DK176068B1 - Rekombinant kanaripoxvirus og anvendelsen af samme - Google Patents

Description

DK 176068 B1

Den foreliggende opfindelse angår en rekombinant kanariepoxvirus, som indeholder DNA fra en ikke-avipox-kilde, samt anvendelse af samme.

OPFINDELSENS BAGGRUND 5

Avipox eller avipoxvirus er en slægt af nært forbundne poxvira, der inficerer fugle. Slægten avipox omfatter arterne fjerkræpox, kanariepox, snefuglepox, duepox, vagtelpox, s purvepox, stærepox og kalkunpox. Slægten avipox deler mange karakteristika med andre poxvira og er et medlem af den samme 10 underfamilie, poxvira hos vertebrater, som vaccinia er. Poxvira, inklusive vaccinia og avipox, replikerer i eukaryote værtsceller. Disse vira skelnes ved deres store størrelse, kompleksitet og ved det cytoplasmiske replikations-sted. Vaccinia og avipox er dog forskellige slægter og er ikke ens, hvad angår deres respektive molekylvægte, antigene determinanter og værtsarter, 15 som rapporteret i Intervirology, vol. 17, side 42-44, Fourth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (1982).

Avipoxviraene inficerer ikke på produktiv vis ikke-fugle vertebrater såsom pattedyr, herunder mennesker. Endvidere formerer avipox sig ikke ved inoku-20 lering i cellekulturer fra pattedyr (inklusive mennesker). I sådanne pattedyrcellekulturer inokuleret med avipox dør cellerne på grund af en cytotoksisk virkning, men viser ingen tegn på produktiv virusinfektion.

Inokulering af en ikke-fugle vertebrat, såsom et pattedyr, med levende avipox 25 resulterer i dannelsen af en læsion på inokuleringsstedet, der ligner en vac-ciniainokulering. Der opnås dog ingen produktiv virusinfektion. Ikke desto mindre har man nu fundet, at et således inokuleret pattedyr responderer immunologisk på avipoxviruset. Dette er et uventet resultat. 1

Vacciner bestående af dræbt patogen eller oprensede antigene komponenter af sådanne patogener skal injiceres i større mængder end levende virusvac- DK 176068 B1 2 ciner for at skabe et effektivt immunrespons. Dette skyldes, at inokulering med levende virus er en meget mere effektiv vaccinationsmetode. Et relativt lille inokulum kan frembringe et effektivt immunrespons, fordi de antigener, man er interesseret i, forstærkes under replikation af viruset. Fra et lægeligt 5 synspunkt giver levende virusvacciner en immunitet, der er mere effektiv og længerevarende end inokulering med en vaccine med et dræbt patogen eller oprenset antigen. Således kræver vacciner bestående af dræbt patogen eller oprensede antigene komponenter af sådanne patogener produktion af større mængder vaccinemateriale, end det er nødvendigt med levende virus.

10

Fra den foregående diskussion er det klart, at der er lægelige og økonomiske fordele ved at anvende levende virusvacciner. En sådan levende virusvaccine omfatter vaccinia-virus. Dette virus er fra litteraturen kendt som et nyttig virus, hvori der ved hjælp af rekombinant DNA-metoder kan indsættes DNA 15 repræsenterende de genetiske sekvenser for antigener fra pattedyr-pato-gener.

I litteraturen er der således udviklet metoder, der tillader dannelsen af rekombinant vaccinia-vira ved indsættelse af DNA fra en vilkårlig kilde (f.eks.

20 viral, prokaryotisk, eukaryotisk, syntetisk) i en ikke-essentiel region af vacci-nia-genomet, herunder DNA-sekvenser der koder for de antigene determinanter i en patogen organisme. Visse rekombinant vaccinia-vira dannet ved disse metoder er blevet brugt til inducering af specifik immunitet i pattedyr mod forskellige pattedyr-patogener, alle som beskrevet i US patent nr. 4 603 25 112, der er inkorporeret i denne beskrivelse med krav ved henvisning.

Umodificeret vaccinia-virus har længe været kendt for at være relativt sikkert og effektivt til anvendelse ved inokulering mod småkopper. Dog var der før udryddelsen af småkopper, hvor det var almindeligt at indgive umodificeret 30 vaccinia, en lille, men reel risiko for komplikationer i form af generaliseret vacciniainfektion, specielt hos de, der lider af eksem eller immunsuppression.

DK 176068 B1 3

En anden sjælden, men mulig komplikation, der kan resultere fra vaccinia-inokulering, er encephalitis postvaccinalis. De fleste af disse reaktioner var resultat af inokulering af individer med hudsygdomme, såsom eksem, eller med svækkede immunsystemer, eller individer i husstande, hvor andre hav-5 de eksem eller svækket immunologisk respons. Vaccinia er et levende virus og er normalt uskadelig for et sundt individ. Det kan dog overføres mellem individer i adskillige uger efter inokulering. Hvis et individ med en svækkelse af det normale immunrespons inficeres, enten ved inokulering eller ved smitsom overførelse fra et nylig inokuleret individ, kan det få alvorlige konse-10 kvenser.

Det vil således forstås, at en fremgangsmåde, der tilfører faget fordelene ved inokulering med levende virus, men som nedsætter eller eliminerer de ovenfor beskrevne problemer, ville være et særdeles ønskeligt fremskridt i forhold 15 til det nuværende teknologiske stade. Dette er endog vigtigere i dag med fremkomsten af sygdommen kendt som erhvervet immunforsvarssyndrom (AIDS). Ofre for denne sygdom lider af alvorlig immulologisk dysfunktion og kunne let skades af et ellers sikkert levende viruspræparat, hvis de kom i kontakt med en sådan virus, enten direkte eller gennem kontakt med en per-20 son, der nyligt er immuniseret med en vaccine indeholdende en sådan levende virus.

OPFINDELSENS FORMÅL

25 Det er et formål med opfindelsen at tilvejebringe rekombinant kanariepoxvira til brug i en vaccine, der kan immunisere vertebrater mod en patogen organisme, som har en levende vaccines fordele, og som har få eller ingen af ulemperne ved enten en levende virusvaccine eller en dræbt virusvaccine som opregnet ovenfor, især når anvendt til immunisering af ikke-fugle ver-30 tebrater.

DK 176068 B1 4

BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Et aspekt af opfindelsen angår syntetisk rekombinant avipoxvirus modificeret 5 ved indsættelse af DNA fra en ikke-avipox-kilde i et ikke-essentielt område af kanariepoxgenomet. Syntetisk modificeret kanariepoxvirusrekombinanter, der bærer exogene (dvs. ikke-avipox) gener, som koder for og udtrykker et antigen, hvilke rekombinanter i en vertebratvært udløser dannelsen af immunologiske responser på antigenet og derfor på det exogene patogen, bruges 10 ifølge opfindelsen til at danne hidtil ukendte vacciner, der ikke har ulemperne ved konventionelle vacciner, som anvender dræbte eller svækkede levende organismer, især ved anvendelse til inokulering af ikke-fugle vertebrater.

Det skal igen fremhæves, at avipoxvirus, herunder kanariepoxvirus, kun kan 15 replikere produktivt i eller blive videreført gennem fuglearter eller cellelinjer fra fugle. De rekombinante avipoxvira høstet fra fugle-værtceller, danner en inokuleringslæsion uden produktiv replikation af avipoxviruset, når de inoku-leres i en ikke-fugle vertebrat, såsom et pattedyr, på en måde, der er analog til inokuleringen af pattedyr med vaccinia-virus. Trods avipoxvirusets mang-20 lende evne til at replikere produktivt i en sådan inokuleret ikke-fugle vertebrat, forekommer der tilstrækkelig udtrykkelse af viruset, til at det inokule-rede dyr responderer immunologisk på det rekombinante avipoxvirus' antigene determinanter og også på de antigene determinanter indkodet i exogene gener deri.

25 Når det anvendes til inokulering af fuglearter, frembringer et sådant syntetisk rekombinant avipoxvirus ikke blot et immunologisk respons på antigener kodet af exogent DNA fra en vilkårlig kilde, der kan være tilstede deri, men resulterer også i produktiv replikation af viruset i værten med fremkaldelsen af 30 et forventet immunologisk respons på avipox-vektoren som sådan.

_____________ —— DK 176068 B1 5

Et andet aspekt af opfindelsen angår anvendelsen af det rekombinante kana-riepoxvirus til fremstilling af et lægemiddel til behandling af sygdomme i ver-tebrater.

5 Adskillige forskere har foreslået dannelsen af rekombinant fjerkræpox, specielt vira til brug som veterinære vacciner til beskyttelse af fjerkræbestande.

Boyle og Coupar, J. Gen. Virol., 67:1591-1600 (1986) og Binns et al., Isr. J.

Vet. Med, 42:124-127 (1986). Hverken forslag eller egentlige rapporter angående brugen af rekombinant avipoxvira som en fremgangsmåde til inducering 10 af specifik immunitet i pattedyr er blevet fremlagt.

Stickl og Mayer, Fortschr. Med. 97(40):1781-1788 (1979) beskriver injektion af avipoxvirus, specifikt fjerkræpox, i mennesker. Disse undersøgelser angår dog kun brugen af almindelig fjerkræpox til at forhøje ikke-specifik immunitet i 15 patienter, der lider af eftervirkningerne af cancer-kemoterapi. Der anvendes ingen rekombinant DNA-teknikker. Der informeres ikke om en avipox, hvori er indsat DNA, som koder for antigener fra vertebrat-patogener, eller om en fremgangsmåde til inducering af specifik immunitet i vertebrater. I stedet regnede man i litteraturen med en generel og ikke-specifik tonisk virkning på den 20 humane vært.

En mere indgående diskussion af grundlaget for genetisk rekombination kan måske hjælpe til at forstå, hvorledes de modificerede rekombinant vira ifølge den foreliggende opfindelse er dannet.

.25

Generelt består genetisk rekombination af udvekslingen af homologe sektioner af deoxyribonukleinsyre (DNA) mellem to DNA-strenge. (I visse vira kan ribonukleinsyre [RNA] erstatte DNA). Homologe nukleinsyresektioner er nu-kleinsyresektioner (RNA eller DNA), der har den samme nukleotidbasese-30 kvens.

DK 176068 B1 6

Genetisk rekombination kan forekomme naturligt under replikationen eller ved dannelsen af nye virale genomer inde i den inficerede værtcelle. Således kan genetisk rekombination mellem virale gener ske under den virale replika-tionscyklus, der foregår i en værtcelle, som er co-inficeret med to eller flere 5 forskellige vira eller andre genetiske konstruktioner. En DNA*sektion fra et første genom bruges udskifteligt til konstruktion af genomsektionen i et andet coinficerende virus, i hvilket DNA'et er homologt med DNA’et i det første virale genom.

10 Imidlertid kan rekombination også forekomme mellem DNA-sektioner i forskellige genomer, der ikke er fuldstændig homologe. Hvis en sådan sektion er fra et første genom, der er homologt med en sektion af et andet genom, med undtagelse af tilstedeværelsen i den første sektion af for eksempel en genetisk markør eller et gen kodende for en antigen determinant indsat i en 15 del af det homologe DNA, kan rekombination stadig forekomme, og produkterne af denne rekombination er således detekterbare ved tilstedeværelsen af denne genetiske markør eller gen.

Der kræves to betingelser, for at den modificerede infektiøse virus gennem-20 fører en vellykket udtrykkelse af den indsatte genetiske DNA-sekvens.

For det første skal indsættelsen ske i et ikke-essentielt område af viruset, for at det modificerede virus forbliver levedygtigt. Hverken fjerkræpox eller de andre avipoxvira har indtil nu udvist ikke-essentielle regioner analoge til de, 25 der er beskrevet for vaccinia-viruset. Derfor blev der ved den foreliggende opfindelse fundet ikke-essentielle områder i fjerkræpox ved at kløve fjerkræ-pox-genomet op i fragmenter med efterfølgende adskillelse af fragmenterne efter størrelse og indsættelse af disse fragmenter i plasmidkonstruktioner med henblik på amplifikation. (Plasmider er små cirkulære DNA-molekyler, 30 der findes som ekstrakromosomale elementer i mange bakterier incl. E. coli. Metoder til indsættelse af DNA-sekvenser, såsom generne for antigene de- DK 176068 B1 7 terminanter eller andre genetiske markører, i plasmider er velkendte inden for faget og er beskrevet i detaljer i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory New York [1982]). Dette blev efterfulgt af indsættelse af genetiske markører og/eller gener, der koder for 5 antigener, i de klonede fjerkræpox-fragmenter. De fragmenter, der førte til vellykket rekombination, som vist ved vellykket genvinding af den genetiske markør eller antigener, var de, der indeholdt DNA indsat i et ikke-essentielt område af fjerkræpox-genomet.

10 Den anden betingelse for udtrykkelse af indsat DNA er tilstedeværelsen af en promotor med en passende beliggenhed i forhold til det indsatte DNA. Promotoren skal være placeret således, at den befinder sig opstrøms fra den DNA-sekvens, der skal udtrykkes. Fordi avipox-vira ikke er velkarakteriserede, og der ikke tidligere er identificeret avipox-promotorer, kan promotorer fra 15 andre poxvira med fordel indsættes opstrøms for det DNA, der skal udtrykkes som en del af den foreliggende opfindelse. Fjerkræpox-promotorer kan også med held anvendes til at udføre fremgangsmåder og lave produkterne ifølge opfindelsen. Ifølge opfindelsen er promotorer fra fjerkræpox, vaccinia og en-tomopox fundet at promotere transkription i rekombinant poxvirus.

20

Boyle og Coupar, J. Gen. Virol. 67:1591 (1986) har offentliggjort spekulation om, at vaccinia-promotorer "måske kan forventes at fungere i (fjerkræpox) virus". Forfatterne lokaliserede og klonede et fjerkræpox TK-gen (Boyle et al., Virology 156:355-365 [1987]) og indsatte det i et vaccinia-virus. Dette TK-gen 25 blev udtrykt, formodentlig fordi fjerkræpox TK-promotorsekvensen genkend-tes af vaccinia-polymerasefunktioner. På trods af deres spekulation, indsatte forfatterne imidlertid ikke nogen vaccinia-promotor i et fjerkræpoxvirus eller observerede nogen udtrykkelse af en fremmed DNA-sekvens tilstede i et fjerkræpox-genom. Det var ikke kendt før den foreliggende opfindelse, at 30 promotorer fra andre poxvira, såsom vaccinia-promotorer, rent faktisk ville promotere et gen i et avipox-genom.

DK 176068 B1 8

BESKRIVELSE AF VISSE FORETRUKNE UDFØRELSESFORMER

Ifølge den foreliggende opfindelse er især fjerkræpox-og kanariepoxvira ble-5 vet anvendt som foretrukne avipox-arter, der modificeres ved rekombination ved indbyggelse af exogent DNA deri.

Fjerkræpox er en art af avipox, der især inficerer høns, men som ikke inficerer pattedyr. Fjerkræpox-stammen, der heri er designeret som FP-5, er en 10 kommerciel fjerkræpoxvirus-vaccinestamme med oprindelse i kyllinge-embryoner, tilgængelig fra American Scientific Laboratories (Underafdeling af Schering Corp.) Madison, Wl, United States Veterinary License nr. 165,

Serie nr. 30321.

15 Fjerkræpox-stammen, der heri er designeret FP-1, er en Duvette-stamme modificeret til anvendelse som en vaccine i daggamle kyllinger. Stammen er en kommerciel fjerkræpoxvirus-vaccinestamme designeret O DCEP 25/CEP67/ 2309 Oktober 1980 og er tilgængelig fra Institute Merieux, Inc.

20 Kanariepox er en anden avipoxart. Analogt med fjerkræpox, inficerer kana-riepox især kanariefugle, men inficerer ikke pattedyr. Kanariepox-stammen, der her er designeret som CP er en kommerciel kanariepox-vaccinestamme designeret LF2 CEP 524 24 10 75 og er tilgængelig fra Institute Merieux, Inc. 1 2 3 4 5 6

De genetiske DNA-sekvenser, indsat i disse avipoxvira ved genetisk rekom 2 bination ifølge opfindelsen, omfatter Lac Z-genet af prokaryotisk oprindelse; 3 rabies-glycoprotein (G) genet, der er et antigen fra et ikke-fuglepatogen (spe 4 cifikt af pattedyroprindelse); kalkuninfluenza-hæmagglutinin-genet, som er 5 antigenet fra et patogent fuglevirus, der ikke er et avipoxvirus; kappegenet 6 gp51.30 fra bovint leukæmivirus, der er et pattedyrvirus; fusionsprotein-genet fra Newcastle disease-virus (Texas-stamme), der er et fuglevirus; FeLV- DK 176068 B1 9 kappegenet fra katteleukæmivirus, der er et pattedyrvirus; RAV-1 env-genet fra det Rous-associerede virus, der er et fuglevirus/fjerkræsygdom; nucleoprotein (NP) genet fra hønse/Pennsylvania/1/83 influenzavirus, der er et fuglevirus; matrixgenet og peplomergenet fra infektiøs bronchitisvirus 5 (stamme Mass 41), der er et fuglevirus; og glycoprotein-D-genet (gD) fra herpes simplex-virus, der er et pattedyrvirus.

Isolering af Lac Z-genet er beskrevet af Casadaban et al., Methods in Enzy-mology 100:293-308 (1983). Strukturen af rabies-G-genet er for eksempel 10 beskrevet af Anilionis et al., Nature 294:275-278 (1981). Dets indbygning i vaccinia og udtrykkelse i denne vektor diskuteres af Kieny et al., Nature 312:163-166 (1984). Kalkuninfluenza-hæmagglutinin-genet er beskrevet af Kawaoka et al., Virology 158:218-227 (1987). Det bovine leukæmivirus gp51.30 env-gen er blevet beskrevet af Rice et al., Virology 138:82-93 15 (1984). Fusionsgenet fra Newcastle disease-virus (Texas stamme) er tilgæn geligt fra Institute Merieux, Inc. som plasmid pNDV 108. Katteleukæmivirus-env-genet er blevet beskrevet af Guilhot et al., Virology 161:252-258 (1987).

Det Rous-associerede virus type 1 er tilgængeligt fra Institute Merieux, Inc. som to kloner, penVRVIPT og mp19env (190). Hønseinfluenza-NP-gen er 20 tilgængeligt fra Yoshihiro Kawaoka, St. Jude Children's Research Hospital som plasmid pNP33. En infektiøs-bronchitis-virus cDNA-klon af IBV Mass 41 matrixgenet og peplomergenet er tilgængelig fra Institute Merieux, Inc. som plasmid plBVM63. Herpes simplex-virus gD-genet er beskrevet i Watson et al., Science 218:381-384 (1982).

