (165). Les cellules infectées par les virus recombinants de la vaccine vP474 ou vP712 produisent également une protéine codée par EBV d'environ 340 kDa (immuno-préci-pitation réalisée avec l'anticorps monoclonal F29-89). La glycoprotéine gp220 de EBV a un poids moléculaire de 220 kDa (165). Les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP480 produisent une protéine codée par EBV d'approximativement 220 kDa.
La glycoprotéine gH de EBV produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire de 110 kDa à 125 kDa avec une forme de précurseur de 93 kDa (206, 208). Les cellules infectées avec les virus recombinants de la vaccine vP561 ou vP712 produisent une protéine principale d'EBV avec un poids moléculaire d'approximativement 125 kDa et quatre protéines mineures avec des poids moléculaires d'approximativement 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa et 45 kDa.
La glycoprotéine EBV gH produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire de 85 kDa avec une forme de précurseur de 70 kDa (209). Les cellules infectées par le virus recombinant vP611 produisent une protéine codée par EBV d'approximativement 85 kDa.
Immunisation de lapins au moven de recombinants de la vaccine exprimant les glycoprotéines de EBV
Des lapins ont été immunisés au moyen de vP474 (gp340) ou vP480 (gp220) ou vP561 (gB) ou vP611 (gH) ou vP712 (triple). Après un rappel, les sérums ont été testés par immuno-fluorescence sur des cellules B95-8 traitées par TPA. Des signaux positifs ont été obtenus dans chaque cas. Une activité de neutralisation in vitro a été démontrée en utilisant des sérums dressés contre vP474 (gp340).
Exemple 17
CLONAGF FT EXPRESSION DES ANTIGENFS DE GLYCOPROTEINE DU CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN DANS DES VECTEURS DE POXVIRUS
Clonage du gène HCMV gB dans le Plasmide donneur de la vaccine pMP409DVC
En se référant maintenant à la fig. 40, le fragment Hindlll-BamHI de 4800 bp du fragment Hindlll D de HCMV ADN a été cloné dans le fragment HindlH-BamHI de 2800 bp du plasmide plBI24. Par mutagénèse in vitro (17, 185) en utilisant les nucléotides CMVM5 (GCCTCATCGCTGCTGGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAATCCAGGATCTG)
CMVM3 (GACAGATTGTGATTTTTATAAGCATCGTAAGCTGTCA),
le gène HCMV gB a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide contenant le gène MCMV gB modifié a été appelé 24CMVgB (5+3) (fig. 40).
Ensuite, on a cloné le fragment EcoRV-BamHI de 2900 bp de 24CMVgB (5+3) dans le fragment EcoRV-BglII de 3100 bp du plasmide pSP131 qui contient le promoteur synthétique H6 (69). La phase de clonage a mis le gène HCMV gB sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide résultant a été appelé SP131gB.
Finalement, le gène HCMV gB promu par H6 a été cloné dans le plasmide donneur de la vaccine pMP409DVC. Le fragment Hindlll de 3000 bp, traité par la nucléase de la fève de Mung, de SP131gB a été cloné dans le site Bgilll traité par la nucléase de fève de Mung, de pMP409DVC. Le plasmide résultant a été appelé 409CMVgB (fig. 40).
Construction du virus recombinant de la vaccine
Le gène CMV gB, promu par H6, dans le plasmide 409CM VgB a été inséré dans le site de M2L du virus de sauvetage vP458. Le virus recombinant de la vaccine a été appelé vP525.
Immuno-fluorescence de la protéine CMV oB dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
Des études d'immuno-fluorescence sur des cellules infectées par vP525, en utilisant un anticorps monoclonal ou un sérum polyclonal de cobaye, a révélé HCMV gB exprimé sur la membrane du plasma.
Immuno-précipitation de CMV oB dans des cellules infectées par un recombinant de la vaccine
La glycoprotéine CMV gB produite dans des cellules infectées de CMV a un poids moléculaire de 55 kDa avec une forme de précurseur de 130 kDa (172). Des cellules infectées par vP525 produisent deux protéines codées par CMV gB d'approximativement 130 kDa et 55 kDa.
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Séquences de nucléotides de HXLF1 et HXLF2
La famille des gènes HXLF est localisée dans le fragment Hindlll X de l'ADN génomique HCMV (172). En utilisant des promoteurs d'oligonucléotide spécifiques, la séquence de nucléotide de HXLF1 et HXLF2 a été déterminée (fig. 41, 42). HXLF1 est long de 648 nucléotides et code pour une protéine de 215 acides aminés. HXLF2 est long de 558 nucléotides et code pour une protéine de 185 acides aminés. Les séquences de nucléotides des mêmes gènes (souche 1D169HCMV) ont été publiées (173) et des études de comparaison montrent une homologie à 99% pour HXLF1 et une homologie de 96% pour HXLF2.
Immunisation de cobaves avec recombinants de la vaccine exprimant des antigènes de HCMV
Trois cobayes ont été immunisés par vP525. Après un rappel, les animaux ont développé des anticorps neutralisants de HCMV (titre moyen: 518). De manière intéressante, 50 à 87% de l'activité neutralisante des sérums humains séropositifs HCMV peuvent être absorbés par des cellules infectées par vP525. Ce résultat indique l'importance potentielle de HCMV gB comme vaccin subunitaire.
Comme il va de soi, l'invention telle que revendiquée ci-après n'est pas limitée aux modes de réalisations décrits mais elle englobe toutes les variantes et modifications qui pourront apparaître à l'homme de l'art.
REFERENCES
1. Allen, G.P. and J.T. Bryans, In: Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, Vol. 2, ed. R. Pandey (Basel), pp. 78-144 (1986).
2. Allen, G.P., and L.D. Coogle, J. Virol. §2, 2850-2858 (1988).
3. Allen, G.P. and M.R. Yeargan, J. Virol. £1, 2454-2461 (1987).
4. Baumann, R.P., D.C. Sulivan, J. Staczek, and D.J. O'Callaghan, J. Virol. 5Z, 816-825 (1986).
5. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, B. Lomniczi, and A. Kaplan, Virology 154. 325-334 (1986).
6. Berman, P.W., D. Dowbenko, L.A. Lasky, and C.C. Simonsen, Science 222. 524-527 (1983).
7. Bertholet, C., R. Drillien, and R. Wittek, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82. 2096-2100 (1985).
8. Cantin, E.M., R. Eberle, J.L. Baldick, B. Moss, D.E. Willey, A.L. Notkins, and H. Openshaw, Proc. Nati. Acad. Sci. USA M, 5908-5912 (1987).
9. Chakrabarti, S., K. Brechling, and B. Moss, Mol. Cell. Biol. 5, 3403-3409 (1985).
10. Cranage, M.P., T. Kouzarides, A.T. Bankier, S. Satchwell, K. Weston, P. Tomlinson, B. Barrell, H. Hart, S.E. Bell, A.C. Minson, and G.L. Smith, EMBO J. 5, 3057-3063 (1986).
