JPH04505248A - ヘルペスウイルス組換えポックスウイルスワクチン - Google Patents

ヘルペスウイルス組換えポックスウイルスワクチン

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘルペスウィルス組換えポックスウィルスワクチン関連出願の相互参照 本出願は米国特許出願第３３９００４号（１９８９年４月１７日出願）の部分継 続出願である米国特許出願第３９４４８８号（１９８９年８月１６日出願）の部 分継続出願である。
発明の分野 本発明は修飾ポックスウィルス並びに該修飾ポックスウィルスの作成方法と使用 方法に関する。本発明は、より詳細には、ヘルペスウィルス遺伝子産物を発現す るような組換えポックスウィルス並びにヘルペスウィルス感染に対する防御免疫 を賦与するワクチンに関する。
本出願においては、括弧内のアラビア数字で示す刊行物を多数引用した。これら の引用文献の詳細は本明細書の最後の「請求の範囲」の直前に記載した。これら の引用文献には、本発明の関連技術分野の技術水準が記載さ外来遺伝子の挿入及 び発現にワクシニアウィルス（ｖａｃｃｉｎｉａ　ｐｉｏｕｓ）が使用されてお り、最近では他のポックスウィルス（ｐｏｘｖｉ＋ｕｓ）も使用されるようにな っている。
生きた感染性ポックスウィルス中に外来遺伝子を挿入するための基本的技術とし ては、外来遺伝要素を挟みこんたドナープラスミド中のボックスＤＮＡ配列と救 援ポックスウィルス中に存在する相同配列との間の組換えがある（２８）。
組換えポックスウィルスは、詳細には、米国特許第４、６０３．１１２号に記載 されたワクシニアウィルスの合成組換え体の作成法などの公知の二段階法によっ て構築されている。
最初の段階では、ウィルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列（特に非ボックス起源 の解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ））を、ポックスウィルスの ＤＮＡ部分と相同なりＮＡを予め挿入しておいた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）プラス ミド構造体中に導入する。別個に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモーター に連結する。このプロモーター−遺伝子連結体を上記プラスミド構造体中に導入 して、ボックスＩ）ＮＡの非必須遺伝子座のフランキング１）ＮＡ配列と相同な ｆ）ＮＡで該プロモーター−遺伝子連結体の両端が挟み込まれるようにする。得 られたプラスミド構造体を次いで大腸菌中で増殖させて増幅しくＩＩ）　、単離 する（１２．２０）。
策２段階では、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドを、ポッ クスウィルスと共に、培養細胞（例えばニワトリ胚繊維芽細胞）に感染させる。
プラスミドとウィルスゲノムに存在する互いに相同なボックスＤＮＡ間の組換え によって、ポックスウィルスゲノムの非必須領域内に外来ＤＮＡ配列が存在する 修飾ポックスウィルスが得られる。「外来Ｊ　ＤＮＡという用語は、外在性のＤ ＮＡ、特に非ボックス起源のＤＮＡで、それらを導入すべきゲノムが通常には産 生じない遺伝子産物をコードするものを指す。
遺伝子組換えは、一般的には、２本のＤＮＡＮ開鎖間ＮＡの相同部分の交換を意 味する。核酸の相同部分とは塩基配列が同一であるような核酸（ＤＮＡ又はＲＮ 　Ａ）の部分をいう。
遺伝子の組換えは、感染宿主細胞中で新たにウィルスゲノムが複製又は生産され る際に自然に起こり得る。
従って、ウィルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２種類以上の異なるウィルス又は その他の遺伝子構造体に同時に感染した宿主細胞内中で展開されるウィルスの複 製周期の間に起こることもある。第一のウィルスゲノムのＤＮＡと相同なりＮＡ を有する第二のウィルスが同時に感染した場合、第二のウィルスゲノムの一部分 を構築する際に前者のゲノムに由来するＤＮＡ部分が交換して用いられる。
ただし、遺伝子の組換えは、異なるゲノム中の完全には相同とはいえないＤＮＡ 部分間でも起こり得る。仮に、かかる部分の一方が第一のゲノム由来のもので、 もう一方のゲノムのある部分と相同ではあるが、前者の相同なりＮＡ部分中に例 えば遺伝マーカー又は抗原決定基をコードする遺伝子の挿入された非相同部分が 存在していたとしても、組換えは依然として起こり得るし、その組換え産物も組 換えウィルスゲノム中の遺伝マーカー又は遺伝子の存在によって検出できる。
かかる感染性修飾ウィルス中ての挿入ＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるため には２つの条件が必要である。
まず第一に、かかる修飾ウィルスが生存し続けるように挿入をウィルスの非必須 領域中で行なう必要がある。挿入ＤＮＡに関する第二の条件は、該挿入ＤＮＡに 適したプロモーターが存在することである。プロモーターは、発現すべきＤＮＡ 配列の上流に位置するように導入しなければならない。
ウマヘルペスウィルス（ｅｑｏｉｎｅ　ｈｅ＋ｐｅｓｖｉｔｕｓ）には２つの亜 型（ｓｕｂｊｙｐｅ）が存在する。これらは交差反応性中和エピトープ（ｃｒｏ ｓｓ−ｎｅｕ＋ｒａｌｉｘｉｎｇ　ｅｐｉｔｏｐｅ）を含んではいるが、それぞ れの抗原特性、制限酵素フィンガープリント及びウマに対する病原性によって区 別できる（１）。
ウマヘルペスウィルス１型（Ｅ）ＩＶ−１）が呼吸器系の疾患、中枢神経系の障 害及び古くから知られているヘルペス性流産に関連するのに対して、ウマヘルペ スウィルス４型（ＥＨＶ−４）は主に呼吸器系の疾患だけに関連している。
ウマヘルペスウィルスは、アルファヘルペスウィルス（ｉｌｐｈｓｈｅ＋ｐｃｓ ｙｉ＋ｕｓ）亜科の一種で、ゲノムの異性化、遺伝子発現の調節、潜伏感染の成 立、欠陥干渉ウィルス粒子の産生、神経障害の誘発並びにインビトロ発がん性形 質転換などのヒトヘルペスウィルス（ｈａｍａｎ　ｈｅｔρｅｓｙｉｒｏｇ）に 特徴的な生物学的及び生化学的性質を示す（＋、　４．２３）。
従って、Ｅｌ（Ｖはヘルペスウィルス感染に関する種々の生物学的因果関係の研 究に好適に使用できる。
ヘルペスウィルスｔｈｅ＋ｐｅｓｖｉ＋ｕｓｌの糖タンパク質は・例えば細胞へ の付着及び侵入、細胞間におけるウイルスの伝播などのウィルスの基本的機能を 縞介し、さらに感染時の病原性をも決定する。ヘルペスウィルスの糖タンパク質 は、宿主免疫系との相互作用に決定的な役割を果たす構成要素である（３６．３ ７）。
単純ヘルペスウィルス（ｂｅ＋ｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉ＋ｕｓｌの糖タン パク質で十分に特徴付けられているものとしては、ｇＢ。
ｇＣ，ｇＤ、　ｇＥ、　ｇＦＳｇＧ、　ｇＨ及びｇｌが挙げられる（　３６．３ ７．４９−５５）。数多くの研究から免疫反応の誘起に対する単純ヘルペスウィ ルス糖タンパク質の重要性が指摘されている（６．８．　＋３．　Ｉｌｌ、　２ １．２２．２６．２７．３０．４４：　４６．４７）。ｇＣがクラスＩ認識（ｃ ｌａｎｇ　Ｉ　＋ｅｓｌｒｉｃ＋ｅｄ）細胞障害性リンパ球を活性化し得るのに 対して（１５，３２）　、ｇＤはクラス■細胞障害性Ｔ細胞の応答を活性化し得 る（２＋、　２２．４４．４６．４７）。
ｇＧは、補体依存性抗体によって支配されるウィルス中和反応の標的となること が示されている（３８．３９）。その他のヘルペスウィルス由来の数多（の糖タ ンパク質についても、重要な免疫反応を誘起することが示されている（　５．　 Ｉ　Ｏ，３６，５６）。
ＥＨＶの２つの亜型は共に６種類の主要糖タンパク質を発現する（　＋、　３． ４３）。ｇｐ２、ｇｐｌｏ、ｇｐ１３、ｇｐ１４、ｇｌｌ１７／１８及びｇｐ２ １／２２をコードするＤＮＡ配列のゲノム部分が、λｇｔｌ１発現ベクターとモ ノクローナル抗体を用いて決定されている（３）。糖タンパク質ｇｐ１３とｇｐ １４はゲノムＬ領域内の、それぞれ単純ヘルペスウィルスのｇｃとｇＢ相同物の 位置する場所と同し位置に位置している。ＥＨＶ−１は、その６種類の主要糖タ ンパク質のうちの５種類がゲノムし領域内の塩基配列によってコードされており 、１種類（ｇｐ１７／１８）だけしかＵ５領域にないという点で、糖タンパク質 遺伝子の位置の判明しているアルファヘルペスウィルスの中では独特である。こ れらのデータの解析から、ＥＨＶ−１ウィルス粒子の余り豊富には存在しない既 同定糖タンパク質の若干、さらには未同定のＥＨＶ川糖少糖タンパク質ゲノムＳ 領域に位置していることが予想されている（３）。エンベロープの糖タンパク質 はヘルペスウィルスの主たる免疫原であって、宿主の体液性免疫及び細胞性免疫 反応双方の誘起に関与しており（５，８，７３−７５）、ワクチンの設計を試み る者にとっては非常に関心のあるものである。
ケンタラキー（Ｋｅｎｌｕｃｋマ）　７４３１株のｇｌｌｌ３をコードするこの 解読枠（ｏｐｅｎ　＋ｅａｄｉｎｇ　ｆ＋ｔｍｅ）は４６８残基のアミノ酸から なる５１ｋＤｘの１次翻訳産物をコードする。このタンパク質は膜貫通性タンパ ク質に特有の性質を有しており、タンパク質のシグナルペプチドと思われる部分 と膜貫通性アンカ一部分との間の膜表在性ドメインに９カ所の潜在的Ｎ−グリコ ジル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅ＋／Ｔｈｒ）が存在している（２）。この糖タン パク質は単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）のｇＣ−１及びｇＣ−２、仮性狂犬病 ウィルス（ｐｓｅｕｄ。
＋ａｂｉｅｓ　ｖｉ「ｕ＋、略してＰ　ＲＶ）のｇｌｌｌ、並びに水痘帯状庖疹 ウィルス（ｖａ「１ｃｅｌｌａ−＋ｏｓｌｅｒ　ｖｉｒｕｓ、略してＶ　Ｉ　Ｖ ）のｇＩ’Ｖと相同であることが判明している（２）。従って、ＥＨｖ−１のｇ ｐ１３は構造上ヘルペスウィルスｇＣ様糖タンパク質の相同物である。
ＥＨＶ−１ｇｐ１４ノ塩基配列が最近報告されり（７１，７２）。
ｇｐ１４ｍタンパク質の予想アミノ酸配列の解析から、１（Ｓｌ’の糖タンパク 質ｇＢとかなりの相同性を有していることが判明した。
幾つかのＥＨＶ−１糖タンパク質に対するモノクローナル抗体が中和抗体である ことが示されている（７６）。受動免疫実験によって、ｇｐ１３もしくはｇｐ１ ４に対するモノクローナル抗体（７７）又はｇ９１３、ｇｐ１４もしくはｇｐｌ ？／１８に対するモノクローナル抗体（７８）が、致死量のウィルスからハムス ターを防御できることが実証された。その他のｇＢ及びｇＣ糖タンパク質アナロ グもアルファヘルペスウィルスに起因する病気の防御機構に関与している（８゜ Ｉｌｌ、　７３）　、　ＥＨＶ−１０）ｇｐ１１／ＩＳ　１１１タンパク質は、 これとは別の潜在的防御免疫原として特徴付けられるが、他のアルファヘルペス ウィルスのＳ領域にコードされた幾つかの塘タンパク質の中でこれと構造的に対 応するものは未だに発見されていない（６６、７９，８０）。ｇｌｌ１７／１８ はそのゲノム内の位置に基づいてＨ３Ｖ　ｇＥアナログらしいと推測されている 。
アルファヘルペスウィルスの一種である仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）はアウジ エスキー病の原因となる病原体である。この病気は感染力が非常に強く、養豚産 業に多大な経済的損失をもたらす。この病気は子豚の罹患率と致死率が高く、重 い呼吸器系疾患、流産、一度に生まれる子豚の数の減少、並びに生き残った豚の 成長速度の低下によって特徴付けられる。感染によって致命的な脳炎に至ること もしばしばある。ヘルペスウィルスに特徴的なウィルスの潜伏感染が成立するこ ともあるが、この場合回復した成豚はウィルスの慢性キャリヤーとなる。
最近の詳細な総説しては、ウィツトマン（Ｗｉｌｌｍａｎ）及びジーハ（Ｒｒｉ ｈａ）のもの（８１）を参照されたい。
ＰＲＹゲノムは　９０ＸＩ０６ダルトンの二本鎖ＤＮＡで構成されており（８２ ）　、倒置反復配列によってユニークロングセグメント（Ｕ、）とユニークショ ートセグメント（Ｕ、）とに隔てられている。ＰＲＹゲノムはおよそ１００個の ポリペプチドをコードしており、それらの発現は他のヘルペスウィルスと同様に カスケード式に調節されている（８５．８６）。現在までのところ、５種類の糖 タンパク質ｇｐｌ、ｇｐＨ，ｇｐＨｌ、ｇｌ１６３及びｇｐ５０がこのウィルス のエンベロープに関連しており、さらにＰＲＹ感染細胞の種々の膜構造にも関連 していることが示されている（８（１，８６−９１）。ＰｌｉＶにコードされた ６番目の糖タンパク質（ｇＸ）は培地中に放出される（９２）。これらの糖タン パク質のＰＲＹゲノム上での位置並びにそれらのＩ）ＩＩＡ配列は現在公知であ る（６２．８０．９ｌ−９８）。他のヘルペスウィルスの場合と同様に、ＰＲＹ 糖タンパク質は、細胞への付着及び侵入並びに細胞からの放出のようなウィルス の基本釣機能を媒介している。ＰＲＹ糖タンパク質はＰＲＶ感染時の病原性に非 常に重要な役割を果たしており、しかも病気の消散及び免疫状態に決定的な役割 を果たす構成要素である。
ＰＲＹ　ｇｐｌはウィルスのインビトロ（＊　ｎ　ｖ　ｉ　＋　「ｏ）及びイン ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での複製には必須でなく、弱毒化ＰＲＶ株の多くには存 在していない（９９）。これらのｇ１欠失株か弱毒性であることは、ｇｌが毒性 に何等かの役割を果たしている可能性のあることを示唆している（９９．１００ ）。ただし、ｇｌが発現しただけではさほど強い毒性を生じないので、他のＰＩ タンパク質もこの機能に関与しているらしい（１０Ｇ）。
ＰＲＹに対する免疫反応の誘起においてｇｌの果たす役割は明らかでない。ｇｌ に対するモノクローナル抗体はインビトロでウィルスを中和しく１００）、受動 免疫マウスを致死量のＰＲＶから防御する（８１）。ワクシニアウィルス組換え 体中で、ＰＲ，Ｖ由来ｇｐｌを単独又はｇｐｓｏ及びｇｐ６３と一緒に発現させ ることが、コスト（Ｋａｒ＋）他によって記載されている（９８）。ワクシニア 組換え体をマウス頭蓋骨に接種すると、特にＰＲＹ　ｇｐｌをｇｐｓｏ及びｇｐ ６３と一緒に発現させた場合に毒性が増大する。
しかしながら、ブタにおいてはｇｐｌに対する中和抗体は産生されない（５）。
さらに、ＰＲＶ　ｇｌ）ｌにコードされるポリペプチドを発現する組換え体ワク シニアウィルス（９８）はマウスを（野生型ワクシニアの対照の与える防御と比 較して）致死量のＰＲＶから防御しない。これらの事実を参酌すると、ＰＲＶ　 ｇｐｌはサブユニットワクチンの構成成分としてよりも、むしろ診断用プローブ として適しているものと思われる。
ＰＲＹ糖タンパク質ｇｐ６３は、ＰＲＹゲノムのＵ　、領域内のｇｐｓｏの隣に 位置している（８０）　、　ＰｌｉＶ　ｇｐ６３ノコ−ト鎖ハ、ｇｐｓｏの終止 コドンの約２０ヌクレオチド上流に位置する３つの連続した＾ＴＧコドンて始ま る。転写シグナルと認め得るモチーフは存在せず、おそら＜　ｇｐｓｏと同じ転 写物から翻訳されるものと思われる。ＰＲＹのｇｐ６３はインビトロでは必須で はない（８８）。コスト（Ｋｏｓｔ）他の報告（９８）によれば、ＰＲＹ　ｇｐ ６３がＰＲＹ　ｇｐ５［Ｂニア７）連続ＤＮＡ配列としてワクシニアウィルス中 で発現した。この研究ではＰＲＶのｇｐ６３とｇｐｓｏのそれぞれの寄与を別個 に分析していないので、ＰＲＹ　ｇｐ６３がＰＲＹ感染に対するマウスの防御に おいて如何なる寄与を果たしているかは評価し難い。
ＰＲＹ糖タンパク質ｇＸは非構造糖タンパク質であり、その最終産物は細胞外液 中に分泌される（８５．９２）。ＰＲＹのｇＸに対するポリクローナル血清又は モノクローナル血清のいずれを用いてもインビトロでのＰＲＹの中和は起こらず （１０２，１０３）　、サブユニットｇＸワクチンは感染に対して非防御性であ った（＋０４）。
ＰＲＹ糖タンパク質ｇｐ５０は、単純ヘルペスウィルス１型（ＩＳＶ”ｌ）　（ ＤｇＤ７＋ｏグであ６　（９７）　。（−）ＤＩＩＡ解読枠は４０２残基のアミ ノ酸をコードする（９５）。グリコジル化された成熟型（５（１−６（ｌｋＤｘ ）は〇−結合による炭水化物を含んでいるが、Ｎ−グリコジル結合は含んでいな い（９５）。ブタ血清はＰＲＶ　ｇｐ５（ｌと強く反応し、その免疫原としての 重要性を示唆している。ｇｐｓｏに対するモノクローナル抗体はインビトロにお いて補体と共に或いは補体なしでＰＲＶを中和しく９７．１０５．１０６）　、 マウス（１０２゜１０５、１０６）及びブタ（１０２）を受動的に防御する。ｇ ｐｓｏを発現するワクシニアウィルス組換え体は血清中和抗体を誘発し、致死量 のＰＲＹに対してマウス及びブタを防御する（９８　、１０７．１０８　）。
ＰＲＹ　ｇｐＨ＋遺伝子はゲノムのＵＬ領領域位置している。
Ｎ３７ｂｐの解読枠は４７０残基のアミノ酸をコードする。予想される５０．９ ｋＬの１次翻訳産物は８カ所の潜在的Ｎ−グリコジル化部位を有する（９６）　 。ＰＩＩＶ　ｇｐＨＮ！）ＩＳＶ−１ｇＣアナログである（９６）　。ＰＲＹ　 ｇｐＨｌをｏｓｖ　ｇｃＴノ機能的に置き換えることはできなかった（ＩＮ）。
Ｐｉｌｌ’　ｇｐＨ＋はインビトロにおける複製には非必須であるが（ＩＩＱ。
ｌ１１）、グリコジル化された成熟型（９８ｋＤａ）はＰ　ＲＶｘンベロープの 主要構成成分である。抗ｇｐＨ＋モノクローナル抗体はインビトロにおいて補体 と共に或いは補体なしてウィルスを中和しく８６．１０６．１１０）　、マウス 及びブタを受動的に防御する（１０２）。ＰＲＹ糖タンパク質ｇｉｌ＋は、大腸 菌（欧州特許出願第０１６２７３８号）又はワクシニア組換え体（欧州特許出願 第０２６１９４０号）中で発現させたＣ＋ｏ／ｇｌｌｌ融合タンパク質による免 疫後、致死量のＰＲＶに対してマウス及びブタを防御する。
ＰＲＶエンベロープの主要構成成分の一つとして・ハングル（Ｈａｍρ１）の命 名法によればｐＲｖ　’ｇｐ＋＋と名付けられている３種類の糖タンパク質のジ スルフィド結合複合体（１２０ｋＤａ、　６７　ｋ　Ｄ　ａ及び５１１ｋＤａ） がある。ＰＲＹ　ｇｐ＋＋をコードするＤＮＡ配列はＵＬの左端に位置している 。２９７６個のヌクレオチドからなる解読枠は、９１．３残基のアミノ酸からな る（ｌＩＯｋＤａ）　１次翻訳産物をコードしている。ＰＲＹノｇｐＨは）ＩＳ Ｖ−１ｇＢ相同物であル（６２）　。ＰＲＹ　ｇｐＨニ対するモノクローナル抗 体はインビトロにおいて（５）補体と共に或いは補体なしで（８１）ウィルスを 中和する。さらに、受動免疫実験の結果、中和モノクローナル抗体はブタを部分 的に防御したが、ビルレントウイルス感染からマウスを防御することはできなか った（＋０２）。ＰＲＹのｇｐｌ＋糖タンパク質によるブタの能動免疫はこれま で報告されていない。
ここ２０年間、単純ヘルペスウィルス２型（ＩＳＶ２）による陰部感染の発生率 は大幅に上昇した。最近の推計では、米国内で５百万人から２千万人が陰部ヘル ペスを保有している（１１２）　ｏ　ＡＣＧ　（ｉｃ７ｃｌｏｙｉｒ）による経 口治療によって１次感染の重篤度が減少しくＩＮ）かつ再発的な症状の再現を抑 制する（＋１４）ことが示されてはいるか、これらの感染症の制御及び治療は理 想からはほど遠い。従って１次感染及び再発感染を防ぐワクチンが必要である。
単純ヘルペスウィルス１型（ＨＳＶＩ）ゲノムは少なくとも８種類の抗原性の異 なる糖タンパク質、ｇＢ、　ｇＣ，ｇＤ、ｇＬ　ｇＧ、ｇＬ　ｇｌ及びｇｌをコ ードしている（１１５）。これらの遺伝子に相同な遺伝子がＨＳＶ２に存在する らしい（＋１６−１１９）。これらの糖タンパク質はウィルス粒子のエンベロー プと感染細胞の細胞質膜の両方に存在するので、体液性免疫防御反応及び細胞性 免疫防御反応を誘起し得る（３７）。
単純ヘルペスウィルス感染に対する防御における体液性免疫と細胞性免疫の相対 的重要性は十分には解明されていない。）ＩｓＶＩの精製ｇＢ、　ｇＣ又はｇＤ で免疫したマウスは致死量ノＨ３ＶＩ感染から防御される（１２０）　。）Ｉｓ ＶＩ　（１２１）もしくはＨ３Ｖ２ウィルス全体（１２２）に対する抗体又は） １ｓＶ２の糖タンパク質ｇＢＳｇＣＳｇＤもしくはｇＥの各々に対する抗体（＋ ２３）で受動免疫したマウスは致死量のｌｌ５Ｖ＋又はＨ５Ｖ２感染から防御さ れる。ただし、放射線照射、シクロホスファミド又は抗胸腺細胞血清で免疫抑制 した動物は防御されないので（＋２４）、この防御は受容能を有するＴ細胞の応 答（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｔ−ｃｅｌｌ　「ｅｓｐｏｎｓｅ）に依存しているら しい。
免疫防御反応の誘起において、個々の糖タンパク質が如何なる寄与をしているか はまだ十分には理解されていない。たたし、これらの糖タンパク質をワクシニア などの異種系中で発現させることによって若干の要因が解析できるようになった 。例えばＨＳＶＩ　ｇＢ（＋２５）又はｌ（ＳＶＩｇＣ（３２）を発現スるワク シニアウィルスベクターは細胞障害性Ｔ細胞応答を誘起することが示されている 。さラニ、ＨＳＶＩ　ｇＢ　（８）　、Ｉｆ’５ｉｌｌ　ｇＣ（１２＆）又ハＨ Ｓ　Ｖ　Ｉ　ｇ　Ｄ（２６）のいずれかを発現する組換えワクシニアウィルスで 免疫したマウスは、致死量のＨＳＶＩに対して防御されることが示されている。
ＨＳＶＩ　ｇＤを発現する組換えワクシニアウィルスは、また、モルモットを用 いたモデル系において、ＨＳＶ２に対する防御力のあることか示されている。
しかしながら、多重１（ＳＶ抗原を発現させたときに上記防御反応が強化される か否かは不明である。
ウシヘルペスウィルス１型（ｂｏｖｉｎｅ　ｈｅ＋ｐｅｓｖｉｒｕｓ）Ｉｒｐｅ 　］、略してＢＨＶＩ）は結膜炎、外陰部膣炎及び流産などの畜生の種々の病気 の病原体である（１２７）。このウィルスはウシ呼吸器病の最も重要な病原体の 一つであり、直接作用することもあるし、細菌感染に対する素因病原体として作 用することもある（＋２１１）。
ＢＨＶには３０種類以上の特異的構造ポリペプチドが存在し、そのうちの１１種 類はグリコジル化されている（１２９）。これらの糖タンパク質のうちの４つ、 即ちｇｌ、ｇｌｌ、ｇｌｌｌ及びｇｌＶが既に特徴付けられており、単純ヘルペ スウィルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質ｇＢ、　ｇＣＳｇＤ及びｇＥの相同物であ ることが判明している（１３０．１３１）。
ｇｌ、ｇｌｌｌ及び／又はｇｌからなるサブユニットワクチンが畜牛を病気から 防御することは（８１（Ｖ／パスツリア・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕ＋ｅｌｌ ａ　ｈａｅｍｏｌＹ＋１ｃａｌエーロゾル感染モデル系を用いて）示されている が、感染を防ぐことはできない（＋３２）。これらの結果は、ＢＨＶＩに対する 免疫反応を十分に誘起する上でのこれらの糖タンパク質の重要性を示している。
ｇｌ及びｇｌｌｌはワクシニアウィルスにもクローン化されており、これらの組 換え体で免疫した畜生はＢＩＩＶＩに対する中和抗体を産生ずる（５６，１３３ ）。
ネコの鼻気管炎は世界中に蔓延している猫の病気であって、ネコヘルペスウィル ス１型（Ｉｅｌｉｎｅ　ｈｅｒρｅｌ−ｖｉ＋ｕｓ　ｔｙｐｅ　ｌ、略してＰＨ Ｖ−１）と名付けられたアルファヘルペスウィルスによって引き起こされる。他 のヘルペスウィルスと同様に、ＦＨＶ−１は潜伏感染を成立し、周期的に再活性 化される（＋３４）。繁殖集団中でのＦＨＶ感染は子猫の死亡率が高いことを特 徴とする。上部気道で２次感染が起きると成体を非常に衰弱させる。修飾生ワク チン又は不活性ワクチンを用いてこの病気を制御する試みが現在なされている。
かかるワクチンは症状の発展を抑制することはできるが、感染を防ぐことはでき ず、ウィルスが発散してしまう。従って、無症状のワクチン接種猫はビルレント ウイルスを伝播することがあり、既存のワクチン（＋３５）又は開発中のより安 全な精製サブユニットワクチン（１３６，１３７）では潜伏感染を防ぐことはヘ ルペスウィルス糖タンパク質は宿主細胞へのウィルス粒子の付着を媒介し、ウィ ルスの感染力に非常に重要である（１３８．１３９）。これらはウィルスの亜型 特異性をも決定する（＋４０）。ヘルペスウィルス糖タンパク質抗原は体液性及 び細胞性免疫系の双方によって認識され、ワクチン接種した宿主中での免疫防御 反応を誘発することが示されている（４４，１０７．１４１．１４２）。ＦＨＶ −１は少なくとも２３種類の異なるタンパク質を含んでいる（１４３．１４４） 。これらの中の少なくとも５種類のタンパク質がグリコジル化されており（１４ ４，１４５）　、それらの分子量は１２０ｋＤａから６０ｋＤａの範囲にあると 報告されている。ＦＩＩＶ−］糖タンパク質は免疫原性を有する事が示されてい る（１４３．１４５）。
幾つかの他のアルファヘルペスウィルスと同様、Ｆｌ（Ｖ−１はＨＳＶ−１の糖 タンパク質Ｂ　（ｇＢ）の相同物を有するらしく、ＦＨＶ−１１Ｂ遺伝子の部分 的塩基配列が最近報告された（＋４６）。ＨＳＶ−１ｇＢはウィルスの侵入及び 細胞融合に必要とされる（１４７−１４９）　。ＩＬＳＶ−１ｇＢ及び他ノヘル ヘスウイルスのｇＢアナログは重要な循環体液性抗体並びに細胞性免疫反応を誘 起する（８．１０．３７．４７゜７３．１５０）　、　ＦＨＶ−１のｇ８糖タン パク質は１３４ｋｌの複合体で、β−メルカプトエタノールによって６６ｋＤｚ と６１１ｋＤａの２つの糖タンパク質に解離する。Ｆ）ＩＹ−１の［ｌＮ＾ゲノ ムの大きさはおよそ＋３４Ｋｂである（＋５３）。
ヒトＢリンパ球由来ヘルペスウィルスであるエプスタイン・バールウィルス（Ｅ ｐ＋ｔｅｉｎ−Ｂａｕ　ｖｉｒｕ＋、略してεａｙ）は、ガンマヘルペスウィル スｆｇａｍｍａｈｅ＋ｐ＋＋ｖｉ＋ｕｓ）亜科のリンホクリプトウイルス属（Ｌ ｙｍｐｈｏｃｒｙｐｌｏｖｉｒｕｓ）の一種である（１１５　’）。このウィル スは伝染性単核症（＋５４）及びＢ細胞リンパ腫（１５６）の病原体である。
ＥＢＶは２種類のヒトの悪性腫瘍、即ち風土的なバーキットリンパ腫並びに未分 化上咽頭かんと関係している（＋５６）。
Ｖ２Ｖ（６６）及びｌｌ５ＶＩ　（１５８）　（７）ゲノムと同様にＥＢｖゲノ ムの塩基配列は完全に決定されており（２０？）、これらの異なるヘルペスウィ ルス間における多くの相同性が判明している（＋５９）。かかる相同性に基づい てＥＢＶの幾つかの解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ＩｒａＴＩＩｅ　；略 してＯＲＦ）の潜在的機能が予想されたこともある。免疫に関連する■ＳＶＩ遺 伝子と相同なＥＢＶ遺伝子が特に興味深い。ＥＢＶＢＡＬＦ４遺伝子はＩＳＶＩ 　ｇＢ　（６８）と、ＥＢＶ　ＢＸ［、Ｆ２遺伝子ハＨＳＶＩ　ｇＨ（１６１） と相同性を有しテイル。また、Ｅ［１Ｙ８８ＲＦ３遺伝子はＣＭＶの膜タンパク 質（＋６２）との相同性部位を含んでいる。
ＥＢＶタンパク質の中でワクチン抗原として使用できそうなもののうち最も特徴 付けられているのは、２つの主要エンベロープ糖タンパク質、即ちｇｐ３４０と ｇｐ２２０である。この２つの糖タンパク質は同一の遺伝子からスプライシング によって得られる。このとき読取り枠に変化はない（１６３，１６４）。ｇｐ３ ４０に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル血清はインビトロでＥＢＶ を中和する（＋６５）、精製ｇｐ３４０　（１６６）並びに組換えＥＢＶ　ｇｐ ３４Ｑワクシニアウィルス（１６７）で免疫するによって、唯一の罹患性動物で ある綿毛タマリン（ｃｏ＋ｔｏｎｔｏｐ　ｆａｍａ＋ｉｎ）を防御することがで きる。この場合、ワクシニアＷＲ株由来の組換え体では防御できたが、ワクシニ アのワイエス（Ｗｙｅｌｈ１株由来の組換え体では防御できなかった。ワイエス 株はワクチン株として広範に使用されているものである。
ｇｐ８５　（Ｅ　Ｂ　ＶニおけルＨ５ＶＩ　ｇＨ相同物）ニ対スルモノクローナ ル抗体はインビトロ中和抗体であると記載されている（１６８．１６９）。
ヒトサイトメガロウィルス（ｈｕｍａｎ　ｃ７ｆｏｍｅｇａｌｏｖｉ＋ｕｓ。
略してＩＩｃＭＶ）は、ベータヘルペスウィルス（ｂｅｌｚｈｅｔｐｅｓｖｉｒ ｕｓｌ亜科（ヘルペスウィルス科）の一種である。ＨＣＭＶは、特異的免疫が実 質的に成立していても、増殖性の持続感染を生じ得る。ＨＣＭＶは普通余り高い 病原性は有さないとはいっても、尿管内感染は新生児全体の約０．１５％に脳障 害又は難聴をもたらし、かつ臓器移植時の最も一般的な感染性合併症である（１ ７０）。実験的な弱毒化生ＩＣＭＶワクチン（タウン（Ｔｏｖｎｅ））株の効能 が実証されてはいるものの（＋７１）、生ワクチン株についての関心はサブユニ ットワクチンとして使用可能な）ＩＣＩＪＶタンパク質の同定に研究を方向付け ている。かかる研究においては、ウィルス粒子の糖タンパク質の同定並びにそれ らの予防薬としての評価が重要なステップとなる。
ＨＣＭＶエンベロープ関連糖タンパク質として免疫学的に区別される３つの群が 記載されている（＋７２）。即ち、ｇ　ＣＩ　（ｇｐ５５及びｇｐ９３−１３０ ）　、ｇｃｌｌ　（ｇｐ４７−５２）及びｇｃＩＩＩ　（ｇｐ８５−ｐ１４５） である。
ｇｃＩをコードする遺伝子は）ＩＳＶＩ　ｇＢと相同である。ｇＣＩ＋糖タンパ ク質は、直列に配置されかつ１カ所もしくは２カ所の相同性領域を有する５つの 遺伝子ファミリー（）ＩＸＬＦ）でコードされている。ただし、ｇｃｌｌは５つ の遺伝子の中の２つの遺伝子だけでコードされている可能性が高い（１７２，１ ７３）。ｇｃｌ　ｌ　１をコードする遺伝子は１１ｓＶＩ　ｇＨと相同であル（ １’７４）。
上記の３つの群のそれぞれに対して特異的なインビトロ中和抗体が記載されてい る（＋７４−１７６）。
ヘルペスウィルス抗原に対する抗体の産生（宿主による）を誘起する抗原決定基 として宿主中で発現するような外来ウマヘルペスウィルス遺伝子を保有する適切 に修飾されたポックスウィルス変異株は、新規ワクチンを与えるが、かかる新規 ワクチンは従前の死滅又は弱毒化生ウィルスを用いるワクチンの欠点を有さない 。従って、例えば死滅ウィルスからワクチンを生産するには、大量のウィルスを 増殖させ、次いで抗原性に影響を与えずにその感染力を選択的に破壊処理する必 要かある。一方、弱毒化生ウィルスを含有するワクチンには、該弱毒化ウィルス か病原状態に復帰する可能性か常に存在する。これに対して、病原性ヘルペスウ ィルスの抗原決定基をコードするウマヘルペスウィルス遺伝子で適切に修飾した 組換えポックスウィルスをワクチンとして用いる場合、かかるポックスウィルス は病原性ウィルスの抗原決定基をコードする遺伝子しか含んでおらず、病原体の 複製を担う遺伝子部分は含んでいないので病原性ウィルスに復帰する可能性はな い。
ＰＲＹは多くの哺乳類（牛や犬など）に感染してその命を奪う。しかしながら、 成豚は感染しても通常は生き残るので、重要なウィルス保菌宿主である。ＰＲＹ は多大な経済的損失をもたらすので、弱毒化又は死滅ワクチンによる豚のワクチ ン接種は多くの国々で行なわれている。
豚のＰＲＹ感染を抑制し、かつ経済的損失を軽減する試みは、修飾生ワクチン又 は不活化ワクチンを用いる能動免疫によって行なわれてきた。弱毒化ワクチンは 一般に長期間持続する免疫を誘起し、価格面での効果も高いが、弱毒化が不十分 である危険性や遺伝的に不安定である危険性がある。不活化ワクチンは有効性が 低く、何度も免疫する必要があり、強いアジュバントを含んでいるのが普通であ る。このようなアジュバントを配合すると、ワクチン接種後に食欲不振、高熱又 は妊娠中の雌豚の流産などのアレルギー反応を起こす場合がある。かかるタイプ のワクチンにはさらに、潜伏感染の予防、ワクチンの効能に対する母性抗体の効 果の克服、並びにワクチン接種動物をＰＲＶ既感染動物から識別するための血清 学的診断検定の使用の可能性の消失の面で欠点がある。
免疫学的関連性を有するＰＲＹ遺伝子産物を発現する組換えポックスウィルスの 使用などのような別のワクチン法には、［）場から弱毒化生ＰＲＹワクチン株を 排除できること、並びに（ｂｌワクチン接種動物と感染もしくは血清学的陽性動 物との識別ができることなどの、幾つかの利点がある。後者は、ワクチン接種動 物を自然感染動物と正確に識別するような適当な診断薬を使用することによって 達成できる。このことは、血清学的に陽性な動物の移動を取締まる規制が存在す るので、考慮すべき重要な事項である。ワクチン接種は、さらに、ある集団から 感染動物を試験し排除するのに、より経済的で都合がよい。かかるワクチンの開 発には、防御免疫を誘起する際のＰＲＹ抗原の寄与に関する知識を必要とする。
ＰＲＶの場合は、ヘルペスウィルス科の他のウィルスと同様に、糖タンパク質が 、有効なサブユニット組換えワクチン中に存在せしめるべき抗原の重要候補であ る。
最近、ワタシニアウイルス組換え体の作成技術が、ポックスウィルス科のさらに 宿主域の限定された池のウィルスにまで拡張された。特に、鳥類の中で複製する アビポックスウィルスが、免疫学的関連性を有する遺伝子産物を発現するように 遺伝子工学的に組換えられている。
アビボックス組換え体を鳥類（４２，１７７）及び非鳥類（４１）に接種すると 、対応する病原体に対する免疫防御反応を誘起する。
ＢＨＶＩに対する弱毒化生ワクチン及び不活化ワクチンは、３０年以上も利用さ れており、ＢＨＶ　ｌ関連病の発生率を十分に低下させてきた。しかしながら、 これらのワクチンは潜伏感染や野生型ウィルスによる再感染を予防しない。
これらのワクチンは、感染動物とワクチン接種動物との識別を複雑化させる。
どちらのタイプのワクチンも他の重大な欠点を有する。妊娠中の雌牛に弱毒化生 ワクチンを接種すると、胎児が死んで流産することもある（＋２７）。さらに、 ワクチン接種動物はウィルスを発散することが示されている（１７８）。従って 、妊娠中の雌牛と一緒に飼育しているワクチン接種動物は、妊娠中の雌牛に感染 性ウィルスを伝播し、胎児を流産させてしまうこともある。
不活化ワクチンは流産を誘発したりウィルスの放出を引き起こすことはない。し かしながら、不活化ワクチンはアジュバントを必要とし、過敏症（アナフィラキ シ−）及び非致命的炎症及び発熱を引き起こす場合がある（＋７９）。
ワクチン接種における最も重要な問題の一つは、母性免疫を克服もしくは回避す ることである。これに関して、仮に母親がある特定の病原体に対する免疫を獲得 していると、母親における「免疫」は初乳中に存在する抗体及）　び／又は他の 経路を介して新生児に伝達される。しかしながら、新生児には母性免疫のレベル が十分に薄れるまでワクチン接種してもうまくいかない。従って、効能をなくす ような母性免疫の存在下で新生児に成功裡にワクチン接種することのできる余地 は僅かしかない。
のであって、現在の技術水準をはるかに超えた進歩であニワトリポックスウィル ス（ｊｏｗｌｐｏｒ　マｉ＋ｕｓ）又はカナ１ノための方法を供することも本発 明の別の目的の一つであイルス中和抗体及び防御免疫を誘起することのできるワ 以下の記載に照らせば、よりいっそう容易に理解できるはすである。
発明の説明 本発明は、その一つの態様において、ポ・ソクスウイルスゲノムの非必須領域中 にヘルペスウィルス由来のＤＮＡ配列を含有する組換えポックスウィルスに関す る。好適には、上記ヘルペスウィルスはアルファヘルペスウィルス亜科、ベータ ヘルペスウィルス亜科又はガンマヘルペスウィルス亜科の一種である。詳細には 、上記ヘルペスウィルス由来のＤＮＡ配列はヘルペスウィルス糖タンパク質をコ ードする。より詳細には、上記ヘルペスウィルス糖タンパク質は、ウマヘルペス ウィルスｇｐ１３、ウマヘルペスウィルスｇｐ１４、ウマヘルペスウィルスｇＤ １ウマヘルペスウィルスｇｌ１６３、ウマヘルペスウィルスｇＥ１仮性狂犬病ウ ィルスｇｐ５０、仮性狂犬病ウィルスｇｐＨ、仮性狂犬病ウィルスｇｐＨＬ仮性 狂犬病ウィルスｇ９１．単純ヘルペスウィルスｇＢ、単純ヘルペスウィルスｇＣ １単純ヘルペスウィルスｇＤ１ウシヘルペスウィルスｇ１、ネコヘルペスウィル スｇＢ１エプスタイン・バールウィルスｇ　ｐ　２２０、エプスタイン・バール ウィルス、　ｐ　３４　Ｇ、エプスタイン・バールウィルスｇＢ１エプスタイン 番バールウィルスｇＨ及びヒトサイトメガロウィルスｇＢからなる群から選択さ れる。
本発明においては、該組換えポックスウィルスは外来ヘルペスウィルス遺伝子の 遺伝子産物を発現する。詳細には、上記外来ＤＮＡ配列はヘルペスウィルス塘タ ンパク質をコードするものであり、該外来ＤＮＡ配列はヘルペスウィルス糖タン パク質の産生によって宿主中で発現する。
好適には、組換えポックスウィルスによって複数のヘルペスウィルス糖タンパク 質を宿主中で同時発現させる。
ポックスウィルスは好適にはワクシニアウィルス又はアビポックスウィルスにニ ワトリポックスウィルスもしくはカナリアポックスウィルスなど）である。
本発明は、別の態様において、ワクチン接種した宿主動物中で免疫応答を誘起さ せるためのワクチンにワクチンにして、ヘルペスウィルス由来のＤＮＡをポック スウィルスゲノムの非必須領域中に含有する組換えポックスウィルスと担体とを 含むワクチンに関する。より詳細には、上記ＯＮ＾はヘルペスウィルス糖タンパ ク質をコードし、発現する。好適には、上記ポックスウィルスによって複数のヘ ルペスウィルス糖タンパク質を宿主中で同時発現させる。本発明で使用するポッ クスウィルスは、好適には、ワクシニアウィルス又はアビポックスウィルスにニ ワトリポックスウィルスもしくはカナリアポックスウィルスなど）である。
本発明は、別の態様において、母性免疫の問題を回避する機構に関する。投与抗 体に対する抗体が存在することが障害になっているとすると、母性免疫による障 害は、ある部分集合に限定した抗原群を発現するベクターを選択的に使用するこ とによって解決もしくは回避できる。
例えば、妊娠中の動物には、仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質ｇｐ５０を発現す る組換えワクシニアウィルスワクチンを接種することができ、その子には、出産 時もしくは出産後まもなく、別の仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質ｇｐｌ＋又は １ｐ＋＋＋又はその組合わせを発現するワクシニア組換え体ワクチンを接種する ことができる。一方、母性免疫による障害がベクターによるものであるとすれば 、母親をあるベクター（ワクシニア又はアビボックス）で、子を別のベクターで 差別的にワクチン接種すればよい。
