DK176165B1 - Rekombinant fjerkræpoxvirus samt anvendelsen af samme - Google Patents

Description

DK 176165 B1

Den foreliggende opfindelse er fremkommet ved afdeling fra PA 2005 01220.

Den foreliggende opfindelse omhandler inducering af et immunologisk respons i vertebrater, herunder ikke-fugle vertebrater, under anvendelse af 5 syntetisk rekombinarit avipoxvirus. Opfindelsen omhandler inducering af et immunologisk respons i en vertebrat, især et pattedyr, mod et vertebrat-patogen ved inokulering af vertebraten med et syntetisk rekombinant avipoxvirus indeholdende DNA, der koder for og udtrykker de antigene determinanter af nævnte patogen, og vacciner indeholdende et sådant modi-10 ficeret avipoxvirus. Opfindelsen angår rekombinant fjerkræavipoxvirus og anvendelse af et sådant virus.

OPFINDELSENS BAGGRUND

15 Avipox eller avipoxvirus er en slægt af nært forbundne poxvira, der inficerer fugle. Slægten avipox omfatter arterne fjerkræpox, kanariepox, snefuglepox, duepox, vagtelpox, spurvepox, stærepox og kalkunpox. Slægten avipox deler mange karakteristika med andre poxvira og er et medlem af den samme underfamilie, poxvira hos vertebrater, som vaccinia er. Poxvira, inklusive 20 vaccinia og avipox, replikerer i eukaryote værtsceller. Disse vira skelnes ved deres store størrelse, kompleksitet og ved det cytoplasmiske replikationssted. Vaccinia og avipox er dog forskellige slægter og er ikke ens, hvad angår deres respektive molekylvægte, antigene determinanter og værtsarter, som rapporteret i Intervirology, vol. 17, side 42-44, Fourth Report 25 of the International Committee on Taxonomy of Viruses (1982).

Avipoxviraene inficerer ikke på produktiv vis ikke-fugle vertebrater såsom pattedyr, herunder mennesker. Endvidere formerer avipox sig ikke ved inokulering i cellekulturer fra pattedyr (inklusive mennesker). I sådanne 30 pattedyr-cellekulturer inokuleret med avipox dør cellerne på grund af en cytotoksisk virkning, men viser ingen tegn på produktiv virusinfektion.

2 DK 176165 B1

Inokulering af en ikke-fugle vertebrat, såsom et pattedyr, med levende avipox resulterer j dannelsen af en læsion på inokuleringsstedet, der ligner en vacciniainokulering. Der opnås dog ingen produktiv virusinfektion. Ikke desto mindre har man nu fundet, at et således inokuleret pattedyr responderer 5 immunologisk på avipoxviruset. Dette er et uventet resultat.

Vacciner bestående af dræbt patogen eller oprensede antigene komponenter af sådanne patogener skal injiceres i større mængder end levende virusvacciner for at skabe et effektivt immunrespons. Dette skyldes, at ίο inokulering med levende virus er en meget mere effektiv vaccinationsmetode.

Et relativt lille inokulum kan frembringe et effektivt immunrespons, fordi de antigener, man er interesseret i, forstærkes under replikation af viruset. Fra et lægeligt synspunkt giver levende virusvacciner en immunitet, der er mere effektiv og længerevarende end inokulering med en vaccine med et dræbt 15 patogen eller oprenset antigen. Således kræver vacciner bestående af dræbt patogen eller oprensede antigene komponenter af sådanne patogener produktion af større mængder vaccinemateriale, end det er nødvendigt med levende virus.

20 Fra den foregående diskussion er det klart, at der er lægelige og økonomiske fordele ved at anvende levende virusvacciner. En sådan levende virusvaccine omfatter vaccinia-virus. Dette virus er fra litteraturen kendt som et nyttig virus, hvori der ved hjælp af rekombinant DNA-metoder kan indsættes DNA repræsenterende de genetiske sekvenser for antigener fra 25 pattedyr-pato-gener. , I litteraturen er der således udviklet metoder, der tillader dannelsen af rekombinant vaccinia-vira ved indsættelse af DNA fra en vilkårlig kilde (f.eks. viral, prokaryotisk, eukaryotisk, syntetisk) i en ikke-essentiel region af 3 0 vaccinia-genomet, herunder DNA-sekvenser der koder for de antigene determinanter i en patogen organisme. Visse rekombinant vaccinia-vira DK 176165 B1 3 dannet ved disse metoder er blevet brugt til inducering af specifik immunitet i pattedyr mod forskellige pattedyr-patogener, alle som beskrevet i US patent nr. 4 603 112, der er inkorporeret i denne beskrivelse med krav ved henvisning.

5

Umodificeret vaccinia-virus har længe været kendt for at være relativt sikkert og effektivt til anvendelse ved inokulering mod småkopper. Dog var der før udryddelsen af småkopper, hvor det var almindeligt at indgive umodificeret vaccinia, en lille, men reel risiko for komplikationer i form af generaliseret 10 vacciniainfektion, specielt hos de, der lider af eksem eller immunsuppression.

En anden sjælden, men mulig komplikation, der kan resultere fra vaccinia-inokulering, er encephalitis postvaccina lis. De fleste af disse reaktioner var resultat af inokulering af individer med hudsygdomme, såsom eksem, eller med svækkede immunsystemer, eller individer i husstande, hvor andre 15 havde eksem eller svækket immunologisk respons. Vaccinia er et levende virus og er normalt uskadelig for et sundt individ. Det kan dog overføres mellem individer i adskillige uger efter inokulering. Hvis et individ med en svækkelse af det normale immunrespons inficeres, enten ved inokulering eller ved smitsom overførelse fra et nylig inokuleret individ, kan det få 20 alvorlige konsekvenser.

Det vil således forstås, at en fremgangsmåde, der tilfører faget fordelene ved inokulering med levende virus, men som nedsætter eller eliminerer de ovenfor beskrevne problemer, ville være et særdeles ønskeligt fremskridt i • 25 forhold til det nuværende teknologiske stade. Dette er endog vigtigere i dag med fremkomsten af sygdommen kendt som erhvervet immunforsvarssyndrom (AIDS). Ofre for denne sygdom lider af alvorlig immulologisk dysfunktion og kunne let skades af et ellers sikkert levende viruspræparat, hvis de kom i kontakt med en sådan virus, enten direkte eller 3 0 gennem kontakt med en person, der nyligt er immuniseret med en vaccine indeholdende en sådan levende virus.

DK 176165 B1 4

OPFINDELSENS FORMÅL

Det er et formål med opfindelsen at tilvejebringe rekombinant fjerkræpoxvirus, der kan anvendes i en vaccine, der kan immunisere 5 vertebrater mod en patogen organisme, som har en levende vaccines fordele, og som har få eller ingen af ulemperne ved enten en levende virusvaccine eller en dræbt virusvaccine som opregnet ovenfor, især når anvendt til immunisering af ikke-fugle vertebrater.

ίο Det er endvidere et formål med opfindelsen at angive en anvendelse af et sådant virus ved fremstilling af et lægemiddel for behandling af sygdomme i vertebraten.

15 BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Et aspekt af opfindelsen angår syntetisk rekombinant fjerkræavipoxvirus modificeret ved indsættelse af DNA fra en vilkårlig kilde, og især fra en ikke-fugle kilde, i et ikke-essentielt område af avipox-genomet. Syntetisk 20 modificeret avipoxvirusrekombinanter, der bærer exogene (dvs. ikke-avipox) gener, som koder for og udtrykker et antigen, hvilke rekombinanter i en vertebratvært udløser dannelsen af immunologiske responser på antigenet og derfor på det exogene patogen, bruges ifølge opfindelsen til at danne hidtil ukendte vacciner, der ikke har ulemperne ved konventionelle vacciner, 25 som anvender dræbte eller svækkede levende organismer, især ved anvendelse til inokulering af ikke-fugle vertebrater.

Det skal igen fremhæves, at avipoxvirus kun kan replikere produktivt i eller blive videreført gennem fuglearter eller cellelinjer fra fugle. De rekombinante 30 avipoxvira høstet fra fugle-værtceller, danner en inokuleringslæsion uden produktiv replikation af avipoxviruset, når de inokuleres i en ikke-fugle DK 176165 B1 5 vertebrat, såsom et pattedyr, på en måde, der er analog til inokuleringen af pattedyr med vaccinia-virus. Trods avipoxvirusets manglende evne til at replikere produktivt i en sådan inokuleret ikke-fugle vertebrat, forekommer der tilstrækkelig udtrykkelse af viruset, til at det inokulerede dyr responderer 5 immunologisk på det rekombinante avipoxvirus' antigene determinanter og også på de antigene determinanter indkodet i exogene gener deri.

Når det anvendes til inokulering af fuglearter, frembringer et sådant syntetisk rekombinant avipoxvirus ikke blot et immunologisk respons på antigener 10 kodet af exogent DNA fra en vilkårlig kilde, der kan være tilstede deri, men resulterer også i produktiv replikation af viruset i værten med fremkaldelsen af et forventet immunologisk respons på avipox-vektoren som sådan.

Adskillige forskere har foreslået dannelsen af rekombinant fjerkræpox, 15 specielt vira til brug som veterinære vacciner til beskyttelse af fjerkræbestande. Boyle og Coupar, J. Gen. Virol., 67:1591-1600 (1986) og Binns et al., Isr. J. Vet. Med, 42:124-127 (1986). Hverken forslag eller egentlige rapporter angående brugen af rekombinant avipoxvira som en fremgangsmåde til inducering af specifik immunitet i pattedyr er blevet 20 fremlagt.

Stickl og Mayer, Fortschr. Med. 97(40):1781-1788 (1979) beskriver injektion af avipoxvirus, specifikt fjerkræpox, i mennesker. Disse undersøgelser angår dog kun brugen af almindelig fjerkræpox til at forhøje ikke-specifik immunitet i • 25 patienter, der lider af eftervirkningerne af cancer-kemoterapi. Der anvendes ingen rekombinant DNA-teknikker. Der informeres ikke om en avipox, hvori er indsat DNA, som koder for antigener fra vertebrat-patogener, eller om en fremgangsmåde til inducering af specifik immunitet i vertebrater. I stedet regnede man i litteraturen med en generel og ikke-specifik tonisk virkning på 30 den humane vært.

DK 176165 B1 6

En mere indgående diskussion af grundlaget for genetisk rekombination kan måske hjælpe til at forstå, hvorledes de modificerede rekombinant vira ifølge den foreliggende opfindelse er dannet.

5 Generelt består genetisk rekombination af udvekslingen af homologe sektioner af deoxyribonukleinsyre (DNA) mellem to DNA-strenge. (I visse vira kan ribonukleinsyre [RNA] erstatte DNA). Homologe nukleinsyresektioner er nukleinsyresektioner (RNA eller DNA), der har den samme nukleotidbasesekvens.

10

Genetisk rekombination kan forekomme naturligt under replikationen eller ved dannelsen af nye virale genomer inde i den inficerede værtcelle. Således kan genetisk rekombination mellem virale gener ske under den virale replikationscyklus, der foregår i en værtcelle, som er co-inficeret med to eller 15 flere forskellige vira eller andre genetiske konstruktioner. En DNA-sektion fra et første genom bruges udskifteligt til konstruktion af genomsektionen i et andet coinficerende virus, i hvilket DNA’et er homologt med DNA'et i det første virale genom.

20 Imidlertid kan rekombination også forekomme mellem DNA-sektioner i forskellige genomer, der ikke er fuldstændig homologe. Hvis en sådan sektion er fra et første genom, der er homologt med en sektion af et andet genom, med undtagelse af tilstedeværelsen i den første sektion af for eksempel en genetisk markør eller et gen kodende for en antigen 25 determinant indsat i en del af det homologe DNA, kan rekombination stadig forekomme, og produkterne af denne rekombination er således detekterbare ved tilstedeværelsen af denne genetiske markør eller gen.

Der kræves to betingelser, for at den modificerede infektiøse virus 30 gennemfører en vellykket udtrykkelse af den indsatte genetiske DNA-sekvens.

DK 176165 B1 7

For det første skal indsættelsen ske i et ikke-essentielt område af viruset, for at det modificerede virus forbliver levedygtigt. Hverken fjerkræpox eller de andre avipoxvira har indtil nu udvist ikke-essentielle regioner analoge til de, der er beskrevet for vaccinia-viruset. Derfor blev der ved den foreliggende 5 opfindelse fundet ikke-essentielle områder i fjerkræpox ved at kløve fjerkræpox-genomet op i fragmenter med efterfølgende adskillelse af fragmenterne efter størrelse og indsættelse af disse fragmenter i plasmidkonstruktioner med henblik på amplifikation. (Plasmider er små cirkulære DNA-molekyler, der findes som ekstrakromosomale elementer i 10 mange bakterier incl. E. coli. Metoder til indsættelse af DNA-sekvenser, såsom generne for antigene determinanter eller andre genetiske markører, i plasmider er velkendte inden for faget og er beskrevet i detaljer i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory New York [1982]). Dette blev efterfulgt af indsættelse af genetiske markører 15 og/eller gener, der koder for antigener, i de klonede fjerkræpox-fragmenter.

De fragmenter, der førte til vellykket rekombination, som vist ved vellykket genvinding af den genetiske markør eller antigener, var de, der indeholdt DNA indsat i et ikke-essentielt område af fjerkræpox-genomet.

20 Den anden betingelse for udtrykkelse af indsat DNA er tilstedeværelsen af en promotor med en passende beliggenhed i forhold til det indsatte DNA. Promotoren skal være placeret således, at den befinder sig opstrøms fra den DNA-sekvens, der skal udtrykkes. Fordi avipox-vira ikke er velkarakteriserede, og der ikke tidligere er identificeret avipox-promotorer, 25 kan promotorer fra andre poxvira med fordel indsættes opstrøms for det DNA, der skal udtrykkes som en del af den foreliggende opfindelse. Fjerkræpox-promotorer kan også med held anvendes til at udføre fremgangsmåderne og lave produkterne ifølge opfindelsen. Ifølge opfindelsen er promotorer fra fjerkræpox, vaccinia og entomopox fundet at 30 promotere transkription i rekorribinant poxvirus.

DK 176165 B1 8

Boyle og Coupar, J. Gen. Virol. 67:1591 (1986) har offentliggjort spekulation om, at vaccinia-promotorer "måske kan forventes at fungere i (ijerkræpox) virus". Forfatterne lokaliserede og klonede et fjerkræpox TK-gen (Boyle et al., Virology 156:355-365 [1987]) og indsatte det i et vaccinia-virus. Dette TK-gen 5 blev udtrykt, formodentlig fordi fjerkræpox TK-promotorsekvensen genkend-tes af vaccinia-polymerasefunktioner. På trods af deres spekulation, indsatte forfatterne imidlertid ikke nogen vaccinia-promotor i et fjerkræpoxvirus eller observerede nogen udtrykkelse af en fremmed DNA-sekvens tilstede i et fjerkræpox-genom. Det var ikke kendt før den foreliggende opfindelse, at ίο promotorer fra andre poxvira, såsom vaccinia-promotorer, rent faktisk ville promotere et gen i et avipox-genom.

BESKRIVELSE AF VISSE FORETRUKNE UDFØRELSESFORMER

15 Ifølge den foreliggende opfindelse er fjerkræpoxvirus blevet anvendt som avipox-art, der modificeres ved rekombination ved indbyggelse af exogent DNA deri.

Fjerkræpox er en art af avipox, der især inficerer høns, men som ikke 2 0 inficerer pattedyr. Fjerkræpox-stammen, der heri er designeret som FP-5, er en kommerciel fjerkræpoxvirus-vaccinestamme med oprindelse i kyllinge-embryoner, tilgængelig fra American Scientific Laboratories (Underafdeling af Schering Corp.) Madison, Wl, United States Veterinary License nr. 165, Serie nr. 30321.

25

Fjerkræpox-stammen, der heri er designeret FP-1, er en Duvette-stamme modificeret til anvendelse som en vaccine i daggamle kyllinger. Stammen er en kommerciel fjerkræpoxvirus-vaccinestamme designeret O DCEP 25/CEP67/ 2309 Oktober 1980 og er tilgængelig fra Institute Merieux, Inc.

30 DK 176165 B1 9

Kanariepox er en anden avipoxart. Analogt med fjerkræpox, inficerer kanariepox især kanariefugle, men inficerer ikke pattedyr. Kanariepox-stammen, der her er designeret som CP er en kommerciel kanariepox-vaccinestamme designeret LF2 CEP 524 24 10 75 og er tilgængelig fra 5 Institute Merieux, Inc.

De genetiske DNA-sekvenser, indsat i disse avipoxvira ved genetisk rekombination ifølge opfindelsen, omfatter Lac Z-genet af prokaryotisk oprindelse; rabies-glycoprotein (G) genet, der er et antigen fra et ikke-io fuglepatogen (specifikt af pattedyroprindelse); kalkuninfluenza-hæmag-glutinin-genet, som er antigenet fra et patogent fuglevirus, der ikke er et avipoxvirus; kappegenet gp51.30 fra bovint leukæmivirus, der er et pattedyrvirus; fusionsprotein-genet fra Newcastle disease-virus (Texas-stamme), der er et fuglevirus; FeLV-kappegenet fra katteleukæmivirus, der er et pattedyris virus; RAV-1 env-genet fra det Rous-associerede virus, der er et fugle-virus/fjerkræsygdom; nucleoprotein (NP) genet fra hønse/Pennsylvania/1/83 influenzavirus, der er et fuglevirus; matrixgenet og peplomergenet fra infektiøs bronchitisvirus (stamme Mass 41), der er et fuglevirus; og glycoprotein-D-genet (gD) fra herpes simplex-virus, der er et pattedyrvirus.

