JP3083839B2 - ヘルペスウイルス組換えポックスウイルスワクチン - Google Patents

ヘルペスウイルス組換えポックスウイルスワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の相互参照 本出願は米国特許出願第339004号（1989年４月17日出
願）の部分継続出願である米国特許出願第394488号（19
89年８月16日出願）の部分継続出願である。
発明の分野 本発明は修飾ポックスウイルス並びに該修飾ポックス
ウイルスの作成方法と使用方法に関する。本発明は、よ
り詳細には、ヘルペスウイルス遺伝子産物を発現するよ
うな組換えポックスウイルス並びにヘルペスウイルス感
染に対する防御免疫を賦与するワクチンに関する。
本出願においては、括弧内のアラビア数字で示す刊行
物を多数引用した。これらの引用文献の詳細は本明細書
の最後の「請求の範囲」の直前に記載した。これらの引
用文献には、本発明の関連技術分野の技術水準が記載さ
れている。
発明の背景 外来遺伝子の挿入及び発現にワクシニアウイルス（va
ccinia virus）が使用されており、最近では他のポック
スウイルス（poxvirus）も使用されるようになってい
る。生きた感染性ポックスウイルス中に外来遺伝子を挿
入するための基本的技術としては、外来遺伝要素を挟み
こんだドナープラスミド中のポックスDNA配列と救援ポ
ックスウイルス中に存在する相同配列との間の組換えが
ある（28）。
組換えポックスウイルスは、詳細には、米国特許第4,
603,112号に記載されたワクシニアウイルスの合成組換
え体の作成法などの公知の二段階法によって構築されて
いる。
最初の段階では、ウイルスに挿入すべきDNA遺伝子配
列（特に非ポックス起源の解読枠（open reading fram
e））を、ポックスウイルスのDNA部分と相同なDNAを予
め挿入しておいた大腸菌（E.coli）プラスミド構造体中
に導入する。別個に、挿入すべきDNA遺伝子配列をプロ
モーターに連結する。このプロモーター−遺伝子連結体
を上記プラスミド構造体中に導入して、ポックスDNAの
非必須遺伝子座のフランキングDNA配列と相同なDNAで該
プロモーター−遺伝子連結体の両端が挟み込まれるよう
にする。得られたプラスミド構造体を次いで大腸菌中で
増殖させて増幅し（11）、単離する（12,20）。
第２段階では、挿入すべきDNA遺伝子配列を含有する
単離プラスミドを、ポックスウイルスと共に、培養細胞
（例えばニワトリ胚繊維芽細胞）に感染させる。プラス
ミドとウイルスゲノムに存在する互いに相同なポックス
DNA間の組換えによって、ポックスウイルスゲノムの非
必須領域内に外来DNA配列が存在する修飾ポックスウイ
ルスが得られる。「外来」DNAという用語は、外在性のD
NA、特に非ポックス起源のDNAで、それらを導入すべき
ゲノムが通常には産生しない遺伝子産物をコードするも
のを指す。
遺伝子組換えは、一般的には、２本のDNA鎖間のDNAの
相同部分の交換を意味する。核酸の相同部分とは塩基配
列が同一であるような核酸（DNA又はRNA）の部分をい
う。
遺伝子の組換えは、感染宿主細胞中で新たにウイルス
ゲノムが複製又は生産される際に自然に起こり得る。従
って、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２種類以上
の異なるウイルス又はその他の遺伝子構造体に同時に感
染した宿主細胞内中で展開されるウイルスの複製周期の
間に起こることもある。第一のウイルスゲノムのDNAと
相同なDNAを有する第二のウイルスが同時に感染した場
合、第二のウイルスゲノムの一部分を構築する際に前者
のゲノムに由来するDNA部分が交換して用いられる。
ただし、遺伝子の組換えは、異なるゲノム中の完全に
は相同とはいえないDNA部分間でも起こり得る。仮に、
かかる部分の一方が第一のゲノム由来のもので、もう一
方のゲノムのある部分と相同ではあるが、前者の相同な
DNA部分中に例えば遺伝マーカー又は抗原決定基をコー
ドする遺伝子の挿入された非相同部分が存在していたと
しても、組換えは依然として起こり得るし、その組換え
産物も組換えウイルスゲノム中の遺伝マーカー又は遺伝
子の存在によって検出できる。
かかる感染性修飾ウイルス中での挿入DNA遺伝子配列
の発現を成功させるためには２つの条件が必要である。
まず第一に、かかる修飾ウイルスが生存し続けるように
挿入をウイルスの非必須領域中で行なう必要がある。挿
入DNAに関する第二の条件は、該挿入DNAに適したプロモ
ーターが存在することである。プロモーターは、発現す
べきDNA配列の上流に位置するように導入しなければな
らない。
ウマヘルペスウイルス（equine herpesvirus）には２
つの亜型（subtype）が存在する。これらは交差反応性
中和エピトープ（cross−neutralizing epitope）を含
んではいるが、それぞれの抗原特性、制限酵素フィンガ
ープリント及びウマに対する病原性によって区別できる
（１）。ウマヘルペスウイルス１型（EHV−１）が呼吸
器系の疾患、中枢神経系の障害及び古くから知られてい
るヘルペス性流産に関連するのに対して、ウマヘルペス
ウイルス４型（EHV−４）は主に呼吸器系の疾患だけに
関連している。ウマヘルペスウイルスは、アルファヘル
ペスウイルス（alphaherpesvirus）亜科の一種で、ゲノ
ムの異性化、遺伝子発現の調節、潜伏感染の成立、欠陥
干渉ウイルス粒子の産生、神経障害の誘発並びにインビ
トロ発がん性形質転換などのヒトヘルペスウイルス（hu
man herpesvirus）に特徴的な生物学的及び生化学的性
質を示す（1,4,23）。従って、EHVはヘルペスウイルス
感染に関する種々の生物学的因果関係の研究に好適に使
用できる。
ヘルペスウイルス（herpesvirus）の糖タンパク質
は、例えば細胞への付着及び侵入、細胞間におけるウイ
ルスの伝播などのウイルスの基本的機能を媒介し、さら
に感染時の病原性をも決定する。ヘルペスウイルスの糖
タンパク質は、宿主免疫系との相互作用に決定的な役割
を果たす構成要素である（36,37）。
単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）の糖
タンパク質で十分に特徴付けられているものとしては、
gB、gC、gD、gE、gF、gG、gH及びgIが挙げられる（36,3
7,49−55）。数多くの研究から免疫反応の誘起に対する
単純ヘルペスウイルス糖タンパク質の重要性が指摘され
ている（6,8,13,18,21,22,26,27,30,44,46,47）。gCが
クラスＩ認識（class I restricted）細胞障害性リンパ
球を活性化し得るのに対して（15,32）、gDはクラスII
細胞障害性Ｔ細胞の応答を活性化し得る（21,22,44,46,
47）。gGは、補体依存性抗体によって支配されるウイル
ス中和反応の標的となることが示されている（38,3
9）。その他のヘルペスウイルス由来の数多くの糖タン
パク質についても、重要な免疫反応を誘起することが示
されている（5,10,36,56）。
EHVの２つの亜型は共に６種類の主要糖タンパク質を
発現する（1,3,43）。gp2、gp10、gp13、gp14、gp17/18
及びgp21/22aをコードするDNA配列のゲノム部分が、λg
t11発現ベクターとモノクローナル抗体を用いて決定さ
れている（３）。糖タンパク質gp13とgp14はゲノムＬ領
域内の、それぞれ単純ヘルペスウイルスのgCとgB相同物
の位置する場所と同じ位置に位置している。EHV−１
は、その６種類の主要糖タンパク質のうちの５種類がゲ
ノムＬ領域内の塩基配列によってコードされており、１
種類（gp17/18）だけしかUS領域にないという点で、糖
タンパク質遺伝子の位置の判明しているアルファヘルペ
スウイルスの中では独特である。これらのデータの解析
から、EHV−１ウイルス粒子の余り豊富には存在しない
既同定糖タンパク質の若干、さらには未同定のEHV−１
糖タンパク質が、ゲノムＳ領域に位置していることが予
想されている（３）。エンベロープの糖タンパク質はヘ
ルペスウイルスの主たる免疫原であって、宿主の体液性
免疫及び細胞性免疫反応双方の誘起に関与しており（5,
8,73−75）、ワクチンの設計を試みる者にとっては非常
に関心のあるものである。
ケンタッキー（Kentucky）T431株のgp13をコードする
EHV−１転写単位の塩基配列が最近報告されている
（２）。この解読枠（open reading frame）は468残基
のアミノ酸からなる51kDaの１次翻訳産物をコードす
る。このタンパク質は膜貫通性タンパク質に特有の性質
を有しており、タンパク質のシグナルペプチドと思われ
る部分と膜貫通性アンカー部分との間の膜表在性ドメイ
ンに９カ所の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（Asn−Ｘ−S
er/Thr）が存在している（２）。この糖タンパク質は単
純ヘルペスウイルス（HSV）のgC−１及びgC−２、仮性
狂犬病ウイルス（pseudo rabies virus,略してPRV）のg
III、並びに水痘帯状疱疹ウイルス（varicella−zoste
r virus,略してVZV）のgp Vと相同であることが判明し
ている（２）。従って、EHV−１のgp13は構造上ヘルペ
スウイルスgC様糖タンパク質の相同物である。
EHV−1 gp14の塩基配列が最近報告された（71,72）。
gp14糖タンパク質の予想アミノ酸配列の解析から、HSV
の糖タンパク質gBとかなりの相同性を有していることが
判明した。
幾つかのEHV−１糖タンパク質に対してモノクローナ
ル抗体が中和抗体であることが示されている（76）。受
動免疫実験によって、gp13もしくはgp14に対するモノク
ローナル抗体（77）又はgp13、gp14もしくはgp17/18に
対するモノクローナル抗体（78）が、致死量のウイルス
からハムスターを防御できることが実証された。その他
のgB及びgC糖タンパク質アナログもアルファヘルペスウ
イルスに起因する病気の防御機構に関与している（8,1
0,73）。EHV−１のgp17/18糖タンパク質は、これとは別
の潜在的防御免疫原として特徴付けられるが、他のアル
ファヘルペスウイルスのＳ領域にコードされた幾つかの
糖タンパク質の中でこれと構造的に対応するものは未だ
に発見されていない（66,79,80）。gp17/18はそのゲノ
ム内の位置に基づいてHSV gEアナログらしいと推測され
ている。
アルファヘルペスウイルスの一種である仮性狂犬病ウ
イルス（PRV）はアウジェスキー病の原因となる病原体
である。この病気は感染力が非常に強く、養豚産業に多
大な経済的損失をもたらす。この病気は子豚の罹患率と
致死率が高く、重い呼吸器系疾患、流産、一度に生まれ
る子豚の数の減少、並びに生き残った豚の成長速度の低
下によって特徴付けられる。感染によって致命的な脳炎
に至ることもしばしばある。ヘルペスウイルスに特徴的
なウイルスの潜伏感染が成立することもあるが、この場
合回復した成豚はウイルスの慢性キャリヤーとなる。最
近の詳細な総説しては、ウィットマン（Wittman）及び
ジーハ（Rziha）のもの（81）を参照されたい。
PRVゲノムは90×106ダルトンの二本鎖DNAで構成され
ており（82）、逆方向反復配列によってユニークロング
セグメント（UL）とユニークショートセグメント（US）
とに隔てられている。PRVゲノムはおよそ100個のポリペ
プチドをコードしており、それらの発現は他のヘルペス
ウイルスと同様にカスケード式に調節されている（85,8
6）。現在までのところ、５種類の糖タンパク質gp I、g
p II、gp III、gp63及びgp50がこのウイルスのエンベロ
ープに関連しており、さらにPRV感染細胞の種々の膜構
造にも関連していることが示されている（80,86−9
1）。PRVにコードされた６番目の糖タンパク質（gX）は
培地中に放出される（92）。これらの糖タンパク質のPR
Vゲノム上での位置並びにそれらのDNA配列は現在公知で
ある（62,80,91−98）。他のヘルペスウイルスの場合と
同様に、PRV糖タンパク質は、細胞への付着及び侵入並
びに細胞からの放出のようなウイルスの基本的機能を媒
介している。PRV糖タンパク質はPRV感染時の病原性に非
常に重要な役割を果たしており、しかも病気の消散及び
免疫状態に決定的な役割を果たす構成要素である。
PRV gp Iはウイルスのインビトロ（in vitro）及びイ
ンビボ（in vivo）での複製には必須でなく、弱毒化PRV
株の多くには存在していない（99）。これらのg I欠失
株が弱毒性であることは、g Iが毒性に何等かの役割を
果たしている可能性のあることを示唆している（99,10
0）。ただし、g Iが発現しただけではさほど強い毒性を
生じないので、他のPRVタンパク質もこの機能に関与し
ているらしい（100）。
PRVに対する免疫反応の誘起においてg Iの果たす役割
は明らかでない。g Iに対するモノクローナル抗体はイ
ンビトロでウイルスを中和し（100）、受動免疫マウス
を致死量のPRVから防御する（81）。ワクシニアウイル
ス組換え体中で、PRV由来gp Iを単独又はgp50及びgp63
と一緒に発現させることが、コスト（Kost）他によって
記載されている（98）。ワクシニア組換え体をマウス頭
蓋骨に接種すると、特にPRV gp Iをgp50及びgp63と一緒
に発現させた場合に毒性が増大する。
しかしながら、ブタにおいてはgp Iに対する中和抗体
は産生されない（５）。さらに、PRV gp Iにコードされ
るポリペプチドを発現する組換え体ワクシニアウイルス
（98）はマウスを（野生型ワクシニアの対照の与える防
御と比較して）致死量のPRVから防御しない。これらの
事実を参酌すると、PRV gp Iはサブユニットワクチンの
構成成分としてよりも、むしろ診断用プローブとして適
しているものと思われる。
PRV糖タンパク質gp63は、PRVゲノムのUS領域内のgp50
の隣に位置している（80）。PRV gp63のコード鎖は、gp
50の終止コドンの約20ヌクレオチド上流に位置する３つ
の連続したATGコドンで始まる。転写シグナルと認め得
るモチーフは存在せず、おそらくgp50と同じ転写物から
翻訳されるものと思われる。PRVのgp63はインビトロで
は必須ではない（88）。コスト（Kost）他の報告（98）
によれば、PRV gp63がPRV gp50との連続DNA配列として
ワクシニアウイルス中で発現した。この研究ではPRVのg
p63とgp50のそれぞれの寄与を別個に分析していないの
で、PRV gp63がPRV感染に対するマウスの防御において
如何なる寄与を果たしているかは評価し難い。
PRV糖タンパク質gXは非構造糖タンパク質であり、そ
の最終産物は細胞外液中に分泌される（85,92）。PRVの
gXに対するポリクローナル血清又はモノクローナル血清
のいずれを用いてもインビトロでのPRVの中和は起こら
ず（102,103）、サブユニットgXワクチンは感染に対し
て非防御性であった（104）。
PRV糖タンパク質gp50は、単純ヘルペスウイルス１型
（HSV−１）のgDアナログである（97）。そのDNA解読枠
は402残基のアミノ酸をコードする（95）。グリコシル
化された成熟型（50−60kDa）はＯ−結合による炭水化
物を含んでいるが、Ｎ−グリコシル結合は含んでいない
（95）。ブタ血清はPRV gp50と強く反応し、その免疫原
としての重要性を示唆している。gp50に対するモノクロ
ーナル抗体はインビトロにおいて補体と共に或いは補体
なしでPRVを中和し（97,105,106）、マウス（102,105,1
06）及びブタ（102）を受動的に防御する。gp50を発現
するワクシニアウイルス組換え体は血清中和抗体を誘発
し、致死量のPRVに対してマウス及びブタを防御する（9
8,107,108）。
PRV gp III遺伝子はゲノムのUL領域に位置している。
1437bpの解読枠は479残基のアミノ酸をコードする。予
想される50.9kDaの１次翻訳産物は８カ所の潜在的Ｎ−
グリコシル化部位を有する（96）。PRV gp IIIはHSV−1
gCアナログである（96）。PRV gp IIIをHSV gCで機能
的に置き換えることはできなかった（109）。PRV gp II
Iはインビトロにおける複製には非必須であるが（110,1
11）、グリコシル化された成熟型（98kDa）はPRVエンベ
ロープの主要構成成分である。抗gp IIIモノクローナル
抗体はインビトロにおいて補体と共に或いは補体なしで
ウイルスを中和し（86,106,110）、マウス及びブタを受
動的に防御する（102）。PRV糖タンパク質g IIIは、大
腸菌（欧州特許出願第0162738号）又はワクシニア組換
え体（欧州特許出願第0261940号）中で発現させたCro/g
III融合タンパク質による免疫後、致死量のPRVに対し
てマウス及びブタを防御する。
PRVエンベロープの主要構成成分の一つとして、ハン
プル（Hampl）の命名法によればPRV gp IIと名付けられ
ている３種類の糖タンパク質のジスルフィド結合複合体
（120kDa、67kDa及び58kDa）がある。PRV gp IIをコー
ドするDNA配列はULの左端に位置している。2976個のヌ
クレオチドからなる解読枠は、913残基のアミノ酸から
なる（110kDa）１次翻訳産物をコードしている。PRVのg
p IIはHSV−1 gB相同物である（62）。PRV gp IIに対す
るモノクローナル抗体はインビトロにおいて（５）補体
と共に或いは補体なしで（81）ウイルスを中和する。さ
らに、受動免疫実験の結果、中和モノクローナル抗体は
ブタを部分的に防御したが、ビルレントウイルス感染か
らマウスを防御することはできなかった（102）。PRVの
gp II糖タンパク質によるブタの能動免疫はこれまで報
告されていない。
ここ20年間、単純ヘルペスウイルス２型（HSV2）によ
る陰部感染の発生率は大幅に上昇した。最近の推計で
は、米国内で５百万人から２千万人が陰部ヘルペスを保
有している（112）。ACG（acyclovir）による経口治療
によって１次感染の重篤度が減少し（113）かつ再発的
な症状の再現を抑制する（114）ことが示されてはいる
が、これらの感染症の制御及び治療は理想からほど遠
い。従って１次感染及び再発感染を防ぐワクチンが必要
である。
単純ヘルペスウイルス１型（HSV1）ゲノムは少なくと
も８種類の抗原性の異なる糖タンパク質、gB、gC、gD、
gE、gG、gH、gI及びgJをコードしている（115）。これ
らの遺伝子に相同な遺伝子がHSV2に存在するらしい（11
6−119）。これらの糖タンパク質はウイルス粒子のエン
ベロープと感染細胞の細胞質膜の両方に存在するので、
体液性免疫防御反応及び細胞性免疫防御反応を誘起し得
る（37）。
単純ヘルペスウイルス感染に対する防御における体液
性免疫と細胞性免疫の相対的重要性は十分には解明され
ていない。HSV1の精製gB、gC又はgDで免疫したマウスは
致死量のHSV1感染から防御される（120）。HSV1（121）
もしくはHSV2ウイルス全体（122）に対する抗体又はHSV
2の糖タンパク質gB、gC、gDもしくはgEの各々に対する
抗体（123）で受動免疫したマウスは致死量のHSV1又はH
SV2感染から防御される。ただし、放射線照射、シクロ
ホスファミド又は抗胸腺細胞血清で免疫抑制した動物は
防御されないので（124）、この防御は受容能を有する
Ｔ細胞の応答（competent T−cell response）に依存し
ているらしい。
免疫防御反応の誘起において、個々の糖タンパク質が
如何なる寄与をしているかはまだ十分には理解されてい
ない。ただし、これらの糖タンパク質をワクシニアなど
の異種系中で発現させることによって若干の要因が解析
できるようになった。例えばHSV1 gB（125）又はHSV1 g
C（32）を発現するワクシニアウイルスベクターは細胞
障害性Ｔ細胞応答を誘起することが示されている。さら
に、HSV1 gB（８）、HSV1 gC（126）又はHSV1 gD（26）
のいずれかを発現する組換えワクシニアウイルスで免疫
したマウスは、致死量のHSV1に対して防御されることが
示されている。HSV1 gDを発現する組換えワクシニアウ
イルスは、また、モルモットを用いたモデル系におい
て、HSV2に対する防御力のあることが示されている（4
4）。しかしながら、多重HSV抗原を発現させたときに上
記防御反応が強化されるか否かは不明である。
ウシヘルペスウイルス１型（bovine herpesvirus typ
e1,略してBHV1）は結膜炎、外陰部膣炎及び流産などの
畜牛の種々の病気の病原体である（127）。このウイル
スはウシ呼吸器病の最も重要な病原体の一つであり、直
接作用することもあるし、細菌感染に対する素因病原体
として作用することもある（128）。
BHV−１には30種類以上の特異的構造ポリペプチドが
存在し、そのうちの11種類はグリコシル化されている
（129）。これらの糖タンパク質のうちの４つ、即ちg
I、g II、g III及びg IVが既に特徴付けられており、単
純ヘルペスウイルス（HSV）の糖タンパク質gB、gC、gD
及びgEの相同物であることが判明している（130,13
1）。
g I、g III及び／又はg IVからなるサブユニットワク
チンが畜牛を病気から防御することは（BHV/パスツリア
・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）エーロゾ
ル感染モデル系を用いて）示されているが、感染を防ぐ
ことはできない（132）。これらの結果は、BHV1に対す
る免疫反応を十分に誘起する上でのこれらの糖タンパク
質の重要性を示している。
g I及びg IIIはワクシニアウイルスにもクローン化さ
れており、これらの組換え体で免疫した畜牛はBHV1に対
する中和抗体を産生する（56,133）。
ネコの鼻気管炎は世界中に蔓延している猫の病気であ
って、ネコヘルペスウイルス１型（feline herpesvirus
type1,略してFHV−１）と名付けられたアルファヘルペ
スウイルスによって引き起こされる。他のヘルペスウイ
ルスと同様に、FHV−１は潜伏感染を成立し、周期的に
再活性化される（134）。繁殖集団中でのFHV−１感染は
子猫の死亡率が高いことを特徴とする。上部気道で２次
感染が起きると成体を非常に衰弱させる。修飾生ワクチ
ン又は不活性ワクチンを用いてこの病気を制御する試み
が現在なされている。かかるワクチンは症状の発展を抑
制することはできるが、感染を防ぐことはできず、ウイ
ルスが発散してしまう。従って、無症状のワクチン接種
猫はビルレントウイルスを伝播することがあり、既存の
ワクチン（135）又は開発中のより安全な精製サブユニ
ットワクチン（136,137）では潜伏感染を防ぐことはで
きない。
ヘルペスウイルス糖タンパク質は宿主細胞へのウイル
ス粒子の付着を媒介し、ウイルスの感染力に非常に重要
である（138,139）。これらはウイルスの亜型特異性を
も決定する（140）。ヘルペスウイルス糖タンパク質抗
原は体液性及び細胞性免疫系の双方によって認識され、
ワクチン接種した宿主中での免疫防御反応を誘発するこ
とが示されている（44,107,141,142）。FHV−１は少な
くとも23種類の異なるタンパク質を含んでいる（143,14
4）。これらの中の少なくとも５種類のタンパク質がグ
リコシル化されており（144,145）、それらの分子量は1
20kDaから60kDaの範囲にあると報告されている。FHV−
１糖タンパク質は免疫原生を有することが示されている
（143,145）。
幾つかの他のアルファヘルペスウイルスと同様、FHV
−１はHSV−１の糖タンパク質Ｂ（gB）の相同物を有す
るらしく、FHV−1 gB遺伝子の部分的塩基配列が最近報
告された（146）。HSV−1 gBはウイルスの侵入及び細胞
融合に必要とされる（147−149）。HSV−1 gB及び他の
ヘルペスウイルスのgBアナログは重要な循環抗体並びに
細胞性免疫反応を誘起する（8,10,37,47,73,150）。FHV
−１のgB糖タンパク質は134kDaの複合体で、β−メルカ
プトエタノールによって66kDaと60kDaの２つの糖タンパ
ク質に解離する。FHV−１のDNAゲノムの大きさはおよそ
134Kbである（153）。
ヒトＢリンパ球指向性ヘルペスウイルスであるエプス
タイン・バールウイルス（Epstein−Barr virus,略して
EBV）は、ガンマヘルペスウイルス（gammaherpesviru
s）亜科のリンホクリプトウイルス属（Lymphocryptovir
us）の一種である（115）。このウイルスは伝染性単核
症（154）及びＢ細胞リンパ腫（156）の病原体である。
EBVは２種類のヒトの悪性腫瘍、即ち風土的なバーキッ
トリンパ腫並びに未分化上咽頭がんと関係している（15
6）。
VZV（66）及びHSV1（158）のゲノムと同様にEBVゲノ
ムの塩基配列は完全に決定されており（207）、これら
の異なるヘルペスウイルス間における多くの相同性が判
明している（159）。かかる相同性に基づいてEBVの幾つ
かの解読枠（open reading frame;略してORF）の潜在的
機能が予想されたこともある。免疫に関連するHSV1遺伝
子と相同なEBV遺伝子が特に興味深い。EBVBALF4遺伝子
はHSV1 gB（68）と、EBV BXLF2遺伝子はHSV1 gH（161）
と相同性を有している。また、EBVBBRF3遺伝子はCMVの
膜タンパク質（162）との相同性部位を含んでいる。
EBVタンパク質の中でワクチン抗原として使用できそ
うなもののうち最も特徴付けられているのは、２つの主
要エンベロープ糖タンパク質、即ちgp340とgp220であ
る。この２つの糖タンパク質は同一の遺伝子からスプラ
イシングによって得られる。このとき読取り枠に変化は
ない（163,164）。gp340に対するモノクローナル抗体及
びポリクローナル血清はインビトロでEBVを中和する（1
65）。精製gp340（166）並びに組換えEBV gp340ワクシ
ニアウイルス（167）で免疫するによって、唯一の罹患
性動物である綿毛タマリン（cottontop tamarin）を防