この手順は、無論、異なるベクターを使用することのみならず、異なる型の糖タ ンパク質を発現するベクターを使用するこさをも考慮に入れたものである。従っ て、本発明は他の方法では新生児にうまく免疫賦与することのできない母性免疫 を解決もしくは回避する方法に関する。本発明では、ポックスウィルスゲノムの 非必須領域に非ボックス由来のＤＮＡを含有する組換えポックスウィルスを新生 児に接種するが、該ＯＮ＾は新生児の病原体の第一の抗原をコードするもので、 しがも該抗原は該新生児の母親において同一病原体に対する免疫応答を誘起する ために使用した同一病原体の第二の抗原とは異なるものである。また、本発明で は、第一のポックスウィルスゲノムの非必須領域に非ボックス由来のＤＮＡを含 有する第一の組換えポックスウィルスを新生児に接種するが、該ＤＮＡは新生児 の病原体の抗原をコードするもので、該第−のポックスウィルスは該新生児の母 親において同一病原体に対する免疫応答を誘起するために使用した第二の組換え ポックスウィルスとは異なるものである。
図面の簡単な説明 本発明は添付図面を参照することによってより深く理解できると思われる。
図１は、組換えワクシニアウィルスｖＰ４２５の構築方法を図示したものである 。
図２は、εＨＶ−１ノｇｐ＋３−７−ド配列を含有すル１．８８Ｋｂ７ラグメン トのＤＮＡ配列を示したものである。
図３は、εＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子を含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ４ ８３の構築方法を図示したものである。
図４は、組換えワクシニアウィルスｖＰ４５８の構築方法を図示したものである 。
図５は、ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子を含有する組換えワクシニアウィルスマＰ５ ７７の構築方法を図示したものである。
図６は、ＥＩＩＶ−１ノｇｐ１４Ｆ−ド配列を含有すル３．３５Ｋｂフラグメン トのＤＮＡ配列を示したものである。
図７は、ＥＩＩＶ−１ｇ＋１１４コード配列に対して相対的親水性度をプロット したものである。
図８は、ＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子を含有する組換えニワトリポックスウィルス ｖＦＰ４４の構築方法を図示したものである。
図９は、ＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子を含有する組換えカナリアポックスウィルス ｖＣＰ４８の構築方法を図示したものである。
図１０は、修飾型ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子を含有するドナープラスミドｐ１（ ＥＳ−Ｍｌ’６３、ｐｉ（ＥＳ−ＭＰＩ及びｐＨＥｓ−ＭＰ３４０）構築方法を 図示したものである。
図１１は、Ｅｌ（１１ケン９　ｙ　キー　Ｄ株）ＢｘｆｆｌＨＩ切断部位地図で あり、ゲノムの倒置反復配列は四角で示しである。
６つの主要ＥＩＩｖ−１糖タンパク質遺伝子の位置、並びにゲノムの領域の拡張 部分（ｇＤ、　ｇｐ６３及びｇＥ遺伝子が含まれる）が示しである。
図１２は、ＥＨＶ−１ノｇＤ、　ｇｐ６３及びｇＥ＋　−ト配列ヲ含有する６４ ０２ｂｐフラグメントの塩基配列を示したものである。
図１３は、ＥＨＶ−１ｇＤを構成する４０２残基のアミノ酸配列の疎水性度をプ ロットしたものである。
図１４は、ＥｆｌＶ−１ｇｐ６３を構成する４１３残基のアミノ酸配列の疎水性 度をプロットしたものである。
図１５は、Ｅｌ（Ｖ−１ｇＥを構成する５５２残基のアミノ酸配列の疎水性度を プロットしたものである。
図１６は、ドナープラスミド　ｐＪｃＡ（１０６、ｐＪｃＡＯＯ７及びｐＪｃＡ ＯＯ８（ソれぞれＷＨＶ−１ｇＤ遺伝子、ＥＨＶ−１ｇＥ遺伝子及びＥＨＶ−１ ｇｐ６３遺伝子を含有する）の構築方法、並びにこれらの遺伝子を含有する組換 えワクシニアウィルスの作成方法を図示したものである。
図１７は、ドナープラスミドｐＪｃＡ００〇　（ＥＨｖｇ由来）ｇＤ及びｇｐ６ ３遺伝子を含有する）及びｐｌｃＡ［ｌＩＯ（ＥＨＶ−１由来のｇＤ、　ｇＥ及 びｇｐ６３遺伝子を含有する）の構築方法、並びにこれらの遺伝子を含有する組 換えワクシニアウィルスの作成方法を図示したものである。
図１８は、ＰＲＹ　ｇｐｌ！遺伝子を含有するドナープラスミドＰＲ１８の構築 方法、並びにＩ’ｌｌＶ　ｇｐ＋＋遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルス の作成方法を図示したものである。
図１９は、Ｉ’ｌｌＶ　ｇｐＨ解読枠のＤＮＡ配列を示したものであ図２０は、 ＰＲＹ　ｇｐＨ１遺伝子を含有するドナープラスミドｐＰＲ２４の構築方法、並 びにＰＲＹ　ｇｐＨ＋遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスの作成方法を 図示したものである。
図２１は、ＰＲＹ　ｇｐＨ＋解読枠のＤＮ’Ａ配列を示したものである。
図２２は、ＰＲＹ　ｇｐ５０遺伝子を含有するドナープラスミドｐＰＲ２６の構 築方法、並びにＰＲＶ　ｇｐ５Ｑ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスの 作成方法を図示したものである。
図２３は、ＰＲＹ　ｇｐ５０解読枠のＤＮ＾配列を示したものである。
図２４ハ、プラスミドＩＩＳ［１４７１１ＶＣ及び１ｌｓＤ４７９Ｖｃ［１Ｇ（ ７）構築方法、並びにβ−ガラクトシダーゼのワクシニアウィルスへの挿入方法 を図示したものである。
図２５は、プラスミドｐＭＰ１３ＰＰの構築方法を図示したものである。
図２６は、ＰＩＩＶ　ｇｐＨ遺伝子を含有するプラスミドｐＦＰＰＲＶ１１の構 築方法を図示したものである。
図２７は、ＰＲＶ　ｇｐｌ＋遺伝子を発現する組換えカナリアポックスウィルス ｖＣＰ５５の構築方法を図示したものである。
図２８は、ＰＩ　ｇ９１遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスｖＰ７１７ の構築方法を図示したものである。
図２９は、Ｈ３Ｖ−２ｇＢ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスｖＰ５６ ９及びｖＰ７３４の構築方法を図示したものである。
図３０は、Ｈ５Ｖ−２ｇｃ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスマＰ５７ ９、ｖＰ７４ｇ及びｖＰ７７６の構築方法を図示したものである。
図３１は、Ｈ５Ｖ−２ｇＤ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスｖＰ５７ ０、ｖＰ７６１．　ｖＰ７７５及びｖＰ７７７の構築方法を図示したものである 。
図３２は、ＢＨＶ−１ｇｌ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスマＰ６３ ７及びマＰ７２４の構築方法を図示したものである。
図３３は、ＦＨＶ−１ｇＢ遺伝子を含有するドナープラスミドｐＪｃＡＯＯＩの 構築方法、並びにＦＨＶ−１ｇＢ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスｖ Ｐ７１３の構築方法を図示したものである。
図３４は、ＦＲＹ−１の糖タンパク質［８をコードするＤＮＡの３４００塩基対 部分の塩基配列を示したものである。
図３５は、ＦＨＶ−１ｇＢを構成する９４７残基のアミノ酸配列の疎水性度をプ ロットしたものである。
図３６は、ＥＢＶ　ｇｐ２２０遺伝子を含有するドナープラスミド４Ｇ９ｇｐ２ ２０、及びＥＢＶ　ｇｐ３４Ｇ遺伝子を含有するドナープラスミド４Ｇ９ｇｐ３ ４Ｇの構築方法の構築方法を図示したものである。
図３７は、ＥＢＶ　ｇＢ遺伝子を含有するワクシニアドナーブラフミド４ｉ１９ ｇｆｌの構築方法を図示したものである。
図３８は、ＥＢＶ　ｇＨ遺伝子を含有するワクシニアドナープラスミド４８６ｇ Ｈの構築方法を図示したものである。
図３９は、ＥＢＶ由来）ｇ　ｐ　３’４０、ｇＢ及びｇ）ｌ遺伝子を含有するワ クシニアドナープラスミド５１３ｇＨｇ［１ｇｐ３４（ｌの構造を図示したもの である。
図４０は、ＣＭＶ　ｇＢ遺伝子を含有するワクシニアドナープラスミド４０９Ｃ ＭＶｇＢの構築方法を図示したものである。
図４１は、ＨＣＩＩＶ　（タウン株）のＨＸＬＦＩ遺伝子の塩基配列及びアミノ 酸配列を示したものである。
図４２は、ＨＣＭＶ　（タウン株）の１ｌＸＬＦ２遺伝子の塩基配列及びアミノ 酸配列を示したものである。
発明の詳細な説明 本発明とその利点は、説明のために挙げる以下の実施例から、より深く理解され るであろう。
烈」ニーウマヘルペスウィルスｇｐ１３糖タンパク質を発現する組換えワクシニ アウィルスの構築この例で使用したワクシニアウイルスコペンハーゲン株は、ロ ータ・メリュー社（［Ｒｈｏ＋ｕ　Ｍｅ口ｅｕｘ、Ｉｎｃ、　）、ジョーシア州 アセンズ（Ａ＋ｈｅｎｓｌ）から入手した。
このウィルスは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するイーグルの最小必須 培地（ＭＥｌｌＩ）中のＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ８１）又はＭＲＣ− ５（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ７１）上の精製プラーク単離物から増殖させた。野生 型ウィルスから、常法（２５，２８）によりチミジンキナーゼ遺伝子の全コード 配列を欠失させた誘導型を単離し、これをｖＰ４１０と命名した。このチミジン キナーゼ欠失変異株をそれ以降の操作に使用した。プラスミドの構築、スクリー ニング及び増殖は常法（２Ｇ、　２７．２８）に従った。
図１を参照して説明する。ワクシニアウィルスの１３ＫｂＳａｌｌ　Ｆフラグメ ント（Ｈ口ｄｌｌｌ　Ａ／Ｂフラグメント連結部にまたがる）を５ａｌｌ消化ｐ Ｕｃ８に連結して、ｐｓＤ４１９Ｖｃを得た。ｐｓＤ４１９Ｖｃの右側アーム（ ａｒｍ）　（Ｓ、ａｌｌ　ＦフラグメントのＨｉｎｄｌｌｌ　８部分に対応する ）をＨｉｎｄｌｌｌで消化して除去し、次イテ連結１．　テ９ＳＤ４５６ＶＣを 得た。ｐｓＤ４５６Ｖｃは従ってＨｉｎｄｌｌｌ　Ａフラグメントの右端を含ん でおり、この中には赤血球凝集素（Ｈ＾）遺伝子（３５）の全コード領域及びそ の両隣の約０．４Ｋｂのワクシニア配列が存在する。
実質上１１Ａコード配列を含まないプラスミドベクターを作成するために、ｐｓ Ｄ４５６ＶｃをＨＡ遺伝子上流のＲｓｘ１部位で切断（部分消化）し、かつＨＡ 遺伝子の３′末端から８０塩基対離れたＥａｇ１部位で切断した。約３．５にｂ のＲｓａｌ／Ｅａｇｌフラグメントをアガロースゲルから単離した。
Ｒｓａ１部位からＩＩＡコード配列の２塩基上流までの領域を置き換え、その直 後にＢｇｌｌｌ　、Ｓｍａｌ及びＰｓｌｌ制限酵素部位並びにＥｘｇｌ付着末端 が続くように、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９−６２を調製した。ＭＰ ＳＹＮ５９−６２の配列とその上記制限酵素部位は以下の通りである。
５’　−ＡＣＡＣＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＣＴＡ＾＾ＧＴＡＴＴＴＧＧ＾＾ＡＧＴ ＴＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＴＴＧＡＴＡＧ＾＾ＣＡＡ３’　−ＴＧＴＧＣＴＴＡＣ ＴＡＡＡＡＧＡＴＴτＣＡＴ＾＾ＡＣＣＴＴＴＣ人Ａ人＾ＴＡＴＣＣＡＴＣＡＡ ＣＴＡＴＣＴＴＧＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡｎＴＴＧＴＡ＾＾ＡＡＴＡＡ　ＡＴＣ Ａ　ＣＴＴＴＴＴＡＴＡ　ＣＴＡＡＧ　ＡＴＣＴ　ＣＣＣＧＧＧ　ＣＴＧＣＡＧ 　b−３’ ＴＴＡＴＧＴＡ丁ＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧ丁ＧＡＡＡＡＡＴＡＴ ＧＡ丁丁Ｃ丁ＡＧＡＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＧ−T’ ｊ遅１奥１　世１　石１ ７　ニー　４　サセｆ＝　ＭＰＳＹＮ５９−６２混合物を、ｐｓＤ４５６Ｖｃ由 来の上記３．５ＫｂのＲｓａｌ／Ｅａｇｌフラグメントに連結して、ｐＳＤ４６ ６ＶＣを得た。従って、ｐｓＤ４６６Ｖｃにおいては、ＨＡ遺伝子がポリリンカ ー領域に置き換っている。
ワクシニアｌ１ｋＤａプロモーター（７）の転写調節下に置かれたｐＭｃ１８７ １　（３４）由来の大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する３、２Ｋｂの Ｂｇｌｌｌ／８ａｍＨ１（部分）フラグメントを、Ｂｇｌｌ＋で消化しておいた ｐＳＤ４６６ＶＣ中にクローン化した。ｌ　１ｋＤａプロモーター／β−ガラク トシダーゼ遺伝子カセット（両隣のワクシニアアームに対して左から右の方向に 置かれている）を含有するプラスミドをｐｓＤ４６６ＶｃＢＧ＾と命名した。こ のプラスミドを、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のチミジンキナーゼ欠失 変異株マＰ４１０と組換えて、β−ガラクトシダーゼを発現するワクシニア組換 え体ＶＰ４２５を得た。ワクシニアゲノムに対して右から左に転写される短い潜 在的解読枠を破壊しないように、Ｈ＾遺伝子のカルボキシ末端の８０ｂｐを残し た。
組換えワクシニアウィルスｖＰ４２５　（１８４）は、文献記載の通り（９，２ ４）、発色基質Ｘ−ｇａ　Ｉ存在下での青色プラーク形成に基づいて同定した。
後続のワクシニア組換え体においてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をさらに別の外 来遺伝子で置き換えた場合、青色プラークの代りに無色のプラークを単離するこ とによって容易に獲得することができる。
以降のクローニング工程を簡単にするために、９ＳＤ４６６ＶＣを８１１１１１ （＋／ＥＣ０ＲＩで消化し、大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑 末端とし、かつ再連結することによって、ｐＵｃ８マルチクローニング領域由来 のＳ＋ｎａ１部位を除去した。従って、得られたプラスミドｐｓＤ４６７Ｖｃに 残っている唯一のＳｍ１１部位はＨ＾欠失部のポリリンカー領域中にある。
ＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子をコードするＤＮＡの同定筒タンパク質ＥＨＶ−１ｇ ｐ１３をコードする　ＤＮＡ配列は、ＥＨＶ−１の７ＪＫｂ　ＢｘｍｌｌＬＨフ ラグメント中に存在する（３）。ｐＵＣ（Ｂａｍｌｌ１４］領域から、重複サブ クローンを利用し、修飾Ｔ７酵素［シーケナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）Ｊ　（ ４０）（ＵＳバイオケミカルズ社（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｊ製、オ ハイオ州クリーブランド）を用いて、それぞれの鎖について塩基配列に関するデ ータを得た。アルカリ中で変性した二本鎖鋳型プラスミドについて標準的なジデ オキシチェーンターミネーション法（３３）を行なった。正逆両方向のＭＩ３プ ライマーを用いて各クローンの最初の塩基配列を得た。標準的な化学的手法（バ イオサーチ８１００　（ｔｌｉｏｓｅａｒｃｈ　８７ＱＱｌ　（カリ７ｆルニア 州サンラフアニル（Ｓａｎ　Ｒａ１ａｅｌ））　、アブライドーバイオシステム ズ３８０Ｂ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓＨｌｅｍｓ　３８０８１　（カリフォ ルニア州フォスターシティ−（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ））　）で合成した＋６ −１７量体プライマーを用いて残りのフラグメントの塩基配列を決定した。塩基 配列のデータ解析にはすべてＩＢＩパステル（ＩＢＩ　Ｐｕ５ｔｅｌｌ）配列決 定プログラム（２９）を使用した。
ＤＮＡ配列の解析から、４６８残基のアミノ酸からなる推定５０．９ｋＤａの１ 次翻訳生成物、をコードする１４０４ｂｐの解読枠が明らかになった。ｇｌｌ１ ３解読枠の予想アミノ酸配列のカルボキシ末端側は、単純ヘルペスウィルス１型 及び２型のｇＣ１仮性狂犬病ウィルスのｇｌｌ＋及び水痘帯状庖疹ウィルスのｇ ９Ｖとかなりの相同性を有しており、ｇｐ１３がヘルペスウィルスのｇＣ様糖タ ンパク質群に属することを示唆している。ＥＩＩＶ〜Ｉ　ｇｐ１３解読枠のより 詳細な解析は先行文献（２）に記載されている。ワクシニアベクター中でのＥＨ Ｖ−１ｇｐ１３解読枠のクローニング及び発現に関する説明を容易にするために 、ｇｐ１３解読枠並びに５゛及び３′側の配列を図２に示しである。図２におい ては、ＴＡＴＡボックスと推定される塩基配列、並びにシグナルペプチドと膜ア ンカーペプチドと推定されるアミノ酸部分に下線を施した。切断シグナル「＾５ ＡＪ（中抜きの丸印で示した部分）に続くシグナル配列の仮想切断部位を矢印で 示した。
潜在的に、シグナル配列とアンカー配列との間にＡ＋ｎ−Ｘ−３ｅ＋／Ｔｈ＋モ チーフで定まるＮ−グリコジル化部位が９カ所存在する（星印の部分）。
εＩＮ’−１ｇｐ１３遺伝子のワクシニアドナープラスミド中へのクローニング ニワトリポックスウィルスベクター（４１，４２）中で外来遺伝子を発現させる ために、ワクシニアウィルスの初期／後期プロモーターであるＨ６を使用した。
このプロモーター要素は、ワクシニアＨｉｎｄｌｌｌ−）１フラグメント中のＨ ６解読枠のすぐ上流にあるＤＮＡ配列に対応する（３１）。
今度は図３を参照して説明する。Ｉ（６プロモーターに変異を導入してｐｓＤ４ ６７Ｖｃに挿入するために、オリゴヌクレオチド対ｆｆ６ｓＹＩｌ　ｏｌｉｇｏ ｓ＾−Ｄを合成した。Ｈ５ＳＹＮ　ａｌｉｇｏｓ＾−〇の配列を、修飾塩基（下 線部）及び制限酵素部位と共に、以下に示す。
ＣＡＣ＾＾ＴＴＴ＾＾ＣＴＴＴＣＧＣＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＴＡＴＴＴ＾＾ＴＡ ＡＡＧＴ＾＾ＴＡＧＣＧＣＴＡＴＡＧＧＣ＾＾ＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＣ ＣＣ−３’上下線の塩基は、ネイティブなＨ６プロモーター配列を修飾した部位 を示す。
Ｈ６５ＹＮ　ｏｌｉｇｏｓ　Ａ−Ｄのアニーリングによってできた全長Ｎ０ｂｐ の二本鎖ＤＮＡをアガロースゲルから電気的に溶出し、ｐｓＤ４６７Ｖｃ由来の ０．５ＫｂのＳｍｘｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント及び３．　ｌＫｂの８ｇ１ １１／Ｈｉｎｄｌｌ１７ラグメントニ連結シタ。
得られたプラスミドｐＴＰ１５　（１８４）は、ＡＴＧ開始コドンがＣＣＣに修 飾されてＳｍ＊Ｉ部位の一部となっており、その直後にＰＨＩ部位が続いている 。！＋ＴＰ１５のＳｍａ１部位に、Ｎｓ白リンカ−［５’　−ＴＧＣＡＴＧＣＡ ＴＧＣＡ−３’　］　（＝　ニー嘩インクランド・バイオラッド（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂ＋）社製、マサチューセッツ州ベヴアリー（Ｂｅｖｅ ＋１７））を挿入して、プラスミドｐＮｓＩを得た。
Ｅ）ＩＶ−１のＥｃｏＲＩ／Ｎａ　ｔ　１フラグメント（ＥｃｏＲ１部位はＡＴ Ｇ開始コドンの＋２０ｂ、上流であり、Ｎａ１ｌはＥＨＶ−１ｇｐ１３のＴＡＧ 終止コドンの２３ｂｐ上流である）をＭＩ３ｍｐ１９ファージにクローン化して 、組換えファージ旧３εｃｏＲＮａ　ｒを得た。
オリゴヌクレオチド特異的変異導入法（１７）を用いてＥＨＶ−１ｇｐ１３ノＴ ＴＧＣＣＴ配列（図２の１３０−１３５番目の塩基）をＡＴＧＣＡＴに変えるこ とによって、Ｎｓ白部位を導入した。
変異ファージＭ１３ＥｃｏＲＮａ＋から得たＥｃｏＲＩ／Ｎａ　ｔ　ｌフラグメ ントを、ｐＨｃ８のＥｃｏＲ１／Ｎａ＋Ｉ部位にクローン化シテ、プラスミドｐ ＮｓＩＥＮを得た。
以下に示す配列及び制限酵素部位を有する２つの４２量体オリゴヌクレオチドを 合成した。
このオリゴヌクレオチドにおいては、終止コドン（ＴＡＧ）の直後にワクシニア 初期転写ターミネータ−（ＡＴＴＴＴＴＡＴ）がある。該４２量体オリゴヌクレ オチド対をアニールして得た二本鎖ＤＮＡフラグメントには、Ｎａｒｌ付着端、 それに続いてＥＨＶ−Ｉ　ｇｐＨ遺伝子のコード配列の３′末端、並びにワクシ ニア初期転写終結シグナル（４５）、Ｐｓｌ１部位、及びＮｄ！ｌ付着端が含ま れている。このフラグメントをｐＮｓＩＥＮのＮａ＋Ｉ／Ｎｄｅ１部位に挿入し て、ｐＮｓＩＥＮＰＮを得た（図３）。
ｐＮＳ　Ｉ　ＥＮＰＮからＮ５ｉｌ／？Ｎフラグメントを単離し、プラスミドｐ ＮｓＩのＮ５ｉｌ／？１１部位にクローン化して、プラスミドｐＶＩＩＡ６ｇ１ ３Ｎｓ　ｉ　ｌを得た（図３）　、　ｐＶｔｌＡ６ｇ１３Ｎｓｉｌを、Ｈ６プロ モーター内のＥ’ｃｏＲＶ部位、及びＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子の始点付近に導 入しておいたＮ５ｉ１部位で切断した。このベクターフラグメントをムング・ビ ーン（ｌＪｕＢ　Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで平滑末端とした。以下に示す配列及 び制限酵素部位を有する相補的３２量体オリゴヌクレオチド対を合成した。
３’　−ＴＡＧＧＣＡＡＴＴＣ＾＾＾ＣＡＴＡＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧ −５’８６　ｐ「ｏｍｏｔｅｒｇｐ１３５’　ｅｎｄ上記オリゴヌクレオチド対 をアニールし、ｐＶＨＡ６ｇ１３Ｎｓｉｌベクターフラグメントに連結して、Ｈ ６プロモーターの＾ＴＧ開始コドン（上記３２量体の配列の下線部）とＥＩＩＶ −Ｉ　ｇｌｌ１３遺伝子とがきちんとつながったプラスミドｐＶＨ＾６ｇ１３を 作成した（図３）。
ｖＰ４２５感染細胞にｐＶ）ｌＡ６ｇ１３をトランスフェクションして・Ｅｔ（ Ｖ−１ｇｐ１３遺伝子を含有するワクシニア組換え体ｖＰ４８３を得た（図３） 。
ワクシニアウィルス組換え体の構築 救援ワクシニアウィルスに感染した組織培養細胞に対する組換えドナープラスミ ドのトランスフェクション並びにニトロセルロースフィルター上でのインシトウ ｆｉｎ　＋ｉ＋ｕ）ハイブリダイゼーションは、文献記載の方法に従って行なっ た（２５．２８）。大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子がワクシニアＨ６コード 配列に置き換ったｖＰ４２５を構築するために、プラスミドＤＮＡ　（ＨｅＢ５ 中のｐｓＤ４６６ＶｃＢＧＡ、２５量ｇ）をＶＥＲＯ細胞中ニ！　気穿孔法−ｃ 　導入した（バイオラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＧｅｎｅＰｕ ｌｓｅｔ）、キャパシタンス９６０．２００ボルト）。亜集密的細胞単層（ｇＵ ｂｃｏｎ＋Ｉ＋＋ｅｎｌ　ｆｆ１ｏｎｏｌａｙｅ＋）に細胞当りＩＯｐ　Ｉ　ｕ のｖＰ４１（ｌを１時間感染させた。感染細胞をトリプシンを用いて採集し、Ｈ ｅＢ５で洗浄した後に電気穿孔を行なった。細胞をＭＥＭ＋５％ウシ胎児血清培 地中において３７℃で２４時間インキユベートシ、プロジエニイウイルスをＶＥ ＲＯ細胞単細胞一層上た。β−ガラクトシダーゼを発現する組換えウィルスを、 基質Ｘ−ｇａ　ｌの存在下における青色プラークとして検出した（９．２４）。
ｖＰ４２５中のβ−ガラクトンダーゼ遺伝子かＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子で置き 換った組換えワクシニアウィルスを作成するために、ｐｖＨ＾６ｇ１３ドナープ ラスミドかつｖＰ４２５を救援ウィルスとしたことを除いては上記と同様のプロ トコルを用いた。ＥＨＶ−１由来ｇｐ＋３含有ワクシニア組換え体ｖＰ４８３を 、基質Ｘ−ｇａ　ｌの存在下における無色プラークとして検出し、プラーク精製 を３回繰返した後にＤＮＡハイブリダイゼーションを行なって真の組換え体であ ることを確認した。
組換えワクシニアウィルスｖＰ４８３感染細胞の細胞表面上におけるＥＨＶ−１ ｇｐ１３遺伝子の発現３５１Ｉｌｆｆｌシヤーレ中の２２ｍｍカバーガラス上に 、シャーレ当り５ＸＩＯ’個のＢ５Ｃ−４０細胞を植えた。細胞の集密度が約８ ０％となったところで、細胞当り２ｐｌｕのウィルスを感染させた。１時間吸着 させた後、ウィルス接種液を除去して、ＭＥＭ＋２％ウシ胎児血清培地を加えた 。感染後２０時間後に、カバーガラスを０，２％ＢＳＡ及び０．１％　ＮａＮｘ 含有リン酸す塩類緩衝液（ＰＢＳ＋）で洗浄し、ＰＢＳ＋で千倍に稀釈した抗ｇ ｐ１３モノクローナル抗体１４Ｈ７（３）に暴露した。室温の加湿チャンバー中 に１時間置いた後、細胞をＰＢＳ＋で３回洗浄した。フルオレセインイソチオシ アネート抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して、上記操作を繰り返した。最後 に、リン酸素塩類緩衝液（ｐａｓ）中の２％パラホルムアルデヒド中で２６分間 細胞を固定した。
カバーガラスを、３％没食子酸ｎ−プロピル含有ＰＢＳ中の８０％グリセロール 中にマウントし、顕微鏡で蛍光を観察した。
ＤＮＡ配列から予想されるタンパク質は、膜貫通性糖夕ンパク質に典型的な特徴 を有している（１４）。増殖性ＥＨＶ川感用においては、ｇｐ１３糖タンパク質 は細胞の様々な膜系に取込まれ、細胞質膜中に輸送されて、感染細胞の外表面上 で検出され得る。ＥＨＶ−１ｇａｌ３はさらにＥＨＶ−１ウィルス粒子の構成成 分である。従って、免疫蛍光法を用いて、ワクシニアウィルス組換え体ｖＰ４８ ３によって発現されるＥｌ（Ｖ−１ｇａｌ３が感染細胞の細胞質膜上にも同様に 存在するか否かを調べた。抗ｇｐ１３モノクローナル抗体、続いてフルオレセン 抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で標識すると、ｖＰ４８３感染細胞には膜上に強い 免疫蛍光がみられたか、ワクシニアウィルスｖＰ４１Ｑ感染細胞ではみられなか った。この事実は、ワクシニアウィルス組換え体ｖＰｎ８３によって発現される ＥＨＶ−１ｇａｌ３が、膜貫通性糖タンパク質の真の合成について予想される通 り、感染細胞の細胞質膜上にも存在することを示唆している。
ワクシニアウィルス組換え体ｖＰ４８３感染細胞で合成されるＥＨＶ−１ｇｐ１ ３産物の免疫沈降反応６０ｍｍシャーレ中で集密的細胞単層を形成した２百万個 の細胞に、細胞当りｌＯｐ　ｆ　ｕのウィルスを感染させた。無メチオニン培地 中で接種した。吸着後、ウィルス接種液を除去して、２μＣｉ／ｍｌの３５３− メチオニンを含有する無メチオニン培地２ｍｌを加えた。２４時間感染反応を続 けた後、３％ＮＰ−４０，３０ｍＭ　Ｔｔｉｓ　（ＰＨ７，４）、４５ＧｍＭ　 ＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、　０．０３％ＮａＮ３及び０．６ｍｇ／ｍｌ　ＰＭ ＳＦを含む３×緩衝液Ａを１ｍｌ添加して細胞を溶解した。溶解細胞及び上清を 回収して、ポルテックスし、ＩｏｏｏｏＸｇで１５分間遠心して、無細胞抽出液 を得た。
■×緩衝液Ａ中で１．１スラリーとして、プロティンＡ−セファロースＣＬ４Ｂ 　（ファルマシア社製、カタログ番号１７．０７８０．０１）を調製した。ラッ ト抗マウス抱合体（ベーリンガー・マンハイム社製、カタログ番号６０５５００ ）を上記スラリー中に１：１００に稀釈して、室温で振盪しながら４時間上記ビ ーズに結合させた。ビーズを１ｍｌの緩衝液Ａで６回洗浄して結合していない抱 合体を除去した。次に、ｇａｌ３に対するモノクローナル抗体を室温で４時間ビ ーズに結合させた。十分に洗浄して過剰の抗体を除去した。１１の感染細胞溶解 液を、正常マウス血清を結合させておいたプロティンＡ−セファロースで予備処 理した。ビーズを遠心で除いた。このように予備抗体を結合させておいたビーズ １００μｍと混合した。この混合物を室温で４時間振盪した。遠心によってビー ズを除去し、Ｉ×緩衝液Ａで４回洗浄し、次いで０．２Ｍ　ＬｉＣｊ及び２Ｍ尿 素を含有する１０ｍＭ　Ｔｔｉｓ　（ＰＨ７，４１で２回洗浄した。抗体−抗原 複合体からビーズを除去し、レームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の解離溶液５０μｍを 添加して解離させた（６０゜１９５）。試料を５分間煮沸処理した後、電気泳動 にかけた。
約４４ｋＤａと約４７ｋＤａの２種類の産物（これらは予想された１次翻訳産物 （５５ｋＤａ）よりも若干小さい）、並びに約９０ｋＤａの大きな産物（この値 はＥＨＶ−ｌ　ｇｐ１３遺伝子産物が完全にグリコジル化されたものに一致する ）が検出された。対照ワクシニアウィルス感染細胞からは、これらに相当する沈 降物は得られなかった。
例２−ウマヘルペスウィルスｇρ１４糖タンパク質を発現する組換えワクシニア ウィルスの構築大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子によるワクシニアＭ２Ｌ遺伝 子の置き換え ＥＨＶ−１ｇｐ１４コード配列をワクシニアウィルスベクター中に挿入するため に、大腸菌１ａｃ２遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスｖＰ４５８を構 築した。組換えウィルスｖＰ４５８中の１ａｃＸ７一ド配列をＥＨＶ−１ｇａｌ ４のコード配列で置き換えると、Ｘ−ｇａｌ　（β−ガラクトシダーゼに対する 発色性基質）存在下での、ＥＨＶ−１ｇｐ１４含有組換えウィルス同定用の青色 −無色プラークスクリーニング系（９゜２４）が得られる。さらに、ＥＨＶ−１ ｇａｌ４及びＥＨＶ−１ｇ９１３双方を発現するワクシニアウィルス組換え体を 構築するために、例１においてＥＩＩＶ−１ｇａｌ３の挿入に用いた赤血球凝集 素欠失座とは別のＥＨＶ−１ｇａｌ４のための挿入座をＨｉｎｄｌｌｌ　ＭのＭ ２Ｌ座に作成した。ワクシニアＨｉｎｄｌｌｌ　Ｍフラグメント中の１．１２Ｌ 遺伝子の全コード配列を除去して、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌１ ａｃ２遺伝子で置き換えた。
ｖＰ４５８を構築するためのクローニング段階を図４に図解した。
今度は図４を参照して説明する。推定２２０残基のアミノ酸からなるタンパク質 をコードしかつワタシニアゲノムに対して右から左に読取る解読枠全体が、ワク シニアウィルスのコペンハーゲン株のＨｉｎｄｌｌｌ　Ｍフラグメント内の唯一 のＢｇｌ＋１部位の左側に位置している。従来の命名法（３１）に従って、ＭＩ Ｌ（５８）のすぐ右側に位置するこの遺伝子をＭ２Ｌと呼ぶ。Ｈｉｎｄｌｌｌフ ラグメントＭ内の唯一のｌ１ｇ１１１部位から左側方向についてのワクシニア（ ＷＲ株）ゲノムの欠失に関する研究（５７）から、１１ｉｎｄｌｌｌ　Ｍ内のＢ ｇ１１１部位の左側に含まれるワクシニアコード配列が組織培養細胞中のウィル スの複製には必須ではないことが示されている。
Ｍ２Ｌ領域を外来遺伝子の挿入座として使い易くするために、Ｍ２Ｌコード配列 全体がＢｇ１１１部位で置き換えられたプラスミドベクターｐＭＰ４０９ＤＶｃ を以下に述べる通り作成した。ｐＭＰ４０９Ｖｃ　（コペンハーゲン株のワクシ ニアＨｉｎｄｌｌｌ　ＭフラグメントをｐＵｃ８のＨｉｎｄｌ１１部位にクロー ン化したもの）をＢａｍＨＩ／Ｂｇｌｌｌで消化して自己連結して、１（ｉｎｄ ｌｌｌ　Ｍの右端を除去し、Ｂｇ１１１部位を破壊した。得うレタフラスミＦｐ ＭＰ４０９ＢＶＣを５ｐｂｌ　（Ｍ　２　Ｌ解読枠内で切断する）で線状化し、 ２分間Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼ消化処理に付した。得られたＤＮＡに、合 成４９量体（５′−ＴＴＴＣ丁ＧＴＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＡＧＡＴ ＣＴＴＡＣＴＣ＾＾ＡＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＡＴ−３′、下線部かＢｇｌ　ｌ　 １部位）を用いて変異を導入した（１９）。変異導入プラスミドｐＭＰ４Ｇ９Ｄ Ｖｃにおいては、Ｍ２Ｌコート配列か＋３番目の位置から解読枠の端まで欠失し ている。開始コドン＾ＴＧのＧをＣに換えて、欠失連結部で唯一のＢｇｌ１１部 位（ＡＧＡＴＣＴ）を生しさせた。
ｐＭｃＩｌ１７１　（３４）の８ａ＋＋＋）１１部位問にある３、ＩＸｂノ大腸 菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をＯ，ｌＫｂワクシニアｌ１ｋＤａプロモーター （７）の転写調節下に含有する３、２Ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ／ＢｘｍＨＩｇｆＳ分フ ラクメントを、ｐＭＰ４［１９ＤＶｃ（７）非反復Ｂｇ１１１部位にクローン化 した。ＩＩｋＯａプロモーター／β−ガラクトシダーゼ遺伝子カセット（両隣の ワクシニアアームに対して右から左の方向に置かれている）及びゲノムを含有す るプラスミドをｐＭＰ４０９０ＶｃＢＧと命名した。
ｐＭＰ４０９ＤＶｃＢＧを、例１に記載した通り、救援ワクシニアウィルスｖＰ ４１θとの組換えにおけるドナープラスミドとして用いた。ｖＰ４５８と名付け た新規ワクシニア組換え体（Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺 伝子を発現する）を、発色性基質Ｘ−ｇａｌを用いて検出しく９゜２４）、プラ ーククローニングを繰返して精製した。
ＨＩＶ−１ｇｐ１４のクローニング 今度は図５を参照して説明する。ＥＨＶ−１ｇｐ１４コート配列は、ＢａｍＨｌ 切断フラグメントａとｉ　（３）との間の連結部にまたがっている。ＥＨＬ−１ の２つのＤＮＡフラグメン）Ｈａｍ）Ｉｌａ　（２１，３Ｋｂ）　七Ｂａｍ）Ｉ ｆ−ｉ　（７，ＩＫｂ）　（５９）をアガロースゲルから単離した。Ｅ）ＩＶ− Ｉ　Ｒａｍ）Ｉｌｉをプラスミドｐｌｉｃ８のＢａｍＨ１部位に挿入して、プラ スミドｐＬ：ｃ　（ＢａｍＨｌ　−１）を構築した。ＥＨｖ−１ＢａｍＨｉａフ ラグメントをＥｃｏＲＩで消化して、εｃｏＲ１／ＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ８に連 結した。プラスミドｐＵＣ（Ｂａｍｆ（１−ａ／εｃｏＲ１１は、ｌ［ｌＫｂの Ｅ）ＩＶ−Ｉ　Ｂａ＋＋ＨＩ／ＥｔｏＲ１挿入部を含んでいる。報告されたフラ グメントの大きさによれば（５９）　、この挿入部のＤＮＡ配列はＥＨＶ川ゲ用 ム内のＢａ＋ｎＨ１ｉフラグメントのＤＮＡ配列と隣接している。
塩基配列の解析 ｐＨｃ　（ＢａｍＨｌ−ａ／ＥｃｏＲ１）とｐＵｃ　（ＢａｍＨｌ−ｉ）の２つ のプラスミドから得た異なるサブクローンを使用して塩基配列の解析を行なった 。ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子はＢａｍＨＩ−ａ／ｉ連結部にまたかッテイるので （３）、プラスミドｐＵｃ　（ＢａｍＨＩ−ａ／ＥｃｏＲＩ）の塩基配列決定は Ｒａｍ）Ｉｔ部位から始めた。プラスミドｐＵＣ（ＢａｍＨｌ−ｉ）の配置を制 限酵素消化で決定した。
ｐυＣ（Ｂａｍ）Ｉｆ−ｉ）のＥｃｏＲ１部位に最も近いＥＨＶ−Ｉ　ＢａｍＨ １末端はｆｌａｍｌ（Ｉ−ａ／ｉ連結部のＢａｌｌ１）１１部位であることが判 明したので、このフラグメントの塩基配列決定はこのＢａｍＨｌ端から開始した 。
例１に記載した方法で、それぞれの鎖について塩基配列に関するデータを得た。
ＥＨＶ−１ｇｐ１４ｐ−４コード配する３３５１ｂｐフラグメントの塩基配列を 図６に示す。欄の左端と右端に付けた番号はそれぞれアミノ酸配列と塩基配列に 関するものである。ＣＡＴボックス及びＴＡＴ＾ボックスと推定される塩基配列 に下線を施した。シグナル及び膜貫通領域にも下線を施し、シグナルペプチドの 推定切断部位を矢印で示した。周知の（Ａｓｎ−Ｘ−５ｅｔ／Ｔｈ＋）配列から なる１３カ所の潜在的グリコジル化部位を星印で示した。
［）ＮＡ配列解析から、３００番目の塩基から３２３９番目の塩基までの解読枠 か判明した。即ち、＾ＴＧ開始コドンはＢａｍＨＩ−ａ／ＥｃｏＲ１フラグメン トに含まれており、終始コドンＴ＾＾は［ｌａｍ）Ｉｌｉフラグメントに含まれ ていた（３．５９）。
転写調節シグナルと思われる配列が、ＡＴＧコドン（３００番目）の５′側に見 付かった。配列ｒ　ＡＡＡＴＡＴＡＴＪ（１４８番目から１５５番目の塩基）を 有するＴＡＴＡホックスが、７１番目から７７番目の配列ｒＧＧＴＣＡＡＴ　Ｊ を有するＣＡＴボックスの７０塩基下流に位置している。ポリアデニル化シグナ ルｒＡＡＴＡＡＡＪ　（３２５１番目から３２５６番目の塩基）が、ＴＡＡ終始 コドン（３２４０番目から３２４２番目の塩基）の８塩基下流に位置している。
配列ｒ　５’−ＴＣＣＴＧＣＧＣＧＣＡ〜３′」（２１８番目から２２８番目の 塩基）中の１１個の塩基のうち９個の塩基が＋１１３リポソームＩＩＩＩＡの配 列「３′−八ＧＧ＾１へＧＧＣＧＴ−５’Ｊ　（６１）と相補的であり、リポソ ーム結合部位として機能している可能性がある。
ＥＨＶ−１　ｇｐ１４構造の解析 ＥｔｌＶ−１　ｇｐ１４解読枠は９８０残基のアミノ酸をコートしており、その 分子量は１０９．　８ｋＤａであると計算される。アミノ酸配列の解析から、膜 関連糖タンパク質に共通する多くの特徴が明らかになった。５８番目から９９番 目までのアミノ酸領域は、特徴的な疎水的性質を有しており、シグナル配列であ ると思われる（図６）。ＥｔｌＶ−１　ｇｐ１４遺伝子産物に特徴的な性質は、 長い疎水性シグナル配列か長い親水性配列に先立って存在することである。この 特徴は、仮性狂犬病ウィルスウィルス（ＰＲＶ）　ｇ　ｌ　ｌ　（６２）とウシ ヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ−１）　ｇｌ遺伝子にもみられるが、この２つは 共にＨ５Ｖｇ．Ｂ相同物である。４５残基のアミノ酸（８２６から８７０番目） からなる疎水性領域は、膜質通性アンカードメインとして機能していると思われ る。
細胞質内に存在する親水性ドメインは１１０残基のアミノ酸を含んでいる。
Ｎ−グリコジル化される可能性のある（６４）＾＋ｎーＸー５ｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘ はプロリン以外のアミノ酸である）部位が１１カ所存在する。特徴的な点は、細 胞質内ドメインにもさらに２カ所の潜在的グリコジル化部位が存在することであ る（図６）。