25

De rekombinante avipoxvira, der beskrives mere detaljeret nedenfor, omfatter én af tre vacciniapromotorer. Pi-promotoren, fra AvalH-regionen af vaccinia, er beskrevet i Wachsman et al., J. of Inf. Dis. 155:1188-1197 (1987). Mere bestemt er denne promotor afledt fra AvalH(XholG)-fragmentet af L-30 variant-WR-vacciniastammen, hvori promotoren leder transkriptionen fra højre til venstre. Kortbeliggenheden af promotoren er ca. 1,3 kbp (kilobasepar) DK 176068 B1 10 fra den venstre ende af AvalH, ca. 12,5 kbp fra den venstre ende af vaccinia-genomet, og ca. 8,5 kbp til venstre for Hindlll-C/N-forbindelsen. Promotorsekvensen er: 5 (GGATCCC) -ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGT-AGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTG-(AATTC) , hvori symbolerne i parentes er koblingssekvenser.

10 HindlllH-promotoren (også kaldet ”HH" og Ή6" heri) blev defineret ved stan-dard-transkriptionelle kortlægningsteknikker. Den har sekvensen:

ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAA TAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATA-15 AATT

ATTTCATTATCGCGATATCCGT TAAGTTTGTATCGTAATG.

Sekvensen er identisk med den, som af Rosen et al., J. Virol. 60:436-449 20 (1986) er beskrevet som værende opstrøms fra åben læseramme H6.

11 K-promotoren er som beskrevet af Wittek, J. Virol. 49:371-378 (1984) og Bertholet, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2096-2100 (1985).

25 De rekombinante kanariepoxvira ifølge opfindelsen er konstrueret ved to inden for faget kendte trin, der er analoge med dem beskrevet i førnævnte US patent 4 603 112 til dannelse af syntetiske rekombinanter af vacciniaviruset.

Først anbringes den DNA-sekvens, som skal indsættes i viruset, i en E. coli-30 plasmidkonstruktion, hvori er indsat DNA, der er homologt til en sektion af ikke-essentielt DNA i avipoxviruset. DNA-gensekvensen, der skal indsættes, DK 176068 B1 11 ligeres separat til en promotor. Promotor-gen-koblingen indsættes derpå i plasmidkonstruktionen, således at promotor-gen-koblingen i begge ender er flankeret af DNA homologt til en ikke-essentiel region af avipox-DNA. Den resulterende plasmidkonstruktion amplificeres derpå ved vækst i E. coli-5 bakterier. (Plasmid-DNA bruges til at bære og amplificere exogent genetisk materiale, og denne metode er velkendt inden for faget. Disse plasmid-teknikker er f.eks. beskrevet af Clewell, J. Bacteriol. 110:667-676 (1972). Teknikkerne til isolering af det amplificerede plasmid fra E. coli-værten er ligeledes velkendte og er f.eks. beskrevet af Clewell et al. i Proc. Natl. Acad.

10 Sci. USA 62:1159-1166 (1969).)

Det amplificerede plasmidmateriale isoleret efter vækst i E. coli anvendes derpå til det andet trin. Nemlig transfektion af plasmidet indeholdende DNA-gensekvensen, der skal indsættes, over i en cellekultur, f.eks. fibroblaster fra 15 kyllingefostre, sammen med avipoxviruset (såsom fjerkræpox stamme FP-1 eller FP-5). Rekombination mellem henholdsvis homologt fjerkræpox-DNA i plasmidet og det virale genom giver et avipoxvirus, der er modificeret ved tilstedeværelsen af ikke-fjerkræpox-DNA-sekvenser i et ikke-essentielt område af sit genom.

20

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler, hvor eksempler 13, 15, 17, 21, 22 og 24 illustrerer opfindelsen, mens de resterende eksempler illustrerer vira til sammenligningsforsøg.

25 EKSEMPEL 1 - Prøvninger for transient udtrvkkelse til demonstrering af fierkræpox-RNA-transkriotionsfaktorers genkendelse af vaccinia-promotorer

Der blev fremstillet et antal plasmidkonstruktioner indeholdende kodesekven-30 sen for Hepatitis B-virus-overflade-antigen (HBSAg) koblet til vacciniavirus-promotorsekvenser. 50 pg af hvert plasmid blev transfekteret på CEF-celler DK 176068 B1 12 inficeret med 10 pfu fjerkrævirus eller vacciniavirus pr. celle. Infektionen fik lov at fortsætte i 24 timer, og cellerne blev derpå lyseret ved tre på hinanden følgende cykler bestående af frysning og optøning.

5 Mængden af HBSAg i lysatet blev beregnet ved brug af det fra Abbott Laboratories, Diagnostic Division, kommercielt tilgængelige AUSTRIA II - 125l-kit. Tilstedeværelsen eller fraværet af HBSAg udtrykkes som et forhold mellem nettotællingerne (prøve minus baggrund) af den ukendte værdi og en negativ afskæringsværdi forudbestemt af fabrikanten. Dette resulterer i et P/N (posi-10 tiv/negativ) forhold. Resultaterne er vist i tabel I.

Der blev anvendt tre forskellige vaccinia-promotorsekvenser: Pi-promotoren, der erkendes tidligt ved vacciniainfektion, før DNA-replikation; 11K-promotoren, der erkendes sent ved vacciniainfektion, efter starten af DNA-15 replikation; og Hindlll H (HH) promotoren, der erkendes både tidligt og sent ved vacciniainfektion. Disse promotorer er tidligere beskrevet heri.

Dataene indikerer, at HBSAg dannet i lysatet af inficerede celler er resultatet af genkendelse af vacciniapromotorer af transkriptionsfaktorer fra enten 20 fjerkræpox eller vaccinia.

DK 176068 B1 13

TABEL I

Plasmid Virus Beskrivelse P/N forhold pMP131piR2 Fjerkræpox SAg koblet til 1,8 5 Vaccinia Pi-promotor 9,1 pMPK22.13S Fjerkræpox SAg koblet til 14

Vaccinia 11 K-promotor 2 10 pPDK22.5 Fjerkræpox SAg koblet til 92,6

Vaccinia 11 K-promotor 5,6 pRW668 Fjerkræpox SAg koblet til 77

Vaccinia HH-promotor 51,4 15 (ingen plasmid) Fjerkræpox 1,1 (ingen plasmid) Vaccinia 1,3 pMPK22.13S (ingen virus) 1,3 20 EKSEMPEL 2 - Konstruktion af rekombinant fierkræpox-virus vFP-1 indeholdende Lac Z-aenet

Et fragment i et ikke-essentielt område af fjerkræpox-viruset blev lokaliseret 25 og isoleret på følgende måde.

Der blev anvendt nuklease Bal31 til fjernelse af de enkeltstrengede terminale hårnåleløkker i FP-5 DNA. Det store Klenowf rag ment af DNA-polymerase I blev anvendt til dannelse af stumpe ender. Efter fjernelse af løkkerne blev 30 fragmenterne frembragt ved nedbrydning med restriktionsendonuklease DK 176068 B1 14

Bglll. Ved denne nedbrydning dannedes en række FP-5-f rag menter, der blev adskilt ved agarosegelelektroforese.

Et 8,8 kbp Bglll-fragment med stumpe ender blev isoleret og ligeret ind i et 5 kommercielt tilgængeligt plasmid, pUC9, der var blevet kløvet med BamHI og Smal. Det resulterende plasmid blev designeret pRW698.

For at nedsætte størrelsen af fjerkræpox-fragmentet blev dette plasmid kløvet med Hindi!I til dannelse af yderligere to fragmenter. Et 6,7 kbp fragment 10 blev kasseret, og det tilbageblevne 4,7 kbp fragment blev ligeret til sig selv til dannelse af et nyt plasmid designeret pRW699.

For at inkorporere et 11 K-promoteret Lac Z-gen i dette plasmid blev pRW699 skåret med EcoRV, der kun kløver plasmidet på ét sted. Det 11K-15 promoterede Lac Z-segment blev derpå indsat som et Pstl-BamHI-fragment med stumpe ender, hvorved der skabtes et nyt plasmid designeret pRW702.

Lac Z-klonen er fra pMC1871, som beskrevet i Casadaban et al., loc. cit.

11 K-promotoren blev ligeret til den ottende codon af Lac Z-genet via en BamHI-linker.

20

Ved rekombinationsteknikker, som beskrevet for vaccinia i US patent 4 603 112, blev pRW702-plasmidet derpå rekombineret med fjerkræpox FP-5, der vokser på kyllingefosterfibroblaster (CEF), idet der anvendtes følgende procedurer til frembringelse af vFP-1. 50 pg pRW702-DNA blev blandet i et slut-25 volumen på 100 pi med 0,5 pg af fjerkræpox-DNA dækkende hele genomet.

Til dette blev sat 10 pi 2,5 M CaC^ og 110 pi 2 x HEBS puffer (pH 7) fremstillet af:

40 mM Hepes 30 300 mM NaCI

1,4 mM Na2HP04 1 — II - ------- DK 176068 B1 15 10 mM KCI 12 mM dextrose.

Efter 30 minutter ved stuetemperatur tilsattes 200 μΙ af en fjerkræpox-5 viruspulje fortyndet til 5 pfu/cell, og blandingen inokuleredes på 60 mm petriskåle indeholdende et monolag af primære CEF. 0,7 ml Eagles medie indeholdende føtal bovint serum (FBS) tilsattes ligeledes på dette tidspunkt. Petriskålene blev inkuberet ved 37 °C i 2 timer, hvorefter yderligere 3 ml Eagles medie indeholdende 2% FBS blev tilsat og petriskålene inkuberet i 3 døgn.

10 Celler blev lyseret ved tre på hinanden følgende cykler bestående af frysning og optøning, og afkom af virus blev derpå prøvet for tilstedeværelsen af re-kombinanter.

Der opnåedes bevis for vellykket gennemførelse af indsættelse ved rekombi-15 nation af det 11 K-promoterede Lac Z-gen i genomet for fjerkræpox FP-5 ved at afprøve for udtrykkelse af Lac Z-genet. Lac Z-genet koder for enzymet β-galactosidase, der kløver det kromogene substrat 5-brom-4-chlor-3-indolyl^-D-galactosid (X-gal) under frigivelse af et blåt indolylderivat. Blå plakker blev udvalgt som positive rekombinanter.

20

Den med held gennemførte indsættelse af Lac Z i genomet af fjerkræpox FP-5 samt dets udtrykkelse blev også bekræftet ved immunpræcipitering af β-galactosidaseprotein med kommercielt tilgængelige antisera og standardteknikker under anvendelse af vFP-1 -inficerede CEF, BSC (abenyrecellelinie -25 ATCC CCL26), VERO (abenyrecellelinie - ATCC CC81) og MRC-5 (human diploid lungecellelinie -ATCC CCL171).

Udtrykkeisen af β-galactosidase af det rekombinante virus vFP-1 blev videre bekræftet in vivo ved inokulering af kaniner og mus med viruset og ved at 30 kunne måle en post-inokuleringsstigning i titerne af antistof rettet mod β-galactosidaseproteinet i serum af de inokulerede dyr.

DK 176068 B1 16

Specielt blev det rekombinante vFP-1 oprenset fra værtcellekontaminanter og inokuleret intradermalt to steder på hver side af to kaniner. Hver kanin modtog en total mængde på 108 pfu.

5

Dyrene fik tappet blod med ugentlige mellemrum, og seraene brugt ved en ELISA prøvning under anvendelse af en kommercielt tilgængelig præparation af oprenset β-galactosidase som antigenkilde.

10 Både kaniner og mus inokuleret med det rekombinante vFP-1 frembragte et immunrespons over for β-galactosidaseprotein som vist ved en ELISA-prøvning. I begge arter var responset detekterbart én uge efter inokulering.

EKSEMPEL 3 - Konstruktion ud fra fierkræpox-virus FP-5 af rekombinant 15 virus vFP-2 indeholdende rabies-G-qenet og Lac Z

Fra FP-5 opnåedes et 0,9 kbp Pvull-fragment, der ved hjælp af standardteknikker blev indsat mellem de to Pvull-steder i pUC9. Den resulterende konstruktion, designeret pRW688.2, har to Hincll-steder med en afstand på ca.

20 30 bp, der er beliggende asymmetrisk inde i PvuIl-fragmentet, og de danner således en lang arm og en kort arm af fragmentet.

Under anvendelse af kendte teknikker blev oligonukleotidadaptere blev mellem disse Hincll-steder til indførelse af Pstl- og BamHI-steder, hvorved 25 plasmid pRW694 dannedes.

Dette plasmid blev nu kløvet med Pstl og BamHI, og Lac Z-genet med en koblet 11K vacciniapromotor, der tidligere er beskrevet, blev indsat til dannelse af det nye plasmid pRW700.

30 DK 176068 B1 17

Til dannelse af et Pi-promoteret rabies-G-gen, blev Bglll-stedet, der er 5'-proximalt i forhold til rabiesgenet (jfr. Kieny et al., loc. cit.), gjort stump-endet og ligeret til det udfyldte EcoRI-sted i Pi-promotoren beskrevet tidligere.

5 Denne konstruktion blev indsat i Pstl-stedet af pRW700 til dannelse af plasmid pRW735.1, som indeholder den fremmede gensekvens Pi-rabies G-11K-Lac Z. Denne indsættelse er således orienteret inden for plasmidet, at den lange Pvull-HincIl-arm af FP-5-donorsekvensen er 3’ i forhold til Lac Z-genet.

10

Den resulterende endelige konstruktion blev rekombineret med fjerkræpox-virus FP-5 ved infektion/transfektion af kyllingefosterfibroblaster ved fremgangsmåderne beskrevet ovenfor til dannelse af rekombinant fjerkræpox-virus vFP-2. Dette rekombinante virus blev selekteret ved X-gal farvning.

15

Korrekt indsættelse og udtrykkelse af både Lac Z-markørgenet og rabies-G-genet blev verificeret ved et antal yderligere metoder beskrevet nedenfor.

Lokalisering af rabies-antigenet ved immunfluorescens med specifikke anti-20 stoffer viste vellykket udtrykkelse af rabies-antigen på overfladen af fugle- og ikke-fugleceller inficeret med vFP-2-virus.

Udtrykkeisen af rabies-antigen og β-galactosidase af fugle- og ikke-fugleceller inficeret med vFP-2-viruset blev ligesom tidligere bekræftet ved 25 immunpræcipiteringsmetoden.

Ved inokulering af to kaniner med vFP-2-virus blev der opnået yderligere bevis for, at vFP-2-udførelsesformen ifølge opfindelsen er en vellykket rekombinant virus, der bærer generne for rabies G og β-galactosidase. Begge ka-30 niner blev inokuleret intradermalt med 1 x 108 pfu vFP-2 pr. kanin. Begge disse kaniner dannede typiske pox-læsioner. Kaninerne fik udtaget blodprø- DK 176068 B1 18 ver med ugentlige mellemrum, og sera blev afprøvet ved ELISA til påvisning af tilstedeværelsen af specifikke antistoffer mod rabiesglycoproteinet og β-galactosidaseproteinet.

5 Som angivet i tabel II nedenfor, viste kanin 205 påviselige mængder af anti-β-galactosidase-antistof ved ELISA-prøven én uge efter inokulering. Dette steg ved to uger til en titer på 1 i 4000, der opretholdes indtil 5 uger efter ino-kuleringen. Ved brug af antigen-indfangning-ELISA-prøvningen, viste sera fra kanin 205 påviselige mængder af anti-rabies-antistoffer fra 3 tiMO uger efter 10 inokulering.

TABEL II

Antistof-dannelse af kanin 205 mod rabies-antigen og β-qalactosidaseprotein 15

Tidspunkt Antistof-titer (reciprokke af serumfortynding) 20 Før udtagning anti^-galactosidase af blodprøve 0

Uge 1 500

Ugerne 2-5 (hver) 4000

Uge 6 500 25 Uge 9 250 Før udtagning anti-rabies af blodprøve 0

Uge 3 200 30 Uge 6 200

Uge 10 100 DK 176068 B1 19 EKSEMPEL 4A - Konstruktion ud fra fierkræpox-virus FP-1 af rekombinant virus vFP-3 indeholdende promoteret rabies-G-qen 5 Denne udførelsesform anskueliggør, at rabies-G-genet udtrykkes fuldtud af andre fjerkræpox-stammer end FP-5, specifikt af en anden stamme af fjerkræpox-virus designeret FP-1.

Som i eksempel 3 opnåedes et 0,9 kbp Pvull-fragment fra FP-1, idet man 10 antog, at fragmentet ville indeholde et ikke-essentielt område, som det var tilfældet for FP-5.

Dette fragment blev indsat mellem de to Pvull-steder i pUC9, hvorved dannedes et plasmid designeret pRW731.15R.

15

Dette plasmid har to Hincll-steder, med en afstand påca. 30 bp, der er beliggende asymmetrisk inde i Pvu 11-fragmentet, og de danner således en lang arm og en kort arm af fragmentet.

20 En kommercielt tilgængelig Pst-koblingssekvens (5') - CCTGCAGG - (3') blev indsat mellem de to Hincll-steder, hvorved dannedes plasmid pRW741.

Et HH-promoteret rabies-G-gen indsattes i dette plasmid i Pstl-stedet til dan-25 nelse af det nye plasmid pRW742B. Ved rekombination af dette plasmid med FP-1 ved infektion/transfektion af CEF-celler opnåedes virus vFP-3.

ATG-translationsinitieringscodonen i den åbne læseramme promoteret af HH-promotoren blev overlejret på initieringscodonen af rabies-G-genet under 30 anvendelse af et syntetisk oligonukleotid, der spænder over EcoRV-stedet i HH-promotoren og Hind I Il-stedet i rabies-G-genet. 5-enden af dette HH- DK 176068 B1 20 promoterede rabiesgen blev ved kendte teknikker modificeret til at indeholde et Pstl-sted, og konstruktionen ligeredes derpå ind i Pstl-stedet af pRW741 til dannelse af pRW742B. Orienteringen af konstruktionen i plasmidet er den samme som i pRW735.1, der tidligere er omtalt i eksempel 3.