御することができる。この場合、ワクシニアWR株由来の
組換え体では防御できたが、ワクシニアのワイエス（Wy
eth）株由来の組換え体では防御できなかった。ワイエ
ス株はワクチン株として広範に使用されているものであ
る。
gp85（EBVにおけるHSV1 gH相同物）に対するモノクロ
ーナル抗体はインビトロ中和抗体であると記載されてい
る（168,169）。
ヒトサイトメガロウイルス（human cytomegalovirus,
略してHCMV）は、ベータヘルペスウイルス（betaherpes
virus）亜科（ヘルペスウイルス科）の一種である。HCM
Vは、特異的免疫が実質的に成立していても、増殖性の
持続感染を生じ得る。HCMVは普通余り高い病原性は有さ
ないとはいっても、子宮内感染は新生児全体の約0.15％
に脳障害又は難聴をもたらし、かつ臓器移植時の最も一
般的な感染性合併症である（170）。実験的な弱毒化生H
CMVワクチン（タウン（Towne）株）の効能が実証されて
はいるものの（171）、生ワクチン株についての懸念か
ら、サブユニットワクチンとして使用可能なHCMVタンパ
ク質の同定に研究が方向付けられている。かかる研究に
おいては、ウイルス粒子の糖タンパク質の同定並びにそ
れらの予防薬としての評価が重要なステップとなる。
HCMVエンベロープ関連糖タンパク質として免疫学的に
区別される３つの群が記載されている（172）。即ち、g
C I（gp55及びgp93−130）、gC II（gp47−52）及びgC
III（gp85−p145）である。
gC Iをコードする遺伝子はHSV1 gBと相同である。gC
II糖タンパク質は、直列に配置されかつ１カ所もしくは
２カ所の相同性領域を有する５つの遺伝子のファミリー
（HXLF）でコードされている。ただし、gC IIは５つの
遺伝子の中の２つの遺伝子だけでコードされている可能
性が高い（172,173）。gC IIIをコードする遺伝子はHSV
1 gHと相同である（174）。
上記の３つの群のそれぞれに対して特異的なインビト
ロ中和抗体が記載されている（174−176）。
ヘルペスウイルス抗原に対する抗体の産生（宿主によ
る）を誘起する抗原決定基として宿主中で発現するよう
な外来ウマヘルペスウイルス遺伝子を保有する適切に修
飾されたポックスウイルス変異株は、新規ワクチンを与
えるが、かかる新規ワクチンは従前の死滅又は弱毒化生
ウイルスを用いるワクチンの欠点を有さない。従って、
例えば死滅ウイルスからワクチンを生産するには、大量
のウイルスを増殖させ、次いで抗原性に影響を与えずに
その感染力を選択的に破壊処理する必要がある。一方、
弱毒化生ウイルスを含有するワクチンには、該弱毒化ウ
イルスが病原状態に復帰する可能性が常に存在する。こ
れに対して、病原性ヘルペスウイルスの抗原決定基をコ
ードするウマヘルペスウイルス遺伝子で適切に修飾した
組換えポックスウイルスをワクチンとして用いる場合、
かかるポックスウイルスは病原性ウイルスの抗原決定基
をコードする遺伝子しか含んでおらず、病原体の複製を
担う遺伝子部分は含んでいないので病原性ウイルスに復
帰する可能性はない。
PRVは多くの哺乳類（牛や犬など）に感染してその命
を奪う。しかしながら、成豚は感染しても通常は生き残
るので、重要なウイルス保菌宿主である。PRVは多大な
経済的損失をもたらすので、弱毒化又は死滅ワクチンに
よる豚のワクチン接種は多くの国々で行なわれている。
豚のPRV感染を抑制し、かつ経済的損失を軽減する試
みは、修飾生ワクチン又は不活化ワクチンを用いる能動
免疫によって行なわれてきた。弱毒化ワクチンは一般に
長期間持続する免疫を誘起し、価格面での効果も高い
が、弱毒化が不十分である危険性や遺伝的に不安定であ
る危険性がある。不活化ワクチンは有効性が低く、何度
も免疫する必要があり、強いアジュバントを含んでいる
のが普通である。このようなアジュバントを配合する
と、ワクチン接種後に食欲不振、高熱又は妊娠中の雌豚
の流産などのアレルギー反応を起こす場合がある。かか
るタイプのワクチンにはさらに、潜伏感染の予防、ワク
チンの効能に対する母性抗体の効果の克服、並びにワク
チン接種動物をPRV既感染動物から識別するための血清
学的診断検定の使用の可能性の消失の面で欠点がある。
免疫学的関連性を有するPRV遺伝子産物を発現する組
換えポックスウイルスの使用などのような別のワクチン
法には、（ａ）場から弱毒化生PRVワクチン株を排除で
きること、並びに（ｂ）ワクチン接種動物と感染もしく
は血清学的陽性動物との識別ができることなどの、幾つ
かの利点がある。後者は、ワクチン接種動物を自然感染
動物と正確に識別するような適当な診断薬を使用するこ
とによって達成できる。このことは、血清学的に陽性な
動物の移動を取締まる規制が存在するので、考慮すべき
重要な事項である。ワクチン接種は、さらに、ある集団
から感染動物を試験し排除するのに、より経済的で都合
がよい。かかるワクチンの開発には、防御免疫を誘起す
る際のPRV抗原の寄与に関する知識を必要とする。PRVの
場合は、ヘルペスウイルス科の他のウイルスと同様に、
糖タンパク質が、有効なサブユニット組換えワクチン中
に存在せしめるべき抗原の重要候補である。
最近、ワクシニアウイルス組換え体の作成技術が、ポ
ックスウイルス科のさらに宿主域の限定された他のウイ
ルスにまで拡張された。特に、鳥類の中で複製するアビ
ポックスウイルスが、免疫学的関連性を有する遺伝子産
物を発現するように遺伝子工学的に組換えられている。
アビポックス組換え体を鳥類（42,177）及び非鳥類（4
1）に接種すると、対応する病原体に対する免疫防御反
応を誘起する。
BHV1に対する弱毒化生ワクチン及び不活化ワクチン
は、30年以上も利用されており、BHV1関連病の発生率を
十分に低下させてきた。しかしながら、これらのワクチ
ンは潜伏感染や野生型ウイルスによる再感染を予防しな
い。これらのワクチンは、感染動物とワクチン接種動物
との識別を複雑化させる。
どちらのタイプのワクチンも他の重大な欠点を有す
る。妊娠中の雌牛に弱毒化生ワクチンを接種すると、胎
児が死んで流産することもある（127）。さらに、ワク
チン接種動物はウイルスを発散することが示されている
（178）。従って、妊娠中の雌牛と一緒に飼育している
ワクチン接種動物は、妊娠中の雌牛に感染性ウイルスを
伝播し、胎児を流産させてしまうこともある。
不活化ワクチンは流産を誘発したりウイルスの放出を
引き起こすことはない。しかしながら、不活化ワクチン
はアジュバントを必要とし、過敏症（アナフィラキシ
ー）及び非致命的炎症及び発熱を引き起こす場合がある
（179）。
ワクチン接種における最も重要な問題の一つは、母性
免疫を克服もしくは回避することである。これに関し
て、仮に母親がある特定の病原体に対する免疫を獲得し
ていると、母親における「免疫」は初乳中に存在する抗
体及び／又は他の経路を介して新生児に伝達される。し
かしながら、新生児には母性免疫のレベルが十分に薄れ
るまでワクチン接種してもうまくいかない。従って、効
能をなくすような母性免疫の存在下で新生児に成功裡に
ワクチン接種することのできる余地は僅かしかない。
従って、ヘルペスウイルス組換えポックスウイルス並
びにヘルペスウイルス感染に対して防御免疫を賦与する
ワクチンを提供することは、現技術に生ウイルス接種の
利点を与え、かつ上述の問題を軽減もしくは解消するも
のであって、現在の技術水準をはるかに超えた進歩であ
る。
発明の目的 本発明の目的は、従って、ヘルペスウイルスの遺伝子
産物を発現するような組換えポックスウイルスを供する
こと、並びにかかる組換えポックスウイルスの作成方法
を供することである。
ポックスウイルスベクター、特にワクシニアウイル
ス、ニワトリポックスウイルス（fowlpox virus）又は
カナリアポックスウイルス（acnarypox virus）ベクタ
ー中でヘルペスウイルスのコード配列をクローニング及
び発現のための方法を供することも本発明の別の目的の
一つである。
致死量のヘルペスウイルス感染に対して、ヘルペスウ
イルス中和抗体及び防御免疫を誘起することのできるワ
クチンを供することも本発明のまた別の目的である。
本発明の上記及びその他の目的と利点は、本明細書の
以下の記載に照らせば、よりいっそう容易に理解できる
はずである。
発明の説明 本発明は、その一つの態様において、ポックスウイル
スゲノムの非必須領域中にヘルペスウイルス由来のDNA
配列を含有する組換えポックスウイルスに関する。好適
には、上記ヘルペスウイルスはアルファヘルペスウイル
ス亜科、ベータヘルペスウイルス亜科又はガンマヘルペ
スウイルス亜科の一種である。詳細には、上記ヘルペス
ウイルス由来のDNA配列はヘルペスウイルス糖タンパク
質をコードする。より詳細には、上記ヘルペスウイルス
糖タンパク質は、ウマヘルペスウイルスgp13、ウマヘル
ペスウイルスgp14、ウマヘルペスウイルスgD、ウマヘル
ペスウイルスgp63、ウマヘルペスウイルスgE、仮性狂犬
病ウイルスgp50、仮性狂犬病ウイルスgp II、仮性狂犬
病ウイルスgp III、仮性狂犬病ウイルスgp I、単純ヘル
ペスウイルスgB、単純ヘルペスウイルスgC、単純ヘルペ
スウイルスgD、ウシヘルペスウイルスg I、ネコヘルペ
スウイルスgB、エプスタイン・バールウイルスgp220、
エプスタイン・バールウイルスgp340、エプスタイン・
バールウイルスgB、エプスタイン・バールウイルスgH及
びヒトサイトメガロウイルスgBからなる群から選択され
る。
本発明においては、該組換えポックスウイルスは外来
ヘルペスウイルス遺伝子の遺伝子産物を発現する。詳細
には、上記外来DNA配列はヘルペスウイルス糖タンパク
質をコードするものであり、該外来DNA配列はヘルペス
ウイルス糖タンパク質の産生によって宿主中で発現す
る。好適には、組換えポックスウイルスによって複数の
ヘルペスウイルス糖タンパク質を宿主中で同時発現させ
る。ポックスウイルスは好適にはワクシニアウイルス又
はアビポックスウイルス（ニワトリポックスウイルスも
しくはカナリアポックスウイルスなど）である。
本発明は、別の態様において、ワクチン接種した宿主
動物中で免疫応答を誘起させるためのワクチンにして、
ヘルペスウイルス由来のDNAをポックスウイルスゲノム
の非必須領域中に含有する組換えポックスウイルスと担
体とを含むワクチンに関する。より詳細には、上記DNA
はヘルペスウイルス糖タンパク質をコードし、発現す
る。好適には、上記ポックスウイルスによって複数のヘ
ルペスウイルス糖タンパク質を宿主中で同時発現させ
る。本発明で使用するポックスウイルスは、好適には、
ワクシニアウイルス又はアビポックスウイルス（ニワト
リポックスウイルスもしくはカナリアポックスウイルス
など）である。
本発明は、別の態様において、母性免疫の問題を回避
する機構に関する。投与抗原に対する抗体が存在するこ
とが障害になっているとすると、母性免疫による障害
は、ある部分集合に限定した抗原群を発現するベクター
を選択的に使用することによって解決もしくは回避でき
る。例えば、妊娠中の動物には、仮性狂犬病ウイルス糖
タンパク質gp50を発現する組換えワクシニアウイルスワ
クチンを接種することができ、その子には、出産時もし
くは出産後まもなく、別の仮性狂犬病ウイルス糖タンパ
ク質gp II又はgp III又はその組合わせを発現するワク
シニア組換えワクチンを接種することができる。一方、
母性免疫による障害がベクターによるものであるとすれ
ば、母親をあるベクター（ワクシニア又はアビポック
ス）で、子を別のベクターで差別的にワクチン接種すれ
ばよい。この手順は、無論、異なるベクターを使用する
ことのみならず、異なる型の糖タンパク質を発現するベ
クターを使用することをも考慮に入れたものである。従
って、本発明は他の方法では新生児にうまく免疫賦与す
ることのできない母性免疫を解決もしくは回避する方法
に関する。本発明では、ポックスウイルスゲノムの非必
須領域に非ポックス由来のDNAを含有する組換えポック
スウイルスを新生児に接種するが、該DNAは新生児の病
原体の第一の抗原をコードするもので、しかも該抗原は
該新生児の母親において同一病原体に対する免疫応答を
誘起するために使用した同一病原体の第二の抗原とは異
なるものである。また、本発明では、第一のポックスウ
イルスゲノムの非必須領域に非ポックス由来のDNAを含
有する第一の組換えポックスウイルスを新生児に接種す
るが、該DNAは新生児の病原体の抗原をコードするもの
で、該第一のポックスウイルスは該新生児の母親におい
て同一病原体に対する免疫応答を誘起するために使用し
た第二の組換えポックスウイルスとは異なるものであ
る。
図面の簡単な説明 本発明は添付図面を参照することによってより深く理
解できると思われる。
図１は、組換えワクシニアウイルスvP425の構築方法
を図示したものである。
図２は、EHV−１のgp13コード配列を含有する1.88Kb
フラグメントのDNA配列を示したものである。
図３は、EHV−1 gp13遺伝子を含有する組換えワクシ
ニアウイルスvP483の構築方法を図示したものである。
図４は、組換えワクシニアウイルスvP458の構築方法
を図示したものである。
図５は、EHV−1 gp14遺伝子を含有する組換えワクシ
ニアウイルスvP577の構築方法を図示したものである。
図６は、EHV−１のgp14コード配列を含有する3.35Kb
フラグメントのDNA配列を示したものである。
図７は、EHV−1 gp14コード配列に対して相対的親水
性度をプロットしたものである。
図８は、EHV−1 gp13遺伝子を含有する組換えニワト
リポックスウイルスvFP44の構築方法を図示したもので
ある。
図９は、EHV−1 gp13遺伝子を含有する組換えカナリ
アポックスウイルスvCP48の構築方法を図示したもので
ある。
図10は、修飾型EHV−1 gp14遺伝子を含有するドナー
プラスミドpHES−MP63、pHES−MP1及びpHES−MP34の構
築方法を図示したものである。
図11は、EHV−１ケンタッキーＤ株のBamH I切断部位
地図であり、ゲノムの逆方向反復配列は四角で示してあ
る。６つの主要EHV−１糖タンパク質遺伝子の位置、並
びにゲノムの領域の拡張部分（gD、gp63及びgE遺伝子が
含まれる）が示してある。
図12は、EHV−１のgD、gp63及びgEコード配列を含有
する6402bpフラグメントの塩基配列を示したものであ
る。
図13は、EHV−1 gDを構成する402残基のアミノ酸配列
の疎水性度をプロットしたものである。
図14は、EHV−1 gp63を構成する413残基のアミノ酸配
列の疎水性度をプロットしたものである。
図15は、EHV−1 gEを構成する552残基のアミノ酸配列
の疎水性度をプロットしたものである。
図16は、ドナープラスミドpJCA006、pJCA007及びpJCA
008（それぞれEHV−1 gD遺伝子、EHV−1 gE遺伝子及びE
HV−1 gp63遺伝子を含有する）の構築方法、並びにこれ
らの遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルスの作成
方法を図示したものである。
図17は、ドナープラスミドpJCA009（EHV−１由来のgD
及びgp63遺伝子を含有する）及びpJCA010（EHV−１由来
のgD、gE及びgp63遺伝子を含有する）の構築方法、並び
にこれらの遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス
の作成方法を図示したものである。
図18は、PRV gp II遺伝子を含有するドナープラスミ
ドPR18の構築方法、並びにPRV gp II遺伝子を発現する
組換えワクシニアウイルスの作成方法を図示したもので
ある。
図19は、PRV gp II解読枠のDNA配列を示したものであ
る。
図20は、PRV gp III遺伝子を含有するドナープラスミ
ドpPR24の構築方法、並びにPRV gp III遺伝子を発現す
る組換えワクシニアウイルスの作成方法を図示したもの
である。
図21は、PRV gp III解読枠のDNA配列を示したもので
ある。
図22は、PRV gp50遺伝子を含有するドナープラスミド
pPR26の構築方法、並びにPRV gp50遺伝子を発現する組
換えワクシニアウイルスの作成方法を図示したものであ
る。
図23は、PRV gp50解読枠のDNA配列を示したものであ
る。
図24は、プラスミドpSD478VC及びpSD479VCBGの構築方
法、並びにβ−ガラクトシダーゼのワクシニアウイルス
への挿入方法を図示したものである。
図25は、プラスミドpMP13PPの構築方法を図示したも
のである。
図26は、PRV gp II遺伝子を含有するプラスミドpFPPR
VIIの構築方法を図示したものである。
図27は、PRV gp II遺伝子を発現する組換えカナリア
ポックスウイルスvCP55の構築方法を図示したものであ
る。
図28は、PRV gp I遺伝子を発現する組換えワクシニア
ウイルスvP717の構築方法を図示したものである。
図29は、HSV−2 gB遺伝子を発現する組換えワクシニ
アウイルスvP569及びvP734の構築方法を図示したもので
ある。
図30は、HSV−2 gC遺伝子を発現する組換えワクシニ
アウイルスVP579、VP748及びvP776の構築方法を図示し
たものである。
図31は、HSV−2 gD遺伝子を発現する組換えワクシニ
アウイルスvP570、vP761、vP775及びvP777の構築方法を
図示したものである。
図32は、BHV−1 g I遺伝子を発現する組換えワクシニ
アウイルスvP637及びvP724の構築方法を図示したもので
ある。
図33は、FHV−1 gB遺伝子を含有するドナープラスミ
ドpJCA001の構築方法、並びにFHV−1 gB遺伝子を発現す
る組換えワクシニアウイルスvP713の構築方法を図示し
たものである。
図34は、FHV−１の糖タンパク質gBをコードするDNAの
3400塩基対部分の塩基配列を示したものである。
図35は、FHV−1 gBを構成する947残基のアミノ酸配列
の疎水性度をプロットしたものである。
図36は、EBV gp220遺伝子を含有するドナープラスミ
ド409gp220、及びEBV gp340遺伝子を含有するドナープ
ラスミド409gp340の構築方法の構築方法を図示したもの
である。
図37は、EBV gB遺伝子を含有するワクシニアドナープ
ラスミド409gBの構築方法を図示したものである。
図38は、EBV gH遺伝子を含有するワクシニアドナープ
ラスミド486gHの構築方法を図示したものである。
図39は、EBV由来のgp340、gB及びgH遺伝子を含有する
ワクシニアドナープラスミド513gHgBgp340の構造を図示
したものである。
図40は、CMV gB遺伝子を含有するワクシニアドナープ
ラスミド409CMVgBの構築方法を図示したものである。
図41は、HCMV（タウン株）のHXLF1遺伝子の塩基配列
及びアミノ酸配列を示したものである。
図42は、HCMV（タウン株）のHXLF2遺伝子の塩基配列
及びアミノ酸配列を示したものである。
発明の詳細な説明 本発明とその利点は、説明のために挙げる以下の実施
例から、より深く理解されるであろう。
例１−ウマヘルペスウイルスgp13糖タンパク質を発現す
る組換えワクシニアウイルスの構築 大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子によるワクシニアHA
遺伝子の置き換え この例で移用したワクシニアウイルスコペンハーゲン
株は、ローヌ・メリュー社（（Rhone Merieux,Inc.）、
ジョージア州アセンズ（Athens））から入手した。
このウイルスは、10％ウシ胎児血清（FBS）を含有す
るイーグルの最小必須培地（MEM）中のVERO細胞（ATCC
番号CCL81）又はMRC−５（ATCC番号CCL171）上の精製プ
ラーク単離物から増殖させた。野生型ウイルスから、常
法（25,28）によりチミジンキナーゼ遺伝子の全コード
配列を欠失させた誘導型を単離し、これをvP410と命名
した。このチミジンキナーゼ欠失変異株をそれ以降の操
作に使用した。プラスミドの構築、スクリーニング及び
増殖は常法（20,27,28）に従った。
図１を参照して説明する。ワクシニアウイルスの13Kb
Sal I Fフラグメント（Hind III A/Bフラグメント連結
部にまたがる）をSal I消化pUC8に連結して、pSD419VC
を得た。pSD419VCの右側アーム（arm）（Sal I Fフラグ
メントのHind III B部分に対応する）をHind IIIで消化
して除去し、次いで連結してpSD456VCを得た。pSD456VC
は従ってHind III Aフラグメントの右端を含んでおり、
この中には赤血球凝集素（HA）遺伝子（35）の全コード
領域及びその両隣の約0.4Kbのワクシニア配列が存在す
る。
実質上HAコード配列を含まないプラスミドベクターを
作成するために、pSD456VCをHA遺伝子上流のRsa I部位
で切断（部分消化）し、かつHA遺伝子の３′末端から80
塩基対離れたEag I部位で切断した。約3.5KbのRsa I/Ea
g Iフラグメントをアガロースゲルから単離した。
Rsa I部位からHAコード配列の２塩基上流までの領域
を置き換え、その直後にBal II、Sma I及びPst I制限酵
素部位並びにEag I付着末端が続くように、合成オリゴ
ヌクレオチドMPSYN59−62を調製した。MPSYN59−62の配
列とその上記制限酵素部位は以下の通りである。
アニールさせたMPSYN59−62混合物を、pSD456VC由来
の上記3.5KbのRsa I/Eag Iフラグメントに連結して、pS
D466VCを得た。従って、pSD466VCにおいては、HA遺伝子
がポリリンカー領域に置き換っている。
ワクシニア11kDaプロモーター（７）の転写調節下に
置かれたpMC1871（34）由来の大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含有する3.2KbのBgl II/BamH I（部分）フ
ラグメントを、Bal IIで消化しておいたpSD466VC中にク
ローン化した。11kDaプロモーター／β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子カセット（両隣のワクシニアアームに対して
左から右の方向に置かれている）を含有するプラスミド
をpSD466VCBGAと命名した。このプラスミドを、ワクシ
ニアウイルスコペンハーゲン株のチミジンキナーゼ欠失
変異株vP410と組換えて、β−ガラクトシダーゼを発現
するワクシニア組換え体vP425を得た。ワクシニアゲノ
ムに対して右から左に転写される短い潜在的解読枠を破
壊しないように、HA遺伝子のカルボキシ末端の80bpを残
した。
組換えワクシニアウイルスvP425（184）は、文献記載
の通り（9,24）、発色基質Ｘ−gal存在下での青色プラ
ーク形成に基づいて同定した。後続のワクシニア組換え
体においてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をさらに別の外
来遺伝子で置き換えた場合、青色プラークの代りに無色
のプラークを単離することによって容易に獲得すること
ができる。
以降のクローニング工程を簡単にするために、pSD466
VCをBamH I/EcoR Iで消化し、大腸菌ポリメラーゼのク
レノウフラグメントで平滑末端とし、かつ再連結するこ
とによって、pUC8マルチクローニング領域由来のSma I
部位を除去した。従って、得られたプラスミドpSD467VC
に残っている唯一のSma I部位はHA欠失部のポリリンカ
ー領域中にある。
EHV−1 gp13遺伝子をコードするDNAの同定 糖タンパク質EHV−1 gp13をコードするDNA配列は、EH
V−１の7.3Kb BamH I−Ｈフラグメント中に存在する
（３）。pUC（BamH I−Ｈ）領域から、重複サブクロー
ンを利用し、修飾T7酵素「シーケナーゼ（SEQUENAS
E）」（40）（USバイオケミカルズ社（U.S.Biochemical
s）製、オハイオ州クリーブランド）を用いて、それぞ
れの鎖について塩基配列に関するデータを得た。アルカ
リ中で変性した二本鎖鋳型プラスミドについて標準的な
ジデオキシチェーンターミネーション法（33）を行なっ
た。正逆両方向のM13プライマーを用いて各クローンの
最初の塩基配列を得た。標準的な化学的手法（バイオサ
ーチ8700（Biosearch 8700）（カリフォルニア州サンラ
ファエル（San Rafael））、アプライド・バイオシステ
ムズ380B（Applied Biosystems 380B）（カリフォルニ
ア州フォスターシティー（Foster City））で合成した1
6−17量体プライマーを用いて残りのフラグメントの塩
基配列を決定した。塩基配列のデータ解析にはすべてIB
Iパステル（IBI Pustell）配列決定プログラム（29）を
使用した。
DNA配列の解析から、468残基のアミノ酸からなる推定
50.9kDaの１次翻訳生成物をコードする1404bpの解読枠
が明らかになった。gp13解読枠の予想アミノ酸配列のカ
ルボキシ末端側は、単純ヘルペスウイルス１型及び２型
のgC、仮性狂犬病ウイルスのg III及び水痘帯状疱疹ウ
イルスのgp Vとかなりの相同性を有しており、gp13がヘ
ルペスウイルスのgC様糖タンパク質群に属することを示
唆している。EHV−1 gp13解読枠のより詳細な解析は先
行文献（２）に記載されている。ワクシニアベクター中
でのEHV−1 gp13解読枠のクローニング及び発現に関す
る説明を容易にするために、gp13解読枠並びに５′及び
３′側の配列を図２に示してある。図２においては、TA
TAボックスと推定される塩基配列、並びにシグナルペプ
チドと膜アンカーペプチドと推定されるアミノ酸部分に
下線を施した。切断シグナル「ASA」（中抜きの丸印で
示した部分）に続くシグナル配列の仮想切断部位を矢印
で示した。潜在的に、シグナル配列とアンカー配列との
間にAsn−Ｘ−Ser/Thrモチーフで定まるＮ−グリコシル
化部位が９カ所存在する（星印の部分）。
EHV−1 gp13遺伝子のワクシニアドナープラスミド中へ
のクローニング ニワトリポックスウイルスベクター（41,42）中で外
来遺伝子を発現させるために、ワクシニアウイルスの初