ＥＨＶ−１　ｇｐＮコード配列の疎水性度をプロットしたものを図７に示す。Ｅ ＨＶ−１　ｇｐ１４の親水性度を、カイト（Ｋ７＋ｅ）及びトリトル（Ｄｏｏｌ ｉＮｌｅ）の方法（６５）に従って、７個のアミノ酸を１ウインドー（ｗｉｎｄ ｏｗｌとしてスムージング（ｉｍｏｏｌｈｉＢ）せずに計算した。真中の線より も下の点は高疎水性域を表しており、シグナル及び／又は膜貫通性領域の可能性 のある部分を示している。膜貫通性糖タンパク質に特徴的なシグナル及びアンカ ー成分並びにシグナル配列の前にある長い親水性領域がＥｌ（Ｖ−１　ｇｐ１４ ｐ−４コード配 抗ＥＨＬＩ　ｇｐ１４モノクローナル抗体３Ｆ６によって認識される抗原決定基 の位置 ｊ．ｇｌ１１発現ベクターとモノクローナル抗体が、主要ＥＨＶ川糖少糖タンパ ク質−ドするＥＨＶ−Ｉ　ＤＮＡ配列の同定に使用されている（３）。λｇｔｌ ｌの組換え体４ａｌは、特異的モノクローナル抗体３Ｆ６によって認識されるＥ ＨＶ−１ｇｐ１４エピトープを発現することが判明している（３）。
このエピトープの身元を決定するために、Ａａｌ内に含まれルＥＨＶ−Ｉ　ＤＮ Ａ（７）塩基配列を決定し、Ｅｌ（Ｖ−１ｇｌｌ１４Ｄ−ド配列のＤＮＡ配列（ 図６）と比較した。λｇｅ１組換え体Ｊａｌ中の（抗ＥＨＶ−１ｇｐ１４モノク ローナル抗体３Ｆ６によって認識される）　ＥＨＶ−１ｇｐ１４エピトープ（３ ）に対応するＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定するために、し１をＥｃｏＲ Ｉで消化し、アガロースゲルからＥＨＶ−１７ラグメントを単離してｐＵＣ８の ＥｃｏＲ１部位に連結した。正逆両方向のＭＩ３汎用プライマーを用いて前述の 通りＤＮＡの塩基配列を決定した。
決定した塩基配列から、このエピトープは推定１次翻訳生成物の１０７０７番目 ｈｅ）から１７２７２番目ａｌＨ：対応する６６残基のアミノ酸領域内に含まれ ていることが示された。従って、該エピトープは推定されるＥＨＶ−１ｇｐ１４ 表面ドメインのアミノ末端領域内に位置している。
Ｅｌ（Ｖ〜Ｉ　ｇｐ１４のアミノ酸配列と他のヘルペスウィルス糖タンパク質と の比較 εＨＬＩ　ｇｐ１４遺伝子のアミノ酸配列との比較から、他のヘルペスウィルス 糖タンパク質とかなりの相同性を有していることが判明した。即ち、ＥＨＶ−１ ｇｐ１４は、ＰＲＹのｇ　ｌ　Ｉ　（６２）　、ＢＨＶ−１（７）ｇｌ　（６３ ）　、水痘帯状庖疹ウイ／ｌ、ス（ｖｚｖ）のｇｌｌ（６６）、単純ヘルペスウ ィルス（Ｈ３ｖ）の、Ｂ　（６７、７１，７２）　、並びにエプスタイン・バー ルウィルス（Ｅ　Ｂ　Ｖ）　（６Ｂ）及びヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ ）（１０）の糖タンパク質に相同であった。
ＥＨＶ−１ｇｐ１４コード配列の５′末端のオリゴヌクレオチド特異的変異導入 再び図５を参照して説明する。ｐＵｃ　（ＢａｍＨＩ−ａ／ＥｃｏＲＩ）由来の Ｋｐｎｌ／Ｂａｍ旧フラグメントをＫｐｎｌ／Ｂａｍ旧で消化しておいたプラス ミドＢｌｕｅｓｃ＋ｉｐｌ　ＳＫ＋に挿入して、プラスミドＢｌｕｅ　（Ｋｐｎ ｌ／ＢｘｍＨＩ）を得た。クンケル（にｕｎｋｅｌｌの方法（１７）を修正して 、宿主ｄｏじｕｎｇ−大腸菌Ｃｌ２３６株中で作成したプラスミドＢＩＩＩｅ　 （Ｋｐｎｌ／ＢａｍＨＩｌ由来のウラシル含有Ｄ　Ｎ　Ａ！型を用いてオリゴヌ クレオチド特異的変異導入を行なった。該変異導入プラスミド中において、ＥＨ ＬＩｇｐ１４遺伝子のコドンｌ及び２にＮ５ｉｌ部位を生じさせ、配列ＡＴＧ／ ＴＣＣ（ＭｅＲＳｅｒ）をＡＴＧ／ＣＡＴ　（Ｍｅｔ／１（ｉｓ）に変えた。こ の変異を導入した塩基配列はＯＮ＾配列解析によって確認した。該変異株由来の Ｋｐｎｌ／ＢａｍＨＩフラグメントを、Ｋｐｎｌ／Ｂｕ＋ＨＩ消化ｐＵｃ１８に 移し換えてプラスミドｐＵｃ（Ｋｐｎｌ／ＢａｍＨｌ）を得た。
ｐＵｃ（にｐｎｌ／ＢａｍＨＩ）由来のＥｃｏＲ１／ＢａｍＨＩフラグメントを ｐＵＣ（ＢａｍＨｌ−ｉ）の３．９ＫｂサブクローンであるＢａｍＨＩ／Ｐｓｔ １消化ｐＵｃ（ＢａｍＨｌ／ＰｓＮ）に挿入して、Ｎａ１１部位変異を含んだＥ ＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子全体を含むプラスミドｐＵｃｇ１４を構築した。
キメラプラスミドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４の構築ｐＭＰ４０９ＤＶｃをＢｇｌｌ＋ で切断し、制限酵素部位と隣接する例１記載の修飾Ｈ６（初期／後期）プロモー ターを含有する合成二本鎖ＤＮＡと連結した。Ｎ５ｉｌ、５ａｃｌ、Ｐｓｔｌ及 びＥｃｏＲＩ制限酵素部位をＨ６の内在性開始コドンのすぐ下流につくった。９ ＭＣ１１におけるＨ６プロモーター下流のポリリンカー配列はＡＴＧ　ＣＡＴ　 ＧＡＧ　ＣＴＣＴＧＣＡＧ＾＾丁Ｔ　ＣＧＧ　ＡＴＣＴである。Ｈ６開始コドン を含んだ非反復Ｎａ１１部位（下線部）の直後に５ａｃｌ、Ｐｓｆｌ及びＥｃｏ ＲＩが続いている。
ｐＵｃｇ１４由来のＥｃｏＲＩ／Ｎ５ｉｌ　ＤＮＡフラグメント（Ｅｌ（Ｖ−１ ｇｐ１４開始コドン上流のＥＨＶ−Ｉ　ＤＮＡ領域を含む）を、プラスミドｐＭ ＧＩｌ由来のＥｃｏＲＩ／Ｎ５ｉｌフラグメントで置き換えて、プラスミドｐＭ ＲＨｇ１４を得た。該ｐＭＲＨｇ１４は、ワクシニア１（ｉｎｄｌｌｌ　Ｍの右 側アーム、Ｈ６プロモーター及びＥＩＩＶ−１ｇｐ１４遺伝子全体を含有する。
プラスミドｐＭＲＨｇ１４由来の）１ｐｘｌ／Ｐｓｌｌ　ＥＨＶ−１ｇ９Ｉ４含 有フラグメントを、Ｈｐａｌ／Ｐｉｆｌで切断しておいたベクタープラスミドｐ ＭＧ１１に移し換えて、プラスミドｌＩＶＭ２ＬＨ６ｇ１４を作成した。ｐｉ’ Ｍ２Ｌｔ１６ｇ１４は、Ｈ６プロモーターの制御下に置かれたＥＨＶ−１ｍ４全 コ一ド配列（コドン２をＴＣＣ（Ｓｅ「）がらＣＡＴ　（ｆ（ｉｓｌに変えたも の、及びＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子下流の約１．２Ｋｂ　ＥＨＶ−Ｉ　ＤＩｒ＾ ）を含有しており、この配列は、Ｍ２Ｌ遺伝子座へのＥＨＶ〜１ｇｐ１４遺伝子 の挿入の目標としたフランニアゲノムに関するフランキングワクシニア配列に対 して右から左に挿入されている。
ｖＰ４５ｇを救援ウィルスとし、ｐＶＭＨ８６ｇ１４をドナープラスミドとして 組換えを行なった。無色のプラークを採取して、ＥＨＶ−１ｇｐ１４に対して特 異的な３２ｐ標識プローブを用いてＥＨＶ−１ｇｐ＋４コード配列の存在につい て分析した。
プラーククローニングを繰返した後、得られたワクシニア組換え体をＶＰ５７７ と命名した。
ＥＨＶ−１ｇｐ１４親水性リーダー配列の切断上述の変異導入及びクローニング 操作を種々変更して、キメラドナープラスミドｐＶ！＋１２ＬＩ（６ｇ１４−１ を構築した。
ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ＋４−１　（ＥＨＶ−１ｇｐ１４ノコトン２から３４までが欠 失し、かつ４つのコドンが置き換っている）を作成するために、プラスミドＢｌ ｕｅ　（Ｋｐｎｌ／ＢａｍＨＩ）上でインビトロ変異導入（１７）を行なって、 コドン１及び２ではなくコドン３２〜３４にＮ５ｉｌ部位を生じさせた。新たに 変異を導入したＢｌｕｅ　（Ｋｐｎｌ／ＢａｍＨＩ）プラスミド由来のＮ５ｉｌ ／Ｂａｍ旧フラグメントを、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４のＮｓ　ｉ　Ｉ／Ｂａｍ旧フ ラグメントと置き換えた。該Ｎ５ｉｌ部位に多重Ｍａｉｌリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社製）を連結して、開始＾ＴＧコドンを残りのＥＨ Ｖ−Ｉ　ＢＩ４コード配列と共に枠内に持ち込んだ。最終的に得られたプラスミ ドｐＶＭ２ＬＨ６ｇＩ４−１は、Ｍｅｔ／）ｌｉｓ／Ａｌａ／Ｃｙｓ／１　ｌ　 ｅ／Ａ　ｌ　ａ、をコードする配列＾ＴＧ／ＣＡＴ／ＧＣＡ／ＴＧＣ／ＡＴＴ／ ＧＣＴを含んでいる。ここで、ＧＣＴ　（ＡｌａｌはＥｌ（Ｖ−１ｇｐ１４の３ ４番目のコドンてあり、ｐＶ１１２Ｌ１１６ｇ＋４−１（７）残りの部分ハｐＶ Ｍ２ＬＨ６ｇ＋４のものと同一である。
救援ウィルスＶＰ４５８とドナープラスミドｐＶＭ２Ｌｌ（６ｇ１４−１との間 で組換えを行なって、ワクシニア組換え体ｖＰ６１３タンパク質を発現するワク シニアウィ ルス組換え体マＰ６３３及びｖＰ６３４の構築ｇｐ１３及びｇｐ１４　ＥＨＶ− １糖タンパク質を共に発現するワタシニア組換え体を構築するために、ｖＰ５７ ７もしくはｖＰ６１３のいずれかを救援ウィルスとして、例１記載のドナープラ スミドｐｖＨ＾６ｇ１３　（ワクシニアのＨ＾欠失座に挿入されたワクシニアＨ ６プロモーターの制御下にあるＥ）ＩＶ−１ｇｐ１３遺伝子を含有する）との組 換えを行なった。組換えウィルス中へのＥ）ＩＶ−１ｇｐ１３配列の挿入は、イ ンシトゥＯＮ人ハイブリダイゼーション法（２５，２８）によって同定した。ｐ ＶＨＡ６ｇ１３とワクシニアウィルス組換え体ｖＰｖ　Ｐ　５７７（全ＥＨＶ− １ｇｐ１４を含有する）との組換えによって、ワクシニアウイルス二重組換え体 ｖＰ６３３が得られ、ｐＶＨＡ６ｇ＋３とワクシニアウィルス組換え体ｖＰｖ　 Ｐ　６１３　（先端の欠けたＥｌ（Ｖ−１ｇｐ１４を含有する）との組換えによ って、ワクシニアウイルス二重組換え体ｖＰ６３４が得られた。ワクシニアウイ ルス二重組換え体ｖＰ６３３及びｙＰ６３４のプラークをクローニングし、ＥＨ Ｖ−１ｇｐ１３及びＥ）ＩＶ−１ｇｐ１４配列の存在ヲＤＮＡハイブリダイゼー ション分析法並びに発現アッセイ法（後述）で確認した。
ワクシニアウィルス組換え体中で発現されるＥｌ（Ｖ−１ｇｐ１３及びｇｐ１４ 糖タンパク質の免疫沈降反応ワクシニアウィルス組換え体によって発現されるε ＨＶ−１ｇｐ１３及びｇｌｌ１４糖タンパク質を調べるために、ＶＥＲＯ細胞に 該組換え体を感染させて、代謝によってタンパク質を１９３−メチオニンで標識 して、例１記載の方法で免疫沈降反応を行なった。室温で４時間、■・１０００ に稀釈したＥＨＬＩ　ｇｐ１３特異的モノクローナル抗体（＋４１１７）又ハＥ ＨＶ−Ｉ　ｇｐ１４特異的モノクローナル抗体（３Ｆ６）を結合させた。
試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ゲル、定電流３０ｍＡ、 　６時間）にかけ、オートラジオグラムを作成した。未感染ＶＥＲＯ細胞又は赤 血球凝集素欠失ワクシニアウィルスｖＰ４５２　（Ｉ　ｌｌ　４）感染対照ＶＥ ＲＯ細胞の産生じたもので、抗ＥＨＶ−１ｇｐＮ特異的モノクローナル抗体１４ Ｈ７（３）又は抗ＥＨＶ−１ｇｐ１４特異的モノクローナル抗体３Ｆ６（３）に よって免疫沈降したものはなかった。これに対して、ＥＨＶ−］　ｇｐ１３だけ を発現するワクシニア組換え体ｖＰ４８３、εＨＶ−１ｇｐ１３とインタクトな ｇｐ１４双方を発現するワクシニアウィルス二重組換え体（ｖＰ６３３）　、又 はＥＩＩＶ−１ｇｐ＋３と先端の欠けたｇｐＩ４双方を発現するワクシニアウイ ルス二重組換え体（ｖＰ６３４）で感染したＹＥＲＯ細胞からは、放射性標識さ れたＥＨＶ−１ｇｐ１３産物がモノクローナル抗体１４Ｈ７によって免疫沈降し た。予想される１次翻訳生成物（５５ｋＤｘ）よりも若干小さい約４４ｋＤａと 約４７ｋＤａの２種類の生成物並びにＥＨＶ−１ｇｐ１３が完全にグリコジル化 された形に相当する約９ＱｋＤａのやや大きい生成物が検出された。ワクシニア 二重組換え体マＰ６３３及びｖＰ６３４において、ＥＨＶ−１ｇｐ１３発現の質 及び量が、どちらの形のＥｌ（Ｖ−１ｇＮ４と同時発現させてもその影響を受け なかったことは重要である。
ｖＰ６３３、ｖＰ６３４、ｖＰ６１３及びｖＰ５７７でそれぞれ感染させたＶＥ ＲＯ細胞は、抗ＥＨＶ−１ｇｐ１４特異的モノクローナル抗体３Ｆ６（３）によ って免疫沈降した。ｖＰ６３３　（全ｇ　ｐ　Ｉ’　４とｇｐ１３を含む）及び ｖＰ５７７　（全ｇｐ１４を含む）については、約３４．４了、６０−６４及び ９０ｋ　Ｄ　ａの位置に主要バンドが観察されたが、ｖＰ６３４　（ｇｐ１３と 先端の欠けたｇｐｌＲ：ヲ含む）及びｖＰ６１３　（先端の欠けたｇ１１１４を 含む）では約３４．４７．５７、？２−８２及び１１６ｋＤａの位置に主要バン ドが観察された。
ＥＨＶ−１ｇｐ１３と同時発現させた際、どちらの形（７）ＥＨＶ−１ｇｐ１４ を合成させても有意の差異はみられなかった。
組換えワクシニアウィルスによって合成されるεＨＶ−１ｇｐＩ３及びｇｐ＋４ 産物の免疫蛍光分析Ｅ）ＩＶ−１ｇｐ１３又はｇＩＩＩ４のいずれかに特異的な モノクローナル抗体を使用して、組換えワクシニアウィルスに感染したＶＥＲＯ 細胞の免疫蛍光分析を例１記載の方法によって行なった。
ワタソニア組換え体ｖＰ４８３、ＶＰ６３３及びｖＰ６３４ニ感染したＶＥＲＯ 細胞においては、その細胞表面上並びにアセトン固定細胞内ｍにＥＨＶ−１ｇｐ １３が容易に検出てきた。
ＶＰ４１Ｑ、ｖＰ５７７又はｙＰ６１３に感染したｖＥＲＯ細胞においては、Ｅ ＨＶ−１ｇｐ１３特異的抗体に対する免疫反応性は細胞内部にも表面上にもみら れなかった。ワクンニア組換え体ｖＰ５７７、ＦＰ６１３、ｙ’Ｐ　５３３及び ｖＰ６４４に感染させたＶＥＲＯ細胞をアセトン固定すると、ＥＨＶ−１ｇｐ１ ４の発現が容易に検出できた。ｖ　Ｐ　４’　Ｉ　Ｑ又はｖＰｄ８３で感染させ た細胞においては、ＥＨｖ−１ｇｐ１４特異的抗体に対するはっきりとした内部 免疫蛍光はみられなかった。ＥＨＶ−１ｇｐ１４に特異的なモノクローナル抗体 ３Ｆ６を用いると、先端欠損型ＥＨＶ−１ｇｐ１４を発現するｖＰ６１３又はｖ Ｐ６４４に感染した細胞には弱い表面免疫蛍光が観察されたが、対照ウィルスｖ Ｐ４１０及びｖＰ４１１３並びに組換えワクシニアウィルスｖＰ５７７又はマＰ ６４４　（ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子全体を発現する）においてははっきりとし た表面反応はみられなかった（例８も参照ワタシニア組換え体ｖＰ４８３によっ て発現されるｇｐ１３ウマヘルペスウィルス遺伝子産物の免疫原性を決定するた めに、該ウィルスをモルモットに接種し、ワクシニアウィルス及びウマヘルペス ウィルス双方に対する血清中和抗体の存在をアッセイした。
体重的４５０ｇの１５匹のモルモットを５つのグループに分けた。一つのグルー プには、皮下接種によって、初日（０日）に１ｍｌのワクシニア組換え体（１０ ８ＴＣＩＤｑｎ／ｍｌ）を接種し、次いて２１日目に１ｍｌの２次免疫を行なっ た。
第二のグループには、ワクシニアｖＰ４５２　（１０８ＴＣＩＤ、、、／Ｔｌ１ ｌ）で同様の接種を行なった。第三のグループには、ワクチン接種を行なわなか った。全モルモットについて、１次ワクチン接種前並びに２１日目及び３５日目 に血液採取した。血清を調製して、ワクシニア及びＥＨＶ−１（ケンタラキー株 ）双方の中和抗体の存在につイテ、ＴＣＩＤ、。＝５０のウィルスを用いてブタ 精巣細胞上でアッセイした。
表１に示す通り、ＥＨＶ−１ｇｐ１３ワクシニア組換え体ｖＰ４８３は、モルモ ット中で明らかな血清変換を誘起する。
ワクシニアウィルスについて得られた血清中和力価は表１の括弧内に示しである 。１次接種から２１日後にはワクシニア及びＥＨＶ−Ｉ双方の中和抗体が検出で き、２１日目に２次接種して２週間後には血清中和抗体力価の顕著な増が加みら れた。ＥＨＹ−１ｇｐ１３発現組換えウィルスを接種したモルモットについて得 られた血清ワクシニア中和力価が、ワクシニアｖＰ４５２ウィルスを接種したモ ルモットで得られた力価よりもかなり高い（＋＝７．２）ことに注目すべきであ る。
表Ｉ　ＥＨＶ−１ｇｐ１３発現ワクシニア組換え体又Ｃｔ対照ワクシニアウイ／ Ｉ／スｖＰ４５２のいずれかを接種したモルモット中に存在する血清中和抗体血 清中和力価（ｌＯｇ＋ｏ）の経日変化接種ウィルス　動物番号　旦一旦　２１日 後　３５日後ワクチン　２６　０．２４　ｆＯＪ５）−０，２４（［１，７Ｑ） 非投与対照群　２７　０．２４　（０，３５）−０，５６（１，０５）２８　０ ．２４　（８，３５）−０，８０（Ｑ、７０）２９　０．２４　ＴＯ，３５）− （１，４０（０，７０）３１１　０．２４　（ＯＪ５）−０，３２（［１，３５ ）対照ワクシニア　１９１　Ｇ、２４　（０，３５＋　０．３６　（０，４７） 　０．７２　（１，７５１ウイルスｖＰ４５２　１９２　０．２４　（ＯＪ５） 　０．２１　（０，９３）　０．２４　（２，３０）１９３　Ｇ、２４　（０， ３５）　０．４１Ｆ　（０，５８）　−−−−１９４０，２４（０，３５）　０ ．２４　（０，８２）　０．２４　（２，１０）１９５　Ｑ、２４　（０，３５ ）　−−−−−−−−組換えワクシニア　１８６　０．２４　（０，３５）　０ ．４８　Ｆｌ、２８）　１．２０　（２，５７１ウイルス　ｖＰ４８３　１８７ 　０．２４　（０，３５）　０．７２　（１，６３）　１．６８　（２，５７） １８８　０．２４　（０，３５１０，２４（１，５２１１，６８（２，５７）１ ８９　０．２４　（０，３５）　０．３６　（１，４０）　１．５６　（２，２ ２１１９００，２４（０，３５）　０．４８　（＋、６３）　１．５６　（３， ００）例５−ワクシニア組換え体ｖＰ５７７及びｙＰ６１３によるモルモットの 免疫 モルモットを免疫して、ワクシニア組換え体ｖＰ５７７及びｖＰ６Ｎによって発 現されたＥＨＶ−１ｇｌｌ１４に対するモルモットの反応を評価した。体重約４ ５０ｇのモルモットに、１Ｇ’　ＴＣＩＤｑｎのｖＰ５７？もしくはｖＰ６Ｎを 、初日（０日）及び２１日目にそれぞれ１１ずつ皮下接種した。００目、２１日 及び３５日目に、モルモットから血液を採取した。
ＴＣＩＪｎ＝５０（ＤＥＨＶ−１ウイルス（ケンタラキー株）に対する中和試験 をブタ精巣細胞上で行なった。ワクシニア抗体の力価は、抗１ｇＧ　ｆＨ＆Ｌ） ペルオキシダーゼ抱合体を用いたＥＬＩＳＡ法で決定した。
結果を表２に示す。ワクシニア組換え体マＰ５７７　（ＥＨＶ−Ｉ　ｇｐ１４遺 伝子全体を含有する）で免疫したモルモットにおいては、ＥＨＬＩに対する血清 中和活性は全くみられなかった（データは示していない）。これに対して、先端 欠損型ＥＨＶ−１ｇＮ４遺伝子を発現するワクシニア組換え体マＰ６１３を接種 したモルモットは、εＨＶ−１ｇｐ１３を発現するワクシニア組換え体ｗＰ４８ ３の場合（表１）と同じ程度のＥＨＶ−１血清中和抗体を誘起した（表２）。１ 次ワクチン接種から３週間後にＥＨＶ−１血清中和抗体が検出されるが、２次免 疫してから２週間後にはより高レベルの血清中和抗体が観察される。ＥＬＩＳＡ 法でワクシニア抗体をアッセイしたところ、免疫したすべての動物において、反 応がみられた。
表２　ＥＨＶ−１ｇｐ１４発現ワクシニア組換え体を接種したモルモット中に存 在する血清中和抗体 血清中和力価（１ＱＩｊ＋ｏ）の経日変化ウィルス　ｙＰ６１３　０．２　０． ７　１．２０、２　Ｇ、　０　１．６ ｇ、　４　０．４ ＥＨＶ−１ｇｐ１３を発現するワクシニア組換え体ｖＰ４８３の効能を評価する ために、ハムスターにワクチンによる１次免疫或いは１次免疫＋２次免疫を施し 、非接種対照群又は対照ワクシニアウィルスｖＰ４５２を２回接種した群と共に 、Ｅ）ＩＶ−１のハムスター適応ケンタラキー株を腹膜内に投与して感染させた 。
４０匹のゴールデンハムスター（４０日齢、体重５５〜６５ｇ）を４つのグルー プに分けた。グループＡには、１０８．１０６　もしくは＋０４ＴＣＩＤ、ｏの ワクシニア組換え体ｖＰ４８３を、各接種量について５匹ずつ、１回皮下接種し た（　１　ｍｌ）。
グループＢには、０日月にｖＰ４８３をワクチン接種し、続いて１４日回定２次 接種した。このとき、１次及び２次接種（］、ｍｌ）は５匹ずつの群に＋［１８ ，１０’又は１０’丁ＣＩＤ、。
を皮下接種した。５匹のハムスターからなるグループＣには、ワクシニアｖＰ４ ５２を０日月と１４日回定２度（１回当り１０８ＴＣＩＤ９０）皮下注射した。
グループＤの５匹は非ワクチン接種対照群としてそのままにしておいた。最後に 免疫してから１４日後に、すべてのハムスターについて、２００　ＬＤ、。量の ＥＩＩＶ−１（ハムスター適応ケンタラキー株）を腹膜内投与によって感染させ た。感染後７日月に生存数を数えた。
結果を表３に示す。非ワクチン接種ハムスター並びにワタシニアｖＰ４５２接種 ハムスターは、すべてＥ）ＩＶ−１感染後５日以内に死亡した。ＥＨＶ＝ｌ　ｇ ｐ１３発現ワクシニア組換え体ｖＰ４１１３をワクチン接種したハムスターでは 、ＥＩＩＶ−１感染に対してかなりのレベルの防御がみられた。１次免疫だけの ハムスターと１次及び２次免疫したハムスターとの間で防御レベルに差異はみら れなかった。半防御量（ＰＤ、１１）は、１次免疫についての１０ｇ、。ＰｒＪ 、。＝６３２．１次免疫＋２次免疫についてのｌ　Ｏｇ＋ｏＰＤ、ｏ＝は６１２ で、同程度の値であった。しかしながら、ＩＮ％防御は、ＩＯ２）　ＴＣＩ０５ ゜の組換えウィルスを２回接種した群についてのみ観察された。
表３　εＨ１’−１ｇｐ１３発現ワクシニア組換え体をワクチン接種したハムス ターのＥ）ＩＶ−１感染からの防御接種量　８６４　１１６４　８ １０ｇ＋ｏＴｃｌＤ５゜ ＥＨＶ−１ｇｐ１４を単独又１ｔＥＨＶ−１ｇｐ１３ト−緒ｔ：発現ｔル’７ク シニア組換え体の防御効果を評価するために、ワクチン接種ハムスターについて ウィルス感染実験を行なった。
ハムスターにワクチンによる１次免疫或いは１次免疫＋２次免疫を施し、非接種 対照群又は対照ワクシニアウィルスマＰ４５２を２回接種した群と共に、ＥＨＶ −１のハムスター適応ケンタラキー株を腹膜内に感染した。体重約６０ｇの２１ 日齢のゴールデンハムスターに、それぞれ１ｍｌの対照ワクシニア又はεＩＩＶ −１ｇｐ１３及び／又はｇｐ１４を発現する組換えワクシニアウィルスｖＰ４８ ３・、ｖＰ５７７、ｖＰｌｙ１３、ＶＰ６３３及びｖＰ６３４を皮下接種した。
１次ワクチン接種に続いて１４日回定同量（１０ｇ＋ｏｐ１ｕ／ｍｌ）のワクチ ンを接種した。最後に免疫してから１４日後に、非接種対照群を含めたすべての ハムスターに、２００　ＬＤｑ。量のＥ）Ｉ’Ｖ叫ハムスター適応ケンタッキー 株を腹膜内注射して感染させた。
感染後１４日日目、５匹からなる群の生存数を数えて実験を終えた。ハムスター の５０％を防御するワクチン接種量をｌ　ｏ　ｇ、ｏｒｃｌ［ｌ、。／ｍｌ接種 量として評価した。
表４に示す通り、全Ｅ）ＩＶ−１ｇｐ（４遺伝子を発現するワクシニアウィルス 組換え体ｖＰ５７７では、ｌ　Ｏｇ＋ｏＰＤ、ｏ≧９．０と計算され、感染に対 する防御力を賦与しなかった。これに対して、ワクシニア組換え体ｖＰ６１３に よって発現される先端欠損型Ｅ）ＩＶ−１ｇｐ１４遺伝子は、感染に対して十分 な防御力を賦与した（表４）。研増されたＰＤ、。（５２）は、ＥＨＶ−＋　ｇ ｐ１３発現ワクシニア組換え体ｖＰ４８３で得られた値（５４）よりも若干良い 値であった。驚くべきことに、Ｅ）ＩＶ−１ｆＮ３及びｇｐ１４を同時発現させ ると、それぞれワクシニアウィルス組換え体ｖＰ５３３及びｖ１６３４中の全ｇ ｌｌ１４遺伝子又は先端欠損型１１４遺伝子のいずれについても、ＥＩＩＶ−１ 糖タンパク質を単独で発現させた場合よりも防御力が著しく増大した。従って、 同一ワクシニアウィルス組換え体中でＥｌｆ〜ニー１　ｇｐ１３及びｇｐ＋４を 同時発現させると、ワクチン接種したハムスターを５０％防御するのに必要なウ ィルス接種量は著しく減少した。
＊　ｖＰ６１３とｖＰ６３４は先端欠損型のＥ）ＩＶ−１ｇｐ１４を発現する。
次ｉ：図８ヲ参照する。ｐＶ）ＩＡ６ｇ＋３をＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子遺伝子 方使用した。全Ｅ）ＩＶ−１ｇｐ１３遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを単離す るために、ｐＶＨＡ６ｇ１３をＮ＋ｕｌとＨｉｎｄｌｌｌで消化した。この消化 によって、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターの３′末端の２８ｂｐ、全ε） ＩＶ−１ｇｐ１３遺伝子及び約４ＩＯＮのワクシニアウィルス配列を含む約１８ にｂのフラグメントが得られた。この１８にｂのＮ＋ｕｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラ グメントを単離して、アビポックスウィルス挿入ベクターｐＦＰＣＶ２及びｐｃ ＰｃＶｌへの挿入に使用した。
ニワトリポックスウィルス（ＦＰ）挿入ベクターｐＦＰｃＶ２は、ＦＰゲノムの １７遺伝子座と呼ばれる非必須領域中に外来遺伝子の挿入された組換え体を作成 するためのビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｌを提供する。ｐＦＰｃＶ２をｐＲＷ７３ １．１３から誘導した。プラスミドｐＲＷ７３１．１３は、ｐＵｃ９の２カ所の Ｐｖｕ１１部位間にＦＰゲノムのＰｖｕｌｌフラグメント（約５．５Ｋｂ）が挿 入されたものである。まず最初に、この５，５ＫｈＦＰゲノム由来Ｐｖｕｌｌフ ラグメント内に存在する非反復Ｈｉｎｃｌｌ挿入部位に多重クローニング配列（ ＭＣ３）を連結した。このＭＣ３は、オリゴヌクレオチドＣＥ　４　（５’　− ＴＣＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧ＾Ｇ　ＣＴＣＧ　ＧＴＡＣＣＧＧＧＧＡ　Ｔ　ＣＣ Ｔ　ＣＴＧ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＣＴＧＣＡＧ　Ｇ　ＣＡＴＧ　ＣＡＡＧＣＴＴ ＧＴＴ−３’　）とＣＦ２（５’−＾ＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡ ＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＧ＾ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡ ＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡ−３’　）とのアニーリングによって誘導したものである 。
ｐＦｅＬＶＩＡｉ；！’７　クシ＝　７挿入ベクターｐＴＰＩ５　（＋　８４） （図３）の誘導体であって、Ｈ６プロモーター下流のＰｓ１１部位にネコ白血病 ウィルス（ＦｓＬＶ）のｅｎｖ遺伝子（１９２）が挿入されたものである。２． ４Ｋｂの発現カセットをＦＰベクターに移し換えるために（図８　）　、ｐＦｅ ＬＶＩＡをＢｇｌｌｌで消化し、Ｐｓ＋１部分消化して、Ｈ６／ＦｅＬＶ　ｅｎ ｖ配列を切り出した。該Ｂｇ１１１部位は１１６プロモ一ター配列の５′末端の 境界にあり、該Ｐｓｔ１部位はＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質の解読枠の翻 訳終結シグナルの４２０ｂｐ下流に位置している。
２、４Ｋｂの上記Ｈ６／ＦｅＬＶ　ｅｎｖ配列を、ＢａｍＨＩとＰｓｉで消化し たｐｃＥＩＩに挿入した。このプラスミドをｐＦｅＬＶＦｌと命名した。ｐＦｅ ＬＶＦｌプラスミドを次にＰｓｌｌで消化してＦｅＬＶ　ｅｎｖ配列を除去した 。得られたプラスミド（ｐｃＥＩＩ中にワクシニアウィルスＨ６プロモーターを 含む）をｐＦＰｃＶｌと命名した。外来の配列を除去するために、５′から該プ ロモーターまでの配列にオリゴヌクレオチドＦ　Ｐ　ＣＶ　ｌ　（５’　−ＣＡ ＧＴＡＡＴＡＣＡＣＧＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＴＴＣＴＴＴＡＴ ＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴ−３’　）を使用して変異を導入しく１９） 、ｐＦＰｃＶｌを得た。、ｔ−ＩＪゴヌクレオチドＦＰＣＶ３　（５’　−ＴＡ ＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＣＧＡＣ− ３”）で、３′から該プロモーターまでの領域（マルチクローニング部位）に変 異を導入して、ｓｐｈ＋部位（＾ＴＧを含む）を除去した。得られたプラスミド をｐＦＰｃＶ２と命名した。
上述の１．８Ｋｂ　Ｎ＋ｕｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌ　ＥＨＶ−１ｇｐ１３７ラグメン トを、ｐＦＰｃＶ２を消化して得た８、ＯＫｂのＮｒｕｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラ グメントに挿入した。この８．０にｂ　Ｎｒｕｌ／　Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメン トは、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターの５′末端部分（１００ｂｐ）　、 ＦＰフランキング配列（挿入部位の４．８Ｋｂ上流及び１．５Ｋｂ下流）並びに ２．４ＫｂのｐＵＣ断片（ＢＲＬ社製、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｊｈｅｓ ｄａ））を含んでいた。これら２つのフラグメントの連結によって、ｐＦＰＥＨ Ｖ１３＾と名付けた９、　８Ｋｂのプラスミドが得られた。
プラスミドｐＦＰＥＨＶ１３Ａをに１１１１１とＨｉｎｄｌｌｌで消化して約６ ００ｂｐのフラグメントを除去した。このフラグメントは、ＥＨＶ−１ｇｐ１３ 遺伝子遺伝子側３′側領域０ｂｐ）と４１［１ｂｐ）’７クシニアウイルスＤＮ Ａ断片とを含んでいた。この６０（ｌｂｐのＫｐｎｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメ ントを、以下の手順で、ｐＮｓＩＥＮＰＮ（図３）由来の２００ｂｐフラグメン トに置き換えた。ｐＮｓＩＥＮＰＮをＰｓｆｌで消化して、該プラスミドを線状 化した。該ＰｔＮ末端を、各ｄＮＴＰ　（０，５ｍＭずつ）の存在下でＴ４　Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬｘｂｓ社製）を作用させ て、平滑末端とした。次にＨｉｎｄｌｌｌリンカ−（ＢＲＬ社製）をこの平滑末 端フラグメントに連結した。Ｈｉｎｄｌｌｌで消化した後、該線状化プラスミド をＫｐｎｌで消化して、ＥＨＶ−Ｉ　ｇｐ１３遺伝子の３′末端部分、終止コド ン（ＴＡＧ）に相当する配列、並びにワクシニアウィルス初期転写終結シグナル として公知の（４５）　ｒＴＴＴＴＴＮＴＪ配列を含む２ＱＯｂｐのフラグメン トを得た。この組換えプラスミドをｐＦＰＥＨＶ１３Ｂと名付けて、Ｈ６プロモ ーター付きＥＨＶ　ｇｐ１３遺伝子をＦＰゲノムの１７座に挿入するためのイン ビトロ組換えに使用した。得られた組換えニワトリポックスウィルスをｖＦＰ４ ４　と名付けた。
次に図９を参照する。ｐＦＰＥＨＶ１３Ｂｌ；ｔ、ｐｃＰｃＶｌへ＋７）挿入用 １．４Ｋｂ　Ｎ＋υｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントの作成にも利用した。ｐｃ ＰｃＶｌプラスミドは、カナリアポックスウィルス（ＣＰ）ゲノムの３ｊＫｂ　 Ｐｖｕｌｌフラグメント内に存在する非反復Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位にワクシニア ウィルスＨ６プロモーターを含んでいる。この挿入プラスミドを用いると、ＣＰ ケノムのＣ３座に外来遺伝子を挿入することが可能になる０ｐｃＰｃＶｌヲｐＲ Ｗ７６４．２　（ｐ　Ｕ　Ｃベタ９−１１ｊＫｂのＣＰゲノム由来Ｐｗｕｌｌフ ラグメントが挿入されている）から誘導した。ｐＲＷ７６４．２をＥｃｏＲｌで 消化して線状化した。このフラグメントを、各ｄＮＴＰ　（０，５ｍＭずつ）の 存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメント（Ｂｏｅｈ＋ｉｎｇ ｅ＋Ｍｘｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を作用させて、平滑末 端とした。ｐＦＰｃＶｌをＫｐｎｌ／　ｔｌｐａｌで消化して、ワクシニアウィ ルスＨ６プロモーター配列とマルチクローニング領域（該プロモーターの３′末 端に位置する）を切取った。この２００ｂｐのフラグメントを、各ｄＮＴＰ　（ ０，５ｍＭずつ）の存在下で７４　ＤＮＡポリメラーゼを作用させて、平滑末端 とし、上記の線状化しかつ平滑末端としたプラスミドｐＲＷ７６４．２に挿入し た。得られたプラスミドをｐｃＰｃＶｌと名付けた。
プラスミドｐｃＰｃＶｌをＮｒｕｌとＨｉｎｄｌｌｌで消化して５．８Ｋｂのフ ラグメントを単離し、上述の１．４Ｋｂ　ＥＨＶ　ｇｐ１３含有フラグメントに 連結した。得られたプラスミドをｐｃＰＥＨＶ１３＾と名付けた。このプラスミ ドを使用して、Ｈ６プロモーター付きＥＨＶ　ｇ９１３遺伝子をＣＰゲノムのＣ ３座に挿入するためのインビトロ組換え実験を行なった。この組換えカナリアポ ックスウィルスをｖＣＰ４８と名付けた。
インビトロ組換え後、ＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子を有する組換えアビポックスウ ィルスを標準的なブラークツ１イブリダイゼーシヨン法によって同定した。プラ ーク単離を３回繰返して陽性プラークを精製した後、ハイブリダイゼーション法 による分析を行なった。ＦＰ組換え体とＣＰ組換え体を、それぞれｖＦＰ４４及 びｖｃＰ４８と名付けた。これらの組換え体を、ＥＨＶ−１ｇｐ１３遺伝子に対 するモノクローナル抗血清を用いたプロティンＡ−β−ガラクトシダーゼ免免疫 スクリーン法法分析した。その結果、ＣＥＦ及びＶＥＲＯ細胞単層にｖＦＰ４４ 又はｖＣＰ４８を感染させると該ウィルス感染細胞表面上にＥＨｖ−１ｇｐ１３ 遺伝子か発現することが実証を発現するワクシニアウィルス組換え体の評価εＨ Ｖ−１ｇｐＩ４を発現する他の組換えワクシニアウィルスの構築と評価 含ＥＨＶ−１ｇｐ１４構築体（例２）を、（ａ　）ＥＨＶ−１ｇｐ１４’Ｊ　− ダー配列の長さを変える、（ｂ）遺伝子の３′側にある過剰ノＥＨＶ−Ｉ　ＤＮ Ａを除去する、並びに（ｃ）ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子の修飾型遺伝子を評価用 ワクシニアウィルスｖＰ２９３宿主域選択系（６９）に挿入する、という３通り の方法で修飾した。
ＥＨＶ−ｌ　ｇｐ１４遺伝子産物は非常に長いリーダー配列を含んでいる。５８ 番目のアミノ酸から９９番目のアミノ酸までの長い疎水性配列はシグナル配列で あると思われる。この領域の前には長い親水性配列が存在している。同様の長い リーダー配列は、他の２つのｇＢ相同物、即ち、仮性狂犬病ウィルスのｇ　ｌ　 １　（６２）とウシヘルペスウィルス１型のｇｌ　（６３）にも認められる。
Ｅｌ（Ｖ−１ｇｐ１４）５’末端の修飾組換えワクシニアウィルス中で発現する ｇｐ１４産物のプロセシング、提示及び免疫力に及ぼすＥＨＬＩ　ｇｐ１４のリ ーダー配列の長さの影響を研究するため、既述の含ＥＨＶ−１ｇｐ１４構築体を 以下の通り修飾することによって、３つの異なる長さのリーダー配列を有するＥ ｌ−１ｇｐ１４遺伝子含有プラスミドを作成した。
ここで図１０を参照する。プラスミドｐＶＭ２Ｌ）１６ｇ１４　（例２）は、Ｈ ６プロモーターの制御の下に置かれた全ＥＨＶ−１ｇｐ１４コード配列（コペン ハーゲン株ワクシニアＭ２Ｌ欠失座に挿入されている）を含有する。ｐＶＭ２Ｌ Ｈ６ｇ１４においては、ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子の２番目のアミノ酸が本来の Ｓｅ＋ではなくてＨｉｓとして存在している。２番目のアミノ酸をＳｅ「に変え るために、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４をコドン１〜２（Ｍｅｔ／Ｈｉｓ）においてＮ ５ｉｌ　（認識配列ＡＴＧＣＡＴ）で切断した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳ ＹＮ２４０　（５’−＾ＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＴＣ ＣＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴＴＣＴＧＴＣ−３’　）を使用して変異を導入した （１９）。得られたプラスミドｐＭＰ１４Ｍは、本来のコドン２（Ｓｅ「）を有 するＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子全体を含んでいる。
７’　ラスミｆ’　ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１　（例２）は、リーダー配列の先 端が欠けていること（Ｈｕｎｃａｊｉｏｎ）並びに合成Ｍａｉｌリンカー由来の コドンが４つ導入されていること以外、ｐＶＭ２’ＬＨ６ｇ１４と同一である。
ｐＶ１４２ＬＨ６ｇ１４−ＩニオケルＥ）ＩＶ−１ｇｐ＋４遺伝子の５′末端配 列はＭｅｔ／Ｈｉｓ／Ａｌａ／Ｃｙｓ／Ｉｌｅ／Ａｌａ、、。
をコードするＡＴＧ／ＣＡＴ／ＧＣＡ／ＴＧＣ／ＡＴＴ／ＧＣＴ　であり、ここ でＧＣＴ　（Ａｌａ）はＥＨＶ−１ｇｐ１４のコドン３５である。変異導入法（ １９）ニヨッテ、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１を２通りに修飾した。
ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１とほぼ同し程度まで先端を切取っては０るかｇｐ１４ の本来の配列により近い修飾型遺伝子を作成するために、ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４ −１をコドン１〜２においてＮ５１１テ切断した。合成オリゴヌクレオチドＭ［ ’５ＹＮ２４＋　（５’−＾ＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧ ＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣ−３’　）を使用し て変異導入を行なった。得られたプラスミドｐＭＰ１４Ｍ−３４においては、Ｅ ）ＩＶ−１ｇｐ１４：ｌ−ド配列はＭｅｔ／Ｓｅ＋／Ｖａｌ／？ｏ、　、　をコ ードするＡＴＧ／＾ＧＴ／ＧＴＣ／ＣＣＡ、、で始まるが、ここでＣＣＡ　（Ｐ ｒｏ）はＥＨＩ−１ｇｐ１４の３６番目のアミノ酸である。ＥＨＶ−１ｇｐ１４ 遺伝子はコドン６１−６３　（Ｌｙｓ／？ｏ／Ａ　ｌ　ａ）にＮａｅ１部位（Ｇ ＣＣＧＧＣ）を含んでいる。より多くの先端を切取った修飾型ＥＨＶ−１ｇｐ１ ４遺伝子を作成するために、ＮａｅｌでｐＶＭ２ＬＨ６ｇ１４−１を線状化し、 次いでＮ５ｉｌで消化して、ベクターフラグメントをアガロースゲルから単離し た。合成オリゴヌクレオチド１ｌｌＰＳＹＮ２４３　（５’　−ＡＴＣＣＧＴＴ ＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡ ＣＡＡＴＡＧＴＴ−３′）を使用して変異導入を行なった。得られたブラスミＦ 　ｐＭＰ　１４Ｍ−６３１＝　オイテハ、ＥＨＶ−ｉ　ｇｐ１４：Ｉ−ド配列は Ｍｅｔ／Ａｌａ　をコードする＾ＴＧ／ＧＣＡ、　、　、て始まるが、ここでＧ ＣＡ　（ＡｌａｌはネイティブなＥＨＶ−１ｇｐ１４の６３番目のアミン酸であ る。
