CN103945864A - 截短的hiv包膜蛋白(env)、其相关方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了关于新HIV包膜蛋白的方法和相关组合物。在某些实施方案中,本发明涉及用于制备、生产和施用分离的新HIV包膜核酸和蛋白质序列(其适于,例如,作为HIV疫苗)的方法及组合物。
Description
联邦资金
本发明部分由政府支持,合作协议号码为W81XWH-07-2-0067。联邦政府在本发明中享有相应权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年4月25日提交的美国临时专利申请系列号61/478,857的优先权权益,其通过引用并入本文。
发明领域
本发明大体上涉及新的HIV包膜蛋白和其相关方法及组合物。更具体地,本发明涉及涉及用于制备、生产和施用分离的新HIV包膜核酸和蛋白质序列(其适于,例如在某些实施方案中,作为HIV疫苗)的方法及组合物。
发明背景
AIDS或获得性免疫缺陷综合征,由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起,具有以下几种临床特征,包括:消耗综合征、中枢神经系统退化和导致机会致病菌感染和恶性肿瘤的深度免疫抑制(profound immunosuppression)。HIV是动物反转录病毒慢病毒(lentivirus)属的成员,该属包括羊的羊髓鞘脱落病毒和牛、猫科及猴免疫缺陷病毒。迄今,人们已鉴定出两种紧密相关的HIV(HIV)类型,称为HIV-1和HIV-2,其中HIV-1是AIDS最常见的致病原因。然而,HIV-2尽管在基因组结构和抗原性上不同,却导致相似的临床症状。
在全球流行的占主要地位的HIV-1的形式被称为HIV-1的主要组。一共有三种HIV-1组,主要组(M组)、异常组(outlier group,O组)和非M/非O组(N组)。还有P组。M组进一步被分为九种不同的遗传亚型,这些亚型通常称作进化枝(clade)和循环重组体型(CRF)。HIV-1的M组 的亚型/进化枝标记为A、B、C、D、F、G、H、J和K。B进化枝在美国最为普遍,而C进化枝在世界范围内最为普遍。CRF01_AE或之前的E进化枝和CRF02_AG在HIV-1的传染中是最为普遍的亚型间重组株。遗传亚型和亚型间重组形式的地理分布持续改变,现有的数据提供的是不完全的估计。
感染性HIV颗粒由两条相同的RNA链组成,每条链大约9.2kb长,包装在一个病毒蛋白质核心中。该核心结构由来自宿主细胞膜的磷脂双层包膜围绕,其中所述磷脂双层包膜还包括病毒编码的膜蛋白(Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,第4版,W.B.Saunders Company,2000,454页)。HIV基因组具有反转录病毒家族的特征性的5′-LTR-Gag-Pol-Env-LTR-3′组织结构。在病毒基因组的每一端的长末端重复(LTR)充当来自宿主的转录调控蛋白的结合位点,并调控病毒对宿主基因组的整合、病毒基因表达和病毒复制。
HIV基因组编码几种结构蛋白。gag基因编码核壳核心和基质的结构蛋白。pol基因编码病毒复制过程所需的反转录酶(RT)、整合酶(IN)和病毒蛋白酶(PR)。tat基因编码病毒转录物延伸所需的蛋白。rev基因编码促进不完全剪接和未剪接的病毒RNA出核转运的蛋白。vif基因产物增强病毒颗粒的感染性。vpr基因产物促进病毒DNA的入核转运和调控G2细胞周期停滞。vpu和nef基因编码的蛋白质下调宿主细胞CD4的表达,同时增强病毒从受感染细胞的释放。env基因编码病毒包膜糖蛋白,该蛋白可翻译为160千道尔顿(kDa)的前体gp160,并被细胞蛋白酶切割生成外部120-kDa的包膜糖蛋白(gp120)和跨膜41-kDa的包膜糖蛋白gp41,其在细胞感染中是必需的。(Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,4th edition,W.B.Saunders Company,2000,pp.454-456)。gp140是Env糖蛋白的修饰形式,包含外部120-kDa包膜糖蛋白部分和Env的gp41部分的胞外部分,并具有gp120和gp41两者的特征。nef基因在灵长类慢病毒中是保守的,并且是感染后最早转录的基因之一。在体外研究中,描述了若干种功能,包括下调CD4和I类MHC的表达、改变T-细胞信号转导和激活、以及增强病毒感染性。
HIV感染起始于病毒颗粒上的gp120与靶细胞的细胞膜上的CD4和趋化因子受体分子(例如CXCR4,CCR5)的结合,所述靶细胞诸如CD4+T- 细胞、巨噬细胞和树突细胞。结合的病毒与靶细胞融合,并反转录RNA基因组。获得的病毒DNA整合进入细胞基因组,并指导产生新的病毒RNA,并由此产生病毒蛋白质和新的病毒体。这些病毒体从受感染细胞膜上出芽并在其他细胞建立增殖性感染。这个过程也杀死最初受感染的细胞。HIV也可以间接杀死细胞,这是由于未感染的T-细胞上的CD4受体具有对表达于受感染细胞表面上的gp120的强亲和性。在这些状况中,这些未感染细胞经由CD4受体与gp120的相互作用结合在感染细胞上并融合为合胞体,所述合胞体不能存活。CD4+T-淋巴细胞对免疫防卫反应非常重要,CD4+T-淋巴细胞的破坏是进行性免疫功能障碍的主要原因,而进行性免疫功能障碍是AIDS疾病发展的标志。CD4+T细胞的缺失严重损害人体与大多数外来侵入物作战的能力,尤其剧烈的影响人体对病毒、真菌、寄生虫、某些细菌包括分支杆菌的防御。
对Env糖蛋白的研究表明该病毒具有很多有效的保护性机制而具有很少弱点(Wyatt & Sodroski,Science.1998Jun19;280(5371):1884-8)。为了与靶细胞融合,HIV-1使用包含gp120与gp41亚基的三聚体Env复合物(Burton等人,Nat Immunol.2004Mar;5(3):233-6)。与CD4受体和共受体(通常是CCR5或CXCR4)的接合触发了Env复合物的感染潜力。中和抗体或者通过与病毒体表面上成熟的三聚体结合并阻止最初的受体接合事件,或者通过病毒附着后的结合抑制融合过程。(Parren & Burton,Adv Immunol.2001;77:195-262)。在后一种情况下,中和抗体可能与因受体结合而增强或触发暴露的表位结合。尽管中和抗体具有以上潜在的抗病毒作用,目前已知HIV-1已经进化出多种机制保护自身免受抗体的结合(Johnson&Desrosiers,Annu Rev Med.2002;53:499-518)。
HIV-1实验疫苗在人体上和/或非人类的灵长类动物的大部分实验建议一种成功的疫苗应包含可以引起广谱中和抗体(bNab)和强的细胞介导免疫的免疫原。HIV-1包膜糖蛋白(Env)是与病毒进入有关的主要病毒蛋白,也是中和抗体的主要靶点,但是由于免疫逃避策略和包膜蛋白基因剧烈的序列变异性,产生bNab是令人畏缩的任务。(Phogat S,Wyatt R.Curr_Pharm Des.2007,13:213-27;Phogat S,等人J Intern Med.2007262:26-43,Karlsson Hedestam GB,等人Nat Rev Microbiol.2008,6:143-55)
开发有效的疫苗来预防HIV感染或中和HIV感染是困难的。引发广 谱的和有效的中和抗体的能力在开发HIV-1疫苗中是主要的挑战。主要的目标是研制HIV疫苗,其可以有效地引发特异性的抗病毒中和抗体以及引起细胞介导的免疫应答从而预防感染和控制HIV的传播,并且对跨越不同遗传进化枝的病毒具有相当广泛的反应性。HIV高度的遗传多样性对疫苗的研制而言是难以解决的问题。
在本申请中引用和标识的任何文献并不代表这样的文献是本发明可获得的现有技术。
发明概述
在某些实施方案中,本申请提供了包含截短的HIV包膜蛋白的分离的肽,其中所述HIV包膜蛋白在天然的gp120/gp41切割位点处被突变以阻止蛋白酶切割,包含gp41的MPER,且在跨膜区前被截断。
在某些实施方案中,HIV包膜蛋白在其C端包含大约1到10个亲水氨基酸。在某些实施方案中,所述大约1到10个亲水氨基酸是3个赖氨酸。
在某些实施方案中,gp41的MPER包含4E10表位。在某些实施方案中,gp41的MPER在其C端包含氨基酸序列:LWYIK(SEQ ID NO:24)。在进一步的实施方案中,HIV包膜蛋白包含在LWYIK氨基酸序列(SEQ ID NO:24)C端的并与LWYIK氨基酸序列(SEQ ID NO:24)连续的大约1-10个非天然亲水性氨基酸。在某些实施方案中,HIV包膜蛋白与整联蛋白α4β7结合。
在某些实施方案中,HIV包膜蛋白衍生自HIV-1毒株,该HIV毒株归类于选自M、O、N、P的组。在某些实施方案中,所述HIV-1毒株分离自急性HIV-1感染的个体。在另外的实施方案中,所述HIV-1毒株分离自慢性HIV-1感染的个体。在某些实施方案中,HIV包膜蛋白衍生自HIV-1的M组毒株。在更进一步的实施方案中,HIV-1M组毒株是选自A、B、C、D、F、G、H、J和K的亚型(进化枝)。在某些具体的实施方案中,所述亚型(进化枝)是B进化枝。在另一个实施方案中,所述亚型(进化枝)是D进化枝。然而另外的实施方案中,所述亚型是C进化枝。
在某些实施方案中,HIV包膜蛋白包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%或更高的相同性的氨基酸序列。
在更进一步的实施方案中,HIV包膜蛋白包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有90%或更高的相同性的氨基酸序列。在另外一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有95%或更高的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有98%或更高的相同性的氨基酸序列。在另外一些实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有99%或更高的相同性的氨基酸序列。在一具体的实施方案中,肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中,本申请涉及分离的核酸,所述核酸包含编码与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高相同性的氨基酸序列的核酸序列。在某些实施方案中,所述核酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一具体的实施方案中,分离的核酸包含SEQ ID NO:20所示的核酸序列。
在另外一些实施方案中,本申请涉及载体,其包含编码与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高相同性的氨基酸序列的核酸。在某些实施方案中,申请涉及包含载体的宿主细胞,所述载体包含编码与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高相同性的氨基酸序列的核酸。在一具体的实施方案中,宿主细胞是CHO细胞。
在其他的实施方案中,本申请涉及制备肽的方法,所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少85%的相同性的氨基酸序列,所述方法包括在适于蛋白表达的条件下培养包含载体的宿主细胞和分离所述肽,所述载体包含编码与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高相同性的氨基酸序列的核酸。
在某些实施方案中,本申请提供了组合物,其包含分离的HIV包膜蛋白和药用可接受的载体,所述分离的HIV包膜蛋白例如包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的分离的HIV包膜蛋白。
在仍另外一些实施方案中,本申请涉及在哺乳动物中生成针对HIV的抗体的方法,包括给所述哺乳动物施用包含分离的HIV包膜蛋白和药用可接受的载体的组合物,所述分离的HIV包膜蛋白例如包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的 氨基酸序列的分离的HIV包膜蛋白。在某些实施方案中,该组合物进一步包含佐剂。在某些实施方案中,佐剂包括脂质体配制物。在进一步的实施方案中,脂质体配制物包含以下的一种或多种:二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰甘油、胆固醇和磷脂。在一具体的实施方案中,脂质体配制物包含磷脂A。在某些实施方案中,在哺乳动物中生成的抗体是与包含截短的HIV包膜蛋白的肽竞争结合整联蛋白α4β7的抗体。
在某些实施方案中,本申请涉及在哺乳动物赋予针对HIV的免疫力的方法,包括给所述哺乳动物施用包含分离的HIV包膜蛋白和药用可接受的载体的组合物,所述分离的HIV包膜蛋白例如包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的分离的HIV包膜蛋白。在某些实施方案中,该组合物进一步包含佐剂。在某些实施方案中,佐剂包含脂质体配制物。在进一步的实施方案中,脂质体配制物包含以下的一种或多种:二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰甘油、胆固醇和磷脂。在一具体实施方案中,脂质体配制物包含磷脂A。在进一步的实施方案中,所述方法包括通过注射给哺乳动物施用所述组合物。
例如,可以使用本发明的组合物的哺乳动物的实例包括人类、非人灵长类、犬、兔、豚鼠和小鼠。
然而在另一些实施方案中,本申请涉及亚单位疫苗,其包含本发明的HIV包膜蛋白,例如包含截短的HIV包膜蛋白的分离的肽,其中所述HIV包膜蛋白在天然的gp120/gp41切割位点处被突变以阻止蛋白酶切割,包含gp41的MPER,且在跨膜区前被截短。在某些实施方案中,HIV包膜蛋白在其C端含有大约1到10个亲水氨基酸。在某些实施方案中,所述大约1-10个亲水性氨基酸是三个赖氨酸。在某些实施方案中,亚单位疫苗包含分离的HIV包膜蛋白,例如包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的分离的HIV包膜蛋白。
在某些实施方案中,本申请涉及包含分离的核酸的核酸疫苗,所述分离的核酸包含编码与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的核酸序列。在某些实施方案中,所述核酸序列编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
在仍其他的实施方案中,本申请涉及分离的肽,所述分离的肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有90%或更高的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有98%或更高的相同性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中,所述肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有99%或更高的相同性的氨基酸序列。在具体的实施方案中,所述肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。
在另一个实施方案中,本申请涉及分离的核酸序列,其包含编码与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的核酸序列。在某些实施方案中,所述核酸序列编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。
在某些实施方案中,本申请涉及试剂盒,其包含(a)包含分离的肽和药物学可接受的载体的组合物,所述分离的肽包含截短的HIV包膜蛋白,其中所述HIV包膜蛋白在天然的gp120/gp41切割位点处被突变以阻止蛋白酶切割,包含gp41的MPER,并在跨膜区前被截短,及(b)给哺乳动物施用所述组合物的说明。在某些实施方案中,HIV包膜蛋白在其C端包含大约1-10个亲水氨基酸。在某些实施方案中,所述大约1-10个亲水性氨基酸是三个赖氨酸。
在某些实施方案中,本申请涉及试剂盒,其包含(a)包含分离的HIV包膜蛋白的组合物,所述分离的HIV包膜蛋白例如包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的分离的HIV包膜蛋白,以及(b)给哺乳动物施用所述组合物的说明。
在另一实施方案中,本申请涉及试剂盒,其包含(a)包含分离的核酸和药用可接受的载体的组合物,所述分离的核酸包含编码与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的核酸序列,及(b)给哺乳动物施用所述组合物的说明。在某些实施方案中,所述核酸序列编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
在某些实施方案中,本申请涉及包含截短的HIV包膜蛋白的分离的 肽,其中所述HIV包膜蛋白在天然gp120/gp41切割位点处被突变以阻止蛋白酶切割,包含gp41的MPER,并在跨膜区前被截短,其中所述HIV包膜蛋白在前导序列处被突变。在某些实施方案中,天然信号肽被tPA信号肽替换。在某些实施方案中,tPA信号肽包含选自SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的序列。
在仍其他的实施方案中,本申请提供了分离的肽,其包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有90%或更高的相同性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中,所述肽包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有98%或更高的相同性的氨基酸序列。在再进一步的实施方案中,所述肽包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有99%或更高的相同性的氨基酸序列。在一具体的实施方案中,所述肽包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中,本申请涉及分离的核酸序列,其包含编码与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有85%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性的氨基酸序列的核酸序列。在某些实施方案中,所述分离的核酸序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示核酸序列。
这些实施方案以及其他的实施方案将在下述发明详述中揭示和阐述。
附图简述
图1为载体pJWIRESpuro的图示。
图2293/pJW Ba-L gp140DC4E10Puro转染免疫共沉淀蛋白质印迹。pJW Ba-L gp140DC4E10Puro转染的293细胞和未处理细胞的条件培养基与人类MPER区域(2F5and4E10)单克隆抗体、HIV-1(+)人血清和正常人血清免疫共沉淀。沉淀的蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分开并转移至PVDF。Ba-L gp140DC4E10蛋白采用gp41(M25)的MoAb接着山羊抗-小鼠IgG AP缀合物,及BCIP/NBT底物检测。用4E10(泳道1)、2F5(泳道2)和HIV-1(+)人血清(泳道3)检测到Ba-L gp140DC4E10,用正常人血清没有检测到(泳道4)。对应Ba-L gp140DC4E10的条带在未处理样品中用4E10(泳道5)、2F5(泳道6)和HIV-1(+)人血清(泳道7)或正常人血清(泳道8)均没有检测到。
图3示出HIV-1Ba-L gp140DC4E10核酸序列(SEQ ID NO:6)。突 出显示的是tPa信号。
图4示出Ba-L gp140DC4E10蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。突出显示的是tPa信号。
图5示出HIV-1Ba-L gp145核酸序列(SEQ ID NO:8)。突出显示的是tPa信号肽。该序列与图3所示gp145区相同,只是tPa信号序列不同。
图6示出HIV-1Ba-L gp145蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。突出显示的是tPa信号。
图7哺乳动物表达载体pJWTCDE-N。
图8HIV-1C亚型gp160表达质粒。HIV-1gp160基因连接进入pSWTIPK3质粒的NheI和EcoRI的限制性内切酶位点处,与t-Pa信号肽读码框融合。
图9示出C进化枝C3728v2c6gp160的核酸序列(SEQ ID NO:10)。HIV-1C3728v2c6gp160的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。
图10示出C进化枝C3728v2c6gp160的核酸序列(SEQ ID NO:11)。HIV-1C3728v2c6gp160DC的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。gp120/gp41切割位点已被突变以阻止切割。
图11示出C进化枝C06838v1c48gp160的核酸序列(SEQ ID NO:12)。HIV-1C06838v1c48gp160的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。
图12示出C进化枝C06838v1c48gp160DC的核酸序列(SEQ ID NO:13)HIV-1C06838v1c48gp160DC的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。gp120/gp41切割位点已被突变以阻止切割。
图13示出C进化枝C06980v1c3gp160的核酸序列(SEQ ID NO:14)。HIV-1C06980v1c3gp160的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。
图14示出C进化枝C06838v1c48gp160DC的核酸序列(SEQ ID NO:15)。HIV-1C06980v1c3gp160DC的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。gp120/gp41切割位点已被突变以阻止切割。
图15C进化枝C06980v0c22gp160的核酸序列(SEQ ID NO:16)HIV-1C06980v0c22gp160的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。
图16C进化枝C06980v0c22gp160DC的核酸序列(SEQ ID NO:17)HIV-1C06980v0c22gp160DC的核酸序列被密码子优化。突出显示的是tPa信号。gp120/gp41切割位点已被突变以阻止切割。
图17为载体pSWTIPK3的图示。
图18示出pSWTIPK3载体的核酸序列(SEQ ID NO:18)。
图19用HIV-1C亚型gp160和gp160DC的表达质粒转染的CHO-K1细胞IP蛋白质印迹。使用HIV-1(+)人血清从转染后48小时的细胞裂解物免疫共沉淀Env蛋白,于4-15%SDS-PAGE凝胶上分开并转移至PVDF。使用HIV-1B亚型gp160的兔抗体检测来自下述构建体的蛋白:C06838v1c48gp160(泳道1)、C06980v1c3gp160(泳道2)、C06980v0c22gp160(泳道3)、C3728v2c6gp160(泳道4)、C06838v1c48gp160DC(泳道5)、C06980v1c3gp160DC(泳道6)、C06980v0c22gp160DC(泳道7)、C3728v2c6gp160DC(泳道8)、空白CHO-K1(-)对照(泳道9)、Ba-L gp145(+)对照(泳道10)和C亚型96ZM651gp140(+)对照(泳道11)。分子量蛋白标记位于泳道12。
图20转染了HIV-1C亚型gp160和gp160DC的表达质粒的HEK293细胞的免疫共沉淀蛋白质印迹。利用针对gp41(4E10)的huMAb从转染48小时后的细胞裂解物免疫共沉淀Env蛋白,于4-15%SDS-PAGE凝胶上分开,并转移至PVDF。使用HIV-1B亚型gp160的兔抗体检测来自下述构建体的蛋白:C06838v1c48gp160(泳道1)、C06980v1c3gp160(泳道2)、C06980v0c22gp160(泳道3)、C3728v2c6gp160(泳道4)、C06838v1c48gp160DC(泳道5)、C06980v1c3gp160DC(泳道6)、C06980v0c22gp160DC(泳道7)、C3728v2c6gp160DC(泳道8)、空白HEK293(-)对照(泳道9)、Ba-L gp160(+)对照(泳道10)空白CHO-K1(-)对照(泳道11)和CHO-K1/Ba-L gp160(+)对照(泳道12)。分子量蛋白标记位于泳道13。
图21HIV-1C06980v0c22gp145表达质粒。HIV-1gp145基因连接进入pSWTIPK3质粒的NheI和EcoRI的限制性内切酶位点处,与t-Pa信号肽读码框融合。
图22示出pSWC06980v0c22gp145的核酸序列(SEQ ID NO:19)