期／後期プロモーターであるH6を使用した。このプロモ
ーター要素は、ワクシニアHind III−Ｈフラグメント中
のH6解読枠のすぐ上流にあるDNA配列に対応する（3
1）。
今度は図３を参照して説明する。H6プロモーターに変
異を導入してpSD467VCに挿入するために、オリゴヌクレ
オチド対H6SYN oligos A−Ｄを合成した。H6SYN oligos
A−Ｄの配列を、修飾塩基（下線部）及び制限酵素部位
と共に、以下に示す。
下線部の塩基は、ネイティブなH6プロモーター配列を
修飾した部位を示す。
H6SYN oligos A−Ｄのアニーリングによってできた全
長130bpの二本鎖DNAをアガロースゲルから電気的に溶出
し、pSD467VC由来の0.5KbのSma I/Hind IIIフラグメン
ト及び3.1KbのBal II/Hind IIIフラグメントに連結し
た。得られたプラスミドpTP15（184）は、ATG開始コド
ンがCCCに修飾されてSma I部位の一部となっており、そ
の直後にPst I部位が続いている。pTP15のSma I部位
に、Nsi Iリンカー［５′−TGCATGCATGCA−３′］（ニ
ュー・イングランド・バイオラボズ（New England BioL
abs）社製、マサチューセッツ州ベヴァリー（Beveru
y））を挿入して、プラスミドpSN Iを得た。
EHV−１のEcoR I/Nar Iフラグメント（EcoR I部位はA
TG開始コドンの120bp上流であり、Nar IはEHV−1 gp13
のTAG終止コドンの23bp上流である）をM13mp19ファージ
にクローン化して、組換えファージM13EcoRNarを得た。
オリゴヌクレオチド特異的変異導入法（17）を用いてEH
V−1 gp13のTTGCCT配列（図２の130−135番目の塩基）
をATGCATに変えることによって、Nsi I部位を導入し
た。変異ファージM13EcoRNarから得たEcoR I/Nar Iフラ
グメントを、pUC8のEcoR I/Nar I部位にクローン化し
て、プラスミドpNSIENを得た。
以下に示す配列及び制限酵素部位を有する２つの42量
体オリゴヌクレオチドを合成した。
このオリゴヌクレオチドにおいては、終止コドン（TA
G）の直後にワクシニア初期転写ターミネーター（ATTTT
TAT）がある。該42量体オリゴヌクレオチド対をアニー
ルして得た二本鎖DNAフラグメントには、Nar I付着端、
それに続いてEHV−1 gp13遺伝子のコード配列の３′末
端、並びにワクシニア初期転写終結シグナル（45）、Ps
t I部位、及びNde I付着端が含まれている。このフラグ
メントをpNSIENのNar I/Nde I部位に挿入して、pNSIENP
Nを得た（図３）。
pNSIENPNからNsi I/Pst Iフラグメントを単離し、プ
ラスミドpNS IのNsi I/Pst I部位にクローン化して、プ
ラスミドpVHA6g13Nsi Iを得た（図３）。pVHA6g13Nsi I
を、H6フロモーター内のEcoR V部位、及びEHV−1 gp13
遺伝子の始点付近に導入しておいたNsi I部位で切断し
た。このベクターフラグメントをムング・ビーン（Mung
Bean）ヌクレアーゼで平滑末端とした。以下に示す配
列及び制限酵素部位を有する相補的32量体オリゴヌクレ
オチド対を合成した。
上記オリゴヌクレオチド対をアニールし、pVHA6g13Ns
i Iベクターフラグメントに連結して、H6プロモーター
のATG開始コドン（上記32量体の配列の下線部）とEHV−
1 gp13遺伝子とがきちんとつながったプラスミドpVHA6g
13を作成した（図３）。
vP425感染細胞にpVHA61g3をトランスフェクションし
て、EHV−1 gp13遺伝子を含有するワクシニア組換え体v
P483を得た（図３）。
ワクシニアウイルス組換え体の構築 救援ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞に対
する組換えドナープラスミドのトランスフェクション並
びにニトロセルロースフィルター上でのインシトゥ（in
situ）ハイブリダイゼーションは、文献記載の方法に
従って行なった（25,28）。大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子がワクシニアH6コード配列に置き換ったvP425
を構築するために、プラスミドDNA（HeBS中のpSD466VCB
GA、25μｇ）をVERO細胞中に電気穿孔法で導入した（バ
イオラッド・ジーン・パルサー（Bio−Rad Gene Pulse
r）、キャパシタンス960、200ボルト）。亜集密的細胞
単層（subconfluent monolayer）に細胞当り10pfuのvP4
10を１時間感染させた。感染細胞をトリプシンを用いて
採集し、HeBSで洗浄した後に電気穿孔を行なった。細胞
をMEM＋５％ウシ胎児血清培地中において37℃で24時間
インキュベートし、プロジェニィウイルスをVERO細胞単
層上に撒いた。β−ガラクトシダーゼを発現する組換え
ウイルスを、基質Ｘ−galの存在下における青色プラー
クとして検出した（9,24）。vP425中のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子がEHV−1 gp13遺伝子で置き換った組換え
ワクシニアウイルスを作成するために、pVHA6g13ドナー
プラスミドかつvP425を救援ウイルスとしたことを除い
ては上記と同様のプロトコルを用いた。EHV−１由来gp1
3含有ワクシニア組換え体vP483を、基質Ｘ−galの存在
下における無色プラークとして検出し、プラーク精製を
３回繰返した後にDNAハイブリダイゼーションを行なっ
て真の組換え体であることを確認した。
組換えワクシニアウイルスvP483感染細胞の細胞表面上
におけるEHV−1 gp13遺伝子の発現 35mmシャーレ中の22mmカバーガラス上に、シャーレ当
り５×105子のBSC−40細胞を植えた。細胞の集密度が約
80％となったところで、細胞当り2pfuのウイルスを感染
させた。１時間吸着させた後、ウイルス接種液を除去し
て、MEM＋２％ウシ胎児血清培地を加えた。感染後20時
間後に、カバーガラスを0.2％ BSA及び0.1％ NaN3含有
リン酸含塩類緩衝液（PBS＋）で洗浄し、PBS＋で千倍に
稀釈した抗gp13モノクローナル抗体14H7（３）に暴露し
た。室温の加湿チャンバー中に１時間置いた後、細胞を
PBS＋で３回洗浄した。フルオレセインイソチオシアネ
ート抱合ヤギ抗マウスIgG抗体を使用して、上記操作を
繰り返した。最後に、リン酸含塩類緩衝液（PBS）中の
２％パラホルムアルデヒド中で20分間細胞を固定した。
カバーガラスを、３％没食子酸ｎ−プロピル含有PBS中
の80％グリセロール中にマウントし、顕微鏡で蛍光を観
察した。
DNA配列から予想されるタンパク質は、膜貫通性糖タ
ンパク質に典型的な特徴を有している（14）。増殖性EH
V−１感染においては、gp13糖タンパク質は細胞の様々
な膜系に取込まれ、細胞質膜中に輸送されて、感染細胞
の外表面上で検出され得る。EHV−1 gp13はさらにEHV−
１ウイルス粒子の構成成分である。従って、免疫蛍光法
を用いて、ワクシニアウイルス組換え体vP483によって
発現されるEHV−1 gp13が感染細胞の細胞質膜上にも同
様に存在するか否かを調べた。抗gp13モノクローナル抗
体、続いてフルオレセン抱合ヤギ抗マウスIgG抗体で標
識すると、vP483感染細胞には膜上に強い免疫蛍光がみ
られたが、ワクシニアウイルスvP410感染細胞ではみら
れなかった。この事実は、ワクシニアウイルス組換え体
vP483によって発現されるEHV−1 gp13が、膜貫通性糖タ
ンパク質の真の合成について予想される通り、感染細胞
の細胞質膜上にも存在することを示唆している。
ワクシニアウイルス組換え体vP483感染細胞で合成され
るEHV−1 gp13産物の免疫沈降反応 60mmシャーレ中で集密的細胞単層を形成した２百万個
の細胞に、細胞当り10pfuのウイルスを感染させた。無
メチオニン培地中で接種した。吸着後、ウイルス接種液
を除去して、２μCi/mlの35S−メチオニンを含有する無
メチオニン培地2mlを加えた。24時間感染反応を続けた
後、３％NP−40,30mMTris（PH7.4）,450mM NaCl,3mM ED
TA,0.3％NaN3及び0.6mg/ml PMSFを含む３×緩衝液Ａを1
ml添加して細胞を溶解した。溶解細胞及び上清を回収し
て、ボルテックスし、10000×ｇで15分間遠心して、無
細胞抽出液を得た。
１×緩衝液Ａ中で1:1スラリーとして、プロテインＡ
−セファロースCL4B（ファルマシア社製、カタログ番号
17.0780.01）を調製した。ラット抗マウス抱合体（ベー
リンガー・マンハイム社製、カタログ番号605500）を上
記スラリー中に1:100に稀釈して、室温で振盪しながら
４時間上記ビーズに結合させた。ビーズを1mlの緩衝液
Ａで６回洗浄して結合していない抱合体を除去した。次
に、gp13に対するモノクローナル抗体を室温で４時間ビ
ーズに結合させた。十分に洗浄して過剰の抗体を除去し
た。1mlの感染細胞溶解液を、正常マウス血清を結合さ
せておいたプロテインＡ−セファロースで予備処理し
た。ビーズを遠心で除いた。このように予備処理した感
染細胞溶解液1mlを、特異的モノクローナル抗体を結合
させておいたビーズ100μｌと混合した。この混合物を
室温で４時間振盪した。遠心によってビーズを除去し、
１×緩衝液Ａで４回洗浄し、次いで0.2M LiCl及び2M尿
素を含有する10mM Tris（PH7.4）で２回洗浄した。抗体
−抗原複合体からビーズを除去し、レームリ（Laemml
i）の解離溶液50μｌを添加して解離させた（60,19
5）。試料を５分間煮沸処理した後、電気詠動にかけ
た。
約44kDaと約47kDaの２種類の産物（これらは予想され
た１次翻訳産物（55kDa）よりも若干小さい）、並びに
約90kDaの大きな産物（この値はEHV−1 gp13遺伝子産物
が完全にグリコシル化されたものに一致する）が検出さ
れた。対照ワクシニアウイルス感染細胞からは、これら
に相当する沈降物は得られなかった。
例２−ウマヘルペスウイルスgp14糖タンパク質を発現す
る組換えワクシニアウイルスの構築 大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子によるワクシニアM2
L遺伝子の置き換え EHV−1 gp14コード配列をワクシニアウイルスベクタ
ー中に挿入するために、大腸菌lacZ遺伝子を発現する組
換えワクシニアウイルスvP458を構築した。組換えウイ
ルスvP458中のlacZコード配列をEHV−1 gp14のコード配
列で置き換えると、Ｘ−gal（β−ガラクトシダーゼに
対する発色性基質）存在下での、EHV−1 gp14含有組換
えウイルス同定用の青色→無色プラークスクリーニング
系（9,24）が得られる。さらに、EHV−1 gp14及びEHV−
1 gp13双方を発現するワクシニアウイルス組換え体を構
築するために、例１においてEHV−1 gp13の挿入に用い
た赤血球凝集素欠失座とは別のEHV−1 gp14のための挿
入座をHind III MのM2L座に作成した。ワクシニアHind
III Mフラグメント中のM2L遺伝子の全コード配列を除去
して、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺
伝子で置き換えた。vP458を構築するためのクローニン
グ段階を図４に図解した。
今度は図４を参照して説明する。推定220残基のアミ
ノ酸からなるタンパク質をコードしかつワクシニアゲノ
ムに対して右から左に読取る解読枠全体が、ワクシニア
ウイルスのコペンハーゲン株のHind III Mフラグメント
内の唯一のBal II部位の左側に位置している。従来の命
名法（31）に従って、M1L（58）のすぐ右側に位置する
この遺伝子をM2Lと呼ぶ。Hind IIIフラグメントＭ内の
唯一のBgl II部位から左側方向についてのワクシニア
（WR株）ゲノムの欠失に関する研究（57）から、Hind I
II M内のBgl II部位の左側に含まれるワクシニアコード
配列が組織培養細胞中のウイルスの複製には必須ではな
いことが示されている。
M2L領域を外来遺伝子の挿入座として使い易くするた
めに、M2Lコード配列全体がBgl II部位で置き換えられ
たプラスミドベクターpMP409DVCを以下に述べる通り作
成した。pSD409VC（コペンハーゲン株のワクシニアHind
III MフラグメントをpUC8のHind III部位にクローン化
したもの）をBamH I/Bgl IIで消化して自己連結して、H
ind III Mの右端を除去し、Bgl II部位を破壊した。得
られたプラスミドpMP409BVCをSph I（M2L解読枠内で切
断する）で線状化し、２分間Bal31エキソヌクレアーゼ
消化処理に付した。得られたDNAに、合成49量体（５′
−TTTCTGTATATTTGCAACAATTTAGATCTTACTCAAAATATGTAACAA
T−３′，下線部がBgl II部位）を用いて変異を導入し
た（19）。変異導入プラスミドpMP409DVCにおいては、M
2Lコード配列が＋３番目の位置から解読枠の端まで欠失
している。開始コドンATGのＧをＣに換えて、欠失連結
部で唯一のBgl II部位（AGATCT）を生じさせた。
pMC1871（34）のBamH I部位間にある3.1Kbの大腸菌β
−ガラクトシダーゼ遺伝子を0.1Kbワクシニア11kDaプロ
モーター（７）の転写調節下に含有する3.2Kb Bgi II/B
amH I部分フラグメントを、pMP409DVCの唯一のBgl II部
位にクローン化した。11kDaプロモーター／β−ガラク
トシダーゼ遺伝子カセット（両隣のワクシニアアームに
対して右から左の方向に置かれている）及びゲノムを含
有する組換えプラスミドをpMP409DVCBGと命名した。pMP
409DVCBGを、例１に記載した通り、救援ワクシニアウイ
ルスvP410との組換えにおけるドナープラスミドとして
用いた。vP458と名付けた新規ワクシニア組換え体（M2L
欠失座に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現
する）を、発色性基質Ｘ−galを用いて検出し（9,2
4）、プラーククローニングを繰返して精製した。
EHV−1 gp14のクローニング 今度は図５を参照して説明する。EHV−1 gp14コード
配列は、BamH I切断フラグメントａとｉ（３）との間の
連結部にまたがっている。EHV−１の２つのDNAフラグメ
ントBamH I−ａ（21.3Kb）とBamH I−ｉ（7.2Kb）（5
9）をアガロースゲルから単離した。EHV−1 BamH I−ｉ
をプラスミドpUC8のBamH I部位に挿入して、プラスミド
pUC（BamH I−ｉ）を構築した。EHV−1 BamH I−ａフラ
グメントをEcoR Iで消化して、EcoR I/BamH I消化pUC8
に連結した。プラスミドpUC（BamH I−a/EcoR I）は、1
0KbのEHV−1 BamH I/EcoR I挿入部を含んでいる。報告
されたフラグメントの大きさによれば（59）、この挿入
部のDNA配列はEHV−１ゲノム内のBamH I−ｉフラグメン
トのDNA配列と隣接している。
塩基配列の解析 pUC（BamH I−a/EcoR I）とpUC（BamH I−ｉ）の２つ
のプラスミドから得た異なるサブクローンを使用して塩
基配列の解析を行なった。EHV−1 gp14遺伝子はBamH I
−a/i連結部にまたがっているので（３）、プラスミドp
UC（BamH I−a/EcoR I）の塩基配列決定はBamH I部位か
ら始めた。プラスミドpUC（BamH I−ｉ）の配置を制限
酵素消化で決定した。pUC（BamH I−ｉ）のEcoR I部位
に最も近いEHV−1 BamH I末端はBamH I−a/i連結部のBa
mH I部位であることが判明したので、このフラグメント
の塩基配列決定はこのBamH I端から開始した。
例１に記載した方法で、それぞれの鎖について塩基配
列に関するデータを得た。EHV−1 gp14コード配列を含
有する3351bpフラグメントの塩基配列を図６に示す。欄
の左端と右端に付けた番号はそれぞれアミノ酸配列と塩
基配列に関するものである。CATボックス及びTATAボッ
クスと推定される塩基配列に下線を施した。シグナル及
び膜貫通領域にも下線を施し、シグナルペプチドの推定
切断部位を矢印で示した。コンセンサス（Asn−Ｘ−Ser
/Thr）配列からなる13カ所の潜在的グリコシル化部位を
星印で示した。
DNA配列解析から、EHV−１ゲノムに対して左から右に
読み取る300番目の塩基から3239番目の塩基までの解読
枠が判明した。即ちATG開始コドンはBamH I−a/EcoR I
フラグメントに含まれており、終始コドンTAAはBamH I
−ｉフラグメントに含まれていた（3,59）。
転写調節シグナルと思われる配列が、ATG（開始）コ
ドン（300番目）の５′側に見付かった。配列「AAATATA
T」（148番目から155番目の塩基）を有するTATAボック
スが、71番目から77番目の配列「GGTCAAT」を有するCAT
ボックスの70塩基下流に位置している。ポリアデニル化
シグナル「AATAAA」（3251番目から3256番目の塩基）
が、TAA終始コドン（3240番目から3242番目の塩基）の
８塩基下流に位置している。配列「５′−TCCTGCGCGCA
−３′」（218番目から228番目の塩基）中の11個の塩基
のうち９個の塩基が18SリボソームRNAの配列「３′−AG
GAAGGCGT−５′」（61）と相補的であり、リボソーム結
合部位として機能している可能性がある。
EHV−1 gp14構造の解析 EHV−1 gp14解読枠は980残基のアミノ酸をコードして
おり、その分子量は109.8kDaであると計算される。アミ
ノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通する多
くの特徴が明らかになった。58番目から99番目までのア
ミノ酸領域は、特徴的な疎水的性質を有しており、シグ
ナル配列であると思われる（図６）。EHV−1 gp14遺伝
子産物に特徴的な性質は、この長い疎水性シグナル配列
の前に長い親水性配列が存在することである。この特徴
は、仮性狂犬病ウイルスウイルス（PRV）g II（62）と
ウシヘルペスウイルス１型（BHV−１）g I遺伝子にもみ
られるが、この２つは共にHSV gB相同物である。45残基
のアミノ酸（826から870番目）からなる疎水性領域は、
膜貫通性アンカードメインとして機能していると思われ
る。細胞質内に存在する親水性ドメインは110残基のア
ミノ酸を含んでいる。
Ｎ−グリコシル化される可能性のある（64）Asn−Ｘ
−Ser/Thr（Ｘはプロリン以外のアミノ酸である）部位
が11カ所存在する。特徴的な点は、細胞質内ドメインに
も２カ所の潜在的グリコシル化部位が存在することであ
る（図６）。
EHV−1 gp14コード配列の親水性度をプロットしたも
のを図７に示す。EHV−1 gp14の疎水性度を、カイト（K
yte）及びドリトル（Doolittle）の方法（65）に従っ
て、７個のアミノ酸を１ウインドー（window）としてス
ムージング（smoothing）せずに計算した。真中の線よ
りも下の点は高疎水性域を表しており、シグナル及び／
又は膜貫通性領域の可能性のある部分を示している。膜
貫通性糖タンパク質に特徴的なシグナル及びアンカー成
分並びにシグナル配列の前にある長い親水性領域がEHV
−1 gp14コード配列にもみられる。
抗EHV−1 gp14モノクローナル抗体3F6によって認識され
る抗原決定基の位置 λgt11発現ベクターとモノクローナル抗体が、主要EH
V−１糖タンパク質をコードするEHV−1DNA配列の同定に
使用されている（３）。λgt11の組換え体4alは、特異
的モノクローナル抗体3F6によって認識されるEHV−1 gp
14エピトープを発現することが判明している（３）。こ
のエピトープの身元を決定するために、4al内に含まれ
るEHV−1 DNAの塩基配列を決定し、EHV−1 gp14コード
配列のDNA配列（図６）と比較した。λgt11組換え体4al
中の（抗EHV−1 gp14モノクローナル抗体3F6によって認
識される）EHV−1 gp14エピトープ（３）に対応するDNA
フラグメントの塩基配列を決定するために、4alをEcoR
Iで消化し、アガロースゲルからEHV−１フラグメントを
単離してpUC8のEcoR I部位に連結した。正逆両方向のM1
3汎用プライマーを用いて前述の通りDNAの塩基配列を決
定した。
決定した塩基配列から、このエピトープは推定１次翻
訳生成物の107番目（Thr）から172番目（Val）に対応す
る66残基のアミノ酸領域内に含まれていることが示され
た。従って、該エピトープは推定されるEHV−1 gp14表
面ドメインのアミノ末端領域内に位置している。
EHV−1 gp14のアミノ酸配列と他のヘルペスウイルス糖
タンパク質との比較 EHV−1 gp14遺伝子のアミノ酸配列との比較から、他
のヘルペスウイルス糖タンパク質とかなりの相同性を有
していることが判明した。即ち、EHV−1 gp14は、PRVの
g II（62）、BHV−１のg I（63）、水痘帯状疱疹ウイル
ス（VZV）のg II（66）、単純ヘルペスウイルス（HSV）
のgB（67,71,72）、並びにエプスタイン・バールウイル
ス（EBV）（68）及びヒトサイトメガロウイルス（HCM
V）（10）の糖タンパク質に相同であった。
EHV−1 gp14コード配列の５′末端のオリゴヌクレオチ
ド特異的変異導入 再び図５を参照して説明する。pUC（BamH I−a/EcoR
I）由来のKpn I/BamH IフラグメントをKpn I/BamH Iで
消化しておいたプラスミドBluescript SK＋に挿入し
て、プラスミドBlue（Kpn I/BamH I）を得た。クンケル
（Kunkel）の方法（17）を修正して、宿主dut-ung-大腸
菌CJ236株中で作成したプラスミドBlue（Kpn I/BamH
I）由来のウラシル含有DNA鋳型を用いてオリゴヌクレオ
チド特異的変異導入を行なった。該変異導入プラスミド
中において、EHV−1 gp14遺伝子のコドン１及び２にNsi
I部位を生じさせ、配列ATG/TCC（Met/Ser）をATG/CAT
（Met/His）に変えた。この変異を導入した塩基配列はD
NA配列解析によって確認した。該変異株由来のKpn I/Ba
mH Iフラグメントを、Kpn I/BamH I消化pUC18に移し換
えてプラスミドpUC（Kpn I/BamH I）を得た。
pUC（Kpn I/BamH I）由来のEcoR I/BamH Iフラグメン
トをpUC（BamH I−ｉ）の3.9KbサブクローンであるBamH
I/Pst I消化pUC（BamH I/Pst I）に挿入して、Nsi I部
位変異を含んだEHV−1 gp14遺伝子全体を含むプラスミ
ドpUCg14を構築した。
キメラプラスミドpVM2LH6g14の構築 pMP409DVCをBgl IIで切断し、制限酵素部位と隣接す
る例１記載の修飾ワクシニアH6（初期／後期）プロモー
ターを含有する合成二本鎖DNAと連結した。Nsi I、Sac
I、Pst I及びEcoR I制限酵素部位をH6プロモーターの内
在性開始コドンのすぐ下流につくった。pMG11におけるH
6プロモーター下流のポリリンカー配列はATG CAT GAG C
TC TGC AGA ATT CGG ATC Tである。H6開始コドンを含ん
だ唯一のNsi I部位（下線部）の直後にSac I、Pst I及
びEcoR Iが続いている。
pUCg14由来のEcoR I/Nsi I DNAフラグメント（EHV−1
gp14開始コドン上流のEHV−1 DNA領域を含む）を、プ
ラスミドpMG11由来のEcoR I/Nsi Iフラグメントで置き
換えて、プラスミドPMRHg14を得た。該pMRHg14は、ワク
シニアHind III Mの右側アーム、H6プロモーター及びEH
V−1 gp14遺伝子全体を含有する。プラスミドpMRHg14由
来のHpa I/Pst I EHV−1 gp14含有フラグメントを、Hps
I/Pst Iで切断しておいたベクタープラスミドpMG11に
移し換えて、プラスミドpVM2LH6g14を作成した。pVM2LH
6g14は、H6プロモーターの制御下に置かれたEHV−1 gp1
4全コード配列（コドン２をTCC（Ser）からCAT（His）
に変えたもの、及びEHV−1 gp14遺伝子下流の約1.2Kb E
HV−1DNA）を含有しており、この配列は、M2L遺伝子座
へのEHV−1 gp14遺伝子の挿入の目標としたワクシニア
ゲノムに関するフランキングワクシニア配列に対して右
から左に挿入されている。
vP458を救援ウイルスとし、pVM2LH6g14をドナープラ
スミドとして組換えを行なった。無色のプラークを採取
して、EHV−1 gp14に対して特異的な32P標識プローブを
用いてEHV−1 gp14コード配列の存在について分析し
た。プラーククローニングを繰返した後、得られたワク
シニア組換え体をvP577と命名した。
EHV−1 gp14親水性リーダー配列の切断 上述の変異導入及びクローニング操作を種々変更し
て、キメラドナープラスミドpVM2LH6g14−１を構築し
た。pVM2LH6g14−１（EHV−1 gp14のコドン２から34ま
でが欠失し、かつ４つのコドンが置き換っている）を作
成するために、プラスミドBlue（Kpn I/BamH I）上でイ
ンビトロ変異導入（17）を行なって、コドン１及び２で
はなくコドン32〜34にNsi I部位を生じさせた。新たに
変異を導入したBlue（Kpn I/BamH I）プラスミド由来の
Nsi I/BamH Iフラグメントを、pVM2LH6g14のNsi I/BamH
Iフラグメントと置き換えた。該Nsi I部位に多重Nsi I
リンカー（New England BioLabs社製）を連結して、開
始ATGコドンを残りのEHV−1 gp14コード配列の枠内に適
合させた。最終的に得られたプラスミドpVM2LH6g14−１