余剰ＥＨＶ−Ｉ　ＤＮＡ（７）除去 上記のすべてのＥＨＶ−１ｇｐ１４含有プラスミドにお（Ｘては、ＥＨＶ　ｇｐ １４Ｄ−ド配列の後に約１２００ｂｐ）ＥＨＶ−Ｉ　ＤＮＡ力（続ふ）ている。
ｇｐ１４遺伝子の終止コドン（ＴＡ人）はＤｅａ１部位（ＴＴＴＡＡ＾）中に存 在する。過剰のＥ）１．Ｖ−１ＤＮＡを除去するために、ｐＨＰ１４Ｍ−６３を Ｄｅａｌで部分消化して、線状ＤＮＡをアガロースゲルから単離して、次いでＰ ｓ）ｌ消化によってＥＨＶ−Ｉ　ＤＮＡと下流のワクシニアフランキングアーム との連結部を切断した。アガロースゲルから６．５にｂのＤｅａｌ／Ｐｓｌｌ　 ＤＮ＾バンドを単離した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２４７　（５’　 −ＡＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴ＾＾ＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡ−３’　）とＭＰＳＹＮ ２４　ｇ　（５’　−ＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴ−３’　）を アニールして、上記６．５Ｋｂフラグメントと連結した。得られたプラスミドｐ ＭＰ１４ｋｌ−６３Ｐニおいてハ、ＥＨＶ−１ｇｐ１４２−ド配列ノ直後に初期 ワクシニア転写終止を支配する配列が続き（４５）、その後にポリリンカー領域 （Ｈ９！Ｉ、Ｘｈｏｌ、Ｐｓｉ制限部位を含む）とＨｉｎｄｌｌｌ　Ｍ由来の左 側ワクシニアフランキングアームが続いている。
Ｈ６プロモーター／ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子のｐＨＥｓ／ｖＰ２９３選択系へ の挿入 上記のすべてのＥｌ−１ｇｐ１４含有プラスミドにおいては、ＥＨＬＩ　ｇｐ１ ４遺伝子は、コペン／％−ゲン株ワタシニアウイルスのＭ２Ｌ欠失座に挿入され たワクシニアＨ６プロモーターの制御下に置かれている。Ｍ２Ｌ挿入座は欠失さ せることのできるゲノムのより大きな領域内に位置している（６９）ので、潜在 的により安定な挿入部位にＨ６プロモーター／ＥＨＶ−１ｇｐ１４発現カセット を移すことについて検討した。予備段階として、異なる長さのリーダー配列を含 有するＥＨＶ−１ｇｐＩ４遺伝子構築体をＷＲｐＨＥｓ／ｖＰ２９３宿主域選択 系（６９）に移し換えることによって、比較対照用のワクシニア組換え体の迅速 な作成が可能になった。
プラスミドｐＨＥｓ−４は、ワクシニアＨ６プロモーターとそれに続くポリリン カー領域及びＫ１１ｆｌ−宿主域遺伝子（７０）を含んでいるが、これらはすべ て２１．７Ｋｂ欠矢部の両隣のＷＲワクシニアアーム間に挿入されている（６９ ）。
ｐＨＥＳ−４は２カ所のＮｒｕ１部位を含んでいるが、その一つはＨ６プロモー ター内にあり、もう一つはワタシニアフランキング配列内にある。ｐＨＥｓ−４ を、ＮｒＩｌｌで部分消化して線状化し、アガロースゲルから完全な長さの線状 ＤＮＡを含むバンドを単離した。この線状ＤＮＡをポリリンカー領域内のＸｈｏ １部位で切断した。ｐＭＰ１４Ｍ−６３Ｐは２カ所のＮ＋ｕ１部位を含んでいる が、その一つはＨ６プロモーター内にあり、もう一つはＥＨＩ／−１ｇｐ１４コ ード配列内（遺伝子の３′末端から０．２ＫｂｒＤ位Ｍ）にある。ｐＭＰＩ４Ｍ −６３ＰをＮｒｕｌで線状化した後Ｘｈｏｌで消化した。２．８ＫｂのＮｔａｌ 　（ｍ分）／Ｘｈｏｌフラグメントをアガロースゲルから単離した。このフラグ メントは、１１６プロモーターの一部とそれに続く修飾型Ｅ）ＩＶ−１ｇｐ１４ 遺伝子（リーダー配列が最も短い型）を含んでいる。ｐＭＰ１４１１−６３Ｆ由 来ノ２８にｂ　）１６プｏモー９−／Ｅｌ−１ｇｐ１４含有フラグメントを、９ ＨＥＳ−４由来のＮｒｕｌ　（部分）／Ｘｈｏｌヘクターフラグメントに連結し た。得られたプラスミドｐＨεＳ−ＭＰ６３は、Ｈ６プロモーター／ＥＨＶ−１ ｇｐ１４遺伝子カセットを含んではいるが、余剰Ｅ）ＩＶ−Ｉ　Ｉ）ＮＡは有し ていない。全長又は適度に先端の切取られたリーダー配列を含むＨ６プロモータ ー／ε８１’−１ｇρ１４の５′末端を移し換えるために、プラスミドｐＭＰ１ ４１１及びｐＭＰ１４Ｍ−３４をＮｔａｌで切断して、それぞれ、２．８Ｋｂと ２．７Ｋｂのバンドをアガロースゲルから単離した。ｐＨＥＳ−ＭＰ６３をＮｔ ａｌで部分消化して、７、２Ｋｂのフラグメントをアガロースゲルから単離した 。
この７．２にｂベクターフラグメントは、Ｈ６プロモーター／Ｅ）ＩＶ−１ｇｐ １４の５′末端を含む２．６Ｋｂ　ＮｒｕｌフラグメントがｐＨＥＳ−ＭＰ６３ カラ除去サレタもノテある。コノｐ）ＩＥＳ−ＭＰ６３由来７，２Ｋｂ　Ｎｔａ ｌ　（部分）ベクターフラグメントを、ｐＭＰ１４Ｍ由来の上記２，８Ｋｂ　Ｎ ＋ｕｌフラグメントと連結して、ｐＨＥｓ−ＭＰＩを得た。ｐＨＥｓ−ＭＰ６３ 由来？、２Ｋｂ　Ｎｔａｌ　（部分）ベクターフラグメントを、ｐＭＰＩ４Ｍ− ３４由来の上記２．７ＫｂＮｒｕｌフラグメントに連結して、ｐＨＥＳ−ＭＰ３ ４を得た。プラスミドｐ）ＩＥｓ−ＭＰ６３、ｐＫＥｓ−ＭＰＩ及ＣＪ’ｐＨＥ Ｓ−ＭＰ３４を作成スルためのクローニング工程を図１０に図解した。
フラ７．　ミ）’　ｐＨＥｓ−ＭＰＩ、ｐＨＥｓ−ＭＰ３４及ヒｐＨＥＳ−ＭＰ ６３を、ｖＰ２９３　（６９）との組換え用ドナープラスミドとして使用して、 それぞれ、組換えワクシニアウィルスｖＰ７５３、ｖＰ７６５及びｖＰ７２１を 得た。ヒトＭＲＣ−５細胞上で組換えプロジェニイを選択した。
ＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子を発現するｖＰ２９３系ワクシニアウィルス組換え体 の評価 組換えワクシニアウィルスマＰ７５３、ｖＰ？６５及びｖＰ７２１中で発現させ た３種類のＥＨＶ−１ｇｐ１４遺伝子産物が、感染細胞表面上に存在するか否か を決定するために、ＶＥＲＯ細胞単層に３種類のＥＨＶ−１ｇｐ１４含有組換え ワクシニアウィルスを感染させた。ＥＨＶ−１ｇｌ１１４に特異的なモノクロー ナル抗体３Ｆ６を使用して、感染させた細胞単層の表面免疫蛍光を測定した。３ 種類のワクシニアウィルス組換え体、ｖＰ７５３、ｖＰ７６５及びｖＰ７２１に 感染させた細胞すべてについて表面免疫蛍光は陽性であった。この結果は、リー ダー配列の長さを変化させてもワクシニア感染細胞中におけるＥＨＶ−１ｇ９１ ４遺伝子産物の適切な輸送には影響がないことを示している。
３種類のＥＨＶ−１ｇｐ１４含有ワ含有ワクシニアウィルス体によって発現され るＨＩＶ−１ｇｐ１４遺伝子産物を比較するために、ｖＰ７５３、ｖＰ７６５及 びｖＰ７２１をＭＲＣ−５細胞に感染させ、代謝されるタンパク質を３５３−メ チオニンを使用して標識した。Ｅ）ＩＶ−１ｇｐ１４に特異的なモノクローナル 抗体３Ｆ６を使用して、放射性標識細胞溶解物について免疫沈降反応を行なった 。
ｖＰ７５３、ｖＰ７６５及びｖＰ７２１に感染した細胞から得られた免疫沈降タ ンパク質を互いに識別不能で、プラスミドｐＶＭ２Ｌｌ（６ｇ１４−１から作成 したＥＨＶ−１ｇｐ１４含有ワクシニア組換え体であるｖｐ６１３由来の免疫沈 降タンパク質と等価であった。これらの結果は、上記組換え体で試したようにε ＩＩＶ−１ｊｐ＋４リーダー配列の長さを変化させても、遺伝子産物の適切なプ ロセシングは促進も妨害もされないことを示している。
異なる型のεＨＶ−［ｇｐ１４を発現する組換えワクシニアウィルスの防御効果 を評価するために、ハムスターにマＰ７５３、マＰ７６５及びマＰ７２１を量を 変化させて接種し、ＥＨＶ−１のハムスター適応ケンタラキー株を感染させた。
３種類のεＩ（Ｖ　ｇｐ１４含有ワクシニア組換え体はすべて防御力があり、そ のｌ　Ｏｇ＋ｏＰＤｓ。値は６，２もしくはそれより優れていた。これら３種類 のワクシニアウィルス組換え体の間で、防御力に統計的有意差はみられなかった 。
ｖＰ５？７とは対照的に、同じ＜　ｐＶＭ２ＬＨ６ｇ＋４とｙＰ４５８との間の 組換えによって得られた別のワクシニアウィルス組換え体は、ｖｐ６Ｎ、ｙＰ７ ５３、！Ｐ７６５及びｖＰ７２１でみられるＥＨＬＩ　ｇｐ１４免疫沈降パター ンと同じ免疫沈降パターンを示し、かつこれらのＥＩＩＶ−１ｇｐ１４発現組換 えワクシニアウィルスと同様に、感染細胞表面上にＥＨＶ−１ｇｐ１４タンパク 質を発現した。
この結果は、ワクシニアウィルス組換え体ｖＰ５７７中で発現したＥＨＶ−１ｇ ｐ１４に欠陥があり、この欠陥がおそらくドナープラスミドｐＶＭ２ＬＨ６ｇ＋ ４とワクシニアウィルスｖＰ４５８との組換えの際に生じたことを示唆している 。
鯉旦−ウマヘルペスウィルス１型に由来する３種類の新規遺伝子の塩基配列とワ クシニアウィルス組換え体中での発現 ｇｐ１？／１８をコードするＥｌｌｌｌ遺伝子をワクシニア組換えウィルス中で 発現させるに先立って該遺伝子を同定・単離するために、ＥＨＶ−１ゲノムのＵ 、領域のほとんどの配列を決定し、このＤＮＡフラグメント上で発見した複数の 異なる解読枠を発現させた。該Ｓ領域にコードされた以下の３種類の新規ＥＨＶ −１遺伝子、即ち、決定した塩基配列から、■Ｈ３Ｙ　ｇＤ遺伝子及びＰＲＹ　 ｇｐ５０遺伝子産物との相同性を示すＥｌ（Ｖ−１ｇＤ、■）ＩＳＶ　ＵＳ７遺 伝子及ヒＰＲＶ　ｇｐ６３遺伝子産物との相同性を示すＥＨＶ−１ｇｐ６３、及 び■）ＩＳＶｇＥ遺伝子及びＰＲＶ　ｇｌ遺伝子の産物との相同性を示すＥＨＶ −１ｇＥを同定し、解析した。これら３種類の遺伝子をすべて、個別又は−緒に 、迅速発現研究用コベンノ＼−ゲンワクシニア株宿主域選択系にクローン化した 。ウサギの抗ＥＩＩＶ用血清を用いた免疫蛍光法によって、ＥＩＩＶ−１特有の 遺伝子産物が発現されることが判明した。
ＥＨＶ−Ｉ　ＢａｍＨＩ　ＤフラグメントのクローニングＥＨＶ−１ｇｐ１７／ １８遺伝子ハＥ　ＨＶ　−１ゲノムのＳ領域に位置しているので（３）、ＵＳ領 域の大部分に相当するＢａｍＨＩ　Ｄフラグメント（５９）を単離してクローニ ングした。
ケンタラキーＤ株のＥＨＶ−１ゲノムＤＩＩＡをＢａｍＨｌで消化した。アガロ ースゲル（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、　ＢｉｏｌＱｌ、Ｉｎｃ社製、カリフォルニア 州うジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ））から１１．’ＯＫｂのＢａｍＨＩ　Ｄフラグ メントを単離し、プラスミドｐｌＢＩ２４にクローン化して、プラスミドｐＥＨ ＶＢａｌｎＨＩＤとした。このフラグメントの制限酵素地図を得た（図ＩＩ）。
ＥＨＶ−１ｇＤ、　ｇｐ６３及びｇＥをコードするＤＮＡ配列の同定例１記載の 手順で、ｐｌＢ＋２４にサブクローン化したＢａｒｎＨＩＤフラグメントの幾つ かのサブクローンから二本鎖に関する塩基配列を得た。連続フラグメント間の連 結部の配列は、最初のクローンｐＥｌ（ＶＢａｍＨＩＤ上でチェックした。
−切の配列データの解析にはＰＣ／ＧＥＮＥソフトウェア−パッケージ（Ｉｎｌ ｅｌｌｉＢｎｅｌｉｃｓ　Ｉｎｃ、社製、カリフォルニア州マウンテン番ビュー （Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｖｌ）を使用した。
Ｅ）ＩＶ−１ｇＤ、　ｇｐ６３及ヒｇＥ遺伝子のＤＮＡ塩基配列解析塩基配列を 決定したＢａｍＨＩ　Ｄフラグメント（特有の短鎖領域の大部分に相当する）由 来の６４０２ｂｐ領域のＤＮＡ配列を解析することによって、少なくとも３つの 完全な解読枠（すべて同−鎖から読取られる）が存在することが明らかになった 。この配列を、図１２に、５’　−３’鎖を右方向に示した。塩基組成はＧ＋Ｃ 含量５０．４４％である。
第一の解読枠（ＯＲＦ＋）は、９７１番目の塩基から２１７６番目の塩基までで ある。転写調節シグナルと思われる配列が、ＡＴＧ開始コドンである可能性の最 も高い９７１番目の塩基の５′側領域にみつかった。配列ＴＡＴＡＴＴＡＡ　（ ヌクレオチド８７１〜８７８）を有するｒ　ＴＡＴＡボックス」は、８１１番目 から８１７番目に位置する配列ＴＧＡＣＡＡ丁を有する仮想ｒＣＡＴボックス」 の６０塩基下流に位置していた。ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は、 ＴＡＡ終止コドン（ヌクレオチド２１７７〜２１７９）の下流にはみられなかっ た。配列５’ＴＣＣＣＴＴＣＧＣＣ３’　（ヌクレオチド８９０〜８９９）の１ ０個の塩基のうちの７個は、１８ｓリポソームＲＮＡの配列３’　ＡＧＧＡＡＧ ＧＣＧＴ５’　（６１）と相補的であり、リポソーム結合部位として機能してい る可能性がある。真核生物のｍＲＮＡの翻訳開始に関する移動（＋ｃａｎｎｉｎ ｇ）モデルが提案されている（＋５１）。このモデルの基本法則は、リポソーム がｍＲＮＡの５′末端に結合して、ｍＲＮＡ分子上を直線的に移動するというこ とである。翻訳の開始に関する符号は、例外も知られてはいるが（＋５２）通常 は最初の５′基部＾ＴＧコドンである。−３位のプリンは翻訳開始に必須であり 、配列の残りの部分が最適でなければ、−１番目及び−２番目の塩基Ｃによって 翻訳が促進される。上述の開始コドンＡＧＣＡＴＧＴ　（ヌクレオチド９６８〜 ９７４）付近の配列状態は、真核生物のｍＲＮＡの翻訳の開始に必要な機能的配 列状態を満足する。さらに２つの潜在的ＡＴＧ開始コドンがヌクレオチド９８９ 〜９９１及び９９２〜９９４に位置している。これら２つのコドンＣＴＴＡＴＧ ＡＴＧＧの前後状況は、翻訳開始の役割を果たし得るものではない。ＥＨＶ−１ ０ＲＦＩは計算上、４５２３９ダルトンの分子量を有する４０２個のアミノ酸を コードする。
ＥＨＶ−１０ＲＦＩタンパク質構造の解析アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タ ンパク質に共通する多くの性質か明らかになった。１番目のアミノ酸から２６番 目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を有しており、シグナル配列であ ると思われる。２４残基のアミノ酸（３５１〜３７４）からなる疎水性領域は膜 貫通性アンカー領域として機能すると予想される。Ｎ−グリコジル化される可能 性のあるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ　（Ｘはプロリン以外のアミノ酸である） 部位か４カ所存在する（１５７）。
Ｅ）ＩＶ−１０ＲＦＩアミノ酸配列の疎水的性質を図１３に示す。シグナル及び アンカー成分などの膜貫通性糖タンノ々り質の特徴が明瞭に現れている。Ｎ末端 とＣ末端付近に存在する２つの最も疎水性の高い領域は、それぞれ糖タンノ々り 質分子のシグナル配列及び膜貫通性領域であろうと思われる。
ＥＨＶ−１０ＲＦＩアミノ酸配列と他のヘルペスウィルス糖タンパク質との比較 予想されるεＨＶ−１０１１ＦＩのアミノ酸組成の比較から、他のヘルペスウィ ルスの糖タンパク質とのかなりの相同性か明らかになった。たとえば、ＥＨＬＩ 　０ＲＦＩタンノ々り質は、ＰＲＹ　ｇｐ５０　（９５）及びＨＳＶ−１ｇＤ　 （７９，１６０）　ニ類似している。
第二の解読枠（ＯＲＦ２）は２２８７番目の塩基から３５２５番目の塩基までで ある。２２８７番目のＡＴＧ開始コドンの５′側領域には、転写調節シグナルと 思われる配列はみつからなかった。ＴＧＡ終止コドン（ヌクレオチド３５２６〜 ３５２８）の下流には、ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルはみられなかった か、潜在的ＹＧ丁Ｇ丁ＴＹＹ配列ポリアデニル化シグナル（＋８０）が、上記終 止コドンの約４ｏｂｐ下流及び７０ｂｐ下流の２カ所に位置していた。予想され る開始コドンＧＣＴＡＴＧＧ付近の配列状態はコザック（Ｋｏｚａｋ）の法則（ １５１，１５５）に合致している。そのほかに少なくとも２つの潜在的＾ＴＧ開 始コドンが、ヌクレオチド２３０５〜２３０７及び２３３２〜２３３４に存在し ているが、これら２つのコドンの配列状態（ＧＧＧＡＴＧＴとＴＣＴＡＴＧＧ） は翻訳開始の役割を果たし得るものではない。ＥＨＶ−１０ＲＦ２は、計算上４ ５４３１ダルトンの分子量を有する４１３残基のアミノ酸からなるポリペプチド をコードしている。
ＥＨＶ−１０ＲＦ２タンパク質構造の解析アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タ ンパク質に共通する多くの性質か明らかになった。１番目のアミノ酸から２２番 目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を有しており、シグナル配列であ ると思われる（コンピューター解析からは、該部位が切断部位として機能する可 能性は低いという結果がでた）。３２残基のアミノ酸（３１５から３４６までの 位置）からなる疎水性領域は膜貫通性アンカー領域として機能すると予想される 。Ｎ−グリコジル化される可能性のあるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈ＋／Ｓｅ＋部位が７カ 所存在する。Ｅ）ＩＶ−１０ＲＦ２アミノ酸配列の疎水的性質を図１４に示す。
シグナルとアンカー成分を含む膜貫通性糖タンパク質の特徴が明瞭に現れている 。Ｎ末端及びＣ末端付近に存在する２つの最も疎水的な領域は、それぞれ糖タン パク質分子のシグナル配列及び膜貫通性領域であろうと思われる。
ＥＨＶ−１０ＲＦ２アミノ酸配列の他のヘルペスウィルス糖タンパク質との比較 予想されるＥＨＶ−１０ＲＦ２のアミノ酸組成の比較によって、その他のヘルペ スウィルスの糖タンパク質とのかなりの相同性が明らかになった。ＥＩＩＶ−１ ０ＲＦ２タンパク質はＰＲＹｇｐ６３　（８０）　、ＶＸｖ　ｇｐｌＶ　（１８ １）及びＨＳＶ−Ｉ　ＵＳ　（７９）ｌｌｉ似している。
第三の解読枠（ＯＲＦ３）は、ヌクレオチド３７９６〜５４５１までである。転 写調節シグナルと思われる配列が、３７９６番目の＾ＴＧ開始コドンの５′側領 域中にみつかった。配列ｒＧＴＴＴＡＡＡＪ　（ヌクレオチド３７０５〜３７１ １）を有するＴＡＴ人ボックスが、ＣＡＴボックスであると思われる３６４９〜 ３６５４に位置する配列ｒ　ＧＣＡＡＴＧＪの５０塩基下流に位置していた。は っきりとしたポリアデニル化シグナルは、ＴＧＡ終止コドン（ヌクレオチド５４ ５２〜５４５４）の下流にはみられなかった。予想開始コドンＡＴＡＡＴＧＧ付 近の配列状態はコザックの法則（１５１，１５５）　１ｍ合致しテイル。ＥＨＶ −１０ＲＦ３は、計算上６１４９３ダルトンの分子量を有する５５２残基のアミ ノ酸からなるポリペプチドをコードする。
ＥＨＶ−１０ＲＦ３タンパク質構造の解析アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タ ンパク質に共通する多くの特徴が明らかになった。１番目のアミノ酸から２３番 目のアミノ酸までの領域は特徴的な疎水的性質を有しており、シグナル配列であ ると思われる。３８残基のアミノ酸（４０４〜４３７）からなる疎水性領域は膜 貫通性アンカー領域として機能すると予想される。Ｎ−グリコジル化される可能 性のある＾５ｎ−Ｘ−Ｔｈ＋／Ｓｅｒ部位が５カ所存在する。ＥＨＶ−１０ＲＦ ３アミノ酸配列の疎水的性質を図１５に示す。シグナルとアンカー成分を含む膜 貫通性糖タンパク質の特徴が明瞭に現れている。Ｎ末端及びＣ末端付近に存在す る２つの最も疎水的な領域は、それぞれ糖タンパク質分子のシグナル配列及び膜 貫通性領域に相当すると予想される。
ＥＩＩＶ−１０ＲＦ３タンパク質のアミノ酸組成の比較によって、その他のヘル ペスウィルスの糖タンパク質とのかなりの相同性が明らかになった。たとえば、 ＥＨＶ−１０ＲＦ３タンハク質ハ、ＰＲＹ　ｇｌ　（８０）　、Ｖ２Ｖ　ｇＥ　 （＋　８１）　及びＨＳＶ−１ｇＥ（７９）に類似している。
ＷＲｐＨＥＳ／ｖＰ２９３宿主域選択系（６９）に類似の、コペンハーゲンワク ンニアウイルス系列の宿主域選択系を構築した。
コペンハーゲンワクンニアウイルス欠失突然変異体ｖＰ６６８は、Ｈｉｎｄｌｌ Ｉ　Ｃからｔｌｉｎｄｌｌｌ　Ｋまでの領域に存在する１２個の遺伝子を欠失し ており、該欠失遺伝子の中には２つのヒト宿主域遺伝子Ｋ　Ｉ　Ｌ　（７０）と Ｃ７Ｌ　（Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｃに位置する）が含まれている。ｖＰ６６８はヒト ＭＲＣ−５細胞中では増殖できない。ｃｏｐｃｓプラスミド系のプラスミドはワ クシニアフランキングアーム内にＣ７Ｌ遺伝子を含んでおり、ｖＰ６６８との組 換えが可能であり、ＭＲＣづ細胞上でのウィルスの増殖能を復元させる。ｖＰ６ ６８／Ｃ０ＰＣ３宿主域選択系を用いた組換えによって生まれた組換えワタシニ アプロジエニイのヒトＭＲＣ−５細胞上におけるプラーク形成能力の有無に基づ いて、かかる組換え体を迅速に同定することができる。プラスミドｐｃＯＰｃｓ ６５７は、合成Ｈ６ワクシニアプロモーター並びにそれに続いて外来遺伝子挿入 用のポリリンカークローニング領域を含んでいる。
該ポリリンカー領域の後には終止コドンとワタシニア転写終結シグナルが続いて いる（４５）。
ＥＨＶ−１ｇＤ遺伝子ノｐＣＯＰＣ８６５７ヘノクローニンクここでは図１６を 参照する。プラスミドｐＥＨＶＢａｍＨＩＤを）１ｉｎｄｌｌｌで消化し、１２ ４０ＭのＥＨＶ−１ｇＤ含有旧ｎｄｌｌｌ　ＤＮＡフラクメントをアガロースゲ ル（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、　ＢｉｏｌＯ１社製）から単離して、ＤＮＡポリメラ ーゼのフレノウフラグメントを用いて一本鎖部分を埋めた。該修復フラグメント を、５ＩＩｌａＩ／ｌ！１化プラスミドｐｃＯＰｃｓ６５７に連結した。得られ たプラスミドｐｊＣ＾００６は、Ｈ６プロモーターから約１０ｂｐ離れた位置に ＡＴＧ開始コドンを有している（図１６）。
ＥＨＶ−＋　ｇｐ６３遺伝子のｐｃＯＰｃｓ６５７へのクローニングプラスミド ｐＥＨＶＢａｍ）ＩＩＤをＨｉｎｄｌｌｌ、ＥｃｏＲＩ及びＰｖｕｌｌで消化し 、１３００ｂｐのＥ）ＩＶ−１ｇｐ６３含有ｆｌｉｎｄｌｌｌ−Ｐｖｕｌｌ　Ｄ ＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、フレノウフラグメントで一本鎖 部分を埋めた。該修復フラグメントを、Ｓｍａ　Ｉ消化プラスミドｐｃＯＰｃｓ Ｉｉ５７に連結した。得られたプラスミドをｐｌｃＡＯＯＨｍおいて、ＥＨＹ− ｌ　ｇｐ６３ハＨ６プロモーターに対して適当な位置にある（図１６）。
ＥＩＩＶ−１ｇｇ遺伝子（Ｄ　ｐｃＯＰｃｓ６５７へ０）　’ｙ　ｏ−ニンクプ ラスミドｐＥＨＶＢａｍＨＩＤをＡａｌｌｌ及びＡｐａｌで消化し、アガロース ゲルから２６３０ｂｐのＥＨＶ−１ｇＥ含有＾ａｔｌｌ−Ａｐａｌ　ＤＮＡフラ グメントを単離して、フレノウフラグメントで一本鎖部分を埋めた。該修復フラ グメントを、ＳｍａｌプラスミドρＣ０ＰＣＳ６５７に挿入した。得られたプラ スミドをｐｌｃＡＯＯ７と命名したが、これは１１６プロモーターに対して適当 な位置に置かれたＥ）ＩＶ−１ｇＥを含有する（図１６）。
ＥＨＶ−１ｇＤ−ｇｐ６３）　ラグメント（７）　ｐｃＯＰｃｓ６５７へ（７） 　クローニング 次に図１７を参照する。プラスミドｐＥＨＶＢａｍＨＩＤをＥｃｏＲＩ及びｐｖ ｕｌｌで消化し、＋８３２ｂｐのＥｃｏＲｌ−Ｐｖｕｌｌ　ＤＮＡフラグメント （Ａ）をアガロースゲルから単離した。プラスミドｐｊｃＡ００６をＣ１ａｌと ＥｃｏＲＩで消化し、＋４５０ｂｐのＣ１ａｌ−Ｅｃ。
Ｉｌｌ　ｆ）ＮＡフラグメント（Ｂ）をアガロースゲルから単離した。プラスミ ドｐｃＯＰｃｓ６５７をＣ１ａｌとＳｍａ　Ｉでｌ肖化し、３７００ｂｐのＣｌ ａｌ−５ｍａｌ　ＤＮＡフラグメント（Ｃ）をアガロースケルから単離した。上 記のフラグメントＡとＢとＣを連結し、得られたプラスミドをｐＪｃＡ［ＩＯ！ ｌと名付けた（図（Ｉ７）。
ＥＨＶ−１ｇＤ−ｇｐ６３−ｇε７ラグメントノｐＣＯＰＣ３６５７ヘノクロー ニング プラスミドＰＥＨＶＢａｍＨＩＤをＥｃｏＲｌと５ｘｃｌｌで消化し、アガロー スゲルから４２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ−５ａｃｌｌ　ＤＮＡフラグメント（Ｄ） を単離した。Ｓａｃｌｌ−５ｍａｌ連結部の修復を確実にするためにｉＴＰを添 加して、フラグメントＤをフラグメントＢ及びＣ（上記参照）と連結した。得ら れたプラスミドをｐＪｃＡＯｌＯと命名した（図１７）。
Ｅｌ−Ｉ　Ｕｓ解解読を発現する組換えワクシニアウィルスｖＰ７７３、ｖＰ８ ０３、ｖＰ８０９、ｖｐＨＨ１及びｙｐＨ２２の構築上記Ｅｌ（Ｖ−１解読枠の 発現を迅速にチェックするために、ｃｏｐｃｓ宿主域選択系を用いて、多数のワ クシニア組換えウィルスを構築した。プラスミドρＣ０ＰＣ５６５７に、塩基配 列の解析から同定された３つの解読枠を単独もしくは一緒に（「二重」及び「三 重」）クローン化した。得られたプラスミドを、ワクシニア組換え体ｖＰＳ６８ 　（救援ウィルス）との組換えに使用した。かかる組換えによって生した様々な 組換えワクシニアウィルスを表５に示す。
ＥＨＶ−１ｇＤ遺伝子を含有するドナープラスミド９１ＣＡＯＯ６との組換えに よって、ワクシニア組換え体ｖＰ７７３を得た。
ＥＨＶ−１ｇｐ６３遺伝子を含有するドナープラスミドｐＪｃＡＯＯ８との組換 えによって、ワクシニア組換え体ｖＮ１２２を得た。
Ｅ）ＩＶ−１ｇＥ遺伝子を含有するドナープラスミドｐｌｃＡＯＯ７との組換え によって、ワクシニア組換え体ｖＰ８０３を得た。
ＥＨＶ−１ｇＤ−ｇ９６３フラグメントを含有するドナープラスミドｐｌｃＡＯ Ｏ９との組換えによって、ワクシニア組換え体ｖＰ８０９を得た。サラニ、ＥＨ Ｖ−１ｇＤ−ｇｌ１６３−ｇＥ　７ラグメントを含有するドナープラスミドｐＪ ｃＡ（１１１１との組換えによって、ワクシニア組換え体ｖＰ８１ｏを得た（表 ５）。
単独又は多重組換えワクシニアウィルスによって合成されりＥＨＶ−１０ＲＦＩ 　（ｇＯ）　、ＱＲＦ２　（ｇｐ６３）及び０ＲＦ３　（ｇＥ）産物の免疫蛍光 分析 組換えワクシニアウィルスに感染したＶＥＲＯ及びＭＲＣ−５細胞の免疫蛍光分 析を、ウサギ抗Ｅ）ＩＶ−１特異的ポリクローナル血清Ｒ５９３５（１：２００ ）を使用して、例１記載の手順で行なった（表６）。
表　５ Ｅ）１１’−１ｇＤＳｇＥ及びｇｐ６３遺伝子を発現するワクシニアウィルス組 換え体の名称 ｐＪｃＡ〇０６　ｇＤ　ｖＰ６６８ｖＰ７７３ｐｌｃ：へ００７　ｇＥ　ｖＰ６ ６８　ｖＰ８０３ｐＪｃＡ［１０８ｇｐ６３　ＶＰ６６８　ｖＰ８２２ｐｌｃＡ ＯＯ９ｇＤ−ｇｐ６３　ｖＰ６ＨｖＰ８［）９ｐｌｃＡＯＩｏ　ｇＤ−ｇｐ６３ −ｇＥ　ｖＰ６６８　ｖＰ８１０表　６ ウサギ抗ＥＨＶ−１血清Ｒ５９３５を用いた組換えワクシニアウィルス感染細胞 の免疫蛍光ＥＨＶ−１組換え体　Ｒ５９３５ 内部　表面 ｇＤ　陽性　°陰性 ｇｐ６３　陽性　陰性 ｇＥ　陰性　陰性 ｇＤ−ｇｌ１６３　陽性　陰性 ｇＤ−ｇｐ６３−ｇＥ　陽性　陰性 一旦−ワクシニアウィルス組換え体によって単独又は−緒に発現する仮性狂犬病 ウィルス糖タンパク質ｇｐＨ、ｇｐｌ　１１及びｇｐ５Ｇのマウス及びブタにお ける免疫学的検定 ワクシニアウィルスコペンハーゲン株及びその誘導体ｖＰ４１０、ｖＰ４２５及 びｖＰ４５８　（１８４）を本例で使用した。
ｇｐＨ、ｇｐｍ及びｇｐ５０をコードすルＰＲＶ遺伝子ノクローニング ＰＲＹ　ＮｌＡ３ウィルス（１８２）をＮＩＬ２培養細胞（＋８３）上で増殖さ せた。３０ＧｔｌＸｇで３０分間遠心分離して、上清から細胞残渣を除去した。
ウィルス粒子は、まず４０％（ｖｔ／ｖｏｌ）（７）シ：＋塘層に乗セＴ　４０ ０００＋ｐ＋ｎテロ０分間（ベックマン（Ｉ１ｇｃｋｍａｎ１社の４５Ｔ１ａ− ター使用）；！１心し、次に３０−５０％（ｗｌ／ｖｏｌ）の不連続ショ糖密度 勾配に乗せて（Ｂｅｃｋｍａｎ社のＳＷ２５０−ター使用）　２３０００＋ｐｍ で５時間遠心することによって精製した。ウィルス粒子層を回収し、ＴＨＥ緩衝 液（５０ｍＭ　Ｔ＋１ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，８）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ及び ｌＯｍＭＥＤＴＡ）で希釈して、さらに３００００＋ｐｍで１時間（Ｂｅｃｋｍ ａｎＳＷ４０ローター使用）遠心を行なってペレットとした。ウィルスペレット をＴＥ緩衝液（５０ｍｌｌ　Ｔ＋ｉ＋−ＨＣｌ　（ｐｆｌ　７．８）、１０ｍＭ 　ε［１ＴＡ）に再び懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度で０５％（ｗｌ ／ｖｏｌ）及びプロテイナーゼＫを１００ｍｇ／ｍ１添加して溶解した。３７℃ で２時間インキュベートした後、ウィルス溶解物をフェノール、クロロホルム（ １１）で１回、次にクロロホルム：イソアミルアルコール（２４１）で１回抽出 した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、水に再溶解した。ＢａｍＨＩで完全に消 化した後、仔牛腸由来のアルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で予備処理したｐ ＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位にクローン化した。この連結体をコンピテントな大 腸菌８Ｍ５２２株（２０）の形質転換に使用した。
次に図１８及び図１９を参照する。ｇｐＨ遺伝子をコードするＤＮＡ配列はＰＲ ＶゲノムのＢａ＋ｎＨＩフラグメント１並びに５ａｌｌサブフラグメントＩＡ及 びＩＢ中に存在する（６２．９４）。
ｐＰＲ９，２５と呼ばれるプラスミド（ＰＲＶ　ＢａｍＨｌフラグメント１をｐ ８Ｒ３２２のＢａｍＨ１部位に挿入したもの）を旨ｏ１て消化した。消化したＤ 　Ｎ　Ａを０８％アガロースケル上で分画して、６．２ＫｂのＮｃｏｌ　ＤＮ＾ フラグメントをＧｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎ　（登録商標、ＢｉｏｌＯ１社製）を用い て精製し、続いて、ＣＩＡＰ処理したｐ８Ｒ３２８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ＋　Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａｌｓ社製）のＮｃａ　１部位に挿入し た。得られたプラスミドｐＰＲ２，１５を５ｐｈｌで消化してアカロースゲル上 で分画した。２．７Ｋｂと１、８Ｋｂのフラグメントを精製し、ホスファターゼ で分解したｐＵｃＩ８の５ｐｈｌ部位に挿入してプラスミドｐＰＲ１及びｐｐＲ ２を作成しく図１８）、Ｍ１３ファージに挿入した。塩基配列を上述の手順で決 定した。ＤＮＡ配列解析から、９１３残基のアミノ酸をコードする２７４２ｂｐ の解読枠が明らかになった。予想通り（６２）　、Ｈ３Ｖ−１ｇＢとかなりの相 同性を有するアミノ酸配列が観察された。ワクシニアウィルスベクター中でＰＨ ｇｐｌ＋を発現させるためのクローニング操作についての説明を簡単にするため に、ＰＲＹ　ｇｐ＋＋解読枠のＤＮＡ配列、並びに５′及び３′側に存在する非 コード配列を図１９に示した。
次いで図２０及び図２１を参照する。ＰＲＹ糖タンパク質ｇｐ１］１をコードす るＤＮＡ配列はＰ、ＲＶゲノムのＢａｍＨＩフラグメント２及び９中に存在する （９６）　。ｐ８Ｒ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入されたＢａ＋ｎＨＩフラグメ ント２を含有するプラスミドｐＰＲ９，９（図２０）をＢａｍＨＩ及び５ｐｈｌ で消化した。
ｐＢＲ３２２のＢａｍ１（Ｉ部位に挿入されたＢａｍＨＩフラグメント９を含有 するプラスミドｐＰＲ７，５をＮｃｏｌ及びＢａｍＨＩで消化した。上記２通り の消化で得られたＤＮＡをアガロース上で分画した。２Ｊ５ＫｂのＳｐｈｌ−Ｂ ａｍ旧フラグメントと１．ＩＫｂのＮｃｏｌ−Ｂａｍ旧フラグメントを精製して 、以下のＮｃｏｌ−ＥｃｏＲＩホスホリル化リンカ−ＭＲ５ＹＮ２＋／ＭＲ３Ｙ Ｎ２２を使用して、ホスファターゼ分解ＩＢ＋２５　（図２０）のＥｃｏＲＩ− ５ｐｈｌ部位に連結した。
Ｎｃｏｌ　ＥｃｏＲＩ ＭＲＳＹＮ２＋　５’ＣＡＴＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧ　３’ＭＲＳＹＮ２２ 　３’　ＣＣＡＧＡＣＧＴＣＡＧＣＴＴＡ＾５′ｐＰＲＩ７と命名したプラスミ ドを単離したが、このプラスミドは全ＰＲＹ　ｇｐ１１１遺伝子（図２０）を含 有すル３４５０ｂｐノ５ｐｈｌ−Ｎｃｏｌ　フラグメントを含んでいた。１１１ ３フアージにクローニングした後、アルカリ変性二本鎖プラスミド鋳型と一本鎖 の鋳型から塩基配列を決定した。ＤＮＡ配列の解析から、４７９残基のアミノ酸 をコードする＋４４０ｂｐの解読枠が明らかになった（図２１）。以前報告され た通り（９６）　、Ｈ５Ｖ　ｇＣとのかなりの相同性がみられた。
次に図２２及び図２３を参照する。ＰＲＹ糖タンパク質ｇｐ５０をコードするＤ ＮＡ配列はＰＲＹゲノムのＢａｍＨＩフラグメント７中に存在する（９５）　。
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位に挿入されたＰＲＹ　ＢａｍＨｌフラグメント７ を含有するプラスミドｐＰＲ７，＋　（図２２）を５ｌｕｌ及びＮｄｅｌで消化 し、ムング・ビーンヌクレアーゼで処理した。１．７Ｋｂのフラグメントをアガ ロースゲルから精製し、ホスファターゼ処理した１Ｂ１２５のｔｌｉｎｃ１１部 位に挿入した。このプラスミド１Ｒ２２（図２２）はＰＲＹ　ｇｐ５０遺伝子全 体を含んでいる。塩基配列の決定によって、４０４残基のアミノ酸をコードする ＋２＋５ｂｐの解読枠が明らかになった（図２３）。以前報告された通り（９５ ）　、）ＩｓＶ−１ｇＤとのかなりの相同性がみられた。
ｐＰＲＩ　（図１８Ａ）から得られたＩ［１６０ｂｐのＰＲＹ　５ｐｈｌ−Ｎｈ ｅｌフラグメントをアガロースゲルから単離し、ＣＩＡＰ処理後、以下のＢａｍ ＨＩ−Ｎｈｅｌホスホリル化リンカ−ＭＩＩＳＹＮＩ／ＭＲ３ＹＮ２を使用して 、ｐｌＢＩ２５のＢａｍｆｌｌ−５ｐｈｌ部位に挿入して、プラスミドｐＰＲ６ （図１８人）を得た。
ＢａｍＨＩ　Ｎｈｅｌ ＭＲＳＹＮＩ　５’ＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧ　３’ＭＲ９ＹＮ２　 ３’　ＧＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣ５’ｐＰＲ６をＨｉｎ＋ＩＩＩＩ及 びＡｐａｌで消化し、ＣＩＡＰで処理した。
＾ｐａ１部位はＰＲＹ　ｇｐＨのＡ丁Ｇ開始コドンの３２ｂｐ下流に位置してい る（図１９）。合成ホスホリル化オリゴヌクレオチドＭＲ５ＹＮ３／ＭＲ３ＹＮ ４対をアニールして二本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。このフラグメントは、Ｅ ｃｏＲＹ部位からＡＴＧ（下線部）までのワクシニアＨ６プロモーターを指定す るＤＮＡとそのすぐ後に続＜　ＰＲＹ　ｇｐＨコード配列を含有する。
ＨｉｎｄｌｌｌＥｃｏＲＶ　Ａｐａ１ ＭＲＳＹＮ３５’　ＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧ Ｔ＾＾ＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＧＣfＣＧＧＧＣＣ３’ この合成りＮＡを、３９２０ｂｐのｐＰＲ６由来Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｐｉｌルミ ｌフラグメントして、プラスミドｐＰＲ９（図１８＾）を得プラスミドｐＰＲ９ をＢａｍＨＩ及びＮｈｅｌで消化し、ＣＩＡＰ処理後、以下のホスホリル化Ｂａ ｍＨｌ−３ｐｈ　Ｉリンカ−を使用して、ｐＰＲｌから得られた１６４０ｂｐの ５ｐｈｌ−Ｎｈｅｌフラグメントに連結してプラスミドｐＰＲ１２（図１１１Ａ 、図１８Ｂ）を得た。
５ｐｈｌ　ＢａｍＨＩ ＭＲ３ＹＮ７　５’　ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧ　３’ＭＲ３ＹＮ８　３’ 　ＧＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧ　５’１０１ｂ、のｐＰＲ２ 由来Ｈｉｎｃ！ｌ−５ｐｈｌフラグメント（図１８Ａ）をアガロースゲルから単 離し、ホスファターゼ処理したｐＵｃ１８のＨｉｎｃｌｌ−５ｐｈ１部位に挿入 した。得られたプラスミド９ＰＲＩＯを）ｌｉｎｄｌｌｌ及びＮａｅｌで消化し 、ＣＩＡＰで処理した。Ｎａｅ１部位はＴＡＧ終止コドンの４４ｂｐ上流に位置 している（図１９）。以下のホスホリル化合酸オリゴヌクレオチドＭＲ３ＹＮ９ ／ＭＲ５ＹＮＩＯ対をアニールして得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントを、３７ ２０ｂｌｌのｐＰＲ１Ｏ由来Ｎａｅｌ−１１ｉｎｄｌｌｌフラグメントに連結し てプラスミドｐＰＲＩ＋を得た。
下線部の配列は、ＰＲＹ　ｇｐｌ＋終止コドン及びワクンニア初期転写終結シグ ナルに相当する（４５）。ｐＰＲ２由来の７７Ｄｂｐ　５ｐｈｌ−Ｈｉｎｃｌ！ フラグメントをアガロースゲルから精製し、ＢａｍＨｌ−５ｐｈｌホスホリル化 リンカ−（＆１Ｒ３ＹＮ７／ＭＲ３ＹＮ８）を使用して、ＣＩＡＰ処理したｐＰ ＲＩｌのＲａｍ旧−旧ｎｃｌ１部位に挿入してｐＰＲｌ３　（図＋８Ａ、図１８ ８）を得た。ＥｃｏＲＩと５ｐｈｌで消化し、かつＣｌＡｌ’で処理したプラス ミドｐＰＲＩ２を、以下のホスホリル化旧ｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩリンカ−（Ｍ Ｒ３ＹＮ１９／ＭＲ５ＹＮ２０）を使用して、９９０ｂｐのｐＰＲ１３由来）１ ｉｎｄｌ１１−Ｓｐｈｌ単離フラグメントに連結してプラスミドｐＰＲ１５を得 た（図１８Ｂ）。