图23HIV-1C06980v0c22gp145的密码子优化的核酸序列(SEQ ID NO:20)。突出显示的是tPa信号。
图24是HIV-1C06980v0c22gp145的蛋白质序列(SEQ ID NO:32)。突出显示的是tPa信号。
图25A(SEQ ID NO:21)和B(SEQ ID NO:22)示出本发明的包膜蛋白采用的tPA序列。
图26转染了pSWC06980v0c22gp145的CHO-K1细胞免疫共沉淀蛋白质印迹。用HIV-1(+)人血清从转染48小时后的条件培养基与裂解物中免疫共沉淀包膜蛋白,于4-15%SDS-PAGE凝胶上分开并转移至PVDF。利用HIV-1B亚型gp160和C亚型gp120的兔抗体检测gp145:未处理CHO-K1(-)对照培养基(泳道1)、超螺旋pSWC06980v0c22gp145培养基(泳道2)、线性化pSWC06980v0c22gp145培养基(泳道3)、未处理CHO-K1(-)对照细胞裂解物(泳道4)、超螺旋pSWC06980v0c22gp145细胞裂解物(泳道5)、线性化pSWC06980v0c22gp145细胞裂解物(泳道6)。分子量蛋白标记位于泳道7。
图27从CHO细胞系H-73-9-2-8和H-73-9-3-9的条件培养基中纯化的C06980v0c22gp145的4-15%SDS-PAGE。在还原和非还原条件下分开5μg蛋白质,采用考马斯蓝R250染色:H-73-9-2-8非还原(泳道1)、H-73-9-3-9非还原(泳道2)、H-73-9-2-8还原(泳道3)和H-73-9-3-9还原(泳道4)。分子量蛋白标记位于泳道5。
图28从CHO细胞系H-73-9-2-8和H-73-9-3-9的条件培养基中纯化得到的C06980v0c22gp145的蛋白质印迹。在还原和非还原条件下采用4-15%SDS-PAGE分开0.5μg蛋白质,转移至PVDF,并用HIV-1的血清检测:H-73-9-2-8非还原(泳道1)、H-73-9-3-9非还原(泳道2)、H-73-9-2-8还原(泳道3)和H-73-9-3-9还原(泳道4)。分子量蛋白标记位于泳道5。
图29gp145的下游纯化方法流程图。
图30纯化的重组HIV-1C06980v0c22gp145的SE-HPLC分析(批次112009)。于1X PBS制备1∶10稀释的纯化蛋白,将20μL上样于TSK-GEL3000SWXL柱(TOSOH BIOSEP)。该柱使用1X PBS等度洗脱,流速1.0mL/min,结果鉴定出4种gp145。
图31gp145的下游纯化方法流程图
图32纯化的重组HIV-1C06980v0c22gp145批次120710A的SE-HPLC分析。于1X PBS制备1∶10稀释的纯化蛋白,取20μL上样于TSK- GEL3000SWXL柱(TOSOH BIOSEP)。该柱使用1X PBS等度洗脱,流速1.0mL/min,结果鉴定出4种gp145物质。
图33gp145的下游纯化方法流程图
图34纯化的重组HIV-1C06980v0c22gp145批次120710B的SE-HPLC分析。于1X PBS制备1∶10稀释的纯化蛋白,取20μL上样于TSK-GEL3000SWXL柱(TOSOH BIOSEP)。该柱使用1X PBS等度洗脱,流速1.0mL/min,结果鉴定出4种gp145。
图35HIV-1C亚型包膜蛋白序列比对。框出的区域代表gp41/gP120切割结构域。氨基端的氨基酸是来自tPa信号肽末端的NheI克隆位点的丝氨酸。
图36C06980v0c22gp145氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。tPA信号、切割位点突变,和C端的三个赖氨酸用方框表明。
图37C06980v0c22gp145核苷酸序列(SEQ ID NO:22)和翻译(SEQ ID NO:32)。在核酸序列和翻译间示出tPA前导序列。方框区标示的是切割位点突变和末端赖氨酸重复。
图38示出依照本发明的HIV包膜蛋白的C末端残基(SEQ ID NO:25和43)。
图39抗原性:通过ELISA测定4E10和VRC01与CO6980gp145的结合。
图40中和:CO6980PV对4E10和VRC01mAb敏感。
图41示出兔C进化枝gp145的研究设计。
图42gp145C进化枝免疫的兔血清中和来自B和C进化枝的Tier1假病毒。
图43免疫接种后生成针对HIV-1C进化枝Tier1假病毒的中和抗体。
图44在使用gp145免疫的兔血清的PBMC测定中B、C和AE IMC跨进化枝中和。
图45免疫接种后生成针对HIV-1B进化枝BaL IMC的中和抗体。
图46gp145免疫的兔血清与C进化枝包膜蛋白结合。
图47GS015的中和由IgG介导(TZMbl中和测定)。
图48免疫原中和值的复合图。
图49示出适应无蛋白培养基的CHO C06980v0c22gp145细胞的I.P.蛋白印迹结果。使用人类抗体从条件培养基中沉淀gp145,于4-15%SDS-PAGE分开,转移至PVDF,并使用gp120和gp160抗血清检测。
图50同源性及糖基化位点。
图51密码子优化后的D进化枝gp140和C进化枝gp145的氨基酸序列。
图52经免疫的兔血清结合不同的包膜蛋白。
图53在HIV-1抗原刺激后A)淋巴结、B)脾中的IFNγELISPOT,显示为斑点计数。
图54细胞内染色检测IL-2表达。
图55所有组对HIV-1包膜蛋白gp145和gp140的ELISA结合滴度。
图56所有组在两种测定平台上的中和结果,A)TZMbl和B)PBMC。
图57基于流式细胞术的α4β7结合和抑制测定。
图58在初始(primary)T细胞上α4β7表达的诱导。从PBMC经磁珠分离出的CD4+(上图)和CD8+(下图)T细胞和抗-CD3/CD28、IL-2和视黄酸培养5天。培养初始CD4+(上图)和CD8+(下图)T细胞以表达结合重组gp120或gp145蛋白、或包含包膜蛋白V2环区的环肽的α4β7。示出了结合的蛋白或肽(蓝色矩形)与非蛋白neutravidin-PE对照(绿色矩形)。gp145图显示出对于a4B7与gp145的结合,CD8+细胞中89.7%阳性,而CD4+T细胞中93.3%阳性。
图59HIV-1包膜蛋白与表达α4β7的T细胞的结合。培养初始CD4+(上图)和CD8+(下图)T细胞使之表达结合重组gp120or gp145蛋白质、或包含包膜蛋白V2环区的环肽的α4β7。示出结合的蛋白或肽(蓝色矩形)与非蛋白neutravidin-PE对照(绿色矩形)。
图60封闭V2和α4β7间的相互作用。如所描述,培养初始分离的T细胞以表达α4β7。抗-V2单克隆抗体在与细胞结合前与生物素化的gp120或环状-V2肽预培养。抗-α4单克隆抗体在加入蛋白质前预先与细胞结合作为正对照。
图61C06980v0c22gp145蛋白质的Blue Native PAGE。5μg下述蛋白使用Invitrogen的Native PAGE系统在4-16%Novex Bis-Tris gel中分开:批次112009(泳道1)、批次120710A(泳道2)和批次120710B(泳道3)。分 子量蛋白标记位于泳道4。对每一组gp145,有3种多聚体物质(A、B和C)都是很明显的。多聚体B占主要地位。
图62在非还原性条件下EGS交联的C06980v0c22gp145(批次120710A)的SDS-PAGE。5μg gp145用12.5、5、1、0.2和0mM EGS处理,在非还原条件下用3-8%NuPAGE Tris醋酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分开:12.5mM EGS(泳道1)、5mM EGS(泳道2)、1mM EGS(泳道3)、0.2mM EGS(泳道4)和0mM EGS(泳道5)。EGS交联的磷酸化酶B位于泳道6,作为分子量蛋白质标记。
图63在Superose6上纯化的EGS交联的C06980v0c22gp145(批次120710A)的SDS-PAGE。从柱上装载并洗脱的10μg gp145与5mM EGS交联。交联与未交联的gp145在3-8%NuPAGE Tris Acetate聚丙烯酰胺凝胶电泳中分开:5μg未交联的gp145柱(A),10μg交联的gp145柱(B)和10μg交联的洗脱片段26-32(C)。EGS与磷酸化酶B交联后位于泳道6,作为分子量蛋白质标记(D)。
发明详述
很多候选的HIV疫苗不能与人类天然的中和抗体相互作用。如本文描述的,申请人证实了HIV-1包膜蛋白可以被修饰为结合广谱反应性的抗体。因此,本申请提供了涉及新HIV包膜蛋白的方法和相关组合物。
本发明中新的HIV包膜蛋白含有HIV包膜蛋白的整个胞外结构域,包括gp41的膜近端外部区域(MPER)。gp41蛋白由三个主要结构域组成,即胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾区。胞外结构域由融合肽、N端七个重复、C端七个重复和MPER组成。
gp41的MPER一般含有gp41胞外结构域C端最后24-28个氨基酸。MPER是HIV包膜蛋白一个高度保守的区域,含有广谱中和人类单克隆抗体的表位,特别是2F5、Z13和4E10单克隆抗体的表位。
如本文所描述,本发明的HIV包膜蛋白是截短的HIV包膜蛋白,其在天然gp120/gp41切割位点处突变以阻止蛋白酶切割,包含gp41的MPER,并在跨膜区前被截短。本发明的HIV包膜蛋白可能含有任何天然的HIV包膜蛋白gp41的MPER区。
在某些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白包含MPER序列,其含 有氨基酸序列ALDSWNNLWNWFDIS(SEQ ID NO:23)。在某些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白包含MPER序列,其含有氨基酸序列LWYIK(SEQ ID NO:24)。在某些实施方案中,所述MPER序列包含氨基酸序列ELLALDSWNNLWNWFDISNWLWYIK(SEQ ID NO:25)。在另一些实施方案中,所述MPER序列包含氨基酸序列DLLALDSWKNLWNWFDITNWLWYIK(SEQ ID NO:26)。
一般来说,本发明的HIV包膜蛋白可以含有2F5、Z13和4E10中至少一种单克隆抗体的表位。2F5表位的实例包括本文公开的ALDSWN(SEQ ID NO:27)、ELDKWA(SEQ ID NO:28)和EKNEQELLELDKWASLW(SEQ ID NO:29)(参见例如,Montero,M,等人,Microbiology and Molecular Biology Reviews(2008)72(1):54-84及其中引用的参考文献)。4E10表位的实例包括本文公开的NWFDIS(SEQ ID NO:30)和NWFDIT(SEQ ID NO:31)(同上)。
本发明的HIV包膜蛋白缺少跨膜结构域和胞质尾区,但是包含gp41整个胞外结构域。在某些实施方案中,胞外结构域被修饰为在C端含有大约1-10个亲水氨基酸。在某些实施方案中,这些亲水氨基酸残基一般被添加至在本发明的截短的HIV包膜蛋白的胞外结构域以通过使其更加亲水而增加该区域的暴露。在其中HIV包膜蛋白在C端含有大约1-10个亲水氨基酸的实施方案中,所述亲水氨基酸一般与天然MPER序列的最后的氨基酸残基是连续的。因此,这1-10个亲水性氨基酸一般包含HIV包膜蛋白C端最后的氨基酸残基。在某些实施方案中,所述1-10个亲水性氨基酸是一个或多个赖氨酸残基。
在某些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白衍生自从急性HIV感染的个体中分离得到的HIV毒株。在另一些实施方案中,所述HIV感染是慢性的。在某些实施方案中,HIV包膜蛋白衍生自归类于M、O、N或P组的HIV-1菌株。在一具体的实施方案中,HIV包膜蛋白衍生自HIV-1M组毒株。在进一步的实施方案中,HIV-1M组毒株是选自A、B、C、D、F、G、H、J和K及杂合体的亚型(进化枝)。在进一步的实施方案中,HIV包膜蛋白衍生自HIV-1M组菌株,所述M组毒株为B进化枝、C进化枝或D进化枝毒株。在某些实施方案中,B、C或D进化枝毒株分离自急性感染的个体。在另一些实施方案中,B、C或D进化枝毒株分离自慢 性感染的个体。可以衍生出本发明的包膜蛋白的适宜的亲本HIV毒株的实例包括序列示于GenBank登记号AF484477、AF484511和AF484502的HIV-1D进化枝和序列示于GenBank登记号HM215344和HM215345的HIV-1C进化枝。.
在某些实施方案中,本文描述的HIV包膜蛋白以不同形式作为免疫原使用,用作HIV疫苗的组分来引发针对例如HIV-1的bNab。HIV包膜蛋白的不同形式可以用于初始免疫(作为表达所述蛋白的DNA/载体或蛋白)和/或用作加强免疫(作为蛋白)。例如,在某些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白作为DNA疫苗被施用至哺乳动物,随后施用蛋白加强免疫。在进一步的实施方案中,HIV包膜蛋白作为质粒中的核酸而施用,随后在病毒载体中施用(如,作为MVA中的核酸),随后作为蛋白质施用。在某些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白也可以通过与病毒颗粒(如Qbeta、豇豆花叶病毒、CRM、HPV、HBsAg等)交联而用作微粒免疫原。
在某些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白被用作试剂,其用于筛选新的广谱中和抗体,和/或依照免疫研究,绘制具有广谱中和血清活性的人类血清和动物血清的图谱。在另一些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白被用于筛选与广谱中和抗体竞争结合的小分子。经鉴定的小分子可以被用作免疫原或抗病毒化合物。
如本文所描述的,申请人生成了具有独特序列的重组包膜蛋白,其中申请人修饰了前导序列、gp120/gp41切割位点,加入亲水性氨基酸尾部,并且于跨膜结构域前终止该序列使其具有gp41的完整胞外结构域。因为经过密码子优化,DNA序列也是独特的。
在另一些有益的实施方案中,HIV包膜蛋白基本上具有与图4、6、24、35、36和/或37所示HIV包膜蛋白序列相似的序列。在另一个更为有益的实施方案中,HIV包膜蛋白具有与图38所示MPER序列基本相似的MPER序列。
在一个更为有益的实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白与SEQ ID NO:1或图3-6、23、24和35-37中所示的任一HIV包膜蛋白序列具有约75%、约76%、约77%、约78%、约79%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、 约98%、约99%或约100%的序列相同性。
在一实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白可以被用作用于筛选和鉴定新的广谱中和抗体的试剂。用于筛选中和抗体的测定是本领域公知。中和测定方法之前已被报道过(Binley JM,等人,(2004)Comprehensive Cross-Clade Neutralization Analysis of a Panel of Anti-Human Immunodeficiency Virus Type1Monoclonal Antibodies.J.Virol.78:13232-13252)。可以通过将至少两个分开编码本发明的可溶性包膜蛋白cDNA和其余HIV基因组的质粒共转染细胞而产生假病毒。在HIV基因组编码载体中,可以用萤火虫萤光素酶基因取代包膜蛋白基因。包含假病毒转染子上清可以与B细胞上清或和单克隆或多克隆(血清)抗体共温育过夜,所述B细胞上清来自经感染的供体初始外周血单核细胞(PBMC)的激活。可以将用CD4及CCR5和CXCR4共受体稳定转染并表达CD4及CCR5和CXCR4的细胞加入混合物中,37℃孵育3天。感染的细胞可以通过荧光测定定量。
在某些实施方案中,为了筛选广谱中和抗体,可以通过将包膜蛋白的C端与酶连接构建包膜-酶融合蛋白。可以生成包含所述融合蛋白和野生型和/或可溶性包膜糖蛋白的病毒颗粒,并用于感染患者血清中存在的靶细胞。在如此感染的细胞中测量的酶活性是由野生型病毒包膜蛋白介导的病毒结合和进入靶细胞的量度。可以用于生成所述融合蛋白的酶的实例,包含但不限于萤光素酶、细菌或胎盘碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白,或毒素。一般而言,也可以在96孔板上完成该测定。在血清存在情况下酶活性的降低表明血清中含有中和抗体。
如本文所用的,下述术语:“药物”、“物质(agent)”和“化合物”包括任何物质的组合物或混合物,其可以体内或体外证实提供药理学作用。这包括小分子、抗体、微生物(microbiological)、疫苗、维生素和其他有益的物质。如本文所用的,这些术语进一步还包含了所有在病人产生局部或全身性生理学或药理学活性的物质。
核酸、蛋白质和重组技术
除非另有说明,本发明采用了普遍的化学、分子生物学、微生物学、DNA重组和免疫学实验技术,其属于本领域普通技术人员的能力范围。这些在参考文献中有阐述。例如,J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis, 1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Books1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M.等人(1995and periodic supplements;Current Protocols in Molecular Biology,ch.9,13,and16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons;M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press;D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press,以上每一个文本通过引用并入本文。
术语“核酸”包括DNA、RNA(即mRNA、tRNA)、异源双链体和能够编码多肽的合成分子,并包括本领域普通技术人员将承认能够取代天然存在的核苷酸和其主链的所有类似物和主链取代物例如PNA。核酸可以是单链或双链,且可以化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为基因密码具有简并性,多于一种密码子可以用于编码一种特定氨基酸,本发明的组合物和方法中包括了编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。
除非另有说明,核酸的书写从左至右为5′至3′方向;氨基酸序列的书写从左至右为氨基至羧基方向。
本文术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”可互换使用,指的是任意长度的氨基酸残基聚合物。该聚合物可以是线性的或分支的,其可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物,且其可以被除氨基酸的外化学部分打断。该术语还包括天然地或人为干预地修饰的氨基酸聚合物;例如形成二硫键、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作与修饰,如与标签或具有生物活性的组分缀合。本文采用的是常规的单字母或三字母氨基酸残基编码。
如本文所用的,“合成的”分子是由体外化学合成或酶促合成产生,而不是由生物体产生。
如本文所用的,术语“表达”指的是基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包含转录和翻译两者。
“基因”指的是编码多肽或RNA的DNA节段(segment)。
“分离的”多核苷酸或多肽指该多核苷酸或多肽基本上没有在其天然环境与之联合的物质。“基本上没有”意味着要求至少50%,有利地至少 70%,更有利地至少80%,甚至更有利地至少90%的这些物质没有了。
“分离的”核酸分子是指从整个生物体中隔开的单独的分离的核酸分子,该分子在自然状态下可以在所述生物体找到;或是指整体或部分缺乏通常自然状态下与之相连的序列的核酸分子;或是自然状态下存在的序列,但是在其含有与之连接的异源序列。
“天然的”蛋白质或多肽指的所述蛋白质天然存在的来源中分离得到的蛋白质或多肽。“重组”多肽指的是由重组DNA技术生产的多肽,例如从转换了编码所需多肽的外源DNA构建体的细胞产生的多肽。“合成的”多肽包括通过化学合成制备的多肽及上面所述的合成的抗原。
“同系物”指的是与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有某些程度相同性的实体。如本文所用的,术语“同系物”包括了关于结构和/或功能的相同性,例如获得的核苷酸序列的表达产物具有目标氨基酸序列的酶活性。关于序列相同性,优选具有至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%的序列相同性。这些术语也包括序列的等位基因变异。术语“同系物”可以用于指物种形成事件分离的基因间的关系,或用于指基因复制事件分离的基因间的关系。
相对序列相同性可以通过商业可获得的计算机程序来确定,其采用任何适宜的算法计算出两个或多个序列间的相同性百分比,例如采用缺省参数。此类计算机程序的典型的例子是CLUSTAL。更有利地,应用BLAST算法,参数设置为缺省值。在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站上有BLAST算法的详细介绍。
本文所提供的肽的同系物一般和这样的肽具有结构相似性。多肽的同系物包含一个或多个保守的氨基酸取代,其可以选自这些氨基酸所属的类别的同一或不同成员。
在一实施方案中,所述序列还可能具有氨基酸残基的缺失、插入或取代,其造成沉默变化并导致产生功能上等同的物质。考虑的氨基酸取代可以基于残基相似的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质进行,只要保持所述物质的二级结合活性。例如,带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸,带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸,具有不带电的极性头部具有相似亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、 甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明也包括可能存在的保守性取代(置换和取代均在本文用于指已存在的氨基酸残基被可选残基交换),例如相似对相似的取代,如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等等。也可以存在非保守性取代,例如从一类残基取代为另一类残基或包括采用非天然氨基酸,例如鸟氨酸(下文表示为Z)、双氨基丁酸鸟氨酸(下文表示为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文表示为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸。保守性取代可以在例如碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、脂肪族氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、羟基氨基酸(丝氨酸和苏氨酸)、大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)组内进行。
DNA扩增的很多方法是本领域公知,并且其中的任一种方法均可使用,例如参见Sambrook等人,Molecular Cloning;A Laboratory Manual2d ed.(1989)。例如,感兴趣的DNA片段可采用聚合酶链式反应进行扩增,或采用某种其他循环聚合酶介导的扩增反应。
扩增的DNA区可以采用本领域公知的任一方法测序。有利地,核酸测序还可以采用自动的方法进行(由Meldrum所作综述,Genome Res.9.2000;10(9):1288-303,这些内容以其整体通过引用并入本文),例如采用Beckman CEQ8000Genetic Analysis System(Beckman Coulter Instruments,Inc.)进行测序。核酸测序的方法包括但不仅仅局限于自动化荧光片段分析(参见例如Watts&MacBeath,Methods Mol Biol.2001;167:153-70和MacBeath等人Methods Mol Biol.2001;167:119-52),毛细管电泳法(参见例如Bosserhoff等人,Comb Chem High Throughput Screen.12.2000;3(6):455-66),DNA测序芯片(参见例如Jain,Pharmacogenomics.8.2000;1(3):289-307),质谱法(参见例如Yates,Trends Genet.January2000;16(1):5-8),焦磷酸测序(参见例如Ronaghi,Genome Res.January2001;11(1):3-11),超薄层凝胶电泳(参见例如Guttman&Ronai,Electrophoresis.12.2000;21(18):3952-64),上述公开以它们的整体通过引用并入本文。测序也可以由任何商业公 司完成。例如这些公司包括但不局限于University of Georgia Molecular Genetics Instrumentation Facility(Athens,Ga.)或SeqWright DNA Technologies Services(Houston,Tex.)。