20

Isolering af Lac Z-genet er beskrevet af Casadaban et al., Methods in Enzymology 100:293-308 (1983). Strukturen af rabies-G-genet er for eksempel beskrevet af Anilionis et al., Nature 294:275-278 (1981). Dets indbygning i vaccinia og udtrykkelse i denne vektor diskuteres af Kieny et al., 25 Nature 312:163-166 (1984). Kalkuninfluenza-hæmagglutinin-genet er beskrevet af Kawaoka et al., Virology 158:218-227 (1987). Det bovine leukæmivirus gp51.30 env-gen er blevet beskrevet af Rice et al., Virology 138:82-93 (1984). Fusionsgenet fra Newcastle disease-virus (Texas stamme) er tilgængeligt fra Institute Merieux, Inc. som plasmid pNDV 108. Katte-30 leukæmivirus-env-genet er blevet beskrevet af Guilhot et al., Virology 161:252-258 (1987). Det Rous-associerede virus type 1 er tilgængeligt fra DK 176165 B1 10

Institute Merieux, Inc. som to kloner, penVRVIPT og mp19env (190). Hønseinfluenza-NP-gen er tilgængeligt fra Yoshihiro Kawaoka, St. Jude Children's Research Hospital som plasmid pNP33. En infektiøs-bronchitis-virus cDNA-klon af IBV Mass 41 matrixgenet og peplomergenet er 5 tilgængelig fra Institute Merieux, Inc. som plasmid plBVM63. Herpes simplex-virus gD-genet er beskrevet i Watson et al., Science 218:381-384 (1982).

De rekombinante avipoxvira, der beskrives mere detaljeret nedenfor, omfatter én af tre vacciniapromotorer. Pi-promotoren, fra AvalH-regionen af 10 vaccinia, er beskrevet i Wachsman et al., J. of Inf. Dis. 155:1188-1197 (1987). Mere bestemt er denne promotor afledt fra AvalH(XholG)-fragmentet af L-variant-WR-vacciniastammen, hvori promotoren leder transkriptionen fra højre til venstre. Kortbeliggenheden af promotoren er ca. 1,3 kbp (kilobase-par) fra den venstre ende af AvalH, ca. 12,5 kbp fra den venstre ende af 15 vacciniagenomet, og ca. 8,5 kbp til venstre for Hindlll-C/N-forbindelsen. Promotorsekvensen er: (GGATCCC)-ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGT-AGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTG-(AATTC), 20 hvori symbolerne i parentes er koblingssekvenser.

HindlllH-promotoren (også kaldet "HH" og “H6" heri) blev defineret ved standard-transkriptionelle kortlægningsteknikker. Den har sekvensen: 25 * j

ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAA

TAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATA-

AATT

ATTTCATTATCGCGATATCCGT

30 TAAGTTTGTATCGTAATG.

DK 176165 B1 11

Sekvensen er identisk med den, som af Rosén et al., J. Virol. 60:436-449 (1986) er beskrevet som værende opstrøms fra åben læseramme H6.

11 K-promotoren er som beskrevet af Wittek, J. Virol. 49:371-378 (1984) og 5 Bertholet, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2096-2100 (1985).

De rekombinante avipoxvira ifølge opfindelsen er konstrueret ved to inden for faget kendte trin, der er analoge med dem beskrevet i førnævnte US patent 4 603 112 til dannelse af syntetiske rekombinanter af vacciniaviruset.

10 Først anbringes den DNA-sekvens, som skal indsættes i viruset, i en E. coli-plasmidkonstruktion, hvori er indsat DNA, der er homologt til en sektion af ikke-essentielt DNA i avipoxviruset. DNA-gensekvensen, der skal indsættes, ligeres separat til en promotor. Promotor-gen-koblingen indsættes derpå i 15 plasmidkonstruktionen, således at promotor-gen-koblingen i begge ender er flankeret af DNA homologt til en ikke-essentiel region af avipox-DNA. Den resulterende plasmidkonstruktion amplificeres derpå ved vækst i E. colibakterier. (Plasmid-DNA bruges til at bære og amplificere exogent genetisk materiale, og denne metode er velkendt inden for faget. Disse plasmid-20 teknikker er f.eks. beskrevet af Clewell, J. Bacteriol. 110:667-676 (1972). Teknikkerne til isolering af det amplificerede plasmid fra E. coli-værten er ligeledes velkendte og er f.eks. beskrevet af Clewell et al. i Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 62:1159-1166(1969).) 25 Det amplificerede plasmidmateriale isoleret efter vækst i E. coli anvendes derpå til det andet trin. Nemlig transfektion af plasmidet indeholdende DNA-gensekvensen, der skal indsættes, over i en cellekultur, f.eks. fibroblaster fra kyllingefostre, sammen med avipoxviruset (såsom fjerkraepox stamme FP-1 eller FP-5). Rekombination mellem henholdsvis homologt fjerkræpox-DNA i 30 plasmidet og det virale genom giver et avipoxvirus, der er modificeret ved DK 176165 B1 12 tilstedeværelsen af ikke-fjerkræpox-DNA-sekvenser i et ikke-essentielt område af sit genom.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

5 EKSEMPEL 1 - Prøvninger for transient udtrykkelse til demonstrering af fierkræpox-RNA-transkriptionsfaktorers genkendelse af vaccinia-promotorer 10 Der blev fremstillet et antal plasmidkonstruktioner indeholdende kodesekvensen for Hepatitis B-virus-overflade-antigen (HBSAg) koblet til vacciniavirus-promotorsekvenser. 50 pg af hvert plasmid blev transfekteret påCEF-celler inficeret med 10 pfu fjerkrævirus eller vacciniavirus pr. celle. Infektionen fik lov at fortsætte i 24 timer, og cellerne blev derpå lyseret ved 15 tre på hinanden følgende cykler bestående af frysning og optøning.

Mængden af HBSAg i lysatet blev beregnet ved brug af det fra Abbott Laboratories, Diagnostic Division, kommercielt tilgængelige AUSTRIA II - 125l-kit. Tilstedeværelsen eller fraværet af HBSAg udtrykkes som et forhold 2 o mellem nettotællingerne (prøve minus baggrund) af den ukendte værdi og en negativ afskæringsværdi forudbestemt af fabrikanten. Dette resulterer i et P/N (positiv/negativ) forhold. Resultaterne er vist i tabel I.

Der blev anvendt tre forskellige vaccinia-promotorsekvenser: Pi-promotoren, 25 der erkendes tidligt ved vacciniainfektion, før DNA-replikation; 11K-promotoren, der erkendes sent ved vacciniainfektion, efter starten af DNA-replikation; og Hindlll H (HH) promotoren, der erkendes både tidligt og sent ved vacciniainfektion. Disse promotorer er tidligere beskrevet heri.

DK 176165 B1 13

Dataene indikerer, at HBSAg dannet i lysatet af inficerede celler er resultatet af genkendelse af vacciniapromotorer af transkriptionsfaktorer fra enten fjerkræpox eller vaccinia.

5 TABEL I

Plasmid Virus Beskrivelse P/N forhold pMP131piR2 Fjerkræpox SAg koblet til 1,8

Vaccinia Pi-promotor 9,1 10 pMPK22.13S Fjerkræpox SAg koblet til 14

Vaccinia 11 K-promotor 2 pPDK22.5 Fjerkræpox SAg koblet til 92,6 15 Vaccinia 11 K-promotor 5,6 pRW668 Fjerkræpox SAg koblet til 77

Vaccinia HH-promotor 51,4 20 (ingen plasmid) Fjerkræpox 1,1 (ingen plasmid) Vaccinia 1,3 pMPK22.13S (ingen virus) 1,3 25 EKSEMPEL 2 - Konstruktion af rekombinant fierkræoox-virus vFP-1 indeholdende Lac Z-qenet

Et fragment i et ikke-essentielt område af fjerkræpox-viruset blev lokaliseret og isoleret på følgende måde.

30 DK 176165 B1 14

Der blev anvendt nuklease Bal31 til fjernelse af de enkeltstrengede terminale håmåleløkker i FP-5 DNA. Det store Klenowfragment af DNA-polymerase I blev anvendt til dannelse af stumpe ender. Efter fjernelse af løkkerne blev fragmenterne frembragt ved nedbrydning med restriktionsendonuklease 5 Bglll. Ved denne nedbrydning dannedes en række FP-5~fragmenter, der blev adskilt ved agarosegelelektroforese.

Et 8,8 kbp Bglll-fragment med stumpe ender blev isoleret og ligeret ind i et kommercielt tilgængeligt plasmid, pUC9, der var blevet kløvet med BamHI og 10 Smal. Det resulterende plasmid blev designeret pRW698.

For at nedsætte størrelsen af fjerkræpox-fragmentet blev dette plasmid kløvet med Hindlll til dannelse af yderligere to fragmenter. Et 6,7 kbp fragment blev kasseret, og det tilbageblevne 4,7 kbp fragment blev ligeret til 15 sig selv til dannelse af et nyt plasmid designeret pRW699.

For at inkorporere et 11 K-promoteret Lac Z-gen i dette plasmid blev pRW699 skåret med EcoRV, der kun kløver plasmidet på ét sted. Det 11K-promoterede Lac Z-segment blev derpå indsat som et Pstl-BamHI-fragment 2 0 med stumpe ender, hvorved der skabtes et nyt plasmid designeret pRW702.

Lac Z-klonen er fra pMC1871, som beskrevet i Casadaban et al., loc. cit.

11 K-promotoren blev ligeret til den ottende codon af Lac Z-genet via en BamHI-linker.

25 Ved rekombinationsteknikker, som beskrevet for vaccinia i US patent 4 603 112, blev pRW702-plasmidet derpå rekombineret med fjerkræpox FP-5, der vokser på kyllingefosterfibroblaster (CEF), idet der anvendtes følgende procedurer til frembringelse af vFP-1. 50 pg pRW702-DNA blev blandet i et slutvolumen på 100 pi med 0,5 pg af fjerkræpox-DNA dækkende hele 30 genomet. Til dette blev sat 10 pi 2,5 M CaC^ og 110 μ! 2 x HEBS puffer (pH

7) fremstillet af: DK 176165 B1 15

40 mM Hepes 300 mM NaCI

1,4 mM Na2HP04 5 10 mM KCI

12 mM dextrose.

Efter 30 minutter ved stuetemperatur tilsattes 200 pi af en fjerkræpox-viruspulje fortyndet til 5 pfu/cell, og blandingen inokuleredes på 60 mm ίο petriskåle indeholdende et monolag af primære CEF. 0,7 ml Eagles medie indeholdende føtal bovint serum (FBS) tilsattes ligeledes på dette tidspunkt. Petriskålene blev inkuberet ved 37 °C i 2 timer, hvorefter yderligere 3 ml Eagles medie indeholdende 2% FBS blev tilsat og petriskålene inkuberet i 3 døgn. Celler blev lyseret ved tre på hinanden følgende cykler bestående af 15 frysning og optøning, og afkom af virus blev derpå prøvet for tilstedeværelsen af rekombinanter.

Der opnåedes bevis for vellykket gennemførelse af indsættelse ved rekombination af det 11 K-promoterede Lac Z-gen i genomet for fjerkræpox 20 FP-5 ved at afprøve for udtrykkelse af Lac Z-genet. Lac Z-genet koder for enzymet β-galactosidase, der kløver det kromogene substrat 5-brom-4-chlor- 3-indolyl-p-D-galactosid (X-gal) under frigivelse af et blåt indolylderivat. Blå plakker blev udvalgt som positive rekombinanter.

25 Den med held gennemførte indsættelse af Lac Z i genomet af fjerkræpox FP-5 samt dets udtrykkelse blev også bekræftet ved immunpræcipitering af β-galactosidaseprotein med kommercielt tilgængelige antisera og standardteknikker under anvendelse af vFP-1-inficerede CEF, BSC (abe-nyrecellelinie - ATCC CCL26), VERO (abenyrecellelinie - ATCC CC81) og 3 0 MRC-5 (human diploid lungecellelinie -ATCC CCL171).

DK 176165 B1 16

Udtrykkeisen af β-galactosidase af det rekombinante virus vFP-1 blev videre bekræftet in vivo ved inokulering af kaniner og mus med viruset og ved at kunne måle en post-inokuleringsstigning i titerne af antistof rettet mod β-galactosidaseproteinet i serum af de inokulerede dyr.

5

Specielt blev det rekombinante vFP-1 oprenset fra værtcellekontaminanter og inokuleret intradermalt to steder på hver side af to kaniner. Hver kanin modtog en total mængde på 10® pfu.

10 Dyrene fik tappet blod med ugentlige mellemrum, og seraene brugt ved en ELISA prøvning under anvendelse af en kommercielt tilgængelig præparation af oprenset β-galactosidase som antigenkilde.

Både kaniner og mus inokuleret med det rekombinante vFP-1 frembragte et 15 immunrespons over for β-galactosidaseprotein som vist ved en ELISA-prøvning. I begge arter var responset detekterbart én uge efter inokulering.

EKSEMPEL 3 - Konstruktion ud fra fierkræpox-virus FP-5 af rekombinant virus vFP-2 indeholdende rabies-G-qenet oq Lac Z

20

Fra FP-5 opnåedes et 0,9 kbp Pvull-fragment, der ved hjælp af standardteknikker blev indsat mellem de to Pvull-steder i pUC9. Den resulterende konstruktion, designeret pRW688.2, har to Hincll-steder med en afstand på ca. 30 bp, der er beliggende asymmetrisk inde i Pvull-fragmentet, 25 og de danner således en lang arm og en kort arm af fragmentet.

Under anvendelse af kendte teknikker blev oligonukleotidadaptere blev mellem disse Hincll-steder til indførelse af Pstl- og BamHI-steder, hvorved plasmid pRW694 dannedes.

30 DK 176165 B1 17

Dette plasmid blev nu kløvet med Pstl og BamHI, og Lac Z-genet med en koblet 11K vacciniapromotor, der tidligere er beskrevet, blev indsat til dannelse af det nye plasmid pRW700.

5 Til dannelse af et Pi-promoteret rabies-G-gen, blev Bglll-stedet, der er 5'-proximalt i forhold til rabiesgenet (jfr. Kieny et al., loc. cit.), gjort stump-endet og ligeret til det udfyldte EcoRI-sted i Pi-promotoren beskrevet tidligere.

Denne konstruktion blev indsat i Pstl-stedet af pRW700 til dannelse af 10 plasmid pRW735.1, som indeholder den fremmede gensekvens Pi-rabies G-11 K-Lac Z. Denne indsættelse er således orienteret inden for plasmidet, at den lange Pvull-HincIl-arm af FP-5-donorsekvensen er 3' i forhold til Lac Z-genet.

15 Den resulterende endelige konstruktion blev rekombineret med fjerkræpox-virus FP-5 ved infektion/transfektion af kyllingefosterfibroblaster ved fremgangsmåderne beskrevet ovenfor til dannelse af rekombinant fjerkræpox-virus vFP-2. Dette rekombinante virus blev selekteret ved X-gal farvning.

20 Korrekt indsættelse og udtrykkelse af både Lac Z-markørgenet og rabies-G-genet blev verificeret ved et antal yderligere metoder beskrevet nedenfor.

Lokalisering af rabies-antigenet ved immunfluorescens med specifikke antistoffer viste vellykket udtrykkelse af rabies-antigen på overfladen af fugle-25 og ikke-fugleceller inficeret med vFP-2-virus.

Udtrykkelsen af rabies-antigen og β-galactosidase af fugle- og ikke-fugleceller inficeret med vFP-2-viruset blev ligesom tidligere bekræftet ved immunpræcipiteringsmetoden.

30 DK 176165 B1 18

Ved inokulering af to kaniner med vFP-2-virus blev der opnået yderligere bevis for, at vFP-2-udførelsesformen ifølge opfindelsen er en vellykket rekombinant virus, der bærer generne for rabies G og β-galactosidase.

Begge kaniner blev inokuleret intradermalt med 1 x 10® pfu vFP-2 pr. kanin.

5 Begge disse kaniner dannede typiske pox-læsioner. Kaninerne fik udtaget blodprøver med ugentlige mellemrum, og sera blev afprøvet ved ELISA til påvisning af tilstedeværelsen af specifikke antistoffer mod rabiesglyco-proteinet og β-galactosidaseproteinet.

ίο Som angivet i tabel II nedenfor, viste kanin 205 påviselige mængder af anti-β-galactosidase-antistof ved ELISA-prøven én uge efter inokulering. Dette steg ved to uger til en titer på 1 i 4000, der opretholdes indtil 5 uger efter inokuleringen. Ved brug af antigen-indfangning-ELISA-prøvningen, viste sera fra kanin 205 påviselige mængder af anti-rabies-antistoffer fra 3 til 10 uger 15 efter inokulering.

DK 176165 B1 19

TABEL II

Antistof-dannelse af kanin 205 mod 5 rabies-antigen og B-qalactosidaseprotein

Tidspunkt Antistof-titer (reciprokke af serumfortynding) 10 Før udtagning anti-p-galactosidase af blodprøve 0

Uge 1 500

Ugerne 2-5 (hver) 4000 15 Uge 6 500

Uge 9 250 Før udtagning anti-rabies af blodprøve 0 20 Uge 3 200

Uge 6 200

Uge 10 100 EKSEMPEL 4A - Konstruktion ud fra fierkræpox-virus FP-1 af rekombinant 25 virus vFP-3 indeholdende promoteret rabies-G-qen

Denne udførelsesform anskueliggør, at rabies-G-genet udtrykkes fuldtud af andre fjerkræpox-stammer end FP-5, specifikt af en anden stamme af fjerkræpox-virus designeret FP-1.

30 DK 176165 B1 20

Som i eksempel 3 opnåedes et 0,9 kbp Pvull-fragment fra FP-1, idet man antog, at fragmentet ville indeholde et ikke-essentielt område, som det var tilfældet for FP-5.

5 Dette fragment blev indsat mellem de to Pvull-steder i pUC9, hvorved dannedes et plasmid designeret pRW731.15R.

Dette plasmid har to Hincll-steder, med en afstand påca. 30 bp, der er beliggende asymmetrisk inde i Pvull-fragmentet, og de danner således en 10 lang arm og en kort arm af fragmentet.

En kommercielt tilgængelig Pst-koblingssekvens (5') - CCTGCAGG - (3f) blev indsat mellem de to Hincll-steder, hvorved dannedes plasmid pRW741.

15

Et HH-promoteret rabies-G-gen indsattes i dette plasmid i Pstl-stedet til dannelse af det nye plasmid pRW742B. Ved rekombination af dette plasmid med FP-1 ved infektion/transfektion af CEF-celler opnåedes virus vFP-3.