Ｈｉｎｄｌｌｌ　ＥｃｏＲＩ ＭｌｌＳＹＮＩ９　５’　ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＧＧ 　３’ＭＲ５ＹＮ２０　３’　ＡＧＡＣＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴ ＾＾５′Ｈｉｎｄ’１ｌｌ−ＥｃｏＲＶで消化したｐＰＲ１５由来の２７８Ｇｂ ｐフラグメントをムング・ビーンヌクレアーゼで処理し、アガロースゲルから精 製した。このフラグメントを、Ｘｍａｌｌｌ−ＥｅｏＲＶ、ムング・ビーンヌク レアーゼ及びＣＩＡＰで予め消化しておいたプラスミドｐＴＰ１５（＋８４）　 （図３）に挿入してプラスミドｐＰＲ１８を得た（図１８Ｂ）。ｐＰＲｌ８にお いて、ＰＲＹ　ｇｐｌ＋は、ワクシニア赤血球凝集素欠失塵の合成ワクシニアＨ ６プロモーターと連結している。このプラスミドをワクシニアウィルス感染細胞 にトランスフェクトして、ＰＲＹ　ｇｐｌ＋遺伝子を含有するワクシニア組換え 体ｖＰ５３４、ｖＰ６４４、ｖＰ６２１及びｖＰ６９２を得た（以下の項を参照 ）。
ＰＲＶ　ｇｐＨ＋遺伝子を操作して、ワクシニアＨｉｎｄｌｌｌ　Ｂフラグメン ト中に位置するワクシニアウィルス初期プロモーターμ（以下の項を参照）の制 御下で発現させた。
部位特異的変異導入法を用いて、ＰＲＹ　ｇｐＨ＋に存在する配列ＣＧＣ（ヌク レオチド１９２〜１９４）（図２１）を＾ＴＧに変えてＮ５ｉｌ部位を導入し、 配列ＧＴＧＡＣＧＴをＴＴＣＴＡＧＡ　（ヌクレオチド１６３２〜＋６３８）　 （図２１）に変えてＸｂａ　１部位を導入した。これを実行するため、ヘルパー ファージＲ４０８（ストラタジーン（Ｓｌｒａｔａｇｅｎｅ）社製）（１８５） を使用して、プラスミドｐＰＲ１７から一本鎖ＤＮＡを得た。上記部位特異的変 異導入は、以下の精製した合成ホスホリル化オリゴヌクレオチド対（ＭＲ３ＹＮ ５及びＭＲＳＹＮ６）を使用し、大腸菌ｄｕｆ−ｕｎｇ−株Ｃｌ２３６　（Ｉ　 Ｂ　１社製）　（１７，１８６）上で選択することによって行なった。
匣Ｉ ＭＲＳＹＮ５５’ＧＣＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＴＧＣＧＡＡＴＧ ＧＣＣＣＣ３’上記の変異導入によってプラスミドｐＰＲ２８が得られた。
プラスミドｐＰＲ２８をＮ５ｉｌとＸｂａ　ｌで消化し、ムング・ビーンヌクレ アーゼで処理した。アガロースゲルから＋４４０ｂｐのフラグメントを精製し、 ムング・ビーンヌクレアーゼとＣＩＡＰｔｌ’処理シタ後、ｐｓＤ４７８Ｖｃ　 Ｃ図２０．図２４）　ノＩｉｇＩＩＩＨｐａ１部位に挿入した。プラスミドｐＰ Ｒ２４をワクシニアウィルス感染細胞にトランスフェクトしてＰＲＶ　ｇｐ＋ｌ ＋遺伝子を含有するワクシニア組換え体ｖＰ６０４、ｖＰ６４４、ｖＰ６９１及 びｖＰ６９２を得た（以下の項を参照）。
ＰＲＶ　ｇｐ５０を操作して、ワクシニアウィルス初期／中期プロモーター＋３ Ｌ（＋８７）の制御下で発現させた。部位特異的変異導入法を用いて、ｇｐ５Ｑ に存在する配列ＣＣＴＧＣＣ＾ＧＣＧＣ（ヌクレオチド１７７〜＋８７）（図２ ３）を＾ＴＧＣＡＴＴＴ＾ＡＴに変えてＮ５ｉｌ部位を導入し、配列ＣＣＴＣＣ ＧＣＡＧ７ＡＣＣＧＧ（ヌクレオチド１４０４〜＋４１８）　（図２３）をＡＡ ＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴに変えてＢｇ１１１部位を導入した。前述の変異導 入法（１７，１８５，１８６）を用いて、以下の精製した合成ホスホリル化オリ ゴヌクレオチドＨ３ＹＮＩ２及びＭＲ５ＹＮｌａ　Ｃ図２２）を使用して、ｐＰ Ｒ２２からプラスミドＱＰＲ２９を得たた。
ｐｉｌｌ！２９をＮ５ｉｌで消化し、ムング・ビーンヌクレアーゼで処理し、Ｂ ｇｌｌ＋で部分消化して＋２Ｈｂｐのフラグメントを得た。プラスミドｐＭＩ’ １３ＰＰ　（図２２、図２５）をＥｃｏＲＩで消化し、ムング・ビーンヌクレア ーゼで処理し、次いでＢａｍＨｌで処理して、ワクシニア１３Ｌプロモーターを 含有する１４Ｑｂｐのフラグメントを得た。上記の１２９０ｂｐと１４０ｂｐの フラグメントをアガロースゲルから精製して、ホスファターゼ処理したｐＭＰ４ ０９ＤＶｃ　（図４、図２２）のＢｇ１１１部位に連結した。得られたプラスミ ドｐＰＲ２６を組換えに用いて、ｇｐ５［１遺伝子を含有するワクシニアウイル ス組換え体ｖＰ５９１、ｖＰ６２１、ｖＰ６９１及びｖＰ６９２を得た（以下の 項を参照）。
ＰＲＹ糖タンパク質ｇｐＨ、ｇｐＨ１及びｇｐｓ０を単独又は−緒に発現するワ クシニア組換え体の構築毒性を有するＰＲＹ感染からの免疫動物の防御における 、３種類のＰＲＹ糖タンパク質（ｇｐＨ、ｇｐＨ＋及びｇｐｓ０）の免疫原性上 相対的寄与を評価するために、かかる３種類のＰＲＹ糖タンパク質を単独又は− 緒に発現するような一連のワクシニア組換え体を構築した。
ここで図２４を参照する。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する組換えワクシ ニアウィルスｖＰ５３３を以下のように１１１築シた。コペンハーゲンゲノムの ５ａｌｌ　Ｆ／ｌ連結部にまたかるワクシニアＨｉｎｄｌｌｌフラグメントＢ内 のＩＫｂの領域は、サザン・プロット法（１８９）で決定されたカラボックスの 出血性（μ）遺伝子（＋８８）と相同なりＮＡを含有している。このμ遺伝子は 、セリンプロテアーゼインヒビターに類似したポリペプチドをコードしており、 生物学的には奨尿膜上のウィルス性の出血性痘痕の形成要因である。コペンハー ケンゲノムのＤＮＡ配列から、μ遺伝子に相当する遺伝子は多くのフレームシフ ト変異を含んでおり、生物学的に機能していないことが明らかになった。プラス ミドｐｓＤ４１９Ｖｃ　（１８４）　（図２４）はμ領域の左側部分を含んでい る。μ領域の残りの部分は、コペンハーゲン５ａｌｌフラグメントＩかｐＨｃ８ にクローン化されたプラスミドｐＳＤ４２２ＶＣに含まれている。不必要な左側 ワクシニア配列を除くために、ｐｓＤ４１９ＶｃをＮｃｏｌとＳｍａｌて消化シ ・大腸菌ポリメラーゼのフレノウフラグメントで平滑末端とした後、再び連結し てプラスミｌ”ｐｓＤ４７６Ｖｃ　（図２４）を得た。プラスミドｐＳＤ４２２ ＶＣをＨｐａｌとＮ＋ｕｌで消化し、μ領域の直ぐ右側に位置する約０．３Ｋｂ のフラグメントをアカロースゲルから単離した。このフラグメントを、）１ｉｎ ａｌｌ　（Ｓａｌｌ１位を認識する）で切断したｐＳ０４７６ＶＣに連結してプ ラスミドｐｓＤ４７７Ｖｃを得た。コペンハーケンワクシニアμプロモーター領 域の制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現させるために、合成オリゴヌクレオチ ド２２量体／２０量体を調製した。該２２量体／２０量体の配列を、制限部位並 びにＡＴＧ開始コドン（下線部）と共にに示す。
上記２２量体／２Ｇ量体をアニールしたものを、Ｃ１ａｌとＨｉｎｃｌｌで消化 したｐｓＤ４７７ｖｃに連結して、新規プラスミドｐｓ［１４７９ＶＣ（図２４ ）を得た。大腸菌β−ガラクトシダーゼコード配列を含有するｐＭｃＩ８７１由 来の３．　ｌＫｂ　ＢａｍＨＩフラグメント（開始コドンとプロモーターを欠＜ ）　（３４）を、ＢａｍＨｌで切断したｐｓＤ４７９Ｖｃに連結した。このよう にして得られたプラスミド（コペンハーゲンμプロモーター制御下の適切な位置 に１ａｃｚ遺伝子が置かれている）をｐｓＤ４７９ＶｃＢＧと命名した。この挿 入ドナープラスミドを、ワクシニアウィルスｖＰ４１０　（１８４）と組換えた 。発色性基質Ｘ−ｇａ　ｌ　（９，２４）存在下における青色プラーク形成に基 づいて組換えワクシニアウィルスを同定し、プラークをクローニングして、ｖＰ ５３３　（図２４）と命名した。
外来遺伝子挿入用のベクタープラスミドを構築するために、以下の合成オリゴヌ クレオチド４２量体／４０量体を調製した。
Ｃ１ａｌ　Ｂｇｌｌｌ　５ａｃｌ　Ｓｍａｌ　Ｘｈｏｌ　ＢａｍＨＩ　Ｈｐａ１ ４２ｍｅ＋　５’　ＣＧＡＴＴＡＣＴＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣ ＴＣＧＡＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴ　３’４Ｑｍｅ＋　３’　Ｔ＾＾ＴＧＡＴＣＴ ＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＣＴＡＧＧＣＡＡ　５’上記 ４２量体／４０ｉ１体をアニールしたものを、Ｃ１ａｌと旧ｎｃ１１で切断した ｌｌ５Ｄ４７７ＶＣ中に連結して新規プラスミドｐＳＤ４７８ＶＣ（図２４）を 得た。このプラスミドは、ワクシニアのコペンハーゲン株のμコード領域と完全 に置き換わったマルチクローニング領域の両側に約０．３Ｋｂのワクシニア配列 を含んでいる。ｐｓＤ４７８Ｖｃを用いて、ＰＲＹｇｐＨ＋コード配列を含有す るｐｐＨ２４（図２０）並びにワクンニア組換え体ｖＰ６０４、ＶＰ５４４、ｖ Ｐ６９１及びｖＰ６９２を得た。
今度は図２５を参照する。プラスミドｐＨＰ４１９はワクシニアｔｌｉｎｄｌｌ ｌフラグメント■由来の８５０ｂｐ　ＢａｍＨＩフラグメントを含んでいるが、 その中にはｐＬｌｃ８　（図２５）のＢａｍＨＩ部位に挿入された＋３Ｌプロモ ーターを含まれる。＋３１プロモ一ター成分は、ワクシニアＨｉｎｄｌｌｌフラ グメント■（＋８７）中の＋３Ｌ解読枠の上流ＤＮＡ配列に相当し、ワクシニア ウィルス組換え体中で外来遺伝子を発現させるのに以前から使用されている（２ ７．１９（１）。ｐＭＰ４１９を＋３Ｌコ一ト配列内の非反復Ｃ１ａ１部位で線 状化し、Ｂａ１３１消化を行って、次にＥｃｏＲｌで消化し、大腸菌ポリメラー ゼのフレノウフラグメントで処理して平滑末端とした。得られたプラスミドｐＭ Ｐ４１９−５　（図２５）はＥｃｏＲ１部位（ヌクレオチド　−８）と連結した 上流＋３Ｌプロモ一ター配列を含有する。ｐＭＰ４１９−５からプロモーター成 分をＥｃｏＲＩ−Ｍｓｐｌフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲｌ−Ｃｌａｌ消 化ｐＵｃ１３ｃ　（Ｃｌａｌリンカ−をＳｍａ　Ｉ部位に含むｐＵｃ１３誘導体 ）に挿入した。
得られたプラスミドｐＭＰ１３ＰＰ　（図２２、図２５）は、＋３Ｌプロモ一タ ー配列（ヌクレオチド−１２６〜−８）とそれに続くＥｃｏＲ１部位（ヌクレオ チド−８）を含んでいる。
ワクシニア＋３Ｌプロモーターの制御下にあるＰＲＹ　ｇｐｓ。
を、Ｍ２Ｌ欠失プラスミドベクターｐＭＰ４０９ＤＶｃ　（図４）に挿入して、 ｐＰＲ２６（図２２）を得た。ｐＰＲ２６を用いてワクシニア組換え体ｖＰ５９ １ＳｖＰ６２Ｌ　ｖＰ６９１及びｖＰ６９２を得た。
組換えワクシニアウィルスの単離 前述の手順て、ＰＲＶ遺伝子含有組換えワクシニアウィルスを同定・精製した。
３種類のＰＲＶ糖タンパク質ｇｐＨ、ｇｐＨ１及びｇｒｒ５０を単独又は−緒に 発現する組換えワクンニアウィルスを表７に示す。
表　７ ＰＲＹ糖タンパク質ｇｐＨ、ｇｐＨ１及びｇｐ５０を発現するワクシニアウィル ス組換え体の名称ドナープ　ＰＲＹ 組換え体　親株　ラスミド　糖タンパク質ｖＰｓ３４　ｖＰ４２５　ｐＰＲ１８ ｇｐＨｖＰ５９１　ｖＰ４５８．、　ｐＰＲ２６ｇｐ５０ｖＰ６１１４　ｖＰ５ ３３　ｐＰＲ２４ｇｐＨ１ｗＰ６２１　ｖＰ５３４　９ＰＲ２６ｇｐＩＩ＋ｇｐ ５０ｖＰ６４４　ＷＰ６０４　ｐＰＲ１＆　ｇｐＨ＋ｇＮＩ＋ｖＰ６９１　ｖＰ ６０４　ｐＰＲ２６ｇｐＨｌ＋ｇ９５０ｖＰ６９２　ｖＰ６４４　ｐＰＲ２６ｇ ｐＨ＋ｇｐＨｌ＋ｇｐ５０ワクシニアウィルス組換え体によって発現したＰＲＶ 糖タンパク質のインビトロ検定 ＰＲＹ糖タンハク質ｇｐＨ、ｇｐＨ＋及びｇｐ５０は、ＰＲＹ感染細胞の膜構造 と関連する典型的な糖タンパク質であり、ウィルスの成分でもある。抗ｇｐｌ！ 、抗ｇｐＨ＋及び抗ｇｌ１５０モノクローナル抗体で処理し、次いでフルオレセ イン抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で処理すると、組換えワクシニアウィルスに感 染した細胞表面上には強い免疫蛍光がみられたが、野生型ワクシニアウィルスに 感染した細胞ではみられなかった。
ワクシニアウィルス組換え体によりマウス及びブタ中で発現させたＰＲＹ糖タン パク質ｇｐ１１、ｇｐＨｌ及びｇｐ５０（１）免疫原性についてのインビトロに おける評価ワクシニアウィルス組換え体で発現した３Ｎ類のＰＩＩＶ糖タンパク 質の相対的な免疫原性を評価するために、組換えウィルスをマウスの足に１μ− から１００μｌの間の種々の接種量で接種した。免疫後１４日目に、ｌ０ＬＤ５ ゜量の毒性ＰＲＹ　Ｋｏｊｎｏｃｋ株をマウス腹腔内に投与した。予備実験にお いて、各ＰＲＹ糖タンパク質をマウスに接種すると、毒性ＰＲＹの感染防御に有 効であることを確認した。５００匹を超えるマウスについて行なった一連のより 詳細な実験で、ＰＲＹ糖タンパク質を発現するワクシニア組換え体の効果を評価 した。毒性ウィルスを投与したマウスを５０％防御することができるワクチン接 種量（ＰＤ９０）を算定したが、その結果を表８に示す。ＰＲＹ糖タンパク質ｇ ｐＨ、ｇｐ［ｌＩ及びｇｐ５０を単独で発現する組換えワクシニアウィルスの” 　ｇ１６ＰＤｇ（４は、それぞれ６．４．５．４及び５．８であった。糟タンパ ク質が一緒に発現したとき、著しく良好なＰＤ、。値が得られた。ＰＲＹのｇｐ Ｈと［１１５０を一緒に発現するワクシニア組換え体のｌ　ＯｇｌｏＰＤ、ｎ値 は３．３で、ＰＲＹのｇ９５０とｇｐｍを同時に発現するワクシニア組換え体で もほぼ同様なｌ　ｏ　ｇ、。ＰＤ、ｎ値（３６）が得られた。１５のｌ　Ｏｇ＋ ｎＰＤｑｏ値を与えたＰＲＶ糖タンパク質ｇｐＨ＋ｇｐＨ１発現組換え体がさら に有効であるのは明らかである。３種類ノＰＲｖｌＩ！タンパク質ｇｐ＋＋、ｇ ｐＨ＋及びｇｐ５０すべてを同一の組換えワクシニアウィルス中で発現させても 、これら３Ｎ類のＰＩＩＶ糖タンパク質を単独で発現する組換えウィルスについ て得られたＰＤ、ｎ値よりもさほど低いＰＤ、。
値は得られない。ｇｐｌ＋及びｇｌｌｌｌ＋を発現するワクシニア組換え体を用 いた場合に遺伝子を単独で発現するワクシニア組換えウィルスよりも高い効果が 得られることは、例６に記載したウマヘルペスウィルス糖タンパク質ｇＮ３及び ｇｐ１４を同時に発現させた場合の結果と類似している。
表　８ 仮性狂犬病ウィルス糖タンパク質 ｇｐ５０、ｇｐＨ及びｇｐｍを発現するワクシニアウィルス組換え体の効力 組換えウィルス　発現Ｐ　ＲＶｉｌｌ伝子　ＰＤ、。
ｖＰ５３イ　ｇｐＨ６，４ ｖＰ５９１　ｇｐ５Ｇ　５．４ ｖＰ６０４　ｇｐＨｌ　５．８ ｖＰ６２１　ｇｐ！Ｉ＋ｇｐ５０　３．３ｖＰ６４４　ｇｐＨ＋ｇｐＨｌ　１． ５”６９１　ｇｐ５０＋ｇｐＨｌ　３．５ｖＰ６９２　ｇｐ５０＋ｇｐ　Ｉ　１ 本ｇｐＨ＋　５．１マウスはＰＲＹ糖タンパク質の免疫原性の評価する際の興味 あるモデル系を提供するが、ＰＲＹワクチンの一番の目的となる種はブタである 。従って、組換えワクシニアウィルス法のブタにおける有効性を評価するために 、以下の実験を行なった。ＰＲＹ糖タンパク質ｇｐｌＬ　ｇｐＨ＋及びｇｐ５Ｄ を一緒に発現するワクシニア組換え体２ｍｌを、約２５ｋｇの子ブタに筋肉内接 種した。接種ウィルスはＰＢＳに希釈した。接種後３５日目に、毒性単離ＰＲＹ の旧Ａ３懸濁液を子ブタ鼻腔内（１匹当り１ａ＋ｌずつ）に投与した。投与後７ 日間、ワクチン接種群と対照群の相対的な体重増加を測定することによって、ワ クチン接種の効果を評価した。相対的な体重増加は、ワクチン接種群について観 察した日々の体重増加率から、非ワクチン接種対照群について観察した日々の体 重増加率を差し引いた値である。
正常な状態におけるブタの通常の体重増加は１．１ｋｇ以上である。表９に示す データにみられるように、毒性ＰＲＹ投与投与口７日間重増加は、ワクチン接種 群のほうが野生型ウィルスを接種した対照群よりも大幅に高い。
ワクシニアウィルス組換え体を１回接種することによって、毒性ＰＲＹ投与後の 体重減少を大幅に防ぐことができる。
表　９ ＰＲＶ糖タンハク質ｇｐＨ、ｇｐＨ＋及びｇｐ５０を発現するワクシニア組換え 体の子ブタにおける評価ワクチン 接種　発現ＰＲＹ　接種量　相対的 ウィルス　遺伝子　ｌｏｇ＋ｏＴｃｌＤ、ｏ／ｍｌ　体重増加ｖＰ４５２　なし 　＋０７’　−０，３１ｖＰ６２１　ｇｐＨ＋ｇｐ５０　Ｈ７，７２，８９ｖＰ ６４４　ｇｐＨ＋ｇｐＨｌ　１０７’　２．１５ｖＰ６９１　ｇｐ５０＋ｇｐＨ Ｉ　ｌＯ’３１．２１ｖＰ６９２　ｇ＋１５０＋ｇｐＨ＋ｇｐＨｌ　１Ｇ７３２ ．６７ＰＲＶの３つの主要部タンパク質を単独又は−緒に発現するワクシニアウ ィルス組換え体が利用できると、ＰＲＹ感染を抑制する上で以下に述べるような 多くの利点が得られる。（ａ）一つの重大な利点は、ワクチン製剤としての組換 えワクシニアウィルスはほんの限られた数のＰＲＹ遺伝子しか発現しないので、 弱毒化ＰＲＹワクチン株が毒性型に戻るという付随的な危険性がなく、また、Ｐ ＲＶウィルスが周囲の環境にもたらされることも全くないことである。（ｂ’） 　ＰＲＶワクチンとして有望な組換えワクシニアウィルスはほんの限られた数の ＰＲＹ抗原しか発現しないので、ワクチン接種動物と自然感染した動物とを区別 できるように他のＰＲＹ抗原からなる診断薬を調合することができ、従って接種 動物と自然感染した動物との区別が可能である。ｆｃ）かかる組換え体ワクチン は、雌豚がらその子供へのＰＲＹの自然な垂直感染を阻止するのに役立てること ができる。これは別個のＰＲＹ糖タンパク質を発現するワクシニアウィルス組換 え体を妊娠中の雌豚にワクチン接種することによって達成できるであろう。
母性免疫はその子供をＰＲＹ感染から防御すべきである。
一方、雌豚のワクチンに使用したものとは異なる構成のＰＲＶ抗原を発現するワ クシニアウィルス組換え体をワクチンとしてその子供に接種することもできるで あろう。
これは、母性免疫の問題を解決することもできる方法の一つである。母性免疫の 問題に対処するもう一つの方法は、全く異なる種類のベクター中で、ＰＲＹ糖タ ンパク質（その組合わせを問わず）を発現させることである。これは、ＰＲＹ糖 タンパク質を発現するアビポックスウィルス組換え体を構築することによって達 成される。天然宿主域が鳥類に制限されているアビポックスウィルス組換え体を 、鳥類以外の動物のワクチンとして利用できることが実証されている（４１）。
このように、母性免疫に伴なう障害の問題対処に、（１）複数ベクター及び（２ ）これらのベクターによって発現する抗原の群、という二つの方法を利用するこ とができる。
以前に報告された条件（４１，４２）を用いて、５ＰＡＦＡＳ社（コネチカット 州ノーウィック（Ｎｏ「ｔｒｉｃｈ））から入手したＩＤ乃至１１日齢のニワト リ有胚卵から培養した初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）上で、カナリアポッ クスウィルスを増殖させた。ショクリック（Ｊｏｋｌｉｋ）の記載した方法（＋ ９１）を用いて、シヨ塘密度勾配遠心法によって親細胞由来の汚染源からウィル スを精製した。ブタ腎臓細胞（ＰＫ−１）は、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（＾ｍｅ＋１ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕＩＩＣｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎｌ　（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））から入手した （　ＡＴＣＣ番号ＣＬＩＯＩ）。
ここでは図２６を参照する。プラスミドｐＰＲ１５（図ｌ１ｌ）をＰＲＹ　ｇｐ ｌ＋遺伝子源として用いた。全ＰＲＹ　ｇｐｌ＋遺伝子を含有するＤＮＡ部分を 単離するために、ｐＰＲ１５をＥｃｏＲＶとＨｉｎｄｌｌｌで消化した。この消 化によって、ワクシニアウィルス（ｖｉ’）　Ｈ６プロモーター（Ｄ３’末端側 ２１ｂｐと全ＰＩＩＶｇｐｌ＋遺伝子を含有する約２．８Ｋｂのフラグメントを 得た。
ｐＦＰＣＶ２に挿入するために、この２．Ｂｂ　ＥｃｏｌＮ’／）ｆｉｎｄｌｌ ｌフラグメントを単離した（図８、図２６）。
ｐＦＰＣＶ２をｆｌｉｎｄｌｌｌで完全に消化しかつＥ　ＣＯＲＶて部分消化し て得た８、ＯＫｂフラグメントに、上記の２．８Ｋｂ　ＥｃｏＲＶ／Ｈｉｎｄｌ ｌｌフラグメントを挿入した。この２つのフラグメントの連結によって、ｐＦＰ ＰＲＶＩ＋と名付けたＩＯ，８Ｋｂのプラスミドが生した。
次に図２７を参照する。プラスミドｐＦＰＰＲＶ１１を用いて、ｐｃＰｃＶＩ挿 入用の２．８ＫｂのＮ＋ｕｌ／　Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを作成した（図９ ）。ｐｃＰｃＶＩプラスミドは、ＣＰゲノムの３゜３Ｋｂ　ＰｖυＩＩフラグメ ント内の非反復ＥｃｏＲ１部位に、ＶＶ由来のＨ６プロモーターを含んでいる。
この挿入プラスミドを用いて、ＣＰゲノムのＣ３座に外来遺伝子を挿入すること が可能になる。プラスミドｐｃＰｃＶＩをＮｒｕｌとＨｉｎｄｌｌｌで消化して 、上記２．８Ｋｂフラグメントに連結するための５、８Ｋｂフラグメントを単離 した。得られたプラスミドをｐｃＰＰＲＶＩｌと命名シタ。
優性選択マーカーである大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ ェラーゼ遺伝子（Ｅｃｏ　ｇｐｔ）をｐｃＰＰＲＶＩｌｌ：挿入して、ＣＰ／Ｐ ＲＹ　ｇｐＨ組換え体の増殖選択手段とした。ポックスウィルス組換え体作成時 の選択マーカーとしてＥｃｏ　ｇｐｔを使用することは既に報告されている（１ ９３，１９４）。Ｅｃｏ　ｇｐ＋遺伝子はプラスミドｐｓＶ２ｇｐ＋　ＣＡＴＣ Ｃ番号３７１４５）から得た。このプラスミドからＥｃｏ　ｇｐ＋遺伝子を含有 する６７０ｂｐのＢｇｌｌｌ／Ｄｒｘｌフラグメントを単離して、９５０４ｇ６ ｖｃのＢｇｌｌｌ／Ｓｍａ１部位に挿入した。得られたプラスミドｐＧＰＴ−１ はワクシニアウィルスμ遺伝子フランキングアームに挟まれたＥｃｏ　ｇｐｌ遺 伝子を含んでおり、該遺伝子はμプロモーターの転写制御下に置かれている。上 記プラスミドｐｓＤ４８６Ｖｃは、以下の手順テｐｓＤ４７８Ｖｃから得た（図 ２４）　、、ｐｓＤ４７８ＶｃノＭＣＲをＥｃｏＲＩで消化し、ｄＮＴＰ存在下 （各０．５ｍＭ）でフレノウフラグメントを用いる常法によって一本鎖部分を埋 め、再連結することによってｐｓＤ４７１１ε−ＶＣを得た。このプラスミドを ＨｐａｌとＢａｍＨＩで消化し、オリゴヌクレオチド）ｌＥＭ５（５’　−ＧＡ ＴＣＣＧＡＴＴＣＴＡＧＣＴ−３’　）とＨＥＭ６　（５’　−ＡＧＣＴＡＧＡ ＡＴＣＧ−３′）とのアニーリング対を挿入して、ｐｓ０４８６Ｖｃを得た。
ｐＧｐＴ刊をＮｃｏｌとεｃａＲＩで消化して、Ｅｔａ　ｇｐｌ遺伝子（６７０ ｂｐ）とｖ　Ｖμプロモーター　（３３０ｂｐ）を含有する１、　ＯＫｂフラグ メントを切り離した。そのＮｃｏｌ及びＥｃｏＲＩ末端を、０．５ｍＭ　ｄＮＴ Ｐの存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いて平滑末 端とした。
Ｈｉｎｄｌｌｌリンカ−（Ｂｅｒｂｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌｊｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ社製、メリーランド州ベテスダ）を該平滑末端フラグメントに付加 させた。このＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌで消化して、１、　ＯＫｂのフラグメント をアガロースゲルから回収した。
該１．ＯＫｂ　ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントをｐｃＰＰＲＶＩｌの）Ｉｉｎｄｌ １１部位に挿入した。ぴったりと連結したＥｃｏ　ｇｐｔとｐＨｌｌ　ｇｐ＋＋ 遺伝子とを含む生成プラスミドをｐｃＰＰＲＶＩｌ　ｇｐｌと命名した。このプ ラスミドを用いて、ＣＰゲノムのＣ３座へ挿入するためのインビトロ組換え実験 を行なった。ｌ　Ｏｈｇ／ｍｌミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　 ａｃｉｄ　）の存在下でＥｃｏ　ｇρＣ遺伝子含有組換え体の選択を行ない、次 いてプラークハイブリダイゼーション法によってＰＲＶ　ｇｐＨ遺伝子の存在を スクリーニングした。Ｅｃｏ　ｇｐｌとＰＲＹ　ｇｐｌ＋に陽性のプラークをプ ラークの単離を３回繰り返すことによって精製し、高感染価で増殖する純粋な集 団を、ｐＣＰ５５と命名した。これらの０２組換え体において上記２つの遺伝子 が遺伝学的に連鎖していることをサザンプロット法で確認した。この０２組換え 体をマＣＰ５５と命名した。
ｖＣＰ５５感染細胞の免疫蛍光 免疫蛍光実験を行なって、ｖｃＰ５５感染細胞中で発現したＰＲＹ　ｇｐ＋＋の 細胞局在性を明らかにした。３５ｍｍシャーレ中の２２画のカバーガラスの上に 、シャーレ当り５Ｘ１０５個ノＣＥ　Ｆ又ハＰＫ−１細胞を植えた。ＣＥ　Ｆ及 ＣＩＰＫ−１細胞に、ｖＣＰ５５もしくはＣＰ親ウィルスのいずれかを感染させ た。ＰＢＳ＋で１乃至１００倍に希釈したモノクローナル抗体７５ＮＩｌｌを用 いて、例１に記載した通り感染及びインキュベートして免疫蛍光アッセイを行な った。
細胞内部及び表面上における発現について感染細胞を分析した。マＣＰ５５に感 染した細胞系では、いずれも、表面上でのｇｐｌ＋の発現は観察されなかった。
しかしながら、ｙｃＰ５５に感染したＣＥＦ細胞及びＰＫ−１細胞において、細 胞内部でのｇｐｌ＋遺伝子産物の発現がみられた。これらの細胞内部においてみ られる蛍光は該感染細胞の核の周辺領域に存在する顆粒に局在化していた。これ らの結果は、ＣＰによって発現したＰＲＹ　ｇｐＨがゴルジ複合体には輸送され るものの原形質膜には輸送されなかったことを示している。この結果は、ワクシ ニアウィルスによって発現するｇｐｌ＋の結果（感染細胞の表面上に検出された ）とは異なる。
ＣＥＦ及びＰＫ−１感染細胞から得られたＰＲＹ　ｇｐｌ＋の免疫沈降反応 ｖｃＰ５５によるＰＩＩＶ　ｇｐｌ＋遺伝子産物の発現を、感染細胞溶解物の免 疫沈降反応によって分析した。細胞当り５ｐｌｕのウィルスを細胞単層に感染さ せた。モノクローナル抗体７５ＮＩＯを用いて、例１記載の通り、免疫沈降反応 を行なった。
ウサギ抗ＰＲＹ血清を用いて、見掛けの分子量（電気泳動の移動度に基づく）約 １２０ｋＤａ、　６７　ｋ　Ｄ　ａ及び５８ｋＤａの感染ＣＥＦ及びＰＫ−１細 胞由来の主要ポリペプチドを沈降させた。上記のポリペプチドはそれぞれ、ＰＲ Ｙ感染細胞で検出されたＰＲＶ　ｇｐＨ（ジスルフィド結合で複合体を形成して いる）の前駆体と２種類のタンパク質分解型である（８６．１０１．１９６）　 、見掛けの分子量約２６ｋＤａのものも少量観察されたが、これはＣＰ／ＰＲＹ 組換え体感染細胞内でｇｐＨがさらにタンパク質分解処を受けていることを反映 しているものと思われる。対照ＣＰウィルス感染細胞並びに非感染細胞の細胞溶 解物については、対応するポリペプチドの沈降は全くみられなかった。
防御実験 ｖｃＰ５５の生ＰＲＶ感染に対する防御免疫反応誘発力をマウス系で分析した。
種々の量のｖｃＰ５５を含有する５０μｌから１００μｌの試料０表１０）をマ ウスの足跡に接種した。
免疫後１４日目に、＋６ｔ、Ｄ、。量のＰＲＶ　ＫａＪｎｏｃｋ株のをマウス腹 膜内に投与した。投与後１４日目にマウスの生存数を数えて実験を終えた。表１ ０に示す通り、＋（１６８５ＴＣＩＤ５０量のワクチンを１回マウスに接種する と、１０匹のうちの８匹が致死量のＰＲＶ感染から防御された。試験したＶＣＰ ５５接種量より低いと、防御レベルに達しなかった。ワクチンを接種しなかった マウスにおいては、生ＰＲＹ感染によって８匹のうちの７匹が死亡した。表１０ に示した結果から、ｖｃＰ５５組換え体のＰＤ５０　（判防御量）はｔｏ６．１ ６であると計算された。
目的とする種である子豚においても、生ＰＲＹ感染に対する免疫賦与剤としての ｖｃＰ５５の効力を評価した。約２５隨の子豚１５匹を３群に分けた。「マＣＰ ５５群」並びに「ＣＰ親ウつルス群」に対して、０日目と２８日目の２回のワク チン接種（２ＸＩＯ８ＴＣＩＤ、θ量を２ｍ１）を筋肉注射によって行なった。
残る５匹の子豚は非ワクチン接種対照群であった。３５日目に、ＰＲｖの毒性１ １１Ａ３株をすべての子豚に鼻腔的投与した。投与してから７日間の、ｖｃＰ５ ５ワクチン接種群の体重増加と対照群の体重増加とを比較することによってその 効力をモニターした。重量変化をΔＧＭＱＲ値（ｋｇ）として計算した。ここで 、ΔＧＭＱＲ値（ｋｇ）　＝（ワクチン接種群の平均ＧＭＱＩＩ％−非ワクチン 接種群の平均ＧＭＱＲ％）である。
非ワクチン接種群においては、ＰＲｖウィルス感染によってすべての子豚が死亡 した（５日目に２匹、６日目に２匹、そして７日目に１匹）。野生型ウィルス（ ＣＰ）を接種した群においては、感染によって５匹のうち４匹が死んだ（６日目 に３匹、７日目に１匹）。ｖｃＰ５５をワクチンとして接種群の子豚は、ＰＲＶ 感染させても全員生存し、成長した。
ＰＲＶ　ｇｐｌ＋糖タンパク質を発現するｖＣＰ５５を接種した子豚においては 、生ＰＲＹ感染対するかなりの防御が観察された（表ＩＩ）。２つの対照群では ＰＲＹ感染後の期間を通してかなりの体重減少かみれれたが、ｖＣＰ５５をワク チンとして接種した動物は実験期間を通じて正味体重の有意の増加がみられた。
さらに、生ＰＲＹ感染によって、対照群は８０％から１００％の死亡率を示した が、ｖｃＰ５５接種群では死亡したものはいなかった。
表　Ｉｎ マウスにおけるｖｃＰ５５の効力 接種量 １０ｇ１ｏＴｃｌＤ、ｏ　防御 ６、８５　８／１０ ４．８５　０／１０ ２、８０　０／１０ 表　ＩＩ 死亡率及び重量増加によって決定したＰｉｌｌ’感染非ワクチン接種　５１５　 −２．１２ 野生型（Ｃｐ）　４１５　＋０．６１ この例では、ワクシニアウィルスのコペンハーゲン株及びそれから誘導した組換 え体を使用した。
ここでは図２８を参照する。ＰＲＶ　ｇｌ遺伝子（ＮＩＡａ株）を含有するプラ スミドｐＧＰＩはＲｂｏｎｅ　Ｍｅｒｉｅａｘ社（フランス国すヨン）から入手 した。このプラスミドがらｇ１遺伝子（配列は（８０）を参照）を単離し、ワク シニア合成Ｈ６プロモーター（６９）の下流にクローン化した。これはｐＧＰｌ の２３３０ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｎｃｏｌ　（部分）フラグメントを、ｐＧＢＣ２の ６４００ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｎｃｏｌフラグメントにクローン化して行なった。（ ｐＧＢｃ２は、ｐＲＷ７６４．５（７）３２００ｂｐ　８ｇｌｌ１７　ラフｌ　 ントにＨ５Ｖ２　ｇＢ遺伝子をクローン化することによって作成した。ｐＲＷ７ ６４．５は、ｐＵｃ１８の２３６０ｂｐ　Ｐｖｕｌｌフラグメントにカナリアボ ックスＤＮＡ由来の０．８Ｋｂ　Ｐｖｏｌｌフラグメントをクローン化すること によって作成した）。この操作で得られたプラスミドをｐＰＧ１２と命名した。
次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇ１遺伝子の開始コドンと整列させた。
この操作は、ｐＰＣＩ２の５９００ｂｐ　Ｅｃ。
ＲＶ−ＡｌｖＮ！　（部分）フラグメントにオリゴヌクレオチドＰ　ＲＶ　Ｌ　 ５　（５’　−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＣＣ ＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＣ−３’　）とＰＲＶＬ６ 　（５’　−ＣＴＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣ＾ＧＡＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴ ＴＡＣＧＡＴＡＣ＾＾＾ＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３’　）をクローン化すること によって行なった。この操作で得られたプラスミドをｐＧ＋３と命名した。
次に、ＰＲＹ　ｇ１３’側外領域の余剰非コード配列を欠失させた。この操作は 、ｐＧＩ３の５２００ｂｐ　５ａｃｌ−Ａａｊｌｌ　（部分）フラグメントにオ リゴヌクレオチドＰＲＶＬ３　（５’　−Ｃ丁ＧＧＴ丁ＣＣＧＣＧＡＴＣＣＧＧ ＡＧ＾Ａ＾ＣＣＧＧＡＡＧＴＧＪＣＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣ＾＾ＣＴＡＴＧＧＣＧ ＴＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＴＴ ＡＡ　ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴ−３’　）及びＰ　ＲＶ 　Ｌ　４　（５’　−ＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＣＧＧ ＧＧ　ＣＧＧＧ　ＣＡＴＴ　ＣＡ　ＡＣＡＧ　ＧＣＧＧ　ＣＴＧＧ　ＣＧＧＴ　 ＣＡ　ＣＧ　ＣＣＡＴ　ＡＧＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡＣＴＴＣＣＧＧ ＴＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＣＧＴ−３’　）　をクロー ン化することによって行ななった。この操作で得られたプラスミドをｐＰＧ１６ と命名する。
次いで、Ｈ６プロモーター付きｇ１遺伝子をワクシニアウィルスドナープラスミ ドにクローン化した。この操作は、ｐＰＧ１６の１７５０ｂｐ　Ｎ＋ｕｌ−Ｂ＋ ｍ）ＩｆフラグメントをｐＢＰＩ４の５０００ｂｐ　Ｎ＋ｕｌ−ＢａｍＨｌフラ グメントにクローン化することによって行なった。（ｐＢＰ１４は、ワクシニア ベクタープラスミドｐｓＤ４９４Ｖｃ中の合成ワクシニアＨ６プロモーターの制 御下に置かれたウシ白血病ウィルスｇａｇ遺伝子を含有する。ｐｓＤ４９４Ｖｃ は、コペンハーゲンワクシニアウイルスのＨｉｎｄｌｌｌ　Ａフラグメントのサ ブクローンであり、カウボックスＡＴＩ遺伝子（２１０）と相同なワクシニア遺 伝子のコード配列がポリリンカー領域で置換されている）。このようにして、＾ Ｔｌ遺伝子の両隣のワクシニアウィルス（コペンハーゲン）配列の間にＨ６プロ モーター付きｇｌ遺伝子が配置される。この操作で得たプラスミドをｐＰＣＩ７ と命名した。
ｐＰＧ＋７をｖＰ４１０感染細胞にトランスフェクトすることによって、組換え ワクシニアウィルスｖＰ７１７を得た。
ＦＰ７１７の構築 ＰＲＹのｇ１遺伝子をワクシニアウィルスベクターにクローン化した。このワク シニアウィルス組換え体ｖＰ７１７の構築に使用した方法の概要を図２８に示す 。ｖＰ７１７に含まれるＰＲＶｇｌ遺伝子を＾Ｔ１遺伝子の両隣のワクシニアウ ィルス配列の間にクローン化し、ワクシニアウィルス初期／後期プロモーターＨ ６（４１，４２，６９）を用いた。
ＰＲＹ感染細胞においては、原形質膜上てｇｌが発現する。ｖＰ７１７感染細胞 を、ＰＩＩＶ　ｇｌ特異的モノクローナル抗体４２Ｍｌ７を用いて分析したとこ ろ、これらの細胞内で生産されるＰＲＹ由来ポリペプチドも原形質膜上で発現す ることが判明した。
マウスにおけるｖＰ７１７の評価 マウスにおいてｖＰ７１７をインビトロで評価したところ、標準的な操作を用い たＰＲＹ感染に対する若干の防御がみえれた（表１２）。
表　１２ ＰＲＶ　ｇｐ１発現ワクシニアウィルス組換え体ｖＰ７１７のマウスにおける評 価 ｙＰ７１７接種量　ＰＲＹ感染に対 １、３　２／１０ Ｐ１１３−ワクシニアウィルスにおける単純ヘルペスウィルス２型糖タンパク質 ｇＢ、　ｇＣ及びｇＤの単独又は同時発現本例で使用したＩＳＶ２（Ｇ株）　（ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ｌｕ＋ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから入手 、＾ＴＣＣ番号ＶＲ７３４）は、■εＲＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ８］）上で 増殖させ、ショ糖密度勾配遠心法によって精製した（＋９７　）。
ＩＳＶ２　ｇＢ遺伝子のワクシニアウィルスドナープラスミドへのクローニング ＩＳＶ２　ｇＢ遺伝子の塩基配列は既に文献に記載されている（＋１６）。ここ で図２９を参照する。Ｈ５Ｖ２ＣＧ株）ゲノムＤＮＡから、ＩＳＶ２　ｇＢ遺伝 子を含有する１２にｂ　Ｂｇｌｌ＋フラグメントを単離し、ｐＵｃ１９のＢａｍ Ｈ１部位に挿入して、プラスミドｐ１４をた。
次に、ｇＢ遺伝子をワクシニアウィルス（コペンハーゲン）フランキングアーム 間にクローン化した。この操作は、ｐ１４の２７００ｂｐ　５ｓｌｌｉ　５ａｃ ｌ　（部分）フラグメントをｐＭＰ４Ｑ９ＤＶｃ３の５ｓｔｌｌ−Ｓａｃｌフラ グメントにクローン化することニヨッテ行なった。（ＰＭＰ４１］９ＤＶＣ３１ ４、Ｂｇｌ＋１部位がホ’Ｊ　’Ｊ　ンｆｙ−領域テ１換すａりＰＭＰ４０９Ｄ Ｖ（１８４）　（図４）の誘導体である）。これによって、Ｍ２Ｌ遺伝子の両隣 のワタシニア配列の間にｇＢ遺伝子が配置される。この操作で得られたプラスミ ドをｐＧＢＩと命名した。
次に、ｇＢ遺伝子の３′末端に枠内終結コドンを付加した。
この操作は、ｐＧＢＩの６３００ｂｐ　ＢａＩｎＨＩ−Ｓａｃｌ　（部分）フラ グメントにオリゴヌクレオチドＧＢＬ３　（５’　−ＣＴＡＡＴＡＧ−３’）及 びＧＢＬ４　（５’　−ＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴ−３’　）をクローン 化することによって行なった。この操作で得られたプラスミドをｐＧＢ２と命名 した。
次に、Ｈ６プロモーターをｇＢ遺伝子の上流にクローン化した。この操作は、ｐ ＧＢ２のＢｇｌ１１部位に、Ｈ６プロモーターを含有するｐＢＬＶ１１１４（７ ）３７０ｂｐ　８ｇｌｌ１７５りｊ　ントヲクローン化することによって行なっ た。（ＤＢＬＶＨ１４は、Ｈ６プロモーター付きウシ白血病ウィルスエンベロー プ遺伝子をワクシニア）ＩＡ欠失座に含んでいる）。この操作で得られたプラス ミドをｐＧｌ１３と命名した。