5

Rekombination blev udført som beskrevet i eksempel 2. Den resulterende rekombinant benævnes vFP-3.

Udtrykkeisen af rabies antigen af både fugle- og ikke-fugle-celler inficeret 10 med vFP-3-viruset blev bekræftet ved de tidligere beskrevne immun-præcipiterings- og immunfluorescensteknikker.

Yderligere bevis for, at vFP-3-udførelsesformen ifølge opfindelsen er en vellykket rekombinant virus, der udtrykker gener for rabies G, opnåedes ved at 15 inokulere kaninpar intradermalt med den rekombinante virus. To kaniner blev inokuleret intradermalt med 1 x 108 pfu vFP-3 pr. kanin. Begge disse kaniner dannede typiske poxlæsioner, der nåede maksimal størrelse 5-6 dage efter inokulering. Kaninerne fik udtaget blodprøver med ugentlige intervaller, og sera blev afprøvet ved ELISA med henblik på påvisning af tilstedeværelsen 20 af specifikt antistof for rabiesglycoproteinet.

Fem rotter blev hver ligeledes inokuleret intradermalt med 5 x 107 pfu vFP-3.

Der sås resulterende læsioner i alle dyrene.

25 Både kaniner og rotter dannede påviselige mængder antistof specifikt mod rabies to uger efter inokulering. To kontrolkaniner inokuleret intradermalt med det parental FP-1-virus havde ikke påviselige mængder af anti-rabies antistof. 1

For at udelukke den mulighed, at antistofresponset skyldtes indførelsen af rabiesantigen, der tilfældigt fulgte med inokulumviruset eller var integreret i DK 176068 B1 21 membranen af det rekombinante fjerkraepox-virus, snarere end at være fremkommet ved de novo syntese af rabiesantigenet af det rekombinante virus i dyret som forudsat, blev vFP-3-viruset kemisk inaktivert og inokuleret i kaniner.

5

Det oprensede virus blev inaktiveret fra den ene dag til den anden ved 4 °C i nærvær af 0,001 % β-propiolacton og derefter pelleteret ved centrifugering.

Det pelleterede virus blev opsamlet i 10 mM Tris-pufret saltvandsopløsning, ultralydsbehandlet og titreret til sikring af, at der ikke var infektiøs virus tilba-10 ge. To kaniner blev inokuleret intradermalt med inaktiveret vFP-3 og to kaniner med en ækvivalent mængde ubehandlet rekombinant. Størrelsen af læsioner blev kontrolleret.

Begge kaniner, der fik ubehandlet vFP-3, udviklede 5 dage efter inokulering 15 typiske pox-læsioner klassificeret som 4-5+. Kaniner inokuleret med inaktiveret virus udviklede også læsioner, men disse blev 5 dage efter inokulering klassificeret som 2*.

Kaninerne fik med ugentlige intervaller udtaget blodprøver, og sera blev ved 20 ELISA afprøvet for tilstedeværelsen af rabiesspecifikke antistoffer og fjerkræpox-specifikke antistoffer. Resultaterne er vist i tabel III nedenfor.

DK 176068 B1 22

TABEL III

Levende vFP-3 Inaktiveret vFP-3

Kanin: Nr. 295 Nr. 318 Nr. 303 Nr. 320

Afprøvet antistof: Rabies FP Rabies FP Rabies FP Rabies FP

Uge efter inokulering 0 00000000 2 250 4000 500 4000 0 50 0 1000 3 1000 4000 500 4000 0 4000 0 2000 4 1000 4000 2000 4000 0 4000 0 2000 5 4000 4000 2000 4000 0 2000 0 4000 6 4000 4000 4000 4000 0 2000 0 2000 I denne afprøvning er titreringsendepunktet (udtrykt som den reciprokke af 5 serumfortyndingen) arbitrært sat til 0,2 efter subtraktion af absorptionsværdi-eme af alle præudfordringssera. Begge kaninerne 295 og 318, der fik den levende virus, udviklede et immunrespons på rabiesglycoproteinet og på fjerkræpox-virusantigener. Kaninerne 303 og 320 udviklede også et immunrespons på fjerkræpox-virusantigener, omend titeren var lav. Ingen af disse 10 kaniner udviklede et påviseligt respons på rabiesglycoproteinet.

Dette resultat er udtryk for, at det immunologiske respons dannet i kaninen er på grund af de novo udtrykkeisen af rabiesglycoprotein-genet, der bæres i det rekombinante virus, og ikke et respons på et tilfældigt medfølgende gly-15 coprotein indeholdt i inokulumviruset.

EKSEMPEL 4B - Konstruktion ud fra fierkræpox-virus FP-1 af rekombinant virus vFP-5 indeholdende upromoteret rabies-G-qen 1

Udtrykkelse af et fremmed gen, indsat ved rekombination i fjerkræpox-genomet, kræver tilstedeværelse af en promotor. Denne blev vist ved at skabe yderligere en rekombinant, vFP-5, der er identisk med vFP-3 bortset fra, DK 176068 B1 23 at HH-promotoren er udeladt. Tilstedeværelsen af rabiesgenet i denne re-kombinant blev bekræftet ved nukleinsyrehybridisering. Der detekteredes dog ikke noget rabiesantigen i CEF-cellekulturer inficeret med viruset.

5 EKSEMPEL 5 - Overførinqsforsøq in vitro til bestemmelseaf om fierkræ- pox-virus replikerer i ikke-fuqleceller

Der blev udført et forsøg, hvori tre cellesystemer, et fra fugle og to fra ikke-fugle, blev inokuleret med den parentale FP-1-stamme eller den rekombinan-10 te vFP-3. To petriskåle hver af hhv. CEF, MRC-5 og VERO inokuleredes med FP-1 eller vFP-3 i en input multiplicitet på 10 pfu pr. celle.

Efter tre dage høstedes én petriskål fra hver. Viruset blev frigivet ved tre på hinanden følgende cykler bestående af frysning og optøning og reinokuleret 15 på et frisk monolag af den samme cellelinje. Dette blev gentaget ved seks på hinanden følgende overføringer, og ved afslutningen af forsøget blev prøver fra hver overføring titreret for virusinfektionsevne på CEF-monolag.

Resultaterne er vist i tabel IVA og indikerer, at serieoverføring af både FP-1 og vFP-3 er mulig i CEF-celler, men ikke i nogen af de to cellelinjer fra ikke-20 fugle. Infektiøst virus kan ikke påvises efter 3 eller 4 overføringer i VERO-eller MRC-5-celler.

Den anden petriskål blev brugt til bestemmelse af, om virus, der ikke er påviseligt ved direkte titrering, kunne detekteres efter amplifikation i de permissi-25 ve CEF-celler. På tredjedagen høstedes celler på den anden petriskål ved skrabning, og en trediedel af cellerne lyseredes og inokuleredes på et frisk CEF-monolag. Ved opnåelse af fuld cytopatisk virkning (CPE), eller 7 dage efter inficering, blev cellerne lyseret, og virusudbyttet titreret. Resultaterne er vist i tabel IVB. Når overføring i CEF-celler blev brugt til amplifikation af et 30 hvilket som helst tilstedeværende virus, kunne viruset ikke påvises efter fire eller fem overføringer.

DK 176068 B1 24

Forsøg på at etablere vedvarende inficerede celler slog fejl.

I et yderligere forsøg på at påvise tegn på fortsat viral udtrykkelse i ikke-fugle 5 celler, blev prøverne, der anvendtes til viral titrering ovenfor, brugt i en standard immunoprik-prøvning (immunodot assay), hvori anti-fjerkræpox antistof og anti-rabies antistof blev brugt til påvisning af tilstedeværelsen af de respektive antigener. Resultaterne af disse prøvninger bekræfter resultaterne opnået ved titrering.

DK 176068 B1 25 TABEL IVA Overforinqsforsøq

Inokulum- virus: FP-1 vFP-3

Celletype CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5

Overføring: 1 6,6a 4,8 4,9 6,6 5,4 66,2 2 6,7 2,9 3,7 6,5 4,2 5,1 3 6,4 1,4 1,0 6,4 1,7 4,4 4 6,1 i.d.b i.d. 6,2 i.e. 1,0 5 6,4 i.d. i.d. 6,3 i.d. i.d.

6 5,7 i.d. i.d. 5,9 i.d. i.d.

3 - virustiter udtrykt som logio pfu/ml 5 b - ikke detekterbar TABEL IVB Amplifikationsforsøq

Inokulum- virus: FP-1 vFP-3

Celletype CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5

Overføring: 1 6,4a 6,2 6,4 6,5 6,3 6,4 2 7,5 6,3 6,0 6,5 6,3 5,5 3 6,2 6,7 5,3 5,9 6,1 6,3 4 5,6 4,6 3,9 5,7 4,8 5,8 5 6,3 4,1 i.d. 6,1 4,7 4,7 6 6,2 i.d.b i.d. 6,2 i.d. i.d. 1 a - virustiter udtrykt som log™ pfu/ml b - ikke detekterbar DK 176068 B1 26

EKSEMPEL 6 - Yderligere rekombinanter af fierkræpox FP-1: vFP-6, vFP-7, vFP-8 nq vFP-Q

Rekombinant vira vFP-6 og vFP-7 blev konstrueret på følgende måde.

5

Et 5,5 kbp Pvull-fragment af FP-1 blev indsat mellem de to Pvull-steder i PUC9 til dannelse af plasmidet pRW731.13. Dette plasmid blev derpå skåret i et unikt Hincll-sted og HH-promoteret rabies G-gen med stumpe ender indsat til dannelse af plasmideme pRW748A og pRW748B, der repræsenterer 10 modsatte orienteringer af indsættelsen. Plasmideme pRW748A og B blev derpå anvendt separat til at transfektere CEF-celler sammen med FP-1-virus til dannelse af hhv. vFP-6 og vFP-7 ved rekombination. Dette locus er nu designeret locus f7.

15 Et 10 kbp Pvull-fragment af FP-1 blev indsat mellem de to Pvull-steder i pUC9 til dannelse af pRW731.15. Dette plasmid blev derpå skåret i et unikt BamHI-sted og et 11 K-promoteret Lac Z genfragment blev indsat til dannelse af pRW749A og pRW749B, der repræsenterer modsatte orienteringer af indsættelsen. Rekombination af disse donorplasmider med FP-1 resulterede i 20 hhv. vFP-8 og vFP-9. Dette locus er nu designeret locus f8.

vFP-8 og vFP-9 udtrykte LacZ-genet, som påvist ved X-gal. vFP-6 og vFP-7 udtrykte rabies G-genet som påvist ved rabiesspecifikt antiserum.

25 EKSEMPEL 7 - immunisering med vFP-3 til beskyttelse af dyr mod udfordring med levende rabiesvirus

Grupper på 20 SPF hunmus, 4-6 uger gamle, blev inokuleret under fødderne med 50 μΙ vFP-3 i doser fra 0,7 til 6,7 TCID50 pr. mus. [TCID50 eller vævskul-30 tur-infektiøs dosis (tissue culture infectious dose) er den dosis, hvorved der ses cytopatisk virkning i 50% af celler i vævskultur). 14 dage efter vaccinatio- DK 176068 B1 27 nen blev 10 mus i hver gruppe slået ihjel, og der blev taget serumprøver med henblik på prøvning ved RFFI-afprøvningen. De tilbageværende 10 mus blev udfordret ved intracerebral inokulering af 10 LD50 rabies af CVS-stammen og overlevende mus optalt 14 dage efter udfordringen.

5

Resultaterne er vist i tabel VA nedenfor.

TABEL VA

10 vFP-3 dosis Rabies antistof titer

Loom TCIDw) Loom Fortynding1 Overlevelse 6.7 1,9 8/10 4.7 1,8 0/10 15 2,7 0,4 0/10 0,7 0,4 0/10 * Som målt ved RFFI (Rapid Fluorescent Focus Inhibition) afprøvningen, Laboratory Techniques in Rabies, 3. udg., 354-357, WHO, Geneve.

20

Forsøget blev gentaget med 12,5 LD5o udfordrende rabiesvirus. Resultaterne er vist i tabel VB nedenfor.

TABEL VB 25 vFP-3 dosis Rabies antistof titer

Login TCI Dsn Loqm Fortynding' Overlevelse 6.7 2,8 5/10 30 4,7 2,1 2/10 2.7 0,6 0/8 0,7 0,6 0/8

Som målt ved RFFI (Rapid Fluorescent Focus Inhibition) afprøvningen, La-35 boratory Techniques in Rabies, 3. udg., 354-357, WHO, Geneve.

DK 176068 B1 28

To hunde og to katte blev immuniseret med en enkelt subcutan inokulering af 8 logio TCID50 af det rekombinante vFP-3. Yderligere blev to hunde og fire katte af tilsvarende alder og vægt holdt som ikke-vaccinerede kontroller. Der blev udtaget blodprøver på alle dyr med ugentlige mellemrum. På dag 94 5 blev hver hund udfordret ved inokulering i tindingemuskelen af to doser på 0,5 ml af et spytkirtelhomogenat af rabies virus af NY-stammen, tilgængelig fra Institut Merieux, Inc. Den totale dosis svarede til 10000 muse LD50 indgivet ad intracerebral vej. De seks katte blev på lignende måde udfordret ved inokulering i nakkemuskelen med to doser på 0,5 ml af den samme virussu-10 spension. Den totale dosis pr. dyr svarede til 40000 muse LD50 indgivet ad intracerebral vej. Dyrene blev observeret dagligt. Alle ikke-vaccinerede dyr døde med rabiessymptomer på den i tabel VI angivne dag. De vaccinerede dyr overlevede udfordringen og blev observeret i tre uger, efter at det sidste kontroldyr døde. Resultaterne er vist i tabel VI nedenfor.

TABEL VI

DK 176068 B1 29

Overlevelse/ Vaccine- Døds- dvr ring Titer på postinokulerinqsdag tidspunkt 5 i 0 14 21 28 94

Kat 7015 vFP-3a 0 2,2b 2,4 2,4 1,5 + 7016 vFP-3 0 1,7 1,9 2,0 1,3 + 10 8271 cc 0 0 0 0 0 d/13d T10 c 0 0 0 0 0 d/12 T41 c 0 0 0 0 0 d/13 T42 c 0 0 0 0 0 d/12 15 Hund 426 vFP-3 0 0,8 1,0 1,1 1,2 + 427 vFP-3 0 1,5 2,3 2,2 1,9 + 55 c 0 0 0 0 0 d/15 8240 c 0 0 0 0 0 d/16 20 a Både katte og hunde vaccineret med vFP-3 modtog 8 log^TCIDso ad sub-cutan vej.

b Titer udtrykt som log™ højeste serumfortynding der giver mere end 50% reduktion i antallet af fluorescerende brønde i en RFFI-test.

25 c Ikke-vaccinerede kontroldyr.

d Dyret døde/dødsdag efter udfordring.

I yderligere forsøg blev de rekombinante vira vFP-2 og vFP-3 inokuleret i kvæg ad flere forskellige indgiveisesveje.

30

Inokulerede dyr blev afprøvet for anti-rabies antistof pådagene 6, 14, 21, 28 og 35. Som vist i den følgende tabel VIIA udviste alle dyr et serologisk respons på rabiesantigenet.

TABEL VIIA

DK 176068 B1 30

Antistof-titere i pattedyr inokuleret med vFP-3 anti-rabies neutraliserende antistoffer 5 RFFI-test loom fortynding

Dag 0 6 14 21 28 35

Kvæg nr.

10 7,3 logio TCID50 1420 (intraderm.) NEG 0,6 2 1,7 1,8 1,7 8 logio TCID50 1419 (subcutan) NEG 1,6 2,2 2,1 2,1 1,9 15 8 logio TCID50 1421 (intramusk.) NEG 0,9 2,2 2,2 1,8 1,7 7,3 log-ιο TCID50 20 1423 (intramusk.) NEG 0,9 1,1+ 1+ Γ 1,1 + + Ikke signifikant.

Hvert stykke kvæg blev revaccineret med 8 log-ιο TCIF50 55 dage efter inoku-25 lering og udviste et anamnestisk respons på rabiesantigenet. Ved booster-revaccination blev alt kvæget inokuleret subcutant undtagen nr. 1421, der igen inokuleredes intramuskulært. RFFI-titere blev bestemt på dagene 55, 57, 63, 70, 77 og 86. Resultaterne er vist i tabel VIIB.

TABEL VIIB

DK 176068 B1 31

Dag 55 57 63 70 77 86 ! Kvæg nr.

5 1419 1,7 1,5 2,9 2,9 2,6 2,9 1420 1,0 0,5 1,9 2,3 2,2 2,0 1421 1,3 1,2 2,9 2,7 2,5 2,5 10 1423 1,0 0,7 2,4 2,5 2,5 2,2

Alle tal er for vFP-3 med undtagelse af dyr nr. 1423, der er for vFP-2.

15 Kvæg, katte og kaniner blev også inokuleret intradermalt med kendte mængder af fjerkræpox-virus, og efter en uge blev sår opsamlet fra dyrene. Disse blev formalet, suspenderet i saltvandsopløsning og titreret til bestemmelse af virusmængderne.

20 Kun residuale mængder af infektiøs virus kunne genvindes. Dette viser, at der in vivo ikke forekom nogen produktiv infektion.

EKSEMPEL 8 - Inokulerinq af kyllinger med vFP-3 25 Det rekombinante fjerkræpox-virus vFP-3 blev inokuleret i kyllinger for at vise udtrykkeisen af fremmed DNA af et rekombinant fjerkræpox-virus i et system, der tillader produktiv replikation af vektoren.

Kyllinger af hvide italienerhøns blev inokuleret intramuskulært med 9 logio 30 TCID50 vFP-3 eller 3 logio TCID50 vFP-3 ved vinge-gennemstikning. Der udtoges blodprøver til en RFFI-afprøvning for rabies antistoftiter 21 dage efter vaccinering. Titere fra dag 21 i inokulerede kyllinger var signifikant højere end titere fra dag 21 i kontroller. Gennemsnitstiteren for de uinficerede kon- DK 176068 B1 32 troller var 0,6, gennemsnittet for de intramuskulært inokulerede fugle var 1,9 og gennemsnittet for de vinge-gennemstukne fugle var 1,2.

EKSEMPEL 9 - Rekombinant fierkræpox vFP-11. der udtrykker kalkun-5 influenza-H5-HA-antiqen

Fuglearter kan immuniseres mod fuglepatogener ved brug af de rekombinan-te avipoxvira ifølge opfindelsen.