11. Clewell, D.B., J. Bacteriol. 11Q, 667-676 (1972).
12. Clewell, D.B. and D.R. Helinski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA S2, 1159-1166 (1969).
13. Cremer, K.J., M. Mackett, C. Wohlenberg, A.L. Notkins, and B. Moss, Science 228. 737-740 (1985).
14. Eisenberg, D., Annu. Rev. Biochem. 5S, 595-623 (1984).
15. Glorioso, J., U. Kees, G. Kumel, H. Kirchner, and P. Krammer, J. Immunol. 135. 575-582 (1985).
16. Graham, F.L. and A.J. Van der Eb., Virology 54, 536-539 (1973).
17. Kunkel, T.A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA S2, 488-492 (1985).
18. Lasky, L.A., D. Dowbenko, C.C. Simonsen, and P.W. Berman, Bio-Technology 2. 527-532 (1984).
19. Mandecki, W., Proc. Nati. Acad. Sci. USA SS. 7177-7181 (1986).
20. Maniatis, T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (1982).
21. Martin, S. and B.T. Rouse, J. Immunol. 138. 3431-3437 (1987).
22. Martin, S., B. Moss, P.W. Berman, L.A. Lasky, and B.T. Rouse, J. Virol. £1, 726-734 (1987).
23. O'Callaghan, DJ., B.E. Henry, J.H. Wharton, S.A. Dauenhauer, R.B. Vance, J. Staczek, and R.A. Robinson, In: Developments in Molecular Virology, Vol. 1, ed. Y. Decker, pp. 387-418 (1981).
24. Panicali, D., A. Grzelecki, and C. Huang, Gene 4L 193-199 (1986).
25. Panicali , D., and E. Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA Zâ, 4927-4931 (1982).
26. Paoletti, E., B.R. Lipinskas, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Nati. Acad. Sci. USA SI, 193-197 (1984).
27. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas, and E. Paoletti, Science 229. 981-984 (1985).
28. Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, Jn: Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and L. Grossman (Academic Press) pp. 545-563 (1987).
29. Pustell, J., and F.C. Rafatos, Nucleic Acids Res. 12, 643-655 (1984).
30. Rooney, J.F., C. Wohlenberg, K.J. Cremer, B. Moss, and A.L. Notkins, J. Virol. §2, 1530-1534 (1988).
31. Rosei, J.L., P.L. Earl, J.P. Weir, and B. Moss, J. Virol. SQ, 436-449 (1986).
32. Rosenthal, K.L., J.R. Smiley, S. South, and D.C. Johnson, J. Virol. SI, 2438-2447 (1987).
33. Sanger, F., S. Nicklen, and A. Coulson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).
48
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50
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60
65
CH 682 671 A5
34. Shapira, S.R., J. Chou, F.V. Richaud, and M.J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983).
35. Shida, H., Virology 15Q, 451-462 (1986).
36. Spear, P.G., Jn: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines, Immunochemistry of Viruses, Vol. 2, eds. M.H.V. Van Regenmortel and A.R. Neurath (New York), pp. 425-443 (1985).
37. Spear, P.G., Jn: The Herpesvirus, Vol. 3, ed. B. Roizman (New York), pp. 315-356 (1985).
38. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen. Virol. SS, 2587-2598 (1987).
39. Sullivan, V. and G.L. Smith, J. gen. Virol. êâ, 859-867 (1988).
40. Tabor, S., and C.C. Richardson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA S4, 4767-4771 (1987).
41. Taylor, J., R. Weinberg, B. Lanquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine S, 497-503 (1988).
42. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. Webster, and E. Paoletti, Vaccine g, 504-508 (1988).
43. Turtinen, L.W., and G.P. Allen, J. gen. Virol. S2, 481-485 (1982).
44. Wachsman, M., L. Aurelian, C.C. Smith, B.R. Lipinskas, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. Infect. Dis. 155, 1188-1197 (1987).
45. Yuen, L. and B. Moss, Proc. Nati. Acad. Sci. USA M. 6417-6421 (1987).
46. Zarling, J.M., P.A. Moran, L.A. Lasky, and B. Moss, J. Virol. 5S, 506-509 (1986).
47. Zarling, J.M., P.A. Moran, R.L. Burke, C. Pachi, P.W. Berman, and LA. Lasky, J. Immunol. 136. 4669-4673 (1986).
48. O'Callaghan, D.J., G.A. Gentry, and C.C. Randall, Jn: The Herpesviruses, Vol. 2, ed. B. Roizman (New York), pp. 215-318 (1983).
49. Ackermann, M., R. Longnecker, B. Roizman, and L. Pereira, Viroloav 150. 207-220 (1986).
50. Frink, R.J., M.R. Eisenberg, G. Cohen, and E.K. Wagner, J. Virol. 45, 634-647 (1983).
51. Frame, M.C., H.S. Marsden, and D.J. McGeoch, J. gen. Virol. §7, 745-751 (1986).
52. Longnecker, R., S. Chatterjee, R. Whitley, and B. Roizman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84. 4303-4307 (1987).
53. Richman, D.D., A. Buckmaster, S. Bell, C. Hodgman and A.C. Minson, J. Virol. 5Z, 647-655 (1986).
54. Swain, M.A., R.W. Peet, and D.A. Galloway, J. Virol, 53, 561-569 (1985).
55. Zezulak, K.M., and P.G. Spear, J. Virol. 4£, 741-747 (1984).
56. van Drunen Littel-van der Hurk, S., T. Zamb, and L.A. Babrick, J. Virol. SS. 2159-2168 (1989).
57. Perkus, M.E., D. Panicali, S. Mercer, and E. Paoletti, Virology 152. 285-297 (1986).
58. Tamin, A., E.C. Villarreal, S.L. Weinrich, and D.E. Hruby, Virology 165. 141-150 (1988).
59. Whalley, J.M., G.R. Robertson, and A.J. Davidson, J. gen. Virol. 5Z, 307-323 (1981).
60. Laemmli, U.K., Nature (London) 22Z, 680-685 (1970).
61. Hagenbuchle, O., M. Santer, J.A. Steitz, and R.J. Mans, Cell IS, 551-563 (1978).
62. Robbins, A.K., DJ. Dorney, M.W. Wathen, M.E. Whealey, C. Gold, R.J. Watson, L.E. Holland, S.D. Weed, M. Levine, J.C. Glorioso, and L.W. Enquist, J. Virol. SI, 2691-2701 (1987).
63. Whitbeck, J.C., L.Z. Bello, and W.C. Lawrence, J. Virol. £2, 3319-3327 (1988).
64. Montreuil, J., J. Biol. Cell. 51, 115-132 (1984).
65. Kyte, J., and R.F Doolittle, J. Mol. Biol. 15Z, 105-132 (1982).
66. Davison, A.J., and J.E. Scott, J. gen. Virol. SZ, 1759-1816 (1986).
67. Bzik, D.J., B.A. Fox, N.A. DeLuca, and S. Person, Virology 133. 301-307 (1984).
68. Pellett, P.E., M.D. Biggin, B.L. Barreil, and B. Roizman, J. Virol. 5S, 807-813 (1985).
69. Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. SS, 3829-3836 (1989).
70. Gillard, S., D. Spehner, R. Drillien, and A. Kirn, Proc. Nati. Acad. Sci. USA SS, 5573-5577 (1986).
71. Whalley, J.M., G.R. Robertson, N.A. Scott, G.C. Hudson, C.W. Bell, and L.M. Woodworth, J. gen. Virol. ZQ, 383-394 (1989).