次いで、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇＢ遺伝子の開始コドンと整列させた 。この操作は、ｐＧＢ３の６３［ＩＱｂｐ　Ｓｓ＋１１−εｃｏＲＶ　（部分） フラグメントにオリゴヌクレオチドＧｅ１Ｌｌ　（５’　−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡ ＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＣ ＧＣＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣ−３’　）及び Ｇ［ｌＬ２　（５’−ＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＧ ＣＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡ ＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３’　）をクローン化することによって行なった。この 操作で得られたプラスミドをｐＧＢ５と命名した。プラスミドｐＧＢ５において は、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下に置かれた）ＩＳＶ　ｇＢ遺伝子がワ クシニアＭ２Ｌ欠失座に挿入されている。ｌｌ！２Ｌ挿入座は、欠失する可能性 のあるゲノムのより大きな領域内に位置しているので、異なるワクシニアウィル スドナープラスミドの異なる挿入部位にＨ６プロモーター付きｇ８遺伝子をクロ ーン化した。この操作は、ｐＧ８５の２ＨＨｐ　ｌｌｇｔｌｌｌｌａｍｌ（１７ ラグメントを９ＳＤ５１３ＶＣＶＱのＢｇｌ＋１部位にクローン化することによ って行なった。（ｐｓＤ５１３ＶｃＶＱはコペンハーゲンヮクシニアウイルスＨ ｉｎｄｌｌｌ　Ｉフラグメントのサブクローンであり、チミジンキナーゼ（ＴＫ ）遺伝子コード配列がポリリンカー領域で置換されている）。こうすることによ って、ＴＫ遺伝子両隣のワクシニアウィルス配列の間にＨ６プロモーター付きｇ Ｂ遺伝子が配置される。この操作で得られたプラスミドをｐＧＢ６と命名した。
ＩＳＶ２　ｇＣ遺伝子のワクシニアウイルスドナープラスミＨ３Ｖ２　ｇＣ遺伝 子の塩基配列は、既に決定されている（１１７）。今度は図３０を参照する。） ＩＳＶ２（Ｇ株）ゲノ”ＤＮＡからＩＳＶ２　ｇｃ遺遺伝子金含有６２９０口ｂ ｐ　５ａｌ１７ラグメントを単離し、これをｐｌＢ＋２５の５ａｌ１部位に挿入 して、プラスミドｐＧＣ３を得た。
次に、ｇＣ遺伝子をワクシニアウィルス（コペンハーゲン）フランキングアーム 間にクローン化した。この操作は、ｐｃｃ３の２９００ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｂａｍ ＨＩフラグメントをｐＧＣ２のＸｈｏｆ−Ｂａｍ旧部位にクローン化することに よって行なった。
ｐＧＣ２は、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有するｐＢＬＶＨＩ４（ ７）３７０ｂｐ　８ｇｌｌ１７ラグメントをｐｓＤ４８６ＶｃノＢｇｌ　１１部 位にクローン化することによって作成した。ｐＳＤ４８６ｖＣはコペンハーゲン ワクシニアウイルスＨｉｎ＋ｌｌ１ｌ　Ｂフラグメントのサブクローンであり、 μ遺伝子コード配列がポリリンカー領域で置換されている。これによって、μ遺 伝子両隣のワクシニアウィルス配列の間にｇＣ遺伝子が配置される。この操作で 得たプラスミドをｐＧＣ５と命名した。
次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇＣ遺伝子の開始コドンと整列させた。
この操作は、ρＣＧ５の５１ＱＱｂｐ　Ｎｔυ１−５【白フラグメントにオリゴ ヌクレオチドＧＣＬ＋　（５’　−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴ丁ＴＧＴＡ　ＴＣＧ ＴＡＡ　ＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＧＣ ＣＴＧＴＧ−３’）　及ヒＧＣＬ２　（５’−ＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＡＧＧ ＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡ ＣＧＧＡＴ−３’　）をクローン化することによって行なった。この操作で得ら れたプラスミドをｐＧｃｌＯと命名した。
次いで、ｐＧｃｌＯから３′側外領域の余剰非コード配列を欠失させた。この操 作は、ｐＧｃＩｏの４９ＱＯｂｐ　５ａｌｌ−３ＩＩｌａｌ（部分）フラグメン トを大腸菌ＯＨ＾ポリメラーゼｒ（フレノウフラグメント）で処理して再び環状 形にすることによって行なった。この操作で得たプラスミドをｐＧＣＩ　１と命 名した。
次に、ｐＧｃｌｌから３′側外領域の余剰非コード配列を欠失させた。この操作 は、ｐＧｃｌｌの４９ＧＧｂｐ　Ｘｂａｌ−Ａｐａｌ　（部分）フラグメントに オリゴヌクレオチドＧＣＬ３　（５’　−ＣＴＡＧＧＧＣＣ−３’）をクローン 化することによって行なった。この操作で得られたプラスミドをｐＧｃＩ２と命 名した。プラスミドｐＧｃ＋２においては、ワクシニアのμ欠失塵に、Ｈ６プロ モーターの制御下に置かれたＨ５Ｖ　ｇＣ遺伝子が挿入されている。μ欠失塵は 欠失する可能性のあるゲノムのより大きな領域内に位置しているので、続いて該 Ｈ６プロモーター付きｇＣ遺伝子をワクシニアウィルスドナープラスミドのＡＴ Ｉ挿入部位にクローン化した。これは、ｐＧｃＩ２の１５５０ｂｐ　Ｎ＋ｕｌ− Ｂａｍｆ（ｌフラグメントをｐＨｌ’１４の５ＨＧｂｐ　Ｎ＋ｕ１−Ｂａｍｌ（ ｌフラグメントにクローン化することによって行なった。これによって、ＡＴＩ 遺伝子の両隣のワクシニアウィルス（コペンハーゲン）配列の間にＨ６プロモー ター付きｇＣ遺伝子が配置される。この操作で得られたプラスミドをｐＧｃ＋３ と名付けた。
Ｈ３Ｖ２　ｇＤ遺伝子のワクシニアウィルストナープラスミドへのクローニング Ｈ５Ｖ２　ｇＤ遺伝子の塩基配列は既に決定されている（＋１８　）。次に図３ １を参照する。Ｈ３Ｖ２（Ｇ株）ゲノムＤＮＡから、１（ＳＹ２　ｇ［ｌ遺伝子 を含有すルア、　５Ｋｂ　Ｘｂａｌ７５グメントを単離し、ｐｌＢ＋２５のＸｂ ａ　１部位に挿入してプラスミドｐＧＤｌを得た。
次に、ｇＤ遺伝子をＨ６プロモーター下流のワクシニアウィルス（コペンハーゲ ン）フランキングアーム間にクローン化した。この操作は、ｐＧＤＩの１５ｉ１ ０ｂｐ　ＤｒａｉＰｓｔｉ７ラグメントをｐ丁Ｐ１５のＳｍａｌ−Ｐｓｉ部位に クローン化することによって行なった。この操作によって、ｇＤ遺伝子はＨ６プ ロモーター下流で、かつＨＡ遺伝子の両隣のワクシニアウィルス配列間に配置さ れる。この操作で得られたプラスミドをｐＧＣ２と命名した。
次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇＤ遺伝子の開始コドンと整列させて。
この操作は、ｐＧＣ２の５１００ｔ＋ｐ　ＥｃｏＲＶ−Ａｈａｌｌ　（部分）フ ラグメントにオリゴヌクレオチドＧＤＬＩ（５’　−ＡＴＣＣＧＴ丁ＡＡＧＴＴ ＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＧＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧ−３’　）及び ＧＤ［，２（５’　−ＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＧＣＣＣＣＡＴＴＡＣＧ ＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３’　）をクローン化することによって 行なった。
この操作で得られたプラスミドをｐＧＣ５と命名した。
次に、３′側外領域の余剰非コード配列を欠失させた。
この操作は、ｐＧＣ５の４８００ｂｐ　Ｎａ１ｌ−Ｐｉｌｌフラグメントにオリ ゴヌクレオチドＧＤＬ３　（５’　−ＧＧＣＡＧＴＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣ ＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＧＴＴＴＴＧＧＧＴＡＣＧＣＣＧＣＣ ＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＣ ＡＣＡＴＣＣＧＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴ（：ＧＣＡＣＣＡＧ ＣＣＡ　ＴＴＧＴＴＴ丁ＡＣＴＡＧＣＴＧＣＡ−３’　）　及びＧＤＬ４　（５ ’−ＧＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧ　ＣＴＧＧＴＧＣＧＡＧＧＧＧＧＧＣＧ ＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＴＡＧＧＣＧＣＴ ＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧ＾ＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＣＣＡＡＡＡＣＧ ＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＴＧＣ Ｃ−３’　）をクローン化することによって行なった。この操作で得られたプラ スミドをｐＧＣ７と命名した。
次いて、Ｈ６プロモーターの５′側に追加配列を付加した。
この操作は、ｐＧＢ６　（図３０）の１５０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ−ＥｃｏＲ’／７ ラクメントをｐＧＣ７（７）　４８００ｂｐ　Ｂｇｌ　ＩＩ−ＥｃｏＲＶ７　ラ ’；Ｉ　Ｊ　ントｌ：　クローン化することによって行なった。この操作で得ら れたプラスミドをｐＧＣ８と命名した。
組換えワクシニアウィルスの構築 ワクシニアウィルスにＨＳＶ２　ｇＢ、　ｇＣ及びｇＤ遺伝子をクローン化する のに用いた方法の概要を、それぞれ図２９、図３０及び図３１に示した。これら の構築体はすべてワクシニアウィルス初期／後期プロモーターＨ６（４１，４２ ，１８４）を利用する。各Ｈ５Ｖ２遺伝子はツクシニアウイルスゲノムの異なる 部位にクローン化されている。Ｈ６プロモーター付きｇＢ遺伝子は、Ｍ２Ｌ遺伝 子のフランキング配列間（ｖｐ５６９）又はＴＫ遺伝子のフランキング配列間（ ｖＰ７３４、ｖＰ７７５及びＶＰ７７６）にクローン化されている。Ｈ６プロモ ーター付きｇＣ遺伝子は、μ遺伝子のフランキング配列間（ｖＰ５７９　）又は ＡＴＩ遺伝子のフランキング配列間（ｖＰ７４１１　、ｖＰ７７６及びｖＰ７７ ７　）にクローン化されている。Ｈ６プロモーター付きｇＤ遺伝子はＨＡ遺伝子 のフランキング配列間にクローン化されている（ｖＰ５７０、ｙＰ７６１、ｖＰ ７７５及びｖ　Ｐ　７７７）　、　ｐＧＢ５をｖＰ４５８感染細胞にトランスフ ェクトして組換えワクシニアウィルスｖＰ５６９を得た。
ｐＧＢ６をｖＰ６１８感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ７３４を得た。ｐＧ ｃＩｌをＦＰ５３３感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ５７９を得た。ｐＧｃ １３をｖＰ６１８感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ７４８を得た。ｐＧＣ５ をｖＰ４２５感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ５７０を得た。ｐＧＤｌｌを ｖＰ６１８感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ７６１を得た。
ｖＰ４２５は野生型ワクシニアウィルス（コペンハーケン）の−変種であり、Ｔ Ｋ遺伝子が欠失し、かつＨＡ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼで置換されている（ 例１）（＋８４）。
ｖＰ４５８は野生型ワクシニアウィルスの一変種でアリ、ＴＫ遺伝子が欠失し、 かつＭ２Ｌ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼで置換されている（例２）。ｖＰ５５ ３は野生型ワクシニアウィルスの一変種であり、ＴＫ遺伝子が欠失し、かっμ遺 伝子がβ−ガラクトシダーゼで置換されている。
ｖＰ６１８は野生型ワクシニアウィルスの一変種であり、ＴＫ。
μ及びＡＴＩ遺伝子が欠失している。
２種類のＨ５Ｖ２糖タンパク質遺伝子を含有する組換えワクシニアウィルスも構 築した。ｖＰ７７５はｇＢ及びｇＤ遺伝子を含有し、ｖＰ７７６はｇＢ及びｇＣ 遺伝子を含有し、ｖＰ７７７はｇＣ及びｇＤ遺伝子を含有する。９ＧＤ８をｖＰ ７３４感染細胞にトランスフェクトしてｖＰγ７５を得た。ｐＧｃＩ３をｖＰ７ ３４感染細胞にトランスフェクトしてｖＰ７７６を得た。ｐＧＤＢをマＰ７４８ 感染細胞にトランスフェクトしてｙＰ７７７を得た。
３種類のＨ３Ｖ２糖タンパク質遺伝子を含有する組換えワクシニアウィルスも構 築した。ｖＰ８１２は、Ｈ３Ｖ−２のｇＢｌｇＣ及びｇＤ遺伝子を含有する。ｐ ＧＤＢをｖＰ１７＆感染細胞にトランスフェクトしてマＰ８１２を得た。
組換えワクシニアウィルス感染細胞中のＨＳＶ２糖タンパク質の免疫蛍光 Ｈ３Ｖ２感染細胞ニオイテは、ｇ［ｌＳｇｃＳｇｅｌ　（並び＋、：１ＩＳＶ２ にコードされた他の糖タンパク質）が原形質膜上に発現する。Ｈ５Ｖ２遺伝子を 含有する組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞について免疫蛍光実験を行 なったところ、これらの組換えワクシニアウィルス感染細胞において産生された Ｈ５Ｖ２ポリペプチドも原形質膜上に発現することが判明した。
組換えワクシニアウィルス感染細胞中の）ＩＳＶ２糖タンパク質の免疫沈降 Ｈ５Ｖ２感染細胞内で生産される１（ＳＶ２　ｇＢ糖タンパク質は約１１７ｋＤ ａの分子量を有する（１９１１．１９９）　。Ｈ３Ｎ２　ｇＢ遺伝子を含有する 組換えワクシニアウィルス（ｖＰ５６９、ｖＰ７３４、ｖＰ’１７５及びｖ　Ｐ 　７７６）を感染させた細胞も、Ｈ３Ｎ２にコードされた分子量約１１７ｋＤａ のポリペプチドを産生ずる。ｖＰ５６９感染細胞について、Ｈ３Ｖ２ウィルス全 体に対する抗血清で免疫沈降反応を行なうと、分子量約１１７ｋＤａと１１［Ｉ ＫＤａの２つの主要なタンパク質、並びに分子量５０ｋＤａ、４５ｋＤａ及び３ ０ｋＤａの３つのマイナーなタンパク質が検出される。ｖＰ７３４、マＰ７７５ 及びマＰ７７６を感染させた細胞についての免疫沈降反応では、分子量約１１０ ｋＤａと９０ｋＤａの２つの主要なタンパク質、並びに約１１７ｋＤａ、　１ｏ ＯｋＤａ。
５ＱｋＤａ、　４５ｋＤａ及び３［１ｋＤａの５つのマイナーなタンパク質が検 出される。
Ｈ５Ｖ２感染細胞内で生産される１ｌｓＶ２　ｇＣ糖タンパク質は約６３ｋＤａ の分子量を有する（１９９．２００）　。Ｈ３Ｎ２　ｇＣ遺伝子を含有する組換 えワクシニアウィルス（ｖＰ５７９、ｖＰ７４８、ｖＰ７７６及びｖＰ７７７） を感染させた細胞も、）ｌｓＶ２にコードされた分子量約６３ｋＤａのポリペプ チドを産生ずる。
ｖＰ５７９、ｖＰ７４８、ｖＰ７７６及びｖＰ７７７で感染させた細胞について 、Ｈ９Ｖ２ウィルス全体に対する抗血清で免疫沈降反応を行なうと、分子量約８ ５ｋＤａの主要なタンパク質と分子量約６５ｋＤａのマイナーなタンパク質が検 出される。
Ｈ５Ｖ２ウィルス全体に対するウサギ抗血清はダコ社（ＤＡＫＯＣｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ、カリフォルニア州すンタバーバラ、コード番号８１１６）から入手し 、１１００に希釈して用いた。
ＨＳＶ２感染細胞内で生産されるＨ３Ｎ２　ｇＤ糖タンパク質は約５１ｋＤａの 分子量を有する（１９８．１９９）　。Ｈ３Ｎ２　ｇＤ遺伝子を含有する組換え ワクシニアウィルス（ｖＰ５７０、ｖＰ７６１、ｖＰ７７５及びｖ　Ｐ　７　？ 　？）を感染させた細胞も、Ｈ３Ｎ２にコードされた分子量約５１ｋＤａのポリ ペプチドを産生する。
ｖＰ５了Ｑ、　ｖＰ７６１、ｖＰ７７５及びｖＰ７７７で感染させた細胞につい て、Ｈ５Ｖ２ウィルス全体に対する抗血清で免疫沈降反応を行なうと、分子量約 ４８ｋＤａの１つの主要なタンパク質さ、分子量約４０ｋｒ：ｘと３ＩｋＤａの マイナーなタンパク質が検出される。
インビボでの評価 パオレッティ（Ｐａｏｌｅｌｔｉ）他の記載した実験（２６）と同様な実験にお いて、ＨＳＢの種々の糖タンパク質形を発現する上記組換えワクシニアウィルス のすへてが、免疫マウスを致死量のＨ３Ｖ感染から防御した。
ＢＨＶＩ　ｇｌ型遺伝子のワクシニアウィルスへのクローン化 ＢＨＶＩ　ｇ＋遺伝子の塩基配列は既に文献に記載されている（６３）。ここで 図３２を参照する。ＢＨＶＩ　ｇ＋遺伝子を含有するプラスミドｐｌＢＲ５６（ ＳＩ＋ａｕｂ株）をＲｈｏｎｅ　Ｍｅｔｉｅｕｘ社から入手した。ｇ１遺伝子の ５′末端を、Ｈ６プロモーター（４１，４２，６９）の下流のワクシニアウィル ス（コペンハーゲン）フランキングアーム間にクローン化した。この操作は、ｐ ｌＨＲｓ６の５４０ｂｐ　５ａｌｌ−ＰｌＮフラグメントをｐＧＤ５の４４ＧＯ ｂｐ　５ａｌｌ／Ｐ＋ｌＩフラグメントにクローン化することニヨッテ行なツタ （ｐＧＤ５１Ｌ）ＩＳＶ２　ｇＤ遺伝子をｐＴＰＩ５１ニークローン化すること によって作成した）（＋８４）（図３）。
こうして、Ｈ６プロモーターの下流のワクンニアウイルスＨ＾フランキングアー ム間にｇ１遺伝子が配置される。この操作で得たプラスミドをｐ　ｌ　ＢＲ２と 名付けた。
次に、Ｈ６プロモーターの開始コドンをｇｌ遺伝子の開始コドンと整列させた。
この操作は、ｐｌＢＲ２の３８０ＱｂｐＮｒｕｌ−Ｓ　ｓ　ｔ　ｌ　ｌフラグメ ントにオリゴヌクレオチドＩＢＲＬＩ（５’　−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧ ＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧＣ ＣＧＣ−３’　）とオリゴヌクレオチド１ＢＲＬ２　（５’−ＧＧＣＧＣＧＴＴ ＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴ ＡＡＣＧＧＡＴ−３’）をクローン化することによって行なった。この操作で得 たプラスミドをｐｌＢＲ４と名付けた。
次いで、後段の操作を行なうために必要なＮｃｏ１部位を生じさせた。この操作 は、ｐｌＢＲ４のＰｓｉ部位にオリゴヌクレオチド）ＢｆｌＬ３　（５’−ＣＣ ＡＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＣＡ−３’）とＩＢＲＬ４（５’　−ＴＴＡＡＡＣＣＡ ＴＧＧＴＧＣ人−３′）をクローン化することによって行なった。この操作で得 たプラスミドをｐｌＢＲ５と名付けた。
次に、ｇ１遺伝子の３′末端をｐｌＢＲ５にクローン化した。
この操作は、ｐｌＢＲｓ６の１７４０ｂｐ　Ｔｔｈｌｌｌｌ　−ＮｃｏＩフラグ メントをｐｌＢＲ５の３７０［１ｂｐ　Ｔｊｈｌｌｌｌ　−Ｎｃｏｌフラグメン トにクローン化することによって行なった。この操作で得たプラスミドをｐｌＢ Ｒ７と名付けた。
次いで、後段の操作を行なうために必要なりｇｌ＋１部位を生じさせた。この操 作は、ｐｌＢＩｔ７の１ｌｃｏ　１部位にオリゴヌクレオチド１ＢＲＬ５　（５ ″−ＣＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＣ−３’　）　及ヒ１ＢＲＬ６　（５’− ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＣ−３’）をクローン化することによって行な った。この操作で得たプラスミドをｐｌＢＲ８と名付けた。
次に、ｇ１遺伝子の長い親水性リーダー配列の一部分を欠失させた。この操作は 、ｐｌＢＲ８（７）４４００ｂｐ　Ｎ＋ｕｌ／Ａｐａｌ（部分）フラグメントに オリゴヌクレオチドＩＢＲ仁７（５′−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧ４ＴＴｆ、７ＡＴ ＣＧＴＡＡ丁ＧＧＣＣＧＣＧＣ丁ＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴ７ＴＧＧＧＣ ＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣ−３’）　？！：　ＩＢＲＬ８　（５’　−ＣＡＣＧＴＣ ＧＣＣＣＡＴＡＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧ ＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ−３’）　ラフローン化することによって 行なった。こうして＋３２ｂｐの親水性リーダー配列が欠失する。この操作で得 たプラスミドをｐＨｌＲ９と名付けた。
次に、Ｈ６プロモーター付き先端欠失ｇ１遺伝子を別のワクシニアウィルスドナ ープラスミドにクローン化した。
コノ操作は、ｐＢＰＩ４（７）４９ＱＯｂｐＮ＋ｕ　ｌ−Ｂａｍ）１１７５　り Ｊ　ントにｐｌＢＲ９の１７００ｂｐ　Ｎｕｌ−８ｇｌｌｌフラグメントをクロ ーン化することによって行なった（２１１）。この操作で得たプラスミドをｐｌ ＢＲＩＯと名付けた。
組換えワクシニアウィルスの構築 Ｂ）Ｉｉ’ｌ　ｇ＋遺伝子をワクシニアウィルスにクローン化スるのに用いた方 法の概要を図３２に示す。ｐｌＢＲ７をｖＰ４１０感染細胞にトランスフェクト することによって組換えワクシニアウィルスｖＰ６３７を得た。ｐｌＢＲｌＯを ｖＰ４１０感染細胞にトランスフェクトすることによって組換えワクシニアウィ ルスジＰ７２４を得た。ＶＰ６３７は全ＢＨＶＩ　ｇ＋遺伝子を含有する。ｖＰ ７２４は＋３２ｂｐの５′シグナル配列の欠失したｇ１遺伝子を含有する（６３ ）。これらの組換えウィルスはワクシニアウィルス初期／後期プロモーターＨ６ を利用す÷　るＣ４１．４２．１１１４）　。ｖＰ６３７中のｇ１遺伝子はＨ＾ 遺伝子（７）７１　ランキング配列間にクローン化されている。マＰ７２４中の にｇ１遺伝子はＡＴＩ遺伝子のフランキング配列間にクローＡ　ン化されている 。
人 ｐ　ＢＨＶＩ感染細胞においては、ｇ（が原形質膜上に発現する。
ｖＰ６３７又はｖＰ７２４で感染させた細胞について免疫蛍光実験を行なったと ころ、これらの細胞内で生産されたＢＩＩＶＩにコードされたポリペプチドも原 形質膜上で発現することが判明した。免疫蛍光実験は例１に記載した手順で行な った。Ｂｌ（Ｖｌ　ｇ＋に特異的なモノクローナル抗体４２ｏ３及び５１１１６ を使用した（２０１）。
一旦一ネコヘルプスウイルス糖タンパク質ｇＢのワクシニアウィルス組換え体に おける発現本例では、ワクシニアウィルスＷＲ株（２０２）を用いた。
ＷＲ株から誘導した組換えワクシニアウィルスｖＰ２９３を救１　援ウィルスと して用いた（６９）。
Ｆ）ＩＶ−Ｉ　ＤＮＡノ抽出及ヒＦＩ（Ｖ−Ｉ　５ａｃｌ　−５ａｃｌ　３．２ Ｋｈ７５　’；ｆメントのクローニング ＦＨＶ−Ｉ　ＤＮＡをＣＤ株から抽出シテ精製した。ＦＨＶ−Ｉ　ＤＮＡゲノム をＥｃｏＲＩで消化し、常法によりプラスミドｐＢｌ１３２２に連結した（２Ｑ ）　。このＦ）ｆｉｌバンク（ｂａｎｋ）を、Ｐ［ｇｌ＋（６２）及びＢ）ＩＶ −１ｇＢａ伝子（２０３）由来ノＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。
このハイブリダイゼーションで陽性であった２つのＥｃｏＲＩクローン由来のサ ブクローンを用いてさらにハイブリダイゼーションを行なうと、ＦＨＶ−１ｇＢ 遺伝子のより正確なマツピングが可能になった。Ｆｌ（Ｖ−］　ｇＢ遺伝子を含 有する３、　２Ｋｂ　５ａｃｌ　−５ａｃｌフラグメントをｐＵＣ１８にクロー ン化してプラスミドｐＦ）ＩＶｇｌｌＣを得た。
ＦＨ’／−１ｇＢをコードする５ａｃｌ　−５ａｃｌフラグメントの配列決定 上述の通り、修飾子７配列を用いてｐＦＨＶｇＢＣ及びｐＦ）ｌＶｇＢＣ由来サ ブクローンから二本鎖双方について塩基配列に関するデータを得た。
Ｆ）ＩＶ−１ＫＢ遺伝子のワクシニアウィルスドナープラスミドへのクローニン グ ここで図３３を参照する。ＦＨＶ−Ｉ　ｇＢ遺伝子をｐＨＥｓ４にクローン化し た。ＤＨＥＳ４は、ワクシニアウィルスＷＲ株における宿主域選択系用に設計さ れたプラスミドの−っである（６９）　（図ＩＯ）。このプラスミドはヒト宿主 域遺伝子ＫＩＬを有しており、欠失変異株ｖＰ２９３にヒト細胞上での複製能力 を与える。ＦＨＶ−１ｇ＆遺伝子を、ワクシニア合成Ｈ６プロモーターのすぐ下 流に挿入した（６９）。プラスミドｐＦＨＶｇＢＣをＫｐｎｌと５ａｃｌて消化 し、ＦＩＩＶ−１ｇＢを含有する３１５θｂｐ制限フラグメントをアガロースゲ ルがら単離して、予めＫｐｎｌと５ａｃｌで消化しておいたプラスミ）”ｐｉｌ Ｅｓ４に連結した。得られたプラスミドをｐＪｃＡ［１０１と名付けた（図３３ ）。
ＦＨＶ−１ｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列解析今度は図３４を参照する。ＤＮＡ配列の 解析から、３３７番目から３１７７１７７番目からなる解読枠が明らかになった 。転写制御調節シグナルと思われる配列が、３３７番目のＡＴＧＪ始コドンの５ ′上流領域に見付かった。配列ＡＡＡＴＡＴＡＴ　（ヌクレオチド１８４〜１９ １）を有するＴＡＴＡボツクスが、ＣＡＴボックスと思われる配列ＧＧＴＧＡＧ 丁Ａの８０塩基下流に位置していた。ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡ　（ ヌクレオチド３２５１〜３２５６）はＴＡＡ終止コドンの５０塩基下流に位置し ていた。配列５゛づＣＡＨＣＴＡＧＣＡ−３’　（ヌクレオチド２００〜２ｊＯ ）の１１個の塩基のうちの８個が１８３リポソームＲＮＡの配列３′−＾ＧＧＡ ＡＧＧＣＧＴ−５’　（６１）と相補性を有しており、リポソーム結合部位とし て機能しているものと思われる。真核生物のｍＲＮＡの翻訳開始に関する移動モ デルが提案されている（１５１．１５５）。開始コドンと思われる周囲の配列Ａ ＴＣＡＴＧＴ　（ヌクレオチド３３４〜３４０）の状況は、真核生物のＱＩＲＮ Ａの翻訳開始に対する機能的配列として適格である。Ｆ）ＩＶ−１ｇＢ解読枠は 、計算上１０６．２ｋＤａの分子量を有する９４７残基のアミノ酸をコードする 。Ｇ＋Ｃ含量は４５６８％である。
Ｆ）ＩＶ−１ｇＢタンパク質の構造分析アミノ酸配列の解析から、膜関連糖タン パク質に共通する幾つかの特徴が明らかになった。２３残基目のアミノ酸から７ ３残基目のアミノ酸の領域は特徴的な疎水的性質を有しており、シグナル配列で あるものと思われる（図３４）。ここで図３５を参照する。この長い疎水性シグ ナル配列に先立って、２２残基のアミノ酸からなる親水性配列が存在する。この 特徴は、仮性狂犬病（ＰＲＹ）ｇ１１遺伝子（６２）　、ウシヘルペスウィルス １型（ＢＨＶ−１）　ｇｌ遺伝子（６３）並びにウマヘルペスウィルス１型（Ｅ ｌ（Ｖ−１）（７１）とウマヘルペスウィルス４型（ＥＨＶ−４）　（７２）の ｇｌ１１４遺伝子にも認められるが、これらはすべてＨ５Ｖ　ｇｆｌ相同物であ る。４２残基のアミノ酸（アミノ酸７８９〜８３１）からなる疎水性領域は膜貫 通性アンカー領域として機能すると予想される。親水性の細胞質ドメインは１１ ６残基のアミノ酸からなる。Ｎ−グリコジル化される可能性のある＾５ｎ４−Ｔ ｈｅ／Ｓｅｔ　（Ｘはプロリン以外のアミノ酸である）部位が１０カ所存在しく ６４）　、そのうちの１つはシグナル配列中に位置している。タンパク質分解を 受ける可能性のある切断部位（Ａｒｇ−Ａｕｇ−５ｅｔ）が２カ所に接近して（ アミノ酸５０４〜５０６及び５１６〜５１８）存在するカベこの配列ハｌ’ＲＶ 　ｇｌｌ　（９４）　、ＶＺＶ　ｇｌＩｌｌ及びＨＣＭＶ　ｇ　Ｂ　（７１）並 び＋：ＥＨＶ−１　ｇｐ１４　（７１，７２）　ニ存在するものと同一である。
ＦＨＬＩ　ｇＢのアミノ酸配列の疎水的性質を図３５に示す。
ＰＨ１’−１ｇＢ遺伝子のアミノ酸組成の比較がら、他のヘルペスウィルスの糖 タンパク質との著しい相同性が明らかになツタ。たとえばＦｌ（Ｖ−１ｇＢハ、 ＰＲＹ　ｇｌｌ　（６２）　、ＢＨＶ−Ｉ　ｇｌ　（６３）　、水痘帯状庖疹ウ ィルス（ＶＺＶ）　ｇ　ｌ　Ｉ　（６６゜２０４）　、Ｈ３Ｖ−１Ｈ８（６７） 　、）ｌｓｖ−２ｇＢ　（２０５）　、ＥｆｌＶ−１ｇｐ１４　（７１）　、並 びにエプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）（６８，２０６）とヒトサイトメ ガロウィルス（ＨＣＭＶ）　（Ｉｆｆ）の糖タンパク質と相同である。
ＷＲ’７クシニアウイルス宿主域選択系ｐＨＥｓ４／ｖＰ２９３　（５９）を用 いて、Ｆ）ＩＶ−１ｇＢコード配列をワクシニアウィルスベクターに挿入した（ ６９）。ＷＲワクシニアウィルスｖＰ２９３／ｐ）ＩＥＳ宿主域選択系を用いた 組換えによって生じる組換えワクシニア子孫（プロジエニイ）はヒトＭＲＣ−５ 細胞上でプラークを形成する能力を有するので、かかる組換え体の同定を迅速に 行なうことができる（６９）。プラスミドｐＪｃＡＯＯ１をドナープラスミド、 ｖＰ２９３を救援ウィルスとして用いた組換えて、ワクシニアウィルス組換え体 マＰ７１３が得られた（図３３）。
ｖＰＨ３の産生ずるＰＨ１’−１ｇＢ糖タンパク質の免疫蛍光ヒツジ抗ＦＨＶ− １ｇＢ血清Ｎｏ、　２８５４を用いて、例１に記載されている通り、組換えワク シニアウィルスｖＰ７Ｎを感染させたＶＥＲＯ及びＭＲＣ−５細胞の免疫蛍光実 験を行なった。
用いた感染多重度は細胞当り２ｐｌｕであった。ＦＩＴＣロバ抗ヒツジＩｇＧを ２次抗体として用いた。
ＦＨＶ−１ｇＢハ、ワタシニア組換え体ｖＰ７１３感染ＶＥＲＯ細胞の細胞表面 上のみならず、アセトンで固定した細胞内部にも検出された。ｖＰ４１０を感染 させた対照細胞においては、ＦＲＹ−１ｇＢに対する免疫反応性は細胞表面にも 細胞内部にも検出されなかった。
ｖＰ７１３の産生するＦＨＶ−１ｇＢ糖タンパク質の免疫沈降マＰ７１３の発現 するＦＨＶ−１ｇＢ糖タンパク質を評価するために、ＶＥＲＯ細胞にｖＰ７１３ を感染させて代謝されるタンパク質を３５５−メチオニンで標識した。放射性標 識した細胞溶解物の免疫沈降反応をヒツジ抗ＦＨＶ〜ｌ　ｇＢ血清Ｎｏ、　２８ ５４を用いて行なった。
６０ｍシャーレ当り２×１０６個の細胞を植えたＶＥｉｌＯ細胞単層に、細胞当 り０．１ｐｌｕと低い感染多重度で、対照（マＰ　４１　Ｑ）又は組換えワクシ ニアウィルスｖＰ７１３を感染させた。免疫沈降反応を例１に記載した手順で行 なった。
非感染ＶＥＲＯ細胞又は対照ワクシニアウィルスｖＰ４１０を感染させたＶＥＲ Ｏ細胞のいずれにも、特異的抗Ｆｌ（Ｖ−１ｇＢ血清によって免疫沈降した生成 物はなかった。ｖＰ７１３を感染させたＶＥＲＯ細胞からは、血清ＮＩ］、２８ ５４＋、：よッテ、ＦＨＶ−Ｉ　ｇＢ放射性標識生成物が沈降した。５種類の代 謝的に放射性標識された主要ポリペプチドが特異的に沈降した。
見掛けの分子量１１５ｋＤａとｌ１ＯｋＤａの２つの大ポリペプチドはグリコジ ル化されていない前駆体タンパク質と成熟形タンパク質に相当するものであろう （理論的分子量はそれぞれｌ０６ｋＤａと９８ｋＤａである）　。６８ｋｌｌａ の幅の広いバンドは、この実験では観察されなかったグリコジル化前駆体（１３ ６ｋＤａ）のタンパク質分解によって生ずる２つのグリコジル化サブユニット（ ６９ｋＤａ　＋　６６ｋＤａ）ではないかと思われる。３つの小さな沈降生成物 （５９ｋＤａ、５３ｋ　Ｄ　ａ及び４８ｋＤａ）はどんな既知Ｆｌ（Ｖ−１ｇＢ 生成物にも相当せず、分解産物であると思われる。
この例において、ＥＢＶ遺伝子はＥ　Ｂ　Ｖ　Ｈ９５−８株から単離しく２０７ ）　、ｇｐ３４０及びｇｐ２２０遺伝子はｃＤＮＡクローン（それぞれプラスミ ドｐＭＬＰｇｐ３４Ｇ及びｐＭＬＰｇｐ２２０）であり、ｇｉｌ、　ｇＨ及びＩ ＩＩＩＲＦ３遺伝子はＢａｍＨＩ遺伝子バンクから単離した。今度は図３６を参 照する。ｐＭＬＰｇｐ２２０プラスミドの２１［１［１ｂｐ　Ｘｍａｌ−Ｃｌａ ｌフラグメントを、Ｘｍｘｌ　−Ａｃｃｌで消化したＭＩ３＋ｎｐ１８にクロー ン化した。この操作で得たファージをｍｐ１８ｇｐ２２０と名付けた（図３６） 。オリゴヌクレオチドＣＭ４　（ＴＡＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＩ及びＣＭ　５　（ＧＣ ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴ＾ＴＣＧＴ ＡＡＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣ）を用いたインビトロ変異導入法（１７） によって、ｇｐ２２０遺伝子をワクシニアＨ６プロモーターの制御下で発現する ように修飾した。修飾ｇｐ２２０遺伝子を含有するプラスミドをｍｐ１８ｇｐ２ ２０　（５＋４）と命名した（図３６）。
修飾ｇｐ２２０遺伝子を、完全Ｈ６合成プロモーターを含有するプラスミド５Ｐ １３１Ｎａｌｌにクローン化した。この操９作は、ｍｐＩ８ｇｐ２２Ｄ　（５＋ ４）の２３［１［１ｂｐ　Ｎａ＋１−ＥｃｏＲＶフラグメントを５Ｐ１３１Ｎａ ｌｌプラスミドの２９４０ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｎａ＋Ｉ７ラグメントにクローン 化することによって行なった。得られたプラスミドを５Ｐ１３１Ｌｐ２２０と命 名した（図３６）。
ｌ１６プロモーターの制御下に置かれたｇｐ３４０遺伝子を、Ｘｈｏｌ　−ＳＣ Ｉ＋　（部分）消化ＳＰ１３１ｇｐ２２０プラスミドにｐＭＬＰｇｐ３４０の２ ３６０ｂｐ　５ｃａｌ−Ｘｈｏｌフラグメントをクローン化することによって得 た。得られたプラスミドをＳＰＩ３１ｇｐ３４０と命名した（図３６）。
Ｈ６プロモーター付きｇｌ１３４０及びｇｐ２２［１遺伝子を、ワクシニアウィ ルスＭ２Ｌ挿入座プラスミドｐＭＰ４ｆ１９ＤＶｃ　（図４、ただし図３６及び 図４０においては、このプラスミドはＭＰ４（１９と記載されている）にクロー ン化した。この操作は、プラスミドｐＭＰ４０９ＤＶｃの［１ｇ１ｌｌムング・ ビーンヌクレア−ゼ処理部位１：、プラスミドＳＰ＋３１ｇｐ３４０（７）　２ ８００ｂｐムング・ビーンヌクレアーゼ処理Ｎｏｎフラグメント及びプラスミド ＳＰ１３１ｇｐ２２Ｑの２ＨＩＯｌｌｐムング・ビーンヌクレアーゼ処理Ｎｏ１ ｌフラグメントをクローン化することによって行なった。得られたプラスミドを それぞれ４０９Ｈ６３４０及び４０９Ｈ６２２Ｇと命名した（図３６）。
ＥＢＶ　ｇＢ遺伝子のワクシニアウィルスドナープラスミド９ＭＰ４０９ＤＶＣ へ（Ｄ　りｏ−ニンク次に図３７を参照する。εＢＶゲノムライブラリーがら、 ＥＢＶ　ＤＮＡのＢａｍＨＩ　Ａフラグメント　（２０７）の３５００ｂｐ　ε ｃ。
Ｒ１−Ｘｍｎ１フラグメント（ＥＢＶ　ｇＢ遺伝子を含有する）を単離して、ｐ ｌＢＩ２５の２８３７ｂｐ　Ｈｉｎｃｌｌ−ＥｃｏＲ１フラグメント（こクロー ン化した。得られたプラスミドをｐ２５ｇＢと命名した（図３７）。
オリゴヌクレオチドＥＢＶＢＭ５　（ＣＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＣ ＧＡＴＡＣＡＡＡＣ丁ＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＧＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＡＧＧ 　）及びＥＢＶＢＭ３　（ＣＴＧＧ＾＾＾ＣＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣ ＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＧＧＧ７ＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣ）を用いたインビト ロ変異導入法（１７，１８５）によっテ、ｇＢ遺伝子がワクシニアＨ６プロモー ターの制御下で発現されるように修飾した。得られたプラスミドをｐ２５ｇＢ　 ｆ５＋３）と命名した。
ｐ２５ｇＢ　ｆ５＋３）の２６００ｂ、εｃｏＲＶ−ＥｃｏＲ１フラグメントを ５ＰＩ３１の３３００ｂｐ　ＥｃｏｉＩＶ−εｃｏｌｉ１７ラグメントにクロー ン化した。得られたプラスミドをＳＰ１３１ｇＢと命名した（図３７）。
次に、Ｈ６プロモーターｌｉｔ遺伝子をワクシニアウィルスドナープラスミドｐ ＭＰ４０９ＤＶｃにクローン化した。この操作は、１Ｐ４０９ＤＶｃのＢｇｌｌ ｌムング・ビーンヌクレアーゼ処理部位にＳＰ１３１ｇ［ｌの２７１１ｉｌｂｐ 　Ｈｉｎｄｌｌｌムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラグメントをクローン化す ることによって行なった。得られたプラスミドを４０９８６ｇＢと命名した（図 ３７）。
ＥＢＶ　ｇ！（遺伝子のワクシニアドナープラスミドｐｓＤ４８６Ｖｃへのクロ ーニング ＥＢＶ　Ｒａｍｔ（ｌクローン化制限フラグメントライブラリーにおいて、解読 枠ＢＸＬＦ２はＢａｍＨＩ　Ｘ及びＢａｍＨＩ　Ｔフラグメントに含有されてい る（２０７）。図３８に示すように、８ＸＬＦ２の完全な解読枠を、ＢａｍＨＩ 　Ｘの８３０ｂｐ　Ｓｍａｌ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐｌＢ＋２４の２ＨＯ ｂｐＳｍａｉｉｌａｎＨＩフラグメントにクローン化することによって再構成し た。得られたプラスミドを２４ｇ１（５と命名した。ＢａｍＨＩ　Ｔの＋８５０ ｂｐ　ＲａｍＨｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを２４ｇ１１５のＨａｍ）ＩＩ −Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントにクローン化した。生じた全ｇｌ（遺伝子を含有 するプラスミドを２４ｇＨと命名した（図３８）。
オリゴヌクレオチドＨＭ　５　（ＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＡ丁ＣＴ ＣＣＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴ）　、）ｌ　Ｍ　４　（ＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣ ＡＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＴＧＣＧ）及びＨＭ　３　（ＧＣＣＡ ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＡ＾＾ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ ＴＧ）を用いたインビトロ変異導入法によって、ｇＨ遺伝子がワクシニア出血性 （μ）初期プロモーターの制御下で発現されるように修飾した。オリゴヌクレオ チド）１Ｍ４を用いて、ｇｌ（遺伝子に含まれるワタシニア初期転写終結シグナ ル（４５）を除去した。かかる修飾ｇｌ（遺伝子を含有するプラスミドを２４ｇ Ｈ（５＋４＋３）と命名した。