可以使用本领域公知的DNA扩增的任一种方法,例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)(Barany,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:189-193(1991))、链置换测定(SDA)或寡核苷酸连接测定(“OLA”)(Landegren,U.等人,Science241:1077-1080(1988))。Nickerson,D.A.等人阐述了一种组合了PCR和OLA的核酸测定方法(Nickerson,D.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87:8923-8927(1990))。另外一些已知的核酸扩增程序也可以使用,例如基于转录的扩增系统(Malek,L T.等人,U.S.Pat.No.5,130,238,Davey,C.等人,European Patent Application 329,822,Schuster等人,U.S.Pat.No.5,169,766,Miller,H.I.等人PCTApplication W089/06700,Kwoh,D.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:1173(1989),Gingeras,T.R.等人PCT Application W088/10315))或等温扩增方法(Walker,G.T.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:392-396(1992))。
为了进行依据本发明的循环酶介导的扩增反应,引物杂交并退火至靶DNA的相对链,而后提升温度使热稳定的DNA聚合酶延伸引物并因此复制出跨越两引物之间的特定DNA节段。而后该反应进行热循环,使得每次循环过后代表两引物间的序列的DNA的量加倍,最终实现基因DNA序列(如果存在)的特异性扩增。
在本发明中可以使用多种聚合酶。对于热循环反应,所述聚合酶为热稳定聚合酶,例如Taq、KlenTaq、Stoffel Fragment、Deep Vent、Tth、Pfu、Vent和UlTma,每一种均易于从商业途径获得。对于非热循环的反应,以及在某些热循环的反应中,聚合酶通常是本领域常用的众多聚合酶中的一种,例如DNA pol1、Klenow片段、T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶。这些聚合酶的使用说明可以很容易的从产品说明上或普通分子生物学指导上找到。
一般来说,引物与目标DNA序列的退火大约在37-55℃进行2分钟,聚合酶(例如Taq聚合酶)对引物序列的延伸在三磷核苷酸存在下大约70-75℃进行3分钟,而变性步骤在大约90-95℃进行约1分钟以释放已 结合的引物。然而,这些参数可以变化,对本领域普通技术人员而言可以很容易知晓如何调整反应时间和温度参数以获得所需的结果。例如,循环可以短至10、8、6、5、4.5、4、2、1、0.5分钟或更短。
此外,还可以采用“两种温度”技术,即退火和延伸步在同样的温度下进行,一般在约60-65℃之间,从而减少每次扩增循环的长度,导致较短的测定时间。
一般来说,如本文所描述的反应重复直至生成的产物达到可检测的量。通常这样的可检测的产物的量在大约10ng至大约100ng之间,不过更大量的产物,如200ng、500ng、1mg甚至更多当然也可以被检测到。如果浓缩,可检测的产物的量可以从大约0.01pmol、0.1pmol、1pmol、10pmol或更多。因此,进行的反应循环的数量可以变化,进行越多次的循环可以得到越多的扩增产物。在某些实施方案中,反应包含2、5、10、15、20、30、40、50或更多个循环。
例如,可以使用25-50ul样品进行PCR反应,所述样品包含大约0.01至1.0ng模板扩增序列,大约10至100pmol的每种引物,大约1.5单位Taq DNA聚合酶(Promega Corp.),大约0.2mM dDATP,大约0.2mM dCTP,大约0.2mM dGATP,大约0.2mM dDTTP,大约15mM MgCl2,大约10mM Tris-HCl(pH9.0),大约50mM KCl,大约1μg/ml明胶和大约10μl/ml Triton X-100(Saiki,1988)。
本领域技术人员能够知道在循环聚合酶介导的扩增反应中可用的的核苷酸种类。一般来说,核苷酸应至少部分由脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)组成,这在商业上很容易获得。dNTP的优化使用参数是本领域技术人员已知的并在在参考文献中描述过。而且,本领域技术人员也知道大量的核苷酸衍生物并且可以在这样的反应中应用。这样的衍生物包括荧光标记的核苷酸,允许如下文所述检测包括如此标记的核苷酸的产物。同时在此类中还包括允许测序包括此类核苷酸的核酸的核苷酸,例如链终止核苷酸、双脱氧核苷酸和硼酸盐核酸酶抗性核苷酸。包含了最经常用于这些DNA测序方法中的试剂的商品试剂盒可以获得并广泛使用。另外一些核苷酸类物,包括具有溴代、碘代或其他修饰基团的核苷酸,所述修饰基团影响获得的核酸的很多性质,包括其抗原性、其可复制性、其解链温度、其结合特性等等。此外,某些核苷酸包含反应性侧基,例如硫基、氨基、N-羟基 琥珀酸亚胺基,其允许进一步修饰包含它们的核酸。
术语“寡核苷酸”指包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸的分子,优选多于3个。它的精确大小取决于很多因素,其反过来依赖于寡核苷酸的最终的功能和用途。在此采用的术语“引物”指的是寡核苷酸,无论是天然存在的(如由限制性内切酶消化产物中纯化得到)还是合成产生的,当置于诱导引物延伸产物(与核酸链互补)合成的条件下可以作为合成起始点,即,在存在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)且在适宜的温度和pH条件下。引物既可以是单链的,也可以是双链的,并且必须足够长,使得在诱导剂存在的条件下可以引发所需延伸产物的合成。引物的准确长度依赖于多种因素,包括温度、引物来源和使用的方法。在某些实施方案中,可以被用作引物在酶介导的循环扩增反应如PCR反应中扩增基因特定的核酸序列的寡核苷酸由寡核苷酸片段组成。这样的片段应足够长以使其特异性退火或杂交至核酸样品。所述序列一般来说长大约8到14个核苷酸,但是可以更长。对某些实施方案,更长的序列,例如大约14-大约50核苷酸是有利的。
在需要扩增DNA片段的实施方案中,考虑具有来自基因序列的大约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的连续延伸(stretch)。
如本文所用,“杂交”指的是核酸一条链与其互补链碱基配对过程,如点杂交技术和PCR技术中的那样。
无论使用哪种探针序列或杂交方法,本领域普通技术人员可以很容易确定适宜的杂交条件,如杂交温度和化学条件。这些杂交方法是本领域公知的。例如,对于需要高选择性的应用,本领域普通技术人员一般需要采用相对严格的杂交反应条件,如,本领域普通技术人员会选用相对低盐和/或高温的条件,如提供大约0.02M至大约0.10M NaCl,温度大约50℃至大约70℃。这些高严格性条件容忍很少的(如果有的话)在探针和模板或目标链之间的错配。通常希望通过添加增加量的甲酰胺来提供更严格的条件。杂交反应条件的其他变化在本领域公知。(例如可以参见Sambrook等人,Molecular Cloning;A Laboratory Manual2d ed.(1989))。
杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度,例如Berger和Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 152,Academic Press,San Diego CA)所教导的那样,并赋予下面所解释的明确的“严格性”。
通常最高严格性出现在大约Tm-5℃(低于探针Tm5℃);高严格性在低于Tm大约5℃至10℃;中等严格性在低于Tm大约10℃至20℃,而低严格性在低于Tm大约20℃至25℃。如本领域普通技术人员将会理解,最高严格性杂交可以用于检测或鉴定核苷酸序列的相同性;而中等或低严格性杂交可以用于检测或鉴定相似或相关的多核苷酸序列。
一方面,本发明采用在严格条件下可杂交于另一核苷酸序列的核苷酸序列(例如65℃和0.1xSSC条件{lxSSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠pH7.0)。当核苷酸序列为双链时,双链体的两条链,单独地或组合,均可以被本发明所采用。当核苷酸序列为单链时,应当理解该核苷酸序列的互补序列也在本发明的涵盖范围内。
杂交的严格性指其中多核苷酸的杂交体是稳定的条件。这些条件对本领域普通技术人员是显而易见的。本领域普通技术人员公知,杂交体的稳定性反映于杂交体的解链温度(Tm),序列相同性每下降1%,杂交体的解链温度降低大约1-1.5℃。通常杂交体的稳定性是钠离子浓度和温度的函数。一般来说,杂交反应在较高严格性条件下进行,随后用不同严格性进行洗涤。
如本文所用的,高严格性包括允许那些在1M Na+在65-68℃形成稳定杂交体的核酸序列杂交的条件。可以提供高严格性条件,例如,通过在包含6x SSC、5x Denhardt′s、1%SDS(十二烷基硫酸钠)、0.1Na+焦磷酸盐和0.1mg/ml变性的鲑精DNA作为非特异性竞争物的水溶液中进行杂交。杂交之后,可以在若干步骤完成高严格性洗涤,最后洗涤在杂交温度下在0.2-0.1x SSC,0.1%SDS溶液中进行大约30分钟。
了解这些条件可以使用多种缓冲液(例如基于甲酰胺的缓冲液)和温度来修改和复制。Denhardt′s溶液和SSC是本领域普通技术人员熟知的其他适宜的杂交缓冲液(参见例如Sambrook等人,eds.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York或Ausubel等人,eds.(1990)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.)。一般来说凭经验确定最优化的杂交条件,因为杂交对的长度和GC含量也起到作用。
与本文所公开的引物和探针序列不同的核酸分子也在本发明范围内。与这些序列互补,或如本文所述在标准或严格条件下与所述序列杂交的核酸序列,以及类似物或衍生物也应在本发明范围内。有利地,这些变体与本文所描述的序列只有少数的核苷酸的不同,例如1个、2个或3个核苷酸的不同。
相应于本文所描述的序列的天然等位基因变体、同源物(即衍生自其他物种的核酸)或其它相关序列(如旁系同源物(paralog))可以基于它们与本文所述的核酸的同源性而分离,例如利用已知序列的全部或部分作探针通过进行标准或严格的杂交反应而分离。这些核酸杂交和克隆的方法本领域公知。
类似的,本发明的方法检测到的核酸分子可能只包含所述特定序列的片段。本文提供的片段定义为至少6个(连续的)核酸的序列,长度足以允许与核酸探针或引物的特异性杂交,并且至多是少于全长序列的一些部分。片段可以衍生自选择的核酸序列的任何连续部分。衍生物和类似物可能是全长或不是全长,如果衍生物或类似物含有修饰的核酸或氨基酸,如下所述。
本发明的核酸的衍生物、类似物、同源物和变体包括但并不限于,包含与本发明的核酸基本上同源的区段的分子,在不同的实施方案中,这些分子与同样大小的核酸序列或与对齐的序列比较(比对采用本领域公知的计算机同源性程序进行)时有至少大约70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或甚至99%的序列相同性。
出于本发明的目的,序列相同性或同源性通过比较序列确定,所述序列被比对以最大化重叠和相同性同时最小化序列缺口。具体地,序列相同性可以使用多种数学算法中的任一种确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制实例为Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990;872264-2268的算法,由Karlin&Altschul修改,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993;90:5873-5877。
另一个用于比较序列的数学算法的实例是Myers&Miller,CABIOS1988;4:11-17的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(2.0版本),其是GCG序列比对软件包的一部分。当运用ALIGN程序进行氨基酸序列比较时,可以使用PAMl20权重残基表、12分的缺口长度罚分和4分的缺口罚 分。另一种鉴定局部序列相似性和比对的有用的算法是FASTA算法,如Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988;85:2444-2448中所描述的。
依据本发明使用的有益的算法是WU-BLAST(Washington University BLAST)版本2.0软件。针对若干UNIX平台的WU-BLAST版本2.0可执行程序可以从ftp://blast.wustl.edu/blast/executables处下载。该程序基于WU-BLAST版本1.4,WU-BLAST版本1.4又是基于公众域NCBI-BLAST版本1.4(Altschul & Gish,1996,Local alignment statistics;Doolittle ed.,Methods in Enzymology266:460-480;Altschul等人,Journal of Molecular Biology1990215:403-410;Gish&States,1993;Nature Genetics3:266-272;Karlin&Altschul,1993;Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877;以上全部通过引用并入本文)。
在套件内的全部搜索程序中,缺口比对程序整合入数据库搜索本身。如果需要,缺口形成(gapping)可以被关闭。长度为1的缺口的缺省罚分(Q)对于蛋白质和BLASTP为Q=9,对于BLASTN为Q=10,但是可以改变为任何整数。延伸缺口的每残基缺省罚分(R)对蛋白质和BLASTP为R=2,对BLASTN为R=10,但是可以改变为任何整数。可以使用Q和R的值的任何组合,以对齐序列使得最大化重叠和相同性同时最小化序列缺口。缺省的氨基酸比较矩阵是BLOSUM62,但是其他氨基酸比较矩阵例如PAM也可以使用。
可选地或额外地,术语“同源性”或“相同性”,例如,针对核苷酸或氨基酸序列,可以表示两条序列间同源性的定量量度。序列同源性百分比可以用(Nref-Ndif)*100/-Nref计算。这里Ndif是两个对齐的序列间不同残基的总的数量,而Nref是其中一条序列的残基数量。因此,DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75%的序列相同性(N Nref=8;N Ndif=2)。“同源性”或“相同性”可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数量除以两个序列中的较短序列中核苷酸或氨基酸的数量,其中两序列的比对可以依据Wilbur和Lipman算法确定(Wilbur&Lipman,Proc Natl Acad Sci USA1983;80:726,通过引用并入本文),例如,使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸字长、缺口罚分为4、以及计算机辅助分析,并且包含比对结果的序列数据解释都可以使用商业上易得的程序很方便的执行(如 Intelligenetics.TM.Suite,Intelligenetics Inc.CA)。当述及RNA序列和DNA序列相似或具有一定程度相同性或同源性时,认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此,RNA序列也在本发明的范围内,且通过将DNA序列中的胸腺嘧啶(T)考虑等同于RNA序列中的尿嘧啶(U),可以衍生自DNA序列。无需过度的实验,本领域技术人员可以借助很多其他的程序或参考文献来计算百分比同源性。
至于密码子优化,本发明的核酸分子具有编码本发明的抗原的核苷酸序列,所述核苷酸序列可以被设计成采用在产生抗原的对象的基因中使用的密码子。本领域技术人员公知这些方法和这些方法的选择。此外,还有若干公司会优化密码子序列,例如Geneart(TUgeneart(dot)comUT)。因此,可以容易地对本发明的核苷酸序列进行密码子优化。
如本文所用,术语“探针”指的是分子(如,寡核苷酸,无论是天然存在的由限制酶切消化纯化得到还是合成产生的,重组的还是PCR扩增的),其能够与另一感兴趣的分子(如另一寡核苷酸)杂交。当探针是寡核苷酸时,它们可以是单链的或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定靶(如基因序列)。如本文所述的,设想本发明使用的探针可以采用标签标记以使其在任何检测系统中都可检测,所述系统包括但不限于酶系统(如ELISA以及基于酶的组织化学测定)、荧光系统、放射性系统和发光系统。
如本文所述的引物和探针可以很容易制备出来,例如通过化学方法直接合成片段或通过引入选定的序列至重组载体进行重组生产。制备载体或重组体或质粒用于在体内或体外扩增片段的方法可以是任何所需的方法,例如以下文献中或其中引用的文献中描述的方法或类似方法:U.S.Pat.Nos.4,603,112、4,769,330、4,394,448、4,722,848、4,745,051、4,769,331、4,945,050、5,494,807、5,514,375、5,744,140、5,744,141、5,756,103、5,762,938、5,766,599、5,990,091、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、5,591,639、5,589,466、5,677,178、5,591,439、5,552,143、5,580,859、6,130,066、6,004,777、6,130,066、6,497,883、6,464,984、6,451,770、6,391,314、6,387,376、6,376,473、6,368,603、6,348,196、6,306,400、6,228,846、6,221,362、6,217,883、6,207,166、6,207,165、6,159,477、6,153,199、6,090,393、6,074,649、6,045,803、6,033,670、 6,485,729、6,103,526、6,224,882、6,312,682、6,348,450和6,312,683;U.S.专利申请系列号920,197,1986年10月16日提交;WO90/01543;W091/11525;WO94/16716;WO96/39491;WO98/33510;EP265785;EP0370573;Andreansky等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11313-11318;Ballay等人.,EMBO J.1993;4:3861-65;Felgner等人.,J.Biol.Chem.1994;269:2550-2561;Frolov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11371-11377;Graham,Tibtech1990;8:85-87;Grunhaus等人,Sem.Virol.1992;3:237-52;Ju等人,Diabetologia1998;41:736-739;Kitson等人,J.Virol.1991;65:3068-3075;McClements等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11414-11420;Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11341-11348;Paoletti,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11349-11353;Pennock等人,Mol.Cell.Biol.1984;4:399-406;Richardson(Ed),Methods in Molecular Biology1995;39,″Baculovirus Expression Protocols,″Humana PressInc.;Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.1983;3:2156-2165;Robertson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11334-11340;Robinson等人,Sem.Immunol.1997;9:271;和Roizman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11307-11312。探针设计的策略如WO95/11995、EP717,113和WO97/29212所述。
本发明进一步考虑了直接和间接标记技术。例如,直接标记将荧光染料直接掺入与阵列连接的探针杂交的核苷酸序列(例如在标记的核苷酸或PCR引物存在的情况下,通过酶促合成将染料掺入核苷酸序列)。直接标记方案产生强杂交信号,通常使用具有相似化学结构和特性的荧光染料家族,并且很容易实现。在某些包括直接标记的核酸的实施方案中,酞菁或Alexa类似物用于多重荧光比较阵列分析。在另一些实施方案中,间接标记方案可以用于在与微阵列探针杂交前或杂交后将表位掺入核酸。一种或多种染色步骤和试剂被用于标记杂交复合物(如,结合表位的荧光分子,由此借助于染料分子与杂交物质的表位的缀合而提供荧光信号)。
用作本发明的探针的寡聚核苷酸序列可以用可检测的部分标记。多种标记部分为本领域公知。所述部分可以是,例如,放射性标记(如3H、125I、35S、14C、32P等)、可检测的酶(如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶等)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明、Cy3、 Cy5、Bodipy、Bodipy Far Red、荧光黄、Bodipy630/650-X、Bodipy R6G-X和5-CR6G等等)、比色法标记如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)、珠或可以形成可检测信号(如比色法、荧光、化学发光法或电化学发光(ECL)信号)的任何其他部分。
探针可以用可检测部分直接或间接标记,或合成探针以掺入可检测部分。在一实施方案中,可检测标记在酶介导的循环扩增反应中至少一个循环期间被掺入核酸中。例如,在酶介导的循环扩增反应过程中可以用聚合酶掺入荧光核苷酸。或者,可以在核酸引物或探针合成期间掺入荧光核苷酸。为了用荧光染料标记寡核苷酸,可以使用众所周知的标签标记方法的其中一种(Nature Biotechnology,14,303-308,1996;Applied and Environmental Microbiology,63,1143-1147,1997;Nucleic Acids Research,24,4532-4535,1996)。有益的探针是用荧光染料在3′或5′端标记并含有G或C作为标记末端处的碱基的探针。如果5′端被标记而3′端未被标记,3′核糖或脱氧核糖位置的C原子上的OH基团可以用磷酸基团等修饰,尽管在这方面没有任何强加的限制。
可以应用分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测这样的标记。检测装置和方法可以包括但不限于光学成像、电子成像、使用CCD照相机成像、集成的光学成像和质谱。此外,可以定量与靶点结合的标记的或未标记的探针的数量。这样的定量包括统计学分析。在另一些实施方案中,可以通过一致和不一致位点间的导电性差异,通过猝灭、通过荧光干扰分析或通过供体和受体分子之间的电子转运进行检测。
在另外一些实施方案中,可以通过在PCR或杂交反应中杂交复合物的分子间的能量传递进行检测,例如通过荧光能量转移(FET)或荧光共振能量转移(FRET)。在FET和FRET方法中,一或多种核酸探针用荧光分子标记,其中一种可以作为能量供体,另一种作为能量受体分子。它们有时被分别称作报道分子和猝灭分子。供体分子被特定波长的光激发,因此其通常显示荧光发射波长。受体分子也可以在该波长激发,从而通过多种依赖距离的能量转移机制接受供体分子的发射能量。一般来说,当受体分子与供体分子接近时(如在同一个分子上或相邻分子上),受体分子可以接受供体分子的发射能量。FET和FRET为本领域公知。参见例如:U.S.Pat.Nos. 5668648、5707804、5728528、5853992和5869255(描述了FRET染料),Tyagi等人Nature Biotech.vol.14,p303-8(1996),和Tyagi等人,Nature Biotech.vol16,p49-53(1998)(描述FET分子信标),和Mergny等人Nucleic Acid Res.vol22,p920-928,(1994)和Wolf等人PNAS vol85,p8790-94(1988)(FET和FRET一般说明和方法),这些各自通过引用并入本文。