72. Riggio, M.P., A.A. Cullinane, and D.E. Onions, J. Virol. SS, 1123-1133 (1989).
73. Glorioso, J., C.H. Schröder, G. Kumel, M. Szczesiul, and M. Levine, J. Virol. 5Q, 805-812 (1984).
74. Wachsman, M., L. Aurelian, J.C.R. Hunter, M.E. Perkus, and E. Paoletti, Bioscience Reports S, 323-334 (1988).
75. Wachsman, M., J.H. Luo, L. Aurelian, M.E. Perkus, and E. Paoletti, J. gen. Virol. 7Q, 2513-2520 (1989).
76. Sinclair, R., R.F. Cook, and J.A. Mumford, J. gen. Virol. ZQ, 455-459 (1989).
77. Shimizu, M., K. Satou, and N. Nishioka, Arch. Virol. 104. 169-174 (1989).
78. Stokes, A., G.P. Allen, L.A. Pullen, and P.K. Murray, J. gen. Virol. ZQ, 1173-1183 (1989).
79. McGeoch, DJ., A. Dolan, S. Donald, and F.J. Rixon, J. Moi. Biol. 181. 1-13 (1985).
80. Petrovskis, E.A., J.G. Timmins, and L.E. Post, J. Virol. SQ, 185-193 (1986).
81. Wittmann, G. and H.-J. Rziha, Jn: Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, ed. G. Witt-mann (Kluwer Academic Publishers) pp. 230-325 (1989).
82. Rubenstein, A.S. and A.S. Kaplan, Virology SS, 385-392 (1975).
83. Stevely, W.S., J. Virol. 22, 232-234 (1977).
84. Ben-Porat, T., F.J. Rixon, and M.L. Blankenship, Virology 25, 285-294 (1979).
85. Ben-Porat, T. and A.S. Kaplan, Jn: The Herpesviruses, voi. 3, ed. B. Roizman (Plenum Publishing Corp., New York) pp. 105-173 (1985).
49
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 682 671 A5
86. Hampl, H., T. Ben-Porat, L. Ehrlicher, K-O. Habermehl, and A.S. Kaplan, J. Virol. 52, 583-590 (1984).
87. Ben-Porat, T. In: Organization and réplication of viral DNA, ed. A.S. Kaplan (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL) pp. 147-172 (1982).
88. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, J. Pendrys, R.A. Veach, and A.S. Kaplan, J. Virol. 5Z, 191-196 (1986).
89. Ben-Porat, T. and A.S. Raplan, Virology 41. 265-273 (1970).
90. Killington, R.A., J. Yeo, R.W. Honess, D.H. Watson, B.E. Duncan, I.W. Halliburton, and J. Hum-ford, J. gen. Virol. 3Z, 297-310 (1977).
91. Robbins, A.K., J.H. Weis, L.W. Enquist, and R.J. Watson, J. Mol. Appi. Genet. 2, 485-496 (1984).
92. Rea, T.J., J.G. Timmins, G.W. Long, and L.E. Post, J. Virol. 54. 21-29 (1985).
93. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and H.-J. Rziha, J. Virol. 53, 52-57 (1985).
94. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, H.-J. Thiel, C. Schreurs, and H.-J. Rziha, Virology 152. 66-75 (1986).
95. Petrovskis, E.A., J.G. Timmins, M.A. Armentrout, C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr., and L.E. Post, J. Virol. 5E, 216-223 (1986).
96. Robbins, A.K., R.J. Watson, M.E. Whealy, W.W. Hays, and L.W. Enquist, J. Virol. 53, 339-347 (1986).
97. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. £1, 57-62 (1984).
98. Kost, T.A., E.V. Jones, R.M. Smith, A.P Reed, A.L. Brown, and T.J. Miller, Virology 171. 365-376 (1989).
99. Mettenleiter, T.C., N. Lukacs, and H.-J. Rziha, J. Virol. 55, 307-311 (1985).
100. Lomniczi, B., S. Watanabe, T. Ben-Porat, and A.S. Kaplan, J. Virol. 52, 198-205 (1984).
101. Lukacs, N., H.-J. Thiel, T.C. Mettenleiter, and H.-J. Rziha, J. Virol. 53, 166-173 (1985).
102. Marchioli, C., R.J. Yancey, Jr., J.G. Timmins, L.E. Post, B.R. Young, and D.A. Povendo, Am. J. Vet. Res. 42, 860-864 (1988).
103. Marchioli, C.C., R.J. Yancey, Jr., R.C. Wardley, D.R. Thomsen and L.E. Post, Am. J. Vet. Res. 4£, 1577-1583 (1987).
104. Thomsen, D.R., C.C. Marchioli, R.J. Yancey, Jr. and L.E. Post, J. Virol. £1, 229-232 (1987).
105. Wathen, L.M.K., K.B. Platt, M.W. Wathen, R.A. Van Deusen, C.A. Whetstone, and E.C. Pirtle, Virus Res. 4, 19-29 (1985).
106. Eloit, M., D. Fargeaud, R. L'Haridon and B. Toma, Arch. Virol. 22, 45-46 (1988).
107. Marchioli, C.C., R.J. Yancey, Jr., E.A. Petrovskis, J.G. Timmins, and L.E. Post, J. Virol. 61. 3977-3982 (1987).
108. Ishii, H., Y. Robayashi, M. Kuroki and Y. Kodama, J. gen. Virol. 52, 1411-1414 (1988).
109. Whealy, M.E., A.K. Robbins and L.W. Enquist, J. Virol. 53, 4055-4059 (1989).
110. Wathen, M.W. and L.M.K. Wathen, J. Virol. 5S, 173-178 (1986).
111. Robbins, A.K., M.E. Whealy, M.E., R.J. Watson and L.W. Enquist, J. Virol. 52, 635-645 (1986).
112. Allen, W.P., and F. Rapp, J. Infect. Dis. 145. 413-421 (1982).
113. Bryson, Y.J., M. Dillon, M. Lovett, G. Acuna, S. Taylor, J.D. Cherry, B.L. Johnson, E. Wies-meier, W. Growdon, T. Creagh-Kirk, and R. Xeeney, N. Engl. J. Med. 308. 916-921 (1983).
114. Douglas, J.M., C. Critchlow, J. Benedetti, G.J. Mertz, J.D. Connor, M.A. Hintz, A. Fahnlander, M. Remington, C. Winter, and L. Corey, N. Engl. J. Med. 310. 1551-1556 (1984).
115. Roizman, B. and A.E. Sears, ]n: Virology, eds. Fields, B.N. and D.M. Knipe (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1795-1841 (1990).
116. Stuve, L.L., S. Brown-Shimer, C. Pachi, R. Najarian, D. Dina, and R.L. Burke, J. Virol. SI, 326-335 (1987).
117. Dowbenko, D.J., and L.A. Lasky, J. Virol. 52, 154-163 (1984).
118. Watson, R.J., Gene 25, 307-312 (1983).
119. McGeoch, DJ., H.W.M. Moss, D. McNab and M.C. Frame, J. gen. Virol. 6£, 19-38 (1987).
120. Chan, W., Immunol. 42, 343-352 (1983).
121. Davis, W.B., J.A. Taylor, and J.E. Oakes, J. Infect. Dis. 140. 534-540 (1979).
122. Oakes, J.E., and H. Rosemond-Hornbeak, InEect. Immun. 21, 489-495 (1978).
123. Balachandran, N., S. Bacchetti, and W.E. Rawls, Infect. Immun. 3L 1132-1137 (1982).
124. Oakes, J.E., W.B. Davis, J.A. Taylor, and W.W. Weppner, Infect. Immun. 22, 642-649 (1980).
125. McLaughlin-Taylor, E., D.E. Willey, E.M. Cantin, R. Eberle, B. Moss, and H. Openshaw, J. gen. Virol. 52, 1731-1734 (1988).