10 Således blev det hidtil ukendte plasmid pRW759 (beskrevet nedenfor), der er afledt fra fjerkræpox-virus FP-1 og som indeholder det Hindlll H-promoterede hæmagglutinin-gen (H5) fra A/turkey/lreland/1378/83 (TYHA), anvendt til transfektion af CEF-celler, der samtidig var inficeret med parentalt virus, FP- 1. Rekombinant fjerkræpox-virus vFP-11 blev opnået ved de tidligere be-15 skrevne teknikker.

Syntesen af et hæmagglutininmolekyle af vFP-11-inficerede celler blev bekræftet ved immunpræcipitering fra metabolisk radiomærkede inficerede cel-lelysater ved brug af specifikt anti-H5-antistof og standard teknikker. Der blev 20 vist specifik immunpræcipitering af prækursor-hæmagglutinin med en molekylvægt på ca. 63 kd (kilodalton) og to kløvningsprodukter med molekylvægte på 44 og 23 kd. Der blev ikke præcipiteret sådanne proteiner fra et lysat af uinficerede CEF-celler eller celler inficeret med parentalt virus, FP-1.

25 Der blev foretaget immunfluorescensundersøgelser til bestemmelse af, at HA-molekylet, dannet i celler inficeret med det rekombinante fjerkræpox vFP-11 blev udtrykt påcelleoverfladen. CEF-celler inficeret med det rekombinante fjerkræpox-virus vFP-11 viste kraftig fluorescerende mærkning på overfladen.

I celler inficeret med det parentale virus FP-1 sås ingen fluorescens.

Plasmid pRW759 blev dannet på følgende måde: 30 DK 176068 B1 33 pRW742B (jfr. eksempel 4) gøres lineært ved delvis nedbrydning med Pstl, og fragmentet skæres igen med EcoRV til fjernelse af rabies-G-genet, hvilket efterlader HH-promotoren på det tilbageværende fragment på ca. 3,4 kbp.

5 Dette behandles med alkalisk phosphatase, og et syntetisk oligonukleotid blev indsat til sammenføjning af HH-promotoren med TYHA ved ATG til dannelse af pRW744.

Dette plasmid blev gjort lineært ved delvis nedbrydning med Dral, det lineære 10 fragment skåret med Sall og det største fragment blev reisoleret og behandlet med alkalisk phosphatase.

Til slut blev pRW759 dannet ved indsættelse i pRW744-vektoren af den isolerede Sall-Dral kodesekvens fra TYHA, beskrevet af Kawaoka et al., Virolo-15 gy 158:218-227(1987).

EKSEMPEL 10 - Immunisering med vFP-11 til beskyttelse af fugle imod udfordring med levende influenzavirus 20 For at vurdere immunogeniciteten af det rekombinante fjerkræpox-virus vFP-11, udførtes vaccinations- og udfordringsforsøg med kyllinger og kalkuner.

Særlige patogenfrie kyllinger af hvide italienere blev i en alder af 2 dage og 5 uger vaccineret ved vingevævspunktur med en dobbelt kanyle, der anvendes 25 til kommerciel vaccinering af fjerkræ med fjerkræpox-virus. Hver fugl blev indgivet ca. 2 pi indeholdende 6 x 105 pfu vPF-1. Der blev udtaget blodprøver fra de ældre fugle før vaccineringen, og der udtoges blodprøver fra alle fugle før udfordring og to uger senere.

DK 176068 B1 34

Til sammenlignende formål blev en anden gruppe kyllinger vaccineret med en konventionel H5-vaccine betående af en inaktiveret H5N2-stamme i en vand-i-olie-emulsion.

5 Inaktiveret H5N2-vaccinne blev fremstillet ud fra A/Mallard/NY/189/82 (H5N2) influenzavirus dyrket i 11 dage gamle embryonerede hønseæg. Den inficerede allantoisvæske med en HA-titer på 800/0,1 ml og infektivitetstiter på 1085/0,1 ml blev inaktiveret med 0,1% propiolacton og suspenderet i vand-i-olie-emulsion som beskrevet i Stone et al., Avian Dis. 22:666-674 (1978) og 10 Brugh et al., Proc. Second Inter. Syrn. on Avian Influenza, 283-292 (1986). Vaccinen blev i et volumen på 0,2 ml indgivet subcutant på indersiden af lår-musklen i 2 dage og 5 uger gamle kyllnger af SPF hvide italienere.

En tredie og fjerde gruppe kyllinger fik hhv. parentalt virus FP-1 eller ingen 15 vaccine.

Kyllingerne blev udfordret med ca. 103 LD50 af den yderst patogene A/Turkey/lreland/1378/83 (H5N8) eller A/Chick/Penn/1370/83 (H5N2) influenzavirus ved indgivelse af 0,1 ml i næseborene af hver fugl. To dage gamle 20 fugle blev udfordret 6 uger efter vaccinering, og 5 uger gamle fugle blev udfordret 5 uger efter vaccinering. Fuglene blev dagligt observeret for tegn på sygdom, indikeret ved opsvulmen og cyanose af ansigtet og kammen, samt blødninger i benene (ofte kunne sådanne fugle ikke stå op), paralyse og død.

De fleste dødsfald skete mellem 4 og 7 dage efter inficering. Der blev taget 25 podninger fra trachea og kloak på hver af de levende kyllinger 3 dage efter inficering, som undersøgtes for virus ved inokulering i embryonerede æg. Kyllingerne inokuleret med enten vildtype eller rekombinant fjerkræpox-virus udviklede typiske læsioner på vingevævet. På trediedagen var dannet pustu-ler på stedet for hvert kanylestik, efterfulgt af cellulær infiltrering med sårdan-30 nelse og bedring på 7. dagen. Der dannedes ikke nogen sekundære læsioner, og der var ikke tegn på spredning til ikke-vaccinerede kontaktkyllinger.

DK 176068 B1 35

Resultaterne af udfordringsforsøget er vist i tabel VIII og de tilhørende serologiske resultater i tabel IX.

TABEL VIII 5

Beskyttelse af kyllinger formidlet af H5 udtrvkt i fierkræpox Påvist udfordring Beskyttelse Virus 10 Kyllingers

Virus_Vaccine_alder Syg/død/total Trachea Kloak _

Ty/lreland Fowlpox-H5 2 dage 0/0/10 0/10 0/10 (H5N8) (vFP-11) 5 uger 0/0/5 0/5 0/5 15 I naktiveret 2 dage 0/0/9 0/9 0/9 H5N2 5 uger 0/0/5 0/5 0/5

Fowlpox 2 dage 10/9/10 2/6 3/6 control 5 uger 4/3/5 0/5 4/5 20

Ingen 2 dage 10/9/10 2/7 5/7 2 dage’ 2/1/2 2/2 2/2 5 uger 2/2/5 0/5 1/5 25 Ck/Penn Fowlpox-H5 2 dage 0/0/10 8/10 0/10 (H5N2) (vFP-11) 5 uger 0/0/6 5/6 2/6

Inaktiveret 2 dage 0/0/8 2/8 0/8 H5N2 5 uge 0/0/5 3/5 0/5 30

Fowlpox 2 dage 10/1/10 10/10 10/10 control 5 uger 5/0/5 5/5 5/5

Ingen 2 dage 9/3/9 9/9 9/9 35 2 dage’ 2/2/2 2/2 2/2 _5 uger 5/2/5_5/5 5/5_

Fire ikke-vaccinerede fugle opholdt sig hos og voksede op med fjerkræpox-H5-gruppen på 10 fugle til afprøvning af spredningen af fjerkræpox-H5.

40 DK 176068 B1 CM ^ >- o o H? ro o o o <£ £ O LO O li) oo m o 2

LU h- CN ^ t“ Tj-Tt CM N B

Q) p (/> p. . . c -t-* c ^ 0) Jr <3 2 cl £ £ >57 "" > 2 ^ 35 o • <|) C O IT>

5£5 *g LU VVt-t-VVVV

L_ > ro „ S g - o0 _ "o 5 a5 ^ g o 00 o § os 3 <n — So o m 00 00

,= — O LU <·Ν ,_ T- CM nr- (O N

p roe

.0 i; OT

3 (U

d) ro ±: ω z > ^ ro o o Ό (C O CD O Tj-

LU I"- t- CO CN V V V V

cu c s ™ ip; 3) o 000000 *- mo 00 00 00 00 00 (N't com -gj LU CO CN in C\l CM CO CM CO CD CO C- CM τ- τ- τ- τ- c 0) T Οχ CL 2 ^

“ LL OT

® UJ i 's S o § o§

CQ g ύί LU V V nr- VV VV VV CM T- VV VV

< E S

r— ro σ 2 2 „ „ C i CN S s. 2. _

“ T c. o „ o o ^ „S

O) 35 CO Ο O O CO O O OO OOS SO

-= o?n m co 00 co cm 00 o ro 00 00 o co —* c LU r— 't r^-CO T-T- CO CM CO CM O ffl CD CD CO ΤΟ i3

s M

Ό ~>> <υ ι— ^ — > 35 ϋ O O o ¢- m o o m m o 00

Q) LU T-T- COCO VV VV T- CO CD CO VV VV

ω o _2 , ro i_ (Dl- (Bl- Φ v_ <1)l- <1)1- Q)i_ OT i- o c u. raro raro raro raro raro raro raro raro c = ro ro rora rora rora rora rora rora rora rora >>α52 "ro 3 o o -do -do -do -00 o o -do ^ ra ro cm in cm in cm en cm m cm in cm in cm m cm lo

O

Q

35 >< >< x x S ro S 0 ro 0 o. ir o. cl S: o.

“ 8 g 5 g -s D o 2 ^ CM ^2 C —CM ^2 c O o T- jc 2 t r ro -ϊ ro cd ro en 2 <n ro ir ra rom rom ro >r ra 2 > iTl £ X 1rS. £ tor cx [go c ω

-D

C Ό roe c -h co o· c ^ ro 2 ro o en !c Z Q_ 2) > i—i· υ in o in o m o T- T- CN CN co DK 176068 B1 37 (Tabel IX fortsat) (a) De 5 uger gamle fugle fik før vaccination udtaget blodprøve og afprøvet 5 ved Hl- og neutraliseringsafprøvninger, ingen indeholdt påviselige anti stofmængder, og resultaterne er ikke vist. De 2 dage gamle kyllinger fik udtaget blodprøve 6 uger efter vaccination (Efter 1), og de 5 uger gamle fugle fik udtaget blodprøve 5 uger efter vaccination (Efter 1); begge grupper fik udtaget blodprøve 2 uger efter udfordring (Efter 2). Tallene 10 er middel-antistoftiteme fra de samme kyllingegrupper beskrevet i tabel 1.

(b) Tallene i parentes repræsenterer de, der overlevede udfordring.

(c) Afprøvninger for hæmagglutinationsinhibering (Hl) blev foretaget på mikrotiterplader under anvendelse af receptornedbrydende 15 enzymbehandlet sera, 4 HA-enheder af Ty/lre-virus, og 0,5% kyllinge- erythrocyter som beskrevet i Palmer et al., Immun. Series nr. 6, 51-52, US Dept. Health, Education and Welfare (1975). Prøvninger for neutralisering af infektivitet blev udført ved inkubering af 103 EID50 Ty/lre-virus med serumfortyndinger i 30 min ved stuetemperatur, 20 efterfulgt af inokulering af embryonerede æg med alikvots. Virusvækst blev bestemt ved hæmagglutinationsprøvninger efter inkubering af æg i 2 dage ved 33 °C.

<= mindre end 10. 1 2 3 4 5 6

Kyllinger inokuleret med fjerkræpox-H5-rekombinanten (vFP-11) eller den 2 inaktiverede H5N2-influenzavaccine i adjuvans var beskyttede mod udfor 3 dring med den homologe Ty/lre (H5N8) influenzavirus og med den beslæg 4 tede, men skelnelige Ck/Penn (H5N2) influenza virus. Derimod udviste stør 5 stedelen af fuglene inokuleret med parental FPV eller som ikke fik nogen 6 vacciner, kliniske tegn på højt patogen influenza, inklusive opsvulmen og cyanose af ansigtet og kammen, blødning i benene og paralyse. Største- DK 176068 B1 38 delen af disse fugle døde. De vaccinerede fugle udskilte ikke påviselige niveauer af Ty/lre, men udskilte Ck/Penn.

Både de inaktiverede og rekombinante vacciner inducerede Hl og neutralise-5 rende antistoffer mod Ty/lre, men mængden af antistof induceret af fjerkræ-pox-H5-rekombinanten, vFP-11, før udfordring inhiberede ikke HA eller neutraliserede det heterologe Ck/Penn H5. Dog var kyllingerne beskyttet mod udfording med både Ty/lre- og Ck/Penn-influenzavira.

10 Immunitet mod H5-influenza induceret af vFP-11-vaccinationen varede i mindst 4 til 6 uger og var krydsreaktiv. For yderligere at undersøge varigheden og specificiteten af responset blev en gruppe af 4 uger gamle kyllinger inokuleret i vingevævet med vFP-11 som tidligere beskrevet og udfordret med månedlige intervaller med den krydsreaktive Ck/Penn-virus. Der blev 15 igen ikke påvist Hl-antistoffer før udfordringen. Ikke desto mindre var fuglene beskyttet i mere end 4 måneder.

Den af vFP-11 udtrykte H5 inducerer ligeledes et beskyttende immunrespons i kalkuner. Udavlede hvide kalkuner blev i alderen 2 dage og 4 uger vaccine-20 ret ved vingevævsinokulering som tidligere beskrevet. Resultaterne er vist i tabel X.

DK 176068 B1 5 Φ cd ® ® cn 2 ‘Τ'1-. Q q

_0 ~ LU "d- Ό -Q

M- O H 00 Ό F= O «- ro ^ φ lo c ^ O ^ ^

LU V T- V V

C\J

Φ J- CD O)

-o 3 O O -D -O

C *- ¢- <D S G

φΟ ίυ T- (O "O Ό «— i- o) p

Il Φ Ji: — 1 .£2 c "5, S: !*►-- ” ωΧ| o ® o o

S Z LU V V V V

c ΐ 3 ^ < ίζ ro X Bo in <n cg cg lo > ^ co δ cg cg

X

X - —I ω C? ro

® LU =5 c S

00 CO F ω sz < c > o (— o »ro 2 ^ CL i— in δ δ δ cd c 3 S ro 03 — ^ Λ% CD “o « -g o -i; in cd cg cg .*—< (/) O) ^ *->* •5 cd >» ^ ^ cg cg j*c CQ CO T- cg cg cg </>

<D

CQ

c/> O m C >_ CD 1_

<D i_ S5 <D O) CD

o) ω -F σ> ro σο

3 P 73 3 -O D

ll ro ^ ^a- cg Έ ro ® ^ i§ s 5 S Tg I ε O LL 5 C c 5 in o 10 o T- T- fg DK 176068 B1 40

Der observeredes signifikant overlevelse imod udfordring med den homologe Ty/lre-virus i begge aldersgrupper. Ikke-vaccinerede kontakt-kontrolfugle opholdt sig sammen med de vaccinerede fugle til afprøvning af spredningen af den rekombinante virus. Disse fugle overlevede ikke udfordring.

5 EKSEMPEL 11 - Konstruktion af fierkræpox-virus FP-1 rekombinant vFP-12, der udtrykker kvllinqeinfluenza nukleoprotein (NP) gen 10 Plasmid pNP33 indeholder en cDNA-klon af influenzaviruset Chick-en/Pennsylvania/1/83 nukleoproteingenet (NP). Kun 5’- og 3'-enderne af det ca. 1,6 kbp NP-gen er blevet sekventeret. NP blev i form af et 5'-Clal-Xhol-3·-fragment med stumpe ender flyttet fra pNP333 over i Smal-nedbrudt pUC9, med pUC9's EcoRI-sted i 3'-enden, hvilket frembragte pRW714. Translation-15 sinitieringscodonen (ATG) i NP indeholder følgende understregede Ahall-sted: ATGGCGTC. Den tidligere beskrevne vaccinia-H6-promotor blev forbundet med NP med et dobbeltstrenget syntetisk oligonukleotid. Det syntetiske oligonukleotid indeholdt H6-sekvensen fra EcoRV-stedet til sit ATG og ind i NP-kodesekvensen i Ahall-stedet. Oligonukleotidet blev syntetiseret 20 med BamHI- og EcoRI-kompatible ender til indsættelse i pUC9 til frembringelse af pRW755. Startende i den BamHI-kompatible ende, med ATG understreget, er sekvensen for det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid:

GATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCG 25 GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA

Det lineære delvist Ahall-nedbrudte produkt af pRW755 blev isoleret og genskåret med EcoRI. pRW755-fragmentet, indeholdende en enkelt Ahall-skæring ved ATG og genskåret med EcoRI, blev isoleret, behandlet med 30 phosphatase og brugt som vektor for pRW714-nedbrydningsproduktet nedenfor.

DK 176068 B1 41

Det isolerede lineære delvist Ahall-nedbrudte produkt af pRW714 blev genskåret med EcoRI. Et isoleret Ahall-EcoRI-fragment på ca. 1,6 kbp indeholdende NP-kodesekvensen blev indsat i den ovennævnte pRW755 vektor til 5 dannelse af pRW757. Den fuldstændige H6-promotor blev dannet ved at tilføje sekvenserne opstrøms (5‘) for EcoRV-stedet. Plasmidet pRW742B (beskrevet i eksempel 4) fik H6-sekvensen nedstrøms (3’) for EcoRV-stedet fjernet sammen med sekvenser hen til pUC9's Ndel-sted. pRW742B EcoRV-Ndel-fragmentet, der var behandlet med phosphatase, blev anvendt som en 10 vektor for pRW757-fragmentet nedenfor. Det isolerede lineære partielle EcoRV-nedbrydningsprodukt af pRW757 blev genisoleret efter Ndel-ned-brydning; dette fragment indeholder H6-promotoren fra EcoRV-stedet gennem NP til pUC9's Ndel-sted. pRW757-fragmentet blev indsat i pRW742B-vektoren til dannelse af pRW758. EcoRI-fragmentet fra pRWW758, indehol-15 dende det fuldstændige H6-promoterede NP, blev gjort stump-endet med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I og indsat i Hincll-stedet af PRW731.13 til dannelse af pRW760. Hincll-stedet i pRW731.13 er FP-1-locuset anvendt i eksempel 6 til konstruktion af vFP-6 og vFP-7.