本发明的核苷酸序列可以插入载体中。术语“载体”由本领域普通技术人员广泛了解和使用。如本文所述,术语“载体”的使用与本领域普通技术人员的了解相同。例如,由本领域普通技术人员通常使用的术语“载体”指的是一种媒介物(vehicle),其允许或便于核酸分子从一种环境到另一种的转移,或者可以允许或便于对核酸分子的操作。
举例来说,载体是复制子(replicon),例如质粒、噬菌体或粘粒,可以与另一DNA节段连接以实现所连接的节段的复制。“复制子”可以是任何遗传元件,其功能在于作为体内DNA复制的自发单元,即可以在其自身控制下复制。“复制起点”指的是参与DNA合成的那些DNA序列。“表达控制序列”指的是DNA序列,其控制和调节另一DNA序列的转录和翻译。当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA,所述RNA随后被翻译为编码序列编码的蛋白质时,所述编码序列在细胞内是“可操作地连接的”和在转录和翻译控制序列的控制之下的。
一般来说,包含促进插入的DNA片段的有效转录和翻译的启动子序列的表达载体与宿主结合使用。表达载体一般来说包含复制起点、启动子、终止子以及能够在转化的细胞提供表型选择的特定基因。当多核苷酸编码多蛋白片段时,有利地,在载体中将起始密码子(ATG)置于读码框5′端,将终止密码子置于3′端。可能存在控制表达的其他元件,例如增强子序列、稳定序列和允许蛋白质分泌的信号序列。转化的宿主可以依据本领域公知的方法发酵或培养以达到最佳的细胞生长。
依据本发明,可以进行使用能够表达本发明免疫原的任何载体。在某些实施方案中,本发明的免疫原可以在体外(如使用无细胞的表达系统)和/或在体外生长的培养细胞中。对于这样的应用,可使用任何允许在体外和/或在培养的细胞内表达免疫原的载体。
DNA“编码序列”是双链DNA序列,当置于适合的调控序列的控制下时,在体内转录并翻译成多肽。编码序列的边界通过5′(氨基)端的起始 密码子和3′(羧基)端的翻译终止密码子来确定。编码序列可以包含但不限于原核生物序列、来自真核生物mRNA的cDNA、真核生物(例如哺乳动物)的基因组DNA、和甚至是合成的DNA序列。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′端。“cDNA”指的是拷贝-DNA或互补-DNA,是mRNA转录物的反转录反应的产物。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列,例如启动子、增强子、核糖体结合位点、上游调控域、多腺苷酸化信号、终止子等,其在宿主细胞中提供编码序列的表达。“顺式作用元件”是核苷酸序列,也被称作为“共有序列”或“基序”,其与其他能够上调或下调特定基因座的表达的蛋白质相互作用。“信号序列”也可以包含于编码序列中。该序列编码信号肽,在多肽的N-端,与宿主细胞联系并引导多肽进入适当的细胞位置。可以发现信号序列与多种原核生物和真核生物天然蛋白质相关。只要需要的基因可以转录和翻译,在重组载体中并不总是需要存在所有的这些控制序列。
“启动子序列”是DNA调控区,可以在细胞内与RNA聚合酶结合并起始下游(3′方向)编码序列的转录。一般来说,启动子序列的边界在其3′端限于转录起始位点,向上游(5′方向)延伸,直至包含最少量的起始达到高于背景的可以检测水平的转录所必需的碱基或元件。在启动子区内是转录起始位点,以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核生物的启动子通常但并不是总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核生物的启动子除了-10和-35共有序列外还包含Shine-Dalgarno序列。
如本文所用的,术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”指的是用来在特定核苷酸序列处或附近切开双链DNA的酶。
“重组DNA技术”指的是将两个异源的DNA分子联合起来的技术,通常是不同生物体的DNA分子在体外连接的结果。重组DNA分子通常由遗传工程实验生产。其同义词包括“基因剪接、“分子克隆”和“遗传工程”。这些操作的产物获得“重组体”或“重组分子”。
当外源的或异源的DNA被引入细胞内部时,细胞被这样的DNA“转化”或“转染”。转化的DNA可能整合也可能不整合(即共价连接)进细胞基因组。例如在原核动物、酵母菌和哺乳动物细胞中,转化的DNA 可以保持在独立的游离型(episomal)元件如载体或质粒上。对于真核细胞,稳定转化的细胞是这样的细胞,其中转化的DNA整合进入染色体使得在染色体复制时被子细胞遗传。通过真核细胞建立含转化DNA的子细胞群组成的细胞系或克隆的能力证实该稳定性。“克隆”是从单个细胞或祖先通过有丝分裂衍生出的细胞群。“细胞系”是原代细胞的克隆,其能在体外稳定生长很多代。被转化进外源DNA的生物体,例如植物或动物,称为“转基因的”。
如本文所用的,术语“宿主”的意义不仅包括原核生物,也包括真核生物,例如酵母菌、植物和动物细胞。原核生物宿主可以包括大肠杆菌、S.tymphimurium、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核生物宿主包括酵母如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞和昆虫细胞和植物细胞,例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Tobaccum nicotiana)。很多哺乳动物细胞系是本领域公知的,包括可从American Type Culture Collection(ATCC)获得的永生细胞系,例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Mandin-Darby牛肾细胞(″MDBK")及其他。类似的,细菌宿主包括,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcus spp.),将可应用于本发明的表达载体。可用于本发明的酵母宿主包括尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Pichia guillerimondii、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)和子囊菌酵母(Yarrowia lipolytica)。在本发明中可用的插入宿主包括但不限于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
DNA构建体的“异源”区域是较大DNA分子中的可鉴别的DNA节段,所述节段没有发现天然与所述较大分子相关。因此,当异源区编码哺乳动物基因,所述基因通常的侧翼DNA不是来源生物体基因组中哺乳动物基因组DNA侧翼的DNA。在另一个实例中,编码序列是构建体,其中所述编码序列自身并不天然存在(如cDNA,而基因组编码序列中含有内含子;或合成的序列,其具有不同于天然基因的密码子)。等位基因变异或天 然发生的突变事件不足以给出如本文定义的DNA异源区。例如,多核苷酸可以通过遗传工程技术置入不同来源的质粒或载体中,就是异源多核苷酸。从其天然编码序列上移走并可操作地连接到除所述天然序列外的编码序列上的启动子是异源启动子。
如本文所用的,用于基因或多肽的“片段”或“部分”,通常长度将是至少10个残基,更典型地为至少20个残基,且优选至少30个(如50个)残基,但是要短于整个完整的序列。这些基因片段可以通过本领域技术人员公知的方法生成,例如通过DNA重组技术产生(使用编码所需基因的载体),或通过化学方法合成。
制备和/或施用载体或重组体或质粒的方法以体内或体外表达本发明的基因的基因产物的方法可以是任何所需的方法,例如以下文献描述的方法或类似方法:美国专利号.4,603,112、4,769,330、4,394,448、4,722,848、4,745,051、4,769,331、4,945,050、5,494,807、5,514,375、5,744,140、5,744,141、5,756,103、5,762,938、5,766,599、5,990,091、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、5,591,639、5,589,466、5,677,178、5,591,439、5,552,143、5,580,859、6,130,066、6,004,777、6,130,066、6,497,883、6,464,984、6,451,770、6,391,314、6,387,376、6,376,473、6,368,603、6,348,196、6,306,400、6,228,846、6,221,362、6,217,883、6,207,166、6,207,165、6,159,477、6,153,199、6,090,393、6,074,649、6,045,803、6,033,670、6,485,729、6,103,526、6,224,882、6,312,682、6,348,450和6,312,683;美国专利申请系列号920,197,1986年10月16日提交;WO90/01543;W091/11525;WO94/16716;WO96/39491;WO98/33510;EP265785;EP0370573;Andreansky等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11313-11318;Ballay等人,EMBO J.1993;4:3861-65;Felgner等人,J.Biol.Chem.1994;269:2550-2561;Frolov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11371-11377;Graham,Tibtech1990;8:85-87;Grunhaus等人,Sem.Virol.1992;3:237-52;Ju等人,Diabetologia1998;41:736-739;Kitson等人,J.Virol.1991;65:3068-3075;McClements等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11414-11420;Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11341-11348;Paoletti,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11349-11353;Pennock等人,Mol.Cell.Biol.1984;4:399-406; Richardson(Ed),Methods m Molecular Biology l995;39,“Baculovirus Expression Protocols,”Humana Press Inc.;Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.1983;3:2156-2165;Robertson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11334-11340;Robinson等人Sem.Immunol.1997;9:271;and Roizman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11307-11312。
本发明也提供了包含本发明的载体的转化的宿主细胞。在某些实施方案中,载体通过转染、电穿孔或感染导入细胞中。本发明也提供了一种制备转化的细胞(该转化的细胞可以表达本发明的免疫原)的方法,包括用表达载体(如DNA疫苗)转染、电穿孔或感染细胞,从而产生被感染的生产细胞,并在足以在所述宿主细胞中表达所述免疫原的生物学条件下维持细胞生长。
依据本发明的另一实施方案,表达载体是用于在适当的细胞系统中体外表达蛋白质的表达载体。表达的蛋白质可以在蛋白质分泌之后或不在分泌之后(如果蛋白质不分泌,一般会出现细胞裂解或进行细胞裂解)从培养物上清中收获,任选地使用浓缩方法(如超滤)进行浓缩和/或使用纯化手段(例如亲和层析、离子交换层析或凝胶过滤型层析方法)纯化。
本领域技术人员了解宿主细胞的培养条件依据特定的基因而不同,因此有时必需通过常规实验来确定含有载体的宿主细胞的最佳培养条件。“宿主细胞”指被遗传学改变的原核或真核细胞,或可以通过施用外源多核苷酸(例如重组的质粒或载体)而在遗传学改变的原核或真核细胞。当提及被遗传学改变的细胞时,该术语既指最初被改变的细胞,也指其后代细胞。
含有所需序列的多核苷酸可以插入适宜的克隆或表达载体中,而所述载体进而被引入适宜的宿主细胞中以进行复制和扩增。多核苷酸可以采用本领域公知的任何方法引入宿主细胞中。可以通过的众多适宜的方法中的任何一将包含感兴趣的多核苷酸的载体引入宿主细胞,包括直接摄取、胞吞作用、转染、f-接合、电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、二乙氨乙基葡聚糖或其他物质的转染、微粒轰击、脂转染(lipofection)和感染(其中载体具有感染性,例如反转录病毒载体)。引入载体或多核苷酸的选择通常依赖于宿主细胞的特征。
对于免疫原需要在体内表达的应用,例如当本发明的免疫原用于 DNA或含DNA的疫苗时,可以使用任何能够表达本发明的免疫原且体内使用安全的载体。在优选的实施方案中,所用的载体在人类、哺乳动物和/或实验动物中使用安全。
一般应该选择本发明使用的载体使得其包含适合的基因调控区(例如启动子和增强子),使得可以表达本发明的免疫原。
例如,当目的是体外或在培养的细胞中,或者在为了生产编码这些免疫原的蛋白质的任何原核或真核系统中表达本发明的免疫原时,可以基于所述应用使用任何适合的载体。例如,可使用质粒、病毒载体、细菌载体、原生动物载体、昆虫载体、杆状病毒表达载体、酵母载体、哺乳动物细胞载体等等。技术人员可以考虑载体的性质和在具体环境下表达免疫原的需要,选择适合的载体。
当目的是在一个对象体内表达本发明的免疫原时,例如为了产生针对HIV抗原的免疫应答和/或针对HIV的保护性或治疗性免疫应答,应当选择适合于在该对象上表达,并且体内使用安全的表达载体。例如,在某些实施方案中,需要在实验动物表达本发明的免疫原,例如用于本发明的HIV免疫原性组合物和疫苗的临床前实验。在另一些实施方案中,需要在人类对象表达本发明的免疫原,例如用于本发明的HIV免疫原性组合物和疫苗进行临床实验和实际临床应用。可以使用任何适合于这些用途的载体,技术人员有能力挑选适合的载体。在某些实施方案中,优选用于这些体内应用的载体被减弱以防止载体在对象内的扩增。例如,如果使用质粒载体,首选那些缺乏在对象中起作用的复制起点的载体,以增强在对象内使用的安全性。如果使用病毒载体,优选地其在对象中是减毒的或是复制缺陷的,也是为了增强在对象内使用的安全性。
适于作为疫苗施用的任何载体可以在本发明中采用。在本发明的某些实施方案中,使用适合作为DNA疫苗使用的载体,例如pVAX和pcDNA载体(Invitrogen)。
在本发明的另一些实施方案中,使用病毒载体。病毒表达载体是本领域技术人员公知,例如包括腺病毒(如腺病毒亚型Ad5、Adl1、Ad26、Ad35、Ad48和Ad49)、腺伴随病毒(AAV)、甲病毒、反转录病毒和痘病毒(包括鸟痘病毒、减毒痘病毒和痘苗病毒如修饰的牛痘病毒(MVA))。在某些实施方案中,本发明的疫苗包含选自Ad5、Adl1、Ad26、Ad35、 Ad48和Ad49的腺病毒。这样的病毒当作为表达载体使用时,其在选定的对象(如人)中天然不致病或经修饰使其在选定的对象中不致病。例如,复制缺陷腺病毒和甲病毒是公知的且可用做基因递送载体。
表达之后,可以使用任何本领域已知的技术分离和/或纯化或浓缩本发明的抗原。例如,可以使用阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、免疫亲和层析、羟磷灰石层析、凝集素层析、分子筛层析、等电点聚焦、凝胶电泳或任何其他适合的方法或方法的组合。
在某些实施方案中,体内施用本发明的核苷酸序列和/或抗原,例如当目的是在对象产生免疫应答时。“对象”在本发明背景下可以是任何动物。例如,在某些实施方案中,需要在实验动物表达本发明的抗原,例如用于本发明的HIV免疫原性组合物和疫苗的临床前实验。在另一些实施方案中,需要在人类对象表达本发明的免疫原,例如用于本发明的HIV免疫原性组合物和疫苗进行临床实验和实际临床应用。在某些实施方案中,对象是人类,例如感染了HIV的人或具有感染HIV风险的人。
对于这样的体内应用,本发明的核苷酸序列和/或抗原,优选地作为免疫原性组合物的组分施用,所述免疫原性组合物包括与药用可接受的载体混合的本发明的核苷酸序列和/或抗原。本发明的免疫原性组合物可用于刺激针对HIV的免疫应答且可以用作针对HIV的预防性或治疗性疫苗的一种或多种组分,用于预防、改善和治疗HIV。本发明的核酸和载体可用于提供遗传疫苗,即用于将编码本发明抗原的核酸递送至对象(如人)的疫苗,使得所述抗原然后在对象内表达并引起免疫应答。
免疫原性组合物
如本文所用的术语“免疫原性蛋白质或肽”也包括免疫学活性的肽或多肽,从该意义上说,一旦给宿主施用,可以诱发针对该蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地所述蛋白质片段与与总蛋白具有基本上相同的免疫学活性。因此,依据本发明的蛋白质片段含有至少一种表位或抗原决定簇。术语表位指的是能够诱导体液免疫应答(B细胞)或细胞免疫应答(T细胞)的蛋白位点。
术语“免疫原性蛋白质或肽”还考虑对序列的缺失、添加和取代,只 要所述多肽行使其诱导如本文所述的免疫应答的功能。
术语“表位”指的是在抗原或半抗原上的B细胞和/或T细胞特异性应答的位点。该术语也可以与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。识别相同表位的抗体可以用简单的免疫测定鉴定,所述免疫测定显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。
对组合物或疫苗的“免疫应答”指的是在宿主中出现的对感兴趣的组合物或疫苗产生的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常,“免疫应答”包含但不限于以下一种或几种效应:生产特异性针对抗原或包含于感兴趣的组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞。优选地,宿主将会展示出治疗性或保护性免疫应答,使得对新的感染的抵抗力将得到增强和/或疾病的临床症状得到减轻。在受感染的宿主中通常呈现的症状的减少或消失,以及在受感染的宿主中较快的恢复时间和较低的病毒滴度都证明这样的保护。
免疫应答的产生可能与抗原呈递细胞(APC)有关。抗原呈递细胞(APC)可能是“专业”的抗原呈递细胞或另外的可被诱导为呈递抗原至T细胞的细胞。抗原呈递细胞(APC)包括树突细胞(DC)如指状突树突细胞或滤泡状树突细胞、郎格尔汉斯细胞、PBMC、巨噬细胞、B淋巴细胞或其它的细胞类型如上皮细胞、成纤维细胞或内皮细胞,这些细胞通过转染在其表面表达I类或II类MHC分子从而活化或工程化。抗原呈递细胞(APC)也包括杂交瘤、淋巴瘤和合成的APC例如脂质膜。抗原呈递细胞(APC)的前体包括CD34+细胞、单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞。可以促进免疫增强作用的细胞因子基因包括IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-18等。这样的蛋白质包括MHC分子(I类或II类)、CD80、CD86或CD40。T细胞的实例包括辅助T细胞(CD4+)和CD8+细胞。
如本文所用的“免疫原性”蛋白质或多肽也指的是引起如上所述的免疫应答的氨基酸序列。如本文所用的“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其具有免疫原性片段。“免疫原性片段”意思是包含一个或多个表位因此可以引起如上所述的免疫应答的蛋白质片段。这样的片段可以使用多种本领域公知的表位定位技术进行鉴定。参见如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)Humana Press,Totowa,N.J。例如,可以通过如下方式确 定线性表位:在固体支持物上同时合成大量肽,所述肽相应于蛋白质分子的一部分,并使所述肽在保持与支持物相连的状况下与抗体反应。这样的技术本领域公知,如U.S.Pat.No.4,708,871;Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715所述,所有内容以其整体通过引用并入本文。类似的,构象决定簇易于通过测定氨基酸的空间构象的方法进行鉴定,例如通过x-射线晶体学和二维核磁共振鉴定。参见例如Epitope Mapping Protocols,同上。
合成抗原也包含在本定义范围内,例如,多表位、侧翼表位和其他重组的或合成的衍生抗原。参见例如Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781;Bergmann等人(1996)J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier,A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75:402-408;Gardner等人(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,Jun.28-Jul.3,1998。为了本发明的用途,免疫原性片段通常包含至少大约3个氨基酸,至少大约5个氨基酸,至少大约10-15个氨基酸或至少大约25个或更多个氨基酸。所述片段的长度并没有严格的上限,可以包含几乎蛋白质序列全长,或甚至是包含所述蛋白质至少一个表位的融合蛋白。
正如前面提到的,表位确定方法无需过度的实验即可用于本发明的实践,例如生成重叠肽文库(Hemmer B.等人,Immunology Today,1998,19(4),163-168)、肽扫描技术(Geysen等人,1984Proc.Nat.Acad.Sci.USA,81,3998-4002;Geysen等人,1985Proc.Nat.Acad.Sci.USA,82,178-182;Van der Zee R.等人,1989Eur.J.Immunol.,19,43-47;Geysen H.M.,1990Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health,21,523-533;Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot A.等人,1999Nature Biotechnology,17,533-561),以及在PCT申请系列号PCT/US2004/022605,所有这些通过引用以其整体并入本文。也可以参考其他在此引用和并入的文献查询测定免疫原或抗原的表位的方法以及测定编码该表位的核酸分子的方法。
如本文所用的,术语“抗原”或“免疫原”可交换使用,指的是物质,通常为蛋白质,其能够在对象中诱导免疫应答。本术语也可以指具有免疫活性的蛋白质,一旦施用至对象(包括向对象直接施用蛋白质或施用编码该蛋白质的核酸序列或载体)能够诱发针对此蛋白质的体液和/或细胞 类型免疫应答。
术语“抗体”包括完整的分子以及其片段,例如Fab、F(ab′)2、Fv和scFv,其可以与抗原决定簇结合。这些抗体片段保留对抗原或受体的选择结合的一些能力,并且包括,例如:
(i)Fab,抗体片段,包含抗体分子的单价抗原结合片段,可以通过整个抗体经木瓜蛋白酶消化而产生,获得完整的轻链以及重链的一部分。
(ii)Fab′,抗体分子的片段,可以通过整个抗体经胃蛋白酶处理,随后还原得到,获得完整的轻链以及重链的一部分,从每个抗体分子可以得到2个Fab′片段。
(iii)F(ab′)2,抗体分子的片段,可以通过整个抗体经胃蛋白酶处理后不经还原过程得到,F(ab′)2是两个Fab′片段通过二硫键结合在一起而成的二聚体。
(iv)scFv,包括遗传工程化的片段,包含重链和轻链的可变区,作为融合的单链分子。
制备这些片段的一般方法本领域公知。(参见例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1988),通过引用并入本文)
“中和抗体”,是能够中和病原体在宿主和/或体外的靶细胞中起始和/或持续感染的能力的抗体。中和抗体可以以中和指数>1.5或>2.0抑制HIV-1的进入。广谱的和有效的中和抗体在中和测定实验中可以中和超过大约50%的HIV-1的病毒(来源于不同进化枝或同一进化枝的不同毒株)。在中和测定实验中,单克隆抗体中和大约50%的输入病毒的抑制浓度可以少于大约25mg/ml。