126. Weir, J.P., M. Bennett, E.M. Allen, K.L. Elkins, S. Martin, and B.T. Rouse, J. gen. Virol. 70. 2587-2594 (1989).
127. Gibbs, E.P.J., and M.M. Rweyemamu, Vet. Bull. 4Z, 317-343 (1977).
128. Yates, W.D.G., Can. J. Comp. Med. 45, 225-263 (1982).
129. Misra, V., R.M. Blumenthal and L.A. Babiuk, J. Virol. 42, 367-378 (1981).
130. Lawrence, W.C., R.C. D'Urso, C.A. Kundel, J.C. Whitbeck and LJ. Bello, J. Virol. 52, 405-414 (1986).
50
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 682 671 A5
131. Zamb, T. 1987, Abstract No. 330. 68th Annual Meeting of Conference of Research Workers in Animal Disease, 16 and 17 November 1987, Chicago, IL., USA.
132. Babiuk, L.A., J. L'Italien, S. van Drunen Littel-van den Hurk, T. Zamb, M.J.P. Lawman, G. Hughes, and G.A. Gifford, J. Virol. 1§2, 57-66 (1987).
133. van Drunen Littel-van den Hurk, S., and L.A. Babiuk, J. Virol. 52, 401-410 (1986).
134. Gaskel, R.M., and R.C. Povey, Res. Vet. Sci. 2Z, 167-174 (1978).
135. Povey R.C., and M.R. Wilson, Feline Practice g, 35-42 (1978).
136. Chappuis, G., C. Benoit-Jeanin, and D. Fargeaud, Jn: Develop. biol. Standard., Vol. 52, eds. M. Bonneau, and W. Hennessen, (S. Karger, Basel) pp. 485-491 (1982).
137. Saint-Gerand, A.L., Vaccine 5, 508 (1988).
138. Sarmiento, M., M. Haffey, and P.G. Spear, J. Virol. 22, 1149-1158 (1979).
139. Ruyechan, W.T., L.S. Morse, D.M. Knipe, and B. Roizman, J. Virol. 22, 677-697 (1979).
140. Pereira, L., E. Cassai, R.W. Honess, B. Roizman, M. Terni, and A. Nahmias, Infect. Immun. 13. 211-220 (1976).
141. Eberle, R., and R.J. Courtney, J. Virol. 35, 902-917 (1980).
142. Papp-Vid, G., and J.B. Derbyshire, Can. J. Comp. Med. 43, 231-233 (1979).
143. Meas, R.X., S.L. Fritsch, L.L. Herr, and P.A. Rota, J. Virol. 51 259-262 (1984).
144. Fargeaud, D., C. Benoit Jeannin, F. Kato, and G. Chappuis, Arch. Virol. SQ, 69-82 (1984).
145. Compton, T., Jn: Cell Biology of Virus Entry, Réplication, and Pathogenesis, eds. Compans, R.W., A. Helenius, and M.B.A. Oidstone (Alan R. Liss, Inc.) pp. 45-56 (1989).
146. Spatz, S.J., R.X. Meas, and C.E. Beisel, Abstracts of the 14,h International Herpesvirus Workshop (Nyborg Strand Denmark) p. 128 (1989).
147. Little, S.P., J.T. Jofre, R.J. Courtney, and P.A. Schaffer, Virology 114. 149-160 (1981).
148. DeLuca, N., D.J. Bzik, V.C. Bond, S. Person, and W. Snipes, Virology 122. 411-423 (1982).
149. Cai, W., B. Gu, and S. Person, J. Virol. 52, 2596-2604 (1988).
150. Courtney, R.J., Jn: Immunobiology of Herpes Simplex Virus Infection, eds. B.T. Rouse and C. Lopez (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.) pp. 33-44 (1984).
151. Kozak, M., Microbial Rev. 47, 1-45 (1983).
152. Pelletier, J., and N. Sonenberg, Nature 334. 320-325 (1988).
153. Rota, P.A., R.K. Maes, and W.T. Ruyechan, Virology 154. 168-179 (1986).
154. Henle, G., W. Henle, and V. Diehl, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 52, 94-101 (1968).
155. Kozak, M., Cell 44, 283-292 (1986).
156. Miller, G., Jn: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. si al- (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1921-1958 (1990).
157. Hubbard, S.C., and R.J. Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 5Q, 555-583 (1981).
158. McGeoch, DJ., M.A. Dalrymple, A.J. Davison, A. Dolan, M.C. Frame, D. McNab, L.J. Perry, J.E. Scott, and P. Taylor, J. gen. Virol. SS, 1531-1574 (1988).
159. Kieff, E., and D. Liebowitz, Jn: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. sì al. (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1889-1920 (1990).
160. Watson, R.J., J.H. Weis, J.S. Salstrom, and L.W. Enquist, Science 218. 381-384 (1982).
161. McGeoch, DJ. and A.J. Davison, Nucleic Acid Res. IQ, 4281-4292 (1986).
162. Lehner, R., H. Meyer, and M. Mach, J. Virol. 52» 3792-3800 (1989).
163. Biggin, M., P.J. Farrell, and B.G Barrell, EMBO. J. 3, 1083-1090 (1984).
164. Beisel, C., J. Tanner, T. Matsuo, D. Thoriey-Lawson, F. Kezdy, and E. Kieff, J. Virol. 54. 665-674 (1985).
165. Qualtiere, L.F., J.F. Decoteau, and M. Hassan Nasr-el-Din, J. gen. Virol. fig, 535-543 (1987).
166. Epstein, M.A., A.J. Morgan, S. Finerty, B.J. Rändle, and J.K. Kirkwood, Nature 318. 287-289 (1985).
167. Morgan, A.J., M. Mackett, S. Finerty, J.R. Arrand, F.T. Scullion, and M.A. Epstein, J. Med. Virol. 25, 189-195 (1988).
168. Stmad, B.C., T. Schuster, R. Klein, R.F. Hopkins, T. Witmer, R.H. Neubauer, and H. Rabin, J. Virol. 41, 258-264 (1982).
169. Miller, N., and LM. Hutt-Fletcher, J. Virol. 52, 2366-2372 (1988).
170. Plotkin, S.A., H.M. Friedman, S.E. Starr, and E. Gonczol, Jn: Contemporary Issues in Infectious Diseases, Vol. 8, eds. Root si ai- (Churchill Livingstone, New York) pp. 65-92 (1989).
171. Plotkin, S.A., S.E. Starr, H.M. Friedman, E. Gonczol, and R.E. Weibel, J. Inf. Dis. 159. 860-865 (1989).
172. Gretch, D.R., B. Kari, L. Rasmussen, R.C. Gehrz, and M.F. Stinski, J. Virol. 52, 875-881 (1988).
173. Weston, K., and B.G. Barreil, J. Mol. Biol. 122, 177-208 (1986).
174. Pachi, C., W.S. Probert, K.M. Hermsen, F.R. Masiarz, L. Rasmussen, T.C. Merigan, and R.R. Spaete, Virology 152, 418-426 (1989).
175. Rasmussen, L., M. Nelson, M. Neff, and T.C. Merigan, Jr., Virology 163. 308-318 (1988).
176. Kari, B., N. Lussenhop, R. Goertz, M. Wabuke-Bunoti, R. Radeke, and R. Gehrz, J. Virol. 60. 345-352 (1986).
51
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 682 671 A5
177. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Virus Res. IQ, 343-356 (1988).
178. Nettieton, P.F., and Ü.M. Sharp, Vet. Ree. 107. 379 (1980).
179. Kahrs, R.F., J. Amer. Vet. Med. Assoc. J21, 1055-1064 (1977).
180. McLauchlan, J., D. Gaffney, J.L. Whitton, and J.B. Clements, Nucleic Acids Res. 12, 1347-1368
(1985).