20 ATG-translationsinitieringscodonen i den åbne læseramme promoteret af HH-promotoren blev overlejret på initieringscodonen af rabies-G-genet under anvendelse af et syntetisk oligonukleotid, der spænder over EcoRV-stedet i HH-promotoren og Hindlll-stedet i rabies-G-genet. 5'-enden af dette HH-promoterede rabiesgen blev ved kendte teknikker modificeret til at indeholde 25 et Pstl-sted, og konstruktionen ligeredes derpå ind i Pstl-stedet af pRW741 til dannelse af pRW742B. Orienteringen af konstruktionen i plasmidet er den samme som i pRW735.1, der tidligere er omtalt i eksempel 3.

Rekombination blev udført som beskrevet i eksempel 2. Den resulterende 3 o rekombinant benævnes vFP-3.

DK 176165 B1 21

Udtrykkeisen af rabies antigen af både fugle- og ikke-fugle-celler inficeret med vFP-3-viruset blev bekræftet ved de tidligere beskrevne immun-præcipiterings- og immunfluorescensteknikker.

5 Yderligere bevis for, at vFP-3-udførelsesformen ifølge opfindelsen er en vellykket rekombinant virus, der udtrykker gener for rabies G, opnåedes ved at inokulere kaninpar intradermalt med den rekombinante virus. To kaniner blev inokuleret intradermalt med 1 x 108 pfu vFP-3 pr. kanin. Begge disse kaniner dannede typiske poxlæsioner, der nåede maksimal størrelse 5-6 10 dage efter inokulering. Kaninerne fik udtaget blodprøver med ugentlige intervaller, og sera blev afprøvet ved ELISA med henblik på påvisning af tilstedeværelsen af specifikt antistof for rabiesglycoproteinet.

Fem rotter blev hver ligeledes inokuleret intradermalt med 5 x 107 pfu vFP-3.

15 Der sås resulterende læsioner i alle dyrene.

Både kaniner og rotter dannede påviselige mængder antistof specifikt mod rabies to uger efter inokulering. To kontrolkaniner inokuleret intradermalt med det parental FP-1-virus havde ikke påviselige mængder af anti-rabies 20 antistof.

For at udelukke den mulighed, at antistofresponset skyldtes indførelsen af rabiesantigen, der tilfældigt fulgte med inokulumviruset eller var integreret i membranen af det rekombinante fjerkræpox-virus, snarere end at være 25 fremkommet ved de novo syntese af rabiesantigenet af det rekombinante virus i dyret som forudsat, blev vFP-3-viruset kemisk inaktivert og inokuleret i kaniner.

Det oprensede virus blev inaktiveret fra den ene dag til den anden ved 4 °C i 30 nærvær af 0,001% β-propiolacton og derefter pelleteret ved centrifugering.

Det pelleterede virus blev opsamlet i 10 mM Tris-pufret saltvandsopløsning, ------- DK 176165 B1 22 ultralydsbehandlet og titreret til sikring af, at der ikke var infektiøs virus tilbage. To kaniner blev inokuleret intradermalt med inaktiveret vFP-3 og to kaniner med en ækvivalent mængde ubehandlet rekombinant. Størrelsen af | læsioner blev kontrolleret.

5

Begge kaniner, der fik ubehandlet vFP-3, udviklede 5 dage efter inokulering typiske pox-læsioner klassificeret som 4-5+. Kaniner inokuleret med inaktiveret virus udviklede også læsioner, men disse blev 5 dage efter inokulering klassificeret som 2+.

10

Kaninerne fik med ugentlige intervaller udtaget blodprøver, og sera blev ved ELISA afprøvet for tilstedeværelsen af rabiesspecifikke antistoffer og fjerkræpox-specifikke antistoffer. Resultaterne er vist i tabel III nedenfor.

15 TABEL III

Levende vFP-3 Inaktiveret vFP-3

Kanin: Nr. 295 Nr. 318 Nr. 303 Nr. 320

Afprøvet antistof: Rabies FP Rabies FP Rabies FP Rabies FP

Uge efter inokulering 0 00000000 2 250 4000 500 4000 0 50 0 1000 3 1000 4000 500 4000 0 4000 0 2000 4 1000 4000 2000 4000 0 4000 0 2000 5 4000 4000 2000 4000 0 2000 0 4000 6 4000 4000 4000 4000 0 2000 0 2000 I denne afprøvning er titreringsendepunktet (udtrykt som den reciprokke af serumfortyndingen) arbitrært sat til 0,2 efter subtraktion af 20 absorptionsværdierne af alle præudfordringssera. Begge kaninerne 295 og 318, der fik den levende virus, udviklede et immunrespons på rabies-glycoproteinet og på fjerkræpox-virusantigener. Kaninerne 303 og 320 DK 176165 B1 23 udviklede også et immunrespons på fjerkræpox-virusantigener, omend titeren var lav. Ingen af disse kaniner udviklede et påviseligt respons på rabiesglycoproteinet.

5 Dette resultat er udtryk for, at det immunologiske respons dannet i kaninen er på grund af de novo udtrykkeisen af rabiesglycoprotein-genet, der bæres i det rekombinante virus, og ikke et respons på et tilfældigt medfølgende glycoprotein indeholdt i inokulumviruset.

10 EKSEMPEL 4B - Konstruktion ud fra fierkræpox-virus FP-1 af rekombinant virus vFP-5 indeholdende upromoteret rabies-G-qen

Udtrykkelse af et fremmed gen, indsat ved rekombination i fjerkræpox-genomet, kræver tilstedeværelse af en promotor. Denne blev vist ved at 15 skabe yderligere en rekombinant, vFP-5, der er identisk med vFP-3 bortset fra, at HH-promotoren er udeladt. Tilstedeværelsen af rabiesgenet i denne rekombinant blev bekræftet ved nukleinsyrehybridisering. Der detekteredes dog ikke noget rabiesantigen i CEF-cellekulturer inficeret med viruset.

20 EKSEMPEL 5 - Overførinqsforsøq in vitro til bestemmelseaf om fierkræpox-virus replikerer i ikke-fuqleceller

Der blev udført et forsøg, hvori tre cellesystemer, et fra fugle og to fra ikke-fugle, blev inokuleret med den parentale FP-1-stamme eller den 25 rekombinante vFP-3. To petriskåle hver af hhv. CEF, MRC-5 og VERO inokuleredes med FP-1 eller vFP-3 i en input multiplicitet på 10 pfu pr. celle.

Efter tre dage høstedes én petriskål fra hver. Viruset blev frigivet ved tre på hinanden følgende cykler bestående af frysning og optøning og reinokuleret 30 på et frisk monolag af den samme cellelinje. Dette blev gentaget ved seks på DK 176165 B1 24 hinanden følgende overføringer, og ved afslutningen af forsøget blev prøver fra hver overføring titreret for virusinfektionsevne på CEF-monolag.

Resultaterne er vist i tabel IVA og indikerer, at serieoverføring af både FP-1 og vFP-3 er mulig i CEF-celler, men ikke i nogen af de to cellelinjer fra ikke-5 fugle. Infektiøst virus kan ikke påvises efter 3 eller 4 overføringer i VERO-eller MRC-5-celler.

Den anden petriskål blev brugt til bestemmelse af, om virus, der ikke er påviseligt ved direkte titrering, kunne detekteres efter amplifikation i de ίο permissive CEF-celler. På tredjedagen høstedes celler på den anden petriskål ved skrabning, og en trediedel af cellerne lyseredes og inokuleredes på et frisk CEF-monolag. Ved opnåelse af fuld cytopatisk virkning (CPE), eller 7 dage efter inficering, blev cellerne lyseret, og virusudbyttet titreret. Resultaterne er vist i tabel IVB. Når overføring i CEF-celler blev brugt til 15 amplifikation af et hvilket som helst tilstedeværende virus, kunne viruset ikke påvises efter fire eller fem overføringer.

Forsøg på at etablere vedvarende inficerede celler slog fejl.

20 I et yderligere forsøg på at påvise tegn på fortsat viral udtrykkelse i ikke-fugle celler, blev prøverne, der anvendtes til viral titrering ovenfor, brugt i en standard immunoprik-prøvning (immunodot assay), hvori anti-fjerkræpox antistof og anti-rabies antistof blev brugt til påvisning af tilstedeværelsen af de respektive antigener. Resultaterne af disse prøvninger bekræfter 25 resultaterne opnået ved titrering.

DK 176165 B1 25

TABEL IVA

Overførinasforsøq

Inokulum- virus: FP-1 vFP-3

Celletype CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5

Overføring: 1 6,6a 4,8 4,9 6,6 5,4 66,2 2 6,7 2,9 3,7 6,5 4,2 5,1 3 6,4 1,4 1,0 6,4 1,7 4,4 4 6,1 i.d.b i.d. 6,2 i.e. 1,0 5 6,4 i.d. i.d. 6,3 i.d. i.d.

6 5,7 i.d. i.d. 5,9 i.d. i.d.

3 - virustiter udtrykt som logio pfu/ml 5 b - ikke detekterbar

TABEL IVB

Amplifikationsforsøq

Inokulum- virus: FP-1 vFP-3

Celletype CEF VERO MRC-5 CEF VERO MRC-5

Overføring: 1 6,4a 6,2 6,4 6,5 6,3 6,4 2 7,5 6,3 6,0 6,5 6,3 5,5 3 6,2 6,7 5,3 5,9 6,1 6,3 4 5,6 4,6 3,9 5,7 4,8 5,8 5 6,3 4,1 i.d. 6,1 4,7 4,7 6 6,2 i.d.b i.d. 6,2 i.d. i.d.

10 a - virustiter udtrykt som logio pfu/ml b - ikke detekterbar DK 176165 B1 26 EKSEMPEL 6 - Yderligere rekombinanter af fierkræpox FP-1: vFP-6, vFP-7. vFP-8 og vFP-9

Rekombinant vira vFP-6 og vFP-7 blev konstrueret på følgende måde.

5

Et 5,5 kbp Pvull-fragment af FP-1 blev indsat mellem de to Pvull-steder i PUC9 til dannelse af plasmidet pRW731.13. Dette plasmid blev derpå skåret i et unikt Hincll-sted og HH-promoteret rabies G-gen med stumpe ender indsat til dannelse af plasmideme pRW748A og pRW748B, der io repræsenterer modsatte orienteringer af indsættelsen. Plasmiderne pRW748A og B blev derpå anvendt separat til at transfektere CEF-celler sammen med FP-1-virus til dannelse af hhv. vFP-6 og vFP-7 ved rekombination. Dette locus er nu designeret locus f7.

15 Et 10 kbp Pvull-fragment af FP-1 blev indsat mellem de to Pvull-steder i pUC9 til dannelse af pRW731.15. Dette plasmid blev derpå skåret i et unikt BamHI-sted og et 11 K-promoteret Lac Z genfragment blev indsat til dannelse af pRW749A og pRW749B, der repræsenterer modsatte orienteringer af indsættelsen. Rekombination af disse donorplasmider med FP-1 resulterede i 20 hhv. vFP-8 og vFP-9. Dette locus er nu designeret locus f8.

vFP-8 og vFP-9 udtrykte LacZ-genet, som påvist ved X-gal. vFP-6 og vFP-7 udtrykte rabies G-genet som påvist ved rabiesspecifikt antiserum.

25 EKSEMPEL 7 - Immunisering med vFP-3 til beskyttelse af dvr mod udfordring med levende rabiesvirus

Grupper på 20 SPF hunmus, 4-6 uger gamle, blev inokuleret under fødderne med 50 μΙ vFP-3 i doser fra 0,7 til 6,7 TCID50 pr. mus. [TCID50 eller 30 vævskultur-infektiøs dosis (tissue culture infectious dose) er den dosis, hvorved der ses cytopatisk virkning i 50% af celler i vævskultur). 14 dage DK 176165 B1 27 efter vaccinationen blev 10 mus i hver gruppe slået ihjel, og der blev taget serumprøver med henblik på prøvning ved RFFI-afprøvningen. De tilbageværende 10 mus blev udfordret ved intracerebral inokulering af 10 LD50 rabies af CVS-stammen og overlevende mus optalt 14 dage efter udfordringen.

5

Resultaterne er vist i tabel VA nedenfor.

TABEL VA

vFP-3 dosis Rabies antistof titer 10 Loom TCIDsn Login Fortynding' Overlevelse 6.7 1,9 8/10 4.7 1,8 0/10 2.7 0,4 0/10 15 0,7 0,4 0/10

Som målt ved RFFI (Rapid Fluorescent Focus Inhibition) afprøvningen, Laboratory Techniques in Rabies, 3. udg., 354-357, WHO, Geneve.

20 Forsøget blev gentaget med 12,5 LD5o udfordrende rabiesvirus. Resultaterne er vist i tabel VB nedenfor.

TABEL VB

vFP-3 dosis Rabies antistof titer 25 Loom TCIDsn Loom Fortynding* Overlevelse 6.7 2,8 5/10 4.7 2,1 2/10 2.7 0,6 0/8 30 0,7 0,6 0/8

Som målt ved RFFI (Rapid Fluorescent Focus Inhibition) afprøvningen, Laboratory Techniques in Rabies, 3. udg., 354-357, WHO, Geneve.

35 To hunde og to katte blev immuniseret med en enkelt subcutan inokulering af 8 logio TCID50 af det rekombinante vFP-3. Yderligere blev to hunde og fire katte af tilsvarende alder og vægt holdt som ikke-vaccinerede kontroller. Der DK 176165 B1 28 blev udtaget blodprøver på alle dyr med ugentlige mellemrum. På dag 94 blev hver hund udfordret ved inokulering i tindingemuskelen af to doser på 0,5 ml af et spytkirtelhomogenat af rabies virus af NY-stammen, tilgængelig fra Institut Merieux, Inc. Den totale dosis svarede til 10000 muse LD50 5 indgivet ad intracerebral vej. De seks katte blev på lignende måde udfordret ved inokulering i nakkemuskelen med to doser på 0,5 ml af den samme virussuspension. Den totale dosis pr. dyr svarede ti) 40000 muse LD50 indgivet ad intracerebral vej. Dyrene blev observeret dagligt. Alle ikke-vaccinerede dyr døde med rabiessymptomer på den i tabel VI angivne dag.

10 De vaccinerede dyr overlevede udfordringen og blev observeret i tre uger, efter at det sidste kontroldyr døde. Resultaterne er vist i tabel VI nedenfor.

TABEL VI Overle- 15 velse/ Vaccine- Døds- dvr ring Titer på postinokulerinasdaq tidspunkt 0 14 21 28 94

Kat 20 7015 vFP-3a 0 2,2b 2,4 2,4 1,5 + 7016 vFP-3 0 1,7 1,9 2,0 1,3 + 8271 cc 0 0 0 0 0 d/13d T10 c 0 0 0 0 0 d/12 T41 c 0 0 0 0 0 d/13 25 T42 c 0 0 0 0 0 d/12

Hund 426 vFP-3 0 0,8 1,0 1,1 1,2 + 427 vFP-3 0 1,5 2,3 2,2 1,9 + 30 55 c 0 0 0 0 0 d/15 8240 c 0 0 0 0 0 d/16 3 Både katte og hunde vaccineret med vFP-3 modtog 8 logi0TCID5o ad subcutan vej.

35 b Titer udtrykt som log10 højeste serumfortynding der giver mere end 50% reduktion i antallet af fluorescerende brønde i en RFFI-test. c Ikke-vaccinerede kontroldyr. d Dyret døde/dødsdag efter udfordring.

DK 176165 B1 29 I yderligere forsøg blev de rekombinante vira vFP-2 og vFP-3 inokuleret i kvæg ad flere forskellige indgivelsesveje.

Inokulerede dyr blev afprøvet for anti-rabies antistof pådagene 6, 14, 21, 28 5 og 35. Som vist i den følgende tabel VIIA udviste alle dyr et serologisk respons på rabiesantigenet.

TABEL VIIA

10 Antistof-titere i pattedyr inokuleret med vFP-3 anti-rabies neutraliserende antistoffer RFFI-test login fortynding

Dag 0 6 14 21 28 35 15 Kvæg nr.

7.3 log-ίο TCID50 1420 (intraderm.) NEG 0,6 2 1,7 1,8 1,7 20 8 log-ιο TCID50 1419 (subcutan) NEG 1,6 2,2 2,1 2,1 1,9 8 logto TCID50 1421 (intramusk.) NEG 0,9 2,2 2,2 1,8 1,7 25 7.3 logi o TCID50 1423 (intramusk.) NEG 0,9 1,1* 1+ 1+ 1,1* + Ikke signifikant.

30

Hvert stykke kvæg blev revaccineret med 8 log10 TCIF50 55 dage efter inokulering og udviste et anamnestisk respons på rabiesantigenet. Ved booster-revaccination blev alt kvæget inokuleret subcutant undtagen nr.

1421, der igen inokuleredes intramuskulært. RFFI-titere blev bestemt på 35 dagene 55, 57, 63, 70, 77 og 86. Resultaterne er vist i tabel VIIB.

DK 176165 B1 30

TABEL VIIB

Dag 55 57 63 70 77 86

Kvæg nr.

5 1419 1,7 1,5 2,9 2,9 2,6 2,9 1420 1,0 0,5 1,9 2,3 2,2 2,0 1421 1,3 1,2 2,9 2,7 2,5 2,5 10 1423 1,0 0,7 2,4 2,5 2,5 2,2

Alle tal er for vFP-3 med undtagelse af dyr nr. 1423, der er for vFP-2.

15 Kvæg, katte og kaniner blev også inokuleret intradermalt med kendte mængder af fjerkræpox-virus, og efter en uge blev sår opsamlet fra dyrene.

Disse blev formalet, suspenderet i saltvandsopløsning og titreret til bestemmelse af virusmængderne.

2 0 Kun residuale mængder af infektiøs virus kunne genvindes. Dette viser, at der in vivo ikke forekom nogen produktiv infektion.

EKSEMPEL 8 - Inokulering af kyllinger med vFP-3 25 Det rekombinante fjerkræpox-virus vFP-3 blev inokuleret i kyllinger for at vise udtrykkeisen af fremmed DNA af et rekombinant fjerkræpox-virus i et system, der tillader produktiv replikation af vektoren.