は、Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala...をコードする配列ATG/
CAT/GCA/TGC/ATT/GCT...を含んでいる。ここで、GCT（A
la）はEHV−1 gp14の34番目のコドンであり、pVM2LH6g1
4−１の残りの部分はpVM2LH6g14のものと同一である。
救援ウイルスvP458とドナープラスミドpVM2LH6g14−
１との間で組換えを行なって、ワクシニア組換え体vP61
3を得た。
例３−ウマヘルペスウイルスgp13及びgp14糖タンパク質
を発現するワクシニアウイルス組換え体vP633及びvP634
の構築 gp13及びgp14EHV−１糖タンパク質を共に発現するワ
クシニア組換え体を構築するために、vP577もしくはvP6
13のいずれかを救援ウイルスとして、例１記載のドナー
プラスミドpVHA6g13（ワクシニアのHA欠失座に挿入され
たワクシニアH6プロモーターの制御下にあるEHV−1 gp1
3遺伝子を含有する）との組換えを行なった。組換えウ
イルス中へのEHV−1 gp13配列の挿入は、インシトゥDNA
ハイブリダイゼーション法（25,28）によって同定し
た。pVHA6g13とワクシニアウイルス組換え体vP577（全E
HV−1 gp14を含有する）との組換えによって、ワクシニ
アウイルス二重組換え体vP633が得られ、pVHA6g13とワ
クシニアウイルス組換え体vPvP613（先端の欠けたEHV−
1 gp14を含有する）との組換えによって、ワクシニアウ
イルス二重組換え体VP634が得られた。ワクシニアウイ
ルス二重組換え体vP633及びvP634のプラークをクローニ
ングし、EHV−1 gp13及びEHV−1 gp14配列の存在をDNA
ハイブリダイゼーション分析法並びに発現アッセイ法
（後述）で確認した。
ワクシニアウイルス組換え体中で発現されるEHV−1 gp1
3及びgp14糖タンパク質の免疫沈降反応 ワクシニアウイルス組換え体によって発現されるEHV
−1 gp13及びgp14糖タンパク質を調べるために、VERO細
胞に該組換え体を感染させて、代謝によってタンパク質
を35S−メチオニンで標識して、例１記載の方法で免疫
沈降反応を行なった。室温で４時間、1:1000に稀釈した
EHV−1 gp13特異的モノクローナル抗体（14H7）又はEHV
−1 gp14特異的モノクローナル抗体（3F6）（３）を結
合させた。試料をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
（10％ゲル、定電流30mA、６時間）にかけ、オートラジ
オグラムを作成した。未感染VERO細胞又は赤血球凝集素
欠失ワクシニアウイルスvP452（184）感染対照VERO細胞
の産生したもので、抗EHV−1 gp13特異的モノクローナ
ル抗体14H7（３）又は抗EHV−1 gp14特異的ノクローナ
ル抗体3F6（３）によって免疫沈降したものはなかっ
た。これに対して、EHV−1 gp13だけを発現するワクシ
ニア組換え体vP483、EHV−1 gp13とインクトなgp14双方
を発現するワクシニアウイルス二重組換え体（vP63
3）、又はEHV−1 gp13と先端の欠けたgp14双方を発現す
るワクシニアウイルス二重組換え体（vP634）で感染し
たVERO細胞からは、放射性標識されたEHV−1 gp13産物
がモノクローナル抗体14H7によって免疫沈降した。予想
される１次翻訳生成物（55kDa）よりも若干小さい約44k
Daと約47kDaの２種類の生成物並びにEHV−1 gp13が完全
にグリコシル化された形に相当する約90kDaのやや大き
い生成物が検出された。ワクシニア二重組換え体vP633
及びvP634において、EHV−1 gp13発現の質及び量が、ど
ちらの形のEHV−1 gp14と同時発現させてもその影響を
受けなかったことは重要である。
vP633、vP634、vP613及びvP577でそれぞれ感染させた
VERO細胞は、抗EHV−1 gp14特異的モノクローナル抗体3
F6（３）によって免疫沈降した。vP633（全gp14とgp13
を含む）及びvP577（全gp14を含む）については、約3
4、47、60−64及び90kDaの位置に主要バンドが観察され
たが、vP634（gp13と先端の欠けたgp14とを含む）及びv
P613（先端の欠けたgp14を含む）では約34、47、57、72
−82及び116kDaの位置に主要バンドが観察された。EHV
−1 gp13と同時発現させた際、どちらの形のEHV−1 gp1
4を合成させても有意の差異はみられなかった。
組換えワクシニアウイルスによって合成されるEHV−1 g
p13及びgp14産物の免疫蛍光分析 EHV−1 gp13又はgp14のいずれかに特異的なモノクロ
ーナル抗体を使用して、組換えワクシニアウイルスに感
染したVERO細胞の免疫蛍光分析を例１記載の方法によっ
て行なった。
ワクシニア組換え体vP483、vP633及びVP634に感染し
たVERO細胞においては、その細胞表面上並びにアセトン
固定細胞内にEHV−1 gp13が容易に検出できた。vP410、
vP577又はvP613に感染したVERO細胞においては、EHV−1
gp13特異的抗体に対する免疫反応性は細胞内部にも表
面上にもみられなかった。ワクシニア組換え体vP577、v
P613、vP633及びvP644に感染させたVERO細胞をアセトン
固定すると、EHV−1 gp14の発現が容易に検出できた。v
P410又はvP483で感染させた細胞においては、EHV−1 gp
14特異的抗体に対するはっきりとした内部免疫蛍光はみ
られなかった。EHV−1 gp14に特異的なモノクローナル
抗体3F6を用いると、先端欠損型EHV−1 gp14を発現する
vP613又はvP644に感染した細胞には弱い表面免疫蛍光が
観察されたが、対照ウイルスvP410及びvP483並びに組換
えワクシニアウイルスvP577又はvP644（EHV−1 gp14遺
伝子全体を表現する）においてははっきりとした表面反
応はみられなかった（例８も参照されたい）。
例４−ワクシニア組換え体vP483によるモルモットの免
疫 ワクシニア組換え体vP483によって発現されるgp13ウ
マヘルペスウイルス遺伝子産物の免疫原生を決定するた
めに、該ウイルスをモルモットに接種し、ワクシニアウ
イルス及びウマヘルペスウイルス双方に対する血清中和
抗体の存在をアッセイした。
体重約450gの15匹のモルモットを５匹ずつのグループ
に分けた。一つのグループには、皮下接種によって、初
日（０日）に1mlのワクシニア組換え体（108TCID50/m
l）を接種し、次いで21日目に1mlの２次免疫を行なっ
た。第二のグループには、ワクシニアvP452（108TCID50
/ml）で同様の接種を行なった。第三のグループには、
ワクチン接種を行なわなかった。全モルモットについ
て、１次ワクチン接種前並びに21日目及び35日目に血液
採取した、血清を調製して、ワクシニア及びEHV−１
（ケンタッキー株）双方の中和抗体の存在について、TC
ID50＝50のウイルスを用いてブタ精巣細胞上でアッセイ
した。
表１に示す通り、EHV1 gp13ワクシニア組換え体vP483
は、モルモット中で明らかな血清変換を誘起する。ワク
シニアウイルスについて得られた血清中和力価は表１の
括弧内に示してある。１次接種から21日後にはワクシニ
ア及びEHV−１双方の中和抗体が検出でき、21日目に２
次接種して２週間後には血清中和抗体力価の顕著な増加
がみられた。EHV−1 gp13発現組換えウイルスを接種し
たモルモットについて得られた血清ワクシニア中和力価
が、ワクシニアvP452ウイルスを接種したモルモットで
得られた力価よりもかなり高い（ｔ＝7.2）ことに注目
すべきである。
例５−ワクシニア組換え体vP577及びvP613によるモルモ
ットの免疫 モルモットを免疫して、ワクシニア組換え体vP577及
びvP613によって発現されたEHV−1 gp14に対するモルモ
ットの反応を評価した。体重約450gのモルモットに、10
5TCID50のvP577もしくはvP613を、初日（０日）及び21
日目にそれぞれ1mlずつ皮下接種した。０日目、21日目
及び35日目に、モルモットから血液を採取した。TCID50
＝50のEHV−１ウイルス（ケンタッキー株）に対する中
和試験をブタ精巣細胞上で行なった。ワクシニア抗体の
力価は、抗IgG（Ｈ＆Ｌ）ペルオキシダーゼ抱合体を用
いたELISA法で決定した。
結果を表２に示す。ワクシニア組換え体vP577（EHV−
1 gp14遺伝子全体を包含する）で免疫したモルモットに
おいては、EHV−１に対する血清中和活性は全くみられ
なかった（データは示していない）。これに対して、先
端欠損型EHV−1 gp14遺伝子を発現するワクシニア組換
え体vP613を接種したモルモットは、EHV−1 gp13を発現
するワクシニア組換え体vP483の場合（表１）と同じ程
度のEHV−１血清中和抗体を誘起した（表２）。１次ワ
クチン接種から３週間後にEHV−１血清中和抗体が検出
されるが、２次免疫してから２週間後にはより高レベル
の血清中和抗体が観察される。ELISA法でワクシニア抗
体をアッセイしたところ、免疫したすべての動物におい
て、反応がみられた。
例６−ワクチン接種ハムスターのEHV−１感染からの防
御 EHV−1 gp13を発現するワクシニア組換え体vP483の効
能を評価するために、ハムスターにワクチンによる１次
免疫或いは１次免疫＋２次免疫を施し、非接種対照群又
は対照ワクシニアウイルスvP452を２回接種した群と共
に、EHV−１のハムスター適応ケンタッキー株を腹膜内
に投与して感染させた。
40匹のゴールデンハムスター（40日齢、体重55〜65
g）を４つのグループに分けた。グループＡには、108、
106もしくは104TCID50のワクシニア組換え体vP483を、
各接種量について５匹ずつ、１回皮下接種した（1m
l）。グループＢには、０日目にvP483をワクチン接種
し、続いて14日目に２次接種した。このとき、１次及び
２次接種（1ml）は５匹ずつの群に108、106又は104TCID
50を皮下接種した。５匹のハムスターからなるグループ
Ｃには、ワクシニアvP452を０日目と14日目の２度（１
回当り108TCID50）皮下注射した。グループＤの５匹は
非ワクチン接種対照群としてそのままにしておいた。最
後に免疫してから14日後に、すべてのハムスターについ
て、200LD50量のEHV−１（ハムスター適応ケンタッキー
株）を腹膜内投与によって感染させた。感染後７日目に
生存数を数えた。
結果を表３に示す。非ワクチン接種ハムスター並びに
ワクシニアvP452接種ハムスターは、すべてEHV−１感染
後５日以内に死亡した。EHV−1 gp13発現ワクシニア組
換え体vP483をワクチン接種したハムスターでは、EHV−
１感染に対してかなりのレベルの防御がみられた。１次
免疫だけのハムスターと１次及び２次免疫したハムスタ
ーとの間で防御レベルに差異はみられなかった。半防御
量（PD50）は、１次免疫についてのlog10PD50＝6.32、
１次免疫＋２次免疫についてのlog10PD50＝は6.12で、
同程度の値であった。しかしながら、100％防御は、108
TCID50の組換えウイルスを２回接種した群についてのみ
観察された。
EHV−1 gp14を単独又はEHV−1 gp13と一緒に発現する
ワクシニア組換え体の防御効果を評価するために、ワク
チン接種ハムスターについてウイルス感染実験を行なっ
た。ハムスターにワクチンによる１次免疫或いは１次免
疫＋２次免疫を施し、非接種対照群又は対照ワクシニア
ウイルスvP452を２回接種した群と共に、EHV−１のハム
スター適応ケンタッキー株を腹膜内に感染した。体重約
60gの21日齢のゴールデンハムスターに、それぞれ1mlの
対照ワクシニア又はEHV−1 gp13及び／又はgp14を発現
する組換えワクシニアウイルスvP483、vP577、vP613、v
P633及びvP634を皮下接種した。１次ワクチン接種に続
いて14日目に同量（log10pfu/ml）のワクチンを接種し
た。最後に免疫してから14日後に、非接種対照群を含め
たすべてのハムスターに、200LD50量のEHV−１ハムスタ
ー適応ケンタッキー株を腹膜内注射して感染させた。感
染後14日目に、５匹からなる群の生存数を数えて実験を
終えた。ハムスターの50％を防御するワクチン接種量を
log10TCID50/ml接種量として評価した。
表４に示す通り、全EHV−1 gp14遺伝子を発現するワ
クシニアウイルス組換え体vP577では、log10PD50≧9.0
と計算され、感染に対する防御力を賦与しなかった。こ
れに対して、ワクシニア組換え体vP613によって発現さ
れる先端欠損型EHV−1 gp14遺伝子は、感染に対して十
分な防御力を賦与した（表４）。計算されたPD50（5.
2）は、EHV−1 gp13発現ワクシニア組換え体vP483で得
られた値（5.4）よりも若干良い値であった。驚くべき
ことに、EHV−1 gp13及びgp14を同時発現させると、そ
れぞれワクシニアウイルス組換え体vP633及びvP634中の
全gp14遺伝子又は先端欠損型gp14遺伝子のいずれについ
ても、EHV−１糖タンパク質を単独で発現させた場合よ
りも防御力が著しく増大した。従って、同一ワクシニア
ウイルス組換え体中でEHV−1 gp13及びgp14を同時発現
させると、ワクチン接種したハムスターを50％防御する
のに必要なウイルス接種量は著しく減少した。
例７−ウマヘルペスウイルスgp13糖タンパク質を発現す
るアビポックスウイルス組換え体の構築 次に図８を参照する。pVHA6g13をEHV−1 gp13遺伝子
源として使用した。全EHV−1 gp13遺伝子を含むDNAフラ
グメントを単離するために、pVHA6g13をNru IとHind II
Iで消化した。この消化によって、ワクシニアウイルスH
6プロモーターの３′末端の28bp、全EHV−1 gp13遺伝子
及び約410bpのワクシニアウイルス配列を含む約1.8Kbの
フラグメントが得られた。この1.8KbのNru I/Hind III
フラグメントを単離して、アビポックスウイルス挿入ベ
クターpFPCV2及びpCPCV1への挿入に使用した。
ニワトリポックスウイルス（FP）挿入ベクターpFPCV2
は、FPゲノムのf7遺伝子座と呼ばれる非必須領域中に外
来遺伝子の挿入された組換え体を作成するためのビヒク
ル（vehicle）を提供する。pFPCV2をpRW731.13から誘導
した。プラスミドpRW731.13は、pUC9の２カ所のPvu II
部位間にFPゲノムのPvu IIフラグメント（約5.5Kb）が
挿入されたものである。まず最初に、この5.5KbFPゲノ
ム由来Pvu IIフラグメント内に存在する非反復Hinc II
挿入部位に多重クローニング配列（MCS）を連結した。
このMCSは、オリゴヌクレオチドCE4（５′−TCGCGAGAAT
TCGAGCTCGGTACCGGGGATCCTCTGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCT
TGTT−３′）とCE5（５′−AACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG
ACTCTTAGAGGATCCCCGGTACCGAGCTCGAATTCTCGCGA−３′）
とのアニーリングによって誘導したものである。
pFeLV1Aはワクシニア挿入ベクターpTP15（184）（図
３）の誘導体であって、H6プロモーター下流のPTs I部
位にネコ白血病ウイルス（FeLV）のenv遺伝子（192）が
挿入されたものである。2.4Kbの発現カセットをFPベク
ターに移し換えるために（図８）、pFeLV1AをBgl IIで
消化し、Pst I部分消化して、H6/FeLV env配列を切り出
した。該Bgl II部位はH6プロモーター配列の５′末端の
境界にあり、該Pst I部位はFeLVエンベロープ糖タンパ
ク質の解読枠の翻訳終結シグナルの420bp下流に位置し
ている。
2.4Kbの上記H6/FeLV env配列を、BamH IとPst Iで消
化したpCE11に挿入した。このプラスミドをpFeLVF1と命
名した。pFeLVF1プラスミドを次にPst Iで消化してFeLV
env配列を除去した。得られたプラスミド（pCE11中に
ワクシニアウイルスH6プロモーターを含む）をpFPCV1と
命名した。外来の配列を除去するために、５′から該プ
ロモーターまでの配列にオリゴヌクレオチドFPCV1
（５′−CAGTAATACACGTTATTGCAGAGAGGACCATTCTTTATTCTA
TACTTAAAAAGT−３′）を使用して変異を導入し（19）、
pFPCV1を得た。オリゴヌクレオチドFPCV3（５′−TAGAG
TCGACCTGCAGGCATCCAAGCTTGTTAACGAC−３′）で、３′か
ら該プロモーターまでの領域（マルチクローニング部
位）に変異を導入して、Sph I部位（ATGを含む）を除去
した。得られたプラスミドをpFPCV2と命名した。
上述の1.8Kb Nru I/Hind III EHV−1 gp13フラグメン
トを、pFPCV2を消化して得た8.0KbのNru I/Hind IIIフ
ラグメントに挿入した。この8.0Kb Nru I/Hind IIIフラ
グメントは、ワクシニアウイルスH6プロモーターの５′
末端部分（100bp）、FPフランキング配列（挿入部位の
4.8Kb上流及び1.5Kb下流）並びに2.4KbのpUC断片（BRL
社製、メリーランド州ベセスダ（Bethesda））を含んで
いた。これら２つのフラグメントの連結によって、pFPE
HV13Aと名付けた9.8Kbのプラスミドが得られた。
プラスミドpFPEHV13AをKpn IとHind IIIで消化して約
600bpのフラグメントを除去した。このフラグメント
は、EHV−1 gp13遺伝子の３′側領域（200bp）と410bp
のワクシニアウイルスDNA断片とを含んでいた。この600
bpのKpn I/Hind IIIフラグメントを、以下の手順で、pN
SIENPN（図３）由来の200bpフラグメントに置き換え
た。pNSIENPNをPst Iで消化して、該プラスミドを線状
化した、該Pst I末端を、各dNTP（0.5mMずつ）の存在下
でT4 DNAポリメラーゼ（New England BioLabs社製）を
作用させて、平滑末端とした。次にHind IIIリンカー
（BRL社製）をこの平滑末端フラグメントに連結した。H
ind IIIで消化した後、該線状化プラスミドをKpn Iで消
化して、EHV−1 gp13遺伝子の３′末端部分、終止コド
ン（TAG）に相当する配列、並びにワクシニアウイルス
初期転写終結シグナルとして公知の（45）「TTTTTNT」
配列を含む200bpのフラグメントを得た。この組換えプ
ラスミドをpFPEHV13Bと名付けて、H6プロモーター付きE
HV gp13遺伝子をFPゲノムのf7座に挿入するためのイン
ビトロ組換えに使用した。得られた組換えニワトリポッ
クスウイルスをvFP44と付けた。
次に図９を参照する。pFPEHV13Bは、pCPCV1への挿入
用1.4Kb Nru I/Hind IIIフラグメントの作成にも利用し
た。pCPCV1プラスミドは、カナリアポックスウイルス
（CP）ゲノムの3.3Kb Pvu IIフラグメント内に存在する
非反復EcoR I部位にワクシニアウイルスH6プロモーター
を含んでいる。この挿入プラスミドを用いると、CPゲノ
ムのC3座に外来遺伝子を挿入することが可能になる。pC
PCV1をpRW764.2（pUCベクターに3.3KbのCPゲノム由来Pv
u IIフラグメントが挿入されている）から誘導した。pR
W764.2をEcoR Iで消化して線状化した。このフラグメン
トを、各dNTP（0.5mMずつ）の存在下で大腸菌DNAポリメ
ラーゼのクレノイフラグメント（Boehringer Mannheim
Biochemicals社製）を作用させて、平滑末端とした。pF
PCV1をKpn I/Hpa Iで消化して、ワクシニアウイルスH6
プロモーター配列とマルチクローニング領域（該プロモ
ーターの３′末端に位置する）を切取った。この200bp
のフラグメントを、各dNTP（0.5mMずつ）の存在下でT4D
NAポリメラーゼを作用させて、平滑末端とし、上記の線
状化しかつ平滑末端としたプラスミドpRW764.2に挿入し
た。得られたプラスミドをpCPCV1と名付けた。プラスミ
ドpCPCV1をNru IとHind IIIで消化して5.8Kbのフラグメ
ントを単離し、上述の1.4Kb EHV gp13含有フラグメント
に連結した。得られたプラスミドをpCPEHV13Aと名付け
た。このプラスミドを使用して、H6プロモーター付きEH
V gp13遺伝子をCPゲノムのC3座に挿入するためのインビ
トロ組換え実験を行なった。この組換えカナリアポック
スウイルスをvCP48と名付けた。
インビトロ組換え後、EHV−1 gp13遺伝子を有する組
換えアビポックスウイルスを標準的なプラークハイブリ
ダイゼーション法によって同定した。プラーク単離を３
回繰返して陽性プラークを精製した後、ハイブリダイゼ
ーション法による分析を行なった。FP組換え体とCP組換
え体を、それぞれvFP44及びvCP48と名付けた。これらの
組換え体を、EHV−1 gp13遺伝子に対するモノクローナ
ル抗血清を用いたプロテインＡ−β−ガラクトシダーゼ
免疫スクリーング法で分析した。その結果、CEF及びVER
O細胞単層にvFP44又はvCP48を感染させると該ウイルス
感染細胞表面上にEHV−1 gp13遺伝子が発現することが
実証された。
例８−ウマヘルペスウイルス１型の糖タンパク質gp14を
コードする遺伝子の未修飾及び修飾型遺伝子を発現する
ワクシニアウイルス組換え体の評価 EHV−1 gp14を発現する他の組換えワクシニアウイルス
の構築と評価 含EHV−1 gp14構築体（例２）を、（ａ）EHV−1 gp14
リーダー配列の長さを変える、（ｂ）遺伝子の３′側に
ある過剰のEHV−1 DNAを除去する、並びに（ｃ）EHV−1
gp14遺伝子の修飾型遺伝子を評価用ワクシニアウイル
スvP293宿主域選択系（69）に挿入する、という３通り
の方法で修飾した。
EHV−1 gp14遺伝子産物は非常に長いリーダー配列を
含んでいる。58番目のアミノ酸から99番目のアミノ酸ま
での長い疎水性配列はシグナル配列であると思われる。
この領域の前には長い親水性配列が存在している。同様
の長いリーダー配列は、他の２つのgB相同物、即ち、仮
性狂犬病ウイルスのg II（62）とウシヘルペスウイルス
１型のg I（63）にも認められる。
EHV−1 gp14の５′末端の修飾 組換えワクシニアウイルス中で発現するgp14産物のプ
ロセシング、提示及び免疫力に及ぼすEHV−1 gp14のリ
ーダー配列の長さの影響を研究するため、既述の含EHV
−1 gp14構築体を以下の通り修飾することによって、３
つの異なる長さのリーダー配列を有するEHV−1 gp14遺
伝子含有プラスミドを作成した。
ここで図10を参照する。プラスミドpVM2LH6g14（例
２）は、H6プロモーターの制御の下に置かれた全EHV−1
gp14コード配列（コペンハーゲン株ワクシニアM2L欠失
座に挿入されている）を含有する。pVM2LH61g4において
は、EHV−1 gp14遺伝子の２番目のアミノ酸が本来のSer
ではなくてHisとして存在している。２番目のアミノ酸
をSerに変えるために、pVM2LH6g14をコドン１〜２（Met
/His）においてNis I遺伝子（認識配列ATGCAT）で切断
した。合成オリゴヌクレオチドMPSYN240（５′−ATCCGT
TAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCTGTC−３′）を
使用して変異を導入した（19）。得られたプラスミドpM
P14Mは、本来のコドン２（Ser）を有するEHV−1 gp14遺
伝子全体を含んでいる。
プラスミドpVM2LH6g14−１（例２）は、リーダー配列
の先端が欠けていること（truncation）並びに合成Nsi
Iリンカー由来のコドンが４つ導入されていること以
外、pVM2LH6g14と同一である。pVM2LH6g14−１における
EHV−1 gp14遺伝子の５′末端配列はMet/His/Ala/Cys/I
le/Ala...をコードするATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT...で
あり、ここでGCT（Ala）はEHV−1 gp14のコドン35であ
る。変異導入法（19）によって、pVM2LH6g14−１を２通
りに修飾した。pVM2LH6g14−１とほぼ同じ程度まで先端
を切取ってはいるがgp14の本来の配列により近い修飾型
遺伝子を作成するために、pVM2LH6g14−１をコドン１〜
２においてNsi Iで切断した。合成オリゴヌクレオチドM
PSYN241（５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTGTCCCAGC
AGCTGGCTCCTGGATC−３′）を使用して変異導入を行なっ
た。得られたプラスミドpMP14M−34においては、EHV−1
gp14コード配列はMet/Ser/Val/Pro...をコードするATG
/AGT/GTC/CCA...で始まるが、ここでCCA（Pro）はEHV−
1 gp14の36番目のアミノ酸である。EHV−1 gp14遺伝子
はコドン61〜63（Lys/Pro/Ala）にNae I部位（GCCGGC）
を含んでいる。より多くの先端を切取った修飾型EHV−1
gp14遺伝子を作成するために、Nae IでpVM2LH6g14−１
を線状化し、次いでNsi Iで消化して、ベクターフラグ
メントをアガロースゲルから単離した。合成オリゴヌク
レオチドMPSYN243（５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGC
ATCATCGAGGGTGGGCACAATAGTT−３′）を使用して変異導
入を行なった。得られたプラスミドpMP14M−63において
は、EHV−1 gp14コード配列はMet/Ala...をコードするA