181. Davison, A.J., EMBO J. 2, 2203-2209 (1983).
182. Todd, D. and J.B. McFerran, Arch. Virol. SS, 167-176 (1985).
183. Diamond, L., Int. J. Cancer 2, 143-152 (1967).
184. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. 22, 4189-4198 (1989).
185. Russel, N., S. Kidd, and M.R. Kelley, Gene 45, 333-338 (1986).
186. Kunkel, T.A., J.D. Roberts, and R.A. Zakour, Jn: Methods in Enzymology, Vol. 154, eds. R. Wu, and L. Grossman (Academic Press, Inc.) pp. 367-382 (1987).
187. Schmitt, J.F.C, and H.G. Stunnenberg, J. Virol. 22, 1889-1897 (1988).
188. Pickup, DJ., B.S. Ink, W. Hu, C.A. Ray, and W.K. Joklik, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 22, 7698-7702 (1986).
189. Southern, E.M., J. Mol. Biol. 32, 503-517 (1975).
190. Bûcher, D., S. Popple, M. Baer, A. Mikhail, Y.-F. Gong, C. Whitaker, E. Paoletti, and A. Judd, J. Virol. 22, 3622-3633 (1989).
191. Joklik, W.K., Virology 12, 9-18 (1962).
192. Guilhot, S., A. Hampe, L. D'Auriol, and F. Galibert, Virology 161. 252-258 (1987).
193. Falkner, F.G., and B. Moss, J. Virol. 22, 1849-1854 (1988).
194. Boyle, D.B., and B.E.H. Coupar, Gene 25, 123-128 (1988).
195. Dreyfuss, G., S.A. Adam, and Y.D. Choi, Mol. Cell. Biol. 4, 415-423 (1984).
196. Kennedy, I.M., D.P. Leader, and W.S. Stevely, J. gen. Virol. 25, 1621-1624 (1984).
197. Powell, K.L. and D.H. Watson, J. gen. Virol. 2S, 167-178 (1975).
198. Marsden, H.S., N.D. Stow, V.G. Preston, M.C. Timbury, and N.M. Wilkie, J. Virol. 22, 624-642 (1978).
199. Marsden, H.S., A. Buckmaster, J.W. Palfreyman, R.G. Hope, and A.C. Minson, J. Virol. 50. 547-554 (1984).
200. Zweig, M., S.D. Showalter, S.V. Bladen, C.J. Heilman, Jr. and B. Hampar, J. Virol. 47, 185-192 (1983).
201. Marshall, R.L., B.A. Israel, and G.J. Letchworth, III., Virology 165. 338-347 (1988).
202. Panicali, D., S.W. Davis, S.R. Mercer, and E. Paoletti, J. Virol. 2Z, 1000-1010 (1981).
203. Misra V., R. Nelson, and M. Smith, Virology 166. 542-549 (1988).
204. Keller, P.M., A.J. Davison, R.S. Lowe, C.D. Bennett, and R.W. Ellis, Virology 152. 181-191
(1986).
205. Bzik, D.J., C. Debroy, B.A. Fox, N.E. Pederson, and S. Person, Virology 155. 322-333 (1986).
206. Gong, M., T. Ooka, T. Matsuo, and E. Kieff, J. Virol. 21, 499-508 (1987).
207. Baer, R., A.T. Bankier, M.D. Biggin, P.L. Deininger, P.J. Farrell, T.J. Gibson, G. Hatfull, G.S. Hudson, S.C. Satchwell, C. Seguin, P.S. Tuffnell, and B.G. Barrell, Nature 310. 207-211 (1984).
208. Emini, E.A., J. Luka, M.E. Armstrong, P.M. Keller, R.W. Ellis, and G.R. Pearson, Virology 157. 552-555 (1987).
209. Heineman, T., M. Gong, J. Sample, and E. Kieff, J. Virol. 22, 1101-1107 (1988).
210. Patel, D.D., and DJ. Pickup, Embo J. 2, 3787-3794 (1987).

Claims (8)

Revendications
1. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome du poxvirus.
2. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit virus de l'herpès est un membre de la sous-famille des virus de l'herpès choisi dans le groupe constitué par l'alphaherpèsvirus, le betaherpèsvirus et le gammaherpèsvirus, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué par le virus de l'herpès chevalin, le virus de la pseudo-rage, le virus de l'herpès simplex, le virus de l'herpès bovin, le virus de l'herpès félin, le virus d'Epstein-Barr et le cytomégalovirus humain.
3. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime une glycoprotéine du virus de l'herpès et plus particulièrement une glycoprotéine choisie dans le groupe constitué par gp13 du virus de l'herpès chevalin, gp14 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gE du virus de l'herpès chevalin, gp50 du virus de la pseudo-rage, gpll du virus de la pseudo-rage, gplll du virus de la pseudo-rage, gpl du virus de la pseudo-rage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, gD du virus de l'herpès simplex, gl du virus de l'herpès bovin, gB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, gp340 du virus d'Epstein-Barr, gB du virus d'Epstein-Barr, gH du virus d'Epstein-Barr et gB du cytomégalovirus humain.
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4. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime au moins deux glycoprotéines du virus de l'herpès.
5. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit poxvirus est un virus de la vaccine ou un poxvirus aviaire, et plus particulièrement un poxvirus aviaire choisi dans le groupe constitué par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.
6. Vaccin pour induire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec ledit vaccin, caractérisé en ce que ledit vaccin comprend un véhicule et un poxvirus recombinant selon l'une des revendications 1, 2, 3, 4 ou 5.
7. Jeu de deux vaccins pour éviter l'immunité maternelle chez un nouveau-né, caractérisé en ce qu'il comporte un premier vaccin destiné à être inocule au nouveau-né et comportant un poxvirus recombinant selon la revendication 1, ledit ADN codant pour un premier antigène pathogène du descendant nouveau-né, ledit antigène étant différent d'un second antigène du même pathogène présent dans le second vaccin destiné à induire une réponse immunologique au même pathogène chez la mère du descendant nouveau-né.
8. Jeu de deux vaccins pour éviter l'immunité maternelle chez un nouveau-né, caractérisé en ce qu'il comporte un premier vaccin destiné à être inoculé au nouveau-né et comportant un premier poxvirus recombinant selon la revendication 1, ledit ADN codant pour un antigène pathogène du descendant nouveau-né, ledit poxvirus étant différent d'un second poxvirus recombinant selon la revendication 1, lequel est présent dans le second vaccin destiné à induire une réponse immunologique au même pathogène chez la mère du descendant nouveauné.