Kyllinger af hvide italienerhøns blev inokuleret intramuskulært med 9 log10 30 TCID50 vFP-3 eller 3 logio TCID50 vFP-3 ved vinge-gennemstikning. Der udtoges blodprøver til en RFFI-afprøvning for rabies antistoftiter 21 dage efter vaccinering. Titere fra dag 21 i inokulerede kyllinger var signifikant højere end titere fra dag 21 i kontroller. Gennemsnitstiteren for de uinficerede DK 176165 B1 31 kontroller var 0,6, gennemsnittet for de intramuskulært inokulerede fugle var 1,9 og gennemsnittet for de vinge-gennemstukne fugle var 1,2.

EKSEMPEL 9 - Rekombinant fjerkræpox vFP-11, der udtrykker kalkun-5 infiuenza-H5-HA-antiqen

Fuglearter kan immuniseres mod fuglepatogener ved brug af de rekombinante avipoxvira ifølge opfindelsen.

io Således blev det hidtil ukendte plasmid pRW759 (beskrevet nedenfor), der er afledt fra fjerkræpox-virus FP-1 og som indeholder det Hindlll H-promoterede hæmagglutinin-gen (H5) fra A/turkey/lreland/1378/83 (TYHA), anvendt til transfektion af CEF-celler, der samtidig var inficeret med parentalt virus, FP- 1. Rekombinant fjerkræpox-virus vFP-11 blev opnået ved de tidligere bels skrevne teknikker.

Syntesen af et hæmagglutininmolekyle af vFP-11-inficerede celler blev bekræftet ved immunpræcipitering fra metabolisk radiomærkede inficerede cellelysater ved brug af specifikt anti-H5-antistof og standard teknikker. Der 20 blev vist specifik immunpræcipitering af prækursor-hæmagglutinin med en molekylvægt på ca. 63 kd (kilodalton) og to kløvningsprodukter med molekylvægte på 44 og 23 kd. Der blev ikke præcipiteret sådanne proteiner fra et lysat af uinficerede CEF-celler eller celler inficeret med parentalt virus, FP-1.

25

Der blev foretaget immunfluorescensundersøgelser til bestemmelse af, at HA-molekylet, dannet i celler inficeret med det rekombinante fjerkræpox vFP-11 blev udtrykt påcelleoverfladen. CEF-celler inficeret med det rekombinante fjerkræpox-virus vFP-11 viste kraftig fluorescerende mærkning på overfladen.

30 I celler inficeret med det parentale virus FP-1 sås ingen fluorescens.

DK 176165 B1 32

Plasmid pRW759 blev dannet på følgende måde: pRW742B (jfr. eksempel 4) gøres lineært ved delvis nedbrydning med Pstl, og fragmentet skæres igen med EcoRV til fjernelse af rabies-G-genet, hvilket 5 efterlader HH-promotoren på det tilbageværende fragment på ca. 3,4 kbp.

Dette behandles med alkalisk phosphatase, og et syntetisk oligonukleotid blev indsat til sammenføjning af HH-promotoren med TYHA ved ATG til dannelse af pRW744.

10 Dette plasmid blev gjort lineært ved delvis nedbrydning med Dral, det lineære fragment skåret med Sall og det største fragment blev reisoleret og behandlet med alkalisk phosphatase.

Til slut blev pRW759 dannet ved indsættelse i pRW744-vektoren af den 15 isolerede Sall-Dral kodesekvens fra TYHA, beskrevet af Kawaoka et al., Virology 158:218-227 (1987).

EKSEMPEL 10 - Immunisering med vFP-11 til beskyttelse af fugle imod udfordring med levende influenzavirus 20

For at vurdere immunogeniciteten af det rekombinante fjerkræpox-virus vFP-11, udførtes vaccinations- og udfordringsforsøg med kyllinger og kalkuner.

Særlige patogenfrie kyllinger af hvide italienere blev i en alder af 2 dage og 5 25 uger vaccineret ved vingevævspunktur med en dobbelt kanyle, der anvendes til kommerciel vaccinering af fjerkræ med ijerkræpox-virus. Hver fugl blev indgivet ca. 2 pi indeholdende 6 x 105 pfu vPF-1. Der blev udtaget blodprøver fra de ældre fugle før vaccineringen, og der udtoges blodprøver fra alle fugle før udfordring og to uger senere.

30 U> ΙΟ to Η Η Ο U1 Ο (_Π Ο 2 ω· = g < ug cd “ ^ ξ ^ g g1 2.0.^^¾^¾¾ £.=f™c?S“|3<i.Sc5: o - ® » a> s i ^ g c 0)Φ3^·ο.3. ^B cCD^^-cq 5' 3 => 230° JL. 0¾ 2 ”££®§-|»®-g. 2.-3^¾ ® s Sa~Xi>®3 5 S 3 · ? £ < 1 3 ® · ; < 8 1 δ 5 ?

Qj 3 ^ *< O C/) C/> Q_ rr CD O nj rri 1 - Λ (Q O" — = D (Q Q) )< -5 ^ 5 <2_ (Q Q) o ^ CD —1 5L c Η©3Λ35Λ3ο.®σ"<Λωσ; _* Q c g 3 ST » 3<|3®σ§[σ§“<ίΜ 1 ^ ^ i- - I o.

(oM tT^^rCL — 3f- o_i Q. 33m—-CT—··< 3 ϊ I ^ ‘ α 3 5' ΐ I ; U «S S σ ΰ ° f i i &§!iissl'!3isil I ff r ς s s i : s. i| i« & is u s 1 “ i I f. - 3 3 ^ ^ ^hi<Q)?^WX 03 13 *< f/j a 0 $

DjS.^-<Da>Q.^a)< oco)oi2 == cl ^ S? ^ ^ o.

13 C 2 ^ ^ Φ o (Q 7 (D -V Q) < 5 π 2- m Q)

®row· _. 5· s φ ii §· fD o g Q- g <0 2. 8 2 a <Q

teipJvifQ?·» Π)”1 "Lk —' CD CD C 3 < 3 CD

® Ό Q_ '<. q CD 2» O a. CD 8 Q 3 o. 2- CD ΠΙ

00>°<=:CD-,92.o'Tj?3:=?>a ?> =S (Q CD — _ CL > CO

CQ U) ?e ,5 -3. p, α 2, 5 IQ CD d (D 7Γ 3D z ω 1 c ^ I 2 ! i 2-2.QffiM32-c<DCQo|i 5 <Q ω (/) ? o> -n

3 r* ^ _. °OCD23roQ. Cfl^J— Ό 9 O 'i Q)· CD

0',iO^®3®0®®IJ0|jD “ (Q M ? £ 3 00 I

•ozr^-S-^cu^wcQ™3·013'0 CD ω o -5 o σ- ^J§^c§“®|. “sg3£B 2 i. i. § £ δ’ g *§ _ ® S ® aaoj^o ^?,-, _ =-< >0 —* cd 11 13 1 i -! 11" *! S I f s 11 i 11 ? å Γ “ I I s S H a 5 · Mg“” 3

Opræ-CD o 2 -?> o 2> y QjwfOCflMD® αΙ(θ“< ^»®»?3Γ τι 2 W ^ i“ |ro ^ 5 2

2 71 ω co q 8 I Q

s ff i S ! 51 · ?δ ^ e α ®® 5’ ^ 2 v> <?> «> g m rø ^ Φ -Q 2 Ο ^<9.(0 m3 ro S -O φ n ^ J o

c« 2 Γ4" CD D. CD 2 - CQ 8 CD CD C CD a CD Q)· M A _. 2 D

DK 176165 B1 34 ikke nogen sekundære læsioner, og der var ikke tegn på spredning til ikke-vaccinerede kontaktkyllinger. Resultaterne af udfordringsforsøget er vist i tabel VIII og de tilhørende serologiske resultater i tabel IX.

5 TABEL VIII

Beskyttelse af kyllinger formidlet af H5 udtrvkt i fierkræpox Påvist 10 udfordrina Beskyttelse Virus

Kyllingers

Virus_Vaccine alder Syg/død/total Trachea Kloak_

Ty/lreland Fowlpox-H5 2 dage 0/0/10 0/10 0/10 (H5N8) (vFP-11) 5 uger 0/0/5 0/5 0/5 15

Inaktiveret 2 dage 0/0/9 0/9 0/9 H5N2 5 uger 0/0/5 0/5 0/5

Fowlpox 2 dage 10/9/10 2/6 3/6 20 control 5 uger 4/3/5 0/5 4/5

Ingen 2 dage 10/9/10 2/7 5/7 2 dage' 2/1/2 2/2 2/2 5 uger 2/2/5 0/5 1/5 25

Ck/Penn Fowlpox-H5 2 dage 0/0/10 8/10 0/10 (H5N2) (vFP-11) 5 uger 0/0/6 5/6 2/6

Inaktiveret 2 dage 0/0/8 2/8 0/8 30 H5N2 5 uge 0/0/5 3/5 0/5

Fowlpox 2 dage 10/1/10 10/10 10/10 control 5 uger 5/0/5 5/5 5/5 35 Ingen 2 dage 9/3/9 9/9 9/9 2 dage' 2/2/2 2/2 2/2 _5 uger 5/2/5_5/5 5/5_ * Fire ikke-vaccinerede fugle opholdt sig hos og voksede op med Ijerkræpox-4 o H5-gruppen på 10 fugle til afprøvning af spredningen af fjerkræpox-H5.

DK 176165 B1 CM —- O O ©

ω o o o S

•e omomoomo-b LU l^-CM'>iT-"<3-M-CMrs'm

c CO

S .. c t: .= " 0) o O £ Q.

m ’> ^ ^ CD = r τ >- > 32 ^ © o

% 0) & o LO

«*=111 VVt-t-VVVV

.b z > CO __ ro o 2- c c b R o o o * o * ~ ω ω ϋ2 So oo oo oa

D <Λ S O O in O O O O

J= ^ T3 UJ τ- CM CO t— tos 7= 10 c S b ro

Id 5 2 fe z

> 1 QJ O O

Ό <b O CO LO Tj-

JiC LU N- -i- CO CM V V V V

CD C

ø ™ b ω o oooooo _© C LOO OO OO OO oo oo CM -b com — LU CO CM mCM CM CO CM CO O CO h- CM t-t- t- t- _ c ^ φ V 9- χ CL g LU -o o ©c oå oo

n CD m LU VV CO T- VV VV VV CM i- v V VV

< E 2? Η D -2 C *7" CM S S S — 'u -r- *— O O -— O O — — J2- CD -1- © CO O O O CO C. O O O O O S s. o

— -r, b m CO OO CO CM oo om oo oo O CO

J c ID 1— [N-co T-T- CO CM CO CM com CO O (O ΤΟ -2 c 2 T3 Ί^·'- CD I-·- —

> QJ o. o O O

^ tc m o om m o o o

Φ LU T-T- COCO VV VV T- CO COCO VV VV

L.

CD

o 3 d) l_ Q)|_ Ol_ Q)l_ d) l_ Q3l_ 0) L. © l_ T3 c 1_ 030) O) 0) 0)0) 0)0) 0)0) 0)0) 0)0) 0)0) C ^ </5 Φ CO O) (0 O) CO O) CO O) (Q O) <0 O) COO) COO) — 3%<S32 Ό 3 “03 “03 Ό 3 Ό 3 "Ο 3 “03 Ό 3 £5 XO)cd cm m cm m cm m cm m cm m cm m cm m cm m

O

Q

Λ« 1 1 1 1

CD X „ X X .. X

R 2 8. 8. 2 8 % 1 § 1N Ιό c § lo c o O "C -* Z £ r © Z "C b © — m © m © m ©. b O) © m com ©. b ©> 2 > iTX -El iT 3 c 073; c x ir5 c

CD

ω 8 Ό © c c 2-55® © O « *- Z Q_ B2 ^ 32 3 > K- i- o in o m o m o H <H CM cm o LO to [Ο |_ι Η O LH O (Jl o

OCCACTC^'^A

s s s s å ! i n -2-s O ~ W Bi -i S; 3 00 jn £ CQ ^ o ‘S 3 MCTO-HI3 c <D 3 > —| CT K> -> C Tra ® ™ 9- « 3' ™ 5 ® «i 3 iifflOyyioi: ^ S (O ® 2 m < m - CW^.N3T^=«> (t> = =

J|ip 3 ? J

Ih! Ixi <5' ® c 3 q. 7 ® ^ w i* 9 “l-ω “ "‘^tQ ® ^ i

Ills!- M i | § : ^ ° § ° ; ! f s 1 £ §f s = ϊi?l| ps|a;?lg ; : 31 : ? ? 1 “· I f i § ^ 3 M |n|S § |i μ ? s ί 11 * g f i ϊ 1:I1H-?11 ϊ & H s 9 ~ S ξ $ 3 ^ ? g 2 O i § ro EqTcqS« E = 5 H 8. -S si- g « a 1 i D-g-^D^DO D o-^ 23 "D<5 9 g 9 O ~ q- ° £ o <2 α. ϋ 2 J a ® ro 9- 2 ω ro s σ 2 ro (, mi;-i fiumii* i*h« ! I! I! t i ! *:! I i;51! jlii: 9 P < | I 5 § S g 3 !e 3 3 ^"| ® <§ S g < <D Q 3‘ g- - i < ~ ® J 5' “ " I ; i r ? i s·5 j i §> ? f c

So!. ?S 3 7 f ! ft “ TI 3 °n ! ? ?

^ ? f| S ^ i I “ I ft I 3 bl ? ? a = ? 5' 9 C

^ ! I 3 I; »s a s. - <« 3 * c Φ » I S 5 I °-B · ?ΐ i ' <8 <g 3 o “ Q 9 9 Q- °· ~i ^<®mno' = ai9 ? ^ (q (c 3 3 id ~ a 3 a !fi “ ^ T* s' § — -§ m m o. £ g O 0 £ 0 O 0 CQ c P n S D.T3 T CO D CD 3 O. D _. Si -i g 9 N ? <D S· ® ® o, jj j DK 176165 B1 37 delen af disse fugle døde. De vaccinerede fugle udskilte ikke påviselige niveauer af Ty/lre, men udskilte Ck/Penn.

Både de inaktiverede og rekombinante vacciner inducerede Hl og 5 neutraliserende antistoffer mod Ty/lre, men mængden af antistof induceret af fjerkræpox-H5-rekombinanten, vFP-11, før udfordring inhiberede ikke HA eller neutraliserede det heterologe Ck/Penn H5. Dog var kyllingerne beskyttet mod udfording med både Ty/lre- og Ck/Penn-influenzavira.

10 Immunitet mod H5-influenza induceret af vFP-11-vaccinationen varede i mindst 4 til 6 uger og var krydsreaktiv. For yderligere at undersøge varigheden og specificiteten af responset blev en gruppe af 4 uger gamle kyllinger inokuleret i vingevævet med vFP-11 som tidligere beskrevet og udfordret med månedlige intervaller med den krydsreaktive Ck/Penn-virus.

15 Der blev igen ikke påvist Hl-antistoffer før udfordringen. Ikke desto mindre var fuglene beskyttet i mere end 4 måneder.

Den af vFP-11 udtrykte H5 inducerer ligeledes et beskyttende immunrespons i kalkuner. Udavlede hvide kalkuner blev i alderen 2 dage og 4 uger 20 vaccineret ved vingevævsinokulering som tidligere beskrevet. Resultaterne er vist i tabel X.

DK 176165 B1 S*® S <° Ό Ό _o — Lu ^ "α ~o s- >* O ·“ GO Ό O T— c C !_ <o c a> ό «ί T— Ο r-

LU V i- V V

04 0) Jr o 0)

-σ ® O O Ό -D

[— k»— vjz! (O Q 0

OjO LU t- CD T3 Ό

r- »- W P

II CD ~ ±: > .£2 c "5- i s5»-- S +-· ΊΓ l-

__ D-*-0 O O O O

-* 2 LU V V V V

Ό < 5®

I E _2 lf> CD 04 CM

LO ’> ^ CO O ?g cg

X

ro ® -i cd c ro « UJ ό c æ 00 CD F w < c > ° I— o »ro 2 o co cg cm X Η δ δ δ δ ω c

D

3 ra **= co id ® ΐ $

CD lO CO CM CM

^ Ο δ ^ ^ $ CM

CD CO V- CM CM CM

CO CD

m

CO

CD Λ\

C ® 1_ CD W

CD i_ S5 CD D) CD

TO CD CD TO CD

3 TD 73 D T3 3 U_ ro ^ M" CM M- c

CO

g - s si •I T § 5 2

O LJ_ O C

5 £ 2

LO Ο ΙΟ O

H r-C CM

DK 176165 B1 39

Der observeredes signifikant overlevelse imod udfordring med den homologe Ty/lre-virus i begge aldersgrupper. Ikke-vaccinerede kontakt-kontrolfugle opholdt sig sammen med de vaccinerede fugle til afprøvning af spredningen af den rekombinante virus. Disse fugle overlevede ikke udfordring.

5 EKSEMPEL 11- Konstruktion af fierkræpox-virus FP-1 rekombinant vFP-12. der udtrykker kvllinaeinfluenza nukleoorotein (NP) gen 10 Plasmid pNP33 indeholder en cDNA-klon af influenza vi ruset Chicken/Pennsylvania/1/83 nukleoproteingenet (NP). Kun 5’- og 3'-endeme af det ca. 1,6 kbp NP-gen er blevet sekventeret. NP blev i form af et 5'-Clal-Xhol-3’-fragment med stumpe ender flyttet fra pNP333 over i Smal-nedbrudt pUC9, med pUC9's EcoRI-sted i 3-enden, hvilket frembragte pRW714.

15 Translationsinitieringscodonen (ATG) i NP indeholder følgende understregede Ahall-sted: ATGGCGTC. Den tidligere beskrevne vaccinia-H6-promotor blev forbundet med NP med et dobbeltstrenget syntetisk oligonukleotid. Det syntetiske oligonukleotid indeholdt H6-sekvensen fra EcoRV-stedet til sit ATG og ind i NP-kodesekvensen i Ahall-stedet. Oligo-20 nukleotidet blev syntetiseret med BamHI- og EcoRI-kompatible ender til indsættelse i pUC9 til frembringelse af pRW755. Startende i den BamHI-kompatible ende, med ATG understreget, er sekvensen for det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid:

25 GATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCG

GC TATAGGCAAT T CAAACATAGCAT TAC C G CAGCTTAA

Det lineære delvist Ahall-nedbrudte produkt af pRW755 blev isoleret og genskåret med EcoRI. pRW755-fragmentet, indeholdende en enkelt Ahall-30 skæring ved ATG og genskåret med EcoRI, blev isoleret, behandlet med DK 176165 B1 40 phosphatase og brugt som vektor for pRW714-nedbrydningsproduktet nedenfor.