TG/GCA...で始まるが、ここでGCA（Ala）はネイティブ
なEHV−1 gp14の63番目のアミノ酸である。
余剰EHV−1 DNAの除去 上記のすべてのEHV−1 gp14含有プラスミドにおいて
は、EHV gp14コード配列の後に約1200pのEHV−1 DNAが
続いている。gp14遺伝子の終止コドン（TAA）はDra I部
位（TTTAAA）中に存在する。過剰のEHV−1 DNAを除去す
るために、pMP14M−63をDra Iで部分消化して、線状DNA
をアガロースゲルから単離して、次いでPst I消化によ
ってEHV−1 DNAと下流のワクシニアフランキングアーム
との連結部を切断した。アガロースゲルから6.5KbのDra
I/Pst I DNAバンドを単離した。合成オリゴヌクレオチ
ドMPSYN247（５−AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA−３′）と
MPSYN248（５′−GCTCGAGTTAACAAAAATTT−３′）をアニ
ールして、上記6.5Kbフラグメントと連結した。得られ
たプラスミドpMP14M−63Pにおいては、EHV−1 gp14コー
ド配列の直後に初期ワクシニア転写終止を支配する配列
が続き（45）、その後にポリリンカー領域（Hpa I、Xho
I、Pst I制限部位を含む）とHind III M由来の左側ワ
クシニアフランキングアームが続いている。
H6プロモーター/EHV−1 gp14遺伝子のpHE/vP293選択系
への挿入 上記のすべてのEHV−1 gp14含有プラスミドにおいて
は、EHV−1 gp14遺伝子は、コペンハーゲン株ワクシニ
アウイルスのM2L欠失座に挿入されたワクシニアH6プロ
モーターの制御下に置かれている。M2L挿入座は欠失さ
せることのできるゲノムのより大きな領域内に位置して
いる（69）ので、潜在的により安定な挿入部位にH6プロ
モーター/EHV−1 gp14発現カセットを移すことについて
検討した。予備段階として、異なる長さのリーダー配列
を含有するEHV−1 gp14遺伝子構築体をWR pHES/vP293宿
主域選択系（69）に移し換えることによって、比較対照
用のワクシニア組換え体の迅速な作成が可能になった。
プラスミドpHES−４は、ワクシニアH6プロモーターと
それに続くポリリンカー領域及びK1Lヒト宿主域遺伝子
（70）を含んでいるが、これらはすべて21.7Kb欠失部の
両隣のWRワクシニアアーム間に挿入されている（69）。
pHES−４は２カ所のNru I部位を含んでいるが、その一
つはH6プロモーター内にあり、もう一つはワクシニアフ
ランキング配列内にある。pHES−４を、Nru Iで部分消
化して線状化し、アガロースゲルから完全な長さの線状
DNAを含むバンドを単離した。この線状DNAをポリリンカ
ー領域内のXho I部位で切断した。pMP14M−63Pは２カ所
のNru I部位を含んでいるが、その一つはH6プロモータ
ー内にあり、もう一つはEHV−1 gp14コード配列内（遺
伝子の３′末端から0.2Kbの位置）にある。pMP14M−63P
をNru Iで線状化した後Xho Iで消化した。2.8KbのNru I
（部分）/Xho Iフラグメントをアガロースゲルから単離
した。このフラグメントは、H6プロモーターの一部とそ
れに続く修飾型EHV−1 gp14遺伝子（リーダー配列が最
も短い型）を含んでいる。pMP14M−63P由来の2.8Kb H6
プロモーター/EHV−1 gp14含有フラグメントを、pHES−
４由来のNru I（部分）/Xho Iベクターフラグメントに
連結した。得られたプラミングpHES−MP63は、H6プロモ
ーター/EHV−1 gp14遺伝子カセットを含んではいるが、
余剰EHV−1 DNAは有していない。全長又は適度に先端の
切取られたリーダー配列を含むH6プロモーター/EHV−1
gp14の５′末端を移し換えるために、プラスミドpMP14M
及びpMP14M−34をNru Iで切断して、それぞれ、2.8Kbと
2.7Kbのバンドをアガロースゲルから単離した。pHES−M
P63をNru Iで部分消化して、7.2Kbのフラグメントをア
ガロースゲルから単離した。この7.2Kbベクターフラグ
メントは、H6プロモーター/EHV−1 gp14の５′末端を含
む2.6Kb Nru IフラグメントがpHES−MP63から除去され
たものである。このpHES−MP63由来7.2Kb Nru I（部
分）ベクターフラグメントを、pMP14M由来の上記2.8Kb
Nru Iフラグメントと連結して、pHES−MP1を得た。pHES
−MP63由来7.2Kb Nru I（部分）ベクターフラグメント
を、pMP14M−34由来の上記2.7Kb Nru Iフラグメントに
連結して、pHES−MP34を得た。プラスミドpHES−MP63、
pHES−MP1及びpHES−MP34を作成するためのクローニン
グ工程を図10に図解した。
プラスミドpHES−MP1、pHES−MP34及びpHES−MP63
を、vP293（69）との組換え用ドナープラスミドとして
使用して、それぞれ、組換えワクシニアウイルスvP75
3、vP765及びvP721を得た。ヒトMRC−５細胞上で組換え
プロジェニィを選択した。
EHV−1 gp14遺伝子を発現するvP293系ワクシニアウイル
ス組換え体の評価 組換えワクシニアウイルスvP753、vP765及びvP721中
で発現させた３種類のEHV−1 gp14遺伝子産物が、感染
細胞表面上に存在するかを決定するために、VERO細胞単
層に３種類のEHV−1 gp14含有組換えワクシニアウイル
スを感染させた。EHV−1 gp14に特異的なモノクローナ
ル抗体3F6を使用して、感染させた細胞単層の表面免疫
蛍光を測定した。３種類のワクシニアウイルス組換え
体、vP753、vP765及びvP721に感染させた細胞すべてに
ついて表面免疫蛍光は陽性であった。この結果は、リー
ダー配列の長さを変化させてもワクシニア感染細胞中に
おけるEHV−1 gp14遺伝子産物の適切な輸送には影響が
ないことを示している。
３種類のEHV−1 gp14含有ワクシニアウイルス組換え
体によって発現されるEHV−1 gp14遺伝子産物を比較す
るために、vP753、vP765及びvP721をMRC−５細胞に感染
させ、代謝されるタンパク質を35S−メチオニンを使用
して標識した。EHV−1 gp14に特異的なモノクローナル
抗体3F6を使用して、放射性標識細胞溶解物について免
疫沈降反応を行なった。
vP753、vP765及びvP721に感染した細胞から得られた
免疫沈降タンパク質を互いに識別不能で、プラスミドpV
M2LH6g14−１から作成したEHV−1 gp14含有ワクシニア
組換え体であるvp613由来の免疫沈降タンパク質と等価
であった。これらの結果は、上記組換え体で試したよう
にEHV−1 gp14リーダー配列の長さを変化させても、遺
伝子産物の適切なプロセシングは促進も妨害もされない
ことを示している。
異なる型のEHV−1 gp14を発現する組換えワクシニア
ウイルスの防御効果を評価するために、ハムスターにvP
753、vP765及びvP721を量を変化させて接種し、EHV−１
のハムスター適応ケンタッキー株を感染させた、３種類
のEHV gp14含有ワクシニア組換え体はすべて防御力があ
り、そのlog10PD50値は6.2もしくはそれより優れてい
た。これら３種類のワクシニアウイルス組換え体の間
で、防御力に統計的有意差はみられなかった。
vP577とは対照的に、同じくpVM2LH6g14とvP458との間
の組換えによって得られた別のワクシニアウイルス組換
え体は、vp613、vP753、vP765及びvP721でみられるEHV
−1 gp14免疫沈降パターンと同じ免疫沈降パターンを示
し、かつこれらのEHV−1 gp14発現組換えワクシニアウ
イルスと同様に、感染細胞表面上にEHV−1 gp14タンパ
ク質を発現した。
この結果は、ワクシニアウイルス組換え体vP577中で
発現したEHV−1 gp14に欠陥があり、この欠陥がおそら
くドナープラスミドpVM2LH6g14とワクシニアウイルスvP
458との組換えの際に生じたことを示唆している。
例９−ウマヘルペスウイルス１型に由来する３種類の新
規遺伝子の塩基配列とワクシニアウイルス組換え体中で
の発現 gp17/18をコードするEHV−１遺伝子をワクシニア組換
えウイルス中で発現させるに先立って該遺伝子を同定・
単離するために、EHV−１ゲノムのUS領域のほとんどの
配列を決定し、このDNAフラグメント上で発見した複数
の異なる解読枠を発現させた。該Ｓ領域にコードされた
以下の３種類の新規EHV−１遺伝子、即ち、決定した塩
基配列から、HSV gD遺伝子及びPRV gp50遺伝子産物と
の相同性を示すEHV−1 gD、HSV US7遺伝子及びPRV gp
63遺伝子産物との相同性を示すEHV−1 gp63、及びHSV
gE遺伝子及びPRV g I遺伝子の産物との相同性を示すEH
V−1 gEを同定し、解析した。これら３種類の遺伝子を
すべて、個別又は一緒に、迅速発現研究用コペンハーゲ
ンワクシニア株宿主域選択系にクローン化した。ウサギ
の抗EHV−１血清を用いた免疫蛍光法によって、EHV−１
特有の遺伝子産物が発現されることが判明した。
EHV−1 BamH I Dフラグメントのクローニング EHV−1 gp17/18遺伝子はEHV−１ゲノムのＳ領域に位
置しているので（３）、US領域の大部分に相当するBamH
I Ｄフラグメント（59）を単離してクローニングし
た。ケンタッキーＤ株のEHV−１ゲノムDNAをBamH Iで消
化した。アガロースゲル（Geneclean、Bio101,Inc社
製、カリフォルニア州ラジョラ（La Jolla））から11.0
KbのBamH I Dフラグメントを単離し、プラスミドpIBI24
にクローン化して、プラスミドpEHVBamH I Dとした。こ
のフラグメントの制限酵素地図を得た（図11）。
EHV−1 gD、gp63及びgEをコードするDNA配列の同定 例１記載の手順で、pIB I24にサブクローン化したBam
H I Ｄフラグメントの幾つかのサブクローンから二本
鎖に関する塩基配列を得た。連続フラグメント間の連結
部の配列は、最初のクローンpEHVBamH I D上でチェック
した。一切の配列データの解析にはPC/GENEソフトウェ
アーパッケージ（Intelligenetics Inc.社製、カリフォ
ルニア州マウンテン・ビュー（Mountain View））を使
用した。
EHV−1 gD、gp63及びgE遺伝子のDNA塩基配列解析 塩基配列を決定したBamH I Dフラグメント（特有の短
鎖領域の大部分に相当する）由来の6402bp領域のDNA配
列を解析することによって、少なくとも３つの完全な解
読枠（すべて同一鎖から読取られる）が存在することが
明らかになった。この配列を、図12に、５′→３′鎖を
右方向に示した。塩基組成はＧ＋Ｃ含量50.44％であ
る。
第一の解読枠（ORF1）は、971番目の塩基から2176番
目の塩基までである。転写調節シグナルと思われる配列
が、ATG開始コドンである可能性の最も高い971番目の塩
基の５′側領域にみつかった。配列TATATTAA（ヌクレオ
チド871〜878）を有する「TATAボックス」は、811番目
から817番目に位置する配列TGACAATを有する仮想「CAT
ボックス」の60塩基下流に位置していた。ポリアデニル
化シグナル（AATAAA）は、TAA終止コドン（ヌクレオチ
ド2177〜2179）の下流にはみられなかった。配列５′TC
CCTTCGCC3′（ヌクレオチド890〜899）の10個の塩基の
うちの７個は、18SリボソームRNAの配列３′AGGAAGGCGT
5′（61）と相補的であり、リボソーム結合部位として
機能している可能性がある。真核生物のmRNAの翻訳開始
に関する移動（scanning）モデルが提案されている（15
1）。このモデルの基本法則は、リボソームがmRNAの
５′末端に結合して、mRNA分子上を直線的に移動すると
いうことである。翻訳の開始に関する符号は、例外も知
られてはいるが（152）通常は最初の５′基部ATGコドン
である。−３位のプリンは翻訳開始に必須であり、配列
の残りの部分が最適でなければ、−１番目及び−２番目
の塩基Ｃによって翻訳が促進される。上述の開始コドン
AGCATGT（ヌクレオチド968〜974）付近の配列状態は、
真核生物のmRNAの翻訳の開始に必要な機能的配列状態を
満足する。さらに２つの潜在的ATG開始コドンがヌクレ
オチド989〜991及び992〜994に位置している。これら２
つのコドンCTTATGATGGの前後状況は、翻訳開始の役割を
果たし得るものではない。EHV−1 ORF1は計算上45239ダ
ルトンの分子量を有する402個のアミノ酸をコードす
る。
EHV−1 ORF1タンパク質構造の解析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通
する多くの性質が明らかになった。１番目のアミノ酸か
ら26番目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を
有しており、シグナル配列であると思われる。24残基の
アミノ酸（351〜374）からなる疎水性領域は膜貫通性ア
ンカー領域として機能すると予想される。Ｎ−グリコシ
ル化される可能性のあるAsn−Ｘ−Thr/Ser（Ｘはプロリ
ン以外のアミノ酸である）部位が４カ所存在する（15
7）。EHV−1 ORF1アミノ酸配列の疎水的性質を図13に示
す。シグナル及びアンカー分などの膜貫通性糖タンパク
質の特徴が明瞭に現れている。Ｎ末端とＣ末端付近に存
在する２つの最も疎水性の高い領域は、それぞれ糖タン
パク質分子のシグナル配列及び膜貫通性領域であろうと
思われる。
EHV−1 ORF1アミノ酸配列と他のヘルペスウイルス糖タ
ンパク質との比較 予想されるEHV−1 ORF1のアミノ酸組成の比較から、
他のヘルペスウイルスの糖タンパク質とのかなりの相同
性が明らかになった。たとえば、EHV−1 ORF1タンパク
質は、PRV gp50（95）及びHSV−1 gD（79,160）に類似
している。
第二の解読枠（ORF2）は2287番目の塩基から3525番目
の塩基までである。2287番目のATG開始コドンの５′側
領域には、転写調節シグナルと思われる配列はみつから
なかった。TGA終止コドン（ヌクレオチド3526〜3528）
の下流には、AATAAAポリアデニル化シグナルはみられな
かったが、潜在的YGTGTTYY配列ポリアデニル化シグナル
（180）が、上記終止コドンの約40bp下流及び70bp下流
の２カ所に位置していた。予想される開始コドンGCTATG
G付近の配列状態はコザック（Kozak）の法則（151,15
5）に合致している。そのほかに少なくとも２つの潜在
的ATG開始コドンが、ヌクレオチド2305〜2307及び2332
〜2334に存在しているが、これら２つのコドンの配列状
態（GGGATGTとTCTATGG）は翻訳開始の役割を果たし得る
ものではない。EHV−1 ORF2は、計算上45431ダルトンの
分子量を有する413残基のアミノ酸からなるポリペプチ
ドをコードしている。
EHV−1 ORF2タンパク質構造の解析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通
する多くの性質がらかになった。１番目のアミノ酸から
22番目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を有
しており、シグナル配列であると思われる（コンピュー
ター解析からは、該部位が切断部位として機能する可能
性は低いという結果がでた）。32残基のアミノ酸（315
から346までの位置）からなる疎水性領域は膜貫通性ア
ンカー領域として機能すると予想される。Ｎ−グリコシ
ル化される可能性のあるAsn−Ｘ−Thr/Ser部位が７カ所
存在する。EHV−1 ORF2アミノ酸配列の疎水的性質を図1
4に示す。シグナルとアンカー成分を含む膜貫通性糖タ
ンパク質の特徴が明瞭に現れている。Ｎ末端及びＣ末端
付近に存在する２つの最も疎水的な領域は、それぞれ糖
タンパク質分子のシグナル配列及び膜貫通性領域であろ
うと思われる。
EHV−1 ORF2アミノ酸配列の他のヘルペスウイルス糖タ
ンパク質との比較 予想されるEHV−1 ORF2のアミノ酸組成の比較によっ
て、その他のヘルペスウイルスの糖タンパク質とのかな
りの相同性が明らかになった。EHV−1 ORF2タンパク質
はPRV gp63（80）、ZVZ gp IV（181）及びHSV−1 US（7
9）と類似している。
第三の解読枠（ORF3）は、ヌクレオチド3797〜5451ま
でである。転写調節シグナルと思われる配列が、3796番
目のATG開始コドンの５′側領域中にみつかった。配列
「GTTTAAA」（ヌクレオチド3705〜3711）を有するTATA
ボックスが、CATボックスであると思われる3649〜3654
に位置する配列「GCAATG」の50塩基下流に位置してい
た。はっきりとしたポリアデニル化シグナルは、TGA終
止コドン（ヌクレオチド5452〜5454）の下流にはみられ
なかった。予想開始コドンATAATGG付近の配列状態はコ
ザックの法則（151,155）に合致している。EHV−1 ORF3
は、計算上61493ダルトンの分子量を有する552残基のア
ミノ酸からなるポリペチドをコードする。
EHV−1 ORF3タンパク質構造の解析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通
する多くの特徴が明らかになった。１番目のアミノ酸か
ら23番目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を
有しており、シグナル配列であると思われる。38残基の
アミノ酸（404〜437）からなる疎水性領域は膜貫通性ア
ンカー領域として機能すると予想される。Ｎ−グリコシ
ル化される可能性のあるAsn−Ｘ−Thr/Ser部位が５カ所
存在する。EHV−1 ORF3アミノ酸配列の疎水的性質を図1
5に示す。シグナルとアンカー成分を含む膜貫通性糖タ
ンパク質の特徴が明瞭に現れている。Ｎ末端及びＣ末端
付近に存在する２つの最も疎水的な領域は、それぞれ糖
タンパク質分子のシグナル配列及び膜貫通性領域に相当
すると予想される。
EHV−1 ORF3アミノ酸配列の他のヘルペスウイルス糖タ
ンパク質との比較 EHV−1 ORF3タンパク質のアミノ酸組成の比較によっ
て、その他のヘルペスウイルスの糖タンパク質とのかな
りの相同性が明らかになった。たとえば、EHV−1 ORF3
タンパク質は、PRV g I（80）、ZVZ gE（181）及びHSV
−1 gE（79）に類似している。
コペンハーゲンワクシニアウイルス宿主域選択系の構築 WR pHES/vP293宿主域選択系（69）に類似の、コペン
ハーゲンワクシニアウイルス系列の宿主域選択系を構築
した。
コペンハーゲンワクシニアウイルス欠失突然変異体vP
668は、Hind III CからHind III Kまでの領域に存在す
る12個の遺伝子を欠失しており、該欠失遺伝子の中には
２つのヒト宿主域遺伝子K1L（70）とC7L（Hind III Cに
位置する）が含まれている。vP668はヒトMRC−５細胞中
では増殖できない。COPCSプラスミド系のプラスミドは
ワクシニアフランキングアーム内にC7L遺伝子を含んで
おり、vP668との組換えが可能であり、MRC−５細胞上で
のウイルスの増殖能を復元させる。vP668/COPCS宿主域
選択系を用いた組換えによって生まれた組換えワクシニ
アプロジェニィのヒトMRC−５細胞上におけるプラーク
形成能力の有無に基づいて、かかる組換え体を迅速に同
定することができる。プラスミドpCOPCS657は、合成H6
ワクシニアプロモーター並びにそれに続いて外来遺伝子
挿入用のポリリンカークローニング領域を含んでいる。
該ポリリンカー領域の後には終止コドンとワクシニア転
写終結シグナルが続いている（45）。
EHV−1 gD遺伝子のpCOPCS657へのクローニング ここでは図16を参照する。プラスミドpEHVBamH I Dを
Hind IIIで消化し、1240bpのEHV−1 gD含有Hind III DN
Aフラグメントをアガロースゲル（Geneclean,Bio101社
製）から単離して、DNAポリメラーゼのクレノウフラグ
メントを用いて一本鎖部分を埋めた。該修復フラグメン
トを、Sma I消化プラスミドpCOPCS657に連結した。得ら
れたプラスミドpJCA006は、H6プロモーターから約10bp
離れた位置にATG開始コドンを有している（図16）。
EHV−1 gp63遺伝子のpCOPCS657へのクローニング プラスミドpEHVBAmH I DをHind III、EcoR I及びPvu
IIで消化し、1300bpのEHV−1 gp63含有Hind III−Pvu I
I DNAフラグメントをアガロースゲルから単離し、クレ
ノウフラグメントで一本鎖部分を埋めた。該修復フラグ
メントを、Sma I消化プラスミドpCOPCS657に連結した。
得られたプラスミドをpJCA008において、EHV−1 gp63は
H6プロモーターに対して適当な位置にある（図16）。
EHV−1 gE遺伝子のpCOPCS657へのクローニング プラスミドpEHVBamH I DをAat II及びApa Iで消化
し、アガロースゲルから2630bpのEHV−1 gE含有Aat II
−Apa I DNAフラグメントを単離して、クレノウフラグ
メントで一本鎖部分を埋めた。該修復フラグメントを、
Sma IプラスミドpCOPCS657に挿入した。得られたプラス
ミドをpJCA007と命名したが、これはH6プロモーターに
対して適当な位置に置かれたEHV−1 gEを含有する（図1
6）。
EHV−1 gD−gp63フラグメントのpCOPCS657へのクローニ
ング 次に図17を参照する。プラスミドpEHVBamH I DをEcoR
I及びPvu IIで消化し、1832bpのEcoR I−Pvu II DNAフ
ラグメント（Ａ）をアガロースゲルから単離した。プラ
スミドpJCA006をCla IとEcoR Iで消化し、1450bpのCla
I−EcoR I DNAフラグメント（Ｂ）をアガロースゲルか
ら単離した。プラスミドpCOPCS657をCla IとSma Iで消
化し、3700bpのCla I−Sma I DNAフラグメント（Ｃ）を
アガロースゲルから単離した。上記のフラグメントＡと
ＢとＣを連結し、得られたプラスミドをpJCA009と名付
けた（図17）。
EHV−1 gD−gp63−gEフラグメントのpCOPCS657へのクロ
ーニング プラスミドpEHVBamH I DをEcoR IとSac IIで消化し、
アガロースゲルから4240bpのEcoR I−Sac II DNAフラグ
メント（Ｄ）を単離した。Sac II−Sma I連結部の修復
を確実にするためにdNTPを添加して、フラグメントＤを
フラグメントＢ及びＣ（上記参照）と連結した。得られ
たプラスミドをpJCA010と命名した（図17）。
EHV−1 US解読枠を発現する組換えワクシニアウイルスv
P773、vP803、vP809、vP810及びvP822の構築 上記EHV−１解読枠の発現を迅速にチェックするため
に、COPCS宿主域選択系を用いて、多数のワクシニア組
換えウイルスを構築した。プラスミドpCOPCS657に、塩
基配列の解析から同定された３つの解読枠を単独もしく
は一緒に（「二重」及び「三重」）クローン化した。得
られたプラスミドを、ワクシニア組換え体vP668（救援
ウイルス）との組換えに使用した。かかる組換えによっ
て生じた様々な組換えワクシニアウイルスを表５に示
す。
EHV−1 gD遺伝子を含有するドナープラスミドpJCA006
との組換えによって、ワクシニア組換え体vP773を得
た。EHV−1 gp63遺伝子を含有するドナープラスミドpJC
A008との組換えによって、ワクシニア組換え体vP822を
得た。EHV−1 gE遺伝子を含有するドナープラスミドpJC
A007との組換えによって、ワクシニア組換え体vP803を
得た。EHV−1 gD−gp63フラグメントを含有するドナー
プラスミドpJCA009との組換えによって、ワクシニア組
換え体vP809を得た。さらに、EHV−1 gD−gp63−gEフラ
グメントを含有するドナープラスミドpJCA010との組換
えによって、ワクシニア組換え体vP810を得た（表
５）。
単独又は多重組換えワクシニアウイルスによって合成さ
れたEHV−1 ORF1（gD）、ORF2（gp63）及びORF3（gE）
産物の免疫蛍光分析 組換えワクシニアウイルスに感染したVERO及びMRC−
５細胞の免疫蛍光分析を、ウサギ抗EHV−１特異的ポリ
クローナル血清R5935（1:200）を使用して、例１記載の
手順で行なった（表６）。
例10−ワクシニアウイルス組換え体によって単独又は一
緒に発現する仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質gp II、g
p III及びgp50のマウス及びブタにおける免疫学的検定 ワクシニアウイルスコペンハーゲン株及びその誘導体
vP410、vP425及びvP458（184）を本例で使用した。
gp II、gp III及びgp50をコードするPRV遺伝子のクロー
ニング PRV NIA3ウイルス（182）をNIL2培養細胞（183）上で
増殖させた。3000×ｇで30分間遠心分離して、上清から
細胞残渣を除去した。ウイルス粒子は、まず40％（wt/v
ol）のショ糖層に乗せて40000rpmで60分間（ベックマン
（Beckman）社の45Tiローター使用）遠心し、次に30−5
0％（wt/vol）の不連続ショ糖密度勾配に乗せて（Beckm
an社のSW25ローター使用）23000rpmで５時間遠心するこ
とによって精製した。ウイルス粒子層を回収し、TNE緩
衝液（50mM Trsis−HCl（pH7.8）、150mM NaCl及び10mM
EDTA）で希釈して、さらに30000rpmで１時間（Beckman
SW40ローター使用）遠心を行なってペレットとした。
ウイルスペレットをTE緩衝液（50mM Tris−HCl（pH7.