53
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Families Citing this family (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US7767449B1 (en) 1981-12-24 2010-08-03 Health Research Incorporated Methods using modified vaccinia virus
US5505941A (en) * 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
GB9014950D0 (en) * 1990-07-06 1990-08-29 Univ Glasgow Ehv-4 glycoprotein vaccine
US5674735A (en) * 1990-07-06 1997-10-07 University Court Of The University Of Glasgow DNA encoding the EHV-4 gH or gC glycoprotein
US7374768B1 (en) * 1990-09-25 2008-05-20 Xenova Research Limited Viral vaccines
EP0550553B1 (fr) * 1990-09-25 2000-07-12 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vaccin viral mutant a genome deficient et produit en transcomplementant la lignee cellulaire
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5759552A (en) * 1991-03-07 1998-06-02 Virogenetics Corporation Marek's disease virus recombinant poxvirus vaccine
GB9105383D0 (en) * 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
DE69229390T2 (de) * 1991-08-26 1999-11-11 Immuno Ag, Wien Direkt molekuläre Klonierung eines modifizierten Genoms eines Chordopocken-Virus
ATE253123T1 (de) * 1991-08-26 2003-11-15 Baxter Healthcare Sa Ein intaktes fpv-tk-gen enthaltender rekombinanter virus der vogelpocken
US5869312A (en) * 1992-01-13 1999-02-09 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5925358A (en) * 1993-02-26 1999-07-20 Syntro Corporation Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
US6136318A (en) * 1993-02-26 2000-10-24 Cochran; Mark D. Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
EP0696204A4 (fr) * 1993-02-26 1999-03-31 Syntro Corp Virus recombinants de la diphterie des volailles et utilisations
US6010703A (en) * 1993-07-26 2000-01-04 Board Of Trustees Operating Michigan State University Recombinant poxvirus vaccine against feline rhinotracheitis
DE69535561T2 (de) * 1994-03-30 2008-06-05 Connaught Technology Corp., Greenville NUKLEOTID- UND AMINOSÄURESEQUENZEN gB, gC UND gD DES HERPESVIRUS DES HUNDES UND IHRE VERWENDUNGEN
AU694519B2 (en) * 1994-04-29 1998-07-23 Immuno Aktiengesellschaft Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
EP0979101B1 (fr) 1996-07-03 2010-10-27 Merial, Inc. ADENOVIRUS CANIN 2 RECOMBINANT (ACR2) CONTENANT DE l'ADN EXOGENE
US6183752B1 (en) * 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US6224882B1 (en) 1997-11-07 2001-05-01 Protein Science Corp. Insect cells or fractions as adjuvant for antigens
EP1997893A1 (fr) 1998-02-24 2008-12-03 Sisters of Providence in Oregon Compositions contenant un agent de liaison de récepteur OX-40 ou un acide nucléique l'encodant et procédés d'amélioration d'une réponse immunitaire antigène spécifique
ATE512231T1 (de) 1998-02-27 2011-06-15 Univ Pennsylvania Impfstoffe, immuntherapeutika und verfahren zur anwendung derselben
US6344337B1 (en) 1999-02-19 2002-02-05 Board Of Trustees Of Michigan State University Antigen test to detect equine protozoal myeloencephalitis in horse serum and cerebrospinal fluid
KR20010103788A (ko) 1999-03-03 2001-11-23 멕코나시 에블린 에이치. 백신 및 유전자요법 조성물 및 이들의 제조 및 사용방법
WO2000066162A1 (fr) * 1999-04-30 2000-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cd80 humain mutant, compositions, et technique de preparation et d'utilisation de ces compositions
BR0011732B1 (pt) * 1999-06-10 2014-02-04 Vacinas de dna para animais de companhia e de esporte
AU5329300A (en) 1999-06-10 2001-01-02 Michigan State University Feline calicivirus isolated from cat urine and vaccines thereof
AU7108700A (en) 1999-09-02 2001-03-26 Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
US7419668B1 (en) 1999-09-02 2008-09-02 Board Of Trustees Of Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
DK1248646T3 (da) * 1999-12-21 2008-05-19 Merial Sas Præparater og vacciner indeholdende antigen(er) fra cryptosporidium parvum og fra andet enterisk patogen
WO2002006303A2 (fr) * 2000-07-14 2002-01-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccins adn codant pour des proteines vih accessoires
AU2002211524B2 (en) * 2000-10-04 2007-03-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Highly expressible genes
US7628980B2 (en) * 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7097842B2 (en) * 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
WO2002042480A2 (fr) * 2000-11-23 2002-05-30 Bavarian Nordic A/S Variant du virus de la vaccine modified vaccinia ankara
US20020108132A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-08 Avigenics Inc. Production of a monoclonal antibody by a transgenic chicken
US7541512B2 (en) * 2001-03-30 2009-06-02 Synageva Biopharma Corp. Avians containing a lysozyme promoter transgene
EP1478751A4 (fr) * 2001-03-30 2005-10-19 Avigenics Inc Promoteur de lysozymes aviaires
US7176300B2 (en) * 2001-03-30 2007-02-13 Avigenics, Inc. Avian lysozyme promoter
US20040037848A1 (en) * 2001-04-06 2004-02-26 Audonnet Jean-Christophe Francis Recombinant vaccine against West Nile Virus
US7740863B2 (en) * 2001-04-06 2010-06-22 Merial Recombinant vaccine against West Nile Virus
FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2004-02-06 Merial Sas Vaccin contre le virus de la fievre du nil
WO2002100317A2 (fr) 2001-05-25 2002-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Particules a destination ciblee et procedes d'utilisation
US7550650B2 (en) * 2001-09-18 2009-06-23 Synageva Biopharma Corp. Production of a transgenic avian by cytoplasmic injection
US20100333219A1 (en) * 2001-11-30 2010-12-30 Synageva Biopharma Corp. Methods of protein production using ovomucoid regulatory regions
US7294507B2 (en) * 2001-11-30 2007-11-13 Avigenics, Inc. Ovomucoid promoters and methods of use
US7335761B2 (en) * 2001-11-30 2008-02-26 Avigenics, Inc. Avian gene expression controlling regions
US6875588B2 (en) 2001-11-30 2005-04-05 Avigenics, Inc. Ovomucoid promoter and methods of use
US7135562B2 (en) * 2002-03-14 2006-11-14 University Of Cincinnati Avian iFABP gene expression controlling region
US20040241723A1 (en) * 2002-03-18 2004-12-02 Marquess Foley Leigh Shaw Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
NZ547776A (en) * 2002-04-19 2009-08-28 Bavarian Nordic As Modified vaccinia virus ankara for protecting an animal against an antigen or self-protein
DK1407033T3 (da) * 2002-05-16 2006-05-22 Bavarian Nordic As Intergeniske områder som insertionssteder i genomet af Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA)
PT1434858E (pt) * 2002-09-05 2008-07-28 Bavarian Nordic As Método de amplificação de um poxvírus em condições sem soro
CA2510229A1 (fr) * 2002-12-13 2004-07-08 Aventis Pasteur, Inc. Production du virus alvac sur des cellules souches embryonnaires d'oiseaux
CN1980571A (zh) * 2003-01-24 2007-06-13 阿维季尼克斯股份有限公司 禽类及禽蛋中表达的外源蛋白质
US7262027B2 (en) * 2003-03-14 2007-08-28 Medical College Of Ohio Polypeptide and DNA immunization against Coccidioides spp. infections
EP2390352A1 (fr) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systemes et procedes pour accroitre la production de proteines et de lait chez des bovins laitiers
US7468273B2 (en) 2003-05-01 2008-12-23 Meial Limited Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use
NZ570709A (en) * 2003-06-13 2010-04-30 Univ Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
EP1633372B1 (fr) 2003-06-13 2011-11-30 The Trustees of The University of Pennsylvania Vaccins, agents immunotherapeutiques et leurs methodes d'utilisation
US20050214316A1 (en) 2003-11-13 2005-09-29 Brown Thomas P Methods of characterizing infectious bursal disease virus
AU2005244673B2 (en) 2004-02-19 2009-12-10 The Governors Of The University Of Alberta Leptin promoter polymorphisms and uses thereof
US20080274140A1 (en) * 2004-11-19 2008-11-06 David B Weiner Vaccines and Methods for Using the Same
CN101223187A (zh) * 2004-11-24 2008-07-16 萨拉普托斯股份公司 用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用
US20080064862A1 (en) * 2004-12-29 2008-03-13 Avigenics, Inc. Transgene expression in a avians
ES2343270T3 (es) 2005-04-25 2010-07-27 Merial Ltd. Vacunas contra el virus nipah.