Det isolerede lineære delvist Ahall-nedbrudte produkt af pRW714 blev 5 genskåret med EcoRI. Et isoleret Ahall-EcoRI-fragment på ca. 1,6 kbp indeholdende NP-kodesekvensen blev indsat i den ovennævnte pRW755 vektor til dannelse af pRW757. Den fuldstændige H6-promotor blev dannet ved at tilføje sekvenserne opstrøms (5') for EcoRV-stedet. Plasmidet pRW742B (beskrevet i eksempel 4) fik H6-sekvensen nedstrøms (3') for 10 EcoRV-stedet fjernet sammen med sekvenser hen til pUC9's Ndel-sted. pRW742B EcoRV-Ndel-fragmentet, der var behandlet med phosphatase, blev anvendt som en vektor for pRW757-fragmentet nedenfor. Det isolerede lineære partielle EcoRV-nedbrydningsprodukt af pRW757 blev genisoleret efter Ndel-nedbrydning; dette fragment indeholder H6-promotoren fra 15 EcoRV-stedet gennem NP til pUC9's Ndel-sted. pRW757-fragmentet blev indsat i pRW742B-vektoren til dannelse af pRW758. EcoRI-f rag mentet fra pRWW758, indeholdende det fuldstændige H6-promoterede NP, blev gjort stump-endet med Klenow-frag mentet fra DNA-polymerase I og indsat i Hincll-stedet af pRW731.13 til dannelse af pRW760. Hincll-stedet i 2 o pRW731.13 er FP-1 -locuset anvendt i eksempel 6 til konstruktion af vFP-6 og vFP-7.

Ved brug af fjerkræpox FP-1 som det reddende virus, blev plasmid pRW760 anvendt i en in vitro rekombinationsafprøvning. Afkom af plakker blev prøvet 25 og plakoprenset under anvendelse af in situ pfakhybridisering. Udtrykkelse af genet er blevet bekræftet ved immunpræcipiteringsstudier under anvendelse af et polyklonalt anti-NP-antiserum fra ged. Størrelsen af proteinet, der specifikt præcipiterede fra et lysat af vFP-12-inficerede CEF-celler, var ca. 55 kD, hvilket ligger inden for den beskrevne størrelsesorden for influenzavirus- 3 0 nukleoproteiner.

DK 176165 B1 41 EKSEMPEL 12 - Fremstilling af en fierkræpox-virus dobbelt rekombinant vFP-15. der udtrykker generne for fualeinfluenza nukleoproteinet (NP) og hæmagglutinin (HA) 5 Hæmagglutinin (HA) genet fra A/Tyr/lre/1378/83 er tidligere beskrevet ved konstruktionen af vFP-11 (eksempel 9). For at fremstille en dobbelt rekombinant blev HA-genet først flyttet til locus f8, der tidligere er defineret ved konstruktionen af vFP-8, under anvendelse af plasmid pRW731.15.

10 Til konstruktion af vFP-11 anvendtes plasmidet pRW759. Hæmagglutinin-genet koblet til H6-promotoren blev fjernet fra dette plasmid ved en delvis Pstl-nedbrydning. Dette fragment blev gjort stump-endet med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I og indsat i det stump-endede BamHI-sted i pRW731.15 til dannelse af pRW771.

15

Plasmid pRW771 blev derpå anvendt i en in vitro rekombinationsafprøvning ved brug af vFP-12 som det reddende virus. Det rekombinante vFP-12-virus indeholder nukleoproteingenet koblet til H6-promotoren i locus f7 i plasmid pRW731.13. Rekombinante plakker, der nu indeholdt begge indsættelser, 20 blev selekteret og plakoprenset ved in situ hybridisering og overfladeudtrykkelse af hæmagglutininet, bekræftet ved en protein-A-β-galactosidase-koblet immunprøvning. Udtrykkelse af begge gener blev bekræftet ved immunpræcipitering fra lysater af celler inficeret med det dobbelt rekombinante virus, vFP-15.

25 EKSEMPEL 13 - Konstruktion af rekombinant kanariepox-vira

Det følgende eksempel viser identificering af fire ikke-essentielle indsættelsesloci i kanariepox-genomet og konstruktionen af fire 3 o rekombinante kanariepox-vira, vCP-16, vCP-17, vCP-19 og vCP-20.

DK 176165 B1 42

Det rekombinante kanariepox vCP-16 blev konstrueret påfølgende måde.

Et Pvull-fragment af kanariepox-DNA på 3,4 kbp blev klonet ind i pUC9 til dannelse af pRW764.2. Der blev fundet et unikt EcoRI-sted beliggende ! 5 asymmetrisk inde i fragmentet med en kort arm på 700 bp og en lang arm på 2,7 kbp. Plasmidet blev nedbrudt med EcoRI og gjort stump-endet under anvendelse af Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I. Det stump-endede H6/rabies-G-gen blev derpå ligeret ind i dette sted og anvendt til transformation af E. coli. Det resulterende plasmid, pRW775, blev brugt ved en in vitro ίο afprøvning for rekombination. Afkom af plakker, der var positive ved en immunscreening, blev selekteret og plakoprenset. Den resulterende re-kombinant blev designeret vCP-16, og indsættelseslocuset designeredes C3.

Plasmidet pRW764.2, anvendt ved ovennævnte konstruktion, indeholdt også 15 et unikt Bglll-sted ca. 2,4 kbp fra EcoRI-stedet. Ved brug af den samme kloningsstrategi blev H6/rabies-G-genet ligeret ind i plasmid pRW764.2 pådette sted til dannelse af pRW774. Dette plasmid blev anvendt til konstruktion af rekombinant vCP-17 med indsættelseslocuset designeret C4.

20 Plasmid pRW764.5 indeholder et Pvull-fragment af kanariepox-DNA på 850 bp med et unikt Bglll-sted beliggende assymmetrisk inde i fragmentet 400 bp fra den ene terminus. Ved brug af den samme kloningsstrategi som før beskrevet blev det til H-6-promotoren koblede rabies-G-gen indsat på dette sted til dannelse af pRW777. Det dannede stabile rekombinant virus blev 25 designeret vCP-19 og indsættelseslocuset designeredes C5.

Plasmid pRW764.7 indeholder et Pvull-fragment på 1,2 kbp med et unikt Bglll-sted 300 baser fra den ene terminus. Plasmidet blev nedbrudt med Bglll og gjort stump-endet med Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I. Det 30 stump-endede 11 K-promoterede Lac Z-gen blev indsat til dannelse af plasmid pRW7778. Det stabile rekombinant virus dannet ved anvendelse af DK 176165 B1 43 dette plasmid blev designeret vCP-20 og indsættelseslocuset designeredes C6.

EKSEMPEL 14 - Konstruktion af en fierkræpox-virus rekombinant. vFP-5 29. der udtrykker fusionsproteinet for Newcastle disease virus

Plasmid pNDV108, cDNA-klonen fra fusionsgenet fra NDV Texas-stamme, » bestod af et Hpal cDNA-fragment på ca. 3,3 kbp indeholdende ίο kodesekvensen for fusionsproteinet såvel som yderligere NDV- kodesekvenser klonet ind i Scal-stedet i pBR322. Trinene til dannelse af indsættelsesplasmidet er beskrevet nedenfor.

(1) Dannelse af plasmid pCE11 15

Der blev konstrueret en FPV-indsættelsesvektor, pCE11, ved indsættelse af polylinkere i Hincll-stedet af pRW731.13 (designeret som locus f7). pRW731.13 indeholder et 5,5 kbp Pvull-fragment af FP-1 DNA. Et ikke-essentielt locus var før blevet defineret i Hincll-stedet ved konstruktion af den 20 stabile rekombinant vFP-6, beskrevet i eksempel 6. Polylinkerne indsat i Hincll-stedet indeholder steder for følgende restriktionsenzymer: Nrul, EcoRI,

Sacl, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Hindi, Sall, Accl, Pstl, Sphl, Hindlll og Hpal.

(2) Dannelse af plasmid pCE19 25

Dette plasmid er en videre modifikation af pCE11, hvori transkriptionsstop-signalet ATTTTTNT fra vaccinia-virus (L. Yuen og B. Moss, J. Virology 60:320-323 [1986]) (hvor N i dette tilfælde er et A) er blevet indsat mellem Sacl- og EcoRI-stedeme af pCE11, med efterfølgende tab af EcoRI-stedet.

30 DK 176165 B1 44 (3) Indsættelse af NDV-kodesekvenser

Et geloprenset BamHI-fragment på 1,8 kbp, indeholdende alle med undtagelse af 22 nukleotider fra 5'-enden af fusionsproteingenet, blev indsat i 5 BamHI-stedet af pUC18 til dannelse af pCE13. Dette plasmid blev nedbrudt med Sall, der skærer i vektoren 12 baser opstrøms fra 5-enden af kodesekvensen. Enderne blev udfyldt med Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I, og plasmidet blev yderligere nedbrudt med Hindlll, der skærer 18 baser opstrøms fra Sall-stedet. Et geloprenset Smal-Hindlll-fragment på xo 146 bp, indeholdende vacciniavirus-H-promotoren, der tidligere er beskrevet i foretrukne udførelsesformer, såvel som polylinker-sekvenser ved hver terminus, blev ligeret til vektoren og transformeret ind i celler af E. co!i. Det resulterende plasmid blev designeret pCE16.

15 For at bringe den initierende ATG-codon af NDV-fusionsproteingenet på linje med 3'-enden af H6-promotoren og for at erstatte de 22 nukleotider, der mangler i NDV-5-enden i pCE16, blev der skabt komplementære syntetiske oligonukleotider, der ender i EcoRV- og Kpnl-steder.

20 Oligonukleotidsekvensen var 5'ATC-CGT-T AA-GTT-TGT-ATC-GT A-AT G -G G C-T C C-AG A-T CT -T CT -ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C 3’.

pCE16-konstruktionen blev derpå nedbrudt med EcoRV og Kpnl. EcoRV-25 stedet findes i H6-promotoren 24 baser opstrøms for det initierende ATG. Kpnl-stedet findes i NDV-kodesekvensen 29 baser nedstrøms for ATG.

Oligonukleotider blev sammensmeltet, phosphoryleret og ligeret til det lineariserede plasmid, og det resulterende DNA anvendtes til transformation 30 af E. coli-celler. Dette plasmid blev designeret pCE18.

DK 176165 B1 45

For at indsætte NDV-kodesekvensen i en FPV-indsættelsesvektor, blev et geloprenset Smal-Hindlll-fragment på 1,9 kbp fra pCE18 (skærende i polylinker-området) ligeret til et Smal-Hindlll-fragment på 7,8 kbp fra pCE19, de er beskrevet ovenfor. Transkriptionsstop-signalet findes 16 baser 5 nedstrøms for Smal-stedet. Det resulterende plasmid blev designeret pCE20.

Plasmidet pCE20 blev brugt ved en in vitro afprøvning for rekombination under anvendelse af fjerkræpox-virus FP-1 som redningsvirus. Det resulterende afkom blev udpladet på CEF-monolag og plakkerne underkastet ίο en β-galactosidase-koblet protein-A-immunundersøgelse under anvendelse af et polyklonalt anti-NDV-kyllingeserum. Positivt farvede plakker blev selekteret og underkastet fire omgange plakoprensning for at opnå en homogen population. Rekombinanten blev designeret vFP-29.

15 EKSEMPEL 15 - Konstruktion af avipox-virus-rekombinanter. der udtrykker kappe (env) olvcoproteinet fra katteleukæmivirus (FeLV)

FeLV-env-genet indeholder sekvenserne, der koder for p70 + p15E

20 polyproteinet. Dette gen blev indledningsvis indsat i plasmidet pSD467vC med vaccinia-promotoren H6 5' sidestillet med FeLV-env-genet. Plasmidet pSD467vC afledtes ved først at indsætte et Sall/Hindlll-fragment på1802 bp indeholdende vaccinia-hæmagglutinin (HA) genet i en pUC18-vektor. Beliggenheden af HA-genet er før defineret (Shida, Virology 150:451-462 25 [1988]). Størstedelen af den åbne læseramme, der koder for HA- genproduktet, blev deleteret (nukleotid 443 til og med nukleotid 1311) og der indsattes et multipelt kloningssted indeholdende Bglll-, Smal-, Pstl- og Eagl-restriktionsendonuklease-steder. Det resulterende pSD467vC-plasmid indeholder flankerende vaccinia-arme på 442 bp opstrøms fra det multiple 30 kloningssted og 491 bp nedstrøms fra disse restriktionssteder. Disse flankerende arme gør det muligt for genetisk materiale indsat i den multiple DK 176165 B1 46 kloningsregion at blive rekombineret ind i HA-regionen af Copenhagen-stammen af vacciniavirus. Det resulterende rekombinante . afkom er HA-negativt.

5 H6-promotoren blev syntetiseret ved sammensmeltning af fire overlappende oligonukleotider, der tilsammen udgør den komplette sekvens beskrevet ovenfor under foretrukne udførelsesformer. Det resulterende 132 bp fragment indeholdt et BglIl-restriktionssted i 5-enden og et Smal-sted i 3’-enden. Dette blev indsat i pSD467vC via Bglll-og Smal-restriktionsstedet.

10 Det resulterende plasmid designeredes pPT15. FeLV-env-genet blev indsat i det unikke Pstl-sted i pPT15, der ligger umiddelbart nedstrøms for H6-promotoren. Det resulterende plasmid designeredes pFeLVIA.

Til konstruktion af FP-1-rekombinanten, blev H6/FeLV-env-sekvenserne på 15 2,4 kbp skåret ud af pFeLVIA ved nedbrydning med Bglll og delvis nedbryd ning med Pstl. Bglll-stedet ligger ved 5'-grænsen af H6-promotorsekvensen. Pstl-stedet er beliggende 420 bp nedstrøms fra translationsterminerings-signalet for kappe-glycoproteinets åbne læseramme.

20 H6/FeLV-env-sekvensen på 2,4 kbp blev indsat i pCE11 nedbrudt med BamHI og Pstl. FP-1-indsættelsesvektoren, pCE11, var afledt fra pRW731.13 ved indsættelse af et multipelt kloningssted i det ikke-essentielle Hincll-sted.

Denne indsættelsesvektor tillader udvikling af FP-1 -rekombinanter indeholdende fremmede gener i FP-1-genomets locus f7. Det rekombinante 25 FP-1/FeLV-indsættelsesplasmid blev derpå designeret pFeLVFI. Denne konstruktion tilvejebringer ikke et perfekt ATG til ATG-substituering.

For at opnå den perfekte ATG:ATG-konstruktion, blev et Nrul/Sstll-fragment på ca. 1,4 kbp afledt fra vacciniavirus-indsættelsesvektoren pFeLVIC. Nrul-30 stedet forekommer inde i H6-promotoren på en position 24 bp opstrøms fra ATG. Sstll-stedet er beliggende 1,4 kbp nedstrøms fra ATG og 1 kbp DK 176165 B1 47 opstrøms fra translationsterminerings-signalet. Dette Nrul/Sstll-fragment blev ligeret til et 9,9 kbp fragment, der var frembragt ved nedbrydning med Sstll og ved delvis nedbrydning med Nrul. Dette 9,9 kbp fragment indeholder de 5,5 kbp af FP-1-flankerende arme, pUC-vektorsekvenser, 1,4 kbp af FeLV-5 sekvens svarende til den nedstrøms del af env-genet, og sekvensen nærmest 5-enden (ca. 100 bp) af H6-promotoren. Det resulterende plasmid blev designeret pFeFLVF2. ATG'et til ATG-konstruktion blev bekræftet ved nukleotidsekvensanalyse.

ίο En yderligere FP-1-indsættelsesvektor, pFeLVF3, blev afledt fra pFeLVF2 ved fjernelse af FeLV-env-sekvenserne svarende til det formodede immunsuppressive område (Cianciolo et al., Science 230:453-455 [1985]) (nukleotid 1548 til 1628 i kodesekvensen). Dette blev udført ved isolering af et Sstll/Pstl-fragment (steder beskrevet ovenfor) på ca. 1 kbp fra 15 vacciniavirus-indsættelsesvektoren pFeLVID. Plasmidet pFeLVID ligner pFeLVIC, bortset fra at env-sekvenserne svarende til det immunsuppresive område (nukleotid 1548 til 1628) var deleteret ved oligonukleotid-dirigeret mutagenese (Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7177-7181 [1987]). Sstll/Pstl-fragmentet på 1 kbp, der mangler nukleotideme 1548 til 1628, blev 2 0 indsat i et 10,4 kbp Sstll/Pstl-fragment indeholdende det resterende H6/FeLV-env-gen afledt fra pFeLVF2.

Indsættelsesplasmiderne pFeLVF2 og pFeLVF3 blev anvendt ved in vitro rekombinations-afprøvninger med FP-1 som det reddende virus. Afkom fra 25 rekombinationen blev udpladet på CEF-monolag og rekombinant virus ! selekteret ved plakhybridisering på CEF-monolag. Rekombinant afkom, identificeret ved hybridiseringsanalyser, blev selekteret og underkastet 4 runder plakoprensning for at opnåen homogen population. En FP-1-rekombinant, husende det fuldstændige FeLV-env-gen, er blevet designeret 30 vFP-25, og en FP-1-rekombinant, indeholdende det fuldstændige gen manglende det immunsuppressive område, blev designeret vFP-32. Begge i DK 176165 B1 48 rekombinanter er ved immunpræcipitering under anvendelse af et bovint anti-FeLV polyklonalt serum (Antibodies, Inc., Davis, CA) vist at udtrykke det passende genprodukt. Det er bemærkelsesværdigt, at disse FP-1-rekombinanter udtrykker det fremmede FeLV-env-gen i CRFK-cellelinjen 5 (ATCC #CCL94), som stammer fra katte.

Til konstruktion af kanariepox (CP) rekombinanter blev et 2,2 kbp fragment indeholdende H6/FeLV-env-sekvenserne udskåret fra pFeLVF2 ved nedbrydning med Smal og Hpal. Smal-stedet ligger på 5-grænsen af Ηβ-ίο promotorsekvensen. Hpal-stedet er beliggende 180 bp nedstrøms fra translationsterminerings-signalet for kappeproteinets åbne læseramme.