20 Ved brug af fjerkræpox FP-1 som det reddende virus, blev plasmid pRW760 anvendt i en in vitro rekombinationsafprøvning. Afkom af plakker blev prøvet og plakoprenset under anvendelse af in situ plakhybridisering. Udtrykkelse af genet er blevet bekræftet ved immunpræcipiteringsstudier under anvendelse af et polyklonalt anti-NP-antiserum fra ged. Størrelsen af proteinet, der speci-25 fikt præcipiterede fra et lysat af vFP-12-inficerede CEF-celler, var ca. 55 kD, hvilket ligger inden for den beskrevne størrelsesorden for influenzavirus-nukleoproteiner.

EKSEMPEL 12 - Fremstilling af en fierkræpox-virus dobbelt rekombinant.

30 vFP-15, der udtrykker generne for f ua leinfluenza nu- kleoproteinet (NP) og hæmagglutinin (HA) DK 176068 B1 42 c· Hæmagglutinin (HA) genet fra A/Tyr/lre/1378/83 er tidligere beskrevet ved konstruktionen af vFP-11 (eksempel 9). For at fremstille en dobbelt rekombi-nant blev HA-genet først flyttet til locus f8, der tidligere er defineret ved kon-5 struktionen af vFP-8, under anvendelse af plasmid pRW731.15.

Til konstruktion af vFP-11 anvendtes plasmidet pRW759. Hæmagglutinin-genet koblet til H6-promotoren blev fjernet fra dette plasmid ved en delvis Pstl-nedbrydning. Dette fragment blev gjort stump-endet med Klenow-10 fragmentet fra DNA-polymerase I og indsat i det stump-endede BamHI-sted i pRW731.15 til dannelse af pRW771.

Plasmid pRW771 blev derpå anvendt i en in vitro rekombinationsafprøvning ved brug af vFP-12 som det reddende virus. Det rekombinante vFP-12-virus 15 indeholder nukleoproteingenet koblet til H6-promotoren i locus f7 i plasmid pRW731.13. Rekombinante plakker, der nu indeholdt begge indsættelser, blev selekteret og plakoprenset ved in situ hybridisering og overfladeudtryk-kelse af hæmagglutininet, bekræftet ved en protein-A-p-galactosidase-koblet immunprøvning. Udtrykkelse af begge gener blev bekræftet ved immunpræ-20 cipitering fra lysater af celler inficeret med det dobbelt rekombinante virus, vFP-15.

EKSEMPEL 13 - Konstruktion af rekombinant kanariepox-vira 25 Det følgende eksempel viser identificering af fire ikke-essentielle indsættel-sesloci i kanariepox-genomet og konstruktionen af fire rekombinante kanariepox-vira, vCP-16, vCP-17, vCP-19 og vCP-20.

Det rekombinante kanariepox vCP-16 blev konstrueret påfølgende måde.

30 ____________———" DK 176068 B1 43

Et Pvull-fragment af kanariepox-DNA på 3,4 kbp blev klonet ind i pUC9 til dannelse af pRW764.2. Der blev fundet et unikt EcoRI-sted beliggende asymmetrisk inde i fragmentet med en kort arm på 700 bp og en lang arm på 2,7 kbp. Plasmidet blev nedbrudt med EcoRI og gjort stump-endet under an-5 vendelse af Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I. Det stump-endede H6/rabies-G-gen blev derpå ligeret ind i dette sted og anvendt til transformation af E. coli. Det resulterende plasmid, pRW775, blev brugt ved en in vitro afprøvning for rekombination. Afkom af plakker, der var positive ved en immunscreening, blev selekteret og plakoprenset. Den resulterende re-10 kombinant blev designeret vCP-16, og indsættelseslocuset designeredes C3.

Plasmidet pRW764.2, anvendt ved ovennævnte konstruktion, indeholdt også et unikt Bglll-sted ca. 2,4 kbp fra EcoRI-stedet. Ved brug af den samme kloningsstrategi blev H6/rabies-G-genet ligeret ind i plasmid pRW764.2 pådette 15 sted til dannelse af pRW774. Dette plasmid blev anvendt til konstruktion af rekombinant vCP-17 med indsættelseslocuset designeret C4.

Plasmid pRW764.5 indeholder et Pvull-fragment af kanariepox-DNA på 850 bp med et unikt Bglll-sted beliggende assymmetrisk inde i fragmentet 400 bp 20 fra den ene terminus. Ved brug af den samme kloningsstrategi som før beskrevet blev det til H-6-promotoren koblede rabies-G-gen indsat på dette sted til dannelse af pRW777. Det dannede stabile rekombinant virus blev designeret vCP-19 og indsættelseslocuset designeredes C5. 1 2 3 4 5 6

Plasmid pRW764.7 indeholder et Pvull-fragment på 1,2 kbp med et unikt 2

Bglll-sted 300 baser fra den ene terminus. Plasmidet blev nedbrudt med Bglll 3 og gjort stump-endet med Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I. Det 4 stump-endede 11 K-promoterede Lac Z-gen blev indsat til dannelse af plas 5 mid pRW7778. Det stabile rekombinant virus dannet ved anvendelse af dette 6 plasmid blev designeret vCP-20 og indsættelseslocuset designeredes C6.

DK 176068 B1 44 EKSEMPEL 14- Konstruktion af en fierkræpox-virus rekombinant, vFP-29, der udtrykker fusionsproteinet for Newcastle disease virus 5

Plasmid pNDV108, cDNA-klonen fra fusionsgenet fra NDV Texas-stamme, bestod af et Hpal cDNA-fragment på ca. 3,3 kbp indeholdende kodesekvensen for fusionsproteinet såvel som yderligere NDV-kodesekvenser klonet ind i Scal-stedet i pBR322. Trinene til dannelse af indsættelsesplasmidet er be-10 skrevet nedenfor.

(1) Dannelse af plasmid pCE11

Der blev konstrueret en FPV-indsættelsesvektor, pCE11, ved indsættelse af 15 polylinkere i Hincll-stedet af pRW731.13 (designeret som locus f7). pRW731.13 indeholder et 5,5 kbp Pvull-fragment af FP-1 DNA. Et ikke-essentielt locus var før blevet defineret i Hincll-stedet ved konstruktion af den stabile rekombinant vFP-6, beskrevet i eksempel 6. Polylinkerne indsat i Hincll-stedet indeholder steder for følgende restriktionsenzymer: Nrul, EcoRI, 20 Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Hindi, Sall, Accl, Pstl, Sphl, Hindlll og Hpal.

(2) Dannelse af plasmid pCE19

Dette plasmid er en videre modifikation af pCE11, hvori transkriptionsstop-25 signalet A l I l II NT fra vaccinia-virus (L. Yuen og B. Moss, J. Virology 60:320-323 [1986]) (hvor N i dette tilfælde er et A) er blevet indsat mellem Sacl- og EcoRI-stedeme af pCE11, med efterfølgende tab af EcoRI-stedet.

30 (3) Indsættelse af NDV-kodesekvenser DK 176068 B1 45

Et geloprenset BamHI-fragment på 1,8 kbp, indeholdende alle med undtagelse af 22 nukleotider fra 5'-enden af fusionsproteingenet, blev indsat i BamHI-stedet af pUC18 til dannelse af pCE13. Dette plasmid blev nedbrudt med Sall, der skærer i vektoren 12 baser opstrøms fra 5'-enden af kodesekven-5 sen. Enderne blev udfyldt med Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I, og plasmidet blev yderligere nedbrudt med Hindlll, der skærer 18 baser opstrøms fra Sall-stedet. Et geloprenset Smal-Hindlll-fragment på 146 bp, indeholdende vacciniavirus-H-promotoren, der tidligere er beskrevet i foretrukne udførelsesformer, såvel som polylinker-sekvenser ved hver terminus, blev 10 ligeret til vektoren og transformeret ind i celler af E. coli. Det resulterende plasmid blev designeret pCE16.

For at bringe den initierende ATG-codon af NDV-fusionsproteingenet på linje med 3-enden af H6-promotoren og for at erstatte de 22 nukleotider, der 15 mangler i NDV-5’-enden i pCE16, blev der skabt komplementære syntetiske i oligonukleotider, der ender i EcoRV- og Kpnl-steder. Oligonukleotidsekven-sen var 5’ ATC-CGT-T AA-GTT-TGT-AT C-GT A-ATG-GG C-T CC-AG A-T CT-T CT -20 ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C 3’.

pCE16-konstruktionen blev derpå nedbrudt med EcoRV og Kpnl. EcoRV-stedet findes i H6-promotoren 24 baser opstrøms for det initierende ATG. Kpnl-stedet findes i NDV-kodesekvensen 29 baser nedstrøms for ATG.

25

Oligonukleotider blev sammensmeltet, phosphoryleret og ligeret til det linea-riserede plasmid, og det resulterende DNA anvendtes til transformation af E. coli-celler. Dette plasmid blev designeret pCE18. 1

For at indsætte NDV-kodesekvensen i en FPV-indsættelsesvektor, blev et geloprenset Smal-Hindlll-fragment på 1,9 kbp fra pCE18 (skærende i polylin- DK 176068 B1 46 ker-området) ligeret til et Smal-Hindlll-fragment på 7,8 kbp fra pCE19, de er beskrevet ovenfor. Transkriptionsstop-signalet findes 16 baser nedstrøms for Smal-stedet. Det resulterende plasmid blev designeret pCE20.

5 Plasmidet pCE20 blev brugt ved en in vitro afprøvning for rekombination under anvendelse af fjerkræpox-virus FP-1 som redningsvirus. Det resulterende afkom blev udpladet på CEF-monolag og plakkerne underkastet en β-galactosidase-koblet protein-A-immunundersøgelse under anvendelse af et polyklonalt anti-NDV-kyllingeserum. Positivt farvede plakker blev selekteret 10 og underkastet fire omgange plakoprensning for at opnå en homogen population. Rekombinanten blev designeret vFP-29.

EKSEMPEL 15 - Konstruktion af avipox-virus-rekombinanter. der udtrykker kappe (env) qlvcoproteinet fra katteleukæmivirus 15 (FeLV)

FeLV-env-genet indeholder sekvenserne, der koder for p70 + p15E polypro-teinet. Dette gen blev indledningsvis indsat i plasmidet pSD467vC med vac-cinia-promotoren H6 5' sidestillet med FeLV-env-genet. Plasmidet pSD467vC 20 afledtes ved først at indsætte et Sall/Hind I Il-fragment på1802 bp indeholdende vaccinia-hæmagglutinin (HA) genet i en pUC18-vektor. Beliggenheden af HA-genet er før defineret (Shida, Virology 150:451-462 [1988]). Størstedelen af den åbne læseramme, der koder for HA-genproduktet, blev deleteret (nu-kleotid 443 til og med nukleotid 1311) og der indsattes et multipelt klonings-25 sted indeholdende Bglll-, Smal-, Pstl- og Eagl-restriktionsendonuklease-steder. Det resulterende pSD467vC-plasmid indeholder flankerende vacci-nia-arme på 442 bp opstrøms fra det multiple kloningssted og 491 bp nedstrøms fra disse restriktionssteder. Disse flankerende arme gør det muligt for genetisk materiale indsat i den multiple kloningsregion at blive rekombineret 30 ind i HA-regionen af Copenhagen-stammen af vacciniavirus. Det resulterende rekombinante afkom er HA-negativt.

DK 176068 B1 47 H6-promotoren blev syntetiseret ved sammensmeltning af fire overlappende oligonukleotider, der tilsammen udgør den komplette sekvens beskrevet ovenfor under foretrukne udførelsesformer. Det resulterende 132 bp frag-5 ment indeholdt et Bglll-restriktionssted i 5'-enden og et Smal-sted i 3-enden.

Dette blev indsat i pSD467vC via Bglll-og Smal-restriktionsstedet. Det resulterende plasmid designeredes pPT 15. FeLV-env-genet blev indsat i det unikke Pstl-sted i pPT15, der ligger umiddelbart nedstrøms for H6-promotoren.

Det resulterende plasmid designeredes pFeLVIA.

10

Til konstruktion af FP-1-rekombinanten, blev H6/FeLV-env-sekvenserne på 2,4 kbp skåret ud af pFeLVIA ved nedbrydning med Bglll og delvis nedbrydning med Pstl. Bglll-stedet ligger ved 5-grænsen af H6-promotorsekvensen. Pstl-stedet er beliggende 420 bp nedstrøms fra translationsterminerings-15 signalet for kappe-glycoproteinets åbne læseramme.

H6/FeLV-env-sekvensen på 2,4 kbp blev indsat i pCE11 nedbrudt med BamHI og Pstl. FP-1-indsættelsesvektoren, pCE11, var afledt fra pRW731.13 ved indsættelse af et multipelt kloningssted i det ikke-essentielle Hincll-sted.

20 Denne indsættelsesvektor tillader udvikling af FP-1-rekombinanter indeholdende fremmede gener i FP-1-genomets locus f7. Det rekombinante FP-1/FeLV-indsættelsesplasmid blev derpå designeret pFeLVFI. Denne konstruktion tilvejebringer ikke et perfekt ATG til ATG-substituering. 1 2 3 4 5 6

For at opnå den perfekte ATG:ATG-konstruktion, blev et Nrul/Sstll-fragment 2 på ca. 1,4 kbp afledt fra vacciniavirus-indsættelsesvektoren pFeLVIC. Nrul- 3 stedet forekommer inde i H6-promotoren på en position 24 bp opstrøms fra 4 ATG. Sstll-stedet er beliggende 1,4 kbp nedstrøms fra ATG og 1 kbp op 5 strøms fra translationsterminerings-signalet. Dette Nrul/Sstll-fragment blev 6 ligeret til et 9,9 kbp fragment, der var frembragt ved nedbrydning med Sstll og ved delvis nedbrydning med Nrul. Dette 9,9 kbp fragment indeholder de DK 176068 B1 48 5,5 kbp af FP-1-flankerende arme, pUC-vektorsekvenser, 1,4 kbp af FeLV-sekvens svarende til den nedstrøms del af env-genet, og sekvensen nærmest 5'-enden (ca. 100 bp) af H6-promotoren. Det resulterende plasmid blev designeret pFeFLVF2. ATG'et til ATG-konstruktion blev bekræftet ved nu-5 kleotidsekvensanalyse.

En yderligere FP-1-indsættelsesvektor, pFeLVF3, blev afledt fra pFeLVF2 ved fjernelse af FeLV-env-sekvenseme svarende til det formodede immunsuppressive område (Cianciolo et al., Science 230:453-455 [1985]) (nukleotid 10 1548 til 1628 i kodesekvensen). Dette blev udført ved isolering af et

Sstll/Pstl-fragment (steder beskrevet ovenfor) på ca. 1 kbp fra vacciniavirus-indsættelsesvektoren pFeLVID. Plasmidet pFeLVID ligner pFeLVIC, bortset fra at env-sekvenserne svarende til det immunsuppresive område (nukleotid 1548 til 1628) var deleteret ved oligonukieotid-dirigeret mutagenese (Man-15 decki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7177-7181 [1987]). Sstll/Pstl-fragmentet på 1 kbp, der mangler nukleotideme 1548 til 1628, blev indsat i et 10,4 kbp Sstll/Pstl-fragment indeholdende det resterende H6/FeLV-env-gen afledt fra pFeLVF2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Indsættelsesplasmiderne pFeLVF2 og pFeLVF3 blev anvendt ved in vitro 2 rekombinations-afprøvninger med FP-1 som det reddende virus. Afkom fra 3 rekombinationen blev udpladet på CEF-monolag og rekombinant virus selek 4 teret ved plakhybridisering på CEF-monolag. Rekombinant afkom, identifice 5 ret ved hybridiseringsanalyser, blev selekteret og underkastet 4 runder pla- 6 koprensning for at opnåen homogen population. En FP-1-rekombinant, hu 7 sende det fuldstændige FeLV-env-gen, er blevet designeret vFP-25, og en 8 FP-1-rekombinant, indeholdende det fuldstændige gen manglende det im 9 munsuppressive område, blev designeret vFP-32. Begge rekombinanter er 10 ved immunpræcipitering under anvendelse af et bovint anti-FeLV polyklonalt 11 serum (Antibodies, Inc., Davis, CA) vist at udtrykke det passende genprodukt. Det er bemærkelsesværdigt, at disse FP-1-rekombinanter udtrykker det DK 176068 B1 49 fremmede FeLV-env-gen i CRFK-cellelinjen (ATCC #CCL94), som stammer fra katte.

Til konstruktion af kanariepox (CP) rekombinanter blev et 2,2 kbp fragment 5 indeholdende H6/FeLV-env-sekvenserne udskåret fra pFeLVF2 ved nedbrydning med Smal og Hpal. Smal-stedet ligger på 5-grænsen af H6-promotorsekvensen. Hpal-stedet er beliggende 180 bp nedstrømsfra transla-tionsterminerings-signalet for kappeproteinets åbne læseramme.

10 Den 2,2 kbp H6/FeLV-env-sekvens blev indsat i det ikke-essentielle EcoRI-sted i indsættelsesplasmidet pRW764.2, efter at EcoRI-stedet var gjort stump-endet. Denne indsættelsesvektor tillader dannelse af CP-rekombinanter indeholder fremmede gener i CP-genomets C4-locus. Det re-kombinante CP-indsættelsesplasmid designeredes derpå pFeLVCP2. Denne 15 konstruktion tilvejebringer et perfekt ATG til ATG substituering.

Indsættelsesplasmidet pFeLVCP2 blev anvendt ved en in vitro afprøvning for rekombination med CP som det reddende virus. Afkom af rekombinanteme blev udpladet påmonolag af CEF og rekombinant virus selekteret ved hjælp 20 af en β-galactosidase-koblet protein-A-immunundersøgelse under anvendelse af et bovint anti-FeLV kommercielt polyklonalt serum (Antibodies, Inc.,

Davis, CA). Positivt farvede plakker blev selekteret og underkastet fire omgange plakoprensning til opnåelse af en homogen population. En rekombinant, der udtrykker hele FeLV-env-genet, er blevet designeret vCP-36.