WO2007012944A2 (fr) * 2005-07-28 2007-02-01 Pfizer Products Inc. Procedes d'administration de vaccins, nouveaux calicivirus felins, et traitements pour immuniser des animaux contre le parvovirus felin et contre l'herpes-virus felin
US20080241184A1 (en) 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
US7771995B2 (en) 2005-11-14 2010-08-10 Merial Limited Plasmid encoding human BMP-7
CA2629522A1 (fr) 2005-11-14 2007-05-18 Merial Limited Therapie genique pour insuffisance renale
US7745158B2 (en) * 2005-12-14 2010-06-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection of secreted aspartyl proteases from Candida species
CA2636867C (fr) * 2006-01-13 2015-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccins et produits immunotherapeutiques utilisant une il-15 optimisee par un codon et leurs procedes d'utilisation
US9259463B2 (en) 2006-01-16 2016-02-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chlamydia vaccine
CA2647566C (fr) 2006-03-29 2017-01-03 Merial Limited Vaccin anti-streptocoques
WO2007136763A2 (fr) * 2006-05-19 2007-11-29 Sanofi Pasteur, Inc. Composition immunologique
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
CA3184778A1 (fr) 2006-07-28 2008-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sequences d'enveloppes de consensus du vih et methodes d'utilisation
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
JP2010525812A (ja) 2007-05-02 2010-07-29 メリアル リミテッド 発現及び安定性が改善されたｄｎａプラスミド
TW200907058A (en) * 2007-05-30 2009-02-16 Wyeth Corp Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins
US20090246226A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 Zeon Corporation Avian vaccines possessing a positive marker gene
JP5744719B2 (ja) * 2008-04-04 2015-07-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア チクングニヤウィルスタンパク質の共通配列、これをコードする核酸分子、並びにこれを使用する組成物および方法
CN105535961A (zh) * 2008-04-04 2016-05-04 宾夕法尼亚大学托管会 使用il-28和组合物的疫苗和免疫治疗及其使用方法
MX2010012069A (es) 2008-05-08 2010-12-14 Merial Ltd Vacuna de la leishmaniasis con el uso del inmunogeno salival de la mosca de la arena.
US8921536B2 (en) 2008-10-29 2014-12-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania HCV vaccines and methods for using the same
AU2008363596B2 (en) 2008-10-29 2015-04-30 Inovio Pharmaceuticals, Inc Improved HCV vaccines and methods for using the same
CA2653478A1 (fr) * 2009-01-23 2010-07-23 Gregg Martin Lave-vehicules industriels
US9050287B2 (en) 2009-01-23 2015-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same
US20100192236A1 (en) * 2009-01-28 2010-07-29 University Of South Carolina Modulation of Delta Opioid Receptor Expression
DK2414386T3 (en) 2009-04-03 2016-02-22 Merial Ltd Birds of vaccines with newcastle disease virus vectors
US20100284977A1 (en) * 2009-04-28 2010-11-11 University Of South Carolina Expression of Anti-Nociceptive Compounds from Endogenously Regulated Promoters
CA2760315C (fr) 2009-04-30 2019-05-28 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (Chuv) Vecteurs d'immunisation modifies
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
CN102821790A (zh) 2009-09-14 2012-12-12 宾夕法尼亚大学托管会 包含IL-15受体α和/或编码IL-15受体α的核酸分子的疫苗和免疫治疗剂,以及其使用方法
KR101851699B1 (ko) 2009-11-02 2018-04-24 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 구제역 바이러스(ｆｍｄｖ) 공통 단백질, 이를 위한 코딩 서열 및 이로부터 만들어진 백신
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
CN102781952B (zh) 2010-02-08 2015-09-02 宾夕法尼亚大学托管会 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法
US9109007B2 (en) 2010-08-18 2015-08-18 Purdue Pharma L.P. MHC-I restricted epitopes containing non-natural amino acid residues
PL2611460T3 (pl) * 2010-08-31 2017-02-28 Merial, Inc. Szczepionki przeciw herpeswirusom przenoszone z pomocą wirusa choroby newcastle
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
ES2718846T3 (es) 2010-11-12 2019-07-04 Univ Pennsylvania Antígenos de próstata consenso, molécula de ácido nucleico que los codifica y la vacuna y usos que los comprenden
WO2012090073A2 (fr) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Procédés et compositions pour prédire la sensibilité à la chimiothérapie
CA2826199A1 (fr) 2011-01-31 2012-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Molecules d'acide nucleique codant de nouveaux antigenes d'herpes, vaccin les comprenant et procedes pour les utiliser
EA037377B1 (ru) 2011-02-11 2021-03-22 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Вакцина для индукции иммунного ответа на hbv
US9238679B2 (en) 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
EP2694677A2 (fr) 2011-04-04 2014-02-12 Netherland Cancer Institute Procédés et compositions pour prédire une résistance à un traitement anti-cancéreux
WO2012138789A2 (fr) 2011-04-04 2012-10-11 Netherlands Cancer Institute Procédés et compositions pour prédire une résistance à un traitement anti-cancéreux
WO2012145577A1 (fr) 2011-04-20 2012-10-26 Merial Limited Vaccin antirabique avec adjuvant à profil de viscosité amélioré
EP2701736A1 (fr) 2011-04-25 2014-03-05 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Protéines tronquées d'enveloppe (env) du vih, procédés et compositions associés à celles-ci
ES2674439T3 (es) 2011-06-01 2018-06-29 Merial, Inc. Administración sin aguja de vacunas contra el VSRRP
JP6117781B2 (ja) 2011-07-11 2017-04-19 イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 交差防御性アレナウイルスワクチンおよびそれらの使用方法
AU2012284558B2 (en) 2011-07-20 2017-06-29 Centre National De La Recherche Scientifique Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
LT2741740T (lt) 2011-08-12 2017-08-10 Merial, Inc. Biologinių produktų, ypatingai vakcinų, vakuuminis konservavimas
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
WO2013033092A2 (fr) 2011-09-03 2013-03-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Antigènes de poil de streptococcus suis
CA2848658C (fr) 2011-10-12 2022-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccins pour le papillomavirus humain et leurs procedes d'utilisation
WO2013062507A1 (fr) 2011-10-24 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccins améliorés contre le vhc et procédés d'utilisation de ceux-ci
KR20140116095A (ko) 2011-12-12 2014-10-01 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Mrsa pbp2a 및 이의 단편들을 포함하는 단백질, 이를 인코딩한 핵산, 및 mrsa 감염을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도
KR102277469B1 (ko) 2011-12-12 2021-07-15 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 개선된 il-12 유전적 컨스트럭트 및 백신을 포함하는 조성물, 면역치료제 및 이를 이용하는 방법
WO2013093629A2 (fr) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Vaccins modulaires, procédés et compositions qui y sont liés
WO2013138776A1 (fr) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Nouveaux procédés pour fournir une immunité de protection à long terme contre la rage chez des animaux, basés sur l'administration d'un flavivirus défectueux en termes de réplication, exprimant la rage g
SG11201405847SA (en) * 2012-03-20 2014-10-30 Merial Inc Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein c and uses thereof
EP2836505B1 (fr) 2012-04-10 2019-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antigènes consensus du virus syncytial respiratoire humain, constructions d'acide nucléique et vaccins préparés à partir de celles-ci, et leurs procédés d'utilisation
MX360137B (es) 2013-02-21 2018-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas h5 del virus de la influenza h5n1 para usarse como un medicamento.