Den 2,2 kbp H6/FeLV-env-sekvens blev indsat i det ikke-essentielle EcoRI-sted i indsættelsesplasmidet pRW764.2, efter at EcoRI-stedet var gjort 15 stump-endet. Denne indsættelsesvektor tillader dannelse af CP- rekombinanter indeholder fremmede gener i CP-genomets C4-locus. Det re-kombinante CP-indsættelsesplasmid designeredes derpå pFeLVCP2. Denne konstruktion tilvejebringer et perfekt ATG til ATG substituering.

20 Indsættelsesplasmidet pFeLVCP2 blev anvendt ved en in vitro afprøvning for rekombination med CP som det reddende virus. Afkom af rekombinanteme blev udpladet påmonolag af CEF og rekombinant virus selekteret ved hjælp af en β-galactosidase-koblet protein-A-immunundersøgelse under anvendelse af et bovint anti-FeLV kommercielt polyklonalt serum (Antibodies, 25 Inc., Davis, CA). Positivt farvede plakker blev selekteret og underkastet fire omgange plakoprensning til opnåelse af en homogen population. En rekombinant, der udtrykker hele FeLV-env-genet, er blevet designeret vCP-36.

DK 176165 B1 49 EKSEMPEL 16 - Konstruktion af fierkræpox-virus-rekombinant vFP-22.

der udtrykker det Rous-associerede virus type 1 (RAV-1) kappe (env) gen 5 Klonen penvRVIPT af RAV-1-kappegenet indeholder 1,1 kbp af RAV-1-env-DNA-kodesekvens, klonet ind i M13mp18 som et Kpnl-Sacl-fragment. Dette fragment er intakt i 5-enden, men mangler en del af 3-sekvensen, og blev anvendt ved de følgende operationer. Et geloprenset EcoRI-Pstl-fragment på 1,1 kbp fra penvRVIPT blev indsat i EcoRI- og Pstl-stederne i pUC9 til 10 dannelse af pRW756. Dette plasmid blev derpå nedbrudt med Kpnl og Hindlll, der skar i vektoren 59 baser opstrøms fra ATG. Der indsattes et Kpnl-Hindlll-fragment på 146 bp indeholdende den oven for beskrevne vaccinia-H6-promotor til dannelse af plasmid pCE6.

15 For at sikre, at det initierende ATG fra RAV env genet var beliggende ved siden af 3'-enden af H6-promotoren med fremmede sekvenser deleteret, blev to komplementære syntetiske oligonukleotider konstrueret med EcoRV- og Banll-steder i termini. Oligonukleotidsekvensen var 5'-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-AGG-CGA-GCC-3\ 20

Plasmidet pCE6 blev nedbrudt med EcoRV, der skærer i H6-promotoren 24 baser opstrøms for ATG, og med Banll, der skærer i RAV-env-kodesekvensen 7 baser nedstrøms for ATG. DNA-segmenteme blev ligeret og anvendt til transformation af celler af E. coli. Det resulterende plasmid, 25 pCE7, tilførte slutkonstruktionen H6-promotoren og korrekt S'-sekvens.

Klonen mp19env (190) fandtes ved restriktionskortlægning at indeholde hele RAV-1 env genet. Et Kpnl-Sacl-fragment af mp19env (190) på 1,9 kbp indeholdende hele genet blev indsat i Kpnl- og Sacl-stederne af pUC18 til 30 dannelse af pCE3. Dette plasmid blev nedbrudt med Hpal, der skærer 132 baser nedstrøms fra det initierende ATG i kodesekvensen for RAV-1, og DK 176165 B1 50

Sacl, der skærer ved genets 3’-terminus. FPV-indsættelsesvektoren pCE11, der før er beskrevet, blev nedbrudt med Smal og Sacl, hvilket skar plasmidet i polylinkerregionen. Hpal-Sacl-fragmentet af pCE3 blev ligeret med pCE11 til dannelse af pCE14.

5

Plasmidet pCE7 blev derpå nedbrudt med Xhol og Hindlll til dannelse af et fragment på 332 bp indeholdende H6-promotoren og korrekt 5'-sekvens. Plasmid pCE14 blev nedbrudt med Hindlll, der skar i vektorens polylinker-region, og Xhol, der skar i kodesekvensen. Dette DNA ligeredes med Hindlll-lo Xhol-fragmentet opnået fra pCE7, hvorved dannedes pCE15, der var den endelige RAV-1-kappegen-konstruktion.

Dette plasmid blev brugt ved en in vitro afprøvning for rekombination med fjerkræpox FP-1 som redningsvirus. Afkom af rekombinationen blev udpladet 15 på CEF-monolag og plakkerne underkastet en β-galactosidase-koblet protein-A-immunundersøgelse under anvendelse af et anti-RAV-1 polyklonalt serum. Positivt farvede plakker blev selekteret og underkastet fire omgange plakoprensning for at opnå en homogen population. Rekombinanten blev designeret vFP-22. Immunpræcipiteringsforsøg under anvendelse af 20 celleiysater inficeret med vFP-22 har påvist specifik præcipitering af to proteiner med tilsyneladende molekylvægte på 76,5 kD og 30 kD, der svarer til kappegenets to genprodukter. Der sås ikke noget prækursor-genprodukt.

Ved indledende forsøg er induceret et immunrespons påRAV-l-25 kappegenprodukt i kyllinger inokuleret med vFP-22.

DK 176165 B1 51 EKSEMPEL 17 - Konstruktion af avipox-virus rekombinanter, der udtrykker GP51.30 kappe fenv) genet fra okseleukæmi-virus (BLV) 5 (1) Konstruktion af pBLVFI og pBLVF2

Plasmiderne pBLVFI og pBLVF2 indeholder gp51.30-env-genet fra BLV. I begge plasmider er BLV-env-genet under transkriptionel kontrol af H6-promotoren fra vacciniavirus og er klonet mellem flankerende arme af ίο fjerkræpox (locus f7). Nukleotidsekvensen af de to plasmider er identisk, undtagen i codonpositioner 268 og 269. (pBLVFI koder for et protein indeholdende aminosyrerne Arg-Ser i disse to positioner, hvorimod pBLVF2 koder for et protein indeholdende aminosyrerne Gln-Thr).

15 pBLVFI og pBLVF2 blev konstrueret ved følgende procedure. Plasmid pNS97-1, et plasmid indeholdende hele BLV-env-genet, blev skåret med BamHI og delvis skåret med Mstll. Fragmentet på 2,3 kbp, indeholdende hele gp51.30 genet, blev isoleret på en agarosegel og de udragende ender udfyldt med E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment). Der blev derpå 20 ligeret Pstl-linkere til enderne af fragmentet, som, efter nedbrydning med Pstl, blev ligeret ind i Pstl-stedet af pTP 15 (eksempel 15). Herved placeres BLV-genet ved siden af Vaccinia-H6-promotoren. (pTP15 indeholder Vaccinia-H6-promotoren klonet i et ikke-essentielt locus i vacciniagenomet).

25 Dette plasmid blev derpå skåret med EcoRV og delvis skåret med Avail. Fragmentet på 5,2 kbp blev isoleret og oligonukleotiderne 5’-AT CCGTT AAGTTT GT AT CGTAAT G CCCAAAG AACG ACG-3' og 5'-GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' anvendt til recirkularisering af plasmidet. Herved fjernes unødvendige baser mellem 3 0 BLV-genet og H6-promotoren.

DK 176165 B1 52

Det resulterende plasmid blev skåret med Pstl og delvis skåret med Bglll, og 1,7 kbp fragmentet indeholdende det H6-promoterede BLV-gen klonedes ind i BamHI-Pstl-stedet af pCE11, den tidligere beskrevne fjerkræpox-virus-ind-sættelsesvektor, under anvendelse af locus f7. Dette placerer det H6-5 promoterede BLV-gen mellem flankerende arme af fjerkræpox. Dette plasmid blev designeret pBLVFI.

Der blev anvendt en identisk procedure til konstruktion af pBLVF2 med undtagelse af, at et yderligere in vitro mutagenesetrin blev udført, før det ΗΘ-ΙΟ promoterede BLV-gen klonedes ind i pCE11. Denne mutagenese blev udført ved følgende procedure. Plasmid pNS97-1 blev skåret med Xmal og delvis skåret med Stul. Fragmentet på 5,2 kbp blev isoleret, og oligonukleotideme 5'-CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCTGACCTTAGG-3’ og 5'-CCTAAGGT CAG GGCTGCGACGGGAGTTT GT CT GAC-3' 15 brugt til recirkularisering af plasmidet. Dette ændrer nukleotidsekvensen af codonerne 268 og 269 fra CGC-AGT til CAA-ACT.

(2) Konstruktion af rekombinant vira 20 Plasmiderne pBLVFI og pBLVF2 blev anvendt ved en in vitro afprøvning for rekombination under anvendelse af FP-1 som redningsvirus. Rekombinant afkom blev selekteret ved in situ plakhybridisering, og når populationen ved dette kriterium blev bedømt som værende ren, blev plakkeme undersøgt ved en β-galactosidase protein-A-immunundersøgelse under anvendelse af en 25 præparation af BLV-gp-specifikt monoklonalt antistof. Begge rekombinanter vFP23 og vFP24, dannet fra hhv. plasmid pBLVFI og pBLVF2, udviste positiv farvning ved immunundersøgelsen, hvilket indikerede, at et immunologisk genkendeligt glycoprotein blev udtrykt på overfladen af de inficerede celler.

30 DK 176165 B1 53

Plasmiderne pBLVK4 og pBLVK6 indeholder hhv. BLV-env-gp51.30-genet og BLV-gp51.30-cleavage-minus-genet. Begge gener er indklonet i det unikke EcoRI-sted af pRW764.2 (locus C3) (pRW764.2 er beskrevet i eksempel 13) og er under transkriptionskontrol af Vaccinia-H6-promotoren.

5

Plasmiderne opnåedes ved følgende procedure: pBLVFI og pBLVF2 blev skåret med restriktionsenzymet Hindlll. Oligonukleotidet BKL1 (AGCTTGAATTCA) blev klonet ind i dette sted, hvorved dannedes et EcoRI-sted 3' i forhold til BLV-genet. Da der også er et EcoRI-sted 5' i forhold til io BLV-genet, blev disse plasmider (pBLVKI og pBLVK2) skåret med EcoRI, og fragmentet indeholdende det H6-promoterede BLV-gen blev klonet ind i EcoRI-stedet af pRW764.2. De resulterende plasmider blev designeret hhv. pBLVK4 og pBLVK6. Disse plasmider blev anvendt ved en in vitro afprøvning for rekombination med kanariepox som redningsvirus. Rekombinanter blev 15 udvalgt og oprenset på basis af overfladeudtrykkelse af glycoproteinet, vist ved en immunprøvning. Rekombinanterne blev designeret vCP-27 og vCP-28 fra hhv. plasmiderne pBLVK4 og pBLVK6.

Fjerkræpox-rekombinanter vFP-23 og vFP-24 er blevet inokuleret i får og 20 kvæg ved forskellige indgivelsesveje. Dyrene fik to inokuleringer, den anden 45 dage efter den første. Serumprøver blev taget 5 uger efter den første inokulering og to uger efter den anden inokulering. Antistof mod gp51 blev målt ved en kompetitiv ELISA-afprøvning og titeren udtrykt som den reciprokke af serumfortyndingen, hvilket giver en 50% reduktion af kompeti-25 tion. Resultaterne er vist i tabel XI.

Ingen af de afprøvede arter udviste et påviseligt immunrespons efter den første inokulering. Både får og kvæg udviste en signifikant antistof-stigning efter den anden inokulering.

DK 176165 B1 54

TABEL XI

Inokulerina af får oa kvæa med vFP-23 oa vFP-24 5 Dyr Virus Dosis og indaivelsesvei ELISA Titer Første Anden Første Anden

Kvæg B56 FP-1 108+10& 108+108 0 0 B59 FP-1 ID subcut 0 0 10 Får M89 FP-1 0 0 M91 FP-1 0 0

Kvæg B62 vFP-23 108+108 108+108 0 200b B63 vFP-23 ID subcut 0 80 15 Får M83 vFP-23 0 80 M84 vFP-23 0 500 M85 vFP-23 0 100

Kvæg B52 vFP-24 108+108 108+108 0 200 20 B53 vFP-24 ID subcut 0 60 Får M87 vFP-24 0 200 M92 vFP-24 0 20 M93 vFP-24 0 20 25 3 Intradermale injektioner blev givet to steder b Titer udtrykt som den reciprokke af fortyndingen, hvilket giver 50% kompetition.

EKSEMPEL 18 - Konstruktion af fierkræpox-virus FP-1 rekombinant vFP-3 0 26, der udtrykker infektiøs-bronchitis-virus-Mass-41- matrixqenet

Plasmid plBVM63 indeholder en infektiøs-bronchitis-virus (IBV) cDNA-klon af stamme Mass-41-matrixgenet. Et EcoRI-fragment på 8 kbp af plBVM63 35 indeholder matrixgenet med peplomergenet opstrøms (5'), og videre opstrøms er der et EcoRV-sted. Plasmid pRW715 har en EcoRI-koblingsse-kvens, der forbinder de to Pvull-steder i pUC9. EcoRI-fragmentet på 8 kbp DK 176165 B1 55 fra plBVM63 blev indsat i EcoRI-stedet i pRW715, hvorved dannedes pRW763. Plasmid pRW776 blev dannet til deletering af det 5'-beliggende EcoRI-sted i pRW763, hvilket efterlod et unikt EcoRI-sted nedstrøms (31) fra matrixgenet. Det isolerede lineære delvise EcoRI-nedbrydningsprodukt af 5 pRW763 blev skåret igen med RcoRV. Det største fragment blev isoleret, gjort stump-endet med Klenow-fragmentet fra DNA polymerase I og selvligeret til dannelse af pRW776. Konstruktionen pRW776 har de fuldstændige IBV-peplomergener og IBV-matrixgener efterfulgt af et enkelt EcoRI-sted.

10

Kun 5'- og 3-enderne af matrixgenet på ca. 0,9 kbp er blevet sekventeret. Begyndende ved den translationsinitierende codon (ATG) indeholder 5'-sekvensen af matrixgenet det følgende understregede Rsal-sted: ATGTCCAACGAGACAAATTGTAC. Den tidligere beskrevne H6-promotor 15 blev forbundet til matrixgenet med et syntetisk oligonukleotid. Det syntetiske oligonukleotid indeholdt H6-sekvensen fra dens RcoRV-sted til ATG og ind i den matrix-kodende sekvens gennem det første Rsal-sted. Oligonukleotidet blev syntetiseret med BamHI- og EcoRI-kompatible ender til indsættelse i pUC9, hvorved dannedes pRW772. EcoRI-enden ligger 3' i forhold Rsal- 2 0 stedet. Begyndende ved den BamHI-kompatible ende, med ATG under streget, er sekvensen af det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid:

GATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCAACGAGACAAATTGTACG

C GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAGGTTGCTCTGTTTAACATGCT TAA

25

Det lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW772 blev isoleret og skåret igen med RcoRI. pRW772-fragmentet, indeholdende en enkelt skæring i det ovennævnte Rsal-sted og skåret igen med EcoRI, blev isoleret, behandlet med phosphatase og anvendt som en vektor for pRW776- 3 o nedbrydningsproduktet nedenfor.

DK 176165 B1 56

Det isolerede lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW776 blev skåret igen med RcoRI. EcoRI ligger lige efter 3'-enden af matrixgenet. Et isoleret Rsal-EcoRI-fragment på ca. 0,8 kbp, indeholdende matrix-kodesekvensen fra det ovennævnte Rsal-sted, blev indsat i ovennævnte 5 pRW772-vektor til dannelse af pRW783. Den fuldstændige H6-promotor blev dannet ved tilføjelse af sekvenser 5' i forhold til EcoRV-stedet. H6-promotorens 5-ende varet Hinfl-sted, der var stump-endet ind i pl)C9's Sall-sted, hvorved dannedes et EcoRI-sted; 5’ i forhold til H6-promotoren ligger pUC9’s Hindlll-sted. Hindlll-EcoRV-fragmentet indeholdende 5’ Ηβ-ίο promotoren blev indsat mellem Hindlll- og EcoRV-stederne i pRW783 til dannelse af pRW786. pRW786’s EcoRI-fragment, indeholdene det fuldstændige H6-promoterede matrixgen, blev gjort stump-endet med Klenow-fragment fra DNA-polymerase I og indsat i det stump-endede BamHI-sted i pRW731.15 (locus f8) til dannelse af pRW789. pRW731.15-15 BamHI-stedet er det FP-1-locus, der i eksempel 6 bruges til konstruktion af vFP-8.

Plasmid pRW789 blev anvendt ved konstruktionen af vFP-26. Rekombinante plakker blev selekteret og behandlet ved in situ plakhybridisering.

20

Ved indledende afprøvninger er induceret et immunrespons mod IBV-matrixproteinet i kyllinger inokuleret med vFP-26.

EKSEMPEL 19 - Konstruktion af fierkræpox-virus FP-1 rekombinant vFP-25 31. der udtrykker infektiøs-bronchitis-virus (IBV) peplomer

Infektiøs-bronchitis-virus (IBV) Mass-41 cDNA-klon pIBVM 63 og dens subklon pRW776 er blevet beskrevet ved konstruktionen af vFP-26 i 30 eksempel 18. Subklon pRW776 indeholder IBV-peplomergenet på 4 kbp efterfulgt af matrixgenet med et unikt EcoRI-sted i 3’-enden. Kun 5’- og 3’- DK 176165 B1 57 enderne af IBV-peplomergenet på ca. 4 kbp er blevet sekventeret. Et unikt Xbal-sted adskiller de to gener. 5’-enden af peplomergenet, der starter ved translationsinitieringscodonen (ATG), indeholder det følgende understregede Rsal-sted: 5 AT GTTGGT AACACCT CTTTT ACT AGT G ACT CTTTT GT GTGTAC. Den tidli gere beskrevne H6-promotor blev forbundet med peplomergenet ved et syntetisk oligonukleotid. Det syntetiske oligonukleotid indeholder H6-promotorsékvensen fra Nrul-stedet til ATG og ind i den peplomer-kodende sekvens gennem det første Rsal-sted. Oligonukleotidet blev syntetiseret med ίο BamHI- og EcoRI-kompatible ender til indsættelse i pUC9, hvorved dannedes pRW768. EcoRI-enden ligger 3' i forhold Rsal-stedet. Begyndende ved den BamHI-kompatible ende, med ATG understreget, er sekvensen af det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid:

GATCTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTTGGTAACACCTCTT 15 AGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACAACCATTGTGGAGAA

TTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTACG

AATGATCACTGAGGAAACACACATGCTTAA

20 Det isolerede lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW768 blev skåret igen med EcoRI. pRW768-fragmentet, indeholdende en enkelt skæring i det ovennævnte Rsal-sted og skåret igen med EcoRI blev isoleret, behandlet med phosphatase og anvendt som en vektor for pRW776-ned-brydningsproduktet nedenfor.