25 DK 176068 B1 50 EKSEMPEL 16 - Konstruktion af fierkræpox-virus-rekombinant vFP-22, der udtrykker det Rous-associerede virus type 1 (RAV-1) kappe (env) gen 5 Klonen penvRVIPT af RAV-1-kappegenet indeholder 1,1 kbp af RAV-1-env-DNA-kodesekvens, klonet ind i M13mp18 som et Kpnl-Sacl-fragment. Dette fragment er intakt i 5-enden, men mangler en del af 3'-sekvensen, og blev anvendt ved de følgende operationer. Et geloprenset EcoRI-Pstl-fragment på 1,1 kbp fra penvRVIPT blev indsat i EcoRI- og Pstl-stederne i pUC9 til dan-10 nelse af pRW756. Dette plasmid blev derpå nedbrudt med Kpnl og Hindlll, der skar i vektoren 59 baser opstrøms fra ATG. Der indsattes et Kpnl-Hindlll-fragment på 146 bp indeholdende den oven for beskrevne vaccinia-H6-promotor til dannelse af plasmid pCE6.

15 For at sikre, at det initierende ATG fra RAV env genet var beliggende ved siden af 3'-enden af H6-promotoren med fremmede sekvenser deleteret, blev to komplementære syntetiske oligonukleotider konstrueret med EcoRV- og Banll-steder i termini. Oligonukleotidsekvensen var 5'-AT C-CGT-T AA-GTT-T GT -AT C-GT A-AT G-AGG-CGA-GCC-3'.

20

Plasmidet pCE6 blev nedbrudt med EcoRV, der skærer i H6-promotoren 24 baser opstrøms for ATG, og med Banll, der skærer i RAV-env-kodesekvensen 7 baser nedstrøms for ATG. DNA-segmenterne blev ligeret og anvendt til transformation af celler af E. coli. Det resulterende plasmid, 25 pCE7, tilførte slutkonstruktionen H6-promotoren og korrekt 5'-sekvens.

Klonen mp19env (190) fandtes ved restriktionskortlægning at indeholde hele RAV-1 env genet. Et Kpnl-Sacl-fragment af mp19env (190) på 1,9 kbp indeholdende hele genet blev indsat i Kpnl- og Sacl-stedeme af pUC18 til dan-30 nelse af pCE3. Dette plasmid blev nedbrudt med Hpal, der skærer 132 baser nedstrøms fra det initierende ATG i kodesekvensen for RAV-1, og Sacl, der DK 176068 B1 51 skærer ved genets 3’-terminus. FPV-indsættelsesvektoren pCE11, der før er beskrevet, blev nedbrudt med Smal og Sacl, hvilket skar plasmidet i polylin-kerregionen. Hpal-Sacl-fragmentet af pCE3 blev ligeret med pCE11 til dannelse af pCE14.

5

Plasmidet pCE7 blev derpå nedbrudt med Xhol og Hindlll til dannelse af et fragment på 332 bp indeholdende H6-promotoren og korrekt 5'-sekvens. Plasmid pCE14 blev nedbrudt med Hindlll, der skar i vektorens polylinker-region, og Xhol, der skar i kodesekvensen. Dette DNA ligeredes med Hindlll-10 Xhol-fragmentet opnået fra pCE7, hvorved dannedes pCE15, der var den endelige RAV-1-kappegen-konstruktion.

Dette plasmid blev brugt ved en in vitro afprøvning for rekombination med fjerkræpox FP-1 som redningsvirus. Afkom af rekombinationen blev udpladet 15 på CEF-monolag og plakkerne underkastet en β-galactosidase-koblet prote-in-A-immunundersøgelse under anvendelse af et anti-RAV-1 polyklonalt serum. Positivt farvede plakker blev selekteret og underkastet fire omgange plakoprensning for at opnå en homogen population. Rekombinanten blev designeret vFP-22. Immunpræcipiteringsforsøg under anvendelse af cellely-20 sater inficeret med vFP-22 har påvist specifik præcipitering af to proteiner med tilsyneladende molekylvægte på 76,5 kD og 30 kD, der svarer til kappegenets to genprodukter. Der sås ikke noget prækursor-genprodukt.

Ved indledende forsøg er induceret et immunrespons påRAV-l-25 kappegenprodukt i kyllinger inokuleret med vFP-22.

DK 176068 B1 52 EKSEMPEL 17 - Konstruktion af avipox-virus rekombinanter, der udtrykker GP51.30 kappe (env) genet fra okseleukæmi-virus (BLV} 5 (1) Konstruktion af pBLVFI og pBLVF2

Plasmiderne pBLVFI og pBLVF2 indeholder gp51.30-env-genet fra BLV. I begge plasmider er BLV-env-genet under transkriptionel kontrol af H6-promotoren fra vacciniavirus og er klonet mellem flankerende arme af 10 fjerkræpox (locus f7). Nukleotidsekvensen af de to plasmider er identisk, undtagen i codonpositioner 268 og 269. (pBLVFI koder for et protein indeholdende aminosyrerne Arg-Ser i disse to positioner, hvorimod pBLVF2 koder for et protein indeholdende aminosyrerne Gln-Thr).

15 pBLVFI og pBLVF2 blev konstrueret ved følgende procedure. Plasmid pNS97-1, et plasmid indeholdende hele BLV-env-genet, blev skåret med BamHI og delvis skåret med Mstll. Fragmentet på 2,3 kbp, indeholdende hele gp51.30 genet, blev isoleret på en agarosegel og de udragende ender udfyldt med E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment). Der blev derpå ligeret 20 Pstl-linkere til enderne af fragmentet, som, efter nedbrydning med Pstl, blev ligeret ind i Pstl-stedet af pTP 15 (eksempel 15). Herved placeres BLV-genet ved siden af Vaccinia-H6-promotoren. (pTP15 indeholder Vaccinia-H6-promotoren klonet i et ikke-essentielt locus i vacciniagenomet). 1 2 3 4 5 6

Dette plasmid blev derpå skåret med EcoRV og delvis skåret med Avail.

2

Fragmentet på 5,2 kbp blev isoleret og oligonukleotiderne 3 5'-AT CCGTT AAGTTT GT AT CGTAAT GCCCAAAG AACG ACG-3' og 4 5'-GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' anvendt 5 til recirkularisering af plasmidet. Herved fjernes unødvendige baser mellem 6 BLV-genet og H6-promotoren.

DK 176068 B1 53

Det resulterende plasmid blev skåret med Pstl og delvis skåret med Bglll, og 1,7 kbp fragmentet indeholdende det H6-promoterede BLV-gen klonedes ind i BamHI-Pstl-stedet af pCE11, den tidligere beskrevne fjerkræpox-virus-ind-sættelsesvektor, under anvendelse af locus f7. Dette placerer det H6-5 promoterede BLV-gen mellem flankerende arme af fjerkræpox. Dette plasmid blev designeret pBLVF 1.

Der blev anvendt en identisk procedure til konstruktion af pBLVF2 med undtagelse af, at et yderligere in vitro mutagenesetrin blev udført, før det H6-10 promoterede BLV-gen klonedes ind i pCE11. Denne mutagenese blev udført ved følgende procedure. Plasmid pNS97-1 blev skåret med Xmal og delvis skåret med Stul. Fragmentet på 5,2 kbp blev isoleret, og oligonukleotideme 5'-CCGGGT CAGACAAACT CCCGT CGCAGCCCT GACCTT AGG-3’ og 5'-CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC-3' 15 brugt til recirkularisering af plasmidet. Dette ændrer nukleotidsekvensen af codonerne 268 og 269 fra CGC-AGT til CAA-ACT.

(2) Konstruktion af rekombinant vira 20 Plasmideme pBLVFI og pBLVF2 blev anvendt ved en in vitro afprøvning for rekombination under anvendelse af FP-1 som redningsvirus. Rekombinant afkom blev selekteret ved in situ plakhybridisering, og når populationen ved dette kriterium blev bedømt som værende ren, blev plakkeme undersøgt ved en β-galactosidase protein-A-immunundersøgelse under anvendelse af en 25 præparation af BLV-gp-specifikt monoklonalt antistof. Begge rekombinanter vFP23 og vFP24, dannet fra hhv. plasmid pBLVFI og pBLVF2, udviste positiv farvning ved immunundersøgelsen, hvilket indikerede, at et immunologisk genkendeligt glycoprotein blev udtrykt på overfladen af de inficerede celler. 1

Plasmideme pBLVK4 og pBLVK6 indeholder hhv. BLV-env-gp51.30-genet og BLV-gp51.30-cleavage-minus-genet. Begge gener er indklonet i det unikke DK 176068 B1 54

EcoRI-sted af pRW764.2 (locus C3) (pRW764.2 er beskrevet i eksempel 13) og er under transkriptionskontrol af Vaccinia-H6-promotoren.

Plasmideme opnåedes ved følgende procedure: pBLVFI og pBLVF2 blev 5 skåret med restriktionsenzymet Hindlll. Oiigonukleotidet BKL1 (AGCTT-GAATTCA) blev klonet ind i dette sted, hvorved dannedes et EcoRI-sted 3’ i forhold til BLV-genet. Da der også er et EcoRI-sted 5' i forhold til BLV-genet, blev disse plasmider (pBLVKI og pBLVK2) skåret med EcoRI, og fragmentet indeholdende det H6-promoterede BLV-gen blev klonet ind i EcoRI-stedet af 10 pRW764.2. De resulterende plasmider blev designeret hhv. pBLVK4 og pBLVK6. Disse plasmider blev anvendt ved en in vitro afprøvning for rekombination med kanariepox som redningsvirus. Rekombinanter blev udvalgt og oprenset på basis af overfladeudtrykkelse af glycoproteinet, vist ved en immunprøvning. Rekombinanterne blev designeret vCP-27 og vCP-28 fra hhv.

15 plasmideme pBLVK4 og pBLVK6.

Fjerkræpox-rekombinanter vFP-23 og vFP-24 er blevet inokuleret i får og kvæg ved forskellige indgivelsesveje. Dyrene fik to inokuleringer, den anden 45 dage efter den første. Serumprøver blev taget 5 uger efter den første ino-20 kulering og to uger efter den anden inokulering. Antistof mod gp51 blev målt ved en kompetitiv ELISA-afprøvning og titeren udtrykt som den reciprokke af serumfortyndingen, hvilket giver en 50% reduktion af kompetition. Resultaterne er vist i tabel XI. 1

Ingen af de afprøvede arter udviste et påviseligt immunrespons efter den første inokulering. Både får og kvæg udviste en signifikant antistof-stigning efter den anden inokulering.

DK 176068 B1 55

TABEL XI

Inokulerina af får og kvæg med vFP-23 oq vFP-24 5 Dyr Virus Dosis og indgivelsesvei ELISA Titer Første Anden Første Anden

Kvæg B56 FP-1 1(^+1083 108+108 0 0 B59 FP-1 ID subcut 0 0 10 Får M89 FP-1 0 0 M91 FP-1 0 0

Kvæg B62 vFP-23 108+108 108+108 0 200b B63 vFP-23 ID subcut 0 80 15 Får M83 vFP-23 0 80 M84 vFP-23 0 500 M85 vFP-23 0 100

Kvæg B52 vFP-24 1 08+108 1 08+108 0 200 20 B53 vFP-24 ID subcut 0 60 Får M87 vFP-24 O 200 M92 vFP-24 O 20 M93 vFP-24 O 20 25 a Intradermale injektioner blev givet to steder b Titer udtrykt som den reciprokke af fortyndingen, hvilket giver 50% kompetition.

EKSEMPEL 18 - Konstruktion af fierkræpox-virus FP-1 rekombinant vFP-30 26, der udtrykker infektiøs-bronchitis-virus-Mass-41- matrixgenet

Plasmid plBVM63 indeholder en infektiøs-bronchitis-virus (IBV) cDNA-klon af stamme Mass-41-matrixgenet. Et EcoRI-fragment på 8 kbp af plBVM63 in-35 deholder matrixgenet med peplomergenet opstrøms (5’), og videre opstrøms er der et EcoRV-sted. Plasmid pRW715 har en EcoRI-koblingssekvens, der forbinder de to Pvull-steder i pUC9. EcoRI-fragmentet på 8 kbp fra plBVM63 DK 176068 B1 56 blev indsat i EcoRI-stedet i pRW715, hvorved dannedes pRW763. Plasmid pRW776 blev dannet til deletering af det 5'-beliggende EcoRI-sted i pRW763, hvilket efterlod et unikt EcoRI-sted nedstrøms (3‘) fra matrixgenet. Det isolerede lineære delvise EcoRI-nedbrydningsprodukt af pRW763 blev skåret igen 5 med RcoRV. Det største fragment blev isoleret, gjort stump-endet med Kle-now-fragmentet fra DNA polymerase I og selvligeret til dannelse af pRW776. Konstruktionen pRW776 har de fuldstændige IBV-peplomergener og IBV-matrixgener efterfulgt af et enkelt EcoRI-sted.

10 Kun 5'- og 3'-endeme af matrixgenet på ca. 0,9 kbp er blevet sekventeret. Begyndende ved den translationsinitierende codon (ATG) indeholder 5'-sekvensen af matrixgenet det følgende understregede Rsal-sted: AT-GT CC AACG AG AC AAATT GTAC. Den tidligere beskrevne H6-promotor blev forbundet til matrixgenet med et syntetisk oligonukleotid. Det syntetiske oli- 15 gonukleotid indeholdt H6-sekvensen fra dens RcoRV-sted til ATG og ind i den matrix-kodende sekvens gennem det første Rsal-sted. Oligonukleotidet blev syntetiseret med BamHI- og EcoRI-kompatible ender til indsættelse i pl)C9, hvorved dannedes pRW772. EcoRI-enden ligger 3’ i forhold Rsal-stedet. Begyndende ved den BamHI-kompatible ende, med ATG under- 20 streget, er sekvensen af det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid:

GATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCAACGAGACAAATTGTACG

CGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAGGTTGCTCTGTTTAACATGCTTAA 1 30

Det lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW772 blev isoleret og skåret igen med RcoRI. pRW772-fragmentet, indeholdende en enkelt skæring i det ovennævnte Rsal-sted og skåret igen med EcoRI, blev isoleret, behandlet med phosphatase og anvendt som en vektor for pRW776-nedbrydningsproduktet nedenfor.

DK 176068 B1 57

Det isolerede lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW776 blev skåret igen med RcoRI. EcoRI ligger lige efter 3-enden af matrixgenet. Et isoleret Rsal-EcoRI-fragment på ca. 0,8 kbp, indeholdende matrix-kodesekvensen fra det ovennævnte Rsal-sted, blev indsat i ovennævnte 5 pRW772-vektor til dannelse af pRW783. Den fuldstændige H6-promotor blev dannet ved tilføjelse af sekvenser 5' i forhold til EcoRV-stedet. H6-promotorens 5’-ende var et Hinfl-sted, der var stump-endet ind i pUC9's Sall-sted, hvorved dannedes et EcoRI-sted; 5’ i forhold til H6-promotoren ligger pUC9’s Hindil l-sted. Hindlll-EcoRV-fragmentet indeholdende 5' H6- 10 promotoren blev indsat mellem Hindlll- og EcoRV-stederne i pRW783 til dannelse af pRW786. pRW786's EcoRI-fragment, indeholdene det fuldstændige H6-promoterede matrixgen, blev gjort stump-endet med Klenow-fragment fra DNA-polymerase I og indsat i det stump-endede BamHI-sted i pRW731.15 (locus f8) til dannelse af pRW789. pRW731.15-BamHI-stedet er 15 det FP-1 -locus, der i eksempel 6 bruges til konstruktion af vFP-8.

Plasmid pRW789 blev anvendt ved konstruktionen af vFP-26. Rekombinante plakker blev selekteret og behandlet ved in situ plakhybridisering.

20 Ved indledende afprøvninger er induceret et immunrespons mod IBV-matrixproteinet i kyllinger inokuleret med vFP-26.

EKSEMPEL 19 - Konstruktion af fierkræpox-virus FP-1 rekombinant vFP- 31. der udtrykker infektiøs-bronchitis-virus (IBV1 peplo-25 mer

Infektiøs-bronchitis-virus (IBV) Mass-41 cDNA-klon pIBVM 63 og dens sub-klon pRW776 er blevet beskrevet ved konstruktionen af vFP-26 i eksempel 18. Subklon pRW776 indeholder IBV-peplomergenet på 4 kbp efterfulgt af 30 matrixgenet med et unikt EcoRI-sted i 3-enden. Kun 5’- og 3’-endeme af IBV-peplomergenet på ca. 4 kbp er blevet sekventeret. Et unikt Xbal-sted DK 176068 B1 58 adskiller de to gener. 5’-enden af peplomergenet, der starter ved translations-initieringscodonen (ATG), indeholder det følgende understregede Rsal-sted: AT GTTGGT AACACCT CTTTT ACT AGT G ACT CTTTT GT GT GT AC. Den tidligere beskrevne H6-promotor blev forbundet med peplomergenet ved et syn-5 tetisk oligonukleotid. Det syntetiske oligonukleotid indeholder H6-promotor-sekvensen fra Nrul-stedet til ATG og ind i den peplomer-kodende sekvens gennem det første Rsal-sted. Oligonukleotidet blev syntetiseret med BamHI-og EcoRI-kompatible ender til indsættelse i pUC9, hvorved dannedes pRW768. EcoRI-enden ligger 3’ i forhold Rsal-stedet. Begyndende ved den 10 BamHI-kompatible ende, med ATG understreget, er sekvensen af det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid:

GATCTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTTGGTAACACCTCTT

AGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAACCATTGTGGAGAA

15 TTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACG

AATGATCACTGAGGAAACACACATGCTTAA

Det isolerede lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW768 blev skåret igen med EcoRI. pRW768-fragmentet, indeholdende en enkelt skæ-20 ring i det ovennævnte Rsal-sted og skåret igen med EcoRI blev isoleret, behandlet med phosphatase og anvendt som en vektor for pRW776-ned-brydningsproduktet nedenfor.