WO2014165291A1 (fr) 2013-03-12 2014-10-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccins améliorés pour le papilloma virus humain et leurs procédés d'utilisation
WO2014164697A1 (fr) 2013-03-12 2014-10-09 Merial Limited Compositions vaccinales contre le virus de schmallenberg obtenues par génétique inverse, et leurs méthodes d'utilisation
AU2014228405B2 (en) 2013-03-15 2017-05-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cancer vaccines and methods of treatment using the same
CN114045295A (zh) 2013-03-15 2022-02-15 宾夕法尼亚大学理事会 口蹄疫病毒(fmdv)共有蛋白、其编码序列以及由其制造的疫苗
JP6395855B2 (ja) 2014-04-03 2018-09-26 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド ブタ流行性下痢ウイルスワクチン
AU2015343369B2 (en) 2014-11-03 2018-11-22 Georgia Tech Research Corporation Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
EA201890110A1 (ru) 2015-06-23 2018-05-31 Мериал, Инк. Рекомбинантные вирусные векторы, содержащие минорные белки prrsv, и способы их получения и применения
DK3344289T3 (da) 2015-08-31 2020-04-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pestivirusvacciner mod medfødt tremor
JP2018526454A (ja) 2015-09-16 2018-09-13 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド ブタコレラ菌−ネズミチフス菌ワクチン
KR102618843B1 (ko) 2016-09-20 2024-01-02 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 신규한 ehv 삽입 부위 orf70
KR102566066B1 (ko) 2016-09-20 2023-08-16 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 신규한 돼지 인플루엔자 백신
WO2018057441A1 (fr) 2016-09-20 2018-03-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vecteurs d'adénovirus canin
BR112019005418A2 (pt) 2016-09-20 2019-10-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh novos promotores
CA3042584A1 (fr) 2016-11-03 2018-05-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccin contre le parvovirus porcin et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin et ses procedes de production
BR112019009133A2 (pt) 2016-11-03 2019-07-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh vacina contra o parvovírus suíno
CN110545841A (zh) 2017-01-30 2019-12-06 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 猪冠状病毒疫苗
KR20200027479A (ko) 2017-07-12 2020-03-12 베링거 인겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인크. 세네카바이러스 a 면역원성 조성물 및 이의 방법
AR113124A1 (es) 2017-09-23 2020-01-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sistema de expresión de paramyxoviridae
WO2019092027A1 (fr) 2017-11-09 2019-05-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Compositions immunogènes à base de sapelovirus et leurs utilisations
US11235044B2 (en) 2017-12-13 2022-02-01 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Cancer vaccines targeting MUC16 and uses thereof
EP3723810A4 (fr) 2017-12-13 2022-02-23 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Vaccins anti-cancéreux ciblant la mésothéline et leurs utilisations
US11338029B2 (en) 2017-12-13 2022-05-24 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Cancer vaccines targeting PRAME and uses thereof
RU2711907C2 (ru) * 2017-12-22 2020-01-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимые фрагменты белков вируса гепатита Е, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е (варианты)
WO2019162294A1 (fr) 2018-02-23 2019-08-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Systèmes de vecteurs viraux recombinants exprimant des gènes de paramyxovirus félin exogènes et vaccins fabriqués à partir de ceux-ci
EP3768307A1 (fr) 2018-03-19 2021-01-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Nouveaux ehv avec ul18 et/ou ul8 inactivés
AU2019239552A1 (en) 2018-03-19 2020-09-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh EHV insertion site UL43
EA202092216A1 (ru) 2018-03-26 2021-06-11 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Способ получения иммуногенной композиции
CN112867505B (zh) 2018-09-20 2024-10-01 勃林格殷格翰动物保健有限公司 经修饰的pedv刺突蛋白
EP3852800A1 (fr) 2018-09-20 2021-07-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Vaccin à vecteur par voie intranasale contre la diarrhée épidémique porcine
WO2021158878A1 (fr) 2020-02-06 2021-08-12 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Polypeptides utiles pour la détection d'anticorps anti-rhabdovirus
EP4225776A1 (fr) 2020-10-05 2023-08-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Protéine de fusion utile pour la vaccination contre les rotavirus
CN116438202A (zh) 2020-10-05 2023-07-14 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 包含圆环病毒科衣壳蛋白的融合蛋白及其构成的嵌合病毒样颗粒
AR128992A1 (es) 2022-04-05 2024-07-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Composición inmunógena útil para la vacunación contra el rotavirus

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1061898A (en) 1963-03-07 1967-03-15 Philips Electronic Pharma Method for protecting dogs against canine distemper
US4722848A (en) * 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4769330A (en) * 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
WO1984002077A1 (fr) * 1982-11-30 1984-06-07 Us Health Procede de production de recombinants du virus de la variole pour l'expression de genes etrangers
EP0162738A1 (fr) 1984-04-09 1985-11-27 MOLECULAR GENETICS RESEARCH &amp; DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP Production d'unités secondaires de vaccins de virus pseudorabique
EP0261940A3 (fr) * 1986-09-23 1989-07-05 Applied Biotechnology, Inc. Vaccins pseudorabiques et vecteurs d'ADN pour recombiner avec les poxvirus
US5242829A (en) * 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
EP0284416B1 (fr) * 1987-03-27 1995-02-22 Nippon Zeon Co., Ltd. Avipoxvirus recombinant
EP0297924A3 (fr) * 1987-07-01 1990-07-11 City Of Hope Virus de la vaccine recombinant exprimant la glycoproteine HSV 1 gB
DE10399031I1 (de) * 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
WO1990001546A1 (fr) * 1988-08-05 1990-02-22 Applied Biotechnology, Inc. Vaccin contre l'herpesvirus equin-1
IE71643B1 (en) 1990-11-20 1997-02-26 Virogenetics Corp A recombinant poxviral vaccine for canine distemper

Also Published As

Publication number Publication date
IE61098B1 (en) 1994-09-21
AU625623B2 (en) 1992-07-16
AU5552090A (en) 1990-11-16
US6183750B1 (en) 2001-02-06
NL195016C (nl) 2003-06-10
GB2246784B (en) 1993-04-28
AT405184B (de) 1999-06-25
DK176464B1 (da) 2008-03-31
KR920700289A (ko) 1992-02-19
FR2647808A1 (fr) 1990-12-07
NL9020677A (nl) 1992-02-03
DE4090565T (fr) 1992-05-14
GB9120655D0 (en) 1991-11-27
DE4090565C2 (de) 2000-03-09
DK174391D0 (da) 1991-10-15
BE1004369A5 (fr) 1992-11-10
IT9020063A0 (it) 1990-04-17
DK174391A (da) 1991-12-12
JP3246735B2 (ja) 2002-01-15
US5338683A (en) 1994-08-16
CA2014465A1 (fr) 1990-10-17
US5482713A (en) 1996-01-09
IE901380L (en) 1990-10-17
LU88018A1 (fr) 1992-03-11
FR2647808B1 (fr) 1995-03-03
JPH04505248A (ja) 1992-09-17
ATA902590A (de) 1998-10-15
JP3083839B2 (ja) 2000-09-04
IT1241119B (it) 1993-12-29
CA2014465C (fr) 1999-06-15
JP2000157292A (ja) 2000-06-13
GB2246784A (en) 1992-02-12
WO1990012882A1 (fr) 1990-11-01
IT9020063A1 (it) 1991-10-17

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