8）、10mM EDTA）に再び懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウ
ムを終濃度で0.5％（wt/vol）及びプロテイナーゼＫを1
00mg/ml添加して溶解した。37℃で２時間インキュベー
トした後、ウイルス溶解物をフェノール：クロロホルム
（1:1）で１回、次にクロロホルム：イソアミルアルコ
ール（24:1）で１回抽出した。DNAをエタノールで沈殿
させ、水に再溶解した。BamH Iで完全に消化した後、仔
牛腸由来のアルカリホスファターゼ（CIAP）で予備処理
したpBR322のBamH I部位にクローン化した。この連結体
をコンピテントな大腸菌NM522株（20）の形質転換に使
用した。
次に図18及び図19を参照する。gp II遺伝子をコード
するDNA配列はPRVゲノムのBamH Iフラグメント１並びに
Sal Iサブフラグメント1A及び1B中に存在する（62,9
4）。pPR9.25と呼ばれるプラスミド（PRV BamH Iフラグ
メント１をpBR322のBamH I部位に挿入したもの）をNco
Iで消化した。消化したDNAを0.8％アガロースゲル上で
分画して、6.2KbのNco I DNAフラグメントをGene Clean
（登録商標、Bio101社製）を用いて精製し、続いて、CI
AP処理したpBR328（Boehringer Mannheim Biochemicals
社製）のNco I部位に挿入した。得られたプラスミドpRP
2.15をSph Iで消化してアガロースゲル上で分画した。
2.5Kbと1.8Kbのフラグメントを精製し、ホスファターゼ
で分解したpUC18のSph I部位に挿入してプラスミドpPR1
及びpPR2を作成し（図18）、M13ファージに挿入した。
塩基配列を上述の手順で決定した。DNA配列解析から、9
13残基のアミノ酸をコードする2742bpの解読枠が明らか
になった。予想通り（62）、HSV−1 gBとかなりの相同
性を有するアミノ酸配列が観察された。ワクシニアウイ
ルスベクター中でPRV gp IIを発現させるためのクロー
ニング操作についての説明を簡単にするために、PRV gp
II解読枠のDNA配列、並びに５′及び３′側に存在する
非コード配列を図19に示した。
次いで図20及び図21を参照する。PRV糖タンパク質gp
IIIをコードするDNA配列はPRVゲノムのBamH Iフラグメ
ント２及び９中に存在する（96）。pBR322のBamH I部位
に挿入されたBamH Iフラグメント２を含有するプラスミ
ドpPR9.9（図20）をBamH I及びSph Iで消化した。pBR32
2のBamH I部位に挿入されたBamH Iフラグメント９を含
有するプラスミドpPR7.5をNco I及びBamH Iで消化し
た。上記２通りの消化で得られたDNAをアガロース上で
分画した。2.35KbのSph I−BamH Iフラグメントと1.1Kb
のNco I−BamH Iフラグメントを精製して、以下のNco I
−EcoR Iホスホリル化リンカーMRSYN21/MRSYN22を使用
して、ホスファターゼ分解IBI25（図20）のEcoR I−Sph
I部位に連結した。
pPR17と命名したプラスミドを単離したが、このプラ
スミドは全PRV gp III遺伝子（図20）を含有する3450bp
のSph I−Nco Iフラグメントを含んでいた。M13ファー
ジにクローニングした後、アルカリ変性二本鎖プラスミ
ド鋳型と一本鎖の鋳型から塩基配列を決定した。DNA配
列の解析から、479残基のアミノ酸をコードする1440bp
の解読枠が明らかになった（図21）。以前報告された通
り（96）、HSV gCとのかなりの相同性がみられた。
次に図22及び図23を参照する。PRV糖タンパク質gp50
をコードするDNA配列はPRVゲノムのBamH Iフラグメント
７中に存在する（95）。pBR322のBamH I部位に挿入され
たPRV BamH Iフラグメント７を含有するプラスミドpPR
7.1（図22）をStu I及びNde Iで消化し、ムング・ビー
ンヌクレアーゼで処理した。1.7Kbのフラグメントをア
ガロースゲルから精製し、ホスファターゼ処理したIBI2
5のHinc II部位に挿入した。このプラスミドpPR22（図2
2）はPRV gp50遺伝子全体を含んでいる。塩基配列の決
定によって、404残基のアミノ酸をコードする1215bpの
解読枠が明らかになった（図23）。以前報告された通り
（95）、HSV−1 gDとのかなりの相同性がみられた。
ワクシニアウイルス挿入ドナープラスミドへのgp I
I、gp III及びgp50をコードするPRV遺伝子のクローニン
グ pPR1（図18A）から得られた1060bpのPRV Sph I−Nhe
Iフラグメントをアガロースゲルから単離し、CIAP処理
後、以下のBamH I−Nhe Iホスホリル化リンカーMRSYN1/
MRSYN2を使用して、pIBI25のBamH I−Sph I部位に挿入
して、フラスミドpPR6（図18A）を得た。
pPR6をHind III及びApa Iで消化し、CIAPで処理し
て。Apa I部位はPRV gp IIのATG開始コドンの32bp下流
に位置している（図19）。合成ホスホリル化オリゴヌク
レオチドMRSYN3/MRSYN4対をアニールして二本鎖DNAフラ
グメントを得た。このフラグメントは、EcoR VからATG
（下線部）までのワクシニアH6プロモーターを指定する
DNAとそのすぐ後に続くPRV gp IIコード配列を含有す
る。
この合成DNAを、3920bpのpPR6由来Hind III−Apa Iフ
ラグメントに連結して、プラスミドpPR9（図18A）を得
た。
プラスミドpPR9をBamH I及びNhe Iで消化し、CIAP処
理後、以下のホスホリル化BamH I−Sph Iリンカーを使
用して、pPR1から得られた1640bpのShp I−Nhe Iフラグ
メントに連結してプラスミドpPR12（図18A、図18B）を
得た。
1030bpのpPR2由来Hinc II−Sph Iフラグメント（図18
A）をアガロースゲルから単離し、ホスファターゼ処理
したpUC18のHinc II−Sph I部位に挿入した。得られた
プラスミドpPR10をHind III及びNae Iで消化し、CIAPで
処理した。Nae I部位はTAG終止コドンの44bp上流に位置
している（図19）。以下のホスホリル化合成オリゴヌク
レオチドMRSYN9/MRSYN10対をアニールして得られた二本
鎖DNAフラグメントを、3720bpのpPR10由来Nae I−Hind
IIIフラグメントに連結してプラスミドpPR11を得た。
下線部の配列は、PRV gp II終止コドン及びワクシニ
ア初期転写終結シグナルに相当する（45）。pPR2由来の
770bp Sph I−Hinc IIフラグメントをアガロースゲルか
ら精製し、BamH I−Sph Iホスホリル化リンカー（MRSYN
7/MRSYN8）を使用して、CIAP処理したpPR11のBamH I−H
inc II部位に挿入してpPR13（図18A、図18B）を得た。E
coR IとSph Iで消化し、かつCIAPで処理したプラスミド
pPR12を、以下のホスホリル化Hind III−EcoR Iリンカ
ー（MRSYN19/MRSYN20）を使用して、990bpのpPR13由来H
ind III−Sph I単離フラグメントに連結してプラスミド
pPR15を得た（図18B）。
Hind III−EcoR Vで消化したpPR15由来の2780bpフラ
グメントをムング・ビーンヌクレアーゼで処理し、アガ
ロースゲルから精製した。このフラグメントを、Xma II
I−EcoR V、ムング・ビーンヌクレアーゼ及びCIAPで予
め消化しておいたプラスミドpTP15（184）（図３）に挿
入してプラスミドpPR18を得た（図18B）。pPR18におい
て、PRV gp IIは、ワクシニア赤血球凝集素欠失座の合
成ワクシニアH6プロモーターと連結している。このプラ
スミドをワクシニアウイルス感染細胞にトランスフェク
トして、PRV gp II遺伝子を含有するワクシニア組換え
体vP534、vP644、vP621及びvP692を得た（以下の項を参
照）。
PRV gp III遺伝子を操作して、ワクシニアHind III B
フラグメント中に位置するワクシニアウイルス初期プロ
モーターμ（以下の項を参照）の制御下で発現させた。
部位特異的変異導入法を用いて、PRV gp IIIに存在する
配列CGC（ヌクレオチド192〜194）（図21）をATGに変え
てNsi I部位を導入し、配列GTGACGTをTTCTAGA（ヌクレ
オチド1632〜1638）（図21）に変えてXba I部位を導入
した。これを実行するため、ヘルパーファージR408（ス
トラタジーン（Stratagene）社製）（185）を使用し
て、プラスミドpPR17から一本鎖DNAを得た。上記部位特
異的変異導入は、以下の精製した合成ホスホリル化オリ
ゴヌクレオチド対（MRSYN5及びMRSYN6）を使用し、大腸
菌dut-ung-株CJ236（IBI社製）（17,186）上で選択する
ことによって行なった。
上記の変異導入によってプラスミドpPR28が得られ
た。プラスミドpPR28をNsi IとXba Iで消化し、ムング
・ビーンヌクレアーゼで処理した。アガロースゲルから
1440bpのフラグメントを精製し、ムング・ビーンヌクレ
アーゼとCIAPで処理した後、pSD478VC（図20、図24）の
Bgl II−Hpa I部位に挿入した。プラスミドpPR24をワク
シニアウイルス感染細胞にトランスフェクトしてPRV gp
III遺伝子を含有するワクシニア組換え体vP604、vP64
4、vP691及びvP692を得た（以下の項を参照）。
PRV gp50を操作して、ワクシニアウイルス初期／中期
プロモーターI3L（187）の制御下で発現させた。部位特
異的変異導入法を用いて、gp50に存在する配列CCTGCCAG
CGC（ヌクレオチド177〜187）（図23）をATGCATTTAATに
変えてNsi I部位を導入し、配列CCTCCGCAGTACCGG（ヌク
レオチド1404〜1418）（図23）をAATTTTTATAGATCTに変
えてBgl II部位を導入した。前述の変異導入法（17,18
5,186）を用いて、以下の精製した合成ホスホリル化オ
リゴヌクレオチドMRSYN12及びMRSYN13（図22）を使用し
て、pPR22からプラスミドpPR29を得たた。
pPR29をNsi Iで消化し、ムング・ビーンヌクレアーゼ
で処理し、Bgl IIで部分消化して1290bpのフラグメント
を得た。プラスミドpMP13PP（図22、図25）をEcoR Iで
消化し、ムング・ビーンヌクレアーゼで処理し、次いで
BamH Iで処理して、ワクシニアI3Lプロモーターを含有
する140bpのフラグメントを得た。上記の1290bpと140bp
のフラグメントをアガロースゲルから精製して、ホスフ
ァターゼ処理したpMP409DVC（図４、図22）のBgl II部
位に連結した。得られたプラスミドpPR26を組換えに用
いて、gp50遺伝子を含有するワクシニアウイルス組換え
体vP591、vP621、vP691及びvP692を得た（以下の項を参
照）。
PRV糖タンパク質gp II、gp III及びgp50を単独又は一緒
に発現するワクシニア組換え体の構築 毒性を有するPRV感染からの免疫動物の防御におけ
る、３種類のPRV糖タンパク質（gp II、gp III及びgp5
0）の免疫原性と相対的寄与を評価するために、かかる
３種類のPRV糖タンパク質を単独又は一緒に発現するよ
うな一連のワクシニア組換え体を構築した。
ここで図24を参照する。β−ガラクトシダーゼ遺伝子
を発現する組換えワクシニアウイルスvP533を以下のよ
うに構築した。コペンハーゲンゲノムのSal I F/I連結
部にまたがるワクシニアHind IIIフラグメントＢ内の1K
bの領域は、サザン・ブロット法（189）で決定されたカ
ウポックスの出血性（μ）遺伝子（188）と相同なDNAを
含有している。このμ遺伝子は、セリンプロテアーゼイ
ンヒビターに類似したポリペプチドをコードしており、
生物学的には奨尿膜上のウイルス性の出血性痘瘡の形成
要因である。コペンハーゲンゲノムのDNA配列から、μ
遺伝子に相当する遺伝子は多くのフレームシフト変異を
含んでおり、生物学的に機能していないことが明らかに
なった。プラスミドpSD419VC（184）（図24）はμ領域
の左側部分を含んでいる。μ領域の残りの部分は、コペ
ンハーゲンSal IフラグメントＩがpUC8にクローン化さ
れたプラスミドpSD422VCに含まれている。不必要な左側
ワクシニア配列を除くために、pSD419VCをNco IとSma I
で消化し、大腸菌ポリメラーゼのクレノウフラグメント
で平滑末端とした後、再び連結してプラスミドpSD476VC
（図24）を得た。プラスミドpSD422VCをHpa IとNru Iで
消化し、μ領域の直ぐ右側に位置する約0.3Kbのフラグ
メントをアガロースゲルから単離した。このフラグメン
トを、Hinc II（Sal I部位を認識する）で切断したpSD4
76VCに連結してプラスミドpSD477VCを得た。コペンハー
ゲンワクシニアμプロモーター領域の制御下でβ−ガラ
クトシダーゼを発現させるために、合成オリゴヌクレオ
チド22量体/20量体を調製した。該22量体/20量体の配列
を、制限部位並びにATG開始コドン（下線部）と共にに
示す。
上記22量体/20量体をアニールしたものを、Cla IとHi
nc IIで消化したpSD477VCに連結して、新規プラスミドp
SD479VC（図24）を得た。大腸菌β−ガラクトシダーゼ
コード配列を含有するpMC1871由来の3.1Kb BamH Iフラ
グメント（開始コドンとプロモーターを欠く）（34）
を、BamH Iで切断したpSD479VCに連結した。このように
して得られたプラスミド（コペンハーゲンμプロモータ
ー制御下の適切な位置にlacZ遺伝子が置かれている）を
pSD479VCBGと命名した。この挿入ドナープラスミドを、
ワクシニアウイルスvP410（184）と組換えた。発色性基
質Ｘ−gal（9,24）存在下における青色プラーク形成に
基づいて組換えワクシニアウイルスを同定し、プラーク
をクローニングして、vP533（図24）と命名した。
外来遺伝子挿入用のベクタープラスミドを構築するた
めに、以下の合成オリゴヌクレオチド42量体/40量体を
調製した。
上記42量体/40量体をアニールしたものを、Cla IとHi
nc IIで切断したpSD477VC中に連結して新規プラスミドp
SD478VC（図24）を得た。このプラスミドは、ワクシニ
アのコペンハーゲン株のμコード領域と完全に置き換わ
ったマルチクローニング領域の両側に約0.3Kbのワクシ
ニア配列を含んでいる。pSD478VCを用いて、PRVgp III
コード配列を含有するpPR24（図20）並びにワクシニア
組換え体vP604、vP644、vP691及びvP692を得た。
今度は図25を参照する。プラスミドpM419はワクシニ
アHind IIIフラグメントＩ由来の850bp BamH Iフラグメ
ントを含んでいるが、その中にはpUC8（図25）のBamH I
部位に挿入されたI3Lプロモーターを含まれる。I3Lプロ
モーター成分は、ワクシニアHind IIIフラグメントＩ
（187）中のI3L解読枠の上流DNA配列に相当し、ワクシ
ニアウイルス組換え体中で外来遺伝子を発現させるのに
以前から使用されている（27,190）。pMP419をI3Lコー
ド配列内の非反復Cla I部位で線状化し、Bal31消化を行
って、次にEcoR Iで消化し、大腸菌ポリメラーゼのクレ
ノウフラグメントで処理して平滑末端とした。得られた
プラスミドpMP419−５（図25）はEcoR I部位（ヌクレオ
チド−８）と連結した上流I3Lプロモーター配列を含有
する。pMP419−５からプロモーター成分をEcoR I−Msp
Iフラグメントとして単離し、EcoR I−Cla I消化pUC13C
（Cla IリンカーをSma I部位に含むpUC13誘導体）に挿
入した。得られたプラスミドpMP13PP（図22、図25）
は、I3Lプロモーター配列（ヌクレオチド−126〜−８）
とそれに続くEcoR I部位（ヌクレオチド−８）を含んで
いる。
ワクシニアI3Lプロモーターの制御下にあるPRV gp50
を、M2L欠失プラスミドベクターpMP409DVC（図４）に挿
入して、pPR26（図22）を得た。pPR26を用いてワクシニ
ア組換え体vP591、vP621、vP691及びvP692を得た。
組換えワクシニアウイルスの単離 前述の手順で、PRV遺伝子含有組換えワクシニアウイ
ルスを同定・精製した。３種類のPRV糖タンパク質gp I
I、gp III及びgp50を単独又は一緒に発現する組換えワ
クシニアウイルスを表７に示す。
ワクシニアウイルス組換え体によって発現したPRV糖タ
ンパク質のインビトロ検定 PRV糖タンパク質gp II、gp III及びgp50は、PRV感染
細胞の膜構造と関連する典型的な糖タンパク質であり、
ウイルスの成分でもある。抗gp II、抗gp III及び抗gp5
0モノクローナル抗体で処理し、次いでフルオレセイン
抱合ヤギ抗マウスIgG抗体で処理すると、組換えワクシ
ニアウイルスに感染した細胞表面上には強い免疫蛍光が
みられたが、野生型ワクシニアウイルスに感染した細胞
ではみられなかった。
ワクシニアウイルス組換え体によりマウス及びブタ中で
発現させたPRV糖タンパク質gp II、gp III及びgp50の免
疫原性についてのインビトロにおける評価 ワクシニアウイルス組換え体で発現した３種類のPRV
糖タンパク質の相対的な免疫原性を評価するために、組
換えウイルスをマウスの足に１μから100μの間の
種々の接種量で接種した。免疫後14日目に、10LD50量の
毒性PRV Kojnock株をマウス腹腔内に投与した。予備実
験において、各PRV糖タンパク質をマウスに接種する
と、毒性PRVの感染防御に有効であることを確認した。5
00匹を超えるマウスについて行なった一連のより詳細な
実験で、PRV糖タンパク質を発現するワクシニア組換え
体の効果を評価した。毒性ウイルスを投与したマウスを
50％防御することができるワクチン接種量（PD50）を算
定したが、その結果を表８に示す。PRV糖タンパク質gp
II、gp III及びgp50を単独で発現する組換えワクシニア
ウイルスのlog10PD50は、それぞれ6.4、5.4及び5.8であ
った。糖タンパク質が一緒に発現したとき、著しく良好
なPD50値が得られた。PRVのgp IIとgp50を一緒に発現す
るワクシニア組換え体のlog10PD50値は3.3で、PRVのgp5
0とgp IIIを同時に発現するワクシニア組換え体でもほ
ぼ同様なlog10PD50値（3.6）が得られた。1.5のlog10PD
50値を与えたPRV糖タンパク質gp II＋gp III発現組換え
体がさらに有効であるのは明らかである。３種類のPRV
糖タンパク質gp II、gp III及びgp50すべてを同一の組
換えワクシニアウイルス中で発現させても、これら３種
類のPRV糖タンパク質を単独で発現する組換えウイルス
について得られたPV50値よりもさほど低いPD50値は得ら
れない。gp II及びgp IIIを発現するワクシニア組換え
体を用いた場合に遺伝子を単独で発現するワクシニア組
換えウイルスよりも高い効果が得られることは、例６に
記載したウマヘルペスウイルス糖タンパク質gp13及びgp
14を同時に発現させた場合の結果と類似している。
マウスはPRV糖タンパク質の免疫原性の評価する際の
興味あるモデル系を提供するが、PRVワクチンの一番の
目的となる種はブタである。従って、組換えワクシニア
ウイルス法のブタにおける有効性を評価するために、以
下の実験を行なった。PRV糖タンパク質gp II、gp III及
びgp50を一緒に発現するワクシニア組換え体2mlを、約2
5kgの子ブタに筋肉内接種した。接種ウイルスはPBSに希
釈した。接種後35日目に、毒性単離PRVのNIA3懸濁液を
子ブタ鼻腔内（１匹当り1mlずつ）に投与した。投与後
７日間、ワクチン接種群と対照群の相対的な体重増加を
測定することによって、ワクチン接種の効果を評価し
た。相対的な体重増加は、ワクチン接種群について観察
した日々の体重増加率から、非ワクチン接種対照群につ
いて観察した日々の体重増加率を差し引いた値である。
正常な状態におけるブタの通常の体重増加は1.1kg以上
である。表９に示すデータにみれられように、毒性PRV
投与後７日間の体重増加は、ワクチン接種群のほうが野
生型ウイルスを接種した対照群よりも大幅に高い。ワク
シニアウイルス組換え体を１回接種することによって、
毒性PRV投与後の体重減少を大幅に防ぐことができる。
PRVの３つの主要糖タンパク質を単独又は一緒に発現
するワクシニアウイルス組換え体が利用できると、PRV
感染を抑制する上で以下に述べるような多くの利点が得
られる。（ａ）一つの重大な利点は、ワクチン製剤とし
ての組換えワクシニアウイルスはほんの限られた数のPR
V遺伝子しか発現しないので、弱毒化PRVワクチン株が毒
性型に戻るという付随的な危険性がなく、また、PRVウ
イルスが周囲の環境にもたらされることも全くないこと
である。（ｂ）PRVワクチンとして有望な組換えワクシ
ニアウイルスはほんの限られた数のPRV抗原しか発現し
ないので、ワクチン接種動物と自然感染した動物とを区
別できるように他のPRV抗原からなる診断薬を調合する
ことができ、従って接種動物と自然感染した動物との区
別が可能である。（ｃ）かかる組換え体ワクチンは、雌
豚からその子供へのPRVの自然な垂直感染を阻止するの
に役立てることができる。これは別個のPRV糖タンパク
質を発現するワクシニアウイルス組換え体を妊娠中の雌
豚にワクチンを接種することによって達成できるであろ
う。母性免疫はその子供をPRV感染から防御すべきであ
る。一方、雌豚のワクチンに使用したものとは異なる構
成のPRV抗原を発現するワクシニアウイルス組換え体を
ワクチンとしてその子供に接種することもできるであろ
う。これは、母性免疫の問題を解決することもできる方
法の一つである。母性免疫の問題に対処するもう一つの
方法は、全く異なる種類のベクター中で、PRV糖タンパ
ク質（その組合わせを問わず）を発現させることであ
る。これは、PRV糖タンパク質を発現するアビポックス
ウイルス組換え体を構築することによって達成される。
天然宿主域が鳥類に制限されているアビポックスウイル
ス組換え体を、鳥類以外の動物のワクチンとして利用で
きることが実証されている（41）。このように、母性免
疫に伴なう障害の問題対処に、（１）複数ベクター及び
（２）これらのベクターによって発現する抗原の群、と
いう二つの方法を利用することができる。
例11−仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質gp II 発現アビポックスベクター 以前に報告された条件（41,42）を用いて、SPAFAS社
（コネチカット州ノーウィック（Norwich））から入手
した10乃至11日齢のニワトリ有胚卵から培養した初代ニ
ワトリ胚遷移芽細胞（CEF）上で、カナリアポックスウ
イルスを増殖させた。ジョクリック（Joklik）の記載し
た方法（191）を用いて、ショ糖密度勾配遠心法によっ
て親細胞由来の汚染源からウイルスを精製した。ブタ腎
臓細胞（PK−１）は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection）
（メリーランド州ロックビル（Rockville））から入手
した（ATCC番号CL101）。
仮性狂犬病ウイルスgp II糖タンパク質発現カナリアポ
ックスウイルス組換え体の構築 ここでは図26を参照する。プラスミドpPR15（図18）
をPRV gp II遺伝子源として用いた。全PRV gp II遺伝子
を含有するDNA部分を単離するために、pPR15をEcoR Vと
Hind IIIで消化した。この消化によって、ワクシニアウ
イルス（VV）H6プロモーターの３′末端側21bpと全PRV
gp II遺伝子を含有する約2.8Kbのフラグメントを得た。
pFPCV2に挿入するために、この2.8Kb EcoR V/Hind III
フラグメントを単離した（図８、図26）。
pFPCV2をHind IIIで完全に消化しかつEcoR Vで部分消
化して得た8.0Kbフラグメントに、上記の2.8Kb EcoR V/
Hind IIIフラグメントを挿入した。この２つのフラグメ
ントの連結によって、pFPPRV IIと名付けた10.8Kbのプ
ラスミドが生じた。
次に図27を参照する。プラスミドpFPPRV IIを用い
て、pCPCV1挿入用の2.8KbのNru I/Hind IIIフラグメン
トを作成した（図９）。pCPCV1プラスミドは、CPゲノム
の3.3Kb Pvu IIフラグメント内の非反復EcoR I部位に、
VV由来のH6プロモーターを含んでいる。この挿入プラス
ミドを用いて、CPゲノムのC3座に外来遺伝子を挿入する
ことが可能になる。プラスミドpCPCV1をNru IとHind II
Iで消化して、上記2.8Kbフラグメントに連結するための
5.8Kbフラグメントを単離した。得られたプラスミドをp
CPPRV IIと命名した。
優性選択マーカーである大腸菌キサンチン−グアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Eco gpt）
をpCPPRV IIに挿入して、CP/PRV gp II組換え体の増殖
選択手段とした。ポックスウイルス組換え作成時の選択
マーカーとしてEco gptを使用することは既に報告され
ている（193,194）。Eco gpt遺伝子はプラスミドpSV2gp
t（ATCC番号37145）から得た。このプラスミドからEco
gpt遺伝子を含有する670bpのBgl II/Dra Iフラグメント
を単離して、pSD486VCのBgl II/Sma I部位に挿入した。
得られたプラスミドpGPT−１はワクシニアウイルスμ遺
伝子フランキングアームに挟まれたEco gpt遺伝子を含
んでおり、該遺伝子はμプロモーターの転写制御下に置
かれている。上記プラスミドpSD486VCは、以下の手順で
pSD478VCから得た（図24）。pSD478VCのMCRをEcoR Iで
消化し、dNTP存在下（各0.5mM）でクレノウフラグメン
トを用いる常法によって一本鎖部分を埋め、再連結する
ことによってpSD478E-VCを得た。このプラスミドをHpa
IとBamH Iで消化し、オリゴヌクレオチドHEM5（５′−G
ATCCGATTCTAGCT−３′）とHEM6（５′−AGCTAGAATCG−
３′）とのアニーリング対を挿入して、pSD486VCを得
た。
pGPT−１をNco IとEcoR Iで消化して、Eco gpt遺伝子
（670bp）とＶ Ｖμプロモーター（330bp）を含有する
1.0Kbフラグメントを切り離した。そのNco I及びEcoR I
末端を、0.5mM dNTPの存在下で大腸菌DNAポリメラーゼ
のクレノウフラグメントを用いて平滑末端とした。Hind
IIIリンカー（Bethesda Research Laboratories社製、
メリーランド州ベテスダ）を該平滑末端フラグメントに
付加させた。このDNAをHind IIIで消化して、1.0Kbのフ
ラグメントをアガロースゲルから回収した。該1.0Kb Hi
nd IIIフラグメントをpCPPRV IIのHind III部位に挿入
し。ぴったりと連結したEco gptとPRV gp II遺伝子とを
含む生成プラスミドをpCPPRV II gptと命名した。この
プラスミドを用いて、CPゲノムのC3座へ挿入するための
インビトロ組換え実験を行なった。100μg/mlミコフェ
ノール酸（mycophenolic acid）の存在下でEco gpt遺伝
子含有組換え体の選択を行ない、次いでプラークハイブ
リダイゼーション法によってRPV gp II遺伝子の存在を
スクリーニングした。Eco gptとPRV gp IIに陽性のプラ
ークをプラークの単離を３回繰り返すことによって精製
し、高感染価で増殖する純粋な集団を、pCP55と命名し
た。これらのCP組換え体において上記２つの遺伝子が遺
伝学的に連鎖していることをサザンブロット法で確認し
た。このCP組換え体をvCP55と命名した。
vCP55感染細胞の免疫蛍光 免疫蛍光実験を行なって、vCP55感染細胞中で発現し
たPRV gp IIの細胞局在性を明らかにした。35mmシヤー
レ中の22mmのカバーガラスの上に、シャーレ当り５×10
5個のCEF又はPK−１細胞を植えた。CEF及びPK−１細胞
に、vCP55もしくはCP親ウイルスのいずれかを感染させ
た。PBS＋で１乃至100倍に希釈したモノクローナル抗体
75N10を用いて、例１に記載した通り感染及びインキュ
ベートして免疫蛍光アッセイを行なった。
細胞内部及び表面上における発現について感染細胞を
分析した。vCP55に感染した細胞系では、いずれも、表
面上でのgp IIの発現は観察されなかった。しかしなが
ら、vCP55に感染したCEF細胞及びPK−１細胞において、
細胞内部でのgp II遺伝子産物の発現がみられた。これ
らの細胞内部においてみられる蛍光は該感染細胞の核の
周辺領域に存在する顆粒に局在化していた。これらの結
果は、CPによって発現したPRV gp IIがゴルジ複合体に
は輸送されるものの原形質膜には輸送されなかったこと
を示している。この結果は、ワクシニアウイルスによっ
て発現するgp IIの結果（感染細胞の表面上に検出され
た）とは異なる。
CEF及びPK−１感染細胞から得られたPRV gp IIの免疫沈
降反応 vCP55によるPRV gp II遺伝子産物の発現を、感染細胞
溶解物の免疫沈降反応によって分析した。細胞当り5pfu
のウイルスを細胞単層に感染させた。モノクローナル抗
体75N10を用いて、例１記載の通り、免疫沈降反応を行
なった。
ウサギ抗PRV血清を用いて、見掛けの分子量（電気泳
動の移動度に基づく）約120kDa、67kDa及び58kDaの感染