Det isolerede lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW776 blev 25 skåret igen med RcoRI. pRW776 fragmentet på 5 kbp, indeholdende en enkelt skæring i det ovennævnte Rsal-sted, til EcoRI-stedet blev isoleret; fragmentet indeholder IBV-sekvenser fra ovennævnte peplomer-Rsal-sted til EcoRI-stedet i 3-enden af matrixgenet. Indsættelse af pRW776-fragmenet i ovennævnte pRW768-vektor frembragte pRW788. Matrixgenet blev fjernet 30 ved det oven for fremhævede Xbal-sted. 5' H6-promotoren blev indføjet i Nrul-stedet ved indsættelse af det stump-endede pRW788-Nrul-Bbal-frag- 59 DK 176068 B1 ment på 5 kbp i den stump-endede pRW760 Nrul-BamHI-vektor til frembringelse af pRW790. Vektoren pRW760 er beskrevet i eksempel 11; kort beskrevet er det et Vaccinia-H6-promoteret influenza-nukleoprotein flankeret af det ikke-essentielle FP-1 locus f7. pRW760-vektoren blev fremstillet ved at 5 fjerne 3’ H6-sekvenserne fra Nrul-stedet til enden af nukleoproteinet ved BamHI. pRW790 er H6-promoteret IBV-peplomer i Hincll-stedet af pRW731.13. Rekombination af donorplasmidet pRW790 med FP-1 resulterede i vFP-31. Immunpræcipiteringsforsøg med anvendelse af CEF-lysater fremstillet fra celler inficeret med vFP-31 har vist specifik præcipitering af en 10 lille mængde prækursorprotein med en molekylvægt på ca. 180 kD og af kløvningsprodukteme på90 kD.

EKSEMPEL 20 - Konstruktion af fjerkræpox-virus FP-1-rekombinant vFP-30. der udtrykker herpes simplex-virus-qD 15

Herpes simplex-virus (HSV) type-1-stamme-KOS-glycoprotein-D-gen (gD) blev klonet ind i pUC9 BamHI-stedet som et 5' BamHI koblet Hpall til 3’

BamHI koblet Nrul fragment; med 5-enden ved siden af pUC9's Pstl-sted. 5'-sekvensen af HSV-gD, begyndende ved translationsinitieringscodonen 20 (ATG), indeholder følgende understregede Ncol-sted: ATGGGGGGGGCTGCCGCCA6GTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTGGG cctccatgg. Den tidligere beskrevne Vaccinia-H6-promotor blev forbundet med HSV-gD-genet ved et syntetisk oligonukleotid. Det syntetiske oligo-nukleotid indeholder 3'-delen af H6-promotoren fra Nrul til ATG ind i gD-25 kodesekvensen til Ncol-stedet. Oligonukleotidet blev syntetiseret med en 5'-Pstl-kompatibel ende. gD-klonen i pUC9 blev skåret med Pstl og Ncol, og 5’-HSV-sekvensen fjernet til udskiftning med det syntetiske oligonukleotid, hvorved dannedes pRW787. Sekvensen af det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid er: 30 DK 176068 B1 60 GTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCG- ACGTGAGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCCTCCACGGC-

CAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTATAGTAGGACTC 5 GT C GAT C T AAT C CAC GACAAT AAAAT AAACAT CAATAT CAT C C T GAGGT AC

Nedbrydning af pRW787 med Nrul og BamHI frembringer et fragment på ca.

1,3 kbp indeholdende 3'-H6-promotoren fra Nrul-stedet, gennem HSV-gD-kodesekvensen til BamHI-stedet. pRW760-vektoren, skåret med Nrul og 10 BamHI, er beskrevet i eksempel 11. Indsættelse af 1,3 kbp-fragmentet i pRW760-vektoren førte til pRW791. pRW791-vektoren indeholder det fuldstændige vaccinia-H6-promoterede HSV-gD-gen i det ikke-essentielle FP-1-Hincll-sted i pRW731.13 (locus f7).

15 Rekombination af donorplasmidet pRW791 med FP-1 resulterede i vFP-30. Overfladeudtrykkelse af glycoproteinet blev påvist i rekombinante plakker under anvendelse af en β-galactosidase-koblet protein-A-immunprøvning og HSV-1-specifikke sera.

20 EKSEMPEL 21 - Anvendelse af entomopox-promotorer til regulering af udtrykkelse af fremmede gener i pox-virus-vektorer (a) Baggrund. Poxvira fra insekter (entomopox) klassificeres for øjeblikket i underfamilien Entomopoxvirinae, der yderligere underopdeles i tre slægter 25 (A, B og C) svarende til entomopoxvira isoleret fra insektordnerne, hhv. Co- leoptera, Lepidoptera og Orthoptera. Entomopox-vira har et snævert værtområde i naturen og er ikke kendt for at replikere i nogen vertebratarter.

Entomopox-viruset anvendt ved disse forsøg var oprindeligt isoleret fra infice-30 rede larver af Amsacta moorei (Lepidoptera: arctildae) fra Indien. (Roberts og -:- ---- DK 176068 B1 61

Granados, J. Invertebr. Pathol. 12:141-143 [1968]). Viruset, designeret AmEPV, er typearten for slægt B.

Vildtype AmEPV blev opnået fra Dr. R. Granados (Boyce Thompson Institute, 5 Cornell University) som infektiøs hæmolymfe fra inficerede larver af Estigme-ne acrea. Viruset fandtes at replikere i en invertebrat-celielinje, IPLB-LD652Y, afledt fra ovarievæv hos Lymantria dispar (gypsy moth) (beskrevet af Goodwin et al., In Vitro 14:485-494 [1978]). Cellerne blev dyrket i IPL-528-medier suppleret med 4% føtal kalve- og 4% kyllingesera ved 28 °C.

10

Vi Idtype-vi ruset blev plakprøvet på LD652Y-celler, og én plak, designeret V1, blev udvalgt til videre forsøg. Dette isoiat danner sent i infektionscyklusen talrige okklusionslegemer (occlusion bodies - OB) i cytoplasmaet af de inficerede celler.

15 (b) Promotor-identifikation. Identifikationen og kortlægningen af en AmEPV-promotor blev opnået på følgende måde. Totalt RNA fra sent inficerede LD652Y-celler (48 timer efter infektion) blev isoleret og brugt til fremstilling af 32P-mærket førstestrengs-cDNA. cDNAet blev derpå anvendt til probe-20 undersøgelse af aftryk indeholdende restriktionsnedbrydningsprodukter af AmEPV-genomet. Denne Southern blot afslørede et stærkt signal pået Clal-fragment på 2,6 kbp, hvilket indikerede, at fragmentet kodede for et stærkt udtrykt gen. Fragmentet blev klonet ind i en plasmidvektor og dets DNA-sekvens bestemt.

25

Analyse af sekvensdataene afslørede en åben læseramme i stand til at kode for et 42 kD polypeptid. In vitro translation af det totale RNA 48 timer efter infektion og adskillelse af produkterne ved SDS-PAGE afslørede et polypeptid på ca. 42 kD.

30 DK 176068 B1 62 (c) Konstruktion af et rekombinant vacciniavirus med udtrvkkelse af et fremmed gen under entomopox-promotorens kontrol. Til bestemmelse af, om en entomopox-promotor ville fungere i et vertebrat-poxvirus-system, blev det følgende plasmid konstrueret. Der blev kemisk syntetiseret et oligonukleotid 5 indeholdendede de 107 baser beliggende i 5’-retningen fra 42K-gen-transla-tionsstartsignalet (herefter betegnet AmEPV-42K-promotoren), flankeret af et Bglll-sted i 5’-enden og de første 14 baser af området kodende for hepatitis-B-virus-præ-S2, derender i et EcoRI-sted, i 3'-enden. AmEPV-42K-promotor-sekvensen er beskrevet nedenfor.

10

TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATC

TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA

ATATGATAATATTTTGGGATTTCAAA

ATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATG

15

AmpEPV-42K-promotoren blev ligeret til hepatitis B-virus-overfladeantigenet (HBVsAg) som følger. Der konstrueredes et pUC-plasmid indeholdende hepatitis B-overfladeantigenet og det præ-S2-kodende område (type ayw beskrevet af Galibert et al., Nature 281:646-650 [1979]) flankeret af vaccinia- 20 virus-arme i det ikke-essentielle område af vaccinia-virus-genomet, der koder for hæmagglutinin (HA) molekylet (HA-arme beskrevet i eksempel 15; HA-område beskrevet af Shida, Virology 150:451-462 [1962]). Oligonukleotidet beskrevet ovenfor blev indsat i dette plasmid ved at anvende det unikke EcoRI-sted i det HBVsAg-kodende område og et unikt Bglll-sted i HA- 25 vaccinia-armen. Det resulterende rekombinante vaccinia-virus blev designeret vP547.

Udtrykkelse af den indsatte HBVsAg-kodesekvens under kontrol af entomo-pox-42K-promotoren blev bekræftet under anvendelse af en immunprøvning.

30 Ækvivalente kulturer af den mammale cellelinje BSC-40 blev inficeret med parentalt vaccinia-virus eller rekombinant vP547. 24 timer efter infektion blev DK 176068 B1 63 cellerne lyseret og lysatet i seriefortyndinger påført en nitrocellulosemembran. Membranen blev først inkuberet med et gede-anti-HBV-serum og derpå med 125l-Protein A. Efter vaskning blev membranen eksponeret på en røntgenfilm. Der blev påvist positive signaler i kulturer inficeret med vP547, 5 men ikke i kulturer inficeret med parentalt virus, hvilket indikerer genkendelse af AmEPV-42K-promotoren af vaccinia-virus i mammale celler.

Disse resultater blev verificeret under anvendelse af en Ausria-prøvning (se eksempel 1 for detaljer) til påvisning af HBVsAg i inficerede mammale celler.

10 Vaccinia-virus-rekombinanter indeholdende HBsAg-genet koblet til AmEPV-42K-promotoren eller vaccinia-virus-H6-promotoren blev anvendt til inficering af BSC-40-celler, og udtrykkelsesniveauet af sAg prøvet ved Ausria-afprøvningsmetoden. Som det ses i tabel XII, viser dataene, at udtrykkelsesniveauet af HBsAg ved anvendelse af 42K-promotoren var signifikant.

15

TABEL XII

Udtrykkelse af HBVsAg i rekombinant vaccinia-virus 20 Rekombinant virus Promotor Ausria P/N-forhold vP410 Kontrol 1,0 vP481 H6 24,3 VP547 42K 44,9 25

Yderligere forsøg blev udført for at fastlægge den tidsmæssige faktor ved reguleringen af AmEPV-42K-promotoren i en vertebrat-poxvirus-baggrund. Ækvivalente kulturer af BSC-40 celler blev inficeret med vP547 i nærvær eller fravær af 40 pg/ml cytosinarabinosid, der er en DNA-replikationsinhibitor, 30 som derfor blokerer sen viral transkription. Udtrykkelsesniveauer 24 timer efter infektion blev prøvet ved en Ausria-afprøvning. Resultaterne indikerede, DK 176068 B1 64 at 42K-promotoren blev genkendt som en tidlig promotor i et vaccinia-virus-replikationssystem.

Bemærk at brugen af AmEPV-42K-promotoren til udtrykkelse af fremmede 5 gener i et pattedyrsystem er klart forskellig fra brugen af Autographa califor-nica-NPV-polyhedrin-promotoren til genudtrykkelse i invertebratsystemer (Luckow og Summers, Biotechnology 6:47-55 [1988]). Polyhedrin- promotoren genkendes ikke af transkriptionsapparatet i pattedyrceller (Tjla et al., Virology 125:107-117 [1983]). Anvendelsen af AmEPV-42K-promotoren i 10 pattedyrceller repræsenterer den første gang, en insektvirus-promotor er blevet brugt til udtrykkeisen af fremmede gener i en ikke-insekt viral vektor i ik-ke-invertebratceller.

Til bestemmelse af, om avipoxvira også ville genkende 42K-entomopox-15 promotoren, blev følgende forsøg udført. Identiske kulturer af CEF-celler blev inokuleret med 10 pfu pr. celle af enten fjerkræpoxvirus, kanariepoxvirus eller vacciniavirus og samtidigt transfekteret med 25 pg af ét af følgende plasmi-der: 1) plasmid 42K.17 indeholdende HBV-præ-S2 + sAg-kodesekvensen koblet til 42K-promotoren eller 2) plasmid pMP15.spsP indeholdende den 20 identiske HBVsAg-kodesekvens koblet til den tidligere beskrevne vaccinia-virus-H6-promotor. Efter 24 timer blev kulturerne frosset, cellerne lyseret, og lysatet analyseret for tilstedeværelsen af HBVsAg under anvendelse af en Ausria-afprøvning. (se eksempel 1). 1 2 3 4 5 6

Resultaterne vist i tabel XIII skal anskues kvalitativt. De indikerer, at 2 transkriptionsapparatet af både fjerkræpox og kanariepox er i stand til at gen 3 kende 42K-promotoren og tillade transkription af den koblede HBVsAg- 4 kodesekvens. Skønt udtrykkelsesniveaueme er lavere end de, der opnåedes 5 med vaccinia-virus-H6-promotoren, ligger niveauerne pænt over baggrunds- 6 niveauer opnået med de negative kontroller.

DK 176068 B1 65

TABEL XIII

Genkendelse af 42K-entomopox-promotor af avipoxvira 5 Virus Promotor P/N-forhold

Fjerkræpox 42K 39,1 H6 356,8 10 Kanariepox 42K 90,2 H6 222,2

Vaccinia 42K 369,4 H6 366,9 15

Ingen 42K 7,8

Ingen H6 7,2

Vaccinia - 7,2 20 EKSEMPEL 22 - Immunisering med VCP-16 til beskyttelse af mus mod udfordring med levende rabiesvirus j Grupper på tyve mus, 4 til 6 uger gamle, blev inokuleret under foden med 50 25 til 100 pi af en række fortyndinger af enten den ene eller den anden af to re-kombinanter: (a) vFP-6, fjerkræpox-rabies-rekombinanten beskrevet i eksempel 6, og (b) vCP-16, kanariepox-rabies-rekombinanten beskrevet i eksempel 13.

30 Efter 14 dage blev 10 mus fra hver gruppe slået ihjel og serum opsamlet. Anti-rabies-titeren i serumet blev beregnet ved brug af en RFFI-afprøvning (beskrevet i eksempel 7). De tilbageværende 10 mus i hver gruppe blev ud-fordret ved intracerebral inokulering med CVS-stammen af rabies-virus anvendt i eksempel 7. Hver mus modtog 30 μΙ, svarende til 16 muse-LDso- Efter 35 28 dage blev overlevende mus vurderet og den beskyttende dosis 50 (PD50) beregnet, resultaterne er vist i tabel XIV.

DK 176068 B1 66

Beskyttelsesniveauet for mus, fundet ved inokulering af vFP-6, bekræfter resultatet fundet efter inokulering af Ijerkræpox-rekombinanten vFP-3 diskuteret i eksempel 7. Det beskyttelsesniveau, som fås ved inokulering af vCP-5 16, er betydeligt højere. På basis af den beregnede PDsoer kanariepox- rabies-rekombinanten 100 gange mere effektiv til beskyttelse mod rabiesudfordring end fjerkræpox-rabies-rekombinanten.

TABEL XIV

10

Beskyttende immunitet mod udfordring med rabies-virus udløst af to avipox-rabies-rekombinanter

Fjerkræpox vFP-6 Kanariepox vCP-16 15 Overle Overle-

Inokulum- RFFI- velses- Inokulum- RFFI- velses- dosis_titer_forhold_dosis_titer_forhold_ 7,5a 2,3b 7/10 6,5 2,5 10/10 20 5,5 1,8 5/10 4,5 1,9 8/10 3.5 0,7 0/10 2,5 1,1 1/10 1.5 0,6 0/10 0,5 0,4 0/10 1 PD50 = 6,17 1 PD50 = 4,18 a Virustitere udtrykt som logio TCID50.

25 b RFFI-titer udtrykt som log10 af højeste serumfortynding der giver over 50% reduktion i antallet af fluorescerende brønde i en RFFI-afprøvning.

DK 176068 B1 67 EKSEMPEL 23 - Anvendelse af rierkræpox-promotorelementer til udtrvk-kelse af fremmede oener I. Identificering af fierkræpox-oenet. der koder for et genprodukt på 25.8 5 kiloDalton (kD)

Visualisering af proteinarter til stede i fjerkræpox (FP-1) inficerede CEF-lysater, ved farvning af SDS-polyacrylamidgeler med Coomassie-blåt, afslørede en i stor mængde forekommende art med en tilsyneladende mole-10 kylvægt på 25,8 kD. Dette protein var ikke til stede i uinficerede cellelysater. Impulsforsøg med anvendelse af 35S-methionin til radiomærkning af syntetiserede proteiner på specifikke tidspunkter efter infektion anskueliggjorde igen rigeligheden af det FP-1-inducerede protein og viste, at det syntetiseres fra 6 til 54 timer efter infektion. På sit højdepunkt udgør dette FP-1-protein på25,8 15 kD ca. 5% til 10% af totalt protein til stede i cellelysatet.

Den rigelige forekomst af det FP-1-inducerede 25,8 kD protein tydede på, at genet, der koder for dette genprodukt, reguleres af et stærkt FP-1-promotorelement. For at lokalisere dette promotorelement med henblik påse-20 nere anvendelse ved udtrykkeisen af fremmede gener i pox-virus-rekombinanter, opnåedes en polysom præparation fra FP-1-inficerede CEF-celler 54 timer efter infektion. RNA blev isoleret fra denne polysome præparation og frembragte, når anvendt til at programmere et in vitro kanin-reticulocyt-translationssystem, fortrinsvis FP-1-proteinet på 25,8 kD.

25

Det polysome RNA blev også brugt som en skabelon for syntese af første-strengs-cDNA under anvendelse af oligo (dT) 12-18 som en initiator. Første-strengs-cDNAet blev anvendt som en hybridiseringssonde ved Southern blotanalyser med nedbrydningsprodukter af FP-1-genomet. Resultater fra disse 30 hybridiseringsanalyser tydede på, at genet, der koder for 25,8 kD-proteinet, var indeholdt i et Hind I Il-fragment på 10,5 kbp. Dette genomiske Hindlll- DK 176068 B1 68 fragment blev derefter isoleret og ligeret ind i en kommerciel vektor, pBS (Stratagene, La Jolls, CA), og klonen designeredes pFP23K-1. Yderligere hybridiseringsanalyser under anvendelse af førstestrengs-cDNAet til sondering af nedbrydningsprodukter af pFP23k-1 lokaliserede 25,8 kD-genet til et 5 EcoRV-subfragment på 3,2 kbp. Fragmentet blev subklonet ind i pBS og designeret pFP23k-2.