次いて図３８を参照する。ワクシニアμプロモーターはプラスミド、５Ｄ４ＨＶ Ｃに含まれている（図３［１）。（このプラスミドは図３８においては５Ｄ４８ ６と記載されている）。
２４ｇｆｌ　ｆ５＋４！３）の２１３０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌムング・ビーンヌクレ アーゼ処理フラグメントを、Ｂｇｌｌｌ　ムング・ビーンヌクレアーゼ処理ｐＳ Ｄ４８６ＶＣにクローン化した。この最後のクローニング操作によって、ｇＨ遺 伝子がワクシニアμプロモーターの制御下に置かれる。この操作によって生じた プラスミドを４８６ｇＨと命名した（図３８）。
解読枠ＢＢＲＦ３のワクシニアウィルスドナープラスミドントに含まれている。
このフラグメントを＆ｇｐ）ＩＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレ ノウフラグメント）で処理し、Ｂｇｌｌｌで消化した。ＢａｍＨｌ　＾フラグメ ント内のＢｇｌ＋１部位は、ＢＢＲＦ３の終止コドンの１０塩基前方に位置する 。上記１２３０ｂｐ　ＢｓｐＨＩ−８ｇｌｌｌフラグメントを単離し、プラスミ ドｐｃＯＰｓｃ−５Ｈの４２００ｂｐ　ＳＨ１−８ｇｌｌｌフラグメントにクロ ーン化した（プラスミドｐｃＯＰｃｓ−５１１はプラスミドｐｃＯＰｃｓ６５７ と同一である（図１６））。この操作で得たプラスミドをＣ０ＰＳＣＥＢＶＸと 命名した。
ＥＢＶ　ｇｐ３４０、ｇＢ及びｇＨ遺伝子のワクシニアウィルスドナープラスミ ドｐｓＤ５１３ＶｃＶＱへのクローニング三重ＥａＶ組換え体の作成に使用した ワクシニアウィルスドナープラスミドは、プラスミドｐｓＤ５１３Ｖｃ１’Ｑで あった（図２９）。このプラスミドはコペンハーゲンワクシニアウイルスＨｉｎ ｄｌｌｌ　ｌフラグメントのサブクローンを含んでいるが、チミジンキナーゼ遺 伝子コード配列かポリリンカー領域によって置換されている。
第一の操作段階において、μプロモーター付きＥＢＶ　ｇＨ遺伝子をｐｓＤ５１ ３ＶｃＶＱにクローン化した。詳細に述べると、４８６ｇＨの２３００ｂｐ　Ｓ ｍａＢｌ−８ｇｌｌｌフラグメントをｐｓＤ５１３ＶｃＶＱの４［）ＨｂρＳｍ ａ　Ｉ−Ｂｇ　ｌ　Ｉ　ｌフラグメントにクローン化した。
この操作で得たプラスミドを５１３０ｇ）ｌと命名した。
次に、Ｈ６プロモーター付きＥＢＶ　ｇｐ３４０遺伝子を５１３０ｇＨにクロー ン化した。詳細を述べると、ＳＰＩ３１ｇｐ３４０の２８００ｂｐ　Ｎｏｆｌム ング・ビーン処理フラグメントを５１３ＵｇＨの６３００ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｐｉ ｌｌムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラグメントにクローン化した。この操作 で得たプラスミドを５］３ＵｇＨ３４０Ｈ６と命名した。
次イテ、Ｈ６プロモーター付きＥＢＶ　ｇＢ遺伝子を５１３０ｇＨ３４０Ｈ６に クローン化した。詳細を述べると、ＳＰＩ３１ｇｐ３４０の２ＨＩＱｂｐ　Ｈｉ ｎｄｌｌｌムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラグメントを５　ｌ　３ＵｇＨ３ ４０Ｈ６の９１００ｂｐ　Ｂｇｌｌｌムング・ビーンヌクレアーゼ処理フラグメ ントにクローン化した。得られたプラスミドを５１３ｇＨｇＢｇｐ３４０と命名 した（図３９）。
組換えワクシニアウィルスの構築 ＥＢＶ　ｇｐ３４０　（ドナープラスミド４０９Ｈ６３４０）　、ＥＢＶ　ｇｐ ２２０（ドナープラスミド４０９Ｈ６２２０）　及ヒＥＢＶ　ｇＢ　（トナープ ラスミド４０９６Ｈ６ｇＢ）を、ワクシニアウィルスＶＰ４５８（Ｍ２Ｌ部位） と組換えた。これらのワクシニアウィルス単一組換え体をそれぞれｖＰ４７４、 ｖＰ４８０及びｖＰ５６１と命名した。ＥＢＶ　ｇＨ（ドナープラスミド４８６ ｇＨ）をワクシニアウィルスｖＰ５３３　（μ挿入部位）に組換えた。このワク シニアウィルス単一組換え体をｖＰ６１］と名付けた。
最後に、ｇｐＮＧ　、ｇＢ及びｇｌｌを含有するワクシニアウィルス三重換え体 を、ドナープラスミド５１３ｇＨｇＢｇｐ３４０をワクシニアウィルスｖＰ６１ ７と組換えてｖＰ６１７のチミジンキナーゼ挿入部位に組込むことによって得た 。この組換えウィルスをｖＰ７１２と名付けた。ｖＰ６１７はＴに、Ｈ＾及びＡ ＴＩ遺伝子欠失コペンハーゲンワクシニアウイルスである。
ｖＰ４７４　（ｇｐ３４０）及びｖＰ４８０　（ｇｐ２２０）感染細胞ニラいて 、モノクローナル抗体Ｆ２９−８９　（１６５）を用いて免疫蛍光実験を行ナツ タとコロ、ＥＢＶ　ｇｐ３４０及びＥＢＶ　ｇｐ２２（１タンパク質が原形質膜 上に発現した。
マＰ６１１（Ｋｌ（）感染細胞は、ヒト血清を用いると、原形質膜上に弱い陽性 シグナルを示した。
最後に、マＰ７＋２　（三重Ｅ　Ｂ’Ｖワクシニア換え体）を感染させた細胞に ついて同じ実験を行なった。モノクローナル抗体Ｆ２９−８９及びＮＥＡ　９２ ４７　（デュポン（ＤｕＰｏｎｊ）社から入手したｇＢ特異的抗体）を用いると 、原形質膜上に陽性シグナルが得られた。
ＥＢＶに感染した細胞内で産生されるＥＢＶ　ｇｐ３４０糖タンパク質は約３４ ０ｋＤａの分子量を有する（＋６５）。組換えワクシニアウィルスｖＰ４７４又 はｖＰ７１２感染細胞も約３４０ｋＤａのＥＢＶタンパク質を産生じた（モノク ローナル抗体Ｆ２９−８９を用いて行なった免疫沈降反応）。ＥＢＶ　ｇｐ２２ ０糖タンパク質は２２０ｋＤａの分子量を有する（１６５）。組換えワクシニア ウィルスｖＰ４８Ｑ感染細胞も約２２０ｋＤａのＥＢＶタンパク質を産生ずる。
ＥＢＶ感染細胞内で生産されるＥＢＶ　ｇＢ糖タンパク質は１１０ｋＤａから１ ２５ｋＤａの分子量を有しており、その前駆体は９３ｋＤａの分子量を有してい る（２０６．２０８）。組換えワクシニアウィルスｖＰ５６１又はｖＰ７１２を 感染させた細胞は、分子量約１２５ｋＤａの主要ＥＢＶタンパク質、並びに分子 量約８ＧｋＤａ、　６０ｋＤａ１５０ｋＤａ及び４５ｋＤａの４つのマイナーな タンパク質を産生ずる。
ＥＢＶ感染細胞内で生産されるＥＢＶ　ｇＨ糖タンパク質は８５ｋＤａの分子量 を有しており、その前駆体は７０ｋＤａの分子量を有している（２０９）。組換 えウィルスｖＰ６１１を感染された細胞は、約８５ｋＤａのＥＢＶにコードされ たタンパク質を産生ずる。
ｖＰ４７４　（ｇｐ３４０）　、ｖＰ４８０　（ｇｐ２２０）　、ｖＰ５６１　 （ｇＢ）、マＰ６１１　（ｇ）ｌ）又はｖＰ７１２　（三重）のいずれかでウサ ギを免疫した。２次免疫を１回行なった後、得られた血清を、ＴＰＡ処理８９５ −８細胞上での免疫蛍光によって試験した。それぞれについて陽性シグナルが得 られた。ｖＰ４７４（ｇｐ３４０）で感作させた血清を用いると、インヒドロ中 和活性がみられた。
ＨＣＭＶ　ｇＢ遺伝子のワクシニアトナープラスミドｐＭＰ４０９ＤＶＣへのク ローニング ココテ図４０を参照する。ＨＣＭＶ　ＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌ　Ｄフラグメント の４８０（ｌｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ７ラグメントを、プラスミドｐ ｌ［１Ｉ２４の２８００ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｍ旧フラグメントニクロー ン化した。オリゴヌクレオチドＣＭＶＭＳ　（ＧＣＣＴＣＡＴＣＧＣＴＧＣＴＧ Ｇ　ＡＴＡＴ　ＣＣＧＴＴＡＡ　ＧＴＴＴＧ　ＴＡＴＣＧＴＡ　ＡＴＧ　ＧＡ　 ＡＴＣＣＡＧ　ＧＡ　ＴＣＴＧ）及びＣＭＶＭ３　（ＧＡＣＡＧＡＴＴＧＴＧＡ ＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＣＡＴＣＧＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡ　）を用いたインビトロ 変異導入法（１７，１８５）によって、ＨＣＭＶ　ｇＢ遺伝子がワクシニアＨ６ プロモーターの制御下テ発現されるように修飾した。この修飾ＨＣＭＶ　ｇＢ遺 伝子を含有ｔ　ル”ｊラスミＦヲ２４Ｃ１ｌＶｇＢ（５＋３）と命名した（図４ ０）。
次に、２４ＣＭＶｇＢ　（５＋３）の２９００ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｂａｍ旧フラ グメントを、合成Ｈ６プロモーターを含有するプラスミドｐｓＰ１３１（６９） の３１００ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−８ｇｌｌ１７ラク）ｌ　：／　）ｌｃクローン化 した。このクローニング操作によって、ＨＣＭＶ　ｇＢ遺伝子がワクシニアＨ６ プロモーターの制御下に置かれる。得られたプラスミドをＳＰ＋３１ｇＢと命名 した。
最後に、Ｈ６プロモーター付きｌ（ＣＭＶ　ｇＢ遺伝子をワクシニアドナープラ スミドｐＭＰ４０９ＤＶｃにクローン化した。
ＳＰ１３１ｇＢの３０００ｂｐ　Ｉ（ｉｎｄｌｌｌムング・ビーンヌ’）　し７ −セ処理フラグメントをｐＭＰ４０９ＤＶｃのＢｇｌｌｌムング・ヒーンヌクレ アーゼ処理部位にクローン化した。得られたプラスミドヲ４Ｇ９ＣＭＶｇＢと命 名した（図４０）。
プラスミドイＧ９ＣＭＶｇｌｌ中ノ１１６プ０モーター付きＣＭＶ　ｇＢ遺伝子 を救援ウィルスｖＰ４５８のＭ２Ｌ部位に挿入した。得られた組換えワクシニア ウィルスをＶＰ５２５と命名した。
ＣＭＶ　ｇＢタンパク質の組換えワクシニアウィルス感染細胞における免疫蛍光 ｖＰ５２５を感染させた細胞について、モノクローナル抗体又はモルモットポリ クローナル血清を用いて免疫蛍光実験を行なったところ、ＨＣＭＶ　ｇＢが原形 質膜上に発現することが判明した。
ＣＭＶ　ｇＢの組換えワクシニア感染細胞における免疫沈降ＣＭＶ感染細胞内で 生産されるＣＭＶ　ｇＢ糖タンパク質は５５ｋ　Ｄ　ａの分子量を有しており、 その前駆体は１３０ｋＤａの分子量を有する（＋７２）。ｖＰ５２５を感染させ た細胞は、約１３０ｋＤａ及び５５ｋ　Ｄ　ａの２種類ののＣＭＶｇＢｌ：コー ドされるタンパク質を産生じた。
ＨＸＬＦＩ及ＵＨＸＬＦ２（Ｄ塩基配列ＨＸＬＦ遺伝子ファミリーは、Ｉ（ＣＭ Ｖゲ／　ムＤＮＡ　（７）ＨｉｎｄｌｌｌＸフラグメント中に局在化している（ １７２）。特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨＸＬＦＩ及びＨＸ ＬＦ２の塩基配列を決定した（図４１及び４２）。ＨＸＬＦＩは６４８個の塩基 からなっており、２１５残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。
）ｌＸＬＦ２は５５８個の塩基からなっており、１８５残基のアミノ酸からなる タンパク質をコードする。同じ遺伝子の塩基配列ＣＡＤ１６９　）１ｃＭＶ株） が文献に記載されているが（＋７３）、これらを比較したところ、ＩＩＸＬＦＩ については９９％の相同性、ＨＸＬＦ２については９６％の相同性を有していた 。
ＨＣＭＶ抗原発現ワクシニア組換え体によるモルモットの免疫 ３匹のモルモットをｖＰ５２５で免疫した。２次免疫を１回行なうと、モルモッ トはＨＣＭＶ中和抗体を生じた（平均力価、５１８＋。興味深いことに、ＨＣＭ Ｖ陽性ヒト血清の中和活性の５０％から８７％をｖＰ５２５感染細胞に吸収させ ることができる。この結果はＨＣＭＶ　ｇＢのサブユニットワクチンの潜在的に 重要性を有していることを示している。
文　献 １、Ａ１１ｃ＋＋、　Ｇ、Ｐ、及びＪ、　Ｔ、　Ｂｔ７！ｎｓ著、［Ｐｒｏｇ＋ ｅｓｓｉｎ　Ｖｅｊｇ＋１ｎｓＢ　ＭｉＣｒ＋ｂｉｏｌｏＢ　＊ｎｄ　ｌ＋＋ｗ ｕｎｏｌｏＢ　Ｊ第２巻、Ｒ，Ｐｘｎｄｓ７編（Ｂ！ｓｓ１社発行）　７１１− １４４頁（１９８６１゜ ２　＾１１ｅｎ、　Ｇ、Ｐ、、及びり、Ｄ、　Ｃｏｏｇｌｅ、　１．　Ｖｉｒｏ ｌ、第６２巻、２１１５０−２８５１１頁（１９８１１）。
３、　＾ＩＩｅ＋＋、　Ｇ、Ｐ、及びＭ、Ｉｔ、　Ｙｅｇｒｇｔｎ、　Ｊ、　Ｖ ｉｒｏｌ、第６１巻、２４５４−２４６１頁（１９Ｈ）。
４、Ｉｌ＊ｏａ＋ｚｎｎ、　Ｒ９Ｐ、、　Ｄ、Ｃ，５ｕｌｉｔｓｎ、　Ｊ、５ｊ ｚｃｓｅｋ、及びり、Ｊ、　Ｏ’ＣｚＩＩＢｂｘｎ、　１．　Ｖｉｔａｌ、第５ ７巻、　８１６−８２５頁（１９８６１゜ ５、Ｂｅｅ−Ｐｏ＋［、Ｔ、、　１．ＤｅＭ＊＋ｃｈｉ、　Ｂ、　Ｌｏａ＋ｎｉ ｃ！ｉ、及び＾、に１１１１！ＩＩ、　Ｖｉ＋ｏｌｏｄ７第１５４巻、　３２５ −３３４頁（１９８６）。
６、Ｂｅ＋＋ｕｎ、　ＰＪ、、　Ｄ、　Ｄｏｖｂｅｎｋｏ、　Ｌ、＾、　Ｌａ５ ｋ７．及びＣ，Ｃ，Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、１ｃｉｅｎｃｅ第２２２巻、５２４−５ ２７頁（１９８３１゜ ？、Ｂｅｒｌｈｏｌｅｆ、　Ｃ，、Ｒ，Ｄ＋１ｌｌｉｅｎ、及びＲ，Ｗｉｌｔｅ ｋ。
Ｐｒｏｃ、ＮＮ１．　Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第８２巻、２０９６−２１００ 頁＋１９８５）。
８、　Ｃｘ＋Ｎｉｎ、　Ｅ、Ｍ、、　Ｒ，Ｅｂｅ＋ｌｅ、　Ｊ、Ｌ、　Ｂｚｌｄ ｉｃｋ、　Ｂ。
Ｍｏ５ｓ、　Ｄ、Ｅ、　１Ｆｉｌｌｅ７．＾、Ｌ、　Ｎ１ｋｉｎｓ、及びＨｏＱ ｐｅｎｓｈｚｖ、Ｐｒｏｃ、Ｎｚ１１．　Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第８４巻。
５９０８−５９１２頁（１９８７３゜ ９、Ｃｈｘｋｒｚｂｘ＋ｌｉ、　ｓ、＋　Ｋ、　Ｂ＋ｅｃｈｌｉｎｇ、及びＢ、 　Ｉｌｏ　ｓ　ｓ。
Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｒｉｏｔ、第５巻、　３４０３−３４０９頁（＋９１１ ５）：ＩＱ、　Ｃ＋ｉｎｘｇｅ、Ｍ、Ｐ、、Ｔ、にｏｎｔｚｔｉｄｅｓ、＾、Ｔ 、８！＋＋ｋｉｃｒ。
Ｓ、Ｓｉｌｃｈｗｅｌｌ、Ｋ、Ｗｅｓｊｏｎ、Ｐ、Ｔｏａｌｉａｓｏａ、８゜Ｂ ｉｒｒ！ｌｌ、　Ｈ，Ｈｔｒｌ、　Ｓ、Ｅ、Ｂｅ１ｌ、＾、Ｃ１旧ｎ５ｏｎ、及 びＧ、Ｌ、　Ｓｓ＋ｉｌｂ、　ＥＭＢＯＪ、第５巻、　３０５７−３０６３頁（ １９１１６１゜ Ｉｌ、Ｃ１ｅｖｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、、１．　Ｂ！ｃｊｅｒｉｏ１．第１１０巻、 　６６７−６７６頁（１９７２）。
１２、Ｃ１ｅｖｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、及びり、Ｒ，）Ｉｅｌｉｎｓｋｉ、　Ｐｒｏ ｃ。
ＮｓＮ、Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第６２巻、１１５９−１１６６　頁（１９６ ９１゜ １３、　Ｃ＋ｅｍｔｒ、Ｋ、Ｊ、、Ｍ、Ｍｘｃｋｅｔｌ、Ｃ，Ｗｏｂｌｅｎｂｅ ｒｇ、Ａ。
Ｌ、　Ｎｏ１ｋｉｎｓ、及びＢ、　Ｍｏ５ｓ、　５ｃｉｅ＋＋ｃｅ第２２８巻１ ７３７−７４０頁（１９８５１， １４、Ｅ口５ｎｂｅｒｌ、　Ｄ、、　Ａｎｎｕ、　Ｒ＠ｗ、Ｂｉｏｃｂｅｍ、第 ５３巻。
５９５−６２３頁（１９８４１゜ １５、　Ｇｌｏｒｉｏｓｏ、１．、Ｕ、　にｅｅｓ、Ｇ、　Ｋｎｅｅｌ、Ｉｆ。
にｉ＋ｃｈｎｅ＋、及びＰ、にｒｕ＋ｍｅ＋、　Ｊ、Ｉａｍｕｎｏｌ、第１３５ 巻、５７５−５８２頁（１９１１５１゜１６、Ｇ＋ｘｈｚｍ、Ｆ、Ｌ、及びＡノ 、ＶｚＩＩｄｅｒ　Ｅｂ、、Ｖｉｒｏｌｏｇ７策５４巻、５３６−５３９頁（＋ ９７３）１７、　ＫＩＩｎｋｔｌ、　丁、＾、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ！ＩＩ、　Ａ ｃ！ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第８２巻、４８１１−４９２頁（１９１１５）。
Ｉｌｌ、Ｌｓｓｋｙ、　Ｌ、Ａ、、　Ｄ、　Ｄｏｖｂｅｎｋｏ、　Ｃ，ＣｏＳｉ ｍｏＣ０５ｉ、及びＰ、Ｗ、　８ｅｒｍ！ｎ、　Ｂｉｏ−ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＹ 第２巻、　５２７−５３２頁（１９１１４）。
１９、　１ｓｓｄｃｃｋｉ、　Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎｒｌｌ、　Ａｃｘｄ、　 Ｓｃｉ　ＵＳＡ第８３巻、７１７７−７１８１頁（１９８６１゜２０、Ｍ■ｉ！ ｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｌｓｃｈ、及びＪ、　Ｓｚｍｂｒｏｏｋ著 ［Ｍ＋Ｉｔｃｕｌｓｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌｘｂｏ＋ｘｆｏｒ７　ＭｉＩｌｕ ｘｌＪ（Ｃｏ１４　Ｓｐｔｉｎｇ　Ｈ！ｔｂｏｒ　Ｌｘｂｏｒａｆｏ＋７発行　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９１１２）。
２１、Ｍｘｒｌｉｎ、　Ｓ、及びＢ、Ｔ、　Ｒｏｕｓｅ、　１．　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、第１３８巻、３４３１−３４３７頁（＋９１１７１゜２２、Ｍｘｒｔｉａ、 　Ｓ、、　Ｂ、　Ｍｏ５ｓ、　Ｐ、Ｗ、　Ｂｅｒ＋ｎｔｎ、　Ｌ、Ａ。
Ｌｘｓｋ７．及びＢ、Ｔ、　Ｒｏｕｔｅ、１．　Ｖｉｒｏｌ、第６１巻、　？２ ６−７３４頁（＋９８７１゜ ２３、０’ＣｚＩＩＢｈｘｎ、Ｄ、Ｉ、、Ｂ、Ｅ、ＨｅｎＢ、１．Ｈ，Ｗｈａｒ ｆｏｎ。
Ｓ、＾、　Ｄ１ａｅｎｈｘｕｅ＋、　Ｒ，Ｂ、Ｖａｎｃｅ、Ｊ、５ｌａｃｚｅｋ 、及びＲ，Ａ、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ著ｒＤｅｙｅｌｏｐｍｅｎｆｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌｘｒＶｉｒｏｌｏｌＹＪ第１ｅｃｕｌｘｒＶｉｒｏｌｏｌＹＪ３８７ −４１８頁（１９１１＋）。
２４、Ｐａｎｃａｌｉ、　Ｄ、、　Ａ、　Ｇ＋ｘｅｌｅｃｋｉ、及びＣ，Ｈｕｘ ｎｇ。
Ｇｅｎｆｆ１第４７巻、！９３−１９９頁（＋９８６＋。
２５、Ｐａｎ１ｃａｌｉ、　Ｄ、、及びＥ、Ｐａｏｌｅ目ｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第７９巻、４９２７−４９３１　頁（１９８２）。
２６、Ｐ！ｏｌｅｌｔｉ、Ｅ、、Ｂ、Ｒ，Ｌｉｐｉｎｓｋａｓ、Ｃ，Ｓｘｍ５ｏ ｎｏ目。
Ｓ、　Ｍｅｔｃｅ「、及びり、　Ｐａｎ１ｃａｌｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第８１巻、＋９３−１９７頁（＋９８４１゜２７、 　Ｐｅｒｋｕｓ、　Ｍ、Ｅ、、　Ａ、　Ｐｉｃｃｉｎｉ、　Ｂ、Ｒ，Ｌｉｐｉｎ ｓｋ！ｓ、及びＥ、　Ｐａｏｌｅ口ｉ、５ｃｉｅｎｃｅ　策２２９巻、９ｇ＋− ９８４頁２８、Ｐｉｅｃｉｎｉ、　人、、　Ｍ、　Ｅ、Ｐｅｒｋｕｓ、及びＥ、 ＰｘｏｌｔＮｉ著ｒＭｅｊｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎＢｍｏｌｏＨＪ第１５３巻、　 ＷＩＩ、　Ｒ，及びり、　Ｇ＋ｏｓｓａ＋ｉｎ編（Ａｃｘｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ発行）５４５−５６３頁（１９ｇ７） ２９、Ｐｕ５ｌｅ１１．　１．、及びＦ、Ｃ，Ｋｘｆａｔｏｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、第１２巻、　６４３−６５５頁（１９８４）。
３◎、Ｒｏｏｎｅ７．　ＬＦ、、Ｃ，Ｗｏｈｌｅｎｂｅｒ！、Ｋ、Ｊ、Ｃ＋ｅａ ＋ｅ＋、Ｂ。
Ｍｅ　ｓ　ｓ、及びＡ、Ｌ、　Ｎｏ１ｋｉｎｓ、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第６２巻、 １５３０−１５３４頁（＋９８８１゜ ３１、Ｒｏｓ！ｌ、Ｊ、Ｌ、、Ｐ、Ｌ、Ｅｚｒｌ、Ｊ、Ｐ、Ｗｅｉｔ、及びＢ。
Ｍｏ５ｔ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第６０巻、　４３６−４４９頁（＋９８６１３ ２、Ｒｏｓｅｎｌｈａｌ、　Ｋ、Ｌ、、Ｊ、Ｒ，Ｓｍ１ｌｅ７．　Ｓ、　５ｏｌ ｈ、及びり、Ｃ，Ｉｏｈｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第６１巻、　２４３８ −２４４７頁（＋９８７）。
３３、Ｓｘｎｇｅ＋、Ｆ、、Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、及びＡ、　Ｃ０１１１＄０ １１゜Ｐｒｏｃ、Ｎ！ｉ１．　＾ｃｘｄ、Ｓｃｉ’、ＵＳＡ第７４巻、５４６３ −５４６７頁（＋９７７）。
３４、　５ｈｉｐｉ＋ａ、Ｓ、に、、１．　Ｃｈｏｏ、Ｆ、Ｖ、　Ｒｉｃｈｉｕ ｄ、及びＭ、１．　Ｃａ５ａｄａｂａｎ、Ｇｅｎｅ第２５巻、７１−８２頁（１ ９８３）３５、　５ｈｉｄａ、　Ｈ，、Ｖｉｒｏｌｏｇ７第１５０巻４５１−４ ６２頁（１９８６１゜ ３６、　５ｐｅｘｒ、Ｐ、Ｇ、著［Ｔｈｅ　Ｂａ５ｉｓ　ｌｏｔ　Ｓｅｒｏｄｉ ｉｇｎｏｓｉｓｇｏｄ　Ｖｇｃｃｉｎｅｓ、１ｍａ＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｊ＋７ 　ｏＩ　ＶｉｔｕｓｅｓＪ第２巻、　Ｍ、Ｈ，Ｖ、　Ｖｇｎ　ＲｅｇｅｎＩＩ＋ ｏｒｌｅｌ及びＡ、Ｒ，Ｎｅｕ＋ｚｌｈ編（Ｎ！ｖ　Ｙｏｒｋ）、　４２５−４ ４３頁（１９８５）。
３？、Ｂｐｅｓｒ、　Ｐ、Ｇ、著ｒＴｈｅ　ｌＩｅ＋ｐｅｓｙｉ＋ｕｓ　Ｊ第３ 巻、Ｂ。
Ｒｏ＋ｔｓｘｅ編（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　３１５−３５６頁（１９８５１゜３ ｇ、５ｗ１ｌｉｖｚｎ、　Ｖ、及びＧ、Ｌ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、　Ｈｅｎ、　 Ｖｉｒｏｌ。
第６８巻、２５８７−２５９８頁（１９８７）。
３９、　５ｍ１１１ｗ！ｎ、　Ｖ、及びＧ、Ｌ、　Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、ｇｅｎ、　 Ｖｉｒｏｌ。
第６９巻、　８５９−８６７頁（１９８８）。
４Ｇ、Ｔ！ｂｏｔ、　Ｓ、、及びＣ，Ｃ，Ｒｉｃｈｘｒｄｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、 　ＮＮＩ。
Ａｃｚｄ、　Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ第８４巻、　４７６７−４７７１頁（１９８７） 。
４１、７ｘ７１ｏｒ、Ｊ、、Ｒ，Ｗｅｉｎｂｅｔｇ、Ｂ、Ｌｚｎｑｕｅｆ、Ｐ。
Ｄｅｓａｅ目ｒｅ、及びε、　Ｐｌｏｌｅｊｔｉ、　Ｖｚｃｃｉｎｅ第６巻。
４９７−５０３頁（１９８８１゜ ４２、　ＴｉＹｌｅｒ、Ｊ、、Ｒ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｙ、にｘｖｚｏｋｘ、Ｒ 。
Ｗｓｂｓｊｔｒ、及びＥ、　Ｐｉｏｌｅ目ｉ、　Ｖｔｃｃｉｎｅ第６巻、　５０ ４−５０８頁（１９８８１゜ ４３゜Ｔｗｒｌｉｉｅｎ、Ｌ、Ｗ、、及びＧ、　Ｐ、＾１ｌｅｎ、　Ｊ、　ｇｅ ｎ。
Ｖｉｒｏｌ、第６３巻、　４８１−４８５頁（１９８２）。
４４、Ｗｚｃｂｅ＋ａｔｎ、Ｍ、、Ｌ、Ａｕ＋ｅ１口ｎ、Ｃ，Ｃ，Ｓｍ１ｔｈ、 Ｂ、Ｒ。
Ｌｉｐｉａｓｋｘｓ、　ｌＪ、Ｅ、　Ｐｅｒｋｕｓ、及びε　Ｐａｏｌｅｔｌｉ 、　Ｉ。
１＋Ｉｔｃｆ、、　Ｄｉｓ、第１５５巻、　１１８８−１１９７頁（１９８７１ ゜４５、Ｙｗｅｓ、　Ｌ、及びＢ、　Ｍｏ５ｓ、　Ｐ「ｏｃ、　Ｎｚｆｌ、　Ａ ｃｚｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ第８４巻、６４１７−６４２１頁（１９８７）。
４６、ｚｘｒｌｉｎｇ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｐ、Ａ、　Ｍｏｒｘｎ、　Ｌ、Ａ、　Ｌ ！ｓｋ７．及びＢ。
Ｍｏ５ｓ、　Ｊ、　Ｖｉｔａｌ、第５９巻、　５０６−５０９頁（１９８６）。
４７、　２ｘｒｌｉｎｇ、１．Ｍ、、　Ｐ、Ａ、　Ｍｏｒａｎ、　Ｒ，Ｌ、Ｂｕ ｒｋｅ、　Ｃ・Ｐａｃｈｌ、Ｐ、Ｗ、Ｂｅ＋ｌｌ１ｉｎ、及び　Ｌ、＾、Ｌｘｔ ｋ７．　Ｉ。
Ｉｍｏｕｎｏｌ、第１３６巻、　４６６９−４６７３頁（１９８６１゜４８、　 ０’Ｃｘｌｌａｇｈａｎ、　ＤＪ、、　Ｇ、Ａ、　Ｇｅｎｊｒ７．及びＣ，Ｃ。
Ｒ１ｎｄｘｌｌ著ｒＴｈｅ　ＨＣｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ　Ｊ第２巻、Ｂ。
Ｒｏｉ！ｍｘｎ編（Ｎｅｗ　Ｙｏｔｋ）、２１５−３１８頁（１９１１３）。
４９、　Ａｃｋｅ＋ｍｚｎｎ、　Ｍ、、　Ｒ，ＬｏＨｎｅｃｋｅｔ、　Ｂ、　Ｒ ａｉｘｍａｎ、及びり、　ｐｔｔｅｉ目、　ＶｔｒｎｌｏＨ第１５０巻、　２０ ？−２２０頁（１９８６）。
５Ｇ、Ｆｒ１ｎｋ、　Ｒ，Ｉ、、　Ｍ、Ｒ，ＥｉｓｅｎｂｅＢ、　Ｇ、　Ｃｏｈ ！ｎ、及びＥ、に、　ＷＢｎｅｒ、　Ｉ、　Ｖｉｒｏｌ、第４５巻、　６３４− ６４７頁（＋９８３）。
５１、Ｆｒｘｍｅ、　Ｍ、Ｃ，、Ｈ，Ｓ、　Ｍｉｒｓｄｔｎ、及びり、Ｊ、　Ｍ ｃＧｅｏｃｈ。
Ｊ、　Ｈｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、第６７巻、　７４５−７５１頁（１９１１６）。
５２、Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅ＋、　Ｒｏ、　５．　ＣｋｘＮｅ＋ｉｃｅ、　Ｒ，Ｗ ｈｉ口ｅ７．及びＢ、　Ｒｏｉ！ｍ＊ｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ！ｊ１．Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾第８４巻、４３０３−４３０７頁（１９８７１゜５３、Ｒ ｉｃｂｍｚｎ、Ｄ、Ｄ、、Ａ、Ｂｕｃｋａ＋ｇｓｌｅｔ、Ｓ、Ｂｅ１ｌ、Ｃ。
Ｈａｄ（ａ＋ｇｎ及びＡ、　Ｃ，旧ｎ５ｏｎ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第５７巻。
６４７−６５５頁（１９８６１ ５４、５ｖｘｉｎ、　Ｍ、Ａ、、　Ｒ，Ｗ、　Ｐｅｅｔ、及びり、　Ａ、　Ｇ！ ｌｌ０ｆ１Ｆ。
１、Ｖｉｒｏｌ、第５３巻、　５６１−５６９頁（１９８５１゜５５、Ｘｅｒｕ ｌｔｋ、に１Ｍ、、及びＰ、Ｇ、　５ｐｅｚｒ、　１．　Ｖｉｔａｌ、第４９巻 、７４１−７４７頁（＋９８４）。
５６．　ｘｎ　Ｄｒａｎｅｎ　ＬＮｔｅトｖｓｎ　ｄｔｒ　Ｈａｒｋ、Ｓ、、Ｔ 、ｌｘｍｂ。
及びり、Ａ、　Ｂｘｂ＋ｉｃｋ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第６３巻、　２１５９− ２１６８頁（１９１１９）。
５７、Ｐｅｒｋａｔ、　Ｍ、Ｅ、、　Ｄ、　Ｐ＊ｎ１ｃｉｌｉ、Ｓ、　Ｍｅｒｃ ｅ＋、及びＥ、　Ｐｓｏｌｅｌｌｉ、　Ｖｉ＋ｏｌｏＢ第１５２巻、　２１１５ −２９７頁（１９８６）。
５ｇ、　Ｔｚｍｉｎ、Ａ、、　Ｅ、Ｃ，Ｙｉｌｌｘｕｅｚｌ、　Ｓ、Ｌ、　Ｗｅ ｉ＋＋＋ｉｃｈ、及びり、Ｅ、　Ｈ＋ｕｂ７．　Ｖｉ＋ｏｌｏＨ第１６５巻、　 ＋４１−１５０頁（１９８１１１゜ ５９、Ｗｂｚｌｌｅ７．　１．Ｍ、、Ｇ、Ｒ，ＲｏｂｅＮｓｏｎ、及びＡ、　Ｊ 。
ＤＩｖｉｄｓｏｎ、　Ｉ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、第５７巻、　３０７−３２ ３頁（１９ｇ＋）。
６０、ＬｘｃＩＩ＋ａ＋Ｉｉ、Ｕに、、Ｎｘ１ｕｔｅ（１，ａｎｄｏｎｌ　第２ ２７巻、１ｉｌｌｆｌ−６８５頁（１９７Ｇ）。
６１、Ｌｇｅｎｂａｃｈｌｅ、　０．、　Ｍ、　５ｚｎｌｔｒ、Ｊ、Ａ、　５Ｉ ｔｉＩｓ、及びＲ，Ｊ、　Ｍｔｎｓ、Ｃｅ１ｌ第１ｌ巻、　５５１−５６３頁（ １９７ｇ）、６２、　Ｒｏｂｂｉｎｓ、＾、に、、０．１．　Ｄｏ＋ｎｅ７．　 Ｍ、Ｗ、Ｗｔｌｈｅｎ、Ｍ。
Ｅ、　Ｗｈｅ！ｌｅ７．　Ｃ，Ｇｏｌｄ、ＲｏＩ、ＷＩＩＩＯＩＩ、Ｌ、Ｅ。
Ｈｏ１ｌｘｎｄ、Ｓ、Ｄ、Ｗｅｅｄ、Ｍ、Ｌｅｒｉｎｅ、１．Ｃ９Ｇｌｏｒｉａ ｓｏ、。
及びり、Ｗ、　Ｅｎｑｕｉ＋ｌ、Ｌ　Ｖｉｔａｌ、第６１巻、　２６９＋−２７ ［１１頁（１９８７）。
６３、Ｗｈｉｆｂｅｃｋ、１．Ｃ，、Ｌ、２．　Ｂｃｌｌｏ、　及びＷ、　Ｃ。
Ｌｘｖｒｅｎｃｅ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第６２巻、　３３１９−３３２７頁（ １９８８）。
６４、Ｍｏｎ１＋ｅｕｉｌ、Ｊ、、］、Ｂｉｏ１．　Ｃｅ１ｌ、第５１巻、＋１ ５−１３２頁（１９８４）。
６５、Ｋ７ｔｅ、１．、及びＲ，Ｆ、Ｄｏｏｌｉｊｔｌｅ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ。
第１５７巻、　１０５−１３２頁（１９ｇ２１．６６、Ｄｘｗｉｓｏｎ、＾、Ｊ １．及び　Ｉ、Ｅ、　Ｓｃｏ口、　１．　ｇｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ、第６７巻、　１７５９−１８１６頁（１９８６）。
６７、　８＊ｉｋ、　Ｄ、ｉ、、　Ｂ、＾、Ｆｏｘ、　Ｎ、Ａ、　ＤｅＬｕｃｘ 、及びＳ。
Ｐｅｒｓｏｎ、ＶｉｒｏｌｏＨ第１３３巻、３０１−３０７頁（１９８４１゜６ ８、　Ｐｅ１ｌｅｔｔ、Ｐ、Ｅ、、Ｍ、Ｄ、ＢｉＢｉｎ、Ｂ、Ｌ、Ｂｚｒ＋ｅｌ ｌ。
及びＢ、　Ｒｏ■ｍ＊ｎ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、第５６巻、　ｇｏｙ−ｇ＋３頁（＋ ９１１５）。
６９、Ｐｅｒｋａｔ、　Ｍ、ε、、　Ｋ、　ｌ、ｉｍｂｇｃｈ、及びＥ、　Ｐｚ ｏｌｅｌｌｉ。
Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第６３巻、　３１１２９−３１１３６頁［１９１１９）。
７（１，Ｇ１１ｌｚｒｄ、Ｓ、、　Ｄ、５ｐｅｈｎｅｒ、　Ｒ，Ｄ＋１ｌｌｉｅ ｎ、及び＾、にｉｒｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎｉ１１．　＾ｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第８ ３巻、５５７３−５５７７頁（１９８６）。
７１、Ｗｈｚｌｌｅｙ、１．Ｍ、、Ｇ、Ｒ，Ｒｏｂ！ｒｔｓｏｎ、Ｎ、＾、Ｓｃ ｏ目。
Ｇ、Ｃ，Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｗ、　Ｂｅ１ｌ、及びり０Ｍ、　Ｗｏｏｄｖｏ＋ ｌｈ。
Ｌ　Ｈｅｎ、　Ｖｉｔａｌ、第７０巻、　３８３−３９４頁（１９８９１゜？２ ．　Ｒｉ！ｌｉｏ、　Ｍ、Ｐ、、　＾、Ａ、Ｃｕ１ｌｉｎ！ｎｅ、及びり、　Ｅ 。
０ｎｉｏｎｓ、　Ｉ、Ｖｉｒｏｌ、第６３巻、　＋１２３−１１３３頁（＋９８ ９１゜７３、　Ｇｌｏ＋１ｏｓｏ、１．、Ｃ，Ｈ，Ｓｃｈ＋ｏｄｅｒ、Ｇ、Ｋｏ ｍｅｌ、Ｍ。
５ｒｃｚｔｓｉｕ１．及びＭ、Ｌｅｙｉｎｅ、Ｉ、　Ｖｉｒｏｌ、第５０巻。
８０５−８１２頁（１９８４）。
７４、Ｗｘｃｂｓｍｉｎ、Ｍ、、Ｌ、＾ｏ＋ｅｌｉ！ｎ、Ｊ、Ｃ，Ｒ，ｆｌｕｎ ｌｅｔ、Ｍ。
Ｅ、　Ｐｅ＋ｋｕｓ、及びＥ、Ｐｘｏｌｓｌｌｉ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒ１ ｐｏ＋Ｉｓ第８巻、　３２３−３３４頁（１９８８）。
７５、　ＷｘｃｈｓＩＩｌｚｎ、Ｍ、、］、＋１．　Ｌｌｌ（ｌ、Ｌ、Ａｕ＋ｅ ｌｉ！ｎ、Ｍ、Ｅ。
Ｐｅｒｋａｔ、及びＥ、　Ｐ！ｏｌｅＮｉ、　１０ｇｅｎ、　Ｖｉｒ＋１．第７ ０巻、２５＋３−２５２０頁（１９８９１゜７６、！１ｉｎｃｌｘｉｒ、　Ｒ， 、Ｒ，Ｆ、　Ｃｏｏｋ、及び１．Ａ、　Ｍｏｍ１ｏｔｄ、’１、　Ｈａ、　Ｖｉ ｔａｌ、第７０巻、　４５５−４５９頁（１９１１９１゜７７、Ｓｈｉｍｉｒｕ 、　Ｍ、、に、Ｓ！ｔｏＩ＋、及びＮ、　Ｎｔｓｈｉｏｋｘ。
＾Ｂｈ、Ｖｉｔａｌ、第１０４巻、＋５９−１７４頁（＋９８９）。
７１　５ｔｏｋｅｓ、　Ａ、、　Ｇ、Ｐ、　＾ｌ１ｅｎ、　Ｌ、Ａ、Ｐｏ１ｌｅ ｎ、及びＰ、Ｋ、　ＭＩＩｕｙ、　Ｊ、　Ｈｔｎ、　Ｖｉｒｏｌ、第７０巻、　 ＋１７３−１１８３頁ｆ＋９８９）。
？９．　ＭｃＧｅｏｃｈ、０．１．、＾、００１１１１．　Ｓ、Ｄｏｎａｌｄ、 　及びＦ。
１、Ｒｉｘｏｎ、Ｉ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　第１８１巻、１−１３頁（１９ ８５）。
８０、ＰｅＨｏｖｓｋｉｓ、　Ｅ、＾、、　Ｊ、Ｇ、　Ｔｉｍｍ１ｎｓ、及びり 、　Ｅ。
Ｐｏ５ｔ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第６０巻、　＋８５−１９３頁（１９８６）。
８１、Ｗｉｌｌａ＋ａｎｎ、　Ｇ、及びＨｌ−１，Ｒｒｉｈａ著ｒ　Ｈｅ＋ｐｅ ｓｗｉｔｕｓＤｉｓｓｉ＋ｅ＋　ｏｆ　Ｃ３口１ｅ、Ｈｏｒｓｅ＋　！ｎｄ　Ｐ ｉｇ＋　Ｊ　Ｇ。
Ｗｉｌ１ｍａｎｎ著　（Ｋｌｕ−ｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂ１口ｈｅｒ ｓ社発行）２３０−３２５頁（１９８９）。
８２、Ｒｕｂｅｎ＋１ｅｉｎ、　Ａ、Ｓ及び＾、Ｓ、　Ｋａｐｌｘｎ、　Ｖｉ＋ ｏｌｏｇ７第６６巻、３８５−３９２頁（＋９７５１゜８３、Ｓｌｅｗｅ１７． 　Ｗ、Ｓ、、Ｉ、　Ｖｉ＋ｏｌ第２２巻、　２３２−２３４頁（＋９７７］。
８４、Ｂｅｎ−Ｐｏｒｘｌ、　Ｔ、、　Ｆ、Ｊ、　Ｒｉｘｏ’ｎ、及びＭ、　Ｌ 。
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８５、ｆｌｅｎ−Ｐｏｒｇｌ、　Ｔ、及び＾、Ｓ、Ｋｓｐ１ｘｎ著ｒ　ＴｈｅＨ ｅｒｐｅｔｖ：ｒｌｌｓｅｓ　Ｊ第３巻、Ｂ、ＲｏｉＩｍｓｎ編（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｏｂｌｉｓｂｉｎｇ　Ｃｏｒｐ社発行Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　１０５−１７３頁 （１９８５）。
８６、Ｈｘｍｐｌ、　Ｈ，、Ｔ、　Ｂｅｌ１−Ｐｏｒｇｌ、　Ｌ、　Ｅｈｒｌｉ ｃｈｅｓ、　に−０゜Ｈ１ｂｅτｍｅｈｌ、及び＾、Ｓ、ＫＩＰＩＩＩＩ、１． 　Ｖｉｒｏｌ、第５２巻。
５８３−５９０頁（１９８４）。
８７、Ｂｅｎ−Ｐｏｒｇｌ、　Ｔ、著ｒ　０ｒＨｎｉｔｓｊｉｏｎ　５ｎｄｒｅ ｐｌｉｃ１１ｉｏｎ　ｏｆ　ｙｉ＋ｉ　ＤＮＡＪ　Ａ、Ｓ、　ＫＩＰＩＩＩＩ編 （ＤＲＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、社発行ＢＯＣＩ　Ｒｌｔｏｌｌ、　ＦＬ）　１４ ７−１７２頁（１９８２１゜ ８ｇ、　Ｂ！ｎ−Ｐｏｒｇｌ、Ｔ、、１．　ＤｅＭ！＋ｃｈｉ、Ｊ、Ｐｅｎｄｒ Ｙｓ、Ｒ，＾。
Ｖｅｚｃｈ、及びＡ、Ｓ、　Ｋｚｐｌｘｎ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第５７巻、　 ＋９１−１９６頁（１９１１６）、 ８９、Ｂｅｎ−Ｐｏｒｇｌ、　Ｔ、及び＾、Ｓ、　Ｋｘｐ１２ｎ、　Ｖｉｔｏｌ ｏＨ，第４１巻、２６５−２７３頁（１９７０＋。
９０、　Ｋｉｌｌｉｎｇｆｏｎ、Ｒ，＾、、Ｌ　Ｙｅｏ、ＲＪ、Ｈａｎｅｓｓ、 Ｄ、）Ｉ。
Ｗａｌｓｏｎ、　Ｂ、Ｅ、　Ｉ）ａ＋＋ｃｚｎ、ＩＪ、　Ｈ！１ｌｉｂＩｌｒ＋ ｏｎ、及びＪＭａａ＋１ａｒｄ、Ｊ、Ｂｒ１．　Ｖｉｒｏｌ、第３７巻、２９７ −３１０頁（＋９７７） ９１、Ｒｏｂｂｉｎｓ、＾、に、、　１．Ｈ，Ｗｅｉｓ、　ＬＪ、　Ｅｎｑｕｉ ｓｌ、及びＲ，１，ＷＩＩＩＯＩＩ、１．１１０１　＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｌ　 第２巻、４８５−４９６頁（１９８４１゜ ９２．　Ｒｅｓ、　Ｔ、Ｊ、、１．Ｇ、　Ｔｉｍ５１ｍ５．　Ｇ、Ｗ、Ｌｏａｇ 、及びり。
Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第５４巻、　２１−２９頁（１９８５） 。
９３、ＭｅＮｅｎｌｅｉｊｅ＋、丁、　Ｃ，、Ｎ、　Ｌｕｋｘｃｓ、及びＨ，− Ｊ。
Ｒｔｉｂｘ、　Ｉ、　Ｖｉｒｏｌ、第５３巻、　５２−５７頁（＋９１１５１゜ ９４、Ｍｅｌｌｅｎｌｅｉｌｅｒ、　Ｔ、Ｃ，、Ｎ、　ＬＩｌｋ！ｃｓ、　Ｈ， −１，Ｔｋｉｅｌ。
Ｃ，５ｃｈｒｅｕｒｓ、及びＨ，−Ｊ、　Ｒ５１ｂｓ、　Ｖｉ＋ｏｌｏＨ第１５ ２巻、６６−７５頁（＋９１１６）。
９５、Ｐｅ１ｒｏｙｓｋｉｓ、Ｅ、Ａ、、Ｊ、Ｇ、Ｔｉａ＋＋ｎ１ｎｓ、Ｍ、Ａ 。
＾＋ａ＋ｃ＋＋１ｒｏｕＬ　Ｃ，Ｃ，Ｍｇｒｅｈｉｏｌｉ、Ｒ，１，Ｙｔｎｃｅ ｙ、Ｊ＋、。
及びり、　Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第５９巻、　２１６−２２３ 頁（＋９１１６１゜ ９６、Ｒｏｂｂｉｎｓ、＾、に、、Ｒ，Ｉ、Ｗ！１＄０１１．　Ｍ、Ｅ、Ｗｈｅ ｘｌｙ、Ｗ。
Ｗ、　Ｈ！ｌｓ、及びり、Ｗ、　Ｅｎｑｕｉｓｌ、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第５８巻 。
３３９−３４７頁（１９８６）。
９７、Ｗｘｌｈｅｎ、　Ｍ、Ｗ、及びり、　Ｍ、に、Ｗｘｌｂｅｎ、　Ｊ、　Ｖ ｉｒｏｌ、第５１巻、５７−６２頁（１９８４＋。
９１１、Ｋｅｅｌ、Ｔ、＾、、Ｅ、Ｖ、Ｊｏｎｅｓ、に、Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ、Ａ、 Ｐ。
Ｒｅｅｄ、＾、Ｌ、Ｂ【ｏｗｎ、及びＴ、１．旧ｆｌｅａ、　Ｖｉｒｏｌｏｇ７ 第１７１巻、　３６５−３７６頁（１９８９）。
９９、Ｍｃｌｌｅｎｌｅｉｌｅ＋、　Ｔ、Ｃ，、Ｎ、　Ｌｕｋｉｃｓ、　及び＋ １．−１゜Ｒ１１ｈａ、１．　Ｖｉ「ａｌ、第５６巻、　３０７−３１１頁（１ ９８５）。
１０Ｇ、Ｌｏｏ＋ｎ１ｃｒｉ、Ｂ、、　Ｓ、　Ｗｉｊａｎａｂｅ、　Ｔ、　Ｂｅ ｎ−Ｐｏｒｉｔ、及び＾、Ｓ、　Ｋａｐｌａｎ、１．　Ｖｉｒｏｌ、第５２巻、 １９８−２０５頁（１９８４）。
１０１、　Ｌａｋｓｃｓ、Ｎ、、Ｈ，−１，Ｔｈ１ｅｆ、、Ｔ、Ｃ，Ｍｅｌｊｅ ＋＋１ｅｉｊｅｒ。
及びＨ，−Ｊ、　Ｒ１１ｈ＊、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第５３巻、　、＋６６−１ ７３頁（１９８５１゜ １０２、　Ｍ＊＋ｃｂｉｏｌｉ、Ｃ，、Ｒｏｌ、Ｙｘｎｃｅ７．　Ｉｔ、、Ｊ、 Ｇ。
Ｔｉｍｍ１ｎｓ、　Ｌ、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、　Ｂ、Ｒ，Ｙｏｕｒ、及びＯ１＾。