CEF及びPK−１細胞由来の主要ポリペプチドを沈降させ
た。上記のポリペプチドはそれぞれ、PRV感染細胞で検
出されたPRV gp II（ジスルフィド結合で複合体を形成
している）の前駆体と２種類のタンパク質分解型である
（86,101,109）。見掛けの分子量約26kDaのものも少量
観察されたが、これはCP/PRV組換え体感染細胞内でgp I
Iがさらにタンパク質分解処を受けていることを反映し
ているものと思われる。対照CPウイルス感染細胞並びに
非感染細胞の細胞溶解物については、対応するポリペプ
チドの沈降は全くみられなかった。
防御実験 vCP55の生PRV感染に対する防御免疫反応誘発力をマウ
ス系で分析した。種々の量のvCP55を含有する50μか
ら100μの試料（表10）をマウスの足蹠に接種した。
免疫後14日目に、16LD50量のPRV Kojnock株のをマウス
腹膜内に投与した。投与後14日目にマウスの生存数を数
えて実験を終えた。表10に示す通り、106.85TCID50量の
ワクチンを１回マウスに接種すると、10匹のうちの８匹
が致死量のPRV感染から防御された。試験したVCP55接種
量より低いと、防御レベルに達しなかった。ワクチンを
接種しなかったマウスにおいて、生PRV感染によって８
匹のうち７匹が死亡した。表10に示した結果から、vCP5
5組換え体のPV50（判防御量）は106.16であると計算さ
れた。
目的とする種である子豚においても、生PRV感染に対
する免疫賦与剤としてのvCP55の効力を評価した。約25k
gの子豚15匹を３群に分けた。「vCP55群」並びに「CP親
ウイルス群」に対して、０日目と28日目の２回のワクチ
ン接種（２×108TCID50量を2ml）を筋肉注射によって行
なった。残る５匹の子豚は非ワクチン接種対照群であっ
た。35日目に、PRVの毒性NIA3株をすべての子豚に鼻腔
内投与した。投与してから７日間の、vCP55ワクチン接
種群の体重増加と対照群の体重増加とを比較することに
よってその効力をモニターした。重量変化をΔGMQR値
（kg）として計算した。ここで、ΔGMQR値（kg）＝（ワ
クチン接種群の平均GMQR％−非ワクチン接種群の平均GM
QR％）である。
非ワクチン接種群においては、PRVウイルス感染によ
ってすべての子豚が死亡した（５日目に２匹、６日目に
２匹、そして７日目に１匹）。野生型ウイルス（CP）を
接種した群においては、感染によって５匹のうち４匹が
死んだ（６日目に３匹、７日目に１匹）。vCP55をワク
チンとして接種群の子豚は、PRV感染させても全員生存
し、成長した。
PRV gp II糖タンパク質を発現するvCP55を接種した子
豚においては、生PRV感染対するかなりの防御が観察さ
れた（表11）。２つの対照群ではPRV感染後の期間を通
してかなりの体重減少がみれれたが、vCP55をワクチン
として接種した動物は実験期間を通じて正味体重の有意
の増加がみられた。さらに、生PRV感染によって、対照
群は80％から100％の死亡率を示したが、vCP55接種群で
は死亡したものはいなかった。
例12−PRV g I糖タンパク質発現ワクシニア組換え体 この例では、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株
及びそれから誘導した組換え体を使用した。
PRV g I遺伝子のカナリアポックス及びワクシニアウイ
ルスドナープラスミドへのクローニング ここでは図28を参照する。PRV g I遺伝子（NIA3株）
を含有するプラスミドpGP IはPhone Merieux社（フラン
ス国リヨン）から入手した。このプラスミドからg I遺
伝子（配列は（80）を参照）を単離し、ワクシニア合成
H6プロモーター（69）の下流にクローン化した。これは
pGP Iの2330bp Xho I−Nco I（部分）フラグメントを、
pGBC2の6400bp Xho I−Nco Iフラグメントにクローン化
して行なった。（pGBC2は、pRW764.5の3200bp Bgl IIフ
ラグメントにHSV2 gB遺伝子をクローン化することによ
って作成した。pRW764.5は、pUC18の2360bp Pvu IIフラ
グメントにカナリアポックスDNA由来の0.8Kb Pvu IIフ
ラグメントをクローン化することによって作成した）。
この操作で得られたプラスミドをpPG I2と命名した。
次に、H6プロモーターの開始コドンをg I遺伝子の開
始コドンと整列させた。この操作は、pPG I2の5900bp E
coR V−AlwN I（部分）フラグメントにオリゴヌクレオ
チドPRVL5（５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGGCCCTTT
CTGCTGCGCGCCGCGCAGCTC−３′）とPRVL6（５′−CTGCGC
GGCGCGCAGCAGAAAGGGCCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT−
３′）をクローン化することによって行なった。この操
作で得られたプラスミドをpG I3と命名した。
次に、PRV g I3′側外領域の余剰非コード配列を欠失
させた。この操作は、pG I3の5200bp Sac I−Aat II
（部分）フラグメントにオリゴヌクレオチドPRVL3
（５′−CTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGGCC
CAACTATGGCGTGACCGCCAGCCGCCTGTTGAATGCCCGCCCCGCTTAAC
TGCAGAATTCGGATCCGAGCT−３′）及びPRVL4（５′−CGGA
TCCGAATTCTGCAGTTAAGCGGGGCGGGCATTCAACAGGCGGCTGGCGGT
CACGCCATAGTTGGGCCCATTCGTCACTTCCGGTTTCTCCGGATCGCGGA
ACCAGACGT−３′）をクローン化することによって行な
なった。この操作で得られたプラスミドをpPG I6と命名
する。
次いで、H6プロモーター付きg I遺伝子をワクシニア
ウイルスドナープラスミドにクローン化した。この操作
は、pPG I6の1750bp Nru I−BamH IフラグメントをpBP1
4の5000bp Nru I−BamH Iフラグメントにクローン化す
ることによって行なった。（pBP14は、ワクシニアベク
タープラスミドpSD494VC中の合成ワクシニアH6プロモー
ターの制御下に置かれたウシ白血病ウイルスgag遺伝子
を含有する。pSD494VCは、コペンハーゲンワクシニアウ
イルスのHind III Aフラグメントのサブクローンであ
り、カウポックスAT I遺伝子（210）と相同なワクシニ
ア遺伝子のコード配列がポリリンカー領域で置換されて
いる）。このようにして、AT I遺伝子の両隣のワクシニ
アウイルス（コペンハーゲン）配列の間にH6プロモータ
ー付きg I遺伝子が配置される。この操作で得たプラス
ミドをpPG I7と命名した。
pPG I7をvP410感染細胞にトランスフェクトすること
によって、組換えワクシニアウイルスvP717を得た。
vP717の構築 PRVのg I遺伝子をワクシニアウイルスベクターにクロ
ーン化した。このワクシニアウイルス組換え体vP717の
構築に使用した方法の概要を図28に示す。vP717に含ま
れるPRVg I遺伝子をAT I遺伝子の両隣のワクシニアウイ
ルス配列の間にクローン化し、ワクシニアウイルス初期
／後期プロモーターH6（41,42,69）を用いた。
PRVにコードされたポリペプチドのvP717感染細胞上での
免疫蛍光 PRV感染細胞においては、原形質膜上でg Iが発現す
る。vP717感染細胞を、PRV g I特異的モノクローナル抗
体42M17を用いて分析したところ、これらの細胞内で生
産されるPRV由来ポリペプチドも原形質膜上で発現する
ことが判明した。
マウスにおけるvP717の評価 マウスにおいてvP717をインビトロで評価したとこ
ろ、標準的な操作を用いたPRV感染に対する若干の防御
がみえれた（表12）。
例13−ワクシニアウイルスにおける単純ヘルペスウイル
ス２型糖タンパク質gB、gC及びgDの単独又は同時発現 本例で使用したHSV2（Ｇ株）（American Type Cultur
e Collectionから入手,ATCC番号VR734）は、VERO細胞
（ATCC番号CCL81）上で増殖させ、ショ糖密度勾配遠心
法によって精製した（197）。
HSV2 gB遺伝子のワクシニアウイルスドナープラスミド
へのクローニング HSV2 gB遺伝子の塩基配列は既に文献に記載されてい
る（116）。ここで図29を参照する。HSV2（Ｇ株）ゲノ
ムDNAから、HSV2 gB遺伝子を含有する12Kb Bgl IIフラ
グメントを単離し、pUC19のBamH I部位に挿入して、プ
ラスミドpJ4をた。
次に、gB遺伝子をワクシニアウイルス（コペンハーゲ
ン）フランキングアーム間にクローン化した。この操作
は、pJ4の27000bp Sst II−Sac I（部分）フラグメント
をpMP409DVC3のSst II−Sac Iフラグメントにクローン
化することによって行なった。（PMP409DVC3は、Bgl II
部位がポリリンカー領域で置換されたPMP409DV（184）
（図４）の誘導体である）。これによって、M2L遺伝子
の両隣のワクシニア配列の間にgB遺伝子が配列される。
この操作で得られたプラスミドをpGB1と命名した。
次に、gB遺伝子の３′末端に枠内終結コドンを付加し
た。この操作は、pGB1の6300bp BamH I−Sac I（部分）
フラグメントにオリゴヌクレオチドGBL3（５′−CTAATA
G−３′）及びGBL4（５′−GATCCTATTAGAGCT−３′）を
クローン化することによって行なった。この操作で得ら
れたプラスミドをpGB2と命名した。
次に、H6プロモーターをgB遺伝子の上流にクローン化
した。この操作は、pGB2のBgl II部位に、H6プロモータ
ーを含有するpBLVH14の370bp Bgl IIフラグメントをク
ローン化することによって行なった。（pBLVH14は、H6
プロモーター付きウシ白血病ウイルスエンベロープ遺伝
子をワクシニアHA欠失座に含んでいる）。この操作で得
られたプラスミドをpGB3と命名した。
次いで、H6プロモーターの開始コドンをgB遺伝子の開
始コドンと整列させた。この操作は、pGB3の6300bp Sst
II−EcoR V（部分）フラグメントにオリゴヌクレオチ
ドGBL1（５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGCGGGGGGGGC
TTGATTTGCGCGCTGGTCGTGGGGGCGCTGGTGGCCGC−３′）及び
GBL2（５′−GGCCACCAGCGCCCCCACGACCAGCGCGCAAATCAAGC
CCCCCCCGCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT−３′）をクロー
ン化することによって行なった。この操作で得られたプ
ラスミドをpGB5と命名した。プラスミドpGB5において
は、ワクシニアH6プロモーターの制御下に置かれたHSV
gB遺伝子がワクシニアM2L欠失座に挿入されている。M2L
挿入座は、欠失する可能性のあるゲノムのより大きな領
域内に位置しているので、異なるワクシニアウイルスド
ナープラスミドの異なる挿入部位にH6プロモーター付き
gB遺伝子をクローン化した。この操作は、pGB5の2800bp
Bgl II−BamH IフラグメントをpSD513VCVQのBgl II部
位にクローン化することによって行なった。（pSD513VC
VQはコペンハーゲンワクニシアウイルスHind III Jフラ
グメントのサブクローンであり、チミジンキナーゼ（T
K）遺伝子コード配列がポリリンカー領域で置換されて
いる）。こうすることによって、TK遺伝子両隣のワクシ
ニアウイルス配列の間にH6プロモーター付きgB遺伝子が
配置される。この操作で得られたプラスミドをpGB6と命
名した。
HSV2 gC遺伝子のワクシニアウイルスドナープラスミド
へのクローン化 HSV2 gC遺伝子の塩基配列は、既に決定されている（1
17）。今度は図30を参照する。HSV2（Ｇ株）ゲノムDNA
からHSV2 gC遺伝子を含有する2900bp Sal Iフラグメン
トを単離し、これをpIBI25のSal I部位に挿入して、プ
ラスミドpGC3を得た。
次に、gC遺伝子をワクシニアウイルス（コペンハーゲ
ン）フランキングアーム間にクローン化した。この操作
は、pGC3の2900bp Xho I−BamH IフラグメントをpGC2の
Xho I−BamH I部位にクローン化することによって行な
った。pGC2は、ワクシニアウイルスH6プロモーターを含
有するpBLVH14の370bp Bgl IIフラグメントをpSD486VC
のBgl II部位にクローン化することによって作成した。
pSD486VCはコペンハーゲンワクシニアウイルスHind III
Bフラグメントのサブクローンであり、μ遺伝子コード
配列がポリリンカー領域で置換されている。これによっ
て、μ遺伝子両隣のワクシニアウイルス配列の間にgC遺
伝子が配置される。この操作で得たプラスミドをpGC5と
命名した。
次に、H6プロモーターの開始コドンをgC遺伝子の開始
コドンと整列させた。この操作は、pCG5の5400bp Nru I
−Sfi IフラグメントにオリゴヌクレオチドGCL1（５′
−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCCTTGGACGGGTGGGCCTAGCC
GTGGGCCTGTG−３′）及びGCL2（５′−AGGCCCACGGCTAGG
CCCACCCGTCCAAGGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT−３′）
をクローン化することによって行なった。この操作で得
られたプラスミドをpGC10と命名した。
次いで、pGC10から３′側外領域の余剰非コード配列
を欠失させた。この操作は、pGC10の4900bp Sal I−Sma
I（部分）フラグメントを大腸菌DNAポリメラーゼＩ
（クレノウフラグメント）で処理して再び環状形にする
ことによって行なった。この操作で得たプラスミドをpG
C11と命名した。
次に、pGC11から３′側外領域の余剰非コード配列を
欠失させた。この操作は、pGC11の4900bp Xba I−Apa I
（部分）フラグメントにオリゴヌクレオチドGCL3（５′
−CTAGGGCC−３′）をクローン化することによって行な
った。この操作で得られたプラスミドをpGC12と命名し
た。プラスミドpGC12においては、ワクシニアのμ欠失
座に、H6プロモーターの制御下に置かれたHSV gC遺伝子
が挿入されている。μ欠失座は欠失する可能性のあるゲ
ノムのより大きな領域内に位置しているので、続いて該
H6プロモーター付きgC遺伝子をワクシニアウイルスドナ
ープラスミドのAT I挿入部位にクローン化した。これ
は、pGC12の1550bp Nru I−BamH IフラグメントをpBP14
の5000bp Nru I−BamH Iフラグメントにクローン化する
ことによって行なった。これによって、AT I遺伝子の両
隣のワクシニアウイルス（コペンハーゲン）配列の間に
H6プロモーター付きgC遺伝子が配置される。この操作で
得られたプラスミドをpGC13と名付けた。
HSV2 gD遺伝子のワクシニアウイルスドナープラスミド
へのクローニング HSV2 gD遺伝子の塩基配列は既に決定されている（11
8）。次に図31を参照する。HSV2（Ｇ株）ゲノムDNAか
ら、HSV2 gD遺伝子を含有する7.5Kb Xba Iフラグメント
を単離し、pIBI25のXba I部位に挿入してプラスミドpGD
1を得た。
次に、gD遺伝子をH6プロモーター下流のワクシニアウ
イルス（コペンハーゲン）フランキングアーム間にクロ
ーン化した。この操作は、pGD1の1500bp Dra I−Pst I
フラグメントをpTP15のSma I−Pst I部位にクローン化
することによって行なった。この操作によって、gD遺伝
子はH6プロモーター下流で、かつHA遺伝子の両隣のワク
シニアウイルス配列間に配置される。この操作で得られ
たプラスミドをpGD2と命名した。
次に、H6プロモーターの開始コドンをgD遺伝子の開始
コドンと整列させて。この操作は、pGD2の5100bp EcoR
V−Aha II（部分）フラグメントにオリゴヌクレオチドG
DL1（５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGGCGTTGACCTCCG
G−３′）及びGDL2（５′−CGCCGGAGGTCAAACGCCCCATTAC
GATACAAACTTAACGGAT−３′）をクローン化することによ
って行なった。この操作で得られたプラスミドをpGD5と
命名した。
次に、３′側外領域の余剰非コード配列を欠失させ
た。この操作は、pGD5の4800bp Nae I−Pst Iフラグメ
ントにオリゴヌクレオチドGDL3（５′−GGCAGTACCCTGGC
GGCGCTGGTCATCGGCGGTATTGCGTTTTGGGTACGCCGCCGGCGCTCAG
TGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCC
CCCTCGCACCAGCCATTGTTTTACTAGCTGCA−３′）及びGDL4
（５′−GCTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAGGGGGGCGCGTCGTCAT
CCCGGATGTGGGGGAGACGTAGGCGCTTGGGGGCCACTGAGCGCCGGCGG
CGTACCCAAAACGCAATACCGCCGATGACCAGCGCCGCCAGGGTACTGCC
−３′）をクローン化することによって行なった。この
操作で得られたプラスミドをpGD7と命名した。
次いで、H6プロモーターの５′側に追加配列を付加し
た。この操作は、pGB6（図30）の150bp Bgl II−EcoR V
フラグメントをpGD7の4800pb Bgl II−EcoR Vフラグメ
ントにクローン化することによって行なった。この操作
で得られたプラスミドをpGD8と命名した。
組換えワクシニアウイルスの構築 ワクシニアウイルスにHSV2 gB、gC及びgD遺伝子をク
ローン化するのに用いた方法の概要を、それぞれ図29、
図30及び図31に示した。これらの構築体はすべてワクシ
ニアウイルス初期／後期プロモーターH6（41,42,184）
を利用する。各HSV2遺伝子はワクシニアウイルスゲノム
の異なる部位にクローン化されている。H6プロモーター
付きgB遺伝子は、M2L遺伝子のフランキング配列間（vp5
69）又はTK遺伝子のフランキング配列間（vP734、vP775
及びvP776）にクローン化されている。H6プロモーター
付きgC遺伝子は、μ遺伝子のフランキング配列間（vP57
9）又はAT I遺伝子のフランキング配列間（vP748、vP77
6及びvP777）にクローン化されている。H6プロモーター
付きgD遺伝子はHAは遺伝子のフランキング配列間にクロ
ーン化されている（vP570、VP761、vP775及びvP777）。
pGB5をvP458感染細胞にトランスフェクトして組換えワ
クシニアウイルスvP569を得た。pGB6をvP618感染細胞に
トランスフェクトしてvP734を得た。pGC11をvP533感染
細胞にトランスフェクトしてvP579を得た。pGC13をvP61
8感染細胞にトランスフェクトしてvP748を得た。pGD5を
vP425感染細胞にトランスフェクトしてvP570を得た。pG
D8をvP618感染細胞にトランスフェクトしてvP761を得
た。
vP425は野生型ワクシニアウイルス（コペンハーゲ
ン）の一変種であり、TK遺伝子が欠失し、かつHA遺伝子
がβ−ガラクトシダーゼで置換されている（例１）（18
4）。vP458は野生型ワクシニアウイルスの一変種であ
り、TK遺伝子が欠失し、かつM2L遺伝子がβ−ガラクト
シダーゼで置換されている（例２）。vP553は野生型ワ
クシニアウイルスの一変種であり、TK遺伝子が欠失し、
かつμ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼで置換されてい
る。vP618は野生型ワクシニアウイルスの一変種であ
り、TK、μ及びAT I遺伝子が欠失している。
２種類のHSV2糖タンパク質遺伝子を含有する組換えワ
クシニアウイルスも構築した。vP775はgB及びgD遺伝子
を含有し、vP776はgB及びgC遺伝子を含有し、vP777はgC
及びgD遺伝子を含有する。pGD8をvP734感染細胞にトラ
ンスフェクトしてvP775を得た。pGC13をvP734感染細胞
にトランスフェクトしてVP776を得た。pGD8をvP748感染
細胞にトランスフェクトしてvP777を得た。
３種類のHSV2糖タンパク質遺伝子を含有する組換えワ
クシニアウイルスも構築した。vP812は、HSV−２のgB、
gC及びgD遺伝子を含有する。pGD8をvP776感染細胞にト
ランスフェクトしてvP812を得た。
組換えワクシニアウイルス感染細胞中のHSV2糖タンパク
質の免疫蛍光 HSV2感染細胞においては、gB、gC、gD（並びにHSV2に
コードされた他の糖タンパク質）が原形質膜上に発現す
る。HSV2遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルスで
感染させた細胞について免疫蛍光実験を行なったとこ
ろ、これらの組換えワクシニアウイルス感染細胞におい
て産生されたHSV2ポリペプチドも原形質膜上に発現する
ことが判明した。
組換えワクシニアウイルス感染細胞中のHSV2糖タンパク
質の免疫沈降 HSV2感染細胞内で生産されるHSV2 gB糖タンパク質は
約117kDaの分子量を有する（198,199）。HSV2 gB遺伝子
を含有する組換えワクシニアウイルス（vP569、vP734、
vP775及びvP776）を感染させた細胞も、HSV2にコードさ
れた分子量約117kDaのポリペプチドを産生する。vP569
感染細胞について、HSV2ウイルス全体に対する抗血清で
免疫沈降反応を行なうと、分子量約117kDaと110KDaの２
つの主要なタンパク質、並びに分子量50kDa、45kDa及び
30kDaの３つのマイナーなタンパク質が検出される。vP7
34、vP775及びvP776を感染させた細胞についての免疫沈
降反応では、分子量約110kDaと90kDaの２つの主要なタ
ンパク質、並びに約117kDa、110kDa、50kDa、45kDa及び
30kDaの５つのマイナーなタンパク質が検出される。
HSV2感染細胞内で生産されるHSV2 gC糖タンパク質は
約63kDaの分子量を有する（199,200）。HSV2 gC遺伝子
を含有する組換えワクシニアウイルス（vP579、vP748、
vP776及びvP777）を感染させた細胞も、HSV2にコードさ
れた分子量約63kDaのポリペプチドを産生する。vP579、
vP748、vP776及びvP777で感染させた細胞について、HSV
2ウイルス全体に対する抗血清で免疫沈降反応を行なう
と、分子量約85kDaの主要なタンパク質と分子量約65kDa
のマイナーなタンパク質が検出される。HSV2ウイルス全
体に対するウサギ抗血清はダコ社（DAKO Corporation,
カリフォルニア州サンタバーバラ、コード番号B116）か
ら入手し、1:100に希釈して用いた。
HSV2感染細胞内で生産されるHSV2 gD糖タンパク質は
約51kDaの分子量を有する（198,199）。HSV2 gD遺伝子
を含有する組換えワクシニアウイルス（vP570、vP761、
vP775及びvP777）を感染させた細胞も、HSV2にコードさ
れた分子量約51kDaのポリペプチドを産生する。vP570、
vP761、vP775及びvP777で感染させた細胞について、HSV
2ウイルス全体に対する抗血清で免疫沈降反応を行なう
と、分子量約48kDaの１つの主要なタンパク質と、分子
量約40kDaと31kDaのマイナーなタンパク質が検出され
る。
インビボでの評価 パオレッティ（Paoletti）他の記載した実験（26）と
同様な実験において、HSV2の種々の糖タンパク質形を発
現なる上記組換えワクシニアウイルスのすべてが、免疫
マウスを致死量のHSV感染さら防御した。
例14−ワクシニアウイルス組換え体におけるウシヘルペ
スウイルス１型糖タンパク質g Iの発現 BHV1 g I型遺伝子のワクシニアウイルスへのクローン化 BHV1 g I遺伝子の塩基配列は既に文献に記載されてい
る（63）。ここで図32を参照する。BHV1 g I遺伝子を含
有するプラスミドpIBRS6（Straub株）をRhone Merieux
社から入手した。g I遺伝子の５′末端を、H6プロモー
ター（41,42,69）の下流のワクシニアウイルス（コペン
ハーゲン）フランキングアーム間にクローン化した。こ
の操作は、pIBRS6の540bp Sal I−Pst Iフラグメントを
pGD5の4400bp Sal I/Pst Iフラグメントにクローン化す
ることによって行なった（pGD5はHSV2 gD遺伝子をpTP15
にクローン化することによって作成した）（184）（図
３）。こうして、H6プロモーターの下流のワクシニアウ
イルスHAフランキングアーム間にg I遺伝子が配置され
る。この操作で得たプラスミドをpIBR2と名付けた。
次に、H6プロモーターの開始コドンをg I遺伝子の開
始コドンと整列させた。この操作は、pIBR2の3800bpNru
I−Sst IIフラグメントにオリゴヌクレオチドIBRL1
（５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCTCGCGGCGGTGCT
GAACGCGCCGC−３′）とオリゴヌクレオチドIBRL2（５′
−GGCGCGTTCAGCACCGCCGCGAGCGGCCATTACGATACAAACTTAACG
GAT−３′）をクローン化することによって行なった。
この操作で得たプラスミドをpIBR4と名付けた。
次いで、後段の操作を行なうために必要なNco I部位
を生じさせた。この操作は、pIBR4のPst I部位にオリゴ
ヌクレオチドIBRL3（５′−CCATGGTTTAATGCA−３′）と
IBRL4（５′−TTAAACCATGGTGCA−３′）をクローン化す
ることによって行なった。この操作で得たプラスミドを
pIBR5と名付けた。
次に、g I遺伝子の３′末端をpIBR5にクローン化し
た。この操作は、pIBRS6の1740bp Tth111 I−Nco Iフラ
グメントをpIBR5の3700bp Tth111 1−Nco Iフラグメン
トにクローン化することによって行なった。この操作で
得たプラスミドをpIBR7と名付けた。
次いで、後段の操作を行なうために必要なBgl II部位
を生じさせた。この操作は、pIBR7のNco I部位にオリゴ
ヌクレオチドIBRL5（５′−CATGGTTTAAGATCTC−３′）
及びIBRL6（５′−CATGGAGATCTTAAAC−３′）をクロー
ン化することによって行なった。この操作で得たプラス
ミドをpIBR8と名付けた。
次に、g I遺伝子の長い親水性リーダー配列の一部分
を欠失させた。この操作は、pIBR8の4400bp Nru I/Apa
I（部分）フラグメントにオリゴヌクレオチドIBRL7
（５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCGCTAGCCGCTGCC
CTGCTATGGGCGACGTGGGCC−３′）とIBRL8（５′−CACGTC
GCCCATAGCAGGGCAGCGGCTAGCGCGGCCATTACGATACAAACTTAACG
GAT−３′）をクローン化することによって行なった。
こうして132bpの親水性リーダー配列が欠失する。この
操作で得たプラスミドをpIBR9と名付けた。
次に、H6プロモーター付き先端欠失g I遺伝子を別の
ワクシニアウイルスドナープラスミドにクローン化し
た。この操作は、pBP14の4900pbNru I−BamH Iフラグメ
ントにpIBR9の1700bp Nru I−Bgl IIフラグメントをク
ローン化することによって行なった（211）。この操作
で得たプラスミドをpIBR10と名付けた。
組換えワクシニアウイルスの構築 BHV1 g I遺伝子をワクシニアウイルスにクローン化す
るのに用いた方法の概要を図32に示す。pIBR7をvP410感
染細胞にトランスフェクトすることによって組換えワク
シニアウイルスvP637を得た。pIBR10をvP410感染細胞に
トランスフェクトすることによって組換えワクシニアウ
イルスvP724を得た。vP637は全BHV1 g I遺伝子を含有す
る。vP724は132bpの５′シグナル配列の欠失したg I遺
伝子を含有する（63）。これらの組換えウイルスはワク
シニアウイルス初期／後期プロモーターH6を利用する
（41,42,184）。vP637中のg I遺伝子はHA遺伝子のフラ
ンキング配列間にクローン化されている。vP724中のg I
遺伝子はAT I遺伝子のフランキング配列間にクローン化
されている。
組換えワクシニアウイルス感染細胞における、BHV1にコ
ードされたポリペプチドの免疫蛍光と検出 BHV1感染細胞においては、g Iが原形質膜上に発現す
る。vP637又はvP724で感染させた細胞について免疫蛍光
実験を行なったところ、これらの細胞内で生産されたBH
V1にコードされたポリペプチドも原形質膜上で発現する
ことが判明した。免疫蛍光実験は例１に記載した手順で
行なった。BHV1 gIに特異的なモノクローナル抗体4203
及び5106を使用した（201）。
例15−ネコヘルプスウイルス糖タンパク質gBのワクシニ
アウイルス組換え体における発現 本例では、ワクシニアウイルスWR株（202）を用い