Ca. 2,4 kbp af dette FP-1-EcoRV-fragment er blevet sekventeret ved Sanger dideoxy-kædetermineringsmetoden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

10 USA 74:5463-5467 [1977]). Analyse af sekvensen afslører en åben læseramme (open reading frame - ORF), der koder for et genprodukt med en molekylvægt på 25,8 kD. In vitro transkription af denne ORF med bakteriofag T7 polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) i en pBS-vektor frembringer en RNA-art, som, når den anvendes til at programmere et in vitro kanin-reticulocyt-15 translationssystem (Promega Biotec, Madison, Wl), giver en polypeptid-art med en tilsyneladende molekylvægt på 25,8 kD. I en SDS-polyacrylamidgel bevæger dette polypeptid sig sammen med det i stor mængde forekommende 25,8 kD-protein observeret i lysater fra FP-1 -inficerede CEF-celler. Resultaterne tyder på, at dette er genet, der koder for det rigeligt forekom-20 mende FP-1-inducerede genprodukt på 25,8 kD. 1

Anvendelse af opstrøms-promotorelementeme af FP-1-genet på 25,8 kD til udtrvkkelse af katteleukæmivirus (FeLV) env-qenet i rekombinanter af FP-1 og vaccinia.

25

Et EcoRV/EcoRI-fragment på 270 bp indeholdende det regulerende område (FP25.8K-promotor) for FP-1-genet på 28,5 kD og 21 bp af kodesekvensen for 25,8 kD-genet blev isoleret fra pFP23k-2. Nedenfor er vist nukleotidse-kvensen af FP25.8K-promotorområdet anvendt til opnåelse af pFeLV25.8F1 30 og pFeLV25.81A. Denne sekvens på 270 nukleotider udgør 249 nukleotider DK 176068 B1 69 af området opstrøms for initieringscodonen (ATG) for 25,8 kD genproduktet og de første 21 bp af kodesekvensen.

5 1 -GATATCCCCATCTCTCCAGAACAGCAGCATAGTGTTAGGACAATCATCTAA-5 TGCAATATCATATATGAATCTCACTCCGATAGGATACTTACCACAGCTATTATA-CCTTAATGTATGTTCTATATATTTAAAAACAGAAACAAACGGCTATAAGTTTAT-ATGATGTCTATATTATAGTGAGTATATTATAAGTATGCGGGAATATCTTTGATT-TAACAGCGTACGATTCGTGATAAGTAAATATAGGCAATGGATAGCATAAATGAA-TTC-3' 10

Dette fragment blev gjort stump-endet og derpå indsat i en Smal-nedbrudt FP-1-indsættelsesvektor (pFeLVFI, se eksempel 15) indeholdende FeLV-env-sekvenseme. Denne indsættelsesvektor muliggjorde rekombination med f7-locuset af FP-1-genomet. Indsættelse af FP25.8K-promotorens opstrøms-15 sekvenser 5' i forhold til FeLV-env-genet, og med den rigtige orientering, blev bekræftet ved sekvensanalyse. Denne indsættelse giver ikke en nøjagtig substition af ATG med ATG, men ATGet fra 25,8 kD-genet er ude af ramme med FeLV-env-ATGet, så der dannes ikke noget fusionsprotein. FP-1-indsættelsesplasmidet indeholdende FP25.8KD-promotoren opstrøms fra 20 FeLV-env-genet blev designeret pFeLV25.8F1.

En lignende konstruktion blev fremstillet ved anvendelse af vaccinia virusindsættelsesvektoren, pFeLVIA, husende FeLV-genet (se eksempel 15). Høpromotoren blev fjernet fra pFeLVIA ved nedbrydning med Bglll og Smal.

25 Efter at Bglll-restriktionsstedet var gjort stump-endet, blev det stump-endede 270 bp EcoRV/EcoRI-fragment indeholdende FP25.8K-promotoren indsat sidestillet 5' i forhold til FeLV-env-genet. Denne konstruktion blev bekræftet ved sekvensanalyse. Der er heller ikke en nøjagtig substitution af ATG med ATG i denne rekombinant, men ATGet fra 25,8 kD-genet er ikke i ramme 30 med ATGet fra FeLV-genet. Vaccinia (Copenhagen-stamme) indsættelses- DK 176068 B1 70 vektoren, husende 25,8 kD-genets opstrømsområde sidestillet 5' i forhold til FeLV-genet, blev designeret pFeLV25.81A.

Indsættelsesplasmiderne pFeLV25.8F1 og pFeLV25.81A blev anvendt ved in 5 vitro rekombination med FP-1 (pFeLV25.8F1) og Copenhagen-stammen af vacciniavirus (pFeLV25.81A) som de reddende vira. Afkom af rekombinationen blev udpladet på passende cellemonolag, og rekombinant virus valgt ved en β-galactosidase-koblet protein-A-immunprøvning og et bovint anti-FeLV-serum (Antibodies, Inc., Davis, CA). Foreløbige resultater tyder på, 10 at FP25.8K-promotoren kan regulere udtrykkeisen af fremmede gener i pox-virus-rekombinanter.

EKSEMPEL 24 - Sikkerhed oo virkninqsfuldhed af vFP-6 og vCP-16 i fjerkræ 15

De to avipox-rekombinanter, vFP-6 og vCP-16 (beskrevet i eksemplerne 6 og 13), blev inokuleret i 18 dage gamle kyllingefostre, 1 dag gamle kyllinger og 28 dage gamle kyllinger, og fuglenes respons evalueret ved tre kriterier: 1) virkninger af vaccination på klækningsevne, vaccinationsreaktioner og døde-20 lighed 2) induceret immunrespons mod rabies-glycoproteinet, og 3) induceret immunrespons mod fjerkræpox-antigener. De udførte forsøg er beskrevet nedenfor.

A. Sikkerhedsafprøvninaer. Grupper på tyve 18 dage gamle fostre blev in-25 okuleret i allantoishulen med 3,0 eller 4,0 logio TCID50 af enten vFP-6 eller vCP-16. Efter udrugning blev kyllingerne observeret i 14 dage, på hvilket tidspunkt de' hver fik udtaget blod, og sera opsamledes. De to rekombinanter inokuleret i kyllingefostrene havde ingen virkning på udrugningsevnen af æggene, og kyllingerne forblev sunde under den 14 dage lange obser-30 vationsperiode.

_____ DK 176068 B1 71

Grupper på 10 SPF 1 dag gamle kyllinger blev ved intramuskulær indgivelse inokuleret med 3,0 logio TCID50 af hver af rekombinanteme. Kyllingerne blev observeret i 28 dage og serumprøver opsamlet 14 og 28 dage efter in-okulering. Der sås ingen vaccinationsreaktion på inokuleringsstedet med no-5 gen af rekombinanteme, og kyllingerne forblev sunde under den 28 dage lange observationsperiode.

Grupper på ti 28 dage gamle kyllinger blev inokuleret med hver af de rekom-binante vira, idet de modtog enten 3,0 logi0 TCID50 ved intramuskulær ind-10 givelse eller 3,0 log-io TCID50 ved cutan indgivelse (vingemembran). Kyllinger blev observeret i 28 dage og serumprøver opsamlet 14 og 28 dage efter ino-kulering. Der sås ingen reaktion efter intramuskulær inokulering med nogen af rekombinanteme. Cutan inokulering resulterede i en meget lille vaccinationsreaktion over for fjerkræpox med læsioner af heterogen størrelse. Kana-15 riepox-inokulering førte til dannelsen af en normal cutan læsion på inokuleringsstedet. Alle læsioner var i tilbagegang ved afslutningen af forsøget.

B. Immunrespons. RFFI-afprøvningen beskrevet i eksempel 7 blev anvendt til vurdering af niveauerne af antistof mod rabiesglycoproteinet. For hver gruppe 20 blev resultaterne udtrykt med den geometriske middeltiter af det individuelle serum omregnet til internationale enheder (IU) ifølge et standardserum, der indeholdt 23,4 IU. Minimums-positivitetsniveauet blev fastsat til én IU og blev brugt til bestemmelse af % positive fugle. Antistoffer mod avipox-viraene blev afprøvet ved en ELISA-metode med brug af fjerkræpoxvirus-stammen som et 25 antigen. Hver serumprøve blev fortyndet 1/20 og 1/80. Der konstrueredes en standardkurve under anvendelse af positive og negative sera. Minimumspositivitetsniveauet blev beregnet med middelværdien af de forskellige værdier af de negative sera lagt til med to standardafvigelser. 1

Resultaterne af serologiske undersøgelser er vist i tabel XV for vFP-6 og tabel XVI for vCP-16.

DK 176068 B1 72

Der observeredes et begrænset serologisk respons for både rabies- og fjerkræpox-antigener med fostre inokuleret med enten vFP-6 eller vCP-16. Fjerkræpox-vektoren inducerede et serologisk respons over for begge anti-5 gener i et større antal fugle, end tilfældet var for kanariepox, men responset var stadig heterogent.

1 dag gamle kyllinger inokuleret med vFP-6 havde et godt serologisk respons, med alle fuglene seropositive over for rabies- og fjerkræpox-antigener 10 28 dage efter inokulering. Responset på inokulering med vCP-16 var meget lavere, med 40% af fuglene seropositive over for rabies-glycoprotein på dag 28 og 10% seropositive for avipox-antigener.

28 dage gamle kyllinger inokuleret intramuskulært med vFP-6 viste 100% 15 serokonversion for begge antigener 14 dage efter inokulering. Selv om størstedelen af fuglene også serokonverterede efter cutan inokulering, var de opnåede titere lavere for både rabies- og avipox-antigener. Som tidligere, udviste kyllinger, inokuleret ad både intramuskulær og subcutan vej med vCP-16, et varierende respons med et maksimum på 70% serokonversion mod 20 rabies ved intramuskulær inokulering. Det lave serokonversionsniveau for avipox-antigener efter kanariepox-inokulering er eventuelt udtryk for graden af serologisk slægtskab mellem viraene.

Resultaterne indikerer, at både vFP-6 og vCP-16 er sikre at inokulere i kyllin-25 ger i forskellige aldre. Fjerkræpox-vektoren vFP-6 synes mere effektiv til in-ducering af et immunrespons i kyllinger. Det er imidlertid signifikant, at begge rekombinante avipoxvira, fjerkræpox og kanariepox, er vist at være nyttige til immunisering in ovum.

DK 176068 B1 Φ >

g vP vP vP

g .O vO .O O' O' O' O' o Q. 0s o'- o'- O O O o o'

X .o "t CD O O O O O O

o o' ιο m- r^-T- T-T- t— oo 2 I g 32 "i ^

® :¾ CO

m LL-

S LU

"ω ® m o om- ^t- -* S ^ <m on £ o Εί » !2 i-_ T- T- CM CO t- o SE o' o" o' o' o ° cT° ω α> o it _ .- 3 2 =5-2 i; -* C .£ ω

— <C Q> 03 nP vP v° vO

0 'ίί^'ΡνΡνΡ®^ o' o' o' o CD Oh=o^o^o^O OO O o' 1 J S! ?8 8? ?? 2§ > g.

C O) 0 t/3 ju o Æ = > o »2 „ * § c φ r2 LU -5 5 00 ^

CQT 2 CM S CO N N-l''- CO ID

< $ S; θ’ °°- t-~ tT~ CO <N T-· o’ 15 ro 0 O)

Q ,_ .E

§ S V w ^ ,* 1 ^is —

5 f .e å ™ ? 8 ? S ? S

o c/3 c o

Q "S

O <11 Q

*— {ft — ν' O U Λ ^ n c*> to

C£ Q |_ O O O O O

o -r- <- «- T- τ ο o c 3

E

E

— ® tr φ c o>

E q) Jtø E $ E

ro ~F o ro 3 ro 03 C 03 _χ 03 φ ® ® §33 ® ® S ω® g £ ro c5 03 E c ro E g ro c § -σ ξ ό ro := -ο ro

δ £5 ίΞ.£ is s I

uo ο lo ο ιο

▼“ *“ CM CM

DK 176068 B1

CD

> tn

2 vO >O vP -O vO vp vP

Ω. o'' o o' o' o' o'" o' x lo in δ^ο oo oo O o' CM CM O T— con CO -c-

CL

<d .2 n 1— »_ “

2 03 O

TO ro $ (D O 0

g LU

^ .TO CO CJ) f'- O) CO N T-T- cn S (Din Nifl o co f- co £ ΙΞ o o_ o o o o_ o^ o_ >«- >- S o" o" o" o* o o" o" o' — 0 fe % g s f c 3 ^ < ξ: — ro -r c co

CO q\ 3 n® vP -sP -P P sP

t— j*J ^ .o .o 0s oN O'" 0^0^ • 0^0 o^o^OO oo oo Q- 2- o'' o oo i— Tf n. co T- <£ & -o o c .li' >-

— ΓΤ) CD

<D , ti

η (Λ V

>2 .2 Z)

v ^ -O

^ 2 8 £ ω UJ -> O CO t- Tf ττ <- m O 12 V- T- T- CM CO CM_ CO T- < C/) ^ o' o" o* o" o' o' o’ o' I- .2

JO

ro o ^ ? Q 0==^

0) C m (D

C Ø-^O) Tf Tf 2 S -* -g ^ ^ ro i— 2 ^ + + Tf oo Tf oo Tf oo

-X .E CO CO T- CM τ- CM T- CM

»ro Ω ω c

O

CL u> g ίίί « Ω ro o — o O ro o- to ro ro -JC l—1 i_ O O O o o C/) - - c— i— t— t** t— 'σ o o c o

E

E ω tr ø tr ω

E ø JB E & E

ro ~p 3 ro 3 ro o c ^ CD _X D) ø ro Ϊ g) 3 ø ø -5 øø o ro E5 θ) ρ o ro) p ø) ro) o 2- ro c σι t c ro fc c ro c 5- "ro = ro ro ^ ό ro := το ro >- O CO ti >*co >ø 3 O llt- ^cm.E Ϊ cm o if) o o o o

T- T- CM CM

DK 176068 B1 75 EKSEMPEL 25 - Sikkerhed og immunoaenicitet af vFP-6-inokulerina i småqrise

To grupper på tre smågrise blev inokuleret med det rekombinante vFP-6 ved 5 én af to indgivelsesveje: a) tre dyr modtog 8,1 log™ TCID5o ved intramuskulær inokulering, og b) tre dyr modtog den samme dosis ved oral inokulering.

Alle dyr fik udtaget blod med ugentlige mellemrum og modtog booster-10 inokulering af den samme dosis ad samme indgivelsesvej på dag 35. Små-grisene blev dagligt observeret for kliniske tegn. Sera blev afprøvet for anti-fjerkræpox-antistofer ved en ELISA-afprøvning og en serum-neutralisationsafprøvning. Rabies-antistoffer blev prøvet ved en RFFI-afprøvning.

15 Alle smågrise forblev sunde, og der observeredes ingen læsioner efter inokulering. Temperaturkurver var normale uden nogen tilsyneladende forskel mellem inokulerede og uinokulerede dyr.

Smågrise inokuleret ved såvel intramuskulær som oral indgivelsesvej udvik-20 lede et serologisk respons på fjerkræpox-antigener som målt ved ELISA og serum-neutralisation. Et sekundært respons var tydeligt efter booster-inokulering (resultaterne ikke vist). Alle smågrise udviklede ligeledes et immunologisk respons på rabies-glycoprotein som målt ved en RFFI-afprøvning, og en booster-virkning er tydelig ved begge indgivelsesveje. Dis-25 se resultater er vist i tabel XVII.

Resultaterne indikerer, at inokulering af en fjerkræpox/rabies-rekombinant er uskadelig i smågrise, og at rekombinanten er i stand til at frembringe et signifikant immunrespons på rabies-glycoproteinet ved oral eller intramuskulær 30 inokulering.

TABEL XVII

i DK 176068 B1 76

Antistof mod rabies-glycoprotein dannet i småqrise inokuleret med vFP-6 j

Vaccinations- Dyr Rabies-antistof på dag (RFFI-titer) . ! 5 indgivelsesvej 14 21 28 35b 42 49 984 2,4a 2,2 2,1 2,2 3 3

Intramuskulært 985 2,5 2,7 2,6 2,4 3 3 986 2,2 2,0 2,1 2,3 3 3 10 987 3 2 2,1 2 3 3

Oralt 988 2,9 2,4 2,2 2,4 2,7 2,5 989 2,8 2 1,7 1,8 2,4 2,5 15 a Titer udtrykt som log-m af højeste serumfortynding der giver over 50% reduktion i antallet af fluorescerende brønde i en RFFI-afprøvning. b Dyrene modtog den anden inokulering på dag 35.

Claims (9)

79 DK 176068 B1 Patentkrav.

1. Rekombinant kanaripoxvirus, kendetegnet ved, at det indeholder DNA fra en ikke-avipox-kilde som koder for et antigen af et vertebratpatogen og er 5 ligeret til en promotor for ekspression af DNA’et, hvor det nævnte DNA og ' promotor er indsat i et ikke-essentielt område af kanaripoxgenomet.

2. Virus ifølge krav 1, hvori den nævnte promotor er en vaccinia-promo-tor, en entomopox-promotor eller en avipox-promotor.

3. Virus ifølge krav 1, hvori det nævnte DNA koder for et antigen af et 10 pattedyrpatogen, valgt blandt rabies G-antigen, gp51,30-kappeantigen fra okseleukæmivirus, FeLV-kappe-antigen fra katteleukæmivirus og glycoprotein D-antigen fra herpes simplex-virus.

4. Virus ifølge krav 1, hvori det nævnte DNA koder for et antigen af et fuglepatogen valgt blandt fugleinfluenza-hæmagglutinin-antigen, et 15 fusionsprotein-antigen af Newcastle disease virus, et RAV-1 kappeantigen af Rous-associeret virus, nucleoprotein-antigen af fugleinfluenzavirus, et matrix-antigen af det infektiøse bronchitis-virus og peplomer-antigen af det infektiøse bronchitis-virus.

5. Anvendelse af et virus ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 ved 20 fremstilling af et lægemiddel for behandling af sygdomme i vertebrater.

6. Anvendelse af et virus ifølge krav 5, hvor vertebratet er et pattedyr og hvor sygdommen er en infektion ved et pattedyrpatogen.

7. Anvendelse ifølge krav 6 hvor pattedyrpatogenet er valgt blandt rabiesvirus, okseleukæmivirus, katteleukæmivirus og herpes simplex-virus.

8. Anvendelse af et virus ifølge krav 5, hvor vertebratet er en fugl og hvor sygdommen er en infektion fra et fuglepatogen. 80 DK 176068 B1

9. Anvendelse ifølge krav 8 hvor fuglepatogenet er valgt blandt fugleinfluenzavirus, Newcastle disease-virus, Rous-associeret virus og infektiøs bronchitis-virus. i