“分离的抗体”或“非天然存在的抗体”是从其天然环境的组分中分离的和/或回收的抗体。天然环境中的污染成分是干扰抗体用于诊断或治疗的物质,可能包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质溶解物。在优选的实施方案中,抗体被纯化至:(1)通过Lowry法测量的按重量计多于95%的抗体,且最优选按重量计多于99%;(2)足以使用旋杯式测序仪获得N-端或内部氨基酸序列中至少15个残基的程度;或(3)通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下使用考马斯蓝染色或更优选采用银染法鉴定的均质性。分离的抗体包括在重组细胞中的原位抗体,因为抗体天然环境的组分中至少 一种不存在。一般来说,尽管如此,分离抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指的是从基本上均质的抗体群中获得的抗体,即组成该抗体群的个体抗体除了自然状态下可能少量出现的突变外是相同的。单克隆抗体是高度特异的,针对单个抗原位点。此外,与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,每一单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体优于多克隆抗体之处在于可以合成,不受其他抗体污染。修饰词“单克隆”并不是限制抗体的生产需要通过任何特定的方法。例如,在本发明中可使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备,该方法首先见于Kohler等人,Nature,256:495(1975);或可以通过在细菌、真核动物或植物细胞中施用重组DNA的方法得到(参见例如U.S.Pat.No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以从噬菌体抗体库中分离得到,使用的技术参见例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选地包含完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双抗体、线性抗体(参见U.S.Pat.No.5,641,870;Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
需要了解的是,蛋白质,包括本发明的抗体,可以与本文图解和描述的确切序列有区别。因此本发明考虑对所示序列的缺失、添加和取代,只要序列的功能与本发明的方法一致。在这方面中,特别优选的取代在自然界中通常是保守的,即发生在氨基酸家族内部的置换。例如,氨基酸通常被分为4个家族:(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸盐;(2)碱性-赖氨酸、精氨酸和组氨酸;(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不带电极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类到芳香族的氨基酸。可以合理推测分离的或非天然存在的以下情况:亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸取代,或反之亦然;天冬氨酸被谷氨酸盐取代,或反之亦然;苏氨酸被丝氨酸取代,或反之亦然;或氨 基酸与结构类似的氨基酸的相似保守性置换,对蛋白质生理活性没有明显影响。因此,基本上具有与图解或描述的序列相同的氨基酸序列,但是具有较少的且不在实质上影响蛋白质的免疫原性的氨基酸置换的蛋白质在本发明的范围内。
依据本发明,在某些实施方案中,在疫苗接种程序框架内本发明中疫苗的施用可以与其他疫苗接种组合,以免疫或疫苗接种试剂盒或方法的形式,或以多价的免疫原性组合物和多价疫苗的形式,如包含至少一种针对靶病原体(如HIV)的疫苗组分,和至少一种针对另一种病原体的疫苗组分。这也包括了同一表达载体表达至少两种病原体的基因。
本发明因此也关于多价的或“鸡尾酒式的”免疫原性组合物,或多价的或“鸡尾酒式的”,针对靶病原体(如HIV),也针对至少另一种靶物种的疫苗,使用同一体内表达载体,其包含和表达至少一种本发明的靶病原体(如HIV)的多核苷酸和至少一种表达另一病原体的免疫原的多核苷酸。
如本文所述,这些多价体组合物或疫苗也可以包含药用可接受的载体或媒介物或赋形剂,以及任选存在的佐剂。
如本文所述的这些免疫原性组合物和疫苗,也可以与至少一种常规疫苗(如灭活的、活减毒的或亚单位疫苗)组合,所述常规疫苗针对同一种病原体或所述免疫原性组合物和疫苗针对的物种的另一种病原体。如本文所述的这些免疫原性组合物和疫苗,可以在常规疫苗施用前或后施用,例如采用一种“初始-加强”方案。
配制物
本发明的组合物可以包括任意本领域已知的药用可接受的载体。
为便于本发明的疫苗的施用,疫苗可以配制成成为合适的药物组合物。一般来说,这些组合物包含活性成分(如DNA疫苗)和药用可接受的载体。用于医学应用,这些组合物适宜递送活性成分至患者,可以按自身已知的方式制备,如借由常规的混合、溶解、粒化、包裹糖衣、研磨、乳化、包囊化、包埋(entrapping)或冻干方法。
用于本发明的药物组合物可以按常规方式使用一种或多种药理学的或生理学可接受的载体制备,包含赋形剂、及任选的辅剂,其有利于将活性 化合物加工成制备物,所述制备物可以在药物学上使用。适当的配制物与选择的施用途径有关。因此,对于注射,活性成分可以配制于水溶液中,优选配制于生理学相容的缓冲液。对于跨粘膜施用,在配制物中采用对于待穿透的屏障为合适的渗透剂。这些渗透剂本领域公知。对于口服施用,活性成分可以与适合包含于片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、悬液等的载体组合。对于通过吸入施用,活性成分方便地以来自加压的包装或喷雾器的气溶胶喷雾的形式递送,使用适合的推进剂。活性成分可以配制用于通过注射肠道外使用,如通过推注或持续输注。这样的组合物可以采用置于油性或水性媒介物中的悬液、溶液、乳状液的形式,并可以包含配方剂(formulatory agent)如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。其他药学赋形剂为本领域公知。
本发明的组合物可以是可注射的悬液、溶液、喷雾剂、冻干粉剂、糖浆剂、酏剂等。可以使用任何适当形式的组合物。为了制备这样的组合物,具有所需的纯度的本发明的核酸或载体,与一种或多种药用可接受的载体和/或赋形剂混合。载体和赋形剂必须是可接受的,意思是与组合物中其他成分相容。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在施用的剂量和浓度下对受体无毒,并包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇或这些的组合,缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚丁基或苯甲基乙醇、烷基对羟苯甲酸如甲基或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚);低分子量多肽(少于大约10个残基);蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白类、亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖类、二糖类和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂如EDTA;糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形成盐的抗衡离子如钠;金属复合物(如Zn-蛋白质复合物);和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本发明中免疫原性或免疫学组合物,如DNA疫苗,也可以被制成水包油乳剂。举例来说,水包油乳剂基于液态石蜡(European Pharmacopea type)、类异戊二烯油,如角鲨烷、角鲨烯、EICOSANEPTMP或四四十烷, 获得自烃聚合的油,如异丁烯或癸烯;包含线性烷基的酸或醇的酯,如植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸盐/癸酸盐)、甘油基三(辛酸盐/癸酸盐)或丙二醇二油酸酯;分支脂肪酸或醇的酯,如异硬脂酸酯。油有利地与乳化剂组合以形成乳状液。乳化剂可以是非离子型表面活性剂,如山梨聚糖、二缩甘露醇(如脱水甘露醇油酸)、甘油、聚合甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟硬脂酸的酯,其任选地乙氧基化,以及聚羟丙基-聚氧乙烯共聚物嵌段,例如产物如L121。佐剂可以是乳化剂、微团形成剂和油的混合物,如商业上可得的产品,名称为(IDEC Pharmaceuticals,San Diego,CA)。
本发明的免疫原性组合物包含额外的物质,例如润湿剂或乳化剂、缓冲剂、或佐剂,用于增强疫苗的效果(Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th edition,Mack Publishing Company,(ed.)1980)。
术语“佐剂”包含疫苗佐剂。疫苗佐剂指可以赋予针对抗原的免疫应答和/或调节其倾向所需的免疫应答的组分。参见The European Medicines Agency(EMEA)Evaluation of Medicines for Human Use,Guideline on Adjuvants in Vaccines,(2005),page6。合适的佐剂的实例包括矿物盐(例如氢氧化铝和磷酸钙或磷酸铝凝胶)、油乳乳状液和基于表面活化剂的配制物,如MF59(微液滴化的去污剂稳定化的水包油乳状液)、QS21(纯化的皂苷)、AS02[SBAS2](水包油+MPL+QS-21)、Montanide ISA-51和ISA-720(稳定化的水包油乳状液),微粒佐剂例如病毒体(并入流感病毒血凝素单的层脂质体媒介物)、AS04([SBAS4]加入MPL的Al盐)、ISCOMS(结构化的皂苷和脂质复合物)、多乳酸化合物共-乙交酯(PLG)、微生物衍生物(天然的和合成的)如单磷酸类脂A(MPL)、Detox(MPL+M.Phlei细胞壁支架)、AGP[RC-529](合成的乙酰化单糖)、DC_Chol(可自组织成脂质体的脂质免疫刺激物)、OM-174(脂质A衍生物)、CpG基序(包含免疫刺激性CpG基序的合成寡核苷酸)、改良的LT和CT(遗传学修饰的细菌毒素,提供无毒佐剂功效)、内源的人类免疫调节剂如hGM-CSF或hIL-12(细胞因子,可以以蛋白质或编码质粒的形式施用)、Immudaptin(C3d串联阵列)和插入载体如金颗粒。同上。
增强疫苗效果的佐剂也可以加入所述配制物中。除上面所述外,佐剂包括但不限于矿物盐(如AlK(SOB4B)B2B、AlNa(SOB4B)B2B、 AlNH(SOB4B)B2B、二氧化硅、明矾、Al(OH)B3B、CaB3B(POB4B)B2、高岭土或碳)、含有或不含免疫刺激复合物的聚核苷酸类(ISCOM)(如CpG寡核苷酸,如Chuang,T.H.et al,(2002)J.Leuk.Biol.71(3):538-44,Ahmad-Nejad,P.et al(2002)Eur.J.Immunol.32(7):1958-68所述;poly IC或polyAU酸、含有或不含CpG的聚精氨酸(也为本领域公知为IC31;参见Schellack,C.等人(2003)Proceedings of the34PthPAnnual Meeting of the German Society of Immunology;Lingnau,K.et al(2002)Vaccine20(29-30):3498-508),JuvaVaxTM(U.S.Patent No.6,693,086),某种天然物质(如来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的D蜡、在Cornyebacterium parvum、百日咳博德特菌(Bordetella pertussi)或布鲁杆菌属成员中发现的物质)、鞭毛蛋白(Toll样受体5配体,参见McSorley,S.J.et al(2002)J.Immunol.169(7):3914-9),皂苷类如QS21、QS17和QS7(U.S.Patent Nos.5,057,540;5,650,398;6,524,584;6,645,495),单磷酰脂质A,特别地3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL),咪喹莫特(也为本领域公知,称为IQM以AldaraTM名商业上可得;U.S.Patent Nos.4,689,338;5,238,944;Zuber,A.K.etal(2004)22(13-14):1791-8)和CCR5抑制剂CMPDl67(见Veazey,R.S.et al(2003)J.Exp.Med.198:1551-1562)。
氢氧化铝或磷酸铝通常以磷酸缓冲盐溶液中的0.05-0.1%溶液使用。也可以使用其他佐剂,特别是DNA疫苗中将霍乱毒素用作佐剂,特别是CTAl-DD/ISCOM(参见Mowat,A.M.et al(2001)J.Immunol.167(6):3398-405)、聚偶磷氮(Allcock,H.R.(1998)App.Organometallic Chem.12(10-11):659-666;Payne,L.G.et al(1995)Pharm.Biotechnol.6:473-93)、细胞因子例如但不局限于IL-2、IL-4、GM-CSF、IL-12、IGF-1、IFN-α、IFN-β和IFN-γ(Boyer等人,(2002)J.Liposome Res.121:137-142;WO0I/095919)、免疫调节的蛋白质例如CD40L(ADX40;参见,例如WO03/063899)、天然杀伤细胞CDl配体(也公知为CRONY或α-半乳糖神经酰胺;参见Green,T.D.et al,(2003)J.Virol.77(3):2046-2055)、免疫刺激融合蛋白例如IL-2融合免疫球蛋白Fc片段(Barouch等人,Science290:486-492,2000)和共刺激因子B7.1and B7.2分子(Boyer)。所有这些都可以以蛋白质或DNA的形式施用,可以在同一编码本发明中抗原的表达载体,或在单独的表达载体。
水包油乳状液特别适合于病毒载体,可以基于液态石蜡(欧洲药典 型),类异戊二烯油例如角鲨烷、角鲨烯,从烯烃类例如异丁烯或癸烯聚合获得的油、具有直链的烷基的酸或醇的酯,例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸盐/癸酸盐)、甘油基三(辛酸盐/癸酸盐)或丙二醇二油酸酯,或分支的脂肪族醇或酸的酯,特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用形成乳状液。乳化剂可以是非离子型表面活性剂,如一方面是山梨聚糖、二缩甘露醇(如脱水甘露醇油酸)、甘油、聚合甘油或丙二醇的酯,另一方面是油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟硬脂酸的酯,所述酯任选地乙氧基化,聚羟丙基-聚氧乙烯共聚物嵌段,例如Pluronic,如L121。
对于马来酸酸酐-烯基衍生共聚物,可以使用EMA(Monsanto),其是直链或与乙烯-马来酸酸酐共聚物交联,且它们例如通过二乙烯乙醚交联,也参考J.Fields等人,Nature186:778-780,Jun.4,1960。关于结构,聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸聚合物和EMA优选地通过基本单元形成,基本单元具有下式,其中:R1和R2,可以相同或不同,代表H或CH3,x=0或1,优选x=1,y=1或2,x+y=2。对于EMA,x=0和y=2。对于卡波姆,x=y=1。这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)且pH可以调整至7.3到7.4,例如通过碳酸钠(NaOH)调节,以提供可以掺入表达载体的佐剂溶液。
佐剂的进一步的例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有益的佐剂化合物为丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物,其是交联的,尤其具有糖或多元醇的聚烯基酯。这些化合物被称作卡波姆(Phameuropa Vol.8,No.2,June1996)。本领域技术人员也可以参照U.S.Patent No.2,909,462(通过引用并入本文),其详细描述这样的与多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物,所述多羟基化合物具有至少3个羟基,优选不多于8个羟基,至少有三个羟基上的氢原子被含有至少两个碳原子的不饱和脂肪基取代。优选的基团包含2至4个碳原子,例如乙烯基、烯丙基和其他乙烯基不饱和基团。不饱和基团自身可以含有其他取代基,如甲基。以名称(BF Goodrich,Ohio,USA)出售的产品是最适合的。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中,可以提及 974P、934P和971P。马来酸酐和烯基衍生物的共聚物之中,优选共聚物(Monsanto),其是马来酸酐和乙烯的共聚物,线性的或交联的,例如与二乙烯醚交联。可以参考J.Fields等人,Nature, 186:778-780,4June1960,通过引用并入本文。
如本文所用的术语“脂质体”包括近晶中间相,可以包含磷脂近晶中间相,或非磷脂近晶中间相。见,例如,文献Small,D.M.,in″The Physical Chemistry of Lipids,From Alkanes to Phospholipids″脂质研究手册,Vol,4,Plenum,NY,1986,pp.49-50中的“近晶中间相”,其中阐述了“加热给定的分子而不是熔化使之直接成为等向性的流体,经过称为中间相或液晶的居间态,具有在某些方向上残基有序而另一些方向上残基序缺乏的特征。一般而言,液晶分子稍微长于其宽度并且在分子长度的某处具有极性或芳香族部分。分子的形状和两极或芳香族的相互作用允许分子排列为局部有序排列。这些结构特异的出现在那些在一端具有极性基团的分子中。液晶的分子长轴方向上长程有序被称为近晶的或分层的或薄片状的液晶。在近晶状态下,分子可能是单层或双层排布,分子层的平面可能是正常的或倾斜的,具有冷冻的或熔化的芳香族链”。也参见Small的图3-4。
有利地,依据本发明的免疫原性组合物和疫苗包含有效量的本文所述的一或多种表达载体和/或多肽以引起免疫应答和/或保护性免疫应答;并且,有效量可以由本文公开的内容,包括本文引用的文献,和本领域的知识确定,无需过度的实验。该免疫原性组合物可以设计为将抗原、核酸或表达载体引入所需的作用部位,并以适当的可控的速度释放。制备控释配制物的方法本领域公知。例如控释制备物可以通过使用聚合物复合或吸收所述免疫原和/或免疫原性组合物而产生。控释配制物可以使用适当的大分子(例如,多酯类、多氨基酸类、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯醋酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)制备,这些大分子可以用来提供所需的控制释放特征或分布。另一种通过控释制备物控制作用持续时间的可能方法是将活性成分掺入至聚合物材料的颗粒中,所述聚合物材料如聚酯类、聚氨基酸类、水凝胶、聚乳酸、聚乙醇酸、这些酸的共聚物、或乙烯乙酸酯共聚物。或者,除了使活性成分并入聚合物颗粒,可能将这些物质包埋进例如通过凝聚法或界面聚合法制备的微胶囊中,例如在胶体药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米微粒和纳米胶囊)或在大乳状液系统中分别使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基异丁烯酸)微胶囊。这些技术在以下文献中公开:New Trends and Developments in Vaccines,Voller等人(eds.),University Park Press,Baltimore,Md.,1978and Remington′s Pharmaceutical Sciences,l6th edition。
施用
本领域技术人员可以容易地确定本发明的免疫原性组合物中的本发明的抗原、核酸和表达载体(统称免疫原)的适宜剂量。例如,免疫原的剂量可以依据给药途径和对象大小不同发生变化。本领域技术人员可以确定适宜的剂量,例如通过测量对象(如实验用动物)的免疫应答,使用常规免疫学技术,并且如果合适则调整剂量。此类测量对象的免疫应答的技术包含但不限于铬释放测定、四聚体结合测定、IFN-γ酶联免疫斑点测定、IL-2酶联免疫斑点测定、胞内细胞因子测定和其他免疫学检测方法如Ed Harlow和David Lane所写的“Antibodies:A Laboratory Manual”中所详细阐述的技术。
在本发明中,对HIV疫苗的细胞应答的测定方法包括细胞内染色(如流式细胞术)和ELISPOT(酶联免疫斑点测定),这些方法可以检测对抗原产生应答而产生细胞因子的细胞,并对其计数。例如,从动物或人类病人中分离脾细胞或外周血单核细胞(PBMC),随后采用HIV表位如2F5或4E10体外攻击,最后利用ELISPOT和/或胞内细胞染色(ICS)测定,最终能确定在疫苗接受者中细胞介导的免疫应答潜能。使用四聚体的流式细胞术(如,由4个拷贝的与其同源肽结合的I类分子和碱性磷酸酶组成的分子)可以对抗原特异性T细胞计数(如检测识别特定肽的T细胞,该特定肽与主要组织相容性复合物(MHC)I分子结合)。可采用标准铬释放测定评估细胞毒性。为了评估细胞介导的对DNA疫苗的免疫应答,也可采用更常规方法,包括测量对抗原响应的T细胞增殖、表达HIV表位的自体细胞的CTL-介导的杀灭。
ELISA测定和蛋白质印迹可用于评估体液免疫应答。特别地,ELISA和蛋白质印迹可用于评估抗体的结合、抗体的中和能力、抗体介导的融合抑制和抗体依赖的细胞毒性。
可以进行MT-2测定测量中和抗体应答。抗体介导的中和采用如先前所述的MT-2细胞-杀灭测定的方法测量(Montefiori等人,1988,J.Clin.Microbiol.,26:231-237)。血清对合胞体的形成的已知显示血清中存在中和抗体(由疫苗接种诱导)活性。简要来说,将疫苗接种测试和对照血清可 以暴露于病毒感染的细胞(如MT-2T细胞系)。可以通过活细胞染色测量中和反应(如,采用Finter′s中性红,当对照孔中细胞病变的效应为大约>70%但少于100%时)。通过计算A540条件下样本孔(细胞+病毒)和细胞对照孔(只含细胞)及病毒对照孔(只含病毒)之间吸光度的差异来检测保护的百分比。中和滴度然后表达为保护至少50%的细胞免于被病毒诱导杀死所需的血浆稀释度的倒数。
当预防性提供时,本发明的免疫原性组合物理论上可以施用于下述对象:在HIV感染前、表现出HIV感染、由于AIDS造成的任何症状出现前,特别是高风险对象。免疫原性组合物的预防性施用可以给对象提供针对HIV感染的保护性免疫,或阻止或减弱已感染HIV的对象的AIDS发病进程。当治疗性提供时,所述免疫原性组合物适用于改善或治疗AIDS综合症,并且在感染后越早施用效果越好,优选地在任何AIDS症状出现前使用最佳,但是在症状出现时和出现后使用亦可。
人用核酸组合物的适宜剂量可以是范围从1μg/kg至1mg/kg的总核酸,例如5μg/kg-500mg/kg的总DNA、10μg/kg-250μg/kg的总DNA或10μg/kg-170μg/kg的总DNA。在某些实施方案中,人类对象(18-50岁,45-75kg)施用1.2mg-7.2mg的DNA。可以多次施用DNA疫苗,如2-6次,如3次。在一具体的实施方案中,人类对象在0、4和12周时分别施用100μgDNA组合物(每次施用100μg)。
蛋白质组合物免疫原性量的范围的实例是5μg/kg-500μg/kg,例如含佐剂的10-100μg/kg的总蛋白质。在一实施方案中,给人类对象(18-55岁,45-75kg)施用的蛋白质组合物剂量为325μg。
可以采用任何适当的递送方法施用免疫原组合物,包含但不限于肌肉注射、静脉注射、真皮内、粘膜或局部递送。这些技术本领域技术人员公知。递送方式中更具体的例子是肌肉注射、皮内注射和皮下注射。尽管如此,递送并不局限于注射方法。此外,还可以通过阳离子脂质体(Watanabe等人,(1994)Mol.Reprod.Dev.38:268-274;and WO96/20013)向动物组织中递送DNA,或是直接注射裸露DNA至动物肌肉组织(Robinson等人,(1993)Vaccine11:957-960;Hoffman等人,(1994)Vaccine12:1529-1533;Xiang等人,(1994)Virology199:132-140;Webster等人,(1994)Vaccine12:1495-1498;Davis等人,(1994)Vaccine12:1503- 1509;Davis等人,(1993)Hum.Mol.Gen.2:1847-1851),或使用基因枪技术皮内注射DNA(Johnston等人,(1994)Meth.Cell Biol.43:353-365)。将DNA递送至动物组织的方法还包括电穿孔、快速注射、声致穿孔、显微操作针介导的递送等等。递送路径可选择使用口服、鼻内摄取或任何其他适当的途径。递送也通过粘膜表面完成,如肛门、阴道或口腔粘膜。
动物(包括人)的免疫程序表(或方案)是众所周知的,并且针对具体对象和免疫原性组合物可以很容易确定。因此,可以对同一个对象一次或多次免疫施用所述免疫原。在某些实施方案中,每次免疫原组合物施用之间有设定的时间间隔。尽管这个时间间隔因对象不同有很大的变化,但是基本上范围是10天至几个星期,通常为2、4、6、或8周。对人类来说,此间隔一般从2至6周一直到6个月或更多。对于DNA穿刺(tatooing),此间隔一般只有3天(如0、3和6天时施用)。免疫方案基本上包含1到6次免疫原组合物的施用,但是可能含少至1或2或4次施用。诱导免疫应答的方法也包含和免疫原一起施用佐剂。在一些实例中,初次免疫方案补充一年或两年或其他长间隔(5-10年一次)的加强免疫。