た。WR株から誘導した組換えワクシニアウイルスvP293
を救援ウイルスとして用いた（69）。
FHV−1 DNAの抽出及びFHV−1 Sac I−Sac I 3.2Kbフラ
グメントのクローニング FHV−1 DNAをCO株から抽出して精製した。FHV−1 DNA
ゲノムをEcoR Iで消化し、常法によりプラスミドpBR322
に連結た（20）。このFHV−１バンク（bank）を、PRV g
II（62）及びBHV−1 gB遺伝子（203）由来のDNAプロー
ブを用いてスクリーニングした。このハイブリダイゼー
ションで陽性であった２つのEcoR Iクローン由来のサブ
クローンを用いてさらにハイブリダイゼーションを行な
うと、FHV−1 gB遺伝子のより正確なマッピングが可能
になった。FHV−1 gB遺伝子を含有する3.2Kb Sac I−Sa
c IフラグメントをpUC18にクローン化してプラスミドpF
HVgBCを得た。
FHV−1 gBをコードするSac I−Sac Iフラグメントの配
列決定 上述の通り、修飾T7配列を用いてpFHVgBC及びpFHVgBC
由来サブクローンから日本鎖双方について塩基配列に関
するデータを得た。
FHV−1 gB遺伝子のワクシニアウイルスドナープラスミ
ドへのクローニング ここで図33を参照する。FHV−1 gB遺伝子をpHES4にク
ローン化した。pHES4は、ワクシニアウイルスWR株にお
ける宿主域選択系用に設計されたプラスミドの一つであ
る（69）（図10）。このプラスミドはヒト宿主域遺伝子
K1Lを有しており、欠失変異株vP293にヒト細胞上での複
製能力を与える。FHV−1 gB遺伝子を、ワクシニア合成H
6プロモーターのすぐ下流に挿入した（69）。プラスミ
ドpFHVgBCをKpn IとSac Iで消化し、FHV−1 gBを含有す
る3150bp制限フラグメントをアガロースゲルから単離し
て、予めKpn IとSac Iで消化しておいたプラスミドpHES
4に連結した。得られたプラスミドをpJCA001と名付けた
（図33）。
FHV−1 gB遺伝子のDNA配列解析 今度は図34を参照する。DNA配列の解析から、337番目
から3177番目の塩基からなる解読枠が明らかになった。
転写制御調節シグナルと思われる配列が、337番目のATG
開始コドンの５′上流領域に見付かった。配列AAATATAT
（ヌクレオチド184〜191）を有するTATAボックスが、CA
Tボックスと思われる配列GGTGAGTAの80塩基下流に位置
していた。ポリアデニル化シグナルAATAAA（ヌクレオチ
ド3251〜3256）はTAA終止コドンの50塩基下流に位置し
ていた。配列５′−TCATTCTAGCA−３′（ヌクレオチド2
00〜210）の11個の塩基のうちの８個が18SリボソームRN
Aの配列３′−AGGAAGGCGT−５′（61）と相補性を有し
ており、リボソーム結合部位として機能しているものと
思われる。真核生物のmRNAの翻訳開始に関する移動モデ
ルが提案されている（151,155）。開始コドンと思われ
る周囲の配列ATCATGT（ヌクレオチド334〜340）の状況
は、真核生物のmRNAの翻訳開始に対する機能的配列とし
て適格である。FHV−1 gB解読枠は、計算上106.2kDaの
分子量を有する947残基のアミノ酸をコードする。Ｇ＋
Ｃ含量は45.8％である。
FHV−1 gBタンパク質の構造分析 アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タンパク質に共通
する幾つかの特徴が明らかになった。23残基目のアミノ
酸から73残基目のアミノ酸の領域は特徴的な疎水的性質
を有しており、シグナル配列であるものと思われる（図
34）。ここで図35を参照する。この長い疎水性シグナル
配列に先立って、22残基のアミノ酸からなる親水性配列
が存在する。この特徴は、仮性狂犬病（PRV）g II遺伝
子（62）、ウシヘルペスウイルス１型（BHV−１）g I遺
伝子（63）並びにウマヘルペスウイルス１型（EHV−
１）（71）とウマヘルペスウイルス４型（EHV−４）（7
2）のgp14遺伝子にも認められるが、これらはすべてHSV
gB相同物である。42残基のアミノ酸（アミノ酸789〜83
1）からなる疎水性領域は膜貫通性アンカー領域として
機能すると予想される。親水性の細胞質ドメインは116
残基のアミノ酸からなる。Ｎ−グリコシル化される可能
性のあるAsn−Ｘ−Thr/Ser（Ｘはプロリン以外のアミノ
酸である）部位が10カ所存在し（64）、そのうちの１つ
はシグナル配列中に位置している。タンパク質分解を受
ける可能性のある切断部位（Arg−Arg−Ser）が２カ所
に接近して（アミノ酸504〜506及び516〜518）存在する
が、この配列はPRV g II（94）、VZV gp II及びHCMV gB
（71）並びにEHV−1 gp14（71,72）に存在するものと同
一である。FHV−1 gBのアミノ酸配列の疎水的性質を図3
5に示す。
FHV−1 gBアミノ酸配列と他のヘルペスウイルス糖タン
パク質との比較 FHV−1 gB遺伝子のアミノ酸組成の比較から、他のヘ
ルペスウイルスの糖タンパク質との著しい相同性が明ら
かになった。たとえばFHV−1 gBは、PRV g II（62）、B
HV−1 g I（63）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）g II
（66,204）、HSV−1 gB（67）、HSV−2 gB（205）、EHV
−1 gp14（71）、並びにエプスタイン・バールウイルス
（EBV）（68,206）とヒトサイトメガロウイルス（HCM
V）（10）の糖タンパク質と相同である。
FHV−1 gB糖タンパク質を発現するワクシニア組換え体v
P713の構築 WRワクシニアウイルス宿主域選択系pHES4/vP293（6
9）を用いて、FHV−1 gBコード配列をワクシニアウイル
スベクターに挿入した（69）。WRワクシニアウイルスvP
293/pHES宿主域選択系を用いた組換えによって生じる組
換えワクシニア子孫（プロジェニィ）はヒトMRC−５細
胞上でプラークを形成する能力を有するので、かかる組
換え体の同定を迅速に行なうことができる（69）。プラ
スミドpJCA001をドナープラスミド、vP293を救援ウイル
スとして用いた組換えで、ワクシニアウイルス組換え体
vP713が得られた（図33）。
vP713の産生するFHV−1 gB糖タンパク質の免疫蛍光 ヒツジ抗FHV−1 gB血清No.2854を用いて、例１に記載
されている通り、組換えワクシニアウイルスvP713を感
染させたVERO及びMRC−５細胞の免疫蛍光実験を行なっ
た。用いた感染多重度は細胞当り2pfuであった。FITCロ
バ抗ヒツジI gGを２次抗体として用いた。
FHV−1 gBは、ワクシニア組換え体vP713感染VERO細胞
の細胞表面上のみならず、アセトンで固定した細胞内部
にも検出された。vP410を感染させた対照細胞において
は、FHV−1 gBに対する免疫反応性は細胞表面にも細胞
内部にも検出されなかった。
vP713の産生するFHV−1 gB糖タンパク質の免疫沈降 vP713の発現するFHV−1 gB糖タンパク質を評価するた
めに、VERO細胞にvP713を感染させて代謝されるタンパ
ク質を35S−メチオニンで標識した。放射性標識した細
胞溶解物の免疫沈降反応をヒツジ抗FHV−1 gB血清No.28
54を用いて行なった。
60mmシャーレ当り２×106個の細胞を植えたVERO細胞
単層に、細胞当り0.1pfuと低い感染多重度で、対照（vP
410）又は組換えワクシニアウイルスvP713を感染させ
た。免疫沈降反応を例１に記載した手順で行なった。
非感染VERO細胞又は対照ワクシニアウイルスvP410を
感染させたVERO細胞のいずれにも、特異的抗FHV−1 gB
血清によって免疫沈降した生成物はなかった。vP713を
感染させたVERO細胞からは、血清No.2854によって、FHV
−1 gB放射性標識生成物が沈降した。５種類の代謝的に
放射性標識された主要ポリペプチドが特異的に沈降し
た。見掛けの分子量115kDaと110kDaの２つの大ポリペプ
チドはグルコシル化されていない前駆体タンパク質と成
熟形タンパク質に相当するものであろう（理論的分子量
はそれぞれ106kDaと98kDaである）。68kDaの幅の広いバ
ンドは、この実験では観察されなかったグルコシル化前
駆体（136kDa）のタンパク質分解によって生ずる２つの
グリコシル化サブユニット（69kDa＋66kDa）ではないか
と思われる。３つの小さな沈降生成物（59kDa、53kDa及
び48kDa）はどんな既知FHP−1 gB生成物にも相当せず、
分解産物であると思われる。
例16−エプスタイン・バールウイルス糖タンパク質のポ
ックスウイルスベクターにおけるクローニング及び発現 EBV gp340及びgp220遺伝子のワクシニアドナープラスミ
ドpMP409DVCへのクローニング この例において、EBV遺伝子はEBV B95−８株から単離
し（207）、gp340及びgp220遺伝子はcDNAクローン（そ
れぞれプラスミドpMLPgp340及びpMLPgp220）であり、g
B、gH及びBBRF3遺伝子はBamH I遺伝子バンクから単離し
た。今度は図36を参照する。pMLPgp220プラスミドの210
0bp Xma I−Cla Iフラグメントを、Xma I−Acc Iで消化
したM13mp18にクローン化した。この操作で得たファー
ジをmp18gp220と名付けた（図36）。オリゴヌクレオチ
ドCM4（TAAAGTCAATAAATTTTTATTGCGGCCGCTACCGAGCTCGAAT
TCG）及びCM5（GCTTGCATGCCTGCAGATATCCGTTAAGTTTGTATC
GTAATGGAGGCAGCCTGC）を用いたインビトロ変異導入法
（17）によって、gp220遺伝子をワクシニアH6プロモー
ターの制御下で発現するように修飾した。修飾gP220遺
伝子を含有するプラスミドをmp18gp220（５＋４）と命
名した（図36）。
修飾gp220遺伝子を、完全H6合成プロモーターを含有
するプラスミドSP131Not Iにクローン化した。この操作
は、mp18gp220（５＋４）の2300bp Nar I−EcoR Vフラ
グメントをSP131Not Iプラスミドの2940bp EcoR V−Nar
Iフラグメントにクローン化することによって行なっ
た。得られたプラスミドをSP131gp220と命名した（図3
6）。
H6プロモーターの制御下に置かれたgp340遺伝子を、X
ho I−Sca I（部分）消化SP131gp220プラスミドにpMLPg
p340の2360bp Sca I−Xho Iフラグメントをクローン化
することによって得た。得られたプラスミドをSP131gp3
40と命名した（図36）。
H6プロモーター付きgp340及びgp220遺伝子を、ワクシ
ニアウイルスM2L挿入座プラスミドpMP409DVC（図４、た
だし図36及び図40においては、このプラスミドはMP409
と記載されている）にクローン化した。この操作は、プ
ラスミドpMP409DVCのBgl IIムング・ビーンヌクレアー
ゼ処理部位に、プラスミドSP131gp340の2800bpムング・
ビーンヌクレアーゼ処理Not Iフラグメント及びプラス
ミドSP131gp220の2100bpムング・ビーンヌクレアーゼ処
理Not Iフラグメントをクローン化することによって行
なった。得られたプラスミドをそれぞれ409H6340及び40
9H6220と命名した（図36）。
EBV gB遺伝子のワクシニアウイルスドナープラスミドpM
P409DVCへのクローニング 次に図37を参照する。EBVゲノムライブラリーから、E
BV DNAのBamH I Aフラグメント（207）の3500bp EcoR I
−Xmn Iフラグメント（EBV gB遺伝子を含有する）を単
離して、pIBI25の2837bp Hinc II−EcoR Iフラグメント
にクローン化した。得られたプラスミドをp258gHと命名
した（図37）。
オリゴヌクレオチドEBVBM5（CCCTACGCCGAGTCATTACGAT
ACAAACTTAACGGATATCAGAGTCGTACGTAGG）及びEBVBM3（CTG
GAAACACTTGGGAATTCAAGCTTCATAAAAAGGGTTATAGAAGAGTCC）
を用いたインビトロ変異導入法（17,185）によって、gB
遺伝子がワクシニアH6プロモーターの制御下で発現され
るように修飾した。得られたプラスミドをp25gB（５＋
３）と命名した。
p25gB（５＋３）の2600bp EcoR V−EcoR Iフラグメン
トをSP131の3300bp EcoR V−EcoR Iフラグメントにクロ
ーン化した。得られたプラスミドをSP131gBと命名した
（図37）。
次に、H6プロモーターgB遺伝子をワクシニアウイルス
ドナープラスミドpMP409DVCにクローン化した。この操
作は、pMP409DVCのBgl IIムング・ビーンヌクレアーゼ
処理部位にSP131gBの2700bp Hind IIIムング・ビーンヌ
クレアーゼ処理フラグメントをクローン化することによ
って行なった。得られたプラスミドを409H6gBと命名し
た（図37）。
EBV gB遺伝子のワクシニアドナープラスミドpSD486VCへ
のクローニング EBV BamH Iクローン化制限フラグメントライブラリー
において、解読枠BXLF2はBamH I X及びBamH I Tフラグ
メントに含有されている（207）。図38に示すように、B
XLF2の完全な解読枠を、BamH I Xの830bp Sma I−BamH
IフラグメントをpIBI24の2880bp Sma I−BamH Iフラグ
メントにクローン化することによって再構成した。得ら
れたプラスミドを24gH5と命名した。BamH I Tの1850bp
BamH I−Hind IIIフラグメントを24gH5のBamH I−Hind
IIIフラグメントにクローン化した。生じた全gH遺伝子
を含有するプラスミドを24gHと命名した（図38）。
オリゴヌクレオチドHM5（ACACAGAGCAACTGCAGATCTCCCG
ATTTCCCCTCT）、HM4（GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCT
GCG）及びHM3（GCCAGGGTTTTCCCAGAGATCTGATAAAAACGACGG
CCAGTG）を用いたインビトロ変異導入法によって、gH遺
伝子がワクシニア出血性（μ）初期プロモーターの制御
下で発現されるように修飾した。オリゴヌクレオチドHM
4を用いて、gH遺伝子に含まれるワクシニア初期転写終
結シグナル（45）を除去した。かかる修飾gH遺伝子を含
有するプラスミドを24gH（５＋４＋３）と命名した。
次いで図38を参照する。ワクシニアμプロモーターは
プラスミドpSD486VCに含まれている（図30）。（このプ
ラスミドは図38においてはSD486と記載されている）。2
4gH（５＋４＋３）の2130bp Bgl IIムング・ビーンヌク
レアーゼ処理フラグメントを、Bgl IIムング・ビーンヌ
クレアーゼ処理pSD486VCにクローン化した。この最後の
クローニング操作によって、gH遺伝子がワクシニアμプ
ロモーターの制御下に置かれる。この操作によって生じ
たプラスミドを486gHと命名した（図38）。
解読枠BBRF3のワクシニアウイルスドナープラスミドpCO
PSC−5Hへのクローニング すべてのBBRF3解読枠がEBV DNAのBamH I Bフラグメン
トに含まれている。このフラグメントをBspH Iで消化
し、大腸菌DNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメン
ト）で処理し、Bgl IIで消化した。BamH I Aフラグメン
ト内のBgl II部位は、BBRF3の終止コドンの10塩基前方
に位置する。上記1230bp BspH I−Bgl IIフラグメント
を単離し、プラスミドpCOPSC−5Hの4200bp Sma I−Bgl
IIフラグメントにクローン化した（プラスミドpCOPCS−
5HはプラスミドpCOPCS657と同一である（図16））。こ
の操作で得たプラスミドをCOPSCEBVXと命名した。
EBV gp340、gB及びgH遺伝子のワクシニアウイルスドナ
ープラスミドpSD513VCVQへのクローニング 三重EBV組換え体の作成に使用したワクシニアウイル
スドナープラスミドは、プラスミドpSD513VCVQであった
（図29）。このプラスミドはコペンハーゲンワクシニア
ウイルスHind III Jフラグメントのサブクローンを含ん
でるが、チミジンキナーゼ遺伝子コード配列がポリリン
カー領域によって置換されている。
第一の操作段階において、μプロモーター付きEBV gH
遺伝子をpSD513VCVQにクローン化した。詳細に述べる
と、486gHの2300bp SnaB I−Bgl IIフラグメントをpSD5
13VCVQの4000bp Sma I−Bgl IIフラグメントにクローン
化した。この操作で得たプラスミドを513UgHと命名し
た。
次に、H6プロモーター付きEBV gp340遺伝子を513UgH
にクローン化した。詳細を述べると、SP131gp340の2800
bp Not Iムング・ビーン処理フラグメントを513UgHの63
00bp Xho I−Pst Iムング・ビーンヌクレアーゼ処理フ
ラグメントにクローン化した。この操作で得たプラスミ
ドを513UgH340H6と命名した。
次いで、H6プロモーター付きEBV gB遺伝子を513UgH34
0H6にクローン化した。詳細を述べると、SP131gp340の2
700bp Hind IIIムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラグ
メントを513UgH340H6の9100bp Bgl IIムング・ビーンヌ
クレアーゼ処理フラグメントにクローン化した。得られ
たプラスミドを513gHgBgp340と命名した（図39）。
組換えワクシニアウイルスの構築 EBV gp340（ドナープラスミド409H6340）、EBV gp220
（ドナープラスミド409H6220）及びEBV gB（ドナープラ
スミド4096H6gB）を、ワクシニアウイルスvP458（M2L部
位）と組換えた。これらのワクシニアウイルス単一組換
え体をそれぞれvP474、vP480及びvP561と命名した。EBV
gH（ドナープラスミド486gH）をワクシニアウイルスvP
533（μ挿入部位）に組換えた。このワクシニアウイル
ス単一組換え体をvP611と名付けた。
最後に、gp340、gB及びgHを含有するワクシニアウイ
ルス三重換え体を、ドナープラスミド513gHgBgp340をワ
クシニアウイルスvP617と組換えてvP617のチミジンキナ
ーゼ挿入部位に組込むことによって得た。この組換えウ
イルスをvP712の名付けた。vP617はTK、HA及びAT I遺伝
子欠失コペンハーゲンワクシニアウイルスである。
組換えワクシニアウイルス感染細胞におけるEBVタンパ
ク質の免疫蛍光 vP474（gp340）及びvP480（gp220）感染細胞につい
て、モノクローナル抗体F29−89（165）を用いて免疫蛍
光実験を行なったところ、EBV gp340及びEBV gp220タン
パク質が原形質膜上に発現した。
vP611（gH）感染細胞は、ヒト血清を用いると、原形
質膜上に弱い陽性シグナルを示した。
最後に、vP712（三重EBVワクシニア換え体）を感染さ
せた細胞について同じ実験を行なった。モノクローナル
抗体F29−89及びNEA 9247（デュポン（DuPont）社から
入手したgB特異的抗体）を用いると、原形質膜上に陽性
シグナルが得られた。
組換えワクシニアウイルス感染細胞におけるEBVタンパ
ク質の免疫沈降 EBVに感染した細胞内で産生されるEBV gp340糖タンパ
ク質は約340kDaの分子量を有する（165）。組換えワク
シニアウイルスvP474又はvP712感染細胞も約340kDaのEB
Vタンパク質を産生した（モノクローナル抗体F29−89を
用いて行なった免疫沈降反応）。EBV gp220糖タンパク
質は220kDaの分子量を有する（165）。組換えワクシニ
アウイルスvP480感染細胞も約220kDaのEBVタンパク質を
産生する。
EBV感染細胞内で生産されるEBV gB糖タンパク質は110
kDaから125kDaの分子量を有しており、その前駆体は93k
Daの分子量を有している（206,208）。組換えワクシニ
アウイルスvP561又はvP712を感染させた細胞は、分子量
約125kDaの主要EBVタンパク質、並びに分子量約80kDa、
60kDa、50kDa及び45kDaの４つのマイナーなタンパク質
を産生する。
EBV感染細胞内で生産されるEBV gH糖タンパク質は85k
Daの分子量を有しており、その前駆体は70kDaの分子量
を有している（209）。組換え体ウイルスvP611を感染さ
れた細胞は、約85kDaのEBVにコードされたタンパク質を
産生する。
EBV糖タンパク質発現ワクシニア組換え体を用いたウサ
ギの免疫 vP474（gp340）、vP480（gp220）、vP561（gB）、vP6
11（gH）又はvP712（三重）のいずれかでウサギを免疫
した。２次免疫を１回行なった後、得られた血清を、TP
A処理B95−８細胞上での免疫蛍光によって試験した。そ
れぞれについて陽性シグナルが得られた。vP474（gp34
0）で感作させた血清を用いると、インビトロ中和活性
がみられた。
例17−ヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質抗原のポ
ックスウイルスベクターにおけるクローニング及び発現 HCMV gB遺伝子のワクシニアドナープラスミドpMP409DVC
へのクローニング ここで図40を参照する。HCMV DNAのHind III Dフラグ
メントの4800bp Hind III−BamH Iフラグメントを、プ
ラスミドpIBI24の2800bp Hind III−BamH Iフラグメン
トにクローン化した。オリゴヌクレオチドCMVM5（GCCTC
ATCGCTGCTGGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAATCCAGGATCT
G）及びCMVM3（GACAGATTGTGATTTTTATAAGCATCGTAAGCTGTC
A）を用いたインビトロ変異導入法（17,185）によっ
て、HCMV gB遺伝子がワクシニアH6プロモーターの制御
下で発現されるように修飾した。この修飾HCMV gB遺伝
子を含有するプラスミドを24CMVgB（５＋３）と命名し
た（図40）。
次に、24CMVgB（５＋３）の2900bp EcoR V−BamH Iフ
ラグメントを、合成H6プロモーターを含有するプラスミ
ドpSP131（69）の3100bp EcoR V−Bgl IIフラグメント
にクローン化した。このクローニング操作によって、HC
MV gB遺伝子がワクシニアH6プロモーターの制御下に置
かれる。得られたプラスミドをSP131gBと命名した。
最後に、H6プロモーター付きHCMV gB遺伝子をワクシ
ニアドナープラスミドpMP409DVCにクローン化した。SP1
31gBの3000bp Hind IIIムング・ビーンヌクレアーゼ処
理フラグメントをpMP409DVCのBgl IIムング・ビーンヌ
クレアーゼ処理部位にクローン化した。得られたプラス
ミドを409CMVgBと命名した（図40）。
組換えワクシニアウイルスの構築 プラスミド409CMVgB中のH6プロモーター付きCMV gB遺
伝子を救援ウイルスvP458のM2L部位に挿入した。得られ
た組換えワクシニアウイルスをvP525と命名した。
CMV gBタンパク質の組換えワクシニアウイルス感染細胞
における免疫蛍光 vP525を感染させた細胞について、モノクローナル抗
体又はモルモットポリクローナル血清を用いて免疫蛍光
実験を行なったところ、HCMV gBが原形質膜上に発現す
ることが判明した。
CMV gBの組換えワクシニア感染細胞における免疫沈降 CMV感染細胞内で生産させるCMV gB糖分タンパク質は5
5kDaの分子量を有しており、その前駆体は130kDaの分子
量を有する（172）。vP525を感染させた細胞は、約130k
Da及び55kDaの２種類ののCMV gBにコードされるタンパ
ク質を産生した。
HXLF1及びHXLF2の塩基配列 HXLF遺伝子ファミリーは、HCMVゲノムDNAのHind II X
フラグメント中に局在化している（172）。特異的なオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いてHXLF1及びHXLF2の
塩基配列を決定した（図41及び42）。HXLF1は648個の塩
基からなっており、215残基のアミノ酸からなるタンパ
ク質をコードしている。HXLF2は558個の塩基からなって
おり、185残基のアミノ酸からなるタンパク質をコード
する。同じ遺伝子の塩基配列（AD169 HCMV株）が文献に
記載されているが（173）、これらを比較したところ、H
XLF1について99％の相同性、HXLF2については96％の相
同性を有していた。
HCMV抗原発現ワクシニア組換え体によるモルモットの免
疫 ３匹のモルモットをvP525で免疫した。２次免疫を１
回行なうと、モルモットはHCMV中和抗体を生じた（平均
力価、518）。興味深いことに、HCMV陽性ヒト血清の中
和活性の50％から87％をvP525感染細胞に吸収させるこ
とができる。この結果はHCMV gBのサブユニットワクチ
ンの潜在的に重要性を有していることを示している。
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フロントページの続き (31)優先権主張番号 ５０２，８３４ (32)優先日 平成２年４月４日(1990．4．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA A61K 39/12 A61K 39/245 AFE C12N 7/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ネコヘルペスウイルス糖タンパク質gBをコ
    ードするDNAインサートを、ポックスウイルスゲノムの
    非必須領域中に、宿主中でDNAインサートによりコード
    されるタンパクの組換えウイルスによる発現をプロモー
    トすることができるプロモーター配列の下流に含有する
    組換えポックスウイルス。
  2. 【請求項２】組換えポックスウイルスが、組換えワクシ
    ニアウイルスである、請求項１記載の組換えポックスウ
    イルス。
  3. 【請求項３】組換えポックスウイルスが、組換えアビポ
    ックスウイルスである、請求項１記載の組換えポックス
    ウイルス。
  4. 【請求項４】組換えアビポックスウイルスが、組換えフ
    ァウルポックスウイルス又は組換えカナリーポックスウ
    イルスである、請求項３記載の組換えポックスウイル
    ス。
  5. 【請求項５】組成物を接種された宿主動物において抗原
    性および／または免疫学的応答を誘導することができる
    組成物であって、請求項１〜４のいずれか１項記載の組
    換えポックスウイルスを接種担体との混合で含むことを
    特徴とする組成物。
  6. 【請求項６】宿主細胞中で糖タンパク質を発現すること
    ができる組換えウイルスを用いる前記宿主細胞のインビ
    トロ感染によりヘルペスウイルス糖タンパク質を産生さ
    せる方法であって、請求項１〜４のいずれか１項記載の
    組換えポックスウイルスを用いる方法。
  7. 【請求項７】インビボ以外で、請求項１〜４のいずれか
    １項記載の組換えウイルスの発現により得られる、ヘル
    ペスウイルス糖タンパク質。
  8. 【請求項８】インビボで宿主細胞において、請求項１〜
    ４のいずれか１項記載の組換えウイルスの発現により得
    られる、ヘルペスウイルス糖タンパク質。
  9. 【請求項９】非ヒト新生児における母性免疫を回避する
    ためのこの新生児の母親及びこの新生児の接種のための
    接種キットであって、前記新生児の出生前の母親への接
    種のための第一のワクチンと、前記新生児に接種するた
    めの第二のワクチンとを含み、第一のワクチンが請求項
    １〜４のいずれか１項記載の第一の組換えポックスウイ
    ルスを含み、第一の組換えポックスウイルスが前記母親
    に接種された場合にDNAインサートによりコードされた
    ヘルペスウイルス糖タンパク質を発現することができ、
    前記第二のワクチンが請求項１〜４のいずれか１項記載
    の第二の組換えポックスウイルスを含み、第二の組換え
    ポックスウイルスが前記新生児に接種された場合にDNA
    インサートによりコードされたヘルペスウイルス糖タン
    パク質を発現することができ、前記第一及び第二のヘル
    ペスウイルス糖タンパク質が同一であり、前記第一及び
    第二の組換えポックスウイルスが異なる組換えポックス
    ウイルスであるがそれぞれ同じ第一及び第二のヘルペス
    ウイルス糖タンパク質に対する免疫応答を誘導すること
    ができる、接種キット。
  10. 【請求項１０】第一及び第二のヘルペスウイルス糖タン
    パク質が、同じ病原体由来であるが異なるタンパク質で
    あり、第一及び第二のポックスウイルスが、同じ組換え
    ポックスウイルスであり、各々がそれぞれのヘルペスウ
    イルス糖タンパク質に対する免疫応答を誘導することが
    できる、請求項９記載の接種キット。
  11. 【請求項１１】請求項９記載のキットの製造における請
    求項１〜４のいずれか１項記載の組換えポックスウイル
    スの使用方法。
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