Ｐｏｖｅｎｄｏ、　ＡＩｌ、　１．　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ、第４９巻、　８６０− ８６４頁（１９８８１゜ １０３、　Ｍｒｒｃｈｉｏｌｉ、Ｃ，Ｃ，、Ｒ，Ｊ、Ｙｚｎｃｅ７．　Ｉｔ、、 Ｒ，Ｃ。
Ｗｚ＋ｄｌｅｙ、　Ｄ、Ｒ，Ｔｈｏｍｓｅｎ及びり、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、＾ｍ、１ ゜Ｖｔ１．　Ｒｅｓ、第４８巻、　＋５７７−１５８３頁（１９８７）、１０４ 、　Ｔｋｏｍｓｅｍ、Ｄ、Ｒ，、Ｃ，Ｃ，Ｍｚｒｃｈｉｏｌｉ、Ｒ，１，Ｙ＊ｎ ｃ＊７゜Ｊｒ、及びり、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、　Ｊ、　Ｖｉｔｏｌ、第６１巻、　２ ２９−２３２頁（１９１１７）。
１０５、　Ｌｊｂｅｎ、　Ｌ、Ｍ、に、、　Ｋ、Ｂ、　ＰＩ！Ｉｔ、　Ｍ、Ｗ、 　Ｗｓｊｂｅｎ、　Ｒ。
Ａ、　Ｖｔｎ　Ｄｅｏｓｅｎ、　Ｃ，Ａ、　Ｗｈｅｔｓｔｏｎｅ、及びＥ、　Ｃ 。
Ｐｉｒｌｌｅ、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、第４巻、１９−２９頁（＋９１１５１゜１ ０６、　Ｅｌｏｉｌ、　Ｍ、、口、　ＦｘＢｅ！ｕｄ、　Ｒ，Ｌ’　Ｌｒ１ｄｏ ｎ及びＢ。
Ｔｏｍ＆、　Ａ【ｃｈ、　Ｖｉｒａｌ、第９９巻、　４５−４６頁（１９８８１ ゜１０７、Ｍ！ｔｃｈｉｏｌｉ、　Ｃ，Ｃ，、Ｒ，１，Ｙｘｎｃｅ７．　Ｉｔ、 、　Ｅ、Ａ。
Ｐｅｌ＋ａｖｓｋｉｔ、１．Ｇ、　Ｔｉｍｍ１ｎｓ、及びり、Ｅ、　Ｐｏｒｔ、 Ｉ。
Ｖｉｒａｌ、第６１巻、　３９７７−３９８２頁（１９８７）。
１０Ｂ、ｌ５ｈｉｉ、Ｈ，、Ｙ、ＫｏｂＢａｓｈｉ、　Ｍ、Ｋａｒｏｋｉ及びＹ Ｋｏｄｉｍａ、１．　ｇｅｎ、　Ｖｉｔａｌ、第６９巻、＋４１１−１４１４頁 （１９８８）、 １０９、　１Ｆｈｅｘ１７．　Ｍ、Ｅｌ、＾、に、　Ｒｏｂｂｉｎｓ及びり、Ｗ 、Ｅｎｑｕｉｓｌ。
１、Ｖｉｔａｌ第６３Ｌ　４０５５−４０５９頁（１９８９）。
１１０、　Ｗｌｌｈｅｎ、　Ｍ、Ｗ、及びり、Ｍ、に、　Ｗｘｌｈｅｎ、　１． 　Ｖｉｒｏｌ、第５８巻、＋７３−１７８頁（１９８６）。
ＩＩｌ、Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ａ、に、、Ｍ、Ｅ、Ｗｈｅｉｌｙ、Ｍ、Ｅ、、Ｒ，Ｉ 。
ＷＩＩＩＯｌｌ及びり、Ｗ、　Ｅｎｑｕｉｓｌ、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第５９巻、 　６３５−６４５頁（１９８６）。
１１２、　Ａ１１ｅｎ、　Ｗ、Ｐ、、及びＦ、Ｒｚｐｐ、　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、 　Ｄｉｓ、第１４５巻、４１３−４２１頁（１９８２）。
１１３、　８Ｂｓ＋＋ｎ、Ｙ、！、、Ｍ、Ｄｉｌｌｏｎ、Ｍ、Ｌｏｗｅｌｌ、Ｇ 。
ＡＣＩＩＩＩＩ、Ｓ、ＴＢｌｏ＋、１．Ｄ、ＣｂｅｔＢ、Ｂ、Ｌ、Ｊｏｈｎｓｏ ｎ。
Ｅ、　Ｗｉｅｔｍｅｉｅ＋、　Ｗ、　Ｇ＋ｏｖｄｏｎ、　Ｔ、　Ｃｔｅｓｇｈ− ｋｉｒｋ、及びＲ，ＫｅｅｎＢ、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、第３０８巻、９＋ ６−９２１頁（１９８３１゜ １１４、Ｄｏｕｇｌ！ｓ、１．Ｍ、、Ｃ，Ｃ＋１ｔｃｈｌｏｖ、Ｊ、Ｂｅｎｃｄ ｅｔｌｉ。
Ｇ、１．　Ｍｓ＋１３　１．Ｄ、Ｃｏ＋＋ｎｔ、Ｍ、Ａ、Ｈｉｎｌｒ、Ａ。
Ｆｚｈｎｌｎｄｅｒ、　Ｍ、　Ｒｅｍｉｎｇｌｏｎ、　Ｃ，ｆｉｌｅｒ、及びり 。
Ｃｏ＋Ｂ、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　１．　Ｍｅｄ、第３１０巻、　＋５５１−１５ ５６頁（１９８４１゜ １１５、Ｒｏｉｒｉｚｎ、　Ｂ、及びＡ、Ｅ、５ｅ１ｒｓ、Ｉｎ：　Ｖｉｒｏｌ ｏ（７゜ｅｄｓ、Ｆｉｓｌｄ＋、Ｂ、Ｎ、及びり、Ｍ、　Ｋｎｉｐｅ（Ｒｘｔｅ ｎ　Ｐｒｔｓｓ。
ｔｔｔ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ）　１７９５−１８４１頁（＋９９０１゜１１６、 ５ｔｕｖｓ、Ｌ、Ｌ、、Ｓ、Ｂｒｏｗｎ−Ｓｈｉｍｔ＋、Ｃ，Ｐｘｃｈｌ、Ｒ。
Ｎｘ１ｔｒ目ｎ、　Ｄ、　Ｄｉｎｉ、及びＲ，Ｌ、　Ｂｕ＋ｋｅ、Ｉ、Ｖｉｒａ ｌ、第６１巻、３２６−３３５頁（１９８７１１１７、Ｄｏｖｂ！ｎｋｏ、　０ ．１．、及びり、Ａ、Ｌｘｓｋｙ、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第５２巻、１５４−１６ ３頁（１９８４）。
１１８、Ｗｘｌｓｏｎ、Ｒ，Ｉ、、Ｇｅｎｅ第２６巻、３０７−３１２頁（＋９ ８３）。
１１９、ＭｃＧｅｏｃｈ、０．１．、Ｈ，Ｗ、Ｍ、Ｍｏ５ｓ、Ｄ、ＭｃＮｓｂ及 びＭ。
Ｃ，Ｆｒｉｍｅ、Ｊ、ｇｅｎ、Ｖｉｒａｌ、第６８巻、＋９−３８頁（１９８７ １゜ １２Ｇ、Ｃｈ！ｎ、　Ｗ、、　１１１１１１１１１１０１．第４９巻、　３４３ −３５２頁（１９ｇ３）。
１２１、Ｄｘｖ口、　Ｗ、Ｂ、、１．＾、ＴＢｌｏｒ、及びＪ、　Ｅ、　０ｘｋ ｅｓ。
Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、第１４０巻、　５３４−５４０頁（＋９７９１ ゜１２２、　０ｓｋｅｔ、　１．Ｅ、、及びＨ，Ｒｏｓｅｍｏｎｄ−Ｈｏ＋ｎｂ ｅｔｋ。
Ｉｎｊｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、第２１巻、　４８９−４９５頁（１９７８１゜１２ ３、Ｂｘｌ！ｃｈｘｎｄｒａｎ、　Ｎ、、　Ｓ、　Ｂｔｃｃｌ＋ｅ目１．及びＷ 、　Ｅ。
Ｒｓｖｌｓ、Ｉｎ１ｅｃ１．Ｉｍｍｕｎ、第３７巻、　１１３２−１１３７頁（ １９８２１゜ １２４、　０１ｋｅｓ、Ｊ、Ｅ、、　Ｗ、Ｂ、　Ｄｘｖｉｓ、１．Ａ、　ＴｓＹ ｌｏｒ、　及びＷ、Ｗ、　Ｗｅｐｐｎｅｒ、１ｎｌｅｃｌ、１ｍｏ＋＋＋ｎ、第 ２９巻、　６４２−６４９頁（１９８０１゜ １２５、　ＭｃＬ！ｕｇｈｌｉｎ−Ｔｓ７１ｏｒ、Ｅ、、Ｄ、Ｅ、Ｗｉｌｌｅ７ ．　Ｅ、Ｍ。
Ｃｘ＋Ｉｉｕ、　Ｒ，Ｅｂｅ＋ｌｅ、　Ｂ、　Ｍｏ５ｓ、及びＨ，０ｐｅｎｓｈ ｘｖ。
Ｊ、　（ｅｎ、　Ｖｉｒａｌ、第６９巻、　１７３１−１７３４頁（１９Ｈ）。
１２６、Ｗｅｉｒ、Ｊ、Ｐ、、Ｍ、１ｅｎｎｅｌｌ、Ｅ、Ｍ、Ａｌｌ！ｎ、Ｋ、 Ｉ、。
ＥＩｋｉ＋＋＋、Ｓ、　Ｍｘｒｆｉｎ、及びＢ、Ｔ、　Ｒｏｕｓｅ、１．　ｇｅ ｎ。
Ｖｉｒｏｌ、第７０巻、　２５ｇ？−２５９４頁（１９８９］。
１２７、Ｇｉｂｂｓ、Ｅ、Ｐノ、、及びＭ、Ｍ、　ＲｖｅｙｅＱｌｉｉｕ、　Ｙ ｅｔ。
Ｂａ１１．第４７巻、　３１７−３４３頁（１９７７１゜１２８、Ｙ＊Ｉｅｓ、 Ｗ、Ｄ、Ｇ、、Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｏｍｐ、Ｍｅｄ、第４６巻。
２２５−２６３頁（１９８２１゜ １２９．　Ｍｉ＋ｒｘ、　Ｖ、、　Ｒ，Ｍ、　Ｂｌｕｍｅｎｌｂｚｌ及びり、Ａ 、Ｂｚｂｉｕｋ。
１、　Ｖｉｔａｌ、第４０巻、　３６７−３７８頁（＋９１１比ＮＯ，Ｌｌｗｒ ｅｎｃｅ、　Ｗ、Ｃ，、Ｒ，Ｃ，Ｄ’１ｌｒｓｏ、　Ｃ，Ａ、　Ｋｕｎｄｃｌ、 Ｉ。
ＣＷｈ＋１ｂｅｃｋ及びり、Ｊ、　Ｂｅ＋１０．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第６０巻 。
４０５−４１４頁（＋９１１６）。
１３１、　！！ａｂ、　τ　１９８フ、　６Ｎｈ　ＡＤｎｕａｌ　Ｍｅｓｌｉａ ＨｏｆＣｏｎｌ！ｒｅｎｃｅ　ｏｌ　Ｒ１５ｅｚｒｃｂ　Ｗｏｒｋｅｔｓ　ｉｎ 　Ａｌ１１ｍ１ｌＤｉｓｅａｓｅ、　Ｊ！！旨集番号第３３０．　１９８７年１ １月１６−１７日。
米国イリノイ州シカゴ １３２、Ｂｚｂｉａｋ、Ｌ、Ａ、、１．　Ｌ’Ｎ１１ｉｅｎ、Ｓ、ｙｓｎ　Ｄ＋ ｕｎｅｎＬ…ｔｌ−ｗｘｎ　ｄｅｎ　Ｈｕｔｋ、　Ｔ、　ｌｌｍｂ、　Ｍ、１． Ｐ、　ＬＩＷＩＩＩＩＩＩ。
Ｇ、　ＨＩｌ山ｓ、及びＧ、Ａ、　Ｃ１１ｉｏ＋ｄ、　Ｊ、　Ｖｉｔａｌ、第１ ５９巻、　５７−６６頁ｆ１９８７）、 Ｂ３．　ｗｚｎ　Ｄｒａｎｅｎ　Ｌ自ｔｅｌ−ｗｉｎ　ｄｅｎ　！（ｕ＋に、Ｓ 、、及びり、＾。
Ｂｘｂｉｕｋ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第５９巻、　４０１−４１０頁（１９８６ １゜１３４、Ｇ！山ｌ、　Ｒ，Ｍ、、　及ヒＲ，Ｃ，Ｐｏｗｅｌ、　Ｒｅｓ、　 Ｖｅ）、Ｓｃｉ第２７巻、＋６７−１７４頁（１９７１１１゜１３５、Ｐｏ＊ｅ ｙ　Ｒ，Ｃ，、及びＭ、Ｒ，Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｆｅ１ｉｎｅＰｒａｃｔｉｃｅ第 １ｉｎｅＰｒａｃｔｉｃｅ＋９７８）。
１３６、Ｃｈａｐｐｕｉｓ、　Ｇ、、　Ｃ，８ｅ＋＋ｏｉｌ−Ｊｅａｎｉｎ、及 びり。
Ｆｘ＋ｇｅｎｕｄ著ｒＤｅｙｅｌｏｐ、　ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａ＋ｄ、Ｊ第 ５２巻。
Ｍ、Ｂｏｎｎｅｘｕ及びＷ、）Ｉｅｎｎｅｓ＋ｅｎｇ　（Ｓ、Ｋａｒｇｅｒ、Ｂ １５ｇ１）４１１５−４９１頁（１９ｇ２） ［７，５ａｉｌ−Ｇｅ＋ａｎｄ、＾、Ｌ、、　Ｖａｃｃｉｎｅ第６巻１５ｏ８頁 （１９８８１゜ Ｈ８，Ｓｘ＋ａ＋１ｔｎｌｏ、　Ｍ、、　Ｍ、　Ｈ＊１Ｉｅ７．及びＰ、　Ｇ、 　５ｐｅｉｒ。
Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第２９巻、１１４９−１１５８頁（１９７９）。
１３９、ＲＢｅｃｈｘｎ、　Ｗ、Ｔ、、　Ｌ、Ｓ、　Ｍｏｒｓｅ、　Ｄ、Ｍ、　 Ｋａｉｐｅ、及びＢ、ＲｏｉＸｍｘｎ、１．　Ｖｉｔａｌ、第２９巻、６７フ一 ６９７頁（＋９７９）。
１４Ｇ、　Ｐｅｒｅｉｒｘ、　Ｌ、、　Ｅ、　Ｃ＊５ｓｚｉ、　Ｒ，Ｗ、Ｈｏｎ ｔｓｓ、　８゜Ｒｏｉｓａ＊ｎ、　Ｍ、　Ｔｅ＋ｎｉ、及び＾、　Ｎｓｈｍ＋ｓ ｓ、Ｉｎｊｅｃｔ。
１ｍ５ｌｌｅ第１３巻、　２１＋−２２０頁（１９７６）。
１４１、Ｅｂｅ＋ｌｅ、　Ｒ，、及びＲ，Ｌ　Ｃｏｏ目ｎｃ７．　Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、第３５巻、９０２−９＋７頁ｆ１９８０）。
１４２、ＰＢｐ−１ｉｄ、　Ｇ、、及びＪ、Ｂ、　Ｄｅｒｂ７ｓｈｉｒｅ、　Ｃ ｉｎ、　Ｉ。
Ｃｏｍｐ、　Ｍｓｄ、第４３巻、　２３１−２３３頁（＋９７９）。
１４３、Ｍｅｌｓ、　Ｒ，に、、　Ｓ、Ｌ、Ｆｒ１ｌｓｃｂ、Ｌ、Ｌ、　Ｈ！ｔ ｔ、及びＰ。
Ａ、　Ｒｏ＋！、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、第５１巻、　２５９−２６２頁（１９８ ４）。
１４４、ＦｘＢｅｘｕｄ、　Ｄ、、　Ｃ，ＢｅｎｏＮ　Ｊｅｘｎｎｉｎ、Ｆ、Ｋ １１ｏ。
及びＧ、　Ｃｈｘｐｐｕ目、　Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、第８０巻、　６９−８ ２頁（＋９１１４）。
１４５、Ｃｏｍｐｌｏｎ、　Ｔ、著１”Ｃｅ１ｌ　ｇｉｏｌｏＨｏｆ　Ｖｉｒｕ ｓ　Ｅｎ＋ｒ７゜ＲｅｐｌｉｅＮｉｏｎ、ｉｎｄ　Ｐ！ｔｈｏｇｅ＋＋ｅｓｉｓ 　Ｊ　Ｃｏｍｐｘｎｓ、Ｒ。
’Ｉ、　、　Ａ、　Ｈｅ１ｅＩｌｉｏｓ及びＭ、Ｂ、Ａ、　０ｌｄｓｌｏｎｅ編 （Ａｌ！ＩＩ　Ｒ。
Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、）４５−５６頁（＋９１１９１゜１４６、　５ｐａｌｒ、Ｓ 、１．、　Ｒ，に、　Ｍｅｘｓ、及びＣ，Ｅ、　Ｂｅ１ｓｅｌｒＡｂｓｌｒａｃ ｌｓ　ｏｆ　ｌｈｅ　１４Ｉｈ　ＩｎｔｅｒｎｌｌｉｏｎｘｌＨｓｒｐｅｓｙｉ ｒｕｓ　Ｗｏ＋ｋｓｈｏｐＪ　（Ｎ７ｂｏ＋ｇ　５ｔｒａｎｄ　Ｄｅｎｍａｒｋ ）＋２１１頁（１９８９）。
１４７、Ｌｉｔｔｌｅ、　Ｓ、Ｐ、、Ｉ、Ｔ、　Ｊｏｌ「（Ｒ，１，Ｃｏｕ＋１ ｎｅ７．及びＰ、＾、　５ｃｈａｔｌ！＋、　ＶｉｒｏｌｏＢ第１１４巻、　１ ４９−１６０頁（＋９８１）。
１４８、ＤｅＬｕｃｘ、Ｎ、、Ｄ、Ｊ、Ｂｒ１ｋ、Ｖ、Ｃ，Ｂｏｎｄ、Ｓ、Ｐｅ ｔｓｏｎ。
及びＷ、　５ｎｉｐ！ｎ、　Ｖｉ＋ｏｌＢ７第１２２巻、　４１１−４２３頁（ １９８２１゜ １４９、Ｃｘｉ、　Ｗ、、　Ｂ、　Ｇｕ、及びＳ、Ｐｅｔｓｏｎ、１．　Ｖｉｒ ｏｌ第６２巻、２５９６−２６０４頁（１９８８）。
１５０、Ｃｏｕ＋ｌｎＢ、　Ｒ，Ｊ、著ｒｌａ＋ａｕｉｏｂｔｏｌＢ７　ａｌ　 ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘ　Ｍｉｎｕｓ　１ｎｌｔｃｊｉｏｎ　Ｊ　Ｂ、Ｔ、 　Ｒｏｏｓｅ及びＣ。
Ｌｏｐｅ！著（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、社発行、　ＢＯＣＩ　Ｒｘ１ｏｎ。
ＦＬ、Ｂ３−４４頁（＋９１１４１゜ １５１、Ｋｏｘｉｋ、　Ｍ、、　Ｍｉｃｒｏｂｉｘｌ　Ｒｅｗ、第４７巻、１− ４５頁（１９８３）。
１５２、Ｐｅ１ｌｅｌｉｅ＋、　Ｊ、、及びＮ、　Ｓｏｎｃｎｂｅｒｇ、　Ｎ！ ｔＩＩｒｅ第３３４巻、３２０−３２５頁（１９８８１゜１５３、Ｒｏｂ、　Ｐ 、Ａ、、　Ｒ，に、　Ｍａ！ｉ、及びＷ、Ｔ、　ＲＢｔｃｈａｎ。
Ｙｉ＋ｏｌＯｇ７第１５４巻、＋６１１−１７９頁（１９１１６ン。
１５４、Ｈ！ｏｌｅ、　Ｇ、、　Ｗ、　Ｈｅｎ１ｅ、及びＶ、　Ｄｉｔｈｌ、？ ｏｃ。
Ｎ！ＩＩ、Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ第５９巻、９４−１０１頁（＋９６１１） １５５、にｏｓ２に、　Ｍ、、　Ｃｅ１ｌ第１ｌ巻、　２＆３−２９２頁（１９ ８６）。
１５６、Ｍｉｌｌｅ’＋、　Ｇ、著ｒＶｉ＋ｏｌｏＢ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉ ｔｉｏｎ、　ＪＦｉｃｌｄ＋、Ｂ、Ｎ、他＠　（Ｒｘｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｉ ｄ、社発行、Ｎｅｗ１’ｏｒｋ１１９２］−１９５８頁（＋９９１１１’。
１５７、Ｈｕｂｂｉｒｄ、　Ｓ、Ｃ，、及びＲ，１，Ｉｔｘｌｔ、＾ｎｎ、　Ｒ ｅｖ。
ａｉｎｃｈｃｉ、第５０巻、　５５５−５８３頁ｆ１９１１１）。
１５８、　ＭｃＧｅｏｃｈ、０．１．、Ｍ、Ａ、ＤａｌＢｍｐｌｅ、＾、Ｊ、Ｄ ｚｗｉｓｏｎ＾、Ｄｏｌ＊ｎ、Ｍ、Ｃ，Ｆｒｘｍｅ、Ｄ、ＭｃＮ＊ｂ、Ｌ、１． 　Ｐｅｒ＋７．　Ｊ。
Ｅ、　５ｃｏｆｆ、及びＰ、　Ｔａ７１ｏ＋、　Ｉ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、 第６９巻、＋５３１−１５７４頁（１９１１８）。
１５９、Ｋｉｅｌｌ、　Ｅ、、及びり、　Ｌｉｅｂｏｖｉｔｒ、著ｒＶｉ＋ｏｌ ｏＨ。
５ｅｃｏｎｄ　ＥｄＨｏｎ　Ｊ　Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｂ、Ｎ、他＆ｉ　ｆＲｘｗｅ ｎ　Ｐｒｅｓ＋。
Ｌｉｄ、社発行Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ）　ＩＨ９−１９２０頁（１９９０１゜１６０ 、Ｌｔｓｏｎ、　Ｒ，１，、１，Ｈ，Ｗｅｉｓ、１．５．５ｘｌｓｌ＋ａｍ、及 びり、Ｗ、　Ｅｎｑａｉｇｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ第２１８巻、　３ｇ＋−３８４ 頁（１９Ｂ２）。
１６１、ＭｃＧｅｏｃｈ、　Ｄ、Ｉ、及びＡ、Ｊ、　Ｄｚｗｉｓｏｎ、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ。
Ａｃ１ｄ　Ｒｅｔ、第１０巻、４２１１１−４２９２頁（１９８６１゜１６２、 Ｌ！ｈｎｅ＋、　Ｒ，、Ｈ，Ｍｔｌｅｒ、及びＭ、　ＭＩＣｈ、　Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、第６３巻、　３７９２−３８００頁（１９ｇ９）。
１６３、　８ｉｙｇｉｉ、　Ｍ、、　Ｐ、Ｊ、　Ｆｊｒｒｅｌｌ、及びＢ、Ｇ、 　Ｂｘｒｒｅｌｌ。
ＥＭＢＯ，１，第３巻、　１０８３−１０９０頁（１９１１４＋。
１６４、　８！１ｓｅｌ、　Ｃ，、］、　Ｔａｎｎｅｒ、　Ｔ、　Ｍｌｌ＄ＩＩ Ｏ，Ｄ、　Ｔｈｏｒｌｅ７−Ｌ！ｖｇｏｎ、　Ｆ、　Ｋｔｔｄｌ、及びε、　Ｋ ：ｅｌｆ、Ｊ、　Ｖｉｔｏｌ、第５４巻、６６５−６７４頁（１９８５）。
１６５、Ｑｕ１１ｔｉｅ＋ｔ、Ｌ、Ｆｌ、１．Ｆ、Ｄｅｃｏｌｅｘｕ、及び鋪。
Ｈａｔｓ＊ｎ　Ｎ１ｔｒ−ｃｌ−Ｄｉｎ、Ｊ、ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、第６８巻、 ５３５−５４３頁（１９８７） ＋６６、　Ｅｐｓｌｅｉｎ、　Ｍ、Ａ、、　＾、Ｉ、　Ｍｏ＋ｇ！ｎ、　Ｓ、　 Ｆｉｎｅ＋＋７．　８．Ｉ。
Ｒｔｓｄｌｅ、　及びＪ、に、Ｉｌ：１ｒｋｖｏｏｄ、Ｎｚ＋ａｒｅ第３１８巻 。
２８７−２８９頁（１９８５）。
１６７　Ｍｏｔｇ■、＾　Ｊ　、Ｍ　Ｍｘｃｋｅ目、Ｓ、Ｆｉｍｅｒｊ７．　Ｊ 、Ｒ。
Ａｒｒ■ｄ、　Ｆ、Ｔ、　５ｃｕｌｌｉｏ１１．及びＭ、　Ａ、εｐｓｌｅｉｎ 、　Ｊ。
Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、第２５巻、　１８９−１９５頁（１９１１１１１゜１６ １１　、　Ｓｊｔ　■ｄ、　Ｂ、Ｃ，、Ｔ、　５ｃｈｕｓｆ　ｃ　ｒ、　Ｒ，Ｋ ｌｅｉｎ、　Ｒ，Ｆ。
Ｈｏｐｋｉｎｓ、　Ｔ、　Ｗｉｓｅｒ、　Ｒ，ｌ（、ＮｅｕｂＩｕｃｒ、及びＨ ｌＲｓｂｉｎ、　１．　Ｖｉｒｏｌ、第４１巻、　２５１１−２６４頁（＋９１ １２１゜１６９、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎ、、及びり、Ｍ、　ｆｌＩｌｔｔ−Ｆｌｔｌ ｃｈｅｒ、Ｊ。
Ｖｉｔａｌ、第６２巻、　２３６６−２３７２頁（１９８８）。
１７０、Ｐｌｏｔｋｉｉ、Ｓ、＾、、　Ｈ，Ｍ、Ｆ＋ｉｅｄｍｉｎ、Ｓ、Ｅ、Ｓ ｌ！ｒｒ。
及びＥ、　Ｇｏｎｃ！ｏｌ著ｒｃｏｎｌｅｍｐｏ＋ｘｒ７　ｌ５ｓｕｅｓ　１ｎ Ｉｎ＋ｅｃｌｉｏａｓ　Ｄ口ｅｉ富ｅｓ　Ｊ第８巻、Ｒｏｏｆ他編（Ｃｈｕｒｃ ｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎ（ｓｔｏｎｅ社発行Ｎｅｗ　Ｙｏ＋ｋｌ　６５−９２頁（ １９１１９）。
１７１、　Ｐｌｏｌｋｉｎ、Ｓ、Ａ、、Ｓ、Ｅ、Ｈｘ＋ｔ、Ｈ，Ｍ、Ｆｒｉ！ｄ ａ＋ｓｎ、Ｅ。
ＧｏｎｃＩｏｌ、及びＲ，Ｅ、　Ｗｅｉｂｅｌ、　Ｊ、　Ｉｎ１．　Ｄｉｓ、第 １５９巻、８６Ｇ−８６５頁（１９８９１゜ １７２、Ｇｒｅｔｃｈ、Ｄ、Ｒ，、Ｂ、Ｋｘ＋ｉ、Ｌ、Ｒｘｓｍｕｓ＋ｅｎ、Ｒ ，Ｃ。
Ｇｅｈｔｔ、及びＭ、Ｆ、　５ｔｉｎｓｋｉ、Ｊ、　Ｖｉｔａｌ第６２巻、　８ ７５−８８１頁（１９８８１゜ １７３、Ｗｅｓｊｏｎ、　Ｋ、、及びＢ、Ｇ、　Ｂｘ＋ｒｅｌｌ、Ｊ、　Ｍｏ１ ．　Ｒｉａｌ。
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２００、　Ｘｖｅｉ（、Ｍ、、　Ｓ、Ｄ、　Ｓｈｏｖｇ目ｅ＋、　Ｓ、Ｖ、　Ｂ ｌｚｄｅｎ、　Ｃｌ。
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Ｌｅｌｃｈｖｏｒｊｈ、ＩＩｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇ７第１６５巻、３３８−３４ ７頁（１９８８１゜ ２０２、Ｐｓｎｉｃｌｌｉ、　Ｄ、、　Ｓ、Ｗ、　Ｄｘｔｉｓ、Ｓ、Ｒ，Ｍｅ「 ｃｅ「、及びＥ、Ｐｘｏｌｅ口ｉ、Ｊ、　Ｖｉｒａｌ、第３７巻、１０００−１ ０１０頁（＋９８１）。
２０３、Ｍ目＋ｚ　Ｖ、、　Ｒ，Ｎｅ１ｓｏｏ、及び１４．　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｖ ｉ＋ｏｌｏｇ７第１６６巻、　５４２−５４９頁（１９８８１゜２０４、Ｋｅｌ ｌｅ「、Ｐ、Ｍ、、＾、Ｊ、Ｄｘｖｉｓｏｎ、Ｒ，Ｓ、Ｌｏｖｅ、Ｃ，ＤＢｅｎ ｎｅ目、及びＲ，Ｗ、Ｅｌｆｉｎ、Ｖｉ＋ｏｌｏＨ第１５２巻。
１８１−１９１頁（１９８６１゜ ２０５．　Ｈｚ目、Ｄ、Ｊ、、Ｃ，Ｄｅｂｔｏｒ、Ｂ、Ａ、ＦＯＩ、Ｎ、Ｅ。
？ｄｅ＋ｓｏｎ、及びＳ、　Ｐｅｒｓｏｎ、　ＶｉｒａｌｏＢ第１５５巻。
３２２−３３３頁（１９８６）。
２０６、Ｇａｎｇ、　Ｍ、、　Ｔ、　０ｏｋｘ、　Ｔ、　Ｍｉ！ｓｕｅ、及びＥ 、　Ｋｉｅｌｌ。
１、　Ｖｉ＋ｏ１．第６１巻、　４９９−５０８頁（＋９８７）。
２０７、Ｂ＊ｅ＋、　Ｒ，、＾、Ｔ、　Ｂｚｎｋｉｔｒ、　Ｍ、Ｄ、　Ｂｉ■ｉ ｎ、Ｐ、Ｌ。
Ｏｅｉｎｉｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｊ、　ＦｓｒｔｅＩＩ、　丁、Ｊ、　Ｇｉｂｓｏｎ 、　Ｇ。
Ｈ！１１１１１１．　Ｇ、Ｓ、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｓ、Ｃ，５ｓｌｃｈｖｅｌｌ、ｃ 。
５ｅｐｉｎ、　Ｐ、Ｓ、　Ｔｕｌｌｎｅｌｌ及びＢ、Ｇ、　ＢＩｒｒｅｌｌ。
！ｌｒｆａｒｇ第３１０巻、２１１７−２１１頁（＋９１１４）。
２０ｇ、　Ｅｍｉｎｉ、Ｅ、Ａ、、１．　Ｌｕｋ３　ｕ、Ｅ、Ａ＋ｍｓｔｕｎｇ 、Ｐ、Ｍ、にｅｌｆ！’、Ｒ，Ｗ、Ｅｌｌ目、　及びＧ、Ｒ，Ｐｅｚ＋ｓｏｎ。
Ｖｉ＋ｏｌｏＢ第１５７巻、５５２−５５５頁（＋９１１７）。
２０９、Ｈｅ１ｎｕ＋Ｉｎ、　Ｔ、、　ＩＪ、　Ｇａｎｇ、　１．　Ｓｉｍｐｌ Ｃ，及びＥ。
Ｋｉｅｌｌ、Ｉ、　Ｖｉ＋ｏ１．第６２巻、　１１０１−１１０７頁（１９８８ ）。
２１１１、Ｐｘｌｅｌ、　Ｄ、Ｄ、、及びり、Ｊ、　Ｐｉｃｋｕｐ、　Ｅｔｎｂ ｏ　Ｊ、第６巻、３７ｇ？−３７９４頁（１９８７］。
ＦＩＧ、４ ＡＡＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＴＴＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣτＡ ＧＣＴＣＧＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＣＧオＵγ寸白シ摩見木１呈−４【 ＦＩＧ、ＩＯ ［Ｉ−ＩＴ−ＩＰｌ　０５′幻喝の４吊＃東Ｅ　Ｖ−ＮＡｆｌ　、、Ｅ Ｈ６１０モー−ＥＨｖ−１１４の　ＨＥＳ系’Ｖ”　Ｌｌ　ｉｉ＾ＧＣＣＣＣＡ ＣＣＡＣＧＴＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＧＣＣＴ＾ＣＣＧＧＣＴＣ （ｉＣＣＧＣＣ（ｉｃＧｃＡｃＧＴ（、＾ｃモモモモモモモモ狽モモ狽モモ狽モ モ`ｃｃｃｃｔｉｃｃｖｃｘｃＦＩＧ、２４ 「１す、　ＣＪ ＦＩＧ、２８−２ ＦＩＧ、２９−１ ＦＩＧ、３０３０ 一３Ｆ、３１−１ □で） ＦＩＧ、　３１−２ Ｎｎ＋ｌ　Ｔｔｈｌ　ｌ　Ｉ ｒｕｌ ＦＩＧ、３５ ＦＩＧ　３６−２ ＦＩＧ　３６−３ ＦＩＧ、　３７−１ ＦＩＧ　３８−Ｉ Ｓｍａ　Ｉ　ＢａｍＨＩ ＴＧ ＦＩＧ　３８−２ ８ｇｌｌ１ Ｂ ＦＩＧ、４Ｏ−１ Ｈｉｎｃｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ＢａｍＨＩ Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ　Ｈｉｎｄｌ　ｌ　ｌ国際調査報告

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ボックスウイルスゲノムの非必須領域中にウマヘルペスウイルス由来のＤＮ Ａを含有する組換えボックスウイルス。 ２．請求項１記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡがウマヘルペ スウイルス糖タンパク質をコードすることを特徴とする組換えボックスウイルス 。 ３．請求項２記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ウマヘルプスウイル ス糖タンパク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３目であることを特 徴とする組換えボックスウイルス。 ４．請求項２記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ウマヘルプスウイル ス糖タンパク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１４であることを特徴 とする組換えボックスウイルス。 ５．請求項１記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが２種類のウ マヘルペスウイルス糖タンパク質をコードすることを特徴とする組換えボックス ウイルス。 ６．請求項５記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記２種類のウマヘルプ スウイルス糖タンパク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３及びウマ ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１４であることを特徴とする組換えボックス ウイルス。 ７．請求項１記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが宿主中での ウマヘルペスウイルス糖タンパク質の産生によって発現されることを特徴とする 組換えボックスウイルス。 ８．請求項７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ウマヘルプスウイル ス糖タンパク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３であることを特徴 とする組換えボックスウイルス。 ９．請求項７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ウマヘルプスウイル ス糖タンパク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１４であることを特徴 とする組換えボックスウイルス。 １０．請求項１記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが宿主中で の２種類のウマヘルペスウイルス糖タンパク質の産生によって発現されることを 特徴とする組換えボックスウイルス。 １１．請求項１０記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記２種類のウマヘ ルプスウイルス糖タンパク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３及び ウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１４であることを特徴とする組換えボッ クスウイルス。 １２．請求項１記載の組換えボックスウイルスにおいて、該ボックスウイルスが ワクシニアウイルスであることを特徴とする組換えボックスウイルス。 １３．請求項１記載の組換えボックスウイルスにおいて、該ボックスウイルスが アビボックスウイルスであることを特徴とする組換えボックスウイルス。 １４．請求項１３記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記アビボックスウ イルスがニワトリボックスウイルス及びカナリアボックスウイルスからなる群か ら選択されることを特徴とする組換えボックスウイルス。 １５．請求項１記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが組換えに よって前記ボックスウイルス中に導入されたものであることを特徴とする組換え ボックスウイルス。 １６．ウマヘルペスウイルス由来のＤＡＮ及び該ＤＮＡの発現用プロモーターを 含有する組換えボックスウイルス。 １７．ワクチン接種宿主動物中で免疫反応を誘起させるためのワクチンにして、 ボックスウイルスゲノムの非必須領域中にウマヘルペスウイルス由来のＤＮＡを 含有する組換えボックスウイルスと担体とを含んでなるワクチン。 １８．請求項１７記載のワクチンにおいて、前記ＤＮＡがウマヘルペスウイルス 糖タンパク質をコードしかつ発現するものであることを特徴とするワクチン。 １９請求項１８記載のワクチンにおいて、前記ウマヘルペスウイルス糖タンパク 質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３であることを特徴とするワクチ ン。 ２０．請求項１８記載のワクチンにおいて、前記ウマヘルペスウイルス糖タンパ ク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１４であることを特徴とするワク チン。 ２１．請求項１７記載のワクチンにおいて、前記ＤＮＡが２種類のウマヘルペス ウイルス糖タンパク質をコードし、かつ発現するものであることを特徴とするワ クチン。 ２２．請求項２１記載のワクチンにおいて、前記２種類のウマヘルプスウイルス 糖タンパク質がウマヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｐ１３及びウマヘルペスウ イルス糖タンパク質ｇｐ１４であることを特徴とするワクチン。 ２３．請求項１７記載のワクチンにおいて、ボックスウイルスがワクシニアウイ ルスであることを特徴とするワクチン。 ２４．請求項１７記載のワクチンにおいて、ボックスウイルスがアビボックスウ イルスであることを特徴とするワクチン。 ２５．請求項２４記載のワクチンにおいて、前記アビボックスウイルスがニワト リボックスウイルス及びカナリアボックスウイルスからなる群から選択されるこ とを特徴とするワクチン。 ２６．請求項１７記載のワクチンにおいて、前記ＤＮＡが組換えによって前記ボ ックスウイルス中に導入されたものであることを特徴とするワクチン。 ２７．ボックスウイルスゲノムの非必須領域中にヘルペスウイルス由来のＤＮＡ を含有する組換えボックスウイルス。 ２８．請求項２７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ヘルペスウイル スがアルファヘルペスウイルス、ベータヘルペスウイルス及びガンマヘルペスウ イルスからなる群から選択されるヘルペスウイルス亜科の一種であることを特徴 とする組換えボックスウイルス。 ２９．請求項２８記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ヘルペスウイル スがウマヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ウシ ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス及び ヒトサイトメガロウイルスからなる群から選択されることを特徴とする組換えボ ックスウイルス。 ３０．請求項２記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡがヘルペス ウイルス糖タンパク質をコードすることを特徴とする組換えボックスウイルス。 ３１．請求項３０記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ヘルペスウイル ス糖タンパク質が、ウマヘルペスウイルスｇｐ１３、ウマヘルペスウイルスｇｐ １４、ウマヘルペスウイルスｇＤ、ウマヘルペスウイルスｇｐ６３、ウマヘルペ スウイルスｇＥ、仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０、仮性狂犬病ウイルスｇｐｌｌ、 仮性狂犬病ウイルスｇｐｌｌｌ、仮性狂犬病ウイルスｇｐｌ、単純ヘルペスウイ ルスｇＢ、単純ヘルペスウイルスｇＣ、単純ヘルペスウイルスｇＤ、ウシヘルペ スウイルスｇｌ、ネコヘルペスウイルスｇＢ、エプスタイン・バールウイルスｇ ｐ２２０、エプスタイン・パールウイルスｇｐ３４０、エプスタイン・バールウ イルスｇＢ、エプスタイン・パールウイルスｇＨ及びヒトサイトメガロウイルス ｇＢからなる群から選択されることを特徴とする組換えボックスウイルズ。 ３２．請求項２７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが少なく とも２種類のヘルペスウイルス糖タンパク質をコードすることを特徴とする組換 えボックスウイルス。 ３３．請求項２７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが宿主中 でのヘルペスウイルス糖タンパク質の産生によって発現されることを特徴とする 組換えボックスウイルス。 ３４．請求項３３記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ウマヘルペスウ イルス糖タンパク質が、ウマヘルペスウイルスｇｐ１３、ウマヘルペスウイルス ｇｐ１４、ウマヘルペスウイルスｌＤ、ウマヘルペスウイルスｇｐ６３、ウマヘ ルペスウイルスｇＥ、仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０、仮性狂犬病ウイルスｇｐｌ ｌ、仮性狂犬病ウイルスｇｐｌｌｌ、仮性狂犬病ウイルスｇｐｌ、単純ヘルペス ウイルスｇＢ、単純ヘルペスウイルスｇＣ、単純ヘルペスウイルスｇＤ、ウシヘ ルペスウイルスｇｌ、ネコヘルペスウイルスｇＢ、エプスタイン・バールウイル スｇｐ２２０、エプスタイン・バールウイルスｇｐ３４０、エプスタイン・バー ルウイルスｇＢ、エプスタイン・パールウイルスｇＨ及びヒトサイトメガロウイ ルスｇＢからなる群から選択されることを特徴とする組換えボックスウイルス。 ３５．請求項２７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが宿主中 での少なくとも２種類のヘルペスウイルス糖タンパク質の産生によって発現され ることを特徴とする組換えボックスウイルス。 ３６．請求項２７記載の組換えボックスウイルスにおいて、該ボックスウイルス がワクシニアウイルスであることを特徴とする組換えボックスウイルス。 ３７．請求項２７記載の組換えボックスウイルスにおいて、該ボックスウイルス がアビボックスウイルスであることを特徴とする組換えボックスウイルス。 ３８．請求項３７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記アビボックスウ イルスがニワトリボックスウイルス及びカナリーボックスウイルスからなる群か ら選択されることを特徴とする組換えボックスウイルス。 ３９．請求項２７記載の組換えボックスウイルスにおいて、前記ＤＮＡが組換え によって前記ボックスウイルス中に導入されたものであることを特徴とする組換 えボックスウイルス。 ４０．ヘルペスウイルス由来のＤＮＡ及び該ＤＮＡの発現用プロモーターを含有 する組換えボックスウイルス。 ４１．ワクチン接種宿主動物中で免疫反応を誘起させるためのワクチンにして、 ボックスウイルスゲノムの非必須領域中にヘルペスウイルス由来のＤＮＡを含有 する組換えボックスウイルスと担体とを含んでなるワクチン。 ４２．請求項４１記載のワクチンにおいて、前記ヘルペスウイルスがアルファヘ ルペスウイルス、ベータヘルペスウイルス及びガンマヘルペスウイルスからなる 群から選択されるヘルペスウイルス亜科の一種であることを特徴とするワクチン 。 ４３．請求項４２記載のワクチンにおいて、前記ヘルペスウイルスがウマヘルペ スウイルス、仮性狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイル ス、ネコヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス及びヒトサイトメガ ロウイルスからなる群から選択されることを特徴とする記載のワクチン。 ４４．請求項４１記載のワクチンにおいて、前記ＤＮＡがヘルペスウイルス糖タ ンパク質をコードしかつ発現するものであることを特徴とするワクチン。 ４５．請求項４４記載のワクチンにおいて、前記ヘルペスウイルス糖タンパク質 が、ウマヘルペスウイルスｇｐ１３、ウマヘルペスウイルスｇｐ１４、ウマヘル ペスウイルスｇＤ、ウマヘルペスウイルスｇｐ６３、ウマヘルペスウイルスｇＥ 、仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０、仮性狂犬病ウイルスｇｐｌｌ、仮性狂犬病ウイ ルスｇｐｌｌｌ、仮性狂犬病ウイルスｇｐｌ、単純ヘルペスウイルスｇＢ、単純 ヘルペスウイルスｇＣ、単純ヘルペスウイルスｇＤ、ウシヘルペスウイルスｇｌ 、ネコヘルペスウイルスｇＢ、エプスタイン・バールウイルスｇｐ２２０、エプ スタイン・バールウイルスｇｐ３４０、エプスタイン・バールウイルスｇＢ、エ プスタイン。 バールウイルスｇＨ及びヒトサイトメガロウイルスｇＢからなる群から選択され ることを特徴とするワクチン。 ４６．請求項４１記載のワクチンにおいて、前記ＤＮＡが少なくとも２つのヘル ペスウイルス糖タンパク質をコードしかつ発現するものであることを特徴とする ワクチン。 ４７．請求項４１記載のワクチンにおいて、該ボックスウイルスがワクシニアウ イルスであることを特徴とするワクチン。 ４８．請求項４１記載のワクチンにおいて、該ボックスウイルスがアビボックス ウイルスであることを特徴とするワクチン。 ４９．請求項４８記載のワクチンにおいて、前記アビボックスウイルスがニワト リボックスウイルス及びカナリアボックスウイルスからなる群から選択されるこ とを特徴とするワクチン。 ５０．請求項４１記載のワクチンにおいて、前記ＤＮＡが組換えによって前記ボ ックスウイルス中に導入されたものであることを特徴とするワクチン。 ５１．ボックスウイルスゲノムの非必須領域に非ボックス由来のＤＮＡを含有す る組換えボックスウイルスを新生児に接種する（ただし、当該ＤＮＡは該新生児 に対する肩原体の第一の抗原をコードするもので、しかも当該抗原は該新生児の 母親において同一肩原体に対する免疫反応を誘起するために使用した同一病原体 の第二の抗原とは異なるものである）ことからなる新生児における母性免疫を回 避する方法。 ５２．第一のボックスウイルスゲノムの非必須領域に非ボックス由来のＤＮＡを 含有する第一の組換えボックスウイルスを新生児に接種する（ただし、当該ＤＮ Ａは新生児に対する病原体の抗原をコードするもので、しかも上記第一のボック スウイルスは該新生児の母親において同一病原体に対する免疫反応を誘起するた めに使用した第二の組換えボックスウイルスとは異なるものである）することか らなる新生児における母性免疫を回避する方法。
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