本方法中也包括了多种初始-加强方案。在这些方法中,一次或多次初始免疫后接着进行一次或多次加强免疫。对每次施用可以采用同样的或不同的实际免疫原性组合物,并且免疫原性组合物的类型(如包含蛋白质或表达载体)、途径和免疫原配制物也可以有多种变化。例如,如果将表达载体应用于初始和加强步骤中,可以是相同的或不同的类型(如DNA或细菌或病毒表达载体)。
本发明的免疫原组合物可以被单独施用,或与其他免疫原和/或免疫原性组合物共同施用或依次连续施用,如和其他免疫的、抗原或疫苗或治疗用组合物共同施用或依次连续施用,从而提供了本发明的多价的或“鸡尾酒式的”或组合的组合物及使用它们的方法。例如,在某些实施方案中,本发明的HIV包膜蛋白在病毒载体中施用,例如MVA,其中还包含编码一个或多个HIV蛋白质的基因,例如gag和pol。另一方面,施用的成分和方式,包括剂量都需要考虑以下各种因素而确定,包括特定对象的年龄、性别、体重、种类和病症以及施用途径。
在某些实施方案中,本发明的免疫原性组合物施用至哺乳动物。进一步详细方案中,哺乳动物可以是人类、非人灵长类、犬、兔、豚鼠或小 鼠。
本领域普通技术人员可以很容易确定每种蛋白质亚基和/或DNA疫苗的合适剂量。一般来说,某些因素可以影响施用剂量,尽管如此,在施用DNA疫苗的具体方案中,适合的剂量就是,外源基因被表达且在哺乳动物特定细胞中产生基因产物。优选地,所述剂量足以对动物具有治疗和/或预防效果。
组合治疗
感染HIV的对象使用本发明的组合物治疗的方法包括组合治疗,在组合治疗中也执行其他HIV治疗方法。例如,进行HIV包膜蛋白亚单位疫苗注射的对象,可以依照本发明单独注射或混合注射抗反转录病毒的药物,例如核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂的多种组合。
核苷反转录酶抑制剂包括:例如齐多夫定(AZT)、去羟肌苷(ddI)、扎昔他宾(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韦(1592U89)、阿德福韦二匹伏酯[bis(POM)-PMEA]、洛布卡韦(BMS-180194)和洛德腺苷(FddA)、9-(2,3-双脱氧-2-氟代-b-D-苏型-戊呋喃)腺嘌呤。
非核苷反转录酶抑制剂包括:奈韦拉平(BI-RG-587)、地拉韦啶(BHAP,U-90152)和依法韦仑(DMP-266)。
蛋白酶抑制剂包括:沙奎那韦(Ro31-8959)、利托纳韦(ABT-538)、英地纲韦(MK-639)、奈夫纳韦(AG-1343)(商业名称VIRACEPTTM,从Agouron Pharmaceuticals,Inc可得)、氨普那韦(141W94)(非肽类蛋白酶抑制剂,商业名称AGENERASETM)和拉西那韦(BMS-234475)。
试剂盒
本发明的组合物及其使用方法理想地适于制备试剂盒。容器内提供了HIV包膜蛋白的核酸和/或蛋白质,可能以任何形式存在,如冻干状态的或溶解状态(如溶解于蒸馏水或缓冲溶液中)的等等。在本发明的试剂盒中,基本上包括了一组说明。
本试剂盒包含一种或多种其他元件,包括:其他试剂(如稀释剂)、制备用于施用的组合物的装置或其它物质、可接受药用载体、给对象施用 的装置或其它物质。使用说明如本文所述包括治疗应用说明,包含建议用量和/或施用方式,如施用至人类的方式。
试剂盒还含有至少一种额外的试剂,例如诊断剂或治疗剂,比如监控组合物在对象内的免疫应答的诊断剂或如本文所述的额外添加的治疗剂。
在一种实施方案中,试剂盒包括了一个小瓶(或其他适合的容器),内装本发明的一种或多种重组的HIV包膜蛋白。在某些实施方案中,试剂盒进一步包含佐剂和赋形剂。佐剂和赋形剂和蛋白质一起配制,且可以包含在配制物中或单独地包装在试剂盒中。
通过以下几个非限制性的实施例进一步描述本发明。
实施例1
Ba-L gp140DC4E10
在Geneart人工合成HIV-1Ba-L gp160基因,去掉了信号肽并进行了密码子优化。gp120/gp41切割位点已被改变以阻止蛋白酶对其水解。Arg501和Arg509被变为丝氨酸。gp140DC4E10序列经PCR扩增,并插入进表达载体pJWIRES,与tPa信号读码框融合。氨基端起始于E(30),羧基端终止于...WLWYIK(681)(SEQ ID NO:45),并额外添加了KKK提高溶解性。pJWIRES包含下述内容:
插入基因的表达由CMV启动子驱动,由牛生长激素(BGH)Poly A终止。嘌呤霉素乙酰基转移酶基因与插入基因通过IRES序列相连,已获得嘌呤霉素抗性。
构建的载体被称为pJW Ba-L gp140DC4E10Puro(图1)。
使用阳离子脂质体2000对HEK293细胞进行转染。使用4E10和2F5人MPER抗体(Polymun Scientific GmbH,Klosterneuburg,奥地利)对条件培养基进行免疫共沉淀蛋白质印迹。结果如图2所示,与gp140DC4E10反应。
B进化枝Ba-L gp140DC4E10核酸和蛋白质序列参见图3-4。
图5-6展示了B进化枝另一个修饰后序列Ba-L gp145的核酸和蛋白质序列。
实施例2
D进化枝gp140方法
细胞系开发和分子克隆
开发了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系,可稳定表达外源3种D进化枝HIV-1分离物的gp160(gp140)蛋白质结构域。建立该细胞系的目的是分泌高水平的gp140蛋白质,从而可以被纯化用于制作HIV-1的疫苗。选作用于表达gp140的分离物是A07412(亲本序列,GenBank登记号AF484477参见GenBank登记号.AY736828)、57128(亲本序列,GenBank登记号AF484502参见GenBank登记号AY736829)和57140(亲本序列,GenBank登记号AF484511)。为了在本系统中最大化表达,gp140密码子在GENEART人工合成。通过这个过程,即设计的基因使用人类细胞中最为丰富的tRNAs的相关密码子,以使得基因在人类细胞内表达密码子最优化。人类密码子最优化是任何应用于人类的DNA疫苗的理想选择,但也是非常有效的在CHO中获得更高表达产量的方法。除密码子最优化外,人工合成的基因也在设计中去除了多种顺式作用元件和其他使mRNA不稳定的基序(例如GC-富含区、TATA框、Qui位点)。去除的那些顺式作用元件可以降低转录和翻译效率(例如剪接位点、poly A位点、腺嘌呤富含元件、Rev作用元件(RRE)和其他mRNA二级结构)。
对每一分离物,采用基于PCR的过程,对gp140的初级和二级gp120/gp41切割位点进行突变。这样阻止了gp120/gp41位点处切割,可以产生稳定的gp140分泌蛋白质。此外,移除了每一个天然信号肽,这样才能将高效信号肽组织型纤溶酶原激活物(tPA)信号构建到表达载体中作为分泌信号。每个gp140序列在跨膜(TM)结构域前插入了终止密码子,阻止gp140在分泌过程中结合于细胞膜上。gp140基因连接到哺乳动物表达载体pJWTCDE-N的限制性酶切位点NheI和EcoRI处,使其可以在CHO细胞中稳定表达。
A07412
氨基酸的氨基端序列为SL(30)WVT(SEQ ID NO:46),羧基端序列为...FSITK(673)-终止子(SEQ ID NO:47)。氨基端丝氨酸是tPa信号末端NheI克隆位点处的外来残基。gp120/gp41切割位点被从 RAKRRVVEREKR(507)(SEQ ID NO:48)改变成RAKSRVVEREKS(SEQ ID NO:49),参见图51,SEQ ID NO:3。
57140
氨基酸的氨基端序列为SL(33)WVT..(SEQ ID NO:46),羧基端序列为...FSISN(673)-终止子(SEQ ID NO:50)。氨基端丝氨酸是tPa信号末端NheI克隆位点处的外来残基。gp120/gp41切割位点被从RAKRRVVEREKR(507)(SEQ ID NO:48)改变成RAKSRVVEREKS(SEQ ID NO:49),参见图51,SEQ ID NO:4。
57128
氨基酸的氨基端序列为SL(33)WVT..(SEQ ID NO:46),羧基端序列为...FSITK(671)-终止子(SEQ ID NO:47)。氨基端丝氨酸是tPa信号末端NheI克隆位点处的外来残基。gp120/gp41切割位点被从KARRRVVEREKR(507)(SEQ ID NO:51)改变成KARSRVVEREKS(SEQ ID NO:52),参见图51,SEQ ID NO:5。
pJWTCDE-N载体包含下述元件,使外源基因在CHO细胞中高效表达:
(1)gp140基因转录由CMV启动子/内含子A驱动,牛生长激素(BGH)Poly A终止。
(2)卡那霉素激酶II(NPT II)基因,由SV40启动子驱动,合成的poly A终止,在硫酸G418选择下挑选出稳定转化的细胞。
(3)二氢叶酸还原酶(DHFR)基因,由特定缺陷的SV40启动子和SV40poly A控制,在转化细胞中非常弱的表达DHFR。这使得在无核苷酸培养基上的筛选更易进行,同时可以用DHFR抑制子甲氨蝶呤(MTX)处理诱导外源基因的扩增。基因扩增可以很大程度的提高gp140的产量,同时提高在含MTX培养基上生存所需的DHFR的产量。
每一个表达载体克隆后,需要进行插入gp140基因的测序,确保载体构建的正确性。
建立稳定分泌gp140的CHO细胞系,缺乏DHFR的CHO细胞
使用脂质体2000转染试剂(Gibco)转化(CHO-dhfr-)。转化细胞采用gp120抗原捕获实验进行分析,利用与HIV-1(+)人血清放射免疫沉淀反应(RIP)检测gp140产物是否存在及含量。将转化细胞置于96孔板中,用于在10%透析胎牛血清和550μg/mlG418Sulfate中进行alpha MEM筛选。活细胞采用gp120抗原捕获筛选,挑选可以相当高量生产gp140的细胞用于扩大培养和单细胞克隆。
gp120抗原捕获实验是基于ELISA的实验,用于gp120的检测和定量。gp140、后续将要介绍的gp140DC4E10和gp145蛋白质分子,均含有gp120序列,也可以用本方法检测。在96孔板上的微量滴定,涂上两种鼠类单克隆抗体,与HIV-1gp120上的特异性表位反应。将gp120标准溶液或组织培养检测样品加入样品槽,与板结合的抗体与溶液中的gp120形成了免疫复合物。然后充分洗脱未结合的物质。然后加入含有过氧化物酶结合的人抗-gp120多克隆抗体的结合溶液。结合抗体复合物捕获gp120上的其他表位。洗脱未结合的结合溶液,加入过氧化酶底物。酶与底物反应导致出现底物变蓝的结果。紧接着加入终止溶液(2N硫酸),蓝色变为黄色,可以通过在450nm下测量吸光度定量测量。在gp120标准和检测样品中gp120的含量与吸光度正相关。在检测样品中的gp120浓度可基于标准曲线进行计算。
使用gp120抗原捕获和RIP对各克隆进行比较,以找到一个新的gp120强生产者。其中最好的用0.02μM MTX处理,以促进外源DNA的扩增。一旦细胞可以在MTX中以正常的速率生长,可以对它们进行克隆和再次筛选产量更高的生产者。经有限稀释克隆得到细胞系,分析适合在无蛋白培养基HyQPFCHO Liquid Soy(HyClone;Logan,Utah)中生长和表达的最适条件。
蛋白质纯化
通过离心从CHO培养物中收集条件培养基,并浓缩至大约2L,浓缩的方法是切向流过100kDa分子量筛截。培养基中含有磷酸盐缓冲液,pH调节至7.2。调节氯化钠浓度至300mM,培养基用0.22微米的滤筛过滤。培养基通过GNL琼脂糖柱,用含500mM甲基α-D-吡喃甘露糖苷的PBS溶液洗脱包膜蛋白。培养基再过3-4次GNL琼脂糖柱,从条件培养基 中消除所有的包膜蛋白。而后进行下一步过程以进一步纯化包膜蛋白。调整GNL琼脂糖洗脱物的氯化钠浓度至212mM并通过含有Q-琼脂糖(Amersham Biosciences;Piscataway,NJ)的吸附柱。高分子量的杂志与Q-琼脂糖结合,而包膜蛋白在此条件下却不结合。为了使任何经空气氧化形成的不正常的多聚体断裂,用包膜蛋白处理的Q琼脂糖浓缩至大约3ml,并用50mM DTT在4℃条件下处理15小时,而后在21℃处理1小时。而后将DTT处理过的制备物通过Superdex20026/60(Amersham Biosciences)凝胶过滤柱移除另外的高或低分子量的杂志,同时也减少包膜蛋白分解产物量。含1mM DTT的PBS以0.5ml/min的速度通过吸附柱。包含纯净包膜蛋白的片段上样进行SDS-PAGE分析。然后蛋白质在用PBS平衡的10ml PD-10吸附柱(Amersham Biosciences)上更换缓冲液。最后,蛋白质用0.22μm过滤器过滤,等分并保存于-70℃。
实施例3
前言
构建和检测了表达4种C亚型分离物包膜蛋白的DNA质粒载体,从中挑选表达gp145蛋白质的最好的候选,这些包膜蛋白DNA是从急性感染和早期血清抗体转化的感染病人身上分离得到。挑选出C06980v0c22分离物,得到表达C06980v0c22gp145蛋白质的稳定细胞系,并生产出用于研究的细胞库。生产纯化的gp145蛋白质,并用于临床免疫学研究。
如上所描述的,申请人共同进行研制开发了D亚型HIV-1的亚单位疫苗。提供了4种D亚型HIV-1分离物的序列,制备了几个gp140和gp120-分泌CHO细胞系。细胞系适合于无血清培养基培养,纯化的包膜蛋白可用于临床免疫学研究。对小动物进行免疫,采用ELISA和中和抗体滴度检测了抗同源原始分离物的gp140和gp120特异性的血清抗体结合滴度,同源原始分离物采用假病毒测定检测。尽管所有的gp120和gp140蛋白质均具有免疫原性,但是对抗同源假病毒分离物的中和抗体没有被检测到。
采用C亚型包膜蛋白序列从事HIV包膜蛋白亚单位疫苗的研制,目的是诱发更有效的宽广的中和抗体反应。如上所讨论的,构建了编码HIV-1Ba-L(B亚型)包膜蛋白修饰的DNA载体。该载体编码了一段截短的糖蛋白gp160,被命名为gp145。gp145蛋白质包含了修饰过的组织型纤溶酶原 激活物(t-Pa)信号肽,该信号肽位于缺乏切割位点的gp160的上游,且gp160在细胞膜近段外侧区域(MPER)末端截短。在C端包含了3个额外的赖氨酸残基,理论上可以提高C端尾部的亲水性,向免疫系统暴露出潜在的MPER中和表位。与上面阐述的gp140不同,gp145分子在ELISA和蛋白质印迹实验中对抗-MPER huMAb4E10起中和反应。
C亚型是已知国际上最普遍的亚型,因为初步资料显示出C亚型可以在天然感染中诱导最广泛的与HIV-1的中和交叉响应,对C亚型的序列进行了研究。计划构建一种gp145载体,使用原始的CCR5-依赖的C亚型包膜蛋白序列。开发出了表达包膜蛋白的稳定CHO细胞系。
包膜蛋白选择(downselection)
提供了来自4种C亚型毒株中的env序列,用于密码子优化和合成。进行瞬时表达研究挑选可用于后续gp145生产的分离物。
提供了4种南非C亚型R5HIV-1包膜蛋白序列的电子拷贝,这些序列取自3个急性感染HIV-1的个体(C06838v1c48,C06980v0c22andC3728v2c6)和一个早期血清转化感染HIV-1(C06980v1c3)的个体。这些序列中的两个来自同一个个体,一个来自急性感染期(C06980v0c22),另一个来自血清抗体转换后(C06980v1c3)。
为了最大化的在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,包膜蛋白基因合成时通过Geneart AG(Regensberg,Germany)结合了中国仓鼠(C.griseus)的密码子偏爱。为了进一步最大化表达,去除了那些会降低翻译效率的顺式作用元件(如内部的TATA盒、chi-位点、核糖体进入位点、RNA二级结构、重复序列等)。每种包膜蛋白基因合成了两个版本:a)gp160,全长gp160去掉天然信号肽;b)gp160DC,全长gp160去掉天然信号肽在gp120/gp41初级和二级切割位点处突变以阻止蛋白酶降解。
4种gp160(野生型)和gp160DC(切割位点突变型)基因的表达对比见图35。在表达蛋白序列中蛋白序列连接在t-Pa信号肽切割位点后。阴影区域为可变区。方框标出的区域标示出了gp120/gp41切割位点:在gp160DC基因中精氨酸至苏氨酸点突变阻止溶蛋白性裂解。gp160基因克隆进入哺乳动物专利表达载体pSWTIPK3(Advanced BioSciences Laboratories,Inc.)的NheI和EcoRI位点处,与tPa信号肽读码框融合(图8)。天然前导序列 被tPa信号肽取代,这提供了更有效的分泌信号,增强了gp160的生产和运输至细胞膜。表达质粒包含了巨细胞病毒(CMV)启动子来控制表达。质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)中进行扩增和纯化,gp160编码区测序以验证其序列相同性。
转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和人胚肾细胞(HEK293;克隆293H)以进行gp160生产,并用蛋白质印迹和抗原捕获ELISA进行分析。基于gp160分子的生产数量和质量确定采用哪个单独分离物建立CHO细胞系用于生产gp145蛋白质。用4种gp160和gp160DC质粒载体采用脂转染的办法转染细胞(Lipofectamine2000;Invitrogen,Carlsbad,CA)。培养物用HIV-1Ba-L gp145、HIV-1Ba-L gp160或HIV-1C亚型gp140表达载体转染,作为正对照。天然未转染的CHO-K1和HEK293作为负对照。培养基和细胞裂解物在转染后48小时收集以用作分析。
转染的CHO-K1中的培养基和细胞裂解物样品利用免疫共沉淀蛋白质印迹的方法对gp41/gP120/gp160含量进行了评估,使用人类HIV-1感染阳性血清进行免疫沉淀,使用免疫了家兔血清的HIV-1Ba-L gp160进行检测。任何载体的培养基中都没有检测到包膜蛋白表达,除了Ba-L gp145对照(数据未显示)。如果处理gp160使之成为gp41和gp120,gp120会流出进入培养基,脱落的gp120的量在含量测定检出限以下。在细胞裂解物中,包膜蛋白表达在每一个C亚型gp160和gp160DC载体中都存在。每种载体生产gp160蛋白质,每一个分离物生产的都具有不同的大小,可能是由于不同糖基化图谱造成的。只有pSWC06980v0c22gp160载体显示出gp160被加工成gp120和gp41。
由于在CHO-K1中的表达水平非常低,进一步对每种载体定量研究时使用HEK293进行转染和分析。从转染的HEK293细胞裂解物样品中利用免疫共沉淀蛋白质印迹测定gp41/gp160含量,使用huMAb至gp41(4E10)进行免疫沉淀,兔血清免疫的HIV-1Ba-L gp160用于检测。包膜蛋白很强的表达在每一个C亚型gp160和gp160DC载体中。每种载体生产gp160蛋白质,每一个隔离群生产的都具有不同的大小,可能是由于不同糖基化图谱造成的。再一次,只有pSWC06980v0c22gp160载体显示出gp160被加工成gp120和gp41。
为了定量gp120/gp160产物的水平,从转染的CHO-K1和HEK293中 取得培养基和细胞裂解物,利用HIV-1gp120抗原捕获实验进行分析(表1)。在转染的CHO-K1中,在每一个载体中检测到包膜蛋白表达,除了C06838v1c48gp160DC。与Ba-L gp145对照对比,所有的表达水平都很低。这是由于非常低的表达水平和很难从这些分离物中检测包膜蛋白造成的。由于转染CHO细胞效率很低造成Ba-L gp145的表达水平也很低。生产C亚型最多的载体是C06980v0c22和C3728v2c6gp160s。值得注意的是浓度值基于从不同分离物中得到的C亚型gp120的相关反应性。确切的浓度可能会与报道浓度有差别,这是由于实验所用抗体在每一个分离物中的亲和性可能存在差异。
表1转化了HIV-1C亚型gp160和gp160DC的表达质粒的CHO-K1细胞HIV-1gp120抗原捕获测定。转染后48小时培养基和细胞裂解物检测到大量的gp120和gp160蛋白质。
由于在CHO-K1中检测到的包膜蛋白非常弱,采用HEK293转染分析来检验结果。在HEK293中,包膜蛋白的表达采用抗原捕获(利用表2中所示载体)的方法被检测到。在HEK293中,06838v1c48gp160DC现在被检测到,但是信号很弱。表达水平明显高于CHO-K1中。生产C亚型最多的载体是C06980v0c22和C3728v2c6gp160s。
表2转化了HIV-1C亚型gp160和gp160DC的表达质粒的HEK293细胞HIV-1gp120抗原捕获测定。转染后48小时培养基和细胞裂解物检测到大量的gp120和gp160蛋白质。
gp160生产的进一步测定采用两种糖蛋白gp160抗原捕获实验来进行,该实验中应用了人类单克隆抗体4E10(表3)和2F5(表4)。每个分离物的gp160与基于4E10的含量测定产生很强的反应。甚至分离物C06838v1c48反应也很强,这暗示出gp120含量测定对本分离物给出了人工低的结果。每个分离物的gp160与基于2F5的含量测定也产生反应,尽管比基于4E10的含量测定反应弱。C06980v1c22分离物反应是最强的。2F5反应较弱是由于合成抗体的B亚型分离物的2F5表位与C亚型分离物显著不同。不受已知理论限制,申请人认为2F5的反应活性可能出自与gp160结合的脂类而非氨基酸骨架的相互作用。这些含量测定表明在每一个载体中MPER都被展示出来。
表3转化了HIV-1C亚型gp160和gp160DC的表达质粒的HEK293细胞HIV-1gp160抗原捕获测定。4E10huMAb连接gp41MPER被用于捕获抗体。转染后48小时培养基和细胞裂解物检测到大量的gp160蛋白质。
表4转化了HIV-1C亚型gp160和gp160DC的表达质粒的HEK293细胞HIV-1gp160抗原捕获测定。2F5huMAb连接gp41MPER被用于捕获抗体。转染后48小时培养基和细胞裂解物检测到大量的gp160蛋白质。
申请人推断分离物C06980v0c22被用于建立CHO细胞系,用来生产gp145。确定采用本分离物基于以下几个因素:
●与C06838v1c48和C06980v1c2分离物相比,具有非常高的表达
●采用此分离物将gp160加工为gp120和gp41的效果最显著。
●该毒株可以在急性感染的早期分离得到。
●与MPER抗体4E10具有强反应活性。
●该病毒是有感染能力的。
CHO-K1/C06980v0c22gp145细胞系的形成
构建C06980v0c22gp145DNA表达质粒并用于建立稳定转染的CHO-K1细胞,用于生产gp145。这些细胞系适合于在无蛋白培养基中生长,同时建立细胞库。挑选出H-73-9-2-8克隆用于生产gp145蛋白质。
C06980v0c22gp145DNA载体通过基于PCR的技术修饰gp160DC基因而构建出。gp145由N30残基组成,位于天然信号肽切割位点的直接下游,穿过刚好位于跨膜区前的K676。接着K676后是三个额外添加的赖氨酸,gp145终止于此(图36和图37)。这些包括理论上提高了C末端的亲水性,因此提高了免疫系统中MPER的暴露性。在信号肽切割位点之上,预测有一个来源于修饰过的t-Pa信号的丝氨酸,这位于氨基端末端。gp145基因被连接在哺乳动物表达载体pSWTIPK3和被命名为pSWC06980v0c22gp145的NheI and EcoRI限制性内切酶位点。该质粒在大肠杆菌DH5α菌株(Invitrogen)中扩增,使用Endofree Plasmid Maxi试剂盒进行纯化(Qiagen,Valencia,CA)。采用限制酶切消化分析质粒,gp145序列的编码区通过DNA双向测序来确认。质粒包含嘌呤霉素乙酰基转移酶基因,用于使用嘌呤霉素筛选稳定转化菌落。受到内部核糖体进入位点(IRES)和CMV启动子的引导。通过将gp145表达与嘌呤霉素抗性标记结合,推进了gp145基因表达水平升高。
哺乳动物表达载体重要特征摘要如下所述:
●载体包含抗生素抗性基因,可被用于构建载体过程中细菌内的选择标记。从这些载体上衍生的治疗产物在其构建过程中应避免使用青霉素或相关抗生素。因此采用卡那霉素而非氨苄青霉素。
●gp145基因表达密码子最优化,从而增强产物的表达。使用CHO密码子偏爱合成基因,使用那些在CHO细胞中最为丰富的tRNAs相关的密码子。合成的基因中设计消除一切顺式作用元件,除了可以稳定mRNA的其他基序,从而降低转录翻译效率。
●gp145基因引入载体符合修饰的t-Pa信号肽读码框,从而可以有效的运至细胞膜。
●基因在强启动子和有效的多聚腺核苷酸poly-A的控制下表达。采用强大的CMV启动子和高效的Bovine Growth Hormone(BGH)poly-A。
●为了筛选稳定蛋白表达的细胞克隆,该载体包含一个选择标记。引起嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素乙酰基转移酶基因受到内部核糖体进入位点(IRES)和CMV启动子的引导
在建立细胞系的过程中,由于临床环境使用这些细胞系的需要,需要小心进行工作,记录档案,使用FDA可接受的物质。CHO-K1(cat#CCL.61)细胞从ATCC(Manassas,VA)得到。为建立稳定CHO-K1细胞系,最优选的转化方法为电穿孔。该方法的益处是避免了非特征化的动物衍生元件。此外,动物衍生产物除非必要需要避免。为了降低BSE污染的机会重组胰蛋白酶取代猪胰蛋白酶,胎儿牛血清(FBS)明确定义其来源为新西兰。FBS受辐射、热灭活并无菌过滤。