25

Det isolerede lineære delvise Rsal-nedbrydningsprodukt af pRW776 blev skåret igen med RcoRI. pRW776 fragmentet på 5 kbp, indeholdende en enkelt skæring i det ovennævnte Rsal-sted, til EcoRI-stedet blev isoleret; fragmentet indeholder IBV-sekvenser fra ovennævnte peplomer-Rsal-sted til 30 EcoRI-stedet i 3-enden af matrixgenet. Indsættelse af pRW776-fragmenet i ovennævnte pRW768-vektor frembragte pRW788. Matrixgenet blev fjernet DK 176165 B1 58 ved det oven for fremhævede Xbal-sted. 5’ H6-promotoren blev indføjet i Nrul-stedet ved indsættelse af det stump-endede pRW788-Nrul-Bbal-frag-ment på 5 kbp i den stump-endede pRW760 Nrul-BamHI-vektor til frembringelse af pRW790. Vektoren pRW760 er beskrevet i eksempel 11; 5 kort beskrevet er det et Vaccinia-H6-promoteret influenza-nukleoprotein flankeret af det ikke-essentielle FP-1 locus f7. pRW760-vektoren blev fremstillet ved at fjerne 3' H6-sekvenseme fra Nrul-stedet til enden af nukleoproteinet ved BamHI. pRW790 er H6-promoteret IBV-peplomer i Hincll-stedet af pRW731.13. Rekombination af donorplasmidet pRW790 med lo FP-1 resulterede i vFP-31. Immunpræcipiteringsforsøg med anvendelse af CEF-lysater fremstillet fra celler inficeret med vFP-31 har vist specifik præcipitering af en lille mængde prækursorprotein med en molekylvægt på ca. 180 kD og af kløvningsprodukterne på90 kD.

15 EKSEMPEL 20 - Konstruktion af fierkræpox-virus FP-1-rekombinant vFP-

30. der udtrykker herpes simplex-virus-qD

Herpes simplex-virus (HSV) type-1-stamme-KOS-glycoprotein-D-gen (gD) blev klonet ind i pUC9 BamHI-stedet som et 5’ BamHI koblet Hpall til 3’ 20 BamHI koblet Nrul fragment; med 5’-enden ved siden af pUC9's Pstl-sted. 5-sekvensen af HSV-gD, begyndende ved translationsinitieringscodonen (ATG), indeholder følgende understregede Ncol-sted: atggggggggctgccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtggg cctccatgg. Den tidligere beskrevne Vaccinia-H6-promotor blev forbundet 25 med HSV-gD-genet ved et syntetisk oligonukleotid. Det syntetiske oligonukleotid indeholder 3’-delen af H6-promotoren fra Nrul til ATG ind i gD-kodesekvensen til Ncol-stedet. Oligonukleotidet blev syntetiseret med en 5-Pstl-kompatibel ende. gD-klonen i pUC9 blev skåret med Pstl og Ncol, og 5'-HSV-sekvensen fjernet til udskiftning med det syntetiske oligonukleotid, 3 o hvorved dannedes pRW787. Sekvensen af det dobbeltstrengede syntetiske oligonukleotid er: DK 176165 B1 59 GTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCG- ACGTCAGCGCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCCTCCACGGC- 5

CAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTATAGTAGGACTC

GTCGATCTAATCCACGACAATAAAATAAACATCAATATCATCCTGAGGTAC

Nedbrydning af pRW787 med Nrul og BamHI frembringer et fragment på ca. lo 1,3 kbp indeholdende 3'-H6-promotoren fra Nrul-stedet, gennem HSV-gD-kodesekvensen til BamHI-stedet. pRW760-vektoren, skåret med Nrul og BamHI, er beskrevet i eksempel 11. Indsættelse af 1,3 kbp-fragmentet i pRW760-vektoren førte til pRW791. pRW791-vektoren indeholder det fuldstændige vaccinia-H6-promoterede HSV-gD-gen i det ikke-essentielle 15 FP-1-Hincll-sted i pRW731.13 (locus f7).

Rekombination af donorplasmidet pRW791 med FP-1 resulterede i vFP-30. Overfladeudtrykkelse af glycoproteinet blev påvist i rekombinante plakker under anvendelse af en β-galactosidase-koblet protein-A-immunprøvning og 20 HSV-1-specifikke sera.

EKSEMPEL 21 - Anvendelse af entomopox-promotorer til regulering af udtrvkkelse af fremmede gener i pox-virus-vektorer 25 (a) Baggrund. Poxvira fra insekter (entomopox) klassificeres for øjeblikket i underfamilien Entomopoxvirinae, der yderligere underopdeles i tre slægter (A, B og C) svarende til entomopoxvira isoleret fra insektordnerne, hhv. Coleoptera, Lepidoptera og Orthoptera. Entomopox-vira har et snævert værtområde i naturen og er ikke kendt for at replikere i nogen vertebratarter.

30 DK 176165 B1 60

Entomopox-viruset anvendt ved disse forsøg var oprindeligt isoleret fra inficerede larver af Amsacta moorei (Lepidoptera: arctildae) fra Indien. (Roberts og Granados, J. Invertebr. Pathol. 12:141-143 [1968]). Viruset, designeret AmEPV, er typearten for slægt B.

5

Vildtype AmEPV blev opnået fra Dr. R. Granados (Boyce Thompson Institute, Cornell University) som infektiøs hæmolymfe fra inficerede larver af Estigmene acrea. Viruset fandtes at replikere i en invertebrat-cellelinje, IPLB-LD652Y, afledt fra ovarievæv hos Lymantria dispar (gypsy moth) (beskrevet ίο af Goodwin et al., In Vitro 14:485-494 [1978]). Cellerne blev dyrket i IPL-528-medier suppleret med 4% føtal kalve- og 4% kyllingesera ved 28 °C.

Vildtype-viruset blev plakprøvet på LD652Y-celler, og én plak, designeret V1, blev udvalgt til videre forsøg. Dette isolat danner sent i infektionscyklusen 15 talrige okklusionslegemer (occlusion bodies - OB) i cytoplasmaet af de inficerede celler.

(b) Promotor-identifikation. Identifikationen og kortlægningen af en AmEPV-promotor blev opnået på følgende måde. Totalt RNA fra sent inficerede 20 LD652Y-celler (48 timer efter infektion) blev isoleret og brugt til fremstilling af 32P-mærket førstestrengs-cDNA. cDNAet blev derpå anvendt til probe-undersøgelse af aftryk indeholdende restriktionsnedbrydningsprodukter af AmEPV-genomet. Denne Southern blot afslørede et stærkt signal pået Clal-fragment på 2,6 kbp, hvilket indikerede, at fragmentet kodede for et stærkt 25 udtrykt gen. Fragmentet blev klonet ind i en plasmidvektor og dets DNA-sekvens bestemt.

Analyse af sekvensdataene afslørede en åben læseramme i stand til at kode for et 42 kD polypeptid. In vitro translation af det totale RNA 48 timer efter 3 0 infektion og adskillelse af produkterne ved SDS-PAGE afslørede et polypeptid på ca. 42 kD.

DK 176165 B1 61 (c) Konstruktion af et rekombinant vacciniavims med udtrvkkelse af et fremmed gen under entomopox-promotorens kontrol. Til bestemmelse af, om en entomopox-promotor ville fungere i et vertebrat-poxvirus-system, blev det 5 følgende plasmid konstrueret. Der blev kemisk syntetiseret et oligonukleotid indeholdendede de 107 baser beliggende i 5’-retningen fra 42K-gen-transla-tionsstartsignalet (herefter betegnet AmEPV-42K-promotoren), flankeret af et Bglll-sted i 5'*enden og de første 14 baser af området kodende for hepatitis-B-virus-præ-S2, der ender i et EcoRI-sted, i 3-enden. AmEPV-42K-promotor-io sekvensen er beskrevet nedenfor.

TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATC TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA ATATGATAATATTTTGGGATTTCAAA 15 ATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATG

AmpEPV-42K-promotoren blev ligeret til hepatitis B-virus-overfladeantigenet (HBVsAg) som følger. Der konstrueredes et pUC-plasmid indeholdende hepatitis B-overfladeantigenet og det præ-S2-kodende område (type ayw 2 0 beskrevet af Galibert et al., Nature 281:646-650 [1979]) flankeret af vaccinia-virus-arme i det ikke-essentielle område af vaccinia-virus-genomet, der koder for hæmagglutinin (HA) molekylet (HA-arme beskrevet i eksempel 15; HA-område beskrevet af Shida, Virology 150:451-462 [1962]). Oligonukleotidet r beskrevet ovenfor blev indsat i dette plasmid ved at anvende det unikke 25 EcoRI-sted i det HBVsAg-kodende område og et unikt Bglll-sted i HA-vaccinia-armen. Det resulterende rekombinante vaccinia-virus blev designeret vP547.

Udtrykkelse af den indsatte HBVsAg-kodesekvens under kontrol af 30 entomopox-42K-promotoren blev bekræftet under anvendelse af en immunprøvning. Ækvivalente kulturer af den mammale cellelinje BSC-40 blev DK 176165 B1 62 inficeret med parentalt vaccinia-virus eller rekombinant vP547. 24 timer efter infektion blev cellerne lyseret og lysatet i seriefortyndinger påført en nitrocellulosemembran. Membranen blev først inkuberet med et gede-anti-HBV-serum og derpå med 125l-Protein A. Efter vaskning blev membranen 5 eksponeret på en røntgenfilm. Der blev påvist positive signaler i kulturer inficeret med vP547, men ikke i kulturer inficeret med parentalt virus, hvilket indikerer genkendelse af AmEPV-42K-promotoren af vaccinia-virus i mammale celler.

ίο Disse resultater blev verificeret under anvendelse af en Ausria-prøvning (se eksempel 1 for detaljer) til påvisning af HBVsAg i inficerede mammale celler. Vaccinia-virus-rekombinanter indeholdende HBsAg-genet koblet til AmEPV-42K-promotoren eller vaccinia-virus-H6-promotoren blev anvendt til inficering af BSC-40-celler, og udtrykkelsesniveauet af sAg prøvet ved Ausria-15 afprøvningsmetoden. Som det ses i tabel XII, viser dataene, at udtrykkelsesniveauet af HBsAg ved anvendelse af 42K-promotoren var signifikant.

TABEL XII

20 Udtrvkkelse af HBVsAg i rekombinant vaccinia-virus

Rekombinant virus Promotor Ausria P/N-forhold vP410 Kontrol 1,0 25 vP481 H6 24,3 vP547 42K 44,9

Yderligere forsøg blev udført for at fastlægge den tidsmæssige faktor ved reguleringen af AmEPV-42K-promotoren i en vertebrat-poxvirus-baggrund.

30 Ækvivalente kulturer af BSC-40 celler blev inficeret med vP547 i nærvær eller fravær af 40 pg/ml cytosinarabinosid, der er en DNA-repli- DK 176165 B1 63 kationsinhibitor, som derfor blokerer sen viral transkription. Udtrykkelsesniveauer 24 timer efter infektion blev prøvet ved en Ausria-afprøvning. Resultaterne indikerede, at 42K-promotoren blev genkendt som en tidlig promotor i et vaccinia-virus-replikationssystem.

5

Bemærk at brugen af AmEPV-42K-promotoren til udtrykkelse af fremmede I gener i et pattedyrsystem er klart forskellig fra brugen af Autographa californica-NPV-polyhedrin-promotoren til gen udtrykkelse i invertebrat-systemer (Luckow og Summers, Biotechnology 6:47-55 [1988]). Polyhedrin-io promotoren genkendes ikke af transkriptionsapparatet i pattedyrceller (Tjla et al., Virology 125:107-117 [1983]). Anvendelsen af AmEPV-42K-promotoren i pattedyrceller repræsenterer den første gang, en insektvirus-promotor er blevet brugt til udtrykkeisen af fremmede gener i en ikke-insekt viral vektor i ikke-invertebratceller.

15

Til bestemmelse af, om avipoxvira også ville genkende 42K-entomopox-promotoren, blev følgende forsøg udført. Identiske kulturer af CEF-celler blev inokuleret med 10 pfu pr. celle af enten fjerkræpoxvirus, kanariepoxvirus eller vacciniavirus og samtidigt transfekteret med 25 pg af ét af følgende 2 0 plasmider: 1) plasmid 42K.17 indeholdende' HBV-præ-S2 + sAg-kode-sekvensen koblet til 42K-promotoren eller 2) plasmid pMP15.spsP indeholdende den identiske HBVsAg-kodesekvens koblet til den tidligere beskrevne vaccinia-virus-H6-promotor. Efter 24 timer blev kulturerne frosset, cellerne lyseret, og lysatet analyseret for tilstedeværelsen af HBVsAg under 25 anvendelse af en Ausria-afprøvning. (se eksempel 1).

Resultaterne vist i tabel XIII skal anskues kvalitativt. De indikerer, at transkriptionsapparatet af både fjerkræpox og kanariepox er i stand til at genkende 42K-promotoren og tillade transkription af den koblede HBVsAg-30 kodesekvens. Skønt udtrykkelsesniveauerne er lavere end de, der opnåedes DK 176165 B1 64 med vaccinia-virus-H6-promotoren, ligger niveauerne pænt over baggrundsniveauer opnået med de negative kontroller.

i j

TABEL XIII

5

Genkendelse af 42K-entomopox-promotor af avipoxvira

Virus Promotor P/N-forhold 10 Fjerkræpox 42K 39,1 H6 356,8

Kanariepox 42K 90,2 H6 222,2 15

Vaccinia 42K 369,4 H6 366,9

Ingen 42K 7,8 2 0 Ingen H6 7,2

Vaccinia - 7,2 EKSEMPEL 22 - Immunisering med VCP-16 til beskyttelse af mus mod 25 udfordring med levende rabiesvirus

Grupper på tyve mus, 4 til 6 uger gamle, blev inokuleret under foden med 50 til 100 pi af en række fortyndinger af enten den ene eller den anden af to rekombinanter: (a) vFP-6, fjerkræpox-rabies-rekombinanten beskrevet i 3 0 eksempel 6, og (b) vCP-16, kanariepox-rabies-rekombinanten beskrevet i eksempel 13.

Efter 14 dage blev 10 mus fra hver gruppe slået ihjel og serum opsamlet. Anti-rabies-titeren i serumet blev beregnet ved brug af en RFFI-afprøvning 35 (beskrevet i eksempel 7). De tilbageværende 10 mus i hver gruppe blev udfordret ved intracerebral inokulering med CVS-stammen af rabies-virus DK 176165 B1 65 anvendt i eksempel 7. Hver mus modtog 30 pi, svarende til 16 muse-LD5o.

Efter 28 dage blev overlevende mus vurderet og den beskyttende dosis 50 (PD5o) beregnet, resultaterne er vist i tabel XIV.

5 Beskyttelsesniveauet for mus, fundet ved inokulering af vFP-6, bekræfter resultatet fundet efter inokulering af fjerkræpox-rekombinanten vFP-3 diskuteret i eksempel 7. Det beskyttelsesniveau, som fås ved inokulering af vCP-16, er betydeligt højere. På basis af den beregnede PD50er kanariepox-rabies-rekombinanten 100 gange mere effektiv til beskyttelse mod rabies-10 udfordring end fjerkræpox-rabies-rekombinanten.

TABEL XIV

Beskyttende immunitet mod udfordring med rabies-virus 15 udløst af to avipox-rabies-rekombinanter

Fjerkræpox vFP-6 Kanariepox vCP-16

Overle Overle-

Inokulum- RFFI- velses- Inokulum- RFFI- velses- 20 dosis_titer_forhold_dosis_titer_forhold_ 7,5a 2,3b 7/10 6,5 2,5 10/10 5.5 1,8 5/10 4,5 1,9 8/10 3.5 0,7 0/10 2,5 1,1 1/10 25 1,5 0,6 0/10 0,5 0,4 0/10 1 PD50 = 6,17 1 PD50 = 4,18 a Virustitere udtrykt som log10 TCID50.

b RFFI-titer udtrykt som log10 af højeste serumfortynding der giver over 50% reduktion i antallet af fluorescerende brønde i en RFFI-afprøvning.

30 DK 176165 B1 66 EKSEMPEL 23 - Anvendelse af fierkræpox-promotorelementer til udtrykkelse af fremmede gener I. Identificering af fierkræpox-oenet. der koder for et genprodukt på 25.8 5 kiloDalton (kD)

Visualisering af proteinarter til stede i fjerkræpox (FP-1) inficerede CEF-lysater, ved farvning af SDS-polyacrylamidgeler med Coomassie-blåt, afslørede en i stor mængde forekommende art med en tilsyneladende mole-10 kylvægt på 25,8 kD. Dette protein var ikke til stede i uinficerede cellelysater. Impulsforsøg med anvendelse af 35S-methionin til radiomærkning af syntetiserede proteiner på specifikke tidspunkter efter infektion anskueliggjorde igen rigeligheden af det FP-1-inducerede protein og viste, at det syntetiseres fra 6 til 54 timer efter infektion. På sit højdepunkt udgør dette 15 FP-1-protein på25,8 kD ca. 5% til 10% af totalt protein til stede i cellelysatet.