超螺旋和线性的pSWC06980v0c22gp145(线性载体具有单酶切位点NruI)分别独立电穿孔转化DNACHO-K1细胞。两种形式的DNA均被采用,因为两种形式在建立细胞系时具有各自的缺点和优势。超螺旋DNA转化一般效率较高,这点是有益的,因为CHO-K1细胞转化很难。线性DNA转化效率较低,但是结合进入宿主基因组的效率比超螺旋DNA高。简要来说,5x106CHO-K1细胞在0.5ml电穿孔转化缓冲液中悬浮(BioRad,Hercules,CA),100μl电穿孔转化缓冲液与100μg质粒DNA在0.4em电极比色杯中混合,采用Gene Pulser脉冲设备(BioRad)在350V电压下125μFD对细胞进行脉冲,冰上放30分钟,混合并培养于5.5ml F-12K完全培养基(Invitrogen,Inc.)中,其中包含了10%热灭活的FBS(Hyclone Laboratories,Logan UT),10μg/ml庆大霉素(Invitrogen,Inc.)和2mM谷氨酰胺(Quality Biologicals,Inc.,Columbia,MD))。
转化后48小时,取得条件培养基和细胞裂解物样品,进行gp120抗原捕获测定分析和免疫共沉淀蛋白质印迹。gp120抗原捕获测定结果证实gp145被分泌至条件培养基。产量很低,线性和超螺旋DNA分别只有4和9ng/ml。与预期相同,超螺旋DNA的产量比线性DNA的产量高。从培养基和细胞裂解物中取得的包膜蛋白样品IP蛋白印迹分析(图26)。与预期相同,超螺旋和线性DNA电转化细胞的条件培养基中均明显存在gp145蛋白,约140KDa。一种稍微低分子量的gp145种类与预期相同,在细胞裂解 物中出现。这可能不完全代表处理的gp145。
电穿孔转化48小时后的细胞在96孔板中放置了大约4500个细胞,以用于筛选cF12-K。24小时后,将细胞放入含10μg/ml嘌呤霉素的cF12K中进行筛选(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),一周更换两次培养基,直到嘌呤霉素抗性菌落达到大约50%融合。应用gp120抗原捕获实验分析条件培养基中gp145产物。具有最多产物的20种细胞系培养物扩大培养、冷冻保存和克隆,通过有限稀释分离真正稳定表达gp145的克隆。非细胞系培养物最佳产物量达到2μg/ml。
从最初的20种培养物中经初始选择和克隆,可以得到>100个经gp120抗原捕获实验分析的克隆。基于gp145的产量水平,确定了代表初始12中培养物的17个细胞系作为生产gp145的潜在候选。每一种细胞系均被冷冻储存。对每一种挑选出的克隆进行产物水平研究。简要来讲,细胞被播种于24孔板中,在1x105个细胞使用1ml组织培养基,并于37℃孵化培养64小时。收集培养基并对其进行gp120抗原捕获实验分析及免疫共沉淀蛋白质印迹。基于抗原捕获和免疫共沉淀蛋白质印迹结果,克隆H-73-9、H-84-1和H-94-10被选出适合进行无蛋白培养基培养生产蛋白质。每种冷冻保存了5凭细胞库。每种克隆生产1至2mg gp145/L。在免疫共沉淀蛋白质印迹中,每种选出的克隆具有很强的gp145反应活性,与预期一致,大约在140kDa左右。
观察发现,CHO-K1细胞电穿孔转化超螺旋DNA比线性DNA获得更高产量的gp145,产量分别为9ng/ml对4ng/ml。尽管如此,经嘌呤霉素筛选,超螺旋和线性DNA均获得大约100个稳定细胞系。有意思的是,17个最佳gp145生产细胞系中有16个都是从线性DNA中衍生的。这一点支持了申请人的预期,即超螺旋DNA可以更有效的被细胞所吸收,但是线性DNA可以更有效的整合从而在稳定细胞系中得到更高的蛋白质产量。
三种选出的细胞系均适合在无蛋白培养基中生长。由于对于某些克隆而言,适应在无蛋白培养基中生长具有难度,选择3个可以增加获得一个适应强的克隆的可能。此外,每种克隆在3中不同培养基上(PowerCHO-1CD、PowerCHO-2CD和PowerCHO-3CD,Lonza,Walkersville,MD),培养,每种均包含5μg/ml嘌呤霉素和4mM谷氨酰胺。在无蛋白培养基中培养几个阶段后,生长于PowerCHO-1CD、PowerCHO-2CD和PowerCHO-3 CD上的克隆H-73-9适应良好,并分别被命名为H-73-9-1、H-73-9-2和H-73-9-3。生长于PowerCHO-2CD上的克隆H-84-1也适应良好,并被命名为H-84-1-2。每种冷冻保存两管细胞库。
以上4种适应培养物经有限稀释再次克隆,并对每种培养物经gp120抗原捕获测定鉴定出其中最好的生产克隆。在这些培养物中,有两个被鉴定为最好的生产者:H-73-9-2-8和H-73-9-3-9。每种冷冻保存两管细胞库,细胞500ml扩大培养以进行小规模蛋白纯化。收集条件培养基,采用20mM Tris,pH8,0.5%Triton-X-100和500mM氯化钠缓冲液。缓冲培养基通过2ml柱Galanthus nivalis lectin(GNL)琼脂糖(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)。该柱采用加入了Tris pH8、0.5%Triton-X-100和500mM氯化钠的缓冲液洗脱,而后用PBS洗脱。结合的gp145经400mM甲基α-D-吡喃甘露糖苷洗脱。纯化的gp145蛋白质应用SDS-PAGE和蛋白印迹进行分析(图27和图28)。两种克隆均生产大约145kDa的蛋白质,该蛋白质在蛋白质印迹中很好的反应。在非还原性条件下,也可以得到一些二聚体和更高阶的多聚体。两种细胞系依照Comassie Plus Protein Assay(Pierce)分析,产量>1.2mg/L。克隆H-73-9-2-8具有更好的生长性质(更健康生长更快),因此被选择生产gp145蛋白。
制备了10管H-73-9-2-8(批次4/17/08)研究细胞库(RCB),并在液氮中冷冻储存。2X106细胞冷冻在10管1ml无蛋白冷冻培养基中。该培养基包含:7.5%二甲亚砜DMSO(Sigma-Aldrich)、50%新鲜生长培养基、42.5%Profreeze CDM(Lonza)。采用试剂盒Qiamp Blood Mini Kit(Qiagen)从5x106细胞中分离基因组DNA,利用PCR扩增gp145基因整合区,并双向测序鉴定。gp145基因编码区具有100%序列匹配。细胞库收集两周后,对细胞进行支原体污染检测(使用MycoAlert Mycoplasma detection Kit(Lonza)试剂盒),并发现结果为阴性。将一管解冻置于培养物中检测其活性。培养3天后,77%细胞是有活力的,并在gp120抗原捕获测定中被检测可以生产gp145蛋白。培养物进行细菌污染检测,接种了SOC培养基后37℃培养24小时显示无细菌生长。
H-73-9-2-8RCB批次4/17/08培养物生长,用于制作25管RCB(批次F1144)并被液氮冷冻保存。10X106细胞冷冻在25管1ml无蛋白冷冻培养基中。该培养基包含:7.5%二甲亚砜DMSO(Sigma-Aldrich)、50%新鲜生 长培养基、42.5%Proffeeze CDM(Lonza)。建立细胞库时,培养物进行支原体污染检测并发现结果为阴性。培养物进行细菌和真菌污染检测,结果显示在巯基乙酸盐液体培养基中无细菌生长,或大豆酪蛋白消化培养基中无真菌生长。从细胞库中取出一管解冻并在如前所述培养基中培养,检测其活性以正式gp145在这些细胞中生产。经过溶解,具有87%活性,可接受。生长特征与预期相同,且gp145生产经抗原捕获测定证实。
C06980v0c22gp145蛋白质生产
生产了3批gp145蛋白质,并传递以用于后续研究(表5)。
表5提供的HIV-1·C06980v0c22gp145批次
批次112009
H-73-9-2-8培养物扩大培养至3L,使用摇瓶培养,采用PowerCHO-2CD培养基添加4mM谷氨酰胺和5μg/ml嘌呤霉素。条件培养基经离心净化。3L收集物中取得培养基样品采用抗原捕获进行分析。结果预示了大体总计产生大致每升培养基4mg gp145。使用3L收集物生产的产量和质量经鉴定可以接受。gp145蛋白质采用如下所描述的方法纯化,并在图29中概述出。
收获的培养基在室温下采用0.1m2Pellicon过滤部件过滤浓缩,分子量被截断至30kDa。该系统先后应用1.0M NaOH、WFI水和1X PBS缓冲液冲洗。引入CHO细胞培养悬浮物(3L),并采用在循环模式操作系统。渗透流速1L每hr/0.1m2及横向流速0.5L/min进行浓缩。浓缩结束后,样品被浓缩至200mL。浓缩的细胞培养悬浮物于-70℃保存至后续处理。
使用凝集素亲和层析Lectin Affinity Chromatography纯化gp145蛋白质。调整浓缩培养基使之适于500mM氯化钠,而后通过GNL凝胶的25ml柱。柱使用PBS冲洗,采用500mM甲基α-D-吡喃甘露糖苷洗脱gp145蛋白 质。10ml/min的流速下进行纯化,100mL洗脱物采用正切流动过滤进行浓缩和透析过滤至PBS中。在此步骤中,采用50cm2Pellicon过滤部件过滤浓缩,分子量被截断至30kDa该系统先后应用1.0M NaOH、WFI水和PBS缓冲液冲洗。而后引入洗脱物,并在循环模式下操作系统。进行环戊氯噻嗪过滤:渗透流速2.0mL/min及横向流速约40ml/min。GNL-Eluate的容量被缩减至溶于8mLPBS。
依据Bradford含量测定进行蛋白质含量评估,蛋白质含量为1.1mg/mL。纯化的gp145中的内毒素采用色度法LAL含量测定(Lonza),其含量为每毫克蛋白质31.8EU。在还原和非还原性条件下进行SDS-PAGE分析显示纯化蛋白质分子量约为145kD。
由SE-HPLC分析可以看出(图30),批次112009gp145以涉及A、B、C和D四种复合物的形式被洗脱。基于蛋白质链的流动性,计算出每一种gp145的表观分子量(表6)。主峰值计算出在>669kDa(估计大约为895kDa)处,与A形式符合。主峰双肩明显位于>669kDa(估计大约为680kDa)和571kDa处,分别与B和C形式符合。第4种但不是主峰位于417kDa处,符合D形式的大小。
表6标准和纯化的gp145蛋白质(批次112009)多聚体种类的分子量和保留时间。
经SDS-PAGE纯化后gp145蛋自质激光光密度测定法测出纯度为96.1%。
批次120710A
H-73-9-2-8培养物扩大培养至11L,使用摇瓶培养,采用PowerCHO-2CD培养基添加4mM谷氨酰胺和5μg/ml嘌呤霉素。条件培养基经离心净化。11L收集物中取得培养基样品采用抗原捕获进行分析。结果预示了大 体总计产生每升培养基8mg gp145。使用11L收集物生产的产量和质量经鉴定可以接受。gp145蛋白质采用如下所描述的方法纯化,并在图31中概述出。
收获的培养基在室温下采用0.1m2Pellicon过滤部件过滤浓缩,分子量被截断至30kDa。如批次112009中所描述的操作再循环模式。11L条件培养基被浓缩至1L。
浓缩的条件培养基的缓冲液包含20mM Tris pH8、500mM氯化钠和0.5%Triton-X-100,然后经0.22μm过滤纯化。条件培养基于4℃,以大约1ml/min流速通过20ml GNL-凝胶树脂。树脂用20mM Tris pH8、500mM氯化钠和0.5%Triton-X-100缓冲液冲洗,而后用PBS平衡。gp145蛋白质在含有0.5M甲基-∝-Dα-D-吡喃甘露糖苷的PBS中洗脱。使用50kDaMWCO过滤使88mLGNL-洗脱物被浓缩为20ml。留出10ml在准备批次120710B中使用。剩余的10ml在PD10缓冲液中经离子交换树脂进入PBS缓冲液。洗脱的物质经0.22μm滤网过滤消毒,等分成分并储存于-70℃。批次120710A终产物有22ml的量。
依据Bradford含量测定进行蛋白质含量评估,蛋白质含量为1.0mg/mL。纯化的gp145中的内毒素采用色度法LAL含量测定,其含量为每毫克蛋白质<313EU。在还原和非还原性条件下进行SDS-PAGE分析显示纯化蛋白质分子量约为142kD。在非还原性条件下,多聚体也是存在的。这代表多聚体结合于二硫键上。
由SE-HPLC分析可以看出(图32),批次120710A gp145以四种与批次112009复合物相同的形式被洗脱。基于蛋白质链的流动性,计算出每一种gp145的表观分子量(表7)。主峰值计算出在666kDa处,与B形式符合。次峰和一肩分别位于>669kDa(估计大约为845kDa)和584kDa处,分别与A和C形式符合。第4种但不是主峰位于411kDa处,符合D形式的大小。
表7蛋白质标准和纯化的分子量及保留时间
HIV-1C06980v0c22gp145批次120710A多聚体种类
经SDS-PAGE纯化后gp145蛋白质激光光密度测定法测出HIV-1C06980v0c22gp145批次120710A纯度为94.2%。
批次120,710B
批次120710B与批次120710A从同一洗脱的gp145蛋白质中制备而来,gp145蛋白质采用凝集素亲和层析方法洗脱得到。为减少分子间的二硫键的目的,制备批次120710B的步骤多出一步。基础理论是基于对先前得到的gp145(批次112009)的观察发现该蛋白主要表现为高阶聚合体的形式。无已有的理论支持,申请人相信很多多聚体产生归因于氧化作用出现了分子间二硫键的结果。减少这些二硫键将有助于生产低阶聚合体形式甚至三聚体的蛋白质,
gp145蛋白质采用如下所描述的方法纯化,并在图33中概述出。
已经留出批次120710A中描述的10ml浓缩的GNL洗脱物以便用于准备批次120710B。这10ml采用50mM DTT在37℃处理30minutes,然后在PD10缓冲液中过离子交换树脂进入PBS缓冲液。洗脱的物质经0.22μm滤网过滤消毒,等分成分并储存于-70℃。批次120,710B终产物有22ml的量。
依据Bradford含量测定进行蛋白质含量评估,蛋白质含量为0.975mg/mL。纯化的gp145中的内毒素采用色度法LAL含量测定,其含量为每毫克蛋白质<0.321EU。在还原和非还原性条件下进行SDS-PAGE分析显示纯化蛋白质分子量约为143kD。在非还原性条件下,仅仅是痕量的多聚体也是存在的。这代表多聚体结合于二硫键上。与未用DTT处理的批次120710A比较,DTT处理后减少了很多这类化学键。
蛋白质印迹显示出在还原性和非还原性条件下主条带在大约143kDa处。几种复合受体形式的gp145很明显出现于非还原性条件下,但是却极少出现在未用DTT处理的批次120710A中。在还原性条件下,这些多聚体主要降解至单体。
由SE-HPLC分析可以看出(图34),gp145以与批次120710A和112009复合物相同的四种形式被洗脱。基于蛋白质链的流动性,计算出每一种gp145的表观分子量(表8)。主峰值计算出在665kDa处,与B形式符合。次 峰和一肩分别位于>669kDa(估计大约为844kDa)和572kDa处,分别与A和C形式符合。第4种但不是主峰位于412kDa处,符合D形式的大小。
表8蛋白质标准和纯化的分子量及保留时间
HIV-1C06980v0c22gp145批次120,710B多聚体种类
经SDS-PAGE纯化后gp145蛋白质激光光密度测定法测出纯度为94.2%。
DTT处理减少了分子间二硫键对gp145多聚体的存在形式有某些影响。在SDS-PAGE中,很明显与未被DTT处理的进行对照,DTT处理破坏了多数分子间二硫键。SE-HPLC显示C型数量只有小幅的上升,这可能由于A形式数量小幅下降。
进一步对复合形式的性质进行研究探索结果包含于下述实施例7中。
实施例4
通过与gp145蛋白质的免疫进行中和抗体的诱导,gp145蛋白质衍生于急性HIV-1C进化枝,是由CHO表达的重组gp145蛋白质。
动物:24只新西兰白色雌兔,1.8-2kg
兔被分为6组每组4只。每组的动物个体都被笼子牌和耳标区分。
抗原25μg/兔/剂
如上所示的gp145蛋白质在CHO细胞中的表达(急性感染组C,C0698v0c22),培养条件是PBS,pH7.4。
mper23(NK-4):LELDKWASLWNWFDITNWLWYIK(SEQ ID NO:53),(HBX2变量;Swiss-Prot登录号P04578,除了674位D氨基酸被N取代)
佐剂:
铝胶(0.6mg A13+/剂)配方:0.125ml PBS中0.6mg A13+,ph7.4;与等量的抗原混合
脂质体配制物1:DMPC∶胆固醇∶DMPG(9∶7.5∶1);50mM磷脂,含100μg lipid A/0.25ml剂;PBS,pH7.4。DMPC指的是二肉豆蔻磷脂酰胆碱,DMPG指的是二肉豆蔻磷脂酰甘油。
脂质体配制物2:DMPC∶胆固醇∶PIP(1∶1.5∶1);50mM磷脂,含100μglipid A/0.25ml剂;PBS,pH7.4。PIP指的是磷脂酰肌醇-4-磷酸。
放血:在-2、0、4、8和10周时使用20-24规格蝶形导管于动物耳动脉处取血。从每一个放血处取大约5ml血。血液于室温保存2-3小时而后冷却至4℃过夜,而后离心移走血清。血清被等分成:1x1ml和3x0.5ml于塑料管中在-80℃冷冻保存。.
在第12周时,采用60cc皮下注射器和18计量注射针用atamine/Xylanine对家兔进行麻醉,而后通过心脏穿刺最后一次放血。血清被等分成:5x1ml和5x5ml于塑料管中在-80℃冷冻保存。
免疫法:第0、4和8周时交替进行尾部大腿肌肉注射。采用23-27计量注射针注射0.25ml。
时间表:
参见图41,结果展示在图42-48、52中。
实施例5
下述对小鼠研究的方法结合了在家兔研究中使用的免疫原性、抗原性方法,如图41-48,52所示,除了家兔收获了25ug的gp145蛋白质或所述脂质体内的安慰剂。
Gp145小鼠免疫原性研究:抗原性、免疫原性方法
抗原
从急性C亚型Tanzania感染个体中分离得到的包膜蛋白序列生产gp145蛋白质。蛋白的整个保外结构与被保留,包括gp41的MPER区。蛋白被设计出含有两个突变点(R508S,R511S),在gp120/gp41切割位点处突变用以阻止蛋白酶的切割,在C末端多赖氨酸突变可以有助于MPER表位呈现及蛋白质生产。蛋白质在CHO细胞中生产,通过凝集素亲和层析纯化,并以一种如实施例7所述的多聚物混合物的形式出现。gp145蛋白质含有下述MPER表位序列:ALDSWNNLWNWFDIS(SEQ ID NO:23)。
脂质体制备:
在免疫前抗原即实验用M13噬菌体或gp145蛋白质均预先被脂质体包被。脂质体由二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰甘油和胆固醇按摩尔比值1.8∶0.2∶1.5组成,由冻干的脂质合剂于磷脂浓度50mM含0.4g/ml脂类A Dulbecco′s PBS中通过色散制备出来,含有或缺乏抗原的两种脂质体均需制备。脂质体采用无菌盐水冲洗两次以移除未包被的抗原。
动物免疫:
40只雌性BALB/C小鼠,每只25g,按照Institutional Laboratory Animal Care and Use Committee中所批准的方案进行免疫。动物被分为8组,每组5只(表9)。小鼠采用在尾侧大腿肌肉肌肉注射4次的方法进行免疫,肌肉注射以2至3周为周期,每次采用10μg gp145蛋白质剂量或5x1011噬菌体进行。血液每两周采集一次,在首次免疫前两周进行第一次采集,并在动物安乐死时进行最后一次采集。血液在室温下保存2-3小 时,而后冷却至4℃过夜,然后离心。收集血清,并于-20℃保存。最后一次注射(第10周)两周后小鼠被施行安乐死。从未处理和免疫后的小鼠中取得血液、脾脏、淋巴结、骨髓和肝脏。
表9小鼠免疫计划
IFNγ-释放ELISPOT(酶联免疫斑点测定)实验
脾细胞分泌的IFNγ通过ELISPOT分析。在无菌PBS中加入10μg/ml抗-gamma干扰素(IFNγ)(PBL Interferon Source)置于96孔硝化纤维素-支持的多重筛选-IP灭菌板(微孔)包膜后于4℃过夜。这些孔用含有0.5%牛血清蛋白的无菌PBS在37℃封闭30分钟,而后用含有0.025%Tween20的洗脱液的PBS洗脱,随后用无菌RPMI-1640完全培养基洗脱。利用每组的小鼠(每组5只小鼠)脾脏制备单细胞悬浮液。细胞(每孔含2x106)置于抗-IFNγ-包被的板上在加入CO2的容器中37℃温育培养18小时。在5μg/ml急性感染C gp145(HIV-1C06980,Advanced Bioscience Laboratories)、gp140(HIV-1IIIB,Advanced Bioscience Laboratories)、酵母衍生的gp41(Meridian Biosciences)或10μg/ml组织蛋白酶讲解酵母衍生的gp41或无蛋白质中培养细胞。培养板采用洗脱液洗脱,随后用蒸馏水洗脱,用0.125μg/ml生物素化的抗-IFNγ(XMG1.2克隆;BD PharMingen)覆盖并于室温下温育培养2h。而后培养板洗脱,并采用1∶1,000稀释的抗生素蛋白偶联的碱性磷酸酶在室温下培养2小时。培养板洗脱,通过添加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)/硝基蓝四唑(NBT)(Kirkegaard and Perry Labs)检测结合的IFNγ。培养板用水洗脱,第二天使用立体双目显微镜观察独立斑并计数。描绘出培养板上每个号码的斑点细胞数量平均数。
通过流式细胞术对T细胞中细胞因子的抗原呈递和检测
从不同组的小鼠的脾脏或淋巴结中取得的细胞用5μg/ml急性感染Cgpl45(HIV-1C06980,Advanced Bioscience Laboratories)、gp140(HIV-1IIIB,Advanced Bioscience Laboratories)、酵母衍生的gp41(Meridian Biosciences)或10μg/ml组织蛋白酶降解的酵母衍生gp41或作为正对照的ConA刺激,于37℃培养22小时。细胞在上述提到的抗原中温育2小时,而后加入布雷菲德菌素A(1mg/ml,Sigma-Aldrich)和莫能菌素(0.07mg/ml,BD Pharmingen)。细胞继续培养20小时.在LSR II(BD Immunocytometry Systems)流式细胞仪上分析细胞,使用FACSDiva软件(BD Immunocytometry Systems)收集了500,000个事件。使用多种生存活性标记将死细胞和B细胞排除在外。CD3+CD4+和CD3+CD8+T-细胞门控分析其中IL-2、TNF-a、IFN-g和CDl07a的表达。使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。展示出每组中每个抗原染色的阳性细胞百分比。黑色条纹代表对照组响应2倍范围之上,M13未插入。
抗原特异性血清IgG ELISA
抗原特异性IgG滴定依赖ELISA滴定,使用gpl45和gp41作为靶点。抗原在PBS(pH7.4)中被稀释至0.25μg/ml,96孔微量滴定聚苯乙烯板上每孔加入100ul。培养板在4℃温育过夜,然后用300ul0.1%PBST(含有0.1%Tween-20的PBS)洗脱3次。血清采用1∶50连续稀释2次,而后在血清稀释液(包含5%脱脂牛奶的0.1%PBST)中进行血清的滴定。培养板在37℃温育培养1小时,然后用洗脱液洗脱3次。HRP-标记的抗-小鼠免疫球蛋白抗体在血清稀释液中以1∶16,000稀释每孔加入100ul。培养板在37℃温育培养1小时,然后用洗脱液洗脱3次。加入TMB(100ul,Kirkegaard and Perry Labs)37℃温育培养30分钟,加入100ul1M磷酸终止反应。培养板在分光光度计中在410nm、570nm基准下过滤读出。抗原结合滴定依赖浓度计算,在此过程中本底结合被检测到超过三次。进行两次独立的测定,取结果的平均值。
使用Biacore进行表面等离激元(SPR)测量
使用CM5芯片用Biacore T200进行表面等离激元测量。使用Biacore 胺偶联试剂盒(Biacore,AB)将肽固定于芯片表面。所有免疫步骤在25℃,10μl/min流速下进行,肽加样缓冲液为20mM醋酸钠,pH4.2。固定术指导使用T200控制软件在各自的独立细胞中固定14700个共振单位(RU)的10uM乱序MPER肽和20500个RU的MPER肽。两种肽在免疫固定中均具有10分钟接触时间。血清样本在三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中以1∶50稀释,然后以30μl/min通过芯片表面3分钟,随后是5分钟解离时间。在5分钟解离时间的最后,绵羊抗-小鼠免疫球蛋白(Fc)抗体(结合位点)的溶液75μg/mL以10μl/min流速通过流式细胞表面2分钟。70秒解离时间后,使用50mM HCl30秒脉冲、100mM EDTA加入20mM Tris,pH7.430秒脉冲、50%乙酸30秒脉冲重建芯片表面,随后进行1分钟注射Tris-缓冲盐水,pH7.4。使用BIAevaluation4.1软件进行数据分析减去非特异性结合。已报道的免疫球蛋白特异性反应单位比值在以下两种情况下具有差异:即在抗免疫球蛋白注射最后5秒窗口取60秒平均值与在抗免疫球蛋白注射前5秒窗口取10秒平均值间具有差异。
假病毒中和分析
TZM-bl细胞用作测定确定HIV-1中和的靶点。BnAb或血浆分别在25μg/ml或1∶20连续稀释4次的系列稀释液中滴定,采用生长培养基[DMEM中含100U/ml青霉索、100μg/ml链霉索、2mM L-谷氨酰胺(Quality Biologics Inc.)、和15%胎牛血清(Gemini Bio-Products)]在黑色平底96孔板中加入25μl双份样品。假病毒在生长培养基中稀释至得到约150,000相关发光单位(RLU),每孔中加入等量上述假病毒。样品在37℃加入5%CO2的容器中温育培养1小时,所有的培养都是在这样的条件下进行。TZMbl细胞在2xl05细胞/ml的生长培养基中重悬,该培养基含有60μg/mlDEAE-dextran(Sigma),每孔加入50μl。每板的孔内含有细胞和假病毒(病毒对照)或仅含有细胞(背景对照)。培养板温育培养48小时,然后每孔加入100μl再生Brite Lite Plus(Perkin Elmer)。使用Victor2luminometer(Perkin-Elmer)测量RLU值。测量由于抗体存在出现的抑制百分比,通过比较含抗体孔内RLU值与病毒对照孔内的RLU值进行该测量。进行两次独立的测定,取结果的平均值。
PBMC中和测定
从HIV未感染者供体中收集并冷藏保存的PBMC用作确定HIV-1中和的测定靶点。含量测定使用具有复制活性的HIV-1感染的分子克隆(IMC),该克隆包含了表达海紫罗兰属萤光素酶(LucR)-HIV-1融合蛋白的报告基因。病毒生产量用分光光度计测定(Edmonds,TG等人Virology408∶1-13(2010))。血清采用IL-2生长培养基1∶20连续稀释4次,该培养基含有以下成分:[RPMI-1600含有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Quality Biologics Inc.)、15%胎牛血清(Gemini Bio-Products)和20U/ml重组白细胞介素-2(Roche Diagnostics)],而后取出25μl作为副本加入圆形底96孔板中。IMC在生长培养基中稀释至得到约50,000RLU,每孔中加入等量上述IMC。样品在37℃加入5%CO2的容器中温育培养1小时,所有的培养都是在这样的条件下进行。PHA/IL-2受激的PBMC在2x106细胞/ml的IL-2生长培养基中重悬,然后每孔加入50μl。每板的孔内含有细胞和IMC(病毒对照)或仅含有细胞(背景对照)。培养板温育培养24小时,每孔中加入100μl生长培养基,然后再温育培养72小时。使用Renilla Luciferase Assay System(Promega)定量化荧光产生量。每孔加入Lysis缓冲液50μl,进行两次冷冻解冻循环,而后转移至黑色平底96孔板中,每孔加入20μl,100μl底物注射后立即测量测量每孔中的RLU。测量由于抗体存在出现的抑制百分比,通过比较含抗体孔内RLU值与病毒对照孔内的RLU值进行该测量。进行两次独立的测定,取结果的平均值。
结果
5种M13-展示的4E10表位的免疫原性能够抑制体外定量的中和反应。35只雌性BALB/C小鼠分成7组,每组5只,接种了单个M13展示的表位,其中包含了所有5种M13-展示的表位或所有5种结合了HIV-1gp145包膜蛋白的M13-展示的表位(表9)。从急性感染HIV-1C进化枝的个体中取得的gp145包膜蛋白引出了家兔的中和抗体。
引起的细胞免疫应答分析
由接种疫苗引起的脾脏和淋巴结中的细胞免疫应答通过INFγ-释放酶 联免疫斑点测定(ELISPOT)和胞内细胞因子染色(ICS)测定评估。在这些测定中,HIV特异性反应使用HIV-1包膜蛋白刺激后进行了测量,包括gp145、gp140、gp41或组织蛋白酶讲解的gp41。小鼠免疫应答是对照组的两倍,其中小鼠与无插入的M13的免疫被认定为正对照(图53and54)。ICS数据分析指出CD3+CD4+或CD3+CD8+T-细胞特异反应。
在INFγ-释放酶联免疫斑点测定中,在淋巴结和脾脏的所有组中均观察到单一的反应,其中M13-全部5种免疫群,在淋巴结中受gp140刺激,gp145免疫群在脾脏中受gp145刺激。(图53)在脾脏T-细胞中对gp140的背景反应很高。通过ICS观察IL-2所有组对几种HIV-1包膜蛋白抗原的免疫应答,TNFα、CD107a和INFγ反应没有被检测到。阳性IL-2反应在淋巴结中比脾脏中更常发生,分别为85%和48%阳性反应,但是分别低于对照组3.9-折和4.5-折。阳性IL-2反应在CD4+T-细胞中比CD8+T-细胞中更常发生,分别为73%和60%阳性反应,且分别高于对照组4.5-折和3.8-折(图54)。小鼠脂质体免疫并不仅仅具有HIV-1特异细胞免疫应答。
引起的抗体应答分析
通过免疫球蛋白结合的ELISA及中和含量测定分析体液免疫应答。检测了所有组针对gp145和gp140的结合滴度(图55)。动物与gp145或gp145/M13-产生的全部5种抗体与高浓度gp145发生免疫应答,平均值分别在512000和409600,而与gp41反应的均值分别在30400和43200。两种均具有对gp145免疫蛋白质最高的滴度。另一些组并不具有在本含量测定中可检测的结合滴度,M13-all5除外,它具有很弱的对gp145的结合滴度,均值1200。应用Biacore展示在混合血清中表位-特异的免疫球蛋白与MPER肽的结合,没有检测到二者结合(数据没有展示)。
中和含量测定使用TZMbl和PBMC作为含量测定靶点进行测定。血清与两种中和-敏感的HIV-1毒株在两种含量测定平台上滴定,测出半感染剂量值(图56)。在TZMbl和PBMC中,动物与gp145/M13-all5免疫均具有最高的中和滴度,分别比gp145-免疫组高出2.1-和1.9-倍。动物与单个M13-展示的MPER表位、M13-12D4和M13-12B7或多个的M13-展示的MPER表位(M13-all5)免疫,也产生HIV中和抗体。所有血清都是由HIV-2/MPER嵌合体及非特异性病毒对照MuLV中筛选得到,所有这些病 毒中均未观察到中和反应。
实施例6
α4β7封闭分析
材料
反应介质:10%FCS/RPMI/Lglut/PenStrep
细胞:RPMI8866
表10试剂
制备α4β7结合缓冲液
-使用MnCl2粉末新鲜制备1M MnCl2(1g MnCl2-4H2O(从Arthos Lab-MW197.9)+5mL dH2O)
-制备下面表中的结合缓冲液
-过滤灭菌并储存于4℃
表11
采集细胞
-采集非贴壁细胞并转移至50ml管中
-细胞颗粒在200xg离心10分钟,倒出上清液。
-将所有细胞结合进10mL培养基中,剧烈混悬以打破小簇并计数。
-调整容量至1mL培养基中1.0x106细胞。
-等分成每孔100uL(100K)细胞置于96孔板(96-well U-bottom polypropylene)中。
-细胞颗粒在200xg离心10分钟
-使用2X结合缓冲液洗脱细胞。
表12样品
加入免疫球蛋白预培养蛋白质
-向96孔板的孔中加入结合缓冲液并进行样本计算
-依据样品计算的结果向适当的样品槽中加入免疫球蛋白
-向UNTREATED、POS CTRL和NO IgG CTRL样本槽中只加入40uL结合缓冲液
-将储存的蛋白质加入在结合缓冲液,使之达到0.025ug/uL。
表13
-向UNTREATED样本槽中加入20uL结合缓冲液。
-向POS CTRL和NO IgG CTRL样本槽中加入20uL蛋白质(每槽=0.5ug蛋白质)。
-培养板在37℃温育培养60分钟。
结合实验
-准备封闭缓冲液(10%小鼠免疫球蛋白、10%人类免疫球蛋白溶于结合缓冲液中)
-每孔中加入50uL封闭缓冲液
-向POS CTRL样本槽中加入4uL(2ug)抗-α4封闭mAb。
-冰上放置10分钟(不要洗脱)
-每套装置转移蛋白质/免疫球蛋白复合物至培养板上。
-冰上放置30分钟
-使用2X结合缓冲液洗脱
染色
-制备染色混合试剂
表14
-向未染色样本槽中加入50uL结合缓冲液。
-向NO IgG CTRL、POS CTRL和所有样本槽中加入50uL染色混合试剂
-4℃温育30min
-使用2X结合缓冲液洗脱
-使用4%PFA x在4℃固定30-60min。
-向下旋转细胞并在150uL结合缓冲液中悬浮细胞。
-4℃保存培养板直至可以读板。
补偿珠的制备
-准备两管补偿珠,用2X染色缓冲液清洗珠子。
-在45uL染色缓冲液中悬浮珠子
-一管中加入5uL CD4-FITC,另一管中加入5uL CD4-PE,混合管。
-4℃温育30min
-使用2X染色缓冲液洗脱
-200uL染色缓冲液中重悬
在细胞系RMPI8866中进行基于流式细胞术的a4B7结合抑制配位测定实验。但是最初在分离的CD4+和CD8+T细胞上进行实验,该细胞培养可表达具有活性的α4β7异源二聚体形式。图57展示了本实验的一个模型。本实验可以作为结合实验用来检测从不同的急性感染个体中选取的HIV-1的衍生序列的变异。本实验的扩大应用包括检测env/α4β7相互作用的功能封闭,这种封闭作用由单克隆抗体或针对包膜蛋白或整联蛋白免疫的纯化的免疫球蛋白血清引起。生产挑选出的HIV-1包膜蛋白,并生物素化,与抗体混合培养,而后与α4β7表达细胞共培养。添加非蛋白抗生素PE检测结合,与非封闭的mAb偶联的FITC染色证实α4β7的存在。检测抗整联蛋白抗体时,细胞与抗体预培养,而后再加入生物素化的包膜蛋白,如描述观察。申请人发展出这种方法用于整个包膜蛋白也用于生物素化的线性或环状肽。在某些实施方案中,该实验被发展用于IMC和VLP载体。
该实验的最重要的特征为能够使用最初的T细胞表达α4β7的活性形式。为生成这种细胞,申请人从PBMC中利用磁性珠分离CD4+和CD8+T细胞。应用了阴性选择方案以使得到的细胞为“未受影响的”、纯化的且无小珠的。紧接着的分离,细胞在抗-CD3/抗-CD28、IL-2和维A酸存在的情况下培养5天,诱导α4β7的表面表达(图58)。
本实验过程中的预实验是用来指导计算结合动力学并运用许多种HIV-1包膜蛋白试剂的全部实验程序。重组的CRF01_AEgp120和急性感染C亚型gp145(如上所述)生物素化并结合于表达α4β7的CD4+或CD8+T细胞(图59,1左面和中间长条)。生物素化的环状肽包含了从CRF01-AE衍生出的HIV-1包膜蛋白的V2环,也被结合在CD4+α4β7+和CD8+α4β7+细胞上。在RPMI8866细胞系中也可见类似结合(数据未显示)。与B进化枝MN衍生的gp120或与在环顶部突变的环状V2肽间检测不到结合。
最初封闭研究使用人类抗V2单克隆抗体(由S.Zolla-Pazner好心提供)、CRF01_AE衍生的gp120或环状V2肽。具有反应活性的V2单克隆抗体697-30D和2158被检测,封闭了包膜蛋白与CD4+α4β7+和CD8+α4β7+细胞的结合。细胞与抗-α4封闭抗体HP2/1预培养,而后再加入蛋白质或肽,作为正对照。申请人进行这些实验检测一组从V2环中衍生出的重叠线性肽,描绘出了这种相互作用所需要的氨基酸残基。(数据 未显不)
方法学:
α4β7T淋巴细胞的制备:在完全培养基中解冻冷藏保存的PBMC,通过磁性珠阴性选择分离CD4+或CD8+T细胞。细胞在抗-CD3/CD28,IL-2和类维生素A存在条件下培养至少5天。应用多色流式细胞术监控表现型、细胞生存和活性形式α4β7的表达。在某些实验中,人类B细胞淋巴瘤细胞系RPMI8866用于大量表达活性形式α4β7。
α4β7结合封闭实验细胞培养于2-5μg生物素化的V2肽或HIV-1包膜糖蛋白中培养30分钟,表达α4β7。随后进行洗脱以移除未结合的肽或蛋白质,用非蛋白抗生素PE得到细胞,并通过流式细胞仪评估其结合。封闭研究中,抗体与α4β7表达细胞或HIV-1包膜蛋白预培养,最好在加入试剂前培养30分钟。
HIV-1包膜蛋白的合成急性的包膜蛋白序列从RV217急性感染研究中选出合成。提交序列至GeneArt,Inc,进行密码子优化并克隆进入哺乳动物表达载体。蛋白质在CHO细胞或HEK293细胞中表达,提供了不同的糖基化模式,对于结合实验可能非常重要。下一步表达,每种蛋白质的一部分进行生物素化,以用于α4β7结合封闭实验。
生物素化的V2肽的合成。由Dr.Tim Cardozo(纽约大学)设计的肽通过Genemed Synthesis Inc.合成并生物素化。这些肽由Dr.Cardozo馈赠。
实施例7
概述
凝胶过滤中的数据支持不同多聚体种类混合物的存在。尽管如此,目前还不确定在本实验中球状性质、疏水区和gp145重糖基化如何影响不同多聚体形式的分辨。因此,对种类存在的比例下结论是很困难的。并且,在本实验中的弱分辨率使得判定每种形式相关含量非常困难。对在C06980v0c22gp145中、Blue Native PAGE(BN PAGE)中和EGS交联中纯化的许多低聚物的进一步分析,使用纯化蛋白质进行。而且,尝试应用凝胶过滤色谱进行不同低聚物形式的分离。
BN PAGE
应用Blue Native PAGE分析纯化的HIV-1C06980v0c22gp145蛋白质 批次s112009、120710A和120710B复合受体的组成。纯化的HIV-1C06980v0c22gp145蛋白质在4-16%Novex Bis-Tris上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,使用了Invitrogen's Native PAGE系统(图61).。作为对照,如前所述的Ba-L gp145和三种D进化枝gp140蛋白质(A07412,57128,and57140)同时进行电泳。激光光密度测定分析在BLUE Native PAGE上进行电泳预示着每种蛋白质均为多种复合受体形式的混合物(表15)。
表15激光光密度测定预测gp140和gp145多聚体组成
*极端扩散的条带跨越了几百kDa,难以确定分子量。在这些片段中可能存在不止一种。
**分隔不全的双联体可能代表了2种包括某些分解产物。
Blue Native PAGE实验清楚显示gp140和gp145蛋白质存在于多种多聚体混合物中。尽管如此,并不是非常清楚到底是哪种存在。一种设想,单体大约140kDa,期望的三聚体、四聚体、五聚体和六聚体分子量分别约为420kDa、560kDa、700kDa和840kDa。尽管如此,由于它们具有球状形式、疏水区和重糖基化,蛋白质疑似可能并没有表现出这种方式。相应的,例如,申请人将每一种多聚体指定为A、B、C或D,其中A是最 多的复合物,D是最少的复合物。所有的C06980v0c22gp145批号具有类似表现:B是占优势地位的形式,同时存在有大量的C和D。批次120710B经DTT处理后在多聚体组成上没有表现出明显影响。在D进化枝57140和57128的gp140蛋白质也看到了类似的趋势。D进化枝A07412gp140蛋白质是类似的,但是其中C型在数量上稍多于B型。对于Ba-Lgp145,最占优势的种类是一条宽的扩散的条带,与高阶多聚体混合物类似,归类于A种。分离的主体C群和较少的B群也都明显存在。
EGS交联/SDS-PAGE
C06980v0c22gp145进一步运用SDS-PAGE进行性质鉴定,其中蛋白质与乙二醇二琥珀酰亚胺琥珀酸盐(EGS)交联用于进一步的复合受体特征鉴定。数据显示出三聚体最占优势,但是二聚体、痕量的单体以及高阶多聚体也是存在的。纯化的HIV-1C06980v0c22gp145(批次120710A)与0.2、1、5和12.5mM EGS交联,在在还原与非还原条件下3-8%NuPAGE Tris乙酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳中(Invitrogen)展开,并被考马斯亮蓝染色(图62)。使用激光光密度测定分析估计每一种gp145的分子量。当采用0.2mM EGS处理时,gp145交联不完全,出现3种大小:334、232和139kDa。相应的样本槽中为三聚体、二聚体和单体形式的预测分子量。EGS浓度上升至5和12.5mM时,交联完全,三聚体是占优势的种类。主要的二聚体形式也存在,但是单体只有总蛋白质的痕量凑数。在非还原性条件下,与高阶多聚物相关的模糊条带出现,这也是完全交联样品的证据。这揭示了一些高阶多聚物的存在,它们是由二硫键结合在一起。复合受体种类A、B和C推测起来与多聚体有关,分离开的三聚体和二聚体种类是分别与EGS交联的蛋白质。基于Blue Native PAGE的结果,主要多聚体种类为B和C,其表观分子量分别为751和621kDa。这些表观分子量非常高以至于不能下它们代表三聚体和二聚体的结论。尽管如此,应用EGS交联,表观分子量更多的与二聚体或三聚体形式一致。EGS交联SDS-PAGE方法是由J.P.Nkolola,等人提出的,用以描述在杆状病毒群系统中生产的重组HIV-192UG037.8gp140蛋白质以三聚体形式存在。利用类似的EGS交联程序C06980v0c22gp145蛋白质在电泳中出现类似的分子量。在BN-PAGE和EGS交联SDS-PAGE中观察到的与预测的gp145低聚体的分子量 间的显著偏差,可能是由于电荷、球状性质、疏水区、gp145蛋白质重糖基化影响了本实验中不同多聚体形式的溶解度。BN-PAGE能够分辨自然状态下的低聚体形式。尽管如此,不能依据gp145和分子量标记之间流动性的成比例差异推测出分子量。在EGS-交联SDS-PAGE中,低聚体共价结合,但是在一般的SDS-PAGE中变性。在这样的条件下,假设当gp145没有交联时,其移动与基于表观分子量的标准高度相关。
二聚体和三聚体纯化
采用凝胶过滤层析研究关于是否可以用于分离gp145多种不同种类低聚物。多种不同形式的成功分离将为可能的研究提供每种形式的抗原性和免疫原性。
应用Superose6进行凝胶过滤层析。目前认为Superose6因其高分子量范围,具有分离高分子量的gp145种类的潜能,最佳的分离蛋白大小为5至500kDa。因为高分子量蛋白质在凝胶过滤树脂中的低溶解性,大蛋白的分离通常证明是很难的,例如gp145低聚物。Superose6显示出分离不同低聚物的可能。
在分析用Superose6PC3.2/30(GE Healthcare)柱中,25μl中含有200μg HIV-1C06980v0c22gp145批次120710A溶于0.05ml/min PBS,pH7.2中。利用EGS交联/SDS-PAGE收集和分析50μl片段(图63)。尽管没有片段含有纯净的二聚体或三聚体,一些三聚体的富集物确实存在于某些片段中。高阶多聚体存在于某些片段中。不同柱大小和条件能够具有更好的分辨率,并且具有将三聚体从高阶多聚体和二聚体中分离出来的能力。在进一步的实施方案中,可能利用Superose6进行分离条件的优化。
参考文献
Nkolola,J.P.,等人.2010.Breadth of neutralizing antibodies elicited by stable,homogeneous clade A and clade C HIV-1gp140envelope trimers in guinea pigs.J.Viro1.84:3270-3279.
***
已经详细描述本发明的实施方案,应当理解在以上段落中阐述的本发 明并不仅仅局限于上文描述的具体细节,由于很多明显的变化也是可能的,其并不背离本发明的精神和范围。
在本申请引用或描述的每项专利、专利申请和出版物通过引用并入本文,就如同每一单个专利、专利申请或出版物被明确和单独地指明通过引用并入本文。
Claims (60)
1.包含截短的HIV包膜蛋白的分离的肽,其中所述HIV包膜蛋白在天然gp120/gp41切割位点处被突变以阻止蛋白酶切割,所述HIV包膜蛋白包含gp41的MPER,并在跨膜区前被截短。
2.权利要求1的肽,其中所述HIV包膜蛋白在其C端包含大约1-10个亲水氨基酸。
3.权利要求2的肽,其中所述大约1-10个亲水氨基酸是3个赖氨酸。
4.权利要求1的肽,其中所述gp41的MPER包含4E10表位。
5.权利要求4的肽,其中所述gp41的MPER在其C端包含氨基酸序列:LWYIK(SEQ ID NO:24)。
6.权利要求5的肽,其中所述HIV包膜蛋白包含位于LWYIK氨基酸序列(SEQ ID NO:24)C端的并与LWYIK氨基酸序列(SEQ ID NO:24)连续的大约1-10个非天然亲水性氨基酸。
7.权利要求1的肽,其中所述HIV包膜蛋白衍生自HIV-1毒株,所述HIV-1毒株归类于选自M、O、N、P的组。
8.权利要求7的肽,其中所述HIV包膜蛋白衍生自HIV-1M组毒株。
9.权利要求8的肽,其中所述HIV-1M组毒株选自A、B、C、D、F、G、H、J和K亚型(进化枝)。.
10.权利要求9的肽,其中所述亚型(进化枝)为B进化枝。
11.权利要求9的肽,其中所述亚型(进化枝)为D进化枝。
12.权利要求9的肽,其中所述亚型(进化枝)为C进化枝。
13.权利要求12的肽,其包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%或更高的相同性的氨基酸序列。
14.权利要求13的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有90%或更高的相同性的氨基酸序列。
15.权利要求14的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有95%或更高的相同性的氨基酸序列。
16.权利要求15的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有98%或更高的相同性的氨基酸序列。
17.权利要求16中的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有99%或更高的相同性的氨基酸序列。
18.权利要求17的肽,其中所述肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
19.分离的核酸,其包含编码权利要求13-18中任一项的氨基酸序列的核酸序列。
20.权利要求19的核酸,其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
21.载体,其包含权利要求19的核酸。
22.宿主细胞,其包含权利要求21的载体。
23.权利要求22的宿主细胞,其中所述宿主细胞是CHO细胞。
24.制备包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有85%或更高的相同性的氨基酸序列的肽的方法,所述方法包括在适于蛋白表达的条件下培养权利要求22或权利要求23的宿主细胞,和分离所述肽。
25.组合物,其包含权利要求13-18中任一项的肽及药用可接受的载体。
26.在哺乳动物中产生针对HIV的抗体的方法,其包括给所述哺乳动物施用权利要求25的组合物。
27.权利要求26的方法,其中所述组合物进一步包含佐剂。
28.在哺乳动物中赋予针对HIV的免疫力的方法,其包括给所述哺乳动物施用权利要求25的组合物。
29.权利要求28的方法,其中所述组合物进一步包含佐剂。
30.权利要求28的方法,包括通过注射给所述哺乳动物施用所述组合物。
31.权利要求26-30中任一项的方法,其中所述哺乳动物选自人类、非人灵长类、犬、兔、豚鼠和小鼠。
32.亚单位疫苗,其包含权利要求1-3中任一项的肽。
33.亚单位疫苗,其包含权利要求13-18中任一项的肽。
34.核酸疫苗,其包含权利要求19的核酸。
35.分离的肽,其包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5所示氨基酸序列具有90%或更高的相同性的氨基酸序列。
36.权利要求35的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有98%或更高的相同性的氨基酸序列。
37.权利要求36的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有99%或更高的相同性的氨基酸序列。
38.权利要求37的肽,其中所述肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
39.分离的核酸序列,其包含编码权利要求35-38中任一项的氨基酸序列的核酸序列。
40.权利要求39的核酸,其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
41.试剂盒,其包含(a)包含权利要求1-3中任一项的肽和药用可接受的载体的组合物,和(b)将所述组合物施用至哺乳动物的说明。
42.试剂盒,其包含(a)权利要求25的组合物,和(b)将组所述合物施用至哺乳动物的说明。
43.试剂盒,其包含(a)包含权利要求19的核酸和药用可接受的载体的组合物,和(b)将所述组合物施用至哺乳动物的说明。
44.权利要求7-12中任一项的肽,其中所述HIV-1毒株分离自具有急性HIV-1感染的个体。
45.权利要求7-12中任一项的肽,其中所述HIV-1毒株分离自具有慢性HIV-1感染的个体。
46.权利要求1的肽,其中所述HIV包膜蛋白在前导序列处被突变。
47.权利要求46的肽,其中天然信号肽被tPA信号肽替换。
48.权利要求47中的肽,其中所述tPA信号肽包含选自SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22的序列。
49.分离的肽,其包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有90%或更高的相同性的氨基酸序列。
50.权利要求49的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9所示氨基酸序列具有98%或更高的相同性的氨基酸序列。
51.权利要求50的肽,其中所述肽包含与SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9所示氨基酸序列具有99%或更高的相同性的氨基酸序列。
52.权利要求51的肽,其中所述肽包含SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
53.分离的核酸序列,其包含编码权利要求49-52中任一项的氨基酸序列的核酸序列。
54.权利要求53的核酸,其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5。
55.权利要求19的核酸,其中所述分离的核酸包含SEQ ID NO:20所示的核酸序列。
56.权利要求27或29的方法,其中所述佐剂包含脂质体配制物。
57.权利要求56的方法,其中所述脂质体配制物包含以下的一种或多种:二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰甘油、胆固醇和磷脂。
58.权利要求57的方法,其中所述脂质体配制物包含磷脂A。
59.权利要求26的方法,其中所述在哺乳动物中产生的抗体为与包含截短的HIV包膜蛋白的肽竞争结合整联蛋白α4β7的抗体。
60.权利要求1的分离的肽,其中所述肽结合整联蛋白α4β7。
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