Den rigelige forekomst af det FP-1-inducerede 25,8 kD protein tydede på, at genet, der koder for dette genprodukt, reguleres af et stærkt FP-1-promotorelement. For at lokalisere dette promotorelement med henblik 20 påsenere anvendelse ved udtrykkeisen af fremmede gener i pox-virus-rekombinanter, opnåedes en polysom præparation fra FP-1-inficerede CEF-celler 54 timer efter infektion. RNA blev isoleret fra denne polysome præparation og frembragte, når anvendt til at programmere et in vitro kanin-reticulocyt-translationssystem, fortrinsvis FP-1-proteinet på 25,8 kD.

25

Det polysome RNA blev også brugt som en skabelon for syntese af førstestrengs-cDNA under anvendelse af oligo (dT) 12-18 som en initiator. Førstestrengs-cDNAet blev anvendt som en hybridiseringssonde ved Southern blot-analyser med nedbrydningsprodukter af FP-1-genomet. Resul-30 tater fra disse hybridiseringsanalyser tydede på, at genet, der koder for 25,8 kD-proteinet, var indeholdt i et Hind I Il-fragment på 10,5 kbp. Dette DK 176165 B1 67 genomiske Hindlll-fragment blev derefter isoleret og ligeret ind i en kommerciel vektor, pBS (Stratagene, La Jolls, CA), og klonen designeredes pFP23K-1. Yderligere hybridiseringsanalyser under anvendelse af førstestrengs-cDNAet til sondering af nedbrydningsprodukter af pFP23k-1 5 lokaliserede 25,8 kD-genet til et EcoRNAsubfragment på 3,2 kbp. Fragmentet blev subklonet ind i pBS og designeret pFP23k-2.

Ca. 2,4 kbp af dette FP-1-EcoRV-fragment er blevet sekventeret ved Sanger dideoxy-kædetermineringsmetoden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

10 USA 74:5463-5467 [1977]). Analyse af sekvensen afslører en åben læseramme (open reading frame - ORF), der koder for et genprodukt med en molekylvægt på 25,8 kD. In vitro transkription af denne ORF med bakteriofag T7 polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) i en pBS-vektor frembringer en RNA-art, som, når den anvendes til at programmere et in vitro kanin-15 reticulocyt-translationssystem (Promega Biotec, Madison, Wl), giver en polypeptid-art med en tilsyneladende molekylvægt på 25,8 kD. I en SDS-polyacrylamidgel bevæger dette polypeptid sig sammen med det i stor mængde forekommende 25,8 kD-protein observeret i lysater fra FP-1-inficerede CEF-celler. Resultaterne tyder på, at dette er genet, der koder for 20 det rigeligt forekommende FP-1-inducerede genprodukt på 25,8 kD.

II. Anvendelse af opstrøms-promotorelementerne af FP-1-genet på 25.8 kD til udtrvkkelse af katteleukæmivirus (FeLV) env-qenet i rekombinanter af FP-1 og vaccinia.

25

Et EcoRV/EcoRI-fragment på 270 bp indeholdende det regulerende område (FP25.8K-promotor) for FP-1-genet på 28,5 kD og 21 bp af kodesekvensen for 25,8 kD-genet blev isoleret fra pFP23k-2. Nedenfor er vist nukleotidsekvensen af FP25.8K-promotorområdet anvendt til opnåelse af 30 pFeLV25.8F1 og pFeLV25.81A. Denne sekvens på 270 nukleotider udgør DK 176165 B1 68 249 nukleotider af området opstrøms for initieringscodonen (ATG) for 25,8 kD genproduktet og de første 21 bp af kodesekvensen.

5' -GATATCCCCATCTCTCCAGAACAGCAGCATAGTGTTAGGACAATCATCTAA-5 TGCAATATCATATATGAATCTCACTCCGATAGGATACTTACCACAGCTATTATA-CCTTAATGTATGTTCTATATATTTAAAAACAGAAACAAACGGCTATAAGTTTAT- atgatgtctatattatagtgagtatattataagtatgcgggaatatctttgatt- TAACAG C GTAC GAT T C GT GATAAGTAAATATAGGCAAT GGATAGCATAAAT GAA-TTC-3' 10

Dette fragment blev gjort stump-endet og derpå indsat i en Smal-nedbrudt FP-1-indsættelsesvektor (pFeLVFI, se eksempel 15) indeholdende FeLV-env-sekvenserne. Denne indsættelsesvektor muliggjorde rekombination med f7-locuset af FP-1-genomet. Indsættelse af FP25.8K-promotorens 15 opstrømssekvenser 5' i forhold til FeLV-env-genet, og med den rigtige orientering, blev bekræftet ved sekvensanalyse. Denne indsættelse giver ikke en nøjagtig substition af ATG med ATG, men ATGet fra 25,8 kD-genet er ude af ramme med FeLV-env-ATGet, så der dannes ikke noget fusionsprotein. FP-1-indsættelsesplasmidet indeholdende FP25.8KD-2 o promotoren opstrøms fra FeLV-env-genet blev designeret pFeLV25.8F1.

En lignende konstruktion blev fremstillet ved anvendelse af vacciniavirus-indsættelsesvektoren, pFeLVIA, husende FeLV-genet (se eksempel 15). H6-promotoren blev fjernet fra pFeLVIA ved nedbrydning med Bglll og Smal.

25 Efter at Bglll-restriktionsstedet var gjort stump-endet, blev det stump-endede 270 bp EcoRV/EcoRI-fragment indeholdende FP25.8K-promotoren indsat sidestillet 5' i forhold til FeLV-env-genet. Denne konstruktion blev bekræftet ved sekvensanalyse. Der er heller ikke en nøjagtig substitution af ATG med ATG i denne rekombinant, men ATGet fra 25,8 kD-genet er ikke i ramme 30 med ATGet fra FeLV-genet. Vaccinia (Copenhagen-stamme) DK 176165 B1 69 indsættelsesvektoren, husende 25,8 kD-genets opstrømsområde sidestillet 5' i forhold til FeLV-genet, blev designeret pFeLV25.81A.

Indsættelsesplasmideme pFeLV25.8F1 og pFeLV25.81A blev anvendt ved in 5 vitro rekombination med FP-1 (pFeLV25.8F1) og Copenhagen-stammen af vacciniavirus (pFeLV25.81A) som de reddende vira. Afkom af rekombinationen blev udpladet på passende cellemonolag, og rekombinant virus valgt ved en β-galactosidase-koblet protein-A-immunprøvning og et bovint anti-FeLV-serum (Antibodies, Inc., Davis, CA). Foreløbige resultater tyder på, ίο at FP25.8K-promotoren kan regulere udtrykkeisen af fremmede gener i poxvirus-rekombinanter.

EKSEMPEL 24 - Sikkerhed oa virkninasfuldhed af vFP-6 oa vCP-16 i fjerkræ 15

De to avipox-rekombinanter, vFP-6 og vCP-16 (beskrevet i eksemplerne 6 og 13), blev inokuleret i 18 dage gamle kyllingefostre, 1 dag gamle kyllinger og 28 dage gamle kyllinger, og fuglenes respons evalueret ved tre kriterier: 1) virkninger af vaccination på klækningsevne, vaccinationsreaktioner og 2 0 dødelighed 2) induceret immunrespons mod rabies-glycoproteinet, og 3) induceret immunrespons mod fjerkræpox-antigener. De udførte forsøg er beskrevet nedenfor.

A. Sikkerhedsafprøvninqer. Grupper på tyve 18 dage gamle fostre blev 25 inokuleret i allantoishulen med 3,0 eller 4,0 log10 TCID50 af enten vFP-6 eller vCP-16. Efter udrugning blev kyllingerne observeret i 14 dage, på hvilket tidspunkt de hver fik udtaget blod, og sera opsamledes. De to rekombinanter inokuleret i kyllingefostrene havde ingen virkning på udrugningsevnen af æggene, og kyllingerne forblev sunde under den 14 dage lange obser-30 vationsperiode.

DK 176165 B1 70

Grupper på 10 SPF 1 dag gamle kyllinger blev ved intramuskulær indgivelse inokuleret med 3,0 logio TCID50 af hver af rekombinanterne. Kyllingerne blev observeret i 28 dage og serumprøver opsamlet 14 og 28 dage efter in-okulering. Der sås ingen vaccinationsreaktion på inokuleringsstedet med 5 nogen af rekombinanterne, og kyllingerne forblev sunde under den 28 dage lange observationsperiode.

Grupper på ti 28 dage gamle kyllinger blev inokuleret med hver af de rekombinante vira, idet de modtog enten 3,0 log10 TCID50 ved intramuskulær 10 indgivelse eller 3,0 logio TCID50 ved cutan indgivelse (vingemembran). Kyllinger blev observeret i 28 dage og serumprøver opsamlet 14 og 28 dage efter inokulering. Der sås ingen reaktion efter intramuskulær inokulering med nogen af rekombinanterne. Cutan inokulering resulterede i en meget lille vaccinationsreaktion over for fjerkræpox med læsioner af heterogen 15 størrelse. Kanariepox-inokulering førte til dannelsen af en normal cutan læsion på inokuleringsstedet. Alle læsioner var i tilbagegang ved afslutningen af forsøget.

B. Immunrespons. RFFI-afprøvningen beskrevet i eksempel 7 blev anvendt til 2 o vurdering af niveauerne af antistof mod rabiesglycoproteinet. For hver gruppe blev resultaterne udtrykt med den geometriske middeltiter af det individuelle serum omregnet til internationale enheder (IU) ifølge et standardserum, der indeholdt 23,4 IU. Minimums-positivitetsniveauet blev fastsat til én IU og blev brugt til bestemmelse af % positive fugle. Antistoffer mod avipox-viraene blev 25 afprøvet ved en ELISA-metode med brug af fjerkræpoxvirus-stammen som et antigen. Hver serumprøve blev fortyndet 1/20 og 1/80. Der konstrueredes en standardkurve under anvendelse af positive og negative sera. Minimumspositivitetsniveauet blev beregnet med middelværdien af de forskellige værdier af de negative sera lagt til med to standardafvigelser.

30 DK 176165 B1 71

Resultaterne af serologiske undersøgelser er vist i tabel XV for vFP-6 og tabel XVI for vCP-16.

Der observeredes et begrænset serologisk respons for både rabies- og 5 fjerkraepox-antigener med fostre inokuleret med enten vFP-6 eller vCP-16. Fjerkræpox-vektoren inducerede et serologisk respons over for begge antigener i et større antal fugle, end tilfældet var for kanariepox, men responset var stadig heterogent.

ίο 1 dag gamle kyllinger inokuleret med vFP-6 havde et godt serologisk respons, med alle fuglene seropositive over for rabies- og fjerkraepox-antigener 28 dage efter inokulering. Responset på inokulering med vCP-16 var meget lavere, med 40% af fuglene seropositive over for rabies-glycoprotein på dag 28 og 10% seropositive for avipox-antigener.

15 28 dage gamle kyllinger inokuleret intramuskulært med vFP-6 viste 100% serokonversion for begge antigener 14 dage efter inokulering. Selv om størstedelen af fuglene også serokonverterede efter cutan inokulering, varde opnåede titere lavere for både rabies- og avipox-antigener. Som tidligere, ud-20 viste kyllinger, inokuleret ad både intramuskulær og subcutan vej med vCP-16, et varierende respons med et maksimum på 70% serokonversion mod rabies ved intramuskulær inokulering. Det lave serokonversionsniveau for avipox-antigener efter kanariepox-inokulering er eventuelt udtryk for graden af serologisk slægtskab mellem viraene.

25

Resultaterne indikerer, at både vFP-6 og vCP-16 er sikre at inokulere i kyllinger i forskellige aldre. Fjerkræpox-vektoren vFP-6 synes mere effektiv til inducering af et immunrespons i kyllinger. Det er imidlertid signifikant, at begge rekombinante avipoxvira, fjerkræpox og kanariepox, er vist at være 3 0 nyttige til immunisering in ovum.

72

TABEL XV

Immunologisk respons på fierkræpox/rabies-glvcoprotein (vFP-6) i kyllinger i forskellige

Antistoffer 5 ____________________

Tid efter Rabies-glycoprotein I

Dosis inokulering

Grupper (TCID50) (dage) Middel IU-tite % fugle/1 IU Middel El 10 Fostre T(P 3+14 (X28 15% 0,125 18 dage gamle 104 3 + 14 ,87 30% 0,129

Kyllinger 103 14 1,8 90% 0,109 1 dag gamle 28 4,2 100% 0,234 15 intramuskulært

Kyllinger 103 1 4 3,7 1 00% 0,317 28 dage gamle 28 2,7 100% 0,378 intramuskulært 20

Kyllinger 103 1 4 1,6 1 00% 0,191 28 dage gamle 28 0,54 90% 0,161 cutant 25 ~~ 73

TABEL XVI

Immunologisk respons på kanarieoox/rabies-alvcoDrotein (vCP-161 i kyllinger i forskellige 5 Antistoffer

Tid efter Rabies-glycoprotein K

Dosis inokulering

Grupper (TCID50) (dage) Middel IU-titer %fugle/1IU Middel Eli: 10 _

Fostre 103 3 + 14 0,14 0% 0,068 18 dage gamle 104 3 + 14 0,19 8% 0,059 15 Kyllinger 103 14 0,18 10% 0,027 1 dag gamle 28 0,21 40% 0,059 intramuskulært j

Kyllinge 103 14 0,61 70% 0,093 20 28 dage gamle 28 0,24 30% 0,087 intramuskulært

Kyllinger 103 14 0,34 40% 0,071 28 dage gamle 28 0,11 10% 0,061 25 cutant L_ DK 176165 B1 74 EKSEMPEL 25 - Sikkerhed og immunoaenicitet af vFP-6-inokulerina I småqrise

To grupper på tre smågrise blev inokuleret med det rekombinante vFP-6 ved 5 én af to indgivelsesveje: a) tre dyr modtog 8,1 log10 TCID50 ved intramuskulær inokulering, og b) tre dyr modtog den samme dosis ved oral inokulering.

Alle dyr fik udtaget blod med ugentlige mellemrum og modtog booster-10 inokulering af den samme dosis ad samme indgivelsesvej på dag 35.

Smågrisene blev dagligt observeret for kliniske tegn. Sera blev afprøvet for anti-fjerkræpox-antistofer ved en ELISA-afprøvning og en serum-neutralisations-afprøvning. Rabies-antistoffer blev prøvet ved en RFFI-afprøvning.

15

Alle smågrise forblev sunde, og der observeredes ingen læsioner efter inokulering. Temperaturkurver var normale uden nogen tilsyneladende forskel mellem inokulerede og uinokulerede dyr.

20 Smågrise inokuleret ved såvel intramuskulær som oral indgivelsesvej udviklede et serologisk respons på fjerkræpox-antigener som målt ved ELISA og serum-neutralisation. Et sekundært respons var tydeligt efter booster-inokulering (resultaterne ikke vist). Alle smågrise udviklede ligeledes et immunologisk respons på rabies-glycoprotein som målt ved en RFFI-25 afprøvning, og en booster-virkning er tydelig ved begge indgivelsesveje. ' j

Disse resultater er vist i tabel XVII.

Resultaterne indikerer, at inokulering af en fjerkræpox/rabies-rekombinant er uskadelig i smågrise, og at rekombinanten er i stand til at frembringe et 30 signifikant immunrespons på rabies-glycoproteinet ved oral eller intramuskulær inokulering.

« DK 176165 B1 75

TABEL XVII

Antistof mod rabies-qlvcoprotein dannet i småqrise inokuleret med vFP-6 5 Vaccinations- Dyr Rabies-antistof på dag (RFFI-titer) indgivelsesvej 14 21 28 35b 42 49 984 2,4a 2,2 2,1 2,2 3 3

Intramuskulært 985 2,5 2,7 2,6 2,4 3 3 10 986 2,2 2,0 2,1 2,3 3 3 987 3 2 2,1 2 3 3

Oralt 988 2,9 2,4 2,2 2,4 2,7 2,5 989 2,8 2 1,7 1,8 2,4 2,5 15 a Titer udtrykt som log-ιο af højeste serumfortynding der giver over 50% reduktion i antallet af fluorescerende brønde i en RFFI-afprøvning. b Dyrene modtog den anden inokulering på dag 35.

20

Claims (9)

1. Rekombinant fjerkræpoxvirus, kendetegnet ved, at det indeholder DNA fra en ikke-avipox-kilde som koder for et antigen af et vertebratpatogen 5 og er ligeret til en promotor for ekspression af DNA'et, hvor det nævnte DNA og promotor er indsat i et ikke-essentielt område af fjerkræpoxgenomet.

2. Virus ifølge krav 1, hvori den nævnte promotor er en vaccinia-promo-tor, en entomopox-promotor eller en avipox-promotor.

3. Virus ifølge krav 1, hvori det nævnte DNA koder for et antigen af et 10 pattedyrpatogen, valgt blandt rabies G-antigen, gp51,30-kappeantigen fra okseleukæmivirus, FeLV-kappe-antigen fra katteleukæmivirus og glycoprotein D-antigen fra herpes simplex-virus.

4. Virus ifølge krav 1, hvori det nævnte DNA koder for et antigen af et fuglepatogen valgt blandt fugleinfluenza-hæmagglutinin-antigen, et 15 fusionsprotein-antigen af Newcastle disease virus, et RAV-1 kappeantigen af Rous-associeret virus, nucleoprotein-antigen af fugleinfluenzavirus, et matrix-antigen af det infektiøse bronchitis-virus og peplomer-antigen af det infektiøse bronchitis-virus.

5. Anvendelse af et virus ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 ved 2 o fremstilling af et lægemiddel for behandling af sygdomme i vertebrater.

6. Anvendelse af et virus ifølge krav 5, hvor vertebratet er et pattedyr og hvor sygdommen er en infektion ved et pattedyrpatogen.

7. Anvendelse ifølge krav 6 hvor pattedyrpatogenet er valgt blandt rabiesvirus, okseleukæmivirus, katteleukæmivirus og herpes simplex-virus. 2 5

8. Anvendelse af et virus ifølge krav 5, hvor vertebratet er en fugl og hvor sygdommen er en infektion fra et fuglepatogen. DK 176165 B1

9. Anvendelse ifølge krav 8 hvor fuglepatogenet er valgt blandt fugleinfluenzavirus, Newcastle disease-virus, Rous-associeret virus og infektiøs bronchitis-virus.